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2013

MANUAL DE TINCIONES HEMATOLOGICAS

JORGE LUIS PALOMINO SNCHEZ 06/09/2013

CONTENIDO

INTRODUCCIN .............................................................................................................................. 1 OBJETIVOS ....................................................................................................................................... 1 TINCIONES EFECTO DE ROMANOWSKY ................................................................................... 2 TINCION DE WRIGHT ..................................................................................................................... 4 TINCIN DE GIEMSA ...................................................................................................................... 5 INDUCCIN DE DREPANOCITOS ................................................................................................. 7 TINCIN DE PERLS ......................................................................................................................... 9 TINCIN DE PASHIFF ................................................................................................................... 11 MIELOPEROXIDASA LEUCOCITARIA ...................................................................................... 14 HEMOGLOBINA FETAL ................................................................................................................ 18 SUDAN BLACK B ........................................................................................................................... 21 CONCLUSIN ................................................................................................................................. 23 BIBLIOGRAFIAS ............................................................................................................................ 23

INTRODUCCIN Las tinciones son tcnicas del laboratorio clnico que consisten en colorear, partculas y componentes de una clula especifica que se quiera observar, algunos de estos componentes son el ncleo, el citoplasma, la presencia de grnulos, enzimas, metales entre muchas cosas mas y que son apreciables gracias a que existes diversas tcnicas que nos permiten teir dichos componentes, pero a la vez realizar contrastes entre los colores para as poder identificar y describir mejor a la clula que se quiere observar. En este manual nos enfocaremos en las tcnicas de tincin mas utilizadas en el laboratorio de hematologa.

OBJETIVOS Conocer la importancia de tcnicas de tincin hematolgicas mas utilizadas en el laboratorio. Conocer la metodologa adecuada para cada una de las tcnicas. Conocer los componentes de cada una de las tinciones, as tambin las estructuras que estas colorean.

TINCIONES EFECTO DE ROMANOWSKY INTRODUCCION La tincin de Wright es un tipo de tincin usada en histologa para facilitar la diferenciacin de los tipos de clulas de la sangre. Se usa principalmente para teir frotis de sangre y punciones medulares, para ser examinadas al microscopio. En citogentica se usa para teir cromosomas, para facilitar el diagnstico de sndromes y enfermedades. Lleva el nombre de James Homer Wright, su descubridor, que la obtuvo modificando la tincin de Romanowsky, en 1902. Debido a que ayuda a distinguir fcilmente las clulas de la sangre se convirti en una tcnica muy usada para el conteo de los glbulos blancos, una tcnica rutinaria usada cuando hay sospecha de infecciones. La tincin de Romanowsky es una tcnica de tincin prototpica que fue predecesora de varios mtodos distintos, pero basados en principios similares entre los que se incluyen las tinciones de Giemsa, Jenner, Wright, Field, y Leishman, las cuales son utilizadas para diferenciar diferentes tipos de clulas en especmenes patolgicos. FUNDAMENTO Una tincin de Romanowsky consiste en azul de metileno y sus productos de oxidacin, as como eosina Y o eosina B. La accin combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky que da una coloracin prpura a los ncleos de los leucocitos y a los grnulos neutroflicos y da color rosado a los eritrocitos. Los componentes de este efecto son el azul B y la eosina Y. Las propiedades de tincin de Romanowsky dependen del enlace de los colorantes a las estructuras qumicas y de las interacciones del azul B y la eosina Y. Los agrupamientos de cidos nucleicos, las protenas de los ncleos celulares y el citoplasma inmaduro reactivo, fijan el azul B, colorante bsico. La eosina Y, colorante cido, se fija a los agrupamientos bsicos de las molculas de hemoglobina y a las protenas bsicas. La tincin de la muestra permite distinguir la forma, tamao y contorno de los hemates, leucocitos y plaquetas y el ncleo, citoplasma y granulaciones de las distintas clulas ya que adquieren diferentes colores: azul, prpura, rosa o salmn. Esta separacin por colores es el llamado efecto Romanowsky.

PROCEDIMIENTO 1. Colocar el frotis secado al aire sobre una rejilla o cubeta de tincin con la sangre hacia arriba. 2. Cubrir completamente el portaobjetos o cubreobjetos con el colorante de Romanowsky gota a gota. Dejarlo que permanezca en el frotis aproximadamente de 5-8 minutos, para fijar los glbulos sanguneos. El colorante deber cubrir completamente el portaobjetos, pero no debe derramarse por los bordes. Deber agregarse una cantidad adicional si ste se comienza a evaporar. 3. Agregar directamente al colorante un volumen igual de amortiguador de Romanowsky, para evitar la coloracin dbil. Esperar la formacin de brillo metlico. Puede usarse de igual manera agua des ionizada. Dejar actuar de 10-15 minutos. 4. Lavar con agua en el chorro cuidadosamente hasta que la extensin presente un aspecto rosado al examinarlo a simple vista. 5. Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa o algodn humedecido en alcohol para eliminar cualquier resto de colorante. 6. Secar al aire y observar con el microscopio con el objetivo de inmersin. IMPORTANCIA La tincin de la muestra con este colorante permite distinguir la forma, tamao y contorno de los hemates, leucocitos y plaquetas y el ncleo, citoplasma y granulaciones de las distintas clulas ya que adquieren diferentes colores: azul, prpura, rosa o salmn. Este colorante es muy usado para el conteo de los glbulos blancos, una tcnica rutinaria usada cuando hay sospecha de infecciones. Se usa principalmente para teir frotis de sangre y punciones medulares, para ser examinadas al microscopio. En citogentica se usa para teir cromosomas, para facilitar el diagnstico de sndromes y enfermedades.

TINCION DE WRIGHT Tincin son un conjunto de procesos que conducen a la coloracin de las estructuras. Esto tiene por objeto el aumentar el contraste entre esas estructuras y el medio que las rodea, y permite por tanto que las clulas sean visualizadas microscpicamente con mayor facilidad. IMPORTANCIA La tincin de Wright. Es de gran trascendencia clnica ya que gracias a ella es capaz de identificarse diversas estructuras en una clula as como la morfologa y en su caso patologa celular no solo de las clulas del sistema inmunolgico sino de todas aquellas que componen la sangre ya sea en un paciente sano o con un estado patolgico. FUNDAMENTO La tincin de Wright cuyo colorante est compuesto de azul de metileno (que tie de color azul las partes acidas de las clulas) y eosina (que tie las partes alcalinas) disueltos en metanol (que permite la fijacin de las clulas), adicionando a la preparacin buffer de fosfatos (que rehidrata a las clulas despus de la exposicin con metanol) PROCEDIMIENTO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Colocar una gota de sangre o impronta de clulas. Hacer la extensin de las sangre con un movimiento suave y firme. Secar al aire Cubrir el frotis completamente con el colorante de Wright durante 7 minutos. Sin tirar el colorante agregar el buffer de fosfatos durante 15 minutos. Decantar y enjuagar con agua destilada. Observar al microscopio.

TINCIN DE GIEMSA Los colorantes ms utilizados para la tincin hematolgica se basan en la coloracin de Romanowsky, constituido fundamentalmente por una mezcla de Eosina y azul de metileno. La naturaleza acida o bsica de las estructuras celulares determina su avidez por los componentes del colorante poli cromtico de Wight; es as como los cidos nucleicos se tien con azul de metileno que es bsico (azul-morado) y la hemoglobina con la eosina que es acida (rosada). MATERIAL Microscopio ptico Portaobjetos Puentes de tincin Pipetas Pasteur con tapn Tubos de ensayo Reactivos Colorantes en solucin segn Giemsa de Panreac Solucin tampn pH 7,2 de Panreac Metanol Aceite de inmersin. MUESTRA Sangre capilar fresca o venosa anti coagulada. El anticoagulante de eleccin es la heparina o el EDTA, ya que el citrato sdico y el oxalato potsico pueden dar preparaciones defectuosas. TCNICA Preparamos una frotis sanguneo Colocamos el frotis sobre el puente de tincin en posicin horizontal. Cubrimos con metanol durante 3 minutos. Escurrimos y dejamos secar al aire. Con esto procedemos a fijar el frotis. Diluimos en el tubo de ensayo 0,2 ml de azur-eosina-azul de metileno segn Giemsa con 2 ml de solucin tampn pH 7,2. Es importante realizar esta dilucin en el momento de la tincin, ya que el colorante precipita y no es vlido para otro da. Mezclamos suavemente en el tubo y con una pipeta Pasteur cubrimos el frontis dejando actuar durante 25 minutos. Escurrimos y lavamos con agua del grifo. Posteriormente lavamos con tampn pH 7,2 hasta eliminar los restos del colorante. Dejamos escurrir y secamos en posicin vertical.

RESULTADOS Se controla con extendidos de sangre en donde cada una de las diferentes clulas sanguneas tien de acuerdo a su composicin as: 1. Glbulos rojos: rojo amarillento. 2. Neutrfilos: cromatina prpura oscuro; citoplasma rosa plido; grnulos lila. 3. Eosinfilos: cromatina prpura oscuro; citoplasma azul plido; grnulos rojo brillante. 4. Basfilos: cromatina prpura oscuro; grnulos azul oscuro. 5. Linfocitos: cromatina prpura oscuro; citoplasma azul cielo. 6. Monocitos: cromatina prpura medio; citoplasma azul grisceo; grnulos lila. 7. Plaquetas: granulomero de violeta a prpura; hialomero azul claro 8. Observar en el microscopio

INDUCCIN DE DREPANOCITOS INTRODUCCIN Los hemates son las clulas ms numerosas en sangre perifrica con una vida media en torno a los 120 das. Posee una estructura bicncava con dimetro de unas 7 micras. El hemate es una clula que presenta importantes diferencias con respecto a otras clulas del organismo. En primer lugar, no tiene ncleo, por lo que le falta la capacidad de divisin. Tampoco tiene mitocondrias o ribosomas, ni ADN o ARN. No obtiene energa del ciclo de Krebs, y no tiene un sistema de transporte de electrones para la fosforilacin oxidativa. A pesar de estas deficiencias, el hemate es una clula compleja y metablicamente activa. La integridad del hemate depende de la interaccin de 3 unidades celulares que lo capacitan para realizar su funcin primaria de transporte de oxigeno y CO2. Estas tres unidades celulares son la hemoglobina, la membrana eritrocitaria y los elementos solubles intracelulares (enzimas, coenzimas y substratos del metabolismo de la glucosa). La alteracin de una de estas unidades celulares da lugar a alteraciones en las otras dos, dando como resultado un acortamiento de la vida media eritrocitaria (hemlisis). El gen de la drepanocitosis se ha hecho frecuente en frica por que el rasgo heterocigoto confiere cierta resistencia al paludismo por Plasmodium falciparum durante la infancia, favoreciendo as la supervivencia del husped y la consiguiente transmisin del gen de la hemoglobina anormal aunque en la presencia de un nico gen anormal puede proteger del paludismo, la herencia de dos genes anormales produce anemia falciforme y no confiere la mencionada proteccin, por lo que el paludismo constituye una importante causa de enfermedad y muerte en nios con anemia drepanocitica.

FUNDAMENTO Induccin de drepanocitos: En un medio carente de oxgeno (O2) la hemoglobina S se hace menos soluble y forma agregados cristalinos con la consiguiente formacin de drepanocitos. Se coloca una gota de sangre en un portaobjetos, se le agrega meta bisulfito de sodio 2%, que es un reactivo consumidor de O2 , se tapa con un cubreobjetos y se sellan los bordes con petrolato;8 en pocos minutos se puede observar el fenmeno. Si no se agrega la meta bisulfito habra que esperar entre seis y 24 horas para que ocurriera.

MATERIAL Solucin de meta bisulfito de sodio al 2% Portaobjetos Muestra con edta Cubreobjetos Parafina Microscopio Pipetas de transferencia Aplicador de madera PROCEDIMIENTO Colocar en un tubo: a) Meta bisulfito de sodio 0.05gr b) Agua destilada 2.5 mL Preparar al momento de usarse TCNICA 1. Colocar 1 gota de solucin de meta bisulfito de sodio al 2% en un portaobjetos y una gota de sangre anti coagulada. 3. Mezclar con un aplicador. 4. Tomar una pequea porcin con la orilla de un cubreobjetos y cuidadosamente sobre un portaobjetos, evitando la formacin de burbujas. 5. Sellar las orillas del cubreobjetos con parafina fundida. 6. Observar al microscopio a los 15, 30, 60 minutos, 2 horas y 24 horas colocar ste

RESULTADOS

TINCIN DE PERLS La tincin de Perls (o azul de Prusia) pone en manifiesto la presencia de hemosiderina en el citoplasma de cualquier tipo de clula, aunque se emplea fundamentalmente sobre frotis de medula sea para localizar estos depsitos de hierro no hemicos en las clulas del sistema mononuclear fagocitico (macrfagos histicos) y en Eritroblastos (sideroblastos). INTRODUCCION El Fe de depsito se encuentra en el interior de las clulas en forma de agregados o grnulos de hemosiderina detectables citoqumicamente mediante la reaccin de Perls. Esta reaccin se basa en la liberacin de los iones frricos de su unin con las protenas por la accin del cido clorhdrico; dichos iones frricos al reaccionar con el ferrocianuro potsico dan un precipitado azul verdoso de ferrocianuro frrico. Por esta reaccin se detecta el Fe hemosidernico, que es insoluble, pero no el Fe contenido en la ferritina que es hidrosoluble. Las partculas hemosidernicas se observan en el interior de los eritroblastos (sideroblastos), en algunos eritrocitos (siderocitos) y en los macrfagos medulares, del hgado y del bazo, dnde se acantonan constituyndose en Fe de depsito. En condiciones normales se observa de un 30 a un 60% de sideroblastos en cuyo interior aparecen de 1 a 4 grnulos distribuidos por la superficie del citoplasma. El aumento en el nmero de grnulos indica un acmulo excesivo de Fe y la existencia de una disfuncin en su metabolismo; esta disfuncin puede conducir a un depsito de Fe en el interior de las mitocondrias, fenmeno que pticamente se traduce por la disposicin de los grnulos hemosidernicos alrededor del ncleo en forma de collarete constituyendo los denominados sideroblastos en anillo, caractersticos y definitorios de la anemia refractaria sideroblstica, en la que deben hallarse en una proporcin superior al 15%. Este tipo de tincin se usa para valorar de forma directa el hierro de reserva. Al igual que la ferritina srica, la valoracin del hierro medular constituye un criterio diagnstico de ferropenia pre latente. En esta etapa del desarrollo de la ferropenia se observa una prctica desaparicin del hierro macrofgico y una disminucin significativa del nmero de sideroblastos. FUNDAMENTO Se basa en la produccin de ferrocianuro frrico (azul de Prusia) cuando los iones (Fe+++) Frricos, reaccionan con ferrocianuro en solucin cida.

REACTIVOS 1. Ferrocianuro de potasio al 2%........................................ 1 vol. 2. cido clorhdrico exento de Fe al 2%.............................. 1 vol. 3. Solucin de safranina al 0.5% en agua bicarbonatada a pH 7.5- 8.0

PROCEDIMIENTO 1. Fijar los frotis con vapores de formol por 5 minutos (aproximadamente de 6 a 8 gotas de Formol) 2. Vaciar la mezcla de incubacin solucin C precalentada a 56 C en un vaso de Copplin, inmediatamente colocar los frotis (previamente fijados) y tapar 3. Incubar por 30 minutos. 4. Lavar con agua de la llave. 5. Secar al aire. 6. Contra teir con solucin de rojo rpido nuclear por 5 minutos. 7. Lavar con agua de la llave. 8. Secar al aire. 9. Cubrir en resina sinttica (Permount) y cubreobjetos del No. 1.

RESULTADOS

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TINCIN DE PASHIFF La tcnica de Schiff, es una reaccin colorimtrica que se usa comnmente en Histoqumica. Utiliza PAS, cido perydico de Schiff, o leucofucsina, un colorante incoloro pero que se torna rojo estable al contacto con los grupos aldehdos. La tcnica de PAS se utiliza en los preparados para microscopa ptica, permite la tincin de componentes celulares que contienen hidratos de carbono, por ejemplo algunas membranas celulares, clulas caliciformes en la mucosa del intestino, fibras reticulares que estn rodeados por hidratos de carbono, etc. Entonces en esta tcnica, el cido perydico oxida a los grupos oxidrilos (OH) de dos carbonos cercanos, formando de esta manera grupos aldehdos compuestos por carbono, oxgeno e hidrgeno. as la leucofucsina puede reaccionar con estos y dejar una tincin rojiza.

La tincin de PAShiff es una tcnica utilizada para teir glucgeno ( presente en neutrfilos) almidn, glucoprotenas, plaquetarias y glicoforinas eritrocitarias, estas estructuras se tien de un color magenta (rosa mexicano). Los fijadores siempre son alcoholes, adems de fijar tienen otra accin, estos precipitan las molculas de glucosa. El Acido perydico libera los radicales aldehdo de las estructuras con las que entra en contacto. Al utilizar el reactivo de shiff este tie los aldehdos liberados por el cido perydico. FUNDAMENTO Durante la tincin de PAS, el cido peridico es un oxidante potente capaz de romper el enlace covalente entre dos funciones OH de una glucopiranosa. Las dos funciones de aldehdos creadas reducen el leuco derivado de la fucsina bsica de Schiff, que se vuelve rosa a rojo prpura. La hematoxilina se usa como contra colorante para intensificar el contraste. Los diagnsticos tan solo pueden darse por personas autorizadas y preparadas.

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IMPORTANCIA Permite la determinacin del glucgeno, delas mucinas, de los mucopolisacridos neutros as como de los filamentos y esporasmicelianos. El cido peridico transforma los glicoles en aldehdo. El reactivo de Schiff, desteido por el cido sulfrico, reacciona con los aldehdos libres formando un producto de condensacin de color rojo, contra teido con la hematoxilina. La manipulacin de este producto queda reservada a los profesionales. MATERIALES 1 SOLUCIN FIJADORA 1 SOLUCIN DE CIDO PERYDICO AL 1% 1 REACTIVO DE SHIFF 1 REACTIVO DE HEMATOXILINA DE GILL

CONSERVACIN: a 4 C: - Solucin fijadora - Solucin de cido perydico al 1% - Reactivo de shiff - Hematoxilina de Gill a temperatura ambiente en un lugar fresco y seco. Tejido bien fijado en secciones de parafina.

REACTIVOS

Reactivo A cido perydico Reactivo B Reactivo de Schiff Reactivo C Potasio meta-Bisulfito solucin Reactivo D Solucin fijadora Reactivo E Hematoxilina de Mayer

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PROCEDIMIENTO

1. Fijar los frotis por 5 minutos (utilizar la solucin fijadora a temperatura ambiente). 2. Lavar con agua de la llave. 3. Secar al aire. 4. Colocar en cido perydico durante 10 minutos (utilizar la solucin a temperatura ambiente) 5. Lavar con agua de la llave y secar perfectamente. 6. Sumergir en el reactivo de Shiff por 20 minutos. (utilizar el reactivo a temperatura ambiente). 7. Lavar con agua de la llave y secar perfectamente. 8. Contra teir con hematoxilina de Gill por 10 minutos. 9. Lavar con agua de la llave y secar perfectamente. 10. Cubrir con resina sinttica (Permount) y cubreobjetos del No. 1 11. Observar en el microscopio.

RESULTADOS

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MIELOPEROXIDASA LEUCOCITARIA INTRODUCCIN La Peroxidasa leucocitaria (Mieloperoxidasa) de Sigma-Aldrich se utiliza para la demostracin histoqumica en peroxidasa leucocitaria. Los reactivos de peroxidasa leucocitaria son para uso diagnstico in vitro. Los mtodos clsicos de la localizacin citoqumica de la mieloperoxidasa (MPO) incluyen el uso de benzidina1 o diaminobenzidina2. En 1977, Hanker y cols.3 describieron el uso de p-fenilenediamina y catecol para detectar la peroxidasa de rbano inyectada. Este sistema indicador es la base del procedimiento de Sigma-Aldrich al detectar la mieloperoxidasa por medio de la siguiente reaccin: MPO p-fenilenediamina + Producto de reaccin insoluble marrn-negro Catecol + H2O2 FUNDAMENTO Se hace a una muestra (frotis) para saber si las clulas (blastos) son de origen mieloide. Cuando se realiza no se sabe si las clulas inmaduras son linfoides o mieloides. Cabe mencionar que la mieloperoxidasa no la tienen las clulas linfoides, slo las mieloides. La peroxidasa es la enzima que esta presente en los grnulos primarios de los neutrfilos y con lo que se tie es con su sustrato y un indicador de la reaccin, y al trasnsformar el sustrato, que es el agua oxigenada, se oxida el indicador que es la bencidina y la clula que tenga mieloperoxidasa se tie de caf o azul y las clulas que no la tengan no se tien, pero se pueden teir con safranina para que los que no reaccione se tiaa de naranja APLICACIN El kit de peroxidasa (mieloperoxidasa) es un sistema de tincin citotcnica para detectar polimorfonucleocitos en frotis de sangre o mdula sea. Las caractersticas detincin de los polimorfonucleocitos se utilizan para diferenciar la leucemia mieloctica de otros tipos de leucemia. Los reactivos de peroxidasa son para uso diagnstico in vitro.

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REACTIVOS TAMPN TRIZMAL 6,3 CONCENTRADO, con cloroformo como conservante. REACTIVO INDICADOR DE PEROXIDASA, p-fenilenediamina diHCl (1 parte) y catecol (2 partes). SOLUCIN DE HEMATOXILINA CIDA, Hematoxilina certificada, 1 g/l, pH 3,3 a 25 C.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD Almacenar el tampn Trizmal 6,3 concentrado y la solucin de hematoxilina cida a temperatura ambiente (1826 C). El reactivo indicador de peroxidasa debe almacenarse refrigerado (28 C). La solucin de hematoxilina cida no debe devolverse al recipiente original despus de su uso en un vaso de Coplin. El perxido de hidrgeno al 3 % en una solucin salina tamponada con fosfato debe guardarse en el frigorfico (28 C). Desechar si presenta turbidez. Los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad.

DETERIORO Desechar el tampn Trizmal 6,3 concentrado si presenta turbidez. Desechar la solucin de hematoxilina cida cuando el tiempo requerido para obtener la tincin adecuada supere en ms de 5 minutos el tiempo recomendado en el procedimiento.

PREPARACIN (REACTIVOS) El tampn Trizmal 6,3 diluido se prepara mezclando 1 volumen de tampn TRIZMAL 6,3 concentrado, nmero de catlogo 90-3C, con 9 volmenes de agua desionizada. Utilizar una sola vez y desecharlo. La solucin fijadora de etanol, 95 % (v/v), se prepara mezclando 5 ml de formaldehdo al 37 % con 45 ml de etanol al 95 %. Las preparaciones deben ser del da. Mantenga el envase bien cerrado.

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El perxido de hidrgeno al 3 % en una solucin salina tamponada con fosfato se prepara aadiendo 1 parte de perxido de hidrgeno, 30 %, a 9 partes de solucin salina tamponada con fosfato, pH 7,4. Debe prepararse al momento.

PROCEDIMIENTO 1 RECOGIDA DE LA MUESTRA Se recomienda que la recogida de la muestra se lleve a cabo de acuerdo con las directrices del documento M29-A2 de la NCCLS. Ningn mtodo de prueba puede garantizar la completa seguridad de que las muestras de sangre o tejido no transmitan infecciones. Por lo tanto, todos los derivados de la sangre o muestras de tejido deben considerarse potencialmente infecciosos. Para el ensayo deben utilizarse frotis de sangre total o de mdula sea recin preparados. La sangre puede recogerse en heparina o EDTA. Debe reducirse al mnimo la exposicin a la luz ya que la peroxidasa leucocitaria es fotosensible. Los frotis sin fijar son estables durante 3 semanas si se guardan en la oscuridad1. Antes de la fijacin, los frotis deben dejarse al aire durante 10 minutos, protegidos de la luz.

MATERIAL ESPECIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO Solucin de formaldehdo, 37 % Etanol, 95 % (v/v) Solucin salina tamponada con fosfato, pH 7,4, nmero de catlogo P 3813 Perxido de hidrgeno, 30 % NOTAS A efectos de comprobacin del funcionamiento del sistema, se recomienda procesar los frotis de sangre procedentes de donantes sanos junto con las muestras de paciente. Aunque la mieloperoxidasa generalmente se considera un marcador de clulas de alineacin mielocitica, es obligatorio reconocer que las clulas monocitoides tambin pueden mostrar actividad leve de peroxidasa. Los datos obtenidos mediante este procedimiento slo sirven como ayuda en el diagnstico y deben ser revisados junto con otras pruebas clnicas o informacin de diagnstico.

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PROCEDIMIENTO 2 (Tecnica) 1. Fijar los frotis a temperatura ambiente durante 30 segundos con solucin fijadora. 2. Lavar los portaobjetos con agua corriente a chorro suave durante 2 minutos y secar al aire durante 10 minutos, en la oscuridad. 3. Precalentar 50 ml de tampn TRIZMAL 6,3 diluido, en un bao de agua a 37 C. 4. Inmediatamente antes de su uso, aadir 1 vial de reactivo indicador de peroxidasa, de hidrgeno al 3 %, al tampn Trizmal 6,3 diluido precalentado. Mezclar a conciencia. Desechar despus de su uso. 5. Colocar los portaobjetos lavados, fijados (paso 2) con solucin de reactivo indicador de peroxidasa (paso 4) durante 30 minutos, en un bao de agua a 37 C, en la oscuridad. 6. Tras la incubacin, lavar los portaobjetos con agua corriente a chorro suave durante 15 30 segundos y dejarlos secar. 7. Contrateir los portaobjetos con solucin de hematoxilina cida, 8. Aclarar los portaobjetos en agua desionizada corriente durante 1530 segundos. Secar los portaobjetos al aire y examinarlos con el microscopio. CARACTERSTICAS DE FUNCIONAMIENTO Los frotis de sangre procedentes de donantes normales se tieron para mieloperoxidasa de acuerdo con este procedimiento y mediante el mtodo de benzidina1. Los neutrfilos muestran una granulacin marrn-negra con este procedimiento, y una granulacin azul con el procedimiento de benzidina. En ambos casos, los monocitos se tieron menos intensamente y los linfocitos no mostraron ninguna actividad de mieloperoxidasa. RESULTADOS

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HEMOGLOBINA FETAL APLICACIONES Los reactivos de hemoglobina fetal estn diseados para la determinacin semicuantitativa de la elucin cida de la hemoglobina fetal en extensiones de sangre. Los reactivos de tincin de la hemoglobina fetal son para uso diagnstico in vitro. Ya en 1864, Korber descubri que la hemoglobina del feto era ms resistente a la desnaturalizacin alcalina que la de los adultos. Los avances en las tcnicas de aislamiento y caracterizacin de protenas han propiciado el descubrimiento de la existencia de varias propiedades distintivas que hacen posible diferenciar la hemoglobina fetal de la adulta. Entre ellas, se encuentra la resistencia de la hemoglobina fetal (hemoglobina F) a la elucincida. Cuando las extensiones de sangre se sumergen en tampn cido, por ejemplo, la hemoglobina adulta se eluye de los eritrocitos, pero la hemoglobina fetal, no. Si las extensiones de sangre se tratan de esta manera y luego se tien, los eritrocitos con hemoglobina F adquirirn la tincin, mientras que aqullos que contienen slo hemoglobina adulta aparecern como fantasmas. La tcnica de portaobjetos para la demostracin de la hemoglobina fetal en relacincon su resistencia a la elucin cida, fue propuesta por primera vez por Kleihauer y cols ,y ms tarde fue modificada por Shepard y cols. El procedimiento de Sigma mejora an ms este enfoque segn lo describen Oski y Naiman. Las estimaciones de la hemoglobina fetal algunas veces se hacen para determinar posibles hemorragias en el recin nacido, especialmente en casos en los que existen signos de sangrado rectal. El ensayo de hemoglobina F tambin se aplica a adultos como ayuda en el diagnstico de ciertos tipos de anemia. Por ejemplo, en pacientes con talasemia mayor la hemoglobina fetal se encuentra en un 1090 %. Asimismo, generalmente se observan pequeos aumentos de pigmento de sangre fetal en pacientes con drepanocitemia. En los casos de incompatibilidad de Rh, cada vez es ms comn suprimir las reacciones inmunes a los hemates que pasan a la circulacin materna desde el feto. La cantidad de gammaglobulina especfica que contiene el anti-Rh (D) a administrar, se calcula evaluando la magnitud de las hemorragias feto-maternas. Segn la tcnica descrita, las extensiones de sangre, debidamente secas y fijadas, se sumergen en un tampn citrato de pH 3,3 a 37 C. La hemoglobina adulta A (HbA) se disuelve fuera de las clulas, mientras que la hemoglobina fetal (HbF), que es cido rresistente, permanece en el interior de las clulas y puede ser teida para proceder al examen microscpico.
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REACTIVOS CONCENTRADO DE TAMPN FOSFATO-CITRATO, nmero de catlogo 285-1 Citrato sdico, 0,7 mol/l, y fosfato sdico, 0,6 mol/l. SOLUCIN DE HEMATOXILINA CIDA, nmero de catlogo 285-2 Hematoxilina certificada, 1 g/l, sulfato de amonio y aluminio, yodato sdico y estabilizantes, pH 3,3. SOLUCIN DE EOSINA B, nmero de catlogo 285-3 Eosina B, 0,1 %, solucin acuosa. Azida sdica, 0,1 %, como conservante. Fijador de etanol, nmero de catlogo 285-8 (80 % v/v, alcohol etlico).

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD Almacenar el concentrado de tampn fosfato-citrato en el frigorfico (28 C). Desechar si el crecimiento microbiano es evidente. Almacenar la solucin de tampn fosfato-citrato en el frigorfico (28 C). Estable durante 2 semanas. Usar una alcuota fresca cada da. Desechar si el crecimiento microbiano es evidente. Almacenar las soluciones de hematoxilina y eosina B a temperatura ambiente (1826 C). Las soluciones se pueden reutilizar si se almacenan en frascos de tincin hermticos con luz atenuada. Almacenar el fijador de etanol a temperatura ambiente. Almacenar hermticamente cerrado y como lquido inflamable. La solucin puede utilizarse varias veces, pero debe desecharse si la fijacin no es la adecuada.

DETERIORO Desechar la solucin de hematoxilina cida cuando el tiempo requerido para obtener la tincin adecuada supere en ms de 8 minutos el tiempo recomendado.

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PROCEDIMIENTO 1. La solucin de tampn fosfato-citrato debe calentarse a 37 C en un vaso de Coplin o en un plato de tincin. 2. Utilizando portaobjetos de microscopio, limpios y etiquetados, preparar extensiones de sangre finas. Preparar portaobjetos de CONTROL utilizando sangre HbF positiva (cordn umbilical) y sangre adulta normal. Secar al aire durante unos 10 minutos. 3. Fijar los portaobjetos sumergiendo fijador de etanol, nmero de catlogo 285-8, durante 5 minutos, aclarar bien con agua del grifo y secar al aire. 4. Sumergir los portaobjetos de PRUEBA y de CONTROL en solucin de tampn fosfatocitrato precalentada a 37 C durante 5 minutos. Agitar tras 1 y 3 minutos de inmersin. El grado de agitacin puede variarse para conseguir los resultados deseados. Aclarar bien con agua destilada y secar al aire completamente para evitar artefactos de tincin. 5. Teir los portaobjetos durante 3 minutos en solucin de hematoxilina cida, nmero de catlogo 285-2. Aclarar los portaobjetos con agua destilada y sacudir el exceso de agua. 6. Contra teir los portaobjetos durante 4 minutos en solucin de eosina B, nmero de catlogo 285-3, al 0,1 %. Aclarar bien con agua destilada y secar al aire. 7. Colocar cubreobjetos secos en el portaobjetos y examinar mediante inmersin de aceite (1000X). La ausencia de HbF se evidencia mediante la presencia de clulas fantasma, mientras que la HbF retenida hace que las clulas aparezcan de color rojo brillante. No aplicar aceite directamente en el portaobjetos. NOTA: Puede utilizarse una ampliacin de 400X, pero el campo resultante ser ms grande y ms difcil de contar. RESULTADOS La proporcin de eritrocitos con hemoglobina fetal puede estimarse de diferentes formas. Al estudiar la sangre materna para ver las clulas con contenido de HbF, Oski y Naiman4 recomendaron lo siguiente: 1. Contar el nmero total de eritrocitos en 5 campos y determinar el promedio por campo. 2. Seguidamente, contar el nmero de eritrocitos con HbF que hayan quedado profundamente teidos en unos 30 campos, y determinar el promedio por campo. 3. Calcular el porcentaje de eritrocitos con HbF basndose en el nmero total de eritrocitos por campo. Los resultados se informan como porcentaje de HbF presente.
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SUDAN BLACK B APLICACIN El sistema de tincin Sudan Black se utiliza en la demostracin histoqumica de grnulos neutrfilos en frotis de sangre o mdula sea. El sistema de tincin Sudan Black B es para uso diagnstico in vitro. Varios lpidos, incluyendo los fosfolpidos, las grasas neutras y los esteroles, se tien intensamente con Sudan Black B. La reaccin de los grnulos neutrfilos con el tinte fue descrita por Sheehan y Storey en 19471. Generalmente, el patrn de tincin leucocitaria de Sudan Black B es parecido al de la mieloperoxidasa. Las clulas que se encuentran a lo largo de las vas linfticas muestran una tincin negativa, mientras que las formas mieloides y monocitoides muestran las reacciones positivas caractersticas. Por lo tanto, Sudan Black B est considerado como un auxiliar til en la identificacin de las leucemias mielocticas y mielomonocticas. Los mtodos antiguos utilizaban una fijacin de vapor de formaldehdo en los frotis de sangre, tcnica que puede dar como resultado una prdida celular y artefactos de tincin. El procedimiento de utiliza un fijador de glutaraldehdo tamponado y un tiempo de incubacin ms corto, lo que da como resultado una excelente tincin sinprdida celular ni distorsin. REACTIVOS REACTIVO DE TINCIN SUDAN BLACK B, Sudan Black B, 0,18 % (p/v), en 69 % de etanol y con fenol tamponado con fosfato. SOLUCIN DE HEMATOXILINA, GILL N 3, Hematoxilina certificada, 6 g/l, yodato sdico, 0,6 g/l, sulfato de aluminio, 52,8 g/l, y estabilizante. SOLUCIN DE GLUTARALDEHDO, Glutaraldehdo, 4 % en tampn borato, pH 7,6.

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PROCEDIMIENTO 1. Enfriar la solucin fijadora de glutaraldehdo en el frigorfico (28 C). 2. Las extensiones o frotis de sangre o mdula sea se fijan durante 1 minuto a 28 C con una suave agitacin seguida de un lavado concienzudo con agua desionizada. 3. Para teir con el reactivo de tincin Sudan Black B, sumergir durante 5 minutos con agitacin intermitente. 4. Enjuagar 3 veces o ms en etanol al 70 % hasta que ya no desprenda tinte. Seguidamente, enjuagar a fondo con agua destilada. 5. Contra teir con solucin de hematoxilina, Gill N 3, durante 5 minutos y seguidamente enjuagar a fondo con agua del grifo. 6. Despus de secar al aire, los portaobjetos pueden montarse en DPX para histologa, o en otro medio de montaje permanente que sea adecuado.

RESULTADOS Los neutrfilos y sus precursores muestran una granulacin intracelular azul-negra. Los monocitos se tien menos intensamente y los linfocitos no se tien con Sudan Black B2. Los frotis de sangre procedentes de donantes normales se tieron con Sudan Black B de acuerdo con el procedimiento descrito y mediante el mtodo clsico de Sheehan Storey. Los neutrfilos mostraron una granulacin azul-negra con este procedimiento y tambin con el procedimiento de Sheehan-Storey. En ambos casos, los monocitos se tieron menos intensamente y los linfocitos no mostraron ninguna actividad de mieloperoxidasa.

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CONCLUSIN Este pequeo manual es una recopilacin de muchos artculos, libros, ideas y comentarios de maestros y compaeros que colaboraron conmigo para poder realizarlo, del cual pienso que podra ser una herramienta de gran utilidad tanto para estudiantes de qumica de secundaria, preparatoria y nivel superior que estn interesados por la hematologa, y que adems de contener informacin til considero que es muy practico. Adems me gustara agregar que este manual solo es una pequea recopilacin de la informacin ms importante y que en un futuro puede que se expanda la informacin que esta contiene.

BIBLIOGRAFIAS 1- KRAFTS K, HEMPELMANN E, OLEKSYN BJ (2011). IN SEARCH OF THE MALARIAL PARASITE: BIOGRAPHICAL SKETCHES OF THE BLOOD STAIN CONTRIBUTORS. PARASITOL RESEARCH 109 (3): PP. 521529. 2- ROMANOWSKY D (1891). ZUR FRAGE DER PARASITOLOGIE UND THERAPIE DER MALARIA. ST PETERSBURG MED WOCHENSCHR 16: PP. 297302, 307 315. 3- HEMATOLOGY: PRINCIPLES AND PROCEDURES, SIXTH EDITION, BROW AB, LEA & FEBIGER, PHILADELPHIA 1993 P. 101 4- GRIGNASCHI U. J.; DIAGNSTICO CITOLGICO DE LAS HEMOPATAS; ED. MDICA PANAMERICANA; MADRID ESPAA 1991. 5- MCKENZIE SHIRLY B; HEMATOLOGA CLNICA; SEGUNDA REIMPRESIN DE LA PRIMERA EDICIN; ED. MANUAL MODERNO; 1994 6- GUILLERMO J. RUIZ ARGELLES, FUNDAMENTOS DE HEMATOLOGIA 7- J. M. ARRIBAS CASTRILLO, EMILIO VALLINA LVAREZ, HEMATOLOGA CLNICA. TEMAS DE PATOLOGA MDICA 8- HEMATOLOGY: PRINCIPLES AND PROCEDURES, SIXTH EDITION, BROWN AB, LEA & FEBIGER, PHILADELPHIA 1993 P101 9- CLARK, GEORGE, STAINS AND STAINING (MICROSCOPY), 4TH EDITION, WILLIAMS & WILKINS, (1981).

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11- BURCK, H. C.: TCNICA HISTOLGICA. MANUAL PARA REALIZAR PREPARACIONES MICROSCPICAS EN EL LABORATORIO. ED PAZ MONTALVO. MADRID, 1969 12- RAIMUNDO GARCA DEL MORAL: LABORATORIO DE ANATOMA PATOLGICA. ED INTERAMERICANA - MCGRAW-HILL. MADRID, 1993. 13- HEMATOLOGA: MEDICINA DE LABORATORIO - PGINA 224 14- PEROXIDASA (MIELOPEROXIDASA) PROCEDIMIENTO NMERO 391, SIGMA ALDRICH. 15- INSERTOS TINCIONES MACEDONIO (COMAC) HEMATOLOGICAS, COMERCIALIZADORAS

16- SISTEMA DE TINCIN SUDAN BLACK B (PROCEDIMIENTO NMERO 380), SIGMA-ALDRICH 17- HEMOGLOBINA FETAL, (PROCEDIMIENTO NMERO 285) 18- MARMONT AM, DAMASIO E, ZUCKER-FRANKLIN D: LOS NEUTRFILOS. EN ATLAS DE LAS CLULAS SANGUNEAS - FUNCIN Y PATOLOGA, VOL. 1, D ZUCKER-FRANKLIN, MF GREAVES, CE GROSSI, AM MARMONT, EDITORS, LEA Y FEBIGER, PHILADELPHIA, 1981, PP 149-242

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