UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERINAR CLUJ-NAPOCA COALA DOCTORAL FACULTATEA DE ZOOTEHNIE I BIOTEHNOLOGII

Ing. TEODORA EMILIA RUSU (COLDEA)

TEZ DE DOCTORAT

STUDIUL COMPARATIV AL BIOMARKERILOR DE CALITATE, SIGURAN I AUTENTICITATE PENTRU BUTURI DISTILATE TRADIIONALE ROMNETI

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

CONDUCTOR TIINIFIC Prof. univ. dr. CARMEN SOCACIU

CLUJ-NAPOCA

2011

CUPRINS
CUPRINS .................................................................................................................................... II INTRODUCERE: SCOP I OBIECTIVE ................................................................................ IV CERCETRI PROPRII ........................................................................................................... VII I. METODE DE OBINERE I DETERMINARE A PARAMETRILOR DE CALITATE LA TREI SORTIMENTE DE BUTURI DISTILATE TRADIIONALE ................................ VIII I.1. Colectarea i selecia probelor pe sortimente, date privind modul de obinere........... VIII I.2. Determinarea parametrilor de calitate ........................................................................... IX II. DETERMINAREA PARAMETRILOR CE CARACTERIZEAZ SIGURANA A TREI SORTIMENTE DE BUTURI DISTILATE TRADIIONALE .......................................... XIII II.1. Materiale i metode utilizate........................................................................................ XIII II.2. Rezultate i discuii ...................................................................................................... XIV II.3. Concluzii .....................................................................................................................XVII III. COMPUI FENOLICI CA BIOMARKERI DE AUTENTICITATE AI DISTILATELOR DIN FRUCTE: AMPRENTA SPECTROMETRIC UV-VIS ........................................... XVIII III.1. Materiale i metode ................................................................................................. XVIII III.2. Rezultate i discuii ................................................................................................. XVIII III.3. Concluzii ..................................................................................................................... XX IV. ANALIZA COMPUILOR FENOLICI DIN BUTURI DISTILATE PRIN CROMATOGRAFIE LICHID DE NALT PERFORMAN (HPLC) .......................... XXI IV.1. Materiale i metode .................................................................................................... XXI IV.2. Rezultate i discuii .................................................................................................... XXI IV.3. Concluzii ................................................................................................................. XXIII V. COMPUII VOLATILI MINORI DIN DISTILATELE DE FRUCTE DETERMINAI PRIN ANALIZA GAZ-CROMATOGRAFIC CUPLAT CU SPECTROMETRIE DE MAS (GC-MS).................................................................................................................. XXIV V.1. Materiale i metode .................................................................................................. XXIV V.2. Rezultate i discuii .................................................................................................. XXIV V.3. Concluzii ................................................................................................................... XXX VI. ANALIZA SPECTROMETRIC N INFRAROU (FTIR) CA METOD DE VERIFICARE A AUTENTICITII ................................................................................ XXXII VI.1. Materiale i metode ................................................................................................ XXXII
II

VI.2. Rezultate i discuii ................................................................................................ XXXII VI.3. Concluzii ...................................................................................................................... XL CONCLUZII GENERALE .................................................................................................... XLII BIBLIOGRAFIE SELECTIV ........................................................................................... XLIV

III

INTRODUCERE: SCOP I OBIECTIVE

Cerinele exigente ale consumatorilor din ultimii ani i dorina productorilor autohtoni de a exporta ct mai mult n rile din Uniunea European, odat cu integrarea Romniei din anul 2007, fac ca probleme legate de calitatea, sigurana i autenticitatea buturilor alcoolice s i preocupe tot mai mult pe productorii romni. Noi metode de verificare a produselor se implementeaz n fiecare an, autoritile utiliznd aceste metode pentru a identifica eventualii falsificatori din domeniul producerii buturilor alcoolice. Analize precum analiza RMN-ul aplicat n cazul verificrii autenticitii vinurilor, metode gaz-cromatografice de verificare a calitii i siguranei buturilor alcoolice, utilizate pn acum civa ani doar n scopul cercetrii, fr a fi aplicate de ctre productori sau autoriti contribuie la verificarea calitii i siguranei vinurilor i a buturilor alcoolice. Astfel, verificarea calitii i siguranei acestor tipuri de buturi distilate, ct i verificarea autenticitii lor, prin diferenierea ntre sortimente i depistarea anumitor metode de adulterare (prin adugarea de alcool provenit din alte surse dect din distilarea fructelor, adugarea de distilat de fructe cu valoare economic mai sczut, comercializarea unui distilat mai puin valoros sub denumirea unuia cu o valoare i o calitate mai ridicat) reprezint probleme eseniale, de interes actual. Scopul acestei teze de doctorat a fost evaluarea parametrilor de calitate i siguran prin aplicarea unor metode uzuale de analiz i stabilirea unor metode de verificare a autenticitii a trei tipuri diferite de distilate din fructe (uic, plinc de mere i plinc de pere).

Principalele obiective au fost: 1. Determinarea parametrilor de calitate a celor trei sortimente de buturi distilate tradiionale din fructe (concentraie alcoolic, densitate relativ - prin densimetrie electronic, pH, aciditate total, extract sec total prin metode fizico-chimice uzuale). 2. Determinarea parametrilor ce caracterizeaz sigurana acestor categorii de buturi (utilizarea analizei gaz-cromatografice cuplate cu detector cu captura de electroni pentru determinarea pesticidelor organoclorurate, aplicarea spectrometriei de absorbie atomic pentru determinarea coninutului n metale grele cupru i plumb, i a gaz-cromatografiei cuplate cu detector de ionizare n flacar n vederea determinrii compuilor volatili majori).

IV

3. Utilizarea spectrometriei UV-VIS n vederea stabilirii amprentei spectrometrice UV-VIS a compuilor fenolici ca markeri de autenticitate ai distilatelor din fructe. 4. Analiza compuilor fenolici prin cromatografie lichid de nalt performan (HPLC). 5. Analiza gaz-cromatografic cuplat cu detecie prin spectrometrie de mas n vederea determinrii compuilor volatili minori specifici fiecrui sortiment de distilat n parte. 6. Analiza spectrometric FTIR ca metod de verificare a autenticitii distilatelor din fructe. 7. Analiza chemometric pentru interpretarea rezultatelor obinute (Analiza Componentelor Principale PCA, Analiza Clusterilor - CA i Regresia de tip Partial Least Squares PLS).

Structura tezei: teza este compus din dou pri principale, denumite studiu bibliografic i cercetri proprii, incluznd materialele i metodele utilizate, rezultatele obinute i discuiile aferente fiecrui capitol n parte.

Prima parte include dou capitole (1-2): Capitolul 1 descrie buturile distilate tradiionale cu definirea, nomenclatura, legislaia aplicat n domeniu i modul lor de obinere Capitolul 2 sumarizeaz metodele de determinare a parametrilor de calitate i siguran din buturile distilate tradiionale

Partea a doua cuprinde ase capitole (3 - 8): Capitolul 3: Metodele de obinere a distilatelor de fructe analizate i determinarea parametrilor de calitate la trei sortimente de buturi distilate tradiionale (uic, plinc de mere i plinc de pere) Capitolul 4: Determinarea parametrilor ce caracterizeaz sigurana a trei sortimente de buturi distilate tradiionale Capitolul 5: Compuii fenolici ca markeri de autenticitate ai distilatelor din fructe: Amprenta spectrometric UV-VIS Capitolul 6: Analiza compuilor fenolici din buturi distilate prin cromatografie lichid de nalt performan (HPLC) Capitolul 7: Compuii volatili minori din distilatele de fructe determinai prin analiza gaz-cromatografic cuplat cu spectrometrie de mas (GC-MS)

Capitolul 8: Analiza spectrometric n infrarou (FTIR) ca metod de verificare a autenticitii Originalitatea tezei de doctorat: 1. Optimizarea unei metode de extracie utilizate n vederea analizei GC-ECD pentru determinarea pesticidelor organoclorurate din buturile alcoolice distilate. 2. Determinarea amprentei spectrometrice UV-VIS a compuilor fenolici ca markeri de autenticitate ai distilatelor din fructe din zona Transilvaniei. 3. Analiza gaz-cromatografic cuplat cu detecie prin spectrometrie de mas n vederea determinrii compuilor volatili minori specifici distilatelor de prune, mere i pere provenite din Transilvania. 4. Aplicarea analizei spectrometrice FTIR ca metod rapid i puin costisitoare de verificare a autenticitii distilatelor din fructe, cu posibiliti de nlocuire a unor metode gaz-cromatografice. 5. Analiza chemometric pentru interpretarea rezulatelor obinute (Analiza

Componentelor Principale - PCA i Regresia de tip Partial Least Squares - PLS).

VI

CERCETRI PROPRII

uica este o butur alcoolic tradiional obinut exclusiv prin fermentarea alcoolic i distilarea prunelor. uica are o concentraie alcoolic cuprins ntre 24 i 86% vol. alc. putnd fi clasificat astfel: uica curent (produs dintr-un amestec de marcuri de prune cu o concentraie alcoolic minim de 24% vol. alc.), uica cu denumire de origine (ex. uic de Piteti, Horezu, Vleni) cu o concentraie alcoolic de minim 28%, uica btrn (maturat n butoaie cel puin un an) cu 28-32% vol. alc., uica superioar (libovia, uic de Tur, uic de Zalu) avnd 4050% vol. alc. (dubla distilare a uicii i nvechirea n butoaie timp de civa ani. Plinca este butur alcoolic tradiional romneasc obinut exclusiv prin fermentarea i distilarea unui fruct sau a unui amestec de fructe, a unui marc de fructe sau a unui suc de fructe sau amestec de fructe. De regul aceste fructe sunt: mere, pere, caise, struguri sau resturi de struguri de la obinerea mustului. n cazul probelor cercetate, s-au obinut probe de plinc de mere i pere, distilarea s-a efectuat n rezervoare din cupru cu flacr deschis sau n instalaii de distilare, la o concentraie alcoolic de maxim 70% vol. alc., distilatul avnd mirosul i aroma fructului utilizat ca materie prim. Concentraia alcoolic minim este n medie de 40% vol. alc. Utilizarea caramelului pentru mbuntirea culorii produsului finit este interzis, culoarea galben sau galben-aurie putnd fi obinut prin maturarea n butoaie de lemn. Se interzice adugarea alcoolului etilic de origine agricol sau a oricrui alt distilat de origine agricol. Depozitarea i maturarea s-a realizat n recipieni din lemn, oel inoxidabil sau sticl.

VII

I. METODE DE OBINERE I DETERMINARE A PARAMETRILOR DE CALITATE LA TREI SORTIMENTE DE BUTURI DISTILATE TRADIIONALE

I.1. Colectarea i selecia probelor pe sortimente, date privind modul de obinere

n perioada octombrie 2008 - septembrie 2010 au fost achiziionate 26 de probe de buturi distilate naturale de fructe (din categoria uic, plinc de pere i plinc de mere) din diferite zone ale Transilvaniei. Probele s-au colectat din judeele Alba, Cluj, Bistria-Nsud, Maramure, Bihor, direct de la productori particulari (cazangii) pentru a avea o ct mai mare siguran cu privire la autenticitatea lor. Principiul de selectare al probelor a fost urmtorul: s-au luat cte 6 probe de uic din judeele Cluj, Bistria-Nsud i Maramure, cte 4 probe de plinc mere din judeele Alba, Cluj, Bistria-Nsud, Bihor i cte 4 probe plinc de pere din judeele Cluj, Maramure, Bistria-Nsud. Acestea au fost produse n perioada 2006-2010. Tabelul 1 include lista probelor analizate, codificarea, proveniena i anul produciei distilatelor. Tabelul 1/Table 1 Lista probelor: codificare, tipul distilatului, localizare, anul produciei The sample list: codification, type of distillate, location, production year
Tipul distilatului/ Type of distillate Anul produciei/ Production year 2009 2009 2009 2009 2008 2009 2009 2009 2009 2009 2009 2009 2009 2009 2009 2010

Codificare/ Codification P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15 P16

Proveniena (Jude / Localitate) Provenience(County/ Location) Cluj Cluj Bistria-Nsud Cluj Maramure Cluj Maramure Maramure Maramure Maramure Maramure Bistria-Nsud Bistria-Nsud Bistria-Nsud Bistria-Nsud Bistria-Nsud VIII Tioltiur Petreti Beclean Ciucea Seini Morlaca Slitea de Sus Vieu de Jos Vieu de Sus Moisei Leordina Nsud Rebrioara Salva Runc Feldru

uica

Codificare/ Codification P17 P18 M19 M20 M21 M22 PE23 PE24 PE25 PE26

Tipul distilatului/ Type of distillate

Proveniena (Jude / Localitate) Provenience(County/ Location) Cluj Cluj Bistria-Nsud Alba Cluj Bihor Cluj Maramure Bistria-Nsud Cluj Brlea Negreni Cobuc Ocoli Ccu Tulca Negreni ieti Runc2 Aiton

Anul produciei/ Production year 2007 2009 2010 2008 2009 2008 2009 2006 2009 2008

Plinc mere

Plinc pere

Fermentarea fructelor, mcinate n prealabil n moara cu ciocane cu sau fr eliminarea smburilor, s-a realizat n butoaie de lemn sau plastic pe o perioad de 2-3 luni, din august pn n octombrie sau chiar pn primvara, n spaii umbrite ferite de razele directe ale soarelui, la temperatur ambiant. La sfritul perioadei de fermentare, distilarea s-a efectuat n cazane din cupru, de obicei n numr de dou, pentru a se optimiza timpii de producie. Astfel, ntr-un cazan prevzut cu omogenizator cu palete acionat de un motor electric sau de manivel, s-a fiert borhotul cu o anumit cantitate de ap adugat n funcie de vscozitatea borhotului. Distilarea s-a efectuat n 2 etape. Astfel, n prima etap s-a fiert borhotul. Ceea ce se colecteaz la nceputul primei etape de distilare se nltur din proces. Etapa se consider ncheiat atunci cnd distilatul colectat ajunge la concentraie alcoolic redus, ct mai srac n alcool etilic (verificat prin arderea distilatului colectat sau cu termoalcoolmetrul). La sfritul acestei etape, borhotul epuizat de alcool, se nltur i el. n etapa a doua, distilatul colectat anterior (vodca) s-a fiert din nou n cel de al doilea cazan. Primul litru de distilat rezultat n aceast etap s-a eliminat (fraciunea fruni), avnd gust arztor i fiind toxic. Concentraia alcoolic a distilatului s-a ajustat cu ap dedurizat sau cu ap de izvor. Distilatul produs finit poate fi consumat fie imediat, fie pstrat n vederea maturrii pentru mbogirea calitilor lui. Depozitarea s-a efectuat pentru nvechire n butoaie din lemn, recipiente din plastic sau damigene din sticl.

I.2. Determinarea parametrilor de calitate

I.2.1. Materiale i metode utilizate
Pentru determinarea concentraiei alcoolice s-a utilizat metoda prin densimetrie electronic (bazat pe oscilaia frecvenei rezonante a unei probe ntr-o celul de oscilare).
IX

Analiza densimetric s-a fcut cu un densimetru electronic, model DDM 2911, cu afiaj digital, cu celul de msurare conectat la un regulator de temperatur ncorporat, fabricaie Rudolph Research Analytical, seria: 2045, domeniu de msur: 0-3 g/cm3. Aciditatea total a fost determinat prin titrare cu soluie de hidroxid de sodiu 0,1n, n prezena fenoftaleinei ca indicator. Pentru msurarea pH-ului probelor s-a utilizat un pH-metru digital cu afiarea rezultatului msurtorii pe ecran, iar extractul sec total a fost determinat prin evaporarea produsului la temperatura de fierbere a apei.

I.2.2. Rezultate i discuii

Valorile obinute pentru concentraia alcoolic i densitatea relativ din probele de uic, plinc de mere i plinc de pere sunt prezentate n tabelele 2, 3 i 4. Pentru aceste tipuri de buturi ali autori au determinat fie valori apropiate (n cazul aplicrii procedeului dublei distilri), fie valori mai sczute. Astfel c, TEEVI et al. (2005) a determinat prin GC-MS valori cuprinse ntre 38-45% v/v n distilatul de prune, GARCA LLOBODANIN LAURA et al. (2008) n sortimentul de distilat de pere din varietatea Blanquilla a determinat valori cuprinse ntre 26-31% v/v. O alt butur obinut prin distilarea fructelor, Drejna, originar din Peninsula Balcanic, a avut concentraii alcoolice cuprinse ntre 42-46%vol. (TEEVI et al., 2009). HERNNDEZ-GMEZ et al. (2005) a obinut prin GC-MS 58-69% v/v etanol n distilatul de pepene. Tabelul 2/Table 2 Valorile obinute pentru concentraia alcoolic i densitatea relativ la probele de uic (P1-P18) The values obtained for alcohol concentration and relative density in uica samples (P1-P18)
Codificare/ Codification P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 Localitate/ Location Tioltiur Petreti Beclean Ciucea Seini Morlaca Slitea de Sus Vieu de Jos Vieu de Sus Moisei Leordina Nsud Rebrioara Densitate relativ/ Relative density, g/cm3 0,93330 0,92916 0,93342 0,93395 0,92551 0,93061 0,93142 0,92406 0,93162 0,92089 0,92626 0,92514 0,91506 X Concentraie alcoolic/ Alcohol concentration, % vol. 48,37 50,50 48,31 48,03 52,32 49,76 49,34 53,03 49,24 54,56 51,95 52,50 57,29

Codificare/ Codification

Localitate/ Location

P14 Salva P15 Runc P16 Feldru P17 Brlea P18 Negreni Valori medii obinute/Mean values Limite admisibile/Admisible limits

Densitate relativ/ Relative density, g/cm3 0,91902 0,93815 0,92160 0,92859 0,92956 0,930,01 -

Concentraie alcoolic/ Alcohol concentration, % vol. 55,45 45,77 54,22 50,80 50,29 51,212,96 min. 24; max. 86

Tabelul 3/Table 3 Valorile obinute pentru concentraia alcoolic i densitatea relativ la probele de plinc de mere (M19-M22) The values obtained for alcohol concentration and relative density in Apple brandy samples (M19-M22)
Codificare/ Codification Localitate/ Location Densitate relativ/ Relative density, g/cm3 0,92976 0,92461 0,93411 0,93003 0,930,004 Concentraie alcoolic/ Alcohol concentration, % vol. 50,19 52,76 47,94 50,06 50,241,97 min. 40; max. 70

M19 Cobuc M20 Ocoli M21 Ccu M22 Tulca Valori medii obinute/Mean values Limite admisibile/Admisible limits

Tabelul 4/Table 4 Valorile obinute pentru concentraia alcoolic i densitatea relativ la probele de plinc de pere (PE23-PE26) The values obtained for alcohol concentration and relative density in pear plinca samples (PE23-PE26)
Codificare/ Codification Localitate/ Location Densitate relativ/ Relative density, g/cm3 0,9337 0,93974 0,93585 0,94784 0,940,01 Concentraie alcoolic/ Alcohol concentration, % vol. 48,16 44,89 47,02 40,12 45,053,55 min. 40; max. 70

PE23 Negreni PE24 ieti PE25 Runc2 PE26 Aiton Valori medii obinute/Mean values Limite admisibile/Admisible limits

Aciditatea total a nregistrat valori cuprinse ntre 0,04 i 0,35 g acid acetic/100 ml alc anh., pH-ul s-a ncadrat ntre valorile 3,7 5,4, iar extractul sec total a avut valori situate n jurul a 0,01 g/100 ml distilat.

XI

I.2.3. Concluzii
1. Valorile medii ale concentraiilor alcoolice au depsit 50% vol. alc. n timp ce plinca de pere, a avut valoare medie de 45% vol. alc. Toate probele analizate s-au ncadrat n limitele legal admise pentru concentraia alcoolic. O singur prob, PE26, s-a apropiat foarte mult de valoarea limitei inferioare a concentraiei alcoolice. 2. Valorile aciditii totale exprimate n g acid acetic/100 ml alc anh. au oscilat ntre 0,14 i 0,20, mai ridicate pentru plinca de pere, dar nu semnificativ statistic. La o singur prob de uic s-a determinat valoarea aciditii totale ca fiind peste limita legal admis, de 0,25 g acid acetic/100 ml alc. anh. i anume la proba P15. Unele probe P1, P2, P5, P12, P13, P15, P17, M20, M21, PE24, PE26 au avut valoarea aciditii totale peste mediile determinate pe sortimente. 3. Valorile medii de pH au fost cuprinse ntre 4,21 i 4,61, valori mai mari fiind nregistrate la plinca de mere. Cea mai sczut valoare a pH-ului s-a stabilit la probele P15, M20, PE24. 4. Valorile obinute pentru extractul sec total au fost asemntoare, fr a exista diferene semnificative statistic, explicaia provenind din faptul c distilatele au compui majoritari apa i etanolul, fiecare cu aport situat n jurul valorii de 50%.

XII

II. DETERMINAREA PARAMETRILOR CE CARACTERIZEAZ SIGURANA A TREI SORTIMENTE DE BUTURI DISTILATE TRADIIONALE
II.1. Materiale i metode utilizate
Pentru determinarea metalelor grele, cupru i plumb, s-a utilizat un spectrometru de absorbie atomic tip AVANTA , serie A5018, cu autosampler PAL 3000 i cuptor de grafit. Pesticidele organoclorurate au fost determinate prin procedura gaz-cromatografic cuplat cu detector cu captur de electroni (GC-ECD) utilizat n cazul apei potabile. O cantitate de 250 ml prob (distilat) au fost extrase de dou ori cu cte 5 ml de n-hexan. Extractele au fost unificate i desicate prin trecere printr-o coloan cu Na2SO4 anhidru. Extractul a fost uscat ntr-un rotavapor la 60oC i redizolvat ntr-un ml de hexan pentru analiza GC. Aparatul utilizat a fost un gazcromatograf Hewlett Packard GC 4890D echipat cu detector cu captur de electroni (ECD), o coloan de separare HP-608 de 30 m lungime, cu diametru interior de 0,53 mm. A fost injectat cte 1 l din fiecare prob (preparat ca mai sus). Pe baza timpilor de retenie s-au identificat pesticidele organoclorurate, iar cu ajutorul amestecului standard de pesticide pure utilizat s-a determinat analiza lor cantitativ. Temperatura coloanei la 120C fost meninut timp de 1 minut, apoi crescut cu 10C/minut pn la 250C; aceast temperatur final a fost meninut timp de 20 minute. Temperatura injectorului a fost de 300C. Temperatura detectorului ECD a fost de 300C. La determinarea compuilor volatili majori s-a utilizat un gaz-cromatograf model 6850A, echipat cu detector FID i autosampler cu 16 poziii pentru injectarea automat a probelor de analizat; separarea compuilor s-a fcut pe o coloan cromatografic capilar ZBWAXplus, cu dimensiunile: 60 m x 0,25 mmID x 0,25 m film tihckness, faz staionar: crosslinked polietilenglicol, domeniu de temperatur: 20 260C. Firma Zebron; Gazul purttor a fost heliul. Pentru detectorul pentru FID, model FID 1000-220 (fabricaie PARKER Balston) sa utilizat o staie de generare hidrogen ultra pur i uscat dintr-o surs de ap deionizat, utiliznd principiul disocierii electrolitice a apei i conducia protonului de hidrogen prin membran. Aceast staie de gaze ncorporeaz i un generator de aer sintetic, care purific aerul furnizat de o surs de aer comprimat la o puritate de sub 0.01 ppm hidrocarburi. Programul de temperatur aplicat n determinarea compuilor volatili majori este prezentat n tabelul 5. Au fost identificai compuii volatili majori pe baza timpilor de retenie i prin comparare cu standarde pure. Standardul intern utilizat n toate probele a fost 3-pentanolul.
XIII

Tabelul 5/Table 5 Programul de temperatur aplicat n determinarea compuilor volatili majori The temperature program applied in major volatile compounds determination
Rata/Rates, C/min 12 3 30 200 Temperatura final/ Final temperature, C 58 85 155 230 Timp final/ Final time, min 4 0 3 5

Rampe/Ramps 1 2 3 4

II.2. Rezultate i discuii

Metale grele cupru i plumb Metalele grele au nregistrat valori cuprinse n tabelul 6.

Tabelul 6/Table 6 Valorile obinute pentru coninutul n metale grele - cupru i plumb - n probele de buturi distilate (uic, plinc de mere, plinc de pere) exprimate n mg/l, respectiv g/l The values obtained for the amounts of heavy metals copper and lead in distilled beverages samples (plum, apple and pear brandy) expressed in mg/l, respectively g/l
Butur distilat din fructe uic Plinc de mere Plinc de pere Cu, mg/l 1,98 10,17 1,54 6,13 2,15 5,87 Pb, g/l 29 - 820 151 468 156 - 314

Pesticide organoclorurate Coninutul n pesticidele organoclorurate din probele analizate a fost urmtorul: 0,025 g/l dieldrin (proba P2), 0,057 g/l dieldrin (proba P3), 0,082 g/l -HCH, 0,169 g/l -HCH, 0,039 g/l Endosulfan2, 0,214 g/l endrin aldehida (proba P5). n figura 1 este reprezentat cromatograma GC-ECD a probei P5.

XIV

Fig. 1. Cromatograma GC-ECD a probei P5 evideniind prezena pesticidelor organoclorurate: alfa-HCH (TR=19,236 min); gama-HCH (TR=20,964 min); endosulfan 2 (TR=35,890 min); endrin aldehida (TR=38,909 min). Fig. 1. The GC- ECD chromatogram of sample P5 showing the presence of organochlorine pesticides: alfa-HCH (TR=19,236 min); gama-HCH (TR=20,964 min); endosulfan 2 (TR=35,890 min); endrin aldehyde (TR=38,909 min). Compui volatili majori. Amprenta gaz-cromatografic GC-FID specific probei M20 este exemplificat n figura 2.

Fig. 2. Gaz-cromatograma compuilor volatili majori n proba M20. Identificarea peak-urilor: 1 = Acetaldehyde; 2 = Ethyl acetate; 3 = Methanol; 4 = 2-Butanol; 5 = 1-Propanol; 6 = Iso-butylic Alcohol; 7 = 3-Pentanol (IS); 8 = 1-Butanol; 9 = Amyl Active Alcohol; 10 = Iso-amylic Alcohol. Fig. 2. The GC-FID chromatogram of major volatile compounds in sample M20. Peak identification: 1 = Acetaldehyde; 2 = Ethyl acetate; 3 = Methanol; 4 = 2-Butanol; 5 = 1Propanol; 6 = Iso-butylic Alcohol; 7 = 3-Pentanol (IS); 8 = 1-Butanol; 9 = Amyl Active Alcohol; 10 = Iso-amylic Alcohol.
XV

Rezultatele obinute pentru mediile compuilor volatili majori din probele de distillate de fructe sunt prezentate n tabelul 7. Tabelul 7/Table 7 Compui volatili majori determinai n distilatele de fructe prin GC-FID. Prin analiza statistic au fost determinate diferenele semnificative dintre valorile medii din uica (MVP) din diferite regiuni de origine, plinc de mere (MVA) i plinc de pere (MVPe). SD-Deviaia standard. Valorile cu litere ataate (a, b, c) sunt seminifativ diferite (P<0.05) Major volatile compounds found in fruit distillates as determined by GC-FID. By statistical analysis, the significance of differences between the mean values for plum brandy between different regions of origin (MVP), apple brandy (MVA) and pear brandy (MVPe) was determined. SD-standard deviation. The values with different letters superscript (a, b, c) are significantly different (P<0.05).

Compus volatil / Volatile compound (mg/100 ml anh. alc.) Codificare/ Sample code

Ethyl Acetate

Acetaldehyde

Amyl Active Alcohol

35,31a 16,87
a

1-Propanol

Iso-butylic Alcohol

MVP CJ SD MVP BN SDP MVP MM SD MVP SD MVA SD MVPe SD

15,11a 8,68 13,60 5,16 14,74 6,76 14,49c 6,62 14,93b 2,63 19,92 8,43
a a b

284,17b 210,82 308,14

a

1099,61a 135,54 928,77

b

2,86b 1,89 3,18

a

7,55b 6,71 4,91

c

94,87a 51,76 79,30

b

76,16a 38,43 41,76

c

10,73b 6,64 12,94

144,36a 72,68 90,05c 32,48

27,11 9,85 28,93

149,90 263,55
b

100,47 837,12
c

2,01 3,25
a

5,89 12,52
a

56,98 94,34
a

15,46 64,58
b

12,23 9,45
c

103,75b 50,73 112,72b 56,42 146,29a 51,57 107,25c 31,79

127,87 285,29b 157,61 246,04c 169,62 312,62

a

308,78 955,17b 221,23 904,70c 256,62 990,68

a

3,73 3,09b 2,52 3,66a 2,19 2,68

c

18,87 8,33b 11.78 1,36c 2,01 61,09

a

35,56 89,50b 46,58 51,09c 56,75 116,90 84,07

a

38,15 60,83a 33,90 46,86c 6,57 53,13

b

7,75 11,04b 8,76 8,13c 4,83 11,95 3,88

a

15,45 30,45b 13,98 38,61a 13,10 27,59

c

175,63

209,54

1,41

36,93

12,17

10,29

Valorile obinute pentru compuii volatili majori au fost n concordan cu cele determinate de ali autori, excepie fcnd doar acetatul de etil care a nregistrat valori mai mari (SATORA and TUSZYSKI, 2010; VERSINI et al., 2009; WINTEROV et al., 2008; RUSU(COLDEA) TEODORA EMILIA et al., 2011).
XVI

Iso-amylic Alcohol

2-Butanol

1-Butanol

Methanol

Furfural

II.3. Concluzii
S-au identificat, pe baza analizelor principalii parametrii de siguran a probelor de buturi distilate investigate. Astfel: 1. S-au identificat probe cu valori crescute ale concentraiilor de cupru (8 probe de uic din 18 analizate) i 2 de plinc de mere (din 4 analizate). S-au identificat de asemenea 6 probe de uic cu valori depite pentru plumb (dou dintre acestea avnd i concentraii depite de cupru), o prob de plin de mere i o prob de plinc de pere. Unele dintre probe au avut valori mult peste valorile medii ale sortimentului de care aparin (de pn la de dou ori mai mari n cazul cuprului, respectiv de aproape trei ori mai mari n cazul plumbului). n general, probele de uic sunt mai expuse la contaminare cu metale grele. 2. Prin analiza GC-ECD probele cu coninut determinat de pesticide organoclorurate sunt P2, P3 i P5. Tipurile de pesticide organoclorurate gsite n probele de uic sunt: dieldrin, -HCH, -HCH, endosulfan 2 i endrin aldehyde. Valorile nregistrate pentru probele P3 i P5, au fost mai mari dect limitele maxime admisibile impuse (n cazul apei potabile, neexistnd standarde pentru aceste produse). Din cauza faptului c acest tip de buturi nu este consumat n cantiti att de ridicate precum apa, acestea nu prezint un risc att de mare pentru sntatea omului. 3. n ceea ce privete analiza GC-FID a compuilor volatili principali, rezultatele obinute n acest studiu au fost n concordan cu alte determinri de referin, excepie fcnd acetatul de etil, care a avut valori mai ridicate fa de datele raportate de ali autori. 4. Cantitativ, metanolul reprezint al doilea compus volatil dup etanol n distilatele analizate. 5. Acetaldehida, acetatul de etil, metanolul i alcoolii superiori totali din plinca de pere au nregistrat valori semnificativ mai ridicate fa de uic sau plinca de mere, doar furfuralul a avut cea mai sczut valoare n plinca de pere, cea de mere fiind cea mai bogat n furfural. 6. S-au observat diferene n funcie de regiunea de origine (n probele de uic). Diferenele statistice n cazul MVPe au fost semnificativ mai ridicate dect MVA pentru acetatul de etil, metanol, 2-butanol, 1-propanol i 1-butanol, iar pentru furfural, alcool amil activ i alcool iso-amilic, valorile MVA au fost semnificativ mai ridicate dect MVPe.

XVII

III. COMPUI FENOLICI CA BIOMARKERI DE AUTENTICITATE AI DISTILATELOR DIN FRUCTE: AMPRENTA SPECTROMETRIC UVVIS

III.1. Materiale i metode

S-au nregistrat spectrele UV-VIS pe domeniul 200-500 nm cu ajutorul spectrometrului JASCO 530. Probele au fost analizate dup o diluare prealabil 1:10 cu ap distilat. Determinarea compuilor polifenolici totali s-a fcut prin metoda Folin-Cioclteu. S-a utilizat 1 ml de prob, care s-a introdus ntr-un balon cotat de 100 ml; s-au adugat 60-70 ml ap distilat i 5 ml reactiv Folin-Cioclteu, apoi s-au omogenizat. Dup 1 minut i nainte de 8 minute s-au adugat 15 ml soluie carbonat de sodiu 7,5 %. S-a notat acest moment ca fiind momentul 0 i s-a omogenizat din nou. S-a adus totul la volum de 100 ml cu ap distilat. Dup 2 ore s-a citit absorbana probelor la = 750 nm fa de martor (blank). Din ecuaia curbei de calibrare s-a calculat cantitatea de polifenoli totali (exprimat n mg/ml distilat).

III.2. Rezultate i discuii

Analiza comparativ a spectrelor UV-VIS Pe parcursul procesului de maturare se extrag compui fenolici (alturi de ali compui) din butoaiele de lemn unde sunt depozitate distilatele. Cantitatea de compui fenolici care se extrage depinde de durata pstrrii distilatului n butoi, tipul distilatului i mrimea butoiului de depozitare. Datorit interaciunilor dintre compui din timpul procesului de nvechire concentraia compuilor fenolici se poate modifica (TEEVI et al., 2005). Comparativ, se constat (Figura 3) deosebiri ale formei spectrelor, dependente de compoziie i de modul de obinere, chiar i la acelai tip de fruct. Se constat n general dou maxime de absorbie, unul la 277-280 nm i un al doilea la 230-250 nm, raportul ntre aceste dou tipuri de semnale de absorbie fiind diferit. n general semnalul intens de la 277-280 nm este atribuit acidului galic, iar semnalele intense de la 230-240 nm, acidului protocatecuic i clorogenic.

XVIII

uic (judeul Cluj): P1 - albastru, P2 - verde, P4 - rou, P6 - galben, P17 - maro, P18 roz uic (Cluj County): P1 - blue, P2 - green, P4 - red, P6 - yellow, P17 - brown, P18 - pink

uic (judeul Bistria-Nsud): P3 - albastru, P12 verde, P13 - rou, P14 - galben, P15 - maro, P16 - roz. uic (Bistria-Nsud County): P3 - blue, P12 - green, P13 - red, P14 - yellow, P15 - brown, P16 - pink

0.8 0.6 0.4 0.2 -0.01 200

0.8 0.6 0.4 0.2 -0.01 200

Abs

Abs

300

400

500

300

400

500

Wavelength [nm]

Wavelength [nm]

uic (judeul Maramure): P5 - albastru, P7 - verde, P8 - rou, P9 - galben, P10 - maro, P11 - roz. uic (Maramure County): P5 - blue, P7 - green, P8 - red, P9 - yellow, P10 - brown, P11 - pink.
1.3 1

Abs

0.5

-0.01 200

300

400

500

Wavelength [nm]

Plinc de mere: M19 - albastru, M20 - verde, M21 - rou, M22 - galben. Apple brandy: M19 - blue, M20 - green, M21 - red, M22 - yellow.
0.8 0.6 0.4 0.2 -0.01 200

Plinc de pere: PE23 - albastru, PE24 - verde, PE25 - rou, PE26 galben Pear brandy: PE23 - blue, PE24 - green, PE25 - red, PE26 yellow
1

Abs

Abs

0.5

300

400

500

-0.01 200

300

400

500

Wavelength [nm]

Wavelength [nm]

Fig. 3. Imaginea comparativ a amprentelor spectrale UV-VIS pe categorii de buturi distilate investigate.

Fig. 3. Comparative UV-VIS spectral fingerprints of different categories of distillates.

XIX

III.3. Concluzii
1. Analiza spectrometric UV-VIS a permis determinarea amprentei specifice compuilor de tip fenolic, stabilindu-se diferene calitative ntre uic, plinc de mere i plinc de pere, evideniate de dou tipuri de maxime de absorbie, unul la 277-280 nm i un al doilea la 230-250 nm, raportul ntre aceste dou tipuri de semnale de absorbie fiind diferit n funcie de tipul de butur. 2. Pe baza analizei spectrometrice UV-VIS se constat o variabilitate mare a compoziiei n compuii fenolici care nu depind de regiunea de provenien n cazul uicii, i nici de tipul fructului. Se consider c diferenele ntre raportul acizilor galic, protocatecuic i clorogenic depinde de soiul fructului utilizat i procedura de obinere. 3. Din punct de vedere cantitativ, valorile absorbiilor UV-VIS la 277 nm (caracteristice compusului major acid galic) au permis ierarhizarea compoziiei astfel: uica a avut o compoziie maxim de compui fenolici, urmat de plinca de mere i plinca de pere. uica provenit din judeul Maramure a avut cea mai mare cantitate de compui fenolici.

XX

IV. ANALIZA COMPUILOR FENOLICI DIN BUTURI DISTILATE PRIN CROMATOGRAFIE LICHID DE NALT PERFORMAN (HPLC)
IV.1. Materiale i metode
Separarea compuilor fenolici din probe s-a efectuat ntr-un sistem HPLC Agilent 1200 (Agilent Technologies) cu detector UV-VIS, utiliznd o coloan Supelcosil LC 18 OA 5m, 4 X 250 mm i o purificare prealabil printr-un filtru milipor de dimensiuni 0,45 m. Probele au fost injectate direct, dup filtrare, utiliznd o faz mobil n gradient, cu debit de 1 ml/min, conform tabelului 8. Pentru fiecare injectare s-au folosit 20 l prob. Temperatura de lucru: 25C. Cromatogramele au fost nregistrate la lungimea de und 280 nm. Tabelul 8/Table 8 Programul de gradient al solvenilor, aplicat n separarea compuilor fenolici prin metoda HPLC. Solvents gradient program, applied in fenolic compounds separation by HPLC.
Solventul/ Solvent (%) Solvent A % Solvent B % Timp /Time (min) 30 45 50 15 50 85

0 100 0

10 85 15

55 100 0

Solventul A: metanol/acid acetic glacial/ap n proporie de 10/2/88 (V/V) Solventul B: metanol/acid acetic glacial/ap n proporie de 90/3/7 (V/V)

Compuii fenolici standard de puritate 95-99 % s-au dizolvat n metanol de puritate HPLC pentru o concentraie de 0,1 mg/ml. Soluiile obinute au fost injectate n sistemul HPLC Agilent 1200 n aceleai condiii ca i probele. Identificarea compuilor fenolici s-a fcut prin compararea timpilor de retenie ai standardelor cu timpii de retenie ai probelor. Identificarea s-a fcut pe baza unei separri de standarde a 11 compui fenolici puri utiliznd condiiile de separare menionate mai sus. Pe baza timpilor de retenie s-au identificat n probe tipurile de compui fenolici, iar pe baza ariilor semnalelor s-a determinat cantitativ concentraia fiecrui tip de compus fenolic.

IV.2. Rezultate i discuii

Amprenta cromatografic HPLC i identificarea compuilor fenolici, n raport cu standard pure Suprapunerea cromatogramelor a trei probe de uic este prezentat n figura 4.

XXI

450

1
400 350

Absorbance (mAU)

300 250 200 150 100 50 0 0 10 20

P10 P14 P18

4
30

11
40

Retention time (min)

Fig. 4. Cromatogramele HPLC suprapuse ale probelor de uic P10, P14, P18 (1 - acid galic; 4 - acid clorogenic; 11-kaemferol). Fig. 4. HPLC Chromatograms of plum brandy samples P10, P14, P18. (1 - galic acid; 4 - chlorogenic acid; 11-kaemferol). Analiza cantitativ HPLC Pe baza amprentei cromatografice i etalonrii cu standarde, tabelul 9 prezint concentraiile calculate pentru compuii fenolici din cele trei tipuri de distilate analizate. Tabelul 9/Table 9 Cantitile compuilor fenolici identificai n probe (mg/l). Amounts of phenolic compounds identified in samples (mg/l).

Peak

1 2 4 10 11

Denumire compui fenolici/ Type of phenolic compound Acid Galic Acid Protocatecuic Acid Chlorogenic Quercetin Kaempherol

Cantitile compuilor fenolici identificai din probele analizate / Amounts of phenolic compounds identified in samples (mg/l) M20 99,4 1,7 5,4 M21 176,3 4,1 8,4 M22 79,1 1,5 14,4 1,1 1,1 10,3 2,8 7,6 0,9 4,5 3,4 4,9 5,1 6,3 3,6 P10 26,6 P14 86,6 P18 175,3 PE23 13,9 PE24 53,1 PE25 68,7

XXII

IV.3. Concluzii
1. Metoda HPLC a fost util pentru identificarea markerilor fenolici specifici materiei prime din care s-au obinut distilatele. 2. Prin comparaie cu etaloane standard s-au putut determina concentraia compuilor fenolici majori i anume: acidul galic, acidul clorogenic. 3. Acidul protocatecuic este specific plincii de mere, quercetina este specific plincii de pere, iar kaempherol, uicii.

XXIII

V. COMPUII VOLATILI MINORI DIN DISTILATELE DE FRUCTE DETERMINAI PRIN ANALIZA GAZ-CROMATOGRAFIC CUPLAT CU SPECTROMETRIE DE MAS (GC-MS)
V.1. Materiale i metode
Echipamente utilizate. S-a utilizat un gaz-cromatograf model TRACE GC ULTRA cuplat cu spectrometru de masa Polaris Q i autosampler cu 8 poziii pentru injectarea automat a probelor de analizat; gaz-cromatograful a fost legat la calculator cu program de nregistrare a datelor, procesarea acestora efectundu-se cu ajutorul soft-ului XCALIBUR 2.0, fabricaie Thermo Electron Corporation, USA. Pentru separare s-a utilizat o coloan cromatografic capilar Agilent HP-5ms, fabricaie Agilent Technologies, cu dimensiunile: 30 m x 0,25 mmID x 0,25 m grosime film, faz staionar: 5% phenyl, 95% dimethylpolysiloxane. Parametrii de lucru. Pentru extracia compuilor volatili s-a utilizat Hexan, produs de firma Riedel-de Han cu o puritate de peste 99%, avnd certificat de calitate. nainte de a fi injectate n gaz-cromatograf, probele au fost prelucrate n felul urmtor: o cantitate de 250 ml prob (distilat) a fost extras de dou ori cu cte 5 ml n-hexan cu ajutorul plniei de separare. Extractul a fost apoi colectat i injectat n gaz-cromatograf. Parametrii de lucru sunt specificai sub denumirea metodei de lucru n programul calculatorului (Tabelul 10). Durata analizei a fost de 60 minute. Volumul de injecie al probei prin autosampler a fost de 2L. Temperatura injectorului a fost de 250C, gazul purttor (eluent) - Heliu 6,0, iar debitul a fost de 1,5 ml/min. Limita de detecie a metodei a fost de 10 picograme substan. Tabelul 10/Table 10 Programul de temperatur n determinarea GC-MS a compuilor volatili. Temperature program used for GC-MS determination of volatile compounds.
Rampe/Ramps 1 2 3 Rata/Rates 6C/min 3C/min 7C /min Temperatura/Temperature 60C 240C 303C Timp/Time 1 min 5 min 1min

V.2. Rezultate i discuii

Amprenta cromatogrtafic GC-MS i identificarea compuilor volatili minori n figura 5 sunt reprezentate cromatogramele GC-MS cu identificarea compuilor volatili minori din proba PE 23.

XXIV

ethyl caproate

PE23

12000000

2-mono-linolein 5-pentadecen-7-yne 11-tetradecanoic acid ethyl 9-hexadecanoate ethyl palmitate methyl linoleate ethyl myristate
38.95755 27.7763 33.94635

10000000

18.35468

8000000

6000000

ethyl 2,4-decadienoate alfa-farnesene

ethyl caprylate

decanoic acid

4000000

caryophyllene

7,10,13-hexadecatrienoic acid methyl ester

39.82162

ethyl benzoate

Intensity

dichlorobenzen

n-butylbenzen

14.22968

22.28152

ethyl laurate

16.28777

2000000

19.33932 19.78672 20.34245 20.6039

7.64843

8.30833

13.8349

21.26042 21.72292

12.04115 12.3401

32.9664 33.30573

10.20338

12.92448

16.99505

10.95573

15.00782 15.35547 15.6302

17.77657

23.46145

27.14895

24.8013

28.30312

25.77343

29.32448

31.84765

36.95287

9.34245

ethyl stearate

11.49037

limonene

10.53593

eugenol

39.12708

30.8625

44.1664

10

20

30
Retention tim e, m in

40

50

Fig. 5. Gaz-cromatograma compuilor volatili minori identificai n PE23. Fig. 5. Gas-chromatogram of minor volatile compounds identified in PE23. Identificarea compuilor volatili separai, pe baza spectrelor de mas Pentru identificarea semnalelor majore din aceste cromatograme s-a utilizat determinarea prin spectrometrie de mas i identificarea fragmentelor specifice. S-au comparat spectrele de mas ale semnalelor de la timpii de retenie de la minutele: 10-13, 13-14, 16-18, 21-23, 22-24, 32-33, 38-39, iar spectrele de mas au fost comparate cu baza de date Lipid Library. Pe baza comparaiilor ntre aceste spectre de mas s-a constatat c derivaii volatili majori sunt esteri etilici ai acizilor grai ncepnd cu esterii acidului acidul caprilic pn la esterul etilic al acidului stearic. Ca urmare a prelucrrii datelor cu ajutorul soft-ului Xcalibur i utiliznd bazele de date Lipid Library i NIST Standard Reference Database s-au putut determina un numr de 36 de compui volatili minori printre care se numr: limonen, caprilat de etil, ionona, eugenol, caproat de etil, 2,4-decadienoat de etil, alfa-farnesen, cariofilena, laurat de etil, gama-elemene, benzoate de etil, palmitat de metil, linoleat de etil, miristat de etil, palmitat de etil, stearat de etil. Compuii identificai au fost n concordan cu alte referine bibliografice (GALEGO
LUDOVINA, 2006; GARCA-LLOBODANIN, 2008; NYKANEN, 1983; TEEVI et al., 2005; TEEVI et al., 2009; VERSINI et al., 2009; WINTEROV et al., 2008).

XXV

50.1776

Analiza cantitativ GC-MS Pentru analiza cantitativ a compuilor volatili identificai, s-au considerat intensitile fiecrui compus n parte, dup care s-au calculat concentraiile procentuale corespunztoare fiecrui compus volatil n parte. S-a observat faptul c preponderena n compui volatili variaz n funcie de sortiment i c uica din judeul Bistria-Nsud are valorile cele mai apropiate de media compuilor volatili a celor trei sortimente de uic.

Analiza chemometric de tip PCA i CA a componentelor volatile minore separate prin gaz cromatografie de tip GC-MS S-au considerat principalii 7 compui din amestecul separat prin GC-MS i s-a reprezentat grafic sistemul scoresloadings al principalelor componente, considernd att compuii volatili ct i tipul probelor. De asemenea s-a efectuat analiza CA prin care s-au efectuat grupri de tip cluster pe patru nivele de asociere a compuilor separai respectiv pe categorii de probe analizate. Se constat o bun grupare a probelor de plinc de mere (M19, M21, M22), a dou probe de plinc de pere (PE23 i PE25), a trei probe de uic din judeul Bistria-Nsud (P3, P13, P12), a trei probe de uic din judeul Maramure (P5, P7, P8) i a patru probe de uic din judeul Cluj (Figura 6).

Fig. 6. Analiza chemometric PCA - n funcie de tipul buturii analizate (scores) - efectuat pentru distilatele analizate prin GC-MS (uic, plinc de mere i plinc de pere). Fig. 6. The PCA Chemometric Analysis considering the analyzed beverages (scores) applied on distillates analyzed by GC-MS (plum, apple and pear brandies).

XXVI

Prin analiza chemometric PCA i CA s-au considerat identificat i valorile procentuale ale fiecrui compus separat prin GC-MS, obinndu-se urmtoarele rezultate (Figurile 7, 8, 9).

Fig. 7. Analiza chemometric PCA - n funcie de compuii volatili separai (loadings) - efectuat pentru buturi distilate, considernd procentele fiecrui compus volatile separat i identificat prin GC-MS. Fig. 7. The PCA Chemometrical Analysis considering the separated volatile compounds (loadings) - applied for distilled beverages referring to the percentage of each volatile compound separated and identified by GC-MS.

Fig. 8. Analiza chemometric PCA - n funcie de tipul buturii analizate (scores) - efectuat pentru buturi distilate, considernd procentele fiecrui compus volatile separat i identificat prin GC-MS. Fig. 8. The PCA Chemometrical Analysis considering the beverage type (scores) - applied for distilled beverages referring to the percentage of each volatile compound separated and identified by GC-MS.
XXVII

Fig. 9. Analiza chemometric CA - gruparea bazat pe categorii de probe - efectuat pentru buturi distilate, considernd procentele fiecrui compus volatil separat i identificat prin GC-MS. Fig. 9. The CA Chemometrical Analysis considering the the sample categories - applied for distilled beverages referring to the percentage of each volatile compound separated and identified by GC-MS. Se constat, pe baza datelor cantitative, c plinca de pere se difereniaz net de celelalte probe luate n studiu, i c ntre acestea apare o difereniere marcat cu sgeat, paralel cu diferenierea dintre compuii volatili. Plinca de pere este caracterizat specific de cantiti mai mari de esteri ai acizilor caproic i benzoic. uica i plinca de mere au i compui terpenoidici, care le difereniaz de plinca de pere, aa cum se vede i din graficul PCA. Prin analiza CA e vizibil gruparea acestora i evidenierea specificului plincii de pere n raport cu celelelte dou buturi. Prin comparaie, s-a efectuat acelai tip de analiz chemometric pentru uic (Figurile 10, 11, 12) evideniind deosebiri semnificative, dependente de provenien.

XXVIII

Fig. 10. Analiza chemometric PCA - n funcie de compuii volatili separai (scores) - efectuat pentru uici, considernd procentele fiecrui compus volatil separat i identificat prin GC-MS. Fig. 10. The PCA Chemometrical Analysis considering the separated volatile compounds (scores) - applied for plum brandy, referring to the percentage of each volatile compound separated and identified by GC-MS

Fig. 11. Analiza chemometric PCA n funcie de regiunea de origine a uicii (loadings). S-au comparat cu valorile medii obinute pentru toate probele- efectuat pentru uici, considernd procentele fiecrui compus volatil separat i identificat prin GC-MS.

Fig. 11. The PCA Chemometrical Analysis considering the provenience region of plum brandy (loadings). There were compared with the mean values obtained for all samples - applied for plum brandy, referring to the percentage of each volatile compound separated and identified by GC-MS.
XXIX

Fig. 12. Analiza chemometric de CA - gruparea este bazat pe categorii de probe, dependent de originea lor geografic - efectuat pentru uici, considernd procentele fiecrui compus volatil separat i identificat prin GC-MS. Fig. 12. The CA Chemometrical Analysis based on sample categories considering the provenience region of plum brandy - applied for plum brandy, referring to the percentage of each volatile compound separated and identified by GC-MS Se confirm prin analiza PCA, a celor trei sortimente de uic, o delimitare a probelor din judeul Cluj, mai bogate n esteri (etil caproate, etil laurat i benzoate), observat i prin gruparea compuilor volatili. Marcarea cu sgeat evideniaz paralelismul dintre gruparea probelor de uic i a compuilor volatili. Analiza CA evideniaz diferena net a probelor de uic din judeul Cluj fa de cele din judeul Maramure i mai ales fa de judeul Bistria-Nsud.

V.3. Concluzii
1. Prin analiza GC-MS a celor 26 de probe de buturi distilate au fost identificai compui volatili minori, din clase diferite: esteri etilici ai acizilor grai, terpenoide, alcooli superiori, cetone. 2. Prin analiza GC-MS au fost determinate relativ (procente din amestec) cele mai importante componente, i anume esterii etilici ai acizilor caproic, benzoic, lauric, miristic, palmitic, stearic. n general esterii reprezint mai mult de 85% dintre compuii volatili minori.

XXX

3. Diferenele dintre cele trei sortimente de distilate de fructe analizate i separat ntre probele de uic, pe baza originii au fost stabilite statistic (prin testul ANOVA) i chemometric prin analiza PCA i CA. Au rezultat diferenieri importante ntre plinca de pere i celelalte dou sortimente, datorate unui coninut mai mare de etil caproat, laurat i benzoat. n general probele de uic i plinc de mere au mai muli compui terpenoidici. 4. n cazul probelor de uic s-au evideniat deosebiri importante ntre uica produs n judeul Cluj i celelalte dou tipuri de uic, provenite din judeul Maramure i judeul Bistria-Nsud. uica din judeul Cluj este mai bogat n esteri i mai srac n compui terpenoidici i alcooli superiori. uica din judeul Bistria-Nsud n schimb este mai bogat n compui din categoria aldehidelor, cetonelor i are mai mult metanol dect celelalte. Considerm c n general deosebirile dintre probele de uic sunt mai mult dependente de calitatea materiei prime dect de originea geografic sau modul de preparare. Acest fapt este dovedit prin analiza PCA combinat cu analiza CA.

XXXI

VI. ANALIZA SPECTROMETRIC N INFRAROU (FTIR) CA METOD DE VERIFICARE A AUTENTICITII

VI.1. Materiale i metode

S-a utilizat un spectofotometru IR Prestige-21 Shimadzu, USA cu sistem de transformant Fourier (FTIR) i accesoriu de tip HATR (Horizontal Attenuated Total Reflectance).

VI.2. Rezultate i discuii

Amprenta spectroscopic FTIR a probelor de buturi distilate Figura 13 arat amprenta spectrometric FTIR pentru trei dintre probele de plinc de mere. Se constat o form identic a acestor spectre n regiunea 900-1700 cm-1 denumit zona de fingerprint. Proba M20 a avut o concentraie mai mare dect M21 i M22 n concordan cu determinrile densimetrice (Figura 14).

1 ,8 1 ,6 1 ,4

M 20 M 21 M 22

Absorbance a.u.

1 ,2 1 ,0 0 ,8 0 ,6 0 ,4 0 ,2 0 ,0 3500

3000

2500

2000
-1

1500

1000

W avenum ber cm

Fig. 13. Spectrele IR comparative, suprapuse pe domeniul 750-3500 cm-1, pentru probele de plinc de mere: M20, M21, M22. Fig. 13. Comparative IR Spectra, overlapped on domain 750-3500 cm-1, for apple brandy samples: M20, M21, M22.

XXXII

1,8 1,6

1047

M20 M21 M22

Absorbance a.u.

1,4 1,2

1087
1,0 0,8 0,6 0,4

1140

1120

1100

1080

1060

1040

1020
-1

1000

980

960

wavenumber cm

Fig. 14. Spectrele IR suprapuse ale semnalelor caracteristice etanolului (1047 i 1087 cm-1) pentru probele de plinca de mere: M20, M21, M22. Fig. 14. Overlapped IR spectra of ethanol signals (1047 i 1087 cm-1) for apple brandy samples: M20, M21, M22. Identificarea i evaluarea cantitativ, prin spectrometrie FTIR, a metanolului din probele de buturi distilate Ca urmare a observaiilor privind spectrele FTIR de absorbie pentru etanol, pe baza unor curbe de etalonare cu amestecuri de etanol i metanol, s-a identificat metanolul din probe, n funcie de absorbia specific. Astfel, figura 15 evideniaz c o soluie de metanol pur are frecvene de vibraie caracteristic la 1020 cm-1 (semnal major) i 1112 cm-1 (semnal minor), n timp ce etanolul are frecvene de vibraie caracteristic la 1047 cm-1 i 1087 cm-1, n raport aproximativ de 1,5. Aceste frecvene sunt specifice vibraiilor de ntindere ale legturii C-O din aceste molecule.

XXXIII

2,5

E tanol M etanol M etanol:etanol 1:9 M etanol:etanol 1:1

1020

1020 1047
m etanol P10 : m etanol 1:1 1112 1087

1047

2,0

Absorbance a.u.

1087
1,5

1,0

1112
0,5

etanol P10 : m etanol 10:1 P10 : m etanol 10 : 0,5 P10 : m etanol 10 :0,25 P10 : m etanol 9:1 P10 : m etanol 8 : 2 P10 : m etanol 8 : 4 P10 : m etanol 8 : 6 P10

1200

1150

1100

1050
-1

1000

950

1200

1150

1100

1050
-1

1000

950

W avenum ber cm

W avenum ber cm

Fig. 15. Spectrele IR specifice pentru metanol i etanol, ca substane pure i n diferite concentraii n amestec metanol:etanol (amestec 1:1 i 1:9) Fig. 15. The specific IR spectra for methanol and ethanol, as pure substances and in different concentration in mixture methanol:ethanol (1:1 mixture, and 1:9 mixture)

Fig. 16. Spectrele IR suprapuse pentru metanol i etanol n diferite proporii fa de proba P10.

Fig. 16. Overlapped IR Spectra for methanol and ethanol in different proportion from sample P10.

Utiliznd amestecuri de metanol-etanol 1:9 i 1:1 (Figura 15), se constat c odat cu creterea ponderii metanolului n amestec, scad frecvenele de la 1087 cm-1i 1047 cm-1, cresc frecvenele de la 1020-1030 cm-1 i apar la 1112 cm-1. Astfel, utiliznd spectrometria n infrarou, este posibil determinarea prezenei metanolului n probe. Pentru a exemplifica efectul prezenei metanolului i limita sa de detecie n probele de uic s-a ales proba P10 (Figura 16), la care n mod controlat s-au adugat concentraii diferite de metanol (2,5%; 5%; 10%; 20%; 33%; 42,8% i 50%) constatndu-se creteri graduale ale intensitii frecvenelor la 1020 cm-1 i 1112 cm-1. Prin analiza comparativ a probelor de distilate de prune, mere i pere nu se constat deosebiri calitative i cantitative, aceast metod avnd nevoie de validare prin tehnica cromatografic de tip GC-FID.

XXXIV

Analiza Componentelor Principale (PCA) Prin aplicarea programului de chemometrie Unscrambler 10.1. i s-a efectuat analiza tip PCA, considerndu-se regiunea de fingerprint din spectrul FTIR care include alcooli (etanol, metanol) i unele glucide nefermentescibile. S-a realizat clasificarea distilatelor tradiionale n funcie de originea biologic i regiunea de provenien, pe baza ariilor din domeniul 1000-1170 cm-1. S-a efectuat reprezentarea PCA cu normalizare i fr normalizare (Figura 17).

Analiza PCA sistem nenormalizat (A)

Analiza PCA sistem normalizat (B)

Fig. 17. Evidenierea, prin analiza PCA n sistem nenormalizat (A) i normalizat (B) a diferenelor (scores) dintre buturile investigate, pe baza analizei FTIR (aria zonelor de fingerprint 1000-1170 cm-1). Fig. 17. Evidence of differences (scores) from analyzed beverages, depending on FTIR analysis (fingerprint zone area 1000-1170 cm-1), by PCA analysis unnormalized system (A) and normalyzed system (B) Se constat 6 cmpuri diferite care discrimineaz probele n funcie de materia prim i regiune. Probele de uic sunt localizate n zona negativ PC2 i aproape de originea lui PC1. Cu excepia a trei probe din judeul Cluj (P1, P2 i P4) care se difereniaz net. Datele obinute prin analiza densimetric indic faptul c aceste probe au o concentraie alcoolic sub 50% vol. alc. (Tabelul 2). Analiza n sistem normalizat prezint o difereniere mai bun a probelor, fiind mai vizibil delimitarea probelor din plinc de pere.

XXXV

Astfel, cmpurile specifice probelor de uic sunt distincte ntre zona Cluj, Maramure i Bistria-Nsud. Chiar i n cazul probelor de judeul Cluj se vd dou cmpuri distincte determinate de coninut mai mare sau mai mic de alcooli (care absorb n domeniul considerat). n figura 18 este individualizat reprezentarea putndu-se vedea c probele de uic P1, P2 i P4 sunt distinct diferite de probele P6 i P17. Printr-o reprezentare individualizat (intit) i care ine seama de tipul probei (Figura 18) se observ c probele de plinc de pere apar ntr-un grup distinct, bine definit.

Fig. 18. Analiza chemometric PCA intit a rezultatelor obinute din FTIR prin PCA - sistem nenormalizat cu evidenierea gruprii probelor. Fig. 18. PCA targeted Chemometric Analysis of FTIR results, by PCA non-normalized system with samples grouping evidence. Proba P18 are o component dominant major n acest domeniu i se aseamn cu proba M20 i P14. n cadranul pozitiv aproape de origine se disting probele P5, P8, P10 i P11, ce provin din judeul Maramure, distinct delimitate de celelalte probe de uic din judeul Cluj sau judeul Bistria-Nsud. Probele de plinc de pere (PE23-PE26), situate ntr-un grup distinct care au un domeniu aparte, cu valori n cadranul negativ PCA, n figura 18; ele au concentraiile alcoolice cele mai sczute cu o medie de 45.05% vol.alc. (Tabelul 4). De asemenea, probele P1, P2, P4 (provenite din judeul Cluj), alturi de probele P3, M21 (cu cea mai sczut concentraie alcoolic dintre probele de plinc de mere) (Tabelul 3), P6, P9 au concentraii alcoolice sub 50% vol. alc. Concentraiile alcoolice peste 50% vol.alc. (respectiv concentraiile n etanol), s-au obinut i pentru probele P5, P10, P11, P8 (judeul Maramure), P17, P18 (judeul Cluj), P12,

XXXVI

P13, P14, P16 (judeul Bistria-Nsud) i M20. Cele mai mari concentraii alcoolice le-au avut probele P13 (57,29% vol.alc.) i P14 (55,45 % vol.alc.), acest lucru s-a observat i din figura 18. n ceea ce privete coninutul n metanol determinat prin metoda GC-FID, proba P2 are cel mai ridicat coninut dintre probele din judeul Cluj. n schimb, probele M19 i P10 au valori sczute pentru metanol, 597,64 mg/100 ml alc.anh, respectiv, 450,50 mg/100 ml alc.anh., acest lucru putndu-se observa i din poziionarea lor n figura 18. Variabilitatea cea mai mare o au probele din judeul Bistria-Nsud. Prin aplicarea Regresiei de tip Partial Least Squares (PLS), n figura 19 i tabelul 11 sunt prezentate distribuiile de tip PLS pentru probele investigate, inndu-se seama de calibrarea cu metanol. Curba de calibrare cu metanol a fost efectuat prin FTIR, utiliznd o serie de 13 concentraii diferite.

Fig. 19. Predicia concentraiilor de metanol din probele de buturi distilate, prin aplicarea Regresiei de tip Partial Least Squares (PLS): A. Valorile concentraiilor de metanol i a deviaiei standard. B. Curba de etalonare cu metanol (pe intervale de concentraie 1-15% metanol). Fig. 19. Prediction of methanol concentration in distilled beverage samples, by appling the Partial Least Squares (PLS) Regretion: A. Values of methanol concentration and standard deviations. B. Calibration curve with methanol (on methanol concentration interval 1-15%)

XXXVII

Tabelul 11/Table 11 Valorile concentraiilor medii previzionate pentru metanol, prin metoda FTIR, bazat pe absorbiile la 1020 cm-1 (g metanol pur/100 g distilat). Mean concentration values predicted for methanol, by FTIR method, based on absorbance at 1020 cm-1 (g pure methanol /100 g distillate).
Concentraii medii previzionate/ Predicted mean concentration 0,436438 0,462905 0,47479 0,494408 0,452036 0,468267 0,441519 0,444799 0,437333 0,46422 0,47132 0,490306 0,454226 0,44553 0,461523 0,462474 0,44764 0,462745 0,4439 0,494502 0,450894 0,447121 0,454878 0,441082 0,443983 0,442704 Deviaia standard/ Standard deviation 0,033782 0,034296 0,039316 0,038952 0,029413 0,035748 0,032857 0,035159 0,033365 0,032783 0,033664 0,034552 0,034236 0,032056 0,034985 0,032587 0,035753 0,033842 0,032664 0,037261 0,030961 0,031736 0,032024 0,028041 0,02965 0,024037

Proba/ Sample P3 P12 P13 P14 P15 P16 P1 P2 P4 P6 P17 P18 P5 P7 P8 P9 P10 P11 M19 M20 M21 M22 PE23 PE24 PE25 PE26

Regiune de provenien/ Location

Bistria- Nsud

Cluj

Maramure

Comparativ cu analiza GC-FID, valorile calculate pentru metanol, pe baza previziunii la calibrare i a spectrelor FTIR s-au obinut concentraii de acelai ordin de mrime ca i prin metoda GC-FID (n domeniul 0-1200 mg/100 ml alcool anhidru). Minimul concentraiei n metanol s-a determinat n proba P10, iar maximul pentru proba PE26, att prin FTIR, ct i prin GC-FID (Tabelul 12). Pe baza analizei statistice (testul t student) s-au determinat diferene mici, nesemnificative statistic, pentru valorile comparative dintre cantitatea de metanol determinat prin metoda FTIR i GC-FID n probele din judeul Bistria-Nsud (p>0,05), Maramure (p>0,1), n plinca de mere (p>0,1), n plinca de pere (p>0,1), diferene semnificative statistic n cazul probelor din

XXXVIII

judeul Cluj (p<0,01). S-a demonstrat astfel c, n general, metoda FTIR nu d valori semnificativ diferite fa de metoda GC-FID, iar diferenele sunt n limita de 5,5%. Tabelul 12/Table 12 Datele comparative obinute pentru concentraiile de metanol din probe prin cele dou metode de analiz FTIR i GC-FID Comparative values obtained for methanol concentrations by the two analysis methods FTIR and GC-FID
Metoda de determinare/ Analysis method, mg/100 ml alc. anh. FTIR 851,91 818,39 850,40 868,18 861,54 906,28 859,45 28,63 843,26 815,72 758,35 819,42 926,54 795,93 826,54 56,63 803,50 841,05 804,21 875,00 755,55 825,07 817,40 40,32 822,32 866,61 878,57 830,68 XXXIX GC-FID 1077,59 1266,97 954,31 1244,35 1100,76 953,69 1099,61 135,54 964,96 901,39 1073,70 913,01 765,86 953,73 928,78 100,47 857,71 504,18 999,81 1256,41 450,50 954,12 837,12 308,77 597,64 1189,29 1020,89 810,97

Proba/ Sample P1 P2 P4 P6 P17 P18 Valoare medie/Mean value Deviaia standard/ Standard deviation P3 P12 P13 P14 P15 P16 Valoare medie/Mean value Deviaia standard/ Standard deviation P5 P7 P8 P9 P10 P11 Valoare medie/Mean value Deviaia standard/ Standard deviation M19 M20 M21 M22

Regiune de provenien/ Location

Cluj

Bistria- Nsud

Maramure

Proba/ Sample Valoare medie/Mean value Deviaia standard/ Standard deviation PE23 PE24 PE25 PE26 Valoare medie/Mean value Deviaia standard/ Standard deviation

Regiune de provenien/ Location

Metoda de determinare/ Analysis method, mg/100 ml alc. anh. FTIR 849,55 27,27 881,89 923,37 883,67 1045,89 933,71 77,20 GC-FID 904,70 256,62 973,61 818,34 880,69 1290,06 990,68 209,54

Cele mai apropiate rezultate pentru metanolul determinat prin metodele FTIR i GC-FID s-au obinut n cazul probelor de uic din judeul Maramure (Tabelul 12). Valorile obinute prin metoda FTIR au deviaii standard mult mai sczute fa de cele prin GC-FID.

VI.3. Concluzii
1. Prin analiza spectrometric FTIR s-au determinat frecvenele specifice absorbiei etanolului, i anume: 1047-1087 cm-1. Astfel, s-a constatat faptul c probele cu valori mai mari de etanol n metoda FTIR, au avut valori maxime i prin metoda densimetric de determinare a concentraiei alcoolice (P14, M20). Acest aspect este valabil i pentru valorile minime obinute (PE24). 2. Metoda FTIR este util nu doar pentru a afla coninutul n etanol, ci i pentru a determina raportul dintre etanol i metanol. 3. La analiza comparativ a celor trei sortimente de distilate tradiionale, nu s-au constatat diferene calitative i cantitative, prin metoda FTIR. Aceasta ar avea nevoie de validare prin tehnica cromatografic de tip GC-FID. 4. Prin analiza chemometric de tip PCA s-au putut grupa probele examinate pe baza amprentei FTIR. S-au constatat domenii diferite pentru probe, n funcie de materia prim i regiunea de provenien, cu i fr identificarea probelor. 5. De asemenea, prin analiza PLS s-au evideniat concentraiile posibile de alcool metilic din probe pe baza unei curbe etalon de calibrare cu metanol n concentraii cunoscute i diferite. Aceste concentraii au fost comparate cu concentraiile determinate prin analiza GC-FID i s-au gsit diferene nesemnificative statistic.
XL

6. Metoda FTIR, prin valorile apropiate obinute comparativ cu metoda GC-FID demonstreaz c poate fi foarte util n determinarea nedistructiv i rapid a metanolului n probe de buturi distilate bogate n etanol.

XLI

CONCLUZII GENERALE

n raport cu obiectivele propuse, pe baza analizelor efectuate pe cele trei sortimente de distilate de fructe tradiionale s-au identificat o serie de diferene att n ceea ce privete aspectele legate calitate i siguran, ct i a celor legate de autenticitate. Astfel c putem concluziona urmtoarele: 1. S-au determinat parametrii de calitate (concentraie alcoolic, densitate reativ, aciditate total, pH, extract sec total) din uic (distilat de prune), plinc de mere i plinc de pere prin metode fizico-chimice uzuale, evideniindu-se diferene semnificative de compoziie ale acestor distilate 2. Au fost stabilii parametrii de siguran din uic, plinc de mere i plinc de pere, cu referire la metale grele, cupru i plumb, determinate prin spectrometrie de absorbie atomic, pesticide organoclorurate determinate prin metoda gaz-cromatografic cuplat cu detector cu captur de electroni, substane volatile principale cu potenial toxic asupra organismului, determinate prin metoda gaz-cromatografica cuplat cu detector cu ionizare n flacr. 3. Au fost evideniai compuii fenolici ca markeri de autenticitate ai distilatelor prin

amprenta spectrometric UV-VIS, precum i prin cromatografie lichid de nalt performan (HPLC). 4. S-a realizat identificarea compuilor volatili majori (metanol, etanol, acetat de etil) care pot conferi sigurana, dar i autenticitatea acestor distilate prin tehnici GC-FID. 5. S-au stabilit compuii volatili minori (36 compui) care prin analiza gaz-cromatografic cuplat cu spectrometrie de mas (GC-MS), pot fi considerai markeri de autenticitate ai acestor produse. Acetia aparin categoriilor de esteri etilici ai acizilor grai, terpenoide, alcooli superiori, cetone. 6. A fost utilizat analiza spectrometric n infrarou (FTIR) ca metod rapid i nedistructiv de verificare a autenticitii acestor produse, validat prin tehnici cromatografice i cu perspective de utilizare online n industrie.

XLII

Autentificnd specificul distilatelor investigate, s-au constatat urmtoarele: 7. Diferenele dintre cele trei sortimente de distilate de fructe analizate i separat ntre probele de uic, pe baza originii au fost stabilite statistic (prin testul ANOVA) i chemometric prin analiza PCA i CA. Au rezultat diferenieri importante ntre plinca de pere i celelalte dou sortimente, datorate unui coninut mai mare de etil caproat, laurat i benzoat. n general probele de uic i plinc de mere au mai muli compui terpenoidici. 8. S-au evideniat, n cazul probelor de uic, deosebiri importante dependente de originea geografic. Astfel, ntre uica produs n judeul Cluj i celelalte dou tipuri de uic, provenite din judeul Maramure i judeul Bistria-Nsud, uica din judeul Cluj este mai bogat n esteri i mai srac n compui terpenoidici i alcooli superiori. uica din judeul Bistria-Nsud n schimb este mai bogat n compui din categoria aldehidelor, cetonelor i are mai mult metanol dect celelalte. Considerm c n general deosebirile dintre probele de uic sunt mai mult dependente de calitatea materiei prime dect de originea geografic sau modul de preparare. Acest fapt este dovedit prin analiza PCA combinat cu analiza CA. 9. Analiza chemometric este foarte util pentru a face o interpretarre adecvat a semnificaiei rezultatelor. Aceasta a permis o bun interpretare a rezultatelor i a gruprii probelor n funcie de originea lor (geografic sau de impact tehnologic).

XLIII

BIBLIOGRAFIE SELECTIV
1. GALEGO LUDOVINA, 2006, Traditional algarvian distillats and liqueurs historic scientific aspects, Traditional Food Processing and Technological Innovation in Peripheral Regions. - Faro, - 20 p. 2. GARCA-LLOBODANIN LAURA, M. FERRANDO, C. GELL and F. LPEZ, 2008, Pear distillates: influence of the raw material used on final quality, European Food Research and Technology A, Volume 228, Number 1, 75-82, DOI: 10.1007/s00217-0080908-9. 3. HERNNDEZ-GMEZ LUIS F., JUAN BEDA-IRANZO, ESTEBAN GARCAROMERO, ANA BRIONES-PREZ, 2005, Comparative production of different melon distillates: Chemical and sensory analyses, Food Chemistry 90 (2005) 115125. 4. NYKANEN, L., 1983, Aroma of beer, wine, and distilled alcoholic beverages, Kluwer Academic Publishers, Holland. 5. RUSU (COLDEA) TEODORA EMILIA, CARMEN SOCACIU, MARIA PRV, D. VODNAR, 2011, Gas-Chromatographic Analysis of Major Volatile Compounds Found in Traditional Fruit Brandies from Transylvania, Romania, Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca, Vol. 39, No 2. 6. SATORA, P., T. TUSZYSKI, 2010, Influence of indigenous yeasts on the fermentation and volatile profile of plum brandies. Food Microbiology 27:418-424. 7. TEEVI, V., N. NIKIEVI, A. JOVANOVIC, D. DJOKOVIC, L. VUJISIC, I. VUKOVI AND M. BONIC, 2005, Volatile components from old plum brandies. Food Technology and Biotechnology. 43 (4):367-372. 8. TEEVI, V., N. NIKIEVI, S. MILOSAVLJEVI, D. BAJI, V. VAJS, I. VUKOVI, L. VUJISI, I. OREVI, M. STANKOVI AND M. VELIKOVI, 2009, Characterization of volatile compounds of Drenja, an alcoholic beverage obtained from the fruits of cornelian cherry. Journal of the Serbian Chemical Society, Belgrade, Serbia, 74 (2):117-128.

XLIV

9. VERSINI, G., M.A. FRANCO, S. MOSER, P. BARCHETTI, G. MANCA, 2009, Characterisation of apple distillates from native varieties of Sardinia island and comparison with other Italian products, Food Chemistry. vol.113 (Nr.4), pp. 1176-1184. 10. WINTEROV, R., R. MIKULKOV, J. MAZ, P. HAVELEC, 2008, Assessment of the authenticity of fruit spirits by gas chromatography and stable isotope ratio analyses, Czech Journal of Food Sciences, Vol. 26, No.5:368-375.

XLV