Determinarea experimental a toxicitii Toate medicamentele de uz uman i veterinar, ca i produsele fitosanitare, nainte de a fi introduse n uzul curent (lansate pe pia),

trebuie testate din punct de vedere al inocuitii i toxicitii. Prin aceste teste se evalueaz riscul de mbolnvire pentru persoanele care fabric, manipuleaz, comercializeaz produsul, pentru persoanele tratate i pentru consumatorii n hrana crora ajung reziduurile din produs. Studiile de toxicitate experimental se clasific n 7 grupe (dup Milhaud i col., 1994): -studiul experimental al toxicitii acute; -studiul efectului iritant local i al sensibilizrii alergice; -studiul efectelor mutagene; -studiul toxicitii pe termen scurt (subacute); -studiul toxicitii pe termen lung i a efectului carcinogen; -studiul embriotoxicitii i a efectelor asupra reproduciei; -studii destinate proteciei mediului. ntruct protocoalele de testare difer n funcie de autor, pe plan mondial se pune problema uniformizrii acestora, astfel nct testele s fie recunoscute de toate rile care comercializeaz produsul. Organizaia pentru Cooperare i Dezvoltare Economic, ce cuprinde rile puternic industrializate, a elaborat unele protocoale standard. n studiile de toxicitate se utilizeaz cel mai frecvent roztoare de laborator (obolani, oareci, iepuri) i carnivore. Tendina de limitare a experimentelor pe animale a dus la dezvoltarea unor metode alternative, de testare a toxicitii pe culturi de celule, esuturi sau embrioni. Aceste metode alternative nu pot ns nlocui n totalitate testele tradiionale pe animale vii, avnd unele dezavantaje legate de: durata de supravieuire a culturilor, alegerea parametrilor revelatori ai toxicitii i faptul c o cultur de celule este un sistem izolat. 2.1.1. Determinarea toxicitii acute Toxicitatea acut exprim efectele nefaste care se manifest ntro perioad dat (obinuit 14 zile) dup administrarea unei doze unice de substan. Indicatorii cei mai utilizai pentru aprecierea toxicitii acute sunt: -doza letal 50 (DL50); 1

-concentraia letal 50 (CL50) i -doza maxim tolerabil (DMT). DL50 este doza unic, calculat statistic, la care mor 50% din animalele supuse experienei. Se exprim n mg/kg. CL50 reprezint concentraia unei substane, calculat statistic, care provoac dup expunerea pentru o perioad definit, moartea a 50% din animale ntr-un interval de timp determinat. DMT este doza maxim care provoac semne de intoxicaie, fr a avea efecte majore asupra supravieuirii. Pentru determinarea DL50 se constituie loturi ct mai omogene de animale: din aceeai su, vrst i greutate apropiat i repartiie egal pe sexe. Se recomand s se lucreze cu loturi de 10 animale (5 masculi i 5 femele). Lotului martor i se administreaz excipientul substanei de testat. Loturilor experimentale li se administreaz doze cresctoare de toxic, alese astfel nct doza cea mai mic s provoace moartea unui numr minim de animale (1-2), iar doza cea mai mare s provoace moartea majoritii animalelor, dar nu a ntregului lot. Administrarea toxicului se face o singur dat, cu sonda, dup o diet de cel puin 6 ore. Animalele sunt cazate la o temperatur situat n zona confortului termic (22 3C), la o umiditate relativ de 30 70% i regim de iluminare de 12 ore/ zi. Sunt inute n observaie 14 zile, timp n care se nregistreaz simptomele i mortalitatea. Se efectueaz examenul necropsic i histopatologic la animalele care au murit intoxicate. DL50 se calculeaz statistic, prin metoda curbei etalon. Calculul este facilitat dac se nregistreaz rezultatele pe hrtie milimetric special, cu scar logaritmic. Se poate determina DL50 i prin administrarea toxicului pe cale parenteral (i.v., i.m., s.c., i.p. sau transcutanat), menionndu-se calea utilizat. Pentru substanele gazoase sau cele care se utilizeaz sub form de aerosoli, se poate determina DL50 prin inhalaie, expunerea la toxic durnd 4 ore. n cazul produselor fitosanitare se impune evaluarea toxicitii pentru psri slbatice (prepeli, potrniche, ra slbatic), peti i albine. La psrile slbatice testarea se face pe tineret, toxicul administrndu-se fie n doze unice, fie timp de 5 zile n hran, n concentraii cresctoare. Alturi de loturile experimentale se utilizeaz un lot martor negativ, care primete hran fr toxic i un lot martor pozitiv, care primete n hran o substan a crei toxicitate este cunoscut (de exemplu, dieldrin). Toxicitatea pentru peti se exprim prin CL50 (concentraia substanei n ap, la care mor 50% din peti). Aceasta variaz n funcie 2

de timpul de expunere (24, 48 sau 96 ore), temperatura apei, gradul de oxigenare i specia utilizat. Cele mai sensibile sunt Salmonidele: Salmo gairdneri (pstrvul curcubeu) .a. Toxicitatea pentru albine trebuie determinat la toate insecticidele. DL50 se exprim n g produs/albin. Determinarea dozei maxime tolerabile (DMT) se face prin metoda secvenial. }innd cont de informaiile disponibile privind produsul, se administreaz animalelor o prim doz, care n-ar trebui s determine dect simptome minime. Dup supravegherea atent i ateptarea unui timp suficient, se administreaz doze cresctoare, pn cnd se nregistreaz simptome evidente de toxicitate (fr s fie afectat supravieuirea). Metodele alternative, de determinare a toxicitii in vitro, pe culturi celulare, constau n aprecierea concentraiei toxicului la care efectul este letal pentru celule i a concentraiei la care apar anumite modificri morfologice. Pentru reducerea numrului de animale de experien, nainte de determinarea DL50 se recomand utilizarea testului limit (limit test). Zece animale (5 masculi i 5 femele) primesc pe o cale determinat (oral sau parental) doza de 2 000 sau 5 000 mg/kg. Dac nici un animal nu moare, se apreciaz c DL50 este superioar celei utilizate. Dac nu moare nici un animal, se recurge la una din urmtoarele metode: -determinarea intervalului de toxicitate sau -metoda secvenial, ascendent sau descendent. Determinarea intervalului de toxicitate const n administrarea de doze cresctoare (de exemplu, 40, 200 i 1 000 mg/kg) la cte un mascul i o femel. n acest fel se poate aprecia c DL50 este situat n intervalul 40 200 sau 200 1 000 mg/kg .a.m.d., ceea ce permite ca la determinarea DL50 s se utilizeze un numr mai mic de loturi experimentale. Metoda secvenial const n administrarea unei doze (d) la un animal. Dac acesta supravieuiete 24 ore, la un alt animal se administreaz o doz superioar de 1,3 ori (d x 1,3). Dac i acesta supravieuiete, se continu cu d x 1,3 x 1,3 .a.m.d., pn cnd animalul de experien moare. Dac animalul a murit la prima doz (d), se continu experiena cu o doz de 1,3 ori mai mic (d/1,3), pn la doza la care animalul nu moare (Milhaud i col., 1995).

Metoda secvenial este preferabil precedentei n pregtirea pentru determinarea DL50, deoarece numrul de animale sacrificate este minim, iar intervalul de toxicitate apreciat este mic (d d x 1,3). 2.1.2. Determinarea aciunii iritante locale i a sensibilizrii alergice Studiul efectului iritant local sau alergizant are ca scop protejarea persoanelor care manipuleaz produsul, de la fabricaie pn la utilizare i cunoaterea reaciilor locale ale pielii i mucoaselor, care pot surveni dup utilizarea produsului. Astfel de testri se fac ndeosebi pentru produse fitosanitare, medicamente topice, cosmetice i produse pentru igiena corporal, de uz uman. Aciunea iritant asupra pielii se testeaz pe iepure. Se utilizeaz 3 6 animale. Produsul de testat se aplic pe pielea intact sau scarificat i se menine n contact 24 ore printr-un plasture, animalele fiind meninute n cuti de contenie speciale sau contenionate cu coliere speciale, care mpiedic ndeprtarea produsului prin lins. Se urmrete efectul local dup o or, 24, 48 i 72 ore. Reaciile cutanate (eritem i/sau edem) se noteaz dup o gril propus de Draize (1971), de la 0 la 4. Dac scorul este 2 (eritem bine definit, respectiv edem uor, bine definit), produsul va purta fraza de risc R38: iritant pentru piele. Aciunea iritant asupra globului ocular se testeaz pe iepure, prin depunerea a 100 mg produs n sacul conjunctival al unui ochi. Se nchid pleoapele i se maseaz globul ocular 20 secunde. Ochiul congener servete ca martor. Se urmrete efectul la o or i zilnic, pn la 7 zile. Se noteaz reacia corneei, irisului i a conjunctivei, dup grila propus de Draize (1971). Dac scorul este 2 pentru opacitate corneean i/sau 1 pentru leziunile irisului i/sau 2 pentru leziunile conjunctivei, produsul poart fraza de risc R36, iritant pentru ochi. Dac produsul de testat este foarte iritant pentru ochi, imediat dup ce se observ leziunile, globul ocular se spal cu o cantitate mare de ap. Aciunea iritant pentru mucoase se testeaz prin aplicarea a 100 mg produs pe mucoasa penian la iepure. Rezultatele se citesc la 24 i 72 ore, interpretarea fcndu-se dup aceleai criterii ca i pentru piele. Pentru produsele topice care necesit aplicri repetate, n special pentru cele dermatologice, se poate urmri clinic i histologic aciunea acestora dup 20 i 90 zile de utilizare.

Testele de sensibilizare alergic local se efectueaz de preferin pe cobai. Se utilizeaz protocoale diverse, dar indiferent de metod, experimentul presupune dou etape: -sensibilizarea animalului, prin contacte unice sau repetate cu produsul (injecii intradermice sau aplicaii locale, ca i n cazul testrii aciunii iritante); -declanarea reaciei alergice, prin recontact cu produsul, dup o perioad de repaus de cca. 15 zile, timp n care se dezvolt reacia imunitar. Testarea se efectueaz pe cel puin 10 animale. Dac cel puin 30% reacioneaz pozitiv, produsul se eticheteaz cu X i, purtnd fraza de risc R43: poate determina sensibilizare prin contact cu pielea (Milhaud i col., 1995). Aciunea fototoxic, constnd n capacitatea de a mri efectul razelor ultraviolete asupra pielii i aciunea fotoalergizant se testeaz prin aplicarea pe piele a produsului n cantitate de 1/4 - 3/4 din doza minim capabil de a produce eritem, urmat de iradierea cu UV i nregistrarea efectului. n cazul substanelor foarte acide (pH 2) sau foarte alcaline (pH 11,5) efectul iritant este de la sine neles, nefiind necesar testarea. Produsele de acest fel sunt incluse direct n clasa X i (iritante). n scopul reducerii numrului de animale de experien, se recomand efectuarea prealabil a testrilor pe un singur iepure. Dac reaciile sunt foarte importante, nu mai este necesar utilizarea a 3 4 animale. Metodele alternative nu sunt nc complet validate. Se utilizeaz: -testul pe membran corioalantoid de embrion de gin, n vrst de 10 zile, apreciindu-se: coagularea proteinelor n i n jurul vaselor sanguine. Se estimeaz viteza apariiei, gradul i dimensiunile leziunilor; testul pe ochi enucleat, constnd n depunerea produsului pe cornee i urmrirea efectului clinic i histologic; -testul pe culturi celulare, pentru materiale biomedicale (catetere, sonde, proteze). Mici buci de material se introduc n cultura de fibroblaste i se apreciaz modificrile celulare prin examen microscopic, dup coloraie. 2.1.3. Determinarea aciunii mutagene Mutaiile pot afecta celulele germinative sau somatice. Primele se transmit la descendeni, putnd determina apariia de anomalii (teratogenez). Mutaiile somatice pot duce la dezvoltarea tumorilor 5

maligne, existnd o strns corelaie ntre aciunea mutagen i aciunea cancerigen. Aceast observaie a permis nlocuirea testelor de carcinogenitate pe animale de laborator, care sunt costisitoare i necesit timp ndelungat, cu testele de mutagenez (Hayes, 1989; Milhaud i col.,1994). Se cunosc trei tipuri de teste de mutagenez: teste de mutaii genice; teste de mutaii cromozomiale; teste de explorare a mecanismelor de reparaie a AND. Dintre testele de mutaii genice, cel mai cunoscut este testul propus de Ames i Mc. Cann (1976), constnd n utilizarea unor sue de Salmonella typhimurium (T98, T100, TA1535, TA1537), care nu se pot dezvolta pe medii fr histidin. ntr-o plac Petri (martor) cu mediu de cultur solid, lipsit de histidin, se nsmneaz 10 9 bacterii. n alte 3 plci cu acela mediu nutritiv se plaseaz rozete sau godeuri cu concentraii diferite ale substanei de testat i se nsmneaz, aceeai tulpin de S. typhimurium, n aceeai doz ca i n placa martor. Dup incubarea la 37C, 24 ore, n placa martor se dezvolt 10 30 colonii, datorit apariiei de mutante spontane ( revertante), capabile s se dezvolte fr histidin. Testul este pozitiv (substana este mutagen) dac n plcile care conin substana de testat se dezvolt un numr mare de colonii (revertante), proporional cu concentraia substanei. Pentru aprecierea mai fidel a efectului mutagen asupra mamiferelor, se utilizeaz teste pe linii standard de culturi celulare de hamster, oarece sau om. Testele pentru evidenierea mutaiilor cromozomiale i testele de explorare a mecanismelor de reparaie a AND sunt mai laborioase i necesit experien n domeniul citogeneticii, dar legislaia european impune efectuarea lor pentru medicamentele de uz uman. Mutaiile cromozomiale pot fi depistate prin prelevarea de celule din mduva osoas a unui hamster tratat i evidenierea anomaliilor cromozomiale sau, mai simplu, prin aprecierea proporiei de eritrocite tinere n care persist resturi nucleare. 2.1.4. Studiul toxicitii subacute Are ca obiective: -evidenierea efectelor nedorite care pot surveni dup administrarea repetat a unui produs, ca urmare a aciunii cumulative sau a altor mecanisme; -precizarea naturii efectelor toxice, a organelor int i a timpului de reversibilitate a efectelor adverse; 6

-determinarea dozei fr nici un efect advers. Durata testrii variaz n funcie de produs, dar nu trebuie s depeasc 1/10 din durata vieii animalelor de experien. De exemplu, pentru medicamente care se administreaz timp de pn la 7 zile, testarea dureaz 28 zile, pentru medicamente care se administreaz 7 30 zile, testarea dureaz 90 zile, iar pentru medicamente care se administreaz peste 30 zile, ar fi necesar testarea timp de 6 luni. Calea de administrare difer n funcie de calea de contaminare: oral, transcutanat sau aerian. Metoda cea mai uzual este determinarea DL50 de 90 zile (DL5090) la obolan, pe cale oral. Ca i n cazul DL 50 unice, se constituie loturi omogene, crora li se administreaz doze diferite (cresctoare) de toxic. n plus, se utilizeaz un lot satelit de minimum 10 animale, cruia i se administreaz doza cea mai mare utilizat la loturile experimentale. Acest lot se ine sub observaie nc 28 zile dup expirarea perioadei de 90 zile, pentru a urmri reversia manifestrilor de intoxicaie. Toxicul se administreaz n hran, timp de 90 zile. Hrana nu trebuie s conin substane cu aciune cumulativ (altele dect cea de testat), ca: micotoxine, reziduuri de pesticide etc. Animalele se examineaz clinic zilnic, urmrind aspectul pielii, mucoaselor, globilor oculari, ritmul respirator, comportamentul, vivacitatea etc. Se fac cntriri sptmnale i se determin cantitatea de furaj consumat. Se efectueaz examenul oftalmologic la nceputul i la sfritul experienei. Se nregistreaz mortalitatea pe durata experienei i se calculeaz statistic DL50-90, dup metoda curbei etalon. Se efectueaz examenul necropsic minuios i examenul histopatologic, la toate animalele moarte, inclusiv cntrirea organelor interne. La sfritul experienei se sacrific toate animalele rmase n via (cu excepia lotului satelit), efectundu-se examenul hematologic i biochimic sanguin i urinar. Examenul anatomopatologic complet (inclusiv histopatologic) se efectueaz la lotul martor i la lotul care a primit cea mai mare doz de toxic. Rezultatele se exprim statistic. Doza cea mai mare la care nu se nregistreaz modificri ale nici unuia dintre parametrii menionai este considerat doza fr efect advers. La examenul anatomopatologic se acord o atenie deosebit leziunilor care ar putea sugera efectul cancerigen al substanei: necroze hepatice i renale, hiperplazia canalelor biliare, proliferri celulare anormale, noduli de regenerare etc. Pentru evaluarea riscului de intoxicaie a personalului care manipuleaz produse chimice sau pesticide, se utilizeaz o variant a 7

testului constnd n aplicarea toxicului pe pielea ras (pe cel mult 1/10 din suprafaa corporal), zilnic, timp de 28 zile la obolan. Evaluarea toxicitii prin inhalaie presupune expunerea zilnic a animalelor, timp de 6 ore. Pentru evaluarea neurotoxicitii ntrziate a organofosforicelor Organizaia pentru Cooperare i Dezvoltare Economic recomand testul de 90 zile, pe gini adulte. Se constituie loturi de 6 gini adulte (de 9 luni), care n-au fost crescute n baterii i nu prezint tulburri locomotorii. Se administreaz oral sau injectabil cte o singur doz de toxic, situat n jurul DL50, astfel nct una din doze s permit supravieuirea a cel puin 3 psri, timp de 21 zile. Dup 21 zile se repet administrarea aceleiai doze. Nu se iau n considerare manifestrile de intoxicaie acut, care apar pn la 48 72 ore de la administrare. Pentru prevenirea mortalitii este permis tratamentul cu atropin. Se noteaz tulburrile locomotorii care apar ntre a 3-a i a 21-a zi, dup fiecare administrare. La sfritul perioadei de 90 zile, psrile se sacrific i se examineaz histologic mduva spinrii i nervii sciatici, pentru a exclude tulburrile locomotorii datorate bolii lui Marek. Pentru evaluarea aciunii cumulative a unui toxic se calculeaz indicele de cronicitate (IC), reprezentnd raportul dintre DL50 i DL50-90. Teoretic, IC poate avea valori cuprinse ntre 1 90. n practic ns nu exist substane total necumulative (IC = 1), nici substane total cumulative (IC = 90). Convenional se consider c sunt cumulative substanele cu IC2. Printre cele mai cumulative toxice se numr raticidele cumarinice (Warfarina, IC = 20,8), unele chimiosterilizante (Metepa, IC = 18,1), insecticidele organoclorurate (Dieldrin, IC = 12,8) etc. 2.1.5. Studiul toxicitii pe termen lung i a efectului cancerigen Testarea toxicitii cronice are aceleai obiective ca i metoda anterioar, iar protocolul utilizat este apropiat celui pentru DL 50-90. Administrarea toxicului i nregistrarea efectelor dureaz mai mult de 1/10 din viaa animalelor de experien: 6 luni, 1 an sau 2 ani. Examenele oftalmologice, biochimice i hematologice se efectueaz din 3 n 3 luni sau din 6 n 6 luni, cnd studiul dureaz 2 ani. Reversibilitatea efectelor toxice se urmrete la lotul satelit, care a primit doza cea mai mare de toxic. La sfritul perioadei experimentale se sacrific 50% din supravieuitori, se registreaz leziunile, iar dup cel puin 28 zile se sacrific restul efectivului, urmrindu-se capacitatea de regenerare a organelor lezate. Studiul fiind foarte costisitor, se utilizeaz doar pentru 8

substane cu efecte toxice tardive, puternic cumulative sau care determin anumite efecte particulare, puin cunoscute. Testarea aciunii cancerigene necesit un protocol riguros i foarte costisitor, impunnd msuri deosebite privind: puritatea produsului de testat i calitatea hranei administrate; cunoaterea susceptibilitii suei de animale de experien fa de tumori spontane; profilaxia bolilor infecioase: utilizarea de animale indemne de germeni patogeni, cuti sterilizate, ventilaia cu aer filtrat i tratat cu UV etc (Hayes, 1989). Loturile experimentale sunt constituite din cel puin 50 animale, separate pe sexe. Supravegherea animalelor se efectueaz pe toat durata vieii (convenional, 18 luni la oareci i 2 ani la obolani) sau pn cnd mor 75 80% din animale, din fiecare lot. Se efectueaz examene hematologice i biochimice periodice, iar animalele moarte sau sacrificate se examineaz anatomo- i histopatologic. Dup Milhaud i col. (1995), un studiu de carcinogenez costa n 1983 2 4 milioane franci. Astfel de studii se efectueaz doar atunci cnd sunt cu adevrat indispensabile, lund n considerare: -structura produsului; -rezultatele testelor de mutagenez; -rezultatele observaiilor din cadrul determinrii DL50-90; -condiiile de utilizare i indicaiile produsului. Ca metode alternative se utilizeaz testele de carcinogenez pe peti (pltic, pstrv), la care se dezvolt uor tumori hepatice i teste pe scoici, care pot concentra toxicele. 2.1.6. Studiul embriotoxicitii i al efectelor asupra reproducerii n cazul substanelor susceptibile de a fi toxice pentru embrioni sau fetui se urmresc: embrioletalitatea i teratogenitatea. Embriotoxicitatea se exercit cel mai bine n perioada multiplicrii zigotului (blastul), scznd odat cu avansarea gestaiei. Teratogeneza, tradus prin apariia de malformaii, se manifest doar n perioada de organogenez (n prima treime a gestaiei). La femelele domestice, perioada de sensibilitate la produsele teratogene este situat ntre a 5-a a 15-a zi de gestaie la pisic, ntre a 8-a a 24-a zi la cea, a 9-a a 35-a zi la la scroaf i pn n a 3-a sptmn la oaie. La femeie, perioada de risc maxim este ntre a 13-a a 50-a zi. Embrioletalitatea poate masca uneori teratogenitatea, cele dou efecte fiind strns legate. 9

Testarea teratogenitii se face pe loturi de 20 obolance sau oricioaice gestante, sau pe 12 20 iepuroaice. Toxicul se administreaz o singur dat, ntre zilele 3 15 de gestaie la oricioaic i obolanc i ntre zilele 6 18 de gestaie la iepuroaic. Femelele se sacrific nainte de data ftrii (ziua a 18-a la oricioaic, a 19-a la obolanc i a 28-a la iepuroaic, pentru a evita consumul nou-nscuilor malformai de ctre femele. Se nregistreaz: numrul de corpi galbeni, numrul de fetui vii, fetui mori, resorbii embrionare, greutatea fetuilor i a placentelor. Se efectueaz examenul extern al fetuilor, cu lupa, dup care acetia sunt mprii n dou loturi. Jumtate din fetui sunt imersai n lichid Bouin, apoi sunt secionai transversal, pentru evidenierea anomaliilor organelor interne. Al doilea lot este cufundat n alcool de 70C, supus unui tratament alcalin, care face esuturile moi transparente, apoi se efectueaz coloraia cu alizarin. Colorantul se fixeaz pe schelet, evideniind anomaliile acestuia i tulburrile de osificare. Efectele toxicelor asupra reproducerii mai sunt urmrite prin: -studierea parametrilor reproducerii pe mai multe generaii; -studierea fecunditii la masculi i femele; -urmrirea toxicitii asupra fetusului n perioada peri- i postsnatal. Dintre metodele alternative, cele mai bune rezultate se obin prin testele pe culturi de embrioni de mamifere. Cei mai utilizai sunt embrionii de obolanc, prelevai n ziua a 9-a de gestaie. Embrionii se cultiv timp de 48 ore in vitro, n mediu cu substana de testat. Tulburrile de dezvoltare se pot decela prin examinare cu lupa. Dac produsul de testat nu este solubil n mediu sau nu penetreaz embrionii, rezultatele pot fi fals negative. S-au mai propus teste de embriotoxicitate efectuate pe ou sau amfibieni, peti, insecte, molute, ns nu sunt nc validate. 2.1.7 Studiul efectelor toxice asupra sistemului imunitar Sunt cunoscute efectele imunosupresoare sau imunotoxice ale unor medicamente (tetracicline, aminozide, cloramfenicol, fenobarbital clorpromazin) i toxice exogene: Pb, Hg, Cd, hidrocarburi aromatice halogenate etc. Imunotoxicitatea se manifest prin: -scderea rezistenei la infecii experimentale sau la implantul de tumori; -perturbarea maturrii i diferenierii limfocitelor T; -inversarea raportului CD4+/CD8+; -efect toxic direct asupra macrofagelor; -inhibiia funciilor polinuclearelor neutrofile; 10

-scderea concentraiei unor imunoglobuline i -creterea incidenei leucemiei acute (Hayes, 1989; Milhaud i col., 1994). Pentru evidenierea efectului imunosupresor, Descotes (1992) a propus 3 etape: -etapa de screening primar; -etapa evalurii funcionale a rspunsului imun; -confirmarea perturbrilor funcionale. Prima etap se realizeaz odat cu testarea toxicitii subacute sau cronice (DL50-90), pe baza numeroilor parametri studiai cu aceast ocazie. Se poate suspecta efectul imunotoxic al produsului de testat, pe baza urmtoarelor date: -modificrile ponderale i morfologice ale organelor interne; -examene imunohistochimice ale esuturilor limfoide; -numrul eritrocitelor i formula leucocitar; -dozarea imunogobulinelor serice; -numrul leucocitelor i al subpopulaiilor limfocitare: limfocite B, Th (CD4+), Ts (CD8+). n etapa a II-a se efectueaz teste specifice pentru imunitatea umoral i celular, in vitro i in vivo. n etapa a III-a se utilizeaz fie teste complementare celor din etapa a II-a, fie verificarea in vivo a rezistenei la infecii sau la tumori implantate. 2.1.8. Teste de ecotoxicitate Aprecierea efectelor nocive ale pesticidelor i ale diverilor poluani chimici asupra mediului nconjurtor se realizeaz prin trei categorii de teste de ecotoxicitate: -teste simple, de ecotoxicitate direct; -teste integrate; -teste n condiii de teren (n ecosisteme naturale). Studiile de ecotoxicitate urmresc evidenierea efectelor nocive induse direct, de ctre produsul de testat, ca i a aciunii metaboliilor acestuia, a capacitii de acumulare i n special de magnificaie biologic (creterea succesiv a concentraiei reziduurilor n lungul lanurilor trofice). S-a stabilit existena unei corelaii ntre proprietile fizicochimice ale substanelor (solubilitate, tensiune superficial, rezistena la reacii de hidroliz i oxido-reducere) i aciunea lor asupra mediului. Testele de ecotoxicitate direct constau n urmrirea efectului produsului de testat asupra unei singure specii, ntreinut ntr-un biotop 11

simplificat (artificial). Cel mai frecvent se utilizeaz organisme acvatice: alge, purici de balt (Daphnia magna), peti (pstrv, crap etc.). Se determin concentraia n ap a produsului, la care este inhibat dezvoltarea a 50% din indivizi (CI50) sau concentraia letal pentru 50% din indivizi (CL50). n funcie de durata expunerii exist teste de ecotoxicitate imediat (expunere de 24 96 ore) i teste pe termen mediu (expunere de 14 28 zile). Testele integrate urmresc efectul toxicului asupra unor microecosisteme artificiale sau asupra unor lanuri trofice. De exemplu, se introduce toxicul n bli artificiale cu o suprafa determinat (cca. 50m2), n anumite concentraii, urmrindu-se aciunea asupra ecosistemului pe o perioad de 3 luni 1 an, comparativ cu o balt martor, fr toxic. Se mai pot utiliza cuti din grilaj metalic care separ anumite specii de restul ecosistemului. Studiile de ecotoxicitate n condiii de teren se fac dup aplicarea produsului de testat pe anumite culturi agicole, urmrindu-se efectele asupra faunei utile i asupra celei duntoare. n cadrul studiilor de ecotoxicitate se mai urmrete procesul de biodegradare i de bioacumulare a toxicului. Produsele care se biodegradeaz n proporie de peste 70% n 28 zile sunt considerate uor biodegradabile. Bioacumularea este corelat direct cu liposolubilitatea. Comportamentul toxicului n sol depinde de proprietile fizicochimice i ncrctura n substane organice ale acestuia. Se efectueaz studii privind adsorbia toxicului, splarea acestuia pe coloane de sol, fotodegradarea, metabolizarea, timpul de njumtire, influena asupra biomasei solului etc. Recoltarea i expedierea probelor pentru examene toxicologice de laborator Comitetul Tehnic de Omologare a Metodelor de Diagnostic Paraclinic Medical Veterinar (C.T.O.M.D.P.M.V.) precizeaz condiiile generale de prelevare a probelor pentru examene toxicologice de laborator (Neda i col. 1998). a. Probe de ap Probele pentru determinarea caracteristicilor fizice i chimice se iau n recipient de sticl cu dop lefuit sau din material plastic cu dop din acelai material, cu capacitatea de 1 l. Recipienii de sticl trebuie curai cu amestec oxidant, apoi cu ap de robinet i n final cu ap 12

distilat. Pentru anumite determinri, unde este necesar o splare suplimentar, aceasta se indic n standardul de analiz respectiv. nainte de luarea probelor, recipienii se vor clti de trei ori cu apa de analizat Recipienii se vor umple cu proba pn la nivelul dopului. Probele pentru determinarea caracteristicilor bacteriologice se iau n recipient de sticl cu dop lefuit, cu capacitatea de 0,5 l, sterilizai n prealabil conform STAS 3001-83. Probele pentru determinarea caracteristicilor biologice se iau n recipieni de sticl cu capacitatea de 1 l, nesterili, conform STAS 632977. Probele de ap potabil pentru determinarea caracteristicilor fizice, chimice, radiochimice, bacteriologice i biologice se iau din reeaua de distribuie, rezervoare, fntni i izvoare. Din reeaua de distribuie, probele se iau dup ce s-a lsat apa s clocoteasc 10 minute. Din rezervoarele de ap, probele se iau de la punctul de ieire. Din puuri de captare noi, probele se iau de la punctele de distribuie dup o pompare continu, pn la atingerea debitului de regim al captrii i pn ce coninutul de cloruri, substane organice, fier, din cel puin 3 probe de control luate la interval de 1 h n timpul pomprii, nu mai variaz. Din fntni, n cazul extragerii apei prin pompare, probele se iau la gura pompei, dup o pompare de minimum 20 minute; n cazul lurii cu gleata, probele se iau de la adncimea de 30 cm sub oglinda apei. n cazul izvorului cu curgere liber, apa se recolteaz de la puntea de curgere liber a izvorului, evitnd tulburarea i ridicarea artificial a oglinzii apei. n cazul izvorului captat, probele se recolteaz de la punctul de distribuie. Recipienii cu probele pentru analiza fizic, chimic i biologic se umplu pn la semn i se nchid etan. Recipienii cu probele pentru analiza radiochimic i bacteriologic se umplu pn la cca 1 cm sub dop i se nchid etan. Intervalul de timp dintre prelevarea probelor i efectuarea analizelor trebuie s fie ct mai scurt, pentru evitarea modificrii caracteristicilor apei. n cazul n care analizele nu se pot efectua n maximum 4 h de la prelevare, probele se conserv conform tabelului 2. Conservarea probelor pentru determinarea caracteristicilor bacteriologice se face prin pstrare la temperatura de 2-40C, timp de max. 24 h. Conservarea probelor pentru determinarea caracteristicilor biologice se face prin adugarea de 10-12 ml soluie 4% de formaldehid la 1 ml de prob. Proba conservat se poate pstra maximum 7 zile.

13

Pentru meninerea organismelor animale microscopice (ex:protozoare) probele se conserv prin adugarea de 4 ml amestec 2:1 de glicerin i alcool etilic 96% vol., la 100 ml prob. Probele de ap luate pentru determinarea caracteristicilor fizice, chimice, bacteriologice i biologice se vor transporta de la locul de recoltare la locul de analiz, n lzi izoterme sau truse frigorifice, n condiii care s asigure meninerea temperaturii la maximum 40C. Fiecare prob va fi nsoit de un buletin care cuprinde urmtoarele specificri: -locul i caracterizarea sursei de ap potabil; -data lurii probei (anul, luna, ziua, ora); -modul de recoltare a probei; -temperatura apei n momentul lurii probei; -modul de conservare a probei (n cazul conservrii); -numele persoanei care a luat proba; Tabelul 2 Modul de conservare a probelor de ap pentru analize de laborator (dup Neda i col.,1998)
Parametrul de analizat Concentraia ionilor de hidrogen Amoniac Arsen Azotai Azotii Cianuri libere Aluminiu Cadmiu Cupru Plumb Zinc Pesticide Organoclorurate Mod de conservare Se pstreaz la o temperatur inferioar temperaturii de recoltare Se adaug 1 cm3 H2SO4 d=1,84 la 1 dm 3 prob i se pstreaz la 2-40C Proba se aduce la pH=2 cu HCl d1,19 Se adaug 40 mg HgCl2 la 1 dm3 prob sau 4 cm3 CHCl3 la 1 dm3 prob i se pstreaz la 2-40C Se adaug 40 mg HgCl2 la 1 dm3 prob sau 4 cm3 CHCl3 la 1 dm3 prob i se pstreaz la 2-40C Se adaug soluie 10% NaOH pn la pH=11 i se pstreaz la 2-40C Proba se aduce la pH=2 Proba se aduce la pH=2 cu HCl d1,19 Se adaug 5 cm3 de HCl cu d=1,19 la 1 dm3 prob Proba se aduce la pH=2 cu HNO3 d 1,4 Se adaug 1 cm3 HCl d=1,19 la 0,1 dm 3 prob Se pstreaz la2-30C Durata de conservare 4h 24 h 30 zile 24 h 24 h 24 h 30 zile 30 zile 30 zile 30 zile 30 zile 7 zile

14

Organofosforice Triazine Substane organice oxidabile

Se pstreaz la 2-30C Se pstreaz la 2-30C Se adaug 15 cm3 H2SO4 d=1,84 diluat 1-3% la 300 cm3 prob

24 h 7 zile 24 h

b. Probe de furaje Furajele trebuie recoltate i expediate la laborator n aa fel nct proba s reprezinte valoarea medie a furajului. La formarea probei medii se vor ndeprta obligatoriu prile superioare ale furajului, care nu se dau n consum, fiind de obicei necorespunztoare. Proba medie se formeaz din mai multe probe pariale, ridicate din puncte ct mai diferite, pentru a reflecta ct mai exact nsuirile i compoziia chimic a diferitelor tipuri de furaje. Recoltarea probelor medii pentru examen de laborator se va face de ctre sau n prezena unor organe neutre (sanitare veterinare, poliie, consilii populare). La recoltare se ntocmete un proces verbal n care se vor meniona urmtoarele: -data recoltrii probelor; -denumirea furajului i a unitii care l-a produs; -modul de depozitare, transport i ambalare, cantitatea existent; -aspectul organoleptic al furajului (culoare, gust, miros); -modul de recoltare a probelor i numele persoanelor care au executat-o; -msurile luate (scoaterea din alimentaie sau nu); -cazurile care au determinat necesitatea examenelor de laborator, artndu-se proporia mbolnvirilor, pierderilor prin mortalitate sau sacrificri de necesitate, semnele clinice, anatomo-patologice, influenele nregistrate asupra produciei animale, perioada cnd s-au constatat aceste fenomene; -nominalizarea analizelor ce se solicit a fi executate de ctre laborator. Din probele pariale recoltate se va face o prob general, care se omogenizeaz dup specificul furajului i din care se prelev proba medie. Acestea se mpart n trei poriuni: una din probe se va trimite laboratorului pentru analiz, a doua rmne organului care a recoltat proba, iar a treia se d beneficiarului. Ultimele dou probe servesc drept contraprob pentru eventuale expertize. Acestea se vor pstra n locuri uscate, rcoroase. Toate cele trei probe se sigileaz de ctre organul neutru care le-a prelevat. Fiecare prob se va ambala n saci, sculei, pungi de hrtie sau material plastic sau borcane cu dop lefuit. n cazul furajelor lichide, 15

borcanele se umplu 4/5 din volumul lor. Greutatea probelor nu trebuie s fie mai mare de 1 Kg. Probele uor alterabile se expediaz la laborator n cel mai scurt timp. n cazul n care se solicit analiza coninutului n minerale (microelemente) trebuie s se aib n vedere ca probele s nu fie umezite i s nu fie impure (nisip, pmnt). Probele pentru astfel de analize se ambaleaz n borcane de sticl splate cu ap distilat i uscate sau sculei din material plastic. Probele se trimit la laborator cu adres la care se anexeaz o copie a procesului verbal de recoltare. Fiecare prob va purta o etichet cu urmtoarele date: -denumirea furajului i numrul curent al probelor; -numele unitii de la care s-a recoltat; -data recoltrii; Recoltarea probelor: -din crue i autocamioane cu furaj vrac, probele se scot din 5 puncte diferite i ct mai adnc; -din vagoane, probele se scot de la patru coluri i la o distan de 50-75 cm de perete; -din silozuri se recolteaz din mai multe puncte i ct mai adnc; -pentru fibroase se iau din ir prin smulgere din mai multe puncte diferite; -probele din culturi mas verde se recolteaz n faza optim de vegetaie, din puncte diferite ale parcelei. Probele se trimit n ambalaje care s nu permit fermentarea. Pe lng proba medie, n episoadele de intoxicaie de natur furajer se recomand expedierea la laborator a unor probe recoltate din aa-zisele locuri fierbini: locurile de unde au consumat animalele care au prezentat manifestri severe de intoxicaie i au murit sau au fost sacrificate de necesitate. Aceste probe servesc doar la identificarea rapid a toxicului, neavnd relevan juridic (Popescu, 1996). c. Probe de material patologic Coninutul stomacal se ambaleaz n borcane de sticl brune, bine nchise, sau pungi de polietilen i se transport n termose veterinare pentru a mpiedica modificrile de pH. Creierul, ficatul, rinichiul se ambaleaz n borcane bine nchise sau n pungi de polietilen, n termose cu ghea. Sngele se recolteaz n eprubete (cca 2/3 din volum) pentru exprimarea serului i n eprubete cu EDTA. Urina, laptele, colostrul se recolteaz n borcane cu dop sau eprubete (bine splate). Voma i fecalele se transport n borcane bine nchise. 16

Adresa de nsoire a probelor trebuie s cuprind toate datele anchetei epizootologice precum i eventualele tratamente individuale sau de grup, asocierile medicamentoase. Culoarea, mirosul diverselor secreii sau excreii vor fi notate i caracterizate. La fel modificrile anatomopatologice: ulcerative, hemoragice, culoare, consisten. Se va cerceta cu atenie habitatul n care s-a produs intoxicaia i se vor recolta momeli, plante, ap, ambalaje de la furaj, aditivi, medicamente, chimicale de orice fel, etichete i sticle suspecte, care vor fi trimise laboratorului mpreun cu restul probelor chiar dac nici una din acestea nu este nc considerat agentul cauzal al intoxicaiei. Probele se trimit prin curier, n timp util, pentru a se evita alterarea i deteriorarea produselor, asigurndu-se totodat securitatea lor. Pentru precizri suplimentare privind particularitile de recoltare, conservare i expediere a probelor n vederea analizelor toxicologice de laborator, recomandm consultarea Legii sanitare veterinare nr. 60/1974, modificat prin Legea 75/1991 i a tratatului Medicin legal veterinar (vol 1 i 2, Enache i col., 1994, 1996).

17