COMPARACIN DE LOS MTODOS DE BIURET Y ULTRAVIOLETA PARA LA IDENTIFICACIN DE ALBMINA EN CLARA DE HUEVO.

Universidad de la Amazonia, Facultad de Ciencias Bsicas, programa de Qumica.

RESUMEN Se determin el porcentaje de protena en clara de huevo con el objetivo de comparar entre el mtodo Biuret y ultravioleta. Para los dos mtodos se cuantifico en un espectrofotmetro pero a diferentes longitudes de onda a 540 nm con el mtodo Biuret y a 290nm para el mtodo ultravioleta. El anlisis estadstico arrojo como resultado que el mtodo ms preciso para determinar el porcentaje (p/v) de protena en clara de huevo fue el mtodo ultravioleta con una desviacin estndar 6,40 y con coeficiente de variabilidad 59,53%. El mtodo mas exacto es el mtodo de Biuret por presentar un % de error de 16,20 a comparacin del mtodo UV que presento un error de 76,76%. PALABRAS CLAVES: Mtodo de Biuret, Mtodo UV, Protena Albumina, Precisin, Exactitud INTRODUCCIN Los principales mtodos empleados para la determinacin de protenas totales son los siguientes: Mtodo del Biuret En solucin alcalina el Cu+2 reacciona con el enlace peptdico de las protenas dando un color purpureo que se cuantifica espectrofotomtricamente (540nm). Como solucin estndar se utiliza una solucin de albumina. Protena + Cu+2 Complejo Cu-Protena (prpura)

El Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de protenas, pptidos cortos y otros compuestos con dos o ms enlaces peptdicos en sustancias de composicin desconocida. Est hecho de hidrxido potsico (KOH) y sulfato cprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4O64H2O). (Fernandez, al). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de protenas, y vira a rosa cuando se combina con polipptidos de cadena corta. El Hidrxido de Potasio no participa en la reaccin, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar.

El mtodo de Lowry: (1951) es un mtodo colorimtrico de valoracin cuantitativa de las protenas. A la muestra se aade un reactivo que forma un complejo coloreado con las protenas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentracin de protenas, segn la ley de Lambert-Beer A= e.l.c Este mtodo consta de dos etapas: 1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las protenas formando complejos con los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Estos complejos Cu2+-protena tienen un color azul claro. Adems, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la protena, exponindose los residuos fenlicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reaccin. El Cu2+ se mantiene en solucin alcalina en forma de su complejo con tartrato.(Badui, 1999). 2) La reduccin, tambin en medio bsico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenlicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayora de las protenas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el cido fosfomolibdotngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenlicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

Mtodo de Bradford se emplea un colorante hidrofbico cuyas disolucionesacuosas en presencia de acidoFosfrico tienen un color pardo y que, al encontrarse en el entorno hidrofbico del interior de una protena, origina un color azul intenso que se puede medir fcilmente. Este mtodo depende, pues de la interaccin relativamente inespecfica entre un colorante hidrofbico y las protenas, por lo que es relativamente sensible a la presencia de contaminantes tales como restos de detergente y lquidos orgnicos como el metanol. Su principal ventaja es que resulta ms rpido y fcil de emplear que otros mtodos alternativos, y ms sensible que la medida de absorbancia a 280 nm. Mtodo kjendhal

El mtodo se basa en la destruccin de la materia orgnica con cido sulfrico concentrado,formndose sulfato de amonio que en exceso de hidrxido de sodio libera amonaco, el quese destila recibindolo en: a) cido sulfrico donde se forma sulfato de amonio y el exceso de cido es valorado conhidrxido de sodio en presencia de rojo de metilo, o, b) cido brico formndose borato de amonio el que se valora con cido clorhdrico.

Las protenas se clasifican segn la solubilidad de la siguiente forma: Albuminas: solubles en agua y en solucin salina Globulinas: poco solubles en agua, solubles en solucin salina Prolaminas: solubles en etanol 60-70%; insolubles en etanol absoluto y agua Glutelinas: insolubles en agua y soluciones salinas, solubles en cidos y bases diluidos. Escleroproteinas: insolubles en agua y soluciones salinas. La curva de calibrado es un mtodo de qumica analtica empleado para medir la concentracin de una sustancia en una muestra por comparacin con una serie de elementos de concentracin conocida. Se basa en la existencia de una relacin en principio lineal entre un carcter medible (por ejemplo la absorbancia en los enfoques de espectrofotometra) y la variable a determinar (la concentracin). Para ello, se efectan diluciones de unas muestras de contenido conocido y se produce su lectura y el consiguiente establecimiento de una funcin matemtica que relacione ambas; despus, se lee el mismo carcter en la muestra problema y, mediante la sustitucin de la variable independiente de esa funcin, se obtiene la concentracin de esta. Se dice pues que la respuesta de la muestra puede cuantificarse y, empleando la curva de calibracin, se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la concentracin del analito. El propsito de esta prctica es el de comparar dos mtodos de anlisis de albmina de la clara de huevo de gallina; el mtodo de Biuret y el mtodo por espectroscopia ultravioleta.

METODOLOGIA Muestra: Clara de huevo de gallina. Materiales: espectrofotmetro para Biuret: Spectronic 20D, y espectrofotmetro para UV GENESYS 5; dos celdas de plstico de 1mL (Spectronic 20D), dos celdas de cuarzo de 1ml (Spectronic 20D), dos balones aforados de 50mL, dos beaker de vidrio de 100 ml, tubos de ensayo, frasco lavador, vidrio de reloj, vortex. Reactivos: NaCl al 0.9% (50 ml), albumina srica bovina, reactivo de biuret.

Procedimiento para el Mtodo de Biuret Se prepar una solucin patrn de albmina de 2,15mg/mL. Volumen final 50mL Se realiz las 7 mezclas indicadas a continuacin en la tabla 1. Tabla 1. Volmenes adicionados de cada sustancia para obtener las Soluciones de trabajo para la curva de calibracin. El volumen final para cada tubo fue de 6mL Muestra/tubo Patrn de albmina Muestra Agua destilada Biuret B1: Blanco B1 0.0 0.0 2.0 4.0 1 0.2 0.0 1.8 4.0 2 0.4 0.0 1.6 4.0 3 0.6 0.0 1.4 4.0 4 0.8 0.0 1.2 4.0 5 1.0 0.0 1.0 4.0 6 0.0 1.0 1.0 4.0 7 0.0 1.5 0.5 4.0

Se agit en el vortex por 30 segundos aproximadamente, y luego se dej en reposo durante 20 minutos a temperatura ambiente. Por ltimo se ley la absorbancia a 540nm Preparacin de la muestra Se pes 0.5 ml de clara de huevo y se llev a 50mL de solucin con Cloruro de sodio (NaCl) al 0.9%p/v. Procedimiento para el Mtodo de Ultravioleta (UV) Se trabaj con la solucin patrn de albmina de 2,15mg/mL, preparada para el mtodo de Biuret. Se tubo realiz las soluciones con cada una de las mezclas indicadas en la siguiente tabla: Tabla 2.Volmenes adicionados para preparar las Soluciones de trabajo para la curva de calibracin. 1 Muestra/tubo B 1 2 3 4 5 6 7 mL Patrn de albmina 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.0 0.0 muestra 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1.0 1.0 NaCl 0.9% 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 2.0 2.0 1 B : Blanco Se agit en el vortex por aproximadamente 30 segundos y se ley la absorbancia a una longitud de onda de 290nm. Preparacin de la muestra Se trabaj con la misma muestra utilizada en el Mtodo de Biuret. RESULTADOS

Mtodo de Biuret Tabla 3. Valores de Transmitancia a una longitud de onda de 540nm. N experimento 1 2 3 4 5 6 7 A 91,6 84 83,2 79,2 74,2 89 83 Ensayo (540nm) B C 94,6 83,6 98,2 86,2 91,6 89,2 88 83,2 87 81,2 92 83,8 77,4 88,6 D 97,1 95 97,2 89,2 85 93,2 80,6

Tabla 4. Valores de Absorbancia a una longitud de onda de 540nm N experimento 1 2 3 4 5 6 7 Muestra de clculos Para determinar los valores de Absorbancia de cada experimento en cada uno se los ensayos, expresados en la tabla 4, se tiene en cuenta la siguiente ecuacin: A = 2 Log T A: Absorbancia. T: Valor de Transmitancia La Absorbancia para el caso del ensayo D, experimento 2: A = 2 Log 95 [Albmina] mg/mL 0,072 0,143 A 0,038 0,076 A = 0,022 Ensayo (540nm) B C 0,024 0,008 0,077 0,064 D 0,012 0,022 A 0,038 0,076 0,080 0,101 0,129 0,051 0,081 Ensayo (540nm) B C 0,024 0,077 0,008 0,064 0,038 0,049 0,056 0,079 0,060 0,090 0,036 0,076 0,111 0,052 D 0,012 0,022 0,012 0,049 0,070 0,030 0,093

0,215 0,080 0,038 0,287 0,101 0,056 0,358 0,129 0,060 Tabla 5. Datos para la curva de calibracin. Muestra de clculos

0,049 0,079 0,090

0,012 0,049 0,070

Para calcular la concentracin de albmina expresada en la tabla 5, se tuvo en cuenta la ecuacin 2 y los volmenes expresados en la Tabla 1. (Ecuacin 2) Donde: C1 es la concentracin inicial de albmina (2,15mg/mL). V1 es el volumen de patrn de albmina adicionado a cada tubo. C2 es la concentracin que se quiere determinar. V2 es el volumen final de cada solucin o experimento (6mL).

Para el caso de la primera concentracin de albmina expresada en la columna 1.

Tabla 6. Datos de las variables de las curvas de calibracin para cada ensayo. Curva de Calibracin A B r R2 A 0,0227 0,2889 0,9745 0,9496 Ensayo (540nm) B C 0,0011 0,1678 0,8716 0,7597 0,0595 0,0573 0,4124 0,1701 D -0,0099 0,1997 0,8820 0,7779

Para hallar el valor de cada una de las variables observadas en la columna 1 de la tabla 6, se emple una calculadora CASIO fx-82ES y se llev a cabo por el mtodo de correlacin lineal. Tabla 7. Ecuaciones de las rectas Ensayo A B Ecuacin de la Recta ( Y= mx + b ) A = 0,2889[Albmina] + 0,0227 A =0,1678[Albmina] + 0,011

C D

A =0,0573[Albmina] + 0,0595 A =0,1997[Albmina] 0,0099 .

La pendiente es positiva, por lo tanto, a medida que aumenta la [Albmina] aumenta la absorbancia. Se elimina el ensayo C teniendo en cuenta el criterio de aceptacin en el que se expresa la siguiente condicin: R2 0,7500. (El R2 se puede observar en la tabla 6, fila 6); y dicho ensayo tiene un R2de 0,1701. Tabla 8. Ecuaciones de las rectas aceptadas. Ensayo A B D Ecuacin de la Recta ( Y= mx + b ) A = 0,2889 [Albmina] + 0,0227 A =0,1678 [Albmina] + 0,011 A =0,1997 [Albmina] 0,0099

Cuantificacin de protena soluble en solucin salina en clara de huevo, Tabla 4 experimento 6, ensayo A (Absorbancia = 0,051). La muestra se manej de la siguiente manera: 0,5 mL de clara de huevo se llev a 50mL de extracto, de ah se tom 1mL y se llev a 6mL de extracto. A = 0,2889 [Albmina] + 0,0227 (Ecuacin 3) 0,051 = 0,2889 [Albmina] + 0,0227 [Albmina] = 0,0980mg/mL

Ahora, teniendo en cuenta la ecuacin 2, se determina la concentracin de albmina en los 6mL de extracto:

La anterior es la concentracin de albmina en los 6mL de extracto, ahora con la misma ecuacin y teniendo en cuenta el factor de dilucin, se determina la [Albmina] (mg/mL) en los 50mL.

Para determinar la cantidad de albmina expresada en %p/v y teniendo en cuenta los clculos anteriores se puede hacer una regla de tres as: 29,4mg de Albmina 0,5mL de Clara de Huevo

X mg de Albmina

100mL de Clara de Huevo

X = 5880mg de Albmina/100mL de Clara de Huevo. Al expresar esta cantidad en g/mL (%p/v) queda: 5,880g de Albmina (protena soluble)/100mL de Clara de Huevo.

Cuantificacin de protena soluble en solucin salina en clara de huevo, Tabla 4 experimento 7, ensayo A (Absorbancia = 0,081). La muestra se manej de la siguiente manera: 0,5mL de clara de huevo se llev a 50mL de extracto, de ah se tom 1,5mL y se llev a 6mL de extracto. Teniendo en cuenta la ecuacin 3 se determina la concentracin de albmina en la solucin. 0,081 = 0,2889 [Albmina] + 0,0227 [Albmina] = 0,2018mg/mL

Por medio de la ecuacin 2 se determina la [Albmina] en los 6mL de extracto:

La concentracin de albmina en los 50mL se halla:

Para expresar el valor en %p/v: 60,54mg de Albmina X mg de Albmina 0,5mL de Clara de Huevo 100mL de Clara de Huevo

X = 12108mg de Albmina/100mL de Clara de Huevo. Al expresar esta cantidad en g/mL queda: 12,108g de Albmina (protena soluble)/100mL de Clara de Huevo. Tabla 9. %p/v expresada en mg de Albmina /100mL de Clara de Huevo. Tubo 6 7 A 5,88 12,11 Ensayo (540nm) B C 12,48 11,06 26,2 4,06 D 11,99 20,61

Mtodo de Ultravioleta Tabla 10. Valores de Absorbancia a una longitud de onda de 290nm. N experimento 1 2 3 4 5 6 7 A 0,002 0,049 0,080 0,116 0,156 0,142 0,151 Ensayo (290nm) B C 0,021 0,000 0,073 0,016 0,083 0,048 0,136 0,105 0,177 0,150 0,139 0,248 0,125 0,121 D 0,084 0,132 0,174 0,265 0,262 0,176 0,195

Tabla 11. Datos para la curva de calibracin [Albmina] mg/mL 0,143 0,287 0,430 0,573 0,717 A 0,002 0,049 0,080 0,116 0,156 Ensayo (290nm) B C 0,021 0,073 0,083 0,136 0,177 0,000 0,016 0,048 0,105 0,150 D 0,084 0,132 0,174 0,265 0,262

Tabla 12. Ecuaciones de las rectas, y Coeficiente de correlacin lineal Ensayo A B C D Ecuacin de la Recta ( Y= mx + b ) A = 0,261[Albmina] - 0,032 A = 0,262 [Albmina] - 0,014 A =0,271 [Albmina] - 0,053 A =0,341 [Albmina] + 0,037 . R2 0,99 0,97 0,96 0,94

Cuantificacin de protena soluble en solucin salina en clara de huevo, Tabla 9 experimento 6, ensayo D (Absorbancia = 0,176). A =0,341 [Albmina] + 0,037 (Ecuacin 4) 0,176 =0,341 [Albmina] + 0,037 [Albmina] = 0,4076mg/mL

Teniendo en cuenta la ecuacin 2, se determina la concentracin de albmina en los 3mL de extracto:

La anterior es la concentracin de albmina en los 3mL de extracto, ahora se determina la [Albmina] en los 50mL.

Para determinar la cantidad de albmina expresada en %p/v y teniendo en cuenta los clculos anteriores se tiene: 61,14mg de Albmina X mg de Albmina 0,5mL de Clara de Huevo 100mL de Clara de Huevo

X = 12228mg de Albmina/100mL de Clara de Huevo. Al expresar esta cantidad en g/mL (%p/v) queda: 12,228g de Albmina (protena soluble)/100mL de Clara de Huevo. Cuantificacin de protena soluble en solucin salina en clara de huevo, Tabla 9 experimento 7, ensayo D ( Absorbancia = 0,195). Con la ecuacin 4, se halla el valor de [Albmina] en dicho experimento: 0,195 =0,341 [Albmina] + 0,037 [Albmina] = 0,4633mg/mL

Concentracin de albmina en los 3mL de extracto:

[Albmina] en los 50mL de extracto:

69,4950mg de Albmina X mg de Albmina

0,5mL de Clara de Huevo 100mL de Clara de Huevo

X = 13899mg de Albmina/100mL de Clara de Huevo. Al expresar esta cantidad en g/mL (%p/v) queda:

13,899g de Albmina (protena soluble)/100mL de Clara de Huevo. Tabla 9. %p/v expresada en mg de Albmina /100mL de Clara de Huevo Tubo 6 7 A 19,97 21,03 Ensayo (290nm) B C 17,52 33,11 15,92 19,0 D 12,23 13,90

Tabla 10. Datos estadsticos obtenidos en las pruebas Biuret y UV PROMEDIO DESVIACION ESTANDAR COEFICIENTE DE VARIACION BIURET 12,55 7,47 59,58% UV 19,09 6,40 33,54%

Tabla 11. Anlisis estadstico de los dos mtodos para la determinacin de la precisin y exactitud de los mtodos. Parmetro Biuret Ultravioleta 1 %p/v Media desviacin 12,55 7,47 a 19,09 6,40a estndar Coef. De variacin 59,58% 33,54% % de error 16,20% 76,76% 1. Diferente letra minscula a la derecha de la media d. estndar indica que hay diferencias significativas entre los dos mtodos. DISCUSION DE RESULTADOS Para la comparacin de estos dos mtodos, biuret y ultravioleta fue necesario de una gran precisin a la hora de adicionar los volmenes al tubo de ensayo expresados en la tabla1, la forma de pipetear es un factor importante a la hora de realizar estos tipos de anlisis y comparaciones, ya que al medir mal los volmenes de cada reactivo la determinacin de albumina tendra valores errneos. Para cada uno de los ensayos realizado por los dos mtodos los resultados de las pendientes fueron positivas, es decir a medida que la concentracin de albumina aumenta la absorbancia aumenta tambin. Segn la tabla 4 en el ensayo C no se sigue la relacin anterior.

Para los anlisis estadsticos y determinacin del porcentaje (%) de albumina en la clara de huevo fue necesario fijar un criterio de aceptacin de los ensayos. Este criterio se determin teniendo en cuenta el R2 de cada ensayo, R2>>>> 0,7500 (ver tabla 7); por lo tanto el ensayo C se descart (tabla 8). Para cada mtodo se le realizo el anlisis estadstico (media, desviacin estndar muestral, coeficiente de variacin y porcentaje de error) tabla No 10; el mtodo de biuret tiene una desviacin estndar mayor (7,47) que el mtodo UV (6,40), igualmente los datos estn ms dispersos biuret que en UV por el coeficiente de variacin. Se realiz un anlisis estadstico en el cual se llev a cabo el test student en donde se determin que no hay diferencias significativas (P 0,05) entre los mtodos sobre el contenido de albumina en la clara de huevo. Segn el anlisis estadstico el mtodo con mayor precisin es el UV porque es el que menor desviacin y coeficiente de variacin; la precisin est en trminos de repetibilidad, es decir las muestras y los anlisis se realizaron el mismo da. El mtodo de biuret fue el mtodo que menor % de error tuvo, por lo tanto es el ms exacto. CONCLUSIONES Entre los dos mtodos no hay diferencias significativas ya que con la prueba test student (p<0,05) lo confirma. El mtodo de ultravioleta es el ms preciso por presentar una desviacin estndar de 6,40 y un coeficiente de variacin de 33,54%, estos son menores que los del mtodo de Biuret para la cuantificacin de protena (Albumina) en la clara de huevo. El mtodo de Biuret es el ms exacto ya que presenta un % de error de 16,20% a comparacin que el mtodo de UV que tiene un error de 76,76%.

BIBLIOGRAFIA Anlisis qumico cuantitativo; Daniel C. Harris Mtodos para la cuantificacin de protenas. Fernandez Emilio, Galvan Aurora. Departamento de bioqumica y biologa molecular. Campus Universitario de Rabanales. Badui S. Qumica De Los Alimentos. 3ed. 5reimpresin Editorial Alambra Mexicana. Mxico (1999)648pp.

Nota 4.7/5.0