ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA CON SDS SDS-PAGE

FUNDAMENTO TERICO La electroforesis es una tcnica de separacin de molculas cargadas por migracin en un campo elctrico. Las molculas se separan en funcin de su carga elctrica, desplazndose al electrodo de carga contraria y a mayor velocidad cuanto mayor es la carga de la molcula. Cada molcula se desplaza en el campo elctrico alcanzando una velocidad constante. En el estado estacionario, la fuerza impulsora (fuerza del campo elctrico) se equilibra con la resistencia al avance (fuerza de friccin hidrodinmica) en el medio en que se desplaza. Se define la movilidad electrofortica como la velocidad de desplazamiento por unidad de campo elctrico. En unas condiciones determinadas de electroforesis, la diferente movilidad de cada molcula define su comportamiento y separacin en el espacio. Diferentes molculas tendrn diferente movilidad electrofortica en un medio determinado. Hay tres tipos de electroforesis: De frente mvil. Zonal. Continua. Se pueden utilizar diferentes medios de soporte para evitar perturbaciones mecnicas y los efectos de las corrientes de conveccin en la separacin. Como medios de soporte se pueden utilizar papel, acetato de celulosa, geles de almidn, geles de agarosa o geles de poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida son el resultado de la polimerizacin qumica de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. Controlando la concentracin de ambas obtenemos geles de diferente grado de reticulacin (diferente dimetro de poro). Uno de los mtodos de electroforesis ms comnmente aplicado para protenas es el que emplea geles de poliacrilamida (PAGE = polyacrylamide gel electrophoresis) en presencia del detergente aninico dodecilsulfato sdico (SDS). Esta tcnica es conocida como SDS-PAGE. Para ello se prepara un gel en placa vertical. En la preparacin del gel, la polimerizacin de los monmeros de acrilamida produce cadenas lineales. Al incluir bisacrilamida, sta da lugar a puntos de ramificacin en el polmero, lo que permite formar una matriz tridimensional, dando lugar al gel de poliacrilamida. El tamao de los huecos o poros que forma la retcula del polmero depende de la concentracin de acrilamida y del grado de entrecruzamiento (es decir, de la proporcin de bisacrilamida con respecto al total). As, variando la concentracin de acrilamida y bisacrilamida en la preparacin del gel se consiguen distintos grados de porosidad y, por tanto, distintos intervalos de separacin de protenas. Tambin se aade un tampn (comnmente Tris-HCl). Adems, se aade un agente iniciador de la polimerizacn como el persulfato amnico, que al disolverse en agua genera radicales libres que transforman la acrilamida en radical libre y se inicia la polimerizacin. Tambin se aade al medio TEMED (N,N,N,N-tetrametil-etilenodiamina) como catalizador porque puede existir en forma de radical libre. Las muestras proteicas se tratan, previamente a su fraccionamiento, con SDS a 100 C. Como consecuencia de este tratamiento y de la presencia posterior de SDS durante toda la

separacin (tanto en el tampn de electroforesis como en la composicin del gel), las protenas se mantienen desnaturalizadas. El SDS tiene la propiedad de unirse a las cadenas polipeptdicas en una proporcin masa:masa constante (1.4 g SDS/g de protena), de modo que en el complejo SDS-protena la carga de la protena queda enmascarada por la de las mltiples molculas de SDS y sta es proporcional al tamao (n de aminocidos). Esta electroforesis es discontinua pues utiliza dos geles: Un gel concentrador con bajo grado de reticulacin y pH 6,8 ( gel acumulador o stacking gel). Un gel separador con grado de reticulacin mayor con valores entre 6% y 15%, pudindose tambin utilizar gradientes de concentracin de acrilamida (gel separador). En la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, la separacin de protenas se hace en funcin de la masa molecular. Tanto es as que la representacin del logaritmo de la masa molecular frente a la distancia migrada obedece a una lnea recta para gran nmero de protenas. Para que esta dependencia sea correcta, es preciso romper los puentes disulfuro intra- e intercatenarios, para lo cual es frecuente aadir durante la preparacin de la muestra un agente reductor, generalmente 2mercaptoetanol. De este modo, la masa molecular observada corresponde a la de cada subunidad de una protena, no a la protena completa, al existir una relacin lineal. Para aplicar la muestra al gel, se le suele aadir un agente que la haga ms densa, generalmente glicerina o sacarosa. Adems, para seguir el avance de la separacin, se aade un colorante, como azul de bromofenol, que sirve como referencia (tracking dye). ste tiene una movilidad mayor que la de cualquier macromolcula y, por tanto, si se aplica corriente hasta que el colorante est a poca distancia del extremo inferior del gel, se tiene la seguridad de que ninguna macromolcula se ha salido del gel por avance excesivo. MATERIAL Y REACTIVOS Fuente de electroforesis. Bao de incubacin Cubeta de electroforesis con cristales, peines y separadores. Formador de geles Pipetas Solucin de acrilamida/bisacrilamida: Contiene 30 % acrilamida + 0.8 % bisacrilamida preparada en agua destilada Disolucin de SDS: 10 % en agua destilada Disolucin de persulfato amnico: 100 mg/mL en agua destilada TEMED (solucin comercial) Tampn del gel separador: Tris 1M; pH = 8,8 Tampn del gel acumulador: Tris 0,5 M; pH = 6,8 Tampn de Ruptura 5X que contiene: 2,5 ml de solucin de SDS 10%; 0,2 ml de 2-mercaptoetanol; 0,5 ml de azul de bromofenol 0,05%; 0,3 ml de tampn de electroforesis; 1 ml de glicerol y 0,5 ml de Tris 0,5 M pH 6,8. Tampn de electroforesis: contiene 14,4 g/l de glicina, 3 g/l de Tris (base) y 10 ml/l de SDS 10%. Marcadores preteidos de peso molecular

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

MONTAJE DEL SISTEMA DE ELECTROFORESIS Se utilizar un gel plano de 1,5 mm de grosor. Montar el sandwich con dos placas de vidrio (uno tiene un rebaje) y los dos separadores en vertical entre ellas y a ambos lados. Introducirlo en el soporte formador de geles. Sujetar el conjunto. Se emplear un gel separador con un 7,5 % de acrilamida y un gel acumulador con un 4,8% de acrilamida. Los geles se preparan mezclando, en un vaso de precipitados, los componentes indicados en la tabla (el persulfato y el TEMED inician la reaccin de polimerizacin, por lo que se deben aadir en ltimo lugar) y rpidamente proceder al llenado con la mezcla (las cantidades indicadas dan para dos geles). La solucin de acrilamida/bisacrilamida se debe utilizar con guantes y pipetear con propipeta. Primero se polimeriza el gel separador (ver tabla). Para ello se rellena, con la mezcla todava lquida, el espacio entre las dos placas hasta unos 3 cm del borde superior del cristal corto, usando una pipeta pasteur. Aadir encima una pequea cantidad de agua destilada (esto hace que la superficie del gel quede recta). Esperar a que polimerice el gel (entre 30 y 60 min, observar la mezcla sobrante en el vaso). Volcar para retirar el agua destilada. Secar con un papel de filtro. Aadir sobre este gel separador la mezcla (ver tabla) del gel acumulador y antes de que polimerice introducir en la parte superior el peine, que formar en el gel acumulador los pocillos para luego poder aplicar las muestras. Se guarda el gel en la cmara fra hasta el da siguiente. Gel separador (7,5%): Agua destilada Acrilamida/Bisacrilamida Tris 1 M pH 8,8 SDS 10% TEMED Persulfato amnico (100 mg/1 ml) Gel concentrador : Agua destilada Acrilamida/Bisacrilamida Tris 0,5 M pH 6,8 SDS 10% TEMED Persulfato amnico (100 mg/ 1 ml) 5,8 mL 1,65 mL 2,5 mL 100 L 6,5 L 94 L

12 mL 6,25 mL 6,25 mL 250 L 12,5 L 200 L

SEPARACION DE LAS PROTEINAS POR SDS-PAGE

PREPARACION DE LAS MUESTRAS Una vez polimerizado el gel concentrador se aplica la muestra. Las muestras deben de contener una masa proteica en torno a 24-30 g. Como todas las muestras tienen que tener la misma cantidad de protena, se toma el volumen que se necesite de cada una de las protenas problema. Para ello, se toman 24 l de la solucin con la protena problema y se aade a la muestra tampn de ruptura 5X en una relacin 4:1 (volumen:volumen) (por tanto, 6 l). Utilizar un tubo con 10 L de patrones preteidos de peso molecular conocido. Esta mezcla ya contiene el tampn de ruptura. Las patrones preteidos contienen las siguientes protenas. Se recoge el peso molecular aparente. Protena patrn preteida Peso molecular aparente (daltons) Miosina 198.840 -Galactosidasa 115.700 Albmina srica 96.740 Ovoalbmina 53.540 Anhidrasa carbnica 37.130 Inhibidor de tripsina 29,130 Lisozima 19.540 Nota: El peso molecular aparente de la protena patrn preteida no se corresponde con el peso molecular real de la protena utilizada. Mantener las muestras durante 5 minutos a 100 C. Centrifugar los tubos a baja velocidad durante un minuto para concentrar toda la muestra en el fondo del tubo. Retirar con cuidado el peine al gel preparado el da anterior. Sacar del formador de geles el sandwich de placas de vidrio, separadores y gel y sujetarlo en vertical en la cubeta de electroforesis. Llenar las cmaras superior e inferior de la cubeta de electroforesis que contienen los electrodos con tampn de electroforesis, de modo que entre en contacto con ambos extremos del gel. Se aplican las muestras y los patrones de peso molecular en los pocillos del gel, usando micropipetas con puntas finas. Se completa cada pocillo con tampn de ruptura 1X preparado diluyendo el tampn de ruptura 5X en tampn de electroforesis. Se aade al pocillo. Es conveniente anotar el orden de aplicacin de las muestras, as como identificar el gel en el que estn las muestras que corresponden a cada taquilla.

DESARROLLO DE LA ELECTROFORESIS Conectar los cables de la cubeta a una fuente de corriente continua (comprobar la polaridad: rojo (+), negro (-)). Aplicar 80 V hasta que el frente (visible por la banda azul de bromofenol) entre en el gel separador; despus subir a 120 V. Cuando el frente, se acerce al extremo inferior del gel, desconectar la corriente y sacar el sandwich (tarda aproximadamente una hora y cuarto). Separar las placas de vidrio con ayuda de una esptula y sacar el gel (usar guantes para evitar tocar el gel con los dedos) con cuidado de no invertir su orientacin. Una vez finalizada la transferencia, se tie el gel de electroforesis mediante su inclusin en solucin de tincin que contiene Azul de Coomassie, cido actico, metanol durante 2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, se pasa el gel a solucin de destincin que contiene cido actico 10% y metanol 10% en agua, destiendo el gel durante toda la noche.

CUESTIONES: 1.- En una electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS, qu protenas presentan mayor movilidad electrofortica en el gel separador? 2.-Qu sustancia se usa como marcador de frente? 3.- Por qu se utilizan dos geles (concentrador y separador) en la electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS? 4.- Qu posibles aplicaciones presenta este mtodo? 5.- Qu patrn de bandas se obtiene en la muestra de marcadores? 6.- Representar las movilidades electroforticas de los patrones de peso molecular preteidos frente al logaritmo del peso molecular de cada patrn (en papel milimetrado). 7.- Calcular la movilidad electrofortica de la protena problema (a partir de la banda que aparece en el gel tras tincin y distincin del mismo). 8.- Calcular el peso molecular de la protena problema.