PRCTICA 1.

RECONOCIMIENTO DE BIOMOLCULAS
1.- Identificacin de glcidos con poder reductor algunos glcidos tienen poder reductor ya que tienen el grupo carbonilo libre(-CHO). Esto pasa en medios alcalinos a todos los monosacridos y a los disacridos unidos por enlace O-glucosduco monocarbonilo(entre el hidrxido del carbono anomrico de un monosacrido y el grupo hidroxilo de un carbono no anomrico de otro). Cosa que no pasa si estn unidos por enlaces O-glucosdicos que son dicarbonilo(entre los grupos hidroxilo de los 2 carbonos anomricos) ya que no tienen libre el grupo aldehdo o cetona para poder reducir. Si tenemos 2 glcilo desconocidos podemos saber si alguno tiene poder reductor mediante la reaccin de Fehling. Que consiste en echar al un glcido Fehling A(CuSO 4 disuelto en H2O) y Fehling B(NaOH y tartrato Na-K disuletos en agua). El Cu 2+ del CuSO4 reacciona con el OH- del NaOH dando Cu(OH)2 y la correspondiente sal Na2SO4. Si alguno de los glcidos es reductor har que el Cu(OH)2,de color azul, forme cu2o, color ladrillo, ya que el Cu cambia su estado de oxidacin ante un compuesto reductor de 2+ a 1+. Por ello ser un glcido reductor aquel que de un color ladrillo a la disolucin. La reaccin se producir antes se hay calor ya que a esas condiciones es muy reaccionante. El glcido reductor en la reaccin se oxida al Cu2+, que es el oxidante que le ha oxidado. El glcido de la prctica podra ser la glucosa, ya que es un monosacrido y todos ellos son reductores.

C uSO

N aO H
4

Quin se oxida y quin se reduce en la reaccin? El glcido(su carbono anomrico) reductor en la reaccin se oxida reduciendo al Cu2+, que es el oxidante que le ha oxidado. Para qu sirven el tartrato Na-K y el calor? Estabiliza al hidrxido de cobre, ya que en estas condiciones es muy reactivo. Y el calor acelera la reaccin. Que resultado dara la reaccin de Fehling con glucosa? Y con sacarosa? El glcido de la prctica podra ser la glucosa, ya que es un monosacrido y todos ellos son reductores. Pero nunca podra ser con la sacarosa por ser un disacrido que no tiene ningn hidroxilo para reducir. 2.- Identificacin de polisacridos: identificacin de almidn mediante la prueba del Lugol En solucin acuosa, la amilosa forma estructuras helicoidales lineales y la amilopectina ramificadas, gracias a la formacin de puentes de H entre los grupos OH de la glucosa y las molculas de H2O. Si a una disolucin de almidn de le aade I, esta toma un color azul intenso. Esta caracterstica es especfica del almidn, debido a su estructura, y se debe a la adsorcin del I por las cadenas helicoidales, especialmente de la amilosa. Aadimos el I con una gota de lugol(solucin acuosa de yodo e yoduro potsico). Por tanto no es una reaccin qumica, sino una interaccin fsica reversible por mtodos fsicos. Esto se puede comprobar fcilmente, pues al calentar la mezcla, el color azul desaparece, y al enfriarla vuelve a aparecer. Cul de las dos soluciones contiene almidn? Solo el almidn da la reaccin de Lugol, ya que los I2 coinciden con su forma helicoidal, a al que se unen sin reaccionar. Al darle calor se rompen los puentes de hidrgeno y se libera el yodo, con lo que se ve el color del lugol. Se prueba que no han reaccionado ya que al enfriarlo cambia de color. El almidn dara positiva la reaccin de Fehling? No, porque tiene muy pocos carbonos anomricos. Tiene enlaces , no da positiva la reaccin por no tener forma helicoidal.

C u (O H )2 (a z u l)

+ C a lo r +R

C u 2O (r o jo la d r illo )

La celulosa dara positiva la prueba del Lugol? No, aunque forme hlices son de forma diferente a la necesaria para coincidir con el yodo. El azul que aparece tras calentar y enfriar es igual de intenso? Por qu? Se debilita un poco el color azul ya que hay menos yodo debido a que se ha evaporado. 3.- Identificacin de lpidos. Reaccin de saponificacin. Se puede saber si hay un lpido si es insoluble en agua y tambin podemos saber si es saponificable, mediante la reaccin de saponificacin, o formacin de jabn. Si el aceite que tenemos es saponificable, sus steres de cidos grasos sufren hidrlisis en presencia de un agente alcalino, el NaOH que le aadimos. Esta hidrlisis conduce a la liberacin del alcohol y a la formacin de sales de cido graso o jabones, para ello hay que calentarlo.
C H C H C H
2 2

C O C O

R R

C H 2O H C H O H

R 1C O O - N a + R 2C O O - N a R 3C O O - N a
S a le s s d ic a s d e a c. g ra so s (J A B N )

O O

+ 3N aO H

C O

C H 2O H
G lic e r in a

T r ig lic r id o

Tras agitar la mezcla para que se homogeneice y reaccione ms rpido, se separan las sustancias segn la densidad. El jabn arriba del todo por ser el menos denso(fase del jabn), luego los triglicridos(fase lipdica), luego una fina capa de jabn que se est produciendo por la interaccin de la fase lipdica con la fase acuosa que es la ms densa y contiene el glicerol que aun no ha reaccionado. Luego los lpidos que se estn reduciendo y convirtindose en jabn ascienden a su fase. Existen lpidos saponificables en el frasco de aceite? Si, porque sino no se habra producido jabn. A qu corresponde cada fase de las que aparecen en el tubo? Las ya dichas. Por qu se da esa disposicin de fases? Por ser lquidos inmiscibles de diferente densidad. Cmo se prepara la NaOH al 20% en agua? 20g de sosa y completar con agua hasta los 100ml 4.- Identificacin de protenas mediante la reaccin el Biuret Una protena con el reactivo de Biuret(CuSO 4 en solucin acuosa alcalina, gracias a la presencia de O C C O NaOH o KOH) da un compuesto de color violeta, debido a la formacin de un complejo de H N N H coordinacin entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrgeno que R C H H C R forma parte de los enlaces peptdicos. Es una C u2+ O C C O reaccin colorimtrica, ya que la intensidad del color formado es proporcional a la cantidad de H N N H sustancia, podemos averiguar su concentracin.. Se miden con un colormetro(si mide slo un R C H H C R determinado color) o un espectrotmetro(si realiza una medida de todo un espectro). Se

introduce un lquido que la mquina va a tomar como color 0 molar, luego introducimos el lquido del que queremos saber su concentracin. Su funcionamiento de basa en la ley de Ver-Lambert: la fraccin de luz incidente que es absorbida por una solucin es proporcional a la concentracin de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz. La relacin entre la luz incidente (I 0) y la reflejada (I) dar una idea de la cantidad de radiacin que ha sido absorbida por la muestra. Es lo que se denomina Absorbancia (Abs) o Densidad ptica (DO)

La Ley de Beer-Lambert se formula como Abs (DO) = x C x l Siendo el coeficiente de extincin molar (especfico para cada sustancia a una amplitud de onda y en unas condiciones determinadas) (M -1 cm-1), C la concentracin de la muestra a medir (M), y l el espesor de la muestra. La mayora de los espectrofotmetros utilizan cubetas para la muestra de 1 cm de espesor, por lo que l se puede ignorar. As, la concentracin desconocida de la sustancia coloreada ser C = Abs / Para determinar la concentracin de protenas por este mtodo sin saber el coeficiente de extincin molar() de las protenas coloreadas con el reactivo del Biuret. Construiremos una curva (en este caso recta, concentracin(mg/ml) Vs Abs) patrn, midiendo la Abs de soluciones con concentraciones conocidas de protena, para, sobre ella interpolar el valor de Abs de la solucin problema y determinar su concentracin. Para ello, se dispone de una solucin de 10 mg.mL -1 de ovoalbmina. A partir de ella se realizarn diluciones conocidas aplicando la frmula: M1 x V1 = M2 xV2 Y estableciendo el blanco. Luego interpolamos en ella la absorbancia que nos del tubo de concentracin desconocida. es la pendiente de la recta. Se podra determinar la concentracin de cualquier muestra de protenas con esta recta patrn? S, si est entre 0 y 10ml, debido a que los datos de nuestra recta son de ese intervalo. Los aminocidos y los dipptidos daran positiva la reaccin del Biuret? Los aminocidos no porque no tiene enlaces peptdicos y un dipptido tampoco porque solo tiene un enlace peptdico. Se necesitan 2 enlaces peptdicos Servira esta reaccin para determinar protenas en orina? No por la presencia de urea, ya que 2 ureas forman diurea y ella siempre reacciona(lo que falseara el resultado). La

reaccin debe su nombre al biuret, una molcula formada a partir de dos de urea (H 2NCO-NH-CO-NH2), que es la ms sencilla que da positiva esta reaccin, comn a todos los compuestos que tengan dos o ms enlaces peptdicos consecutivos en sus molculas. 4.- Actividades enzimticas: especificidad y desnaturalizacin por cambios de pH y temperatura Prctica 4.1. Especificidad de la invertasa La invertasa o sacarasa hidroliza el enlace entre los C 1-2 de la sacarosa, liberando glucosa y fructosa libres. La enzima slo rompe este tipo de enlace glucosdico y no otros. Mtodo 1. Preparar 3 tubos de ensayo con los siguientes reactivos: TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 1mL solucin de sacarosa 1mL solucin de sacarosa 1mL solucin de almidn 1mL solucin de invertasa 1mL H2O 1mL solucin de invertasa Luego realizamos la reaccin de Fehling en cada tubo. En qu tubo/s da positiva la reaccin de Fehling?En cul/es negativa?Por qu?Es positiva en el tubo uno porque se libera glucosa y fructosa que por ser monosacrido tienen poder reductor y verifican la reaccin de Fehling. En el tubo 2 no hay azcares y en el tubo 3 la invertasa no hace efecto al almidn y este no verifica la reaccin. Qu demuestran el tubo 2 y el tubo 3 respectivamente? Prctica 4.2. Desnaturalizacin a pH cido de la amilasa Las enzimas tienen un pH ptimo de actuacin. Cambios de pH desnaturalizan la protena y, por tanto, inhiben la actividad enzimtica. La amilasa es una de las enzimas encargadas de la digestin del almidn, concretamente hidroliza enlaces 1-4 entre molculas de -glucosa. La amilasa se encuentra en la saliva de los mamferos. 1. Preparar 2 tubos de ensayo con los siguientes reactivos : Luego les aadimos almidn(para que se produzca maltosa y glucosa) y realizamos en cada tubo la prueba de TUBO 1 TUBO 2 Amilasa (escupir un poco Amilasa (escupir un poco de Lugol. de saliva) saliva) 2 gotas de H2O 2 gotas de HCL 1N Cuestiones En qu tubo/s da positiva la prueba del lugol?En cul/es negativa?Por qu? Es positiva en la 2 ya que el cido clorhdrico ha disminuido el pH lo que desnaturaliza a la aminasa que no rompe al almidn y da positiva ante la reaccin del lugol. Al contrario que en el tubo 1. Prctica 4.3. Desnaturalizacin de la catalasa por calor Las enzimas tienen una temperatura ptima de actuacin. La catalasa se encuentra en todos los tejidos vivos, donde descompone el H 2O2 en H2O y O2, que al ser gas, en solucin acuosa se desprende en forma de burbujas. Por tanto, al aadir agua oxigenada a un tejido vivo, la deteccin de desprendimiento de oxgeno gas, indicar actividad catalasa. En la mesa hay dos platos con trozos de patata. En uno de ellos, la patata ha sido previamente cocida. Por eso cuando aadimos H202 a cada tipo de trozo solo burbujear el trozo que no est cocido. Ya que el cocido a sufrido tales temperaturas que han desnaturalizado a la protena.