INSTITUTO DE CINCIAS DA SADE

CURSO DE FARMCIA

ROTEIRO PARA AULAS PRTICAS

DISCIPLINA:

IMUNOLOGIA CLNICA

Curso: FARMCIA Disciplina: Imunologia Clnica

Instituto de Cincias da Sade

AULA

Titulo da Aula: Aglutinao

OBJETIVO: mostrar ao aluno, reaes de anticorpo in vitro

formao do complexo antgeno-

Aglutinao Passiva: Determinao de Protena C-Reativa Finalidade: Teste de aglutinao passiva para deteco da Protena C-Reativa no soro humano. A Protena C-Reativa (PCR) em altas concentraes est associada infeces agudas, situaes necrticas e a uma variedade de estados inflamatrios. A monitorizao dos nveis de PCR nos permite avaliar a eficcia do tratamento e a recuperao do paciente. Princpio: As partculas de ltex so sensibilizadas com anticorpos humanos antiPCR. Quando se mistura a suspenso de ltex contendo elevados nveis de PCR, ir produzir-se uma aglutinao ntida em um perodo mximo de 2 minutos. Procedimento: Teste Qualitativo 1) Em cada crculo da placa colocar:

Crculo nmero 1 Controle Negativo Controle Positivo Amostra nmero 1 **Ltex FR 50l 1 gota

Crculo nmero 2 50l 1 gota

Crculo nmero 3 50l 1 gota

Crculo nmero 4 1 gota

2) Misturar com auxlio de esptula utilizando toda a extenso de cada crculo da lmina. 3) Agitar a lmina com movimentos circulares por dois minutos. 4) Observar os resultados. REAO POSITIVA: Ntida aglutinao. REAO NEGATIVA: Ausncia de aglutinao (suspenso homognea). 2) Aglutinao Passiva: Determinao de Fator Reumatide Finalidade: Teste de aglutinao passiva para o diagnstico de fator reumatide (FR).

Princpio: Partculas de ltex sensibilizadas com IgG. A aglutinao visvel em amostra com concentrao de FR igual ou superior a 8 UI/ml, de acordo com as referncias estabelecidas.

3) Aglutinao Passiva: Determinao de hCG Finalidade: Teste de aglutinao passiva para o diagnstico de gravidez, por deteco de hCG. Princpio: Aglutinao direta em lmina de partculas de ltex sensibilizadas com anticorpos anti-hCG altamente purificados. Os anticorpos so especficos para a cadeia do hCG. Quando o hCG est presente na urina ocorre aglutinao, a qual considerada como resultado positivo. A sensibilidade do teste de 0,2UI/mL, nvel de hormnio encontrada 3-4 dias aps atraso menstrual. Procedimento: Teste Qualitativo 1) Em cada crculo da placa colocar: 50ul amostra (1gota) + 50 gota ltex (1gota) 2) Misturar com auxlio de esptula utilizando toda a extenso de cada crculo da lmina. 3) Agitar a lmina com movimentos circulares por dois minutos. 4) Observar os resultados. REAO POSITIVA: Ntida aglutinao. REAO NEGATIVA: Ausncia de aglutinao (suspenso homognea). Exerccios propostos (no obrigatrio) 1) Nos testes de hamaglutinao para Toxoplasmose e doena de Chagas, pede-se: a) Qual suporte foi empregado? b) Realizou-se a pesquisa de anticorpos. Que tipo de antgeno foi empregado? c) Quais cuidados devem ser observados na realizao do teste? d) Qual tipo de resposta imunolgica foi ativada? Explique. e) Suponhamos que tenha se detectado na pesquisa da paciente a presena de IgM (IgM+ - ou reagente), o que significa? Qual a relevncia da positividade de uma IgM em uma gestante? f) Qual o valor da pesquisa de IgG para a Doena de Chagas? Explique.

MATERIAIS Descarte com hipoclorito Placa de fundo escuro (acompanha o kit) Palito para homogeneizar os reagentes (acompanha o kit) Pipeta automtica de 5l -20l Ponteiras amarelas (menor volume)

QUANTIDA DE

EQUIPAMENTOS

QUANTIDA DE

Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurana:

Curso: FARMCIA Disciplina: Imunologia Clnica
Instituto de Cincias da Sade

AULA

Titulo da Aula: Precipitao

OBJETIVO: Orientar o aluno sobre a aplicao e execuo da tcnica de

precipitao Imunodifuso Radial. Tcnica de Imunodifuso Radial Princpio do Teste: Tcnica segundo Mancini, Carbonara e Heremans. Tem como finalidade a dosagem das imunoglobulinas IgG, IgA, IgM e outras protenas sricas como C3 e C4. O gar misturado com a diluio apropriada do anticorpo especfico para determinado atgeno e a mistura colocada em placa de Petri. Em locais apropriados do gel so feitos orifcios onde se colocam volumes precisos das solues de antgenos a serem testadas, bem como solues-padro, com pelo menos trs concentraes conhecidas do antgeno. O suporte incubado em cmara mida at o trmino da difuso 72horas mtodo de Mancini. O mtodo de Mancini mede o dimetro do halo aps o trmino da difuso (ponto final), baseia-se no fato que aps que aps um certo tempo, dependendo da concentrao e do peso molecular da protena, o halo de precipitao alcana um valor mximo, que no aumenta, ainda que o perodo de incubao seja ampliado. (Adaptado de: Ferreira, W.A., vila, L.M.S. Diagnstico laboratorial das principais doenas infecciosas e auto-imunes, Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan, 2001). Procedimento: 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) Escolher a placa adequada para cada tipo de protena a ser dosada. Abrir a placa para permitir a evaporao de excesso de umidade, se presente. Aplicar 5l de amostra. Aguardar de 5 a 10 minutos (sem movimentar a placa). Fechar firmemente a tampa. Incubar em cmara mida durante (48-72h), temperatura ambiente. Proceder leitura do halo de precipitao com preciso de 0,1mm, com rgua especial. 8) Determinar a concentrao da amostra mediante grfico.

Observao: Para a construo da curva-padro os dados sero fornecidos pelo professor

MATERIAIS Descarte com hipoclorito Pipeta automtica de 5l

QUANTIDAD E

EQUIPAMENTOS

QUANTIDAD E

Descarte do Segurana:

material

utilizado

conforme

Normas

Internacionais

de

Curso: FARMCIA Disciplina: Imunologia Clnica

Instituto de Cincias da Sade

AULA

Titulo da Aula: Enzimtico - ELISA

OBJETIVO: Mostrar ao aluno, reaes de formao do complexo antgeno-anticorpo in vitro com o emprego de um teste enzimtico aplicado na prtica de diagnstico e de triagem. Princpio A amostra diluda no suporte no qual se encontra o antgeno imobilizado. Se a mesma contiver os anticorpos especficos, estes formaro um complexo com os antgenos e permanecero unidos. A frao no unida eliminada por lavagem. Adicionar os anticorpos anti-imunoglobulina humana marcados pela enzima (conjugado). Se ocorrer a reao na primeira etapa do processo, o conjugado se unir ao anticorpo da amostra. Aps uma nova lavagem, se adiciona o substrato cromognico. Nos casos onde o conjugado tiver se unido, haver surgimento de colorao celeste. A reao se detm com cido sulfrico, com o que a colorao azul celeste torna-se amarela. Procedimento 1. Estabelecer o plano de distribuio e identificao das amostras e dos controles. 2. Pipetar 200l do diluente + 10l dos controles positivo, negativo e amostra. Fazer um controle branco no qual ser adicionado somente 200l do diluente. 3. Bater levemente nas laterais da placa. 4. Incubar por 30 minutos a 37C . 5. Desprezar o lquido de cada poo e lavar 5 vezes com tampo de lavagem. 6. Distribuir 50l do conjugado anti-Ig humano peroxidase. 7. Incubar por 30 minutos a 37C. 8. Lavar como no item 5. 9. Distribuir 50l do Revelador A + 50l do Revelador B. (uma gota de cada e cada um dos poos). 10. Incubar por 30 minutos a 37C. 11. Distribuir 50l do stoper em cada poo. LEITURA: Proceder leitura da reao em espectrofotmetro para microplacas utilizando filtro 450m. Exerccio proposto (no obrigatrio) Para as tcnicas imunoenzimticas, responda:

a) Explique o princpio do teste imunoenzimtico. b) Esquematize um teste ELISA para a pesquisa de anticorpos. c) Explique como em um teste ELISA pode-se determinar a fase da doena, contra qual doena o anticorpo encontrado na amostra. d) O que o conjugado empregado no teste ELISA para a pesquisa de anticorpos? Explique. e) Qual o princpio do teste de Western blotting WB? Explique. f) Porque devemos realizar as etapas de lavagem? Qual o objetivo? g) Diferencie o substrato cromognico do teste ELISA e WB.

MATERIAIS Descarte com hipoclorito Pipeta automtica de 5l , 25l, 50l, 100l, 500l Proveta 50mL (para diluir tampo de lavagem) Balo volumtrico 200mL (para diluir tampo de lavagem) Ponteiras amarelas (volume at 200l) Ponteiras azuis (volume at 1000l) Bquer de 200mL (para soluo de lavagem) Pipeta Pasteur de plstico ou vidro (para lavagem)

QUANTIDAD E

EQUIPAMENTOS Leitora de placas (ELISA)

QUANTIDAD E

Descarte do Segurana:

material

utilizado

conforme

Normas

Internacionais

de

Antes de descartar as placas usadas autoclavar.

MATERIAIS

QUANTIDA DE

EQUIPAMENTOS

QUANTIDA DE

Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurana: