Sunteți pe pagina 1din 19

UNIVERSITATEA VASILE ALECSANDRI DIN BACU FACULTATEA DE INGINERIE SPECIALIZAREA CoSAMIB

Metode de separare, purificare i valorificare a acidului clorogenic din boabe verzi de cafea Robusta
Masterand, Andreea Madlina BORT Coordonator, Prof. univ. dr. chim. Adriana FNARU

2013

Sumar executiv
Proiectul prezint metodele de separare i purificare a acidului clorogenic din boabele verzi de cafea Robusta utiliznd cele mai moderne tehnici. Proiectul este structurat n trei pari. Prima parte prezint descrierea sursei vegetale care are influnena cea mai mare asupra calitii compusului de extras. Uurarea sau ngreunarea metodelor de separare are loc n funcie de natura materiei prime, de parametrii de procesare, de compuii (alii dect acidul clorogenic) ce pot da reacii secundare sau de metodele de pregtire (ce pot deteriora compusul dorit, astfel nct caliatate acestiua scade). n vederea obinerii acidului clorogenic s-a ales ca materie prim boabele de cafea verzi Robusta fiind printre plantele cu cel mai mare coninut n acid clorogenic. Deasemenea n acest capitol s-au caracterizat i solvenii de extracie alegndu-se pe baza avantajelor i dezavantajelor solventul cu cel mai bun randament de extracie i cel mai puin nociv. A doua parte cuprinde caracteristicile produsului finit, importana acestuia n diverse industrii, efectele negative i pozitive ce trebuie cunoscute nainte de consum, precum i studiile i cercetrile realizate pe acest polifenol. Partea a treia prezint descrierea variantelor posibile de separare i purificare, avantaje i dezavantaje, solvenii utilizai precum i rezultatele unor experimente din literatura de specialitate. Proiectul se ncheie cu prezentare posibilitilor de valorificare n diferite industrii a compusului obinut.

Cuprins
Cuprins................................................................................................................... 3 Capitolul 1. Sursa vegetal..................................................................................... 4 Boabele verzi de cafea Robusta..........................................................................4 Capitolul 2. Substana activ.................................................................................. 7 Acidul clorogenic.................................................................................................... 7 Rolul acidului clorogenic...................................................................................... 8 Capitolul 3. Metode de separare i purificare a acidului clorogenic.......................9 Metode clasice de extracie................................................................................. 9 Metode moderne de extracie...........................................................................11 Cromatografia................................................................................................... 14 HPLC-DAD ..................................................................................................... 14 HPLC- X5........................................................................................................ 15 Capitolul 4. Valorificarea acidului clorogenic........................................................16 Concluzii .............................................................................................................. 17 Bibliografie........................................................................................................... 18

Capitolul 1. Sursa vegetal


Boabele verzi de cafea Robusta
Boabele de cafea Robusta fac parte din genul Coffea descris tiinific de ctre Carl Linnaeus la mijlocul secolului al XVIII-lea. Marele naturalist a stabilit numele tiinific i a ncadrat genul n familia Rubiaceae. Robusta este o specie alogam, cu cretere rapid i rezisten la intemperii i la boli, n special la boala cauzat de ciuperca Hemilea vastatrix. Originea a fost stabilit n regiunea subsaharian din centrul i vestul Africii, care cuprinde Guineea i nordul Sudanului. Prima plant a fost colecionat n anul 1890, de Lomani, un tributar al Fluviului Congo i n jurul anului 1900, a fost transferat din Zair, via Bruxelles, spre Java, de unde a fost introdus i n alte teritorii. Este cultivat la altitudini de circa 600 m, pe terenuri umede i n pdurile tropicale din regiunile tropicale ale Africii Centrale i de Vest, din Indonezia, India, i Brazilia, unde colonitii francezi au introdus-o n secolul al XIX-lea. n ultimii ani produciile de cafea robusta din Vietnam au depit cantitile Figura 1. Fructe de cafea Robusta obinute n Brazilia, India, Indonezia, aceast din urm devenind cel mai mare exportator de cafea Robusta. Planta are sistem radicular superficial, dar partea aerian se dezvolt ca un arbust robust sau ca un arbore cu nlimea de pn la 10 m. Ramificaiile se arcuiesc spre sol, n form de umbrel. nflorete din anul al 2-lea de la plantare, dup care, pe durata fiecrui an, formarea florilor i nflorirea sunt continue [1]. Fructele (Figura 1) se coc dup 10-11 luni de la nflorire. Boabele sunt de culoare brun-deschis pn la brun-roiatic, mici, fine, cu form oval, mai mici dect cele de C. arabica i de calitate medie. Robusta este specia cu cel mai ridicat coninut de cafein: de 2 ori mai mare dect C. arabica. Specia este diploid i autosteril. Fertilizarea florilor se face cu polen strin. Recoltarea fructelor se efectueaz n diferite luni ale anului i la atingerea maturitii complete. Recoltarea se face manual, prin culegerea fructelor de pe ramuri sau prin scuturarea plantelor cu ajutorul prjinilor. n cazul scuturrii plantelor, fructele pot fi colectate pe prelate, folii de plastic, rogojini sau direct pe sol dar n acest caz, fructele trebuie splate. Producia constant se obine ncepnd cu vrsta de 5 ani a plantelor. O plant de C. robusta produce ntre 0,6 i 2 kg semine. Dup recoltare, n cteva zile, fructele se prelucreaz n vederea extragerii seminelor. ntrzierea prelucrrii cauzeaz fermentarea pulpei i deteriorarea calitii boabelor. Este nevoie de circa 5 kg de fructe pentru a ob ine 1 kg semine [1]. Coninutul de acid clorogeni este mai mare n boabele de cafea verzi comparativ cu boabele toastate (Tabel 1) ceea ce denot faptul c acest compus este sensibil la temperaturi ridicate. 4

Tabelul 1. Compoziia chimic a boabelor de cafea verzi/toastat Robusta [2]


Componente Alcaloizi (cafeina) Trigonelina Minerale Acizi: clorogenici alifatici Zaharuri: zaharoz reductoare polizaharide Lignin Pectine Proteine Aminoacizi liberi Lipide (ulei de cafea) Produi de condensare Substane volatile, altele Boabe verzi% 2,2 0,7 4,4 10 1 4 0,4 3 2 11 0,8 Boabe toastate% 2,4 1,7 4,7 3,8 1 0 0,3 37 3 2 7,5 0 11 25 0,7-0,8

Cafeina este un alcaloid din grupa purinelor


i unul dintre cei mai vechi stimuleni naturali folosii de om. Formula chimic a cafeinei (C8H10N4O2) este descoperit de ctre Pfaff i Justus von Liebig n anul 1832, iar formula structural a fost descoperit n 1895 de Hermann Emil Fischer [1]. Dup nomenclatura IUPAC, denumirea cafeinei este 1,3,7-trimetil-2,6-purindion Figura 2. Structura cafeinei [2] sau, pe scurt, 1,3,7-trimetilxantina. Structura cafeinei (Figura 2) const dintr-un inel dublu, care la exterior are o serie de substitueni, n centru fiind nucleul purinic. [1] Cafeina stimuleaz uor sistemul nervos i cardiovascular, afecteaz creierul, reduce oboseala, crete gradul de energie. De asemenea crete ritmul cardiac, fluxul sanguin, rata respiratorie i rata metabolic pentru mai multe ore. Consumul de cafein a peste 600 mg/zi (aproximativ ase ceti de cafea), poate provoca nervozitate, transpiraii, pierderea tonusului, stomac deranjat, anxietate i insomnie. Chiar i atunci cnd este ntrerupt consumul de cafein simptomele persist puternic 24-48 ore i ncep s scad progresiv pe parcursul unei sptmni. Pentru a minimiza simptomele de sevraj, se recomand reducerea aportului de cafein treptat. Cafeina mpiedic transportul facil al ovulului de la ovare ctre uter. De muli ani, se cunoate despre cafea c ngreuneaz procesul reproductiv, dar nu era cunoscut mecanismul prin care cafeina acioneaz asupra fertilitii. Pentru obinerea acestor rezultate s-au efectuat studii pe aproximativ 10 femei, iar cercetrile au artat c un consum mai mare de patru ceti de cafea zilnic reduce ansele de concepie cu aproape 25%. [1]. n Tabelul 2 sunt prezentate proprietile fizico-chimice, senzoriale i solubilitatea cafeinei n diferii solveni. 5

Tabel 2. Proprietile i solubilitatea cafeinei[2].


Proprieti senzoriale Proprieti fizice Solubilitate n diferii solveni ap la temperatura ambiant: 21,76 g/L Proprieti chimice formeaz cristale cu o molecul de ap formeaz precipitate cu reactivi ce conin metale bazicitatea cafeinei este mai mic dect bazicitatea xantinei

aspect: pulbere fin,


omogen, fr aglomerri

punct de topire:
238 C

ap la temperatura de 80 C:
181,82 g/L etanol la temperatura ambiant: 15,15 g/L

culoare: alb, uniform


n ntreaga mas

masa molecular:
194,19 g/mol

etanol la temperatura de 60
C: 45,45 g/L

gust i miros: specifice

plcute, bine exprimate, densitate: gust amar, fr miros 1,23 g/mL strin

aceton: 20 g/L cloroform: 181,82g/L

Trigonelina (Figura 3) este o substan


natural din grupa alcaloizilor piridinici, a crei denumire provine de la denumirea tiinific a unei Fabaceae schinduful (Trigonela foenum-graecum). n organismul uman, trigonelina inhib acidul nicotinic (niacina) din snge, avnd tendina de neutralizare sau eliminare a previtaminei PP. Dei este uor Figura 3. Structura pelagrogen, trigonelina prezint i efecte favorabile trigonelinei [2] asupra organismului uman, prin proprietile antistreptococice, diuretice i depurative. Sursele bogate n trigonelin sunt: boabele de schinduf, seminele imature sau nepregtite termic al altor leguminoase (boabele de fasole i mazre verde, arahidele neprjite), boabele neprjite de cafea. n boabele mature de schinduf, soia, fasole, mazre, linte, n cafeaua prjit, precum i n arahidele coapte i prjite, trigonelina nu dispare n ntregime ci, n cantitate modest, nsoete acidul nicotinic, care predomin, astfel de surse fiind indicate n alimentaia sntoas. Ca o consecin a nivelului ridicat de trigonelin, se cere precauie la consumul de mazre verde i evitarea boabelor imature de fasole din alimentaie (tecile verzi ale pstilor de fasole n schimb sunt foarte sntoase), semine care pn la coacere, de altfel, conin i alte principii toxice. [3]

Minerale
Printre cele mai imporatante minerale din boabele verzi de cafea enumerm potasiu, calciu, magneziu, fosfai i sulfai, iar 40% din coninutul de minerale gsit ntr-o ceac de cafea este compus din potasiu. [3] 6

Lignina este un derivat fenolic, asigur rezistena peretelui celular i are rol n
aprarea fa de diferii ageni patogeni. Este insolubil n ap i solveni organici obinuii, solubil fiind n bisulfit de calciu la cald. Lignina este hidrolizat de acizii minerali i de o enzim specific hadromaz produs de unele bacterii i ciuperci. [3]

Pectinele
Sunt compui macromoleculari coloidali, de natur poliglucidic neomogen, care se gsesc n majoritatea sau probabil n toate esuturile vegetale, n special n fructele, tulpinile i rdcinile plantelor. Pectinele reprezint un produs fiziologic normal al organismului vegetal, constituind cimentul intermediar care alctuiete lamela pectic ce sudeaz celulele n complexe tisulare sau fac parte din membrana celular propriu-zis respectiv reprezint constitueni citoplasmatici. Elementul de baz, precursorul biogenetic l reprezint D-glucoza, provenit din ciclul fotosintezei i care fie, conduce prin izomerizare la galactoz i mai departe la galactane, fie prin intermediul acidului glucuronic, la acid galacturonic. n boabele verzi de cafea predomin coninutul de pectin insolubil sub denumirea de protopectin. Macromoleculele protopectinei sunt formate din resturi ai acidului poligalacturonic, parial ramificate din resturi de L- arabinoz i D- galactoz. [3]

Importan i utilizare
n Frana amestecul de 70% Robusta i 30% Arabica se comercializeaz cu denumirea de cafea tradiional. Robusta este folosit n lucrrile de ameliorare pentru a mbunt i caracteristicile altor specii cu privire la cretere i nflorire, productivitate, dimensiunea i forma bobului, calitatea cafelei, rezistena la boli i uscciune. Boabele prjite au arom distinctiv de pmnt, savoarea puternic devine agreabil n amestec, cruia i d trie i modelare [1].

Ambalarea i depozitarea
Ambalarea fructelor se face de obicei n saci din fibre naturale (iut) care permit schimburile de gaze i nu altereaz boabele. Se folosesc saci cu capacitate de 60 kg care se depoziteaz n camere uscate, prevzute cu rafturi. Depozitele moderne sunt prevzute cu instalaii de condiionare a aerului. Dup prjire, cafeaua se mpacheteaz i se depoziteaz n condiii care s nu altereze prospeimea gustului: containere etane i inute n spaii uscate, fr lumin i la temperaturi sczute. Factorii naturali care afecteaz calitatea cafelei sunt: aerul, umezeala, cldura i lumina. Sacii i pungile la care gura este ndoit sunt o alternativ pentru pstrare pe durat scurt, pentru c n aceste ambalaje aerul poate intra. Mult mai bune sunt ambalajele cu valv care blocheaz ptrunderea aerului [1].

Capitolul 2. Substana activ


Acidul clorogenic
7

Acidul clorogenic sau acidul 5orto-cafeol-quinic (Figura 4), cu formula chimic C16H18O9 este un ester a acidului cafeic cu acidul quinic. Face parte din clasa compuilor polifenolici i a fost descoperit prima dat n
boabele de cafea n 1837 de ctre Robiquet i Boutron. Acidul clorogenic este un Figura 4. Structura acidului clorogenic

important intermediar biosintetic realiznd biosinteza ligninei n plant.[4]

Caracteristicile unui produs sunt foarte importante n deciziile productorilor sau cumprtorilor deoarece influeneaz n mod direct orice proces tehnologic de prelucrare asupra acestuia. n Tabelul 3 sunt prezentate proprietile fizico, chimice, senzoriale i solubilitatea acidului clorogenic n diferii solveni. Tabel 3. Proprietile i solubilitatea acidului clorogenic[5].
Proprieti senzoriale aspect: pulbere fin, omogen, fr aglomerri culoare: alb, uniform n ntreaga mas gust i miros: specifice, bine exprimate, gust i miros astringent. Proprieti fizice Solubilitate n diferii solveni Proprieti chimice salefiaz n prezena electroliilor prin reacia cu FeCl3d culoare verde

punct de topire:
207-209 C

ap la temperatura de
60 C

masa molecular:
354,31 g/mol

alcooli, aceton

densitate:
1,28 g/mL

insolubil n eteri, benzen, cloroform

Rolul acidului clorogenic


Acidul clorogenic este foarte important datorit activitilor antioxidante, antidiabetice, anti-hiperglicemice i anti-virale pe care le are asupra organismului uman, de aceea ii gsete cu uurin aplicabilitate n diverse industrii. Printre cele mai importante

roluri enumerm:
acioneaza ca filtru solar; ncetinete oxidarea produselor alimentare; inhib creterea microbilor; contribuie la anihilarea radicalilor liberi; inhib eliberarea de glucoz n snge; scade semnificativ a tensiunii arteriale. [6,7]

Capitolul 3. Metode de separare i purificare a acidului


clorogenic
Pentru a obine acidul clorogenic din boabele verzi de cafea s-au elaborat i aplicat o serie de metode, fiecare prezentnd anumite avantaje i dezavantaje. Pentru obinerea acidului clorogenic se ine cont n primul rnd de alegerea materialului vegetal (s aib coninutul cel mai mare de acid clorogenic), dar i de uurina de procurare precum i de normele pe care trebuie s le ndeplineasc. Procedeul principal de obinere a acidului clorogenic este extracia cu solveni iar solvenii utilizai pentru extracia acidului clorogenic sunt clasificai n: solveni anorganici: apa; solveni organici: etanol, metanol, aceton, glicerol. n funcie de natura produsului vegetal, a solventului utilizat, de condiiile de extracie i procedeele de izolare i purificare putem clasifica metodele de extracie dup cum urmeaz: a) Metode clasice de extracie extracia la cald; extracia Soxhlet; percolarea; b) Metode modern de extracia extracia presurizat; extracia cu fluide supercritice; extracia cu ultrasunete; extracia asistat de microunde; c) Metode de purificare cromatografie; distilare; adsorbie pe rin de tip X-5.

Metode clasice de extracie


Extracia la cald
Pentru procesul de extracie la cald se utilizeaz boabe de cafea verde neprjite. Acestea se scufund mai nti n clorur de metil pentru ndeprtarea alcaloizilor (cafeina i trigonelina) apoi boabele sunt cufundate n ap fierbinte elibernd acidul clorogenic. Apa mpreun cu acidul clorogenic este trecut printr-un filtru de carbon pe care se reine doar acidul clorogenic, iar apa este reutilizat pentru o nou extracie. Printre avantaje se menioneaz faptul c se poate utiliza oricare solvent enumerat anterior diferena fiind temperatura la care se va efectua extracia. Procedeul conduce la recuperarea a 10-20% din acidul clorogenic existent n sursele vegetale. [8] 9

Extracia Soxhlet [9]


Extractorul Soxhlet, a fost utilizat de ctre chimiti pentru extracia compuilor chimici dintr-o prob solid nc de la mijlocul secolului al XIX-lea. n extractor se introduce solidul care conine substanele de interes. Proba solid (boabe de cafea) este introdus mai nti ntr-un cartu de hrtie de filtru. Dispozitivul este prevzut cu un vas pentru solvent i dou tuburi laterale de sticl care fac legtura ntre extractor i vasul cu solvent organic. Tubul pentru circulaia vaporilor este cuprins ntre partea superioar a vasului cu solvent i partea superioar a extractorului n care se introduce cartuul cu proba. Tubul pentru recircularea solventului organic leag i el cele dou pri componente; ncepe de la baza extractorului, se continu pn la jumtatea corpului extractorului i apoi coboar brusc i intr n vasul cu solvent. Extractorul Soxhlet reprezentat n Figura 4 lucreaz n cicluri. Solventul fierbe n vas i se formeaz vapori care ajung la condensator unde condenseaz, iar condensul curge peste i prin prob i se colecteaz la partea inferioar. n acest moment solventul va conine o concentraie mic de acid clorogenic extras din prob. Nivelul lichidului crete simultan n camera de extracie i n tubul lateral de recirculare. Cnd tubul se umple, sub aciunea gravitaiei, lichidul se scurge rapid napoi n vasul cu solvent, acesta fiind sfritul unui ciclu. Avantajul acestei metode n uurina de realizare la nivel de laborator, dar i n Figura 4. Aparat Soxhlet uurina de recuperare a solventului. Dezavantajul rezid din puritatea mic a extractului.

Extracia prin percolare


Este un procedeu de extracie n care solventul (apa, alcool, aceton), adugat treptat, strbate ncet, sub aciunea gravitaiei, un strat de produs vegetal mrunit, antrennd principiile active cedate de produsul vegetal prin osmoz sau prin dizolvare. Este operaia care d cele mai bune rezultate. Se execut n vase cilindrice sau conice prevzute cu orificii de scurgere i de reglare a debitului denumite percolatoare. Aceast extracie urmrete epuizarea progresiv a produsului vegetal (boabe cafea) prin scurgerea lent, regulat i repetat a unui solvent adecvat. Boabele de cafea aduse la un grad de diviziune convenabil se plaseaz ntr-un vas de form aproape cilindric, cu un tub de scurgere la partea inferioar, dup care se toarn poriuni de solvent. Solventul traverseaz boabele pe direcie vertical, exercitnd capacitatea de extracie asupra straturilor succesive de produs vegetal, pn ajunge la saturare. Lichidul coboar datorit gravitaie i presiunii coloanei de lichid de deasupra, dei forele capilare tind s-l rein. 10

Cnd cantitatea de solvent nu este suficient de mare, acesta mbib produsul i fiind reinut de forele capilare nu ajunge la orificiul din partea inferioar a percolatorului. Prin adugarea atent a unei poriuni de solvent, acesta deplaseaz poriunea iniial absorbit i i ia locul fiind apoi nlocuit la rndul su de o alt poriune proaspat de solvent. n acest timp poriunea de lichid saturat n principii active se scurge i este culeas, constituind percolatul. Toate aceste procese dureaz aproximativ 24 ore. Percolarea prezint avantaje deoarece permite o epuizare superioar a produsului vegetal comparativ cu celelalte metode de laborator prin mprosptarea cu solvent pur, ceea ce face posibil o extracie practic total [9].

Metode moderne de extracie Extracia presurizat


Extracia accelerat cu solvent este o tehnic de extracie din probe solide sau semisolide cu solveni lichizi obinuii, care utilizeaz temperaturi i presiuni ridicate pentru a crete eficiena procesului de extracie. Aceast extracie poate nlocui extracia Soxhlet sau alte tipuri de extracii pentru c are ca i baz creterea vitezei de extracie i deci cre te randamentul extraciei. [10] Etapele de lucru sunt, n general, urmtoarele: introducereaprobei n celula de extracie; umplerea celulei cu solvent; aducerea celulei la presiunea i temperatura corespunztoare; meninerea probei la temperatura i presiunea prestabilite; pomparea solventului n celula cu prob; purjarea solventului din celul cu gaz inert; Avantajele acestui tip de extracie sunt: este o tehnic de extracie mai rapid dect alte tehnici convenionale de extracie; necesit cantiti mai mici de solvent; deoarece materialul dup extracie este uscat, se poate repeta extracia cu acelai solvent sau cu ali solveni de polaritate cresctoare. [10]

Extracia cu ultrasunete
Ultrasunetele au fost descoperite nainte de primul rzboi mondial. n anii 1938-1940, au nceput s fie folosite pentru construirea tuburilor electronice de putere mare. n 1970 ultrasunetele s-au utilizat pentru uscarea diferitelor produse. Pentru utilizarea ultrasunetelor raional i cu eficien sporit este necesar cunoaterea bazelor tiinifice ale propagrii ultrasunetelor n diferite medii, efectele lor la interaciunea cu aceste medii, efecte care pot fi utilizate n diferite operaii tehnologice.Viteza ultrasunetelor este viteza cu care se propag unda prin mediu, chiar dac particulele individuale vibreaz numai n jurul propriilor lor medii, fr deplasarea aparent a materiei. Viteza ultrasunetelor nu trebuie confundat cu 11

viteza particulei, care reprezint viteza instantanee a unei particule care vibreaz intr-un punct mediu. Influena ultrasunetelor asupra extraciei solid-lichid are la baz efecte termice, succesive, structurale ale cavitaii. Prin tratarea cu ultrasunete a sistemului solid-lichid, avantajele extraciei sunt: creterea randamentului extraciei, scaderea duratei de extracie, micorarea consumului de energie termic, iar procesul are loc la temperaturi sczute. [11]

Extracia cu fluide supercritice


n domeniul extraciei, unde se folosesc cantiti mari de solveni organici, ar trebui redus cantitatea acestora i unii chiar ar trebui nlocuii. O alternativ nepoluant este considerat aplicarea extraciei cu fluide supercritice i subcritice. Punctul critic al unei substane pure este definit ca cea mai nalt temperatur i presiune la care substana exist n echilibru lichid-vapori. La temperaturi i presiuni mai mari dect acest punct se formeaz un fluid omogen numit fluid supercitic, iar la temperaturi i presiuni inferioare se formeaz fluide subcritice. Ceea ce face ca fluidele supercritice s fie considerate solveni atractivi, este faptul c densitatea gazelor devine mult mai mare la presiuni ridicate, n timp ce vscozitatea i difuzivitatea au valori apropiate de cele la presiune atmosferic. Aceste proprieti fac ca mobilitatea i puterea de solvatare s fie unice. De aceea, fluidele supercritice sunt candidai foarte buni pentru extracia unor substane active de origine vegetal, i nu numai. [12] n plus, fluidele supercritice pot avea proprieti chiar surprinztoare fa de fluidele din care provin i pe care le cunoatem n condiii normale de presiune i temperatur. Pentru extracia acidului clorogenic se pot utiliza apa, etanol, metanol sau aceton.

Extracia asistat de microunde


Extracia asistat de microunde este o tehnic relativ recent, care utilizeaz energia microundelor pentru a nclzi solventul i proba n vedere creterii ratei transferului de mas dintre substanele dizolvate din matricea probei i solvent, contribuind la trecerea mai uoar a acestora n solvent. Avantajul acestei tehnici const n timpul redus de extracie, n condiiile folosirii unui consum redus de energie i solvent i cu o eficien de extracie ridicat. Solvenii polari precum acetona, metanolul, diclorometanul se nclzesc rapid sub influena micoundelor, n schimb solvenii nepolari nu pot fi nclzii prin aciunea microundelor, deoarece neavnd moment de dipol nu absorb radiaia de microunde. MAE se aplic probelor solide, care sunt introduse ntr-un solvent organic sau amestec de solveni organici i apoi, i apoi iradiat sistemul pentru un interval scurt de timp (0,5-10 min). Dup rcirea sistemului soluia de supernatant (extractul) este decantat, iar matricea solid este splat de cteva ori cu solventul utilizat, care se adaug extractului. n cazul utilizrii solvenilor nepolari se adaug un solvent polar pn n 10%. MAE se poate aplica la presiune atmosferic i la punctul de fierbere a solventului (n sistem deschis cnd pierderea de solvent se evit prin condensarea vaporilor i revenirea n extractor) sau la presiune ridicat (presiunea din sistem crete n timpul extraciei). [13] Extracia asistat de microunde este un proces care utilizeaz energia microundelor alturi de solvent pentru a extrage acidul clorogenic din boabele verzi de cafea Robusta. 12

Creterea temperaturii i a presiunii cauzeaz migrarea selectiv a acidului clorogenic, obinnd extracte bogate n aceste compus ntr-un timp relativ scurt comparativ cu metoda convenional. Prin utilizarea microundelor se reduce att cantitatea de solvent ct i timpul de extracie. Boabele verzi de cafea Robusta sunt degresate cu hexan timp de 8h ntr-un sistem de extracie Soxhlet. Boabele degresate sunt mcinate i supuse extraciei cu alcooli sau ap utiliznd microundele. Extractul obinut este separat i apoi analizat n vederea gradului de puritate. Separarea acidului clorogenic de alcool are loc prin evaporarea solventului ntr-un rotavapor la 500C i la presiune sczut. Cantitatea de acid clorogenic este analizat cu spectrofotometru UV. Etanolul, metanolul i apa au fost selectai din studii recente pentru extracia acidului clorogenic din boabele verzi de cafea cu ajutorul microundelor. Condiiile de extracie au fost: 2, 5, 10 min; 400, 600, 800 W; 300C, 500C, 700C. [12]

Rezultate i discuii [12]


Tabel 5. Influena parametrilor asupra randamentului extraciei [14]
Parametri variabili Parametri constani Variabilele extraciei asistate de microunde % % acid clorogenic

Solvent

5 min; 500C; 800 W

Metanol Etanol Ap

9,05 8,95 18,1 17,2 17,5 17,1 17,6 18,1 17,6 16,8 15,4 17,8 18,2

46,41 55,31 61,9 35,28 38,57 37,24 37,89 44,88 38,35 37,92 30,52 32,68 46,13

Extract apos Timp

500C; 800 W

2 min 5 min 10 min

Temperatur

5 min; 800 W

300C 500C 700C 900C

Puterea de iradiere

5 min; 500C

400 W 600 W 800 W

1. Efectul duratei de radiaie a microundelor

Cantitatea maxim de acid clorogenic obinut n extract apos la 800 W cu durate de timp diferite a fost aproximativ 17,5%. Extracia asistat de microunde timp de 5 min s-a 13

dovedit a fi cea mai eficient, obinndu-se randament maxim. Odat cu creterea timpului peste 5 min s-a observat o stagnare a randamentului ceea ce nseamn c, creterea timpului de radiaie nu influeneaz n mod pozitiv cantitatea de acid clorogenic. Cercettorii Pan, Niu i Liu (2003), au stabilit c nivelul maxim al extraciei are loc ntre 4-5 min. [14] 2. Efectul temperaturii asupra eficienei MAE Temperatura de extracie este deasemenea foarte importantpentru izolarea acidului clorogenic din boabele de cafea. Experimentul s-a realizat la 4 temperaturi diferite: 30, 50, 70 i 900C. S-a observat c randamentul maxim de extracie are loc la temperatura de 500C. Creterea temperaturii peste aceast valoare nu a condus la o cretere a randamentului ci din contra, creterea temperaturii duce la scderea cantitii de acid clorogenic extras. [14] 3. Efectul puterii de radiaie a microundelor asupra extraciei Valorile stabilite pentru extracia acidului clorogenic au fost 400W, 600W i 800W.Extracia asistat de microunde a fost stabilit la o temperatur de 500C i o durat de 5 min. S-a observat c randamentul extraciei crete odat cu creterea puterii de radiaie devenind maxim la 800W. n cazul experimentul de fa, analiza randamentului peste aceast valoare nu a mai putut fi realizat datorit limitrii echipamentului. Randamentul extraciei a fost maxim atunci cnd s-a folosit ca solvent apa (61,9%) timp de 5 min la 800 W comparativ cu alcoolii. Motivul este reprezentat de faptul c polaritatea i constanta dielectric este mult mai mare n cazul apei. Rezultatele ntregului experiment sunt reprezentate n tabelul 5.[14]

Cromatografia
HPLC-DAD
Cromatografia de nalt performan cuplat cu un detector fotodiod (DAD), a fost utilizat pentru determinarea acidului clorogenic dintr-un preparat medicinal chinezesc. Compusul int a fost extras cu succes utiliznd o soluie de metanol 80% timp de 15 min utiliznd baia de ultrasunete. HPLC-DAD s-a dovedit a fi o metod rapid de detectare a constituienilor din surse naturale, DAD fiind un detector care poate oferi informaii abundente asupra structurii compusului facilitnd identificrile structurele a compuilor neidentificai. Acest metod a poate fi cu succes aplicat i n cazul determinrii acidului clorogenic din boabele verzi de cafea Robusta. Boabele sunt mcinate i supuse extraciei cu apa cu ajutorul ultrasunetelor timp de 24 de ore. Absorbana extractelor obinute au fost nregistrate cu ajutorul unui spectrofotometru JASCO/2005 pentru a se stabili care este concentraia total de compui fenolici (semnalul caracteristic fiind la 280 nm). Extractul obinut astfel este supus analizei, utiliznd un cromatograf HPLC SHIMADZU, echipat cu o pomp solvent binar, un degazor, cuptor pentru coloan i detectorul fotodiod (DAD). Se poate utiliza o coloan cromatografic de 14

tip SUPELCOLOSIL LC-18, 5 m, 25x4,6 mm la o temperatur de 30 0C. Faza mobil este format din 2 solveni: solventul A (metanol:acid acetic:ap bidistilat 10:1:88) i solventul B (metanol:acid acetic:ap bidistilat 90:3:7). Separarea dureaz 30 ore, iar ordinea eluiei este n funcie de timpii de retenie astfel c pentru acidul clorogenic s-a stabilit un timp de 13,15 min. S-a observat ca timpul de retenie depinde de solvenii din faza mobil, astfel ca pentru o faza mobil compus din acetonitril i acid fosforic, timpul de retenie a acidului clorogenic scade la 2,45 min. [15] O metod pentru determinarea coninutului de acid clorogenic este utilizarea unei coloane de tip DIONEX P680 echipat cu un detector UV-Vis i o coloan C18 DIKMA (250x4,6 mm, 5 m). Debitul la ieirea din coloan a fost stabilit la 1 mL/min. n cazul acidului clorogenic, lungimea de und a fost 322 nm, faza mobil fiin constituit din metanol 30% n soluie apoas. Rezultatele HPLC au artat c, curbele de calibrare cu care se lucreaz au liniaritate bun n intervalul 17,6-1760 mg/L. Liniile de regresie pentru acidul clorogenic au fost y= 0,9749x-1,3322, unde y este zona de vrf a acidului clorogenic, iar x este concentraia de acid clorogenic (mg/L). [15]

HPLC- X5
Pentru separarea i purificarea polifenolilor s-au ales 8 rini macroporoase a cror proprieti sunt prezentate n tabelul de mai jos. Capacitatea de adsorbie i desorbie a rinii de tip X5 este cea mai ridicat comparativ cu celelalte. Cum acest tip de rin s-a dovedit a fi cea mai avantajoas s-a ales pentru separarea i purificarea acidului clorogenic. Extractul apos este introdus ntr-o coloan de sticl (45x600mm), umplut cu rin X5 la un debit de curgere de 1Bv/h. n acest fel acidul clorogenic este adsobit n porii rinii. Dup adsorbie, 2 Bv de ap distilat au fost utilizate pentru a spla sorbantul de impuriti. Se utilizeaz o soluie de etanol 30% ca stripant pentru separarea acidului clorogenic de ali polifenoli la un debit de curgere de 2 Bv/h. Eluaii sunt colectai la intervale de 0,5 Bv, iar concentraia de acid clorogenic din soluia de desorbie se determin prin HPLC. Fraciunile colectate sunt supuse uscrii sub vid rezultnd pulberea de acid clorogenic. [16] Tabel 6. Proprietile rinilor macropoaroase Tip rin Suprafaa Diametrul Polaritate specific mediu al (m2/g) porilor () X5 D4020 D101 LS-305 LS-46D NKA-9 500-600 540-580 480-520 400-500 400-500 250-290 290-300 100-105 200-300 150-250 150-250 155-165 Non-polar Non-polar Non-polar polar polar polar 15 Capacitate de adsorbie (mg/g)a 53,8 45,7 45,3 45,7 42,8 51,2 Raia de desorbie (%)a 82,9 72,4 72,6 54,2 56,1 78,3

NKA-2 AB-8

160-200 480-520

145-155 130-140

polar polar

50,4 45,2

74,2 70,2

Capitolul 4. Valorificarea acidului clorogenic


Industria alimentar Azi, noi studii arat c acidul clorogenic este mai mult dect un antioxidant natural pentru c are proprietatea de a ntrzia oxidarea produselor alimentare meninndu-le proaspete mai mult timp. Ca antioxidant, acid clorogenic ajut la meninerea proaspt a aromelor i valorilor nutriionale ale alimentelor, care sunt alterate, atunci cnd grsimile i uleiurile din ele sunt oxidate. Acest acid prezint cea mai remarcabil activitate antioxidant 16

comparativ cu antioxidanii sintetici, este utilizat pe scar larg n industria alimentar pentru a inhiba creterea microbilor i prelungi timpul de depozitare a produselor alimentare.[3] Industria cosmetic Antioxidanii reprezint o materie prim important pentru industria sntii i a cosmeticelor. Acest fapt s-a bazat pe o teorie veche de 50 de ani. n 1956, cercettorii au ajuns la concluzia c procesul de mbtrnire este provocat de o anumit distrugere molecular, o consecin a formelor reactive ale oxigenului, denumite superoxizi sau "radicali liberi", care circul prin organism. Acest proces este numit stres oxidativ. Dup mai multe analize, specialitii au ajuns la concluzia c acidul clorogenic contribuie la anihilarea acestor radicali liberi, reducnd distrugerile moleculare pe care ei le provoac. [4] Industria farmaceutic Studii tiinifice au demonstrat c acidul clorogenic inhib eliberarea de glucoz n snge. Atunci cnd glucoza intr n snge dup consumul de alimente sau buturi, ficatul elibereaz insulina iar aceasta stocheaz excesul de glucoz sub form de grsimi . Prin administrarea de acid clorogenic are loc ncetinirea absorbiei glucozei n snge i implicit absorbia grsimilor. Datorit acestei aciuni ficatul metabolizeaz grsimile mult mai repede. Un alt studiu a fost realizat de cercettorii japonezi care n anul 2005 au realizat un test cu privire la efectele acidului clorogenic asupra persoanelor cu hipertensiune arterial uoar, folosind un placebo pentru unii participani i acidul clorogenic extras din boabe verzi de cafea pe alii. Rezultatele au artat n cazul celei de-a doua categorii de participani o scdere semnificativ a tensiunii arteriale i nu s-au nregistrat efecte secundare negative.[3]

Concluzii
Importana acestui studiu este justificat de posibilitile variate de valorificare ale acidului clorogenic: n industria farmaceutic, cosmetic i alimentar. Dintre metodele de extracie ale acidului clorogenic descrise n literatura de specialitate s-a constatat c extracia asistat de microunde prezint cele mai multe avantaje. Extracia asistat de microunde pentru izolarea compuilor polifenolici a fost considerat o alternativ de succes a extraciei tradiionale solid-lichid. n prezent studiile au 17

fost focalizate pe extracia acidului clorogenic, cafeinei i a altor compui polifenolici din boabe verzi de cafea Robusta. S-a stabilit n cazul acidului clorogenic c parametri extraciei pentru randament maxim sunt conform tabelului 5, 500C, 5 min, 800 W. Cu aceast metod extractul obinut conine 32- 62% acid clorogenic. Dup separarea compusului din matricea vegetal, metodele de purificare cele mai avantajoase la nivel de laborator sunt metoda HPLC-DAD i HPLC-X5, aducnd acidul clorogenic la puritatea necesar permis pentru a putea fi valorificat.

Bibliografie
[1] Tomescu, A. :Cafeaua, Ed. Cramen, Bucureti, 2010; [2] Clarke, RJ., Macrae, E.: Coffee Chemistry, Vol.1, Ed. Elsevier Applied Science, London, 1985; [3]***Farmacopeea Romn, ed. a X-a, Ed. Medical, Bucuresti, 1993; [4] C.J:Dillard, J.Bruce German, J.Sci.Food Agric. 80 (2000) 1744-1756; [5] Vinson,J., Su,X., Zubik,L., Bose, P.; Phenol antioxidant quantity and quality in foods. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49 (2002), 5315-5321; 18

[6] http://www.chlorogenic-acid.com/En-Post/chlorogenic-acid-in-the-food-industry; [7] http://www.chlorogenic-acid.com/En-Post/Chlorogenic-acid-application-in-cosmetics; [8] Romualdo, V.: Encyclopedia of Chemical Technology, 1993, 37 (3), 416-420; [9] Soxhlet, F.: Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes , Ed. Polytechnisches, 1879; [10] Berger, S., Dieter S.: Classics in Spectroscopy-Isolation and Structure Elucidation of Natural Products, Ed. Wiley-VCH, 1991; [11] Ayaz A. Memon, Najma Memon, Muhammad I. Bhanger: Separation and Purification Technology, 76 (2010) 179-183; [12] Rohit Upadhyay, K. Ramalaskshmi, L.Jagan Mohan Rao: Microwave-assisted extraction of chlorogenic acids from green coffe beans. Food Chemistry, 130 (2012) 184-188; [13] Rahoma, S., Mohameda, G.: The Use of Supercritical Fluid Extraction, Ed. WMRC, iunie, 2002; [14] Pan, X., Niu, G., Liu, H.: Microwave-assisted extraction of tea polyphenols and tea caffeine from green tea leaves. Chemical Engineering and processing, 42 (2003), 129-133. [15] Lijun Sun, Yurong Guo, Chengcheng Fu, Jingjing Li, Zhuo Li: Simultaneous separation and purification of total polyphenols, chlorogenic acid and phlorizin from thinned young apples. Food chemistry, 136 (2013) 1022-1029; [16] Li Yang, Qinghua Yan, Haizhen Mo, Xiaomin Li, Qing Wang: Determination of chlorogenic acid, baicalin and forsythin in shuanghuanglian preparations by HPLC-DAD, 4 (2012) 1361-1363.

19