TOXICOLOGIE CELULARA NOIUNI DE BAZ

Metodele alternative sunt, conform etimologiei, altele dect cele clasice, dar care de asemenea ofer o alegere ntre mai multe posibiliti. Aria metodelor alternative este foarte vast i include de fapt toate metodele care nu implic experimente pe animale, care suprim sau diminueaz semnificativ utilizarea animalelor de laborator. n prezent, metodele in vitro reprezint cvasi-totalitatea metodelor alternative. Termenul in vitro include utilizarea organelor, a seciunilor de organe, a culturilor de celule, a celulelor izolate i a organitelor celulare. Culturile celulare, dup definiia dat de Comitetul de terminologie al Asociaiei americane de culturi tisulare, corespund meninerii n afara organismului a celulelor neorganizate n esut, dar capabile s se divid i s exprime in vitro metabolismul i funciile specifice. Aceast definiie, ca majoritatea definiiilor, nu acoper complet realitatea tiinific actual. Se poate propune alta: meninerea in vitro a celulelor care posed toate sau o parte a caracteristicilor pe care le manifest in vivo i care ar putea, n anumite condiii de cultur, s ajung la o adevrat organizare tisular. Prima cultur celular a fost realizat n 1952, cnd Moscona a supus digerrii un fragment de embrion de gin ntr-o soluie de tripsin, obinnd celule separate de reeaua lor tisular i capabile s se dezvolte in vitro. Toxicologia a fost una dintre primele discipline tiinifice care a utilizat culturile celulare, deoarece n 1956 Eagle i Foley au publicat rezultatele unor experimente care au urmrit efectul antimitoticelor asupra celulelor in vitro. Totui, abia n ultimii ani, interesul toxicologiei in vitro a crescut remarcabil, principalele direcii fiind: evaluarea toxicitii generale a diferitelor substane ca factor de predicie (n raport cu experimentele pe animale); determinarea toxicitii organospecifice n vederea unui studiu profund al mecanismului de aciune a xenobioticelor.

Alternative la utilizarea animalelor n experimente 1959: regula celor 3 R (Russel i Burch, n Principiile tehnicii experimentale) Replacement (nlocuire): utilizarea de metode care nu folosesc animale intacte (ex. culturi celulare sau nevertebrate n loc de vertebrate) Reduction (reducere): utilizarea unui numr mai mic de animale prin modificarea protocoalelor (ex. a protocoalelor pentru determinarea dozei medii letale) Refinement (perfecionare): modificare procedurilor existente n aa fel nct animalele s fie supuse la ct mai puin stres sau durere Modele experimentale in vitro: organele izolate explantele de organe (culturi organo-tipice) culturile embrionare culturile celulare (de celule dispersate, de reagregate celulare, de linii celulare), fragmentele subcelulare (receptori membranari, microzomi) Avantaje ale tehnicilor in vitro: acceptabile din punct de vedere moral i etic folosesc un numr redus de animale folosesc un material biologic omogen studiaz aciunea substanelor la nivelul intei faciliteaz studiul mecanismelor de aciune sunt uor de observat i cuantificat au o reproductibilitate bun permit un control riguros al dozei aplicate i al timpului de contact necesit cantiti mici de substan testat Limite ale tehnicilor in vitro: lipsa interaciunilor complexe ntre organe absena proceselor toxicocinetice

 dificultatea de detectare a efectelor retard sau cronice dificultatea de testare a compuilor greu solubili, gazoi sau volatili complexitatea extrapolrii Posibile interpretri ale lipsei de corelare ntre rezultatele studiilor in vitro i cele ale studiilor in vivo 1. n studiile in vivo substana nu este absorbit sau este foarte puin absorbit 2. Substana este bine absorbit, dar sufer un efect al primului pasaj hepatic intens 3. Substana este distribuit, astfel nct cantitatea care ajunge la receptori este mai mic (sau mai mare) comparativ cu cea prevzut pe baza absorbiei 4. Substana este rapid metabolizat la metabolii activi sau inactivi, care au un profil deferit al activitii i/sau o durat diferit de aciune comparativ cu compusul printe 5. Substana este eliminat rapid (de exemplu printr-un mecanism de secreie) 6. Speciile utilizate n cele dou sisteme de testare sunt diferite 7. Condiiile experimentale din experimentele in vitro i cele in vivo sunt diferite i ar fi putut conduce la efecte diferite fa de cele ateptate. Aceste condiii includ factori cum ar fi: temperatura, vrsta, sexul sau rasa animalului. 8. Efectele produse in vitro i in vivo de respectiva substan au caracteristici diferite 9. Testele utilizate pentru msurarea rspunsurilor pot fi foarte diferite pentru studiile in vitro i in vivo, iar tipurile de date obinute pot s nu fie comparabile 10. Studiul in vitro nu a utilizat martori adecvai (ex. pH, vehiculul utilizat, volumul agentului de testat administrat, probele prelevate de la animale la care s-a simulat o operaie), ceea ce determin mai degrab artefacte de metod i nu de rezultate 11. Datele in vitro nu pot prevedea volumele de distribuie n compatimentul central sau periferic 12. Datele in vitro nu pot prevedea constantele vitezelor de transfer ntre diferite compartimente

13. Datele in vitro nu pot prevedea constantele vitezelor de eliminare 14. Datele in vitro nu pot prevedea tipul de cinetic, liniar sau non-liniar, care caracterizeaz anumite doze de substane administrate in vivo 15. Parametrii farmacocinetici (ex. biodisponibilitate, picul concentraiilor plasmatice, timpul de nhumtire) nu pot fi prevzui doar pe baza studiilor in vitro

16. Efectele in vivo ale substanelor sunt consecina unor alterri ale sistemelor superioare de integrare ale animalului intact, care nu pot fi reproduse ntr-un sistem mult mai puin complex

Testarea letalitii cu ajutorul modelelor in vitro Avantaje comparativ cu metodele in vivo: limitarea numrului de animale utilizate costul mult mai redus screening rapid al unui numr mare de substane simplitatea lor permite evaluarea efectului la nivelul unui singur tip ce celul int sau de esut condiiile de cultivare a celulelor pot fi uor controlate, eliminndu-se influena factorilor exogeni (diet, utilizarea de medicamente, expunerea la substane chimice din mediu) sau a celor endogeni sistemici (metabolism, status imunologic, variaii hormonale) Diferene ntre creterea celulelor n cultur i n organul intact: celulele normate in situ cresc ntr-un aranjament tridimensional complex, n timp ce n cultur sunt forate s creasc pe un substrat bidimensional celulele n cultur pierd nu numai arhitectura spaial normal a esutului, dar pe msur ce se dezvolt ncep s piard capacitatea normal de interaciune i comunicare n culturile in vitro lipsesc mecanismele de control neuronal i hormonal necesare reglrii homeostaziei i care sunt inerente in vivo

Sisteme de culturi celulare utilizate pentru evaluarea in vitro a toxicitii i letalitii: 1. Culturi primare o se prepar din esuturi sau organe recoltate direct din organism, imediat dup necropsie o suspensia de celule individuale se obine prin dispersia mecanic sau chimic a celulelor prin utilizarea de enzime cum ar fi colagenaza o celulele se suspend n mediul de cultur i se incubeaz cel puin 24 ore n cultur, timp n care se pot ataa de suprafaa vasului de cultur, sau pot rmne n suspensie, dependent de caracteristicile de cretere ale esutului n cauz o exceptnd celulele hematopoietice mature, majoritatea celulelor normale se ataeaz de un substrat, se multiplic i cresc n cultur monostratificat o liniile de celule transformate i liniile dezvoltate din celule tumorale pot prolifera n suspensie, deoarece au pierdut necesitatea de a se ataa o viabilitatea culturilor este influenat de leziunile mecanice sau enzimatice ale membranei celulare n timpul izolrii celulelor i de depleia nutrienilor eseniali i/sau a hormonilor necesari pentru supravieuirea celulei o culturile primare sunt dificil de reprodus deoarece viabilitatea i cinetica de cretere a celulelor variaz ntre culturi ca rezultat al diferenelor individuale genetice, hormonale i de vrst; fiecare replicat de cultur derivat din acelai esut conine proporii variabile din diferite tipuri de celule o culturile celulare primare sunt iniial heterogene i bine difereniate, pstrnd multe din funciile biochimice complexe ale esutului animal din care provin; ele au ns durat limitat de via n cultur n cteva zile creterea mai rapid i subpopulaiile mai stricte ncep s devin predominante datorit presiunii selective a condiiilor de cultur n care sunt meninute.

o n timp, culturile devin mai omogene, mai puin difereniate i ncep s piard funciile celulare specifice i proprietile metabolice. 2. Linii celulare permanente o Deriv n general prin subcultur a unei culturi primare care conduce la o linie diploid, continu sau clonal ce poate crete fie n suspensie, fie se poate ataa sub form de strat monocelular pe suprafaa unei plci de cultur. o Cel puin 75% a populaiei de celule dintr-o linie de celule diploide conine acelai complement normal al materialului genetic ca i organismul din care deriv, i de obicei pot suferi n cultur aproximativ 40-50 diviziuni. o Liniile celulare continue sau stabilizate sunt linii celulare permanente care sunt derivate din celule tumorale, fie prin transformare spontan sau indus a unei culturi primare, fie a unei linii de celule diploide ce rezult prin imortalizarea liniei. Transformarea poate fi indus de virusuri, de mutageni chimici sau de iradiere i conduce la celule cu caracteristici de cretere morfologic dobndite, transmisibile din generaie n generaie tuturor celulelor derivate. o Genomul liniilor celulare continue este deviat genetic fa de genomul celulelor normale din care deriv. Majoritatea celulelor sunt aneuploide sau heteroploide comparativ cu kariotipul normal, n principal diploid. o Celulele transformate sunt similare celulelor tumorale, prin aceea c prezint aspect morfologic alterat i lips a inhibiiei de contact, dependen de ancoraj i inhibiie dependent de densitate a multiplicrii celulare, care conduc la diviziune celular nelimitat n cultur. 3. Linii de celule clonale o Liniile de celule clonale deriv din mitoza unei singure celule dintr-o cultur primar, linie diploid sau continu, pentru a forma o sub-linie omogen din punct de vedere genetic denumit su celular.

o Pentru a reduce heterogenitate care apare n timp prin deviaie genetic sunt necesare reizolri i clonri frecvente, meninndu-se astfel o populaie de celule omogen genetic. o Celule cu trsturi fenotipice specifice sau cu markeri specifici pot fi selectate prin creterea lor ntr-un mediu de selecie ce conine un medicament sau o substan chimic ce permite supravieuirea doar a clonelor ce prezint respectiva trstur. o O alternativ const n subcultura n densitate relativ sczut, care permite celulelor individuale s se ataeze i s formeze colonii ce pot fi selectate n funcie de fenotipul dorit. Parametrii de evaluare permit msurarea obiectiv a efectelor: o citotoxice reduc n final viabilitatea celulelor o citostatice inhib diviziunea celular normal, fr a le modifica n mod necesar viabilitatea citotoxicitatea bazal descrie efectele toxice pe care substanele chimice le pot avea asupra funciilor celulare bazale i a structurilor care sunt comune i critice pentru toate celulele eucariote Viabilitatea celulelor: o Reducerea numrului de celule intacte, produs prin degenerare sau liz : cuantificare microscopic, utiliznd un hemocitometru sau contoare electronice de celule o Cuantificarea celulelor moarte sau lezate care sunt nc intacte: pe baza modificrii permeabilitii membranei evaluat prin excluderea coloranilor de ctre celulele vii i scurgere prin membran pentru celulele moarte sau lezate Excluderea/captarea coloranilor: o Albastru tripan, nigrosin = colorani folosii pentru detectarea celulelor moarte sau cu membranele lezate care i-au pierdut capacitatea de a exclude coloranii; celulele cu membranele lezate permit colorantului s 7

ptrund n citosol, n timp ce celulele nelezate sunt capabile s exclud colorantul. o Colorani supravitali ex. rou neutru pot difuza prin membrana plasmatic, concentrndu-se n lizozomii celulelor vii determinare prin: spectrofotometrie n vizibil dup extracie, tehnic de fluorescen dual, citometrie n flux Scurgerea prin membran a enzimelor solubile din citosol: lactat dehidrogenaza o Avantaj cuantific scurgerea enzimei din celulele care au suferit citoloz, dar i din cele moarte i lezate, cu membrane ce permit scurgerea o Determinarea cantitii de enzim eliberat n mediul de cultur: substrat piruvat de sodiu, cofactor NADH. LDH determin conversia NADH la NAD+ i viteza de modificare a absorbanei NADH la 340 nm se msoar spectrofotometric. o Dezavantaj: sunt detectate doar celulele cu leziunile cele mai severe sau ireversibile, nu i pe cele a cror funcie este afectat sau nu mai sunt capabile s se divid. Creterea celular Eficiena clonrii o Se determin pentru celulele care cresc n straturi monocelulare prin dispersarea unei suspensii diluate, ce conine un numr cunoscut de celule (100-200) pe o plac de cultur. Dup incubarea celulelor mai multe zile fr a fi micate, se numr clonele formate de celulele care au capacitate de reproducere. o Reducerea eficienei clonrii se poate datora morii celulelor sau afectrii capacitii de reproducere Sinteza ADN o Reducerea sintezei ADN determinare direct, prin msurarea captrii timidinei tritiate celulele implicate activ n sinteza ADN ncorporeaz timidina ca i constituent normal al ADN, inclusiv timidina radiomarcat o Indirect msurarea coninutului de ADN al celulelor prin utilizarea unor proceduri specifice de marcare fluorescent a ADN-ului 8

Mitogenicitatea o Indicele mitotic util pentru evaluarea competenei reproductive a celulelor; celulele trebuie s fie capabile nu numai s sintetizeze ADN, dar i s progreseze n faza G2, iar cromatina trebuie s se poat condensa pentru a forma cromozomii. o Celulele cultivate n suspensie, n straturi monocelulare pe plci de cultur sau direct ataate sunt tratate cu substana de testat 6-48 ore, iar n ultimele ore de tratament se adaug colchicin, pentru oprirea celulelor n metafaz. Celulele sunt fixate, colorate i observate la microscop, numrndu-se proporia celulelor aflate n mitoz i calculndu-se indicele mitotic ca numrul de metafaze per 100 celule.

Cinetica ciclului celular o Pe baza ncorporrii 5-bromo,2-deoxiuridinei (BUdR) analog al timidinei ce poate fi captat n celule i ncorporat n ADN n locul timidinei n timpul sintezei ADN; o Cultivarea celulelor tratate n prezena BUdR 2 cicluri celulare colorare cu colorant fluorescent Hoechst oprirea celulelor n metafaz observarea lor calcularea indicelui de replicare o Folosind anticorpi anti-BUdR ataarea unui marker fluorescent msurarea fluorescenei o Tratarea celulelor cu cytochlasin B interfereaz cu polimerizarea actinei, care blocheaz citokineza celulelor fr a afecta sinteza ADN sau mitoza; celulele mononucleate nu au suferit nc replicare, n timp ce celulele binucleate i polinucleate au suferit una, respectiv mai multe replicri

Morfologia celulei i a culturii Morfologia celulei o Prin microscopie clasic sau electronic Indicatori morfologici ai citotoxicitii 9

o Modificri ale mrimii, formei (umflare) i a integritii membranei celulare o Modificri la nivelul nucleului, citoplasmei, organitelor celulare o Marcare cu reactivi fluoresceni Cuantificarea modificrilor morfologice o Analiza imaginilor cu ajutorul programelor software specializate o Metode planimetrice o Microscopia AVEC-DIC (Allen video-inhanced contrast differential interference contrast) Funciile celulei Funcia termodinamic i metabolic o Analiza ATP = sursa primar de energie la nivel celular = indicator de citotoxicitate Testul MTT o Succinat dehidrogenaza responsabil de conversia succinatului la fumarat, reacie ce furnizeaz perechea de electroni necesar pentru producerea de ATP o Tetrazolium MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2difenil tetrazolium bromide) este un substrat de culoare galben pal ce poate fi clivat de enzim cu formarea de formazan, un pigment de culoare albastru-nchis determinare spectrofotometric n vizibil la 540 nm. Ionii de calciu o Lezarea celular modificri ale homeostaziei ionilor de calciu o Creterea concentraiilor intracelulare a acestor ioni asociat cu leziuni ireversibile ale celulei o Determinarea concentraiilor intracelulare msurat cu ajutorul aequorinei, o fotoprotein sensibil la ionii de calciu Validarea testelor

10

necesar pentru a demonstra relevana, ncrederea i capacitatea de a prevedea efectele scopurile validrii trebuie definite ca baz pentru selectarea parametrilor de validare corespunztori pentru testele in vitro i in vivo, a protocoalelor de tratament i a compuilor testai

nainte

de

definirea

protocolului

de

tratament

este

util

cunoaterea

farmacocineticii i a metabolismului in vivo pentru fiecare din compuii testai rezultatele testelor in vitro trebuie comparate cu un parametru corespunztor letalitii in vivo, cum ar fi valorile DL50 dac se utilizeaz un model animal care nu are valoare predictiv bun pentru toxicitatea la om, atunci metoda in vitro dezvoltat pornind de la acest model are valoare limitat Oricare ar fi complexitatea culturii celulare, este necesar cunoaterea principiilor fundamentale. Puncte comune pentru toate metodele de cultur (de organe sau celulare): mediul de cultur, sterilitatea, temperatura.

11

MEDIUL DE CULTUR Este vectorul elementelor nutritive. Contribuie la meninerea constantelor fizico-chimice. Primii utilizatori de culturi menineau celulele in vitro n lichide biologice complexe ca limfa, extract embrionar sau ser. Ulterior au nceput s se utilizeze medii din ce n ce mai bine definite, iar apoi medii cu coninut bine cunoscut att calitativ, ct i cantitativ, a-a numitele medii sintetice. Exist numeroase firme care comercializeaz medii gata preparate, care faciliteaz mult munca cercettorilor. Adesea la acestea, care poart numele cercettorilor care le-au descoperit: Eagle, Ham, se adaug n proporie de 5 15% ser de animale tinere. Cel mai des folosit este serul de viel sau serul fetal de viel. n prezent se utilizeaz i medii lipsite de ser, cci serul conine cantiti variabile de produi diveri care pot modifica sau chiar perturba metabolismul celular. n acest caz, n mediile de cultur sintetice trebuie s se adauge n loc de ser un anumit numr de hormoni i factori de cretere cunoscui. Aceste medii poart numele de medii definite sau medii fr ser i par s favorizeze meninerea funciilor specifice celulelor care sunt cultivate n ele. Indiferent dac sunt medii sintetice sau definite, mediile de cultur trebuie s conin patru grupe de constitueni, substane nutritive fundamentale pentru meninerea vieii in vitro: sruri minerale, zaharuri, aminoacizi i vitamine.

SRURILE MINERALE apte ioni sunt indispensabili: Na+, K+, Ca++, Mg++, PO43-, CO32- i Cl-. Au rol n meninerea presiunii osmotice i intervin n transporturile membranare i n procesele metabolice. Unele medii conin metale n urme, cum ar fi fier, cupru, cobalt. Sunt importante n special pentru mediile definite. Seleniul de exemplu este component al glutation-peroxidazei, enzim care intervine n degradarea peroxizilor toxici metabolizai de celul n timpul culturii.

12

ZAHARURILE D-glucoza este substana energetic fundamental pentru biosintezele celulelor n cultur. Se folosete n general n concentraie de 1g/L, concentraie apropiat de cea a serului uman. Alte substane energetice ca acizii cetonici, acidul -cetoglutaric sau piruvatul intr n componena mediilor sintetice bogate, cum ar fi mediile Ham F10 i F12. Aceti intermediari metabolici pot fi sintetizai i de anumite tipuri celulare n cultur n prezena L-glutaminei. AMINOACIZII Pe lng L-glutamin, nc 12 aminoacizi sunt indispensabili biosintezei in vitro: cei opt aminoacizi eseniali plus ali patru tirozina, lizina, arginina i histidina. Necesarul de aminoacizi difer n funcie de tipul celulelor i starea lor proliferativ. Aminoacizii au rol important deoarece intervin n sinteza proteinelor structurale i funcionale, n reglarea sistemelor enzimatice, n reglarea sintezei de ARN i ADN, deci n meninerea ciclului celular. VITAMINELE Necesarul n vitamine difer de asemenea n funcie de tipul celulelor. Opt vitamine sunt considerate a fi indispensabile celulelor n cultur: colina, acidul folic, piridoxalul, riboflavina, tiamina, inositolul, acidul nicotinic i acidul pantotenic. Unele medii conin i alte vitamine, de exemplu vitamina C care are rol important n meninerea potenialului oxido-reductor. Toate aceste componente particip i la meninerea constantelor fizico-chimice. pH-ul mediului trebuie s fie ntre 7,2 i 7,4, asemenea celui sanguin; cel optim variaz n funcie de tipul celular. Variaiile de pH sunt controlate prin adugarea unui indicator de pH n mediul de cultur, cum ar fi rou de fenol, care vireaz de la violet la pH alcalin la galben la pH acid. Toate mediile sintetice conin sisteme tampon, anorganice, ca bicarbonat sau fosfat, sau organice, ca Hepes. Cel mai des folosit este tamponul bicarbonat, n echilibru cu 5% CO 2 n atmosfera ambiant a mediului de cultur.

13

Mediul gazos al celulelor este format dintr-un amestec de 75% azot, 20% aer i 5% CO 2. Necesarul de oxigen difer n funcie de tipul celular. Majoritatea celulelor se cultiv n normoxie (21% oxigen n atmosfera ambiant), dar capacitatea proliferativ a celulelor embrionare crete net atunci cnd mediul de cultur are coninut sczut n oxigen (5% O 2). O uoar hiperoxie poate fi suportat de hepatocite, dar ea este toxic pentru toate tipurile de celule peste 50%. Atmosfera de cultur trebuie s fie saturat n vapori de ap pentru mpiedicarea evaporrii i creterii osmolaritii mediului. Pentru majoritatea celulelor, osmolaritatea optim este n jur de 270 miliosmoli. STERILITATEA Mediile de cultur, att cele definite ct i cele sintetice, conin numeroase substane nutritive i sunt medii ideale i pentru dezvoltarea contaminanilor bacterieni, virali sau fungici. Este indispensabil deci s se lucreze steril. Sterilizarea materialelor se poate face: n autoclav sterilizare umed, sau n cuptor sterilizare uscat. Lucrul n atmosfer steril se realizeaz n hote cu flux laminar, orizontal sau vertical, la care se poate aduga utilizarea unei flcri tip bec bunsen n timpul manipulrilor i a unei lmpi UV ntre experiene. Sterilizarea mediilor de cultur se face de obicei prin filtrare prin filtre Millipore de 0,45 m sau, mai bine, de 0,22 m. n plus, n mediul de cultur se pot aduga cantiti atoxice de antibiotice i antifungice, pentru eliminarea oricrui risc de contaminare. TEMPERATURA Temperatura ideal de cultur este de 37C. Majoritatea tipurilor celulare prezint un procent important de mortalitate peste 38C, dei exist anumite tipuri care rezist bine la hipertermie. Hipotermia provoac n general o ncetinire a proceselor metabolice, experimentele realizate n aceste condiii fiind necorespunztoare.

14

METODE DE CULTUR IN VITRO

Se disting: a) modele celulare i b) modele acelulare.

A. MODELELE CELULARE I. celule n cultur, II.trane sau seciuni de organ culturi organotipice de organ, III. organ izolat perfuzat I. CULTURILE DE CELULE Cultura de esut Cultura celular staionar n monostrat Cultura n suspensie CULTURA DE ESUT Prima metod de cultur in vitro, descris de A. Carrel n 1910, a constat n: prelevarea unei buci de esut, redus apoi la un mic explant, adugarea la suprafa a unui amestec format din dou picturi de plasm de coco i dou picturi de extract embrionar diluat; incubare pn a doua zi pentru ca celulele s migreze din explant. Metoda lui Carrel este istoric, n prezent folosindu-se celelalte tipuri de culturi. CULTURILE CELULARE Metode de obinere a celulelor: 1) metode bazate pe disecie,

15

2) metode enzimatice. 1) Metoda general de disecie const n: - tierea unui fragment de esut de 1-4 mm3, mrunit apoi cu ajutorul penselor, - plasarea fragmentelor n flaconul de cultur, nntr-un volum mic de mediu nutritiv; celulele vor migra n mediul de cultur i apoi se vor multiplica. Dezavantaj: timpul necesar obinerii unui strat celular confluent este n general lung (pn la 30 de zile), dependent de tipul celular; din explant migreaz celulele cele mai active, ca fibroblastele, nu totdeauna cele dorite. 2) Metodele enzimatice sunt folosite frecvent. Se folosesc enzime proteolitice, ca tripsina, brut sau cristalizat, n concentraie de 0,5-205 g/L, ntr-o soluie salin de tip Hanks sau tampon fosfat salin (PBS), cu sau fr calciu i Magneziu. Protocolul general include: disecia esutului ales, pretripsinizare se pun n contact mai multe fragmente de esut cu tripsin pentru ~15 min i apoi se ndeprteaz supernatantul pentru eliminarea elementelor sanguine i a celulelor moarte, tripsinizarea propriu-zis, sub agitare magnetic lent, inactivarea tripsinei prin diluarea suspensiei celulare fie cu mediu de cultur n care sa adugat ser, fie cu un inhibitor specific al tripsinei; centrifugare la 4C pentru recuperarea celulelor cultivate. Pentru esuturile bogate n colagen se folosete colagenaz [0,1-2 g/L n soluie salin]. Se poate folosi amestec de tripsin i colagenaz. Alte enzime ce se pot folosi: pronaz, amestec de proteaze neutre i alcaline, obinute din Streptomyces griseus, i dipsaza, proteaz neutr izolat din Bacillus polymyxa. Avantaje: - se obin foarte rapid rezultate cu randament celular bun. Dezavantaje: - unele celule cu membran celular fragil pot fi lezate prin acest metod;

16

- nu se poate adapta metoda pentru fragmente de esut foarte mici. CULTURI CELULARE STAIONARE Majoritatea celulelor dintr-un organism animal au fost fixate ntr-un esut organizat. Aceast proprietate de aderen a celulelor in vivo se regsete i in vitro: introdu-se ntr-un recipient de cultur, celulele ader la suprafaa lui, la nivelul creia se dezvolt. Natura suportului este foarte important: sticla s-a utilizat la nceput, materii plastice diverse, special tratate pentru culturi celulare, de exemplu acoperite cu colagen, fibronectin sau membrane bazale constituite din produi extracelulari pentru anumite tipuri celulare. Variante ale culturii celulare staionare: cultura tridimensional (C3D) celulele nu mai sunt nsmnate la suprafaa matricei, ci inclus n snul ei; cele mai utilizate molecule pentru acest tip de cultur sunt colagenul i agaroza. Este aplicabil exclusiv celulelor care in vivo triesc nconjurate de matrice, cum ar fi fibroblatii dermici sau condrocitele. coculturile - pot fi de dou tipuri: cocultur de dou tipuri celulare n acelai flacon de cultur prezint interaciuni celule-celule prin schimburi membranare; cocultur de dou tipuri celulare ntr-o camer de cultur cu dou compartimente prezint interaciuni celule-celule prin intermediul factorilor care difuzeaz. De exemplu: hepatocitele n camera de sus asigur biotransformarea unui xenobiotic, iar metabolitul acestuia difuzeaz n camera de jos n care se gsesc celulele int, cum ar fi celule nervoase sau cardiomiocite. Tipuri de linii celulare:

17

liniile cu via limitat corespund culturii cu celule normale, cu cariotip diploid; celulele normale mor dup un anumit numr de subculturi, moartea fiind precedat de mbtrnire;

liniile imortalizate, cu via nelimitat, obinute prin transferul de gene imortalizante, care capt capacitatea de a se diviza la infinit; linii transformate sunt linii imortalizate, dar care au cptat i toate caracteristicile celulelor tumorale. CULTURA DE CELULE N SUSPENSIE Este caracteristic celulelor sanguine care triesc n mod normal n suspensie n mediul

de cultur. Aceast tehnic este foarte utilizat n biotehnologie pentru producerea de celule n vederea obinerii de proteine celulare cu finalitate terapeutic, i mai puin folosit n toxicologia n vitro. II. CULTURILE ORGANOTIPICE DE ORGAN Au rectigat interesul n ultimii ani datorit posibilitii obinerii de trane cu grosime relativ uniform, de ~150-250 m, din diferite esuturi, n special din ficat, rinichi sau plmn. Avantaje: Se pot obine din diferite esuturi prelevate prin biopsie de la acelai donator, inclusiv de la om. Pstreaz organizarea tisular i interaciunile celul-matrice i celul-celul. Funciile specifice sunt pstrate timp de mai multe ore (peste 10 ore). Tranele de organ pot fi conservate n azot lichid. Permite localizarea intralobular preferenial a leziunilor induse de un xenobiotic. Poate s apar relativ repede o diminuare a nivelului de citocrom P450.

Dezavantaj:

III. ORGAN IZOLAT PERFUZAT Se utilizeaz rar n toxicologie, de exemplu pentru a preciza un mecanism de toxicitate dificil de neles cu ajutorul altor metode.

18

Avantaje: Menine arhitectura tridimensional a organului.

Dezavantaje: Timpul de utilizare a unui organ perfuzat nu poate depi cteva ore. Nu pot fi evaluate diferite condiii experimentale (variaia concentraiei unui toxic sau efectul diferitelor molecule) folosind un singur organ. Unele organe umane sntoase nu ar fi disponibile pentru studii toxicologice, fiind rezervate pentru transplante.

B. MODELELE ACELULARE - utilizarea fraciunii S9 (sau supernatantul 9000g) ca sistem de bioactivare a xenobioticelor. Este folosit larg n teste de mutagenez, n asociere cu bacterii de tip Salmonella (testul Ames) sau cu celule de mamifere proliferante. Dezavantaj: uneori, metaboliii reactivi formai sunt incapabili s penetreze ntr-o celul ntreag sau care are o durat de via prea scurt. - utilizarea microzomilor hepatici ca sistem de bioactivare a xenobioticelor. Este o tehnic uoar i rapid de biotransformare oxidativ a medicamentelor. Permite identificarea metaboliilor formai pe cale oxidativ, aprecierea fixrii lor covalente, ca i a peroxidrii lipidice induse de compuii hepatotoxici. - utilizarea mitocondriilor izolate pentru estimarea efectelor exercitate de xenobiotice asupra lanului respirator, a sintezei de ATP i a beta-oxidrii acizilor grai. Fraciunile subcelulare sunt funcionale numai cteva ore de la preparare. Pot fi obinute de la animale pretratate cu inductori enzimatici.

19

NTREINEREA I TEHNICA TRIPSINIZRII LINIILOR CELULARE

Orice manipulare a unei linii celulare se face sub hota n flux laminar, cu mnui, n cele mai bune condiii de sterilitate.

1. TRIPSINIZAREA Tripsinizarea celulelor este efectuat n flacoane de cultur de 75 cm, numite i flacoane de producie . Se spal mai nti covorul celular cu 5 mL PBS fr Ca ++-Mg++, care permite tripsinei s acioneze rupnd legturile dintre celule. Se adaug 5 mL de tripsin-EDTA timp de 1-10 min la 37C, n funcie de tipul liniei celulare (aciunea tripsinei permite desprinderea i individualizarea celulelor). Cnd celulele sunt bine rotunjite, prelevarea se face prin desprindere de pe flacon cu ajutorul unei pipete Pasteur cu vat, steril, prin jeturi de mediu suficient de puternice. Se introduce aceast suspensie ntr-un tub de centrifug steril de 50 mL (Falcon) coninnd n prealabil mediu de cultur cu [40 mL 5%] SFV (ser fetal de viel) care va stopa aciunea tripsinei. Nu se las tripsina s acioneze prea mult timp, cci exist risc de afectare a membranei celulare dac timpul este mai mare de 10 min. Se centrifugheaz tubul timp de 5 min la 1200 rpm. Se aspir supernatantul prin nclinarea tubului i glisarea pipetei Pasteir de-a lungul peretelui pn unde ncepe fundul conic.

20

 Dac tripsinizarea este folosit numai pentru ntreinerea flacoanelor de producie, nu s numr, ci se nsmneaz celulele n raport de un flacon de producie la 3 flacoane de 75 cm. Dac este necesar o numrare a celulelor : Se reia sedimentul cu un volum cunoscut de mediu de cultur [2 mL MB 20% SFV]. Se fac mai multe aspiraii-refulri cu pipeta Pasteur (prevzut cu vat, steril), dirijnd jetul pe tub pentru a permite o bun disociere a celulelor ntre ele, astfel nct s nu se subestimeze sau s se supraestimeze numrul de celule i s nu existe pachete de celule. Trebuie s se evite mai multe de 15 aspiraii-refulri, altfel exist riscul afectrii celulelor. De asemenea, trebuie s se evite nmuierea vatei din pipeta Pasteur. ntr-un tub de hemoliz nesteril se preleveaz 100 L de suspensie i se adaug 100 L albastru de Trypan. Se numr celulele pe un dispozitiv Mallassez. Se face calculul dup cum urmeaz : Numrul de celule numrate n = __________________________ x 2 x 105 x V, Numrul de careuri numrate n = numrul de celule totale coninute n tubul de centrifug, 2 = factor de diluare cu albastru de Trypan, 105 = factor de multiplicare care permite obinerea unui numr de celule per mL, V = volumul total de mediu (n mL) n care se gsesc celulele. Se calculeaz apoi volumul de suspensie celular final de prelevat pentru nsmnarea flacoanelor sau a plcilor (n funcie de tipul de celule) : plac cu 6 godeuri : 100 000 - 150 000 celule par per godeu, flacon de 10 cm : 1 - 1,5 milioane de celule, unde:

21

 flacon de 6 cm : 300 000 - 500 000 celule. Incubarea se face n atmosfer umed de 5% CO2 i 95 % O2. 2. NTREINEREA LINIILOR CELULARE Mediul de cultur utilizat este constituit din : 5 sau 10% SFV (1 sau 2 tuburi de SFV) 2 alicote de glutamin 1mM 1 alicot de glucoz 1 g/L 1 alicot de antibiotice (Penicilin i Streptomicin) Acest mediu este schimbat a doua zi dup tripsinizare, apoi tot la dou zile dup stabilizare n mediu, pe baie de ap la 37C. Se face totdeauna i un martor de ne-contaminare, dup utilizarea mediului de cultur. 3. CONGLAREA LINIILOR CELULARE Se prepar mediul de baz steril coninnd 20% SFV (4 mL SFV + 16 mL mediu de baz) i un altul coninnd 20% DMSO (4 mL DMSO + 16 mL mediu de baz). Se filtreaz cele dou soluii. Dup numrarea celulelor, se dilueaz cu 20% SFV astfel nct s se obin 3 milioane de celule n 300 L (per tub de congelare) n acest mediu. n tuburile de congelare sterile se introduc 300 L din aceast suspensie. Se adaug pictur cu pictur 300 L de mediu coninnd 20% DMSO. Se nchid tuburile i se las mai nti n repaus n hot, timp de 10 min. Se pun la congelat ntr-o cutie de polistiren, mai nti la -20C timp de 2 ore. Dup 2 ore se plaseaz la -80C pn a doua zi. Apoi se pun n containerele cu azot prevzute pentru stocarea liniilor celulare. S se indice n caietul aferent liniat: tipul de linie celular i numrul de tuburi congelate.

22

4. DECONGELAREA LINIILOR CELULARE Se ia tubul congelat din containerul cu azot i se marcheaz n caietul aferent liniat. Se decongeleaz tubul n baie de ap la 37C. Se introduce ntr-un tub de centrifug steril de 50 mL (Falcon) mediul de cultur SFV. Se centrifugheaz 5 min. la 1200 rmp. Se aspir supernatantul cum este indicat la Tripsinizare . Se reia sedimentul cu 5 mL mediu SFV. Se nsmneaz cu acest suspensie un flacon de 25 cm. Se plaseaz flaconul n incubator i se schimb a doua zi, iar apoi tot la dou zile.

23