TUBERCULOZA ETIOLOGIE

Istoric

Tuberculoza- boala infecto - contagioasa Identificata la mumiile egiptene si schelete din epoca de piatra Hippocrate gaseste legatura cauzala intre ftiziehemoptizie si intuieste caracterul contagios Evul Mediu -localizare pulmonara insotita de casexie Renasterea demonstreaza extensia si la alte organe Sir Percival Pott (1720) descrie tuberculoza osoasa cu localizare vertebrala Braille (1810) descriu tuberculii si evolutia spre ulcerare

Istoric 2

Laennec intemeietorul metodei anatomo - clinice precizeaza caracterul leziunilor tuberculoase (materia tuberculoasa cenusie, ulterior galbena opaca) Ranke sistematizeaza in 3 stadii evolutia tuberculozei: -afect primar, -perioada secundara de diseminare -perioada tertiara de ftizie Villlemin stabileste transmisibilitatea maladiei, 1865 Koch 1882 evidentiaza bacilul tuberculozei, cultivarea lui, punctul de plecare in studiul imunitatii, primul plan de profilaxie 24 martie ZIUA INTERN. DE LUPTA CONTRA TUBERCULOZEI !!!

Istoric 3
Roentgen 1896 a evidentiat Razele X(premiu Nobel 1902 !) Cl von Pirquet utilizeaza tuberculina la cutireactie 1920 Uniunea Internationala Contra Tuberculozei la Paris 1921 Calmette si Guerin prepara vaccinul antituberculos dupa 13 ani de cercetare 1943:ERA MEDICAMENTELOR ANTITUBERCULOASE !!! Waksman decopera SM 1943, HIN 1952, RMP 1965 Babes 1887 in Romania Ioan Cantacuzino 1926 conserva tulpina originala de BCG

1926 primul dispensar antituberculos la Cluj-Daniello 1942 Leon Daniello -profesor titular la Catedra de Ftiziologie

Tuberculoza - reprezinta o boala infecto-contagioasa

specifica cu caracter endemic si larga raspandire in lume . - n urma tuberculozei mor mai muli copii i adulti dect n urma oricrei alte boli infecioase. - n lume n fiecare 10 secunde moare un om de tuberculoz. - n fiecare 4 secunde se mbolnvete un om de tuberculoz.

- Fiecare bolnav de tuberculoz netratat poate molipsi anual de la 10 la 15 persoane (i n primul rnd pe cei apropiai din familia bolnavului). - 80% dintre bolnavii de tuberculoz au vrste de la 15 pn la 45 ani.

Tuberculoza in lume-2006 conform OMS

1,656 milioane de decese n 2006 9,157 milioane de cazuri noi n 2006

219,000 decese prin TB/HIV

Cazuri de MDR-TB detectate n 102 din cele 109 ri din programul de supraveghere MDR al OMS i apariia cazurilor de XDR-TB( rezistenta extensiva-HIN+RMP asociata cu rezist la o quinolona si aminoglicozid/capreomicina)

Incidena TB estimat-conform OMS

pt. toate formele- WHO European Region, 2006

Number of cases (per 100 000pop.)

Number < 10 of cases (per 100 000pop.)
< 10 10-24 10-24 25-49 25-49 50-99 > 100 50-99

445,000 new TB cases 55,000 TB deaths

> 100

Incidenta TB in lume

Incidenta TB in Romania
%000

600 500 492.7 400 300 200 100 0 1950 1965 1970 1975 1980 1985 1987 1990 1995 2000 2001 2002 2003 184.4 152.1 110 61 55.8 53.2 70 102.6 121.9 134.1 142.2 135.6

Mortalitatea prin TB in Romania

%000

200 150 100

180.2

44.9 50 0 1950 1955 1960 1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995 35.1 24 18.5 6.7 3.7 4.2 6.9 11.3 9.5 2000

Incidenta TB

Conform OMS, Romania ocupa locul 4 in regiunea Europa, dupa Kazahstan, Kirghikistan si Republica Moldova, Incidenta este mai crescuta la:
barbati grupele de varsta 25-29 ani pana la 60-64 ani

Epidemiologia tb in jud. Cluj

Rata de notificare globala ) incidenta 58,23%ooo, Incidenta cazurilor extrapulmonare Mo +: 16,42%ooo, Incidenta tb la copii: 15,21%ooo.

Epidemiologia tb in jud. Cluj

Incidenta meningitei la copii: 0, Prevalenta periodica: 45,37%ooo, Mortaliatate: 2,41%ooo,

Prevalenta instantanee ( la toate cazurile ramase in tratament): 37,92%ooo,

Epidemiologia tb in jud. Cluj

Rata de confirmare bacteriologica a cazurilor pulmonare prin: - microscopie: 54, 49%, - cultura: 21,55%, Proportia cazurilor cu tb pulm. negative M si pozitive in C: 52,94%, Cazuri cu tb extrapulmonar: 11,97%.

Ordinul ACTINOMYCETALES: structura citologica si citochimica similara bacteriilor tipice; au analogii cu micetele filamentoase, 4 genuri: actinomycetaceae, streptomycetaceae, actinoplanaceae, mycobacteriaceae, Genul Mycobateriaceae: acidoacoolerezistenta, aspectul de bastonas ( myces=ciuperca, mucegai bacterion=bastonas).

CLASIFICARE M.T NOMENCLATURA

CLASIFICARE: 1. dupa patogenitate: -patogene exclusiv pt om: M leprae -patogene ptr.om, animale si pasari: Complexul M.t.( hominis, bovis,africanum), -oportuniste majore: kansasii, avium, xenopi, scrofulaceum, -oportuniste minore: ranae, chelonei, terrae, -saprofite: gordonae, flavescens, phei, smegmatis.

CLASIFICARE M.T NOMENCLATURA

2. dupa viteza de crestere (dezvoltare de colonii): -cu crestere lenta: strict patogene-compl.M.t, -M.leprae,

CLASIFICARE M.T NOMENCLATURA

grupul fotocromogene-

grupul scotocromogeneszulgai, gordonae,

kansasii, marinum, simiae, africanum,

scrofulaceum,

intracel, ulcerans, xenopi, -cu crestere rapida: grI-necromogene (fortuitum, chelonei), gr.II-termofile ( smegmatis, phei), gr.III-scotocromogene ( flavescens), gr. IV-aletele ( vacae).

grupul necromogene-comp.avium

MORFOLOGIA MICROSCOPICA
MICROSCOPUL OPTIC: -acido-alcoolorezistenta - bastonase drepte sau incurbate cu capete rotunjite, - lungime: 1-5, - grosime: 0,2-0,4, - necapsulate, nesporulate,imobili - dispozitia in gramezi( un plus de rezistenta) sau filamente

MORFOLOGIA MICROSCOPICA
MICROSCOPUL ELECTRONIC: Perete celular tristratificat Dublat pe fata interna de m.celulara, Membranainvaginatii citoplasmatice cu rol de mitocondrii ( mezosomi), Citoplasma: structura nucleara: AND, granulatii, vacuole, incluzii citoplasmatice.

DEZVOLTAREA PE MEDII DE CULTURA

PARAZITISM OBLIGATORIU: indiv.Genului M, Cultivarea M. se face pe medii artificiale speciale: Lwenstein Jensen, Compozitie: saruri minerale, glicerina (sursa de C), asparagina, clorura de amoniu ( sursa de N), ou, amidon ( fecula de cartof), verde malachit ( indicator de pH), Medii sintetice: Youmans, Sula, Dubos, Conditii de dezvoltare: T=37,5-38C, pH=77,5, aerobioza obligatoriu,

DEZVOLTAREA PE MEDII DE CULTURA

Cresterea: lenta ( durata de viata a unei generatii=18-24 h), Primele microcolonii punctiforme: 10-15 zile, maturarea dupa 3-4 saptamani (tipul bovin dupa 2 luni), Aspectul coloniilor: IDENTIFICAREA MYCOBACTERIEI,

Aspectul coloniilor: IDENTIFICAREA MYCOBACTERIEI

M.t.hominis: colonii, proeminete, verucoase, uscate, rugoase ( tip R= rough), culoare galbuie, dezvoltarea este eugonica pe toata suprafata mediului M.t.hominis sub actiunea medicamentelor antituberculoase: aspect disgonic,

M.t.bovis: coloniile sunt netede, plate, culoare albicioasa, aspect cremos ( tip S- smouth), cresterea mai putin luxurianta ( caracter disgonic), lent in 2 luni.

DEZVOLTAREA PE MEDII DE CULTURA

Din cultura matura se efectueaza fortiu microscopic ( col. Z-N): prezenta cord factor asigura dispunerea in forma de benzi serpuitoare ( substratul virulentei) pentru M hominis Absenta cord factor: M.t.bovis, hominis ( tratat cu medicamente pierde cord factorul) dispunere in gramezi compacte

STRUCTURA BIOCHIMICA
80-85%: apa, 15-20% reziduu uscat, Saruri minerale, substante organice: lipide ( 30-40%), proteine, glucide, Lipide: -caracterul .hidrofob al peretelui celular, -fixeaza colorantii greu colorantii( fuxina fenicata, fluorcromii), -acidoalcoolorezistenta la acizi, eteri, acetona, (in special prin ac micolic), -etc.

ANTIGENE PASIVE incapabile sa produca Ac, dar actioneaza specific cu Ac Proteinele: reprezentantul - tuberculina, netoxica ptr. Org. animal neinfectat,produce hipersensibilitate de tip intarziat la org. alergizate Glucidele: legate de prot, lipide, ac.nucleici, Enzime: amilaze, transaminaze, ureaze, fosfolipaze, lipaze, catalaze. ANTIGENE ADEVARATE produc Ac in vivo si reproduc leziuni anatomopatologice

STRUCTURA ANTIGENICA

REZISTENTA LA AG.FIZICI, CHIMICI

Rezistenta deosebita: lipide ( hidrofobia), gruparea in gramezi, invelis organic ( saliva), Rezistenta la frig: - 180C, rezistenta la uscaciune, DISTRUGERE: 1. UV: componenta UV a luminii albe mor in 10 min 2. caldura umeda: fierbere, autoclavare ( timp raportat la gradul de infectare), 2 min prin fierbere, 3. substante antiseptice: formol la 50 grade, cloramina 5-10%, lizol, detergenti cationici, clorura de var20%, 4. medicamente antituberculoase ( bactericide ).

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC

PRODUSUL PATOLOGIC: A. Recoltarea corecta: recipiente speciale, identitate, Dimineata, a jeun, inainte de mancare, toaleta, inainte de inceperea tratamentului Spontan: tuse provocare a tusei: aerosoli, spalatura bronsica, iritatia faringe, ef.fizic cu glota inchisa, Dirijat: endoscopie bronsica, sondaj gastric matinal,

Valoarea diagnostica pe tipuri de prelevate

SPUTA adulti: sensibilitate 80-90%, specificitate 99% copii: microscopia confirma 10-15%, cultura 30-40 3-5 ml

SPUTA INDUSA (SI) - bolnavii care nu expectoreaza in aceeasi zi- la interval de cel putin 8 ore sau zile succesive 3 SI mai sensibil decat 3 AG Sensibilitate- 90%
Indian J Med Microbiol 2006;24:249-51 J Clin Microbiol 2000; 38(1):466

Valoarea diagnostica pe tipuri de prelevate

ASPIRAT BRONSIC (AB) nu creste sensibilitatea dg* sensibilitate 70% 10-15 ml

ASPIRAT GASTRIC - bolnavi care nu expectoreaza, copii,>60 rata maxima de pozitivitate**- adulti 20-29 ani - copiii <9 ani si varstnicii>60 Sensibilitatea scade cu cresterea varstei, Prelucrare imediata *Clin Inf Dis 2007;44:1415-20
**PakJMed Sci 2007:23(1):51-53

Valoarea diagnostica pe tipuri de prelevate

FLUIDE ALE CORPULUI: pleural, peritoneal, pericardic, colectii, LCR minim 2 ml 50 ml paucibacilare pastrare maxim 4 zile la intuneric, 4-80 C, fara conservan citrat de sodiu ca anticoagulant URINA matinala esantioane multiple precedata de urocultura pentru non-Tb 10 50 ml

Alte produse patologice

Sperma Sange menstrual sau sange bioptic dupa chiuretaj Aspirat de maduva osoasa Fragmente de peritoneu, Fragmente intestin , Fragmente ganglioni

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC
2. Transportul si prelucrarea: cat mai rapid ( pastrare la +4C, max.5 zile, transport in cutii spaciale-lemn, metal) in laboratoare dotate in acest sens, Decontaminare cu fosfat trisodic15%, antibiotice cu spectru larg

EVIDENTIEREA M.T. SE FACE PRIN: metode clasice (ex.M direct, dezvoltarea pe mediile de cultura, inocularea la animalul de laborator), metode moderne de evidentiere a M.t.

EXAMENUL MICROSCOPIC DIRECT: Metoda simpla, rapida, ieftina, usor repetabila,fara aparatura sofisticata si personal superspecializat DESCOPARA RAPID MARII ELIMINATORI DE B: criterii ptr. Inceperea traatmentului, izolarea bolnavului, Controlul sterilitatii expectoratiei Metode: coloratia Ziehln Neelsen ( fuxina fenicata la cald, flurocromi la rece), Sensibilitatea metodei creste prin: concentrarea produsului patologic ( centrifugare, flotatie), omogenizare ( fluidificare cu NaOH), Limite: sensibilitate (nr. mare de bacili 5.000-10.000pe ml ), Nu ofera inf. asupra viabilitatii bacililor, identitatii, sensibiltatii la medic.antitub, Interpretarea rezultatelor.

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC avantaje,dezavantaje

Examenul microscopic

Se bazeaza pe proprietatea comuna tuturor speciilor de mycobacterium-acidoalcoolorezistenta In celula patrund greu coloranti ( se folosesc mordanti sau caldura), dar odata intrati pot fi greu de extra cu ajutorul acizilor, alcoolului si a altor substante de decolorare BAAR este o rezistenta la decolorare persista si la cadavrele de bacili Poate disparea prin procese enzimatice, tratamente tuberculostatice, UV

METODA ZIEHL-NEELSEN
Colorarea la cald a frotiului cu fuxina fenicata Decolorare cu solutie alcoolica de acid clorhidric Recolorare cu sol de albastru de metilen(verde malachit, acid picric) Bacili rosii, subtiri, incurbati pe fond albastru (verde sau galben) Tehnica Margineanu coloreaza la rece folosind xilol amestecat cu fuxina fenicata

Tehnica cu auramina-rodamina

Examenul microscopic in lumina fluorescenta Colorare la rece cu ajutorul fluorocromilor ( auramina sau rodamina) Decolorare cu solutie alcoolica de acid clorhidric Recolorare cu permmmanganat de potasiu pentru diminuarea fluorescentei nespecifece Examinare cu obiectiv uscat, la microscop dotat cu examinare pentru fluorescenta la care se anexeaza sursa UV, in camera intunecata

EXPRIMAREA SEMICANTITATIVA A REZULTATELOR EXAMENULUI MICROSCOPIC

Ziehl-Neelsen 1000x
0 BAAR 1-9 BAAR/100 campuri 10-99 BAAR / 100 campuri 1-10 BAAR / camp > 10 BAAR / camp

Rezultat

Marirea in examinarea fluorescenta 250x 450x 630x

0 BAAR 0 BAAR 0 BAAR Se Se Se imparte imparte imparte numarul numarul numarul BAAR BAAR BAAR observati observati observati la 10 la 4 la 2

NEGATIV BAAR Numarul exact de BAAR / 100 campuri POZITIV BAAR 1+ POZITIV BAAR 2+ POZITIV BAAR 3+

In fluorescenta permite evidentierea bacililor cu un obiectiv slab maritor(25), cu obiectiv de 20x si ocular de 10x, iar campul microscopului acopera o suprafata mai mare de aproape 16x, ceea ce scurteaza timpul de examinare Bacili portocalii stralucitori pe fond intunnecat Examinarea frotiului 1-2 min permite parcurggerea a 30 de campuri, ce coincide cu examinarea a cel putin 300 de camopuri la M cu imersie Rezultate 0 BAAR/30 camp negativ 1-5 bacili se noteza nr exact Se imparte nr de BAAR la 10

Examinarea frotiurilor

Cauze de eroare in microscopie

A. Produsul patologic
B. Prepararea frotiului C. Coloratie D.Examinarea microscopica

Cauze de eroare fals pozitive

-particule alimentare, precipitate, zgarieturi -precipitate de coloranti, granule de polen in sputa - spori de Bacillus subtilis, nocardia, alte micabacterii saprofite -transferul de pe o lama pozitiva pe una negativa la colorare, saubacili aderenti in uleiul de cedru

Consecintele rezultatelor eronate

A. Rezultat fals pozitiv
Inceperea unui tratament inutil Irosirea medicamentelor antituberculoase Prelungirea inutila fazei intensive a tratamentului

Pacientul isi pierde increderea in PNCT

B. Rezultat fals negativ

Netratarea

bolnavului cu tbc, care sufera, raspandeste boala si poate muri

Neprelungirea Pacientul

fazei intensive a tratamentului

isi pierde increderea in PNCT

Erori fals negative

Recoltare incorecta a expectoratie ( saliva) Expunerea directa la soare a produsului patologic sau dupa mai mult de o saptamana Fixarea necorespunzatoare a frotiului Supraincalzirea sau contact insuficient cu fuxina Citirea prea rapida sau superficiala a lamelor( sau daltonismul examinatorului)

CULTIVAREA MICOBACTERIILOR
In scop diagnostic se aplica: pacientilor suspecti de tuberculoza care au 3 examene microscopice BAAR negativ; pentru bolnavii infectati HIV/SIDA, copii;
Pentru identificarea Complexului M.tuberculosis;

Pentru testarea sensibilitatii micobacteriilor la antituberculoase (antibiograma);

La pacientii cu retratamente, cronici, esecuri terapeutice este importanta pentru decelarea MDR, XDR.

Dezvoltarea pe medii de cultura

Mycobacteriile sunt pretentioase, necesitand medii speciale complexe, aerobioza obligatorie, temperatura optima de 37 grade si au dezvoltare lenta Sursa de carbon( hidrocarbonate ca glucoza, glicerol) Sursa de azot ( aminoacizi ca asparaginina, sau acidul glutamic, sau oua ser sau bulion de carne) Ioni esentiali (Fierul si magneziu) Verde malachit ca indicator de ph , bactericid si colorare de mediu facand mai vizibile coloniile de M Mediu solid Lovenstein Jensen Medii lichide Youmans, dubos, Middlebrook

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC
EXAMINAREA PRIN CULTURI. Insamantarea produsului patologic pe mediul de cultura, Incubare la 37C, Citirea tuburilor la 3-7-14 -21-30-45-60 Aspectul coloniilor mature: identificarea tipului ( tipizarea coloniei), Avantaje: sensibilitate ( produse paucibacilare ce contin 10100 bacili), Procedeu selectiv de confirmare al dg. etiologic M.t, Viabilitatea bacililor, identificarea b, sensibilitatea (ABG), Dezavantaje: metoda laborioasa, costisitoare, latenta rezultatelor de 2 luni,

Micobacterii atipice

Fotocromogene nu se pigmenteaza la intuneric, la lumina determinand aparitia pigmentului galben Scotocromogeni au colonii colorate in portocaliu atat la intuneric cat si la lumina Nefotocromogeni absenta pigmentarii sau pigment gri sau crem neinfluentat de lumina Micobacterii cu crestere rapida se dezvolta in 2-5 zile Testul catalazei pozitive si testul Konno negativ

Exprimarea rezultatelor culturilor

Crestere bacterian < 30 colonii* 30- 100 colonii* Notarea rezultatului Nr. exact de colonii / tub Cultura Mycobacterium Pozitiv 1+ Cultura Mycobacterium Pozitiv 2+ Cultura Mycobacterium Pozitiv 3+ Cultura contaminat

> 100 colonii izolate* Colonii confluente*

Contaminare cu alte microorganisme dect micobacterii

Rezultate fals negative

Expunerea produsului patologic la lumina solara sau raze ultraviolete Stocarea produsului timp indelungat inaintea prelucrarii; Suprainfectarea produsului cu mucegaiuri sau alte microorganisme; Nealegerea particulei purulente in cazul sputelor;

Prelungirea peste 25-30 a perioadei de decontaminare;

Neutralizarea incorecta; Folosirea unor medii vechi, uscate sau preparate necorespunzator; Incubare necorespunzatoare (sub 36 sau peste 37C); Centrifugare la FRC > 3000 xg; Eliberarea unui rezultat de cultura negativa pe un singur tub; (celelalte 2 tuburi fiind suprainfectate sau uscate)

Rezultate fals pozitive

Micobacterii netuberculoase, levuri sau microorganisme diagnosticate drept M.tuberculosis;
Interpretarea culturii numai dupa aspectul macroscopic al coloniilor.

Avantajele si dezavantajele insamantarii prin culturi

AVANTAJE Mult mai sensibila decat microscopi 10 bacili/ml sputa) depisteaza asimptomatici diferentierea de cadavrele de bacili identificarea tipului de mycobacterii prin inglobbarea tuberculostaticelor testarea sensibilitatii DEZAVANNTAJEccostisitoare

rezultate finale peste 60 de zile (pentru medii solide).

DIAGNOSTIC POZITIV
METODE MODERNE DE DETECTIE A M.T. 1. Detectia rapida a diviziunii (BACTEC): Principiu: masurarea CO2 marcat cu carbon radioactiv (14 C), eliberat in timpul multiplicarii in cultura lichida ( sursa de C este ac. Palmitic marcat cu 14 ), Metoda este sensibila ( detectarea unor cant. Minime de 14C, in timp scurt 10-21-28 zile.

MB Bact Utilizeaza mediile lichide si un sistem computerizat de citire pe principii colorimetrice, ceea ce permite obbtinerea mai rapida a rezultatelor

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC
INOCULAREA

LA ANIM. DE LABORATOR: Metoda sensibila, inocularea prod.patol. la animale de experienta ( cobai, iepure), Metoda laborioasa, costisitoare, Metoda de alternativa: nesigura la bolnavii tratati, utilizata in situatii de exceptie ( Tub. extrapulmonara) Pentru cercetare

2. NAP-test. Principiu: NAP: nitro acetil amino hidroxipropiofenon) inhiba dezvcltarea M.t. h. si b. dar nu si pe cele atipice, Dg.# cu M.atipice ( in 5 zile). 3. Cromatografia ac. Micolici. Principiu: determinarea. profilului ac.micolici ( sunt specifici cant. Si calit. fiecarei specii ai g. My), Identificarea in 24 h, doar M.t. in cultura pura. 4. Sonde genetice. Principiu: separarea lant de AND sub act. Caldurii, Fiecare lant, la temp. se reasociaza ( hibrideaza) specific cu lantul specific, fiecare secventa nucleotidica cu secventa nucleotidica complementara, Sonde genetice: secvente nucleotidice artificialese hibrideaza cu secv. Complementara, Sondele permit in cateva ore identificarea col. M.t, Un singur produs patologic.

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC

5. Detectarea ac. tuberculostearic. Pricinpiu:prin cromatografie gazoasa ( spectrofotometrie de masa), Ac. Micolic este prezent la toate M.t, Evidentierea ac. Tuberculostearic indica o infectie tuberculoasa, Metoda este sensibila, dar necesita un volum mare de munca si costisitoare. 6. Serodiagnosticul in detectarea antigenelor M.t. Principiu: RFC, hemaglutinarea, hemagregarea, precipitarea si difuziunea in gel, imunofluorescenta, ELISA, Antic. Monoclonali si antig.recombinate, Se apreciaza gradul de activitate a tuberculozei.

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC
7. amplificarea genomica prin reactia de polimerizare in lant ( PCR). Principiu: AND polimeraza respons. de replicarea AND e capabila sa copieze in vitro secv. Sp. Ale AND cu cond. De a dispune de tipare, ele insele specifice, Utilizarea AND polimeraza sp-Taq polimeraza a carei termoresistenta ii confera rezistenta la temperaturi inalte se poate amplifica pana la 1.000.000 X secventa de AND pe care dorim sa-l detectam, Metoda: este laborioasa, costisitoare, prea sensibila ( uneori se inregistreaza o amplificare nespecifica sau contaminarea prod. Patol. De catre AND exogen).