Sunteți pe pagina 1din 11

PRELUCRAREA PROBELOR CONGELATE Tehnica secionrii pieselor biologice congelate este apanajul laboratoarelor de anatomie patologic i permite analiza

microscopic rapid a unui preparat. Recoltarea, fixarea, secionarea, etalarea, colorarea, montarea i etichetarea se desfoar ntr-un timp foarte scurt (cca 10 minute) fa de tehnica seciunilor fine la parafin (cca 16 ore). La aceast metod, etapele de fixare i includere se realizeaz n acelai timp, practic se suprapun. Calitatea preparatului este ns diminuat fa de probele incluse in parafin i secionate la microtom. Aplicaiile tehnicii de secionare a pieselor congelate - efectuarea unui examen anatomopatologic rapid: o n cadrul tehnicii chirurgicale Mohr (chemiochirurgie) - o metod simpl de control microscopic 100% al marginilor unei probe chirurgicale; o pentru examinarea n timpul operator a unei tumori cu presupuse metastaze; proba suspect de a fi o metastaz este prelucrat prin congelare i secionare la criotom iar rezultatul decide continuarea procedurii operatorii n sens radical sau conservator; - evidenierea unor componente tisulare care se pierd la prelucrarea prin tehnici histologice uzuale (n care, de exemplu, folosirea formolului ca fixator dizolv lipidele); se pot detecta lipidele, enzimele, mucopolizaharidele. - efectuarea unor preparate care s permit detecia unor antigene, prin tehnici complementare de imunofluorescen sau imunohistochimie; aceste antigene pot fi mascate de fixarea cu formalin, motiv pentru care se poate opta pentru secionarea la criotom.

Materiale i echipamente necesare esut proaspt recoltat; metodele de recoltare sunt similare celor utilizate pentru esuturile incluse n parafin;

criotom = un microtom pentru seciuni congelate, amplasat ntr-o incint frigorific; grosimea seciunilor este de 5-60m;

gel crioprotector OCT (Optimal Cutting Temperature) = un amestec de glicerol i rini care mpiedic formarea cristalelor de ghea n interiorul esutului (fapt care ar afecta structura tisular);

- soluii de colorare (fie albastru de toluidin fie clasica tehnic de colorare HE), lame, lamele, mediu de montare, alcool, xilol.

Tehnic de lucru 1. Recoltarea Recoltarea se poate realiza prin metodele cunoscute (biopsie, puncie bioptic etc); 2. Fixarea i includerea 2.1 Metoda 1 Fixarea se realizeaz prin congelarea probei (implicit - metod fizic) Congelarea probei se realizeaz ntr-un container special (fig.a)

Piesa este acoperit cu soluie crioprotectoare (fig.b) i sigilat cu o membran PET. Congelarea se poate realiza i n sistemul de rcire al criotomului, pe o plac rcit la -58C. Preparatele pot fi apoi stocate ntr-un congelator la -74C, dac nu sunt secionate imediat. Incinta criotomului ajunge la -35C

Incinta criotomului, vedere de sus

Incinta criotomului, detaliu al camerei de congelare, rcit la -35C. 1=piston rcire instant (-58C); 2=suport plac rcire instant; 3=port-obiect pentru piesa congelat; 4=cuit

Panoul de comand a criotomului, include afiaj pentru numrarea seciunilor, grosimea seciunilor, modul de acionare a motorului de deplasare a portobiectului. Pentru congelarea probelor, piesa de esut se amplaseaz pe suportul rcit n incinta criotomului, pe placa de rcire, la -58C. Iniial se adaug o picatur de crioprotector.

Pentru congelarea probelor, piesa de esut se amplaseaz pe suportul rcit n incinta criotomului, pe placa de rcire, la -58C. Iniial se adaug o picatur de crioprotector. Ulterior se adaug mai mult agent crioprotector peste piesa tisular.

(seamn acum cu un ou-ochi) Peste pies se coboar aplicatorul rcit i el la -58C. Piesa este congelat simultan din partea superioar i inferioar. Se las la rcit (congelare = fixare + includere) cteva minute.

2.2. Metoda 2 Se amplaseaz esutul n godeuri speciale incluse n placa de rcire.

Se acoper esutul cu gel crioprotector OCT.

Se amplaseaz mandrenul metalic peste gelul OCT. Se apas uor mandrenul peste godeu.

Aceste mandrenuri de oel inoxidabil sunt prercite pentru a fi utilizate n rcirea rapid; modelul depe suprafaa de contact ajut la maximizarea contactului cu gelul OCT i cu piesa de esut.

Pentru a amplifica efectul de congelare, putem utiliza un bloc perforat, numit supra-mandren sau manon. Manoane Sunt paralelipipezi metalici, cu o perforaie central care servesc pentru: - congelare, prin aplicare peste mandren - detaarea blocului congelat din locaul plcii de congelare. Lovirea uoar a tijei madrenului cu manonul poate cliva planul de aderen al blocului format n godeu.

Se plaseaz manonul peste tija mandrenului (stnga). Se nltur blocul cu o lovitur uoar asupra tijei mandrenului cu ajutorul manonului (dreapta)

Blocurile congelate pot fi stocate la -80C, dac nu sunt secionate imediat.

Reducerea artefactelor rezultate din congelare Rcirea agentului crioprotector Congelarea i formarea cristalelor de ghea ncepe imediat dup ce esutul atinge placa de racire. esuturile care conin mult ap sau care sunt edemaiate pot forma cristale de ghea care s le afecteze structura. Acest fenomen poate fi redus prin rcirea gelului OCT la frigider. Gelul crioprotector este folosit de obicei pentru biopsiile cerebrale, tiroidiene, pulmonare sau renale. Viteza de congelare este crescut prin aceast metod. Pre-rcirea esutului esuturile rcite rapid prezint mai puine artefacte. esuturile primate din clinic au temperature cuprinse ntre temperatura corpului i temperatura camerei. Prercirea esutului nainte de congelare (la zero grade) este util n accelerarea etapei de fixare+includere. Timp aproximativ de rcire la -24C , utiliznd un mandren rcit: - godeu 18mm - 20 secunde - godeu 24mm - 35 secunde - godeu 30mm - 60 secunde

Containerul special de congelare este amplasat pe sistemul portobiect al criotomului. Blocul congelat cu esutul trebuie s fie paralel cu lama cuitului; acum se poate ncepe secionarea.

n timpul secionrii, care poate fi automat, semi-automat sau manual, cu ajutorul unui penson se mpiedic incurbarea seciunilor.

Acelai fenomen poate fi evitat cu ajutorul unui panou de sticl anti-incurbare, ataat i amplasat deasupra cuitului.

n final seciunile sunt preluate cu un penson i amplasate pe lam.

Colorarea seciunilor la ghea Colorarea seciunilor din blocuri de esut congelat se poate face fie pe seciuni libere fie pe seciuni lipite pe lame portobiect. Pentru seciunile libere, bateria de colorare este formata din cutii Petri cu diametru mic prin care seciunile se trec cu ajutorul unor baghete de sticla in forma de L. Dup colorare, aceste seciuni se pescuiesc pe lame portobiect i se monteaz n medii apoase (glicerin, gelatin). Pentru seciunile etalate pe lam, colorarea se realizeaz cu diferii colorani i prim metode variate, n funcie de timpul disponibil. Coloraiile utilizate sunt cele folosite de obicei pentru seciuni fine (albastru de toluidin sau hematoxilin eozin - coloraii de rutin) sau sunt adaptate rezultatelor scontate (ex. imunofluorescen).

Colorarea seciunilor lipite pe lame cu soluie 1% de albastru toluidina - etape de lucru Seciunile lipite pe lam, dup secionarea la criotom, sunt hidratate dar conin nc impuriti, grsimi. n consecin este necesar o clarificare cu xilol (solvent organic). Xilolul nu este miscibil cu apa, aadar, nainte de clarificare, seciunile trebuie deshidratate, iar dup clarificare, seciunile trebuie rehidratate deoarece soluia de colorare este apoas. Etape:
Alcool 90% DESHIDRATARE Alcool 100% CLARIFICARE Xilol Alcool 100% REHIDRATARE Alcool 90% COLORARE PROPRIU-ZIS Albastru de toluidin, soluie 1% se toarn n picturi peste seciuni, pe lama aezat pe marginile unei cutii Petri. Se las cteva secunde, apoi se scurge n vasul Petri se toarn n picturi peste seciuni, pe lama aezat pe marginile unei cutii Petri. Se las cteva secunde, apoi se scurge n vasul Petri se toarn n picturi peste seciuni, pe lama aezat pe marginile unei cutii Petri. Se las cteva secunde, apoi se scurge n vasul Petri se toarn n picturi peste seciuni, pe lama aezat pe marginile unei cutii Petri. Se las cteva secunde, apoi se scurge n vasul Petri se toarn n picturi peste seciuni, pe lama aezat pe marginile unei cutii Petri. Se las cteva secunde, apoi se scurge n vasul Petri se toarn n picturi peste seciuni, pe lama aezat pe marginile unei cutii Petri. Se las 30-60 secunde, apoi se scurge n vasul Petri

Dup colorare, seciunile parcurg etapele de postcolorare, n funcie de mediul de montare: - pentru un mediu de montare apos - se adaug direct 1-2 picturi de mediu de montare i se acoper cu o lamel; se elimin bulele de aer pin presarea uoar a lamelei. Se poate examina la microscop; - pentru un mediu de montare anhidru (Balsam de Canada) etapele sunt:
Alcool 90% DESHIDRATARE Alcool 100% CLARIFICARE MONTARE Xilol Balsam de Canada se toarn n picturi peste seciuni, pe lama aezat pe marginile unei cutii Petri. Se las cteva secunde, apoi se scurge n vasul Petri se toarn n picturi peste seciuni, pe lama aezat pe marginile unei cutii Petri. Se las cteva secunde, apoi se scurge n vasul Petri se toarn n picturi peste seciuni, pe lama aezat pe marginile unei cutii Petri. Se las cteva secunde, apoi se scurge n vasul Petri se adaug direct 1 pictur de mediu de montare i se acoper cu o lamel; se elimin bulele de aer pin presarea uoar a lamelei. Se poate examina la microscop;

Rezultatele colorrii cu albastru de toluidin: nuclei apar in albastru nchis, iar citoplasma n albastru deschis.