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PARTE I Biotecnologa y Agricultura

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

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IZQUIERDO, Juan

I.-Captulo1
Hacia una agricultura sustentable: las alternativas de las ciencias de la vida y de la biotecnologa
Izquierdo, Juan 1 El contexto del debate En lnea con las conclusiones de la ltima Cumbre de la Alimentacin de la FAO y diez aos despus de la Cumbre de Ro y de la adopcin de la Agenda 21, la Cumbre Mundial sobre Desarrollo Sustentable organizada en Johannesburgo, Africa del Sur, por el Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente (PNUMA), reforz que la sostenibilidad es cada vez ms un precepto crucial, ampliamente aceptado y prioritario en el plano internacional dentro de un contexto integral que involucra la lucha contra la pobreza, el hambre y la malnutricin, la lucha contra las enfermedades infecciosas, la cooperacin tecnolgica, la educacin y la liberalizacin de los intercambios. Las previsiones indican un importante aumento de la demanda alimentaria, especialmente en los pases en vas de desarrollo, lo que implica que para poder dar respuesta a este reto una de las posibilidades es aumentar la superficie de terrenos cultivados. Sin embargo, estos terrenos adicionales, limitados por la proteccin indispensable de los entornos naturales, tan slo representaran una quinta parte del crecimiento de la produccin mundial de cereales. Por consiguiente, resulta obligatoria la mejora del rendimiento y/o la adaptacin a condiciones extremas de produccin (sequa, salinidad, fro, altas temperaturas y otras) en zonas poco aptas para la agricultura convencional que permitan intensificar a los cultivos alimenticios y diversificar, sobre la base de especies de cultivos introducidas o autctonas, alimenticias o volcadas al agroprocesamiento, la base productiva de los pases de la regin. En este desafo, en donde las ciencias de la vida y la biotecnologa tienen un rol central, deben estar juntos todos los actores del proceso del desarrollo (cientficos, legisladores, expertos en desarrollo, agricultores y

los representantes de la sociedad civil) para abordar los aspectos tecnolgicos y econmicos, ms urgentes y polmicos, relacionados con el desarrollo y utilizacin segura de las biociencias y su capacidad de ofrecer soluciones sustentables para la produccin de alimentos y la reduccin de la pobreza. En este contexto, la cooperacin entre el mundo desarrollado y el mundo en vas de desarrollo resulta crucial si se quieren lograr los objetivos relativos a la sostenibilidad. La seguridad y el uso de organismos genticamente modificados (OGM) implican a priori, situar a la ciencia en un contexto de desarrollo mucho ms amplio, tratando de asegurar que los agricultores de los pases en vas de desarrollo formen parte del proceso colaborativo de investigacin. Compartiendo el derecho de la sociedad civil a cuestionar, sobre bases bien informadas, los avances cientficos y las consecuencias que de ellos eventualmente pudieran derivar, debe tomarse nota de que un cierto grado de escepticismo es un elemento saludable y esencial del proceso de demostracin que permite dar a conocer las cuestiones cientficas apropiadas para as poder proceder a un debate en toda regla. 2 Movilizar los recursos El proceso anterior significa movilizar recursos tanto para apoyar a la innovacin y a la investigacin en biotecnologa, as como para desarrollar un marco regulatorio alcanzable dentro de las realidades de los pases de la regin, acompaado por canales de informacin tecnolgica confiables y honestos, que permitan y promuevan una percepcin pblica crtica pero realista de las ventajas que ofrecen los nuevos desarrollos de las ciencias de la vida y la biotecnologa. Este proceso es, en la actualidad, el centro vital de la cooperacin horizontal que lleva adelante la red REDBIO/FAO (http:// www.redbio.org) con ms de 12 aos de existencia y un cuerpo de laboratorios de ms de 650 instituciones de 32 pases de Amrica latina y el Caribe. Si la solucin a tal desafo dependiera en primer y nico lugar de la movilizacin de los recursos humanos y de los medios financieros, los progresos actuales y futuros de las

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ciencias de la vida y de la biotecnologa, representaran un potencial nada desdeable para el impulso de una agricultura sustentable y segura en los pases en vas de desarrollo. En concreto, dicha accin podra permitir abandonar el uso de mtodos ms agresivos para el ambiente como, por ejemplo, los mtodos mecnicos y qumicos que inciden en los costos de produccin, en sus efectos desfavorables sobre las fuentes hdricas, la fauna y la flora y sobre la salud de los agricultores. Este planteamiento no queda exento de fuertes reticencias en ciertos sectores de la opinin pblica mundial y especialmente en Europa, que expresan su desconfianza en cuanto al uso de organismos modificados genticamente en el mbito de la agricultura y la alimentacin. Estas fuerzas compuestas de variados actores de la sociedad civil representan, a su vez, un fuerte desafo que limita la movilizacin de los recursos. El tema de los OGM es ineludible pero no supone ms que una parte de la totalidad del debate. La salud de los suelos y de los cultivos, el conocimiento real del estado de la biodiversidad, las producciones vegetales en los lmites ecoclimticos y la emancipacin tecnolgica en las zonas rurales son tambin temas que revisten la misma importancia. 3 Un contexto propicio para la accin La produccin agrcola en los pases en vas de desarrollo ha de aumentar en la medida en que contine creciendo el nmero de bocas que alimentar. Este incremento se ha de lograr en gran medida con los terrenos agrcolas existentes y mediante el uso de mtodos que no agoten los recursos de la tierra o causen daos medioambientales duraderos. Las perspectivas de las generaciones venideras resultarn daadas irreversiblemente si no se emplean adecuadamente formas sustentables de cultivar la tierra. La adopcin de mtodos agrcolas sustentables es un elemento importante en todo el proceso del desarrollo rural. La Agenda 21 indica que: Con el fin de crear las condiciones para la agricultura y el desarrollo rural sustentables es preciso reajustar considerablemente la poltica agrcola, ambiental y macroeconmica, a nivel tanto nacio-

nal como internacional, en los pases desarrollados y en los pases en desarrollo. El principal objetivo de la agricultura y el del desarrollo rural sustentables es aumentar la produccin de alimentos de manera sustentable y mejorar la seguridad alimentaria. La reciente conferencia Rio+10, celebrada en Johannesburgo en septiembre de 2002, reforz el compromiso mundial con los principios del desarrollo sustentable. Entre los muchos logros importantes de la cumbre hay que destacar el mejor entendimiento de lo que representa el desarrollo sustentable y, en particular, en cuanto a la interrelacin entre la pobreza, el medio ambiente y el uso de los recursos naturales. Amrica latina y el Caribe, como regin productora y exportadora de alimentos, debe transformarse en uno de los protagonistas en el campo de las ciencias de la vida y la biotecnologa. Dentro de este inters superior por ayudar al desarrollo de nuevas tecnologas no se debe olvidar la necesidad de generar, acceder y compartir los avances con el mundo desarrollado de un modo justo y responsable. La regin debe preparar y endosar una declaracin de poltica en donde las ciencias de la vida y las biotecnologas son una opcin estratgica para los pases (http://europa.eu.int/comm/ biotechnology/pdf/com2002-27_en.pdf) subrayndose con claridad la necesidad de poner los medios necesarios a la disposicin de los pases en vas de desarrollo. El progreso en estos mbitos ayudar a la investigacin y a la evaluacin cuidadosa de las aplicaciones potenciales, con el fin de cubrir los temas de seguridad medioambiental y las necesidades locales relacionadas con la reduccin de la pobreza, la mejora de la seguridad alimentaria y el aumento de la calidad nutricional. El desarrollo rural sustentable y la seguridad alimentaria son componentes importantes de las estrategias regionales contra la pobreza. Habida cuenta de que el sustento de la poblacin rural depende de una agricultura sostenible, no se podr erradicar la pobreza sin una modernizacin sustancial de la produccin agrcola en los pases en vas de desarrollo. 4 Alimentar sin destruir Segn las estadsticas de la Organizacin de las Naciones Unidas para la Alimentacin

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y la Agricultura (FAO), hay alrededor de 800 millones de personas en el mundo que sufren malnutricin. Muchas ms dependen de aprovisionamientos poco fiables de alimentos a causa de problemas naturales, econmicos o polticos. Las prcticas agrcolas no sustentables tan slo vienen a sumarse a todas estas dificultades. El uso adecuado de las ciencias de la vida y de la biotecnologa puede contribuir al logro de aumentos sustentables de la produccin agrcola mediante la transferencia de prcticas de gestin mejoradas, un mejor rendimiento, la resistencia a plagas y enfermedades y el aumento de la tolerancia al estrs abitico de las cosechas, el ganado y la pesca. La seleccin adecuada de estas tecnologas reducir la necesidad de recurrir a sustancias agroqumicas, de modo que se proteger el medio ambiente y a los agricultores de sus efectos negativos. Adems, las ciencias de la vida y la biotecnologa pueden contribuir a la conservacin de la diversidad gentica. Por ejemplo, ya hay proyectos en marcha que evalan cmo se explotan y se extenan los ecosistemas a causa del uso humano de los recursos naturales. Con la informacin recopilada se puede lograr un uso ms razonable de los ecosistemas que reduzca el riesgo de prdida de especies esenciales. 5 La creacin de un dilogo responsable Organizar y promover una Plataforma de Debate sobre las Ciencias de la Vida, que permita a los cientficos participar en un debate con las diversas partes implicadas interesadas en las aplicaciones beneficiosas y en la divulgacin de los nuevos conocimientos, es parte del proceso. En este sentido se debe organizar un debate informativo y plural sobre el papel de las ciencias de la vida en un contexto de urgencia econmica y social, centrado en las necesidades de los pases en vas de desarrollo y apoyar foros de debate con la sociedad civil presentando estudios de cientficos nacionales, cada uno claramente ubicado en su contexto social y econmico. Las presentaciones deben realizarse en un lenguaje comprensible para los legos en la materia, porque se evitarn las referencias a teoras e ideologas y se prestar atencin a las soluciones prcticas a problemas con-

cretos. Estas presentaciones servirn de valiosa introduccin general a los diversos temas e irn dirigidas a un pblico amplio, con el fin de que ofrezcan una base para el inicio del debate pblico. 6 Reforzar los conocimientos Las ciencias de la vida y biotecnologa (http://europa.eu.int/comm/ biotechnology/pdf/com2002-27_en.pdf) son pilares en el contexto de la construccin de una sociedad y una economa basada en el conocimiento. Las inversiones en investigacin y desarrollo, en educacin y formacin y en los nuevos enfoques de gestin tienen una importancia clave para hacer frente a los desafos de la biotecnologa y las ciencias de la vida. Coherente con lo anterior, el reforzamiento de los vnculos entre la investigacin y otras polticas socioeconmicas y la necesidad de la participacin de los cientficos en el proceso de creacin de un consenso es parte de la creacin de nuevas asociaciones de investigacin entre los pases desarrollados y los pases en vas de desarrollo, a fin de aprovechar al mximo las ventajas de tecnologas prometedoras y el potencial de la biodiversidad. El libro Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal, para el cual he tenido el honor de escribir este captulo, es producto del trabajo de un nmero importante de investigadores jvenes latinoamericanos. La obra representa una contribucin significativa a la realidad de las instituciones acadmicas y de investigacin en ciencias agronmicas y biolgicas al aportar conocimientos y el estado del arte y llenar el vaco temporal en la disponibilidad de un libro en espaol de consulta actual, dando seguimiento a la obra pionera Cultivo de Tejidos en la Agricultura: Fundamentos y Aplicaciones realizada en 1991 y llevada a cabo por el Centro Internacional de Agricultura Tropical bajo la edicin de los Drs. William Roca y Luis Mroginski. La Oficina Regional de la FAO para Amrica Latina y el Caribe colabor con la edicin de dicho libro y reafirma el inters por este tipo de material, que provee un conjunto de documentacin consolidada para el uso de estudiantes y profesionales.

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I.-Captulo 2
El papel de las nuevas biotecnologas en la produccin agropecuaria
Pagliano, Daniel 1 Introduccin La nueva economa determina que aquellas naciones que pretendan crecer y generar riqueza debern necesariamente aceptar el desafo que implica el aprender a utilizar los idiomas digital y gentico. Es as entonces que las empresas e instituciones basadas en el uso intensivo del conocimiento son fundamentales en la creacin de prosperidad. Empresas de distinto porte han evolucionado y crecido en el sector de la biotecnologa generando, directa e indirectamente, cientos de miles de puestos de trabajo en todo el mundo1 como resultado de inversiones que se realizaron tanto en el sector pblico como en el privado, y que hoy se consolidan a travs de la generacin de un modelo productor de bienes y servicios. Entender este continuum es vital. Pero el punto principal es la creacin de comunidades con visin competitiva. Es as que desde un tiempo a esta parte muchos pases desarrollados estn implementando diferentes estrategias para impulsar el sector de la biotecnologa como un rea prioritaria de su economa, no slo por lo que significa en trminos productivos sino tambin por lo que significa culturalmente. Para los pases latinoamericanos es entonces fundamental entender que hay que buscar un lugar dentro de esta nueva economa, que es una economa de conceptos ms que una economa de toneladas, y a la vez tratar de establecer parmetros de desarrollo sustentables que generen inversin, empleo genuino y valor agregado. El incremento de la demanda por factores de productividad y calidad en el producto terminado exige la utilizacin de tecnologas que introduzcan calidad en el material inicial y que la continen y expandan hasta
The economic contributions of the biotec industry of the US economy. Informe realizado por Ernst & Young, Mayo 2000. www.bio.org
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la obtencin de un producto final de mayor calidad. Considerando que los sectores productivos ms importantes son la produccin animal, de granos, hortifruticultura y forestales, la biotecnologa incide fundamentalmente desde el inicio de las cadenas productivas. Son bsicamente nuevas semillas, plantas o animales con nuevas caractersticas genticas que confieren caracteres sanitarios, de calidad o adaptativos, los que llevan un valor agregado biotecnolgico. A modo de ejemplo, si consideramos al sector lcteo, las demandas comenzaran en pasturas con especies forrajeras de alta productividad, seguiran en una gentica animal que aporte la mejor capacidad de una produccin de calidad, se continan en la industria con elaboracin de productos diferenciados y ms an, sigue en la valorizacin de los desechos industriales. Hay un continuum tecnolgico donde la suma de los valores agregados en cada tramo expande el valor agregado final. Por otra parte, la agricultura y la industria farmacutica comparten ahora una misma caja de herramientas. El desarrollo de tecnologas que pueden ser usadas en cualquier campo de la vida es un elemento dinamizador nuevo que permite que un logro en un campo pueda ser rpidamente traspasado a otro. Los cdigos usados en genmica, bioinformtica, qumica combinatoria y protemica tambin son compatibles. Por todo esto, se habla de una industria de las ciencias de la vida. Los pases de la regin poseen una especial habilidad para el agregado de valor a su produccin agropecuaria mediante la utilizacin de conocimientos de base biolgica. Los pases poseen no slo el know how (conocimiento) sino tambin la experiencia de haber llevado esos conocimientos al campo productivo, como lo demuestran las industrias lctea, forestal, citrcola, cafetera y el complejo ganadero, entre otros. Pero es necesario comprender que la actual revolucin existente en las ciencias de la vida modificar o sustituir progresivamente tecnologas existentes, permitiendo superar lmites tcnicos bsicos, haciendo viables nuevos parmetros de productividad y de calidad para productos y procesos existentes, sentando la base de nuevas industrias.

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Esto generar cada vez ms cambios sustanciales en toda la cadena productiva agroalimentaria, donde nuevos patrones tecnolgicos sern los responsables de la aparicin de nuevos productos en los mercados. Estar preparados o ser parte de estos cambios se torna una cuestin de soberana. 2 Desarrollo de una visin La sociedad de un pas, como sistema humano, se mueve en direccin a las preguntas que se formula, y acta en funcin de stas. Para el diseo de una visin, la regin debe lograr entender los cambios que en el plano mundial se estn procesando. Cualquier tecnologa compleja necesita para su desarrollo de una infraestructura sustentada en una comunidad que involucra la investigacin, el gobierno, la educacin, los negocios, las finanzas, la legislacin y otros. Se requiere de varios actores para hacer que una tecnologa pase por etapas de prueba de concepto, desarrollo, maduracin, extensin y finalmente termine con su adopcin. Es fundamental tener una capacidad de seguimiento de lo que ocurre mundialmente en el desarrollo de nuevos productos, programas marcos de investigacin, prioridades estratgicas de programas de ciencia y tecnologa, etc. Luego de tener estas tendencias mundiales es menester generar una estrategia regional de desarrollo y posicionamiento en el contexto mundial. Los ejercicios de prospectiva tecnolgica son una herramienta vlida en este sentido. De acuerdo con la definicin de la OCDE (Organizacin para la Cooperacin y el Desarrollo Econmico), prospectiva tecnolgica es un conjunto de intentos sistemticos para mirar a largo plazo el futuro de la ciencia, la tecnologa, la economa y la sociedad, con el fin de identificar aquellas tecnologas genricas emergentes que probablemente generarn los mayores beneficios econmicos y/o sociales. El objetivo central de una prospectiva tecnolgica es la estimacin de las tendencias futuras para llevar a cabo en forma anticipada acciones para disear el futuro deseado. En este sentido la prospectiva tecnolgica identifica aquellas tecnologas emergentes

y estima el impacto de stas sobre el mundo de los negocios y la sociedad en general. Histricamente, la regin ha invertido de forma sistemtica en programas de I+D (Investigacin y Desarrollo) en apoyo a la investigacin biolgica aplicada, lo cual ha permitido mantener y aumentar la competitividad de los sectores productivos de base natural. En la actualidad, es prioritario para los sistemas de I+D y produccin de la regin tener una visin prospectiva para poder alcanzar un nuevo paso en su nivel de desarrollo. Es prioritario que los lderes comprendan la profundidad del cambio, los cambios tecnolgicos, econmicos, culturales y que se promuevan las reformas y los cambios estructurales necesarios para lograr desarrollar sistemas de innovacin propios en biotecnologa. Esto permitir a la regin seguir liderando el desarrollo de productos y procesos de base biolgica. Las estrategias de Usuario de Biotecnologa son una posibilidad para aquellos pases que tengan importantes industrias agrcolas y agroindustriales, pero que carecen de industrias productoras de insumos biolgicos. Sin embargo, pases que quieran potenciar estas ltimas y ser parte del mercado del conocimiento, se vern forzados a acciones ms proactivas y ambiciosas. 3 Interaccin sistema acadmico y sector privado Hoy, la mayor parte de la infraestructura y de las capacidades disponibles en la regin se encuentran fuertemente orientadas a la investigacin. Esto es fundamental para avanzar hacia las etapas de desarrollo y posteriores, que permitan alcanzar los mercados con productos y servicios. Estas etapas sucesivas necesitan ser practicadas y es fundamentalmente en el sector privado donde deben articularse, contando con un sistema productivo organizado para hacer demandas al sistema cientfico. La ciencia pura es tan pertinente como la aplicada, pero en el mediano y largo plazo la nica forma de competir seriamente es a travs de productos y servicios innovadores. En la nueva sociedad del conocimiento el rol que cumplen las universidades se torna an ms clave. Es importante que las universi-

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PAGLIANO, Daniel

dades de la regin puedan analizar y canalizar lo que est pasando en pases como Estados Unidos, Inglaterra, Blgica, Canad y Australia, donde existe una fuerte integracin de las carreras cientfico-tecnolgicas con escuelas de negocios, integrando la visin comercial al desarrollo de la ciencia y la tecnologa. En este sentido la regin posee una excelente capacidad cientfica-tecnolgica, pero debe complementarla con la capacidad de gestin de la tecnologa. Se requiere, por ejemplo, del marketing (mercadeo) para poder vender productos fuera de la regin, para lo cual habr que estudiar y comprender los mercados que van a recibir nuestros productos. Para esto, es menester lograr sinergias entre cientficos y empresarios, y potenciar la formacin de nuevas empresas a partir del reconocimiento de la capacidad de la biotecnologa de la regin. 4 Conclusiones Para la regin es muy importante, sin duda, continuar trabajando en el camino emprendido, buscando forjar las alianzas estratgicas entre los mbitos pblico y privado de las bioindustrias, coordinando esfuerzos en investigacin y desarrollo hacia obje-

tivos que potencien las capacidades. De esta forma se podrn lograr mejores parmetros de competitividad global que permitan continuar con la creacin de emprendimientos y puestos de trabajo altamente calificados y as contribuir al desarrollo. La regin tiene una gran oportunidad generada por la globalizacin pero, para aprovecharla, necesita entender que es indispensable involucrar a la comunidad entera y participar activamente para capturarla. Se debe promover una cultura que favorezca a los emprendimientos y genere un mayor grado de asociatividad entre las empresas y la capacidad cientfica, as como la formacin de redes de capital de riesgo que permitan la generacin de nuevos negocios. Albert Einstein afirmaba que todos los imperios del futuro van a ser imperios del conocimiento, y solamente sern exitosos los pueblos que entiendan cmo generar conocimientos y cmo protegerlos, cmo buscar a los jvenes que tengan la capacidad para hacerlo y asegurarse que se queden en el pas. Los otros pases se quedarn con litorales hermosos, con iglesias, minas, con una historia fantstica; pero probablemente no se queden con las mismas banderas ni con las mismas fronteras ni, mucho menos, con un xito econmico.

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PARTE II Herramientas Bsicas

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RADICE, Silvia

II.-Captulo 1
Morfognesis in vitro
Radice, Silvia 1 Introduccin

La embriognesis somtica y la organognesis son dos procesos morfognicos muy frecuentes en el cultivo in vitro de especies vegetales. La embriognesis somtica es el proceso por el cual se obtiene una estructura similar al embrin zigtico sin que 2 Tipos de morfognesis. Definiciones medie la fertilizacin de las gametas, mienEn condiciones de cultivo in vitro, las ctras que por organognesis pueden obtenerse tallos, races o flores. Estos rganos son lulas somticas pueden regenerar embriones inducidos a partir de una clula o de un gru- (Fig. 1) o brotes, races y/o flores (Fig. 2) como po de clulas que, segn las condiciones de respuesta a un determinado estmulo. La recultivo, tienen la propiedad de mantenerse en activa divisin. Esta totipotencialidad celular haba sido anunciada por Haberlandt en 1902, quien propuso la teora de que todas las clulas vegetales tienen la capacidad de regenerar plantas completas. Este autor, sin embargo, no pudo demostrar su hiptesis debido a que no pudo lograr la divisin celular porque los medios de cultivo que empleaba no incluan reguladores del crecimiento, an desconocidos en ese entonces. Los avances en cultivo de tejidos fueron muy lentos en sus inicios. En 1934, White pudo mantener en forma ilimitada el crecimiento de races en medios lquidos a partir de pices de tomate. Al mismo tiempo se identific el cido indol actico (AIA), Figura 1: A-F) Embriognesis somtica obtenida por cultivo in vitro. A, C y E) que posibilit el manteni- Embriognesis somtica en diferentes fases de crecimiento observada en miento indefinido in vitro Codiaeum variegatum (L) Blume cultivado en MS + 1 mg l-1 de BAP. B, D y F) sp a partir de callos de zanahoria y ta- Embriognesis somtica obtenida en diversos cultivares de Prunus de embriones zigticos inmaduros cultivados en MS + 0,1 mg l-1 de ANA + 1 baco. mg l-1 de Kin con una previa induccin en MS + 2 mg l-1 de 2,4-D. Las barras Posteriormente se des- representan 5 mm.

cubri el efecto de la leche de coco como estimulante de la formacin de callo sobre el cultivo de embriones de Datura stramonium. Skoog y Tsui en 1948, trabajando con cultivos de callo de tabaco, demostraron la existencia de una regulacin qumica en la parte area y en la raz. Trabajos posteriores en callos de tabaco y con el agregado de cinetina , la primera citocinina descubierta, fue posible demostrar que la diferenciacin de brotes, races o de ambos, era regulada por el balance de auxinas/citocininas.

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Figura 3: Esquema de los diferentes procesos morfognicos obtenidos a partir de la siembra in vitro de diferentes explantes. Las lneas continuas expresan organognesis o embriognesis directa mientras que las lneas quebradas indican que la morfognesis se obtiene por va indirecta.

generacin es un proceso que comprende diferentes fases que se suceden de manera similar para los tres tipos de morfognesis citadas. De Klerk y colaboradores en 1997 denominaron a estas diferentes fases como fase de adquisicin de la competencia, fase de induccin y fase de realizacin. En la primera fase las clulas no responden al estmulo organognico pero adquieren esa competencia durante una fase de desdiferenciacin. En la segunda fase o fase de induccin, las clulas son receptivas al estmulo morfognico y hay una relacin directa entre el tipo, concentracin y combinacin de reguladores del crecimiento agregados al medio de cultivo y el rgano a desarrollar. En la fase de realizacin, la clula sufre las sucesivas divisiones para formar el rgano determinado. A partir de la siembra in vitro de diferentes explantes relativamente grandes y en condiciones adecuadas, puede inducirse la formacin de nuevos rganos de manera directa sin la formacin de callo. Si la forma-

cin es de brotes, races o flores se denomina organognesis directa. Si en cambio se induce la formacin de embriones somticos, este proceso se denominar embriognesis directa (Fig. 1 y Fig. 3). Si por el contrario, a partir de la siembra de un explante in vitro se observa la proliferacin de clulas en forma desordenada y sin ninguna funcin predeterminada, se iniciar la produccin de callos o suspensiones celulares (Fig. 2 A y Fig. 3). La diferenciacin de rganos a partir de callos o morfognesis indirecta, estar condicionada a la previa formacin de los meristemoides. La denominacin de morfognesis directa o indirecta fue descripta por primera vez por Hicks en 1980.
Figura 2: A-E) Organognesis somtica obtenida por cultivo in vitro . A) Callo organognico obtenido en Abelia sp. (Andr) Rehder cultivada en MS + 1 mg l-1 de picloran. B) Inicio de brotes (flechas) en hojas crecidas in vitro de Crimson Gold (Prunus persica L.) cultivadas en MS + 0,1 mg l-1 de ANA + 1 mg l-1 de Kin. C) Brotes de Gerbera jamesonii Bolus obtenidos a partir del cultivo de captulos florales en MS 0,05 mg l-1 de IBA + 0.75 mg l-1 de BAP + 0,1 mg l-1 de GA3. D) Brotes florecidos in vitro de Abelia sp. (Andr) Rehder cultivados en MS + 1 mg l-1 de BAP. E ) Races (flechas) crecidas de callo de Abelia sp . (Andr) Rehder cultivadas en inducidas en MS + 1 mg l-1 de 2iP, previamente inducidas con 1 mg l-1 de picloran. Las barras representan 5 mm.

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RADICE, Silvia

3 Histologa de la morfognesis Despus de 48 horas de realizada la siembra del explante en el medio de cultivo adecuado, a partir de una clula epidrmica o del mesfilo foliar, como ocurre en las conferas, se suceden una serie de divisiones mitticas. As se pueden observar, a travs del estudio histolgico, pequeas masas de clulas que contienen un citoplasma denso y grandes nuclolos. Este conjunto de clulas agrupadas a modo de esferas fueron denominadas meristemoides por Torrey en 1966, y son los responsables de la diferenciacin de los nuevos rganos. Este tipo de meristema puede iniciarse en forma directa a partir de clulas diferenciadas, pertenecientes a un explante cultivado in vitro o, indirectamente, a partir de una clula o grupo de clulas diferenciadas que promueven la proliferacin celular (Fig. 4 A). Su evolucin determinar el crecimiento de un rgano como, por ejemplo, una yema adventicia (Fig. 4 B). Las clulas embriognicas son similares a las clulas meristemticas debido a que no son demasiado voluminosas, tienen gran cantidad de ribosomas, citoplasma denso, un nuclolo agrandado y pequeos granos de almidn. Estas clulas en general se agrupan y pueden variar en tamao y nmero. Dentro de un grupo de clulas embriognicas, el desarrollo de las mismas no est sincroniza-

do. Estas clulas son capaces de dividirse o de transformarse en embriones segn las condiciones del medio de cultivo. Seguidamente, las clulas que no desarrollan proembriones comienzan el proceso de diferenciacin, es decir, se vacuolizan, disminuye el volumen de ncleo y nuclolo y desaparecen los grnulos de almidn. Las experiencias demuestran que las clulas embriognicas se desarrollan slo cuando se modifican las condiciones de cultivo. En general ocurren cuando se reducen las cantidades de auxina y citocinina o cuando se elimina la auxina. Las clulas embriognicas desarrollan como embriones cuando las condiciones experimentales permiten que stas expresen su potencial. Pueden ocurrir dos situaciones ontognicas diferentes, es decir que su origen sea unicelular o pluricelular. En el caso de iniciarse a partir de una clula, ocurre que estas clulas embriognicas se aslan unas de otras por una importante modificacin en su pared celular, en particular por la gelificacin de la laminilla media. Esta clula, que est rodeada por un polisacrido mucilaginoso, sufre divisiones polarizadas formando un embrin globular, en donde pueden diferenciarse deposiciones de almidn en una etapa previa a la polarizacin de este proembrin. Luego ocurre la formacin de la epidermis y adquiere la simetra bilateral. Sucesivamente se observa el crecimiento de uno o ms cotiledones, el desarrollo de los tejidos provasculares, la iniciacin de los pices radicales y de tallo y una progresiva acumulacin de sustancias del tipo almidn, lpidos y protenas. En el caso de que los embriones somticos se originen de un grupo de clulas pueFigura 4: A-E) Cortes histolgicos de diferentes explantes cultivados in vitro. A) Meristemoides (flechas) observados en cultivo de Silybum marianum L. en MS + 1 mg l-1 de AIA + 5 mg l-1 de BAP 10 x. B) yemas adventicias (flechas) en pices de Fragaria x ananassa Duch. cultivados en Boxus + 0,1 mg l-1 de IBA + 0.5 mg l-1 de BAP + 0,1 mg l-1 de GA3 4 x. C) grupo de clulas embriognicas (flechas) en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurn. 20 x. D) Embriones somticos en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurn 10 x. E) Embriognesis secundaria en Codiaeum variegatum (L) Blume cultivados en 1 mg l-1 de tidiazurn 10 x.

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den observarse diversos patrones. Los embriones somticos se forman a partir de grupos de clulas epidrmicas y subepidrmicas (Fig. 4 C). Este tipo de ontogenia de origen multicelular se llama comnmente budding o embriognesis adventicia . Estas clulas pequeas tienen una alta relacin ncleo/ citoplasma, un denso citoplasma y un nuclolo voluminoso y teido. Se diferencian de las clulas embriognicas por la falta de sustancias de reserva, por su delgada pared celular y su frecuente divisin celular. Estas estructuras pueden ser denominadas como proembriones globulares (Fig. 1 A y B). En una etapa posterior, desarrollan una epidermis, un tejido provascular, acumulan material de reserva y tambin sufren la polarizacin. Estas estructuras globulares producen cotiledones y se transforman en embriones somticos con la formacin de pices de tallo y raz. Para una misma especie puede ocurrir uno u otro tipo de inicio segn las condiciones de cultivo. El desarrollo de un embrin somtico de origen unicelular es comparable a la de un embrin zigtico. En dicotiledneas, la etapa globular es seguida por una etapa corazn que se corresponde con la adquisicin de la simetra bilateral: desarrollo de la epidermis, de los estratos procambiales y, de manera sucesiva, el desarrollo del pice radical. El pice de tallo se desarrolla ms tarde en la etapa de cotiledonar. En los embriones somticos de algunas especies hay una etapa intermedia entre la globular y corazn llamada oblonga, que corresponde a la individualizacin del pice de la raz y al procambium en respuesta a la elongacin axial del embrin somtico debido al transporte de auxinas (Fig. 1 C). Los embriones de origen multicelular obtenidos por budding muestran la misma ontogenia que los zigticos, as como tambin la produccin de sustancias de reserva. Sin el seguimiento histolgico detallado, la formacin del embrin somtico slo puede ser confirmado por la germinacin (Fig. 1 F). Sin embargo debido al bajo porcentaje de embriones que llegan a esta etapa, esta tarea es casi imprescindible para una correcta evaluacin de las respuestas encontradas con los diversos medios de cultivo empleados. Los embriones somticos, comparados con los embriones zigticos de la misma es-

pecie, frecuentemente desarrollan de manera anormal o son inmaduros. La anomala ms frecuente es la formacin doble o triple del sistema vascular, causada por la pobre polarizacin del transporte de auxinas. Tambin se puede encontrar un contenido excesivamente alto, reducido o ausente de las reservas de almidn y/o proteicas, que el meristema apical o radical no estn desarrollados o que la embriognesis sea repetitiva o secundaria (Fig. 4 E). La falta del meristema apical o de una escasa deposicin de sustancias lipoproteicas observada en los embriones somticos de algunas especies, no debe ser tomada como una anormalidad sino que puede ser sntoma de inmadurez debido a la rpida formacin de los mismos. En este caso una etapa intermedia que permita la maduracin de las estructuras formadas permitir incrementar el porcentaje de embriones somticos capaces de germinar. 4 Factores que afectan los procesos morfognicos

Los cuatro factores principales que condicionan la obtencin y el crecimiento de nuevos rganos en condiciones in vitro son: el genotipo las condiciones qumicas seleccionadas para realizar el cultivo las condiciones fsicas seleccionadas para realizar el cultivo el explante El genotipo es un factor determinante en todos los procesos morfognicos desde la capacidad del explante para su establecimiento en condiciones in vitro as como tambin para la proliferacin de callo, o la diferenciacin y crecimiento de nuevos rganos. Por esta causa, no es posible generalizar metodologas o protocolos de trabajo debido a que los medios de cultivo como las condiciones de cultivo seleccionados, deben ser especficos para cada situacin en particular. Un ejemplo de ello es el protocolo empleado por Stamp y Meredith en diferentes cultivares de Vitis vinifera. En cuatro de ellos fue posible la obtencin de embriones somticos a partir de embriones zigticos, pero estos resultados no se repitieron con el cultivar Pinot Noir.

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Varios son los compuestos qumicos que influyen en los patrones morfognicos in vitro dentro de los cuales podemos considerar: 1. La composicin salina del medio de cultivo. La composicin salina ms empleada para inducir la formacin de callo, la organognesis directa o indirecta en la mayora de las especies vegetales, es la de Murashige & Skoog (1962) (MS). Sin embargo, existen otras formulaciones diseadas para inducir determinados patrones morfognicos. Existe, adems, una estrecha relacin entre la composicin hormonal del explante y la concentracin de reguladores del crecimiento agregada al medio de cultivo. 2. Reguladores del crecimiento. Estos compuestos pueden promover la morfognesis aun cuando la concentracin salina no sea la adecuada. En condiciones ptimas de cultivo pueden incrementar significativamente la diferenciacin de rganos. En muchas de las especies vegetales, para la induccin de embriones somticos, es necesario el agregado de auxinas como ocurre en Tilia spp.; sin embargo, para otras, como es el caso del crotn (Codiaeum variegatum), es suficiente con el agregado de thidiazurn. El genotipo y el tipo y concentracin de reguladores del crecimiento empleados estn estrechamente relacionados. 3. Antibiticos. En procesos de transformacin es muy comn el agregado de antibiticos del tipo cefotaxime, kanamicina y carbenicilina para la eliminacin de Agrobacterium tumefaciens. En explantes de hoja de diferentes cultivares de Malus domestica se ha encontrado que 250 mg. L1 de cefotaxime aumentan significativamente la regeneracin de brotes mientras que 500 mg. L1 de carbenicilina promueven la formacin de callo y la kanamicina inhibe los procesos morfognicos. 4. Carbn activado. En general se usa para absorber compuestos txicos de la microatmsfera gaseosa o el exceso de reguladores del crecimiento presentes en el medio de cultivo. E.K. Pettersson y su equipo de colaboradores de la Swedish University of Agriculture, Suecia, demostraron que este compuesto puede promover la embriognesis somtica debido a ciertos compuestos que

se incorporan por difusin al medio de cultivo. 5. Agar. Otro aspecto importante a tener en cuenta es la consistencia del medio de cultivo. Puede emplearse como semislido o lquido. El agente gelificante ms empleado en el cultivo in vitro es el agar extrado de diversas algas marinas. Las diferentes calidades existentes en el mercado modifican la expresin morfognica debido a que pueden contener sustancias inhibitorias o promotoras del crecimiento. Tal es el caso del cultivo de hojas de Actinidia chinensis, cultivadas en una solucin de MS con el agregado de 0,1 mg.L-1 de AIA + 1 mg.L-1 de BAP, donde se observ una respuesta morfognica diversa segn el tipo de agar seleccionado. Por ejemplo, cuando el gelificante empleado fue Chubut-agar, de produccin nacional, se observ una gran diferenciacin de yemas adventicias, mientras que con el agregado de agar SIGMA R slo se indujo la proliferacin de callo. En caso de seleccionar medios de cultivo lquidos, la respuesta morfognica observada vara de manera considerable. El cultivo lquido es imprescindible cuando se busca promover la morfognesis indirecta a travs de suspensiones celulares. Para ello es necesario cultivar los callos en medio lquido con agitacin para permitir que las clulas se disgreguen y puedan diferenciar races, brotes o embriones somticos en forma aislada. La seleccin del medio de cultivo lquido o slido depende, adems, de la especie empleada. En Cymbidium spp, por ejemplo, se ha observado que el empleo de medio de cultivo lquido promueve una mayor diferenciacin de protocormos respecto del mismo medio gelificado. A su vez, este proceso puede mantenerse durante varios subcultivos mientras que en medio de cultivo gelificado se observ que los protocormos tienden a formar tallos. 6. Atmsfera gaseosa. Es un factor determinante en los procesos morfognicos y est condicionada por el tipo y tamao de envase seleccionado as como tambin el sistema de cobertura del mismo. Las tapas usadas en cultivo in vitro varan desde el tapn de algodn, papel de aluminio, pelcula de resinite transparente o tapas rgidas de polipropileno. El intercambio gaseoso es di-

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ferente para cada tipo de tapa; en consecuencia, la atmsfera interna tambin sufrir variaciones. En condiciones in vivo la atmsfera contiene 78 % de nitrgeno; 21 % de oxgeno y 0,035 % de dixido de carbono. En cultivos in vitro se han registrado, adems, etileno y otros compuestos hidrocarbonados. El nivel de oxgeno disponible para el explante condiciona el crecimiento y los procesos morfognicos. En general se necesita una buena aireacin para obtener cualquier tipo de proceso morfognico. En alfalfa se puede obtener un buen incremento de material a partir de suspensiones celulares embriognicas cuando la solucin se satura con 70% de oxgeno en la solucin. Por el contrario, una tensin de oxgeno del 5 % estimula la produccin de plantas a partir de anteras de tabaco. La concentracin de dixido de carbono (CO2) en la atmsfera gaseosa in vitro vara segn la respiracin y la actividad fotosinttica de las plantas. En condiciones de oscuridad, el CO2 se incrementa mientras que, en condiciones de luz disminuye. En trabajos realizados con Ficus lyrata se han encontrado concentraciones variables que van del 0,5 al 8,5 %, segn el tipo de sello o tapa empleados. Estas concentraciones superiores a 1 %, generalmente txicas para las condiciones in vivo , probablemente no son limitantes para la actividad fotosinttica. La presencia de etileno en condiciones in vitro promueve diversas respuestas. Para el cultivo de clulas, callos y anteras, su acumulacin tiene efectos inhibitorios. La cantidad de etileno producida in vitro vara con la especie, el tipo de explante, la concentracin de citocininas en el medio de cultivo, el tipo de agar seleccionado y con la luz. Una forma de incorporar etileno al envase de cultivo es a travs de la esterilizacin del material de diseccin realizada con el material embebido en alcohol y flameado con mechero Bunsen. En muchos casos, el etileno acta como promotor de la morfognesis, pero luego es inhibitorio del crecimiento de los rganos diferenciados.

Entre las condiciones fsicas podemos mencionar los efectos de la temperatura, la humedad relativa y la luz. 32

1. La temperatura de incubacin de los cultivos es un factor importante a tener en cuenta. Si bien en las condiciones naturales de cultivo las plantas tienen diferencias trmicas durante el da y la noche, las temperaturas in vitro se mantienen casi estables. Es importante sealar que cuanto ms se asemejen las condiciones in vitro a las ptimas de crecimiento de la especie estudiada, mayor ser la respuesta esperada. En cultivos de hojas de Streptocarpus x hybridus sometidos a diferentes temperaturas, se observ que la regeneracin mayor de brotes se obtuvo a 12 C, mientras que por encima de los 30 C casi no hubo diferenciacin. 2. La humedad relativa (HR) como medida de la cantidad de vapor de agua contenida en la atmsfera gaseosa, es otro de los parmetros fsicos a tener en cuenta. La HR depender del sello o cobertura del envase empleado. Si este cierre es hermtico, la humedad interior ser del 100 %. Si existe la posibilidad de un intercambio gaseoso, la humedad interna puede descender a niveles cercanos al 50 %. Este importante descenso del contenido de HR puede promover una prdida veloz de agua del medio de cultivo, variando la concentracin de sus compuestos hasta llegar a niveles txicos (Debergh, comunicacin personal). 3. La luz suministrada a los cultivos debe ser evaluada en cuanto a la calidad, intensidad y perodo de suministro. La respuesta morfognica de un explante puede variar segn se le proporcione luz o no. Para estimular la formacin de callo es comn que se prefiera la oscuridad. El suministro de luz favorece la diferenciacin de rganos. Tal como ya se seal anteriormente, los procesos morfognicos dependen del genotipo seleccionado, pero, adems, debe sumarse el efecto del explante seleccionado. El tratamiento de la planta madre, las condiciones fsicas y fisiolgicas en las que sta se encuentre y el sector del cual se tome el explante determinarn a su vez la respuesta morfognica en condiciones in vitro . Un ejemplo muy interesante es la diferente respuesta morfognica observada sobre hojas de Camellia japonica cultivadas en un mismo medio de cultivo, segn la porcin de la lmina que se cultive. Estos resultados fueron obtenidos por Pedroso y Pais (1993) des-

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pus de seis semanas de cultivo in vitro previa inmersin del explante en una solucin de IBA (1 mg l1) durante 20 minutos (Fig. 5).

5 Lecturas recomendadas
BUDDENDORF-JOOSTEN, J.M.C. and WOLTERING, E.J. 1994. Components of the gaseous environment and their effects on plant growth and development in vitro. Plant Growth Regulation 15: 1-16. DE KLERK, G.J., Arnholdt-Schmitt B., Lieberei R. and Neumann K.H. 1997. Regeneration of roots, shoots and embryos: physiological, biochemical and molecular aspects. Biologia Plantarum 39 (1): 53-66. GEORGE, E. 1993. Plant propagation by tissue culture Part 1 The technology. Butler and Tanner Ltd (ed). Gran Bretaa. 1361pp.

Figura 5: Esquema de las diferentes respuestas morfognicas obtenidas despus de seis semanas de cultivo in vitro de hojas de Camellia japonica L. segn la porcin de la lmina cultivada. 1. organognesis indirecta, 2. embriognesis somtica directa, 3. regeneracin directa de races, 4. callo organognico.

HICKS, G.S. 1980. Patterns of organ development in plant tissue culture and the problem of organ determination. Bot. Rev. 46: 1-23. WILLIAMS, E.G. and MAHESWARAN, G. 1986. Somatic embryogenic factors influencing coordinated behavior of cells as an embryogenic group. Ann. Bot. 57: 443-597.

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II.-Captulo 2
Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales
Mroginski, Luis; Sansberro, Pedro; Flaschland, Eduardo 1 Introduccin El cultivo de tejidos en su acepcin amplia puede ser definido como un conjunto muy heterogneo de tcnicas que presentan en comn el hecho de que un explante (una parte separada del vegetal que pueden ser protoplastos clulas desprovistas de pared celular clulas, tejidos u rganos) se cultiva aspticamente en un medio artificial de composicin qumica definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. La imprecisin de esta definicin puede generar muchas polmicas, pero es actualmente aceptada. Generalmente es comn dividir las tcnicas del cultivo de tejidos en dos grandes grupos: a) cultivos en medios semislidos y b) cultivos en medios lquidos, los que a su vez pueden ser agitados (mediante el empleo de agitadores de uso continuo) o estacionarios. Tambin es frecuente dividir al cultivo de tejidos atendiendo a los niveles de complejidad en cultivo de rganos, cultivos celulares y cultivo de protoplastos. Para el establecimiento de los cultivos utilizando cualquiera de los sistemas es necesario tener en cuenta algunos aspectos generales comunes relacionados con el explante, la asepsia, el medio de cultivo y las condiciones de incubacin. La discusin de estos aspectos constituye el objetivo de este captulo. Adicionalmente se incluye el tema de la aclimatacin de las plantas regeneradas in vitro, que es de gran importancia en la mayora de las aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura. 2 Explante Varios factores deben ser tenidos en cuenta en la eleccin del explante apropiado para el establecimiento de los cultivos in vitro, entre ellos:

1. Objetivo del cultivo: si bien es difcil tratar de clasificar las aplicaciones que se persiguen con el cultivo de tejidos, se podra esquematizarlas en aplicaciones para:

Estudios bsicos . En este caso, los explantes cultivados pueden ser diversos. Si lo nico que se quiere lograr es un sistema de callos para estudiar algn proceso fisiolgico, se puede cultivar cualquier rgano, tejido o clula viva. En este caso en que lo nico que se busca es la induccin de callos lo ideal es cultivar explantes jvenes, derivados de semillas en germinacin, donde se obtienen respuestas rpidas y, en general, hay menores problemas de contaminacin con microorganismos. A veces se hace uso del cultivo de tejidos porque representa un sistema experimental que simplifica la complejidad generada por los fenmenos de correlacin entre las distintas partes que normalmente estn presentes en una planta entera. El explante que se usar estar condicionado por lo que se quiere estudiar. Un buen ejemplo lo constituye el cultivo de ovarios fecundados del tomate para estudiar los requerimientos nutricionales durante el crecimiento de los frutos. Asimismo, el cultivo de vulos ha sido muy til para estudiar aspectos relacionados con la formacin de las fibras en algodn. El cultivo de discos de tallos brind una valiosa ayuda para estudiar la rizognesis in vitro. Obtencin de plantas con sanidad controlada. Es muy comn la utilizacin del cultivo de tejidos para la obtencin de plantas libres de virus (ver VIII.-9). El explante ideal para ello es el meristema (dependiendo de la especie, de 0,2-0,5mm de longitud) consistente del domo y de un par de primordios foliares. Micropropagacin . En este caso depender del sistema que se quiere utilizar. Si lo que se quiere explotar es la brotacin de meristemas, los pices terminales y los segmentos uninodales de ramas jvenes constituyen excelentes explantes. En este caso el cultivador de tejidos debe conocer perfectamente la biologa de la reproduccin de la planta para aprovechar aquellos explantes que en forma natural son propgulos. En cambio, si se pretende micropropagar mediante el empleo de semillas sintticas (ver 35

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V.-2) el explante original deber posibilitar la induccin de la embriognesis somtica. En este caso, la utilizacin de embriones zigticos inmaduros u hojas, suelen ser frecuentes como explantes. Obtencin de hbridos interespecficos. Una de las primeras aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura lo constituy su empleo como ayuda para la obtencin de hbridos derivados de cruzamientos interespecficos, donde se produce el aborto temprano de embriones. En estos casos, el explante cultivado es el embrin cigtico en estadios tempranos de su desarrollo. Con la misma finalidad tambin se utilizan ovarios u vulos fecundados. Obtencin de plantas de semillas con embriones rudimentarios. Para esta finalidad los explantes pueden ser semillas (por ej. orqudeas) o bien, se aslan los embriones en un estado temprano de desarrollo (corazn) como en el caso de yerba mate o de algunas variedades de duraznero. Obtencin de plantas haploides (considerando como haploide a un esporofito que contiene el complemento gamtico de cromosomas). En este caso, los explantes ms utilizados son las anteras, aunque tambin pueden emplearse microsporas aisladas, vulos y ovarios no fertilizados. Induccin de variacin somaclonal. En este caso se pueden utilizar varios explantes, pero si la finalidad de su utilizacin es la aplicacin en planes de mejoramiento gentico de plantas, los explantes utilizados deben posibilitar la regeneracin de plantas enteras. Produccin y/o conversin de sustancias tiles. Se puede utilizar una gran variedad de explantes. Explantes de races suelen ser muy utilizados. Obtencin de hbridos somticos . Para esta finalidad se recurre a la fusin de protoplastos. En la mayora de los casos se aslan los protoplastos de mesfilos de hojas y de suspensiones celulares. Conservacin e intercambio de germoplasma . Los meristemas son los explantes preferidos para el desarrollo de sistemas de conservacin a mediano y largo plazo (cro- conservacin con nitrgeno lquido) y para el intercambio de material gentico.

Establecimiento de suspensiones celulares. En este caso se recomienda iniciar los cultivos a partir de explantes extrados de semillas en germinacin (hipoctilo, epictilo, cotiledones, races).
2. Posibilidad de contaminacin con microorganismos. De ser posible, se deben cultivar explantes de plantas dadoras que crecen en condiciones de invernadero, con ello se reduce sustancialmente las tasas de contaminacin. Por otra parte, es recomendable evitar el uso de explantes sucios (races, rizomas) que provienen de plantas crecidas en macetas o en el campo, dado que en la mayora de los casos no es posible conseguir una buena desinfeccin de los mismos. 3. Edad fisiolgica. Este es un aspecto de gran influencia en la morfognesis. Como regla general se puede decir que cuando ms joven e indiferenciado se encuentre el explante a cultivar, mejor ser su respuesta in vitro . Es por ello que los meristemas apicales y axilares son ampliamente usados en numerosas especies. En el caso de la micropropagacin de plantas leosas, la edad del explante es un factor crtico. Si los tejidos son jvenes, la micropropagacin tiene mayores posibilidades de ser exitosa que con tejidos maduros. Este hecho genera la necesidad de realizar tratamientos de rejuvenecimiento de las plantas dadoras de explantes. 4. Tamao. En general, cuanto ms grande sea el explante mayores sern las posibilidades de inducir la proliferacin de callos o la regeneracin directa de rganos. Sin embargo, a mayor tamao de explante tambin son mayores las probabilidades de que los cultivos se contaminen con microorganismos. Tambin es necesario tener en cuenta que existe un tamao mnimo del explante, que depende de la especie y del material vegetal, por debajo del cual no es fcil lograr el establecimiento de los cultivos. Los explantes muy pequeos suelen requerir del empleo de medios ms complejos o de los denominados medios acondicionados. 5. Epoca del ao. Es un factor que suele tener mucha importancia en la micropropa-

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gacin y que generalmente est asociado al grado de dormicin que presentan ciertos explantes (yemas, por ejemplo) y tambin con la posibilidad de mayor o menor proliferacin de microorganismos. 3 Asepsia Uno de los principales problemas que se presentan cuando se tratan de establecer los cultivos es el de la contaminacin de los mismos con diversos tipos de microorganismos (hongos, levaduras, bacterias, fitoplasmas, virus). El ambiente generado por explantemedio de cultivo-condiciones fsicas de incubacin es altamente propicio para la proliferacin de muchos de estos microorganismos que pueden provocar la destruccin de los cultivos. Es difcil cuantificar el impacto de estas prdidas, pero en promedio, en laboratorios dedicados a la micropropagacin se lo puede estimar en alrededor del 10%. En el mejor de los casos, estos microorganismos no destruyen los cultivos pero compiten con el explante por los nutrientes del medio de cultivo o bien lo modifican. Es muy difcil conseguir cultivos estrictamente aspticos dado que en la mayora de los casos es altamente probable que los mismos contengan virus y fitoplasmas, por lo que en la prctica, cuando se refiere a cultivos aspticos, en general se quiere significar que son cultivos donde no se produce la proliferacin de hongos y bacterias. Dos son las fuentes de contaminaciones: a) microorganismos presentes en el interior o en la superficie de los explantes y b) fallas en los procedimientos de cultivo en el laboratorio. La correcta deteccin de estas fuentes y del tipo de microorganismo son aspectos importantes para el xito de los cultivos, pues por un lado ayuda a determinar la fuente de contaminacin y por otro lado, ayuda a la planificacin de los procedimientos para controlarlos. Varios gneros de bacterias (Pseudomonas , Xanthomonas, Erwinia, Enterobacter, Agrobacterium, Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, Mycobacterium, Corynebacterium) y de hongos filamentosos ( Aspergillus, Penicilium, Fusarium, Alternaria, Cladosporium y Neurospora) estn frecuentemente en los cultivos . Es conveniente ins-

peccionar visualmente con la ayuda de un microscopio estereoscpico los cultivos en forma peridica (por lo menos semanalmente). Tambin se pueden realizar pruebas con medios de cultivo diferenciales y test bioqumicos especficos. Para evitar y/o minimizar las contaminaciones de los cultivos con microorganismos es necesario: 1) Conocer el material vegetal con que se trabaja y los posibles contaminantes especficos. 2) Realizar una adecuada preparacin de la planta dadora de explantes, cultivndola preferentemente en invernaderos tratadas con productos qumicos que eliminen patgenos y eventuales microorganismos endfitos. 3) Proceder a la desinfeccin superficial de los explantes mediante el uso de compuestos qumicos con el objeto de eliminar los microorganismos con el menor dao posible para el explante. Si bien no es posible recomendar un procedimiento general, se puede sealar que el procedimiento ms popularizado consiste en una doble desinfeccin mediante la inmersin de los explantes en etanol (70%v/v) durante 20-60 segundos seguido de hipoclorito de sodio 1 -3%, contenido en el agua de lavandina comercial, durante 3 a 30 minutos, dependiendo de la naturaleza del explante. Algunos procedimientos se basan en el empleo de nicamente etanol o de hipoclorito de sodio. Finalmente, es necesario eliminar los restos de estos productos mediante varios lavados con agua destilada estril. En este ltimo punto hay que aconsejar que se utilice agua destilada estril de reciente preparacin, dado que est demostrado que el almacenaje prolongado del agua estril puede ser la causa de contaminaciones con bacterias. Es aconsejable realizar estas operaciones de desinfeccin superficial en una cmara de transferencia con aire estril. En lugar del hipoclorito de sodio se puede utilizar hipoclorito de calcio (6 -12 %) o el cloruro de mercurio (0,1-1,5%). Es preciso recomendar extrema cautela con el empleo de este ltimo compuesto, dado que es altamente txico y adems no es removido con facilidad del explante.

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En los casos en que no se utilice etanol, la adicin de agentes tensoactivos junto con el desinfectante es una prctica recomendada. Entre los ms usados figuran Tween-20 (0,01 0,1%) o unas gotas de Triton. El lavado previo de los explantes con agua corriente y detergentes, ayuda a una mejor desinfeccin. La inmersin de los explantes en soluciones conteniendo sustancias antibiticas y /o antimicticas (gentamicina, sulfato de estreptomicina, ampicilina, tetraciclina, carbenicilina, sulfato de gentamicina, pentacloronitrobenceno, rifampicina, anfotericina B, benomil, carbendazim) puede ser de utilidad, pero deben ser utilizados en casos excepcionales. Estos productos tienen el inconveniente de que alteran la composicin de los medios de cultivo y adems pueden ser metabolizados por los explantes. Ultimamente han aparecido soluciones biocidas que matan bacterias y hongos, previenen la germinacin de esporas y a altas concentraciones pueden eliminar contaminaciones de microorganismos endfitos. Uno de estos compuestos es el PPM (Plant Preservative Mixture). Otro ejemplo es el denominado G-1, un compuesto derivado de los furfurales de la caa de azcar. Este compuesto, qumicamente: 1-(5-bromofur-2-il)-2bromo-2-nitroeteno fue desarrollado en la Universidad Central de las Villas (Cuba) y tiene efecto bactericida y fungicida de amplio espectro. En los casos en que se utilicen plntulas crecidas in vitro como plantas dadoras de explantes, es necesario desinfectar las semillas para su cultivo y germinacin y luego es aconsejable desinfectar tambin las plntulas resultantes. En algunos materiales vegetales se utiliza la preincubacin de los explantes mediante lo cual stos son desinfectados suavemente y precultivados durante 24 horas en un medio conteniendo sacarosa, y finalmente son desinfectados nuevamente y cultivados. 4) Emplear medios e instrumentos de cultivo esterilizados, es decir, liberados completamente de cualquier microorganismo vivo o esporas. Para la esterilizacin, en la mayora de los casos se hace uso del calor en sus diversas formas: llama directa, calor hmedo (en forma de vapor abierto o bajo presin), calor seco (aire caliente). Se pueden usar hor-

nos a microondas. El agua caliente tambin puede ser usada. En el caso de sustancias termolbiles, la esterilizacin se puede hacer mediante filtracin a travs de filtros bacteriolgicos. No es posible recomendar ningn sistema de esterilizacin dado que la exitosa destruccin de los microorganismos depende de mltiples factores entre los que interesan el tamao del recipiente, el tiempo de esterilizacin y la naturaleza de la sustancia a esterilizar. Sin embargo, se pueden dar algunas sugerencias: La esterilizacin en estufas mediante calor seco (aire caliente) es recomendable para esterilizar recipientes de vidrios secos (pipetas, cpsulas de Petri, tubos). En estos casos, 2-4 horas en estufas a 180-200 C brindan excelentes resultados. La esterilizacin con calor hmedo con vapor bajo presin (en autoclave o en una olla a presin), es el procedimiento ms empleado para la esterilizacin de los medios de cultivo (salvo, como se indic ms arriba, para aquellos que posean componentes termolbiles). En este caso, lo ms comn es usar una presin de 1.46 kg.cm-2 durante 20 minutos, con lo que prcticamente se destruyen todas las formas de vida. Es importante que en todos los puntos del autoclave se alcance dicha temperatura, para lo cual hay disponibles cintas detectoras colorimtricas. 5) Cultivar los explantes en una cmara de transferencia con aire estril (gabinete de flujo laminar), localizada en un ambiente limpio y no expuesta a corrientes de aire. De no disponer este equipamiento, se pueden sustituir con cuartos esterilizados previamente con luz ultravioleta (nunca exponerse a la luz UV en forma directa). La mesada de trabajo y las paredes del gabinete deben ser desinfectadas previamente con etanol al 70%. De la misma manera deben ser desinfectados exteriormente todos los recipientes (conteniendo medios de cultivo, agua, etc.) que ingresen en el rea del aire estril. Los operarios constituyen frecuentemente una importante fuente primaria de contaminacin, por lo que es recomendable que, antes de comenzar a trabajar laven sus manos y antebrazos con abundante agua y jabn y se desinfecten con etanol al 70 %. La

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utilizacin de guardapolvos, guantes y mscaras protectoras de la boca y de la nariz, as como los gorros protectores de los cabellos, ayudan a reducir sensiblemente los niveles de contaminacin. Los instrumentos de trabajo (pinzas, pipetas, tijeras, agujas, cpsulas de Petri) deben ser esterilizados antes de su uso. Muchos de estos instrumentos pueden ser colocados en etanol al 95% y, antes de ser usados, se deben flamear cuidadosamente en la llama de un mechero. Tambin es necesario flamear la boca de los recipientes que contienen los medios de cultivo antes y despus de cultivar el explante. 6) Incubar los cultivos en cmaras o cuartos de cultivo, cerrados, libres de corrientes de aire y bien higienizados. En lo posible se debe restringir la circulacin de personas, y los recipientes con cultivos contaminados deben ser rpidamente eliminados de este sector. Es conveniente que antes del lavado, estos cultivos sean esterilizados. 4 Medios de cultivo Un medio de cultivo puede ser definido como una formulacin de sales inorgnicas y compuestos orgnicos requeridos para la nutricin y manipulacin de los cultivos. Existen numerosas formulaciones, cada una de las cuales comprende entre 6 y 40 compuestos. Para dar una idea de la cantidad de formulaciones disponibles, George y col., luego de revisar ms de 3.000 trabajos cientficos describen en dos tomos (casi 1.000 pginas en total) ms de 2.000 medios de cultivo. Tambin dos empresas multinacionales ofrecen para la venta ms de 60 medios cada una, listos para su utilizacin especialmente en la micropropagacin comercial de plantas. En la Tabla 1 se presentan tres medios que son muy usados en la actualidad. Bsicamente, los medios de cultivo se componen de: Una fuente de carbono Nutrientes minerales Sustancias vitamnicas Sustancias reguladoras del crecimiento Agente gelificante (en el caso de medios semislidos) Otros compuestos

Fuente de carbono: Prcticamente todos los cultivos son hetertrofos (comparativamente unos pocos son auttrofos) y por ende necesitan del suministro de una fuente de carbono. La sacarosa, en concentraciones de 2 al 5%, es el azcar ms utilizado. En algunos medios se la reemplaza por glucosa. En casos particulares se cita el empleo de maltosa o galactosa. Tambin myo-inositol (100 Mg/L) suele ser incorporado a los medios resultando un mejor crecimiento de los cultivos. Nutrientes minerales: Los medios de cultivo deben suministrar los macro y micronutrientes esenciales para el crecimiento de las plantas enteras. En general se destacan las concentraciones relativamente altas de nitrgeno y potasio. El nitrgeno es suministrado en forma de amonio y/o nitrato. Tambin se pueden utilizar urea, glutamina y casena hidrolizada. Es fundamental que el hierro sea incorporado conjuntamente con un agente quelante (Na2EDTA), lo que lo hace disponible en un amplio rango de pH. Sustancias vitamnicas: De todas las que comnmente se incorporan a los medios, pareciera que la tiamina es la nica realmente imprescindible para el buen crecimiento de los cultivos. Sustancias reguladoras del crecimiento: En la mayora de los casos los medios utilizados para el establecimiento de los cultivos contienen auxinas (ANA, 2,4-D, AIA, IBA, NOA, Dicamba, Picloram) y/o citocininas ( BA, CIN, ZEA, 2iP, Thidiazurn). Las giberelinas (especialmente GA3) son requeridas en algunas ocasiones para el cultivo de meristemas o para la elongacin de brotes. El ABA, es usado en algunos casos. Agente gelificante (en el caso de medios semislidos): El agar (entre 0,6 y 1%) es el compuesto ms utilizado. Tambin pueden emplearse Agargel (0,40-0,60%), Transfergel (2-2,60%), Phytagel (0,250,40%), agarosa (0,80-0.90%) y Gelrite (0,10-0,20%). Otros compuestos : Muchas sustancias, de variada composicin qumica, suelen ser adicionadas a los medios bsicos. Adems de la glicina, otros aminocidos se pueden agregar a los medios. Es el caso de L-tirosina, asparagina y cistena, aunque hay que tener presente que en dosis altas pueden inhibir el

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Durante el perodo de incubacin, los cultivos son expuestos a condiciones ambientales dismiles al ambiente externo. Tabla 1: Composicin de tres medios bsicos usados en el cultivo La atmsfera interna se caracteriza in vitro de tejidos. por presentar una considerable variacin diurna en la concentracin de CO2, humedad relativa elevada, temperatura constante e intensidad lumnica baja. A su vez, el medio de cultivo compuesto por concentraciones elevadas de azcares (en aquellos sistemas heter-trofos y semiauttrofos de micropropagacin), sales y reguladores del crecimiento, sumado a la ausencia de microorganismos, generan anormalidades morfolgicas, anatmicas y fisiolgicas que las plantas debern corregir cuando son transferidas al ambiente externo. Este perodo de adaptacin al nuevo hbitat es llamado fase o etapa de aclimatacin. La estrategia a implementarse durante el mencionado ciclo deber contemplar el control minucioso de los parmetros ambientales (humedad, temperatura y luz) de tal manera que permita disminuir la deshidratacin y, al mismo tiempo, estimular la fotosntesis con 5 Condiciones ambientales para la el objeto de generar un rpido crecimiento incubacin. de los plantines. La incubacin de los cultivos se debe lleEl retraso en el desarrollo de la cutcula y var a cabo en condiciones controladas. Por la escasa funcionalidad del aparato estomlo menos en lo que se refiere a temperatura, tico que presentan las hojas de la mayora

crecimiento de los cultivos. El carbn activado (0,1 a 5%) suele ser incorporado al medio, dado que es probable que absorba metabolitos txicos para los cultivos. En algunos medios se incorporan cidos orgnicos como el mlico, el ctrico, el pirvico y el succnico y es frecuente el empleo de Lglutamina y de casena hidrolizada. An hoy se siguen utilizando ciertas sustancias de composicin qumica indefinida como el agua de coco (5 a 15%), jugo de tomate y pur de banana. Tambin en ocasiones es necesaria la incorporacin de agentes antioxidantes (Lcistena, cido ascrbico, polivinilpirrolidona) para prevenir el ennegrecimiento tisular causado por la oxidacin de polifenoles presentes en los explantes. Este ennegrecimiento puede causar la muerte de los mismos. La preparacin de los medios de cultivo puede llevarse a cabo de diferentes maneras, en lecturas recomendadas se citan manuales de laboratorio donde se describe detalladamente este punto.

calidad e intensidad de luz, fotoperodo, humedad atmosfrica e higiene. Estas condiciones se logran con el empleo de cmaras climatizadas o cuartos especialmente preparados con aire acondicionado (fro-calor), una buena y uniforme circulacin de aire en el interior, dotados de un buen sistema de alarma para interrumpir la iluminacin en caso de no funcionar el aire acondicionado. En general, los cultivos son incubados a temperatura constante de 25-28 C, con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz es generalmente provista por lmparas fluorescentes del tipo luz da con una irradiancia de entre 50 y 200mol.m-2.s-1.La humedad atmosfrica debe ser elevada (8090%). 6 Aclimatacin de las plantas regeneradas in vitro.

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de las especies cultivadas in vitro, determinan una alta tasa de transpiracin que puede ocasionar la muerte por deshidratacin. El control de este proceso fisiolgico es de vital importancia durante la aclimatacin, teniendo en cuenta que la disminucin de la transpiracin ser gradual y depender de la rehabilitacin de los estomas, as como tambin del desarrollo de la cutcula. El equipamiento necesario estar sujeto a la especie, pudiendo utilizarse desde tneles de polietileno para plantas que posean un elevado control de la transpiracin (por ej. Malus pumila o Agave tequilana) o bien, a travs del empleo de cmaras climatizadas (Fig.1) equipadas con sensores que permiten un descenso paulatino de la humedad relativa. En algunos casos puede resultar necesaria la aplicacin exgena de ABA (hormona involucrada en el control del cierre de los estomas) o bien, el empleo de sustancias antitranspirantes que forman una capa semipermeable en la superficie de la hoja. En este ltimo caso debern tomarse algunas precauciones debido a que pueden observarse reacciones de fitotoxicidad. Resulta imprescindible evitar la exposicin a temperaturas extremas tanto en la fase area como en el substrato. Mediante el empleo de extractores y/o acondicionadores de aire combinados con un sistema de niebla, es posible establecer la temperatura de la fase gaseosa entre los 25 y 30 C durante la estacin estival, mientras que en la poca invernal es necesario, a veces, el empleo de mantas trmicas o serpentinas, sea de agua o aire caliente a nivel del substrato, para mantener la temperatura por encima de los 18-20 C. Sin lugar a dudas, la opcin ms econmica es el empleo de la luz natural, disminuyendo su irradiancia (20-50%) mediante el agregado de mallas de sombreado (saram). No obstante, en aquellas latitudes donde el nivel medio de luz natural es bajo y los das son cortos durante una parte considerable del ao, la luz artificial puede ser aplicada como complemento de la luz natural. Las lmparas tubulares fluorescentes del tipo luz da son empleadas en horticultura para prolongar el fotoperodo. Asimismo, las lmparas tubulares de sodio alta presin presen-

tan una distribucin espectral de la energa adecuada para estimular fotosntesis y se emplean para tal fin en una amplia variedad de cultivos. Otro aspecto importante a tener en cuenta lo constituye la eleccin del sustrato; siendo el adecuado aquel que permita el normal crecimiento y desarrollo de las races. Se puede emplear: arena, perlita, turba, vermiculita, o mezclas de ellos, teniendo la precaucin de realizar una esterilizacin previa. Es conveniente el agregado de fertilizantes, ya sea a travs del sustrato (fertilizantes de liberacin controlada) o bien, mediante el sistema de riego (fertilizantes solubles); emplendose proporciones ricas en fsforo (N-P-K: 9-45-15) y potasio (N-P-K: 4-25-35) que favorecern el desarrollo radicular y la rustificacin de las plantas. En todo momento deber realizarse un riguroso control fitosanitario emplendose antibiticos, fungicidas e insecticidas de uso universal. En la Figura 1, se detalla un modelo de cmara de aclimatacin diseada por los autores y empleada por el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Instituto de Botnica del Nordeste. Bsicamente, est compuesta por una fase area construida en aluminio y policarbonato alveolar (9) y un recipiente o batea (11) que contiene grnulos de arcilla expandida a fin de facilitar el drenaje. Mediante el agregado de arena u otro substrato adecuado, esta cmara puede ser utilizada tanto para el enraizamiento ex vitro de los brotes obtenidos en la etapa de multiplicacin, como as tambin, para el enraizamiento convencional (a raz desnuda) de estacas de tallos u hojas. La humedad relativa de la fase area es controlada por un sensor (6) ubicado por encima de la tubera de riego (4). El sistema humidificador est compuesto por picos tipo fog y es alimentado por una bomba de bajo caudal y alta presin (13). Con el propsito de evitar el goteo que pudiese ocasionar el agua remanente en las caeras, el sistema consta de una vlvula solenoide de descarga y desage (7). La fase gaseosa es renovada en forma intermitente mediante el empleo de extractores ubicados en ambos extremos de la cmara (3) los que, conjunta-

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7 Agradecimientos Los autores agradecen al Ing. Pablo F. Luna por la planificacin digital de la cmara de aclimatacin. A la Secretara General de Ciencia y Tcnica (UNNE) y al Establecimiento La Cachuera por el aporte financiero recibido para construir la misma. 8 Lecturas Recomendadas
GEORGE, E.F.; D.J.M. PUTTOCK y H.J. GEORGE. 1987. Plant Culture Media . Vol. 1 (Formulations and Uses). Exegetics Limited. England. 567 pg. GEORGE, E.F.; D.J.M. PUTTOCK y H.J. GEORGE. 1988. Plant Culture Media . Vol. 2 (Commentary and analysis). Exegetics Limited. England. 420 pg. HURTADO, D.V. y MERINO, M.E. 1991. Cultivo de Tejidos Vegetales. Ed.Trillas. Mxico. 232 pg. PREZ PONCE, J.N. 1998. Propagacin y Mejora Gentica de Plantas por Biotecnologa. Instituto de Biologa de Plantas.Santa Clara. Cuba. 390 pg. POSPOSILOVA, J.; I. TICHA, P. KADLECEK, D. HAISEL, S. PLZAKOVA. 1999. Acclimatization of micropropagated plants to ex vitro conditions. Biologia Plantarum 42: 481497. ROCA, W.M. y L.A. MROGINSKI. 1993 (segunda edicin). Cultivo de tejidos en la Agricultura: Fundamentos y aplicaciones. CIAT. Cali, Colombia, 970 pg. TORRES, A.C.; L.A. CALDAS y J.A. BUSO. 1998. Cultura de Tecidos e Transformacao Gentica de Plantas. (Vol.1) Embrapa. Brasil.509 pg. TORRES, A.C.; L.A. CALDAS, y J.A. BUSO. 1999 Cultura de Tecidos e Transformacao Gentica de Plantas. (Vol.2) Embrapa. Brasil.355 pg.

Figura 1: Diseo de una CMARA DE ACLIMATACIN

mente, introducen o extraen aire, generando un movimiento masal. Debido a la latitud geogrfica en que se encuentra, la cmara est equipada con un acondicionador de aire (3000 frigoras) para evitar situaciones de estrs trmico en poca estival. A su vez, y dado que la mayora de las especies estudiadas son originarias de climas tropicales y subtropicales, el sistema cuenta con mantas trmicas que son colocadas por debajo de los tubetes, manteniendo la temperatura del substrato durante el invierno. En este ltimo caso se agrega un material aislante entre la leca (10) y la malla de hierro (16) de tal manera de dirigir el calor hacia la fase area.

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II.-Captulo 3
Herramientas bsicas de ingeniera gentica
Gmez, Marisa; Echenique, Viviana 1 Introduccin Hasta aproximadamente 1970 el ADN era la molcula de la clula que planteaba ms dificultades para su anlisis bioqumico. Excesivamente larga y qumicamente montona, la secuencia de nucletidos del ADN slo poda ser estudiada por caminos indirectos, tales como la determinacin de la secuencia de protenas, del ARN o por el anlisis gentico. Actualmente es posible separar regiones determinadas del ADN, obtener cantidades ilimitadas de esos fragmentos y determinar incluso la secuencia de esos nucletidos. Estos adelantos tcnicos forman parte de la tecnologa del ADN recombinante, constituida por una mezcla de tcnicas, algunas de las cuales son nuevas, pero otras son adaptaciones de procesos naturales de la gentica microbiana que han sido estudiados y se conocen en profundidad. 2 Gentica microbiana En los procariotas existen mecanismos de intercambio gentico que permiten tanto la transferencia de genes como la recombinacin. La recombinacin gentica en procariotas ocurre porque se transfieren fragmentos de ADN homlogos desde un cromosoma donador a una clula receptora por uno de estos tres procesos: Transformacin: es un proceso por cual el ADN libre del medio ambiente se incorpora en una clula receptora, trayendo aparejado un cambio gentico. Esto ocurre slo en algunas especies bacterianas. El movimiento de las molculas de ADN a travs de la membrana y dentro del citoplasma de la clula receptora es un proceso activo, que requiere energa. Una clula que es capaz de tomar una molcula de ADN y ser transformada se dice que es competente. Estas clulas secretan el factor de competencia, que es

una pequea protena que induce la sntesis de 8 a 10 nuevas protenas requeridas para la transformacin. Transduccin: es un proceso por el cual el ADN se transfiere de una clula a otra por medio de un virus (que en el caso de hospedadores bacterianos se denomina fago). Puede ocurrir de dos maneras. En la llamada transduccin generalizada, una fraccin del ADN celular, que puede proceder de cualquier porcin del genoma del hospedador, pasa a formar parte del ADN de la partcula vrica madura, reemplazando al genoma del fago. En la transduccin especializada, que ocurre slo en algunos fagos atemperados (aquellos que se integran en el genoma como parte de su ciclo biolgico), el ADN de una regin especfica del cromosoma del hospedador se integra directamente en el genoma del fago, reemplazando algunos de sus genes. En ambos casos, la partcula vrica transductora es normalmente defectiva como virus, ya que los genes vricos han sido reemplazados. No todos los fagos pueden transducir, ni todas las bacterias son transducibles. Pero el fenmeno est lo suficientemente extendido para suponer que desempea un importante papel en las transferencias genticas que se producen en la naturaleza. Conjugacin: es un proceso de transferencia gentica que requiere contacto de clula a clula y que est mediado por un plsmido. Consiste en la transferencia de una copia de este plsmido al nuevo hospedador. Sin embargo, otros elementos genticos resultan a veces movilizados durante la conjugacin, como pueden ser otros plsmidos o grandes bloques del cromosoma del hospedador. La conjugacin requiere una clula donadora, que contiene un tipo particular de plsmido conjugativo, y una clula receptora que carece de l. El contacto se realiza a travs del filamento o pelo sexual, que permite el apareamiento especfico y que poseen slo las clulas donadoras. Constituye un puente de conjugacin a travs del cual pasa el ADN. 3 La clonacin molecular El desarrollo de la tecnologa del ADN recombinante y la clonacin molecular han

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aportado sofisticados procedimientos que permiten el aislamiento, purificacin y replicacin de fragmentos especficos de ADN. La finalidad de la clonacin molecular es aislar gran cantidad de genes especficos, en forma pura. El procedimiento implica esencialmente dos etapas (Fig 1): Creacin del ADN recombinante, que consta de dos pasos: 1) Aislamiento del ADN de partida. Este puede ser ADN genmico, ADN sintetizado a partir del ARNm por transcripcin reversa (ADNc por copia), ADN amplificado por la reaccin en cadena de la polimerasa o sintetizado in vitro . Si se parte de ADN genmico, generalmente se corta con enzimas de restriccin para obtener los fragmentos a clonar. 2) Unin de los fragmentos de ADN a un vector de clonacin utilizando una ligasa de ADN. Un vector es una molcula de ADN que vehiculizar al fragmento de inters. Los vectores de clonacin estn diseados de forma tal que permiten la recombinacin de ADN forneo en un sitio de restriccin del vector, sin afectar su replicacin. A fin de seleccionar las clulas que incorporaron el vector, el mismo lleva genes marcadores (por ejemplo un gen de resistencia a antibiticos). Introduccin del ADN en una clula hospedadora donde se replicar (amplificacin): ste es realmente el verdadero evento de clonacin, en el cual el ADN recombinante es multiplicado para producir varias copias idnticas. Involucra tres pasos: 1) Introduccin y mantenimiento del ADN recombinante en un organismo hospedador. La molcula de ADN recombinante se introduce en el organismo hospedador, que puede ser procariota (bacterias) o eucariota (levaduras, clulas de mamferos cultivadas). En el caso de la utilizacin de sistemas bacterianos, la introduccin se realiza por los procesos naturales de la gentica microbiana (transformacin, transduccin, conjugacin) o modificaciones especficas de los mismos. Tambin se utiliza ampliamente la introduccin del ADN mediante electroporacin (descargas elctricas que crean poros en la membrana celular permitiendo la introduccin del ADN). 2) Deteccin y purificacin del clon deseado. La transferencia del ADN al hospedador

a menudo genera un grupo de clones que portan el vector. A fin de separar las clulas que incorporaron el plsmido de las que no lo hicieron se inoculan las clulas en un medio slido (agarificado) que contiene el antibitico al cual son resistentes las clulas que poseen el vector. Slo stas sobrevivirn. Luego deber buscarse especficamente aquellas clulas que poseen el fragmento de inters. Para ello puede utilizarse la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) o la hibridacin molecular con una sonda especfica. 3) Crecimiento y amplificacin de las clulas hospedadoras que incorporaron el ADN recombinante deseado para su aislamiento, estudio, etctera

ADN forneo a insertar Ligacin Vector plasmdico

Gen de resistencia a antibitico

Molcula de ADN recombinante

Introduccin en la clula hospedadora

Seleccin de las clulas que contienen molculas de ADN recombinante por crecimiento en presencia de antibitico

Figura 1: Pasos bsicos en la clonacin de un fragmento de ADN. En primer lugar el ADN a clonar y el vector (plsmido) se cortan con la misma enzima de restriccin. Luego se ponen en contacto en presencia de una ligasa para obtener una molcula de ADN recombinante que se introduce en bacterias que multiplicarn el plsmido junto con el fragmento de inters (Modificado de Watson y col., 1992).

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4 Herramientas y procedimientos implicados.

Endonucleasas de restriccin La habilidad para clonar cualquier gen o secuencia de ADN de inters, depende, en gran medida, de un tipo especial de enzimas denominadas endonucleasas de restriccin, que son enzimas que cortan la molcula de ADN en sitios especficos denominados sitios de restriccin. Estas enzimas reconocen secuencias especficas de 4 a 8 bases. Las diferentes endonucleasas de restriccin son producidas por distintos microorganismos, para los cuales constituyen un mecanismo de defensa contra el ataque de fagos. Cuando el ADN de un fago ingresa en la clula bacteriana, sta lo degrada gracias a su batera de enzimas de restriccin. Para proteger su propio ADN, las bacterias contienen enzimas ( metilasas ) que se encargan de modificar (metilar) ciertas bases en los sitios que reconocen sus propias enzimas de restriccin, de manera que ya no pueden reconocer dichos sitios de clivaje. La metilacin ocurre rpidamente despus de la replicacin, catalizada por metilasas producidas por el microorganismo. Las enzimas de restriccin se denominan utilizando la primera letra del gnero y las dos primeras letras de la especie que la produce, seguidas por un nmero que indica el orden en que han sido identificadas las enzimas correspondientes a la misma especie (Tabla 1). Una interesante caracterstica de las enzimas de restriccin es que comnOrganismo Bacillus subtilis Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Haemophilus influenzae Designacin BsuRI EcoRI EcoRII EcoRV HindII

mente reconocen secuencias de ADN que son palndromes (conjunto de caracteres que se lee de igual manera de derecha a izquierda que de izquierda a derecha). Adems producen cortes en las dos cadenas . Muchas enzimas de restriccin estn compuestas de dos unidades idnticas, cada una de las cuales reconoce y corta una de las cadenas. Como las secuencias reconocidas son relativamente cortas y frecuentemente palindrmicas, tales enzimas siempre hacen cortes en ADN bicatenarios y tales cortes no estn sujetos a correccin por enzimas de reparacin. Gracias a este mecanismo pueden destruir el ADN extrao. Ciertas enzimas como Eco RI producen cortes escalonados que crean colas cortas de cuatro bases de cadena simple en cada extremo del fragmento. Estas colas tienden a asociarse a una cadena complementaria por apareamiento de bases, por eso se denominan extremos cohesivos o pegajosos (sticky ends) (Fig. 2 A). Los extremos cohesivos pueden unirse permanentemente a secuencias complementarias de otro fragmento con colas producidas de la misma manera (corte con la misma enzima), adicionando la enzima ADN ligasa, que cataliza la formacin de nuevos puentes fosfodisteres y las apropiadas condiciones de renaturalizacin. Esta cohesividad permite unir fragmentos de ADN no homlogos, una caracterstica de relevancia para la creacin del ADN recombinante. Existe otro tipo de enzimas de restriccin, como HindII, que cortan el ADN en el centro

Secuencia 5..GGCC..3 3..CCGG..5 5..GAATTC..3 3..CTTAAG..5 5..CCAGG..3 3..GGTCC..5 5..GATATC..3 3..CTATAG..5 5..GTPyPuAC..3 3..CAPuPyTG..5

Nota Genera extremos romos Genera extremos cohesivos No palindrmica Genera extremos romos Pu: cualquier purina Py: cualquier pirimidina

Tabla 1: Secuencias reconocidas y sitios de restriccin de diferentes endonucleasas de restriccin

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Figura 2: Mecanismo de corte del ADN por las enzimas de restriccin. a. Corte en secuencias palindrmicas originando extremos cohesivos (ej. enzima EcoRI). b. Corte en el centro de la secuencia de reconocimiento de la enzima, originando extremos romos (ej enzima Hind II). c. Incorporacin de extremos cohesivos a un fragmento de extremos romos por la transferasa terminal. (Modificado de Watson y col., 1992).

de la secuencia de reconocimiento (en el mismo punto, en ambas cadenas) produciendo extremos romos (blunt-ends), es decir que las bases estn apareadas en sus extremos, y por lo tanto no presentan tendencia para unirse con las bases complementarias (Fig. 2 B). Esto puede solucionarse adicionando extremos cohesivos por medio de la transferasa terminal, enzima que permite adicionar colas de poliA o poliT, que se comportarn como extremos cohesivos (Fig. 2 C).

Vectores de clonacin Como se mencionara ms arriba, un vector es una molcula de ADN que vehiculizar al fragmento de inters y permitir su amplificacin. Los vectores de clonacin ms utilizados derivan del genoma viral o de plsmidos bacterianos. Un vector de clonacin tiene tres componentes esenciales: 1. Un origen de replicacin 2. Un gen marcador fcilmente seleccionable 3. Al menos un sitio nico de restriccin 46

Los vectores de clonacin de ltima generacin son muy prcticos y sencillos de manejar. Incluyen un sitio mltiple de clonacin o sitio de restriccin mltiple (polylinker), que es un segmento corto de ADN con muchos sitios de restriccin diferentes, cada uno de ellos nico para el vector (Fig. 3 A). Este sitio suele formar parte del marco abierto de lectura (ORF) de un gen responsable de alguna caracterstica fenotpica, por lo que resulta sencillo confirmar si tras la restriccin y ligado se ha insertado efectivamente un fragmento de ADN, ya que la inclusin de este interrumpe la secuencia del vector, lo cual redunda en la prdida de funcionalidad del gen mediante inactivacin por insercin. Los vectores pueden clasificarse de la siguiente manera: A) Plsmidos: son molculas de ADN circular, de doble cadena, extracromosmicas, presentes en las bacterias, que poseen propiedades muy tiles como vectores de clonacin:

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Figura 3: Vectores de clonacin. a. Sitio de restriccin mltiple: corto segmento de ADN con varios sitios de restriccin, cada uno de ellos nico para el vector. b. Plsmido pBR322 con los sitios de restriccin de BamHI y Pst I dentro de los genes marcadores (genes de resistencia a la tetraciclina y ampicilina, respectivamente). (Modificado de Watson y col., 1992).

1. Pequeo tamao que permite mayor facilidad de aislamiento y manipulacin. 2. Son circulares, lo que hace que el ADN sea ms estable durante su aislamiento qumico. 3. Su replicacin transcurre independientemente del ADN nuclear en la clula bacteriana. 4. Existen mltiples copias en la clula, dependiendo del plsmido y de la especie hospedadora, puede haber de varias a numerosas copias (por ej. 1.000 a 3.000 copias de pBR322 por clula). 5. La presencia de genes de resistencia a los antibiticos que actan como marcadores seleccionables facilita la deteccin y seleccin de los clones que los contienen. 6. El tamao de los insertos que se pueden clonar puede ser considerable; sin embargo, si son mayores de 10 kb, el plsmido se hace generalmente inestable.

Aunque en el ambiente natural los plsmidos conjugativos generalmente se transfieren por contacto clula a clula, los plsmidos vectores de clonacin generalmente han sido modificados a fin de evitar su transferencia por conjugacin y as lograr su contencin biolgica. Sin embargo, en el laboratorio es posible realizar la transferencia a la clula hospedadora por transformacin , utilizando choque de calor, o por electroporacin. Los primeros plsmidos utilizados como vectores de clonacin existan en forma natural. El plsmido pBR322 constituye una generacin posterior de vectores construidos in vitro (Fig 3 B). En este plsmido, el sitio de restriccin de BamHI est dentro del gen de resistencia a la tetraciclina, y el sitio para PstI est dentro del gen de resistencia a la ampicilina. Si se inserta un trozo de un ADN en uno de estos sitios, la resistencia al antibitico conferida por el gen que contiene este sitio se pierde (inactivacin por insercin). Por tanto, cuando pBR322 es digerido con BamHI y se liga a un ADN, y luego se aslan los clones transformados, aquellos transformantes que posean resistencia a la tetraciclina y ampicilina no portan ningn ADN clonado. Aquellas clulas que continan siendo resistentes a la ampicilina pero sensibles a la tetraciclina, contienen el plsmido con el fragmento del ADN clonado. Como la resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina pueden determinarse independientemente en placas con agar, resulta fcil aislar bacterias que contengan los clones deseados y eliminar las clulas que no los contengan. B) Bacterifagos o fagos: Fago : tiene un mapa gentico complejo. Se conoce la secuencia completa de sus 48.502 pares de nucletidos y la funcin de sus genes. El tercio central del cromosoma contiene genes que son requeridos para la lisogenia (estado integrado) pero no para el ciclo ltico (ciclo productivo de nuevas partculas virales). Esa parte central (de aproximadamente 15 kb) del cromosoma puede ser cortada con enzimas de restriccin y substituida por un fragmento de ADN forneo (Fig. 4 A). La molcula resultante de ADN recombinante puede ser empaquetada en las cabezas del fago in vitro. Las partculas

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del fago pueden inyectar el ADN recombinante en E. coli, que se replica produciendo colonias bacterianas que contienen los fragmentos a clonar. El fago l silvestre no es indicado como vector de clonacin porque tiene demasiados sitios para enzimas de restriccin. Para obviar esta dificultad se han construdo fagos l modificados (Charon), en los cuales los sitios de restriccin no deseados han sido alterados de manera tal que la correspondiente enzima no los reconozca. Es un vector de clonacin particularmente til porque: 1. Se conoce bien su estructura, secuencia y funcionamiento 2. Puede insertar mayor cantidad de ADN que la mayora de los plsmidos (entre 10 y 20 kb) 3. El ADN puede ser eficientemente empaquetado in vitro dentro de las partculas del fago 4. Las partculas del fago son mucho ms eficientes en la infeccin de las clulas hospedadoras (transfeccin) que la transformacin. Fago M13: es un fago filamentoso que contiene ADN monocatenario y se replica sin matar a su hospedador. Para poder utilizarlo como vector de clonacin es necesario disponer de una forma bicatenaria, ya que las enzimas de restriccin slo trabajan sobre ADN de doble cadena. El ADN bicatenario de M13 puede obtenerse de clulas infectadas, donde se encuentra en forma replicativa bicatenaria. La mayor parte del genoma del tipo silvestre contiene informacin gentica esencial para la replicacin. Existe, sin embargo, una pequea regin llamada secuencia intergnica que puede ser utilizada como sitio de clonacin. Es posible clonar ADN de longitudes variables (hasta 5kb), sin afectar la viabilidad del fago. El ADN monocatenario de M13 y de sus vectores derivados ha sido extremadamente til para secuenciar ADN. Tanto en el fago l como en M13 se ha insertado un fragmento funcional de lacZ, el gen de E. coli que codifica para la enzima galactosidasa (-gal), que es utilizado como gen marcador. En el inicio de este gen se ha insertado un sitio mltiple de clonacin. Por lo tanto, los fragmentos de ADN clonados en el polylinker interrumpen el gen lacZ y

anulan la actividad de la -galactosidasa. Cuando esta enzima hidroliza un compuesto qumico denominado X-gal, se libera un colorante azul relativamente insoluble. El Xgal se incorpora al medio de cultivo en placa de Petri, donde crecern las clulas hospedadoras del ADN recombinante. Si el ADN clonado se insert en el polylinker y desactiv la -galactosidasa, no se producir pigmento azul y las clulas formarn colonias que se vern blancas en la placa de Petri. En caso contrario, las colonias de las clulas hospedadoras se vern de color azul.

C
Figura 4: Vectores de clonacin. a. Utilizacin del fago. 1. Dos sitios de restriccin EcoRI en el ADN del fago. 2. Regin central no esencial del fago 3. El ADN forneo puede reemplazar al segmento no esencial del ADN del fago 4. Unin con ADN ligasa, se eligen las condiciones para que el ADN hbrido tenga la longitud adecuada para ser empaquetada dentro de la partcula del fago y 5. Empaquetamiento del ADN hbrido aadiendo extractos celulares que contengan las partculas de la cabeza y cola para permitir la formacin de partculas viables del fago. b. Cromosoma artificial de levadura (YAC). ARS: origen de replicacin, CEN: centrmero, TEL: telmeros, URA. gen marcador seleccionable par el desarrollo en medio con uracilo. Modificado de Watson et al., 1992). c. Cromosomas artificiales de bacterias (BAC) (Modificado de Griffith et al., 2000).

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C) Csmidos: Son vectores hbridos, que combinan las caractersticas ventajosas de los plsmidos bacterianos y del fago . Cos proviene de sitio cohesivo (cohesive site), en referencia a las secuencias terminales de simple cadena de 12 bases complementarias en el cromosoma de maduro. El sitio cos es reconocido por el sistema de empaquetamiento de ADN de , que hace cortes escalonados que originan los extremos cohesivos complementarios en el cromosoma maduro del fago. Poseen la habilidad del plsmido para replicarse autnomamente en las clulas de E. coli y la capacidad de empaquetamiento in vitro del cromosoma de . Contienen el origen de replicacin y los genes de resistencia a los antibiticos de su plsmido parental. La principal ventaja de los csmidos como vectores es su habilidad para insertar fragmentos de ADN de 35 a 45 kb. D) Fsmidos (fagmidos): Son vectores que combinan las caractersticas de un fago filamentoso (M13) y un plsmido (pBR323) y contienen tanto el origen de replicacin del fago como del plsmido. Normalmente la replicacin depende del plsmido, pero cuando una clula que contiene un fsmido se infecta con un fago de tipo silvestre, el origen del fago es responsable de la replicacin y se generan copias

monocatenarias. Este ADN monocatenario es empaquetado en viriones y puede aislarse fcilmente y ser utilizado para secuenciar. Habitualmente, los fsmidos pueden transportar de forma estable un fragmento de ADN clonado mayor que un vector tpico derivado de M13. E) Cromosomas artificiales: Estos vectores se desarrollaron con el objetivo de clonar grandes segmentos de cromosomas eucariticos. En la preparacin de mapas fsicos de genomas se utilizan vectores como los csmidos, los YAC (cromosomas artificiales de levaduras), los BAC (cromosomas artificiales de bacterias) y los PAC (cromosomas artificiales basados en el fago P1). Los YAC son minicromosomas de levadura creados por ingeniera gentica que pueden contener insertos de ADN de 200 a 500 kb (Fig. 4 B) y contienen un origen de replicacin y un centrmero de levadura, dos telmeros en los extremos del cromosoma, un marcador seleccionable y un sitio mltiple de clonacin. Los BAC se basan en el plsmido F de 7kb de E. coli y pueden llevar insertos de 300 kb, aunque el promedio es de 100 kb (Fig. 4 C). Los PAC son equivalentes. Aunque los BAC y los PAC aceptan fragmentos menores que los YAC tienen algunas ventajas:

Figura 5: Mtodo de hibridacin de Southern. a. Inclusin del ADN en el gel de agarosa. b. las molculas de ADN migran a travs del gel dependiendo de su tamao y forma, c. transferencia de las molculas de ADN del gel a una membrana por capilaridad (S. Solucin tampn, M: mecha, A gel de agarosa, N: membrana de nitrocelulosa, P: papel de filtro y peso), d. incorporacin de la sonda e hibridacin con las molculas de ADN, f: deteccin por autorradiografa, contacto de la membrana con el filme autorradiogrfico, g: revelado de la autorradiografa, observacin de las bandas hibridadas. (Modificado de Micklos et al., 1990).

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1. Son menos complejos y por lo tanto ms fciles de construir. Pueden amplificarse en bacterias y manipularse con la tecnologa bsica de los plsmidos bacterianos. 2. Contienen menor cantidad de insertos hbridos (insertos compuestos por dos o ms fragmentos no contiguos en el genoma) que los YAC. Estos insertos hbridos pueden entorpecer los intentos de ordenar los clones Por estos motivos los BAC han reemplazado a los YAC como vectores en la construccin de mapas fsicos de cromosomas enteros. Estos vectores simplifican mucho el proceso de secuenciacin, ya que an organismos simples como el nemtodo Caenorhabditis elegans poseen enormes cantidades de ADN (100 Mb). En este caso se necesitaran 2.500 csmidos para contener el genoma completo (el inserto promedio de un csmido es de 40 kb). Los YAC pueden aceptar 1Mb, por lo cual el proceso se simplifica. 5 Anlisis molecular de ADN, ARN y protenas: hibridacin. La hibridacin es la construccin artificial de un cido nucleico bicatenario por apareamiento (emparejamiento) de bases complementarias de dos cidos nucleicos monocatenarios. Para que exista la formacin de hbridos estables debe haber un alto grado de complementaridad. Se define formalmente como sonda (probe) a un fragmento determinado de ARN o ADN marcado qumica o radiactivamente, utilizado para localizar determinadas secuencias de cidos nucleicos mediante hibridacin. Anlisis de ADN por hibridaciones Southern Blot La electroforesis en gel es una poderosa herramienta para separar macromolculas de diferentes tamaos y cargas. Las molculas de ADN tienen esencialmente una carga constante por unidad de masa, por lo tanto se pueden separar en geles de agarosa o acrilamida, casi completamente, sobre la base de su tamao o conformacin. Los geles de agarosa o acrilamida actan como tamices moleculares, retardando el pasaje de las molculas ms grandes en relacin con las ms pequeas. Los geles de agarosa actan

como mejores tamices para las molculas ms grandes, mientras que los de acrilamida separan mejor las molculas pequeas. Los procedimientos utilizados, para separar cidos nucleicos y protenas tienen el mismo principio, pero involucran algunas diferencias de tcnicas debidas a las caractersticas particulares de cada clase de molculas. En 1975 E. M. Southern, public un nuevo procedimiento que permiti a los investigadores ubicar los genes y otras secuencias de ADN sobre fragmentos de restriccin separados por electroforesis en gel. La principal caracterstica de esta tcnica es la transferencia de las molculas de ADN que han sido separadas por electroforesis en gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa. Esta transferencia se denomina Southern Blot, en honor al cientfico que desarroll la tcnica (Fig. 5). Para realizarla, el ADN es desnaturalizado (abierto en sus dos cadenas), sea antes o durante la transferencia, ubicando el gel en una solucin alcalina. Una vez completada la transferencia, el ADN es inmovilizado sobre la membrana por exposicin a elevada temperatura o a radiacin UV. Una sonda de ADN conteniendo la secuencia de inters es entonces incubada con el ADN inmovilizado. La sonda slo va a hibridar con molculas de ADN que contienen la secuencia de nucletidos complementaria a su secuencia. El excedente de sonda no hibridada se elimina mediante repetidos lavados de la membrana. Las sondas pueden marcarse por diferentes mtodos: con elementos radioactivos, por mtodos qumicos que producen color o luminiscencia, etc. Luego de la hibridacin, la membrana se somete a diferentes procedimientos para poner en evidencia la sonda, de acuerdo al mtodo con el que haya sido marcada. Anlisis de ARN por transferencia e hibridacin: Northern Blot De manera similar al tratamiento realizado con las molculas de ADN, las molculas de ARN tambin pueden ser separadas por electroforesis en geles de agarosa, transferidas a membranas y analizadas. La transferencia de ARN se denomina Northern blot, en reconocimiento al hecho de que el procedimiento es la imagen de espejo de la tcnica Southern blot. Ambos procedimientos son esencialmen-

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Figura 6: Reaccin en cadena de la polimerasa. a) Los tres pasos de un ciclo de PCR. En primer lugar se eleva la temperatura de la reaccin para separar las hebras de ADN (1) y a continuacin la temperatura baja nuevamente, lo que permite que los cebadores o primers se peguen a las regiones adecuadas de la hebra de ADN (2), y entonces se ensamblan, actuando como lmites de la regin de la molcula que va a ser duplicada. Para terminar, se eleva la temperatura nuevamente y la Taq polimerasa comienza a copiar (3), y sobre la plantilla crece una hebra nueva complementaria (4). Despus de varios ciclos se obtienen mltiples copias del fragmento en cuestin. b) La PCR es una reaccin donde el nmero de copias del gen de inters crece exponencialmente. c) Verificacin de un producto de PCR sobre un gel de agarosa. En primer calle se observa un producto de aproximadamente 1850 pares de bases (bp) de longitud, en la calles 2 y 4 fragmentos de 800 bp, en la calle 3 fall la amplificacin y en la calle 5 se han formado tres bandas debido a que el primer ha encontrado complementariedad en ms de un sitio en el genoma.

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te idnticos. Sin embargo, las molculas de ARN son muy sensibles a la degradacin por ARNasas. Por lo tanto, se debe tener mucha precaucin para evitar la contaminacin de los materiales con estas enzimas. Adems, la mayora de las molculas de ARN contienen estructuras secundarias (producidas por apareamiento complementario intracadenas), por lo tanto deben mantenerse desnaturalizadas durante la electroforesis para poder separarlas sobre la base de su tamao. La desnaturalizacin se provoca incorporando formaldehdo u otro qumico desnaturalizante a la solucin tampn (buffer) utilizada en la electroforesis. Despus de la transferencia a la membrana apropiada, las molculas de ARN pueden hibridar con sondas de ADN o ARN. Anlisis de protenas por transferencia e inmunodeteccin o Western Blot La electroforesis en gel de poliacrilamida es una herramienta muy importante para la separacin y caracterizacin de protenas. Debido a que muchas de las protenas estn compuestas por dos o ms subunidades, los polipptidos individuales son separados por electroforesis en presencia del detergente dodecil sulfato de sodio (SDS), que desnaturaliza las protenas. Los polipptidos separados por electroforesis tambin pueden ser transferidos del gel a una membrana de nitrocelulosa y pueden ser detectados utilizando anticuerpos especficos. Esta transferencia de protenas se denomina Western blotting y se realiza utilizando una corriente elctrica para trasladar las protenas del gel a la superficie de la membrana. Despus de la transferencia, la protena de inters es identificada colocando la membrana con las protenas inmovilizadas en una solucin que contiene un anticuerpo contra esa protena. El anticuerpo est conjugado (marcado) ya sea con istopos radioactivos, que permiten la deteccin por autorradiografa , o con enzimas que producen un producto visible cuando se adiciona el sustrato correspondiente. 6 La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) La PCR es una tecnologa poderosa que involucra la sntesis enzimtica in vitro de

millones de copias de un segmento especfico de ADN. La reaccin se basa en la hibridacin y extensin de un par de oligonucletidos, sintetizados artificialmente, utilizados como iniciadores o cebadores (primers) que delimitan una secuencia de ADN de doble cadena que se desea amplificar. Un ciclo de PCR comprende tres etapas (Fig. 6): desnaturalizacin de la doble cadena, unin de una secuencia de ADN (primer) a la hebra simple y replicacin del ADN a partir del primer. La doble cadena de ADN se desnaturaliza por elevacin de la temperatura a 92-95C. Luego la temperatura se baja rpidamente a 35-60C, dependiendo del tamao y secuencia del oligonuclotido utilizado, permitiendo la hibridacin ADN-ADN de cada primer con las secuencias complementarias que flanquean la regin objetivo. Luego, se eleva la temperatura a 72 C para que la Taq polimerasa (una ADN polimerasa termoresistente aislada de Thermus aquaticus , bacteria que vive en fuentes termales) realice la replicacin a partir de cada extremo 3 de los primers. Este ciclo es repetido por algunas decenas de veces y, como el producto de cada polimerizacin sirve como molde para el siguiente, cada ciclo duplica la cantidad de producto del anterior. El resultado de la reaccin es un fragmento de ADN de doble cadena, cuyos extremos corresponden a los extremos 5 de los primers y su tamao a la distancia entre los mismos. A pesar de que se forman molculas ms largas a partir del molde original en cada ciclo, se acumulan solo a una tasa lineal y no contribuyen significativamente a la masa final de secuencia blanco. Despus de apenas 20 ciclos se logra ms de un milln de veces la cantidad inicial de la secuencia de inters. Esta escala de amplificacin permite, por lo tanto, iniciar el proceso con cantidades mnimas de ADN (del orden de pico o nanogramos) y terminar la reaccin con grandes cantidades de una secuencia de inters. La versatilidad de esta reaccin es enorme y la combinacin de la PCR y la secuenciacin constituye una poderosa herramienta para el anlisis de genes. La tecnologa de PCR es de suma utilidad para amplificar ADN a partir de fragmentos clonados en distintos vectores. Solo se nece-

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sita un par de iniciadores complementarios a los sitios del vector que flanquean el fragmento para amplificar cualquier fragmento independientemente de su secuencia. Puede amplificarse ADN de material embebido en parafina por varios aos, de material momificado, de restos fsiles, etc. Se utiliza para detectar enfermedades genticas, determinar el sexo en embriones humanos, para clonar genes, para mutagnesis in vitro y para mapeo y secuenciacin de genomas, entre otras aplicaciones.

RT-PCR La reaccin de PCR en unin con la transcripcin reversa (RT-PCR) puede ser utilizada para el estudio de ARNm casi a nivel de una clula individual. Esta tcnica puede utilizarse para determinar la presencia o ausencia de un transcripto, para estimar el nivel de su expresin y para el clonado de ADNc sin la necesidad de construir una genoteca. Consiste en la sntesis de una cadena de ADN a partir de ARNm por medio de la transcriptasa reversa (enzima extrada de virus tumorales cuyo material gentico es ARN), que utiliza ARN como molde para sintetizar una hebra de ADN. La cadena complementaria se sintetiza por PCR . Subsecuentes ciclos de PCR nos permiten tener cantidades apropiadas del ADNc para diversas manipulaciones genticas. PCR cuantitativa La clave en la PCR cuantitativa es la posibilidad de detectar el nivel de amplificacin de una secuencia de inters, con el objeto de estimar la cantidad de esa secuencia en la muestra original. Para llevar a cabo esta deteccin existen varios mtodos pero casi todos basados en la utilizacin de otro fragmento de ADN (sonda) complementario a una parte intermedia del ADN que se quiere amplificar. Esta sonda lleva adherida una molcula fluorescente y otra molcula que inhibe esta fluorescencia (quencher), de tal forma que slo cuando la sonda es desplazada de su sitio por accin de la ADN polimerasa la molcula fluorescente se libera de la accin del quencher y emite fluorescencia al ser iluminada con un lser. La fluorescencia detectada durante cada ciclo de la PCR ser proporcional a la cantidad de ADN que se est amplificando. En gene-

ral para que sea vlida esta tcnica requiere realizar en paralelo una curva patrn en las mismas condiciones para conocer la cantidad total de ADN que se est amplificando. Existen varios tipos de PCR cuantitativa. La ms moderna y sofisticada es la llamada PCR en tiempo real. PCR en tiempo real La PCR en tiempo real es una tcnica que ha ganado mucha importancia en los ltimos aos debido a que ofrece la posibilidad de cuantificar el nmero de copias de un transgen incorporadas en un genoma. Como se explicara ms arriba, se basa en la deteccin de un informador fluorescente cuya seal aumenta en proporcin directa con la cantidad de producto de PCR en la reaccin. Se emplea un ciclador trmico que tiene acoplado un sistema de deteccin capaz de captar y cuantificar la seal emitida por el informador al final de cada ciclo. Se pueden utilizar diferentes reactivos fluorescentes como agentes intercalantes (SYBR green) que se unen a la doble cadena de ADN dando un incremento de la fluorescencia a medida que aumenta la cantidad del producto de PCR. Tambin se pueden emplear sondas que tienen unidas un fotocromo informador y un fotocromo quencher (TaqMan ). Cuando ambos fotocromos estn unidos a la sonda, el informador no emite seal, pero cuando sta hibrida con la secuencia de inters, durante la reaccin de PCR, la enzima Taq polimerasa, mediante su actividad de exonucleasa, cliva al fotocromo informador, liberndolo del resto de la sonda y permitiendo la emisin de una seal fluorescente. Se monitorea esta seal que se va acumulando en los sucesivos ciclos de PCR. De este modo, es posible estimar la cantidad de la secuencia original expresada en nmero de copias por genoma o en unidad de masa. En la Parte IX, Captulo 4, se detalla ms este punto y se aplica esta tcnica para la deteccin de organismos genticamente modificados (OGM). 7 Genotecas Una genoteca (gene library) es una coleccin de fragmentos de ADN clonados que representan en su conjunto el ADN to-

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tal de un organismo de inters o bien el ADNc, que representa el conjunto de genes que se estn expresando en un rgano o tejido determinado o bajo una situacin particular o momento de crecimiento o desarrollo. En el primer caso hablamos de una genoteca genmica, donde se encuentran todas las secuencias que se expresan y no se expresan en el organismo y en el segundo de una genoteca de ADNc, donde se encuentran slo las secuencias expresadas. Estas genotecas carecen de un catlogo a travs del cual se pueda saber cul es el clon que contiene una secuencia de inters. Por ello es necesario realizar un relevamiento de todas las colonias utilizando una sonda con la secuencia de cido nucleico que tenga que sea complementaria a la secuencia o gen buscados. Parte de esta secuencia puede ser conocida o puede deducirse de la secuencia de aminocidos de la protena purificada. Alternativamente, puede buscarse la protena producida por un gen clonado usando anticuerpos contra la protena o a travs de un anlisis funcional. Una de las principales dificultades en el clonado de ADN genmico es que algunas secuencias estn representadas una sola vez en el genoma y es difcil hallarlas. Para obviar esta dificultad puede clonarse directamente el ADNc, ya que el nmero de copias del ARNm en el tejido es ms elevado. El problema se plantea cuando no se sabe en qu circunstancias o en qu tejido se expresa un gen en particular. Pero existen varias formas de determinarlo. Actualmente es posible clonar un ADNc a partir de mensajeros poco abundantes en la clula, con concentraciones de 1 a 2 molculas por clula. Genotecas de ADNc El primer paso en la construccin de una genoteca de ADNc consiste en el aislamiento del ARN del cual es posible separar el ARNm tomando ventaja de la caracterstica cola de poliadeninas que posee en su extremo 3. Para ello se empaqueta en una columna de celulosa a la cual se unen oligonucletidos compuestos slo por desoxitimina oligo(dT), a travs de la cual pasa el ARN quedando el mensajero unido a la timina a travs de la cola de poliA. Este es luego eluido de la columna utilizando una solucin tampn adecuada.

Estas colas de poliA tambin son utilizadas en el prximo paso de clonado. La reaccin consiste en poner en contacto el ARNm aislado con oligo(dT) de 12 a 20 desoxitiminas que actan como cebadores o primers para la transcriptasa reversa. El producto de la reaccin es un hbrido ARN-ADN. El problema que tiene esta tcnica es que si el ADNc es muy largo, al comenzar en el extremo 3, muchas veces no se llega al extremo 5. Para salvar esta dificultad existe otra tcnica donde se utilizan primers al azar. Estos constan de 6 a 10 nucletidos de longitud y estn confeccionados de manera de representar muchas secuencias diferentes, por lo que la reaccin comienza a partir de muchos sitios diferentes, no slo del extremo 3. Por cualquiera de los dos mtodos se obtiene un hbrido ARN-ADN, a partir del cual se obtienen molculas de ADN de doble cadena que puede clonarse en el vector apropiado. El primer mtodo desarrollado para obtener la segunda cadena tomaba ventaja de una vuelta o giro que da la hebra recin sintetizada, como un efecto de cambio de rumbo de la transcriptasa reversa al llegar al final de la cadena de ARN. Este artefacto provee un cebador adecuado para la sntesis de la segunda cadena de ADN y puede eliminarse una vez obtenida la segunda cadena, con una nucleasa S1, perdindose parte de la secuencia correspondiente al extremo 5 del mensajero. Existe una segunda tcnica, que presenta dos ventajas sobre la anterior. Una es que genera molculas de ADNc ms largas y la segunda es que contiene prcticamente toda la secuencia correspondiente al extremo 5. Se basa en la utilizacin de la enzima RNasaH, que reconoce molculas hbridas ARN-ADN y digiere la cadena de ARN dejando trozos pequeos que permanecen unidos a la primera cadena del ADNc y sirven como primers para la ADN polimerasa I, que usa el ADNc original como molde para sintetizar la hebra complementaria de ADN. Slo queda un pequeo segmento de ARN en el extremo 5. La segunda cadena de ADN tiene algunos sectores no unidos que son sellados por una ligasa de ADN. Estas molculas de ADNc de doble cadena estn listas ahora para ser insertadas en

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un vector, que puede ser un plsmido o un derivado del fago l. Para ello se utiliza la transferasa terminal, que adiciona colas de poliA o poliT, o se agregan adaptadores, que son sitios artificiales de reconocimiento de alguna enzima de restriccin que se unen a los extremos de la secuencia. Se trata de oligonucletidos artificiales (8-12 bp) que se unen al fragmento utilizando una ligasa de ADN y son cortados con la enzima de restriccin apropiada (Fig. 7 a). Ambos procedimientos sirven para generar extremos cohesivos a fin de unir el fragmento al vector, que posee extremos cohesivos cortados por la misma enzima. Los plsmidos son introducidos en bacterias por transformacin (choque trmico o electrofusin), y se seleccionan por la caracterstica del gen marcador del plsmido. Si se trata de fagos, los vectores son empaquetados in vitro para formar partculas vricas, que introducirn su ADN en el hospedador apropiado por infeccin de un csped de bacterias crecido sobre la superficie de una placa de agar (Fig. 7 a). Si bien los vectores plasmdicos son ms fciles de manipular, las genotecas construidas en los fagos poFigura 7: Clonado de ADNc de doble cadena en un fago. a) Para ello se le deben adicionar hebras de cadena simple complementarias a los sitios de restriccin del ADN del fago. El ADN del fago se prepara cortando con una enzima de restriccin, en este caso EcoRI, y se purifican los dos brazos del fago. Mientras tanto se adicionan al ADNc los adaptadores que llevan sitios EcoRI. Para ello se utiliza una ligasa. Previamente, el ADN se trata con una metilasa, que metila los sitios de reconocimiento de la enzima de restriccin, a fin de protegerlo de la accin de la enzima. Los adaptadores se cortan con la enizma de manera de generar extremos cohesivos que puedan acoplarse con el ADN del fago, cortado con la misma enzima. Se genera as una serie de molculas recombinantes dispuestas en tandem, flanquedas por los sitios cos. Este ADN recombinante se empaqueta formando partculas infecciosas del fago, que se utilizarn para infectar un csped de bacterias. Esto se visualizar como placas o calvas. Cada placa surge de una molcula recombinante individual, que se propaga ahora como un fago. b) Una vez construda la genoteca puede localizarse un gen en la misma por hibridacin con una sonda marcada apropiadamente (Modificado de Watson et al., 1992).

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seen fragmentos de mayor tamao. Como resultado del cultivo en placa (plaqueo) de la genoteca, se obtienen cientos de miles a un milln de placas de fagos (zonas claras o de lisis resultado de la produccin de particulas vricas) o, en el caso de vectores plasmdicos, colonias bacterianas, cada una conteniendo un fragmento clonado, distribuidas sobre la placa de agar. A fin de realizar la bsqueda de un gen particular (screening), la genoteca es replicada en membranas de nylon o nitrocelulosa, de manera tal que el patrn de placas en la caja original se vea exactamente reproducido en la membrana de nylon o filtro (Fig. 7 B). Bsqueda del gen clonado: Eleccin de la sonda La bsqueda se lleva a cabo por hibridacin con una sonda de cido nucleico, lo cual requiere un conocimiento previo de la secuencia de inters. En algunos casos, donde parte del gen ha sido clonado, este se utiliza para buscar las partes faltantes. Si se usa una sonda donde la homologa es completa, el screening puede realizarse en condiciones de alta rigurosidad (es decir, con lavados ms fuertes, temperatura elevada y concentracin salina baja, que tienden a despegar lo que se ha unido inespecficamente). Si la sonda no es completamente homloga el screening deber realizarse a menores temperaturas y utilizando concentraciones salinas ms elevadas en los lavados. Si no se tiene conocimiento previo de la secuencia puede construirse una sonda a partir de la secuencia de aminocidos de la protena. Cuando se utiliza esta estrategia, el tamao mnimo de la sonda debe ser de 15 a 16 nucletidos (que permite encontrar secuencias nicas en genotecas de ADNc eucariticos. Generalmente se utilizan sondas de 17 a 20 nucletidos (correspondientes a 6 aminocidos contiguos). Otra consideracin a tener en cuenta cuando se construye la sonda es que existe ms de un codn o triplete para definir la mayora de los aminocidos (es lo que se conoce como la degeneracin del cdigo gentico), por lo que un aminocido puede estar especificado por hasta 6 codones diferentes. Por ello, estas sondas oligonucleotdicas estn constituidas por una mezcla de todas las combinaciones posibles. Una de ellas corresponde-

r a la secuencia correcta del gen buscado. El problema de esta estrategia es el elevado nmero de falsos positivos que pueden dar las secuencias adicionales. Una variante consiste en usar un menor nmero de oligonucletidos o uno solo pero de mayor longitud (35-75 nucletidos), eligiendo una regin de la protena que contenga el menor nmero posible de codones degenerados, utilizando el conocimiento de los codones ms probables para la especie en estudio. Existen otras tcnicas para localizar genes en las genotecas de ADNc, como hibridacin diferencial, si se trata de genes expresados en diferentes tejidos o la utilizacin de sondas de regiones conservadas en familias de protenas para encontrar genes relacionados o bien la utilizacin de vectores de expresin. Genotecas Genmicas Un genoteca genmica puede obtenerse de cualquier tejido, ya que todas las clulas de un organismo tienen la misma constitucin gentica. Como se mencionara previamente, se encuentran en ella no slo secuencias expresadas y no expresadas sino tambin las correspondientes secuencias regulatorias. Pueden utilizarse fagos como vectores, pero sucede que muchos de los genomas eucariotas son muy grandes, por ejemplo el de mamferos contiene 3x109 pb de ADN. Si el promedio tpico de inserto es de 15.000 pb, se necesitarn unos 200.000 fagos para contener el genoma completo. Para asegurar que todas las secuencias estn representadas al menos una vez, los clculos estadsticos dicen que debern analizarse aproximadamente de 1 a 2 millones de fagos. Muchos genes eucariticos tienen ms de 1000 kb, por lo que deben ser clonados como un conjunto de fragmentos parcialmente superpuestos. Para esto pueden utilizarse csmidos, que pueden contener unas 45 kb. Para hacer una genoteca con estos vectores el ADN se corta con enzimas de restriccin de manera de dejar fragmentos de tamao apropiado. El csmido se empaqueta in vitro en fagos que se usan para infectar E. coli . Una vez dentro de la clula el csmido se replica y puede recuperarse de la clula como un plsmido.

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Cuando se trata de genomas muy grandes, como es el caso del humano o de varias especies vegetales y animales la utilizacin de csmidos resulta ineficiente. Por ello en estos casos se utilizan los YAC y BAC. A) Genotecas genmicas en cromosomas artificiales La capacidad de clonar fragmentos de ms de 100 kb es crucial para la genmica estructural, funcional y comparativa de organismos complejos. El primer sistema de clonado de grandes fragmentos de ADN fue

informado en 1987 por Burke y colaboradores. Este sistema estaba basado en YAC, que permitan clonar y mantener fragmentos de ms de 1000 kb en levaduras. Debido a esta ventaja el sistema fue rpidamente adoptado para los proyectos de genmica. Sin embargo, tienen algunos problemas que limitan su utilizacin, como el alto nivel de quimerismo o insertos hbridos (artefacto que resulta de la unin de fragmentos no contiguos en el genoma original en un mismo clon), la inestabilidad de los insertos y la dificultad de purificar los insertos clonados. Para minimizar estos problemas se desarrollaron sistemas alternativos que utilizan bacterias en lugar de levaduras: los BAC y los PAC, que son vectores de clonacin de copia simple. Cuando se los utiliza para transformar plantas se los llama BIBAC . BAC y PAC pueden contener establemente fragmentos mayores de 300 kb en E. coli. Para preparar una genoteca genmica, el ADN se corta con enzimas de restriccin o, para evitar la presencia de fragmentos demasiado largos o cortos, se fragmenta al azar. Un paso crtico en el proceso es el aislamiento de molculas intactas de ADN de elevado peso molecular, esencialmente ADN cromosmico. Para ello las clulas se embeben en bloques de agarosa de baja temperatura de gelificacin y se tratan con en-zimas y otros

Figura 8: Bsqueda de imgenes en una genoteca genmica. Utilizacin de la reaccin en cadena de la polimerasa para buscar un gen especfico en una genoteca de BACs. Las 180 placas de cultivo, de 96 pocillos, contienen un genoma vegetal completo. Estas placas se replican, de a 4, en filtros o membranas. Todos los clones de un mismo filtro son juntados y varios de estos conjuntos de clones son agrupados para preparar agrupaciones de conjuntos. El ADN de estos conjuntos se aisla y se amplifica por PCR utilizando primers especficos para el gen de inters. Como control positivo se utiliza un ADN vegetal, tambin amplificado por PCR. La reaccin se analiza sobre un gel de agarosa. Un resultado positivo indica la presencia del gen en el ADN genmico del vegetal y tambin en uno de los clones. En este caso en el conjunto que contena los filtros 1-3. Cuando se chequean los conjuntos individuales se encuentra que el clon positivo pertenece al filtro 1. El producto de PCR se hibrida luego con este filtro y esto nos dar la posicin exacta en la placa de 96 pocillos donde se encuentra el gen de inters (Modificado de Watson et al., 1992).

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reactivos para separar el ADN de las protenas celulares y del RNA. La funcin del bloque de agarosa es proteger a las grandes molculas, que, embebidas en esta matriz, se someten a la digestin con enzimas de restriccin que realicen cortes poco frecuentes (rare cutters). La preparacin de ADN de alta calidad en plantas es ms complicada que la correspondiente para el caso de animales debido a la presencia de la pared celular, que dificulta el embebido en agarosa de bajo punto de gelificacin. Para obviar esta dificultad se aslan los ncleos y se trabaja con ellos directamente. Si se desea separar estos fragmentos por electroforesis, los bloques de agarosa conteniendo el DNA digerido pueden ser directamente embebidos en la matriz del gel que se correr. B) Separacin de grandes trozos de ADN: electroforesis de campo pulstil Las tcnicas estndares de separacin de ADN en geles de agarosa no son adecuadas para molculas mayores de 10 kb. Esta limitacin ha sido subsanada con una tcnica llamada electroforesis de campo pulstil, por la cual el campo elctrico que conduce a las grandes molculas de ADN a travs del gel cambia peridicamente de orientacin. De esta manera pueden separarse molculas tan grandes como los cromosomas de levaduras (200 a 3000 kb) (ver VII.-1). La separacin de las molculas de este tamao depende de su relativa facilidad o dificultad para reorientarse en respuesta a direcciones cambiantes de un campo elctrico. Esta tcnica puede utilizarse para hacer mapas fsicos a gran escala. C) Preparacin de una genoteca de BAC El procedimiento consiste en 4 pasos, preparacin del vector, aislamiento y digestin del ADN y seleccin de los fragmentos por tamao, transformacin de las bacterias y ensamblado de la genoteca El vector debe estar bien purificado, digerido y defosforilado (cuando se corta con una sola enzima, se eliminan los fosfatos terminales, para evitar la recircularizacin). La digestin del ADN es crtica para obtener fragmentos adecuados para clonar. Los fragmentos son seleccionados por electroforesis de campo pulstil y se separan de la matriz de agarosa por digestin de la misma con

agarasa o gelasa, o por elucin del ADN desde el gel . Esto permite construir genotecas con fragmentos de tamaos similares, de aproximadamente 150 kb. Estas genotecas de grandes insertos son consideradas recursos de largo plazo para investigacin genmica y deben ser mantenidas continuamente, especialmente cuando son utilizadas para proyectos de secuenciado y mapeo a gran escala. En general, cuando se va a construir una genoteca debe elegirse cuidadosamente el genotipo de la especie utilizada como fuente de ADN, el tipo de inserto, etc. ya que la misma puede utilizarse para variados propsitos. Si en lugar de una genoteca de BAC se hace una de BIBAC, se tiene la ventaja adicional de poder usar directamente los fragmentos para transformar plantas utilizando Agrobacterium tumefaciens En la Fig. 8 se esquematiza la bsqueda de un gen en una genoteca de BAC. Ms detalles acerca del ensamblado de los distintos fragmentos clonados pueden encontrarse en el captulo correspondiente a genmica. Genotecas de cromosomas especficos o de segmentos de cromosomas Cuando se busca un gen que se sabe est ubicado en un cromosoma especfico simplifica mucho el trabajo hacer una genoteca de ese cromosoma solamente. Se trata de una tcnica que permite separar cromosomas metafsicos teidos con un colorante fluorescente (Hoechst 33258) (para regiones ricas en AT) y cromomicina A (para regiones ricas en GC) y tratados de manera que el ADN no se desnaturalice. Los cromosomas teidos fluorescern cuando se expongan a luz UV (de longitudes de onda de 361 y 363 nm) (Hoechst 33258) o 458 nm (cromomicina A). Las cantidades y proporciones de colorantes varan para cada cromosoma y una computadora reconoce el patrn fluorescente tpico de cada cromosoma. Algunos cromosomas son muy similares, por lo que no pueden ser separados. Se necesita un milln de cromosomas para hacer una genoteca. Equipos automticos pueden hacer este trabajo en unas pocas horas. Tambin puede microdisectarse un cromosoma, tomando un segmento del mismo que tenga la regin de inters. En principio se utiliz esta tcnica para cromosomas

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grandes, fcilmente distinguibles por microscopa de contraste de fase. Actualmente, la combinacin con PCR posibilita la aplicacin de la tcnica a cualquier cromosoma. Estos son teidos con Giemsatripsina y las bandas deseadas son cortadas con agujas de vidrio ultrafinas y clonadas. Primers posicionados en el vector permiten amplificar secuencias desconocidas. El ADN amplificado se clona en un vector apropiado y la localizacin cromos-mica de cada clon se determina utilizando hibridacin in situ (ver III.5) 8 Secuenciacin Una vez que se ha obtenido el clon con el fragmento de inters, el paso siguiente es secuenciarlo. La determinacin de la secuencia puede realizarse por el mtodo qumico de Maxam y Gilbert o por el mtodo enzimtico de Sanger. El primero consiste en la utilizacin de un compuesto que destruye selectivamente una o dos de las 4 bases que constituyen el ADN. Se realizan 4 reacciones de sntesis de ADN, marcando un extremo de las molculas, dependiendo de la base a destruir (G, A+G, T+C, C). De esta forma, se generan fragmentos de distinto tamao en funcin de la distancia de la base destruida al extremo marcado radiactivamente del fragmento a secuenciar. Los productos de las 4 reacciones se corren lado a lado en un gel de poliacrilamida y la secuencia del fragmento se determina a travs del patrn de bandas, despus de efectuada una autorradiografa para revelarlas. El mtodo de Sanger, se basa en el mismo principio y consiste en preparar 2,3didesoxinucletidos (ddNTP) de cada una de las 4 bases. Estas molculas pueden ser incorporadas al ADN por el ADN polimerasa de E.coli porque tienen un 5trifosfato normal, pero no pueden formar un enlace fosfodister con el nucletido siguiente, por lo que el crecimiento de la cadena se detiene. En la mezcla de la reaccin se incluye la cadena a secuenciar, una proporcin controlada de uno de los 4 ddNTP con su desoxinucletido normal y los otros 3 dNTP. Cuando se agrega polimerasa la reaccin comienza a partir del primero hasta que se introduce en la cadena un ddNTP, con lo

cual su crecimiento cesa. Con una proporcin correcta ddNTP:dNTP, se generan una serie de fragmentos de distinta longitud, dependiendo de la distancia de la ltima base incorporada al extremo marcado del ADN. Estos fragmentos son separados en un gel de poliacrilamida, donde, previa autorradiografa, se determina el patrn de bandas, que refleja la secuencia del ADN. Al principio, la posicin de cada banda revelada en la pelcula radiogrfica se anotaba manualmente, luego, los digitalizadores de imgenes posibilitaron la lectura directa de la pelcula. Existen actualmente secuenciadores automticos que realizan la electroforesis en gel y determinan autom-ticamente la secuencia utilizando un sistema de deteccin con lser. Messing desarroll una serie de vectores de clonado basados en el fago filamentoso M13, muy tiles para el secuenciado enzimtico. La ventaja es que slo una de las cadenas del vector es empaquetada en las cabezas del fago (ver Vectores de clonacin). Este ADN de simple cadena es ideal para utilizar con el mtodo de Sanger. Clonando el inserto en M13, en las dos orientaciones posibles, se obtiene una o la otra hebra del ADN a secuenciar. Para ello se utiliza un primer que se posiciona en un lugar adyacente a la regin de policlonado de M13, que se llama primer universal, ya que se puede utilizar para secuenciar cualquier clon recombinante. Actualmente se utilizan fsmidos (ver Vectores de clonacin). La adicin de un fago ayudante (helper phage) a las clulas que lo contienen, hace que el ADN del mismo, de simple cadena, sea replicado, empaquetado y extrado de la clula. Al ser de menor tamao (aprox. 3000 bp) que M13 permite la insercin de fragmentos de ADN ms largos. Los proyectos de secuenciacin genmica han requerido mtodos de secuenciado ms veloces y econmicos. Para ello se ha desarrollado una tcnica llamada Multiplex, que permite manejar mayor cantidad de muestras en menor tiempo. Se utilizan 20 vectores plasmdicos que permiten construir 20 genotecas diferentes a partir del mismo ADN. Cada vector lleva dos secuencias nicas que flanquean al sitio de clonado, que pueden ser usadas como eti-

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quetas (tags) para el ADN clonado y estarn presentes sobre cada fragmento a ser secuenciado. Se toma un clon de cada una de las genotecas plaqueadas (20 colonias) y se mezclan. Se hace crecer el cultivo, se asla el ADN y se secuencian los plsmidos utilizando el mtodo Maxam y Gilbert. Los productos de 12 conjuntos de reacciones de secuenciacin se corren en un gel y se transfieren a una membrana de nylon. El filtro se hibrida secuencialmente (es decir, se despega una sonda para luego hibridar con las siguiente y as sucesivamente), utilizando como sonda la etiqueta de cada uno de los 20 vectores. En cada caso se van leyendo las secuencias correspondientes a cada uno de los distintos vectores. De esta manera, una sola reaccin produce datos de 20 clones a la vez. Actualmente existen equipos robotizados que pueden llevar a cabo dos de las reacciones ms limitantes en el proceso de secuenciado: la deteccin de las bandas de ADN y la traduccin de un patrn de bandas en uno de secuencia. Estos equipos utilizan nucletidos marcados con fluorocromos. Se utilizan 4 colorantes diferentes, que al ser exitados por lser emiten luz de diferente longitud de onda. Los colorantes pueden utilizarse para marcar el primer universal de secuenciacin de M13 o cada uno de los 4 terminadores de cadena didesoxi. En este caso, cada mezcla de reaccin con un terminador diferente se marca con un colorante diferente. Cuando la reaccin es completada, los productos de las 4 reacciones se mezclan y se corren en una sola calle de un gel, en un secuenciador automtico. A medida que los fragmentos pasan a travs del l-

ser, sus marcas fluorescentes se excitan y emiten luz que se detecta mediante un fotomultiplicador. Despus de ser procesada por una computadora, la secuencia es mostrada como una serie de picos o cromatograma, donde cada uno de los 4 colores representa a un nucletido diferente (rojo: timina, verde: adenina, negro: guanina y azul: citosina). 9 Lecturas Recomendadas
FTTERER, J.; GISEL, A; IGLESIAS, V.; KLOTI, A.; KOST, B.; MITTELSTEN SCHEID, O.; NEUHAUS, G.; NEUHAUS-URL, G.; SCHROTT, M.; SHILLITO, R.; SPANGENBERG, G.; WANG, Z.Y. 1995. Standard Molecular Techniques for the Analysis of Transgenic Plants. En Gene Transfer to Plants. Potrykus, Y.; Spangenberg, G. (eds.). Springer Lab Manual. GRIFFITHS, A.; MILLER, J.; SUZUKI, D.; LEWONTIN, R.; GELBART, W. 2000. An introduction to the genetic analysis. Sptima Edicin. W:H:Freeman, N:York. 860 pp. MICKLOS, D. ; FREYER, G. 1990. DNA Science. Cold Sprong Harbor Lab. Press. Carolina Biol. Supply Comp. 477. pp. MADIGAN, M.; MARTINKO, J.; PARKER, J. BROCK. 1998 (Octava Edicin). Biologa de los Microorganismos. Prentice Hall. NEWTON, C.; GRAHAM, A. 1997 (Second Edition). PCR. Springer. N. York. SAMBROOK, J.; SMITCH, E.F.; MANIATIS, T. 1989 (Second Edition). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratomy Press. Cold spring Harbor. SOUTHERN, E.M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J.Mol. Biol. 98:503-517 WATSON, J. D.; GILMAN, M.; WITKOWSKI, J.; ZOLLER, M. 1992 (Second Edition). Recombinant DNA. Scientific American Books. N. York.

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II.- Captulo 4
Marcadores Moleculares
Picca, Aurora; Helguera, Marcelo; Salomn, Nelly; Carrera, Alicia 1 Introduccin Desde sus comienzos, el objetivo del mejoramiento vegetal ha sido seleccionar genotipos superiores a partir del reconocimiento de fenotipos superiores. El grado de xito en este proceso depende de i) el control gentico de la caracterstica, es decir el nmero de genes que la codifican y controlan (herencia monognica o polignica) y las relaciones interallicas (dominancia o aditividad), ii) el grado de influencia ambiental que se mide normalmente a travs del parmetro de heredabilidad. Una serie de tcnicas moleculares de gran desarrollo en los ltimos veinte aos permiten conocer la informacin gentica que los organismos portan. Funcionan como sealadores de diferentes regiones del genoma y se los conoce en forma genrica como marcadores moleculares . Son ampliamente utilizados en gentica humana, vegetal, animal y microbiana. Permiten evidenciar variaciones (polimorfismos) en la secuencia del ADN entre dos individuos, modifiquen stas o no su fenotipo. En relacin a los vegetales son de utilidad en estudios evolutivos y de gentica poblacional, manejo de bancos de germoplasma, identificacin, proteccin legal de germoplasma, mapeo, seleccin asistida por marcadores y clonado de genes. Para que un carcter sea considerado un marcador gentico debe mostrar una variacin experimentalmente detectable entre los individuos de la poblacin y un modo de herencia predecible segn las leyes de Mendel. Esta variacin puede ser considerada a diferentes niveles biolgicos, desde cambios fenotpicos heredables significativos hasta la variacin de un solo nucletido. Un marcador ideal debe ser: altamente polimrfico o variable dentro y entre especies, de herencia mendeliana no episttica (sin interaccin

entre genes), insensible a los efectos ambientales, codominante, de rpida identificacin y simple anlisis y de posible deteccin en los estadios tempranos del desarrollo de la planta. En los anlisis genmicos, se han utilizado varios tipos de marcadores genticos: morfolgicos, isoenzimas, protenas y marcadores basados en ADN. 2 Marcadores morfolgicos Son caractersticas fenotpicas de fcil identificacin visual tales como forma, color, tamao o altura. Muchos de ellos se convierten en importantes descriptores, a la hora de inscribir nuevas variedades. Por ejemplo, alrededor de 50 caracteres de plntula, tallo, hoja, espiga, espiguilla y cariopse se utilizan para inscribir e identificar variedades de trigo en la Secretara de Agricultura Ganadera Pesca y Alimentacin. Este tipo de marcadores contribuy significativamente al desarrollo terico del ligamiento gentico y a la construccin de las primeras versiones de mapas genticos. Un gran nmero de marcadores morfolgicos ha sido mapeado en tomate y maz. En girasol, los primeros hbridos se obtuvieron utilizando el color de hipoctile como marcador ligado al gen ms de androesterilidad; de este modo las plantas verdes que eran androestriles se utilizaban como lneas maternas y las plantas con antocianas que eran frtiles se eliminaban del lote de produccin al comienzo de su desarrollo. Las principales limitaciones de los marcadores morfolgicos se encuentran en: i) nmero reducido de marcadores disponibles en cada poblacin, ii) bajo nivel de polimorfismo, iii) pueden producir alteraciones fenotpicas que dificultan el desarrollo de la planta, iv) varios se hallan bajo control polignico, v) dominancia, vi) muchos de ellos se expresan en estado de planta adulta, lo cual prolonga los tiempos de evaluacin en los programas de mejoramiento. No obstante, los marcadores morfolgicos permanecen como caracteres tiles en la identificacin de materiales dado que representan un conjunto de genes que pueden ser evaluados con mtodos sencillos y a bajo costo.

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3 Isoenzimas Se definen como diferentes formas moleculares de una enzima, que poseen una actividad cataltica comn, es decir actan sobre el mismo sustrato. Ciertos cambios en el ADN que codifica estas enzimas (mutaciones) pueden resultar en cambios en la composicin de aminocidos, originando protenas con la misma actividad biolgica pero con diferente carga neta y por tanto con diferentes velocidades de migracin en un campo elctrico. Estas diferencias determinan patrones caractersticos de migracin electrofortica de las formas iso-enzimticas. Varios factores determinan el patrn de bandas o zimograma: 1) Nmero de genes que las codifican. La presencia de varios genes codificando para una misma enzima ha sido atribuida a procesos de duplicacin gnica y subsecuente divergencia a travs de mutaciones diferentes en cada caso. 2) Estados allicos. El proceso ms simple de generacin de nuevas formas enzimticas es la mutacin de un gen estructural; las variantes allicas se denominan aloenzimas. Estos marcadores muestran codominancia 3) Estructura cuaternaria de los productos proteicos . La enzima funcional puede estar compuesta por un nmero variable de sub-unidades. En las formas ms simples o monomricas los individuos homocigotas presentan una banda y los heterocigotas simplemente la suma de ambas. Cuando la estructura cuaternaria se vuelve ms compleja, encontramos enzimas activas compuestas por dmeros, tetrmeros, etc.. En este caso el individuo heterocigota presenta bandas adicionales no presentes en los homocigotas, que se generan por la combinacin de subunidades codificadas por los distintos alelos o loci. (Fig. 1). 4) Compartimentalizacin subcelular. Se encuentran formas enzimticas localizadas en citoplasma, cloroplasto o mitocondria, codificadas todas por genes nucleares pero con diferentes velocidades de migracin. Las isoenzimas se obtienen por homogenizacin del tejido (semilla, raz, hoja)

Figura 1: Locus isoenzimtico Pgd-3 en girasol. Variantes allicas a y b. Genotipos parentales P1, P2 homocigotas y F1 heterocigota

en soluciones buffer y se analizan mediante electroforesis en un soporte slido, generalmente almidn. El gel puede ser cortado en capas horizontales y cada una se destina a una solucin de revelado especfica que consta de un sustrato, un colorante y cofactores, disueltos en un buffer apropiado. La preparacin del gel es relativamente simple y el equipamiento es de bajo costo. Las enzimas se clasifican de acuerdo a su funcin y se representan con una sigla de tres letras. Por ejemplo: dehidrogenasas (alcohol dehidrogenasa ADH, glutamato dehidrogenasa GDH), oxidasas (peroxidasas PRX), hidrolasas (fosfatasas cidas ACP, esterasas EST), isomerasas (fosfoglucoisomerasa PGI) y transferasas (fosfoglucomutasas PGM). Los loci en general se representan con las tres letras sealadas en tipo cursiva y se agrega un nmero para designar al locus y una letra para el alelo, de acuerdo a distancias decrecientes de migracin. Por ejemplo: Adh-1a, Adh-1b, Adh-2a, Adh-2b, Adh-2c. Las isoenzimas han tenido un rol prominente en estudios de poblaciones vegetales para determinar variabilidad y estructura gentica, sistemtica y biologa evolutiva as como en descripcin de germoplasma e identificacin de variedades. Su aplicacin en la construccin de mapas se ha visto limitada por el nmero de marcadores isoenzimticos disponibles, en general menor a 50 y por su reducido polimorfismo, 2-4 alelos. Por otro lado, las formas enzimticas extradas de hoja o raz (no as las de semilla) presentan variaciones en relacin a las condiciones ambientales de crecimiento y a la edad del tejido, lo cual afecta la reproducibilidad de los zimogramas. No obstante, estos loci representan importantes marcas de referencia para relacionar mapas obtenidos a partir de

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distintos marcadores de ADN. 4 Protenas de reserva El endosperma de los cereales es el principal componente de la semilla ya que representa aproximadamente el 80-90% de su peso seco. Almidn y protenas son las dos macromolculas ms importantes. El contenido de protena vara segn la especie y el manejo de cultivo a campo. Los valores ms altos se dan en trigo y avena (10-17%) y los ms bajos en maz y arroz (6%). La concentracin de protenas en los cereales es apreciablemente menor que en las leguminosas ya que en stas los rganos de reserva o cotiledones son capaces de almacenar hasta un 40% de su peso seco en protenas. Las protenas del endosperma fueron estudiadas ya a comienzos del siglo pasado por Osborne, quin dio las bases para las clasificaciones actuales. La misma se basa en la solubilidad relativa en diferentes solventes: albminas solubles en agua, globulinas en solucin salina, prolaminas en alcohol y glutelinas en cidos o lcalis. Para el grupo de las prolaminas se ha asignado un nombre especfico para cada uno de los cereales. De esta manera en maz se la denomina zena, en cebada hordena, en avena avenina y en trigo gliadina. En el caso especfico de trigo a las glutelinas se las conoce con el nombre de gluteninas. En la mayora de los cereales las prolaminas y glutelinas estn codificadas por varios genes relacionados conformando familias. Durante la evolucin de estos genes se han detectado duplicaciones, translocaciones, inserciones de elementos mviles entre otros re-arreglos cromosmicos. Estos cambios genticos han generado un alto nivel de polimorfismo proteico entre especies, as como entre variedades de la misma especie. Adems, el anlisis gentico de cruzamientos ha demostrado que la variacin en el patrn de protenas es debida a la existencia de variantes allicas en cada locus. Las glutelinas se analizan en geles discontinuos de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio, en medio bsico (SDS-PAGE) utilizando diferentes tamaos de poros (tamiz molecular) (Fig. 2). El fraccionamiento de las prolaminas se realiza en electroforesis ci-

Figura 2: Fraccionamiento de Gluteninas en variedades de trigo por SDS-PAGE para su correlacin con variables de calidad industrial.

da (A-PAGE), en geles continuos, utilizando el principio de diferencias en la carga elctrica. La visualizacin se realiza en ambos casos mediante tincin con Coomassie Brilliant Blue R250. En trigo pan, Triticum aestivum, los genes estructurales para las dos principales protenas, gluteninas y gliadinas, estn confinados al conjunto de los cromosomas homelogos (cromosomas parcialmente homlogos pertenecientes a los tres genomas) 1 y 6. Los genes para las subunidades de gluteninas de alto peso molecular (GAPM) estn ubicados en el brazo largo de los cromosomas 1A,1B y 1D, cercanos al centrmero. Las gluteninas de bajo peso molecular (GBPM) son codificadas por genes ubicados en los brazos cortos de ese mismo grupo de cromosomas, distantes del centrmero. El patrn electrofortico de las gliadinas muestra cuatro grupos proteicos denominadas a, b, g y w gliadinas. Las fracciones g y w se encuentran codificadas por genes del cromosoma 1 de los tres genomas, prximos al grupo de genes correspondientes a GAPM. Los genes de las fracciones a y b se ubican en el brazo corto de los cromosomas 6A, 6B y 6D. La localizacin cromosmica de los genes de protenas en trigo se ha establecido principalmente utilizando materiales aneuploides tales como nulismicos o tetrasmicos de la variedad Chinese Spring. La posicin relativa del locus sobre el cromosoma fue determinada por cruzamientos entre lneas con contenidos contrastantes de protena y determinando la frecuencia de recombinacin en la progenie. La posicin cromosmica de estas protenas ha sido estable a lo largo de la

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evolucin y han sido usadas como marcadores para el estudio de la homeologa cromosmica de la Tribu Triticeae. 5 ADN y marcadores moleculares Un marcador de ADN es simplemente un punto de referencia en un cromosoma, que puede o no corresponder a un gen. Diversas tcnicas de biologa molecular se encuentran disponibles para detectar variabilidad en la secuencia de ADN. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), las enzimas de restriccin, la separacin electrofortica de los fragmentos de ADN, las sondas marcadas y las hibridizaciones son algunas de las tcnicas que permiten obtener un nmero virtualmente ilimitado de marcadores moleculares y cubrir la totalidad del genoma de un organismo (para ms detalles ver II.- 3) Los marcadores moleculares pueden ser clasificados en tres grupos: A) Marcadores basados en la hibridacin del ADN: los ms utilizados en plantas son los RFLP restriction fragment length polymorphisms o polimorfismos en la longitud de fragmentos de restriccin de ADN. Este tipo de estudio involucra la deteccin de un segmento especfico (marcador molecular) en el ADN de estudio por hibridacin con un fragmento marcado radiactivamente de secuencia complementaria al marcador (sonda). En el proceso, el ADN en estudio es digerido por medio de una enzima de restriccin. Este tipo de enzimas corta el ADN en una secuencia determinada o sitio de restriccin. La variabilidad gentica presente en el marcador molecular se observa como diferencias en la secuencia del ADN genmico debidas a duplicaciones, deleciones, inserciones, etc. que modifican la distancia entre pares de sitios de restriccin y generan fragmentos polimrficos (de diferentes tamaos). Los fragmentos clivados por la enzima de restriccin se separan por su tamao mediante electroforesis y se transfieren a una membrana donde son hibridados con la sonda. En el proceso, la sonda hibrida solamente con fragmentos de ADN inmovilizados en la membrana que presenten la secuencia complementaria a la misma. Para visualizar los polimorfismos se expone la membrana a una

placa radiogrfica La ventaja de los RFLPs radica en que son altamente reproducibles, codominantes y multiallicos. A su vez cuentan con la desventaja de ser muy laboriosos, difciles de automatizar, requieren de infraestructura adecuada para mantener las sondas, trabajar con radiactivos, lo que los hace relativamente caros. Los minisatlites o VNTR variable number of tandem repeats son repeticiones en tandem de secuencias del genoma que contienen de 9 a 100 pares de bases. El nmero de repeticiones es variable pero en general es menor a 1000. Existen dos formas de detectar los VNTR ya sea por hibridacin o por tcnicas de PCR. El ADN genmico es digerido con enzimas de restriccin que reconocen los sitios de restriccin que flanquean las repeticiones en tandem, separado electroforticamente e inmovilizado en una membrana. Cuando la enzima de restriccin corta las secuencias adyacentes a un locus hipervariable, la longitud de los fragmentos de restriccin producidos en diferentes individuos vara con el nmero de repeticiones de minisatlites. Estos fragmentos con diferentes longitudes son detectados utilizando sondas diseadas a partir de las secuencias de ADN que flanquean las repeticiones o a partir de las repeticiones mismas. Estos fragmentos pueden ser considerados como un tipo especfico de RFLP. La diferencia bsica entre RFLP y VNTR reside en el tipo de sonda utilizada. En la tcnica de VNRT las sondas estn constituidas por secuencias homlogas a las secuencias repetidas de los minisatlites, por lo tanto todos los locus hipervariables son detectados simultneamente, mientras que en RFLP, las sondas son homlogas a secuencias nicas del genoma, detectando as uno o pocos loci cada vez. De esta manera, en el autoradiograma al contrario del patrn simple de bandas obtenido por RFLP (una banda para genotipos homocigotas o dos bandas para genotipos heterocigotas), para minisatlites se obtiene un perfil complejo de bandas mltiples. Una ventaja de los VNRT, es que adems de explorar el polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin en cada locus hipervariable, utilizan tambin el polimorfismo en el nmero y distribucin de estos loci a lo largo del genoma, posibilitando as

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la visualizacin simultnea de diversas regiones del mismo. Las limitaciones para esta tcnica, son las mismas descriptas oportunamente para RFLP. Los minisatlites tambin pueden ser detectados mediante la amplificacin por PCR de los segmentos conteniendo diferente nmero de repeticiones, utilizando primers o cebadores, que flanqueen dichos segmentos.

B) Marcadores basados en la amplificacin del ADN: mediante la reaccin de PCR polymerase chain reaction o reaccin en cadena de la polimerasa de ADN. Esta tcnica se basa en la sntesis enzimtica de millones de copias de un segmento especfico de ADN en presencia de una polimerasa de ADN termoestable. Para ello se utilizan dos oligonucletidos llamados cebadores o primers. El segmento de ADN a amplificar esta compuesto por dos hebras (a y b), la secuencia de uno de los oligonucletidos hibrida en uno de los extremos del segmento y es complementaria a la hebra a, el segundo oligonucletido hibrida en el otro extremo del segmento y es complementario a la hebra b. Para que exista amplificacin del fragmento es imprescindible que ambos oligonucletidos hibriden en secuencias complementarias presentes en las hebras del ADN en estudio. La presencia de mutaciones en el sitio de hibridacin de cualquiera de los oligonucletidos impide la amplificacin del fragmento. La necesidad de disponer de informacin previa acerca de la secuencia del ADN a amplificar para disear oligonucletidos, limit inicialmente el desarrollo de marcadores Figura 3: RAPDs en DNA genmico de trigo candeal. basados en la reaccin de Genotipos parentales K y D y progenie F7. PCR en plantas. La primera solucin a este problema vino de la mano de que son rpidas y sencillas, de bajo costo de los RAPDs random amplified polymorphic implementacin, automatizables y no radioDNAs o fragmentos polimrficos de ADN activas. La desventaja, adems de su baja amplificados aleatoriamente. Esta tcnica reproducibilidad, es que es un marcador dose basa en la utilizacin de un nico minante (al observar un fragmento es impooligonucletido de 10bp que hibrida al azar sible determinar si el mismo se origin de una con el ADN en estudio. Para que se genere o dos copias de la secuencia amplificada). un fragmento RAPD es necesario que las dos La disminucin en los costos de secuen-

hebras del ADN en estudio presenten sitios de hibridacin con el oligonucletido en orientaciones opuestas suficientemente cercanas (menos de 3000bp) como para permitir la amplificacin. La secuencia del oligonucletido es aleatoria al igual que los sitios de hibridacin, por lo que la secuencia amplificada es desconocida. El polimorfismo que se observa entre distintos individuos consiste en la presencia o ausencia de fragmentos de ADN amplificado (Fig. 3). DAF DNA amplification fingerprinting y AP-PCR arbitrary primer PCR son tcnicas similares a RAPDs. DAF involucra el uso de primers arbitrarios de longitud tan corta como 5 pares de bases. Esto reduce la especificidad del apareamiento con el ADN molde y resulta en un perfil ms complejo de bandas. La visualizacin se lleva a cabo por medio de geles de poliacrilamida teidos con plata. AP-PCR utiliza primers ligeramente ms largos que la tcnica anterior (aprox. 20 pares de bases). Los productos de amplificacin son marcados radiactivamente y tambin pueden ser resueltos por electroforsis en geles de poliacrilamida La ventaja de estas tcnicas consiste en

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ciacin y PCR, junto a la creciente informacin sobre genomas animales y vegetales han permitido el desarrollo de marcadores basados en PCR con diferentes caractersticas, entre ellos los ms frecuentemente utilizados en plantas son: SSR simple sequence repeats o microsatlites y AFLPs amplified fragment length polymorphisms. Los microsatlites (SSR), son regiones genmicas hipervariables constituidas por repeticiones en tandem de unos pocos pares de bases (1 a 4) flanqueadas por secuencias de copia nica. La base gentica del polimorfismo detectado en microsatlites se basa en la variabilidad del nmero de repeticiones en tandem y consecuentemente del tamao del microsatlite amplificado en individuos de una especie. El microsatlite amplificado por PCR es sometido a electroforesis en geles de alta resolucin que permiten detectar diferencias de 2, 3 o 4 nucletidos que corresponden al mnimo polimorfismo de longitud en un microsatlite. Por el alto polimorfismo que presentan por locus (multialelismo) se los considera los marcadores ideales para el mejoramiento en especies autgamas como el trigo. Estos marcadores son codominantes, genoma-especficos y altamente polimrficos en comparacin con los RFLPs y RAPDs. Su implementacin en un laboratorio requiere de mayor infraestructura y presupuesto que los RAPDs. C) Marcadores mixtos: AFLP (polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados de ADN) puede considerarse como una combinacin de RFLP y RAPDs. Esta tcnica consiste en esencia de cuatro etapas: 1) el ADN genmico es cortado con enzimas de restriccin (generalmente una de corte raro y otra de corte frecuente). 2) adaptadores de ADN de doble cadena se adhieren en forma especfica a los extremos de los fragmentos obtenidos en el paso anterior, generando as el molde para la amplificacin del ADN. 3) una fraccin de los fragmentos obtenidos es amplificada selectivamente por la accin de primers especficos que fueron diseados para reconocer la secuencia de los adaptadores ligados en el segundo paso, el sitio de la enzima de restriccin, ms una a tres bases selectivas al azar agregadas en el

extremo 3. El uso de bases selectivas al azar permite la amplificacin de slo un grupo de fragmentos de restriccin (aquellos en que coincide la secuencia del adaptador + sitio de restriccin + bases selectivas). 4) anlisis de la subpoblacin de fragmentos amplificados mediante su desnaturalizacin por electroforesis en geles de alta resolucin (poliacrilamida) y visualizacin por autoradiografa o por tincin con nitrato de plata (Fig. 4). Su implementacin en laboratorio requiere de una infraestructura y presupuesto similar a los microsatlites. Estos marcadores presentan un alto poder de deteccin de la variabilidad gentica, ya que se explora simultneamente el polimorfismo de ausencia/presencia de sitios de restriccin (como los RFLP) y la ocurrencia o no de amplificacin a partir de secuencias arbitrarias (como los RAPDs). La base del polimorfismo es la ausencia o presencia de fragmentos amplificados de un tamao determinado y al igual que en los RAPDs, no es posible distinguir individuos heterocigotas por lo que se trata de un marcador dominante. Es un marcador mucho ms robusto

Figura 4: AFLPs en trigo candeal. Cinco combinaciones de primers para las enzimas de restriccin Pst I y Mse I en las variedades K y D.

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que los RAPDs, ya que en la amplificacin se (ARNm transcripto a ADN utilizando la enziutilizan oligonucletidos ms largos, que au- ma transcriptasa reversa). La ventaja de los mentan significativamente la especificidad de ESTs, al ser derivados de ARNm maduro es la reaccin sin perder las ventajas de la am- que generalmente se ven libres de intrones plificacin de secuencias al azar (no requiere y de ADN repetitivo. Esto implica que los ESTs informacin previa de secuencia de ADN). representan genes funcionales y son por lo Otra ventaja de los AFLPs es el nmero de tanto ms tiles como marcadores fragmentos (marcadores) resueltos por moleculares que las secuencias annimas. electroforesis que oscila entre 30 - 50 contra En una variante conocida como CAPs los 4 10 de RAPDs. cleavage amplified polymorphic Para una utilizacin ms eficiente en pro- sequence, los productos de amplificacin de gramas de mejoramiento de marcadores secuencias especficas se digieren con una RFLPs, RAPDs y AFLPs existe la posibilidad de enzima de restriccin. Este mtodo permite transformarlos en marcadores PCR alelo-es- identificar individuos heterocigotas, por lo pecficos, que son econmicos, robustos y de que se comporta como marcador codomisencilla implementacin en cualquier labora- nante. La informacin para la secuencia de torio. los primers utilizados en CAPs puede proveExisten distintas estrategias para la con- nir de un banco de genes o de clones versin de marcadores RFLP, RAPDs y AFLPs genmicos o de cDNA. Recientemente meen marcadores PCR alelo-especficos, en ge- diante CAPS ha sido posible seleccionar planneral ligados a un caracter de inters agro- tas de trigo hexaploide portadoras del alelo nmico. Se conocen como STS sequence- 2NS, proviente de una translocacin de tagged sites. En estos casos se aisla el frag- Triticum ventricosum que contiene genes de mento de ADN polimrfico del gel, se clona, resistencia a roya Lr37, Sr38, Yr 17 (Fig. 5). se secuencia y se disean oligonucletidos especficos de alrededor de 20 pb, para ser utilizados como cebadores. Cuando se parte de un fragmento RAPD, el marcador derivado mediante este proceso es conocido como SCAR regin amplificada de secuencia caracterizada. El paso siguiente es detectar el alelo de valor agronmico Figura 5: CAPS en trigo. Calle 1 planta control (sin amplificacin). Calles superior, por ejemplo un alelo 2, 3, 6 y 7 plantas homocigotas para el alelo 2AS (275 pb = 166 + 109). 4 y 5 homocigotas 2NS (285 pb). Calles 8 y 9 plantas heterocigotas asociado a la resistencia a un pa- Calles 2AS/2NS. tgeno y el marcador entonces se hace evidente con una simple reaccin de PCR. El problema que enfrentan Existen tcnicas de alta resolucin que estas estrategias suele ser el bajo nivel de permiten detectar mutaciones a nivel de un polimorfismo entre variedades de una espe- solo nucletido conocidas como SNPs sincie (trigo, soja, etc), lo que disminuye las po- gle nucleotide polymorphisms. Entre ellas, sibilidades de encontrar mutaciones tiles los SSCPs single-strand conformational para desarrollar estos marcadores. De todos polymorphism tienen la capacidad de demodos, existen antecedentes exitosos de tectar cambios de un solo nucletido en fragdesarrollo de marcadores de PCR alelo-espe- mentos de ms de 1000 pares de bases. La cficos en trigo para locus altamente tcnica de SSCPs se basa en la movilidad de polimrficos como pueden ser alelos de las cadenas simples del ADN en geles de gluteninas. poliacrilamida no desnaturalizantes, moviliLos ESTs expressed sequence tags son dad que depende tanto de su tamao como similares a los STSs y sirven para los mismos de su secuencia. Las cadenas simples de ADN propsitos pero derivan de clones de cDNA tienen tendencia a formar apareamientos

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intramoleculares de bases que resultan en una conformacin dependiente de la secuencia y con una movilidad especfica en geles de acrilamida. Por lo tanto cambios en la secuencia del ADN, aunque sea de un solo par de bases, causan modificaciones en la conformacin y consecuentemente en la movilidad electrofortica. Los SSCPs pueden detectarse clivando el ADN con enzimas de restriccin, separando los distintos fragmentos segn su conformacin por corrida en un gel. Posteriormente se realiza una hibridacin de Southern a partir del gel con fragmentos especficos como sondas para la hibridacin. Otra metodologa para obtener SSCPs consiste en la amplificacin de un fragmento especfico por PCR y posterior corrida electrofortica en geles de alta resolucin. De la descripcin realizada, se desprende que los marcadores varan ampliamente en el grado de complejidad del mtodo, el modo de herencia, el nivel de polimorfismo y en los factores costo y tiempo, de gran importancia cuando los objetivos del estudio incluyen el anlisis de un nmero elevado de individuos. La tabla 1 resume algunos aspectos importantes a considerar a la hora de elegir el tipo de marcador a utilizar.

CARRERA, A.; POVERENE, M.; RODRGUEZ, R. 1996. Isozyme variability in Helianthus argophyllus. Its application in crosses with cultivated sunflower. Helia 19 (25): pp. 19-28. DIEFFENBACH, CW.; DVEKSLER, GS. 1995. PCR primer: A laboratory manual. CSHL press. 714 pp. DUBCOVSKY 2003. PCR assays for the Lr37-Yr17-Sr38 cluster of rust resistance genes and their use to develop isogenic hard red spring wheat lines. Crop Science, en prensa. FERREIRA, M.; GRATTAPAGLIA, D. 1996. Introduao ao uso de marcadores moleculares em anlise gentica. 2 ed. EMBRAPA-CENARGEN. 220 pp. GUPTA, PK.; VARSHNEY, RK.; SHARMA, PC.; RAMESH, B. 1999. Molecular markers and their applications in wheat breeding. Pl. Breed. 118: pp. 369-390. HELGUERA, M.; ECHENIQUE, V. 2003. Biotechnology in wheat breeding. Aceptado para publicar en Advances In Plant Physiology, vol 7. NG., P.K.; BUSHUK, W. 1987. Glutenin of Marquis Wheat as a Reference for Estimating Molecular Weights of Glutenin Subunits by Sodium Dodecyl SulfatePolyacryilamide Gel Electrophoresis. Cereal Chemistry. 64(4): pp. 324-327. SALOMN, N., MIRANDA, R.; POVERENE, M. 1998 Variacin de la calidad panadera en trigos de diferentes orgenes a travs de la escala Glu-1. IV Congreso Nacional de Trigo y II Simposio Nacional de Cereales de Siembra OtooInvernal. Mar del Plata. pp. I-21. SALOMN, N., CARRERA, A.; MIRANDA, R.; POVERENE, M. 2001. Estudio de los descriptores de trigo en Argentina. Publicado en Estrategias metodolgicas utilizadas en el mejoramiento de trigo: Un enfoque multidisciplinario. Colonia, Uruguay. pp. 294. SOLTIS, D.; SOLTIS, P. (Eds.). 1989. Isozymes in Plant Biology . Advances in Plant Sciences Series. Vol. 4. Portland, Oregon. 268 p.

Tabla 1: Comparacin entre algunos sistemas de marcadores moleculares.

6 Lecturas recomendadas
BUSHUK W.; ZILLMAN, R.R. 1978. Wheat Cultivar Identification by Gliadins Electrophoregram I: Apparatus, methods and nomenclature. Canadian Journal of Plant Science, 58: pp. 505-515.

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PICCA, Aurora; HELGUERA, Marcelo; SALOMN, Nelly; CARRERA, Alicia

II.-Captulo 5
Citogentica
Poggio, Lidia; Naranjo, Carlos A. 1 Introduccin Los estudios citogenticos han permitido realizar valiosos aportes al conocimiento de los mecanismos de aislamiento reproductivo y modos de especiacin en plantas. La especiacin hbrida es muy comn en el reino vegetal, en especial la especiacin por poliploida. En estos casos la citogentica, a travs del anlisis genmico, ha contribuido a la resolucin del origen y evolucin de distintos grupos taxonmicos. Mutaciones cromosmicas que alteran la morfologa de los cromosomas jugaran un papel importante en la determinacin de los mecanismos de aislamiento reproductivo y distintos modos de especiacin. Aun sin alterar la morfologa de los cromosomas, existen ejemplos en los que mutaciones gnicas que afectan el apareamiento han sido determinantes en la evolucin de distintos grupos. La citogentica brinda valiosos aportes para la resolucin de problemas taxonmicos, evolutivos y aplicados. Esta disciplina tiene grandes ventajas pero tambin limitaciones y sus aportes deben ser complementados con estudios provenientes de otros campos. Sin embargo es importante sealar que trabajar en biologa o gentica de eucariontes, usando tcnicas clsicas o moleculares, pero desconociendo las caractersticas y el comportamiento de sus cromosomas puede llevar a errores en la interpretacin de causa y efecto de muchos fenmenos. En esta contribucin se explicar brevemente la informacin que la citogentica puede brindar, con el anlisis del cariotipo, anlisis meitico en hbridos y poliploides, estudio de la variacin intra e interespecifica en el tamao del genoma y con la citogentica molecular (hibridacin in situ , FISH, GISH), exponiendo como ejemplos, algunos aportes realizados por nuestro grupo de trabajo.

2 Anlisis del cariotipo Las caractersticas estructurales y cuantitativas de los cromosomas (cariotipo) son importantes en investigaciones bsicas (taxonmicas y evolutivas) y aplicadas. Los taxnomos y evolucionistas estn familiarizados con el hecho de que los cromosomas son parte de un sistema dinmico que est moldeando el proceso de evolucin. Esta variacin se expresa en caractersticas fcilmente analizables como el nmero, forma y tamao de los cromosomas y no est relacionada con complejidad gentica u organsmica. Es importante analizar tambin, la cantidad y localizacin de heterocromatina (ADN repetitivo no codificante) mediante distintas tcnicas de bandeo, y caracterizar citoqumicamente distintos tipos de heterocromatina utilizando fluorocromos, y en algunos casos, identificar ADN satlite y relacionarlo con bandas heterocromticas. Adems, deben localizarse las regiones organizadoras del nucleolo (NOR). Es frecuente y normal la existencia de variacin cariotpica interespecfica. Por otro lado, aunque menos frecuente, tambin puede existir variabilidad cariotpica intraespecfica manifestada como polimorfismos o politipismos cromosmicos. Varios parmetros del cariotipo pueden ser alterados por rearreglos estructurales. En algunos casos puede variar el nmero cromosmico y la simetra del cariotipo. Un ejemplo de este caso lo constituyen las fusiones cntricas entre cromosomas con centrmero subterminal produciendo cromosomas metacntricos de mayor tamao, con o sin eliminacin de regiones centromricas. El fragmento con centrmero puede persistir como un cromosoma supernumerario o cromosoma B. En otros casos no se encuentra variacin en el nmero cromosmico ya que en muchos gneros el nmero y, a veces, la morfologa cromosmica es constante entre las distintas especies que lo componen. En Bulnesia (Zygophylaceae) siete de las nueve especies que lo componen son diploides (2n=26). Sin embargo existen diferencias importantes interespecficas en cuanto a la morfologa cromosmica, simetra del cariotipo y tamao del genoma. El cariotipo de B. retama es el ms asimtrico ya que

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posee un cariotipo bimodal por adicin de heterocromatina en 24 de los 26 cromosomas del complemento. El nmero cromosmico tambin puede variar por poliploida. Nuevos nmeros bsicos que no tengan relacin directa con los ancestrales pueden surgir si ocurren nuevas reestructuraciones o hibridacin entre poliploides con distintos nmeros bsicos. Variaciones en el cariotipo pueden ocurrir sin cambios notorios en el exofenotipo. Sin embargo rearreglos en condicin heterocigota pueden ocasionar disturbios en el apareamiento meitico e iniciar aislamiento reproductivo. Si se dan las condiciones adecuadas para la fijacin de estos rearreglos pueden iniciarse eventos especiognicos que involucren rearreglos cromosmi- FIGURA 1. A-E = Bandeo C. A, C, E = metafases mitticas. B, D = interfases. A, B = cos. Estos procesos Zea luxurians. C, D = Zea mays ssp. mays. E = Bulnesia retama, las flechas sealan el nico par de cromosomas metacntricos eucromticos.- F = Metafase I. Eulophia pueden conducir, en paiveana ssp. borealis, n = 42; las flechas muestran ejemplos de asociacin algunos casos, a la exis- secundaria de bivalentes.- G, H = Zea luxurians x Z. diploperennis , n = 10; G = tencia de especies Metafase I, 8 bivalentes y 4 univalentes, la flecha seala un bivalente heteromorfo; crpticas o hermanas, H = Anafase I, 2 puentes (flechas) y 2 fragmentos (cabeza de flecha).- I, J = Zea mays ssp mays, diacinesis. n = 10; I = dos grupos de 5 bivalentes y un cromosoma B; J = con pocas diferencias a Asincrona meitica, 5 bivalentes en Metafase I y 10 cromosomas en Anafase I.- K = nivel bioqumico o Zea luxurians x Z. perennis, 2n=30; metafase I, 5 trivalentes, 5 bivalentes y 5 morfolgico pero con univalentes. A-D y F-K poseen el mismo aumento. Las barras representan 10 micrones. diferencias cromos- Ver explicacin extensa de las figuras en: Poggio et al., 1986a y b, 1999; Tito et al., 1991. micas que las mantendran aisladas reproductivamente. matina constitutiva compuesta por secuenUn anlisis ms preciso de la variacin cias cortas repetidas en tandem. La cariotpica puede obtenerse empleando tc- heterocromatina constitutiva es un componicas de bandeo que revelan marcadores nente aditivo del genoma y presenta, en cromosmicos (secuencias de ADN altamen- muchos grupos, variacin intra e te repetidas ricas en AT o GC, regiones orga- interespecfica. Aunque no contiene genes nizadoras del nucleolo, etc.). El bandeo C es activos podra tener importancia en eventos el que se utiliza de rutina y revela heterocro- regulatorios, en el desarrollo y en la organi-

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zacin tridimensional de los cromosomas en el ncleo. Bennett (1983, 1988) crea el trmino cariotipo natural para referirse al ordenamiento de los cromosomas de acuerdo a la posicin real que los mismos ocupan en el ncleo interfsico. Se han postulado varios modelos que explican la organizacin supracromosmica en los ncleos eucariontes estableciendo que si bien sta no es universal, es indudable que la informacin gentica no est contenida caoticamen-te en el ncleo sino que est ordenada de acuerdo a patrones que actualmente no conocemos. 3 Anlisis meitico en hbridos y poliploides Una especie diploide con reproduccin sexual para ser frtil debe poseer un comportamiento meitico normal, o sea que debe poseer buen apareamiento entre cromosomas homlogos y consecuentemente formacin de bivalentes. Ello determina que exista buena segregacin y formacin de gametos balanceados y frtiles. En general el grado de apareamiento meitico es una medida de la homologa que existe entre los cromosomas. Esto es cierto cuando son normales los genes que regulan fisiolgicamente todas las etapas y procesos de la divisin meitica. Estos principios han permitido realizar rpidas evaluaciones de la homologa genmica entre dos entidades por medio del estudio meitico de su hbrido F1, cuando stos han sido posibles de obtener artificialmente o se los ha encontrado en poblaciones naturales. Si el hbrido analizado es frtil y posee formacin de bivalentes se puede concluir que hay afinidad (homologa) entre los genomas parentales. El grado de irregularidades meiticas es una estimacin de diferencias gnicas y estructurales de las entidades en estudio. Configuraciones meiticas anormales como univalentes, bivalentes heteromrficos o multivalentes en Profase-Metafase I y, en estados posteriores (puentes, fragmentos, cromosomas con cromtidas desiguales, husos multipolares, etc.,), pueden deberse a heterocigosis para distintos tipo de rearreglos estructurales.

Si el hbrido es estril habr que analizar si el aislamiento reproductivo postcigtico obedece a causas gnicas o cromosmicas. La formacin de univalentes podra significar falta de homologa entre los cromosomas de los progenitores y, en estos casos, el poliploide artificial debera poseer meiosis regular y fertilidad elevada. Sin embargo podra ocurrir que aunque las especies parentales tuvieran una elevada homologa en cuanto a las secuencias de ADN, los hbridos fueran estriles, con formacin de univalentes en su meiosis. Esto ltimo podra deberse a la accin de genes que interfieren con el proceso normal de apareamiento (formacin del complejo sinaptonmico, ocurrencia y/o posicin de sobrecruzamientos) o alteran la disposicin espacial de los genomas en el ncleo provocando asinapsis. En algunos casos la formacin de univalentes en los hbridos se debera a divergencia cuantitativa en el nmero de copias de secuencias de ADN altamente repetidas. Este mecanismo disminuye el valor adaptativo del heterocigota por provocar disturbios en la alineacin estructural de los cromosomas. Otro caso frecuente en la naturaleza es la existencia de hbridos diploides con formacin regular de bivalentes y desarrollo normal de los estados II de la meiosis, pero elevada esterilidad. Este fenmeno es muy comn en hbridos entre distintas especies de Amaranthus, Prosopis y Bromus entre otros. Stebbins (1971) ha denominado a este fenmeno hibridez estructural crptica y ocurrira cuando las especies progenitoras se diferencian en pequeos rearreglos estructurales. En estos casos se pueden formar bivalentes pero se segregan combinaciones gnicas inviables a las gametas. El comportamiento meitico puede tambin verse alterado por interacciones particulares ncleo - citoplasmticas. En los hbridos el citoplasma puede ejercer una accin diferencial sobre la condensacin cromosmica de los genomas parentales o en el ritmo de contraccin cromosmica durante la meiosis (alociclia genmica). Cuatro lneas aloplsmicas fueron obtenidas por el Ing. Agr. L. Mazoti utilizando maz ( Zea mays ssp mays) como progenitor masculino recurrente durante al menos 10 retrocruzas so-

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bre teosinte como progenitor femenino. Estas lneas presentaron comportamiento meitico regular con formacin de bivalentes. Todas las lneas aloplsmicas presentaron caractersticas citolgicas en comn. Una de estas caractersticas es que, en mas del 50 % de las clulas analizadas en Diplotene Metafase I, los 10 bivalentes se distribuyeron en dos grupos de cinco bivalentes cada uno. Si bien este comportamiento meitico fue descripto en hbridos y en razas nativas de maz, en las lneas aloplsmicas se observa con mayor claridad y frecuencia. Otra caracterstica observada en las lneas aloplsmicas es que, en aproximadamente 20-40% de los meiocitos en Profase I, Metafase I y Anafase I, los dos grupos de 5 II presentan una leve asincrona en su comportamiento meitico (es decir que, por ejemplo, un grupo de 5 II inicia la Anafase I mientras que el resto de los bivalentes permanecen en Metafase I). La drstica separacin en dos grupos de 5 II en la mayora de las clulas sugiere que la interaccin citoplasma de teosinte-nucleo de maz influencia la distribucin espacial de los cromosomas en el ncleo. La presencia de dos grupos de 5 II y la asincrona de los mismos en lneas aloplsmicas de maz sugiere que el citoplasma de teosinte promueve la separacin y asincrona de dos genomas diferentes con 10 cromosomas cada uno (x=5). Evidencias citogenticas de la naturaleza poliploide del maz y especies afines se discutirn con mayor detalle en la prxima seccin. Citogentica de poliploides. El estudio meitico de poliploides e hbridos entre taxones con distinto nivel de ploida aporta mayor informacin que el realizado en hbridos diploides puesto que se puede analizar la afinidad relativa de distintos genomas en el mismo fondo gentico. En estos casos la formacin de multivalentes es decisiva para establecer las relaciones entre genomas. En el gnero Larrea el hbrido estril entre la especie diploide L. divaricata (2n=26) y L. cuneifolia (2n=52) hemos encontrado, en MI, 13 II y 13 I en un gran porcentaje de las clulas analizadas, indicando que L. divaricata o una especie muy afn sera un progenitor de L. cuneifolia. El anlisis de las asociaciones meiticas en especies e hbridos del gnero Zea nos revel la naturaleza

alotetraploide del maz y especies relacionadas con 2n=20 cromosomas. En hbridos con 2n=30 cromosomas (Z. diploperennis x Z. perennis y Z. mays ssp mays x Z. perennis) la configuracin meitica ms frecuente fue 5 III + 5 II + 5I. Zea perennis , con 2n=40 cromosomas present, con frecuencia elevada, 5 IV + 10 II. Estas configuraciones slo pueden ser claramente explicadas proponiendo dos genomas (A y B) de 5 cromosomas cada uno, siendo AmAm BmBm y ApAp ApAp Bp1Bp1 Bp2Bp2 las frmulas genmicas postuladas para maz y Zea perennis , respectivamente. Nuestro grupo de trabajo ha encontrado, en especies e hbridos con 2n=20 cromosomas, formacin frecuente de dos grupos de 5 II cada uno en MI. Este doble huso observado sera una evidencia de la existencia de genomas ancestrales con 10 cromosomas cada uno. Adems, en alrededor del 50 % de las clulas observadas en algunas lneas de maz e hbridos interespecficos se observ asociacin secundaria de bivalentes, sugiriendo la existencia de homeologa entre los genomas ancestrales A y B postulados. Tratamientos premeiticos con soluciones diluidas de colchicina (0,5 x 10 -4) en el gnero Helianthus indujeron apareamiento homelogo y formacin de multivalentes en especies que, aunque tienen origen poliploide, posean meiosis regular con formacin de bivalentes. Los resultados obtenidos sugirieron que estos tratamientos pueden inducir apareamiento intergenmico. Este tratamiento produce el mismo efecto que alelos mutantes de genes que controlan el apareamiento, permitiendo recombinacin entre genomas que normalmente no recombinaran. Hemos realizado tratamientos con soluciones diluidas de colchicina en maz y Z. perennis con la finalidad de detectar recombinacin entre los genomas A y B postulados anteriormente. El maz tratado mostr en Diplotene-MI de 1 a 5 IV mientras que el maz testigo slo form bivalentes. Estos resultados sugirieron que en maz existen genomas homelogos (Am y Bm) con 5 cromosomas cada uno. El tratamiento en Zea perennis di como resultado un incremento en la frecuencia de IV sealando tambin manifestacin de homeologa dentro de los genomas A y B. El tratamiento con colchicina

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de los hbridos con 2n=30 cromosomas, Z. diploperennis x Z. perennis y Z. perennis x Z. mays ssp mays dieron resultados diferentes. En Z. diploperennis x Z. perennis el tratamiento con colchicina provoc un aumento en la frecuencia de trivalentes, no observndose nunca IV VI. En cambio el hbrido Z. perennis x Z. mays ssp. mays tratado con colchicina, no slo mostr un aumento en el porcentaje de III sino que el 43% de las clulas analizadas en Diacinesis -MI mostraron IV y VI. Estos resultados permitieron concluir que si se comparan los genomas Am-Bm Ad-Bd y Ap-Bp, slo son homelogos los genomas Am y Bm. El anlisis conjunto de los datos obtenidos en nuestro laboratorio no slo confirma la naturaleza alopoliploide del maz y especies afines con 2n=20 cromosomas, sino que sugiere que en estas especies existen genes (semejantes al Ph descripto en trigo) que impiden el apareamiento entre genomas homelogos. En Amaranthus la configuracin cromosmica de 8 II + 17 I observada en el hbrido A. hybridus (2n=32) x A. spinosus (2n=34), conjuntamente con la asociacin secundaria de bivalentes observada en especies e hbridos con meiosis regular apoyaron la hiptesis de que las especies actuales de Amaranthus con 2n=32 cromosomas son poliploides con x=8. EL nmero n=16 sera un nmero bsico derivado y n=17 habra surgido por trisoma primaria. Se han dado varios ejemplos en los cuales el anlisis meitico ha permitido dilucidar el origen y postular modos de especiacin en varios grupos. Como ya se ha discutido, el apareamiento puede estar bajo control gentico (por ejemplo genes tipo Ph) y a menudo estos genes pueden constituir un sistema mucho mas simple que los que controlan caracteres diagnsticos de especies y gneros. El establecimiento de sistemas taxonmicos basados en relaciones genmicas deben en lo posible estar apoyados por estudios citogenticos completos (cariotipo, bandeo C y fluorescente, contenido de ADN, etc.), morfolgicos, bioqumicos y moleculares. Adems de la utilidad en estudios taxonmicos y evolutivos el conocimiento de

la meiosis es de importancia fundamental en estudios aplicados. En la produccin de hbridos o poliploides de importancia agronmica se debe lograr un mximo de fertilidad y esto est relacionado con el comportamiento cromosmico. Aunque no siempre la esterilidad es de origen cromosmico, ste es un parmetro que debe ser controlado. 4 Variacin intra e interespecifica en el tamao del genoma: evolucin y significado adaptativo Durante el proceso evolutivo ocurren cambios cuantitativos y cualitativos en el contenido de ADN total. En Angiospermas el tamao del genoma es muy variable entre grupos, oscilando entre 0,2 pg en Arabidopsis thaliana a 127,4 pg en Fritillaria assyriaca no estando esta variacin relacionada necesariamente con nivel de ploidia. El contenido de ADN (valor C) se evala mediante microdensitometra o citometra de flujo. Si se descarta la variacin en el nivel de ploida, las principales causas de variacin (intra o interespecfica) del contenido de ADN serian: aneuploida, polimorfismo numrico para cromosomas accesorios o supernumerarios, reordenamientos cromosmicos con perdida o duplicacin de material gentico y variacin en el nmero de copias de secuencias no codificantes. La variacin del tamao del genoma se encuentra, a grandes rasgos, relacionada con diferencias en la complejidad organsmica pues los virus tienen genomas mas pequeos que las bacterias y stas a su vez menores que el de eucariotas. Sin embargo en organismos superiores se encontr que el aumento en el valor C no estaba relacionado con complejidad organsmica, ni era explicable por la existencia de mayor nmero de genes funcionales (el contenido de ADN de un alga unicelular, por ejemplo, puede ser igual al de una angiosperma leosa). Esta paradoja o enigma del valor C (C: contenido de ADN del genoma haploide no replicado) fue explicada, en parte, cuando se demostr que en Angiospermas la variacin del tamao del genoma involucra cambios en la cantidad y proporcin de secuencias de ADN repetidas. Los estudios moleculares han reve-

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lando gran complejidad dentro de los genomas existiendo, adems del ADN codificante, secuencias repetidas que no codifican tales como ADN satlite, minisatlites, microsatlites, y elementos transponibles. En general, la relacin ADN gnico, no gnico disminuye con el aumento del tamao del genoma y en angiospermas con elevado contenido de ADN las secuencias repetidas pueden representar hasta el 90% del ADN total. Estos resultados explican la naturaleza de la variacin pero plantean interrogantes acerca del significado evolutivo de esta arquitectura repetida del genoma: cul es el origen, funcin y/o significado de esta variacin? cul es el papel del ADN repetido, tpicamente no codificante?, qu relacin poseen estos cambios con la fluidez y plasticidad del genoma en plantas? y cual es la direccin, distribucin y extensin de estos cambios en distintos grupos vegetales?. Un enfoque para comprender el significado del tamao del genoma fue analizar las relaciones que existan entre el contenido de ADN y caractersticas celulares, organsmicas y geogrficas. En varios grupos de plantas se vio que las variaciones en el contenido de ADN total estn correlacionadas positivamente con: volumen o longitud cromosmicas, rea y volumen celular, porcentaje de heterocromatina, longitud del complejo sinaptonmico, duracin del ciclo mittico, duracin de la meiosis, tiempo mnimo de generacin, factores fenolgicos, latitud y altitud. Bennett (1987) crea el trmino nucleotipo para referirse a los aspectos del ADN nuclear que afectan al fenotipo independientemente del ADN codificante. En la literatura existen muchos datos que sugieren que el tamao del genoma posee significado adaptativo y que los parmetros nucleotpicos juegan un papel importante en la evolucin, diversificacin y adaptacin a distintos ambientes, limitando el rango de expresin fenotpica que puede ser alcanzado por accin gnica. Por otro lado, varios autores opinan que las secuencias de ADN no gnico que pueden variar en el genoma no poseen significado adaptativo constituyendo ADN egosta, parsito o ignorante. Otros investigadores sealan que no puede descartarse la existencia de mecanismos moleculares que generen

ADN repetido no codificante que, en forma oportunista, acte como mutgeno y /o agente regulador. En algunos organismos se ha demostrado que la transposicin de elementos mviles retrovirales pueden alterar la dinmica del genoma provocando una inestabilidad que se puede traducir en una sbita explosin de variabilidad. Se conocen procesos de escisininsercin de elementos mviles produciendo por ejemplo, plantas variegadas. Estos procesos pueden, adems, producir reestructuraciones cromosmicas alterando el orden y posicin de los genes. Estos cambios rpidos pueden ser potentes mecanismos evolutivos ya que concomitantemente con el aislamiento reproductivo que implica la diferencia en rearreglos estructurales, los mismos pueden involucrar efectos de posicin que, en algunos casos, poseen valor adaptativo. Todos estos procesos tienen, adems relevancia en aspectos aplicados ms inmediatos ya que un cambio en la posicin de un gen puede cambiar la expresin o la funcin bioqumica del mismo. Se ha demostrado que el genoma de las plantas es inestable y responde al estrs provocado por alteraciones genmicas, ambientales, cromosmicas o citoplasmticas. Estos factores fsicos, bioqumicos o genticos inducen mecanismos de inestabilidad insercional o modifican el numero de copias de secuencias de ADN no codificante. La hibridacin, en la naturaleza o en prcticas de mejoramiento, ha sido, en algunos casos, un factor que desencadena mecanismos de aumento de ADN repetido. Otros experimentos han mostrado que la interaccin entre el genoma y el medio resulta en una rpida generacin de variacin. En lino, por ejemplo, se encontraron diferencias en el nmero de copias de ADN repetido entre lneas que crecan en medios con diferentes nutrientes. En lneas aloplasmicas de maz hemos encontrado que el citoplasma de teosinte provocaba activacin de elementos transponibles concomitantemente con aumento de secuencias de ADN repetido correspondientes a las zonas heterocromticas. El anlisis del contenido de ADN ha permitido evaluar rpidamente fenmenos de aneuploida y poliploida generados por estrs durante prcticas de cultivo de tejidos.

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La variabilidad intraespecfica en el contenido de ADN fue informada y probada en varios grupos taxonmicos. El maz y especies silvestres relacionadas constituyen un ejemplo de variacin intraespecfica donde est bien demostrada la variacin en el contenido de ADN debida a variacin en porcentaje de heterocromatina (ADN repetido) y en el nmero de cromosomas supernumerarios. En veintiuna razas nativas de maz del noroeste argentino ubicadas a lo largo de un gradiente altitudinal encontramos una correlacin lineal negativa significativa entre el contenido de ADN de los cromosomas normales (A) y la altitud de cultivo, esto significa que el contenido de ADN de los cromosomas del maz es menor en lugares de cultivo elevado, sugiriendo que las diferencias no pueden ser al azar y obedecen a procesos selectivos. Es interesante sealar que esta disminucin del contenido de ADN de los cromosomas A se correlaciona con un aumento en la frecuencia de cromosomas accesorios no codificantes (B). Aunque se desconocen las causas de este cline discordante entre dos tipos de ADN supernumerario no codificante (ADN repetido- cromosomas B), su repetibilidad en distintos ambientes sugiere que existen fuerzas selectivas involucradas en su mantenimiento. La presencia de cromosomas accesorios (heterocromticos, no codificantes sin funciones vitales para el organismo), en razas nativas de plantas cultivadas tales como maz y centeno, es una de las incgnitas actuales de la biologa evolutiva y aun no se comprende el papel que pueden jugar los mismos en futuros planes de mejoramiento. El particular modo de herencia de estos cromosomas accesorios (con mecanismos de impulso que hacen que se hereden con mayor frecuencia que la esperada por herencia mendeliana) abre un nuevo campo de investigacin en lo que se refiere a su utilidad como portadores de genes tiles en programas de mejora. En resumen, la evolucin del genoma eucariota ha involucrado casos de amplificacin, divergencia, reamplificacin y delecin de secuencias de ADN repetido. Estos procesos han llevado a grandes diferencias en el tamao del genoma, quedando aun muchas cuestiones por resolver en lo que se refiere a los mecanismos moleculares involucrados, la

frecuencia con que ocurren estos eventos y la relacin de los mismos con factores ambientales, genticos fisiolgicos. Resolver estas cuestiones permitir comprender el papel de la variacin del tamao del genoma en la evolucin y analizar la relevancia de la variacin del contenido de ADN con relacin a caractersticas de importancia agronmica. 5 Citogentica molecular: resolucin de problemas bsicos y aplicados El hallazgo de tcnicas para identificar genomas y cromosomas en preparaciones de rutina ha representado un gran progreso en la citogentica vegetal, ya que disponer de marcadores cromosmicos permite estudiar la organizacin del genoma y la arquitectura nuclear. Las tcnicas de bandeo (C, fluorescente) permiten revelar zonas de ADN altamente repetido (heterocromatina constitutiva), pero no diferencian la composicin molecular del ADN. En ausencia de bandas marcadoras no es posible identificar cromosomas con morfologa similar. Adems en especies algamas suele existir polimorfismo para nmero y posicin de zonas heterocromticas, lo que dificulta la caracterizacin cromosmica y la deteccin de regiones introgresadas. Un notable ejemplo de polimorfismo y politipismo para bandas heterocromticas lo constituye el estudio de lneas y razas nativas de maz. Los marcadores moleculares combinados con la citogentica resultaron ser de gran utilidad para entender la organizacin cromosmica y la distribucin fsica de las secuencias repetidas. El gran potencial de las tcnicas de hibridacin in situ resulta de combinar informacin acerca de la morfologa nuclear o cromosmica con la informacin molecular de la estructura de las secuencias. Aunque estas tcnicas se conocen desde 1969 utilizando marcacin radioactiva, en plantas se comenz a aplicar a fines de la dcada del 80 debido a la gran disponibilidad de secuencias clonadas para utilizar como sonda. Adems, la posibilidad de utilizar ADN genmico total como sonda ( GISH) y modernos sistemas de marcacin y deteccin no radioactivos han impulsado el uso de esta tcnica en forma rutinaria, complementando los resultados obtenidos por metodologas ms clsicas.

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Mediante la aplicacin de estas tcnicas se obtienen datos que podrn ser utilizados en estudios de sistemtica, filogenia, biodiversidad, evolucin, mejoramiento y biotecnologa. La hibridacin in situ (ISH) de sondas de cidos nucleicos en preparaciones cromosmicas involucra cuatro pasos fundamentales que son: 1) Obtener una sonda marcando secuencias de ADN; 2) reaccin de hibridacin entre la sonda y el ADN blanco (cromosomas), ambos desnaturalizados previamente. Las secuencias complementarias de la sonda y del ADN de los cromosomas hibridarn, en relacin a su homologa, en un sitio citolgico; 3) remocin de la sonda que no se uni o que se hibrid en forma inespecfica; 4) Deteccin de la hibridacin y visualizacin de la hibridacin a travs de fluorocromos. Una de las aplicaciones de esta tcnica (FISH o fluorescent in situ hybridization) es la obtencin de un mapa fsico, funcional y estructural del genoma utilizando secuencias de distinto origen como sondas. El anlisis de la organizacin fsica de secuencias repetidas, genes, secuencias clonadas (BACs, ESTs, ver II_3), rDNA, transgenes, retrovirus, etc., permite identificar cromosomas, analizar la arquitectura nuclear del genoma y verificar hiptesis acerca de la relacin entre posicin y funcin de determinadas secuencias. Otras aplicaciones de esta tcnica consisten en determinar la distribucin y posicin de material cromosmico extraespecfico, la existencia de apareamiento y recombinacin intergen-mica, la existencia de segregacin preferencial (responsables de herencia no mendeliana de algunos tipos cromosmicos), la presencia y tipo de rearreglos cromosmicos y analizar la segregacin de determinados cromo-somas en estudios evolutivos y planes de mejora. Estos son relevantes para comprender la relacin entre estos fenmenos y variaciones en la expresin gnica. La hibridacin in situ utilizando ADN genmico total como sonda (GISH o Genomic ISH) revela homologas especficas del ADN, principalmente en lo que respecta a secuencias repetidas y ha permitido realizar aportes relevantes en estudios evolutivos, biosistemticos y en mejoramiento vegetal.

Esta tcnica ha facilitado, por ejemplo, el reconocimiento de especies parentales en hbridos y poliploides, analizar afinidades genmicas interespecficas, detectar reestructuraciones cromosmicas, corroborar que en el ncleo existen dominios espaciales de genomas o secuencias particulares, detectar la existencia de apareamiento intergenmico y recombinacin. Adems, permite analizar la organizacin nuclear y desarrollo cromosmico en especies e hbridos; detectar la presencia de cromosomas o segmentos cromosmicos introgresantes en planes de mejoramiento; analizar afinidades genmicas interespecficas en cuanto a variacin en secuencias de ADN repetitivo disperso y determinar la naturaleza del apareamiento meitico en generaciones segregantes de hbridos y poliploides. Es importante sealar que las relaciones obtenidas mediante GISH no son afectadas por genes que producen disturbios en el apareamiento meitico (asinapsis, desinapsis, apareamiento homelogo o heterlogo). Como ya fue mencionado, el ADN repetido es el mayor componente del genoma en la mayora de los eucariontes. En maz, por ejemplo, el genoma est dominado por elementos repetidos, siendo la mayora de stos del tipo disperso (como, por ejemplo, retroelementos), los que ocuparan el 33- 62% del genoma. En el gnero Zea, por ejemplo, existen variaciones intra e interespecficas en el tamao del genoma. Su valor (2C) en especies con 2n = 20 oscila, en lneas y razas argentinas de maz, entre 4,9 y 6,9 pg (5700 Mpb) y es de 9,2 pg (8878 Mpb) en Z. luxurians . Estas variaciones, tanto intercomo intraespecficas se deberan principalmente a diferencias en la heterocromatina, reveladas por bandeo C y DAPI, que corresponderan a secuencias repetidas en tandem. Sin embargo, tanto este tipo de ADN repetido en tandem, como as tambin el disperso correspondiente a los retrotransposones, pudieron haber experimentado amplificaciones y diversificaciones durante la evolucin de las especies del gnero Zea. La tcnica GISH es, en la actualidad, la herramienta adecuada para revelar tales amplificaciones y divergencias. Esta tcnica puede discriminar en forma directa aquellos genomas que presentan secuencias tan divergentes que no existe hibridacin cruza-

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POGGIO, Lidia; NARANJO, Carlos A.

FIGURA 2. A-B, FISH: Zea luxurians (2n=20, A = las zonas amarillas brillantes muestran hibridacin con la sonda Knobs de maz marcada don digoxigenina y revelada con FITC; B = contratincin con DAPI, las zonas intensamente hibridadas en A coinciden con las zonas DAPI (+) de B.- C y D = Zea mays ssp. parviglumis , ncleo interfsico; la mayora de las zonas DAPI (+) observadas en D muestran fuerte seal de hibridacin en C; se utiliz sonda Knob de maz marcada con dioxigenina y revelada con FITC. E = Zea mays ssp. mays (2n=20 + 5 cromosomas B), hibridacin con sonda rDNA pta71 de trigo, marcada con biotina y revelada con Cy3, se sealan (puntas de flechas) los organizadores nucleolares en cromosomas y ncleo interfsico. F = Prometafase I meitica de la F1 Zea mays ssp. mays x Zea perennis (2n=30); se observan III, II y I; la seal de hibridacin se encuentra en un trivalente (sealado con flecha), se utiliz como sonda rDNA (pta71) como fue indicado en E. G-I = clula de Tricepiro; G = hibridada con sonda de ADN genmico total de centeno marcado con dioxigenina y revelada con FITC (GISH), se observan 14 cromosomas con fuerte seal de hibridacin indicando que Tricepiro posee 14 cromosomas de centeno. H = igual clula rehibridada con la sonda pSc119.2 marcada con biotina y que da fuerte seal con Cy3 (en rojo), permiti reconocer los genomas de trigo presentes en Tricepiro. I = contratincin con DAPI. La barra representa 10 micrones, todas con igual aumento. Ver explicacin extensa de las figuras en: Ferrari et al., 2001, 2004; Poggio, et al.,1999a,b y 2000.

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da entre ellas. El uso de ADN genmico total como sonda especie-especfica tiene algunas ventajas sobre sondas clonadas pues el ADN genmico total incluye un rango muy amplio de secuencias mltiple copia y es por lo tanto improbable que exista slo un lugar afn a la sonda. Esto es una ventaja cuando se necesita una amplia especificidad, ya que una sonda clonada sera homloga de algunos pocos cromosomas o segmentos de cromosomas. En los casos en que la divergencia sea leve, puede modificarse el nivel de exigencia en la hibridacin y utilizar DNA no marcado como bloqueante. Esta modificacin consiste en agregar a la mezcla de hibridacin ADN no marcado en alta concentracin. Este bloqueo no slo aumenta la diferenciacin entre la especie que se usa como sonda y la que se usa como bloqueante, sino que reduce la hibridacin cruzada con otras especies, ya que muchas plantas de la misma familia comparten muchas secuencias. Para diferenciar especies y cuando la resolucin es importante se requiere bloqueo y estricto control de exigencia. Estudios de hibridacin in situ (FISH, GISH) mostraron que el cereal sinttico Tricepiro (2n=6x=42) est compuesto por 28 cromosomas de trigo, 14 de centeno y pequeas zonas de introgresin de Thynopyrum. Mediante el uso de sondas repetidas particulares se logr identificar la totalidad de los cromosomas de Tricepiro. Experimentos con GISH han demostrado que Bromus setifolius (2n=28), es uno de los progenitores de B. pictus (2n=70), gramnea patagnica de potencial importancia forrajera. En el genero Zea la tcnica GISH nos ha permitido: analizar la afinidad genmica entre subespecies de la seccin Zea, y entre maz, teosinte y gneros relacionados. Mediante GISH hemos demostrado que existen zonas de alta homologa entre Tripsacum dactyloides (una de las especies que pudieron haber estado involucradas en el origen del maz) y Zea mays spp. mays. Estas zonas coinciden con regiones controladoras de la apomixis y secuencias neocentromricas. Estos resultados apoyan hiptesis planteadas previamente sobre la existencia de zonas de homologa entre ambas especies que favoreceran el intercambio

gentico y la transferencia de genes de importancia para el mejoramiento del maz. Estudios realizados en especies de la seccin Luxuriantes permiti determinar, mediante tcnicas de FISH, que Zea luxurians presentara secuencias telomricas de ADN altamente repetitivo. El anlisis de estas secuencias marcadoras en meiosis nos permiti resolver la constitucin cromosmica de las complejas configuraciones meiticas que se observan en hbridos intra e interseccionales. Estos resultados permitieron corroborar las frmulas genmicas planteadas para las distintas especies, avalando la hiptesis propuesta sobre el origen poliploide del maz y especies afines. Las mismas tcnicas, aplicadas en razas de maz que presentan polimorfismo numrico para cromosomas B, permitieron postular hiptesis acerca del origen de los mismos. 6 Lecturas recomendada
APPELS R., MORRIS R., BIKRAM S. & CEDRIC M. 1998. Chromosome Biology. Kluger Academic Publish. London BENNETT M. D. 1982. Nucleotype basic of spatial ordening of chromosomes in eukaryotes and the implications of the order for genome evolution and phenotypic variation. In Genome Evolution, Academic Press, London, pp. 230-261. BENNETT M. D. 1983. The spatial distribution of chromosomes, Kew Chrom. Conf. II. George Allen & Unwin. P. Brandham & M. D. Bennett (eds.). pp. 71-79. BENNETT M. D. 1984. The genome, the natural karyotype and biosystematics. In: Plant biosistematics (Grant, W.F., ed.). Academic Press, New York, pp 41-66. BENNETT, M. D. 1995. The development and use of genomic in situ hibridization (GISH) as a new tool in plant biosystematics. In: Kew Chromosome Conference IV (Brandham, P.E. and Bennett, M.D. eds.). Royal Botanic Gardens, Kew, pp 167-183. CUADRADO, A. & JOUVE, N. 1995. Fluorescent in situ hybridization and C-banding analysis of highly repetitive DNA sequence in the heterochromatin of rye (Secale montanum Guss.) and wheat incorporating S.montanum chromosome segments. Genome 38: 795-802. FELDMAN, M. & AVIVI, L. 1988. Genetic control of bivalent pairing in common wheat. The mode of Ph 1 action. In: Kew Chromosome Conference III (Brandham, P.E. ed.). Royal Botanic Gardens, Kew, pp 269-279. FERRARI, M.R., GREIZERSTEIN, H.E., PACAPELO, A., NARANJO, C.A. & L. POGGIO. 2001. Identificacin cromosmica de Tricepiro, mediante tcnicas de bandeo e hibridacin in situ (GISH). XXX Congreso Argentino

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POGGIO, Lidia; NARANJO, Carlos A.

de Gentica y IV Jornadas Argentino-Uruguayas de Gentica, Mar del Plata, 16-19 de Septiembre de 2001, pg. 80. FERRARI, M.R., GREIZERSTEIN, H.E., PACAPELO, A., NARANJO, C.A., CUADRADO, A., JOUVE, N. & L. POGGIO. 2004. The genomic composition of Tricepiro, a synthetic forage crop. Genome (Canad), en prensa. FUTUYMA, D.J. 1998. Evolutionary biology. (Third Edition). Sinauer Associates Inc. GRANT, V. 1981. Plant Speciation. Columbia Univ. Press. New York. 435 pp. GRANT, V. 1985. The Evolutionary Process. W.H. Freeeman and Co. San Francisco, 499 pag. GREIZERSTEIN, E. & POGGIO L. 1995. Meiotic studies of sponta-neus hybrids of Amaranthus: genome analysis. Plant Breeding (Alemania) 114: 448-450. GRIPYA & T. TSUCHIYA (eds) 1991. Chromosome engineering in plants: genetics, breeding, evolution. Part A. Elsvier. HARRISON, G. R. 1993. Hybrid zones and the Evolutionary Process. Oxford University Press. New York. JACKSON, R.C. & MURRAY, B.G. 1983. Colchicine-induced quadrivalent formation in Helianthus : evidence of ancient polyploidy. Theor. Appl. Genet. 64: 219-222. KING, MAX. 1993. Species Evolution. The role of chromosome change .Cambridge Univ. Press LACADENA J. R. 1996. Citogenetica. Editorial Complutense. 991 pags. LEWIN B. 2000. GENES VII. Oxford University Press, NY. NARANJO, C. A., MOLINA, M. C. & POGGIO, L. 1990. Evidencias de un nmero bsico X=5 en el gnero Zea y su importancia en estudios del origen del maz. Acad Nac Cs Ex Fis Nat, Buenos Aires, Monografa 5: 43-53. NARANJO, C. A., POGGIO, L., MOLINA, M. & BERNATEN, E. 1994. Increase in multivalent frequency in F1 hybrids of Zea diploperennis x Z. perennis by colchicine treatment. Hereditas 120: 241-244. PAGE & HOLMES. 1998. Molecular Evolution. Blackwell Science. POGGIO, L., CONFALONIERI, V., COMAS, C., CUADRADO, A., JOUVE, N. & NARANJO, C. A. 1999a. Genomic in situ hybridization (GISH) of Tripsacum dactyloides and Zea mays ssp. mays with B-chromosomes. Genome 42: 687691. POGGIO, L., CONFALONIERI, V., COMAS, C., GONZALEZ, G. & NARANJO, C. A. 1999b. Genomic affinities of Zea luxurians, Z. diploperennis and Z. perennis: meiotic behaviour of their F1 hybrids and genomic in situ hybridization (GISH). Genome 42: 993-1000. POGGIO, L., CONFALONIERI, V., COMAS, C., GONZALEZ, G. & NARANJO, C. A. 2000. Evolutionary relationships in

the genus Zea: analysis of repetitive sequences used as cytological FISH and GISH markers. Genetics and Molecular Biology (Brasil) 23,4,1021-1027. POGGIO, L., NARANJO, C. A. & JONES, K. 1986. The chromosomes of Orchids IX. Eulophia. Kew Bulletin 41:45-49. POGGIO, L., ROSATO, M. & NARANJO, C. A. 1997. Meiotic behavior in alloplasmic lines of Zea mays ssp. mays. Genome 40: 723-729. POGGIO, L., ROSATO, M., CHIAVARINO, A. M. & NARANJO, C. A. 1998. Genome size and environmental correlations in maize (Zea mays ssp. mays). Annals of Botany (UK) 82 Suppl.A:107-115. POGGIO L., ROSATO. M., MAZOTI L. B. & NARANJO, C. A. 1997. Variable meiotic behaviour among plants of an alloplasmic line of maize. Cytologia (Japn) 62:271-274, POGGIO, L.., WULFF, A.F. & HUNZIKER, J.H. 1986b. Chromosome size, nuclear volume and DNA content in Bulnesia (Zygophyllaceae). Darwiniana 27:25-38. SHARMA, A.K. & SHARMA, A. (eds.) 2001. Chomosome Painting. Principles, Strategies and Scope. Kluwer Academic Publishers, 179 pp. (Reprinted from Methods in Cell Science 23: (1-3), 2001). SOLTIS D. E., SOLTIS P. S. & DOYLE J. 1998. Molecular Systematics of Plants II. DNA Sequencing. Kluwer Academic Publishers. 574pp. STEBBINS, G.L. 1971. Chromosomal Evolution in Higher Plants. Addison Wesley Publ. Reading. Massachusetts. 216 pags. SUMNER, A.T. 1990. Chromosome banding. London Unwin Hyman.434 pp. SWANSON, C.P., T. MERZ & W.J. YOUNG. 1981. Cytogenetics. Englewood Cliffs., New Jersey. Prentice Hall, Inc. SYBENGA, J. 1975. Meiotic Configurations. Springer Verlag. 251 pp TITO, C.M., POGGIO, L. & NARANJO, C.A. 1991. Cytogenetic studies in the genus Zea. 3. DNA content and heterochromatin in species and hybrids. Theor. Appl. Genet. 83:58-64.

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PARTE III Mtodos para generar variabilidad

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CARDONE, Susana; OLMOS, Sofa; ECHENIQUE, Viviana

III.-Captulo 1
Variacin somaclonal
Cardone, Susana; Olmos, Sofa; Echenique, Viviana 1 Introduccin El comportamiento celular normal es el resultado de una compleja cascada de programas genticos que son sensibles a la disrupcin por estreses biticos y abiticos. El cultivo in vitro per se puede ser muy estresante para las clulas vegetales e involucra procesos mutagnicos durante el establecimiento del explanto, la induccin de callo, la formacin de embriones y la regeneracin de plantas. Por esta va es posible obtener variacin, de origen nuclear y/o citoplasmtica, que podra ser utilizada para el mejoramiento vegetal. Este proceso, denominado variacin somaclonal por Larkin y Scowcroft (1981), involucra cambios en las plantas regeneradas que son transmitidos a la progenie. Asimismo cabe citar la ocurrencia in vitro de interacciones no especficas que no generan variacin estable y transmisible, pero que conducen a cambios en la expresin gnica. Dichos cambios, denominados epigenticos, son tambin considerados por algunos autores como variacin somaclonal mientras que otros slo incluyen en la misma los cambios estables. Los mecanismos por los cuales ocurre la variacin somaclonal no han sido completamente dilucidados, pero entre sus causas se mencionan alteraciones en el cariotipo, mutaciones puntuales, recombinacin somtica e intercambio de cromtidas hermanas, rearreglos gnicos somticos, elementos genticos transponibles, amplificacin y/o metilacin del ADN y cambios en el ADN de las organelas. Por ello, aunque los caracteres morfolgicos (como por ejemplo el hbito de crecimiento, la morfologa floral, etc.) son fciles de evaluar, muchos aspectos de la variacin suceden sin manifestarse en cambios morfolgicos evidentes. Una diferencia estructural en un producto gnico puede no alterar su actividad biolgica lo suficiente como para producir un fenotipo modificado.

Por ello, la variacin debe analizarse a varios niveles. Esta variacin depende del genotipo, de la fuente de explanto, del tiempo en que el material ha estado sometido al cultivo in vitro, de las condiciones y composicin del medio de cultivo y de la va de regeneracin, donde la embriognesis somtica generara menores alteraciones que la organognesis. Los cambios producidos son generalmente indeseables, pero la aparicin ocasional de caracteres no encontrados en las poblaciones naturales y que representan una ventaja desde el punto de vista agronmico permite utilizar este fenmeno en programas de mejora vegetal. Se ha utilizado en algunos casos para conferir caracteres deseables a cultivares de importancia econmica, entre los que se incluyen resistencia a enfermedades, tolerancia a suelos cidos y a salinidad. El desarrollo de nuevos cultivares por esta tcnica involucra un balance entre la cantidad de variacin inducida y el mantenimiento de los caracteres agronmicos del cultivar. Como ejemplo puede citarse el caso de somaclones de pasto bermuda, Cynodon dactylon, donde se encontr resistencia a la oruga militar en un cultivar que reuna otras buenas caractersticas, dando origen al cultivar Brazos-R3. Si bien desde el punto de vista prctico no resulta una tcnica muy eficiente en todos los casos, debido a que no es posible predecir ni dirigir el tipo de variacin y se hace menester trabajar con grandes poblaciones de plantas, es necesaria la compresin del mecanismo para evitarlo en casos donde se quiere fidelidad gentica, como en la micropropagacin, la conservacin de germoplasma y la transformacin de plantas. Tambin, en algunos casos, puede representar una fuente rpida y fcilmente accesible de variacin para ser utilizada en programas de mejoramiento, especialmente para especies con sistemas genticos limitados y/o de base gentica estrecha, como en el caso de la apomixis, donde la variabilidad dentro de las poblaciones naturales o cultivadas es limitada. Los primeros casos de variacin somaclonal fueron registrados en plantas de reproduccin agmica como la caa de azcar y la papa, pero el fenmeno ha sido ob-

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servado en monocotiledneas como trigo, maz, avena, arroz, pasto miel (Paspalum dilatatum) y pasto llorn (Eragrostis curvula) y en dicotiledneas como tabaco, tomate, zanahoria y col, entre muchas otras especies. 2 Factores relacionados con la aparicin de variacin somaclonal La aparicin de la variacin somaclonal depende de varios factores, entre los que se han citado: el genotipo, el tipo de explanto, la va de regeneracin, la composicin del medio de cultivo utilizado, los reguladores de crecimiento y la duracin del perodo de cultivo. Genotipo. En general se asume que la frecuencia de cambios depender de variaciones preexistentes en el genotipo y de las interacciones que surgen entre el genotipo y el proceso de cultivo. En arroz, ciertas variedades estables muestran niveles de variacin que oscilan entre el 0 y el 1%, mientras que en otras, consideradas inestables, oscilan entre el 10 y el 27%. En Kalanchoe, especie ornamental, la variacin somaclonal es genotipo dependiente y se la utiliza como una herramienta para la obtencin de variedades. El nivel de ploida es otro factor a tener en cuenta. Por ejemplo en raigrs (Lolium multiflorum) y en papa se observ que las variedades diploides muestran estabilidad, mientras que las tetraploides tienden a generar aneuploidas durante el cultivo de tejidos. La explicacin ms razonable es que los poliploides, con ms de dos juegos completos de cromosomas, estn tamponados, y por lo tanto toleran la ganancia o prdida de cromosomas, pudiendo as cumplir con los requisitos impuestos por la regeneracin. En los diploides, la prdida o la alteracin de cromosomas que llevan genes vitales impedir la regeneracin de las plantas, llegando con xito a esta etapa slo aquellos explantos que tengan su complemento cromosmico completo. Existen evidencias de una mayor inestabilidad en hbridos interespecficos cultivados in vitro, si se los compara con las especies parentales. Como ejemplo puede citarse el caso de los hbridos obtenidos de la cruza de Hordeum vulgare x Hordeum jubatum ,

donde el cultivo in vitro gener entre un 5% y un 10% de regenerantes haploides que contenan slo el genoma de Hordeum vulgare. Por esta causa ciertos cruzamientos interespecficos suelen utilizarse como metodologa para la obtencin de haploides. Explanto. La variacin tambin puede ser una consecuencia de quimerismo en el explanto original. Las quimeras son mosaicos genticos. Esto significa que dentro de una misma planta existen clulas con diferente constitucin gentica, lo cual se debe a una serie de cambios producidos durante el desarrollo en el ADN nuclear de ciertos tipos celulares. Si estos tejidos se utilizan como explantos y sus clulas son inducidas a dividirse y rediferenciarse, las diferentes lneas celulares podran entonces dar origen a plantas genticamente diferentes. Por lo tanto, la utilizacin de explantos con tejidos quimricos preexistentes puede resultar en una fuente extra de variacin. Sin embargo, la recuperacin de quimeras a partir de explantos no quimricos es un fenmeno frecuente que puede ocurrir a partir de procesos organognicos. La utilizacin de explantos con tejidos organizados como esquejes radicales o caulinares sera una buena opcin si es necesario mantener estabilidad gentica durante el cultivo in vitro. Sin embargo, diferentes genotipos reaccionan de manera distinta, an con explantos seguros. Parecera que el cultivo de meristemas aislados sera la mejor opcin para minimizar el riesgo de variacin somaclonal. Sin embargo, esto no debera tomarse como regla. Utilizando tcnicas moleculares fue posible detectar la ocurrencia de variacin en plantas de frutilla y paraso obtenidas a partir de meristemas. El cultivo de protoplastos parecera inducir, en ocasiones, inestabilidad gentica, como fue observado en papa y Nicotiana. Esto, en ocasiones, ha sido asociado a los mayores tiempos en cultivo involucrados en la regeneracin de plantas a partir de explantos tan pequeos. La va de regeneracin tambin tiene un rol importante en la ocurrencia de alteraciones en plantas obtenidas in vitro. En especies de los gneros Pennisetum, Panicum, y Lolium la variacin observada en cultivos embriognicos es relativamente menor que

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la que aparece en cultivos organognicos. Esto probablemente se debe a la gran presin de seleccin impuesta en la formacin de los embriones, mayor que la requerida en la formacin de vstagos. Se postula que el gran nmero de genes requeridos para la iniciacin y maduracin de embriones cigticos y somticos impedira la acumulacin de mutaciones deletreas. Sin embargo, se observaron variantes en plantas de caf, apio y caa de azcar regeneradas a travs de embriognesis somtica. En estos casos se observ que algunos fenotipos anormales de embriones somticos se asemejan a los mutantes del desarrollo embrionario obtenidos en Arabidopsis y maz. La mayor parte de la variacin obtenida in vitro parece provenir de la fase de callo. La iniciacin de un callo puede ser anloga a la respuesta de las plantas a heridas, que se sabe que activan elementos transponibles y estimulan la induccin de enzimas y productos especficos que se inducen tambin en situaciones de estrs. Cuando comienza la divisin celular a partir de tejidos diferenciados, que dar origen a un callo, se incrementa el riesgo de inestabilidad cromosmica. La variacin que ocurre en los nmeros cromosmicos en la primera fase de la induccin del callo sera el resultado de fragmentacin nuclear seguida por mitosis de los fragmentos nucleares, combinada con la mitosis normal de los ncleos intactos (ncleos euploides). La naturaleza del callo tambin puede afectar el nivel de variacin obtenida. Un callo verdadero es una masa de clulas desdiferenciadas que proliferan desorganizadamente, lo cual probablemente genera considerable variacin. En varias monocotiledneas, el callo representa, a menudo, una masa de rganos suprimidos o proembriones ms que un tejido completamente desorganizado. Este tipo de callo mantiene un alto grado de estabilidad gentica, como se ha observado en esprrago. En un estudio realizado en Cymbopogon se observ que muchas de las plantas regeneradas a partir de callos de semilla fueron anormales, mientras que las obtenidas por callos de inflorescencias fueron muy semejantes a las plantas de las cuales provenan los explantos. En ocasiones tambin fue posible

observar variacin en plantas obtenidas por regeneracin directa, es decir, sin que medie un proceso previo de desdiferenciacin celular y formacin de callo. Medio de cultivo. El estado fsico del medio de cultivo tambin influye en el nivel de variacin obtenida. Un mismo explanto puede tener diferente comportamiento si se lo cultiva en medio slido o en medio lquido. Otro factor importante es la temperatura, que puede inducir inestabilidad cariotpica o puede incrementar el nmero de plantas albinas. Los reguladores de crecimiento, principalmente el 2,4-D (cido 2,4 diclorofenoxiactico) han sido sealados como inductores de inestabilidad. Ejercen profundos efectos sobre la respiracin celular, el consumo de azcares y en el control de la divisin celular. Por ello se especula acerca de su rol indirecto en la induccin de cambios en el metabolismo celular y tisular de plantas creciendo in vitro. Si bien el modo de accin herbicida del 2,4-D no es totalmente comprendido, aparentemente involucra un incremento sustancial en la transcripcin que puede alterar la estructura de la cromatina, siendo utilizado en gramneas como inductor de aneuploidas. Lo que algunos autores sugieren es que el 2,4-D induce desdiferenciacin y este proceso sera el generador de los cambios. La fragmentacin nuclear amittica citada anteriormente observada en algunas plantas regeneradas tambin se reconoce como causa de aneuploida. Este fenmeno es causado por una relacin especial auxina:citocinina. El 2,4-D, el AIA (cido indolactico) y el ANA (cido naftalenactico) han sido sealados como los responsables de los incrementos en la metilacin de la citosina que tiene lugar durante el cultivo in vitro. Los sectores en el ADN, donde la citosina se encuentra metilada en posicin 5 son considerados puntos calientes de mutacin, ya que la desaminacin de una 5-metil citocina resulta en un cambio de la base de citocina a timina. Las auxinas naturales y sintticas tienen una elevada correlacin con el porcentaje de 5metil citocina, las citocininas no tienen efecto en este sentido.

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Estudios tendientes a analizar los efectos de los reguladores de crecimiento sobre la regeneracin de plantas a partir de protoplastos, realizados en papa, indicaron que la variacin en el tipo y concentracin de reguladores de crecimiento en los estadios iniciales de cultivo no generara variacin gentica. Sin embargo, si el cambio en la composicin de los reguladores ocurre en el estadio que va desde el crecimiento del callo a la iniciacin de los vstagos, se generan elevados niveles de variacin gentica. Estos datos sugieren que la fase de callo sera un perodo sensible en el cual la manipulacin hormonal afecta la estabilidad de las plantas regeneradas, de manera que las hormonas induciran la inestabilidad gentica sin ser, necesariamente, el origen de la misma. Otro factor a considerar es la deficiencia de oxgeno que se genera durante el curso del cultivo. La tensin de oxgeno de las clulas en la superficie del callo es diferente a la de aquellas clulas que se encuentran situadas profundamente en la masa del mismo. La anaerobiosis resultara en la produccin de etanol, el cual podra comportarse como un mutgeno. Tambin existen especies de plantas que producen compuestos mutagnicos durante el cultivo. Un efecto similar podra tener la acumulacin de metabolitos producidos por las propias clulas durante el proceso. Se ha mencionado que las condiciones de cultivo in vitro podran afectar los niveles de resistencia celular al efecto de los metabolitos que normalmente se encuentran presentes en los tejidos en bajas concentraciones. La edad del cultivo es otro factor que afecta el nivel de variacin, aumentando la proporcin de variantes en cultivos envejecidos y tambin en plantas obtenidas a travs de varios subcultivos. Esto se ha observado en ajo, maz, avena, tabaco, triticale y raigrs triploide. La variacin puede minimizarse realizando subcultivos frecuentes de explantos no envejecidos. El nmero ptimo de subcultivos podra estimarse empricamente luego de realizar pruebas de fidelidad gentica en las plantas regeneradas a travs de subcultivos subsecuentes. Una observacin comn es que en los perodos prolongados de cultivo hay una prdida de totipotencia y que esto sucedera debido a la acumulacin

de mutaciones y a la alteracin de los genes que son responsables de la regeneracin. Sin embargo, un estudio realizado por nuestro grupo de trabajo en la UNS, en colaboracin con el IBONE, demostr que las variaciones se producen al azar en los diferentes subcultivos, no habiendo una relacin lineal entre el nmero de subcultivos y la cantidad de variacin obtenida en plantas micropropagadas de paraso gigante. La variacin en este caso se detect mediante la tnica de RAPD a lo largo de de 10 subcultivos (Olmos y col., 2002). La deficiencia o exceso de minerales tambin podra afectar la estabilidad gentica in vitro. Se ha observado que las deficiencias o excesos de azufre, fsforo, nitrgeno, calcio y magnesio pueden resultar en cambios genmicos. En la variedad de lino Stortmont Cyrrus se detectaron cambios genticos estables y heredables inducidos por una alta fertilizacin del suelo con fsforo o con nitrgeno. Varias lneas estables obtenidas, fundamentalmente una llamada L y otra llamada S, denominadas genotrofos, se caracterizaron por poseer diferentes contenidos de ADN nuclear, de ADN repetitivo y diferencias a nivel del ADN ribosomal. 3 Cambios genmicos producidos durante el cultivo de tejidos Las plantas poseen una amplia capacidad de acomodarse a las situaciones cambiantes de su entorno, pero en algn momento esa capacidad de amortiguacin se vuelve deficiente y los organismos caen en un estado de crecimiento subptimo que podra inducir a mecanismos generadores de cambios genmicos. Las bases metablicas de la interaccin entre el estrs y estos cambios son desconocidas. Sin embargo, en la literatura se menciona la posibilidad de ocurrencia de alteraciones a nivel del ADN a consecuencia de diferentes estreses ambientales, dependiendo de la intensidad del estrs y del estado de diferenciacin de las clulas en el momento de experimentarlo. Estos cambios ocurren probablemente debido a un mecanismo de respuesta al estrs que comprende la prdida del control del ciclo celular. En el caso de un callo, la desdiferenciacin que se produce durante la induccin del mis-

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mo provoca en las clulas una serie de procesos metablicos que resultan en reordenamientos genmicos que podran dar lugar a fenotipos alterados. Entre las alteraciones genticas registradas durante el cultivo in vitro pueden citarse mutaciones gnicas, cambios cromosmicos que involucren la estructura o el nmero de los cromosomas y activacin de elementos genticos transponibles. Tambin existen anomalas, como el intercambio entre cromtidas hermanas o el crossing over somtico, que pueden alterar su frecuencia de aparicin en plantas regeneradas respecto de plantas que no pasaron por cultivo in vitro. Varias hiptesis han intentado explicar y relacionar la serie de eventos que tienen lugar durante el cultivo in vitro, como por ejemplo las perturbaciones del ciclo celular, las aberraciones estructurales y numricas, los cambios en la metilacin y las mutaciones gnicas. Kaeppler y Phillips (1993) han propuesto una base molecular comn para todos estos eventos mutagnicos. Tal mecanismo podra afectar la expresin gnica y la estructura de la cromatina. Un posible mecanismo involucra alteracin en los patrones de metilacin. Esta hiptesis establece que el estrs inducido por el proceso de cultivo in vitro, al involucrar efectos hormonales y desbalance en el conjunto de nucletidos, provoca alteraciones en los patrones de metilacin del ADN. Estas alteraciones podran afectar la expresin de genes especficos, incluyendo elementos transponibles y/ o podran afectar la estructura de la cromatina de una manera ms global, involucrando, por lo tanto, a un gran nmero de genes. Los cambios en la metilacin del ADN podran estar relacionados con la replicacin tarda de la heterocromatina, que, en definitiva resulta en eventos de ruptura cromosmica. El mecanismo por el cual se producen los cambios en metilacin no ha sido totalmente dilucidado. Kaeppler y Phillips (1993) indican que plantas bajo estrs severo de nutrientes o de agua no presentan estos cambios de metilacin encontrados en los regenerantes de cultivo in vitro. Esto podra indicar que la variacin en metilacin no es una respuesta general a todos los estreses.

El cultivo de tejidos podra representar, por lo tanto, un tipo muy particular de estrs que podra inducir una respuesta nica y un perfil particular de mutacin. Un posible efector de esta variacin en la metilacin sera la alta concentracin de reguladores de crecimiento utilizada para inducir a las clulas a crecer en cultivo. El 2,4-D provoca cambios en la estructura de la cromatina en pices de raz de echalote y tambin en cultivos de clulas humanas. Las auxinas podran ejercer el mismo efecto durante el cultivo de tejidos vegetales. Se cree, adems, que los cambios en los modelos de metilacin causados por el cultivo de tejidos no seran aleatorios. En este sentido, en raigrs se ha propuesto la existencia de puntos calientes de inestabilidad en el ADN genmico. Los puntos de ruptura de muchas de las alteraciones estructurales presentes en las plantas regeneradas se hallan en zonas heterocromticas, de manera que parecera que la variacin somaclonal no es al azar y que habra loci especficos que tendran mayor tendencia a la mutacin. Los cambios estructurales que no estn asociados a cambios en el dosaje gnico o a cambios en la regulacin suelen pasar desapercibidos fenotpicamente, pero pueden causar infertilidad. Por otra parte ocurren tambin cambios genmicos que involucran alteraciones en el nmero de cromosomas, como aneuploidas y poliploidas. La poliploida es el ms comn de estos fenmenos y estara relacionada con fallas en la mitosis, mientras que la aneuploida puede surgir por segregacin desigual en la mitosis o por fragmentacin nuclear, seguida de mitosis. A veces estos cambios en el nmero cromosmico pueden afectar el fenotipo a travs de dosajes gnicos alterados. En papa, por ejemplo, se observaron fenotipos aberrantes por aneuploida o por duplicacin cromosmica; sin embargo, no todos los regenerantes aneuploides o poliploides pudieron detectarse a nivel fenotpico. Los cambios pueden ocurrir tambin en el genoma de los plstidos y las mitocondrias. Como ejemplo puede mencionarse la restauracin parcial de la fertilidad en plantas de sorgo androestriles obteni-

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das in vitro. Tambin puede citarse el caso del cultivo in vitro de plantas androestriles de maz con citoplasma T (susceptibles a Helminthosporium maydis), que condujo a la reversin de la androesterilidad y de la susceptibilidad. Estos cambios se corresponderan con mutaciones en el ADN mitocondrial. Otro caso de variacin debida al cultivo in vitro es el albinismo, problema que se presenta frecuentemente en el cultivo de anteras en las Gramneas. El anlisis de los genomas de cloroplastos de plantas albinas de trigo obtenidas a partir del cultivo de anteras revel la presencia de deleciones y rearreglos. Si bien parecera que los tejidos somticos son menos sensibles a la variacin, tambin se ha observado albinismo en plantas regeneradas a partir de los mismos. Como puede apreciarse a travs de los casos mencionados, son varios los mecanismos que conducen a la variacin somaclonal. Como se mencionara anteriormente existen, adems, variaciones epigenticas, que no son estables y que son el resultado de cambios en los patrones de metilacin del ADN y de amplificaciones gnicas, provocados por las condiciones microambientales del cultivo de tejidos. Caractersticas tales como el acostumbramiento a la citocinina y la resistencia a heladas pueden citarse como ejemplos de este tipo de variacin. La comprensin de los mecanismos por los cuales ocurre la variacin somaclonal ayudara a comprender y definir los procesos celulares de respuesta al estrs y permitira definir cmo los mismos actan en los procesos de evolucin (Kaeppler et al., 2000). 4 Niveles de deteccin de la variacin somaclonal Es evidente que los mecanismos que operan para inducir variacin son numerosos y diversos, y probablemente actan simultneamente, conduciendo a cambios en caracteres cuali y cuantitativos. Detectar y analizar los distintos niveles de modificaciones genmicas generadas por cultivo in vitro reviste inters desde un punto de vista prctico, ya que las mismas podran ser potentes fuentes de material para seleccionar caracteres de inters y, desde un punto de vista terico, ya que posibilitaran realizar estudios

bsicos acerca de la variacin y el posible control de la misma. La ocurrencia de variacin somaclonal puede detectarse con marcadores fenotpicos, bioqumicos y moleculares. La correlacin de dichos marcadores con caracteres agronmicos es un requisito relevante para su implementacin en los programas de mejoramiento. Se citan a continuacin algunos ejemplos de la utilizacin de marcadores de varios tipos en la evaluacin de la variacin somaclonal.. La utilizacin de marcadores morfolgicos para detectar variantes somaclonales ha sido exitosa y citada en varios trabajos de investigacin. El examen visual y la utilizacin de un analizador de imgenes posibilitaron la diferenciacin entre fenotipos normales y aberrantes de plantas regeneradas de Pelargonium x hortorum Ro. Plantas de (man) presentaron variaciones epigenticas en altura, tamao de hojas, nmero y peso de semillas. El cultivo in vitro de yemas de anan dio como resultado plantas que exhiban cambios estables en el tamao de frutos, tasa de proliferacin de vstagos y color y textura de las hojas; el cultivo de tejidos de violeta africana, variedad Crimson Frost, result en un 67% de variacin en el color de las flores de las plantas regeneradas. A nivel fisiolgico, se detectaron y seleccionaron variaciones en cultivo de clulas y tejidos por presentar resistencia a enfermedades, tolerancia a herbicidas, sales, diferencias de crecimiento en condiciones de pHs variables, entre otros, tanto para cereales como para plantas frutales. La mayora de estos estudios se basaron en la implementacin de una alta presin de seleccin durante la etapa de regeneracin celular mediante la adicin de agentes selectivos en el medio de establecimiento y regeneracin, tales como inculos, toxinas, herbicidas, condiciones de pH extremas o concentraciones salinas elevadas. El estudio del cariotipo permite detectar cambios en el nmero y estructura de los cromosomas. De esta manera podran detectarse translocaciones, inversiones, deleciones y duplicaciones. Los cambios cariotpicos constituyen una fuente importante de variacin que muchas veces es subestimada cuando se realizan recuentos cromosmicos. Por esto

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mismo existen otras tcnicas que estiman cambios cariotpicos con mayor eficiencia, como por ejemplo el bandeo cromosmico. Esta tcnica fue aplicada a suspensiones celulares de Brachycome dichromosomatica (2n = 4), donde permiti detectar rearreglos importantes en individuos donde el nmero cromosmico permaneci estable. La hibridacin in situ es otra de las tcnicas que podra aportar informacin til para detectar cambios genticos estructurales. Entre los marcadores bioqumicos utilizados para analizar progenies de plantas regeneradas pueden mencionarse las isoenzimas, que permitieron detectar entre un 24 a 35% de variacin en plantas de Populus tremuloides regeneradas a travs de callos. Esta variacin fue detectada mediante electroforesis en geles de almidn utilizando los sistemas isocitrato deshidrogenasa (IDH) shiquimato deshidrogenasa (SKDH), malato deshidrogenasa (MDH), fosfogluco- isomerasa (PGI) y 6-fosfogluconato - deshidrogenasa (6-PGD). Los patrones electroforticos permitieron caracterizar a las plantas fenotpicamente normales y anormales. Sin embargo, las plantas albinas obtenidas en este estudio no presentaron polimorfismos en los loci estudiados. En otros casos el anlisis isoenzimtico no permiti detectar variacin. El estudio de lneas de callos derivadas de embriones cigticos y de embriones somticos de abeto (Picea glauca x engelmannii) utilizando 15 sistemas isoenzimticos no evidenci la presencia de variacin somaclonal en 25 loci analizados. Los patrones isoenzimticos de lneas isognicas de Trifolium pratense L. que diferan en su capacidad de regeneracin, resultaron idnticos para los sistemas de peroxidasas, glutamato deshidrogenasas, alcohol deshidrogenasas y esterasas. Las isoenzimas, por lo tanto, pueden proveer informacin til acerca de la variacin generada in vitro. Sin embargo, se estn analizando los productos de genes expresados, cuya regulacin puede estar en cierta medida afectada por factores ambientales o fisiolgicos. Por otro lado, slo se transcribe y traduce una pequea proporcin del genoma. Por ello, los mtodos de anlisis a nivel molecular pueden proporcionar mucha informacin, ya que las secuencias de ADN son

esencialmente las mismas en todas las clulas vivas de la planta, independientemente del estado fisiolgico o de desarrollo de las mismas. Los marcadores moleculares presentan varias ventajas a la hora de detectar inestabilidad gentica debido a su amplia cobertura del genoma y a que no son influenciados por el ambiente ni por los estados fenolgicos de las plantas. Utilizando RAPD pudo detectarse la existencia de polimorfismos en plantas de Triticum tauschii obtenidas mediante callognesis. Los RAPD para diagnosticar fidelidad gentica en plantas regeneradas por cultivo in vitro han sido utilizados en Pinus mariana (Mill), Festuca pratensis Huds., Picea abies , Quercus suber L.y Panax notoginseng. En Phalaenopsis se ha encontrado correspondencia entre variaciones morfolgicas y moleculares, pudindose discriminar plantas normales de variantes morfolgicas mediante la combinacin de perfiles RAPD generados por 38 cebadores. En otros casos no ha sido posible realizar esta asociacin, probablemente debido a la necesidad del empleo de un mayor nmero de cebadores. En Pelargonium x hortorum Ro el empleo de un conjunto de 13 cebadores permitieron la deteccin de polimorfismos en solamente el 50% de las plantas con fenotipos aberrantes. En Mentha arvensis se obtuvieron perfiles RAPD polimrficos con 12 cebadores en las 6 plantas fenotpicamente diferentes obtenidas por micropropagacin. En otro estudio se observ que no todas las plantas de Musa de fenotipo anormal (enanas) obtenidas presentaban el mismo patrn de bandas. En este mismo gnero, la tcnica permiti detectar polimorfismos en plantas micropropagadas de fenotipo normal. Esto indicara que la variacin molecular no siempre se expresa a nivel fenotpico y viceversa. Existen otros ejemplos que corroboraran esta afirmacin, tal es el caso de la palmera datilera (Elaeis guineensis Jacq.), donde no se detectaron polimorfismos en plantas regeneradas que haban presentado fenotipos florales anormales o el de plntulas micropropagadas de Populus deltoides, donde a travs de la utilizacin de microsatlites se detectaron polimorfismos en plantas

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fenotpicamente normales. Otros marcadores moleculares utilizados con xito para la evaluacin de variacin somaclonal, como los AFLP, permitieron detectar en banana la existencia de diferencias a nivel molecular entre plantas regeneradas de fenotipo normal y aberrantes. A veces, para detectar un cambio es necesario realizar pruebas especficas. Por ejemplo, se evaluaron somaclones de Cynodon dactylon en laboratorio, invernculo y a campo para resistencia a la oruga militar. Un somaclon, el Brazos-R3 (Croughan y col., 1994), tena un rendimiento a campo equivalente al del cultivar madre, pero adems era resistente a dicho insecto. Esto fue debido a que produca menores niveles de un estimulante para la alimentacin del insecto. Es decir que mantena los caracteres agronmicos positivos del cultivar parental, pero tena un cambio en la produccin de un metabolito secundario que confera resistencia a la oruga. 5 La variacin somaclonal y su aplicacin en el mejoramiento gentico de las plantas La base del mejoramiento gentico es la optimizacin de interacciones gnicas. Para lograr combinaciones gnicas ptimas o superiores se requiere de diversidad gentica. Esta diversidad, que se encuentra normalmente en las poblaciones de individuos, puede provenir de cruzamientos sexuales, mutaciones inducidas (fsicas o qumicas o producidas por ADN-T o por elementos transponibles o retrotrasposones), hibridacin somtica y transformacin gentica. La variacin somaclonal proveera una fuente adicional de variabilidad gentica, utilizable en programas convencionales de mejoramiento. Algunas de las ventajas que presenta la variacin somaclonal pueden resumirse de la siguiente manera:

que son difciles de mejorar a travs de tcnicas tradicionales. Es exitosa para eliminar uno o pocos defectos en cultivares bien adaptados. Puede utilizarse para mejorar especies de propagacin sexual y vegetativa. Las tasas de mutacin son relativamente altas si se comparan con las tasas de mutaciones espontneas. La variacin somaclonal ocurre con una frecuencia de 1 mutacin cada 100 plantas regeneradas, en contraste con la tasa esperada de mutacin espontnea de 10-7 10-9 mutaciones por par de nucletidos por generacin. El conocimiento de las condiciones que generan inestabilidad gentica durante el cultivo in vitro permitira utilizar el fenmeno como estrategia de mejoramiento y permitira eludirlo en aquellos casos en que se requiera estabilidad gentica, como en la micropropagacin, la conservacin de germoplasma y la transformacin gentica. El nivel de cambios no deseados es menor que cuando se utilizan mutgenos qumicos o fsicos, ya que, en el caso de la variacin somaclonal, la mayora de los cambios deletreos producidos son eliminados por el filtro que representa la regeneracin de plantas. Entre las desventajas cabe mencionar:

Es relativamente poco costoso generarla: requiere de un laboratorio de rutina y facilidades de campo. Constituye una forma rpida de generar variabilidad gentica, particularmente para cultivos con base gentica estrecha y

En algunos casos, las variantes somaclonales no han avanzado de la etapa de laboratorio o invernculo, probablemente debido a que el material seleccionado tiene poca importancia prctica. La escasa regeneracin de plantas en cultivos de largo trmino. Generalmente en estos casos existe prdida de la capacidad morfognica. La regeneracin est limitada a genotipos especficos que pueden no ser de mucho inters para los mejoradores. Algunos somaclones son inestables (originados por variacin epigentica). Algunos presentan alteraciones no deseables como aneuploida, esterilidad, etc.
Desde el punto de vista productivo y comercial, una variante somaclonal debera cumplir los siguientes requerimientos:

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Involucrar caracteres agronmicamente


tiles. El nivel de expresin del carcter debe superar al de sus progenitores. El carcter mejorado debe estar combinado con todos los otros caracteres agronmicos de la variedad que son importantes para el cultivo. La variacin debe ser heredable (o bien estable) en las generaciones subsiguientes. En general, los mejoradores buscan en los somaclones caracteres de importancia prctica. La estrategia es utilizar cultivares altamente adaptados para modificar unos pocos caracteres, ya que resulta ms sencillo mejorar selectivamente una variedad corriente que crear una nueva. 5.1 Estrategias para la seleccin de variantes tiles Las estrategias que se han utilizado para obtener variacin somaclonal comprenden:

etapa de multiplicacin de semillas, que permitir realizar pruebas agronmicas en diferentes ambientes, al menos en dos aos distintos, para evaluar los efectos del componente ambiental en la expresin del carcter. El programa finaliza con la etapa de multiplicacin de semillas para el lanzamiento de la variedad nueva al mercado. Una modificacin para la produccin de nuevas variedades est basada en el empleo de variantes gametoclonales (Fig. 1). Si se utilizan clulas haploides como fuente de tejido, las variantes obtenidas se denominan variantes gametoclonales. Los gametoclones

a) La obtencin de plantas por cultivo de clulas o tejidos, que luego son analizadas para el carcter deseado. La Figura 1 resume los pasos a seguir para la obtencin de un cultivar por variacin somaclonal. Para este fin se cultiva la mejor variedad Figura 1: Estrategia para la produccin comercial de variantes disponible y se seleccionan, entre las somaclonales (izquierda) y gametoclonales (derecha) en arroz. plantas regeneradas, aquellas que expresen el carcter de inters. Estas plan- se refieren a regenerantes haploides duplitas (generacin R0) se emplean para generar cados, derivados del cultivo de anteras. Esta progenies sexuales (en el caso de plantas con metodologa tendra la ventaja de permitir este tipo de reproduccin), sobre las cuales recuperar caracteres recombinantes adems se vuelve a realizar la seleccin para el carc- de los que pudieran surgir in vitro. Las planter agronmico buscado, tratando de man- tas haploides obtenidas son duplicadas metener a la vez todas las caractersticas favora- diante la exposicin al alcaloide colchicina. Las bles de la variedad. En plantas autgamas, evaluaciones a campo se realizan en forma como trigo, arroz y cebada, se considera conjunta a medida que los nuevos materiaaceptable la evaluacin de la estabilidad del les van siendo multiplicados, de manera de carcter hasta la generacin R4. A partir de aumentar las replicas bajo diferentes condieste momento pueden realizarse cruzamien- ciones ambientales. tos de las plantas R4 selectas con las lneas b) La seleccin a nivel celular, seleccin parentales a fin de determinar, mediante el anlisis de segregacin, la base gentica del in vitro, que se hace con el objetivo de obcarcter mejorado. Posteriormente viene la tener resistencia a estreses biticos o

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abiticos y se utiliza generalmente para caracteres tales como resistencia a toxinas fngicas, herbicidas, concentraciones salinas elevadas y temperaturas extremas. Mediante esta estrategia pueden cultivarse explantos de distintos genotipos y observarse el comportamiento de los callos frente al agente selectivo, en condiciones de laboratorio. Una vez seleccionados los genotipos resistentes se procede a la regeneracin de las plantas, que son analizadas para ver si expresan la resistencia a campo y luego son introducidas en el programa de mejoramiento. La seleccin efectuada sobre cultivos celulares in vitro puede llevarse a cabo mediante dos modalidades: - Seleccin directa en un solo paso, donde el agente de seleccin es utilizado en concentraciones dobles o triples Figura 2: Seleccin in vitro de plantas de arroz tolerantes a altas de la MIC (concentracin m- concentraciones de aluminio nima que produce un 100 % racin de callo en el medio de cultivo al que de inhibicin). - Seleccin en varios pasos, donde la con- se ha adicionado aluminio es indicadora de centracin del agente selectivo es gradual- la tolerancia del genotipo al metal en cuesmente incrementada en cultivos sucesivos y tin. Una vez que se han regenerado las plantas se requieren posteriores evaluaciones a frecuentes. El primero es un mtodo simple y efecti- campo, en suelos con concentraciones elevo, ya que las clulas sensibles al agente mo- vadas de aluminio, a fin de corroborar la toriran, permitindo el crecimiento de las tole- lerancia evidenciada in vitro por los materiarantes. Sin embargo, elevados niveles de les. A continuacin se citan ejemplos donde estrs seran deletreos a nivel celular, eliminando materiales que tal vez, con un mayor se combin la seleccin in vitro con la subsinivel de diferenciacin tisular hubiesen sido guiente regeneracin de plantas: capaces de regenerar plantas tolerantes. La - Produccin in vitro de plantas de arroz eleccin de un mtodo u otro depender de un monitoreo preliminar que proporciona resistentes a concentraciones txicas de aluuna indicacin acerca de la reaccin del teji- minio. Se obtuvieron plantas resistentes utido vegetal a las concentraciones letales y lizando distintas concentraciones de aluminio en el medio de cultivo. Por otro lado, se subletales del agente selectivo. En la Figura 2 se representan las etapas observ la aparicin de plantas resistentes a de la seleccin in vitro. En el ejemplo dife- partir de callos de variedades susceptibles rentes lneas de arroz son evaluadas para to- mantenidos en medio de cultivo desprovislerancia al aluminio. La induccin y la prolife- to de aluminio. Estos estudios indicaran que CARDONE, Susana; OLMOS, Sofa; ECHENIQUE, Viviana

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el cultivo in vitro per se puede originar modificaciones tiles en el genoma de arroz. - Obtencin de resistencia a Fusarium oxysporum en clavel. El cultivo de segmentos internodales de dos cultivares de clavel susceptibles a Fusarium oxysporum f.sp. dianthi permiti, luego de dos ciclos de seleccin, la obtencin de callos resistentes que se utilizaron para regenerar plantas. El 32% de las plantas regeneradas a partir estos callos evidenci considerable resistencia al patgeno en experimentos de campo. La bsqueda de variantes a nivel celular permitira verificar y seleccionar fenotipos adecuados entre millones de clulas, con una inversin menor en tiempo, espacio y dinero y ha sido extensamente utilizada en diferentes cultivos. Sin embargo, no existe total garanta de que la resistencia manifestada in vitro se expresar a nivel de la planta entera. Hay diferentes explicaciones para este fenmeno, como por ejemplo que la resistencia o tolerancia observada se deba a cambios epigenticos, a la naturaleza quimrica del material, al uso de toxinas no especficas (en el caso de resistencia a enfermedades), a la complejidad del carcter a ser seleccionado (como por ejemplo la resistencia a salinidad o sequa) o a la falla de las clulas para expresar el carcter cuando se diferencian. En ambos casos (a y b) la obtencin de resistencia slo ser posible si sta existe en la poblacin original (entonces el cultivo servira slo para recuperar los genotipos tiles) o bien si surge por variacin somaclonal durante el proceso de cultivo. 6 Variantes somaclonales liberadas comercialmente La variacin somaclonal fue utilizada para la produccin de variedades comerciales con caracteres agronmicos superiores en diferentes especies. A continuacin se enumera, para cada especie, el carcter agronmico seleccionado y el centro de investigacin responsable de dicho logro: en geranio, aquitectura florar (Purdue Univ., USA); en batata: calidad de races y arquitectura de la canopia (North Carolina Research Service, USA); en caa de azcar: resistencia a estrs y a enfermedades (Sugarcane Research Cen-

tre, Fiji); en maz: contenido de triptfano (Molecular Genetic, USA); en tomate y apio: contenido de materia seca y rendimiento, respectivamente (DNA Plant technology of New Jersey, USA); en arroz: resistencia a enfermedades (Plantech Research Institute, Japan y Univ. Agricultural Sciences, Hungary); en mostaza: rendimiento (ICAR, India). Las primeras observaciones de variacin en caracteres morfolgicos fueron realizadas en arroz y otras especies a partir de 1968. Diez aos ms tarde se inform en detalle la variacin obtenida en la progenie de plantas de arroz cultivadas in vitro y autopolinizadas. Tambin se encontraron alteraciones en la altura de la planta, la longitud del tallo y otras caractersticas en alfalfa. En arroz, la variacin somaclonal result en el mejoramiento de varios caracteres cuantitativos, incluyendo parmetros morfolgicos, caracteres agronmicos y tolerancia a estreses biticos y abiticos. Pueden mencionarse adems otros ejemplos de variacin somaclonal en cultivos agrcolas de inters, como por ejemplo caa de azcar , donde se obtuvieron somaclones provenientes del cultivar Pindar resistentes a una virosis transmitida por fidos. Paralelamente, tambin por variacin somaclonal, se seleccion el cultivar Ono, que presenta resistencia al downy mildew, causado por Sclerospora sacchari. En papa, el cultivo de protoplastos obtenidos de suspensiones celulares cromosmicamente variables produjo gran cantidad de variantes somaclonales del cultivar Russet Burbano, que presentaron resistencia a Phytophthora infestans, a Alternaria solana y a la colonizacin por fidos que transmitan el virus Y de la papa (PVY) y el virus del enrrollamiento de la hoja (PLRV). Se encontr tambin tolerancia a glifosato en somaclones de cebada regenerados en medios conteniendo el herbicida. En sorgo se encontr variacin somaclonal estable para altura, nmero de macollos, mayor produccin de granos y mayor nmero de semillas y tolerancia a suelos cidos y a sequa. La incidencia de variacin somaclonal en banana se encuentra extensamente documentada. En el caso de cultivares comerciales de banana Cavendish en Taiwn se obtu-

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vo resistencia a la Raza 4 de Fusarium oxysporum f. sp. Cubense. Estos cultivares no haban podido ser mejorados por mtodos tradicionales. No obstante, para lograr una variedad con rendimiento equiparable a las variedades no resistentes se necesitaron varios ciclos de micropropagacin adicionales, que permitieron combinar ambas caractersticas en un somaclon. Otros ejemplos donde se han obtenido cultivares por variacin somaclonal son tabaco (tolerante a aluminio y resistente a herbicida), trigo (resistente a Helminthosporium sativum) y alfalfa (resistente a Fusarium oxysporum). Se han detectado tambin caracteres interesantes modificados por esta tcnica para

su explotacin comercial en ornamentales, como por ejemplo variacin en el color de las flores en gerbera, clavel y crisantemo. En gramneas forrajeras puede citarse variacin cromosmica en Festuca arundinacea y pasto llorn ( Eragrostis curvula), albinismo en Lolium perenne y Festuca pratense, cambios en la morfologa de planta, forma y tamao de hoja y espiga, desarrollo floral, vigor, y supervivencia en somaclones de Lolium y Festuca arundinacea , variacin isoenzimtica en Festuca arundinacea; disturbios reproductivos y resistencia al moteado de hoja en pasto bermuda (Cynodon dactylon). En el laboratorio de Gentica del Dpto.

Figura 3: Obtencin de variantes somaclonales de pasto llorn, Eragrostis curvula (Schrad.) Nees a partir del cultivo de inflorescencias A) Formacin de callos, B) Masa de callo a partir de la cual comienza a evidenciarse morfognesis. C) Estudio histolgico de los mismos callos mostrando clulas embriognicas y D) embriones somticos. E) En el mismo callo se observaron embriones bipolares y tambin F) organognesis. G) Plntula completa en el momento de salir del tubo de ensayo. H) Las plantas llevadas al campo fueron frtiles (I). J) Cromosomas en el pice radical de la planta donadora de explanto, 2n=4x=40 apomctica. K) Cromosomas de una regenerante primaria (R0) obtenida a partir de la anterior 2n=2x=20, sexual L) Isoenzimas de peroxidasas de las descendientes de la planta R0, mostrando variacin, lo cual indica la presencia de sexualidad. M) Idem anterior, pero malato deshidrogenasas.

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de Agronoma de la UNS se llev a cabo un proyecto para obtener somaclones de pasto llorn (Fig.3). Se trabaj con varios cultivares de esta gramnea apomctica y luego de la evaluacin de gran nmero de plantas se seleccionaron los siguientes materiales: - Una planta diploide sexual, obtenida a partir de un cultivar tetraploide apomctico. Dicho material est en proceso de registracin, y est siendo utilizado en estudios de apomixis. - Dos plantas hexaploides apomcticas a partir de un cultivar tetraploide apomctico. Dichas plantas dieron origen a dos nuevos cultivares de Eragrostis curvula , muy promisorios por sus caractersticas forrajeras, que estn en proceso de registro. La variacin in vitro en trigo y en otros cereales como cebada es altamente dependiente del genotipo. En plantas regeneradas de triticale y trigo se informaron variaciones a nivel del ADN mitocondrial y de protenas de la semilla, como las gliadinas. A nivel fenotpico, se han informado cambios estables en longitud de la espiga, nmero de granos por espiga, peso de 100 granos, densidad y biomasa de la espiga, mayor contenido de protena en grano sin reduccin del rendimiento, aristas, altura de la planta, fertilidad, nmero de macollos, color del grano, tiempo de espigazn, dureza, sensibilidad al cido abcsico, color de las glumas, entre otros caracteres morfolgicos. Las mutaciones observadas han sido de dominantes a recesivas y viceversa. El nico antecedente en nuestro pas de bsqueda de variacin somaclonal en trigo es un estudio acerca de la estabilidad in vitro de tres cultivares de trigo con elevados niveles de inestabilidad cariotpica espontnea. Se evaluaron caracteres tales como estructura cromosmica, patrn de gliadinas, color del grano y de las glumas, tipo de aristas, niveles de clorofila y morfologa de la planta, detectndose slo una translocacin no descripta previamente y un patrn diferente de gliadinas como consecuencia del cultivo in vitro, sugiriendo que esta tcnica no es efectiva para inducir variacin que pueda ser utilizada en programas de mejoramiento (Franzone y col., 1996).

7 Lecturas recomendadas
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CARDONE, Susana; OLMOS, Sofa; ECHENIQUE, Viviana

III.-Captulo 2
Hibridacin somtica
Polci, Pablo; Friedrich, Pablo 1 Introduccin La mejora gentica de las plantas cultivadas en procura de incrementar la produccin viene siendo practicada por el ser humano desde hace miles de aos, seguramente desde el inicio mismo de la agricultura. Para ello, el hombre ha empleado los cruzamientos con el fin de incrementar la variabilidad gentica, paso inicial en el proceso de mejoramiento. De esta manera la hibridacin entre especies diferentes permiti aumentar de modo significativo la productividad de diversos cultivos, como por ejemplo los cereales. Sin embargo, en otros cultivos esta estrategia no result exitosa a causa de esterilidad sexual o incompatibilidad gentica. La hibridacin somtica, es decir, la obtencin de plantas hbridas a partir de la fusin de clulas o de protoplastos derivados de clulas somticas, surgi hace unos 30 aos como una herramienta muy promisoria para sortear problemas de incompatibilidad precigtica. Esta tcnica, si bien presenta algunas limitaciones, como una elevada esterilidad o imposibilidad de regenerar plantas en algunos casos, demostr ser til en la mejora gentica de plantas, principalmente por permitir la introgresin limitada de genes de especies silvestres en los cultivos. Se utiliza, por ejemplo, cuando se quiere transferir resistencia a enfermedades o tolerancia a estreses. Tambin permite la obtencin de citoplasmas hbridos (cbridos). La hibridacin asimtrica y cibridizacin sirve como puente para la transferencia de genes individuales La tcnica de fusin de protoplastos se desarroll en la dcada de 1950-60, a partir de la observacin de que ciertos virus pueden inducir la fusin de clulas animales. Sin embargo, recin en la dcada de 1980-90 tuvo un mayor auge debido a la aparicin de mtodos qumicos y elctricos ms apropiados para la fusin de clulas vegetales. La pared presente en estas clulas representa una

barrera que normalmente impide la fusin entre ellas. Por ello, la obtencin de plantas hbridas somticas requiere del previo aislamiento de protoplastos mediante la digestin enzimtica de las paredes celulares, para luego proceder a la fusin de protoplastos de distintos tipos parentales (distintos genotipos) y posterior regeneracin de plantas a partir de los productos de fusin. La hibridacin somtica en plantas comenz a desarrollarse a principios de 1970 con la aplicacin de mtodos qumicos de fusin, y se extendi en los 80 con el empleo de mtodos de electrofusin. Es relevante destacar que, a los fines del mejoramiento gentico, el sistema de protoplastos no slo se emplea para la obtencin de hbridos somticos, sino que tambin constituye un material apropiado para la incorporacin de ADN exgeno. Asimismo, la fusin de protoplastos tiene un uso mucho ms amplio que el estrictamente de inters agronmico; en tal sentido, es de gran utilidad en estudios de biologa celular as como para otras aplicaciones biotecnolgicas, por ejemplo, la produccin de anticuerpos monoclonales. 2 Hibridacin somtica vs. hibridacin sexual Con relacin a su potencialidad para producir hbridos, existen diferencias importantes entre la fusin de protoplastos somticos y el cruzamiento sexual: La hibridacin sexual entre organismos de diferentes especies est limitada por barreras de incompatibilidad. En algunos casos estas barreras son precigticas, es decir, no permiten que se produzca la fecundacin. Tal limitacin no existe en la fusin de protoplastos, dado que este proceso es noespecfico, permitiendo la fusin de clulas de orgenes muy diversos, incluso de organismos muy distanciados filogenticamente (por ejemplo, clulas animales y vegetales). Ello no significa que pueda regenerarse un organismo viable y frtil a partir de cualquier tipo de combinacin entre clulas. De hecho, la bsqueda de hbridos de inters agronmico ha demostrado que el principal aporte de esta metodologa es la introgresin, en los cultivos, de genes provenientes de plantas silvestres emparentadas.

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La hibridacin sexual ocurre normalmente por fusin de clulas haploides (n + n), mientras que en la hibridacin somtica se fusionan dos protoplastos con sus genomas completos (2n + 2n) o con uno de ellos conteniendo slo parte de su genoma. Otra diferencia est dada por la herencia de los genes extranucleares, esto es, plastdicos y mitocondriales. Mientras que en la reproduccin sexual el genoma citoplasmtico es aportado casi exclusivamente por la gameta femenina, en la hibridacin somtica se combinan organelas de ambos progenitores, produciendo nuevas combinaciones de genes citoplasmticos.
3 Hibridacin somtica vs. transformacin gentica

bridacin somtica pero no por transformacin gentica. Sin embargo, en la actualidad, con las nuevas herramientas aportadas por la genmica se est avanzando en el conocimiento de todos los genes involucrados en diversas vas metablicas. Estos podran ser transferidos en conjunto va transgnesis. 4 Tipos de hbridos somticos Cuando se realiza la fusin de protoplastos se obtienen clulas con el aporte de cromosomas de dos o ms ncleos (Fig.1.) Si los protoplastos involucrados en la fusin proceden de distintos tipos parentales se originan heterocariones, y si proceden del mismo tipo parental se originan homocariones. Cuando en el heterocarin ocurre la fusin de los ncleos (cariogamia), se forma una clula hbrida. A partir de una clula hbrida, que contiene dos genomas completos, se puede regenerar una planta que, segn cual haya sido el destino del material gentico nuclear durante las divisiones celulares que siguen a la fusin, puede ser de tres tipos: 1. Hbrido simtrico , que tiene el genoma nuclear completo de cada tipo parental. 2. Hbrido asimtrico , que tiene el genoma nuclear completo de uno de los parentales y slo una parte del genoma nuclear del otro parental.

La preponderancia que han tomado las tcnicas de transformacin gentica ha relegado a la hibridacin somtica a un papel de menor significacin como herramienta biotecnolgica aplicada al mejoramiento de los cultivos. Comparando ambas metodologas, podemos destacar las siguientes diferencias: En la transformacin gentica se incorporan uno o pocos genes exgenos en una planta, mientras que en la hibridacin somtica el nmero de genes introducidos es mayor dado que se transfieren cromosomas de una especie a otra o se combinan dos genomas completos. La hibridacin somtica permite transferir caracteres sin necesidad de contar con un conocimiento detallado de los mecanismos moleculares que determinan la expresin de dichos caracteres. Por el contrario, la transformacin gentica requiere la previa identificacin y aislamiento de los genes que determinan la expresin del carcter de inters. Caracteres tales como productividad, tolerancia a ciertos tipos de estrs, resistencia horizontal a enfermedades y otros son polignicos, por lo que su Fig. 1. Destino del material gentico nuclear y extranuclear en la fusin transferencia es factible por hi- de protoplastos.

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3. Cbrido, que contiene el genoma nuclear completo de uno de los parentales, reteniendo slo material gentico extranuclear del otro parental. Es usual que en el proceso de regeneracin de plantas hbridas ocurra una eliminacin gradual de cromosomas de uno de los tipos parentales, producindose de este modo hbridos asimtricos o cbridos. La prctica de la hibridacin somtica en plantas demostr que, en general, los hbridos asimtricos y cbridos son ms valiosos que los simtricos producidos entre plantas alejadas filogenticamente. Por esta razn se han desarrollado mtodos para inducir la hibridacin asimtrica o cibridacin, alterando el genoma de uno de los protoplastos parentales. En este caso se dice que se transfiere parte del genoma de un protoplasto donante a uno receptor. Por lo tanto, teniendo en cuenta el material de partida empleado para la fusin, pueden producirse tres tipos de clulas hbridas: 1. Clulas hbridas simtricas, por fusin de dos protoplastos con sus genomas completos. 2. Clula hbrida asimtrica, por fusin de un protoplasto conteniendo su genoma completo con otro conteniendo su ncleo inviable o slo una parte de su genoma nuclear. Los protoplastos donantes son irradiados con rayos X o Gamma, lo que provoca la fragmentacin de los cromosomas. Una vez producida la fusin, dichos fragmentos tienden a eliminarse en las sucesivas mitosis, pero algunos de ellos pueden integrarse con el genoma del receptor produciendo un hbrido asimtrico. El tratamiento de irradiacin parece no tener efectos deletreos o mutagnicos sobre los genomas de organelas, probablemente debido a que cada clula posee varias copias de ellas. Tambin puede producirse una clula hbrida asimtrica fusionando protoplastos receptores con microprotoplastos, conteniendo uno o pocos cromosomas. Los microprotoplastos se obtienen induciendo la formacin de microncleos por tratamientos con agentes antimicrotbulos. 3. Cbridos, por fusin de un protoplasto conteniendo su genoma nuclear completo

con un protoplasto enucleado o con su ncleo inviable. Los protoplastos enucleados o citoplastos pueden obtenerse centrifugando los mismos a alta velocidad en un gradiente de densidad isosmtico. Asimismo, el mtodo de irradiacin con rayos X o Gamma puede generar cbridos en casos en que se produzca la eliminacin total de los fragmentos cromosmicos. Los protoplastos que poseen su genoma nuclear completo (receptores), pueden ser tratados previamente con inhibidores metablicos. En este caso slo pueden sobrevivir, por complementacin metablica, los heterocariones conteniendo el ncleo del receptor y el citoplasma del donante enucleado. La segregacin de los plstidos y mitocondrias de los dos tipos parentales tambin constituye una fuente importante de variabilidad en la regeneracin de plantas hbridas. Es frecuente que ocurran recombinaciones de los genomas mitocondriales de ambos tipos parentales, pero ello es poco comn entre plstidos. Dado que las organelas segregan independientemente unas de otras, la regla es que al cabo de pocas divisiones mitticas las clulas formadas contengan plstidos provenientes de uno u otro tipo parental. As, una clula hbrida origina una colonia de clulas que exhiben diferentes combinaciones de genes citoplasmticos, pero con una mayor frecuencia de clulas que poseen mitocondrias recombinantes y plstidos de uno u otro tipo parental. El destino que sufre el material gentico nuclear y extranuclear durante las divisiones celulares determina que, a partir de una poblacin de clulas hbridas similares, se puedan regenerar plantas con diferentes combinaciones de genes nucleares, plastdicos y mitocondriales. La Figura 2 muestra un esquema de las etapas involucradas en la hibridacin somtica, las cuales son tratadas a continuacin. 5 Aislamiento de protoplastos El desarrollo de mtodos enzimticos de aislamiento a partir de 1960 brind la posibilidad de obtener grandes cantidades de protoplastos vegetales. Ello tuvo gran influen-

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establecerse en forma emprica las condiciones ptimas para un sistema determinado. Las etapas del aislamiento y los factores a considerar en cada una de ellas se describen a continuacin: 1. Seleccin del material de partida. Influye en el resultado del aislamiento as como en el proceso de regeneracin posterior. Generalmente se emplean hojas y clulas en cultivo lquido o slido. Cuando se emplean hojas, la edad y las condiciones de cultivo de la planta afectan el rendimiento. Se obtienen mejores resultados con hojas jvenes totalmente expandidas que con hojas viejas. (Fig. 3A.). Para facilitar el contacto de las enzimas con las clulas, las hojas suelen cortarse en trozos pequeos, muy finos en el caso de las monocotiledneas. Algunas veces se extrae la epidermis inferior antes de colocar la hoja en la solucin Figura 2: Materiales y procesos involucrados en la hibridacin enzimtica, como sucede con las somtica. dicotiledoneas. Cuando se emplean cia en diferentes reas de la biologa y la clulas en suspensin, se obtienen mejores biotecnologa de plantas, dada la utilidad de resultados si se encuentran en la fase los protoplastos como sistema experimental exponencial de crecimiento. para estudios fisiolgicos, bioqumicos y 2. Tratamiento enzimtico. La concentramoleculares, as como para su aplicacin al cin de la enzima y el tiempo de incubacin mejoramiento gentico. requeridos para lograr la liberacin de los Los protocolos de aislamiento emplean protoplastos dependen del producto comerenzimas fngicas con actividad celulasa y cial utilizado. El pH generalmente se ajusta pectinasa, siendo necesario en algunos casos en un rango de 4,7 a 6, y la temperatura enel agregado de hemicelulasas. Las celulasas y tre 25 y 30 C. La duracin del tratamiento hemicelulasas degradan la pared celular, en enzimtico y la relacin volumen de solucin/ tanto que las pectinasas digieren la matriz cantidad de tejido influyen en el rendimiende pectina que mantiene adheridas a las c- to. Durante el aislamiento se produce la lisis lulas. El uso de enzimas disponibles comer- de algunas clulas, que liberan enzimas cialmente posibilit el aislamiento de hidrolticas y compuestos oxidantes que pueprotoplastos de prcticamente cualquier te- den daar los protoplastos, por lo que se jido vegetal, siempre que el mismo no est suelen agregar inhibidores de proteasas y lignificado. Se ha podido aislar protoplastos antioxidantes tales como el Polivinilpirrolide una gran cantidad de especies vegetales dona-10. El agregado de un estabilizador y regenerar plantas a partir de los mismos, osmtico a la solucin enzimtica es esencial permitiendo el uso de este sistema para la para evitar la ruptura de los protoplastos a propagacin clonal y la modificacin gentica medida que son liberados, siendo ms estade plantas. bles si la solucin es ligeramente hipertnica. El nmero de protoplastos aislados, su Para ello se utilizan solutos osmticamente viabilidad y la pureza de la suspensin obte- activos, comnmente manitol o sorbitol, en nida dependen de varios factores, debiendo concentraciones que varan entre 0,3 a 0,8

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6 Mtodos de fusin 6.1 Mtodos qumicos Los primeros casos informados de fusin controlada y reproducible de protoplastos vegetales y de regeneracin de hbridos somticos se produjeron a principios de la dcada de 1970, empleando nitrato de sodio como agente fusgeno. La frecuencia de formacin de heterocariones en tales casos era muy baja. Posteriormente, se lograron mejores resultados fusionando protoplastos de clulas del mesfilo de Nicotiana en un medio conteniendo alta concentracin de Ca++ (50 mM) y pH elevado (10,5). Sin embargo, el fusgeno que alcanz mayor aceptacin es el polietilenglicol (PEG) debido a que, en comparacin con los otros agentes qumicos, produce mayor proporcin de heterocariones y, para muchos tipos celulares, resulta menos txico. Adems, el tratamiento con PEG genera una mayor proporcin de heterocariones binucleados, con menor ocurrencia de fusiones entre ms de dos protoplastos. El procedimiento de fusin con PEG ms ampliamente utilizada es, en lo esencial, una combinacin del mtodo original del PEG y el de CA++ y pH elevados. Los protoplastos de dos tipos parentales se mezclan en una solucin conteniendo 15 a 45 % de PEG (peso molecular de 1500 a 6000), durante 15 a 30 minutos. La temperatura de incubacin ptima para inducir la fusin es de 35 a 37 C pero, en la prctica, suele ajustarse a 24 C. La densidad de protoplastos adecuada para la formacin de heterocariones es de 4 a 5 % (volumen de protoplastos/volumen de suspensin). La remocin del PEG se lleva a cabo en forma gradual, siendo esto fundamental para asegurar una elevada frecuencia de heterocariones. Para ello, la suspensin se somete a sucesivos lavados con una solucin alcalina (pH 9-11) de CaCl2 10-50 mM, disminuyendo progresivamente la concentracin de PEG con cada lavado. En la fusin de los protoplastos ocurren, en forma sucesiva, los siguientes eventos: (1) las membranas plasmticas de protoplastos adyacentes entran en ntimo contacto, (2) se producen alteraciones en sitios localizados

Figura 3: Aislamiento de protoplastos de tabaco. A. Eliminacin de las nervaduras centrales y seccionado de la hoja en trozos pequeos. B. Digestin enzimtica de las paredes celulares. C. Centrifugacin y obtencin de protoplastos libres de restos de tejidos vegetales.

M segn el tipo de protoplasto. La solucin enzimtica es por lo general suplementada con sales, comnmente CaCl2, que incrementan la estabilidad de la membrana (Fig. 3B). 3. Limpieza y purificacin de los protoplastos. Una vez lograda la liberacin de los protoplastos, se procede a la remocin de las enzimas y de los restos de tejido y de clulas rotas. La suspensin se pasa por un filtro de nylon o metlico con un dimetro de poro (30-100 mm) que permita el paso de los protoplastos y retenga los restos de tejido y grupos de clulas no digeridas. Posteriormente, se efectan 3 4 lavados centrifugando la suspensin por 5 minutos a baja velocidad (50-100 g). Finalmente, los protoplastos sedimentados se resuspenden en una solucin salina que contenga un estabilizador osmtico. De este modo se eliminan las enzimas y restos celulares. Para lograr una mayor pureza de la suspensin es conveniente centrifugarla en un gradiente de densidad (Fig. 3C). Para el recuento de protoplastos se emplea un hemocitmetro. La viabilidad se determina generalmente empleando colorantes que son incorporados (rojo neutro, diacetato de fluorescena) o excluidos (azul de Vean) por las clulas viables; tambin pueden evaluarse la actividad fotosinttica (emisin de fluorescencia) y la respiratoria (consumo de O2).

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de las mismas, formndose puentes citoplasmticos entre protoplastos vecinos, y (3) las interconexiones citoplasmticas se expanden, provocando la fusin. La carga negativa neta de la superficie de las membranas produce la repulsin entre ellas; el tratamiento con Ca++ y pH elevados neutraliza las cargas superficiales, favoreciendo el contacto entre protoplastos. El PEG actuara como un puente molecular causando alteraciones en las membranas plasmticas que promueven la adhesin y formacin de puentes citoplasmticos entre protoplastos vecinos, producindose finalmente la fusin. 6.2 Electrofusin En 1973 se descubri que pulsos de elevado potencial elctrico en un rango muy estrecho de intensidad y duracin conducen a un incremento reversible, experimentalmente controlable, de la permeabilidad de la membrana celular. Este efecto se denomin ruptura elctrica reversible para enfatizar la habilidad de la membrana para reparar tales perturbaciones. El voltaje mnimo para un protoplasto (umbral) con el cual se produce la formacin de poros disminuye a mayor duracin del pulso elctrico. Este fenmeno de ruptura reversible tambin es aplicado en la tcnica de electroporacin, con la que se pueden introducir en las clulas construcciones de ADN y otras molculas de alto peso molecular. El mtodo de electrofusin en esencia involucra dos pasos: 1. Los protoplastos, colocados en un medio de baja conductividad entre dos electrodos, se ponen en contacto al aplicar corriente alterna de alta frecuencia (0,5 a 1,5 MHz) en un campo elctrico no uniforme. Las cargas se separan dentro de las clulas formando un dipolo y generando, por lo tanto, un potencial de membrana. La fuerza del campo a ambos lados de una clula es diferente (campo no uniforme), dando origen a una fuerza neta que la empuja a una regin de mayor intensidad de campo (hacia uno de los electrodos). Este proceso se denomina dielectroforesis. La polaridad de la clula incrementa el campo local no uniforme, atra-

yendo a las clulas vecinas. Luego, los protoplastos se aproximan unos a otros y forman cadenas paralelas a las lneas de campo aplicadas (Fig. 4A). La fuerza ejercida sobre la clula bajo condiciones dielectroforticas depende (1) de la intensidad de campo elctrico, (2) del gradiente del campo, (3) del volumen del protoplasto y (4) de la diferencia entre las constantes dielctricas de la clula y su ambiente (as como la correspondiente diferencia entre sus conductividades). 2. El segundo paso consiste en la aplicacin de uno o ms pulsos cortos de corriente directa de 15 a 100 seg., con una intensidad de campo elevada (1 a 3 Kv/cm), suficiente para causar la ruptura reversible de la membrana. Para que esto ocurra es necesario que el voltaje crtico de membrana sea alcanzado en cuestin de nanosegundos a microsegundos. Ocurre entonces la fusin de las dos clulas cuyas membranas estn en estrecho contacto (1 a 2 nanmetros de distancia). El proceso de resellado es principalmente atribuido a las molculas lipdicas debido a que su coeficiente de difusin es dos rdenes de magnitud mayor que el de las protenas. Durante este proceso pueden formarse puentes lipdicos entre las membranas de las dos clulas. En otras palabras, las membranas no se vuelven a sellar separadamente en la zona de contacto. Los puentes formados de esta manera, con continuidad citoplasmtica entre las dos clulas, conducen a un radio de curvatura muy pequeo y a altas tensiones superficiales. Como consecuencia se forma una nueva clula esfrica, ya que el proceso es favorecido energticamente (Fig. 3B y C). La ruptura es reversible si el nmero y el tamao de los poros son pequeos en relacin con el total de la superficie de la membrana. Fuerzas de campo supra crticas, as como tambin largos perodos de exposicin, rompen reas mayores de membrana y pueden producir la destruccin total de la clula La frecuencia de fusin depende de varios factores: El genotipo. La procedencia de los protoplastos dentro del mismo genotipo. Diferentes poblaciones de protoplastos exhiben frecuen-

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Figura 4: Electrofusin de protoplastos de mesfilo de pasto llorn. A. Dielectroforesis de clulas. Las diferencias en intensidad de campo elctrico hacen que las clulas se muevan hacia la zona cercana al electrodo. B. Aplicacin de pulsos cortos de corriente directa, que inducen la formacin de poros en la membrana, generando puentes entre las membranas de las clulas adyacentes. C. Los puentes con continuidad citoplasmtica poseen un radio de curvatura muy pequeo. Las altas tensiones superficiales generadas en ese sector conducen a la formacin de una nueva clula esfrica.

cias de fusin diferentes, aun cuando provengan del mismo genotipo. En general, los protoplastos obtenidos a partir de hojas se fusionan ms fcilmente que los provenientes de raz o de cultivos celulares. El tamao de los protoplastos. Los ms grandes se fusionan ms fcilmente. La densidad de los protoplastos. El nmero, la duracin y la fuerza de los pulsos de corriente directa. La duracin del pulso elctrico es de 15 a 50 seg. El tiempo requerido para la fusin que sigue a la aplicacin de un pulso vara desde pocos segundos a varios minutos. Esto probablemente est relacionado a la diferencia de fluidez de la membrana en los distintos tipos celulares y a las propiedades del citoesqueleto dentro de la clula. El medio de fusin. Un factor de limitacin en la agregacin dielectrofortica de las clulas es la conductividad elctrica del medio; si sta es muy alta, hay mucho flujo de corriente en la solucin y se producen calentamientos y turbulencias que impiden la formacin de cadenas. El potencial osmtico del medio de fu-

sin. La inclusin de iones en el medio puede incrementar el porcentaje de fusin. Sin embargo, existe la limitacin de que la dielectroforesis debe realizarse en un medio de baja conductividad; el medio de fusin usualmente consiste en manitol (cuya concentracin se ajusta segn los protoplastos empleados) y CaCl2 1 mM. Valores bajos de presin osmtica en el medio de suspensin de los protoplastos pueden favorecer el proceso de fusin. La longitud de las cadenas de protoplastos formadas durante la dielectroforesis, que adems depende de factores como la densidad de protoplastos, fuerza del campo elctrico y tiempo durante el cual es aplicado. Cadenas ms largas darn mayor frecuencia de fusin que las cadenas cortas. Pulsos de corriente ms largos y de mayor voltaje producen un aumento de los eventos de fusin mltiple; obviamente, pulsos muy largos y voltajes muy elevados pueden matar a los protoplastos. La composicin y propiedades de la membrana plasmtica pueden ser afectadas por la actividad metablica de los protoplastos y por el tipo de enzimas empleadas en el proceso de aislamiento, influyendo en consecuencia en el proceso de fusin. Las condiciones experimentales deben ajustarse de modo de obtener la mayor frecuencia de fusin posible (nmero de protoplastos fusionados sobre el total de protoplastos), intentando maximizar la proporcin de heterocariones (productos de la fusin de protoplastos diferentes) formados por sobre la de homocariones (productos de la fusin de protoplastos del mismo tipo parental), y minimizando la ocurrencia de eventos de fusin mltiple (fusin de ms de dos protoplastos). La proporcin de cada uno de los dos tipos de protoplastos en la suspensin puede fijarse a fin de incrementar la formacin de heterocariones por sobre la de homocariones. El tipo de protoplasto con mayor tendencia a fusionar se mezcla con el de menor tendencia a fusionar en una relacin de 1:5 a 1:10. As, durante la formacin de cadenas, los protoplastos ms fusionables estarn mayoritariamente en contacto con los menos fusionables, y stos a su vez esta-

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rn ligados entre ellos mismos. Seleccionando las condiciones duracin y voltaje de los pulsos que promuevan slo la fusin de los protoplastos ms fusionables, los productos sern mayormente heterocariones. Sin embargo, aun cuando las condiciones de fusin puedan fijarse de modo de incrementar la frecuencia de fusin y la proporcin de heterocariones formados, la fusin de protoplastos a gran escala (macrofusin), tanto por mtodos qumicos como elctricos, resultar en una mezcla de protoplastos parentales, homocariones y heterocariones. Esto conlleva la necesidad de emplear mtodos de seleccin de los hbridos somticos obtenidos. Una tcnica alternativa que ofrece la ventaja de no requerir una posterior seleccin de heterocariones, aunque demanda mayor manipulacin, es la microfusin o electrofusin de pares de protoplastos. Esta tcnica se basa en los mismos principios que la electrofusin a gran escala pero est diseada para inducir la fusin en pares seleccionados de protoplastos. Este sistema emplea microelectrodos de platino fijados a un soporte montado debajo del condensador de un microscopio invertido. Los pares de protoplastos seleccionados se colocan en microgotas de medio de fusin sobre un soporte, recubiertas por aceite mineral. En cada evento de fusin, los microelectrodos se posicionan a cada lado de una microgota conteniendo un par de protoplastos, y se aplican los pulsos elctricos. Despus de la fusin, los heterocariones resultantes son transferidos a gotas con medio de cultivo para la posterior regeneracin de plantas hbridas. La tasa de fusin es de aproximadamente 30 pares de protoplastos fusionados y transferidos a medio de cultivo por hora, pudiendo alcanzarse frecuencias de fusin cercanas al 50 %. Ventajas de la electrofusin: 1. El proceso entero puede ser seguido bajo microscopio por lo que los hbridos pueden ser fcilmente identificados y transferidos a un medio nutritivo o selectivo. 2. Puede preseleccionarse el nmero de clulas a ser fusionadas. Las formaciones de dos clulas son favorecidas por bajas densidades en la acanaladura entre los electrodos.

Para obtener productos de multifusin deben emplearse elevadas densidades. 3. El proceso de fusin es sincrnico, ya que el pulso provoca la fusin de todas las clulas expuestas al campo. 4. Se obtienen elevadas plasmogamia (80 - 100 %) y cariogamia. 5. La viabilidad de las clulas fusionadas es muy buena. 6. Este mtodo ofrece ventajas sobre otros como el del PEG, que: -requiere condiciones no fisiolgicas -las frecuencias de formacin de heterocariones binucleados son bajas y variables -resultan txicos para diversos tipos celulares- el fusgeno debe ser removido antes del cultivo de los protoplastos y tiene bajo rendimiento de clulas fusionadas. 7 Seleccin de heterocariones La fusin de protoplastos a gran escala produce una mezcla de tipos parentales y productos de fusin. Si no se efecta una previa seleccin de las clulas hbridas, la regeneracin de plantas y la posterior identificacin de los hbridos demandar mucho trabajo y recursos. Dicha seleccin es particularmente necesaria cuando se emplean mtodos qumicos, que producen una baja proporcin (<10%) de clulas hbridas. Por el contrario, los mtodos elctricos no requieren necesariamente del posterior proceso de seleccin dado que normalmente producen frecuencias de fusin muy elevadas o porque, en el caso de la microfusin, no se generan mezclas heterogneas de protoplastos debido a que se fusionan dos clulas por vez. Cualquiera que sea el caso, la condicin de hbrido debe verificarse en la planta regenerada mediante diferentes anlisis que se explican ms adelante. La seleccin de clulas hbridas puede llevarse a cabo empleando los siguientes mtodos: Seleccin sobre la base de caracteres morfofisiolgicos. En ciertos casos es posible diferenciar los callos hbridos de los parentales. Por ejemplo, en algunos cruzamientos, los callos hbridos poseen un color intermedio al de los parentales. Cuando se produce un cruzamiento entre un parental con capacidad para regene-

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rar planta con uno recalcitrante, los hbridos somticos normalmente regeneran plantas, ya que este carcter se comporta como dominante. Si los protoplastos del genotipo respondedor son tratados con inhibidores metablicos irreversibles (iodoacetamida, dietilpirocarbamato, etc.) no sobrevivirn, y solamente podrn regenerarse los hbridos. Seleccin por complementacin. La seleccin se produce porque el medio de cultivo resulta restrictivo para el crecimiento de los parentales, pero no para el de los hbridos. La complementacin puede lograrse por las siguientes vas: a) Empleando dos parentales con defectos metablicos o genticos no allicos. Si dichos caracteres son recesivos, la fusin produce una clula hbrida en la que los defectos se anulan por complementacin. Por ejemplo, la fusin de dos variedades albinas no allicas (nucleares) de tabaco, permiti obtener plantas verdes. AAbb (albina) x aaBB (albina) AAaaBBbb (verde) Asimismo, a partir de dos lneas mutantes no allicas de tabaco deficientes en nitrato reductasa, se obtuvieron colonias capaces de crecer en un medio conteniendo nitrato como nica fuente de nitrgeno. b) Fusionando parentales que expresan caracteres dominantes tales como resistencia a antibiticos o herbicidas. Para ello se emplea una lnea resistente a cierta droga, y otra resistente a una segunda droga, efectundose la seleccin de las clulas hbridas en un medio conteniendo ambas drogas a concentraciones que resultan letales para las lneas parentales. c) Una lnea que presente una mutacin autotrfica (por ejemplo: albinismo, deficiencia a nitrato reductasa) y un carcter dominante (por ejemplo, resistencia a antibiticos o herbicidas) es de gran utilidad para la seleccin. Los hbridos producidos por el cruzamiento de estos parentales con cualquier genotipo silvestre pueden ser seleccionados en medio mnimo suplementado con el antibitico o herbicida, que no permite el crecimiento de los parentales. Seleccin por aislamiento de los

heterocariones o clulas hbridas. Es el sistema ms confiable y de ms amplio espectro de aplicacin. El aislamiento puede realizarse de dos maneras: a) Seleccin mecnica directa utilizando tcnicas de micromanipulacin con micropipeta. Puede realizarse cuando los protoplastos parentales presentan rasgos que los distinguen al microscopio, permitiendo reconocer las clulas hbridas. Por ejemplo, al fusionar protoplastos del mesfilo (verdes) con protoplastos de suspensiones celulares (incoloros). Tambin pueden colorearse las clulas de ambos progenitores con diferentes colorantes vitales, como el rojo neutro y azul brillante de cresilo. b) Citometra de flujo. Los protoplastos parentales se marcan con diferentes colorantes fluorescentes; por ejemplo, rodamina (rojo) y fluorescena (verde amarillento). El aislamiento de los heterocariones marcados con ambos colorantes se realiza utilizando un citmetro de flujo (FACS, fluorescenceactivated cell sorter), que es preciso y muy rpido. El equipo posee fotoclulas que detectan fluorescencia, pudiendo separar los protoplastos marcados con un solo fluorocromo (parentales) de aqullos doblemente marcados (hbridos). 8 Cultivo de protoplastos La habilidad para regenerar plantas a partir de clulas y tejidos en cultivo es un componente esencial en la biotecnologa para la manipulacin gentica y el mejoramiento vegetal. Esto resulta relativamente fcil para las dicotiledneas herbceas, pero ha sido bastante difcil para las monocotiledneas, particularmente las gramneas. Los protoplastos se cultivan en cajas de Petri en medio lquido o semislido, rico en compuestos orgnicos e inorgnicos, suplementado con reguladores del crecimiento, y en presencia de un estabilizador osmtico. Suelen ser cultivados en cajas de Petri con medio agarificado, donde se mezcla la solucin de protoplastos con un medio de cultivo lquido a 40C conteniendo 1,2% de agar, perferen-temente agarosa (Fig. 5AyB). Los protoplastos quedan, as, atrapados en el medio semislido y, luego de varios das, se ven las colonias formadas (Fig. 5C). Sin em-

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dos con vitaminas, azcares, aminocidos, reguladores de crecimiento y tambin con aditivos inespecficos como leche de coco, hidrolizado de casena, extracto de levadura, etctera. El potencial osmtico del medio de cultivo: los protoplastos requieren de proteccin osmtica antes de regenerar la pared celular. Normalmente se ajusta con el agregado al medio de cultivo de manitol o sorbitol. La densidad celular: la densidad inicial de protoplastos vara de 104 105 protoplastos/ml de medio de cultivo. Los cultivos con altas densidades producirn, a partir de cada protoplasto, colonias que debern separarse tempranamente para evitar quimeras. Si deseamos colonias bien separadas para asegurar que provengan de un solo protoplasto, la densidad inicial debe ser baja, de 100 500 protoplastos/ml. Hay protoplastos de varias especies y tipos que no logran dividirse a bajas densidades de cultivo. Para estos casos se desarroll la tcnica de cultivo con clulas nodrizas o alimentadoras. Esta tcnica consiste en exponer una suspensin de 106 protoplastos/ml a rayos X a dosis que inhiben la divisin celular, pero que quedan metablicamente activas. Estas clulas se plaquean en un medio agarificado, y luego se colocan por sobre stas los protoplastos sin irradiar, de los cuales se formarn las colonias. Tambin suele utilizarse papel de filtro para separarlas de las clulas nodrizas. Otra tcnica utilizada es el cultivo en microgota, donde se puede cultivar hasta un solo protoplasto. Cada microgota contiene entre 0,25 - 25 l de medio de cultivo, logrando densidades de 2 4 x 103 proto-plastos/ml. Con ayuda de un micromani-pulador se coloca la clula y se la cubre con aceite mineral para evitar la deshidratacin del medio. Los tratamientos fsicos: tratamientos de choque elctrico y trmico estimulan la divisin de los protoplastos. Las condiciones de cultivo: en geFigura 5: Cultivo de protoplastos de tabaco. A. Protoplastos de neral los protoplastos son sensibles a mesfilo. B y D. Cultivo de los protoplastos en perlas de agarosa suspendidas en medio lquido. C. Detalle de la formacin de la luz, por lo cual durante el cultivo se callo a partir de protoplastos. E. Callo en medio de regeneracin. los mantiene en oscuridad o bajo luz F. Desarrollo de plantas a partir de callos de protoplastos. G. muy tenue. Planta regenerada. El origen de los protoplastos: el

bargo, el medio lquido da mejores resultados por varias razones: (a) los protoplastos de varias especies slo pueden dividirse en medio lquido, (b) la presin osmtica del medio puede ser fcilmente reducida a los pocos das en cultivo, (c) la densidad celular puede ser modificada agregando medio de cultivo o las clulas con especial inters pueden ser aisladas y cultivadas a alta densidad, (d) la degradacin de algunos componentes del medio por la poblacin de protoplastos puede producir algunas sustancias citotxicas, cuya concentracin alrededor de las clulas ser menor en el medio lquido. Una tcnica muy eficiente que combina medio slido y lquido es la de cultivo en perlas de agarosa, donde los bloquecitos con los protoplastos inmovi-lizados en agarosa son cortados en cuatro mitades y colocados en medio lquido, donde se cultivan en continua agitacin. Los protoplastos regeneran la pared celular luego de uno a cuatro das en cultivo. La presencia de pared es esencial para lograr una divisin regular. Luego de dos a tres semanas, producto de mitosis sucesivas, se forman microcolonias derivadas cada una de una clula, que dos semanas despus se pueden ver a simple vista. Estos callos son transferidos a un medio de cultivo y a condiciones apropiadas para regenerar plantas (Fig. 5). Los principales factores a tener en cuenta para el cultivo de protoplastos son: Los requerimientos nutricionales: se han utilizado en muchos casos los mismos medios de cultivo que se utilizan en el cultivo de clulas y tejidos, pero en general son enriqueci-

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estado fisiolgico del tejido del cual provienen y la calidad de los protoplastos son muy importantes para obtener una elevada eficiencia en la respuesta al cultivo. 9 Identificacin de las plantas hbridas La condicin de hbrido debe verificarse en la planta regenerada aun cuando se haya efectuado algn tipo de seleccin para el cultivo de las clulas hbridas. A tal fin es conveniente efectuar diferentes evaluaciones, lo que permite una mejor caracterizacin del hbrido. Comnmente se llevan a cabo los siguientes estudios: 1. Morfolgicos. Los hbridos somticos pueden presentar rasgos morfolgicos caractersticos. Los mismos pueden ser intermedios a los de los parentales, la suma de ellos, u otros completamente nuevos. 2. Citolgicos. El anlisis del complemento cromosmico permite revelar si el hbrido posee el total de cromosomas de cada parental, si se han fusionado ms de dos protoplastos, el grado de aneuploida y posibles translocaciones intergenmicas. Mediante hibridacin in situ empleando sondas de ADN repetitivo especfico de especie puede evaluarse con ms profundidad la contribucin de los genomas parentales y reestructuraciones cromosmicas en el hbrido. 3. Isoenzimticos. El patrn de bandas isoenzimticas del hbrido debe mostrar bandas de ambos parentales, pudiendo haber otras bandas que resultan de nuevas combinaciones de las subunidades enzimticas. Habitualmente se analizan los patrones de glucosa-6-fosfato deshidrogenasas, fosfoglucoisomerasas, glutamato oxalacetato transaminasas, esterasas, peroxidasas y fosfatasas cidas. Las isoenzimas son extremadamente variables entre tejidos vegetales, por lo que para el anlisis se deben emplear los mismos tejidos u rganos, y en el mismo estado fenolgico. 4. En el mbito del ADN. La demostracin de la presencia de ADN de ambos parentales es la prueba ms directa de la hibridacin. El anlisis de ADN es independiente del tejido empleado y de la edad de la planta. Puede llevarse a cabo por RFLP (polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restriccin), RAPD (polimorfismos en

el ADN amplificado al azar) o Southern blot, empleando sondas de ADN repetitivo especfico de especie o de genes de ARN ribosomal. 10 Logros y tendencias de la hibridacin somtica La hibridacin somtica ha permitido producir hbridos que no se haban podido obtener por cruzamientos sexuales, incrementando as el flujo de genes en los cultivos. La tabla 1 muestra algunos ejemplos de hbridos somticos que presentan algunas ventajas agronmicas. En sus inicios, algunos esperaban que la hibridacin somtica permitiera producir nuevas especies que expresaran las caractersticas deseadas de ambos progenitores. Por ejemplo, por hibridacin entre tomate y papa, se busc producir plantas que desarrollaran tomates en la parte area y tubrculos en la raz (pomato). La experiencia mostr que difcilmente puedan lograrse estos hbridos espectaculares, debindose ms bien dirigir la tcnica hacia la introgresin de pocos genes silvestres en las especies cultivadas mediante hibridacin asimtrica o cibridacin, manteniendo las caractersticas generales del cultivo. Uno de los factores que dificulta la obtencin de hbridos simtricos es la progresiva prdida de cromosomas de uno de los parentales, que normalmente ocurre durante la regeneracin. Si bien la fusin de protoplastos permite sortear las barreras precigticas, siguen existiendo barreras genmicas que resultan en la eliminacin espontnea de cromosomas durante las divisiones celulares. El mecanismo que determina la eliminacin de cromosomas no est bien comprendido, pero generalmente se retienen los cromosomas del parental que tiene el ciclo celular ms corto. Uno de los factores que puede producir incompatibilidad genmica es el estado de diferenciacin de los tipos celulares involucrados en la fusin. Por ejemplo, cuando se fusionan clulas en fase de crecimiento activo con clulas del mesfilo, que no se dividen, generalmente se pierden los cromosomas de estas ltimas. Los hbridos somticos o sexuales entre especies silvestres y cultivadas contienen

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Tabla 1: Ejemplos de hbridos somticos que exhiben algn carcter de inters agronmico

muchas caractersticas no deseadas de la primera, adems de aqullas deseadas. El retrocruzamiento con la especie cultivada es requerido para remover los genes no deseados del parental silvestre, pero ello no siempre es posible debido a que los hbridos suelen ser estriles. La hibridacin asimtrica y la cibridacin tienen la ventaja de incorporar slo uno o pocos caracteres provenientes del parental silvestre en la especie cultivada, y producir plantas con mayor fertilidad. Algunos caracteres deseables estn codificados por el genoma extranuclear, tales como la androesterilidad citoplasmtica y ciertos tipos de resistencia a enfermedades y a herbicidas. Para estos casos es de particular utilidad la cibridacin, dado que es un mtodo simple para transferir estos genes. 11 Algunos ejemplos Se han obtenido hbridos intergenricos de Panicum maximum (+) Pennisetum americanum (Ozias-Atkins et al ., 1986), Saccharum officinalis (+) Pennisteum americanum, Oriza sativa (+) Echinochloa

oryzicola, Triticum monococcum (+) Pennisetum americanum , Festuca arundinacea (+) Lolium multiflorum. El primer caso de regeneracin de plantas maduras de hbridos intergenricos (simtricos y asimtricos) en gramneas fue el Festulolium. A pesar de los esfuerzos realizados, la aplicacin de esta estrategia no ha conducido a la obtencin de nuevos hbridos de especies importantes, fundamentalmente debido a problemas de baja o nula fertilidad. Los mtodos actuales de transferencia de genes aislados han desplazado el inters en la hibridacin somtica. Sin embargo son una excelente herramienta para estudiar las interacciones ncleo-citoplasmticas entre genomas. 12 Lecturas recomendadas
BHOJWANI, S.S.; RAZDAN, M.K. 1996. Protoplast isolation and culture. Somatic hybridization and cybridization. En: Plant Tissue Culture: Theory and Practice, Capitulos 12 y 13. S.S. Bhojwani y M.K. Razdan (eds.) Elsevier, Amsterdam. pp. 337-406. LINDSEY Y JONES, 1992. Biologa celular de la ingeniera gentica. En: Biotecnologa vegetal agrcola, Captulo 6. Editorial ACRIBIA, S.A., Zaragoza. pp.105-142. MATSUMOTO, K. 2001. Hbridos somticos. Biotecnologa Ciencia & Desenvolvimiento, 20,mayo / junio: pp. 26-28. ZIMMERMANN, U. 1983. Electrofusion of cells: principles and industrial potential. Trends in Biotechnology, 1,5: pp. 149-156.

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III.-Captulo 3
Transformacin gentica
Daz, Marina L.; Zappacosta, Diego C.; Franzone, Pascual M.; Ros, Ral D. 1 Introduccin El mejoramiento gentico vegetal se origin hace aproximadamente 10.000 aos, cuando el hombre se hizo agricultor y comenz la domesticacin de las plantas. En el siglo XX, con la incorporacin de los cruzamientos sexuales, el conocimiento de la biologa floral de las especies, los avances de la gentica y de la estadstica experimental, entre otros, se desarrollaron los mtodos de mejoramiento actualmente utilizados. El mejoramiento gentico se basa en la existencia de variabilidad gentica para los caracteres que se desea mejorar y la reproduccin sexual para la incorporacin de los mismos. Este hecho hace que el aprovechamiento de la variabilidad est restringido por barreras de cruzabilidad. El reciente desarrollo de mtodos no sexuales para transferir genes, como la transformacin gentica, permite superar esta limitacin, abriendo nuevas perspectivas en el mejoramiento de las plantas. La ingeniera gentica o transformacin gentica, tcnica conocida como del ADN recombinante, permite introducir en plantas genes provenientes no slo de otras especies vegetales muy alejadas desde el punto de vista evolutivo sino incluso de hongos, virus, bacterias y animales. Conviene destacar que la transformacin de plantas es una tecnologa que aporta variabilidad gentica conocida sin alterar el fondo gentico. Este ltimo aspecto es de gran importancia ya que la creacin de cultivares es un proceso acumulativo; es decir que se desea incorporar caractersticas favorables sin perder las mejoras logradas anteriormente. El germoplasma transgnico es posteriormente incorporado al proceso de mejoramiento, el cual depender de la especie y del tipo de cultivar a obtener. En 1983 se informaron los primeros experimentos de expresin de un transgen (gen

introducido) en clulas vegetales y al ao siguiente se obtuvieron las primeras plantas transgnicas (tabaco y petunia). Desde entonces se ha extendido la aplicacin de esta tecnologa a unas 120 especies. Las plantas transgnicas obtenidas hasta la fecha se desarrollaron por diversos mtodos, los que han sido modificados para cada especie en particular, aumentndose de esta forma la eficacia de los mismos. Entre sus aplicaciones se encuentran la obtencin de plantas con resistencia a virus, insectos, hongos y bacterias, tolerancia a herbicidas y a estreses abiticos y modificacin de la calidad nutritiva de los cultivos entre otras. Asimismo, a travs del uso de transgenes es posible modificar la expresin de genes presentes en el genoma de la planta. La transformacin gentica tambin constituye una herramienta til para estudios bsicos que permiten conocer y/o profundizar acerca de la estructura y funcin de genes especficos, aspecto particularmente relevante en la era genmica (ver VII.-1). 2 Requerimientos para la obtencin de plantas transgnicas Para todas las tcnicas de transformacin desarrolladas hasta el momento es necesario disponer del transgen (secuencias regulatorias y codificante clonadas en un vector de transformacin) y de una metodologa eficiente para la transferencia al genoma vegetal. Una vez introducido el gen de inters en la clula, se induce el desarrollo de plantas mediante distintas tcnicas de cultivo de tejidos. Se procede luego al anlisis molecular de las plantas regeneradas in vitro para identificar aquellas que porten y expresen el o los transgenes en los niveles deseados. Finalmente, a travs de experimentos de campo y laboratorio se estudia el comportamiento de los individuos transgnicos y su descendencia. Por lo tanto, los elementos bsicos que se requieren en trabajos de transformacin gentica en plantas son: 1. Un sistema de cultivo de tejidos que permita regenerar plantas completas y frtiles. 2. Vectores apropiados, que permitan el

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clonado del gen de inters y/o su transferencia al tejido blanco de transformacin. 3. Un protocolo de transformacin (sistema de transferencia de genes y de seleccin del material transformado). 4. Herramientas de anlisis para detectar la presencia del transgen y los productos del mismo en la planta. Antes de iniciar la descripcin de los tem anteriores, resulta importante destacar que para lograr una planta transgnica deben ocurrir tres procesos en la misma clula: a) El transgen debe ser transferido al interior de la clula, b) El transgen debe integrarse al ADN celular y c) Se debe regenerar una planta completa a partir de la clula transgnica en la que se verificaron los procesos a y b. Dado que las clulas tienen diferente competencia o capacidad de respuesta para cada uno de estos procesos, la puesta a punto de un protocolo de transformacin eficiente requiere maximizar la cantidad de clulas competentes para todos ellos de manera simultnea. 2.1 Cultivo de tejidos vegetales Los mtodos de transformacin ms utilizados actualmente se basan en la obtencin de clulas transgnicas y posterior recuperacin de plantas completas y frtiles a partir de las mismas a travs del cultivo y seleccin in vitro. Esto es posible gracias a la propiedad de totipotencia expresada por las clulas vegetales (ver II.-1). En la mayora de las especies se observa una importante influencia del genotipo en la respuesta al cultivo in vitro. Por ello, cuando se usa esta tecnologa con fines de mejoramiento gentico es muy importante conocer la respuesta morfogentica de distintos genotipos con adaptacin local. En el cultivo in vitro, un prolongado perodo de subcultivos puede inducir la aparicin de variacin somaclonal no deseable, ya que es conveniente introducir slo las modificaciones que se desean y en forma controlada (ver III.-1).

2.2 Construccin del vector Para introducir un transgen es necesario que el mismo sea incorporado previamente en un vector (por ejemplo un plsmido). Para ello se digiere el ADN extrado de un organismo, cualquiera que sea su origen, con enzimas de restriccin. Estas endonucleasas tienen la capacidad de reconocer en el ADN secuencias especficas compuestas por pocos nucletidos y posteriormente producir cortes en las mismas. Los fragmentos de restriccin as obtenidos pueden ser ligados enzimticamente a vectores de clonado, obtenindose, de este modo, clones de ADN recombinante (ver II.-3)

Figura 1: Estructura molecular del transgen

Un transgen est compuesto por una secuencia codificante (regin comprendida entre los codones de iniciacin y terminacin de la traduccin) y por secuencias regulatorias que determinan el tejido, el momento del desarrollo y el nivel de expresin del transgen en la planta. La adecuada expresin de los transgenes es un aspecto importante en la obtencin del fenotipo deseado en la planta transgnica. Muchas veces los genes utilizados provienen de bacterias y usualmente no pueden expresarse eficientemente en clulas eucariotas. Por ello, para optimizar la expresin del transgen es necesario reemplazar las secuencias regulatorias bacterianas por otras aptas para su expresin en clulas vegetales. En este contexto, la secuencia ms importante es el promotor, sitio del ADN al cual se une la enzima ARN-polimerasa para iniciar el proceso de transcripcin (Fig. 1). Cabe destacar que la expresin gnica es controlada por las secuencias regulatorias y no depende de la secuencia codificante. Por lo tanto, una secuencia codificante aislada de un gen A, puesta bajo el control de un promotor aislado de un gen B, se expresar de acuerdo con el patrn de expresin de dicho promotor. Asimismo, en la eleccin del pro-

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motor a utilizar en la construccin del transgen, hay que considerar la especie vegetal a transformar, ya que su nivel y patrn de expresin pueden variar al ser utilizados en especies distintas a la de origen del mismo. Dentro de los promotores se distinguen aquellos constitutivos, que permiten la expresin del gen en toda la planta en forma continua, los inducibles que responden a factores ambientales y finalmente los especficos de tejido que permitirn la transcripcin en determinados rganos y tejidos (Tabla 1). Los promotores pueden ser modificados con el fin de aumentar la expresin de los genes que regulan, pueden truncarse, adicionrseles un intrn o unrseles secuen-

nidos en el mismo experimento. La solucin para evitar los efectos de posicin es dirigir la secuencia de inters a sitios especficos del genoma vegetal, elegidos por su patrn de expresin adecuado y estable. Esto se puede lograr usando sistemas de recombinacin heterloga sitio-especficos o mediante reemplazo gnico por recombinacin homloga. 2.3 Mtodos de transformacin

La pared celular impide la entrada del ADN en la clula, constituyendo un obstculo que todos los mtodos de transformacin gentica tienen que superar de algn modo. Estos mtodos pueden dividirTabla 1: Promotores usados en transformacin gentica de plantas se en:
nos (nopalina sintetasa de Agrobacterium) 35 S (virus del mosaico del coliflor) Ubi (ubiquitina de maz) Act 1 (actina de arroz)

Constitutivos

Promotores

TA 29 (tapete de la antera de tabaco) faseolina (cotiledones de poroto) Especficos de tejido TobRB 7 (raz de tabaco) patatina (tubrculo de papa) glutenina (endosperma de trigo) subunidad pequea de Rubisco inducible por luz alcohol deshidrogenasa-1 inducible por Inducibles anaerobiosis protena de shock trmico inducible por calor

a) Transformacin mediada por Agrobacterium, vector biolgico que participa del proceso de transferencia. b) Mtodos de transformacin gentica directa, tambin llamados fsicos, mediante los cuales, por distintos mecanismos, se introduce el ADN en la clula.

cias de otros promotores. Al momento de elegir el promotor debe tenerse en cuenta tambin la planta a transformar ya que algunos de ellos son menos activos en monocotiledneas, como el 35S; por otra parte el de ubiquitina 1 (ubi1) de maz es uno de los ms efectivos en gramneas. Adems, es necesario que el transgen disponga de una regin no traducida en el extremo 3 del mismo, que incluya la seal de corte y poliadenilacin (terminador), necesaria para el correcto procesamiento del transcripto correspondiente. Por otra parte el nivel y patrn de expresin del gen tambin puede estar afectado por la posicin del mismo en el genoma de la planta transformada (efecto de posicin). Esto puede deberse a la presencia de otras secuencias regulatorias cercanas, a la estructura de la cromatina, al patrn de metilacin, etc. La cantidad de protena producida por el transgen comnmente vara ms de 100 veces entre individuos transformantes obte-

2.3.1 Transformacin mediada por Agrobacterium Las especies del gnero Agrobacterium son bacterias Gram-negativas aerbicas obligadas que viven en el suelo. Ellas son capaces de desarrollar un crecimiento saproftico o parastico. El gnero comprende cuatro especies fitopatognicas, dos de ellas ampliamente estudiadas ( A. tumefaciens y A. rhizogenes). Ambas especies son capaces de infectar una amplia variedad de especies de dicotiledneas y tienen como blanco de infeccin a las heridas, atacando clulas individuales y provocando su proliferacin. A. tumefaciens causa tumores, enfermedad que se conoce como agalla de la corona y A. rhizogenes induce la proliferacin de races dando lugar a la enfermedad denominada raz en cabellera . La capacidad patognica de estas bacterias esta asociada a la presencia de megaplsmidos (150-200 kilo pares de bases o Kb) llamados Ti (por

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tumor-inducing o inductor de tumores) o Ri (por root-inducing o inductor de races), presentes en algunas de las agrobacterias. Se demostr que durante la patognesis un fragmento de estos plsmidos llamado Figura 2: Estructura del T-DNA T-DNA (por transfer-DNA), es transferido a la clula estn involucrados genes cromosmicos (chv vegetal, donde se integra al ADN A, chv B, chv E, cel, psc A y att), se produce cromosmico de la planta y cuya expresin el procesado y la transferencia del T-DNA, causa proliferacin de clulas de la planta a mediados por los genes vir (por virulencia) travs de la sntesis y alteracin de la respues- que son inducidos por azcares y compuesta a hormonas vegetales. El T-DNA contiene tos fenlicos, como la acetosiringona, produgenes que se expresan eficientemente en la cidos por clulas vegetales heridas. Se conoclula vegetal infectada y producen sntesis ce con mucho detalle la etapa de la de hormonas vegetales (llamados oncogenes patognesis que ocurre en la bacteria (ver porque son los responsables de la prolifera- revisin de Gelvin, 2000). La regin de virucin anormal del tejido) y genes que provo- lencia (de alrededor de 30 Kb) est organizacan la sntesis de opinas (fuente de carbono da en operones esenciales para la transferencia del T-DNA (vir A, vir B, vir D, vir G) o y nitrgeno para la bacteria). A. tumefaciens es el caso ms estudiado que permiten incrementar la eficiencia de la y utilizado en la transformacin de plantas. transformacin (vir C, vir E). El ingreso de El T-DNA est delimitado por dos repeticio- Agrobacterium en la era genmica permitines directas imperfectas de 25 pares de ba- r avanzar en el conocimiento de la ses (bp) que lo flanquean, llamadas bordes interaccin de esta bacteria con las plantas. El desarrollo de la patognesis de planderecho e izquierdo (Fig. 2). Estos bordes son los nicos elementos en cis necesarios para tas por Agrobacterium representa una situadirigir el procesamiento del T-DNA. Cualquier cin nica en la naturaleza: la transferencia fragmento de ADN ubicado entre estos bor- de un elemento gentico (T-DNA) de un ordes puede ser transferido a la clula vegetal. ganismo procariota a un organismo eucariota Contrariamente a lo que sucede con otros superior, con su subsiguiente integracin y tipos de secuencias mviles de ADN, el T-DNA expresin en el genoma hospedador. Este no codifica los productos que median su mecanismo de ingeniera gentica natural es transferencia. El T-DNA es una regin relati- aprovechado para la transferencia de genes vamente grande (ca. 20 Kb) que contiene de inters a las plantas, para lo cual, los genes con secuencias regulatorias (promoto- oncogenes y genes de sntesis de opinas, son res y seales de poliadenilacin) tpicamente reemplazados por un marcador seleccionable y el gen a transferir (Fig. 2). El mtodo llamaeucariticas. Desde la dcada de 1950-60 se sabe que do del explante (Horsch y col., 1984) conlos tumores de la agalla de la corona se desa- siste en inocular un explante con A. rrollan si hay A. tumefaciens patognicas en tumefaciens, dejar la bacteria en contacto presencia de heridas. Un aspecto destacable con el explante durante un cierto tiempo, en de esta bacteria es que usa la respuesta de la l se produce la transferencia del T-DNA que planta a las heridas (cicatrizacin y defensa) contiene un gen marcador seleccionable y el como quimioatractivo y activador del proce- o los transgenes de inters. Posteriormente so de patognesis. Luego de la adhesin de se transfieren los explantes a un medio de la bacteria a la clula vegetal, etapa en la que cultivo que contiene un antibitico que ac-

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ta como bacteriosttico y el agente selectivo correspondiente al gen marcador seleccionable utilizado. Una vez completado el protocolo de cultivo y seleccin in vitro se recuperan las plantas transgnicas (Fig. 3). Anlisis por hibridacin del T-DNA en plantas transgnicas y su progenie han demostrado que el T-DNA se incorpora al ADN cromosmico y se hereda en forma estable. Los plsmidos Ti sin oncogenes se denominan desarmados, son de gran tamao y resulta difcil introducir genes en su T-DNA usando tcnicas habituales de ADN recombinante. Por esta razn se han desarrollado dos sistemas de vectores para introducir genes en Agrobacterium: los vectores cointegrados, que deben formar estructuras cointegradas para replicarse en A. tumefaciens y los vectores binarios, que son capaces de replicarse en forma autnoma en esta bacteria. En los vectores cointegrados, la insercin del ADN que contiene los transgenes dentro del T-DNA de un plsmido Ti desarmado se logra por recombinacin homloga. Sobre la base de la capacidad de los genes de virulencia de actuar en trans, movilizando el T-DNA presente en otro plsmido, se construyen vectores denominados binarios que contienen un T-DNA no oncognico en un plsmido pequeo, con un origen de replicacin de amplio espectro de hospedantes, caractersticas que permiten su fcil manipulacin gentica usando E. coli como husped. La introduccin de este plsmido a una cepa de Agrobacterium que contenga un plsmido llamado helper de virulencia (con la regin vir intacta y sin TDNA) la hace apta para la transferencia del T-DNA a las clulas vegetales. Si bien ambos tipos de vectores son herramientas eficientes para la transformacin, se aprecia una notable preferencia por el uso de vectores binarios. La integracin del T-DNA en el ADN cromosmico de la planta se produce al azar, por recombinacin ilegtima, preferencialmente en regiones con actividad transcripcional y con la participacin de protenas de la bacteria y de la planta. Este sistema de transformacin permite transferir fragmentos de ADN de hasta 150 Kb. Para ello se utilizan vectores especiales que tienen caractersticas tanto de cromosomas artificiales de

bacterias (BACs) como de vectores binarios. El uso de estos vectores permite clonar fragmentos de ADN de gran tamao y posteriormente transferirlos al genoma vegetal va A. tumefaciens. Esta tecnologa es de gran utilidad para el clonado posicional de genes. Ms de 600 especies vegetales son hospedantes naturales de A. tumefaciens. Estas pertenecen en su mayora a dicotiledneas y gimnospermas y ms raramente a monocotiledneas. Para muchas de ellas se han puesto a punto protocolos de transformacin gentica basados en este vector. El inters en el desarrollo de este tipo de tecnologa hizo que se expandiera el rango de hospedantes de A. tumefaciens a especies que no son susceptibles en condiciones naturales a este patgeno. Esto fue posible debido al amplio conocimiento que se tiene de esta patognesis. As, se ha puesto nfasis en la utilizacin de A. tumefaciens como vector de transformacin en gramneas y se han desarrollado protocolos en varias especies de este grupo (arroz, maz, cebada, trigo y gramneas forrajeras). Cabe notar que su aplicacin es actualmente una rutina en arroz y maz. La transformacin con A. rhizogenes tiene fundamentalmente dos aplicaciones: la produccin de races con alta tasa de crecimiento capaces de sintetizar metabolitos secundarios como productos farmacuticos, aditivos alimentarios y cosmticos, y por otra parte representa una valiosa herramienta para la estimulacin de la rizognesis en especies recalcitrantes, por ejemplo, leosas. La puesta a punto de un protocolo eficiente y reproducible de transformacin mediada por Agrobacterium es un proceso complejo en el que adems de tener muy buen conocimiento de la respuesta al cultivo in vitro de la especie a transformar, hay que considerar aspectos tales como el genotipo vegetal, la cepa bacteriana, el tejido blanco de transformacin, la induccin de los genes de virulencia y el control del estrs durante todo el proceso. 2.3.2 Transformacin directa o por mtodos fsicos La primer metodologa de transformacin gentica de plantas desarrollada fue la de A.

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Figura 3: Comparacin de tcnicas de transformacin directa e indirecta

tumefaciens. Inicialmente esta tecnologa no result de utilidad para abordar la transformacin de especies de gran importancia econmica como los cereales, debido a que no son hospedantes naturales de esta bacteria. Este hecho condujo al desarrollo de los mtodos fsicos de transformacin. En ellos el transgen es introducido en la clula vegetal mediante distintas tcnicas que se detallan a continuacin. - Transformacin de protoplastos La introduccin y expresin de ADN for-

neo en protoplastos fue el primer mtodo de transferencia directa claramente demostrado en plantas y esto se debi a que se dispona, para algunas especies, de procedimientos eficientes para la regeneracin a partir de protoplastos. Se basa en el hecho de que la pared celular es la principal barrera para la introduccin de ADN en las clulas vegetales por lo que sta es temporariamente removida. Los protoplastos pueden ser aislados en forma mecnica o por un proceso enzimtico que digiere la pared. As se obtiene una suspensin conteniendo millones de clulas individuales lo que favorece la transformacin de clulas aisladas. Los protoplastos pueden ser transformados utilizando polietilenglicol (PEG), electroporacin, microinyeccin o liposomas. La transformacin de protoplastos mediada por PEG es el mtodo ms comnmente usado. Tanto el PEG como la electroporacin producen poros en la membrana plasmtica por alteracin de la polaridad de la misma y por ellos penetra el ADN forneo. En el ltimo caso se someten los protoplastos a un campo elctrico. Ambas tcnicas permiten el tratamiento de un gran nmero de protoplastos al mismo tiempo. La microinyeccin es un mtodo difcil y laborioso que consiste en la introduccin de ADN dentro de protoplastos individuales mediante el uso de capilares de inyeccin y micro-manipulador y aunque con esta metodologa es necesario manipular las clulas individualmente, es posible lograr un alto grado de integracin del ADN forneo. Cabe notar que el cultivo de protoplastos es la metodologa ms sofisticada de cultivo in vitro de plantas por lo cual representa gran complejidad experimental y no est disponible ms que para algunas especies y dentro de ellas particularmente en genotipos modelo. Por ello se desarrollaron metodologas alternativas de transformacin directa como la electroporacin de tejidos, el uso de fibras

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de carburo de silicio para facilitar la entrada corporar de manera permanente la informadel ADN en las clulas en cultivo y el bombar- cin gentica transferida. A pesar de la desdeo con microproyectiles o micropartculas. ventaja que representa el bajo nmero de - Bombardeo de micropartculas transformantes producido por un solo epiEs un proceso por el cual micropartculas sodio de bombardeo, la versatilidad de la cubiertas con ADN son aceleradas por un gas aceleracin de partculas para introducir comprimido e introducidas en clulas vege- transgenes ha superado muchas de las batales. Esta tcnica se ha ido perfeccionando rreras asociadas a otros mtodos de transy actualmente es la ms difundida entre los formacin, como son el rango de huspedes mtodos de transformacin directa. Inicial- de Agrobacterium y las dificultades inherenmente, la fuerza impulsora de las partculas tes al cultivo y regeneracin de protoplastos. estaba dada por plvora, pero luego fue reemplazada por el Tabla 2: Comparacin entre mtodos de transformacin del genoma sistema de helio comprimido nuclear Mtodo biolstico Agrobacterium que brinda una mejor regulacin de la fuerza, distribucin Especies a transformar - dicotiledneas y algunas - sin limitaciones monocotiledneas de microproyectiles y mayor Eficiencia de transformacin - alta - baja reproducibilidad entre bombar- Tipo de integracin en el - aleatoria en regiones con - aleatoria transcripcin genoma vegetal deos. Se utilizan micropro- bajo nmero de copias - multicopia en tandem yectiles de oro o tungsteno independientes - precisa - imprecisa (qumicamente inertes) cuyos Construccin de vectores - compleja - simple tamaos van desde 0,5 a 3 Dependencia del genotipo - mayor - menor vegetal mm, que al ser disparados a grandes velocidades pueden La biolstica ha demostrado ser la mejor opatravesar pared y membranas de la clula cin para la produccin de plantas vegetal bombardeada sin causarle daos le- transgnicas de soja, sorgo, papaya, esprratales (Klein y col., 1987). Para el bombardeo go, caa de azcar y trigo. se puede emplear cualquier tipo de explante vegetal, desde clulas o protoplastos hasta 2.3.3 Transformacin directa vs. indirecta plntulas completas, pasando por tejidos organizados en embriones y meristemas. El Con el transcurso de las investigaciones explante es generalmente sometido a un tra- se ha logrado optimizar los protocolos de tamiento osmtico pre y posbom-bardeo, transformacin para muchas especies vegeque produce plasm-lisis celular, evitando tales; igualmente, en la actualidad, ambas que el impacto y la penetracin de las part- vas de transformacin presentan ventajas y culas daen las clulas (Fig. 3). Los vectores desventajas que las hacen ms o menos conplasmdicos que se usan en este tipo de pro- venientes para los distintos fines. En la Tacedimiento slo requieren un origen de bla 2 se presenta una comparacin entre la replicacin que permita un alto nmero de transformacin del genoma nuclear mediacopias de los mismos en E. coli, aspecto que da por A. tumefaciens y el mtodo biolstico facilita en la prctica la preparacin del ADN como representante de los mtodos de necesario en grandes cantidades para la transformacin directa. transformacin gentica por este mtodo. Uno de los procesos necesarios para obEsta tcnica, sin embargo, tiene manifies- tener plantas transgnicas es la integracin tas limitaciones. Algunas especies oponen del transgen al ADN cromosmico. Con reuna resistencia natural a la penetracin de lacin a este proceso existen diferencias enlas partculas, dada por cutculas endurecidas, tre ambos mtodos. A. tumefaciens posee paredes celulares lignificadas o superficies un mecanismo natural muy eficiente para vellosas. Sin embargo, la principal limitacin transferir, al ncleo celular, el T-DNA que condel mtodo contina siendo la baja relacin tiene el transgen y producir una integracin entre el total de clulas sometidas al bom- aleatoria en regiones cromosmicas con acbardeo y el nmero de clulas que logran in- tividad transcripcional. Generalmente, los

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patrones de insercin de transgenes son ms sencillos en comparacin a los producidos por el mtodo biolstico. As, el nmero de copias que se incorpora es bajo y cuando hay ms de una copia, suelen distribuirse en loci independientes, lo que facilita la posterior eliminacin de las copias no deseadas por segregacin. Por otra parte, el mecanismo involucrado hace que se transfiera un segmento de ADN definido: el T-DNA, acompaado de protenas que lo protejen de la accin de nucleasas. Por el contrario, en el mtodo biolstico el ADN transferido no est asociado a protenas, por lo que al ser parcialmente degradado, slo parte del mismo llega al ncleo donde se produce, con baja eficiencia, la integracin al azar en el ADN cromosmico. En este mtodo es comn que se produzcan inserciones de varias copias del transgen en un mismo sitio del genoma con distinto grado de reordenamiento de la secuencia del transgen. Este ltimo aspecto es considerado como una desventaja ya que tanto desde el punto de vista de la percepcin pblica como el de la optimizacin de la expresin de los transgenes, es deseable disponer de inserciones simples y bien definidas molecularmente. Esto es particularmente relevante cuando se tiene por objetivo el desarrollo de productos comerciales. As, el fenmeno de silenciamiento de transgenes (prdida de su expresin), observado en algunos casos, puede resultar de la presencia de varias copias del transgen. Por otra parte, cuando se utiliza el mtodo biolstico, el segmento de ADN plasmdico que se integra al ADN cromosmico no est definido, como en el caso de T-DNA, sino que es de longitud variable. La construccin de vectores es mucho ms sencilla en el caso del mtodo biolstico. Este aspecto puede resultar importante en el contexto del desarrollo de proyectos de investigacin, en los cuales muchas veces se requiere utilizar un nmero considerable de vectores diferentes. Es conveniente destacar que en ambos mtodos la integracin del transgen en el genoma se produce al azar. Como consecuencia de ello, diferentes plantas transgnicas provenientes de un mismo experimento, presentan inserciones en distintos sitios del genoma receptor. As, la expre-

sin fenotpica de un transgen ser diferente en distintas plantas que contienen el mismo transgen, por lo cual, para clarificar la situacin se considera a cada una de ellas como eventos de transformacin distintos. La aplicacin de cualquiera de estos mtodos de transformacin al mejoramiento vegetal depende, en gran medida, de la disponibilidad de genotipos con muy buena respuesta al cultivo in vitro. Finalmente, cabe mencionar que en el caso de A. tumefaciens, debido a que se trata de una interaccin biolgica entre una planta y una bacteria, la dependencia del genotipo es mucho ms acentuada, ya que influyen tambin en la eficiencia de transformacin, tanto el genotipo de la planta como el de la bacteria. 2.3.4 Genes de seleccin e informadores En el proceso de obtencin de plantas transgnicas, los genes marcadores seleccionables (Tabla 3), generalmente de origen bacteriano, cumplen un rol de relevancia, sea para poner a punto un protocolo de transformacin o como acompaantes de genes de inters que se desean introducir. El gen marcador seleccionable otorga a las clulas transgnicas que lo expresan una importante ventaja, con respecto a las clulas no transgnicas, al permitirles crecer en un medio de cultivo que contiene el agente selectivo correspondiente. Entonces, si el gen marcador codifica para una protena que confiere resistencia a agentes fitotxicos como antibiticos o herbicidas, las clulas que lo expresen podrn crecer y desarrollarse en medio de cultivo que contenga dichos agentes selectivos mientras que las clulas no transgnicas no lo harn (seleccin negativa). En otros casos, la ventaja estar dada por la posibilidad de utilizar diferencialmente un sustrato. As, el gen man A de E. coli permite a las clulas vegetales que lo expresan utilizar la manosa como fuente de carbono, lo cual no es posible para las clulas no transgnicas (seleccin positiva). Es necesario tener en cuenta que algunas especies pueden poseer una resistencia natural a los agentes selectivos antes mencionados, por lo que es importante evaluar este aspecto cuando se elige el gen de seleccin a utilizar, as como

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Tabla 3: Genes marcadores utilizados comnmente en transformacin de plantas


Marcadores

2.4 Tcnicas de deteccin del transgen y sus productos

Seleccionables (Agente selectivo) npt II (kanamicina, paromomicina, G418) hph (higromicina) pat o bar p ( hosphinotricina, bialaphos) CP 4 (glifosato) man A (manosa 6 fosfato)

Visualizables (Fenotipos asociados) gus A (color azul ndigo) luciferasa (luminiscencia) gfp (fluorescencia verde)

el agente selectivo y las concentraciones del mismo. En la puesta a punto de las metodologas de transferencia de genes son asimismo de gran utilidad los genes marcadores visualizables o informadores que posibilitan la observacin directa de las clulas que los expresan (Tabla 3). Estos genes codifican para protenas que no estn presentes en las clulas vegetales y producen un fenotipo caracterstico de fcil y rpida observacin. As, el gen gus A proveniente de E. coli codifica para la enzima - glucuronidasa. Esta protena puede ser detectada cualitativamente por tincin histoqumica, en presencia de un sustrato especfico, por la produccin de un precipitado azul-ndigo de fcil visualizacin. Este marcador tambin puede ser detectado cuantitativamente usando tcnicas fluoromtricas. Como ejemplo de la aplicacin de estos mtodos de deteccin podemos mencionar el estudio de la expresin de un promotor en una especie vegetal. Para ello se puede construir un vector con la secuencia codificante de gus A y con una secuencia de terminacin de transcripcin, y estudiar en plantas transgnicas el patrn de expresin espacio-temporal del promotor (en qu tipo de clulas y cundo se expresa) por tincin histoqumica y su nivel de expresin por fluorometra. Recientemente, el gen de la protena fluorescente verde, gfp (green fluorescent protein), aislado de una medusa, se ha convertido en un gen marcador visualizable in vivo muy utilizado. Cuando se ilumina con luz ultravioleta o luz azul, tejidos que contienen clulas que expresan este gen, se observa un brillo verde fluorescente. Al ser ste un ensayo no destructivo, es decir que permite conservar vivo el material en estudio, representa una herramienta de utilidad para visualizar diferentes etapas del proceso de transformacin.

Luego de la seleccin in vitro, las plantas regeneradas deben ser analizadas por mtodos moleculares para identificar aquellas que porten y expresen los transgenes en los niveles deseados. Para ello se emplean tcnicas como: - Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR): con el uso de primers homlogos a la secuencia del transgen se puede determinar la presencia del mismo. Esta tcnica permite hacer un screening rpido de las plantas regeneradas, aunque tiene algunas limitaciones, un resultado positivo indica solamente que en la muestra existe una secuencia que amplifica con los primers utilizados pero no indica si el transgen se encuentra incorporado al genoma de la planta. Para maximizar la robustez de esta prueba es necesario utilizar temperaturas de annealing o apareamiento de primers altas (ms de 60 C) y primers relativamente largos (ms de 20 nucletidos). Una variacin de esta tcnica, PCR en tiempo real, resulta de utilidad para evaluar el nmero de copias del transgen incorporadas al genoma de la clula vegetal.

- Hibridacin southern o Southern blotting: es una de las herramientas moleculares ms poderosas para caracterizar las plantas transgnicas. Adems de indicar la presencia o no de la secuencia de inters, da informacin acerca de la integracin de la misma en el genoma de la clula husped (nmero de copias integradas y nmero de loci en los cuales se produjo la integracin). En la Fig. 4 se representa el anlisis de un caso hipottico de transformacin mediante Agrobacterium, aunque ste es aplicable tambin a plantas obtenidas por mtodos directos. El esquema 4-a representa parte del vector que contiene el gen de inters y el gen marcador. Si se utiliza como sonda el T-DNA completo y la digestin del ADN genmico se realiza con enzimas de restriccin que no cortan dentro del T-DNA, el nmero de bandas del patrn representa el nmero de si-

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Hind III

Eco RI

Sal I

Sal I

Hind III

BI

Gen Marcador 2 kb b)

Gen de Inters 3 kb c) 1 2 3 4 5 d) 1 2 3

BD

1 2 3

4 5

4 5

Sitio de corte: Sonda: Frag: tamao

Ausente dentro del T -DNA T-DNA (frag.Hind III) > 5 kb

Uno interno (Eco RI) Un sitio (EcoRI) entre el marcador y el transgen T-DNA (frag.Hind III) > 2 kb Gen marcador > 2 kb

e) 1

2 3

f)

2 3

Sitio de corte: Un sitio (Eco RI) entre el marcador y el transgen Sonda: Frag: ta mao cantidad Transgen > 3 kb Igual que en d)

Dos sitios (Sal I) dentro del transgen Fragmento (Sal I) del transgen 1 kb Uno

Figura 4: Patrones de Hidridacin de Southern (Modificado de Bhat y Srinivasan, 2002)

tios de insercin. El tamao de las bandas ser mayor que el T-DNA ya que se estn utilizando enzimas que cortan por fuera de ste. Plantas transgnicas obtenidas en forma independiente tendrn patrones de hibridacin diferentes (4-b). Por otra parte, si la enzima tiene un sitio de corte nico dentro del T-DNA, utilizando la sonda antes mencionada, sta dar dos seales de hibridacin para

cada sitio de insercin independiente del TDNA (4-c). La aparicin de un nmero impar de bandas indica que en un mismo sitio se insertaron mltiples copias, ocurrieron rearreglos o se produjo el truncado del TDNA. Si se digiere la muestra con una enzima de restriccin que posee un sitio nico de corte entre el gen marcador y el gen de inters y utilizando como sonda el gen marca-

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dor, se obtendr una sola banda por cada insercin independiente (4-d). Si la membrana se hibrida con el gen de inters (4-e) aparecer un patrn que tendr el mismo nmero de bandas que el anterior. La ausencia de una banda es indicativo de la insercin de una copia truncada de uno de los genes por lo que se pierde el sitio de corte. La aparicin de una banda del tamao del T-DNA puede indicar la presencia de repeticiones en tandem. Para estimar el nmero de copias del transgen en un locus transgnico, se deben utilizar enzimas de restriccin con sitios flanqueantes del transgen y como sonda, el transgen. Se observar una sola banda del tamao del transgen; sin embargo, la intensidad de la seal variar entre las distintas plantas analizadas de acuerdo con el nmero de copias del mismo (4-f). Para realizar la comparacin es necesario utilizar simultneamente estndares conteniendo un nmero conocido de copias del transgen. Esta determinacin no es del todo precisa ya que existe mucha variabilidad en los resultados debido a diferencias en la digestin de las muestras y a la degradacin que sufre el ADN. En lo que respecta a la cuantificacin, esta tcnica ha sido reemplazada en gran medida, en los ltimos aos, por la PCR en tiempo real o real time PCR, antes mencionada, dado que esta ltima resulta menos costosa en reactivos y tiempo y requiere menos cantidad de material vegetal para realizar el anlisis. - Anlisis de ARN: Las tcnicas de RTPCR (transcripcin reversa seguida de PCR) con la hidridacin de ARN o Northern blotting pueden resultar valiosas herramientas para detectar los transcriptos de inters presentes en la muestra. La RT-PCR presenta algunas ventajas frente al Northern blotting: se requiere poca cantidad de material, posee una alta sensibilidad y la muestra es de fcil preparacin. Por otra parte, la hibridacin del ARN utiliza como sonda el transgen, ofrece informacin sobre el tamao del transcripto y permite su cuantificacin. - ELISA y Western blotting: aquellas plantas que poseen la secuencia de inters y la expresan como transcripto, pueden ser analizadas con estas tcnicas inmunolgicas a fin de determinar la presencia de la protena codificada por el transgen.

La actividad de la protena debe ser medida, sea por ensayos bioqumicos o por bioensayos, a fin de interpretar correctamente el fenotipo de la planta obtenida. Adems, es conveniente confirmar la estabilidad meitica de los transgenes estudiando su transmisin sexual a la generacin siguiente. Estas tcnicas se encuentran descriptas detalladamente en la seccin II.3 y su aplicacin para el anlisis de plantas transgnicas en Register (1997) y en Bhat y Srinivasan (2002). Finalmente, el comportamiento de los individuos transgnicos se estudia en laboratorio, invernculo y campo. Cabe aclarar que para realizar experimentos de invernculo y de campo es necesario contar con autorizacin de la Comisin Nacional Asesora de Biotecnologa Agropecuaria (CONABIA) (ver IX.-3). 3 Aporte de la transformacin gentica a la variabilidad gentica Como ya se mencion, la transformacin gentica permite introducir variabilidad gentica novedosa en las diferentes especies vegetales. Analizando con ms detalle este concepto podemos considerar que este aporte puede ser realizado de diferentes maneras. As, este puede consistir en: a) La expresin de secuencias codificantes no existentes en la especie (ejemplo: protenas insecticidas de origen bacteriano). b)La expresin de nuevas formas allicas de genes que ya estn presentes en el genoma (ejemplo: tolerancia al glifosato en soja). c) La expresin de secuencias codificantes presentes en el genoma pero bajo el control de nuevas secuencias regulatorias que modifican su nivel o patrn de expresin (ejemplo: protenas relacionadas a la patognesis). d)La inhibicin de la expresin de genes residentes en el genoma . Para lograr la inhibicin de la expresin gnica se pueden usar diferentes tcnicas: cosupresin, antisentido y la denominada interferencia del ARN. Todas ellas se basan en un proceso denominado silenciamiento gnico post-transcripcional. Este involucra la degradacin del ARN mensajero producido

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por un gen determinado. La cosupresin consiste en la obtencin de plantas transgnicas que expresan un transgen homlogo del gen residente que se desea silenciar. La tcnica del ARN antisentido involucra la sntesis de molculas de ARN que son complementarias al ARNm producido por la transcripcin del gen que se quiere silenciar. El transgen consta de la secuencia codificante del gen cuya expresin se desea alterar pero con la orientacin invertida, cuando esta secuencia se transcribe genera ARN que hibrida con el ARNm formando una hebra doble que bloquea la traduccin. Como resultado de este mecanismo las clulas transformadas producirn poco o ningn producto proteico. Esta tcnica ha sido utilizada para obtener variedad de tomates (FlavrSavr) la que mantiene su firmeza durante mas tiempo luego de la cosecha debido a que la enzima responsable de la rotura de la pared celular, la polygalacturonidasa, se expresa en un 10% del nivel normal. La interferencia del ARN es parte de un mecanismo regulatorio natural de la expresin gnica que es actualmente muy estudiado y es la metodologa ms eficiente, y por ello la ms utilizada, para silenciar genes en plantas. La tcnica se basa en la construccin de transgenes cuyo producto final es un ARN. Este contiene parte de la secuencia transcripta del gen a silenciar en forma de repeticin invertida. Como consecuencia de esta estructura , cuando este tipo de transgen se transcribe en la planta se genera un ARN de doble cadena que dispara el mecanismo de degradacin dependiente de la secuencia antes mencionado (Agrawal et al., 2003). El uso de una secuencia espaciadora entre las repeticiones confiere a las construcciones mayor estabilidad durante las manipulaciones en bacterias. Este tipo de construcciones se denominan ARN hairpin. Adems, se observ que el uso de un intrn como secuencia espaciadora, produce un silenciamiento ms eficiente en la planta. Esta metodologa es una herramienta muy valiosa para los proyectos de genmica funcional para poner en evidencia la funcin de genes clonados mediante su inactivacin. Otra posibilidad es utilizarla para la obtencin de plantas transgnicas mejoradas mediante la inactivacin de genes endgenos cuya expre-

sin es indeseada (Kusaba, 2004). Una interesante aplicacin de inters agronmico de esta tecnologa fue la obtencin de plantas transgnicas de caf que no contienen cafena. 4 Obtencin de plantas transplastmicas Las clulas vegetales contienen tres genomas: el nuclear, el plastdico y el mitocondrial. Los mtodos presentados en las secciones precedentes tienen como blanco de transformacin al genoma nuclear. Sin embargo, en los ltimos aos la obtencin de plantas transplastmicas ha recibido notable atencin (Maliga, 2002). As, el genoma de los plstidos (plastoma) se ha convertido en un blanco atractivo para la ingeniera gentica ya que esta tecnologa ofrece una serie de ventajas sobre la transformacin del genoma nuclear: 1. Se pueden obtener altos niveles de expresin de los transgenes y elevados niveles de acumulacin de las protenas codificadas por ellos (hasta el 47% de las protenas solubles totales). Cabe notar que el nivel de acumulacin observado a partir de transgenes nucleares es generalmente inferior al 1%. 2. Es posible expresar un transgen opern con varias secuencias codificantes bajo el control de un mismo promotor. 3. No se observa efecto de posicin debido a que la integracin del transgen est dirigida a un sitio particular del plastoma. Esto hace que no sea necesario obtener una gran poblacin de transformantes, a diferencia de lo que actualmente ocurre con las plantas transgnicas nucleares. 4. No se observa silenciamiento de transgenes. 5. Para las especies que tienen transmisin materna de los plstidos (la mayora). Se minimiza la dispersin de los transgenes por el polen debido a la ausencia de transmisin de los plstidos por el mismo. 6. A pesar de la naturaleza eminentemente procariota del sistema gentico de los plstidos, se ha demostrado que estas organelas pueden procesar protenas eucariotas permitiendo su correcto plegamiento y la formacin de puentes disulfuro gracias a la presencia de protenas

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chaperonas endgenos.

sistemas

enzimticos

Los protocolos existentes para la obtencin de plantas transplastmicas se basan en la transferencia de genes por el mtodo biolstico, un eficiente proceso de cultivo y seleccin in vitro, y la utilizacin de vectores con secuencias homlogas al genoma del cloroplasto. A diferencia de lo que ocurre en la transformacin del genoma nuclear, la integracin dirigida de los transgenes en el plastoma se realiza mediante recombinacin homloga. Para lograr esto, los vectores contienen los transgenes de inters flanqueados por secuencias con alta homologa al ADN plastdico. La homologa entre el ADN del vector y del ADN del cloroplasto determina la potencialidad del plsmido para ser utilizado en la transformacin gentica del plastoma. En este contexto, la existencia de secuencias altamente conservadas en el plastoma de varias especies es explotada para el diseo de vectores universales, potencialmente tiles en la transformacin de los cloroplastos de numerosas especies. La expresin exclusivamente plastdica de los transgenes queda asegurada a travs de la utilizacin de promotores especficos del cloroplasto, cuya transcripcin tiene caractersticas tpicamente procariticas. 5 Importancia y aplicaciones de las plantas transgnicas Las primeras plantas transgnicas experimentales fueron obtenidas a mediados de los aos 80. La disponibilidad de esta tecnologa permiti importantes avances en el rea del conocimiento de la biologa vegetal. Por otra parte, se constituy en una herramienta disponible para el mejoramiento gentico vegetal (ver aspectos para esta aplicacin en Birch, 1997) y el gran esfuerzo realizado en este sentido tuvo como consecuencia la llegada al mercado, a partir de 1995, de los primeros cultivares transgnicos. Es destacable la rpida adopcin que tuvieron estos productos. As en el 2002 se cultivaron en el mundo 58,7 millones de hectreas con plantas transgnicas. El 99% de este rea global se cultiv en 4 pases (USA, Argentina, Canad y China) mientras que el 1% restante se

distribuy en 12 pases. Esta superficie estuvo ocupada prcticamente por 4 cultivos: soja (62%), maz (21%), algodn (12%) y canola (5%). Los caracteres modificados que presentaron estos cultivos fueron resistencia a herbicidas (75%), resistencia a insectos (17%) o una combinacin de ambos (8%). En la Argentina los eventos con autorizacin de comercializacin son los siguientes: soja (tolerancia a glifosato), maz (resistencia a lepidpteros, tolerancia a glufosinato de amonio) y algodn (resistencia a lepidpteros, tolerancia a glifosato). La CONABIA (ver en la pgina de la Secretara de Agricultura, Ganadera, Pesca y Alimentos, Repblica Argentina; http:// www.sagpya.mecon.gov.ar/), ha autorizado desde el ao 1991, 520 solicitudes para liberaciones a campo, en distintas especies y con diferentes eventos de transformacin. Los cultivos transgnicos actuales corresponden a lo que se denomina la primera generacin que tiene por objetivo el aumento de la productividad de los cultivos, la reduccin en el uso de agroqumicos, la conservacin de la tierra arable, el agua y la energa, la reduccin de la contaminacin del ambiente y los beneficios para la salud humana derivados de estos aspectos. Se considera que la segunda generacin de cultivos transgnicos tendr ms beneficios directos para los consumidores. Estos comprenden el mejoramiento de la calidad nutricional (protenas, aceite, vitaminas y minerales), la eliminacin de alergenos, la fitoremediacin (es decir la recuperacin de ambientes contaminados mediante el uso de plantas) y la utilizacin de plantas como bioreactores para la expresin de protenas recombinantes con fines tales como la produccin de vacunas comestibles, anticuerpos y otras protenas de uso teraputico o industrial. Esta aplicacin se conoce como molecular farming (produccin de molculas en la granja) y presenta numerosas ventajas para la produccin en gran escala de estas protenas en particular en lo que respecta a costos, practicidad y seguridad. Sin embargo an quedan algunos aspectos que limitan su potencial como biorreactores como son la calidad y homogeneidad del producto final. En los ltimos 10 aos, se han desarrollado varios sistemas de expresin basados en plantas y en la ac-

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tualidad se producen ms de 100 protenas recombinantes en diferentes especies vegetales, generndose un estrecho vnculo entre la agricultura y muchas ramas de la industria. Un ejemplo destacable es el arroz dorado, llamado as por la pigmentacin amarilla que tienen sus granos debido a que acumula altos niveles de provitamina A en el endosperma. La tercera generacin de cultivos transgnicos se basar en la informacin producida por los proyectos genmicos y tendr por objeto aspectos tales como la modificacin de la arquitectura de la planta, la manipulacin de la floracin, el mejoramiento de la eficiencia fotosinttica, la manipulacin de la heterosis y la apomixis, etc. 6 Perspectivas La continuidad en el desarrollo de tecnologa de transferencia de genes en plantas es importante tanto para ampliar el rango de especies a transformar como el de genotipos dentro de cada especie. En los ltimos aos se nota un creciente inters en el control del nivel de expresin de transgenes as como de su regulacin espacial y temporal. La expresin de los genes nucleares eucariticos est controlada en varios niveles que involucran la transcripcin propiamente dicha, el procesamiento, transporte y estabilidad de los transcriptos y su traducibilidad, as como la estabilidad, modificacin y compartimentalizacin del producto proteico final. Por otra parte, es necesario aprovechar la experiencia acumulada en cuanto a la expresin de transgenes, de modo de disear protocolos de transferencia que minimicen las posibilidades de silenciamiento gnico. En este contexto, est recibiendo notable atencin el estudio de la recombinacin homloga como mecanismo para la transformacin del genoma nuclear (ver revisin de Hanin y Paszkowski, 2003). Del anlisis comparativo de mtodos presentado cabe destacar dos aspectos actualmente en desarrollo. Por un lado, contina el inters en extender el uso de la transformacin mediada por A. tumefaciens a especies que no son hospedantes naturales de la bacteria. Por otro lado, como fuera anteriormente mencionado, los mtodos de transformacin gentica actualmente en uso re-

quieren de genotipos con una excelente respuesta al cultivo in vitro, lo cual resulta en una clara limitacin cuando se desea aplicar esta tecnologa a los materiales usados por los mejoradores, los que generalmente no poseen esta caracterstica. Por ello, se est tratando de reducir y si es posible evitar la fase de cultivo in vitro durante el proceso de transformacin, lo que permitir ampliar el rango de genotipos a los cuales se podr aplicar esta moderna tecnologa. As, se desarroll un mtodo eficiente y reproducible de transformacin in planta para Arabidopsis thaliana. Este consiste en infiltrar con vaco plantas adultas de esta especie, con una suspensin de A. tumefaciens de modo que los tejidos y rganos reproductivos sean invadidos por la bacteria. Posteriormente se propuso una simplificacin de este mtodo que consiste en reemplazar el tratamiento de vaco y sumergir la inflorescencia en una suspensin bacteriana que incluye un surfactante. Las plantas transgnicas que se obtienen por autofecundacin de las plantas as transformadas, son hemicigotas y se demostr que esta metodologa produce la transformacin de la gameta femenina. El logro de determinados objetivos como puede ser el redireccionamiento de una ruta metablica o la modificacin de un carcter complejo de inters agronmico como por ejemplo la resistencia durable a enfermedades fngicas, requiere de la integracin de mltiples transgenes y de la expresin coordinada de los mismos en la planta transgnica. Este tema est recibiendo notable atencin (ver revisin de Franois y col., 2002). Los mtodos de transformacin que hemos descripto se basan en la utilizacin de genes marcadores seleccionables. Sin embargo, hay razones por las cuales la presencia del marcador no es deseable en plantas transgnicas que se liberan al ambiente. Hay un manifiesto rechazo por parte del pblico con respecto a la utilizacin de genes de resistencia antibiticos y en determinadas situaciones, el uso de genes de resistencia a herbicidas puede ser inconveniente. Por otra parte, desde un punto de vista experimental puede ser necesario transformar una misma planta varias veces con distintos trans-

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genes y con la metodologa convencional no hay ms que un nmero limitado de genes marcadores disponibles. Por ello se consideran estrategias alternativas para la obtencin de plantas transgnicas libres de marcadores (Puchta, 2003). La estrategia que ha recibido ms esfuerzo hasta ahora, plantea la remocin va cruzamiento sexual del marcador seleccionable luego de haber obtenido la planta transgnica. Una posibilidad para ello es cotransformar, esto implica que el transgen de inters y el marcador seleccionable estn presentes en vectores distintos y que posteriormente se separen los genes por segregacin luego de la reproduccin sexual. Sin embargo, esta puede ser una alternativa poco atractiva en circunstancias particulares como cuando no se dispone de un protocolo eficiente de cotransfor-macin o cuando no se desea reproducir sexualmente la planta transgnica. Otra opcin dentro de esta lnea es la utilizacin del sistema de recombinacin sitio-especfica de origen viral Cre/lox. Ms recientemente se ha propuesto como estrategia alternativa el desarrollo de mtodos de transformacin que no usen marcadores seleccionables. La idea subyacente es incrementar la frecuencia de transformacin a travs del uso de genes que promuevan la regeneracin. Finalmente, las plantas transgnicas actualmente cultivadas comercialmente, en su mayora resistentes a herbicidas nos permiten ganar experiencia y acumular el conocimiento necesario para desarrollar nuevas y mejores generaciones de productos.

7 Lecturas recomendadas
AGRAWAL, N.; DASARADHI, V.; MOHAMMED, A.; MALHOTRA, P.; BHATNAGAR, R. y MUKHERJEE, S. 2003 RNA Interference: Biology, Mechanism , and Applications. Microbiology and Molecular Biology Reviews Dec. 2003, p. 657-685. BIRCH R. 1997. Plant transformation: Problems and strategies for practical applications. Annu. Rev.Plant Physiol. Plant Mol.Biol. 48: 297-326. FRANOIS, I.; BROEKAERT, W.; CAMMUE, B. 2002. Different approaches for multi-transgene-stacking in plants. Plant Science 63: 281-295. GELVIN S. 2000. Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and integration. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 51: 223-256. HANIN, M.; PASZKOWSKI, J. 2003. Plant genome modification by homologous recombination. Current Opinion in Plant Biology 6: 157-162. HORSCH, R.; FRALEY, R.; ROGERS, S.; SANDERS, P.; LLOYD, A.; HOFFMAN, N. 1984. Inheritance of functional foreign genes in plants. Science 223: 496-498. KLEIN, T.; WOLF, E.; WU, R.; SANFORD, J. 1987.High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature 327: 70-73. KUSABA, M. 2004. RNA interference in crop plants Current Opinion in Biotechnology 15: 1-5. MALIGA, P. 2002. Engineering the plastid genome of higher plants. Current Opinion in Plant Biology 5: 164172. PUCHTA, H. 2003. Marker-free transgenic plants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 74: 123-134. REGISTER J. 1997. Approaches to evaluating the transgenic status of transformed plants. TiBTech, 15:141-6.

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III.-Captulo 4
Polinizacin y fertilizacin in vitro.
Picca, Aurora; Cardone, Susana 1 Introduccin Muchas plantas con flores producen menos frutos maduros que flores, y los frutos, a su vez, generan menos semillas que el nmero de vulos disponibles para la fecundacin. Considerando que la produccin de polen no es el factor limitante, existen diferentes razones que explican esta situacin. En ocasiones, a pesar de la ocurrencia de la polinizacin, la fecundacin no puede llevarse a cabo. Otras veces, la fecundacin ocurre normalmente pero el embrin aborta en forma precoz. En cualquiera de estas circunstancias, las tcnicas de cultivo in vitro y manipulacin de clulas aisladas son apropiadas para lograr el proceso completo de desarrollo del embrin y del endosperma y la obtencin de semillas normales. En este captulo se utilizarn indistintamente los trminos fecundacin y fertilizacin como sinnimos, refirindose a la unin de las gametas masculina y femenina para originar un nuevo individuo. La tcnica de fertilizacin o polinizacin ovular in vitro fue desarrollada por Kanta et al. en 1962, quienes demostraron que en algunas especies de papaverceas los granos de polen tenan la capacidad de germinar in vitro directamente sobre los vulos en cultivo. En estas condiciones el tubo polnico alcanzaba el saco embrionario para concretar la fertilizacin, con la consiguiente formacin de semilla normal en el mismo medio de cultivo. Esta tcnica desarrollada en Papaver somniferum, ha sido luego empleada en varias especies de plantas como Dianthus caryophyllus, Nicotiana tabacum, N. rustica, Argemone mexicana, Eschechlozia californica, Petunia violacea, Antirrhinum majus y Dicranostigma franchetianum. Bajo el nombre de polinizacin in vitro se suele englobar a varias tcnicas que si bien poseen puntos en comn, difieren en otros. Entre ellas se pueden citar la polinizacin in vitro de vulos, la polinizacin placental

in vitro y la polinizacin estigmtica in vitro. En todos los casos la gameta femenina es fecundada por clulas espermticas liberadas por el tubo polnico, en forma casi idntica a la va natural. El trmino fertilizacin in vitro se utiliza para aquellos casos donde la fusin de las gametas aisladas se logra por distintos mtodos como electrofusin, alta concentracin de calcio o elevado pH. A veces la fertilizacin ocurre normalmente, pero el embrin no puede alcanzar la madurez debido a una ruptura del equilibrio entre el mismo y el endosperma o por anomalas en el desarrollo embrionario que impiden una nutricin normal. Esto es lo que se conoce como barreras posfertilizacin o poscigticas , que pueden contrarrestarse con el rescate de los embriones y su posterior crecimiento en un medio nutritivo adecuado. 2 Fertilizacin in vitro Durante aos, los cientficos utilizaron tcnicas de fertilizacin in vitro de gametas aisladas tanto en animales como en plantas inferiores. Sin embargo, estos mtodos no pudieron ser aplicados a las plantas superiores hasta comienzos de la dcada de los noventa. Esto se debi a que la fertilizacin in vitro de las gametas aisladas de plantas superiores es un proceso muy diferente al que ocurre in vivo, y tambin lo es de los sistemas animales y de las plantas inferiores, donde las gametas son de vida libre. El hecho ms notable de la fertilizacin in vivo de las angiospermas es el de la doble fecundacin, que es un proceso muy complejo en comparacin con lo que acontece en todos los dems seres vivos. Esto ocurre en el saco embrionario, que se halla profusamente cubierto por el tejido materno. Los ncleos espermticos se encuentran dentro de los granos de polen o tubos polnicos. Durante la fertilizacin, el tubo polnico llega hasta el aparato ovular, desorganizndose entonces el ncleo vegetativo. Las dos clulas espermticas contenidas en el tubo, se vuelcan en una de las sinrgidas, la misma se desorganiza y uno de los ncleos espermticos se fusiona con la osfera para dar el cigoto, que luego producir el embrin.

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El otro ncleo masculino se reunir con dos ncleos femeninos secundarios para dar la clula madre del endosperma triploide (Fig. 1). Para que la fertilizacin tenga lugar in vitro no slo deben aislarse las gametas fe-

la clula espermtica con la ovoclula, dando como resultado un cigoto, un embrin y finalmente una planta madura. Estudios posteriores (1998,1999) posibilitaron el desarrollo de endosperma in vitro de maz a partir de la fusin por pares de clulas espermticas y nOsfera en fusin con uno de cleos secundarios aislados. los gametos La fusin del ncleo de la clula espermtica puede ocurrir con uno de los dos nNcleos polares cleos polares o con los nSaco embrionario recibiendo al segundo cleos secundarios y se comSaco embrionario gameto pleta aproximadamente dos horas despus de la fusin in Sinrgida que vitro de las clulas. Los esturecibi el extremo dios in vitro sobre los primedel tubo polnico ros eventos despus de la fusin de las clulas y ncleos indicaron que las primeras clulas del endosperma resultante desarrollan un tejiTubo polnico polnico Tubo do caracterstico capaz de autoorganizarse en forma Figura 1: Corte longitudinal de un vulo mostrando la doble fecundacin en angiospermas. separada del tejido materno. meninas y masculinas sino que deben ser inducidas a fusionarse en ausencia de las clu- 2.1 Aislamiento y seleccin de las las asociadas. Las tcnicas de micromani- gametas pulacin desarrolladas durante los aos 80 Se han desarrollado mtodos de aislapermitieron el aislamiento y la fusin in vitro de gametas femeninas y masculinas de miento y seleccin de gametas para una angiospermas. La combinacin de estas tc- amplia variedad de especies vegetales entre nicas con mtodos de cultivo de clulas ni- ellas maz ( Zea mays ), trigo ( Triticum cas posibilitaron la fertilizacin in vitro. Se aestivum ), cebada ( Hordeum vulgare ), pudo concretar de esta manera el desarrollo raygrass ( Lolium perenne ) y algunas de cigotos y de endospermas en forma indi- brasicceas. Los pasos a seguir son los siguientes: vidual in vitro, lo cual demuestra que cigotos a) Conocer exhaustivamente la morfoloy endosperma son capaces de autoorganizarse en cultivo, independientemente del ga floral de la especie a utilizar con el objetitejido materno. Tanto los cigotos obtenidos vo de ubicar el saco embrionario y sus clulas in vitro como los que son aislados despus constituyentes. b)Aislar las gametas masculinas a partir de la polinizacin in vivo desarrollan embriones normales y posteriormente plantas fr- de los granos de polen mediante choque osmtico y/o de pH. tiles en cultivo. c) Aislar el saco embrionario y las gametas En 1989 se fusionaron por primera vez gametas aisladas de maz in vitro (Zea mays). femeninas mediante microdiseccin individual Llev tres aos ms regenerar plantas en asociacin con maceracin enzimtica. hbridas frtiles, va embriognesis cigtica, a Este paso es crtico y limitante ya que puepartir de esos cigotos cultivados individual- den obtenerse pocas gametas femeninas y mente. Actualmente puede reproducirse in el proceso de manipulacin es muy delicado. vitro el ciclo completo de vida de una planta El tratamiento de las espigas no polinizadas superior, comenzando con la electrofusin de con 2,4-D, que induce a la expansin del ova-

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Figura 2: Fertilizacin in vitro mediante electrofusin. rio, facilita el proceso, resultando en ovarios ms grandes y vulos ms blandos, incrementando la eficiencia en el aislamiento de las ovoclulas. Fertilizacin in vitro propiamente dicha. Esta puede ser realizada mediante la microinyeccin de clulas espermticas o ncleos espermticos aislados en clulas individuales obtenidas de los sacos embrionarios o por electrofusin (Fig. 2). En este ltimo caso las gametas se ponen en contacto en una cmara de electrofusin por alineacin dielectrofortica y se fusionan mediante pulsos elctricos. Los productos de fusin pueden ser entonces cultivados en una solucin con clulas nodrizas y algunos de ellos desarrollarn en proembriones. 2.2 Fusin de las gametas Muchos de estos estudios, algunos de los cuales datan de 1994, fueron realizados en maz, donde las gametas masculinas se obtienen a partir de granos de polen fresco sometidos a un shock de pH en una solucin 0,5 M de manitol. Las ovoclulas y los protoplastos de las clulas centrales se aislan

de vulos por tratamiento con enzimas celulolticas y microdiseccin manual. Las gametas femeninas y masculinas aisladas se colocan de a pares, bajo condiciones de esterilidad, en un medio de fusin simple compuesto por manitol y cloruro de calcio (CaCl2). El uso de microagujas de vidrio permite poner en contacto las gametas femeninas y masculinas a fin de facilitar y dirigir la fusin. La adhesin y posterior fusin de las gametas es rpida (aproximadamente 10 segundos). A los 20 minutos de realizada la fusin, deja de visualizarse el ncleo masculino y 20 horas despus es posible visualizar mediante contraste de fases la presencia de dos ncleos, de manera similar a lo que se observa in vivo. En 1995 se logr la fertilizacin exitosa de trigo a travs de la electrofusin de ovoclulas con clulas espermticas. En promedio, la frecuencia de fusin suele ser del 30%, pero bajo condiciones ptimas es posible alcanzar frecuencias superiores al 55%. Dos das despus de la fusin elctrica aproximadamente el 60% de los productos de fusin comenz a dividirse y cerca del 90% de ellos form estructuras multicelulares y en unos pocos casos microcallos. Pese a que se ha tomado al maz (Zea mays L) como sistema vegetal modelo en el cual estudiar los procesos de fusin de gametas y posterior embriognesis, tambin se han realizado trabajos exitosos de fusin de gametas en trigo (Triticum aestivum L.) obteniendo como resultado estructuras multicelulares y en algunos casos del tipo de microcallos. Los recientes progresos relacionados a los sistemas de fertilizacin in vitro as como los proyectos de genmica posibilitarn una mejor comprensin de los procesos de reconocimiento gamtico, fusin, seales intracelulares, eventos tempranos de activacin del huevo y formacin del cigoto. 3 Polinizacin in vitro En muchos casos el polen no puede germinar sobre el estigma de la propia flor aunque ste se halle receptivo. Este hecho puede deberse a barreras genticas o fisiolgicas. Algunas de estas barreras de prefertilizacin o precigticas se deben a:

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a) la incapacidad del polen de germinar en estigmas extraos b)la incapacidad del tubo polnico para alcanzar el vulo debido a una lenta velocidad de crecimiento o a una excesiva longitud del estilo. En estos casos, el ovario aborta antes de que el tubo polnico alcance la base del estilo o sin que la alcance en absoluto c) el hecho que el tubo polnico se deshaga en el estilo. La polinizacin in vitro de vulos con el desarrollo posterior de embriones ha sido exitosa en 14 familias de Angiospermas, resultando ms adecuada su aplicacin en aquellas especies que poseen ovarios grandes y que contienen muchos vulos. No obstante, con el tiempo se desarrollaron varias tcnicas de polinizacin in vitro ms sofisticadas ampliando con esto las posibilidades de aplicacin. Entre estas tcnicas se encuentran: - La polinizacin estigmtica, que consiste en cultivar el pistilo in vitro y colocar el polen sobre el estigma. - La polinizacin placental, donde los vulos se ponen en contacto con el polen a travs de un corte en la parte superior del ovario o quedan directamente expuestos por remocin de la pared del ovario. - La polinizacin de vulos aislados que se cultivan directamente sobre el medio de cultivo. - El injerto del estilo, en el cual los granos de polen germinan en un estilo compatible y luego se los une al ovario de la planta madre que se desea fertilizar. Es de esperar que en todos estos casos el polen germine en pocas horas, y que despus de la polinizacin, tenga lugar la fertilizacin. En la polinizacin placental in vitro los porcentajes de supervivencia son muy buenos, ya que los vulos no resultan daados durante las manipulaciones involucradas en su aislamiento. El cultivo junto con la placenta incrementa, en general, las posibilidades de un rpido desarrollo embrionario. El cultivo de vulos aislados (separados de su placenta) es un procedimiento mucho ms complicado y que ha sido empleado con xito slo en pocas especies de plantas. Para que las tcnicas sean exitosas es

crucial realizar el aislamiento de los vulos y del polen en el estado fisiolgico adecuado, por lo que es indispensable realizar un estudio de la duracin de los distintos estadios del desarrollo de ambos. Este estudio consiste en: a) Determinar los tiempos de antesis, dehiscencia de las anteras y polinizacin. b)Precisar el momento en que el estigma est receptivo c) Especificar el momento adecuado para la polinizacin. d)Establecer el tiempo adecuado para recoger el polen. Experimentalmente se intent la polinizacin in vitro de vulos de varias especies de angiospermas con polen proveniente de varias especies de gimnospermas. El anlisis embriolgico de los vulos de Melandrium album, fijados tres das despus de la polinizacin con polen de Pinus wallihiana, revel la presencia de remanentes de tubos polnicos y embriones de 2-clulas en los sacos embrionarios. 4 Cultivo de vulos y embriones in vitro El cultivo de vulos es un procedimiento muy complejo debido a que la manipulacin del material es difcil. El vulo es una estructura delicada, muy pequea, altamente hidratada, que puede ser daada con suma facilidad. Es imprescindible realizar la microciruga con rapidez para evitar que los tejidos sufran desecacin durante el proceso. Pese a las dificultades de la tcnica, en algunos cruzamientos interespecficos como los realizados en papa, algodn y Hevea brasiliensis, se comprob que el cultivo de vulos completos es ms exitoso para el rescate de embriones que el cultivo de los embriones aislados. El rescate de embriones consiste en aislar los embriones de los vulos de una planta y cultivarlos en un medio estril que contenga los nutrientes esenciales que les permita concluir su desarrollo normal y germinar. Esta tcnica es relativamente fcil de llevar a cabo en embriones maduros y sus posibilidades de xito son muy buenas. Las dificultades incrementan cuanto ms inmaduro sea el

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embrin a rescatar, ya que los requerimientos nutricionales son ms especficos en las etapas tempranas de desarrollo del embrin. El cultivo de vulos y de embriones vegetales se emplea en mejoramiento vegetal cuando se desea: - sortear algunas de las barreras de autoincompatibilidad - rescatar embriones abortivos derivados de la hibridacin interespecfica o intergenrica - superar problemas de abscisin precoz del fruto - recuperar embriones de cruzas interespecficas que conducen a la obtencin de haploides - acortar el perodo de latencia que ocurre en algunas semillas por presentarse inhibidores del desarrollo del embrin, en el endosperma o en la cubierta de la misma. El cultivo de embriones ha ayudado tambin al mejoramiento gentico de especies leosas que tienen dificultad en la germinacin de sus semillas como en Taxus mairei o con escasa produccin de semillas como es el caso de Pseudotsuga macrolepis y constituye una herramienta interesante en estudios bsicos de biologa reproductiva ya que permite analizar la embriognesis in vitro. 4.1 Factores externos que condicionan el cultivo de vulos y de embriones Entre los factores externos ms importantes que afectan el cultivo de vulos y de embriones se citan el medio de cultivo, la osmolaridad y los reguladores de crecimiento. El vulo presenta una gran cantidad de requerimientos nutricionales, que varan con el estadio de desarrollo del mismo y que es necesario identificar para cada especie en particular. Es importante adems obtener un medio de cultivo adecuado para favorecer la germinacin de los granos de polen y permitir el desarrollo de los vulos fertilizados hasta semillas maduras. En general, todos los medios de cultivo para germinacin de los granos de polen poseen altas concentraciones de sacarosa y de cido brico. Un aspecto fundamental a tener en cuen-

ta en el rescate de embriones es la seleccin correcta de un medio de cultivo que pueda soportar los cambios progresivos de requerimientos durante las distintas etapas del desarrollo embrionario. Se pueden reconocer dos fases en el desarrollo embrionario con respecto a la nutricin: la fase heterotrfica en la que el embrin es dependiente del endosperma y dems tejidos maternos que lo rodean, y la fase autotrfica, en la cual el embrin es capaz de sintetizar las sustancias requeridas para su crecimiento a partir de sales minerales y azcares. La etapa crtica de pasaje de una fase a otra vara con las especies. Este cambio de requerimientos nutricionales hace que, cuando crecen in vitro, sea imprescindible la transferencia de los embriones de un medio de cultivo a otro para garantizar un ptimo crecimiento. Entre los medios de cultivo ms difundidos podemos citar el de Murashige & Skoog, Monnier, Randolph & Cox, Gamborg, Liu y col., etctera. El agua de coco y los extractos de endospermas han sido muy tiles, activando el crecimiento y desarrollo de los embriones en el cultivo de vulos de algunas especies vegetales. No existe demasiada evidencia acerca de la absoluta necesidad de los reguladores de crecimiento para el desarrollo de los embriones extrados, sean inmaduros o maduros, fuera de su rol en la ruptura de la dormicin. La concentracin osmtica es un factor importante en el desarrollo de vulos y embriones, dependiendo del estado de madurez de los mismos. La sacarosa presente en los medios de cultivo no slo provee la fuente de carbono necesaria para el crecimiento sino que adems mantiene la osmolaridad requerida para cada etapa del desarrollo. Est demostrado que una presin osmtica elevada previene la germinacin precoz de los embriones inmaduros, evitando as la ocurrencia de malformaciones estructurales. A medida que van creciendo, los embriones necesitan ser transferidos a medios con progresivas disminuciones en los niveles de sacarosa. Los embriones de la mayora de las especies presentan un buen crecimiento en un rango de temperaturas que va de los 25C a los 30C. Aunque algunos estudios indican

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que la luz no es crtica para el crecimiento de los embriones, se demostr que en el caso de la cebada la luz disminuye las probabilidades de germinacin precoz en los embriones inmaduros. 5 Aplicaciones La polinizacin placental in vitro puede ser empleada para superar las barreras de autoincompatibilidad e incompatibilidad cruzada. Los granos de polen de plantas autoincompatibles son capaces de germinar directamente sobre los vulos y llevar a cabo el proceso completo de la reproduccin sexual. En algunas combinaciones de cruzamientos, la polinizacin directa de los vulos permite que se superen las barreras de incompatibilidad precigtica, obtenindose embriones hbridos y aun plantas hbridas imposibles de obtener mediante tcnicas convencionales, como es el caso de Zea mays x Z. mexicana , Nicotiana tabacum x N. amplexicaulis, Melandrium album x Viscaria vulgaris, M. Album x Silene schafta, etc. En aquellos cruzamientos en los que la barrera de incompatibilidad se encuentra a nivel del ovario como en Trifolium repens x T. hybridum, es necesario rescatar los vulos recin fecundados. La polinizacin placental in vitro tambin se emplea como va para la obtencin de plantas resistentes a estreses ambientales, ya que permite seleccionar para la fecundacin aquellos granos de polen que tuvieron capacidad de germinar bajo diferentes condiciones de estrs. La polinizacin in vitro con polen obtenido de plantas de maz creciendo a temperaturas elevadas condujo a la obtencin de plantas tolerantes a estrs por calor. En Brassica rapa, la seleccin de polen a baja temperatura tuvo un efecto positivo en el crecimiento de la progenie en condiciones de fro, logrando acumular ms peso seco que en progenies normales. Se podra entonces seleccionar para la fecundacin aquellos granos de polen que hayan sido capaces de germinar bajo condiciones de estreses ambientales, en este caso trmico, acelerando as la obtencin de plantas resistentes. Dentro de las aplicaciones del cultivo de embriones est la del rescate de embriones

para la produccin de plantas haploides, donde se cultivan embriones que se forman por partenognesis o por eliminacin de cromosomas luego de la hibridacin interespecfica o intergenrica. Los embriones haploides en algunos casos se distinguen morfolgicamente de los normales, de manera que se extraen y se los cultiva in vitro en medios y condiciones de cultivo adecuados (ver IV.-1). Otras veces es necesario esperar a obtener las plantas para determinar el nivel de ploida. Esta tcnica se ha utilizado con xito en cebada, trigo y tabaco. El cultivo de embriones se utiliza tambin en el caso de plantas que sufren el aborto de los mismos en estadios tempranos del desarrollo debido a la incompatibilidad con el endosperma, como en la produccin artificial del triticale. Precisamente fue en este caso donde la tcnica de cultivo de embriones junto con la aplicacin de colchicina fueron de fundamental importancia en la transformacin del triticale en cultivo comercial, para superar el alto grado de incompatibilidad del cruzamiento inicial y la marcada esterilidad que posea la F1. El perfeccionamiento de estas dos metodologas fue decisiva para la produccin de un gran nmero de triticales hexaploides y octoploides, cruzando el centeno con trigos duros y harineros, respectivamente, con un alto grado de fertilidad. Tambin se emplea el cultivo de embriones en casos en que el endosperma no se desarrolla normalmente, como sucede en los cruzamientos de cultivares diploides y tetraploides de Citrus, o cuando el mismo se desintegra despus de la fecundacin, como en Oenothera biennis x O. muricata o O. biennis x O. lamarckiana. Esta tcnica tambin es de utilidad para sortear barreras de dormicin o en casos donde la viabilidad de la semilla es baja, como en yuca y otras especies del gnero Manihot. El cultivo in vitro de embriones es una alternativa para el intercambio de semilla a travs de fronteras internacionales. En un proyecto de mapeo de genes con resistencia al virus del mosaico en yuca, desarrollado entre CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical, con sede en Colombia) y IITA (Instituto Internacional de Agricultura Tropical, con sede en Nigeria) donde fue necesario trasladar stocks de semillas desde

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Sudamrica al continente africano, el cultivo de embriones result ser un excelente mtodo para transferir germoplasma con mnimos riesgos fitosanitarios. El cultivo de embriones inmaduros tambin puede ser aplicado como complemento del mejoramiento convencional, entre las estrategias utilizadas para disminuir el tiempo necesario en la obtencin de un nuevo cultivar. Por ejemplo en soja se requieren unos diez aos para este fin. Si se consiguen realizar varias generaciones por ao, en contraestacin, se acelera el proceso. El cultivo de embriones inmaduros ahorrara adems el tiempo de maduracin de la semilla. Cultivo de nucelas. Existen pocos explantos que poseen la capacidad de producir callos embriognicos. Las inflorescencias y los embriones inmaduros se utilizan para este fin en los pastos y en los cereales, constituyendo excelentes herramientas para la transformacin de plantas. En las plantas leosas los explantos de tejidos maduros pierden la capacidad de regeneracin, se ha inducido entonces con xito la embriognesis somtica a partir de nucelas de vulos jvenes. Este es el caso de Citrus sp , Vitis vinifera , Malus domesticus , Psidium guajava y Pyrus serotina. En estas especies tambin permiten acortar el perodo de siembra a floracin. Otro sistema que puede utilizarse en algunos experimentos bsicos es la obtencin de un embrin a partir de cigotos transgnicos o micromanipulados. Para ello son importantes la fertilizacin in vitro de gametas aisladas y el cultivo de los productos de fusin hasta la obtencin de una planta. Bajo esas condiciones el embrin no se diferencia de los embriones obtenidos in vivo. En maz tambin es posible cultivar los cigotos fertilizados in vivo dentro de sacos embrionarios parcialmente aislados. 5.1 El cultivo de vulos y embriones y la embriognesis somtica para dilucidar aspectos bsicos del desarrollo en plantas Las plantas parecen poseer un programa embriognico especfico preestablecido que puede dispararse en respuesta a condiciones especficas. La embriognesis cigtica se dispara por la fertilizacin mientras que la

somtica lo hace a travs del cultivo de tejidos. El estudio de los eventos moleculares que tienen lugar durante la embriognesis temprana es actualmente uno de los campos principales de la biologa vegetal. Los embriones somticos constituyen una excelente herramienta para estudiar los procesos de desarrollo en plantas, ya que facilitan el acceso a gran cantidad de embriones libres. En su medio natural los embriones cigticos ofrecen dificultades debido a su pequeo tamao y al hecho de estar inmersos en el tejido materno. Los embriones vegetales son morfolgicamente simples pero molecularmente complejos. A diferencia de lo que ocurre en los embriones animales, donde los patrones de expresin gnica se hacen ms complejos a medida que progresa el desarrollo, en los embriones vegetales se encontraron unos 20.000 ARN, nmero similar al encontrado en rganos ms complejos como hojas, races, flores, anteras, etc., donde los ARN que son especficos de un estadio determinado constituyen una modesta fraccin del total, representando, sin embargo, a un gran nmero de genes. En algodn, por ejemplo, el 10% de los ARN presentes en embriones en la fase media de maduracin son nicos de aquel estadio. Muchos de estos genes especficos de estadio han sido clonados como ADNc, pero en general se trata de genes expresados mayoritariamente, como aquellos de las protenas de reserva de la semilla. Estos ADNc resultaron ser marcadores tiles de la diferenciacin celular, como el gen inhibidor de la tripsina de Kunitz, cuyo ARN se acumula en el polo micropilar del embrin globular (por donde penetra el ncleo espermtico al saco embrionario) antes de que sea evidente la diferenciacin celular. La expresin de este gen es uno de los primeros indicadores moleculares de polaridad en la transicin del embrin globular a uno de simetra bilateral con forma de corazn. Para estudiar el desarrollo en plantas, al igual que en el caso de animales, se ha recurrido al uso de mutantes. El organismo modelo en este caso es Arabidopsis thaliana, que es una planta de genoma pequeo y ci-

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clo de vida muy corto, lo cual la hace apta para estudios genticos. Se han detectado dos tipos de mutantes, letales embrionarios y con alteraciones en el patrn de desarrollo. Calculando el nmero de mutantes letales embrionarios que se encontraron, algunos investigadores han concluido que existen unos 4.000 genes expresndose durante la embriognesis. En el punto superior de esta compleja va se encuentran genes reguladores principales (master regulators) y slo de 40 a 50 genes que afectan el patrn embriognico. Entre las mutaciones estudiadas se encuentran bio1 , que es letal y detiene la embriognesis en el estadio de corazn temprano. No es un gen regulador principal y sus efectos se ven revertidos en presencia de biotina. Otra mutacin es raspberry. Estos mutantes quedan bloqueados en el estado globular y poseen protuberancias en las clulas externas lo que le da el aspecto de una frutilla. El bloqueo se presenta en un estadio anterior a la formacin de rganos, momento en el que ya existe diferenciacin celular. En maz tambin se han encontrado mutantes letales embrionarios. En algunos se encuentran inhibidos el desarrollo del embrin y el endosperma. En otros, slo el embrin. Una importante conclusin a la que permitieron arribar estos mutantes es que el embrin de Arabidopsis est constituido por el ensamblaje de dos patrones superpuestos, uno a lo largo del eje apical-basal y el otro a lo largo del eje radial. Ninguno de los mutantes encontrados fueron mutantes tempranos, lo cual sugerira un control de los primeros estadios del desarrollo embrionario por parte de genes maternos, como sucede en animales. Sin embargo, se han identificado pocos genes maternos que afecten el desarrollo en plantas y el hecho de que se puedan formar los embriones somticos o que se puedan desarrollar embriones producto de la fertilizacin in vitro inducira a sospechar que los genes maternos no juegan un rol primordial. Un gen materno encontrado en Arabidopsis es sin1 (short integument 1). Este gen afecta la formacin de vulos, el tiempo de floracin y el desarrollo embrionario. No se sabe si real-

Preglobular

Globular

Embrin maduro Corazn Torpedo

Figura 3: Estados de la embriognesis de Arabidopsis thaliana.

mente se requiere para la embriognesis o si los defectos observados se deben a las limitaciones impuestas por los defectos en el tejido materno. Los embriones provenientes de madres sin1/sin 1 tienen grandes defectos morfogenticos. Embriones con ese genotipo en madres normales tienen un desarrollo normal (Fig. 3). Un gen embrionario muy importante es GN/EMB30. No se sabe si es un regulador principal y acta muy temprano en el desarrollo, durante la primera divisin celular del cigoto. En los mutantes las dos clulas resultantes no son diferentes, como ocurre en embriones normales, donde la primera divisin celular es asimtrica. El sistema mejor estudiado en relacin con la embriognesis somtica es el de suspensiones celulares de zanahoria (Daucus carota). En este sistema, la remocin del cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) genera un respuesta embriognica por la cual los agregados celulares forman embriones que crecen de a millares en un medio lquido. La disponibilidad de gran cantidad de embriones creciendo sincrnicamente en un medio lquido representa un buen sistema para estudiar los eventos genticos involucrados en el desarrollo embrionario. Los primeros estudios tendientes a identificar patrones de expresin gnica relacionados con la embriognesis somtica fueron realizados en 1981. Utilizando electroforesis bidimensional se encontra-

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ron pocas diferencias entre patrones proteicos de embriones somticos y clulas en proliferacin, aunque, en virtud de lo expresado anteriormente, se esperara un patrn ms complejo. Habra varias explicaciones para esta inconsistencia. Una es que los productos de genes individuales involucrados en el desarrollo embrionario no fueran muy abundantes como para ser detectados en las genotecas de ADNc. Otra es que la sincronizacin fuera slo aparente, particularmente en estadios tardos y que estas diferencias enmascararan las diferencias entre estadios. Otra es que las constelaciones gnicas involucradas en la embriognesis somtica podran estar ya activadas en las clulas proliferando en cultivo. Algunos estudios indicaran que muchos de los genes expresados en los embriones somticos ya estaran hacindolo en las masas proembriognicas. Uno de estos genes es el SERK que se expresa en clulas competentes. Se conoce la secuencia de su ADNc y codificara para una protena receptora con repeticiones ricas en leucina del tipo protena quinasa. La expresin de este gen est correlacionada con la aparicin de clulas competentes en cultivos primarios derivados de explantos de hipoctilos. La expresin contina en las masas proembriognicas y persiste hasta el estadio de embrin globular. Se encontr una lnea celular (ts11) sensible a la temperatura (letal condicional) que en la temperatura restrictiva detiene su desarrollo en el estadio de corazn. Este efecto es revertido al colocar las clulas en un medio condicionado proveniente de suspensiones celulares normales. El compuesto responsable de la reversin result ser una endoquitinasa acdica. Aparentemente, esta enzima puede hidrolizar un sustrato que se encuentra en las paredes celulares vegetales y liberar un compuesto indispensable para disparar la embriognesis somtica. Tal sustrato no pudo ser identificado pero se encontr un lipoligosacrido de Rhizobium, NodRlv-R (Ac, C18:4), que puede rescatar a estas lneas celulares mutantes a fin de que prosigan los procesos de embriognesis somtica. Hasta el momento no se ha encontrado cul es la sustancia en clulas vegetales que produce este efecto. El programa de eventos que tiene lugar

durante la embriognesis somtica es muy elaborado como para estar regulado solamente por el 2,4-D. La perturbacin causada por la deprivacin de este regulador del crecimiento debe disparar una serie de eventos clave que involucran la accin de factores de crecimiento ms especficos y fuerzas biofsicas que confieren informacin posicional y de desarrollo. 6 Lecturas recomendadas
BARNABAS, B.; PONYA, Z. 1999. Test-tube Plants as Tools for Crop Improvement. Hungarian Agriculture Research. 2: 5 9. BHOJWANI, S. S.; RAZDAN, M. K. 1996. Plant Tissue Culture: Theory and Practice, a Revised Edition. Elsevier. DUMAS, C; MORGENSEN, H. L. 1993. Gametes and fertilization: Maize as a model system for experimental embryogenesis in flowering plants. Plant Cell. 5: 13371348. FAURE, J. E.; DIGONNET, C.; DUMAS, C. 1994. An in Vitro System for Adhesion and Fusion of Maize Gametes. Science. Vol 263, pp 1598-1600. FAURE, J. E.; ALDON, D.; ROUGIER, M.; DUMAS, C. 1996. Emerging data on pollen tube growth and fertilization in flowering plants, 1990-1995. Protoplasma, Vol 193, Iss 1-4, pp 132-143. GUEVARA, C.; OSPINA, J.; MAFLA, G.; V. VERDIER. 1998. Zygotic embryo culture of Manihot esculenta Crantz : a practical approach for the safe internacional movement of cassava seed stocks. Plnat Genetic Resources Newsletter 115:33-38. HOWELL, S. 1998. Molecular Genetics of Plant Development. Cambridge University Press. KANTA, K.; RANGASWAMY, W. S.; MAHESHWARI, P. 1962. Test tube fertilization in a flowering plant. Nature 194:1214-1217. KOVACS, M.; BARNABAS, B.; E. KRANZ. 1995. Electrofused isolated wheat (Triticum aestivum L.) gametes develop into multicellular structures. Plant Cell Rep. 15: 178-180. KRANZ, E.; DRESSELHAUS, T. 1996. In vitro fertilization with isolated higher plant gametes. Trends in plant science reviews. Vol. 1, Nro. 3, pp 82-89. KRANZ, E.; KUMLEHN, J. 1999. Angiosperm fertilization, embryo and endosperm development in vitro. Plant Science. Vol. 142, Iss 2, pp 183-197. LITZ, R. E. 1991. Cultivo de embriones y vulos. En Cultivo de tejidos en la Agricultura. Fundamentos y Aplicaciones. Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT). Roca y Mroginsky editores. pp 295-312.

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PICCA, Aurora; CARDONE, Susana

PARTE IV Mtodos para acelerar programas de mejoramiento e identificacin varietal

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POLCI, Pablo; CONTI, Vernica; MIRANDA, Rubn

IV.-Captulo 1
Obtencin de plantas doblehaploides
Polci, Pablo; Conti, Vernica; Miranda, Rubn 1 Introduccin

Identificacin de Haploides
Varios procedimientos facilitan la bsqueda de haploides en muestras grandes en nmero de individuos. Algunos de ellos son: - Morfologa: Las plantas haploides son, en general, ms pequeas que las diploides, tanto en sus partes vegetativas como florales. Esto se debe principalmente a la disminucin en el tamao de sus clulas. Es lgico pensar que el fenotipo ms pequeo de las plantas puede ser una primera aproximacin en la bsqueda de haploides. Si esta disminucin de tamao fuera notable en las semillas, sera muy fcil realizar una seleccin mecnica, aunque sucede en pocas especies. - Poliembriona : La presencia de poliembriona facilita la deteccin de embriones haploides; no obstante ello, debe realizarse el control citolgico correspondiente. El porcentaje de embriones gemelos observados vara con la especie y el genotipo. - Genes marcadores: Con este fin puede utilizarse cualquier par de alelos cuyos fenotipos dominante y recesivo sean fcilmente distinguibles. En la prctica, conviene utilizar marcadores que posean manifestaciones fenotpicas claras en semilla o en plntula y de esta manera hacer una seleccin ms econmica en tiempo y esfuerzo. Para identificar haploides en una variedad que se supone homocigota, se realizan cruzamientos con otra variedad que sea homocigota para el alelo alternativo. La mayor parte de la descendencia ser heterocigota (diploide), con fenotipo dominante. Los individuos que aparezcan con el fenotipo recesivo seran haploides, obtenidos por partenognesis o andrognesis, segn sea el fenotipo recesivo materno o paterno, respectivamente.

Comentarios generales sobre los haploides Para referirnos al trmino haploide es necesario conocer previamente el origen de dicha denominacin, y definir algunos conceptos bsicos sobre el tema. Si consideramos haploide al individuo que posee un solo juego de cromosomas de la especie, no estaramos incluyendo en esta clasificacin a aquellos individuos derivados de especies poliploides, cuya constitucin gentica es igual a la de los gametos normales de dicha especie. Por ejemplo, un autopoliploide AAAA (2n = 4x) dara lugar a individuos haploides AA (n = 2x), que por tener dos juegos cromosmicos (AA) no podran ser incluidos en la definicin. Por lo tanto, una solucin sera denominar como haploides a los individuos originados a partir de especies diploides, que posean un solo juego de cromosomas (n = x), llamando polihaploides a aquellos individuos con una composicin cromosmica igual que la gamtica normal de la especie, que tengan dos o ms juegos cromosmicos (n > x). Otra posibilidad sera considerar el trmino haploide en un sentido ms amplio, comprendiendo en ste a todos los individuos que posean una constitucin cromosmica igual a la de los gametos normales de la especie (n = 2n/2). Llamaramos de esta manera monoploides y polihaploides a los individuos provenientes de plantas diploides (2n= 2x) y poliploides (2n> 2x) respectivamente. De aqu en adelante, a los fines prcticos y en concordancia con la segunda definicin, nos referiremos al trmino haploide indistintamente del nivel de ploida de la especie en cuestin, como a aquellos individuos que poseen la mitad del nmero cromosmico normal contenido en las clulas somticas de la especie.

Antecedentes El valor de los haploides es conocido desde 1922, cuando se descubri la produccin espontnea de los mismos. Actualmente son ms de cien las especies vegetales capaces de producirlos in vivo. Sin embargo, la frecuencia con la cual se producen es muy baja, con valores que van de 0,001 a 0,01 %. Entre los casos de haploida espontnea es comn la poliembriona, que, con una gran variacin entre los distintos genotipos, ocurre en una amplia gama de especies, gneros y familias. En estos casos es frecuente 137

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la aparicin de haploides procedentes de una sinrgida del saco embrionario, puesto que se ha comprobado en muchas especies que las clulas antpodas degeneran antes de la fecundacin. En 1966, Guha y Maheshwari descubrieron que las anteras de Datura innoxia Mill. generaban plantas haploides al ser cultivadas in vitro. Este proceso, confirmado posteriormente por Nitsch y Nitsch (1969) en tabaco, se ha utilizado para producir haploides en numerosas especies. En el caso de Datura innoxia, las frecuencias de induccin son casi del 100% y el rendimiento es de ms de mil plntulas o callos por antera en condiciones ptimas (Fig. 1).

das mundiales de produccin. A pesar de que cada ao se liberan al mercado numerosas variedades, no persisten demasiado. Los objetivos de mejoramiento a largo plazo no podrn ser alcanzados a menos que se genere mucha variabilidad gentica que pueda ser utilizada con estos fines y que existan mtodos que acorten el tiempo necesario para la obtencin de variedades. El advenimiento de las tcnicas biotecnolgicas y los avances en biologa molecular han permitido el desarrollo de nuevas herramientas de gran utilidad en el mejoramiento vegetal. Entre stas, la produccin de haploides y doblehaploides es una herramienta interesante ya que permite acortar el tiempo requerido para la obtencin de nuevas variedades, siendo un buen complemento para los programas de mejoramiento tradicionales. En algunos casos, las poblaciones haploides o doblehaploides (DH) carecen de genotipos heterocigotas y sirven para encontrar genotipos raros, especialmente en el caso de caracteres recesivos, ya que stos no quedan enmascarados por los alelos dominantes. Estas poblaciones presentan mayor variacin gentica aditiva y ausencia de varianza gentica debida a Figura 1: Obtencin de plantas haploides por cultivo de anteras. la dominancia, si se las compara En estudios de andrognesis in vitro se con poblaciones segregantes. Es decir que se ha detectado especial facilidad para regene- eliminan las complejidades del estado rar haploides a partir de anteras aisladas o heterocigota y se facilita enormemente el de granos de polen en miembros de la fami- anlisis gentico. De esta manera pueden lia de las solanceas Tambin se han encon- distinguirse las mutaciones recesivas de fortrado resultados sorprendentes en numero- ma inmediata, haciendo que el proceso de sos gneros de las crucferas, gramneas y de seleccin sobre una poblacin de haploides las ranunculceas, aunque resulta comn resulte ms eficiente (Fig. 2). La produccin de haploides es una alterobservar diferencias significativas, incluso dentro de un mismo gnero. No se ha logrado, nativa biotecnolgica de gran importancia y sin embargo, el mismo xito en especies ha resultado exitosa en varios cultivos, entre ellos cebada, arroz y trigo. arbreas y arbustivas. Un sistema de produccin de DH debe cumplir con tres requisitos bsicos para su 2 Importancia de los haploides y utilizacin en programas de mejoramiento: aplicaciones en el mejoramiento vegetal - Debe producir lneas DH eficientemente Los mtodos tradicionales para el mejo- a partir de todos los genotipos. - Los DH obtenidos deben ser normales ramiento vegetal han sido practicados por cientos de aos. Actualmente se ha llegado y estables. Estos deberan representar una muestra a una etapa en donde estos mtodos son insuficientes para hacer frente a las deman- al azar del conjunto de gametos parentales.

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trigo de ciclo invernal es de aproximadamente diez aos, a travs Gametos Ab aB del mejoramiento tradicional (Fig. 3). AaBb Generacin F La biotecnologa se presenta hbrido intervarietal como una alternativa atractiva no AB Ab aB ab Gametos F slo para reducir el tiempo de obtencin de los genotipos deseados, sino tambin para lograr una economa de mano de obra y espacio en el campo experiCultivo de anteras Autofecundacin mental. Genotipos posibles despus del Genotipos posibles despus de un Ciclo En las plantas autgamas , cultivo de anteras: de autofecundacin de la F1: Plantas haploides AB Ab aB ab con los mtodos convencionales Ab aB ab AB de mejoramiento, la homocigosis AB AABB AABb AaBB AaBb prctica se logra recin luego de Ab AABb AAbb AabB Aabb seis a ocho generaciones de aB AaBb AaBb aaBB aaBb Duplicacin con colchicina ab AaBb Aabb aaBb aabb autofecun-dacin, mientras que Plantas doblehaploides * La probabilidad de ocurrencia de los recuadros AABB AAbb aaBB aabb con una tcnica de produccin de internos es de 1/16 (1/4 x 1/4) 1/4 1/4 1/4 1/4 haploides, seguida de duplicacin cromosmica, es posible llegar a Figura 2: Ventaja del uso de haploides en el mejoramiento cuando los homocigosis completa en una gecultivares parentales difieren, tericamente, en dos pares de genes. Si el genotipo buscado es, por ejemplo, el doble recesivo aabb, se tiene, por neracin. En las plantas algamas, la autofecundacin convencional, una probabilidad de 1/16 de encontrarlo. Si se induce haploida, el mismo genotipo tendr una probabilidad de produccin de homocigotas resulocurrencia de porque no se producirn los genotipos heterocigotas. ta de gran importancia. Al trabajar con especies de polinizacin Entre las aplicaciones ms importantes de cruzada se favorece naturalmente la heterolos doblehaploides en el mejoramiento ve- cigosidad, y, de ser posible la autofecungetal podemos citar: dacin, la obtencin de homocigotas se ve dificultada por la endogamia. Acortamiento de los programas de En plantas bulbosas, rboles frutales y mejoramiento forestales la homocigosis juega un rol muy El desarrollo de nuevos cultivares por los importante en el aceleramiento de los promtodos tradicionales actuales comprende gramas de mejoramiento. Debido al prolontres etapas fundamentales: gado tiempo requerido para alcanzar la fase (a) Generacin de variabilidad gentica, sea por medio de hibridaciones sexuales intra Progenitor A x Progenitor B e interespecfica, por induccin de mutaciones, o por transformacin gentica. (b) Recuperacin de progenies homocigotas a travs de generaciones repetidas de F 1 autofecundacin o retrocruzamiento, selec6-7 ciclos cionando a favor de los caracteres de inteSeleccin De @ rs. Autofecundacin (c) Evaluacin del comportamiento de los @ nuevos materiales en ensayos comparativos a campo. Lneas puras Estos pasos son bsicos en un programa (homocigosis prctica: F7-8) de mejoramiento, pudiendo existir otras etapas en funcin del modo reproductivo de la Figura 3: Representacin esquemtica de los pasos especie. As, por ejemplo, el tiempo requeri- requeridos para la obtencin de lneas puras en un do para la obtencin de un nuevo cultivar de programa de mejoramiento tradicional.
AAbb X aaBB
Generacin parental
1 1

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4 1/4

1/4 1/4

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adulta, el proceso de mejoramiento resulta extremadamente largo, aun siendo posible la autopolinizacin.

Generacin de poblaciones de mapeo Diversos tipos de poblaciones pueden ser utilizadas para el mapeo gentico de plantas. La eleccin del tipo de poblacin se realiza en funcin de los objetivos de la investigacin y del tiempo y recursos disponibles. Las poblaciones de mapeo con el mayor contenido de informacin son aquellas obtenidas a partir del cruzamiento entre dos indivduos homocigotos contrastantes. En las plantas F 1 obtenidas, el desequilibrio de ligamiento es mximo, y las poblaciones derivadas a partir de estas plantas F1 procuran explorar este desequilibrio. Para especies de autofecundacin o que toleran la autofecundacin pueden utilizarse poblaciones F2, Fn, RILs (Recombinant Imbreed Lines), derivadas de retrocruzas y doblehaploides. Las poblaciones de doblehaploides representan la variabilidad gentica entre los progenitores luego de ocurrida una meiosis (F1), y son especialmente indicadas cuando se realizan estudios con QTL (quantitative trait loci), ya que al obtenerse genotipos 100 % homocigotas se dispone de poblaciones estables o inmortales de mapeo. Esto permite analizar la misma poblacin en diferentes aos y localidades, debido a la constante disponibilidad de semilla, obtenindose estimaciones mas precisas de los parmetros de los caracteres cuantitativos a ser mapeados. Estudio de especies poliploides La induccin de haploides en plantas poliploides facilita el trabajo de investigacin y mejoramiento, ya que permite manejar niveles de ploida menores para los estudios de herencia y la combinacin de caracteres de inters. Fusin de protoplastos Al fusionar dos protoplastos haploides se origina uno diploide que puede duplicarse y llevar a la obtencin de un hbrido interespecfico o intergenrico, siendo esto una ventaja importante cuando se trabaja en hibridacin somtica. Variacin gametoclonal 140

La andrognesis in vitro provee un excelente sistema para analizar, a nivel esporoftico, la variacin debida a recombinacin y segregacin meitica. Las variantes gametoclonales expresan el carcter recesivo en la R 0, a diferencia de las somaclonales, que requieren de autofecundacin y anlisis de progenie. Algunos logros de esta tcnica: - Frutos de tomate con mayor contenido de slidos - Plantas enanas de arroz con granos ms largos y con elevados niveles de protenas de reserva y ms macolladoras. - Plantas de Datura innoxia con contenidos ms elevados de alcaloides en las hojas. - Plantas de tabaco con mayor resistencia a bajas temperaturas. - Plantas de Brassica napus con mayor contenido de aceite del cido ercico en las hojas. Este aceite se usa como lubricante en la industria.

Mutagenesis Si se aplica mutagnesis a un sistema de haploides, se obtienen mutantes slidos, logrndose la homocigosis del mutado rpidamente luego de la duplicacin con colchicina. Entre los agentes mutagnicos ms frecuentemente utilizados se encuentra la N-metil-N-nitrosurea (20 mM), los rayos (0,5 krad) y el etil metil sulfonato. Transformacin gentica Rige el mismo principio que para mutagnesis. La transformacin de haploides permite la obtencin del transgen en homocigosis luego de la duplicacin con colchicina. Puede realizarse con PEG, microinyeccin o utilizando Agrobacterium tumefaciens. Produccin de plantas homogamticas Asparagus officinalis es una especie cultivada, dioca, en la cual las plantas femeninas son XX y las masculinas son XY. De esta manera, para obtener una poblacin de plantas deben cruzarse ambos tipos, lo que dar una progenie constituida por 50 % de plantas XX y 50 % de plantas XY. Sin embargo, desde el punto de vista del productor, es deseable la obtencin de una poblacin cons-

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Por este tratamiento se han obtenido haploides de Triticum monococcum. 2) Polinizacin retrasada: la castracin de las flores y la posterior polinizacin Progenitor masculino en el lmite de la madurez receptiva XY del estigma permiten obtener hasta Formacin de gametos un 30 % de haploides en trigo. 3) Polinizacin con polen inviable: X Y a) Utilizando polen extrao (tpiPlantas haploides co de cruzamientos interespecficos), Cultivo de anteras incapaz de fecundar a la especie en X Y cuestin, puede servir de estmulo Duplicacin para inducir haploida, como sucede cromosmica Homocigotos, XX YY en el cruzamiento entre Solanum hembra y supermacho tuberosum x S. phureja (papa silvestre). El polen de la papa silvestre contiene slo un ncleo generativo, proFormacin de ducto de una gametognesis anorGametos X Y gametos mal, por lo cual la fertilizacin doble no logra producirse, pero se forman XY embriones haploides por partenogHbrido nesis. b) Utilizando polen previamente irradiado. Para solucionar este problema y obtener 100 4) Cultivo de ovarios: puede ser eficaz % de plantas masculinas se ide un sistema para obtener haploides a partir de cruzaque consiste en el cultivo de anteras y mientos interespecficos. diploidizacin de plantas YY, llamadas supermachos. La ventaja de estas plantas es II. Andrognesis: desarrollo de un gameque, al ser cruzadas con plantas XX darn to masculino. 100 % de plantas XY, como se muestra en el esquema: 1) Cultivo de anteras: se ha inducido Con este sistema, en 1990 fue liberada haploida en mono y dicotiledneas, siendo una variedad llamada Andrea (es un hbrido ms fcil en las ltimas. Es una tcnica simple obtenido como se mencionara anteriormen- que, dependiendo del genotipo y de las conte). Andrea es una variedad muy homog- diciones de cultivo permite obtener elevados nea, de alto rendimiento y de excelente cali- nmeros de plantas en tiempos relativamendad. te cortos. Ha sido ms difcil en los cereales; no obstante ello, se obtuvieron haploides de 3 Obtencin de Haploides arroz, trigo, cebada con diferentes grados de dificultad. Como se mencionara anteriormente, las 2) Cultivo de micrsporas: en 1974 Nitsch plantas haploides aparecen en muy baja fre- indujo la regeneracin de plantas haploides cuencia en la naturaleza, siendo necesaria la de Nicotiana terbium y Datura inoxia a parposterior ocurrencia de duplicacin tir de cultivos en suspensin de micrsporas, cromosmica para la obtencin de semillas. previo choque trmico a baja temperatura Por ello, la produccin artificial de haploides de las flores. Este mtodo tiene la ventaja de producir haploides masivamente (ms de resulta siempre ms efectiva. 7000 plantas por botn floral en tabaco), y de permitir la aplicacin de diferentes trata Origen de los haploides mientos a las micrsporas como transformaI. Ginognesis: desarrollo de un gameto cin o mutagnesis para luego obtener plantas por embriognesis partiendo de una nifemenino no fecundado. Se logra por: 1) Castracin y aislamiento de las flores. ca clula inicial. Para conseguir diferenciar

tituida solamente por plantas XY, que tienen un menor contenido de fibra y son, por lo tanto, preferidas por los consumidores.

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plantas a partir de micrsporas es necesario quebrar el mecanismo responsable de la asimetra en la primera mitosis del polen. III. A partir de alguna clula haploide del saco embrionario distinta del gameto femenino (sinrgidas o antpodas). IV. Cruzamientos interespecficos o intergenricos con eliminacin cromosmica: se produce la fertilizacin de manera de que se forme un cigoto diploide, que, a lo largo de las sucesivas divisiones mitticas, va perdiendo el genoma del individuo que aport el gameto masculino, como sucede en los cruzamientos entre Hordeum vulgare y H. bulbosum. V. Interaccin ncleo-citoplasma: utilizando lneas de sustitucin y restauracin nuclear se encontr que los individuos con citoplasma de Aegilops caudata y ncleo de Triticum aestivum o Triticale mostraban una frecuencia de haploida del 3,1% y del 52,9% respectivamente. Esto se debe a que ciertas interacciones entre un citoplasma y un ncleo extrao inducen haploida. VI. Semigamia: el ncleo del gameto masculino penetra en la ovoclula pero sin fusionarse con el ncleo femenino. Ambos ncleos comienzan a dividirse independientemente, produciendo un individuo haploide con tejidos de origen materno y paterno.

Figura 4. Produccin de callos y plantas a partir del cultivo de anteras de Triticum aestivum. A. Callo blanco y compacto sobre una antera(flecha). B. Detalle del callo sealado en (A). C. Callo transferido a medio de cultivo para regenerar planta. D. Plntula de trigo regenerada a partir de callo, con sistema radicular en formacin. E. Planta haploide completa finalizando la etapa de rusticacin, creciendo sobre sustrato inerte (Perlita).

Mtodos ms utilizados para la obtencin de plantas haploides: Entre los mtodos disponibles actualmente para la obtencin de doblehaploides, los ms utilizados son la hibridacin interespecfica e intergenrica y la andrognesis.
- Cultivo de Anteras: Consiste en el cultivo de anteras inmaduras en un medio de induccin, donde las micrsporas competentes originarn callos, que sern luego transferidos a un medio apropiado para la regeneracin de plantas (Fig. 1). En algunas especies de dicotiledneas el nmero de plantas obtenidas por cada cien anteras cultivadas es muy elevado. En cambio en las gramneas la tcnica no ha sido tan exitosa. Sin embargo, los progresos en

los mtodos de cultivo in vitro durante las ltimas dcadas han permitido obtener buenos resultados con gramneas (Fig. 4), aun en aquellas consideradas recalcitrantes. La capacidad de respuesta al cultivo de anteras, denominada capacidad andrognica, puede ser evaluada a travs de la produccin de callos y de plantas verdes, y su eficiencia es altamente dependiente de: a) El genotipo: es quizs el factor ms importante que afecta al cultivo de anteras. En la naturaleza, la haploida es controlada por el gen hap, llamado gen inhibidor de la haploida. Existe suficiente evidencia que sugiere que la andrognesis in vitro tambin est bajo control gnico y que este carcter puede ser transferido desde clones con alta respuesta a otros no respondedores. Se ha hallado variabilidad en la respuesta entre especies y aun dentro de ellas. En cebada y trigo los caracteres de induccin de callos y regeneracin de plantas son altamente heredables, y ha sido sugerido que ambos caracteres estaran controlados por muchos genes. Por lo tanto, el mejoramiento de la capacidad andrognica no parece difcil, sien-

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do la identificacin de genotipos con gran capacidad de respuesta un paso indispensable para su incorporacin en los bloques de cruzamiento. b) El % de albinismo: La ocurrencia de plantas albinas representa un serio problema para la aplicacin del cultivo de anteras en programas de mejoramiento de cereales. La incidencia depende no solo de la especie sino tambin de la variedad, citndose valores de 50, 70 y 100 % para tres variedades diferentes de arroz (Wang y col., 1978). Bernard (1980) ha sugerido que las altas temperaturas incrementan la diferencia entre la velocidad de replicacin del material nuclear y el de las organelas, resultando en un desarrollo retardado o incompleto de los plstidos, lo cual conducira a la produccin de fenotipos albinos. De acuerdo con este autor, el desarrollo de un sistema fotosinttico funcional es promovido por el tratamiento con bajas temperaturas, aunque no siempre un pretratamiento con fro reduce incidencia de albinismo. c) Las condiciones de crecimiento de las plantas donantes: la edad y las condiciones ambientales en que crecen las plantas afectan considerablemente la capacidad andrognica de las mismas. Los factores ambientales ms crticos son el fotoperodo, la intensidad de luz, la temperatura, la nutricin y la concentracin de CO2. Estos factores incidiran en la capacidad de producir las divisiones celulares morfognicas que conducen al desarrollo de embrioides y la regeneracin de plantas. Este ltimo paso es crtico dentro de todo el proceso, es altamente dependiente de la calidad del callo y est asociado fuertemente a toda la historia previa del cultivo. En general, se ha informado que la utilizacin de anteras de las primeras floraciones favorece la respuesta andrognica, mientras que las colectadas al final de la estacin muestran una menor respuesta al cultivo, generando una menor cantidad de embrioides. En Brassica napus, el crecimiento de las plantas a bajas temperaturas mejora la produccin de embrioides obtenidos a partir de anteras. d) El estado de desarrollo de las microsporas: en la fase gametoftica de las plantas, que comienza luego de la meiosis, las micrsporas sufren inicialmente una divisin mittica asimtrica que da origen a dos

clulas de distintos tamaos: la generativa, ms pequea y con un ncleo altamente condensado; y la vegetativa, ms grande y con un ncleo difuso. En las gramneas, el ncleo generativo se divide nuevamente originando dos ncleos espermticos. Uno generar el endosperma triploide al fusionarse con los dos ncleos polares del saco embrionario, mientras que el segundo fertilizar a la oosfera produciendo el cigoto diploide, que constituir el primer paso de la nueva fase esporoftica. Los embrioides haploides se originan in vitro a partir de una de las vas que se enuncian a continuacin. Cuando la primer divisin mittica de la micrspora es asimtrica, los haploides se originan por repetidas divisiones de la clula vegetativa, de la generativa o de ambas. Cuando la primer divisin mittica es simtrica, ambas clulas resultantes contribuyen al desarrollo del haploide. Por lo tanto, una clula gamtica masculina puede revertir su desarrollo gametoftico hacia el grano de polen y dar origen directamente a un nuevo individuo. En general, las micrsporas que se encuentran en la primera divisin mittica son las que mejor responden. Esto vara levemente con la especie vegetal, pero esta reversin no es posible luego de iniciada la deposicin de almidn. El estado ms apropiado para los cereales es el de micrspora uninucleada media y tarda. e) Los pretratamientos: distintos tipos de estrs aplicados durante el estado adecuado pueden enmascarar el programa gametoftico e inducir la expresin de genes especficos del desarrollo esporoftico. Si bien las bajas temperaturas son consideradas como el mejor pretratamiento, tambin otros pueden estimular la andrognesis, como el calor, el choque osmtico, la centrifugacin de las anteras o hasta una incisin en la parte superior de la inflorescencia donante. Tambin se citan la poda, la pulverizacin con etrel, la irradiacin, la reduccin en la presin atmosfrica, la anaerobiosis, el tratamiento en una atmsfera saturada de agua y la aplicacin de gametocidas. Las bajas temperaturas aplicadas sobre la planta madre, sobre las yemas florales jvenes o sobre las anteras, generalmente estimulan la embriognesis. El fro estimula la divisin mittica simtrica de las micrsporas. Esto se

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debera a una alteracin en la orientacin del huso que conducira a una primera mitosis anormal del grano de polen. Por otra parte, se ha mencionado que las bajas temperaturas retardan el envejecimiento de la pared de la antera, lo cual aumentara la supervivencia y la viabilidad del polen. En general, las temperaturas citadas varan entre 2 y 10 C y la duracin del tratamiento de 2 a 30 das. Es importante determinar la temperatura adecuada para cada especie vegetal, aun para variedades dentro de la misma especie. En algunas especies, tales como Capsicum annun, avena y algunos genotipos de trigo se ha logrado xito con un choque con alta temperatura. Temperaturas de 30 - 35C durante los primeros 1 a 4 das del cultivo ayudaron a inducir la andrognesis en varias especies de gnero Brassica. f) La composicin del medio de cultivo: es otro de los factores importantes para el xito en el cultivo de anteras. No existe una recomendacin general y las variaciones dependen de la especie a cultivar.

aerbicas, permitiendo elevadas tasas de embriognesis y de produccin de plantas verdes. En cuanto a los reguladores de crecimiento, la mayora de los cereales requiere de la presencia de auxinas y de citocininas en el medio de cultivo y las respuestas parecen depender de los niveles endgenos de tales reguladores. Por ejemplo, para lograr la induccin en trigo es indispensable el uso de 2,4-D (cido 2,4 diclorofenoxiactico) en concentraciones de 1,5 a 2 mg/l. Existen otras sustancias que, adicionadas al medio de cultivo, ayudan en la estimulacin de la andrognesis, como la glutamina y el inositol. Tambin se citan otros compuestos inespecficos como extracto de papa, de batata, de mandioca, de trigo germinado y de endospermas de arroz y de maz. En ocasiones, si el medio se suple con leche de coco, los granos de polen desarrollan directamente en embrioides.

Medios de induccin : dos tipos de estrs, osmtico y nutricional, han sido identificados como causas disparadoras de la induccin de embriognesis en las micrsporas de mono y dicotiledneas. En tabaco, el cultivo de las anteras en un medio carente de sacarosa durante los primeros 6 das de la etapa de induccin permiti una mxima respuesta andrognica. Los carbohidratos cumplen dos roles fundamentales en los medios de induccin ya que actan como osmolito y como nutriente. Los agentes gelificantes representan otro aspecto importante en la evolucin de los medios de induccin. Tradicionalmente se utiliz agar como gelificante de los medios de cultivo, debido a su disponibilidad y bajo costo. Pero en 1973 se detect una mejor respuesta andrognica en tabaco cuando las anteras fueron cultivadas en un medio solidificado con agar y suplementado con carbn activado. En medios lquidos la adicin de Ficoll (polmero sinttico de sacarosa, inerte, no inico y de alto peso molecular) incrementa la tensin superficial y la viscosidad del medio. De esta manera, las anteras y callos flotan sobre el medio lquido y se desarrollan en condiciones 144

Medios de regeneracin: la variedad de medios de regeneracin citada es menor cuando se la compara con la de los medios de induccin. Los ms utilizados son modificaciones derivadas del medio MS, con concentraciones de carbohidratos similares a las utilizadas en los medios de cultivo de tejidos tradicionales (30gr/l de sacarosa), utilizando agar (0,6 %) como gelificante, auxinas menos poderosas, y un balance hormonal a favor de las citocininas.
g)Las condiciones de incubacin: las caractersticas ideales de cultivo son especficas para cada especie, y aun para cada genotipo dentro de una misma especie. Estas afectan particularmente la tasa de absorcin final de nutrientes y la regeneracin de plantas verdes. La duracin e intensidad lumnica, la temperatura y la orientacin de las anteras sobre el medio de cultivo pueden tener un efecto considerable en algunas especies.

y Cultivo de Micrsporas: comprende la obtencin de individuos haploides a partir de micrsporas aisladas. Las espigas son pretratadas y las micrsporas liberadas son colocadas en un medio de cultivo donde desarrollarn embriones haploides, que sern luego transferidos a un medio de regeneracin para originar plntulas (Fig. 5).

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Figura 5. El diagrama muestra las diferentes etapas del cultivo de anteras y de micrsporas aisladas. Para el cultivo de anteras, las etapas requeridas a partir de anteras hasta la obtencin de las plantas haploides pueden describirse como sigue: a) yema floral previo a la antesis, 1b) anteras, 1c) anteras en cultivo, 1d) y 1e) proliferacin de las anteras, 1f) callo haploide, 1g) diferenciacin de callo, h) planta haploide. Para el cultivo de micrsporas aisladas: a) yema floral previo a la antesis, 3b) micrsporas aisladas de una antera, 3c) cultivo de micrsporas, 3d) estado multinucleado, 3e) y 3f) embrin en desarrollo.

plantas en condiciones controladas de fotoperodo y temperatura es esencial y debe ser ajustado en funcin de la especie. Se han citado resultados en cebada cuando las plantas son cultivadas en ambientes libres de patgenos, con alta humedad relativa (60-80%), fotoperodo de 16 hs. de luz, y adecuado rgimen de fertilizacin y riego. Cuando las plantas crecen estresadas, sea por riego excesivo, sequa, enfermedades, o la aplicacin de algn plaguicida, la respuesta al cultivo de micrsporas es menor.

Este sistema es considerado el de mayor potencial para la produccin de doblehaploides, debido a que induce a los miles de micrsporas que contiene una flor a dividirse y producir embriones. La ausencia de la pared de la antera podra mejorar la nutricin y eliminar las restricciones fsicas para la andrognesis. El cultivo de micrsporas tiene la ventaja de originar embriones de similar tamao y etapa fisiolgica debido a que pueden separarse las micrsporas de tamaos semejantes por centrifugacin diferencial. La optimizacin de los diferentes pasos crticos para el xito de esta tcnica puede llevar a la obtencin de una alta cantidad de plantas verdes con menores costos y esfuerzos. Entre los factores determinantes de la eficiencia del mtodo podemos citar: (a) Genotipo: se han citado cultivares de cebada con una alta respuesta al cultivo de micrsporas, en contraste con otros menos respondedores. (b) Albinismo: al igual que en el cultivo de anteras el nmero de plantas albinas depende del genotipo, y tambin se ve influido por la densidad de cultivo de las micrsporas. (c) Condiciones de crecimiento de la planta donadora: el mantenimiento de las

(d) Estado: Como se citara anteriormente para el cultivo de anteras, es imprescindible el chequeo del estadio correcto para que conserven su capacidad androg-nica. (e) Pretratamientos: los pretratamientos ms utilizados consisten en el uso de fro, estrs osmtico, presencia o ausencia de determinados nutrientes, etc. Se ha demostrado que los nutrientes disponibles durante el pretratamiento constituyen un factor decisivo que determina la calidad de los embriones originados. (f) Densidad de cultivo: La densidad de las micrsporas en cultivo afecta el desarrollo de las mismas y el nmero que entrarn en divisin. Existe una concentracin mnima para el desarrollo de las micrsporas, y una densidad ptima para una mayor regeneracin. Las condiciones ms favorables deben ser ajustadas en cada caso y para cada genotipo en particular. (g) Medio de induccin: Se han estudiado diferentes concentraciones de azcares, distintas fuentes de nitrgeno orgnico, y la adicin de diferentes auxinas al medio. En general se sugiere la sustitucin de sacarosa por maltosa como fuente de carbohidratos, la disminucin de la concentracin de nitra-

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to de amonio, el agregado de glutamina, y el empleo de APA (cido fenil actico) como auxina para favorecer la induccin (Kasha y col. , 2001). (h) Medio de regeneracin: la composicin del medio de regeneracin puede afectar el vigor y supervivencia de las plntulas. Kasha et al. (2001), trabajando con cebada, encontraron en este mtodo una manera eficiente de produccin de DH, con una mejor respuesta y una menor dependencia del genotipo que en el caso del cultivo de anteras. A esto se le suma la ventaja de contar con una elevada cantidad de micrsporas haploides en un estado fisiolgico uniforme, que constituyen excelentes blancos para la mutagnesis, la seleccin y la transformacin. - Hibridacin interespecfica e intergenrica : en este caso los haploides se originan a travs de la eliminacin del genoma del polinizador. El sistema de hibridacin de trigo x Hordeum bulbosum, inicialmente descubierto y empleado con xito en cebada, ha sido considerado superior al cultivo de anteras por tres razones: (a) La produccin de haploides es ms fcil. (b) El tiempo requerido para la regeneracin de plantas es menor. (c) La eficiencia en la regeneracin de plantas parece ser mayor.

Figura 6. Produccin de haploides de Triticum aestivum por cruzamientos de trigo x maz (Zea mayz). A. Espigas de trigo cortadas en el campo y castradas en el laboratorio. B. Plantas de maz (donantes de polen) crecidas en invernculo. C. Desgrane de espigas para realizar la desinfeccin de los granos y posterior rescate de embriones. D. Grano con dos embriones haploides (poliembriona). E. Embriones inmaduros rescatados y creciendo in vitro. F. Planta rusticada. G y H. Plantas con 3-5 macollos con sus races sumergidas en solucin de colchicina para la duplicacin cromosmica. I. Plantas tratadas con colchicina y llevadas a macetas con tierra en cmara de crecimiento.

La gran limitante de este sistema lo constituye el hecho de que la mayora de los cultivares de trigo no pueden cruzarse con H. bulbosum debido a la presencia de los genes de incompatibilidad, Kr1 y Kr2, y al desconocimiento del estado de estos genes en los genotipos de trigo y de H. bulbosum involucrados en los cruzamientos, debido a que los genotipos se seleccionan sobre la base de criterios agronmicos y no a un sistema de compatibilidad de cruzamientos con H. bulbosum. Para sortear estos inconvenientes se ha sugerido como alternativa realizar

los cruzamientos, en el caso de trigo, utilizando maz como polinizador (Fig. 6). Luego de la fertilizacin del vulo de trigo por el polen de maz, durante las primeras mitosis del cigoto, los cromosomas del maz son eliminados. Esto se debe a una incompatibilidad entre los cinetocoros de estos cromosomas y las fibras de los husos acromticos que hace que en las primeras anafases los cromosomas de maz vayan quedando rezagados en el citoplasma, donde finalmente son degradados. El resultado de este proceso es un em-

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brin haploide de trigo. Seguidamente, los embriones inmaduros deben ser rescatados en un medio de cultivo apropiado. A travs de las cruzas con maz se han obtenido haploides de trigo de cultivares tanto compatibles como incompatibles con H. bulbosum, lo cual sugiere que el sistema de incompatibilidad no afecta al mtodo de trigo x maz, por lo que sera menos dependiente del genotipo. 4 Duplicacin cromosmica Despus de la duplicacin cromosmica, ya sea espontnea o inducida, se logra la homocigosis y se restaura la fertilidad. La planta haploide, sin duplicar, es estril por lo que no podra producir semillas. Entre las tcnicas que han sido utilizadas para la duplicacin de haploides cabe mencionar: (a) Duplicacin espontnea durante la etapa de callo o de rescate de embriones. (b) Regeneracin de plantas doblehaploides a partir de callos de mdula de plantas haploides de tabaco (Kasperbauer y Collins, 1972). (c) Sustancias qumicas: aunque se conocen casos mediante agentes qumicos tales como acenafteno, hidrato de cloral, sulfanilamida, etc., la mayor eficacia se ha logrado con la colchicina y el xido nitroso. La aplicacin del xido nitroso bajo presin (2-6 atmsferas) resulta de especial inters por su fcil penetracin en los tejidos y la rpida desaparicin de los mismos cuando cesa la presin. Puede utilizarse en flores recin polinizadas. La ventaja que presenta este tratamiento es que, al poder ser aplicado durante la primera divisin mittica del vulo fecundado, se ve reducida la aparicin de quimeras. Por otro lado, los residuos de este agente resultan menos txicos para la planta que otros que se aplican en forma lquida, aunque la frecuencia de aneuploides puede ser muy elevada. La accin de la colchicina fue descubierta en 1937 y desde entonces ha pasado a ser prcticamente el agente diploidizante ms importante Esta droga acta impidiendo el autoensamblaje de la tubulina, inhibiendo as la formacin de los microtbulos del huso y, en consecuencia, la

segregacin anafsica de las cromtides. Afecta por lo tanto slo a las clulas que se encuentran en divisin. Puede aplicarse a plntulas, plantas adultas, semillas, micrsporas y anteras. El tratamiento puede realizarse utilizando una solucin acuosa donde se sumergen las races, dejando fuera la parte area. Tambin se puede hacer llegar la solucin al interior de la planta utilizando una jeringa con la dosis deseada (microinyeccin), o por absorcin de la solucin a travs de los tallitos decapitados, sobre los que se vierte. Otra forma de hacerlo es tratar los callos con colchicina antes de trasladarlos al medio de regeneracin. Este ltimo mtodo permite la obtencin de gran nmero de doblehaploides, pero presenta la desventaja de que la mayora de las plantas as obtenidas son mosaicos cromosmicos. Otra alternativa, para micrsporas y anteras, es la adicin del agente duplicador directamente en el medio de induccin, antes de la primer mitosis. La diploidizacin en este momento requiere menos tiempo y esfuerzo y ha sido utilizada en programas de mejoramiento de trigo, maz, Tritordeum y arroz. El problema de la suplementacin del medio de induccin con colchicina es que reduce la embriognesis en trigo, si bien en Oryza sativa y Brassica la puede incrementar. La duracin del tratamiento y la concentracin de la solucin varan para cada especie. Cualquiera que sea el mtodo con que se duplique la planta, un macollo o slo una yema floral, lo importante es lograr que las semillas que stas produzcan sean viables. 5 Consideraciones finales La eleccin de los progenitores y la seleccin son etapas decisivas en un programa de mejoramiento que avanzar luego generacin tras generacin, hacia una homocigosis que permita entrar en las etapas de evaluacin. Ganar tiempo en estos casos puede significar una reduccin de costos muy importante y una ms temprana entrada en el mercado de la nueva variedad. En el caso de una especie autgama como el trigo es posible ganar generaciones haciendo dos cosechas en un ao, especialmente en aquellos cultivares de corto ciclo vegetativo. Esto, sin

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embargo, dificulta la observacin de algunas caractersticas agronmicas importantes, que no pueden ser observadas en los genotipos en esas condiciones, atentando contra una seleccin eficiente. Para los trigos de tipo invernal y facultativos, con ligeros requerimientos de vernalizacin, esta ganancia de generaciones no es posible o es difcil. La produccin de individuos doblehaploides que puedan participar anticipadamente en la etapa de evaluacin agronmica se plantea como una solucin promisoria a este problema, reduciendo los tiempos y presupuestos. Muchos interrogantes, sin embargo, quedan an sin resolver, limitando la aplicacin extensiva de esta tecnologa a algunos modernos programas de mejoramiento vegetal. Algunas preguntas a las que debemos encontrar respuestas son: En que generacin segregante se aplica el mtodo de doblehaploides? Cul es el nmero de individuos doblehaploides derivados de un cruzamiento, representativo de la variabilidad gamtica creada en la cruza, que permita un aprovechamiento integral, comparable al logrado con el mtodo convencional de seleccin a campo? Cmo superar la escasa cantidad de semilla producida? Es una tcnica alternativa, o complementaria del mejoramiento tradicional? La eficiencia en la produccin de doblehaploides justifica su alto costo dentro de un plan de mejoramiento? De acuerdo con Mujeb-Kazi (1998), las generaciones segregantes adecuadas para producir doblehaploides son la F2 y F3. Si eligiramos individuos F3, que ya cuentan con un ao de seleccin a campo durante la F2 generacin que ha mostrado la mayor varianza gentica entre los dos padres- estaramos evitando producir un gran nmero de plantas doblehaploides que no sern agronmicamente promisorias. No obstante, debemos considerar que seran necesarios varios cientos de individuos DH para que el proceso tenga posibilidades de xito agronmico. En general, la produccin de doblehaploides resulta en un gasto excesivo en com-

paracin a los mtodos tradicionales de mejoramiento, por lo cual en la mayora de los programas slo genotipos lite son sometidos a este sistema. Si bien el costo de produccin de los DH depende directamente del mtodo elegido y la eficiencia lograda, la aplicacin de esta metodologa al mejoramiento vegetal se vislumbra ms bien como una herramienta complementaria al mejoramiento tradicional, y que en ningn modo intentara reemplazarlo. 6 Lecturas Recomendadas
ATANASSOV, A.; ZAGORSKA, P.; BOYADJIEV, P.; DJILIANOV, D. 1995. In vitro production of haploid plants. World Journal of Microbiology & Biotechnology 11, 400408. BERNARD, S. 1980. In vitro androgenesis in hexaploid triticale: determination of physical conditions increasing embryoid and green plant production. Z. Pflazenzucht 85: 308-321. BHOJWANI, S.S.; RAZDAN, M.K. 1996. Haploid Production. En: Plant Tissue Culture: Theory and Practice, Capitulo 7. S.S. Bhojwani y M.K. Razdan (eds.) Elsevier, Amsterdam. pp.167-213. KASHA, K.J.; SIMION, E.; ORO, R.; YAO, W.A.; HU, T.C.; CARLSON, A.R. 2001. An improved in vitro technique for isolated microspore culture of barley. Euphytica 120:379385. KASPERBAUER, M.; COLLINS, G. 1972. Reconstitution of diploids from leaf tissue of anther derived haploid in tobacco. Crop Sci. 12: 98-101. LACADENA, J.R. 1988. Variaciones cromosmicas numericas. En: Gentica, Captulo 15. Lacadena, J.R.(ed.) A.G.E.S.A., Madrid. pp. 683-719. SNAPE, J.; SIMPSON, E.; PARKER, B.; FRIEDT, W.; FOROUGHI-WHER, B. 1986. Criteria for the selection and use of doubled haploid systems in cereal breeding programmes. En: Genetic manipulation in plant breeding. Proc. Int. Symp. Eucarpia W. Horn, C. Jensen, W. Odenbach, O. Schieder (eds). W. De Gruyter, Berlin. pp. 217-229. WANG, C.; CHU, Z.; SUN, C.; CHI, C.; WU, W. 1978. Studies on the albino pollen plantlets of rice. En: Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Pekin Press, pp149-160.

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IV.-Captulo 2
Aplicaciones de los marcadores moleculares
Carrera, Alicia; Tranquilli, Gabriela; Helguera, Marcelo Las herramientas descriptas en II.-4 se utilizan en numerosas reas relacionadas con el mejoramiento vegetal y el anlisis de la biodiversidad. A continuacin se describen algunas de esas aplicaciones. Cada uno de estos campos posee una base terica en ocasiones compleja y muchos de ellos requieren del uso de programas de estadstica avanzada. De este modo, el presente captulo debe ser considerado como una introduccin a los temas considerados. 1 Identificacin de genotipos Pureza varietal El control de la pureza varietal y la discriminacin de variedades protegidas (es decir, registradas) requieren de una adecuada identificacin de los materiales. Esta identificacin se basa tradicionalmente en el uso de descriptores morfolgicos y fisiolgicos. En la mayora de los cultivos, la utilizacin de recursos genticos similares en diferentes programas de mejoramiento ha reducido la eficiencia de discriminacin por marcadores fenotpicos. Por otro lado, varios de los caracteres usados como descriptores presentan limitaciones en cuanto al nmero restringido de variantes, influencia ambiental y dependencia del estadio de desarrollo de planta. Como alternativa para resolver estos problemas, los polimorfismos moleculares de protenas y ADN resultan de utilidad en la determinacin de los criterios DUS (distincin, uniformidad y estabilidad). Se utilizan localmente como datos complementarios de los descriptores morfolgicos y fisiolgicos para el registro de los cultivares, en aquellos casos en que las diferencias entre materiales no son conspicuas. ISTA (International Seed Testing Association) y UPOV (Union Pour La Protection Des Obtenions Vegtales) son

entidades internacionales que han desarrollado protocolos para estandarizar los anlisis de laboratorio para identificacin de cultivares y reglamentar la utilizacin de diferencias moleculares en el control de la pureza varietal, la discriminacin de variedades protegidas y en el otorgamiento de nuevas patentes. Con el objeto de evitar el registro de variedades esencialmente equivalentes, UPOV ha establecido umbrales mnimos de diferencias moleculares sobre la base de distancias genticas obtenidas a partir de caracteres tradicionales. En la actualidad se dispone de patrones moleculares varietales para una extensa lista de especies. Como ejemplo podemos mencionar al trigo pan (Triticum aestivum L.), para el que se desarroll una matriz de identificacin varietal sobre la base de marcadores microsatlites de ADN, que permite la individualizacin de variedades argentinas. (Manifesto y col., 1998). A partir de datos moleculares es posible obtener distintos ndices de distancia gentica y generar esquemas ramificados o dendrogramas, que ponen en evidencia la similitud gentica de los materiales (Ver VI.1). La pureza varietal es uno de los principales requisitos de la semilla comercial. En la produccin de semilla hbrida la heterogeneidad intralote puede originarse por falta de uniformidad en las lneas parentales, polinizacin cruzada espontnea o mezcla de semillas durante la cosecha o embolsado. Los individuos fuera de tipo pueden identificarse mediante el patrn molecular. Del mismo modo pueden establecerse las relaciones de descendencia entre una serie de lneas parentales y sus hbridos. Se ha observado que an despus de 5-6 generaciones de autofecundacin, una lnea puede no haber alcanzado completa uniformidad para ciertos marcadores moleculares. Esto puede interpretarse como una porcin residual del genoma que permanece segregando. Cuando la evaluacin de estos lotes muestra uniformidad morfolgica, fisiolgica y de caracteres agronmicos, pueden aceptarse ciertos niveles de variacin molecular sin expresin fenotpica evidente. El mejorador considerar en cada caso los niveles mximos de variacin admisibles. Sin embargo, la ocurrencia de polimorfismos moleculares

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intravarietales puede representar una limitante para el uso de marcadores como descriptores complementarios en la inscripcin de nuevos cultivares. 2 Uso en bancos de germoplasma Las prcticas de la agricultura moderna han generado una prdida de diversidad en la mayora de las especies cultivadas. El reemplazo paulatino de las variedades primitivas por los cultivares hbridos de indudables ventajas econmicas ha producido una reduccin en el nmero de genotipos que se cultivan. La erosin gentica puede tener graves consecuencias para el cultivo, principalmente en relacin a su vulnerabilidad sanitaria. Este proceso puede ser atenuado mediante la creacin de bancos de germoplasma, que constituyen un componente vital de los programas de mejora. Las colecciones pueden mantenerse como bancos de semilla, a campo o in vitro. Los recursos genticos de una especie cultivada comprenden i) cultivares antiguos y de reciente obtencin ii) poblaciones locales mantenidas por los productores, landraces iii) poblaciones silvestres de la misma especie o formas maleza y iv) especies relacionadas. Los marcadores moleculares permiten caracterizar las accesiones o muestras a ser incluidas en las colecciones, estudiar el proceso de domesticacin, establecer relaciones filogenticas y colaborar en la eleccin de las estrategias de conservacin. El procedimiento consiste bsicamente en analizar los materiales mediante marcadores proteicos o de ADN y calcular medidas de diversidad (nivel de polimorfismo, riqueza allica, presencia de alelos nicos) y de similitud gentica. Esta informacin luego se complementa con datos geogrficos (procedencia de las accesiones, distribucin), pedigr y datos histricos de obtencin. La informacin generada por los marcadores resulta de inmediata aplicacin en los procesos de acopio (dnde colectar, qu intercambios realizar), conservacin (identificacin de duplicados en las colecciones, monitoreo de los cambios en la composicin gentica que puedan ocurrir durante la multiplicacin o conservacin de los materiales), caracterizacin (diversidad gentica de la co-

leccin) y distribucin eficiente de los recursos genticos hacia los usuarios. Veamos algunos ejemplos. En casos como el girasol (Helianthus annuus), el anlisis de diversidad molecular ha demostrado que el proceso de domesticacin ha reducido considerablemente la base gentica de los materiales cultivados con relacin a las poblaciones silvestres. Por el contrario, en poroto (Phaseolus vulgaris) y olivo (Olea europea), las formas cultivadas conservan gran parte de la variabilidad presente en las poblaciones de los centros de origen en Amrica y Europa, respectivamente. La comparacin entre los materiales silvestres y cultivados de una especie permite adems identificar los lugares de origen del cultivo, conocidos como centros de domesticacin. Una vez que los recursos genticos disponibles han sido caracterizados, es posible decidir cules seran los cruzamientos que ms contribuiran a la expansin de la base gentica. Frecuentemente, limitaciones en cuanto a espacio fsico y presupuesto, hacen que los centros nacionales e internacionales de recursos genticos deban restringir el nmero de entradas a conservar en el banco de germoplasma. La informacin reunida a partir de datos moleculares y morfolgicos puede contribuir a establecer una coleccin ncleo o representativa de la variabilidad total. Esta coleccin central debera incluir los caracteres que estn presentes en numerosas accesiones o comunes, pero tambin los denominados componentes raros y aquellos presentes en pocas accesiones de manera bastante frecuente. La mayor parte de los polimorfismos moleculares carecen de expresin fenotpica y son selectivamente neutros, siendo la deriva gnica el proceso ms importante para el cambio de frecuencia en las poblaciones. Una gran parte de ellos se encuentran en regiones no codificantes del genoma. En contraste, los genes que codifican los rasgos morfolgicos poseen un fuerte efecto fenotpico y han estado sometidos a intensas presiones de seleccin en las distintas etapas del mejoramiento; podran, por lo tanto, constituir una muestra de genes atpica con respecto a la mayora de genes de una especie. Estos caracteres representan grupos de genes sometidos a diferentes fuer-

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zas de seleccin a lo largo del proceso de domesticacin. Los marcadores moleculares combinados con datos morfolgicos, agronmicos y de origen, conforman una base de datos integral que permite describir la variacin gentica en colecciones de germoplasma. 3 Mapeo gentico Un mapa gentico de una especie animal o vegetal muestra la distribucin linear de un grupo de genes y marcadores en cada uno de los cromosomas que constituyen el genoma de un organismo. Este mapa esta basado en el concepto clsico de ligamiento: si dos o ms genes o marcadores estn fsicamente cercanos sobre el mismo cromosoma, sus alelos se heredan usualmente juntos a travs de la meiosis. Las proporciones en que estos genes segregan en una poblacin se apartan de las esperadas bajo la ley de Mendel de segregacin independiente. La mayor parte de los gametos contendrn las mismas combinaciones allicas que los padres; slo aquellos meiocitos que experimenten un intercambio entre cromtides no hermanas o crossover generarn gametos con combinaciones allicas diferentes de las parentales (recombinantes). El fundamento del mapeo gentico reside en la relacin directa entre la frecuencia de recombinacin y la distancia fsica entre los loci. Es as como determinando la frecuencia de recombinacin entre dos genes, uno puede estimar la distancia de mapa entre los mismos, siendo la unidad de mapeo equivalente a una frecuencia de recombinacin del 1%. Usualmente esta distancia se expresa en centimorgan (cM). La relacin entre frecuencia de recombinacin y distancia fsica es distorsionada por factores tales como la distribucin no al azar de los entrecruzamientos, las diferencias entre organismos, la presencia de hot spots o sitios de alta frecuencia de recombinacin y la evidencia de control gentico de la recombinacin. No obstante, el uso de la intensidad de ligamiento como estimador de la distancia gentica genera un modelo de la disposicin linear de genes y marcadores de gran utilidad en mltiples reas del estudio genmico.

Recordemos que el grado de recombinacin gentica (r), tambin conocido como fraccin de recombinacin, es la proporcin de gametos recombinantes, nr sobre el total de gametos. r = nr / n Para tres loci, ABC, ligados en ese orden, las fracciones de recombinacin entre los tres se relacionan a travs de la siguiente expresin: rAC = rAB + rBC 2C rAB rBC donde 2rAB rBC representa la frecuencia esperada de entrecruzamientos dobles y C, el coeficiente de coincidencia, una medida de la independencia con la que ocurren quiasmas (entrecruzamientos) en regiones cercanas. La fraccin de recombinacin no es aditiva a lo largo del cromosoma y la desviacin respecto de la aditividad aumenta con la distancia entre los loci. De este modo se han desarrollado funciones de mapa tales como Haldane o Kosambi que tornan aditiva la fraccin de recombinacin. Funcin de Haldane : m = - 0.5ln (1-2r), donde m representa unidades de mapa gentico. Si un marcador resulta estar genticamente ligado a un gen que controla un carcter de inters agronmico, la seleccin de este marcador resulta en la seleccin indirecta del gen de inters. Este hecho constituye el fundamento del proceso denominado seleccin asistida por marcadores moleculares, aplicado en el mejoramiento gentico vegetal y animal (ver seccin correspondiente en este captulo). La eficiencia del proceso de seleccin indirecta basado en la cosegregacin del marcador y del gen, es una funcin de distancia, expresada como la probabilidad de recombinacin gentica entre el marcador y el gen; por lo tanto, cuanto ms prximos estn el marcador y el gen en cuestin, ms eficiente ser la seleccin. Este anlisis puede aplicarse tanto en caracteres cualitativos como cuantitativos. La diferencia entre un carcter cuantitativo y uno cualitativo se basa en la magnificacin del

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efecto de sustitucin de un alelo por otro en un determinado locus (Falconer, 1988). Si el efecto de la sustitucin allica sobre la variacin fenotpica total del carcter es pequeo, se considera el carcter como cuantitativo o QTL (quantitative trait loci). Si el efecto de la sustitucin de un alelo por otro es grande en relacin con la variacin fenotpica total, el carcter es cualitativo (genes de herencia simple). En general, la mayora de los caracteres de importancia econmica y/o agronmica, principalmente aquellos relacionados con la productividad, poseen herencia cuantitativa o fenotipos complejos. Para incorporar un carcter de inters agronmico en un mapa gentico es necesario cumplir con una serie de premisas: 1- Desarrollar una poblacin segregante para el carcter agronmico en cuestin. 2- Caracterizar la poblacin segregante utilizando marcadores moleculares polimrficos (con diferencias en la secuencia de ADN entre los parentales). Para construir un mapa mnimo es deseable disponer de al menos cuatro marcadores moleculares por cada cromosoma del genoma en estudio. Cuanto mayor sea el nmero de marcadores incorporados al mapa, mayor ser su resolucin y la probabilidad de identificar algn marcador ligado al carcter agronmico de inters. 3- Evaluar fenotpicamente el carcter agronmico, sobre los individuos de la poblacin segregante. Este punto es crucial, ya que si la evaluacin del carcter en la poblacin de mapeo no es clara, es imposible incorporarlo al mapa gentico. 4- Identificar marcadores ligados al carcter agronmico (cosegregacin entre fenotipo del carcter y fenotipo del marcador). Para esta instancia, al igual que para la construccin del mapa gentico, se pueden utilizar herramientas informticas especficas tales como los programas Mapmaker, MapmakerQTL, Genemap, etctera. Cuanto mayor sea la distancia gentica entre los parentales que darn origen a la poblacin de mapeo, mayor ser la probabilidad de detectar marcadores polimrficos, que es un punto crtico para identificar marcadores ligados al carcter en estudio.

En el contexto del mejoramiento vegetal los mapas genticos posibilitan: ~ La cobertura y anlisis de genomas completos ~ La descomposicin de caracteres genticos complejos (QTL) en componentes mendelianos ~ La localizacin de regiones genmicas que controlan caracteres de importancia agronmica ~ La cuantificacin del efecto de estas regiones en la caracterstica estudiada ~ La canalizacin de esta informacin en programas de mejoramiento La construccin de un mapa gentico genera informacin bsica sobre la estructura y organizacin de un genoma tal como reordenamientos cromosmicos (inversiones, translocaciones, duplicaciones) e identificacin de regiones con alta densidad de genes. Por otro lado un mapa gentico constituye el punto de partida para proyectos de clonado posicional de genes (ver seccin 6 de este captulo). 4 Seleccin asistida por marcadores El advenimiento de nuevas tcnicas moleculares ha facilitado el anlisis gentico de caracteres de inters agronmico y la seleccin asistida por marcadores moleculares. Un argumento frecuentemente utilizado en contra de la seleccin asistida por marcadores es que el mejoramiento de caracteres de herencia simple no necesita de marcadores para seleccin si los fenotipos son fcilmente identificables. Si bien esto es correcto, en estos casos, la utilizacin de marcadores en un programa de mejoramiento puede aportar una ventaja muy importante basada en su naturaleza molecular y es que la seleccin se independiza del fenotipo y el ambiente. Estas caractersticas permiten identificar rpidamente genotipos nicos en poblaciones segregantes e incorporar varios genes de inters en un fondo gentico, proceso tambin denominado piramidizacin o apilamiento de genes. Los ejemplos ms claros para ilustrar la utilidad de la seleccin asistida por marcadores moleculares en la piramidizacin de genes se observan en los casos en que interacciones

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gnicas como la epistasis (efectos de ciertos genes sobre la funcin de otros) enmascaran la presencia de un gen, dificultando su seguimiento mediante el fenotipo. Esta situacin se presenta con los genes de resistencia a enfermedades, cuando se desea sumar en un genotipo resistente a una determinada enfermedad otros genes de resistencia al mismo patgeno, como estrategia de resistencia durable. Otro impacto de la seleccin asistida por marcadores moleculares es el menor tamao de las progenies mantenidas en un programa. Con la seleccin asistida, el nmero de generaciones necesarias para la estabilizacin de los genotipos es menor, ya que la heredabilidad de los caracteres es prxima a 100%, aumentando la ganancia gentica. Tambin es posible incrementar la velocidad de un programa de mejoramiento, ya que al independizarse la seleccin del ambiente y de la expresin del fenotipo, se logra adelantar el nmero de generaciones por ao.

En la Figura 1 se representa un programa de retrocruzas asistida por marcadores moleculares como ejemplo de la utilizacin de esta herramienta en el mejoramiento vegetal. La utilidad potencial que los marcadores moleculares presentan en el proceso de mejoramiento gentico resulta clara. Sin embargo, a pesar de ello, el uso actual de estas herramientas en algunos casos es limitado. Diversos son los factores que determinan esta situacin. Por un lado podramos considerar los de orden tcnico y por otro los de ndole econmico. Dentro de los primeros, adems de lo mencionado en prrafos anteriores respecto de la necesidad de contar con el mapa gentico, con alta resolucin y de una poblacin segregante, debemos tener en cuenta el paso siguiente que es la validacin de los marcadores que se identifiquen como promisorios para el seguimiento de caracteres de inters, es decir, la confirmacin de determinados marcadores como herramien-

Figura 1. Esquema de un programa de retrocruzas, asistido por un marcador especfico para el gen de resistencia a roya de la hoja del trigo Lr47. Pavon: variedad donora de la fuente de resistencia. PI Gaucho: variedad susceptible recurrente. BC: generacin de retrocruza.

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ta efectiva de seguimiento o seleccin de un gen particular. La validacin es un aspecto fundamental previo a la implementacin de estas herramientas en programas de mejoramiento, y su importancia reside en que la mayora de los marcadores disponibles hasta el momento derivan de regiones del genoma que, como ya fuera indicado, son neutras y en que la asociacin con caracteres de inters est determinada por ligamiento gentico en la poblacin evaluada. Dado que ese ligamiento puede no mantenerse en otro germoplasma, es necesario confirmar en los materiales de mejoramiento que el carcter deseado est determinado por gen/es presentes en el locus marcado. Desde este punto de vista, el mejor marcador es aquel que reconoce sitios polimrficos que estando dentro del gen son los determinantes de la variacin fenotpica observada. Estos marcadores, tambin llamados diagnstico o funcionales, pueden ser usados en forma confiable en poblaciones en los que no se hayan mapeado previamente, sin correr el riesgo de que la informacin de inters se pierda por recombinacin. (Andersen y Lbberstedt, 2003). Como ejemplo podemos mencionar al marcador desarrollado para el gen denominado Pinb-D1. Este gen codifica para una de las protenas relacionada con textura de grano en trigo y se ha observado que la mutacin de una base especfica dentro de su secuencia implica el cambio de un aminocido (de glicina a serina) en la protena codificada y que esto es suficiente para determinar un mayor grado de dureza de grano. Para este gen, se ha desarrollado un marcador cuyo polimorfismo esta dado por dicha mutacin, y esto asegura que su uso sea vlido para identificar la presencia de esta caracterstica, sea en poblaciones de mejoramiento como en la caracterizacin de germoplasma. Sin dudas, la disponibilidad de marcadores diagnstico aumentar progresivamente a partir de nuevos conocimientos que surjan de los proyectos genmicos emprendidos en diversos cultivos de inters econmico. Dentro de los factores de ndole econmico, la limitante en la adopcin de esta tecnologa ha sido la relacin entre el costo de la misma y el valor comercial de la semilla mejorada. En los programas de mejoramien-

to de aquellas especies donde el material de cultivo es hbrido, en general se observa mayor uso de seleccin asistida por marcadores moleculares. Es esperable que esta tendencia se modifique con el tiempo, ya que el permanente avance tecnolgico ha permitido simplificar las metodologas a aplicar, por ejemplo, sustituyendo marcadores basados en hibridacin (RFLP, por ejemplo) por marcadores basados en amplificacin (RAPD, AFLP), reduciendo costos y tambin aumentando la eficiencia en el proceso de seleccin. 5 Mapeo comparativo La comparacin de mapas de ligamiento entre diferentes especies se denomina mapeo comparativo. Si un grupo de marcadores moleculares mantiene el orden y sus relaciones de ligamiento entre dos especies se dice que son colineares o que muestran sintenia. Los mapas comparativos en vegetales comenzaron a realizarse a partir del desarrollo de los marcadores RFLP y de la posibilidad de obtener hibridacin entre las secuencias de ADN utilizadas como sondas con genomas distintos a los utilizados para la obtencin de las mismas. Es decir, a partir de los RFLP fue posible identificar sitios comunes en distintas especies que servan como puntos de referencia para la comparacin de sus genomas. Es as que los mapas comparativos dieron las primeras evidencias de que el ligamiento de grupos de genes podra haberse conservado a travs de largos perodos evolutivos. Estudios en diversos grupos taxonmicos han revelado una estrecha relacin entre los genomas de las especies comprendidas dentro de cada grupo. Esto se ha observado, por ejemplo, entre especies pertenecientes a las Solanceas (tomate, papa, pimiento), entre Arabidopsis y cultivos del gnero Brassica, y dentro de las gramneas entre especies pertenecientes a la tribu Triticeas (trigo, cebada, centeno) as como entre especies pertenecientes a distintas subfamilias taxonmicas, tal el caso de arroz, maz y sorgo. Es importante sealar que los tamaos de los genomas de las especies comparadas, en general, son significativamente diferentes. Sin embargo, a pesar de esa gran variacin en el tamao del genoma, el orden

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linear de los genes se encuentra altamente conservado. La utilidad de los mapas comparativos puede apreciarse desde distintos puntos de vista. Por un lado, aportan informacin muy valiosa para conocer los cambios producidos en la estructura cromosmica (inversiones, translocaciones, duplicaciones, deleciones) durante el proceso evolutivo que lleva a la diferenciacin de especies a partir de un antecesor comn, as como tambin permiten evaluar niveles de ploida. Por ejemplo, a partir de la comparacin de mapas moleculares, ciertas especies consideradas inicialmente diploides han modificado su estatus. Sobre la base de estudios citogenticos, el maz posee un comportamiento meitico que corresponde al de una especie diploide tpica. Sin embargo, numerosos loci RFLP de arroz estn representados dos veces en el genoma de maz por lo que actualmente se considera que el maz desciende de un poliploide ancestral. Por otro lado, los mapas comparativos posibilitan la transferencia de informacin entre especies con genomas simples y bien caracterizados, tales como Arabidopsis y arroz, a especies con genomas ms complejos tales como trigo, cebada y avena. Este ha sido tal vez el objetivo principal para impulsar el desarrollo de estos mapas. Las notables similitudes observadas entre genomas fue la base sobre la que se postul el uso de especies modelos, como arroz o Arabidopsis, a partir de las cuales estudiar y avanzar en el conocimiento de genomas ms complejos. Asimismo, partiendo del supuesto de que los genes que gobiernan aspectos fundamentales de la biologa vegetal muy probablemente estn conservados entre distintas especies, y el hecho de que la variacin en el tamao de los genomas de especies relacionadas se debe fundamentalmente a variacin en la cantidad de ADN no codificante y no a una variacin en el nmero de genes, la idea de llegar a la identificacin, clonado y estudio de genes en las especies modelo se vio fortalecida. De este modo la informacin generada podra hacerse extensiva a una amplia gama de especies, incluyendo las cultivadas, facilitando as el estudio en estos organismos.

6 Clonado posicional El clonado posicional de un gen es un claro ejemplo de la utilizacin de informacin gentica (disposicin espacial de genes), molecular (secuencia nucleotdica de genes) y del funcionamiento ( expresin de los genes) de un genoma (conjunto de genes) para identificar al gen responsable de un carcter particular. El primer paso para lograr esto es seleccionar parentales que sean contrastantes para el gen en cuestin; por ejemplo, una variedad de trigo susceptible y otra resistente a la roya de la hoja, para desarrollar una poblacin de mapeo segregante para el gen de resistencia (Stein y col., 2000). Una vez seleccionados los parentales se desarrolla una poblacin segregante para el carcter, la ms sencilla es una F2. Posteriormente, se caracteriza esta poblacin utilizando marcadores moleculares (microsatlites, RFLP, AFLP, RAPD) que cubran todo el genoma del organismo en estudio (en este caso trigo). El siguiente paso es determinar el fenotipo de los individuos que constituyen la poblacin de mapeo (en este caso plantas resistentes o susceptibles a roya de la hoja). Una vez obtenida la informacin fenotpica y molecular de la poblacin de mapeo, con la ayuda de programas especficos de computacin (por ejemplo, Mapmaker QTL), se identificarn marcadores ligados genticamente al carcter en una regin especfica del genoma. Una vez identificada la regin cromosmica portadora del gen responsable del carcter, se satura dicha regin con nuevos marcadores moleculares. El objetivo es delimitar el intervalo del genoma al fragmento mnimo posible que contenga al gen de inters. Muchos de estos marcadores pueden obtenerse del mapeo comparativo, identificando las regiones cromosmicas colineares de las especies ms estudiadas, por ejemplo en plantas, arroz, Arabidopsis, maz, sorgo, tabaco, etctera. Una vez reducido al mnimo el intervalo de genoma portador del gen de inters, el paso siguiente es obtener la secuencia nucleotdica del mismo. Una forma de hacerlo es mediante una caminata cromosmica.

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La caminata se inicia seleccionando clones de una genoteca de trigo (BAC library, Ver Captulo II.-3) con los marcadores que flanquean al intervalo portador del gen. Los dos grupos de BAC (uno para cada marcador) son digeridos con enzimas de restriccin para identificar en cada grupo fragmentos compartidos y no compartidos. Se estima que, en cada grupo los BAC seleccionados deben tener en comn al menos un fragmento de digestin (el fragmento que posee la secuencia del marcador). Los fragmentos no compartidos corresponden a los extremos de estos BAC parcialmente solapados entre s. Estos extremos se utilizan como nuevos marcadores para extender la caminata cromosmica en ambos sentidos. Este proceso se hace simultneamente con ambos grupos de BAC hasta que se superpongan y se forme un continuo o contig de BAC. Este contig contiene la secuencia del gen en estudio. El paso siguiente consiste en la secuenciacin del contig. A partir de esta informacin, y por anlisis de secuencia, se determinan los genes presentes, posibles candidatos del carcter en estudio. La prueba definitiva para establecer el hallazgo del gen en cuestin es la prueba de complementacin. Esto consiste en transformar una planta que carece del carcter en estudio (por ejemplo es susceptible a un patgeno) con cada uno de los genes candidatos y determinar cul de ellos le confiere el carcter (en este caso resistencia al patgeno). En algunos genomas (por ejemplo, arroz), la regin cromosmica colinear a trigo puede estar secuenciada, y a partir de esta informacin se puede tener una primera estimacin del nmero de genes candidatos para la resistencia al patgeno en la regin cromosmica homloga a trigo en arroz. En el caso del trigo pan, que posee un genoma extremadamente grande (16000Mb/ genoma haploide) es crtico obtener un intervalo genmico lo ms pequeo posible, ya que si bien posee aproximadamente el mismo nmero de genes que arroz, su genoma haploide es diez veces mayor, y la diferencia est constituida principalmente por ADN repetitivo no codificante que dificulta el clonado posicional. Como ejemplo, para el clonado posicional del gen Vrn-1 que controla el momento de floracin del trigo

se utiliz una poblacin de trigo diploide (Triticum monococcum) de 3095 individuos F2, para llegar a delimitar un intervalo de 0.03 cM que contena dos genes candidatos para Vrn-1 (Yan et al. 2003). Esta regin present una densidad de genes de uno cada 70000 pares de bases, la mitad del valor promedio de fragmentos contenidos en un BAC. 7 Distribucin de la variabilidad gentica en poblaciones naturales Las especies estn constituidas por unidades o demos ms o menos aislados denominados poblaciones. Una especie vegetal raramente se extiende en forma continua e ininterrumpida. En general adopta una distribucin en parches. El nmero de individuos en cada poblacin, el modo reproductivo (autogamia-alogamia), las distancias inter-demos, el tipo de polinizacin (gravedad-anemfila-entomfila), la accin del hombre en la fragmentacin del hbitat y el origen histrico (especies nativas-especies introducidas) determinan en conjunto una distribucin de la variacin gentica propia de cada especie. Los programas de conservacin utilizan a menudo informacin acerca de la distribucin de la variacin gentica para establecer prioridades y estrategias de manejo. El estudio de los componentes de la variacin dentro y entre poblaciones colaboran en la definicin de las unidades a conservar y se convierten en elementos importantes para la toma de decisiones relacionadas con la proteccin de la biodiversidad. Es deseable que las poblaciones seleccionadas para formar parte de las reas protegidas, contengan la mayor diversidad gentica posible de modo de asegurar el mayor potencial evolutivo. A partir de marcadores codominantes como las isoenzimas pueden ser obtenidos parmetros de diversidad: P: nmero de loci polimrficos/nmero total de loci analizados. A: nmero promedio de alelos por locus He: heterocigocidad esperada promedio (1- fi2, fi : frecuencia allica) Ho: heterocigocidad observada Tambin se calculan coeficientes de endogamia (F) a partir de la heterocigocidad observada y esperada, e ndices de simili-

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tud (I) o distancia gentica (D) que cuantifican la semejanza o diferencia gentica entre poblaciones a partir de las frecuencias allicas (Ver VI.-1 ). La diversidad gentica cuantificada por marcadores moleculares puede mostrar por ejemplo, que en una especie nativa de inters forestal todas las poblaciones presentan altos niveles de variabilidad gentica y son bastante similares entre s. En este caso la decisin de cules poblaciones formarn parte del programa de conservacin podra basarse en consideraciones exclusivamente prcticas ya que las poblaciones son genticamente equivalentes. Por el contrario, una especie compuesta de poblaciones con niveles bajos de variabilidad en cada unidad pero con alto grado de diferenciacin entre poblaciones, requerir que los esfuerzos de proteccin sean dirigidos hacia tantas poblaciones como sea posible, ya que cada una de ellas posee una identidad gentica diferente. Poblaciones de especies endmicas, con niveles de diversidad gentica extremadamente bajos y un reducido nmero de individuos, son normalmente ingresadas a la categora de especies en peligro de extincin. En este punto, es importante recordar que los marcadores moleculares representan variacin gentica esencialmente neutra, es decir se encuentran sometidos a la accin de fuerzas evolutivas no selectivas tales como deriva o flujo gnico. Las decisiones finales de un programa de conservacin deberan por lo tanto combinar los datos obtenidos a partir de marcadores moleculares junto con la evaluacin de ciertos rasgos morfolgicos, fisiolgicos o reproductivos, que son crticos en el proceso de adaptacin y supervivencia de las poblaciones en su hbitat. El conocimiento de los componentes de variacin entre y dentro de las poblaciones naturales puede utilizarse adems en situaciones de repoblamiento, es decir, la introduccin de individuos en reas en proceso de declinacin. De acuerdo a la informacin obtenida por la caracterizacin molecular, es posible seleccionar la las poblaciones donadoras sobre la base de la similitud gentica con la receptora, de modo de evitar los efectos indeseables de la depresin por exogamia. Las malezas de mayor impacto en la agri-

cultura mundial son en general especies introducidas. En el nuevo territorio, libre de presiones selectivas tales como especies competidoras o patgenos caractersticas del ecosistema de origen, la especie introducida es capaces de establecerse y colonizar todos los territorios que renan determinadas condiciones ambientales. La caracterizacin gentica de las poblaciones de malezas puede aportar informacin de utilidad en los programas de control. Mediante diferentes marcadores moleculares puede establecerse si las poblaciones actuales provienen de un solo evento de introduccin, con unos pocos individuos iniciales o por el contrario, ocurrieron mltiples eventos de introduccin. Adems, determinados marcadores informativos pueden establecer con bastante precisin cul es el lugar de origen de las poblaciones introducidas, y en este caso rastrear enemigos naturales que pudieran ser tiles como control biolgico de la especie invasora. Del mismo modo puede ser analizada la variabilidad gentica de patgenos o parsitos vegetales tales como razas de royas, virus, nematodos, etc. y a partir de esta informacin disear programas de control ms eficaces. El tipo de reproduccin de una especie vegetal determina en gran parte la distribucin de variabilidad gentica entre poblaciones. Los mecanismos reproductivos pueden clasificarse en los tres tipos bsicos: alogamia, autofecundacin y apomixis (ver Captulo VIII.-3). En realidad existen combinaciones de estos tipos bsicos, con porcentajes variables de cada uno de ellos, segn las especies, y aun dentro de las poblaciones, con formas obligadas o facultativas. El estudio de marcadores moleculares en diferentes plantas de una poblacin y su progenie ha contribuido a determinar el tipo de reproduccin de numerosas especies vegetales. 8 Estimacin del flujo gnico El flujo gnico entre poblaciones vegetales ocurre mediante el movimiento de polen o de semillas. La morfologa de semilla y polen, los mecanismos de dispersin, el tipo de polinizacin, etc., hacen que la contribucin de estas dos vas al flujo total vare de acuerdo a la especie. Los marcadores moleculares

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permiten cuantificar cada uno de estos procesos. Si el flujo gnico se produce bsicamente a travs de polen, los marcadores de ADN de organelas, como por ejemplo cloroplastos, no sern transferidos de una poblacin a otra porque este tipo de informacin es slo heredada por va materna. En contraste, si el flujo gnico se realiza principalmente a travs de semillas, tanto los marcadores de herencia materna como los de herencia biparental o nuclear, sern transmitidos entre poblaciones. Mediante el uso de marcadores altamente polimrficos como los microsatlites es posible determinar cul ha sido la planta donadora del polen de cada semilla por ejemplo, en especies arbreas. En este caso, por un lado se obtiene informacin acerca de la distancia de transporte de polen y adems constituye un test de paternidad. La estimacin del flujo gnico ha cobrado especial relevancia en los estudios tendientes a evaluar el efecto sobre el ambiente de los materiales genticamente modificados. Dicho efecto comprende diferentes facetas. Por un lado la posibilidad de que poblaciones silvestres cercanas a las formas cultivadas, adquieran el transgen mediante fecundacin cruzada, generando cambios en la dinmica poblacional, competitividad o relacin con otro miembros de la comunidad bitica tales como polinizadores, patgenos, etc.. Esta potencial transferencia de genes se torna preocupante cuando se trata de flujo gnico hacia poblaciones silvestres catalogadas como malezas. En este escenario los marcadores moleculares de ADN o isoenzimas constituyen herramientas muy tiles. Los individuos de una determinada poblacin pueden ser analizados y comparados con su progenie, producto de una polinizacin libre. Los alelos que no estaban presentes en la poblacin materna son atribuidos al ingreso externo de polen del cultivo. Evaluando poblaciones a distancias crecientes desde una determinada fuente de polen, el flujo gnico puede ser cuantificado, y cuando esta informacin se complementa con datos de compatibilidad sexual, polinizadores y clima se arriba a una serie de conclusiones que pueden aplicarse al cultivo en gran escala de variedades transgnicas. A modo de ejemplo, con el objeto de estable-

cer el riesgo ambiental de la liberacin de girasol genticamente modificado en la Argentina, se est realizando un estudio que comprende el relevamiento de las especies silvestres del gnero Helianthus, su distribucin y el grado de intercambio gentico en las zonas de contacto cultivo-silvestre (Ver IX.2). Se trate de variedades transgnicas o no, los procesos de hibridacin de formas cultivadas de base gentica estrecha con silvestres alteran los niveles de diversidad gentica de las poblaciones naturales, produciendo una erosin de los recursos genticos vegetales, con potencial aplicacin en mejora. Nuevamente la estimacin del flujo gnico y la determinacin de la variabilidad gentica mediante marcadores pueden contribuir a atenuar los procesos de homogenizacin gentica y dar tiempo a la evaluacin de las poblaciones naturales en cuanto a rasgos como resistencia a enfermedades o parmetros de calidad. 9 Filogenia La filogenia intenta reconstruir las relaciones jerrquicas de descendencia entre especies o grupos de especies y utiliza esta informacin como criterio de clasificacin biolgica. El conocimiento de la filogenia y diversidad gentica de los recursos silvestres permite optimizar los procesos de hibridacin con los materiales cultivados. Cultivos importantes como trigo, girasol, tomate, poroto, arroz cuentan con numerosas especies y gneros silvestres relacionados, con potencial uso en el mejoramiento gentico mediante cruzamientos. Los marcadores RFLP son particularmente tiles dado que estn basados en reacciones de hibridizacin, lo que garantiza la homologa de los segmentos que se comparan entre los diferentes taxa. RAPD no requiere un conocimiento previo del genoma en estudio y puede ser aplicado a diferentes especies pero la interpretacin de los datos parte de asumir que los productos de amplificacin de iguales tamaos son homlogos. El procedimiento consiste bsicamente en calcular un ndice de distancia gentica sobre la base del nmero de bandas en comn y luego realizar un anlisis de agrupa-

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miento (UPGMA) o rbol filogentico (Neighbour Joining), que refleje las relaciones entre los taxa. Establecer cul es el rbol correcto entre todos los posibles es una tarea difcil que en parte es resuelta mediante el uso de mtodos estadsticos, como tcnicas de re-muestreo, que generan ndices de consistencia o confiabilidad para cada rbol. Las relaciones establecidas de este modo se comparan luego con vas filogenticas propuestas a partir de datos citogenticos, morfolgicos, ecolgicos, cruzamientos, etctera. Los polimorfismos en los fragmentos de restriccin de ADN de cloroplasto resultan tiles para establecer relaciones filogenticas en el mbito de familias y gneros debido a su tasa de evolucin ms lenta y a su modo de herencia uniparental. Para los niveles de especie e infraespecficos es conveniente complementar con marcadores de origen nuclear, entre los cuales las sondas para ARN ribosmico 45S y ADNc son frecuentemente usadas. El mapeo comparativo ha permitido conocer el tipo de reorganizacin genmica que ha operado durante el proceso de especiacin. Cuando se compara el orden de los marcadores moleculares del girasol, Helianthus annuus, y especies relacionadas como H. petiolaris y H. anomalus se observa que las especies poseen zonas colineares y zonas no colineares, originadas estas ltimas en cambios estructurales como inversiones y translocaciones. Adems se ha comprobado que H. anomalus es una especie resultante de la hibridacin entre las dos especies mencionadas, que conserva el mismo nmero cromosmico de las especies parentales. Mediante marcadores isoenzimticos es posible dilucidar las especies parentales ancestrales de una especie alopoliploide, como ocurri con el tabaco y el algodn. Basta con examinar las variantes moleculares de las especies candidatas diploides y compararlas con las de la especie poliploide derivada. El modo de herencia de un locus isoenzimtico, es decir, dismico vs. polismico, permite adems caracterizar una especie en cuanto a su origen alo- o autopoliploide, respectivamente.

En la evolucin del gnero Citrus ha operado la hibridacin natural a travs de reproduccin sexual pero tambin estn presentes mecanismos apomcticos que constituyen barreras al intercambio de genes. La taxonoma de este grupo resulta particularmente compleja ya que no puede ser aplicado el concepto biolgico de especie. Marcadores de ADN han permitido esclarecer las relaciones de este polimrfico grupo que incluye naranjas, limones, limas y mandarinas. Los estudios moleculares ms recientes han colocado al tomate, previamente denominado Lycopersicon esculentum, dentro del gnero Solanum, pasndose a denominar Solanum lycopersicon. Los estudios sobre ADN de cloroplasto y la similitud de los mapas de ligamiento constituyen evidencias de que el tomate y la papa comparten un antecesor comn muy reciente. Esta informacin resulta de gran aplicacin en el mejoramiento de estos cultivos as como en la comprensin de la evolucin de los genomas. 10 Lecturas recomendadas
ANDERSEN, J. R.; LBBERSTEDT, T. 2003 Functional markers in plants. Trends in Plant Science 8: 554-560. ANGIOLILLO, A.; MENCUCCINI, M.; BALDONI, L. 1999. Olive genetic diversity assessed using amplified fragment polymorphisms. Theor. Appl. Genet. 98: 411-421. CARRERA, A.; PIZARRO, G.; POVERENE, M.; FEINGOLD, S.; BERRY, S.; LEN, A. 2002. Variability among inbred lines and RFLP mapping of sunflower isozymes. Genetics and Molecular Biology 25: 65-72. FALCONER, DS. 1988. Introduction to quantitative genetics. New York, Longman. GRIFFITH, S.; ANTHONY, J.F.; GELBART, WILLIAM, M.; MILLER, JEFFREY H.; LEWONTIN, RICHARD C.1999. Modern Genetic Analysis. New York: W.H: Freeman & Co. (eds.) ISBN 0-7167-3118-5 http:// w w w . n c b i . n l m . n i h . g o v / b o o k s / bv.fcgi?call=bv.View..ShowSection&rid=mga GODT M, HAMRICK J. 1998. Allozyme diversity in the grasses. En: Population biology of grasses. G. P. Cheplick (ed). Cambridge University Press. 399 pp. MANIFESTO M.M., SCHLATTER A.R., HOPP H.E., SUREZ E.Y., AND DUBCOVSKY J. Quantitative evaluation of genetic diversity in wheat germplasm using molecular markers. 2001, Crop Science 41: 682- 690. MOORE G. 2001. Oranges and lemons: clues to the taxonomy of Citrus from molecular markers. Trends in Genetics 17: 536-540.

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PARTE V Mtodos de propagacin y conservacin de germoplasma

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OLMOS, Sofa; LUCIANI, Gabriela; GALDEANO, Ernestina

V.-Captulo 1
Micropropagacin
Olmos, Sofa; Luciani, Gabriela; Galdeano, Ernestina 1 Introduccin La micropropagacin consiste en la propagacin de un genotipo a gran escala a travs del empleo de tcnicas de cultivo de tejidos. El cultivo es as una herramienta muy til en los programas de mejoramiento, ya que tiene el potencial de producir plantas de calidad uniforme a escala comercial, a partir de un genotipo selecto y con una tasa de multiplicacin ilimitada. Esto es posible gracias a la propiedad de totipotencia que tienen las clulas vegetales; esto es la capacidad de regenerar una planta completa cuando estn sujetas a los estmulos adecuados. As, las clulas somticas de cualquier tejido podran formar tallos, races o embriones somticos de acuerdo con la competencia que posean y al estmulo que reciban. Esta regeneracin ocurre en fases consecutivas: la fase de desdiferenciacin, donde las clulas se vuelven competentes para responder ante cualquier estmulo organognico o embriognico; la fase de induccin, donde las clulas se determinan para formar un rgano o embrin, y la fase de realizacin, donde se forma el rgano o embrin propiamente dicho. Estas fases estn directamente afectadas por el balance hormonal del medio de cultivo, por lo cual la optimizacin de los protocolos de regeneracin debe realizarse teniendo en cuenta los requerimientos intrnsecos de cada genotipo en cada fase del cultivo. As, en general, puede decirse que el proceso de desdiferenciacin generalmente es promovido por una auxina, la fase de induccin por un balance hormonal especfico del rgano o embrin a formarse y la fase de realizacin, por una disminucin de la concentracin hormonal en el medio de cultivo. 2 Etapas de la micropropagacin La regeneracin de plantas in vitro presenta cuatro etapas principales: 1) estableci-

miento del cultivo, 2) desarrollo y multiplicacin de vstagos, 3) enraizamiento y 4) aclimatacin de las plntulas. Generalmente, las etapas de enraizamiento y aclimatacin pueden combinarse en condiciones ex vitro. En algunos casos tiene importancia considerar una etapa previa (Etapa 0), que es la etapa de preparacin de los explantos para el establecimiento.

Etapa 0: Preparacin del material vegetal El empleo de explantos que se encuentran expuestos a bajos niveles de patgenos puede resolver el problema de la contaminacin por hongos y bacterias durante el establecimiento del cultivo in vitro. Los factores que influyen sobre la calidad del explanto son: 1) El tipo de rgano que sirve como explanto, 2) la edad ontognica y fisiolgica del mismo, 3) la estacin en la cual se colecta el material vegetal, 4) el tamao y 5) el estado sanitario general de la planta donante. La planta donante debe elegirse sobre la base de una seleccin masal positiva para las caractersticas agronmicas deseables. Una vez seleccionados los individuos, es preciso definir el tipo de explanto a establecer en condiciones in vitro. En general, los rganos jvenes o bien rejuvenecidos son los que tienen mejor respuesta en el establecimiento que los obtenidos a partir de materiales adultos. Se recomienda colectar explantos primarios a campo durante la estacin primaveral y estival, cuando existe una brotacin activa de las yemas, ya que el empleo de yemas en estado de dormicin ocasiona serios problemas de contaminacin. A fin de lograr explantos de ptima calidad es conveniente hacer crecer las plantas donantes por un tiempo mnimo en condiciones de invernculo. De esta forma es posible incidir directamente sobre el estado sanitario y la calidad de los explantos mediante el control de la intensidad lumnica, temperatura y reguladores de crecimiento. Para especies ornamentales tropicales y subtropicales se recomienda mantener las plantas donantes en condiciones de alta temperatura (25C) y baja humedad relativa (75%), a fin de reducir la proliferacin de patgenos. 163

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Los procesos morfognicos de floracin, dormicin y bulbificacin son controlados por el fotoperodo y la temperatura. Controlando estos factores tambin es posible obtener plantas donantes y explantos ms homogneos durante todo el ao. Pueden aplicarse adems pretratamientos con reguladores de crecimiento a las plantas donantes, as como tambin a los explantos mismos. En especies leosas suele utilizarse como pretratamiento la inmersin de los explantos primarios en soluciones con citocininas a fin de inducir la brotacin de yemas.

Etapa 1: Establecimiento del cultivo El objetivo de esta etapa es establecer cultivos viables y axnicos. El xito est determinado por la edad de la planta donante, la edad fisiolgica, el estado de desarrollo y el tamao del explanto. En esta etapa los principales procesos a controlar son la seleccin, el aislamiento y la esterilizacin de los explantos. Los materiales que demuestran tener mayor capacidad regenerativa son los obtenidos de tejidos meristemticos jvenes, sean yemas axilares o adventicias, embriones o semillas en plantas herbceas y aquellos tejidos meristemticos que determinan el crecimiento en grosor, como el cambium en las plantas leosas. En este sentido, es importante sealar que el empleo de yemas adventicias (tambin llamadas yemas formadas de novo) est asociado con una mayor probabilidad de ocurrencia de variantes somaclonales respecto de los sistemas de propagacin, basados en la regeneracin a partir de yemas axilares o embriones somticos. La obtencin de cultivos axnicos puede lograrse trabajando tanto sobre aspectos preventivos como curativos. Una accin preventiva la constituye el empleo de mtodos de verificacin de patgenos en los explantos. Esto puede realizarse mediante anlisis especficos para las enfermedades del cultivo, tales como DAS-ELISA o PCR, anlisis generales para patgenos cultivables como el empleo de medios de cultivo para el crecimiento de bacterias y hongos y mtodos especficos para la deteccin e identificacin de patgenos intracelulares como virus, viroides y bacterias. La realizacin de estos 164

anlisis directamente sobre las plantas donantes, previo establecimiento, presenta dos ventajas. En primer lugar, el empleo de tejidos maduros permite visualizar los sntomas ms marcados de la enfermedad; en segundo lugar, la carga de patgenos es mayor y por lo tanto la precisin del sistema de deteccin aumenta. Por otro lado, las plantas enfermas pueden tratarse con tcnicas adecuadas para la eliminacin de patgenos como la termoterapia, la quimioterapia a travs de la aplicacin de antibiticos, desinfectantes, antivirales y el cultivo de meristemas. La desinfeccin superficial incluye varios pasos: el lavado de los explantos con agua corriente, el empleo de etanol al 70% por 1 minuto, seguido de concentraciones variables de hipoclorito de sodio (0,5 a 1,5% de cloro activo) con unas gotas de tensoactivos para favorecer su penetracin y actividad. Posteriormente, los explantos deben ser enjuagados al menos tres veces con agua destilada estril. Algunos patgenos permanecen latentes y se expresan cuando son transferidos a un medio de cultivo nuevo. En general, estos patgenos incluyen los patgenos superficiales del material vegetal, los patgenos endgenos y los patgenos propios del manejo en laboratorio. En la Etapa 1 tambin pueden observarse infecciones por bacterias y hongos asociados a trips que sobreviven a los tratamientos de esterilizacin y por patgenos endgenos latentes dentro del sistema vascular, resultado de una esterilizacin inefectiva de los explantos. Estos patgenos latentes podran manejarse mediante el empleo de bacteriostticos o antibiticos en el medio de cultivo. El objetivo de esta etapa es mantener y aumentar la cantidad de brotes para los nuevos ciclos de multiplicacin sucesivos y poder destinar parte de ellos a la siguiente etapa de produccin (enraizamiento, bulbificacin, etc.). Es importante sealar que en esta etapa, cualquiera que sea la va de regeneracin empleada, es conveniente evitar la formacin de callo para disminuir el riesgo de variacin somaclonal. En esta etapa, los medios de cultivo, los reguladores de crecimiento como auxinas, citocininas y cido giberlico y las

Etapa 2: Multiplicacin

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condiciones de crecimiento juegan un papel implementacin a escala comercial. Los crtico sobre la multiplicacin clonal de los biorreactores son equipos que contienen explantos. aproximadamente 2 litros de medio de cultiAmbas vas de regeneracin, organog- vo lquido estril y donde los embriones nesis y embriognesis, pueden darse en for- somticos pueden regenerar y madurar a ma directa o indirecta. Esta ltima implica la partir de suspensiones celulares, sustentados formacin de callo. En general, la organo- por la circulacin permanente de nutrientes gnesis conduce a la produccin de vstagos y de aire (Fig.1). Hoy en da, el empleo de unipolares que enrazan en etapas sucesivas, biorreactores para la micropropagacin a gran mientras que por embriognesis somtica se escala est limitado por dos motivos crticos. forman embriones bipolares a travs de etapas ontognicas similares a la embriognesis cigtica. La organognesis puede darse por induccin de yemas axilares o adventicias. La induccin de yemas axilares comprende la multiplicacin de yemas preformadas, usualmente sin formacin de callo. La induccin de yemas adventicias comprende la induccin de tejido meristemtico localizado mediante un tratamiento con reguladores de crecimiento, conduciendo a la diferenciacin del primordio y desarrollo del vstago, esto ltimo generalmente en au- Figura 1: Embriognesis somtica en zanahoria. A partir de clulas del floema sencia del regulador de creci- se obtienen los embriones somticos que son un excelente sistema de miento que indujo la propagacin clonal. Los biorreactores permiten el cultivo a gran escala de los mismos.(Gentileza Dr. Miguel Pedro Guerra) organognesis. La principal desventaja del primer mtodo es que el nmero de yemas En primer lugar, el declinamiento de las lneas axilares por explanto limita la cantidad de celulares (clones) por efecto de la variacin vstagos. Esto se ve compensado, sin embar- somaclonal y segundo, por los altos costos go, por un aumento en la tasa de multiplica- asociados con la conversin de estos embriocin con los sucesivos subcultivos. La forma- nes somticos en plntulas. cin de yemas adventicias ofrece mayor poLas condiciones culturales en las cuales tencial para la produccin de vstagos, ya crece el explanto son el resultado de la que la induccin de vstagos ocurre en sitios interaccin de tres factores: el estado del distintos al de los meristemas. explanto o material vegetal, determinado en La embriognesis somtica es una va ms parte por el medio de cultivo, el recipiente conveniente porque permite saltar las eta- de cultivo y el ambiente externo o condiciopas de formacin de yemas y enraizamiento nes de crecimiento del cuarto de cultivo. La regenerando plantas en una forma mucho capacidad de respuesta de los explantos a ms rpida y eficiente, disminuyendo adems un mismo medio de cultivo cambia con el el riesgo de variacin somaclonal. A su vez, la nmero de subcultivos, el tipo de explanto disponibilidad de protocolos para la obten- subcultivado y el mtodo del repique. Por cin de embriones somticos es clave para la esto mismo, el medio de cultivo debe automatizacin de la micropropagacin y la optimizarse a fin de lograr la mayor tasa de consecuente reduccin de costos para su multiplicacin vegetativa. Comnmente se

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emplea como medio basal el medio MS completo sugerido por Murashige & Skoog (1962) suplementado con 3% de sacarosa como fuente de carbono. A este medio se le adicionan adems reguladores de crecimiento, tanto del tipo de auxinas como de citocininas. La etapa de multiplicacin generalmente comprende dos perodos, la fase de induccin y la fase de multiplicacin propiamente dicha. La primera implica, generalmente, el empleo de concentraciones elevadas de reguladores de crecimiento (generalmente de auxinas ms que citocininas) para favorecer la desdiferenciacin. La segunda etapa requiere del empleo de un balance hormonal adecuado para favorecer los procesos de diferenciacin y multiplicacin celular. En este caso, el sistema es ms dependiente de reguladores del tipo de las citocininas. En algunos casos, como ocurre en la formacin de embriones somticos, se requiere de una tercera y cuarta etapa, denominadas de maduracin y de germinacin respectivamente, cuya duracin vara entre 1 a 2 semanas. Para la etapa de maduracin se adiciona ABA (cido absccico) al medio basal en rangos de 5 a 20 micromolar, seguido del subcultivo a un medio basal conteniendo AG (cido giberlico) en concentraciones de 0,1-1 micromolar, cuyo fin es lograr la germinacin de los embriones obtenidos. Los tipos de auxinas (a) y citocininas (b) y los rangos de concentracin ms empleados se mencionan a continuacin: a) IBA (cido 3-indolbutrico): 0,1-2 M; 2,4-D (cido 2,4diclorofenoxiactico): 4-35 M; AIA (cido 3indolactico): 0,1-2 M ; ANA (cido naftalenactico): 1-5 M; y, picloram: 1-10 M; b) BA (N6-benciladenina): 1-20 M; CIN (cinetina): 0,1-1 M; ZEA (zeatina): 1-10 M; 2ip (isopentiladenina): 1-5 M ; y, TDZ (tidizuron): 0,01-1 M. Los tipos de reguladores, sus combinaciones y rangos de concentraciones deben ser optimizados para cada especie, genotipo y etapa de multiplicacin determinada. Los cultivos se incuban en luz a 272 C con 14 horas de fotoperodo e intensidad lumnica moderada (100 mol m-2 s-1). La presencia de compuestos fenlicos oxidados se encuentra asociada con tejidos vegetales sometidos a situaciones de estrs, tales como aquel provocado por el dao mecnico producido durante el aislamiento del explanto de la planta madre. Estos compuestos se encuentran en ge-

neral en las plantas en estado reducido y el ataque de patgenos producira su oxidacin y liberacin. Esto inhibira el crecimiento de los mismos, daando, indirectamente, a los explantos. Estas sustancias (quinonas, fitoalexinas y protectores de auxinas) son muy lbiles y fcilmente oxidables. Por esto mismo, durante el establecimiento y multiplicacin in vitro es necesario emplear estrategias tendientes a disminuir el estrs de las plantas y limitar al mnimo la produccin y oxidacin de los compuestos fenlicos. Para ello se emplean agentes absorbentes de fenoles en el medio de cultivo, tales como el carbn activado y la polivinilpirrolidona o antioxidantes como el cido ascrbico, la modificacin del potencial redox con agentes reductores, la inactivacin de las fenoloxidasas con agentes quelantes o la reduccin de su actividad o afinidad por el sustrato utilizando un bajo pH, o bien cultivando in vitro en condiciones de oscuridad. Es recomendable adems lograr que la tasa de intercambio gaseoso entre los ambientes del recipiente y externo sea ptima, evitndose la acumulacin de CO 2 y de etileno. En este sentido, el sellado del recipiente es importante, el intercambio gaseoso es ms limitado con el empleo de una tapa de plstico que con un film de polietileno extensible. La utilizacin de una tapa perforada con tapn de gomaespuma es altamente recomendable (Fig. 2). Los principales problemas que pueden presentarse durante los sucesivos subcultivos in vitro son la vitrificacin y la produccin de compuestos fenlicos por los explantos. La vitrificacin consiste en un proceso de morfognesis anormal con cambios anatmicos, morfolgicos y fisiolgicos que producen hojas de una apariencia vidriosa. Este fenmeno est regulado por dos factores clave que son la humedad relativa y el potencial agua, y afecta a dos procesos fisiolgicos fundamentales: la fotosntesis y la transpiracin. Debido a la disfuncin metablica asociada, las plantas se vuelven hetertrofas y transpiran excesivamente debido a un mal funcionamiento estomtico y a cambios estructurales en las paredes celulares. La principal consecuencia de la vitrificacin es la baja supervivencia de las plntulas obtenida du-

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Figura 2: Plantas de tabaco creciendo in vitro en un recipiente de vidrio con tapa metlica perforada y tapn de gomaespuma, que evita la acumulacin de CO2, etileno y excesiva humedad en el ambiente de cultivo.

rante la aclimatacin ex vitro. Por ello, es fundamental conocer el rol de los distintos factores que inciden negativamente sobre el desarrollo morfognico normal (auttrofo) in vitro. Estos factores son el ambiente de cultivo, los componentes orgnicos e inorgnicos del medio, los reguladores de crecimiento, la luz y la temperatura. Una baja humedad relativa, elevada irradiacin, la remocin de la fuente de carbohidratos del medio de cultivo y la defoliacin de las plantas para estimular la formacin de hojas nuevas estimulan la fotosntesis y otras actividades metablicas de las hojas en forma normal. Otras estrategias para lograr un ptimo crecimiento implican el empleo de retardantes del crecimiento para estimular la formacin de hojas nuevas despus del transplante. O bien, el empleo de altos niveles de CO2 (antagonista del etileno) para estabilizar la va de lignificacin y prevenir la vitrificacin a travs de la inhibicin de la hiperhidratacin, la hipolignificacin y la formacin de aernquima. En esta etapa se produce la formacin de races adventicias. En las especies herbceas es relativamente fcil mientras que en las

Etapa 3: Enraizamiento y aclimatacin

especies leosas es complicado por su limitada capacidad rizognica. El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso pueden emplearse varios tipos de sustratos y reguladores de crecimiento (auxinas) para promover la rizognesis. Los sustratos incluyen: medio solidificado con agar, perlita y/o vermiculita humedecidas con medio nutritivo o agua. En un medio solidificado con agar, los nutrientes se reducen de 1/2 a 1/4 de la composicin original, y la sacarosa se reduce a una concentracin final de 1-2%. Medios con baja concentracin salina, como el WPM (Lloyd & Mccown, 1980) y GD (Gresshoff & Doy, 1972), incrementan el porcentaje de enraizamiento de vstagos axilares en plantas latifoliadas. El empleo de agar presenta ventajas y desventajas sobre la rizognesis. Por un lado, el enraizamiento de especies forestales en agar se favorecera al producirse una rizognesis ms sincrnica como resultado del contacto ntimo de las estacas con el medio de cultivo. Sin embargo, las races producidas por este mtodo son usualmente delgadas y no se forman races cabellera. Adicionalmente, el empleo de agar est asociado con la formacin de callo en la base de las estacas, que conduce al establecimiento de conexiones vasculares interrumpidas entre races y vstagos. Comnmente, a fin de proceder a su enraizamiento, los vstagos de buen tamao provenientes de la etapa de multiplicacin y provistos de al menos 4-5 yemas, se colocan durante perodos cortos en soluciones con concentraciones elevadas de auxinas. La auxina ms utilizada es el IBA (cido 3indolbutrico), que puede utilizarse a concentraciones de 1-10 M durante pocas horas. Alternativamente se pueden emplear niveles ms bajos de auxinas (0.1 a 1M ), pero manteniendo la induccin por un perodo ms prolongado (3 a 7 das). Luego los vstagos se transfieren a un medio de cultivo basal desprovisto de reguladores de crecimiento para permitir el desarrollo de las races. Aproximadamente 20 das despus del tratamiento de induccin es posible la obtencin de una adecuada cantidad de races funcionales que permitan continuar hacia la etapa de aclimatacin. Es importante acentuar que el uso de

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auxinas a elevadas concentraciones es contraproducente porque induce la formacin de callo en la base de las estacas. Por ello, para cada cultivo es necesario optimizar un protocolo de rizognesis que minimice la formacin de callo y maximice la tasa de rizognesis y supervivencia de las plantas. El enraizamiento ex vitro permite que el enraizamiento y aclimatacin se logren simultneamente y que raramente se forme callo en la base de las estacas, asegurando as una conexin vascular continua entre el vstago y la raz. Sin embargo, el estrs asociado a la evapotranspiracin acelerada de las plantas durante las etapas iniciales del trasplante puede reducir considerablemente la tasa de supervivencia. Por ello, es conveniente contar con instalaciones de invernadero o cmaras de crecimiento adecuadas para brindar temperatura y humedad relativa moderadas, que permitan lograr la rusticacin de las plantas en forma progresiva. Bajo condiciones ex vitro se utilizan diferentes sustratos, mezclas de tierra y arena y/o abonos, los cuales conviene que estn debidamente esterilizados. 3 Propagacin de especies leosas El empleo de clones en programas de reforestacin genera al menos un 10 % de incremento en ganancia gentica en relacin con el empleo de plantas regeneradas por semillas de rboles selectos. Sin embargo, la mxima ganancia gentica puede ser obtenida mediante el empleo conjunto de propagacin sexual y agmica. La reproduccin sexual es importante para la introduccin de genes nuevos, prevenir los efectos de la endogamia y el mejoramiento de caractersticas controladas por efectos aditivos de genes. La reproduccin asexual, por otro lado, permite la multiplicacin de individuos o grupos de individuos seleccionados de una poblacin lite, que exhiben una significativa ganancia gentica debida a efectos no aditivos de genes. Tradicionalmente, las especies forestales fueron propagadas vegetativamente mediante el enraizamiento de estacas, de braquiblastos en conferas, as como tambin por injertos. La propagacin por estacas de Cryptomeria japonica (kiri), Populus (lamo) y Salix (sauce) ha sido llevada a cabo duran-

te siglos en Asia y Europa. Sin embargo, para la mayora de los rboles propagados por estacas se observa una rpida prdida de capacidad de rizognesis al aumentar la edad de la planta donante de las estacas. En este sentido, una de las principales ventajas de la micropropagacin es la capacidad potencial de desarrollar protocolos de multiplicacin optimizados para multiplicar rboles adultos que han demostrado ser fenotpicamente superiores. 3.1 Mtodos de Micropropagacin Los trabajos pioneros en el cultivo de tejidos cambiales de especies forestales condujeron, en el ao 1940, a la formacin de yemas adventicias en Ulmus campestris. Durante la dcada del 40 se publicaron logros adicionales en al produccin separada de vstagos y races en especies latifoliadas. En 1950 se public por primera vez la obtencin de organognesis en conferas, con la formacin de vstagos a partir de callos de Sequoia sempervirens. En la dcada 1970-80 se obtuvieron las primeras plantas de lamo (Populus tremuloides) y Pinus palustris. En ambos casos la formacin de plntulas se logr va organognesis. Luego del ao 1975 la micropropagacin de especies latifoliadas se realiz a travs de la regeneracin indirecta, pasando por una etapa de callo. Actualmente, la multiplicacin in vitro de conferas y latifoliadas se logra a travs de tres vas, 1) brotacin de yemas adventicias, 2) produccin de yemas adventicias y 3) embriognesis somtica. La brotacin de yemas adventicias emplea pices de vstagos, yemas laterales y microestacas. Es el principal mtodo utilizado para especies latifoliadas. En las conferas, la elongacin de las yemas axilares a partir de braquiblastos de plantas adultas no ha sido muy exitosa. En latifoliadas de clima templado los mejores explantos los constituyen las yemas y vstagos en activo crecimiento ms que las yemas en estado de dormicin. Los vstagos se colectan en primavera y a principios del verano a fin de obtener material con reducido nivel de contaminacin. Alternativamente, las yemas en dormicin pueden ser colectadas y brotadas en condiciones ambientales controladas.

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Para la induccin de vstagos, tanto en gimnospermas como en angiospermas, se requiere el empleo de citocininas. Las ms usadas son la N6-benciladenina (BA) y el tidiazurn (TDZ). Los medios basales ms usados para angiospermas son el MS (Murashige & Skoog, 1962) o el WPM (Lloyd & Mccown, 1980). Para el caso de gimnospermas, el empleo de medios reducidos en sales minerales y baja cantidad de nitrgeno resulta mucho mejor que el empleo de un medio altamente salino y nitrogenado como el MS. La induccin de yemas adventicias es el mtodo ms empleado para gimnospermas y angiospermas. En este caso, las yemas se inducen directamente sobre el explanto en general sin previo pasaje por una etapa de callo. En general, cuanto ms joven es el tejido, tanto mayor es la respuesta a los tratamientos que conducen a la organognesis de novo. Los explantos ms frecuentes son embriones cigticos maduros, seguidos de cotiledones y epictilos de plntulas. Generalmente se utiliza BA a concentraciones mayores o iguales a 5 ppm como nica fuente de induccin o en combinacin con otras citocininas. La adicin de auxinas puede ser beneficiosa, aunque en conferas se ha encontrado que promueve la formacin de callo y reduce el proceso de organognesis. En algunos casos, como en Populus spp., la formacin de yemas adventicias se logra a partir de un callo originado a partir de tejido cambial. El mtodo llamado multiplicacin mediante ndulos meristemticos es un mtodo tambin utilizado para pino radiata y lamo. En este caso se obtiene bsicamente un tejido meristemtico (no un verdadero callo) usando relaciones altas de auxina/citocinina para luego inducir la produccin de vstagos. La disponibilidad de protocolos va embriognesis somtica para especies forestales es an limitada. En las angiospermas los primeros embriones somticos se obtuvieron de Santalum album, donde sin embargo no fue posible la obtencin de plantas completas. Veinte aos despus pudieron lograrse plantas completas de abeto (Picea abies ), una gimnosperma. En las gimnospermas los mayores xitos se lograron empleando como explantos embriones cigticos maduros e

inmaduros. En la mayora de los casos los embriones se originan en forma indirecta a partir de callos embriognicos o bien, directamente, desde el explanto. En las conferas puede ocurrir un proceso de poliembriona, previa formacin de callo que conduce a una alta tasa de multiplicacin inicial. En general, los medios de cultivo ms efectivos para estos fines contienen elevados niveles de sales y suministran nitrgeno tanto como NH4+ y NO3-. Las auxinas ms comnmente empleadas en el medio de induccin son el 2,4-D (cido 2,4-diclorofenoxiactico) y el ANA (cido naftalenactico), en concentraciones mayores de 2 M. En algunos casos es necesario adems el empleo de alguna citocinina, generalmente en concentraciones mayores a 1 M si se trata de BA y entre 0,1-1 M en el caso del TDZ. 3.2 Condiciones de cultivo Los explantos jvenes de especies leosas, particularmente angiospermas, a menudo secretan al medio de cultivo polifenoles oxidados, visibles como pigmentos marrones y/o negros. Se observa tambin que en los explantos de rboles adultos el problema se acenta. Por ello se recomienda el empleo de explantos primarios juveniles. Los tipos de explantos ms utilizados para el establecimiento in vitro son los segmentos nodales de explantos juveniles, las yemas axilares obtenidas por rejuvenecimiento de plantas adultas, y los embriones cigticos y plntulas obtenidas de semillas de origen sexual. La desinfeccin de los mismos se logra mediante inmersin en etanol al 70 % (1 a 2 minutos) seguido de una solucin de lavandina comercial conteniendo de 0,8 a 2,4 % de hipoclorito de sodio durante 5-30 minutos. En la mayora de los casos se emplean agentes tensoactivos, tales como Tritn y Tween20 , adicionados en la solucin de lavandina. En todos los casos los explantos son lavados finalmente varias veces con agua destilada estril. Los medios basales ms empleados son el MS, formulado por Murashige & Skoog (1962), diludo a la mitad o a un cuarto de su formulacin original o el WPM, formulado por Lloyd & McCown (1981). Como medios de

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blanco y negro

Figura 3: Etapas de la micropropagacin en plantas de paraso gigante, Melia azedarach var. gigantea L. (Olmos et al., 2002): A) Huerto semillero de paraso gigante con ejemplares de seis aos de edad, provincia de Misiones, Danzer Forestacin S.A. Las semillas de los genotipos seleccionados fueron empleadas para generar una poblacin de plantas donantes de explantos. B) Etapa 0, Preparacin del material vegetal: plantas de origen sexual de 6 meses de edad crecidas en condiciones de invernadero y utilizadas como donantes de meristemas. C) Etapa 1: Establecimiento del cultivo: vstagos desarrollados a partir de meristemas luego de 30 das sobre medio de establecimiento (Medio basal de Murashige y Skoog, 1962 (MS) suplementado con 2,22 M 6-bencil amino-purina (BAP) + 0,29 M cido giberlico (GA3) + 0,25 M cido 3-indolbutrico (IBA). D) Etapa de Multiplicacin: vstagos luego de 30 das sobre medio de multiplicacin (medio MS suplementado con 2,22 M BAP, estos vstagos fueron empleados como explantos para los subcultivos siguientes o para pasar a la etapa de enraizamiento. E) Explantos provenientes de la etapa de multiplicacin con problemas de vitrificacin y presencia de callo. En estos casos, el medio de multiplicacin para los cultivos subsiguientes fue modificado reduciendo la concentracin de BAP a 0,44 M. F) Vstago enraizado en medio de MS con la concentracin salina reducida a la mitad, suplementado con 9,89 M IBA durante 2 das, seguido por el subcultivo en medio basal durante 30 das hasta estar listo para pasar a la etapa de aclimatacin.

multiplicacin se emplean adems el BTM (broadleaved tree medium, Chalupa, 1983) y el medio de Prinet y Lalonde (1983). Los reguladores de crecimiento ms utilizados son el cido naftale-nactico (ANA) y la benciladenina (BA). Tambin han sido efectivas auxinas como el cido indol-butrico (IBA) y el cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) y citocininas como la 2- isopentil amino purina (2iP), cinetina (CIN), zeatina (Z) y tidiazurn (TDZ). En general, los cultivos se incuban a 272 C con 14 horas de fotoperodo e intensida-

des lum-nicas moderadas. En la Fig. 3 se muestran las etapas de la micropropagacin de plantas de paraso gigante, Melia azedarach var. gigantea L. (Olmos et al., 2002). 3.3 Problemas asociados a la micropropagacin de especie leosas Es mucho ms difcil propagar material adulto que juvenil ya que los primeros son recalcitrantes, es decir, difciles de regenerar. Sin embargo, an en estos casos es posible

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extraer ex-plantos de mayor capacidad regenerativa mediante dos formas: 1) seleccionando los tejidos ms juveniles dentro de un rbol o 2) induciendo el rejuvenecimiento del rbol donante antes de aislar los explantos. Para seleccionar el material ms juvenil en una planta adulta hay que considerar el fenmeno de topfisis. Este es un proceso por el cual el tipo de crecimiento de un nuevo individuo est determinado por la posicin que ocupaba en la planta adulta. Esto es ocasionado por efecto del envejecimiento fisiolgico e implica que los explantos ms reactivos in vitro se encuentran en las yemas de las reas basales del tronco y races. A su vez, el rejuvenecimiento es un proceso de reversin temporaria de las caractersticas adultas que permite lograr material vegetal en estado de juvenilidad. En general, a fin de contrarrestar los efectos debidos a la topfisis, se recomienda emplear tejidos juveniles y un tamao de explanto muy pequeo. La juvenilidad puede lograrse por dos mtodos. En primer lugar, mediante el empleo de rganos juveniles separados de plantas adultas, la utilizacin de estacas enraizadas o bien de brotes epicrmicos. En segundo lugar, mediante el rejuvenecimiento de partes adultas, la iniciacin de yemas adventicias y embriones (en este caso se logra un rejuvenecimiento total por el inicio de un nuevo ciclo ontognico), del injerto de yemas adultas sobre pies juveniles, de tratamientos con reguladores de crecimiento (como citocininas como el BA), por la poda severa (recepado de rboles adultos) y a travs del cultivo in vitro de meristemas. Tanto los atributos de supervivencia a campo, como la tasa de crecimiento, el plagiotropismo y la susceptibilidad a enfermedades de las plantas, tienen una correlacin directa con la calidad de los vstagos durante el cultivo in vitro. Un problema crucial a resolver en cada sistema de propagacin es la calidad diferencial de las races de las plantas regeneradas en relacin con aquellas obtenidas por semillas. Por ejemplo, las plantas regeneradas de Pinus elliotti suelen tener una raz principal no ramificada y gruesa. En cambio, las plantas obtenidas a travs de semillas tienen races ms delgadas y de

mayor crecimiento lateral que permiten comparativamente un mejor anclaje y una mayor resistencia a los vientos. 4 Propagacin de especies herbceas La micropropagacin de especies herbceas est orientada a proveer material libre de patgenos, propagar material seleccionado por su mayor rendimiento o por su mayor resistencia a enfermedades y estreses ambientales, conservar la diversidad especfica en bancos de germoplasma, obtener material para estudios fisiolgicos y genticos y sentar las bases para la aplicacin de tcnicas de ingeniera gentica. Existe una gran variedad de protocolos, desarrollados en funcin de la especie y de los objetivos de la propagacin. Existen protocolos generales para monocotiledneas como en el caso ciertos cereales (trigo, maz, cebada, avena, arroz), pasturas (pasto bermuda, festuca alta, raigrs, pasto llorn) y hortcolas (cebolla, ajo, puerro); protocolos generales para dicotiledneas que incluyen especies hortcolas (tomate, papa, pimiento y zanahoria) y leguminosas forrajeras (alfalfa, man, trbol blanco) y protocolos para especies modelo como Arabidopsis y tabaco. En todos los casos, las formas de propagacin son las mismas. Se emplean vas de regeneracin por formacin de yemas axilares, yemas adventicias y embriognesis somtica. En los dos primeros casos, el sistema de propagacin a travs de la organognesis directa asegura la estabilidad gentica de las plantas regeneradas y se emplean cuando el objetivo es la propagacin clonal a gran escala. La embriognesis u organognesis indirecta, con formacin de callo, se emplea en cambio para generar variabilidad en programas de mejoramiento. En el caso de ajo y cebolla, por ejemplo, las etapas de la micropropagacin incluyen tanto la multiplicacin de yemas axilares por el cultivo de meristemas, la formacin directa de yemas adventicias en explantos obtenidos a partir de placas basales o umbelas inmaduras y la formacin indirecta de yemas adventicias y/o embriones somticos obtenidos a partir de callos que provienen de distintos tipos de explantos (meristemas, bro-

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tes, placa basal races). En el caso de alfalfa y otras leguminosas como soja y man, la micropropagacin es llevada a cabo por la va de la embriognesis somtica, donde los embriones se obtienen utilizando tejidos juveniles (embriones, cotiledones y pecolos) como explantos. En algunos casos como pasto llorn (Eragrostis curvula) es posible la regeneracin de plantas mediante embriognesis, organognesis y regeneracin directa a partir de los explantos. 5 Lecturas Recomendadas
CASO, O. H. 1992. Juvenilidad, rejuvenecimiento y propagacin vegetativa de las especies leosas. Agriscientia 9 (1): 5-16. CHALUPA, V. 1983. Micropropagation of conifer and brodleaved forest trees. Communicationes Instituti Forestalis Cechosloveniae 13: 7-39. DEBERGH PC; PE READ, 1993. Micropropagation. En Micropropagation. Debergh PC y Zimmerman RH eds, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands: 1-13. EVANS, D.A.; SHARP, W.R.; BRAVO, J.E. 1984. Cell culture methods for crop improvement. Handbook of Plant Cell Culture 2: 47-68. KLOPFENSTEIN, N.B.; KERL, J.G. 1995. The potential of biotechnology in temperate agroforestry practices. In:

Agroforestry systems 32. Kluwer Academic Publishers. Netherlands: 29-44. LLOYD, G.; B. MCCOWN. 1981. Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, Kolmia latifolia, by use of shoot tip culture. Combined Proceedings International Plant Propagator Society 30: 421-427. MURASHIGE, T.; SKOOG, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497. PRINET, P.; M. LALONDE. 1983. In vitro propagation and nodulation of the actinorhizal host plant Alnus glutinosa (L.) Gaertn. Plant Science Letters 29: 9-17. SCHENK, R.U.; HILDEBRANDT, A.C. 1972. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Can J Bot 50:199-204. THORPE, T.A.; HARRY, I.S.; KUMAR, P.P. 1991. Application of micropropagation to forestry. En Micropropagation. Debergh PC y Zimmerman RH eds, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands: 311-336. ZIV M, 1993. Vitrification: morphological and physiological disorders of in vitro plants. En Micropropagation. Debergh PC y Zimmerman RH eds, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands: 45-92.

172

OLMOS, Sofa; LUCIANI, Gabriela; GALDEANO, Ernestina

V.-Captulo 2
Semilla sinttica
Rey, Hebe Y.; Mroginski, Luis A. 1 Concepto Resulta difcil determinar como se origin la idea de producir semillas sintticas o artificiales. Estas son el resultado de la aplicacin en agricultura del fenmeno de embriognesis somtica, descripto por primera vez en 1958 por Jakob Reinert y F.C.Steward y colaboradores. Sin embargo, un gran propulsor de su utilizacin para la propagacin a gran escala de plantas fue Toshio Murashige, quien en un simposio realizado en 1977 en Ghent (Blgica) present formalmente la idea de la produccin de las semillas sintticas, entendiendo como tal a un simple embrin somtico encapsulado. Esta semilla se diferencia de la semilla verdadera en que el embrin es somtico (producido por el fenmeno conocido como embriognesis somtica) y no cigtico, y que si tiene endosperma y cubierta, stos son artificiales (Fig.1 a y b). Esta semilla, puesta en condiciones adecuadas, germina (Fig.1 c) y se convierte en una planta (Fig.1 d). Muchos grupos de investigacin han contribuido al desarrollo de tales semillas. Entre ellos se deben destacar el grupo liderado por Keith Walker de la Compaa Monsanto, quien a partir de mediados de la dcada que va de 1970 a 1980 trabaj especialmente con alfalfa. Tambin hay que mencionar la labor de Robert Lawrence de la Union Carbide, quienes comenzaron los trabajos con especies forestales, lechuga y apio. Otros investigadores como Drew, Kitto y Janick realizaron sus trabajos con zanahoria. El aporte del grupo liderado por Keith Redenbaugh de la Plant Genetic Inc. fue muy importante, especialmente por su descubrimiento de que hidrogeles como el alginato de sodio podan utilizarse para producir semillas artificiales que podan germinar en condiciones de invernadero. Existe otro tipo de semilla sinttica, diferente del definido ms arriba, donde, en lu-

Figura 1: a) Partes de una semilla sinttica. b, c y d) Obtencin de plantas de Arachis pintoi (2n=3x=30) mediante semillas sintticas (las barras verticales indican 3 mm).

gar de encapsular embriones somticos se encapsulan yemas. Este tipo de semillas sintticas de una utilizacin muy restringida no ser tratado en este captulo. 2 Tipos de semillas sintticas Las semillas sintticas pueden fabricarse de diferentes maneras (Fig. 2). Bsicamente pueden utilizarse embriones hidratados, tal como resultan del proceso de embriognesis somtica, o bien pueden ser desecados. En algunos casos estos embriones estn protegidos por cubiertas protectoras. De esta manera se pueden distinguir 5 tipos bsicos de semillas sintticas: 1) Semillas sintticas con embriones desecados sin cubierta (Tipo 1, Fig. 2). Se

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

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de los embriones somticos tal como resultan del proceso de embriognesis somtica, sin ningn tipo de cubierta protectora. Este sistema ha sido desechado en la prctica por la escasa conversin de embriones en plantas. 4) Semillas sintticas con embriones somticos hidratados suspendidos en un gel viscoso (fluid drilling)(Tipo 4, Tabla 1: Ejemplos de semillas sintticas basadas en la desecacin de Fig. 2). Inicialmente fue desarrollaembriones sin cubierta protectora. do en zanahoria y ms recientemente en batata; consiste en la Especie % humedad en la semilla % conversin en plantas inclusin de varios embriones en Apium graveolens 10-13 35-85 una especie de tubo que contieDactylis glomerata 13 5-30 Medicago sativa 8-20 33-95 ne un gel viscoso. 5) Semillas sintticas con dad de este tipo de embriones por un ao, embriones somticos hidratados y provisaproximadamente, en condiciones de labo- tos de una cubierta protectora (Tipo 5, Fig. 2). Es el sistema ms usado. Por esta razn, ratorio. 2) Semillas sintticas con embriones de aqu en adelante, cuando se mencione somticos desecados y provistos de cubier- semilla sinttica se referir a este tipo. Tieta protectora (Tipo 2, Fig. 2). Esta tcnica ha ne la ventaja de que los embriones no estn sido utilizada en zanahoria y apio, donde los sujetos a la desecacin, que constituye la prinembriones fueron recubiertos con cipal causa de los bajos valores de conversin polyoxietileno y luego desecados. Los resul- en plantas. Si bien se han ensayado numetados han mostrado que es factible lograr rosas sustancias para encapsular a los embriouna buena supervivencia de stos; sin embar- nes somticos (agar, gelrite, gomas), una de go, la conversin en plantas es realmente la tcnicas ms utilizadas consiste en lograr la formacin de una cubierta protectora de baja. 3) Semillas sintticas con embriones alginato de calcio, compuesto que no es txihidratados sin cubierta (Tipo 3, Fig. 2). Es el co para el embrin y permite una rpida sistema ms simple; consiste en la utilizacin encapsulacin. El proceso es muy simple y consiste bsicamente en sumergir a los embriones somticos en una solucin de Explante alginato de sodio al 2%, pasndolos luego a una solucin acomplejante de, por Cultivo e induccin de la ejemplo, 100 mM de Ca (NO3)2 (Fig. 3). embriognesis somtica Con esta tcnica se genera una semilla sinttica consistente en un embrin somtico recubierto con una cubierta Embriones somticos seminal y provisto de un endosperma artificial (Fig.1 a y b). Eventualmente esDesecados tas cpsulas pueden ser recubiertas por Hidratados sustancias tales como polioxieti-lenglicol, que sirve para mantener una adecuada Gel Viscoso Encapsula do hidratacin de las cpsulas y embriones. Encapsulado Este procedimiento ha posibilitado la obtencin de semillas sintticas de nu1 2 3 4 5 merosas especies de inters econmico, entre las que pueden mencionarse alfalSiembra en el suelo fa, zanahoria, apio y especies forestales como Picea abies, Pinus radiata , Figura 2: Tipos de semillas sintticas. Santalum album y Pseudotsuga trata de un sistema muy simple donde los embriones son desecados hasta alcanzar porcentajes de humedad del 8 al 20% y no estn provistos de ningn tipo de cubierta protectora. En el caso de alfalfa, embriones sometidos a la desecacin mostraron porcentajes de conversin en plantas de hasta el 95% (Tabla 1). Es posible mantener la viabili-

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REY, Hebe Y.; MROGINSKI, Luis A.

tores que regulan la embriognesis somtica. Sin embargo, en muchos casos, la base A B C D gentica de este fenmeno no est completamente dilucidado. En alI E falfa es un carcter hereF H G dable, codificado por dos genes dominantes de segregacin independiente. Una vez inducida la ) seleccin de embriones somticos, F) embriognesis Figura 3: A-D) Induccin de la embriognesis somtica,E) inmersin de los embriones en alginato de sodio,G) acomplejamiento con nitrato de calcio, H) somtica, el lavado, I) semilla sinttica (i) segundo menziesii. 3 Produccin de semillas sintticas En la Fig.4 se esquematizan 6 aspectos que deben tenerse en cuenta para la produccin y manipulacin de las semillas sintticas. En primera instancia es necesario contar con un sistema eficiente de induccin de embriognesis somtica in vitro, es decir, la produccin de embriones sin la necesidad de la fusin de gametas. Estos embriones deben ser estructuras bipolares perfectas (con un polo que genere el vstago y el otro la raz) capaces de convertirse (germinar) en plantas enteras (ver II.-2). Si bien la existencia de embriognesis somtica ha sido informada en centenares de especies de angiospermas y gimnospermas, en muchos casos no es de utilidad para iniciar la produccin de semillas sintticas debido a la baja tasa de produccin de embriones aptos para la encapsulacin. En los ltimos aos se han hecho notables avances en el conocimiento de los facInduccin de la embriognesis somtica

Produccin sincronizada y en gran escala de los embriones somticos

Maduracin de los embriones somticos

Encapsulamiento mecanizado

Almacenamiento de las semillas sintticas

Siembra en invernadero o a campo


Figura 4: Etapas en la produccin de las semillas sintticas.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

175

paso consiste en lograr una produccin sincronizada, a gran escala, de los embriones. Es fundamental contar con embriones simples, en estado cotiledonar, que no se fusionen entre s y que no generen embriones secundarios. A fin de seccionarlos se han desarrollado diferentes procedimientos basados en filtros y equipos clasificadores automticos. Para la produccin a gran escala se han diseado biorreactores y sistemas mecanizados de encapsulamiento adaptados a las particularidades de cada especie. Gran parte de la investigacin se halla centrada en lograr una adecuada maduracin de los embriones, que es un factor esencial para la obtencin de altos valores de conversin en el suelo. En alfalfa se ha demostrado la necesidad del empleo de tratamientos con cido abscsico, maltosa y de pretratamientos con temperaturas bajas (4C). El almacenamiento de las semillas sintticas es otro aspecto importante a tener en cuenta. Lo ideal sera que las semillas sintticas tuvieran un comportamiento similar al de la mayora de las semillas verdaderas y permanecieran viables por mucho tiempo. Los resultados obtenidos con semillas sintticas de muchas especies muestran que an hay que trabajar arduamente para que ello ocurra. La criopreservacin con nitrgeno lquido (ver V.3) podra resolver este punto. Por ltimo, si bien muchos factores inciden negativamente para que ello ocurra, lo ideal sera que la semilla sinttica fuera sembrada directamente en el suelo, rindiendo elevados porcentajes de conversin en plantas. Actualmente, en la mayora de los casos, las semillas sintticas son sembradas primeramente en cmaras climatizadas o en invernaderos para luego ser llevadas al campo. 4 Calidad de la semilla sinttica Otro aspecto de gran importancia tecnolgica es el contar con semillas sintticas que, adems de no generar variantes somaclonales, tengan un alto porcentaje de conversin en plantas cuando stas son sembradas en el suelo. Este aspecto se ve afectado por varios factores, entre los que figuran el tipo de embrin, la calidad del endosperma sinttico, la dureza de la cpsula y la proteccin

contra agentes patgenos. Generalmente, la carencia de embriones de calidad es el factor limitante para la produccin de semillas sintticas. Los mismos deben poder generarse rpidamente, en grandes cantidades, sin fusionarse entre s ni formar callos. Deben desarrollarse de manera sincronizada y convertirse rpidamente en plantas. Es adems altamente deseable que conserven su viabilidad por largo tiempo en condiciones de laboratorio o preservados en refrigeradores comerciales. El endosperma sinttico tiene que proteger y nutrir al embrin hasta que germine y pueda crecer autotrficamente. En este punto es preciso recordar que si bien los embriones somticos son muy similares a los embriones cigticos, carecen de las sustancias de reserva necesarias para su conversin en plntulas. El endosperma sinttico generalmente est compuesto de los mismos medios de cultivo que se usan para inducir la germinacin in vitro de los embriones. Estos medios contienen macro y micronutrientes, vitaminas, sacarosa y sustancias reguladoras de crecimiento. La composicin de este endosperma lo hace susceptible al ataque de patgenos, por lo que tambin se incorporan compuestos de accin fungicida y bactericida. Es comn el agregado de 1-5 mg/ L de benomyl y de algunos antibiticos como cefotaxina o ampicilina. La dureza de la cpsula puede afectar, por accin mecnica o por dificultar la respiracin, la conversin de los embriones en plantas. En general, la dureza debe ser del orden de 0,2 y 2 Kg/cm2 de presin, y puede obtenerse mediante una adecuada manipulacin de la concentracin de alginato y de los tiempos de la reaccin de acomplejamiento. 5 Ventajas del empleo de semillas sintticas La mayora de las plantas de inters econmico son propagadas mediante semillas verdaderas. Estas constituyen excelentes propgulos que pueden ser producidos a bajo costo, en forma rpida, y pueden ser sembrados mecnicamente. Adems, la mayora de ellas pueden ser conservadas fcilmente por mucho tiempo. Sin embargo, existen muchas plantas que no se propagan median-

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te semillas verdaderas y lo hacen a travs de sus partes vegetativas, como es el caso, entre otras, de la caa de azcar, mandioca, ajo, frutilla, papa, batata, varios rboles y plantas ornamentales. Otras especies tienen semillas de baja calidad (muchas conferas) o presentan dificultades para la germinacin (como, por ejemplo, la yerba mate). En otras un alto grado de heterocigosis hace que las poblaciones derivadas de semillas sean muy heterogneas (t, yerba mate, paraso), lo que hace muy recomendable su propagacin asexual. Tambin es el caso de muchos hbridos y de plantas que no producen semillas verdaderas o bien el caso de ciertas plantas transgnicas. En todas estas situaciones el uso de semillas sintticas resultara ventajoso. Las plantas podrn ser clonadas y sembradas en el campo utilizando sembradoras similares a las que hoy se emplean con las

semillas verdaderas. Adicionalmente las semillas sintticas podrn actuar como transportadoras de reguladores de crecimiento, microorganismos y pesticidas que se quieran incorporar durante la siembra. De esta manera, los costos de los transplantes se vern reducidos, las poblaciones sern genticamente uniformes y podrn ser comercializados ciertos hbridos resultantes de costosas manipulaciones manuales. En la Tabla 2 se sealan algunas especies para las cuales sera necesario contar con un sistema de semilla sinttica. La falta de una difusin masiva de esta tecnologa en la actualidad obedece a razones tcnicas, ya que en muchas especies an no se ha logrado inducir eficientes sistemas que permitan la generacin de grandes cantidades de embriones somticos de calidad, y econmicas. Los clculos realizados en rela-

Tabla 2. Necesidad de contar con semillas sintticas en algunas plantas leosas subtropicales de inters para la Argentina y estado actual de su desarrollo.

Especie

Estado de desarrollo Estado de Inters en contar con de la induccin de la desarrollo de la semillas sintticas Embriognesis produccin de la Somtica semilla sinttic a XXX X ---

Agua (Chrysophyllum gonocarpum ) Araucarias (Araucaria spp.) Algarrobo (Prosopis spp) Ctricos * (Citrus spp.) Eucaliptos* (Eucalyptus spp.) Mango (Mangifera indica) Paraso (Melia azedarach) Pinos* (Pinus spp.) Quebracho (Schinopsis balansae) T (Camellia sinensis) Toona (Toona ciliata) Yerba mate (Ilex paraguariensis)

XXX XXX XX XXX XX XXX XXX XX

XX --XXX X X XX XX ---

----X ----X X ---

XXX XXX XXX

XXX --X

-------

Ref.: * depende de la especie --- Nulo, X

escaso,

XX

regular, XXX elevado

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

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cin a alfalfa indican que su costo de produccin supera en casi cien veces el costo de produccin de la semilla verdadera. Sin embargo, este costo es casi similar o incluso inferior al de la produccin de semillas verdaderas para algunos hbridos de alcaucil, geranio y gerbera. 6 Conclusiones Si bien el uso de semilla sinttica en la agricultura es an incipiente y slo es utilizada en ciertos grupos de rboles forestales, las perspectivas para esta tecnologa son altamente promisorias, pudiendo llegar a convertirse, en un futuro cercano, en el principal mtodo de propagacin de plantas. Si bien los progresos logrados en los ltimos 20 aos han sido notables, existe an la necesidad de realizar estudios bsicos sobre embriognesis somtica para luego abordar los aspectos industriales de la produccin a gran escala de semillas sintticas, tanto de angiospermas como de gimnospermas. En la Argentina, la mayor demanda proviene del sector de productores de plantas leosas, donde el desarrollo de esta tecnologa es an incipiente (Tabla 2). Existe, sin embargo, la capacidad tcnica y humana para encarar este desafo.

7 Lecturas recomendadas
CANTLIFFE, D. J. 2001. Bioreactor technology in plant cloning, Proceedings of the Fourth International Symposium on In Vitro Culture and Horticultural Breeding. Acta Horticulturae. 560: 345-351. CARLSON, W. C.; HARTLE J. E. 1995. Manufactured seeds of woody plants. In S.M. Jain , P K.Gupta,R.J. Newton (eds.) Somatic embryogenesis in woody plants. London, Kluwer Acad. Press. 1 : 253-263. GRAY, D. J. P., A. 1991. Somatic embryogenesis and development of synthetic seed technology. Critical Reviews in Plant Sciences 10: 33-61. GUERRA, M. P. T., A.C.; TEIXEIRA, J.B. 1999. Embriogenese somtica e sementes sintticas. In: A.C.Torres, L.S.Caldas, J.A.Buso (eds.) Cultura de Tecidos e Transformacao Gentica de Plantas. CBAB. Embrapa. Brasilia . 2: 533-568. IBARAKI, Y. K., K. 2001. Automation of somatic embryo production. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 65: 179199. JIMNEZ GONZLEZ,E.A.; MENDOZA ,E.Q. 1998. In :Prez Ponce,J.N. (ed.) Propagacin y Mejora Gentica de Plantas por Biotecnologa. Instituto de Biologa de Plantas.Santa Clara. Cuba. pp.225-240. McKERSIE,B.D.; BROWN D.C.W. 1996. Somatic embryogenesis and artificial seeds in forage legumes. Seed Science Research 6: 109-126. MROGINSKI, L. A.; REY, H.; OLMOS, S.; GONZALEZ, V. 1995. Semillas artificiales para la propagacion de plantas. Paradigmas 1: 5-9. TIMMIS,R. 1998. Bioprocessing for tree production in the forest industry: Conifer somatic embryogenesis. Biotechnol. Progress 14: 156-166.

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REY, Hebe Y.; MROGINSKI, Luis A.

V.-Captulo 3
Conservacin de germoplasma in vitro
Scocchi, Adriana; Rey, Hebe 1 Introduccin Desde sus inicios, el hombre ha dependido bsicamente de los vegetales como fuente de energa. Al aumentar rpidamente el tamao de la poblacin, se han ido implementando tcnicas de explotacin, en particular agropecuarias, que han contribuido a la destruccin de las poblaciones vegetales pioneras, que fueron el producto de siglos de evolucin. Por otro lado, las tcnicas modernas de produccin de variedades mejoradas, altamente homogneas, han provocado la reduccin de la variabilidad gentica de las especies cultivadas, ocasionando una verdadera erosin gentica. Es en este contexto en que se recurre a las fuentes genticas originales de variabilidad, las que se deben preservar adecuadamente. Cuando se habla de preservacin de germoplasma hay que subrayar que el objetivo es conservar, con la mayor integridad posible, la variabilidad gentica de las poblaciones seleccionadas. 2 Mtodos empleados para la conservacin de germoplasma La estrategia a seguir para la conservacin de germoplasma depende de la naturaleza del material vegetal, y est definida por la duracin de su ciclo de vida, el modo de reproduccin y el tamao de sus individuos. De acuerdo con estas caractersticas se han intentado diversas alternativas de conservacin, que van desde el tradicional banco de semillas hasta el mantenimiento de reas de reserva. Sin embargo, en muchos casos el mantenimiento no es posible y en otros resulta sumamente costoso, siendo muy elevados los riesgos de prdidas por manipulacin o desastres naturales. Por ello se ha buscado implantar nuevas estrategias para conservar los recursos genticos en una forma ms eficiente.

Los mtodos de conservacin de germoplasma pueden dividirse en mtodos in situ y mtodos ex situ. Los primeros se basan en la conservacin de las plantas en sus hbitat naturales e incluyen la conservacin en parques nacionales y en reservas ecolgicas, lo cual requiere de un considerable espacio fsico e implica altos costos, asociados a la necesidad de mano de obra especializada, control permanente de enfermedades y malezas, a la par que las plantas estn expuestas a las inclemencias del clima y de los incendios. Por otra parte, los mtodos de conservacin ex situ se basan en el mantenimiento del material biolgico en bancos de semillas, bancos de cultivo in vitro, colecciones de plantas (en campo, viveros o jardines botnicos). En general, los bancos de semillas constituyen uno de los mtodos ms convenientes para la conservacin de germoplasma ex situ, porque permiten almacenar una gran variabilidad gentica en forma econmica y prctica. Para la conservacin de semillas el International Plant Genetic Resouces Institute (IPGRI) recomienda su desecacin hasta un 3-7% de humedad y su almacenamiento a bajas temperaturas (-18C). Este protocolo de conservacin es, en general, el ms recomendado para la mayora de las especies que se propagan por semillas y cuyas semillas resisten la desecacin sin que ello implique prdida de viabilidad. A las semillas que presentan estas caractersticas se las denominan semillas ortodoxas, como por ejemplo las semillas de arroz, trigo, avena, tabaco, tomate y lechuga. Sin embargo, en ciertos casos este mtodo de conservacin no es aplicable porque la especie se propaga, en la prctica, vegetativamente, (como la mandioca, papa, caa de azcar, pltanos y bananos), o bien porque sus semillas pierden rpidamente la viabilidad cuando son sometidas a procesos de desecacin. A estas semillas se las denominan semillas recalcitrantes. Las semillas de numerosas especies que viven en zonas tropicales o subtropicales se incluyen en esta categora, como por ejemplo las de coco, cacao, frutales tropicales perennes y diversas palmeras. Otro mtodo de conservacin de germoplasma ex situ, es mediante el cultivo in vitro de tejidos. El descubrimiento de la

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

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totipotencialidad de las clulas vegetales y la posibilidad de desarrollar plantas normales y completas a partir de diferentes explantes ha permitido pensar en el establecimiento de bancos de germoplasma utilizando el cultivo de tejidos vegetales. Algunos de los primeros estudios sobre el mantenimiento in vitro del germoplasma fueron realizados en mandioca en el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) y en papa en el Centro Internacional de la Papa (CIP). En 1980 se reconoci el potencial de los mtodos del cultivo in vitro para la conservacin de especies de plantas consideradas difciles (este trmino se refiere a las especies propagadas vegetativamente en forma obligada o que tienen semillas recalcitrantes). En estos casos, la conservacin de los genotipos se realiza mediante el mantenimiento de plantas vivas o mediante el cultivo in vitro de pices caulinares o de nudos. El mantenimiento de los recursos fitogenticos mediante los mtodos de cultivo in vitro se logra generando cambios en el ambiente de cultivo que permiten desacelerar el crecimiento de las clulas y de los tejidos. El objetivo es aumentar al mximo el perodo de transferencia del cultivo. Es esta necesidad la que estimul algunos de los primeros estudios sobre el mantenimiento in vitro del germoplasma de diversas especies. Este mtodo cubre un amplio espectro de tcnicas que implican el cultivo, bajo condiciones de asepsia, de rganos o fragmentos de rganos (meristemas, semillas, embriones somticos, embriones cigticos, hojas, tallos, races, yemas, polen, anteras, callos o protoplastos), en un medio de cultivo artificial definido, bajo condiciones ambientales controladas. Esta tcnica ha sido utilizada para mantener colecciones en crecimiento mnimo, para lo cual se requiere: reducir la temperatura, reducir las condiciones de luminosidad, modificar el medio de cultivo, adicionar al mismo inhibidores osmticos o retardantes del crecimiento, deshidratadores de tejido o modificar la fase gaseosa del recipiente de cultivo. La modificacin de uno o ms de estos factores es usada para la conservacin de numerosas especies, como por ejemplo para la conservacin de microestacas de Manihot esculenta ; de vstagos de especies de

Fragaria , Ipomoea, Rubus , Musa , Saccharum , Zingiber , Ananas , Coffea, Dioscorea y de microtubrculos de Solanum. Estas tcnicas de almacenamiento se realizan a mediano plazo, es decir, se basan en reducir el metabolismo celular y con ello reducir el crecimiento y el nmero de subcultivos durante meses hasta un ao, sin que ello afecte la viabilidad de los cultivos. Desde hace varios aos en el Laboratorio de Cultivo in vitro del Instituto de Botnica del Nordeste (IBONE), en la Facultad de Ciencias Agrarias de la UNNE, se llevan a cabo experimentos referidos a la conservacin de germoplasma de paraso (Melia azedarach). Utilizando como explantes meristemas de clones selectos de paraso mantenidos durante 12 meses a tasas de crecimiento reducidas (medios de cultivo subptimos o empobrecidos y en condiciones de oscuridad) se logr mantener con xito y regenerar plantas de paraso que actualmente se encuentran en la etapa de evaluacin a campo (Fig. 1). En el IBONE tambin se realizan experimentos tendientes a optimizar las tcnicas de conservacin in vitro a largo plazo, que consisten en el almacenamiento a la temperatura del nitrgeno lquido (-196C) crioconservacin, con lo cual se consigue la supresin del crecimiento hasta llegar a un estado de suspensin animada. En el mencionado Instituto se ha logrado la crioconservacin de meristemas de paraso mediante la tcnica de encapsulacin-deshidratacin (Fig. 1). El uso de la crioconservacin para el almacenamiento de germoplasma ofrecen varias ventajas en relacin con las tcnicas tradicionales, pues permiten la conservacin a largo plazo (aos), con bajos costos de mantenimiento, fcil manipulacin de las muestras y no dependen del suministro elctrico. Luego del informe, en 1968, acerca de la crioconservacin de clulas de lino y de los resultados satisfactorios que se obtuvieron con la crioconservacin de meristemas de frutilla en el Instituto de Biotecnologa de Plantas en Saskatoon, Canad, en 1985 se iniciaron algunas investigaciones colaborativas entre el CIAT y el IPGRI para desarrollar esta tcnica para meristemas de mandioca. A partir de estos estudios numerosos trabajos han dado muestras de la importancia de esta tcnica, de sus usos y aplicaciones.

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SCOCCHI, Adriana; REY, Hebe

con el tipo de propagacin de la especie. Por ejemplo, en el caso de la mandioca, especie que se propaga principalmente por va asexual (mediante estacas), en el CIAT se conserva su germoplasma in vitro mediante el cultivo de microestacas y tambin de meristemas, con lo cual paralelamente a la conservacin se consigue el saneamiento de los cultivares. Actualmente se estn realizando estudios tendientes a desarrollar protocolos para la crio-conservacin de meristemas.

Deshidratacin La deshidratacin del explante es un paso crucial para el xito de la crio-conservacin, ya que es necesario eliminar toda el agua libre presenFigura 1: Estrategias para la conservacin de germoplasma de paraso (Melia azedarach te en el tejido veL.), desarrolladas en el Laboratorio de Cultivo in vitro de Tejidos Vegetales. IBONE. getal, minimizanFacultad de Ciencias Agrarias. UNNE. do as posibles daos debidos a conLa crioconservacin consta de seis pasos: gelacin. La deshidratacin del tejido puede realizarse en una cmara a 0C o en cmaras Seleccin del material a crioconservar hermticamente cerradas utilizando sustanCuando se realiza la seleccin del mate- cias higroscpicas como silica gel o glicerol (5 rial a crioconservar se debe tener la absoluta - 20%), o sometiendo al explante a una coseguridad de que a partir del mismo se ob- rriente de aire en un flujo laminar de aire estendrn plantas completas. El explante se- tril. leccionado depender del objetivo de conservacin y est estrechamente relacionado Aclimatacin
Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

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La aclimatacin puede realizarse en forma rpida o lenta. La aclimatacin rpida consiste en colocar el explante directamente en nitrgeno lquido, con o sin la adicin exgena de crioprotectores. La aclimatacin lenta se realiza bajando gradualmente la temperatura (0.1-3C/min.). Este punto debe ser manejado cuidadosamente, pues una deshidratacin excesiva de las clulas puede exponerlas a una alta concentracin interna de solutos. Por esta razn, el material generalmente se congela lentamente, a una velocidad adecuada, hasta alcanzar una temperatura prxima a los -40 C. Luego se lleva directamente a la temperatura del nitrgeno lquido (-196 C). A fin de preparar (aclimatar) el explante para enfrentar las bajas temperaturas a las que ser sometido, se utilizan sustancias crioprotectoras como azcares (sacarosa, glucosa), alcoholes (glicerol, etileglicol, manitol y sorbitol), dimetilsulfxido (DMSO) y polivinilpirrolidona (PVP). Tambin pueden utilizarse soluciones de vitrificacin, que son una combinacin de varios crioprotectores tales como el PVS2, que est compuesto por 30% de glicerol, 15% de etilenglicol, 15% de DMSO y 0.04M de sacarosa. Tanto los crioprotectores como las soluciones de vitrificacin actan fundamentalmente como agentes anticongelantes, aumentando la viscosidad del tejido vegetal y reduciendo la permeabilidad de las clulas.

nor preparacin para el almacenamiento y comprenden aquellas especies que habitan zonas fras y/o templadas. En cambio, los sistemas hidratados son ms susceptibles a las bajas temperaturas y estn representados por todas aquellas especies que habitan zonas tropicales y subtropicales, las cuales no estn adaptadas para soportar temperaturas inferiores a 0C. Por este motivo estos tejidos deben ser protegidos exgenamente mediante el uso de crioprotectores.

Descongelamiento y rehidratacin Cuando se desea recuperar el explante mantenido en nitrgeno lquido se puede realizar un descongelamiento rpido en bao de agua (generalmente 1-2 min. a 30-40 C) o en forma lenta, sometiendo al explante a la temperatura del laboratorio o a una corriente de aire en el flujo laminar de aire estril. Tests de viabilidad Los tests de viabilidad nos permiten comprobar la/s zona/s del tejido que ha/n muerto y cul/es ha/n sobrevivido al fro. La evaluacin de la viabilidad puede llevarse a cabo en forma visual, realizando el re-cultivo y determinando la capacidad de regeneracin, utilizando TTC (cloruro de 2,3,5TrifenilTetrazolio) que colorea el tejido que ha sobrevivido a la crioconservacin o midiendo la conductividad elctrica, que permite estimar el dao producido en las membranas celulares. Tcnicas de almacenamiento del material a preservar En la ltima dcada han surgido numerosas tcnicas que combinan el uso de crioprotectores y de soluciones de vitrificacin con tcnicas de deshidratacin y encapsulacin, las cuales bsicamente pueden resumirse en tcnicas de: - Encapsulacin-deshidratacin - Vitrificacin - Encapsulacin-vitrificacin - Desecacin - Precultivo - Precultivo-desecacin - Gotita congelada.
En la Tabla 1 se detallan las especies y

Almacenamiento De acuerdo al material vegetal que se utilice, se presentan dos grandes sistemas:
- Sistemas secos: comprenden todos aquellos tejidos vegetales endgenamente resistentes y tolerantes a las bajas temperaturas y a la deshidratacin. - Sistemas hidratados: son todos aquellos tejidos vegetales no tolerantes a las bajas temperaturas y a la deshidratacin, por lo cual se requiere de una proteccin exgena. Esta proteccin puede lograrse a travs del uso de crioprotectores o bien por la utilizacin de soluciones de vitrificacin. Los sistemas secos, por tratarse de tejidos ms resistentes, necesitan de una me-

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Tabla 1: Utilizacin de tcnicas de crioconservacin en diferentes explantes de algunas especies de inters agronmico.
Tcnica Empleada Explante y Especie

Suspensiones celulares de Catharanthus roseus . Meristemas de 125 variedades de Solanum spp. Meristemas de Dioscorea alata, Malus domestica, Pyrus spp. y Morus spp. EncapsulacinApices de Pyrus spp., Malus spp., Saccharum spp. y Solanum Deshidratacin tuberosum Apices caulinares de Camellia japonica, Coffea racemosa x Coffea sessiliflora, Citrus spp, y de Saccharum spp. Embriones somticos de Elaeis guineensis . Clulas nucelares de Citrus sinensis . Lneas celulares embriognicas de Pinus silvestris . Suspensiones celulares y callos embriognicos de Gossypium hirsutum. Meristemas de Pyrus communis, Malus spp y de Pyrus spp., Ipomoea batata, Manihot esculenta (15 genotipos), Prunus spp., y de Solanum spp. Meristemas, polen y anteras de Arachis hypogaea. Vitrificacin pices de Ananas comosus, Colocasia esculenta . Yemas adventicias de Guazuma crinita Mart., Populus alba. Semillas de Bletilla striata Semillas y protocormos de Dendrobium candidum. Suspensiones celulares embriognicas de Oryza sativa . Embriones somticos de Abies cephalonica Semillas, embriones cigticos, polen, anteras y suspensiones celulares de Triticum spp. Meristemas, segmentos nodales, segmentos de raz y yemas Encapsulacin- adventicias de Guazuma crinita, y de Fragaria x ananassa . Vitrificacin Apices de Dyanthus cariophyllus, Armoracia rusticana, Lilium spp. y de Wasabia japonica Meristemas de Morus spp. Embriones somticos de Cucumis melo, y de Elaeis guineensis Embriones somticos y ejes embriognicos de Camellia japonica . Desecacin Ejes embriognicos de Junglans cinerea . Ejes embriognicos y semillas de Gossypium hirsutum. Semillas de Pinus silvestris , y de Apium graveolens . Meristemas de Musa spp. Embriones cigticos de Triticum aestivum, Phaseolus vulgaris y Oryza spp. Precultivo Polen y anteras de Oryza spp Lneas celulares y callos de Oryza sativa . Embriones somticos de Phoenix dactylifera, Coffea spp., PrecultivoPyrus spp., Cucurbita spp., Cocos nucifera, y de Elaeis Desecacin guineensis (aplicada como rutina a 80 clones).
Gotita Congelada Apices de 150 variedades de Solanum tuberosum.

explantes en los cuales cada una de estas tcnicas ha sido empleada con resultados satisfactorios. -Encapsulacin-Deshidratacin La tcnica de encapsulacin-deshidratacin se basa en la metodologa aplicada a las

semillas sintticas, en la cual un explante es recubierto por una matriz de alginato de sodio y polimerizado en una solucin de cloruro de calcio, formando un gel de alginato de calcio alrededor del explante. Una vez encapsulados, los explantes son pretratados, generalmente con sacarosa (desde 0.3 has-

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ta 1.5M), que acta como crioprotector. En especies tolerantes al fro la exposicin de las plantas madres a bajas temperaturas durante varias semanas, previo a la criopreservacin, incrementa la supervivencia. La deshidratacin puede llevarse a cabo sometiendo las cpsulas de alginato (conteniendo a los explantes) a una corriente de aire en el flujo laminar o exponindolas en cmaras hermticamente cerradas con silica gel. Las cpsulas, as deshidratadas, pueden sumergirse directamente en nitrgeno lquido o bien pueden ser llevadas a un descenso lento de temperatura. - Vitrificacin Esta tcnica involucra el pretratamiento de las muestras con soluciones de vitrificacin, como el PVS2, ya mencionado, o bien otra, compuesta por 40% de etilenglicol, 15% de sorbitol y 6% de albmina srica bovina. Luego de la exposicin a las soluciones de vitrificacin (generalmente a una temperatura de 0C, a fin de disminuir los riesgos de fitotoxicidad), las muestras pueden ser sumergidas directamente en nitrgeno lquido o a travs de un descenso lento de la temperatura. Las soluciones crioprotectoras recomendadas en los protocolos de vitrificacin son generalmente txicas para las clulas. El tiempo de exposicin a la solucin debe estar relacionado con el tamao del explante y la misma debe ser removida rpidamente luego del descongelado. - Encapsulacin-Vitrificacin La tcnica de encapsulacin-vitrificacin es una combinacin de las tcnicas de encapsulacin-deshidratacin y vitrificacin. Las muestras son encapsuladas en alginato de calcio y sometidas a vitrificacin durante el enfriamiento. La supervivencia del material vegetal cuando se utiliza esta tcnica es un 30% mejor que cuando se usa la de encapsulacin-deshidratacin. Esto puede explicarse debido a que las cpsulas de alginato de calcio reducen la toxicidad de las soluciones de vitrificacin. - Desecacin La tcnica de desecacin es un proceso muy simple que slo requiere la deshidratacin del material vegetal, la cual es crucial para

el xito de la crioconservacin. Esta tcnica consiste en someter al explante a una corriente de aire en un flujo laminar o en cmaras hermticamente cerradas, que contienen silica gel, luego de lo cual se realiza un enfriado rpido sumergiendo el material directamente en nitrgeno lquido. - Precultivo La tcnica del precultivo involucra la incorporacin de crioprotectores (durante distintos tiempos que dependen del explante) antes del congelamiento. Como ejemplos pueden citarse la adicin de altas dosis de sacarosa para la crioconservacin de meristemas de Musa spp.; la utilizacin de polietilenglicol (PEG) y DMSO en el caso de embriones cigticos de Triticum aestivum y Phaseolus vulgaris; la utilizacin de sacarosa y DMSO o glicerol en semillas, embriones cigticos, polen y anteras de Oryza spp., y la utilizacin de cido abscsico para la conservacin de lneas celulares y de callos de Oryza sativa. - Precultivo-Desecacin Esta tcnica es una combinacin de dos de las tcnicas descriptas anteriormente. Las muestras son tratadas con crioprotectores, parcialmente desecadas y luego sometidas a enfriamiento rpido o lento. Generalmente en el precultivo se emplean azcares como sacarosa o glucosa. La duracin del tratamiento es variable, desde horas, como en el caso de la conservacin de embriones maduros de Cocos nucifera, donde el cultivo dura 11-20 hs., hasta das, como en el caso de embriones somticos de Elaeis guineensis, que dura 7 das. - Gotita congelada Esta tcnica ha sido aplicada con xito en pices de Solanum tuberosum. Consiste en pretratar el material con DMSO por 2-3 hs. en medio lquido y formar una microgota (2.5 ml), la cual se suspende sobre papel de aluminio y luego se sumerge directamente en nitrgeno lquido. Este procedimiento es una adaptacin de la tcnica clsica desarrollada para meristemas de mandioca. Esta tcnica ha sido satisfactoriamente aplicada en 150 variedades de Solanum tuberosum, con un porcentaje de supervivencia del 40%.

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3 Conclusiones Los recursos fitogenticos constituyen un reservorio de informacin gentica imprescindible para la solucin de muchos de los problemas a los que se enfrenta la agricultura. Los mtodos para asegurar su conservacin son diversos y cada uno de ellos posee sus ventajas e inconvenientes. Por ello, se considera que el conjunto de tcnicas de conservacin in situ y ex situ son mtodos complementarios, no excluyentes, para lograr el objetivo comn de preservar los recursos fitogenticos, como parte esencial de una estrategia global para la conservacin de la biodiversidad. En la ltima dcada se han producido avances significativos en el desarrollo de tcnicas in vitro de conservacin. La disponibilidad de bancos de germoplasma in vitro, tanto en condiciones de crecimiento lento como la conservacin a temperaturas ultrabajas (crioconservacin), han contribuido a dicho avance. Las tnicas de crecimiento lento son utilizadas como rutina en centros internacionales tales como el CIAT (Cali, Colombia), donde se aplican a la conservacin de germoplasma de mandioca y para la conservacin de germoplasma de papa en el CIP (Centro Internacional de la Papa, Per). Las

tcnicas de crioconservacin ofrecen una alternativa muy valiosa cuando se piensa en conservar los recursos fitogenticos por tiempo ilimitado (aos), si bien hasta el momento slo se aplica como rutina para la conservacin de lneas celulares en laboratorios de investigacin y para la conservacin de algunos genotipos pertenecientes a los gneros Rubus spp. , Pyrus spp. , Solamun spp. y Elaeis guineensis. 4 Lecturas recomendadas
ENGELMANN, F. 1997. Status report on the development and application of in vitro techniques for the conservation and use of plant genetic resources. Engelmann, F. (ed.) IPGRI :1-63. ENGELMANN, F. and H. TAKAGI. 2000. Cryopreservation of tropical plant germoplasm. Current research progress and application. Engelmann, F. and H. Takagi (eds.) JIRCAS-IPGRI pp 496. MROGINSKI, L.A., W.M. ROCA, K.K. KARTHA. 1991. Criopreservacin del Germoplasma. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. Roca W. M. y L. A. Mroginski (eds.) CIAT (32) :715-730. ROCA, W.M., D.I. ARIAS y R. CHVEZ. 1991. Mtodos de conservacin in vitro de germoplasma. En: Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y aplicaciones. Roca, W.M. y L.A. Mroginski (eds.) CIAT (31) :697-714.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

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PARTE VI Mtodos de anlisis de la variabilidad

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OLMOS, Sofa y DI RENZO, Miguel

VI.-Captulo 1
Consideraciones estadsticas y biolgicas para estimar variabilidad gentica
Olmos, Sofa; Di Renzo, Miguel 1 La variacin biolgica La variabilidad gentica es un hecho universal en las poblaciones reproductivas y una condicin preliminar necesaria para el cambio evolutivo y para la respuesta al mejoramiento gentico mediante seleccin o hibridacin. Por otra parte son conocidos los peligros que implica la uniformidad y la falta de diversidad en las especies cultivadas y en los animales domsticos, como consecuencia de la erosin gentica. La variacin que presentan los individuos de una poblacin puede ser discontinua o continua. Los caracteres cualitativos de variacin discontinua, como los marcadores moleculares, permiten clasificar a los individuos sin ambigedades, ya que estos caracteres estn regidos por uno o por pocos genes y el ambiente no tiene efecto en su manifestacin fenotpica. En cambio, los caracteres cuantitativos, representados por la mayora de los caracteres de inters agronmico, presentan variacin continua y los fenotipos, que estn determinados por poligenes y por efectos ambientales, son difciles de clasificar en categoras discretas. Para su anlisis deben emplearse mtodos biomtricos, que no miden el efecto de genes individuales o de segmentos cromosmicos especficos, sino de todo el genoma. Durante los ltimos aos ha surgido un consenso entre los mejoradores y genetistas moleculares sobre la conveniencia del uso de marcadores moleculares para asistir a la seleccin de caracteres cuantitativos (MAS, Marker Assisted Selection). La biotecnologa ha colaborado mediante la construccin de mapas genticos saturados, esto es, con innumerables marcadores moleculares a lo largo de los cromosomas, que permiten ubicar regiones de actividad cuantitativa (QTL, Quantitative Trait Loci). De esta manera, un

carcter de variacin contnua puede ser manejado como si se tratara de un carcter de herencia mendeliana mediante la introgresin de un fragmento de cromosoma conteniendo un QTL por retrocruzamientos sucesivos en las variedades comerciales. Los QTL representan un nuevo sistema de enfocar el estudio bsico y el manejo prctico de los sistemas polignicos y de la gentica cuantitativa. 2 Experimento cientfico La ciencia, que tiene como objetivo la explicacin y la prediccin de los hechos, cuenta con el mtodo cientfico como un procedimiento que contempla un proceso en flujo desde los hechos observados hasta la proposicin de hiptesis explicatorias. Un requisito fundamental en toda ciencia fctica es la contrastacin de las hiptesis planteadas, poniendo a prueba las mismas mediante una confrontacin con la experiencia. El diseo experimental crea artificialmente las condiciones para la contrastacin de la hiptesis y brinda la metodologa estadstica correspondiente para el anlisis de los datos. El experimento cientfico, que como queda dicho es un ensayo destinado a probar la validez de una hiptesis, se basa en la reproduccin de ciertos fenmenos bajo condiciones controladas con el objeto de medir el efecto que produce la modificacin de uno o varios factores en estudio (tratamientos) sobre la variable dependiente. El ensayo , cuidadosamente diseado, deber ser lo ms simple posible, evitando los errores tendenciosos y sistemticos (biass=sesgo) de manera tal que los datos recavados provean conclusiones con un amplio rango de validez. Por otra parte, para magnificar el efecto de los tratamientos y disminuir el error experimental, se procura minimizar el efecto de otros factores no controlados que ejercen influencia en las observaciones. Esto se logra utilizando materiales y condiciones experimentales lo ms homogneas posibles. De esta manera, las variaciones observadas se debern casi exclusivamente a los tratamientos. Para conocer el efecto de los factores controlados y el de los factores no controlados (error experimental) sobre el material

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experimental es necesario formular claramente una hiptesis, utilizar un diseo experimental apropiado y analizar e interpretar los resultados obtenidos. Por ejemplo, la aplicacin de distintos tratamientos (ej.: distintas dosis de fertilizante = causa), producen variaciones sobre una caracterstica de inters (ej. rendimiento = efecto):

- Variable independiente: es la causa que afecta los resultados del experimento y est representada por los distintos niveles del factor cuyo efecto se quiere medir (tratamientos) o que se quiere controlar (bloques). - Variable dependiente: variable respuesta o simplemente variable es el rasgo o carcter de inters cuyas mediciones constituyen los datos u observaciones del experimento. Ej. rendimiento (kg./ha), dimetro de colonia (mm); ( variables continuas), tiempo a panojamiento (das), tamao de camada, nmero de colonias (nmero), grado de respuesta a un patgeno (tolerante, intermedio, susceptible), (variables discretas). La variacin de estos datos permite cuantificar el efecto del factor al que est sometido el material. 3 Hiptesis estadstica Como se indicara previamente, el experimento cientfico es un ensayo destinado a probar la validez de una hiptesis. Las hiptesis estadsticas plantean supuestos referentes a algn parmetro poblacional. Por lo general se utiliza la hiptesis nula (Ho), que se refiere a la igualdad entre los parmetros probados. Frente a la Ho se plantea una hiptesis alternativa (Ha). Para determinar si un tratamiento tuvo algn efecto, se considera a la Ho como la ausencia de efectos, lo que equivale probar la igualdad entre las medias de los tratamientos. La Ha plantea que al menos una de las medias difiere significativamente del resto, o sea que al menos uno de los niveles del factor probado tiene efecto sobre la variable de inters. Las hiptesis estadsticas tambin prueban otras caractersticas poblacionales, como por ejemplo la igualdad entre varianzas o entre coeficientes de regresin. El ensayo y las pruebas de significancia permiten calcular la probabilidad a favor de la hiptesis nula. Es decir que P es la probabilidad que la Ho sea verdadera. Si la probabilidad calculada es igual o mayor que un nivel de significancia preestablecido (de 0,05 por ejemplo), la Ho no se rechaza y se infiere que no hay diferencias significativas entre las medias de los tratamientos. Se concluye que los tratamientos no tienen efecto significati-

Terminologa - Factor: es la causa cuyo efecto se quiere medir (ej. fertilizante, competencia, medio de cultivo) - Nivel: es cada una de las categoras o alternativas del factor en estudio (ej. dosis de un fertilizante, densidades de siembra, pH de los medios de cultivo). - Tratamiento: Es cada nivel del factor en estudio. Si se estudia el factor fertilizante, cada dosis (o nivel) es un tratamiento distinto. Si se prueba el efecto de concentraciones crecientes de un fertilizante los tratamientos tendran un orden natural ( discreto ordinal); pero si se prueban distintas combinaciones de fertilizantes (NPK), no habra un orden entre los tratamientos ( discreto categrica). Cuando se estudian dos (o ms) factores simultneamente, los distintos tratamientos resultan de la combinacin de cada nivel de un factor con cada nivel del otro factor. Por ejemplo, si se estudia el efecto de fertilizante y competencia, cada tratamiento resulta de la combinacin de una dosis de fertilizante y una densidad de siembra determinada.

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vo en la variabilidad del carcter estudiado y las diferencias observadas no son mayores que las que se produciran por azar. En cambio si la probabilidad calculada es pequea (P0,05) se rechaza la Ho y se infiere, de acuerdo con la Ha, que hay diferencias significativas entre los tratamientos. Si P0,01 se dice que las diferencias son altamente significativas.

El anlisis de la varianza es un procedimiento aritmtico que permite la descomposicin de la varianza total en varianzas parciales. El cociente entre las varianzas permite obtener un valor de F calculado (Fc), el cual se compara con un F de tabla (Ft) para un determinado nivel de significacin (por ejemplo = 0,05) y los grados de libertad de los tratamientos y del error. Los programas de computacin calculan directamente el P (la probabilidad) del test. Varianza total Se puede considerar a la variacin total como la resultante de dos fuentes de variacin: una fuente de variacin debida a las diferencias entre grupos o tratamientos, sealadas por los promedios de stos y otra debida a la diferencia dentro de los tratamientos, que se calcula sobre la base de las diferencias entre las observaciones de cada tratamiento. Varianza entre tratamientos Para aislar la variacin entre los grupos necesitamos suprimir la variacin dentro de los tratamientos. Podemos obtener este resultado haciendo a todos los individuos de un mismo grupo iguales entre s e iguales a la media del grupo. Mediante esta operacin, la variacin entre los grupos no se modifica mientras que toda la variacin dentro del grupo queda anulada. Varianza dentro de tratamientos Para obtener la varianza dentro de los grupos debemos tener en cuenta solamente la variacin entre las observaciones de un mismo tratamiento. La variacin dentro de un tratamiento se debe a las desviaciones que presentan los valores individuales en ese grupo en relacin con la media de ese grupo. 5 Anlisis multivariado El anlisis multivariado brinda los mtodos estadsticos para el anlisis conjunto de dos o ms variables que pueden estar interrelacionadas. Esta rama de la estadstica comprende procedimientos y tcnicas para la sntesis, la presentacin y el anlisis multidimensional de caracteres, tanto cualitativos como cuantitativos, obtenidos a par-

El nivel de significancia, generalmente designado por , representa hasta qu punto, en trminos de probabilidad, estamos dispuestos a aceptar un error de tipo I, es decir, rechazar una Ho que sea verdadera. Esto conlleva a que aceptemos una Ho como verdadera con una probabilidad 1-. Si se fija = 0,05 estamos dispuestos a aceptar el error tipo I aproximadamente una de cada 20 veces. 4 Anlisis univariado Los anlisis univariados emplean una variable dependiente, mientras que los anlisis multivariados comparan muestras sobre la base de dos o ms variables que estn relacionadas. La significancia estadstica de una diferencia entre dos medias puede verificarse mediante una prueba t o mediante una prueba F. Ambas son equivalentes, t2 = F. La prueba F, que es un cociente de varianzas, es una generalizacin de la prueba t, especialmente til cuando se comparan ms de dos tratamientos. En el anlisis de la varianza (ANOVA), por ejemplo, se utiliza la prueba F para verificar la igualdad de medias. Prueba F Una prueba F consiste en un cociente entre dos varianzas: F = s2entre / s2dentro Para realizar la prueba F resulta necesario descomponer la varianza total (s2total) en dos componentes: s2entre y s2dentro

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tir de un nmero de individuos, una OTU Operational Taxonomic Unit, objetos o tratamientos. Debido a que las variables se consideran en forma simultnea, estas tcnicas permiten realizar interpretaciones ms complejas a las que surgen mediante la utilizacin de mtodos univariados. El anlisis multivariado colabora en la comprensin ms adecuada y completa de las ciencias biolgicas; por tal motivo, en este captulo se brindar un panorama simplificado y algunos comentarios sobre las tcnicas ms usuales con la finalidad de poder discernir y elegir la metodologa ms apropiada para analizar la informacin que se disponga. Hay algunas razones que justifican el anlisis conjunto de diferentes variables en lugar de analizar cada variable separadamente por mtodos univariados. Por ejemplo, cuando se trata de probar hiptesis mediante procedimientos de inferencia estadstica. En este caso, la aplicacin del anlisis univariado a cada una de las variables aumenta el error Tipo I mientras que la aplicacin del anlisis multivariado preserva el valor de y aumenta en muchos casos el poder del test (1-). El anlisis multivariado utiliza las relaciones (correlaciones) entre las variables o entre los objetos que el mtodo univariado directamente no considera. El anlisis multivariado aprovecha estas relaciones para buscar en los datos patrones o estructuras enriqueciendo as la descripcin de los mismos. En el captulo siguiente (VI.2) se desarrollarn en ms detalle algunas metodologas multivariadas, seleccionandose aquellas que se utilizan con mucha frecuencia y que no requieren demasiados conocimientos previos. Anlisis exploratorio y confirmatorio Con los datos provenientes de observaciones realizadas sobre un hecho en particular es necesario, en primer lugar, realizar un anlisis exploratorio. Posteriormente, mediante las inferencias realizadas a partir de este anlisis y con la informacin que se pueda disponer acerca de los mecanismos que originan el proceso biolgico, es posible desarrollar un anlisis confirmatorio y as plantear un modelo descriptivo de causalidad, el que, a su vez, es confirmado mediante una prueba de bondad de ajuste.

En otras palabras, toda investigacin llevada a cabo especialmente en reas nuevas, donde existen pocos antecedentes, comienza con una exploracin de los datos con el objeto de reconocer cualquier estructura o patrn no aleatorio que requiera una explicacin. En una segunda etapa, es posible que surja la necesidad de formular la pregunta, lo cual es a menudo ms interesante que buscar la respuesta subsiguiente, ya que el objetivo primordial es, en primer lugar, generar hiptesis interesantes que promuevan estudios ms avanzados. En este caso, los mtodos que estn diseados para responder a preguntas especficas no seran necesarios. En cambio resultaran apropiados aquellos mtodos que puedan detectar un patrn de comportamiento no previsto en los datos y que, adems, abran un amplio campo de posibles explicaciones del proceso. Estas tcnicas generalmente se caracterizan por el nfasis puesto en la utilizacin de representaciones visuales y grficas y por la carencia de modelos estocsticos, donde la significacin estadstica de los resultados pierde importancia. La aplicacin de los anlisis confirmatorios se vuelve ms apropiada cuando el investigador tiene en mente hiptesis bien definidas. Es aqu donde son necesarias las pruebas de significacin estadstica. Sin embargo, no existe una divisin muy estricta entre tcnicas exploratorias y confirmatorias. Por ello sera importante que el investigador tenga una perspectiva flexible y pragmtica para analizar sus datos y una experiencia suficiente que le permita elegir la herramienta analtica adecuada. El error ms grave que se podra realizar en este sentido sera arribar a conclusiones que expliquen causas a partir de datos exploratorios y descriptivos sin haber realizado ningn tipo de diseo experimental para probarlos. Se plantea como causa probable de esta tendencia generalizada el mal uso semntico entre las terminologas estadsticas y las biolgicas. El uso estadstico de trminos como efectos o variable independiente no implica causalidad. Sntesis de mtodos: objetivos y limitaciones Los anlisis multivariados ms comnmente adoptados, en orden decreciente, son:

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anlisis de componentes principales, anlisis lineales. Cuando se utilizan combinaciones de de funciones discriminantes, anlisis de variables hay que considerar que el coeficienagrupamientos o clusters, regresin mltiple, te que afecta a una variable representa la anlisis multivariado de la varianza, anlisis contribucin de esta variable a la combinade correspondencia, coordenadas principa- cin lineal y que este valor depende de las les, anlisis factorial, correlacin cannica, otras variables incluidas en el anlisis. No se modelos logartmicos lineales, escalamiento considera correcto el empleo de estos coefimultidimensional, y la regresin logstica ml- cientes individuales para la interpretacin de tiple. dichas correlaciones. En la Tabla 1 se mencionan los objetivos Antes de aplicar cualquier tcnica de angenerales de los mtodos de anlisis lisis resulta imprescindible realizar un examen multivariado ms utilizados. Los procedimien- inicial de los datos. El examen inicial, bsicatos enumerados del 1 al 7 utilizan combina- mente, consiste en la evaluacin de datos ciones lineales de las variables, estos mto- faltantes, identificacin de outliers (fuera dos son ms eficientes con datos continuos, del rango o fuera de tipo) y cuando el anlimientras que aquellos mtodos enumerados del 8 al Tabla 1. Objetivos y limitaciones de los 12 tipos de anlisis multivariados ms comnmente utilizados. 12, comprenden mtodos no lineales y son ms apropiados cuando se cuenta con datos binarios. Los mtodos lineales son apropiados cuando se quiere interpretar combinaciones ptimas de variables (por ejemplo, componentes principales en ACP (anlisis de componentes principales), factores en AF (anlisis factorial, funciones discriminantes en AD (anlisis discriminante). Quienes aplican mtodos lineales, usualmente asumen que los valores de las variables incrementan o decrecen regularmente y que entre ellas no hay interacciones. Estas relaciones no lineales en el MANOVA aparecen en los trminos de las interacciones y pueden revelar efectos no lineales importantes en el anlisis de datos experimentales. Para examinar con mayor eficiencia datos binarios (presencia/ausencia) y datos en rangos, se pueden usar otros modelos donde las variables se combinan acordes con funciones no

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sis multivariado a emplear as lo requiera, verificar si se cumplen los supuestos bsicos de normalidad, homogeneidad de varianzas, independencia de error y linealidad. Por otro lado, y al igual que en el anlisis univariado, hay que tener precauciones con el uso del nivel de significancia () que se adopte, de las subsiguientes inferencias es-

tadsticas y de las conclusiones a que se arriba luego del anlisis. Las conclusiones confirmatorias solamente se justifican si los estudios estuvieron basados en un muestro apropiado. Esto significa que la inferencia est justificada en relacin a la forma en que los datos fueron tomados y en que el experimento fue realizado, ms que en la tcnica de anlisis en s misma. Las inferencias slo estn justificadas cuando los datos son tomados de una muestra grande y bien definida. Cuando esto no ocurre, los valores de probabilidad directamente no se deberan informar y las conclusiones a las que se arriba slo deberan limitarse a los datos utilizados y a las condiciones en las que se desarroll el experimento. De la misma manera resulta poco aconsejable elaborar generalizaciones demasiado amplias cuando los estudios se realizan sobre casos particulares o especficos que no son representativos. A menudo sucede que el investigador prefiere o necesita interpretar las variables en forma separada cuando maneja un grupo de variables correlacionadas. En estos casos sera ms apropiado utilizar mtodos univariados, con el complemento de pruebas de Bonferroni ajustadas. Sin embargo, cuando sea posible, la consideracin conjunta de las variables, mediante la aplicacin del anlisis multivariado, puede brindar conclusiones ms fuertes que las logradas a travs de un grupo de comparaciones simples. Si se tiene cuidado durante el proceso de in-

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terpretacin de resultados, las combinaciones de variables (componentes, factores, etc.) podran ser de significativa importancia para estudiar un proceso. El uso racional de la estadstica multivariada, el modelamiento y el conocimiento biolgico pueden ayudar al investigador a disear con criterio un experimento crucial y a llegar a conclusiones consistentes. Como dijimos anteriormente, el anlisis multivariado aprovecha las relaciones entre las variables para buscar patrones o estructuras en los datos. En este sentido, podra encontrarse un origen de patrones cuando se realizan mediciones sobre grupos de objetos similares. Pueden existir casos donde no se conoce a priori si los grupos estn ya formados, cuntos son, o cules objetos pertenecen a cada grupo; es all donde habra que ver qu tipo de anlisis es ms apropiado. En general, en esta etapa se podran usar mtodos como los de ordenamiento de objetos (donde se logra la reduccin de dimensiones entre las variables o entre objetos a una o pocas dimensiones). Otra posibilidad es hacer anlisis de agrupamientos donde los objetos se clasifican en categoras jerrquicas sobre la base de matrices de similitud entre los mismos. En el primer caso, los objetos son representados en un espacio grfico en los cuales los ejes constituyen gradientes de combinaciones de variables. El mtodo de anlisis de componentes principales (ACP), que es un ejemplo de anlisis por ordenamiento, utiliza para tal fin las estructuras de los autovectores (tambin llamados eigens races latentes) de la matriz de correlacin o bien de una matriz de varianza-covarianza entre las variables originales. El ACP y el anlisis factorial (AF) tienen como objetivo encontrar una estructura ms simple reduciendo la dimensionalidad de las variables sin perder informacin. Para simplificar el anlisis de los datos se reduce el nmero de variables a un pequeo nmero de ndices o factores. Algunas diferencias entre estas dos tcnicas son que las componentes principales estn definidas como una combinacin lineal de la variables originales y no estn basadas en un modelo estadstico particular y por lo tanto no se requiere el cumplimiento de supuestos previos. En el AF las variables estn expresadas como una combi-

nacin de factores, est basado en un modelo especial y requiere el cumplimiento de distintos supuestos. Por otra parte mediante el ACP se busca explicar una gran parte de la varianza total, mientras que con el AF se enfatiza el estudio en las relaciones entre las variables explicadas con las covarianzas o correlaciones. El AF resulta apropiado cuando el objetivo consiste en encontrar un grupo de variables similares, altamente correlacionadas, y postular que esas similitudes provienen del hecho de que stas son variables latentes o factores que actan en forma particular sobre el proceso estudiado. Cuando el investigador est interesado en definir grupos homogneos de objetos y estudiar la estructura natural de las observaciones puede aplicar el anlisis de clusters. El objetivo consiste en descomponer un conjunto de objetos en dos o ms grupos basados en la similitud de los objetos debido a una serie de caractersticas especificadas. El uso tradicional de clusters ha sido para propsitos exploratorios. Dado que no es una tcnica de inferencia estadstica, para que los clusters de objetos exhiban la mayor homogeneidad interna y la mayor diferenciacin entre clusters slo se requiere que la muestra sea representativa y que las variables no sean multicolineales. En este anlisis, adems, slo se deben incluir aquellas variables que contribuyan a caracterizar los objetos y que se encuentren relacionadas con los objetivos del anlisis. Este anlisis es similar al AF, la diferencia es que ste agrupa a variables, mientras que el anlisis de clusters agrupa a objetos. Se recomienda que un anlisis de clusters sea posteriormente complementado con un anlisis de funciones discriminantes (AD) sobre los grupos previamente identificados. El escalamiento multidimensional (EMD), involucra una serie de tcnicas que ayudan al analista a identificar dimensiones subyacentes en la evaluacin de objetos. Es especialmente utilizado en ciencias del comportamiento, ya que permite identificar dimensiones no conocidas que afectan el comportamiento. Se basa en evaluaciones comparativas de objetos cuando las bases de comparacin son desconocidas o indefinibles. Se transforma el comportamiento de quienes perciben los objetos en distancias, las que fi-

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nalmente se representan en un espacio multidimensional. Si bien mediante el anlisis de clusters los objetos se agrupan de acuerdo con sus caractersticas, con el EMD no se enfoca el inters en los objetos en s sino ms bien, en cmo stos son percibidos. Esta tcnica mide la correlacin o covarianza de los estmulos derivados de las caractersticas de los objetos a ser evaluados. As, las representaciones grficas enfatizan las relaciones entre los estmulos que se estudian. El anlisis de correspondencia (AC) es un procedimiento de ordenacin apropiado para datos de frecuencias (tablas de contingencia). En este caso, la distincin entre objeto y variable es menos relevante porque stos son ordenados en forma simultnea. Cuando los objetos o individuos se renen en dos o ms grupos, definidos a priori, frecuentemente se plantea el problema de cmo describir las diferencias entre grupos sobre la base de un conjunto de variables. El propsito bsico del AD es estimar la relacin que existe entre una variable dependiente cualitativa (machos vs. hembras o genotipos resistentes vs. genotipos susceptibles) y entre un grupo de variables independientes cuantitativas con distribucin normal. Lo mismo que en el caso de ACP y AF, el AD se basa en la posibilidad de encontrar una combinacin lineal de las variables originales. Como caracterstica, el AD permite identificar aquellos grupos ya formados a los cuales pueden ser asignados nuevos objetos en estudio (individuos, genotipos). Posibilita adems la identificacin de cul o cules de las variables independientes contribuye ms a la diferenciacin entre grupos. El anlisis multivariado de la varianza (MANOVA) es un procedimiento de inferencia estadstica usado para evaluar la significancia de la diferencia entre los grupos, que se hallan delimitados sobre la base de las distintas variables independientes discretas o tratamientos. Es una extensin del ANOVA, slo que las diferencias se establecen teniendo en cuenta simultneamente dos o ms variables dependientes cuantitativas de distribucin normal. Por ello este anlisis es particularmente til cuando los datos provienen de diseos experimentales. Tambin pude ser considerado como una extensin del AD, aunque en ste la nica

variable dependiente es categrica y las variables independientes son cuantitativas, mientras que el MANOVA involucra un grupo de variables dependientes cuantitativas y las variables independientes son cualitativas. Las correlaciones cannicas (CC) reducen las dimensiones de dos grupos de variables provenientes de un mismo conjunto de objetos o individuos de manera que se puedan estudiar las relaciones conjuntas entre los grupos. Es similar al AD slo que en las CC las variables (no los objetos o individuos) son divididas en grupos, por lo que el inters se centra sobre las relaciones entre los grupos de variables. Por ejemplo, las CC se pueden utilizar cuando interesa conocer la relacin existente entre los patrones de marcadores moleculares, que representan diferentes genotipos, y algunas caractersticas ambientales donde viven los individuos muestreados. La regresin mltiple (RM) se considera el mtodo apropiado cuando se presume que los valores de una variable continua dependen de los valores que tomen las otras variables. Esta tcnica, que explora todo tipo de relaciones dependientes, tiene como objetivo predecir los cambios en una variable dependiente cuantitativa en respuesta a los cambios en las distintas variables independientes o predictoras. Los modelos de RM constituyen la base para la estimacin de parmetros en gentica cuantitativa. Son ejemplos de su aplicacin la descomposicin del valor genotpico en el efecto medio de cada alelo y las interacciones debidas a dominancia y epistasis, el clculo de la estabilidad de los genotipos mediante la descomposicin de la interaccin genotipo ambiente, el parecido entre parientes, la ubicacin y la utilizacin de QTL mediante marcadores moleculares. La ecuacin de regresin es una combinacin lineal de las variables independientes que mejor predicen la variable dependiente. La seleccin de las variables con mayor poder de prediccin se realiza mediante aproximaciones secuenciales, llamadas estimaciones stepwise (pasos inteligentes). Mediante los coeficientes de regresin estandarizados es posible determinar la importancia relativa de cada variable predictora. Las variables in-

196

OLMOS, Sofa y DI RENZO, Miguel

dependiente y dependiente deben ser cuantitativas si bien, mediante transformaciones previas, es posible incluir variables independientes no mtricas. La aplicacin del anlisis de RL permite predecir una variable dependiente binaria (0,1). Es importante tener en cuenta que para asignar causalidad en forma justificada es necesario disponer de una cantidad adecuada de datos biolgicos experimentales. Si se cumplen los supuestos bsicos, en especial la normalidad de las variables, no hay mayores diferencias entre la RL y el AD, slo que en el caso que sea posible formar ms de dos grupos, este ltimo resulta el ms apropiado. Los modelos logartmicos lineales (LOGL) comprenden a otros anlisis que permiten mostrar las relaciones que existen entre variables categricas.

Lecturas recomendadas EVERITT, B.S.; DUNN, G. 1991. Applied Multivariate Data Analysis. E. Arnold, London. HAIR, J.F.; ANDERSON, R.E.; TATHAM, R.L.; BLACK, W.C. 1995. Multivariate Data Analysis. 4ta. Ed. Prentice Hall - Upper Saddle River, New Jersery. MANLY, B.F. 1986. Multivariate Statistical Methods. A Primer. Chapman and Hall, London. RENCHER, A.C. 1995. Methods Of Multivariate Analysis. J. Wiley & Sons, Inc. New York.

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

197

VI.-Captulo 2
Mtodos para estimar variabilidad gentica
Winzer, Nlida; Di Renzo, Miguel; Olmos, Sofa 1 Introduccin La informacin procesada a partir de las tcnicas que se desarrollan en este libro pueden ser de diversos tipos y puede tratarse, por otro lado, del anlisis de una sola variable o de varias variables evaluadas en cada individuo o muestra. Los anlisis estadsticos a utilizar dependen de estos dos aspectos, tipo de datos y nmero de variables, y, adems, de qu objetivo se haya planteado el investigador. Si se trata de una sola variable se podrn aplicar las tcnicas aprendidas en un curso bsico de estadstica (comparacin de dos medias, anlisis de la varianza, anlisis de regresin, pruebas chi-cuadrado, etc.), o bien alguna de sus generalizaciones. En este captulo se desarrollarn en ms detalle algunas metodologas multivariadas. Se han seleccionado aquellas que se utilizan con mucha frecuencia y que no requieren demasiados conocimientos previos. Los datos multivariados se ordenan en una matriz. A efectos de unificar el lenguaje se considerar que cada fila de la matriz representar un individuo, una muestra, una especie; en definitiva, una OTU (Operational Taxonomic Unit). Las columnas representarn los caracteres o variables que se observan en cada OTU. 2 Tipo de datos DATOS DOBLE ESTAD: Son los tambin llamados datos binarios o dicotmicos. Estos datos se presentan cuando el carcter puede tomar slo dos estados posibles. Habitualmente se codifican como 0 1. Hay que reconocer dos tipos de situaciones donde pueden aparecer datos binarios. a) Datos de presencia o ausencia. Slo se registra la presencia ausencia del carcter.

Ejemplo: Presencia o no de una banda en una corrida electrofortica de isoenzimas o marcadores moleculares. b) Datos doble estado excluyentes. El carcter tiene slo dos estados posibles y la asignacin del 0 el 1 es indistinta. Ejemplos: Carcter: Sexo. Codificacin: Hembra = 0, Macho = 1, Hembra = 1, Macho = 0. Tipo de Fruto: dehiscente indehiscente. Clasificacin de hojas: paripinadas imparipinadas. La distincin entre uno u otro tipo de dato binario es importante al momento de seleccionar la medida de asociacin. DATOS MULTIESTADO CUALITATIVOS: El carcter puede tomar un conjunto finito de estados. Ejemplos: Margen de la hoja: aserrado, lobulado, entero. Color de la flor: blanca, roja o rosada. Disposicin de fololos en el raquis: alternos, subopuestos, opuestos. Identificacin de los nucletidos presentes en una determinada secuencia de ADN: A,C, T, G. Identificacin de los aminocidos esenciales presentes en una protena: Gly, Ala, Ser, Thr, Cys, Val, Ile, Leu, Pro, Phe, Tyr, Met, Trp, Asn, Gln, His, Asp, Glu, Lys, Arg. Clases de embriones somticos: globular, acorazonado, torpedo, cotiledonar. DATOS MULTIESTADO CUANTITATIVOS DISCRETOS: estn asociados a valores de conteo. Ejemplos: Nmero de hileras por espiga, nmero de macollos por planta, nmero de inflorescencias. DATOS MULTIESTADO CUANTITATIVOS CONTNUOS: Representan propiedades que se pueden expresar en una escala contnua. Ejemplos: Biomasa de plantas, peso de semillas, longitud de partes verdes, concentracin de protena del grano, frecuencia relativa de un alelo. 3 Medidas de asociacin y distancia Un objetivo frecuente suele ser la descripcin del grado de parecido que hay entre las

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OTUs,. Para ello ser necesario medir ese grado de similitud. Se describirn a continuacin algunas de las medidas que aparecen con mayor frecuencia en la literatura. Hay dos tipos de medidas: los ndices de asociacin y las distancias. Los primeros miden el grado de similitud: Cuanto ms parecidas sean 2 muestras, mayor ser su asociacin. Las segundas miden el grado de disimilitud: cuanto ms parecidas son 2 muestras menor ser su distancia. Para datos binarios es usual trabajar con medidas de asociacin. Entonces, para caracterizar a dos OTUS existen 4 valores a considerar: a = N de caracteres donde ambas muestras coinciden en el 1; b = N de caracteres donde la primera muestra tiene un 1 y la otra un 0; c = N de caracteres donde la primera muestra tiene un 0 y la otra un 1; d = N de caracteres donde ambas muestras coinciden en el 0. La suma de estos 4 valores dar el total de caracteres medidos.

J12 =

a a+b+c

Es la proporcin de caracteres presentes que comparten, respecto al total de caracteres presentes en las 2 OTUs. DICE

D12 =

Es la proporcin de caracteres copresentes respecto al promedio de los caracteres presentes en cada OTU. Se puede probar que Jaccard siempre dar un valor de asociacin menor que Dice, salvo cuando toman el valor 0 1, caso en que siempre coinciden. Ms an, ambos estn relacionados mediante la ecuacin J = D/ (2-D) D = 2J/(1+J). Esta relacin tiene como consecuencia, entre otras, que en un Anlisis de Cluster, cuando se usa ligamiento simple o completo, den los mismos grupos, slo que con distintos valores de asociacin. Ejemplo: Como resultado de la aplicacin de la tcnica RAPD sobre 6 muestras se registr la siguiente informacin sobre la presencia o ausencia de 8 bandas generadas por un cebador: Este es un proceso tpico en el anlisis de la informacin a partir de bandas. Primero se codifica la informacin, se construye la matriz de datos y, en este caso, se calcularon

2a a = + + (a + c) (a b) 2a + b + c 2

OTU 2

1 0

OTU 1 1 0 a b c d
A B 1 2 3 4 5 6 7 8

F
1 2 3 4 5 6 7 8

Si los datos son de presencia/ausencia, un criterio vlido es considerar que dos muestras son ms parecidas cuantos ms unos compartan. La coincidencia de ceros no aporta a la similitud porque puede estar generado por falta de informacin (la no amplificacin de un fragmento RAPD no informa si esto es producido por la carencia del sitio de hibridacin del cebador o bien como consecuencia de una mutacin de punto en dicho sitio, por ejemplo). Dos de los ndices que comparten este criterio son Jaccard y Dice. JACCARD

Codificacin

A 1 1 0 1 1 0 1 0

B 0 1 1 1 1 0 0 0

C 0 0 1 0 0 1 0 1

D 1 1 1 0 0 0 0 0

E 1 1 0 1 1 0 1 0

F 0 1 1 1 1 1 1 1

Matriz de Datos
1 1 0 0 1 1 0 2 1 1 0 1 1 1 3 0 1 1 1 0 1 Bandas 4 1 1 0 0 1 1 5 1 1 0 0 1 1 6 0 0 1 0 0 1 7 1 0 0 0 1 1 8 0 0 1 0 0 1

A B C D E F

Asociacin de Jaccard
A A B C D E F B C D E F A A B C D E F

Asociacin de Dice
B C D E F

1 0.5 0 0.333 1 0.5

0.5 1 0.167 0.4 0.5 0.571

0 0.167 1 0.2 0 0.429

0.333 0.4 0.2 1 0.333 0.25

1 0.5 0 0.333 1 0.5

0.5 0.571 0.429 0.25 0.5 1

1 0.667 0 0.5 1 0.667

0.667 1 0.286 0.571 0.667 0.727

0 0.286 1 0.333 0 0.6

0.5 0.571 0.333 1 0.5 0.4

1 0.667 0 0.5 1 0.667

0.667 0.727 0.6 0.4 0.667 1

200

WINZER, Nlida; DI RENZO, Miguel y Sofa OLMOS

las matrices de asociacin de Jaccard y Dice a efectos de observar las caractersticas mencionadas ms arriba. Entre las muestras A y C no se observaron bandas en comn, por lo tanto a = 0 y tanto Jaccard como Dice dan 0. Por otro lado, A y E comparten la presencia de las mismas bandas: a = 5, b = 0, c = 0. Tanto Jaccard como Dice dan 1. Entre B y E: a = 3, b = 1, c = 2. Por lo tanto, de las 6 bandas presentes en una u otra muestra comparten 3. As Jaccard vale 0.5. El total de bandas de B es 4 y el total de bandas detectadas en E es 5. El promedio de estos totales da 4,.5 por lo que la asociacin de Dice da (3/4,5) = 2/3 = 0,667. Se observa tambin que, salvo los 0 y los 1, todos los valores de Jaccard son menores que los de Dice. Adems, ambas matrices son simtricas: la asociacin entre A y E es la misma que la que se da entre E y A. Por eso, basta mostrar la mitad de la matriz de asociacin. Esta observacin ser vlida para todas las medidas que se presenten en este captulo. Si los datos son binarios pero de estados equivalentes, 2 muestran debern considerarse ms asociadas tanto cuando comparten unos como ceros, ya que la codificacin que se les asigna es indistinta. Un ndice recomendable por su simplicidad es el de Simple Matching o de Concordancia Simple: SIMPLE MATCHING

Se observa que A y E comparten todos los caracteres, por lo tanto tienen la mxima asociacin. En cambio C y E no coinciden en ninguno, su asociacin es 0. La asociacin entre C y D y entre D y E es 0,5, lo que significa que coinciden en la mitad de los caracteres evaluados. Adems de las que se han definido hasta ahora, existen muchas otras medidas para datos binarios. Tambin se pueden definir medidas de distancia o asociacin para distintos tipos de datos multiestado. Para no extender en demasa esta seccin se presentarn algunas distancias definidas especficamente para frecuencias allicas. 4 Distancias genticas Se pueden clasificar en 2 grupos: las basadas en un modelo geomtrico (Cavalli-Sforza y Rogers) y las basadas en modelos consideraciones biolgicas (Nei). Para n poblaciones, hay n(n-1)/2 pares, y si en cada una de ellas se tiene la informacin sobre los loci para m alelos, y tambin sus frecuencias correspondientes, stas pueden expresarse de la siguiente manera: Pob. 1: p1, p2, ... , pm Pob. 2: q1, q2, ... , qm Distancia Cuerda de CAVALLI-SFORZA y EDWARDS (1967)

SM12 =

a+d a+b+c+d

m d12 = 2 1 - pi q i ) i =1

Simplemente es la proporcin de caracteres que comparten las dos muestras. Si se piensa que la matriz de datos anterior corresponde a 8 caracteres binarios de estados equivalentes la matriz de asociacin con el ndice de Simple Matching dar:
A A B C D E F B C D E F

0.625 1

0 0.375 1

0.5 0.625 0.5 1

1 0.625 0 0.5 1

0.5 0.625 0.5 0.250 0.5 1

Los puntos P* = ( p1 , p 2 ,..., p m ) y Q*= ( q1 , q 2 ,..., q m ) estn sobre una esfera de radio 1. La distancia Cuerda es, precisamente, la longitud de la cuerda que une esos 2 puntos. Para el caso m = 2, se ve en el grfico la distancia cuerda entre los puntos P = (0.3, 0.7) y Q = (0.8, 0.2). Los puntos originales son llevados a la esfera (crculo) de radio 1 y luego se calcula la distancia entre esos 2 puntos: d = 0.5324

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

201

P*
0.8

P
0.6

Los dos ltimos trminos equivalen a un estado de homocigosis en la poblacin 1 y 2, respectivamente. Nei define primero la Identidad normalizada (vara entre 0 y 1) :
Q*

0.4

I=
Q

p q
i =1 m i =1

i i m

0.2

pi2 qi2
i =1

0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

y luego la Distancia Estndar: D12 = - ln I. Si se consideran simultneamente varios loci la distancia Cuerda se calcula as:
r d12 = 2 1 - i =1

j=1

mi

pijq ij )

Si se usan varios loci se trabaja con el promedio aritmtico de las probabilidades definidas anteriormente resultando:

Distancia de ROGERS (1972)

D12 = - ln

p q
i =1 j=1 2 ij r mi r i =1 j=1

mi

ij ij mi

p q
i =1 j=1

2 ij

1 r R 12 = r i =1

(p
j=1

mi

ij

- q ij ) 2

En el grfico, sta es la distancia habitual entre los puntos P y Q. Distancia Estndar de NEI (1972): Esta distancia tiene una base biolgica. Expresa la probabilidad de que dos alelos tomados al azar de dos poblaciones diferentes sean idnticos (con respecto a la probabilidad de que lo sean dos alelos tomados al azar de la misma poblacin). Sean, como antes, las poblaciones 1 y 2 y las frecuencias allicas de un solo locus:

Ejemplo: Para la informacin de la tabla, en el caso de las frecuencias de cinco alelos provenientes de dos loci, se tiene: I = 0.857986 y, por lo tanto, D = 0.15317.

pi q i se puede interpretar como la probabilidad que 2 alelos sean iguales si uno ha sido elegido al azar de la poblacin 1 y el otro de la poblacin 2.
sera la probabilidad que 2 alelos elegidos al azar de la poblacin 1 sean iguales; sera la probabilidad que 2 alelos elegidos al azar de la poblacin 2 sean iguales.

En las poblaciones naturales una de las formas de realizar el agrupamiento jerrquico de las mismas en razas, es mediante el empleo de medidas de divergencia gentica. Aqu, las llamadas distancias genticas tienen su mayor aplicacin. Las medidas de distancias genticas basadas en modelos biolgicos son las ms empleadas en estudio de gentica poblacional, debido a que resumen los conocimientos obtenidos de las fuerzas evolutivas que conllevan a los cambios genticos es decir, mediante mutaciones y deriva gentica. La medida de distancia gentica estndar de Nei es ms confiable cuando se utilizan

202

WINZER, Nlida; DI RENZO, Miguel y Sofa OLMOS

datos provenientes de muchos alelos. La distancia de Nei est formulada para un modelo donde se asume que las mutaciones ocurren en forma infinita, con la misma probabilidad para todos los alelos a una tasa de mutacin neutral, y que la variabilidad gentica inicial en la poblacin est en equilibrio entre la variabilidad producida por mutaciones y por deriva gentica, siendo el tamao efectivo de la poblacin, en cada una, constante. Basndose en estos supuestos, y de que todos los loci sean equivalentes entre s, se espera que la Distancia de Nei incremente linealmente con el tiempo. Si las frecuencias allicas en cada poblacin han sido estimadas con pocas muestras se pueden utilizar en cambio algunas modificaciones a la Distancia Estndar de Nei como las propuestas por Nei, (1978) y Hillis, (1984). La distancia de Cavalli-Sforza y Edwards, por el contrario, asume que las diferencias entre las poblaciones no provienen de mutaciones sino solamente como consecuencia de la deriva gentica. Adems, no asume que el tamao poblacional ha permanecido constante en todas las poblaciones. Considera que el tamao de la poblacin cambia en forma lineal pero no con el tiempo sino con 1/N, donde N es el tamao efectivo de la poblacin. As en estos casos, los conocimientos bsicos de gentica poblacional brindarn las herramientas necesarias en el momento de la eleccin del mtodo ms apropiado para el anlisis de nuestros datos. 5 Anlisis de coordenadas principales Si se tiene una matriz de distancias entre N muestras ser posible representar cada muestra mediante un punto de manera tal que las distancias resultantes reproduzcan las de la matriz? Veamos dos ejemplos: (i) Si se tiene la siguiente matriz D de distancias entre las muestras A, B y C:
1 .447 0 D= 1 0 .707 .447 .707 0

1.4 1.2 1.0 B 0.8 0.6 0.4 0.0


0.5 0.3 C 0.1 -0.1 -0.3 -0.5 -1.0
0.5 0.3 0.1 -0.1 C -0.3 -0.5 -1.0 A B

I
C

0.5

1.0

1.5

2.0

II

-0.5

0.0

0.5

1.0

III

-0.5

0.0

0.5

1.0

Coordenadas de A, B y C: I:(1.444, 0.881); (0.445, 0.94); (1.111, 1.179) II:(0.444, -0.119); (-0.555, -0.06); (0.111,0.179) III: (0.444, 0.119); (-0.555, 0.06); (0.111,-0.179) Si se calcula la distancia eucldea entre los puntos en uno cualquiera de estos grficos se ve que se han reproducido exactamente los valores de la matriz D. Por ejemplo:
d E (A, B) = (1.444 - 0.445) 2 + (0.881 - 0.94) 2 = 1

en el grfico I. (ii) Si se tuviera la matriz de distancias entre las muestras P1, P2 y P3: Es fcil ver que es imposible representar en un plano puntos separados por estas distancias porque si P1 y P2 se ubican como extremos de un segmento de longitud 0.9, no hay manera de ubicar un punto P3 que est a 0.5 de P1 y a 0.3 de P2.
0 0.9 0.5 # D = 0.9 0 0.3 0.5 0.3 0

se podran hacer algunos de los siguientes grficos:

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203

P1 P1 P 3? P 3?

P2 P2

donde Sij es la asociacin entre la muestra i y la j. Si la asociacin de una muestra consigo misma es 1, es decir Sii = 1, como ocurre con la mayora de los ndices, la ecuacin se reduce a: d2(i, j) = 2(1- Sij ). (2)

Se van a considerar, por ahora, distancias como las del ejemplo i). Esto es, distancias para las que se puedan encontrar puntos que reproduzcan esas distancias. Otro aspecto a considerar es el nmero de coordenadas necesarias para esos puntos. Es intuitivo que si slo hay 2 muestras a una distancia dada se pueden graficar en una recta (dimensin =1); si hay 3 muestras ya se vi que se pueden graficar en un plano (dimensin = 2); si se tuvieran 4 muestras ya son necesarias 3 coordenadas (dimensin = 3); ... y si se tienen N muestras se necesitarn, en general, N-1 coordenadas. Con lo cual si se quieren graficar 40 muestras sern necesarias 39 coordenadas!!! Es evidente que esto no es cmodo si el objetivo es obtener una representacin grfica de los puntos o muestras. Lo ideal sera obtener dos coordenadas pues se podran graficar en un plano, o bien tres para graficar en 3 dimensiones. El problema, entonces, es encontrar las 2 mejores coordenadas ( las 3 mejores) para obtener esta representacin. Ese es el objetivo del Anlisis de Coordenadas Principales (ACOOP): encontrar las k mejores coordenadas para las muestras de manera tal que si se calculan las distancias eucldeas entre ellas reproduzcan lo mejor posible una matriz de distancias dada. Habitualmente k = 2 3, a stas, se las llama Coordenadas Principales. Naturalmente se perder la informacin de las restantes coordenadas. Como se vi en el ejemplo (i) hay muchas representaciones posibles. Ah se han dado 3 pero se podran haber dado muchas ms. Una manera de reducir las opciones es obtener coordenadas de manera tal que los puntos estn centrados en el origen, como en II III. Se explicar el mtodo de obtencin de las Coordenadas Principales partiendo de una matriz de Asociacin S. En este caso las distancias que se van a reproducir son las definidas por: d2(i, j) = Sii+ Sjj- 2 Sij (1)

Se detallarn los pasos que se deberan realizar para hacer este anlisis al simple efecto de poder manejar con idoneidad los programas estadsticos de que se dispongan. Los pasos 1) a 3) son responsabilidad de esos programas. El usuario deber, fundamentalmente, indicarle qu asociacin o distancia desea calcular y cuntas coordenadas quiere. PASO 1) Centrar doblemente la matriz S S0 . P A S O 2) Calcular los autovalores y autovectores de S0. PASO 3) Calcular las coordenadas de los puntos representativos de las muestras. PASO 4) Graficarlos. El PASO 1 tiene como fin hacer que los puntos resultantes estn centrados. Cada elemento de la matriz de asociacin S se centra por filas y por columnas: (3) donde Si es el promedio de la fila i de S, S j es el promedio de la columna j y S es el promedio de todos los elementos de S. En el PASO 2 se encuentran: a) una matriz NxN donde cada columna es un vector de longitud uno. Son los autovectores. b) N nmeros ordenados en forma decreciente: los autovalores. Estos elementos son caractersticos de cada matriz S0. Por eso tambin se los conoce como vectores y valores caractersticos. Cada autovector est asociado a un autovalor. Si la matriz de distancias es representable (como la del ejemplo (i)) los autovalores sern positivos o ceros (el ms chico es siempre cero para estas matrices representables).

0 Sij

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WINZER, Nlida; DI RENZO, Miguel y Sofa OLMOS

En el PASO 3 , si se desean k coordenadas, se toman los k primeros autovectores y se multiplican por la raiz del autovalor respectivo. El primer autovector da la primera coordenada de todas las muestras, el segundo la segunda coordenada y as siguiendo hasta la k-sima. Si slo se desean 2 coordenadas para graficar los puntos en un plano se toman los 2 primeros autovectores (k=2). Veamos un ejemplo sencillo:
0.5 0.9 1 S = 0.5 1 0.75 0.9 0.75 1
Autovalores de S0 :

de las distancias. Hay 2 tipos de porcentajes que se pueden calcular: Porcentaje de Dispersin:

a1=

l1 + l2 x 100% l1 +l2 +...+ln

si slo se usan 2 coordenadas. Este porcentaje se interpreta teniendo en 2 d ij cuenta que: 2N (1 + ...+ N) = , sumando sobre todos los pares de muestras. En cambio, la suma del cuadrado 0.21110.2390.028 de las distancias reconstruidas Doble centrado S0 = -0.239 0.3111 -0.072 con las dos coordenadas es igual 0.0280.0720.0444 a 2N (1 + 2). Por lo tanto, este l1 = 0.5167 l2 = 0.05 l3 = 0 porcentaje mide cunto se rev1 v2 v3 construye del cuadrado de todas 0.6173 - 0.5344 0.57735 las distancias.

Autovectores de S0 : Columnas de V = -0.7716

0.1543

- 0.2674 0.8019
l 22 v

0.57735 0.57735

Primeras 2 Coordenadas: Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3

l11 v
0.4437 -0.5546 0.1109

-0.1195 -0.0598 0.1793

Si se usan ms de 2 coordenadas se van sumando los autovalores correspondientes en el numerador. En nuestro ejemplo: 1 = 100% .

0 sij

Grfico: Es el Grfico II que se vi ms arriba donde A es la muestra 1, B la 2 y C la muestra 3. Las distancias ( 2 ) calculadas a partir de la matriz de asociacin S dan la matriz de Distancias D. Por esa razn ambas matrices tienen la misma representacin.
2 d12 = 2(1 - S12 ) = 2(1 - 0.5) = 1
2 d13 = 2(1 - S13 ) = 2(1 - 0.9) = 0.2

Porcentaje de Distorsin:

l1+l2 a1= 2 x 100% l 1 +l22 +...+l2n


Este valor mide cunto se acercan los valores de la matriz de asociacin reconstruda respecto de la matriz de asociacin original S0. Ms exactamente:
a2= 1- S - 0S2 S
0 0* 2

d12 = 1
d13 = 0.447

d2 d 23 = 0.707 23 = 2(1 - S23 ) = 2(1 - 0.75) = 0.5

x 100%= 1-

(S - S (S )
0 ij

0* 2 ij

0 2 ij

x 100%

OBSERVACIN 1: Como en el ejemplo slo hay 3 muestras los autovectores tienen 3 componentes. Si se trabajara con una matriz de asociacin entre 40 muestras, los autovectores tendran 40 componentes, una por cada muestra. OBSERVACIN 2: Para la matriz S se han reconstrudo totalmente las distancias porque slo son 3 muestras. Si hubiera ms (N=40, por ejemplo) slo se reconstruiran totalmente las distancias si se usan 39 coordenadas. Si se usan slo las dos primeras se reconstruye, en general, slo un porcentaje

En este algoritmo se ve que lo que se est comparando son las asociaciones originales, 0* ,con las reconstruidas, sij , una a una. Para el clculo de 2 se usa la primera frmula por lo que el lector no debe traumatizarse con la segunda. OBSERVACIN 3: Si se hubieran obtenido autovalores negativos la primera medida no es recomendable. Hasta podra darse el caso que 1 fuera mayor al 100%. La segunda, en cambio, sigue teniendo sentido. Por

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otro lado, no se podran calcular coordenadas asociadas a ese autovalor porque no se puede calcular i . La aparicin de autovalores negativos no es necesariamente un problema grave para la representacin siempre que los autovalores negativos sean pocos y pequeos. Por ejemplo, si se trabaja con 50 muestras, en el PASO 2 se obtendrn 50 autovalores, de los cuales uno, seguramente, es cero. Para la representacin en el plano se usan slo los 2 primeros. Si los ltimos 10 son negativos no se vern afectados los clculos de las coordenadas. Hay asociaciones y distancias que nunca dan autovalores negativos, entre ellos se encuentran Jaccard, Ochiai, Russell y Rao, Simple Matching, y distancia eucldea. Si en lugar de tener una matriz de asociaciones se tiene una matriz de distancias el procedimiento consiste en calcular una matriz S cuyos elementos son: (4) 2

No debe causar sorpresa, entonces, que con un programa se obtenga un grfico y con otro el mismo grfico pero con una reflexin sobre uno u otro eje, o sobre los dos. Por otro lado, tambin es lcito cambiar, por alguna razn, el signo de una coordenada. Por ejemplo, esto puede ser til cuando se quieren comparar Anlisis de Coordenadas Principales realizados con distintas asociaciones o distancias sobre el mismo conjunto de muestras. Ejemplo: Presentamos la caracterizacin de 8 cultivares comerciales y 35 cultivares en experimentacin mediante anlisis isoenzimtico de semillas de Amaranthus. Estas accesiones pertenecen a siete especies: A. caudatus, A. cruentus , A. hypochondriacus , A. mantegazzianus, A. dubius, A. tricolor, y A. hybridus. Del total de 43 cultivares, 31 fueron polimrficas con 7 sistemas isoenzimticos. Se aplic anlisis de coordenadas principales el cual, estuvo basado en la presencia o ausencia de las 23 bandas polimrficas. En la figura puede observarse el nivel de diversidad gentica dentro de este germoplasma representado por las coordenadas 1 y 2. Este anlisis agrup la mayora de los cultivares de acuerdo a su clasificacin taxonmica as como mostr que existen relaciones entre diferentes accesiones. Se concluye que el anlisis isoenzimtico de semillas fue efectivo para caracterizar los cultivares destinados a los programas de mejoramiento de Amaranthus.
A.hypoch A.caudat. A.manteg. A.dubius A.tricolor A.hybrid.

sij = -

d ij 2

y luego seguir los PASOS 1, 2, 3 y 4 anteriores. OBSERVACIN 4: Cada autovector de S0 es un vector de longitud 1 en una cierta direccin. Pero por cada direccin podemos tener 2 vectores: v y -v. Por ejemplo:
-0.5344 v 2 = -0.2674 0.8019 0.5344 - v 2 = 0.2674 -0.8019
0.6

A.cruen.

Cualquiera de estos dos vectores pueden usarse como segundo autovector y, ms an, algunos programas pueden dar como resultado el primero y otros el segundo. Como consecuencia de esta seleccin se obtendr el grfico II el III. Se ve que el nico efecto de usar uno u otro vector es una reflexin del grfico respecto del primer eje. Si se cambia el signo de v1 se obtendr una reflexin respecto del segundo eje. Ninguno de estos cambios modifica la distancia entre los puntos.

38-39 40-43 0.4 6-9-10-11 2 0.2 14 5 0.0 12 15 7 8 29-30 -0.4 31 3 28 1 35 20 16 25 26 21 23 24 -0.6 -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 13 36 34 27 4 17 41 42 37

-0.2

19

18-22 32-33

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WINZER, Nlida; DI RENZO, Miguel y Sofa OLMOS

Matriz de datos

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43

1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

2 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1

3 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0

4 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1

6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0

7 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1

8 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

9 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

10 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1

11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

16 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0

17 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

18 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0

19 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

20 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

21 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0

22 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0

23 0 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

207

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

V1 -0.12709 -0.10710 -0.12311 -0.00462 -0.22005 -0.23182 -0.12459 -0.12472 -0.23182 -0.23182 ...

V2 0.03060 0.13683 0.09085 0.07441 0.07043 0.16179 -0.11226 -0.09717 0.16179 0.16179 ...

CP1 -0.27881 -0.23496 -0.27007 -0.01014 -0.48274 -0.50856 -0.27331 -0.27360 -0.50856 -0.50856 ...

CP2 0.05495 0.24570 0.16313 0.13362 0.12647 0.29052 -0.20157 -0.17448 0.29052 0.29052 ...

Autovalores: 4.81258 3.22431 1 = 46.85 2 = 78.2

Al slo efecto de que el lector pueda repasar algunos clculos se dan los primeros 10 elementos de los 2 primeros autovectores y las 2 primeras coordenadas Principales. 6 Anlisis de agrupamientos (cluster) Esta tcnica tiene como objetivo formar grupos de muestras, poblaciones, individuos u OTUs que sean similares entre s y diferentes a los elementos de los otros grupos. El primer problema es fijar el criterio para decidir cundo dos elementos son similares. Si se tuviera un mazo de cartas, cmo formar grupos? por el valor de la carta?, porque comparten el palo?. Segn el criterio que se aplique los grupos que se formen sern distintos. En la seccin anterior hemos visto distintas maneras de definir la similitud o disimilitud entre OTUs. Cada una de ellas, u otras que no se han presentado aqu, plantean distintas formas de medir la similitud entre los elementos a agrupar. Existen, adems, muchos mtodos para formar los grupos. Uno de los ms usados son los agrupamientos jerrquicos que pueden, a su vez, ser divisivos o aglomerativos. Los primeros comienzan con todos los elementos en un solo grupo y en sucesivas divisiones se van formando grupos cada vez ms pequeos. Los aglomerativos, por el contrario, empiezan considerando tantos grupos como elementos se tienen y se van agrupando segn su grado de parecido. Los sucesivos pasos de uno y otro mtodo se pueden representar en un grfico denominado dendrograma.

En esta seccin se tratarn solamente los mtodos jerrquicos divisivos. Aqu se plantea un segundo problema: Qu tipo de ligamiento se va a utilizar? Esto es, una vez realizado el primer agrupamiento, cmo se define la distancia entre ese grupo y los restantes elementos? Supongamos que en un primer paso se han agrupado los elementos A y B porque son los que presentan la menor distancia entre s. La distancia entre el nuevo grupo AB y otro elemento C se puede definir segn el criterio empleado para incorporar al nuevo elemento: LIGAMIENTO SIMPLE: d(AB,C) = mn {d(A, C), d(B, C)}, LIGAMIENTO d(B, C)},
COMPLETO:

d(AB,C) = mx {d(A, C),

LIGAMIENTO PROMEDIO: d({A,B},C) =

En el caso del ligamiento simple, la incorporacin del nuevo elemento est basada en la extraccin de los menores valores de distancias entre el nuevo elemento y el grupo preformado, y entre el nuevo elemento y las restantes OTUs que se consideren. En cambio, el ligamiento completo lo que hace es extraer los mayores valores de distancia, respectivamente. Si A, B y C son grupos formados en pasos anteriores, se usan los mismos algoritmos en el caso del ligamiento simple o completo. Para el ligamiento promedio hay que promediar todas las distancias entre ele-

d(A, C) + d(B, C) 2

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WINZER, Nlida; DI RENZO, Miguel y Sofa OLMOS

mentos de AB y de C:

d(AB, C) =

d
i, j

ij

A B C D E F

A 0 1 1.41 1.15 0 1.1

B 1 0 1.29 1.10 1 0.93

C 1.41 1.29 0 1.26 1.41 1.07

D 1.15 1.10 1.26 0 1.15 1.22

E 0 1 1.41 1.15 0 1

F 1.1 0.93 1.07 1.22 1 0

n AB n C

AE B C D F

AE 0 1 1.41 1.15 1.1

B 1 0 1.29 1.10 0.93

C 1.41 1.29 0 1.26 1.07

D 1.15 1.10 1.26 0 1.22

F 1.1 0.93 1.07 1.22 0

donde dij es la distancia entre el elemento i del grupo AB y el j de C; nAB y nC son los nmeros de elementos en el grupo AB y C, respectivamente. Este ligamiento promedio se conoce tambin por las siglas UPGMA (Unweighted Pair Groups Method with Arithmetic AE BF C D Averages). AE 0 1.1 1.41 1.15 0 1.29 1.22 Consideremos la matriz de dis- BF 1.1 1.41 1.29 0 1.26 tancias de la tabla. Se realizar un C D 1.15 1.22 1.26 0 agrupamiento aplicando ligamiento simple. AEBF C D En primer lugar se agrupan los AEBF 0 1.41 1.22 C 1.41 0 1.26 elementos A y E porque estn a D 1.22 1.26 0 menor distancia (son iguales). ForAEBFD C mado ese primer grupo habra que AEBFD 0 1.41 calcular las nuevas distancias del C 1.41 0 grupo AE a los restantes elementos pero como d(A, U) = d(E, U) para todos los restantes elementos U se AE BF C D mantienen esas distancias. AE 0 1.05 1.41 1.15 En el segundo paso se observa BF 1.05 0 1.18 1.16 1.41 1.18 0 1.26 que la menor distancia es la de B a C D 1.15 1.16 1.26 0 F; se forma ese grupo y se recalculan las distancias del nuevo AEBF C D grupo a los restantes. Y as hasta AEBF 0 1.295 1.155 C 1.295 0 1.26 que se han agrupado todos. TamD 1.155 1.26 0 bin se puede detener el proceso AEBFD C fijando algn otro criterio para ello. AEBFD 0 1.277 Por ejemplo, cuando se ha alcanC 1.277 0 zado una distancia mxima fijada previamente. A continuacin se aplica el ligamiento mados inicialmente se van acoplando los rescompleto. Los 2 primeros agrupamientos co- tantes elementos. En cambio, el ligamiento inciden en este ejemplo, por lo que slo se completo tiende a generar muchos grupos muestran los tres ltimos pasos. chicos que se reunirn en los ltimos pasos. El ligamiento promedio conduce a las siEl anlisis de Agrupamientos slo debe guientes agrupaciones: tomarse como un mtodo exploratorio. Si Los mismos mtodos se pueden aplicar originalmente los datos forman grupos bien sobre matrices de asociacin cambiando los separados cualquier mtodo de agrupamienconceptos de menor distancia por el de to dar, aproximadamente, los mismos remenor asociacin. sultados. Pero si las muestras forman un En general, el ligamiento simple produce contnuo, cada mtodo y cada medida de agrupamientos en cadena: a los grupos for- distancia pueden conducir a resultados muy
AE BF C D AE 0 1 1.41 1.15 BF 1 0 1.07 1.10 C 1.41 1.07 0 1.26 D 1.15 1.10 1.26 0
AEBFC D AEBFC 0 1.10 D 1.10 0

AEBF C D

AEBF 0 1.07 1.10

C 1.07 0 1.26

D 1.10 1.26 0

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dispares. En este caso las conclusiones deben realizarse con cautela. A veces es conveniente realizar un Anlisis de Coordenadas Principales para determinar si existen grupos claramente definidos o no. 7 Lecturas recomendadas
CAVALLI-SFORZA, L.L. y A.W.F. EDWARDS. 1967. Phylogenetic analysis: models and estimation procedures. Am. J. Hum. Gen. 19: 233-257. DI RENZO, M.; BONAMICO, N.; GESUMARIA, J. 2001. Characterisation of amaranth accessions by isozymic patterns. Seed Science And Technology, v.29 (1): 227238. EVERITT, B.S.; DUNN, G. 1991. Applied Multivariate Data Analysis. E. Arnold, London. HAIR, J.F.; ANDERSON, R.E.; TATHAM, R.L.; BLACK,

W.C. 1995. Multivariate Data Analysis. 4ta. Ed. Prentice Hall - Upper Saddle River, New Jersery. HILLIS D, 1984. Misuse and modification of Neis genetic distance. Syst Zool 33:238-240. MANLY, B.F. 1986. Multivariate Statistical Methods. A Primer. Chapman and Hall, London. NEI, M. 1972. Genetic distances between populatios. Am. Nat. 106: 283-292. NEI, M. 1978. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from small number of individuals. Genetics 76: 379-390. RENCHER, A.C. 1995. Methods Of Multivariate Analysis. J. Wiley & Sons, Inc. New York

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WINZER, Nlida; DI RENZO, Miguel y Sofa OLMOS

PARTE VII Genmica

Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

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ECHENIQUE, Viviana; SCHRAUF, Gustavo; SELVA, Juan P.

VII.-Captulo 1
Genmica
Echenique,Viviana; Schrauf, Gustavo; Selva, Juan P. 1 Introduccin La genmica se desarroll en los ltimos 10 aos como consecuencia de los avances realizados en biologa molecular e Informtica, dos reas de la ciencia que han tenido un desarrollo tecnlogico enorme, generando una revolucin en el conocimiento y en la comprensin de los procesos biolgicos. El trmino fue acuado en 1986 por Thomas Roderick para referirse a la subdisciplina de la gentica que se ocupa del mapeo, secuenciacin y anlisis de las funciones de genomas completos y sirvi de nombre para una revista especializada en la publicacin de los mencionados temas, Genomics . Consiste en la caracterizacin molecular de genomas enteros y aporta informacin acerca de la secuencia y de la funcin de cada sector del genoma en diferentes situaciones de desarrollo y bajo diferentes condiciones ambientales, as como de los mecanismos implicados en la regulacin de la expresin e interaccin gnica. Para ello, las herramientas que se utilizan para el anlisis individual de genes o pequeas regiones cromosmicas, se aplican al anlisis global de genomas completos, estudiando en conjunto los miles de genes, protenas y metabolitos que constituyen un organismo, as como las complicadas redes de interacciones que operan entre ellos. La informacin generada es enorme y es clave para la identificacin y el aislamiento de genes de inters y permitir interpretar, en trminos moleculares, los procesos biolgicos. Para ayudar en este proceso han surgido poderosas herramientas bioinformticas que permiten almacenar e interpretar esta informacin. Las aplicaciones de la genmica alcanzan a todos los mbitos de la actividad humana relacionados con la biologa, como la salud, la alimentacin y el medio ambiente. En pocos aos estarn disponibles las secuencias

de nucletidos y aminocidos de todos los genes y productos gnicos codificados por los genomas de varios organismos complejos. Estas servirn para el estudio de enfermedades humanas complejas y para comprender fenmenos tales como la fisiologa celular, el desarrollo, la conducta, la evolucin, etc. Tambin aportarn informacin acerca de todos los aspectos del crecimiento y desarrollo vegetal, diferenciacin y respuesta a estreses biticos y abiticos. Gracias al potencial de relacionar fenotipos biolgica y econmicamente importantes con los genes responsables de los mismos ser posible identificar genes de inters que puedan ser transferidos a otros organismos por medio de tecnologa gnica. Por otro lado, el conocimiento de la secuencia de los genes posibilitar el desarrollo de marcadores perfectos, basados en la secuencia del mismo gen, lo cual facilitar la seleccin y la transferencia de los mismos a variedades de inters. La conjuncin entre tecnologa gnica, marcadores moleculares, genmica y bioinformtica revolucionar el mejoramiento gentico vegetal, dando origen a lo que se denomina mejoramiento molecular y conducir al desarrollo de nuevos y promisorios cultivares (Fig. 1). La genmica se divide en dos grandes reas: - Genmica estructural, que se ocupa de la caracterizacin fsica de genomas enteros. - Genmica funcional, que caracteriza el transcriptoma, que est constitudo por el conjunto completo de transcriptos, producidos por un organismo, el proteoma o conjunto de protenas codificadas por un genoma, y el metaboloma o conjunto total de metabolitos de una clula, consecuencia de la funcin de los RNA y protenas. El objetivo de la genmica es la dilucidacin completa y exacta de la secuencia de ADN de un genoma haploide representativo de una especie. Cuando esta secuencia se conoce, abre la puerta a numerosas posibilidades. Por anlisis computacional de la misma y utilizando principios conocidos de gentica y el anlisis molecular de los transcriptos y protenas es posible: - Comparar secuencias similares presentes en diferentes entidades biolgicas y comprender el papel de dichas secuencias.

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Esto ha dado origen a la genmica comparativa y ha demostrado que existe considerable sintenia es decir una localizacin conservada de genes en posiciones equivalentes en especies relacionadas (Fig. 2). Tambin ha sido una excelente herramienta para identificar motivos de secuencia altamente conservados y, por lo tanto, funcionalmente importantes en regiones codificantes y no codificantes del genoma. Catalogar las variaciones genticas entre individuos ayudar a identificar aquellos cambios que conducen a enfermedades genticas, investigar nuevas terapias y establecer la resistencia o susceptibilidad a diferentes factores. En Febrero de 2001, coincidiendo con el cincuenta aniversario de la puFigura 1: La conjuncin entre tecnologa gnica, marcadores moleculares, genmica y bioinformtica revolucionarn el blicacin del modelo estructural del mejoramiento vegetal, conduciendo al desarrollo de nuevos DNA por Watson y Crick, la revista cultivares. Los nuevos genes hallados sern introducidos en Nature public el primer borrador del plantas por tecnologa gnica. Esto a su vez permitir establecer genoma humano, que ha sido la funcionalidad de los mismos. El conocimiento de la secuencia permitir la obtencin de mapas, marcadores perfectos y realizar secuenciado completamente. Tamseleccin asistida por marcadores moleculares (MAS), as como bin se han secuenciado el fenotipeado molecular. Gentileza de G. Spangenberg. exitosamente en los ltimos aos los genomas completos de ms de 30 bacterias - Realizar predicciones acerca de todas y de varios eucariotas, entre los que se enlas protenas codificadas por una especie. cuentran la levadura, Saccharomyces - Establecer las variaciones genticas cerevisiae , el nematodo Caenorhabitis entre distintas poblaciones de una misma especie. - Comparar secuencias de diferentes especies y entender procesos evolutivos.
Figura 2: Sintenia entre los genomas de varias gramneas. El genoma de arroz contiene grupos de marcadores que se hallan altamente conservados en muchos cereales, por lo cual dichos genomas pueden sintetizarse bsicamente como compuestos por bloques de ligamiento de arroz. En la figura se muestra el alineamiento de los cromosomas y segmentos de cromosomas (identificados con letras maysculas) de varias gramneas con los del arroz (centro). El genoma del maz tiene dos copias semejantes de cada bloque de genes por lo que est representado por dos anillos del crculo. Las lneas externas punteadas conectan sectores adyacentes de los cromosomas de trigo. Modificado de Gale y Devos (1998) y de Snustad et al. (2003)

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ECHENIQUE, Viviana; SCHRAUF, Gustavo; SELVA, Juan P.

elegans, la mosca del vinagre Drosophila melanogaster y una planta, Arabidopsis thaliana. Actualmente se encuentran en marcha proyectos de secuenciacin de los genomas de diferentes modelos animales como rata, ratn, perro, gato, cerdo, etc. y vegetales como arroz, maz, colza, soja, trbol, raigrs, etc. A continuacin se brinda un panorama global acerca de la forma en que se articulan los proyectos de genmica, algunos resultados relevantes, las aplicaciones en agricultura y el estado de la investigacin en Sudamrica. 2 Genmica estructural

Como su nombre lo indica, el objetivo de la misma es caracterizar la estructura del genoma. Conocer la estructura de un genoma individual puede ser de utilidad para manipular genes y segmentos de ADN en una especie particular. El anlisis comparativo de diferentes genomas posibilitar deducir reglas generales que gobiernan la estructura de todos los genomas. La genmica estructural procede a travs de niveles incrementales de resolucin analtica, comenzando con la asignacin de genes y marcadores a cromosomas individuales, mapeando estos genes y marcadores dentro de los cromosomas, finalizando con la preparacin de un mapa fsico a travs de la secuenciacin. Es decir, que se procede desde un mapeo gentico de baja resolucin, basado en el anlisis de recombinacin meitica, hacia uno de alta resolucin, basado en marcadores moleculares, llegando a la realizacin de un mapa fsico, basado en la secuencia de fragmentos clonados parcialmente solapantes (Fig. 3). Los pasos seran: Mapeo cromosmico de baja resolucin (ubicacin de genes que producen fenotipos mutantes conocidos y algunos marcadores). Las distancias genticas se basan en frecuencias de entrecruzamientos (crossing overs) y son medidas como porcentaje de recombinacin en centiMorgans (cM). - Mapeo gentico de alta resolucin de cada cromosoma (con marcadores moleculares ubicados muy prximos entre s).

Figura 3: Niveles de complejidad de la genmica estructural. La genmica estructural procede desde un mapeo gentico de baja resolucin, basado en el anlisis de recombinacin meitica, a uno de alta resolucin, basado en marcadores moleculares hasta la realizacin de un mapa fsico, basado en la secuencia de fragmentos clonados solapantes. Modificada de Griffths et al. (2000).

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- Mapeo fsico , basado en distancias moleculares, resultantes de mapas de fragmentos de restriccin parcialmente superpuestos. La distancia entre dos marcadores puede ser medida determinando el tamao de los fragmentos de restriccin que los contienen, siendo el fragmento ms pequeo que lleva ambos marcadores una estimacin de la distancia entre ellos. Utilizando combinaciones de sondas y enzimas de restriccin puede construirse un mapa fsico determinando qu fragmentos poseen marcadores en comn. Las distancias fsicas se miden en kilobases (Kb) o megabases (Mb). - Anclado del mapa gentico en el mapa fsico. - Secuenciacin de ADN a gran escala, que brinda un mapa completo de cada cromosoma. - Anclado del mapa gentico y del mapa fsico en el de secuencia. Las distancias fsicas generalmente no se correlacionan directamente con las distancias genticas porque las frecuencias de recombinacin no son siempre proporcionales a las distancias moleculares. Sin embargo, a menudo las dos correlacionan razonablemente bien en las regiones eucromticas de los cromosomas (aquellas menos condensadas, que se colorean de manera ms difusa ). En humanos, un cM es equivalente, en promedio, a aproximadamente 1 Mb de ADN. 2.1 Asignacin de loci a cromosomas especficos Se utilizan los siguientes mtodos: - Ligamiento a loci conocidos: anlisis tradicional basado en cruzamientos, en especies en las que es factible hacerlo. - Electroforesis de campo pulstil: se usa en el caso de especies que poseen cromosomas pequeos, separables por esta tcnica, como sucede con los de levaduras. Las bandas en el gel corresponderan a cromosomas individuales y pueden utilizarse para localizar nuevos genes por hibridacin. Primero, utilizando sondas de localizacin conocida se establece que banda corresponde a cada cromosoma. Luego, un nuevo gen clonado de ubicacin desconocida se utiliza como sonda para asignarle una posi-

cin en un cromosoma determinado. - Hbridos celulares interespecficos, por ejemplo humano-ratn. Se utiliza exclusivamente en mapeo del genoma humano o de especies animales. Se establecen bancos de lneas celulares que contengan todos los cromosomas del roedor y un cromosoma humano particular. Siempre incluye un cromosoma humano que lleva un alelo salvaje defectivo para una funcin bioqumica determinada en el genoma del ratn. Si sobreviven en un cultivo deficiente para el factor que no sintetizan es porque llevan el alelo humano equivalente, que complementa la funcin faltante . 2.2 Ubicacin de los genes a lo largo del cromosoma El prximo nivel de resolucin consiste en determinar la posicin de un gen o marcador molecular sobre el cromosoma. Este paso es importante porque los mapas genticos pueden alinearse con los mapas fsicos y utilizarse para validar los mismos. - Mapeo por recombinacin: en los casos en que ha sido factible hacerlo -organismos experimentales como levaduras, la mosca de la fruta, ratn, Arabidopsis, etc- ha posibilitado la construccin de mapas que a lo largo de los aos aparecen repletos de genes con efectos fenotpicos determinados. Sin embargo, los intervalos recombinacionales entre genes conocidos contienen cantidades muy grandes de ADN. Estos intervalos o gaps no pueden ser completados utilizando anlisis de ligamiento debido a la ausencia de marcadores en esas regiones. Para llenarlos y construir mapas de alta resolucin surgieron los marcadores moleculares, entre los que se encuentran los RFLP y los SSLP (mini y microsatlites) (ver II.-4 y IV.-2). Estos marcadores permiten la construccin de mapas genticos con una densidad de un marcador /centimorgan (cM). Aunque tal resolucin es un logro muy importante, un centimorgan representa, en humanos, una megabase, lo que equivale a un milln de pares de bases o 1000 kb. Para lograr mayor resolucin actualmente existen los SNP, que son marcadores basados en el polimorfismo de un solo nucletido. - Hibridacin in situ: cuando se dispone

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de un gen clonado ste puede ser utilizado como sonda para hibridar con los cromosomas in situ , para lo cual se lo marca radiactivamente o por fluorescencia. Puede, de ese modo, identificarse a los cromosomas portadores de la secuencia, determinar si son secuencias especficas de un cromosoma y determinar la posicin del gen en el mismo. En el caso de fluorescencia, la tcnica se denomina FISH (fluorescence in situ hybridization). La localizacin del fragmento en el cromosoma se visualiza como un punto brillante (ver II.-5). - Mapeo fsico de los cromosomas: aporta un nivel de resolucin mayor. Se trata de identificar un conjunto de fragmentos de ADN clonados superpuestos que juntos representen un cromosoma o un genoma completo. Los mapas as obtenidos se llaman mapas fsicos, porque el ADN es el material fsico del genoma. El mapa fsico es til en tres aspectos: 1- Los marcadores genticos ubicados en los clones pueden ordenarse y contribuir al proceso general de mapeo. 2- Cuando se han obtenido los clones contiguos, ellos representan una genoteca ordenada de secuencias de DNA que puede utilizarse para futuros anlisis genticos, como, por ejemplo, correlacionar fenotipos mutantes con disrupciones en regiones moleculares especficas. 3- Estos clones constituyen la materia prima para secuenciar en proyectos genmicos a gran escala. 2.3 Secuenciacin a gran escala del genoma - Generacin de bancos de EST (etiquetas de secuencias expresadas) La complejidad de los genomas eucariotas hace aconsejable, como primera aproximacin, no abordar el estudio del genoma completo. Es preferible estudiar slo una fraccin del mismo, es decir, aquellos genes que se estn expresando en un momento determinado de la vida del organismo. Para ello se obtienen poblaciones de ADNc (que reflejan slo secuencias expresadas) que se secuencian de forma masiva para

generar miles de secuencias parciales conocidas como ESTs (ver VII.- 2). Estas secuencias de entre 300-500 pb suelen ser suficientes para la identificacin de los genes mediante comparacin con las secuencias existentes en las bases de datos pblicas (ej. Genbank, EMBL), utilizando para ello programas de anlisis informtico. Si la informacin contenida en la secuencia parcial no es suficiente, habra que determinar la estructura del ADNc completo para estudiar su funcin por otros mtodos. - Secuenciacin genmica La aproximacin anterior no permite identificar genes que se expresan a bajo nivel o en situaciones fisiolgicas no consideradas o regiones no representadas en el ARNm. Para obtener esta informacin debe secuenciarse el genoma completo. Para ello, el ADN genmico total se digiere con enzimas de restriccin apropiadas o se fragmenta mecnicamente para generar fragmentos de gran tamao (100-300 kb), que se clonan en vectores apropiados, para construir genotecas que contienen, al menos, una representacin completa del genoma, que puede estudiarse en detalle y secuenciarse (ver II.-3). A fin de distinguir las regiones codificantes para genes, que en muchos organismos representan un porcentaje bastante pequeo del genoma, de las no codificantes, las secuencias se comparan con las secuencias de ESTs y ADNc previamente estudiadas. a) Secuenciacin de los clones y ensamblado de los fragmentos El clonado comienza obteniendo un nmero elevado de fragmentos al azar que se clonan en un vector apropiado. En la preparacin de mapas fsicos de genomas se utilizan vectores como los csmidos, los YAC, los BAC y los PAC, que aceptan insertos de gran tamao (ver II.-3). El contenido de estos clones se caracteriza y se ordenan, buscando los puntos de solapamiento o superposicin. Un conjunto de clones solapantes se llama contiguo (contig). Para establecer el solapamiento de clones al azar se secuencian regiones cortas del inserto proximales al sitio de clonado utilizando primers posicionados en el vector. Los vacos (gaps) se completan utilizando el final de un

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Se utilizan varias tcnicas para ordenar los clones en contiguos. Entre ellas: - FISH: para localizar las posiciones aproximadas de insertos grandes. - Fenotipificacin (fingerprinting): se corta el clon con enzimas de restriccin que generan un grupo de bandas que representan un fingerprint o huella digital del clon. Las bandas generadas por vaFigura 4: Estrategia de secuenciado jerrquico (hierarchical shotgun rios clones pueden sequencing strategy). El primer paso consiste en construir una alinearse visualgenoteca por fragmentacin del ADN e introduccin del mismo en mente o por un vectores que aceptan grandes insertos, en este caso de BACs. Los programa de comfragmentos de ADN representados en la misma son organizados en putacin para deun mapa fsico y los clones individuales son seleccionados y secuenciados terminar si se superpara lo cual se hace una nueva genoteca de trozos ms pequeos ponen o solapan. (shotgun library). La secuencia de los clones se ensambla finalmente - STS (sequenpara reconstruir la secuencia del genoma. Modificada de la publicacin ce tag sites o sidel International Human Genome Sequencing Consortium, 2001. tios de secuencia marcada) : son sefragmento clonado para llegar al siguien- cuencias cortas de insertos grandes clonados. te (primer walking). A medida que se van Se rene un conjunto de clones al azar y se caracterizando los clones, los contiguos se cortan en fragmentos ms pequeos que se alargan y van convergiendo unos con otros. clonan en y se secuencian pequeas regioEl proyecto termina cuando se tiene un con- nes de cada uno. Para ello se disean primers junto de contiguos que equivale al nme- que amplifican una secuencia corta de ADN ro de cromosomas de la especie en estu- (STS). dio. En la Fig. 4 se resume una estrategia de secuenciacin jerrquica ( hierarchical 3 Utilizacin de mapas genmicos para el shotgun sequencing ). Esta se usa para anlisis gentico genomas grandes. Para genomas ms pequeLos mapas genticos y los mapas fsicos os se utiliza otra, llamada secuenciacin de son un importante punto de partida para vagenomas completos ( whole genome rios tipos de anlisis gentico, incluyendo el shotgun sequencing). aislamiento de genes y genmica funcional. Todos los estados del anlisis genmico Por ejemplo: como la preparacin de clones, el aislamien- Aislamiento de genes por clonado to de ADN, la electroforesis y la secuenciacin posicional: para ubicar un gen cuya secuenhan sido bien adaptados a diferentes m- cia se desconoce se puede partir de un marquinas o robots, automatizando el trabajo. cador conocido que est estrechamente lib) Ordenamiento de los clones gado al mismo. Este marcador acta como

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punto de partida para el procedimiento de caminado cromosmico ( chromosome walking), por el cual los fragmentos finales del marcador ligado son utilizados como sondas para seleccionar otros clones de la genoteca. Del segundo grupo de clones (los que solapan con el inicial) se hacen mapas de restriccin y los fragmentos obtenidos son utilizados para hacer una nueva ronda de seleccin de clones superpuestos. As el proceso de caminado se mueve hacia ambos lados a partir del sitio inicial, que culmina cuando se llega al gen de inters. Existe otra tcnica relacionada llamada salto cromosmico, que permite saltar a travs de reas distantes y potencialmente no clonables del ADN y genera marcas, ampliamente espaciadas a lo largo de la secuencia, que pueden utilizarse como puntos de inicio para mltiples caminatas cromosmicas bidireccionales. Esta tcnica consiste en crear fragmentos grandes (entre 80-150 kb) por restriccin del ADN en la regin que se cree contiene al gen de inters. Cada fragmento de ADN es luego circularizado, poniendo en contacto los extremos libres. Este procedimiento acerca puntos relativamente distantes de la regin de genoma en estudio. Se trata de generar en esa unin un sitio que no sea cortado en una posterior restriccin, de manera que esas dos regiones que estaban distantes en el genoma ahora esten unidas en un fragmento. El crculo se corta con una nueva enzima de restriccin y los fragmentos obtenidos, entre los que se encuentran los sitios de unin, se clonan en fagos. Esto es lo que se llama una genoteca de saltos. Una sonda del sector de comienzo de la regin que contiene al gen de inters puede utilizarse como punta de partida para comenzar a saltar por el genoma. Un salto puede, por ejemplo, avanzar unos 50 kb hacia el locus de inters. Una vez all, el otro extremo de la unin del fragmento inicial se corta y se usa para buscar el siguiente punto de salto en la genoteca. O sea que a travs de las uniones se va avanzando hacia el punto donde se encuentra el locus. Cada posicin de salto es un punto de partida para una caminata cromosmica. Estas regiones se van secuenciando. All comienza la bsqueda de genes utilizando programas de prediccin y se seleccionan las secuencias

candidatas. Esta estrategia de saltos se utiliz para clonar el gen de la fibrosis qustica, que es una enfermedad humana que resulta fatal y es causada por mutaciones en gen de gran tamao localizado en el cromosoma 7. - Estrategia del gen candidato: la caracterizacin de una regin cromosmica hace que aparezcan varios genes de funcin desconocida. Si un gen de inters es mapeado en esa regin, estas secuencias pasan a ser candidatas. Para cada una de ellas, o para la ms probable de acuerdo al anlisis de secuencia, se disean experimentos tendientes a determinar en cuales tejidos se expresa, en qu condiciones, etc., utilizando Northern blot o RT-PCR. Si el patrn de expresin encontrado coincide con el patrn esperado es altamente probable que hayamos encontrado el gen de inters. El experimento ideal para confirmar esto, sera la transformacin de un individuo mutante para esta funcin con el gen normal. Si se produce la reversin del fenotipo mutante (complementacin), tendremos la prueba irrefutable de que estamos frente al gen buscado. - Genes con patrones complejos de herencia: no todos los genes muestran patrones simples de herencia. Puede suceder que: - La variacin fenotpica sea cuantitativa, como peso o altura. Este tipo de variacin se debe a la interaccin acumulativa entre alelos + y de varios genes y el ambiente. La disponibilidad de miles de marcadores moleculares como los SSLP, dispuestos a lo largo del cromosoma, ha posibilitado el mapeo de algunos de estos genes que contribuyen a la variacin cuantitativa cuyos loci son llamados QTL (quantitative trait loci). Para abordar este problema, se buscan dos tipos de lneas que muestren fenotipos contrastantes para un carcter cuantitativo y se cruzan para generar descendencia homocigota que contenga solo un segmento o un pequeo nmero de segmentos de una de las lneas. Se realizan cruzas y retrocuzas y se obtienen lneas endocriadas recombinantes (RIL). Estos individuos pueden caracterizarse por su fenotipo y puede estimarse la contribucin de los segmentos especficos a la variacin observada. (ver IV.2) En el futuro, el anlisis de SNP (polimorfismos de un nucletido simple) promete ace-

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lerar el mapeo de caracteres complejos. Nuevos enfoques de mapeo de QTL y QTN (quantitative trait nucleotide) estn disponibles. El concepto emergente es la posibilidad de explorar directamente la variacin dentro de genes y no a travs de marcadores annimos. 4 Anlisis funcional de los genes Una vez secuenciado el genoma completo pueden identificarse la mayora de los genes de una especie. Restara entonces determinar cul es la funcin de cada uno de ellos y cmo interaccionan para definir un fenotipo determinado. La genmica funcional intenta resolver esta cuestin a travs del estudio de: - El transcriptoma: se refiere al estudio de los perfiles de expresin de todos los genes presentes en el genoma. El mtodo ms utilizado es el de micromatrices de ADN, que permite analizar simultneamente la expresin de miles de genes, pudindose disponer 5000-6000 genes (ESTs, ADNc, oligonucletidos) sobre un portaobjetos utilizando un sistema robotizado. Sobre este chip de ADN se realizan experimentos de hibridacin con muestras marcadas radioactivamente o con fluorforos apropiados, y los resultados se cuantifican mediante anlisis con phosphorimager o microscopa confocal (ver VII.-2). De esta manera se pueden identificar, de forma simultnea, los patrones de expresin de miles de genes en un momento del desarrollo o en respuesta a diferentes estmulos ambientales. El anlisis bioinformtico de estos datos permite asociar grupos de genes que se expresan de forma coordinada y proporciona informacin importante sobre la funcin de los mismos, ver (VII.3). - El proteoma: comprende el conjunto total de protenas expresadas por un genoma completo, incluyendo las modificadas despus de la traduccin. El estudio del transcriptoma debe ser complementado con el anlisis de expresin de las protenas codificadas por los transcriptos, puesto que estas macromolculas estn al final de la ruta de expresin gnica. El mtodo ms utilizado para estudiar la abundancia relativa de cientos de protenas es la electroforesis

bidimensional en geles de poliacrilamida (2DPAGE), que permite separar con gran resolucin, la mayora de los polipptidos celulares combinando de forma secuencial diferencias en carga y en masa molecular. Utilizando sistemas computarizados de anlisis de imagen se seleccionan las protenas cuya abundancia relativa cambia durante el desarrollo o en respuesta a diferentes estmulos ambientales. Los polipptidos se purifican y digieren con proteasas para generar una coleccin de pptidos que se analizan por espectrometra de masas o se secuencian a partir del extremo amino. Para identificar la protena, los perfiles de masa molecular o secuencias de aminocidos obtenidos se comparan con las bases de datos de protenas existentes. - El metaboloma: comprende el conjunto total de metabolitos de una clula. En plantas, el metabolismo secundario (conjunto de reacciones que no son vitales para el individuo y que conducen a la producin de compuestos que no tienen una funcin reconocida en el manteniento de los procesos fisiolgicos fundamentales de los organismos que los sintetizan pero que a veces ayudan a la supervivencia, como por ejemplo antraquinonas, alcaloides, digoxina, taumatina, vainillina, menta, etc.) produce una enorme variedad de compuestos diferentes de los que se han identificado 40.000 y se estima que an quedan por descubrir alrededor de 100.000. Los investigadores que trabajan en este nuevo campo de la qumica aplicada a la biologa (metabolmica) consideran que slo de esta forma se podra definir, en trminos moleculares, un fenotipo concreto. En metabolmica se emplean herramientas analticas muy sensibles (tales como espectrometra de masa, cromatrografa lquida o gaseosa y resonancia magntica nuclear) para analizar los cambios metablicos provocados por mutaciones gnicas o por la expresin de transgenes. La metabolmica puede ser aplicada al monitoreo de estreses inducidos, para identificar pasos metablicos limitantes, para el anlisis de mutantes y hasta para realizar la evaluacin de manejos agronmicos, tales como el efecto de fertilizantes sobre el metabolismo, etc. - La bioinformtica intenta dar sentido

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a la informacin derivada de las tcnicas anteriormente descritas. La importancia de esta ciencia resulta obvia cuando se considera que los genomas poseen miles de millones de pares de bases (ver VII.-3). 5 Modelos El mapeo comparativo ha demostrado que la organizacin de los genes dentro de los genomas ha permanecido muy conservada a travs de la evolucin, existiendo estrechas relaciones de colinearidad entre los genomas de casi todas las gramneas cultivadas, entre las solanceas, entre las brasicaceas cultivadas y Arabidopsis, entre los pinos, rosceas y varias leguminosas. Por ello, teniendo en cuenta la envergadura de un proyecto de secuenciado de un organismo, los emprendimientos genmicos tomaron especies modelo, representativas de un genoma vegetal. El primer modelo vegetal fue una dicotilednea, Arabidopsis thaliana. Le sigui una monocotilednea, el arroz, cuyo genoma es seis veces menor que el del maz y 37 veces menor que el del trigo. El estudio de estas dos especies permitir arribar a conocimientos clave para el mejoramiento vegetal. Arabidopsis thaliana es una dicotilednea que posee uno de los genomas vegetales ms pequeos. Carece de importancia econmica pero resulta ser un excelente organismo para la investigacin puesto que es fcil de transformar y su ciclo de vida tarda slo 7 semanas, de semilla a semilla. Alrededor de 12.000 cientficos trabajan coordinadamente en Arabidopsis, conformando el ms avanzado sistema de experimentos en biologa de plantas del mundo. Su secuencia gentica es de libre acceso en el sitio Web www.arabidopsis.org, as como tambin las experiencias biotecnolgicas que se estn o se han realizado con esta planta. En un artculo publicado en Nature (2000) se analiza el genoma de esta planta a partir de las 115.4 megabases secuenciadas (de un total de 125). Pudo establecerse que la evolucin de Arabidopsis involucr una duplicacin completa del genoma, seguida por una subsecuente prdida y duplicacin de genes,

lo cual dio origen a un genoma dinmico, enriquecido por una transferencia lateral de genes de cianobacterias. El genoma contiene 25.498 genes que codifican para 11.000 familias de protenas, con una diversidad funcional similar a la encontrada en Drosophila y Caenorhabditis elegans. Arabidopsis posee varias familias de protenas nuevas pero carece de otras comunes, indicando que los conjuntos de protenas en comn han experimentado una expansin y contraccin en estos tres grupos eucariotas. 6 Algunas generalizaciones acerca de los genomas Los estudios en especies modelo han permitido arribar a varias generalizaciones. Una de ellas es que el nmero de genes no es la base de la complejidad. La mosca de la fruta tiene unos 13000 genes, Caenorhabitis elegans 18000, Arabidopsis 26000 y los humanos 31000. Si el nmero de genes nos es muy diferente entre estas especies, cul es la base de la mayor complejidad en los humanos? La explicacin estara en el proteoma, ms que en el genoma. Las protenas codificadas por los genes pueden agruparse en familias en base a su similitud y muchas de estas familias proteicas son compartidas por todos los grupos mencionados, aunque el nmero de miembros por familia es mayor en humanos. Esto es particularmente evidente en aquellos genes involucrados en el desarrollo . Los humanos tenemos 30 genes para factores de crecimiento del fribroblasto, mientras que Drosophila y Caenorhabitis elegans tienen 2. Las nuevas protenas surgen a travs de cortes y empalmes alternativos de un mismo ARN (alternative splicing), lo que permite aumentar considerablemente la diversidad proteica a partir de los mismos mensajes. Las predicciones indican que el 60 % de los genes humanos tiene dos o ms alternativas de splicing. En Caenorhabitis el 22%. Un elevado nmero de factores de transcripcin y modificaciones postraduccionales tambin conducen a una mayor complejidad. En el caso de Arabidopsis, cerca del 9 % de los genes son factores de transcripcin

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(FT). Si se compara la proporcin con los genomas de otras especies, se observa que Arabidopsis no slo tiene ms genes que algunos animales pequeos, sino que la proporcin de FT es ms alta que en cualquier clase de organismo estudiado. Esto parece reflejar el hecho de que las plantas deben adaptarse a una amplia variedad de condiciones medioambientales, a diferencia de los animales, que pueden movilizarse y cambiar de lugar si este no les resulta propicio. En humanos, los genes ocupan una cuarta parte del genoma, y slo el 1,5% codifica para protenas. Las secuencias correspondientes a los exones (secuencias del mensajero que se encuentran representadas en la protena, las secuencias correspondientes a los intrones no lo estn) comprenden un porcentaje bajo del genoma, mientras que los intrones comprenden el 24%. Los genes no estn distribudos en forma pareja. Algunos se encuentran agrupados en ciertas regiones del genoma mientras que otros se encuentran aislados. En la mosca, el nematodo y Arabidopsis la disposicin de los genes es mucho ms regular. Aproximadamente la mitad del genoma humano consiste de secuencias repetitivas, siendo la mayora de ellas secuencias parsitas de elementos transponibles que se propagan replicndose e insertando una copia de s mismos en otras regiones del genoma. En la actualidad solo dos tipos de elementos son activos, Alu y LINE1. La mayora de los mismos se encuentran en regiones ricas en A y T, mientras que los genes se encuentran en reas con elevado contenido de G y C. Fragmentos de estos elementos tambin se encontraron en las secuencias regulatorias que controlan la expresin de varios genes, por lo que se ha sugerido que, de alguna manera, podran afectar positivamente su expresin y evolucin. Los genomas vegetales tambin estn plagados de estas secuencias repetitivas. Haciendo uso de la posibilidad que nos brindan las bases de datos de llevar a cabo Northerns electrnicos fue posible encontrar elementos repetitivos en las bases de EST de trigo, cebada y centeno, siendo 0.15 % de las EST similares a retrotransposones (elementos genticos transponibles, es decir que pueden movilizarse de un sector del genoma

a otro y cuyo movimiento depende de la transcripcin reversa . Son secuencias sin funcin aparente que han contribudo a lo largo de la evolucin a la expansin de los genomas de plantas y animales superiores). Ejemplo aplicado al mapeo y caracterizacin de los genes de vernalizacin de los cereales Un ejemplo interesante para aplicar varios de estos conceptos ha sido la investigacin que llev al mapeo y caracterizacin de los genes de vernalizacin de trigo (Yang y col., 2004). El descubrimiento de estos genes es un buen ejemplo de cmo se encaran algunos proyectos de genmica. Se utiliz trigo diploide (2n=2x=14 AA) debido a la menor complejidad de su genoma que los del trigo pan y candeal y se confeccionaron detallados mapas genticos y fsicos para la regin cromosmica que los contena en trigo, arroz y sorgo. Haciendo uso de las herramientas de la genmica comparativa se determin que uno de estos genes, VRN1, est involucrado en la transicin de los pices desde un estado de crecimiento vegetativo a uno reproductivo. Este gen es similar a uno hallado en Arabidopsis llamado APETALA1, que no est involucrado en la respuesta a la vernalizacin. El otro gen involucrado en el proceso, VRN2 es un represor dominante de la floracin en cereales de invierno. Por mapeo gentico de alta densidad, utilizando una poblacin de trigo diploide obtenida de cruzar progenitores con hbitos contrastantes de crecimiento, uno primaveral y el otro invernal, se determin que este gen se encuentra ubicado en el brazo largo del cromosoma 5A. A partir de aqu se realiz el clonado posicional del mismo. Esto significa que a partir de marcadores conocidos ubicados en el genoma se comenz una caminata cromosmica. De esta manera se construy un mapa fsico o de secuencia de la regin que contena el gen. Para ello se utilizaron marcadores moleculares distruibudos en la regin, genotecas de BAC y genotecas de ADNc. La comparacin de la secuencia de esta regin con regiones equivalentes de cebada y de arroz permiti establecer que esta regin contena ocho genes,

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Figura 5: La inhibicin de la expresindel gen VRN2 por transgnesis acelera la floracin en aproximadamente un mes en comparacin con la misma variedad de trigo no modificada. De Yan et al. (2004), gentileza Dr. Jorge Dubcovsky.

cinco de los cuales se encontraron en el mismo orden y orientacin que en la cebada y tres como en el arroz. La funcin de algunos de estos genes es an desconocida. La regin tambin contena elementos repetitivos o retrotransposones. Dos de los genes all ubicados, denominados ZCCT1 y ZCCT2, codificaban para protenas muy similares, lo cual permiti inferir que los mismos provienen de un evento de duplicacin que ocurri millones de aos atrs. Estas protenas resultaron ser similares a una protena de Arabidopsis y de arroz que est involucrada en la regulacin del tiempo de floracin. Por ello, este gen era un candidato atractivo para ser el represor de floracin, es decir VRN2. Los transcriptos de este gen son muy poco abundantes en las hojas y desapare-

cen durante el proceso de vernalizacin, no obstante ello, el anlisis de su expresin permiti determinar que junto con la desaparicin de los transcriptos de VRN2 se produce un incremento de los transcriptos de VRN1 , lo cual resultaba coherente con la interaccin episttica entre los dos genes y con el hecho de que VRN2 acte como un represor de la floracin, que directa o indirectamente reprime la transcripcin de VRN1. Todas las pruebas de localizacin de los transcriptos y niveles de expresin condujeron a concluir que ZCCT1 era VRN2. Tambin se estableci que las diferencias entre variedades invernales y primaverales de trigo estaran dadas por diferencias en la regin codificante de este gen (es decir en aquella regin que est representada en el ARN mensajero). En una accesin de hbito primaveral se encontr una mutacin de punto que redundaba en un cambio de un aminocido arginina por un triptofano en una regin crtica del gen, lo cual afectara su funcin. La arginina se encuentra en todas las protenas del tipo ZCCT de Arabidopsis, arroz y cebada. Esta mutacin de punto sera la causante del hbito primaveral. El anlisis de este sitio en variedades cultivadas de trigo diploide permiti verificar que la mutacin est ausente en todas las variedades de trigo invernal. Lo mismo ocurri en cebada. Todo esto llev a sugerir que la gran adaptabilidad de los cereales de clima templado fue favorecida por un sistema muy flexible de regulacin de la iniciacin de la floracin. El hbito ancestral de crecimiento invernal, esencial para la adaptacin a clima fro, poseera el potencial para generar formas primaverales por mutaciones de prdida de funcin en los dos principales loci de vernalizacin. Para validar la hiptesis de que ZCCT1 era VRN2 se transform trigo pan invernal con una construccin que inactivaba los mensajeros del mismo, tcnica denominada de ARN de interferencia (ver III.3). Estas plantas transformadas, donde estaba inhibida la expresin del gen (efecto que semejaba la inhibicin del mismo por fro) mostraron una aceleracin en el tiempo de floracin (23 das) en relacin a los controles no transformados (Fig.5). Esto confirm que la disminucin en los niveles de los transcriptos de VRN2

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economa y la calidad de vida que en el mbito de la salud humana. Gracias al aporte de grupos de investigacin de todo el mundo se dispone de bases de datos pblicas con informacin genmica de utilidad para los mejoradores. El conocimiento de cmo actan los genes en una especie puede ayudar a los mejoradores a perfeccionar su funcin en otra especie. La secuencia de los genomas de Arabidopsis y de arroz proporcionarn informacin relevante acerca de otros cultivos, como el maz y el trigo. Dado que estos tres cereales representan ms de la mitad de la produccin alimentaria mundial y que el arroz es el alimento bsico de ms de la mitad de la poblacin del planeta, la trascendencia de la genmica en la agricultura es indiscutible. La similitud entre las especies de cereales tambin implica que cuando se trasladan genes de una especie de cereales a otra, tendern a funcionar Figura 6: Categorizacin funcional de ESTs de Deschampsia bien y en la misma forma con una antarctica . El objetivo de este proyecto es encontrar genes mnima manipulacin gentica. involucrados en la resistencia a bajas temperaturas para ser transferidos, A travs de esfuerzos pblipor tecnologa gnica, a especies de cultivo. Gentileza de G. cos y privados podrn identificarSpangenberg. se conjuntos de genes asociados genes de floracin. En variedades invernales con caracteres como rendimiento, resistende trigo, VRN2 evita la floracin. Cuando la cia a la sequa, calidad de los alimentos, resisplanta se expone a un perodo de fro dutencia a insectos y tolerancia a herbicidas. De rante la vernalizacin, la actividad del mismo esta manera se acelerar significativamente disminuye y permite que la planta florezca. A diferencia del gen VRN1, VRN2 es dife- el aporte de nuevas variedades al mercado, rente de un gen de Arabidopsis que tiene ya sea por modificacin gentica o por seuna funcin similar. Esto permiti sugerir que leccin con marcadores moleculares o utien su evolucin, Arabidopsis y los cereales y lizando criterios de seleccin a partir de la pastos de clima templado desarrollaron di- informacin molecular. La genmica comparativa, basada en el ferentes mecanismos de vernalizacin, que anlisis de ESTs de diferentes plantas toleincluyen genes similares y genes muy diferenrantes a estreses abiticos, permitir la identes. tificacin de redes de genes comunes asoDe ello tambin se concluye que si bien ciados con estreses ambientales, tales como los modelos son importantes, no siempre se adaptan a todos los casos y hay que analizar salinidad, sequa, bajas y altas temperaturas. todos los detalles antes de extrapolar infor- El anlisis de especies tolerantes a situamacin para aplicarla a la comprensin de los ciones extremas permitir localizar genes involucrados en los mecanismos que las hafenmenos biolgicos. cen tolerantes. Dichos genes podrn entonces ser transferidos a especies de cultivo. 7 Genmica y Agricultura Como ejemplos pueden citarse Agrostis Especialistas en varias disciplinas han lle- adamsonii y Agrostis robusta, tolerantes a gado a la conclusin de que el alcance de la salinidad, Microlaena stipoides, tolerante a genmica ser mayor en lo que se refiere a la aluminio y Deschampsia antarctica, toleran-

(ZCCT1) est directamente relacionada con la aceleracin del tiempo de floracin. Este experimento demostr, adems, que esta tecnologa puede ser utilizada para manipular el tiempo de floracin del trigo y confirm que VRN2, un factor de transcripcin, juega un rol central en la regulacin de la floracin. Este sera entonces un nuevo tipo de gen involucrado en la regulacin de otros

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te a bajas temperaturas (la nica gramnea que crece en la Antrtida) (Fig. 6). Tambin se ha mencionado que los factores de transcripcin seran las llaves para desbloquear funciones gnicas que aprovechen la diversidad de la naturaleza para producir mejores cultivos. Estos son genes que virtualmente controlan todo carcter importante, desde el punto de vista agrcola, en las plantas, incluyendo rendimiento, resistencia a las enfermedades, proteccin contra las heladas y sequa, produccin de qumicos, protenas usadas en farmacutica, etc. La mayora de los caracteres vegetales a los que interesa aplicar la ingeniera gentica son multignicos (ej. tolerancia al estrs hdrico) y los genes involucrados se expresan en cascadas de forma tal que genes primarios activan a genes secundarios que a su vez activan a genes terciarios. Los factores de transcripcin seran los responsables de hacer funcionar a los genes primarios , obtenindose largas cascadas de expresin de genes por la manipulacin de un solo gen. Durante los ltimos aos se ha obtenido una gran coleccin de FT de plantas, funcionalmente caracterizados, no slo en Arabidopsis, sino tambin en especies como tomate, maz y soja. En total hay cerca de 1900 FT en Arabidopsis pero en el contexto de la genmica funcional el inters recae en unas 60 familias que tienen funciones reconocidas. La herramienta primaria que se utiliza para conocer la funcin de los FT consiste en sobre-expresarlos y/o detener la expresin de algunos de ellos por disrupcin gnica o knock out. Se puede, por ejemplo, medir el efecto de cada FT en la composicin de los lpidos en las semillas aceiteras y la composicin de lpidos en las hojas, la composicin de azcares, de esteroides, etc., estudiar procesos bsicos, a travs de la dilucidacin de sus efectos en el desarrollo vegetal y la resistencia a las enfermedades, o tratar de identificar el FT que regula el consumo de nitrgeno (N). El N es uno de los insumos ms costosos para la agricultura, por lo que identificar los genes que controlan y modifican la respuesta al N sera de gran valor. En este sentido tambin existen proyectos genmicos sobre leguminosas y sus simbiontes fijadores de nitrgeno. Recientemente se han secuenciado los genomas de

las especies de Mesorhizobium y Sinorhizobium y se han producido cientos de miles de EST de Medicago truncatula, Lotus corniculatus y soja. En el caso de M. truncatula no slo se han disectado los pasos que controlan las seales entre la bacteria fijadora y la planta sino tambin entre la planta y otro simbionte, las micorrizas (asociacin de un hongo con la raz de una planta superior. Esta asociacin no es especfica de especie como el caso de Rhizobium y las leguminosas. El hongo puede ser de varios gneros y aportan fsforo a la planta,). Recientemente se logr la identificacin, en alfalfa, de un receptor requerido para el reconocimiento de seales bacterianas de nodulacin, los llamados factores NOD. Las plantas medicinales aportan el 25% de los compuestos activos utilizados actualmente por la industria farmacutica. Entre estos compuestos se encuentran los citocromos P450 , que participan en la biosntesis de muchos compuestos anticancergenos, alcaloides, fitoesteroides, antioxidantes y antimicrobianos. Tambin tienen un rol muy importante en la detoxificacin de xenobiticos (herbicidas y pesticidas). Se han identificado 1052 citocromos P450 y el objetivo actual es, utilizando herramientas de metabolmica, determinar su funcin bioqumica precisa. Otro de los objetivos de la metabolmica es el estudio de la sntesis de las esencias que confieren perfume a las flores y el mejoramiento del sabor de algunas plantas utilizadas en alimentacin humana, como por ejemplo Cassava, donde el objetivo sera la eliminacin de los glicsidos cianognicos que le confieren sabor amargo. La devastacin de los bosques es motivo suficiente para invertir en proyectos de genmica tendientes a la identificacin de genes involucrados en perennidad, desarrollo, interaccin con herbvoros, respuesta a estrs y sntesis de metabolitos secundarios como lignina y celulosa. Se han comenzado a colectar EST de lamo, abedul, abeto, pino y eucaliptus. El lamo se utiliza como sistema modelo para el anlisis de los genes involucrados en la formacin de madera. Otro objetivo en este campo es la bsqueda de estrategias para inducir floracin temprana,

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que es un factor crtico en el mejoramiento de forestales. La secuenciacin de los genes y la dilucidacin de las vas que controlan la floracin en los cereales, que difiere en varios aspectos con los corresponientes en Arabidospsis, ha sido otro de los logros de la genmica. Como se mencionara anteriormente en este captulo, recientemente se localizaron y caracterizaron, en trigo y cebada, los genes VRN1 y VRN2, que son los genes centrales en la va de vernalizacin en trigo, cebada y otros cereales invernales. Este conocimiento es clave en agricultura, ya que permitira, potencialmente, controlar la floracin en cultivos de gran importancia econmica, como los cereales y los forrajes. 8 Aportes de la genmica al mejoramiento de trigo El trigo pan (Triticum aestivum L 2n= 6x= 42; AABBDD) es uno de los principales cultivos alimenticios ya que provee cerca del 55% de los carbohidratos consumidos por el hombre. La gentica de este cultivo resulta compleja, es de naturaleza hexaploide, con tres genomas homelogos denominados A, B y D, que aportan 7 pares de cromosomas cada uno. Los genes redundantes son una norma, con sets homoallicos triplicados en la mayora de ellos. Dentro de los cereales, el genoma de trigo pan es el de mayor tamao (17000 Mb trigo, 2800 Mb maz, 800 Mb sorgo, 450 Mb arroz). Ms del 80% del genoma de trigo lo constituyen secuencias de ADN altamente repetitivo. El restante 20% est compuesto por ADN de bajo nmero de copias o copia nica, donde se encuentran la mayora de los genes. Si bien las secuencias del ADN altamente repetitivo varan de especie en especie, las secuencias de los genes en general son conservadas. Esta caracterstica permite el uso de sondas heterlogas (de otros genomas) en experimentos de hibridacin de tipo RFLP (ver II.4) para identificar secuencias conservadas en especies diferentes dentro de una misma familia taxonmica (Devos y Gale, 2000). En 1989 se public el primer mapa gentico molecular de trigo correspondiente a los cromosomas homelogos del grupo

7, observndose que en gran parte de los tres genomas de trigo hexaploide se conservaba el orden de los genes y marcadores. Esta fue la primera prueba de colinearidad en gramneas y posibilita el desarrollo de la gentica comparativa en cereales. En trabajos posteriores pudo comprobarse que largos segmentos de los cromosomas de maz, sorgo, arroz, trigo y cebada conservan la presencia y el orden de marcadores y genes, aunque en algunos casos la correspondencia cromosmica ha sido modificada por duplicaciones, inversiones o translocaciones . En la actualidad se ha logrado consensuar un mapa unificado de gramneas en el que se detallan secuencias y genes conservados en diferentes genomas (Fig. 2). A partir de esta herramienta es posible transferir informacin proveniente de plantas de genomas pequeos (arroz, sorgo) a plantas de genomas ms complejos como el trigo. Esto facilita la ubicacin ms precisa de genes para tolerancia a estrs bitico y abitico, prebrotado, dormicin, vernalizacin, etc. y el desarrollo de marcadores tiles para el mejoramiento. La informacin generada a partir de los proyectos genmicos de Arabidopsis, arroz y maz con el descubrimiento de nuevos genes y QTLs permitir el desarrollo de marcadores perfectos, generados a partir de la informacin de la secuencia del gen a seleccionar, en lugar de marcadores genticamente ligados. Actualmente el acceso a los principales genes que afectan la calidad ha abierto nuevas vas para el desarrollo comercial de diferentes productos derivados del trigo. Es posible obtener variedades con diferente calidad de almidn, diferente textura de grano, diferente composicin de gluteninas y gliadinas en funcin del uso industrial. Por otro lado, el descubrimiento de nuevos genes valiosos de otros genomas y la posibilidad de incorporarlos al trigo a travs de la transformacin permitir resolver problemas del cultivo, como pueden ser limitantes debido a estreses biticos y abitico o desarrollar nuevas generaciones de transgnicos en funcin de las necesidades del consumidor con mayor contenido de aminocidos esenciales como la lisina, vitaminas, etc. La complejidad del genoma del trigo ha hecho aconsejable abordar los estudios genmicos a travs del transcriptoma. Para ello, se han establecido consorcios interna-

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cionales. Las bases de datos de EST han crecido exponencialmente en la ltima dcada, de manera que en el National Center for Biotechnology Information dbEST database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST) en Marzo de 2004 haba 20 millones de ESTs. Esto incluye cerca de 1 millon de ESTs de trigo hexaploide y sus parientes ms cercanos de la tribu Triticeae, que son Hordeum vulgare L., especies diploides y tetraploides de Triticum, Secale cereale L. y Aegilops speltoides Tausch. Toda esta informacin permite inferir que la biotecnologa puede cambiar el escenario del trigo en dos reas principales: (1) protegiendo al cultivo de estreses biticos y abiticos y (2) modificando el concepto de produccin de commodities por el de produccin de specialities derivadas de trigo, de mayor valor agregado, como noodles (tipo de fideo muy utilizado por los asiticos), galletitas dulces, crackers (un tipo de galletita que se rompe fcilmente), masa congelada, pan de molde, pasta, almidones, plsticos biodegradables, etc. 9 Genomas trabajadores La genmica aplicada a dilucidar los mecanismos por los cuales funcionan los microorganismos puede conducir al aislamiento de sus componentes para desarrollar nanoestructuras que lleven a cabo complejas funciones. Como ejemplos pueden citarse: Methanococcus jannaschii: es una bacteria que produce metano, una importante fuente de energa. Contiene enzimas que soportan temperaturas y presiones elevadas por lo que son potencialmente tiles para fines industriales .Deinococcus radiodurans: soporta niveles de radiacin extremadamente elevados por lo cual tiene un alto potencial para limpiar desechos radiactivos. Thalassiosira pseudonana: se trata de una diatomea marina que es la principal participante en el bombeado biolgico de carbono hacia las profundidades de los ocanos, por lo que posee un elevado potencial para mitigar los cambios climticos del planeta

10 Proyectos de Genmica en Sudamrica En Sudamrica se han desarrollado y se encuentran en ejecucin algunos proyectos genmicos. Frente al estado del desarrollo de estas reas en el mundo, existen en la regin serias carencias, tanto de recursos humanos entrenados como de infraestructura y equipamiento. En Brasil se estableci una red de cooperacin que secuenci completamente el genoma de Xylella fastidiosa, bacteria que ataca a los ctricos causando importantes prdidas econmicas. Tambin incursion en el estudio de genmica funcional de clulas cancerosas y de secuenciacin del genoma de caa de azcar, Saccharum oficinalis. En Argentina se ha trabajado en la secuenciacin de Brucella abortus, agente causal de la brucelosis bovina . Investigadores argentinos participan tambin en proyectos de genmica en cooperaciones internacionales, como el consorcio involucrado en la secuenciacin del genoma de Trypanosoma cruzzi, el proyecto que llev a la clonacin y caracterizacin de los genes de vernalizacin en trigo o el proyecto de bsqueda de genes de tolerancia a fro en Deschampsia antarctica. En Chile se ha completado recientemente la secuenciacin de Piscirickettsia salmonis, patgeno intracelular de salmones que causa importantes prdidas en esta industria. Otros ejemplos son el desarrollo de marcadores de microsatlites (ver II.4) de diversas especies, como girasol (colaboracin de INTA-Argentina con empresas semilleras locales), vides (INIA-Chile como parte de un consorcio internacional), alpacas y otros camlidos sudamericanos (INIA-Chile), entre otros. Actualmente se est desarrollando en Chile un programa de genmica funcional coordinado por diversos ministerios, destinado a enfrentar problemas de postcosecha y enfermedades en plantas de inters agrcola. En varios pases se han secuenciado fragmentos de genomas de virus, y viroides (Argentina, Chile, Uruguay). Los objetivos para programas de genmica sudamericanos deberan enfocarse hacia el aumento de la productividad y la mejora de la calidad de los productos, desarrollando capacidades para identificar genes

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propios del germoplasma regional, de manera de disminuir la dependencia de variedades y genes desarrollados y aislados por pases del primer mundo y buscar soluciones para problemas propios de la regin, que difcilmente pueden ser enfrentados por programas de mejoramiento gentico ajenos a la misma. 11 Lecturas recomendadas
CENCI A., CHANTRET N., XY K., GU Y., ANDERSON O.D., FAHIMA T., DISTELFELD A., y DUBCOVSKY J.. 2003. Construction and characterization of a half million clones Bacterial Artificial Chromosome (BAC) library of durum wheat. Theor Appl Genet 107:931-939. ECHENIQUE V., STAMOVA B., WOLTERS P., LAZO G., CAROLLO V y DUBCOVSKY J. 2002. Frequencies of Ty1copia and Ty3-gypsy retroelements within the Triticeae EST databases. Theor. Appl. Genet. 104: 840-844. GALE M. y DEVOS K. 1998. Plant comparative genetics after 10 years. Science, 282: 656-658. DEVOS, K.M,; GALE, M.D. 2000. Genome relationship: the grass model in current research. Plant Cell 12:637-646 GOFF, S.A.; RICKE, D.; LAN, T.H.; PRESTING, G.; WANG, R.; DUNN, M.; GLAZEBROOK, J.; SESSIONS, A.; OELLER, P.; VARMA, H. et al. 2002. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. japonica). Science, 296:92-100. GRIFFITHS, A.; MILLER, J.; SUZUKI, D.; LEWONTIN, R.; GELBART, W. 2000. An introduction to the genetic analysis. Sptima Edicin. W:H:Freeman, N:York. 860 pp. KNIGHT, JONATHAN. 2003. News Feature. A Dying Breed Nature 579, vol. 421 KONCZ, C. 2003. Plant Biotechnology. From genome projects to molecular breeding. Current Opinion in Biotechnology 14:133-135. KUMAR, A. y BENNETZEN, J.L. 1999. Annu Rev Genet 33:479532 LAGUDAH, E.; DUBCOVSKY, J. y POWELL, W. 2001. Wheat Genomics. Plant Physiology and Biochemistry. 39:335-344. MORGANTE, M. y SALAMINI, F. 2003. From plant genomics to breeding parctice.Current Opinion in Biotechnology14:214-219. RAFALSKI, A. 2002. Applications of single nucleotide polymorphisms in crop genetics. Curr Opin Plant Biol,

5:94-100. SANMIGUEL, P.; RAMAKRISHNA, W.; BENNETZEN, J. L.; BUSSO, C. y DUBCOVSKY, J. 2002. Transposable elements, genes and recombination in a 215-kb contig from wheat chromosome 5A. Functional and Integrative Genomics. 2: 70-80. SCHNEIDER, K.; WEISSHAAR, B.; BORCHARDT, D.C.; SALAMINI, F. 2001.SNP frequency and allelic haplotype structure of Beta vulgaris expressed genes. Mol Breed, 8:63-74 SNUSTAD, D.; SIMMONS, M. 2003. Principles of Genetics. 3th. edition. John Wiley and Sonds, Inc. 840 pp. WADE, C.M.; KULBOKAS, E.J. III; KIRBY, A.W.; ZODY, M.C.; MULLIKIN, J.C.; LANDER, E.S.; LINDBLAD-TOH, K. y DALY, M.J. 2002. The mosaic structure of variation in the laboratory mouse genome. Nature, 420:574-578. YAN, L.; ECHENIQUE, V.; BUSSO, C. S.; SANMIGUEL, P.; RAMAKRISHNA, W.; BENNETZEN, J.L.; HARRINGTON, S. y DUBCOVSKY, J. 2002. Cereal genes similar to Snf2 define a new subfamily that includes human and mouse genes. Molecular and General Genomics 268:488-499. YAN, L.; LOUKOIANOV, A.; BLECHL, A.; TRANQUILLI, G.; RAMAKRISHNA, W.; SANMIGUEL, P.; BENNETZEN, J.; ECHENIQUE, V. y J. DUBCOVSKY. 2004. Positional cloning of wheat VRN2 gene reveals a new vernalization pathway. Science. En prensa. YANO, M.; KATAYOSE, Y.; ASHIKARI, M.; YAMANOUCHI, U.; MONNA, L.; FUSE, T.; BABA, T.; YAMAMOTO, K.; UMEHARA, Y.; NAGAMURA, Y. Y SASAKI, T. 2000. Hd1, a major photoperiod sensitivity quantitative trait locus in rice, is closely related to the Arabidopsis flowering time gene CONSTANS. Plant Cell, 12:2473-2484. YU, J.; HU, S.; WANG, J.; WONG, G.K.; LI, S.; LIU, B.; DENG, Y.; DAI, L.; ZHOU, Y.; ZHANG, X. et al. 2002. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. indica). Science, 296:79-92. The Arabidopsis Genome Initiative: Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature 2000, 408:796-815. The Caenorhabitis elegans Sequencing Consortium. Science, 282, 2012-2018. The Genome International Sequencing Consortium. Nature, 409, 860-921 2001. The Yeast Genome Directory, Nature, 387, supplement 1-105 1997.

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VII.-Captulo 2
Mtodos para el estudio de la expresin de genes
Pessino, Silvina C.; Martelotto, Luciano G. 1 Introduccin La capacidad de secuenciar genomas completos desarrollada en la ltima dcada ha impulsado a la investigacin cientfica en la direccin de definir la funcin de cada uno de los genes identificados. Para contribuir con ese objetivo se han diseado tcnicas que permiten estudiar la expresin gnica global en un determinado tejido y en un momento particular del desarrollo, posibilitando la identificacin inicial y el agrupamiento en clases funcionales de secuencias nuevas con una actividad asociada. Los procedimientos para esta evaluacin han progresado desde los mtodos desarrollados para el anlisis de genes nicos especficos (como el Northern slot y dot blotting, la RT-PCR semicuantitativa y cuantitativa y los ensayos de proteccin de nucleasas) hacia otros enfocados en la identificacin de mltiples transcriptos que difieren en su representacin entre las diversas muestras experimentales (como la hibridacin substractiva, el display diferencial, el ADNc-AFLP , la secuenciacin de etiquetas expresadas o EST, el anlisis serial de la expresin de genes o SAGE y la hibridacin de microarreglos). La organizacin de las secuencias dentro de grupos funcionales basada en los datos de expresin y de homologa proporciona un marco bsico para conducir nuevos estudios dirigidos a definir la actividad precisa de cada producto gnico. 2 Hibridacin substractiva Los mtodos de hibridacin substractiva fueron creados a principios de la dcada que comenz en 1980 con el propsito de construir bibliotecas de ADNc para obtener sondas de genes expresados diferencialmente. Fueron los primeros que se utilizaron de manera amplia con el propsito de identificar genes regulados positiva o negativamente en

una escala global. Sus ventajas incluyen la habilidad de aislar genes de funcin relacionada sin tener conocimientos previos de su secuencia o identidad y el uso de tcnicas comunes de biologa molecular que no requieren equipos especializados de deteccin y anlisis. El procedimiento general consiste en la hibridacin de ADNc provenientes de una muestra prueba (tester) con un exceso de ARNm proveniente de una muestra control (driver). Los transcriptos expresados en ambas muestras (tester y driver) forman molculas de ARNm/ADNc hbridas, mientras que las secuencias de ADNc que estn presentes nicamente en la muestra tester permanecen como hebras simples. Las molculas de hebras simples y dobles se separan usando cromatografa en hidroxilapatita. Los ADNc expresados diferencialmente pueden entonces ser recuperados y clonados o usados directamente como sondas para analizar una biblioteca. Dos limitaciones importantes del protocolo original son: i) el requerimiento de grandes cantidades de ARNm y ii) la tendencia a una menor eficiencia en la identificacin de transcriptos poco abundantes. La hibridacin substractiva es aplicable slo a comparaciones de pares de muestras y debe ser realizada por duplicado con el tester y el driver invertidos para detectar tanto aumentos como disminuciones en los niveles de expresin. Adems no genera una medida cuantitativa y aunque es eficiente en la identificacin de genes que estn completamente ausentes en el driver no revela fcilmente a aquellos que estn presentes en ambas muestras en distinta proporcin. A fin de mejorar el protocolo original se realizaron modificaciones que incluyen la produccin de ADNc con marcas de biotina u oligo(dT)30-ltex de manera de refinar la separacin de las molculas de cadena simple y doble. Tambin se incorpor la amplificacin de ADNc selectos por PCR para disminuir la cantidad inicial de mARN requerido y aumentar la eficiencia de clonado de los transcriptos seleccionados. En la actualidad se utiliza ms comnmente un protocolo ingenioso conocido como hibridacin substractiva de supresin (SSH) que fue diseado para favorecer la deteccin de

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transcriptos raros expresados diferencialmente. Este incluye una normalizacin en la representacin de los transcriptos diferenciales basada en la inhibicin de la amplificacin de aquellos que son ms abundantes, eliminando tambin la necesidad de separar molculas de cadena doble y simple (Fig.1).

3 Display diferencial y RAP-PCR Las tcnicas conocidas en general como huellas digitales genticas de ARN (ARN fingerprinting) incluyen al display diferencial (DD) y al fingerprinting de ARN con una PCR cebada arbitrariamente (RAP-PCR). Ambos mtodos estn basados en una amplificacin por PCR de subgrupos al azar de transcriptos a partir de dos o ms muestras. La primera etapa de ambos procedimientos es comn y consiste en generar ADNc haciendo una transcripcin reversa de una fraccin de las molculas de ARNm de una muestra. En el display diferencial esto se logra utilizando como cebador de la transcripcin reversa a un poliT anclado con una o ms bases adicionales al extremo 3 del ARN mensajero (por ejemplo (T)12AC). Estos oligonucletidos se fijan al ARN mensajero a travs de la unin de las bases adicionales, impidiendo que el poliT resbale sobre distintas zonas del poli A. El nico grupo de ARNm que es transcripto en forma reversa es el integrado por las molculas que llevan las bases complementarias a las bases adicionales del poliT en el extremo del mensajero adyacente al poliA. En contraste, la RAP-PCR utiliza oligonucletidos de secuencia arbitraria para la transcripcin reversa. Estos cebadores tienen normalmente 10 bases de largo y se unen a sus secuencias com-

Figura 1: Esquema general que describe el procedimiento de hibridizacin substractiva de supresin (SSH). El ADNc prueba (tester) se divide en dos porciones iguales que se ligan a dos adaptadores diferentes y son hibridizadas por separado con un exceso de ADNc de la muestra control (driver), lo que conduce a la formacin de los productos de tipo a, b, c y d que se indican en la figura. Luego ambas muestras se mezclan y se rehibridizan en presencia de un exceso adicional del driver desnaturalizado, lo que origina los productos a, b, c, d y e. Los extremos de las hebras dobles se rellenan y los fragmentos se amplifican por PCR utilizando cebadores complementarios a los adaptadores. El enriquecimiento en las molculas e se logra durante la amplificacin por PCR ya que: i) a y c pueden unir un solo cebador por lo que se amplifican linealmente; ii) la amplificacin de b est suprimida debido a la complementariedad de unas terminaciones largas repetidas invertidas presentes en la secuencia del adaptador que promueven la formacin de estructuras secundarias internas en las hebras simples; iii) d no contiene sitios de unin a los adaptadores. Los productos de PCR resultantes provendrn de transcriptos presentes esencialmente en el tester y ausentes en el driver y adems su representacin estar normalizada ya que los fragmentos diferenciales abundantes tendrn mayores posibilidades de formar molculas de tipo b. Este esquema fue adaptado de Diatchenko et al. 1996.

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plementarias permitiendo formar una hebra en los distintos tratamientos experimentade ADNc desde este sitio. En este caso el les representan potenciales transcriptos de subgrupo de ARNms que sufre transcripcin ARNm de expresin diferencial. Tpicamenreversa estar integrado por aquellas mol- te, las bandas son evaluadas slo si amplificulas que presenten la secuencia complemen- can en forma consistente en reacciones de taria a la del cebador orientada en el senti- PCR duplicadas para cada muestra (Fig. 2). do adecuado. La fase final del display diferencial consisLuego de haberse realizado la sntesis de te en la identificacin de la secuencia del la primer hebra del ADNc, se amplifican seg- transcripto representado por el producto de mentos de los transcriptos usando pares ml- PCR y la confirmacin de que este realmente tiples de cebadores de PCR. Tanto para el se expresa en forma contrastante. Estas etadisplay diferencial como para la RAP-PCR, el pas se logran localizando fsicamente y cebador superior es un oligonucletido arbi- escindiendo la seccin del gel de trario de 10 pares de bases. El cebador infe- poliacrilamida que contiene al producto de rior es el mismo oligonucletido poliT anclado (para el caso del display diferencial) o el decmero arbitrario (para el caso de RAP-PCR) que se usaron alternativamente para hacer la transcripcin reversa. Se ha estimado que los productos de PCR de 240 combinaciones particulares de pares de cebadores de display diferencial (por ejemplo todas las combinaciones de 20 oligonucletidos arbitrarios y 12 oligonucletidos anclados) representan estadsticamente a todos los ARNm originalmente presentes en la muestra. Los productos de PCR pueden ser marcados por incorporacin de un nucletido radiactivo o de una molcula que pueda ser detectada a travs de su interaccin con un anticuerpo conjugado a un sistema de deteccin (por ejemplo digoxigenina). Tambin puede usarse un cebador unido a un fluorforo u optarse por no marcar los fragmentos amplificados y usar luego una tincin con nitrato de plata para revelar los geles. La visualizacin de los productos de PCR se logra Figura 2: Representacin grfica del mtodo de display diferencial. luego de la electroforesis en geles de Las muestras de ARN son transcriptas en forma reversa usando poliacrilamida seguida de la apropia- como cebador un oligonucletido poliT de secuencia 5T(T)nTXY da generacin y deteccin de imge- 3 (donde 10 n 12) que se fija en forma estable al extremo 3de transcriptos a travs de la unin de las bases adicionales de nes, que son evaluadas comparando los secuencia arbitraria X e Y. Una vez sintetizada la primer hebra del la intensidad relativa de las bandas ADNc, sta se usa como molde para una reaccin de PCR que producidas a partir de diferentes utiliza como cebadores el mismo poliT anclado y un decmero de secuencia arbitraria. Distintas combinaciones de poliTs y decmeros muestras experimentales. Los fragmentos que estn presen- generan numerosos perfiles de amplificacin a partir de diversas subpoblaciones de ARN mensajeros. El patrn de bandas de las tes en una muestra y ausentes en la muestras experimentales se compara en busca de diferencias de otra o aquellos que estn presentes tipo presencia-ausencia o alteraciones en la intensidad de las con diferentes intensidades relativas bandas.

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inters. En la mayora de los casos debe realizarse un alineamiento de las imgenes de los fragmentos de amplificacin con el gel de poliacrilamida seco. En los casos en que se utiliza tincin con nitrato de plata no es necesario realizar este paso, por lo cual la recuperacin de la banda es mucho ms eficiente. Los productos de PCR son purificados del gel y reamplificados. Se han utilizado varias estrategias para confirmar la expresin diferencial de los transcriptos, que incluyen el uso de los fragmentos como sondas de Northern, la siembra de los fragmentos en membranas para someterlos a anlisis de Northern inverso y el clonado y secuenciacin de los productos para disear cebadores especficos que permitan realizar PCR semicuantitativas. Independientemente de cul sea la tctica usada para confirmar la expresin diferencial, las secuencias de los fragmentos de los genes expresados diferencialmente se requieren siempre para comenzar a entender la funcin del gen. El aislamiento de la secuencia completa de los genes involucrados puede lograrse usando los clones diferenciales en estudios de bibliotecas de ADNc o realizando experimentos de 5RACE. Dos ventajas importantes de los mtodos de fingerprinting de ARN con respecto a los de hibridizacin substractiva son la capacidad de comparar muestras experimentales mltiples en forma simultnea y la de identificar genes que estn regulados tanto positiva como negativamente en una muestra respecto de las otras. Sin embargo, los mtodos de fingerprinting de ARN comparten con el SSH la limitacin de que no son cuantitativos. Adems suelen aparecer numerosos falsos positivos, es decir, fragmentos de genes que parecen estar diferencialmente expresados pero son artefactos de PCR. Otro problema es que estas tcnicas deben aplicarse en general a muestras provenientes del mismo individuo sometido a distintas condiciones o sobre individuos genticamente idnticos (por ejemplo, isolneas). Cuando se comparan los perfiles de ARNm de individuos diferentes genticamente, pueden aparecer falsos positivos que son resultado de una amplificacin diferencial debida a una variacin en la secuencia de los transcriptos ms que a

diferencias en su representacin. Ese problema puede ser evitado utilizando estrategias de anlisis de segregantes en grupo (BSA) aplicadas al estudio de perfiles de ARN. Finalmente, la investigacin de todos los genes que potencialmente se expresan en forma diferencial requiere el uso de equipamiento de ltima generacin y una inversin extensiva de tiempo y trabajo para detectar y confirmar la expresin diferencial de cada uno de los genes individuales. 4 Polimorfismos en la longitud de los fragmentos de ADNc amplificados (ADNc-AFLP) La tecnologa de AFLP , generalmente utilizada para producir huellas genticas de ADN genmico, puede ser aplicada tambin a preparaciones de ADNc de doble hebra para obtener un perfil del transcriptoma. Los patrones obtenidos por esta tcnica son una herramienta confiable y eficiente para la identificacin de los ARNm expresados diferencialmente. La tcnica de ADNc-AFLP detecta fragmentos de restriccin de ADN por medio de amplificacin por PCR. Comprende las siguientes etapas: i) generacin de ADNc, ii) restriccin del ADNc con dos endonucleasas especficas, preferiblemente una que reconoce sitios de 6 bases y otra que reconoce sitios de 4 bases, iii) ligacin de adaptadores de cadena doble a los extremos de los fragmentos de restriccin, iv) amplificacin de un subgrupo de los fragmentos de restriccin usando dos cebadores complementarios al adaptador que llevan bases selectivas adicionales en el extremo 3 v) electroforesis de los fragmentos de restriccin amplificados en geles de poliacrilamida, vi) visualizacin de las huellas digitales genticas mediante el uso de autorradiografas, fosfoimgenes y otros mtodos (Fig. 3, ver pg.7). Las mayores ventaja del uso de la tecnologa de ADNc-AFLP son: i) no se requiere informacin previa de secuencia; ii) se puede estudiar una fraccin muy grande de todos los genes expresados, iii) es una tcnica muy sensible que permite la deteccin de transcriptos de baja abundancia, iv) los fragmentos son extrados fcilmente de los geles

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y las secuencias correspondientes pueden determinarse sin necesidad de clonados previos. 5 Etiquetas de secuencia expresadas (Expressed sequence tags, EST) Los avances tecnolgicos que facilitan la secuenciacin masiva condujeron a principios de los aos 90 a idear el concepto de las bibliotecas de etiquetas de secuencia expresadas (bibliotecas de ESTs). Las secuencias EST son generadas tomando clones al azar de una biblioteca de ADNc y realizando una sola reaccin de secuenciacin que abarca 300-500 pb del clon. Las diferencias en la expresin de genes pueden ser identificadas considerando el nmero de veces en que aparece representada una secuencia en particular. Sin embargo, las secuencias EST a menudo se generan a partir de bibliotecas de ADNc que han sido normalizadas para ecualizar la abundancia de clones que corresponden a los diferentes transcriptos. Los EST secuenciados a partir de estas ltimas pueden ser comparados para identificar transcriptos que se expresan en una biblioteca y estn completamente ausentes en otra, pero si se pretende obtener datos cuantitativos exactos que describan abundancia relativa se debe recurrir indefectiblemente a bibliotecas de ADNc no normalizadas. La posibilidad de detectar diferencias en la expresin de genes a travs de la comparacin de la abundancia de secuencias en las bases de datos de EST se incrementa con el crecimiento de estas bases. La combinacin de la informacin generada por los EST (nivel y localizacin espacio/ temporal de la expresin gnica) y la de los proyectos de secuenciacin de genomas (secuencias completas de los genes y sus promotores) permite realizar asociaciones de expresin y homologa estructural que en muchos casos facilitan la inferencia de la posible funcin de los genes identificados. Por supuesto, esto constituye una instancia inicial en la identificacin de la funcin de cada gen. Para determinar su actividad precisa deben hacerse estudios particulares en general dirigidos a bloquear o aumentar su expresin por ingeniera gentica y a modificar estructuralmente la molcula de manera de

alterar la actividad de los diferentes dominios de la protena que codifica. 6 Anlisis serial de la expresin de genes El anlisis serial de la expresin de genes (SAGE) consiste esencialmente en una versin acelerada de la secuenciacin de EST. Est basada en el concepto de que una etiqueta corta de unas pocas bases es suficiente para identificar inequvocamente a un transcripto, siempre y cuando est ubicada en una posicin definida dentro de la secuencia del mensajero. Una etiqueta SAGE consiste tpicamente en 9 bases de secuencia ubicadas por debajo del ltimo sitio de reconocimiento de una endonucleasa especfica en el transcripto blanco. Mltiples etiquetas SAGE se ligan juntas en un vector de clonado de manera que una reaccin de secuencia de 300 a 500 pb genera las secuencias de 20 a 30 etiquetas al mismo tiempo (Fig. 4, ver pg.7). Como cada etiqueta SAGE representa un nico transcripto de ARNm, es posible obtener una visin general de todos los genes expresados en la muestra original. Las diferencias en la expresin de genes entre muestras experimentales pueden entonces ser identificadas comparando la abundancia relativa de etiquetas SAGE especficas en diferentes bibliotecas. Los genes o las secuencias EST representados por las etiquetas SAGE son localizados en las bases de datos detectando aquellos transcriptos que tengan la etiqueta SAGE en la posicin adecuada. Una limitacin del SAGE es la identificacin de los genes representados por las secuencias de etiquetas. Este proceso est en primer lugar restringido a secuencias que estn accesibles en las bases de datos. Sin embargo, esta limitacin se tornar menos problemtica a medida que se generen ms secuencias EST y que a las secuencias existentes se les asignen asociaciones y funcin. Otra limitacin potencial es la identificacin errnea de las etiquetas. Esto puede resultar de errores de secuenciacin y de la identificacin fallida de la regin que corresponde al SAGE en la base de datos de secuencia. Adems, ciertos transcriptos pueden estar ausentes en la muestra, dependiendo de cul sea la enzima especfica usada para generar la biblioteca de SAGE. Otros ARNm por el contrario

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pueden estar representados por mltiples etiquetas SAGE a causa de la existencia de polimorfismos en un slo nucletido o el procesamiento alternativo de los transcriptos. Se espera que muchos de esos problemas afecten a una porcin relativamente pequea de los genes representados, pero no deberan ser dejados de lado en la interpretacin de los resultados. Por otra parte, dos ventajas importantes del SAGE sobre la hibridacin substractiva y el display diferencial es que los datos obtenidos son cuantitativos y acumulativos. Si se genera la suficiente cantidad de informacin de secuencia se obtienen perfiles exactos de la expresin de los transcriptos, que describen la abundancia de todos los genes expresados en una clula o tejido. Existe una base de datos pblica de expresin gnica que ha sido creada para el almacenamiento y anlisis de secuencias de SAGE cuyo poder continuar creciendo a medida que se contribuya con ms informacin. Otra caracterstica de los datos de SAGE es que pueden complementar datos de ESTs generados a partir de bibliotecas de ADNc normalizadas o substradas. Los EST brindan informacin de secuencia mientras que el SAGE provee datos cuantitativos describiendo la abundancia de los transcriptos. Finalmente, a pesar de que el SAGE requiere capacidad de secuenciacin de ltima generacin, la cantidad de datos que aporta puede ser 20 veces mayor que el que posibilita la misma cantidad de secuenciacin EST. 7 Hibridacin de microarreglos o micromatrices La evaluacin de la expresin de genes usando la tecnologa de micromatrices ha demostrado ser un procedimiento muy efectivo para una variedad de aplicaciones. Los tres tipos generales de micromatrices incluyen: i) chips de oligonucletidos, construdos realizando la reaccin de sntesis de cebadores cortos directamente sobre una matriz de vidrio, ii) arreglos de oligonucletidos, construdos depositando oligonucletidos sobre placas de vidrio o membranas de nylon, iii) arreglos de ADNc, obtenidos depositando insertos amplificados por PCR a partir de una biblioteca sobre placas

de vidrio o membranas de nylon. Uno de los aspectos ms importantes de la experimentacin con micromatrices es la seleccin de los fragmentos de ADN que contendr. An cuando el nmero de genes representado suele ser grande (3000 a 10000), pueden faltar algunos que sean importantes para una cuestin experimental particular. La seleccin de la biblioteca ms adecuada para una aplicacin en particular y la eleccin de los clones son factores crticos que determinan el xito de estos experimentos. En algunas situaciones, puede ser ms efectivo enfocar los experimentos en un grupo pequeo de genes seleccionados por criterios ms especficos como, por ejemplo, perfiles de distribucin de tejidos, clasificacin funcional o cambio de expresin conocidos. Se pueden adquirir clones de fuentes comerciales u otras fuentes y/o clonar secuencias especficas usando tcnicas estndar de biologa molecular. Despus de que los clones han sido seleccionados deben ser ensamblados y organizados para generar el arreglo de ADNc junto con los controles apropiados. Tpicamente, el largo de los insertos ser mayor a 500 bases, pero esto depende de los clones seleccionados. Los productos de PCR son purificados y luego depositados (o impresos) en lugares precisos sobre una placa de vidrio o una membrana de nylon. Los instrumentos usados para la produccin de micromatrices han mejorado en los ltimos aos. Las opciones varan desde la construccin de un arreglo por raspado hasta la compra del sistema completo. Independientemente de cul sea el origen de los clones, es esencial saber con seguridad la secuencia de cada sonda que est siendo ubicada sobre la matriz para asegurar una interpretacin exacta de los datos resultantes. Por la tanto, puede ser necesario secuenciar por duplicado todos o una porcin de los fragmentos organizados (Fig. 5, ver pg.8). El ARNm que representa las muestras experimentales se prepara para la hibridacin con las micromatrices de ADNc por transcripcin reversa y marcado con nucletidos fluorescentes (Cye3 y Cye5 dUTP) o radiactivos ([ 33 P] dCTP). Las molculas

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Figura 3: Generacin de una huella digital de ARN por la tcnica de ADNc-AFLP. El RNA mensajero se transcribe en forma reversa utilizando un poliT como cebador. Las hebras de ADNc se digieren con dos enzimas de restriccin, una de corte raro y otra de corte frecuente. Se ligan adaptadores complementarios a ambos extremos y se preamplifican por PCR los fragmentos utilizando cebadores que reconocen la secuencia de los adaptadores. Los fragmentos que contienen adaptadores diferentes en los extremos son amplificados preferentemente a causa de que en general tienen un tamao intermedio. Luego se realiza una segunda amplificacin utilizando cebadores anclados con una o dos bases adicionales en el extremo 3que amplifican una subpoblacin de fragmentos. El cebador correspondiente al adaptador para la enzima de corte raro est marcado radiactivamente. La combinacin de diferentes cebadores anclados genera perfiles provenientes de distintos subgrupos de ARNms.

Figura 4: Procedimiento general para la obtencin de etiquetas de secuencia SAGE. El ARN mensajero es transcripto en forma reversa utilizando un poliT biotinilado como cebador. Luego es digerido con una enzima de restriccin ancla que reconoce sitios de 4 bases frecuentes en la secuencia de los mensajeros. Es probable que la mayora de los mensajeros sean digeridos por esta enzima en algn sector de su secuencia. Los extremos 3de las molculas son recuperados por unin a esferas de estreptavidina. La muestra se divide en dos partes iguales que se ligan alternativamente a dos adaptadores diferentes (A y B). A continuacin son digeridas con una segunda enzima de restriccin (enzima de etiquetado) que reconoce un sitio dentro de la secuencia del adaptador pero corta al transcripto unos 20 pares de base ms abajo generando un extremo romo. Ambas muestras se mezclan, se ligan y amplifican con dos oligonucletidos A y B complementarios a los respectivos adaptadores. Los amplicones se digieren nuevamente con la enzima ancla y los fragmentos se ligan como concatmeros y se clonan. Este diagrama fue adaptado a partir del presentado por Velculescu et al. 1995.

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Figura 5: Expresin de genes controlada a travs del uso de microarreglos de ADNc. Los clones amplificados por PCR se imprimen sobre un soporte slido. Las muestras a analizar se marcan con diferentes fluorforos y se hibridizan con la matriz. Un detector permite medir por separado la emisin de cada fluorforo. La intensidad de la seal de hibridizacin ser proporcional al contenido de cada molcula particular de ARN en la muestra. Los patrones de emisin de ambas muestras son comparados para detectar expresin diferencial.

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fluorescentes generalmente se usan para marcar sondas con las que se hibridarn placas de vidrio, mientras que las radiactivas se incorporan a sondas que se usarn sobre membranas de nylon. Los fluorforos Cye3 y Cye5 presentan diferentes espectros de emisin, por lo tanto dos muestras experimentales pueden ser marcadas alternativamente con cada uno de ellos, hibridadas juntas en una reaccin nica competitiva y luego evaluadas en forma separada con un detector de fluorescencia. Por el contrario, las muestras radiactivas deben ser hibridadas individualmente en reacciones seriales y pueden ser detectadas usando un sistema de fosfoimgenes. Independientemente del diseo experimental, el anlisis de micromatrices se basa en la premisa de que la intensidad de la seal de hibridacin resultante para una secuencia es proporcional a la cantidad de ARNm que corresponde a esa secuencia en la muestra original. La expresin relativa de cada secuencia representada en el microarreglo es evaluada comparando las seales de intensidad de hibridacin generadas por las diferentes muestras experimentales. Cada experimento de micromatrices genera una gran cantidad de datos y es crtico realizar un procesamiento apropiado de los mismos. El anlisis de la informacin obtenida puede ser dividido en tres componentes: i) identificacin y cuantificacin de las intensidades de hibridacin; ii) visualizacin de los datos; iii) tcnicas de agrupamiento. El primer componente incluye la identificacin exacta de los puntos de la imagen, la normalizacin segn el fondo, la cuantificacin de las intensidades de hibridacin y la salida de los datos en una forma utilizable. La visualizacin de los datos incluye su clasificacin y presentacin en una forma lgica y su organizacin en diferentes formatos para apuntar a la resolucin de cuestiones mltiples. Finalmente, los algoritmos de agrupamiento permiten identificar conjuntos de genes con patrones de expresin similar a travs de distintas muestras experimentales. En base a la presuncin de que la expresin de los genes con funciones relacionadas estn regulada en forma coordinada, el agrupamiento de datos de microarreglos se convierte en un mtodo poderoso para asignar

posibles clasificaciones funcionales a genes nuevos. 8 Conclusin Los mtodos descriptos en este captulo son tecnologas eficaces que expanden los estudios de expresin desde los genes nicos hasta el nivel genmico. Ninguno de estos procedimientos per se es ptimo para todas las aplicaciones y la mejor estrategia para situaciones especficas puede ser crear combinaciones de varios de ellos. El continuo refinamiento de las tcnicas genmicas y de la bioinformtica relacionada proporcionar a los investigadores nuevas herramientas para estudiar la expresin de la informacin hereditaria y lograr un mejor entendimiento sobre el control gentico de los procesos fisiolgicos. 9 Lecuras Recomendadas
ADAMS, M. D.; J. M. KELLEY, J. D. GOCAYNE, M. DUBNICK, M. H. POLY-MEROPOULOS, H. XIAO, C. R. MERRIL, A. WU, B. OLDE, R. F. MORENO. 1991. Complementary DNA sequencing: expressed se-quence tags and human genome project. Science (Wash DC) 252:16511666. DAVIS, M. M.; D. I. COHEN, E. A. NIELSEN, M. STEINMETZ, W. E. PAUL, L. HOOD. 1984. Cell-typespecific ADNc probes and the murine 1 region: the localization and orientation of Ad. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:21942198. DIATCHENKO, L.; Y.-F. C. LAU, A. P. CAMPBELL, A. CHENCHIK, F. MOQA-DAM, B. HUANG, S. LUKYANOV, K. PUKYANOV, N. GURSKAYA, E. D. SVERDLOV, P. D. SIEBERT. 1996. Suppression subtractive hybridization: A method for generating differentially regulated or tissue-specific ADNc probes and libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:60256030. GURSKAYA, N. G.; L. DIATCHENKO, A. CHENCHIK, P. D. SIEBERT, G. L. KHASPEKOV, K. A. LUKYANOV, L. L. VAGNER, O. D. ERMOLAEVA, S. A. LUKYANOV, E. D. SVERDLOV. 1996. Equalizing ADNc subtraction based on selective suppression of polymerase chain reaction: cloning of Jurkat cell transcripts induced by phytohemaglutinin and phorbol 12-myristate 13-acetate. Anal. Biochem. 240:9097. LIANG, P.; A. B. PARDEE. 1992. Differential display of eukaryotic messenger ARN by means of the polymerase chain reaction. Science (Wash DC) 257:967971. MOODY D. E. 2001. Genomics techniques: an overview of methods for the study of gene expression. J. Anim. Sci. 79 (E. Suppl.): E128-E135.

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OKUBO, K.; N. HORI, R. MATOBA, T. NIYAMA, A. FUKUSHIMA, Y. KOJIMA, K. MATSUBARA. 1992. Large scale ADNc sequencing for analysis of quantitative and qualitative aspects of gene expression. Nat. Genet. 2:173 179. SARGENT, T. D.; I. B. DAWID. 1983. Differential Gene expression in the gastrula of Xenopus laevis. Science (Wash DC) 222: 135-139. SCHENA, M.; D. SHALON, R. W. DAVIS, P. O. BROWN. 1995. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science (Wash DC) 270:467470. VELCULESCU, V. E.; L. ZHANG, B. VOGELSTEIN, K. W. KINZLER. 1995. Serial analysis of gene expression. Science (Wash DC)270:484487. WELSH, J.; K. CHADA, S. S. DALAL, R. CHENG, D. RALPH, M. McCLELLAND. 1992. Arbitrarily primed PCR fingerprinting of ARN. Nucl. Acids Res. 20:49654970.

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VII.- Captulo 3
Anlisis informtico de secuencias moleculares
Paniego, Norma; Heinz, Ruth; Fernndez, Paula; Lew, Sergio; Hopp, Esteban 1 Introduccin La Bioinformtica es el rea de las ciencias de la computacin que aborda la bsqueda de soluciones a los problemas biolgicos con herramientas computacionales. Tanto el anlisis genmico como sus disciplinas relacionadas pueden ser abordados desde una perspectiva diferente a partir de la enorme disponibilidad de secuencias moleculares acumuladas en las bases de datos internacionales como GenBank [1], EMBL [2], DDBJ [3] y SwissProt [4]. El impacto de los proyectos genmicos durante los ltimos 10 aos, ha sido por un lado la creciente disponibilidad de secuencias, y por el otro la gran diversidad de datos biolgicos acumulados. Esto, junto con el desarrollo de las tecnologas informticas y el arribo de Internet transformando la estructura de almacenamiento y acceso de los datos, ha permitido el desarrollo de aspectos fundamentales para el avance de los conocimientos sobre los sistemas biolgicos, como lo son la bsqueda de similitud en secuencias moleculares, el anlisis comparativo (filogentico, taxonmico y sintnico) de las especies, el anlisis de macromolculas, la ingeniera y diseo de estructuras proteicas, entre otros [5]. El propsito de este captulo es introducir los conceptos y las herramientas bsicas de la Bioinformtica a los estudiantes de un curso de biotecnologa vegetal o de biologa molecular de plantas. De ninguna manera este material pretende cubrir la totalidad de los recursos existentes para la materia, por el contrario el objetivo es guiar el inters de los estudiantes en la exploracin y el uso de mtodos computacionales decisivos para el desarrollo de su actividad cientfica o profesional futura. Por lo cual, en primer lugar describiremos las bases de datos generales para secuencias de ADN y protenas y las bases

de datos especficas de plantas remitiendo en cada caso al estudiante a visitar las paginas principales de los sitios mencionados para ampliar el conocimiento de los mismos. Posteriormente, con la misma orientacin abordaremos aspectos relacionados a la bsqueda, el anlisis y la interpretacin de secuencias biolgicas. 2 Bases de datos moleculares Un proyecto tpico de anlisis genmico genera secuencias nucleotdicas las cuales se hacen pblicas envindolas a las bases de datos internacionales. No slo lo hacen los proyectos dedicados a la secuenciacin a gran escala. Tambin lo hacen los investigadores involucrados en proyectos ms especficos de biologa molecular, dado que el depsito de la secuencia es una condicin frecuentemente exigida por las revistas internacionales que publican estos trabajos. As, las bases de datos moleculares se alimentan constantemente y contienen una enorme y heterognea cantidad de datos que incluyen secuencias de cidos nucleicos, protenas, estructuras macromoleculares, etc., asociados a recursos informticos que asisten el acceso, el envo, la actualizacin, y la extraccin de datos. Existen varios cientos de bases de datos accesibles desde la Web, pero la dinmica enunciada no asegura tener el mximo provecho sustentable de las mismas, empezando por mantener una actualizacin constante. Con este fin, se pueden revisar catlogos como DBCAT [6], o el componente DATABANK de la plataforma SRS (Sequence Retrieval System [7]) de integracin de datos del European Molecular Biology Laboratory (EMBL). Otra fuente de actualizacin exhaustiva la constituye el primer nmero de cada ao de la revista Nucleic Acid Research [8] de acceso libre a travs de Internet, que presenta una coleccin actualizada de artculos de los sitios ms importantes como son las bases de datos generales National Center for Biotechnology Information (NCBI, USA), European Bioinformatics Institute (EBI, EU) y DNA Data Bank of Japan (DDBJ, Japn) y bases de datos ms especficas. Otro punto de inters es que la calidad de las secuencias vara notablemente: desde secuencias obtenidas a partir de un pasa-

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je por amplificacin por PCR por secuenciacin nica (es decir, con posibles artefactos tcnicos y sin rechequeos) hasta secuencias obtenidas de clones independientes y que han sido secuenciadas en ambas hebras. Lo mismo pasa con la funcin hipottica de los genes representados. Tpicamente los proyectos de biologa molecular bsica generan datos muy bien caracterizados en cuando a la funcin de los genes estudiados, mientras que los proyectos genmicos generan secuencias annimas cuya funcionalidad es primero hipottica, es decir, deducida a partir de su similitud con otros genes de funcin conocida (ver prediccin de genes, ms abajo) y debe ser corroborada funcionalmente, por ejemplo, mediante experimentos de complementacin gentica. Incluso los perfiles de usuarios que atienden estas bases de datos pueden ser bastante heterogneos: desde el tpico bilogo molecular que clon y secuenci un gen involucrado en su tema de estudio (por ejemplo, genes que se activan a partir de una aplicacin hormonal) hasta evolucionistas interesados en redefinir la taxonoma tradicionalmente basada en caractersticas fenotpicas. A pesar de esta heterogeneidad de intereses y de recursos disponibles, lo ms comn es que los usuarios frecuenten las tres bases de datos generales de acceso pblico. Estos sitios colaboran desde 1982 manteniendo las bases de datos de nucletidos de Genbank (NCBI), EMBL Nucleotide Sequence Database (EMBL-Bank, EBI), y DDBJ [8]. Estos grupos coleccionan una porcin del total de las secuencias producidas y reportadas en el mundo, e intercambian diariamente todas las secuencias nuevas o actualizadas. Las bases de datos de protenas incluyen aquellas que derivan de las bases de datos de nucletidos como Swissprot, TrEMBL [4] y PIR [9], y las bases de datos estructurales como PDB (Protein Data Bank [10]) que contiene mas de 21.000 estructuras resueltas por cristalografa o resonancia magntica nuclear y Macromolecular Structure Database (MSD) [11] que es una base de datos de EBI derivada en parte de PDB. El NCBI, el EBI y el DDBJ disponen de otros recursos como bases de datos de transcriptos (dbEST), polimorfismos de un

solo nucletido (dbSNP), sitios de secuencia especfica (dbSTS), genomas completos, taxonoma, literatura, vectores, etc. por lo cual recomendamos explorar estos recursos visitando la pgina About NCBI [12] y 2CAN [13] del EBI. En general, las bases de datos archivan la informacin a partir de una organizacin o estructura lgica, cada entrada en la base de datos se identifica con un cdigo nico que es una cadena de nmeros y letras. Este identificador o nmero de acceso de la secuencia nunca cambia y es la forma en que se cita la secuencia en las publicaciones. A este identificador se le suma otro cdigo que da cuenta de la versin de la secuencia depositada (seq.versin, geninfo identifier, GI). A medida que la secuencia se va actualizando, el nmero de acceso incorpora un punto seguido de un valor incremental que corresponde a la versin actualizada, mientras que el GI toma un valor diferente en cada actualizacin. Las protenas tambin poseen identificadores o nmeros de acceso (protein_ids) (Fig. 1). 2.1 Sistemas de bsqueda de las bases de datos: ENTREZ, SRS y DBGET Las bases de datos no solo proveen la informacin molecular, sino tambin los medios adecuados para acceder fcilmente a esa informacin. Las interfases de bsqueda principales son ENTREZ [14], SRS [7] y DBGET [15]. La ms usada probablemente sea el sistema ENTREZ del NCBI, una de las caractersticas nicas del mismo es que fue el primero en incorporar relaciones lgicas o nexos entre las entradas individuales de datos en distintas bases de datos pblicas (Fig. 2). La interfase SRS rene unas 400 bases de datos (Fig. 3), en el ltimo ao se desarroll como un sistema integrado de bsqueda y recuperacin de datos asociados y aplicaciones para anlisis de secuencias [16]. DBGET es un sistema simple de acceso de datos a un grupo diverso de bases de datos moleculares (Fig. 4). 2.1.1 Uso avanzado de ENTREZ y SRS NCBI desarroll Entrez como una herramienta para permitir a los usuarios interac-

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Figura 1: La Figura muestra los cdigos asignados por las bases de datos a cada secuencia ingresada. A) Nmero de acceso y gi de una secuencia nucleotdica. B) Nmero de acceso y gi de la secuencia de aminocidos correspondiente.

una interfase de usuario. Es decir, constituye el nexo entre el usuario y las bases de datos subyacentes. Esto le permite al usuario realizar consultas simples y obtener resultados, an desconociendo la arquitectura de las bases de datos. Sin embargo, para realizar consultas ms poderosas (en selectividad y eficiencia), es necesario conocer dicha arquitectura u ordenamiento de la estructura de la base de datos, al menos en parte, y saber como restringir las bsquedas a ciertas reas de la base de datos. Para profundizar en los alcances y la operabilidad de Entrez se recomienda visitar el documento de ayuda en la pgina del NCBI [17]. Sin embargo, desde el punto de vista de la facilidad de uso, tal vez SRS sea una mejor opcin, dado que los formularios de bsquedas avanzados son un tanto ms exFigura 2: Representacin grfica de las relaciones del sistema Entrez plcitos que en el caso de Entrez. para la bsqueda y la recuperacin de datos depositados en el sitio NCBI. Entrez es una plataforma dinmica, en la cual se agregan SRS es un paquete de manejo de constantemente nuevos componentes o cambian de manera dinmica bases de datos desarrollado por las vnculos establecidas entre los elementos. EBI y accesible desde distintos si-

cionar o consultar estas bases de datos. Desde el punto de vista informtico, Entrez es

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Figura 3: Algunas de las Bases de Datos accesibles desde el servidor SRS.

tios, que a diferencia de Entrez, puede ser operado de manera local. 2.1.2 Uso de PubMed (ENTREZ) Otra forma muy popular de acceso es a travs del PubMed , usualmente utilizado para el relevamiento bibliogrfico por la mayora de los cientficos. Se basa en el mapeo automtico de trminos (automatic term mapping): cuando se ingresa un trmino para realizar una bsqueda en PubMed, el servidor que recibe el requerimiento intenta identificar el tipo de bsqueda que se est intentando hacer: est el usuario intentando buscar un autor, o una revista, o un rea de conocimiento? Entonces el servidor filtra los trminos de bsqueda a travs de listas sucesivas para intentar responder dicha pregunta y usar los trminos en forma eficiente. Este proceso utiliza las siguientes listas

MeSH (Medical Subject Headings): vocabulario controlado utilizado para indexar artculos en PubMed. Journals: nombre completo de la revista, abreviaturas usadas en MedLine y nmeros ISSN. Lista de frases: cientos de miles de frases generadas a partir de MeSH y otros vocabularios controlados similares. ndice de autores: apellido e iniciales. Si el trmino ingresado est presente en alguna de estas listas, la bsqueda se limitar a ese campo de la base de datos. En caso contrario, el trmino ser utilizado para buscar sobre todos los campos de la base de datos. Es evidente que si uno slo est interesado en buscar publicaciones en determinada revista (por ejemplo Cell), es ineficiente utilizar el trmino Cell como palabra clave, ya que muy probablemente exista algn autor llamado as, y la palabra Cell se encuentre presente en varios ttulos o resmenes.

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Figura 4: Representacin grfica de las relaciones del sistema DBGET para la bsqueda y la recuperacin de datos

El mapeo automtico de trminos puede evitarse en primer lugar encerrando el trmino o frase entre comillas. Esto evitar el filtrado a travs de listas, realizando una bsqueda sobre todos los campos de la base de datos en forma directa. Adems, en caso de una bsqueda con una frase (ms de una palabra), esto fuerza la bsqueda usando la frase tal como fue ingresada (con las palabras en ese orden), lo cual puede resultar til en algunos casos. Los trminos de una bsqueda pueden proporcionarse truncados (truncation), utilizando un asterisco (*). Por ejemplo, una bsqueda con el trmino enzym* retornar citas conteniendo la palabra enzyme, pero tambin enzymes, enzymology, enzymatic, etc. La bsqueda con trminos truncados desactiva el mapeo automtico, por lo cual

las bsquedas utilizando este mtodo van a diferir de las que no lo usan. PubMed ignora ciertas palabras en las bsquedas, estas son llamadas stopwords y corresponden a palabras muy comunes, presentes en la gran mayora de las citas de la base de datos: artculos, proposiciones, adverbios, etc. La lista de stopwords se encuentra en la documentacin de PubMed. Entrez permite combinar trminos utilizando operadores lgicos ( AND, OR, NOT). Los operadores lgicos, tambin llamados operadores volanos ( boolean operators), deben ser ingresados en maysculas para ser reconocidos como tales por Entrez (por ejemplo: vitamin C OR zinc, DNA AND Crick AND 1993). Entrez lee los operadores lgicos de izquierda a derecha. Es posible cambiar el orden de evaluacin de los ope-

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radores usando parntesis. Para focalizar las bsquedas es recomendable utilizar cdigos de calificacin de trminos (search field qualification). Esto es, describir qu tipo de trmino se est usando: si se busca por nombre de un autor, de una revista, o por fecha, etc. La calificacin de trminos se realiza agregando una etiqueta entre corchetes al lado del trmino a calificar. Es muy poco intuitivo el criterio de uso de estos calificadores, por lo que se recomienda leer el manual como fue sugerido al inicio del captulo. Entrez realiza las bsquedas sobre cierto tipo de campos de la base de datos. Estos campos se encuentran indexados, y es posible acceder a los ndices para evaluar la eficacia de nuestra estrategia de bsqueda. Cuando se realiza una bsqueda, se selecciona en Preview/Index, esto permite acceder a un formulario para ver los ndices y eventualmente agregar un trmino a la bsqueda. 2.1.3 Uso de SRS El SRS ofrece a los usuarios la posibilidad de buscar datos y analizarlos a travs de distintos paquetes de software en el mismo sitio. La pgina de inicio de este servidor presenta distintas opciones: Comenzar un proyecto temporario o permanente. Correr una aplicacin. Acceder a informacin disponible sobre las bases de datos. Acceder a la documentacin en lnea. Para realizar una bsqueda hay que seleccionar sobre Start a Temporary Project, con lo que se abre una pgina que muestra las bases de datos disponibles en el sitio. Una vez all deber seleccionarse la(s) base(s) de datos sobre la cual(es) buscar. Es posible seleccionar todas las bases de datos seleccionando sobre el botn all. Luego se accede a la solapa de bsqueda estndar (denominada QUERY) donde se definen las opciones de bsqueda y se ingresan las palabras clave. Dentro de las opciones de bsqueda, si seleccionamos Append wildcards to words la bsqueda se realizar sobre las palabras claves ingresadas y tambin sobre todas aquellas posibles termina-

ciones de dichas palabras. Combine searches with permite relacionar los trminos de la bsqueda mediante los conectores & AND, OR y BUTNOT. Number of entries to display per page permite definir el nmero mximo de registros listados en cada pgina. Pueden hacerse bsquedas extendidas para lo cual hay que ingresar al sitio seleccionando sobre el botn Extended, habiendo seleccionado primero una base de datos. En este formulario se pueden definir los mismos parmetros que en el formulario estndar (wildcards, nmero de registros por pgina, etc.), pero a su vez contiene una lista de reas de datos (que varan de acuerdo con el tipo de base de datos utilizada) sobre la cual pueden realizarse bsquedas. Una vez elegido el campo sobre el cual se quiere buscar, simplemente hay que ingresar la(s) palabra(s) clave en el cuadro de texto de la derecha. 3 Otras bases de datos moleculares Aparte de las bases de datos generales existe un gran nmero de bases de datos especializadas de gran importancia para focalizar proyectos y obtener informacin adicional generalmente no accesible desde las bases generales como son fenotipos, datos experimentales, datos de mapeo, etc.; bases de datos derivadas del anlisis de las bases de datos generales (bases de datos de motivos funcionales y estructurales) y bases de datos de interacciones. Un rea de estas bases especializadas por especies la constituye el rea de proyectos genmicos de plantas. Aqu las iniciativas centrales la constituyen la secuenciacin completa de especies modelo como Arabidopsis thaliana [18] y el arroz, Oryza sativa var. indica [19] y Oryza sativa var. japonica [20]. Sin embargo, estn en marcha muchos proyectos de secuenciacin parcial de genomas en gramneas, crucferas, solanceas, compuestas, etc., que aportan informacin para sustentar el anlisis comparativo de regiones de inters entre genomas ampliando los conocimientos sobre la estructuracin de genes y genomas de las plantas. La identificacin de regiones sintnicas (conservacin de las posiciones cromosmi-

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cas relativas de secuencias marcadoras homlogas en especies relacionadas, es decir, conservacin de mapas genticos a escala evolutiva) har posible el aislamiento de genes en especies con genoma complejo, usando la informacin de genes homlogos en especies con genomas ms pequeos y ms profusamente estudiados (los as llamados clonados posicionales en base a mapas) [21]. Desde lo acadmico, el anlisis comparativo de los genomas usando una estrategia bioinformtica persigue entender cuales son los mecanismos esenciales para el funcionamiento mnimo de una planta, su crecimiento normal, su desarrollo y metabolismo, entender las bases de la especiacin y la diversidad, los mecanismos bsicos de la adaptacin y la enorme diversidad qumica [22]. 3.1 Bases de datos de motivos Existe otro conjunto de bases de datos denominadas secundarias porque derivan
Base de Datos Blocks CDD CluSTr DOMO InterPro IproClass MetaFam Pfam PIR PIR-ALN PRINTS-S ProClass ProDom PROSITE ProtoMap SBASE SMART Descripcin

de las bases de datos generales, son las llamadas de motivos estructurales y funcionales. Estas bases de datos introducen el concepto de patrones y perfiles de secuencias. Los patrones definen secuencias cortas de aminocidos conservados que corresponden a sitios activos, sitios de unin, etc. Al ser regiones acotadas, no dan cuenta del resto de la secuencia adyacente y son muy poco sensibles al momento de encontrar secuencias relacionadas que presenten una divergencia mnima en la regin definida por el patrn [23, 24, 25]. Los perfiles compensan esta debilidad dado que cubren reas ms largas de la secuencia a travs de la representacin numrica de las posiciones conservadas en un alineamiento mltiple. En otras palabras, los perfiles representan las posiciones comunes y caractersticas de aminocidos de una coleccin particular de secuencias, frecuentemente de una familia de protenas. Usando perfiles es posible encontrar miembros muy divergentes de familias de protenas que presenten muy baja identidad de secuencia [23, 24, 25].
URL http://blocks.fhcrc.org/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml http://www.ebi.ac.uk/clustr/ http://www.infobiogen.fr/services/domo/ http://www.ebi.ac.uk/interpro/ http://pir.georgetown.edu/iproclass/ http://metafam.ahc.umn.edu/ http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/ http://pir.georgetown.edu/ http://pir.georgetown.edu/pirwww/dbinfo/piraln.html http://www.bioinf.man.ac.uk/dbbrowser/PRINTS/ http://pir.georgetown.edu/gfserver/proclass.html http://prodes.toulouse.inra.fr/prodom/doc/prodom.html http://www.expasy.ch/prosite/ http://www.protomap.cs.huji.ac.il/ http://www3.icgeb.trieste.it/~sbasesrv/ http://smart.embl-heidelberg.de/ http://www.ebi.ac.uk/swissprot/ or http://www.expasy.org/sprot/ http://systers.molgen.mpg.de/ http://www.tigr.org/TIGRFAMs/

Database of protein alignment blocks Conserved domain database Clusters of SWISS-PROT and TrEMBL proteins Protein-domain database based on sequence alignments Integrated documentation resource for protein families, domains and functional sites Integrated protein classification database Database of protein family information Collection of multiple sequence alignments and hidden Markov models Protein Information Resource Curated database of protein sequence alignments Compendium of protein fingerprints Non-redundant protein database organized by family relationships Automatic compilation of homologous domains Database of patterns and profiles describing protein families and domains Automatic hierarchical classification of SWISS -PROT proteins Curated protein domain library based on sequence clustering Simple Modular Architecture Research Tool - a collection of protein families and domains

SWISSPROT Protein sequence databases and TrEMBL Systematic re-searching method for sequence searching and SYSTERS clustering TIGRFAMs Protein families based on hidden Markov models

Tabla 1: Bases de datos y recursos para el anlisis de datos de familias de protenas, dominios y motivos [25].

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Dentro de este grupo de bases de datos que proveen informacin para la bsqueda de secuencias homlogas remotas y para la prediccin de funcin se incluyen Prosite, PRINT-S, Pfam, SMART, TIGRfam y Blocks entre otras listadas en la Tabla 1. 4 Alineamiento de Secuencias: Fundamentos 4.1 Alineamiento de pares de secuencias Una de las maneras mas frecuentes de obtener informacin sobre una o un grupo de secuencias incgnitas, es mediante la bsqueda comparativa utilizando la informacin depositada en distintas bases de datos. Uno de los mtodos comparativos ms comunes es el alineamiento de pares de secuencias, la descripcin del resultado del mismo trae aparejado el uso (o mal uso) de los trminos: identidad, similitud y homologa. La identidad significa que existe exactamente el mismo nucletido o aminocido en la misma posicin de las secuencias alineadas. Similitud expresa una medida observable que considera por un lado las identidades y por otro lado, le da valor a las sustituciones favoreciendo aquellas que sean conservativas respecto de las que no lo son. Finalmente, homologa significa que las secuencias no slo se parecen mucho entre s, sino que tambin comparten una historia evolutiva [26, 27]. Los algoritmos de comparacin de secuencias ms comunes tales como BLAST [28], FASTA [29] y SSEARCH [30, 31] miden similitud o identidad entre secuencias pero no miden homologa. La forma que estos algoritmos emplean para darle significado a cada uno de los alineamientos posibles es asignndole un valor (score) a cada uno de ellos, el score ms alto corresponde al mejor alineamiento. La manera ms comn de asignar este valor es, a travs de una suma simple de scores especificados para cada alineamiento de pares de letras (que representan igualdades o sustituciones), y de letras con caracteres nulos (que representan deleciones o inserciones). El conjunto de estos scores mencionados representa una matriz de scores, las ms populares son las matrices de bloques de sustitucin BLOSUM [32] y las matrices de mutaciones

puntuales aceptables PAM [33, 34]. La construccin de estas matrices se basa en el modelo de Dayhoff [33], que establece que relaciones lejanas entre secuencias pueden modelarse con suficiente precisin usando la informacin de secuencias estrechamente relacionadas. Ambas matrices se basan en grupos de alineamientos altamente confiables de protenas homlogas, a partir del cual miden la frecuencia de todas las sustituciones a travs de mtodos diferentes [26]. Las matrices PAM fueron calculadas sobre la base de un modelo de distancia evolutiva sobre alineamientos de secuencias muy relacionadas, as PAM1 define una unidad de cambio evolutivo y representa la probabilidad de que 1 aminocido en 100 haya experimentado una sustitucin. Multiplicando PAM1 por s mismo se obtiene una familia de matrices de sustitucin arbitrarias que representan distintos grados de parentesco. La matriz PAM120 es considerada una buena matriz de sustitucin para analizar secuencias evolutivamente ms cercanas, mientras que PAM250 es ms apropiada para comparar secuencias ms distantes [26, 27]. Las matrices BLOSUM son calculadas de manera similar pero usando una estrategia diferente para estimar las frecuencias de sustitucin [27, 32]. Los bloques representan alineamientos mltiples de secuencias relacionadas (a diferencia de PAM, que usa secuencias estrechamente relacionadas). Los nmeros asociados a estas matrices indican el valor de corte del porcentaje de identidad que define el grupo. Por lo tanto, las matrices con valores de corte ms bajo (ej. BLOSUM62) admiten una mayor diversidad de secuencias en los grupos y son ptimas para comparar secuencias ms distantes. No obstante, los eventos de mutacin no slo incluyen sustituciones sino tambin inserciones y deleciones, por lo cual tambin se asigna un score a los intervalos vacos o gaps observables en los alineamientos. Una vez definido el score para un alineamiento arbitrario, surge la necesidad de encontrar el alineamiento ptimo entre los muchos alineamientos posibles. Dado que lo ms comn entre secuencias de ADN o protenas es que sean similares en algunos seg-

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mentos y no en toda la extensin de las secuencias involucradas, lo ms frecuente es usar en esta instancia programas basados en el algoritmo de Smith-Waterman que busca ptimos en alineamientos locales de pares de secuencias [35]. No obstante, tratn-

dose de mtodos de programacin dinmica, para los cuales el tiempo de clculo es proporcional al cuadrado del tamao de las secuencias que se comparan [23], son extremadamente lentos para realizar bsquedas exhaustivas en las bases de datos de mayor

Figura 5: Resultado de una bsqueda en BLAST. A) el encabezado muestra el nombre de la secuencia incgnita y el nombre de la base de datos analizada. Como el programa usado fue BLASYx, la secuencia fue traducida en las seis marcos de lectura correspondientes y comparada con la base de datos nr (non redundant}de protenas mantenida por NCBI. B) muestra una representacin grfica de los alineamientos. C) muestra un resumen de los alineamientos mas significativos junto con el score normalizado y el valor E. D) muestra los lineamientos detallando las propiedades

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referencia (GenBank, Swissprot, etc.). En cambio, tanto FASTA como BLAST emplean otro tipo de desarrollo llamado heurstico, que favorecen la velocidad a cambio de la sensibilidad y la selectividad [26]. Ambos programas operan de manera similar pero usando distintas estrategias para localizar las posiciones donde es ms probable que ocurra el mejor alineamiento. FASTA busca cadenas de letras exactamente iguales de un tamao fijo establecido (words). BLAST, en cambio, usa matrices de sustitucin (tomando de base BLOSUM62 para secuencias de aminocidos) para encontrar words que sin ser exactamente iguales muestren el score ms alto, en este nivel de bsqueda ambos algoritmos no admiten gaps. BLAST realiza algunas otras operaciones como filtrar las regiones de baja complejidad (regiones repetitivas), y elimina words con baja probabilidad de producir un score alto. Una vez que se identifican estas regiones de alto score, se aplican algoritmos ms sofisticados de programacin dinmica, ahora s permitiendo la existencia de gaps. En esta segunda etapa BLAST busca segmentos similares a la lista de words establecidos en toda la base de datos y cuando encuentra un alineamiento posible trata de extenderlo hacia ambas direcciones, hasta tanto el score contine incrementndose. Luego BLAST evala si el valor E de los alineamientos obtenidos satisface el umbral seleccionado por el usuario (normalmente entre 0,1-0,001) para finalmente informar la lista de los seleccionados. La Figura 5 muestra un resultado obtenido a partir de BLAST. El encabezado cita la versin del algoritmo empleado y su referencia, el nombre y la longitud de la secuencia analizada y la base de datos que se us como blanco. La segunda parte del informe presenta un resumen de todas las secuencias que produjeron alineamientos significativos junto con un valor de score normalizado y el valor E . La tercera parte muestra los alineamientos detallando los valores de los scores, identidad y valor E obtenidos y la ltima parte del informe muestra los parmetros utilizados en la bsqueda. Para interpretar los resultados obtenidos de la bsqueda de similitud en bases de datos moleculares usando cualquiera de los algoritmos (FASTA, BLAST o SSEARCH), el valor ms representativo es el valor E [26, 35].

Este depende del valor de score, del largo de la secuencia incgnita y del tamao de la base de datos analizada y mide las chances de que el alineamiento obtenido sea solamente causa del azar. As un valor E de 0.001 (que es el valor de corte ms usado par las bsquedas con BLAST) significa que hasta 1 de cada 1000 alineamientos puede haberse dado por azar. Un valor cercano o menor a 1 e-50 es menos frecuente de encontrar, y resulta muy confiable en cuanto a que las secuencias alineadas estn evolutivamente relacionadas, no obstante esta apreciacin exige una confirmacin mediada por un anlisis filogentico. 4.2 Alineamiento mltiple de secuencias Como se mencion ms arriba, el advenimiento de proyectos genmicos a gran escala ha llevado a la acumulacin de un enorme y heterogneo nmero de secuencias depositadas en bases de datos pblicas. El alineamiento mltiple de secuencias juega un papel importante en la biologa molecular actual. Tanto la anotacin (edicin por correccin e interpretacin de hipotticas funciones por homologa) de dichas secuencias como las herramientas de anlisis dependen de alineamientos mltiples adecuados. El objetivo de la aplicacin ha pasado de una simple transferencia de anotacin funcional de una secuencia a otra, a un enfoque genmico ms amplio. El anlisis de familias proteicas, la prediccin de su estructura secundaria, la estimacin de los diferentes tipos de plegamientos as como la deteccin de homlogos entre especies distantes como pasos intermedios en la construccin de rboles filogenticos, se han constituido en los principales objetivos de este tipo de alineamiento [37, 23]. El alineamiento mltiple de secuencias puede ser visto como una generalizacin del alineamiento de pares de secuencias, donde la complejidad de esta aproximacin crece exponencialmente con el nmero de secuencias que intervienen. La posibilidad de resolver el problema por mtodos manuales [38] debe quedar descartada por la enorme complejidad del problema, limitndose su uso a casos con pequeos grupos. Por analoga con la comparacin de pares de secuencias, es

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posible aplicar la misma tcnica de programacin dinmica al caso exhaustivo multidimensional, pero el crecimiento exponencial de la complejidad de mtodo limit su aplicacin prctica [39, 40, 41]. Introdujeron un esquema de acotamiento que utiliza alineamientos de parejas de secuencias para limitar el volumen del espacio N dimensional que se necesita para el alineamiento exhaustivo, resultando en importantes mejoras en la velocidad, que posibilitaron su implementacin en el programa MSA [42] y la aplicacin del mtodo a pequeos grupos de secuencias. Por lo general tampoco es posible alinear ms de 10 secuencias usando el riguroso modelo del programa MSA. De esta forma es fcilmente entendible la proliferacin de mtodos aproximados para conjuntos ms grandes de secuencias. Los programas desarrollados abarcan una amplia gama, desde aquellos que utilizan mtodos progresivos tradicionales [43, 44, 45] a aquellos iterativos y con mayores requerimientos computacionales [40, 46, 47, 48]. Los mtodos iterativos tienden a una optimizacin de la funcin de puntajes. El objetivo buscado es que la funcin de puntaje refleje una funcin biolgica tal que su optimizacin lleve a un alineamiento biolgicamente correcto. El alineamiento mltiple puede dividirse en dos categoras principales: aquellos mtodos de alineamiento de secuencias en toda su extensin (globales) y aquellos mtodos que alinean regiones con alta similitud. Tradicionalmente se ha focalizado en los mtodos globales tales como el mtodo CLUSTAL W, que son aplicables a casos en los que las secuencias comparadas tienen extensiones similares. Sin embargo ms recientemente se ha puesto mayor inters en los mtodos de alineamiento mltiple local para el alineamiento de secuencias derivadas de proyectos genmicos que slo alinean parcialmente [37]. En los mtodos de alineamiento global, la solucin clsica se basa en la formacin de agrupamientos (clusters) de secuencias, los cuales se resuelven progresivamente [48]. Para ello, dada una medida del parecido o semejanza entre dos secuencias, se elige aquel par correspondiente al valor ms alto y se alinean y agrupan entre s para formar

un nico grupo o cluster de secuencias. A partir de este momento este cluster ser tratado como una sola secuencia, y el proceso se repetir hasta tener un solo cluster con todas las secuencias que intervenan en el alineamiento mltiple. Posiblemente, los programas ms difundidos de este tipo sean CLUSTAL V [45] o CLUSTAL W en su ltima versin [49], y PILEUP, el cual utiliza el mtodo heurstico para el clculo de los niveles de semejanza entre las secuencias [50]. La aplicacin de esta estrategia no garantiza resultados ptimos (en una primera etapa evala por coincidencias de residuos, por lo que s utilizar esquemas de puntuacin, aunque podran existir otras soluciones posibles con puntuacin mayor). Sin embargo, la calidad de los alineamientos es bastante aceptable, y permiten alinear algunos pocos cientos de secuencias [51, 52]. Otro algoritmo de comparacin mltiple global progresivo es el POA que no generaliza perfiles sino que emplea grficos parcialmente ordenados partiendo de las secuencias ms similares y va adicionando otras secuencias progresivamente. Este programa permite comparar no slo secuencias relacionadas originadas por mecanismos de delecin, insercin o mutacin sino secuencias ms distantes [53]. Los algoritmos de comparacin mltiple local, como el DIALIGN, alinean segmentos completos en vez de residuos simples. Inicialmente realiza alineamientos de pares, seleccionando luego las regiones sin intervalos no apareados que aparecen como diagonales de una matriz, para progresar en una comparacin iterativa [46]. Otros programas como el T-Coffee combinan alineamientos mltiples globales y locales, realizando primero una comparacin de a pares global utilizando el algoritmo CLUSTAL W y luego una comparacin local utilizando FASTA [47]. Tanto el DIALIGN como el T-Coffee arrojan mejores resultados con grupos de secuencias ms diversas pero tienen altos requerimientos computacionales. Con la idea de mejorar la sensibilidad de estos resultados, tambin se han propuesto numerosas posibilidades hbridas, tales como la representada por el programa MACAW [54] basado tanto en informacin estadstica sobre alineamientos de segmentos de las secuencias como en la posibilidad de interaccin con el usuario. As mismo, se ha

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propuesto la utilizacin de matrices de consenso [55] para describir la preferencia de cada aminocido, o de cada delecin, para situarse en el alineamiento. Tambin se ha recurrido a informacin sobre las estructuras secundarias [56, 57], o a la localizacin de motivos y/o dominios conservados en las secuencias [58], o a la utilizacin de las caractersticas fsico-qumicas de los aminocidos en cada posicin [59]. 5 Bsqueda por perfiles para localizar homlogos remotos Existe una tercera generacin de mtodos ms elaborados para realizar bsquedas de similitud con mayor sensibilidad [60]. Los ms exitosos son PSI-BLAST y los mtodos basados en los modelos ocultos de Markov (HMM, [61]). El primero es un mtodo extremadamente sensible para detectar similitudes dbiles basndose en un proceso iterativo mediante el cual el algoritmo de BLAST puede ser generalizado para utilizar un perfil en vez de una secuencia [5], se recomienda usar este algoritmo cuando no se encuentran resultados significativos a partir de una bsqueda estndar a travs de BLASTP. El proceso de PSI-BLAST comienza con una secuencia provista por el usuario, la cual es alineada mediante el algoritmo BLASTP contra una base de datos seleccionada. A partir de los alineamientos ms significativos, el programa usa de base aquellos alineamientos que presentan un valor E menor que 0.005 , construye una matriz de scores especficos de posicin o perfil (position-specific scoring matrix, PSSM o profile). En la segunda ronda, la versin adaptada del algoritmo BLAST usa la matriz como entrada para realizar una bsqueda ms refinada. De una manera similar, HMMs genera perfiles a partir de alineamientos mltiples de secuencias, tales como los obtenidos usando Clustal W o X [49, 62] y calcula scores especficos de posicin que guarda en un archivo de formato compatible que luego se usa para analizar una base de datos. Tanto PSI-BLAST como HMMs facilitan el desarrollo de bases de datos secundarias como las bases de datos de dominios de protenas [63, 64] que permiten el anlisis de la

arquitectura modular de las protenas y sus unidades funcionales. Hoy en da se prefiere usar estas bases de datos para predecir o confirmar la funcin de genes o protenas, dado que resultan ms confiables que las bases de datos primarias que reciben grandes cantidades de informacin regularmente lo cual hace difcil controlar que las anotaciones de los datos sean correctas. 6 Prediccin de Genes La expansin de los proyectos genmicos en los ltimos aos ha sido tal que al da de hoy existen 717 iniciativas de este tipo en el mundo, 140 de los cuales corresponden a genomas completos, entre ellos el genoma humano, el genoma de Arabidopsis thaliana [18], Oryza sativa variedad indica [19] y Oryza sativa variedad japonica [20], 235 corresponden a organismos eucariotas, 38 de los cuales son genomas vegetales y 342 corresponden a organismos procariotas (GOLD [65]). La gran cantidad de datos generados por estos, y otros proyectos de anlisis genmico parcial fuerzan las necesidades de disponer de las herramientas adecuadas para darle interpretacin biolgica a estos datos. Una de las etapas ms crticas de este proceso es la de identificar todos lo genes y sus protenas asociadas. La manera ms directa de abordar esta tarea es mediante mtodos comparativos como los descriptos anteriormente basados en encontrar una secuencia altamente similar a la secuencia incgnita en otro organismo usando generalmente bases de datos de protenas. Sin embargo, slo un 50-70% de los genes nuevos suelen encontrar homologa con genes o protenas conocidas [66]. La caracterizacin del resto de las secuencias requiere la aplicacin de mtodos predictivos, los mismos tratan de identificar secuencias codificantes a partir de patrones caractersticos, usualmente secuencias cortas sobre el ADN genmico que representan sitios claves para procesos como la transcripcin (sitios de unin a factores de transcripcin, cajas TATA), el procesamiento postranscripcional del ARN (sitios de splicing) y la traduccin (codones de iniciacin y terminacin) [67]. Existen muchos programas para predecir genes, la mayora de los cuales son accesibles desde la Web, el

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sitio Computational Gene Recognition mantenido por W Li [68] ofrece una lista completa y actualizada de publicaciones y software dedicado a este tema. Sin embargo, aunque los recursos son vastos y los algoritmos de prediccin han ido avanzando junto con los desarrollos en informtica y el avance de los conocimientos, cimentados en una mayor disponibilidad de informacin biolgica caracterizada, actualmente no existen mtodos precisos para identificar estas seales en las secuencias moleculares. Este problema se acenta cuando se trata de predecir genes eucariticos que tienen una organizacin y una estructura ms compleja que la de los genes de organismos procariticos. En genomas complejos los genes no estn dispuestos en forma continua, estn separados por distancias intergnicas enormes y a su vez estn estructurados en fragmentos codificantes (exones) separados por regiones no codificantes (intrones), los cuales adems varan en tamao y nmero dentro y, ms an, entre especies. Algunos programas, adems de reconocer y modelar las seales de patrones especficos, tratan de incorporar un modelo estadstico de las propiedades que definen de manera ms global exones, intrones y regiones intergnicas, aprovechando los sesgos de composicin de bases (en regiones codificantes es ms alto el porcentaje de G+C) [69], el uso de codones, la frecuencia de hexmeros o dicodones [70, 71, 72, 73], la periodicidad de aparicin de bases [74], etc. Sin embargo, todas estas consideraciones no son suficientes para reconocer con exactitud exones e intrones cuando stos son cortos. En la mayora de los casos, los programas ms promisorios para reconocer genes en la especie bajo estudio deben ser analizados particularmente, a partir de lo cual muchos son redefinidos o diseados especficamente [67]. Dado que los algoritmos usan distintas medidas y scores para predecir regiones codificantes, lo recomendable es combinar el resultado de algunos o varios de ellos para construir el mejor modelo, en este sentido existen distintas herramientas de acceso libre como RiceGAAS [75, 76], y GenMachine [77, 78], GenMark [79], entre muchos otros.

7 Conclusiones La biologa moderna ha generado una explosin de informacin en el rea de secuenciacin de genomas completos, la protemica, la transcriptmica, la genmica funcional, la interactmica, la metabolmica, etc. Todo esto genera la necesidad constante de actualizar esta informacin y aplicarla en beneficio de los proyectos particulares. Para ello, es necesario entender cmo se genera esa informacin, cun confiable es, cmo se maneja y cmo se analiza. En este proceso juega un papel clave el desarrollo de la bioinformtica, que se define como un rea de fusin entre la biologa, la matemtica avanzada y la computacin cuyo objetivo discurre en observar la biologa en trminos de macromolculas, con el fin de ordenar y entender la informacin contenida en las mismas a partir de recursos de la informtica. En este sentido, la bioinformtica enfoca tres reas bsicas, la primera tiene que ver con el desarrollo de un sistema simple de organizacin de los datos biolgicos de manera de favorecer el acceso y el ingreso de nuevas entradas a las bases de datos compartidas. La segunda rea tiene que ver con el desarrollo de recursos y herramientas para analizar la informacin coleccionada en las bases de datos, lo cual implica conocimientos slidos en las teoras computacionales y biolgicas.El tercer rea, implica el uso de estas herramientas para analizar los datos e interpretar los resultados de manera biolgicamente significativa. En este captulo hemos intentado dar una visin amplia de la bioinformtica focalizando dos elementos fundamentales como son las secuencias y los alineamientos, familiarizando a los lectores con los recursos bsicos disponibles para el acceso a la informacin y su anlisis, e instalando el concepto de que existen diferentes caminos para resolver un problema. Sin dejar de tener en cuenta que la mayora de los mtodos computacionales se basan en conocimientos limitados sobre genes, protenas y caminos biosintticos por lo cual todos los resultados obtenidos a travs de estos medios exigen una verificacin experimental. En su defecto, es recomendable explorar dis-

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tintos programas que aborden el problema desde perspectivas diferentes. En este sentido, tambin es aconsejable no confiar en los parmetros de base (defaults) de los programas sino experimentar valores diferentes (tales como valor E, enmascarado de regiones de baja complejidad, matriz de score, etc.) para lo cual es crucial leer la documentacin asociada a los programas o bases de datos usadas. 8 Lecturas Recomendadas
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PANIEGO, N.; HEINZ, R.; FERNNDEZ, P.; LEW, S.; HOPP, E.

PARTE VIII Aplicaciones

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ESCANDN, Alejandro S.

VIII.-Captulo 1
Biotecnologa en el Cultivo de Especies Ornamentales
Escandn, Alejandro S.

2 El cultivo de tejidos en ornamentales Una de las tcnicas biotecnolgicas que se emplean en ornamentales es el cultivo de tejidos. Esta tcnica no slo permite la produccin masal de plantas, sino que tambin posibilita el estudio y caracterizacin de la biologa del desarrollo de las mismas. Dependiendo del objetivo planteado es posible clonar individuos utilizando cultivo de pices o meristemas, o bien buscar aumentar la variabilidad gentica por medio del cultivo de callos, suspensiones celulares o protoplastos. La tcnica de micropropagacin (Fig.1) es una excelente herramienta que ha sido am-

1 Introduccin

La industria florcola es de una importancia ms que relevante a escala mundial, ya que representa un negocio de alrededor de 30.000 millones de dlares. Tradicionalmente se ha empleado el mejoramiento clsico para obtener variedades exitosas que satisfagan las demandas de un mercado vido de novedades, que busca nuevas caractersticas en cuanto a colores, formas, aromas, etc. Sin embargo, las tendencias actuales hacia la mejora ecolgica de los cultivos y la necesidad de incorporar caracteres tales como resistencia a herbicidas, insectos, enfermedades, mayor vida en postcosecha, modificar la arquitectura de las flores, etc., ha conducido a la industria de la floricultura a adoptar las nuevas biotcnicas. El presente captulo tiene como objetivo brindar un panorama sobre la situacin actual de la Biotecnologa en relacin al cultivo de plantas ornamentales. No se profundi- Figura 1. Cultivo de tejidos de Santa Rita. A: Desarrollo de la yema principal y de zar en los detalles de las brotes subsidiarios en la base de la misma que sern cultivados in vitro. B: Brotes subsidiarios aislados. C: La flecha seala la yema principal, los restantes son tcnicas involucradas, que brotes subsidiarios cultivados en forma aislada. D: Estado previo a la transferencia ya han sido tratadas en de los brotes al medio de enraizamiento. E: Plantas ex vitro enraizando en otros captulos de este vo- sustrado artificial. F: Plantas ex vitro floreciendo en condiciones de invernculo. Modificado de Escandn et al. RIA 32 (1):11-122. Abril 2003. lumen.

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pliamente utilizada para la propagacin a gran escala de especies ornamentales, ya que no slo permite la obtencin de miles de individuos a partir de un genotipo elite seleccionado, sino que tambin permite la multiplicacin de plantas raras o en peligro de extincin, resguardando la estabilidad gentica de las mismas. Algunos gneros y especies de plantas que se pueden cultivar in vitro a partir de diferentes explantos son: - Cultivo de meristemas: Ghypsophyla, Chrysantemum, Maranata sp., Gladiolus, Iris sp., Pelargonium, Saintpaulia spp. - Apices: Diphaenbachia , Daphne L., Dracaena sp., Gerbera sp., Mammillaria sp., Rosa L. , Iris sp. - Yemas o segmentos nodales: Dianthus, Bignoniaceae, Nierembergia, Jacaranda mimosifolia, Bougainvillea, Blandfordia sp., Anthurium sp. Bromeliaceas, Maranta sp., Campanula sp., Daphne L., Dracaena sp., Gerbera sp., Mammillaria sp., Mediocactus coccineus, Zinnia elegans, Rosa L., Gardenia, Chrysantemum, Gladiolus, Impatiens, Iris sp. , Saintpaulia spp. - Segmentos de mdula: Chrysantemum, Orchidea, Saintpaulia spp. - Pecolos: Rhododendron sp., Anthurium sp., Gerbera sp., Chrysantemum. - Discos de hojas: Rhododendron sp., Bromeliaceas. Begonia sp., Gardenia. Chrysantemum, Saintpaulia spp. - Lmina: Saintpaulia spp. - Escamas: Lilium - Bulbos o Segmentos de bulbos: Sego lily, Narcissus - Rizomas: Cymbidium - Cotiledones: Zinnia elegans. - Semillas: Cattleya sp., Mammillaria sp., Orchidea, Saintpaulia spp. - Embriones maduros: Alstroemeria sp., Zinnia elegans, Impatiens , Iris sp. - Embriones inmaduros: Alstroemeria sp., Orchidea spp. - Secciones de flores: Iris sp. - Anteras: Saintpaulia spp. - Segmentos de ptalos: Chrysantemum. - Segmentos de inflorescencia: Chrysantemum, Saintpaulia spp.. - Captulos: Gerbera sp. - Ovulos: Impatiens

- Callos: Chrysantemum, Iris sp. - Protoplastos: Chrysantemum. - A partir de plntulas in vitro : Bromeliaceae, Gerbera sp., Cyclamen persicum, Gardenia, Scoparia sp. La lista precedente es apenas una muestra de la gran diversidad de explantos que se utilizan para la multiplicacin in vitro de plantas y, como tal, est muy lejos de abarcar el total de las especies ornamentales que se multiplican por este mtodo. Adems de la micropropagacin, la posibilidad de obtener plantas libres de virus por medio del cultivo de meristemas tambin ha sido explotada en ornamentales. Hace ms de 50 aos Morel y Martn informaron la regeneracin de plantas de dalia libres de virus por escisin y cultivo del domo meristemtico de pices de plantas infectadas. Este descubrimiento dio un gran impulso al cultivo de tipo intensivo en general. El cultivo de meristemas es uno de los mtodos ms eficaces para la eliminacin de virus, ms an si se lo combina con termoterapia y/o mtodos qumicos; es de gran aplicacin en el campo de los cultivos intensivos tanto ornamentales como hortcolas. Como la mayora de los cultivos ornamentales se multiplican asexualmente, estas enfermedades virales suelen ser un problema importante. La eleccin errnea de un material, por error o desconocimiento, provocara la diseminacin de estas enfermedades, con las consecuentes prdidas econmicas Gerbera representa un claro ejemplo de la necesidad de la aplicacin de estas tcnicas en la industria florcola. En Europa la demanda anual del mercado de plantas de este gnero oscila entre 15 y 20 millones de unidades. Con el mtodo convencional (semillas o divisin de la corona sobre sustrato artificial e inerte) se logra una tasa de multiplicacin de 30 plantas por ao. Por otro lado, se hace necesario eliminar de los cultivos de esta especie los virus que los afectan normalmente, entre ellos el del mosaico del coliflor (CMV). Si bien existe una dependencia del genotipo, por medio de la multiplicacin de yemas apicales in vitro es posible obtener una tasa de multiplicacin de hasta 300 yemas por pice cultivado en 90 das, libres de virus. En general, con todos los genotipos,

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estas tcnicas de produccin superaron largamente los rendimientos del mtodo convencional, por lo que fueron adoptadas como mtodo de rutina para la multiplicacin comercial de este gnero. El cultivo in vitro tambin puede ser fuente de variabilidad gentica. La produccin de plntulas por regeneracin a partir de callos, suspensiones celulares o protoplastos, puede dar origen a individuos que presentan algn rasgo diferente respecto de la planta madre. Esto tambin puede lograrse utilizando mutgenos durante el cultivo in vitro asociados con una presin de seleccin conferida por factores tales como pH, salinidad, toxinas y baja temperatura. Las plantas regeneradas luego de estos tratamientos pueden mostrar caractersticas que difcilmente se puedan obtener por otra va. La induccin de variantes somaclonales tiene especial significado en la floricultura debido a la constante bsqueda de nuevas variedades, seleccionndose las variantes prometedoras y estables e incorporndolas a los programas de mejoramiento. En la actualidad se conoce un importante nmero de variantes en ornamentales. Se han obtenido individuos con diferencias en la forma, el color y el tamao de la flor (en Chrysantemum, Zinnia, Geranium y Saintpaulia). En Chrysantemum, se han obtenido individuos con resistencia al estrs salino y con cambios interesantes en la forma de las hojas. Otro ejemplo de variacin somaclonal es el caso de Zinnia. Los somaclones en este gnero se obtuvieron a travs del desarrollo de yemas adventicias a partir de cotiledones cultivados con diferentes concentraciones de tidiazuron (TDZ). Este fue un avance importante para la especie Z. marylindica, que es un hbrido estril. A partir de este tratamiento se recuper una gran cantidad de variantes, plantas con diferentes tamaos, hbitos de floracin, color de ptalos y, lo que es ms interesante, en algunos casos se restaur la fertilidad. Aquellas variantes cuyos nuevos caracteres mostraron ser heredables se seleccionaron para incorporar en el programa de mejoramiento. Asimismo, la variacin somaclonal tambin se ha utilizado a fin de seleccionar genotipos resistentes a enfermedades fngicas en el gnero Rosa, lo mismo que la

fusin de protoplastos. En este caso se obtuvieron yemas a partir de callos originados de protoplastos interespecficos fusionados que haban sido pretratados con antimetabolitos como iodoacetato o rodamina-6G o, alternativamente, con rayos X. La obtencin de plantas completas y frtiles a partir de estos materiales hace a esta estrategia muy promisoria para incorporar nuevos caracteres. Una tcnica tradicional para la obtencin de mutantes in vitro que tambin se utiliza en especies ornamentales es la aplicacin de inductores de poliploida, como la colchicina y los herbicidas orizalina y trifluralina, que ha sido aplicada en Rhododendron y Lilium. Esta tcnica se est utilizando en el Centro Tecnolgico en Flori, Fruti y Horticultura (CETEFFHO) con el objetivo de obtener cruzamientos interespecficos viables en especies de los gneros Calibrachoa y Scoparia. Para ello, una vez efectuado el cruzamiento, se duplican los cromosomas del hbrido a fin de que sea frtil. Las plantas de Calibrachoa que sobrevivieron al tratamiento demostraron ser quimeras diploides/tetraploides. Se multiplicaron las tetraploides y se espera la floracin a fin de establecer la posibilidad de cruzarlos con otras especies del gnero. 3 Marcadores moleculares para el mejoramiento y la seleccin de ornamentales Los marcadores moleculares como herramienta para la caracterizacin y diferenciacin entre genotipos fueron rpidamente utilizados por genetistas y mejoradores de plantas. Su neutralidad en relacin al proceso de seleccin, su poder de resolucin y la celeridad con que se obtiene la informacin, son algunas de las ventajas que ofrece esta herramienta. A pesar de que diferentes clases de marcadores moleculares fueron probados en ornamentales, los AFLPs y los microsatlites son los ms frecuentemente utilizados por su alta reproducibilidad y la gran cantidad de informacin que brindan. Estos marcadores moleculares aplicados a la diferenciacin de genotipos son un arma muy poderosa para la proteccin de los derechos de los mejoradores y productores. Para detectar la

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propagacin fraudulenta de un cultivar el mtodo tradicional se basa en el anlisis y la comparacin de los caracteres fenotpicos de plantas crecidas y en perodo de floracin. Esta estrategia tiene la desventaja de que requiere mucho tiempo y depende de factores ambientales. Esto se soluciona utilizando marcadores moleculares de manera ms rpida y precisa. La genmica tambin est realizando aportes en el rea de las plantas ornamentales. La rosa, que como flor de corte es uno de los cultivos ornamentales ms importantes del mundo, es un ejemplo interesante. A mediados de la dcada de 1990, se inici un proyecto conjunto entre las Universidades de Clemson y Texas a fin de obtener el mapa gentico de esta especie. El mismo tiene como objetivos, a largo plazo, ubicar los genes involucrados en la produccin de la fragancia y los de la resistencia a la enfermedad de la mancha negra, causada por el hongo Diplocarpon rosae. Esta enfermedad es la de mayor incidencia en el produccin de rosas. Se caracteriza por la presencia en las hojas de manchas negras de contorno irregular, defoliacin, prdida del vigor de la planta, y disminucin en la produccin de flores. La enfermedad se controla con aplicaciones de fungicidas. Un hecho de importancia es que se han detectado variedades de rosas que manifiestan resistencia a la enfermedad y se estn buscando los genes que la confieren. Con este fin los investigadores texanos estn analizando la F2 de un cruzamiento seleccionado entre una variedad susceptible y una resistente, donde la progenie segreg adems para varios caracteres de inters para la industria florcola, como color de la flor (rosa vs blanco), nmero de ptalos (5 vs. 10 o ms), presencia o ausencia de espinas en el tallo, floracin una vez al ao o siempre florecida. A partir del anlisis de esta F2 se est construyendo un mapa de alta densidad con distintos marcadores moleculares, entre los que se encuentran los AFLPs. Una vez construdo este mapa, se proceder al anlisis de los perfiles detectados a fin de establecer la asociacin entre los marcadores utilizados y los caracteres de inters. Esto permitira llevar a cabo en el gnero Rosa un programa de mejoramiento asistido por marca-

dores moleculares. Como el resto de las tcnicas biotecnolgicas, la de marcadores moleculares est siendo intensamente aplicada en especies ornamentales, sobre todo por la relevancia
Tabla 1: Aplicacin de marcadores moleculares para determinar la distancia gentica (DG), identificacin varietal (I.V) y anlisis gentico (A.G), en algunos gneros ornamentales.
Gnero Alstroemeria Calladium Cephalotaxus Cymbidium Dahlia Dedrathema Dianthus Euphorbia Geranium Gerbera Heliconia Jacaranda Junipers Lilium Osteospermum Ozothamnus Pelargonium Petunia Rhododendron Rosa Scaevola Syringa Viola X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X I. V. X X X X X X X X X X X X D. G. X A. G. X

que estos estn adquiriendo en la verificacin de los criterios de distinguibilidad, estabilidad y uniformidad de las nuevas variedades que ao a ao ingresan al mercado. En la Tabla 1 se mencionan los cultivos ornamentales en los cuales se han aplicado marcadores moleculares. 4 Mejorando la ecologa de los cultivos y modificando las formas y los colores de las flores La tecnologa gnica es otra de las estra-

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tegias que se ha aplicado exitosamente en el mejoramiento y se ha difundido en forma sostenida entre los principales cultivos ornamentales. Varios factores han contribudo a este importante desarrollo, entre los que se puede considerar un profundo conocimiento de la bioqumica de las plantas (sobre todo en lo que hace a la sntesis de pigmentos), un notable manejo del cultivo de tejidos en las especies de inters, el alto valor agregado que implica la aplicacin de la tcnica, adems de las ventajas adicionales que se pueden lograr en la incorporacin de un caracter determinado (por ejemplo: ahorro de insumos, incremento en el rendimiento, etc.). Asimismo, y desde un punto de vista totalmente ligado el mercado, los organismos genticamente modificados (OGMs) ornamentales, no generan el mismo tenor de controversias que provocan los OGMs ligados al consumo alimentario humano como los cereales y las oleaginosas. Para el mejoramiento de ornamentales por transgnesis existe un considerable inters en la incorporacin de caractersticas tales como: resistencia a insectos, a enfermedades fngicas y virales, tolerancia a herbicidas, androesterilidad, etc., que son los de aplicacin en la mayora de los cultivos. A estas se suman los caracteres especficos para la floricultura, como son la modificacin del color y la forma de las flores, el incremento de la vida post cosecha, la modificacin de la fragancia, el control de la floracin y el mejoramiento de la eficiencia de enraizamiento. En el tema donde ms se ha avanzado es en la modificacin de los pigmentos de los ptalos. El color de las flores se debe a tres tipos de pigmentos. De los colores amarillo y naranja son responsables los carotenoides. Del rojo y del rosa son responsables los flavonoides (cianidina y pelargonidina, flavonoides, se encuentran en las flores rosas y rojas respectivamente). El color azul se debe a un pigmento denominado delfinidina. La modificacin del color de las flores se plante como objetivo por los grupos de mejoradores de ornamentales. El primer informe acerca de la modificacin de los colores de flores por ingeniera gentica lo efectu en 1987 el Instituto Max Planck de Colonia, Alemania. Desde mediados de la dcada que comenz en 1990 se sucedieron una

serie de publicaciones acerca de la alteracin de la pigmentacin de flores de crisantemo por aplicacin de la tecnologa antisentido para el gen de la chalcona sintetasa (chs). En clavel se utiliz la secuencia antisentido de la flavonona 3-hidroxilasa (Fht), para bloquear la va metablica de las antocianinas. De esta manera se logr la modificacin del color original y se obtuvieron nuevos genotipos de la variedad utilizada en el ensayo. Asimismo, se encontr que los genotipos transgnicos que tenan reprimida la expresin de Fht resultaron tener mucho ms fragancia que los controles. Estudios de cromatografa gaseosa mostraron incrementos de 10 a 100 veces en los niveles de los derivados del cido benzoico, por lo que a partir de la alteracin de la expresin de un transgen, se logr la modificacin de dos caracteres. La introduccin de la secuencia en sentido del gen de la chalcona sintetasa en petunia permiti redireccionar la va metablica de los flavonoides hacia la produccin de chalconas, lo que deriv en la obtencin de flores amarillas en el gnero por acumulacin de pigmentos como chalconas, auronas y algunos flavonoles en los ptalos. El color azul no es muy frecuente en las flores. Slo en petunia el azul tiene la intensidad que los mejoradores pretenden. Este color depende de tres factores: la sntesis de un pigmento denominado delfinidina (3,5hidroxiantocianina), la presencia de copigmentos como flavonas y un pH alcalino en las vacuolas de las clulas de los ptalos. La obtencin de flores dentro de la gama del azul se constituy un desafo para las semilleros. Una idea de la relevancia de este tema lo indica el hecho que en el ao 1986 se fund en Melbourne, Australia, la compaa Florigene cuyo principal objetivo era el desarrollo de claveles, crisantemos y rosas de color azul (las tres especies abarcan el 50% del mercado mundial de flores de corte). Esta empresa aisl el gen que codifica para la enzima clave para la biosntesis de delfidina, la flavonoide 3',5'-hidroxilasa, el Blue Gene. A mediados de la dcada que comenz en 1990 se obtuvieron claveles azules. Otro gen involucrado en la produccin de delfinidina fue identificado en 1999. Este gen codifica para un citocromo del tipo b5. La expresin

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del mismo incrementa la produccin de la antocianina 3,5 sustituda. El silenciamiento de este gen en plantas de petunia redunda en un 60% menos de acumulacin de delfinidina en relacin a plantas no tratadas. En la actualidad existen en el mercado siete variedades de claveles cuya pigmentacin fue modificada por ingeniera gentica por incorporacin del Blue Gene. En cuanto a la obtencin de rosas azules, un inconveniente a resolver es que la va metablica de produccin de pigmentos en estas plantas es muy diferentes a la petunia, ya que la rosa es deficiente en la enzima flavonoide 3',5' hidroxilasa. En consecuencia no puede sintetizar los pigmentos adecuados. Otro inconveniente es el pH vacuolar, que en las rosas es cido y bajo estas condiciones la delfidina se torna de color rosa. Los datos indican que el microambiente de las clulas del ptalo de la rosa no sera el ms propicio para la produccin de pigmentos azules va flavonoides, por lo que esta estrategia no sera la ms adecuada para la produccin de una rosa de color azul. En la actualidad Florigene est probando el citocromo P450 (responsable de la detoxificacin heptica en mamferos), como alternativa para la obtencin de rosas de color azul. Experimentos efectuados en la Universidad de Queensland demostraron que bacterias transformadas con el gen que codifica para el P450 son capaces de generar un color azul intenso usando como sustrato compuestos con grupos indlicos, que se encuentran normalmente presentes en los vegetales. Si bien presenta la ventaja de que se trata de una va metablica directa (de un solo paso), habra que determinar si los productos de la conversin de grupos indol no

presentan fitotoxicidad. Todava no se han obtenido resultados concluyentes con la aplicacin de esta estrategia para la obtencin de rosas azules. Otro importante avance tecnolgico, desarrollado y patentado por la misma empresa, es la produccin de claveles larga vida (long vessel life, LVL) por bloqueo de la sntesis de etileno. La va metablica de produccin de esta hormona es bien conocida, la enzima ACC (cido 1 amino ciclo propano-1carboxlico) sintetasa, convierte a la Sadenosilmetionina en ACC que, por accin de la ACC oxidasa se transforma en etileno. Aplicando tecnologa antisentido se logr suprimir la expresin de ambas enzimas, por lo que se bloque la produccin de etileno en los claveles transgnicos. La falta de produccin de etileno impide el deterioro prematuro de las flores una vez cortadas (principalmente, el enrollamiento de los ptalos), retrasando su envejecimiento. La tecnologa ofrece una importante ventaja tanto en lo comercial como en lo ecolgico, ya que los productores podrn abandonar el uso de las sales de plata, muy contaminantes, para prevenir la produccin de etileno en el perodo post-cosecha. En otros laboratorios se ha modificado la forma de las flores de crisantemo por la introduccin del gen rol C de Agrobacterium rhizogenes, obtenindose plantas de menor tamao, flores de menor dimetro y ptalos y hojas modificados. En clavel la incorporacin de este transgn produjo una serie de modificaciones morfolgicas muy ventajosas como ser disminucin de la dominancia apical, mayor capacidad de enraizamiento, mejor incorporacin de metabolitos y mayor produccin de varas (se increment tres veces

Tabla 2: Algunos avances logrados en el mejoramiento de ornamentales por ingeniera gentica

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en relacin al producto no transgnico). En trminos prcticos estas modificaciones implican una sensible mejora en el rendimiento del cultivo. La Tabla 2 resume algunos avances logrados en el mejoramiento de ornamentales por ingeniera gentica. 5 La situacin en la Argentina

La revisin de los libros de resmenes del Primer Congreso Argentino de Floricultura y del V Simposio de Redbio Argentina 2002 muestra que en nuestro pas son muy pocos los laboratorios que trabajan en biotecnologa de ornamentales. La lista alcanza a 5 instituciones trabajando en el rea. En el Dpto. de Agronoma de la Universidad Nacional del Sur y en el Centro de Recursos Naturales Renovables de la Zona A B Semirida (CERZOS) se trabaja en multiplicacin in vitro de Lilium. En el laboratorio de Cultivo de Tejidos del Instituto de Botnica del Noreste (IBONE) y Universidad Nacional del Noreste (UNNE) se multiplican orqudeas in vitro. Este Instituto en colaboracin con el Dpto. de Agronoma de la UniversiC D dad Nacional del Sur estudia la variabilidad gentica Figura 2. A) Individuos tetraploides del gnero Scoparia (izq.) obtenidos a en la micropropagacin de partir de un diploide (der.) tratado con colchicina en condiciones in vitro, comparados con el correspondiente control. B). Comparacin entre las flores paraso (Melia azaderach). de ambas plantas, tetraploide (izq.) y control (der.). C) Hojas de la planta Sobre esta misma especie tetraploide (arr.) y de la planta control (ab.). D) Planta tetraploide florecida. en el IBONE se efectan estudios de crioconservacin. En el Laboratorio de Propagacin y Pro- en la Argentina se est trabajando en flora duccin Vegetal del Centro Austral de Inves- nativa de importancia ornamental, entre tigaciones Cientficas de Usuahia se trabaja otros con los gneros: Tabebuia, Jacaranda, Tecoma, Nierembergia, Lilium, Calibrachoa, en Berberis sp. En el Centro de Produccin Vegetal Bougainvillea y Scoparia (Fig.2). Adems de importantes avances en el (CEPRoVe) de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de La Plata se establecimiento in vitro de Tabebuia y est trabajando en la micropropagacin de Tecoma, se han logrado interesantes resultados en la micropropagacin de J. Pelargonium.

En la Ctedra de Produccin Vegetal de la Facultad de Agronoma de la UBA se han realizado experiencias en la micropropagacin de Pelargonium , Lupinus , Jasminum mensyi y Gerbera. En el CETEFFHO, futuro Instituto de Floricultura de INTA-Castelar, se trabaja desde hace algunos aos en micropropagacin de especies ornamentales como, entre otras, alstroemeria, clavel, rosa, orqudeas, Poinsetia, Ghypsophylla, Gerbera, etc. Dentro del mismo Instituto y en el marco del proyecto INTA-JICA: Desarrollo de la Floricultura

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mimosifolia, Bougainvillea sp, Lilium sp, Calibrachoa sp y Scoparia spp. En algunos casos con el objetivo de micropropagacin en s misma, y en otros, para aplicar mutagnesis in vitro. Otra de las reas en las que se trabaja en el CETEFFHO es la puesta a punto de tcnicas de marcadores moleculares para la identificacin, va fingerprinting (fenotipeado), de los individuos que se obtienen por mejoramiento. Se han obtenido resultados promisorios en la aplicacin de microsatlites anclados en la caracterizacin molecular de clones de Jacarand, siendo la primera vez que se informa un resultado de esta ndole para el gnero. De esta revisin se desprende que en nuestro pas la herramienta biotecnolgica de aplicacin en cultivos de inters ornamental es la multiplicacin in vitro. Si bien a partir del desarrollo del proyecto INTA-JICA Desarrollo de la Floricultura en la Argentina se dieron pasos sustanciales en la formacin de recursos humanos, nuestro pas debera potenciar el desarrollo y aplicacin de las nuevas tecnologas en el rea del mejoramiento de cultivos ornamentales. Estos dos aspectos son fundamentales para que el pas pueda intervenir en el mercado mundial de ornamentales, aprovechando los inmensos e interesante recursos naturales de los cuales dispone. Se espera que la incorporacin de nuevas variedades al mercado incidir en forma positiva sobre el desarrollo de la industria local y permitir el ingreso de la Argentina en el mercado florcola mundial como generador de germoplasma mejorado. 6 Perspectivas El advenimiento de la genmica y protemica y el desarrollo de la bioinformtica han aportado herramientas de utilidad que podran aplicarse en el mejoramiento de especies ornamentales. Los estudios sobre el genoma de Arabidopsis facilitarn la comprensin de la estructura y funcin del genoma de los cultivos ornamentales, en especial a travs de la identificacin de genes involucrados en estrs abitico, sntesis de hormonas, resistencia a patgenos, etc. Tambin ser sustancial el aporte que se haga acerca de los mecanis-

mos que intervienen en el establecimiento de la arquitectura de la planta, en el funcionamiento de los meristemas (en especial de las flores), o en los componentes de la resistencia a enfermedades. La identificacin y el aislamiento de estos genes posibilitar su incorporacin, va transgnesis, a los cultivos ornamentales a fin de lograr un mejoramiento sustancial que involucre todos los aspectos del cultivo. Los avances efectuados en fotobiologa y en el conocimiento de los ritmos circadianos vegetales permitirn ajustar finamente el control de procesos tan importantes como la floracin. Tambin se abren nuevas y muy interesantes perspectivas para la creacin, seleccin y uso de la variabilidad gentica. 7 Lecturas Recomendadas
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