Sunteți pe pagina 1din 5

Fuziunea protoplastilor

Pentru a obtine o fuziune eficienta este necesar sa se lucreze cu un numar mare de protoplasti viabili. Fuziunea este in general indusa prin incubarea intr-o concentratie mare de PEG (polietilena glicol), o concentratie mare de si un pH relativ crescut. Accest

tratament este necesat pentru a indeparta incarcatura negativa din protoplasti. Ionii PEG si sunt spalati dupa ce fuziunea a avut loc. Electrofuziunea a devenit populara in ultimii ani. Zimmermann a anticipat posibilitati mari pentru aceasta tehnica din care rezulta protoplasti mai viabili decat prin utilizarea de PEG. Kameya (1984) a realizat fuziunea protoplastilor cu ajutorul dextranului si a stimulilor electrci. Daca 2 protoplasti diferiti fuzioneaza (provenind de la 2 genotipuri sau specii diferite) rezulta un heterocarion, iar daca fuzioneaza 2 protoplasti similari se obtine un homocarion. Dupa ce a avut loc fuziunea celulara, fuziunea nucleara poate sa apara atunci cand nucleii se divid simultan. Dupa hibridizarea somatica , cea mai mare problema o reprezinta selectarea hibrizilor somatici din populatia celulara. Daca de exemplu, fuziunea are loc intre doua tipuri de protoplasti, A si B, atunci se va obtine o populatie care contine protoplasti nefuzionati A si B , homocarionii AA si BB, heterocarionii AB si diversi carioni multipli (fuziuni). Au fost dezvoltate multe proceduri de selectie pentru a selecta eficient doar heterocarionii AB din amestec. Multi hibrizi somatici au fost produsi in ultimii ani, mai ales dintre membrii Familiei Solanaceae. Faptul ca hibridizarea somatica intre Brassica si Arabidopsis si intre Daucus carota si Aegopodium podagraria a fost un succes arata ca este posibila chiar si hibridizarea intergenerica. Acest lucru este foarte interesant din moment ce acesti hibrizi nu pot fi obtinuti pe cale sexuala. Insa utilitatea practica a acestora este foarte indoielnica deoarece plantele obtinute sunt sterile. Hibridizarea somatica este foarte importanta pentru regenerarea plantelor intregi pornind de la protoplasti. Exemple: Brassica napus, Brassica campestris x Brassica oleraceae, Medicago tuberosum, Trifolium repens, Daucus carota, Nicotiana sp. si Petunia sp.

Culturile de protoplasti
Cultura de protoplasti prezinta cerinte specifice, doarece ea consta in: regenerarea peretelui celular, diviziune celulara, formare de calus si, in final, diferentiere embrionara si/sau diferentiere de organe. In timpul regenerarii peretelui celular, concentratiile de ar

trebui sa fie ridicate, iar potentialul osmotic (negativ) al mediului de nutritie sa fie scazut, in timp ce densitatea celulara ( ca si in cazul culturilor celulare in suspensie) joaca un rol important. Dupa regenerarea peretelui celular (in primele zile), potentialul osmotic (negativ) al mediului trebuie crescut gradat. Prima diviziune celulara are de obicei loc la 2-7 zile dupa izolarea protoplastilor. Cultivarea protoplastilor: 1. Suspensie intr-un strat subtire de mediu lichid intr-o placa Petri. 2. Pe un mediu solid utilizand tehnica Bergmann. 3. In microcamere intre placi de sticla sau suspendate in picaturi. 4. In picaturi de mediul lichid ( metoda micropicaturilor) care sunt plasate intr-o placa Petri. 5. In culturi-crese , in special cand densitatea protoplastilor este mica. Stratul de alimentare poate fi folosit in locul culturilor-cresa. Aici protoplastii sunt crescuti pe un strat celular de care sunt separati printr-un celofan sau hartie de filtru. 6. Intr-un strat sau mediu semi-lichid care este pe un mediu solid. 7. In culturi cu discuri de agaroza sau margele de agaroza. \ Cultivarea protoplastilor cu perete celular este foarte similara cu cea a celulelor individuale, necesitand o atentie speciala pentru compozitia mediul de cultura si a factorilor de crestere fizici. Protoplastii sunt crescuti in cea mai mare parte la intuneric sau la lumina foarte slaba. Dupa producerea de microcalusuri, sunt necesare subcultivari pe alte medii pentru a induce regenerarea.

Regenerarea plantelor
Sansa regenerarii unei plante din protoplasti izolati este relativ mica. Pana in anul 1983 aceasta tehnica era posibila doar la 66 de specii din tre care majoritatea apatniceau familiei Solanaceae. Gramineele (cu exceptia orezului) sunt foarte dificil de regenerat.

Urmatorii factori determina rata de succes in regenerarea palntelor din protoplasti: 1. Familia, specia si genotipul. 2. Starea de diferentiere a celulelor donatoare; celulele juvenile si cele din meristemul apica (shoot tips?) au un potential regenerativ mai mare. 3. Starea fiziologica a materialului donator. 4. Folosirea unui mediu de nutritie imbogatit. Formarea de calus din protoplasti izolati este frecvent indusa pe mediile Kao si Michayuluk, in timp ce formarea de embrioni si organe este indusa pe mediul B5 la care se adauga 5-10% lapte de cocos. Mediul Murashige si Skoog este des folosit.

Relevanta hibridizarii somatice


Posibile avantaje ale hibrizilor somatici: 1. Utilizand hibridizarea somatica este posibil sa fie creati hibrizi care nu pot fi obtinuti din incrucisari normale, datorita barierei taxonomice sau a altor bariere. Un exemplu interesant il constituie hibridizarea somatica intre Solanum tuberosum (formare de tuberculi, rezistenta la boli foarte mica sau absenta) cu Solanum brevidens (fara formare de tuberculi, rezistenta la boli), fapt ce nu ar fi posibil in vivo. Alte exemple: Brassica oleracea x B. campestris , Medicago sativa x M. falcata . Totusi, ultimele doua exemple pot fi obinute si pe cale sexuala, insa aceste incrucisari sunt mai greu de realizat in vivo si depind de genotip. 2. Hibridizarea somatica poate fi folosita ca o alternativa in obtinerea tetraploizilor, daca tratament cu colchicina nu da rezultate. Hibridizarea somatica este valoroasa doar in cazul in care metodele normale ale duplicarii prin mitoza sunt imposibile. 3. In principiu, se pot obtine hibrizi de la plante subletale, a caror organe sexuale sunt anormale sau a caror masculi sunt complet sterili, insa accesti hibrizi pot stoca caractere recesive nedorite la nivelul materialului genetic. 4. Hibridizarea este posibila intre plante juvenile (ca nu au inflorit) si intre cele deja inflorite,mature. 5. Hibridizarea partiala da nastere la asa numitii hibrizi asimetrici la care nu toti cromosomii se combina dupa fuziunea nucleara.

6. In timpul reproducerii sexuale doar cromosomii de la gametul mascul sunt transferati descendentilor. Prin hibridizare somatica atat gametii femeli cat si cei masculi transfera nucleul si citoplasma hibrizilor si descendentilor. Prin hibridizare citoplasmatica, nucleul unuia din partenerii fuziunii ar trebui sa fie eliminat, fie inaintea fuziunii (prin iradiere) sau dupa fuziune (dupa hibridizarea somatica).

Dezavantaje si probleme ale hibridizarii somatice


1. Lipsa unei metode eficiente de selectie 2. Produsul rezultat in urma hibridizarii somatice este uneori steril, malformat, instabil, deci nu sunt viabili, in special daca fuziunea a avut loc intre specii taxonomic indepartate. 3. Dezvoltarea de calusuri chimerice in locul hibrizilor. Acest lucru se datoreaza faptului ca nucleii nu fuzioneaza dupa ce celulele au fuzionat, si se divid separat. Plantele regenerate din chimere ulterior is pierd caracteristicile chimerice. 4. Hibridizarea somatica intre doi diploizi duce la formarea unui amfidiploid care este in general nefavorabila ( cu exceptia formarii intentionate a tetraploizilor). Hibridizarea a 2 protoplasi diploizi este in general recomandata. 5. Plantele regenerate in urma hibridizarii somatice sunt in general foarte variabile, ca rezultat al: a. Eliminarii cromosomilor, lucru comun in hibridizarea speciilor taxonomic diferite pentru ca nucleii sunt incompatibili. Rezulta aneuploizi si cibrizi. b. Translocatiei c. Variabilitatii somaclonale d. Segregarii organitelor. 6. Niciodata nu este sigur ca o anumita caracteristica va fi exprimata dupa hibridizarea somaclonala. 7. Stabilitate genetica scazuta 8. Numar mic al plantelor regenerate din protoplasti 9. Se presupune ca hibridizarea somatica este posibila in vitro la 2 specii incompatibile in vivo. 10. Producerea de cibrizi (hibrizi citoplasmatici) nu prea a avut succes. Un exemplu de succes il constituie hibridizarea intre Nicotiana plumbaginifolia (neiradiata) si

Nicotiana tabacum ( iradiata cu cobalt radioactiv). Nucleul de la N. tabacum este eliminat, in timp ce citoplasma este transferata noului hibrid.

Fig1. Fuziunea protoplastilor

Fig2. Hibridizare somatica