PRACTICA NO.

2 VIABILIDAD DE GAMETOS
INTRODUCCIN El semen es un fluido biolgico que est constituido por espermatozoides y por una fase lquida denominada lquido seminal. El anlisis de las caractersticas fisicoqumicas del lquido seminal, y de las caractersticas numricas, estructurales y funcionales, de los espermatozoides se realiza mediante una metodologa de laboratorio denominada espermatobioscopia que desarrollaremos en esta prctica. Los espermatozoides se encuentran en valores de aproximadamente 5% del total del semen (espermatocrito), son clulas altamente especializadas cuya estructura (Fig. 1) cuya estructura se encuentra constituida por: a) Cabeza compuesta por el sistema acrosmico (caperuza y casquete) y ncleo, b) Cuello formado por el centrolo proximal, c) Cuerpo o pieza intermedia donde se encuentran organizadas las mitocondrias y d) Cola o flagelo que le confiere movilidad; en humano mide entre 50 a 60 m de longitud pero el dimetro mximo en la cabeza es de aproximadamente 3 m. Los espermatozoides se producen en los testculos los cuales son glndulas mixtas, pares situadas generalmente en la regin dorsal del abdomen en la mayora de los vertebrados e incluso en muchos invertebrados salvo en mamferos, en los cuales se encuentran en la bolsa escrotal ya que en stos animales la temperatura de espermatognesis es menor, p. ej. en humano es de 350C. Los espermatozoides se producen especficamente en los tbulos seminferos mediante el proceso de espermatognesis (Fig. 2), que inicia en la pubertad bajo el influjo de las gonadotropinas y de la testosterona con la proliferacin de las espermatogonias de tipo A que por mitosis formarn un 50% de espermatogonias A y 50 % de espermatogonias B las cuales se dividen por mitosis para formar dos espermatocitos primarios (primera divisin mittica) que a su vez despus de una breve interfase forman a los espermatocitos secundarios (segunda divisin mittica), para dar origen a las espermtidas que por un proceso de maduracin llamado Espermiognesis (Fig. 3) formarn finalmente al espermatozoide maduro estructuralmente.

El lquido seminal es producido por diferentes estructuras del sistema reproductor masculino (Fig. 4) entre las que se encuentran a) El epiddimo y las glndulas de Cowper, b) Las vesculas seminales y c) La prstata. El epiddimo (Fig. 4) contribuye con un escaso volumen a la produccin de lquido seminal bsicamente su funcin es la de almacenar a los espermatozoides (ms o menos 21 das) y madurarlos funcionalmente para que adquieran movilidad bajo influjo de la testosterona, aunque en todo el trayecto de las vas espermticas no desarrollan movilidad activa por el pH cido (6.5%) y por bajas concentraciones de oxgeno. Las glndulas de Cowper o bulbo uretrales o de Littr son 2 pequeas glndulas situadas a los lados de la porcin final de la uretra membranosa, con forma de pequeas hojas redondeadas (semejantes a lentejas), producen un lquido mucoso transparente rico en glucoprotenas, cido glucornico, cido silico, galactosa y galactosamina entre otras substancias; su funcin es lubricar al conducto uretral durante el acto sexual. Las vesculas seminales (Fig. 5): Son glndulas msculo membranosas pares que en humano miden de 5 a 7 cm de longitud, de 1.5 a 3 cm de ancho y de 5 a 10 cm3 de capacidad variable de acuerdo a la actividad sexual y la edad, su conducto de desembocadura se une al conducto deferente para formar el conducto eyaculador que se introduce en la prstata. Las vesculas seminales producen una secrecin constante amarilla viscosa con un pH cercano a 7 conteniendo una gran cantidad de substancias (Cuadro 1) con diferentes funciones y constituyen aproximadamente el 20% del total del lquido seminal. La prstata (Fig. 6) es la glndula accesoria del sistema reproductor masculino ms importante por su tamao y secrecin; es impar, en humano est situada en la cavidad plvica, tiene forma de una castaa y sus dimensiones son: 3 cm de longitud, 4 cm de ancho y 2 cm de grosor, con un peso de 20 a 25 g. La prstata tiene dos tipos de secrecin una que inicia durante la pubertad,

con un volumen de 0.5 a 2 mL por da, conocida como secrecin de reposo que se elimina de manera imperceptible durante la miccin; la otra se produce por un estmulo parasimptico durante la eyaculacin en valores de 3 a 5 mL, siendo un lquido con un pH aproximado a 7.5, es opalescente, viscoso y contiene fofatasa cida as como otras substancias (Cuadro 1 ). La prstata produce del 80% al 85% de agua del lquido seminal, contribuyendo a formar el medio de transporte de los espermatozoides.

OBJETIVOS Analizar la viabilidad y la vitalidad de los espermatozoides en una muestra de semen procesada mediante la espermatobioscopia. Identificar las caractersticas fsicas del semen. Observar las caractersticas morfolgicas, estructurales y funcionales de los espermatozoides. Interpretar los resultados de la espermatobioscopia y emitir una opinin diagnstica de fertilidad o infertilidad del donante.

FUNDAMENTO La viabilidad y la vida de los gametos estn determinadas por los factores estructurales y funcionales de las clulas germinativas y por la composicin del medio que las contiene. Un mtodo fcil, econmico y demostrativo para determinar dichos factores en los gametos masculinos (espermatozoides) es la espermatobioscopia. La espermatobioscopia es un mtodo diagnstico en el estudio de la pareja estril en humanos, adems es utilizado actualmente como una prueba de control de calidad de las muestras que entran y salen de los bancos de semen para la inseminacin artificial, es tambin ampliamente utilizado en algunos animales de inters econmico como los sementales (reses y cerdos entre otros), ya que es un mtodo de evaluacin de la calidad de su semen directamente relacionada con su utilidad econmica. MATERIAL Y EQUIPO

Microscopio compuesto Estufa Placa de calentamiento Papel seda Termmetro Cmara de Newbauer Tubo de centrfuga cnico graduado Vasos de precipitado de 10 ml y 250 ml Papel pH Portaobjetos Cubreobjetos 22 mm * 40 mm Pipetas Pasteur con bulbo Pipeta de Thoma para glbulos blancos Guantes de ltex Charola de plstico para inactivacin del semen

REACTIVOS Aceite de inmersin Petrolato (vaseline) Solucin de bicarbonato de sodio al 5% (diluyente) Colorante de Giemsa Colorante Azul de Tripan Hipoclorito de sodio (blanqueador)

MATERIAL BIOLGICO Semen

PROCEDIMIENTO Examen fsico del semen Obtencin de la muestra. Despus de un periodo de abstinencia sexual se obtiene el semen1 por masturbacin recogiendo la muestra en un frasco de vidrio (vaso de precipitado de 20 mL) limpio, seco y de preferencia estril que deber mantenerse muy cercano a la temperatura corporal durante su transporte. Mantener la muestra en bao mara a 370C durante toda la metodologa Evaluacin de la licuefaccin del semen. En el momento de la eyaculacin y minutos despus el semen tiene una alta viscosidad, para evaluarla se introduce un palillo al semen y se retira lentamente, la muestra escurrir en forma de hilo y luego de 30 min. se procede de la misma manera para que el semen escurra por goteo, lo cual indicar que se ha

Hay dos tipos de espermatobioscopia: a). indirecta o de Sims Hunter donde previo coito de la pareja estril se obtiene la muestra por aspiracin de semen del cuello uterino y b). la directa obtenida por masturbacin que es el mtodo que utilizaremos.

licuado por efecto de las fibrinolisinas presentes en el plasma, as como de aminopeptidasas y pepsina. Evaluacin de volumen. Se coloca todo el eyaculado en un tubo de ensaye cnico de vidrio graduado y se registra el volumen. Evaluacin de pH. Se mide con papel pH y se anotan los valores encontrados. Evaluacin de color. Observe y anote el color. Evaluacin del olor. Determine el aroma y anote el resultado. Examen microscpico Movilidad espermtica. Limpia y desengrasan perfectamente los portaobjetos y cubreobjetos a utilizar, colocarlos en la estufa para mantenerlos a 37 0C, trazar un crculo de vaselina en el portaobjetos en medio del cual se coloca una gota de semen y se cubre con el cubreobjetos. Evaluar la movilidad de los espermatozoides observando varios campos con el objetivo de 40x. Los espermatozoides tendrn espermodrmia cuando se caractericen por tener una gran movilidad progresiva, es normal encontrar en el semen humano un 80% de espermatozoides mviles con una velocidad de aproximadamente 3 mm por min. Los espermatozoides que no cumplan ste ltimo parmetro tendrn astenosprmia y sern incapaces de fecundar. Morfologa espermtica. Hacer el frotis tomando una muestra de semen con un palillo procediendo a extenderla en el centro de un portaobjetos, deje secar la laminilla y fjela con metanol durante 5 min. concluido el tiempo de fijacin se deja secar y se tie con Giemsa diluido 1 a 10 en agua por 15 min. Observar al microscopio a 10x, 40x y 100x, en ste ltimo se cuentan 100 espermatozoides y se identifica las formas normales contra las anormales (Fig. 7 anexos).Elabore una lista indicando el porcentaje de formas normales y anormales. En una muestra normal es comn hallar hasta un 30% de espermatozoides alterados estructuralmente, el grado de aumento de formas anormales es directamente proporcional a las posibilidades de esterilidad. Despus de que el semen se ha licuado se aspira en una pipeta de Thoma para glbulos blancos hasta la marca de 0.5 y se llena con lquido de dilucin (bicarbonato de sodio al 5%) hasta la marca de 11, se agita la muestra con la pipeta horizontal hasta su completa homogenizacin; deseche las 3 primeras gotas y despus aplique la muestra por duplicado en una cmara de Newbauer (Fig. 8 anexos) deje reposar 3 min para proceder al conteo en un microscopio compuesto en dos cuadrculas grandes (para leucocitos).La cantidad obtenida se multiplica por 100,000 y el resultado es el nmero de espermatozoides por mL. En una muestra normal de humano se encuentran 100 millones de espermatozoides por mL, un eyaculado normal es de 3.5 a 5 mL, por lo tanto en cada eyaculado habr de 350 a 500 millones de espermatozoides. Cuando se encuentran disminuidos dichos valores en un 30% o ms aumentarn las posibilidades de esterilidad. Evaluacin de vitalidad de los espermatozoides de la muestra. Tomar una muestra de semen ya licuado y teir con azul de tripan (colorante supravital), observar al microscopio a 10x, 40x y 100x verificando si el colorante tie o no tie a los espermatozoides. Los espermatozoides muertos o deteriorados fijan el colorante mientras que los vivos no. Una vez terminada la prctica se proceder a inactivar al semen sumergiendo el material que haya estado en contacto con dicho fluido biolgico en hipoclorito de sodio (blanqueador) por espacio de 30 min.

NOTA: La tabla con los valores de referencia de la espermatobioscopia se encuentra en los anexos. REPORTE DE RESULTADOS Elaborara una tabla semejante a la presentada en valores de referencia donde anotara sus resultados y de acuerdo a los mismos emitir su diagnstico con respecto a la muestra y al donante. Interprete si la muestra es normal o no y si el donante es frtil o no frtil. BIBLIOGRAFA Balinsky B. Fabian B. C. (1998). Introduccin a la Embriologa. 5ta. Ed. Omega Espaa Bruce Alberts, Dennos Bray, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts y James D. Gilbert ngel M., Mauricio ngel R. (1996). Interpretacin clnica del laboratorio. 5ta. Ed. Editorial mdica internacional.Bogota Colombia. Lynch M. J., Stanley S. R., Meter D. S., Martin J. H. (1972). Mtodos de laboratorio. 2da. Ed. Nueva editorial interamericana. Mxico. Ruiz M. Fernanda. (1988). Fundamentos de embriologa y fisiologa de la reproduccin. 1ra Ed. Editorial UNAM Mxico Scout Gilbert. (2002). Developmental Biology Sinauer Ed. USA Tierney L. M., Stephen J. Mc P., Maxine A. P. (2001). Diagnstico clnico y tratamiento 2001 36 Ed. El manual moderno. Mxico. Tood, Sandford, Davidsohn. (1984). Diagnstico y tratamiento clnicos por el laboratorio. 7a. Ed. Salvat editors Barcelona Espaa. Tietz L. M., Finley P. R. (1985). Guia clnica del laboratorio. 1ra. Ed. Editorial mdica panamericana. Argentina. Watson. (2002). Biologa molecular de la clula. 3rd. Omega. Barcelona Espaa.

CUESTIONARIO Escriba cuales estructuras celulares estn involucradas en el proceso espermiognico. Describa en detalle los mecanismos celulares que se llevan a cabo durante el proceso espermiognico. Defina los trminos esterilidad e infertilidad. Especifique las diferencias entre viabilidad y vida espermtica y ovular indicando para cada caso sus valores normales. Qu significa el termino reproduccin asistida y cmo lo relaciona con la metodologa?

ANEXOS

Valores de referencia para la espermatobioscopia o espermiograma

Licuacin del semen al inicio Licuacin del semen a los 30 min Volumen pH Color Olor Espermatocrito Movilidad Morfologa formas normales Morfologa formas anormales Vitalidad a las 6 hs. Vitalidad a las 12 hs Vitalidad a las 24 hs Recuento promedio Recuento mnimo Viscoso escurre en hilo Lquido escurre en gotas 3.5 ml a 5 ml 7.5 a 8.0 Blanco opalecente Ocre sui generis 5% a 7% alta minimo 80% mviles Minimo 70% No ms de 30% 90% 50% 10% 100 millones por ml 50 a 60 millones por ml