MINISTERUL EDUCAIEI, CERCETRII, TINERETULUI I SPORTULUI UNIVERSITATEA DIN ORADEA FACULTATEA DE TIINE

ROMOCEA (GERGELY) JULIETA - EMILIA

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Conductor tiinific: Prof. univ.dr. Cachi-Cosma Dorina

ORADEA 2011
1

Investete n oameni! Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial pentru Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 2013 Axa prioritar: 1. Educaie i formare profesional iniial de calitate n sprijinul dezvoltrii i creterii economice Domeniul major de intervenie: 1.5. Programe doctorale i postdoctorale n sprijinul cercetrii Titlul proiectului: Cercettori romni competitivi prin programe doctorale moderne i eficiente Cod Contract: POSDRU/59/1.5/S/1 Beneficiar: UNIVERSITATEA DIN ORADEA

VITROCULTURILE DE BEGONIA SP. MODEL EXPERIMENTAL N MORFOFIZIOLOGIA VEGETAL

Conductor tiinific: Prof. univ.dr. Cachi-Cosma Dorina Doctorand Romocea (Gergely) Julieta-Emilia

ORADEA 2011
2

CUPRINS
PREFA ....................................................................................................................... 8 1. CONSIDERAII GENERALE .......................................................................... 9 1.1. INTRODUCERE N BIOTEHNOLOGIA VEGETAL ................................ 9 1.2. MICROPROPAGAREA DEFINIIE I DESCRIERE ................................. 12 1.3. PREZENTAREA LABORATORULUI DE VITROCULTURI VEGETALE I A METODELOR DE LUCRU UTILIZATE ..................................................... 14 1.3.1. Organizarea spaiilor ................................................................................... 14 1.3.2. Dotarea laboratorului de vitroculturi........................................................... 15 1.3.2.1. Sticlria ........................................................................................ 15 1.3.2.2. Instrumentarul .............................................................................. 16 1.3.2.3. Aparatur i dispozitive ................................................................ 16 1.3.2.4. Produse chimice variate necesare n laboratorul de vitroculturi vegetale ........................................................................................ 16 1.3.3. Asepsizarea ................................................................................................. 17 1.3.4. Compoziia mediilor de cultur i metodele de preparare a acestora......... 17 1.3.4.1. Substanele anorganice introduse n mediile de cultur destinate utilizrii lor ca substrat pentru cultivarea in vitro a fitoinoculilor ... 20 1.3.4.2. Substanele organice introduse n mediile de cultur destinate creterii in vitro a fitoinoculilor ..................................................... 24 1.3.4.3. Substanele naturale complexe ...................................................... 27 1.3.4.4. Regulatorii de cretere .................................................................. 28 1.3.5. Surse de iluminare a vitroculturilor vegetale .............................................. 31 1.3.5.1. Lumina natural ........................................................................... 32 1.3.5.2. Surse de lumin artificial ............................................................ 32 1.4. ROLUL BIOTEHNOLOGIEI VEGETALE N VIAA PLANTELOR DE BEGONIA ............................................................................................................ 34 1.5. DATE DIN LITERATURA DE SPECIALITATE REFERITOARE LA DIFERITELE REACII PREZENTATE DE VARIATELE TIPURI DE EXPLANTE DE BEGONIA CRESCUTE N REGIM DE VITROCULTUR . 47 1.5.1. Condiiile de cultur .................................................................................... 47 1.5.2. Modul de sterilizare a materialului vegetal n vederea utilizrii lui pentru prelevarea de explante .................................................................................. 48 1.5.3. Mediul de cultur i condiiile de cretere a fitoinoculilor de Begonia n camera de vegetaie ...................................................................................... 49 1.5.4. Schema micropropagrii la Begonia ........................................................... 50 1.5.5. Creterea i ameliorarea vitroplantulelor de Begonia ................................. 54 1.5.5.1. nmulirea plantelor de Begonia in vitro, n bioreactoare ............... 55 1.5.5.2. Micropropagarea la Begonia prin embriogenez somatic............. 57 1.6. MOTIVELE CARE AU STAT LA BAZA ALEGERII ACESTEI TEME DE CERCETARE....................................................................................................... 59 2. CERCETRI PROPRII .......................................................................................... 61 2.1. MATERIAL I METOD DE LUCRU............................................................ 61

2.1.1. Genul Begonia descriere botanic i ncadrare taxonomic .................... 61 2.1.2. Experimente de tatonare efectuate n vederea selectrii speciei de Begonia cu reactivitate bun n vitrocultur............................................................... 66 2.1.2.1. Iniierea unei culturi in vitro la Begonia boweri var. Tiger din mugurai axilari ............................................................................ 67 2.1.2.1.1. Particulariti de metodic .......................................................... 67 2.1.2.1.2. Rezultate i discuii .................................................................... 69 2.1.2.1.3. Concluzii pariale ....................................................................... 70 2.1.2.2. Iniierea unei culturi in vitro la Begonia coccinea L. din mugurai axilari ........................................................................................... 70 2.1.2.2.1. Particulariti de metodic .......................................................... 70 2.1.2.2.2. Rezultate i discuii .................................................................... 71 2.1.2.2.3. Concluzii pariale ....................................................................... 73 2.1.2.3. Iniierea unei culturi in vitro la Begonia erythrophylla L. din mugurai foliari ............................................................................. 73 2.1.2.3.1. Particulariti de metodic .......................................................... 73 2.1.2.3.2. Rezultate i discuii .................................................................... 74 2.1.2.3.3. Concluzii pariale ....................................................................... 78 2.1.2.4. Iniierea unei culturi in vitro la Begonia semperflorens var. Ambassador White din mugurai axilari ..................................... 79 2.1.2.4.1. Particulariti de metodic .......................................................... 79 2.1.2.4.2. Rezultate i discuii .................................................................... 80 2.1.2.4.3. Concluzii pariale ....................................................................... 85 2.1.3. Alegerea tipului de material vegetal utilizat de noi n experimente............ 86 2.1.4. Compoziia mediului de cultur utilizat pentru operarea de culturi in vitro la Begonia sp. ................................................................................................... 89 2.1.5. Modul de inoculare a explantelor de Begonia semperflorens var. Ambassador White .................................................................................... 94 2.1.6. Regimul de vitrocultur i parametrii monitorizai la explantele de Begonia semperflorens var. Ambassador White...................................................... 94 2.1.7. Alte metode de lucru utilizate de noi n cadrul experimentelor .................. 96 2.1.7.1. Observaii de morfo- i organogenez ........................................... 96 2.1.7.2. Determinarea coninutului de pigmeni asimilatori ........................ 96 2.1.7.2.1. Reactivi i materiale ................................................................... 97 2.1.7.2.2. Aparate i echipamente utilizate ................................................ 98 2.1.7.2.3. Principiul metodei ...................................................................... 98 2.1.7.2.4. Determinarea spectrometric a extractului etanolic neacidulat .. 99 2.1.7.2.5. Acidularea extractului etanolic................................................. 100 2.1.7.2.6. Determinarea spectrometric a extractului acidulat ................. 100 2.1.7.2.7. Calcularea rezultatelor ............................................................. 101 2.1.7.3. Determinarea coninutului de pigmeni carotenoidici din vitroplantulele de Begonia semperflorens var. Ambassador White101 2.1.7.3.1. Particulariti de metodic ........................................................ 101 2.2.7.3.2. Analiza HPLC a carotenoidelor din Begonia semperflorens var. Ambassador White ................................................................. 102

2.1.7.3.3. Determinarea cantitativ a carotenoidelor totale ...................... 104 2.1.8. Prelucrarea matematic a datelor experimentale ...................................... 104 2.2. REZULTATE I DISCUII .......................................................................... 106 2.2.1. Germinarea in vitro a seminelor de Begonia semperflorens var. Ambassador White .................................................................................. 106 2.2.2. Iniierea unei vitroculturi de Begonia semperflorens var. Ambassador White din minibutai apicali prelevai de la vitroplantule de origine zigotic, obinute prin germinarea n regim aseptic a seminelor ............................. 110 2.2.2.1. Particulariti de metodic .......................................................... 110 2.2.2.2. Rezultate i discuii .................................................................... 112 Concluzii pariale .................................................................................... 118 2.2.3. Operarea unei subculturi prin intermediul propagulilor desprini din culturi de Begonia semperflorens var. Ambassador White ce au fost iniiate din minibutai apicali prelevai de la plantule de origine zigotic obinute prin germinarea n regim aseptic a seminelor................................................... 119 2.2.3.1. Particulariti de metodic .......................................................... 119 2.2.3.2. Rezultate privind reacia propagulilor provenii dintr-o cultur primar de Begonia semperflorens var. Ambassador White inoculai i crescui pe medii MB-MS cu adaos de acid indolilbutiric (AIB) sau de tidiazuron (TDZ), administrai n concentraii diferite, adugai ca atare sau n amestec .................................................. 120 2.2.3.2.1. Evoluia propagulilor pe mediu MB-MS cu adaos fie de acid indolilbutiric (AIB), fie de tidiazuron (TDZ), fie a unui amestec a celor dou, doza administrat fiind de 1 mg/l din fiecare ......... 121 Concluzii pariale .................................................................................... 129 2.2.3.2.2. Evoluia propagulilor pe mediu MB-MS cu adaos fie de acid indolilbutiric (AIB), fie de tidiazuron (TDZ), fie a unui amestec a celor dou, doza administrat fiind de 1,5 mg/l din fiecare ...... 130 Concluzii pariale .................................................................................... 139 2.2.3.2.3. Evoluia propagulilor pe mediu MB-MS cu adaos fie de acid indolilbutiric (AIB), fie de tidiazuron (TDZ), fie a unui amestec a celor dou, doza administrat fiind de 2 mg/l din fiecare ......... 140 Concluzii pariale .................................................................................... 148 2.2.3.3. Compararea reaciilor propagulilor de Begonia semperflorens var. Ambassador White cultivai fiind in vitro n prezena n mediul de cultur a auxinei de acid indolilbutiric (AIB), administrat n diferite concentraii ................................................................................. 149 Concluzii pariale .................................................................................... 156 2.2.3.4. Compararea reaciilor propagulilor de Begonia semperflorens var. Ambassador White cultivai fiind in vitro n prezena n mediul de cultur a citochininei de tidiazuron (TDZ), administrat n diferite concentraii ................................................................................. 157 Concluzii pariale .................................................................................... 165 2.2.3.5. Compararea reaciilor propagulilor de Begonia semperflorens var. Ambassador White cultivai fiind in vitro n prezena n mediul de

cultur a acidului indolilbutiric (AIB) i tidiazuron (TDZ), administrat n diferite concentraii ............................................. 165 Concluzii pariale .................................................................................... 173 2.2.4. Rezultate privind reacia propagulilor provenii dintr-o cultur primar de Begonia semperflorens var. Ambassador White inoculai i crescui pe medii MB-MS cu adaos de acid -naftilacetic (ANA) sau de tidiazuron (TDZ), administrai n concentraii diferite, adugai ca atare sau n amestec173 2.2.4.1. Particulariti de metodic .......................................................... 173 2.2.4.1.1. Evoluia propagulilor pe mediu MB-MS cu adaos fie de acid naftilacetic (ANA), fie de tidiazuron (TDZ), fie a unui amestec a celor dou, doza administrat fiind de 1 mg/l din fiecare ......... 174 Concluzii pariale .................................................................................... 183 2.2.4.1.2. Evoluia propagulilor pe mediu MB-MS cu adaos fie de acid naftilacetic (ANA), fie de tidiazuron (TDZ), fie a unui amestec a celor dou, doza administrat fiind de 1,5 mg/l din fiecare ...... 184 Concluzii pariale .................................................................................... 192 2.2.4.1.3. Evoluia propagulilor pe mediu MB-MS cu adaos fie de acid naftilacetic (ANA), fie de tidiazuron (TDZ), fie a unui amestec a celor dou, doza administrat fiind de 2 mg/l din fiecare ......... 193 Concluzii pariale .................................................................................... 202 2.2.4.2. Compararea reaciilor propagulilor de Begonia semperflorens var. Ambassador White cultivai fiind in vitro n prezena n mediul de cultur a acidului -naftilacetic (ANA), administrat n diferite concentraii ................................................................................. 202 Concluzii pariale .................................................................................... 209 2.2.4.3. Compararea reaciilor propagulilor de Begonia semperflorens var. Ambassador White cultivai fiind in vitro n prezena n mediul de cultur a tidiazuronului (TDZ), administrat n diferite concentraii210 Concluzii pariale .................................................................................... 217 2.2.4.4. Compararea reaciilor propagulilor de Begonia semperflorens var. Ambassador White cultivai fiind in vitro n prezena n mediul de cultur a acidului -naftilacetic (ANA) i tidiazuron (TDZ), administrat n diferite concentraii ............................................. 218 Concluzii pariale .................................................................................... 226 2.2.4.5. Determinarea coninutului de clorofila a i b n frunzuliele vitroplantulelor de Begonia semperflorens var. Ambassador White227 2.2.4.5.1. Generaliti. Clorofila pigment fotosintetic .......................... 227 2.2.4.5.2. Particulariti de organizare a experimentului ......................... 227 2.2.4.5.3. Rezultate i discuii .................................................................. 229 2.2.4.5.3.1 Variaia coninutului n clorofila a n frunzuliele vitroplantulelor de Begonia semperflorens var. Ambassador White, determinare fcut n cea de a 90-a zi de la inocularea propagulilor .......................................................................... 229 Concluzii pariale .................................................................................... 231

2.2.4.5.3.2 Variaia coninutului n clorofila b n frunzuliele vitroplantulelor de Begonia semperflorens var. Ambassador White, determinare fcut n cea de a 90-a zi de la inocularea propagulilor .......................................................................... 232 Concluzii pariale .................................................................................... 233 2.2.4.5.3.3 Variaia coninutului n total pigmeni verzi (clorofila a + b) n frunzuliele vitroplantulelor de Begonia semperflorens var. Ambassador White, determinai n cea de a 90-a zi de la inocularea propagulilor pe mediu MB-MS, cu adaos de acid naftilacetic (ANA) sau de tidiazuron (TDZ), de diferite concentraii........................................................................... 234 Concluzii pariale .................................................................................... 235 2.2.4.6. Determinarea coninutului de pigmeni carotenoidici n frunzuliele vitroplantulelor de Begonia semperflorens var. Ambassador White..236 2.2.4.6.1. Generaliti Pigmenii carotenoidici...................................... 236 2.2.4.6.2. Rezultate i discuii .................................................................. 237 2.2.4.6.2.1 Variaia coninutului n pigmeni carotenoidici identificate n frunzuliele vitroplantulelor de Begonia semperflorens var. Ambassador White, determinare fcut n cea de a 90-a zi de la inocularea propagulilor .................................................... 237 Concluzii pariale .................................................................................... 240 2.2.4.6.2.2 Studii comparative privind cantitatea de pigmeni clorofilieni a i b i carotenoidici identificate n frunzuliele vitroplantulelor de Begonia semperflorens var. Ambassador White, la subcultur dup 90 de zile de cretere ................................. 241 Concluzii pariale .................................................................................... 243 2.2.4.7. Aclimatizarea exvitroplantulelor de Begonia semperflorens var. Ambassador White la viaa n mediul septic, aplicate ex vitro ... 243 2.2.4.7.1. Particulariti de metodic ........................................................ 244 2.2.4.7.2. Rezultate i discuii .................................................................. 244 Concluzii pariale .................................................................................... 246 3. CONCLUZII GENERALE .................................................................................... 247 REALIZRI ORIGINALE I RECOMANDRI DE PERSPECTIV ................. 254 BIBLIOGRAFIE ......................................................................................................... 255 SITOGRAFIE.............................................................................................................. 269

PREFA
Biotehnologiile reprezint, astzi, un fascinant domeniu de cercetare i de producie, care au o dinamic spectaculoas. Unul dintre obiectivele avute n vedere la elaborarea metodelor de cultivare in vitro a plantelor sunt condiiile de mediu care trebuie s fie ct mai apropiate de acelea pe care celulele respective le au atunci cnd ele se afl n organismul mam, la locul lor de origine. De regul, cele mai reuite vitroculturi vegetale sunt cele care au la baz meristemele primare, respectiv meristemele apicale ale tulpinilor, dar i meristemele secundare, cum este i esutul cambial. Celulele explantate i cultivate in vitro se gsesc n alte condiii fizico-chimice dect cele pe care le aveau acestea la locul lor de origine. Aceste circumstane, de multe ori, provoac schimbri calitative n exprimarea informaiei genetice deinute de ctre acestea. Metodele de cultivare in vitro a esuturilor i celulelor vegetale, sunt utilizate la rezolvarea diferitelor probleme ale biologiei contemporane, dar i n micropropagarea plantelor n regim industrial i chiar robotizat. Cultivarea explantelor vegetale in vitro reprezint un model biologic care, n condiii controlate, ofer posibilitatea de a studia mecanismele de interaciune celular, diferenierea celular, factorii care regleaz procesele de morfogenez etc. Prin lucrarea de fa doresc s-mi aduc o contribuie la cercetrile teoretice axate pe problematica studierii micropropagrii, respectiv a reaciei explantelor de Begonia la vitrocultur pe medii cu un coninut variat de regulatori de cretere, date care pot servi la eficientizarea acestui gen vegetal, de larg interes pentru floricultori, mai ales pentru cei ce utilizeaz aceast plant n realizarea de covoare vegetale, ornamentale. Printre abordrile biotehnologice, micropropagarea plantelor este una dintre tehnicile cele mai viabile, ce permite o mai eficient i o mai rapid cale de multiplicare vegetativ, a multor culturi importante din punct de vedere economic. Lucrarea este rezultatul activitii de cercetare din perioada anilor 20082011, derulat n cadrul proiectului POSDRU/59/1.5/S/1 Cercettori romni competitivi prin programe doctorale moderne i eficiente, finanat prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 2013. De-a lungul celor trei ani de studii, efectuate de mine n cadrul colii doctorale, am fost cluzit, cu o deosebit competen i rspundere, de ctre doamna profesoar universitar. dr. Dorina Cachi-Cosma, o profesionist unic i de excepie, mentor a mai multor doctoranzi care au devenit oameni de valoare n ara noastr, pionier a acestui domeniu de cercetare, n Romnia. Pe aceast cale, i adresez sincere mulumiri, exprimndu-mi ntreaga recunotin i nemrginitul respect pentru ndrumarea, susinerea i nelegerea de care m-am bucurat pe parcursul programului de cercetare. n acest timp, am beneficiat de un stagiu de pregtire, cu o durat de trei luni, la CRA-CIN Institutul de Cercetare de Culturi Industriale din Rovigo, Italia, sub ndrumarea domnului dr. Gianpaolo Grassi, cercettor tiinific superior, 8

coordonatorul departamentului. n perioada stagiului am adunat informaii privitoare la metodele de cercetare, concentrndu-ne asupra metodelor de micropropagare a plantelor. Am avut acces la literatura de specialitate din biblioteca online i la diverse surse de documentare din arhivele instituiei de cercetare CRA-CIN. Doresc s i mulumesc pentru oportunitatea de a studia n cadrul departamentului coordonat cu profesionalism de ctre dumnealui, precum i colegilor din cadrul instituiilor italiene de cercetare CRA-CIN din Rovigo i Bolognia. De asemenea, doresc s le aduc mulumiri doamnei confereniar universitar dr. Pintea Adela de la Departamentul de Chimie i Biochimie, Universitatea de Stiine Agricole i Medicin Veterinar (USAMV), Cluj-Napoca pentru ajutorul acordat, care mi-a furnizat date utile alctuirii i finalizrii tezei. Nu n ultimul rnd, o deosebit recunotin doresc s aduc mulumirile mele familiei, colegilor i prietenilor mei, care mi-au fost alturi i m-au ncurajat pe tot parcursul perioadei de doctorat. INTRODUCERE Lucrarea de fa intitulat Vitroculturile de Begonia sp. model experimental n morfo-fiziologia vegetal, reprezint un studiu axat pe o tematic extrem de modern de cercetare, de Biotehnologie vegetal, care se refer, n principal, la utilizarea vitroculturilor de Begonia sp. ca model experimental n studiile de morfofiziologie vegetal. Culturile de esuturi i celule vegetale constituie un instrument de cercetare deosebit de valoros n studiile de fiziologie vegetal, de ameliorare i de genetic, de biologie celular i molecular, ele reprezentnd o procedur modern de multiplicare rapid, clonal, a diferitelor specii de plante de interes economic, la scar industrial. Obiectivul principal al cercetrilor a fost studierea reaciei diferitelor tipuri de fitoinoculi de Begonia semperflorens var. White la variate condiii de vitrocultur, n ceea ce privete morfogeneza i creterea, respectiv capacitatea regenerativ a acestora, n funcie de variai regulatori de cretere introdui n mediul de cultur, de intensitatea luminoas utilizat pentru iluminarea vitroculturilor, dar i de lungimea de und a acesteia. Aceste cercetri sunt de mare interes tiinific, ntruct ele prezint o serie de nouti pe plan mondial, asupra unor aspecte i modificri survenite ca urmare a utilizrii ca regulator de cretere a citochininei tidiazuron. Lucrarea de fa este structurat pe 3 capitole, ce vizeaz consideraiile generale privind vitroculturile vegetale, rezultatele i discuiile, respectiv concluziile generale. Studiul se ncheie cu realizrile originale i recomandri de perspectiv. n teza de doctorat sunt prezentate: 41 tabele, din care 35 tabele sunt ntocmite pe baza cercetrilor i rezultatelor obinute, 81 figuri, din care doar 14 9

figuri conin imagini descrcate de pe site-uri i din literatura de specialitate, 33 de figuri fiind imagini originale, iar alte 35 de figuri reprezint histograme originale. Teza de doctorat cuprinde 269 pagini tehnoredactate, din care 254 pagini text, 14 pagini de bibliografie, nsumnd 182 titluri citate, un numr nsemnat din aceste lucrri (50 titluri) fiind publicate dup anul 2000, precum i o pagin de sitografie, nsumnd 15 site-uri, iar n final, sunt prezentate lucrrile tiinifice din cadrul tezei de doctorat care au tangen cu teza de doctorat, din care o lucrare se afl sub tipar. Capitolul 1 este structurat pe urmtoarele pri componente: Prefa (2 pag.), Consideraii generale ce cuprind aspecte referitoare la prezentarea domeniului de cercetare al biotehnologiei vegetale, detalierea aspectelor legate de organizarea unui laborator de vitroculturi (repartizarea speciilor i dotarea acestora, capitol n care sunt ncorporate i date din literatura de specialitate referitoare la cultivarea in vitro, n variate scopuri, a speciilor de Begonia (total 56 de pagini). Acest capitol se finalizeaz cu dou pagini care conin motivarea care a stat la baza alegerii temei de doctorat. n general, n cercetrile experimentale de biologie se practic utilizarea unor organisme, organe, esuturi, celule i n cazul biotehnologiei vegetale a unor protoplati, ca material biologic ce manifest anumite reacii specifice, ce se prezint n condiii de lucru similare, ceea ce asigur nu numai o reproductibilitate a rezultatelor experimentale, ci i folosirea unor astfel de ansambluri experimentale ca modele de reactivitate, permind compararea manifestrilor nregistrate n cadrul unui anumit element (compus) variabil, cu reacia materialului biologic de un acelai tip, supus sau expus altui regim de lucru. Astfel, din compararea rezultatelor obinute n condiiile efecturii a diferite experimente, cu un acelai tip de material n cazul de fa vegetal (fitoinoculi) se ajunge s se poat aduce contribuii originale cu privire la aciunea a diferii factori aplicai ntr-un regim de lucru particular, n tez fiind vorba despre reactivitatea fitoinoculilor de Begonia sp. la prezena n substratul de cultur aseptic acelai pe tot parcursul experimentelor efectuate a unor regulatori de cretere variabili ca natur, concentraie, administrai singuri sau n amestec. n acest complex factorial au fost utilizai, ca fitoinoculi, fie minibutai, fie propaguli, experimentele fiind polifactoriale. Capitolul 2 cuprinde Cercetrile proprii, n care n primul rnd sunt detaliate aspectele de Material i metod de cercetare, n care se regsete un subcapitol de descrierea botanic i ncadrarea taxonomic a genului Begonia, experimente de tatonare efectuate n vederea selectrii speciei de Begonia, cu reactivitate bun n vitrocultur, 7 subcapitole subcapitol n care sunt detaliate toate amnuntele referitoare la iniierea unei vitroculturi de Begonia din muguraii axilari, din muguraii foliari, din minibutai apicali prelevai de la plantule de origine zigotic obinute din semine germinate n regim aseptic, vitroculturile realizate i biometrizarea plantulelor, operarea de subculturi prin intermediul separrii de propaguli regenerai din fitoinoculi de tip minibutai prelevai de la plantule de origine din embrionul seminei, culturile primare i subculturile fiind realizate pe un mediu de baz Murashige-Skoog (1962) cu adaos de variai 10

regulatori de cretere, administrai ca atare sau n amestec, de diferite concentraii, dar i de determinarea coninutului n pigmeni asimilatori (clorofil a, i clorofil b, total pigmeni verzi i total pigmeni carotenoidici), precum i determinri privind capacitatea de adaptare i procentul de supravieuire, a exvitroplantulelor la regimul de via n condiii septice. Toate datele experimentale obinute au fost reprezentate grafic. Biometrizrile au fost operate n cea de a 30-a, 60-a i a 90-a zi de la iniierea unui nou experiment.

2.1. MATERIAL I METOD DE LUCRU

2.1.1. Genul Begonia descriere botanic i ncadrare taxonomic
Genul Begonia face parte din ncrengtura Spermatophyta, Diviziunea Magnoliophyta, Clasa Magnoliopsida (Dicotiledonatae), Subclasa Dillenidae, Familia Begoniaceae. Speciile de Begonia sunt utilizate - n marea lor majoritate - ca plante ornamentale. n cadrul prezentei lucrri de doctorat, ca material vegetal cu care am experimentat menionm explantele prelevate de la exemplare de Begonia semperflorens var. Ambassador White. ntruct cele mai bune rezultate privind supravieuirea explantelor le-am obinut cu specia Begonia semperflorens var. Ambasssador White (Fig. 12), ne-am propus s Fig. 12 Begonia semperflorens var. Ambasador continum cercetrile noastre White (www8). cu aceast specie. 2.1.2. Experimente de tatonare efectuate n vederea selectrii speciei de Begonia cu reactivitate bun n vitrocultur Pentru a atinge obiectivele menionate anterior, s-a procedat la identificarea speciei de Begonia i a explantului celui mai reactiv i receptiv la procedeele experimentele aplicate. Pentru aceasta, s-a examinat reactivitatea la vitrocultur, respectiv rspunsul dat de ctre explante prelevate de la plante mame cultivate n ser, la regimul aseptic de cultur. Experimentele de tatonare efectuate cu explante prelevate de la specii de B. boweri var Tiger, B. coccinea L., i a celor de B. erythrophylla L. au dovedit un randament foarte sczut n ceea ce privete posibilitatea de iniiere a unor vitroculturi, ntruct dac dezinfectarea materialului vegetal se fcea cu substane 11

asepsizate eficiente se produce o distrugere a vitalitii viitoarelor explante, iar dac diluia acestora a fost mai mare s-a facilitat meninerea n via a o serie de spori de microorganisme saprofite, care la scurt timp de la inocularea materialului vegetal pe medii aseptice a provocat o invadare a mediilor de cultur de ctre micelii fungice, i sufocarea fitoinoculilor de ctre micoze. Fiecare subcapitol a fost submprit n experimente, la finele fiecrui experiment existnd concluziile pariale la care s-a ajuns, n urma aplicrii unei anumite balane constituit din regulatorii de cretere adugai mediului de cultur baz Murashige-Skoog. 2.1.3. Alegerea tipului de material vegetal utilizat de noi n experimente Dup cum s-a putut constata, tehnologia culturilor de esuturi vegetale este utilizat pe scar larg n multiplicarea plantelor. Este cunoscut faptul c, cultura in vitro poate fi un factor de inducere, stimulare sau chiar scoatere din repaus a celulelor unor specii vegetale, funcii de natura componentelor hormonale introduse n substratul de cultur (Cachi, 1987). Cunoaterea exact a speciei, a originii i a locului de provenien (arealul n care este rspndit planta donatoare de explante) i, nu n ultimul rnd, spaiul de unde este recoltat planta mam sau materialul vegetal donator de explante, este foarte important pentru c, nu ntotdeauna exist posibilitatea aducerii ei de la locul de origine. Aa este cazul unor specii care provin din grdini botanice, din arealele de rspndire sau din locuri de drumeii unde se pot gsi sporadic, a cror autenticitate este exact stabilit, de ctre persoane specializate n domeniul taxonomiei vegetale. 2.1.4. Compoziia mediului de cultur utilizat pentru operarea de culturi in vitro la Begonia sp. Majoritatea studiilor efectuate asupra micropropagrii prin culturi de esuturi la Begonia au fost fcute pe medii agarizate (Takayama i Misawa, 1982). n vitroculturile vegetale, cel mai utilizat substrat de cretere a fost, i este, mediul nutritiv Murashige-Skoog (1962), abreviat MS (dup Takayama i Misawa, 1981; Castillo i Smith, 1997; Ab Aziz, 2006 .a.). Studiind literatura de specialitate, cu privire la aciunea i combinaia de regulatori de cretere utilizai n vitroculturile de Begoniaceae, rezultate spectaculoase s-au obinut prin adugarea n mediul de baz Murashige-Skoog (1962), a auxinelor (acidul -naftilacetic - ANA) i a citochininelor (tidiazuron TDZ i benziladenin - BA) (Chlyah i colab., 1975; Mok i colab., 1982; Katterman, 1986; Chin, 1993; Nhut i colab., 2005 i Ab Aziz, 2006). Pentru a studia comportamentul explantelor de Begonia semperflorens var. Ambassador White n condiiile cultivrii lor pe medii cu balan hormonal variat, n substratul de cultur, gelificat cu agar-agar, ca regulatori de cretere, de sintez, au fost introdui compui variai cum sunt auxinele: acidul indolilbutiric (AIB) i acidul 2,4-diclorofenoxiacetic (2,4-D), precum i citochinina tidiazuron (TDZ), a cror efecte fiziologice (n reglarea proceselor de dedifereniere celular, multiplicare i cretere celular, precum i de morfogenez i de organogenez) 12

sunt parial similare cu efectele fitohormonilor. Dar, prin introducerea n substrat exclusiv a acidului 2,4-diclorofenoxiacetic (2,4-D), n concentraie de 2,5 mg/l (varianta V4), am urmrit s obinem, la nivelul explantelor, regenerare de calus. Prezena exclusiv a tidiazuronului (TDZ), la nivelul mediului de cultur, n concentraie de 0,5 mg /l, (varianta V2), a fost aleas ca variant experimental deoarece acest compus este cea mai eficient citochinin de sintez. Tidiazuronul (TDZ) sau fenilurea, n culturile de esuturi induce lstrirea (Mok i colab., 1982; Huetteman i colab., 1993). Proprietile fitofiziologice ale acestei citochinine a fost raportat n anul 1982, de ctre Mok. De atunci, aceast citochinin i-a dovedit eficiena n stimularea proliferrii de lstari axilari sau n formarea la nivelul vitroculturilor vegetale, de mugurai adventivi. Morfogeneza indus de TDZ depinde, probabil, i de nivelul endogen al fitohormonilor, acest compus de sintez avnd capacitatea de a modula nivelul endogen de auxin (Murthy i colab., 1998). Combinaia sinergetic a auxinei i a citochininei promoveaz regenerarea lstarilor (Khawar i colab., 2004; Youmbi i colab., 2006). ntr-o cultur in vitro, balana hormonal nu poate fi controlat n totalitate, combinarea regulatorilor de cretere - n cazul de fa a citochininei tidiazuron (TDZ) influeneaz organogeneza, ntre anumite limite (Rout i Jain, 2004), avnd alturi o auxin - acidul indolilbutiric (AIB), prin schimbarea concentraiei i a raportului dintre acetia. La nfiinarea unei culturi primare de Begonia semperflorens var. Ambassador White, am utilizat acest mediu de baz (MB) de cultur MS, care a fost suplimentat cu fitoregulatori de cretere, adugai n diferite concentraii, administrai singuri sau n amestec. n scopul testrii reactivitii inoculilor la regulatorii de cretere de tip auxinic, am suplimentat mediul de cultur, lipsit de regulatori de cretere, fie cu acid indolilbutiric (AIB), fie cu tidiazuron (TDZ), n concentraii variate, de 0,5 mg/l, 1 mg/l sau 1,5 mg/l, fie n amestec ntre ele; ntrun singur caz la varianta V4 am substituit cei doi regulatori de cretere menionai anterior, cu acid 2,4-diclorfenoxiacetic (2,4-D) n concentraie de 2,5 mg/l, pentru a provoca regenerarea de calus, din explante. Astfel, ntr-un prim experiment am obinut urmtoarele variante experimentale: - V0 varianta martor, mediu lipsit de regulatori de cretere; - V1 mediu MB - MS suplimentat cu 0,5 mg/l AIB (acid indolilbutiric); - V2 mediu MB - MS suplimentat cu 0,5 mg/l TDZ (tidiazuron); - V3 mediu MB - MS suplimentat cu amestec de 0,5 mg/l AIB (acid indolilbutiric) plus 0,5 mg/l TDZ (tidiazuron); - V4 mediu MB - MS suplimentat cu 2,5 mg/l acid 2,4diclorfenoxiacetic (2,4-D). n scopul gsirii unei formule ct mai eficient de balan hormonal, care s permit exprimarea potenialului morfogenetic al explantelor de Begonia semperflorens var. Ambassador White, vitrocultivate, n continuarea 13

experimentului descris anterior, am sporit la 1 mg/l, 1,5 mg/l sau 2 mg/l concentraia fiecrui regulator de cretere, administrat singuri sau n amestec, format din cantiti egale de acid indolilbutiric (AIB) i/sau din tidiazuron (TDZ) (variantele V5-V13), pe care l-am adugat n mediul lipsit de regulatori de cretere i nu am mai utilizat 2,4-D. Astfel, am realizat urmtoarele variante experimentale: - V5 mediu MB - MS suplimentat cu 1 mg/l AIB (acid indolilbutiric); - V6 mediu MB - MS suplimentat cu 1 mg/l TDZ (tidiazuron); - V7 mediu MB - MS suplimentat cu amestec de 1 mg/l AIB (acid indolilbutiric) plus 1 mg/l TDZ (tidiazuron); - V8 mediu MB - MS suplimentat cu 1,5 mg/l AIB (acid indolilbutiric); - V9 mediu MB - MS suplimentat cu 1,5 mg/l TDZ (tidiazuron); - V10 mediu MB - MS suplimentat cu amestec de 1,5 mg/l AIB (acid indolilbutiric) plus 1,5 mg/l TDZ (tidiazuron); - V11 mediu MB - MS suplimentat cu 2 mg/l AIB (acid indolilbutiric); - V12 mediu MB - MS suplimentat cu 2 mg/l TDZ (tidiazuron); - V13 mediu MB - MS suplimentat cu amestec de 2 mg/l AIB (acid indolilbutiric) plus 2 mg/l TDZ (tidiazuron). La operarea unei subculturi din cultura primar, am studiat capacitatea regenerativ i de organogenez a propagulilor de Begonia semperflorens var. Ambassador White i reactivitatea in vitro a acestora, n funcie de prezena auxinei acid -naftilacetic (ANA) (variantele V14-V22), administrat n concetraii variate, obinnd urmtoarele variante experimentale: - V14 mediu MB - MS suplimentat cu 1 mg/l ANA (acid -naftilacetic); - V15 mediu MB - MS suplimentat cu 1 mg/l TDZ (tidiazuron); - V16 mediu MB - MS suplimentat cu amestec de 1 mg/l ANA (acid -naftilacetic) plus 1 mg/l TDZ (tidiazuron); - V17 mediu MB - MS suplimentat cu 1,5 mg/l ANA (acid naftilacetic); - V18 mediu MB - MS suplimentat cu 1,5 mg/l TDZ (tidiazuron); - V19 mediu MB - MS suplimentat cu amestec de 1,5 mg/l ANA (acid -naftilacetic) plus 1,5 mg/l TDZ (tidiazuron); - V20 mediu MB - MS suplimentat cu 2 mg/l ANA (acid -naftilacetic); - V21 mediu MB - MS suplimentat cu 2 mg/l TDZ (tidiazuron); - V22 mediu MB - MS suplimentat cu amestec de 2 mg/l ANA (acid -naftilacetic) plus 2 mg/l TDZ (tidiazuron). Notarea variantelor, s-a realizat astfel nct abrevierea acestora s nu se suprapun, codurile alese s permit o recunoatere rapid a variantei, avnd n vedere c aceast notare este unitar pentru toate experimentele n care am folosit aceeai reet de mediu de cultur, la Begonia semperflorens var. Ambassador White. Aceast notare unitar ne ajut s comparm capacitatea regenerativ i organogen a fitoinoculilor de Begonia sp., n funcie de componena n regulatori de cretere a substratului nutritiv. 14

n consecin, n partea de Rezultate i discuii prezentm, ealonat, seriile experimentale care au fcut obiectul de studii al prezentei teze de doctorat, respectiv: 1. Germinarea in vitro a seminelor de Begonia semperflorens var. Ambassador White pe mediu simplu Murashige-Skoog (1962). 2. Iniierea unei vitroculturi de Begonia semperflorens var. Ambassador White din minibutai apicali prelevai de la plantule de origine zigotic, obinute prin germinarea n regim aseptic a seminelor, explante cultivate pe mediu Murashige-Skoog (1962) (MB-MS) cu adaos de 0,5 mg/l acid indolilbutiric (AIB) sau de tidiazuron (TDZ). 3. Inocularea de propaguli provenii dintr-o cultur primar de Begonia semperflorens var. Ambassador White pe medii MB-MS, cu adaos de acid indolilbutiric (AIB) sau cu tidiazuron (TDZ), de diferite concentraii, respectiv de 1 mg/l, 1,5 mg/l i 2 mg/l, compui administrai ca atare sau n amestec. 4. Operarea unei subculturi de propaguli provenii dintr-o cultura primar de Begonia semperflorens var. Ambassador White pe medii MB-MS, cu adaos de acid -naftilacetic (ANA) sau de tidiazuron (TDZ), n concentraii variate, regulatori de cretere administrai ca atare sau n amestec. 5. Studii comparative privind reacia fitoinoculilor de Begonia semperflorens var. Ambassador White cultivai in vitro n prezena n mediul de cultur a auxinelor acid indolilbutiric (AIB) sau acid naftilacetic (ANA) sau/i a citochininei TDZ, de diferite concentraii, administrate singure sau n balan hormonal. 6. Determinarea coninutului de clorofila a i b n frunzuliele vitroplantulelor de Begonia semperflorens var. Ambassador White. 7. Determinarea coninutului de pigmeni carotenoidici n frunzuliele vitroplantulelor de Begonia semperflorens var. Ambassador White. 8. Aclimatizarea exvitroplantulelor de Begonia semperflorens var. Ambassador White la viaa n mediul septic, aplicate ex vitro. Tot n acest capitol sunt prezentate i rezultatele obinute, respectiv concluziile pariale fiecrui experiment n parte.

2.2. REZULTATE I DISCUII

2.2.1. Germinarea in vitro a seminelor de Begonia semperflorens var. Ambassador White n urma experimentelor efectuate cu Begonia semperflorens var. Ambassador White, n regim de vitrocultur, am reuit s iniiem o cultur primar din minibutaii caulinari, prelevai de la plantulele de origine zigotic, n vrst de 30 de zile, obinute prin germinarea aseptic a seminelor. Un minibuta a fost constituit din apexul plantulei, care a deinut muguraul i epicotilul subiacent, 15

cele dou cotiledoane, i zona de inserie a lor pe hipocotil. n ntregul su, talia minibutaului a avut cca. 4 mm, din care cca. 1 mm a fost reprezentat de ctre muguraul plantulei. Germinarea aseptic a seminelor i creterea in vitro a plantulelor zigotice timp de 30 de zile s-a realizat pe mediu Murashige-Skoog (1962) (MB-MS) cu vitaminele (modificate de noi), utiliznd ca regulatori de cretere un amestec de acid indolilbutiric (AIB) i de tidiazuron (TDZ), cte 0,5 mg/l, din fiecare. 2.2.2. Iniierea unei vitroculturi de Begonia semperflorens var. Ambassador White din minibutai apicali prelevai de la vitroplantule de origine zigotic, obinute prin germinarea n regim aseptic a seminelor

Fig. 32. Imagini ale vitroculturilor de Begonia semperflorens var. Ambassador White iniiate din minibutai apicali, prelevai de la plantule de origine zigotic n cea de a 30-a zi de la inocularea acestora in vitro pe urmtoarele variante de medii de cultur: V0 - (lot control) mediu MB - MS lipsit de regulatori de cretere (A); V1 mediu MB - MS suplimentat cu 0,5 mg/l acid indolilbutiric (AIB) (B); V2 mediu MB - MS suplimentat cu 0,5 mg/l tidiazuron (TDZ) (C); V3 mediu MB - MS suplimentat cu 0,5 mg/l acid indolilbutiric (AIB) n amestec cu 0,5 mg/l tidiazuron (TDZ) (D); V4 mediu MB - MS suplimentat cu 2,5 mg/l acid 2,4-diclorfenoxiacetic (2,4-D) (E), unde: fr frunzulie; cs calus; mc mediu de cultur; mg mugurai; r - rdcini.

Minibutai au fost inoculai pe acest tip de mediu de baz, fie lipsit de regulatori de cretere lot martor fie cu adaos exclusiv de 0,5 mg/l TDZ, care a stimulat filogeneza (generndu-se, n medie, cte 3,5 frunzulie/explant), marcnd un spor de 16,66%, n raport cu neogeneza de numai 3 frunzulie/explant, la nivelul minibutailor cultivai i crescui pe mediu lipsit de regulatori de cretere, fie 16

mediu MB-MS cu amestec de AIB n concentraie de 0,5 mg/l plus TDZ 0,5 mg/l combinaie care nu a stimulat filogeneza, obinndu-se o regenerare doar a cte 2,6 frunzulie/explant, marcndu-se o descretere de 13,34% a acestui proces de organogenez, fa de lotul martor; - dar, la aceast variant a sczut i rizogeneza, la nivelul minibutailor generndu-se doar cte 1,4 rdcinie/explant, marcndu-se o descretere de 12,5% a neogenezei, de rdcinie; - la varianta MB-MS suplimentat cu AIB, cte 0,5 mg/l, s-a nregistrat un spor de 75%, a neogenezei de rdcine, n raport cu rizogeneza constatat la lotul martor, care a fost de cte 2,8 rdcinie/explant; - prezena n mediul de cultur a acidului 2,4 diclorofenoxiacetic (2,4-D), aplicat n concentraie de 2,5 mg/l, a favorizat calusogeneza. 2.2.3. Operarea unei subculturi prin intermediul propagulilor desprini din culturi de Begonia semperflorens var. Ambassador White ce au fost iniiate din minibutai apicali prelevai de la plantule de origine zigotic obinute prin germinarea n regim aseptic a seminelor 2.2.3.2. Rezultate privind reacia propagulilor provenii dintr-o cultur primar de Begonia semperflorens var. Ambassador White inoculai i crescui pe medii MB-MS cu adaos de acid indolilbutiric (AIB) sau de tidiazuron (TDZ), administrai n concentraii diferite, adugai ca atare sau n amestec Pentru a urmri, n regim de subcultur, evoluia fitoinoculilor de Begonia semperflorens var. Ambasador White, constnd din propaguli dezmembrai din cultura primar iniiat din minibutai apicali, n cea de a 30-a zi de la montarea experimentului respectiv, s-au separat propagulii care au posedat cte 3 frunzulie, scurt peiolate, deposedate de eventualele rdcinie, ce au fost inoculai pe mediul menionat anterior, cu adaos de AIB sau de TDZ, administrai ca atare, sau n amestec, regulatori de cretere utilizai i n cultura primar, n subcultur crescnd concentraiile acestora. 2.2.3.2.1. Evoluia propagulilor pe mediu MB-MS cu adaos fie de acid indolilbutiric (AIB), fie de tidiazuron (TDZ), fie a unui amestec a celor dou, doza administrat fiind de 1 mg/l din fiecare Dintr-o cultur primar de B. semperflorens, iniiat din apexuri de plantule de origine zigotic, provenite din germinarea n regim aseptic a seminelor; la 30 de zile de la demararea ei, tufa de frunzulie i mugurai, regenerat din minibutaii apicali, a fost dezmembrat n propaguli, cu talia de cca. 3-4 mm, trifoliai, scurt peiolai, ce au fost subcultivai pe mediu de baz, agarizat, Murashige-Skoog (1962), cu unii componenii organici modificai de noi, mai ales cantitativ. Propagulii de B. semperflorens subcultivai in vitro, pe mediu de baz enunat mai sus, cu adaos de 1 mg/l tidiazuron (TDZ), pe parcursul a 90 de zile de vitrocultur au nregistrat att o puternic stimulare a neogenezei de frunzulie i de mugurai, ct i creterea acestora. 17

Fig. 39. Imagini cu vitroplantule de Begonia semperflorens var. Ambassador White la 90 de zile dup subcultivarea propagulilor in vitro, pe variantele: V0 - (lot control) mediu MB - MS lipsit de regulatori de cretere (A); V5 - mediu MB - MS suplimentat cu un adaos de 1 mg/l acid indolilbutiric (AIB) (B); V6 - mediu MB - MS suplimentat cu un adaos de 1 mg/l tidiazuron (TDZ) (C); V7 - mediu MB - MS suplimentat cu un amestec realizat ntre 1 mg/l acid indolilbutiric (AIB) i 1 mg/l tidiazuron (TDZ) (D), unde: f frunzuli; m mugura; r rdcini; mc mediu de cultur; cs calus; n - necroz.

Prezena n mediul de cultur doar a 1 mg/l acid indolilbutiric (AIB) a condus la nregistrarea la nivelul fitoinoculilor de tip propaguli a unui proces de morfogenez, apropiat ca manifestare de cel nregistrat la lotul martor, la care n substratul de cultur nu a fost introdus nici un regulator de cretere. Introducerea n substratul de subcultur a propagulilor de B. semperflorens al unui amestec de 1 mg/l TDZ cu 1 mg/l AIB a stimulat la nivelul vitroculturilor realizate a neogenezei de mugurai i de frunzulie, dar mult sub amplitudinea organogenezei nregistrate la inoculii similari crescui pe mediu de baz Murashige-Skoog (1962) cu adaos de doar TDZ, n concentraie de 1 mg/l. Este de menionat i faptul, c sub influena acestui tip de balan hormonal i chiar n amestec de 1mg/l TDZ cu 1 mg/l AIB n zona bazal a fitoinoculilor s-a observat regenerarea de calus (Fig. 39D).

18

2.2.3.2.2. Evoluia propagulilor pe mediu MB-MS cu adaos fie de acid indolilbutiric (AIB), fie de tidiazuron (TDZ), fie a unui amestec a celor dou, doza administrat fiind de 1,5 mg/l din fiecare n continuarea experimentului de investigare a reaciei propagulilor, provenii dintr-o cultur primar prin separarea de tufe, de Begonia semperflorens var. Ambasador White, n condiiile cultivrii lor in vitro, subcultivai fiind pe mediu de cultur de baz Murashige-Skoog (1962), la care au fost adugai, regulatori de cretere: acid indolilbutiric (AIB) i tidiazuron (TDZ), am majorat concentraia acestora la 1,5 mg/l (Romocea, 2011).

Fig. 42. Imagini cu vitroplantule de Begonia semperflorens var. Ambassador White la 90 de zile dup inocularea in vitro a propagulilor, pe variantele: V0 - (lot control) mediu MB - MS lipsit de regulatori de cretere (A); V8 - mediu MB - MS suplimentat cu un adaos de 1,5 mg/l acid indolilbutiric (AIB) (B); V9 - mediu MB MS suplimentat cu un adaos de 1,5 mg/l tidiazuron (TDZ) (C); V10 - mediu MB MS suplimentat cu un amestec realizat ntre 1,5 mg/l acid indolilbutiric (AIB) i 1,5 mg/l tidiazuron (TDZ) (D), unde: f frunzuli; mc mediu de cultur; m mugura; n necroz; r - rdcini.

Sporind cantitatea de regulatori de cretere la cte 1,5 mg/l fie de AIB, fie de TDZ, fie a melanjului dintre ele, s-a constatat c la varianta de amestec, la nivelul propagulilor s-au regenerat cei mai muli mugurai (cte 7 mugurai/explant), marcndu-se un spor de 366,66% fa de parametrul respectiv marcat la lotul martor, la care s-au regenerat doar cte 1,5 mugurai/explant. Prezena doar a auxinei AIB, ca adaos la mediul de cultur, n concentraie de 1,5 mg/l, a stimulat nc dup 30 de zile de la operarea subculturii de propaguli producerea rizogenezei, la nivelul acestora regenerndu-se cte 1,5 rdcinie/explant, 19

marcnd un spor de 50%, cu o lungime medie a celei mai lungi rdcinie de 8 mm i un spor de 220% fa de lotul martor (la care lungimea maxim a rdciniei a fost de 2,5 mm), proces care la 90 de zile de vitrocultur s-a finalizat printr-o sporire a numrului de rdcinie la cte 3,33 rdcinie/explant, marcnd un spor de 66,5%, fa de martor, lungimea maxim a acestora fiind de 17,6 mm, respectiv sporind cu 232,07%. La fitoinoculii crescui pe mediul suplimentat cu 1,5 mg/l TDZ, s-a remarcat neogeneza de frunzulie regenerndu-se cte 9,67 frunzulie/explant marcnd un spor de 190,39% fa de lotul martor (3,33 frunzulie/explant), iar dimensiunea acestora a fost de 8,3 mm nregistrnd un spor de 59,61%, respectiv numrul mediu de mugurai a fost de 6,25 mugurai/explant fa de martor, marcnd un spor de 316,66%. 2.2.3.2.3. Evoluia propagulilor pe mediu MB-MS cu adaos fie de acid indolilbutiric (AIB), fie de tidiazuron (TDZ), fie a unui amestec a celor dou, doza administrat fiind de 2 mg/l din fiecare n continuarea experimentelor efectuate i descrise anterior, n studiul de fa, ne-am propus s analizm reacia propagulilor de Begonia semperflorens var. Ambasador White, cultivai pe un acelai mediu de cultur MB MS, dar cu adaos de regulatori de cretere n concentraii de 2 mg/l.

Fig. 45. Imagini cu vitroplantule de Begonia semperflorens var. Ambassador White la 90 de zile dup subcultivarea propagulilor in vitro, pe variantele: V0 - (lot control) mediu MB - MS lipsit de regulatori de cretere (A); V11 - mediu MB - MS suplimentat cu un adaos de 2 mg/l acid indolilbutiric (AIB) (B); V12 - mediu MB MS suplimentat cu un adaos de 2 mg/l tidiazuron (TDZ) (C); V13 - mediu MB - MS suplimentat cu un amestec realizat ntre 2 mg/l acid indolilbutiric (AIB) i 2 mg/l tidiazuron (TDZ) (D), unde: f frunzuli; m mugura; mc mediu de cultur; cs calus; n - necroz.

20

Prezena acidului indolilbutiric (AIB) n concentraie de 2 mg/l a favorizat formarea de rdcinie, astfel, s-a nregistrat formarea a cte 4 rdcinie/explant, astfel la 90 de zile de la operarea subculturii de propaguli, lungimea medie a celei mai lungi rdcinie a atins 18 mm marcnd un spor de 239,62% fa de lotul martor (5,3 mm). Mrirea concentraiei regulatorilor de cretere la 2 mg/l, n cazul TDZ-ului la nivelul propagulului s-a nregistrat formarea unui mai mare numr de frunzulie i de mugurai, dar n prezena acestei citochinine s-a stimulat substanial producerea de calus. Pe parcursul experimentului, chiar dac pe lng 2 mg/l TDZ s-a adugat auxin AIB 2 mg/l, suplimentarea mediului de cultur cu acest amestec s-a potenat organogeneza la nivelul propagulilor, cel mai bun rspuns caulogen nregistrndu-se cei mai muli mugurai 7,33 regenerai/propagul inoculat sporul realizat fa de martor cifrndu-se la 388,66%, lot martor la care numrul mediu de mugurai/propagul iniiat a fost de 1,5 exemplare. 2.2.4. Rezultate privind reacia propagulilor provenii dintr-o cultur primar de Begonia semperflorens var. Ambassador White inoculai i crescui pe medii MB-MS cu adaos de acid -naftilacetic (ANA) sau de tidiazuron (TDZ), administrai n concentraii diferite, adugai ca atare sau n amestec Spre deosebire de experimentele precedente, n care am realizat culturi primare de Begonia semperflorens var. Ambassador White, n prezentul experiment a avut drept scop, studierea modului n care reacioneaz fitoinoculii de Begoniaceae, la suplimentarea mediul de cultur modificat de noi - V0 mediu lipsit de regulatori de cretere modificnd auxina de acid indolilbutiric (AIB) cu acidul -naftilacetic (ANA), folosind o combinaie format din cantiti egale, ntre acid -naftilacetic (ANA) i citochinina tidiazuron (TDZ), adugat n concentraii diferite, respectiv de 1 mg/l (variantele V14-V16), 1,5 mg/l (variantele V17-V19) i respectiv 2 mg/l (variantele V20-V22). Dup 90 zile de la vitrocultur a propagulilor rezultai din culturile primare pentru subcultur au fost dimensionai din vitroculturile de Begonia semperflorens var. Ambassador White regenerate la varianta de mediu fr regulatori de cretere (V0), propagulii atingnd o talie de 7-8 mm, care au fost inoculai n condiii aseptice pe mediu de cultur Murashige-Skoog (1962). 2.2.4.1.1. Evoluia propagulilor pe mediu MB-MS cu adaos fie de acid naftilacetic (ANA), fie de tidiazuron (TDZ), fie a unui amestec a celor dou, doza administrat fiind de 1 mg/l din fiecare Pentru a urmri, n regim de subcultur, evoluia fitoinoculilor de Begonia semperflorens var. Ambasador White, constnd din propaguli, dezmembrai dintr-o cultur primar, n cea de a 90-a zi de la subcultivarea propagulilor crescui pe mediu lipsit de regulatori de cretere (V0), propagulii entiti care au posedat cte 3-4 frunzulie scurt peiolate, deposedate de eventualele rdcinie au fost inoculai pe mediul menionat anterior, cu adaos de ANA sau de TDZ. 21

Fig. 58. Imagini cu vitroplantule de Begonia semperflorens var. Ambassador White la 90 de zile dup subcultivarea propagulilor in vitro, pe variantele: V0 - (lot control) mediu MB - MS lipsit de regulatori de cretere (A); V14 - mediu MB - MS suplimentat cu un adaos de 1 mg/l acid -naftilacetic (ANA) (B); V15 - mediu MB - MS suplimentat cu un adaos de 1 mg/l tidiazuron (TDZ) (C); V16 - mediu MB - MS suplimentat cu un amestec realizat ntre 1 mg/l acid -naftilacetic (ANA) i 1 mg/l tidiazuron (TDZ) (D), unde: f frunzuli; m mugura; cs calus; mc mediu de cultur; r rdcini; n - necroz.

Dup cum se poate vedea n figura 58 B, la baza coloniei de plantule i de frunzulie rezultate din propagulii subcultivai pe medii MS, n cea de a 90-a zi de vitrocultur, pe substrat MB-MS, cu adaos de ANA 1 mg/l (V14), s-a regenerat i o bogat mas de rdcinie, care au msurat n medie aproximativ o lungime maxim de 24,3 mm nregistrnd un spor de 107,69% prezentnd o diferen distinct semnificativ din punct de vedere statistic. Calusul generat la nivelul fitoinoculilor crescui pe mediul mineral de baz MB MS suplimentat cu un adaos de 1 mg/l ANA n amestec cu 1 mg/l TDZ (varianta V16) a atins un diametru mediu de 9,5 mm. n general, prezena auxinelor n mediile de cultur, la unele tipuri de fitoinoculi provoac neogeneza de rdcinie.

22

2.2.4.1.2. Evoluia propagulilor pe mediu MB-MS cu adaos fie de acid naftilacetic (ANA), fie de tidiazuron (TDZ), fie a unui amestec a celor dou, doza administrat fiind de 1,5 mg/l din fiecare Minibutaii de tip propagul, au fost inoculai pe un mediu de cultur de baz Murashige-Skoog (1962) (MB - MS), modificat de noi i suplimentat (sau nu) fie cu 1,5 mg/l acid -naftilacetic (ANA varianta V17), fie cu 1,5 mg/l tidiazuron (TDZ varianta V18), fie cu amestec a celor doi regulatori de cretere (varianta V19).

Prin adugarea n mediu de cultur exclusiv a 1,5 mg/l ANA, la nivelul propagulilor, nc de la 30 zile de la subcultivarea acestora, a indus fenomenul de rizogenez, astfel la 90 de zile, s-au regenerat 2,67 rdcinie/explant, nregistrnd un spor de 14,59% fa de martor, ele fiind cele mai lungi rdcinie (17,7 mm), acestea marcnd un spor n ceea ce privete talia acestora de 51,28%, acest mediu dovedindu-se a fi cel mai potrivit pentru inducerea i susinerea rizogenezei; prezena n mediul de cultur exclusiv a TDZ (1,5 mg/l) a produs cel mai stimulativ efect exercitat de regulatorii de cretere utilizai n prezentul experiment asupra neogenezei de frunzulie, numrul acestora cifrndu-se la 40,6 exemplare/propagul, marcndu-se astfel un spor de 176,75% fa de filogeneza nregistrat la parametrul respectiv la lotul martor (14,67 exemplare/propagul), limea celei mai mari frunzulie fiind de 12 mm, sporul procentual marcat fa de media parametrului 23

similar nregistrat la lotul martor cifrndu-se la valoarea de 90,47%; - prezena n mediul de cultur att a 1,5 mg/l ANA, ct i a 1,5 mg/l TDZ, la 90 de zile de la subcultivarea propagulilor, a stimulat neogeneza de mugurai, parametrul menionat marcnd un spor de 279,04%, respectiv 6,33 exemplare/propagul la varianta analizat, fa de lotul control cu 1,67 exemplare/propagul, iar generarea de frunzulie, per inocul, fiind de 29,33 exemplare/propagul, n timp ce la martor a fost de 14,67 exemplare/propagul, ceea ce semnific un spor de 99,93% fa de martor; totodat, la aceast variant s-a nregistrat i un mare numr de rdcinie, cte 3,67 exemplare/propagul, nregistrnd un spor de 57,51% fa de martor, la care numrul acestora a fost de 2,33 exemplare/propagul, lungimea celei mai lungi rdcinie a atins un maxim de 13,7 mm i a nregistrat un spor de 17,09% fa de lotul martor. 2.2.4.1.3. Evoluia propagulilor pe mediu MB-MS cu adaos fie de acid naftilacetic (ANA), fie de tidiazuron (TDZ), fie a unui amestec a celor dou, doza administrat fiind de 2 mg/l din fiecare

Fig. 64. Imagini cu vitroplantule de Begonia semperflorens var. Ambassador White la 90 de zile dup subcultivarea propagulilor in vitro, pe variantele: V0 - (lot control) mediu MB - MS lipsit de regulatori de cretere (A); V20 - mediu MB - MS suplimentat cu un adaos de 2 mg/l acid -naftilacetic (ANA) (B); V21 - mediu MB - MS suplimentat cu un adaos de 2 mg/l tidiazuron (TDZ) (C); V22 - mediu MB - MS suplimentat cu un amestec realizat ntre 2 mg/l acid -naftilacetic (ANA) i 2 mg/l tidiazuron (TDZ) (D), unde: f frunzuli; m mugura; mc mediu de cultur; r rdcini; n necroz; a - antociani.

24

n regim de subcultur, s-a urmrit evoluia fitoinoculilor de Begonia semperflorens var. Ambasador White, constnd din propaguli, dezmembrai dintr-o cultur primar, n cea de a 90-a zi de la subcultivarea propagulilor, inoculai pe mediul menionat anterior, cu adaos de 2 mg/l ANA sau de TDZ. Prezena acidului -naftilacetic (ANA) n concentraie de 2 mg/l a favorizat formarea de rdcinie, nc de la 60 de zile de la subcultivarea propagulilor, s-a nregistrat formarea a cte 5,33 rdcinie/explant, astfel la 90 de zile de la operarea subculturii de propaguli s-au generat cte 5,67 rdcinie/explant marcnd un spor de 143,34%, lungimea medie a celei mai lungi rdcinie a atins 8 mm marcnd o descretere de 31,63% fa de lotul martor (11,7 mm). Mrirea concentraiei regulatorilor de cretere la 2 mg/l, n cazul TDZ-ului la nivelul propagulilor s-a nregistrat formarea unui mai mare numr de frunzulie, parametrul menionat marcnd un spor de 215,26%, respectiv 46,25 exemplare/propagul la varianta analizat, dar n prezena acestei citochinine s-a stimulat substanial dimensiunea acestora, limea medie a celei mai mari frunzulie a atins 10,3 mm marcnd un spor de 63,49% fa de lotul martor (6,3 mm). Pe parcursul experimentului, chiar dac pe lng 2 mg/l TDZ s-a adugat auxin 2 mg/l ANA, suplimentarea mediului de cultur cu acest amestec s-a potenat organogeneza la nivelul propagulilor, cel mai bun rspuns caulogen nregistrndu-se cei mai muli mugurai 15 exemplare/propagul inoculat sporul realizat fa de martor cifrndu-se la 798,2%, lot martor la care numrul mediu de mugurai/propagul iniiat a fost de 1,67 exemplare. ntruct cele mai bune rezultate n ceea ce privete supravieuirea vitroculturilor, respectiv a propagulilor de Begonia semperflorens var. Ambassador White, le-am obinut la aceste ultime experimente, fcute cu acid naftilacetic (ANA) i tidiazuron (TDZ), la aceste loturi am continuat cercetrile cu un studiu referitor la coninutul n pigmeni asimilatori verzi (clorofila a i b) i carotenoidici, etap care am continuat-o cu efectuarea de determinri legate de procentul de supravieuire a exvitroplantulelor de Begonia semperflorens var. Ambassador White la mediul septic de via. Capitolul 3 este consacrat concluziilor generale i, la final, sunt punctate realizrile originale n cadrul acestei teze de doctorat i recomandrile de perspectiv. 1. Pentru selectarea speciei de Begonia cu care urma s efectum studiul pe care ni l-am propus s-l realizm potrivit tematicii abordate n prezenta tez de doctorat, am efectuat o serie de experimente de tatonare n care am urmrit s iniiem o vitrocultur la patru specii de Begonia, respectiv la Begonia boweri var. ,Tiger, Begonia coccinea L., Begonia erythrophylla L. i la Begonia semperflorens var. Ambasssador White, cu explante constnd din muguri axilari i am constatat c procentul de supravieuire a acestor categorii de fitoinoculi a fost foarte sczut, din cauza gradului ridicat al infeciilor prezente la nivelul vitroculturilor realizate. 25

ntruct cele mai bune rezultate privind supravieuirea explantelor leam obinut cu specia Begonia semperflorens var. Ambasssador White, neam propus s continum cercetrile noastre cu aceast specie. 2. n urma experimentelor efectuate cu Begonia semperflorens var. Ambassador White, n regim de vitrocultur, am reuit s iniiem o cultur primar din minibutaii caulinari, prelevai de la plantulele de origine zigotic, n vrst de 30 de zile, obinute prin germinarea aseptic a seminelor. Un minibuta a fost constituit din apexul plantulei, care a deinut muguraul i epicotilul subiacent, cele dou cotiledoane, i zona de inserie a lor pe hipocotil. n ntregul su, talia minibutaului a avut cca. 4 mm, din care cca. 1 mm a fost reprezentat de ctre muguraul plantulei. Germinarea aseptic a seminelor i creterea in vitro a plantulelor zigotice timp de 30 de zile s-a realizat pe mediu Murashige-Skoog (1962) (MB-MS) cu vitaminele (modificate de noi), utiliznd ca regulatori de cretere un amestec de acid indolilbutiric (AIB) i de tidiazuron (TDZ), cte 0,5 mg/l, din fiecare. 3. Minibutai au fost inoculai pe acest tip de mediu de baz, fie lipsit de regulatori de cretere lot martor fie cu adaos exclusiv de 0,5 mg/l TDZ, care a stimulat filogeneza (generndu-se, n medie, cte 3,5 frunzulie/explant), marcnd un spor de 16,66%, n raport cu neogeneza de numai 3 frunzulie/explant, la nivelul minibutailor cultivai i crescui pe mediu lipsit de regulatori de cretere, fie mediu MB-MS cu amestec de AIB n concentraie de 0,5 mg/l plus TDZ 0,5 mg/l combinaie care nu a stimulat filogeneza, obinndu-se o regenerare doar a cte 2,6 frunzulie/explant, marcndu-se o descretere de 13,34% a acestui proces de organogenez, fa de lotul martor; - dar, la aceast variant a sczut i rizogeneza, la nivelul minibutailor generndu-se doar cte 1,4 rdcinie/explant, marcndu-se o descretere de 12,5% a neogenezei, de rdcinie; - la varianta MB-MS suplimentat cu AIB, cte 0,5 mg/l, s-a nregistrat un spor de 75%, a neogenezei de rdcine, n raport cu rizogeneza constatat la lotul martor, care a fost de cte 2,8 rdcinie/explant; - prezena n mediul de cultur a acidului 2,4 - diclorofenoxiacetic (2,4-D), aplicat n concentraie de 2,5 mg/l, a favorizat calusogeneza. 4. Propagulii rezultai, cu o talie de 3-4 mm, trifoliai fiind i scurt peiolai, subcultivai pe acelai mediu de baz, dar cu adaos de AIB sau de TDZ, ca atare, sau administrai n amestec, dublnd concentraia acestora la 1 mg/l (n raport cu cultura primar), organogeneza examinat n cea de a 90-a zi de vitrocultur a acestora, a relevat faptul c, n prezena n mediul de cultur MB-MS a 1 mg/l AIB procesul de morfogenez a fost apropiat ca manifestare n ceea ce privete nlimea celei mai lungi tulpinie care a atins 6,8 mm, marcnd un spor de 11,47% fa de cel nregistrat la lotul martor (6,1 mm), la care n substratul de cultur nu a fost introdus nici un regulator de cretere. Prin adugarea n mediu a 1 mg/l AIB la nivelul propagulilor, doar de la 90 de zile, s-a regenerat cte o rdcini/explant nregistrnd o descretere de 50%, iar lungimea acestora a atins 2,9 mm 26

marcnd o descretere de 45,29%, fa de lotul martor (5,3 mm). Prezena n mediul de cultur MB-MS a 1 mg/l TDZ a stimulat neogeneza de mugurai (generndu-se cte 5,88 mugurai/explant) cu un spor de 292% fa de lotul martor V0. Procesul de morfogenez a fost apropiat ca manifestare n ceea ce privete limea celei mai mari frunzulie care a atins 9,3 mm i marcnd un spor de 78,84% fa de cel nregistrat la lotul martor (5,2 mm), la care n substratul de cultur nu a fost introdus nici un regulator de cretere. Este de menionat i faptul c, sub influena acestui tip de balan hormonal, n zona bazal a propagulilor s-a observat i o slab regenerare de calus, diametrul mediu al calusului a fost de 7,3 mm. Amestecul de 1mg/l TDZ cu 1 mg/l AIB a stimulat la nivelul vitroculturilor realizate n cadrul acestui experiment neogeneza de mugurai (generndu-se cte 2,75 mugurai/explant) cu un spor de 55,33% i de frunzulie (la nivelul propagulului regenerndu-se n medie cte 7,75 frunzulie/explant), marcnd un spor de 132,73% fa de lotul martor a neogenezei acestora. Este de menionat i faptul c, sub influena acestui tip de balan hormonal, n zona bazal a propagulilor s-a observat i o slab regenerare de calus, diametrul mediu al calusului fiind de 7,3 mm; - sporind cantitatea de regulatori de cretere la cte 1,5 mg/l fie de AIB, fie de TDZ, fie a melanjului dintre ele, s-a constatat c la varianta de amestec, la nivelul propagulilor s-au regenerat cei mai muli mugurai (cte 7 mugurai/explant), marcndu-se un spor de 366,66% fa de parametrul respectiv marcat la lotul martor, la care s-au regenerat doar cte 1,5 mugurai/explant. Prezena doar a auxinei AIB, ca adaos la mediul de cultur, n concentraie de 1,5 mg/l, a stimulat nc dup 30 de zile de la operarea subculturii de propaguli producerea rizogenezei, la nivelul acestora regenerndu-se cte 1,5 rdcinie/explant, marcnd un spor de 50%, cu o lungime medie a celei mai lungi rdcinie de 8 mm i un spor de 220% fa de lotul martor (la care lungimea maxim a rdciniei a fost de 2,5 mm), proces care la 90 de zile de vitrocultur s-a finalizat printr-o sporire a numrului de rdcinie la cte 3,33 rdcinie/explant, marcnd un spor de 66,5%, fa de martor, lungimea maxim a acestora fiind de 17,6 mm, respectiv sporind cu 232,07%. La fitoinoculii crescui pe mediul suplimentat cu 1,5 mg/l TDZ, s-a remarcat neogeneza de frunzulie regenerndu-se cte 9,67 frunzulie/explant marcnd un spor de 190,39% fa de lotul martor (3,33 frunzulie/explant), iar dimensiunea acestora a fost de 8,3 mm nregistrnd un spor de 59,61%, respectiv numrul mediu de mugurai a fost de 6,25 mugurai/explant fa de martor, marcnd un spor de 316,66%. - prezena acidului indolilbutiric (AIB) n concentraie de 2 mg/l a favorizat formarea de rdcinie, astfel, s-a nregistrat formarea a cte 4 rdcinie/explant, astfel la 90 de zile de la operarea subculturii de propaguli, lungimea medie a celei mai lungi rdcinie a atins 18 mm marcnd un spor de 239,62% fa de lotul martor (5,3 mm). Mrirea concentraiei regulatorilor de cretere la 2 mg/l, n cazul TDZ-ului la nivelul propagulului s-a nregistrat formarea unui mai mare numr de frunzulie i de mugurai, dar n prezena 27

acestei citochinine s-a stimulat substanial producerea de calus. Pe parcursul experimentului, chiar dac pe lng 2 mg/l TDZ s-a adugat auxin AIB 2 mg/l, suplimentarea mediului de cultur cu acest amestec s-a potenat organogeneza la nivelul propagulilor, cel mai bun rspuns caulogen nregistrndu-se cei mai muli mugurai 7,33 regenerai/propagul inoculat sporul realizat fa de martor cifrndu-se la 388,66%, lot martor la care numrul mediu de mugurai/propagul iniiat a fost de 1,5 exemplare. 5. Inlocuirea AIB n substratul de subcultur a propagulilor de B. semperflorens var. Ambasador White cu acid -naftilacetic (ANA) 1 mg/l, sau cu un amestec de 1mg/l ANA cu 1 mg/l TDZ, ori administrarea exclusiv de TDZ, au fost stimulate procesele de morfogenez la nivelul vitroculturilor realizate, att neogeneza de mugurai i de frunzulie, ct i de calus (9,5 mm). Astfel, la 90 de zile de la subcultivarea propagulilor, prin adugarea a 1 mg/l ANA n mediul de cultur s-a produs cea mai puternic regenerare de cele mai multe rdcinie, ele fiind i cele mai lungi (24,3 mm), consecin care face din aceast variant de mediu cea mai potrivit compoziie pentru stimularea rizogenezei n contextul experimental enunat. La fitoinoculii crescui pe mediul suplimentat cu 1 mg/l TDZ, s-a remarcat neogeneza de frunzulie regenerndu-se cte 43 frunzulie/explant marcnd un spor de 193,11% fa de lotul martor (14,67 frunzulie/explant), iar limea celei mai mari frunzulie a fost de 10,3 mm nregistrnd un spor de 63,49%, respectiv numrul mediu de mugurai a fost de 5,25 mugurai/explant fa de martor, marcnd un spor de 214,37%. Suplimentarea mediului de cultur cu 1 mg/l TDZ n amestec cu ANA 1 mg/l acest amestec s-a potenat organogeneza la nivelul propagulilor, cel mai bun rspuns caulogen nregistrndu-se cei mai muli mugurai 5,75 regenerai/propagul inoculat sporul realizat fa de martor cifrndu-se la 244,31%, lot martor la care numrul mediu de mugurai/propagul iniiat a fost de 1,67 exemplare. Prin adugarea n mediu de cultur exclusiv a 1,5 mg/l ANA, la nivelul propagulilor, nc de la 30 zile de la subcultivarea acestora, a indus fenomenul de rizogenez, astfel la 90 de zile, s-au regenerat 2,67 rdcinie/explant, nregistrnd un spor de 14,59% fa de martor, ele fiind cele mai lungi rdcinie (17,7 mm), acestea marcnd un spor n ceea ce privete talia acestora de 51,28%, acest mediu dovedindu-se a fi cel mai potrivit pentru inducerea i susinerea rizogenezei; - prezena n mediul de cultur exclusiv a TDZ (1,5 mg/l) a produs cel mai stimulativ efect exercitat de regulatorii de cretere utilizai n prezentul experiment asupra neogenezei de frunzulie, numrul acestora cifrndu-se la 40,6 exemplare/propagul, marcndu-se astfel un spor de 176,75% fa de filogeneza nregistrat la parametrul respectiv la lotul martor (14,67 exemplare/propagul), limea celei mai mari frunzulie fiind de 12 mm, sporul procentual marcat fa de media parametrului similar nregistrat la lotul martor cifrndu-se la valoarea de 90,47%; - prezena n mediul de cultur att a 1,5 mg/l ANA, ct i a 1,5 mg/l TDZ, la 90 de zile de la subcultivarea propagulilor, a stimulat neogeneza de 28

mugurai, parametrul menionat marcnd un spor de 279,04%, respectiv 6,33 exemplare/propagul la varianta analizat, fa de lotul control cu 1,67 exemplare/propagul, iar generarea de frunzulie, per inocul, fiind de 29,33 exemplare/propagul, n timp ce la martor a fost de 14,67 exemplare/propagul, ceea ce semnific un spor de 99,93% fa de martor; totodat, la aceast variant s-a nregistrat i un mare numr de rdcinie, cte 3,67 exemplare/propagul, nregistrnd un spor de 57,51% fa de martor, la care numrul acestora a fost de 2,33 exemplare/propagul, lungimea celei mai lungi rdcinie a atins un maxim de 13,7 mm i a nregistrat un spor de 17,09% fa de lotul martor; - prezena acidului -naftilacetic (ANA) n concentraie de 2 mg/l a favorizat formarea de rdcinie, nc de la 60 de zile de la subcultivarea propagulilor, s-a nregistrat formarea a cte 5,33 rdcinie/explant, astfel la 90 de zile de la operarea subculturii de propaguli s-au generat cte 5,67 rdcinie/explant marcnd un spor de 143,34%, lungimea medie a celei mai lungi rdcinie a atins 8 mm marcnd o descretere de 31,63% fa de lotul martor (11,7 mm). Mrirea concentraiei regulatorilor de cretere la 2 mg/l, n cazul TDZ-ului la nivelul propagulilor s-a nregistrat formarea unui mai mare numr de frunzulie, parametrul menionat marcnd un spor de 215,26%, respectiv 46,25 exemplare/propagul la varianta analizat, dar n prezena acestei citochinine s-a stimulat substanial dimensiunea acestora, limea medie a celei mai mari frunzulie a atins 10,3 mm marcnd un spor de 63,49% fa de lotul martor (6,3 mm). Pe parcursul experimentului, chiar dac pe lng 2 mg/l TDZ s-a adugat auxin 2 mg/l ANA, suplimentarea mediului de cultur cu acest amestec s-a potenat organogeneza la nivelul propagulilor, cel mai bun rspuns caulogen nregistrndu-se cei mai muli mugurai 15 exemplare/propagul inoculat sporul realizat fa de martor cifrndu-se la 798,2%, lot martor la care numrul mediu de mugurai/propagul iniiat a fost de 1,67 exemplare. 6. Analiznd rezultatele obinute n urma determinrii cantitii de clorofila a, dup 90 de zile de vitrocultur, prin extragerea pigmenilor asimilatori din frunzuliele vitroplantulelor de Begonia semperflorens var. Ambassador White regenerate la nivelul inoculilor de tip propaguli putem trage concluzia, potrivit creia, cea mai mic concentraie de clorofila a s-a nregistrat la nivelul explantelor crescute la lotul martor (1,87 g/g de material vegetal proaspt), variant de lucru care nu a avut n mediu de cultur nici un adaos hormonal, iar cea mai mare cantitate de clorofila a s-a determinat la explantele crescute pe mediul suplimentat cu un adaos de 1 mg/l ANA n amestec cu 1 mg/l TDZ, cantitatea nregistrat n acest caz fiind de 27,5 g/g de material vegetal proaspt marcnd un spor de 1370,58% fa de lotul martor. 7. Cea mai mare cantitate de clorofila b s-a determinat n cazul variantei de lucru (mediu MB - MS suplimentat cu un amestec realizat ntre 1 mg/l ANA i 1 mg/l TDZ), la care s-a identificat o concentraie de 29,62 g de clorofila 29

b nregistrnd un spor de 715,97%, fa de varianta martor (mediu MB-MS lipsit de regulatori de cretere) la care valoarea acestui parametru a fost de 3,63 g de clorofila b /g de material vegetal proaspt. 8. Calculnd cantitatea total de pigmeni verzi (clorofila a + clorofila b) se poate observa c la lotul martor s-a determinat cea mai mic cantitate de pigmeni verzi i anume doar 5,5 g biomas proaspt, iar la explantele crescute pe mediul suplimentat cu un amestec realizat ntre 1 mg/l ANA + 1 mg/l TDZ, valoarea acestui parametru a fost de 57,17g substan proaspt. 9. Prin extragerea pigmenilor carotenoidici din frunzuliele vitrotulpinielor de Begonia semperflorens var. Ambassador White, cea mai mic cantitate s-a determinat la nivelul variantei de lucru (MB - MS suplimentat cu 1 mg/l ANA), adic 5,63 g/gram substan proaspt marcnd o descretere de 19,11%, n timp ce cea mai mare concentraie s-a nregistrat la nivelul variantei de lucru MB MS, mediu suplimentat cu un amestec realizat ntre 2 mg/l ANA i 2 mg/l TDZ, valorile acestui parametru fiind de 14,85 g/g de material vegetal proaspt marcnd un spor de 113,36% fa de martorul V0 (6,96 g/g de material vegetal proaspt). 10. n urma transferrii exvitroplantulelor de Begonia semperflorens var. Ambassador White n condiii septice de via, dup 90 de zile, am observat c aceste plantule au reacionat pozitiv la msurile de aclimatizare adoptate de noi, constnd n propaguli i s-au adaptat condiiilor de cultur ex vitro, unde alturi de lotul control am obinut exvitroplantule care au atins o nlime maxim a tulpiniei principale de 57 mm, cu cte 13 frunzulie/plantul, procentul de supravieuire fiind de 66%, la exvitroplantulele variantelor de mediul de cultur MB - MS suplimentat cu 1 mg/l ANA n amestec cu 1 mg/l TDZ i cele provenite de pe mediul de cultur MB - MS suplimentat cu 1,5 mg/l ANA n amestec cu 1,5 mg/l TDZ, rezultatele au fost asemntoare, comparativ cu celelalte variante unde s-au format exvitroplantule mai puin dezvoltate, cu excepia variantei de mediu MB - MS suplimentat cu 2 mg/l ANA, n amestec cu 2 mg/l TDZ, care nu au supravieuit. Deci, experimentele noastre au permis evidenierea faptului c, la iniierea unei culturi primare de Begonia semperflorens var. Ambassador White, se poate realiza cu succes din minibutai caulinari, prelevai de la plantule de origine zigotic prin utilizarea citochininei tidiazuron, simplu n concentraii optime medii ntre 0,5 mg/l i 1 mg/l obinnd o caulogenez, bun n ceea ce privete formarea de frunzulie, mugurai i calus. Prin mrirea concentraiei de tidiazuron se poate obine doar calus, n timp crescnd diametrul acestora. Rizogeneza maxim a fost realizat doar pe mediul de cultur suplimentat cu un adaos de 2 mg/l acid indolilbutiric (AIB). Reaciile vitroplantulelor s-a corelat i cu stadiul de dezvoltare a materialului biologic ce s-a desfurat n sezonul calendaristic de toamn-iarn, dat fiind i problema procentului de supravieuire a acestora care a fost foarte mic i era 30

necesar efectuarea unei subculturi, respectiv schimbarea acidului indolilbutiric (AIB) cu acid -naftilacetic (ANA) pentru o cretere mai eficient a propagulilor. n ceea ce privete reacia propagulilor dezmembrai din culturile primare de Begonia semperflorens var. Ambassador White, s-a putut realiza cu succes din propaguli de 7-8 mm cu cte 3-4 frunzulie, regenerai doar de pe mediul de cultur lipsit de regulatori de cretere pentru a evita eventualele consecine negative provocate de adaosul fitohormonal la fitoinoculii crescui pe variantele testate. n acest caz a fost urmrit reacia propagulilor de Begonia semperflorens var. Ambassador White rezultai n stadiul calendaristic de var-toamn, care a fost o perioad favorabil subcultivrii acestora. Propagulii de Begonia semperflorens subcultivai in vitro, pe mediu de baz Murashige-Skoog (1962), cu un adaos de 2 mg/l tidiazuron, pe parcursul a trei luni de vitrocultur, s-a nregistrat att o puternic stimulare a neogenezei de frunzulie i de mugurai, ct i creterea dimensiunii propagulilor. Prezena n mediul de cultur att doar a auxinei n concentraie de 1,5 mg/l acid -naftilacetic (ANA), ct i n amestec cu tidiazuronul, a condus la nregistrarea la nivelul fitoinoculilor de tip propaguli a unui proces de rizogenez, apropiat ca manifestare de cel nregistrat la lotul martor, acest substrat de cultur a fost cel mai optim n culturile in vitro la Begonia semperflorens var. Ambassador White.

31

REALIZRI ORIGINALE I RECOMANDRI DE PERSPECTIV n urma efecturii experimentelor cu iniierea i subcultivarea in vitro a explantelor prelevate de la Begonia semperflorens var. Ambassador White s-a observat faptul c, esuturile imature au avut un potenial organogenetic mai mare prin utilizarea citochininei tidiazuron (TDZ) Prezena exclusiv a tidiazuronului (TDZ), simplu sau n amestec cu o alt auxin, n mediul de cultur, adugat n concentraii diferite, a constituit cea mai eficient citochinin de sintez. Proprietile fitofiziologice ale acestei citochinine i-a dovedit eficiena n stimularea formrii de mugurai adventivi, frunzulie i calus la nivelul vitroculturilor vegetale de Begonia semperflorens, conducnd la obinerea unor rezultate surprinztoare, respectiv nu sa manifestat vitrificare, care se manifest prin transparentizarea sau ca o form de cancerizare al esuturilor afectate de acest sindrom, spre deosebire de alte citochinine cum ar fi benziladenina (BA), care n general, n micropropagarea altor plante ornamentale a aprut fenomenul de hiperhidrie, care afecteaz n general culturile in vitro. Introducerea n substratul de subcultur a propagulilor de Begonia semperflorens var. Ambassador White, al unui amestec de 1,5 mg/l ANA n amestec cu 1,5 mg/l TDZ a stimulat la nivelul vitroculturilor realizate a neogenezei de frunzulie, mugurai i de rdcinie, dovedindu-se a fi cel mai recomandabil amestec hormonal pentru aceast specie ornamental. Tidiazuronul nefiind studiat ndeajuns de ctre ali cercettori sau specialiti, cu siguran va avea un impact favorabil asupra industriei plantelor, ajutndu-i s economiseasc sume importante de bani.

32

BIBLIOGRAFIE SELECTIV 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Ab Aziz, R., 2006, Micropropagation And Heavy Metal Content Of Begonia Pavonina (Ridl.). Masters thesis, Universiti Putra Malaysia. Cachi C.D., 1987, Metode in vitro la plantele de cultur baze teoretice i practice, Ed. Ceres, Bucureti. Castillo B., Smith M.A.L., 1997, Direct somatic embryogenesis from Begonia gracilis explants. Plant Cell Report, 16(6), p.385388. Chin Y.L., 1993, The use of thidiazuron in tissue culture. In vitro Cell and Developmental Biology, Planta, 29, p. 92-96. Chlyah-Arnason A., Tran Thanh Van M., 1975, Differential reactivity in epidermal cells of Begonia rex excised and growth in vitro. Physiologia Plantarum, 35, p.16-20. Huetteman C.A., Preece J.E., 1993, Thidiazuron: a potent cytokinin for woody plant tissue culture. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 33, p.105119. Katterman T.J.C., 1986, Cytokinin activity induced by thidiazuron. Plant Physiology, 81, p. 681-683. Khawar K.M., Sancak C., Urbanbey S., zcan S., 2004, Effect of Thidiazuron on Shoot Regeneration from Different Explants of Lentil (Lens culinaris Medik.) via Organogenesis, Turkish Journal of Botany, 28, p.421-426. Mok M.C., Mok D.W.S., Armstrong D.J., 1982, Cytokinin activity of N-phenyl-N1, 2, 3-thidiazol-5yl urea (thidiazuron). Phytochemistry, 21, p.1509-1511. Nhut D.T., Hai N.T., Huyen P.X., Huong D.T.Q., Hang N.T.T.N., Teixeira da Silva J.A., 2005, Thidiazuron induces high frequency shoot bud formation from Begonia petiole transverse thin cell layer culture, Propagation of Ornamental Plants, 5(3), p.149-155. Murashige T., Skoog F., 1962, A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15, p.473-497. Muthy B.N.S., Murch S.J., Saxena P.K, 1998, Thidiazuron: A potent regulator of in vitro plant morphogenesis. In vitro cellular and developmental biology. Plant, 34(4), p. 267-275. Romocea J.E., 2011, In vitro reactivity of Begonia semperflorens cv. Ambassador White to growth regulators, Analele Universitii din Oradea, Fascicula Biologie, vol. I, Oradea, p.77-80. Rout G.R., Jain S.M., 2004, Micropropagation of ornamental plants cut flowers. Propagation of Ornamental Plants, 4(2) , p.328. Takayama S, Misawa M., 1981, Mass propagation of Begoniahiemalis plantlets by shake culture. Plant Cell Physiology, 22, p.461467. 33

9. 10.

11. 12. 13. 14. 15.

16. Youmbi E., Ella B., Tomekpe K., 2006, Effect of thidiazuron on in vitro proliferation capacities of some banana (Musa spp.) cultivars with weak multiplication potential, Akdeniz Universitesi Ziraat Facultesi Dergisi, 19 (2), p.255-259.

SITOGRAFIE
(www8). = http://www.outsidepride.com/seed/flower-seed/begonia/begonia-waxwhite.html, consultat la data de 25.01.2010

Lucrri tiinifice din cadrul tezei de doctorat Lucrri publicate 1. Romocea J.E., Pop L., Gergely I., 2010, Initiation of Begonia erythrophylla L. vitroculture from axillary buds, Analele Universitii din Oradea, Fascicula Biologie, vol. II, Oradea, p.324-328. 2. Romocea J.E., 2011, In vitro reactivity of Begonia semperflorens cv. Ambassador White to growth regulators, Analele Universitii din Oradea, Fascicula Biologie, vol. I, Oradea, p.77-80. 3. Gergely J.E., Cachi C.D., 2011, Initiation of Begonia semperflorens cv. Ambassador White vitroculture from plant apex of zygote origin, Studia Universitas Vasile Goldi Arad. Ser. tiinele Vieii, Ed. Vasile Goldi, vol. 21(3), University Press Arad, p. 607-612. 4. Gergely J.E., Cachi C.D., 2011, Reaction comparison of Begonia semperflorens cv. 'Ambassador' White phytoinocula minipropagule type in the presence of thidiazuron and / or indolebutyric acid, Studia Universitas Vasile Goldi Arad. Ser. tiinele Vieii, Ed. Vasile Goldi, vol. 21(4), University Press Arad, p 737-742. Lucrri tiinifice din cadrul tezei de doctorat aflate sub tipar 5. Romocea J.E., Cachi C.D., 2011, Reactions of Begonia semperflorens var. cultorum grown in vitro in the presence in culture medium of a combination consisting of equal amounts between thidiazuron (TDZ) and active charcoal (CA) - Zilele Academice Ardene 2011, 20-22 Mai, Universitatea de Vest Vasile Goldi.

34