Utilizarea unui preparat enzimatic cu activitate proteazic, pentru ameliorarea calitilor tehnologice ale unor aluaturi provenite din

finuri de gru R. TAMBA-BEREHOIU, N. C. POPA, S. POPESCU, D. BALAN, A. IANCU* Faculty of Biotechnology, Bd. Marasti No. 59, 71331, Bucharest, Romania * S.C. Boromir S.A. Abstract Keywords: wheat flours, improvment, proteases, quality parameters, farinogramm, alveogramm etc. Introducere Folosirea preparatelor proteazice este necesar n cazul finurilor puternice, care formeaz reele glutenice caracterizate prin rezisten i elasticitate foarte mare dar extensibilitate mic, respectiv n cazul produselor obinute n urma unor procese tehnologice scurte n care timpii de fermentare sunt redui sau lipsesc (srele, rulouri, biscuii, vafe, napolitane). Adaosul de proteaze are n vedere reducerea timpilor de frmntare i slbirea aluaturilor n conformitate cu necesitile tehnologice, pe seama hidrolizei legturilor peptidice din gluten. Rezultatul aciunii enzimatice se manifest n creterea extensibilitii i a proprietilor de fluaj ale aluatului. Cele mai frecvente surse de proteaze sunt Aspergillus oryzae, Bacillus subtillis i o serie de produse vegetale din care se obin papaina i bromelina.Deasemenea malul constituie o important surs de proteaze, ns efectul puternic amilolitic al acestuia l face mai puin folosit. Efectul hidrolitic al proteazelor este puternic dependent de sursa de obinere, cele mai bune rezultate asupra reologiei aluaturilor fiind nregistrate n cazul

proteazelor de origine fungic i bacterian. Proteazele vegetale produc o proteoliz profund a glutenului motiv pentru care sunt utilizate extrem de rar. Dozarea cantitii de poteaz adugate aluaturilor este foarte important pentru conducerea corect a proceselor tehnologice n vederea obinerii de produse de bun calitate. Excesul de proteaze determin obinerea unor aluaturi lipicioase, dificil de prelucrat, cu capacitate redus de retenie a gazelor i coloraie intens a cojii. Subdozarea conduce la obinerea de produse cu volum mic, simetrie slab i miez sfrmicios. Cele mai frecvente metode de analiz a efectelor adaosului de proteaz asupra calitii proteinelor din fin sunt reprezentate de metoda farinografic i cea alveografic. Metoda farinografic investigheaz calitatea finii pe seama principalelor caracteristici ale farinogramei: timp de dezvoltare, stabilitate, nmuiere, indice de toleran. Farinograma reprezint filmul evoluiei aluatului n condiii specifice de frmntare dup ce acesta a fost adus la o consisten standard de 500 U.B. Metoda alveografic analizeaz rezistena la ntindere a unei foi de aluat supuse presiunii aerului. Aceasta se umfl sub forma unui balon pn cnd se rupe. Sunt nregistrate rezistena maxim a aluatului la ntindere (P), extensibilitatea (L), cantitatea total de energie (W) etc. Aceast lucrare a avut n vedere analiza comportamentului reologic al unor aluaturi tratate cu proteaz n comparaie cu aluaturile finurilor netratate din care acestea au provenit. S-a urmrit n acelai timp identificarea unor legiti statistice care s exprime interdependenele dintre parametrii de calitate ai finurilor i cantitatea de proteaz folosit la ameliorare n scopul identificrii unui procedeu matematic care s

simplifice decizia de dozare i care s diminueze ansele apariiei unor greeli la acest nivel al procesului tehnologic. Material i metod Experimentul a constat n evaluarea comparativ a calitilor tehnologice ale unor finuri martor (neameliorate) i a acelorai finuri ameliorate prin adaosul unui preparat enzimatic cu activitate proteazic. Parametri de calitate ai aluatului rezultat din eantioanele de fin martor i fin ameliorat au fost testai n primul rnd, prin explorarea unor parametri fizico-chimici, precum: umiditatea, proteina, glutenul umed, indicele de deformare al glutenului, capacitatea de hidratare, iar n al doilea rnd, prin explorarea caracteristicilor reologice, respectiv farinogramele i alveogramele

corespunztoare. Metodele de analiz utilizate sunt cele descrise n standardele naionale i internaionale n vigoare: STAS 90-88 pentru determinarea parametrilor fizico chimici ai finii (umiditate, protein, cantitatea de gluten umed, indice de deformare) respectiv ICC-Standard No. 121 i ICC-Standard No. 115/1 pentru realizarea farinogramelor i alveogramelor. Aparatura utilizat a fost reprezentat de un farinograf Brabender respectiv un alveograf Chopin. Materialul luat n studiu a fost reprezentat de 23 eantioane de fin tip 480 neameliorate (martor), din loturi de producie diferite, provenind de la S.C Boromir S.A. Acestea au fost ameliorate n mod diferit cu un preparat enzimatic, avnd activitate proteazic, anume: Veron W, furnizat de firma AB Enzymes. Substana activ a acestuia

este reprezentat de o metalproteinaz provenit din culturi specifice de Bacillus subtilis (IUB- No.: 3.4.24.28). Cantitatea de preparat enzimatic adugat a fost cuprins ntre 10 60 ppm. Maniera n care s-a fcut ameliorarea este evideniat n tabelul 1. Tabelul 1. Variantele de ameliorare ale finurilor cercetate, cu Veron W Nr. lot fin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Cantitatea de preparat enzimatic (ppm) 140 170 150 140 130 200 160 140 500 10 50 70 80 Nr. lot fin 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Cantitatea de preparat enzimatic (ppm) 100 170 190 210 200 180 170 150 110 100 100 100 600

Diferenele aprute ntre finurile martor i cele tratate enzimatic au fost analizate prin metodele analizei statistice. Rezultate i discuii n tabelul 2 sunt prezentate valorile medii ale parametrilor de calitate ai finurilor martor, nsoite de principalii indicatori statistici ai variabilitii. Tabelul 2. Estimatele variabilitii parametrilor de calitate ai finurilor martor Parameter Moisture (%) Proteins (%) Wet gluten (%) Gluten deformation (mm) Hydration capacity (%) X sx 14.052 0.294 9.690 0.344 26.457 1.254 5.722 2.562 56.738 0.723 s 0.086 0.119 1.573 6.565 0.522 CV % 2.094 3.966 4.739 44.777 1.274
4

Stability (min) Deformation energy W (E-4J) Extensibility L (mm) Resistance P (mm) P\L

8.000 1.680 220.000 66.762 92.162 24.218 70.980 13.346 0.848 0.321

2.062 4459.583 586.587 178.126 0.103

21.001 30.351 26.879 18.990 37.950

Media valorilor parametrilor de calitate la finurile ameliorate este prezentat n tabelul 3. Tabelul 3. Estimatele variabilitii parametrilor de calitate ai finurilor ameliorate Parameter Moisture (%) Proteins (%) Wet gluten (%) Gluten deformation (mm) Hydration capacity (%) Stability (min) Deformation energy W (E-4J) Extensibility L (mm) Resistance P (mm) P\L X sx 13.753 0.409 9.487 0.172 25.675 0.467 10.970 5.447 56.925 0.798 6.15 1.593 162.709 45.580 105.100 14.138 54.05 10.816 0.537 0.138 s 0.167 0.003 0.218 29.659 0.636 2.735 2077.606 199.884 116.997 0.019 CV % 2.970 1.820 1.819 49.660 1.401 25.585 28.014 13.451 20.012 25.710

Se observ o serie de modificri substaniale ale coeficienilor de variaie n cazul anumitor parametri ai finurilor tratate enzimatic n raport cu finurile martor, netratate. Acesta este rezultatul aplicrii tratamentelor difereniate cu enzim. Parametri care au nregistrat modificri semnificative ale coeficienilor de variaie (test Fisher) au fost: proteina (F = 4. 714**), deformarea (F = 0.005***), parametrul L al alveogramei (F = 2.934*), precum i raportul P\L (F = 6.894***). Mediile parametrilor de calitate au evideniat diferene statistice (testul t) ntre finurile martor i cele ameliorate, conform tabelului 4.

Tabelul 4. Semnificaia diferenelor dintre mediile parametrilor de calitate ai finurilor martor i ai celor ameliorate Fina Parameter Moisture (%) Proteins (%) Wet gluten (%) Gluten deformation (mm) Hydration capacity (%) Stability (min) Deformation energy W (E-4J) Extensibility L (mm) Resistance P (mm) P\L Martor 14.052 9.690 26.457 5.722 56.358 8.000 220.000 92.160 70.980 0.848 ameliorat 13.753 9.487 25.675 10.970 56.625 6.150 162.708 105.100 54.005 0.537 t 2.560 2.318 2.365 3.499 0.689 3.180 3.272 1.237 4.590 4.405 Semnificaia * * * ** ns ** ** * *** ***

Se observ c indicele de deformare al glutenului a crescut distinct semnificativ la fnurile ameliorate (t=3.499**); stabilitatea (t=3.180**) i W (t=3.272**) au sczut distict semnificativ la fina ameliorat; P i raportul P/L au sczut foarte semnificativ la fina ameliorat (t=4.590*** i respectiv t=4.405***). Umiditatea, proteina, glutenul umd i L au prezentat doar diferene semnificative ntre finuri, conform tabelului de mai sus. Putem aprecia c cel mai puin sensibil parametru de calitate la activitatea proteazic, este capacitatea de hidratare, pe cnd aciunea specific enzimei a determinat o scdere distinct semnificativ a rezistenei la rupere. Scderea foarte semnificativ a cantitii totale de energie absorbit de aluat la ntindere (W) s-a realizat pe seama scderii rezistenei la rupere (P). Analiza corelaiilor dintre parametri de calitate ai finurilor tratate enzimatic i cantitatea de preparat enzimatic utilizat, a subliniat o serie de interrelaii interesante.

Dei ntre anumii parametri de calitate ai finurilor martor i ameliorate, per ansamblu, au aprut diferene semnificative conform tabelului 4, acestea nu s-au corelat ntotdeauna cu cantitatea de preparat utilizat. Fenomenul dovedete c o parte dintre diferenele la care se face referire n tabelul 4 se datoreaz interaciunii amelioratorului cu factori caracteristici fiecrei fini n parte. Efectul strict al enzimei adugate poate fi estimat, innd cont de individualitatea eantioanelor de fin, cu ajutorul coeficienilor de corelaie i al curbelor de regresie, n vederea interpretrii efectului de ameliorare printr-o legitate statistic general. Corelaiile semnificative dintre cantitatea de preparat enzimatic utilizat i valoarea unor parametri fizico-chimici i reologici ai finurilor, precum i ecuaiile de regresie corespunztore sunt prezentate n tabelul 5. Menionm c s-au folosit diferite modele de regresie, astfel nct s obinem cei mai buni coeficieni de determinare. Astfel, pentru indicele de deformare al glutenului, extensibilitate (L) i capacitate de hidratare-cantitate de preparat enzimatic s-a utilizat ecuaia de regresie liniar, pentru regresia stabilitate-cantitate de preparat enzimetic, ecuaia de regresie exponenial, iar pentru regresia energie (W)-cantitate de preparat ecuaia de regresie logaritmic. Tabelul 5. Corelaii i regresii ntre valoarea parametrilor de calitate ai finurilor i cantitatea de preparat enzimatic utilizat la ameliorare CoefiCantitatea de preparat enzimatic (P) parametru Gluten deformation Stability W cient de corelaie r 0.862 -0.843 -0.508 Ecuaia de regresie y = 4.400 + (0.032x) y = 8.287e-0.0016x y = -36.254 Ln(x) + 335.82 Coeficient de determinare r2 0.744 0.711 0.258 Semnificaia *** ** *

-0.544

y = 123.460 + (-0.140x)

0.296

De asemenea, s-au prezentat coeficienii de corelaie semnificativi i ecuaiile de regresie respective, pentru diferenele nregistrate de parametri de calitate la finurile martor, comparativ ce cele ameliorate, n raport de cantitatea de preparat enzimatic utilizat (tabelul 6). Menionm c s-au utilizat urmtoarele tipuri de ecuaii de regresie: pentru diferenele dintre parametrii Gluten deformation, Resistance (P) i Energy(W) cu cantitatea de preparat, ecuaii logaritmice iar pentru diferena dintre raiile P\L cantitate de Veron W, ecuaie polinomial. Tabelul 6. Corelaii i regresii ntre diferenele parametrilor de calitate ai finurilor martor i ameliorate, cu cantitatea de preparat enzimatic utilizat la ameliorare CoefiCantitatea de Veron W diferen parametru Gluten deformation Extensibility, W Resistance, P P\L cient de corelaie r 0.815 0.600 0.870 0.774 Ecuaia de regresie y = 8.717Ln(x)-38.781 y = 25.833Ln(x)+21.412 y = -8.626Ln(x)+21.44 y = -2E-0.5x2+0.002x0.0073 Se observ, corelarea pozitiv foarte semnificativ (r=0.862***) a deformrii glutenului cu cantitatea de preparat enzimatic (fig.1). Coeficientul de determinare obinut sugereaz c activitatea proteolitic foarte semnificativ diferit n finurile tratate
Gluten deformation

Coeficient de determinare r2 0.664 0.361 0.758 0.599

Semnificaia ** * *** **

(mm)

25 20 15 10 5 0

y = 0.0322P + 4.3994 R 2 = 0.7436

8
0 200 400 Veron W (ppm) 600 800

enzimatic, fa de cele martor se datoreaz n proporie de aproape 75 % proteazei adugate i doar n mic msur activitii unor factori interni ai finii.

Figure 1. Regresia indicelui de deformare al glutenului fucie de cantitatea de Veron W Probabilitatea de transgresiune a regresiei indice de deformare-cantitate de preparat este mai mic de 0.01 %, ceea ce arat c valoarea acestui parametru poate fi controlat foarte strict prin adaos de proteaz. Ecuaia de regresie a diferenei deformrii glutenului dintre finurile martor i cele tratatate enzimatic, cu cantitatea de preparat proteazic folosit, prezentat n figura 2, a confirmat influena semnificativ a enzimei asupra acestui parametru. Totodat, valoarea parametrului indice de deformare n finurile martor, ca indicator al activitii proteolitice iniiale ale acestora, trebuie luat n considerare n momentul dozrii amelioratorului enzimatic, deoarece aceasta constituie o surs inportant a diferenei dintre indicii de deformare ai glutenului ntre finurile martor i ameliorate.

Gluten deformation difference (mm)

20 15 10 5 0 0 200

y = 8.717Ln(x) - 38.781 R2 = 0.6645

400 Veron W (ppm)

600

800

Figure 2. Regresia diferenei indicelui de deformare al glutenului, ntre fina martor i fina ameliorat, cu cantitatea de preparat enzimatic folosit
9

Creterea cantitii de preparat enzimatic a determinat o scdere distinct semnificativ a parametrului farinografic stabilitate (r = -0.843**), n proporie de peste 71 % (r2 = 0.71), aa cum se observ din figura 3.

10 Stability (min) 8 6 4 2 0 0 200 400 Veron W (ppm)

y = 8.287e -0.0016x R2 = 0.7113

600

800

Figure 3. Regresia stabilitate aluat - cantitate de preparat enzimatic Cantitatea de preparat enzimatic nu a influenat diferena dintre stabilitile aluatului la finurile martor i cele ameliorate (r = 0.285). Acest lucru arat c efectul proteolizei asupra parametrului stabilitate nu a fost influenat hotrtor de valoarea parametrului n finurile martor. Corelaia direct a parametrului stabilitate ntre finurile martor i cele cu adaos enzimatic a fost de asemenea nesemnificativ (r = 0.369).

300 250 W (E-4 J) 200 150 100 50 0 0 50 100 150

y = -36.254Ln(x) + 335.82 R2 = 0.2579

200

250

Veron W (ppm )

Fig 4 Curba de regresie Veron W W

10

Cantitatea de energie absorbit de aluat poate fi sczut prin adaos de proteaz, aceasta influennd n proporie de cca. 26% valoarea parametrului n finurile tratate (fig 4). Scderea cantitii de energie s-a realizat pe seama atacului enzimei asupra legturilor peptidice din aluat, fiind corelat cu scderea extesibilitii acestuia i a rezistenei la rupere. Corelaia semnificativ s-a pstrat i n cazul analizei legturilor dintre diferenele parametrilor W dintre finurile ameliorate i cele martor cu cantitatea de preparat folosit (fig 5). Cantitatea de preparat a contribuit cu cca. 37% la realizarea acestei diferene.

0 W difference -50 -100 -150 -200 Veron W (ppm) y = -25.833Ln(x) + 21.412 R 2 = 0.3613 0 50 100 150 200 250

Fig. 5 Regresia dintre diferenele parametrilor W ale finurilor martor i ale celor ameliorate cu cantitatea de Veron W Aciunea enzimei asupra extensibilitii a fost determinant n proporie de 29.6% (fig 6).

11

150 L (mm) 100 50 0 0 50 100 150

y = -0.1401x + 123.46 R 2 = 0.2959

200

250

Veron W (ppm)

Fig. 6 Curba de regresie cantitate de preparat - L Nu s-au nregistrat corelaii semnificative ntre parametrii L ai finurilor martor respectiv ai celor ameliorate i nici ntre cantitatea de enzim utilizat i diferenele dintre acetia. Dei n finurile ameliorate valoarea parametrului L a crescut semnificativ fa de finurile martor (vezi tabelul 3) acest lucru nu se corleaz cu activitatea enzimei, care a avut un efect contrar, de scdere a extensibilitii. O explicaie n acest sens ar putea s fie legat de unele efecte indirecte ale enzimei. Astfel, proteoliza enzimatic a aluatului a activat o serie de procese reductoare fie prin eliberarea de aminoacizi cu grupri -SH, fie prin modificri capabile s disponibilizeze aceste grupri pentru astfel de procese. Intensitatea proceselor reductoare din aluat este dependent de natura finii martor, enzima deblocnd potenialul acestora. O dovad n acest sens o poate constitui corelarea invers a parametrului stabilitate din finurile martor cu parametrul L al finurilor ameliorate (r = - 0.54*), cunoscnd faptul c finurile mai stabile prezint activiti preponderent oxidazice Nu s-au nregistrat corelaii directe, cuantificabile, ntre cantitatea de preparat folosit i rezistena la rupere (P) a finurilor ameliorate, dei acest parametru a prezentat

12

diferene distinct semnificative fa de finurile martor. Adaosul de proteaz a contribuit ns cu 75.8% la scderea acestui parametru n finurile ameliorate fa de cele martor aa cum se observ din figura 7.

P difference (mm)

10 0 -10 0 -20 -30 -40 50 100

y = -8.6258Ln(x) + 21.44 R 2 = 0.7577 150 200 250

Veron W (ppm)

Fig. 7 Regresia diferenei dintre rezistena la rupere a finurilor martor respectiv cele ameliorate cu cantitatea de preparat enzimatic

n ceea ce privete raportul P\L s-a constatat o scdere semnificativ a acestuia pe msura creterii cantitii de proteaz adugat. Diferena P\L martor P\L fin tratat enzimatic a crescut semnificativ odat cu creterea cantitii de Veron W aa cum se observ din figura 8. Aceast cretere a diferenei s-a realizat pe n special pe seama scderii rezistenei la rupere (P).

P\L difference

0 -0.2 0 -0.4 -0.6 -0.8 -1 y = -2E-05x2 + 0.0021x - 0.0734 R 2 = 0.599 Veron W (ppm) 50 100 150 200 250

13

Fig 8 Regresia dintre diferena raiilor P\L ale finurilor martor i ale celor ameliorate cu cantitatea de preparat enzimatic Pentru a ilustra efectul adaosului de proteaz asupra principalilor parametrii de calitate farinografici i alveografici au fost analizate separat rezultatele obinute n interiorul unei serii de trei experiene realizate n cadrul cercetrii noastre. n acest caz s-a procedat la ameliorarea aceluiai martor cu 170, 190 i respectiv 210 ppm de preparat enzimatic.Considerm c rezultatele obinute, prezentate n figurile 9 14, sunt sugestive pentru ntregul ciclu de experiene i confirm estimaiile statistice pe care le-am prezentat mai sus.

14

Fig. 9 - Farinograma finii tratate cu 170 ppm Veron W

Fig. 10 - Farinograma finii tratate cu 190 ppm Veron W

Fig. 11 - Farinograma finii tratate cu 210 ppm Veron W

15

Fig. 12 - Alveograma finii tratate cu 170 ppm Veron W

Fig. 13 - Alveograma fainii tratate cu 190 ppm Veron W

Fig. 14 - Alveograma finii tratate cu 210 ppn Veron W

16

Aa cum se observ i din figura 15, parametrii farinografici stabilitate repectiv dezvoltare au prezentat scderi tot mai accentuate pe msura creterii cantitii depreparat folosite la ameliorarea finii. Acelai comportament a fost remarcat i n cazul parametrului deformare. Toate aceste observaii confirm estimaiile statistice realizate la nivelul global al celor 26 de testri realizate.

Gluten deformation (mm) Stability (min) Development (min) 0 5 10 15 20

210 ppm 190 ppm 170 ppm

Fig. 15 Evoluia principalilor parametri farinografici i ai deformrii glutenului n funcie de cantitatea de preparat enzimatic adugat Observaia noastr anterioar poate fi meninut i n ceea ce privete parametrii alveografici, a cror comportament la tratarea cu proteaz a fost ns mai puin uniform. Astfel, parametrul energie (W) a prezentat o scdere uoar, aproape nesemnificativ, la nivelul primei secvene de ameliorare (190 ppm fa de 170 ppm), urmat de o scdere brusc, major la nivelul celei de-a doua secvene (210 ppm fa de 190 ppm).

17

200 150 100 50 0 P (mm) L (mm) W (10E4j) P\L

170 ppm

190 ppm

210 ppm

Fig 16. Evoluia principalilor parametri alveografici n funcie de cantitatea de preparat enzimatic adugat

Conclusions *Cei mai sensibili parametri la aciunea proteazic, conform testelor de semnificaie realizate asupra diferenelor dintre mediile acestor parametri n finurile tratate enzimatic comparativ cu finurile martor, au fost: indicele de deformare al glutenului, stabilitatea, cantitatea de energie W, rezistena P i raportul P\L. Valoarea acestora a nregistrat diferene foarte semnificative i distinct semnificative fa de finurile martor. Cel mai puin sensibil parametru la tratamentul cu proteaz a fost capacitatea de hidratare care nu a diferit semnificativ ntre cele dou finuri. * Dei valoarea anumitor parametri de calitate a fost semnificativ sau foarte semnificativ diferit n finurile ameliorate fa de cele martor aceasta nu s-a corelat ntodeauna cu cantitatea de preparat folosit. Acest lucru dovedete modularea activitii

18

proteazice de ctre o serie de factori interni ai finii a cror efect sinergic nu poate fi anticipat dect pornind de la individualitatea fiecrui eantion n parte pe baza unor teste specifice. * References

19