Inés Gómez Padilla

Laboratorio Multidisciplinario 3
TINCION GRAM
La tinción de Gram. Fue
desarrollada empíricamente
por Christian Gramen
1884, a pesar del tiempo
transcurrido la tinción
apenas se ha modificado y
es uno de los primeros
pasos que se realiza para
cualquier identificación
bacteriana.
La técnica es capaz de diferenciar dos
grandes grupos de eubacterias: Gram
positivas y Gram negativas

Gram Gram
positivo negativo
• La tinción de Gram. requiere cuatro soluciones:
1.       Primer colorante un colorante básico (+) que en contacto con las
células cargadas negativamente, reacciona con ellas coloreándolas. El
mas utilizado es el cristal violeta.
2.       Solución mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad
entre el colorante y las células. Los mordientes usados suelen ser
sales metálicas, ácidos o bases, como por ejemplo, una sol. diluida de
yodo.
3.       Agente decolorante: Es un disolvente orgánico; por ejemplo
alcohol acetona (1:1).
4.       Colorante de contraste. Es un colorante básico de distinto
color que el primer colorante, como por ejemplo, la Safranina.
 
 Tinción de Gram

Cristal-violeta Alcohol-acetona

Lugol Safranina
El cristal violeta (colorante catiónico)
penetra en todas las células bacterianas
(tanto Gram positivas como Gram
negativas).
El lugol está formado
por I2 (yodo) en
equilibrio con KI (
yoduro de potasio), el
cual está presente para
solubilizar el yodo. El I2
entra en las células y
forma un complejo
insoluble en solución
acuosa con el cristal
violeta.
La mezcla de alcohol-
acetona que se
agrega, sirve para
realizar la
decoloración, ya que
en la misma es soluble
el complejo I2/cristal
violeta. Los
organismos Gram
positivos no se
decoloran, mientras
que los Gram
Para poner de manifiesto
las células Gram
negativas se utiliza una
coloración de contraste.
Habitualmente es un
colorante de color rojo,
como la safranina o la
fucsina. Después de la
coloración de contraste
las células Gram
negativas son rojas,
mientras que las Gram
positivas permanecen
PARED CELULAR DE LAS GRAM
POSITIVAS
• La capa de peptidoglicano es
mucho más gruesa

• Secretan exo-enzimas y realizan

digestión extracelular

• Ac. Teicóico y el
peptidoglicano son
factores pirogénicos y
• Los polisacáridos permiten la
serotipificación de cepas
bacteriana

Gram
PARED CELULAR DE LAS GRAM
NEGATIVAS
• La membrana citoplasmática
es igual a la de las Gram
positivas
•Tienen una membrana
externa
adicional
• Importante barrera de
permeabilidad
•En el espacio periplásmicose

almacenan enzimas
• Los Lipopolisacaridos (LPS) actúa
como endotoxinas
•Los LPS constituyen los Antígenos
O
(Ag somático)

Gram
Diferencias entre gram (+) y (-)
 TINCION DE GRAM

FROTIS FIJADO CON

CALOR

CUBRIRLO CON CRISTAL

VIOLETA

TODAS LAS CELULAS

SE TIÑEN DE AZUL-
VIOLETA
CUBRIRLO CON LUGOL

TODAS LAS CELULAS

SE TIÑEN DE AZUL-
NEGRO
DECOLORAR CON ALCOHOL -
ACETONA

GRAM-POSITIVAS RETIENEN EL COMPLEJO COLORANTE

GRAM-NEGATIVAS SE DECOLORAN

CUBRIRLO CON
SAFRANINA- COLORANTE
DE CONTRASTE
GRAM-POSITIVAS LAS CELULAS APARECEN AZUL-
VIOLETA
GRAM-NEGATIVAS LAS CELULAS APARECEN ROJAS
Teoría Stearn y Stearn
1. Los microorganismos grampositivos
pueden hacerse gramnegativos al
aumentar la acidez.
2. Los microorganismos gramnegativos
pueden hacerse grampositivos al
aumentar la alcalinidad.
3. Los microorganismos de reacción
positiva a los colorantes ácidos pueden
hacerse gramnegativos por aumentar la
alcalinidad.
4. Los microorganismos de reacción
positiva a los colorantes básicos pueden
hacerse gramnegativos por aumentar la
acidez.
5. En la zona isoeléctrica característica de
cada especie es muy escasa la tendencia a
retener cualquier colorante.
6. Parece estar bien demostrado que las
proteínas de las bacterias no son simples,
sino más bien una débil combinación de
sustancias proteínicas con otras lipoideas o
7. La materia grasa extraída de los
microorganismos grampositivos difiere de
la obtenida de los microorganismos
gramnegativos, en que la primera contiene
una proporción mucho mayor de ácidos no
saturados que muestren gran afinidad por
los agentes oxidantes. Todos los
mordientes (como el yodo) empleados en
la coloración Gram son oxidantes; su
efecto, en general, consiste en dar a la
sustancia oxidada un carácter más ácido.
Esto aumenta la afinidad de un
microorganismo por los colorantes básicos.
8. El cambio de respuesta a la
coloración de Gram con el tiempo es
propio, sobre todo, de los
microorganismos débilmente
grampositivos cultivados en los medios
que contengan sustancias capaces de
fermentar, y cuya reacción se vuelve
ácida en el curso del desarrollo.
Teoría de Libenson y Mcllroy

La permeabilidad de la pared
celular al violeta cristal, la escasa
solubilidad del complejo de yodo y
colorante en alcohol y acetona, y el
libre acceso del disolvente al
complejo constituido, son los
principales factores que intervienen
en el mecanismo de esa coloración.
Bacillus Enterobacteria

Bacillus + E. coli