3.2.

Secvenierea ADNului.

Secvenierea ne ofer informaii precise privind succesiunea nucleotidelor n cadrul moleculei de ADN. La ora actual exist mai multe metode de secveniere clasificate n funcie de momentul apariiei lor n metode clasice i metode de generaia a doua (next generation). Din prima categorie fac parte metoda chimic a lui Maxam i Gilbert i metoda enzimatic sau metoda dideoxy a lui Sanger care vor fi prezentate succint n cele ce urmez. Metoda chimic ine mai mult de istoria secvenierii deoarece este relativ greoaie i nu se preteaz la automatizri. n prezent este utilizat metoda dideoxy cu multiplele ei variante dintre care electroforeza de capilaritate este cea mai uzual deoarece se preteaz la automatizare. Metoda chimic utilizeaz chimicale pentru a rupe molecula de ADN n dreptul anumitor nucleotide. Dup marcarea capetelor 5` cu (este fcut monocatenar) i se mparte n patru mostre. Fiecare din cele patru mostre este tratat chimic (cu piperidin) pentru a produce rupturi la nivelul unor nucleotide cu baze specifice, care sunt deasemenea modificate n prealabil chimic ntr-un anumit fel. Condiiile sunt astfel reglate ca rupturile s nu se produc la toate nucleotidele din fragment astfel c se obin populaii de fragmente de dimensiuni diferite pentru fiecare mostr, unele marcate la captul 5` . Fragmentele sunt separate prin electroforez i sunt identificate prin autoradiografie. Menionm faptul c, n funcie de pretratamentul aplicat, rupturile la cele patru mostre se produc n dreptul unei anumite baze, astfel la o mostr ruptura se produce n dreptul guaninei (G) , la alta n dreptul adeninei sau guaninei (A+G), la alta n dreptul citozinei sau timinei (C+T) iar la alta
Fig. 3.10: Autoradiograma obinut de la cele patru mostre rezultate de la bucata de ADN analizat n vederea stabilirii secvenei nucleotidice prin metoda chimic
32

P, ADN-ul de secveniat se denatureaz

59

n dreptul timinei (T). Pe autoradiografie citirea se face de la fragmentele cele mai mici de la captul 5` a bucii de ADN analizat spre fragmentele de dimensiuni mai mari dinspre captul 3`, du cum se poate vedea n fig.10. Dac banda este prezent , de exemplu, att la mostra G ct i la mostra G+A nseamn s considerm c este secvena G iar dac banda este prezent doar la mostra G+A i nu este prezent la mostra G, considerm c este secvena A. La fel se raioneaz i n cadzul mostrelor C+T i T. Aa dar bucata de ADN analizat prezint urmtoarea secven: 5` CAGCCGACCTTGAG 3` Metoda dideoxi sau metoda enzimatic. n cazul metodei dideoxi ADN-ul ce dorim s-l secveniem este de regul subclonat ntr-un vector capabil s produc ADN monocatenar. Vectorul poart, de asemenea, un sit de fixare a primerului de secveniere pentru sinteza celei de a doua catene. ADNul monocatenar se mparte n patru mostre. n mediul de reacie, alturi de enzima ADN polimeraza i cele patru dNTPuri se afl nucleotide modificate i anume 2`3` dideoxinucleotid trifosfat cu baze azotate specifice pentru fiecare mostr. Lipsind grupul OH i la carbonul 3`, atunci cnd o astfel de nucleotid este primit pe baz de complementaritate n catena n curs de sintez, sinteza este blocat, neputndu-se realiza legturile monofosfodiester ntre dou cte o nucleotide alturate. Ca urmare rezult

populaie de fragmente , de lungimi variabile, nou sintetizate. Pentru fiecare mostr blocarea sintezei fcndu-se specific n raport cu felul nucleotidei modificate adugate. Fragmentele pot fi marcate radioactive fie prin utilizarea unui primer marcat sau a unui dNTP marcat, eventual radioactiv. Fragmentele pot fi separate prin electroforez i identificate, n cazul nostru, prin autoradiografie. Pe autoradiografie citirea se face de la fragmentele cele mai mici de la captul 5` a bucii de ADN analizat spre fragmentele de dimensiuni mai mari dinspre captul 3`, dup cum se poate vedea n fig. 2.11.
Fig. 3.11: Autoradiograma obinut de la cele patru mostre rezultate de la bucata de ADN analizat n vederea stabilirii secvenei nucleotidice prin metoda dideoxi

60

n urma analizei autoradiogramei secvena nucleotidic a bucii de ADN analizate (de fapt a catenei nou sintetizate) este urmtoarea: 5`GGTCCAGACTTCGA 3` Metoda dideoxi a cunoscut o rspndire rapid odat cu dezvoltarea tehnologiei electroforezei n capilaritate, care este o variant tehnic a electroforezei clasice cu deosebirea c migrarea probelor se face printr-un tub capilar, n ordinea mrimii lor (Fig 2.12 Fragmentele de ADN marcate florescent sunt detectate de ctre un senzor optic n urma excitrii flourocromului cu o lumin laser. Metoda face posibil automatizarea procesului precum i multiplexarea celor patru reacii diferite caracteristice metodei dideoxi ntr-un singur amestec de reacie care conine toate cele patru nucleotide dideoxi, marcate fluorescent diferit, precum i migrarea ntr-un singur canal de migrare pentru toate nucleotidele simultan, marind astfel foarte mult viteza de lucru dar i acurateea analizei. Fragmentele de ADN rezultate n urma replicrii ADN-ului n prezena celor patru nucleotide modificate (dideoxi), fiecare fiind marcat cu un fluorocrom diferit, migreaz prin tubul capilar spre anod. n drumul lor fragmentele sunt citite de un detector, fiecrei nucleotide dideoxi corespunzndu-i o culoare. Datele sunt nregistrate de un computer i sunt afiate sub forma unei cromatograme (Fig.2.13).

capilar senzor

laser

catod
tampon tampon

anod computer

sursa proba

destinaie proba

Figura 3.12: Cromatograma unui fragment de AND obinut n urma migrrii electroforetice n capilaritate.

Figura 3.13: Prezentarea schematic a echipamentului pentru electroforeza de capilaritate destinat secvenierii AND-ului.