Analizador de Elisa 1 Descripcin El analizador de ELISA es un espectrofotmetro especializado, diseado para efectuar la lectura de los resultados de una tcnica

que se utiliza para determinar la presencia de anticuerpos o antgenos especficos presentes en una muestra. La tcnica se basa en la deteccin de un antgeno inmovilizado sobre una fase slida, mediante anticuerpos que, directa o indirectamente, producen una reaccin cuyo producto puede ser ledo por el espectrofotmetro. Se le conoce tambin con el nombre de Lector de ELISA. La palabra ELISA es el acrnimo de las palabras en lengua inglesa Enzyme-Linked mmunosorbent Assay. Emplea reactivos econmicos, fciles de conseguir y es utilizada en combinacin con diferentes mtodos de espectrofotometra para la posterior identificacin del antgeno. Figura 1

Fuente: http://articulo.mercadolibre.com.ve/MLV-24139913-analizador-de-microelisa-marca-mindray-_JM 2 Propsito El analizador de ELISA se utiliza para leer el resultado de las pruebas efectuadas, utilizando la tcnica de ELISA, la cual tiene aplicacin directa en inmunologa y en serologa; permite confirmar la presencia en el organismo de anticuerpos o antgenos de un agente infeccioso, vacunal o autoanticuerpos artritis reumatoide, por ejemplo, entre otras aplicaciones.

3 Principio de funcionamiento El analizador de ELISA es un espectrofotmetro especializado. A diferencia de los espectrofotmetros convencionales que permiten efectuar lecturas en un rango amplio de longitudes de onda, este dispone de filtros o rejillas de difraccin que limitan el rango de longitudes de onda a aquellas que se utilizan en la tcnica ELISA, la cual generalmente se realiza con longitudes de onda comprendidas entre los 400 y los 750 nm nanmetros. El sistema ptico utilizado por muchos fabricantes utiliza la fibra ptica para llevar la luz hasta los pozos de la placa, donde se encuentra la muestra bajo anlisis. La luz que atraviesa la muestra tiene un dimetro que vara entre 1 y 3 mm. Un sistema de deteccin recibe la energa lumnica, proveniente de la muestra, la amplifica, determinan la absorbancia y, a travs de un sistema de lectura, la convierte en datos que permiten interpretar el resultado de la prueba. Las muestras del ensayo de ELISA se colocan en placas de diseo especial, las cuales disponen de un nmero definido de pozos o vasos, en los cuales se lleva a cabo el procedimiento o ensayo. Son comunes las placas de 8 columnas por 12 filas, con un total de 96 pozos. Tambin existen placas con un mayor nmero de pozos. La ubicacin de los sensores pticos en el analizador de ELISA vara dependiendo de los fabricantes. Algunos los colocan sobre la placa porta muestras, mientras que otros los ponen directamente bajo los pozos de la placa. 4 Equipos requeridos para efectuar ensayos de ELISA Para desarrollar la tcnica de ELISA se requiere disponer al menos de los siguientes equipos: 1. Un analizador de ELISA. 2. Un lavador de ELISA. 3. Un sistema dispensador de lquidos. (Pueden usarse pipetas multicanal). 4. Una incubadora especializada para las placas. La ilustracin que se presenta a continuacin da una idea de la forma en que se encuentran interrelacionados los equipos mencionados.

Figura 2

Fuente: Manual de mantenimiento para equipo de laboratorio, Organizacin Panamericana de la Salud, Washington D. C., 2005 4.1 Fases mecnicas de un ensayo utilizando la tcnica de ELISA Uso de equipos Cuando se realiza una prueba de ELISA, generalmente se siguen estos pasos: 1. Utilizando el lavador de ELISA o micro placas, se efecta un primer lavado de la placa. Figura 3

Fuente: http://www.zonamedicasac.com/lavadora.html

2. Mediante el dispensador de lquidos o las pipetas multicanal, se llenan los vasos o pozos de las placas con las soluciones preparadas para ser utilizadas en el ensayo. Figura 4

Fuente: http://www.cannabiscafe.net/foros/showthread.php?t=69381 3. A continuacin, se coloca la placa en la incubadora donde, a temperatura controlada, se lleva a cabo un conjunto de reacciones. Las etapas 1, 2 y 3 se pueden repetir varias veces dependiendo del ensayo, hasta que se logre que las muestras colocadas en las placas hayan terminado sus reacciones. 4. Finalmente, cuando se han completado las reacciones qumicas, se lleva la placa al analizador de ELISA y se efectan las lecturas que permiten emitir un diagnstico. 4.2 Fases qumicas de la tcnica de ELISA Se presenta a continuacin un breve resumen de cmo funciona la tcnica de ELISA, desde el punto de vista qumico1. 1. Se recubren los pozos de una placa con anticuerpos o antgenos. 2. Se aaden las muestras, controles y estndares a los pozos de la placa y se incuban a temperaturas que oscilan entre la temperatura ambiente y 37 C, por un perodo de tiempo determinado, segn caractersticas de la prueba. Durante la incubacin, una parte del antgeno de la muestra se une al anticuerpo del recubrimiento de la placa, o el anticuerpo de la muestra se une con el antgeno ubicado en el recubrimiento de la placa, en funcin de su presencia y cantidad en la muestra analizada. 3. Despus de la incubacin, las entidades no unidas antgenos o anticuerpos se lavan y se retiran de la placa, utilizando el lavador de ELISA que utiliza un buffer de lavado adecuado.

4. A continuacin, se aade un anticuerpo secundario, denominado el conjugado, el cual tiene una enzima que reaccionar con un sustrato para producir un cambio de color. 5. Se inicia entonces un segundo perodo de incubacin, durante el cual el conjugado se unir al complejo antgeno-anticuerpo en los pozos de la placa. 6. Despus de la incubacin, se realiza un nuevo lavado para retirar de los pozos de la placa cualquier vestigio del conjugado no unido. 7. Se aade un sustrato. La enzima reaccionar con el sustrato y causar un cambio de color en la solucin, brindando un medio para medir la cantidad de conjugado que a la vez dir cunto complejo antgeno- anticuerpo est presente. Otro perodo de incubacin permitir que esta reaccin tenga lugar. 8. Cumplido el tiempo de incubacin, se aade un reactivo para detener la reaccin sustrato-enzima y prevenir cambios adicionales de color. Generalmente este reactivo es un cido diluido. 9. Finalmente, se efecta la lectura de la placa en el analizador de ELISA. Los valores de los resultados se usan para determinar las cantidades de antgeno o anticuerpo especfico presentes en la muestra. Algunos de los pozos en la placa se destinan para colocar estndares y controles. Los estndares permiten definir los puntos de corte ( cut off). Los controles son cantidades conocidas que se usan para medir el xito del ensayo, evaluando los datos recibidos contra las concentraciones establecidas para cada control. El proceso antes descrito es comn, aunque muchas pruebas de ELISA tienen variantes. 5 Lectura La placa puede ser leda visualmente o con un lector de placas manual o automtico. 5.1 Lectura inmediata en forma visual. Los pocillos correspondientes a muestras positivas sern de color amarillo y podrn ser fcilmente diferenciados de los pocillos negativos, los que sern incoloros o presentarn una leve coloracin amarilla. 5.2 Lectura con un Lector de placas de ELISA. Lea la placa con un lector manual o automtico para placas de ELISA usando un filtro de 450 nm. Se recomienda un lector de placas con capacidad de lectura de 2 o ms unidades de absorbancia. 6 Clculos del cut off Cut Off = Promedio Control Negativo + 0,260 Ejemplo de clculo: 1) Promedio de Control Negativo (n=3) = 0,086 2) Promedio de Control Positivo (n=3) = 2,700 3) Cut Off = 0,086 + 0,260 = 0,346 6.1 Interpretaciones de resultados Si la razn Control Positivo/Control Negativo es menor que 10, se invalida el ensayo. Una muestra ser positiva cuando su absorbancia sea mayor que el valor del Cut Off.

Una muestra ser negativa cuando su absorbancia sea menor que el valor de Cut Off. Si la absorbancia de una muestra est en el valor del Cut Off 10%, repita el ensayo en duplicado. Si la lectura persiste en esta zona, considere la muestra como sospechosa para BKD. 7 Servicios requeridos Para que el analizador de ELISA opere correctamente, es necesario verificar los siguientes puntos: 1. Un ambiente limpio, libre de polvo. 2. Una mesa de trabajo estable. Lo recomendable es que la misma est alejada de equipos que generen vibraciones centrfugas, agitadores, que tenga un tamao adecuado que permita ubicar, al lado del analizador de ELISA, los equipos complementarios requeridos para efectuar la tcnica en mencin: lavadores, incubadora, dispensador y computador con perifricos. 3. Una fuente de suministro elctrico de acuerdo con las normas y estndares implementados en el pas. En los pases americanos se utilizan por lo general voltajes de 110 V y frecuencias de 60 Hz. 8 Mantenimiento preventivo Frecuencia: Trimestral 1. Verificar la estabilidad de la lmpara. Usar el filtro de calibracin, efectuando lecturas con intervalos de 30 minutos o una misma placa. Comparar las lecturas. No deben existir diferencias. 2. Limpiar los sistemas pticos de los detectores y los sistemas de iluminacin. 3. Limpiar el mecanismo de avance de la placa. 4. Verificar la alineacin de cada pozo con los sistemas emisores y detectores de luz. 9 Bibliografa Manual de mantenimiento para equipo de laboratorio, Organizacin Panamericana de la Salud, Washington D. C., 2005 ELISA Automation, Hudson Control Group, AB104A, 2002. (www.hudsoncontrol.com) Solid Phase Guide, NUNC, Brand Products, Introduction to Solid Phase Techniques. (http://www.nuncbrand.com/PDF/Guides%20and%20Manuals/Guide %20to%20Solid%20P hase.pdf) Universal Medical Device Nomenclature System (UMDNS), Product Categories Thesaurus, ECRI, 5200 Butler Pike, Plymouth Meeting, PA, USA, 2000. Zoon, Kathryn, Recommendations to users of medical devices that test for infectious disease markers by enzyme immunoassay (EIA) test systems, Division of Blood Applications, Bethesda, MD. (http://www.fda.gov/cber/bldmem/122094.txt)