Sunteți pe pagina 1din 52

Generaliti Se vorbete de o analiz chimic atunci cnd activitatea depus, de o persoan, grup sau organizaie, are drept rezultat

cel puin o caracteristic chimic calitativ (adic o proprietate ce indic prezena sau absena unei specii chimice) sau cel puin o cifr care indic un coninut dintr-o specie sau material dat. Ansamblul de operaii i msurtori, plus condiiile experimentale, menite s dea, mcar n parte, compoziia fizico-chimic a unei "probe" din material, produs sau esut biologic, convenim s-l numim sistem analitic. n trecut, rezultatele analizelor n medicin erau obinute n mod calitativ, de aceea, majoritatea diagnosticelor erau bazate pe simptoame i/sau examinrile cu raze X, dei era cunoscut faptul c multe boli fiziologice erau nsoite de schimbri chimice n lichidele metabolice. Uneori erau utilizate teste pentru a detecta componenii normali sau anormali n diferite probe recoltate pentru analiz. Aceste teste n procedee prin intermediul crora a devenit posibil determinarea cantitativ a componenilor inclui . Pe msur ce precizia a crescut i au fost stabilite proporiile normale, a devenit clar c rezultatele de laborator au putut fi folosite n scopul precizrii diagnosticelor. 2. Alegerea unei metode de analiz Odat ce este definit obiectivul analizei, trebuie ca la alegerea metodei de analiz s se precizeze o serie de factori cum sunt: domeniul de concentraie, precizia i sensibilitatea cerute, selectivitatea i rapiditatea. n funcie de cantitatea aproximativ de substan care trebuie determinat dintr-o prob, metodele analitice se clasific ca n tabelul 1.2:

n conformitate cu aceast clasificare, metodele chimice se preteaz cel mai bine la determinarea macrocantitilor, iar metodele instrumentale pentru microcantiti.

Exactitatea Este msura ncrederii acordat msurtorii efectuate cu un mijloc de msur. Aceasta se refer la sistemul analitic, n ansamblu, indiferent de locul i timpul msurtorii. Exactitate a se msoar folosind un material (substan) zis etalon - n care ncrederea este deplin. Diferena dintre valoarea adevrat, adic aceea recunoscut unanim, i cea msurat o denumim eroare. Este esenial ca etalonul s fie recunoscut de toate laboratoarele interesate. Exactitatea este msurat i de corelaia ce exist ntre un standard i o prob, la msurtori repetate. n acelai timp, exactitatea estimeaz posibilitatea de apariie a erorilor sistematice. O comparaie intuitiv dintre exactitatea unei analize i trasul la int cu o puc scoate n eviden sensul exactitii Sensibilitate, precizie i selectivitate ntr-o metod analitic, noiunea de sensibilitate corespunde concentraiei minime intr-o substan ce poate fi determinat cu o anumit siguran. Alegerea unei metode de analiz depinde de sensibilitatea cerut. Cu ct este mai mic proba i cu ct compusul de interes n prob este mai puin prezent cu att metoda trebuie s fie mai sensibil. Precizia se refer la corectitudinea rezultatului obinut printr-o metod analitic. La fel ca i sensibilitatea, precizia variaz de la o metod la alta. Practic, se va alege metoda care furnizeaz gradul de acuratee cerut. Selectivitatea constituie o proprietate a unei metode de a furniza o precizie mai mare la determinarea unei anumite substane dintr-un amestec, comparativ cu alte substane coprezente. Cu ct proba este mai complex, metoda trebuie s fie mai selectiv. Adesea se mai folosete termenul de specificitate. Dac selectivitatea arat o anumit preferin pentru o substan, noiunea de specificitate, ntr-o metod analitic implic un rspuns specific. n general ns, metodele analitice nu sunt complet specifice fa de un anumit component. Timpul i costul realizrii unei analize sunt corelate cu dotarea laboratoarelor cu echipament adecvat i prezena unui personal 4

calificat. Dac exist mai multe probe similare, de exemplu n cazul controlului de calitate, devin posibile mijloace de automatizare. Adesea, scurtarea timpului n care se execut o analiz se face pe seama preciziei care, n anumite situaii, poate fi admis.

Limita de detecie Limita de detecie (Cd), reprezint coninutul minim, sigur detectabil. n general, se poate reda sub forma funciei: Cd = f(0 + kdsfond). Valoarea coeficientului de discriminare kd se alege din considerente practice una dintre valorile: kd = 2...6, 0 reprezentnd media zgomotului de fond iar sfond simboliznd abaterea standard a semnalului de fond. n practic, din considerente statistice, cea mai obinuit modalitate de exprimare este aceea cu kd = 3

Rapiditatea Se msoar n uniti de timp per analiz iar costul la preul unei analize incluznd: materialele, manopera, chiria laboratorului, amortizarea aparatelor (uzura mijloacelor fixe), costurile reactivilor folosii, energia i apa.

Evidena analizelor Activitatea de laborator este reflectat n registrele de analize. Acestea sunt registre, cu pagini numerotate, n care se trec toate rezultatele analizelor efectuate i semntura executantului sau a celui ce rspunde de analiza respectiv. n mod obligatoriu se nregistreaz data i ora primirii probei, numele celui ce a efectuat analiza, rezultatul, data i ora eliberrii buletinului de analiz. Caietele de laborator, folosite de fiecare coparticipant la execuia analizei chimice, conin, pe zile: msurtori, cntriri, calcule etc. se numeroteaz de asemenea, pagin cu pagin, i se pstreaz n arhiv. Acelai sistem este valabil n cazul monitorizrilor cu deosebirea ca datele nu se mai pstreaz doar pe hrtie ci i n memorii ale calculatoarelor, n aa numitele baze de date, din care informaiile nu se pot terge niciodat. Pentru a se putea verifica rezultatele analizelor, n caz de litigii ulterioare referitoare la calitatea probelor ce fac obiectul analizei, fiecare laborator are obligaia de a lua o astfel de cantitate de proba de analizat nct pentru analiz s nu se foloseasc dect cel mult un sfertdin cantitatea luat. De asemenea, are obligaia s pstreze restul probei un anumit timp (6 luni) astfel ca proba s nu-i modifice compoziia n acest timp. Probele este bine s fie pstrate n vase speciale, nchise i care se deschid n vederea unei noi analize numai n prezena tuturor prilor interesate. n cazul unor probe prelevate din mediu, concentraiile coborte fac practic imposibil acest deziderat. Buletinul de analiz este actul prin care este certificat compoziia sau calitatea oricrui material, primit pentru analiz de ctre un laborator. Comunicarea telefonic grbete adesea transmiterea informaiei dar nu poate constitui prob ntr-un eventual litigiu. Standarde analitice n vederea obinerii unor rezultate ale analizelor care s poat fi valabile pentru mai multe uniti (firme, instituii sau uniti economice) pe teritoriul unei ri sau al unui grup de ri, de regul analizele se fac prin metode verificate i adaptate la probe de o anumit categorie. De exemplu, cuprul din oel sau cuprul din prul uman se aseamn n principiu dar reetele difer din mai multe puncte de vedere. n prezent n rile avansate 6

exist organizaii care studiaz i verific metodele de analiz pentru cele mai diverse grupuri materiale. Echivalentul acestora la noi este Institutul Romn de Standardizare. Cele mai potrivite metode sunt recomandate a fi utilizate n toate laboratoarele de acelai tip din ara respectiv. Aceste metode se denumesc metode standardizate i sunt publicate, existnd chiar n unele biblioteci. Acestea prevd toate operaiunile, modul de determinare a fiecrui component - inclusiv formula de calcul (fr a se da explicaii privind principiile) sau instrumentul necesar. Exist ns i standarde care se ocup cu aspecte comune mai multor metode de analiz cum ar fi luarea probei medii pentru diferite materiale, de exemplu probe de sol, de aer de ap, nisip,gru sau minereu.n cazul n care nu s-au elaborat nc reete standard, fiind vorba de un produs nou, analizele se fac pe baza unei norme interne stabilite de comun acord ntre productorul i beneficiarul respectivei analize. Colecia de metode unanim acceptate formeaz un sistem de standarde de analiz chimic i acestea sunt denumite diferit n funcie de ar. De exemplu, ASTM n SUA, DIN n Germania iar n ultimul timp, pentru Comunitatea European, standardele ISO. Tipuri de metode analitice Metodele analitice de pot clasifica pe tipul i starea fizic a probei, scopul analizei, mrimea probei (tabelul 2) sau dup tipul metodei analitice. Dup acest din urm criteriu, metodele analitice se mpart n metode chimice i metode instrumentale. Metodele chimice se bazeaz pe diferite operaii chimice folosind sticlria uzual de laborator format din aparate simple. n general n aceste metode se msoar masa sau volumul. Metodele instrumentale implic utilizarea unui echipament complex, bazat pe principii electronice, optice sau termice. n aceste cazuri, se msoar diferite proprieti corelate cu compoziia probei. Cele mai bune rezultate se obin prin cuplarea tehnicilor chimice cu cele instrumentale . Fiecare categorie de metode prezint avantaje i dezavantaje, i alegerea metodei sau complexului de metode trebuie s se fac minimiznd interferena dezavantajelor i maximiznd influena avantajelor asupra cerinelor concrete ale analizei de efectuat.

Avantajele metodelor instrumentale: determinarea este foarte rapid; pot fi utilizate probe mici; pot fi cercetare probe complexe; prezint o sensibilitate ridicat; dau un grad mare de siguran rezultatelor msurtorilor. Avantajele metodelor chimice: procedeele sunt simple i precise; metodele se bazeaz n general pe msurtori absolute; echipamentul necesar nu este scump. Din prezentarea avantajelor, nu trebuie s se trag concluzia c metodele instrumentale le-au nlocuit pe cele chimice. n practic, metodele chimice constituie parte integrant dintr-o metod instrumental. Astfel, n orice analiz exist etape ca: prelevarea probelor; dizolvarea; schimbri n starea de oxidare; ndeprtarea excesului de reactiv; ajustarea pH-ului; adugarea de ageni de complexare; precipitarea; concentrarea; ndeprtarea impuritilor. Unele dintre aceste metode implic utilizarea metodelor de separare. Dezavantajele metodelor chimice: uneori lipsete specificitatea; realizarea unei analize ia de obicei un timp destul de lung; precizia scade odat cu micorarea cantitilor de prob (msurtori absolute); sunt lipsite de flexibilitate; sunt poluante pentru mediul nconjurtor. Dezavantajele metodelor instrumentale: este necesar o etalonare iniial sau continu a aparatului; sensibilitatea i precizia depind de aparatura sau metoda chimic de etalonare; precizia final se afl adesea n domeniul 5%; costul iniial i pentru ntreinerea echipamentului este ridicat; intervalul de concentraie este limitat (msurtori relative); n mod obinuit, necesit spaiu destul de mare; implic un personal cu o pregtire special. Analiza cantitativ Analiza cantitativ este bazat pe msurarea unei proprieti care este corelat direct sau indirect, cu cantitatea de constituent ce trebuie determinat dintr-o prob. n mod ideal, nici un constituent, n afar de cel cutat, nu ar trebui s contribuie la msurtoarea efectuat. Din nefericire, o astfel se selectivitate este rareori ntlnit. Pentru a proceda la o analiz cantitativ, trebuie urmate o serie de etape: 1. Obinerea unei probe semnificative prin metode statistice; 2. Prepararea probei; 3. Stabilirea procedeului analitic n funcie de: 8

Metode: (chimice; fizice cu sau fr schimbri n substan); Condiii: (determinate de metoda de analiz aleas; determinate de substana cercetat); Cerine: (rapiditate, exactitate, costuri; posibilitatea de amortizare); 4. Evaluarea i interpretarea rezultatelor. Practic, dup natura analizei, exist 7 tipuri de metode de analiz: (1) gravimetrice; (2) volumetrice; (3) optice; (4) electrice; (5) de separare; (6) termice; (7) de rezonan. n general, (1) i (2) sunt metode chimice, iar (3-7) sunt instrumentale (bazate pe relaii ntre o proprietate caracteristic i compoziia probei). Adeseori, n analiz se cupleaz dou sau mai multe dintre aceste procedee de baz. O alt clasificare a metodelor de analiz se poate face dup implicarea componenilor n reacii chimice, n metode stoechiometrice i metode nestoechiometrice. Metode de separare Adesea este necesar s se ndeprteze impuritile din prob nainte ca aceasta s fie supus analizei. Procedeele folosite pentru acest lucru sunt cuprinse sub titlul general de metode de separare. Metodele de separare se bazeaz pe fenomene fizice sau chimice i nu totdeauna sunt asociate doar cu separarea impuritilor . Separarea componenilor dintr-un amestec poate avea o importan att calitativ ct i cantitativ, separarea poate fi util pentru purificare, pentru concentrarea unuia dintre componeni sau a tuturor. O clasificare a metodelor de separare este dat n tabelul 4. Sub aspect analitic, procedeele de separare sunt deosebit de importante, deoarece metodele de analiz sunt selective i conduc la rezultate corecte numai dac n prealabil s-au izolat constituenii probei . Metodele de separare aplicate sistemelor chimice au ca scop separarea sau mprirea unui amestec eterogen sau omogen n unitile sale individuale, n grupuri, componente sau chiar n elemente .

Standarde, reactivi i soluii etalon Este foarte important stabilirea de standarde sau de referine pentru orice fel de msurtoare. Astfel, standardul de baz n cazul msurrii unor proprieti fizice este o unitate de msur foarte precis definit. n chimie, standardul de baz poate fi o substan a crei puritate a fost verificat. Deoarece standardele de baz nu sunt ntotdeauna accesibile, se recurge la comparaii cu materialul de referin. Acestea sunt numite standarde secundare. Este de menionat c cuvntul standard se mai folosete n chimie i n alt context. Astfel, sunt stabilite standarde pentru coninutul de poluani admis n aer, de impuriti n alimente sau medicamente sau pentru reziduurile de pesticide n produsele agricole. n acest caz, pentru un analist se pune problema de a determina dac un produs a fost fabricat astfel nct s se ncadreze ntr-un anumit tip de standard. Standardele chimice au o contribuie major n succesul unei metode analitice. Alegerea materialului de referin pentru etalonare d calitatea msurtorilor. Trebuie ales nct s ndeplineasc urmtoarele condiii: s fie accesibil i la un pre convenabil; s aib o puritate cunoscut de cel puin 99%; s fie stabil n solventul utilizat; s fie stabil i nehigroscopic; s participe la reacii n proporii stoechiometrice; s posede o mas molecular mare. Numrul de substane ce satisfac toate aceste cerine este limitat. Totui, pentru majoritatea metodelor analitice este necesar un etalon chimic - standard de baz. De exemplu, la determinarea titrimetric (volumetric) a unei substane este necesar un volum msurat de reactiv de concentraie cunoscut, cu ajutorul cruia se produce o reacie chimic pn cnd reactivul ajunge ntr-o proporie stoechiometric (punct de echivalen sau stoechiometric) cu substana cercetat. O substan care ndeplinete condiiile amintite anterior poate fi considerat un standard primar. Cu ajutorul acesteia se pot apoi prepara standarde secundare, care nu prezint aceleai caliti ca i standardul primar, ns realizeaz cerinele minimale pentru determinrile pe care le efectum cu ajutorul lor. n principiu, pentru o analiz cantitativ sau calitativ instrumental trebuie utilizai reactivi de puritate analitic (pro analysis sau pentru analiz, prescurtat p.a.). Astfel de reactivi sunt furnizai de regul de ntreprinderi specializate (de exemplu Merck n Germania sau "Chimopar" Bucureti n Romnia). Odat cu coborrea limitei de detecie la diversele tipuri de analiz instrumental 10

necesarul unor reactivi purificai a crescut nct astzi exist reactivi spectral puri (for spectroscopy n l. englez) sau reactivi cromatografici (for chromatography), mai puri dect cei p.a. n unele cazuri nu avem reactivi suficient de puri. De aceea se pleac de la o alt substan pur, de exemplu un metal pur (purificat electrolitic, sau prin topire zonar) care se dizolv ntr-un acid de nalt puritate. Nu trebuie uitat c eticheta de pe sticl nu garanteaz, n mod infailibil, puritatea. Motivele sunt diverse: unele impuriti nu au fost determinate de fabricant, sau reactivul a devenit impur, dup primire, fie prin deschiderea sticlei (borcanului) ntr-un mediu poluat (de exemplu cu praf de un anumit metal) sau prin turnarea napoi n container a unei cantiti de reactiv de ctre o persoan neavizat. Dac reactivul procurat este sigur de calitate corespunztoare "regulile de aur" privind lucrul cu reactivi sunt urmtoarele: 1. nu se ine sticla deschis dect timpul minim necesar; 2. nici o foarte mic cantitate de reactiv nu se ntoarce napoi n sticl dup ce a fost scoas afar o cantitate ceva mai mare de reactiv; 3. reactivii lichizi sau soluiile se vor turna prealabil din sticl ntr-un pahar i niciodat nu se va introduce o pipet direct n sticl. O atenie deosebit trebuie acordat dopurilor de la sticlele de reactivi pentru a nu fi impurificate n timpul transvazrii reactivilor. Proba De cele mai multe ori, luarea unei probe, la o analiz fcut n laboratoarele didactice, const ntr-o cntrire sau o msurare a unui volum de prob cu care se ncepe lucrul n laborator. Trebuie s avem n vedere c practica din realitate este diferit. i anume, aceasta poate constitui etapa cu care ncepe analiza n laborator dar originea eantionului adus la laborator este alta - provenind din materialul de analizat.

11

Prelevarea probelor Toate procedeele de analiz cantitativ includ cteva operaiuni de laborator comune. Acestea sunt: luarea probelor, uscarea, cntrirea i dizolvarea. Dizolvarea este singura operaiune care nu este ntotdeauna necesar, deoarece exist unele metode instrumentale prin care msurarea se face direct pe prob . Orice analist experimentat execut aceste operaiuni acordndu-le o atenie deosebit, deoarece este tiut c o pregtire adecvat pentru msurare este la fel de important ca i msurarea n sine. O prob trebuie s fie reprezentativ pentru toi componenii lundu-se n considerare i proporiile n care aceste componente sunt incluse n materialul de analizat. Dac materialul este omogen, prelevarea probei nu constituie o problem. Pentru materialele eterogene se impun msuri de precauie speciale pentru a obine o prob reprezentativ. O prob de mrime potrivit pentru laborator se poate alege ntmpltor sau se poate seleciona dup un plan elaborat n mod statistic, care n mod teoretic, ofer fiecrui component din prob o ans egal de a fi decelat i analizat. Exist instruciuni standardizate pentru orice material n ceea ce privete luarea probei. Principiul general, care va duce la o regul comun, este acela c proba medie trebuie s se compun dintr-un numr ct mai mare de poriuni mici, luate din diferite locuri ale materialului de analizat, alese n ordine ntmpltoare. De asemenea, pe ct posibil, extragerea probelor e bine s se fac mecanizat sau automatizat pentru a se elimina factorul subiectiv. Dar, aplicnd aceste precauii se obin de regul cantiti prea mari de material de analizat format din buci cteodat neomogene i diferite, n ceea ce privete compoziia, de la un punct la altul. Aceast prob reprezentativ, este sfrmat i mrunit nite scule specifice de exemplu concasoare sau mori i redus treptat pn la cantitatea trimis la laborator, care poate fi ntre 25 g i 1 kg. Aceasta, nainte de cntrire, se macin fin (50). n prepararea probelor se folosesc materiale dure i totodat pure ca agat, cuar, porelan, platin, Teflon sau polietilen. Acestea se spal n mod special. De exemplu, sticla se spal cu detergent apoi se umecteaz cu amestec cromic, se cltete cu ap apoi cu ap distilat i n final, se usuc fr tergere.

12

Exist 3 metode de baz pentru colectarea probelor gazoase. Acestea sunt: prin expansiune ntr-un container din care proba poate fi ulterior evacuat; prin absorbie pe un suport i prin nlocuire cu un lichid. n toate cazurile, trebuie s se cunoasc volumele vaselor de colectare, temperatura i presiunea. n mod obinuit, vasele de colectare sunt confecionate din sticl i trebuie prevzute cu un orificiu de intrare i unul de ieire ce pot fi nchise i deschise, n mod convenabil. Pentru a elimina contaminarea probelor, se recomand iniial splarea containerului cu gazul din care se preleveaz proba. Concepia dispozitivului de prelevare a probei trebuie s permit ca acest procedeu s se execute cu uurin. Aerul este un amestec complex de diferite gaze. Studiul compoziiei aerului este o problem frecvent n studiul mediului . Compoziia sa real este dependent de mediul nconjurtor i de locul de unde se ia proba. n prezent, datorit polurii, multe eforturi sunt ndreptate pentru studiul i supravegherea calitii aerului. Exist mai multe modaliti pentru prelevarea probelor de aer.

1.ISTORIC

Analiza chimic cromatografic este un domeniu mai recent al analizei instrumentale care include mai multe metode de separare i totodat de analiz a componenilor amestecului din prob. n toate variantele, separarea precede analiza i se realizeaz prin repetarea, de un numr mare de ori, a echilibrului de distribuie ntre dou faze. Una dintre faze este imobil i poart denumirea de faz staionar (aflat de regul ntr-un tub numit coloan) iar cealalt faza mobil - aflat n micare, se deplaseaz prin golurile primei faze. Separarea se petrece n coloana cromatografic, piesa cheie a ntregii metode. Faza mobil, denumit i eluent scurgndu-se continuu (deci cu vitez constant) prin interstiiile fazei staionare, adeseori poroase, poate provoca migrarea, cu viteze diferite, a celor n componeni ai amestecului de separat de-a lungul coloanei. Amestecul supus separrii se introduce sub form de soluie la nceputul coloanei, folosindu-se un dispozitiv de introducere a probei (de exemplu o microsering), i se afl iniial fixat ntr-o zon ngust de la nceputul coloanei. Splai de 13

eluent, o parte din componenii probei migreaz apoi prin coloan cu viteze diferite. Acest lucru se datoreaz interaciunilor fizice specifice, dintre moleculele probei i faza staionar (desigur, nu orice molecul poate migra pe orice faz staionar). Efectul, este numit retenie i aceasta provoac o aa-numit migrare difereniat. Adic moleculele migreaz n grupri, n fiecare grup existnd doar molecule de acelai fel. Aceasta face posibil sesizarea componenilor, pe rnd, la prsirea coloanei, de ctre un instrument, n grupurile respective - denumite uneori zone. Instrumentul amintit este un analizor fizico-chimic, sensibil la mai muli (n mod ideal la oricare) dintre componeni ce ies din coloan i care este plasat n eluent, imediat dup ieirea din coloan. Acest analizor, denumit detector este capabil s dea un semnal proporional cu masa sau cu concentraia soluiei de component n faza mobil. n consecin, dispozitivul, "marcheaz" trecerea fiecreia din substanele ce formeaz iniial proba, similar cu o fotocelul care nregistreaz trecerea concurenilor la sosire n atletism. Reprezentarea grafic a semnalului detectorului n funcie de timp poart numele de cromatogram

2.CLASIFICAREA METODELOR CROMATOGRAFICE

S-au imaginat i realizat numeroase variante ale metodei cromatografice, diferind unele de altele n primul rnd prin natura fazei mobile, dar i a celei staionare. Astfel se distinge cromatografia de lichide (LC) cnd faza mobil este un lichid, cromatografia de gaze (GC) cnd aceasta este un gaz sau cromatografia cu fluide supracritice la care faza mobil este un lichid aflat peste temperatura critic. n cadrul cromatografiei de lichide se mai face distincie ntre cromatografia pe coloan deschis i cea pe coloan nchis Pe de alt parte, n cadrul fiecreia dintre acestea, distingem mai multe variante. n cadrul LC se disting, n funcie de mecanismele de separare: Cromatografia de adsorbie, una dintre primele tehnici utilizate, veche de mai bine un secol (vet, 1903), utilizat pentru separarea substanelor organice cu molecule de dimensiuni 14

mici i medii pe adsorbeni, ca silicagel i alumin, folosindu-se, ca faze mobile, diferite amestecuri de solveni organici. Cromatografia ionic (de schimb ionic), care se petrece pe o faz staionar solid, poroas, format din materiale specifice - schimbtorii de ioni - substane cu o reea solid afnat, de natur organic sau anorganic, pe care se gsesc grefate, prin procesul de obinere, nite centre de schimb ionic. Cele mai rspndite sunt rinile schimbtoare de ioni - organice la care scheletul-suport este unul organic - un polimer poros. Pe aceste centre are loc o reacie ionic sau o interaciune ntre substana din soluie (electrolit sau neelectrolit) i funciunea legat chimic de suportul solid, numit reacie de schimb ionic. Cromatografia de excluziune steric se desfoar pe faze staionare poroase dar cu porozitatea selecionat astfel nct s corespund dimensiunilor moleculelor supuse separrii. O parte dintre molecule intr prin pori, reuind s interacioneze cu suportul solid, prin fore de adsorbie foarte slabe, iar altele sunt excluse deplasndu-se practic nereinute odat cu faza mobil. Se obine astfel un soi de sit la scar molecular separarea moleculelor fcndu-se n funcie de dimensiune. Tehnica se mai ntlnete i sub denumirea de filtrare prin geluri sau permeaie prin geluri n funcie de natura apoas sau organic a fazei mobile. Cromatografia lichid-lichid (LLC), n care faza staionar este o faz lichid, nemiscibil cu cea mobil i imobilizat pe un suport solid, ntr-o coloan. Aici suportul solid este, cel puin principial, inert fa de componentele din prob. ntruct simpla impregnare a unui suport poros cu un lichid permitea splarea acestuia n timp, s-a recurs la legarea pe cale chimic a acestora de suport, obinndu-se nite faze cu totul specifice - faze staionare legate chimic. Molecule organice de dimensiuni mici sunt, prin sintez, legate de suportul poros, fenomenul de pierdere prin splare de ctre faza mobil, fiind practic anulat. Acest tehnic este cea mai rspndit devenind aproape sinonim cu cromatografia de lichide. Cromatografia pe coloan deschis sau cromatografia planar (PC), se refer la un grup de tehnici nrudite cu cele din LC, care au toate n comun faptul c faza mobil circul

15

printr-un material poros dispus ntr-un plan i formnd un strat relativ subire, dar de compoziie asemntoare cu cele menionate la cromatografia pe coloan. Se disting: Cromatogafia pe hrtie, tehnic n care faza staionar este o hrtie poroas din celuloz (iniial o hrtie de filtru) care este irigat de solvent prin fore capilare - o tehnic, azi, de importn istoric. Cromatografia pe strat subire (TLC), n care faza staionar pulverulent este fixat de suportul plan (sticl, aluminiu, material plastic) cu un liant, formnd un strat subire (0.10.5mm) de asemenea irigat prin capilaritate. Cromatografia pe strat subire de nalt performan (HPTLC), n care faza staionar are granulaie extrem de fin ridicndu-se astfel eficiena separrilor dar i viteza acestora. Toate acestea se caracterizeaz prin simplitate, accesibilitate i pre de cost cobort, dar totodat prin performane ceva mai slabe dect cromatografia de lichide pe coloan sub presiune ridicat (HPLC) varianta modern a LC. n mod analog, n cazul cromatografiei de gaze (sau mai pretenios cromatografiei n faz gazoas), denumit prescurtat GC se disting urmtoarele tehnici: Cromatografia gaz-lichid n care faza staionar este un lichid nevolatil imobilizat pe un suport solid. Aici suportul poate fi unul granular, poros, situat ntr-o coloan n aanumita cromatografie de gaze convenional sau chiar pe pereii coloanei, confecionat de dimensiuni capilare, n cromatografia pe coloan capilar. Cromatografia gaz-solid este analog cu cele discutate la cromatografia de adsorbie i la cea de excluziune steric cu deosebirea c schimbarea gazului nu modific selectivitatea. Faza staionar o constituie tot silicagelul sau alumina, respectiv sitele moleculare (nite silicai naturali sau sintetici) respectiv granulele de carbon poros. Metoda este extrem de important pentru separarea gazelor permanente (CO, CO2, O2, N2, gaze nobile etc.) Din punct de vedere istoric, evoluia cromatografiei a cunoscut o suit de progrese, care au adus-o din situaia iniial de metod de separare i purificare de laborator la o tehnic de separare i analiz chimic cu o arie de aplicare aproape universal. Iniial rusul vet, a introdus n 1903 16

cromatografia de lichide pe coloan (LC). Aceast metod a fost uitat mult vreme i abia dup 1930, anul descoperirii cromatografiei n strat subire pe alumin, s-a perfecionat metoda utiliznd coloana, o dat cu nevoile de separare i purificare a compuilor organici naturali sau sintetici implicai n biochimie. n 1941 enlezii Martin i Synge descoper cromatografia de repartiie pe hrtie, reuind s separe cu ajutorul unui amestec de solveni care irig o band de hrtie de filtru (coninnd o pictur de prob) aproape toi aminoacizii, descoperire extrem de important pentru dezvoltarea ulterior a biochimiei. Doar n 1952 aceiai A. J. P. Martin and R. L. M. Synge au nlocuit faza mobil lichid cu un gaz, realiznd pentru prima oar cromatografia de repartiie gaz-lichid. n aceast variant, detecia a fost realizat fizico-chimic, n efluentul gazos, dup ieirea din coloan, reuind astfel s mbunteasc marcant separrile. Din acest moment asistm la demarajul extraordinar al acestor tehnici, devenite azi cteva din principalele mijloace de analiz n chimia organic i biochimie, dar i n criminalistic, igien, controlul alimentelor, industria metalurgic etc. Din 1968 Halazs, (profesor la Franckfurt/Main), a pus la punct LC folosind un solvent sub presiune n calitate de faz mobil i detecie fizico-chimic n efluentul lichid, acesta fiind nceputul dezvoltrii cromatografiei de lichide sub presiune nalt (200 atm). Din 1980 s-a reuit i obinerea unor separri analitice performante bazate pe schimb ionic prin introducerea eluenilor diluai i a supresorului ionic - datorate americanilor Hamisch i Schmall, tehnic care de atunci a primit denumirea de cromatografie ionic (IC). Azi se lucreaz nu numai cu cromatografe de laborator, analitice, ci i cromatografe de proces, dedicate analizelor automate ale proceselor industriale sau cromatografe preparative, destinate obinerii de substane pure n industria farmaceutic sau n biotehnologii.

17

3 PARAMETRI CROMATOGRAFICI. PRINCIPII TEORETICE GENERALE

3.1. Cromatograma: elementele acesteia i mrimi fundamentale n orice tip de cromatografie detectorul d un semnal proporional, uneori cu concentraia, alteori cu masa componentului aflat n celula de msur, semnal ce poate fi nregistrat n funcie de timp. Diagrama semnal, funcie de timp sau de volumul de eluent se numete cromatogram. Pe cromatogram distingem o serie de maxime, numite picuri (peak = vrf n l. englez), care se produc deasupra liniei de baz sau a poriunii orizontale a curbei, paralel cu axa timpului. Aceasta apare ori de cte ori n detector nu apare nici un component, n afara eluentului respectiv.

18

Oricare pic are, n cazul ideal, forma distribuiei normale Gauss. S considerm cea mai simpl cromatogram posibil: cazul introducerii unui singur component, ntr-un gaz, C, care conine urme de aer - aerul fiind un component inert. Aspectul acestei cromatograme este cel prezentat n fig. 1. Pe axa absciselor s-a considerat timpul (sau volumul) de eluent scurs, cu debit cunoscut, de la introducerea (injectarea) probei, iar pe cea a ordonatelor, semnalul detectorului n uniti arbitrare. Distingem urmtoarele elemente de baz: Picurile cromatografice. n cazul prezentat n fig. 1, cele dou semnale sau vrfuri sunt denumite picuri. Acestea sunt semnalele valorificabile n analiza calitativ i cantitativ n toate metodele cromatografice. Primul pic, mai mic, corespunde unui component inert (aerul de exemplu n CG) - care nu este reinut de loc - iar cel de-al doilea, notat cu C, corespunde componentului (unic n cazul de fa) al probei considerate i este datorat 19

moleculelor care se distribuie pe parcursul migrrii prin coloan ntre faza mobil i cea staionar i care, n consecin, ies mai trziu din coloan. Timpul mort, tM - este timpul n care un component, complet nereinut de ctre faza staionar, parcurge coloana i tuburile de legtur pn la detector. Acesta nu poate fi zero. n cazul CG timpul mort, de exmplu, este egal cu timpul de retenie al aerului: tM = tR (R = Retenie). Deci, cu alte cuvinte, reprezint timpul scurs de la injectarea (introducerea) probei n coloan i apariia maximului de concentraie n detector, pentru componentul nereinut. Timpul de retenie, tR - o mrime caracteristic pentru fiecare component al amestecului separat de coloan - reprezint timpul scurs de la injectarea probei i apariia maximului de concentraie n detector . Volumul de retenie, VR este volumul de eluent corespunztor timpului de retenie (legat de timpul tR prin intermediul debitului eluentului, Fe): VR = tRFe (1) Timpul de retenie ajustat, tR'- introdus n cromatografie pentru a se putea compara timpii msurai pe coloane diferite, n cazul aceluiai component - este dat de diferena: tR' = tR - tM (2) Corespunztor exist i un volum de retenie ajustat, VR' = VR - VM unde VM este volumul mort; acest volum mort este legat de debitul eluentului coloanei, Fe, prin produsu l: VM = tMFe, i reprezint volumul golurilor din coloan plus volumul tuburilor de legtur de la coloan la detector.

20

3.2. Cromatograme ideale i reale

Aspectul unui pic dintr-o cromatogram ideal este acelai cu curba obinut prin reprezentarea grafic a funciei de distribuie a erorilor (Gauss), a crei expresie, scris n coordonate carteziene x,y este:

unde - o constant - simbolizeaz media distribuiei; n cazul cromatografiei aceasta corespunde chiar timpului de retenie, iar - abaterea standard a distribuiei - tot o constant care reprezint distana pe axa absciselor de la maxim la punctul de inflexiune al curbei de eluie (fig. 1). Valoarea reflect chiar lrgirea picului la trecerea acestuia prin coloan. O expresie i mai simpl a acestei funcii consider c axa ordonatelor trece chiar prin maximul picului (= 0) iar = 1 (ec. 3). Ultima ecuaie este o curb simetric cu un maxim pentru xmax = 0 i ymax = 1/2 = 0.399 care mai are i dou puncte de inflexiune, pentru x = 1 i y = 0.242 adic ~60,6% din valoarea ymax. Limea picului la punctul de inflexiune este 2 pentru ecuaia (3) i evident =1 pentru reprezentarea funciei (4). Prin convenie, n cromatografie w1/2 simbolizeaz limea picului la jumtate din nimea sa i w1/2 = 2.35 iar 2 poart numele de dispersia picului. Limea picului la baz notat w se msoar de fapt la 13.5% din nlime unde n mod riguros w = 4. Picurile reale nu respect ntotdeauna forma gaussian din mai multe motive. Pe de-o parte, coeficientul de distribuie K nu este constant la orice concentraie iar pe alt parte, mai exist i diferene ntre viteza eluentului transversal prin coloan i anume n vecintatea pereilor aceasta este practic zero pe cnd la mijloc este maxim.

21

Fig. 2. Picuri reale a cror apariie se datorete izotermelor de adsorbie;depirea domeniului liniar al coloanei atrage dup sine apariia asimetriilor Formele posibile pentru picuri depind de forma funciei CS = f(CM) adic de izoterma de adsorbie (desigur mecanismul nu este ntotdeauna acesta). Cnd izoterma este liniar (I) avem picuri simetrice. Cnd aceasta este convex (II) sau concav (III) avem picuri asimetrice (fig. 2). Acest asimetrie, ntlnit relativ frecvent, se evalueaz cu un factor de asimetrie (sau de trenaj), Ft. Acest factor se calculeaz prin raportul distanelor, de la dreapta y = xmax la cele dou ramuri, msurat la 10% din nlime, adic: Ft = b/ a n cazul izotermelor convexe Ft > 1 iar n cazul celor concave (III pe fig. 2) Ft < 1 , ultimele fiind extreme de rare.

3.3. Mrimi i ecuaii caracteristice unei coloane Factorul de retenie, RF reprezint raportul, subunitar, dintre vitezele de deplasare prin coloan ale unui component i ale eluentului. Cum vitezele amintite se pot calcula din raportul spaiului parcurs n unitatea de timp, lungimea coloanei fiind notat LCOL, avem conform definiiei:

22

Coeficientul de distribuie, K (sau KD) este o mrime identic celei din extracie (repartiia ntre faze) definit ntotdeauna prin raportul dintre concentraiile componentului n chestiune din fazele staionar, CS, respectiv mobil, CM. Conform definiiei (dup Nernst):

n cazul cromatografiei de adsorbie acesta a fost denumit coeficient de adsorbie, n cazul cromatografiei de schimb ionic (denumit ulterior cromatografie ionic), coeficient de distribuie ionic iar n cadrul cromatografiei de excluziune steric coeficient de difuziune. Factorul de capacitate, k (notat n tratate mai vechi k') se definete ca raportul dintre numrul de moli distribuii ntre fazele: staionar, , respectiv mobil. Numrul de moli din faza staionar pot fi exprimai prin produsul CSVS iar din cea mobil CMVM unde C sau notat concentraiile molare i cu VS respectiv VM s-au notat volumele fazelor staionar respectiv mobil - din coloan, volumul ultimei fiind egal numeric cu volumul mort al coloanei. Ecuaia de definiie pentru k este aadar:

n ultimul timp a primit i denumirea de factor de separare. Acest factor este legat de timpul de retenie, respectiv de cel mort, printr-o ecuaie simpl: tR = tM(1+k) Deci, cu ct factorul de capacitate este mai mare coloana reine mai puternic un component iar timpul de retenie crete. Pe de alt parte din ecuaia anterioar se poate vedea c dac k = 0 atunci tR = tM. Pentru determinarea practic a valorii k se exprim aceast mrime din ecuaia de mai sus, i innd cont de cele amintite anterior, anume: tR' = tR - tM se obine relaia de calcul: 23

k = tR '/tM Retenia relativ, , a mai fost denumit i factorul de separare tocmai pentru c, cu ct valoarea acestuia este mai mare cu att poziia picurilor pe aceiai cromatogram este mai distanat - deci separarea pe coloana respectiv este mai net. S-a constatat c influena variabilelor experimentale este cu mult mai redus dac se utilizeaz pentru exprimarea reteniei aceast retenie relativ. Pentru calculul acesteia trebuie efectuat msurarea, att pentru componentele probei ct i pentru o substan considerat etalon (sau standard) a timpului (sau volumului) de retenie, n condiii absolut identice. De multe ori substana etalon este parte a probei i nu este adugat intenionat. Retenia relativ se poate exprima astfel: 2/1 = tR'/(tR')std = K2/K1 unde K2 i K1 sunt coeficienii de distribuie (vezi expresia K de mai sus) ai substanelor 2 respectiv 1, iar cu 1 s-a notat substana etalon (standard). Substanele recomandate n calitate de substane standard n GC, n vederea calculrii reteniei relative, sunt n - alcanii. Numrul de talere teoretice al coloanei, n. Conform teoriei talerelor migrarea unei substane separate prin coloan se poate descompune teoretic ntr-o succesiune de deplasri prin dreptul a n mici incinte din interiorul coloanei n care au loc echilibre perfecte ntre fazele staionar, din incinte, i cea mobil. Similar cu distilarea pe coloane prevzute cu talere, aceste mici incinte ideale au fost denumite talere teoretice. Lungimea poriunii dintr-o coloan, ce corespunde unei asemenea incinte, pe parcursul creia se realizeaz un echilibru termodinamic, se noteaz cu H i poart numele de nlime echivalent a unui taler teoretic. Aceasta caracterizeaz performana coloanei i se poate calcula din raportul: H = Lcol/N unde cu LCOL s-a notat lungimea coloanei iar cu N numrul de talere teoretice. Cu ct valoarea H este mai mare separarea este mai bun. Numrul n se poate calcula pe baza cromatogramei 24

obinute experimental din limea picului la baz, wb, care dup cum se vede din fig. 1, este de 4 ori valoarea dispersiei curbei gaussiene care modeleaz matematic picul, ceea ce permite scrierea ecuaiei: wb = 4 Valoarea numrului de talere teoretice N constituie de asemenea o msur a eficacittii (totale) a coloanei cromatografice utilizate ntr-o separare sau analiz concret. Pentru un component dat acest numr reprezint patratul raportului dintre timpul de retenie i deviaia standard asociat picului corespunztor: N = tR2/2 La o examinare mai atent acest raport reprezint patratul numrului de picuri ce ar ncpea pe o cromatogram n intervalul corespunztor timpului tR, picurile fiind separate toate doar parial (de exemplu cele cu rezoluia RS = 0.75, aa cum se prezint pe fig. 3a. Se poate observa c, nlocuind din ecuaia (11), avem: N= 16 tR2 / wb Aceeai ecuaie scris n funcie de limea picului la jumtate (w1/2) este: N=5.54 tR2 / w1/22 Se mai poate observa i c, cu ct valoarea n este mai mare, picurile sunt mai nguste (w1/2 scade). Deci, cu ct numrul de talere este mai mare cu att vor "ncpea" mai multe picuri pe aceeai cromatogram. ntruct se pot separa mai multe componente i separarea picurilor, dou cte dou, va fi mai net se consider coloana mai eficient. Cum n timpul mort, tM nu poate iei din coloan nici un component al amestecului injectat, n cromatografie se mai utilizeaz o mrime: numrul efectiv de talere teoretice, Nef,

25

considerat un numr mai apropiat de realitate dect cellalt (N) tocmai pentru c nu se mai ia n calcul timpul mort - practic timpul n care componentul nu se afl nc n coloan:

Din ecuaia (13) se poate scoate wb i prin nlocuire n (15) se poate apoi exprima Nef funcie de numrul de talere teoretice, N:

unde, nlocuind tR din (7) i exprimnd apoi Nef din (16), avem : Nef = Nk2 / (1 + k)2 Rezoluia, simbolizat RS, este mrimea ce exprim gradul de separare a dou componente date de pe o cromatogram. Pentru componentele oarecare A i B aceasta se exprim prin raportul :

unde tR este diferena dintre timpii de retenie ai componentelor B i A adic tR = tR,B - tR,A, iar w1/2 reprezint limea medie a picurilor la baz, w1/2= (wA + wB)/2. Rezoluia mai poate fi exprimat datorit nevoilor practice i n variantele:

26

Pentru dou picuri alturate RS = 1 iar pentru dou picuri complet separate RS = 1.5 (fig. 3). Rezoluia egal cu unitatea reprezint o separare de 98% ntre cele dou picuri. O alt expresie a rezoluiei se poate obine pe baza notaiilor:

care nlocuite n expresia (19) duc la ecuaia:

Aceast exprimare este important pentru c reflect cei trei factori de care depinde rezoluia prin cele trei paranteze (fig. 4), n ordine: prima - eficiena, a doua - selectivitatea, i a treia - capacitatea de separare a coloanei. n ultima ecuaie N se refer la ambele picuri considerate egale ca lime adic N = (NA + NB)/2.

27

Pentru o coloan i un sistem supus separrii date, ncercnd s mrim cantitatea de prob pierdem din rezoluie pentru c depim capacitatea de sorbie (ad- sau absorbie) a coloanei. n general suma dintre cantitatea de prob, eficiena coloanei (sau rezoluia) i viteza de separare este o constant. Considernd valori reduse (unitare) pentru fiecare dintre acestea ne putem imagina poziia noastr, n faa unei probleme de separare, ca pe un punct din interiorul unui triunghi echilateral, cu laturile 1 (redat n fig. 4). Suma paralelelor la cele trei laturi este ntotdeauna 1. Deci ntotdeauna facem un compromis: ca s ctigm n vitez, renunm la rezoluie i la cantitatea de prob sau ca s separm cantiti mari de prob va trebui s sacrificm att rezoluia ct i viteza. n analiza chimic este foarte important mai ales eficiena (proporional cu ptratul rezoluiei). De aceea, se va lucra ntotdeauna cu o cantitate minim de prob i cu viteza optim ncercnd prin modificarea naturii coloanei (compoziia fizico-chimic, lungimea, temperatura, viteza eluentului) sau a compoziiei fazei mobile (doar n LC) s modificm parametrii separrii a dou componente K, N, k i pentru a asigura separarea complet a amestecului de interes practic.

28

4. CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE NALT PERFORMAN (HPLC)

4.1. Introducere Cromatografia de lichide de nalt performan (HPLC) acoper azi, n proporie aproximativ 80%, analiza substanelor moleculare: organice, organo-metalice i anorganice inclusiv compuii foarte polari sau labili termic precum i compuii cu mas molecular ridicat (naturali sau sintetici). De aceea, mpreun cu cromatografia de gaze constituie un punct de sprijin important n analizele chimice moderne. Dei eficacitatea coloanelor nu o egaleaz nc pe cea din GC, prin faptul c se poate modifica, pe lng faza staionar, i faza mobil, cromatografia de lichide (LC) face posibile separri i analize uneori imposibil de realizat prin alte tehnici. Cuplajul cu spectrometria de mas a transformat, n ultimul timp, aceast metod n principalul mijloc de analiza a compuilor moleculari naturali sau sintetici, constituind unul din pilonii pe care se sprijin chimia sintetic actual i pe care s-a dezvoltat biochimia i biotehnologia modern.

Fig.5 . Prezentarea schematic a unui cromatograf de lichide (HPLC) modern

29

Metoda constituie o evoluie a unei metode mai vechi, cromatografia pe coloan clasic, care servea n primul rnd la izolarea preparativ a compuilor naturali. Prin introducerea pompelor i n consecin, lucrndu-se la presiuni tot mai ridicate (200atm), dezvoltarea unor faze staionare performante, de dimensiuni tot mai mici (recent constituite din granule de faze staionare sferice, cu diametre 2-5m), n coloane tot mai scurte (3-10cm) s-a ajuns, ncepnd cu anul 1969, la configuraia actual (fig. 1). Se poate observa c din rezervoarele coninnd unul sau mai muli solveni pompa (sau pompele), alimenteaz coloana cu eluent (de regul un amestec de doi sau mai muli solveni). n imediata vecintate a coloanei se introduce proba, automat, prin intermediul unui ventil cu by pass . n coloana aflat ntr-o etuv termostat, are loc separarea propriu-zis. Efluentul coloanei intr ntr-un detector de unde componentul, dac este separat complet, poate fi colectat i izolat, cu ajutorul unui colector de fraciuni. Semnalul este nregistrat fie cu un nregistrator, fie direct n memoria unui calculator. n esen, un cromatograf analitic HPLC are structura din fig. 6 unde nu s-a mai prezentat colectorul de fraciuni, interesant doar din punct de vedere preparativ. Se poate observa asemnarea cu GC singura deosebire major constituind-o sursa de eluent - pompa.

30

Solvent Pomp Injector Coloan Detector nregistrator Fig. 6. Schema bloc a unui cromatograf HPLC

4.2. Pompe pentru HPLC Pompa este considerat una dintre cele mai importante componente ale HPLC deoarece permite realizarea unui debit constant al eluentului prin ntreg sistemul: injector, coloan, detector mrind deosebit de mult viteza separrii. ntr-un cromatograf de lichide pot exista una sau mai multe pompe, fiecare furniznd o presiune care poate atinge 20mii kPa (cca. 200atm). Presiunea deosebit este necesar deoarece coloana are o umplutur de finee mare i, n lipsa presiunii, debitul ar fi nepractic de mic. Exist n uz dou tipuri principale de pompe, clasificate astfel n funcie de debit: pompe cu presiune constant (i debit variabil) i pompe cu debit constant. Pompele cu presiune constant sunt mai simple (a se citi ieftine) i nu prezint pulsaii n funcionare (care nu ar permite obinerea unei linii de baz netede). Acestea, prezint dezavantajul c debitul trebuie frecvent modificat pentru a se menine ct mai constant, ceea ce la separri de durat pune probleme, deoarece prin obturarea coloanelor debitul se modific continuu. Se nelege c orice modificare de debit (datorit viscozitii sau temperaturii eluentului i a structurii umpluturii) afecteaz timpul de retenie i totodat semnalul detectorilor, n majoritate sensibili la concentraie. Pompele cu debit constant nu mai prezint dezavantajele de mai sus. De-a lungul timpului s-au selecionat dou variante: pompele cu piston (alternative) i pompele de tip sering (cu deplasare pozitiv). La primele, cele mai utilizate, micarea du-te-vino a pistoanelor i a supapelor cu bil permit o funcionare indefinit dar presupun existena unor atenuatoare de pulsaii - dispozitive care s elimine micile variaii de debit. Acestea constau dintr-o alternan de mai multe rezistene, de exemplu tuburi subiri i capaciti - care pot fi incinte cu perei elastici, fie chiar manometre. Pompele cu presiune constant, asemntoare cu o sering dar avnd o capacitate mai mare, pompeaz continuu pe toat durata separrii, pistonul deplasndu-se cu o vitez liniar constant dar dup fiecare curs este necesar oprirea debitului i reumplerea cu solvent a corpului pompei. 31

Dei solvenii utilizai se degazeaz pentru a se reduce efectele corozive ale oxigenului, datorit presiunilor ridicate la care se lucreaz, coroziunea este totui deosebit. De aceea aceste pompe (corpul, cilindrii, garniturile i supapele) se execut din materiale rezistente la coroziune: safir, agat, teflon sau aliaje speciale.

4.3. Sisteme de introducere a probei n cazul HPLC injecia probei trebuie fcut ntr-un timp ct mai scurt, pentru a nu deranja regimul dinamic al eluentului prin coloan i detector. Dificultatea provine de la presiunea ridicat la care lucreaz coloana (20mii kPa). Sistemul cel mai utilizat n cromatografele de lichide este ventilul cu 6 ci, numit i ventil de introducere a probei, prevzut cu bucle interschimbabile (fig. 7).

Fig. 7. Ventilul pentru introducerea probei (cu 6 ci); lucreaz n dou etape:A - alimentarea buclei cu proba; B - dup o rotire cu 60 n sensul acelor de ceasornic,antrenarea probei din bucl n coloan Deoarece eluentul ader la perei, pentru completa ndeprtare a sa n momentul alimentrii buclei cu prob, este necesar injectarea prin bucl a unui volum de cel puin de trei ori volumul acesteia, nainte de comutarea pe analiz. Bucla lucreaz n dou etape. Etapa A (fig. 3-A) n care bucla este umplut cu prob cu ajutorul unei seringi sau n alt mod. Apoi are loc comutarea pe analiz (fig. 3-B) cnd prin rotire cu 60, n direcia acelor de ceasornic, manual 32

sau automat, bucla este parcurs de eluentul de la pomp i coninutul acesteia este antrenat n coloan. Volumul probelor pentru coloane obinuite (25cmx4.6mm) este de 10- 50l. Evident aceste ventile sunt confecionate din materiale rezistente la coroziune i la solveni (oel inoxidabil, tantal, teflon etc).

4.4. Coloanele n LC Locul n care se petrece separarea propriu-zis i - n funcie de calitatea acesteia se mrete sau micoreaz raportul semnal/zgomot, este coloana cromatografic. Dei muli autori denumesc coloana piesa cea mai important dintr-un cromatograf, acesta din urm, fiind format dintr-o serie de componente, rezult c fiecare compartiment n parte, contribuie separat la obinerea rezultatului analitic. Pentru un practician din domeniul LC ns, locul unde acesta intervine efectiv i unde se concepe logic separarea este ntr-adevr coloana.

Corpul coloanei i mecanisme de separare Materialul din care se confecioneaz corpul coloanei n LC trebuie s asigure acesteia rezistena mecanic adecvat presiunilor nalte (20mii kPa) precum i rezistena la coroziune fa de faza mobil. n majoritatea cazurilor a fost preferat oelul inoxidabil 316 lucios. Acesta rezist la majoritatea solvenilor, excepie fcnd doar srurile halogenilor, n special n soluie puternic acid. Alte alternative o constituie coloanele compozite: sticl sau plastic n interior - oel inoxidabil sau material plastic n exterior.

Fig. 8. Aspectul coloanelor din LC: coloan analitic (stnga), semipreparativ (dreapta) Din punctul de vedere al geometriei (fig. 8), aceste coloane sunt cilindrice, iar dimensiunile depind, n primul rnd, de dimensiunea granulelor i porozitatea umpluturii. Astfel diametrul coloanelor variaz ntre 0.3-5cm iar lungimea poate fi ntre 3-25cm. Pentru scopuri preparative, n cazul unor componente necunoscute, se utilizeaz chiar diametre mai mari. Cu ct 33

umplutura este mai fin, cu att coloana este mai scurt. Pentru a se reine eventualele impuriti sau componeni care nu pot prsi coloana (fiind reinui practice ireversibil) se folosesc adesea precoloane care, fiind de dimensiuni mai mici (acelai diametru i lungimi de 0.4-1cm), pot fi nlocuite mai des, evitndu-se astfel scoaterea prematur din funcie a coloanei principale. Pentru a nu fi antrenat faza staionar n afara coloanei, aceasta este blocat la capete de dou discuri metalice, poroase, avnd diametrul porilor ntre 0.5- 10m. De asemenea pentru a nu se lrgi prea mult prin coloan zona cromatografic (cu diluarea ce are loc simultan), tot volumul mort ale acesteia (goluri n coloan, tubul de aduciune de la injector, tubul de evacuare spre detector) trebuie redus la minim. Se cunosc pn n prezent mai multe mecanisme de separare prin coloane, care depind mult de fazele mobil i staionar. Mai exact, depind de natura fenomenului fizico-chimic pe care se bazeaz retenia difereniat i separarea. Metodele LC (HPLC) se pot clasifica, dup mecanismele principale amintite, astfel: cromatografie de adsorbie, cromatografie de repartiie, cromatografie ionic, cromatografie de excluziune steric. Se disting dou moduri de realizare a cromatografiei de repartiie: Cromatografie de repartiie direct (sau cu faze normale - clasic); Cromatografia de repartiie cu faze inversate - metoda preferat n zilele noastre - pe care se realizeaz cele mai numeroase separri. n primul caz faza staionar este format dintr-un lichid polar iar faza mobil dintr - un solvent organic nepolar iar n al doilea, situaia se inverseaz: lichidul imobil este nepolar iar faza mobil este un amestec de solveni polari. De exemplu, una dintre cele mai rspndite faze inversate este cea staionar - silicagel, iar cea mobil - un amestec ap, metanol, acrilonitril (sau tetrahidrofuran). O separare reuit pe o astfel de faz este prezentat n fig. 9.

34

Fig. 9. Separarea unor pesticide prin HPLC Cromatografia ionic (IC) are mai multe variante. Cea mai frecvent ntlnit astzi folosete n calitate de faz mobil solveni apoi diluai de electrolii iar ca faz staionar schimbtori de ioni. Metoda va fi descris ntr-un capitol separat datorit implicaiilor actuale n analizele de ape legate de protecia mediului. O alt variant denumit cromatografie prin perechi de ioni folosete faze staionare capabile s fixeze anumii ioni care fixeaz ioni de semn contrar (perechi de ioni). Acest mecanism se prefer n cazul substanelor ionice sau ionizabile. n fine, mai exist cromatografia de afinitate, o variant considerat uneori un mecanism separat, se bazeaz pe afinitatea extrem de specific a unor molecule cu alte molecule fixate pe suport. Dei este vorba de interaciuni coordinative sau alte afiniti de natur biochimic dintre suport i componentele de separat mecanismul poate fi asemnat cu adsorbia sau chiar cu schimbul ionic dar mult mai specific. Suportul este materialul pe care ligandul este fixat (ideal este ca acesta s fie rigid, stabil i s aib o suprafa mare). De exemplu agarul este cel mai cunoscut suport, de asemenea se mai folosete celuloza, dextranul i poliacrilamida. Ligandul este fixat pe gelul de agaroz fiind un polimer al D-galactozei i al 3,6-anhidro-Lgalactozei i poate fi folosit la o presiune de 1atm i ntr-un interval de pH de la 4 la 9. Avnduse n vedere complexitatea problemei i diversitatea acestor perechi de faze mobile i staionare, vom limita n cele ce urmeaz discuia doar la cele mai utilizate dintre acestea pentru domeniul 35

analizei poluanilor mediului. n funcie de componentele de separat i tipul de mecanism preferat, faza mobil se alege folosind schema din fig. 10.

Fig 10 Tipurile de mecanisme de separare cunoscute n LC

Faza staionar Silicagelul (SiO2) este considerat materialul cel mai important utilizat ca faz staionar. Acesta a devenit, n ultimii 20 de ani, doar suportul adevratelor faze fazele chimic legate - ceea ce nu schimb importana sa. Silicagelul s-a obinut la nceput n form granular, neregulat, apoi n form sferic (fig. 11).

36

Indiferent de form, granulaia trebuie s fie uniform (se elimin partea fin) pentru c astfel caracteristicile curgerii eluentului sunt mult mbuntite. Obinerea silicagelului sferic se face plecnd de la soluii coninnd silicat de sodiu dar i ali compui hidrolizabili ai siliciului (tetraclorur de siliciu, silicat de etil etc.). De la acetia, printro reacie cu apa urmat de o pulverizare i apoi de o sinterizare, procese vizibile pe fig. 12, se obin granule cu aspect sferic.

37

Puritatea sa avansat este o condiie a bunei funcionri a materialului n LC deoarece prezena unor ioni metalici modific structura determinnd apariia unor centre de adsorbie puternice i de aici apariia unor cozi ale picurilor. Silicagelul are o structur tridimensional cu o reea de baz, tridimensional, format din legturi Si-O-Si iar pe suprafaa porilor sau cea exterioar mai prezint grupe silanol, Si-OH. Punile de oxigen apar ntre atomii de siliciu cu ocazia polimerizrii acidului silicic, Si(OH)4. n ultimul timp a mai aprut un tip de faz staionar cu performane ridicate. Este vorba de coloanele monolit, realizate din aceleai materii prime i printr-o tehnologie asemntoare din punct de vedere chimic cu cea din fig. 12. Coloana este format direct n tubul rigid (metalic), de unde i numele. Aceasta nu mai are granule dup cum se poate observa din fig 13. Prin noua tehnologie, s-au obinut coloane cu performane superioare fa de cele umplute cu granule.

38

Exist trei tipuri de grupe silanol superficiale I- legate, II- reactive i III- libere (v. fig. 14) cu tria relativ I < III < II. n funcie de tehnologia de obinere difer i porozitatea intern, suprafaa specific, rezistena la compresiune i polaritatea. Silicagelul este considerat, n general, un material puternic polar. Grupele funcionale de pe suprafa au un caracter acid (pKa pentru grupele silanol este similar fenolului). Pentru a se reduce cozile picurilor pe care le dau centrele de adsorbie puternice, silicagelul se poate dezactiva, de exemplu prin adaos controlat de ap (3-8% ap). Cteva mrci de silicagel comercial sunt prezentate n tabelul 2.

Se poate observa c suprafaa specific scade cu creterea diametrului porilor iar pHul acestora se situeaz n domeniul 5.4-8.4. Ali adsorbeni mult mai puin utilizai sunt alumina, oxidul de zirconiu, crbunele macroporos, polimerii poroi (de ex. spuma poliuretanic). Fazele 39

staionare chimic legate au aprut n urma ncercrilor mai puin eficace de utilizare a unor faze staionare lichide depuse pe un suport poros solid - permeabil pentru eluent (a fost preferat kieselgur-ul sau pmntul diatomitic - n esen tot SiO2 dar cu pori mari i o suprafa mult mai mic. Deoarece n toate aceste ncercri faza staionar era splat de pe suport de ctre eluentul n micare i n felul acesta deranja funcionarea detectorului, s-a recurs la soluia crerii unor faze care s fie fixate prin legturi chimice - mult mai puternice dect cele fizice. Aspectul unei faze staionare chimic legate poate fi imaginat ca n fig. 8, adic catenele legate alctuiesc o adevrat pdure de molecule care se comport fizic asemntor unui strat subire, aderent la suport (imposibil de dizolvat) dar cu o valoare a factorului de capacitate k mai favorabil. Dac gruprile silanol Si-OH de pe suprafaa silicagelului sunt puse n situaia de a reaciona cu anumii derivai organometalici, se poate realiza sinteza unor faze chimic legate. Cele mai stabile legturi sunt cele care au la baz apariia structurilor legate prin intermediul unei puni: Si-O-Si. Obinerea acestora se realizeaz prin reacii de condensare la care particip grupele silanol - superficiale, efectuate n prezena unor clorsilani. Un exemplu este reacia: SiOH + ClSi(CH3)2R -HCl Si-O-Si(CH3)2-R unde cel mai frecvent R = C8H17 sau C18H37. Prin astfel de reacii (astzi se cunosc mai multe variante) suprafaa silicagelului se acoper cu un strat monomolecular de dimetil-alchilsiloxan nepolar. Pentru se mri i mai mult stabilitatea s-a recurs la soluia legrii radicalului de hidrocarbur R prin intermediul mai multor legturi cu suprafaa silicagelului. Stratul de hidrocarbur grefat de suport se comport ca un strat foarte subire, uniform, de lichid nepolar dar mult mai stabil. Aceste faze stau la baza cromatografiei cu faze inversate. Polaritatea acestor faze se poate regla prin legarea n cadrul unor catene laterale ale radicalului de hidrocarbur R, de exemplu a unor funciuni aminopropil, cianopropil, benzil, crendu-se astfel o mare diversitate de faze staionare.

40

Faza mobil Faza mobil sau eluentul n LC nu reprezint un mediu inert ca gazul purttor din GC. De aceea alegerea fazei mobile se face aici n perfect concordan cu faza staionar. Astfel faza mobil difer destul de mult n funcie de tipul interaciunilor componentelor separate cu faza staionar din coloan. Singurele caracteristici generale sunt urmtoarele: (1) faza mobil trebuie s aib o viscozitate cobort, (2) aceasta trebuie s dizolve bine componentele, (3) nu trebuie s afecteze funcionarea coloanei (4) trebuie s permit funcionarea detectorului. Unii elueni provoac migrarea unui anumit component mai repede prin coloan. Se spune c acetia au o trie relativ mai mare sau, altfel spus, au o putere de eluie mai ridicat. Aceast denumire provine de la faptul c factorul de capacitate, k, este mai mare i de aceea componentul migreaz mai repede. Dar totul depinde de trio-ul component faz mobil - faz staionar. Astfel, pe o faz staionar polar, folosind o faz mobil nepolar, se vorbete de cromatografie de repartiie normal (sau cu faze directe). Din contr, pe o faz staionar nepolar utilizndu-se o faz mobil polar se vorbete de cromatografie de repartiie cu faze inverse (sau inversate). n acest ultim caz au devenit uzuale fazele mobile formate din amestecuri metanol - ap care n cromatografia de repartiie sunt considerate printre fazele mobile mai puin tari.

41

Pe o faz staionar polar, amestecul metanol-ap face parte dintre cei mai tari elueni cunoscui. n tabelul 3 se prezint civa dintre cei mai ntlnii solveni i ordinea n care crete tria lor relativ, n cele dou tipuri de cromatografie de repartiie. n cromatografia ionic (IC) se folosesc soluii diluate de electrolii ca: NaOH, NaHCO3, HCl, iar n cea de excluziune steric solveni simpli - evident compatibili cu polimerii, separai unii de alii dup dimensiuni. O alt cale de mbuntire a separrilor existent n LC (cale inexistent n GC) este folosirea gradienilor de eluie. De exemplu, n GC, prin modificarea eluentului gazos nu se constat nici o mbuntire a calitii separrii, n sensul mririi selectivitii. n HPLC, din contr, solventul are o contribuie important n procesul de separare, dar nu trebuie neglijat importana decisiv a cuplului faz mobil - faz staionar. Dei unii compui sunt reinui slab prin coloan, ieind destul de repede, cei reinui puternic ies din coloan dup un timp cteodat nepractic de lung, lucru care determin diluarea n eluent a componentul n urma parcurgerii coloanei, aceasta micorndu-se calitatea analizei. De aceea s-a recurs la introducerea treptat peste primul solvent (eluent), a unui al doilea solvent mai tare sau a celui de-al treilea, ceea ce n limbajul de specialitate se numete gradient de eluie (sau de concentraie). La ora actual soluia la care s-a recurs n practic const, n general, dintr-un sistem de ventile electromagnetice care permite intrarea solvenilor n aceeai pomp, prin intermediul unei camere de amestecare aflate la joas presiune. Este posibil i un alt montaj n care fiecare solvent are pompa proprie, comandat de un dispozitiv de control al debitului. Aceti solveni intr n camera de amestec i de aici n coloan. Gradienii de faz mobil pot fi foarte diferii n practic dar formele principale sunt cele descrise n fig. 12.

42

4.5. Detectori Tehnica HPLC s-a dezvoltat o dat cu perfecionarea detectorilor. Am amintit c detectorii n cromatografie sunt instrumente analitice specializate, situate la ieirea eluentului dintr-o coloan i care pot nregistra continuu substanele separate de ctre aceasta. Deci detectorii constituie acea parte a instrumentaiei care permite s se observe modul cum decurge separarea prin coloan fr a se vedea componenii propriu zii ci doar semnalul lor. ntruct coloanele de separare performante au capaciti de ncrcare mici, sistemul de detecie trebuie s fie unul foarte sensibil. Totodat, pentru c n LC volumul de prob este de ordinul microlitrilor (8-10l), volumul detectorilor trebuie s fie de volum apropiat pentru a se putea sesiza n mod continuu picul cromatografic. n calitate de instrumente se poate utiliza, n principiu, oricare dispozitiv de analiz chimic cunoscut, pentru probe lichide, precum i orice combinaii de instrumente fizice. De exemplu, n ultimul timp, combinaia dintre un detector refractometric i unul bazat pe difuzia luminii este extrem de eficace n analiza polimerilor n amestec cu monomeri sau oligomeri dintr-un material. Exist chiar posibilitatea creterii sensibilitii deteciei printr-o reacie chimic n urma adugrii, cu un debit controlat, a unui reactiv potrivit. Tehnica se numete derivatizare i se poate practica chiar nainte de introducerea probei n coloan, dar i dup ieirea din coloan a componentelor separate. Metoda a fost utilizat pn n prezent n special 43

legat de metodele spectrofotometrice (colorimetrice) sau fluorimetrice i mai ales pentru analiza unor amestecuri de compui numeroi avnd aceleai funciuni reactive (de exemplu aminoacizi). Caracteristicile detectorilor sunt asemntoare cu ale celorlalte instrumente analitice i oarecum similare cu cele descrise la metoda GC.

Detectori spectrofotometrici n UV-VIS Acest grup de detectori sunt cei mai folosii detectori pn n prezent, att n LC, ct i n HPLC. Pentru a putea fi utilizai, compuii separai cromatografic trebuie s fie colorai - adic s absoarb lumina pe domeniul de lungimi de und al detectorului. Pe de alt parte, eluentul trebuie s fie practic transparent pentru acelai domeniu spectral. Legea fizic pe baza creia funcioneaz aceti detectori a fost prezentat - este vorba de legea Lambert-Beer (A = lC). Deci unitile vor fi uniti de absorban, adimensionale. De aceea limita de detecie sau zgomotul de fond se prezint n cazul acestor detectori n AUFS (prescurtare de la Absorbance Units Full Scale = uniti de absorban raportate la ntreaga scal). Astfel n cadrul instrumentelor actuale sensibilitatea este de 0,001 AUFS cu zgomotul de fond de 1%. Motivul principal al popularitii acestor detectori este acela c numeroasele substane organice, anume cele care conin legturi duble (electroni ), respectiv au grefate funciuni organice cu electroni neparticipani, absorb lumina n UV-VIS. Este vorba de toate hidrocarburile olefinice i aromatice precum i derivaii tuturor hidrocarburilor cu diferite funciuni organice (=C=O, =C=S, -N-O, -N=N-, -NH2). ntre acestea se includ i numeroasele combinaii de interes biologic ca enzime, acizi nucleici etc. Un mare avantaj al acestor detectori este faptul c sunt insensibili la micile variaii de debit i temperatur. Celula de detecie face parte dintr-un spectrofotometru i are un volum extrem de mic, de 8-10l, respectiv un diametru interior de 1mm la o lungime a celulei de10 mm. Construcia acestora este ilustrat n fig. 13.

44

Se pot distinge i n cazul acestei clase de detectori mai multe tipuri de detectori. Detectorii monocromatici au fost primii utilizai, fiind mai ieftini deoarece lucreaz doar la o lungime de und. Modelul cel mai rspndit se compune dintr-o surs luminoas cu deuteriu sau cu vapori de mercur, un monocromator care separ un domeniu ngust (de ex. linia 254nm a mercurului) i un detector. Schema bloc a unui astfel de detector este prezentat n fig. 14. SursMonocromatorCelulnregistrator Fig. 14. Schema bloc a unui detector HPLC spectrofotometric Detectorii policromatici mai frecvent utilizai n cromatografele HPLC moderne permit i selectarea lungimii de und la care se lucreaz, dar chiar pot nregistra electronic absorbana celulei la mai multe lungimi de und simultan. Acest mod de lucru d o mai mare siguran analizei, n sensul c permite stabilirea puritii, adic dac picul constituie un semnal dat de o singur substan sau de un amestec (ceea ce se cunoate sub numele de stabilirea puritii picului). Aceti detectori conin celula amintit montat ntr-un spectrofotometru cu reea de diode.

45

Detectori refractometrici Detectorii refractometrici, au la baz legile refraciei luminii. Principiul de funcionare al acestor detectori are la baz legea lui Fresnel - de transmitere a luminii prin medii transparente avnd un indicele de refracie dat. Astfel, un fascicul luminos (mono sau policomponent) trece printr-o celul cu dou compartimente unul coninnd doar eluentul pur iar cellalt faza mobil care prsete coloana (fig. 15).

Diferena dintre indicii de refracie pentru soluiile aflate n cele dou compartimente vor fi practic nule, atta timp ct din coloan iese doar eluentul pur, dar diferit n momentul n care n eluent mai apare un component separat - antrenat de ctre eluent din coloan. n momentul ieirii unui component are loc o deplasare a poziiei fascicolului emergent din detector deplasare care este proporional cu concentraia i sesizat de ctre detectorul D. n cazul acestui tip de detector sunt posibile i picuri negative, ceea ce face necesar aducerea liniei de baz la jumtatea scalei lucru care, pe lng sensibilitatea relativ cobort (10-5molL-1), constituie un dezavantaj. Acest detector este universal, dar nu poate fi utilizat n cromatografia cu gradieni deoarece, n acest caz, compoziia eluentului la intrarea n coloan difer de cea de 46

la ieire i se modific continuu, neexistnd o linie de baz. De asemenea fenomenul este foarte sensibil la temperatur (0.0001C) fiind necesar termostatarea, att a detectorului ct i a coloanei.

Detectorii conductometrici Acest tip de detectori se utilizeaz cu precdere n cromatografia pe schimbtori de ioni i sunt sensibili la ioni anorganici sau organici inclusiv acizi organici. Sunt aadar detectori specifici. Sunt suficient de sensibili (500pg-1ng). Principiul de funcionare este descris schematic n fig. 16. Tehnic este vorba de o celul miniaturizat cu totul analog unei celule conductometrice.

Pe lng cei amintii, mai rspndii, n practica analitic se mai ntlnesc i ali detectori prezentai schematic n tabelul 4. Dintre acetia o meniune special trebuie fcut pentru cei bazai pe spectrometria de mas i FT-IR , care au permis determinri calitative uneori imposibil de realizat prin alte variante de detecie n lipsa etaloanelor cunoscute.

47

Aceti detectori permit ca, pe baza unei baze de date format din spectre cunoscute, s se obin compuii cei mai apropiai (3 dintre acetia), din toate substanele chimice cunoscute, care ar putea fi prezeni n prob.

48

5. APLICATII ALE HPLC IN ANALIZA ALIMENTELOR

Dezvoltarea i modernizarea economic a rii noastre, integrarea ei n circuitul european i mondial de valori materiale, impun acordarea unei atenii speciale calitilor produselor, care trebuie s fie competitive i s ndeplineasc condiiile de calitate cerute de acest circuit. Calitatea alimentelor este o entitate deosebit de complex deoarece, spre deosebire de cea a altor produse industriale, ea are un cuprins mult mai larg i efecte mult mai profunde. Dac pentru majoritatea produselor industriale, calitatea se caracterizeaz printr-o nsuire sau grup de nsuiri fizice i chimice bine definite, n cazul produselor alimentare calitatea nglobeaz caracteristici senzoriale, fizicochimice, biochimice, microbiologice i toxicologice. Trebuie evideniat faptul c alimentul, prin calitatea sa, are implicaii profunde asupra vieii deoarece alimentele reprezint un factor esenial al proceselor metabolice i echilibrului organismului. Realiznd produse pentru colectiviti mari, productorii de alimente sunt responsabili de starea de sntate a consumatorilor, participnd la una din cele mai eficiente ci de ocrotire i promovare a sntii. Ca urmare, producia de alimente trebuie s fie sub imperiul a trei mari cerine: s posede caliti igienice; s posede caliti nutriionale; s posede caliti senzoriale. Aceste cerine impun un permanent control prin utilizarea unor metode complexe i performante care s permit obinerea unor date certe i reproductibile. Problemele recente legate de mbolnvirile cauzate de consumul de alimente, ca cele privitor la dioxin, metale grele, acrilamid, encefalopatie spongiforma bovin, au sczut ncrederea consumatorilor n unele alimente. Pentru a rectiga ncrederea acestora, organismele legislative i productorii de alimente au nceput s pun caracteristicile legate de inocuitatea alimentelor naintea celor referitoare la caliti senzoriale i nutriionale. Noua abordare, denumit generic sigurana alimentelor, se refer la msurile de protecie a alimentelor fa de hazarduri microbiene, chimice i fizice care ar putea apare de-a lungul ntregului lan alimentar i

49

care ar pune n pericol sntatea consumatorilor. Cu alte cuvinte, msurile de siguran alimentar protejeaz calitatea produselor alimentare. Prin urmare, orientarea actual a consumatorilor din rile dezvoltate este ctre alimentele sigure, care, n plus, prin coninutul de compui bioactivi, s garanteze starea de sntate (alimente funcionale). n acest context, calitile senzoriale ale alimentelor au devenit un criteriu de selecie secundar pentru consumator, fr s i piard, ns, semnificaia economic pentru productori. Calitile senzoriale ale produselor alimentare obinute la nivel industrial nu pot fi asigurate i pstrate un timp ct mai lung dect utiliznd o gam larg de aditivi. Acetia sunt fie compui naturali, fie de sintez, a cror adugare n alimente este strict reglementat i a cror siguran este reevaluat periodic pe baza noilor informaii tiinifice. De aceea, utilizarea aditivilor admii i respectarea dozelor permise de aditivi este o condiie esenial pentru meninerea sntii consumatorilor, motiv pentru care este necesar urmrirea tipurilor de aditivi folosii i a nivelurilor acestora . Cromatografia de lichide de nalt performan (HPLC) este o tehnic de laborator foarte utilizat, fiind introdus ca metod sigura de control a produselor alimentare n legislaia mai multor state. Dozarea diversilor compui din alimente implic tehnici preparative, separarea cromatografic i detectia (pe baza indicelui de refractie, prin spectroscopie UV/VIS, fluorimetric, conductometric etc.) Au fost stabilite proceduri pentru numeroase clase de compui organici. n prezent se folosete pentru: identificarea i dozarea glucidelor. Prin metoda HPLC se pot determina simultan monoglucide (glucoz, fructoz etc.), diglucide (zaharoz, maltoz etc.), precum i oligozaharuri. Astfel, determinarea simultan a glucozei, fructozei i zaharozei permite detectarea adugrii ilegale de zahr invertit n produsele alimentare. Metoda poate fi folosit pentru determinarea lactozei din laptele praf degresat, astfel putndu-se evalua indirect coninutul de grsime. Se folosete la determinarea rafinozei i stahiozei, prezena lor indicnd adugarea de fin de soia n preparatele de carne. Determinarea prezenei unor oligozaharuri permite selectarea surselor de compui cu proprieti prebiotice necesari dezvoltrii unei game importante i interesante de alimente funcionale i anume probioticele. determinarea compoziional a lipidelor. Prin aceast metod se poate determina natura i cantitatea procentual de acizi grai saturai i nesaturai din uleiuri sau grsimi. De asemenea, analiza cromatografic este util pentru determinarea coninutului de acid linoleic 50

conjugat (CLA) n produsele de origine animal (carne de vit, lapte, unt ). Acidul linoleic conjugat este n ultimul timp n atenia nutriionitilor datorit proprietilor sale benefice n bolile cardiovasculare, maligne, n stimularea sistemului imunitar. compoziia n aminoacizi. Tehnica HPLC este cea mai bun metod de separare a aminoacizilor din alimente i, n special, a aminoacizilor eseniali. Investigarea prezenei i proporiei aminoacizilor eseniali este obligatorie pentru evaluarea calitilor nutriionale ale proteinelor din diverse alimente mai ales, ale proteinelor din alimentele obinute prin utilizarea unor proteine de diferite caliti (ex. introducerea derivatelor proteice din soia, sau a crnii dezosate mecanic MDM - n preparatele de carne.). Totodat, folosind HPLC se poate determina autenticitatea i tipul unor proteine. Astfel, concentraia i proporia relativ a aminoacizilor sunt dou criterii dup care se poate identifica tipul de protein dintr-un preparat de carne. Aceast determinare se bazeaz pe faptul c exist mici variaii ale cantitilor de Laminoacizi din diverse surse proteice. determinarea tipului si cantitatii de proteine, a diferitelor peptide dozarea vitaminelor: hidrosolubile i liposolubile, alte substante cu actiune vitaminica alte tipuri de substane. HPLC este o tehnic util pentru determinarea componenilor minori i a metaboliilor. Se pot determina: coloranii din sucurile de fructe sau vin, diacetilul din unt, flavonoidele din sucurile de fructe, antioxidanii din vegetale etc. Tehnicile spectrofotometrice sunt indispensabile pentru dozarea compuilor care absorb n UV (antioxidani, vitamine, aminoacizi aromatici, acizi nucleici, nucleotide etc.). Pe baza indicilor de refracie se detecteaz glucide (xiloz, fructoz, glucoz, manoz, zaharoz, maltoz, lactoz, maltotrioz etc), acizi organici (citric, tartric, malic, lactic, acetic etc.), metanol, etanol etc.

51

6. CRITERIILE DE EVALUARE A METODEI HPLC

6.1. Domeniul de aplicabilitate Pentru o analiz cantitativ domeniul de aplicabilitate (intervalul cuprins ntre minimul i maximul de concentraie de analit) se stabilete prin examinarea mai multor probe de concentraii diferite i determinarea concentraiilor cu incertitudini acceptabile. 6.2. Linearitatea Domeniul de liniaritate, utilizat pentru realizarea curbei de calibrare, este, n general, mai restrns dect acela de aplicabilitate. Dependena semnalului analitic de concentraie se consider satisfctoare, din punct de vedere al liniaritii, pentru o valoare a coeficientului de regresie liniar, r 0.99. Un coefficient de regersie liniar sub aceast valoare implic utilizarea unui standard suplimentar. 6.3. Limita de detecie (LOD) Limita de detecie reprezint cea mai mic valoare a concentraiei de analit din prob ce poate fi determinata distinctiv fat de blank. LOD este acea concentraia a analitului pentru care semnalul analitic este de 2 sau 3 ori mai mare dect rspunsul blank-ului. 52

n cazul detectorului UV este dificil de stabilit cu caracter de permanen LOD datorit scderii graduale a sensibilitii odat uzarea lmpii UV. 6.4. Limita de cuantificare (LOQ) Limita de cuantificare este cea mai joas concentraie dintr-o prob msurat cu precizie i exactitate n limit acceptabil i distinct fa de blank. LOQ poate fi obinut prin extrapolare din curba de calibrarea sau poate fi considerat standardul cu concentraia cea mai joasa de pe curb (excluznd blank-ul). O alt posibilitate ar fi aceea de a considera LOQ ca fiind de 5, 6 sau 10 ori deviaia standard a valorii msurate pentru blank, dar poate fi afectat de sensibilitatea diferit a fiecrui detector. Pentru stabilirea LOQ cu o ct mai bun precizie se recomand evaluarea repetabilitii msurtorii acestei concentraii 6.5. Exactitatea Exactitatea este acel parametru care exprim deviaia ntre dou rezultate ale unor ncercri independente. Exist dou modaliti de exprimare a exactitii:

Repetabilitatea reprezint precizia msurtorilor realizate n aceleai condiii analitice (acelai analist, acelai echipament, perioad scurt de timp) Reproductibilitatea este msura preciziei metodei cnd se variaz una sau mai multe din condiiile analitice (analist diferit, echipament diferit, perioada lung de timp)

Aceste dou caracteristici se exprim cantitativ sub forma unui coeficient de variaie sau ca deviaie standard relativ procentual (abaterea fa de valoarea medie). Determinarea repetabilitii const n mai multe msurtori pentru aceeai prob realizate de acelai analist utiliznd acelai echipament. Se recomand un minim de 10 msurtori (3 probe de concentraii diferite, c1, respectiv c1 20 %). 6.6. Robusteea

53

Utilizarea metodei n dou laboratoare diferite presupune, inevitabil, mici variaii n condiiile analitice, ce pot influena performana metodei. Robusteea reprezint capacitatea metodei de a rmne insensibil la micile variaii ale parametrilor de lucru. Aceast caracteristic se obine introducnd n mod deliberat mici modificri ale condiiilor analitice i examinnd consecinele.

7. BIBLIOGRAFIE

1.Compendiu de Lucrri Practice: Metode fizico-chimice de analiz, Ed. Lumina, Chiinu, 1993. 2. Engineering Statistics Handbook, disponibil pe Internet la site-ul: http://www.itl.nist.gov.div989/handbook/ 3. C. Luca, Al. Duca, Al. Crian, Chimie Analitic i Analiz Instrumental, EDP, Bucureti, 1983. 4.S. Gocan, Cromatografie de nalt Performan, p. II-a, Cromatografia de Lichide pe Coloan, Ed. Risoprint, Cluj-Napoca, 2002. 5. http://en.wikipedia.org/wiki/HPLC 6.http://www.waters.com/WatersDivision/ContentD.asp?watersit=JDRS- 5LTGBH&WT.svl=1 7.http://www.chromatography-online.org

54