METODE CROMATOGRAFICE DE ANALIZA CROMATOGRAFIA-reprezinta o metoda de separare bazata pe repartitia diferentiata a componentilor unui amestec de separate intre doua

faze in contact si care se situeaza intr-un raport de miscare relativ una fata de cealalta (definita prin termenii de faza stationara si faza mobile).Separarea cromatografica este rezultatul unor procese repetate de sorbtie-desorbtie a componentilor probei in faza stationara si faza mobila[26] Repartitia diferentiata a analitilor intre cele doua faze aflate in contact este controlata prin constanta de distributie K, descrisa prin raportul:K = CS/CM, unde Cs reprezinta concentratia analitului in faza stationara,iar CM reprezinta concetratia analitului in faza mobila. CLASIFICAREA METODELOR CROMATOGRAFICE DE ANALIZA - Metodele cromatografice se clasifica dupa o serie de criterii: caracteristicile fizico-chimice ale proceselor sau sistemelor, natura fazelor mobile si stationara, aspectele de ordin tehnic(dispunerea fazei stationare, modul de deplasare a probei, parametrii de operare), tabelul 1 1.Cel mai utilizat criteriu de clasificare este natura sau starea de agregare a celor doua faze. FAZA STATONARA poate sa fie solida sau lichida, in cel de al doilea caz lichidul fiind depus pe un suport solid.fazele stationare lichide trebuie sa indeplineasca unele conditii speciale cum ar fi volatilitatea foarte scazuta, miscibilitate redusa cu solventii uzuali,viscozitate ridicate pentru a ramane pe un support in timp ce faza mobila curge prin coloana. FAZA MIBILA poate fi un lichid(L), un gaz(G) sau un fluid supercritic(FS), nemiscibile cu faza stationara. Daca faza mobile este un gaz vorbim de cromatografie de gaze(CG), daca este un lichid de cromatografie de lichide(CL), iar daca este un fluid supercritic de cromatografie de fluide in stare supercritical (CFS), fuidul supercritic este o substanta care se afla deasura presiunii si temperaturii sale critice.

Tabelul 1. Clasificarea metodelor cromatografice in functie de natura fazelor intre analiti se distribuie diferentiat FAZA MOBILA gaz gaz lichid lichid Fluid supercritic FAZA STATIONARA solid lichid lichid solid Solid sau lichid DENUMIRE Cromatografia de solid Cromatografia de lichid Cromatografia de lichid Cromatografia de solid Cromatografia de supercritica repartitie gazrepartitie gazrepartitie lichidrepartitie lichidfluide in stare SIMBOL CGS CGL CLL CLS CFS

2.In functie de PROCESUL DE SEPARARE metodele cromatografice se impart in doua categorii : -metode bazate pe afinitatea diferiat a componentilor(in care sunt incluse metodele de repartitie, absorbtie, schimb ionic, afinitate); -metode bazate pe marimea diferita a componentilor(ex: excluziunea sterica) 3.Considerand MODUL DE DEPLASARE a probei se pot distinge urmatoarele tehnici: cromatografia prin elutie, prin dizlocare, frontala si cu goluri sau vacante 4.In ceea ce priveste PARAMETRII DE OPERARE-temperatura coloanei si debitul purtatorului-acestia pot fi constanti sau variabili, rezultand cromatografia izoterma, cu temperatura programata(gradient de tempertatura) sau cu debit programat(gradient de presiune). SCHEMA BLOC A UNUI CROMATOGRAF - Procesul cromatografic de separare se realizeaza prin alternarea succesiva a starilorde echilibru si neechilibru generate de repartitia analitului intre faze. Sistemul cromatografic evolueaza in sensul realizarii starii de echilibru la repartitie(este atinsa constanta de

distributie K, pentru fiecare dintre analiti). Starea de neechilibru, imediat consecutiva starii e echilibru este generata prin miscarea fazei mobile.Elementele constructive ale unui cromatrograf sunt prezentate schematic in fig. 1.

1121

proba 3 4

5 6

Fig.1-schema unui cromatograf 1-sursa de eluent; 2-injector; 3-coloana;4-detector; 5-termostat,6-inregistrator 1.Eluentul(faza mobila) are rolul de a transporta proba prin coloana cromatografica. 2.Injectorul asigura reproductibilitatea probei introduse in coloana. Eficienta separarii si exactitatea rezultatelor depend de introducerea probei si deci constructia injectorului. Injectoarele sunt diferite pentru cromatografia de gaze si cea de lichide .3.coloana cromatografica cotine la un moment dat cele doua faze cromatografice si este locul unde se realizeaza separarea componentelor probei. Din cauza interactiunii moleculelor cu faza stationara, componentele din probaraman in urma eluentului in functie de diferentele care exista intre constantele echilibrului de repartitie intre cele doua faze. Ca urmare se produce o diferentiere a vitezelor lor de migrare si in final separarea. 4.Scopul Detectorului este de a pune in evidenta componentii ce parasesc coloana cromatografica antrenati de faza mobila. Detectorul este piesa cea mai importanta a unui cromatograf dupa coloana cromatografica .Exista 2 categori de detector : universali si specifici . Cei universali sunt sensibili la un nr. Mare de componenti , iar cei specifici sunt sensibili numai la anumiti componenti .Un detector ideal trebuie sa indeplineasca o serie de conditii : raspuns rapid in prezenta solutului ; stabilitate in timpul functionarii ;un domeniu larg de raspuns linear ; sensibilitate inalta ;

manipulare si etalonare usoara . Detectorii pot fi diferentiali si integrali. Detectorii diferentiali masoara conc. instantanee sau debitul de masa al solutului ce paraseste coloana cromatografica. Detectorii integrali acumuleaza raspuns datorat componentilor probei , iar semnalul inregistrat ne indica cantitatea totala care a parasit coloana cromatografica la un anumit moment. Raspunsul detectorului este functie de unele schimbari in proprietatile fizice ale gazului ce paraseste coloana cromatografica in prezenta componentilor probei. Aceste schimbari pot fi : conductibilitate termica ;ionizare in flacara ; conductibilitate electrica ; ionizare sub influenta radiatiei . 5.Termostatul-asigura temp uniforma a intregului system prin care circula proba. 6.Inregistratorul-preia semnalele amplificate de circuitul detectorului , inscriind rezultatele analizei sub forma cromatografica . Cromatografele moderne sunt conectate la un calculator , legat la randul sau la o imprimata care preia rolul de inregistrator. Cromatograma- reprezinta rezultatul unei separari cromatograme si este generata de procesul de detective a analitilor . in ordinea elutiei acestora(fig2.7.)Procesul de detect ie consta in masurarea continua , in timp , a unei prop care caracterizeaza , dupa caz , totalitatea sau numai specii de analiti separate in procesul cromatografic .Cromatograma reprezinta deci o dependecnt functional reprezentabila intr-un system bidimensional de coordonate .Pe abscisa ste reprezentat timpul scurs din momentul injectiei probei in sist romatografic si pana in momentul elutiei ultimei specii de analiti ( cea mai puternica retinuta in faza stationara ). Pe ordonata se va reprezenta proprietatea masurata. 3 12 4 6 0 Momentul elutei unei specii de analit din sist cromatografic corespunde unei variatii a raspunsului generat de sist de detectie , proportional cu masa sau conc compusului in cauza .Un astfel de semnal produs de catre detector , in momentul evolutiei unui anumit compus , este cunoscut sub numele de pic cromatografic . Picul 5 Fig.2 Cromatograma

cromatografic poate fi caract. prin 2 tipuri de parametri :-calitativi (timpul de retentie absolut, timpul de retentie relativ , volumul de retentie absolut , volumul de retentie relativ si factorul de capacitate ) si cantitativi ( aria si inaltimea picului cromatografic ). Timpul de retentie absolut (tR)-repre timpul scurs de la injectarea probei in sist cromatografic si pana in momentul detectiei unui raspuns maxim , la elutia uneia din speciile separate . Timpul de retentie relativ (tR)- corespunde timpului pe care o specie de analiti il petrece in faza stationara .Diferenta dintre timpul de retentie absolute si timpul de retentie relativ corespunde perioadei de timp pe care solutul a petrecut-o in faza mobila .Timpul necesar frontului de faza mobile pt a parcurge coloana cromatografica se defineste ca fiind timpul mort (t M) .Ca definitie alternativa , timpul mort poate fi considerat timpul de retentie absolute al unui compus care nu se distribuie deloc in faza stationara (ct sa de distributie K fiind nula ). Se stabileste in acestmod relatia : tR= tR + tM Marimilor tR respective tR li se pot asocia valorile VR si respective VR ,cunoscute sub numele de volum de retentie absolute , respectiv volum de retentie relative .Retentia se masoara de obicei in unitati de timp , dar unitatile de volum sunt mai exacte .Relatia dintre unitatea de timp si cea de volum se face prin intermediul debitului fazei mobile (D). tR*D . V R= Factorul de capacitate (kI)- poate fi definit ca marime care indica de

cate ori timpul de repartitie a specie de analit in faza stationara este mai mare decat timpul cat acesta se gaseste in faza mobile . kI=tR /tM=tR-tM /tM

Marimile ce caracterizeaza procesul de separare : Eficienta- separarii cromatografice se refera la capacitatea sist cromatografic de a elua analitii supusi separarii sub forms unor picuri exrem de inguste .Acest termen este corelat cu nr. de echilibre de repartitie intre faze , care se realizeaza pe toata durata procesului de separare . Pt a caract acest proces se introduce notiunea de taler teoretic ca fiind portiunea din coloana cromatografica in care se realizeaza un proces elementar de repartitie la echilibru .Lungimea de coloana pt care o astfel de stare de echilibru este atinsa poarta denumirea de inaltime a talerului teoretic (H). Intre lungimea totala a coloanei cromatografice (L)si inaltimea talerului (H) se stabileste relatia : L=H*N , unde N reprez nr talerelor teoretice ale unei coloane

cromatografice ( este practic echivalent cu nr de stari consecutive de echilibru pe parcursul separarii cromatografice in acea coloana ). Nr de talere teoretice (N) poate fi calculate cu aj marimilor ce caract picul cromatografic . N=tR2/ 2=16tR2/w2b=5.545tR2 /w20.5=4 t2R/W2i Selectivitatea-separarii cromatografice reprez capacitatea sist cromatografic de a separa analiti cu proprietati extreme de asemanatoare si este descrisa prin factorul de separare , notat cu . Factorul de separare se refera la o pereche de analiti eluati consecutiv din coloana,reprezentati in urma detectiei prin doua picuri adiacente. Daca =1, adica cei doi analiti au acelasi coeficienti de distributie, ei nu pot fi separati si conditiile analitice trebuie modificate. =K2/K1=k2I/k1I unde :K1 si K2 sunt coeficientii de repartitie(distributie) intre cele doua faze, corespunzator celor doi analiti separati consecutive,1 si 2; iar K`1 si k`2 sunt factorii de capacitate corespunzatori. REZOLUTIA unei separari cromatografice este o masura mai explicita a gradului de separare a doi compusi. Rezolutia cromatografica(Rs) se defineste ca marimea ce caract global calitatea separarii, fiind masurabila prin insasi parametrii care definesc picul cromatografic RS=tR2-tR1/2*( 1+ 2)Unde: tR1 si tR2 sunt timpii de retentie ai celor doi compusi; 1 si 2 repr distributiile lor exprimate in unitati de timp. Daca R s=1, aprox 94% din moleculele celor doi compusi vecini sunt separate. Se considera ca separarea este totala atunci cand Rs=1,5. ANALIZA CALITATIVA SI CANTITATIVA IN CROMATOGRAFIE ANALIZA CALITATIVA(IDENTIFICAREA SUBSTANTELOR SEPARATE) se realizeaza la iesirea din coloana cu ajutorul detectorului. Cromatograma reprez succesiunea de picuri cromatografice produsa de detector. Detectorul transforma o prop a compusilor da analizat in semnal electric, proportional cu cantitatea de substanta. Identificarea componentilor corespunzatori picurilor cromatografice se poate face in doua moduri:-prin compararea timpilor de retentie ai componentilor cu al unor etaloane cunoscute in aceleasi conditii experimentale; aceasta metoda nu asigura certitudinea identitatii unei substante;-prin retinerea componentilor eluati pentru o analiza ulterioara prina alte tehnici analitice, cum ar fi spectometria in IR

sau spectometria de masa, contribuind astfel la cresterea procentelor de certitudine. Daca pentru caract sunt utilizate datele de retentie este necesar sa se controleze cu grija parametrii de curgere si de temperatura, deoarece comparatia dintre proba necunoscuta si standard se face tocmai pe baza acestor date. Intrucat foarte multi compusi diferiti pot avea acelasi timp(sau volum) de retentie este necesar sa se utilizeze mai multe coloane cu selectivitati diferite. Pentru ANALIZA CANTITATIVA este foarte important standardizarea conditiilor de lucru si cunoasterea factorului de raspuns al detectorului pentru fiecare component determinat. Analiza cantitativa consta in trei etape:-obtinerea comtogramei; -masurarea maximelor(picurilor) sau a suprafetelor -interpretare rezultatelor Suprafata integrate a unui pic este direct prop cu cantiatea de solut eluat. Se poate utilize si inaltimea picului, dar rezultatele sunt mai putin precise. Masurarea suprafetei se face prin urmatoarele metode:metoda triunghiului, metoda planimetrarii(care consta in determinarea ariei cu ajutorul unui planimetru), metoda decuparii si cantaririi, integrarea electronica. Calculul rezultatelor se poate face in mai multe moduri: normalizarea interna, standardizarea interna, metoda adaosului standard.In cadrul metodei de normalizare comnpozitia procentuala este determinate prin masurarea ariei fiecarui pic si impartirea ariilor individuale la toata aria totala. Acest lucru presupune ca au fost eluate toate picurile probei si ca raspunsul detectorului este acelasi pentru fiecare compus. STANDARDIZAREA INTERNA consta in adugarea la proba de analizat, inainte de a fi analizata, a unei cantitati cunoscute dintr-o substanta standard. Se determina apoi raportul dintre suprafetele picurilor substantei standard si cele ale substantei de analizat, pe baza caruia se poate determina cantiatea de substanta din proba . Ci=Ai*fi /AS*fs *CS Unde: Ci este concentratia compusului de analizat ; Cs este concentratia standardului ; Ai este aria corespunzatoare picului compusului de analizat; A s este aria corespunzatoare picului standard; fi , fs sunt factorii de raspuns ai detectorului pentru cele doua substante.

In cazul metodei adaosului standard se obtin cromatograme pentru proba ca atare si dupa ce s-a adaugat in proba o cantiate cunoscuta din substanta de analizat. Diferenta dintre suprafetele celor doua picuri cromatografice este suficienta pentru a determina cantiatea initiala de substanta din proba . Ci=CS*Ai /A-Ai -unde A este aria obtinuta dupa adaugarea cantitatii standard.