INSTITUTUL NAIONAL DE CERCETARE DEZVOLTARE PENTRU CARTOF I SFECL DE ZAHR BRAOV

TEHNOLOGIE MODERNIZAT DE PRODUCERE A MATERIALULUI CLONAL LA CARTOFUL PENTRU SMN

2010

Lucrare elaborat n cadrul Programului 4 Parteneriate n domeniile prioritare Proiect nr.2974/2007, Contract 51-019/2007 ntre CENTRUL NAIONAL DE MANAGEMENT PROGRAME CNMP, BUCURETI, autoritatea contractant i INSTITUTUL NAIONAL DE CERCETARE - DEZVOLTARE PENTRU CARTOF I SFECL DE ZAHR BRAOV, Contractor.

Parteneri: USAMV BUCURETI ULB SIBIU SCDA SUCEAVA

Lucrarea se distribuie gratuit

Autori: Dr.ing. Nicoleta CHIRU Dr. chim. Carmen BDRU

TEHNOLOGIE MODERNIZAT DE PRODUCERE A MATERIALULUI CLONAL LA CARTOFUL PENTRU SMN

Introducere n contextul economico-social actual, efectele crizei mondiale, care preseaz astzi omenirea, se manifest cu intensitate sporit i n unul din cele mai importante sectoare ale Romniei agricultura. Aceste influene perturbatoare sunt prezente i la cultura cartofului, cu potenri difereniate de zona climatic, de nivelul de asigurare a bazei materiale, de existena unor strategii anticriz. ntr-o lume confruntat cu ocul climatic, cu criza de energie i alimente, cartoful rmne una dintre cele mai importante culturi care va putea asigura alimentaia mondial pentru perioada urmtoarelor decenii. Cartoful are o tradiie relativ ndelungat n agricultura Romniei, principalele referiri fiind consemnate n Transilvania secolului XVIII. Ca i n alte ri europene, marea foamete din 1800 a contribuit la rspndirea cartofului n cele trei ri romne: Moldova, Transilvania i Valachia. Diferitele denumiri ale cartofului pstrate n limba romn atest zonele de provenien, majoritatea fiind localizate n Germania i Austria. Cu trecerea timpului importana culturii a crescut i astzi cartoful este considerat ca fiind a doua pine a Romniei. Optimizarea principalilor factori de producie care contribuie la mbuntirea calitii cartofului pentru smn, capt o importan deosebit n condiiile actuale cnd preurile inputurilor cresc de la an la an. Obinerea de producii ct mai mari cu costuri mai reduse, pentru creterea eficienei economice a culturii a devenit principala preocupare a cultivatorilor de cartof. Pentru realizarea acestor deziderate, pe baza cerecetrilor efectuate n ultiumii ani s-a elaborat actuala tehnologie modernizat care isi propune imbunatatirea metodei clasice de producere a cartofului pentru samanta si implicit cea de multiplicare in vitro a soiurilor de cartof pretabile pentru o agricultura durabila si n conditiile din Romania: soiuri cu rezistenta genetica la viroze si mana, care necesita mai putine tratamente de combatere a bolilor si daunatorilor, soiuri mai tolerante la stresul termohidric, soiuri cu un coeficient mai ridicat al apei si fertilizantilor. Prin obtinerea de microtuberculi in vitro se reduce schema producerii de samanta certificata la cartof cu 3-4 ani fata de sistemul clasic, deci scade numarul de ani de cultivare in camp si implicit numarul tratamentelor cu pesticide, ducand in final i la eliminarea oboselii solului

Extinderea tehnologiei de producere a microtuberculilor cu cea mai buna aplicabilitate la agentii economici specializati in producerea cartofului de samanta va duce la sporirea materialului pentru plantat din categoria prebaza. Materialul obtinut si reinmultit in continuare contribuie la obtinerea unei cantitatiti sporite de cartof pentru samanta de o calitate foarte buna. Date statistice i tendine Cu excepia perioadei 1970-1990, cnd suprafeele au fost concentrate ntr-un sistem industrial de cultur, att perioada anterioar ct i cea actual se caracterizeaz prin dimensiunile mici ale parcelelor. In perioada ultimilor 50 de ani suprafaa medie a fost de 250000-316000 ha (plasnd Romnia pe locul 2-3 mpreun cu Germania i dup Polonia) cu o producie medie de 14.5 t/ha i cu o producie total de 2.6-4.4 milioane tone (figurile 1, 2 i 3).

350 300 Suprafata (x 1000 ha) 250 200 150 100 50 0 19571960 19611970 19711980 19811990 Perioada Suprafata ProdMED Linear (Suprafata) 19912000 20012007 2008

18,0 16,0 14,0 12,0 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0 Prod. Medie (t/ha)
Productia medie (t/ha)

Linear (ProdMED)

Figura 1. Evoluia suprafeei i a produciei medii n Romnia n ultimii 50 de ani (1957-2007) i 2008
Suprafata (x 1000 ha) 600,0 500,0 400,0 300,0 200,0 100,0 0,0

50,0 45,0 40,0 35,0 30,0 25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0
rit an ie Ita lia O la nd a Sp an ia Fr an ta D an em B Be lg ia ar ca

Po lo ni a R om an ia G er m an ia

M ar ea
Tara Productia medie

Suprafata

Linear (Productia medie)

Figura 2. Locul Romniei n UE dup suprafa i producie medie (Topul primilor 10 productori, 2007)

600,0 Suprafata (x 1000 ha) 500,0 400,0 300,0 200,0 100,0 0,0

14,0 12,0 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0

Po lo ni a R om an ia G er m an ia

rit an ie

Ita lia

O la nd a

Sp an ia

Fr an ta

M ar ea

Tara Productia totala

Suprafata

Figura 3. Locul Romniei n UE dup suprafa i producie total (Topul primilor 10 productori, 2007) Comparat cu producia medie de 30-40 t/ha obinut n rile vestice, n perioada respectiv, n ara noastr producia a fost de 2,5-3,0 ori mai mic, fiind determinat de o serie de factori restrictivi: 1. mrimea redus a exploatailor agricole (peste 2 milioane proprietari cu pn la 0,3 ha), (tabelul 1); 2. calitatea fitosanitar a materialului de plantat (tabelul 2). Analiza suprafeelor ocupate cu loturi semincere la cartof n perioada 1999-2009 (tabelul) este de natur s ngrijoreze, deoarece se constat o diminuare a suprafeelor de pn la 70% comparativ cu anul 1999, dei n anul 2009 se observ o cretere relativ a categoriilor superioare comparativ cu anul 2008; Tabelul 1. Suprafaa medie cultivat cu cartof n funcie de tipul exploataiei agricole

Tipul exploataiei agricole

Numrul de Suprafaa medie cu proprietari 2261000 1197 498 5 cartof (ha) 0,3 13,7 25,6 86,0

Cultivatori individuali Asociaii familiale Societi comerciale Uniti de cercetare

D an em

Be lg ia

ar ca

Productia totala (mil tone

Tabelul 2. Situaia evoluiei loturilor semincere la cartof (1999-2009)

Pe categorii biologice Anul Suprafata plantat ha Prebaz 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 6438,50 4945,00 5185,00 3353,40 2810,10 3095,80 1731,00 2257,00 2620,64 2174,32 1973,09 2,80 1,00 44,00 35,00 64,80 30,00 38,50 8,00 37,00 Baz SE 369,60 82,50 86,50 65,00 140,00 146,80 80,00 175,00 102,80 54,00 68,70 E 1201,30 658,70 579,20 158,10 213,70 510,30 181,50 152,00 304,28 158,30 194,60 Certificat Clasa A 1857,20 1391,30 1279,20 1252,60 1030,00 1167,20 960,70 1212,00 1106,72 1201,50 919,81 Clasa B 1938,30 1414,80 2200,30 1316,30 1382,50 1027,00 444,50 686,00 1068,34 752,52 752,98

3. lipsa resurselor financiare pentru cultivatorii de cartof; 4. nivelul sczut al cunotiinelor profesionale la cultivatorii de cartof; 5. condiiile climatic n ultimii ani. O analiz a poziiei Romniei comparativ cu rile central i est europene, n perioada 19972007, arat c dup Polonia ara noastr ocup locul al doilea din punct de vedere al suprafeei, produciei medii i a produciei totale (figurile 4 i 5). O caracteristic general este faptul c suprafeele rmase n cultur, n majoritatea rilor enumerate, au sczut la 49-68%, excepie face Romnia la care suprafaa a sczut cu numai 5%. Aceiai tendin de scdere se vede i la producia total de cartof (tabelul 3).

600,00 Su p rafata (x 1000 h a) 500,00 400,00 300,00 200,00 100,00 0,00

Polonia Supraf ata Productia medie 569,60 21 Romania 267,03 14 Rep. Ceha 31,90 26

30 25 20 15 10 5 0
Ungaria 25,40 21 Bulgaria 22,43 13 Slov acia 17,77 16 Slov enia 5,73 23

Suprafata

Productia medie

Figura 4. Suprafaa i producia medie n 7 ri UE Central i Est Europene (2007)

Pro d u ctia m ed ie (t/h a)

S u p ra f a t a ( x 1 0 0 0 h a )

600,00 500,00 400,00 300,00 200,00 100,00 0,00 Polonia Romania Suprafata Productia totala 569,60 11791 267,03 3705 Republic Ungaria Bulgaria Slovacia Slovenia a Ceha 31,90 820 Suprafata 25,40 531 22,43 290 Productia totala 17,77 287 5,73 131

14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0

Figura 5. Suprafaa i producia total n 7 ri UE Central i Est Europene (2007)

P ro d u c t ia t o t a la ( x 1 0 0 0 t )

Tabelul 3. Evoluia suprafeei cultivate cu cartof i producie total n Romnia i n apte ri central i est europene (1997-2007) i 2007 Suprafaa (ha x 1000) ara Media 1997-07 Polonia Romania Republica Ceh Ungaria Bulgaria Slovacia Slovenia 1036,16 300,39 55,73 42,53 43,19 27,26 8,37 2007 569,60 267,03 31,90 25,40 22,43 17,77 5,73 Diferena 465,56 33,36 23,83 17,13 22,43 17,77 5,73 % 55 89 57 60 52 62 68

Producia total (t x 1000) ara Media 1997-07 Polonia Romania Republica Ceh Ungaria Bulgaria Slovacia Slovenia 18465.9 4166.44 796.36 913.87 520.86 415.31 174.02 2007 11791.1 3705.69 820.51 531.30 290.55 287.66 131.05 Diferena 6674.79 460.75 -24.15 382.57 230.31 127.65 42.97 % 64 89 103 58 56 69 75

Pornind de la analiza situaiei actuale din ara noastr i de la contextul european i mondial se prevede urmtoarea evoluie a culturii cartofului n Romnia n perioada 2008-2013 (tabelul 4). Din datele prezentate se constat c n anul 2013 producia medie va fi de cca 23.0 t/ha, suprafaa total reducndu-se la 200000 ha n timp ce producia total va ajunge la 4.6 milioane tone,

crescnd ponderea cartofului timpuriu i de var i a cartofului pentru procesare i producere de smn. Tabelul 4. Evoluia culturii cartofului n Romnia n perioada 2008-2013 Realizat Prognoz 2008 2009 2010 4042 250 16000 4000 42 3597 3597 2011 4362 240 18000 4320 42 3908 3908 2012 4442 220 20000 4400 42 3988 3988 2013 4542 200 23000 4600 42 4088 4088

Specificaie 1.Ofert-total Suprafa Prod. Medie Prod. Total Import 2.Cerere-total Consum d.c.: -consum uman -smn -furaje Consum industrial Disponibil Surs: MAPDR, 2009

UM Mii tone Mii ha Kg/ha Mii tone Mii tone Mii tone

3781.77 3960 281 13322 3743 47 3624 3624 280 14000 3920 40 3525 3525

intern, Mii tone

Mii tone Mii tone Mii tone Mii tone Mii tone

3524 27 400 100 166

3425 25 410 100 435

3477 25 420 120 445

3758 24 430 150 454

3688 24 430 300 454

3788 24 430 300 454

Cartoful, aceast plant minunat, al crui rspuns este proporional cu atenia acordat, este astzi o soluie pentru omenirea aflat n plin criz economic. Cultivarea raional a pmntului poate rmnne principala activitate uman care s asigure n condiii sporite de protecie a echilibrului ecologic, transferul energiei solare n ntregul lan trofic de pe planeta noastr. Particularitatile genetice, fiziologice si agrotehnice ale cartofului, impun cu necesitate asigurarea unui material de plantat corespunzator din punct de vedere fitosanitar, pentru intreaga suprafata cultivata cu cartof din tara si eventualele disponibilitati pentru export. Acest obiectiv se poate realiza prin transpunerea in practica a solutiilor si conceptelor metodologice noi pentru eficientizarea procesului de producere a materialului de plantat la cartof din categoriile biologice superioare si realizarea de tehnologii agricole curate, rentabile si competitive pe plan national si international.

Cartoful se nmultete, n mod obinuit pe cale vegetativ, prin tuberculi. Din punct de vedere morfologic i anatomic, tuberculul de cartof, este o tulpin subteran modificat, n care sunt nmagazinate substanele de rezerv, dintre care predomin hidraii de carbon sub form de amidon. Din punct de vedere fiziologic, tuberculul de cartof, reprezint un organ de nmultire prin care planta se pastreaz peste iarn i se nmultete pentru o nou perioad de vegetaie. De o deosebit importan n realizarea unor producii mari, de calitate superioar i constante, este folosirea unui material de plantat cu valoare biologic ridicat, sntos, care s pstreze fidel caracterele i nsuirile de soi i s prezinte rezisten la boli i duntori. Astfel, materialul de plantat trebuie rennoit periodic, n cantitati suficiente, datorita degenerarii prin infectarea continu i progresiv, cu boli virotice. n zonele de step i silvostep, cu temperaturi ridicate i precipitaii limitate, cartoful este supus la stresuri puternice, care corelate cu condiiile precare de pstrare, adaug procesului de degenerare virotic i o puternic degenerare fiziologic. Pe parcursul nmulirii vegetative nu apar modificari genetice, cu exceptia unor mutatii somatice, care apar rar i cu o inciden foarte mic. Metodologia producerii de smn la catof trebuie s ina seama de modul de reproducere, cu urmatoarele implicatii esentiale: - la nmulirea vegetativ se reproduc neschimbate caracterele la toi indivizii care provin dintr-o singur descendena, obtinut din samna botanic. Astfel, toate plantele unui soi sunt identice, fiind descendeni vegetativi ai aceluiasi genotip; - prin nmulirea vegetativ, materialul de plantat este supuse infeciei virotice i stresurilor fiziologice, se degenereaz i si reduce simitor capacitatea iniiala de producie. Consecinele procesului de degenerare se diminueaz prin rennoirea periodic a materialului de plantat. Multiplele scopuri de folosin a cartofului i diversitatea condiiilor n care se cultiv, impun nmulirea unui sortiment variat de soiuri. Pentru obinerea materialului de plantat liber de viroze, se practic diferite metode. Cea mai modern, cu posibiliti de mbuntaire, n perspectiv, este metod este multiplicarea in vitro , pornind de la culturile de meristeme, iar ca sisteme de cultur in vitro cele mai utilizate pentru cartof sunt: - nmulirea prin intermediul microbutailor; - nmulirea prin intrmediul microtuberculilor; - nmulirea prin intermediul minituberculior. Experiena i practica productiv de pn acum au demonstrat c, prin utitlizarea tehnicilor de cultivare in vitro a explantelor, se pot produce i multiplica plante cu nsuiri biologice superioare, libere de virusuri, micoplasme, bacterioze, nematozi i fungi, eliminndu-se o serie de verigi specifice metodelor convenionale de nmulire, iar randamentului de nmulire a soiurilor valoroase i introducere mai rapid a acestora n cultur este mult mrit

10

Dac avem n vedere c nmulirea cartofului este de tip vegetativ, care asigur concentrarea virusurilor n tuberculi, rezult c singurele posibiliti de prevenire a pagubelor produse de acetia constau n producerea i utilizarea la plantare a unui material liber de viroze, material ce nu poate fi obinut dect prin culturi de meristeme.

Cultura de meristeme la cartof Cultura de meristeme, se realizeaz prin explantarea meristemelor caulinare (apicale sau axilare) i inocularea lor pe un mediu nutritiv de regenerare de plante. Reuita eliminrii virusurilor la cartof, depinde att de tipul de virus ce trebuie eradicat, ct i de mrimea explantului meristematic ce urmeaz a fi inoculat, care constituie principalul factor ce condiioneaz capacitatea de obinere de plante sntoase. Succesul eradicrii bolilor, n general, i a virusurilor, n special, este invers proporional cu mrimea meristemului. Un inconvenient al metodei este acela c planta nu este imunizat contra paraziilor de care a fost eliberat i exist riscul de a surveni o nou infecie, prin transplantarea plantelor generate in vitro, n condiii normale de cultur. Din meristeme se regenereaz plantule, care sunt fragmentate n microbutai, care repicai pe un mediu de cultur se dezvolt n plantule, care apoi pot fi folosite pentru microbutire. Astfel, se creeaz clone identice cu planta mam, care se conserv n eprubete, ca descenden a unei plante sntoase, cu o stare sanitar corespunztoare. Avantajul micropropagrii in vitro prin minibutire, este acela al multiplicrii rapide la infinit a unui material identic genetic cu planta de la care s-a pornit, material n special rentinerit, sntos i mult mai omogen. n consecin, cultura de meristeme ofer posibiliti considerabile, permind: - reproducerea intensiv de indivizi selecionai, cu o rat de multiplicare mai ridicat, dect prin metodele de cultur clasice, i meninerea uniformitii genetice a materialului biologic; - regenerare soiurilor infectate de maladii, n special de virusuri; - conservarea pe termen lung (crioconservarea) a soiurilor valoroase, dar i a materialului gernetic valoros, sau pe cale de dispariie (varieti vechi), n vederea selecionrii de cultivari performani din punct de vedere agronomic. Etapele tehnologiei de multiplicare in vitro n producia comercial de plante prin micropropagare se folosete terminologia propus de Murashige (stadiile I-IV). Stadiile I-III sunt parcurse in vitro, iar stadiul al-IV-lea n condiii de tunele insect-proof. Acestora le-a mai fost adugat un stadiu -O- n care se constituie stocul de plante care vor fi multiplicate dup testarea infeciei virale cu testul ELISA. Etapele tehnologiei de micropropagare sunt prezentate n fig. 6

11

Fig.6 Multiplicarea in vitro. a cartofului Etapa a I-a i a II-a Prima etap const n selectarea materialului biologic pentru propragare in vitro. n mod obinuit explantul meristematic este prelevat de la plante identificate i cunoscute sub raportul autenticitii soiului urmat de pregtirea materialului biologic n vederea inoculrii, care se realizeaz prin sterilizarea acestuia cu ajutorul unor substane chimice. Se trece apoi la excizarea explantelor meristematice (0,1-0,2mm) i inocularea acestora n vase cu mediul de cultur aseptic. Odat cu creterea explantelor i alungirea lstarilor se intr n etapa a-II-a: faza de multiplicare. Aceasta este etapa cea mai important, deoarece coeficientul de multiplicare este criteriul economic major n cazul propagrii. n aceast etap, principalul obiectiv este obinerea unui numr mare de clone n vederea testrii. Pentru un pasaj i un ciclu sunt necesare, n general, patru sptmni. n funcie de specie aceast etap dureaz 10-36 luni. Etapa a III- a Dup testarea plantelor n vederea depistrii prezenei infeciei virale, clonele sntoase existente n stoc in vitro sunt multiplicate prin tehnica minibutirii. Microbutaii obinui sunt plasai pe un mediu de iniiere i cretere ce vor regenera noi plantule cu frunze ce vor fi din nou supuse procesului multiplicrii. Mediul de multiplicare este Murashighe-Skoog.

12

Dei nrdcinarea nu este ntotdeauna o etap uoar, pot fi obinute rezultate satisfctoare dac: se utilizeaz o auxin (n cazul cartofului acid ananaftil acetic (ANA)-); este redus cantitatea de agar din mediul de cultur; este redus intensitatea luminii; iniierea primordiilor radiculare i sczut la 250C n perioada de cretere a rdcinilor. nrdcinarea poate dura ntre 1 i 4 sptmni. Un microbuta dezvolt n condiiile noastre n medie 4 noduri n timp de 3-4 sptmni, ceea ce nseamn 4 plante noi la 3-4 sptmni. Se pot obine teoretic 4n plante, unde n reprezint numrul de cicluri de cultur: 4 plantule dup 3-4 sptmni de multiplicare; 256 plantule dup 3-4 luni de multiplicare; 65536 plantule dup 6-7 luni de multiplicare; 16777216 plantule dup 9-10 luni de multiplicare; 1,7+10n plantule dup un an de multiplicare.

La realizarea unei rate mari de multiplicare, concur numeroi factori asociai cu inoculul, mediul de cultur, condiiile de mediu din camerele de cretere. Un prim factor deosebit de important este umiditatea relativ, care n camera de cretere trebuie meninut la un nivel destul nalt (70%), deoarece vasele nu se nchid etan, pentru a nu se mpiedica schimbul de gaze cu atmosfera exterioar. Lumina are un rol important n orientarea procesului de morfogenez, intensitatea de 0,5 w.m.2 este suficient n timpul culturii. Fotoperioada ideal pentru minibutaii de cartof cultivai in vitro este de 16 ore lumin i 8 ore ntuneric. Un alt factor important pentru dezvoltarea i creterea plantulelor in vitro este temperatura, care trebuie meninut ntre 2210C, fr a ine cont de fluctuaiile diurne i sezoniere la care sunt supuse plantele ntregi cultivate n cmp. n aceast etap se efctueaz testul ELISA. Identificarea infeciilor virotice prin testul ELISA Infeciile cu unele virusuri care infecteaz cartoful - virusul A (PVA), Y (PVY) sau virusul rsucirii frunzelor (PLRV)- duc la apariia unor simptome distinctive; ali ageni patogeni (PVM sau PVS) sunt virusuri latente care adesea nu produc simptone vizibile. Acestea pot fi detectate numai prin testele cu plante indicatoare, microscopie electronic sau teste serologice. Virusurile care cauzeaz simptome foliare sunt controlate pentru identificarea i certificarea direct, periodic, asupra materialului biologic. Pn recent, virusurile latente au fost acceptate nu doar datorit faptului c nu existau surse de material biologic disponibil, liber de astfel de virusuri, ci i datorit lipsei

13

tehnicii de laborator necesare pentru identificarea lor. n prezent, obinerea de plantule libere de viroze aparinnd unui sortiment larg de soiuri i varieti, este din ce n ce mai mult utilizat datorit perfecionrii metodelor de cultur a meristemelor izolate din plante pretratate termic, pe medii nutritive in vitro, perfect controlate. nainte de nceperea procedurilor de eliminare a virusurilor din plantele de cartof trebuie testat starea de sntate iniial a plantelor donoare de meristeme, n scopul reducerii semnificative a numrului de testri i determinri ce trebuie aplicate fiecrei plantule obinut n cultura in vitro. Chiar dac toate tipurile de virusuri pot fi eliminate prin aceleai proceduri de laborator, iar aplicarea metodei care elimin virusurile PVX i PVS de obicei are efect i asupra altor tipuri de virusuri, formele rezistente pot s rmn neafectate. Acestea se determin cu ajutorul plantelor test (indicatoare). Probele pentru analiz se pot preleva n trei moduri: -din frunzele plantelor crescute din coli (TLC) sau tuberculi -direct din tuberculi cu ntreruperea artificial a repausului vegetativ -din colii tuberculilor, n cazul ntreruperii pe cale natural a repausului. Pn n prezent, n ara noastra, pentru certificarea cartofului pentru smn s-a utilizat la testare doar suc extras din plante crescute din coli. n acest scop, probele de suc s-au extras din frunzele plantelor crescute n ser, plante obinute din colii tuberculilor la care s-a efectuat ntreruperea artificial a repausului vegetativ. Dei metoda este aplicat pe scar larg pentru testarea materialului clonal i n programele de certificare a cartofului pentru smn, ea are i cteva dezavantaje legate n special de durata complet a testului i consumul de energie. Pentru determinarea gradului de infecie cu virusuri s-a utilizat Testul ELISA (enzimelinkeed immunosorbent assay). Testul Elisa este un test imunologic foarte sensibil al crui principiu se bazeaz pe interaciunea antigen anticorp. Sensibilitatea acestui test este de 1000 de ori mai mare dect a testului de aglutinare. Aceasta permite evidenierea sigur a unor concentraii sczute de virus. Probele necesare pot fi mici i n principiu la plantele in vitro se folosete ntreaga plant. Testarea virotic prin tehnica DAS ELISA (probe prelevate din frunze). Principiul metodei. Exist mai multe variante ale testului ELISA, n funcie de modul de executare. Pentru identificaera infeciilor cu principalele virusuri ale cartofului se folosete de obicei aa numitul tip dublu anticorpi sandwich (anticorpii adsorbii de faza solid, leag antigenul, iar complexul format leag apoi conjugatul). Ca faza solid se folosesc plci microtest. Anticorpii specifici pentru identificarea viruilor se formeaz n animale (iepuri) n sistemul lor imunitar, se mbogesc n snge i de aici se separ serul imun prin decantare i centrifugare, din care apoi se separ fracia cea mai activ i anume imunoglobinele G. n acest scop anticorpii din

14

serul imun se precipit cu soluie saturat de sulfat de amoniu iar dup centrifugare sunt resuspendai n tampon fosfat salin. Apoi ionii de amoniu sunt eliminai prin dializ repetat, soluia cu anticorpi este filtrat printr-o coloan cu DEAE 52 celuloz iar concentraia fraciilor colectate se determin spectofotometric la 280nm. n final se ajusteaz concentraia la 1 mg/ml (OD=1,4-1,8) prin amestecarea treptat a fraciilor colectate i citiri repetate la spectofotometru. Acest antiser se utilizeaz att la tratarea microplcilor, ct i la realizarea conjugatelor, prin cuplarea (marcarea) anticorpilor cu enzima fosfataz alcalin. Ca agent de cuplare a anticorpilor cu enzima se utilizeaz glutaraldehida. Conjugatul este format din anticorpi cuplai cu o enzim, n cazul nostru cu fosfataz alcalin. Aceast enzim scindeaz substratul i rspunde n final de evidenierea vizual sau fotometric a prezenei virusurilor. Pentru evidenierea fotometric este necesar un substrat. Acest substrat este para-nitro fenil fosfat. Sub aciunea enzimei (fosfataz alcalin) substratul se scindeaz i se formeaz para nitrofenolul care are culoare galben. Rata de scindare a substratului este cu att mai mare cu ct sunt cuplate mai multe molecule de enzim n alveolele plcii. Deoarece IgG marcat cu enzim este ataat de complexul anticorpantigen, moleculele de enzim pot aprea pe plac numai atunci cnd n proba cercetat se gsesc particule de virus. Prin urmare apariia i intensitatea culorii depinde de prezena i concentraia virusului. Interpretarea poate fi vizual i fotometric, cea din urm fiind mult mai exact. Astfel cu ajutorul unui spectrofotometru se msoar extincia la lungimea de und 405 mm. Principalele etape ale tehnicii ELISA (figura 7) sunt urmtoarele: A. TRATAREA MICROPLCILOR (ALVEOLELOR) Mai nti se dilueaz IgG (imunoglobulina) n tampon carbonat cu pH 9,6, apoi se introduc cte 100-200micro-litri de IgG diluat n fiecare alveol. B. INCUBAREA MICROPLCILOR Microplcile se acoper cu grij cu folie adeziv i se introduc n camere umede sau pungi de PVC. Incubarea se face la o temperatur de 30-37 C timp 2-6 ore, n funcie de temperatur. C. SPLAREA MICROPLCILOR Splarea const n umplerea alveolelor de 3-4 ori cu tampon de splare i scuturarea lor energetic la golire. Dup ultima golire se bat plcile pe un prosop absorbant sau hrtie de filtru pentru nlturarea total a tamponului. Splarea trebuie fcut cu grij, fiind extrem de important. D. ADUGAREA EXTRACTULUI DE PLANTE Pentru extragerea sucului din microplante s-a utilizat o pres electric cu valuri netede. S-au pipetat cte 100-200 micro-litri extract/alveol, dup ce a fost diluat n prealabil 1:3-1.10 cu tampon de omogenizare. E. INCUBAREA MICROPLCILOR

15

Incubarea se face timp de 12-16 ore la temperatura de 2-8C, bine acoperite i introduse n camera sau pungi de PVC. n aceast etap virusul se fixeaz pe anticorp. F. G. SPLAREA MICROPLCILOR ADUGAREA CONJUGATULUI

Conjugatul este de fapt IgG cuolat cu o enzim. Conjugatul se dilueaz cu tampon i apoi se adaug 100-200 micro-litri conjugat diluat n fiecare alveol. H. INCUBAREA MICROPLCILOR SPLAREA MICROPLCILOR Se face timp de 2-5 ore la 30-37 C, acoperite i introduse n camera umed sau pungi PVC. I. Toate splrile s-au efectuat cu o main automat de splat, iar pentru pipetrile de la punctele A,D,i J s-a utilizat multipipeta automat SUMAL AD-96. J. ADUGAREA SUBSTRATULUI Aceast etap ncepe cu dizolvarea 4-nitrofenilfosfatului n tampon substrat, n proporie de 1 mg substrat/ml de tampon, dup care se pun n fiecare alveol cte 100-200 micro-litri de 4nitrofenilfosfat diluat. K. INCUBAREA MICROPLCILOR De aceast dat incubarea se face la temperatura camerei timp de 1-2 ore, la lumina natural, plcile fiind ferite de soare. L. MSURAREA EXTINCIEI LA 405 nm Estimarea reaciilor s-a efectuat cu cititorul automat PR 1100, care indic valoarea extinciei pentru fiecare alveol din microplcile analizate. Citirea plcilor s-a efectuat la 60-120 minute de la adugarea substratului. M. ADUGAREA SUBSTRATULUI Aceast etap ncepe cu dizolvarea 4-nitrofenilfosfatului n tampon substrat, n proporie de 1 mg substrat/ml de tampon, dup care se pun n fiecare alveol cte 100-200 micro-litri de 4nitrofenilfosfat diluat. N. INCUBAREA MICROPLCILOR De aceast dat incubarea se face la temperatura camerei timp de 1-2 ore, la lumina natural, plcile fiind ferite de soare. O. P. MSURAREA EXTINCIEI LA 405 nm Estimarea reaciilor s-a efectuat cu cititorul automat PR 1100, care indic valoarea extinciei

pentru fiecare alveol din microplcile analizate. Citirea plcilor s-a efectuat la 60-120 minute de la adugarea substratului.

16

Fig 7. Etapele principale ale tehnicii de testare virotic DAS ELISA. Testarea virotic prin tehnica DAS ELISA (probele prelevate direct din tuberculi) Efectuarea analizelor direct pe tuberculi permite unele mbuntiri ale procesului de testare virotic, prin aplicarea unei tehnologii care: - necesit o durat redus (nu se mai ateapt 6-8 sptmni pentru obinerea de plante n ser, plante de la care se prelevau frunzele necesare pentru testare) ; - elimin consumul de ap necesar dezvoltrii plantelor ; - elimin utilizarea unor eventuale pesticide folosite pentru combaterea duntorilor din sere (impact ecologic asupra mediului) ; - elimin consumul de energie termic i electric necesar pentru a asigura condiiile de cretere a plantelor din sere . Tehnica ELISA aplicat direct pe tubercul reduce perioada de efectuare a analizelor, oferind posibilitatea de a efectua selecia materialului sntos la scurt timp dup recoltare, evitndu-se ntrzierile datorate eventualelor probleme care apar de obicei la creterea plantelor n ser. Totodat, prin scurtarea perioadei de testare, certificarea cartofului pentru smn n cazul unor soiuri timpurii se poate face ntr-un interval mai scurt, ceea ce permite cultivatorilor s cunoasc gradul de infecie al materialului de plantat chiar nainte de a-l nsiloza. Devansarea certificrii n precultur a

17

cartofului pentru smn vine n sprijinul fermierilor, care ar putea valorifica n timp util producia obinut. La testul ELISA din tuberculi i coli, etapele care difer fa de metoda din frunze sunt: pregtirea tuberculilor, modul de prelevare i distribuire a extractului (figura 8). Pentru testul ELISA direct din tuberculi, sucul de plant este extras, diluat si distribuit direct n plci utiliznd un burghiu dentar modificat i un sistem automat de absorbie, diluie i repartizare a amestecului de soluie tampon de extracie i extract vegetal (figura 9). Testarea ELISA cu prelevarea probelor direct din tuberculi este mai rapid, implic o perioad de testare mai scurt comparativ cu testul din frunze, dar are unele dezavantaje - o detectare satisfctoare a virusurilor PVY si PVA se face numai dac tuberculii au fost tratai cu Rindite i s-au respectat condiiile de temperatur i umiditate necesare pentru o ncolire corespunztoare i pentru evitarea deshidratrii tuberculilor; - randament mai redus datorit modului de extracie i de umplere a microplcilor (extracia probei din tubercul necesit mai mult timp comparativ cu cea realizat din frunze, cu presa electric); - o detectabilitate ceva mai redus a testului n cazul nerespectrii condiiilor de pregtire a tuberculilor nainte de testare. Testul ELISA din coli se poate face n timpul perioadei de depozitare, utiliznd tuberculi ncolii pe cale natural. Colii prelevai n pungi de plastic sunt zdrobii i omogenizai cu soluie de tampon de extracie, dup care probele sunt pipetate manual n plci. Printre avantajele metodei amintim: - este singura posibilitate de testare ELISA a tuberculilor cu ntreruperea natural a repausului germinativ; - se reduc costurile necesare pentru ntreruperea artificial a repausului i pentru creterea plantelor n sere; - se pstreaz intact materialul testat deoarece starea fiziologic a tuberculilor nu este afectat nici n timpul i nici dup prelevarea probelor. Prelevarea probelor din coli implic urmtoarele dezavantaje: - detectarea virusului rsucirii frunzelor (PLRV) este posibil doar dac mrunirea esutului vegetal este realizat corespunztor (avnd n vedere localizarea virusului n consecin, virusul s nu ajung n extractul pentru testare); - randament ceva mai redus, datorat n principal modului de prelevare pentru testare. floem,prin sistemul de prelevare a probelor este posibil uneori ca membrana celulelor conductoare s nu fie distrus i n

18

Fig. 8. Pregtirea tuberculilor i prelevarea probelor pentru testul ELISA.

TUBERCUL n repaus vegetativ

NTRERUPEREA ARTIFICIAL A REPAUSULUI

NTRERUPEREA NATURAL A REPAUSULUI

TESTUL DIN FRUNZE

Tratare cu soluie acid giberelinic

TESTUL DIRECT DIN TUBERCUL

Tratare cu soluie acid giberelinic

TESTUL DIN COLI

ncolire tuberculi 20-22oC

min. 2 sptmni

ncolire tuberculi 20-22oC

min. 3 sptmni

ncolire tuberculi la 2224oC pn ce mrimea colilor este 0,3-1cm

(aprox. 2-3 sptmni)

Plantare n ser Dezvoltare plante timp de 6-8 sptmni Prelevare suc din frunze n tampon extracie Prelevare suc direct din tubercul de lng baza colilor apicali, o dat cu dozarea automat a tamponului de extracie Prelevare coli din zona apical Zdrobirea manual a colilor i omogenizare cu tampon de extracie Pipetare MANUAL n microplci tratate cu anticorpi

Pipetare AUTOMAT n microplci tratate cu anticorpi

Pipetare MANUAL/ AUTOMAT n microplci tratate cu anticorpi

DAS ELISA continuarea testului cu etapele urmtoare (adugare conjugat, adugare substrat, citire prob)

19

Fig. 9. Prelevarea probelor din tuberculi pentru testare prin tehnica ELISA. Dup testare plantele libere de boli sunt multiplicate in vitro iar plantulele sunt folosite fie pentru obinerea de microtuberculi in vitro fie pentru plantarea n sere tip insect-proof.

Producerea de microtuberculi in vitro

Microtuberculii (sau tuberculii in vitro) sunt cartofi de smn n miniatur i pot fi considerai ca o etap intermediar ntre plantule in vitro i minituberculii. Microtuberculii sunt prima generaie de smn de cartof produi din cultura de esuri: ei sunt folosii pentru a rezolva probleme transplantrii plantulelor fragile din condiiile in vitro n condiiile in vivo, pentru a rezolva proplemele depozitrii. Datorit marimii mici i a greutii sczute, microtuberculii au numeroase avantaje n depozitare, transport, mecanizare. Pot fi plantai direct n pmnt i pot fi produi n orice perioad a anului. Au o morfologie similar i caracteristici biochimice cu tuberculii produi n cmp. Producerea de microtuberculi in vitro este foarte benefic n propagarea i depozitarea unui stoc valoros de cartofi Microtuberculii sunt produi n laborator din partea axilar a frunzelor. Procedura convenional ncepe din lstarul cultivat in vitro n condiii aseptice dup ce este asigurat eliminarea de boli. ntunericul, camera cald furnizeaz un mediu care este similar mediului cultivarii cartofului. Plantulele in vitro formeaz microtuberculii n urmtoarele 60 de zile. Factorii importani n timpul perioadei de tuberizare sunt: - concentraia de zahr n mediu (condiia optim: 8%); - coninutul de azot (este o intreacie clar ntre concentraia de zahr i azot);

20

- temperatura (este de preferat la 18 - 200C); - condiiile de lumin (incubaia poate avea loc la ntuneric sau la o intensitate slab a luminii cu o fotoperioad de 8h). Zaharul este cel mai critic stimul pentru formare de a tuberculilor. Zahrul este esenial in vitro pentru efectul osmotic, ca surs de energie, iar la concentraii mai mari poate avea rol n formarea de microtuberculi. Pentru a crete la maximum inducerea de microtuberculi, nivelul de zahr crete de la 2 - 3%, de obicei folosit pentru micropropagare la 8 - 9%. Nivele de zahr peste 8% nu sunt benefice. Mai mult, n general, microtuberculii sunt produi in vitro, cu o variabilitate a mediului, componente de mediu i intervale de depozitare. Multe interacii ntre condiiile de cretere in vitro influeneaz seminificativ productivitatea i multe din aceste interaciuni par a fi specific-genotipice. Prin urmare, microtuberculii au diferite mrimi, au diferite perioade de conservare, i difer larg n potenialul de cretere i productivitate. Ei au de obicei marimea unui bob de mazre i variaz: n form (rotund sau alungit), suprafa (moale sau aspr), culoare (de la glbui la verzui), greutate (de la 24 la 273 mg), diametru (4 - 7 mm), i lungime (10 - 12 mm). n timp ce temperaturile de 20 - 250 C determin creterea plantulelor micropropagate, pentru inducerea microtuberculilor, temperaturile sunt n general mai sczute (15 - 180 C). Interacia temperaturii cu zahrul din mediu i regulatorii de cretere influeneaz tuberizarea in vitro. Aceste relaii sunt complexe. Depozitarea pe termen lung a microtuberculilor este discutabil i abilitatea lor de a fi plantai direct n cmp cu probabilitatea de a produce smn normal este discutabil n cel mai bun caz. Probele de cmp impun un potenial de producie sczut pentru culturi crescute in vitro din tuberculi comparativ cu tuberculii de smn convenionali.

Tehnica de microtuberizare in vitro - Schema experimental Microtuberizarea in vitro a cartofului constituie faza tranzitorie ntre multiplicarea in vitro
a materialului sntos i multiplicarea n cmp. Producerea de microtuberculi reprezint o metod eficient pentru obinerea unui material sntos, prin care se reduce procesul produciei de cartof cu 3-4 ani. Microtuberculii sau vitrotuberculii sunt tuberculi de talie mic (3-8 mm), de form sferic sau alungit, cu greutatea de 0,05 pn la 0,2 grame. Aceti microtuberculi au un coninut n azot proteic de 2,5 ori mai mare dect tuberculii normali. n condiii normale de cultur, microtuberculii de cartof plantai n tunele insct-proof, produc plante care la rndul lor, dau natere la minituberculi sau la tuberculi normali utilizabili pentru producerea categoriilor biologice superioare.

21

Dup perioada de tuberizare (7-8 sptmni de ntuneric), plantulele de cartof au fost extrase din recipientele de cultur, iar microtuberculii recoltai au fost splai, pentru a ndeprta toate urmele de mediu i pentru a evita infeciile ulterioare care ar putea apare n timpul pstrrii acestora. Apoi, microtuberculii au fost uscai, calibrai, numrai i pui pentru conservare n frigidere la temperaturi de 4-5oC, la ntuneric. Aceast conservare se poate prelungi pn la un an. n momentul recoltrii lor, cei mai muli microtuberculi sunt n stare de repaus vegetativ i nu pot, deci, ncoli. Durata repausului vegetativ este foarte variabil de la un tubercul la altul i deci, constituie un handicap important n momentul plantrii. Pentru a putea rezolva aceast problem, tuberculii trebuie tratai cu acid giberelinic. Utilizarea microtuberculilor prezint cteva avantaje n comparaie cu plantulele. Acestea includ: pot fi produi n orice perioad a anului i nu este necesar s fie produi doar naintea sunt uor de transportat i de depozitat pentru cteva luni.

utilizarii; -

Fig.10. Fotografie din camera de cretere; Plantule regenerate

Fig.11. Microtuberizarea in vitro

22

Fig.12. Microtuberculi

23

. Etapa a IV a const n transferarea microtuberculilor obinute pe mediile de cultur aseptice, n mediul de cultur natural. Dup parcurgerea etapei de repaus care dureaz 4-6-8 luni, funcie de genotip, microtuberculii sunt plantai n tunele tip insect-proof (fig13. ). Pentru a putea s ndeplineasc condiiile de cretere a plantulelor din microtuberculi: tunelele s fie bine izolate pentru a nu permite ptrunderea afidelor sau a musculiei albe de ser; umiditatea atmosferic s fie n jur de 60%; temperatur n perioada de vegetaie i de tuberizare s nu depeasc 26-28C, lucru care se poate realiza prin stropirea serelor serelor cu var, ventilaie zilnic. Plantarea se face pe parapei ntr-un amestec de nisip-pmnt-mrani n proporie de 1:2:2, cte 200 microtuberculi/m2. n timpul vegetaiei plantele trebuie s fie protejate mpotriva afidelor, paianjenilor de ser i a musculiei albe prin stropiri repetate. Dup 3-4 luni se recolteaz minituberculii , minituberculi care reprezint punctul de plecare n producerea unui material de plantat certificat ntr-un timp mai scurt.

Fig.13. Plantule obinute din plantarea microtuberculilor in tunel tip insect-proof

24

Pentru evitarea producerii de noi infecii, spaiile utilizate, substratul de cultur (solul), ustensilele, etc. se sterilizeaz. Materialului biologic transplantat se izoleaz de posibile surse de infecie (fig.13), pentru evitarea transmiterii acestora prin intermediul unor vectori, precum afidele, iar factorii de vegetaie, n special temperatura, umiditatea i lumina, se menin la un nivel optim, pentru a favoriza minituberizarea. n schema de producere a cartofului pentru smn, segmental urmrit pentru a fi modernizat, este reprezentat de multiplicarea materialului clonal iniial, utiliznd o tehnologie modernizat pentru producerea minituberculilor din microtuberculi n tunele tip insect proof. Spaiile protejate tip insect proof pot fi utilzate cu success pentru obinerea minituberculilor avnd ca material de pornire microtuberculii, permind trecerea la o nou schem de producere a cartofului pentru smn., ducnd la reducerea perioadei de nmulire de la 9 ani la 5 ani (Fig.14). Concret, prin utilizarea pe scar mult mai mare a minituberculilor pentru producerea materialului PREBAZ, obinui din microtuberculi produki in vitro, se poate realiz cu success scurtarea schemei actuale de obinere a materialului BAZ (clasa SE i E) de la 5-6 ani la 2-3 ani. Avantajele aplicrii acestui nou sistem sunt : reducerea perioadei de producere a cartofului pentru smn n cmp de la 9 ani la maxim 5 ani i a prebazei de la 6 ani la 2 ani; nmulirea i promovarea rapid a soiurilor; mbuntirea calitii biologice i fitosanitare a cartofului pentru smn; asigurarea necesarului de cartof pentru smn n cantiti suficiente; manipularea unui volum redus de material i necesitatea unor spaii reduse de depozitare. Pn n momentul n care nu a fost posibil obinerea unui material de plantat perfect sntos, nu a existat un termen de comparaie pentru aprecierea diferenelor de productivitate calitativ i cantitativ ntre o recolt provenit de la o cultur infiinata cu material de plantat incert i o recolt provenit din plante eradicate de ageni fitopatogeni. Datorita diminurii suprafeelor din zonele de producere a cartofului pentru smna, nmulirea rapid prin culturi de meristeme i producerea de plantule, microtuberculi i minituberculi rmne singura alternativ de producer a unui material clonal de bun calitate.

25

26

Sistemul clasic n Romnia

Sistemul modernizat

Micropropagare realizat la I.N.C.D.C.S.Z

Microtuberizare realizat la I.N.C.D.C.S.Z

Minituberculi n sere Clone A Clone B Clone C

Microtuberculi n tunele Material PREBAZ Material PREBAZ Material BAZ

Clone D Material BAZ (SE) Material BAZ (E) Material CERTIFICAT (clasa A) Material CERTIFICAT (clasa B) Figura 14.Schema comparativa de producere a cartofului pentru smn Material CERTIFICAT (clasa A) Material CERTIFICAT (clasa B)

27

28

INSTITUTUL NAIONAL DE CERCETARE - DEZVOLTARE PENTRU CARTOF I SFECL DE ZAHR BRAOV Str. Fundturii nr.2 Braov, cod 500470 Tel: 0268 - 476795, Fax: 0268 476608 E-mail: icpc@potao.ro Tiprit la Tipotex SA