Disciplina de Microbiologie UMF Tg.

Mure LP4

Diagnosticul hepatitelor virale

- Hepatita viral A Produs patologic snge, saliv - pentru evidenierea anticorpilor materiile fecale, biopsie din ficat pentru evidenierea virusului

Examen direct nu se practic de rutin evidenierea virusului din materii fecale prin ME evidenierea antigenelor virale din biopsie hepatic prin reacii imunohistochimice din materii fecale prin reacii antigen-anticorp - greu evideniabile la nceputul bolii Izolare nu se practic de rutin dei virusul poate crete pe linii celulare, nu produce efect citopatic

Diagnostic serologic Dinamica apariiei anticorpilor: o IgM: apar odat cu primele simptome de boal ajung la titru maxim n 1-3 sptmni, dispar n 3-6 luni o IgG: apar dup aproximativ o lun de la infecie, ajung la titru maxim n 3-6 luni, apoi persist la un nivel detectabil toat viaa o anticorpii se detecteaz prin ELISA

-1-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP4

- Hepatita viral B Produs patologic snge pentru detectarea markerilor virali (antigene i anticorpi) esut hepatic detectarea antigenelor virale virusul se mai elimin prin secreii genitale, saliv. Izolare virusul nu este cultivabil Diagnostic Markeri virali detectabili din snge prin ELISA: o Ag HBs, Ac anti HBs o Ag HBe, Ac anti HBe o Ag HBx, Ac anti HBx (cercetare) o Ac anti HBc o din snge se mai poate evidenia ADN-ul viral prin PCR, polimeraza (cercetare). Markeri virali detectabili din biopsie hepatic prin imunohistochimie o Ag HBs o Ag HBc o AgHBx (markerul cronicizrii i al malignizrii - cercetare) o ADN viral Dinamica apariiei markerilor virali n snge: 1. AgHBs: se evideniaz primul, apare n perioada de incubaie (la 1-2 sptmni de la infecie), scade n convalescen; dispare odat cu apariia anticorpilor antiHBs; detectarea lui dup 6 luni de la infecie semnific cronicizare. 2. AgHBe: se evideniaz nc din perioada de incubaie, imediat dup apariia AgHBs; dispare n convalescen odat cu apariia anticorpilor antiHBe; detectarea lui indic infectivitatea persoanei. -2-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP4

3. Anticorpi antiHBc primii anticorpi produi, apar odat cu simptomele bolii i persist mai muli ani; se determin IgM sau Ig totale (IgG+IgM); detectarea IgM indic replicare viral.

4. Anticorpi antiHBe apar dup anticorpii antiHBc

5. Anticorpi antiHBs apar la cteva luni sau ani de la infecie, dup anticorpi antiHBe; detectarea lor indic instalarea imunitii.

Ac anti HBc (IgG) AgHBs AgHBe Ac anti HBs

Ac anti HBe

Ac anti HBc (IgM) 2-3 spt 3-6 luni > 20 ani

Profiluri serologice posibile n hepatita viral B Prezena AgHBs = infectivitate o AgHBs + IgM antiHBc = hepatit acut o AgHBs + Ig totale antiHBc (> 6 luni) = infecie persistent o AgHBs + Ig totale antiHBc + AgHBe (> 6 luni) = hepatit cronic Prezena Ac anti HBs = vindecare o Ac anti HBs + IgM anti HBc (titru crescut) = infecie recent, vindecat o Ac anti HBs + Ig totale antiHBc (titru sczut) = infecie n antecedente, vindecat o Ac anti HBs (fr ali markeri) = imunitate postvaccinal Persistena AgHBs dup 6 luni = infecie persistent -3-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP4

- Hepatita viral C Produs patologic snge esut hepatic

Examen direct evidenierea acidului nucleic din snge (viremie) sau din ficat prin PCR.

Izolarea nu se practic Diagnostic serologic detectarea anticorpilor anti VHC prin ELISA, metode radioimune, folosind antigene recombinate detectarea imunoglobulinelor prin metode Western-blot

- Hepatita viral D Produs patologic snge esut hepatic

Virusul hepatitei D este un virus defectiv, infecia apare doar n prezena virusului hepatitei B. Examen direct evidenierea virusului n nucleul hepatocitelor prin ME, metode imunohistochimice; evidenierea ARN-ului viral din snge, dup tratarea serului cu detergeni pentru a ndeprta AgHBs care nvelete virusul. Diagnostic serologic evidenierea anticorpilor anti VHD prin ELISA.

-4-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP4

- Hepatita viral E Virusul hepatitei E se transmite enteral, determinnd forme uoare de boal, cu excepia femeilor gravide la care boala poate avea o evoluie letal. Boala evolueaz epidemic n Asia, n nord-vestul Africii i n Mexic. Foarte rar apare n SUA. Nu s-au descris cazuri la noi n ar. Nu se fabric reactivi comerciali pentru diagnosticul de laborator de rutin. n scop tiinific: o se evideniaz antigenele virale din celula hepatic prin IME; o se evideniaz ARN-ul viral prin PCR; o se evideniaz anticorpii anti VHE.

-5-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP4

Diagnosticul de laborator n infecia HIV

Produs patologic
Snge (pentru examen direct i serologie) o ser o plasm pe EDTA o snge integral Virusul se poate identifica n secreii genitale, saliv, urin, LCR, lapte de mam. Anticorpii se mai gsesc n laptele de mam i n saliv.

n cursul diagnosticului infeciei cu HIV se evideniaz: Antigene virale ARN viral, ADN proviral Anticorpi: Ac. anti core, Ac. antienvelope

Dinamica producerii markerilor virali

Antigenul p24 se gsete n serul persoanei infectate detectabil n infeciile recente, nainte de apariia anticorpilor dispar dup apariia anticorpilor anti p24 reapar n stadiile tardive de boal (SIDA), semnificnd replicare viral intens i un prognostic grav Anticorpii anti p24 apar la 3-12 sptmni de la infecie. Perioada de la infecie pn la apariia lor se numete fereastr imunologic. Anticorpii anti gp120 nu au rol protector sunt folosii ca marker de diagnostic

-6-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP4

Infecie HIV SIDA Fereastr imunologic

ARN-HIV

Ac anti GP120 Ac anti P24

P24

P24

Luni Dinamica producerii markerilor virali

Ani

Diagnostic
Protocolul standard de diagnostic: se evideniaz anticorpii prin metoda ELISA ELISA reprezint prima etap de diagnostic a infeciei HIV (screening), avnd sensibilitate de aproape 100% o generaia I: se folosete lizatul total viral de pe culturi de limfocite (whole virus) o generaia II: se folosesc antigene clonale o generaia III: se folosesc antigene recombinate o generaia IV: metode combinate care testeaz simultan prezena anticorpilor anti HIV i a antigenului P24 metodele de generaie III i IV au sensibilitate i specificitate ridicat este posibil apariia rezultatelor false: o fals negative (fereastra imunologic, diferite tipuri virale (HIV-1, HIV-2) i subtipuri (HIV-1-N, HIV-1-O, HIV-1-M)) o fals pozitive (probe de snge alterate, incorect etichetate sau schimbate, greeli de laborator, contaminarea probelor) rezultatul pozitiv al testrii ELISA se raporteaz ca ser reactiv, i NU confirm diagnosticul pozitiv de infecie HIV -7-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP4

n cazul pozitivrii se face o retestare prin printr-o metod cel puin la fel de sensibil din aceeai prob de snge (determinare ELISA la centre de referin)

dup retestare, probele reactive trebuie confirmate prin metoda Western-blot o se detecteaz proteine specifice virale: glicoproteine de nveli (env): gp41, gp120, gp160 proteine nucleare (gag): p18, p24/25, p55 endonucleaze-polimeraze( pol): p34, p40, p52, p68

o se consider pozitive probele care prezint: 2 benzi pentru antigene din grupul env (dup World Health Organization WHO) 1 band (glicoprotein) + 1 band (alt protein specific HIV) (dup Deutsches Institut fr Normung - DIN) benzi pentru P24, p34, gp41, gp120/160 (dup Food and Drug Administration) Interpretarea Western-blot Proba 1: Proba 2: HIV+ (control pozitiv) HIV- (control negativ)

Proba A: Pacient A Proba B: Pacient B Proba C: Pacient C * pacientul C prezint un pattern sugestiv pentru infecie HIV * pacientul B rezultat intermediar dup WHO, dar pozitiv dup DIN

Teste rapide de diagnostic (point-of-care, bedside tests) Se bazeaz pe 4 principii: aglutinare, immunodot, immunofiltration sau immune chromatography Se poate efectua din snge capilar/venos Rezultatele se obin n 15-30 min. Ex: OraQuick, Reveal, Uni-Gold Recombigen au specificitate i sensibilitate nalt -8-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP4

Diagnostic direct nu se face de rutin detectarea AN virali: ADN proviral din limfocite sau ARN viral Reprezint marker de infecie Se folosete n situaii speciale: o Calitativ: suspiciune de infecie primar, cnd Ac lipsesc (fereastra imunologic); nou nscut din mam infectat cu serologie pozitiv (Ac materni) o Cantitativ (ncrctura viral): marker de prognostic; monitorizarea tratamentului. NU se folosete ca metod de diagnostic PCR (polymerase chain reaction), b-DNA (branched DNA), NASBA (nucleic acid sequence-based amplification), LCR (ligase chain reaction) Izolarea virusului rezervat pentru cazuri speciale, se face n laboratoare specializate pe culturi de limfocite umane stimulate cu fitohemaglutinin, n prezena interleukinelor efect citopatogen n 2-3 sptmni

-9-

Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mure LP4

Protocol de diagnostic i management al infeciei HIV

Screening (ELISA generaia 3 sau 4)

Ser nereactiv

Ser reactiv

Expunere recent Semne i simptome sugestive pentru HIV

Retestare prin metode de screening sau printr-o metod cel puin la fel de sensibil din aceeai prob de snge

Repetarea probei peste 7-10 zile (Ag, Ac din ser i PCR din snge pe EDTA)

Reactiv

Nereactiv

Fr expunere recent Fr semne i simptome sugestive pentru HIV

Trimiterea probei pentru confirmare

Eroare de lucru

Infecie absent

Urmrire prin recoltare de noi probe ct mai rapid

Calibrarea aparatelor i reevaluarea modalitilor de lucru

Urmrire periodic la persoanele cu risc

-10-