Comisia Europeană: (Comunicări)

19.2.
2010
RO
Jurnalul Oficial al Uniunii Europene
C 43/1
II
(Comunicri)
COMUNICRI PROVENIND DE LA INSTITUIILE, ORGANELE I ORGANISMELE UNIUNII EUROPENE
COMISIA EUROPEAN
Lista i descrierea metodelor de analiz menionate la articolul 120g primul paragraf din Regulamentul (CE) nr. 1234/2007 al Consiliului (1) [publicate n conformitate cu articolul 15 alineatul (2) din Regulamentul (CE) nr. 606/2009 al Comisiei din 10 iulie 2009 (2)] (2010/C 43/01) Tabelul de mai jos regrupeaz lista metodelor de analiz care se aplic la verificarea limitelor i a cerinelor stabilite n legislaia comunitar privind fabricarea produselor vitivinicole. n cea de-a treia coloan se gsete, pentru fiecare parametru specific, trimiterea la metoda de analiz corespunztoare descris n Culegerea de metode internaionale de analiz a vinurilor i musturilor a OIV, n ultima ediie (2009) disponibil la data prezentei publicri. Pentru fiecare parametru sunt descrise numai metodele de referin (tip I sau tip II n clasificarea OIV), cu excepia parametrilor pentru care nu exist n prezent nicio metod de tip I sau II validat. Descrierea metodelor figureaz n anexa la comunicare.
Observaie: Culegerea OIV stabilete, n anexa A seciunea I, definiia diferitelor tipuri de metode de analiz, n special a tipului I (metod de referin criteriu), a tipului II (metod de referin) i a tipului IV (metod provizorie).
Metodele de analiz pentru plumb i cadmiu sunt descrise n prezent n Regulamentul (CE) nr. 333/2007 al Comisiei din 28 martie 2007 (anexa C-3) (3). De asemenea, Regulamentul (CE) nr. 401/2006 din 23 februarie 2006 (4) stabilete criterii generale pentru metodele de analiz pentru ocratoxina A n anexa II.4, drept pentru care nu este necesar s se descrie, pentru aceast substan, o metod specific produselor vitivinicole.
LISTA METODELOR DE ANALIZ

Nr. Parametrul Metoda din Culegerea OIV Tipul
1 2 3 4
Masa volumic / densitatea Indicele refractometric Extractul sec total Raportul izotopic
18O/16O
AS-2-01-MASVOL AS-2-02-SUCREF AS-2-03-EXTSEC al apei din vin AS-2-09-MOUO18
I I I II
(1 ) (2 ) (3 ) (4 )
JO JO JO JO
L L L L
299, 16.11.2007. 193, 24.7.2009, p. 1. 88, 29.3.2007, p. 29. 70, 9.3.2006, p. 12.
C 43/2
RO
19.2.2010
Nr.
Parametrul
Metoda din Culegerea OIV
Tipul
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Indicele Folin-Cioclteu Coninutul de zahr (= glucoz+fructoz) Coninutul de zaharoz (determinarea HPLC) Rezonana magnetic nuclear Deuteriu a etanolului din vin Tria alcoolic n volume % (TAV) Raportul izotopic vin Aciditatea total Aciditatea volatil Acidul citric Acidul sorbic pH-ul mustului Acidul ascorbic CO2 n g/l CO2 n g/l (manometrie) Suprapresiunea CO2 Lizozima Sulfatul de potasiu Fierul Cuprul Sulfiii (SO2) sau Dioxidul de sulf total
13C/12C
AS-2-10-INDFOL AS-311-02-GLUFRU AS-311-03-SUCRES AS-311-O5-ENRRMN (n revizuire) AS-312-01-TALVOL AS-312-06-ETHANO AS-313-01-ACITOT AS-313-02-ACIVOL AS-313-09-ACIENZ AS-313-14-ACISOR AS-313-15-PH AS- 313-22 ACASCO AS-314-01-DIOCAR AS-314-04-CO2MAN AS-314-02-SURPRES AS-315-14-LYSOZY AS-321-05-SULFAT AS-322-05-FER AS-322-06-CUIVRE AS-323-04-DIOSU
IV II II I I II I I II IV I II II II I IV II IV IV II
al etanolului din
Descrierea ctorva metode de analiz face obiectul unei actualizri realizate de ctre autoritile OIV. Descrierile respective vor fi publicate ntr-o viitoare comunicare a Comisiei, imediat ce un text actualizat va fi publicat de OIV n ediia 2010 a Culegerii de metode internaionale de analiz a OIV.
19.2.2010
RO
C 43/3
ANEX CUPRINS 1. MASA VOLUMIC LA 20 C I DENSITATEA RELATIV LA 20 C (OIV-AS2-01-MASVOL) Metod tip I 2. EVALUAREA PRIN REFRACTOMETRIE A CONINUTULUI DE ZAHARURI DIN MUSTURI, DIN MUSTURILE CONCENTRATE I DIN MUSTURILE CONCENTRATE RECTIFICATE (OIV-AS2-02-SUCREF) Metod tip I 3. EXTRACTUL SEC TOTAL (OIV-AS-2-03-EXTSEC) Materia uscat total Metod tip I . . . . . . . . . . . . . . . . 4. DETERMINAREA RAPORTULUI IZOTOPIC 18O/16O AL CONINUTULUI DE AP DIN VIN (OIV-AS-2-09MOUO18) Metod tip II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5. INDICELE FOLIN-CIOCALTEU (OIV-AS-2-10-INDFOL) Metod tip IV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6. GLUCOZA I FRUCTOZA (OIV-AS-311-02-GLUFRU) Metod tip II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7. DETERMINAREA ZAHARURILOR PRIN HPLC (ZAHAROZ) (OIV-AS-311-03-SUCRES) Metod tip II . . . 8. DETECTAREA MBOGIRII MUSTURILOR DE STRUGURI, A MUSTURILOR DE STRUGURI CONCENTRATE, A MUSTURILOR DE STRUGURI CONCENTRATE RECTIFICATE I A VINURILOR, PRIN APLICAREA REZONANEI MAGNETICE NUCLEARE A DEUTERIULUI (OIV-AS-311-05-ENRRMN) Metod tip I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9. TRIA ALCOOLIC N VOLUME (OIV-AS-312-01-TALVOL) Metod tip I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10. DETERMINAREA PRIN SPECTROMETRIA IZOTOPIC DE MAS A RAPORTULUI IZOTOPIC 13C/12C AL ETANOLULUI DIN VIN SAU AL ETANOLULUI OBINUT PRIN FERMENTAREA MUSTURILOR, A MUSTURILOR CONCENTRATE SAU A MUSTURILOR CONCENTRATE RECTIFICATE (OIV-AS-312-06ETHANO) Metod tip II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11. ACIDITATEA TOTAL (OIV - AS-313-01-ACITOT) Metod tip I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12. ACIDITATEA VOLATIL (OIV - AS-313-02-ACIVOL) Metod tip I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13. ACIDUL CITRIC (OIV -AS-313-09-ACIENZ) Metod tip II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14. ACIDUL SORBIC (OIV - AS-313-14-ACISOR) Metod tip IV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15. pH-ul (OIV - AS-313-15-PH) Metod tip I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16. DETERMINAREA SIMULTAN A ACIDULUI L-ASCORBIC I A ACIDULUI D-IZOASCORBIC PRIN HPLC I DETECTARE UV (OIV-AS-313-22-ACASCO) Metod tip II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17. DIOXIDUL DE CARBON (OIV - AS-314-01-DIOCAR) Metod tip II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18. DETERMINAREA DIOXIDULUI DE CARBON DIN VIN PRIN METODA MANOMETRIC (OIV AS314-04CO2MAN) Metod tip II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19. MSURAREA SUPRAPRESIUNII VINURILOR SPUMANTE I PETIANTE (OIV - AS-314-02-SURPRES) Metod tip I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20. DETERMINAREA LIZOZIMEI DIN VIN PRIN HPLC (OIV-AS-315-14) Metod tip IV . . . . . . . . . . . . . . . . . 21. SULFAII (OIV- AS-321-05-SULFAT) Metod tip II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22. FIERUL (OIV - AS-322-05-FER) Metod tip IV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23. CUPRUL (OIV AS 322-06) Metod tip IV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24. DIOXIDUL DE SULF (OIV - AS-323-04-DIOSU) Metod tip II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 8 10 11 12 14 17
18 19
20 27 30 33 36 39 41 45 47 48 51 54 55 56 58
C 43/4
RO
19.2.2010
1 MASA VOLUMIC LA 20 C I DENSITATEA RELATIV LA 20 C (OIV - AS2 - 01- MASVOL) METOD TIP I 1. DEFINIII Masa volumic reprezint masa per unitate de volum de vin sau de must, la 20 oC. Aceasta se exprim n grame pe mililitru i este reprezentat prin simbolul 20 C. Densitatea relativ la 20 C sau densitatea 20 C/20 C reprezint raportul, exprimat n numr zecimal, dintre masa unui anumit volum de vin sau de must la 20 C i masa aceluiai volum de ap, la aceeai temperatur. Se C exprim prin simbolul d20 20 C 2. PRINCIPIUL METODELOR Masa volumic i densitatea relativ la 20 C sunt determinate pe proba de testare: fie prin picnometrie: metoda de referin, fie prin densimetrie cu balana hidrostatic sau prin densimetrie electronic. Not Pentru determinri foarte precise, masa volumic trebuie corectat de aciunea dioxidului de sulf. 20 C = 20 C 0,0006 S 20 C = masa volumic corectat 20 C = masa volumic observat S 3. = dioxid de sulf total n g/l
TRATAREA PRELIMINAR A PROBEI Dac vinul sau mustul conine cantiti semnificative de dioxid de carbon, acesta se elimin n cea mai mare parte prin agitarea a 250 ml de vin ntr-un recipient de 1 000 ml sau prin filtrarea la presiune redus prin 2 g de vat plasat ntr-un tub prelungitor.
4. 4.1.
METODA DE REFERIN Aparatura Echipament de laborator normal, n special:
4.1.1.
Picnometru (1) din sticl pirex cu o capacitate de aproximativ 100 ml, dotat cu un termometru detaabil cu mbinare din sticl lefuit, calibrat n zecimi de grad, de la 10 la 30 C. Termometrul trebuie s fie standardizat (figura 1).
Figura 1 Picnometru i tar Acest picnometru are un tub lateral cu o lungime de 25 mm i un diametru interior de maxim 1 mm, care se termin printr-o mbinare conic lefuit. Tubul lateral poate fi etanat cu un dop rezervor format dintr-un tub conic de legtur din sticl lefuit i terminat cu o seciune ascuit. Dopul folosete drept camer de expansiune.
(1) Se poate utiliza orice picnometru cu caracteristici echivalente.
19.2.2010
RO
C 43/5
Cele dou mbinri lefuite ale aparatului se pregtesc cu atenie deosebit. 4.1.2. Un recipient tar cu acelai volum exterior (sub 1 ml, cu aproximaie) ca i picnometrul i cu masa egal cu masa picnometrului umplut cu un lichid cu densitatea 1.01 (soluie de clorur de sodiu 2,0 % m/v). Recipient izolat termic, ajustat exact pe corpul picnometrului. 4.1.3. O balan cu dou talere cu o plaj de cel puin 300 g i cu o sensibilitate de 0,1 mg, sau, o balan cu un taler cu o plaj de cel puin 200 g i cu o sensibilitate de 0,1 mg. 4.2. Calibrarea picnometrului Calibrarea picnometrului implic determinarea urmtoarelor caracteristici: tara picnometrului vid, volumul picnometrului la 20 C, masa picnometrului umplut cu ap la 20 C. 4.2.1. Metoda utilizrii unei balane cu dou talere Recipientul tar fiind aezat pe talerul stng al balanei, iar picnometrul curat, uscat i prevzut cu dopul rezervor pe talerul drept, se realizeaz echilibrarea prin adugarea de greuti pe talerul pe care se afl picnometrul: se noteaz cu p grame. Se umple picnometrul cu ap distilat la temperatura ambiant i se fixeaz termometrul; se terge picnometrul pentru a-l usca i se aeaz n recipientul izolat termic; se amestec prin rotirea recipientului pn cnd temperatura artat de termometru este constant. Se regleaz cu atenie nivelul, pn la marginea superioar a tubului lateral. Se usuc prin tamponare tubul lateral i se aeaz dopul; se citete cu atenie temperatura t C corectnd-o pentru eventuala imprecizie a scalei termometrului. Se cntrete picnometrul umplut cu ap i se noteaz cu p greutatea, n grame, necesar stabilirii echilibrului. Calculare Tararea picnometrului vid: Tara picnometrului vid= p + m m= masa aerului coninut n picnometru unde m= 0,0012 (p p). Volumul la 20 C: V20 C= (p + m p) Ft unde Ft= factor luat din tabelul I pentru temperatura t C V20 C trebuie s fie cunoscut n intervalul 0,001 ml. Masa apei la 20 C: M20 C= V20 C 0,998203 0,998203 = densitatea apei la 20 C. 4.2.2. Metoda utilizrii unei balane cu un taler Se determin: masa picnometrului curat i uscat: P masa picnometrului umplut cu ap la t C: P1 urmnd metoda descris la punctul 4.2.1 masa recipientului tar T0
C 43/6
RO
19.2.2010
Calculare Tararea picnometrului vid: Tara picnometrului vid= P m unde m= masa aerului din picnometru m= 0,0012 (P1 P) Volumul la 20 C: V20 C= [P1 (P m)] Ft unde Ft= factor luat din tabelul I pentru temperatura t C. Volumul la 20 C trebuie s fie cunoscut n intervalul 0,001 ml. Masa apei la 20 C: M20 C= V20 C 0,998203 0,998203= densitatea apei la 20 C. 4.3. 4.3.1. Metoda de determinare Metoda utilizrii unei balane cu dou talere Se cntrete picnometrul umplut cu proba pregtit pentru testare (punctul 3), urmndu-se procedura descris la punctul 4.2.1. Se noteaz cu p greutatea, n grame, necesar stabilirii echilibrului la t C. Masa lichidului coninut n picnometru = p + m p Masa volumic aparent la t C: t
C
= (p + m p)/V20 C
Se calculeaz masa volumic la 20 C utiliznd unul dintre tabelele de corecie prezentate mai jos, n confor mitate cu natura lichidului testat: vin sec (tabelul II), must natural sau concentrat (tabelul III), vin dulce (tabelul IV). Densitatea 20 C/20 C a vinului se calculeaz prin mprirea la 0,998203 a masei volumice acestuia la 20 C. 4.3.2. Metoda utilizrii unei balane cu un taler Se cntrete recipientul tar i se noteaz masa acestuia cu T1 Se calculeaz dT = T1 To Masa picnometrului vid n momentul msurrii = P m + dT Se cntrete picnometrul umplut cu proba pregtit pentru testare (punctul 3), urmndu-se procedura descris la punctul 4.2.1. Se noteaz cu P2 masa acestuia la t C. Masa lichidului din picnometru la t C = P2 (P m + dT) Masa volumic aparent la t C: t
C
= (P2 (P m + dT))/V20 C
Se calculeaz masa volumic la 20 C a lichidului testat: vin sec, must natural i concentrat, vin dulce, cum s-a artat la punctul 4.3.1. Densitatea 20 C/20 C se calculeaz prin mprirea la 0,998203 a masei volumice la 20 C. 4.3.3. Repetabilitatea determinrilor de mas volumic: pentru vinurile seci i demidulci: r = 0,00010 pentru vinurile dulci: r = 0,00018 4.3.4. Reproductibilitatea determinrilor de mas volumic: pentru vinurile seci i demidulci: R = 0,00037 pentru vinurile dulci: R = 0,00045
19.2.2010
RO
C 43/7
TABELUL I Factorii F de multiplicare a masei de ap coninut n picnometrul din sticl pirex la t C, pentru calcularea volumului picnometrului la 20 C [A se consulta tabelul I din anexa II la metoda AS2 - 01 descris n Culegerea de metode internaionale de analiz a OIV] TABELUL II Corecia c de temperatur a masei volumice a vinurilor seci i a vinurilor seci dezalcoolizate, msurat cu un picnometru din sticl pirex la t C, pentru exprimarea rezultatului la 20 C [A se consulta tabelul II din anexa II la metoda AS2 - 01 descris n Culegerea de metode internaionale de analiz a OIV] 20 = t (c/1 000) dac t C este sub 20 C + dac t C este peste 20 C
TABELUL III Corecia c de temperatur a masei volumice a musturilor naturale i concentrate, msurat cu un picnometru din sticl pirex la t C, pentru exprimarea rezultatului la 20 C [A se consulta tabelul III din anexa II la metoda AS2 01 descris n Culegerea de metode internaionale de analiz a OIV] 20 = t (c/1 000) dac t C este sub 20 C + dac t C este peste 20 C
TABELUL IV Corecia c de temperatur a masei volumice a vinurilor cu 13 % vol. i mai mult, cu coninut de zahr rezidual, msurat cu un picnometru din sticl pirex la t C, pentru exprimarea rezultatului la 20 C [A se consulta tabelul IV din anexa II la metoda AS2 - 01 descris n Culegerea de metode internaionale de analiz a OIV] 20 = t (c/1 000) dac t C este sub 20 C + dac t C este peste 20 C
C 43/8
RO
19.2.2010
2 EVALUAREA PRIN REFRACTOMETRIE A CONINUTULUI DE ZAHARURI DIN MUSTURI, DIN MUSTURILE CONCENTRATE I DIN MUSTURILE CONCENTRATE RECTIFICATE (OIV - AS2 - 02SUCREF) METOD TIP I 1. PRINCIPIUL METODEI Indicele de refracie la 20 C, exprimat fie ca valoare absolut, fie ca procent din masa de zaharoz, este dat de tabelul corespunztor pentru a furniza un mijloc de a obine coninutul de zaharuri n grame per litru i n grame per kilogram din musturi, din musturile concentrate i din mustul concentrat rectificat. 2. 2.1. APARATURA Refractometru Abb Refractometrul utilizat trebuie prevzut cu o scal care s arate: fie un procentaj din masa de zaharoz la 0,1 %, fie indicii de refracie cu patru zecimale. Refractometrul trebuie prevzut cu un termometru cu o scal cel puin de la + 15 C la + 25 C i cu un dispozitiv de circulare a apei care s permit efectuarea determinrilor la o temperatur de 20 C 5 C. Instruciunile de folosire a acestui instrument trebuie respectate cu strictee, n special n ceea ce privete calibrarea i sursa de lumin. 3. 3.1 PREGTIREA PROBEI Musturi i musturi concentrate Dac este necesar, se trece mustul printr-un tifon mpturit n patru i, dup eliminarea primelor picturi de lichid filtrat, se efectueaz determinarea pe produsul filtrat. 3.2 Musturi concentrate rectificate n funcie de concentraie, se utilizeaz fie mustul concentrat rectificat, fie soluia obinut prin completarea a 200 g de must concentrat rectificat, pn la 500 g, cu ap, toate cntririle fiind efectuate cu exactitate. 4. METODA DE LUCRU Se aduce proba la o temperatur apropiat de 20 C. Pe prisma inferioar a refractometrului se pune un volum mic din proba de testare, avnd grij ca lichidul testat s acopere uniform suprafaa sticlei (deoarece prismele sunt ferm presate una pe cealalt). Determinrile se realizeaz n conformitate cu instruciunile de funcionare ale instrumentului utilizat. Se citete procentul de zaharoz din mas cu o precizie de 0,1 % sau se citete indicele de refracie cu patru zecimale. Se efectueaz cel puin dou determinri pe aceeai prob pregtit. Se noteaz temperatura t C. 5. 5.1. 5.1.1. 5.1.2. CALCULARE Corecii de temperatur Instrumente gradate n procente pe mas de zaharoz: pentru obinerea coreciilor de temperatur se utilizeaz tabelul I. Instrumente gradate n indice de refracie; se afl indicele msurat la t C din tabelul II (coloana 1) pentru a se obine valoarea corespunztoare a procentului din masa de zaharoz la t C. Aceast valoare este corectat pentru temperatur i este exprimat la 20 C cu ajutorul tabelului I. Coninutul de zaharuri din musturi i din musturile concentrate Se afl din tabelul II procentul din masa de zaharoz la 20 C pentru a se obine coninutul n zaharuri n grame pe litru i n grame pe kilogram. Coninutul n zaharuri este exprimat cu o zecimal, ca zahr invertit. 5.3. Coninutul de zaharuri din mustul concentrat rectificat Se afl din tabelul III procentul din masa de zaharoz la 20 C pentru a se obine coninutul n zaharuri n grame pe litru i n grame pe kilogram. Coninutul n zaharuri este exprimat cu o zecimal, ca zahr invertit. n cazul n care determinarea a fost efectuat pe must concentrat rectificat i diluat, rezultatul se nmulete cu factorul de diluie. 5.4 Indicele de refracie al musturilor, al musturilor concentrate i al musturilor concentrate rectificate Se afl din tabelul II procentul din masa de zaharoz la 20 C pentru a se obine indicele de refracie la 20 C. Acest indice este exprimat cu patru zecimale. Not: Tria alcoolic potenial a musturilor, a musturilor concentrate i a musturilor concentrate rectificate poate fi determinat utiliznd tabelul de coresponden care figureaz n anexa I la Regulamentul (CE) nr. 1623/2000 al Comisiei din 25 iulie 2000 (JOCE L 194, 31 iulie 2000)
5.2.
19.2.2010
RO
C 43/9
TABELUL I Corecii care trebuie operate n cazul n care procentul din masa de zaharoz a fost determinat la o alt temperatur dect la 20 C [a se consulta tabelul I din anexa la metoda AS2 - 02 descris n Culegerea de metode internaionale de analiz a OIV] TABELUL II Tabelul coninutului de zaharuri din musturi i din musturile concentrate n grame pe litru i n grame pe kilogram, determinat cu ajutorul refractometrului gradat, fie n procente din masa de zaharoz la 20 C, fie n indice de refracie la 20 C. Este dat, de asemenea, masa volumic la 20 C. [a se consulta tabelul II din anexa la metoda AS2 - 02 descris n Culegerea de metode internaionale de analiz a OIV] TABELUL III Tabelul coninutului de zaharuri din musturile concentrate rectificate n grame pe litru i n grame pe kilogram, determinat cu ajutorul refractometrului gradat, fie n procente din masa de zaharoz la 20 C, fie n indice de refracie la 20 C. Este dat, de asemenea, masa volumic la 20 C. [a se consulta tabelul III din anexa la metoda AS2 - 02 descris n Culegerea de metode internaionale de analiz a OIV]
C 43/10
RO
19.2.2010
3 EXTRACTUL USCAT TOTAL (OIV-AS-2-03-EXTSEC) MATERIA USCAT TOTAL METOD TIP I 1. DEFINIIE Extractul uscat total sau materia uscat total reprezint totalitatea substanelor care, n condiii fizice specificate, nu se volatilizeaz. Aceste condiii fizice trebuie s fie de aa natur nct substanele care formeaz extractul s fie alterate ct mai puin posibil. Extractul nereductor reprezint diferena dintre extractul uscat total i totalul zaharurilor. Extractul redus reprezint diferena dintre extractul sec total i totalul zaharurilor care depesc 1 g/l, sulfatul de potasiu care depete 1 g/l, manitolul, dac acesta este prezent, i orice alte substane chimice care au fost adugate vinului. Extractul rezidual reprezint diferena dintre extractul nereductor i aciditatea fix, exprimat ca acid tartric. Extractul se exprim n grame pe litru i trebuie determinat cu o precizie de 0,5 g. 2. PRINCIPIUL METODEI [Descrierea acestei metode de analiz face obiectul unei actualizri de ctre autoritile OIV. Aceasta va fi publicat ntr-o viitoare comunicare a Comisiei imediat ce textul actualizat va fi publicat de OIV n ediia 2010 a Culegerii de metode internaionale de analiz a OIV. Cu titlu informativ, n ateptarea acestei publicri, se poate consulta capitolul 4 din anexa la Regulamentul (CEE) nr. 2676/90 al Comisiei.]
19.2.2010
RO
C 43/11
4 DETERMINAREA RAPORTULUI IZOTOPIC 18O/16O AL CONINUTULUI DE AP DIN VIN (OIV-AS-2-09MOUO18) METOD TIP II (p.m.) [Descrierea acestei metode de analiz face obiectul unei actualizri de ctre autoritile OIV. Aceasta va fi publicat ntr-o viitoare comunicare a Comisiei imediat ce textul actualizat va fi publicat de OIV n ediia 2010 a Culegerii de metode internaionale de analiz a OIV. Cu titlu informativ, n ateptarea acestei publicri, se poate consulta capitolul 43 din anexa la Regulamentul (CEE) nr. 2676/90 al Comisiei.]
C 43/12
RO
19.2.2010
5 INDICELE FOLIN-CIOCLTEU (OIV-AS-2-10-INDFOL) METOD TIP IV 1. DEFINIIE Indicele Folin-Cioclteu este rezultatul obinut din aplicarea metodei descrise mai jos. 2. PRINCIPIUL METODEI Toi compuii fenolici din vin sunt oxidai de reactivul Folin-Cioclteu. Acest reactiv este format dintr-un amestec de acid fosfowolframic (H3PW12O40) i de acid fosfomolibdic (H3PMo12O40) care, dup oxidarea fenolilor, este redus la un amestec de oxizi albatri de tungsten (W8O23) i de molibden (Mo8O23). Coloraia albastr produs are o absorbie maxim n zona 750 nm i este proporional cu totalul cantitii de compui fenolici prezeni iniial. 3. REACTIVI Reactivii trebuie s fie analitici. Apa utilizat trebuie s fie ap distilat sau de puritate echivalent. 3.1. Reactivul Folin-Cioclteu Acest reactiv este disponibil n comer ntr-o form pregtit pentru utilizare. Reactivul poate fi preparat dup cum urmeaz: se dizolv 100 g de wolframat de sodiu (Na2WO4 2H2O) i 25 g de molibdat de sodiu (Na2MoO4 2H2O) n 700 ml de ap distilat; se adaug 50 ml de acid fosforic 85 % (20 = 1,71 g/ml) i 100 ml de acid clorhidric concentrat (20 = 1,19 g/ml). Se aduce la temperatura de fierbere i se fierbe zece ore la reflux. Se adaug apoi 150 g de sulfat de litiu (Li2SO4 H2O) i cteva picturi de brom i se fierbe timp de nc 15 minute. Se las s se rceasc i se completeaz pn la un litru cu ap distilat. 3.2. 4. Carbonat de sodiu anhidru (Na2CO3) n soluie de 20 % (m/v). APARATURA Aparatura normal de laborator, n special: 4.1. 4.2. 5. 5.1. Baloane cotate de 100 ml. Spectrofotometru care poate funciona la 750 nm. METODA DE LUCRU Vinuri roii ntr-un balon cotat de 100 ml (punctul 4.1), se introduc urmtoarele, respectnd exact ordinea dat: 1 ml de vin diluat 1:5 50 ml de ap distilat 5 ml de reactiv Folin-Cioclteu (3.1) 20 ml de soluie de carbonat de sodiu (3.2) Se completeaz pn la 100 ml cu ap distilat. Se amestec pentru omogenizare. Se ateapt 30 minute pentru stabilizarea reaciei. Se determin absorbia la 750 nm printr-un drum optic de 1 cm fa de un blanc pregtit cu ap distilat n locul vinului. Dac absorbia nu este n jur de 0,3, trebuie s se modifice diluarea vinului. 5.2. Vinuri albe Se efectueaz aceeai procedur cu 1 ml de vin nediluat. 5.3. 5.3.1. Musturi concentrate rectificate Pregtirea probei Se utilizeaz soluia cu un coninut de zaharuri de 25 % (m/m) (25 Brix) pregtit conform descrierii din capitolul pH seciunea 4.1.2.
19.2.2010
RO
C 43/13
5.3.2.
Determinri Se procedeaz conform descrierii din cazul vinurilor roii (punctul 5.1) utiliznd 5 ml de prob preparat conform descrierii de la punctul 5.3.1, msurnd absorbia fa de un blanc pregtit cu 5 ml de soluie de zahr invertit 25 % (m/m).
6. 6.1.
EXPRIMAREA REZULTATELOR Metoda de calcul Rezultatul este exprimat sub forma unui indice, obinut prin nmulirea absorbiei cu 100 n cazul vinurilor roii diluate 1:5 (sau cu factorul corespunztor diluiei utilizate) i cu 20 n cazul vinurilor albe. n cazul musturilor concentrate rectificate, absorbia se nmulete cu 16.
6.2.
Repetabilitatea Diferena dintre rezultatele a dou determinri efectuate simultan sau imediat una dup cealalt, de ctre acelai analist, nu trebuie s fie mai mare de 1. O bun repetabilitate a rezultatelor este obinut prin utilizarea unei aparaturi (baloane cotate i cuve spec trometrice) curate foarte atent.
C 43/14
RO
19.2.2010
6 GLUCOZA I FRUCTOZA (OIV-AS-311-02-GLUFRU) METOD TIP II 1. DEFINIIE Glucoza i fructoza pot fi determinate individual printr-o metod enzimatic, avnd ca unic obiectiv calcularea raportului glucoz/fructoz. 2. PRINCIPIUL METODEI Glucoza i fructoza sunt fosforilate cu adenozin trifosfat (ATP) printr-o reacie enzimatic catalizat de hexochinaz (HK) i produc glucoz 6-fosfat (G6P) i fructoz 6-fosfat (F6P): glucoz + ATPG6P + ADP fructoz + ATPF6P + ADP ntr-o prim etap, glucoz 6-fosfat este oxidat n gluconat 6-fosfat de ctre nicotinamid adenin dinucleotid fosfat (NADP) n prezena enzimei glucoz 6-fosfat dehidrogenaz (G6PDH). Cantitatea de nicotinamid adenin dinucleotid fosfat redus (NADPH) produs corespunde celei de glucoz 6-fosfat i, prin urmare, celei de glucoz. G6P + NADP+Gluconat 6-fosfat + NADPH + H+ Cantitatea de nicotinamid adenin dinucleotid fosfat redus se determin din absorbia la 340 nm. La sfritul acestei reacii, fructoza 6-fosfat este transformat n glucoz 6-fosfat, prin aciunea fosfoglucozei izomerizate (PGI): F6PG6P Glucoza 6-fosfat reacioneaz din nou cu nicotinamid adenin dinucleotid fosfat pentru a rezulta gluconat 6fosfat i nicotinamid adenin dinucleotid fosfat redus; acesta din urm va fi determinat. 3. APARATURA Spectrofotometru pentru determinri la 340 nm, lungimea de und la care absorbia de NADPH este maxim. n ceea ce privete msurtorile absolute (fr a fi folosite diagrame de calibrare, dar standardizarea efectundu-se pe baza coeficientului de extincie al NADPH), trebuie controlate scala lungimilor de und i valorile puterii de absorbie. n cazul n care acesta nu este disponibil, se poate utiliza un spectrofotometru cu o surs cu spectru discontinuu pentru determinri la 334 nm sau la 365 nm. Cuve de sticl cu lungimea drumului optic de 1 cm sau cuve de unic folosin. Pipete pentru soluiile testului enzimatic de 0,02, 0,05, 0,1 i 0,2 ml. 4. 4.1. REACTIVI Soluia 1: soluie-tampon (trietanolamin 0,3 M; pH = 7,6; 4 103 M n Mg2+): se dizolv 11,2 g de clorhidrat de trietanolamin (C2H5)3NHCl) i 0,2 g Mg SO47H2O n 150 ml de ap bidistilat. Se adaug aproximativ 4 ml de soluie 5 M de hidroxid de sodiu (NaOH) pentru a obine o valoare a pH-ului de 7,6 i se completeaz pn la 200 ml. Aceast soluie-tampon se pstreaz timp de 4 sptmni la + 4 C. 4.2. Soluia 2: soluia de nicotinamid adenin dinucleotid fosfat (aproximativ 11,5 103 M): se dizolv 50 mg de nicotinamid adenin dinucleotid fosfat disodic n 5 ml de ap bidistilat. Aceast soluie se pstreaz timp de 4 sptmni la + 4 C. 4.3. Soluia 3: soluia de adenozin 5-trifosfat (aproximativ 81 103 M): se dizolv 250 mg de adenozin 5trifosfat disodic i 250 mg de bicarbonat de sodiu Na H CO3 n 5 ml de ap bidistilat. Aceast soluie se pstreaz timp de 4 sptmni la + 4 C. 4.4. Soluia 4: Hexochinaz/glucoz 6-fosfat dehidrogenaz: se amestec 0,5 ml de hexochinaz (2 mg de protein/ml sau 280 U/ml) cu 0,5 ml de glucoz 6-fosfat dehidrogenaz (1 mg de protein/ml). Aceast soluie se pstreaz timp de un an la + 4 C.
19.2.2010
RO
C 43/15
4.5.
Soluia 5: Fosfoglucoizomeraz (2 mg de protein/ml sau 700 U/ml). Suspensia este utilizat nediluat. Aceast soluie se pstreaz timp de un an la + 4 C. Not: Toi reactivii necesari pentru aceast determinare sunt disponibili n comer.
5. 5.1.
METODA DE LUCRU Pregtirea probei n funcie de cantitatea estimat de glucoz + fructoz pe litru, proba se dilueaz dup cum urmeaz:
Msurare la 340 i 334 nm Msurare la 365 nm Diluie cu ap Factorul de diluie F
Pn la 0,4 g/l Pn la 4,0 g/l Pn la 10,0 g/l Pn la 20,0 g/l Pn la 40,0 g/l Peste 40,0 g/l 5.2. Determinarea
Pn la 0,8 g/l Pn la 8,0 g/l Pn la 20,0 g/l Pn la 40,0 /l Pn la 80,0 g/l Peste 80,0 g/l
1 + 9 1 + 24 1 + 49 1 + 99 1 + 999
10 25 50 100 1 000
Cu ajutorul spectrofotometrului reglat pe lungimea de und 340 nm, se efectueaz msurtori folosind aerul (fr cuv pe drumul optic) sau apa ca referin. Temperatura ntre 20 i 25 C. n dou cuve cu drumul optic de 1 cm se introduc urmtoarele:
Cuva de referin Cuva prob
Soluia 1 (4.1) (la 20 C) Soluia 2 (4.2) Soluia 3 (4.3) Prob pentru msurare Ap bidistilat
2,50 ml 0,10 ml 0,10 ml
2,50 ml 0,10 ml 0,10 ml 0,20 ml
0,20 ml
Se amestec i, dup aproximativ 3 minute, se citete absorbia soluiilor (A1). Reacia se ncepe prin adugarea: Soluia 4 (4.4) 0,02 ml 0,02 ml
Se amestec i se ateapt 15 minute; se citete absorbia i, dup 2 minute, se verific dac reacia s-a oprit (A2). Se adaug imediat: Soluia 5 (4.5) 0,02 ml 0,02 ml
Se amestec; se citete absorbia dup 10 minute i, dup 2 minute, se verific dac reacia s-a oprit (A3). Se calculeaz diferenele de absorbie: A2 A1 corespunztoare glucozei, A3 A2 corespunztoare fructozei, pentru cuva de referin i cuva prob.
C 43/16
RO
19.2.2010
Se calculeaz diferena de absorbie dintre cuva de referin (AR) i cuva prob (AS) i se obine: pentru glucoz: AG = AS AR pentru fructoz: AF = AS AR Not: Timpul necesar pentru aciunea enzimelor poate varia de la un lot la altul. Valoarea de mai sus are doar caracter orientativ i se recomand ca ea s fie determinat pentru fiecare lot. 5.3. 5.3.1. Exprimarea rezultatelor Calculare Formula general pentru calcularea concentraiilor este urmtoarea: C = ((V PM)/( d v 1 000)) A (g/l) V = volumul soluiei testate(ml) v = volumul probei (ml) M = masa molecular a substanei de determinat d = drumul optic al cuvei (cm) = coeficientul de absorbie al NADPH la 340 nm = 6,3 (mmol1 l cm1) V = 2,92 ml pentru msurarea glucozei V = 2,94 ml pentru msurarea fructozei v = 0,20 ml M = 180 d = 1. Se obine: pentru glucoz: C (g/l) = 0,417 AG pentru fructoz: C (g/l) = 0,420 AF Dac proba a fost diluat n timpul preparrii, se nmulete rezultatul cu factorul de diluare F. Not: n cazul n care determinrile se efectueaz la 334 sau 365 nm, se obin urmtoarele: msurarea la 334 nm: = 6,2 (mmol1 l cm1) pentru glucoz: C (g/l) = 0,425 AG pentru fructoz: C (g/l) = 0,428 AF msurarea la 365 nm: = 3,4 (mmol1 l cm1) pentru glucoz: C (g/l) = 0,773 AG pentru fructoz: C (g/l) = 0,778 AF 5.3.2. Repetabilitatea (r) r = 0,056 xi 5.3.3. Reproductibilitatea (R) R = 0,12 + 0,076 xi xi = coninutul de glucoz sau fructoz n g/l.
19.2.2010
RO
C 43/17
7 DETERMINAREA ZAHARURILOR PRIN HPLC (ZAHAROZ) (OIV-AS-311-03-SUCRES) METOD TIP II (p.m.) [Descrierea acestei metode de analiz face obiectul unei actualizri de ctre autoritile OIV. Aceasta va fi publicat ntr-o viitoare comunicare a Comisiei imediat ce textul actualizat va fi publicat de OIV n ediia 2010 a Culegerii de metode internaionale de analiz a OIV. Cu titlu informativ, n ateptarea acestei publicri, se poate consulta capitolul 6 alineatul (3) din anexa la Regulamentul (CEE) nr. 2676/90 al Comisiei.]
C 43/18
RO
19.2.2010
8 DETECTAREA MBOGIRII MUSTURILOR DE STRUGURI, A MUSTURILOR DE STRUGURI CONCENTRATE, A MUSTURILOR DE STRUGURI CONCENTRATE RECTIFICATE I A VINURILOR PRIN APLICAREA REZONANEI MAGNETICE NUCLEARE A DEUTERIULUI (OIV-AS-311-05-ENRRMN) METOD TIP I (p.m.) [Descrierea acestei metode de analiz face obiectul unei reexaminri de ctre autoritile tiinifice ale OIV. Aceasta va fi publicat ntr-o comunicare a Comisiei imediat ce textul definitiv va fi adoptat de Adunarea General a OIV. Cu titlu informativ, n ateptarea acestei decizii a OIV, se poate consulta capitolul 8 din anexa la Regulamentul (CEE) nr. 2676/90 al Comisiei.]
19.2.2010
RO
C 43/19
9 TRIA ALCOOLIC N VOLUME (OIV-AS-312-01-TALVOL) METOD TIP I (p.m.) [Descrierea acestor metode de analiz face obiectul unei actualizri de ctre autoritile OIV. Aceste metode vor fi publicate ntr-o viitoare comunicare a Comisiei imediat ce textul actualizat va fi publicat de OIV n ediia 2010 a Culegerii de metode internaionale de analiz a OIV. Cu titlu informativ, n ateptarea acestei publicri a OIV, se poate consulta capitolul 3 din anexa la Regulamentul (CEE) nr. 2676/90 al Comisiei.]
C 43/20
RO
19.2.2010
10 DETERMINAREA PRIN SPECTROMETRIA IZOTOPIC DE MAS A RAPORTULUI 13C/12C AL ETANOLULUI DIN VIN SAU AL ETANOLULUI OBINUT PRIN FERMENTAREA MUSTURILOR, A MUSTURILOR CONCENTRATE SAU A MUSTURILOR CONCENTRATE RECTIFICATE (OIV-AS-312-06ETHANO) METOD TIP II 1. DOMENIUL DE APLICARE Metoda permite msurarea raportului izotopic 13C/12C al etanolului din vin i al etanolului obinut prin fermentarea produselor vitivinicole (must, must concentrat, must concentrat rectificat). 2. STANDARDE DE REFERIN ISO: 5725:1994 Acurateea metodelor de msurare Determinarea repeta bilitii i a reproductibilitii unei metode de msurare standard prin studii inter-laborator. Vienna-Pee-Dee Belemnite (RPDB = 0,0112372).
V-PDB:
Metoda OIV AS-311-O5-ENRRMN Detectarea mbogirii musturilor, a musturilor concentrate, a musturilor concentrate rectificate i a vinurilor prin aplicarea rezonanei magnetice nucleare a deuteriului (RMN-FINS). 3. TERMENI I DEFINIII
13C/12C:
Raportul dintre izotopul de carbon 13 (13C) i izotopul de carbon 12 (12C) pentru o prob dat. coninutul de carbon 13 (13C) exprimat n pri la mie (). Fracionarea izotopului natural specific, studiat prin rezonan magnetic nuclear. Vienna-Pee-Dee Belemnite. PDB este materialul primar de referin pentru msurarea variaiilor naturale ale coninutului izotopic de carbon 13, constnd ntr-un carbonat de calciu provenit dintr-un rostru de belemnit din Cretacic din formaiunea Pee-Dee din Carolina de Sud (SUA). Raportul su izotopic 13C/12C sau RPDB este RPDB = 0,0112372. Rezervele de PDB sunt epuizate de mult vreme, ns acesta a rmas materialul primar de referin pentru exprimarea variaiilor naturale ale coninutului izotopic de carbon 13, fa de care se etaloneaz materialul de referin disponibil la Agenia Internaional pentru Energia Atomic (IAEA) din Viena (Austria). Determinrile izotopice ale rezervelor naturale de carbon 13 se exprim, prin convenie, n raport cu V-PDB. Raportul mas/sarcin.
13C: RMN-FINS:
V-PDB:
m/z: 4. PRINCIPIU
n timpul fotosintezei, asimilarea dioxidului de carbon de ctre plante se produce prin dou forme principale de metabolism, i anume metabolismul C3 (ciclul lui Calvin) i metabolismul C4 (Hatch i Slack). Aceste dou mecanisme de fotosintez prezint o fracionare izotopic diferit. Astfel, produsele provenite din plante C4, cum ar fi zaharurile i alcoolul derivat din fermentaie, au un coninut mai ridicat de carbon 13 dect produsele similare provenite din plante C3. Majoritatea plantelor, inclusiv via-de-vie i sfecla de zahr, aparin grupului C3. Trestia de zahr i porumbul aparin grupului C4. Msurarea coninutului de carbon 13 permite detectarea i evaluarea zaharurilor cu origine C4 (zahr din trestie de zahr sau izoglucoz de porumb) adugate produselor provenite din struguri (musturi de struguri, vinuri etc.). Informaiile privind coninutul de carbon 13, combinate cu cele obinute prin RMN-FINS, permit determinarea cantitilor adugate de amestecuri de zaharuri sau de alcooluri derivate din plante C3 i C4. Coninutul de carbon 13 se determin pe dioxidul de carbon rezultat n urma combustiei complete a probei. Abundena principalilor izotopomeri cu masa de 44 (12C16O2), 45 (13C16O2 i 12C17O16O) i 46 (12C16O18O), care rezult din diferitele combinaii posibile ntre izotopii 18O, 17O, 16O, 13C i 12C, se determin pe baza curenilor ionici msurai prin trei colectori diferii ai unui spectrometru izotopic de mas. Contribuiile izotopomerilor 13C17O16O i 12C17O2 pot fi neglijate, datorit nivelurilor reduse ale acestora. Curentul ionic
19.2.2010
RO
C 43/21
pentru m/z = 45 se corecteaz prin contribuia 12C17O16O, care se calculeaz n funcie de intensitatea curentului msurat pentru m/z = 46, innd seama de abundena relativ a 18O i 17O (corecia Craig). Comparaia cu o referin etalonat fa de referina internaional V-PDB permite calcularea coninutului de carbon 13 pe scara relativ 13C. 5. REACTIVI Materialul i consumabilele depind de aparatura (punctul 6) utilizat de laborator. Sistemele utilizate n general se bazeaz pe analizori elementari. Aceste sisteme pot fi echipate pentru a permite introducerea de probe nchise n capsule metalice sigilate sau injectarea de probe lichide printr-un septum, cu ajutorul unei seringi. n funcie de tipul dispozitivului utilizat, se pot utiliza materialele de referin, reactivii i consumabilele de mai jos: materiale de referin disponibile de la IAEA:
Denumire Material 13C n raport cu V-PDB (9)
IAEA-CH-6 IAEA-CH-7 NBS22 USGS24
zaharoz polietilen ulei grafit
10,4 31,8 29,7 16,1
disponibile de la Institutul pentru materiale i msurri de referin (IRMM) din Geel (BE):
Denumire Material 13C n raport cu V-PDB (9)
CRM/BCR 656 CRM/BCR 657 CRM/BCR 660
alcool din vin glucoz soluie 12 %) hidroalcoolic (TAV
26,93 10,75 26,72
O prob de lucru standard, cu un raport internaionale.
13C/12C
cunoscut, etalonat fa de materialele de referin
Lista indicativ de consumabile de mai jos se stabilete pentru sistemele cu flux continuu: heliu pentru analiz (CAS 07440-59-7), oxigen pentru analiz (CAS 07782-44-7), dioxid de carbon pentru analiz, utilizat ca gaz de referin secundar pentru coninutul de carbon 13 (CAS 00124-38-9), reactiv de oxidare pentru cuptorul sistemului de combustie, de exemplu oxid de cupru () pentru analiz elementar (CAS 1317-38-0), deshidratant pentru eliminarea apei produse n combustie, de exemplu anhidron pentru analiz elementar (perclorat de magneziu) (CAS 10034-81-8) (nu este necesar n cazul aparatelor echipate cu un sistem de eliminare a apei prin crioseparatoare sau capilare selectiv permeabile). 6. 6.1. APARATUR I ECHIPAMENT Spectrometru de mas de raport izotopic (SMRI) Spectrometru de mas de raport izotopic (SMRI), care permite determinarea coninutului relativ de 13C din gazul de CO2 n form natural, cu o precizie intern de cel puin 0,05 , exprimat n valoare relativ (punctul 9). Precizia intern se definete aici ca diferena dintre dou msurtori efectuate pe aceeai prob de CO2. Spectrometrul de mas utilizat pentru msurarea raporturilor izotopice este, n general, echipat cu un colector triplu, pentru msurarea simultan a intensitilor pentru m/z = 44, 45 i 46. Spectrometrul de mas de raport izotopic trebuie s fie echipat cu un sistem de introducere dublu, pentru msurarea alternativ a unei probe necunoscute i a unei probe de referin, fie s utilizeze un sistem integrat care efectueaz combustia cantitativ a probelor i separ dioxidul de carbon de ali produi de combustie naintea msurtorii din spectrometrul de mas.
C 43/22
RO
19.2.2010
6.2.
Aparatur de combustie Aparatur de combustie care s permit convertirea cantitativ a etanolului n dioxid de carbon i eliminarea tuturor celorlali produi de combustie, inclusiv a apei, fr nicio fracionare izotopic. Aparatura poate fi fie un sistem cu flux continuu integrat n aparatura de spectrometrie de mas (punctul 6.2.1), fie un sistem separat de combustie (punctul 6.2.2). Aparatura trebuie s permit obinerea unei precizii cel puin echivalente cu cea indicat la punctul 11.
6.2.1.
Sisteme cu flux continuu Acestea sunt constituite fie dintr-un analizor elementar, fie dintr-un cromatograf n faz gazoas, echipat cu un sistem de combustie integrat. Pentru sistemele echipate pentru introducerea de probe coninute n capsule metalice, se utilizeaz urmtorul echipament de laborator: microsering sau micropipet volumetric cu vrfuri corespunztoare, cntar cu precizie de cel puin 1 g, penset pentru ncapsulare, capsule de staniu pentru probe lichide, capsule de staniu pentru probe solide. Not: pentru a reduce riscul de evaporare a probelor de etanol, se poate introduce n capsule un material absorbant (de exemplu, chromosorb W 45-60 mesh), dup ce s-a verificat n prealabil, printr-o msurtoare fr prob, c acesta nu conine o cantitate semnificativ de carbon care ar putea modifica rezultatele. n cazul utilizrii unui analizor elementar prevzut cu un injector pentru lichide sau n cazul unui sistem de pregtire prin cromatografie de combustie, se utilizeaz urmtoarele echipamente de laborator: sering pentru lichide, flacoane prevzute cu sisteme de nchidere etan i septumuri inerte. Echipamentele de laborator indicate n lista de mai sus constituie exemple i pot fi nlocuite cu alte echi pamente cu performane echivalente, n funcie de tipul de combustie i de aparatura de spectrometrie de mas utilizat de ctre laborator.
6.2.2.
Sisteme separate de pregtire n acest caz, probele de dioxid de carbon care rezult din combustia probelor de analizat i a probei de referin se colecteaz n fiole, care sunt introduse apoi n sistemul dublu de intrare al spectrometrului pentru analiza izotopic. Se pot utiliza mai multe tipuri de aparate de combustie descrise n literatur: sistem nchis de combustie umplut cu oxigen circulant, analizor elementar cu flux de heliu i oxigen, flacon etan de sticl umplut cu oxid de cupru () ca agent de oxidare.
7.
PREGTIREA PROBELOR PENTRU TESTARE Etanolul trebuie extras din vin naintea determinrii izotopice. Extracia se realizeaz prin distilarea vinului n conformitate cu descrierea de la punctul 3.1 din metoda RMN-FINS (OIV - MA-E-AS311-05-ENRRMN). n cazul mustului de struguri, al mustului de struguri concentrat i al mustului de struguri concentrat rectificat, zaharurile trebuie fermentate mai nti n etanol, n conformitate cu descrierea de la punctul 3.2 din metoda RMN-FINS (OIV - MA-E-AS311-05-ENRRMN).
8.
PROCEDUR Toate etapele pregtitoare trebuie realizate fr o pierdere semnificativ de etanol prin evaporare, care ar putea modifica compoziia izotopic a probei.
19.2.2010
RO
C 43/23
Urmtoarea descriere se refer la procedurile utilizate n general pentru combustia probei de etanol cu ajutorul sistemelor automatizate de combustie comerciale. Orice alt metod, care asigur convertirea ntregii probe de etanol n dioxid de carbon, fr nicio pierdere de etanol prin evaporare, poate fi utilizat pentru pregtirea dioxidului de carbon pentru analiza izotopic. Procedeul experimental bazat pe utilizarea unui analizor elementar: a) introducerea probelor n capsule: se utilizeaz capsule, o penset i o tav de preparare curate, se ia o capsul de dimensiuni corespunztoare, cu ajutorul pensetei, se introduce o cantitate corespunztoare de lichid n capsul, cu ajutorul micropipetei, Not: Pentru obinerea a 2 mg de carbon sunt necesare 3,84 mg de etanol absolut sau 4,17 mg de distilat cu o trie alcoolic de 92 % m/m. Cantitatea corespunztoare de distilat trebuie calculat pe aceast baz, n funcie de cantitatea de carbon necesar, avnd n vedere sensibilitatea aparaturii de spectrometrie de mas. se nchide capsula cu ajutorul pensetei, fiecare capsul trebuie complet sigilat. n caz contrar, aceasta se arunc i se pregtete o nou capsul, pentru fiecare prob trebuie pregtite dou capsule, se introduce capsula n locul corespunztor de pe platoul modulului automat de manevrare a probelor al analizorului elementar. Fiecare capsul trebuie identificat cu atenie printr-un numr de serie, se introduc sistematic capsulele care conin referinele de lucru, la nceputul i la sfritul seriei de probe, se introduc regulat probe de control n seria de probe; b) controlul i ajustarea analizorului elementar i a aparatului de spectrometrie de mas se ajusteaz temperatura cuptoarelor analizorului elementar i fluxurile de heliu i de oxigen pentru combustia optim a probei, se verific analizorul elementar i sistemul de spectrometrie de mas pentru a detecta eventualele scurgeri (de exemplu, prin controlarea curentului ionic pentru m/z = 28 pentru N2), se ajusteaz spectrometrul de mas pentru msurarea intensitii curenilor ionici pentru m/z = 44, 45 i 46, se verific sistemul cu ajutorul unor probe de control cunoscute nainte de nceperea msurrii probelor; c) efectuarea unei serii de msurtori Probele aezate pe modulul automat de manevrare a probelor al analizorului elementar (sau al cromato grafului) se introduc pe rnd. Dioxidul de carbon din fiecare combustie a probei este eluat spre spec trometrul de mas care msoar curenii ionici. Calculatorul interfaat nregistreaz intensitile curenilor ionici i calculeaz valoarea pentru fiecare prob (punctul 9). 9. CALCUL Obiectivul metodei l reprezint msurarea raportului izotopic 13C/12C al etanolului extras din vin sau din produse derivate din struguri n urma fermentaiei. Raportul izotopic 13C/12C poate fi exprimat prin deviaia sa n raport cu o referin de lucru. Deviaia izotopic a carbonului 13 ( 13C) este apoi calculat pe o scar delta la mie (/1 000), prin compararea rezultatelor obinute pentru proba de msurat cu cele ale referinei de lucru etalonate anterior pe baza referinei primare internaionale (V-PDB). Valorile 13C sunt exprimate n raport cu referina de lucru, dup cum urmeaz: 13Cpro/ref = 1 000 (RproRref)/Rref unde Rpro i Rref sunt rapoartele izotopice de referin.
13C/12C
ale probei, respectiv ale dioxidului de carbon utilizat ca gaz
C 43/24
RO
19.2.2010
Valorile 13C sunt exprimate n raport cu V-PDB, dup cum urmeaz: 13Cpro/V-PDB = 13Cpro/ref + 13Cref/V-PDB + (13Cpro/ref 13Cref/V-PDB)/1 000 unde 13Cref/V-PDB este deviaia izotopic determinat anterior pentru referina de lucru, n raport cu V-PDB. n timpul msurrii integrate pot s apar mici variaii, datorit modificrii condiiilor instrumentale. n acest caz, valorile 13C ale probelor trebuie corectate n funcie de diferena dintre valoarea 13C msurat a referinei de lucru i valoarea sa real, etalonat anterior fa de V-PDB, prin compararea cu unul dintre materialele de referin internaionale. ntre dou msurtori ale referinei de lucru, variaia i, implicit, corecia care trebuie aplicat rezultatelor obinute din probe pot fi considerate liniare. Referina de lucru trebuie msurat la nceputul i la sfritul fiecrei serii de probe. Se poate calcula apoi o corecie pentru fiecare prob, cu ajutorul unei interpolri liniare. 10. ASIGURAREA CALITII I CONTROLUL Se controleaz ca valoarea 13C pentru referina de lucru s nu difere cu mai mult de 0,5 fa de valoarea admis. n caz contrar, trebuie s se verifice i, dup caz, s se ajusteze reglajele aparatului de spectrometrie. Pentru fiecare prob, se controleaz ca diferena dintre rezultatele a dou capsule msurate succesiv s fie mai mic de 0,3 . Rezultatul final pentru o prob dat este valoarea medie a celor dou capsule. n cazul n care deviaia este mai mare de 0,3 , msurarea trebuie repetat. Verificarea corectitudinii msurrii poate fi bazat pe intensitatea curentului ionic pentru m/z = 44, care este proporional cu cantitatea de carbon injectat n analizorul elementar. n condiii standard, intensitatea curentului ionic ar trebui s fie, practic, constant pentru probele analizate. O deviaie semnificativ poate indica o evaporare de etanol (de exemplu, o capsul insuficient sigilat) sau instabilitatea analizorului elementar sau a spectrometrului de mas. 11. CARACTERISTICI DE PERFORMAN ALE METODEI (PRECIZIE) Un studiu iniial n colaborare (punctul 11.1) a fost realizat pe distilate care conin alcool provenit din vin i alcool de trestie de zahr i de sfecl de zahr, precum i diferite amestecuri de alcool cu aceste trei origini. ntruct acest studiu nu a luat n considerare procedura de distilare, s-au avut n vedere i informaii supli mentare furnizate de alte studii inter-laborator asupra vinurilor (punctul 11.2) i, n special, serii de teste de eficacitate (punctul 11.3) pentru msurrile izotopice. Rezultatele arat c, n condiii satisfctoare, n special cele aplicabile msurtorilor prin RMN-FINS, sistemele diferite de distilare nu produc o variaie semnificativ n determinarea valorii 13C a etanolului din vin. Parametrii de fidelitate observai pentru vin sunt aproape identici cu cei obinui n cadrul studiului comun asupra distilatelor (punctul 11.1). 11.1. Studiu comun asupra distilatelor Anul testelor inter-laborator: 1996 Numr de laboratoare: Numr de probe: Analit: 20 6 probe n comparaie dublu-orb 13C a etanolului
Codul probei
Alcool provenit din vin
Alcool din sfecl de zahr
Alcool din trestie de zahr
A & G B & C D & F E & I H & K J& L
80 % 90 % 0% 90 % 100 % 0%
10 % 10 % 100 % 0% 0% 0%
10 % 0% 0% 10 % 0% 100 %
19.2.2010
RO
C 43/25
Probe
A/G
B/C
D/F
E/I
H/K
J/L
Numr de laboratoare reinute eliminarea rezultatelor aberante Numr de rezultate acceptate Valoare medie (13C) Sr2
dup
19
18
17
19
19
19
38 25,32 0,0064 0,08 0,22 0,0389
36 26,75 0,0077 0,09 0,25 0,0309 0,18
34 27,79 0,0031 0,06 0,16 0,0382 0,20
38 25,26 0,0127 0,11 0,32 0,0459 0,21
38 26,63 0,0069 0,08 0,23 0,0316 0,18
38 12,54 0,0041 0,06 0,18 0,0584 0,24
Deviaia standard de repetabilitate (Sr) Limita de repetabilitate r (2,8 Sr) SR2 Deviaia (SR) standard de reproductibilitate
0,20
Limita de reproductibilitate R (2,8 SR)
0,55
0,49
0,55
0,60
0,50
0,68
11.2.
Studiu comun pe dou vinuri i un alcool Anul testelor inter-laborator: 1996 Numr de laboratoare: Numr de probe: Analit: 14 pentru distilarea vinului, dintre care 7 au msurat i 13C a etanolului din vin, 8 pentru msurarea valorii 13C a probei de alcool 3 (vin alb cu TAV de 9,3 %, vin alb cu TAV de 9,6 % i alcool cu tria alcoolic de 93 % m/m) 13C a etanolului
Probe
Vin rou
Vin alb
Alcool
Numr de laboratoare Numr de rezultate acceptate Valoare medie (13C) Variaia de reproductibilitate SR2 Deviaia standard de reproductibilitate (SR) Limita de reproductibilitate R (2,8 SR)
7 7 26,20 0,0525 0,23 0,64
7 7 26,20 0,0740 0,27 0,76
8 8 25,08 0,0962 0,31 0,87
S-au utilizat sisteme diferite de distilare de ctre laboratoarele participante. Determinrile izotopice 13C efectuate ntr-un singur laborator pe toate distilatele returnate de participani nu prezint valori aberante sau valori care difer semnificativ de valorile medii. Variaia ntre rezultate (S2 = 0,0059) este comparabil cu variaiile de repetabilitate Sr2 din studiul comun asupra distilatelor (punctul 11.1).
11.3.
Rezultatele exerciiilor efectuate pentru monitorizarea eficacitii n realizarea testelor izotopice Din decembrie 1994, au fost organizate teste internaionale de eficacitate pentru determinarea msurilor izotopice pentru vin i alcool (distilate cu TAV de 96 %). Rezultatele permit laboratoarelor participante s verifice calitatea propriilor analize. Rezultatele statistice permit aprecierea variaiei ntre msurtori n condiii de reproductibilitate i, prin urmare, permit estimarea parametrilor de varian i a limitei de reproductibilitate. Rezultatele obinute pentru determinarea 13C pentru etanolul din vin i distilate sunt rezumate n tabelul urmtor:
C 43/26
RO
19.2.2010
Data
Vinuri N SR S R2 R N SR
Distilate SR2 R
Decembrie 1994 Iunie 1995 Decembrie 1995 Martie 1996 Iunie 1996 Septembrie 1996 Decembrie 1996 Martie 1997 Iunie 1997 Septembrie 1997 Decembrie 1997 Martie 1998 Iunie 1998 Septembrie 1998 Media ponderat
6 8 7 9 8 10 10 10 11 12 11 12 12 11
0,210 0,133 0,075 0,249 0,127 0,147 0,330 0,069 0,280 0,237 0,127 0,285 0,182 0,264 0,215
0,044 0,018 0,006 0,062 0,016 0,022 0,109 0,005 0,079 0,056 0,016 0,081 0,033 0,070 0,046
0,59 0,37 0,21 0,70 0,36 0,41 0,92 0,19 0,78 0,66 0,36 0,80 0,51 0,74 0,60
6 8 8 11 8 11 9 8 11 11 12 13 12 12
0,151 0,147 0,115 0,278 0,189 0,224 0,057 0,059 0,175 0,203 0,156 0,245 0,263 0,327 0,209
0,023 0,021 0,013 0,077 0,036 0,050 0,003 0,003 0,031 0,041 0,024 0,060 0,069 0,107 0,044
0,42 0,41 0,32 0,78 0,53 0,63 0,16 0,16 0,49 0,57 0,44 0,69 0,74 0,91 0,59
N: numr de laboratoare participante.
11.4.
Limite de repetabilitate i de reproductibilitate Pe baza datelor obinute n urma diferitelor teste inter-laborator prezentate n tabelele de mai sus, se pot stabili urmtoarele limite de repetabilitate i de reproductibilitate pentru aceast metod, inclusiv etapa de distilare: Limita de repetabilitate r: 0,24 Limita de reproductibilitate R: 0,6.
19.2.2010
RO
C 43/27
11 ACIDITATEA TOTAL (OIV - AS-313-01-ACITOT) METOD TIP I 1. DEFINIIE Aciditatea total reprezint suma aciditilor titrabile atunci cnd pH-ul ajunge la 7 prin adugarea unei soluii alcaline titrate. Dioxidul de carbon nu este inclus n aciditatea total. 2. PRINCIPIUL METODEI Titrarea poteniometric sau titrarea cu albastru de bromotimol ca indicator de sfrit de reacie prin comparare cu un standard de culoare. 3. 3.1. REACTIVI Soluie tampon cu pH 7,0: Fosfat monopotasic KH2PO4: 107,3 g Soluie de hidroxid de sodiu 1 M (NaOH): 500 ml Ap pn la: 1 000 ml. Ca alternativ, exist n comer soluii tampon gata preparate. 3.2. 3.3. Soluie de hidroxid de sodiu 0,1 M (NaOH). Soluie indicatoare de albastru de bromotimol: 4 g/l. Albastru de bromotimol (C27H28Br2O5S) ................................................................................................ ............ Alcool neutru 96 % vol. ................................................................................................ ............................................ Dup dizolvare, se adaug: Ap lipsit de CO2 ............................................................................ .......................................................................... Soluie de hidroxid de sodiu 1 M suficient pentru a produce culoarea albastru-verde (pH 7) .......................................................................... 7,5 ml 200 ml 4g 200 ml
Ap pn la ................................................................ ................................................................................................ ... 1 000 ml 4. 4.1. 4.2. 4.3. APARATURA Pomp de vid cu ap. Balon de vid de 500 ml. Poteniometru cu scal gradat pentru valori pH i electrozi. Electrodul de sticl trebuie pstrat n ap distilat. Electrodul de calomel/clorur de potasiu saturat trebuie pstrat n soluie saturat de clorur de potasiu. Cel mai des este folosit un electrod combinat, care trebuie pstrat n ap distilat. Cilindri gradai de 50 ml (pentru vin) i de 100 ml (pentru must concentrat rectificat). METODA DE LUCRU Pregtirea probei Vinuri Se elimin dioxidul de carbon. Se pun aproximativ 50 ml de vin ntr-un balon de vid; se face vid n balon cu pompa de ap timp de 1-2 minute, agitnd continuu. 5.1.2. Must concentrat rectificat ntr-un balon cotat de 500 ml, se introduc 200 g de must concentrat rectificat msurat cu precizie. Se completeaz pn la cot cu ap. Se omogenizeaz.
4.4. 5. 5.1. 5.1.1.
C 43/28
RO
19.2.2010
5.2. 5.2.1.
Titrarea poteniometric Calibrarea pH-metrului Calibrarea pH-metrului se efectueaz la 20 C, conform instruciunilor productorului, cu soluia tampon cu pH 7 la 20 C.
5.2.2.
Metoda de determinare ntr-un cilindru gradat (punctul 4.4) se introduce o cantitate din prob, preparat n conformitate cu punctul 5.1, cantitate egal cu 10 ml, n cazul vinului, i cu 50 ml, n cazul mustului concentrat rectificat. Se adaug circa 10 ml ap distilat i apoi se adaug soluie de hidroxid de sodiu 0,1 M (punctul 3.2) din biuret, pn cnd pH-ul este egal cu 7 la 20 C. Hidroxidul de sodiu trebuie adugat ncet i soluia trebuie amestecat continuu. Se noteaz cu n numrul de mililitri de NaOH 0,1 M adugai.
5.3. 5.3.1.
Titrarea cu indicator (albastru de bromotimol) Test preliminar: determinarea etalonului de culoare ntr-un cilindru gradat (punctul 4.4), se pun 25 ml ap distilat fiart, 1 ml soluie de albastru de bromotimol (punctul 3.3) i o cantitate preparat n conformitate cu punctul 5.1 egal cu 10 ml, n cazul vinului, i cu 50 ml, n cazul mustului concentrat rectificat. Se adaug soluie de hidroxid de sodiu 0,1 M (punctul 3.2) pn cnd culoarea devine albastru-verde. Apoi se adaug 5 ml soluie tampon cu pH 7 (punctul 3.1).
5.3.2.
Msurare ntr-un cilindru gradat (punctul 4.4), se pun 30 ml ap distilat fiart, 1 ml soluie de albastru de bromotimol (punctul 3.3) i o cantitate din proba preparat n conformitate cu punctul 5.1, egal cu 10 ml, n cazul vinului, i cu 50 ml, n cazul mustului concentrat rectificat. Se adaug soluie de hidroxid de sodiu 0,1 M (punctul 3.2) pn cnd se obine aceeai culoare ca n testul preliminar de mai sus (punctul 5.3.1). Se noteaz cu n numrul de mililitri de soluie de hidroxid de sodiu 0,1 M adugai.
6. 6.1. 6.1.1.
EXPRIMAREA REZULTATELOR Metoda de calcul Vinuri Aciditatea total exprimat n miliechivaleni pe litru este dat de formula: A = 10 n Se noteaz cu o cifr zecimal. Aciditatea total exprimat n grame de acid tartric pe litru este dat de formula: A = 0,075 A Se noteaz cu o cifr zecimal.
6.1.2.
Must concentrat rectificat Aciditatea total exprimat n miliechivaleni pe kilogram de must concentrat rectificat este dat de formula: a= 5 n Aciditatea total exprimat n miliechivaleni pe kilogram de zaharuri totale este dat de formula: A = (500 n)/P P = procentul de concentraie (m/m) a zaharurilor totale. Se noteaz cu o cifr zecimal.
6.2.
Repetabilitatea (r) pentru titrare cu indicator (5.3) r = 0,9 meq/l r = 0,07 g acid tartric/l pentru vinuri albe, ros i roii.
19.2.2010
RO
C 43/29
6.3.
Reproductibilitatea (R) pentru titrare cu indicator (punctul 5.3) Pentru vinuri albe i ros: R = 3,6 meq/l R = 0,3 g acid tartric/l. Pentru vinuri roii: R = 5,1 meq/l R = 0,4 g acid tartric/l.
C 43/30
RO
19.2.2010
12 ACIDITATEA VOLATIL (OIV - AS-313-02-ACIVOL) METOD TIP I 1. DEFINIIE Aciditatea volatil este constituit din acizii aparinnd seriei acetice prezeni n vin n stare liber i sub form de sare. 2. PRINCIPIUL METODEI Titrarea acizilor volatili separai din vin prin antrenare cu vapori de ap i rectificarea vaporilor. Mai nti se elimin dioxidul de carbon din vin. Aciditatea dioxidului de sulf liber i a dioxidului de sulf combinat, distilate n aceste condiii, trebuie sczut din aciditatea produsului rezultat n urma distilrii. Trebuie sczut, de asemenea, aciditatea oricrui acid sorbic adugat eventual n vin. Not: Acidul salicilic folosit n unele ri pentru a stabiliza vinurile naintea analizei este prezent n produsul rezultat n urma distilrii. Acesta trebuie determinat i sczut din aciditate. Metoda de determinare se afl la punctul 7 din prezentul capitol. 3. 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7. REACTIVI Acid tartric cristalizat (C4H6O6) Soluie de hidroxid de sodiu 0,1 M (NaOH) Soluie de fenolftalein 1 % n alcool neutru 96 % vol. Acid clorhidric (20 = 1,18 pn la 1,19 g/ml) diluat la 1/4 (v/v) Soluie de iod 0,005 M (I2) Iodur de potasiu (Kl) cristalizat Soluie de amidon 5 g/l: Se amestec 5 g de amidon cu aproximativ 500 ml de ap. Se aduce la punctul de fierbere, amestecnd continuu, i se fierbe timp de 10 minute. Se adaug 200 g de clorur de sodiu. Cnd s-a rcit, se completeaz pn la un litru. 3.8. 4. 4.1. Soluie saturat de borax (Na2B4O7, 10 H2O), adic aproximativ 55 g/l la 20 C. APARATURA Aparatul de antrenare cu vapori de ap este format din: 1) generator de abur; aburul produs nu trebuie s conin dioxid de carbon; 2) barbotor de sticl; 3) coloan de rectificare; 4) refrigerent. Aceast instalaie trebuie s treac urmtoarele trei teste: a) se pun 20 ml de ap fiart n barbotor. Se colecteaz 250 ml de produs distilat i se adaug 0,1 ml de soluie de hidroxid de sodiu 0,1 M (punctul 3.2) i dou picturi de soluie de fenolftalein (punctul 3.3). Nuana roz trebuie s se pstreze cel puin 10 secunde (aburul s nu conin dioxid de carbon). b) se pun n barbotor 20 ml de soluie de acid acetic 0,1 M. Se colecteaz 250 ml de produs distilat. Se titreaz cu soluie de hidroxid de sodiu 0,1 M (punctul 3.2). Volumul utilizat trebuie s fie de cel puin 19,9 ml. (Acidul acetic antrenat de vapori 99,5 %).
19.2.2010
RO
C 43/31
c) se pun n barbotor 20 ml de soluie de acid lactic 1 M. Se colecteaz 250 ml de produs distilat i se titreaz acidul cu soluie de hidroxid de sodiu 0,1 M (punctul 3.2). Volumul de soluie de hidroxid de sodiu adugat trebuie s fie mai mic sau egal cu 1,0 ml (Acid lactic distilat 0,5 %). Orice aparat sau procedeu care trece aceste teste n mod satisfctor, ndeplinete condiiile cerute aparatelor i procedeelor oficiale internaionale. 4.2. 4.3. 5. 5.1. Pomp de vid cu ap. Balon de vid. METODA DE LUCRU Pregtirea probei: eliminarea dioxidului de carbon. Se pun circa 50 ml de vin n balonul de vid ; se face vid n balon cu pompa de ap timp de un minut sau dou, agitndu-se continuu. 5.2. Antrenarea cu vapori de ap. Se pun n barbotor 20 ml de vin fr dioxid de carbon, conform indicaiilor de la punctul 5.1. Se adaug aproximativ 0,5 g de acid tartric (punctul 3.1). Se colecteaz cel puin 250 ml de produs distilat. 5.3. Titrarea Se titreaz cu soluie de hidroxid de sodiu 0,1 M (punctul 3.2), folosindu-se dou picturi de soluie de fenolftalein (punctul 3.3) ca indicator. Se noteaz cu n ml cantitatea de hidroxid de sodiu folosit. Se adaug 4 picturi de acid clorhidric diluat 1:4 (3.4), 2 ml de soluie de amidon (punctul 3.7) i cteva cristale de iodur de potasiu (punctul 3.6). Se titreaz dioxidul de sulf liber cu o soluie de iod 0,005 M (punctul 3.5). Se noteaz cu n ml cantitatea folosit. Se adaug soluie saturat de borax (punctul 3.8) pn cnd nuana roz reapare. Se titreaz dioxidul de sulf combinat cu o soluie de iod 0,005 M (punctul 3.5). Se noteaz cu n ml cantitatea folosit. 6. 6.1. EXPRIMAREA REZULTATELOR Metoda de calcul Aciditatea volatil exprimat, cu o cifr zecimal, n miliechivaleni pe litru este dat de formula: A = 5 (n 0,1 n 0,05 n) Aciditatea volatil exprimat, cu dou zecimale, n grame de acid acetic pe litru este dat de formula: 0,300 (n 0,1 n 0,05 n) 6.2. Repetabilitatea (r) r = 0,7 meq/l r = 0,04 g acid acetic/l. 6.3. Reproductibilitatea (R) R = 1,3 meq/l R = 0,08 g acid acetic/l. 6.4. Vin n care exist acid sorbic Deoarece 96 % din acidul sorbic este antrenat de vapori ntr-un volum distilat de 250 ml, aciditatea acestuia trebuie sczut din aciditatea volatil, tiind c 100 mg de acid sorbic corespunde unei aciditi de 0,89 miliechivaleni sau 0,053 g de acid acetic i cunoscnd concentraia de acid sorbic exprimat n mg/l deter minat prin alte metode. 7. 7.1. DETERMINAREA ACIDULUI SALICILIC ANTRENAT N DISTILATUL ACIDITII VOLATILE Principiu Dup determinarea aciditii volatile i rectificarea dioxidului de sulf, prezena acidului salicilic este caracte rizat, dup acidificare, de nuana violet care apare cnd se adaug o sare de fier III.
C 43/32
RO
19.2.2010
Determinarea acidului salicilic antrenat n produsul distilat cu aciditate volatil se realizeaz pe un al doilea produs distilat, cu acelai volum cu acela asupra cruia s-a efectuat determinarea aciditii volatile. n acest produs distilat, acidul salicilic se determin printr-o metod colorimetric comparativ. Acesta se scade din aciditatea volatil a produsului distilat. 7.2. 7.2.1. 7.2.2. 7.2.3. 7.2.4. 7.3. 7.3.1. Reactivi Acid clorhidric (HCl) (20 = 1,18 pn la 1,19 g/ml). Soluie de tiosulfat de sodiu (Na2 S2 O3 5 H2O) 0,1 M. 10 % (m/v) soluie de sulfat de fier III i de amoniu [Fe2 (SO4)3 (NH4)2 SO4 24 H2O]. Soluie de salicilat de sodiu 0,01 M. Soluia conine 1,60 g/l salicilat de sodiu (Na C7 H5 O3). Metoda de lucru Identificarea acidului salicilic n distilatul aciditii volatile. Imediat dup determinarea aciditii volatile i rectificarea pentru dioxidul de sulf liber i combinat, se pun ntrun balon conic 0,5 ml de acid clorhidric (punctul 7.2.1), 3 ml de soluie de tiosulfat de sodiu 0,1 M (punctul 7.2.2) i 1 ml de soluie de sulfat de amoniu i fier (III) (punctul 7.2.3). Dac acidul salicilic este prezent, apare o culoare violet. 7.3.2. Determinarea acidului salicilic Pe balonul conic se noteaz cantitatea produsului distilat printr-un semn de referin. Se golete i se spal balonul. O nou prob test de 20 ml de vin se supune antrenrii cu vapori de ap i se colecteaz produsul distilat n balonul conic pn la cota de referin. Se adaug 0,3 ml de acid clorhidric pur (punctul 7.2.1) i 1 ml de soluie de sulfat de amoniu i fier (III) (punctul 7.2.3). Coninutul balonului va deveni violet. ntr-un balon conic, identic cu acela care are semnul de referin, se pune ap distilat pn la acelai nivel cu acela al produsului distilat. Se adaug 0,3 ml de acid clorhidric pur (punctul 7.2.1) i 1 ml de soluie de sulfat de amoniu i fier (III) (punctul 7.2.3). Din biuret se pune soluie de salicilat de sodiu 0,01 M (punctul 7.2.4) pn cnd nuana de violet obinut are aceeai intensitate cu aceea din balonul conic care conine vinul distilat. Se noteaz cu n cantitatea de soluie adugat. 7.4. Rectificarea aciditii volatile Se scade volumul 0,1 n ml din volumul de n ml soluie de hidroxid de sodiu 0,1 M folosit pentru titrarea aciditii produsului distilat n timpul determinrii aciditii volatile.
19.2.2010
RO
C 43/33
13 ACIDUL CITRIC (OIV -AS-313-09-ACIENZ) METOD TIP II 1. PRINCIPIUL METODEI Acidul citric este convertit n oxaloacetat i acetat printr-o reacie catalizat de citrat-liaz (CL): Citrat oxaloacetat + acetat n prezena maleat-dehidrogenazei (MDH) i lactat-dehidrogenazei (LDH), oxaloacetatul i derivatul acestuia de decarboxilare, piruvatul, sunt redui la L-maleat i L-lactat de nicotilamid adenin dinucleotid redus (NADH): Oxaloacetat + NADH + H+ L-maleat + NAD+ Piruvat + NADH + H+ L-lactat + NAD+ Cantitatea de NADH oxidat la NAD+ n aceste reacii este proporional cu cantitatea de citrat prezent. Oxidarea NADH este msurat prin descreterea puterii sale de absorbie la o lungime de und de 340 nm. 2. 2.1. REACTIVI Soluie tampon pH 7,8 (0,51 M glicilglicin; pH = 7,8; Zn2+: 0,6 10 3M) Se dizolv 7,13 g de glicilglicin n aproximativ 70 ml de ap bidistilat. Se ajusteaz pH-ul la 7,8 cu aproximativ 13 ml de soluie de hidroxid de sodiu 5 M; se adaug 10 ml de soluie de clorur de zinc ZnCl2, 80 mg n 100 ml de ap, i se completeaz pn la 100 ml cu ap bidistilat. Aceast soluie rmne stabil cel puin 4 sptmni la 4 C. 2.2. Soluie de nicotilamid adenin dinucleotid redus (NADH), aproximativ 6 10 3 M. Se dizolv 30 mg NADH i 60 mg NaHCO3 n 6 ml ap bidistilat. Soluie de maleat dehidrogenaz /lactat dehidrogenaz, (MDH/LDH) (0,5 mg MDH/ml; 2,5 mg LDH/ml): Se amestec mpreun 0,1 ml MDH (5 mg MDH/ml), 0,4 ml de soluie de sulfat de amoniu (3,2 M) i 0,5 ml LDH (5 mg/ml). Aceast suspensie rmne stabil cel puin un an la 4 C. 2.4. Citrat-liaz CL (5 mg protein/ml): Se dizolv 168 mg de liofilizat n 1 ml de ap foarte rece. Aceast soluie rmne stabil cel puin o sptmn la 4 C i cel puin 4 sptmni dac este ngheat. Se recomand ca nainte de determinare s fie verificat activitatea enzimei. 2.5. Polivinilpolipirolidon (PVPP) Not: Toi reactivii de mai sus sunt disponibili n comer. 3. 3.1. APARATURA Spectrofotometru pentru determinri la 340 nm, lungimea de und la care absorbia NADH este maxim. n cazul n care acesta nu este disponibil, se poate utiliza un spectrofotometru cu o surs spectral discontinu, pentru determinri la 334 nm sau la 365 nm. Deoarece sunt incluse determinri ale absorbiei absolute (nu sunt folosite curbe de calibrare, dar standardizarea se face prin considerarea coeficientului de extincie a NADH), trebuie verificate scalele de lungime de und i absorbia spectral a aparatului. 3.2. 3.3. 4. Cuve de sticl cu lungimea drumului optic de 1 cm sau cuve de unic folosin. Micropipete pentru pipetarea de volume n intervalul 0,02 la 2 ml. PREGTIREA PROBEI Determinarea citratului se efectueaz n general direct n vin, fr ndeprtarea preliminar a coloraiei i fr diluare, n cazul n care coninutul de acid citric este mai mic de 400 mg/l. n caz contrar, se dilueaz vinul pn cnd concentraia citratului se situeaz ntre 20 i 400 mg/l (cantitatea de citrat n eantionul analizat cuprins ntre 5 g i 80 g).
2.3.
C 43/34
RO
19.2.2010
La vinurile roii care sunt bogate n compui fenolici, se recomand un tratament preliminar cu PVPP: Se pregtete o suspensie de aproximativ 0,2 g PVPP n ap i se las n repaus 15 minute. Se filtreaz folosind un filtru cu pliuri. Se pun 10 ml de vin ntr-un flacon conic de 50 ml, se adaug PVPP umed luat de pe filtru cu o spatul. Se agit 2-3 minute. Se filtreaz. 5. METODA DE LUCRU Cu spectrofotometrul ajustat la o lungime de und de 340 nm, se determin absorbia folosind cuve de 1 cm, utiliznd aerul ca standard de absorbie zero (fr cuv n drumul optic). n cuvele de 1 cm se adaug urmtoarele: Cuv de referin Soluia 2.1 Soluia 2.2 Proba de msurat Ap bidistilat Soluia 2.3 1,00 ml 0,10 ml 2,00 ml 0,02 ml Cuv prob 1,00 ml 0,10 ml 0,20 ml 1,80 ml 0,02 ml
Se amestec i, dup aproximativ 5 minute, se citesc absorbiile soluiilor din cuvele de referin i prob (A1). Se adaug: Soluia 2.4 0,02 ml 0,02 ml
Se amestec; se ateapt pn la terminarea reaciei (aproximativ 5 minute) i se citesc absorbiile soluiilor din cuvele de referin i prob (A2). Se calculeaz diferena absorbiilor (A1-A2) pentru cuvele de referin i prob. Se calculeaz diferena dintre absorbia din cuva de referin i absorbia din cuva de prob: A = AS AR Not: Timpul necesar pentru aciunea enzimelor poate varia de la un lot la altul. Valoarea de mai sus este dat numai orientativ i se recomand determinarea ei pentru fiecare lot. 6. EXPRIMAREA REZULTATELOR Coninutul de acid citric este dat n miligrame pe litru (mg/l) rotunjit la cel mai apropiat numr ntreg. 6.1. Metoda de calcul Formula general pentru calcularea concentraiei n miligrame pe litru este: C = ((V PM)/( d v)) A V v = = volumul soluiei test n mililitri (aici 3,14 ml) volumul probei n mililitri (aici 0,2 ml) masa molecular a substanei de determinat (aici, pentru acid citric anhidru = 192,1) drumul optic n cuv n centimetri (aici 1 cm) coeficientul de absorbie a NADH; la 340 nm, 6,3 mmol
1
PM = d = = =
l cm 1.
Se obine: C = 479 A Dac proba a fost diluat n timpul pregtirii, rezultatul se nmulete cu factorul de diluare. Not: la 334 nm: C = 488 A ( = 6,2 mmol la 365 nm: C = 887 A ( = 3,4 mmol
1 1
l cm 1)
l cm 1)
19.2.2010
RO
C 43/35
6.2.
Repetabilitatea (r) Concentraia acidului citric mai mic de 400 mg/l: r = 14 mg/l. Concentraia acidului citric mai mare de 400 mg/l: r = 28 mg/l.
6.3.
Reproductibilitatea (R) Concentraia acidului citric mai mic de 400 mg/l: R = 39 mg/l. Concentraia acidului citric mai mare de 400 mg/l: R = 65 mg/l.
C 43/36
RO
19.2.2010
14 ACIDUL SORBIC (OIV - AS-313-14-ACISOR) METOD TIP IV 1. 1.1. PRINCIPIUL METODELOR Determinarea prin spectrofotometria de absorbie n ultraviolet Acidul sorbic (acidul trans, trans 2,4 hexadienoic) extras prin distilarea cu vapori de ap este determinat n distilatul de vin prin spectrofotometria de absorbie n ultraviolet. Substanele care interfer n ultraviolet sunt ndeprtate prin evaporarea pn la uscare a probei de distilat uor alcalinizat de o soluie de hidroxid de calciu. Un coninut mai mic de 20 mg/l trebuie confirmat prin cromatografie n strat subire (sensibilitate: 1 mg/l). 1.2. Determinarea prin gaz cromatografie Acidul sorbic extras n eter etilic se determin prin gaz cromatografie n prezena unui etalon intern. 1.3. Identificarea urmelor prin cromatografia n strat subire Acidul sorbic extras n eterul etilic este separat prin cromatografia n strat subire, iar concentraia acestuia este evaluat semi-cantitativ. 2. 2.1. 2.1.1. 2.1.2. 2.1.3. DETERMINARE PRIN SPECTROFOTOMETRIE DE ABSORBIE N ULTRAVIOLET Reactivi Acid tartric cristalin (C4H6O6). Soluie de hidroxid de calciu Ca (OH)2 aproximativ 0,02 M. Soluie de referin de acid sorbic, 20 mg pe litru. Se dizolv 20 mg de acid sorbic, C6H8O2 n aproximativ 2 ml de soluie de hidroxid de sodiu 0,1 M. Se pune ntr-un balon cotat de 1 000 ml i se completeaz cu ap pn la cot. Este posibil, de asemenea, dizolvarea a 26,8 mg de sorbat de potasiu, C6H7KO2 n ap i completarea pn la 1 000 ml cu ap. 2.2. 2.2.1. 2.2.2. 2.2.3. Aparatura Aparat de distilare cu aburi (a se vedea capitolul Aciditatea volatil). Baie de ap la 100 C. Spectrofotometru pentru determinarea absorbiei la o lungime de und de 256 nm i avnd o cuv de cuar cu drum optic de 1 cm. Metoda de lucru Distilarea Se pun n balonul aparatului de distilare cu aburi 10 ml de vin i se adaug 1-2 g de acid tartric (2.1.1). Se colecteaz 250 ml de distilat. 2.3.2. Pregtirea curbei de calibrare Se prepar, prin diluarea soluiei de referin (punctul 2.1.3), patru soluii de referin diluate, cu 0,5, 1, 2,5 i 5 mg de acid sorbic la litru; se determin absorbiile cu spectrofotometrul la 256 nm, folosindu-se apa distilat ca blanc. Se obine curba variaiilor absorbanei reprezentat n funcie de concentraiile soluiilor. Variaia este liniar. 2.3.3. Determinarea Se pun 5 ml de distilat ntr-o capsul de evaporare cu diametrul de 55 mm i se adaug 1 ml de soluie de hidroxid de calciu (punctul 2.1.2). Se evapor, pn la uscare, pe o baie de ap. Se dizolv reziduul n civa mililitri de ap distilat, se transfer cantitativ ntr-un balon cotat de 20 ml i se completeaz pn la cot cu ap de cltire. Se msoar absorbia la 256 nm folosind spectrofotometrul fa de un blanc constituit dintr-o soluie obinut prin diluarea a 1 ml de soluie de hidroxid de calciu (punctul 2.1.2). Valoarea absorbiei msurate se trece pe curba valorii i de aici se gsete concentraia C a acidului sorbic n soluie. Not: n practic, pierderea datorat evaporrii poate fi neglijat, iar absorbia se msoar direct n distilatul total, diluat cu ap distilat.
2.3. 2.3.1.
19.2.2010
RO
C 43/37
2.4. 2.4.1.
Exprimarea rezultatelor Calcularea Concentraia acidului sorbic n vin, exprimat n mg/l, este egal cu: 100 C, Unde C = concentraia acidului sorbic n soluia analizat prin spectrofotometrie, exprimat n mg/l.
3. 3.1. 3.1.1. 3.1.2. 3.1.3. 3.2. 3.2.1.
DETERMINAREA PRIN CROMATOGRAFIE N FAZ GAZOAS Reactivi Eter etilic (C2H5)2O distilat chiar nainte de folosire. Soluie intern de referin: soluie de acid undecanoic C11H22O2 n etanol 95 % vol. la o trie de 1 g/l. Soluie apoas de acid sulfuric H2SO4 (20 = 1,84 g/ml) diluat 1:3 (v/v). Aparatura Cromatograf cu gaz prevzut cu detector de ionizare n flacr i o coloan de oel inoxidabil (4 m 1/8 oli), tratat n prealabil cu dimetil-diclorasilan i prevzut cu o faz staionar alctuit dintr-un amestec de succinat dietilenglicol (5 %) i acid fosforic (1 %) (DEGS H3 PO4) sau un amestec de dietilenglicol adipat (7 %) i acid fosforic (1 %) (DEGA H3 PO4) legat pe Gaschrom Q 80 100 mesh. Pentru tratarea cu dimetil-diclorasilan (DMDCS), se trece prin coloan o soluie coninnd 2-3 g de DMDCS n toluen. Se spal imediat coloana cu metanol, urmat de azot, apoi se spal cu hexan, urmat din nou de azot. Apoi se umple. Condiii de lucru: Temperatura cuptorului: 175 C. Temperatura injectorului i a detectorului: 230 C. Gaz purttor: azot (rata de scurgere = 20 ml/min.).
3.2.2.
Microsering cu o capacitate de 10 microlitri, gradat n 0,1 microlitri. Not: Pot fi folosite alte tipuri de coloane care permit o bun separare, n special coloane capilare (cum ar fi FFAP). Metoda de lucru descris este dat ca exemplu.
3.3. 3.3.1.
Metoda de lucru Pregtirea probei pentru analiz ntr-o eprubet de sticl cu o capacitate de aproximativ 40 ml i prevzut cu un dop de sticl rodat, se introduc 20 ml de vin, se adaug 2 ml de soluie etalon (punctul 3.1.2) i 1 ml de acid sulfuric diluat (punctul 3.1.3). Dup ce se amestec soluia prin rsturnri repetate ale eprubetei, se adaug n coninut 10 ml de eter etilic (punctul 3.1.1). Se extrage acidul sorbic n faza organic prin scuturarea eprubetei timp de 5 minute. Se las s se aeze.
3.3.2.
Pregtirea soluiei de referin Se selecteaz un vin pentru care cromatograma extractului cu eter nu arat niciun vrf corespunztor eluiei acidului sorbic. Vinul este suprancrcat cu acid sorbic cu o concentraie de 100 mg/l. Se trateaz 20 ml din proba astfel preparat n conformitate cu procedura de la punctul 3.3.1.
3.3.3.
Cromatografia Folosind o microsering, se injecteaz pe rnd n cromatograf 2 l din faza extras cu eter obinut cum s-a artat la punctul 3.3.2 i 2 l din faza extras cu eter obinut cum s-a artat la punctul 3.3.1. Se nregistreaz cromatogramele respective: se verific identitatea timpilor de reinere ai acidului sorbic i ai etalonului. Se msoar nlimea (sau suprafaa) fiecruia dintre picurile nregistrate.
C 43/38
RO
19.2.2010
3.4. 3.4.1.
Exprimarea rezultatelor Calculare Concentraia acidului sorbic n vinul analizat, exprimat n miligrame pe litru, este dat de relaia: 100 (h/H) (l/i) H = nlimea picului acidului sorbic n soluia de referin h = nlimea picului acidului sorbic n proba pentru analiz l = nlimea picului etalonului intern n soluia de referin I = nlimea picului etalonului intern n proba pentru analiz Not: Concentraia acidului sorbic poate fi determinat, n acelai mod, prin msurarea suprafeelor aflate sub picurile respective.
19.2.2010
RO
C 43/39
15 PH (OIV - AS-313-15-PH) METOD TIP I 1. PRINCIPIU Se msoar diferena de potenial dintre doi electrozi cufundai n lichidul de analizat. Unul dintre electrozi are un potenial care este o funcie definit a pH-ului lichidului, n timp ce cellalt are un potenial stabilit i cunoscut i reprezint electrodul de referin. 2. 2.1. 2.2. 2.2.1. 2.2.2. 2.2.3. 3. 3.1. 3.1.1. APARATURA pH-metru cu o scal n uniti pH, permind realizarea determinrilor la cel puin 0,05 uniti de pH. Electrozi: Electrod de sticl, pstrat n ap distilat. Electrod de referin de clorur de potasiu saturat, pstrat ntr-o soluie saturat de clorur de potasiu. Sau un electrod mixt, pstrat n ap distilat. REACTIVI Soluii tampon: Soluie saturat de tartrat acid de potasiu, coninnd minimum 5,7 g/l de tartrat acid de potasiu (C4H5KO6), la 20 C. Aceast soluie poate fi pstrat pn la dou luni adugnd 0,1 g de timol la 200 ml. 8 3,57 la 20 C > > > > < 3,56 la 25 C > > > > : 3,55 la 30 C
pH
3.1.2.
Soluie de ftalat acid de potasiu 0,05 M, coninnd 10,211 g/l de ftalat acid de potasiu (C8H5KO4), la 20 C. (Perioada maxim de pstrare este de dou luni). 8 3,999 la 15 C > > > > > > > > < 4,003 la 20 C > > 4,008 la 25 C > > > > > > : 4,015 la 30 C
pH
3.1.3.
Soluie coninnd:
Fosfat monopotasic, KH2 PO4 ................................................................ ................................................................. 3,402 g Fosfat dipotasic, K2 H PO4 ................................................................ ....................................................................... 4,354 g Ap pn la ................................................................ ................................................................................................ ... (Perioada maxim de pstrare este de dou luni) 8 6,90 la 15 C > > > > > > > > < 6,88 la 20 C > > 6,86 la 25 C > > > > > > : 6,85 la 30 C 1l
pH
Not: Pot fi utilizate, de asemenea, soluii tampon de etalonare din comer.
C 43/40
RO
19.2.2010
4. 4.1 4.1.1.
METODA DE LUCRU Pregtirea probei pentru analiz Pentru must i vin Se analizeaz direct mustul sau vinul.
4.1.2.
Pentru must concentrat rectificat Se dilueaz mustul concentrat rectificat cu ap pentru a obine o concentraie de 25 0,5 % (m/m) a totalului zaharurilor (25 o Brix). Dac P reprezint procentajul concentraiei (m/m) totalului zaharurilor n mustul concentrat rectificat, se cntrete o mas de 2 500/P i se completeaz pn la 100 g cu ap. Apa utilizat trebuie s aib o conductibilitate sub 2 micro-siemens pe centimetru.
4.2
Stabilirea punctului zero al aparatului Aceast operaie se realizeaz naintea oricrei determinri, n conformitate cu instruciunile furnizate o dat cu aparatul utilizat.
4.3.
Calibrarea pH-metrului Calibrarea se realizeaz la 20 C, urmnd instruciunile furnizate pentru aparatul utilizat, cu soluii tampon cu pH 6,88 i 3,57 la 20 C. Se utilizeaz soluiile tampon cu pH 4,00 la 20 C pentru verificarea calibrrii scalei.
4.4.
Determinarea Se cufund electrodul n proba ce trebuie analizat, a crei temperatur trebuie s se situeze ntre 20 i 25 C i ct mai aproape posibil de 20 C. Se citete valoarea pH-ului direct de pe scal. Se realizeaz cel puin dou determinri pentru aceeai prob. Media aritmetic a determinrilor este considerat rezultatul final.
5.
EXPRIMAREA REZULTATELOR pH-ul mustului, vinului sau soluiei 25 % (m/m) (25 zecimale.
o
Brix) de must concentrat rectificat este exprimat cu dou
19.2.2010
RO
C 43/41
16 DETERMINAREA SIMULTAN A ACIDULUI L-ASCORBIC I A ACIDULUI D-IZOASCORBIC PRIN HPLC I DETECTARE UV (OIV-AS-313-22-ACASCO) METOD TIP II 1. INTRODUCERE Acidul ascorbic este un antioxidant prezent, n mod natural, ntr-o ntreag serie de produse alimentare. Cantitatea normal de acid ascorbic din strugure scade n momentul producerii mustului i n cursul vinificrii. n anumite limite, acidul ascorbic poate fi adugat la musturi i la vinuri. Metoda descris a fost validat n cadrul unor studii inter-laborator, prin analiza unor probe de vin la care s-au adugat 30 mg/l la 150 mg/l, respectiv 10 mg/l la 100 mg/l de acid L-ascorbic i acid D-izoascorbic. 2. DOMENIUL DE APLICARE Prezenta metod este adecvat pentru determinarea simultan a acidului L-ascorbic i a acidului D-izoascorbic (acid erithorbic) din vin prin cromatografie lichid de nalt performan i detectare UV pe o plaj cuprins ntre 3 i 150 mg/l. Pentru coninuturile mai mari de 150 mg/l, este necesar diluarea probei. 3. PRINCIPIUL Probele sunt injectate direct n sistemul HPLC dup filtrarea prin membran. Analiii sunt separai pe o coloan cu faz invers i sunt supui unei detectri UV la 266 nm. Cuantificarea acidului L-ascorbic i a acidului Dizoascorbic se realizeaz n raport cu un etalon extern. Not: Coloanele i condiiile de funcionare sunt date ca exemplu. O bun separare poate fi asigurat i de alte tipuri de coloane. 4. 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.1.6 4.1.7 4.1.8 4.1.9 4.1.10 4.2. 4.2.1 REACTIVI I PRODUI Reactivi n-octilamin, puritate 99,0 % Acetat de sodiu 3 H2O, puritate 99,0 % Acid acetic pur, 100 % Acid fosforic, aproximativ 25 % Acid oxalic, puritate 99,0 % Ascorbat oxidaza Acid L-ascorbic, ultra 99,5 % Acid D-izoascorbic, puritate 99,0 % Ap bidistilat Metanol, p.A. 99,8 % Pregtirea fazei mobile Soluii pentru faza mobil Pentru faza mobil, se prepar urmtoarele soluii: 4.2.1.1 4.2.1.2 4.2.1.3 4.2.1.4 12,93 g de n-octilamin n 100 ml de metanol 68,05 g de acetat de sodiu 3 H2O n 500 ml de ap bidistilat 12,01 g de acid acetic pur n 200 ml de ap bidistilat Soluie tampon (pH 5,4): 430 ml de soluie de acetat de sodiu (4.2.1.2) i 70 ml de soluie de acid acetic (4.2.1.3)
C 43/42
RO
19.2.2010
4.2.2
Pregtirea fazei mobile ntr-un pahar Berzelius, se amestec 5 ml de soluie de n-octilamin (4.2.1.1) cu aproximativ 400 ml de ap bidistilat. Se aduce aceast soluie la un pH ntre 5,4 i 5,6, adugnd acid fosforic 25% (4.1.4), pictur cu pictur. Se adaug 50 ml din soluia tampon (4.2.1.4) i se transfer compusul ntr-un balon cotat de 1 000 ml, apoi se completeaz cu ap bidistilat. nainte de utilizare, faza mobil trebuie filtrat cu ajutorul unei membrane (celuloz regenerat de 0,2 m) i, pe ct posibil, degazat cu heliu (aproximativ 10 minute), n funcie de necesitile sistemului HPLC utilizat.
4.3
Prepararea soluiei standard Not: Toate soluiile standard (soluia mam 4.3.1. i soluiile de etalonare 4.3.2) trebuie preparate n ziua utilizrii i pstrate, de preferin, n frigider nainte de injectare.
4.3.1
Prepararea soluiei mam (1 mg/ml) Se prepar o soluie apoas de acid oxalic 2 % i se elimin oxigenul dizolvat prin barbotare cu azot. Se cntresc cu exactitate 100 mg de acid L-ascorbic i 100 mg de acid D-izoascorbic ntr-un balon cotat de 100 ml, care se umple cu soluie apoas de acid oxalic 2 %.
4.3.2
Prepararea soluiilor de etalonare Pentru soluiile de etalonare, se dilueaz soluia mam (4.3.1) cu soluia de acid oxalic 2 % pn cnd se obin concentraiile dorite. Se recomand concentraiile ntre 10 mg/l i 120 mg/l. De exemplu 100 l, 200 l, 400 l, 800 l 1 200 l la 10 ml, care corespund concentraiilor de 10, 20, 40, 80 i 120 mg/l.
5.
APARATURA Echipament de laborator normal, n special urmtoarele:
5.1 5.2 5.3 6.
Pomp HPLC Bucl de injecie de 20 l Detector UV EANTIONARE nainte de injectare, probele de vin sunt filtrate printr-o membran cu diametrul porilor de 0,2 m. Pentru concentraii mai mari de 150 mg/l, este necesar diluarea probei.
7. 7.1
METODA DE LUCRU Condiiile de utilizare a sistemului HLPC Se injecteaz n aparatul cromatografic 20 l din proba filtrat prin membran. Precoloana: Coloana: Volumul de injecie: Faza mobil: Debit: Detectare UV: Ciclul de cltire: de exemplu Nucleosil 120 C18 (4 cm 4 mm 7 m) de exemplu Nucleosil 120 C18 (25 cm 4 mm 7 m) 20 l vezi 4.2.2, eluie izocratic 1 ml/min 266 nm cel puin 30 ml de ap bidistilat, urmai de 30 ml de metanol i 30 ml de acetonitril
19.2.2010
RO
C 43/43
7.2
Identificare/Confirmare Identificarea picurilor se efectueaz prin compararea timpilor de retenie ai soluiilor standard cu cei ai probelor. Cu sistemul cromatografic descris n exemplul de mai jos, timpii de retenie sunt de 7,7 minute pentru acidul L-ascorbic, respectiv 8,3 minute pentru acidul D-izoascorbic (a se vedea figura 1, cromatograma A). Pentru a se confirma rezultatele pozitive, aceste probe trebuie tratate cu o spatul de ascorbat oxidaz i msurate din nou (a se vedea figura 1, cromatograma B). Ca urmare a descompunerii acidului L-ascorbic i a acidului D-izoascorbic provocat de ascorbat oxidaza, nu ar trebui s apar niciun semnal n timpul reteniei de acid L-ascorbic i acid D-izoascorbic. n cazul detectrii unor picuri parazite, suprafaa acestora trebuie luat n considerare n calcularea concentraiei analiilor.
Figura 1 Exemplu de cromatogram pentru vin alb: A nainte de tratarea cu ascorbat oxidaz; B dup tratare. Legend: acid L-ascorbic; acid D-izoascorbic Not: Se recomand ca analiza probelor tratate cu ascorbat oxidaz s se efectueze la sfritul unei secvene urmate de ciclul de cltire, pentru a se elimina resturile de ascorbat oxidaz de pe coloan. n caz contrar, acidul L-ascorbic i acidul D-izoascorbic ar putea fi convertii de resturile de ascorbat oxidaz n timpul msurrii HPLC, iar rezultatul ar putea fi afectat din aceast cauz. 8. CALCULARE Se pregtete o curb de calibrare utiliznd soluiile de etalonare (4.3.2). Conform metodei etalonului extern, cuantificarea acidului L-ascorbic i a acidului D-izoascorbic se realizeaz prin msurarea suprafeelor picurilor i compararea acestora cu concentraia corespunztoare de pe curba de calibrare. Exprimarea rezultatelor Rezultatele se exprim n miligrame de acid L-ascorbic, respectiv de acid D-izoascorbic per litru, cu o cifr zecimal (de exemplu 51,3 mg/l). Pentru concentraii mai mari de 150 mg/l, se ia n calcul diluia. 9. FIDELITATEA Metoda a fost testat n cadrul unui studiu inter-laborator organizat n anul 1994 de fostul Oficiu federal de igien public (Bundesgesundheitsamt, Germania), la care au participat 27 de laboratoare. Programul studiului inter-laborator a urmrit art. 35 din legea german privind produsele alimentare, care a fost acceptat de OIV pn la introducerea noului protocol (OENO 6/2000).
C 43/44
RO
19.2.2010
Studiul a avut n vedere patru probe diferite de vin dou de vin alb i dou de vin rou cu cinci repetri solicitate pentru fiecare prob. Dat fiind faptul c era imposibil s se prepare probe cu o stabilitate suficient a analiilor (viteze de descompunere diferite), s-a hotrt s se trimit participanilor cantiti stabilite de substane etalon pure, precum i probele de vin. Sarcina laboratoarelor a fost de a transfera cantitativ substanele etalon n probele de vin i de a le analiza imediat. Au fost analizate volume de la 30 la 150 mg/l pentru acidul L-ascorbic i de la 10 la 100 mg/l pentru acidul D-izoascorbic. Rezultatele detaliate ale studiului sunt prezentate n ANEXA publicat de OIV. Evaluarea s-a realizat n conformitate cu DIN/ISO 5725 (versiunea 1988). Deviaiile standard de repetabilitate (sr) i de reproductibilitate (sR) erau n concordan cu concentraiile de acid L-ascorbic i acid D-izoascorbic. Parametrul de precizie real se poate calcula cu ajutorul ecuaiilor urmtoare: Acid L-ascorbic sr = 0,011 x + 0,31 sR = 0,064 x + 1,39 x: concentraia de acid L-ascorbic (mg/l) Acid D-izoascorbic sr = 0,014 x + 0,31 sR = 0,079 x + 1,29 x: concentraia de acid D-izoascorbic (mg/l) Exemplu: 50 mg/l de acid D-izoascorbic sr = 1,0 mg/l sR = 5,2 mg/L 10. 10.1 ALTE CARACTERISTICI ALE ANALIZEI Limita de detecie Limita de detecie a acestei metode a fost estimat la 3 mg/l pentru acidul L-ascorbic i acidul D-izoascorbic. 10.2 Precizia Recuperarea medie calculat pornind de la studiul inter-laborator efectuat pe patru probe (a se vedea ANEXA publicat n Culegerea OIV) a fost de: 100,6 % pentru acidul L-ascorbic 103,3 % pentru acidul D-izoascorbic
19.2.2010
RO
C 43/45
17 DIOXIDUL DE CARBON (OIV - AS-314-01-DIOCAR) METOD TIP II 1. 1.1. PRINCIPIUL METODEI Vinuri nespumoase (suprapresiune CO2 0,5 105 Pa) (1) Volumul de vin luat din prob este rcit la aproximativ 0 C i amestecat cu o cantitate suficient de soluie de hidroxid de sodiu pentru a obine un pH de 10-11. Titrarea este efectuat cu o soluie acid n prezena anhidrazei carbonice. Coninutul de dioxid de carbon este calculat din volumul de acid necesar schimbrii pHului de la 8,6 (forma bicarbonat) la 4,0 (acid carbonic). n aceleai condiii se efectueaz i o titrare blanc, pe vin decarbonatat, n scopul de a se ine cont de volumul de soluie de hidroxid de sodiu absorbit de acizii din vin. 1.2. Vinuri petiante i spumante Proba de vin de analizat este rcit aproape de punctul de nghe. Dup nlturarea unei cantiti utilizate ca blanc dup decarbonatare, restul coninutului sticlei este alcalinizat pentru a fixa tot dioxidul de carbon sub forma Na2CO3. Titrarea este efectuat cu o soluie acid, n prezena anhidrazei carbonice. Coninutul de dioxid de carbon este calculat din volumul soluiei acide necesar pentru schimbarea pH-ului de la 8,6 (forma bicarbonat) la 4,0 (acid carbonic). n aceleai condiii se ntreprinde i o titrare blanc, pe vin decarbonatat, n scopul de a ine cont de volumul de soluie de hidroxid de sodiu absorbit de acizii din vin. 2. 2.1. 2.1.1. 2.1.1.1. 2.1.1.2. 2.1.2. 2.1.2.1. 2.1.2.2. 2.1.2.3. 2.1.3. DESCRIEREA METODEI Vinuri nespumoase (dioxid de carbon sub presiune 0,5 105 Pa). Aparatura Agitator magnetic. pH metru. Reactivi Soluie de hidroxid de sodiu (NaOH) 0,1 M. Soluie de acid sulfuric (H2SO4) 0,05 M. Soluie de anhidraz carbonic 1 g/l. Metoda de lucru Se rcete proba de vin la aproximativ 0 C mpreun cu pipeta utilizat pentru eantionare. Se pun 25 ml de soluie de hidroxid de sodiu (punctul 2.1.2.1) ntr-un pahar de laborator de 100 ml; se adaug dou picturi de soluie apoas de anhidraz carbonic (punctul 2.1.2.3). Se introduc 10 ml de vin, utiliznd pipeta rcit la 0 C. Se pune paharul pe agitatorul magnetic, se instaleaz electrodul i tija magnetic i se agit moderat. Cnd lichidul a ajuns la temperatura camerei, se titreaz ncet cu soluia de acid sulfuric (punctul 2.1.2.2) pn cnd pH-ul ajunge la 8,6. Se continu titrarea cu acid sulfuric (punctul 2.1.2.2) pn cnd pH-ul atinge valoarea 4,0. Se noteaz cu n ml volumul utilizat ntre pH 8,6 i 4,0. Se nltur CO2 din aproximativ 50 ml de prob de vin prin agitarea n vid timp de trei minute, balonul fiind nclzit ntr-o baie de ap la aproximativ 25 C. Se repet procedura de mai sus pe 10 ml de vin decarbonatat. Se noteaz cu n ml volumul utilizat. 2.1.4. Exprimarea rezultatelor 1 ml de soluie de acid sulfuric 0,05 M titrat corespunde la 4,4 mg de CO2. Cantitatea de CO2 din vin, n grame pe litru, este dat de formula 0,44 (n n) Se exprim cu dou zecimale. Not: n cazul vinurilor care conin puin CO2 (CO2 < 1 g/l), nu este necesar adugarea anhidrazei carbonice pentru catalizarea hidratrii CO2.
(1) 105 pascal (Pa) = 1 bar.
C 43/46
RO
19.2.2010
2.2. 2.2.1. 2.2.1.1. 2.2.1.2. 2.2.2. 2.2.2.1. 2.2.2.2. 2.2.2.3. 2.2.3.
Vinuri spumante i petiante Aparatura Agitator magnetic. pH metru. Reactivi Soluie de hidroxid de sodiu (NaOH) 50 % (m/m). Soluie de acid sulfuric (H2SO4) 0,05 M. Soluie de anhidraz carbonic 1 g/l. Metoda de lucru Se noteaz nivelul vinului n sticl i se rcete pn cnd ncepe s nghee. Se las sticla s se nclzeasc uor, n timp ce se agit, pn la dispariia cristalelor de ghea. Se scoate dopul rapid i se pun 45-50 ml de vin ntr-un cilindru gradat, pentru titrarea blanc. Volumul exact nlturat, v ml, este determinat prin citirea valorilor pe cilindrul gradat dup ce vinul a ajuns la temperatura camerei. Imediat dup ce proba blanc a fost nlturat, se adaug 20 ml de soluie de hidroxid de sodiu (punctul 2.2.2.1) ntr-o sticl cu capacitatea de 750 ml. Se ateapt pn cnd vinul ajunge la temperatura camerei. Se pun 30 ml de ap distilat fiart i dou picturi de soluie de anhidraz carbonic (punctul 2.2.2.3) ntr-un pahar de laborator de 100 ml. Se adaug 10 ml de vin care a fost alcalinizat. Se pune paharul pe agitatorul magnetic, se instaleaz electrodul i tija magnetic i se agit uor. Se titreaz uor cu soluie de acid sulfuric (punctul 2.2.2.2) pn cnd pH-ul ajunge la 8,6. Se continu uor titrarea cu acid sulfuric (punctul 2.2.2.2) pn cnd pH-ul ajunge la valoarea 4,0. Se noteaz cu n ml volumul utilizat ntre pH 8,6 i 4,0. Se nltur CO2 din v ml de vin pus deoparte pentru titrarea blanc prin agitarea timp de 3 minute n vid, balonul fiind nclzit la aproximativ 25 oC ntr-o baie de ap. Se nltur 10 ml de vin decarbonatat i se adaug la 30 ml de ap distilat fiart ; se adaug dou-trei picturi de soluie de hidroxid de sodiu (punctul 2.2.2.1) pentru aducerea pH-ului la 10-11. Se urmeaz apoi procedura de mai sus. Se noteaz cu n ml volumul de acid sulfuric 0,05 M adugat.
2.2.4.
Exprimarea rezultatelor 1 ml de soluie de acid sulfuric 0,05 M corespunde la 4,4 mg de CO2. Se golete sticla de vin care a fost alcalinizat i se determin, cu precizie de 1 ml, volumul iniial de vin prin completarea cu ap pn la cot. Se noteaz cu V ml. Cantitatea de CO2, exprimat n grame pe litru de vin, este dat de urmtoarea formul: 0,44(n n) ((V v + 20)/(V v)) Rezultatul se noteaz cu dou zecimale.
2.3.
Calculul suprapresiunii teoretice Suprapresiunea la 20 C, Paph20, exprimat n pascali, este dat de formula: Paph20 = ((Q)/(1,951 105(0,86 0,01 A)(1 0,00144 S))) Patm unde: Q: A: S: Patm: coninutul de CO2 al vinului, n g/l tria alcoolic a vinului la 20 C coninutul de zahr al vinului, n g/l presiunea atmosferic, exprimat n pascali
19.2.2010
RO
C 43/47
18 DETERMINAREA DIOXIDULUI DE CARBON DIN VIN PRIN METODA MANOMETRIC (OIV AS314-04CO2MAN) METOD TIP II (p.m.) [Descrierea acestei metode de analiz face obiectul unei actualizri de ctre autoritile OIV. Aceasta va fi publicat ntr-o viitoare comunicare a Comisiei imediat ce textul actualizat va fi publicat de OIV n ediia 2010 a Culegerii de metode internaionale de analiz a OIV]
C 43/48
RO
19.2.2010
19 MSURAREA SUPRAPRESIUNII VINURILOR SPUMANTE I PETIANTE (OIV - AS-314-02-SURPRES) METOD TIP I 1. PRINCIPIU Dup stabilizarea termic i agitarea sticlei, suprapresiunea se msoar cu ajutorul unui afrometru (manometru). Se exprim n pascali (Pa) (metod de tipul I). Metoda se poate aplica i vinurilor spumoase i vinurilor perlante. 2. APARATURA Aparatul care permite msurarea suprapresiunii din sticlele cu vin spumant i petiant se numete afrometru. Acesta are diferite forme, corespunztor modului n care este astupat sticla (capsul metalic, capac, dop de plut sau plastic). 2.1. Pentru sticlele dotate cu o capsul Este format din trei pri (figura 1): partea superioar (sau urub port-ac) se compune din manometru, inel de strngere manual, urub melcat care culiseaz n partea median i un ac care traverseaz capsula. Acul este dotat cu o deschidere lateral care comunic presiunea la manometru. O garnitur asigur contactul etan cu capsula sticlei partea median (sau piuli) servete la centrarea prii superioare. Ea se nurubeaz pe partea inferioar, meninnd ferm pe sticl ntreaga instalaie partea inferioar (sau etrier) este prevzut cu o ghear care se prinde sub capul sticlei, fixnd instalaia. Exist capete adaptate pentru fiecare tip de sticl. 2.2. Pentru sticlele prevzute cu dop Este format din dou pri (figura 2): partea superioar este identic cu aparatul precedent ; cu toate acestea, acul este mai lung. Acesta este format dintr-un tub lung gurit, cu un vrf la unul din capete, pentru a traversa dopul. Vrful este detaabil i cade n vin dup traversarea dopului partea inferioar este format dintr-o piuli i o baz care se aeaz pe dop. Aceasta este prevzut cu patru uruburi de strngere pentru meninerea ntregii instalaii pe dop.
Figura 2: Afrometru pentru dopuri
Figura 1: Afrometru pentru capsule
19.2.2010
RO
C 43/49
Observaii privind manometrele cu care sunt dotate cele dou tipuri de aparate: manometrele pot fi fie mecanice cu tub Burdon, fie digitale cu senzori piezoelectrici. n primul caz, tubul Burdon trebuie obligatoriu s fie din oel inoxidabil sunt gradate n pascali (Pa). Pentru vinurile spumante este mai practic s se utilizeze, ca unitate, 105 pascali (105 Pa) sau kilopascalul (kPa) se mpart n diferite clase. Clasa unui manometru este dat de precizia citirii, n raport cu o citire pe ntreaga scal, exprimat ca procentaj (de exemplu, un manometru de 1 000 kPa din clasa I nseamn o presiune maxim de 1 000 kPa i o citire n intervalul 10 kPa). Instrumentele din clasa I se recomand pentru msurtori de precizie. 3. METODA DE LUCRU Determinrile trebuie efectuate pe sticle a cror temperatur a fost stabilizat cel puin 24 de ore. Dup ce a fost strpuns capsula, dopul din plut sau din plastic, sticla trebuie agitat puternic, pn cnd presiunea este constant, n scopul efecturii citirii. 3.1. Cazul sticlelor nchise cu o capsul Se fixeaz gheara etrierului sub capul sticlei. Se strnge piulia pn ce aparatul este fixat ferm pe sticl. Apoi se nurubeaz partea superioar n piuli. Pentru a se evita eliminarea de gaz, strpungerea capsulei trebuie efectuat ct mai rapid posibil, pentru a pune n contact garnitura i sticla. Sticla trebuie apoi agitat puternic, pn la o presiune constant, n scopul efecturii citirii. 3.2. Cazul sticlelor prevzute cu dop Se poziioneaz vrful acului. Aparatul se aeaz n poziie pe dop. Se strng cele patru uruburi pe dop. Se nurubeaz partea superioar (acul traverseaz dopul). Vrful trebuie s cad n interiorul sticlei pentru a permite manometrului s transmit presiunea. Se efectueaz citirea dup agitarea sticlei pn la o presiune constant. Dup citire, se recupereaz vrful. 4. EXPRIMAREA REZULTATELOR Suprapresiunea la 20 C (Paph20) se exprim n pascali (Pa) sau n kilopascali (kPa). Ea trebuie s fie n concordan cu precizia manometrului (de exemplu: 6,3 105 Pa sau 630 kPa i nu 6,33 105 Pa sau 633 kPa pentru un manometru din clasa I, cu o scal complet de citire de 1 000 kPa). Dac temperatura la care se efectueaz msurtoarea este diferit de 20 C, trebuie efectuat o corecie, prin nmulirea presiunii msurate cu coeficientul corespunztor (vezi tabelul 1). Tabelul 1 Raportul dintre suprapresiunea Paph20 ntr-un vin petiant sau spumant la 20 C i suprapresiunea Papht la temperatura t
C C
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1,85 1,80 1,74 1,68 1,64 1,59 1,54 1,50 1,45 1,40 1,36 1,32 1,28
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
1,24 1,20 1,16 1,13 1,09 1,06 1,03 1,00 0,97 0,95 0,93 0,91 0,88
C 43/50
RO
19.2.2010
5.
CONTROLUL REZULTATELOR Metoda de determinare direct a parametrilor fizici (metod criteriu de tip I) Verificarea afrometrelor Afrometrele trebuie verificate cu regularitate (cel puin o dat pe an). Verificarea se face cu ajutorul unei pompe de presiune pentru etalonare. Aceasta permite compararea mano metrului de testat cu un manometru de referin, de clas superioar, racordat la etaloanele naionale, montat n paralel. Controlul este utilizat pentru a confrunta valorile indicate de cele dou aparate pentru presiuni n cretere, apoi n descretere. n cazul n care apare o diferen ntre cele dou, un urub de reglaj permite efectuarea coreciilor necesare. Laboratoarele i organismele autorizate sunt toate dotate cu astfel de pompe de presiune pentru etalonare; acestea se pot obine i de la productorii de manometre.
19.2.2010
RO
C 43/51
20 DETERMINAREA LIZOZIMEI DIN VIN PRIN HPLC (OIV-AS-315-14) METOD TIP IV 1. INTRODUCERE Pentru lizozim, este de preferat s se utilizeze o metod analitic, care nu se bazeaz pe activitatea enzimatic. 2. DOMENIUL DE APLICARE Aceast metod permite cuantificarea lizozimei (mg de protein per litru) prezente n vinurile albe i roii, independent de activitatea enzimatic (care ar putea fi compromis de o descompunere parial sau de fenomene de complexare i de coprecipitare) a matricei. 3. DEFINIIE Cromatografia lichid de nalt performan (HPLC) ofer o abordare analitic bazat pe interaciunea de tip steric, polar sau de absorbie ntre faza staionar i analit i, n consecin, nu este legat de activitatea enzimatic real a proteinei. 4. PRINCIPIUL METODEI Analiza se efectueaz prin cromatografie lichid de nalt performan (HPLC), prin asocierea unui detector spectrofotometric cu un detector spectrofluorimetric. Coninutul necunoscut din proba de vin se calculeaz n funcie de suprafaa picului cromatografic, utiliznd metoda etalonrii externe. 5. 5.1. REACTIVI Solveni i soluii Acetonitril (CH3CN) pentru analiza HPLC Acid trifluoroacetic (TFA) pur Ap deionizat pentru analiza HPLC Soluie standard: acid tartric 1g/l, Alcool etilic 10% v/v cu pH-ul ajustat la 3,2 cu tartrat de potasiu neutru 5.2. Eluani A: CH3CN 1 %, TFA 0,2 %, H2O= 98,8 % B: CH3CN 70 %, TFA 0,2 %, H2O= 29,8 % 5.3. Soluii de referin De la 1 la 250 mg/l de lizozim standard dizolvat n soluia matrice prin agitare continu timp de minim 12 ore. 6. 6.1. 6.2. 6.3. 6.4. 6.5. 6.6. 7. MATERIAL Aparat HPLC prevzut cu sistem de pompare pentru efectuarea unui gradient de eluare Instalaie pentru coloana termostat (cuptor) Detector spectrofotometric asociat cu un detector spectrofluorimetric Bucl de injecie, 20 L Coloan polimer cu faz invers cu grupe funcionale fenil (diametrul porilor = 1 000 , limita de excludere = 1 000 000 Da), Tosoh Bioscience TSK-gel Phenyl 5PW RP 7,5 cm 4,6 mm ID, spre exemplu Precoloan din acelai material ca i coloana, Tosoh Bioscience TSK-gel Phenyl 5PW RP Guardgel 1,5 cm 3,2mm ID, spre exemplu PREPARAREA PROBEI Probele de vin se acidifiaz cu HCl (10 M) diluat 1:10 i, dup 5 minute, se filtreaz cu un filtru de poliamid ai crui pori au un diametru de 0,22 m. Analiza cromatografic se efectueaz imediat dup filtrare. 8. 8.1. 8.2. CONDIII DE LUCRU Debitul eluantului: 1 ml/min Temperatura coloanei: 30 C
C 43/52
RO
19.2.2010
8.3. 8.4. 8.5.
Detectarea prin spectrofotometrie: 280 nm Detectarea prin spectrofluorimetrie: ex = 276 nm; em = 345 nm; Ctig = 10 Programul gradientului de eluare
Timp (min) Sol A % Sol B % gradient
100
0 izocratic
100
0 liniar
10
65
35 izocratic
15
65
35 liniar
27
40,5
59,5 liniar
29
100 izocratic
34
100 liniar
36
100
0 izocratic
40 8.6. 9.
100
Timpul mediu de retenie a lizozimei: 25,50 minute CALCUL Soluiile de referin care conin urmtoarele concentraii de lizozim sunt analizate de trei ori: 1; 5; 10; 50; 100; 200; 250 mg/l. Pe fiecare cromatogram, suprafeele picului corespunztor lizozimei sunt reprezentate pe o diagram, n funcie de concentraiile lor respective, obinndu-se dreptele de regresie liniar exprimate cu ajutorul formulei Y = ax+b. Coeficientul de determinare r2 va trebui s fie > 0,999.
10.
CARACTERISTICILE METODEI n scopul evalurii aptitudinii metodei pentru obiectivul formulat, s-a realizat un studiu de validare, innd cont de linearitatea, limitele de detectare i de cuantificare i de precizia metodei. Acest ultim parametru a fost determinat prin definirea nivelului de precizie i de exactitate a metodei.
Reproductibi litatea (n=5) RSD % Std1
Plaja de linearitate (mg/l)
Panta dreptei
Coeficient de determinare (r2)
LD (mg/l)
LC (mg/l)
Repetabilitatea (n=5) RSD % Std1 V.R.2 V.A.3
UV FLD
5-250 1-250
3,786 52,037
0,9993 0,9990
1,86 0,18
6,20 0,59
4,67 2,61
5,54 2,37
0,62 0,68
1,93 2,30
Tabelul 1: Datele referitoare la caracteristicile metodei: Std1 soluie standard; V.R.2 vin rou; V.A.3 vin alb
19.2.2010
RO
C 43/53
10.1.
Linearitatea metodei Pe baza rezultatelor obinute n urma analizei de regresie liniar, metoda s-a dovedit liniar pentru plajele indicate n tabelul 1.
10.2.
Limita de detectare i de cuantificare Limita de detectare (LD) i limita de cuantificare (LC) au fost calculate ca un semnal echivalent cu de 3 ori, respectiv de 10 ori zgomotul de fond cromatografic n condiii de lucru pe o matrice real (tabelul 1).
10.3.
Precizia metodei Parametrii luai n considerare sunt repetabilitatea i reproductibilitatea. Tabelul 1 indic valorile acestor parametri (exprimate ca % de ecart standard ale unor msurtori repetate cu concentraii diferite) obinute pentru soluia standard, pentru vin alb i pentru vin rou.
10.4.
Exactitatea metodei Procentul de recuperare s-a calculat pe soluiile standard care conineau 5 i 50 mg de lizozim per litru, la care s-a adugat o cantitate dat de lizozim, astfel cum se indic n tabelul de mai jos.
[C] iniial nominal (mg/l) Completare (mg/l) [C] teoretic (mg/l) [C] gsit (mg/l) Ecart standard Recuperare %
UV 280 nm FD UV 280 nm FD
50 50 5 5
13,1 13,1 14,4 14,4
63,1 63,1 19,4 19,4
62,3 64,5 17,9 19,0
3,86 5,36 1,49 1,61
99 102 92,1 97,7
Fig.1 Cromatograma unui vin rou care conine lizozim pur (cantitatea de vin s-a completat cu o soluie standard coninnd 1 000 mg/l de lizozim, pentru a se obine o concentraie final de 125 mg/l de lizozim). A: detector UV la 280 nm; B: detector UV la 225 nm; C: detector FLD ( ex 276 nm; em 345 nm).
C 43/54
RO
19.2.2010
21 SULFAI (OIV- AS-321-05-SULFAT) METOD TIP II 1. 1.1. PRINCIPIUL METODELOR Metoda de referin Precipitarea i cntrirea sulfatului de bariu. Fosfatul de bariu precipitat n aceleai condiii este eliminat prin splarea precipitatului cu acid clorhidric. n cazul musturilor sau al vinurilor bogate n dioxid de sulf, se recomand desulfitarea prealabil prin fierbere ntr-un vas etan. 1.2. Metoda de testare rapid Vinurile sunt clasificate n mai multe categorii utiliznd aa-numita metod a limitelor, bazat pe precipitarea sulfatului de bariu utiliznd titrarea cu ioni de bariu. 2. 2.1. 2.1.1. 2.1.2. 2.2. 2.2.1. METODA DE REFERIN Reactivi Soluie de acid clorhidric 2 M. Soluie de clorur de bariu la 200 g/l BaCl2 2H2O. Metoda de lucru Metoda general Se introduc 40 ml de prob de analiz ntr-un tub de centrifugare de 50 ml ; se adaug 2 ml de acid clorhidric 2 M i 2 ml de soluie de clorur de bariu la 200 g/l. Se amestec utiliznd o baghet de sticl; se cltete bagheta cu puin ap distilat i se las s stea 5 minute. Se centrifugheaz timp de 5 minute, dup care se decanteaz cu atenie lichidul supernatant. Se spal apoi precipitatul de sulfat de bariu dup cum urmeaz: se adaug 10 ml de acid clorhidric 2 M, se pune precipitatul n suspensie i se centrifugheaz 5 minute, dup care se decanteaz cu atenie supernatantul. Se repet de dou ori procedeul de splare a precipitatului n aceleai condiii, utiliznd 15 ml de ap distilat de fiecare dat. Precipitatul se transfer cantitativ, prin splare cu ap distilat, ntr-o capsul tarat de platin i se pune deasupra unei bi de ap la 100 oC pn la evaporarea complet. Precipitatul uscat este calcinat scurt de mai multe ori deasupra unei flcri, pn cnd se obine un reziduu alb. Se las s se rceasc n exsicator i se cntrete. Se noteaz cu m masa, n miligrame, a sulfatului de bariu obinut. 2.2.2. Metoda special: must sulfitat i vin cu un coninut ridicat de dioxid de sulf n prima faz se elimin dioxidul de sulf. Se introduc 25 ml de ap i 1 ml de acid clorhidric pur (20 = 1,15 1,18 g/ml) ntr-un balon conic de 500 ml, echipat cu o plnie picurtoare i un tub de ieire. Soluia se fierbe pentru eliminarea aerului i se introduc 100 ml de vin prin plnia picurtoare. Se continu fierberea pn cnd volumul lichidului din balon a fost redus la aproximativ 75 ml i se transfer cantitativ, dup rcire, ntr-un balon cotat de 100 ml. Se completeaz cu ap pn la cot. Se determin sulfaii dintr-o prob de 40 ml n conformitate cu procedura de la punctul 2.2.1. 2.3. 2.3.1. Exprimarea rezultatelor Calcule Coninutul de sulfat, exprimat n miligrame pe litru de sulfat de potasiu K2SO4 reprezint: 18,67 m Coninutul de sulfat din must sau vin este exprimat n miligrame de sulfat de potasiu pe litru, fr zecimale. 2.3.2. Repetabilitatea pn la 1 000 mg/l: r = 27 mg/l circa 1 500 mg/l: r = 41 mg/l 2.3.3. Reproductibilitatea pn la 1 000 mg/l: R = 51 mg/l circa 1 500 mg/l: R = 81 mg/l
19.2.2010
RO
C 43/55
22 FIERUL (OIV - AS-322-05-FER) METOD TIP IV 1. PRINCIPIUL METODELOR METODA DE REFERIN Dup diluarea corespunztoare a vinului i eliminarea alcoolului, fierul este determinat direct prin spectrofo tometria de absorbie atomic. METODA OBINUIT Dup mineralizarea vinului cu perhidrol, fierul aflat sub form de Fe(III) se reduce la Fe(II) i este determinat prin coloraia roie produs de ortofenantrolin. 2. 2.1. 2.1.1. METODA DE REFERIN Reactivi Soluie standard concentrat de fier, coninnd 1 g de Fe(III) per litru. Se utilizeaz o soluie standard (1 g/l) din comer. Aceast soluie poate fi preparat dizolvnd 8,6341 g de sulfat de fier (III) i amoniu [FeNH4(SO4)2, 12H2O] n ap distilat, acidificat uor cu acid clorhidric 1 M, i completnd pn la un litru. 2.1.2. 2.2. 2.2.1. 2.2.2. 2.2.3. 2.3. 2.3.1. Soluie standard diluat, coninnd 100 mg de fier per litru. Aparatura Evaporator rotativ, cu baie de ap controlat termostatic. Spectrofotometru de absorbie atomic, echipat cu un arztor aer-acetilen. Lamp catodic pentru fier. Metoda de lucru Pregtirea probei Se elimin alcoolul din vin prin reducerea volumului probei la jumtate din volumul original utiliznd un evaporator rotativ (50-60 C). Se completeaz pn la volumul original cu ap distilat. Dac este cazul, se dilueaz nainte de determinare. 2.3.2. Calibrarea n cinci baloane cotate de 100 ml, se pun 1, 2, 3, 4 i 5 ml de soluie coninnd 100 mg de fier per litru (punctul 2.1.2) i se completeaz pn la 100 ml cu ap distilat. Soluiile astfel preparate conin 1, 2, 3, 4 i 5 mg de fier per litru. Soluiile trebuie pstrate n flacoane de polietilen. 2.3.3. Determinarea Se regleaz lungimea de und la 248,3 nm. Se regleaz absorbia la zero utiliznd ap distilat. Se aspir proba diluat direct n arztorul spectrofotometrului, urmat succesiv de cele cinci soluii standard pregtite conform indicaiilor de la punctul 2.3.2. Se citesc valorile absorbiei. Se repet fiecare msurtoare. 2.4. 2.4.1. Exprimarea rezultatelor Metoda de calcul Se traseaz un grafic al variaiei absorbiei n funcie de concentraia de fier n soluiile standard. Se reprezint pe acest grafic valoarea medie a absorbiei obinut pentru proba de vin diluat i se determin concentraia de fier C. Concentraia de fier, exprimat n mg per litru de vin, cu o cifr zecimal, este: C F F = factorul de diluare.
C 43/56
RO
19.2.2010
23 CUPRUL (OIV AS 322-06) METOD TIP IV 1. PRINCIPIUL METODEI Metoda se bazeaz pe utilizarea spectrofotometriei de absorbie atomic. 2. 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 3. 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. APARATURA Capsul de platin. Spectrofotometru de absorbie atomic. Lamp catodic pentru cupru. Surse de gaz: aer-acetilen sau oxid nitros/acetilen. REACTIVI Cupru metalic. Acid nitric, concentraie 65 % (HNO3, 20 = 1,38 g/ml). Acid nitric diluat 1:2 (v/v). Soluie coninnd cupru 1 g/l Se utilizeaz o soluie standard de cupru 1 g/l, din comer. Aceast soluie poate fi preparat prin cntrirea a 1 000 g de cupru metalic i transferarea, fr pierderi, ntr-un balon cotat de 1 000 ml. Se adaug acid nitric diluat 1:2 (punctul 3.3), n cantitate suficient pentru dizolvarea metalului, se adaug, de asemenea, 10 ml de acid nitric concentrat (punctul 3.2) i se completeaz pn la cot cu ap bidistilat. 3.5. Soluie coninnd cupru 100 mg/l Se introduc 10 ml de soluie, preparat corespunztor punctului 3.4, ntr-un balon cotat de 100 ml i se completeaz pn la cot cu ap bidistilat. 4. 4.1. METODA DE LUCRU Prepararea probei i determinarea cuprului Se iau 20 ml din prob, se introduc ntr-un balon cotat de 100 ml i se completeaz pn la cot cu ap bidistilat. Dac este necesar, se modific diluia. Pe spectrofotometrul de absorbie atomic, se msoar absorbia probei diluate la lungimea de und de 324,8 nm, dup ce s-a reglat valoarea zero cu ap distilat. Dac este necesar, se prepar o soluie diluat cores punztor cu ap bidistilat. 4.2. Calibrarea Se pipeteaz 0,5, 1 i 2 ml de soluie (punctul 3.5) (100 mg de cupru per litru) ntr-un balon cotat de 100 ml i se completeaz volumul cu ap bidistilat; soluiile astfel obinute conin 0,5, 1 i 2 mg de cupru per litru. Avnd valorile absorbiilor acestor soluii, msurate conform indicaiilor de la punctul 4.1., se traseaz curba de calibrare. 5. EXPRIMAREA REZULTATELOR Utiliznd absorbia msurat a probei de vin diluat, se citete concentraia C, n mg/l, de pe curba de calibrare. Dac F este factorul de diluare, concentraia cuprului din vin, n miligrame per litru, este dat de: F C. Se noteaz cu dou zecimale. Note: a) Pentru stabilirea curbei de calibrare i a diluiilor probei, se aleg soluiile corespunztoare sensibilitii aparatului utilizat i concentraiei cuprului prezent n prob.
19.2.2010
RO
C 43/57
b) Cnd se prevd concentraii de cupru foarte sczute n proba analizat, se procedeaz dup cum urmeaz. Se pun 100 ml de prob ntr-un vas de platin i se evaporeaz ntr-o baie de ap la 100 C pn cnd devine siropoas. Se adaug 2,5 ml de acid nitric concentrat (punctul 3.2), pictur cu pictur, pn cnd se acoper complet fundul vasului. Se arde cu grij reziduul pe un reou electric sau la o flacr sczut ; apoi vasul se pune ntr-un cuptor izolat, setat la 500 C 25 C i se ateapt aproximativ o or. Dup rcire, se amestec cenua cu 1 ml de acid nitric concentrat (punctul 3.2), zdrobind-o cu o baghet de sticl; se las s se evaporeze amestecul i se arde din nou, ca i mai nainte. Se pune din nou vasul n cuptor timp de 15 minute ; se repet tratamentul cu acid nitric concentrat cel puin de trei ori. Se dizolv cenua prin adugarea n vas a unui mililitru de acid nitric concentrat (punctul 3.2) i a 2 ml de ap bidistilat i se transfer ntr-un balon cotat de 10 ml. Se spal vasul de trei ori, utiliznd de fiecare dat 2 ml de ap bidistilat i se completeaz volumul cu ap bidistilat. Se face determinarea conform indicaiilor de la punctul 4.1. utiliznd cei 10 ml de soluie. n exprimarea rezultatelor, se ine cont de factorul de concen traie.
C 43/58
RO
19.2.2010
24 DIOXIDUL DE SULF (OIV - AS-323-04-DIOSU) METODA TIP II 1. DEFINIII Se numete dioxid de sulf liber, dioxidul de sulf prezent n must sau n vin, n formele urmtoare: H2SO3, H SO3 al cror echilibru este n funcie de pH i de temperatur: H2SO3 H+ + HSO3 H2SO3 reprezint dioxidul de sulf molecular. Dioxidul de sulf total este definit ca totalul diferitelor forme de dioxid de sulf prezente n vin, fie n stare liber, fie combinat cu constituenii si. 2. 2.1. 2.1.1. 2.1.1.1. DIOXIDUL DE SULF LIBER I TOTAL Principiul metodelor Metoda de referin Pentru vinuri i musturi Dioxidul de sulf este transportat de un curent de aer sau de azot ; este fixat i oxidat fiind trecut printr-o soluie diluat i neutr de ap oxigenat. Acidul sulfuric format este determinat prin titrarea cu o soluie standard de hidroxid de sodiu. Dioxidul de sulf liber se extrage din vin prin antrenare la temperatur sczut (10 C). Dioxidul de sulf total se extrage din vin prin antrenare la temperatur ridicat (aproximativ 100 C). 2.1.1.2. Pentru mustul concentrat rectificat Dioxidul de sulf total se extrage din mustul concentrat rectificat diluat nainte prin antrenare la temperatur ridicat (aproximativ 100 C). 2.1.2. Metod rapid de determinare (pentru vinuri i musturi) Dioxidul de sulf liber este determinat prin titrare iodometric direct. Dioxidul de sulf combinat este determinat prin titrare iodometric dup hidroliz alcalin. Dac este adugat dioxidului de sulf liber, se obine dioxidul de sulf total. 2.2. 2.2.1. 2.2.1.1. Metoda de referin Aparatura Aparatele utilizate trebuie s fie conforme cu diagrama prezentat mai jos, n special n ceea ce privete condensatorul.
Figura 1 Dimensiunile sunt date n milimetri. Diametrele interioare ale celor patru tuburi concentrice care formeaz condensatorul sunt: 45, 34, 27 i 10 mm
19.2.2010
RO
C 43/59
Tubul de alimentare cu gaz care ajunge n balonul B se termin ntr-o mic sfer cu diametrul de 1 cm cu 20 de orificii cu diametrul de 0,2 mm pe circumferina orizontal cea mai mare. Alternativ, acest tub se poate termina ntr-o plac de sticl sinterizat care produce un numr mare de bule foarte mici, care asigur contactul dintre faza gazoas i cea lichid. Curentul de gaz care traverseaz aparatele trebuie s fie de aproximativ 40 de litri pe or. Sticla din dreapta diagramei are rolul de a limita la 20-30 cm reducerea presiunii produs de pompa de ap. Pentru reglarea vidului la valoarea corect, trebuie instalat un debitmetru, cu un tub semicapilar, ntre barbotor i sticl. 2.2.1.2. 2.2.2. 2.2.2.1. 2.2.2.2. 2.2.2.3. Microbiuret. Reactivi Acid fosforic 85 % (H3PO4) (20 = 1,71 g/ml). Soluie de ap oxigenat, 9,1 g d'H2O2/l (3 volume). Reactivul indicator: rou de metil ................................................................................................ .................................................................... 100 mg albastru de metilen ............................................................................ ............................................................................. 50 mg alcool, 50 % vol. ................................................................................................ ............................................................. 100 ml 2.2.2.4. 2.2.3. 2.2.3.1. Soluie de hidroxid de sodiu (NaOH), 0,01 M. Determinarea dioxidului de sulf liber Metoda de lucru Vinul se pstreaz ntr-o sticl plin i nchis cu dop, la 20 C, timp de dou zile naintea determinrii. Se pun 2-3 ml de soluie de ap oxigenat (punctul 2.2.2.2) i dou picturi din reactivul indicator n balonul B i se neutralizeaz soluia de ap oxigenat cu soluie de hidroxid de sodiu 0,01 M (punctul 2.2.2.4). Se conecteaz balonul la aparate. Se introduc 50 ml din prob i 15 ml de acid fosforic (punctul 2.2.2.1) n balonul A de 250 ml al aparatului de antrenare. Se conecteaz balonul la aparate. Bulele de aer (sau azot) traverseaz aparatele timp de 15 minute. Dioxidul de sulf liber transportat este oxidat la acid sulfuric. Se ndeprteaz balonul de aparat i se titreaz acidul care s-a format cu soluie de hidroxid de sodiu 0,01 M (punctul 2.2.2.4). Se noteaz cu n ml volumul utilizat. 2.2.3.2. Exprimarea rezultatelor Dioxidul de sulf liber este exprimat n miligrame pe litru (mg/l), rotunjit la cel mai apropiat numr ntreg. 2.2.3.2.1. Calculare Dioxidul de sulf liber, n miligrame pe litru, este 6,4 n. 2.2.4. 2.2.4.1 Determinarea dioxidului de sulf total Metoda de lucru
2.2.4.1.1. Pentru mustul concentrat rectificat, se folosete soluia obinut prin diluarea probei de analizat la 40 % (m/v), conform indicaiilor din capitolul Aciditatea total, punctul 5.1.2. Se introduc 50 ml din aceast soluie i 5 ml de acid fosforic (punctul 2.2.2.1) n balonul A de 250 ml al aparatului de antrenare. Se conecteaz balonul la aparat. 2.2.4.1.2. Pentru vinuri i musturi n cazul n care concentraia estimat n prob nu depete 50 mg de SO2 total per litru, se pun 50 ml din prob i 15 ml de acid fosforic (punctul 2.2.2.1) n balonul A de 250 ml al aparatului de antrenare. Se conecteaz balonul la aparat. n cazul n care concentraia estimat n prob depete 50 mg de SO2 total per litru, se pun 20 ml din prob i 5 ml de acid fosforic (punctul 2.2.2.1) n balonul A de 100 ml al aparatului de antrenare. Se conecteaz balonul la aparat.
C 43/60
RO
19.2.2010
Se pun 2-3 ml de soluie de ap oxigenat (punctul 2.2.2.2) n barbotorul B, se neutralizeaz cum s-a artat mai sus i se aduce vinul din balonul A la fierbere utiliznd o flacr mic de 4-5 cm nlime, care trebuie s ating direct fundul balonului. Nu se pune balonul pe o plac de metal, ci pe un disc cu o deschiztur de 30 mm diametru. Acest lucru este necesar pentru a evita supranclzirea substanelor extrase din vin care sunt depozitate pe pereii balonului. Se menine la fierbere n timp ce trece un curent de aer (sau azot). n 15 minute, dioxidul de sulf total a fost antrenat i oxidat. Se determin acidul sulfuric format prin titrarea cu soluie de hidroxid de sodiu 0,01 M (punctul 2.2.2.4). Se noteaz cu n ml volumul utilizat. 2.2.4.2. Exprimarea rezultatelor Dioxidul de sulf total este exprimat n miligrame pe litru (mg/l), respectiv n miligrame pe kilogram (mg/kg) din zaharurile totale, rotunjit la cel mai apropiat numr ntreg. 2.2.4.2.1. Calculare Pentru vinuri i musturi Dioxidul de sulf total n miligrame per litru. Probe cu coninut sczut de dioxid de sulf (50 ml de prob testat): 6,4 n Alte probe (20 ml de prob testat): 16 n Pentru mustul concentrat rectificat Dioxidul de sulf n miligrame per kilogram din zaharurile totale (50 ml de prob testat preparat) (punctul 2.2.4.1.1): (1,600 n)/(P) P = procentajul concentraiei (m/m) a zaharurilor totale 2.2.3.4.2. Repetabilitatea (r) Concentraie < 50 mg/l (50 ml de prob testat), r = 1 mg/l Concentraie > 50 mg/l (20 ml de prob testat), r = 6 mg/l 2.2.3.4.3. Reproductibilitatea (R) Concentraie < 50 mg/l (50 ml de prob testat), R = 9 mg/l Concentraie > 50 mg/l (20 ml de prob testat), R = 15 mg/l

Comisia Europeană: (Comunicări)

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Comisia Europeană: (Comunicări)

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

19.2.

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

COMUNICRI PROVENIND DE LA INSTITUIILE, ORGANELE I ORGANISMELE UNIUNII EUROPENE

LISTA METODELOR DE ANALIZ

AS-2-01-MASVOL AS-2-02-SUCREF AS-2-03-EXTSEC al apei din vin AS-2-09-MOUO18

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

Metoda din Culegerea OIV

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

METODA DE REFERIN Aparatura Echipament de laborator normal, n special:

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

2,50 ml 0,10 ml 0,10 ml

2,50 ml 0,10 ml 0,10 ml 0,20 ml

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

IAEA-CH-6 IAEA-CH-7 NBS22 USGS24

zaharoz polietilen ulei grafit

10,4 31,8 29,7 16,1

CRM/BCR 656 CRM/BCR 657 CRM/BCR 660

alcool din vin glucoz soluie 12 %) hidroalcoolic (TAV

26,93 10,75 26,72

O prob de lucru standard, cu un raport internaionale.

cunoscut, etalonat fa de materialele de referin

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

ale probei, respectiv ale dioxidului de carbon utilizat ca gaz

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

Alcool provenit din vin

Alcool din sfecl de zahr

Alcool din trestie de zahr

A & G B & C D & F E & I H & K J& L

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

38 25,32 0,0064 0,08 0,22 0,0389

36 26,75 0,0077 0,09 0,25 0,0309 0,18

34 27,79 0,0031 0,06 0,16 0,0382 0,20

38 25,26 0,0127 0,11 0,32 0,0459 0,21

38 26,63 0,0069 0,08 0,23 0,0316 0,18

38 12,54 0,0041 0,06 0,18 0,0584 0,24

Limita de reproductibilitate R (2,8 SR)

7 7 26,20 0,0525 0,23 0,64

7 7 26,20 0,0740 0,27 0,76

8 8 25,08 0,0962 0,31 0,87

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

N: numr de laboratoare participante.

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

4.4. 5. 5.1. 5.1.1.

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene

Jurnalul Oficial al Uniunii Europene