UNIVERSIDAD NACIONAL DE MAR DEL PLATA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS BIOQUIMICA I

TRABAJO PRACTICO: Actividad enzimtica: invertasa de levadura.

Introduccin Las enzimas catalizan las reacciones disminuyendo la energa libre de activacin necesaria para que las mismas ocurran. La molcula sobre la cual la enzima acta se denomina sustrato, esta molcula se transforma

obtenindose el producto. La molcula de enzima no se modifica al trmino de la reaccin y puede continuar catalizando la misma repetidas veces. Las enzimas son protenas globulares*1. Su conformacin espacial presenta un rea, denominada sitio activo, el cual es fundamental para su actividad cataltica. La naturaleza y el arreglo espacial de los aminocidos en este sitio activo hacen que ste sea especfico para un nico tipo de sustrato. An cuando existan distintas molculas que podran ser sustrato, slo aquella cuya forma sea complementaria con el sitio activo ser capaz de unirse al mismo. Cuando el sustrato apropiado se une a la enzima, se producen cambios en el sitio activo. Esta modificacin, denominada ajuste inducido, incrementa la catlisis. La liberacin de los productos restablece la enzima a su forma original, pudiendo la misma repetir el proceso sucesivas veces, mientras haya sustrato presente. La conformacin de una enzima es mantenida por las interacciones que se establecen entre las regiones especficas de los aminocidos que componen la cadena polipeptdica. Debido a ello la misma es susceptible ante cambios en el ambiente en el cual se encuentra, siendo dos de los factores ms

*1

Existen algunos tipos de ARN que pueden actuar como enzimas, catalizando el clivaje y formacin de uniones fosfodister. Estos ARN con actividad cataltica se denominan ribozimas y son menos comunes que las enzimas proteicas

importantes la temperatura y el pH. Cuando estos varan de forma tal que la conformacin de la protena es alterada, la enzima pierde su actividad. Cada enzima funciona mejor en un determinado rango de pH. Por ejemplo la pepsina, presente en el estmago, presenta mxima actividad cataltica en un ambiente fuertemente cido, mientras que la lipasa, presente en el intestino delgado, lo hace a pH bsico. La concentracin de H+ afecta la velocidad de reaccin debido a su efecto tanto a nivel de la ionizacin del sitio activo como de la estructura espacial de la enzima. La catlisis usualmente requiere que tanto la enzima como el sustrato presenten grupos qumicos especficos en su forma ionizada o deionizada para reaccionar. Por ejemplo, la actividad cataltica puede requerir que un grupo amino de la enzima est en su forma protonada (-NH3+), a pH alcalino este grupo estar deprotonado, por lo cual la tasa de la reaccin decaer. Por otra parte, en el rango ptimo de pH para la actividad de la enzima el sitio activo presenta la conformacin apropiada para la unin del sustrato. En cambio, ante un exceso de H+ o de OH- se altera la conformacin espacial de la protena globular, incluido su sitio activo, lo cual lleva a que la enzima no pueda catalizar la reaccin. Las reacciones qumicas incrementan su velocidad con la temperatura, por ello la catlisis tambin puede incrementarse con la temperatura. Sin embargo, cada enzima presenta un rango de temperatura ptima. Por encima de ste la velocidad de reaccin disminuye, hasta que la protena pierde su configuracin funcional, lo cual se denomina desnaturalizacin.

Invertasa de levadura La sacarosa, comnmente conocida como azcar de mesa, es un disacrido compuesto por -D-glucosa y -D-fructosa unidos mediante enlace glicosdico -1,2. Cuando este enlace es roto en la reaccin de hidrlisis, se genera una mezcla equimolar de glucosa y fructosa. La sacarosa puede ser hidrolizada en presencia de una enzima comnmente denominada invertasa o sacarasa:
Sacarasa

Sacarosa + H2O --------------------------- Glucosa + Fructosa

La denominacin sistemtica de la invertasa es -fructofuranosidasa, debido a que la reaccin catalizada por esta enzima es la hidrlisis del residuo terminal -fructofuransico. Existe otra enzima, la -D-glucosidasa, que tambin cataliza esta reaccin, escindiendo la unidad terminal de la glucosa. La sacarosa tambin puede ser hidrolizada de manera no enzimtica en medio cido. La invertasa es una enzima muy utilizada en la industria alimenticia ya que debido a su sabor ms dulce y a que no cristaliza tan fcilmente, se prefiere a la fructosa sobre la sacarosa. Un amplio rango de microorganismos sintetizan invertasa pudiendo, por lo tanto, emplear la sacarosa como nutriente. A escala comercial es biosintetizada por las cepas de levadura Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces carsbergensis. A diferencia de otras enzimas, la invertasa presenta actividad relativamente elevada en un rango amplio de pH (desde 3,5 a 5,5) con el ptimo en pH= 4,5. En cuanto a la temperatura, el mximo de actividad se registra alrededor de los 55 C. El valor de la cons tante de Michaelis-Menten vara segn las diferentes isoformas entre 2 mM y 5 mM. El plomo, mercurio y otros metales pesados son extremadamente txicos dado que actan como inhibidores de enzimas. Por ejemplo, el plomo puede reaccionar fcilmente con los grupos sulfhidrilos (-SH) de las protenas: protena-SH + Pb++ + HS-proteina proteina-S-Pb-S-proteina + 2H+

Los puentes disulfuro son vitales en la estabilizacin de la estructura tridimensional de la protena, la cual es determinante de la funcionalidad de la enzima. La actividad de la invertasa es inhibida en presencia de metales pesados, por ejemplo los iones Ag1+ atacan a la histidina de la cadena peptdica inactivndola. El sulfato de cobre en concentraciones elevadas tambin presenta un efecto inhibidor. Objetivo: En el presente trabajo prctico se realizar la extraccin de la invertasa de levadura y, posteriormente, se verificar su accin sobre una solucin de

sacarosa. La misma se comprobar mediante el test de Fehling, el cual permite detectar la presencia de los productos de la hidrlisis de este disacrido (glucosa y fructosa).

Protocolo de trabajo: A- Obtencin de la enzima Colocar 7,5 g de levadura de cerveza (Saccharomyces cerevisiae) en un mortero y agregar 15 ml de solucin de bicarbonato de sodio 0,1M (buffer de extraccin). Mezclar y dejar en contacto durante 20' agitando peridicamente. Trasvasar a un tubo de centrfuga y centrifugar durante 10' a 3000 rpm. Recuperar el sobrenadante, el cual contiene la enzima, y ser el extracto

enzimtico (EE*) a utilizar. Tomar una alcuota de 2 ml del EE y hervirla a BM durante 10 minutos, este ser el extracto enzimtico hervido (EEH**).

B- Proceso enzimtico Realizar una batera de tubos de ensayo siguiendo las indicaciones de la siguiente tabla: Sacarosa Inulina (1) Tubo 0,02M (0,5%) Na OH (0,5%) SO4Cu (0,25 %) mL 1 2 3 4 5 6 7 8 9 2 2 2 2 2 2 2 2 2 0,25 1 0,25 1 0,5 1 1 1 1 1 1 1 EE* EEH**

(1) La inulina es un polmero de fructosa que se utiliza como posible sustrato alternativo. Dejar reaccionar durante 15' a temperatura ambiente.

C- Deteccin de los productos de la catlisis Agregar a cada tubo 2 ml del reactivo A de Fehling y 2 ml del reactivo B de Fehling. Colocar los tubos en bao de agua a 100 C durante 10', retirarlos y dejarlos enfriar en la gradilla.

D- Resultados Los productos de la hidrlisis de la sacarosa -fructosa y glucosa- dan resultado positivo para el test de Fehling, lo cual es indicado por la aparicin de un precipitado rojo ladrillo. Compare los resultados obtenidos en los distintos tubos -aparicin o no del precipitado y cantidad del mismo- y trate de explicarlos en base a los reactivos agregados en cada uno.

Bibliografa - Brock, T.D.; M.T. Madigan; J.M. Martinko and J. Parker. 1994. Biology of microorganisms. Seventh edition, Prentice-Hall International (UK) Limited, London. - Devlin, M.D. 1992. Textbook of Biochemistry. Third edition. Wiley-liss, INc. EUA. Univ. of Missouri, Columbia.1973-1974. Laboratory Manual for 210

Biochemistry-Dept of Agricultural Chemistry. Lucas Brothers Publishers.

Actividades complementarias 1- En el potocolo experimental realizado, cul es el rol del Na OH agregado a algunos de los tubos? a- Es el sustrato sobre el que acta la enzima. b- Acelera la reaccin entre la enzima y el sustrato. c- Desnaturaliza la enzima por alterar su sitio activo. d- Bloquea el sitio activo de la enzima.

2- Cul es el objeto de realizar el primer tubo de la serie -el cual contiene slo sacarosa-?

3- La tasa de reaccin puede medirse, a travs del tiempo, por desaparicin de sustrato o por aparicin de producto. Este ltimo es el mtodo empleado en el Grfico 1. En base al mismo, cul es la tasa de reaccin, en moles.segundo-1, en el intervalo entre 0 y 10 segundos?

N de moles de producto

Tiempo (segundos) Grfico 1: 4- Las actividades planteadas a continuacin estn basadas en el siguiente grfico de catlisis enzimtica:

Grfico 2:

N de moles de producto

Tiempo (segundos)

A)- En cul de los siguientes intervalos de tiempo se alcanza la mxima velocidad de reaccin? a. 0-30 segundos b- 60-120 segundos

c- 120-180 segundos d- durante todo el periodo considerado.

B) Con el objeto de mantener una tasa constante durante todo el perodo considerado, cul de los siguientes pasos debera realizarse? a- agregar ms enzima b- incrementar la temperatura gradualmente despus de los 60 segundos. c- agregar ms sustrato. d- Remover el producto acumulado.

C) Cul de los siguientes grficos representa la tasa de reaccin mostrada en el grfico 2? Nota: en el eje y se representa la evolucin del nmero de molculas de sustrato.

Nmero de molculas .seg-1

Tiempo (segundos) Nmero de molculas .seg-1

Nmero de molculas .seg-1 Tiempo (segundos) Tiempo (segundos) Nmero de molculas .seg-1 Tiempo (segundos)