Sunteți pe pagina 1din 10

Tehnici de laborator si rezultate 1. Reactii serologice simple (aglutinare, precipitare) 1.

1 Metode de aglutinare
Principiile aglutinarii Precipitarea si aglutinarea sunt expresia visibila a agregarii antigenelor si anticorpilor prin formarea unui mediuu in care particulele antigenice sau moleculele alterneaza cu moleculele anticorpilor. Precipitarea este termenul utilizat pentru agregarea antigenelor solubile. Aglutinarea este termenul utilizat pentru descrierea testului de agregare a macroparticulelor antigenice. Aglutinarea particulelor la care antigenul solubil este absorbit reprezinta o metoda serica de evidentiere a precipitarii. Aceasta metoda utilizeaza drept suport sintetic pentru antigen particulele de latex si carbunele coloidal. Celulele fara legatura cu antigenul cum ar fi eritrocitele pot fi invelite cu antigen si utilizate ca suport biologic in reactia de aglutinare. Toate celulele bacteriene pot contine un antigen care se va lega cu anticorpii produsi ca raspuns la acel antigen. Calitatea rezultatelor depinde in principal de trei factori: timpul de incubare cu sursa de anticorpi; cantitatea si aviditatea antigenului conjugat cu carrier-ul; conditiile mediului de testare. Testele de aglutinare sunt usor de realizat, fiind cele mai sensibile teste disponibile in mod curent. Aceste au un larg domeniu de aplicare in diagnosticul clinic al tulburarilor imune, infectioase sau noninfectioase. Latex aglutinarea In tehnica de aglutinare cu latex moleculele de anticorpi sunt fixate pe suprafata particulelor de latex. Mai multe molecule de anticorpi (Ac) pot fi legate de fiecare particula de latex, crescand numarul potential al situsurilor de legare. Daca un antigen (Ag) este prezent intr-o proba cum ar fi proteina C reactiva (CRP), antigenul se va lega de situsurile combinative ale anticorpilor expusi pe suprafata particulelor de latex, formand agregate vizibile rezultate in urma legarilor incrucisate dintre particulele de latex si antigen (figura 1). Metodele bazate pe latex aglutinare trebuie realizate in conditii standardizate. Numarul de legaturi Ag Ac poate fi influentat de urmatorii factori: pH-ul mediului de reactie; osmolaritatea solutiei; concentratia ionica a solutiei.

1/10

Coaglutinarea si aglutinarea latex liposom intensificata Coaglutinarea este o varianta a latex aglutinarii care utilizeaza Ac legati de particule ce intensifica vizibilitatea aglutinarii. Aceasta metoda este inalt specifica, dar mai putin sensibila pentru determinarea cantitatilor mici de Ag (figura 2). Testul de floculare Testul de floculare pentru detectia Ac se bazeaza pe interactiunea Ag solubile cu Ac care are drept rezultat formarea unui precipitat de particule fine. Aceste particule macro sau microscopice sunt vizibile doar datorita faptului ca produsul de precipitare este fortat sa ramana intr-un spatiu limitat. Metoda este utilizata pentru testarea serologica a sifilisului (VDRL si RPR). Aglutinarea directa bacteriana Majoritatea testelor de baza sunt acelea care masoara Ac produsi de gazda fata de determinantii antigenici de pe suprafata bacterie ca raspuns la infectie. Intr-o suspensie densa de becterii legarea Ac specifici de Ag de suprafata bacteriene determina gruparea bacteriilor in agregate vizibile, metoda poarta numemle de aglutinare bacteriana. Formarea agregatelor in solutie este influentata de forte electrostatice, asadart sunt necesare respectarea anumitor conditii pentru obtinerea rezultatelor satisfacatoare. Utilizarea serului fiziologic ce contine ioni pozitivi liberi in procesul aglutinarii intensifica agregarea bacteriilor deoarece majoritatea bacteriilor expun la suprafata incarcatura negativa ceea cele face sa se respinga intre ele. Este de preferat ca pentru aceasta metoda sa se utilizeze drept suport de reactie tubul ci nu lama, deoarece acesta nu permite evaporarea mediului de reactie ceea ce duce la marirea timpului de reactie dintre Ag Ac. Hemaglutinarea directa sau pasiva (PHA) Hemaglutinarea (aglutinarea celulelor rosii sanguine) este un test de detectie a Ac. In aceasta tehnica eritrocitele swunt invelite cu diferite substante precum extracte de celule bacteriene, ricketsia, fungi patogeni, protozoare sau cu polizaharide ori proteine purificate. Eritrocitele umane de grup 0, ovine sau de iepure, actioneaza ca vectori pentru detectarea si titrarea Ac corespunazatori prin aglutinare. Aceasta tehnica poarta numele de hemaglutinare indirecta sau pasiva, deoarece nu Ag eritrocitare se leaga de Ac, ci Ag pasive atasate lor. Pentru a avea siguranta ca rezultatul pozitiv se datoreaza Ac anti Ag absorbit si nu Ac anti ertrocit natural, este necesara utilizarea de controale pozitive si negative.

2/10

Hemaglutinarea Detecteaza Ac fata de Ag eritrocitare. Ac din proba pot fi diluati in serie si suspensia de celule rosii se adauga la dilutii. Daca este prezenta o concentratie suficenta de Ac eritrocitele sunt legate si aglutinate, daca Ac sunt absenti sau in cantitate insuficienta eritrocitele nu vor aglutina. Tehnica de hemaglutinare poate fi extinsa pentru detectia Ac din ser prin legarea diferitelor Ag la celulele rosii (tabelul 1) Tabelul 1 Exemple de teste imunologice executate prin PHA Anti ribonucleoiproteine nucleare (Anti nRNP) Anti Sm Anti Thiroglobulina si Anti microsomi tiroidieni Anti Rubeola Titru de aglutinare al celulelor de oaie (SCAT) Pentru legarea incrucisata de celule pot fi utilizate substante chimice precum: clorida crmica; acid tanic; glutaraldehida. Unii Ac (IgG) nu aglutineaza direct cu eritroicitele. Acest tip de Ac blocati sau incompleti pot fi detectati utilizand un mediu de intensificare precum reactivul globulinic antiuman. Daca este adaugat, acest reactiv antiglobulinic uman, acest al doilea Ac se leaga de Ac prezenti pe eritrocite. Mecanismul aglutinarii Aglutinarea este agregarea particulelor cu Ag pe suprafata lor precumeritrocitele, prin moleculele de Ac care formeaza punti intre determinantii antigenici. Aglutinarea este influentata de mai multi factori si se crede ca se produce in doua etape: A sensibilizarea B formarea retelei A Sensibilizarea reprezinta prima faza a aglutinarii si consta in atasamentul fizic al moleculei de Ac de Ag de pe membrana eritro-citelor. In aceasta interactiune reversibila Ac se combina rapid cu Ag. Cantitatea de Ac care va reactiona este afectata de constanta de echilibru sau constanta de afinitate, a Ac. Gradul de asociere a Ag cu Ac este afectat de o multitudine de factori si in unele cazuri poate fi alterata in vitro.

3/10

Factorii care influenteaza asocierea Ag Ac incud: 1. Raportul Ag Ac sau numarul moleculelor de Ac referitoare la numarul de situsuri antigenice/celula. 2. Conditii fizice precum pH, temperatura, durata incubarii, putere ionica si impiedicarea sterica. Raportul de descrestere Ag Ac In conditiile excesului de Ac, exista un surplus de situsuri de combinare moleculara Ag Ac nelegate de deterninantii antigenici. Rezultataul concentratiei excesive de Ac este cunoscut ca fenomenul de prozona, care poate aeva drept rezultat reactii fals negative. Acest fenomen poate fi contracarat prin dilutii seriate ale Ac serici pana la cantitati optime de Ac si Ag. pH-ul cu toate ca pH-ul optim pentru toate reactiile nu a fost stabilit, in testarile de laborator de rutina este utilizat un pH de 7,0. Se stie ca unii Ac reactioneaza mai bine la pH mai scazut. Temperatura si durata incubarii Temperatura optima pentru atingerea echilibrului reactiei Ac A g difera pentru diferiti Ac. Ac IgM sunt de reactie rece (domeniu termic de 4 22 C), iar IgG de reactie calda, avand temperatura optima de reactie de 37 C. Timpul de incubare necesar pentru obtinerea eficientei maxime depinde de rata de asociere si disociere a fiecarui Ac specific. In testarea de laborator, timpul de incubare este cuprins intre 15 60 minute. Timpuloptim de incubare variaza de clasa imunoglobulinei si de cat de strans se ataseaza un Ac de Ag specific. Puterea ionica Concentratia salina a mediului de reactie are efect asupra absorbtiei Ac de catre Ag legati de membrana eritrocitara. Ionii Na + si Cl din solutie au efect de ecranare. Acest complex ionic inconjoara si neutralizeaza partial sarcinile opuse ale Ag si moleculele de Ac, impiedicand asocierea Ac cu Ag. Prin scaderea puterii ionice a mediului de reactie cum ar fi putere ionica salina joasa (LISS), absorbtia Ac este intensificata. Impiedicarea sterica Este un important efect fiziochimic ce influenteaza absorbtia Ac de catre Ag de pe suprafata celulara. Daca diferiti Ac cu aproximativ aceeasi constanta de legare sunt directionati anti determinanti antigenici avand distante relative mici, 4/10

pentru a ajunge la situsirile combinative ale receptorilor specifici, vor intra in competitie pentru spatiu. Aceasta competitie poate avea drept efect blocarea mutuala, impiedicarea sterica, nici un tip de Ac ne se va mai lega de determinantul sau corespunzator. Impiedicarea sterica se poate produce de cate ori apare o modificare conformationala a situsului receptorului antigenic relativa la suparafata exterioara. Mai poate sa produca impiedicare sterica si competitia dintre complementul de legare, alte molecule proteice, sau actiunea agentilor care interfereaza cu integritatea structurala a suprafetei celulare. Combinare Ag si Ac este o reactie chimica reversibila. Alterarea conditiilor fizice poate avea drept efect eliberarea Ac din situsuril combinative. Procedura prin care conditiile fizice sunt utilizate cu scopul de a desface complexul Ag Ac se numeste procedura de elutie. B Formarea retelei sau stabilirea legaturilor incrucisate dintre particulele sensibilizate (Ex. Eritrocitele) si Ac avand ca rezultat agregarea, este un proces mult mai lent decat faza de sensibilizare. Formarea legaturilor chimicie si a retelei rezultante depind de abilitatea unei celulei cu Ac atasat la suprafata sa de a veni suficient de aproape de o alta celula astfel incat sa-i permita combinarea moleculelor de Ac cu receptorul antigenic al celei de a doua. Legarea incricisata este influentata de factori cum ar fi cei zeta potentiali. Metode de intensificare a aglutinarii Pentru intensificarea aglutinarii pot fi utilizate mai multe tehnici care incud: 1. Centrifugarea incearca sa inlature problema distantei prin supunerea celulelor sensibilizate unei mari forte gravitationale care contracareaza efectul de respingere si fortele fizice dintre celule. 2. Tratamentul cu enzime proteolitice. Tratamentul enzimatic altereaza zeta potentialul sau constanta dielectrica. Tratamentul mediu cu enzime proteolitice poate inlatura unele din sarcinile negative ale membranei celulare prin: indepartarea reziduurilor de acid sialic, reducerea sarcinii suprafetei celulare, scaderea potentialului zeta, micsorarea distantei relative dintre celule pentru legarea chimica de moleculele Ac specifici. 3. Utilizarea coloizilor. Unii Ac IgG vor aglutina daca potentialul va fi ajustat cu atentie prin adaugarea coloizilor si sarurilor. 4. Testarea antiglobulina umana (AHC). In unele cazuri Ag pot fi atat de adanc incorporate in suprafata membranara incat tehnicile descrise anterior nu vor reusi sa aduca Ag si Ac suficient de aproape pentru legare. Testul antiglobulina umana este face parte din protocilul multor tehnici de laborator pentru facilitarea aglutinarii. Testul direct antiglobulinic poate fi utilizat pentru detectarea unor tulburari precum: anemia hemolitica a nou-nascutilor, reactiile transfuzionale si in hemolizele mediate de complement.

5/10

Interpretarea reactiei de aglutinare Tipurile reactiei de aglutinare sunt prezentate in tabelul 2. Tabelul 2 Clasificarea reactiilor de aglutinare () Rezultat Negativ Aspect mixt Salb (+/) 1+ 2+ 3+ 4+ Descrieire Lipsa agregatelor Putine agregate izolate Mici agregate greu observabile macroscopic, multe eritrocite libere, supernatant tulbure rosiatic Putine agregate mici, abia vizibile macroscopic, multe eritrocite libere, supernatant tulbure rosiatic Agregate de marime medie, putine eritrocite libere, supernatant limpede Multe agregate mari, putine eritrocite libere, supernatant limpede Toate eritrocitele combinate intr-un agregat solid, supernatant limpede

Tehnica inhibarii hemaglutinarii Multe virusuri umane au abilitatea de a se lega la suprafata structurilor eritrocitare a diferitelor specii. Pentru detectia unor Ac antivirali, inhibarea hemaglutinarii (HAI) reprezinta un standard la care se raporteza alte teste de screening si diagnostic. Proba de testat este pretratata cu o substanta precum caolin pentru inlaturarea inhibitorilor nespecifici ca beta lipoproteinele. O cantitate cunoscuta de Ag virale se amesteca cu dilutiile serului, la care se adauga hematii. Daca Ac din ser sun absenti, virusul se ataseaza spontan de hematie si aglutineaza, acest rezultat interpretandu-se negativ. Daca Ac antivirali sunt prezenti, atunci particulele virale se leaga de Ac, prevenind sau inhiband hemaglutinarea, testul fiind considerat pozitiv. Testele fals-negative se datoreaza titrului foarte scazut al Ac sau indepartarii Ac in procesul de pretratare. Testele fals-pozitive pot fi cauzate de inhibitori nespecifici. Utilizarea controalelor este de mare importanta pentru evitarea utilizarii inhibitorilor nespecifici.

6/10

1.2 Metode de percipitare


Reactiile de precipitare Precipitatii pot fi produsi impotriva majoritatii proteinelor, precum si a unor carbohidrati si a unor complexe de carbohidrati-lipidici. Una din primele observatii a reactiilor Ag Ac a fost abilitatea lor de a precipita cand sunt combinate in proportii echivalente sau aproapre echivalente (figura 8-1; pg. 132). Metodele de precipitare prin difuzie in gel permit identificarea facila a complementelor antigenice solubile dintr-un amestec si sunt utile in studiul omogenitatii si identitatii Ac dintr-un material natural (ex.: serul). Aceasta metoda a fost extinsa la examinarea relatieie dintre diferite Ag. Sunt disponibile mai multe sisteme in care testele de precipitare sunt executate in mediu semisolid precum: agarul sau agaroza, sau mediul suport nongel precum acetatul de celuloza. Agarul, extras din alge, s-a observat ca interfereaza cu migratia particulelor incarcate, fiind in mare parte inlocuit cu un alt mediu de imunodifuzie: agaroza, un gel neutru, incolor, transparent. Ag si Ac pot difuza unul fata de celalalt in gel. Daca ei reactioneaza incrucisat, se vor lega unul de altul formand precipitate vizibile in benzi sau linii cand sunt in proportii optime sau aproape optime, totusi trebuie sa fie in sectiuni de agar de forme si marimi identice. Forma benzilor de precipitat depinde partial de greutatile moleculare ale Ag si Ac, daca ambii au aceleasi greutati moleculare, in mod obisnit benzile vor fi drepte, in caz contrar au tendinta sa concave spre constituentul mai cu greutatea moleculara mai mare. Rata difuziei, locatia si densitatea benzilor de precipitat sunt influentate de greutatile moleculare si numarul reactantilor. Laboratoarele clinice utilizeaza mai multe aplicatii ale reactiilor de precipitare: 1. 2. 3. 4. Imunodifuzaia dubla Electroimunodifuzia Imunoelectroforeza Electroforeza de contracurent

1. Imunofidufuzia dubla Tehnica difuziei duble (metoda Ouchterlony), poate fi utilizata utilizata pentru determinarea relatiei dintre Ag si Ac. Principiu Dilutiile Ag si Ac specifici solubili sunt plasate in godeuri adiacente. Daca marimea si forma godeului, distanta dintre ele, temperatura si timpul de incubare, sunt optime, aceste solutii vor difuza, se vor lega una de alta si incrucisat, formand precipitate vizibile. Benzile de precipitare ale probei sunt examinate si comparate cu Ag standard ce a reactionat cu o concentratie cunoscuta a Ac 7/10

specific intr-un test de comparatie. Localizarea precisa a benzii depinde de concentratia si rata de difuzie a Ag si Ac. In conditiile excesului de Ac, banda va fi mai aproape de godeul antigenului. Daca in solutii sunt prezente doua Ag ce pot fi recunoscute de Ac, se vor forma doua benzi de precipitare independente (figura 8-2A; pg. 133). Prin difuzie dubla pot fi identificati Ac asociati tulburarilor autoimune precum artrita reumatoida si lupusul sistemic eritematos (tabelul 3). Tabeleul 3 () Exemple de analizae imunologice executate prin difuzie dubla Anti Ag nuclear artrita reumatoida (Anti RANA) Ribonucleopreoteina antinucleara (Anti nRNP) Anti Scl sau Anti Scl 70 Anti Sm Anti SS A (SS A precipitin, Anti Ro) Anti SS B (SS B precipitin, Anti La) Ac Jo 1 Ac Ku Ac Mi 1 Ac PM 1 Controlul de calitate Antiserul contine Ag solubile cunoscute si trebuie testat concurent cu proba, controlul cunoscut al antiserului diluat. Raportarea rezultatelor Din realatia Ag cu Ac rezulta trei modele de reactie de baza. a) Identitatea. Reactia de identitate este indicata de formarea unui singur arc neted (figura 8-2A; pg. 133). Formarea acestui arc de precipitare datoreata fuziunii dintre Ac si cele doua Ag, arata ca Ac si precipitarile Ag sunt identice in fiecare preparat. Acest fapt nu are semnificatia ca Ag au o identitate absoluta, Ac putandu-le deosebi. b) Nonidentitatea. Un model nonidentic (figura 8-2B; pg. 133) este exprimat cand liniile de precipitare se intersecteaza, deoarece proba nu contine determinanti antigenici comuni. c) Identitatea partiala. Modelul iddentitatii partiale prezinta liniile de precipitare unite, rezultand un pinten, ceea ce indica Ag nonidentice, dar posedand determinanti comuni. Sursele de eroare. Alterarea difuziei poate fi datorata de: condensarea excesiva in godeuri; umplerea necorespunzatoare a godeurilor; 8/10

incubarea insuficienta poate conduce la rezultate fals negative. Aplicatiile clinice. Prin difuzie dubla pot fi identificati Ac asociati urmatoarelor afectiuni autoimune: artrita reumatoida; lupus sistemic eritematos; sindrom Sjorgen; vasculite. Limite. Desi grosimea benzilor de precipitare sugereaza nivelele Ac, difuzia dubla este doar o metoda semicantitativa. Imunodifuzia radiala (RID) Prin tehnicile in gel sepot identifica doar calitativ Ag si Ac, dar dupa modificari suplimentare si utilizarea unei singure imunodifuzii radiale (RID), aceste pot deveni canitative. Tehnica RID este o metoda antitativa, simpla si specifica de identificare si determinare a numarului de proteine atat din serul uman, cat si din alte fluide (tabelul 4). Aceasta tehnica se utilizeaza atunci cand este greoaie prin utilizarea altor proceduri electroforetice standard. Tabelul 4 () Exemple de analize imunologice executate prin imunodifuzie radiala Alfa 1 Acid glicoproteic Alfa 1 Antitripsina Hepatoglobina Transferina C3 C4 C5 Proteina c reactiva Imunoglobuline (IgM. IgG, IgA, si IgD) Principiu

2. Reactii de (electroforeza, imuno-electroforeza ) 3. Reactii serologice complexe 4. Proceduri automate

9/10

5. Tehnici de genetica si bilologie moleculara

10/10