Aspecte moleculare privind citoplasma androsteril PET1 de la floarea soarelui (Helianthus annuus L.

)
IOANA ISPAS Institutul de Genetic, Universitatea Bucureti

Introducere
Floarea-soarelui (Helianthus annuus L.) este cultivat de aproape 3000 de ani n America de Nord. n principal, seminele sale sunt folosite ca surs de ulei dar i ca hran. Iniial floarea-soarelui a fost introdus n Europa prin Spania, din Mexic i ulterior s-a raspndit n toata Europa. Primele documente privind acest transfer dateaz din 1568 (Dodonaeus).Producia de floarea -soarelui a crescut n Europa, n cursul primului i al doilea razboi mondial cnd, practic a devenit plant de cultur. Diversitatea genetic este extrem de important pentru dezvoltarea i adaptarea la mediu a plantelor de cultur.Accentul n ceea ce privete ameliorarea florii-soarelui este pus n principal pe dezvoltarea hibrizilor cu cretere viguroas (efect heterozis ) folosind sisteme CMS (citoplasmic male sterility ).Totui baza genetic a hibrizilor actuali de floarea-soarelui este extrem de ingust.Cultivarea florii-soarelui se face aproape exclusiv pe baza hibrizilor ce au la baza sursa Leclercq de androsterilitate citoplasmatic. Prima surs CMS a fost descoperit de Leclercq n 1969, n urma ncrucirii interspecifice dintre H.petiolaris i H.annuus. Datorit folosirii aproape exclusive a acestei surse CMS pentru obinerea de semine hibride, toi hibrizii din cultur sunt puternic inrudii, cel puin n ceea ce privete citoplasma lor. Eforturile n domeniul ameliorrii vizeaz mai ales creterea variabiliti genetice a hibrizilor de floarea-soarelui, prin dezvoltarea de noi sisteme CMS.

Conceptul de androsterilitate citoplasmatic. Prezentare general

Androsterilitatea citoplasmatic a fost observat la peste 150 de specii de plante. Este o caracteristic transmis matern i const n avortarea polenului, nsoit de meninerea fertilitii plantelor femele i de o dezvoltare vegetativ normal. In limbaj agronomic liniile androsterile sunt denumite cu termenul de citoplasm androsteril urmat de o prescurtare a speciei din care provin. De exemplu : citoplasma PET1 este echivalent ca terminologie cu linia androsterila PET1 (derivat de la H.petiolaris). Meninerea liniilor androsterile n cmp necesit surse de restaurare a fertilitii i de meninere a acestora din urm. Sistemele CMS reprezint excelente modele pentru studiul interaciilor dintre nucleu i citoplasm ntruct restaurarea fertilitii implic gene nucleare care suprim disfunciile citoplasmatice. Plantele cu androsterilitate citoplasmatic se pot obine prin tehnici conventionale (emascularea manual a anterelor hibridizare interspecific, backcross), inginerie genetic
51

IOANA ISPAS

(exprimarea enzimei barnaza folosind un promotor specific anterelor) sau prin biotehnologie (fuziunea de protoplati, embriogeneza somatic). Fenotipul CMS (cytoplasmic male sterility) este n multe cazuri asociat cu mutaii n genomul mitocondrial i este sub controlul genelor nucleare, dominante, de restaurare a fertilitii (Hanson,1991).La multe specii de plante, amelioratorii au identificat una sau mai multe gene nucleare, care confer fertilitate, cnd plantele purtatoare ale acestor gene sunt ncruciate cu prini cu citoplasm androsteril. Daca o linie CMS este ncruciat cu o linie fertil, homozigot pentru gena Rf (linie restauratoare) se obin hibrizi F1 heterozigoi, pentru alela Rf ( fertili). Meninerea liniei CMS este realizat prin ncruciarea unei linii aproape izogene, lipsit de gena Rf (linia menintoare). Propagarea liniilor restauratoare i menintoare are loc prin self-fertilizare. Dac aceast gen este introdus la printele productor de polen (prin liniile de restaurare a fertilitii ) sterilitatea mascul este suprimat iar hibrizii obinui n F1 sunt heterozigoi pentru gena Rf, produc polen i sunt masculi fertili. Liniile CMS inbred sunt reproduse prin ncruciarea unei varieti fertile izonucleare, lipsit de alele de restaurare (linia menintoare de fertilitate) cu linia CMS inbred. Liniile de restaurare i de meninere se pot apoi propaga prin self-fertilizare. S-au descoperit prin experiene de ameliorare noi surse CMS, n care s-au realizat backcrossuri, prin care s-au produs substituiri ale genomului nuclear de la o linie ameliorat cu background-ul citoplasmatic al altei linii. Plantele CMS n populaiile rezultate n urma backcrossului au aprut fie datorit ndeprtrii alelelor de restaurare prezente n genotipul original, fie datorit incompatibilitilor citoplasm-nucleu (Hanson,1991 ). Plantele CMS apar spontan n populaiile ameliorate din camp i iniial au fost induse prin ncruciri interspecifice i mutagenez. n majoritatea cazurilor fenotipul CMS provine din rearanjri la nivelul genomului mitocondrial, de la progenitorii masculi fertili sau ca rezultat al evenimentelor de recombinare intra sau intermoleculare. Aceste mutaii pot fi silenioase fenotipic, n background-ul nuclear original. Totui dac, sursa de androsterilitate citoplasmatic care conine mutaia este transferat ntr-un background diferit non-fertil, apare fenotipul steril mascul. Aceasta se datoreaz incapacitii nucleului de a supresa sau compensa mutaia n toate stadiile de dezvoltare ale plantei (Leaver,1991).

Principalele linii androsterile la floarea soarelui

Dupa 1999, s-au raportat cel puin 62 de noi surse CMS la floarea-soarelui. Multe din ele sunt derivate din ncruciri interspecifice, n timp ce altele au aprut spontan n populaiile slbatice de floarea-soarelui sau au fost obinute prin mutagenez. Toate sursele de androsterilitate citoplasmatic prezentate n tabelul 1 au fost caracterizate din punct de vedere al interaciilor nucleu-citoplasm. n tabelul 1 este indicat originea speciei donor de citopalsm i codul FAO. Dup 1995 s-au descris 19 surse noi de CMS.: -9 surse CMS originare din H.annuus slbatic,aprute spontan: PI432513: ANN2101 ,ANN2108, ANN2112, ANN2141 sau din forme cultivate de H.annuus: CMS G, CMS DP, CMS VL, CMS AN-126, denumite conform FAO: CMS-ANN14, ANN15, ANN17, ANN18, ANN19, ANN20, ANN21, ANN22. -7 surse CMS provenite din hibridizri interspecifice: de la H.resinosus. Aceast linie CMS s-a descoperit la descendenii rezultai din ncrucirile ntre H. resinosus 243 i floarea -soarelui cultivat. Generaiile BC3 i BC4 rezultate din ncruciarea ntre H.resinosus i HA89, RHA271 i RHA801 ca prini recureni a produs progeni masculi sterili (cod FAO: CMS-RES1).
52

Aspecte moleculare privind citoplasma androsteril PET1 de la floarea soarelui ( Helianthus annuus L.)

de la H.mollis s-au obinut prin hibridizri interspecifice ale plantelor mascule sterile cu linia HA89, hibrizi masculi sterili. Prin ncruciarea cu H.debilis vestitus, H.annuus RHA274 i prin polenizare deschis s-au obinut 100% progeni masculi sterili. Sursa CMS a fost denumit CMS-MOL1. 3 alte surse CMS deriv din: H.strumosus .Aceast linie androsteril a fost obinut prin ncrucirile interspecifce dintre H.strumosus i floarea soarelui cultivat (cod: CMS-STR1). H.argpophyllus (cod FAO: CMS-ARG4) H.praecox sp. Praecox. ncrucirile interspecifice ntre H.praecox i H.annuus produc n generatia F3, plante mascule sterile. Backcrossurile cu liniile B au generat n multe cazuri 100% plante mascule sterile. Noua surs a fost denumit CMS-PRP2. 2 surse CMS deriv din : H.praecox.Toate ncrucirile care implic H.praecox cu H.annuus produc plante sterile (cod FAO: CMS-PRA I). H.petiolaris.Toate ncrucirile care implic H.petiolaris i H.annuus produc plante sterile (CMS-PET5). 3 surse CMS au fost induse prin mutagenez (raze gamma): CMS MUT3, MUT4, MUT 5. n tabelul 1 sunt prezentate speciile de origine ale ctorva linii CMS la floareasoarelui. Tabelul 1. Sursele CMS de la floarea-soarelui. Denumirea uzual a liniei CMS KOUBAN INDIANA 1 VIR 126 397 517 519 521 NS-ANN-81 NS-ANN-2 Denumirea speciei H.annuus lenticularis H.annuus lenticularis H. lenticularis H.annuus salbatic H.annuus salbatic H.annuus salbatic H.annuus salbatic H.annuus salbatic H.annuus salbatic H.annuus salbatic H.annuus salbatic H.annuus salbatic H.annuus texanus H.annuus H.annuus H.annuus H.annuus H.annuus H.annuus H.annuus H.annuus H.annuus H.annuus H.annuus H.annuus
53

Cod FAO ANL1 ANL2 ANL3 ANN1 ANN2 ANN3 ANN4 ANN5 ANN6 ANN7 ANN8 ANN9 ANT1 ANN10 ANN11 ANN12 ANN13 ANN14 ANN15 ANN16 ANN17 ANN18 MUT1 MUT2 MUT3

FUNDULEA 1 AN-67 AN-58 AN-2-91 AN-2-92 CMS-G CMS-DP CMS-VL HEMUS PEREDOVICK STADION

IOANA ISPAS

ANOMALUS ARGOPHYLLUS BOLANDERI DV-10 EXILIS EXI2 CMG2 CMG3 MOLLIS NEGLECTUS CANESCENS FALLAX PET/PET CMS clasica CMG1 PETIOLARIS BIS PET34 PRAECOX PHIR-27 PRAECOX PRP-28 RUN-29 RESINOSUS 243 VULPE RIG-M-28 STRUMOSUS

H.anomalus H.argophyllus H.bolanderi H.debilis H.exilis H.exilis H.giganteus H.maximiliani H.mollis H.neglectus H.niveus canescens H.petiolaris fallax H.petiolaris petiolaris H.petiolaris Nutt. H.petiolaris Nutt. H.petiolaris Nutt. H.petiolaris H.praecox H.praecox hirtus H.praecox praecox H.praecox praecox H.praecox H.resinosus H.rigidus H.rigidus H.strumosus

ANO1 ARG1 BOL1 DEB-1 EXI1 EXI2 GIG1 MAX1 MOL1 NEG1 NIC1 PEF1 PEP1 PET! PET2 PET3 PET4 PRA1 PRH1 PRP1 PRP2 PRR1 RES1 RIG1 RIG2 STR1

Prima surs stabil de androsterilitate citoplasmatic a fost descoperit de Leclercq, n 1968 prin ncruciri interspecifice ntre H.petiolaris Nutt. i H.annuus. Identificarea genelor pentru restaurarea fertilitaii n special din sursa T66006-2 descoperit de Kinman(1970) a permis obinerea de semine hibride. Primii hibrizi produi prin sistemul CMS-restauratori de fertilitate au fost introdui n SUA n 1972. Dupa 5 ani acetia au reprezentat 80% din totalul hibrizilor. Ei se caracterizeaz printr-o productie cu 20% mai mare dect cea obinut de la floarea-soarelui cultivat normal. Hibrizii au fost nalt self-compatibili, rezisteni la man i uniformi ca nlime i mrimea inflorescenei la maturitate. Hibridul 894 a fost unul dintre cei mai populari hibrizi obtinui prin aceast metod. Sursa de androsterilitate citoplasmatic descoperit de Leclercq (1969) este aproape exclusiv folosit ca surs n ameliorarea curent ca i pentru producia de semine. Sterilitatea controlat citoplasmatic nu are efecte adverse asupra caracterelor agronomice. Actualmente sunt disponibile peste 60 de surse CMS, dar nu toate prezint restauratori de fertilitate iar cteva surse CMS au efecte negative asupra unor caractere agronomice (Havekes i colab., 1991).

Ipoteze privind mecanismele moleculare de apariie ale CMS la plante

Membrana mitocondrial intern este o structur nalt specializat n care sunt localizate complexele enzimatice multimerice specifice fosforilrii oxidative i lanului
54

Aspecte moleculare privind citoplasma androsteril PET1 de la floarea soarelui ( Helianthus annuus L.)

respirator.Aceste complexe enzimatice includ subuniti codificate de genomul nuclear dar i de cel mitocondrial.Distrugerea interaciilor nucleu-citoplasm i mutaiile mitocondriale sau nucleare pot afecta asamblarea sau funcionarea complexelor enzimatice multimerice. Analiza CMS la numeroase specii de plante arat c fenotipul CMS este nrudit cauzal cu : prezena unor polipeptide noi, himere, variabile, codificate de mitocondrii. Aceste polipeptide pot conine secvente noi de aminoacizi (figura 1) sau secvene care blocheaz homologia cu aminoacizii din polipeptidul normal (codificat de secvena de DNA din care au derivat). Domeniile proteinei pot conferi polipeptidului diferite caractere structurale sau functionale ale proteinelor progenilor sau caractere noi care se pot manifesta la nivelul membranei mitocondriale interne unde pot competiiona cu polipeptidele native inrudite sau pot fi asociate specific cu un complex enzimatic. Prezena polipeptidelor adionale sau modificate poate impune constrngeri asupra biosintezei i funciei complexelor multimerice ale membranei mitocondriale interne. Acestea pot fi tolerate n cursul creterii normale vegetative dac complexele enzimatice native sunt capabile s produc suficient energie pentru a susine dezvoltarea celular, ceea ce poate conduce la insuficien mitocondrial n cursul creterii (n ceea ce privete activitatea mitocondriei n cursul formrii polenului). O ipotez alternativ sugereaz c secvenele promotor care sunt comune genelor noi dar i genelor progenilor normali, competiioneaz pentru factorii limitativi care controleaz exprimarea polipeptidelor noi i variabile. n acest fel apare un dezechilibru n ceea ce privete cantitatea de subuniti enzimatice individuale ceea ce conduce la imperfeciuni n biogeneza sau funciile mitocondriilor, care astfel devine un factor limitant n dezvoltarea polenului. Aceste ipoteze sunt argumentate de CMS-T la porumb i de CMS de la petunie. Genele himere T-urf13 i pcf prezint secvene promotor similare cu genele mitocondriale normale. Acestea, n plus, codific diferite polipeptide cu caracteristici structurale i funcionale noi. Un alt model molecular care explic degradarea funciilor mitocondriale asociate cu fenotipul CMS implic editarea incorect a ARN, a transcriptului genei mitocondriale din linia androsteril. Iwabuchi i colab., 1993, au demonstrat c transcriptul atp6 la orez nu este editat eficient i a fost translatat ntr-un polipeptid alterat. O cantitate mare de polipeptid alterat (atp6) poate cauza CMS prin competiionarea cu proteina normal atp6, pentru a reduce activitatea ATP-azic. Nu este clara relaia dintre CMS spontan si scderea editrii ARNm. Totui s-a raportat ca editarea complet a genei atp6 poate restaura fertilitatea CMS la orez. Baza teoriei difereniale a editrii ARN este realizat de Hernould (1992) care a identifcat proteina atp9 alterat translat din atp9ARN needitat i polipeptidul normal derivat din atp9ARN editat n mitocondriile plantelor de tomate. Formele needitate ale subunitii proteice 9 determin prezena a 50% din polenul steril, n ciuda existenei subunitii 9 endogene a proteinei.

55

IOANA ISPAS

Figura 1. Regiuni himere din ADN mitocondrial de la diferite plante, asociate cu androsterilitatea citoplasmatic .

n concluzie se poate aprecia ca androsterilitatea citoplasmatic este determinat de scderea capacitii mitocondriei de a furniza energie celulei, ceea ce genereaz disfuncii mitocondriale cu diferite grade de severitate, n celulele tapet.

Caracterizarea molecular a liniei androsterile PET1

Studiile asupra androsterilitii citoplasmatice efectuate la o serie de plante precum: porumb, petunia, sorg, floarea-soarelui, arat c n genomul mitocondrial rearanjrile au
56

Aspecte moleculare privind citoplasma androsteril PET1 de la floarea soarelui ( Helianthus annuus L.)

generat secvene de DNA mitocondrial himere, ce se exprim ca polipeptide noi sau modificate, care determin alterri n cee ce privete funcile mitocondriilor. Aceste alterri constau n disfuncionaliti la nivelul esuturilor, care se traduc prin incapacitatea de a produce polen viabil.

Structura genomului mitocondrial la linia androsterila PET1 de la floarea-soarelui

Figura 2. Localizarea orf522 in genomul mitocondrial la plantele cu androsterilitate citoplasmatica de H.annuus-linia PET1.

atpA: subunitate F1-ATP-aza :cob : Apocitocrom b ndh1 : NADH/H+ Dehidrogenaza 1 rps13 : proteina ribozomal S13 ,: ARNr18S ; ARNr26S atp6: subunitatea 6 a F0 ATPaza atp9 subunitatea 9 a F0 ATPaza coxI-III Citocrom b Oxidaza I-III Linia androsteril PET1 este foarte rspndit si intens studiat,n cmp, fiind utilizat pentru producerea de semine hibride la floarea-soarelui. S-a analizat DNA mitocondrial de la linii fertile, androsterile PET1 i hibrizi restauratori de fertilitate folosind tehnicile RFLP i Southern blotting. S-a constatat c genomul mitocondrial PET1 conine rearanjri unice n cel puin 5 loci: atp6, atp9, atpA, nad1+5 i cox III. Cu ajutorul unor gene sond s-a aratat c aceste molecule de DNA sunt coliniare, cu o regiune cadru ntre atpA i gena cob (figura 2). Analiza detaliat a acestei arii, cu ajutorul hrii fizice i a metodelor de secveniere a demonstrat c organizarea DNA mitocondrial din liniile androsterile, difer de cea din liniile fertile, inclusiv la H.
57

IOANA ISPAS

Petiolaris (Kohler si colab., 1991), printr-o inversie de 11kb i o inserie de 5 kb (Leroy i colab., 1985, Crouzillat i colab., 1987, Kohler i colab., 1991).

Figura 3. Organizarea unei regiuni din ADN mitocondrial situat ntre atpA i cob la liniile fertile de H.annuus (Baso ), H.petiolaris (fertile ) i linii mascule sterile de H.annuus (BASO-CMS)(dup Horn,1991 ).

La hibrizii restauratori de fertilitate ai BASO (CMS) i HA89(CMS) organizarea DNA mitocondrial ntre gena atpA i cob este aceeai ca i n linile CMS ceea ce arat c restaurarea fertilitii nu induce rearanjri n aceast regiune a DNA. S-a constatat c regiunea rearanjat a DNA mitocondrial este flancat de repetiii inverse de 261pb (Kohler si colab., 1991). Repetiia invers este de asemenea prezent n amonte de gena coxIII la hibridul Gloriasol (Qugliariello i colab., 1990). La nivelul locusului atpA repetiia const din 64 de nucleotide n regiunea 3 a regiunii codificatoare atpA i se extinde cu 30 de nucleotide n regiunea 5 a orf H522 care este localizat n aval de gena atpA.Repetiiile inverse prezente n marginile regiunii rearanjate a DNA mitocondrial pot fi implicate n inversia unei secvene de 11kb ntre genele atpA i cob. Datorit acestei inversii orf H873 este translocat din poziia sa, n aval de gena atpA la formele fertile de H. annuus i H. petiolaris i de gena cob n linile mascule sterile BASO (CMS) i HA89(CMS). Prezena a 57 de nucleotide de la orfH708 n aval de gena atpA, ca parte a orf H522 n liniile androstrile i a 223 pb din secvena codificatoare a regiunii 3 a orf H708 de o parte i de alta a inseriei de 5kb indic faptul c inseria a avut loc n orfH708 dup inversia acestei regiuni. Datorit evenimentelor de recombinare , cea mai mare parte a orf H708 a fost deletat sau mutat n alt regiune din genomul mitocondrial (Zetsche si Horn, 1993).

58

Aspecte moleculare privind citoplasma androsteril PET1 de la floarea soarelui ( Helianthus annuus L.)

Figura 4. Harta detaliat a inseriei de 5kb situat n aval de gena atpA la liniile mascule sterile Baso (CMS) ce prezint citoplasma PET1.

Ipoteza inversiei, anterioar inseriei, este susinut de faptul c, n cteva cazuri clare, orfH708 intact este localizat n aval de gena atpA. Inversia pare s existe ntr-o serie de subpopulaii minore ale DNA mitocondrial. n linile androsterile inseria de 5 kb creaz un nou orf de 522 nucleotide (orfH522) ncepnd cu nucleotidul 164 n aval de codonul stop al atpA. Acest ORF specifica fie folosirea singurului codon start, o protein de 19,5kDa, sau o protein de 14,5kDa (Kohler si colab., 1991). Primele 57pb ale orfH522 sunt homoloage cu cele ale orfB de la Oenopthera (Hiesel i colab., 1987). Aceast parte a orf H522 prezint de asemenea homologie cu secvena 5a orfH708 localizat mai jos de gena cob n liniile fertile. Secvenele rmase ale orfH522 nu prezint homologie cu o anumit gen mitocondrial cunoscut sau cu alte secvene din libraria EMBO. Nu s-a reuit obinerea de semnale de hibridizare folosind sonde din aceast regiune cu DNA mitocondrial sau cu DNA plastidial din plantele fertile. Totui o secven situat la 11 nucleotide n aval de orfH522, este homoloag cu partea de nceput a genei atp 9 la floarea-soarelui (Kohler si colab., 1991, Recipon, 1990).

Originea inseriei de 5kb la linia androsteril PET1

S-a studiat (Horn, 1991), inseria de 5kb prin hibridizare cu ajutorul metodei Southern, cu sonde ce acoper ntreaga inserie, la nivelul DNA mitocondrial , nuclear i cloroplastic , pentru a obine informaii despre originea secvenei ce formeaz inseria de 5kb. Sonda Ins1 ce prezint secvene homoloage cu regiunea atp9 a insertului, a generat semnale in cazul experimentelor cu DNA mitocondrial i nuclear, la liniile fertile de H.annuus i H.petiolaris.Analiza secvenelor a artat c regiunea, din zona de inserie de 5kb
59

IOANA ISPAS

homoloag cu DNA mitocondrial de la liniile fertile, const dintr-o secven de circa 1kbz, localizat n liniile fertile ntre gena coxI i cox III. Totui sondele Ins 2 i Ins 3 ce acoper restul secvenelor de inserie de 5kb nu produce semnale de hibridizare cu DNA mitocondrial, DNA nuclear din plantele fertile (Horn, 1991, Zetsche i Horn, 1993) i nici cu DNA plastidial. S-a ajuns la concluzia c att orfH522 ct i inseria par s fie compuse din secvene diferite parial homoloage cu DNA mitocondrial i cu DNA nuclear i parial cu secvene de origine necunoscut. Un fragment de 1,7kb ce reprezint o parte din insert a fost folosita ca sond. S-a constatat c o secven de 9kb ce acoper o parte din Dna mitocondrial MAX1 prezint homologie cu orfH873 ca i cu orfH522. Totui aceast ultim secven nu prezint homologie cu gena atpA i gena cob. Populaia investigat la H. petiolaris a artat o organizare identic a ADN mitocondrial din regiunea de flancare a genei atpA i a genei cob n liniile fertile de H.annuus.Dac subpopulaia de molecule DNA ce prezint inversia, reprezint organizarea iniial a DNA mitocondrial n H.petiolaris, atunci se pare c ncruciarea interspecific a cauzat evenimente de recombinare care au condus la organizarea specific a PET1. Linia androsteril MAX1 conine o regiune homoloag cu secvena de inserie de 5kb din PET1 (Hahn i Friedt, 1992, Hahn i Friedt, 1994). Cercetrile au fost realizate pe 5 populaii slbatice de H. maximilliani (MAX30 , MAX40, MAX42, MAX44, MAX 1654). Sa constatat ca populatia MAX30 a aratat aceeai homologie i o organizare identic a DNA mitocondrial ca i MAX1 (Hahn, 1993). Aceste rezultate pot fi interpretate astfel: inseria de 5 kb poate fi datorat fie unor noi evenimente de recombinare, induse de ncrucirile interspecifice ale H. petiolaris cu H.annuus, fie de secvena de inserie original, care a fost deja prezent n populaia iniial de H.petiolaris. O alt ipotez legat de apariia liniei androsterile PET1 este aceea c, zona rearanjat a locusului atpA observat n PET1 este deja prezent ca sublimon n DNA mitocondrial de la liniile fertile (Laver i colab., 1991, Moneger i colab., 1994 ). Orf H522 se pare c are originea n molecule de ADN substoechiometrice, care rezult din evenimente aberante de recombinare. Sublimonul se pare mai degrab, c a fost amplificat n cursul primei ncruciri ,dect c a fost rezultatul unei noi recombinri n linia mascul steril, indus de incompatibilitatea citoplasm-nucleu. Aceast teorie este argumentat de amplificarea unui fragment din DNA mitocondrial de la linia fertil, cu primeri alei pentru zona rearanjat a PET1, ceea ce corespunde cu analiza Southern, in care s-a observat c zona rearanjat a locusului atpA apare la un nivel redus n linia fertil i invers (Laver i colab., 1991).

Pattern-ul transcripional al genei atpA

Pentru a detecta diferenele n patternul transcripional al zonelor rearanjate de la plantele fertile i sterile, s-au folosit sonde DNA ce acoper locusul atpA, inseria de 5kb, zonele de flancare a inversiei i gena cob (Kohler, 1991). S-au observat alterri, n ceea ce privete patternul transcripional ntre liniile BASO i BASO (CMS), la nivelul locususlui atpA. Diferenele aparente analizate, cu sondele corespunztoare ale regiunilor de flancare 3ale genei cob, au aprut ca rezultat al hibridrii interspecifice, datorit prezenei unei repetiii inverse de 261pb la locusul atpA. S-a identificat transcriptul genei atpA de aproximativ 1700 nucleotide, n plantule etiolate, de la linia fertil BASO, ( n extracte de RNA total ). La nivelul liniei androsterile BASO(CMS), cu o sond ce acoper captul 5al genei atpA, s-a constatat c exist un transcript de 2500 de nucleotide.S-a mai detectat un transcript adiional de circa 1200 de
60

Aspecte moleculare privind citoplasma androsteril PET1 de la floarea soarelui ( Helianthus annuus L.)

nucleotide (cu sonde homoloage cu captul 3 al atpA i cu orfH522 la linile androsterile). Cu o sond ce conine o secven localizat n amonte de orfH522 cu 465pb, care este homoloag cu capul 5 al genei atp9 (Recipon, 1990) s-au detectat transcripi adiionali de 250 nucleotide, 500 nucleotide, 3100 nucleotide. Aceste semnale detectate sunt datorate hibridizrii acestor sonde cu transcripi ai genei atp9. Prezena transcripilor de 1700 nucleotide i 1200 nucleotide din RNA-ul plantelor androsterile se explic prin faptul c fie cei doi transcripi se obin prin scindarea unui transcript primar prin procesare, fie transcripia se oprete n aval de gena atpA i este iniiat mai apoi n amonte de orfH522. Explicaia nu este ns valabil pentru secvene cu o lungime de 250 de nucleotide. Hibridizarea cu RNA total izolat din H. petiolaris folosind sondele DNA menionate anterior, genereaz acelai transcript atpA ca i RNA de la plantele fertile de H. annuus (Kohler i colab., 1991). Moneger i colab., 1994, folosind linii diferite de floarea-soarelui, au obinut un pattern similar al transcripilor locusului atpA pentru liniile fertile i androsterile. Patternul transcripional, obinut sub forma unui extract nuclear brut de HA89 este ns mult mai complex (Horn i colab., 1991, Sicullela i Palmer, 1988). n transcriptul orfH522 s-au identificat 2 situsuri de editare a RNA, ambele fiind conversii C-----U (Moneger, 1994). Prima, la pozitia 16, conduce la nlocuirea serinei cu leucina i reprezint un situs de editare conservat care este de asemenea prezent n orf B de la Oenthera (Schuster si colab., 1991) i la floarea-soarelui (Quggliariello si colab., 1990). Al doilea situs de editare, la poziia 38, determin nlocuirea argininei cu cisteina, este localizat n regiunea orfH522 i nu arat homologie cu alt parte a ADN mitocondrial (Moneger i colab., 1994). Un mecanism ce conduce la restaurarea fertilitii mascule poate fi cel care acioneaz prin modificarea exprimrii orf-urilor asociate cu androsterilitatea citoplasmatic (Laver i colab., 1991). S-a analizat transcripia la nivelul locusului atpA, n cazul a doi hibrizi ce restaureaz fertilitatea : RHB4 i RHB5, liniilor androsterile PET1 i conin gene restauratoare nucleare. S-a artat c cei doi hibrizi prezint co-transcripi ai atpA i orf H522 de 2500 de nucleotide. Nu s-au inregistrat efecte cantitative i calitative ale genelor de restaurare asupra patternului transcripional al hibrizilor restauratori de fertilitate (Kohler i colab., 1991). Totui, in antere s-a observat o reducere esut specific a nivelului steady-state al transcriptului mare, ce conine orfH522 i care poate fi observat la hibrizii restauratori de fertilitate, n timp ce nivelul transcriptului de 1700 de nucleotide rmne constant (Moneger i colab., 1994). Produsul genei nucleare de restaurare la nivel post-transcripional destabilizeaz noul transcript mitocondrial, ntr-un mod esut specific. Nu s-a observat editarea diferenial a orfH522 ca rezultat al restaurrii fertilitii de ctre genele de restaurare (Moneger i colab., 1994).

Translaia in organello a produilor mitocondriali din plantele de floarea-soarelui fertile i androsterile

La floarea-soarelui, analiza liniei androsterile citoplasmatice PET1 arat o singur diferen, n ceea ce privete produii translaiei mitocondriale in organello. Astfel n linia CMS s-a identificat un polipeptid de 16kD, (Horn i colab., 1991, Laver i colab., 1991) sintetizat n toate backgroundurile nucleare investigate cu sursa de androsterilitate citoplasmatic PET1 (HA89, BASO, RHA1G, RHA2G, RPA842). Acest fenomen contrasteaz cu situaia de la porumb (Zea mays) i Petunia, unde s-a observat o reducere a proteinelor asociate cu CMS, n esuturile somatice (Dewey i colab., 1987, Nivisin i
61

IOANA ISPAS

Hanson, 1989). Totui n florile mascule de floarea-soarelui, nivelul sintezei polipeptidului de 16 kD este de dou ori mai redus, la formele restauratoare de fertilitate, comparativ cu linia androsteril (Moneger i colab., 1994). Aceast reducere n exprimarea proteinei de 16kDa, dup restaurarea fertilitii, poate fi privit ca un argument, n favoarea ipotezei c polipeptidul de 16kD, asociat cu CMS, este cel mai probabil responsabil pentru disfuncia mitocondrial ce conduce la avortarea microsporilor. Mrimea polipeptidelor codificate de orfH522 coincide cu mrimea estimat a noii proteine de 16kDa sintetizate n urma translaiei in organello, n mitocondriile din linia androsteril (Horn i colab.,1991, Laver i colab.,1991). Prin folosirea anticorpilor policlonali fa de proteinele de fuziune derivate din secvena orfH522, s-a observat c acetia precipit doar cu proteina de 16kDa, din mitocondriile plantelor androsterile. Aceste rezultate stabilesc c orfH522 codific proteina de 16kDa. Folosind anticorpi fa de 2 oligopeptide sintetice deduse din secvena proteic prezis a orfH522 (Moneger i colab., 1994) au obinut aceleai rezultate. n urma tratamentului cu carbonat de sodiu (Fujiki i colab., 1982) s-a artat c proteina de 16kDa este membranar ca i cea de 13kDa de la porumb (Hack i colab., 1991). Totui aceasta nu pare a fi o trstur general a proteinelor asociate cu CMS, pentru c la Petunia, o protein de 25kDa este prezent i n membran i n fracia solubil (Nivison i Hanson, 1989). S-a investigat prezena proteinei de 16kD de la PET1, i n alte linii CMS. Din 26 de linii CMS (Horn, 1994), 9 au exprimat proteina de 16 kDa. Aceste linii CMS s-au obinut fie prin ncruciri interspecifice ale speciilor H.argophyllus ,H.exilis, H.neglectus,H.petiolaris,2 subspecii de H.praecox fie prin mutageneza de la 2 menintori ai citoplasmei PET1. Exprimarea subunitii alfa a F1-ATP-azei se modific datorit patternului transcripional al atpA i co-transcripiei genei atpA cu orfH522. Cei 2 transcripi ai locusului atpA sunt prezeni n fracia polisomal total din liniile androsterile i hibride astfel nct subunitatea alfa a F1-ATP-aza poate fi translat din transcriptul normal ca i din transcriptul adiional asociat cu orfH522 (Moneger i colab., 1994). n acest fel, exprimarea subunitii alfa a F1-ATP -azei poate fi afectat de translaia orfH522. Subunitatea alfa a F1-ATP-azei reprezint cel mai mare produs de translaie in organello de la liniile fertile i androsterile. Nivelul subunitii alfa, din liniile fertile i sterile, ca i cel din restauratorii de fertilitate este similar, prezentnd o masa molecular identic, cu cea obinut n urma digestiei cu proteaza V8, de la Staphyllococcus (Horn i colab.,1991). Prin teste imunologice (ELISA indirect ) s-a artat c nu exist nici o diferen ntre cantitatea de subunitate alfa a F1-ATP-aza de la linia fertil BASO, de la linia CMS BASO i restauratorii de fertilitate. Deci modificrile n nivelul subunitii alfa prezente n mitocondrii (Hustedt i colab., 1992) nu par s aib vreun rol n generarea CMS la plantele cu linia androsteril PET1.

Studiul efectelor androsterilitii citoplasmatice asupra principalelor caractere utile agronomic, la floarea-soarelui
ntruct au fost identificate numeroase surse CMS este important pentru amelioratori s cunoasc avantajele genetice i sau agronomice ale acestora, pentru a le putea exploata cu eficien maxim n programele de ameliorare. Christov (1998) a evaluat performanele agronomice pentru 9 genotipuri hibride, provenite din 13 surse CMS (PET1, PET4, ANN10, ANN14, ARG1, ARG3, ARG4, PRH1,
62

Aspecte moleculare privind citoplasma androsteril PET1 de la floarea soarelui ( Helianthus annuus L.)

PRR1, DEB1, PII4, GVL) i a stabilit importana efectelor nucleare i citoplasmatice pentru caracteristicile biologice studiate: nlimea plantelor, diametrul capului i coninutul n ulei. Principalele concluzii confirm prevalena efectelor nucleare asupra celor citoplasmatice i puternicele interacii nucleu-citoplasm. 1. Cantitatea de smn. Nu s-au nregistrat efecte citoplasmatice semnificative asupra acestei nsuiri. S-au observat o serie de efecte pozitive pentru anumii hibrizi, combinaii ale surselor CMS: ANN2 i GIG1. Efecte negative s-au nregistrat n cazul folosirii liniilor CMS: ANN2, ANN4, PET2, MAX1, PET 1. 2. Inlimea plantelor. La sursele ANN1, ANN2, PET2, PET1,s-a constatat c androsterilitatea citoplasmatic determin creterea plantelor n nlime. 3. Coninutul n ulei. Nu s-au detectat efecte pozitive ci mai degrab efecte negative n cazul hibrizilor ce au ca prini liniile CMS: ANL2, PET2, PET1. 4. Perioada de inflorire. Tendina noilor surse CMS este de a crete durata nfloririi (hibrizii provenii din liniile CMS: ANL2, ANN1, ANN4, ANO1, BOL1, MAX1 i PET1 sunt cu nflorire trzie). Prin analiza varianei s-a aratat c interaciile nucleu-citoplasm sunt mai mari, n cazul BOL1 , MAX1, ANO1, dect n cazul liniilor CMS GIG1 sau PET1. Efectele liniilor androsterile asupra unor caractere de importan agronomic sunt n general reduse, rar sunt semnificative i n multe cazuri au tendina de a determina efecte negative. O posibil explicaie este aceea c liniile inbred bazate pe citoplasma androsteril PET1 au beneficiat de o ameliorare lung, eforturile amelioratorilor conducnd la o relaie optim ntre genotipul nuclear i cel mitocondrial la H.petiolaris. Totui unele combinaii nuclearo-citoplasmatice exprim un potenial ridicat pentru caracterele agronomice majore, dar n majoritatea cazurilor acestea sunt greu de prevzut.

Aspecte generale privind conceptul de restaurare fertilitii

Sistemele de restaurare a fertilitaii sunt de dou tipuri : sporofitice (care restaureaz fertilitatea n esuturile sporofitice sau n alte esuturi, nainte de meioz ) i gametofitice (care restaureaz fertilitatea dup meioz, la nivelul microsporilor sau la nivelul gruncioarelor de polen). Aceste diferene antreneaz modaliti diferite de transmitere. Astfel: o plant diploid, heterozigot pentru un restaurator dat, cu androsterilitate citoplasmatic, va produce dou tipuri de gruncioare de polen: cu i fr restaurator. n cazul restaurrii sporofitice, ambele clase de grunciori vor fi funcionale, n timp ce n cazul restaurrii gametofitice, doar gameii ce prezint i gena de restaurare vor fi funcionali. Sistemele de restaurare sunt extrem de diferite, n principal n funcie de numrul de gene de restaurare implicate. De exemplu: pentru porumbul androsteril T, citoplasma androsteril PET1 de la floarea-soarelui i citoplasma T de la ceap restaurarea complet este asigurat de 2 gene de restaurare independente. Se cunosc o serie de sisteme de restaurare care implic loci de restaurare duplicai. De exemplu: la porumb, gena Rf8 poate substitui parial Rf1 pentru restaurarea fertilitii citoplasmei T. O situaie similar apare i la citoplasma PET1 de la floarea-soarelui, citoplasma T de la ceap i CMS de la Phaseolus. Aceste funcii suprapuse pot fi o consecin a duplicrii funciilor genelor sau o indicaie c restaurarea poate fi indus de mecanisme extrem de diferite.

63

IOANA ISPAS

Restaurarea fertilitii la floarea-soarelui

Folosirea liniilor androsterile n lucrarile de ameliorare la floarea-soarelui necesit utilizarea unor restauratori de fertilitate ntruct hibrizii rezultai din combinaiile liniilor androsterile cu alte linii sunt sterili .Prin experiene n cmp agronomii au descoperit diferite linii capabile s restaureze parial sau total fertilitatea hibrizilor. O linie de restaurare a fertilitii poate aciona asupra uneia sau mai multor linii androsterile. S-a constatat astfel c : liniile CMS pot fi clar difereniate pe baza comportamentului lor fa de liniile restauratoare de fertilitate. De exemplu: pentru linia androsterila GIG1 s-au identificat 2 linii de restaurare a fertilitii din care una a fost derivat de la linia inbred obinut prin ncruciarea dintre: HA89 (CMS) X MAX40. S-au obinut semine de calitate bun, dei polenul era galben i uneori alb. n alte cazuri s-au format antere de mrime variat, cu o producie moderat de polen. Restaurarea fertilitii polenului este din punct de vedere genetic expresia interaciunilor dintre citoplasm i nucleu, ntruct la nivel molecular restaurarea fertilitii este sub controlul genelor nucleare. n funcie de linia de restaurare i de sursa CMS, n acest proces sunt implicate una sau mai multe gene dominante, eventual complementare.

Determinismul genetic al restaurrii fertilitii la floarea-soarelui

n tabelul 2 sunt prezentate principalele date privind genetica restaurrii fertilitii la floarea-soarelui (H.annuus L). Tabelul 2. Gene implicate n restaurarea fertilitii la floarea-soarelui. Codul FAO pentru liniile Gene implicate n CMS restaurarea fertilitii PET1 Rf1 o singur gen dominant Rf2 Msc1 Rf2 Rf1,Rf2 4 gene 2 gene 3 gene 2gene o gen dominant 2 gene ANL1 PET2 GIG1 o gena 2 gene 3 gene 2 gene dominante 2 gene complementare o gena dominant
64

Sursa sau modul de aciune al genei T66006-2-1 Acc(MO)1338 MZ-1398 H.petiolaris prezent la prinii femeli 2 gene complementare 2 gene complementare, dominante complementare dominante complementare dominante nonalelice, cumulative soiul Progres duplicate, dominante 2 gene complementare dominant 2 gene complementare 3 gene independente RPET2, CMG1 CMG1 RGIG1, CMG2

Aspecte moleculare privind citoplasma androsteril PET1 de la floarea soarelui ( Helianthus annuus L.)

MAX1 ANT1 ANN2 ANN3 RIG1 PEF1

2 gene complementare 1 gen dominant 2 gene complementare o genadominant o gen dominant 2 gene complementare 2 gene complementare

RMAX1, CMG3 RHA274 (Rf1) Rf-ANT P21, RMAX1, PPI413178 P21, RPET2, PI 413180,RHA280 RPET2 Zaria, HA60.

Ipoteze privind modul de aciune al alelelor restauratoare

Pentru a explica aciunea alelelor retauratoare nucleare au fost emise urmtoarele ipoteze: Daca apariia CMS este determinat de disfuncii mitocondriale, atunci restauratorii compenseaz sau nlocuiesc funcia genei mitocondriale distruse. Bonnett i colab. (1991) sugereaz c restaurarea nuclear de la formele cultivate ce au CMS provenit de la Nicotiana, poate declana introducerea n celule, a produilor genelor mitocondriale astfel nct instruciunile nucleare proprii sunt folosite pentru a corecta deficienele n funcionarea mitocondriilor. Daca CMS apare ca rezultat al achiziiei unor gene noi i care genereaz o substan toxic, genele nucleare implicate n restaurarea fertilitii afecteaz abundena genei ce codific substana toxic sau chiar exprimarea acestei gene . Acest utim model coincide cu datele obinute la Petunia (Pruitt i Hanson,1991), porumb (Zea mays) (Dewey i colab.,1987, Wise, 1987), orez (Kadowaki i colab.,1990).La porumb i petunie, aciunea genelor nucleare implicate n restaurare se traduce prin reducerea exprimrii genelor de la locusurile himerice la nivelul tuturor esuturilor. La linia CMS Petiolaris de la floarea-soarelui, analiza restaurrii fertilitii sugereaz c abundena redus a transcriptului este specific celulelor mam, premeiotice ale polenului (Smart i colab., 1993). O alt ipotez este corelaia dintre genele de restaurare i genele implicate n controlul recombinrii DNA mitocondrial, al amplificrii sau meninerii moleculelor substoechiometrice. Introducerea genelor de restaurare ale fertilitii poate determina alterri ale genomului mitocondrial sau amplificarea preferenial a moleculelor substoechiometrice preexistente. Editarea RNA n mitocondriile plantelor (Covello i Gray, 1989, Gualberto, 1989, Hiesel, 1989) reprezint un alt mecanism potenial care explic aciunea genelor de restaurare a fertilitii ntruct editarea diferenial la plantele restaurate va permite obinerea de transcripi cu structur primar i secundar alterat. La fasole, prezena alelelor restauratoare este determinat de deleia DNA mitocondrial la nivelul unei regiuni specifice (Mackenzie i colab.,1988, Mackenzie i Chase, 1990, Johns i colab., 1992). Alterarea genomului mitocondrial ncepe n generaia F1 i determin o fertilitate parial a polenului.Restaurarea incomplet a fertilitii se pare c
65

IOANA ISPAS

este generat de heteroplasmie. n generaia F2 se observ deja pierderea segmentului mitocondrial. Prezena regiunii modificate din DNA mitocondrial este asociat cu sterilitatea n esuturile verzi ale plantelor F2 i cu restaurarea fertilitii i absena secvenei mitocondriale deletate din polenul F2 restaurat (Johns i colab., 1992 ). Aceste date sugereaz c segementul din DNA mitocondrial este pierdut nainte sau n cursul meiozei i al microgametogenezei. Observarea semisterilitii la plantele F1 i la un numar mic de plante F2 reprezint un model al schimbrilor graduale ce afecteaz mitocondria n cursul dezvoltrii plantei. Nu este clar modul n care genele de restaurare afecteaz structura genomului mitocondrial n diferite stadii ale dezvoltarii plantei. Un model alternativ care s explice aciunea genelor de restaurare ale fertilitii este cel realizat pentru Brassica polima -linia androsteril. Organizarea genei mitocondriale atp6 din linia androsteril de la ridiche (Raphanus sativus) (Makaroff, 1989) i de la Brassica napus i Polima napus (Singh i Broun, 1991) este diferit. La ridichi i n liniile androsterile de la Brassica napus, regiunea 5 a genei atp6 din ADN mitocondrial, respectiv a genei RNAt i a pseudogenei RNAt sunt localizate i modificate n DNA mitocondrial din citoplasma de la Polima. Captul 5 al moleculelor RNAm corespunzatoare atp6 normale, la Raphanus sativus (ridiche) i la Brassica napus este probabil format prin procesarea RNAt. Obinerea CMS de la Polima este aparent limitat de rearanjri care au loc mai sus de situsul de procesare. Deci produii genelor de restaurare ale fertilitii pot fi cauza alterrii subtile a specificitii mainriei de procesare ca i schimbri n configuraia transcriptului, care pot fi recunoscute i procesate local. Iwabuchi i colab. (1993) au propus un model de restaurare a fertilitii prin care procesarea urmat de editarea complet a RNA alterat din mitocondrie antreneaz restaurarea fertilitii la liniile androsterile de orez. Ei au demonstrat c procesarea RNA influeneaz editarea post-transcripional. Genele nucleare implicate n restaurarea fertilitii care codific enzime ce proceseaz RNA post-transcriptional, promoveaz producerea de proteine funcionale. Deci interaciile dintre procesarea i editarea RNA au un rol esenial n controlul exprimrii androsterilitii citoplasmatice i n restaurarea fertilitii la plante. S-a demonstrat experimental c n mitocondriile plantelor are loc poliadenilarea RNAm (figura 6). Astfel s-a izolat RNAm din mitocondriile plantelor fertile, sterile i restauratoare care a apoi fost reverstranscris folosind un primer oligo(dT) 18. DNA complementar obinut a fost amplificat prin reacia PCR cu ajutorul unui primer adaptor corespunztor i al unui primer specific pentru secvena orf de interes. Produii PCR obinui aveau dimensiuni de 190pb. Dup clonare i secveniere s-a constatat c toate clonele aveau secvena poliA de 17-21nucleotide care corespunde aproximativ cu lungimea oligo(dT) primerului folosit pentru sinteza ADN complementar. La floarea- soarelui linia steril este caracterizat prin prezena RNAm dicistronic aferent atpA-orf522 .Nivelul acestui transcript este redus dup restaurarea fertilitii ntr-un mod dependent de tipul de esut. Astfel fenomenul se observ doar n florile mascule ale plantelor hibride restaurate dar nu i n esuturile vegetative ale acestora. S-a demonstrat c transcripii atpA-orf522 pot fi poliadenilai in vivo la captul lor 3 terminal, procesul avnd loc n cotiledoane i flori mascule.

66

Aspecte moleculare privind citoplasma androsteril PET1 de la floarea soarelui ( Helianthus annuus L.)

Figura 4. Sitususri de poliadenilare identificate la nivelul ADN mitocondrial de la plantele sterile i restauratori.

Restauratori de fertilitate la floarea-soarelui

La floarea-soarelui, seminele sunt recoltate si folosite n cmp i de aceea hibrizii F1 trebuie s fie fertili. Fertilitatea liniilor mascule poate fi restaurat prin introducerea prin incruciare a genelor nucleare denumite Rf (restorer fertility) . Pentru a conferi fertilitate liniilor CMS sunt necesare una sau mai multe gene de restaurare a fertilitii, n funcie de sursa CMS. Restaurarea i transmiterea genelor de restaurare a fertilitii la floareasoarelui, pentru linia PET1 ca i pentru noile surse CMS este prezentat de Miller (1992). Kinman(1970) a raportat pentru linia de floarea-soarelui T66006-2-1 prezena unei singure gene de restaurare a fertilitii, gena dominant Rf1. Plecnd de la aceasta linie, folosind semine hibride, s-au obinut pentru uz agronomic diferite linii de restaurare ale fertilitii. n 1971 Vrnceanu i Stoenescu au iniiat o serie de cercetri privind prezena diferiilor factori de restaurare ai fertilitii n unele backgrounduri geografice. S-a observat c, doar sursa MZ-1398, derivat din populaia local Mezehedeshy are restauratori de fertilitate. S-a determinat prezena unei singure gene dominante ce controleaz restaurarea: Rf2. Enns i colab. (1970) care au lucrat pe linii canadiene, derivate din ncrucisarea ntre floarea-soarelui cultivat i floarea-soarelui salbatic, au raportat c restaurarea fertilitii este controlat de ctre o singur gen dominant. Fick i colab(1974) au ncruciat liniile de restaurare ale fertilitii Acc(Mo) 1338 din Canada i bcl-17-2-2 din
67

IOANA ISPAS

Frana cu o linie derivat de la T66006-2-1. S-a ajuns la concluzia c linia canadian poart gena Rf1 de restaurare a fertilitii, n timp ce sursa francez de restaurare poart o gen sau mai multe, diferite de Rf1. Kinman (1974) a artat c, pentru ca fenomenul de restaurare a fertilitii s se exprime complet, este necesar i o a doua gen dominant, complementar cu Rf. El a descoperit n populaia F2, (rezultat n urma ncrucirii CMS PET1 cu o linie compozit R1970), un raport de segregare de 9:7(fertil/steril), i a denumit aceast gen Rf2.Astfel au fost obinute o serie de plante homozigote Rf2Rf2, mascule i femele sterile, cu citoplasm PET1. ntruct a fost prezent doar gena Rf2, plantele parentale femele au exprimat o sterilitate complet. Vranceanu i Stoenescu (1978) au determinat relaiile alelice ntre diferite surse de gene de restaurare ale fertilitii. ncrucirile ntre sursele MZ1398 i T66006-2-1B au indicat c MZ-1398 are o gen de restaurare diferit, alta dect Rf1 din T66006-2-1B. Ei au confirmat c T66006-2-1B i MO-1338 din Canada au aceeai gen Rf1.Controlul genetic al restaurrii fertilitii polenului pare s fie dat de aciunea cumulativ a 2 gene dominante nonalelice, ce dau un raport de segregare de 9:6:1 (fertil/parial fertil /steril). Acest studiu i datele prezentate de Fick i colab. (1974) au indicat c factorul de restaurare derivat din aceste linii este codificat de o gen diferit de Rf1 sau de Rf2. Dominguez-Gimenez i Fick (1975) au raportat prezena a 4 gene de restaurare ale fertilitii printre descendenii de tip slbatic H.annuus i H.petiolaris, i a presupus c cel puin 2 alele dominante trebuie s fie prezente la unul din cei patru loci, pentru a se exprima complet restaurarea fertilitii. Una dintre genele care par a fi prezente la prinii femeli din liniile androsterile de HA89(PET1), confirm concluziile lui Kinman (1970), Fick i Zimmer (1974b) i anume c majoritatea liniilor CMS au factori de restaurare. Artemenko (1987) a artat c o singur gen dominant a controlat restaurarea liniei CMS OD2625. Gena de restaurare descoperit i are originea n linia Progress (derivat din ncruciarea interspecific ntre H.tuberosus L. i H.annuus ). Aceast gen ca i cea care codific restaurarea fertilitii la H.petiolaris au fost localizate pe cromozomi homologi(nu sau observat fenomene de crossing-over ntre ele ). Kukosh (1984) a raportat prezena unei singure gene dominante Rf1, responsabil de restaurarea fertilitii mascule pentru linia androsteril derivat de la H.annuus ssp. Lenticularicke ,sau citoplasma CMS ANL1. S-au descoperit totui cteva linii menintoare ale PET1, ce pot restaura CMS ANL1. Aceste gene se disting funcional de Rf1 i Rf2, prin aceea c plantele purtatoare prezint antere normale dar sterile, cnd sunt prezente n genomul plantelor cu citoplasma PET1. Acest studiu confirm prezena factorilor de restaurare Rf, la prinii CMS PET1. Cercetri ample ntreprinse de Anashchenko i Kukosh (1984) i Anashchenko i Duka (1985 ) au confirmat controlul genetic al restaurrii fertilitii mascule la floareasoarelui. Ei au studiat 40 de linii de restaurare a fertilitii, din punct de vedere al controlului genetic, la nivelul citoplasmei androsterile PET1. S-a constatat c 5 dintre ele controleaz restaurarea prin 2 gene dominante independente, n timp ce 4 linii controleaz restaurarea prin 2 gene dominante complementare. CMS ANL1 a fost restaurat de 11 din cele 27 de linii, printr-o singur gen dominant. n schimb, alte linii au controlat restaurarea prin: 3 gene non-alelice dominante, 2 gene dominante complementare i 3 gene dominante complementare. La o linie s-a constatat c controlul genetic al restaurrii fertilitii s-a realizat prin 2 gene non-alelice cu efecte cumulative iar n generaia F2 s-au observat 3 clase fenotipice n raportul 1:2:1(fertil/parial fertil/steril). Anaschchenko i colab. (1974) au observat c restaurarea fertilitii la liniile
68

Aspecte moleculare privind citoplasma androsteril PET1 de la floarea soarelui ( Helianthus annuus L.)

androsterile ANL1 este mai complex dect la liniile androsterile PET1, fiind implicate mai mult de 3 perechi de gene ce controleaz restaurarea fertilitii. Lucrnd cu linii de restaurare a fertilitii pentru liniile androsterile ANL1 i PET1 Anaschchenko i Duka (1986) au descoperit linii care au 2 gene non-alelice ce controleaz restaurarea fertilitii, la liniile androsterile ANL1 i PET1. Liniile BC8, CMS HA89 (PET2), CMS HA89 (GIG1) i CMS HA89(MAX1) au aprut prin substituiri la nivelul ADN din genomul HA89 cu secvene de ADN de la plantele cu androsterilitate citoplasmatic CMG1, CMG2, i CMG3 (Miller&Wolf, 1991). Plantele fertile au fost apoi ncruciate, pentru a produce linii de restaurare RPET2, RGIG1 si RMAX1 (Miller si Wolf,1991).Pentru a studia modul n care se transmite restaurarea cele 3 surse CMS, liniile respective au fost apoi ncruciate cu liniile corespunztoare de restaurare a fertilitii (Kurai i Miller,1992). Analiza descendenilor BC1F1 din F2, a indicat c au fost necesare 2 gene dominante pentru restaurarea complet a fertilitii la RPET2. Aceast concluzie a fost diferit de cea a lui Whelan (1980), care n studiile sale preliminare a indicat c restaurarea complet a necesitat 2 gene dominante complementare. O gen dominant din RGIG1 i 2 gene dominante complementare din RMAX1 controleaz restaurarea citoplasmei respective. Linia RHA274(Rf1) nu a fost eficient n restaurarea fertilitii la liniile androsterile PET2 i GIG1, dei o gen dominant din RHA274 a controlat restaurarea fertilitii la linia androsteril MAX1. Iuoras i colab.(1992) au descoperit o nou surs CMS, stabil la diferite condiii de mediu: CMS ANT1, derivat de la H.annuus ssp texanus Heiser. n studii pe plante fertile provenite din ncruciarea CMS ANT1 cu H.annuus ssp. Texanus, s-a descoperit c o singur gen dominant, controleaz restaurarea fertilitii la liniile androsterile. Linia restauratoare a fost denumit Rf-ANT. Plante androsterile au fost descoperite i la liniile de H.annuus: PI 413178 i PI 413180 (Jan, 1988). Aceste surse de CMS stabile au fost denumite ANN2 i ANN3. Sursele CMS au fost ncruciate cu testere de restaurare i cu plante fertile rezultate de la PI413178 i PI 413180 (Jan,1991). Liniile P21, RMAX1 i linia fertil 413178 au restaurat linia CMS ANN2 (controlat de o singur gen dominant ), n timp ce P21, RPET2 i linia fertil 413180 au restaurat linia CMS ANN3 (controlat de o singur gen dominant) iar linia RHA280 a restaurat CMS ANN3 (controlat de 2 gene complementare dominante). Restaurarea fertilitii la liniile androsterile de floarea-soarelui este controlat de aranjamente complexe de gene ce reacioneaz variabil fa de liniile CMS. Studiile de transmitere a restaurrii fertilitii sunt complicate de genele complementare existente n cteva linii parentale femele ca i de genele prezente n liniile de restaurare a fertilitii. Sunt necesare n viitor studii complexe, la nivelul genelor alele, pentru a se face distincie ntre genele implicate n restaurarea fertilitii liniilor androsterile i a determina corelaiile existente ntre genele corespunztoare aflate in liniile androsterile respective.

Perspective
Actualmente se studiaz corelaiile dintre apoptoz la plante i cea de la mamifere din punct de vedere al cilor moleculare de semnalizare. De exemplu s-a analizat modul de eliberare al citocromului c, ceea ce antrenez casacada de enzime proteolitice care determin degradarea specific a DNA nuclear i moartea celular. Analiza imunocitochimic a artat c citocromul c a fost eliberat din mitocondrii n celulele tapet nainte de evenimentele morfologice asociate cu moartea celular. Cercetrile cu markeri biochimici i morfologici specifici apoptozei, efectuate pe citoplasma PET1 de la floarea-soarelui (Baker, 2001) au
69

IOANA ISPAS

indicat c aceasta surs determin apoptoza prematur a celulelor tapetului care se extinde ulterior si n alte esuturi ale anterelor.

Bibliografie selectiv
BINO, R. J. (1985). Histological aspects of microsporogenesis in fertile, cytoplasmic male sterile and restored fertility Petunia hybrid.Theor.Appl.Genet.,69,423-428. BLUM, B., SIMPSON, L. (1992). Formation of guideRNA/mRNA chimeric molecules in vitro, the initial step of RNA editing is dependent on an anchor sequence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 89: 11944-11948. BRAUN, C. J., SIEDOW, J. N., WILLIAMS, M. E., LEVINGS III, C. S . (1989). Mutations in the maize mitochondrial T-urf 13 gene eliminate sensitivity to a fungal pathotoxin. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 86, 4435-4439. BRAUN, C. J., SIEDOW, J. N., WILLIAMS, M. E.,LEVINGS III, C. S (1990). Fungal toxins bind to the urf 13 protein in maize mitochondria and E.coli.Plant Cell,2,153-161. BURLOV, V. V. (1974). Utilization of male sterility in sunflower breeding for heterosis p.353-360.In Proc.6th. Int.Sunflower Conf. Bucharest, Romania.22-24 July, 1974.Int. Sunflower Assoc.Paris, France. CONNETT, M. B., HANSON, M. R., ( 1990).Differential mitochondrial transport through the cyanide-sensitive and cyanide insensitive pathway in isonuclear lines of cytoplasmic male sterile ,male fertile and restored Petunia. Plant Physiol., 93, 1634-1640. COVELLO, P. S., GRAY, M. V. (1989). RNA editing in plant mitochondria. Nature, 341, 662-666. CROUZILLAT D., LEROY, P. PERRAULT A., LEDOIGT G . (1987).Molecular analysis of the mitochondrial genome of Helianthus annuus in relation to cytoplasmic male sterility and phylogeny. Theor. Appl. Genet. 74:773-780.. DEWEY, R. E., LEVINGS III, C. S., TIMOTHY, D. H. (1986). Novel recombinations in the maize mitochondrial genome produce a unique transcriptional unit in the Texas male sterile cytoplasm. Cell, 44, 439-449. DEWEY, R. E., LEVINGS III, C. S., TIMOTHY, D. H (1987). A mitochondrial protein associated with cytoplasmic male sterility in the cytoplasm T of maize. Proc. Natl. Acad. Sci., USA , 84, 5374-5378. FAURON, C. M., CASPER, M., GESTELAND, R., ALBERTSEN, M. (1992). A multi recombination model for the mitochondrial rearrangements seen in maize CMS-T regenerated plants. The Plant J., 2, 949-958. FOLKERTS, O., HANSON, M. R. (1991). The male sterility-associated pcf gene and the normal atp9-1 gene in Petunia are located on different mitochondrial DNA molecules. Genetics, 129, 885-895. FUJIKI Y., HUBBARD AL., FOWLER S., LAZAROW PB. (1982). Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate tratment: application to endoplasmatic reticulum. J. Cell Biol. 93, 97-102. GEORGIANA -TODOROVA J. (1984). Interspecific hybridisation in the genus Helianthus L. Z. Planzenzuchtg. 93:265-279. GERSTEL, D. U. (1980). Cytoplasmic male sterility in Nicotiana. Tech. Bull. N. C. Agr. Res. Ser., 2635, 1-31. HAHN, V., FRIEDT, W. (1992). Molecular analysis of the mitochondrial DNA of cytoplasmic male sterile sunflower cytoplasm MAX1. In: Proc.13 th International Sunflower Conf. Pisa, Italy, pp. 1466-1471.
70

Aspecte moleculare privind citoplasma androsteril PET1 de la floarea soarelui ( Helianthus annuus L.)

HAHN, V., FRIEDT, W (1994). Molecular analysis of the CMS-inducing MAX1 cytoplasm in sunflower. Theor. Appl. Genet. (in press). HAKANSSON, G., GLIMELIUS, K., BONNETT, H. T. (1990). Respiration in cells and mitochondrial of male fertile and male sterile Nicotiana species. Plant Physiol., 93, 367-373. HANSON, M. R. (1991). Plant mitochondrial mutations and male sterility. Annu.Rev. Genet., 25, 461-486. HERNOLD, M., SUHARSONA, S., LITVAK, S., ARAYA, A. (1992). Male sterility induction in transgenic tobacco plants with non-edited atp9 mitochondrial gene from wheat. In Book of poster abstracts XIII th Eucarpia Congress, pp. 85-86. HORN, R., KOHLER, R. H., ZETSCHE K. (1991). A mitochondrial 16kDa protein is associated with cytoplasmic male sterility in sunflower. Plant Mol. Biol. 17, 29-36. HORN R. (2001) . Molecular diversity of male sterility inducing and male fertile cytoplasms in the genus Helianthus. Theor. Appl. Genet. (im Druck). HORN, R., HUESTEDT J. E. G., HORSTMEYER A. (1996). The CMS-associated 16 kDa protein encoded by orfH522 is also present in other male sterile cytoplasms of sunflower. Plant Mol. Biol. 30: 523-538. KOHLER R.H., HORN R., LOSSL A.,ZETSCHE K. (1991). Cytoplasmic male sterility in sunflower is correlated with the co-transcription of a new open reading frame with the atpA gene. Mol. Gen. Genet. 227: 369-376. HORN R., FRIEDT W. (1998) . CMS mechanisms in sunflower How many are there? In: Plant Mitochondria: From Gene to Function, eds. IM Moller, P Gardestrom, K Glimelius, E Glaser, Backhuys Publishers, Leiden, S. 79-82. IWABUCHI, M., KYOZUKA J., SHIMAMOTO, K. (1993). Processing followed by complete editing of an altered mitochondrial atp6 RNA restores fertility of cytoplasmic male sterile rice. EMBO J., 12, 1437-1446. JOHNS, C., LU, M., LYZNIT, A., MACKENZIE, S. (1992). A mitochondrial DNA sequence is associated with abnormal pollen development in cytoplasmic male sterile bean plants. The Plant Cell, 4, 435-449. KADOWAKI, K. I., SUZUKI, T., KAZAMA, S. (1990), A chimeric gene containing the 5 portion of atp6 is associated with cytoplasmic male sterility of rice. Mol. Gen. Genet., 224, 10-16. KAUL, M. L. H. (1988). Male sterility in higher plants. In:Monographs an theoretical and Applied Genetics, Springer -Verlag, Berlin Heidelberg, New York, vol10, pp. 758-775. KINMAN, M. L. (1970). New developments in the USDA and state experiment station sunflower breeding programs, p.181-183. In Proc. 4th. Int. Sunflower Conf. Memphis, T. N. 23-25 June (1970). Int. Sunflower Assoc.Paris France. KOHLER, R., HORN, R., LOSSL, A., ZITSCKE, K. (1991). Cytoplasmic male sterility in sunflower is correlated with the co-transcription of a new open reading frame with the atp A gene. Mol. Gen. Genet., 227, 369-376. KURAL A., J. F., MILLER (1992). The inheritance of male fertility restoration of the PET2, GIG1 and MAX1 sunflower cytoplasmic male sterility sources p.1107-1112.In Proc.13 th Int.Sunflower Conf. Pisa Italy 7-11 Sept.,1992.Int. Sunflower Assoc. ,Paris , France. LEAVER, C. J. (1991). Mitochondrial Genetic Information In: Huang A. H. C. (ed). Molecular Approaches to Compartimentation and Metabolic Regulation.American Society of Plant Physiologists. pp. 48-58. LECLERCQ P. (1966). Une sterilite male utilisable pour la production dhybrids simples de tournesol. Ann. Amelior. Plant, 16, 135-144..
71

IOANA ISPAS

LEROY P., BAZETOUX S., QUETIER F., DELBUT, J., BERVILLE A. (1985). A comparison between mitochondrial DNA of an isogenic male sterile (S) and male fertile (F) coryle (HA 89) of sunflower. Curr. Genet 9, 245-251. LU, B., HANSON, M. R. (1992). A single nuclear gene specifies the abundance and extend of RNA editing of a plant mitochondrial transcript. Nucleic Acids Res., 20, 5699-5703. MACKENZIE S. A., CHASE PR, D. R., BASSETT, M. J. (1988). Mitochondrial DNA rearrangement associated with fertility restoration and cytoplasmic male sterility in Phaseolus vulgaris L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85, 2714-2717. MARIANI C., GOSSELE, V., DE BEUCKELEER, M., DE BLOCK ., M. GOLDBERG, R. B., DE GREEF, W. (1992). A chimeric ribonuclease inhibitor gene restores fertility to male sterile plants. Nature, 357, 384-387. MILLER J. F., S. L.,WOLF (1991). Registration of three cytoplasmic male sterility and three restorer sunflower germoplasm lines. Crop Sci., 31, 500. MONEGER F., SMART, C. J., LEAVER, C. J. (1994). Nuclear restoration of cytoplasmic male sterility in sunflower is associated with tissue -specific regulation of a novel mitochondrial gene. EMBO J., 13, 8-17. NIVISON H., HANSON T., M. R. (1989). Identification of a mitochondrial protein associated with cytoplasmic male sterility in Petunia. Plant Cell, 1, 1121-1130. RECIPON H. (1990). The sequence of the sunflower mitochondrial ATP-ase subunit 9 gene. Nucl. Acids Res. 18, 1644. SAMALL, I., SUFFOLK, R., LEAVER, C. J. (1989). Evolution of plant mitochondrial genomes via substoechiometric intermediates. Cell, 58, 69-76. .SCHEIKE, R., GEROLD, E, BRENNICKE A., MEHRING -SEMPLER, M.,WRICKE, G. (1992). Unique patterns of mitochondrial genes transcripts and proteins in different male sterile cytoplasms of Daucus carota. Theor. Appl. Genet., 83, 419-427. SICULELLA L., PALMER JD. (1988). Physical and gene organization of mitochondrial DNA in fertile and male sterile sunflower CMS-associated alterations in structure and transcription of the atpA gene. Nucleic Acids Res., 16, 3787-3799. SKORIC, D. (1988). Sunflower breeding. Uljarstvo, 25 (1), 1-90. SMART, C. J., LEAVER,C. J. (1993). Cell specific regulation of the mitochondrial genome during male flower development in sunflower. Journal of Cellular Biochemistry.Keystone Symposia and Molecular and Cellular Biology, pp.24. SNEEP J., HENDRIKSEN, A. J. T. (1979). Plant Mitochondria. Publication of Kouinklijk Kweekbedrijf en Zaadhandel D. J. von der Have 1879-1979, Pudoc,Wageningen, pp. 127130. SPASSOVA. M., MONEGER, F., LEAKER, C. J., CRISTOV M., ATANASSOV, A. NYKAMP, H. J. J., HILLE, J. (1993). Molecular analysis of three independently selected cytoplasmic male sterile sunflower sources.Mol.Gen.Genet.,submitted. WHELAN, E. D. P. (1978). Hybridzation between annual and perennial diploid species of Helianthus. Can. J. Genet. Cytol. 20, 523-530. WHELAN, E. D. P., W. DEDIO (1980). Registration of sunflower germoplasm composite crosses CMS 1,CMS2,CMS3. Crop Sci. 20, 832. YOUNG, E., G., HANSON, M. R. (1987). A fused mitochondrial gene associated with cytoplasmic male sterility is developmentally regulated. Cell, 50, 41-49. ZABALETA, E., MOURAS A., HERNOULD, M., SUHARSONO AND ARAYA A. (1996). Transgenic male-sterile plant induced by an unedited atp9 gene is restored to fertility by inhibiting its expression with antisense RNA. Proceedings of the National Academy Sciences of the USA 93: 11259-11263.
72