Universitatea Academiei de tiine a RM Facultatea tiine ale Naturii Specialitatea biologie

Lucrare de laborator nr. 1

,, Procedee de precipitare a unor proteine

Elaborat de: Studenta anului I Roca Mariana

Chiinu 2013

Principii fizico-chimice

Materiale, reactivi, condiii de lucru

A. Reacii de precipitare reversibil. n reaciile de precipitarereversibil, proteinele sub form dizolvat n soluie vor fi precipitate fr modificarea semnificaiv a structurii i proprietilor fizico-chimice. Astfel, dup nlturarea agentului de precipitare reversibil, proteinele i pstreaz solubilitatea lor, manifestat prin nsuirea de a trece din nou n soluie cu meninerea propriet ilor chimice i biologice iniiale, adic a strii lor native. Experiena 1. Fracionarea proteinelor prin salifiere cu sulfat de amoniu [(NH4)2SO4; (SA)] Procesul de precipitare reversibil a proteinelor n prezena anumitor sruri solubile poart denumirea de salifiere a proteinelor. Concentraiile nalte ale srurilor neutre genereaz o competiie pentru apa de hidratare ntre ionii srii i protein i, prin aceasta, diminueaz concentraia apei efective pentru protein. n consecin, se descoper parial radicalii aminoacizilor periferici, prin interaciunea crora moleculele proteice se aglomereaz i precipit. Concentraia de sare necesar pentru precipitarea unei proteine concrete depinde de muli factori, inclusiv de numrul de grupri periferice hid rofile, de masa molecular, forma moleculelor etc. La 20 picturi soluie de protein se adaug un volum egal de soluie saturat de (NH4)2SO4, care devine astfel semisaturat (saturare de 0,5 sau 50%). Se agit. Se constat apariia unui precipitat consti tuit din globuline. Se filtreaz prin filtru umezit cu soluie semisaturat de SA. Pe hrtia de filtru rmn globulinele precipitate, iar n filtrat trec albuminele rmase n soluie. n filtrat se adaug agitnd sulfat de amoniu cristalin, pulberizat pn la saturarea deplin. Se formeaz precipitat de __________________________________________. Prin pipetarea a cteva picturi de ap, precipitatul de albumine se dizolv, ceea ce denot, c precipitarea a fost reversibil. Concluzie: Globulinele precipit la __________ saturaie a SA. Albuminele precipit la __________ saturaie a SA. Experiena 2. Precipitarea proteinelor cu solveni organici miscibili cu apa (etanol, aceton) La adausul solventului organic, moleculele de ap de hidratare din regiunile hidrofile ale globulei proteinice se substituie cu moleculele solventului organic; radicalii hidrofobi ai acestor solveni interacioneaz cu radicalii similari din proteine. Ca rezultat are loc dezgolirea moleculelor proteice, scderea solubilitii, agregarea i precipitarea proteinelor. n apropierea pH-ului de punctul izoelectric al proteinelor, cnd numrul sarcinilor + = -, precipitarea are loc la o concentraie mai joas a solventului organic. Moleculele proteinice cu dimensiuni mari, fa de cele cu dimensiuni mici, precipit la concentraii mai sczute ale solvenilor organici. Precipitarea survine numai n soluii neutre sau puin acide i mai efectiv, n prezen de urme de electrolit (NaCl). Timpul scurt de aciune a solvenilor organici la temperaturi joase, de la 0 pn la -15C, pstreaz proteina n stare nativ, iar o aciune ndelungat denatureaz proteinele bacteriilor. proteina. Utilizarea alcoolului ca dezinfectant, se bazeaz pe faptul c el denatureaz n dou eprubete se iau cte 10 picturi

soluiercit ( + 4C) de protein, se adaug 1-2 cristale de NaCl i se agit pentru dizolvare. Agitnd se pipeteaz n una din eprubete alcool, n a doua aceton pn la apariia precipitatului. Cte aproximativ din suspensiile obinute se transvazeaz n alte dou eprubete i n ele se adaug numrnd picturile c ap distilat, pn sunt la dizolvarea native. precipitatului. Aceasta atest c procesul e reversibil i proteinele Eprubetele cu suspensia rmas se las la temperatura laboratorului timp de 1-2 ore, apoi se pipeteaz acelai coninut de ap. Precipitatul nu se dizolv, ceea ce demonstreaz c proteinele poate fi s-au denaturat. la Concluzie: Metoda utilizat

fracionarea unorproteine, ns operaiunile trebuie efectuate la temperatur _______________ i ntr-un interval de timp ct mai _____________ . B. Reacii de precipitare ireversibil. n reaciile de precipitare ireversibil se produc modificri profunde n organizarea spaial a moleculelor de proteine. Precipitarea ireversibil induce denaturarea proteinelor, nsoit de pierderea proprietilor fizice, chimice i biologice iniiale; astfel, dup nlturarea agentului de precipitare ireversibil, proteinele nu mai manifest proprietatea de a trece n soluie, rmnnd n stare denaturat. La denaturare sunt lezate legturile necovalente, care stabilizeaz nivelurile II IV de organizare structural, ns nu-i afectat structura primar. Ruperea legturilor peptidice se face hidrolitic (cu HOH) numai de enzime proteolitice n condiii

fiziologice de temperatur i pH sau de acizi minerali sau baze alcaline cu concentraie nalt i temperatur de peste 100C. Reaciile de precipitare ireversibil se utilizeaz n cazurile, cnd este necesar de a nltura proteinele, de exemplu la cercetarea componenilor neproteici (glucide, vitamine) sau cnd starea nativ a proteinelor nu are mare importan, de exemplu - la electroforeza proteinelor n prezena agenilor denaturativi. Experiena 3. Precipitarea proteinelor cu acizi minerali concentrai (HCl, H2SO4, HNO3) Acizii minerali concentrai precipit ireversibil proteinele n soluia apoas, ca urmare a denaturrii lor. La o aciune ndelungat acizii sulfuric i clorhidric parial hidrolizeaz proteinele i produsele de hidroliz (peptide, aminoacizi) sunt solubile. n acid azotic solubilizarea precipitatului are loc mult mai lent, iar soluia obinut are culoarea galben. n 3 eprubete la cte 20 picturi soluie de protein se substrateaz atent pe peretele eprubetei nclinate cte 10 picturi de acizi minerali concentrai: azotic, clorhidric i respectiv sulfuric. La hotarul dintre lichide se observ precipitatul proteic. Coninutul eprubetelor se agit i se las n repaus. Peste ctva timp n eprubetele cu acid clorhidric i sulfuric precipitatul se dizolv. n eprubeta cu acid azotic precipitatul nu se Concluzie:Aciunea ndelungat a HCl sau ____________________________ . Experiena 4. Precipitarea proteinelor cu anumii acizi organici tricloracetic (ATA), sulfosalicilic, picric. Metoda posed o specificitate foarte nalt. Complexele formate nu se dizolv n excesul acidului respectiv. ATA precipit numai proteine mari, iar cel sulfosalicilic att proteine, ct i peptide mari peptone ioligopeptide, ce face posibil diferenierea lor. Pe o lam de sticl se aplic cte o pictur soluii de 10% acizi: tricloracetic i, aparte, sulfosalicilic. Atent, fr a atinge vrful pipetei sau a baghetei de sticl, se adaug cte o pictur soluie de proteine. Concluzie:Precipitatul este mai abundent n proba cu __________________. Experiena 5. Precipitarea proteinelor cu sruri ale metalelor grele (Hg, Cu, Pb, Ag i a.) Cationii metalelor grele formeaz legturi trainice cu anionii n dou eprubete la cte 10 picturi soluie de protein se adaug cte 2 picturi soluie de 5% sare a metalului greu: n una sulfat de cupru (CuSO4), n alta acetat de plumb (Pb(CH3COO)2). Se constat formarea precipitatului. Se adaug nc cte 5-10 picturi de soluie corespunztoare i se constat procesul Concluzie:Peptidarea este ____________________. de mai rapid n peptidare. mediu cu dizolv. H2SO4provoac

carboxilici i deseori rup legturile ionice, formnd precipitate insolubile n ap proteinai. Prin adugarea unui exces de sare a unui astfel de metal precipitatul proteic se dizolv. Acest fenomen poart numele depeptidare i este condiionat de adsorbia ionilor metalelor grele de ctre particulele coloidale, apariia sarcinii pozitive la suprafaa moleculelor proteice i mrirea gradului de dispersare a macromoleculelor.

Experiena 6. Coagularea (nchegarea) proteinelor la temperaturi nalte Coagularea reprezint trecerea unui sistem coloidal din starea de sol n stare de gel. Sub aciunea temperaturii nalte energia termic duce la o vibrare puternic a atomilor proteinei, ceea ce produce ruperea legturilor de hidrogen i celor ionice i proteina coaguleaz. Coagularea proteinelor este maxim la punctul izoelectric al lor. Precipitarea poate fi ns anulat de un mediu puternic acid sau alcalin, deoarece n acest caz toate moleculele poart sarcin de acelai semn ceea ce duce la creterea gradului de respingere dintre macromolecule. 20 picturi soluie de protein se aciduleaz cu 1-2 picturi soluie CH3COOH 2% (apropiere de punctul izoelelctric). Se adaug 1-2 cristale NaCl. Partea superioar a lichidului se nclzete la flacr. Se constat apariia unui precipitat. n alt eprubet experiena se efectueaz n mod analog cu excepia c volumul de CH3COOH va fi de 10 ori mai mare. Concluzie:n exces de acid acetic, proteinele nu coaguleaz deoarece ___________________ .