Sunteți pe pagina 1din 99

UNIVERSITATEA DE STAT DIN MOLDOVA Facultatea de Biologie i Pedologie Catedra Biologie Vegetal

Pavel Grigorcea, Ala Cherdivar, Maria Pisov

INTRODUCERE N BIOCHIMIA ANALITIC


ndrumar metodic pentru practica didactic

Aprobat de Consiliul metodico-tiinic i editorial al USM

Chiinu - 2005 CEP USM

CZU 577.1 (076.5) G 82

CUPRINS

Recomandat de Consiliul profesoral al Facultii de Biologie i Pedologie


Redactor responsabil: Maria

PREFA ................................................................................. 1. NORME DE PROTECIE A MUNCII .............................

5 7

Duca, doctor habilitat n biologie, prof. universitar Redactor tiinic: Veaceslav Reva, doctor habilitat n biologie, conf. universitar

2. NOIUNI GENERALE DE ANALIZ BIOCHIMIC ..... 11 3. TEHNIC EXPERIMENTAL N BIOCHIMIE ............ 14 3.1. Vase i ustensile, utilizate n analiza biochimic. Unele reguli de mnuire a lor ....................................... 14 3.2. Operaii de baz n laboratorul de biochimie .............. 24 4. ETAPELE ANALIZEI BIOCHIMICE CANTITATIVE ... 4.1. Cunoaterea compoziiei biochimice a probei de analizat ........................................................ 4.2. Alegerea metodei de analiz ........................................... 4.3. Stabilirea mrimii probei de analizat i a numrului de probe paralele ......................................... 4.4. Luarea probei .................................................................. 4.5. Aducerea probei n soluie ............................................. 4.6. Eliminarea interferenelor ............................................. 4.7. Analiza propriu-zis ....................................................... 5. TRATAREA MATEMATIC A ANALIZEI BIOCHIMICE .............................................. 5.1. Clasicarea erorilor ........................................................ 5.2. Noiuni de statistic ........................................................ 5.2.1. Indicatorii statistici ai unui ir de determinri experimentale ......................................... 5.2.2. Evaluarea gradului de dispersie a valorilor determinate ... 5.2.3. Eliminarea rezultatelor anormale ................................ 5.2.4. Exemple de prelucrare statistic a rezultatelor unei analize biochimice .................................................. 5.2.5. Prezentarea datelor ca numr semnicativ .................. 5.2.6. Redactarea i tehnoredactarea .....................................
3

48 48 48 49 49 50 51 51 52 52 54 56 57 61 63 65 67

Descrierea CIP a Camerei Naionale a Crii


Grigorcea, Pavel Introducere n biochimia analitic. ndrumar metodic pentru practica didactic / P. Grigorcea, A. Cherdivar, M. Pisov; red. resp.: Maria Duca, Veaceslav Reva. Univ. de Stat din Moldova. Facultatea de Biologie i Pedologie. Catedra Biologie Vegetal.-Chiinu: CEP USM, 2005. -196 p. Bibliogr. p.195-196 (23 tit.) ISBN 978-9975-70-613-1 577.1(076.5)

ISBN 978-9975-70-613-1

Pavel Grigorcea, Ala Cherdicvar, Maria Pisov, 2005 USM, 2005

6. METODE GRAVIMETRICE DE ANALIZ ................... 69 6.1. Determinarea gravimetric a apei n materiale vegetale ... 69 7. METODE VOLUMETRICE DE ANALIZ ..................... 71 7.1. Principii generale ale analizei volumetrice ................... 71 7.1.1. Condiiile reaciilor volumetrice. Clasicarea metodelor de analiz volumetric ................................. 72 7.1.2. Soluii ......................................................................... 73 7.1.3. Soluii titrate ............................................................... 83 7. 2. Metode volumetrice bazate pe reacii de neutralizare ..... 91 7.2.1. Alcalimetria ................................................................ 91 7.2.2. Acidimetria ................................................................ 96 7.3. Metode volumetrice bazate pe reacii de oxidoreducere ............................................................... 97 7.3.1. Manganometria ........................................................... 102 7.3.2. Iodometria ................................................................... 108 7.3.3. Complexometria .......................................................... 116 8. METODE FIZICO-CHIMICE DE ANALIZ BIOCHIMIC .............................................. 123 8.1. pH-metria ........................................................................ 123 8.1.1. Deniia pH-ului ........................................................ 123 8.1.2. Indicatorii de pH ........................................................ 126 8.1.3. Determinarea experimental a pH-ului ...................... 129 8.2. Soluii tampon ................................................................. 137 8.2.1. Mecanismul de aciune a soluiilor tampon ............. 138 8.2.2. Determinarea capacitii de tamponare a plasmei sanguine ......................................................... 142 8.2.3. Modaliti de preparare a unor soluii tampon ........... 143 8.2.4. Tria ionic ................................................................. 144 8.3. Analiza spectrofotometric ........................................... 146 8.3.1. Noiuni generale de spectrofotometrie ......................... 147 8.3.2. Legile spectrofotometriei ........................................... 148 8.3.3. Denirea unor noiuni utilizate n spectrofotometrie .. 150 8.3.4. Categorii de soluii n spectrofotometrie ................... 154 8.3.5. Aparatura pentru determinri spectrofotometrice ..... 154 BIBLIOGRAFIE ........................................................................ 195
4

PREFA
Biochimia ca tiin a aprut graie contientizrii faptului c procesele activitii vitale sunt determinate de fenomene ce pot explicate pe baza chimiei i zicii. Datorit eforturilor unor savani ilutri, care au reuit s traseze obiective juste, s creeze metode de laborator adecvate pentru rezolvarea acestor obiective, au fost descoperite multe particulariti ale materiei vii. n ultimii 50-60 de ani biochimia a beneciat de o avalan de descoperiri de importan major. Aceasta se conrm prin faptul c n perioada respectiv a favorizat explozia geneticii moleculare mpreun cu care a format temelia biologiei moleculare i a bioingineriei cu o puternic inuen n medicin, agricultur, industrie i n multe alte domenii ale activitii omului. Totui, au rmas numeroase aspecte ale vieii a cror elucidare urmeaz a realizat de biochimie cu efortul tinerilor ce tind s mbrieze profesia de biochimist. Obiectivul principal al ndrumarului metodic pentru practica de studiu (practica didactic, de iniiere) la specializarea Biochimie const n formarea la studeni a abilitii de a executa de sine stttor acele analize biochimice care sunt strict necesare pentru ndeplinirea practicii de producere i a lucrrilor de licen. Deci, se prezint a un compendiu n biochimia analitic, disciplin care actualmente pentru alte domenii ale biochimiei, precum i pentru multe direcii ale biologiei joac acelai rol ca i matematica pentru zicieni. Graie faptului c multe dintre metodele biochimiei analitice calitative, inclusiv electroforeza, cromatograa i alte metode moderne de izolare, puricare i caracterizare a proteinelor i polipeptidelor, au fost elaborate la catedra noastr, n cele ce urmeaz vom prezenta n temei acele lucrri de biochimie analitic cantitativ care sunt aplicate la catedr i n laboratorul de biochimie a plantelor. Deoarece practica de studiu are scopul de a forma la studeni deprinderi de a executa de sine stttor majoritatea experienelor, unele din ele ind executate neglijent, ceea ce poate provoca accidente grave, ndrumarul ncepe cu unele norme de protecie a muncii n laborator. ndrumarul familiarizeaz studenii cu vasele, ustensilele,
5

dispozitivele i aparatele ce alctuiesc un minim obligatoriu pentru orice laborator de biochimie. n el sunt prevzute cile de planicare, executare, prelucrare statistic, pregtire i prezentare a unei mici lucrri tiinice. Cuprinde noiuni generale de biochimie analitic, clasicarea metodelor de analiz biochimic clasic (gravimetric, volumetric); sunt explicate metodele de preparare a soluiilor (soluii titrate, soluii tampon), de exprimare a concentraiei lor. Din metodele volumetrice de analiz sunt descrise metodele alcalimetrice, acidimetrice, iodometrice, manganometrice i complexometrice. Ca metode zico-chimice de analiz sunt prevzute pH-metria, electrofotocolorimetria, sunt descrise principiile de exploatare a colorimetrelor Specol i EK. Metodele cromatograce cuprind metode pe suprafa plat (pe hrtie i pe plci de Silufol) i pe coloan (pe baza gelltrrii pe coloane de Sephadex). Principiul ecrei metode este suplimentat de o aplicaie practic, n care studenii execut de sine stttor o analiz asupra unei anumite substane ce se conine ntr-un obiect de origine biologic. La selectarea temelor, descrierea unora dintre lucrri, corectarea majoritii lucrrilor au participat specialiti cu renume n biochimie: eful catedrei de biochimie, genetic i microbiologie a Universitii Al.I.Cuza, Iai profesorul universitar Artenie Vlad, profesorul universitar Dumitru C. Cojocaru i confereniarul universitar Elena Tnase de la aceeai catedr, decanul facultii de Biologie i Pedologie a Universitii de Stat din Moldova profesorul universitar Vasile Ciobanu crora autorii le sunt foarte ndatorai pentru preioasele sfaturi i suport moral. Ne exprimm adnca noastr gratitudine confereniarului universitar T. Homenco pentru contribuirea n tratarea matematic a datelor experimentale, liceniatului n biologie I. Popescu pentru prezentarea grac a gurilor, liceniatului n chimie V. Cernuean pentru graa formulelor i ecuaiilor chimice, licenianilor n biologie V. Paiu i M. Calistru pentru probarea experimental a unor lucrri.

1. NORME DE PROTECIE A MUNCII


nainte de a ncepe lucrrile, se aranjeaz inuta de lucru (halat, mnui, ochelari de protecie etc.) i se aaz n ordine pe masa de lucru toate materialele necesare. Nu se recomand a pune pe masa de laborator obiecte sau substane inutilizabile n cadrul lucrrilor la zi. Lucrrile de laborator trebuie s e executate doar cu cantitile i concentraiile de substane strict necesare, cntrite sau msurate exact, respectndu-se condiiile indicate n normele de specialitate puse la dispoziia studenilor. Nu se permite ca sticlele cu soluii i reactivi s e lsate deschise pe mese sau s se schimbe dopurile de la un vas la altul. Fiecare sticl va purta o etichet pe care va scris corect formula (n unele cazuri i/sau denumirea) substanei ce o conin. Cnd se toarn reactivi din sticle, lichidul nu trebuie s se preling peste etichete, distrugndu-le i ngreunnd citirea denumirii reactivului. Este interzis gustarea substanelor i a soluiilor cu care se lucreaz, precum i mirosirea lor fr precauie. n cazul sesizrii substanelor volatile, vasul se ine la distan, iar vaporii care se degaj se apropie de nri prin micarea minii. n timpul desfurrii lucrrilor nu se permite a se apleca deasupra vasului n care s-a turnat sau erbe un lichid oarecare, de asemenea nu este permis nclinarea vasului respectiv spre student. ntruct majoritatea laboratoarelor folosesc nclzirea cu gaze naturale, pentru a evita accidentele, trebuie respectate instruciunile de manipulare. Pentru a aprinde acra de gaz, se aprinde mai nti chibritul n dreptul oriciului de ieire a gazului, apoi se deschide treptat robinetul de gaz. Dac becul de gaz se aprinde n interior, se nchide imediat robinetul de la conducta de gaz i se informeaz conductorul lucrrii. Este interzis aprinderea becurilor de gaz cu bucele de hrtie plimbate de la o mas de lucru la alta.
7

Nu se las niciodat becuri de gaz aprinse fr supraveghere. ntotdeauna, nainte de a prsi laboratorul se controleaz gazul. Aparatele electrice trebuie montate i exploatate n aa fel, nct s e prevenite electrocutrile, arsurile, incendiile i exploziile. Aparatele de nclzire electric (cuptoare, etuve, bi electrice) trebuie aezate pe mese protejate cu tabl de oel. Ele vor conectate la o priz de pmnt pentru evitarea electrocutrilor. Nu se admite conectarea mai multor aparate electrice la o singur priz. Aparatele n urma conectrii crora se observ scntei sau care au cauzat apariia scurtcircuitului nu vor utilizate dect dup nlturarea defeciunii. Conectarea aparatelor electrice la reea se va face respectnd riguros condiiile de intensitate i tensiune electric indicate pe aparatul respectiv. Instalaiile electrice, precum i aparatele electrice din laborator nu trebuie manipulate cu mna umed. Majoritatea accidentelor pot surveni la manipularea incorect a reactivilor din substane chimice corosive, toxice, inamabile sau explozibile. Aa, de exemplu, deosebit de corosive sunt soluiile concentrate de NaOH i KOH, soluia concentrat de amoniac, acizii concentrai (acidul clorhidric, acidul sulfuric, acidul azotic), perhidrolul, bromul. Cnd se lucreaz cu acizi concentrai, substane corosive, toxice, manipularea lor se face doar sub ni, utiliznd mnui i ochelari de protecie. La diluarea acidului sulfuric concentrat se toarn acidul n ap (i nu invers), ncet sub agitare, utiliznd vase rezistente la ocuri termice, reacia ind puternic exotermic. Soluia de amoniac, acidul clorhidric i azotic concentrat se vor turna numai sub o ventilaie continu a aerului. O deosebit atenie se cere la manipularea bromului. n acest caz, experienele se execut sub ni. Ochii i minile se vor feri de vaporii de brom prin utilizarea ochelarilor, respectiv a mnuilor de
8

protecie. La turnare, pictura din gtul aconului se va scoate foarte atent pe marginea vasului, deoarece bromul se prelinge uor pe sticl i poate provoca arsuri pe mini, care se vindec foarte greu. Unii solveni organici prezint o aciune narcotic i toxic (spre exemplu: cloroformul, eterul etilic); alii sunt toxine ale sngelui (ca benzenul i omologii si); dereglatori ai sistemului nervos (spre exemplu, alcoolul metilic), sau dereglatori ai metabolismului (cum sunt hidrocarburile clorurate); ali solveni organici sunt deosebit de volatili i prezint pericol de inamabilitate (eterul etilic, eterul de petrol, benzenul). Din aceste considerente se cere o deosebit atenie la manipularea acestor lichide. Nu se vor pstra n vase de sticl cantiti de lichide inamabile mai mari de un litru. Dac din ntmplare se vars o cantitate oarecare de lichid inamabil, se sting imediat toate becurile, se deconecteaz nclzitoarele electrice, se nchid uile i se deschid ferestrele. Lichidul vrsat se va terge cu o crp, iar apoi prin stoarcere se colecteaz ntr-un balon cu dop. n cazul aprinderii unui lichid inamabil, n linite, fr panic, trebuie mai nti s se sting becurile, s se acopere acra cu o plapum sau cu nisip. Concomitent cu operaiile de stingere se scot din ncpere toate vasele cu substane inamabile. Dac acra nu se stinge, se cheam pompierii, anunndu-i n prealabil ce substane anume au luat foc. nainte de a ncepe operaiile de stingere, dac sunt aparate electrice racordate la reea, se va ntrerupe curentul electric. Alcoolul i alte substane lichide solubile n ap se pot stinge cu stingtoarele cu spum chimic, bioxid de carbon sau tetraclorur de carbon. n caz c se aprinde mbrcmintea, este indicat ca persoana n cauz s nu alerge, ci s se sting, nvelindu-se cu o plapum. Distrugerea lichidelor inamabile, miscibile cu apa, se face prin aruncarea la canal i amestecarea cu o cantitate de ap care s
9

asigure o diluare corespunztoare. Lichidele inamabile nemiscibile cu apa, sau cu substane toxice n coninut, nu se vor arunca la canal, ci se vor mprtia pe un teren viran. n caz de arsuri termice, superciale sau profunde, se recomand pansamente cu alcool de 60%. n caz de arsuri produse de substane chimice, se spal plaga cu mult ap, dup ndeprtarea n prealabil a mbrcmintei, apoi se va proceda dup cum urmeaz: la arsuri produse de acizi se va spla plaga cu soluie de bicarbonat de sodiu 2%; la arsuri produse de substane alcaline plaga se va spla cu o soluie de acid boric sau acetic de 2%; plgile produse de brom se vor spla cu soluie concentrat de tiosulfat de sodiu. Cnd substanele chimice au ptruns n ochi, se va spla ochiul cu mult ap, apoi se vor face splturi cu colir (medicament pentru ochi), utiliznd un phrel special de splat ochii. n cazul nghiirii unor acizi sau baze tari, se vor introduce n stomac substane neutralizante: bicarbonat de sodiu sau, respectiv, acid acetic. Dac a survenit intoxicaia, accidentatul va scos din ncpere i va culcat ntr-o camer aerisit, unde i se va nltura mbrcmintea din jurul toracelui i a gtului spre a-i uura respiraia. n caz c nu mai respir, i se va face respiraie articial, de preferin gur la gur. n caz de electrocutare, se ntrerupe rapid curentul electric i se scoate ct mai repede accidentatul din zona respectiv; n caz c nu se poate ntrerupe curentul electric, nu se pune mna direct pe accidentat, ci cu ajutorul unor obiecte (haine uscate) se apuc bolnavul i i se face respiraie articial. Bolnavul va apoi transportat la spital.

2. NOIUNI GENERALE DE ANALIZ BIOCHIMIC


Biochimia analitic constituie un domeniu al biologiei care are ca obiect de studiu stabilirea prin metode adecvate a compoziiei calitative i cantitative a substanelor sau a amestecurilor de substane n materiale biologice. Dup scopul i obiectivele urmrite, biochimia analitic se subdivide n: biochimie analitic calitativ i biochimie analitic cantitativ. Analiza compoziiei unei substane sub aspectul naturii elementelor care o compun formeaz obiectul analizei calitative. Determinarea raporturilor cantitative n care se gsesc aceste elemente ntr-o substan constituie obiectul analizei cantitative. Biochimia analitic are o importan aplicativ major, ea constituind un mijloc indispensabil de cercetare pentru diferite domenii ale activitii practice. Astfel, unitile de cercetri tiinice, cele industriale i diferite uniti cu prol medical, agrozoo-veterinar utilizeaz intensiv biochimia analitic n scopul efecturii analizei sngelui i a altor uide la om i animale, a materiilor prime, a controlului proceselor tehnologice, a analizei solului, ngrmintelor, pesticidelor, organismelor vegetale i animale, a produselor de origine vegetal, animal, microbian i a celor de sintez chimic. Pentru determinarea cantitativ (dozarea) a diferitelor substane, biochimia analitic utilizeaz anumite metode experimentale analitice. Metode gravimetrice. Se bazeaz pe transformarea componentului biochimic de analizat ntr-o alt substan, practic insolubil, ce se izoleaz din soluie sub form de precipitat. Aceast substan greu solubil se formeaz n urma reaciei dintre soluia iniial a substanei de analizat i un anumit reactiv precipitant. Cantitatea componentului, care este complet inclus n precipitat, se determin prin cntriri, i respectiv, prin calcul din masa substanei care formeaz precipitatul.
11

10

Metode volumetrice. Se bazeaz, n principiu, pe msurarea exact a volumului soluiei unui anumit reactiv, de concentraie precis cunoscut, care reacioneaz cu substana de analizat. Ele se mai numesc i metode titrimetrice de analiz, deoarece principala operaie este titrarea. Metode zico-chimice sau metode instrumentale de analiz. Utilizeaz diferite aparate bazate pe anumite principii zice. n funcie de proprietile zico-chimice ale substanelor analizate, metodele zico-chimice de analiz includ: metode optice de analiz i metode electrochimice de analiz. Metodele optice se bazeaz pe anumite proprieti optice ale substanelor de analizat, n baza crora se poate determina cantitatea lor. Ca metode optice de analiz, menionm: a) metode fotometrice de analiz, cum sunt: colorimetria, care se bazeaz pe compararea intensitii culorii unor soluii de concentraii diferite; spectrofotometria, care folosete aparate speciale (denumite spectrofotometre), cu ajutorul crora se poate determina coecientul de extincie al soluiei pentru diferite lungimi de und; nefelometria, care se bazeaz pe msurarea cantitii de lumin difuzat de particulele unui sistem coloidal; b) metode refractometrice de analiz, care msoar indicele de refracie al substanei de analizat cu ajutorul refractometrului; c) metode polarimetrice de analiz, care msoar cu ajutorul polarimetrului rotirea planului luminii polarizate trecute prin soluia de analizat. Metodele electrochimice se bazeaz pe proprietile electrochimice ale substanelor de analizat. Dintre aceste metode menionm: a) metoda de analiz prin electroliz, n care substana de analizat se depune pe electrod sub aciunea curentului electric. b) metoda poteniometric, care folosete determinarea potenialelor ce se stabilesc ntre soluia substanei de analizat i un electrod polarizat cufundat n soluia respectiv;
12

c) metoda conductometric, care determin conductibilitatea electric a soluiei de analizat; d) metoda polarograc, ce se bazeaz pe procesele de polarizare care se produc pe un electrod pictor de mercur. Metodele cromatograce de analiz reprezint metode cu capacitate major de separare a substanelor individuale din amestecuri naturale. Determinarea cantitilor de substane izolate se face cu ajutorul metodelor sus-menionate de analiz, n special cu cele foto- sau spectrofotometrice. Metodele electroforetice de analiz sunt bazate pe capacitatea substanelor ce poart careva sarcin electric de a se deplasa ntr-un cmp electric cu viteze corelative cu sarcina electric, precum i cu dimensiunile i forma substanelor separabile. Depistarea i dozarea substanelor separate se face de asemenea cu ajutorul metodelor zico-chimice de analiz.

13

3. TEHNIC EXPERIMENTAL N BIOCHIMIE


Tehnica experimental n biochimie reprezint totalitatea procedeelor ntrebuinate n practica de cercetare a substanelor de provenien biologic. n afar de aparatura de performan cu destinaie special, ea cuprinde o serie de metode chimice i zicochimice de larg acreditare care folosete o mulime de dispozitive i aparate. Acestea, n multe cazuri, necesit cunoaterea unor operaiuni foarte simple, de exemplu, unirea corect a dou lifuri de sticl sau prepararea unei soluii de careva reactiv de anumit concentraie. Cu toate c la prima vedere astfel de operaiuni par a banale, lipsa cunotinelor n acest domeniu poate avea consecine grave. Acestea sunt considerentele din care studenii trebuie s cunoasc unele obiecte de lucru, materialele din care ele sunt confecionate, regulile de manipulare corect a lor. 3.1. Vase i ustensile utilizate n analiza biochimic. Unele reguli de mnuire a lor Pentru efectuarea lucrrilor de laborator n majoritatea cazurilor sunt necesare vase (recipiente care servesc pentru pstrarea lichidelor, iar uneori i a unor substane solide sub form de granule sau pulbere) i ustensile (obiecte care servesc la efectuarea unor operaii curente), de alegerea corect a crora n mare msur depinde reuita experienei. Vasele i ustensilele pot din sticl, din materiale ceramice, din metal, lemn, mase plastice sau uneori combinate ntre ele. Majoritatea lucrrilor de laborator se execut cu ustensile din sticl, aceasta deoarece sticla posed astfel de proprieti ca transparen, pasivitate fa de majoritatea agenilor chimici, o anumit rezisten mecanic, bun rezisten termic, poate curit dup ntrebuinare, costul ei ind relativ mic n comparaie cu alte materiale.
14

Vase i aparate din sticl. n practica de laborator se utilizeaz urmtoarele vase din sticl: eprubete, pahare Berzelius, vase Erlenmayer, baloane cu fund rotund i cu fund plat, baloane Wrtz, cristalizoare, capsule din sticl, sticle de ceas, sticlue picurtoare, borcane i sticle pentru reactivi etc. (Fig.1). Dintre aparatele din sticl menionm: refrigerentele (Fig.2) utilizate n procesul de distilare sau pentru evitarea evaporrii unei anumite substane dintr-un amestec supus nclzirii; ba1oanele de reacie cu dou, trei sau patru gturi i vasele de reacie cu capac. Acestea vor folosite exclusiv pentru operaii nepericuloase. Tuburile din sticl care urmeaz a introduse n gurile dopurilor sau n tuburile de cauciuc trebuie tiate drept, iar marginile trebuie rotunjite la acr. La lucrrile sub vid, de exemplu la distilare, se vor ntrebuina numai baloane mici, cu fundul rotund, sau vase speciale pentru lucrri sub vid. La folosirea lifurilor i reduciilor se respect urmtoarele condiii: manonul i conul trebuie s e din acelai tip de sticl; mbinarea lor se face prin rsucirea uoar a conului n manon; se evit contactul lor cu substanele puternic alcaline, se evit rcirea brusc sau nclzirea prelungit a sticlei. La confecionarea unui ansamblu experimental se utilizeaz un singur tip de sticl. Cnd se lucreaz sub vid, lifurile i reduciile se ung cu vaselin siliconic, cu precauie, evitndu-se contactul cu substanele chimice din instalaie sau aparat. lifurile i reduciile nepenite nu se vor desface prin rsucire, ci se vor nclzi uor la acra unui bec de gaz (circa 70C), avnd grij s nu se nclzeasc i conul, apoi conul se mpinge cu degetul mare, innd aparatul cu celelalte degete. De asemenea, se poate folosi un ciocan de lemn cu care se lovete uor liful (metoda se poate aplica i la scoaterea dopurilor de sticl). n practica de laborator se mai folosesc i alte legturi, cum ar : prin dopuri de cauciuc, plut sau mas plastic, prin tuburi de
15

Fig. 1. Vase i ustensile din sticl:


a - eprubet; b - pahar Berzelius; c - vas Erlenmayer; d - balon cu fund plat; e - balon cu fund rotund; f - balon Wrtz; g - sticl de ceas; h - ol de cntrire, form joas (box); i - ol de cntrire, form nalt; j - creuzet din sticl pentru uscare sau cntrire; k - balon cu fund rotund cu un lif; l - balon de tip par cu un lif; m - balon cu dou gturi cu lif; n - balon cu trei gturi cu lif, o - piset din sticl; p - instilator sau picurtoare; q - butelie pentru reactivi.

cauciuc sau polietilen, iar pentru ramicaii se utilizeaz tuburile n form de T, Y, U, simple sau cu olive (Fig.2). Robinetele pot ataate la un vas sau separate. Ele pot cu o cale sau cu dou, n form de T, Y sau U. n afar de tuburile din sticl care pot drepte sau ndoite, de diverse lungimi i diametre, n laborator se mai folosesc alonjele sau prelungitoarele (Fig.2), care sunt tuburi din sticl drepte sau ndoite, avnd diametrul la unul din capete mult mai mic dect la cellalt. Acestea se utilizeaz cel mai mult la legtura dintre un refrigerent descendent i vasul de culegere al distilatorului. Din sticl de calitate inferioar se confecioneaz baghete - vergele din baton de sticl, utilizate n general la amestecarea soluiilor; spatule, fabricate din vergele de sticl. Din sticl cu proprieti speciale de calitate superioar (Jena, Pyrex, Duran, sticl clit, sticl de cuar etc.) se confecioneaz n ateliere specializate vase i ustensile cu destinaie special. Recipientele de sticl mari nu se vor pune direct pe mas, ci pe o plac de material elastic. Dopurile de cauciuc, plut sau de polietilen trebuie s intre n gtul balonului numai cu o uoar forare. n momentul introducerii vasul trebuie inut de gt i nu de fund. Vasele de sticl se nclzesc progresiv pe bi de ap, de ulei, nisip etc. Pentru a evita supranclzirea lichidelor, se folosesc bile de ceramic sau sticl poroas, e bucele de piatr ponce (roc vulcanic sticloas, foarte poroas) sau porelan poros, care se introduc n lichidul rece. Acestea condiioneaz o erbere progresiv i linitit a lichidelor. Baloanele cu fund rotund se aaz pe masa de lucru, sprijinindule pe nite inele din material elastic i de mrime potrivit. Vasele ce conin substane solide n suspensie trebuie agitate n timpul nclzirii. Capetele baghetelor folosite pentru amestecare trebuie rotunjite la acr; agitarea cu bagheta se face printr-o micare circular de-a
17

16

Fig. 2. Vase i aparate din sticl:


a - refrigerent simplu cu aer; b - refrigerent cu aer cu bule; c - refrigerent Liebich; d - refrigerent cu bule; e - refrigerent cu spiral; i - alonj; f - plnii; j - tuburi de legtur, g - canale sau robinete; k - reducii. h - lifuri;

lungul pereilor vasului. Pentru transvazarea precipitatelor se vor folosi baghete de sticl avnd aplicat pe unul din capete o bucat de tub de cauciuc. Splarea vaselor se face imediat dup terminarea operaiei, cu lichide, n care impuritile respective sunt solubile. Aparatura erbinte se apuc, dup caz, cu crp uscat, cu un clete de lemn sau metalic, n cazul creuzetelor sau capsulelor supuse calcinrii. Aparatura de sticl erbinte se va feri de oc termic, respectiv nu se va aeza pe un loc ud sau rece i nu se vor turna lichide reci n ea. Se interzice nclzirea aparaturii de sticl direct pe acr. Cletele cu care se apuc aparatura erbinte de sticl se va nclzi puin n prealabil la capt. Vase i ustensile din ceramic. n practica de laborator cele mai folosite materiale ceramice sunt: porelanul, faiana i amota, care au proprietatea de a mult mai rezistente termic fa de sticl, precum i la aciunea agenilor chimici. De asemenea, datorit coecientului de dilataie termic mic, aceste materiale suport diferene mari de temperatur, ceea ce determin utilizarea larg n laborator. Dezavantajele pe care le prezint faiana i porelanul sunt: fragilitatea, costul ridicat, faptul c nu sunt transparente. Din materiale ceramice se confecioneaz pahare, capsule de evaporare, creuzete, mojare cu pistile, spatule, plnii Bchner, plcue cu falduri, triunghiuri de amot, plci pentru exsicatoare i altele (Fig.3). Manipularea vaselor i ustensilelor din ceramic se face n acelai mod ca i cu vasele i aparatura din sticl. nclzirea creuzetelor i a capsulelor de porelan se face pe triunghiuri de ceramic. nclzirea n cuptoarele de calcinare se va supraveghea permanent, iar scoaterea lor din cuptor se face n exsicator cu plac din ceramic (nu din tabl), fr a se atinge de pereii acestuia sau de alte vase din sticl. Materiale din metal. n laboratorul de biochimie se utilizeaz ustensile i materiale de laborator confecionate din er, font, alam, aluminiu etc.
19

18

Fig. 3. Ustensile din ceramic:


a - mojare i pistile pentru frmiat diferite substane solide; b - capsul din porelan pentru evaporare i uscare; c - creuzet cu capac; d - plnia de ltrare Bchner sau ltrul-plac cu vid (schem i seciune); e - spatule din porelan; f - triunghi din porelan.

Dintre aceste materiale vom cita: stativele din er, utilizate la xarea instalaiilor de laborator, constau dintr-o vergea metalic rigid, xat pe un postament greu de form dreptunghiular sau pe trei piciorue din font; trepiedele, folosite ca suporturi pentru susinerea vaselor i aparatelor de laborator n timpul nclzirii; sita de er, folosit pentru protejarea vaselor de sticl supuse nclzirii; cletele, utilizat la manipularea creuzetelor sau a altor vase erbini; clemele Hoffmann (cu urub) sau Mohr (cu arc),
20

xate pe tuburi din cauciuc pentru oprirea sau reglarea debitelor de lichide; inelele metalice, utilizate ca suporturi pentru susinerea vaselor sau pentru susinerea plniei n timpul ltrrii; creuzetele metalice, confecionate din oel, font sau platin; bile de ap, ulei sau cu nisip, folosite la nclzirea diverselor soluii n vase din sticl; plitele i reourile electrice; buteliile din oel pentru gaze; trompele de ap; stativele pentru eprubete (din tabl de aluminiu); spatulele metalice; lingurile de ars; pensetele; foarfecele i altele (Fig. 4). Dintre aparate menionm: perforatorul de dopuri, becurile de gaz (Fig.4); etuva electric i cuptorul de calcinare (Fig. 5); balanele de laborator tehnic i analitic (Fig. 10). n afar de vasele i aparatele din sticl, ceramic i metal, n laboratorul de biochimie se utilizeaz i alte materiale confecionate din lemn, cauciuc i din materiale plastice. Dopurile de plut, nainte de a gurite (cu perforatoare speciale pentru dopuri), se preseaz uor cu ajutorul unei prese de dopuri. Gurirea se face cu un perforator ceva mai mic dect diametrul termometrului sau al tubului ce urmeaz s e introdus prin dop. Potrivirea gurii denitive se face prin frecarea cu o pil rotund. Etaneitatea perfect se poate obine prin ungerea, la dopuri i la legturile dintre diferitele pri ale aparatului, cu vaselin special (un amestec de vaselin i cear). nclzirea vaselor i a instalaiilor de laborator se poate face cu gaz sau energie electric. Gazul prezint avantajul c transmiterea cldurii se face repede, acra rezultat are o temperatur ridicat i se poate regla uor: de la acra oxidant (albastr), care n zona central atinge temperatura de peste 1500C, la acra reductoare (roie). Cnd se nclzete cu energie electric, se folosesc o serie de aparate de nclzit prezentate mai nainte, care, n funcie de temperatura pe care o pot furniza, se mpart n: - bi de ap i termostate (0 - 100C); - bi de nisip, etuve i bi de ulei (0 - 250C); - reouri i cuptoare de calcinare (peste 300C).
21

Fig. 4. Ustensile din metal


a - perforatoare de dopuri; d - bec de gaz Teclu e - bec de gaz nzestrat b - perii pentru eprubete; 1 - conduct de gaz, cu rozet (uture dublu c - bec de gaz Bunsen 2 - deschiztur pentru ncruciat, uture lat); 1 - conduct de gaz, ptrunderea aerului, f - foarfece; g - pensete; 2 - deschiztur pentru 3 - disc pentru reglarea h - spatule, i - clete metalice; ptrunderea aerului, cantitii de aer; j - trepied metalic (pirostrie); 3 - oriciul n manon 4 - robinet pentru k - cleme Mohr (cu arc); pentru reglarea reglarea cantitii l - cleme Hoffmann (cu urub). cantitii de aer); de gaz);

Fig.5. Etuve electrice


a - cu termoreglare; b - fr termoreglare.

22

23

3.2. Operaii de baz n laboratorul de biochimie Mojararea. Deseori n laboratorul de biochimie este nevoie de mrunirea, mcinarea sau pulverizarea materialului brut de analizat, pentru a obine dimensiunile dorite la luarea probelor de laborator. Pentru obinerea unei cantiti mici de substan, n laborator, se folosete mojarul din porelan, iar pentru materialele mai dure mojarul din agat. Se iau poiuni mici din material, de mai multe ori. Mrunirea materialului nu se face prin lovire (apare pericolul spargerii pistilului sau mojarului), ci prin frecarea pistilului de pereii mojarului prin micri circulare, operaia numindu-se mojarare. Pentru substanele explozive se folosesc mojare speciale, cu pistil de cauciuc. n cazul substanelor necunoscute, mojararea se face cu mult precauie, efectundu-se ncercri pe cantiti mici. Pentru sortarea substanelor se folosesc site rotunde, cu ochiuri din srm, iar pentru materialele foarte ne - site din estur de capron sau mtase. Cernerea se execut printr-o micare de dutevino sau prin scuturarea sitei. Extragerea este procedeul de separare a unei substane dintrun material. Dizolvarea este fenomenul de rspndire a moleculelor unei substane printre moleculele altei substane. Dac amestecul este omogen, poart numele de soluie. Componentele soluiei sunt: solvatul (care se dizolv) i solventul (n care se dizolv). O soluie poate avea diferite concentraii, concentraia ind raportul dintre solvat i solvent. La prepararea soluiilor se folosesc baloane Erlenmayer sau baloane cotate, n care se introduce substana de dizolvat, pe care se toarn o cantitate de dizolvant mai mic dect e necesar. Se nclzete, dac e cazul chiar pn la erbere, se agit mereu i se adaug apoi restul de solvent. E bine ca substana de dizolvat s e n prealabil pulverizat n mojar. Pentru efectuarea unei analize biochimice, substanele, de cele mai
24

multe ori, se aduc n soluie. Atunci cnd substana nu e solubil n ap, se ncearc solubilitatea ei n ali solveni. ntr-un sens mai larg putem vorbi de dizolvare i atunci cnd n urma unor reacii chimice substanele insolubile n ap se transform n substane solubile n ap. De exemplu, CaCO3 e insolubil n ap, dar solubil n acizi diluai, deoarece n urma reaciei dintre CaCO3 i acid se obine o sare solubil n ap. CaCO3 + 2HCl CaCl2 + CO2 + H2O
Insolubil Solubil

Globulinele sunt insolubile n ap, ns sunt solubile n soluii saline. ncercarea solubilitii se face n cantiti mici (1-2 mg) de material, n dependen de substanele ce urmeaz a investigate. Astfel, proteinele sumare se dizolv n soluii diluate de sruri (NaCl sau KCl), acizii nucleici - n soluie de acid percloric 0,5 N la 0C, monozele - n soluie de alcool etilic 75-80% la erbere, lipidele - n alcool etilic i ali solveni organici etc. Substane complet insolubile nu exist, de aceea e corect s se foloseasc termenul de substan practic insolubil. Amestecarea i agitarea au rolul de a produce omogenizarea i micarea materialelor. n laborator prin amestecare se nelege, n mod obinuit, folosirea unui dispozitiv n interiorul vasului de reacie care produce amestecarea; prin agitare se nelege micarea ntregului vas de reacie, n mod curent nu se face ns distincie ntre aceste dou operaii. Amestecarea se realizeaz: - manual cu baghete de sticl; - cu amestectoare sau agitatoare, piese ce se rotesc n interiorul vasului, acionate de obicei de un motor electric. Agitatoarele pot confecionate din sticl, porelan, metal acoperit cu cauciuc sau mase plastice i au diferite forme. n cazul unor volume mici se folosesc deseori agitatoare magnetice formate din corpuri de oel nvelite pentru protejare cu o manta de sticl sau polietilen. Se folosesc mult astzi metodele de amestecare cu ajutorul ultrasunetelor.
25

Agitarea se realizeaz n general n vase de reacie mai mici, obinuite, uneori n baloane cu fund rotund, xate n piesa mobil a unui aparat de agitare, care execut micri de dute-vino, de oscilaie sau de rotaie. Cea mai simpl operaie de agitare este scuturarea lateral a eprubetei sau a balonului. La agitare, eprubeta nu trebuie astupat. Evaporarea este operaia care are drept scop concentrarea soluiilor sau eliminarea componenilor volatili. Prin evaporare se recupereaz reziduurile nevolatile din soluie. Evaporarea poate decurge la presiune normal sau sub vid. Componenii volatili care se pot elimina sunt: apa, amoniacul, excesul de unii acizi etc. Evaporarea se execut n capsule de porelan sau n pahare aezate pe baie de ap sau de nisip. Soluia de evaporat se aduce la erbere, prin amestecare continu cu bagheta de sticl. Pentru a nu se produce supranclzirea lichidului, se obinuiete s se introduc cioburi de porelan poros (nu i n cazul n care se separ o substan solid). n timpul evaporrii rapide, reziduul solid se urc pe marginile capsulei, depind-o de cele mai multe ori, fenomen nedorit, care poate evitat prin nclzirea capsulei n alta mai mare. Pentru evaporare se folosesc i lmpile cu radiaii infraroii. Eliminarea dizolvantului se poate face i prin absorbie. De exemplu: vaporii de ap pot absorbii cu H2SO4 conc., KOH, CaCl2, P2O5, silicagel. Pentru concentrarea soluiilor de substane macromoleculare se folosesc granule de biogeluri, de exemplu de Sephadex cu pori mici, care adsorb apa i substanele cu mase moleculare mici. Precipitarea reprezint separarea unei substane insolubile dintr-o soluie printr-o metod anumit (reacie chimic, micorarea solubilitii substanei prin rcire, evaporare, cristalizare etc.). Este mai bine ca precipitarea s se efectueze la temperatura laboratorului, apoi s se lase la rece (+4C), pentru c prin rcire se mresc particulele de precipitat. n soluia rmas limpede deasupra precipitatului, cu o pictur de reactiv se ncearc dac precipitarea este complet. Excesul de reactiv poate dizolva uneori precipitatele.
26

Decantarea este operaia prin care se poate separa un precipitat de supernatant (lichidul de deasupra sa), n baza diferenei de densitate (masa substanei n unitate de volum). Pentru ca separarea componenilor s e total, precipitatul se spal cu ap distilat de treipatru ori, n pahar, ateptnd de ecare dat depunerea lui, efectund decantarea (scurgerea) lichidului cu ajutorul unei baghete de sticl. La general, pentru a mpiedica dizolvarea precipitatelor formate, se folosete pentru splare o soluie foarte diluat din reactivul pentru precipitare. Filtrarea este o metod prin care un precipitat se poate separa de faza lichid cu ajutorul unor materiale poroase, numite ltre. Filtrarea se folosete n mod curent n laborator, la analiza calitativ i cantitativ, la cristalizri, la separarea unor impuriti mecanice. Drept ltre n laboratoare se folosesc: hrtie special (hrtie de ltru), care poate avea mrimea diferit a porilor, sticl poroas (frite), porelan poros, vat de sticl. Hrtia de ltru poate aleas cu densitatea i mrimea porilor n dependen de substana sau precipitatul de ltrat. Exist ltre cu pori ni i densitate mare pe unitatea de suprafa (panglic albastr cu diametrul porilor de circa 1 2,5 nm), ltre medii (panglic alb cu diametrul porilor de circa 3 nm) i ltre rare (panglic roz sau neagr cu diametrul porilor de circa 10 nm). Soluiile care pot distruge hrtia de ltru cum sunt acizii concentrai sau bazele concentrate, se ltreaz pe vat de sticl, pe frite (ltre de sticl poroas) sau porelan poros. Filtrarea se poate face: la presiune atmosferic, sub vid, la cald, la rece. Filtrarea la presiune atmosferic se efectueaz folosind o plnie simpl de sticl i hrtie de ltru. Filtrul simplu din hrtie poroas (ltrul neted) se confecioneaz astfel: se ia o bucat de hrtie de form ptrat, de mrime potrivit pentru plnia aleas, se mpturete n patru, se rotunjete cu o foarfec, se xeaz, prinznd cu degetele mari n interiorul plniei, i, dac e necesar, se umezete (Fig.6).
27

Fig.6. Confecionarea ltrului simplu

Fig.7. Confecionarea ltrului cu faluri (gofrat) Pentru mrirea vitezei ltrrii, se ntrebuineaz ltre cu suprafa mai mare numite ltre cree, cutate sau ltre n faluri. Un ltru cre se poate pregti pornind de la ltrul neted: rondela de hrtie de ltru se ndoie n semicerc, apoi de-a lungul unei jumti de diametru (raz), se ndoaie hrtia n faluri mici, schimbnd sensul ndoiturii n mod succesiv, pn ce se ajunge la cealalt parte a diametrului, iar hrtia are aspectul unui evantai dublu. Se despart cele dou pri ale evantaiului, hrtia lund forma unei plnii ncreite, care se aeaz pe o plnie obinuit de sticl (Fig.7). Filtrele cree se folosesc mai ales pentru ltrarea precipitatelor voluminoase i gelatinoase, n special la cald sau pentru cazul cnd ne intereseaz numai soluia ltrat, precipitatul de pe ltru urmnd s e ndeprtat din lucru. n timpul ltrrii, vrful tieturii oblice a plniei se alipete de peretele vasului n care se ltreaz. Marginea hrtiei de ltru trebuie s e cu un centimetru mai jos de marginea plniei. Soluia se toarn n plnie sprijinind marginea paharului, din care se face decantarea, pe o baghet de sticl i soluia se prelinge de-a lungul baghetei i curge n plnie pe pereii conului, nu direct n vrful conului hrtiei de ltru, pentru a evita ruperea ltrului (Fig.8). Filtrul nu se umple pn la marginea sa cu soluia ce se ltreaz, ci cu cm mai jos. Vasul n care s-a aat soluia se cltete de 3-4 ori cu ap distilat sau cu solvent, volumele de splare trecndu-se pe ltru.
28

b Fig.8. Tipuri de ltrare:


a simpl; b n vid.

Plniile obinuite numite plnii calitative, au tubul de scurgere cu acelai diametru pe toat lungimea lui, sau au diametru din ce n ce mai mic spre extremitatea lui. Sunt plnii de sticl cu o gtuitur n interior, ceva mai jos de vrful conului plniei. Aceste plnii servesc mai ales pentru ltrri cantitative, de aceea se mai numesc i plnii cantitative, ele avnd avantajul de a mri viteza ltrrii. Filtrarea n vid se realizeaz cu ajutorul plniei Bchner pe care se aeaz o hrtie de ltru i care e ataat la un balon Erlenmayer cu tromp (Fig. 8). Pentru ltrarea la presiuni sczute sunt folosite i plniile de sticl cu plac de sticl poroas. Filtrarea prin acest procedeu este rapid i izoleaz bine faza solid de cea lichid. Cnd se termin ltrarea, nu trebuie oprit trompa nainte de a se desface ncet aconul n care s-a fcut ltrarea. Dac nti nchidem trompa, atunci apa, din cauza depresiunii din vas, se ridic n sus, trece prin tubul de cauciuc i impuric lichidul sau soluia ltrat. O desprindere brusc a vasului de tromp poate arunca lichidul afar din vas, cauznd pierderi, mai ales atunci cnd intereseaz numai lichidul ltrat. ndeprtarea de pe ltru a substanei solide ltrate sau a precipitatului se face astfel: se rstoarn plnia deasupra
29

unei sticle de ceas sau capsule de porelan, pe care cade ltrul cu precipitatul, sau se scoate ltrul din plnie cu ajutorul unei pensete, se desface ltrul i se rstoarn. Se tamponeaz sau se preseaz uor cu o hrtie de ltru uscat pentru a se suge excesul de lichid care nu a fost sucient de bine tras la pomp. Uscarea precipitatelor. Uneori cu precipitatul se lucreaz mai departe aa umed cum rmne de pe ltru. De cele mai multe ori ns trebuie ca mai trziu precipitatul s e uscat. Uscarea unei substane umede se face prin mai multe procedee: a) substana cristalizat se ntinde n strat subire pe o foaie tripl de hrtie de ltru, de mrime potrivit, se acoper cu alte dou-trei hrtii de ltru suprapuse i se preseaz uor. Hrtiile de ltru ce vin n contact direct cu substana se rennoiesc pn ce nu mai apar umezite; b) substanele solide ntinse pe o sticl de ceas se pot usca ntrun exsicator simplu, n care se a o substan deshidratant.

a Fig. 9. Exsicatoare
a simplu, b de vid.

Cel mai puternic deshidratant este pentoxidul de fosfor, ns el se ntrebuineaz mai rar. n mod obinuit ca substan deshidratant se folosete acidul sulfuric concentrat sau clorura de calciu granulat, iar cnd substana cedeaz uor amoniac uscarea se face pe sod caustic (NaOH solid ) sau pe calce sodat (NaOH + CaO). Uscarea se poate grbi prin evacuarea aerului dintr-un exsicator de vid. Vidul n exsicator se face cu ajutorul unei trompe de ap, pompe de ulei etc. Mai nti trebuie s se nchid robinetul exsicatorului, apoi s se ntrerup legtura cu trompa i la urm s se nchid apa. Dac mai nti oprim apa, atunci apa ntr n exsicatorul n care se a vid; c) substanele care nu se schimb la o temperatur mai ridicat se pot usca n etuve. Separarea unui amestec eterogen lichid-lichid. Lichidele care nu se amestec, de exemplu apa i uleiul, se separ cu ajutorul unei plnii cu robinet numit plnie de separare. De asemenea, se poate utiliza centrifugarea. Practica de laborator cere uneori ltrarea la cald, ceea ce se realizeaz cu dispozitive speciale, cum ar introducerea ltrului ntro manta conic de cupru prin care circul vapori de ap sau aer cald, sau ntr-o spiral ce are forma plniei i prin care trec vaporii de ap. Filtrarea la temperaturi joase se face cu plnii obinuite din sticl, montate n vase prin care circul lichide de rcire sau ntr-un vas cu ghea sau amestec rcitor. Plnia se poate acoperi cu o sticl de ceas sau capsul n care se pune ghea cu sare sau ghea carbonic. Uscarea const n ndeprtarea lichidelor dintr-o substan. Exist mai multe procedee de uscare, n funcie de natura substanelor i scopul urmrit. Uscarea substanelor solide la temperatur normal se realizeaz: n curent de aer, precipitatele ind splate cu alcool, cu eter etc., n vid, tot dup splare cu lichide volatile; n exsicatoare ce conin substane higroscopice: H2SO4 conc., P2O5 granulat, silicagel, etc.
31

30

Uscarea la cald la 100-150C se realizeaz n etuve, timp de 1-2 ore (pn la masa constant). Pentru determinarea coninutului de ap, uscarea se face la 105C. Uscarea lichidelor i gazelor se face cu ajutorul unor substane deshidratante (higroscopice). Msurarea maselor (cntrirea). Cntrirea se realizeaz cu ajutorul balanelor. n principiu, cntrirea la balan se face comparnd masa substanei de cntrit cu masa unui etalon sau a unei greuti. n laboratoarele de biochimie se folosesc urmtoarele tipuri de balane, care difer prin precizia lor: - balane tehnice, care au o precizie de ordinul gramelor; - balane analitice, care au o precizie de 0,1-0,2 mg. Balana tehnic se compune dintr-o prghie cu brae egale care se sprijin prin intermediul unui cuit din oel sau agat pe o coloan central de susinere. Prghia este prevzut la mijloc cu un ac indicator care poate oscila n dreptul unei scale gradate. La capetele prghiei se a suspendate, cu ajutorul unor cuite ne, dou talere (platane). Balana este prevzut cu un dispozitiv de oprire. Reglarea orizontalitii balanei care este montat pe un suport se face cu ajutorul unui r prevzut la captul liber cu plumb. Balana analitic este un instrument cu ajutorul cruia se efectueaz cntrirea precis, foarte exact, necesar n analiza cantitativ. Cntririle la balana analitic se fac cu precizie pn la a patra zecimal de gram. Balana analitic este construit pe principiul prghiilor i poate prevzut cu amortizor care, dup un numr mic de oscilaii, oprete acul indicator n dreptul unei diviziuni de pe scala gradat. Balana analitic obinuit (Fg.10) este alctuit dintr-o prghie cu brae egale (1), sprijinit prin intermediul unui cuit (prism) de oel sau de agat pe o coloan vertical (2). La capetele prghiei sunt sprijinite cu ajutorul altor dou cuite (prisme) dou furci de care sunt
32

suspendate cele dou platane (3). 1 Acestea sunt cuitele marginale 6 (terminale). Muchiile de sprijin, att ale cuitului din centru, ct i 12 ale celor dou marginale trebuie 11 s e paralele i situate n acelai plan. La mijlocul prghiei se 4 2 a un ac indicator (4) care se 3 mic o dat cu prghia, prin 3 faa unei scale gradate (5) xate 8 pe coloana central. Balana este prevzut cu un dispozitiv 5 7 9 10 de oprire (aretare) (6) prin care Fig. 10. Schema balanei prghia balanei poate ridicat analitice. de pe cuite, pentru a nu se uza n timp cnd nu se lucreaz. Mecanismul de oprire se pune n funciune cu butonul (7) sau cu ajutorul unei bascule. Acest buton este situat sub placa de suport a balanei (8) sau lateral. Imaginea scalei este mrit prin intermediul unui sistem optic i proiectat pe un ecran de sticl mat (9). Rotirea butonului (10) servete la coborrea maselor etalonate (n form de inele) (11) pe o bar suport (12). Balana este nchis ntr-o cutie cu perei de sticl i ui laterale, pentru a ferit de praf. Cntrirea se efectueaz cu ajutorul unei serii de mase etaloane (greuti) care pot ataate direct la balan sau sunt pstrate ntr-o cutie special. Una din seriile de mase etalonate, des ntlnit, este compus din urmtoarele mase din alam nichelat: 100 50 20 10 5 2 2 1 g. Masele etalonate sub un gram sunt de: 500 200 100 50 20 10 mg. Pentru masele de ordinul miligramelor i zecimilor de miligrame se folosesc indicaiile acului de pe scala gradat. Balanele analitice se caracterizeaz prin sensibilitate, precizie i exactitate.
33

Sensibilitatea se exprim prin numrul de diviziuni de pe scal cu care se deplaseaz acul indicator la adugarea pe unul dintre platane a unei sarcini de un miligram sau prin numrul de miligrame ce corespund unei diviziuni de pe scala gradat. Dup valoarea sensibilitii, balanele analitice pot : - macrobalane cu sensibilitate de 10 diviziuni /mg; - semimicrobalane cu sensibilitate de 100 diviziuni /mg; - microbalane cu sensibilitate de 1000 diviziuni /mg; - ultramicrobalane cu sensibilitate de 10000-100000 diviziuni/mg. Precizia balanei analitice reprezint msura gradului reproductibilitii rezultatelor obinute la cntriri succesive ale aceluiai obiect. Cu ct rezultatele cntririlor repetate ale unui obiect difer mai puin ntre ele, cu att mai mare este precizia balanei. Exactitatea balanei se caracterizeaz prin diferena dintre valoarea masei cntrite a unui obiect i valoarea ei adevrat. Balanele analitice moderne sunt simple, uor de manevrat i permit o cntrire rapid. Exist balane analitice i cu un singur platan, la care masele etalonate sunt ncorporate la balan i manevrate din exterior prin intermediul unui mecanism, eliminnduse complet cutia cu mase etalonate. Reguli de cntrire. Utilizarea corect a balanei analitice necesit respectarea cu strictee a urmtoarelor reguli de cntrire: se controleaz dup lentila vizirului dac balana analitic este aranjat strict orizontal; balana analitic trebuie s e perfect curat, fr urme de praf; deschiderea i nchiderea balanei se fac ncet, fr manipulri brute; naintea cntririi trebuie s se stabileasc i s se verice punctul zero al balanei; obiectele sau substanele de cntrit se aeaz pe platanul din stnga al balanei, iar masele etalonate pe cel din dreapta; balana analitic nu se ncarc niciodat peste sarcina maxim;
34

obiectele sau substanele ce se cntresc trebuie s aib temperatura ncperii n care se a amplasat balana; balana analitic trebuie s e oprit n timpul ncrcrii sau descrcrii sale; cntrirea se face cu uile nchise ale balanei; masele etalonate de ordinul gramelor se pstreaz n cutii speciale; masele etalonate se manipuleaz numai cu penseta (gramele) i cu ajutorul dispozitivului de manevrare a maselor etalonate (zecimile i sutimile de gram); toate cntririle necesare n efectuarea unei anumite analize sau a unui grup de analize se execut la aceeai balan analitic i cu aceeai cutie de mase etalonate (greuti analitice). Operaiile cntririi. Pentru a prepara soluii de diferite concentraii, se calculeaz cantitatea de substan necesar. Aceast cantitate se cntrete la balana tehnic n cazul preparrii soluiilor aproximative, sau la balana analitic n cazul preparrii de soluii etalon. Cntririle la balana analitic implic urmtoarele operaii: - balana analitic se conecteaz la sursa de curent electric pentru aprinderea becului ce lumineaz scala gradat n dreptul creia oscileaz un ac indicator; - se deschide uor balana i se regleaz punctul zero: acul indicator trebuie s se opreasc n dreptul diviziunii zero de pe scala gradat (Fig. 11); - obiectul sau substana de cntrit se aeaz pe platanul din stnga balanei; - pe platanul din dreapta se pun mase etalonate (greuti) de ordinul gramelor i se adaug apoi mase etalonate sub form de inele (decigrame i centigrame), pn cnd se ajunge la echilibrare, adic deschiznd uor balana acul indicator se oprete n dreptul unei diviziuni de pe scala gradat (miligrame i zecimi de miligram).
35

De exemplu, dac pe platanul balanei au fost puse mase etalonate n valoare de 14 g, iar masele etalonate sub form de inele au valoarea de 5 decigrame i, respectiv, 6 centigrame, iar acul indicator s-a oprit pe scala gradat la diviziunea +8,2 mg, rezult c masa obiectului cntrit este de: 14 + 0,5 + 0,06 + 0,0082 = 14,5682 g. De obicei, se recomand efectuarea cntririi astfel nct acul indicator s devieze n partea pozitiv a scalei. n cazul n care acul indicator se oprete n partea negativ a scalei gradate, valoarea miligramelor i a zecimilor de miligram se scade din valoarea maselor folosite la echilibrare. De exemplu, n cazul de mai sus, cnd 8,2 va n partea negativ (-), rezultatul cntririi va : 14 + 0,5 + 0,06 - 0,0082 = 14,5518 g. - dup terminarea cntririi, balana se descarc prin scoaterea maselor etalonate n ordine descrescnd, precum i a obiectului cntrit; - se veric punctul zero al balanei; - se ntrerupe alimentarea cu curent electric a balanei.
-10
-3 -2 -1 0 +1 +2 +3

+10

Fig. 11. Scala balanei analitice. Dizolvarea substanelor pentru prepararea reactivilor Substana cntrit la balana analitic sau la balana tehnic, n funcie de precizia necesar, se aduce n soluie, efectundu-se urmtoarele operaii: - sticla de ceas sau ola cu substana cntrit se ine deasupra unui pahar Berzelius n care substana se trece cantitativ (cu ajutorul apei distilate dintr-o piset); - se agit uor prin micri circulare ale paharului sau cu o baghet de sticl, pn la completa dizolvare a substanei;
36

- cu ajutorul unei plnii, lichidul se transvazeaz ntr-un balon cotat, n cazul preparrii soluiilor etalon, sau ntr-un cilindru gradat, n cazul preparrii soluiilor aproximative; - paharul se spal de cteva ori cu ap distilat, volumele de splare trecndu-se n balonul cotat sau n cilindrul gradat; - se ndeprteaz plnia i, cu ajutorul pisetei sau al pipetei, se adaug ap distilat pn la cota balonului sau pn la o anumit diviziune a cilindrului; - soluia din balonul cotat se omogenizeaz prin micri de rsturnare, dup nchiderea prealabil a balonului cu un dop rodat; soluia din cilindrul gradat se omogenizeaz cu ajutorul unei baghete de sticl; - soluiile obinute se transvazeaz n sticle de reactivi adecvate, perfect curate, uscate i etichetate. Msurarea volumelor de reactivi. n ansamblul analizelor cantitative, cntrirea i msurarea exact a volumelor de reactivi reprezint operaiile cele mai importante de care depinde precizia rezultatelor. Pentru msurarea volumelor se utilizeaz diferite tipuri de vase din sticl riguros gradate, respectiv etalonate. Pentru msurarea exact a volumelor este necesar s se lucreze la temperatura la care s-a fcut etalonarea vaselor respective (de regul, 20C). n Figura 12 sunt prezentate unele vase gradate ntrebuinate curent pentru msurarea volumelor. Baloanele cotate sunt vase de sticl cu fund plat i gt alungit pe care se a marcat un semn circular denumit cot. Acest semn indic capacitatea balonului cotat, respectiv limita pn la care trebuie s se umple balonul. Pe corpul baloanelor cotate se a notat capacitatea i temperatura la care au fost etalonate. Baloanele cotate au diferite capaciti: 10, 25, 50, 250, 500, 1000, 2000 cm3 (ml) i, uneori, sunt prevzute cu dopuri rodate pentru nchidere. Umplerea baloanelor cotate cu soluie se face pn la cot, astfel nct meniscul lichidului s e tangent la cota nscris pe balon.
37

Fig.12. Ustensile de msurat volume:


a - biuret cu robinet; b - citirea corect la biuret sau la pipet cu evitarea erorii de paralax; c - cilindre gradate; d - pahar gradat (menzur); e - baloane cotate; f - pipete gradate cu diviziuni; g - plnii de separare cu diviziuni; h - pipet cu bul; i dozator.

Baloanele cotate se utilizeaz pentru msurarea exact a volumelor, respectiv pentru prepararea soluiilor titrate. Cilindrii gradai sunt vase cilindrice din sticl gradate n cm3 (ml) i fraciuni de ml. Volumul cilindrilor gradai variaz de la 1 la 2000 cm3. Pentru msurarea lichidelor volatile se folosesc cilindri prevzui cu dop rodat. Cilindrii gradai se utilizez numai pentru msurri aproximative de volum, avnd o precizie mai mic dect baloanele cotate. Volumul de lichid se msoar la diviziunea de pe cilindru care marcheaz acest volum, astfel ca meniscul lichidului s e tangent la diviziunea respectiv. Pipetele reprezint tuburi de sticl elate la partea inferioar i sunt utilizate pentru msurarea exact a volumelor mici de soluie. Dup forma i modul de gradare, se deosebesc pipete cu bul i pipete gradate cu diviziuni. Pipetele cu bul se caracterizeaz prin existena unei bule pe care sunt notate volumul i temperatura de etalonare. Ele sunt folosite pentru msurarea unor volume xe de lichid i nu prezint gradaii intermediare. Volumul maxim de umplere a pipetelor cu bul este indicat printr-o cot marcat cu un semn circular la partea superioar sau prin dou cote: una la partea superioar a bulei i alta la partea inferioar. Pipetele cu bul au capaciti diferite: 5; 10; 15; 20; 25; 50 i 100 cm3 (ml). Pipetele gradate (sau normale) sunt utilizate i pentru msurarea unor volume de lichid mai mic dect cel total nscris pe pipet. Ele sunt gradate n cm3 (ml) i fraciuni de cm3 (chiar sutimi de cm3), permind astfel msurarea de volume intermediare. Pipetele gradate au capaciti: 1; 2; 5; 10; 20 i 25 cm3 (ml). Micropipetele se folosesc pentru msurarea volumelor foarte mici de lichid, avnd capacitatea de 0,1 sau 0,2 cm3 (ml). Ele pot gradate n sutimi i miimi de cm3 i sunt, n general, utilizate pentru msurarea unor volume de lichid egale sau mai mici de 0,2 cm3. Msurarea volumelor cu pipeta implic urmtoarele operaii: - se imerseaz vrful pipetei n lichid i se aspir pn cnd lichidul depete gradaia dorit;
39

38

- se astup captul superior al pipetei cu degetul arttor; - innd pipeta n poziie vertical, se stabilete contactul cu degetul arttor lsnd lichidul s curg uor pn cnd meniscul ajunge tangent la cot sau la diviziunea dorit; n acest moment, se astup imediat captul superior al pipetei cu degetul arttor; - se terge vrful pipetei cu hrtie de ltru i se aduce vrful pipetei pe peretele interior al vasului n care se introduce volumul de lichid msurat cu pipeta; - se ridic degetul arttor i se las s se scurg liber ntregul volum de lichid din pipet, sau numai o parte din aceasta, n funcie de volumul dorit a pipetat; - msurarea volumelor se face prin meninerea pipetei n poziie vertical (nu oblic), iar citirea cotei (diviziunii) se face astfel ca orizontala tangentei la meniscul de lichid s e situat n dreptul ochilor observatorului (Fig. 12,b). Biuretele sunt tuburi gradate de sticl cu ajutorul crora se msoar exact volumele de soluii utilizate ca reactivi n analiza volumetric. Biuretele sunt prevzute la partea inferioar elat cu un dispozitiv de scurgere, respectiv de nchidere. Acest dispozitiv poate un tub de cauciuc prevzut cu o bil de sticl sau cu o clem sau cu un robinet din sticl, care permite reglarea scurgerii lichidului din biuret. Biuretele cu bil sau cu clem se folosesc n cazul soluiilor alcaline, iar cele cu robinet din sticl n cazul soluiilor acide. n funcie de capacitatea lor, biuretele pot : - macrobiurete, cu capaciti de 25, 50 i 100 cm3, gradate n cm3 i fraciuni de cm3; - microbiurete cu capaciti de l, 2 i 5 cm3, gradate n zecimi i sutimi de cm3. Dac se lucreaz cu soluii uor alterabile, se folosesc biurete cu umplere automat. Msurarea volumelor de lichid cu biureta implic urmtoarele operaii: - biureta se xeaz n poziie vertical cu ajutorul unui stativ i al unei cleme;
40

- biureta se umple cu lichid pe la partea superioar (deschis), astfel nct s e depit diviziunea zero sau alt gradaie considerat; - din partea inferioar a biuretei se evacueaz aerul; - se las lichidul s se scurg prin picurare pn cnd meniscul inferior al lichidului devine tangent la diviziunea zero sau la alt diviziune considerat, n cazul lichidelor incolore, iar pentru cele colorate pn cnd meniscul superior devine tangent la gradaia respectiv; - msurarea volumelor cu ajutorul biuretei se face prin scurgerea lichidului cu vitez mic, treptat i n picturi, astfel nct erorile datorate aderenei lichidului la pereii biuretei s e minime. Erori posibile la msurarea volumelor. Eroarea de picurare. Sfritul unei titrri este pus n eviden cu ajutorul unui indicator chimic, adic o substan care la punctul de echivalen i modic vizibil una din proprieti (culoarea, uorescena, turbiditatea etc.). Pentru aceast modicare este necesar o fraciune dintr-o pictur a reactivului volumetric. Practic, punctul nal al titrrii se nregistreaz dup adugarea unei picturi de reactiv n exces. Acest exces constituie eroarea de picurare. Eroarea de scurgere. La scurgerea unei soluii printr-un tub, n funcie de tensiunea supercial, densitate, viscozitate i viteza de scurgere a lichidului, o cantitate de soluie ader pe suprafaa interioar a tubului. Aceast eroare de scurgere apare n cazul msurrii volumelor cu pipeta sau cu biureta. Eroarea de citire. Modul de citire a cuplului menisc-gradaie are o mare importan. n acest sens, pot interveni dou erori de citire, care trebuie evitate pentru a nu afecta precizia rezultatelor: prima este eroarea de paralax, care se produce n cazul cnd, la citirea gradaiei, ochiul observatorului este situat deasupra sau sub orizontala tangentei la menisc. Pentru evitarea erorii de paralax, ochiul trebuie s se ae pe orizontala tangentei la menisc sau, dac biureta are gradaii
41

circulare, partea din fa a gradaiei trebuie s se suprapun peste partea din spate a acesteia; a doua eroare de citire se poate produce din cauza fenomenului de refracie a luminii la suprafaa lichidului. Eroarea de temperatur. Ustensilele folosite pentru msurarea volumului (baloane cotate, pipete, biurete) sunt etalonate la o anumit temperatur (de obicei la 20C) stabilit convenional. Volumul soluiilor se modic n funcie de temperatura mediului ambiant. Dac soluia se prepar la o temperatur diferit de 20C, apare eroarea de temperatur. Msurarea densitii lichidelor. Msurarea densitilor lichidelor se efectueaz cu ajutorul densimetrului (sinonim - areometru), iar densitatea solidelor poroase cu ajutorul picnometrului. Areometrul este un tub de sticl nchis la capete i gol n interior. n partea lui superioar se gsete o scal, iar n partea inferioar are un rezervor, umplut de obicei cu alice de plumb, din care cauz areometrul cufundat ntr-un lichid st n poziie vertical. Areometrul se gradeaz pentru o anumit temperatur indicat pe scal. Scala are diviziuni corespunztoare valorii greutilor specice. Folosind o serie de areometre, se poate determina repede greutatea specic a unui lichid. n acest scop, lichidul care urmeaz a cercetat se toarn ntr-un cilindru ngust i uscat, cu capacitate de 100 - 250 ml, n care se introduce areometrul. n prealabil, lichidul se aduce la temperatura la care este etalonat areometrul. Distilarea. Metoda se aplic la puricarea sau separarea substanelor lichide dintr-un sistem omogen sau eterogen lichid sau dintr-un sistem solid-lichid. Metoda se bazeaz pe diferena dintre presiunile de vapori ale componentelor sistemului, deci pe diferenele ce exist ntre punctele de erbere ale componentelor. n cazul n care diferena dintre punctele de erbere ale componentelor este mai mare de 20C, se poate utiliza metoda distilrii simple la presiune obinuit sau la presiune redus. Cnd aceast diferen este mult mai mic, se va aplica metoda distilrii fracionate. n procedeul distilrii fracionate, componentele se culeg separat, n funcie de temperatura la care se distileaz. Pentru puricare
42

fraciunile se redistileaz. Descrierea instalaiei. Instalaia de distilare (Fig.13) simpl const dintr-un balon care conine sistemul sumativ supus distilrii (1), nchis la capt cu un dop (2), prin care trece un termometru (3). Balonul Wrtz este aezat pe o sit de metal i sprijinit cu un trepied i o clem de stativ. Utiliznd un dop perforat (n cazul cnd nu avem lif) se racordeaz balonul la un refrigerent descendent cu ap (4). La captul cellalt al refrigerentului se aplic o alonj (5), care se introduce n gura unui vas de culegere (6). nclzirea se face la acra unui bec de gaz, iar rcirea cu ap de apeduct. Procedeu experimental. Obinerea apei distilate i redistilate. n

Fig.13. Instalaie pentru distilare simpl:


1 - balon Wrtz; 2 - dop; 3 - termometru; 4 - refrigerent Liebich; 5 - alonj; 6 - balon Erlenmayer.

43

balonul Wrtz se introduc 2/3 din capacitatea sa ap de apeduct, apoi se adaug cteva cristale de permanganat de potasiu (soluie roz) i cteva bucele de porelan poros pentru a uura erberea i a evita supranclzirea. Se adapteaz termometrul i refrigerentul i se ncepe nclzirea la acra becului de gaz. Distilatul se va culege ntr-un vas curat, iar refrigerentul se va spla bine nainte de montare. Pentru a obine ap cu puritate mai ridicat, aceasta se va supune redistilrii, n urma creia se obine ap bidistilat. Distilarea n vid. Sunt multe substane care nu se pot distila sub presiunea atmosferic din cauz c se descompun. Acest fel de substane se pot distila ns cu uurin sub presiune redus, fr s se descompun. Coborrea punctului de erbere n vid este destul de important fa de punctul de erbere al acelorai substane la presiunea obinuit, De exemplu, acidul acetic, sub o presiune de 12 mm al coloanei de mercur, erbe la 19C n loc de 118C la presiune atmosferic. Procedeu experimental pentru distilarea n vid. Cea mai simpl montare este urmtoarea (Fig.14): se ia un balon Cleisen sau un balon de fracionare a cu tubulur lateral lung, care se introduce pn aproape de fundul unui al doilea balon de fracionare b i se xeaz n gtul balonului a cu un dop de plut sau cauciuc. n gtul primului balon de fracionare a se xeaz un dop cu dou gturi. Prin una din guri trece un termometru; prin a doua gaur un tub de sticl c tras n capilar la captul care ajunge pn aproape de fundul balonului a. La cellalt capt al acestui tub c este xat un tub de cauciuc scurt de civa cm i care se poate nchide prin turtire, cu ajutorul unei cleme cu urub d. Tubulura lateral a balonului b se pune n legtur cu o tromp de ap care formeaz vid n interiorul aparaturii. ntre balonul b i tromp se intercaleaz un vas de siguran e care poate un vas de tromp conic cu tubulur lateral. Balonul b se rcete cu ap de la un robinet. Sub balonul b se aeaz o plnie de mrime potrivit, prin care se scurge ap. Tubul de scurgere al plniei se prelungete
44

cu un tub de cauciuc pn la chiuveta canalului. Baloanele de fracionare a i b trebuie s e de sticl rezistent

Fig. 14. Instalaie pentru distilare n vid.


a - balon Cleisen; d - clem; b - balon Wrtz; e - vas de siguran. c - tub de sticl capilar;

la presiune, iar dopurile i legturile s se nchid bine. Legturile se fac cu un tub de cauciuc cu perei groi, numite i tuburi de vid, pentru ca s nu se nchid prin turtire. Rostul tubului c, elat n capilar, este de a putea introduce n balonul a, prin masa lichidului de distilat, un curent foarte mic de aer, pentru a uura erberea i pentru a nu se produce un vid prea naintat n aparat. Intrarea aerului n aparat se poate regla prin manipularea clemei cu urub d. nainte de a ncepe nclzirea pentru distilare, se controleaz dac aparatul se nchide bine peste tot, fcnd vid. La terminarea distilrii nu se desfac brusc legturile i nici nu se
45

nchide trompa. Mai nti se desface treptat clema cu urub d pentru a lsa s intre ct mai mult aer, i numai dup aceea se desface legtura de la tromp. Se poate proceda i altfel: ntre vasul de siguran i tromp, pe tubul de cauciuc de legtur, xm o clem cu urub. Cnd vrem s ntrerupem operaia, strngem tubul de cauciuc cu clema, desfacem legtura cu trompa i apoi desurubm treptat clema, n aa fel ca aerul s intre n aparat ncetul cu ncetul. Dup aceste operaii, putem s desfacem diferitele pri ale aparatului fr nici un risc. Pentru a putea ti, care este presiunea redus la care se face distilarea n vid, ntre balonul b i vasul de siguran e se intercaleaz un manometru cu mercur. Atunci cnd trebuie s se separe mai multe substane prin distilare fracionat la vid, n locul balonului b se monteaz un aparat care conine nchise ntr-un vas cilindric mai multe eprubete ce pot aduse pe rnd n dreptul tubului de scurgere (refrigerent) printr-o micare de rotaie. Antrenarea cu vapori. Sunt substane de natur biochimic, de exemplu uleiurile eterice, care prin volatilizare direct se descompun, dar care se volatilizeaz mult mai uor i fr s se descompun cnd n masa lor trece un curent de vapori de ap. Acest fel de substane se pot purica sau separa dintr-un amestec prin distilare sau antrenare cu vapori de ap. Procedeu experimental pentru antrenarea cu vapori de ap. Aparatura necesar pentru antrenarea cu vapori de ap este urmtoarea: bidon cu ap, productor de vapori, un balon de sticl n care se pune amestecul de antrenat, un refrigerent model Liebich i un recipient (Fig.15). Vasul n care se produc vaporii este un bidon de tabl a n care se toarn ap pn la l/2. Gtul bidonului se astup cu un dop de plut strbtut de dou oricii. Prin unul trece un tub de sticl b de siguran care ajunge sub ap pn aproape de fundul bidonului; prin cealalt gaur trece un tub de sticl ndoit c. Un capt al acestuia se termin imediat sub dopul bidonului, iar cu cellalt capt se face legtura cu balonul n care este pus substana de antrenat. Balonul d poate aezat nclinat, i prin dopul cu care se astup
46

trec dou tuburi de sticl. Unul e ajunge la un capt aproape de fundul balonului, iar cu cellalt capt, n afara dopului, se face legtura cu tubul c de la bidonul n care se produc vaporii. Legtura se face cu un tub de cauciuc. Al doilea tub f de la balon se termin imediat sub dop. Captul cellalt al acestui tub, ndoit n unghi ascuit, se unete cu un refrigerent Liebich la a crei ieire se ataeaz recipientul. La nceputul operaiei se nclzete separat, att bidonul n care se produc vaporii, ct i balonul n care se a substana de antrenat. Cnd vaporii de ap se dezvolt constant din apa n erbere i lichidul din balon a fost sucient nclzit, se face legtura dintre

Fig. 15. Instalaie pentru antrenare cu vapori:


a - bidon cu ap pentru producerea vaporilor; b - tub de siguran (din sticl, ajunge pn aproape de fundul bidonului); c - tub de sticl (un capt se termin imediat sub dopul bidonului, iar cellalt la fundul balonului cu fund rotund, aezat nclinat); f - tub de legtur cu un refrigerent lung.

balon i bidon, lsnd totul n funciune ct este necesar. Cnd cantitatea substanei de antrenat este mic, nu se mai face prenclzirea ei; n acest caz, vaporii de ap erbini se introduc direct n lichidul rece.

47

4. ETAPELE ANALIZEI BIOCHIMICE CANTITATIVE


Analiza biochimic cantitativ necesit msurri exacte, deoarece, indiferent de metoda utilizat n analiz, rezultatele obinute trebuie s corespund valorilor determinate. Fiecare metod de analiza biochimic este constituit dintr-o suit de operaii (dizolvare, precipitare, ltrare, cntrire etc.) pentru efectuare a cror se folosete aparatur special, diferii reactivi. 4.1. Cunoaterea compoziiei biochimice a probei de analizat nainte de a efectua o analiz biochimic cantitativ este necesar a cunoate compoziia biochimic a probei. Dac aceasta nu e cunoscut, primul pas l constituie analiza biochimic calitativ. Aceasta se execut prin metode clasice de analiz biochimic calitativ. Cele mai importante dintre ele au fost efectuate n cadrul lucrrilor de laborator la biochimia general [7]. 4.2. Alegerea metodei de analiz Metoda de analiz se alege n funcie de: concentraia n care se gsete componentul analizei n prob (exemplu: cnd concentraia este de ordinul procentelor sau zecilor de procente analiza cantitativ clasic: gravimetrie sau volumetrie; dac componentul se gsete n urme metode zico-chimice); proprietile zice i chimice ale componentului de analizat i ale celor nsoitoare (exemplu: dac formeaz compui greu solubili gravimetria; dac formeaz compui colorai spec trofotocolorimetria); componena probei; exactitatea cerut; consideraii economice (la o investigaie cu un numr prea mare de analize se vor consuma prea muli reactivi).
48

Alegerea metodei necesit un amplu proces de documentare, selectarea metodei optime, adaptarea ei pentru proba ce urmeaz a analizat i testarea metodei pe probe standard, asemntoare cu proba real. 4.3. Stabilirea mrimii probei de analizat i a numrului de probe paralele Mrimea probei luate spre analiz depinde de concentraia componentului care urmeaz a dozat i de sensibilitatea metodei utilizate (reactivi, produi de reacie i aparatur). Pentru prelucrarea statistic a rezultatelor obinute este necesar efectuarea analizelor cel puin n trei repetri. 4.4. Luarea probei Aceasta este etapa care include cele mai mari erori, putndu-se ajunge chiar la denaturarea complet a rezultatelor. Proba care este supus analizei trebuie s e reprezentativ, adic s aib aceeai compoziie cu cea a materialului din care a fost extras. Uneori acest pas prezint cele mai dicile aspecte din tot procesul analitic. Prelevarea probelor lichide se realizeaz cu ustensile i n recipieni curai, confecionai din materiale care nu interacioneaz cu componenii probei. Dac proba poate suferi transformri n timp, atunci analiza se efectueaz imediat sau proba se xeaz. Dac xarea duce la modicri ale compoziiei probei, atunci xarea se face n azot lichid sau se liolizeaz. Dac xarea duce la deshidratare, concomitent este necesar a determina umiditatea materialului. Pentru lichidele omogene luarea probei nu ridic probleme deosebite. n cazul soluiilor, probele pentru analiza cantitativ au un volum mic, deoarece acestea prezint un grad ridicat de omogenitate pn la nivel molecular. Dac sistemul cercetat nu este prea mare i este constituit din mai multe faze lichide, nainte de luarea probei materialul va omogenizat prin agitare.
49

n cazul n care sistemul este foarte mare (exemplu: parcel, cmp, lac, ru), probele vor luate din mai multe locuri i adncimi (proba medie). Probele se unesc, se usuc (cu acest prilej se determin umiditatea probei) i se macin n. n funcie de exactitatea cerut, de gradul de neomogenitate a materialului i de mrimea particulelor de la care ncepe s se manifeste neomogenitatea, masa probei poate varia ntre zecimi i sute de grame. Reducerea masei pn la nivel de grame sau i mai mic se poate realiza prin metoda sferturilor: dup o amestecare minuioas a probei, aceasta se turtete i se mparte n patru, se iau dou sferturi opuse i acest proces de reducere se continu pn se ajunge la cantitatea dorit. 4.5. Aducerea probei n soluie n majoritatea cazurilor, analiza biochimic se realizeaz n soluii apoase. Pentru aceasta este necesar transformarea probei solide n componeni solubili. Agentul de dizolvare potrivit se alege n funcie de natura probei i scopul urmrit. n cazul n care este necesar pstrarea strii native a proteinelor i activitii enzimelor, aducerea probei n soluie se efectueaz n condiii blnde, n soluii tampon, la care pH-ul, compoziia i tria ionic sunt apropiate de cele ziologice, la temperaturi sczute i n timp redus. n alte cazuri, aducerea probei n soluie se execut n condiii dure. De exemplu, pentru dozarea proteinelor dup coninutul de azot prin metoda Kjeldahl proba se dezintegreaz pe cale umed n acid sulfuric la erbere (340C). n aceste condiii, proba este dezintegrat pn la CO2 i H2O, iar azotul transformat n sulfat de amoniu. Dezagregarea alcalin pe cale umed se utilizeaz n cazul analizei aminoacide a proteinelor pentru a putea doza triptofanul, serina i treonina, care n mediu acid se distrug. De regul, dezagregarea pe cale umed se realizeaz n sisteme nchise: vasul n care are loc acest proces (pahar Erlenmayer, Berzelius sau Kjeldahl) se acoper cu un refrigerent sau sticl de ceas, pentru a evita pierderile.
50

Aducerea probelor la sec ridic multe diculti condiionate de pierderile prin stropire, mai ales n ultima parte, cnd exist un volum mic de solvent; din acest motiv, evaporarea se realizeaz prin nclzire lent. 4.6. Eliminarea interferenelor Interferena reprezint o intensicare sau slbire a intensitii prin suprapunerea a dou sau a mai multor efecte. Interferena este ntlnit n analizele biochimice n orice situaie n care proba conine specii ce mresc sau atenueaz semnalul componentului analizat. Exist dou modaliti de eliminare a interferenelor: utilizarea agenilor de mascare substane care interacioneaz cu speciile interferente, transformndu-le n compui stabili care nu mai intervin la generarea semnalului; ndeprtarea speciei interferente din sistemul analizat, apelnduse la diverse tehnici de separare: precipitarea selectiv, extracia lichid-lichid, distilarea, metode cromatograce etc. 4.7. Analiza propriu-zis Analiza propriu-zis de determinare a concentraiei (cantitii) unui component se poate realiza: gravimetric componentul aat n soluie este transformat n compus greu solubil, separat prin ltrare, uscat n termostat i cntrit la balana analitic. Masa componentului se determin inndu-se cont de factorul gravimetric; volumetric componentului aat n soluie i se adaug, prin intermediul unei biurete, cantitatea echivalent necesar de reactiv aat ntr-o soluie de concentraie riguros determinat. Sfritul titrrii este pus n eviden cu ajutorul indicatorilor. Determinri cantitative se mai pot realiza utiliznd metode zico-chimice, analiza cromatograc, analiza electroforetic. Ultimele sunt descrise n [6,7,23].

51

5. TRATAREA MATEMATIC A ANALIZEI BIOCHIMICE


La realizarea analizelor biochimice concur foarte muli factori, care pot introduce o serie de erori. Pentru a trage cele mai juste concluzii din rezultatele obinute n urma msurrilor analitice, necesare unei interpretri corecte a diverselor procese cercetate, biochimistul trebuie s nsueasc metodele adecvate pentru evaluarea datelor experimentale. Discuii detaliate asupra acestor ntrebri pot gsite n [4, 9, 15, 17, 20]. n cele ce urmeaz ne vom referi doar la unele noiuni strict necesare n analiza biochimic. 5.1. Clasicarea erorilor La ecare etap de analiz biochimic pot comise erori, care fac ca rezultatul nal X al unei analize s difere de valoarea real A (sau X0). Diferena X = [X - A] este numit eroarea analizei, deci eroarea msurrii se numete devierea rezultatelor msurtorilor de la valoarea real a mrimii msurate. Erorile se pot clasica avnd n vedere diferite criterii de clasicare. Astfel, dup cauzele care le produc, pot mprite n trei categorii: - erori sistematice (determinate sau permanente); - erori ntmpltoare (accidentale sau temporare); - erori grobe (anormale). Erorile sistematice au cauze permanente ce pot cunoscute. Cauzele ind permanente, erorile se repet n toate determinrile, astfel cauza poate descoperit i nlturat evitndu-se n felul acesta abaterea. O eroare sistematic determinat pentru metoda dat se va aduga sau se va scdea din rezultatul nal. Din grupa erorilor sistematice fac parte: erorile care depind de metoda de analiz utilizat. Acestea pot proveni: dintr-o anumit solubilitate a precipitatului;
52

datorit unor reacii care nu se produc practic total; din cauza unor reacii i fenomene zico-chimice secundare; datorit caracterului higroscopic al unor produi, atunci cnd pot precipita i ali ioni existeni n soluie; datorit pierderilor prin descompunere sau volatilizare la calcinare etc.; erorile care depind de aparate i manipularea lor: aparate defecte, etalonarea greit a vaselor de msur i a aparatelor, necunoaterea manevrrii aparatelor etc.; erori datorate impuricrii soluiilor prin atacarea materialului din care sunt confecionate vasele n care acestea sunt pstrate etc.; erori care depind de tehnica executrii analizei: nerespectarea indicaiilor prevzute de metod, slaba calicare a operatorului etc. Erorile ntmpltoare au cauze variabile, de aceea la msurri repetate se pot schimba att ca mrime, ct i ca semn. Ele nu pot apreciate din timp i apar datorit condiiilor specice n care se execut determinarea, ca: variaia factorilor mediului extern (uctuaii de temperatur, de presiune, de umiditate), datorit impuricrii accidentale, neateniei n timpul lucrului, vibraiilor n timpul citirii la aparate etc. Pentru estimarea erorilor ntmpltoare se folosete teoria probabilitilor, ale crei concluzii nu sunt absolut sigure, ci numai cele mai probabile. Erorile grobe se datoresc unor abateri grave de la metodica determinrii sau unor greeli de calcul. Fiind puse n eviden, rezultatele eronate sunt nlturate. Exactitate i precizie. n discuiile obinuite, termenii exactitate i precizie sunt folosii cu neles sinonim, atunci ns cnd aceti termeni sunt aplicai unor date tiinice este necesar s se fac distincie ntre ei. Un rezultat exact este acela care concord cu valoarea adevrat a mrimii msurate. Precizia se refer la concordana ntre rezultatele experimentale ale unui grup de msurtori. Valoarea erorilor sistematice determin gradul exactitii
53

rezultatului, iar valoarea erorilor ntmpltoare determin precizia lui. Cu ct sunt mai mici valorile erorilor sistematice, cu att este mai exact rezultatul i cu ct rezultatele mai multor determinri efectuate asupra aceleiai mrimi sunt mai apropiate ntre ele, cu att precizia este mai mare (rezultatele sunt reproductibile). n analiza biochimic cantitativ se cere ca rezultatele prezentate s corespund valorilor reale ale mrimilor determinate i de aceea este necesar s e nlturate, pe ct e posibil, erorile ce intervin la efectuarea unei analize. Prezentarea unor rezultate ct mai apropiate de cele adevrate necesit corecii, care se bazeaz pe calculul statistic al erorilor. Dup modul de exprimare, erorile pot absolute i relative. 5.2. Noiuni de statistic Unul dintre obiectivii principali ai tiinelor este acela de a descoperi n cadrul fenomenelor complexe ale naturii legile dup care au loc aceste fenomene. Cunoaterea legilor permite cunoaterea legturilor dintre cauz i efect, iar aceasta se obine pe baza determinrilor experimentale. Statistica tiina care, folosind calculul probabilitilor, se ocup cu studiul cantitativ al fenomenelor de mas, prezentate de elemente ce au anumite caracteristici comune. Statistica analizeaz i prelucreaz datele statistice (valorile asupra crora inueneaz o mulime de cauze, care constituie populaii de valori). Populaia de valori reprezint o mulime (colectivitate, efectiv, ansamblu) innit de valori omogene din punct de vedere calitativ. Practic, pentru cunoaterea exact a populaiei ar trebui msurate toate elementele ce constituie populaia i calculai indicatorii statistici ai populaiei. n unele situaii, studierea ntregii populaii este dicil i chiar imposibil (populaii foarte numeroase, timp ndelungat necesar msurrii etc.). n astfel de cazuri studierea caracteristicilor comune ale elementelor unei populaii se poate efectua cu ajutorul unei probe extrase din populaie.
54

Proba (eantionul, mostra) este o parte din populaie care servete la studiul populaiei din care a fost extras. Desigur, proba nu poate indica totul despre populaia din care a provenit, ns d o anumit informaie asupra populaiei, materializat prin valorile unor mrimi care poart numele de indicatori (parametri) statistici ai probei. Indicatorii statistici ai probei sunt cu att mai apropiai de indicatorii statistici ai populaiei, cu ct proba este mai reprezentativ pentru populaie, adic este extras aleator (ntmpltor), i cu ct mai numeroas ea este. 5.2.1. Indicatorii statistici ai unui ir de determinri experimentale S presupunem c, pentru determinarea valorii unei mrimi oarecare (X), care caracterizeaz elementele dintr-o populaie, s-a extras din populaia respectiv o prob format din n elemente (n<30). n urma determinrilor experimentale s-au obinut pentru mrimea respectiv valori care difer ntre ele i care se noteaz cu x1, x2, ......., xn. Deoarece mrimea respectiv prezint o dispersare (mprtiere), ea se numete variabil sau caracteristic, dat ind c caracterizeaz nite elemente. Prin prelucrarea statistico-matematic a valorilor eantionului extras din populaie se obin indicatorii (parametrii) statistici ai eantionului, care sunt cele mai probabile valori ale indicatorilor statistici ai populaiei din care a fost extras eantionul. Dei o prob extras dintr-o populaie poate avea, n principiu, orice compoziie, totui se pot determina nite valori limit (o limit inferioar i una superioar), astfel nct probabilitatea s e foarte redus. Aceste valori limit se determin cu un anumit coecient de siguran (ncredere). Valorile limit calculate determin intervalele de ncredere n care se gsesc parametrii statistici ai populaiei din care a fost extras proba. Cu siguran, cu ct sunt mai reduse intervalele de ncredere, cu att rezultatele obinute n urma prelucrrii statistice a datelor experimentale sunt mai valoroase.
55

Parametrii (indicatorii) statistici ai unui ir de determinri experimentale se mpart n dou categorii: - valorile tipice, care indic ordinul de mrime i tendina central a ansamblului de msurtori: medie, median i moda; - indicii de dispersie, care arat gradul de mprtiere (dispersie, uctuaie) a valorilor obinute experimental fa de valoarea medie. Dintre valorile tipice, n cercetrile cu caracter biologic se folosete mai des media aritmetic. Media aritmetic simpl a probei ( X ) (se citete x barat este cel mai rspndit indice statistic) este valoarea cea mai probabil a mrimii msurate i se calculeaz astfel: X + X 2 + X 3 + ......... + X n X = 1 n sau dup formula:

5.2.2. Evaluarea gradului de dispersie a valorilor determinate Dintre indicii de dispersie cei mai utilizai sunt: 1. Abaterea (eroarea) parial a ecrei determinri (Xi). Este diferena dintre valoarea din prob (Xi) i media aritmetic a probei ( X ), adic: dX i = X i - X . Abaterile pariale pot pozitive, negative sau nule. Pentru un numr n de determinri, suma algebric a tuturor abaterilor pariale este nul, abaterile pozitive compensndu-se cu cele negative, adic: n dX i = 0.
i =1

1 n Xi n i =1 unde: Xi sunt valorile mrimii determinate experimental, iar n este numrul elementelor din prob. Diferena | X - Xi| = X este numit eroare absolut a unei determinri individuale. Media aritmetic indic valoarea (tendina) central a ansamblului de msurri. Importana ei const n faptul c ea ine seama de toate valorile irului. n cazul irurilor cu volum mare, media aritmetic este destul de stabil. Ca orice indicator statistic, ea nu conine dect o parte din informaia cuprins n irul de valori, deoarece media aritmetic cuprinde ntr-un singur numr toate informaiile date de valorile determinate experimental. O lucrare care prezint numai media aritmetic a unui ir de determinri este incomplet, deoarece nu d o indicaie cu privire la gradul de dispersie a valorilor determinate fa de valoarea central. X =
56

2. Abaterea (eroarea) absolut (X). Pentru a calcula abaterea medie din abaterile pariale, trebuie adunate abaterile pariale, iar suma lor raportat la numrul determinrilor. Dar suma algebric a abaterilor pariale este nul, adic ar rezulta c abaterea (eroarea) medie este nul, ceea ce, evident, nu corespunde realitii. De aceea, pentru calculul abaterii medii se consider abaterile pariale n modul (valoare absolut). Media aritmetic a abaterilor pariale (n modul) se numete abatere (eroare) absolut a irului de msurtori i este dat de relaia:

Eroarea absolut X se mai numete i abatere medie sau eroare medie i uneori se noteaz prin D (deviaie). Rezultatul msurtorilor efectuate asupra mrimii X se va putea, deci, exprima ntr-o form, astfel: X = X X. 3. Abaterea (eroarea) relativ (). n unele aplicaii practice intereseaz s se cunoasc abaterea (eroarea) ce revine unitii de msur corespunztoare mrimii respective; alteori, este necesar s
57

se compare abaterile corespunztoare n cazul determinrii a dou mrimi diferite. n aceste cazuri se calculeaz abaterea (eroarea) relativ (), denit ca abaterea corespunztoare unitii de msur i care este dat de raportul dintre abaterea absolut (X) i valoarea cea mai probabil (media aritmetic), ( X ), adic:
dX . X 4. Abaterea (eroarea) procentual. Datorit faptului c abaterea relativ este foarte mic, ea se exprim mai comod raportnd-o la suta de uniti, deci n procente. Ea se calculeaz nmulind abaterea relativ cu 100, adic: e=

de media aritmetic. Abaterea standard se obine extrgnd rdcina ptrat din dispersie, adic:

Dac se calculeaz abaterea standard a probei, rezultatul msurtorilor se poate prezenta sub forma: X = X S. 7. Abaterea medie ptratic a mediei unei probe fa de media populaiei (Sm). n cazul cercetrilor biologice, cnd populaia studiat se caracterizeaz printr-un numr foarte mare de elemente, studiul se face pe probe cu un numr mai mic de elemente. n asemenea situaii, statistica matematic permite determinarea abaterilor indicatorilor probei fa de indicatorii populaiei. Abaterea medie ptratic a mediei unei probe fa de media populaiei se calculeaz dup formula:

% = 100. Dac se calculeaz abaterea procentual, rezultatul msurtorii se poate prezenta i sub forma: X = X %. 5. Dispersia (variana) probei (S2) este un indicator statistic folosit pentru a preciza mai bine gradul de dispersie (de mprtiere) al valorilor obinute experimental fa de valoarea medie. Dispersia se calculeaz dup formula:

unde n numrul msurrilor 6. Abaterea standard a probei (S). Dezavantajul dispersiei este acela c ea se msoar n unitile de msur ale mrimii respective ridicate la ptrat, ceea ce nu are nici o semnicaie zic pentru msurtoare. Din acest motiv s-a denit abaterea standard a probei, care indic dispersia valorilor determinate experimental fa
58

n care n este numrul de elemente din prob. Acest indicator statistic se folosete la determinarea intervalelor de ncredere (siguran) n care media aritmetic a populaiei se gsete cu anumite probabiliti. 8. Intervalul de ncredere (siguran) n care media aritmetic a populaiei se gsete cu o anumit probabilitate. n statistica matematic se demonstreaz c folosind valorile elementelor unei probe extrase, aa cum s-a artat n mod aleator, se pot determina dou valori limit care delimiteaz un interval de ncredere n care media aritmetic a populaiei se gsete cu o anumit probabilitate, lucru foarte important n cercetrile biologice.
59

Pentru o prob (cu un anumit efectiv), cele dou valori limit, inferioar i superioar, ale intervalului de ncredere depind numai de coecientul de ncredere (siguran) notat cu 1-. Coecientul de ncredere reprezint probabilitatea ca intervalul de ncredere s conin media populaiei. Mrimea , complementarul coecientului de ncredere (suma probabilitilor a dou evenimente contrare este egal cu unitatea), se numete nivel de semnicaie i reprezint probabilitatea ca media populaiei s nu se conin n intervalul de ncredere. Nivelul de semnicaie se stabilete la alegerea mrimii eantionului avndu-se n vedere ca precizia concluziilor s e asigurat cu o anumit probabilitate i s satisfac, astfel, scopul urmrit. Pentru o populaie repartizat normal, dac se cunoate media aritmetic a probei ( X ) i abaterea mediei ptratice a mediei probei fa de media populaiei (Sm), atunci, pentru probe cu un numr mic de elemente (n<30) limitele de ncredere (limita superioar XS i limita inferioar XI) n care se gsete media aritmetic a populaiei sunt calculate, cu o anumit probabilitate, dup formulele: XS = X + t Sm; XI = X - t Sm, n care t (coecienii Student) este un parametru ce depinde de valoarea coecientului de ncredere (respectiv, nivelului de semnicaie) i de numrul gradelor de libertate (t ; N = n-1). De obicei, pentru se iau valorile de 0,05; 0,01 sau 0,001, respectiv pentru coecienii de siguran de 0,95; 0,99 sau de 0,999. n biologie i medicin, datorit variabilitii accentuate, se consider acceptabile intervalele de ncredere corespunztoare primilor doi coecieni de ncredere (n procente 95% i 99%, respectiv coecienii de risc de 5% i 1%), n funcie de care valorile parametrului t au fost calculate i tabelate.
60

n alegerea mrimii eantionului (a numrului n de determinri) pe baza crora s se estimeze ct mai precis un indicator statistic sau un fenomen, trebuie s se in seama c, n cazul unei populaii neomogene, numrul elementelor (indivizilor) eantionului va trebui s e mai mare dect n cazul unei populaii cu dispersie mic (populaie omogen). Tabelul 5.1.1. Valorile parametrului Student (t) n funcie de valorile coecientului de siguran (de probabilitatea aleas) i de numrul gradelor de libertate
Numrul gradelor de libertate N=n-1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 20 30 60 200 Valorile coecienilor de siguran (P) 95% 12,706 4,303 3,182 2,776 2,571 2,447 2,365 2,306 2,262 2,228 2,086 2,042 2,000 1,960 99% 63,657 9,925 5,841 4,604 4,032 3,707 3,499 3,355 3,250 3,169 2,845 2,750 2,660 2,570

5.2.3. Eliminarea rezultatelor anormale Deseori, ntr-o serie de determinri unul sau mai multe rezultate difer mult de restul irului. Eliminarea acestui rezultat nu se face la ntmplare, ci dup anumite metode. 1. Un rezultat poate considerat anormal atunci cnd diferena | X - Xi| depete valoarea tripl a abaterii standard a determinrii individuale: | X - Xi| > 3S.
61

2. Testul Q se consider cea mai raional metod de eliminare a rezultatelor anormale pentru un numr nu mai mare de 10 determinri. Pentru aceasta, toate rezultatele se aranjeaz n ordinea crescnd a valorilor X1, X2 ......... Xn . Diferena dintre valorile maximal i minimal R se numete amplitudine. Coecientul Q se calculeaz ca raportul dintre diferena valorii suspecte ca rezultat anormal Xn i cea vecin Xn-1, la amplitudine: X - X n-1 Qp = n . R Valoarea calculat Qp se compar cu cele tabelate pentru o anumit probabilitate (Tabelul 5.2.2.). Dac Qp>Qtab., valoarea suspectat este calicat ca rezultat anormal i este nlturat. Tabelul 5.2.2. Valorile testului Q n funcie de numrul gradelor de libertate N i de probabilitatea P P N=n-1 95 99 2 0,94 0,99 3 0,77 0,89 4 0,64 0,76 5 0,56 0,70 6 0,51 0,64 7 0,48 0,58 Exemplu: coninutul glucozei a fost determinat prin metoda iodometric n 5 probe paralele, obinndu-se rezultatele: 8,30, 8,56, 8,60, 8,66, 8,70%. Rezultatul 8,30 se deosebete de restul seriei i este suspectat ca nesigur. Pentru a lua decizia de a-l elimina ca rezultat anormal sau de a-l lsa pentru prelucrarea statistic, folosim testul Q: 8,56 - 8,30 Q= = 0,65. 8,70 - 8,30
62

Din Tabelul 5.2.2. gsim c pentru o probabilitate P = 95 i N = 4, valoarea coecientului Q este 0,64. Deoarece 0,65>0,64, rezultatul 8,30 urmeaz a eliminat. 3. Criteriul t (Student) n acest caz se folosete n felul urmtor: a) se elimin rezultatul suspect 8,30 b) se calculeaz
X n -1 = 8,56 + 8,60 + 8,66 + 8,70 = 8,63 5 -1

S = 0,062
t= 8,63 - 8,30 = 4,74 5 0,062 4

Din Tabelul 5.1.1. pentru P = 95 i n 1 = 3,182. Din motivul c tcalculat >ttabelat, rezultatul 8,30 se va nltura. 5.2.4 Exemple de prelucrare statistic a rezultatelor unei analize biochimice Exemplul 1. S presupunem c pentru determinarea coninutului de azot ntr-un obiect biologic au fost efectuate 7 determinri cu urmtoarele rezultate: 3,25, 3,40, 3,28, 3,38, 3,17, 3,33, 3,21%. Valoarea 3,40 difer semnicativ de celelalte valori. Pentru a decide de a o nltura aplicm testul Q:
X n - X n -1 3,40 - 3,25 0,15 = = = 0,78. 3,40 - 3,21 0,19 R Din Tabelul 5.2.2. gsim c pentru o probabilitate de P = 95 i N = 6 valoarea Q = 0,51. Deoarece 0,78>0,51, valoarea 3,40 este eliminat ca ind anormal (dubioas).
63

Media aritmetic va :

Eroarea ptratic medie a unei determinri:

Eroarea medie ptratic a mediei de selecie:

Din Tabelul 5.1.1. se sustrage t (5; 95), care este egal cu 2,571, i se calculeaz intervalul de ncredere: = t (5; 95) S X = 2,57 0,0315 = 0,08. Rezultatul nal X se prezint sub forma: X = 3,27 0,08%. Exemplul 2. La determinarea coninutului de fructoz n ciree au fost obinute urmtoarele rezultate (n %): 9,80; 9,73 i 9,75. De calculat X , S X . 1. X =
9,80 + 9,73 + 9,75 = 9,76% 3

2. S = 3. S X =

(9,80 - 9,76 )2 + (9,73 - 9,76 )2 + (9,75 - 9,76 )2


3 -1

= 0,036

0,036 3

= 0,021.

Deci, n ciree se conine 9,76 0,02% fructoz.


64

5.2.5. Prezentarea datelor ca numr semnicativ O metod mult mai simpl n analizele biochimice cantitative are la baz prezentarea rezultatului ca numr semnicativ (important, nsemnat). Regula 1. Un numr este considerat semnicativ, adic este cert, dac conine toate cifrele sigure (pentru care exist gradaie) plus prima cifr nesigur (citit prin aproximare). Exemplul 1. Volumul de soluie, adugat cu o biuret gradat din 0,1 n 0,1 ml, se citete ca numr semnicativ astfel: cu ajutorul gradaiilor (cifrele certe): 25,4 prin aproximaie (prima cifr incert): 0,03 cifra raportat: 25,43 ml (4 cifre semnicative). Exemplu 2. La balana analitic, numrul rezultat n urma msurtorii va conine 4 cifre semnicative dup virgul (primele trei ind sigure, iar a patra cifr obinut prin aproximare): 1,4628 g. n exemplele date mai sus, 0,01 i 0,0001 reprezint incertitudinea absolut a biuretei, respectiv a balanei. Incertitudinea relativ se denete a raportul dintre incertitudinea absolut a msurtorii i valoarea msurat. n exemplele de mai sus incertitudinea relativ va : la msurarea cu biureta gradat: 0,01/25,43 = 0,0003932, iar la msurarea cu balana analitic: 0,0001/1,4628 = 0,0000683. Cu ct mai mare va valoarea msurat cu att mai mic va incertitudinea relativ. Regula 2. Rotunjirea numerelor: a) dac, n urma calculelor, prima cifr nesemnicativ este mai mare dect 5, atunci cifra din stnga, imediat urmtoare (ultima semnicativ), se majoreaz cu o unitate. Exemplu: n urma unui calcul rezult numrul 1,4628. Dac rezultatul trebuie dat cu dou cifre semnicative dup virgul, numrul rotunjit se va scrie 1,463; b) dac, n urma calculelor, prima cifr nesemnicativ este mai mic dect 5 atunci numrul raportat nu va modicat prin rotunjire.
65

Exemplu: n urma unui calcul rezult numrul 14,733. Dac rezultatul trebuie s e dat cu dou cifre semnicative dup virgul, numrul rotunjit se va scrie 14,73. Regula 3. Stabilirea cifrelor semnicative dup virgul, pentru numerele obinute n urma calculelor se va face inndu-se cont de urmtoarele reguli: a) n urma operaiilor de adunare i scdere, numrul obinut va avea attea cifre semnicative dup virgul cte coninea numrul cu cele mai puine cifre semnicative dup virgul. Exemplu: Pentru oxidarea total a substanelor organice dintr-o prob de ap s-au adugat 100,0 ml soluie KMnO4 0,1 N, cu o biuret gradat din ml n ml. Dintr-o alt biuret cu aceeai gradaie s-au adugat 58,4 ml soluie de acid oxalic 0,1 N, soluia decolornduse total. Excesul de acid oxalic a fost retitrat cu 4,27 ml din aceeai soluie de permanganat de potasiu, ns utiliznd o biuret de 25 ml cu gradaiile din 0,1 n 0,1 ml. S se determine volumul de KMnO4 necesar oxidrii substanelor organice din proba de ap. 100,0 58,4 + 4,27 = 45,86 ml Rezultatul nal: 45,9 ml (obinut prin rotunjire i meninerea numai a unei cifre semnicative dup virgul). b) n urma operaiilor de nmulire i mprire, rezultatul obinut va cuprinde attea cifre semnicative astfel nct incertitudinea 2X lui relativ s se ncadreze n intervalul: 2 X , unde X este cea 10 mai mare incertitudine relativ a factorilor luai n calcul. De obicei, se fac urmtorii pai: efectuarea calculului; calcularea i selectarea celei mai mari incertitudini relative (X); calcularea incertitudinii relative a rezultatului pentru cteva cazuri i stabilirea rezultatului nal.
Exemplu: 10 ml prob de acid acetic, luai cu o biuret de 25 ml gradat din 0,1 n 0,1 ml, au fost titrai cu 11,45 ml soluie NaOH 0,1103 N, n prezen de fenolftalein. S se determine titrul soluiei de acid acetic. 66

efectuarea calculului:

TCH 3COOH =
TCH 3COOH =

V NaOH N NaOH Eg CH 3COOH VCH 3COOH 1000

11,45 0,1103 60 = 0,0075776 g ml. 10 1000 determinarea incertitudinii absolute (vezi mai sus);

Xabs.VNaoH = 0,01; Xabs N NaOH = 0,0001


determinarea incertitudinii relative:

XrelativVNaOH =
Xrelativ N NaOH
Xrelativ max =

0,01 = 0,0008733; 11,45 0,0001 = = 0,0009066; 0,1103


0,01 = 0,001. 10
2X : 10

Cea mai mare incertitudine relativ:

calculul intervalului 2 X 20,001 = 0,002 = 1/500

Xrelativ TCH 3COOH = 0,00001 0,00758 = 1 758


(se ncadreaz n domeniul calculat); rezultatul nal:

1/5001/5000 determinarea incertitudinii relative a rezultatului (titrului soluiei):

TCH 3COOH = 0,00758 g ml .

5.2.6. Redactarea i tehnoredactarea Lucrarea de laborator se niseaz cu prezentarea unui referat. n referat se indic titlul lucrrii, principiul lucrrii, se indic materialul de cercetare, se d lista de reactivi i utilaj, utilizate la ndeplinirea experimentului; se prezint condiiile de executare a lucrrii conform
67

variantei propuse; se descriu rezultatele de cercetare i de prelucrare statistic a datelor experimentale. Referatul se nalizeaz cu concluzii. Referatul trebuie corect redactat, deci se cere a formulat n scris, n mod metodic i ordonat, rezultatul procesului de gndire i tehnoredactat, adic pregtirea tehnic a manuscrisului pentru a editat. Pentru aceasta, este necesar de a utiliza corect regulile morfologice ale limbii romne i unele reguli de tehnoredactare. Ne vom referi doar la unele din ele: - scrierea cuvintelor mprumutate din alte limbi se face ca n limba din care provin: kilometru din francez kilometre; wolfram din german wolfram; nylon din francez nylon; protein din francez proteine; - la scrierea acestor cuvinte se recomand ca atunci cnd cuvntul va aprea prima dat n lucrare transliterarea s e susinut, ntre paranteze, de transcriere, deci aa cum se rostete: Lehninger (Leninger); Khne (Chiune); Fischer (Fier); Eijkman (Eicman). - liniua (cratima) se pune i n locul apostrofului; - linia de dialog se pune la nceputul convorbirii personajelor n dialoguri; - virgula se pune dup intonaie, ritmul vorbirii i nuanele de gndire i de sens, ns nu se pune dup substantivele i verbele urmate de conjuncia c. Majuscula (litera mare) se utilizeaz la scrierea numelor proprii, mitologice i religioase, primele litere din formulele de politee. - Abrevierile (prescurtrile) se utilizeaz ct mai rar posibil. Dup ecare liter a abrevierilor se pune punct: C.E. = Comisia de enzime, iar n abrevierile provenite din alte limbi, n care punctele nu se utilizeaz, nu le vom folosi nici noi: EC = Enzyme Commission. - titlurile, tabelele, gracele nu se admite de a le trece de pe o pagin pe alta. Se pot trece tabelele voluminoase numerotnd rubricile sub denumirea lor, iar pe paginile urmtoare de prezentat numai numeraia rubricilor. Foarte comod este de a efectua redactarea computerizat.
68

6. METODE GRAVIMETRICE DE ANALIZ


6.1. Determinarea gravimetric a apei n materiale vegetale Apa este componentul cel mai abundent n organismele vii. Ea este o substan puternic reactiv, cu proprieti speciale. Organismele vii i-au dezvoltat mijloace de exploatare a proprietilor neobinuite ale apei. Apa i produii si de ionizare ionii de hidroniu (H3O+) i hidroxil (OH) sunt determinani importani ai structurii caracteristice i ai proprietilor biologice ale proteinelor i acizilor nucleici, precum i ale membranelor biologice, ribozomilor, mitocondriilor i ale multor ali componeni celulari. Apa permite stabilirea legturilor dintre organism i mediu. Viaa nu este posibil fr prezena apei. La plante coninutul de ap variaz cu specia, starea ziologic, vrsta, regiunea geograc, cu intensitatea metabolic. Determinarea coninutului de ap permite de a aprecia calitatea recoltei, de a compara diferite soiuri, inuena condiiilor de cultivare, de pstrare, a tehnologiilor de prelucrare etc. De obicei, toate rezultatele analizelor biochimice se recalculeaz la materia absolut uscat. n organismele vegetale apa este rspndit att extracelular, ct i intracelular. Apa din compartimentul extracelular cuprinde apa de circulaie intravascular (vase lemnoase), din lichidul interstiial, care spal toate celulele, i apa lacunar. n compartimentul intracelular, apa se gsete sub trei forme: apa care se gsete n constituia compuilor organici (ap legat puternic), apa care asigur starea coloidal a materiei vii protoplasmatice (apa legat slab, sau apa absorbit) i ap liber. Apa liber i pstreaz proprietile obinuite (nghea la 0C), pe cnd apa legat are proprieti diferite, ea nu nghea nici la -60C. Determinarea apei libere din diferite esuturi i organe se efectueaz prin nclzirea acestora la 105C, temperatur la care apa liber ce mbib esutul se evapor, fr ca materia organic s se altereze. Prin aceast metod se pierd unele substane volatile.
69

Metod de determinare a apei libere n materiale vegetale. 510 g (eroarea admisibil - 0,1 g) de produs vegetal, mrunit pn la dimensiunile de 10 mm, se pun n boxa n prealabil uscat i cntrit. Boxa cu masa dat (mpreun cu capacul scos) se las n dulapul pentru uscare, nclzit pn la 100-105C. Temperatura din dulap va scdea. Timpul n care produsul vegetal trebuie s se usuce se calculeaz de la momentul cnd temperatura n dulap va atinge iari 100-105C. Prima cntrire a prilor aeriene (orile, frunzele) se efectueaz dup 2 ore; pentru rdcini, rizomi, scoar, fructe, semine peste 3 ore. Produsul vegetal se usuc pn la masa constant. Masa constant se socoate din momentul cnd diferena dintre dou cntriri dup 30 min. de uscare i 30 min. de rcire n exsicator nu va depi 0,01 g. Cantitatea procentual a umiditii n produsul vegetal X se calculeaz dup formula
X= (m - m1 ) 100 , m

7. METODE VOLUMETRICE DE ANALIZ


7.1. Principii generale ale analizei volumetrice n principiu, analiza volumetric se bazeaz pe msurarea exact a volumului unei soluii de reactiv de concentraie cunoscut, care reacioneaz cantitativ cu substana determinat cantitativ (dozat). Determinrile volumetrice se bazeaz pe diverse reacii chimice cantitative, de exemplu: neutralizarea, oxidoreducerea, formarea de precipitate, formarea de substane complexe etc. Denumirea volumetrie i are explicaia n faptul c prin aceast metod de analiz cantitativ se msoar volume de soluie; metoda volumetric se mai numete i metod titrimetric, deoarece operaia principal folosit n volumetrie este titrarea. Reacia decurge dup urmtoarea schem: xA + yB = zC + qD, n care: A reprezint componentul a crui concentraie urmeaz a determinat dintr-un anumit volum de soluie; B soluia de reactiv de concentraie cunoscut (soluia titrant) cu care reacioneaz componentul A; C i D produii de reacie; x, y, z, q coecieni stoechiometrici ai reaciei. Conform reaciei menionate, cantitatea de substan A se poate determina prin adugarea treptat a unor volume mici (pictur cu pictur) din soluia B de concentraie cunoscut, pn n momentul n care ntreaga cantitate de substan A a reacionat complet (cantitativ) cu substana B. Sfritul reaciei, respectiv stadiul titrrii n care toat cantitatea din componentul de dozat (A) a reacionat cu soluia de concentraie cunoscut (B) adugat, se numete punct de echivalen i reprezint momentul n care substanele A i B au reacionat total n cantiti echivalente.
71

unde: m este masa produsului vegetal pn la uscare, g; m1 masa produsului vegetal dup uscare, g. n cazul cnd produsul vegetal conine substane volatile (uleiuri eterice) umiditatea se calculeaz dup formula:
X =

(m - m1 )100
m

- A,

unde A coninutul de ulei volatil n produsul vegetal exprimat n %, care, la rndul su, se calculeaz dup formula:
A= a 0,9 100 , m

unde a volumul de ulei obinut (ml); 0,9 greutatea specic a uleiului volatil; m masa produsului vegetal din care s-a obinut uleiul; 100 recalculare la 100 g de produs vegetal. Drept rezultat denitiv se ia media aritmetic a dou determinri paralele, calculate pn la zecimi de procent. Diferena admisibil dintre rezultatele celor dou determinri paralele nu trebuie s depeasc 0,5%.
70

n analiza volumetric este necesar s se cunoasc exact concentraia i s se msoare precis volumul soluiei de reactiv utilizat la titrare, precum i volumul soluiei n care se dozeaz componentul. Pentru stabilirea punctului de echivalen se utilizeaz una din proprietile soluiei care, la punctul de echivalen sau foarte aproape de acesta, sufer o schimbare brusc ce poate sesizat prin: - metode vizuale, care utilizeaz diferite substane chimice numite indicatori chimici; punctul nal este indicat prin schimbarea unei proprieti a indicatorului, uor de observat (culoare, uoriscen, turbiditate etc.); - metode instrumentale, care msoar cu ajutorul unui instrument adecvat o anumit mrime zic ce variaz n timpul titrrii (titrare conductometric, poteniometric, spectrofotometric, uorimetric, radiometric). 7.1.1. Condiiile reaciilor volumetrice. Clasicarea metodelor de analiz volumetric Condiiile pe care trebuie s le ndeplineasc o reacie chimic utilizat n analiza volumetric sunt urmtoarele: - s e stoechiometric, adic s e exprimat printr-o ecuaie chimic exact, reactanii i produii de reacie ind n raporturi cantitative bine denite; - s e practic total, adic s aib loc o transformare cantitativ a reactanilor; - s e rapid, adic s se desfoare ntr-un timp ct mai scurt, practic spontan; - sfritul reaciei s e indicat printr-o schimbare brusc a uneia dintre proprietile zice sau chimice ale sistemului de reacie, care s e uor sesizabil; - reactivul volumetric i produii de reacie nu trebuie s reacioneze cu alte substane eventual prezente n soluia de analizat.
72

Tipurile generale de reacii care ndeplinesc aceste condiii sunt urmtoarele: - reacii ionice de dublu schimb, care pot : reacii de neutralizare i reacii de precipitare; - reacii de oxidoreducere (redox); - reacii de complexare. Metode. n funcie de tipul de reacie folosit, metodele de analiz volumetric se clasic astfel: - metode de neutralizare, bazate pe reacii de neutralizare care includ: acidimetria, care folosete o soluie de acid tare de concentraie exact cunoscut pentru dozarea bazelor tari, bazelor slabe i a srurilor cu hidroliz alcalin, i alcalimetria, care folosete o soluie de hidroxid tare de concentraie exact cunoscut pentru dozarea acizilor tari, acizilor slabi i a srurilor cu hidroliz acid; - metode de precipitare, care se bazeaz pe reacii de precipitare; - metode de oxidoreducere, care se bazeaz pe reacii de oxidoreducere, i anume: permanganatometria, care folosete o soluie de permanganat de potasiu de concentraie exact cunoscut pentru dozarea substanelor reductoare, iodometria, care folosete ca oxidant o soluie de iod de concentraie exact cunoscut, i complexometria, care se bazeaz pe reacii ce decurg cu formare de combinaii chimice complexe. 7.1.2. Soluii Uniti i subuniti de mas i volum. Biochimia analitic cantitativ opereaz cu anumite uniti, respectiv subuniti, prin care se exprim masa substanelor sau volumul reactivilor la care se raporteaz o anumit analiz. Conform Sistemului Internaional de Uniti (S.I.U.), ca unitate de mas se consider kilogramul (kg), iar ca unitate de volum metrul cub (m3). Unitile i subunitile de mas i volum, utilizate
73

n titrimetrie, sunt prezentate n Tabelul 7.1. Not: n biochimia analitic, n calitate de volum actualmente se utilizeaz att metrul cub (m3), ct i litrul (L), precum i subunitile respective. Tabelul 7.1. Uniti i subuniti de mas i de volum
Denumire Simbol Exprimare

Gram Miligram Microgram Nanogram Picogram Litru Mililitru Microlitru Nanolitru Picolitru

g mg g ng pg L (dm3) ml (cm3) L nL pL

110-3 kg 110-3 g 110-6 g =110-3 mg 110-6 mg =110-3 g 110-12 mg =110-6 g =110-3 ng 110-3 m3 110-3 L 110-6 L = 110-3 cm3 110-9 L = 110-6 cm3 110-12 L = 110-6 cm3 =110-6 L = 110-3 nL

Masa atomic este un numr care indic de cte ori atomul unui element chimic este mai greu dect unitatea de mas atomic (UMA). Unitatea de mas atomic reprezint 1/12 din masa atomului ). de carbon ( 12 6C Cantitatea dintr-un element chimic exprimat n grame, egal numeric cu masa sa atomic, se numete atom-gram. Exemplu:
Atomul Masa atomic Atom-gram

Na Ca Cl

22,9898 40,08 35,453

22,9898 g 40,08 g 35,453 g

Denirea unor mrimi utilizate pentru prepararea soluiilor n volumetrie. Volumetria, respectiv metodele volumetrice de analiz, se bazeaz pe msurarea exact a volumului soluiei de reactiv de concentraie cunoscut, care a reacionat cantitativ cu componentul de analizat. Deoarece pe baza volumului de reactiv utilizat n analiza volumetric se stabilete, prin calcul, cantitatea componentului de dozat, rezult c n analiza volumetric trebuie cunoscut cu exactitate concentraia reactivilor folosii. Astfel, volumetria utilizeaz soluii de reactivi de concentraie precis determinat, denumite soluii titrate. Prepararea soluiilor titrate implic cunoaterea semnicaiei analitice i operaionale a unor noiuni ca: mas atomic, atomgram, mas molecular, molecul-gram, echivalent chimic, echivalent-gram.
74

Masa molecular (Mr) este un numr care indic de cte ori molecula unei substane este mai grea dect o unitate de mas atomic. Masele moleculare ale diferitelor substane pot obinute prin simpla nsumare a maselor atomice ale atomilor ce alctuiesc moleculele respective. Cantitatea dintr-un compus chimic exprimat n grame i care este egal numeric cu masa sa molecular se numete moleculgram (mol-gram sau mol). Exemplu:
Molecula Masa molecular Molecul-gram

H2 H2O H2SO4

2,016 18,016 98,075

2,016 g 18,016 g 98,075 g

Echivalent chimic (E) reprezint un numr care arat cte pri n greutate dintr-un element sau compus chimic se combin, substituie sau pune n libertate 1,008 pri de hidrogen.
75

Echivalentul chimic al unui element chimic sau compus se calculeaz n funcie de natura reaciei chimice la care particip elementul sau compusul respectiv. A. Calcularea echivalentului chimic (E) n reaciile ionice: Echivalentul chimic al elementelor se calculeaz mprind masa atomic a elementului (A) la valena sa (V):
E= A . V

E Na

Exemple : 22,9898 27 40,08 = = 22,9898; E Ca = = 9. = 20,04; E Al = 1 3 2

Echivalentul chimic al acizilor se calculeaz mprind masa molecular (Mr) a acidului la numrul de atomi de hidrogen din molecul care pot disocia i care particip la reacia respectiv (atomi de hidrogen activi). Exemple:
E HCl = 36,465 = 36,465; 1 E CH 3COOH = 60 = 60. 1

Echivalentul chimic al bazelor se calculeaz mprind masa molecular (Mr) a bazei la numrul de grupri hidroxil (-OH) din molecul care iau parte la reacia respectiv (grupri hidroxil active). Exemple: 74 78 40,005 = 37; E Al(OH )3 = E NaOH = = 40,005; E Ca (OH ) = = 26. 2 1 3 Echivalentul chimic al srurilor se calculeaz mprind masa molecular (Mr) a srii la numrul atomilor de hidrogen nlocuii de metal n molecula acidului corespunztor sau se mparte masa molecular la produsul obinut prin nmulirea valenei cationului cu numrul acestor cationi. Exemple : 84,3 74,55 E MgCO = = 42,15; E KCl = = 74,55; 2 1 273,01 399,9 E FeSO 7 H O = = 136,505; E Fe (SO ) = = 66,66. 2 6 Echivalentul chimic al oxizilor se calculeaz mprind masa molecular la produsul dintre numrul atomilor de metal i valena metalului. Exemple :
2 3 4 2 2 4 3

n reacia: H3PO4 + NaOH NaH2PO4 + H2O,


E H 3 PO 4 97,998 = = 97,998; 1 E CaO =

56 = 28,00 2

E Al2O3 =

102 = 17,00 6

deoarece numai unul din ionii de hidrogen ai moleculei de acid fosforic particip la reacie. n cazul reaciei: H3PO4 + 2NaOH Na2HP04 + 2H2O, 97,998 E H PO = = 48,999, 2 deoarece n aceast reacie particip doi ioni de hidrogen ai moleculei de acid fosforic.
3 4

B. Calcularea echivalentului chimic (E) n reacii de oxidoreducere. n reaciile de oxidoreducere care decurg cu schimb de electroni, echivalentul chimic se calculeaz mprind masa atomic (A) sau masa molecular (Mr) la numrul de electroni cedai sau primii de componentul respectiv n reacia de redox. Exemple: - n mediul acid, permanganatul de potasiu se comport
77

76

conform urmtoarei reacii de oxidoreducere: 2KMnO4 + 3H2SO4 2MnSO4 + K2SO4 + 3H2O + 5O. n care manganul heptavalent din KMnO4 se transform n mangan bivalent. n aceast reacie de oxidoreducere, schimbul de electroni este urmtorul: 4 Mn7+ + 5e- Mn2+ (reducere) 5 2O2- - 4e- (oxidare) Rezult c echivalentul KMnO4 este egal cu masa molecular mprit la 5 (numrul de electroni transferai n reacie):

Echivalentul-gram (Eg) reprezint cantitatea exprimat n grame dintr-un element sau dintr-o combinaie, care se combin sau nlocuiete un atom-gram de hidrogen (1,008 g H2 ) sau un atomgram de oxigen (8g O2). Rezult, astfel, c echivalentul/gram este echivalentul chimic exprimat n grame. Exemplu:

EgKOH = 56 g. Miliechivalentul-gram (mEg) reprezint miliechivalentul chimic, exprimat n grame. Exemplu :


mE g KOH = 56 10 -3 = 0,056 g.

- n mediul alcalin se efectueaz reacia: 2KMn04 + 2KOH 2K2MnO4 + H2O + O, cu urmtorul schimb de electroni: 2 Mn7+ + 1e- Mn6+ 1 O2- - 2e- n acest caz,

- n mediu neutru, E KMnO 4 se calculeaz conform reaciei: 2KMnO4 + 2H2O 2MnO2 + 2KOH + 3O 2 3 Mn7+ + 3e- Mn4+ O2- - 2e-

Miliechivalentul (mE) - reprezint a mia parte (1/1000) din echivalentul chimic: mE = E 10-3.
78

Exprimarea concentraiei soluiilor. Soluia poate denit ca un sistem format dintr-o singur faz, compus din dou sau din mai multe specii de molecule care nu interacioneaz chimic. Soluiile pot de trei tipuri: gazoase, lichide i solide. n biochimia analitic astzi se folosesc soluiile lichide (apoase, parial apoase sau neapoase). O soluie lichid este format din dou componente, i anume: dizolvantul (solventul) i una sau mai multe substane dizolvate (solvani). Concentraia unei soluii reprezint cantitatea de substan dizolvat ntr-un anumit volum sau mas de soluie. Concentraia soluiilor se poate exprima n mai multe moduri, i anume: concentraie procentual; concentraie molar sau molaritate; concentraie molal sau molalitate; concentraie normal sau normalitate.
79

Concentraia procentual (C%). Soluiile care au concentraia exprimat procentual se numesc soluii procentuale. Concentraia procentual de mas la volum (c% G/V) reprezint cantitatea de substan exprimat n grame dizolvat n 100 cm3 soluie. Exemplu: o soluie de NaOH 7% (G/V) conine 7 g NaOH dizolvate n 100 cm3 de soluie. Concentraia procentual de volum (c% V/V). Acest mod de exprimare a concentraiei se folosete frecvent n cazul dizolvrii substanelor chimice lichide sau gazoase i reprezint numrul de centimetri cubi de substan dizolvat n 100 cm3 soluie. Exemplu: o soluie de aldehid formic 2% (V/V) conine 2 3 cm aldehid formic dizolvat n 100 cm3 de soluie. Concentraia procentual de mas (c% G/G) reprezint cantitatea de substan exprimat n grame dizolvat n 100 g soluie. Exemplu: o soluie apoas de glucoz 1% (G/G) se obine prin dizolvarea a l g glucoz n 99 g ap, adic 100 g soluie conine l g glucoz. Concentraia molar sau molaritatea. Aceast concentraie reprezint numrul de moli-gram de substan dizolvat ntr-un litru (1000 cm3) de soluie. Soluiile a cror concentraie se exprim prin molaritate se numesc soluii molare i se noteaz cu simbolul M care nsoete cifra ce indic concentraia respectiv. Molaritatea unei soluii reprezint raportul dintre masa de substan (G) exprimat n grame coninut ntr-un litru (L) de soluie i masa molecular (Mr) a substanelor dizolvate:
M = G mol L-1 . Mr

adic 98,08 g H2SO4 la litrul de soluie, deoarece masa molecular a H2SO4 = 98,08. - O soluie de H2SO4 0,1 M conine 0,1 moli de H2SO4, adic 9,808 g H2SO4 la litru de soluie. - O soluie de acid oxalic 0,1 M conine 0,1 moli de H2C2O4 la litru. Acidul oxalic cristalizeaz cu dou molecule de ap (H2C2O4 2H2O), masa sa molecular este 126,068 g; deci, un litru de soluie 0,1 M conine 12,6068 g H2C2O4 2H2O. - O soluie de clorur de sodiu 2 M conine 2 moli de NaCl, adic 117,0 g NaCl la un litru de soluie. Molaritatea unei soluii care conine 0,4 g NaOH la un litru de soluie se calculeaz astfel: 0,4 -1 M = L = 10 - 2 mol gram L-1 . 40 Molaritatea unei soluii care conine 0,4 g NaOH n 100 cm3 de soluie rezult din raportul:
M = 0,4 10 -1 L = 10 -1 mol gram L-1 . 40

Soluiile molare pot molare (l M), bimolare (2 M), multiplu molare sau decimolare (0,l M = 110-1 M), centimolare (0,01 M = 110-2 M). Exemple: - O soluie de acid sulfuric 1 M conine un mol de acid sulfuric,
80

Concentraia formular sau formularitatea. Molul presupune c se lucreaz cu molecule, n realitate ns n unele cazuri se lucreaz cu ioni. De exemplu, clorura de sodiu, att n stare solid, ct i n soluie, exist n stare de ioni (Na+ i Cl-). Din aceast cauz este mai corect ca masa de 58,44 s e numit mas formular i nu mas molar. Formularitatea se noteaz prin F. Fracii molare. Concentraia unei soluii exprimat n fracii molare reprezint raportul dintre numrul de moli ai unui component i numrul total de moli din soluie.
Ni = ni

ni
i =1

i=n

81

Suma fraciilor molare ale tuturor componenilor este 1. Concentraia normal sau normalitatea.Aceast concentraie reprezint numrul de echivalent-gram de substan dizolvat ntr-un litru (1000 cm3) de soluie. Soluiile a cror concentraie se exprim prin normalitate se numesc soluii normale i se noteaz cu simbolul N, care nsoete cifra ce indic concentraia respectiv. Cunoscnd cantitatea n grame dintr-o substan (G) dizolvat ntr-un litru de soluie, se poate calcula normalitatea soluiei respective din relaia:
G echivalent i L-1 , E n care: E - reprezint echivalentul-gram al substanei dizolvate. Exemple : - Pentru a prepara o soluie de NaOH l N se calculeaz, n primul rnd, echivalentul-gram al NaOH: N= 40 = 40,0 g . 1 Astfel, 1000 cm3 soluie de NaOH l N conine 40,0 g NaOH. Regula general. Cantitatea de substan (G) exprimat n grame, care trebuie dizolvat ntr-un litru (1000 cm3) de soluie pentru a obine o anumit normalitate, se calculeaz nmulind echivalentul-gram (E) cu normalitatea (N): G = E N. Adeseori nu este necesar s se prepare un litru de soluie de o anumit normalitate, ci un volum (V) mai mic sau mai mare de un litru. n acest caz, cantitatea de substan (G) care trebuie dizolvat ntr-un anumit volum de soluie (V) cu normalitate (N) se calculeaz nmulind echivalentul-gram (E) cu normalitatea (N) i volumul (V) exprimat n litri: G = E N V. Exemplu: pentru a prepara 250 cm3 soluie de NaCl 0,3 N, se E NaOH =
82

calculeaz cantitatea de clorur de sodiu exprimat n grame (GNaCl), dup relaia: GNaCl = E N V, n care: E NaCl =
58,5 = 58,5 g ; N = 0,3; V = 0,250 L. 1

Astfel, GNaCl = 58,5 0,3 0,250 = 4,387 g. Deci, n 250 cm3 de soluie se vor dizolva 4,387 g NaCl. Utilizarea soluiilor normale n volumetrie se bazeaz pe faptul c soluiile de aceeai normalitate reacioneaz n volume egale, deoarece conin substane dizolvate n cantiti echivalente. 7.1.3. Soluii titrate. Analiza volumetric opereaz cu soluii titrate, respectiv cu soluii de concentraie riguros determinat. Calcularea titrului unei soluii. Titrul unei soluii reprezint cantitatea de substan exprimat n grame, care se gsete dizolvat ntr-un centimetru cub (cm3) de soluie. Titrul unei soluii se noteaz cu simbolul T i se calculeaz dup formula: G M M N E T= = = g, 1000 1000 1000 n care: G este cantitatea de substan exprimat n grame dizolvat n 1000 cm3 de soluie; M molaritatea soluiei; Mr masa molecular a substanei exprimat n grame; N normalitatea soluiei; E echivalentul-gram al substanei dizolvate. Titrul calculat conform relaiei menionate se numete titru teoretic (Tt) sau titru exact. Exemple: - Titrul teoretic al soluiei care conine 5,6 g KOH la 1000 ml este: 5,6 Tt = = 0,0056 g cm 3 . 1000
83

- Titrul teoretic al unei soluiei de KOH 2 M este:


2 56 = 0,112 g cm 3 1000 - Titrul teoretic al soluiei care conine 71g Na2SO4 este: Tt = 71 0,5 142 1 71 = = = 0,071 g cm 3 . 1000 1000 1000 - Titrul teoretic al unei soluii de NaOH 2 N este egal cu 0,08g NaOH, deoarece: 1000 cm3 soluie NaOH 2 N conine dizolvate 2 40 = 80g NaOH. l cm3 soluie NaOH 2 N conine dizolvate Tt g NaOH. Deci: Tt =
Tt = 2E 2 40 = = 0,08 g cm 3 1000 1000

Deoarece G reprezint cantitatea de substan exprimat n grame dizolvat n 1000 cm3 de soluie cu densitatea , concentraia procentual se calculeaz astfel:
C %(G V ) = G M Mr N E = = = 100 T 10 10 10

C %(G G ) =

G M Mr N E 100 T r = = = . 10 10 r 10 r r

Exemplu: Pentru H2SO4 0,1 N ( MrH 2 SO4 = 98), se pot calcula: Titrul: T = N mE = 0,1 0,049 = 0,0049 g H2SO4 / cm3 soluie. Cantitatea de substan: G = 1000 T = 4,9 g H2SO4 /1000 cm3. Concentraia molar:
M = G 4,9 = = 0,05moli H2SO4 / 1000 cm3 soluie. Mr 98

Din raportul

E = mE (miliechivalent-gram), rezult c: 1000 T = N mE.


t

Regula general. Titrul unei soluii de normalitate exact se calculeaz nmulind miliechtvalentul substanei dizolvate (mE) cu normalitatea (N). Transformarea reciproc a modurilor de exprimare a concentraiilor. Transformarea unui mod de exprimare n altul se poate face folosind relaia care exprim titrul, relaie din care rezult: G = Mr M = N E = 1000T, de unde: G 1000 T = , molaritatea = M = Mr Mr normalitatea = N =
84

Concentraia procentual:
C %(G V ) = G 4,9 = = 0,49 g H2SO4 / 100 cm3 soluie; 10 10

c%(G/G) = C %(G G ) =

G 4,9 = = 0,49 g H2SO4 /100 g soluie, 10 r 10 r unde = g/cm3 (conform tabelelor).

G 1000 T = . E E

Substane etalon. Soluii etalon. Substane etalon sau standard se numesc acele substane din care se pot obine soluii cu titru exact.
85

O substan etalon trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii: - s e sucient de pur, astfel nct gradul ei de impuricare s nu afecteze precizia determinrilor ce se efectueaz; - s aib formula bine denit, compoziia s e unitar i stabil n condiiile de lucru (substana s nu se carbonizeze, s nu se oxideze, s nu absoarb apa, s nu piard apa de cristalizare); - s e sucient de stabil n solventul care se utilizeaz (de regul, n ap); - s aib masa molecular, respectiv echivalentul-gram, relativ mare, astfel nct eroarea de cntrire s e ct mai mic. Ca exemple de substane etalon care ndeplinesc condiiile menionate se pot cita: dicromatul de potasiu (K2Cr2O7), acidul oxalic (H2C2O4 ), carbonatul de sodiu (Na2CO3), bromatul de potasiu (KBrO3), iodatul de potasiu (KIO3), clorura de potasiu (KC1), acidul benzenic (C6H5COOH) etc. Substanele etalon se utilizeaz n urmtoarele scopuri: a) pentru obinerea direct, prin simpl cntrire i dizolvare, a soluiilor care se folosesc n efectuarea diferitelor analize prin titrare. Aceste soluii se numesc soluii etalon sau standard primare; b) pentru determinarea exact a concentraiei unor soluii ce urmeaz a folosite n diferite determinri volumetrice. Aceast operaie se numete standardizare. Soluiile a cror concentraie se determin prin standardizare se numesc soluii etalon sau standard secundare. De exemplu, o soluie de hidroxid de potasiu este o soluie etalon (standard) secundar, deoarece concentraia sa exact se stabilete cu ajutorul unei soluii etalon primar de acid oxalic sau acid benzenic. Soluia de acid clorhidric reprezint, de asemenea, un etalon (standard) secundar, concentraia sa exact stabilindu-se cu ajutorul unei soluii etalon primar de carbonat de sodiu. Soluii etalon sau soluii exacte reprezint acele soluii al cror titru real (Tr) este egal cu titrul exact sau titrul teoretic rezultat din calcul (Tr = Tt = N mE).
86

Soluii aproximative sau reale. Substanele care ndeplinesc condiiile de substane etalon primar sunt relativ puine. Majoritatea substanelor nendeplinind aceste condiii sunt folosite pentru prepararea unor soluii care au o concentraie aproximativ. Aceste soluii se numesc soluii aproximative sau reale. Cantitatea n grame de substan dizolvat n l cm3 de soluie aproximativ poart denumirea de titru real (Tr), care este diferit, dar apropiat valoric de titrul teoretic (Tt). Soluiile aproximative sau reale pot utilizate n analiza volumetric la fel ca i soluiile etalon primare, cu condiia de a standardizate n prealabil. Prin standardizare se stabilete concentraia exact a acestor soluii. Aceast condiie se realizeaz prin determinarea pe cale experimental, i anume prin titrare, a factorului de corecie. Factor de corecie. Pentru ca o soluie aproximativ s poat folosit n analiza volumetric, este necesar s se determine factorul de corecie (F), care reprezint raportul dintre titrul real i titrul teoretic al unei soluii: T F= r . Tt n cazul soluiilor etalon care au titrul real egal cu titrul teoretic, factorul de corecie are valoarea 1,0000. Factorul de corecie al unei soluii aproximative se determin experimental prin titrarea ei cu soluie etalon de o concentraie exact. Exemplu: Pentru soluia aproximativ de NaOH 0,1 N se determin titrul real prin titrarea ei cu soluie etalon de H2SO4 0,1 N. Presupunem c la neutralizarea a 5 ml (V1) NaOH 0,1N (N1) s-au folosit 4,85 ml (V2) H2SO4 0,1N (N2). Folosind legea echivalenilor chimici (N1V1 = N2V2) determinm normalitatea real a soluiei de
87

NaOH:

N1 =

N 2V2 0,1 4,85 = = 0,097echivalenti L-1 V1 5,0

Fiind cunoscute normalitatea i miliechivalentul bazei date putem determina titrul real dup formula: Tr = mE N = 0,040 0,097 = 0,0039 g/cm3. Deci, F =

Tr 0,0039 = = 0,9750. Tt 0,0040

Cu ajutorul factorului de corecie se pot obine: - transformarea unui volum de soluie aproximativ (Vr) ntr-un volum de soluie exact (Ve), utiliznd relaia: Ve = F Vr. - calcularea titrului real (Tr) sau a concentraiei reale a unei soluii aproximative pe baza relaiei: Tr = F Tt. Prin aplicarea legii echivalenilor chimici la cazul a dou soluii, o soluie etalon i o soluie real, de aceeai concentraie, rezult egalitatea: Vr F = Ve Fe. Din aceast relaie reiese c n cazul n care Ve = Vr, factorul de corecie este egal cu unu, fapt ce denot c titrul real este egal cu titrul teoretic; n acest caz, soluiile respective reacioneaz n volume egale, ambele ind deci exacte. Dac factorul soluiilor etalon (Fe) are valoarea 1,0000, rezult c: V Fe = e . Vr Deci, n mod practic, factorul de corecie se calculeaz din raportul volumelor exact msurate a dou soluii, una etalon (Ve) i una aproximativ (Vr), care au aceeai normalitate.
88

Factorul de corecie este un numr care poate egal, mai mic sau mai mare n raport cu cifra unu i se calculeaz cu patru zecimale. Pentru dozrile volumetrice cu soluii aproximative, este indicat ca factorul de corecie s aib valori cuprinse ntre 0,9000 i l,100; - dac F>1,0000, soluia aproximativ este mai concentrat dect soluia exact (etalon). n acest caz, titrul real al soluiei aproximative este mai mare dect titrul teoretic; - dac F<1,0000, soluia aproximativ este mai diluat dect soluia exact i titrul su real este mai mic dect titrul teoretic. Regula amestecurilor. Un procedeu simplu pentru prepararea soluiilor de anumite concentraii este regula amestecurilor (sau regula dreptunghiului). Aceast regul se aplic n cazul amestecrii a dou sau a mai multor soluii de concentraii diferite ale aceleiai substane, concentraia soluiei nale rezultat ind diferit de cea a ecreia din soluiile iniiale. Regula amestecurilor poate enunat astfel: cantitile de soluii care se amestec sunt invers proporionale cu valorile absolute ale diferenelor dintre concentraiile lor i concentraia soluiei nale obinut dup amestecare. Pentru a prepara din dou soluii A i respectiv B, de concentraii diferite a i b, o soluie C de concentraie c se amestec din soluiile A i B cantitile gA i gB exprimate n grame (n cazul soluiilor procentuale) sau n litri (n cazul soluiilor molare sau normale). Pentru acest caz, pot scrise egalitile: a gA + b gB = c(gA + gB), gA (a - c) = gB (c - b), de unde se obine expresia matematic a regulii amestecurilor:

gA c - b = . gB a -c
89

n mod practic, expresia de mai sus se rezolv folosind regula dreptunghiului. Se construiete un dreptunghi trasndu-se cele dou diagonale. n colurile din stnga se trec numerele ce reprezint concentraiile soluiilor iniiale (a i b), astfel nct concentraia mai mare s e trecut n colul de sus. La intersecia celor dou diagonale, se trece concentraia care trebuie obinut, n colurile din dreapta se trec cantitile (sau volumele) de soluii ce se amestec gA i gB, care se obin scznd numrul cel mai mic din cel mai mare, de-a lungul diagonalelor dreptunghiului (Fig. 7.1. a).
a c b c-b n care: a-c gA=c-b gB=a-c

Spre exemplu, dac se aplic regula amestecurilor n cazul dilurii cu ap a HNO3 ( = 1,52) care (conform tabelelor) are concentraia 99,67%, pentru a obine HNO3 ( = 1,40) care (conform tabelelor) are concentraia 65,30% rezult c este necesar s se amestece 65,30 g HNO3 ( = 1,52) cu 34,37 g ap pentru a obine HNO3 (p = 1,40) de concentraie 65,3%. 7.2. Metode volumetrice bazate pe reacii de neutralizare Metodele volumetrice de analiz care reprezint reacii cu transfer de protoni se aplic pentru determinarea cantitativ a acizilor, utiliznd ca reactiv de titrare o baz (alcalimetria) sau pentru determinarea cantitativ a bazelor, folosind ca reactiv de titrare un acid (acidimetria). O reacie cu transfer de protoni este reacia de neutralizare dintre un acid i o baz: ( H+ + A- ) + ( B+ + OH- ) ( B++ A- ) + H2O Acid Baz Sare n alcalimetrie se utilizeaz ca reactiv de dozare o soluie de baz cu titru stabilit, iar n acidimetrie o soluie cu titru stabilit de acid. Determinarea punctului de echivalen n metodele volumetrice bazate pe reacii de neutralizare se poate face pe cale chimic, utiliznd indicatori de pH. 7.2.1. Alcalimetria Alcalimetria reprezint metoda de analiz volumetric prin care se dozeaz acizi tari, acizi slabi i sruri cu hidroliza acid prin neutralizare cu un volum determinat (msurat) dintr-o soluie de baz (NaOH sau KOH), de o concentraie cunoscut.
91

a
20 - 5 = 15 99,67

30 20 5

65,3-0=65,30 65,30

30 - 20 = 10

99,67-65,3=34,37

Fig. 7.1. Regula dreptunghiului Exemple: - Pentru a obine o soluie de NaOH 20% folosind soluii de NaOH 30%, respectiv 5%, se traseaz dreptunghiul (Fig. 7.1.b). Prin urmare, este necesar s se amestece 15 g soluie de NaOH 30% cu 10 g soluie de NaOH 5%, pentru a prepara 25 g soluie 20%. - Dac diluarea unei soluii se face cu ap, n locul concentraiei trecute n colul din stnga jos se trece cifra zero (Fig. 7.1.c).
90

Deci, metodele alcalimetrice de dozare necesit prepararea unor soluii de hidroxizi (NaOH sau KOH) de concentraie cunoscut. Hidroxizii nu ndeplinesc condiiile de substan etalon, soluiile ce se obin ind aproximative. Pentru a putea folosi ns aceste soluii n determinri cantitative, este necesar s li se stabileasc factorul de corecie cu ajutorul unor soluii titrate de acizi. Prepararea unei soluii aproximative de NaOH 0,1 N. Dup cum s-a menionat, hidroxizii nu ndeplinesc condiiile de substane etalon, deoarece absorb dioxidul de carbon din atmosfer i se carbonateaz la suprafa; totodat, sunt substane higroscopice, adic absorb vaporii de ap din atmosfer. Din aceste motive, hidroxizii pot utilizai numai pentru obinerea soluiilor aproximative. n principiu, pentru a prepara un anumit volum (V) de soluie aproximativ de NaOH 0,1 N, se procedeaz astfel: - se calculeaz echivalentul gram al NaOH:
E NaOH = 40 = 40 g 1

hidroxidul de sodiu liber de carbonat se dizolv n 200-300 cm3 de ap distilat; soluia obinut se trece ntr-un balon cotat de 1000 cm3 i se completeaz cu ap liber de CO2 pn la volumul total de un litru, se omogenizeaz i se trece ntr-o sticl de reactivi prevzut cu dop de cauciuc; se stabilete factorul de corecie cu ajutorul unei substane etalon (acid oxalic), soluia de NaOH putnd astfel folosit pentru dozri. Determinarea factorului de corecie al soluiei aproximative de NaOH 0,1 N. Principiul. Determinarea factorului de corecie al soluiei aproximative de NaOH 0,1 N se bazeaz pe reacia de neutralizare dintre hidroxidul de sodiu i acidul oxalic (H2C2O4): (2H+ + C2O42-) + 2(Na+ + HO-) (2Na+ + C2O42-) + 2H2O Un volum exact msurat dintr-o soluie etalon de acid oxalic se neutralizeaz cu un volum de soluie aproximativ de hidroxid de sodiu. Punctul nal al titrrii, respectiv punctul de echivalen, se determin utiliznd ca indicator fenolftaleina care are domeniul de viraj n mediu alcalin (coloraie roz). Tehnica: Prepararea unei soluii etalon de acid oxalic 0,1 N. - Cunoscnd c M H 2C2O4 2 H 2O = 126,067 g , iar
M 126,067 = = 63,0333 g 2 2 se cntrete la balana analitic, ntr-o ol de cntrire, o cantitate de exact 0,6303 g acid oxalic, deoarece: Eg H 2C2O4 2 H 2O =
G H 2C 2O4 2 H 2O = E N V = 63,0333 0,1 0,100 = 0,6333 g

Cantitatea teoretic de NaOH ce trebuie cntrit i dizolvat n volumul V de soluie (exprimat n litri) rezult din relaia: G=ENV Pentru volumul (V) de un litru, cantitatea de NaOH necesar este:
G NaOH = 40 0,1 = 4 g

Tehnica: pentru a obine o soluie de hidroxid de sodiu decarbonat, se cntrete la balana tehnic o cantitate mai mare de hidroxid, i anume, aproximativ 5-6 g; granulele de sodiu se spal repetat de 3-4 ori cu ap distilat art i rcit, pentru a ndeprta stratul de carbonat de la suprafaa lor;
92

- Cristalele de acid oxalic se dizolv n ap distilat i soluia rezultat se trece cantitativ ntr-un balon cotat de 100 cm3.
93

- Se aduce volumul total la 100 cm3 cu ap distilat. - Soluia se omogenizeaz prin agitare. Stabilirea factorului de corecie: ntr-un pahar Erlenmayer se msoar 10 cm3 soluie etalon de acid oxalic 0,1 N (Ve); se nclzete la 60-70C pentru eliminarea dioxidului de carbon; se adaug 2-3 picturi de fenolftalein (soluie alcoolic 0,1%); fenolftaleina n mediu acid este incolor, n mediu bazic este colorat n rou-violet, iar la punctul de echivalen n roz; se umple biureta (cu bil sau cu clem) cu soluia aproximativ de NaOH 0,1 N; se evacueaz aerul din vrful pictor al biuretei i se aduce meniscul inferior al soluiei tangent la o diviziune (de obicei zero) de pe biuret (V1); se titreaz soluia cald de acid oxalic cu soluie de NaOH din biuret pn la apariia culorii roz, factor ce corespunde punctului de echivalen; culoarea persist aproximativ 30 de secunde; dup acest interval de timp, datorit absorbiei dioxidului de carbon din atmosfer, mediul de reacie devine slab acid i coloraia dispare; se citete la biuret diviziunea la care a ajuns volumul de soluie dup efectuarea titrrii (V2); volumul soluiei aproximative de NaOH 0,1 N consumat n reacia de neutralizare (Vr), se calculeaz dup formula: Vr = (V2 V1) cm3 NaOH 0,1 N Pentru o determinare riguroas se efectueaz un numr de cel puin trei titrri.
94

Calculul:

FNaOH =

Ve VC2O4 H 2 10 = = Vr VNaOH (V2 - V1 )

Dac valorile factorilor calculai pe baza celor trei titrri nu difer ntre ele cu mai mult de dou uniti la a patra zecimal, se calculeaz media lor, care reprezint factorul de corecie al soluiei aproximative de NaOH 0,1 N. Determinarea aciditii totale n esuturi vegetale. Aciditatea total a esuturilor vegetale este condiionat de prezena n plante a numeroaselor clase de compui organici unii dintre care fac legtura ntre metabolismul intermediar al diferitelor grupe de substane. Ea constituie o surs de energie i de materii prime pentru plante, animale i om. O parte din ei determin gustul, aroma i mirosul produselor vegetale, n special al fructelor i legumelor. Valoarea aciditii totale poate determinat cu ajutorul alcalimetriei sau poteniometriei. Principiul. Acizii din materialul biologic mrunit se extrage prin nclzirea lui cu ap la 80-90C timp de 30 minute. Acizii extrai se titreaz cu o soluie de baz. De obicei, cantitatea de acizi se recalculeaz n uniti de acid malic, deoarece acesta predomin n mai multe fructe i legume. Tehnica determinrii. Fructele, legumele sau frunzele proaspete se mrunesc prin rztoare, maina de tocat sau n mojar. Materialul se amestec i se iau 10g, se transvazeaz cantitativ ntr-un balon cotat de 100 ml cu gt lung. n balon se adaug 75 ml ap distilat i se menine 30 minute la baia de ap la temperatura 8090C. Apoi balonul se rcete, se aduce la cot cu ap distilat i se ltreaz ntr-un pahar sau balon uscat. Filtratul obinut servete pentru determinarea aciditii totale.
95

25 ml de ltrat, care conine acizi, se transvazeaz ntr-un balon Erlenmayer cu volumul de 50 ml. Apoi se adaug cteva picturi de soluie alcoolic de fenolftalein 1% i se titreaz din microbiuret cu soluie de NaOH 0,1 N pn la apariia culorii roze. n locul fenolftaleinei se poate utiliza ca indicator soluia de timolftalein. n acest caz se titreaz pn la apariia culorii albastre. Determinarea schimbrii culorii la soluiile colorate se face mai uor prin comparare cu aceeai cantitate de indicator aat ntr-un balon similar aranjat alturi. n cazul n care coloraia soluiei este intens i schimbarea culorii la adugarea bazei este greu de observat, la titrare se utilizeaz hrtie de turnesol: pe o bucic de hrtie de turnesol se depune periodic, cte o pictur de soluie titrat din balon i se urmrete schimbarea culorii. Calculul rezultatelor. La calculare trebuie de inut cont de baza alcalin utilizat pentru titrare i de factorul de corecie al titrului acesteia. Calculele se efectueaz dup formula:
X= V F 100 10 , m 25

7.2.2. Acidimetria Acidimetria reprezint metoda de dozare volumetric a bazelor tari, a bazelor slabe i a srurilor cu hidroliz bazic prin neutralizare cu un volum determinat (msurat) din soluia titrat a unui acid. n biochimie aciditatea deseori este folosit pentru determinarea amoniacului provenit din compuii azotai, n special cu scopul dozrii acestor compui, de exemplu prin metoda Kjeldahl. n acidimetrie se utilizeaz n mod curent soluii cu titrul exact ale unor acizi ca: H2C2O4, HCl, H2SO4. Pentru determinarea concentraiei diferitelor baze este necesar s se prepare soluii standard de acizi, respectiv soluii de concentraie cunoscut (exact). Prepararea unei soluii standard de acid oxalic am analizat-o n compartimentul Alcalimetria, prepararea soluiei standard de acid clorhidric i sulfuric este mai comod de fcut din xanale, aa cum este descris n [6]. 7.3. Metode volumetrice bazate pe reacii de oxidoreducere n analiza biochimic se ntlnete un numr foarte mare de reacii cu transfer de electroni, numite i reacii de oxidoreducere (redox), de aceea acestea prezint o importan deosebit. Reaciile se realizeaz printr-un transfer de electroni de la un atom sau ion la altul. Oxidarea este o cedare de electroni, deci o cretere de sarcin pozitiv (sau diminuare de sarcin negativ). Reducerea este o acceptare de electroni, deci o cretere de sarcin negativ (sau diminuare de sarcin pozitiv). Oxidantul produce oxidarea, ind un acceptor de electroni (el se reduce). Oxidani pot unele elemente electronegative (nemetale), ca: 02, Cl2, S etc., sau substane compuse, ca: H2O2, KClO3, KMnO4, K2Cr2O7, H2SO4, HNO3 etc.
97

unde: V cantitatea de NaOH 0,1 N utilizat pentru titrare; F factorul de corecie al titrului bazei; 100 volumul total de extras, ml; 25 volumul de extras luat pentru titrare, ml; m masa materialului cercetat, n grame; 10 transformare n miliechivaleni de acid (1 ml NaOH 0,1 N corespunde la 0,1 miliechivaleni de acid); X cantitatea de acizi n materialul cercetat, miliechivaleni/gram. Deseori, coninutul de acizi nu se exprim n miliechivaleni/ gram, ci n procente. Pentru aceasta, numrul echivalenilor se nmulete la masa unui miliechivalent de acid n grame: 1 miliechivalent de acid malic = 67 mg (0,067 g), de acid citric = 64 mg, de acid tartric = 65 mg, de acid oxalic = 45 mg. n dependen de predominarea unui sau altui acid organic n materialul cercetat se utilizeaz factorul respectiv pentru recalculare.
96

Reductorul produce reducerea, cednd electroni (el se oxideaz). Reductori pot metalele, H2, C, CO2, H2S, aldozele, cetozele. n biochimia analitic de obicei se folosesc SnCl2, hidrochinona, euconogenul (acidul 1-amino-2-naftol-4-sulfonic), aldozele, cetozele, acidul ascorbic. Metodele volumetrice care se bazeaz pe reacii ce se efectueaz cu transfer de electroni ntre substanele care reacioneaz permit dozarea reductorilor, utiliznd ca reactiv de titrare un oxidant, sau dozarea oxidanilor, folosind ca reactiv de titrare un reductor. Reaciile redox folosite n volumetrie trebuie s se desfoare rapid. De asemenea, este necesar s existe posibilitatea de a pune n eviden punctul de echivalen. ntr-o reacie cu transfer de electroni de tipul: Donor Acceptor + eacceptorul de electroni se numete oxidant, iar donorul se numete reductor. Echilibrul de mai sus denete un cuplu oxidant reductor (redox), care poate formulat astfel:

Red. Ox. + ne-.


Spre exemplu, n reaciile: Sn2+ Sn4+ + 2e-, Mn2+ Mn7+ + 5e-, Zn0 Zn2+ + 2e-, Cl- Cl0 + e-. 2+ 2+ ionii Sn , Mn , CI i atomul de zinc Zn0 sunt reductori, iar ionii de Sn4+, Mn7+, Zn2+ i atomul de clor Cl0 sunt oxidani. n cazul substanelor chimice compuse (amioni, substane organice) se consider, convenional, c numai un singur atom particip la schimbul de electroni. ntotdeauna oxidarea este nsoit de o reducere, i invers. De aceea, fenomenul se numete oxidoreducere.
98

Numrul de oxidare notat N.O. (stare de oxidare sau grad de oxidare) este sarcina real sau formal a unui atom participant la o reacie redox. n compuii covaleni, se atribuie numr de oxidare negativ elementului cu electronegativitate mai mare i numr de oxidare pozitiv elementului cu electronegativitate mai mic. De exemplu, n HCl, N.O. pentru Cl este -l, iar pentru H este +1. Pentru calcularea numerelor de oxidare trebuie reinute urmtoarele reguli: - substanele n stare elementar au N.O. zero: H20, O20, Cl20, S0, C0, Na0, Cu0, Fe0 etc.; - n compuii ionici, numerele de oxidare sunt egale cu sarcina electric a ionului: Na+, Ca+2, Al+3, O-2, Cl-, SO4-2, N03- etc.; - n compuii covaleni hidrogenul are N.O. = +1, de ex.: H+C1-, H2+O-2; - oxigenul n compuii covaleni sau ionici are N.O. = -2, de ex.: H2O-2, SO4-2, CO3-2, CaO-2; - n H2O2 i n peroxizi (-0 - 0-), oxigenul are N.O. = negativ (O2-2 sau O-); - metalele au ntotdeauna N.O. pozitiv; - suma algebric a numerelor de oxidare ntr-o substan compus neutr este zero, de ex.: Ca+2O-2. Aceast regul ne permite s calculm N.O. al unui element dintr-un compus. De exemplu, care este N.O. al sulfului n H2SO4? Dac notm cu x N.O. pentru sulf, putem scrie: 2(+l) + x + 4(-2) = 0; x = +6 Oxidanii i reductorii se pot gsi n diferite stri de oxidare; 0; +2; +4; +5 i +7. Pierderea de electroni are ca urmare creterea numrului de oxidare. Prin acceptare de electroni numrul de oxidare scade. Spre exemplu, n reacia: Fe2+ Fe3+ + e-, starea de oxidare a ionului de Fe2+ crete de la +2 la +3, ca
99

urmare a cedrii unui electron. Prin acceptarea unui electron, starea de oxidare a ionului Fe3+ scade de la +3 la +2. Astfel, reacia de oxidare poate denit ca o cedare de electroni urmat de creterea numrului de oxidare; reacia de reducere poate denit ca o acceptate de electroni urmat de scderea numrului de oxidare. n accepiunea clasic, prin oxidare se nelege procesul chimic prin care un element sau o substan se combin cu oxigenul sau pierde hidrogenul. Prin reducere se nelege procesul invers, de combinare cu hidrogenul sau de pierdere a oxigenului. Reaciile de oxidoreducere implic transfer de electroni ntre dou sisteme redox simple, care alctuiesc un sistem redox dublu. Expresia general a unui sistem de oxidoreducere poate formulat astfel: pRed1 pOx1 + pne- (reacie de oxidare) qOx2 + pne- qRed2 (reacie de reducere) pRed1 + qOx2 pOx1 + qRed2 n care: Red1 i Red2 reprezint reductorul, respectiv forma redus; Ox2 i Ox1 reprezint oxidantul, respectiv forma oxidat; pne- - numrul de electroni transferai; p i q coecieni stoechiometrici. Rezult, astfel, c n reacia redox Ox2 este agentul de oxidare care primind electroni de la reductorul Red1, trece n forma redus Red2, iar agentul reductor Red1 se transform n forma oxidat Ox1. Reaciile redox sunt reversibile i se a ntr-un echilibru chimic. Coecienii stoechiometrici ai reaciilor cu schimb de electroni se stabilesc pe baza numrului de electroni transferai. n majoritatea lor, sisteme redox cu aplicaii n volumetrie sunt formate din ioni aai n soluie n stri diferite de oxidare. Dac ntr-o astfel de soluie se introduce un electrod inert (de platin, aur,
100

paladiu sau crbune), acesta capt un potenial determinat, care depinde de concentraia celor dou tipuri de ioni din soluie. Astfel, n cazul sistemului redox:

ionul Fe3+ poate capta un electron de la electrodul inert trecnd n Fe2+, i invers, ionul Fe2+ poate ceda un electron electrodului inert trecnd n Fe3+. Prin urmare, creterea concentraiei ionilor Fe3+ din soluie va mri electropozitivitatea electrodului inert, iar creterea concentraiei ionilor Fe2+ n soluie va mri electronegativitatea electrodului inert. Diferena de potenial ce se creeaz ntre electrodul inert i soluia ce conine cele dou tipuri de ioni capabili s se transforme reversibil se denete ca potenial redox al sistemului. Reactivitatea chimic a unui sistem redox este determinat de tendina sa de a pierde sau de a ctiga electroni. Aceast tendin se msoar, deci, tot prin potenialul redox. Deplasarea echilibrului unei reacii redox ntr-o direcie sau alta depinde de diferena dintre potenialele redox ale celor dou cupluri simple de reacii; cu ct aceast diferen este mai mare, cu att este mai mare i viteza de reacie. n volumetria redox, n timpul titrrii se modic concentraia reactanilor i, ca urmare, se modic i potenialul redox al soluiei. Indicatorii redox permit stabilirea punctului de echivalen. Aceti indicatori pot : de culoare, de uorescen, de absorbie, turbidimetrici i indicatori reactivi. n metodele volumetrice bazate pe reacii redox punctul nal al titrrii poate stabilit utiliznd urmtoarele tipuri de indicatori: substane chimice care, avnd capacitatea de a reaciona specic cu unul dintre reactani, conduc la un compus colorat. Astfel, prin reacia dintre iod i amidon apare o coloraie albastr.
101

substane reactante colorate care particip la reacia redox i care, adugate n mic exces, imprim o colorare caracteristic (permanganatul de potasiu). substane care se prezint n cele dou forme oxidat i redus colorate diferit (Cr6+ colorat n portocaliu i Cr3+ colorat n verde). n timpul unei titrri redox, ca urmare a modicrii concentraiei reactanilor, se modic i potenialul redox al soluiei; variaia brusc de potenial evideniaz punctul de echivalen (titrare poteniometric). Se cunosc numeroase metode volumetrice bazate pe reacii redox, care pot clasicate n funcie de natura oxidanilor (KMnO4, K2Cr2O7, I2, KIO3 etc.) sau de natura reductorilor (Na2S2O3, C2O4H2, FeSO4 etc.). Dintre metodele volumetrice redox cu aplicaii multiple pot menionate manganometria i iodometria. 7.3.1. Manganometria Numit i permanganometrie, este o metod de analiz volumetric, bazat pe reacii de oxidoreducere, prin care se dozeaz substane reductoare, utiliznd ca oxidant o soluie de permanganat de potasiu. Dozrile manganometrice se efectueaz, de obicei, n mediu acid conform urmtoarei reacii de oxidoreducere: MnO4- + 8H+ + 5e- Mn2+ + 4H2O.
(ion colorat) (ion incolor)

Dozrile manganometrice necesit prepararea, n prealabil, a unei soluii oxidante de permanganat de potasiu cu titrul cunoscut. Aceast soluie este aproximativ, deoarece KMnO4 nu ndeplinete condiiile de substan etalon; n consecin, folosirea soluiei de permanganat de potasiu ca reactiv de dozare presupune stabilirea factorului de corecie. Prepararea unei soluii aproximative de KMnO4 0,1 N. Pentru a prepara o soluie de KMnO4 0,1 N este necesar s se calculeze echivalentul chimic al permanganatului de potasiu n reacia: 2(K+ + MnO4-) + 3(2H+ + SO42-) (2K+ + SO42-) + 2(Mn2+ + SO42-) + 3H2O + 5O2 Aceasta reprezint reacia de baz n manganometrie, conform creia manganul acioneaz ca oxidant trecnd de la starea de oxidare +7 la starea de oxidare +2. Schimbul de electroni este urmtorul: Mn7+ + 5e- Mn2+ | 4 (reacie de reducere) 2O2- - 4e- O0 | 5 (reacie de oxidare) Deoarece n reacie ionul Mn7+ din permanganatul de potasiu primete cinci electroni, rezult c echivalentul KMnO4 n mediu acid este: M KMnO4 158,038 EKMnO4 = = = 31,67 5 ne Pentru a prepara 1000 ml soluie de KMnO4 0,1 N, este necesar o cantitate de permanganat de potasiu egal cu: G = N E V = 0,1 31,6 = 3,16 g KMnO4 Soluia de KMnO4 0,1 N astfel obinut este o soluie aproximativ, care trebuie standardizat prin determinarea factorului de corecie.
103

n aceast reacie, ionul de mangan, prin reducere, i modic numrul de oxidare de la +7 la +2: Mn + 5e Mn
7+ 2+

n mediu acid, neutru sau alcalin se formeaz un precipitat brun de MnO2, care ncurc xarea punctului de echivalen.
102

Tehnica: - se cntresc aproximativ 3,2 g KMnO4; - se dizolv aceast cantitate n l000 ml ap distilat; - soluia obinut se erbe timp de o or sau se las la temperatura camerei timp de 7-8 zile; - se ltreaz pe un creuzet cu masa ltrant tip G3 sau G4, care reine eventualele urme de dioxid de mangan (MnO2) sau se decanteaz de pe acest precipitat; - soluia aproximativ de KMnO4 0,1 N astfel obinut, de culoare violet, se trece ntr-o sticl brun de reactivi, deoarece lumina catalizeaz descompunerea KMnO4. Determinarea factorului de corecie al soluiei aproximative de KMnO4 0,1 N. Factorul de corecie al soluiei aproximative de KMnO4 0,1 N se stabilete pe baza reaciei de oxidoreducere dintre permanganatul de potasiu i acidul oxalic n prezen de acid sulfuric: 5(2H+ + C2O42-) + 3(2H+ + SO42-) + 2(K+ + MnO4-) 2(Mn2+ + SO42-) + (2K+ + SO42-) + 10CO2 + 8H2O n aceast reacie, schimbul de electroni este urmtorul: Mn7+ + 5e- Mn2+ | 2; C2O42- - 2e- 2CO2 | 5. Un volum cunoscut de soluie etalon de acid oxalic 0,1 N se titreaz cu o soluie aproximativ de permanganat de potasiu 0,1 N n prezen de acid sulfuric. Ca indicator redox se folosete chiar soluia de KMnO4. La punctul de echivalen, o pictur suplimentar de reactiv coloreaz soluia titrat n roz-slab.
104

Tehnica: ntr-un pahar Erlenmayer se msoar 10 ml (Ve) soluie etalon de H2C2O4 0,1 N (prepararea vezi n Determinarea factorului de corecie al soluiei aproximative de NaOH 0,1 N); se adaug aproximativ 10 ml de H2SO4 20%; se nclzete pn la 75-80C, fr a se erbe; soluia etalon erbinte se titreaz cu soluie aproximativ de KMnO4 0,1 N pn la apariia unei coloraii slab-roz. Este de menionat faptul c, dup primele picturi de KMnO4 adugate, soluia se poate colora n roz, deoarece reacia debuteaz lent (perioada de incubaie). Prin agitare la cald se formeaz cationul de Mn2+, cu rol autocatalitic, care determin creterea vitezei de reacie (perioada de inducie). Soluia se decoloreaz i titrarea poate continuat pn la punctul de echivalen. Titrarea se efectueaz n trei repetri. Calculul: Se aplic relaia:

FKMnO4 =

Ve VC2O4 H 2 10 = = Vr VKMnO4 ( V2 - V1 )

Se face media valorilor factorilor calculai pe baza celor trei determinri, stabilindu-se astfel factorul de corecie al soluiei aproximative de KMnO4 0,1 N. Dozarea manganometric a apei oxigenate. Apa oxigenat (H2O2 = peroxid de hidrogen) este un oxidant puternic. Soluia apoas de 30% se numete perhidrol. n organismele vii se sintetizeaz din hidrogenul luat de la careva substrat (SH2) de ctre enzima oxidaza i cedat oxigenului molecular: SH2 + O2 S + H2O2. Este descompus n H2O i O2, sub aciunea luminii, cldurii, metalelor, enzimelor catalaza i peroxidaza. Se ntrebuineaz la nlbirea esturilor, iar soluia de 3% este utilizat ca dezinfectant pentru rni.
105

Principiul: Sub aciunea oxidant a apei oxigenate, n mediu acid, starea de oxidare a ionului Mn7+ din permanganatul de potasiu se modic de la 7+ la 2+, conform reaciei: 5H2O2 + 2(K+ + MnO4-) + 3(2H+ + SO42-) 2(Mn2+ + SO42-) + (2K+ + SO42-) + 8H2O + 5O2. n aceast reacie de reducere a ionului Mn7+, schimbul de electroni este urmtorul: Mn7+ + 5e- Mn2+ | 2 O22- - 2e- O20 |5 Dozarea apei oxigenate se efectueaz n prezena acidului sulfuric, prin titrare cu o soluie de permanganat de potasiu cu factor cunoscut. Pe baza volumului consumat la titrare (KMnO4 0,1 N), se calculeaz cantitatea de ap oxigenat din soluia de analizat. Tehnica: ntr-un pahar Erlenmayer ce conine proba de analizat (H2O2), se adaug 2 cm3 soluie de H2SO4 20%, se titreaz cu soluia de KMnO4 0,1 N, pn la apariia unei coloraii roz-alb. Calculul: Aplicnd formula general de calcul volumetric, rezult:
gH 2 O2 = ( Vr F N )KMnO mE H 2O2 ,

Dozarea vitaminei P n esuturi vegetale prin metoda manganometric. Principiul metodei. Dozarea vitaminei P prin metoda permanganometric se bazeaz pe capacitatea acesteia de a se oxida sub aciunea permanganatului de potasiu. n calitate de indicator se folosete indigo carmin, care reacioneaz cu excesul de permanganat dup oxidarea complet a vitaminei P. S-a stabilit experimental, c 1 ml soluie de KMnO4 0,1 N corespunde la 6,4 g de vitamina P. Modul de lucru. Se cntresc la balana analitic 100 mg ceai indian, georgian, de ceylon sau chinezesc sau ori de tei, frunze de ment etc. i se face o infuzie n 50 ml ap distilat. n acest scop se erb 40 ml ap distilat ntr-un pahar Berzelius, iar n momentul n care apa a ajuns la erbere se adaug ceaiul, meninnd paharul acoperit cu o sticl de ceas timp de 20-30 secunde deasupra sursei de nclzire i alte 5-10 minute pe masa de laborator. Coninutul se rcete i se ltreaz ntr-un balon cotat de 50 ml i se aduce la cot cu ap distilat. ntr-un balon Erlenmayer de 100 ml se pipeteaz 10 ml ltrat i se adaug 10 ml de ap distilat i se adaug 10 picturi soluie alcoolic de indigo carmin 0,01%. Se titreaz apoi cu soluie de KMnO4 0,05 N pn la apariia unei coloraii galbene stabile n timp. Observaie. Titrarea se face cu atenie pentru diferenierea culorii galbene a ceaiului de cea galben-aurie a indicatorului la punctul de virare. Pentru comparare e bine de avut un balon Erlenmayer de acelai volum cu aceiai componeni. Calculul rezultatelor se face dup formula:

n care: Vr volumul soluiei de KMnO4 0,1 N folosit la titrare; F factorul de corecie al soluiei de KMnO4 0,1 N; N normalitatea soluiei de KMnO4; mE H O = 0,017 .
2 2

unde: X coninutul de vitamina P (mg/100 g produs vegetal); A volumul soluiei de KMnO4 consumat la titrare (ml); F factorul de corecie al soluiei de KMnO4 stabilit n ziua determinrii.
107

106

7.3.2. Iodometria Iodometria reprezint o metod de analiz volumetric ce se bazeaz pe urmtoarea reacie de oxidoreducere: I2 + 2e- 2IDac iodul se comport ca un oxidant, reacia decurge de la stnga la dreapta; acesta este cazul reaciilor dintre iod i tiosulfat de sodiu, acid sulfuros, clorur stanoas etc. n cazul n care iodul se comport ca reductor, reacia decurge n sens invers, de la dreapta la stnga, de preferin n mediu acid, ionul I- reducnd oxidani puternici cum sunt: permanganatul de potasiu, dicromatul de potasiu, iodatul de potasiu etc. n general, metodele iodometrice de dozare sunt indirecte i pot clasicate n: - metode iodometrice de dozare a substanelor reductoare n care se utilizeaz ca reactiv volumetric o soluie titrat de iod (I2); - metode iodometrice de dozare a substanelor oxidante n care reactivul volumetric este o soluie de iodur de potasiu (KI). Practic, soluia de iod se prepar prin dizolvarea iodului n soluie de iodur de potasiu, reacia redox putnd formulat astfel: I2 + 2e- 2IDeterminarea volumetric a iodului prezent n exces la dozarea substanelor reductoare sau a iodului pus n libertate la dozarea substanelor oxidante se face prin titrare cu o soluie de tiosulfat de sodiu (Na2S2O3) cu factor cunoscut. Astfel, reacia de baz n iodometrie este urmtoarea: 2 2 I2 + 2(2Na+ + S2O3) 2(Na+ + I ) + 2(Na+ + S4O6). n aceast reacie, schimbul de electroni decurge astfel: I |2 I0 + e 2S2O3 2- - 2e S4O62108

ntruct doi atomi de iod reacioneaz cu dou molecule de tiosulfat de sodiu schimbnd doi electroni, rezult c echivalentul tiosulfatului de sodiu, cristalizat cu cinci molecule de ap, este egal cu masa sa molecular (248,1825), iar echivalentul iodului este egal cu masa sa atomica (126,9044). Deci:
mE Na 2 S 2O3 = 0,2481 i mE I 2 = 0,1269.

n iodometrie, ca indicator se folosete amidonul, care cu iodul formeaz un compus de incluziune colorat n albastru. Prezena sau absena iodului n mediul de reacie, la punctul de echivalen, este sesizat prin apariia i, respectiv, dispariia coloraiei albastre. Prepararea unei soluii aproximative de I2 0,1 N. Pentru a prepara 1000 cm3 soluie aproximativ de iod 0,1 N, este necesar cantitatea calculat astfel:
G I 2 = N E = 0,1 126,904 = 12,6904 g Tehnica: - ntr-o ol de cntrire cu dop lefuit se cntresc la balana analitic 12,6904 g I2 pur; - cristalele de iod se trec ntr-un balon cotat de 1000 cm3, care conine o soluie concentrat de iodur de potasiu, aproximativ 25 g KI (iodul ind puin solubil n ap, prezena KI este necesar pentru a-i mri solubilitatea); - se agit pentru a se dizolva iodul; - se completeaz cu ap distilat pn la volumul de 1000 cm3; - se omogenizeaz, obinndu-se astfel o soluie aproximativ de I2 0,1 N. Factorul de corecie al acestei soluii se stabilete utiliznd o soluie etalon (standard) secundar de tiosulfat de sodiu 0,l N.
109

|l

Prepararea unei soluii aproximative de Na2S2O3 0,1 N. Prin dizolvarea tiosulfatului de sodiu se obin soluii aproximative, deoarece acesta conine ap de cristalizare (Na2S2O3 5H2O). Pentru a prepara 1000 cm3 soluie aproximativ de Na2S2O3 0,1 N, este necesar cantitatea de:
G Na 2 S 2O3 5 H 2O = N E = 0,1 248,22 = 24,82 g

Schimbul de electroni este urmtorul: Cr6+ + 3e- Cr3+ | 1 | 2 I - 1e- I0 | 3 | 6 Iodul eliberat din reacie se titreaz cu o soluie de tiosulfat de sodiu: I2 + 2(2Na+ + S2O32-) 2(Na+ + I ) + (2Na+ + S4O62-). Ca indicator se folosete amidonul. Conform reaciei menionate, rezult c echivalentul dicromatului de potasiu se calculeaz mprind masa sa molecular la 6 (numrul total de electroni acceptai de ionii Cr6+ pentru a trece n ioni Cr3+):
E K 2Cr2O7 = 294,216 = 49,036; 6

Tehnica: - se cntresc la balana tehnic circa 25 g tiosulfat de sodiu; - se dizolv tiosulfatul de sodiu n 200-300 cm3 ap distilat decarbonat. Se ntrebuineaz ap distilat decarbonat pentru a evita reacia dintre tiosulfatul de sodiu i dioxidul de carbon care determin formarea de carbonat acid de sodiu, acid sulfuros i sulf. Acidul sulfuros poate oxidat de ctre iod, consumnd o cantitate mai mare dect tiosulfatul de sodiu; - ntr-un cilindru gradat, se aduce volumul total al soluiei la l000 cm3 cu ap distilat decarbonat; - soluia aproximativ de tiosulfat de sodiu 0,1 N astfel obinut se las pentru stabilizare 8-10 zile la ntuneric. Protejarea contra microorganismelor se face prin introducerea unor ageni de dezinfecie (urme de cloroform); - factorul de corecie al soluiei aproximative de tiosulfat de sodiu 0,1 N se stabilete cu ajutorul unei soluii etalon primar de dicromat de potasiu. Prepararea unei soluii de K2Cr2O7 0,1 N. Dicromatul de potasiu ndeplinete condiiile de substan etalon i, deci, poate utilizat pentru prepararea de soluie etalon. n mediu acid (H2SO4), dicromatul de potasiu oxideaz ionul I cu formare de iod n cantitate echivalent: (2K+ + Cr2O72-) + 6(K+ +I ) + 7(2H+ + SO42-) 4(2K+ + SO42-) + (2Cr3+ + 3SO42-) + 3I2 + 7H2O.
110

mE K 2Cr2O7 = 0,049036 .

Cantitatea de substan necesar pentru obinerea a l000 cm3 soluie etalon de K2Cr2O7 0,1 N este:
mE K 2Cr2O7 = N E V = 0,1 49,036 1 = 4,9036.

unde V volumul exprimat n litri. Tehnica: - se cntresc circa 5,5 g dicromat de potasiu, se pulverizeaz bine ntr-un mojar, se usuc la 120-150C pn la greutate constant i apoi se cntresc exact la balana analitic 4,9036 g dicromat de potasiu; - se dizolv n 200-300 cm3 ap distilat i se trece cantitativ ntrun balon cotat de 1000 cm3; - se aduce soluia la un volum total de l000 cm3 cu ap distilat; - se omogenizeaz. Soluia astfel obinut se utilizeaz ca etalon primar pentru determinarea factorului de corecie al soluiei aproximative de Na2S2O3 0,1 N.
111

Determinarea factorului de corecie al soluiei aproximative de Na2S2O3 0,1 N. Principiul: Dicromatul de potasiu reacioneaz cu iodura de potasiu n prezena acidului sulfuric, conform reaciei menionate n Prepararea soluiei etalon de K2Cr2O7 0,1 N. Iodul pus n libertate se titreaz cu soluie de tiosulfat de sodiu, n prezena amidonului ca indicator. Tehnica: - ntr-un acon cu dop rodat se msoar exact un volum de 10 cm3 soluie etalon de dicromat de potasiu 0,1 N (Ve); soluia este colorat portocaliu, datorit prezenei ionului Cr6+; - se adaug l0 cm3 soluie de KI 15% i 10 cm3 soluie de H2SO4 20%; - se nchide aconul cu dopul rodat, se agit coninutul i se las n repaus, la ntuneric, timp de 5 minute; soluia capt o coloraie brun datorit iodului pus n libertate; - se adaug aproximativ 50 cm3 ap distilat; - se titreaz iodul eliberat cu o soluie aproximativ de Na2S2O3 0,1 N; - titrarea se face de la coloraia brun pn la coloraia galbendeschis; - se adaug 1 cm3 soluie de amidon 1%, ca indicator; apare o coloraie albastr; - se continu titrarea pn la dispariia culorii albastre. Soluia se coloreaz n verde graie formrii ionului Cr3+; - se citete la biuret volumul soluiei aproximative de Na2S2O3 0,l N folosit la titrare ( Vr = V Na 2 S 2O3 = V2 - V1 ); - se calculeaz factorul de corecie; - determinarea se repet de trei ori. Calculul: Factorul de corecie al soluiei aproximative de Na2S2O3 0,1 N se stabilete din relaia: VK Cr O V 10 FNa2 S2O3 = e = 2 2 7 = . Vr V Na2 S 2O3 V2 - V1 Se face media valorilor celor trei factori calculai i se obine factorul de corecie al soluiei aproximative de Na2S2O3 0,1 N.
112

Determinarea factorului de corecie al soluiei aproximative de I2 0,1 N. Principiul: Determinarea factorului de corecie al soluiei aproximative de iod 0,1 N are la baz reacia: I2 + 2(2Na+ + S2O32-) 2(Na+ + I ) + (2Na+ + S4O62-). Un volum, msurat exact, din soluia aproximativ de iod se titreaz cu o soluie aproximativ de tiosutfat de sodiu cu factor cunoscut (etalon secundar), n prezen de amidon ca indicator. Tehnica: - ntr-un pahar Erlenmayer se msoar 10 cm3 soluie aproximativ de I2 0,1 N (Vr); - se titreaz cu soluie de Na2S2O3 0,1 N cu factor cunoscut, pn cnd coloraia iniial, brun, trece n galben; - se adaug 4-5 picturi soluie de amidon 1%, care imprim mediului de reacie o coloraie albastr; - se continu titrarea pn ce soluia devine incolor, - se noteaz volumul soluiei de Na2S2O3 0,1 N folosit la titrare; - se repet determinarea de 2-3 ori; - se calculeaz factorul de corecie al soluiei aproximative de I2 0,1 N. Calculul: Volumul soluiei aproximative de Na2S2O3 0,1 N se standardizeaz prin nmulirea cu factorul de corecie:
Ve = V Na 2 S 2O3 FNa 2 S 2O3 .

Factorul de corecie al soluiei aproximative de iod 0,1 N se calculeaz din relaia:


FI 2 = Ve V Na2 S 2O3 FNa2 S 2O3 = , Vr VI 2

Vr = VI 2 = 10 cm3 soluie de I2 0,1 N. Se face media valorilor factorilor calculai pe baza celor trei determinri.
113

Dozarea iodometric a glucozei. Principiul: Glucoza este o substan cu caracter reductor. Ca urmare, poate oxidat cu iod (n exces) n mediu alcalin pn la acid gluconic. Iodul, n prezena hidroxidului de sodiu, formeaz iodur de sodiu i hipoiodit de sodiu: (1) I2 + 2NaOH NaI + NaOI + H2O Hipoioditul de sodiu, n mediu alcalin, oxideaz glucoza pn la acid gluconic, respectiv gluconat de sodiu: HC=O O=CONa | | (CHOH)4 + NaOI + NaOH (CHOH)4 + NaI + H2O (2) | | CH2OH CH2OH Sumnd reaciile 1i 2, obinem reacia nal HC=O O=CONa | | (CHOH)4 + I2 + 3NaOH (CHOH)4 + 2NaI + NaOI + 2H2O | | CH2OH CH2OH Excesul de iod, aat n mediul de reacie sub form de iodur i hipoiodit de sodiu, se elibereaz prin titrare cu acid clorhidric: NaI + NaOI + 2HCl I2 + 2NaCl + H2O (4)

Tehnica: ntr-un acon Erlenmayer cu dop rodat, care conine proba de analizat, se introduc 25 cm3 soluie de I2 0,1 N; se adaug, cu pipeta, soluie de NaOH 10%; adugarea se face pictur cu pictur, pn cnd coloraia brun a soluiei trece n galben-deschis; se agit i se las n repaus, la ntuneric, timp de 15 minute; se aciduleaz cu 10 cm3 soluie de HCl 4 N; apare o coloraie brun datorat iodului pus n libertate; se titreaz cu soluie de Na2S2O3 0,1 N pn la apariia unei coloraii galbene; se adaug l cm3 soluie de amidon 1%, care imprim mediului de reacie o coloraie albastr; se continu titrarea pn ce soluia devine incolor; se citete volumul total al soluiei de Na2S2O3 0,1 N consumat la titrare. Calculul: Volumul soluiei de I2 0,1 N (V) consumat n reacia de oxidare a glucozei se stabilete prin diferen:

V = V I 2 FI 2 - V Na 2 S 2O3 FNa2 S 2O3

) cm

soluie I2 0,1 N,

Iodul pus astfel n libertate se titreaz cu o soluie de tiosulfat de sodiu cu factor stabilit: I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6 (5)

unde: VI 2 - volumul soluiei de I2 introdus iniial n exces, n acest caz 25 cm3; VNa2 S 2O3 - volumul soluiei de Na2S2O3 0,1 N consumat la titrarea iodului rmas nereacionat. Echivalentul glucozei se calculeaz pe baza reaciei globale de oxidare a glucozei (3), din care rezult c: 1 mol I2 ......... oxideaz ............ l mol glucoz (180g), I 180 deci: 1E I 2 = 2 ..... oxideaz ............. 1E glucoz = = 90 g . 2 2 Prin urmare, mEglucoz = 0,090g.
115

Cunoscnd volumul soluiei de iod 0,1 N consumat n reacia de oxidare a glucozei, se poate determina cantitatea de glucoz din proba de analizat.
114

Introducnd valorile respective n formula general de calcul volumetric, g = (V F N) mE, se obine:


g glucoz = V I 2 FI 2 - V Na 2 S 2O3 FNa 2 S 2O3 0,1 0,090.

7.3.3. Complexometria Complexometria cuprinde metodele volumetrice bazate pe formarea de combinaii complexe. Combinaiile complexe sau complecii sunt aa-numitele combinaii de ordin superior, rezultate prin unirea a mai multor ioni sau molecule. Combinaiile complexe sunt formate dintr-un atom central sau mai exact, un ion central (mai des ionul unui metal tranziional Ag, Cu, Fe, etc.) i un numr de molecule neutre sau ioni negativi ce posed electroni neparticipani, numii liganzi sau adenzi. ntre ionul central i liganzi exist legturi coordinative (ionul central este acceptor, iar ligandul donor de electroni). Ionul central mpreun cu liganzii formeaz ionul complex a crui sarcin se a prin nsumarea algebric a sarcinilor ionului central i ale liganzilor. De exemplu: [PtCl6]2Pt = +4 Cl = -1 Ionul complex = + 4 + 6(-1) = -2 sau [Ag(NH3)2]+ Ag = +l NH3 = 0, deci, ionul complex are sarcina +1. Ionul central formeaz sfera interioar a complexului, iar ionii care neutralizeaz sarcina ionului central formeaz sfera exterioar. Numrul liganzilor din jurul atomului central se numete numr de coordinaie i poate : 2, 4, 6, 8.
116

Combinaiile complexe n soluie ionizeaz ionul complex (sfera interioar) i ionii din sfera exterioar: [Ag(NH3)2]Cl > [Ag(NH3)2]+ + ClK2[PtCl6] > 2K+ + [PtCl6]2Se observ c ionii compleci pot avea sarcin pozitiv sau negativ. Complecii sunt mult folosii n analiza chimic la identicare, datorit culorilor lor intense, att n cazul celor solubili, ct i al celor sub form de precipitat. Sunt folosii i la separri, n cazul unor compleci incolori. Denumirea complecilor se face inndu-se seama de tipul ionului complex (anion sau cation), de valena ionului central i de numrul de liganzi. Astfel: [Ag(NH3)2]Cl [Cu(NH3)4](OH)2 Co[Hg(SCN)4] K3[Fe(CN)6] K2[HgI4] K3[Co(NO2)6] K4[Fe(CN)6] Fe4[Fe(CN)6]3 Fe3[Fe(CN)6]2 - clorur diaminoargentic sau clorur de diaminoargint (I) - hidroxid tetraminocupric sau hidroxid de tetraaminocupru (II) - tetrarodanomercuriatul de cobalt (II) - hexacianoferatul (III) de potasiu - tetraiodomercuriatul de potasiu - hexanitrocobaltul (III) de K - hexacianoferatul (II) de K - hexacianoferatul (II) de Fe (III) - hexacianoferatul (III) de Fe (II).

Dup una din clasicrile existente, combinaiile complexe pot : - Combinaii complexe de adiie, care rezult prin simpla unire a moleculelor ionizabile sau neionizabile, ca de exemplu: HCl + AuCl3 H [AuCl4 ] - Combinaii complexe de interpunere, n care ntre cationul i anionul unei sri este interpus ligandul, ca de exemplu: CuSO4 + 4NH3 [Cu (NH3)4]SO4
117

- Combinaii complexe interne, n care atomul central este legat de liganzi organici printr-o legtur covalent i o legtur covalent coordinativ, cu formare de cicluri. Liganzii organici trebuie s conin dou grupe funcionale care s poat substituite (COOH, SO3H- etc.). Combinaiile complexe interne sunt puternic colorate. O combinaie complex intern de culoare roie este cea care se formeaz ntre zinc i ditizon:
C6H5 N C S N N C6H5 NH Zn HN C6H5 N S N C6H5 N C

Reacia complexonului III cu un cation bivalent (Me2+) n care se formeaz un chelat poate redat simplicat astfel: H2Y2- + Me2+ MeY2- + 2H+ Datorit formrii chelailor, aceste metode se mai numesc i chelatometrice. Titrrile complexometrice se efectueaz n soluii tampon care se opun variaiilor de pH posibile datorate eliberrii de protoni n mediul de reacie. Indicatorii folosii n complexometrie sunt substane organice colorate care mpreun cu diferii cationi formeaz combinaii complexe a cror culoare difer de cea iniial. Aceti indicatori se numesc indicatori de ioni i trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii: s formeze soluii colorate diferit de soluia complexonului; intensitatea culorii determinate s e sesizabil i pentru concentraii foarte mici ale complexului (10-5 - 10-6 mol/dm3); stabilitatea complexului indicator-ion titrat s e mai mic comparativ cu cea a complexului format n titrarea complexometric. Astfel de indicatori sunt: negru eriocromul (erio-T), colorat n albastru i murexidul (sarea de sodiu a acidului purpuric), colorat n violet (pH11).
O NH+ 4 O N N N H N H O

Pentru obinerea complecilor interni, cel mai frecvent se folosesc acizii aminopolicarboxilici liganzi numii complexoni. Complecii formai cu complexonii se numesc complexonai. Complexonii reacioneaz de obicei cu cationi divaleni (Ca2+, Mg2+) i trivaleni (Al3+). Un exemplu l constituie sarea disodic a acidului etilendiaminotetraacetic (Na2H2EDTA), denumit i complexon III.

H N O

OH Na O3 S
+ - -

OH

N=N

NO2

Murexid

Negru-eriocrom

118

119

Aceti indicatori se utilizeaz n stare solid i n amestec cu clorur de sodiu, soluiile lor ind instabile. Prepararea unei soluii de complexon III 0,05M. n dozrile complexometrice se folosete o soluie de sare disodic a acidului etilendiaminotetraacetic (Na2H2EDTA), numit i complexon III, de concentraie 0,05 M. Masa molecular a complexonului III cristalizat cu dou molecule de ap (Na2H2Y 2H2O) este egal cu 372,24 g. Pentru a obine l000 cm3 soluie de complexon III 0,05 M este necesar cantitatea de: gcomplexon III = 0,05 372,240 = 18,6100. Soluia de complexon III are, deci, titrul:
T= 18,61 = 0,01861 g cm 3 1000

Acest raionament este valabil n cazul utilizrii de complexon III de puritate avansat. n caz contrar, titrul se determin cu ajutorul unor substane etalon: MgSO4 7H2O, Mg(CH3COO)2 etc. Spre exemplu, dac se folosete ca substan etalon MgSO47H2O (M = 246,48), acesta se titreaz cu soluie de complexon III 0,05 M la pH=10, n prezen de negru-eriocrom-T, pn cnd culoarea soluiei vireaz de la rou la albastru. n acest caz titrul soluiei de complexon III 0,05 M se calculeaz astfel:

se aduce volumul total la l000 cm3 cu ap distilat; se omogenizeaz soluia i se transvazeaz ntr-o sticl de polietilen. Pentru stabilirea titrului soluiei de complexon III 0,05 M cu ajutorul unei substane etalon (MgSO4 7H2O), se procedeaz astfel: se cntresc la balana analitic 3-5 probe de MgSO4 7H2O, avnd masa de 0,1230-0,4930 g; ecare prob se dizolv n 50 cm3 ap distilat; se aduce soluia la pH=10, folosind o soluie tampon de NH4OH/NH4C1 (70 g NH4C1 i 570 cm3 amoniac concentrat se completeaz la l000 cm3 cu ap distilat); se adaug un vrf de spatul de indicator (eriocrom-negru T i clorur de sodiu n raport 1:500); se titreaz cu soluia de complexon III 0,05 M pn cnd culoarea vireaz de la rou la albastru. Dozarea complexometric a ionului de Ca2+. Principiul: Dozarea ionilor de calciu se face prin complexare cu sarea disodic a acidului etilendiaminotetraacetic (Na2H2EDTA), numit i complexon III, n prezen de murexid ca indicator . Ionii de calciu din soluie reacioneaz cu murexidul n modul urmtor: Ca2+ + 2Ind-NH4+ Ca2+2Ind- + 2NH4+ Complexul format ntre ionii de calciu i indicator este colorat n roz-violet. Prin titrarea ionilor de calciu liberi din soluie cu soluie de complexon III (H2Y2-) se formeaz un complexonat de calciu: Ca2+ + H2Y2- Ca2+Y2- + 2H+ n momentul apariiei n soluie a unui ct de mic exces de complexon III, dup blocarea ionilor de calciu liberi, are loc reacia cu complexul iniial format ntre ionii de calciu i murexid: Ca2+2Ind- + H2Y2- Ca2+Y2- + H2Ind.
121

T=

a 18,61 , V 12,324

n care: a cantitatea de MgSO4 7H2O cntrit (g); V volumul soluiei de complexon III 0,05 M folosit la titrare (cm3). Tehnica: se cntresc la balana analitic 18,6l00 g complexon III pur; substana se trece ntr-un balon cotat de l000 cm3, cu ap distilat;
120

Murexidul eliberat coloreaz soluia n albastru. Din volumul de complexon III folosit la titrare se poate calcula concentraia ionilor de calciu din proba de analizat. Tehnica: ntr-un pahar Erlenmeyer se msoar un volum de 50 cm3 soluie de analizat, care nu trebuie s conin mai mult de 25 mg Ca2+; se adaug 5 cm3 soluie de NaOH 1 N pentru a asigura pH = 12-13; se adaug un vrf de spatul de murexid n amestec cu clorur de sodiu (n raport 1:100) i se agit; soluia se coloreaz n roz; se titreaz rapid, sub agitare, cu o soluie de complexon III 0,05 M, pn cnd culoarea soluiei vireaz de la roz la violet; se citete volumul de complexon III (V) utilizat la titrare. Calculul: Cantitatea de complexon III folosit la titrarea probei de analizat rezult din urmtorul raionament: l cm3 complexon III 0,05 M conine T g complexon III; V cm3 complexon III 0,05 M vor conine VT g complexon III. Cunoscnd c 1000 cm3 soluie de complexon III 0,05 M titreaz 0,05 A g Ca2+, unde A = 40,08 (masa atomic, a Ca), rezult c: 18,6100 g complexon III ........ 0,05 40,08 = 2,0040 g Ca2+ V T g complexon III ................................................ g Ca2+
g Ca 2 + = V T 2,0040 ; 18,6100

8. METODE FIZICO-CHIMICE DE ANALIZ BIOCHIMIC


8.1. pH-METRIA ntr-o accepie general, pH-ul este o noiune prin care se poate exprima proprietatea unei soluii de a acid, neutr sau alcalin. pH-ul unei soluii este funcie de disociere i reect aciditatea ionic sau real a soluiei, respectiv concentraia de ioni de hidrogen existeni n stare liber. pH-ul se exprim prin valori numerice cuprinse ntre 0 i 14. Reaciile biochimice se efectueaz n condiiile meninerii n mediul biologic a anumitor valori ale pH-ului, respectiv ale concentraiei ionilor de hidrogen [H+], valori care sunt compatibile cu activitatea biochimic i ziologic. Rezult, astfel, c pH-ul mediului intern al organismelor reprezint o constant biologic ce asigur desfurarea normal a reaciilor biochimice care stau la baza tuturor manifestrilor vitale. Homeostazia organismelor se manifest i prin valorile constante ale pH-ului, riguros meninute ntre anumite limite datorit interveniei unor mecanisme de reglare. De exemplu, echilibrul acido-bazic din mediul celular i din lichidele biologice este asigurat i meninut prin mecanisme de reglare zico-chimice i ziologice. De asemenea, pH-ul constituie o caracteristic determinant i pentru alte medii de desfurare a reaciilor chimice i biochimice in vitro; totodat, pH-ul constituie i un parametru important pentru utilizarea n scopuri analitice a unor metode ca electroforeza n diferite variante, cromatograa etc. 8.1.1. Deniia pH-ului pH-ul reprezint logaritmul zecimal cu semn schimbat al concentraiei ionilor de hidrogen [H+] i se exprim prin relaia:
123

n care: V volumul de complexon III 0,05 M folosit la titrare (cm3); T titrul soluiei de complexon III 0,05 M (g/cm3), adic 0,01861 g/cm3. De regul, rezultatul se exprim n mg Ca2+ existent n 100 cm3 soluie. n acest caz, relaia de mai sus devine:
mg Ca 2+ 100cm 3 = V T 2,0040 2 10 3. 18,6100

122

pH = - lg [H+]

(1)

rezultai prin disocierea apei:

Demonstraie. Apa distilat, obinut chiar ntr-un grad nalt de puritate, prezint totui o conductibilitate electric foarte mic, ns constant i bine denit. Aceast conductibilitate se datoreaz ionilor rezultai prin disocierea moleculelor de ap: (2) H2O H+ + OH+ n realitate, ionul de H este asociat cu o molecul de ap formnd ionul de hidroniu (H3O+), conform reaciei: H + + H 2O H 3O + (3) Rezult c disocierea apei poate formulat i prin ecuaia: (4) 2H2O H3O+ + OHDeci, apa este un dizolvant amionolitic (amprotolitic), deoarece, prin disociere, funcia acid este conferit prin ionul de hidrogen, respectiv ionul de hidroniu (H3O+), iar funcia alcalin prin ionul hidroxil (OH- ). Aplicnd legea aciunii maselor sau legea echilibrului chimic (raportul dintre produsul concentraiilor ionilor rezultai prin disociere i concentraia moleculelor nedisociate este constant) n cazul reaciei de disociere a apei (2) se obine relaia:
[H + ] [OH - ] =K [H 2 O]

pH = lg

[ ]

1 = - lg H + + H

[ ]

Pe baza determinrilor de conductibilitate electric a apei pure s-a calculat valoarea produsului ionic al apei ( PH 2O ) care, la temperatura de +25C, este de 110-14. Deci, relaia precedent poate exprimat astfel: [H+] [OH-] = PH 2O = 1 10-14 (ioni gram/L)2 (7) + ntr-o soluie acid, concentraia H este mare, iar concentraia OH-, respectiv, sczut; ntr-o soluie alcalin, situaia este invers.

PH 2O , produsul ionic al apei, st la baza scrii de pH (Tabelul 8.1.) i reprezint modul de apreciere a concentraiei reale a ionilor de H+ i OH-, n orice soluie apoas pe intervalul de aciditate ntre H+ 1 M i OH- 1 M. Scara de pH a fost inventat de biochimistul danez S.P.L. Srensen ca o modalitate de evitare a unor numere dicile ca 0,0000001 sau 110-7, utilizate pentru exprimarea concentraiilor mici de H+ n lichidele biologice. El a denit termenul de pH ca:
pH = lg

[ ]

1 = - lg H + + H

[ ]

(5)

ntr-o soluie complet neutr, la 25C: [H+] [OH-] = 1 10-7 M pH-ul unei astfel de soluii este:
pH = lg 1 = 7,0 1 10 -7

ns, concentraia moleculelor de ap nedisociat poate considerat constant, deoarece ea variaz nensemnat prin disocierea unui numr foarte mic de molecule (disocierea este neglijabil). Deci, [H+] [OH-] = K [ H2O] = PH 2O (6) Constanta ( PH 2O ) reprezint produsul ionic al apei i se denete ca produsul dintre concentraiile la echilibru ale ionilor
124

Valorile pH-ului. Valoarea 7,0 pentru pH-ul unei soluii complet neutre nu este doar un numr ales arbitrar: ea provine din valoarea absolut a produsului ionic al apei la 25C. De menionat c scara de pH este logaritmic i nu aritmetic. Faptul c dou soluii difer ntre
125

ele numai printr-o unitate de pH nseamn c una din soluii are o concentraie a ionilor de hidrogen de 10 ori mai mare dect cealalt. Tabelul 8.1 Scara de pH
[H+], M 1,0 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12 10-13 10-14 pH 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 [OH], M 10 10-13 10-12 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 1,0
-14

Ind OH OH- + Ind


(culoare n mediu bazic) (culoare n mediu acid)

(2)

Reacia mediului Puternic acid Slab acid Neutr Slab alcalin

Puternic alcalin

8.1.2. Indicatorii de pH n scopul determinrii pH-ului diferitelor soluii incolore sau slab colorate se utilizeaz indicatori de pH, denumii i indicatori acido-bazici. Aceti indicatori sunt substane de natur organic, i anume: acizi sau baze organice foarte slabe care i modic culoarea n funcie de concentraia ionilor de H+ sau de OH-, respectiv de pH-ul unei anumite soluii. Indicatorii de pH acido-bazici (HInd, IndOH) disociaz dup schemele: H Ind H+ + Ind(1)
(culoare n mediu acid) (culoare n mediu bazic)

n ambele cazuri, moleculele nedisociate ale indicatorilor se deosebesc prin culoarea lor de ionii corespunztori. Prin adugarea de volume mici din soluia unui acid sau a unei baze la o soluie de indicator se produce o schimbare (virare) treptat a culorii soluiei ntr-un interval de pH determinat, interval care este caracteristic pentru ecare indicator. Astfel, fenolftaleina este un indicator care se comport ca un acid slab, ind incolor la pH < 8,0; dac la o soluie de fenolftalein se adaug treptat volume mici din soluia unei baze, apare o coloraie roz care se intensic pn la rou-carmin prin trecere la pH ~ 9,8. Deci, fenolftaleina indic o modicare a pH-ului care se evideniaz prin virarea culorii indicatorului respectiv; domeniul de pH cuprins ntre 8,2 - 10,0 reprezint intervalul de viraj al fenolftaleinei. Generaliznd, intervalul de viraj se denete ca domeniul de pH n afara cruia nu se observ o schimbare a culorii indicatorului. n intervalul de viraj, indicatorul prezint o coloraie cu nuan progresiv variabil. n Tabelul 8.2. sunt prezentai unii indicatori acido-bazici utilizai n volumetrie i intervalele lor de viraj. Tabelul 8.2. Indicatori acido-bazici
Indicator Albastru de timol Metil oranj Rou de metil Turnesol Fenolftaleina Timolftaleina Mediu acid rou rou rou rou incolor incolor Mediu alcalin galben galben galben albastru rou-carmin albastru Intervalul de viraj 1,2 2,8 3,1 - 4,4 4,4 6,2 5,0 8,0 8,2 10,0 9,3 10,5

126

127

Mecanismul de aciune. Unul dintre mecanismele prin care se explic modicarea culorii indicatorilor n funcie de pH se bazeaz pe teoria cromoforoionic, conform creia schimbarea de culoare este determinat de anumite modicri n structura moleculei indicatorului, precum i de modicarea gradului de disociere al acestuia. De exemplu, n cazul indicatorului metiloranj, virarea culorii se datoreaz unei modicri structurale de tipul:
SO3Na SO3Na

Culoarea nchis i intens a acestui compus este datorat prezenei grupei C = O i a grupei OH-, la un sistem compus din grupe C = C conjugate. De menionat c n soluii foarte puternic acide sau bazice, dincolo de limitele obinuite ale scrii de pH, indicatorii cu cromofor ionic variaz considerabil cu aciditatea mediului (efect de indicator). Astfel, fenolftaleina n acid sulfuric concentrat formeaz un cation de culoare oranj-brun, n acid clorhidric de 9-12 N formeaz o chinon neionizat de culoare roz-palid. 8.1.3. Determinarea experimental a pH-ului pH-ul unei soluii se poate determina prin metoda colorimetric sau prin metoda poteniometric. Metoda colorimetric. Principiul metodei. Acest principiu se bazeaz pe proprietatea indicatorilor de a-i modica culoarea n funcie de pH-ul soluiei; aceti indicatori sau amestecuri de indicatori (indicatori universali) au intervalul de viraj n diferite domenii de pH, unii posednd capacitatea de a-i modica culoarea ntr-un domeniu mai extins de pH. O modalitate simpl, expeditiv i cu o larg aplicabilitate pentru determinarea orientativ a pH-ului o constituie utilizarea hrtiei indicatoare de pH, care poate considerat ca procedeu colorimetric. Descriere. Hrtia indicatoare de pH se prezint sub form de benzi nguste de hrtie impregnat cu amestecuri de indicatori i care, n contact cu soluia al crei pH se determin, i schimb culoarea; nuana obinut se compar cu o scal etalon de culori pe care sunt indicate valorile de pH. Hrtia indicatoare de pH se prezint e sub forma unor carnete sau pliante, e sub forma unor discuri nchise ntr-o cutie de material plastic pe al crei capac sunt indicate nuanele de culori etalon corespunztoare diferitelor valori de pH.
129

N N

N + HCl N +

Cl-

N H3C CH3 H3C

N CH3

Forma ozoid (culoare galben n mediu alcalin)

Forma chinoid (culoare roie n mediu acid)

n cazul fenolftaleinei forma lactoid este incolor, insolubil n ap, solubil n alcool, trecnd, la o anumit valoare a pH-ului alcalin, n forma chinoid roie (anion bibazic).
OH C OH O C O
Forma ozoid (incolor n mediu acid)

OH + NaOH
-

C O COO Na
+

Forma chinoid (culoare roie n mediu alcalin)

128

n funcie de sensibilitate i de domeniul de pH pe care l acoper, hrtiile indicatoare de pH sunt de dou tipuri; a) hrtie indicatoare cu macrodiviziuni, care acoper domeniul de pH cuprins ntre 1 - 14, indicnd valoarea pH-ului din unitate n unitate; b) hrtie indicatoare cu microdiviziuni, care cuprinde numai anumite domenii de pH (de exemplu, pH = 1-5; pH = 6-8; pH = 8-10 etc.), indicnd valoarea pH-ului cu diferene de 0,2 uniti; acest tip de hrtie indicatoare prezint, deci, o sensibilitate mai mare. Determinarea pH-ului. Se prepar soluiile indicate n tabel i se amestec n proporiile indicate mai jos:
Na2HPO4 2H2O 6,6 10-2 M (cm3) KH2P04 6,6 10-2 M (cm3) pH-ul teoretic pH-ul determinat

se las n contact soluia cu hrtia indicatoare timp de cteva secunde; se compar apoi culoarea poriunii de hrtie indicatoare cu culorile etalon indicate pe scala de pH; se stabilete corespondena dintre culoarea dat de ctre soluia al crei pH se determin i culoarea similar de pe scala etalon; se citete valoarea pH-ului respectiv indicat pe scala etalon; se procedeaz n mod identic cu soluiile coninute i n celelalte eprubete; se dilueaz cu ap distilat soluiile coninute n eprubetele respective i se determin pH-ul, se obin, practic, aceleai valori ca pentru probele nediluate. Se constat c valoarea pH-ului foarte puin variaz cu diluia. Determinarea pH-ului n unele lichide biologice. Prin procedeul descris anterior, se determin pH-ul lichidelor biologice menionate n tabel sau al altor lichide. Se completeaz valorile de pH obinute i se compar cu valorile de pH normale.
Proba Ser uman Saliv Lapte Urin uman Suc de mere Suc de struguri pH Determinat .............. ............... ............... ................ ................ ................. Valori normale 7,3 7,4 6,8 7,2 6,5 6,7 5,8 6,4 2,5 4,2 3,0 4,0

Eprubeta

1 2 3 4 5 6 7

0,05 0,25 2,00 3,00 4,00 4,75 4,85

4,95 4,75 3,00 2,00 1,00 0,25 0,15

5,0 5,6 6,6 7,0 7,4 8,0 8,3

............... ............... ............... ............... ............... ............... ...............

n eprubete se determin pH-ul cu hrtie indicatoare de pH (cu macro- i microdiviziuni), efectundu-se urmtoarele operaii: dintr-o band de hrtie indicatoare de pH se taie cu o foarfec mai multe poriuni mici; pe cte o poriune de hrtie indicatoare, care se ine prins de un col cu o penset (se va evita contactul cu mna!), se depune cu o pipet (sau cu o baghet de sticl) o pictur din soluia coninut n eprubeta l;
130

Metoda poteniometric. Aceast metod se bazeaz pe determinarea diferenei de potenial, utilizndu-se un electrod de referin (calomel: Hg2Cl2) i un electrod de msur (electrod de
131

sticl); iniial, se determin diferena de potenial ce se stabilete ntr-o soluie tampon de pH cunoscut i, ulterior, se determin direct pH-ul soluiei de cercetat. Asemenea determinri de pH se efectueaz actualmente cu aparate sensibile denumite pH-metre, care indic direct pe un cadran i cu o mare precizie (de ordinul sutimilor) valorile de pH. O larg rspndire o are pH-metrul-milivoltmetrul de laborator pH-metru-voltmetru pH-673.M. pH-metru-voltmetru pH-673.M. Aparatul este constituit din dou module: convertizor, conine elementele schemei electrice; suport pentru xarea electrozilor i instalarea (paharului) cu soluia destinat msurrii pH-ului. 1. Principiul de funcionare a aparatului Funcionarea aparatului este bazat pe convertizarea forei electromotoare a sistemului electrodic, constituit din electrod de lucru i electrod de referin n curent continuu, proporional cu valoarea msurat. 2. Pregtirea de funcionare a pH-metrului - electrodul de lucru se conecteaz la borna ; - n calitate de electrod de referin se utilizeaz electrodul de sticl -IM3, care se conecteaz la borna ; - se controleaz zero mecanic al indicatorului. La necesitate, cu ajutorul urubelniei, acul indicatorului se duce la semnul iniial al scalei; - se conecteaz pmntarea aparatului; - se instaleaz comutatorul 7 (Fig. 8.3) n borna 6; - se deplaseaz comutatorul de compensare termic n poziia ; - se conecteaz aparatul la reea 220 V, 50 H; - se nclzete aparatul timp de 30 min. Convertizorul este gata de funcionare.
132

Fig. 8.1. Aspectul exterior frontal al pH-metru-voltmetrului pH-673M


a panoul frontal al convertizorului: 1 indicator de tensiune a alimentrii; 2 ntreruptorul de reea; 3 comutatorul de funcionare (mV, pH); 4 butonul poteniometrului de compensare a temperaturii; 5 comutatorul diapazoanelor de msurri; 6 microampermetru pH-metru. b suport pentru xarea electrozilor: 1 stativ metalic; 2 msu rotatorie; 3 susintor de electrozi, termometru sau termocompensator; 4 console.

Fig. 8.2. Panoul lateral al convertizorului


1 axa poteniometrului coordonatei pH; 2 butonul poteniometrului soluiei tampon ; 3 ni-comutator de ieire 0-2V; 4 ni-comutator de ieire 0-20mV.

133

xeaz n stativ i se conecteaz la borna al convertizorului, iar comutatorul tipului de termocompensare se instaleaz n poziia ABT; - se toarn ap n phrel, se deplaseaz msua ntr-o parte; se introduc electrozii n phru i sub el se aduce msua; - se regleaz poziia suporturilor astfel ca electrozii s ajung cu 4-5 mm fundul phruului. Modul de lucru - Electrozii de lucru la temperaturi joase (0 - 40C) pentru termostabilizare se in n ap distilat timp de 2-3 zile sau timp de o zi n soluie de HCl 0,1N. - nainte de scufundare n soluia tampon electrozii minuios se spal cu piseta cu ap distilat i resturile de ap se nltur cu hrtie de ltru. - Dup terminarea msurrilor electrozii trebuie s rmn cufundai n ap distilat sau n soluie de HCl 0,1N. Nu se admite uscarea electrozilor. - n primele cteva zile de exploatare a aparatului sau a electrodului de sticl este necesar de a efectua controlul aparatului (calibrarea) dup soluii tampon, apoi nu mai rar de o dat n 3 zile. - La msurarea pH-ului soluiilor a cror temperatur se modic n timpul msurrii se recomand de a utiliza compensarea termic automat: n locul termometrului de mercur se instaleaz termocompensatorul la o adncime de cel puin 30 mm i comutatorul de termocompensare se stabilete n poziia ABT. - Citirea valorii pH pe scala aparatului se face numai dup ce valoarea a devenit stabil; de obicei, nu mai mult de 3 min., iar n cazul soluiilor prea acide, prea alcaline sau a soluiilor cu capacitatea de tamponare prea joas timpul de stabilizare a indicaiilor pH-metrului se poate majora semnicativ (pn la 10 min.).
135

11

10

Fig. 8.3. Panoul dorsal al convertizorului


1 born pentru conectarea electrodului de sticl, 2 born pentru conectarea electrodului indicator de platin; 3 born pentru curentul de polarizare; 4 born pentru conectarea electrodului auxiliar, 5 comutator al tipului de compensare termic; 6 comutator pentru conectarea poteniometrului; 7 - poteniometru; 8 born pentru conectarea termocompensatorului TKA-3; 9 born pentru pmntarea aparatului; 10 cablu la reea; 11 purttor de siguran.

3. Pregtirea stativului pentru msurri n pahar - se xeaz msua rotatorie; - se xeaz susintorul de electrozi la o deprtare de msu n dependen de paharuele utilizate; - se aleg electrozii necesari i se pregtesc n conformitate cu cerinele prevzute n paaportul lor; - se xeaz termometrul; - n caz de utilizare a termocompensatorului automat el se
134

Citirea indicaiilor La stabilirea comutatorului n diapazonul 1 - 14 citirea indicaiilor se face dup scala de jos a aparatului, iar la lucrul n unul din intervalele nguste (1-4; 4-9, 9-14) citirea se face pe scala de sus a aparatului, utiliznd scala numeric corespunztoare diapazonului ales de msurare i poziiei respective a comutatorului de diapazon. Msurarea poteniometric a pH-ului 1. Soluii tampon pentru calibrarea pH-metrului i prepararea lor Soluiile tampon se prepar numai din reactivi de calicaie pentru pH-metrie, care se comercializeaz n form de titrustandard (xanale) pentru ecare denumire. Prepararea lor se efectueaz cu ap distilat decarbonat dup regulile de lucru cu xanale descrise n [6]. 2. Calibrarea aparatului dup soluiile tampon - Acordarea se efectueaz dup soluiile tampon valoare a cror se a n diapazonul (domeniul) valorilor pH-ului msurat la temperatura de 20C: 1 - 4 soluia tampon cu pH 1,68; 4 - 9 soluia tampon cu pH 6,88; 9 - 14 soluia tampon cu pH 9,22. - Se stabilete comutatorul diapazoanelor de msurri n poziia respectiv, se introduc electrozii n soluia tampon cu pH-ul necesar la 20C i cu butonul de calibrare se stabilete indicaia acului la valoarea pH-ului soluiei tampon. - Se controleaz aparatul dup celelalte dou soluii tampon. Eroarea msurrilor n aceste cazuri nu trebuie s depeasc valoarea de 0,05 pH. - n cazul cnd temperatura soluiei de msurat nu se schimb n procesul de msurare a pH-ului calibrarea se face nu la
136

20C, ci la temperatura soluiei de msurat aducnd la aceast temperatur soluiile tampon; iar valoarea pH-ului soluiilor tampon la temperatura respectiv se ia din tabelele anexate la paaportul aparatului. - pH-metrul este calibrat. - Se introduc electrozii n soluia de msurat i dup stabilizarea indicatorului (acului) se citete valoarea pH-ului. 8.2. Soluii tampon Strile de echilibru chimic n soluii apoase, precum i desfurarea reaciilor chimice i biochimice sunt condiionate de concentraia ionilor de hidrogen. ntr-adevr, majoritatea reaciilor chimice in vitro, ca i a reaciilor biochimice in vivo se efectueaz la valori riguros denite ale pH-ului. Pentru a-i menine echilibrul acido-bazic n condiii compatibile cu viaa, organismele posed mecanisme de reglare ne i precise care se opun oricror variaii de pH ce ar tinde s modice acest echilibru. Asemenea mecanisme de reglare se realizeaz prin intervenia unor sisteme tampon, care au rolul de a menine pH-ul n limitele unor valori optime pentru desfurarea reaciilor i proceselor biochimice. De exemplu, plasma sanguin reprezint un sistem tampon foarte eficient care menine valoarea pH-ului din snge n limitele 7,2 - 7,3. De asemenea, enzimele i exercit aciunea lor catalitic la valori de pH bine denite. Soluia tampon se definete ca un amestec n echilibru i n anumite proporii ntre un acid slab i baza sa conjugat (pereche acid - baz conjugat) care, la adugarea de substane cu caracter acid sau alcalin, are proprietatea de a se opune modicrilor de pH, meninnd astfel valoarea pH-ului n limite constante.
137

Soluiile tampon prezint urmtoarele caracteristici: - au o concentraie a ionilor de hidrogen denit i constant, invariabil prin diluare; - creeaz ntr-o soluie dat o anumit concentraie a ionilor de hidrogen; - menin aceast concentraie n anumite limite; - se opun unor variaii brute ale pH-ului unei soluii. Rezult, astfel, c soluiile tampon dein rolul esenial de a menine pH-ul unei soluii la o valoare constant; procesul respectiv prin care se realizeaz aceast aciune se numete tamponare. 8.2.1. Mecanismul de aciune a soluiilor tampon Conform teoriei lui Brnsted, un acid este orice substan care poate s doneze un proton ( H + ) , iar o baz este o substan care poate s accepte un proton (H+). Expresia generalizat pentru un acid este: HA = H+ + A(acid) (proton) (baz)

n principiu, aciunea de tamponare exercitat de o soluie tampon se realizeaz prin urmtorul mecanism: - n prezena sau la adaosul unui acid n anumite proporii, baza corespunztoare, respectiv anionii aai n soluia tampon, formeaz cu ionii H+ un acid care este slab disociat; n acest mod, se neutralizeaz efectul acidului adugat, pH-ul soluiei rmnnd practic nemodicat; - n prezena sau la adaosul unei baze n anumite proporii, ionii H+ ai acidului care se gsesc n soluia tampon formeaz cu ionii OH- molecule de ap puin disociate; astfel, se neutralizeaz efectul bazei adugate prin formarea de ap, pH-ul soluiei rmnnd practic nemodicat. Pornind de la reacia general: Acid = Baz conjugat + H+, mecanismul de aciune al soluiilor tampon poate redat astfel: - la adugare de acid (H+) baza conjugat reacioneaz cu H+, iar echilibrul se deplaseaz spre stnga (pH-ul nu se modic); - la adugare de baz (OH-) acidul reacioneaz cu OH-, iar echilibrul se deplaseaz spre dreapta (pH-ul nu se modic). Exemplul 1. Se consider soluia tampon format din mestecul: CH3COOH i CH3COONa, care disociaz astfel: CH3COOH = CH3COO- + H+ CH3COONa = CH3COO- + Na+ Aplicnd legea aciunii maselor la disocierea acidului acetic, la echilibru se obine relaia:

Expresia generalizat pentru o baz este: A- + H+ = HA


(baz) (proton) (acid)

Deci, HA constituie un acid, deoarece poate furniza un proton; anionul A- reprezint baza conjugat respectiv, deoarece poate accepta un proton pentru a forma acidul HA. Exemple de acizi: HC1 = H+ + ClCH3COOH = H+ + CH3COONH4+ = H+ + NH3 Exemple de baze: Cl- + H+ = HCl CH3COO- + H+ = CH3COOH NH3 + H+ = NH4+
138

[ CH COO ][ H ] =K
[CH 3COOH ]
139
3 +

(1)
acet

Din relaia (1) rezult valoarea concentraiei ionilor de hidrogen:


CH COOH ] [H ]= [[ K CH COO ]
+ 3 3 acet.

(2)

Deci, concentraia ionilor de hidrogen din soluie este dat de raportul dintre concentraia moleculelor nedisociate de acid acetic i concentraia anionilor acidului acetic. Dac soluiei tampon respective i se adaug un acid oarecare (de exemplu, HC1), ionii H+ pui n libertate prin disocierea acestui acid vor reaciona imediat cu anionii CH3COO-, conform reaciei: H + + CH 3COO - CH 3COOH Se formeaz, astfel, molecule nedisociate de acid acetic care este un acid slab. n acest mod, se restabilete echilibrul conform relaiei (1), iar concentraia ionilor de hidrogen rmne neschimbat. n aceste condiii, valoarea pH-ului nu se modic. n mod analog, dac soluiei tampon i se adaug o baz (de exemplu, NaOH), ionii OH- rezultai prin disocierea bazei vor reaciona imediat cu rezerva de molecule de acid acetic existent n soluie. Acidul acetic disponibil va disocia pentru a furniza protoni suplimentari care reacioneaz cu ionii OH-. Vor rezulta, astfel, sarea respectiv i molecule de ap puin disociate; prin aceast reacie se va restabili echilibrul iniial i, deci, valoarea concentraiei ionilor de hidrogen conform relaiei (1). n aceste condiii, valoarea pH-ului nu se modic. Deci: CH3-COOH = CH3-COO- + H+ Na+ OH- CH3-COONa H 2O Exemplul 2. Se consider sistemul tampon de fosfai reprezentat prin reacia: H2PO4 = HPO42 + H+
140

- la adugare de acid (H+), HPO42 reacioneaz cu H+ pentru a forma un acid mai slab (H2PO4), echilibrul deplasndu-se spre stnga; pH-ul rmne astfel constant, - la adugarea de baz (OH), HPO42 reacioneaz cu OH pentru a forma H2O, iar echilibrul se deplaseaz spre dreapta; pH-ul rmne astfel constant. Exemplul 3. Fosfaii reprezint unul dintre sistemele tampon ale sngelui. Efectul unui acid (HA) mai puternic dect fosfatul monobazic BH2P04 (B = Na sau K), acid prezent n snge i care tinde s modice pH-ul, va anulat, deoarece fosfatul bibazic B2HPO4 din snge va reaciona cu acidul (HA); se vor forma, astfel, o sare neutr (BA) i fosfat monobazic (BH2P04), produi de reacie care nu vor permite modicarea valorii pH-ului: B2HPO4 + HA BH2P04 + BA n mod analog, aciunea unei baze (BOH) va , practic, anulat, deoarece aceasta va reaciona cu fosfatul monobazic (BH2PO4) existent n snge, formnd ap i fosfat bibazic (B2HPO4); datorit acestui mecanism, valoarea pH-ului se va menine n limitele ziologice: B2HPO4 + BOH BH2PO4 + H2O n concluzie, soluiile tampon au proprietatea de a menine, practic, constant concentraia ionilor de hidrogen, respectiv pH-ul cnd se adaug cantiti mici de acid sau de baz. Aceste soluii posed, deci, o rezerv de aciditate sau de alcalinitate reacionnd amfoter, de aceea amestecurile care compun soluiile sau sistemele tampon poart denumirea de amfolii. Capacitatea de tamponare a unei soluii tampon este determinat de doi factori: concentraia molar a componenilor tamponului (care este direct proporional cu capacitatea de tamponare) i raportul dintre concentraia acidului slab i a bazei conjugate.
141

8.2.2. Determinarea capacitii de tamponare a plasmei sanguine Principiul. Soluia indicator rou de fenol prezint dou zone de viraj distincte ntre pH 6,8 (coloraie galben) i pH 8,4 (coloraie roie). Reactivi: l. Soluie de indicator rou de fenol 0,1%; 2. Soluie de HC1 0,01 N; 3. Soluie de NaOH 0,01 N; 4. Ser ziologic (soluie de NaCl 0,90%); 5. Plasm sanguin (obinut din snge recoltat pe anticoagulant). Tehnica: Se realizeaz urmtoarea schem experimental:
Proba Plasm, cm3 Ser ziologic, cm3 Rou de fenol, cm3 HCl, cm3 NaOH, cm3

Eprubeta A Eprubeta B Eprubeta C Eprubeta D

1 1 -

4 4 5 5

0,1 0,1 0,1 0,1

0,1 0,1 -

0,1 0,1

Rezult, deci, c adugarea de HC1 a produs o modicare de pH a soluiei din eprubeta C, n comparaie cu soluia din eprubeta A, aceast soluie meninndu-i pH-ul iniial. Adugarea de soluie de NaOH la coninutul eprubetelor B i D ilustreaz, de asemenea, capacitatea de tamponare a plasmei sanguine manifestat prin meninerea constant a valorii pH-ului. n concluzie, soluia coninnd plasm sanguin se comport ca un sistem tampon care, prin capacitatea sa de tamponare, se opune modicrii pH-ului iniial la adugare de acid sau baz. Soluiile din eprubetele C i D nu conin plasm i, deci, sisteme tampon capabile s menin pH-ul constant; aceste soluii nu manifest capacitate de tamponare a mediului i, n consecin, pH-ul variaz imediat la adugare de acid sau baz. Rezult, deci, c sngele i, respectiv, plasma sanguin funcioneaz ca un mediu tamponat datorit sistemelor tampon pe care le conin i care menin valorile pH-ului n limite compatibile cu activitatea ziologic. 8.2.3. Modaliti de preparare a unor soluii tampon A. Nomogramele pentru prepararea soluiilor tampon permit calcularea rapid a cantitii componenilor soluiei tampon cu pH-ul i tria ionic solicitat. Nomograma pentru prepararea soluiilor tampon fosfai i nomograma pentru soluii tampon acetat pot gsite n [6]. B. Tris: soluii tampon compuse pe baza clorurii tris (oximetil aminometanul) (masa molecular 121,14); apar n comer n form de soluii cu denumirea Trizma sau n form solid a clorhidrailor. n dependen de concentraie ele posed urmtorul pH: 7,55-9,67 (5C); 7,00-9,10 (25C) i 6,70-8.79 (37C). De exemplu, soluia de 0,05 M posed pH 9,5, 8,9 i 8,6 la temperatura de 5, 25 i 37C respectiv. C. Succinat: soluie tampon preparat din srurile acidului succinic monosodic (masa molecular 140) i disodic (masa
143

Rezultate i interpretare. Iniial, eprubetele A i B, care conin plasm sanguin, ser ziologic i soluie de indicator rou de fenol prezint o coloraie n general asemntoare (plasma avnd o nuan uor spre portocaliu datorit faptului c este mai alcalin dect soluia de ser ziologic) cu cea a eprubetelor C i D care conin numai ser ziologic i soluie de indicator rou de fenol. Adugarea de HC1 n eprubeta A nu indic nici o modicare de culoare a indicatorului, respectiv nici o modicare de pH, n raport cu culoarea pe care o prezint coninutul eprubetei B. Adugarea de soluie de HC1 n eprubeta C determin, ns, o virare a culorii soluiei respective, care devine galben n raport cu coninutul eprubetei D.
142

molecular 162). Soluia ce conine cte 0,05 M a ecrei din aceste sruri posed un pH de 5,34 la temperatura de 25C. D. Carbonat: soluie tampon, preparat din NaHCO3 i Na2CO3. Soluia ce conine cte 0,05 M a ecrei din aceste sruri va poseda un pH de 9,93 la temperatura de 25C. E. Fosfai: soluia de fosfat trisodic Na3PO4 0,05 M are un pH de 12,04 la temperatura de 25C. F. Soluii tampon pentru electroforez i cromatograe sunt prezentate n [13,14]. 8.2.4. Tria ionic Concentraia ionic din celule, din unele lichide biologice i, n general, concentraia unor soluii care constituie mediul de reacie condiioneaz efectiv desfurarea efectiv a anumitor reacii biochimice. Concentraia optim a unei soluii coninnd diferii ioni se reprezint prin noiunea de trie (for) ionic (). Tria ionic se denete ca semisuma produsului dintre concentraia molar a speciilor de ioni constitueni ai unei soluii i ptratul sarcinii electrostatice (valena) a acestor sarcini (z). Tria ionic se exprim prin urmtoarea relaie: 2 1 2 C Z 2 + C2 Z 2 + C 3 Z 32 sau m = i Z i (1) m= 1 1 2 i 2 n care: tria ionic; Ci concentraia molar a speciilor de ioni i; Zi sarcina electrostatic a speciilor de ioni (respectiv, valena ionilor constitueni); simbolul de nsumare a tuturor termenilor CZ2 pentru ecare specie ionic din soluie. Exemple de calculare a triei ionice. Se calculeaz tria ionic pentru urmtoarele soluii: - soluie ziologic NaCl (15,4 10-2 M); - soluie tampon CH3COONa (2 10-2 M) - CH3COOH (3,5 10-1 M); - soluie tampon KH2PO4 (6,6 10-2 M) - Na2HPO4 (6,6 10-2 M).
144

Pentru nlesnirea calculelor se ntocmete urmtorul tabel, pe baza parametrilor ecuaiei (1):
Componentele Molaritate soluiei NaCl 0,154 Ioni Na+ Cl CH3COONa CH3COOH 0,020
-

C 0,154 0,154 0,020 0,020 0,035 0,035 0,066 0,066 0,066 0,066

Z2 1

m=

0,308 1 1 1 0,110 1 1 1 1 0,528 1 4

0,154

Na+ CH3COOH+ 0,035 CH3COOK+ KH2PO4 Na2HPO4 0,066 H2PO42Na 0,066


+

0,055

0,264

HPO42-

Din analiza ecuaiei (1) rezult c tria ionic este o caracteristic a unei soluii care reect att concentraia ionilor componeni, ct i natura acestora. Activitatea celular este dependent de ambii factori, iar valoarea optim a triei ionice ziologice este de aproximativ 0,15. De aceea, n determinrile experimentale este necesar ca esuturile, respectiv celulele, s e plasate sau meninute n soluii cu concentraie ionic de cel puin aproximativ echivalent cu concentraia ionic a mediului intracelular (citoplasm); n caz contrar, celulele e se vor liza datorit ptrunderii apei (umare), deoarece tria ionic a lichidului extracelular este mult mai mic dect cea a citoplasmei, e se vor ratatina datorit pierderii de ap, deoarece tria ionic a lichidului extracelular este mult mai mare dect valoarea 0,15.
145

Tria ionic a soluiilor tampon folosite n analizele biochimice are valori cuprinse ntre 0,01 i 0,2. n general, tria ionic a soluiilor tampon utilizate este dependent de concentraia soluiei supus analizei, crescnd o dat cu aceast concentraie. 8.3. Analiza spectrofotometric Spectrofotometria constituie o metod de analiz zicochimic al crei principiu se bazeaz pe msurarea, n condiii standard, a intensitii de culoare a unei soluii, intensitate care este proporional, n anumite limite, cu concentraia componentului chimic ce se dozeaz. Gradul de absorbie a radiaiei poate exprimat prin transmitan (transmisie) sau absorban (absorbie). Aarea concentraiei componentului de analizat se face pe baza unei curbe de etalonare (de calibrare) absorban - concentraie sau transmitan - concentraie. n cazul n care substana de determinat nu absoarbe lumina n domeniul spectral n care se lucreaz, se recurge la o reacie chimic de formare a unui produs colorat, a crui concentraie s e proporional cu concentraia componentului n cauz. Acest domeniu al spectrofotometriei este denumit de fotocolorimetrie (lat. photos lumin; colori - culoare). Colorimetria este pe larg rspndit n biochimie, deoarece deseori se reuete de a gsi astfel de reacii, n care cantiti foarte mici de substan pot forma coloraii foarte intense. Metodele fotometrice sunt simple, expeditive i permit dozarea unor substane n prezena altora, fr a necesar o separare prealabil a acestora. De aceea, aceste metode au o larg aplicabilitate pentru dozarea unei game variate de componente biochimice din esuturi i lichide biologice.
146

8.3.1. Noiuni generale de spectrofotometrie Termenul generic de lumin desemneaz energia radiant constituit din fotoni (cuante de energie luminoas), lungimi de und () care se ncadreaz n domeniul vizibil, precum i din lungimi de und din domeniul invizibil: mai scurte (ultraviolete) i, respectiv, mai lungi (infraroii). Astfel, lumina reprezint un ansamblu complex de mai multe radiaii luminoase de culori diferite, constituind un spectru de energie radiant alctuit din anumite lungimi de und pe care ochiul le percepe ca lumin alb. Deoarece lumina se propag prin unde, lungimea de und reprezint o mrime caracteristic ce se denete ca distana dintre dou maxime (vrfuri). Aceast distan, respectiv lungimea de und (), se exprim n nanometri (nm): l nm = l 10-9 nm = l 10-6 mm sau: l nm = 1m (milimicron) = 10 (l angstrm = 10-8 cm). Energia radiant se caracterizeaz, astfel, prin lungimea sa de und. Majoritatea corpurilor posed capacitatea de a absorbi selectiv energie radiant de diferite lungimi de und. Ochiul uman percepe radiaiile luminoase n domeniul = 400-760 nm, radiaii care constituie domeniul vizibil din spectru. Lungimile de und mai mari de 760 nm constituie domeniul infrarou (IR) care este invizibil, iar lungimile de und mai mici de 400 nm constituie domeniul ultraviolet (UV) care, de asemenea, este invizibil. Radiaiile luminoase cu lungimi de und din domeniile IR i UV pot msurate cu aparate special construite, denumite spectrofotometre. Lumina obinuit (policromatic). poate descompus prin diferite procedee (prisme, reele de difracie) n radiaii luminoase cu lungimi de und diferite. Radiaia compus dintr-o singur lungime de und sau dintr-un domeniu foarte ngust de lungimi de und izolat din spectru poart denumirea de radiaie monocromatic.
147

n tabelul ce urmeaz este redat relaia dintre valorile ale diferitelor radiaii luminoase i culoarea caracteristic pentru anumite domenii din spectrul luminii. Majoritatea substanelor chimice prezint proprietatea de a absorbi selectiv energia radiant de o anumit lungime de und. Astfel, o soluie apare colorat datorit faptului c ea absoarbe toat lumina incident, cu excepia aceleia pe care o percepe ochiul.
(nm) Domeniul din spectru Culoarea observat Culoarea complementar

180 - 400 400 440 440 500 500 580 580 600 600 620 620 760 760 - 2000

U.V. Vizibil Vizibil Vizibil Vizibil Vizibil Vizibil I.R.

Invizibil Violet Albastr Verde Galben Portocalie Roie Invizibil

Galben-verde Galben Roie Albastr Albastr-violet Verde-albastr -

De exemplu, o soluie apare colorat n rou, deoarece absoarbe radiaiile albastre cu , mai mici i, n consecin, va transmite numai radiaia roie cu , cuprins ntre 620 i 760 nm; prin analogie, o soluie colorat n albastru va absorbi radiaii roii cu mai mari i, n consecin, va transmite numai radiaia albastr cu , cuprins ntre 440 - 500 nm. 8.3.2. Legile spectrofotometriei n general, cnd un fascicul de lumin cu intensitatea I0 (lumin incident) cade asupra unui corp, o parte din intensitatea acestei lumini incidente este absorbit de ctre corp (Ia), iar o alt parte este transmis (trece) prin corp (It) (se consider reexia neglijabil), n conformitate cu relaia:
148

I0 = Ia + It Deoarece intensitatea luminii incidente (I0), ca i a luminii transmise (It), pot determinate direct, rezult c valoarea intensitii luminii absorbite (Ia) se poate obine din relaia: Ia = I0 It. Pe baza acestor date experimentale, Lambert a formulat una dintre legile colorimetriei, i anume: straturi de soluii cu aceeai grosime i care conin dizolvat o anumit substan absorb totdeauna n condiii experimentale identice aceeai cantitate din lumina incident. ntre intensitatea luminii transmise (It) dup trecerea printr-un strat de lichid, intensitatea luminii incidente (I0) i grosimea stratului de lichid absorbant (d) exist o relaie care, n sistemul de logaritmi zecimali, se exprim prin urmtoarea ecuaie: (1) It = I0 10-kd n care k este coecientul de extincie. Prin coecientul de extincie (k) se poate caracteriza capacitatea de absorbie a unei substane n soluie; acest coecient depinde de natura substanei care absoarbe i de lungimea de und a luminii incidente. S-a demonstrat experimental c, n cazul absorbiei luminii de ctre diferite soluii, coecientul k este direct proporional cu concentraia substanei absorbante: k=c (2) n care: c este concentraia substanei; coecient care nu depinde de concentraie (este o constant a substanei absorbante). poart numele de coecient molar de extincie i reprezint extincia unei soluii cu concentraia de l M, parcursul radiaiei de lumin cu o anumit lungime de und prin soluie ind de l cm. Deoarece coecientul molar de extincie este, de regul, foarte mare, se utilizeaz o alt mrime, absorbana luminii de ctre soluia ce conine proba de analizat n concentraie de 1% n cuva cu 1% grosimea de l cm: E1 cm
149

nlocuind n ecuaia (1) valoarea lui k din ecuaia (2), se obine relaia: It = I0 10-cd (3) unde: It intensitatea radiant emergent din cuva cu proba; I0 intensitatea radiant incident pe cuva care conine proba; coecientul molar de extincie; d grosimea stratului de prob din cuv; c concentraia componentului care absoarbe radiaia n moli/L sau g/cm3. Aceast relaie exprim legea fundamental a colorimetriei, cunoscut sub numele de legea Lambert - Beer. Ea este valabil numai pentru lumin cu o anumit lungime de und, adic pentru lumina monocromatic. 8.3.3. Denirea unor noiuni utilizate n spectrofotometrie Transmitana sau transmisia (T). Cnd lumina monocromatic incident cu intensitatea I0 trece printr-un strat de lichid optic omogen, intensitatea luminii transmise (It) prin soluie va mai mic dect cea a luminii incidente (I0), deoarece o parte din lumin a fost absorbit. I Raportul t denete mrimea denumit transmisie (T). I0 I Deci: T = t =10-cd (4) I0 Transmitana variaz ntre 0 i l. Adesea se utilizeaz transmisia procentual (T%): I T % = t 100 (5) I0 Absorbana sau absorbia (A) reprezint gradul n care intensitatea luminii incidente (I0) este micorat datorit proprietii absorbante a soluiei pe care o parcurge radiaia respectiv. Absorbia este dat de raportul:
150

A=

I0 - It I0

(6)

Ea poate varia ntre 0 i . ntre absorban i transmitan exist o relaie invers exponenial i, deci, acolo unde absorbana este minim transmitana este maxim, respectiv invers. Deoarece ntre absorban i concentraie exist o relaie de proporionalitate, iar ntre transmitan i concentraie exist o relaie exponenial (ecuaia 4), experimental se determin de obicei absorbana i mai puin transmitan. Extincia (E), deseori denumit incorect densitatea optic (D), reprezint logaritmul mrimii reciproce (inverse) a transmisiei (T):

E = lg

I 1 = lg 0 = ecd . T It

(7)

Deci: E = cd. (8) Extincia este o mrime care se determin experimental i depinde de grosimea stratului de soluie colorat (d) care se analizeaz. La grosimi egale ale stratului de lichid, extincia este direct proporional cu concentraia. n condiii standardizate de lucru, i d sunt constante, i n consecin: E = kc. (9) Rezult, astfel, c extincia (E) este direct proporional cu concentraia (c) a unei substane dintr-o soluie colorat. Relaia dintre extincie i concentraie, exprimat prin ecuaia (9), se reprezint grac printr-o dreapt. n cazul n care soluia analizat nu se supune legii LambertBeer, proporionalitatea direct dintre extincie i concentraie nu se mai pstreaz i, n consecin, reprezentarea E = f(c) nu mai respect forma unei drepte. Deci, relaia extincie-concentraie este liniar (proporionalitate direct) ntr-un anumit domeniu de concentraie a substanei analizate,
151

domeniu n care se aplic legea Lambert-Beer. Abateri de la aceast lege pot surveni graie faptului c sub aciunea luminii unele substane se pot ioniza, la concentraii nalte se pot polimeriza, se pot coagula, ceea ce duce la majorarea sau la diminuarea extinciei. Domeniul optim al extinciei (unde eroarea de determinare a concentraiei este mic) este cuprins ntre 0,2 i 0,7. Viteza de modicare a extinciei (V) reprezint diferena extinciilor ntr-un interval de timp t, n care t poate avea valorile de 1, 2, ... 8 i 9 minute: E - E1 (10) V= 2
t

Reiese, astfel, c pentru diferite concentraii (c) ale aceleiai soluii de analizat vor corespunde anumite extincii (E). Pentru un ir de determinri experimentale se obin n conformitate cu relaia general (12) urmtoarele rapoarte: E E1 E 2 = = 3 .......... ..... k c1 c2 c3 sau pentru o pereche de rapoarte: E1 E 2 = . c1 c2 Se deduce, astfel, c: E1c2 = E2c1, de unde:

Concentraia C = E F

(11)

unde: F coecientul de validare, determinat n prealabil dup o curb de etalonare cu valoarea n limitele de 0,001 - 0,999. Relaia dintre fraciunea de lumin absorbit, transmitan i extincie este reprezentat n tabelul de mai jos.
Lumina absorbit 0 25 50 75 83 90 95 99 99,9 100 Transmitana (T) % 100 75 50 25 17 10 5 1 0,1 0 fraciunea 1,0 0,75 0,50 0,25 0,17 0,10 0,05 0,01 0,001 0 1 T 1 1,3 2 4 6 10 20 100 1000 Extincia 0,00 0,12 0,30 0,60 0,95 1,00 1,30 2,00 3,00

c1 =

E1 c2 . E2

(13)

Pentru determinrile experimentale se noteaz: c1 = concentraia necunoscut a probei care se analizeaz = cp; c2 = concentraia cunoscut a unei soluii etalon de referin = cet; E1 = extincia probei de analizat, extincie care se determin experimental = Ep; E2 = extincia soluiei etalon care se determin, de asemenea, experimental = Eet. n aceste condiii i innd seama de relaia (13), formula general de calcul care se aplic pentru determinrile fotometrice (dozri) este urmtoarea: Ep cp = cet . (13) Eet

Formula general de calcul n analiza fotometric Din relaia (9) rezult c: E k= c


152

(12)
153

8.3.4. Categorii de soluii n spectrofotometrie n spectrofotometrie se lucreaz cu trei categorii de soluii, dup cum urmeaz: 1) soluia de analizat conine elementul sau elementele, pe care dorim s le determinm; 2) soluii etalon au o compoziie calitativ similar cu soluia de analizat i conin concentraii cunoscute din elementul sau elementele pe care dorim s le analizm. Ele se folosesc la etalonarea aparaturii pentru determinri cantitative; 3) soluia martor (referin) sau blanc conine toi reactivii n aceeai concentraie ca i soluia de analizat i etaloanele, dar nu conine elementul sau elementele de analizat. Rolul acestor soluii este de a compensa absorbia luminii de ctre pereii cuvei, solvent i reactiv, deoarece valoarea de I0 se consider nu lumina incident la cuv ci radiaia care a strbtut cuva cu proba martor. 8.3.5. Aparatura pentru determinri spectrofotometrice Principii generale. Analiza fotometric se bazeaz pe msurarea, n condiii standard, a intensitii radiaiei luminoase, utiliznd o anumit lungime de und () izolat din spectru prin anumite procedee. Aparatele de msurare concepute n baza acestui principiu poart denumirea generic de fotometre; acestea pot fotometre cu ltre colorate care permit selectarea unei anumite lungimi de und i spectrofotometre cu prisme sau cu reea de difracie pentru descompunerea luminii incidente n benzi spectrale. Spectrofotometria se bazeaz pe msurarea absorbiei unei radiaii luminoase monocromatice care strbate o soluie de o anumit grosime i cu o anumit concentraie n componentul biochimic de dozat, prin comparaie cu o radiaie de lumin identic ce strbate o soluie de referin (martor sau blanc) n care nu este prezent componentul de dozat.
154

Spectrofotometrele implic determinarea valorii absolute a extinciei (E) sau a densitii optice (D). Diferitele tipuri de fotometre pot izola i utiliza din spectrul luminii domenii cu o anumit lungime de und (lumin monocromatic). Spectrofotometrele sunt dotate cu un sistem de selectare (izolare) a anumitor radiaii din spectru cu o lungime de und dorit, excluznd radiaiile cu alte lungimi de und; acest sistem poart denumirea de monocromator. n sistemul optic al fotometrelor, nainte i dup monocromator, se intercaleaz diferite lentile i fante care permit dirijarea radiaiei luminoase i, respectiv, izolarea unor poriuni nguste ale acesteia. Lungimea de und selectat trebuie s corespund maximului de absorbie al soluiei colorate de analizat (sau s minimalizeze absorbia unor substane care pot s interfereze), n scopul de a obine o sensibilitate maxim. Schema general. Schema bloc a unui spectrofotometru conine o secven alctuit din urmtoarele componente principale:
Sursa de curent Sursa de radiaie Filtre colorate sau monocromator Compartiment cu cuve Msur i aaj Amplicator Fotodetector Fant Obturator

Sursele de radiaie sunt becuri cu lament de wolfram pentru domeniul vizibil al spectrului (400-700 nm) i lmpi de hidrogen sau de deuteriu pentru ultraviolet (200-400 nm). Alimentarea lor trebuie fcut de la surse bine stabilizate electronic pentru a se asigura constana radiaiei i valabilitatea msurtorilor.
155

Selectarea i izolarea lungimii de und se face cu ltre sau monocromatoare. Filtrele se utilizeaz n aparatele de performan medie, pentru determinri n domeniul vizibil, i permit selectarea numai a ctorva lungimi de und. Monocromatoarele sunt dispozitive mai complexe, bazate pe dispersia radiaiei continue de ctre o prism sau o reea de difracie. Cu ajutorul lor se pot separa radiaiile de lungime de und dorit att n regiunea vizibil, ct i ultraviolet a spectrului. Monocromatoarele permit izolarea unei benzi spectrale mai nguste dect cea izolat de ltre, de multe ori limea acestei benzi ind reglabil prin intermediul unei fante. n realitate, la cuv nimerete nu o radiaie de o singur lungime de und, ci o radiaie cuprins ntr-un anumit domeniu al lungimilor de und. Acest domeniu poart denumirea de lime spectral a fantei. Cuvele sunt componentele de mare importan ale sistemului optic al spectrofotometrului, considerent din care este necesar o comportare foarte grijulie cu ele: n nici un caz nu se admite atingerea cu degetele a pereilor optici ai cuvei. n ultraviolet se utilizeaz cuvele de cuar, iar n domeniul vizibil cuve de sticl. Fotodetectorii utilizai sunt, n ordinea sensibilitii lor, fotoelemente, fotocelule i fotomultiplicatori. Acestea din urm se utilizeaz numai n spectrofotometrele de performan destinate nregistrrii spectrelor att n ultraviolet, ct i n vizibil. Amplcatorul pentru fotocurent este, de regul, un convertor curent-tensiune urmat de un amplicator de tensiune. Instrumentul de msurare poate de tipul analogic (instrument cu ac) sau digital, caz n care se compune dintr-un convertor analog numeric i un sistem de aaj numeric (o main microelectronic de calcul i comand). Spectrofotometrul a crui schem a fost prezentat mai sus face parte din categoria aparatelor cu monofascicul, destinat n
156

primul rnd determinrilor cu caracter cantitativ. Uneori se utilizeaz instrumente cu dublu fascicul. La acestea, radiaia monocromatic este separat n dou fascicule, care sunt trecute simultan sau alternativ prin dou cuve: una cu proba i una cu soluia de referin. Prelucrarea optic sau electronic a semnalului rezultat permite nregistrarea direct a absorbiei sau transmitanei n funcie de lungimea de und. Spectrofotometrul tip SPEKOL. Principiul de funcionare. Aparatul SPEKOL este un fotometru cu celul fotoelectric ce funcioneaz cu un singur fascicul de lumin; msurarea extinciei se efectueaz prin metoda deviaiei: n calea radiaiei monocromatice se aeaz succesiv soluia de referin (martorul) i ulterior soluia coninnd proba de analizat. Fasciculul de lumin emis de o lamp este descompus spectral cu ajutorul unei reele de difracie, obinndu-se radiaii monocromatice de anumite lungimi de und. Radiaia monocromatic, stabilit n funcie de culoarea soluiei de analizat, strbate stratul de lichid al probei ce se analizeaz i, ulterior, cade pe celula fotoelectric, determinnd astfel apariia unui fotocurent. Acest fotocurent exprim gradul de transmisie a radiaiei care a strbtut soluia de analizat (i, respectiv, proba martor) i se evalueaz pe scala instrumentului de msur n valori de extincie. Extinciile citite sunt proporionale cu intensitatea culorii soluiei de analizat i, deci, cu concentraia componentului de dozat. Componentele i principiul de funcionare a spectrofotometrului de tip SPEKOL sunt prezentate n gura 8.4. Manipularea aparatului i tehnica de lucru. Tehnica ntrebuinrii aparatului i a determinrii experimentale implic urmtoarea succesiune de operaii; - conectarea aparatului la reeaua de curent prin deschiderea comutatorului amplasat pe redresor (pies anex a aparatului);
157

- aezarea obturatorului n poziia 0; - alegerea lungimii de und ( = nm) indicat pentru efectuarea determinrii, prin rotaia tamburului cu urub micrometric 2; - reglarea instrumentului de msurare 4 prin aducerea acului indicator n poziia 0 a scalei cu ajutorul butonului 5; - aezarea obturatorului 1 n poziia l (deschis), poziie care permite trecerea luminii monocromate n direcia cuvei cu soluie i a celulei fotoelectrice; - reglarea instrumentului de msurare 4, prin aducerea acului indicator n poziia 100 a scalei cu ajutorul butonului 6; - nchiderea obturatorului 1 (poziia 0); - introducerea cuvei cu soluia de referin (martor) ntr-unul din cele dou compartimente ale suportului glisant 3 i deplasarea corespunztoare a acestui suport, astfel nct cuva s e amplasat exact n dreptul fantei prin care trece radiaia luminoas; - deschiderea obturatorului (poziia 1) i citirea valorii extinciei pe scala respectiv (indicat cu E) a instrumentului de msurare; - introducerea cuvei coninnd soluia de analizat n cellalt compartiment rmas liber al suportului glisant i amplasarea acestei cuve exact n dreptul fantei prin care trece radiaia luminoas; - citirea valorii extinciei pe scala respectiv (indicat cu E) a instrumentului de msurare; - nchiderea obturatorului 1 (poziia 0) i deconectarea aparatului de la reeaua de alimentare prin nchiderea comutatorului amplasat pe redresor; - se calculeaz diferena dintre extincia probei de analizat (Ep) i extincia probei martor (Em). Valoarea astfel obinut permite determinarea concentraiei substanei de dozat utiliznd e metoda curbei etalon, e metoda comparaiei cu o soluie etalon de concentraie cunoscut.
158

Fig. 8.4. Spectrofotometrul Spekol


1 - obturator, care este nchis n poziia 0 i deschis n poziia 1; 2 - tambur pentru fixarea lungimii de und; 3 - cuv; 4 - instrumente de msurare (galvanometru); 5,6 - butoane de reglare pentru poziiile 0 i, respectiv, 100 ale instrumentului de msurare.

Spectrofotometrul tip SPEKOL 20. Spectrofotometrul SPEKOL 20 este un aparat monofascicol monobloc. Deosebirile principale fat de spectrofotometrul SPEKOL sunt: - are capacitatea de a selecta o band spectral foarte ngust, care se consider c conine o singur lungime de und; - domeniul spectral acoperit 320 - 850 nm; - utilizeaz un fotomultiplicator; - aarea rezultatului este digital (sub form de numere); - are o singur cuv; - umplerea cuvei se realizeaz automat cu ajutorul unei pompe peristaltice.
159

Spectrofotometrul SPEKOL 20 se potrivete mai bine pentru msurri cantitative (trasare dreapt de etalonare i msurare direct concentraie) i mai puin pentru msurri calitative (trasri de spectre). Componentele i principiul de funcionare a spectrofotometrului de tip SPEKOL 20 sunt redate n Figura 8.5.

Fig. 8.5. Panoul frontal al spectrofotometrului (SFM) Spekol 20.


Spectrofotometrul SPEKOL 20 conine urmtoarele componente: compartimentul I aat n partea stng sus a aparatului conine blocul electric de alimentare cu curent de la reea; compartimentul II aat n partea stng jos a aparatului conine sursa stabilizat de tensiune care alimenteaz sursa de radiaie; compartimentul III aat n partea central sus a aparatului conine mecanismele de acionare prin intermediul unor prghii ale deschiderii fantei de intrare i de rotire a reelei de difracie, compartimentul IV aat n partea central jos a aparatului conine partea optic a lui, i anume: monocromatorul Czerny-Turner; compartimentul V aat n partea dreapt jos a aparatului este compartimentul cuvei, conine cuva cu prob i anexele necesare pentru umplerea i golirea cu soluie a cuvei cu o pomp peristaltic. 160

De asemenea mai conine obturatorul optic i angrenajul mecanic de acionare a lui; compartimentul VI este compartimentul de msur i aaj. Conine sistemul electronic aferent alegerii modului de lucru al aparatului, sistemul electronic de reglare a amplicrii i sistemul electronic de aare; compartimentul VII conine fotomultiplicatorul (senzorului optic). Semnicaia tastelor (14) este urmtoarea: T tast alegere aaj n transmitan; E tast alegere aaj n absorban; C - tast legere aare rezultat n concentraie; F - tast validare pentru coecientul necesar la aarea rezultatului n concentraie; X aparatul funcioneaz n regim continuu de msur; Y tasta pentru trecerea de la regimul continuu de msur la regimul manual de msur; o palm aparatul funcioneaz n regim manual (discontinuu) e msur; R tast pentru validare referin (punct de 100 transmitan). Se menioneaz c toate tastele sunt dotate cu un LED de semnalizare care se aprinde n cazul c sunt apsate. Spectrofotometrul SPEKOL 20 poate utilizat la msurarea absorbanei, transmitanei i concentraiei. Msurarea dup modul de alegere a regimului de lucru poate continu sau discontinu (manual).

1) 2)

3)

4)

Msurarea absorbanei i transmitanei cu SFM Spekol 20. I. Modul de msurare continuu se conecteaz aparatul la reea prin apsarea butonului de conectare (1); se alege lungimea de und prin rotirea butonului de rotire a reelei de difracie (4). Lungimea de und este aat la indicatorul (3); se alege deschiderea fantei prin rotirea comutatorului (2) n una din cele trei poziii ale sale. Se recomand deschiderea cea mai mic; se apas pe urmtoarele taste (14): transmitan (T); msurare continu (X) i referin (R);
161

5) se pornete pompa peristaltic prin acionarea comutatorului de pe soclul motorului pompei; 6) se regleaz punctul de 0 transmitan prin apsarea manetei (7), care deplaseaz obturatorul optic n faa fasciculului luminos, nchizndu-l. Pe aajul digital (9) va apare cifra 0; 7) se regleaz punctul de 100 transmitan. Pentru aceasta se aspir n cuv soluia martor (referina) prin introducerea capilarei de aspiraie (5) n paharul cu prob (6). Cnd cuva este plin (soluia aspirat de pompa peristaltic iese la refularea pompei) se oprete pompa. Se urmrete rezultatul de pe aajul digital (9). n funcie de acesta se rotete butonul de reglare grosier a amplicrii (12) pn ce pe aajul (9) apare un numr cat mai aproape de 100. Dac aajul plpie, atunci amplicarea grosier este prea mare i se micoreaz. Se regleaz n amplicarea prin rotirea butonului de reglare n amplicare (11) pn ce pe aajul (9) apare cifra 100; 8) se golete cuva de soluia martor. Pentru aceasta se scoate capilara din paharul cu prob (6) i se repornete pompa peristaltic. Se apas pe maneta (7) care coboar capilara de aspiraie a pompei pn n fundul cuvei, permind astfel golirea acesteia; 9) se aspir n cuv soluia de analizat. Cnd cuva este plin (iese lichid la refularea pompei), se oprete pompa peristaltic; 10) se citete valoarea transmitanei pe aajul digital (9). II. Modul de msurare discontinuu sau manual 1) se regleaz punctele de 0 i 100 transmitan pe modul de msurare continuu, dup operaiile (l-7, pag. 161-162); 2) se apas pe tasta X trecerea de la regimul continuu la cel discontinuu (manual);
162

3) se golete cuva de soluia martor cu ajutorul pompei peristaltice; 4) se aspir n cuv soluia de analizat cu pompa peristaltic. n momentul n care cuva s-a umplut cu soluie (iese soluie pe refularea pompei), se oprete pompa; 5) prin apsri intermitente pe tasta de impuls pe regimul de lucru manual (8), sau pe tasta (o palm) se citete valoarea transmitanei. Se menioneaz c aparatul msoar doar n momentul cnd se apas pe una din aceste taste. III. Ridicarea spectrelor de absorbie Aparatul SPEKOL 20 poate utilizat i pentru ridicarea spectrelor de absorbie, el permind selectarea lungimilor de und cu un increment de l nm. Fiind un aparat monofascicul, permite ridicarea spectrelor de absorbie numai punct cu punct. Pentru aceasta se citete valoarea absorbanei sau transmitanei la mai multe lungimi de und: e pe modul de lucru continuu, e pe modul de lucru manual, conform operaiilor prezentate anterior. Deoarece este un aparat monofascicul, este obligatoriu ca la xarea lungimii de und s se refac punctele de 0 i 100 transmitan. Pentru aceasta se impune ca dup citirea absorbanei sau transmitanei, la o lungime de und (), s se procedeze astfel: 1) se terge valoarea vechii referine prin apsarea tastei referin (R), cnd se stinge LED-ul de pe tast; 2) se iniializeaz o nou referin prin apsarea tastei referin (R), cnd se reaprinde LED-ul de pe tast; 3) se alege o nou lungime de und prin rotirea bulonului (4); 4) se apas pe tasta transmitan (T), dac aparatul se gsete pe msurare absorban (A). Dac aparatul se gsete pe msurare transmitan (T), nu mai este necesar apsarea acestei taste; 5) dac aparatul se gsete pe regimul de msur manual (arde LED-ul de pe tasta X), se trece pe regimul de lucru continuu Y; 6) se regleaz punctul de 0 i 100 transmitan conform operaiilor (6) i (7) de la modul de msurare continuu;
163

7) se continu conform operaiilor (8-10) pentru citirea absorbantei sau transmitanei pe regimul de msurare continuu sau conform operaiilor (2-5) pentru citirea pe regimul de msurare manual. Toate aceste operaii trebuie refcute la ecare lungime de und. Msurarea direct a concentraiei cu SFM Spekol 20. Spectrofotometrul SPEKOL 20 permite msurarea direct a concentraiei att pe regimul de lucru continuu, ct i manual. I. Msurarea continu a concentraiei: 1) se efectueaz operaiile (1-8); 2) se msoar absorbana unor soluii etalon. Pentru aceasta se apas pe tasta absorbant (A) i se aspir n cuv pe rnd soluiile etalon n ordinea creterii concentraiei. Absorbana se citete pe aajul digital (9). Se menioneaz c dup ecare msurare cuva trebuie golit de soluia precedent, splat cu soluia urmtoare i apoi umplut cu aceast soluie. Msurarea absorbantei se poate face e continuu, cnd este apsat tasta msurare continu, e manual, cnd este apsat tasta msurare manual; 3) se traseaz dreapta de etalonare a aparatului A = f(C) i se calculeaz inversul pantei dreptei de etalonare i se noteaz acest coecient; 4) se introduce valoarea coecientului determinat anterior prin apsarea tastelor (16). Valoarea coecientului va citit pe aajul digital (13). La o apsare a unei taste (16) indicaia aajului digital (13) se modic cu o unitate. Ultima tast (16) este pentru deplasarea virgulei; 5) dac s-au reglat nainte punctele 0 i 100 transmitan, se procedeaz n continuare astfel: - se introduce n cuv soluia de analizat; - se apas pe tasta (C) msurare concentraie; - se apas pe tasta (F) validare coecient indicat pe aajul digital (13).
164

n acest fel, valoarea absorbantei este nmulit cu coecientul introdus, rezultatul ind aat direct n concentraie. Se menioneaz c dac se dispune de inversul pantei dreptei de etalonare (determinat la o dat anterioar) nu se mai determin absorbanele soluiilor etalon, adic nu se mai efectueaz operaiile (2) i (3). n acest caz determinarea concentraiei se face conform operaiilor (1, 5). Este obligatoriu ns ntotdeauna ca punctele de 0 i 100 transmitan s se refac, naintea efecturii msurtorii de concentraie. II. Msurarea discontinu sau manual a concentraiei Operaiile sunt similare cu cele de la msurarea continu, cu meniunea c dup reglarea punctelor de 0 i 100 transmitan (operaiile 1-8, pag. 161-162) se apas tasta (X). Pentru citirea concentraiei n aceast situaie este necesar apsarea intermitent a tastei (8) sau a tastei (o palm). Spectrofotometrul C-46. Spectrofotometrul C-46 este un aparat monofascicul monobloc. Particularitile de construcie: - are capacitatea de a izola i selecta o band spectral foarte ngust, considerat monocromatic (se consider c conine o singur lungime de und); - este nzestrat cu dou surse de radiaie luminoas: lampa de incandescen, destinat pentru lungimile de und 340-1100 nm, i lampa de deuteriu pentru domeniul ultraviolet (190-350 nm); - senzorul optic este alctuit din dou fotoelemente; de stibiu-cesiu cu ochiul din sticl de cuar pentru lungimile de und 190-700 nm, i de oxigen-cesiu pentru 600-1100 nm. Lungimile de und la care trebuie de trecut de la un fotoelement la altul sunt indicate n a tehnic a spectrofotometrului; - pentru diminuarea luminii de difuzie i de excludere a domeniilor majore de difracie aparatul este nzestrat cu dou ltre optice: unul pentru lungimile de und de 230-450 nm i altul pentru 6001100 nm. Schimbarea ltrelor se produce automat; - lentilele spectrofotometrului sunt fabricate din sticl de cuar cu un coecient foarte nalt de transmitan a radiaiei ultraviolete.
165

Componentele de baz ale spectrofotometrului sunt prezentate n Figura 8.6.

Fig. 8.6. Spectrofotometrul C-46. Pe platforma de montare a compartimentelor spectrofotometrului, acoperit cu o manta de protecie, sunt xate urmtoarele compartimente principale: detaliile optice i mecanice ale monocromatorului se a n partea dorsal din stnga a aparatului i sunt acoperite cu o manta proprie de protecie; n partea frontal din stnga a aparatului se a un tambur (25) prin a crei rotaie are loc antrenarea monocromalorului, iar deasupra lui se gsete indicatorul lungimii de und n nm (20); tot n stnga se a conjuctorul de conectare la reeaua electric (48); aproape de centrul prii frontale se a compartimentul de alimentare a sistemului microprocesoral (14); n centrul prii frontale se a tamburul de reglare a limii spectrale a fantei (21); pe platforma de montare n partea dreapt, rigid este xat nc o platform pe care sunt montate compartimentele detaabile ale aparatului: compartimentul cuve (15) i compartimentul (16) cu fotoreceptorul i amplicatorul; n partea dorsal a aparatului este ataat compartimentul cu sursele de lumin i stabilizatorul de curent.
166

I. Pregtirea pentru lucru. Destinaia organelor de dirijare i indicaii - Butonul CET servete pentru conectare la reeaua electric. Lampa indicator de deasupra butonului semnalizeaz conectare. - Borna (25) servete pentru stabilirea lungimii de und (rotire a reelei de difracie). Valorile lungimii de und sunt aate pe dispozitivul (20). - Comutatorul (21) servete pentru alegerea fantelor, care trebuiesc reglate n corespundere cu domeniul spectral. Valoarea limii fantelor spectrale sunt gradate n nanometri pe panoul frontal al spectrofotometrului. - Maneta (40) transport cruciorul cu cuve n canalul optic. - Maneta (49) servete de a deschide (OTKP) obturatorul canalului optic i de al nchide (3AKP). - Cu maneta (50) se compenseaz curentul obscur al fotoelementelor atunci, cnd obturatorul (49) este nchis (3AKP). - Maneta (41) are destinaia de a schimba fotoelementele. - Maneta (34) servete la schimbarea surselor de lumin (17). - Tastele micromainii electronice de calcul (micro-MEC) (14) au destinaia de dirijare a sistemului i de alegere manual a modului de funcionare a spectrofotometrului. - Tasta CK conecteaz micro-MEC, ce se semnalizeaz prin aarea pe ecranul numeric a unei virgule. - La apsarea tastei (0) se determin tensiunea curentului electric de ieire de la foto elementul obscur, iar a tastei K (1) - a curentului de la fotoelementul care primete fascicula de lumin emergent de la cuva de control. Valorile tensiunilor de ieire n voli sunt aate pe ecranul numeric. - La apsarea tastei T (2) sau D (5) are loc calcularea i aarea pe ecranul numeric a transmitantei - n % sau a absorbanei n uniti de absorban, n conformitate cu formula: U - UT T= 100 , U0 - UT
167

n care: U tensiunea curentului electric trecut prin cuva cu proba de analizat; U0 tensiunea curentului electric trecut prin cuva cu soluia de control; UT tensiunea curentului obscur. - Tasta /P servete pentru impulsionarea regimului de lucru pe manual (discontinuu) sau ciclic, despre ce indic semnalele luminoase P (de o singur dat) sau (ciclic). n regimul ciclic de funcionare calculul i aarea valorilor msurate se execut peste ecare 5 secunde fr o alt apsare a tastei. - Tastele C (4) i A (3) au destinaia pentru lucrrile de determinare a concentraiei i vitezei de variabilitate a absorbanei. - Tastele CP, TB, [ i b servesc pentru nlturarea i introducerea n micro-MEC a valorilor coecienilor n regimurile C i A. Aceti coecieni se introduc n memoria micro-MEC cu tastele 0-9. La apsarea tastelor n partea stng a ecranului numeric se aeaz simbolul, care corespunde regimului de funcionare a micro-MEC. La executarea msurtorilor i a controlului toate tastele trebuie s e apsate nu mai des dect odat n 2 secunde. Conectarea spectrofotometrului 1. Se nchide obturatorul canalului optic, aducnd maneta (49) n poziia 3AKP. Fascicolul de lumin emergent nu va nimeri la fotoelemente. Cu comutatorul (21) se stabilete limea fantei egal cu 0,15 nm. 2. Se apas butonul CET. La aceasta se va lumina indicatorul CET. Se apas tasta CK de pe tastiera micro-MEC. Trebuie s se aeze o virgul pe ecranul numeric. 3. La apsarea butonului CET n cazul cnd maneta (34) se a n poziia H imediat se aprinde lampa de incandescen, iar cnd se a n poziia , dup o minut de nclzire, se va aprinde lampa de deuteriu.
168

4. Funcionarea stabil a spectrofotometrului va asigurat dup 30 min. de la conectare. 5. Deconectarea spectrofotometrului se execut prin apsarea butonului CET. Ordinea de lucru 1. Pregtirea pentru msurtori. - Se conecteaz spectrofotometrul dup cum a fost indicat mai sus. - Se introduc n crucior de la l la 3 probe de cercetat, iar n lcaul al patrulea cuva cu proba de control. - Se stabilizeaz lungimea de und necesar, prin rotirea butonului (25) n direcia majorrii lungimii de und. Dac scala se va roti la o valoare mai mare dect cea necesar, atunci trebuie de ntors ndrt cu 5-10 nm i iari de adus la valoarea necesar. - Se stabilete cu manetele (41) i (34) fotoelementul i sursa de lumin n poziia care corespunde domeniului spectral necesar de msurtori. - nainte de a executa o nou msurtoare, cnd nu este cunoscut valoarea tensiunii de ieire, este necesar de a stabili limea fantei (21) de 0,15 nm pentru a proteja fotoelementele de suprailuminare. - Msurtorile trebuie efectuate cu capacul compartimentului optic nchis etan. A deschide capacul compartimentului optic (15), se admite numai n cazul cnd obturatorul canalului optic (49) este nchis (3AKP). 2. Determinarea transmitanei. 1. Se instaleaz maneta (49) n poziia nchis 3AKP. 2. Se apas tasta (0). Pe ecranul numeric se va afia valoarea semnalului n voli, care este proporional cu curentul obscur al fotoelementului. 3. Cu butonul H (50) se instaleaz pe ecranul numeric o valoare numeric n domeniu 0,09 i 0,1. Se scoate
169

aajul numeric de pe ecranul numeric apsnd tasta (0) pn la aarea pe ecran a unei indicaii, egal cu cea precedent, sau care difer nu mai mult dect cu 0,001. Ultima valoare se introduce n memoria micro-MEC, unde se va pstra pn la o nou apsare pe tasta (0). 4. Se aduce cuva cu proba de control n faa fascicolului luminos cu ajutorul manetei (40) pn la sprijin. 5. Se deschide obturatorul (49) (OTKP). 6. Apsnd tasta K (1) se culege valoarea de pe ecranul fotometric. La stnga va aprea indecele 1. Valoarea numeric s e n limita 0,5 5,0. Dac valoarea va mai mic dect 0,5 trebuie mrit limea fantei. La indicii mai mari dect 5,0 se va aa indicele . n acest caz trebuie de micorat limea fantei i apsnd tasta K(1) de cteva ori pn va aprea o valoare ce difer de cea precedent nu mai mult dect cu 0,001. 7. Se apas tasta T (2). Pe ecranul numeric trebuie s apar indicaia 100,0 0, iar la stnga indicele 2. Dac se indic alt valoare, trebuie nc o dat de inclus valoarea semnalului de comparaie, apsnd pe tasta K (1). 8. Se apas tasta /P. Trebuie s apar indicele . Se apas tasta T (2). Spectrofotometrul este gata de a funciona n domeniul ciclic de msurtori; efectueaz msurtori peste ecare 5 secunde i aeaz rezultatele ecrei msurtori. 9. Se aduce cu maneta (40) n faa fascicolului de lumin incident una cte una din cuvele cu soluiile de msurat. Pe ecranul numeric apare valoarea transmitanei. Valorile aate nu se schimb n timp cu mai mult de 0,1. Se nregistreaz valoarea transmitanei; se aduce urmtoarea cuv cu soluia de msurat i a. m. d. 10. n caz de msurri nu prea ndelungate de timp, cnd valoarea curentului obscur nu se schimb, nu este necesar de a introduce aceast valoare de ecare dat n memoria microMEC. n acest caz toate msurtorile ulterioare, ncepnd cu a doua, urmeaz de a executate, ncepnd cu operaia din p.4.
170

3. Determinarea absorbantei. 1. Se execut operaiile indicate n p. 2. l - 2.6. 2. Se apas tasta D (5). Pe ecranul numeric trebuie s e aat indicaia 0,0000,001, iar la stnga indicele 5. Dac se indica alt valoare, este necesar nc odat de introdus valoarea semnalului de comparare apsnd pe tasta K (1). 3. Se apas tasta /P. Trebuie s se aeze indicele domeniului ciclic . Se apas tasta D (5). Se aduce cu maneta (40) n faa fasciculului de lumin incident una cte una cuvele cu soluiile de msurat. Pentru ecare prob se nregistreaz absorbana, dac valoarea ei n timp nu se schimb cu mai mult de 0,001. Not: In domeniul determinrii absorbantei probei microMEC calculeaz absorbanta D dup relaia: D = -lgT, unde T - transmitana probei msurate. Colorimetrul fotoelectric de concentraie KK-2. Colorimetrul fotoelectric de concentraie (n continuare colorimetru) este un aparat monofascicol alctuit din dou blocuri mecanic unite ntre ele. Cu ajutorul colorimetrului se pot executa msurtori ale coecienilor de transmitan i de absorbant ale soluiilor lichide i corpurilor solide, precum i pentru determinarea concentraiei substanelor n soluie cu ajutorul curbelor de etalonare. Colorimetrul permite de asemenea efectuarea msurtorilor coecienilor de transmitan a emulsiilor (nefelometrie). Msurarea transmitanei i respectiv a absorbantei se efectueaz prin metoda deviaiei: n calea radiaiei cu limea spectral aleas se expune succesiv soluia de referin i ulterior soluia de analizat. Panoul frontal al colorimetrului este prezentat pe gura 8.7.
171

Componentele i principiul de funcionare a colorimetrului KK 2. Colorimetrul este constituit din dou blocuri unite mecanic: blocul optic i blocul de alimentare electric. Blocul optic conine: - surs de radiaie - bec de halogen cu incadescen stabilizat de 6,3 V cu dispozitiv de ajustare; - compartimentul optic, n care sunt montate condensatorul, fanta i obiectivul; - comportamentul ltre optice - ltrele colorate sunt montate ntr-un disc. Fiecare ltru poate xat n fascicolul luminos cu ajutorul tamburului 3 (g. 8.7.). Caracteristicile spectrale ale ltrelor optice sunt prezentate n tabelul de mai jos i n g.8.8. Caracteristicile spectrale ale ltrelor optice ale colorimetrului KK-2
Lungimea de und, Marcarea Marcarea corespunztoare maximului pe disc ltrului optic transmitanei, nm Limea benzii de transmitan, nm

Fig. 8.7. Panoul frontal al colorimetrului KK-2.


1 - microampermetru cu gradaie numeric a valorilor T i D; 2 - manta de protecie a sursei de radiaie; 3 - tambur de stabilire a ltrelor optice; 4 - manet de aducere a cuvelor n fascicolul de lumin; 5 - conjuctor de stabilire a sensibilitii; 6 - buton de aducere a acului miliampermetrului n poziia 100 pe scala coecientului de transmitan T cu aproximaie, iar mai sus butonul - exact; 7 - capacul compartimentului cuve

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

315 364 400 440 490 540 590 670 750 870 980

315 5 364 5 400 5 440 10 490 10 540 10 590 10 670 5 750 5 870 5 980 5
173

35 15 25 10 45 10 40 15 35 10 25 10 25 10 20 5 20 5 25 5 25 5

172

, % 60

n blocul electric de alimentare sunt dispuse: - stabilizatorul de tensiune cu redresor; - transformator energetic.

50

40

30

Blocul de alimentare se deplaseaz n blocul optic, se unete cu el printr-o tij i se xeaz cu dou uruburi. Pe peretele dorsal al blocului de alimentare se a o born de siguran pmnt, cablu electric cu un tecr pentru curent de 220 V 50/60 H, siguran de 1,25 A, conjuctor la reeaua electric. Pe tecr se a un contact de siguran pmnt i el poate conectat numai la o priz special conectat la pmnt. Indicaii generale de exploatare: Dup o ntrerupere ndelungat de funcionare a colorimetrului este oportun (favorabil) de a-l conecta i antrena timp de 2-5 ore. Pentru comutarea filtrelor optice conjuctorul 5 trebuie s se afle n poziia l, iar butonul 6 100 rpyo n poziia extremal din stnga (sensibilitate minim). Prin aceasta se protejeaz de la suprancrcri aparatul de nregistrare i posibilitatea defectrii lui. Expunerea 0 mecanic a aparatului de nregistrare (microampermetrului) trebuie executat pn la conectarea colorimetrului n circuit sau nu mai devreme dect peste o or de la deconectarea lui. Pentru msurtori cu ltrele optice 315, 364, 400, 440, 490, 540 nm relevate cu coloraie neagr pe panoul frontal al colorimetrului, conjuctorul se xeaz n una din poziiile 1,2,3 relevate de asemenea cu coloraie neagr. La msurtori cu ltre optice 590, 670, 750, 870, 980 nm relevate pe panoul frontal al colorimetrului cu coloraie roie, conjuctorul se xeaz n una din poziiile l, 2, 3, relevate de asemenea cu coloraie roie.
175

20

10

1.

0 300

400

500

600

700

800

900

1000

1100 , nm

2.

Fig. 8.8. Caracteristicile spectrale ale ltrelor optice.


compartimentul cuve conine cruciorul cu cuve, care se instaleaz pe msua compartimentului astfel ca cele dou resorte (arcuri) s se ae spre partea frontal a colorimetrului. Aducerea cuvelor n fascicolul luminos se efectueaz cu maneta 4 pn la sprijin. n cazul cnd capacul compartimentului cuve este deschis obturatorul optic este nchis i lumina nu trece spre receptorii optici. compartimentul fotometric conine un fotoelement -26 pentru lucrul n diapazonul spectral de la 315 la 540 nm, fotodiod -24K pentru diapazonul spectral 590-980 nm, placa de divizare a fascicolului luminos (10% la fotodiod i 90% la fotoelement) i amplicator. Reglarea receptorilor fotometrului se execut cu conjuctorul 5. compartimentul de aare a rezultatului este asigurat de un microampermetru M 1792 cu cadran marcat cu cifre pentru coecieni de transmitan T (de la 100% la 1%) i absorban (densitate optic) D (de la 0 la 2). Pe partea dorsal a micro ampermetrului sunt tije pentru conectarea voltmetrului cu cifre cu limita de msurare 0,1 V. 174

3.

4.

5. Suprafeele de lucru a cuvelor nainte de ecare msurtoare trebuie minuios terse cu un amestec de alcool i eter dietilic (1:1). La amplasarea cuvelor n crucior nu se admite atingerea cu degetele a suprafeelor de lucru ale lor (mai jos de semnul de pe peretele lateral al cuvei). Prezena murdriei sau a picturilor de soluie pe suprafaa cuvei duce la obinerea de rezultate incorecte ale msurrilor. Lichidul se toarn pn la semnul de pe peretele lateral al cuvei. n unele cazuri lichidul poate forma menisc, ridicndu-se mai ales n colurile cuvei cu 5-6 mm i dac nivelul va mai nalt de semnul lateral face impresie de curgere a cuvei. Dac nivelul va mai jos, atunci hotarul lichid-aer va afecta fasciculul luminos i rezultatele msurtorilor. Nu se admite nclinarea cuvelor la introducerea lor n crucior. 6. Dup schimbarea ltrului optic i n caz de inere a colorimetrului cu capacul compartimentului cuve deschis mai mult de 5 minute msurtorile pot ncepute numai dup un timp de iluminare a compartimentului receptor optic (capacul nchis) nu mai puin de 5 minute. 7. Dup terminarea lucrului nainte de deconectarea colorimetrului de la reea conjuctorul trebuie adus n poziia l relevat cu coloraie roie, iar butonul 6 100 rpyo n poziia de la extremitatea din stnga i numai dup aceasta se deconecteaz conjuctorul Ce. Indicaii de securitate: 1. Lucrul la colorimetru trebuie executat n ncpere curat, lipsit de praf, vapori de acizi i alcalii. 2. n apropierea colorimetrului nu trebuie s e ngrmdite obiecte ce ar putea crea incomoditi n lucrul operatorului. 3. Toate lucrrile de reglare n prile nchise ale colorimetrului
176

ce sunt sub tensiune electric (schimbul lmpilor, detaliilor) se pot efectua numai dup deconectarea aparatului de la circuitul electric. 4. Colorimetrul trebuie s e cu siguran legat cu pmntul. Ajustarea sursei de radiaie. n cazul cnd colorimetrul mult timp n-a fost exploatat sau a fost mutat dintr-un loc n altul este necesar de a controla corectitudinea instalrii becului de radiaie. Pentru aceasta n fereastra de ieire a compartimentului cuve se instaleaz dopul de ajustare. Se slbete urubul mantalei de protecie a blocului electric, se scoate mantaua, se conecteaz colorimetrul la reeaua electric, se slbesc 2 uruburi i un bulon i micnd sabotul se reuete a obine o imagine uniform luminat pe dopul de ajustare, apoi uruburile i bulonul se strng. Nu se admite atingerea urubelniei de blocul colorimetrului. Pregtirea colorimetrului KK-2 pentru lucru: 1. Colorimetrul se conecteaz la reeaua electric cu 15 minute nainte de nceputul msurtorilor. n acest timp capacul compartimentului cuve este deschis (obturatorul nchide calea fascicolului de lumin ctre fotoreceptori). 2. Se instaleaz ltrul optic necesar pentru genul de msurtori. 3. Se stabilizeaz sensibilitatea minim a colorimetrului. Pentru aceasta conjuctorul se xeaz n poziia l, iar butonul 100 rpy6o n poziia extrem din stnga. 4. nainte de msurtori i dup recomutarea fotoreceptorilor trebuie de controlat, dac acul microampermetrului pe scala coecienilor de transmitan se a la 0 n timp ce compartimentul cuve este deschis. n caz de deviere, acul se aduce la zero cu ajutorul poteniometrului Hy.
177

Ordinea de lucru: A. Msurarea coecientului de transmitan sau de absorban (densitii optice). 1. n fascicolul de lumin care strbate compartimentul cuve se instaleaz cuva cu solvent sau cu soluia martor n raport cu care se vor efectua msurtorile. 2. Se nchide capacul compartimentului cuve. 3. Cu conjuctorul i butoanele 100 rpy6o i se stabilete acul microampermetrului la diviziunea 100. Conjuctorul poate n una din trei poziii: l, 2 sau 3. 4. Prin permutarea manetei 4 cuva cu solvent sau cu soluia martor se schimb cu cuva ce conine soluia de cercetat. 5. Se citete valoarea coecientului de transmitan T a soluiei cercetate pe scala microampermetrului n procente sau a densitii optice pe scala D n uniti de densitate optic. 6. Msurtorile se efectueaz de 3-5 ori i valoarea nal a msurtorilor se determin ca medie aritmetic a valorilor obinute. B. Determinarea concentraiei unei substane n soluie la colorimetrul KK-2. La determinarea concentraiei substanei n soluie trebuie de respectat urmtoarea succesiune de lucru: - alegerea ltrului optic; - alegerea cuvei; - construirea curbei de etalonare pentru substana cercetat; - msurarea densitii optice a soluiei cercetate i determinarea concentraiei substanei n soluie. 1. Alegerea ltrului optic. Prezena n colorimetru a unei garnituri de ltre optice i a unei truse de cuve fac posibil o atare selectare i combinare a lor, la care eroarea n determinarea concentraiei va minim.
178

Alegerea ltrului optic se realizeaz astfel: se toarn soluie n cuv (alegerea cuvei vezi mai jos) i se determin densitatea optic pentru ecare ltru optic; dup datele obinute se construiete o curb de etalonare, depunnd pe axa absciselor maximele lungimilor de und, care sunt indicate pe panoul tamburului de stabilire a ltrelor optice, iar pe axa ordonatelor - valorile densitilor optice corespunztoare ale soluiei. Se remarc acel segment al curbei pentru care se ndeplinesc urmtoarele condiii: - densitatea optic are cea mai nalt valoare; - desfurarea curbei este aproximativ paralel axei absciselor, adic densitatea optic puin depinde de lungimea de und. A doua condiie nu este obligatorie, deoarece sunt i abateri de la ea. Filtrul optic se alege astfel, ca lungimea de und corespunztoare maximului coecientului de transmitan s se ncadreze pe segmentul curbei mai sus remarcat. n cazul cnd aceste condiii se ndeplinesc pentru cteva ltre optice, atunci se alege acel pentru care sensibilitatea colorimetrului este mai nalt. 2. Alegerea cuvei. Eroarea absolut a msurtorilor coecientului de transmitan la colorimetrul KK-2 nu depete 1%. ns eroarea relativ a determinrii concentraiei soluiei va diferit la msurri n diferite domenii ale scalei microampermetrului i va atinge minimul la valoarea de 0,4 ale densitii optice. Din acest motiv n lucrul cu colorimetrul se recomand, ca prin selectarea cuvei corespunztoare s se lucreze n apropierea valorii densitii optice menionate. Selectarea prealabil a cuvelor se efectueaz vizual dup intensitatea coloraiei soluiei. Dac soluia este intens colorat (ntunecat), urmeaz de a utiliza cuve cu lungime de lucru mic. n cazul soluiilor slab colorate se recomand de a lucra cu cuve ce au o lungime de lucru mare.
179

n cuva n prealabil selectat se toarn soluia i se msoar densitatea optic, utiliznd ltrul optic corespunztor acestei soluii. Cnd se lucreaz cu serii de soluii, cuva se umple cu soluia de concentraie medie. Dac valoarea densitii optice obinute va constitui aproximativ 0,3-0,5, atunci aceast cuv trebuie luat pentru msurtorile cu aceste soluii. n cazul cnd aceast condiie nu se respect, urmeaz de a ncerca alt cuv: dac valoarea densitii optice msurate este mai mare de 0,5-0,6, se ia o cuv cu lungimea de lucru mai mic, ns dac valoarea este mai mic de 0,2-0,3, trebuie de luat o cuv cu lungimea de lucru mai mare. 3. Construirea curbei etalon pentru o anumit substan. Se prepar o serie de soluii ale acestei substane cu concentraie cunoscut, care ar cuprinde domeniul probabil de modicare a concentraiei acestei substane n soluia de cercetat. Se msoar densitile optice ale tuturor soluiilor si se construiete curba de etalonare, aplicnd pe axa absciselor concentraiile cunoscute, iar pe axa ordonatelor - valorile densitii optice respective. 4. Determinarea concentraiei substanei n soluie. Soluia de cercetat se toarn n cuva utilizat pentru construirea curbei etalon i utiliznd acelai ltru optic, se determin densitatea optic. Apoi dup curba etalon se gsete concentraia care corespunde valorii densitii optice msurate. Adnotare 1. Deseori este mai comod de a utiliza tabele etalonate care se compun pe valorile curbei de etalonare, ns i mai util este utilizarea programei respective la mainile electronice de calcul. 2. Curba etalon periodic trebuie vericat.
180

Defectri posibile ale colorimetrului i procedee de nlturare Simptoma 1 1. La conectarea colorimetrului la reea i apsarea conjuctorului becul semnalizator nu lumineaz. 2. La deschiderea capacului compartimentului cuve acul miliampermetrului nu se stabilizeaz la zero. Cauza posibil 2 - a ieit din funcie sigurana; - a ars lampa semnalizatoare; - ruptur n reea electric. - obturatorul optic nu nchide etan lumina de la lampa colorimetrului sau cea de la lumina din laborator; - s-a dezbalansat poziia acului. Ci de nlturare 3 - de schimbat sigurana; - de schimbat becul semnalizator; - de gsit i de reparat locul rupt din reea. - de reparat obturatorul; - de stabilit acul n poziia 0 cu ajutorul poteniometrului .

3. Nu lumineaz becul incadescent.

- de schimbat becul; - a ars becul de - de curat i de halogen; ntrit contactele; - s-au defectat - de controlat contactele de xare a tensiunea electric la becului; contactele de xare - s-a defectat a becului i dac stabilizatorul de curentul lipsete de tensiune de 6,3V. expediat colorimetrul la reparaie.

181

1 4. n orice poziie a conjuctorului acul microampermetrului nu se stabilete la 100 la rotirea butonului 100 .

2 - fotoreceptorul a pierdut sensibilitatea; - s-a dezajustat sistemul optic; - pentru fotoelementul -26 e posibil o ruptur n reeaua de alimentare (6015)V; - diminuarea intensitii radiaiei becului 6,3-15 ca consecin a ntunecrii balonului.

3 - a schimba fotoreceptorul; - de ajustat sistemul optic; - de vericat, gsit i reparat ruptura n reea sau n contactele cu stabilizatorul (6015)V; - a schimba becul 6,3-15. - de vericat contactele i integritatea reelei i de nlturat defectul; - de expediat aparatul la reparaie. - de scos becul, de curit contactele, de xat becul i de ajustat poziia lui; - de schimbat becul; - de vericat soliditatea unirii contactelor i n caz de oxidare de curit.

Fotometrul fotoelectric KK-3. Fotometrul fotoelectric KK-3 (n continuare fotometrul) este un aparat monofascicol monobloc. Particulariti de construcie i funcionare: - domeniul spectral acoperit este de 315-990 nm. - monocromatorul - reea de difracie. - sursa de radiaie - lamp de halogen. - senzorul optic - fotodiod. - aarea rezultatului - digital. - la comanda consumatorului fotometrul poale asigurat cu un compartiment cu cuv curgtoare. - fotometrul poate unit la un dispozitiv de termoimprimare de tip YT - 2. Componentele de baz i principiul de funcionare a fotometrului sunt prezentate n gura 8.9.

- ruptur sau lips de contact n reeaua 5. Acul de alimentare a microamperamplicatorului de metrului tensiune de +18V sau depete 0 -18V; sau 100. - s-a defectat stabilizatorul 18V. - au ars contactele de xare a becului incadescent 6,36. Indicaiile 15; miliamper- defectarea becului; metrului nu sunt - s-au oxidat contactele stabile. de unire a blocului de alimentare cu blocul optic.

Fig. 8.9. Panoul frontal al fotometrului KK-3.

182

183

Pe platforma de montare a compartimentelor fotometrului (1) sunt xate componentele aparatului, care sunt acoperite cu o manta de protecie (2). Aparatul conine urmtoarele compartimente principale: - compartimentul electric de alimentare cu tensiune stabilizat, aat n partea dorsal a aparatului; - compartimentul optic aat n partea din stng i centrul aparatului; - compartimentul cuve (3), situat n centrul aparatului i conine cruciorul cu cuve i obturatorul optic cu antrenaj mecanic de funcionare a lor; - compartimentul de msur i aaj (4), aat n partea dreapt a aparatului i conine sistemul electronic aferent alegerii modului de lucru a aparatului, sistemul electronic de reglare a amplicrii i sistemul electronic de aaj. Pe peretele din dreapta se gsete axa razistorului de reglare (YCT.O) i conjuctorul (5) de conectare la reeaua electric (Ce). Pe peretele dorsal se gsete o priz pentru ataarea compartimentului cu cuv curgtoare; sigurana de l A, borna pentru conectarea aparatului la pmnt; cablu electric nzestrat cu tecr care poate introdus numai ntr-o priz special conectat la pmnt. I. Pregtirea fotometrului KK-3 pentru funcionare: fotometrul se conecteaz la reeaua electric de 220V prin priza conectat la pmnt; se apas pe tasta CK. Pe ecranul numeric apare simbolul (gradarea fotometrului) i valoarea lungimii de und; se las cu capacul compartimentului de cuve (3) deschis un timp de 30 min. La aceasta obturatorul optic este nchis i lumina nu trece spre receptorul optic; se apas tasta H capacul compartimentului cuve ind deschis. Pe ecranul numeric la dreapta de la virgula clipitoare se aeaz valoarea n0, iar la stng simbolul 0. Valoarea n0 trebuie s e nu mai mic de 0,005 i nu mai mare de 0,200;
184

- dac valoarea n0 nu se ncadreaz n limitele menionate, este necesar de a aduce valoarea n0 n aceste limite cu ajutorul rezistorului .0. Instalarea 0 se face la apsarea tastei H. Ordinea de lucru 1. Msurarea transmitanei sau a extinciei. 1.1. - n compartimentul pentru cuve se introduc 2 cuve cu grosimea identic, coninnd soluie pn la semnul cu care sunt marcate; - n locaul ndeprtat al cruciorului se introduce cuva cu solvent sau cu soluia de referin; - n locaul apropiat - cuva cu soluia de msurat. Se nchide capacul. La aceasta obturatorul este deschis i lumina emergent (transmis) trece la fotodetector; - alegerea lungimii de lucru a cuvei se face ca i la fotometrul -2; - se duce maneta (6) la stng pn la sprijin. La aceasta fascicolul luminos trece prin cuva cu solvent sau cu soluia de referin; 1.2.- se alege lungimea de und prin rotirea butonului (7) de rotire a reelei de difracie. Lungimea de und este aat la ecranul numeric de sus; 1.3.- se apas tasta . Pe ecranul numeric de jos la stng de la virgula clipitoare se va aa simbolul . - se apas pe tasta (msurarea coecientului de transmitan} sau E (msurarea extinciei). La stnga de la virgula clipitoare se va aa respectiv simbolul sau E, iar la dreapta de el corespunztor valorile 100,00,2 sau 0,0000,002, ceea ce indic c alegerea transmitanei sau a extinciei n fotometru s-a stabilit corect;
185

- n cazul cnd valorile 100,00,2 sau 0,0000,002 s-au stabilit cu mari devieri, se apas nc odat pe tasta , apoi pe sau E, respectnd pauze de 3-5 secunde, - se deschide capacul compartimentului de cuve i se apas tasta H, se nchide capacul i se apas tasta sau E; 1.4.- se duce maneta (6) la dreapta pn la sprijin. La aceasta fascicolul luminii va trece prin cuva cu soluia de msurat. Aajul pe ecranul numeric la dreapta de la virgula clipitoare corespunde transmitanei, respectiv a extinciei soluiei de msurat; 1.5.- se repet operaiile indicate n p. 1.1 - 1.4 de trei ori, se calculeaz media aritmetic a valorii msurate; 1.6.- pentru ridicarea spectrelor de absorbie a probei de analizat se efectueaz msurri n conformitate cu p. 1.1 - 1.4. la diferite lungimi de und din domeniul spectral (se recomand din 20 n 20 nm), se noteaz ntr-un tabel lungimile de und i extinciile respective, apoi se traseaz o curb a spectrelor de absorbie E = f(), depunnd pe axa absciselor , iar pe a ordonatelor E; 1.7. - se alege lungimea de und optim de lucru ca ind cea corespunztoare maximului spectrului deoarece la aceast lungime de und sensibilitatea este maxim (dreptele de etalonare la analiza cantitativ vor avea pant maxim), iar precizia msurtorii este cea mai corect. Se calculeaz valoarea coecientului molar de extincie () pe baza relaiei: E e = max L / mol cm bc unde: Emax - extincia corespunztoare maximului; b - grosimea cuvei, n cm; c - concentraia substanei n soluie, n moli/L.
186

2. Msurarea direct a concentraiei substanei n soluie. Pentru msurarea direct a concentraiei substanei n soluie este necesar de a efectua n prealabil o serie de operaii de pregtire n urmtoarea succesiune: alegerea lungimii de und; alegerea cuvei; construirea curbei de etalonare pentru substana dat i determinarea coecientului de factorizare F; introducerea valorii coecientului de factorizare n memoria micro-MEC; msurarea concentraiei substanei. 2.1. Alegerea lungimii de und. Pentru a obine o eroare minim la determinarea concentraiei este necesar de a alege corect lungimea de und, la care se vor executa msurtorile. Pentru aceasta, dup curba spectral a soluiei care a fost ridicat conform p.1.1.-1.7. se alege acel segment pe care se ndeplinesc urmtoarele condiii: - extincia are valoarea maxim; - cursa curbei este aproximativ paralel axei absciselor, adic extincia puin depinde de lungimea de und. Pentru msurri se ia lungimea de und care corespunde centrului acestui segment. Dac pentru unele soluii condiia a doua nu se respect, atunci lungimea de und se ia dup prima condiie. 2.2. Alegerea cuvei. Eroarea absolut de determinare a transmitanei nu depete 0,5%. Eroarea relativ de determinare a concentraiei soluiei va diferit i va atinge minimul la o valoare a extinciei de 0,4 (E = 0,434). Din aceste considerente se recomand de a alege cuva cu o astfel de lungime a stratului de soluie la care se va putea lucra n domeniul extinciei ntre 0,3 i 0,6. 2.3. Trasarea dreptei de etalonare i determinarea
187

coecientului de factorizare F. Se prepar o serie de soluii etalon - cu o compoziie calitativ similar cu soluia de analizat i conin concentraii cunoscute din substana pe care dorim s o analizm, care cuprind domeniile de variaie posibil a concentraiei acestei substane n soluia de analizat. Se determin extincia succesiv n soluiile etalon n ordinea creterii concentraiei. Se menioneaz c dup ecare msurtoare, cuva este necesar de a o spla cu soluia urmtoare i apoi umplut cu aceast soluie. Se traseaz un grac aplicnd pe axa absciselor concentraiile cunoscute, iar pe axa ordonatelor - valorile extinciei. Este necesar de a ne convinge, c dependena extinciei de concentraie este o dreapt. Se determin dup grac coecientul de factorizare F. Pentru aceasta se raporteaz valoarea concentraiei dintr-un punct de la mijlocul dreptei de etalonare la valoarea extinciei corespunztoare acestei concentraii: C F= E. n cazul cnd dependena dintre valoarea extinciei nu este liniar coecientul de factorizare nu poate utilizat, i determinarea concentraiei se efectueaz dup curba de etalonare. 2.4. Pentru includerea coecientului de factorizare F n memoria micro-MEC se apas tasta F. Pe aajul numeric la stnga de la virgula clipitoare v-a aprea simbolul F. Se culege cu tastele numerice valoarea coecientului de factorizare. Pe aaj la dreapta de la virgula clipitoare v-a aprea valoarea culeas. Fotometrul este gata de a msura concentraiile. Not. La o includere repetat a coecientului de factorizare se poate ntmpla ca pe aajul numeric ultima cifr a valorii F s e mai mic cu o unitate. 2.5. Msurarea concentraiei substanei n soluie:
188

- se efectueaz operaiile indicate n p. 1.1.- 1.4. Este obligatoriu, ca soluia cercetat s e turnat n cuve cu aceeai lungime de lucru cu care s-a determinat coecientul F i de a instala lungimea de und., aleas n conformitate cu p. 2.1. - se apas tasta C. Pe aajul numeric la stnga de la virgula clipitoare apare simbolul C, iar la dreapta valoarea concentraiei soluiei cercetate. 3. Determinarea vitezei de variaie a extinciei unei soluii. Metoda st la baza titrrii spectrofotometrice care prezint numeroase avantaje fa de titrarea volumetric, precum i la cercetarea cineticii enzimatice. Ea permite de a determina starea reaciei ce are loc n soluie, prin msurarea vitezei de variabilitate a extinciei ntr-un anumit interval de timp. 3.1. se efectueaz operaiunile indicate n p. 1.1.-1.4., stabiliznd lungimea de und conform p. 1.2; 3.2. se apas pe tasta A. Pe aajul numeric la stnga de la virgul va aprea simbolul A; 3.3. se include n memoria micro-MEC timpul t, dup care trebuie de determinat viteza A de modicare a absorbanei (timpul se comand n minute i poate exprimat prin numere ntregi de la l la 9); 3.4. dup timpul t pe aajul numeric dup virgula clipitoare va aprea valoarea vitezei de variaie a absorbanei; 3.5. dac trebuie de determinat viteza de modicare a absorbanei aceleiai soluii n urmtorul interval de timp stabilit n p.3.3, iari se apas tasta A. Determinarea experimental a concentraiei unei substane prin fotometrie. Determinarea concentraiei (dozarea) unei substane dintr-o prob se poate efectua prin dou procedee: procedeul prin construirea curbei de etalonare; procedeul folosind o soluie etalon. 1. Procedeul prin construirea curbei de etalonare.
189

Principiul. Se realizeaz o scal de diferite concentraii cunoscute ale componentului de dozat i se determin pentru ecare concentraie extincia corespunztoare. Concentraiile i extinciile obinute se nscriu ntr-un sistem de axe de coordonate i prin unirea punctelor respective se obine o dreapt denumit curb de etalonare care indic proporionalitatea direct (ntr-un anumit domeniu) dintre extincie i concentraie. Curba de etalonare este valabil numai pentru lungimea de und i pentru grosimea de strat de lichid folosite la obinerea sa. Exemplu. Construirea curbei de etalonare pentru dozarea fosforului. Principiul reaciei. Fosforul din diferite combinaii reacioneaz n mediu alcalin i n prezena unui reductor cu molibdatul de amoniu formnd un complex de culoare albastr; intensitatea culorii obinute este proporional cu concentraia n fosfor. Reactivi: 1. Soluie etalon de fosfor 10 mg% (10 mg n 100 ml soluie) Pentru prepararea acestei soluii se utilizeaz KH2P04. tiind c masa molecular a KH2P04 = 136, iar masa atomic a P = 31, se aplic urmtorul calcul: 31g P ................................. 136g KH2P04 1g P ................................. x g
X = 136 1 = 4,387 g KH2PO4 31

i se completeaz la 100 cm3. Se obine, astfel, soluia etalon de concentraie 10 mg% P. 2. Soluie de molibdat de amoniu (NH4)2MoO4 1% n soluie de HNO4 concentrat. 3. Soluie de acid ascorbic 1% n soluie de CuSO4 0,001 M (soluia nu este stabil i se prepar numai n momentul utilizrii). Tehnica: Din soluia etalon (1) coninnd 10 mg P% se realizeaz, prin diluie cu ap distilat, o scal de concentraii cuprins ntre l - 10 mg P%. Se adaug 1 ml soluie de molibdat de amoniu, se agit, se adaug 0,5 ml soluie de acid ascorbic. Se agit i se las n repaus timp de exact 10 min. Coninutul eprubetelor se colorimetreaz la = 660 nm, utiliznd cuva cu d = 5 mm. Toate datele se nscriu ntr-un tabel de forma urmtoare:
Nr. prob. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Soluie etalon de 10 mg%, ml 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 0,0 Concentraia Soluie DensiAp Soluie n P realizat de acid tatea distilat, (NH4)2MoO4, ascorbic, mg% optic ml ml (n 1 ml) ml (D660) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 1,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 0,0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Pentru a se obine o soluie coninnd 10 mg P% se cntresc la balana analitic 0,0439 g KH2P04, deoarece: lg P .................................... 4,387g KH2P04 0,010g P .................................... Y g
Y= 4,387 0,010 = 0,04387 g 1

Deci, cantitatea de 0,0439 g KH2P04 se dizolv n ap distilat


190

Cu datele nserate n tabel se construiete curba de etalonare


191

pentru dozarea fosforului; pe ordonat se nscriu valorile extinciilor, iar pe abscis valorile concentraiilor, obinndu-se o dreapt. Utilizarea curbei de etalonare. Pentru dozarea fosforului ntro prob (de exemplu, ser sanguin) cu concentraie necunoscut n fosfor, se procedeaz astfel: - se iau 0,1 cm3 prob de analizat i se adaug, ap distilat, soluie de molibdat de amoniu, soluie reductoare n proporiile indicate n schema experimental menionat; - dup 5 minute se determin extincia (E) n condiiile descrise; - valoarea extinciei (E) se interpeleaz pe curba de etalonare i se obine, astfel concentraia de fosfor (mg/100 cm3) a probei analizate. Factor de pant (factor de proporionalitate). Deseori, pentru obinerea rezultatului unei determinri cantitative, se utilizeaz valoarea factorului de pant (F), care rezult din curba de etalonare. Conform legii Lambert-Beer, la o serie de valori cresctoare ale concentraiilor corespunde o serie de valori ale extinciilor. Deci, pentru domeniul de proporionalitate (poriunea dreapt a curbei de etalonare) se poate scrie relaia: c c1 c (1) = 2 = 3 .............. = F (constant). E1 E 2 E3 n consecin, pentru factorul de pant se poate scrie relaia general: c (2) F= , E n care: F este factor de pant (constant); c concentraia componentului analizat nscris pe abscis la care corespunde extincia (E) nscris pe ordonat; E extincia corespunztoare unei concentraii cunoscute nscris pe abscis. Factorul de pant (F) se calculeaz nlocuind n relaia (1)
192

valorile corespunztoare pentru c i E n cazul ecrei probe, valori cu care s-a construit curba de etalonare. Se obine, astfel, valoarea factorului de pant F. De exemplu: 1 2 3 4 F= = = = ......... = 20 0,050 0,095 0,145 0,200 (valoare).

Deci, factorul de pant F reprezint o constant i se obine c fcnd media valorilor factor tuturor rapoartelor . n exemplul E menionat, F = 20. Cu ajutorul factorului de pant F se poate aa direct concentraia unui component chimic de dozat prin multiplicarea extinciei (E) citit la spectrofotometru i care corespunde probei de analizat cu valoarea calculat a factorului de panta F. Deci, din relaia (2) rezult: c=EF (3) Exemplu: extincia determinat pentru o prob de concentraie necunoscut n fosfor este E = 0,250, iar F = 20. n acest caz, concentraia (c) va : c = E F = 0,250 20 = 5 mg P/100 cm3. 2. Procedeul cu soluie etalon. Principiul. Se utilizeaz o soluie etalon a substanei de dozat, soluia avnd o concentraie cunoscut. Se determin la spectrofotometru extincia acestei soluii (n anumite condiii experimentale precizate pentru ecare metod) i se compar cu extincia probei n care se a substana de dozat de concentraie necunoscut. Concentraia pentru proba analizat se obine din relaia: Ep (4) cp = cet . Eet n care:
193

cp este concentraia substanei de dozat; cet - concentraia soluiei etalon; Ep - extincia probei determinat la spectrofotometru; Eet - extincia soluiei etalon determinat la spectrofotometru. Exemplu. Dozarea fosforului prin procedeul cu soluie etalon. Principiul reaciei, reactivii i condiiile de determinare experimental snt similare cu cele indicate la construirea curbei de etalon. Se utilizeaz, ns, o soluie etalon cu o concentraie de 4 mg P/100 cm3. Se realizeaz urmtoarea schem experimental:
Soluii Proba analiz, ml Soluie etalon, ml Proba martor, ml

BIBLIOGRAFIE
1. Artenie V., Tanase E. Practicum de biochimie general. Iai, 1981. 291 p. 2. Cojocaru D.C., Ciornea E., Cojocaru D.I. Biochimia vitaminelor i hormonilor. Lucrri practice. Iai: CORSON, 2000. 264 p. 3. Cordo E., Kekady Nady L., Frenui T. Lucrri de analiz instrumental. Cluj-Napoca, 1993. 249 p. 4. Duca Gh., Gladchi V. Lucrri practice la cursul: Metode zice de cercetare. Chiinu: USM, 2002. 140 p. 5. Duca M., Kaloshian I. Tehnici de cercetare n biologia molecular. Chiinu: USM, 2002. 70 p. 6. Grigorcea P., Glijin A. Biochimie tehnologic: Lucrri de laborator. Chiinu: CE USM, 2003. 200 p. 7. Grigorcea P., Ciobanu V., Reva V. Biochimie general: Lucrri de laborator. Chiinu: USM, 1998. 125 p. 8. Gulea A., Sandu I., Popov M. Lucrri practice de chimie anorganic. Chiinu, 1994. 398 p. 9. Haiduc I., Cobzac S. Chimie analitic cantitativ. Cluj-Napoca, Universitatea Babe-Bolyai, 1996. 119 p. 10. Lsi L., Ivasi G., Mucua A., Floca E., Bobcova S. Lucrri practice de biochimie. Chiinu, U.S.M.F. 1991. 143 p. 11. Milic C.I. Biotehnologiile viitorului. Iai: Ion Ionescu de la Brad, 1999. 359 p. 12. Neamu G. Biochimie alimentar. Bucureti: CERES. 1997. 541 p. 13. Reva V., Ciobanu V., Grigorcea P. Electroforeza proteinelor i polipeptidelor. Chiinu: USM, 1999. 112 p. 14. Reva V., Ciobanu V., Mueller-Uri F. Strategia izolrii i puricrii proteinelor. Chiinu, 2001. 185 p. 15. Revenco M., Srghie I., Chetru P. Titrimetrie. Manual. Chiinu: USM, 1998. 277 p.
195

Acid ascorbic Soluie tampon Soluie de molibdat de amoniu Soluie cu concentraie necunoscut n P Soluie etalon (4 mg P %) Se omogenizeaz.

0,5 2,0 1 0,1 -

0,5 2,0 1 0,1

0,5 2,1 1 -

Dup zece minute se citesc extinciile (E) la spectrofotometru, sczndu-se valoarea extinciei obinut pentru proba martor. Determinarea se efectueaz la = 700 nm, utiliznd cuva cu d = l cm. Calcul. Se presupune c pentru soluia etalon (4 mg P%) s-a determinat E = 0,310, iar pentru proba de concentraie necunoscut n fosfor s-a determinat E = 0,155. Concentraia n fosfor se obine astfel: 0,155 mg P/100 cm3. cp = 4 = 2 0,310

194

16. erban M., Cmpeanu G., Ionescu E. Metode de laborator n biochimia animal. Bucureti: Editura Didactic i Pedagogic, 1993. 252 p. 17. Vasiliev V.P. Chimie analitic. Chiinu, 1991. 336 p. 18. .., .. : . : , 1988. 240 . 19. ., ., ., . . : , 1991. 544 . 20. .. ( ). : , 1985. 352 . 21. / . .. : , 1987. 430 . 22. / .. , .. . . 1989. 509 . 23. . : .- , 1996. 200 .