PROPRIETILE FIZICO-CHIMICE PROTEINELOR

Obiectivele:

1. Proprietile fizico-chimice ale proteinelor 2. Masa molecular, metode de deteminare 3. Solubilitatea proteinelor, factorii ce o influieneaz. 4. Proprietile soluiilor proteice (coloizi). Factorii de stabilizare n soluie a substanelor coloidale. 5. Starea soluiilor coloidale sol, gel, xerogel. Exemple. 6. Sarcina electric a proteinelor. Punctul i starea izoelectric. 7. Denaturarea proteinelor, agenii ce provoac denaturarea. Ce modificri sufer structura proteinei la denaturare. 8. Coagularea proteinelor. Factorii care previn coagularea. 9. Metodele de studiere a componenei calitative i cantitative a proteinelor a) hidroliza b) cromatografie c) electroforeza d) salifiere e) dializa f) gel-filtrare

Proprieti fizico-chimice

Masa molecular Solubilitatea proteinelor Proprietile amfotere Sarcina electric a proteinei Denaturarea

Masa molecular a proteinelor

1.

2.

3.

4. 5.

intre 10.000 i 40.000.000 Daltoni. se determin prin urmtoarele metode: prin calcul cu ajutorul compoziiei chimice cunoscute: Ex: Masa mol. a Hb (Fe)=56x100 / 0,34=16470Da mrimea presiunii osmotice, constanta ultracentrifugrii (pr. sedimenteaz n raport cu m i mrimea lor) Metoda difuziunii luminii (intensitatea ei e dependent de nr. particulelor i de m ei) Mrimea difraciei razelor Roentgen Microscopia electronic

Masa molecular a diferitelor proteine

Solubilitatea proteinelor

Proteinele - substane cu proprieti hidrofile Solubilitatea variaz n limite mari: - Proteinele globulare prezint grade diferite de solubilitate, - cele fibrilare sunt insolubile n ap.

Solubilitatea este deteminat de:

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Componena aminoacidic Forma moleculei Sarcina proteinei Natura solventului Temperatura solventului pH-ul solventului

Solubilitatea este influienat de:

1. 2.

Prezena srurilor metalelor uoare NaCl, MgCl2, Na2SO4, care: la concentraii mici mresc solubilitatea proteinelor la concentraii mari scad solubilitatea proteinelor i ele precipit. Acest proces se numete salifiere.

Stabilitatea soluiei proteice e determinat de 2 factori:

sarcina electric determin respingerea moleculelor proteice ncrcate pozitiv sau negativ. membrana apoas care ndeprteaz moleculele proteice una fa de alta impiedicnd agregarea i precipitarea lor.

Membrana apoas (apa fixat)

Se formeaz la interaciunea grupelor ionogene ce fixeaz dipolii de ap: Grupa COO fixeaz 4 mol de H2O, NH2- -3; OH i NH cte 2. Apa ce intr n componena membranei apoase e numit ap legat

Membrana hidric

Proprietile apei fixate

1. moleculele ei au o dispunere mai compact, ce o apropie de un corp solid 2. proprietile ei de solvent sunt reduse 3. nghea la temperaturi joase( -40C) 4. constanta dielectric (fora de atracie dintre ionii ncrcai opus) este de 2,8, pe cnd la H2O obinuit este de 8

Proprietile electrochimice

Pr. prezint polielectrolii amfoteri Sarcina electric este determinat: 1. de componena AA:

1.

dac predomin AA acizi (Glu,Asp) sarcina sumar a proteinei va fi negativ

2. dac predomin AA bazici (Lys,Arg)

proteinei va fi pozitiv

sarcina sumar a

Sarcina electric este influenat 2. de pH mediului:

n ap aminoacizii se comport ca vetiriioni n mediu acid sarcina sumar va fi pozitiv n mediu bazic sarcina sumar va fi negativ
Datorit acestui fapt la trecerea unui curent electric n soluie, AA vor migra n mediu acid spre catod(-), iar n mediu alcalin spre anod(+).

Punct izoelectric

Este o valoare a pH-ului la care suma sarcinilor pozitive este egal cu suma sarcinilor negative (migrarea proteinelor sau a AA ntr-un cmp electric este nul) se noteaz pHi i este diferit pentru fiecare aminoacid sau protein. n aceast form se exercit fore de atracie reciproce ntre gruprile COO- i - NH3+; are loc o aglomerare a moleculelor din soluie i solubilitatea devine minim.

pHi

Pentrui AA neutri se afl ntre pH 56 Pentrui AA bazici se afl n mediu bazic Pentrui AA acizi se afl n mediu acid

Sarcina proteinei

La un pH mai acid ca valoarea pHi proteina capt o sarcin pozitiv (cation) i migreaz spre catod(-); la PH mai mare ca pHi proteina capt o sarcin negativ i migreaz spre anod(+)

Proprietile coloidale i osmotice ale proteinelor

Proteinele sunt substane macromoleculare,solubile, la dizolvarea crora se formeaz soluii coloidale proteice. Spre deosebire de soluiile coloidale obinuite, soluiile proteice nu necesit prezena stabilizatorului. Soluiile proteice sunt stabile i cu timpul nu se precipit.

Soluiile proteice posed proprieti caracteristice soluiilor coloidale:

Proprietile optice (efectul Tindal) Vitez de difuzie mic. Viscozitate mare Proprieti osmotice Proprietatea de a forma geluri

Proprietile optice

1. 2.

La iluminarea lateral a soluiei proteice raza de lumin n ea devine vizibil, formnd conul de lumin- efectul Tindal. Acest efect de dispersie a luminii se explic prin difracia razelor de lumin de ctre particulele n soluie. Capacitatea proteinelor de a dispersa lumina este folosit: la determinarea cantitativ a proteinelor prin metoda nefelometric la studierea microscopic a structurilor celulare. Soluiile proteice posed absorban n limitele spectrului ultrafiolet, caracterizat de prezena in ele a resturilor aminoacizilor fenilalanina, tirozina i triptofan. Fenilalanina i tirozina are absorbana maxim la lungimea de und 280 nm, iar triptofanul - 254 nm.

Vitez de difuzie mic.

Difuzie deplasarea spontan a moleculelor substanei dizolvate datorit gradientului de concentraie (de la zone cu concentraii mai mare spre cele cu concentraie sczut). Viteza de difuzie a proteinelor depinde mai mult de forma moleculei, dect de masa ei. Repartizarea intracelular a proteinelor din locul de sintez (ribosomi) are loc prin difuzie. Deoarece viteza de difuzie e mic are loc limitarea vitezei proceselor dependente de funciile proteinelor difuzabile n sectorul respectiv.

Viscozitate mare

1.
2.

e dependent de masa i forma moleculelor. Mrirea c% proteinei conduce i la mrirea viscozitii soluiei (se mresc forele de coeziune ntre moleculele proteice). Proteinele fibrilare sunt mai vscoase comparativ cu cele globulare. Viscozitatea e dependent de: temperatur- t0 viscozitatea scade prezena electroliilor (ex. srurile de Ca2+ mresc viscozitatea prin formarea punilor de Ca2+)

Proprieti osmotice

proteine fiind macromolecule nu difundeaz prin membrane semipermiabile, pe cnd micromoleculele trec prin asemenea membrane. Acest proces e numit dializ. Incapacitatea de a difuza prin membranele semipermiabile are ca urmare apariia fenomenului de osmoz (deplasarea mol. de H2O prin membran n soluia proteic). Deplasarea apei este limitat de presiunea hidrostatic (presiunea coloanei de ap) i se numete presiune osmotic Presiunea osmotic depinde de concentraia molar a proteinei i de temperatur. Presiunea osmotic determinat de proteine presiune oncotic.

Proprietatea de a forma geluri

Proteinele prezint coloizi liofili, i deci pot forma geluri. Moleculele proteinei interacioneaz ntre ele formnd reele structurale n interiorul crora se imobilizeaz apa. Gelatinizarea are loc mai uor n sol. pr. fibrilare Formarea de gel se observ la coagularea sngelui (formarea reelei de fibrin). La nvechirea gelurilor are loc sinerezisa expulzarea apei, datoprit contraciei mol din reea i eliminarea apei.

Formarea gelului depinde de :

concentraia soluiei (odat cu creterea concentraiei); temperatur (la scderea temperaturii); concentraia ionilor de hidrogen (n punctul izoelectric se observ o vitez maxim de formare a gelului); prezena electroliilor (Ionul SO42- contribuie n mod preferat la transformarea solului n gel).

Xerogel

este gelul secat (uscat) - lipsit de ap. se capt prin secare liofil a soluiilor coloidale Secarea liofil const n ndeprtarea apei n vid din soluia coloidal ngheat. se pstreaz un timp mai ndelungat ceea ce prezint importan practic n industria de preparare a medicamentelor de origine proteic. Ex: deferite proteine (albumina, gama-globulinele i altele).

Denaturarea proteinelor
este distrugerea nivelurilor superioare de organizare ale moleculei proteice (secundar, teriar, cuaternar) n afar de structura primar cu pierderea proprietile fizico-chimice i biologice ale proteinei. Agenii denaturani se mpart n fizici i chimici. 1. factorii fizici: temperatura, presiunea, radiaiile ultraviolete i ionizante. 2. factorii chimici : acizi, bazele, solvenii organici, detergenii, amidele, srurile metalelor grele.

Trsturile proteinei denaturate:

pierderea activitii biologice micorarea solubilitii schimbarea formei i mrimii moleculelor creterea reactibilitii unor grupe pierderea capacitii de a se cristaliza

Substanele ce pot mpedica denaturarea

soluii de glucide glicerina a. grai Pentru a evita denaturarea proteina se pstreaz la rece, n soluii concentrate de sruri la un PH anumit

Renaturare (renativare).

- este restabilirea structurii i activitii biologice a proteinei la nlturarea agentului denaturant.

FOLFING I REFOLDING

FOLDING aranjarea spaial corect de novo a catenei:

Metodele de studiere a componenei calitative i cantitative a proteinelor

a) hidroliza (ruperea unei legturin ordinare cu adiia unei

molecule de ap)

b) cromatografie c) electroforeza d) salifiere e) dializa f) gel-filtrare

Cromatografie

- este identificarea i separarea aminoacizilor. Principiul: Metoda este bazat pe diferena coeficientului de repartiie a aminoacizilor n ap i solvent organic (butanol), care nu se amestec cu apa. Apa se absoarbe pe hrtia cromatografic, constituind faza staionar, iar solventul organic, migreaz pe ea. Concomitent cu ultimul se mic i aminoacizii. Viteza migrrii aminoacizilor pe banda cromatografic este direct proporional cu gradul de solubilitate n butanol.

Electroforeza
-

este metoda de separare a particulelor ce posed sarcin (proteine) ntr-un cmp electric

Direcia migrrii Pr depinde de pH-ul mediului; Pr fiind electrolii amfoteri n mediul acid ele posed sarcin + i se mic spre C, n mediul bazic posed sarcin -migreaz spre A. Separarea Pr din serul sanguin La pH-ul 8,6 -8,9 n cmpul electric continuu Pr serului posed sarcina negativ i vor migra spre A cu o vitez care depinde n aceeai msur de mrimea sarcinii electrice i de masa molecular a particulelor. n rezultat se separ Albumine(care agung primele),apoi globulinele care se separ n fracii: 1, 2; i n final -globulinele.

Salifierea

este metoda de precipitare a P din soluie la aciunea c %mari de sruri neutre (sulfatul de amoniu, clorura de sodiu i al.) este un proces reversibil. Mecanismul salifierii se reduce la dehidratare macromoleculelor proteice i nlturarea sarcinii electrice. Asupra vitezei de precipitare a proteinelor prin salifiere acioneaz un ir de factori ca: hidrofilitatea proteinei, masa molecular, sarcina electric; de aceea salifiere diferitelor proteine are loc n concentraii diferite de sruri. De exemplu, albuminele se precipit n soluie saturat de sulfat de amoniu, pe cnd globulinele - n soluie semisaturat

Dializa proteinelor

Dializa (din grecete dialisis separare) metoda de separare i purificare a substanelor macromoleculare i soluiilor coloidale de substane micromoleculare cu ajutorul membranelor semipermeabile (celofan, pergament etc.). Prin porii acestor membrane pot trece numai substanele micromoleculare, ce au mas molecular i dimensiuni mici. Membrana nu poate fi traversat de proteine i alte macromolecule.

Gel filtrare

Sitele moleculare sunt formate din granule de gel polizaharidic inert hidratat. Granulele posed pori de diferit diametru. Micromoleculele cu dimensiuni mici ptrund prin aceti pori,macromoleculele- nu. V migrrii micromol. prin coloan este mai mic dect a macromol. fapt ce permite purificarea proteinelor de subst micromoleculare. Viteza migrrii proteinelor prin coloan este n funcie de masa i dimensiunile lor se mic mai repede cele ce au m i d mai mari.