XVIII. CATABOLISMUL PROTEINELOR XVIII.1. DIGESTIA PROTEINELOR Majoritatea compuilor cu azot, ingerai de om, sunt proteine.

Atunci cnd discutm digestia proteinelor discutm i digestia compuilor cu azot. Moleculele proteice intacte nu pot fi absorbite ca atare prin tractul intestinal la animalele adulte, dect n cazuri excepionale i foarte rare. Pentru a putea fi absorbite, proteinele sunt hidrolizate la structuri moleculare mai mici de aminoacizi sau peptide. Cu toate c proteinele au structuri complexe, ele sunt formate dintr-un numr de aminoacizi diferii, legai ntre ei prin legtur peptidic (-HN-CO-). Legtura peptidic se rupe uor conducnd la un amestec de aminoacizi liberi. Teoretic o singur enzim specific poate asigura scindarea legturilor polipeptidice deci digestia proteinelor. n realitate situaia este ceva mai complicat deoarece enzimele digestive prezint o mare specificitate pentru localizarea respectivelor polipeptide, localizarea punctului de hidroliz i natura aminoacizilor care intervin n legtura peptidic respectiv. Cu toate c n alimentaie, exist n mod obinuit milioane de proteine, ele pot fi digerate de un numr redus de enzime proteolitice, ce pot fi clasificate n dou grupe mari: exopeptidaze i endopeptidaze. Exopeptidazele au rolul de a ndeprta un aminoacid de la captul lanului prin hidroliza unei legturi peptidice, cu obinerea unui aminoacid i a unei polipeptide cu o molecul de aminoacid mai puin n molecul. De exemplu, ar fi carboxipeptidaza, aminopeptidaza, dipeptidaza, tripeptidaza etc. Endopeptidazele au rolul, n general, de a hidroliza legturile peptidice din interiorul lanului, dnd natere la lanuri polipeptidice mai mici. Exemple ar fi pepsina, tripsina, chimotripsina, elastina etc.

181

Proteinele ptrunse n tractul digestiv sufer aciunea diferitelor enzime degradndu-se pn la aminoacizi, care la rndul lor sunt catabolizai pe ci diferite. O enzim deosebit de important pentru laboratorul clinic, din categoria N-aminoacidpeptidazelor este LAP (leucilaminopeptidaza). Nivelul acestei enzime crete mult i specific n afeciunea cilor biliare (icter mecanic), dar rmne nemodificat n leziunile paremchinului hepatic. Are valoare n diagnosticul diferenial al icterului mecanic fa de cel hepatocelular i cel hemolitic. n ultimele dou forme de icter nivelul su rmne cel normal. Prezentm, mai jos, schema de degradare a proteinelor.
Proteine alimentare
endopeptidaze -pepsin (stomac pH 1,0-2,0) -tripsina (pancreas pH 7,9-8,0) -chimotripsina (pancreas pH 8,0)

polipeptide
exopeptidaze

-N-aminoacidpeptidaza -C-aminoacidpeptidaza

aminoacizi-oligopeptide
absorbtie si transport la

ficat

intestin subtire unde sunt: -catabolizati

-utilizati n biosinteza proteinelor

tesut enterohepatic unde sunt

-catabolizati -utilizati n biosinteza proteinelor

XVIII.2. METABOLISMUL INTERMEDIAR AL AMINOACIZILOR Aminoacizii sunt substanele cele mai importante ale metabolismului azotului n organismele heterotrofe. De asemenea, ei pot servi ca surse de energie, n special, prin intermediul oxidrii lanului de atomi de carbon. Metabolismul aminoacizilor se gsete ntr-o stare dinamic, la fel ca i cel al hidrailor de carbon i al lipidelor. n sistemele vii valorile pool-ului fiecrui aminoacid la organismele animale adulte, rmne constant n condiiile fiziologice, el corespunde la diferena dintre stocul de aminoacizi provenii din exterior (exogeni) sau

182

ocazional din surse endogene, i transferul de aminoacizi servind ca substrat pentru procesele anabolice i catabolice. Sistemele vii nu acumuleaz aminoacizi i proteine ca i compui de rezerv, ele trebuie s-i extrag cantitatea de azot necesar (cel mai bine sub form de aminoacizi) din hran. n organismul adult cantitatea de azot primit i excretat este aceeai. Aminoacizii din sursele exogene sunt absorbii n tractul digestiv i transportai, prin snge, la ficat i alte esuturi i organe tisulare care sunt n permanen metabolizate la aminoacizi. Se pare, ns, c aceti aminoacizi sunt utilizai pentru sintez de protein n mai mic msur. Sursa endogen de de proteine este foarte important. Ea reprezint 2/3 din aportul total de aminoacizi, n timp ce aportul aminoacizilor exogeni este de numai 1/3. Timpul biologic de njumtire al proteinelor din ficat i din plasm este de 10 zile, pentru proteinele musculare de 180 de zile i pentru proteinele din mucoasa intestinal de numai cteva zile, iar a hormonilor de natur proteic i a enzimelor de numai cteva ore sau chiar minute (insulina uman 6-8 minute). Din aminoacizii eliberai o parte sunt reutilizai pentru o nou sintez de proteine, iar cei rmai fiind metabolizai la deeurile azotate (amoniac i uree), cetone i dioxid de carbon.
SURSE EXOGENE (70 mg/24 h) proteine alimentare SURSE ENDOGENE (140 mg/24 ore) proteine tisulare, enzime, hormoni polipeptidici
sinteze aminoacizi esentiali

digestie si absorbtie

"SCHIMBUL" de AMINOACIZILOR
TRANSAMINARE DEZAMINARE

sinteze si degradare
constituieni tisulari azotai eseniali, neproteici(purine, pirimidine, colina, creatina, niacina, porfirina, adrenalina, tiroxina, acizi biliari, melanina, prosui de detoxifiere etc.

EXCES DE AMINOACIZI
(0,9-1,0 mg/24/h)

NH3+uree CETOACIZI GLUCOZ CORPI CETONICI ACETIL-CoA CICLUL CITRIC

CO2 + H2O + ATP

183

Proteine corporale
degradarea proteinelor (25-30 g azot/zi) reutilizarea pentru o nou sintez proteic (15-28 g/zi)

aminoacizi

n urmtoarea schem sunt artate sursele globale de aminoacizi i utilizarea lor. PROTEINE CORPORALE PROTEINE DIN DIETA AMINOACIZI CICLUL KREBS GLICOLIZ UREE GLUCOZ CO2 O parte din aminoacizii organismului nostru se numesc eseniali. Ei nu pot fi sintetizai de ctre organism, dar sunt absolut indispensabili bunei sale funcionri. Acetia sunt valina, leucina, izoleucina, metionina, treonina, fenilalanina, triptofanul i n unele condiii arginina i histidina. DERIVATI NEPROTEICI

(5-7 g/zi azot)

CATABOLISM

NH3 CETONE

XVIII.2.1. Schimbul de aminoacizi dintre organe n faza alimentar i cea postabsorbtiv

184

Dup investigarea unei mese bogate n proteine, esuturile elibereaz mari cantiti de aminoacizi liberi, predominnd cei ramificai: valina, izoleucina, leucina reprezint 60% din aminoacizi ce intr n circulaia sistemic (n opoziie cu circulaia portal), chiar dac ei reprezint numai 20% din totalul aminoacizilor n cazul unei mese srace n proteine. Concomitent cu eliberarea acestor aminoacizi dup o mas, muchii periferici extrag aminoacizii, predominant cei ramificai. ncorporarea de aminoacizi n esutul muscular dup o mas bogat n proteine este de cca 50% aminoacizi ramificai. La 2-3 ore dup mas 90-100% din aminoacizii incorporai n esuturile periferice sunt aminoacizi ramificai. Aceti aminoacizi sunt oxidai la nivelul muchilor ca rspuns la alimentaie, sevind, probabil, ca donori majori de grupri amino pentru transaminarea piruvatului la alanin. Meninerea concentraiei strii staionare a aminoacizilor din plasma circulant ntre mese, depinde de balana net dintre eliberarea aminoacizilor proteinele de stocare i utilizarea de ctre diferite esuturi. CREIER RINICHI INTESTIN ALA

VAL MUSCHI

GLN

ALA FICAT

60% aminoacizi ramificati

Muchii genereaz mai mult de 50% din pool-ul total al aminoacizilor liberi, n timp ce ficatul este locul enzimelor necesare ciclului ureei (ureogenetic) pentru eliberarea azotului rezidual. Astfel muchii i ficatul joac un rol major n determinarea nivelului i turnower-ul aminoacizilor liberi circulani.

185

CREIER NH3 VAL MUSCHI GLN ALA RINICHI INTESTIN ALA ALA SER FICAT

Metabolismul aminoacizilor include cteva probleme de interes medical. Acestea ar fi sinteza i degradarea proteinelor, conversia scheletului hidrocarbonat a aminoacizilor n intermediari amfibolici, sinteza ureei i formarea unor compui fiziologic activi (adrenalina, noradrenalina, DAPAamina, serotonina, acidul -aminobutiric, tiroxina, creatina, nucleul heminic, baze purinice etc.) XVIII.2.2. Catabolismul azotului aminoacidic Aminoacizii de tip din esuturile mamiferelor provin fie prin degradarea proteinelor tisulare, fie din diet. Ultima etap de transformare a gruprii -aminice este ureea care este excretat prin urin. Ureea este produsul final de metabolizarea azotului aminoacidic numai la om i alte organisme ureotelice. La organismele uricotelice (reptile i psri) produsul final de metabolizare este acidul uric, iar organismele amonotelice (peti) produc amoniac. n schema urmtoare se arat transformarea azotului aminoacidic cu parcurgerea a celor patru procese fundamentale: transaminarea, dezaminarea oxidativ, formarea amoniacului i ciclul ureogenetic.
TRANSAMINARE alfa-aminoacid alfa-cetoglutarat NH3 alfa-cetoacid UREE L-glutamat GLUTAMATDEHIDROGENAZA CO2 CICLUL UREOGENETIC

186

n cele ce urmeaz vom discuta pe rnd cele patru procese implicate n sinteza ureei la nivelul organismului uman. Orice deficit al reaciilor implicate prezint un deosebit interes medical. XVIII.2.2.1. TRANSAMINAREA Transaminarea este un proces de transfer a unei grupe aminice de pe un aminoacid pe un cetoacid, cu formarea unui nou aminoacid i respectiv a unui nou cetoacid. Reacia este catalizat de aminotransferaze sau transaminaze, avnd ca i coenzim piridoxalfosfatul (vitamina B 6 fosforilat). n toate reaciile aminoacizilor piridoxalfosfat-dependente, n faza intermediar se formeaz o baz Schiff, conform reaciei:
R1-CH-COOH + O=HC-(E)
aminoacid -H2O +H2O

R1-CH-COOH
baz Schiff I

R1-C-COOH N-CH2(E)

+H2O -H2O

NH2

piridoxal fosfat-enzim

N=HC-(E)

baz Schiff II

R1-C-COOH + H2N-CH2-(E)
cetoacid

piridoxamin fosfat-enzim

R2-C-COOH + H2N-CH2-(E)
cetoacid

-H2O +H2O

R1-C-COOH
baz Schiff II

R2-CH-COOH N=HC-(E)
baz Schiff I

+H2O -H2O

piridoxamin fosfat-enzim

N-CH2-(E)

R2-CH-COOH + O=HC-(E)
aminoacid

NH2

piridoxal fosfat-enzim

Baza Schiff se formeaz prin interaciunea cu o regiune cationic a situsului activ. n felul acesta enzima particip n cursul transaminrii la transportul gruprii amino. Cele mai importante transaminaze din esutul mamiferelor sunt: - GOT - glutamic oxalilacetic transaminaz sau AST - aspartat aminotransferaz i - GPT - glutamic piruvic transaminaz sau ALT - alanin aminotransferaz. Aminotransferazele sunt enzime ubiquitare, adic sunt rspndite n toate esuturile. AST sau GOT se gsete n ficat, inim i muchii scheletici,
187

fiind distribuit relativ uniform n toate esuturile. Raportul dintre nivelul hepatic i extrahepatic al enzimei este de 1:1. Enzima exist sub dou forme, una solubil i una mitocondrial. Cele dou forme sunt perfect distincte cinetic i electroforetic. ALT sau GPT este mai reactiv n ceea ce privete distribuia. Ea se gsete aproape exclusiv n faza solubil a citoplasmei i n cantiti mult mai mari n hepatocite. Raportul dintre nivelul hepatic i extrahepatic al enzimei este de 10:1. Reaciile catalizate de aceste enzime sunt: COOH CH2 CH2 C=O
ac. alfa-ceto glutaric

COOH COOH + CH2 CH-NH2

ac. aspartic AST(GOT)

CH2 CH2 CH-NH2

ac. glutamic

COOH + CH2 C=O COOH

ac. oxalil acetic

COOH

COOH

COOH

Reaciile catalizate de transaminaze asigur o mare plasticitate a cilor metabolice pentru obinerea aminoacizilor n concentraia necesar proceselor metabolice-biosintetice. De asemenea, acidul -cetoglutaric, acidul oxalilacetic i acidul piruvic servesc ca substrate ciclului tricarboxilic. COOH CH2 CH2 C=O
ac. alfa-ceto glutaric

COOH CH3 + CH-NH2

alanin ALT(GPT)

CH2 CH2 CH-NH2

ac. glutamic

CH3 + C=O COOH

ac.piruvic

COOH

COOH

COOH

Majoritatea aminoacizilor sunt substrate pentru reacii de transaminare. Excepie fac lizina, treonina, prolina i hidroxiprolina. Reacia

188

de transaminare nu este restrns numai la -aminoacizi. Prin transaminarea ornitinei se obine -semialdehida acidului glutamic conform reaciei:
CH2-NH2 CH2 CH2 CH-NH2 COOH
ornitina

COOH CH2 + CH2 C=O COOH

ac. alfa-ceto glutaric transaminaz

CH=O CH2 CH2 CH-NH2 COOH

semialdehida ac. glutamic

COOH CH2 + CH2 CH-NH2 COOH

ac. glutamic

Importana medical. Introducerea n laboratorul clinic a determinrii AST (GOT) i ALT (GPT) la sfritul anilor 50 au determinat o adevrat revoluie n ceea ce privete diagnosticul clinic enzimologic. Determinarea nivelului seric a acestor dou enzime prezint o deosebit importan n diagnosticul fenomenelor de citoliz hepatic i extrahepatic care nsoete anumite stri patologice. Doagnosticul leziunii de organ este posibil n acest fel, datorit distribuiei inegale a celor dou enzime n esuturi. n citoliza extrahepatic, citoliza miocardic (n infarctul miocardic) sau citoliza muscular (distrofii musculare progresive) crete nivelul ambelor enzime serice, dar mai mult a AST (GOT), de aceea raportul AST/ALT crete fa de normal. Raportul AST/ALT (GOT/GPT) se numete coeficientul RITTIS I N MOD NORMAL ARE VALOARE 1,33. Valorile normale sunt pentru AST (12 mU/ml), iar pentru ALT (9 mU/ml). La 6 - 12 ore de la instalarea infarctului miocardic se detecteaz activitate crescut pentru AST. Ea crete apoi rapid pn la un maxim la 20 48 de ore dup instalarea simptomelor. n cazurile lipsite de complicaii activitatea scade n scurt timp, revenind la valorile normale dup cinci zile sau mai puin. n infarctul sever, n ser se detecteaz prezena AST mitocondrial i acest lucru contribuie la prognoz. Citoliza hepatic. Valorile mari caracteristice ale amino transferazelor reprezint o trstur obinuit a hepatitei virale. De aceea raportul AST/ALT sau coeficientul lui Rittis rmne normal sau aproape normal. Valorile maxime ale celor dou enzime, pot atinge la debutul icterului valori de 10 - 30 de ori mai mari dect cele normale, ceea ce se
189

ntlnete rar la alte boli. Creterea incepe cu faza prodomal cu 10 zile nainte ca icterul s fie evident. n perioada de nsntoire asistm la o scdere rapid a nivelului seric al enzimelor. Dar dac n aceast perioad survine o recrudescen a bolii, tendina de scdere a aminotransferazelor este reversibil i survine o cretere transient. Creterea continu a activitii aminotransferazelor este un indiciu al prezenei unei boli hepatice cronice active. Dac valorile sunt moderate i dac raportul AST/ALT este mai mic dect unitatea este prezent o hepatit cronic persistent. Dac valoruile sunt mai mari dect moderate i raportul AST/ALT este mai mare dect 1 este prezent o hepatit cronic agresiv, prognoza este puin favorabil i este absolut necesar un tratament cu steroide i imunosupresoare. n mod obinuit pacienii cu obstrucii hepato-biliare prezint creterea aminotransferazelor. De obicei, aceste creteri sunt de 2 - 8 ori mai mari fa de valoare normal, depinznd de gradul icterului. n cazul n care obstrucia se datoreaz unei boli benigne este neobinuit ca activitatea AST s fie mai mare dect a ALT. n cazul n care obstrucia se datoreaz unei tumori maligne activitatea AST este mai mare dect ALT i ea este aminotransferaza dominant n aproape jumtate din cazurile care manifest metastaze hepatice. XVIII.2.2.2. DEZAMINAREA OXIDATIV La mamifere procesul de dezaminare oxidativ are loc la nivelul esutului hepatic i a esutului renal. Enzimele implicate n dezaminarea oxidativ sunt aminoacid oxidazele de tip L i D. Aminoacid oxidazele sunt flavoproteine autoxidabile. FMNH2 i FADH2 sunt reoxidate direct de ctre oxigenul molecular cu formare de H2O2 fr participarea citocromilor sau a altor transportori de electroni. H2O2 fiind un produs toxic pentru organism, este imediat degradat sub aciunea catalazelor la O 2 i H2O. Dac catalaza este absent, produsul de reacie -cetoacidul este decarboxilat neenzimatic de ctre H2O2 formnd un acid carboxilic cu un atom de carbon mai puin. Reacia are loc n modul urmtor:

190

R-CH-COOH NH2

aminoacidoxidaza

R-C-COOH NH

spontan

R-C-COOH NH3 O

FADH2

FAD

H2O

O2

H2O2

ciclul ureogenetic catalaza

1/2O2

H2O

Unii aminoacizi cum sunt serina, treonina, aminoacizii dicarboxilici i cei bazici nu prezint, n general, reacia de dezaminare oxidativ. De exemplu, acidul glutamic este metabolizat, nu sub aciunea aminoacid oxidazelor, ci sub aciunea L-glutamatdehidrogenazei (GDH), enzim NAD+ sau NADP+ dependent, transformndu-se n acid -cetoglutaric, prin intermediul acidului iminoglutaric, conform schemei:
NAD(P)+ NAD(P)H+H+

HOOC-CH2-CH2-CH-COOH NH2

glutamat dehidrogenaz

HOOC-CH2-CH2-C-COOH NH
H2O NH3

HOOC-CH2-CH2-C-COOH O

Reacia este reversibil iar echilibrul este deplasat spre snga. Mamiferele conin un grup de -aminoacid oxidaze FMNdependente, fiind prezente numai n ficat i n rinichi. Activitatea acestor enzime este n general sczut i sunt fr efect asupra glicinei, -amino-hidroxiaminoacizilor i a izomerilor de tip L ai aminoacizilor dicarboxilici. n ficatul i rinichii majoritii memiferelor se gsete o D-aminoacidoxidaz FAD-dependent cu o specificitate larg. Totui, D-asparagina i D-

191

glutamina nu sunt oxidate, dar glicina i izomerii de tip D a aminoacizilor cu caracter bazic sau acid sunt puin oxidai. O serie de amine de mare importan biologic, ca de exemplu, norepinefrina (noradrenalina), epinefrina (adrenalina) i dopamina, pot fi i ele dezaminate oxidativ cu formarea amoniacului i a aldehidelor corespunztoare sub aciunea unor flavoproteine monoamin i diamin oxidaze. n concluzie rezultatul dezaminrii oxidative a aminoacizilor este un cetoacid i amoniac. Amoniacul fiind un produs toxic este ndeprtat. La mamifere prin ciclul ureogenetic a lui Krebs-Henseleit sau prin formare de glutamin sub aciunea glutaminsintetazei. Cetoacidul format este catabolizat direct sau indirect n compui care intr n ciclul citric. acid glutamic acid aspartic valina leucina izoleucina acid alfa-cetoglutaric acid oxalilacetic acid succinic 3 acetil-CoA propionil-CoA + Acetil-CoA

De aceea se poate considera c aminoacizii constituie rezerve energetice prin oxidarea lor n ciclul citric n special n diabet. De asemenea, particip n procesele de biosintez. n cazul diabeticilor se consum cu precdere leucin i izoleucin, creindu-se, astfel, un deficit al acestor aminoacizi. Un grup de aminoacizi din care amintim serina, homoserina, treonina, cisteina i posibil homocisteina, prezint o dezaminare neoxidativ sub aciunea unor dehidraze, avnd ca i coenzim piridoxal fosfatul. n acest caz se formeaz, de asemenea, amoniac i un cetoacid. CH2OH CH-NH2 COOH
H2O

CH2 C-NH2 COOH

CH3 C=NH COOH H2O

NH3

CH3 C=O COOH

XVIII.2.2.3. FORMAREA AMONIACULUI

192

n afara amoniacului care apare n esuturi ca rezultat al metabolizrii aminoacizilor (dezaminare oxidativ), o cantitate considerabil se mai formeaz din proteinele alimentare sub aciunea bacteriilor intestinale i din ureea prezent n lichidele secretate din tractul gastrointestinal. Acest amoniac este absorbit din intestin n sngele portal venos, care conine cantiti mai mari de amoniac dect sngele sistemic. n condiii normale, ficatul ndeprteaz promt amoniacul din sngele portal, astfel nct sngele ce prsete ficatul, este n mod virtual liber de amoniac. Acest lucru este esenial deoarece cantiti mici de amoniac sunt toxice pentru sistemul nervos (normal n snge se gsesc 10-20 gNH3/100 ml.) Simptomele intoxicaiei cu amoniac sunt rezultatul unei slbiri ale funciilor creierului i se manifest prin grea i vrsturi, letargie, ataxie, convulsii, iar n cazuri mai grave com prin hiperamonemie (cca 100 gNH3/100 ml.) i chiar moartea. Aceste simptome sunt asemntoare comei hepatice, cnd nivelul amoniacului din ficat i probabil din creier este foarte crescut. ntoxicaia cu amoniac pare s fie un factor etiologic n coma hepatic. Simptome asemntoare apar i n hepatomegalie i n general, cnd funciile hepatice sunt puternic alterate, deoarece ficatul este sediul transformrii amoniacului n uree. Mecanismul prin care amoniacul i exercit efectul asupra creierului nu se cunoate. Poate c se datoreaz descreterea formrii de ATP pe calea ciclului citric din cauta transformrii unei cantiti excesive de -cetoglutarat n glutamat i glutamin. Nivelul acestor metabolii, la fel ca i a amoniacului, este crescut n creier n decursul ntoxicaiei cu amoniac. Alterri ale proceselor de transmisie neural datorit unor formri excesive de acid aminobutiric (GABA) din glutamat poate fi, de asemenea, implicate. Coninutul de amoniac din sngele din venele renale, mai mare dect n arterele renale, indic faptul c amoniacul este produs n rinichi i apoi trece n snge. Excreia n urin a amoniacului produs n celulele tubilor renali, constituie cel mai semnificativ aspect al metabolismului amoniacului renal. Producerea de amoniac este un mecanism important al tubilor renali, de reglare a balanei acido-bazice i conservare de cationi, fiind foarte crescut n acidoza metabolic i sczut n alcaloz. Amoniacul produs la nivelul rinichilor deriv din aminoacizi intracelulari i n special din glutamin. Eliberarea de amoniac este catalizat de glutaminaza renal, conform reaciei:

193

H2N-OC-CH2-CH2-CH-COOH NH2
glutamin

glutaminaz H2O NH3

HOOC-CH2-CH2-CH-COOH NH2
acid glutamic

Amoniacul poate fi excretat sub form de sruri de amoniu, marea majoritate este excretat sub form de uree, care se formeaz n ciclul ureogenetic al lui Krebs-Henseleit. Practic amoniacul format n esuturi, dar prezent n sngele periferic n urme, este ndeprtat rapid din circulaie sub form de glutamin i uree. Formarea de glutamin este catalizat de glutaminsintetaz, enzim prezent n cantiti mari n esutul renal. COOH CH2 CH2 CH-NH2 COOH
glutaminsintetaz Mg+2 ATP NH3 H2O ADP+Pa

CO-NH2 CH2 CH2 CH-NH2 COOH

La animale, plante i microbi exist o reacie catalizat de Lasparaginaz analoag celei catalizate de glutaminaz la om. Asparaginaza i glutaminaza sunt utilizai ca ageni antitumorali, deoarece tumorile necesit cantiti mari de acid aspartic i acid glutamic. n timp ce la nivelul creierului calea major de ndeprtare a amoniacului este formarea glutaminei, n ficat calea major o constituie transformarea n uree. La un om cu o activitate moderat, consumnd cca. 300 g hidrai de carbon, 100 g lipide i 100 g proteine, excret zilnic 16,5 g azot. Din acesta 95% se elimin prin rinichi, iar 5% este stocat i apoi eliminat prin fecale. Ureea constituie 80-90% din azotul excretat. Interconversia amoniacului i a glutaminei, catalizat de glutamin sintetaz i glutaminaz, poate fi prezentat schematic:

194

Glu+Mg-ATP

Mg-ADP

glutaminsintetaz

ioni de amoniu (NH4+)

glutaminaz

-CO-NH2 Glutamin

acid glutamic

HOH

XVIII.2.2.4. CICLUL UREOGENETIC n cursul reaciilor ce alctuiesc un ciclu complet dintr-un mol de amoniac rezult 1 mol de uree i se consum 3 moli de ATP (doi trec n ADP i fosfat i uul n AMP i pirofosfat). Reaciile succesive sunt catalizate de cinci enzime. Carbamoil sintetaza prezent n mitocondriile hepatice ale organismelor ureotelice, inclusiv organismul uman, catalizeaz sinteza carbamoilfosfatului cu consum a dou molecule de ATP. OH NH3 + CO2 + 2ATP
Mg
+2

HO-P-O-C-NH2 + 2ADP + Pa O O CH2-NH-C-NH2

CH2-NH2 CH2 CH2 CH-NH2 COOH

ornitin

OH + HO-P-O-C-NH2 O O

CH2 CH2 CH-NH2 COOH

citrulin

O + H3PO4

195

Ornitincarbamoillaza se gsete n mitocondriile hepatice, catalizeaz reacia de sintez a citrulinei, pentru care are o mare specificitate. Argininosuccinatsintetaz catalizeaz reacia de sintez a argininosuccinatului, cu consumul unei molecule de ATP. NH2 COOH NH2 COOH CH2-NH-C=N-CH
ATP Mg+2 AMP+PP

CH2-NH-C=O + H2N-CH CH2 CH2 CH-NH2 COOH

citrulin

CH2 COOH

CH2 CH2

CH2 COOH

acid aspartic H2O

CH-NH2 COOH
argininosuccinat

Argininosuccinaza, prezent n esutul hepatic i renal al mamiferelor, este o enzim labil la rece. Catalizeaz reacia de scindare a argininosuccinatului n arginin i acid fumaric, care intr n ciclul citric. NH2 COOH CH2-NH-C=N-CH CH2 CH2 CH-NH2 COOH
argininosuccinat

NH2 CH2-NH-C=NH CH2 CH2 CH-NH2 COOH

arginin

CH2 COOH

HOOC-C-H +
acid fumaric

H-C-COOH

n continuare acidul fumaric, n ciclul acidului tricarboxilic, va suferi o transformare obinuit, adic n prezen de fumaraz trece n acid malic, care la rndul su, sub aciunea malat dehidrogenazei trece n oxalilacetat. Oxalilacetatul schimb gruparea funcopnal cu acidul glutamic n prezen de AST (GOT) cu regenerarea acidului aspartic.

196

COOH H-C-COOH HOOC-C-H

acid fumaric fumaraza H2O

COOH
malatdehidrogenaz

CH-OH CH2
acid malic

C=O CH2
acid oxalilacetic

COOH

COOH

HOOC-CO-CH2-COOH + HOOC-CH(NH2)-CH2-CH2-COOH
acid oxalilacetic acid glutamic acid aspartic

GOT

HOOC-CH(NH2)-CH2-COOH + HOOC-CO-CH2-CH2-COOH
acid cetoglutaric

Arginaza, prezent n ficatul tuturor animalelor ureotelice, este activat de prezena ionilor de Co+2 i Mn+2. Are, rol de a oliva arginina n ornitin i uree. n cantiti mici se gsete i n rinichi, creier, gland mamar, esut testicular i piele. Ornitina i lizina sunt inhibitori competitivi foarte puternici ai enzimei. NH2 CH2-NH-C=NH CH2 CH2 CH-NH2 COOH
arginin H2O

CH2-NH2 CH2 CH2 CH-NH2

ornitina

+ H2N-C-NH2 O

COOH

Ciclul ureogenetic este o cale metabolic foarte costisitoare pentru organism, deoarece pentru fiecare molecul de uree ce se formeaz, se consum trei legturi macroergice. Cantitatea de uree excretat de un om adult normal prin urin este de 25-30 g n 24 de ore. Aceast cantitate reprezint 90% din substanele azotate excretate i variaz proporional cu cantitatea de protein ingerat. n condiii normale excreia de amoniac reprezint numai 2,5-4,5% din totalul azotului urinar. Excreia amoniacului reprezint o funcie
197

important n meninerea balanei acido-bazice. Amoniacul se formeaz la nivelul rinichilor unde se combin cu ionii de hidrogen formnd ioni de amoniu. Coninutul su crete n acidoz i scade n alcaloz. Boli metabolice legate de dereglri aprute n ciclul ureogenetic. Lipsa uneia dintre enzimele care intervin n ciclul ureogenetic, determin apariia unor afeciuni, care toate sunt cauzate de intoxicaie cu amoniac, acesta nu se mai poate transforma n uree, produs netoxic care se elimin. Deficitul de carbamoilfosfat sintetaz este probabil ereditar i cauzeaz hiperamonemia de tip I. Deficitul de transcarbamoilaz a fost ntlnit la numeroi subieci. Aceasta afeciune este legat de cromozomul X. Mamele acestor pacieni prezint i ele hiperamonemie i intolerana la alimente bogate n proteine. n snge, lichid cerebrospinal i urin s-au gsit, n asemenea cazuri, cantiti mari de glutamin, iar n esuturi cantiti mari de amoniac. Boala este cunoscut sub numele de hiperamonemie de tip II. Lipsa activitii argininosuccinat sintetazei, conduce la citrulinemie, o boal foarte rar. n sngele i n lichidul cerebrospinal al pacienilor se gsesc cantiti mari de citrulin, iar n urin eliminarea este masiv (1-2 g citrulin n 24 de ore). Absena argininsuccinazei conduce la argininosuccinurie. Enzima este absent n creier, ficat, rinichi, eritrocite i fibroblastele din piele. Absena arginazei conduce la hiperarginemie. Se caracterizeaz prin creterea nivelului de arginin n snge i lichid cefalospinal. Arginaza cerebrospinal nu este ntodeauna absent. Uneori poate fi mai sczut. XVIII.2.3. Catabolismul scheletului de atomi de carbon ai aminoacizilor n acest capitol ne vom ocupa de procesul de transformare a catenei hidrocarbonate n catabolismul aminoacidic. Acest capitol ne permite s urmrim strnsa legtur dintre aminoacizi, hidrai de carbon i lipide, legtur ce se realizeaz la nivelul ciclului citric i este reprezentat mai sus. Intermediarii metabolici ce iau natere prin transformarea scheletului de carbon ai aminoacizilor se numesc: glicogeni, cetogeni sau glucogenici i cetogenici, dup cum formeaz glicogen, grsimi sau ambele.

198

Hip Ser Thr Trp Gly Ala Cys citrat PIRUVAT

GLUTAMAT

cetoglutarat

Arg His Gln Pro

succinil-CoA

CAT
oxalil acetat fumarat Ile Met Val

Ile Leu Trp

acetil-CoA

Leu Lys Phe Trp Tyr

ASPARTAT

Tyr Phe

Asn

AMINOACIZI I INTERMEDIARII LOR AMFIBOLICI glicogenici Ala Hip Arg Met Asp Pro Cys Ser Gly Val His cetogenici Leu glicogenici i cetogenici Ile Lys Phe Trp Tyr

XVIII.2.3.1. AMINOACIZI CE FORMEAZ PIRUVAT

199

Transformarea scheletului de carbon ai aminoacizilor poate fi urmrit cel mai bine prin schema: L-treonin glicin L-serin L-alanin piruvat L-cistin L-cistein

acetil-CoA Glicina. Intermediarii amfibolici ce se formeaz din glicin includ piruvatul, dioxidul de carbon i 5,10-metilentetrahidrofolatul. Formarea piruvatului din glicicn poate avea loc n momentul conversiei glicocolului n serin, reacie catalizat de serinhidroximetil transferaz n prezena tetrahidrofolatului. Apoi serina se deshidrateaz. Serina. Conversia serinei la piruvat are loc sub aciunea serin dehidrazei, enzim piridoxalfosfat dependent. Printr-o reacie de transaminare acidul piruvic se poate transforma n alanin. Reacia este reversibil. CH2OH CH-NH2 COOH
H2O

CH2 C-NH2 COOH

CH3 C=NH COOH

H2O NH3

CH3 Glu C=O COOH

K-glu

CH3 CH-NH2 COOH

ALT

Alanina. Din reacia de mai sus se observ c alanina sub aciunea alaninaminotransferazei (ALT), printr-un proces de transaminare, trece n piruvat. Acesta la rndul su sufer un proces de decarboxilare oxidativ sub aciunea complexului multienzimatic al piruvatdehidrogenazei (PDH) trecnd n acetil-CoA.

200

H3C-CH-CH-COOH
L-treonina

OH NH2

H H3C-C
FAD

treoninaldolaza

H2C-COOH O NH2

CO2 + NH3

H2O aldehiddehidrogenaza

N4,N5-metilen-F4 serinhidroximetilaza F4

FADH2

CH3COOH

H2C-CH-COOH HO NH2
serindehidrataza NH3

H3C-CO-COOH H3C-CO-SCoA
NAD+ NADH+H+ piruvatdehidrogenaza

HSCoA CO2

Treonina. Sub aciunea treonin aldolazei, treonina se scindeaz n aldehid i glicocol. La rndul ei aldehida acetic se transform n acetil-CoA care intr n ciclul citric. Glicina trece n serin sub aciunea serinhidroximetil transferazei, iar apoi n acid piruvic, care prin decarboxilare oxidativ se transform n acid piruvic. Cistina i cisteina. Cistina este convertit n cistein sub aciunea unei oxidoreductaze NADH-dependente, conform reaciei: CH2-S-S-CH2 H2N-CH COOH CH-NH2 COOH
2H

CH2-SH 2 CH-NH2 COOH

cistein

cistina

201

Cisteina se metabolizeaz mai departe la piruvat i respectiv la AcCoA pe trei ci. Astfel: ao o cale, via cisteindesulfhidraz, printr-o reacie piridoxal fosfat dependent; bo printr-o reacie de transaminare i apoi pierderea de hidrogen sulfurat sub aciunea unei transsulfuraze; co prin oxidarea gruprii SH cu formare de acid cisteinsulfinic, urmat de o transaminare i apoi pierderea unei molecule de dioxid de sulf sub aciunea unei desulfinaze. Acidul cisteinsulfinic obinut n cursul acestei reacii se poate transforma ulterior n taurin pe urmtoarele dou ci: 1o fie printr-o decarboxilare, urmat de oxidarea gruprii sulfinice la grupare sulfonic; 2o fie oxidarea gruprii cu sulf, urmat de decarboxilare. Acidul cistein sulfuric i acidul cisteic reprezint o surs de taurin pentru ficat. Taurina servete pentru conjugarea acizilor biliari.
1. CH2-SH CH-NH2
cistein

CH2 C-NH2
H2S acid aminoacrilic

CH3 C=NH
acid iminopiruvic

CH3 C=O
acid piruvic

AcCoA

COOH

COOH

COOH

COOH

2. CH2-SH CH-NH2 COOH

cistein ka aa

CH2-SH C=O
2H acid tiolpiruvic

CH3 C=O
H2S acid piruvic

COOH

COOH

202

3. CH2-SH CH-NH2 COOH

cistein

[O]

CH2-SO2H CH-NH2 COOH

transaminaza aa

CH2-SO2H C=O COOH

desulfinaza

CH3 C=O
acid piruvic

ka acid cisteinsulfinic

COOH

acid sulfinilpiruvic

Taurina se formeaz dup urmtoarele scheme de reacie: CH2-SO2H CH-NH2 COOH

acid cisteinsulfinic -CO2

CH2-SO2H [O]
hipotaurin

CH2-SO3H CH2-NH2
taurin

CH-NH2

CH2-SO2H CH-NH2 COOH

acid cisteinsulfinic [O]

CH2-SO3H CH-NH2
acid cisteinsulfonic -CO2

CH2-SO3H CH2-NH2
taurin

COOH

Cistinuria. Este o boal metabolic n care secreia urinar de cistin crete de 20-30 de ori fa de normal. Excreia de lizin, arginin i ornitin este de asemenea mrit. Cistinuria este o boal care se datoreaz transportului renal deficitar i anume este deficitar mecanismul renal de reabsorbie. Complicaia major a acestei boli este formarea de calculi de cistin la nivelul tubilor renali, deoarece cistina este relativ puin solubil, va precipita la acest nivel. Cistinoza. Spre deosebire de cistinurie este o boal ereditar de se caracterizeaz prin depuneri de calculi n toate organele i n special la nivelul sistemului reticuloendotelial. Este, n general, nsoit de o aminoacidurie generalizat. Majoritatea pacienilor mor, manifestnd o boal renal acut. Hidroxiprolina. Trei din cei cinci atomi de carbon ai hidroxiprolinei sunt transferai la piruvat, ceilali formeaz acid glioxilic. Prima etap din catabolismul hidroxiprolinei este catalizat de o dehidrogenaz mitocondrial. Secvena reaciilor este prezentat mai jos.

203

HO N H COOH

hidroxiprolin dehidrogenaz

HO N COOH

HO-CH-CH2
H2O

HC CH-COOH O NH2

hidroxiprolin

delta1-prolin-3 -hidroxi-5-carboxilat

COOH
NAD+ NADH+H+

COOH H-C-OH
transaminaz ka aldolaz

CHO COOH
acid glioxilic

H-C-OH CH2

CH2 C=O COOH

COOH C=O CH3

acid piruvic

H2O

H-C-NH2 COOH

aa

acid eritro-gamahidroxi L-glutamic

acid alfa-cetogama-hidroxi-glutaric

Deficitul de catabolizare a hidroxiprolinei, la fel ca i n cazul prolinei este nsoit de o sever retardare mintal. Hidroxiprolinemia se datoreaz absenei enzimei care catalizeaz conversia 4-hidroxiprolinei la acid L-1-prolin-3-hidroxi-5-carboxilic. Semnele clinice includ retardare mintal, un nivel crescut al hidroxiprolinei plasmatice i o cretere anormal de ridicat a excreiei urinare de hidroxiprolin i hidroxiprolin peptid. XVIII.2.3.2. AMINOACIZII CE SUNT CONVERTII DIRECT N ACETIL CoA Majoritatea aminoacizilor care au ca i produs final de metabolizare acetil-CoA, formeaz mai nti acid piruvic, care printr-un proces de decarboxilare oxidativ sub aciunea complexului multienzimatic al piruvat dehidrogenazei, trece n cele din urm n acetil-CoA. Astfel sunt alanina, serina, glicina, treonina, cisteina, cistina i hidroxiprolina. Exist, ns, un numr de cinci aminoacizi care se metabolizeaz direct n acetil-CoA, fr a mai trece prin stadiul de acid piruvic. Acetia sunt fenilalanina, tirozina, triptofanul, lizina i leucina.

CH3COSCoA

204

Fenilalanina i tirozina. Fenilalanina este convertit mai nti la tirozin sub aciunea fenilalaninhidroxilazei dup care urmeaz calea comun de metabolizare conform reaciilor:
CH2-CH-COOH NH2
KG Glu

fenilalaninhidroxilaz O2 NADPH+H+ NADP+

HO

CH2-CH-COOH NH2

HO

CH2-C-COOH O

parahidroxifenilpiruvat hidroxilaz

OH HO CH2-COOH

acid p-hidroxifenilpiruvic

[O]

CO2 acid homogentizinic

H
homogentizatoxidaz Fe+2 [O]

H O

COOH O CH2-COOH

maleinacetoacetat cis-trans izomeraz GLUTATION

acid maleilacetoacetic

COOH H O H O
fumarilacetoacetat hidrolaza

H-C-COOH HOOC-C-H + CH3-CO-CH2-COOH

acid acetoacetic acid fumaric

CH2-COOH

H2O

acid fumarilacetoacetic

CH3-CO-SCoA

CH3-COOH

Cele cinci secvene de reacii sunt n acest caz transaminarea sub aciunea tirozin--cetoglutarat transaminazei, enzim inductibil n ficat. A doua reacie const ntr-o hidroxilare n poziia orto a acidului phidoxifenilpiruvic, nsoit de o decarboxilare oxidativ i de o migrare a lanului cu trei atomi de carbon. P-hidroxifenilpiruvat hidroxilaza care catalizeaz aceast reacie, este o metaloenzim cu cupru, similar tiroxinazei. Ca i factor i ca agent reductor intervine acidul ascorbic. Produsul de reacie este acidul homogentizinic sau alcaptona.

205

A treia reacie este o reacie de oxidare. Sub aciunea homogentizat oxidazei, o metaloenzim cu fier prezent n ficatul mamiferelor, nucleul benzenic se rupe formnd acid maleilacetoacetic. n a patra etap, acidul maleilacetoacetic este izomerizat sub aciunea maleilacetoacetat cis-trans izomerazei, o -SH enzim din ficatul mamiferelor, trecnd n acid fumarilacetoacetic. Ultima reacie const n scindarea acidului fumarilacetoacetic sub aciunea fumarilacetoacetat hidrolazei n acid fumaric i acid acetilacetic. Aceasta din urm sub aciunea -cetotiolazei poate fi convertit n acetil-CoA i acid acetic. Afeciunile care apar n cazul dereglrii metabolismului tirozinei se caracterizeaz, n general, prin excreia crescut a tirozinei i a cataboliilor si din urin. Tiroxinoza se datoreaz probabil absenei fie a p-hidroxifenil-piruvathidroxilazei, fie a tirozin transaminazei. Pacienii excret n urin cantiti mari de tirozin, pn la 1,5-3 g n 24 h. Dac dieta este bogat n tirozin, se excret, de asemenea, cantiti mari de DOPA (dihidroxi-fenilalanin) i acid p-hidroxifenilacetic. Alcaptonuria se manifest prin nchiderea la culoare a urinii n prezena aerului pn la brun negru. Mai trziu apare i pigmentare a esutului conjunctiv i o form de artrit. Deficitul metabolic este atribuit homogentizoxidazei, enzim de deciclizare a alcaptonei. Incidena afeciunii este de aproximativ 1:5000000. Boala nu prezint manifestri clinice grave. Triptofanul este un aminoacid esenial, deci nu poate fi sintetizat, de aceea aportul su extern este absolul necesar pentru buna funcionare a organismului. Calea de metabolizare a triptofanului a putut fi studiat cu ajutorul mutanilor de neurospora, o bacterie Pseudomonas precum i izolarea din urin a metaboliilor triptofanului. S-a observat urmtoarea secven de reacii:
NH2 CH2-CH-COOH triptofanpirolaz N H NH2
[O] Fe+2

CO-CH2-CH-COOH NH-CHO
N-formilkinurenina

L-triptofan

206

NH2
kinureninformilaza

CO-CH2-CH-COOH NH2
kinurenina

kinureninhidroxilaza [O] NADP+

H2O

HCOOH

NADPH+H+

NH2 CO-CH2-CH-COOH NH2 OH

3-hidroxikinurenin kinureninaz PLP Ala 3-hidroxi COOH antranilatoxidaz

NH2
acid 3-hidroxiantranilic

OH

[O]

H OHC C C C COOH OHC C

H C C H
NADH+H+ NAD+

H C NH2 HOOC
acid acrolein-3-aminofumaric

CO2 acid aminomuconic-6-semialdehida

H C NH2 HOOC

HOOC-CH=CH-CH2-CO-COOH
acid oxalocrotonic (NADPH+H+) NADH+H+ NAD+ HADP+

HOOC-CH2-CH2-CH2-CO-COOH
acid cetoadipic

CH3-CO-S-CoA Triptofanpirolaza sau oxigenaza este o metalenzim cu fier porfirinic (heminic) prezent n ficatul mamiferelor, amfibiilor, psrilor i insectelor. Este o enzim inductibil de ctre triptofan. De asemenea este inhibat printr-un mecanism de tip feed back de ctre derivaii acidului nicotinic, incluznd i NADPH. Enzima poate cataliza reacii similare cele de formare de N-formilkinurenin cu arilformil amine. Hidroxilarea kinureninei la 3-hidroxikinurenin este catalizat de kinurenin hidroxilaz, enzim NADPH dependent, asemntoare reaciei de hidroxilare a fenilalaninei la tirozin. Kinureninaza care catabolizeaz reacia de formare a acidului 3hidroxiantranilic, are ca i coenzim piridoxalfosfatul. Deficitul de vitamin

207

B6 are ca i consecin principal, imposibilitatea metabolizrii derivailor kinureninici, care sunt transformai la nivelul esuturilor extrahepatice n acid xanturenic. Acest metabolit anormal apare n urina oamenilor, maimuelor i obolanilor n caz de deficit de vitamina B6. OH

N COOH

OH

acid xanturenic

La multe animale posibilitatea conversiei triptofanului n acid nicotinic, suplinete deficitul de acid nicotinic din diet (obolan, iepure, cine, porc etc). La i alte animale triptofanul determin o cretere a secreiei derivailor acidului nicotinic. n cazul deficitului de vitamin B6, sinteza de NAD+ i NADP+ poate fi mpiedicat, ca rezultat a unei conversii neadecvate a triptofanului n acid nicotinic ntr-o cantitate suficient, sinteza de nucleotide are loc i n absen de B6. O anomalie ereditar a metabolismului triptofanului este cunoscut sub numele de boala lui Hartnup. Se caracterizeaz printr-o urticarie a pielii asemntoare pelagrei, ataxie cerebral i deteriorare mintal. Urina acestor pacieni conine cantiti mari de acid indolacetic i triptofan. n urina pacienilor cu aceast boal s-au izolat, pn n prezent, 38 de acizi indolici diferii. S-a observat c n cazul unor pacieni cu boli psihice, excreia urinar tinde s revin la normal prin administrarea de antibiotice cu spectru larg. Lizina. Mamiferele transform scheletul de carbon al lizinei n acid -aminoadipic care trece apoi n acid -cetoadipic. Etapa de formare a glutaril-CoA este etap de decarboxilare oxidativ. Glutaril-CoA printr-o serie de reacii ajunge la dioxid de carbon i ap. Catabolismul lizinei prezint dou anomalii metabolice rare. Hiperlizinemie asociat cu hiperamonemie este caracterizat prin creterea nivelului plasmatic de lizin. Nu este asociat cu retardare mintal. Nu se cunoate exact deficitul metabolic. Hiperamonemia nu reflect un deficit pentru nici una din enzimele ciclului ureogenetic.

208

COOH CH2-NH2 (CH2)3 CH-NH2 COOH

lizin

COOH + O=C (CH2)2 COOH

ac. cetoglutaric H2O

CH2-N

C
dehidrogenaz NAD+

(CH2)3 (CH2)2 CH-NH2 COOH COOH

baza Schiff (I)

NADH+H+

COOH CH2-NH- CH (CH2)3 (CH2)2 CH-NH2 COOH COOH

saccharopina NAD+ NADH+H+ dehidrogenaz

COOH CH N-CH
H2O

(CH2)3 (CH2)2 CH-NH2 COOH

baza Schiff (II)

COOH

CHO (CH2)3 CH-NH2 COOH

acid L-alfaaminoadipic semialdehida
+

COOH H2N-CH (CH2)2 COOH

acid L-glutamic

NAD+

NADH+H+

COOH (CH2)3 CH-NH2

transaminaza PLP KG Glu

H2O

COOH
acid aminoadipic

COOH CoASH (CH2)3 C=O COOH

CO2

COOH (CH2)3 CO-S-CoA CO2 + H2O

209

Hiperlizinemia persistent n care lizina plasmatic este crescut dar nu foarte mult. Nu este nsoit de retardare mintal evident. Uneori crete mult nivelul plasmatic al unui catabolit al lizinei saccharopina. XVIII.2.3..3. AMINOACIZI CE FORMEAZ PRIN METABOLIZARE SUCCINIL-CoA Succinil-CoA este produsul amfibolic final de catabolizare a metionibei, leucinei, izoleucinei i valinei. Patru cincimi din carbonii valinei, trei cincimi din carbonii metioninei i jumtate din cei ai izoleucinei formeaz succinil-CoA. Leucina, izoleucina i valina. Datorit asemnrii structurale ne-am atepta ca reaciile biochimice s fie similare. Aceste reacii, ns, difer n parte, iar produii finali de catabolizare sunt i ei diferii. Valina este un aminoacid glicogenic, n timp ce leucina este cetogenic, iar izoleucina att cetogenic ct i glicogenic. Primele trei etape de carboxilare sunt asemntoare. Prima este o transaminare, a doua o decarboxilare oxidativ cu formare de tioester acilCoA, iar a treia este o dehidrogenare cu formare de tioestei ai acil-CoA, - nesatrurai. ncepnd cu a patra reacie apar diferenele n ceea ce privete metabolizarea n continuare. Blocajul enzimelor din poziiile (2) i (3) conduce la boli metabolice ereditare. Dac este blocat enzima din poziia (2) este afectat metabolismul celor trei aminoacizi Leu, Val i Ile. Dac este afectat enzima din poziia (3) este dereglat numai metabolismul leucinei. Schematic catabolismul acestor aminoacizi se poate reprezenta astfel:

210

Leu

Val

Ile

(1) TRANSAMINARE

alfa-cetoacizi corespunztori
(2) DECARBOXILARE OXIDATIV

aciltioesterii corespunztori
(3) DEHIDROGENARE

ACILTIOESTERI NESATURATI COERESPUNZTORI Leu BETA-HIDROXIBETA-METIL GLUTARIL-coa LEUCINA

H3C-CH-CH2-CH-COOH CH3 NH2
leucin transaminaz KA AA

Val

Ile

SUCCINIL-CoA PROPIONIL-CoA + ACETIL-CoA

H3C-CH-CH2-C-COOH CH3 O
acid ceto izocaproic

decarboxilaz CoA CO2

H3C-CH-CH2-CO-S-CoA CH3

dehidrogenaz [2H]

H3C-C=CH-CO-S-CoA CH3

biotin-CO2 carboxilaz biotin ATP

ADP + P

OH HOOC-CH2-C=CH-CO-S-CoA CH3
beta-metil-gluconil-CoA crotonaz H2O

HOOC-CH2-C-CH2-CO-S-CoA CH3
beta-hidroxi-beta-metilglutaril-CoA

211

n mitocandrii din ficat, rinichi si inim de mamifere

HOOC-CH2-CO-CH3 + CH3-CO-S-CoA
acid acetilacetic acetil-CoA

VALIN
NH2 H3C-CH-CH-COOH
valin transaminaz KA AA

O H3C-CH-C-COOH
acid cetoizovalerianic decarboxilaza CoASH CO2

H3C-CH-CO-SCoA
izobutiril-CoA

CH3

CH3

CH3

dehidrogenaz [2H]

H2C=C-CO-SCoA CH3
metilacril-CoA

crotonaz

HOH2C-CH-CO-SCoA deacilaz CH3

acid beta-hidroximetil butiric H2O CoA

H2O

H2O

NAD+

NADH+H+

HOH2C-CH-COOH CH3

dehidrogenaz NAD+ NADH+H+

OHC-CH-COOH CH3
semialdehida metil malonic

HOOC-CH-COOH
acid metilmalonic

CH3

acid beta-hidroxibutiric

ATP

ADP+P

HOOC-CH-COOH CH3
acid metilmalonic CoA H2O

HOOC-CH-CO-CoA
metilmalonil-CoA

coenzima B12

CH3

HOOC-CH2-CH2-COCoA
succinil-CoA

212

OHC-CH-COOH CH3
semialdehida metil malonic

transaminaz KA

H2N-H2C-CH-COOH
AA acid aminoizobutiric

CH3

IZOLEUCINA
NH2 CH3-CH2-CH-CH-COOH
izoleucina transaminaz KA AA

O CH3-CH2-CH-C-COOH CH3
decarboxilaz CoA H2O

CH3

H3C-CH2-CH-CO-SCoA
metilbutiril-CoA

dehidrogenaz [2H] dehidrogenaz [2H]

H3C-CH=C-CO-SCoA
tiglil-CoA

crotonaz H2O

CH3

CH3

H3C-CH-CH-CO-SCoA OH CH3
alfa-metil-betahidroxibutiril-CoA

H3C-CO-CH-CO-SCoA CH3

tiolaz CoASH

alfa-metilacetoacetil-CoA

CH3-CH2-CO-SCoA + CH3-CO-SCoA Pn n prezent se cunosc patru deficite metabolice ale aminoacizilor ramificai. Dintre toate, cel mai mult studiat este boala siropului de arar sau boala urinii cu miros de sirop de arar. Este o boal ereditar, caracterizat prin lipsa sau reducerea foarte mult a activitii cetoaciddecarboxilazei, enzim care transform pe toi cei trei aminoacizi ramificai n aciltioesteri (acil-CoA) cu eliminare de dioxid de carbon. Urina bolnavilor prezint un miros specific asemntor siropului de arar sau de zahr ars. Plasma i urina conin cantiti mari din aceti trei aminoacizi, precum i cetoacizii lor corespunztori. La natere copilul pare normal, boala manifestndu-se numai dup prima sptmn de via extrauterin. Copilul prezint dificulti la alimentare, vomit i uneori apar stri letargice. Copii care supravieuiesc prezint leziuni intinse ale creierului. Fr tratament mor la sfritul primei sptmni de via.
213

Hipervalinemia este o alt boal metabolic ereditar, se datoreaz imposibilitii transformrii valinei n acid cetoizovalerianic. Este caracterizat prin creterea nivelului plasmatic al valinei (nu i al leucinei sau a izoleucinei). Acidemia izovalerianic se datoreaz activitii sczute a izovalerilCoA-dehidrogenazei. Se caracterizeaz printr-un miros intens de brnz a respiraiei i a fluidelor corporale, vom, acidoz i com, printr-o precipitarea excesiv a proteinelor ingerate sau apariia de boli infecioase. De asemenea, apare retardarea mintal i excreia de acid izovalerianic prin urin i transpiraie. Cetonuria intermitent este o boal metabolic ereditar cauzat tot de un deficit metabolic al aminoacizilor ramificai, este o variant a bolii urinii cu miros de arar. Metionina. Produsul final de metabolizare a metioninei este propionil-CoA. Catabolismul se realizeaz n mai multe etape. n prima etap, metionina se condenseaz cu ATP formnd S-adenozilmetionina, forma activ a metioninei. Este un compus foarte important pentru metabolism, deoarece gruparea S-metil activ este utilizat n reaciile de metilare cu formare de compui metilai importani. Astfel, betainele, colina, creatina, adrenalina, melatonina, sarcozina, nucleotide metilate i alcaloizii din plante.. Secvena reaciilor n cazul catabolizrii metioninei este:
NH2 CH3 HOOC-CH-CH2-CH2-S-CH2 HOOC-CH-CH2-CH2-S-CH3 NH2
ATP PP +

N O N

NH2 OH

OH

Prin pierderea gruprii metil, S-adenozilmetionina se transform n Sadenozilhomocistein. Aceasta prin condensare cu serina formeaz cistationin, care la rndul ei este scindat n homoserin i cistein. Printr-o reacie de dezaminare, homoserina se transform n acid -cetobutiric, care prin decarboxilare oxidativ este transformat n propionil-CoA. Dac transformarea homoserinei n acid -cetobutiric este blocat, apare o boal metabolic ereditar cistatinuria
214

NH2 N
acceptor

HOOC-CH-CH2-CH2-S-CH2 NH2

acceptor metilat

H2O

adenozin

OH
S-adenozil homocistein

OH

HOOC-CH-CH2-CH2-SH + HO-CH2-CH-COOH
homocistein

NH2

serin

NH2

H2O

HOOC-CH-CH2-CH2-S-CH2-CH-COOH NH2
cistationin

NH2

HOOC-CH-CH2-CH2-S-CH2-CH-COOH NH2
cistationin

H2O

HS-CH2-CH-COOH + HO-CH2-CH2-CH-COOH
cistein

NH2

NH2

homoserin

NH2

HOOC-CH-CH2-CH2-OH
homoserin

HOOC-C-CH2-CH3 NH3
acid cetobutiric CoA CO2

NH2

CH3-CH2-CO-SCoA
NAD+ NADH+H+

Homocistinuria este o afeciune metabolic. La nivel plasmatic metionina este crescut. n urin homocisteina este excretat masiv (peste 300 mg n 24 h) asociat uneori cu S-adenozilmetionin. Homocistinuria se datoreaz activitii anormale a cistatiosintetazei. Clinic boala este asociat

215

cu tromboz, osteoporoz, frecvent retardare mintal i dizlocarea cristalinului la ochi. XVIII.2.4. Conversia aminoacizilor la produi specializai Acest subcapitol cuprinde transformarea aminoacizilor n compui deosebii avnd un mare interes biologic. Astfel, aminele biogene de mare importan (histamina, dopamina, adrenalina, noradrenalina, serotonina, acidul -aminobutiric, sinteza creatinei i a creatinfosfatului, formarea acidului -aminolevulinic precursor al porfirinelor etc. XVIII.2.4.1. DECARBOXILAREA AMINOACIZILOR Reaciile de decarboxilare a aminoacizilor fac parte din reaciile ce conduc la formarea unor compui speciali. Decarboxilarea are loc sub aciunea unor decarboxilaze specifice rspndite n toate esuturile. Anumite decarboxilaze se gsesc numai n anumite esuturi. Coenzima decarboxilrii este piridoxalfosfatul. Histidina se decarboxileaz n prezena unei L-aminoacid decarboxilaz aromatic i se transform n histamin. Aceast enzim acioneaz i asupra 5-hidroxitriptofanului, DOPA, fenilalaninei, tirozinei i chiar asupra triptofanului ca atare. Decarboxilarea histidinei mai poate avea loc sub aciunea histidin decarboxilazei, o enzim complet diferit, care este prezent n majoritatea esuturilor.
N N H CH2-CH-COOH NH2
histidin

N
histidin decarboxilaz

CH2-CH2-NH2 N H
histamin

CO2

Histamina se formeaz la nivelul mastocitelor. Este o substan cu aciune puternic vasodilatatoare acionnd la nivelul capilarelor. Ea este implicat n unele procese patologice ca stri alergice, oc etc. n ocul histamic, histamina din esuturi este eliberat n circulaie. Datorit efectului vasodilatator al histaminei, sngele se acumuleaz n capilare, avnd loc aa numitul fenomen de prbuire a capilarelor. Tensiunea scade brusc i apare hemoragia intravascular. Compuii din organism care conin histidin sunt

216

ergotioneina (n hematii i ficat), carnosina (o dipeptid cu -alanin i histidin) i anserina (1-metil-carnisina). Ultimii doi se gsesc n muchi. n urina normal se gsete 3-metil-histidina ntr-o proporie de 50 mg/ 100 ml. Aceast valoare scade foarte mult la pacienii cu boala lui Wilson. Histidina poate fi metabolizat la acid glutamic, proces ce include patru reacii. Prima reacie este dezaminarea desaturant care are loc sub aciunea histidinazei, n urma creia rezult acidul urocanic. Aceasta sub aciunea urocanazei, printr-un proces de reducere intern i adiia unei molecule de ap, se transform n acid N-forminoglutaric (FIGLU). n prezena glutamatformilaminotransferazei i a acidului tetrahidrofolic, gruparea formil este transferat pe acidul folic i se obine acidul gluatmic liber. Printr-un proces de transaminarea, acesta, poate fi transformat n acid cetoglutaric. Acesta intr n ciclul lui Krebs sau n metabolismul lipidic. La pacienii care prezint deficit de acid folic, trecerea de la acid Nformiminoglutaric la acid glutamic este parial blocat i acidul foriminoglutaric este excretat prin urin. Aceast observaie st astzi la baza unui test pentru stabilirea deficitului de acid folic. n acest caz dup o administrare masiv de histidin, n urin este detectat acidul N-forminomoglutamic. Testul este utilizat n diagnosticul anemiei megaloblastice (anemie pernicioas) prin deficit de acid folic.
N N H CH2-CH-COOH NH2
histidin histidaz

N N H CH=CH-COOH

urocanaza H2O

NH3

acid urocanic

N N H

O CH=CH-COOH

imidazol propinathidrolaza

NH H C N H

COOH CH CH2-CH2-COOH

acid 4-imidazolon-5-propionic

acid N-forminoglutamic

217

gluamaiformimino transferaz H4folat N5-formimino-H4 -folat

HOOC-CH-CH2-CH2-COOH NH2

alaninamino transferaz piruvat

alanin

HOOC-C-CH2-CH2-COOH O Histidinemia este o boal metabolic ce se caracterizeaz printr-o cretere a nivelului histidinei n snge i n urin. Crete, de asemenea, i excreia acidului imidazolpiruvic. Blocajul metabolic se datoreaz unei activiti sczute a histidinazei hepatice care nu mai transform histidina n acid urocanic. n felul acesta histidina va fi transformat n acid imidazolpiruvic, form sub care se i excret prin urin. Sarcina normal este adesea nsoit de histidinurie, probabil datorit schimbrii caracteristice ale funciilor renale n cursul sarcinii. Imidazolaminoaciduria a fost descoperit la pacieni cu degenerare cerebromacular. Pacienii au excretat n urin cantiti relativ mari de histidin, 1-metil histidin, carnozin i anserin. Boala se transmite genetic. Triptofanul. O cale secundar de matabolizare a triptofanului include oxidarea sa la un derivat 5-hidroxilat, reacie analoag conversiei fenilalaninei n tirozin sub aciunea triptofanhidroxilazei hepatice, care catalizeaz i hidroxilarea triptofanului. Decarboxilarea 5-hidroxitriptofanului conduce la formare de hidroxitriptamin sau serotonin, un puternic vasodilatator arterial i stimulator al contraciei musculaturii netede. 5-Hidroxitriptofan decarboxilaza este prezent n rinichi, ficat i stomac. Formarea 5-hidroxitriptaminei sau a serotoninei are loc n special la nivelul celulelor nervoase i n trombocite. Enzima limitant de formare de serotonin este hidroxilaza. n unele cazuri patologice se formeaz cantiti mari de serotonin n celulele tumorale a esutului argenafin din cavitatea abdominal (carcinomul intestinului subire). Carcinomul este considerat ca o consecin a metabolizrii anormale. 1% din triptofan se metabolizeaz, n mod normal, la serotonin, restul pe calea hidroxiindolului. n cazul pacienilor cu carcinom la intestinul subire, 60% din triptofan se metabolizeaz sub form de serotonin. Paralel se reduce foarte mult formarea de acid nicotinic pe seama triptofanului i apar simptome de pelagr.

218

Serotonina este un mediator chimic al influxului nervos, mecanismele serotonigene sunt implicate n afeciunile psihice. Serotonina eliberat la nivelul trombocitelor particip n fenomenele de hemostaz datorit aciunii sale vasoconstrictor arteriolar. Majoritatea serotoninei se metabolizeaz prin dezaminare oxidativv sub aciunea monoaminozidazei (MAO) la acid 5-hidroxi-indolacetic.
CH2-CH-COOH N H NH2 HO N H CH2-CH-COOH NH2

hidroxilaz

triptofan

5-hidroxitriptofan decarboxilaz

HO N H

CH2-CH2-NH2

5-hidroxitriptamina serotonina

Acidul glutamic. La sistemul nervos, n creier, are loc decarboxilarea acidului glutamic cu formare de acid -aminobutiric sau GABA, mediator chimic al influxului nervos. COOH CH-NH2 CH2 CH2 COOH
acid glutamic gabadecarboxilaz CO2

CH2NH2 CH2 CH2 COOH

acid gamaaminobutiric [O] PLP NH3

CHO CH2 CH2 COOH

semialdehida succinic

Acidul -aminobutiric este metabolizat prin dezaminare oxidativ la acid succinic, fie redus la acid -hidroxibutiric.

219

COOH CH-NH2 CH2 CH2 COOH

acid glutamic transaminaz KA AA

COOH C=O CH2 CH2 COOH

acid ceto glutaric CO2

CHO CH2 CH2 COOH

semialdehida succinic

CHO CH2 CH2

semialdehid succinic semialdehidsuccinat dehidrogenaz

COOH CH2 CH2

NAD+ NADH+H+

COOH

COOH
acid succinic

Lizina i ornitina. Sub aciunea bacteriilor de putrefacie lizina i ornitina sufer reacii de decarboxilare formnd diamine deosebit de toxice din grupul toxinelor cadaverice. Astfel lizina formeaz putrescein iar ornitina formeaz putrescein. CH2-CH2-CH2-CH2-CH-COOH NH2 NH2
CO2

CH2-CH2-CH2-CH2-CH2 NH2 NH2

CH2-CH2-CH2-CH-COOH NH2 NH2

CO2

CH2-CH2-CH2-CH2 NH2 NH2

XVIII.2.4.2. OBINEREA PRODUILOR SPECIALIZAI PE CI DIFERITE

220

Fenilalanina i tirozina. La nivelul celulelor neurale i adrenale, fenilalanina i tirozina se transform n norepinefrin (noradrenalin) i epinefrin (adrenalin). n faza intermediar se formeaz i DOPA-amin. La nivelul melanocitelor se formeaz melanin. Toate aceste substane, rezultate n urma metabolizrii acestor doi aminoacizi aromatici prezint o importan deosebit. Melanina este pigmentul pielii i a prului. Hidroxilarea tirozinei cu formare de DOPA la nivelul melanocitelor sau celulelor formatoare de pigmeni, are loc sub aciunea tirozinazei, enzim cupru dependent. DOPAoxidaza transform apoi DOPA n DOPA-chinon. Acesta prin ciclizare formeaz compui indolici, care prin polimerazare genereaz melanina. Aceste reacii specifice au loc n melanocite, celule ce deriv din crestele neurale. DOPA-amina, noradrenalina i adrenalina sunt amine biogene cu rol de mediatori chimici ai influxului nervos, iau natere n celulele neurale i adrenale sub aciunea unui set de enzime. Astfel, dup ce fenilalanina este transformat n tirozin, aceasta sub aciunea tirozin hidroxilazei, enzim cupru dependent, avnd ca i coenzim tetrahidrobiopterina, este transformat n DOPA. Aceasta este decarboxilat sub aciunea DOPAdecarboxilazei, enzim piridoxal dependent, formnd DOPA-amin. Aceasta la rndul ei, sufer o reacie de hidroxilare sub aciunea DOPA-decarboxilazei, enzim cupru dependent, care utilizeaz vitamina C. Se formeaz noradrenalin, care este metilat sub aciunea fenil etanolami-Nmetil-transferazei i n prezen de S-adenozilmetionin formnd adrenalin.
CH2-CH-COOH NH2
fenilalanin hidroxilaz O2 NADPH+H+ NADP+

HO

CH2-CH-COOH NH2

-formarea melaninei: CH2-CH-COOH HO NH2

O O
tirozinaz O2 [Cu]

HO HO

CH2-CH-COOH NH2
DOPA

DOPA-oxidaz

CH2-CH-COOH NH2
DOPA-chinon

(ciclizare)

O O N H COOH

221

O O N H COOH

HO HO N H COOH

5,6-dihidroxiindol

MELANIN

formarea adrenalinei:
CH2-CH-COOH
transhidroxilaz

HO HO

CH2-CH-COOH NH2
DOPA

HO
tirozin

NH2

H2-biopterin H -biopterin 4

decarboxilaz (PLP) CO2

HO HO

CH2-CH2-NH2
DOPA-amin

DOPA-aminoxidaz [vit. C] [Cu]

O2

HO HO

CH-CH2-NH2 -N-metiltransferaz
noradrenalin

feniletanolamin

HO HO

CH-CH2-NH-CH3 OH
adrenalin

OH

Aminele biogene care iau natere n cursul acestor reacii la nivelul sistemului nervos, sunt condiionate de doi factori: biosintez i incativare prin catabolism. Aceste amine cu funcii de mediatori chimici ai influxului nervos sunt inactivate de ctre aminoxidaza (MAO), enzim localizat pe membrana mitocondrial extern. Specificitatea de substrat a acestei enzime este destul de larg. Unul din substratele prevzute este DOPA-amina dar i serotonina. Sub aciunea MAO, DOPA-amina se transform ntr-o aldehid conform reaciei.

222

HO HO

CH2-CH2-NH2
FAD

MAO

HO HO
FADH2

CH2-CH=NH

H2O NH3

H2O2

O2 1/2O2

HO HO

CH2-CHO

H2O

La boala lui Parkinson, care este o consecin a leziunii sistemului nervos extrapiramidal, nivelul de DOPA-amin este foarte sczut fa de normal. n acest caz meninerea nivelului normal al DOPA-aminei se face prin aport de precursori sau de administrare de MAO, adic substane din clasa tranchilizantelor i antidepresivilor. Tot din fenilalanin i tirozin pot s apar i ali compui deosebit de importani cum sunt hormonii tiroidieni. Aciunea fiziologic a acestor hormoni a fost studiat pe bolnavi afectai de tulburri funcionale tiroidiene i pe animale cu glanda extirpat. n funcie de gradul leziunilor tiroidiene i de simptomele nsoitoare, se vorbete despre mixedem i cretinism, n cazul hipofunciilor tiroidiene; manifestri similare sunt caracteristice pentru gua endemic, produs prin lipsa de iod din alimente i din apa potabil. Pe animale tiroidectomizate a fost studiat casexia tireopriv, manifestnd n cel mai nalt grad consecinele lipsei hormonilor tiroidieni. Invers, hiperfuncia tiroidian produce dereglri metabolice grave constituind boala lui Basedow. I HO CH2-CH-COOH NH2
3-monoiodtirozina (I1 TIR)

I HO I CH2-CH-COOH NH2
3,5-diiodtirozina (I2 TIR)

223

I HO I O

I CH2-CH-COOH NH2 HO

I O I

I CH2-CH-COOH I NH2

3,5,3'-triodtironina (TRIAC, T3)

3,5,3',5'-tetraiodtirozina (TETRAC T4)

T3 i T4 liberi sunt hormoni metabolic activi n plasm. Legtura cu macromoleculele proteice este deosebit de important deoarece previne clearenceul rapid i degradarea T3 i T4 circulani de ctre rinichi. T3 i T4 pot fi disociai din legtura lor proteic de ctre anioni competitivi cum sunt salicilaii, dinitrofenolul etc. Deoarece T 3 se leag mai slab de proteine serice, el dispare din snge mai rapid de 20 de ori dect T 4. Dereglrile care apar n cursul catabolizrii acestor doi aminoacizi (fenilalanina i tirozina) conduc la grave tulburri metabolice cu deficiene, n special, la nivelul sistemului nervos. Cea mai grav este absena fenilalaninhidroxilazei, prima enzim din lanul metabolic, care are rol de a transforma fenilalanina n tirozin. Apare o boal metabolic cunoscut sub denumirea de fenilcetonurie sau idioenie fenilpiruvic. Este o boal congenital cu o frecven de 1:10000 noi nscui. Se manifest prin depigmentare, diminuarea funciilor biologice i retardare mintal. Pacienii sunt incapabili s converteasc fenilalanina n tirozin, aa cum am amintit, n schimb au loc alte reacii din care rezult o serie de catabolii toxici n special pentru sistemul nervos (acid fenilpiruvic, acid fenil acetic, acid fenilacetilglutamic etc). CH2-CH-COOH NH2
transaminare PLP KG Glu

CH2-C-COOH
acid fenilpiruvic

Aceti metabolii apar i n urina oamenilor sntoi, dar n cantiti nesemnificative. Copiii pot fi salvai de la retardare mintal dac imediat dup natere se depisteaz afeciunea i se administreaz copilului o diet lipsit de fenilalanin pn la vrsta de 6 ani cnd sistemul nervos fiind complet dezvoltat, prezena fenilalaninei nu afecteaz. Tirozinemia este o afeciune ereditar de hepatosplino-megalie, ciroz nodular hepatic, metabolism anormal al tirozinei i a metioninei, parahidroxifenil-lactacidurie. Totodat se observ creterea nivelului plasmatic al tirozinei.
224

NAD+ NADH+H+ H2O CO2

CH2-C-COOH O
NADH+H+ NAD+

CH2-COOH
Gln H2O

CH2-CH-COOH OH

COOH CH2-CO-NH-CH CH2 CH2 COOH

-Alanina intr n compoziia acidului pantotenic i reprezint componenta major a pereilor bacterieni. Serina este implicat n sistemul de sintez a sfingozinei. De asemenenea, particip la sinteza bazelor purinice i pirimidinice. Carbonul din este o surs de grupri metil pentru timin i colin i a carbonului 2 i 8 din nucleul purinic. Arginina servete ca i donor de grupare guanidinic pentru sinteza creatinei la primate i pentru sinteza streptomicinei la Streptomices. Sub aciunea florei intestinale formeaz apermina i spermidina. Etapele sintezei creatinei:

225

H2N-C-NH-CH2-CH2-CH2-CH-COOH + H2N-CH2-COOH NH NH2

arginin-glicin transamidaz (rinichi)

HN-C-NH-CH2-COOH + CH2-CH2-CH2-CH-COOH
acid guanidinacetic

NH

NH2

ornitin

NH2

HN C

NH2 NH-CH2-COOH

guanidinacetat metiltransferaz SAM SAH

NH2 HN C N-CH2-COOH CH3

ATP ADP

H NH-P HN C N-CH2-COOH CH3

neenzimatic

HN C H N CH2

Sinteza acidului guaninoacetic are loc numai la nivelul rinichilor, nu i n miocard sau n ficat. n schimb metilarea acidului guaninacetic la creatin are loc numai n ficat. Creatinfosfatul este un compus macroergic specific muchilor. n acest fel se ciclizeaz neenzimatic pierznd ap i acid fosforic trecnd n creatin. Travaliul muscular este alimentat direct cu energie de fosfaii macroergici formai n muchi prin glicoliz sau alte procese exergonice. Depozitul major de energie este fosfocreatina macroergic format printr-o reacie reversibil. ATP + creatina ADP + fosfocreatina

Argininofosfatul apare n muchii nevertebratelor avnd o funcie asemntoare creatinfosfatului la mamifere. O schem ce red relaia dintre arginin, ornitin i protein poate fi prezentat astfel:

226

PROTEINE PROLIN GLUTAMIC gama SEMIALDEHID GLUTAMAT PUTRESCEIN SPERMIDIN SPERMIN ORNITIN UREE ARGININ

PROTEINE alfa-CETOARGININ CREATIN CREATINFOSFAT CREATININ ARGININFOSFAT

Cisteina este utilizat pentru sinteza coenzimei A, ea servind ca precursor al tioetanolaminei. Cisteina este, de asemenea, precursor al taurinei, utilate pentru conjugarea acizilor biliari. Glicocolul sau glicina nu este un -aminoacid esenial deoarece poate fi sintetizat de multe organisme animale. Dezaminarea i transaminarea glicocolului. Ficatul i rinichii prezint o flavoprotein specific, glicinoxidaza care dezamineaz oxidativ glicocolul transformndu-l n acid glioxalic.
H2O

CH2-COOH NH2

glicinoxidaz NAD+ NADH+H+

CH-COOH NH
iminoacid NH3

CH-COOH O

Dezaminarea glicocolului este uor reversibil. Acidul glioxalic rezultat poate urma dou ci de metabolizare: a. o cale normal, prin care are loc, mai nti, o decarboxilare concomitent cu o oxidare rezultnd acid formic, astfel format, are rol n biosintez sub form de C1 activ sau se poate decarboxila n prezen de biotin;
[O]

O=HC-COOH
CO2

HCOOH

C1 activ CO2 + H2

b. o cale anormal, prin care acidul glioxilic este transformat n acid oxalic.
227

n acest caz are loc numai procesul de oxidare nu i de decarboxilare. Prezena acidului oxalic n cantitate mare determin o depire a nivelului su normal din snge i este apoi depus n esuturi i n special n esutul renal sub form de calcul. O=HC-COOH + [O] HOOC-COOH

Acidul glioxilic poate suferi i un proces de transaminare folosind ca donori de grup amino glutamina, acidul glutamic, asparagina sau ornitina, cu formare de glicocol. Glicocolul este un aminoacid glicogenic i anticetogenic. Conversia glicinei n serin. Studiile lui Tracer sugereaz mecanismul: CH2-COOH NH2
glicin H2C=O H2C=O

HO-CH2-CH-COOH
serin

NH2

-CO2

HOCH2-CH2-NH2
etanolamin

transaminaz

HO-CH2-CHO OHC-COOH HO-CH2-COOH

oxidaza

NH3

Produsul final de decarboxilare a serinei, etanolamina poate fi convertit n glicin. Sinteze de purine. Molecula de glicin este folosit integral pentru a forma poziiile 4,5 i 7 din scheletul purinei.
1 2

N C

C5 C

N 4 N 9
3

8 C

Glicina este un constituient al glutationului . Aceast tripeptid este alctuit din acid glutamic, cistein i glicocol. Azotul aminic din glicocol nu este disponibil pentru transaminare. Legtura peptidic se face cu gruparea carboxilic din poziia a acidului glutamic. Glutationul are un rol important

228

n protejarea gruprilor SH. De asemenea, joac un rol important la nivelul eritrocitelor pentru ndeprtarea apei oxigenate care poate oxida hemoglobina la methemoglobin. HOOC-CH2-CH2-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOH NH2 CH2-SH

Glicina particip la reacii de conjugare. Acizii biliari se conjug cu glicocolul pentru a forma produi de condensare uor eliminai prin bil. Cu acidul colic glicocolul formeaz acidul glicocolic.
OH COOH
H2N-CH2-COON

HO

OH

OH CO-NH-CH-COOH

HO

OH

Glicocolul se poate conjuga i cu acidul benzoic, formnd acid hipuric. Abilitatea ficatului de a transforma o doz msurat de acid benzoic n acid hipuric, este utilizat ca test al funciilor hepatice. Totodat acidul hipuric este calea de eliminare din organism a derivailor organici care apar ca produi de metabolizare a unor medicamente sau ai unor metabolii normali. Reacia de formare a acidului hipuric este:
COOH
CoASH Mg+2 ATP ADP+P H2O

CO-SCoA
H2NCH2COOH CoA

CO-NH-CH2-COOH

229

Glicocolul particip la sinteza creatinei, creatininei i a creatin fosfatului. Creatinogeneza prezint dou etape importante i anume transamidarea i transmetilarea. Ao. Etapa de transamidare are loc la nivelul rinichilor sub aciunea arginin-glicin-transamidazei cu formare de acid guanidinacetic sau glicocianin, conform reaciilor:
HOOC-CH 2-NH 2 + H 2N-C-NH-(CH 2)3-CH-COOH NH NH2 HN-C-NH-CH 2-COOH + H 2N-(CH 2)3-CH-COOH NH NH2
arginin-glicin transamidaz

Bo. Etapa de transmetilare are loc la nivelul ficatului cu participarea S-adenozil metioninei i a guanidoacetat metil transferazei. Are loc formarea creatinei care se poate transforma, apoi la nivelul muchilor, n creatinfosfat sau n creatinin. Trecerea creatinei n creatinin depinde de vrst. Pn la pubertate se formeaz creatina, iar n perioada adult aceasta se transform n creatinin. n unele afeciuni musculare dozarea creatinkinazei ct i a creatininei din snge i urin ne poate da informaii importante asupra bolii. Glicocolul ia parte la ciclul succinat-glicin. Din acest ciclu rezult metabolii importani necesari sintezei hemoglobinei ca: succinil-CoA i acidul -aminolevulinic. .Acidul -cetoglutaric (-KG) format intr, din nou, n ciclul acidului tricarboxilic. Aceast schem reprezint legtura dintre ciclul citric i unii produi de metabolizare a glicinei, cel mai important fiind acidul aminolevulinic. Rolul important a glicinei n sinteza porfirinelor i n sinteza purinei, a sugerat lui Shemin i Russel (1955) o relaie a metabolismului glicolic cu ciclul citric. Aceast cale a fost sintetizat n ciclul succinat-glicin, numit i ciclul lui Shemin. Dup cum se observ succinil-CoA se condenseaz cu carbonul al glicinei formnd acidul -amino--ceto adipic. n acest punct metabolismul glicinei se leag de ciclul acidului tricarboxilic care furnizeaz succinil-CoA. Acidul -amino--ceto adipic este convertit apoi n acid -aminolevulinic prin pierdere de dioxid de carbon. Acest compus servete ca precursor la sinteza porfirinei dup dezaminare.

230

CICLUL CITRIC

COOH (CH2)2 C=O

succinil-CoA

COOH (CH2)2 C=O

CoASH CH-NH
2

CO2

COOH (CH2)2 C=O CH-NH2

acid delta-amino levulinic [O]

PORFIRINE

S-CoA

COOH
acid alfa-aminobetacetoadipic

+ H2N-CH 2-COOH
H2O GDP +P GT P NADH+H
+

NH3 NAD
+

COOH (CH2)2 COOH

+H2O

COOH (CH2)2 CH=O

COOH (CH2)2 C=O CHO

NAD

-H2O NADH+H
alfa+

KG

Glicocolul particip la biosinteza hemului. Prin folosirea de glicin marcat s-a putut stabili c atomul de carbon metilenic i atomul de azot sunt utilizai pentru sinteza nucleului porfirinic din hem. Practic glicocolul particip att la biosinteza hemului ct i a globinei. Azotul din nucleele pirolice deriv din azotul glicinic, iar carbonul din poziia este sursa carbonilor din ciclul pirolic, dar n acelai timp i din punile metilenice. Reaciile care au loc sunt urmtoarele:

231

COOH CH2 CH2 CO SCoA

+

COOH CH2
(ALAS) AM LEV sintetaz CoA (ALAS) AM LEV sintetaz PLP CO2

COOH CH2 CH2 CO CH-NH2

CH2 CO H-C-NH2 COOH

H H-C-NH2 COOH

acid alfa-aminobeta-ceto adipic

Dou molecule de acid -aminolevulinic se condenseaz apoi, cu formare de porfibilinogenv (PBG) sub aciunea aminolevulinic sintetazei (AL LEV sintetaz). AM LEV sintetaza este o enzim mitocondrial, n timp de AM LEV dehidraza este prezent n citosol. n faz citoplasmatic patru molecule de porfibilinogen, printr-o serie de reacii condiionate enzimatic, formeaz compuii tetrahidropirolici substituii.
COOH COOH CH2 CH2 H2N-CH2-C=O + CH2 CH2 O=C H-C-H NH2
AM LEV dehidraza -2 H2O

COOH COOH CH2 H2N-CH2 CH2 CH2

porfibilinogen (PBG)

Dintre bolile metabolice ale glicocolului amintim. Glicinuria este asociat cu tendina de a forma calculi renali pe baz de oxalai, n timp ce cantitatea de oxalai eliminat prin urin este normal. De asemenea, excreia urinar de glicin atinge valori de pn la 600-1000 mg n 24 de ore, n timp ce nivelul glicinei din plasm este normal. De aceea,

232

glicinuria este considerat ca datorndu-se unui deficit de transport tubular renal al glicinei, deoarece crete reabsorbia glicinei de ctre tubii contori renali, permite aminoacidului s scape n urin n cantiti mari. Hiperoxaluria este boala metabolic caracterizat printr-o excreie urinar crescut de acid oxalic, care nu este legat de aportul alimentar de acid oxalic i de oxalai. Istoricul bolii este legat de urolitiaza bilateral progresiv de oxalat de calciu, nefrocalcinoz i unei infecii repetate a travtului urinar. Deficitul gliciltransaminazei, mpreun cu oxidarea acidului glioxilic format la acid oxalic i nu la acid formic, poate prezenta explicaia biochimic a hiperoxaluriei primare. n orice caz acidul oxalic eliminat este de origine endogen. Se poate presupune, de asemenea, c deficitul n vitamina B6 determin o excreie crescut de acid oxalic, deoarece glutamic sau alanin-glioxil transaminaza sunt enzime dependente de vitamina B6. n ficat activitatea AGA (alanin-glioxil transaminaz) este de cca 20 de ori mai mare dect a GGA (glutamic-glioxil transaminaz). Un deficit de AGA mpreun cu oxidarea acidului glioxilic la acid oxalic, ar putea constitui o explicaie pentru hiperoxalurie primar. XVIII.3. BIOSINTEZA AMINOACIZILOR Dintre aminoacizii cunoscui numai un numr de 20 prezint importan pentru biosinteza proteinelor. Unele forme de via (plante, bacterii) sunt capabile s sintetizeze toi 20 de aminoacizi din intermediari amfibolici. Altele, inclusiv mamiferele i n special omul, pot sintetiza numai o parte din ei, care au fost numii aminoacizi neeseniali. Cei ce nu pot fi sintetizai i care trebuie suplimentai prin diet sunt numii aminoacizi eseniali. Aminoacizi eseniali arginina (Arg) histidin (His) izoleicin (Ile) leucin (Leu) lizin (Lys) metionin (Met) fenilalanin (Phe) treonin (Thr) triptofan (Trp) valin (Val) aminoacizi neeseniali alanin (Ala) asparagin (Asn) acid aspartic (Asp) cistein (Cys) acid glutamic (Glu) glutamin (Gln) glicin (Gly) hidroxiprolin (Hip) prolin (Pro) serin (Ser) Tirozin (Tyr)

233

XVIII.3.1. Aminoacizi neeseniali care se sintetizeaz din intermediari amfibolici Alanina se formeaz din acid piruvic printr-o reacie de transaminare. H3C-C-COOH O
transaminaz Glu(Asp) KG

H3C-CH-COOH NH2

Acidul glutamic se formeaz din -cetoglutarat printr-o reacie catalizat de L-glutamat dehidrogenaz. COOH C=O (CH2)2 COOH
L-glutamat dehidrogenaza NH4+ NADPH+H+ H2O

COOH CH-NH2 (CH2)2

NADP+

COOH

Acidul aspartic se sintetizeaz din oxalilacetat prin transaminare. COOH C=O CH2 COOH
Glu

COOH
transaminaz

CH-NH2 CH2

KG

COOH

Glutamina se sintetizeaz printr-o reacie catalizat de ctre glutaminsintetaz, plecnd de la acid L-glutamic. Reacia necesit ATP ca i donor de energie.

234

COOH CH-NH2 (CH2)2 COOH + NH4+

glutaminsintetaz Mg+2 ATP ADP+P

COOH CH-NH2 (CH2)2 CONH2

Asparagina se sintetizeaz printr-o reacie similar plecnd de la acid L-aspartic sub aciunea asparaginsintetazei. ATP trece, n acest caz, la AMP i PP. COOH CH-NH2 CH2 COOH + NH4+
asparaginsintetaz Mg+2 ATP ADP+P

COOH CH-NH2 CH2 CONH2

n cazul serinei, n esutul mamiferelor coexist dou ci de biosintez. n ambele cazuri punctul de plecare n sintez este acidul 3fosfogliceric, intermediar din glicoliz.
H2C-O-PO3H2 HC-OH COOH H2O
P

H2C-OH HC-OH COOH NAD+ NADH+H+ H2C-O-PO3H2 C=O COOH

AA

H2C-OH C=O COOH AA H2C-O-PO3H2 HC-NH2

KA H2O KA

H2C-OH HC-NH2 COOH

NAD+

NADH+H+

COOH

Calea prin intermediul derivailor fosforilai necesit n prima etap o dehidrogenaz, apoi o transaminaz i o fosforilaz. Calea prin intermediari nefosforilai, necesit o fosfataz i o transaminaz.

235

Sinteza glicinei n esutul mamiferelor poate s se fac pe mai multe ci. n citosolul hepatic se gsete glicintransaminaza care transform acidul glioxilic i acizii glutamic i aspartic n glicin. La mamifere exist dou ci importante de sintez a glicinei, una plecnd de la colin i alta de la serin.
(H3C)3N-CH2-CH2OH
colin + colinoxidaz 2[H]

(H3C)3N-CH2-CHO
betainaldehid

betainaldehid dehidrogenaz NAD+ NADH+H+

(H3C)3N-CH2-COOH
betain

(transmetilare) CH3

(H3C)2N-CH2-COOH
dimetilglicin

dimetilglicinoxidaz CH2O

H3C-HN-CH2-COOH
sarcozin

sarcozinoxidaz CH2O

H2N-CH2-COOH
glicin

HOH2C-CHNH2-COOH
H4 folat

H2N-CH2-COOH
metilen H4 folat

n cea de a doua cale serina sufer o reacie de hidroximetilare n prezena tetrahidrofolatului. XVIII.3.2. Aminoacizi neeseniali care se sintetizeaz din ali aminoacizi neeseniali Prolina se sintetizeaz la mamifere plecnd de la glutamat printr-o serie de reacii reversibile care sunt utilizate i la catabolismul prolinei. H2C HO-C O CH2 CH-COOH NH2
NADH+H+ NAD+

H2C HC O

CH2 CH-COOH NH2

H2O

236

H2C HC N

CH2 CH-COOH
NADH+H+ NAD
+

H2C HC N H

CH2 CH-COOH

Hidroxiprolina se sintetizeaz din prolin prin aciunea prolin hidroxilazei. Reacia necesit prezena de oxigen molecular, Fe+2 i de vitamina C. HO N H COOH N H COOH

XVIII.3.3. Aminoacizi neeseniali care iau natere din aminoacizi eseniali Cisteina se sintetizeaz din L-serin i homocistein, care provin ca intermediari n metabolizarea metioninei. CH2-SH CH2 CH-NH2 COOH
L-homocistein +H2O

HO-CH2 + CH-NH2 COOH

L-serin H2O

CH2 CH2 CH-NH2 COOH

CH2 CH-NH2 COOH

cistationina

HO-CH2-CH2-CH-COOH + HS-CH2-CH-COOH
L-homoserin

NH2

L-cistein

NH2

Tirozina se sintetizeaz din fenilalanin sub aciunea fenilalanin hidroxilazei. Reacia este ireversibil i necesit prezen de NADPH, oxigen molecular i tetrahidrobiopterin.

237

CH2-CH-COOH NH2

fenilalanin hidroxilaz I H4 biopterin II NADP+ NADPH+H+

HO

CH2-CH-COOH NH2

H2 biopterin

Complexul fenilalanin hidroxilazei prezint dou activiti distincte; activitatea I reprezint reducerea oxigenului molecular la ap i fenilalaninei la tirozin, iar activitatea II, reprezint reducerea dihidrobiopterinei la tetrahidrobiopterin pe socoteala NADPH. Hidroxilizina la fel ca i prolina este prezent n fibra de colagen. Hidroxilizina este, ns, absent din aproape toate proteinele mamiferelor, provine din lizina alimentar prin hidroxilare, dar numai dup incorporarea lizinei n legtura peptidic, analog formrii hidroxiprolinei din prolin. Enzima care catalizeaz aceast reacie este lizinhidroxilaza. XVIII.4. METABOLISMUL HEMOGLOBINEI XVIII.4.1. Biosinteza Datorit pierderii permanente de hemoglobin prin catabolism i prin mbtrnirea hematiilor este evident necesitatea nlocuirii n mod permanent. Durata medie de via a eritrocitelor umane este n jur de 120 de zile. Ele sunt apoi lizate i hemoglobina coninut n ele, este convertit n produi de excreie. S-a estimat c exist aproximativ 30 de trilioane de eritrocite n sngele circulant a unui brbat adult, dintre care n fiecare secund se distrug aproximativ 3 milioane. Dac, fiecare eritrocit se presupune c conine aproximativ 300 de milioane de molecule de hemoglobin. n acest caz n fiecare secund trebuie s se sintetizeze aproximativ 900 de trilioane de molecule de hemoglobin, pentru a menine nivelul normal de hemoglobin din snge. Dei pare s fie o cantitate enorm, un individ sntos poate sintetiza aceast cantitate ce corespunde la aproximativ 8 g hemoglobin n 24 de ore. XVIII.4.1.1. BIOSINTEZA GLOBINEI

238

Biosinteza globinei se realizeaz din aportul corporal de aminoacizi ntr-o cantitate de 8 g/zi. Aproximativ 14% din aminoacizii aparinnd proteinlor ingerate, sunt utilizai pentru obinerea globinei. Din acest motiv biosinteza globinei este considerat prioritar. Procesul de sintez a globinei survine, n primul rnd, n eritrocitele nucleate (normoblaste) din mduva osoas i de asemenea, n reticulocite. Sinteza globinei are loc la nivelul ribozomilor ntr-o manier foarte asemntoare cu a celorlalte proteine. Studiile electronomicroscopice indic c sinteza hemoglobinei n reticulocite are loc pe structura multiribozomal care conine cinci ribozomi. Aceti ribozomi sunt nirai pe un lan ARNm. Nucleul eritrocitelor nucleate din mduva osoas uman nu sintetizeaz cantiti semnificative de hemoglobin. Formarea globinei nu pare s implice factori genetici sau mecanisme speciale. Cele dou tipuri de lanuri se formeaz independent sub controlul diferitelor gene i de asemenea, cu viteze egale. Exist unele dovezi evidente c hemina crete viteza de sintez a hemoglobinei n reticulocitele de iepure, n timp ce descrete sinteza hemului. Astfel, poate servi ca o parte a unui mecanism de control al sintezei globinei i probabil al lanurilor i la un raport molar de 1:1. Porfirina IX crete, de asemenea, sinteza globinei. XVIII.4.1.2. BIOSINTEZA PORFIRINEI I A HEMULUI Biosinteza porfirinelor i a hemului const din trei etape succesive: 1 . biosinteza acidului -aminolevulinic din glicin i succinil-CoA; 2o. formarea porfibilinogenului din acid -aminolevulinic; 3o. conversia porfibilinogenului ntr-un ciclu tetrahidropirol-porfirinic i apoi a hemului. Biosinteza acidului -aminolevulinic (ALA). Se pleac de la glicin i succinil-CoA (provenit din ciclul tricarboxilic). Se presupune c mecanismul de reacie const n formarea unei baze Schiff ntre glicin i piridoxal fosfat. Este necesar, de asemenea, prezena ionilor de magneziu sau a altor ioni bivaleni ca i cofactori. Reacia decurge cu formarea n faza intermediar a acidului -amino--cetoadipic, un compus labil, care prin decarboxilare trece n acid -aminolevulinic. Procesele se desfoar conform reaciilor:
o

HOOC-CH2-CH2-CO-SCoA + H2N-CH2-COOH

delta-aminolevulinic sintetaz (ALAS) Mg+2 PLP CoA 239

HOOC-CH2-CH2-CO-CH-COOH NH2
O HO-P-O-H2C OH N CH=O OH CH3

-CO2

HOOC-CH2-CH2-CO-CH2 NH2

+ H2N-CH2-COOH

ALAS -H2O

O ALAS-O-P-O-H2C OH

CH=N-CH2-COOH OH N CH3

COOH O
H
+

CH=N-CH--COOOH N CH3 +
+2

CH2 CH2 Mg --- O=C SCoA

-CoA

ALAS-O-P-O-H2C OH

240

COOCH2 CH2 Mg+2 O=C N-CH-COOO ALAS-O-P-O-H2C OH N CH OH CH3

-CO2, Mg+2

COOCH2 CH2 Mg+2 O=C N-CHO ALAS-O-P-O-H2C OH N CH OH CH3

-Aminolevulinat acil sintetaza (ALAS), este o enzim mitocondrial allosteric, limitant de vitez, n sinteza porfirinelor la nivelul ficatului. Ea este inhibat de produsul final de reacie hemul, hemoglobina i alte proteine memice. Aparent inhibiia survine n faza de post transcriere a sintezei ALAS. Enzima este metabolizat rapid, avnd un timp de njumtire, la nivelul ficatului, de cca 1 or. Sunstanele care induc sinteza hepatic a -aminolevulinat sintetazei includ unii metabolii i hormoni steroizi i alilizopropilacet-amida. Biosinteza acidului -aminolevulinic are loc la nivel mitocondrial. Formarea porfirinogenului (PBG). Descoperirea n urina pacienilor cu porfirie acut intermitent a porfibilinogenului (PBG) i determinarea structurii sale chimice, a condus la elucidarea etapelor implicate n biosinteza porfirinelor i a hemului. S-a postulat imediat, c acest compus este intermediar (de fapt primul produs ciclic) din biosinteza porfirinelor. Formarea porfibilinogenului are loc la nivelul citosolului prin condensarea a dou molecule de acid -aminolevulinic, sub aciunea a porfibilinogen sintetazei (PBGS) numit -aminolevulinat hidrataz (enzim localizat n citoplasm).

241

COOH COOH CH2 CH2 + C=O CH2 NH2 CH2 CH2 O=C CH2 NH2
PBGS -H2O

COOH COOH CH2 H2N-CH2 CH2 CH2

N H

Porfirinogen sintetaza (PBGS), conine 8 lanuri polipeptidice identice. O subunitate are o greutate molecular de aproximativ 35000. Centrul activ al enzimei conine un rest de lizin i dou grupri sulfhidril, necesare activitii sale. Acest lucru a fost demonstrat de Shemin i colaboratorii. Se pare c, resturile SH particip n cataliza acido-bazic necesar secvenei de protonare-deprotonare din sinteza PBG. Enzima din ficatul de bou conine 4 ioni de Zn+2 per molecul fiind absolut necesar activitii sale. Recent s-a sugerat c ionii de zinc interacioneaz cu gruprile sulfhidril din centrul activ fiind i ei implicai n procesul de protonaredeprotonare menionat mai nainte. Se pare c ei acioneaz ca un acid Lewis, polariznd o grupare carbonil a unei molecule de acid aminolevulinic (ALA), fcnd-o mai susceptibil pentru atacul nucleofil. Aa cum se vede din reaciile de mai jos, mecanismul de aciune al PBGS implic formarea, n primul rnd, a unei baze Schiff ntre molecula de acid -aminolevulinic i gruparea aminic a enzimei, probabil gruparea aminic a lizinei din centrul activ al enzimei, formnd un intermediar anionic.

242

COOH COOH CH2 CH2 PBGS-NH2 + O=C CH2 NH2 COOH COOH CH2 CH PBGS-N=C CH2 NH2 COOH COOH CH2 PBGS-H2N+ CH2 CH2
-PBGS-NH2 -H2O;H+

COOH CH2
-CH

CH2 CH2 C=O + CH2 NH2

PBGS-N=C CH2 NH2

COOH COOH CH2

H+ -H2O

CH2 CH2 C-OH CH2 NH2

CH2 CH2 C CH2 NH2

C PBGS-N=C CH2 NH2

COOH COOH CH2 H2N-CH2 CH2 CH2

CH2 N H NH2

n cursul acestei reacii se elibereaz o molecul de ap i un proton. Aceasta este urmat de un atac nucleofil asupra carbonului din gruparea
243

carbonil a celei de a doua milecul de acid aminolevulinic i prin protonare leag cele dou molecule de ALA. Se presupune c secvenele de protonaredeprotonare sunt mediate de grupa tiolic a cistinei i probabil de o grupare imidazolic a histidinei de la centrul activ al enzimei. Are loc apoi protonarea bazei Schiff i se elimin o molecul de ap. Gruparea aminic liber a celei de a doua molecule de ALA nlocuiesc gruparea aminic a PBGS printr-o reacie trans-Schiff. Are loc o protonare i apoi o rearanjare intramolecular, formnd astfel porfibilinogenul. Se elimin PBG liber i PBGS liber pentru desvrirea ciclului. PBGS poate suferi inhibiie de tip feed back prin hem, hemoglobin i alte proteine hemice. Enzima este, de asemenea, inhibat de ctre concentraii sczute de plumb, care reacioneaz cu gruprile tiol, grupri eseniale pentru activitatea enzimei. Acest lucru justific excreia mare de acid levulinic la pacienii intoxicai cu plumb. Conversia porfibilinogenului n porfirine i HEM. Reciile implicate sunt prezentate mai jos. Legand: V-vinil, A- acid acetic, P-acid propionic, M-metil i ALA acid -aminolevulinic. Reaciile prezentate nu cuprind i mecanismele implicate. Practic patru molecule de PBG se combin cu pierderea a 4 grupri NH 4+, pentru a forma un ciclu tetrapirolic. Este introdus apoi ionul de Fe+2 pentru a forma molecula de hem. Prima etap este catalizat de uroporfilinogen I sintetaz (porfirinogen deaminaz). Gruparea aminin a unei molecule de PGB este ndeprtat cu un atom de hidrogen aparinnd unei alte molecule. Se elimin NH4+ i se formeaz o punte -CH2- ntre dou molecule de PBG. De fapt, fiecare atom de carbon al unei molecule de glicin servete ca surs de carbon metilenic. Rezult n faza intermediar un dipirilmetan, iar apoi prin pierdere de NH4+ se formeaz inelul porfirinotetrapirolic numit uroporfirinogen I. Gruprile substituite ale celor patru nuclee sunt aranjate simetric. Uroporfirinogen I este un produs incolor neutilizat de organism. El fie c sufer un proces de autoxidare, cu formarea unui produs colorat n purpuriu, uroporfirina I, care este excretat, fie cele dou grupri acetat sunt decarboxilate sub aciunea uroporfirinogen decarboxilazei formnd grupri metil (M) i obinndu-se coproporfirina I, compus colorat n purpuriu i care este excretat prin urin i fecale. Uroporfirinogen I sintetaza este larg rspndit n esuturile animale, plante i microrganisme. Enzima din eritrocitele umane a fost separat prin tehnicile de gel-filtrare n trei fraciuni proteice active, avnd greutatea molecular cuprins ntre 38000 i 40000. Se pare c cele trei enzime sunt izoenzime. Mecanismul implicat n conversia celor patru molecule de PBG n

244

uroporfirinogen I, de ctre uroporfirinogen sintetaz este i rmne nc neclarificat. Majoritatea PBG nu este convertit n organismul animal n izomerul uroporfirinogen I, ci n izomerul uroporfirinogen III. Acesta difer de tipul I prin inversarea ordinei substituienilor la unul din nucleele pirolice (D). Astfel, n loc de A-P, apare P-A. Aceast reacie de izomerizare apare datorit aciunii catalitice a uroporfirinogen III cosintetaz (sau izomeraz). Enzima nu este activ n absena uroporfirinogen sintetaze. Izomerul de tip III se formeaz prin aciunea combinat a celor dou enzime i este utilizat pentru formarea hemului. Celelalte dou forme izomere de tip II i de tip IV nu apar n mod natural. Mecanismul prin care cele patru molecule de porfibilinogen sunt convertite n urobilinogen III prin efectul combinat a celor dou enzime (uroporfirinogen I sintetaza i uroporfirinogen III cosintetaza) a rmas nc o enigm. Uroporfirinogenul de tip III format este convertit rapid n coproporfirinogen III prin decarboxilarea celor patru acetai (A) pentru a forma grupri metil (M). Reacia este aparent catalizat de uroporfirinogen decarboxilaz. Gruparea (P) de la nucleele pirolice A i B ale coproporfirinogenului III, sunt decarboxilate oxidativ cu formarea gruprilor vinil (V) sub aciunea coproporfirinogen III oxidazei. n felul acesta rezult protoporfirinogenul III, care la rndul su este oxidat la protoporfirina III sub aciunea protoporfirinogen oxidazei. HOOC-CH2-CH2 CH2-COOH N H CH2-NH2

(PBG)

PBG-deaminaz

245

A HOCH2

P CH2

P CH2

P CH2

N H

N H

N H

N H

hidroximetil-bilan
etaz sint o c II en I urog spon tan

A A
UROPORFIRINOGENI

NH

HN

NH

HN

NH

HN

A P

NH
tip I

HN

A P

tip III

urogendecarboxilaz -4CO2

urogendecarboxilaz -4CO2

P M

M P
COPROPORFIRINOGENI citoplasma

P M

M P

NH

HN

NH

HN

NH

HN

M P
2CO2

NH
tip I

HN

M P

tip III

coprogenoxidaza 2H2

246

V M

M V
protogenoxidaza mitocondrie

V M

M V

NH

HN

NH

NH

HN

M P

HN

M P

protoporfirina

CH=CH2 H3C
ferochelataza Fe+2

CH3 CH=CH2
HEM

N Fe

H3C

CH3

CH2 CH2 COOH

CH2 CH2 COOH

n etapa final, Fe+2 disponibil datorit transferinei plasmatice, este nserat n molecula protoporfirinei sub aciunea ferochelatazei formnd hemul, produs final de reacie. Aproximativ 85% din hemul sintetizat este utilizat pentru formarea hemoglobinei, cca 10% este utilizat pentru formarea mioglobinei i 5% pentru formarea citocromilor sau alte proteine hemice. Porfirinele care iau natere n cantiti mici (uroporfirine de tip I i II, coproporfirinele de tip I i II etc), sunt compui colaterali care ies din calea biosintezei hemului. Nu pot fi utilizai i se elimin ca atare prin urin, constituind aa numitele cadavre metabolice. Formarea n cantitate mare a acestor porfirine, reprezint o perturbare n secvena biosintezei hemului. Aceast perturbare reprezint boli

247

genetice, prin deficit enzimatic, cu sau fr manifestri clinice cunoscute sub numele de porfirii i caracterizate printr-o eliminare crescut de porfirine prin urin, fotosensibilitate etc.
SUCCINIL-CoA + GLICINA ALA sintetaz CoASH acid aminolevulinic CO2 porfibilinogen

uroporfirinogen III

uroporfirina III

coproporfirinogen III

coproporfirina III

protoporfirinogen III

protoporfirina III ferochelataz Fe+3 globin HEMOPROTEIN

HEM

molecul de apopresor

Reglarea biosintezei hemului. Reacia limitant de vitez n biosinteza hemului este reacia catalizat de ALAS. Nivelul acestei enzime n esuturile capabile s sintetizeze hemul este semnificativ mai sczut dect a altor enzime. ALAS este enzima reglatoare. Hemul acionnd prin
248

intermediul unei molecule apopresoare, acioneaz ca un efect negativ asupra acumulrii de ALAS. Se pare c n aceast etap acioneaz un fenomen de retroinhibiie semnificativ. Mecanismul este ilustrat mai sus. Efectul reglator major al hemului const n faptul c viteza de acumulare a ALAS crete foarte mult n absena hemului i descrete foarte mult n prezena lui. Muli compui cu structuri foarte diferite incluznd insecticidele, carcinogenele, produsele farmaceutice etc, cnd sunt administrate la om, pot avea ca rezultat creterea nivelului ALA sintetazei. Majoritatea acestor substane sunt metabolizate printr-un sistem din ficat care utilizeaz o hemoprotein specific citocrom P450. n timpul procesului de metabolizare a acestor substane, consumul hemului de ctre citocrom P450 este foarte crescut, ceea ce determin scdere intracelular a hemului, care la rndul su determin o depresie de ALA-sintetaz i o cretere a biosintezei hemului. Exist i ali factori care afecteaz introducerea de ALAS la nivelul ficatului. Un astfel de exemplu l constituie glucoza. Fierul sub form de chelat prezint un efect sinergic asupra induciei ALAS hepatice. Steroizii, de asemenea, joac un rol important n depresia indus de droguri ALAS. n esuturile extrahepatice, hipoxia crete activitatea ALAS, fr a avea activitate care s poat fi demonstrat la nivelul ficatului. XVIII.4.1.2. PORFIRII Porfiriile constutuie un grup heterogen de boli caracterizate prin excreie crescut de porfirine i precursori ai porfirinelor. Tipurile mai importante de porfirii sunt. Porfiria hepatic acut intermitent, se datoreaz unui deficit congenital de uroporfirinogen I sintetaz. Nu se exprim nainte de pubertate. n urin se secret cantiti crescute de porfirinogen (PBG) i acid aminolevulinic (ALA), stnd la aer i lumin urina se nchide la culoare. n urin apare coproporfirina III i uroporfirina III. Principalele manifestri clinice sunt dureri abdominale, spasme ale musculaturii netede, anomalii neurologice, confuzii, hipertensiune i hipercolesterolemie. Porfiria eritropoetic congenital, se datoreaz deficitului de uroporfirinogen III cosintetazei. De fapt exist un dezechilibru ntre cele dou sintetaze. Se observ o cretere marcant de uroporfirin I n snge, fecale i urin. Raportul ntre cegenii I i III este de 100/1. Ca i manifestare clinic prezint fotosensibilitate, leziuni cutanate, oasele i dinii devin roz, prezint anemie hemolitic etc. eritrocitele circulante i mduva osoas conin cantiti crescute de ogeni I dar nu i hepatocitele.

249

Coproporfiria ereditar se datoreaz deficitului parial de coproporfirinogen III oxidaz. Prin fecale se elimin coproporfirina de tip III. n urin se elimin ALA i PBG. Este o porfirie caracteristic condiiilor de stres. Are loc i depresia ALA-sintetazei cu producie de ALA i PBG. Manifestrile clinice sunt asemntoare cu cele din porfiria acut intermitent. Protoporfiria se datoreaz deficitului ferochelatazei din toate mitocondriile i toate esuturile. Eritrocitele, plasma i fecalele conin protoporfirina de tip IX, iar reticulocitele prezint fluorescen roie. Ca manifestri clinice, bolnavii prezint fotosensibilitate, ciroz i urticarie prin expunere la soare. Porfiria cutanat tardiv, se datoreaz deficitului de uroporfirinogen decarboxilaz. Se manifest prin creterea excreiei ALA i PBG, de asemenea, coproporfirin III n urin i fecale. Ca i principale manifestri clinice prezint fotosensibilitate cutanat i leziuni cutanate; este asociat bolilor hepatice, alcoolismului i suprancrcrii cu fier. Porfiria toxic se datoreaz creterii ALA sintetazei. n perioada acut se elimin ALA i PBG prin urin, de asemenea, coproporfirina III n urin i fecale. Ca i principal manifestare clinic este reacia la unele droguri (barbiturice, alcool, unii steroizi, pesticide, anticonceptive orale, apronalide etc). Porfiria dobndit poate rezulta n urma expunerii la compui toxici ca hexaclorbenzen, plumb i sruri ale metalelor grele, deoarece metalele grele inhib necompetitiv ALA-dehidraza, porfibilinogen sintetaza, uroporfirinogen sintetaza i ferochelataza. De asemenea droguri ca griseofulvina, apronalida, etc. Porfirii variate se datoresc descreterii protoporfirinogen III oxidazei.n fecale se elimina coproporfirina I i III i protoporfirin, iar n urin ALA i PBG. Ca manifestri clinice apar leziuni cutanate, simptome abdominale i neurologice. Declanarea bolii este grbit de alcool i droguri. XVIII.4.2. Catabolismul hemoglobinei n condiii fiziologice la un om adult se distrug 1-2. 10 8 eritrocite pe zi. Un adult de 70 de kg prezint un turnover al hemoglobinei de 6 g Hb/zi. Din eritrocitele mbtrnite hemoglobina este eliberat prin fagocitoz n celulele reticuloendoteliale, n special n splin. Hemoglobina eliberat n snge este captat de ctre o glicoprotein specific numit heptaglobin (Hp), care prezint proprieti peroxidice.

250

AH2 + H2O2

2Hb/Hp

A + 2H2O

Formarea complexului 2Hb/Hp faciliteaz descompunerea hemoglobinei. Cnd eliberarea de hemoglobin n snge depete captarea sa de ctre heptoglobin, apare hemoglobinuria. Complexul 2Hb/Hp este transportat prin snge la celulele reticulo-endoteliale hepatice (celulele Kupffer) unde hemoglobina este scindat. Globina este reutilizat ca aminoacizi, n timp ce nucleul heminic este convertit prin mai multe etape n pigmeni biliari (biliverdin i bilirubin) i excretai n bil. Atomul de fier din hem este ndeprtat prin legarea de o transferin plasmatic fiind fie reciclat, fie depozitat n ficat ca i feritin. Hemul altor proteine este transportat n plasm legat de protein, hemopexin i convertit n mod similar n biliverdin i n bilirubin. Degradarea hemului are loc la nivelul microzomilor hepatici i implic o oxidare unic a atomului de carbon din puntea metilenic cu formare de monoxid de carbon. Reacia este catalizat de ctre hem-oxigenaz, o enzim microzomal, n prezen de oxigen molecular, citocrom c reductaz i NADH. Inelul tetrapirolic al hemului se deschide i atomul de fier este eliberat. Se formeaz, probabil ca i intermediar, verdohemin. Se ajunge apoi la biliverdin care sub aciunea biliverdin oxidazei i NADPH, este transformat n bilirubin. O parte din bilirubin se formeaz i la nivelul altor esuturi din diferite hemoproteine i este transportat la ficat i legat de o albumin plasmatic. Bilirubina este insolubil n mediu apos. n ficat bilirubina este conjugat cu acid glucuronic formnd acid bilirubin diglucuronic care este solubil n ap i este rapid excretat prin intermediul bilei n intestin. Formarea bilirubin diglucuronidului implic reacia celor dou grupri carboxil ale sale cu gruparea hidroxil de la C1 a doua molecul de acid UDP-glucuronic. Reacia este catalizat de bilirubinUDP-glucuronil transferaz, enzim microzomal hepatic. Bilirubin diglucuronidul este hidrolizat la nivelul intestinelor de ctre -glucuronidaz. Bilirubina este redus de flora bacterian, trecnd n D- sau L-urobilinogen incolor. O parte din el este reabsorbit i exctretat n urin sub forma unui compus de oxidare colorat n galben oranj, L-urobilin. Partea rmas de urobilinogen este redus n intestin la L-stercobilinogen, care este excretat n fecale sub forma unui produs de oxidare de culoare brun Lstercobilin.

251

-OOC-(CHOH) -O-C=O 4

O=C-O-(CHOH)4-COOCH2 CH2 D N H CH CH3 A N H CH2 CH O

CH2 CH3 O B N H CH CH CH3 C N H

CH2 CH2 CH2

Schema catabolizrii hemoglobinei

HEMOGLOBIN
disociere

HEM

hemoxigenaz O2 NADPH+H+ CO

VERDOHEMIN
(reutilizat)

Fe

AMINOACIZI
(reutilizati)

BILIVERDIN

biliverdin reductaz NADPH+H+ NADP+

BILIRUBIN

1. incorporarea bilirubinei n celulele parenchinului hepatic; Hemoglobin formeaz 35 mg bilirubin. La om se formeaz zilnic 250-300 mg. Metabolismul bilirubinei la nivelul ficatului este divizat n trei procese: 2. conjugarea bilirubinei la nivelul reticulului endoplasmatic 3. secreia bilirubinei conjugate n bil printr-un proces de transport activ limitant de vitez. Fiecare dintre aceste procese trebuiesc privite separat. Schema conjugrii bilirubinei la nivelul microzomilor hepatici

252

BILIRUBINA
acid UDP glucuronic bilirubin UDP-glucuronil transferaz UDP

BILIRUBIN DIGLUCURONID
excretie prin intermediul bilei

INTESTIN SUBTIRE XVII.5. TEHNICI DE ANALIZ XVIII.5.1.Tehnici de separare a aminoacizilor XVIII.5.1.1. CROMATOGRAFIA n toate sistemele de cromatografie moleculele sunt repartizate ntre o faz staionar i o faz mobil. Separarea depinde de tendina relativ a moleculelor din amestec s se asocieze mai mult sau mai puin de o singur faz. Aceste tehnici de separare sunt discutate n principiu cu exemplificare pe aminoacizi. Cromatografia pe hrtie. n timp ce au aprut tehnici tot mai sofisticate, cromatografia pe hrtie are aplicaii fundamentale n separarea aminoacizilor. Proba este aplicat la un punct marcat la aproximativ 2 cm de captul unei fii de hrtie de filtru. Fia este astfel suspendat ntr-un vas care conine solventul cromatografic. (Figura XVIII.1.) Pentru separarea aminoacizilor, solventul polar este un amestec binar, ternar sau un amestec mai complex de ap, alcool, acizi i baze. Componenta mai polar a solventului se asociaz cu celuloza i formeaz faza staionar. Componenta mai puin polar formeaz faza mobil. Aceasta este repartiia cromatografic normal. Pentru cromatografia de reapartiie cu faz invers, polaritile fazei mobile i a fazei staionare sunt inversate. Acest tip de cromatografie este folosit pentru separarea peptidelor nepolare sau a lipidelor, nu i pentru compui polari cum ar fi aminoacizii. Solventul poate migra pe hrtie n sus n jos sau de jos n sus (cromatografie ascendent sau descendent). Cnd migrarea solventului a ajuns la captul final fia de
253

hrtie este uscat i tratat pentru vizualizarea moleculelor interesate (de exemplu, pentru aminoacizi cu soluie de ninhidrin 0,5% n aceton urmat de o nclzire la 90-110o pentru cteva minute).

directia de migrare a solventului

fsie de hrtie cuv cu solvent

Figura XVIII.1. Aparat descendent pentru cromatografie pe hrtie Aminoacizii cu o polaritate nepolari (cum ar fi leucina, izoleucina, fenilalanina, triptofanul, valina, metionina i tirozina) migreaz cu mult mai mult dect aminoacizii puin nepolari (prolina, alanina i glicocolul) i evident dect aminoacizii polari (treonina, acidul glutamic, serina, arginina, acidul aspartic, histidina, lizina i cisteina). (Figura XVIII.2.) Acest lucru reflect solubilitatea relativ a moleculelor polare n faza staionar hidrofil i a moleculelor nepolare n solventul organic. De notat c pentru seria nepolar de aminoacizi (glicin, alanin, valin, leucin) crete distana de migrare n mediu nepolar, cu creterea caracterului nepolar, rezultatul este o cretere a mobilitii. Raportul dintre distana la care a migrat aminoacidul i linia de migrare a solventului (frontului) se poate msura de la punctul de aplicare (punctul de start) a amestecului de aminoacizi este exprimat prin valoare Rf (mobilitatea relativ fa de frontul solventului). Valorile Rf pentru aminoacizi variaz n funcie de condiiile experimentale, de exemplu solventul utilizat. n acest caz mobilitatea poate fi o expresie relativ fa de standard (de exemplu, valoarea Rala fa de Rf).

254

n cromatografia bidimensional, proba este aplicat la unul din colurile ptratului format din hrtia cromatografic. De regul, se utilizeaz amestecuri diferite de solveni pe cele dou direcii de migrare (figura nr. XVIII.3.).

direcia de migrare a solventului

Lys Asp Gly T hr Pro Val T rp Phe Leu

Figura nr. XVIII.2. Identificarea aminoacizilor prezeni n proteine dup vizualizare cu ninhidrin.

. . . . . . .. . . .
. . .
. . .

originea

Cys His Arg Ser Glu Ala T yr Met Ile

butanol-acid acetic-ap (4:5:1) m-crezol-fenol (1:1) pH= 9,3 n tampon borat

originea

Cys

. .

Asp-NH2

. .

Lys

.
His

....
Asp Ser

Glu

Gly Thr

Glu-NH2

..
Ala

Arg

Met

Pro

. .. . .
Tyr Val Ile Trp

Leu

Phe

Figura nr. XVIII.3. Cromatografie bidimensional a aminoacizilor din proteine

Cromatografia pe strat subire. Se disting dou metode de cromatografie n strat subire, TLC (thin-layer chromatography). Cromatografia de repartiie n strat subire, PTLC (partition thin-layer chromatography) seamn foarte mult cu cromatografie de repartiie pe hrtie. Aici se utililizeaz suport relativ inert, sistemul de solveni i reaciile de identificare a aminoacizilor este similar cromatografiei pe hrtie. Cromatografia de absorbie pe strat subire (ATLC), care nu este similar cu cromatografia pe hrtie, depinde de abilitatea solventului (care este un sistem binar sau unul mult mai complex) i ca substrat se utilizeaz site moleculare sau silicagel activat. Cromatografia pe schimbtori de ioni. Principiul repartiiei a fost perfecionat n continuare n cromatografia de schimb ionic, dezvoltat pentru prima dat de W. Cohn. n aceast metod, moleculele substanelor din amestec sunt separate pe baza deosebirilor n proprietile acido bazice. Pentru acest proces se umple o coloan cu granulele unei rini sintetice care conine grupri ncrcate fixe. Exist dou clase mari de rini schimbtoare

255

de ioni: schimbtori de ioni cationici i schimbtori de ioni anionici. Aminoacizii sunt separai, de obicei, pe o coloan cu schimbtor de ioni cationic, umplut cu granule solide de polistiren sulfonat, echilibrat cu o soluie de hidroxid de sodiu pentru a ncrca gruprile sulfonice cu ioni de sodiu. Aceast form a rinii se numete form sodiu; rina poate fi preparat i n form protonat, splnd coloana cu un acid.

Figura nr. XVIII.4. Analiza cromatografic automat a aminoacizilor pe o rin schimbtoare de ioni Pe coloana cu rin n form sodiu se aplic amestecul de aminoacizi ntr-o soluie acid (pH=3,0); la pH=3 aminoacizii sunt cationi cu sarcin net pozitiv. Aminoacizii cationici tind s deplaseze ionii de sodiu legai de rin; cantitatea deplasat variaz puin de la un aminoacid la altul, datorit diferenei mici n gradul de ionizare. La pH=3, cei mai bazici aminoacizi (lizina, arginina, histidina) sunt cel mai puternic legai de rin prin fore electrostatice i cei mai acizi aminoacizi (acidul glutamic i acidul aspartic) sunt cel mai slab legai. Prin creterea treptat a pH-ului i concentraiei de NaCl n soluia apoas de eluare, aminoacizii migreaz n coloan cu viteze diferite i eluatul este colectat n numeroase fracii mici. Fraciile sunt analizate cantitativ cu ajutorul reaciei cu ninhidrin. Aminoacidul cel mai anionic, de exemplu acidul glutamic, apare primul i cel mai cationic, de exemplu, lizina, apare ultimul. Din datele obinute se traseaz o curb de eluie (figura nr. XVIII.4.). Procedura analitic a fost complet automatizat, astfel nct eluia, colectarea de fraciuni, analiza fiecrei fracii i datele nregistrate sunt realizate automat ntr-un aparat numit analizor de aminoacizi. Pentru reducerea timpului necesar msurtorilor cromatografice exacte a aminoacizilor, n special a hidrolizatelor proteice, se folosesc coloane cu schimbtori de ioni foarte scurte i tampoanele de eluie sunt trecute pe coloan sub presiune. Aceste perfecionri, mpreun cu altele, fac

256

posibil determinarea tipului i cantitilor tuturor aminoacizilor dintr-un amestec n mai puin de 2 ore; pentru aceast analiz este necesar numai o fracie de un miligram de prob. XVIII.5.1.2. ELECTROFOREZ LA TENSIUNE RIDICAT PE UN SUPORT INERT (HVE) Separarea aminoacizilor, polipeptidelor i a altor amfolii (molecule ale cror sarcini nete depinde de pH-ul mediului nconjurtor) impune utilizarea direct a curentului care are aplicaii largi n biochimie. Pentru aminoacizi foaia de hrtie sau stratul subire de praf de celuloz este folosit foarte des ca i suport. Separri la 2000 la 3000 de voli ntr-un cmp de curent continuu n timp de 0,5-2 ore depinde de sarcina amfolitului i de masa sa molecular. Pentru molecule cu sarcini identice, migrarea acestora va fi n funcie da masa molecular. Sarcina net este, de asemenea, un factor important n determinarea separrii. Aplicaiile includ aminoacizi, polipeptide cu mase moleculare mici, anumite proteine, nucleotide i fosfoglucide. Probele sunt aplicate pe suportul, care este imersat ntr-o soluie tampon apropiat pH i conectat la rezervorul de tampon. Cnd curentul este aplicat, moleculele cu sarcin net negativ la pH-ul ales migreaz ctre anod i cele cu sarcin net pozitiv vot migra spre catod. Vizualizarea electroforeogramei dup uscare se realizeaz cu ninhidrin (aminoacizi i peptide) sau expuse la lumin ultraviolet pentru nucleotide.

XVIII.5.2. Tehnici de separare pentru peptide Separarea peptidelor n urma hidrolizei pariale a proteinelor este mult mai dificil dect separarea i identificarea aminoacizilor. Acset fenomen se datoreaz faptului c numrul de polipeptidede este mult mai mare i mult mai heterogen dect numrul de aminoacizi. Pentru separarea polipeptidelor se folosesc mai multe tehnici. Harta peptidic bidimensional se obine prin tehnica prin combinarea a dou metode i anume o elecroforez pe o anumit direcie, apoi cromatografia n unghi drept fa de direcia electroforezei. Peptidele pot fi localizate pe hrtia uscat dup stropire cu ninhidrin i uscare la cald.
direcia de migrare a solventului spot care conine amestecul de peptide

. . . . .

.. . . . . . . . . ........
o

257

Cromatografie sau Hrtia dup cromatografia elect orforeza n primul n sistemul de solvent A sistem de solvent
(sistem de solvent A)

Hrtie rotit cu 90 i introdus n solvent ul B

cromatogram bidimensional

Figura nr. XVIII.5. Cromatogram bidimensional pe hrtie. O alt cale foarte eficient de separare a peptidelor este cromatografia de excludere sau gel filtrarea, n coloane care conin derivai de hidrai de carbon polimerizai, numii Sephadex. Acest tip de cromatografie separ peptidele dup masele lor moleculare. O combinaie ntre cromatografia pe schimbtori de ioni i de excludere este foarte eficient. XVIII.5.3. Determinarea compoziiei n aminoacizi a peptidelor. Dup ce au fost separate toate fragmentele peptidice rezultate din hidroliza parial a lanului polipeptidic, cte o prob din fiecare fragment este hidrolizat complet i I se determin compoziia n aminoacizi. Apoi, se determin, pe alte probe, secvena de aminoacizi a fiecrei peptide prin degradarea segmenial Edman. Dac peptida este prea lung pentru a putea fi segmentat pe aceast metod, resturile N-terminale i C-terminale sunt identificate prin metodele prezentate. Peptidele mici se pot determina dup metodele descrise. XVIII.5.4. Determinarea structurii primare a polipeptidelor Ordonarea fragmentelor peptidice. O dat obinute cele dou fragmente de peptide prin dou procedee diferite de scindare a lanului polipeptidic iniial i stabilit secvena de aminoacizi a tuturor fragmentelor, se poate deduce secvena complet de aminoacizi prin suprapunerea secvenelor peptidice. Principiul este prezentat n figura XVIII.6. Evident c n multe cazuri nu se pot trage concluzii echivoce prin aplicarea acestei metode. n acest caz este necesar al treilea sau chiar al patrulea tip de hidroliz parial a polipeptidei iniiale pentru a se obine suprapunerile necesare.

258

Fragmente de la scindarea cu tripsin

Fragmente de la scindarea cu bromcian

[ [
:

Tyr-Lys Glu-Met-Leu-Gly-Arg Ala-Gly

Tyr-Lys-Glu-Met Leu-Gly-Arg-Ala-Gly Tyr-Lys-Glu-Met-Gly-Arg-Ala-Gly

Secventa dedus

Figura nr. XVIII.6. Determinarea secvenei de aminoacizi de aminoacizi din suprapunerea peptidelor Stabilirea poziiei legturilor disulfurice. O dat dedus complet secvena de aminoacizi a catenelor polipeptidice ale unei proteine, urmtorul pas este stabilirea resturilor de cistein pereche, care formeaz legturi disulfurice intra i intercatenare, n caz c exist. Aceasta se realizeaz, n general, prin fragmentarea unei probe de protein cu legturi disulfurice nc intacte, de obicei prin hidroliz parial cu tripsin. Se izoleaz peptidele care conin puntea disulfuric, legturile lor disulfurice sunt reduse i gruprile lor sulfhidril sunt alchilate. Din fiecare fragment care conine o legtur disulfuric deriv cte dou peptide, care sunt identificate prin comparaie cu peptidele triptice obinute din lanul polipeptidic iniial redus. Stabilirea poziiei amidice. Gruparea amid ale resturilor de asparagin i glutamin sunt eliberate sub form de amoniac n timpul hidrolizei acide sau bazice, formndu-se resturile acidului aspartic i, respectiv, glutamic. Dei numrul moleculelor de amoniac format pe mol de protein n timpul hidrolizei acide poate da suma resturilor de asparagin i glutamin, poziiile gruprilor amid, ndeosebi n proteinele care conin att acizii glutamici i aspartic ct i amidele lor, nu pot fi deduse din fragmentele peptidice obinute prin hidroliz acid; aciunea proteazelor specifice, care nu hidrolizeaz gruprile amid. Secvena de aminoacizi a unor peptide i proteine. Figura XVIII.7. prezint secvena complet de aminoacizi a insulinei bovine, prima protein a crei secven de aminoacizi a fost stabilit. Insulina este format din dou catene polipeptidice: catena A, cu 21 de resturi de aminoacizi i catena B, cu 30 resturi. Cele dou catene polipeptidice ale insulinei sunt
259

legate prin dou puni disulfurice; n plus mai exist i o legtur disulfuric intracatenar. Sanger a scindat att legturile disulfurice inter- ct i intracatenare i a separat catena A de catena B. dup stabilirea secvenei de aminoacizi a fiecrei catene, el a localizat poziiile legturilor intra- i intercatenare, urmnd strategia prezentat mai sus. Lucrarea lui Sanger, terminat n anul 1953, a deschis drumul pentru analiza secvenei lanurilor polipeptidice lungi. Curnd, dou grupuri de cercetare diferite au raportat secvena de aminoacizi din hormonul adrenocorticotrop, un hormon al hipofizei anterioare, care stimuleaz cortexul suprarenal (figura nr. XVIII.8.). Acest hormon este constituit dintrun lan de 39 de aminoacizi, cu masa molecular n jur de 4600. Ribonucleaza are 124 de resturi de aminoacizi, prezentate ntr-un singur lan (figura XVIII.9). Urmtoarea piatr de hotar important, identificarea secvenei de aminoacizi a celor dou tipuri de catene ale hemoglobinei (figura nr. XVIII.10), prima analiz secvenial a unei catene oligomere mari, a fost realizat de dou grupuri, unul n Statele Unite i altul n Germania. Hemoglobina conine patru catene polipeptidice, dou catene identice i dou catene identice (146 de resturi). Catenele i conin resturi de

260

Figura XVIII.7. Secvena de aminoacizi ai insulinei.

261

aminoacizi identice n multe poziii; deci cele dou catene posed o secven omolog. Singura caten polipeptidic a mioglobinei, o protein muscular, care conine, de asemenea, o grupare Fe-porfirin i se aseamn cu hemoglobina prin capacitatea de a lega oxigen, prezint, de asemenea, secvene omoloage cu catenele hemoglobinei. Semnificaia secvenelor omoloage ale proteinelor similare ca funcie sau ale proteinelor omoloage cu catenele hemoglobinei. Semnificaia secvenelor omoloage ale proteinelor similare ca funcie sau ale proteinelor omoloage de la diferite specii va fi discutat n alt parte. Din cele mai lungi catene polipeptidice pentru care sau dedus pn azi secvenele complete de aminoacizi sunt cele ale alcool dehidrogenazei de cal (374 de resturi) i ale glutamat dehidrogenazei bovine (500 de resturi).
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-ArgArg-Pro-Val20-Lys-Val-Tyr-Pro-Asp-Ala-Gly-Glu-Asp-Gln-Ser-Ala-Glu-Ala Phe-Pro-Leu-Glu-Phe39

Figura XVIII.8. Secvena de aminoacizi din hormonul adrenocorticotrop uman

Lys-Glu-Thr-Ala-Ala-Lys-Phe-Glu-Arg-Gln-His-Met-Asp-Ser-Ser-Thr-Ser-AlaAla-Ser-Ser-Ser-Asn-Tyr-Cys-Asn-Gln-Met29-Met-Lys-Ser-Arg-Asn-Leu-Thr-LysAsp-Arg-Cys-Lys-Pro-Val-Asn-Thr-Phe-Val-His-Glu-Ser-Leu-Ala-Asp-Val-GlnAla-Val-Cys67-Ser-Gln-Lys-Asn-Val-Ala-Cys-Lys-Asn-Gly-Gln-Thr-Asn-Cys-TyrGln-Ser-Tyr-Ser-Thr-Met-Ser-Ile-Thr-Asp-Cys-Arg-Glu-Thr87-Gly-Ser-Ser-LysTyr-Pro-Asn-Cys-Ala-Tyr-Lys-Thr-Thr-Gln-Ala-Asn-Lys-His-Ile-Ile-Val-AlaCys-Glu-Gly-Asn-Pro-Tyr-Val126-Pro-Val-His-Phe-Asp-Ala-Ser-Val134

Figura XVIII.9. Secvena de aminoacizi a ribonucleazei bovine. Din analiza secvenelor de aminoacizi ale multor proteine globulare se pot face, cu pruden, cteva generalizri. Pn azi s-au gsit n proteinele globulare secvene ca ABABABABAB sau ABCDABCDABCD care se

262

repet frecvent i neperiodic. Numai rareori, un singur aminoacid poate s apar mai mult de trei ori ntr-un ir, cu excepia protaminelor care conine secvena 4,5 i 6 resturi de arginin consecutiv. De aceea n secvena aminoacizilor exist o periodicitate destul de mic. Examinarea secvenelor cunoscute ale proteinelor globuare arat c se ntlnesc toate sau aprope toate secvenele scurte posibile de 2 sau 3 aminoaci, dar fr o structur periodic aparent. Nici n ceea ce privete prezena sau poziia legturilor intracatenare -S-S- nu exist o regularitate aparent; unele proteine nu posed nici o legtur de acest gen, iar altele pot avea numeroase. Pe de alt parte, n unele proteine fibrilare, anumii aminoacizi apar n secvene periodoce. n colagen sunt preponderente resturile de glicocol, prolin i hidroxiprolin, care se gsesc n secvena periodic -Gly-X-Y, unde Y este frecvent prolin sau hidroxiprolin. Aprope 80% din resturile de aminoacizi ale fibroinei din mtase sunt reprezentate de alanin, glicocol i serin. Proteinele anti-freeze ale unor peti antartici au secvena repetat -Ala-Ala-Thr-, cu undizaharid esterificat la restul de treonin. XVIII.5.5. Variaii ale secvenei proteinelor omoloage n funcie de specie Corelarea informaiilor despre secvenele de aminoacizi n proteinele omoloage din specii diferite a artat c unele resturi de aminoacizi din poziii specifice ale proteinelor omoloage sunt relativ invariabile; adic sunt identice n toate speciile sau sunt nlocuie rareori. Proteinele omoloage conin i resturi variabile, de obicei majoritatea resturilor din lan, care variaz mult mai mult de la o specie la alta i n care mai muli aminoacizi diferii se pot nlocui unii pe alii. Secvenele complete de aminoacizi ale insulinei izolate de la diferite specii de vertebrate nu sunt cunoscute. Aceste insuline au n mod virtual aceeai activitate specific hormonal i aceeai mas molecular. Catenele A a insulinei de om, porc, cine, iepure i caalot sunt identice i catenele B ale insulinei izolate din vac, porc, cine, caalot, oaie, ap i cal sunt identice. Catena B a insulinei de om este identic cu catena B a insulinei de elefant. n catena A, nlocuirea unor aminoacizi de la o specie la alta are loc de obicei n poziiile 8, 9 i 10, adic poziiile dintre cele dou resturi de jumti de cistin care formeaz legtura intracatenar. Totui, nlocuiri s-au observat n poziiile 4, 13, 14, 15 i 18. Studiile ulterioare asupra secvenei insulinei n diferite specii au artat c, n poziia A8, alanina, histidina i treonina se pot nlocui unele pe altele; n A9, serina, arginina, lizina,

263

asparagina i glicocolul se nlocuiesc unele pe altele; i la A10, valina, izoleucina, prolina i treonina se nlocuiesc unele pe altele.

264