BIOLOGA MOLECULAR DE

LA CLULA
TERCERA EDICION

Bruce Alberts Dennis Bray Julian Lewis Martin Raff Keith Roberts James D. Watson
Traducido por

Merc Durfort i Coll

Catedrtica de Biologa Celular Animal y Vegetal de la Facultad de Biologa de la Universidad de Barcelona

Miquel Llobera i Sande

Catedrtico de Bioqumica y Biologa Molecular de la Facultad de Biologa de la Universidad de Barcelona

EDICIONES OMEGA

Bruce Alberts es Doctor (Ph.D.) por la Universidad de Harvard y

actualmente es Presidente de la National Academy of Sciences y Profesor de Bioqumica y Biofsica en la Universidad de California, San Francisco. Dermis Bray es Doctor (Ph.D.) por el Massachusetts Institute of Technology y actualmente est becado por el Medical Research Council en el Departamento de Zoologa de la Universidad de Cambridge. Julian Lewis es Doctor (D.Phil.) por la Universidad de Oxford y actualmente es Senior Scientist en el Imperial Cancer Research Fund Developmental Biology Unit, de la Universidad de Oxford. Martin Raff es Doctor (M.D.) por la Universidad de McGill y actualmente es Profesor del MRC Laboratory for Molecular Cell Biology y del Biology Department University College de Londres. Keith Roberts es Doctor (Ph.D.) por la Universidad de Cambridge y actualmente es Director del Department of Cell Biology del John Innes Institute de Norwich. James D. Watson es Doctor (Ph.D.) por la Universidad de Indiana y actualmente es Director del Cold Spring Harbor Laboratory. Es autor de Molecular Biology o f the Gene y, con Francis Crick y Maurice Wilkins, recibi el Premio Nobel de Medicina y Fisiologa en 1962.

En la traduccin han colaborado: Dra. M. Grcia Bozzo, Dra. Roser Pagan, Dra. Montserrat Poquet, Dr. Manuel Reina, Dr. Josep Valero y Dr. Senn Vilar.

Reimpresin: Enero 2002

Quedan rigurosamente prohibidas, sin la autorizacin escrita de los titulares del Copyright, bajo las sanciones establecidas en las leyes, la reproduccin total o parcial de esta obra por cualquier medio o procedimiento, comprendidos la reprografa y el tratamiento informtico, y la distribucin de ejemplares de ella mediante alquiler o prstamo pblicos, as como la exportacin e importacin de estos ejemplares para su distribucin en venta, fuera del mbito de la Unin Europea. Authorized translation from English language edition published by Garland Publishing, Inc.

MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL 1993,1989,1994 by Bruce Alberts, Dennis Bray, Julian Lewis,
Martin Raff, Keith Roberts and James D. Watson y para la edicin espaola 1996,2002 Ediciones Omega, S.A. Plat, 26 - 08006 Barcelona www.ediciones-omega.es ISBN 84-282-1011-X Depsito legal B. 39.082-2001 Printed in Spain Ind. Grf. Ferr Olsina, SA. - Viladomat, 158-160 int. - 08015 Bai

Cubierta anterior: la fotografa muestra una bra nerviosa de rata en cultivo. Est marcada con un fluorocromo asociado a un anticuerpo que reconoce el soma celular y las prolongaciones dendrticas de la clula (am arillo ). Los terminales nerviosos (verde) de otras neuronas (no visibles) que han establecido sinapsis con la clula estn marcados con un anticuerpo diferente. (Por cortesa de Olaf Mundigl y Pietro de Camilli.) Cubierta posterior: los autores, en orden alfabtico, atravesando Abbey Eoad en Londres, yendo a comer. La mayor parte de esta tercera edicin se ha escrito en una casa situada en el ngulo de la imagen. (Fotografa de Richard Olivier.) Dedicatoria; Gavin Borden, ltimo presidente de Garland Publishing, curtido durante la ascensin cerca del Mount McKinley, a mediados de 1980, con Bruce Alberts, autor de Biologa Molecular de la Clula" y el famoso gula de montaa Mugs Stump (1940-1992).

Gavin Borden 1 de mayo de 1939 - 20 de diciembre de 1991

Prefacio a la tercera edicin

La investigacin biolgica se encuentra en una fase explosiva impulsada por los nuevos conocim ientos de las unidades bsicas de todas las formas de vida. Ac tualmente, la clave de un problema sobre neuronas, clulas vegetales o cncer puede encontrarse investigando en levaduras, ranas o moscas. Ahora ms que nunca, la gentica molecular nos ensea cmo reconocer y aprovechar estas co nexiones y nos obliga a reflexionar sobre los antiguos orgenes de los com po nentes a partir de los cuales estamos construidos. Al sobrevolar la biologa celu lar uno no sabe si maravillarse ms con la variedad sin fin de sistemas vivos o con las similitudes fundamentales de los mecanismos a travs de los que estos sistemas actan. El desafo que supone escribir un libro de texto consiste en escoger los con ceptos ms importantes de todo lo que conocem os. El problema de revisarlo consiste en descubrir qu conceptos han cambiado o cules han aparecido de nuevo. Se trata de algo muy diferente a hacer un resumen de hechos aparecidos recientemente: una gran cantidad de nuevos conceptos pueden cambiar muy poco nuestra visin de las clulas, mientras que algunos pueden transformar la visin global de la cuestin. Reconociendo que es imposible ser exhaustivos, nos hemos esforzado en intentar asegurar que nuestro libro pueda proporcionar una visin de la biologa celular que los estudiantes puedan leer y digerir. Por ello nos hemos dedicado a reflexionar tanto sobre el problema de qu haba que eli minar como sobre el problema de qu haba que aadir. En esta tercera edicin, grandes partes del texto se han reescrito totalmente de acuerdo con los nuevos avances. Dos captulos -e l de los vegetales y el de neurobiologa- se han fragmentado y sus componentes se han integrado en otros captulos, poniendo de relieve que estos temas no son elementos colatera les propios de especialistas sino que pertenecen al ncleo de la biologa celular. Algunos de los captulos centrales del libro se han subdividido en partes ms manejables y se ha aadido un captulo sobre la tecnologa del DNA recombinante. Tam bin hemos insertado otro captulo sobre los principios de la funcin de las protenas, que muestra que las protenas trabajan como molculas con partes mviles, constituyendo los artilugios dinmicos de la clula viva -u n a cuestin fundamental que est empezando a cobrar la importancia que se m ere ce gracias al rpido incremento de conocimientos que se est produciendo so bre la estructura de las protenas. Al final del libro hemos aadido un glosario de trminos tcnicos esenciales. Para estudiar las molculas de la vida, hemos seleccionado una antologa de ellas y las hemos incluido en un disquete de ordenador junto con el programa Kinemage, que nos permite ver las estructuras moleculares en tres dimensiones, rotarlas y manipularlas sobre la pantalla del ordenador, as como observar cmo sufren cambios conformacionales. Tim Hunt y John Wilson han actualizado y ampliado su libro de problemas que acompaa lo ms importante del texto y que ayuda a los estudiantes a apreciar los experimentos y a razonar sobre las ba ses de nuestro conocim iento de las clulas. Tanto el disquete de las estructuras moleculares como el libro de problemas puede conseguirse a travs de la edito rial americana: Garland Publishing, Inc. 717 Fifth Avenue, New York, NY 10022. Estados Unidos. Queremos agradecer especialmente a nuestros colaboradores (todos ellos de la Universidad de California, San Francisco) que han contribuido de forma importante en la redaccin de determinados captulos: Sandy Johnson (Captu los 8 y 9), Peter Walter (Captulos 12 y 13), Andrew Murray (Captulo 17) y Tim Mitchison (Captulos 16 y 18); tambin a Michael Klymkowsky (Universidad de Colorado, Boulder) por su contribucin en el Captulo 16. Una vez ms tenemos

una deuda con los expertos que, generosamente, nos han hecho sugerencias, comentarios y correcciones; estn mencionados individualmente en las pginas xxxix-xli. Como editora, Miranda Robertson, ha jugado, como siempre, un papel crucial en conseguir que el texto resulte claro, coherente y accesible a los estu diantes. En esta edicin, nos hemos aventurado con las imgenes a todo color. Nigel Orme ha transformado los dibujos en imgenes en color, con un acierto y efecti vidad mgicos. Carol Winter de nuevo ha escrito al ordenador todo el libro con esmero y ha preparado los disquetes finales. John M-Roblin ha compaginado el texto con las figuras y se ha encargado de la transicin desde el ordenador hasta el libro impreso final. Brian Rubin ha colaborado en las referencias, Fran Dependahl en la tipografa y Emily Preece nos ha asesorado en cuanto a estilo mientras escribamos. Les hacemos llegar nuestro agradecimiento a todos ellos y a m u chos otros, especialmente al grupo de Garland Publishing, quienes han contri buido de formas demasiado numerosas para poder ser citados. Debemos un agradecimiento especial a Ruth Adams quien, una vez ms, ha supervisado la produccin del libro con una eficiencia infatigable y buen humor, y a Elizabeth Borden, ahora directora de Garland Publishing, cuya clida hospitalidad, senti do comn y estimulante amistad nos ha acompaado hasta el final de una em presa intimidante, por tercera vez. Gracias, sobre todo, a nuestras sufridas fami lias, nuestros estudiantes y nuestros colegas, que pacientemente han cargado con nuestras ausencias y preocupaciones. Por ltimo, en una nota triste, recordamos nuestra deuda a Gavin Borden, nuestro editor y gran amigo, que muri de cncer en diciembre de 1991. Sin l este libro no habra existido. Nosotros, y el propio libro, le debemos ms de lo que podemos expresar a su espritu de aventura, su generosidad, su amor a la vida y su amistad. Dedicamos esta edicin a su recuerdo.

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Prefacio a la tercera edicin

Prefacio a la segunda edicin

Hace ms de 50 aos, E.B. Wilson escribi: La clave de cualquier problema bio lgico tiene que buscarse finalmente en la clula. Hasta hace muy poco, la bio loga celular se aprenda nicamente como un curso de especializacin para bilogos basado fundamentalmente en la microscopa electrnica. En la mayo ra de las facultades de medicina muchas de las cuestiones de la biologa celular, como los mecanismos de la endocitosis, de la quimiotaxis, del movimiento celu lar y de la adhesin celular, se trataban superficialmente, ya que eran considera dos demasiado celulares para la bioqumica y demasiado moleculares para la histologa. Sin embargo, con los extraordinarios avances recientes sobre el co nocim iento de las clulas, la biologa celular empieza a ocupar el lugar que le co rresponde en el centro de las enseanzas de la biologa y de la medicina. En Es tados Unidos la biologa celular constituye cada vez ms un curso completo imprescindible de cualquier graduado en biologa y bioqumica, y se est convir tiendo en la base sobre la que se organiza el primer ao de la mayora de los currculos de medicina. La primera edicin de Biologa Molecular de la Clula se escribi antes de que se produjeran todas estas necesarias reformas del currculo, con la esperanza de catalizarlas. Estaremos satisfechos si esta segunda edi cin ayuda a acelerar y difundir estas reformas. Al revisar el libro hemos encontrado algunos casos en los que recientes des cubrimientos han invalidado antiguas conclusiones. Pero en los seis aos trans curridos desde que apareci la primera edicin, ha surgido una cantidad fants tica de nueva informacin sobre las clulas que ha puesto al descubierto nuevas conexiones y en muchos casos ha obligado a un cambio radical del nfasis del apartado correspondiente. La presente revisin, por lo tanto, se ha hecho en profundidad: cada captulo ha sufrido cambios sustanciales, muchos de ellos prcticam ente han sido reescritos completamente y se han aadido otros dos captulos completamente nuevos, los relativos al control de la expresin gnica y al cncer. Algunos comentaristas, especialmente profesores, echaron en falta en la pri mera edicin discusiones ms detalladas de las evidencias experimentales sobre las que se basan los diferentes conceptos discutidos. Nosotros pretendemos no romper el hilo conceptual ni alargar un libro ya de por s muy voluminoso, pero estamos de acuerdo en que resulta crucial proporcionar a los alumnos una sen sacin de cm o se han producido los diferentes avances de la ciencia. La segunda edicin, como la primera, ha supuesto una larga dedicacin. Como en aqulla, cada Captulo ha pasado varias veces del autor que ha escrito la primera versin a los otros autores, para su crtica y profunda revisin, de for ma que cada una de las secciones del libro representa una verdadera com posi cin; a menudo, Tim Hunt y John Wilson han participado en este proceso. Ade ms, se han invitado a diversos expertos en cada tema para que realizaran sugerencias para su revisin y, en algunos casos, para que contribuyeran con material para el texto, que los autores integraron en el libro. Estamos especial mente agradecidos a James Rothman (Princeton University) por su contribucin al Captulo 8 y a Jeremy Hyams (University College London), Tim Mitchison (University of California, San Francisco) y Paul Nurse (University of Oxford) por sus contribuciones al Captulo 13. Todas las secciones del texto revisado han sido ledas por expertos, cuyos comentarios y sugerencias han resultado extraor dinariamente valiosas. A todos ellos nuestro agradecimiento. Miranda Robertson ha desempeado un papel importante para que el libro resultara legible, insistiendo en que cada pgina fuera coherente y reescribiendo muchas que no lo eran. Tambin estamos en deuda con el equipo de Garland Publishing y en particular con Ruth Adams, Alison Walker y Gavin Borden por su

amabilidad, eficiencia e incansable apoyo durante los cuatro aos de prepara cin de esta edicin. Agradecimientos especiales para Carol Winter por su esme rado cuidado en la mecanografa de todo el libro y por la preparacin de los disquetes para la impresora. Finalmente, tambin ofrecemos nuestra gratitud a nuestras esposas, familias, colegas y estudiantes, solicitando de ellos excusas por varios aos de imposiciones y negligencias; sin su ayuda y tolerancia, este libro no podra haber sido escrito.

Prefacio a la segunda edicin

Prefacio a la primera edicin

Existe una paradoja en el desarrollo de los conocimientos cientficos. A medida que la informacin se va acumulando en cantidades cada vez mayores, los h e chos inconexos y los misterios impenetrables pueden sustituirse por explicacio nes racionales, y del caos surge la simplicidad. Gradualmente se ponen de m ani fiesto los principios esenciales de un tema. Esto es lo que sucede actualmente en la biologa celular. Las nuevas tcnicas de anlisis a nivel molecular estn reve lando la existencia de una asombrosa elegancia y econom a en la clula viva, y de una satisfactoria unidad en cuanto a los principios por los que funcionan las clulas. Este libro trata de estos principios. No es una enciclopedia sino una gua para el conocim iento. Debemos admitir que existen an amplias reas de igno rancia en la biologa celular y numerosos hechos que an no pueden ser explica dos. Pero estos problemas todava no resueltos constituyen un gran estmulo, y hemos intentado subrayarlos para estimular a los lectores a que se animen a la tarea de su descubrimiento. As, en lugar de presentar simplemente hechos in conexos en las reas que estn an mal comprendidas, hemos aventurado a m e nudo hiptesis para que el lector las estudie y, esperamos, las critique. Biologa Molecular de la Clula se ocupa principalmente de las clulas eucariticas, estudindolas de forma contrapuesta con las bacterias, reflejando su t tulo la importancia capital de los conocimientos que se han adquirido a travs del enfoque molecular. Las partes I y II del libro analizan las clulas desde esta perspectiva y cubren los temas tradicionales de los cursos de biologa celular. Pero la biologa molecular por s sola no es suficiente. Las clulas eucariticas que forman los animales y plantas pluricelulares son organismos sociales hasta un grado extremo: viven gracias a la cooperacin y a la especializacin. Para com prender cmo funcionan, las clulas se deben estudiar en las comunidades pluri celulares, adems de efectuar investigaciones sobre el funcionamiento interno de las clulas aisladas. Se trata de dos niveles de investigacin muy diferentes, pero cada uno de ellos depende del otro en cuanto a enfoque y direccin. Por ello he mos dedicado la parte III del libro al comportamiento de las clulas en los anim a les y plantas pluricelulares. As, la biologa del desarrollo, la histologa, la inmu nologa y la neurobiologa se estudian aqu con mucho ms detalle que en otros libros de biologa celular. Aunque estos temas pueden ser omitidos en un curso de biologa celular bsica y tratados en cursos optativos o suplementarios, repre sentan una parte esencial de nuestro conocimiento sobre las clulas y resultan especialmente tiles a quienes deciden proseguir estudios biolgicos o mdicos. La amplitud del tema refleja nuestra conviccin de que la biologa celular debera constituir el centro de una educacin biolgica moderna. Este libro est dedicado principalmente a quienes empiezan el primer curso de biologa celular, ya sean estudiantes, graduados o estudiantes de doctorado. Aunque presuponemos que la mayor parte de los lectores habrn recibido por lo menos un curso de introduccin a la biologa, hemos intentado escribir el libro de forma que incluso un profano de la biologa pueda seguirlo si empieza por el principio. Por otro lado, esperamos que resulte tambin de utilidad para los cientficos que buscan una gua que les ayude a encontrar un camino a travs de este amplio campo de conocimientos. Por esta razn hemos incluido una lista de referencias mucho ms extensa de lo que necesitara un estudiante universi tario no graduado, procurando al mismo tiempo que la seleccin de obras pre sentadas pueda encontrarse en la mayora de bibliotecas. Es ste un libro extenso, que ha tenido un largo perodo de gestacin -tres veces ms que un elefante y cinco veces ms que una ballena. Muchas personas han contribuido. Cada captulo ha pasado varias veces desde el autor que escri bi el primer borrador a los otros autores, que lo criticaron y revisaron, por lo

que cada captulo representa una obra de conjunto. Adems, varios expertos han aportado material escrito, que los autores han revisado para adaptarlo al resto del libro, y todos los captulos han sido ledos por expertos, cuyos comen tarios y correcciones han sido de gran valor. Hemos incluido la lista completa de agradecimientos a estos colaboradores y lectores, por su ayuda en la confeccin de captulos especficos. Paul R. Burton (University of Kansas), Douglas Chandler (Arizon State University), Ursula Goodenough (Washington University), Robert E. Pollack (Columbia University), Robert E. Savage (Swarthmore College) y Charles F. Yocum (University of Michigan) leyeron todo o parte del manuscrito y aportaron muchas sugerencias tiles. El manuscrito fue ledo tambin por estu diantes no graduados, quienes nos ayudaron a identificar los pasajes que queda ban oscuros o resultaban difciles de comprender. La mayor parte de los consejos obtenidos de los estudiantes y de los exper tos ajenos a la obra fueron filtrados y digeridos por Miranda Robertson. Insis tiendo en que cada pgina deba ser lcida y coherente, y escribiendo de nuevo muchas de las que no lo eran, Miranda Robertson ha desempeado un impor tante papel en la creacin de un libro de texto que los estudiantes leern con fa cilidad. Lydia Malim dibuj muchas de las ilustraciones de los Captulos 15 y 16, y numerosos cientficos nos proporcionaron fotografas con gran generosidad: sus nombres se encuentran en el texto que acompaa las ilustraciones. A nues tras familias, nuestros colegas y estudiantes manifestamos nuestro agradeci miento por su paciencia, y pedimos disculpas por varios aos de abuso y negli gencia. Finalmente, tenemos una deuda especial de gratitud con nuestros editores. Tony Adams desempe un importante papel en la mejora de la clari dad de exposicin y Ruth Adams, con un grado de jovial eficacia que avergonz a los autores, organiz toda la produccin del libro. Gavin Borden se ocup de la publicacin, y su generosidad y su hospitalidad convirtieron el trabajo de escri bir en un placer y en una leccin para nosotros.

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Prefacio a la primera edicin

Indice general
Caractersticas especiales ndice de m aterias Agradecimien tos Nota al lector Nota de los traductores

XV
x vii xxx ix xliii xlv PARTE 3 43 93 147

Introduccin a la clula
1. La evolucin de la clula 2. Pequeas molculas, energa y biosntesis 3. Macromolculas: estructura, forma e informacin 4. Cmo se estudian las clulas

Gentica molecular
5. Funcin de las protenas 6. Mecanismos genticos bsicos 7. Tecnologa del DNA recombinante 8. El ncleo celular 9. El control de la expresin gnica 207 237 313 359 429

PARTE

II

Organizacin interna de la clula

10. Estructura de la membrana 11. Transporte de molculas pequeas a travs de la membrana y base inica de la excitabilidad de la membrana 12. Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas 13. Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica 14. Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos 15. Transmisin de seales entre clulas 16. El citoesqueleto 17. El ciclo de divisin celular 18. Los mecanismos de la divisin celular 509 541 589 641 697 771 843 925 977

PARTE

III

Las clulas en su contexto social

19. Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular 20. Clulas germinales y fecundacin 21. Mecanismos celulares del desarrollo 22 . Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos 23. El sistema inmunitario 24. Cncer Glosario ndice alfabtico 1017 1083 1111 1219 1279 1345 G-l

IV

PARTE

1-1

Caractersticas especiales
Panel 1-1 Panel 1-2 Panel 1-3 Tabla 2-1 Panel 2-1 Panel 2-2 Panel 2-3 Panel 2 -4 Panel 2-5 Panel 2-6 Tabla 3-1 Tabla 3-2 Panel 3-1 Tabla 3-3 Panel 3-2 Tabla 11-1 Panel 11-1 Panel 11-2 Panel 11-3 Tabla 12-1 Tabla 12-2 Panel 12-1 Panel 13-1 Panel 14-1 Panel 16-1 Panel 18-1 Panel 21-1 Panel 21-2 Clulas eucariotas: esquema de sus principales orgnulos Modelos celulares y tejidos con los que estn construidas las plantas superiores Algunos de los diferentes tipos de clulas existentes en el cuerpo de un vertebrado Composicin qumica aproximada de una clula bacteriana Propiedades qumicas del agua y su influencia sobre el comportamiento de las molculas biolgicas Enlaces y grupos qumicos frecuentes en las molculas biolgicas Algunos de los tipos de azcares encontrados habitualmente en las clulas Algunos de los tipos de cidos grasos encontrados habitualmente en las clulas y las estructuras que forman Los 20 aminocidos que intervienen en la sntesis de las protenas Resumen de los principales tipos de nucletidos y sus derivados existentes en las clulas Composicin qumica aproximada de una bacteria tpica y de una clula de mamfero tpica Enlaces qumicos covalentes y no covalentes Principales tipos de fuerzas no covalentes dbiles que unen las molculas entre s La relacin entre las diferencias de energa libre y las constantes de equilibrio Estructuras del DNA y del RNA Comparacin de las concentraciones inicas en el interior y el exterior de una clula de mamfero Equilibrio del agua intracelular: el problema y su solucin Deduccin de la ecuacin de Nernst Algunos experimentos clsicos realizados en el axn gigante del calamar Volmenes relativos ocupados por los principales compartimientos intracelulares en una clula heptica tpica (hepatocito) Cantidades relativas de tipos de membrana en dos clulas eucariotas Estudio de las secuencias seal y de la translocacin de protenas a travs de membranas Estrategias utilizadas para estudiar los mecanismos moleculares implicados en el transporte vesicular Energa libre y reacciones biolgicas Polimerizacin de la actina y la tubulina Los seis estadios de la divisin celular Revisin de gentica clsica Caractersticas generales del desarrollo temprano de las plantas con flores 18-19 30-31 38-39 45 50-51 52-53 54-55 56-57 58-59 60-61 94 95 96-97 101 104-105 542 552 562 568 591 591 598 682-683 714-715 882-883 982-983 1148-1149 1189 1271-1274

Captulo 22 Apndice Catlogo de las clulas del cuerpo humano adulto

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ndice de materias
Introduccin a la clula
La evolucin de la clula
Desde las molculas hasta la primera clula En condiciones prebiticas se pueden formar molculas biolgicas Pueden desarrollarse sistemas qumicos complejos en un entorno alejado de su equilibrio qumico Los polinucletidos son capaces de dirigir su propia sntesis Las molculas autorreplicantes estn sometidas a la seleccin natural Algunas molculas especializadas de RNA pueden catalizar reacciones bioqumicas La informacin fluye desde los polinucletidos a los polipptidos Las membranas definieron la primera clula Todas las clulas actuales utilizan el DNA como material hereditario Resumen De los procariotas a los eucariotas Las clulas procariotas son estructuralmente simples pero bioqumicamente diversas Las reacciones metablicas evolucionan Comparando secuencias de DNA se pueden deducir relaciones evolutivas Las cianobacterias pueden fijar C 02 y N2 Las bacterias pueden realizar la oxidacin aerbica de las molculas nutritivas Las clulas eucariotas poseen varios orgnulos caractersticos Las clulas eucariotas dependen de las mitocondrias para su metabolismo oxidativo Los cloroplastos son descendientes de una clula procariota incorporada 4 4 4 6 7 8 8 10 11 12 12 12 14 15 16 17 20 21 22 Las clulas eucariotas contienen una rica dotacin de membranas internas Las clulas eucariotas tienen un citoesqueleto Entre los protozoos se encuentran las clulas ms complejas conocidas En las clulas eucariotas el material gentico est empaquetado de forma compleja Resumen De las clulas simples a los organismos pluricelulares Las clulas se pueden asociar formando colonias Las clulas de un organismo superior se especializan y cooperan La organizacin pluricelular depende de la cohesin entre las clulas Las capas de clulas epiteliales envuelven un medio interno protegido La comunicacin clula-clula controla es esquema espacial de los organismos pluricelulares La memoria celular permite el desarrollo de patrones complejos Los programas bsicos de desarrollo tienden a ser conservados en la evolucin Las clulas somticas del cuerpo de los vertebrados muestran ms de 200 tipos diferentes de especializacin Los genes pueden ser activados y desactivados Comparaciones entre secuencias revelan centenares de familias de genes homlogos Resumen Bibliografa P arte

i
Captulo

23 25 25 26 27 27 28 29 32 32 33 34 34 36 37 37 41 41

Pequeas molculas, energa y sntesis

Los componentes qumicos de una clula La qumica celular se basa en los compuestos de carbono Las clulas utilizan cuatro tipos bsicos de molculas pequeas Los azcares son las molculas alimenticias de la clula Los cidos grasos son componentes de las membranas celulares Los aminocidos son las subunidades de las protenas Los nucletidos son las subunidades del DNA y del RNA Resumen Orden biolgico y energa El orden biolgico resulta posible gracias a la liberacin de energa calorfica por parte de las clulas Los organismos fotosintetizadores utilizan la luz solar para sintetizar compuestos orgnicos La energa qumica pasa de las plantas a los animales 43 43 45 46 47 48 49 62 62 63 63 64 Las clulas obtienen energa mediante la oxidacin de molculas biolgicas La degradacin de una molcula orgnica se realiza a travs de una secuencia de reacciones catalizadas enzimticamente Parte de la energa liberada en las reacciones de oxidacin se acopla a la reaccin de formacin de ATP La hidrlisis del ATP genera orden en las clulas Resumen

Captulo

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66 66 67 69 69 69 70 73

El alimento y la obtencin de la energa celular Las molculas alimenticias son degradadas en tres etapas para producir ATP La glucolisis puede producir ATP incluso en ausencia de oxgeno El NADH es el intermediario central en el catabolismo oxidativo

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El metabolismo est dominado por el ciclo del cido ctrico En la fosforilacin oxidativa, la transferencia de electrones al oxgeno impulsa la formacin de ATP Los aminocidos y los nucletidos forman parte del ciclo del N Resumen La biosfntesis y la creacin de orden El cambio de energa libre de una reaccin determina si sta puede producirse o no A menudo las reacciones de biosntesis estn acopladas directamente a la hidrlisis del ATP Las coenzimas intervienen en la transferencia de determinados grupos qumicos La estructura de las coenzimas sugiere que se formaron en un mundo de RNA La biosntesis necesita poder reductor

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Los polmeros biolgicos se sintetizan mediante la repeticin de reacciones elementales de deshidratacin Resumen Coordinacin entre catabolismo y biosfntesis El metabolismo est organizado y regulado Las vas metablicas estn reguladas a travs de cambios de la actividad enzimtica Las reacciones catablicas pueden revertirse mediante un aporte de energa Las enzimas pueden activarse e inhibirse mediante modificaciones covalentes Las reacciones estn comprtimentadas, tanto dentro de las clulas como dentro de los organismos Resumen Bibliografa

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Macromolculas: estructura, forma e informacin

Procesos de reconocimiento molecular Las interacciones especficas de una macromolcula dependen de enlaces dbiles no covalentes Una hlice es un motivo estructural comn en las estructuras biolgicas generadas a partir de subunidades repetidas La difusin es el primer paso hacia el reconocimiento molecular Los movimientos trmicos unen a las molculas y luego las separan La constante de equilibrio constituye una medida de la fuerza de interaccin entre dos molculas Los tomos y las molculas se mueven rpidamente Los procesos de reconocimiento molecular nunca pueden ser perfectos Resumen cidos nucleicos Los genes estn formados por DNA Las molculas de DNA consisten en dos largas cadenas unidas por pares de bases complementarias La estructura del DNA proporciona una explicacin del proceso de la herencia Los errores en el proceso de replicacin del DNA generan mutaciones La secuencia de nucletidos de un gen determina la secuencia de aminocidos de una protena Porciones de la secuencia de DNA se copian en molculas de RNA para guiar la sntesis de protenas Las molculas de RNA de eucariotas son cortadas y recombinadas, eliminndose secuencias intrn Las secuencias de nucletidos del mRNA son ledas en grupos de tres y traducidas a aminocidos Las molculas de tRNA emparejan los aminocidos con los grupos de nucletidos El mensaje de RNA se lee de un extremo al otro por un ribosoma Algunas molculas de RNA actan como catalizadores Resumen Estructura de las protenas La forma de una molcula proteica est determinada por la secuencia de sus aminocidos Diferentes cadenas proteicas presentan esquemas de plegamiento iguales Las protenas son molculas asombrosamente verstiles Las protenas presentan diferentes niveles de organizacin estructural 93 94 99 99 99 Los dominios estn formados por cadenas polipeptdicas que se pliegan adelante y atrs, generando delgadas circunvoluciones en la superficie de la protena De entre la gran cantidad de cadenas polipeptdicas posibles, nicamente un nmero relativamente pequeo de ellas llegara a ser til Normalmente las nuevas protenas se desarrollan por alteraciones menores de protenas antiguas Las nuevas protenas pueden desarrollarse por recombinacin de dominios polipeptdicos preexistentes Las homologas estructurales pueden contribuir en la asignacin de funciones a las protenas descubiertas recientemente Las subunidades proteicas pueden ensamblarse formando grandes estructuras Un solo tipo de subunidad proteica puede interaccionar consigo misma formando agregados geomtricos regulares A menudo las protenas superenrolladas colaboran en la construccin de grandes estructuras en las clulas Las protenas pueden ensamblarse formando lminas, tubos o esferas Muchas estructuras celulares son capaces de autoensamblarse No todas las estructuras biolgicas se forman por autoensamblaje Resumen Las protenas como catalizadores La conformacin de una protena determina sus propiedades qumicas El primer paso de la catlisis enzimtica es la unin del substrato Las enzimas aceleran las reacciones estabilizando determinados estados de transicin Las enzimas pueden facilitar la formacin y la rotura de enlaces covalentes a travs de una catlisis cida y bsica simultnea Adems, las enzimas pueden incrementar las velocidades de reaccin formando enlaces covalentes intermedios con sus substratos Las enzimas aceleran las reacciones qumicas pero no pueden hacerlas energticamente ms favorables Las enzimas pueden determinar el sentido de una va acoplando determinadas reacciones a la hidrlisis del ATP Los complejos multienzimticos ayudan a incrementar la velocidad del metabolismo celular Resumen Bibliografa

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ndice de materias

Cmo se estudian las clulas

Observacin de la estructura de las clulas con el microscopio El microscopio ptico puede resolver detalles situados a 0,2 nm de distancia Para la observacin microscpica, normalmente los tejidos son fijados y seccionados Los diferentes componentes de la clula pueden ser teidos selectivamente Mediante la microscopa de fluorescencia se pueden localizar molculas en las clulas de forma especfica Las clulas vivas se pueden observar con nitidez en un microscopio de contraste de fases o de contraste de fases interferencial Mediante tcnicas electrnicas las imgenes pueden ser amplificadas y analizadas Gracias al microscopio de barrido confocal es posible obtener imgenes de complejos objetos tridimensionales El microscopio electrnico resuelve la estructura fina de la clula Para poder ser estudiadas al microscopio electrnico, las muestras biolgicas requieren una preparacin especial Mediante la microscopa electrnica de barrido se pueden obtener imgenes tridimensionales El sombreado metlico permite el examen a alta resolucin de detalles superficiales, mediante el microscopio electrnico de transmisin La microscopa electrnica de criofractura y la de grabado por congelacin proporcionan una nueva visin del interior celular La tincin negativa y la microscopa crioelectrnica permiten observar macromolculas a alta resolucin Resumen Aislamento y crecimiento de clulas en cultivo Las clulas de un tejido pueden ser aisladas y separadas en diversos tipos celulares Las clulas pueden cultivarse en una placa de cultivo Los medios definidos qumicamente, libres de suero, permiten la identificacin de factores de crecimiento especficos Las lneas celulares eucariotas constituyen una fuente ampliamente utilizada para la obtencin de clulas homogneas Las clulas pueden fusionarse formando clulas hbridas Resumen 147 149 150 151 152

Captulo

4
Fraccionamiento de las clulas y anlisis de sus molculas Los orgnulos y las macromolculas pueden separarse por ultracentrifugacin Los detalles moleculares de los procesos celulares complejos nicamente se pueden descifrar en sistemas libres de clulas Las protenas pueden separase mediante cromatografa Mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS pueden determinarse el tamao y la composicin de subunidades de una protena Mediante electroforesis bidimensional sobre gel de poliacrilamida, se pueden resolver ms de 1000 protenas sobre un mismo gel La hidrlisis selectiva de una protena genera un conjunto caracterstico de fragmentos peptdicos Mediante mquinas automatizadas pueden analizarse secuencias cortas de aminocidos La difraccin de rayos X por cristales de protena puede revelar la estructura exacta de una protena Tambin se puede determinar la estructura molecular utilizando espectroscopia de resonancia magntica nuclear (NMR) Resumen Siguiendo el rastro y cuantiflcando las molculas del interior de las clulas Los tomos radiactivos pueden ser detectados con una gran sensibilidad Los radioistopos se utilizan para marcar las molculas en las clulas y en los organismos y seguirles la pista Las concentraciones de los iones se pueden medir mediante electrodos intracelulares Los cambios rpidos en las concentraciones inicas intracelulares se pueden medir mediante indicadores emisores de luz Existen diferentes sistemas que permiten introducir molculas en una clula para las que la membrana celular sea impermeable La activacin inducida por la luz de molculas precursoras empaquetadas facilita el estudio de la dinmica intracelular Se pueden utilizar anticuerpos para detectar y aislar molculas determinadas Las lneas celulares de hibridomas constituyen una fuente permanente de anticuerpos monoclonales Resumen Bibliografa 172 172

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Gentica molecular
Funcin de las protenas
Las protenas como mquinas La unin de un ligando puede cambiar la conformacin de una protena A menudo cuando dos ligandos se unen a la misma protena, cada uno de ellos afecta la unin del otro Dos ligandos cuyos lugares de unin estn acoplados pueden afectar recprocamente uno la unin del otro 207 208 209 210 Las transiciones alostricas colaboran en la regulacin del metabolismo A menudo las protenas forman agregados simtricos que sufren transiciones alostricas cooperativas La transicin alostrica de la aspartato transcarbamilasa se conoce a nivel atmico

Parte

II

Captulo

5
210

212 212

ndice de materias

xix

La fosforilacin de protenas es un mecanismo para dirigir transiciones alostricas en las clulas eucariotas Una clula eucariota contiene muchas protena quinasas y fosfatasas La estructura de la protena quinasa Cdk muestra de qu forma una protena puede actuar como un microchip Las protenas que unen e hidrolizan GTP son reguladores celulares ubicuos Otras protenas controlan la actividad de las protenas que unen GTP, determinando si se une GDP o GTP La transicin alostrica de la protena EF-Tu muestra de qu manera pequeas molculas pueden generar grandes movimientos Protenas que hidrolizan ATP realizan trabajo mecnico en las clulas La estructura de la miosina revela de qu forma los msculos generan fuerza Protenas alostricas unidas a membrana y dirigidas por ATP pueden actuar como bombas inicas o trabajar en sentido inverso, sintetizando ATP Las transiciones alostricas acopladas energticamente permiten a las protenas actuar como motores, como relojes, como factores de ensamblaje o como transductores de informacin

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A menudo las protenas forman grandes complejos que actan como mquinas proteicas Resumen Nacimiento, ensamblaje y muerte de las protenas Se cree que las protenas se pliegan a travs de un intermediario globular fundido Las chaperonas moleculares facilitan el plegamiento de las protenas Muchas protenas contienen series de molculas plegadas de forma independiente Los mdulos confieren versatilidad y a menudo median las interacciones protena-protena Las protenas pueden unirse unas a otras a travs de diferentes tipos de interfases La conexin y la proteolisis selectiva aseguran los ensamblajes del tipo todo o nada La proteolisis dependiente de ubiquitina es la responsable principal del recambio proteico selectivo en los eucariotas La vida media de una protena puede ser determinada por enzimas que alteran su extremo N Resumen Bibliografa

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Mecanismos genticos bsicos

Sntesis de RNA y de protenas La RNA polimerasa copia el DNA a RNA: el proceso de la transcripcin del DNA Slo se utilizan zonas seleccionadas de un cromosoma para producir molculas de RNA Las molculas de RNA de transferencia actan como adaptadores que traducen secuencias de nucletidos a secuencias de protena Unas determinadas enzimas acoplan cada aminocido con su molcula apropiada de tRNA Los aminocidos se van aadiendo al extremo carboxilo terminal de una cadena polipeptdica en crecimiento El cdigo gentico es degenerado Los acontecimientos de la sntesis proteica estn catalizados sobre el ribosoma El ribosoma se desplaza, paso a paso, a lo largo de la cadena de mRNA Cuando se alcanza uno de los tres tipos de codn de terminacin, la cadena proteica se libera del ribosoma El proceso de iniciacin establece la pauta de lectura para la sntesis proteica En clulas eucariotas, normalmente slo se sintetiza un tipo de cadena polipeptdica sobre cada molcula de mRNA La unin de varios ribosomas a una misma molcula de mRNA genera polirribosomas En los eucariotas, la velocidad general de sntesis de protenas est controlada por factores de iniciacin La fidelidad de la sntesis de protenas est incrementada gracias a dos procesos independientes de correccin de galeradas Muchos inhibidores de la sntesis de protenas en procariotas resultan tiles como antibiticos Cmo evolucion el proceso de la sntesis de protenas? Resumen 237 238 241

Captulo

6
La mayora de mutaciones de las protenas resultan perjudiciales y son eliminadas por seleccin natural Para que exista la vida tal como la conocemos, es necesario que se den estas bajas frecuencias de mutacin El hecho de que las frecuencias de mutacin sean bajas significa que los organismos relacionados han de estar formados esencialmente por las mismas protenas Si no fueran corregidas, las alteraciones espontneas del DNA podran cambiar rpidamente las secuencias del DNA La estabilidad de los genes depende de la reparacin del DNA Las alteraciones del DNA pueden ser eliminadas por ms de una va Las clulas pueden producir enzimas de reparacin de DNA en respuesta a las alteraciones del DNA La estructura y las propiedades qumicas de la doble hlice del DNA hacen que sea fcil de reparar Resumen Mecanismos de repllcacin del DNA Tal como ocurre para el proceso de reparacin del DNA, el fundamento del proceso de replicacin es el apareamiento de bases La horquilla de replicacin del DNA es asimtrica El elevado grado de fidelidad del mecanismo de replicacin del DNA requiere la existencia de una mecanismo de correccin de galeradas" Slo la replicacin del DNA en direccin 5 a 3 permite la existencia de un eficiente procesos de correccin de errores Una enzima especial que polimeriza nucletidos sintetiza cortas molculas cebadoras de RNA sobre la cadena retrasada Unas protenas especiales ayudan a abrir la doble hlice del DNA por delante de la horquilla de replicacin Una molcula de DNA polimerasa mvil se mantiene unida al DNA mediante un anillo deslizante En la horquilla de replicacin, una serie de protenas cooperan entre s formando una mquina de replicacin Un sistema de correccin de galeradas que elimina los errores de replicacin producidos por la mquina de replicacin 259 260

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Mecanismos de reparacin del DNA 258 Las secuencias de DNA se mantienen con un elevado grado de fidelidad 258 Las frecuencias de mutacin observadas en clulas proliferativas son consistentes con los valores evolutivos estimados 259

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ndice de materias

Las horquillas de replicacin se inician en el origen Las DNA topoisomerasas evitan que el DNA se enrede durante la replicacin La replicacin del DNA en los eucariotas es bsicamente similar a la de los procariotas Resumen

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Recombinacin gentica 281 La recombinacin general est guiada por interacciones de apareamiento de bases entre cadenas complementarias de dos molculas homologas de DNA 282 La recombinacin general puede iniciarse en una muesca de una cadena de la doble hlice de DNA 283 Las reacciones de hibridacin del DNA proporcionan un modelo sencillo para la fase de apareamiento de bases en la recombinacin general 284 La protena RecA permite a una molcula de una sola cadena de DNA aparearse con una regin homologa de una doble hlice en E. coli 285 La recombinacin gentica general habitualmente supone un intercambio cruzado de cadenas o entrecruzamiento 287 La conversin gnica se produce combinando procesos de recombinacin general y de sntesis limitada de DNA 287 Los mecanismos de correccin de errores pueden evitar la recombinacin gentica promiscua entre dos secuencias de DNA mal apareadas 288 Enzimas de recombinacin especfica de lugar ponen y quitan del genoma secuencias especiales de DNA 289 La recombinacin transposicional puede insertar un elemento gentico mvil en cualquier secuencia de DNA 291 Resumen 292

Virus, plsmidos y elementos genticos transponibles Los virus son elementos genticos mviles La cubierta exterior de un virus puede ser una cpside proteica o una envoltura membranosa Los genomas vricos se presentan en una gran variedad de formas vricas y pueden ser tanto de DNA como de RNA Los cromosomas vricos codifican enzimas implicadas en la replicacin de su cido nucleico Tanto los virus RNA como los virus DNA se replican mediante la formacin de cadenas complementarias Los virus utilizan la maquinaria de trfico intracelular de sus clulas husped Diferentes virus recubiertos geman a partir de diferentes membranas celulares Los cromosomas vricos pueden integrarse en los cromosomas del husped La sntesis continuada de algunas protenas vricas puede transformar a las clulas en cancerosas Los virus tumorales RNA son retrovirus El virus del SIDA es un retrovirus Algunos elementos transponibles estn estrechamente relacionados con los retrovirus Otros elementos transponibles se transfieren directamente a s mismos desde un lugar a otro del genoma Probablemente la mayora de los virus evolucionaron a partir de plsmidos Resumen Bibliografa

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Tecnologa del DNA recombinante

Fragmentacin, separacin y secuenciacin de molculas de DNA Las endonucleasas de restriccin cortan las molculas de DNA en secuencias nucleotdicas especficas Los mapas de restriccin muestran la distribucin de pequeas secuencias nucleotdicas a lo largo del cromosoma Las molculas de DNA de diferentes tamaos pueden separarse mediante la electroforesis en gel Las molculas purificadas de DNA pueden ser marcadas in vitro con radioistopos o con marcadores qumicos Los fragmentos aislados de DNA pueden ser rpidamente secuenciados Las huellas del DNA revelan los lugares donde las protenas se unen a la molcula de DNA Resumen Hibridacin de cidos nucleicos La hibridacin de cidos nucleicos proporciona un mtodo sensible para la deteccin de secuencias determinadas de nucletidos Las transferencias Northern y Southern facilitan la hibridacin con molculas de cidos nucleicos separadas electroforticamente El anlisis de los polimorfismos de longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP) facilita el anlisis gentico de los grandes genomas Las molculas sintticas de DNA facilitan el diagnstico prenatal de enfermedades genticas La hibridacin poco rigurosa permite identificar genes relacionados de forma indirecta Las tcnicas de hibridacin in situ permiten localizar secuencias especficas de cidos nucleicos en los cromosomas y en las clulas Resumen 314 315 315 317 318 319 320 322 322

Captulo

7
ClonajedeDNA Se puede construir una librera de DNA utilizando vectores vricos o vectores plasmdicos Dos tipos de libreras de DNA cubren diferentes propsitos Los clones cDNA contienen secuencias codificantes continuas Pueden preparse libreras cDNA a partir de poblaciones seleccionadas de molculas de mRNA Para identificar los clones de inters en una librera de DNA puede utilizarse tanto una sonda DNA como un ensayo para la protena expresada La traduccin in vitro facilita la identificacin del clon de DNA correcto La seleccin de clones DNA solapados permite caminar sobre el cromosoma hasta un gen vecino de inters Se estn construyendo libreras genmicas de clones ordenados para organismos seleccionados El clonaje posicional de DNA revela la presencia de genes de funciones imprevistas Mediante una reaccin de polimerizacin en cadena se pueden clonar segmentos de DNA en un tubo de ensayo Resumen Ingeniera de DNA Se pueden construir molculas de DNA de cualquier secuencia uniendo fragmentos de DNA Es posible producir grandes cantidades de molculas de RNA homogneas mediante transcripcin de DNA in vitro Utilizando vectores de expresin es posible producir grandes cantidades de protenas celulares minoritarias Los genes marcadores permiten analizar la funcin de las secuencias de DNA reguladoras Los organismos mutantes revelan mejor la funcin de un gen 331 332 333 334 335

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ndice de materias

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Pueden fabricarse a medida clulas y organismos que contengan genes alterados Los genes se pueden redisear para que produzcan protenas de cualquier secuencia que se desee Habitualmente las protenas de fusin son de gran utilidad para analizar la funcin proteica Los genes normales son fcilmente reemplazables por imitantes, tanto en bacterias como en algunos eucariotas inferiores Genes desarrollados por ingeniera gentica pueden crear mutaciones dominantes especficas en los organismos diploides

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Genes sometidos a ingeniera gentica se pueden insertar de forma permanente en la lnea germinal de un ratn o de la mosca del vinagre, produciendo animales trangnicos El direccionamiento gnico hace posible obtener ratones transgnicos que carecen de determinados genes Las plantas transgnicas son importantes tanto para la biologa celular como para la agricultura Resumen

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Bibliografa

El ncleo celular
El DNA cromosmico y su empaquetamiento Cada molcula de DNA que forma un cromosoma ha de contener un centrmero, dos telmeros y varios orgenes de replicacin La mayor parte del DNA cromosmico no codifica protenas esenciales ni RNA Cada gen produce una molcula de RNA La comparacin entre secuencias de DNA de organismos relacionados permite diferenciar entre regiones de DNA de secuencia conservada y no conservada Las histonas son las principales protenas estructurales en los cromosomas eucariotas La asociacin de las histonas con el DNA conduce a la formacin de los nucleosomas, las partculas unitarias de la cromatina La posicin de los nucleosomas en el DNA viene determinada por la tendencia del DNA a formar bucles estrechos y por la presencia de otras protenas de unin al DNA Habitualmente los nucleosomas se empaquetan con la histona H1 formando estructuras regulares de orden superior Resumen La estructura global de los cromosomas Los cromosomas plumulados contienen bucles de cromatina descondensada Tambin se pueden apreciar dominios estructurales organizados en la cromatina interfsica en los cromosomas politnicos Los diferentes dominios de la cromatina de los cromosomas politnicos pueden empaquetarse y desempaquetarse como una unidad Es probable que tanto las bandas como las interbandas de los cromosomas politnicos contengan genes La cromatina est menos condensada en las regiones que son transcripcionalmente activas La cromatina activa es bioqumicamente diferente La heterocromatina est muy condensada y es transcripcionalmente inactiva Los cromosomas mitticos estn formados por cromatina en su forma ms condensada Cada uno de los cromosomas mitticos presenta un patrn caracterstico de grandes dominios estructurales Resumen Replicacin del cromosoma Secuencias especficas de DNA actan como orgenes de replicacin Un sistema eucariota libre de clulas replica el cromosoma de un virus de simio Los orgenes de replicacin de los cromosomas eucariotas se activan en grupos 361

Captulo

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Regiones distintas del mismo cromosoma se replican en diferente momento La cromatina muy condensada se replica tardamente en la fase S, mientras que la cromatina activa se replica temprano Las unidades de replicacin tardas coinciden con las bandas ricas en A-T en los cromosomas metafsicos El patrn ordenado de activacin de los orgenes de replicacin puede contribuir a la memoria de la clula Factores unidos a la cromatina aseguran que cada regin del DNA slo se replique una vez A medida que el DNA se replica, se van ensamblando nuevas histonas en la cromatina Los telmeros son secuencias cortas, repetidas, ricas en G, que se aaden al extremo de los cromosomas por accin de la telomerasa Resumen Sntesis y procesamiento del RNA Las RNA polimerasas intercambian subunidades cuando inician cada cadena de RNA En las clulas eucariotas, el RNA sintetiza por tres RNA polimerasas diferentes La RNA polimerasa II transcribe algunas secuencias de DNA mucho ms frecuentemente que otras Los precursores de los RNA mensajeros son modificados covalentemente en sus dos extremos El procesamiento del RNA elimina largas secuencias nucleotdicas del interior de las molculas de RNA Los transcritos hnRNA son inmediatamente recubiertos por protena y snRNP Las secuencias intrnicas se eliminan de las molculas de RNA en forma de lazo Habitualmente de cada transcrito de RNA se eliminan muchas secuencias intrnicas El estudio de la talasemia revela de qu forma la maduracin del RNA puede permitir que las protenas evolucionen Probablemente la maduracin del RNA catalizada por el espliceosoma evolucion a partir de mecanismos de automaduracin El transporte de los mRNA al citoplasma se retrasa hasta que la maduracin se ha completado Los RNA ribosmicos y los RNA de transferencia se sintetizan sobre conjuntos de genes idnticos dispuestos en tndem El nuclolo es una mquina productora de ribosomas El nuclolo es un subcompartimiento nuclear muy organizado Despus de cada mitosis, el nuclolo se ensambla de nuevo en determinados cromosomas Los cromosomas ocupan territorios discretos en el ncleo interfsico Est muy ordenado el ncleo? Resumen

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ndice de materias

Organizacin y evolucin del genoma nuclear Los genomas se van ajustando de forma precisa por mutaciones puntuales y se remodelan radicalmente o aumentan de tamao por recombinacin gentica Las secuencias repetidas en tndem de DNA tienden a permanecer inalteradas La evolucin de la familia de los genes de la globina muestra que las duplicaciones al azar contribuyen a la evolucin de los organismos Los genes que codifican nuevas protenas se pueden crear mediante la recombinacin de exones La mayora de las protenas se han originado probablemente a partir de genes altamente fragmentados Una fraccin mayoritaria del DNA de los eucariotas superiores est formada por secuencias de nucletidos repetidas y no codificantes

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Las secuencias de DNA satlite no tienen ninguna funcin conocida La evolucin de los genomas se ha acelerado mediante al menos tres tipos de elementos transponibles Los elementos transponibles afectan frecuentemente a la regulacin gnica Las explosiones de transposicin provocan cambios catastrficos en los genomas e incrementan la diversidad biolgica Aproximadamente un diez por ciento del genoma humano consiste en dos familias de elementos transponibles Resumen Bibliografa

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El control de la expresin gnica

Introduccin al control gnico 429 Los distintos tipos celulares de un organismo pluricelular contienen el mismo DNA 429 Distintos tipos celulares sintetizan distintos conjuntos de protenas 430 Un clula puede cambiar la expresin de sus genes como respuesta a seales externas 431 La expresin gnica se puede regular en muchas de las etapas de la va que conduce desde el DNA al RNA y a las protenas 431 Resumen 432 Motivos estructurales de unin a DNA en las protenas de regulacin gnica Las protenas de regulacin gnica se descubrieron utilizando tcnicas de gentica bacteriana El exterior de la hlice de DNA puede ser ledo por protenas La geometra de la doble hlice de DNA depende de la secuencia de nucletidos Secuencias cortas de DNA son componentes fundamentales de los interruptores genticos Las protenas de regulacin gnica contienen motivos estructurales que pueden leer secuencias de DNA El motivo hlice-giro-hlice es uno de los motivos de unin a DNA ms simples y comunes Las protenas de homeodominios son una clase especial de protenas hlice-giro-hlice Existen diferentes tipos de motivos de unin a DNA en forma de dedos de zinc Las lminas P tambin pueden reconocer el DNA El motivo cremallera de leucina est implicado tanto en el reconocimiento del DNA como en la dimerizacin El motivo hlice-bucle-hlice tambin est implicado en la dimerizacin y la unin al DNA An no es posible predecir la secuencia de DNA que es reconocida por una protena reguladora Un ensayo de movilidad en gel permite detectar con gran facilidad protenas que se unen a una secuencia especfica de DNA La cromatografa de afinidad de DNA facilita la purificacin de protenas de unin a secuencias especficas de DNA Resumen Cmo funcionan los interruptores genticos El represor de triptfano es un interruptor simple que activa y desactiva genes en bacterias Los activadores transcripcionales activan los genes Un activador transcripcional y un represor transcripcional controlan el opern lac 432 432 433 433 435 435 437 438 439 440 440 442 442

Captulo
B La regulacin de la transcripcin en las clulas eucariotas es compleja Las RNA polimerasas eucariotas requieren factores de transcripcin generales Los incrementadores o activadores controlan los genes a distancia Una regin de control eucariota est formada por un promotor y por las secuencias de DNA reguladoras Muchas protenas activadoras aceleran el ensamblaje de los factores generales de transcripcin Las protenas represoras pueden inhibir la transcripcin de diferentes formas Las protenas reguladoras de genes de clulas eucariotas frecuentemente se ensamblan formando pequeos complejos sobre el DNA Los complejos interruptores genticos que regulan el desarrollo de D rosophila estn formados por mdulos menores El gen eve de Drosophila est regulado por controles combinatorios En mamferos las regiones de control tambin estn formadas a partir de mdulos reguladores sencillos A su vez, la actividad de una protena de regulacin gnica puede estar regulada Las bacterias utilizan subunidades intercambiables de la RNA polimerasa para colaborar en el control de la transcripcin gnica Los interruptores genticos han evolucionado gradualmente Resumen Estructura de la cromatina y el control de la expresin gnica La transcripcin del DNA que est empaquetado en nucleosomas se puede activar Algunas formas de la cromatina impiden la transcripcin Antes de que los genes de globina de mamfero puedan transcribirse, puede ser necesaria una etapa de descondensacin No se conocen los mecanismos que forman la cromatina activa La tensin superhelicoidal del DNA permite la accin a distancia Resumen Mecanismos genticos que originan tipos celulares especializados Los cambios de fase de las bacterias son provocados por reorganizaciones del DNA

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ndice de materias

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En levaduras, algunas protenas reguladoras determinan la identidad del tipo celular Dos protenas fgicas que se reprimen mutuamente su sntesis determinan el estado del bacterifago lambda La expresin de una protena reguladora crtica puede disparar la expresin de una batera de genes situados por debajo (en direccin 3) El control gnico combinatorio es la norma en los eucariotas Se hereda un cromosoma X inactivo Los genes de Drosophila y de levadura tambin pueden inactivarse por caractersticas hereditarias de su estructura cromatnica Cuando las clulas de vertebrados se dividen, pueden heredar el patrn de metilacin del DNA En las clulas de los vertebrados la metilacin del DNA refuerza las decisiones del desarrollo La actividad genmica heredable requiere metilacin del DNA En los mamferos, las islas ricas en CG estn asociadas con alrededor de 40 000 genes Resumen Controles post-transcripcionales La atenuacin de la transcripcin causa una terminacin temprana de algunas molculas de RNA La maduracin alternativa del RNA puede producir diferentes formas de proteina a partir de un mismo gen La determinacin del sexo en D rosophila depende de una serie de procesos de maduracin alternativa regulada del RNA

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Un cambio en el punto de rotura del transcrito de RNA y la adicin de poli-A puede cambiar el extremo carboxilo terminal de una protena La definicin de gen se ha de modificar debido al descubrimiento de la maduracin alternativa del RNA El transporte de RNA desde el ncleo puede ser regulado Algunos RNA estn localizados en regiones especficas del citoplasma La edicin del RNA puede cambiar el sentido del mensaje del RNA Las clulas eucariotas y procariotas utilizan estrategias diferentes para especificar el lugar de inicio de la traduccin en una molcula de mRNA La fosforilacin de un factor de iniciacin regula la sntesis de protenas Las protenas que se unen a la regin 5 lder de los mRNA intervienen en el control traduccional negativo La expresin gnica puede estar controlada por variaciones de la estabilidad del mRNA La degradacin selectiva del mRNA est acoplada a la traduccin El control citoplasmtico de la longitud de las cadenas de poli-A pueden afectar tanto la traduccin como la estabilidad del mRNA Algunos mRNA contienen seales d reconocimiento que interrumpen el proceso normal de la traduccin Es muy probable que las reacciones catalizadas por RNA tengan un origen muy antiguo Resumen Bibliografa

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Organizacin interna de la clula

Estructura de la membrana
La bicapa lipidica Los lpidos de las membranas son molculas antipticas que espontneamente forman bicapas La bicapa lipidica es un fluido bidimensional La fluidez de una bicapa lipidica depende de su composicin La bicapa lipidica es asimtrica En la superficie de todas las membranas plasmticas hay glucolpidos Resumen Protenas de membrana Las protenas de membrana pueden estar asociadas a la bicapa lipidica de varias maneras Se considera que, en la mayora de protenas transmembrana, las regiones de la cadena polipeptdica que cruzan la bicapa lipidica presentan una conformacin en hlice a Las protenas de membrana pueden solubilizarse y purificarse mediante detergentes El lado citoplasmtico de las protenas de membrana se puede estudiar en fantasmas de eritrocito La espectrina es una proteina del citoesqueleto asociada no covalentemente a la cara citoplasmtica de la membrana del eritrocito 510 510 511 513 514 516 517 517 518 La glucoforina atraviesa la bicapa lipdica del glbulo rojo, formando una hlice a sencilla La banda 3 de la membrana celular del eritrocito es una protena de membrana multipaso que cataliza el cotransporte aninico La bacteriorrodopsina es una bomba de protones que atraviesa la bicapa en forma de siete hlices a Las porinas son protenas transmembrana formadoras de canales que cruzan la membrana en forma de un barril (3 Las protenas de membrana actan a menudo como grandes complejos Muchas protenas de membrana difunden en el plano de la membrana Las clulas pueden confinar a lpidos y a protenas en dominios especficos de la membrana La superficie celular est recubierta con residuos de azcar Las selectinas son protenas de membrana que se unen a carbohidratos de la superficie celular y que median adhesiones celulares transitorias en el torrente sanguneo Resumen Bibliografa 526

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Transporte de molculas pequeas a travs de la membrana y base inica de la excitabilidad de la membrana

Principios de transporte a travs de membrana Las bicapas lipdicas libres de protena son altamente impermeables a los iones Existen dos clases principales de protenas de transporte a travs de membrana: protenas transportadoras y protenas de canal El transporte activo est mediado por protenas transportadoras acopladas a una fuente energtica La tecnologa del DNA recombinante ha revolucionado el estudio de las protenas de transporte a travs de membrana Se pueden utilizar ionforos como herramientas para incrementar la permeabilidad de las membranas a determinados iones Resumen Protenas transportadoras y transporte activo a travs de membrana La bombas Na+ -K+de la membrana plasmtica es una ATPasa La ATPasa de Na+ -K+es necesaria para mantener el equilibrio osmtico y estabilizar el volumen celular Algunas bombas de Ca2 +tambin son ATPasas unidas a membrana Algunas enzimas ligadas a membrana que sintetizan ATP son ATPasas de transporte que actan en sentido opuesto El transporte activo puede ser impulsado por gradientes inicos Las protenas de transporte impulsado por Na+de la membrana plasmtica regulan el pH citoslico En las clulas epiteliales, la distribucin asimtrica de protenas transportadoras permite el transporte transcelular de solutos Algunas ATPasas transportadoras de membrana son homlogas a las ATPasas transportadoras de eucariotas, que participan en la resistencia a drogas y en la fibrosis qustica: la superfamilia de transportadores ABC Resumen Canales inicos y propiedades elctricas de las membranas Los canilles inicos son selectivos para el ion y fluctan entre estados abiertos y cerrados 542 542

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El potencial de membrana de las clulas animales depende principalmente de los canales de fuga de K+y del gradiente de K+a travs de la membrana plasmtica Cuando se para la bomba de Na+ -K+ , el potencial de reposos slo decae lentamente La funcin de una clula nerviosa depende de su estructura alargada Los canales inicos regulados por voltaje son los responsables de la generacin de potenciales de accin en clulas excitables elctricamente La mielinizacin incrementa la velocidad y la eficiencia de la propagacin de los potenciales de accin en las clulas nerviosas El registro de zona indica que cada uno de los canales de Na+se abre siguiendo la ley del todo o nada Los canales catinicos regulados por voltaje estn relacionados evolutiva y estructuralmente En las sinapsis qumicas los canales inicos regulados por transmisor transforman seales qumicas en seales elctricas Las sinapsis qumicas pueden ser excitadoras o inhibidoras Los receptores de acetilcolina de las uniones neuromusculares son canales catinicos regulados por transmisor Los canales inicos regulados por transmisor son las dianas principales de la accin de drogas psicoactivas La transmisin neuromuscular implica la activacin secuencial de al menos cuatro grupos de canales inicos regulados El potencial postinptico principal de una neurona representa la suma espacial y temporal de muchos pequeos potenciales postsinpticos La integracin neuronal requiere la combinacin de al menos tres tipos de canales de K+diferentes La potenciacin a largo plazo en el hipocampo de los mamferos depende de la entrada de Ca2 + a travs de canales receptores NMDA Resumen Bibliografa

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Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas

La compartimentacin de las clulas superiores Todas las clulas eucariotas tienen la misma coleccin bsica de orgnulos rodeados de membrana La relacin topolgica de los orgnulos rodeados de membrana puede ser interpretada en trminos de sus orgenes evolutivos Las protenas pueden desplazarse entre compartimientos de diferentes maneras Los pptidos seal y la regin seal determinan el destino celular correcto de las protenas Las clulas no pueden construir d e novo sus orgnulos rodeados de membrana: necesitan informacin del propio orgnulo Resumen El transporte de molculas hacia dentro y hacia fuera del ncleo Los poros nucleares atraviesan la envoltura nuclear 589 589 Unas seales de localizacin nuclear dirigen las protenas nucleares hacia el ncleo Las macromolculas son transportadas activamente hacia dentro y hacia fuera del ncleo a travs de los poros nucleares La envoltura nuclear se desorganiza durante la mitosis El transporte entre el ncleo y el citosol puede ser regulado evitando el acceso a la maquinaria transportadora Resumen El transporte de protenas al interior de mitocondrias y de cloroplastos La translocacin hacia la matriz mitocondrial depende de una seal tpica de la matriz La translocacin hacia la matriz mitocondrial depende del gradiente electroqumico a travs de la membrana interna y de la hidrlisis de ATP

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Las protenas mitocondriales son importadas hacia la matriz mediante un proceso de dos etapas, a travs de lugares de contacto que unen las membranas externa e interna Las protenas son importadas hacia el interior de la matriz mitocondrial, en un estado desplegado La unin secuencial de las protenas importadas a las protenas mitondriales hsp70 y hsp60 impulsa su translocacin y ayuda al plegamiento proteico El transporte de protenas al espacio intermembrana mitocondrial requiere dos seales Para dirigir el transporte de protenas a la membrana tilacoidal de los cloroplastos se necesita la participacin de dos pptidos seal Resumen Peroxisomas Los peroxisomas utilizan el oxgeno molecular y el perxido de hidrgeno para realizar reacciones oxidativas Una corta secuencia seal dirige la importacin de protenas hacia los peroxisomas Resumen El retculo endoplasmtico Los ribosomas adheridos a las membranas definen el ER rugoso El ER liso es abundante en algunas clulas especializadas Las regiones lisas del ER pueden separarse de las rugosas mediante centrifugacin Los pptidos seal fueron descubiertos por primera vez en protenas importadas al ER

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Una partcula de reconocimiento de seal (SRP) dirige los pptidos seal para el ER a un receptor especfico de la membrana del ER La translocacin a travs de la membrana del ER no siempre requiere que se est produciendo el crecimiento de la cadena polipeptdica La cadena polipeptdica pasa a travs de un poro acuoso en el aparato de translocacin El pptido seal del ER es eliminado de la mayora de protenas solubles despus de la translocacin En las protenas transmembrana de un solo paso, un pptido seal interno permanece en la bicapa lipdica como una hlice a que atraviesa la membrana Combinaciones de seales de inicio y de paro de transferencia determinan la topologa de las protenas transmembrana de multipaso Las cadenas polipeptdicas translocadas se pliegan y se ensamblan en el lumen del ER rugoso La mayora de protenas sintetizadas en el ER rugoso son glucosiladas por la adicin de un AT-oligosacrido comn Algunas protenas de membrana, poco despus de entrar en el ER, intercambian un cola transmembrana carboxilo terminal por un glucosilfosfatidilinositol (GPI) unido de forma covalente La mayora de las bicapas lipdicas de membrana son ensambladas en el ER Las protenas de intercambio de fosfolpidos pueden transportar fosfolpidos desde el ER a las mitocondrias y a los peroxisomas Resumen Bibliografa

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Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

Transporte desde el ER al complejo de Golgi El complejo de Golgi est formado por una serie de compartimientos ordenados Las protenas residentes en el ER son selectivamente recuperadas de la red del cis Golgi Las protenas del Golgi vuelven al ER cuando las clulas se tratan con la droga brefeldina A En el complejo de Golgi se procesan las cadenas de oligosacrido Las cisternas del Golgi estn organizadas en forma de series secuenciales de compartimientos de procesamiento Los proteoglucanos son ensamblados en el complejo de Golgi Los carbohidratos de las membranas celulares se encuentran en la cara de la membrana que es topolgicamente equivalente al exterior de la clulas Cul es el propsito de la glucosilacin? Resumen Transporte desde la red del trans Golgi a los lisosomas Los lisosomas son el lugar principal de digestin intracelular Los lisosomas son heterogneos Las vacuolas de las plantas y de los hongos son lisosomas muy verstiles Los materiales son transportados hasta los lisosomas a travs de varias rutas Algunas protenas citoslicas son transportadas directamente a los lisosomas para ser degradadas Las enzimas lisosomales son clasificadas en la red del trans Golgi por un receptor proteico unido a membrana que reconoce la maosa 6-fosfato El receptor de maosa 6-fosfato viaja como una lanzadera, adelante y atrs, entre determinadas membranas 642 643 644 645 646 647 649

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Una regin seal en la cadena polipeptdica proporciona la clave para marcar una enzima lisosomal con la maosa 6-fosfato Los defectos en la GlcNAc-fosfotransferasa causan una enfermedad de acmulo lisosomal en humanos Resumen Transporte desde la membrana plasmtica va endosomas: endocitosis Clulas fagocticas especializadas pueden ingerir grandes partculas Las vesculas de pinocitosis se forman en la membrana plasmtica a partir de depresiones revestidas Las depresiones revestidas de clatrina pueden actuar como un mecanismo concentrador internalizando macromolculas extracelulares especficas Las clulas importan colesterol por endocitosis mediada por receptor El material endocitado termina frecuentemente en los lisosomas Determinadas protenas son recuperadas de los endosomas tempranos y devueltas a la membrana plasmtica La relacin entre endosomas tempranos y tardos es incierta Las macromolculas pueden ser transferidas a travs de las lminas de clulas epiteliales mediante transcitosis Las clulas epiteliales tienen dos compartimientos endosomales tempranos distintos pero un solo compartimiento endosomal tardo comn Resumen Transporte desde la red del trans Golgi hasta la superficie celular: exocitosis Parece que muchas protenas y lpidos son transportados automticamente desde el ER y el complejo de Golgi a la superficie celular

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Las vesculas de secrecin emergen por gemacin desde la red del trans Golgi A menudo las protenas son procesadas proteolticamente durante la formacin de las vesculas de secrecin Las vesculas de secrecin permanecen cerca de la membrana plasmtica hasta que una seal les hace liberar su contenido La exocitosis regulada es una respuesta localizada de la membrana plasmtica y del citoplasma subyacente Los componentes de la membrana de las vesculas de secrecin se reciclan Las vesculas sinpticas se forman a partir de los endosomas Las clulas polarizadas dirigen las protenas desde la red del trans Golgi hasta el dominio apropiado de la membrana plasmtica Resumen Mecanismos moleculares del transporte vesicular y mantenimiento de la diversidad de compartimientos El mantenimiento de las diferencias entre compartimientos requiere un aporte de energa libre Existe ms de un tipo de vesculas revestidas

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El ensamblaje del revestimiento de clatrina conduce a la formacin de la vescula Las adaptinas reconocen protenas transmembrana especficas y las unen al revestimiento de clatrina Las vesculas revestidas de coatmero median el transporte vesicular no selectivo El transporte vesicular depende de protenas reguladoras que unen GTP Parece que ARF sealiza el ensamblaje y el desensamblaje del revestimiento de coatmero Marcadores proteicos de orgnulo, llamados SNARE, colaboran en la direccin del transporte de vesculas Se cree que las protenas Rab aseguran la especificidad de la unin de las vesculas La fusin de vesculas est catalizada por una maquinaria de fusin de membrana La protena de fusin de membrana mejor caracterizada est sintetizada por un virus Resumen Bibliografa

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Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

La mitocondria La mitocondria presenta una membrana externa y una membrana interna que define dos compartimientos internos La oxidacin mitocondrial empieza cuando se generan grandes cantidades de acetil CoA a partir de piruvato y de cidos grasos en el espacio de la matriz El ciclo del cido ctrico oxida el grupo acetilo del acetil CoA, generando NADH y FADH2 para la cadena respiratoria En la membrana mitocondrial interna, un proceso quimiosmtico convierte la energa de oxidacin en ATP Los electrones son transferidos desde el NADH hasta el oxgeno, a travs de tres grandes complejos enzimticos respiratorios La energa liberada por el paso de los electrones a lo largo de la cadena respiratoria se almacena en forma de gradiente electroqumico de protones a travs de la membrana mitocondrial interna La energa almacenada en el gradiente electroqumico de protones se utiliza para producir ATP y para transportar metabolitos e iones inorgnicos hacia el espacio de la matriz La rpida conversin de ADP en ATP en las mitocondrias mantiene una elevada relacin ATP-ADP en las clulas La diferencia entre AG y AG: para que la hidrlisis de ATP sea til para la clula es necesario que tenga un valor muy negativo de AG La respiracin celular es notablemente eficiente Resumen La cadena respiratoria y la ATP sintasa A partir de las mitocondrias se pueden aislar partculas invertidas funcionales La ATP sintasa puede ser purificada y de nuevo incorporada a las membranas La ATP sintasa puede funcionar de manera reversible, hidrolizando ATP y bombeando H+ La cadena respiratoria bombea H+a travs de la membrana mitocondrial interna Se han utilizado mtodos espectroscpicos para identificar muchos transportadores de electrones de la cadena respiratoria La cadena respiratoria contiene tres grandes complejos enzimticos incluidos en la membrana 699 700

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En la citocromo oxidasa, un centro de hierro-cobre cataliza de forma eficiente la reduccin del 0 2 Las transferencias de electrones estn mediadas por colisiones aleatorias que se producen entre los dadores y los aceptores que difunden en la membrana mitocondrial interna Una gran cada de potencial redox a travs de cada uno de los tres complejos enzimticos respiratorios aporta energa para el bombeo de H+ El mecanismo del bombeo de H+se conoce mejor en bacteriorrodopsina Los ionforos de H+disipan el gradiente de H+ , desacoplando as el transporte de electrones de la sntesis de ATP Normalmente el control respiratorio restringe el flujo de electrones a travs de la cadena Existen desacoplantes naturales que transforman las mitocondrias del tejido adiposo marrn en mquinas generadoras de calor Todas las bacterias utilizan mecanismos quimiosmticos para ahorrar energa Resumen Cloroplastos y fotosntesis El cloroplasto es un miembro de una familia de orgnulos exclusivos de las plantas -los plastidios Los cloroplastos se parecen a las mitocondrias, pero tienen un compartimiento adicional Dos reacciones caractersticas de los cloroplastos: la produccin de ATP y de NADPH, impulsada por la luz, y la conversin de C 02 en carbohidratos La fijacin del carbono est catalizada por la ribulosa bisfosfato carboxilasa En el ciclo de fijacin del carbono se consumen tres molculas de ATP y dos molculas de NADPH por cada molcula de C 0 2 fijada En algunas plantas, la fijacin del carbono est compartimentada para facilitar el crecimiento a concentraciones bajas de C 0 2 La fotosntesis depende de la fotoqumica de las molculas de clorofila Un fotosistema contiene un centro de reaccin y un complejo antena

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En un centro de reaccin, la energa capturada por la clorofila genera un dador fuerte de electrones a partir de uno dbil En plantas y en cianobacterias, la fotofosforilacin no cclica produce NADPH y ATP Los cloroplastos pueden producir ATP por fotofosforilacin cclica sin generar NADPH El gradiente electroqumico de protones es similar en las mitocondrias y los cloroplastos Como la membrana mitocondrial interna, la membrana interna del cloroplasto contiene protenas transportadoras que facilitan el intercambio de metabolitos con el citosol Los cloroplastos llevan a cabo otros procesos biosintticos Resumen Evolucin de las cadenas de transporte de electrones Probablemente las clulas ms primitivas producan ATP mediante fermentacin La evolucin de la cadena de transporte electrnico conservadora de energa capacit a las bacterias anaerbicas para utilizar compuestos orgnicos no fermentadles como fuente de energa Las bacterias fotosintticas, suministrando una fuente inagotable de poder reductor, superaron el mayor obstculo de la evolucin de las clulas Las cadenas de transporte electrnico de los complejos fotosintticos de las cianobacterias produjeron oxgeno atmosfrico y permitieron nuevas formas de vida Resumen Los genomas de las mitocondrias y de los cloroplastos La biosntesis de las mitocondrias y de los cloroplastos supone la contribucin de dos sistemas genticos diferentes

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El crecimiento y la divisin de los orgnulos mantiene el nmero de mitocondrias y de cloroplastos en la clula Generalmente los genomas de los cloroplastos y de las mitocondrias son molculas de DNA circulares Las mitocondrias y los cloroplastos contienen sistemas genticos completos El genoma del cloroplasto de las plantas superiores contiene aproximadamente 120 genes Los genomas mitocondriales presentan varias caractersticas sorprendentes Las mitocondrias de animales contienen el sistema gentico ms simple de los conocidos Por qu los genomas mitocondriales en las plantas son tan grandes? Algunos genes de orgnulos contienen intrones Los genes mitocondriales se pueden distinguir de los genes nucleares gracias a su herencia no mendeliana (citoplasmtica) En muchos organismos, los genes de los orgnulos se heredan de la madre Los mutantes diminutos en levadura demuestran la extraordinaria importancia del ncleo celular en la biognesis mitocondrial Las mitocondrias y los cloroplastos contienen protenas especficas de tejido Las mitocondrias importan la mayor parte de sus lpidos mientras que los cloroplastos producen la mayor parte de ellos Probablemente, tanto las mitocondrias como los cloroplastos han evolucionado a partir de bacterias endosimbiticas Por qu los cloroplastos y las mitocondrias tienen sus propios sistemas genticos? Resumen Bibliografa

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Transmisin de seales entre clulas

Principios generales de la sealizacin celular 771 Las molculas seal extracelulares son reconocidas por receptores especficos de la superficie o del interior de las clulas diana 772 Las molculas secretadas median tres formas de sealizacin: la paracrina, la sinptica y la endocrina 773 La sealizacin autocrina puede coordinar decisiones de grupos de clulas idnticas 774 Las uniones comunicantes permiten que la informacin de sealizacin sea compartida por las clulas vecinas 776 Cada clula est programada para responder a combinaciones especficas de molculas seal 776 Diferentes clulas pueden responder de forma diferente a la misma seal qumica 777 La concentracin de una molcula puede ajustarse rpidamente slo si la vida media de la molcula es corta 777 El gas xido ntrico acta como una seal, unindose directamente a una enzima en el interior de la clula diana 779 Las hormonas esteroideas, las hormonas tiroideas, los retinoides y la vitamina D se unen a receptores intracelulares que son protenas reguladoras de genes activadas por ligando 779 Se conocen tres clases de protenas receptoras de superficie celular: las asociadas a canales inicos, las asociadas a protenas G y las asociadas a enzimas 782 Los receptores de superficie celular, una vez activados, desencadenan la adicin de grupos fosfato a una red de protenas intracelulares 783 Resumen 784

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Sealizacin va receptores de superficie celular asociados a protenas G Las protenas G trimricas transmiten la seal intracelular desde los receptores asociados a protenas G Algunos receptores incrementan los niveles intracelulares de AMP cclico activando la adenil ciclasa a travs de una protena G estimuladora (Gs) Se cree que las protenas G trimricas se desensamblan cuando son activadas Algunos receptores disminuyen los niveles de AMP cclico inhibiendo la adenil ciclasa va una protena G trimrica inhibidora (G,) La protena quinasa dependiente de AMP cclico (quinasa A) media los efectos del AMP cclico Diversas protena serina/treonina fosfatasas revierten rpidamente los efectos de la quinasa A Para utilizar el Ca2 +como seal intracelular, las clulas han de mantener los niveles basales de Ca2 + muy bajos El Ca2 + acta como un mensajero intracelular ubicuo Algunos receptores relacionados con protenas G activan el proceso de sealizacin de fosfolpidos de inositol activando la fosfolipasa C-0 El inositol trisfosfato (IP3) acopla la activacin del receptor con la liberacin de Ca2 + del ER A menudo las oscilaciones de Ca2 + prolongan la respuesta inicial de Ca2 + inducida por IP3 El diacilglicerol activa la protena quinasa C (quinasa C) La calmodulina es un receptor intracelular de Ca2 +ubicuo 786 786

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En las clulas animales la mayora de acciones del Ca2t se producen a travs de protena quinasas dependientes de Ca2+ -calmodulina (quinasas CaM) Los procesos de Ca2 +y de AMP cclico interaccionan entre s Algunas protenas G trimricas regulan directamente canales inicos La olfaccin y la visin dependen de receptores asociados a protenas G y de canales inicos regulados por nucletidos cclicos Las seales extracelulares son notablemente amplificadas mediante la utilizacin de mensajeros intracelulares y de cascadas enzimticas Las clulas pueden responder de forma sbita a incrementos graduales de la concentracin de una seal extracelular El efecto de algunas seales puede ser recordado por la clula Resumen Sealizacin va receptores de superficie celular asociados a enzimas Los receptores guanilato ciclasa generan GMP cclico directamente Los receptores para la mayora de los factores de crecimiento son protenas transmembrana que presentan actividad protena tirosina quinasa especfica Los residuos tirosina fosforilados son reconocidos por protenas con dominios SH2 Las protenas Ras constituyen un eslabn crucial en la cascada intracelular de sealizacin activada por receptores protena quinasa Una protena SH adapatadora acopla los receptores tirosina quinasa con Ras: evidencias que provienen del desarrollo del ojo de Drosophila Ras activa una cascada de fosforilaciones serina/treonina que activa la MAP- quinasa La actividad de los receptores asociados a tirosina quinasa depende de tirosina quinasas que no son receptores Algunos receptores son protena tirosina fosfatasas

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La utilizacin de oncogenes que provocan cncer ha permitido identificar muchos componentes del proceso de sealizacin de los receptores tirosina quinasa Las protenas de la superfamilia TGF-P activan receptores que son protena serina/treonina quinasas El receptor transmembrana Notch media la inhibicin lateral mediante un mecanismo desconocido Resumen Adaptacin de las clulas diana La adaptacin lenta depende de la regulacin por disminucin del nmero de receptores A menudo la adaptacin rpida se produce por fosforilacin de los receptores Algunas formas de adaptacin son debidas a cambios en el proceso de sealizacin La adaptacin desempea un papel crucial en la quimiotaxis bacteriana La quimiotaxis bacteriana est mediada por una familia de cuatro receptores transmembrana homlogos y por un sistema de fosforilacin que transmite la seal En la quimiotaxis bacteriana, la metilacin del receptor es responsable de la adaptacin Resumen La lgica de la sealizacin intracelular: lecciones de redes neuronales basadas en los ordenadores Las redes neuronales basadas en el ordenador pueden ser entrenadas Las redes de sealizacin celular pueden observarse como redes neuronales entrenadas por la evolucin Las redes de sealizacin capacitan a las clulas para responder a complejos patrones de seales extracelulares Las redes seal son robustas Resumen Bibliografa

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El citoesqueleto
La naturaleza del citoesqueleto El citoplasma de una clula eucariota est organizado espacialmente por los filamentos de actina, los microtbulos y los filamentos intermedios La dinmica de los microtbulos emana del centrosoma La red microtubular puede encontrar el centro de la clula Determinadas protenas motoras utilizan la red microtubular como gua para posicionar los orgnulos rodeados de membrana El crtex de actina puede generar y mantener la polaridad celular Normalmente los filamentos de actina y los microtbulos actan juntos polarizando la clula Las funciones del citoesqueleto son difciles de estudiar Resumen Filamentos intermedios Los filamentos intermedios son polmeros de protenas fibrosas Las clulas epiteliales presentan una familia muy diversa de filamentos de queratina Muchas clulas no epiteliales presentan sus propios filamentos intermedios citoplasmticos diferenciales La lmina nuclear est constituida por un tipo especial de protenas de filamentos intermedios: las lamininas Los filamentos intermedios proporcionan estabilidad mecnica a las clulas animales Resumen 844

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Microtbulos Los microtbulos son cilindros huecos formados por tubulina Los microtbulos son estructuras muy lbiles, sensibles a drogas antimitticas especficas El alargamiento de un microtbulo es un proceso rpido, mientras que la nucleacin de un nuevo microtbulo es un proceso lento Los dos extremos de un microtbulo son diferentes y crecen a velocidades diferentes Los centrosomas son el lugar primario de nucleacin de los microtbulos en las clulas animales En las clulas animales los microtbulos se despolimerizan y repolimerizan continuamente La hidrlisis de GTP puede explicar la inestabilidad dinmica de los microtbulos individuales La inestabilidad dinmica de los microtbulos proporciona un principio organizador para la morfognesis celular Los microtbulos sufren una lenta maduracin como resultado de modificaciones post-traduccionales de sus subunidades de tubulina Las protenas asociadas a microtbulos (MAP) se unen a los microtbulos y modifican sus propiedades Las MAP colaboran en la generacin de regiones citoplasmticas funcionalmente distintas La quinesina y la dinena dirigen el movimiento de los orgnulos a lo largo de los microtbulos 860 860 861

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La velocidad y la direccin de desplazamiento a lo largo de los microtbulos son especficas del dominio globular de las protenas motoras Resumen Cilios y centrolos Los cilios se mueven por el batido de un axonema -un complejo haz de microtbulos La dinena dirige el movimiento de los cilios y de los flagelos Cilios y flagelos crecen a partir de corpsculos basales que estn muy ntimamente relacionados con los centrolos Los centrolos suelen aparecer por duplicacin de los centrolos preexistentes Resumen Filamentos de actina Los filamentos de actina son delgados y flexibles La actina y la tubulina polimerizan por mecanismos parecidos El comportamiento dinmico de los filamentos de actina requiere la hidrlisis del ATP Las funciones de los filamentos de actina son inhibidas por drogas estabilizadoras y desestabilizadoras del polmero La molcula de actina se une a pequeas protenas que ayudan a controlar su polimerizacin Muchas clulas emiten, desde su borde frontal de avance, microespinas y lamelipodios dinmicos que contienen actina El borde frontal de avance de las clulas mviles nuclea la polimerizacin de la actina Algunas bacterias patgenas utilizan la actina para moverse dentro y entre las clulas La polimerizacin de la actina en el crtex celular est controlada por receptores de la superficie celular Protenas G heterotrimricas y pequeas GTPasas transmiten seales desde la superficie celular al crtex de actina Los mecanismos de polarizacin celular pueden ser analizados en las clulas de levadura Resumen Protenas de unin a la actina Un citoesqueleto unido de manera sencilla a la membrana proporciona soporte mecnico a la membrana plasmtica de los eritrocitos

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Protenas de entrecruzamiento con diferentes propiedades organizan ensamblajes particulares de actina Las protenas de unin a la actina con propiedades diferentes estn construidas a partir de mdulos semejantes La gelsolina, cuando se activa por Ca2+ , fragmenta los filamentos de actina En las clulas eucariotas se han encontrado mltiples tipos de miosina En clulas no musculares pueden formarse transitoriamente ensamblajes semejantes a los musculares Los contactos focales permiten que los filamentos de actina se extiendan hacia el substrato Los microvilli ilustran de qu forma los haces de filamentos entrecruzados de actina pueden estabilizar zonas locales de la membrana plasmtica El comportamiento de la corteza celular depende de un equilibrio de interacciones cooperativas y competitivas entre una gran coleccin de protenas de unin a la actina La migracin de las clulas animales comporta tres subprocesos distintos dependientes de actina El mecanismo de la locomocin celular puede ser diseccionado genticamente Resumen El msculo Las miofibirillas estn formadas por ensamblajes repetitivos de filamentos gruesos y delgados La contraccin se produce por el deslizamiento de los filamentos de miosina y de actina entre s Las cabezas de miosina caminan hacia el extremo menos de los filamentos de actina La contraccin muscular se inicia por un aumento repentino de la concentracin de Ca2 + citoslico La troponina y la tropomiosina median la regulacin de la contraccin del msculo esqueltico por el Ca2 + Otras protenas accesorias mantienen la arquitectura de la miofibrilla y le proporcionan su elasticidad La misma maquinaria contrctil, en una forma modificada, se encuentra en el msculo cardaco y en el msculo liso En muchas clulas, la activacin de la miosina depende de la fosforilacin de la cadena ligera de la miosina Resumen Bibliografa

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El ciclo de la divisin celular

La estrategia general del ciclo celular La replicacin del DNA nuclear ocurre durante una fase especfica de la interfase: la fase S Paralelamente al crecimiento continuo de la clula, durante el ciclo celular se producen una serie de procesos discretos Un sistema de control central desencadena los procesos esenciales del ciclo celular El control del ciclo celular es un mecanismo basado en una protena quinasa Resumen El ciclo celular de los embriones tempranos y la funcin del MPF El crecimiento del oocito de Xenopus est equilibrado por la divisin del huevo Un regulador citoplasmtico, el MPF, controla la entrada en la mitosis Las oscilaciones de la actividad MPF controlan el ciclo de divisin celular 926 927 La acumulacin y la destruccin de ciclina controla la activacin y la inactivacin de MPF La degradacin de la ciclina desencadena la salida de la mitosis El MPF puede actuar como autocataltico, estimulando su propia activacin El MPF activo induce los procesos subordinados de la mitosis El sistema de control del ciclo celular permite tiempo suficiente para que se produzca una ronda de replicacin del DNA en cada interfase Un bloqueo de la re-replicacin asegura que ningn segmento de DNA se replique ms de una vez en cada ciclo celular El paso por la mitosis hace desaparecer el bloqueo a las re-replicaciones Resumen Las levaduras y la gentica molecular del sistema de control del ciclo celular El crecimiento celular requiere una interfase prolongada con puntos de control del ciclo celular 937 939 939 939

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Las levaduras de fisin y de gemacin cambian de forma a medida que van progresando a lo largo del ciclo celular Las mutaciones del ciclo de divisin celular detienen el ciclo en puntos especficos; las mutaciones wee permiten al ciclo saltarse un punto de control de tamao Las subunidades del MPF en las levaduras son homologas a las del MPF en animales La actividad del MPF est regulada por fosforilacin y desfosforilacin El mecapismo de activacin del MPF controla el tamao de las levaduras de fisin Para la mayora de las clulas el punto de control principal del ciclo celular se encuentra en el Inicio de G, La protena Cdc2 se asocia con la ciclina G, para conducir a la clula ms all del Inicio Las ciclinas G, median muchos de los controles que actan en el Inicio La quinasa de Inicio pone en marcha la fabricacin de los componentes necesarios para la replicacin del DNA Los controles por retroalimentacin aseguran que las clulas completen un proceso de ciclo celular antes de comenzar el siguiente El DNA daado genera una seal que retrasa la mitosis Generalmente los controles por retroalimentacin en el ciclo celular dependen de seales inhibidoras Resumen Controles de la divisin celular en los animales pluricelulares El sistema de control del ciclo celular es ms elaborado que el de las levaduras

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La regulacin del crecimiento y de la proliferacin de las clulas de mamfero se estudia normalmente en lneas celulares cultivadas Los factores de crecimiento estimulan la proliferacin de clulas de mamfero El crecimiento celular y la divisin celular pueden ser regulados independientemente Las clulas pueden retrasar su divisin entrando en un estado especializado de no-crecimiento La ausencia de suero evita el paso por el punto de control G, El sistema de control del ciclo celular puede desensamblarse rpidamente pero slo puede ensamblarse de nuevo, lentamente Las clulas vecinas compiten por los factores de crecimiento Las clulas animales normales en cultivo necesitan anclarse para superar el Inicio Estudios en clulas cancerosas revelan la existencia de genes implicados en el control de la proliferacin celular Los factores de crecimiento desencadenan cascadas de seales intracelulares Las ciclinas y la Cdk son inducidas por factores de crecimiento tras un largo retraso La protena retinoblastoma acta manteniendo la proliferacin bajo control La probabilidad de entrar en G0 aumenta con el nmero de divisiones celulares: la senescencia celular El cuerpo se genera y se mantiene mediante complicados patrones reguladores de la divisin celular Resumen Bibliografa

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Los mecanismos de la divisin celular

Visin de conjunto de la fase M Tres caractersticas son exclusivas de la fase M: la condensacin cromosmica, el huso mittico y el anillo contrctil La divisin celular depende de la duplicacin del centrosoma Tradicionalmente la fase M se divide en seis estadios Los orgnulos citoplasmticos grandes se fragmentan durante la fase M asegurando que se heredan correctamente Resumen 977 Las cromtidas hermanas se separan repentinamente en la anafase La anafase se retrasa hasta que todos los cromosomas se posicionan en la placa metafsica Dos procesos diferentes separan las cromtidas en la anafase El desensamblaje de los microtbulos cinetocricos se produce durante la anafase A Dos fuerzas distintas podran contribuir a la anafase B En la telofase se recompone la envoltura nuclear alrededor de los grupos de cromosomas Resumen Citocinesis El huso mittico determina el lugar de la segmentacin del citoplasma durante la citocinesis El huso se reposiciona especficamente creando divisiones celulares asimtricas La actina y la miosina generan las fuerzas necesarias para la segmentacin En casos especiales, determinados componentes celulares se pueden segregar a una sola clula hija En las clulas de las plantas superiores, la citocinesis ocurre mediante un mecanismo especial Una red de citoesqueleto determina el plano de divisin de las clulas vegetales La elaborada fase M de los organismos superiores evolucion gradualmente a partir de organismos procariotas de fisin Resumen Bibliografa 995 996 996 996 998 999 1000 1001 1001 1002 1003 1005 1006 1007

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Mitosis 985 La formacin del huso mittico en una clula en fase M se acompaa de cambios sorprendentes en las propiedades dinmicas de los microtbulos 986 Las interacciones entre microtbulos orientados en direcciones opuestas conducen el ensamblaje del huso 986 Los cromosomas replicados se unen a los microtbulos por sus cinetocoros 988 En los cromosomas de la levadura los complejos proteicos cinetocricos se ensamblan siguiendo secuencias especficas de DNA centromrico 989 Los cinetocoros capturan los microtbulos nucleados en los polos del huso 990 Los extremos ms de los microtbulos cinetocricos pueden aadir y perder subunidades de tubulina mientras estn adheridos al cinetocoro 991 Los polos del huso repelen los cromosomas 991 Las cromtidas hijas se unen a polos opuestos del huso mediante sus cinetocoros 992 Fuerzas bipolares equilibradas mantienen a los cromosomas en la placa metafsica 992 Los microtbulos son dinmicos en el huso metafsico 993

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Las clulas en su contexto social

Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular
Uniones celulares Las uniones estancas forman una barrera de permeabilidad selectiva a travs de los epitelios Las uniones de anclaje conectan el citoesqueleto entre clulas o entre la clula y la matriz extracelular Las uniones adherentes conectan haces de fibras de actina entre clulas o entre la clula y la matriz extracelular Los desmosomas conectan filamentos intermedios entre clulas; los hemidesmosomas los unen a la lmina basal Las uniones de tipo gap permiten el paso directo de pequeas molculas entre clulas Los conexones de las uniones de tipo gap estn compuestos por seis subunidades La mayor parte de las clulas embrionarias estn acopladas entre s durante las primeras etapas del desarrollo mediante uniones de tipo gap La permeabilidad de las uniones de tipo gap est regulada En los vegetales, los plasmodesmos realizan muchas de las funciones de las uniones de tipo gap Resumen 1018 1019 1021 Los proteoglucanos de superficie celular actan como correceptores Las colgenas son las protenas ms abundantes de la matriz extracelular Las molculas de colgena son secretadas con unas extensiones no helicoidales en cada una de las regiones terminales Despus de su secrecin, las molculas fibrilares de procolgena son degradadas hasta molculas de colgena, las cuales se organizan en fibrillas Las colgenas asociadas a fibrillas organizan estas fibrillas Las clulas participan de la organizacin de las fibras de colgena que secretan ejerciendo tensiones mecnicas sobre la matriz La elastina confiere a los tejidos su elasticidad La fibronectina es un protena extracelular adhesiva que contribuye a la adhesin de la clula a la matriz Las diversas formas de fibronectina son producto de una maduracin alternativa del RNA Las glucoprotenas de la matriz ayudan a determinar las vas de migracin celular Las molculas de colgena de tipo IV se ensamblan formando una red laminar que facilita la formacin de la lmina basal La lmina basal est compuesta fundamentalmente por colgena de tipo IV, proteoglucanos del tipo heparn sulfato, laminina y entactina Las lminas basales realizan diversas y complejas funciones La degradacin de los componentes de la matriz extracelular est estrechamente controlada Resumen Receptores de la matriz extracelular en clulas animales: las integrinas Las integrinas son heterodmeros transmembrana Las integrinas pueden interaccionar con el citoesqueleto para unir las clulas a la matriz extracelular Las integrinas permiten al citoesqueleto y a la matriz extracelular comunicarse a travs de la membrana plasmtica Las clulas pueden regular la actividad de sus integrinas Las integrinas pueden activar cascadas de sealizacin intracelular Resumen La pared celular de los vegetales La composicin de la pared celular depende del tipo celular Las fuerzas de tensin de las paredes celulares permiten a las clulas vegetales desarrollar una presin de turgencia La pared celular est constituida por microfibrillas de celulosa entretejidas con una red de polisacridos y protenas Los microtbulos orientan la deposicin de la pared celular Resumen Bibliografa 1048 1048

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Adhesin intercelular 1032 Existen dos vas fundamentales mediante las cuales las clulas animales se unen para formar tejidos 1032 Las clulas de vertebrados disociadas pueden reagregarse en tejidos organizados mediante mecanismos de adhesin selectiva clula-clula 1033 Las cadherinas median la unin clula-clula dependiente de Ca2 +en los vertebrados 1035 Las cadherinas median la adhesin clula-clula a travs de un mecanismo homoflico 1036 La adhesin intercelular independiente de Ca2 +est mediada principalmente por unas protenas pertenecientes a la 1037 superfamilia de las inmunoglobulinas Muchos tipos de molculas de superficie celular actan paralelamente mediando la adhesin selectiva clula-clula y clula-matriz 1038 Los contactos no adhesivos pueden ser los iniciadores de fenmenos de adhesin intercelular especficos de tejido que posteriormente son orientados y estabilizados por contactos de unin 1040 Resumen 1041 La matriz extracelular de los animales La matriz extracelular est producida y orientada por las clulas que engloba Las cadenas de glucosaminoglucano (GAG) ocupan grandes volmenes, formando geles hidratados Parece que el cido hialurnico facilita la migracin celular durante la morfognesis y la reparacin de los tejidos Los proteoglucanos estn compuestos por cadenas de GAG unidas covalentemente a una protena central Las cadenas de proteoglucanos pueden regular las actividades de molculas secretadas de sealizacin Las cadenas de GAG pueden estar altamente organizadas en la matriz extracelular 1041 1042 1043

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Clulas germinales y fecundacin

Las ventaj as del sexo En los animales pluricelulares, la fase diploide es compleja y larga mientras que la haploide es sencilla y corta La reproduccin sexual confiere una ventaja competitiva a los organismos que se encuentran en un ambiente que cambia de forma imprevisible Resumen Meiosis La meiosis implica dos divisiones nucleares en lugar de una sola La redistribucin gnica aumenta debido al entrecruzamiento entre las cromtidas homologas no hermanas El apareamiento meitico cromosmico culmina con la formacin del complejo sinaptonmico Se cree que los nodulos de recombinacin median los intercambios de cromtidas Los quiasmas desempean un importante papel en la segregacin cromosmica durante la meiosis El apareamiento de los cromosomas sexuales asegura que tambin ellos se segreguen La divisin meitica II es semejante a la mitosis Resumen Oocitos El oocito es la nica clula de un animal superior que es capaz de desarrollarse produciendo un nuevo individuo 1083 1084

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Un oocito est altamente especializado para su desarrollo independiente, presentando grandes reservas nutritivas y una compleja cubierta protectora Los oocitos se desarrollan por etapas Los oocitos crecen hasta alcanzar su gran tamao por medio de mecanismos especiales Resumen Espermatozoides Los espermatozoides estn altamente adaptados para depositar su DNA en un oocito En muchas especies de mamferos los espermatozoides se producen de manera continua Resumen Fecundacin El contacto con la cubierta pelcida estimula al espermatozoide a sufrir la reaccin acrosmica La reaccin cortical del oocito contribuye a asegurar que sea fecundado por un solo espermatozoide Una protena de fusin transmembrana de la membrana plasmtica del espermatozoide cataliza la fusin espermatozoide-oocito El espermatoide proporciona un centriolo al zigoto Resumen Bibliografa

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Mecanismos celulares del desarrollo

Movimientos morfognicos y la forma del mapa corporal La polaridad del embrin de anfibio depende de la polaridad del huevo La segmentacin produce muchas clulas a partir de una clula inicial La blstula es una cavidad rodeada por un epitelio La gastrulacin transforma una esfera hueca de clulas en una estructura triestratificada con un intestino primitivo Los movimientos de gastrulacin se organizan alrededor del labio dorsal del blastoporo Cambios activos del empaquetamiento celular suministran una fuerza conductora para la gastrulacin Las tres capas germinales formadas por la gastrulacin tienen destinos distintos El mesodermo situado a cada lado del eje del cuerpo se fragmenta en somitos, de los que derivan las clulas musculares Los patrones cambiantes de molculas de adhesin celular regulan los movimientos morfognicos Clulas migratorias invaden los tejidos del embrin de forma estrictamente controlada El plano estructural del cuerpo de los vertebrados se forma primero en miniatura y despus se mantiene a medida que el embrin crece Resumen 1111 1112 1113 1114 Interacciones inductivas generan nuevos tipos de clulas en un patrn cada vez ms detallado Un sencillo gradiente de morfgeno puede organizar un complejo patrn de respuestas celulares Las clulas pueden reaccionar de forma distinta a una seal segn el momento en que la reciban: funcin de un reloj intracelular En los mamferos, el protegido entorno uterino permite un tipo extraordinario de desarrollo temprano Todas las clulas del embrin animal temprano tienen el mismo potencial de desarrollo Las clulas madre embrionarias de los mamferos muestran cmo seales procedentes del entorno pueden controlar el ritmo y la va de desarrollo Resumen

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Diversificacin celular en el embrin animal temprano 1125 Las diferencias iniciales entre los blastmeros de Xenopus surgen a partir de la segregacin espacial de determinantes en el huevo 1126

Memoria celular, determinacin celular y el concepto de valores posicionales A menudo las clulas quedan determinadas para su futuro papel especializado mucho antes de que se diferencien manifiestamente El momento de la determinacin celular puede ponerse de manifiestojior medio de experimentos de trasplante La determinacin y la diferenciacin celulares reflejan la expresin de genes reguladores El estado de determinacin puede estar controlado por el citoplasma o puede ser intrnseco a los cromosomas Las clulas de los tejidos en desarrollo recuerdan sus valores posicionales El patrn de valores posicionales controla la proliferacin celular y se regula a travs de intercalacin Resumen

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El gusano nemtodo: los genes controladores del desarrollo y las leyes del comportamiento celular C aenorhabditis elegans es anatmica y genticamente sencillo El desarrollo del nemtodo es prcticamnte invariable Los genes de control del desarrollo definen las leyes del comportamiento celular que generan el mapa corporal La induccin de la vulva depende de un amplio conjunto de genes controladores del desarrollo Pruebas genticas microquirrgicas revelan la lgica del control del desarrollo; el clonaje y la secuenciacin de genes nos ayudan a descubrir su bioqumica Mutaciones heterocrnicas identifican los genes que especifican cambios en las leyes del comportamiento celular a medida que transcurre el tiempo El tempo del desarrollo no est controlado mediante el ciclo de divisin celular Las clulas mueren ordenadamente como parte del programa de desarrollo Resumen

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Los genes selectores hometicos son esenciales para la memoria de la informacin posicional de las clulas de los discos imagnales Los genes selectores hometicos y los genes de polaridad del segmento definen los compartimientos del cuerpo La expresin localizada de protenas especficas antecede la produccin de quetas sensitivas La inhibicin lateral regula el patrn detallado de tipos celulares diferenciados Los genes de control de desarrollo de D rosophila tienen homlogos en los vertebrados Los mamferos tienen cuatro complejos HOM homlogos Los genes Hox definen los valores posicionales en los vertebrados tal como ocurre en los insectos Subconjuntos de los genes Hox se expresan distribuidos a lo largo de los dos ejes ortogonales de las yemas de las extremidades de los vertebrados Resumen El desarrollo vegetal El desarrollo embrionario empieza con el establecimiento del eje raz-brote y se detiene en el interior de la semilla Los mdulos repetitivos de una planta son generados secuencialmente por los meristemos La forma de cada nueva estructura depende de la orientacin de la divisin celular y de la expansin Cada mdulo de la planta crece a partir de un conjunto microscpico de primordios de un meristemo Seales hormonales de largo alcance coordinan los procesos del desarrollo en partes distantes de la planta Arabidopsis se utiliza como organismo modelo para la gentica molecular de las plantas Los genes selectores hometicos definen las partes de una flor Resumen El desarrollo neural Las reservas de neuronas generadas en el inicio del desarrollo neural no se reemplazarn posteriormente El momento y el lugar de nacimiento de una neurona determinarn sus conexiones Cada axn o dendrita se extiende gracias a un cono de crecimiento situado en su extremo El cono de crecimiento conduce in vivo a la neurita en desarrollo a travs de una va definida con precisin Los tejidos diana liberan factores neurotrficos que controlan el crecimiento y la supervivencia de las clulas nerviosas Los valores posicionales de las neuronas guan la formacin de mapas neuronales ordenados: doctrina de la especificidad neuronal Los axones de lados opuestos de la retina responden de forma distinta al gradiente de las molculas repelentes del tectum Los patrones difusos de las conexiones sinpticas se definen mediante la eliminacin de la sinapsis dependiente de actividad La experiencia moldea el patrn de conexiones sinpticas del cerebro Resumen Bibliografa

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Drosophila y la gentica molecular del patrn

de formacin. I. Gnesis del mapa corporal El cuerpo del insecto se construye mediante la modulacin de un patrn fundamental de unidades de repeticin D rosophila inicia su desarrollo como un sincitio Dos sistemas ortogonales definen el mapa geomtrico del embrin Influencias procedentes de las clulas que envuelven el huevo marcan el inicio del modelaje del embrin El eje dorsoventral se define en el interior del embrin mediante una protena reguladora de genes con un gradiente de concentracin intranuclear El sistema posterior define las clulas germinales y tambin los segmentos corporales posteriores El mRNA localizado en el polo anterior codifica una protena reguladora de genes que constituye el gradiente morfognico anterior Tres clases de genes de segmentacin subdividen el embrin La expresin localizada de los genes de segmentacin est regulada por una jerarqua de seales de posicin El producto de un gen de segmentacin controla la expresin de otro gen generando un patrn detallado Los genes de polaridad del huevo gap y de regla par generan un patrn transitorio que es recordado por otros genes Los genes de la polaridad de segmento marcan las subdivisiones bsicas de cada parasegmento Resumen

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Drosophila y la gentica molecular del patrn

de formacin. II. Genes selectores hometicos y modelaje de las partes del cuerpo Los genes selectores hometicos del complejo bithorax y del complejo Antennapedia definen las diferencias entre parasegmentos Los genes selectores hometicos codifican un sistema de marcadores moleculares de direccin Las regiones de control de los genes selectores hometicos actan como chips de memoria de informacin posicional La mosca adulta se desarrolla a partir de un conjunto de discos imagnales que contienen informacin posicional 1171

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Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

Mantenimiento del estado diferenciado La mayora de las clulas diferenciadas recuerdan su carcter esencial incluso en un nuevo entorno El estado diferenciado se puede modular por el entorno celular Resumen Tejidos con clulas permanentes Las clulas del centro del cristalino del ojo de un adulto son residuos del embrin La mayora de las clulas permanentes renuevan sus componentes: las clulas fotorreceptoras de la retina Resumen Renovacin por biparticin simple Las funciones del hgado como interfase entre el tracto digestivo y la sangre La prdida de clulas hepticas estimula la proliferacin de clulas hepticas La regeneracin requiere el crecimiento coordinado de los constituyentes de los tejidos Las clulas endoteliales revisten todos los vasos sanguneos Las nuevas clulas endoteliales se generan por biparticin simple de clulas endoteliales ya existentes Los capilares se forman mediante proliferacin La angiognesis est controlada por factores de crecimiento liberados por los tejidos prximos Resumen Renovacin por medio de clulas madre: la epidermis Las clulas madre pueden dividirse sin lmite y dar lugar a una progenie diferenciada Las clulas madre epidrmicas se encuentran en la capa basal Las clulas epidrmicas en diferenciacin sintetizan una secuencia de queratinas diferentes a medida que maduran Las clulas madre epidrmicas son un subconjunto de las clulas basales La proliferacin de las clulas basales se regula en funcin del grosor de la epidermis Las clulas secretoras de la piel estn agrupadas en glndulas que tienen su propia cintica de poblacin Resumen Renovacin por medio de clulas madre pluripotenciales: formacin de las clulas sanguneas Existen tres tipos principales de glbulos blancos: los granulocitos, los monocitos y los linfocitos La produccin de los distintos tipos de clulas sanguneas en la mdula sea se halla controlada individualmente 1219 1221 1221 1222 1222 1223 1224 1226 1227 1227 1230 1231 1231 1232 1233 1234 1235 1236 1237 1238 La mdula sea contiene las clulas madre hematopoyticas Las clulas madre pluripotenciales dan lugar a todos los tipos de clulas sanguneas El nmero de clulas sanguneas especializadas se amplifica por divisiones de clulas progenitoras determinadas Los factores que regulan la hematopoyesis pueden analizarse en cultivo La eritropoyesis depende de la hormona eritropoyetina En la produccin de los neutrfilos y de los macrfagos influyen mltiples CSF Las clulas madre hematopoyticas dependen del contacto con clulas que expresan el factor Steel El comportamiento de una clula hematopoytica depende parcialmente del azar La regulacin de la supervivencia celular es tan importante como la regulacin de la proliferacin celular Resumen Gnesis, modulacin y regeneracin del msculo esqueltico Las nuevas clulas del msculo esqueltico se forman por fusin de los mioblastos Las fibras musculares pueden modular sus propiedades mediante cambios de las protenas isoformas que poseen En el adulto persisten algunos mioblastos como clulas madre quiescentes Resumen Los fibroblastos y sus transformaciones: la familia de las clulas del tejido conjuntivo Los fibroblastos cambian sus caractersticas en respuesta a seales de la matriz extracelular La matriz extracelular puede influir en la diferenciacin de las clulas del tejido conjuntivo, afectando a su adhesin y a su forma Distintas molculas seal actan de forma secuencial regulando la produccin de adipocitos El hueso se remodela continuamente por medio de las clulas que lo constituyen Los osteoblastos segregan matriz sea, mientras que los osteoclastos la erosionan Durante el desarrollo, los osteoclastos erosionan el cartlago y se abren paso en el hueso La estructura del cuerpo est estabilizada mediante su armazn de tejido conjuntivo y mediante la cohesin selectiva de las clulas Resumen Apndice Catlogo de las clulas del cuerpo humano adulto Bibliografa 1247 1249 1250 1251 1252 1253 1255 1255 1256 1258 1258 1260

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El sistema inmunitario
Base celular de la inmunidad El sistema inmunitario humano est compuesto por billones de linfocitos Los linfocitos B producen las repuestas humorales con anticuerpos; los linfocitos T producen las respuesta mediadas por clulas Los linfocitos se desarrollan en los rganos linfoides primarios y reaccionan con los antgenos extraos en los rganos linfoides secundarios 1280 1280 Los marcadores de superficie celular permiten distinguir y separar las clulas T de las clulas B El sistema inmunitario acta mediante la seleccin clonal La mayora de antgenos estimulan muchos clones diferentes de linfocitos La mayora de los linfocitos recirculan continuamente La memoria inmunolgica se debe a la expansin clonal y a la maduracin de los linfocitos 1283 1284 1286 1286 1288

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La falta de respuesta ante los antgenos propios es debida a una tolerancia inmunolgica adquirida Resumen Propiedades funcionales de los anticuerpos Los receptores de las clulas B especficos para los antgenos son molculas de anticuerpo Las clulas B pueden ser estimuladas a segregar anticuerpos en una placa de cultivo Los anticuerpos tienen dos lugares idnticos de unin al antgeno Una molcula de anticuerpo est compuesta por dos cadenas ligeras idnticas y dos cadenas pesadas idnticas Existen cinco clases diferentes de cadenas pesadas, cada una de las cuales tiene propiedades biolgicas distintas Los anticuerpos pueden tener cadenas ligeras k o A ,, pero no de ambos tipos La intensidad de una interaccin antgeno-anticuerpo depende tanto del nmero de lugares de unin ocupados como de la afinidad de cada lugar de unin La utilizacin del complemento por los anticuerpos contribuye a la lucha contra las infecciones bacterianas Resumen La estructura fina de los anticuerpos Las cadenas ligeras y las cadenas pesadas presentan regiones constantes y regiones variables Las cadenas ligeras y las cadenas pesadas contienen tres regiones hipervariables cada una, que en conjunto forman el lugar de unin al antgeno Las cadenas ligeras y las cadenas pesadas estn plegadas en dominios repetitivos similares Estudios por difraccin de rayos X han revelado la estructura tridimensional de los dominios de las Ig y de sus lugares de unin al antgeno Resumen La generacin de la diversidad de los anticuerpos Durante el desarrollo de las clulas B, los genes de los anticuerpos se ensamblan a partir de segmentos gnicos aislados Cada regin V est codificada por ms de un segmento gnico La unin imprecisa de los segmentos gnicos aumenta la diversidad de las regiones V La hipermutacin somtica dirigida por el antgeno acaba de afinar las respuestas de anticuerpos La unin de los segmentos gnicos de los anticuerpos est regulada asegurando que las clulas B sean monoespecficas Cuando las clulas B son estimuladas por un antgeno, pasan de la produccin de anticuerpo ligado a la membrana a la produccin de la forma segregada del mismo anticuerpo Las clulas B pueden cambiar la clase de anticuerpo que producen Resumen Los receptores de las clulas T y sus subclases Los receptores de la clula T son heterodmeros similares a los anticuerpos Las diferentes respuestas de las clulas T estn mediadas por distintas clases de clulas T Resumen

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Las molculas MHC y la presentacin del antgeno a las clulas T Existen dos clases principales de molculas MHC Estudios por difraccin de rayos X revelan el lugar de unin al antgeno de las protenas MHC as como el pptido de unin Las molculas MHC de clase I y de clase II tienen funciones distintas Las protenas CD4 y CD8 actan como correceptores de unin a MHC en las clulas T colaboradoras y citotxicas, respectivamente Resumen Las clulas T citotxicas Las clulas T citotxicas reconocen fragmentos de protenas vricas en la superficie de clulas infectadas por virus Los transportadores ABC codificados por MHC transfieren fragmentos peptdicos desde el citosol hasta la luz del ER Las clulas T citotxicas inducen a las clulas diana infectadas a destruirse a s mismas Resumen Clulas T colaboradoras y activacin de las clulas T Las clulas T colaboradoras reconocen fragmentos de protenas antignicas endocitadas, asociadas con protenas MHC de clase II Las clulas T colaboradoras se activan por las clulas presentadoras de antgeno El receptor de una clula T forma parte de un gran complejo de sealizacin en la membrana plasmtica Para activar la clula T colaboradora se requieren dos seales simultneas Las clulas T colaboradoras, una vez activadas, se estimulan a s mismas y a otras clulas T para proliferar mediante la secrecin de interleuquina-2 Para responder ante un antgeno, la mayora de las clulas B necesitan la participacin de las clulas T colaboradoras La activacin de las clulas B por clulas T colaboradoras se produce tanto por seales unidas a la membrana como por seales segregadas Algunas clulas T colaboradoras activan las clulas T citotxicas y los macrfagos mediante la secrecin de interleuquinas Resumen Seleccin del repertorio de clulas T Las clulas T que reconocen pptidos asociados a las molculas MHC propias son seleccionadas positivamente durante su desarrollo en el timo Las clulas T en desarrollo que reaccionan fuertemente con los pptidos propios unidos a molculas MHC propias son eliminadas en el timo Algunas formas allicas de molculas MHC no son efectivas en la presentacin de antgenos especficos a las clulas T: genes de la respuesta inmunitaria {Ir) El papel de las protenas MHC en la presentacin del antgeno a las clulas T proporciona una explicacin de las reacciones de trasplante y del polimorfismo MHC Las molculas de reconocimiento inmunitario pertenecen a una antigua superfamilia Resumen Bibliografa

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Cncer
El cncer como un proceso de microevolucin Los cnceres difieren en funcin del tipo celular del que derivan La mayora de cnceres derivan de una sola clula anormal Probablemente la mayora de cnceres se inician por un cambio en la secuencia de DNA de una clula Una sola mutacin no es suficiente para causar cncer Los cnceres evolucionan mediante etapas lentas a partir de clulas alteradas benignas La progresin de los tumores implica rondas sucesivas de mutacin y seleccin natural El desarrollo de un cncer puede estar estimulado por factores que no alteran la secuencia de DNA de las clulas La mayora de cnceres se producen por combinaciones evitables de causas ambientales La bsqueda de curaciones para el cncer es dura pero no imposible El crecimiento canceroso depende a menudo de desrdenes de la diferenciacin celular Para formar metstasis, las clulas cancerosas han de ser capaces de cruzar la lmina basal Las mutaciones que aumentan la frecuencia de mutacin aceleran el desarrollo del cncer El incremento de la capacidad de mutar de las clulas cancerosas confiere a estas clulas una cierta capacidad de evadirse de la destruccin producida por drogas anticancerosas Resumen Gentica molecular del cncer Los retrovirus pueden actuar como vectores para los oncogenes que modifican el comportamiento celular Los retrovirus recogen oncogenes por accidente Un retrovirus puede transformar una clula husped insertando su DNA en un lugar prximo a un proto-oncogn del husped 1345 1346 1348 1349 1350 1352 1354

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Diferentes investigaciones sobre la base gentica del cncer convergen sobre disfunciones de un mismo pequeo grupo de proto-oncogenes Un proto-oncogn puede ser convertido en oncognico de muchas maneras Las acciones de los oncogenes puede ensayarse individualmente o combinadas entre s en ratones transgnicos La prdida de una copia de un gen supresor de tumores puede generar predisposicin hereditaria al cncer La prdida del gen supresor de tumores de retinoblastoma interviene en muchos cnceres distintos Los virus de DNA tumorales activan la maquinaria de replicacin del DNA de la clula como parte de su estrategia para sobrevivir Los virus de DNA tumorales activan la maquinaria de replicacin de la clula bloqueando la accin de los genes clave supresores de tumores Mutaciones en el gen p53 inhabilitan el freno de emergencia de la proliferacin celular y conducen a una inestabilidad gentica Los cnceres colon-rectales se desarrollan lentamente, a travs de una sucesin de cambios estructurales visibles Las mutaciones que conducen al cncer colon-rectal pueden ser identificadas examinando las clulas cancerosas y estudiando las familias propensas a desarrollar cncer Deleciones genticas en las clulas cancerosas colon-rectales revelan lugares de prdida de genes supresores de tumores Las etapas de la progresin tumoral puede correlacionarse con determinadas mutaciones Cada caso de cncer se caracteriza por su propia sucesin de lesiones genticas Resumen Bibliografa

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Agradecimientos
Al escribir este libro, nos hemos beneficiado enormemente de las opiniones de muchos bilogos y bioqumicos. Adems de los que nos han aconsejado por te lfono, queremos agradecer a las personas que se citan a continuacin sus con sejos por escrito, as como a todos los que nos ayudaron a preparar la primera y la segunda edicin. (Los que nos han ayudado en esta edicin aparecen primero y los que lo hicieron en las ediciones primera y segunda, despus.)
Captulo 1 Alan Grafen (University of Oxford), David Haig (Harvard University), Laurence Hurst (University of Cambridge), Jack Szostak (Massachusetts General Hospital, Boston). Captulo 2 Carl Branden (European Synchrotron Facility, Grenoble, France), Greg Petsko (Brandis University). Captulo 3 David Agard (University of California, San Francisco), Greg Petsko (Brandis University), Richard Wolfenden (University of North Carolina). Captulo 4 Tim Mitchison (University of California, San Francisco). Captulo 5 Henry Bourne (University of California, San Francisco), Steven Harrison (Harvard University), David Morgan (University of California, San Francisco), Greg Petsko (Brandis University), Martin Rechsteiner (University of Utah, Salt Lake City), Howard Schachman (University of California, Berkeley), Mathias Sprinzl (University of Bayreuth), Alex Varshavsky (California Institute of Technology, Pasadena). Captulo 6 Nancy Craig (Johns Hopkins University), Sandy Johnson (University of California, San Francisco), Kelly Komachi (University of California, San Francisco), Tomas Lindahl (IRCF Clare Hall Laboratories), Harry Noller (University of California, Santa Cruz), John Wilson (Baylor University), Rick Wood (ICRF Clare Hall Laboratories). Captulo 7 Martha Arnaud (University of California, San Francisco), Mario Capecchi (University of Utah), Walter Gehring (Biozentrum, University of Basel), Tim Hunt (ICRF Clare Hall Laboratories), Barbara Meyer (University of California, Berkeley), Richard Myers (Stanford University), John Wilson (Baylor University). Captulo 8 Sandy Johnson [colaboracin principal] (University of California, San Francisco), Larry Gerace (Scripps Clinic, La Jolla, CA), Christine Guthrie (University of California, San Francisco), Martha Stark (University of California, San Francisco), Peter Walter (University of California, San Francisco), Keith Yamamoto (University of California, San Francisco). Captulo 9 Sandy Johnson [colaboracin principal] (University of California, San Francisco), Tanya Awabdy (University of California, San Francisco), Steve Burley (The Rockefeller University), Beverly Emerson (The Salk Institute), Frank Grosveld (Erasmus Universiteit, Rotterdam), Alan Hinnebusch (National Institutes of Health, Bethesda), Nancy Hollingsworth (University of California, San Francisco), Mike Levine (University of California, San Diego), Richard Losick (Harvard University), Stuart Orkin (Childrens Hospital, Boston), Roy Parker (University of Arizona, Tucson), Alan Sachs (University of California, Berkeley), Madhu Wahi (University of California, San Francisco), Peter Walter (University of California, San Francisco), Harold Weintraub (Fred Hutchinson Cancer Research Center), Sandra Wolin (Yale University), Keith Yamamoto (University of California, San Francisco). Captulo 10 Mark Bretscher (MRC Labortory of Molecular Biology, Cambridge, UK), Richard Henderson (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK), Kai Simons (EMBL, Heidelberg, Germany), Tim Springer (Center for Blood Research, Boston). Captulo 11 Barbara Barres (Stanford University), Bertil Hille (University of Washington, Seattle), Ron Kaback (University of California, Los Angeles), Chuck Stevens (The Salk Institute, La Jolla, CA), Roger Thomas (University of Bristol, Bristol, UK). Captulo 12 Peter Walter [colaboracin principal] (University of California, San Francisco), Larry Gerace (Scripps Clinic, La Jolla, CA), Reid Gilmore (University of Massachusetts), Walter Neupert (University of Mnchen, Germany), George Palade (University of California, San Diego), Gottfried Schatz (Biozentrum, University of Basel). Captulo 13 Peter Walter [colaboracin principal] (University of California, San Francisco), Ari Helenius (Yale University), Ira Mellman (Yale University), Keith Mostov (University of California, San Francisco), Jim Rothman (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center), Randy Schekman (University of California, Berkeley). Captulo 14 Martin Brand (University of Cambridge), Richard Henderson (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK), William W. Parson (University of Washington, Seattle), Gottfried Schatz (University of Basel), Alison Smith (John Innes Institute, Norfolk, UK). Captulo 15 Michael J. Berridge (University of Cambridge), Henry Bourne (University of California, San Francisco), Ernst Hafen (Universitt Zurich), Robert J. Lefkowitz (Duke University, Durham, NC), Mark E. Nelson (University of Illinois, Urbana), Melvin I. Simon (California Institute of Technology, Pasadena), Lewis T. Williams (University of California, San Francisco). Captulo 16 Tim Mitchison [colaboracin principal] (University of California, San Francisco), Mike Klymkowsky [colaboracin importante] (University of Colorado, Boulder), Douglas Kellogg (University of California, San Francisco), Michelle Mortiz (University of California, San Francisco), Jordan Raff (University of California, San Francisco), Murray Stewart (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK).

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Captulo 17

AndrewM urray [colaboracin principal] (University

France), Paul Wassarman (Roche Institute o f Molecular Biology, Nutley, NJ), Keith Willison (Chester Beatty Laboratories, London). Capitulo 21 Michel Akam (University o f Cambridge), Enrico Coen

of California, San Francisco), Gerard Evan (Imperial Cncer Research Fund, London), Tim Hunt (Imperial Cncer Research Fund, Clare Hall Laboratories), Paul Nurse (Imperial Cncer Research Fund, London). Captulo 18 Tim M itchison [colaboracin principal] (University of

(John Innes Institute, Norwich, UK), David Ish-Horowicz (Imperial Cancer Research Fund, Oxford), Roger Keynes (University of Cambridge), Jonathan Slack (Imperial Cancer Research Fund, Oxford), Paul Sternberg (California Institute ofTechnology, Pasadena). Capitulo 22 Capitulo 23 John Harris (University o f Otago, New Zealand). N.A. Mitchison (Deutsches Rheuma-

California, San Francisco). Captulo 19 David Birk (UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical

School), Robert Cohn (University of California, San Francisco), Benny Geiger (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel), Dan Goodenough (Harvard University), Barry Gumbiner (Memorial Sloan-Kettering Cncer Center), Richard Hynes (Massachusetts Institute o f Technology), Louis Reichardt (University of California, San Francisco), Erkki Ruoslahti (La Jolla Cncer Research Foundation), Robert Trelstad (UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School), Frank Walsh (Guys Hospital, London), Peter Yurchenco (UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School). Captulo 20 Nancy Kleckner (Harvard University), Daniel Szollosi

Forschungszentrum Berlin), Klaus Rajewsky (Institut fr Genetik der Universitt, Cologne, Germany), Ronald Schwartz (National Institutes of Health, Bethesda), Alain Townsend (Institute of M olecular Medicine, John Radcliffe Hospital, Oxford, UK). Capitulo 24 M ichael Bishop (University of California, San

Francisco), Julian Downward (Imperial Cancer Research Fund, London), David Lane (University of Dundee), Andrew Murray (University of California, San Francisco), Bruce Ponder (University of Cambridge), Harold Varmus (National Institutes of Health).

(Institu National de la Recherche Agronomique, Jouy-en-Josas,

Prim era y segunda ediciones Fred Alt (Columbia University), Michael Ashburner (University of Cambridge), Jonathan Ashmore (University o f Sussex, UK), Peter Baker (Kings College London), M ichael Banda (University of California, San Francisco), Michael Bennett (Albert Einstein College o f Medicine), Darwin Berg (University of California, San Diego), Tim Bliss (National Institute for Medical Research, London), Hans Bode (University of California, Irvine), Piet Borst (Jan Swammerdam Institute, University of Amsterdam), Alan Boyde (University College London), Marianne Bronner-Fraser (University of California, Irvine), Robert Brooks (Kings College London), Barry Brown (Kings College London), Michael Brown (University of Oxford), Stephen Burden (Harvard Medical School), Steven Burden (Massachusetts Institute of Technology), Max Burger (University of Basel), John Cairns (Harvard School o f Public Health), Zacheus Cande (University of California, Berkeley), Lewis Cantley (Harvard University), Charles Cantor (Columbia University), Roderick Capaldi (University of Oregon), Adelaide Carpenter (University o f California, San Diego), Tom Cavalier-Smith (Kings College London), Pierre Chambon (University of Strasbourg), Philip Cohen (University of Dundee, Scotland), Roger Cooke (University o f California, San Francisco), Jam es Crow (University o f Wisconsin, Madison), Stuart Cull-Candy (University College London), M ichael Dexter (Paterson Institute for Cancer Reserch, M anchester, UK), Russell Doolittle (University of California, San Diego), Graham Dunn (MRC Cell Biophysics Unit, London), Jim Dunwell (John Innes Institute, Norwich, UK), Sarah Elgin (Washington University, St. Louis), Ruth Ellman (Institute of Cancer Research, Sutton, UK), Charles Emerson (University of Virginia), David Epel (Stanford University), Ray Evert (University of Wisconsin, Madison), Gary Felsenfeld (National Institutes of Health, Bethesda), Gary Firestone (University of California, Berkeley), Gerald Fischbach (Washington University, St. Louis), Robert Fletterick (University of California, San Francisco), Judah Folkman (Harvard Medical School), Larry Fowke (University of Saskatchewan, Saskatoon), Daniel Friend (University of California, San Francisco), Joseph Gall (Yale University), Anthony GardnerMedwin (University College London), Peter Garland (University of

Dundee, Scotland), John Gerhart (University o f California, Berkeley), Gunther Gerisch (Max Planck Institute for Biochemistry, Martinsried), Bernie Gilula (Baylor University), Charles Gilvarg (Princeton University), Bastien Gomperts (University College Hospital Medical School, London), Peter Gould (Middlesex Hospital Medical School, London), Walter Gratzer (Kings College London), Howard Green (Harvard University), Leslie Grivell (University of Amsterdam), Brian Gunning (Australian National University, Canberra), Jeffrey Hall (Brandeis University), John Hall (University of Southampton, UK), Zach Hall (University of California, San Francisco), David Hanke (University of Cambridge, UK), Graham Hardie (University o f Dundee, Scotland), Leland Hartwell (University of Washington, Seattle), John Heath (University of Oxford), Glenn Herrick (University of Utah), Ira Herskowitz (University of California, San Francisco), Leroy Hood (California Institute ofTechnology), Robert Horvitz (Massachusetts Institute of Technology), David Housman (Massachusetts Institute of Technology), James Hudspeth (University of California, San Francisco), Jeremy Hyams (University College London), Philip Ingham (Imperial Cancer Research Fund, Oxford), Norman Iscove (Ontario Cancer Institute, Toronto), Tom Jessell (Columbia University), Andy Johnston (John Innes Institute, Norwich, UK), E.G. Jordan (Queen Elizabeth College, London), Ray Keller (University of California, Berkeley), Regis Kelly (University of California, San Francisco), John Kendrick-Jones (MRC Laboratory of M olecular Biology, Cambridge, UK), Cynthia Kenyon (University of California, San Francisco), Judith Kimble (University of Wisconsin, Madison), Marc Kirschner (University of California, San Francisco), Juan Korenbrot (University of California, San Francisco), Tom Kornberg (University of California, San Francisco), Stuart Kornfeld (Washington University, St. Louis), Daniel Koshland (University of California, Berkeley), Marilyn Kozak (University of Pittsburgh), Mark Krasnow (Stanford University), Peter Lachmann (MRC Center; Cambridge, UK), Trevor Lamb (University of Cambridge), Hartmut Land (Imperial Cancer Research Fund, London), Jay Lash (University of Pennsylvania), Peter Lawrence (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK), Alex Levitzki (Hebrew

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Agradecimientos

University), Vishu Lingappa (University of California, San Francisco), Clive Lloyd (John Innes Institute, Norwich, UK), Brian McCarthy (University of California, Irvine), Richard McCarty (Cornell University), Anne McLaren (University College London), Jam es Mailer (University of Colorado Medical School), Colin Manoil (Harvard Medical School), Mark Marsh (Institute of Cancer Research, London), Gail Martin (University of California, San Francisco), Freiderick Meins (Freiderich Miescher Institut, Basel), Robert Mishell (University of Birmingham, UK), Avrion Mitchison (University College London), J. Murdoch Mitchison (University of Edinburgh), Mark Mooseker (Yale University), Montrose Moses (Duke University), Anne Mudge (University College London), Hans Miiller-Eberhard (Scripps Clinic and Research Institute), Alan Munro (University of Cambridge), David Nicholls (University of Dundee, Scotland), Duncan ODell (University College London), Patrick OFarrell (University of California, San Francisco), John Owen (University of Birmingham, UK), Dale Oxender (University of Michigan), Wiliam Paul (National Institutes of Health, Bethesda), Robert Perry (Institute of Cancer Research, Philadelphia), David Phillips (Rockefeller University), Jeremy Pickett-Heaps (University of Colorado), Tom Pollard (Johns Hopkins University), Darwin Prockop (Rutgers Medical School), Dale Purves (Washington University, St. Louis), Efraim Racker (Cornell University), George Ratcliffe (University of Oxford), David Rees (National Institute for Medical Research, Mill Hill, London), Fred Richards (Yale University), Phillips Robbins (Massachusetts Institute of Technology), Elaine Robson (University of Reading, UK), Robert Roeder (Rockefeller University), Joel Rosenbaum (Yale University), Jesse Roth (National Institutes of Health, Bethesda), David Sabatini (Rockefeller University), Michael Schramm (Hebrew University), Robert Schreiber (Scripps Clinic and Research Institute), James Schwartz (Columbia University), John Scott (University of

M anchester), John Sedat (University of California, San Francisco), Zvi Sellinger (Hebrew University), Philippe Sengel (University of Grenoble), Peter Shaw (John Innes Institute, Norwich, UK), Samuel Silverstein (Columbia University), John Maynard Smith (University of Sussex), Michael Solursh (University of Iowa), Scott Stachel (University of California, Berkeley), Andrew Staehelin (University of Colorado, Boulder), David Standring (University of California, San Francisco), Wilfred Stein (Hebrew University), Malcolm Steinberg (Princeton University), Monroe Strickberger (University o f Missouri, St. Louis), Michael Stryker (University o f California, San Francisco), Masatoshi Takeichi (Kyoto University), Vernon Thornton (Kings College London), Cheryll Tickle (Middlesex Hospital Medical School, London), Jim Till (Ontario Cancer Institute, Toronto), Lewis Tilney (University of Pennsylvania), Anthony Trewavas (Edinburgh University), Victor Vacquier (University of California, San Diego), Tom Vanaman (University o f Kentucky), Harry van der Westen (Wageningen, The Netherlands), Virginia Walbot (Stanford University), Trevor Wang (John Innes Institute, Norwich, UK), Anne Warner (University College London), Fiona Watt (Imperial Cancer Research Fund, London), John Watts (John Innes Institute, Norwich, UK), Klaus Weber (Max Planck Institute of Biophysical hemistry, Gottingen), Martin Weigert (Institute o f Cancer Research, Philadelphia), Norman Wessells (Stanford University), Judy White (University of California, San Francisco), William Wickner (University of California, Los ngeles), Michael Wilcox (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK), Richard Wolfenden (University of North Carolina), Lewis Wolpert (Middlesex Hospital Medical School, London), Abraham Worcel (University o f Rochester), John Wyke (Imperial Cancer Research Fund, London), Charles Yocum (University of Michigan), Rosalind Zalin (University College London), Patricia Zambryski (University of California, Berkeley).

Agradecimientos

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Nota al lector
A pesar de que los captulos de este libro pueden leerse de forma independiente uno de otro, estn ordenados siguiendo una secuencia lgica en cuatro partes. Los tres primeros captulos de la Parte I tratan de principios elementales y bsi cos de bioqumica. Pueden ser tiles a modo de introduccin para aquellos que no han estudiado bioqumica y tambin como un sistema para refrescar la m e moria para los que ya estudiaron estas materias. El Captulo 4, que concluye la Parte I, trata de las bases de los principales mtodos experimentales de que dis ponemos para estudiar las clulas. No es necesario leer este captulo para poder entender los captulos siguientes, sino que puede ser til como referencia. Las Partes II y III representan el ncleo central de la biologa celular y prin cipalmente tratan de los procesos que son comunes a la mayora de las clulas eucariotas. La Parte II estudia la expresin y la transmisin de la informacin ge ntica mientras que la Parte III discute la organizacin interna de la clula. La Parte IV sigue el comportamiento de las clulas en los organismos pluri celulares, empezando con las uniones clula-clula y con la matriz extracelular y acabando con la alteracin de la organizacin pluricelular que se presenta en el cncer. El Captulo 4 incluye varias tablas que contienen datos sobre el desarrollo de hechos cruciales con los nombres de los cientficos que participaron en ellos. A lo largo de todo el libro hemos seguido el criterio de omitir el nombre de los cientficos. Sin embargo, los autores de los principales descubrimientos pueden identificarse consultando la bibliografa al final de cada captulo. Frecuente mente esta bibliografa incluye los trabajos originales en los que estos descubri mientos importantes se describieron por primera vez. Los superndices que acompaan a los ttulos de los prrafos corresponden a las citas de la bibliogra fa que contienen informacin adecuada para seguir el prrafo en cuestin. A lo largo de todo el texto se ha utilizado la negrita para destacar los trmi nos clave en los lugares del captulo en que se discuten con mayor profundidad, pudiendo coincidir o no con el lugar en que el trmino aparece por primera vez. Las cursivas se utilizan para resaltar trminos importantes pero con un nfasis menor. Tambin hemos adoptado el convenio de que los nombres de los genes se indican en cursiva (por ejemplo ras, Notch) mientras que los nombres de las protenas correspondientes se indican en tipo normal con la primera letra en mayscula (por ejemplo Ras, Notch). Al final del libro hemos aadido un glosario que recoge los trminos tcni cos de uso comn en la biologa celular actual; puede utilizarse como primera solucin para el lector que encuentre un trmino que no le es familiar utilizado sin ninguna explicacin correspondiente. El Libro de problem as (The Problems Book) est diseado como un volu men acom paante que puede ayudar al lector a apreciar la elegancia, el ingenio y las sorpresas de la investigacin. Proporciona problemas que acompaan la porcin central de este libro (Captulos 5-19). Cada captulo de problemas est dividido en secciones que se corresponden con las secciones de libro de texto, y el principal enfoque de cada seccin consiste en una coleccin de problemas orientados a la investigacin derivados de la literatura cientfica. La mayora de los problemas de investigacin ilustran puntos del texto principal. Adems, cada seccin empieza con un conjunto de preguntas de verdadero-falso y de llenarel-hueco que intentan ayudar al lector a revisar el vocabulario y los conceptos principales del tema de que se trate. El libro est publicado en ingls y puede so licitarse a Garland Publishing, Inc. 717 Fifth Avenue, New York, NY 10022. Esta dos Unidos.

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Nota de los traductores

La traduccin de cualquier texto es una obra compleja. La de un texto cientfico no debe entraar en principio la misma dificultad que la traduccin de una obra literaria respecto a la falta de correspondiente entre las expresiones y matices propios de cada idioma. Sin embargo, tambin tiene sus escollos. En primer lugar, la inexistencia de numerosos trminos cientficos hace que la presencia de anglicismos sea la nota predominante en la mayora de traduc ciones, no slo al castellano sino tambin al francs y a otras lenguas. Por otra parte, la falta de uniformidad terminolgica que existe en muchos campos de la ciencia, a pesar de repetidos esfuerzos por parte de muchos autores y divulgado res de la ciencia, es otro agravante aadido. A estos problemas terminolgicos hay que aadir el de la velocidad de enve jecim iento de los conceptos que se recogen en el texto que se traduce: resulta impensable dedicar dos o tres aos a la traduccin de una obra como Biologa Molecular de la Clula ya que continuam ente se producen nuevos hallazgos y cada tres o cuatro aparece una nueva edicin ampliada y modificada. Por ello, hay que recurrir a la colaboracin de diferentes especialistas que traduzcan los captulos de su competencia. El inevitable cambio de estilo se puede minimizar mediante un corrector nico que realice una revisin general de todo el texto. A todo ello hay que aadir la enorme responsabilidad que supone el tradu cir, ya que uno se hace el vehculo de las ideas del autor. En algunas ocasiones puede ocurrir que exista una cierta disconformidad entre lo expuesto por los au tores de la obra y las ideas de los traductores. En estos casos hay que hacer un esfuerzo considerable para no introducir modificaciones en el texto original. Por otro lado, la fidelidad al texto original tiene que ir acompaada de la adecuacin a las estructuras gramaticales de la lengua a la que se traduce. No es nada senci llo. Sin duda, lo ideal es que cada uno pueda entender el texto original. An ms, si nos referimos a un texto cientfico escrito en ingls y a alumnos de carreras universitarias, parece casi obligado y debera favorecerse. A pesar de ello, no resistimos la tentacin de aceptar la traduccin de Mole cular Biology o f the Cell porque consideramos que se trata de una obra magnfi ca, actualizada, de gran rigor cientfico y a la vez muy didctica y con un enfoque integrado y moderno de la biologa celular y molecular. Esta tercera edicin est sensiblemente ampliada respecto a la segunda, in corporando muchos conceptos y una reestructuracin de algunos temas, as como la edicin de nuevos captulos. Al igual que en la revisin que realizamos de la primera edicin, en la traduccin de las posteriores nos encontramos nue vamente con graves dificultades terminolgicas del castellano, tanto por el hecho de que todava no se ha aceptado la denominacin de una serie de nue vos conceptos (capping, splicing, enhancer, etc.), como porque tradicional mente se han utilizado com o castellanas las palabras inglesas originales (blott, cluster, symport, etc.). Cuando ha sido posible, hemos mantenido las recom en daciones de la Real Academia de la Lengua y de la Real Academia de las Ciencias Exactas, Fsicas y Naturales, aunque ello supusiera en ocasiones ir en contra de trminos utilizados muy frecuentemente (las enzimas y no los enzimas, DNA y no ADN, cAMP y no AMPc, acervo y no pool, etc.). Con todo, despus de consul tar a especialistas sobre cada uno de los temas, hemos tenido que adaptar al gunos trminos, los ms importantes de los cuales se citan a continuacin en un intento de uniformizar nuestro lxico en el campo de la biologa y molecular. Esperamos que este esfuerzo sea til en alguna medida. Cualquier crtica o consejo ser bien acogido para posteriores revisiones. Los traductores

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Lxico de trminos utilizados en esta edicin

allolactose = alolactosa annealing = unin, enlace antiport = transporte de intercambio antisense = antisentido, sin sentido backstitching = punto hacia atrs beads on a string = cuentas ensartadas blott = transferencia branch migration = migracin de la cadena boundary = lmite budding yeast = levadura de gemacin bulk lesion = gran lesin cap = capucha, caperuza capping = formacin de la capucha o caperuza catabolite activator protein = protena activadora de los catabolitos chromosome walking = caminar por el cromosoma cleavage = fragmentacin cloth of tissue fluid = cogulo de plasma cloverleaf = estructura en hoja de trbol cluster = grupo, agregacin coated pits = depresiones revestidas (o recubiertas) coated vesicles = vesculas revestidas (o recubiertas) cohesive ends = extremos cohesivos coiled coil = hlice sobreenrollada combinatorial gene regulation = regulacin gnica por combinacin core = ncleo, zona central cosmids = csmidos (clones de C. elegans en vectores del fago lambda) counterpart = complementario crossing-over = entrecruzamiento cross-strand exchange = intercambio cruzado de cadenas; entrecruzamiento decondensation = desespiralizacin deep-etch = sublimacin depurination = despurinacin derepressed = desreprimido (opern inducible) directs = gua DNA-looping model for enhancer action = modelo de accin de los activadores mediante de DNA domain shuffling = barajado de los dominios donor junction acceptor = enlace entre la regin dadora y la aceptora donor splice junction = regin dadora en la maduracin double minute chromosomes = pares de cromosomas diminutos down-stream = en direcci 3 down regulation = regulacin por disminucin ear vesicle = vescula auditiva engineered = construido in vitro enhancer element = elemento activador (enhancer, aumentador, activador) expression vectors = vectores de expresin feedback = retroalimentacin fingerprint = anlisis de huellas dactilares fisin yeast = levadura de fisin footprinting = anlisis de huellas frameshifting = modificacin de la pauta de lectura freeze-drying = liofilizacin freeze-etch = grabado por congelacin fruit fly = mosca del vinagre gap junctions = uniones comunicantes, uniones de tipo gap gel-mobility shift studies = experimentos de retencin en geles gene cassettes = casettes gnicas gene regulatory protein = protena reguladora de genes, protena reguladora general transcription machinery = maquinaria general para la transcripcin genetic linkage = ligamiento gentico hairpin = horquilla helix-turn-helix = hlice-vuelta-hlice helper virus = virus auxiliar heteroduplex joint = unin heterodplex Holliday junction = intermedio de Holliday housekeeping = constitutivo

xlvi

Nota de los traductores

hybride selection = seleccin de hbridos hybride ion = ion hidruro (H) input = aporte insertional m utagenesis = mutagnesis por insercin interspersed repeated DNAs = secuencias repetidas intercaladas de DNA lactose repressor protein = proteina represora de la lactosa lagging strand = hebra retardada, hebra retrasada lampbrush = plumulados (cromosomas) large T-antigen = antgeno T grande leader = gua leading strand = hebra conductora leak = fuga (del K+ ) left-handed = levgira ligand = ligando mapp (to) = hacer un mapa master gene = gen patrn mating-type = tipo de apareamiento m em brane zippering m echanism = cierre de la mem brana por cremallera midbrain = mesencfalo mismatch = error de apareamiento natural killer = clulas agresoras naturales nick = muesca NMR = resonancia magntica nuclear notochord = notocorda nuclear run on = run on nuclear nuclease-hipersensitive site = zona hipersensible a las nucleasas nucleosom e phasing = distribucin de los nucleosomas en fase off = inactivado on = activado output = salida patch = mancha, porcin, zona patch clamp recording = registro de zona patching = parcheam iento pattern = patron pellet = precipitado phase variation = cam bio de fase photobleaching = fotoblanqueamiento playing head = aparato reproductor polimerase chain reaction = reaccin en cadena de la polimerasa pool = acervo primase = primasa primer = cebador primosome = primosoma probe = sonda probe (to) = sondar processing = maduracin proofreading m echanism = verificacin de lectura puff = asa, protuberancia, lazo pulse-field gel electrophoresis = electroforesis en gel de campo pulsante rate = proporcin, relacin reading frame = pauta de lectura recording patch = registro de zona replication bubble = burbuja de replicacin replication fore = horquilla de replicacin reporter gene = gen informativo restrictrion fragment length polymorphism = polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccin reverse genetics = gentica reversa, gentica inversa right-handed = dextrgira scanning = barrido sea squirt = ascidia self assembly = autoensamblado self splicing = automaduracin selfish = egosta, interesado SEM = microscopia electrnica de barrido Semliki forest virus = virus Semliki forest sequence-specific DNA-binding protein = proteina que se une a secuencias especficas del DNA shadowing = sombreado shotgun = perdigonada shuffling = mezclado, barajado

Nota de los traductores

xlvii

sinaptonemal = sinaptonm ico single-strand DNA-binding protein = protena de unin al DNA de una sola hebra site specific recom bination = recom binacin de sitio especfico size = centro, lugar slot = muesca snRNP = RPNsn solid bead = superficie de cuentas space-filling model = modelo tridimensional spliceosom e = espliceosoma splicing = maduracin por corte y empalm e stable transcription com plex = com pleto transcripcional estable staggered = escalonados, protuberantes staggered joint = unin solapada, enlace o unin de extremos protuberantes start site = lugar de iniciacin start site for RNA synthesis = punto de inicio de la sntesis de RNA step = etapa stepwise = gradualmente stop codons = codones de terminacin strand = hebra, cadena stringency = rigor, grado, exigencia substractive hybridization = hibridacin substractiva subvert = destruir, trastornar supercoil = sobreenrollado swivel = desenrollamiento alrededor de la cadena intacta symport = cotransporte unidireccional target = diana TATA box = caja TATA template = patrn, molde tight junction = unin herm tica, unin fuerte, unin estable time-lapse m icrocinem a = microcinematografa a intervalos tomato bushy stunt virus = virus achaparrado peludo del tomate transcripts = transcritos transposable = transponible transposases = transposasas trigger = poner en marcha, disparar trimming = ajuste turn off a gene = desactivar un gen turn on a gene = activar un gen two-dimensional polyacrylamide-gel electrophoresis = electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida underfocus = desenfocado uniport = transporte sencillo unwing = desenrollar upstream = en direccin 5 upstream prom otor elem ent = elem ento prom otor en direccin 5 , elem ento promotor video-enhanced contrast light microscopy = microscopa de contraste vdeo-amplificada western blotting = transferencia de protenas desde un gel de poliacrilamida a un filtro de nailon o nitrocelulosa, transferencia de tipo western whisker = pelo, fleco wind = enrollar, empaquetar wing bud = yema de ala wobble (tercera base) = balanceo zinc finger = dedos de cinc

xlviii

Nota de los traductores

Introduccin a la clula

m m m
i La evolucin de la clula Z Pequeas molculas, energa y biosntesis 3 Macromolculas: estructura, forma e informacin 4 Cmo se estudian las clulas

El sentido de la escala: estas electronm icrografas tom ad as a am p liaciones cad a vez m ayores m uestran clu las b acterian as sobre la punta de un alfiler d om stico. (Por cortesa de T ony Brain y de Scien ce Photo Library.)

E lectronm icrografa de barrid o de clu las de levadura en desarrollo. Estos eucariotas unicelulares generan por gem acin p equ e as clu las hijas cu and o se m u ltiplican. (Por cortesa de Iva Herskowitz y Eric Sch abatach.)

La evolucin de la clula
Desde las molculas hasta la primera clula De los procariotas a los eucariotas De las clulas simples a los organismos pluricelulares

Todas las criaturas vivas estn formadas por clulas -pequeos compartim ien tos rodeados de membrana y llenos de una solucin acuosa concentrada de compuestos qumicos. Las formas ms simples de vida son clulas solitarias que se propagan dividindose en dos. Los organismos superiores, como nosotros mismos, son como ciudades celulares en las que grupos de clulas realizan fun ciones especializadas y estn unidos por intrincados sistemas de comunicacin. Las clulas ocupan un punto intermedio en la escala de la complejidad biolgi ca. Las estudiamos para aprender, por un lado, cmo estn formadas a partir de las molculas y, por otro, cmo cooperan para constituir un organismo tan com plejo como un ser humano. Se cree que todos los organismos, y todas las clulas que los constituyen, descienden por evolucin mediante seleccin natural de una clula ancestral co mn. La evolucin im plica dos procesos esenciales: (1) la aparicin de una variacin al azar en la informacin gentica transmitida de un individuo a sus descendientes, y (2) la seleccin de la informacin gentica que ayuda a su porta dor a sobrevivir y multiplicarse. La evolucin es el principio central de la biolo ga, ya que nos ayuda a comprender la asombrosa diversidad del mundo vivo. Este captulo, al igual que todo el libro, se ocupa de la progresin desde las molculas hasta los organismos pluricelulares. Estudia la evolucin de la clula, primero como unidad viva constituida por partes menores, y luego como bloque constitutivo de estructuras mayores. A travs de la evolucin presentamos los componentes y actividades celulares que se tratarn con mayor detalle en los cap tulos siguientes, y en una secuencia ms o menos igual. Empezando con los orge nes de la primera clula en la Tierra, estudiamos cmo las propiedades de ciertos tipos de grandes molculas permiten que se transmita y exprese la informacin he reditaria y permiten que se produzca la evolucin. Rodeadas por una membrana, estas molculas constituyen la parte esencial de una clula que se replica a s mis ma. Luego describimos la transmisin principal que se produjo en el transcurso de la evolucin, desde unas pequeas clulas parecidas a bacterias hasta unas clulas mucho mayores y complejas, tales como las que se encuentran en los animales y plantas actuales. Finalmente, sugerimos la manera en que las clulas aisladas, de vida libre, dieron lugar quizs a los grandes organismos pluricelulares, especiali zndose y cooperando en la formacin de rganos tan complejos como el cerebro. Es evidente que presentar la clula a travs de su evolucin tiene sus riesgos: las grandes lagunas de nuestro conocim iento slo pueden superarse por medio de especulaciones quizs errneas en muchos detalles. No podemos retroceder en el tiempo para conocer los fenmenos moleculares que tuvieron lugar hace

miles de millones de aos. Pero algunos sucesos antiguos han dejado muchas huellas para nuestro anlisis. Plantas ancestrales, animales y tambin bacterias estn preservadas como fsiles. An ms importante, todos los organismos ac tuales proporcionan evidencias de las caractersticas de los seres vivos del pasa do. Concretamente, las molculas biolgicas actuales son una fuente rica de in formacin sobre el curso de la evolucin, ya que ponen en evidencia semejanzas fundamentales entre los ms dispares organismos vivos y nos permiten organi zar las diferencias que existen entre ellos construyendo una escala objetiva uni versal. Estas diferencias y similitudes moleculares representan para nosotros un problema sem ejante al que se enfrenta un literato que intenta establecer cul es el texto original de un autor antiguo, comparando varios manuscritos diferentes que han sido variados por repetidas copias y ediciones. La tarea es dura y la evi dencia es incompleta, pero al menos es posible proponer conjeturas inteligentes acerca de las principales fases de la evolucin de las clulas vivas.

descarga elctrica
O

Desde las molculas hasta la primera clula1

En condiciones prebiticas se pueden formar molculas biolgicas12
Las condiciones que reinaban en la Tierra durante los primeros mil millones de aos son an tem a de discusin. Estaba inicialm ente fundida la superficie terrestre? Contena la atmsfera amonaco, o metano? Sin embargo, todo el mundo parece estar de acuerdo en que la Tierra era un lugar violento, con erup ciones volcnicas, relmpagos y lluvias torrenciales. Exista muy poca, o ningu na, cantidad de oxgeno libre, y no exista una capa de ozono que absorbiera la radiacin ultravioleta del sol. La radiacin, mediante su accin fotoqumica, pudo haber contribuido a que la atmsfera fuese rica en molculas reactivas y alejadas de su equilibrio qumico. Es probable que bajo estas condiciones se produjeran molculas orgnicas (es decir, molculas que contienen carbono) simples. La prueba ms clara de ello procede de experimentos de laboratorio. Si se toman mezclas de gases como C 0 2, CH4, NHt y H2, se calientan con agua y se activan mediante descargas elc tricas o radiacin ultravioleta, se observa cmo los gases reaccionan formando pequeas molculas orgnicas -p or lo general, un pequeo nmero de molcu las diferentes, cada una de ellas producida en grandes cantidades (Figura 1-1). Entre estos productos se cuentan diversos compuestos, tales como el cianuro de hidrgeno (HCN) y el formaldehdo (HCHO), que en solucin acuosa sufren r pidamente reacciones posteriores (Figura 1-2). Y lo que es ms importante, se generan molculas representativas de la mayora de las principales clases de molculas orgnicas encontradas en las clulas como aminocidos, azcares y las purinas y pirimidinas necesarias para sintetizar nucletidos. Aunque estos experimentos no pueden reproducir con toda exactitud las condiciones primitivas de la Tierra, ponen de manifiesto el hecho de que la for macin de molculas orgnicas es sorprendentemente fcil. Y la Tierra en for macin tena inmensas ventajas sobre cualquier experimentador humano; era muy grande y poda producir una amplia gama de condiciones. Pero, sobre todo, dispona de mucho ms tiempo -cientos de millones de aos. En tales cir cunstancias, parece muy posible que, en algn lugar y en algn momento deter minados, muchas de las molculas orgnicas simples que se encuentran en las clulas actuales se acumularan en concentraciones elevadas.

calor
Figura 1-1 Tpico experimento que simula las condiciones en la Tierra primitiva. Se calienta agua en un
aparato cerrado que contiene CH4, NHy I\ 2, y se hace pasar una descarga elctrica a travs de la mezcla gaseosa. En el tubo en IJ se acumulan compuestos orgnicos.

HCHO HCOOH HCN CH:iCOOH NH2CH2COOH CH-jCHCOOH OH NH2CHCOOH I CH:, NH CHzCOOH CH3
nh2 C

form aldehdo cido frm ico cianuro de hidrgeno cido actico glicina cido lctico alanina

I I O

NH2 cido asprtico

n h 2c h c o o h I ch2 cooh

Pueden desarrollarse sistemas qumicos complejos en un entorno alejado de su equilibrio qumico

Las molculas orgnicas simples como los aminocidos y los nucletidos se pueden asociar formando grandes polmeros. Un aminocido puede unirse a

Figura 1-2 Algunos de los compuestos que se pueden formar en el experimento descrito en la Figura 1-1.
Los compuestos indicados en color son componentes importantes de las clulas vivas actuales.

Captulo 1 : La evolucin de la clula

otro formando un enlace peptdico, mientras que dos nucletidos se pueden unir entre ellos mediante un enlace fosfodister. La repeticin de estas reaccio nes da lugar a polmeros lineales conocidos como polipptidos y polinucletidos, respectivamente. En los organismos vivos actuales, los polipptidos -c o n o cidos como protenas- y los polinucletidos -e n forma de cidos ribonucleicos (RNA) y cidos desoxirribonucleicos (DNA)- son considerados habitualmente los constituyentes ms importantes. Un restringido conjunto de 20 aminocidos forman los bloques constitutivos universales de las protenas, mientras que las molculas de RNA y DNA estn construidas a partir de cuatro tipos de nucleti dos cada una. Aunque no sabemos por qu se seleccionaron estos conjuntos de monmeros en particular para biosntesis en lugar de otros qumicamente simi lares, veremos que las propiedades qumicas de los polmeros correspondientes los hacen especialmente adecuados para desempear sus funciones especficas en la clula. Los primeros polmeros pudieron formarse de varias maneras -p or ejemplo, mediante el calentamiento de compuestos orgnicos secos o gracias a la activi dad cataltica de las elevadas concentraciones de polifosfatos inorgnicos u otros catalizadores inorgnicos crudos. Los productos obtenidos de reacciones similares en el laboratorio son polmeros de longitud variable y de secuencia aleatoria, en los que la adicin de un aminocido o de un nucletido en un m o mento dado depende principalmente del azar (Figura 1-3). Sin embargo, una vez formado, un polmero puede influir sobre reacciones qumicas posteriores ac tuando como un catalizador. El origen de la vida requiri que en un conjunto de molculas de este tipo hubiera algunas que tuvieran, al menos en parte, una propiedad crucial: la capa cidad de catalizar reacciones que generaran, directa o indirectamente, la pro duccin de ms molculas del propio catalizador. La produccin de catalizado res con esta propiedad autogenerativa especial estuvo favorecida y las molculas ms eficientes en generar su propia produccin captaron los materiales crudos eliminndolos de los procesos de produccin de otras substancias. De esta ma nera puede concebirse el desarrollo gradual de un sistema qumico complejo de monmeros orgnicos y de polmeros que actuaban juntos generando ms m o lculas de los mismos tipos, alimentadas por materiales crudos simples del en torno. Un sistema autocataltico como ste tendra las mismas propiedades que creemos que son las caractersticas de la materia viva: estara formado por una gran cantidad de molculas interactivas seleccionadas al azar; tendera a autorreproducirse; competira con otros sistemas dependientes de la misma materia prima; y si se eliminara esta materia prima o si se mantuviera a temperaturas errneas que alteraran el balance de las velocidades de reaccin progresara ha cia el equilibrio qumico y morira. Pero, qu tipo de molculas pudo haber tenido propiedades autocatalticas como stas? En las clulas actuales los catalizadores mas verstiles son dos poli pptidos, compuestos de muchos aminocidos diferentes con cadenas laterales qumicamente diversas y por tanto capaces de adoptar diferentes formas tridi-

I imilla i i Form acin de polinucletidos y de polipptidos. Cuatro tipos de nucletidos (aqu representados con las letras A, U, G y C) pueden sufrir una polimerizacin espontnea con prdida de agua. El producto es una mezcla de polinucletidos de longitud y secuencia aleatorias. De forma similar, aminocidos de diferentes tipos, simbolizados aqu mediante nombres abreviados de tres letras, pueden polimerizar entre ellos formando polipptidos. Las protenas actuales estn formadas a partir de un conjunto estndar de 20 tipos de aminocidos.

Desde las molculas hasta la primera clula

------- B B i l B M

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T0 iSafi r^ f\
'''

mensionales erizadas de lugares reactivos. Sin embargo aunque los polipptidos son verstiles com o catalizadores no conocem os sistemas por los que una de es tas molculas pueda autorreproducirse especificando directamente la formacin de otra de la m isma secuencia.

Figura 1-4 Polinucletidos como patrn. Se produce el enlace preferencial entre pares de nucletidos (C con G y A con U) mediante enlaces qumicos relativamente dbiles {arriba). Este apareamiento permite que un polinucletido acte como patrn para la sntesis de otro polinucletido ( izq u ierd a ).

Los polinucletidos son capaces de dirigir su propia sntesis3

Los polinucletidos tienen propiedades que contrastan con las de los polippti dos. Su capacidad como catalizadores es ms limitada pero pueden dirigir direc tamente la formacin de copias exactas de su propia secuencia. Esta capacidad depende del apaream iento com plem entario de subunidades de nucletidos, el cual permite a un polinucletido actuar como patrn en la formacin de otro. En el caso ms simple un polmero compuesto por un nucletido (por ejemplo, cido policitidlico o poli C) puede alinear en su superficie las subunidades n e cesarias para generar otro polinucletido, (en este ejemplo el cido poliguanlico o poli G) favoreciendo as su polimerizacin formando poli G (Figura 1-4). Debi do a que las subunidades C se unen preferentemente a las subunidades G, y vi ceversa, a su vez la m olcula de poli G favorecer la sntesis de ms poli C. Consideremos ahora un polinucletido con una secuencia de subunidades ms compleja, concretam ente una molcula de RNA formada por cuatro tipos de nucletidos con las bases uracilo (U), adenina (A), citosina (C) y guanina (G) dispuestas siguiendo una secuencia particular. Debido al apareamiento com ple mentario entre las bases A y U, y entre las bases G y C, cuando esta molcula se aade a una mezcla de nucletidos activados y bajo condiciones adecuadas, di rigir la polimerizacin de una secuencia complementaria a la suya. La nueva molcula de RNA resultante ser una especie de molde del original, de manera que cada A del original corresponder con una U en la copia, y as sucesivamen te. La secuencia de nucletidos de la cadena original de RNA contiene una infor m acin que esencialm ente se conserva en las cadenas complementarias recin formadas: una segunda operacin de copia, tomando la cadena complementaria como patrn, da lugar a la secuencia original (Figura 1-5). Estos mecanism os de molde o patrn complementario son elegantemente sencillos y se hallan en la base de los procesos de transferencia de informacin de los sistemas biolgicos. La informacin gentica contenida en cada clula

paso 1 LA SECUENCIA ORIGINAL FORMA LA SECUENCIA COMPLEMENTARIA

paso 2 LA SECUENCIA COMPLEMENTARIA FORMA LA SECUENCIA ORIGINAL

[|H ppgHgH|KJ
6 Captulo 1 : La evolucin de la clula

Figura 1-5 Replicacin de una secuencia de polinucletido (en este caso una molcula de RNA). En el paso 1, la molcula original de RNA acta como patrn en la formacin de una molcula de RNA de secuencia complementaria. En el paso 2, esta molcula com plementaria de RNA acta a su vez como patrn, formando molculas de RNA de secuencia igual a la original. Puesto que cada molcula patrn puede producir numerosas copias de la hebra complementaria, estas reacciones pueden dar lugar a la multiplicacin de la secuencia original.

est codificada en las secuencias de nucletidos de sus molculas de polinucletidos, y esta informacin se transmite (hereda) de generacin en generacin m e diante las interacciones entre los pares de bases complementarios. Sin embargo, para que se produzcan estos mecanismos de molde se necesi ta la participacin de catalizadores: sin una catlisis especfica, la polimeriza cin sobre un patrn es lenta e ineficaz y adems la formacin de rplicas co rrectas est claramente dificultada por la existencia de reacciones competitivas. En la actualidad las funciones catalticas que replican polinucletidos estn pro porcionadas por protenas altamente especializadas, llamadas enzimas. En el caldo prebitico quiz hubiera polipptidos primitivos que colaboraron en al guna tarea cataltica. Sin embargo la existencia de molculas con especificidad cataltica adecuada debi ser escasa a no ser que el propio RNA fuese capaz, de alguna manera, de favorecer su propia produccin. Volveremos a estudiar las re laciones recprocas entre las sntesis de RNA y las sntesis de protenas, de cru cial importancia en todas las clulas vivas. Pero primero consideraremos qu puede ocurrir con el RNA, ya que las molculas de RNA pueden presentar varias propiedades catalticas adems de actuar como patrones de su propia replicacin. Concretamente, una molcula de RNA con una secuencia de nucletidos adecuada puede actuar como catalizador en la replicacin apropiada de otra molcula de RNA -e l patrn- cuya secuencia puede ser arbitraria. Se cree que la especial versatilidad de las molculas de RNA ha jugado un papel central en los procesos del origen de la vida.

Las molculas autorreplicantes estn sometidas a la seleccin natural3,4

Las molculas de RNA no son nicamente cadenas de smbolos que contienen in formacin de una manera abstracta. Tambin tienen personalidades qumicas concretas que afectan a su comportamiento. Concretamente, la secuencia de nu cletidos determina el modo en que la cadena se pliega en solucin. Del mismo modo que los nucletidos de un polinucletido se pueden aparear con nucletidos complementarios libres de su entorno formando un nuevo polmero, tambin se pueden aparear con residuos complementarios de nucletidos del propio polme ro. Una secuencia GGGG de una regin de una cadena polinucleotdica puede for mar una asociacin relativamente fuerte con una secuencia CCCC de otra regin de la misma molcula. Dichas asociaciones producen diversos pliegues tridimen sionales, y el conjunto de la molcula adopta una forma tpica que depende com pletamente de la secuencia de sus nucletidos (Figura 1-6). La estructura plegada tridimensional de un polinucletido afecta a su esta bilidad, a su accin sobre otras molculas y a su capacidad de replicacin, de modo que no todas las formas de polinucletidos tendrn igual xito en una mezcla de replicacin. Adems resulta inevitable que en cualquier proceso de copia se produzcan errores y las copias imperfectas del original se irn propa gando. Por lo tanto tras repetidas replicaciones se generarn continuamente nuevas secuencias variantes de nucletidos. En estudios de laboratorio se ha de mostrado que los sistemas replicantes de molculas de RNA sufren una especie de seleccin natural a travs de la cual predominan diferentes secuencias favo rables, segn cules sean las condiciones experimentales utilizadas. Lo que es ms importante, las molculas de RNA pueden ser seleccionadas por su capaci dad de unir especficamente casi cualquier otro tipo de molculas. Esto tambin se ha demostrado en experimentos in vitro que se inician con una preparacin de cortas molculas de RNA de secuencias de nucletidos al azar sintetizadas ar tificialmente. Esta mezcla se hace pasar a travs de una columna llena de una re sina a la que se ha unido alguna substancia determinada. Las molculas de RNA que no se unen a esta substancia pasan a travs de la columna y son eliminadas; el pequeo nmero de molculas que se unen a ella es retenido y utilizado como patrn para dirigir la produccin de mltiples copias de su propia secuencia. Esta nueva preparacin de RNA, enriquecida en secuencias que se unen a la

Figura 1 -6 Conformacin de una molcula de RNA. El apareamiento de nucletidos entre diferentes regiones de la propia cadena de polinucletido (RNA) hace que la molcula adopte una forma particular.

Desde las molculas hasta la primera clula

substancia escogida, se utiliza entonces como material de partida para repetir de nuevo el proceso. Tras varios de estos ciclos de seleccin y reproduccin la mez cla de RNA consiste en mltiples copias de un relativamente pequeo nmero de secuencias, cada una de las cuales se une a la substancia de ensayo casi espe cficamente. Por consiguiente, una molcula de RNA tiene dos caractersticas especiales: transporta informacin codificada en su secuencia de nucletidos que puede transmitir mediante el proceso de replicacin, y tiene una estructura plegada nica que determina la manera en que interactuar con otras molculas y res ponder a las condiciones ambientales. Estos dos rasgos -uno de informacin y el otro de funcin- son las dos propiedades esenciales que se necesitan para la evolucin. La secuencia de nucletidos de una molcula de RNA es anloga al genotipo -la informacin hereditaria- de un organismo. La estructura tridimen sional plegada es anloga al fenotipo -la expresin de la informacin gentica en la que acta la seleccin natural.

Algunas molculas especializadas de RNA pueden catalizar reacciones bioqumicas5

La seleccin natural depende del entorno, y para una molcula de RNA que se replica, un com ponente crtico del entorno es el conjunto de las otras molculas de RNA de la mezcla. Adems de actuar como patrn para su propia replicacin, estas molculas de RNA pueden catalizar la rotura y la formacin de enlaces covalentes, incluyendo uniones entre nucletidos. Por ejemplo, algunas molculas de RNA especializadas pueden catalizar cambios en otras molculas de RNA cor tando la secuencia de nucletidos en un punto determinado; otros tipos de m o lculas de RNA eliminan espontneam ente una porcin de su propia secuencia y renen los extremos cortados (un proceso conocido como automaduracin por corte y em palm e, self-splicing). Cada reaccin catalizada por una molcula de RNA depende de una ordenacin especfica de los tomos que forman la su perficie de esta molcula de RNA cataltica (la ribozima ), la cual hace que algu nos grupos qumicos de uno o ms de sus nucletidos sean altamente reactivos. Ciertas actividades catalticas pudieron tener una importancia capital en el caldo primordial. Consideremos una molcula de RNA que catalice el proceso de polimerizacin utilizando cualquier molcula de RNA como patrn. (Esta ac tividad ribozima se ha demostrado directamente in vitro al menos de una forma rudimentaria.) Esta molcula cataltica puede actuar sobre copias de s misma, replicndose con elevada velocidad y eficiencia (Figura 1-7A). Al mismo tiempo, puede promover la replicacin de otras molculas de RNA vecinas (Figura 1-7B). Algunas de estas molculas pueden desarrollar acciones catalticas que ayuden o dificulten la supervivencia o la replicacin del RNA en otras vas. Si los efectos beneficiosos son recprocos, diferentes tipos de molculas de RNA, especializa das en diferentes actividades, pueden desarrollar un sistema cooperativo que se replique con una eficiencia extraordinaria.

La informacin fluye desde los polinucletidos a los polipptidos6

Todo lo expuesto sugiere que hace entre 3,5 y 4 mil millones de aos, unos siste mas autorreplicantes de molculas de RNA, mezcladas con otras molculas or gnicas como algunos polipptidos simples, iniciaron, en algn lugar de la Tie rra, el proceso de la evolucin. Sistemas con diferentes dotaciones de polmeros compitieron por los materiales precursores disponibles para construir copias de ellos mismos, tal y como compiten los organismos actualmente; el xito depen di de la exactitud y de la rapidez con que se producan las copias, y de la estabi lidad de las mismas. Sin embargo, como destacamos anteriormente, aunque la estructura de los polinucletidos est bien adaptada al almacenamiento y replicacin de la infor-

Captulo 1 : La evolucin de la clula

(A) catlisis

replicacin

(B)

Figura 1-7 D iag ram a d e tre s p asos su cesiv o s en la ev olu ci n d el siste m a a u to rre p lic a n te d e m o l cu la s de RNA q u e s o n c a p a ce s de d irig ir la s n te sis p ro te ica .

M olcula de RNA cataltico que une nucletidos para reproducir su m ism a secuencia de nucletidos y por lo tanto su m isma form a.

(C) Familia de m olculas de RNA catalticas que se mantienen m utuam ente, catalizando una de eilas la reproduccin de las otras.

RNA codificante (m olde para la sntesis proteica)

_ RNA adaptadores Evolucin de nuevas m olculas de RNA catalticos, algunas de las cuales unen por s solas am inocidos activados. Por apaream iento de bases a una m olcula de RNA codificante, estas m olculas de RNA perm iten que una secuencia de RNA acte com o m olde o patrn para la sntesis de polm eros de am inocidos, generando as la aparicin de las prim eras secuencias proteicas determ inadas genticam ente. De esta form a, estas m olculas actan com o los prim eros adaptadores entre una secuencia de nucletidos y una secuencia de am inocidos.

macin, sus capacidades catalticas son limitadas respecto a las de los polipptidos, y en las clulas modernas la replicacin eficiente de los polinucletidos es absolutam ente dependiente de las protenas. En el origen de la vida cualquier polinucletido que dirigi la sntesis de un polipptido til debi tener en el am biente competitivo de la evolucin una gran ventaja para sobrevivir. Sin embargo, de qu manera poda la informacin codificada en sus se cuencias determinar las secuencias de otro tipo de polmeros? Sin duda, los poli nucletidos debieron actuar como catalizadores uniendo determinados am ino cidos entre s. En los organismos actuales, un sistema de colaboracin de molculas de RNA juega un papel central en la direccin de la sntesis de polipptidos -la sntesis proteica- pero en el proceso tambin colaboran otras protenas previamente sintetizadas. La maquinaria bioqumica para la sntesis proteica est notablem ente elaborada. Una molcula de RNA contiene la informacin ge ntica de un polipptido determinado, en forma de cdigo, mientras que otras molculas de RNA actan como adaptadores, uniendo cada una de ellas un am i nocido especfico. Estos dos tipos de molculas de RNA forman pares de bases complementarias entre s, permitiendo que las secuencias de nucletidos del RNA codificante dirijan la incorporacin de aminocidos especficos, transpor tados por el RNA adaptador, a la cadena polipeptdica en crecimiento. Probable mente los precursores de estos dos tipos de molculas de RNA dirigieron la pri mera sntesis proteica sin la ayuda de protenas (Figura 1-7C).

Desde las molculas hasta la primera clula

En la actualidad, estos procesos de ensamblaje de nuevas protenas tienen lugar en la superficie de los ribosomas -partculas complejas compuestas por va rias grandes molculas de RNA de otro tipo, y por ms de 50 tipos diferentes de protenas. En el Captulo 5 veremos que este RNA ribosmico juega un papel ca taltico central en el proceso de la sntesis proteica y constituye ms del 60 % de la masa ribosomal. Al menos en trminos evolutivos, este RNA es el componente fundamental del ribosoma. As pues, parece que el RNA dirigi la sntesis primordial de protenas, qui zs de una forma torpe y primitiva. De esta manera el RNA fue capaz de crear herramientas -e n forma de protenas- que permitieron conseguir una biosntesis ms eficiente. Algunas de estas protenas pudieron ser utilizadas en la replicacin del RNA y en el propio proceso de produccin de herramientas. La sntesis de protenas especficas bajo la direccin del RNA requiere la evolucin de un cdigo a travs del cual una secuencia de polinucletidos espe cifique la secuencia de aminocidos que formar la protena. Este cdigo -e l c digo gentico- se deletrea en forma de un diccionario de palabras de tres le tras: diferentes tripletes de nucletidos codifican aminocidos determinados. El cdigo parece haber sido seleccionado arbitrariamente (tal vez sometido a algu nos condicionantes), y todava hoy es prcticamente el mismo en todos los orga nismos vivos* Esto sugiere claram ente que todas las clulas actuales descienden de una lnea celular primitiva que desarroll el m ecanismo de sntesis proteica.

Las membranas definieron la primera clula7

Uno de los acontecim ientos cruciales que condujeron a la formacin de la pri mera clula debi de ser el desarrollo de una membrana externa. Por ejemplo, las protenas sintetizadas bajo el control de un determinado tipo de RNA no faci litaran la reproduccin de este tipo de RNA a menos que permanecieran en sus proximidades; adems, mientras estas protenas tuvieran libertad para difundir entre la poblacin de molculas de RNA en replicacin, podra beneficiar por igual a cualquier especie competidora de RNA que estuviera presente. Si surga una variante de RNA que produca un tipo superior de enzima, la nueva enzima no poda contribuir selectivamente a la supervivencia del RNA variante en la com petencia de ste con los otros RNA. La seleccin de las molculas de RNA de acuerdo con la calidad de las protenas que generaban no pudo empezar hasta que apareci alguna forma de compartimiento que retuviera las protenas pro ducidas por cada molcula de RNA y que por lo tanto hiciera que estas protenas quedaran disponibles slo para el RNA que las produjo (Figura 1-8). Esta necesidad de contener es ejecutada fcilmente por otro tipo de mol culas que poseen la sencilla propiedad fisicoqumica de ser anfipticas, lo cual consiste en que una zona de la molcula es hidrofbica (insoluble en agua) y

SIN COMPARTIMIENTOS

CON COMPARTIMIENTOS

e
10 Captulo 1 : La evolucin de la clula

Figura 1-8 Dibujo esquem tico que m uestra la ventaja evolutiva que suponen los com partim ientos semejantes a una clula. En una mezcla de molculas de RNA autorreplicantes capaces de realizar la sntesis proteica (tal com o se ilustra en la Figura 1-7), cualquier forma de RNA mejorada que sea capaz de producir una protena ms til debe compartir esta protena con todas sus competidoras. Sin embargo, si el RNA est encerrado en un compartimiento, com o por ejemplo una membrana lipdica, cualquier protena que produzca quedar confinada para su uso exclusivo; entonces, el RNA puede ser seleccionado en base a su capacidad de sintetizar una protena mejor.

otra hidroflica (soluble en agua). Cuando tales molculas se encuentran en un medio acuoso se agregan poniendo en ntimo contacto sus zonas hidrofbicas y estableciendo contacto con el agua por sus zonas hidroflicas. Molculas anfipticas de forma adecuada se agregan espontneamente formando bicapas, que generan pequeas vesculas cerradas cuyo contenido acuoso se halla aislado del medio externo (Figura 1-9). Este fenmeno se puede reproducir en el tubo de ensayo simplemente mezclando fosfolpidos y agua: en condiciones apropiadas, se formarn pequeas vesculas. Todas las clulas actuales estn delimitadas por una m em brana plasm tica formada por molculas anfpticas -mayoritariamente fosfolpidos- en esta configuracin; en las membranas celulares la bicapa lipdica tambin contiene protenas anfpticas. Al microscopio electrnico es tas membranas aparecen com o lminas de aproximadamente 5 nm de grosor, con un aspecto triestratifcado caracterstico, debido al empaquetamiento colacon-cola de las molculas de fosfolpidos. Probablemente, las primeras clulas rodeadas de membrana se formaron por ensam blaje espontneo de molculas de fosfolpidos del caldo prebitico, incluyendo una mezcla de molculas autorreplicantes de RNA y otras molculas. No est claro en qu punto de la evolucin de la catlisis biolgica y sntesis pro teica se formaron las primeras clulas. En cualquier caso, cuando las molculas de RNA fueron confinadas con una membrana cerrada pudieron empezar a evo lucionar eficazmente como transportadores de instrucciones genticas: pudie ron ser seleccionadas no solamente en base a su propia estructura, sino tambin por el efecto que ejercieron sobre otras molculas de su mismo compartimiento. Las secuencias de nucletidos de las molculas de RNA pudieron ser expresadas en el carcter de la clula como un todo.

i ACEITE ; \

monocapa de fosfolpidos AGUA

: :

\ : * :

V :

bicapa de fosfolpidos

v ................./

..................

Todas las clulas actuales utilizan el DNA como material hereditario3,6,8

Evidentemente, el cuadro que acabamos de presentar es especulativo: no exis ten datos fsiles que registren los orgenes de la primera clula. Sin embargo, los organismos actuales y los experimentos realizados proporcionan pruebas bas tante convincentes de que los rasgos principales de esta historia evolutiva son correctos. La sntesis prebitica de pequeas molculas, la autorreplicacin de las molculas de RNA cataltico, la traduccin de las secuencias de RNA a se cuencias de aminocidos y el ensamblaje de las molculas lipdicas formando compartimientos rodeados de membrana: todo esto debi de ocurrir durante la gnesis de la clula primitiva hace unos 3,5 o 4 mil millones de aos. Resulta til comparar estas clulas primitivas con las clulas actuales ms sencillas, los micoplasmas. Son pequeas bacterias de un tipo degenerado que normalmente llevan una vida parasitaria en estrecha asociacin con clulas ve getales o animales (Figura 1-10). Algunos tienen un dimetro de aproximada mente 0,3 fim y slo contienen el cido nucleico suficiente para codificar la sn tesis de unas 400 protenas diferentes. Algunas de estas protenas son enzimas, otras son protenas estructurales; otras se hallan en el interior de la clula; otras estn incluidas en su membrana. En conjunto los micoplasmas sintetizan las pe queas molculas esenciales que no se encuentran accesibles en el entorno, re distribuyen la energa necesaria para conducir las reacciones biosintticas y mantienen las condiciones apropiadas en el interior de la clula. Probablemente, las primeras clulas de la Tierra fueron menos sofisticadas y se dividan ms lentamente y con menor eficiencia. Pero exista una diferencia ms fundamental entre las clulas primitivas y un micoplasma o cualquier otra clula actual: la informacin hereditaria en todas las clulas vivas actuales est almacenada en el DNA y no en el RNA, que es como se supone que las clulas primitivas almacenaban la informacin hereditaria. Ambos tipos de polinucletidos se encuentran en las clulas actuales, pero actan de una manera coopera tiva, ya que cada uno ha evolucionado en el sentido de desempear tareas espe cializadas. Pequeas diferencias qumicas hacen que cada uno de los dos tipos

Figura 1 -9 Form acin de m em branas por fosfolpidos. Dado que estas molculas tienen una cabeza hidroflica y unas colas lipoflicas, en una interfase aceite-agua se alinean espontneam ente con la cabeza hacia el agua y las colas en el aceite. En agua se asocian formando bicapas vesiculares cerradas, en las cuales las colas lipoflicas estn en contacto con otras colas y las cabezas hidroflicas estn expuestas al agua.

i__________ i

5 (jm

Figura 1-10 Spiroplasma citrii, un m icoplasm a que crece en clulas vegetales. (Por cortesa de J. Burgess.)

Desde las molculas hasta la primera clula

11

de molculas sean adecuadas para funciones diferentes. El DNA acta como de positario permanente de la informacin gentica y a diferencia del RNA se halla en las clulas principalmente en forma de doble hebra, compuesta por un par de molculas complementarias de polinucletidos. Esta estructura de doble hebra hace al DNA celular ms robusto y estable que el RNA; tambin determina que el DNA sea relativamente fcil de replicar (vase el Captulo 3) y permite que acte un mecanismo de reparacin que utiliza la hebra intacta como patrn para la correccin o reparacin de la hebra lesionada asociada. El DNA dirige la sntesis de molculas especficas de RNA, de nuevo por el principio de apareamiento de pares de bases complementarias, aunque el apareamiento se produce aqu entre tipos de nucletidos ligeramente diferentes. Luego, las molculas de RNA resul tantes, de una sola hebra, realizan otras dos funciones primordiales: dirigen la sntesis proteica tanto com o molculas de RNA codificantes (RNA ) como de RNA catalticos (RNA y otros no mensajeros). Brevemente, se sugiere que el RNA apareci antes que el DNA en el proceso evolutivo, presentando las propiedades gentica y cataltica; posteriormente, el DNA tom el relevo de la funci gentica primaria y las protenas se constituye ron en los principales catalizadores, mientras que el RNA qued relegado a prin cipal intermediario entre ambos (Figura 1-11). Con el advenimiento del DNA, las clulas pudieron ser cada vez ms complejas, ya que pudieron contener y trans mitir una cantidad de informacin gentica mayor de la que poda almacenarse de forma estable en las molculas de RNA.

EVOLUCIN DE RNA ADAPTADORES

sistemas basados en el RNA y en las protenas

------- protn*

ribosmicos

mensajeros

EVOLUCIN DE NUEVAS ENZIMAS QUE GENERAN DNA Y LO COPIAN EN MOLCULAS DE RNA

Resumen

Las clulas vivas surgieron probablemente en la Tierra gracias a la agregacin es pontnea de molculas, hace aproximadamente 3,5 mil millones de aos. Sobre la base de nuestros conocimientos acerca de los organismos actuales y de las molculas que contienen, parece probable que el desarrollo de los mecanismos autocatalticos fundamentales para los sistemas vivientes empezara con la evolucin de familias de molculas de RNA que podan catalizar su propia replicacin. Con el tiempo, una de estas familias de RNA catalticos cooperativos debi de desarrollar la habili dad de dirigir la sntesis de polipptidos. Finalmente, debido a que la acumulacin de catalizadores proteicos permiti la evolucin de clulas ms complejas y eficientes, el DNA de doble hebra substituy al RNA como molcula ms estable para el almacenaje de las cantidades crecientes de informacin gentica requerida por estas clulas. De los procariotas a los eucariotas9
Se cree que todos los organismos que viven actualmente sobre la Tierra derivan de una nica clula primitiva nacida hace ms de tres mil millones de aos. Esta clula, superando a sus competidoras, tom la delantera en el proceso de divi sin celular y evolucin y, con el tiempo, cubri de verde la Tierra y cambi la composicin de su atmsfera, convirtindola en el hogar de la vida inteligente. Los parecidos familiares entre todos los organismos son demasiado acusados para ser explicados de otra manera. Un hito importante a lo largo de este cam i no evolutivo se produjo hace 1,5 mil millones de aos, cuando ocurri la transi cin desde las clulas pequeas con una estructura interna relativamente senci lla -las denominadas clulas procariotas, que incluyen los diversos tipos de bacterias- hasta las clulas mayores y radicalmente ms complejas, tal como las encontram os hoy en los animales y plantas superiores.

l isura 1-11 Estadios propuestos para la evolucin desde sencillos sistemas autorreplicantes de molculas de RNA hasta las clulas actuales. Actualmente el DNA es el depositario de la informacin gentica y el RNA acta mayoritariamente como intermediario de la sntesis proteica.

eucariotas,

Las clulas procariotas son estructuralmente simples pero bioqumicamente diversas1 0

Las bacterias son los organismos ms sencillos que se encuentran en la mayora de hbitats naturales. Se trata de clulas esfricas o alargadas, generalmente de

12

Captulo 1 : La evolucin de la clula

S pirillum

Figura 1-12 Estructuras y tamaos de procariotas. (A) Algunas clulas

procariotas dibujadas a escala. (B) Mlcrograffa electrnica de una seccin longitudinal de una bacteria {Escherichia coty; el DNA celular est concentrado en la regln plida de la figura. (Por cortesa de E. Kellenberger.)

Bacillus grande

o
(A)

Escherichia coli 3 especies de M ycoplasm a (B)

1

Staphylococcus

un dimetro de varios micrmetros (Figura 1-12). A menudo poseen una envol tura protectora resistente, denominada pared celular, por debajo de la cual una membrana plasmtica rodea a un nico compartimiento citoplasmtico que contiene DNA, RNA, protenas y pequeas molculas. Al microscopio electrni co, este interior celular aparece como una matriz de textura variable y sin ningu na estructura interna organizada evidente (vase la Figura 1-12B). Las bacterias son pequeas y se pueden replicar a gran velocidad, simple mente dividindose en dos mediante fisin binaria. Cuando el alimento es abundante, "la supervivencia del ms apto significa generalmente la supervi vencia de los que pueden reproducirse con mayor rapidez. En condiciones pti mas, una misma clula procariota se puede dividir cada 20 minutos, y por lo tan to dar lugar a 5 mil millones de clulas (aproximadamente el mismo nmero de la poblacin humana mundial actual) en menos de 11 horas. La capacidad de di vidirse con rapidez permite que las poblaciones de bacterias se adapten rpida mente a los cambios de su ambiente. Por ejemplo, en condiciones de laboratorio una poblacin de bacterias mantenida en un gran recipiente evoluciona en unas cuantas semanas, mediante mutacin espontnea y seleccin natural, y consi gue utilizar como fuente de carbono nuevos tipos de molculas de azcar. En la Naturaleza las bacterias viven en una gran variedad de nichos ecolgi cos y muestran la riqueza correspondiente a su composicin bioqumica. Se
bacterias anaerbicas que viven en condiciones cidas calientes (por ejemplo, bacterias del azufre) bacterias que viven en condiciones salinas extremas (halfilas extremas) bacterias anaerbicas que reducen el CO2 a metano (metangenas) bacterias gram positivas bacterias verdes fotosintetizadoras (anaerbicas) EUBACTERIAS
(procariotas)

ARQUEBACTERIAS (procariotas)
PROCARIOTA ANCESTRAL

cianbacterias (algas verde-azules) bacterias prpuras fotosintetizadoras bacterias gram negativas no fotosintetizadoras espiroquetas

Figura 1-13 Relaciones familiares entre las bacterias actuales. Las

flechas Indican posibles vas de evolucin. El origen de las clulas eucariotas se discute ms adelante en el texto.

De los procariotas a los eucariotas

13

pueden reconocer dos grupos distintos: las eubacterias, que son las formas ms habituales y viven en el suelo, el agua y los organismos vivos; y las arquebacterias, que se encuentran en ambientes tan incmodos como cinagas, profundi dades marinas, aguas salobres y fuentes cidas calientes (Figura 1-13). Existen especies de bacterias que pueden utilizar como alimento prctica mente cualquier tipo de molcula orgnica, incluidos azcares, aminocidos, grasas, hidratos de carbono, polipptidos y polisacridos. Algunas son capaces incluso de obtener los tomos de carbono del CO;, y los tomos de nitrgeno del N2. A pesar de su simplicidad relativa, las bacterias han sobrevivido durante ms tiempo que cualquier otro organismo y todava constituyen el tipo de clulas ms abundante de la Tierra.

Las reacciones metablicas evolucionan10,1 1

Una bacteria que crezca en una solucin salina que contenga un nico tipo de fuente de carbono, como por ejemplo la glucosa, debe realizar un elevado n mero de reacciones qumicas. No slo debe obtener de la glucosa la energa qu mica necesaria para muchos procesos vitales, sino que tambin debe utilizar los tomos de carbono de la glucosa para sintetizar todos los tipos de molculas or gnicas que la clula necesita. Estas reacciones estn catalizadas por cientos de enzimas que trabajan en cadenas de reacciones, de forma que el producto de una reaccin es el sustrato de la siguiente; estas cadenas enzimticas, deno minadas vas metablicas, se estudiarn en el captulo siguiente. Probablemente cuando empez la vida sobre la Tierra estas elaboradas re acciones m etablicas eran poco necesarias. Las clulas podan sobrevivir y cre cer gracias a las molculas de su entorno. Pero a medida que se agotaron estos recursos naturales, la com petencia por estas limitadas fuentes de recursos fue

m etabolitos asequibles en el m edio externo clula

m etabolito asequible en el m edio externo

Figura 1-14 Dos m aneras posibles a travs de las cuales pudieron evolucionar las vas metablicas. (A) La clula de la izquierda tiene a su disposicin una serie de substancias afines (A, B, C, D) producidas por sntesis prebitica. Una de ellas, la substancia D, es m etablicam ente til. Cuando la clula agota la reserva disponible de D, obtiene una ventaja selectiva con la evolucin de una nueva enzima que puede producir D a partir de la substancia afn C. Mediante una serie de pasos similares pueden haber surgido vas metablicas fundamentalmente importantes. (B) A la derecha, un compuesto A m etablicam ente til se halla disponible en abundancia. En el transcurso de la evolucin aparece una enzima que, por casualidad, tiene la capacidad de convertir la substancia A en la substancia B. Luego se producen otros cambios dentro de la clula, que le permiten utilizar la nueva substancia. La aparicin de otras enzimas puede dar lugar a una larga cadena de reacciones.

nueva enzima

nueva enzima

nueva enzima

nueva enzima

nueva enzima

(A)
14 Captulo 1 : La evolucin de la clula

(B)

h 2o

Figura 1-15 El enlace tioster.

SH + H O C
h2 o

S C

tiol

cido carboxlico

tioster

cada vez ms intensa. Los organismos que haban desarrollado enzimas para fa bricar molculas orgnicas posean una gran ventaja selectiva. De esta manera, se cree que la dotacin de enzimas de las clulas aument gradualmente, gene rando las vas metablicas de los organismos actuales. La Figura 1-14 muestra dos maneras plausibles por las que podra haber surgido una va metablica du rante la evolucin. Si las vas metablicas evolucionaron por adicin secuencial de nuevas reac ciones enzimticas a las ya existentes, las reacciones ms antiguas, al igual que los anillos ms viejos del tronco de un rbol, deben de hallarse ms prximas al centro del rbol m etablico, donde se sintetizan los bloques constitutivos m o leculares bsicos ms esenciales. Esta posicin central del metabolismo est cla ramente ocupada por los procesos qumicos en los que intervienen los azcares fosfato. Entre estos procesos el ms central probablemente es la secuencia de re acciones conocida com o glucolisis mediante la cual la glucosa puede ser degra dada en ausencia de oxgeno (es decir, de forma anaerbica ). Las vas m etabli cas ms antiguas debieron ser anaerbicas ya que no exista oxgeno libre en la atmsfera de la Tierra primitiva. La glucolisis se produce prcticam ente en todas las clulas vivas e impulsa la formacin del compuesto adenosn trifosfato o ATP, que es utilizado por todas las clulas como una verstil fuente de energa qumi ca. Algunos compuestos tioster desempean un papel fundamental en las reac ciones de transferencia de energa de la glucolisis y en un gran nmero de otros procesos bioqumicos bsicos en los que dos molculas orgnicas (un grupo tiol y un cido carboxlico) se unen mediante un enlace rico en energa en el que in terviene el azufre (Figura 1-15). Se ha argumentado que esta simple pero pode rosa estrategia es una reliquia de procesos prebiticos, que refleja las reacciones que tuvieron lugar en el ambiente sulfuroso volcnico de la tierra primitiva, an tes incluso de que el RNA hubiera empezado a evolucionar. Conectados a estas reacciones centrales de la glucolisis se encuentran cien tos de procesos qumicos distintos. Algunos de ellos son responsables de la sn tesis de pequeas molculas, muchas de las cuales son utilizadas en reacciones posteriores para producir los grandes polmeros especficos del organismo. Otras reacciones se utilizan para degradar a unidades qumicas ms simples molculas complejas ingeridas como alimento. Uno de los rasgos ms notables de estas re acciones m etablicas consiste en que se producen en todos los tipos de organis mos, lo cual sugiere que su origen es extremadamente antiguo.

Comparando secuencias de DNA se pueden deducir relaciones evolutivas1 2

Las enzimas que catalizan las reacciones m etablicas fundamentales, sin dejar de desarrollar las mismas funciones esenciales, sufrieron modificaciones pro gresivas a medida que los organismos evolucionaron hacia formas divergentes. Por esta razn la secuencia de aminocidos del mismo tipo de enzima de dife rentes especies actuales proporciona un ndice extremadamente valioso de la re lacin evolutiva existente entre estas especies. Los resultados obtenidos mues tran un estrecho paralelismo entre este ndice y los proporcionados por otros mtodos, como por ejemplo el registro fsil. Una fuente de informacin an ms rica se halla presente en la clula viva en las secuencias de nucletidos del DNA. Mtodos modernos de anlisis permiten determinar estas secuencias de DNA en un gran nmero de especies y compararlas entre s. Las comparaciones de se cuencias altamente conservadas, que tienen un papel central y por consiguiente

De los procariotas a los eucariotas

15

hom bre 1 sapo ------------ hongo i------maz --------- Volvox ---------------------------------------protozoos ciliados ----------------------------- D ictyostelium -------------------------------------------------Euglena ----------------------------------------------------tripanosom a ------------------------------------------------------------------------------------------------------ m icrosporidios ----------------------------------------------------------------------------- Giardia Halobacterium E. coli

Figura 1*10 Relaciones evolutivas entre los organismos, deducidas a partir de las secuencias de nudedtldos de los genes de la subunldad ribosdmica pequea. Estos
genes presentan secuencias altamente conservadas, que han cambiado tan lentamente que pueden ser utilizadas para medir las relaciones fliogenticas abarcando el conjunto entero de ios organismos vivos. Los datos sugieren que los linajes de las plantas, animales y hongos divergieron de un ancestro comn relativamente tarde en la historia de las clulas eucariotas. Halobacterium y E. coli son procartotas; el resto son eucariotas. Giardia, los microsporidios, los tripanosomas, Euglena, y los protozoos ciliados son protistas (eucariotas unicelulares). (Adaptado de M.L. Sogn, J.H. Gunderson, HJ. Elwood, R.A. Alonso and D.A. Peattle, Science 243:75-77,1989. < >1989 the AAAS.)

durante la evolucin slo cambian lentamente, pueden poner de manifiesto pa rentescos entre organismos que divergieron hace tiempo (Figura 1-16), mientras que secuencias que evolucionan rpidamente pueden utilizarse para determinar cmo evolucionan especies ntimamente relacionadas. Es de esperar que la con tinua aplicacin de estos mtodos permitir seguir el curso de la evolucin con una exactitud sin precedentes hasta el momento.

Las cianobacterias pueden fijar C02y N21 3

A medida que se intensific la competencia por los materiales crudos necesarios para sntesis orgnica, los organismos capaces de utilizar directamente de la at msfera tomos de carbono y de nitrgeno (en forma de C02 y de N2) tuvieron ms ventaja. Sin embargo, aunque el C02 y el N2 eran muy abundantes, tambin resultaban muy estables, por lo que era necesaria una gran cantidad de energa y un elevado nmero de reacciones qumicas complicadas para transformarlos en formas utillzables -es decir, en molculas orgnicas como los azcares simples. En el caso del C02, el mecanismo principal que apareci para conseguir esta transformacin fue la fotosntesis, en la que la energa radiante obtenida del sol se utiliza para facilitar la conversin de C02 en compuestos orgnicos. La inter accin de la luz solar con una molcula de pigmento, la clorofila, excita un elec trn que pasa a un estado de mayor energa. Cuando el electrn cae de nuevo a un nivel de menor energa, la energa que se desprende impulsa unas reacciones qumicas, facilitadas y dirigidas por molculas proteicas. Probablemente una de las primeras reacciones impulsadas por la luz solar fue la generacin de poder reductor. Los tomos de carbono y de nitrgeno del C02 y del N2 atmosfricos se hallan en un estado oxidado e inerte. Una manera de con seguir que sean ms reactivos para que participen en las reacciones de biosntesis consiste en reducirlos -es decir, en proporcionarles una mayor cantidad de elec trones. Ello se consigue en varias etapas. En la primera, se liberan electrones de dadores dbiles de electrones, y se transfieren a un dador fuerte de electrones, por medio de la clorofila, a travs de una reaccin en la que interviene la luz; en el pro ceso de reduccin el dador fuerte de electrones se utiliza para reducir el C02 o el N2. El estudio de los mecanismos de fotosntesis en diversas bacterias actuales su giere que una de las primeras fuentes de electrones fue el H2S, siendo el producto residual primario el azufre elemental. Ms tarde se llev a cabo el proceso mucho ms difcil, pero en ltimo trmino ms rentable, de obtener electrones del H20 y el 0 2 fue liberado en grandes cantidades como producto residual. Actualmente las cianobacterias (conocidas tambin como algas azules) son una va principal a travs de la cual el carbono y el nitrgeno son transformados
16 Captulo 1 : La evolucin de la clula

en molculas orgnicas, penetrando as en la biosfera. Constituyen los organis^ mos ms autosuficientes de los que viven en la actualidad. Al ser capaces de "fi ja r el C 0 2 y el N2 en molculas orgnicas estn capacitadas, en una primera aproximacin, para vivir nicamente del agua, del aire y de la luz solar; es probable que los mecanismos mediante los cuales lo consiguen hayan permanecido esencialm ente constantes durante varios miles de millones de aos. Conjunta* mente con otras bacterias que tienen algunas de estas capacidades, crearon las condiciones adecuadas para la evolucin de otros tipos de organismos ms complejos: en cuanto algn tipo de organismos fue capaz de sintetizar a partir de material inorgnico crudo la gama completa de componentes orgnicos celulares, otros organismos pudieron subsistir alimentndose de los sintetizadores primarios y de sus productos.

Las bacterias pueden realizar la oxidacin aerbica de las molculas nutritivas1 3

Actualmente mucha gente est preocupada, y con razn, por las consecuencias ambientales de las actividades humanas. Sin embargo, en el pasado otros orga nismos provocaron tam bin (aunque mucho ms lentamente) cambios revolu cionarlos en el medio ambiente de la Tierra. Este cambio resulta especialmente evidente en cuanto a la composicin de la atmsfera terrestre, que a travs de la fotosntesis (proceso que liber oxgeno) fue transformndose desde una mezcla prcticam ente carente de oxgeno hasta una mezcla en la que el oxgeno consti tuye un 21% del total (Figura 1-17). Puesto que el oxgeno es un elemento qumico extremadamente reactivo, que puede interaccionar con la mayora de los constituyentes citoplasmtlcos, debi de ser txico para muchos organismos primitivos, al igual que lo es para muchas bacterias anaerbicas actuales. Sin embargo, esta reactividad tambin proporciona una fuente de energa qumica, y por tanto no es sorprendente que haya sido utilizada por los organismos en el transcurso de la evolucin. Utilizan do oxgeno, los organismos pueden oxidar de manera ms completa las m olcu las que ingieren. Por ejemplo, en ausencia de oxgeno, la glucosa nicamente puede ser degradada hasta cido lctico o etanol, los productos finales de la glucolisis anaerbica. Pero en presencia de oxgeno, la glucosa puede ser degradada completamente a C 0 2 y H20 . De esta manera se puede obtener mucha ms energa por cada gramo de glucosa. La energa liberada en la respiracin -la oxi dacin aerbica de las molculas alim enticias- se utiliza para impulsar la snte sis de ATP, de una manera muy parecida a la que los organismos fotosintticos

Figura 1*17 El oxgeno atmosfrico y el curso de la evolucin. Relacin entre los cambios en los niveles de oxgeno atmosfrico y algunas de las principales etapas que ai parecer ocurrieron durante la evolucin de los organismos vivos sobre la Tierra. Como se indica, las evidencias geolgicas sugieren que pasaron ms de mil millones de aos entre la aparicin de las clanobacterlas (probablemente el primer organismo que liber oxgeno) y el momento en que los niveles de oxgeno empezaron a acumularse en la atmsfera. Se cree que este intervalo fue debido fundamentalmente al rico aporte de hierro ferroso disuelto en los ocanos, que reaccion con el oxgeno liberado formando enormes depsitos de xido de hierro.

20 NIVELES DE OXGENO EN LA ATMSFERA

(% )

10

inicio del acum ulo rpido de O j (el Fe2* de los ocanos lo utilizan)

TIEMPO (MILES DE MILLONES DE AOS)

formacin de los ocanos y Ir los continental formacin da la Tier i n

'

JL
primaras primara liberacin callas tie oxigeno por vivas fotosntesis primeras clulas fotoslnttlcas

actualmente origen de las clulas primeros fotosinttlcas vertebrados eucar iotas la respiracin aerbica primeros animales su geneiall/a y plantas pluricelulares

De los procariotas a los eucariotas

17

EL SISTEMA DE MEMBRANAS DE LA CELULA

MEMBRANA PLASMATICA
El lm it e e x t e r n o d e la c lu la e s la m e m b r a n a p la s m tic a , u n a c a p a c o n tin u a d e m o l c u la s lip d ic a s d e u n o s 4 -5 n m d e g r o s o r , e n la q u e e s t n in c lu id a s v a r ia s p r o t e n a s ,

RETICULO ENDOPLASMATICO
P o r t o d o el c ito p la s m a d e las c lu la s e u c a ri tic a s se e x tie n d e un s is te m a d e m e m b r a n a f o r m a n d o c is te rn a s , s c u lo s y tu b o s a p la n a d o s , o c u p a n d o r o d e a n d o un a m p lio e s p a c io n tr a c e lu la r . La m e m b r a n a d e l RE se h a lla e n c o n tin u id a d e s tr u c tu r a l c o n la m e m b r a n a e x te r n a d e la e n v o ltu r a n u c le a r y e s t e s p e c ia liz a d a e n la s n te s is y e n el t r a n s p o r te d e lp id o s y p r o te n a s d e m e m b r a n a . El re tc u lo e n d o p la s m tic o r u g o s o (ER ru g o s o ) se s u e le p r e s e n ta r c o m o s c u lo s a p la n a d o s y e x t e r io r m e n t e e s t r e c u b ie r to p o r r ib o s o m a s , d e d ic a d o s a la s n te s is p r o te ic a .

ESPACIO EXTRACELULAR

bom ba proteica

o
proteina

I bicapa J lipidica

iflii*

CITOPLASMA

canal proteico x- ' ;

ribosom as

A lg u n a s de estas p ro te n a s a c t a n c o m o b o m b a s y c a n a le s p a ra el tra n s p o rte d e m o l c u la s e sp e c fic a s hacia fu e ra y d e n tro de la c lu la .

COMPLEJO DE GOLGI
U n s is t e m a d e s c u lo s a p ila d o s , lim it a d o s p o r m e m b r a n a y a p la n a d o s , im p lic a d o s e n la m o d ific a c i n , s e le c c i n y e m p a q u e t a m i e n t o d e m a c r o m o l c u la s p a r a la s e c r e c i n o p a ra la e x p o r ta c i n a o tr o s r g a n u lo s .

nucleo El re tc u lo e n d o p la s m tic o liso (ER liso ) s u e le s e r m s t u b u la r y c a re c e d e r ib o s o m a s . S u p r in c ip a l fu n c i n se c e n tra e n el m e ta b o lis m o lip d ic o . .

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3 e~\
LISOSOMAS

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PEROXISOMAS 0,2-0,5 |um

0,2-0,5 ju m
v e s c u la s lim it a d a s p o r m e m b r a n a q u e c o n t ie n e n e n z im a s o x id a t iv a s q u e g e n e r a n y d e s t r u y e n el p e r x id o d e h id r g e n o

A lr e d e d o r d e l c o m p le jo d e G o lg i se e n c u e n tr a n n u m e r o s a s v e s c u la s p e q u e a s r o d e a d a s d e m e m b r a n a (d e m s d e 5 0 n m ) S e c re e q u e t r a n s p o r t a n m a t e r ia l d e s d e el c o m p le jo d e G o lg i a lo s d if e r e n t e s c o m p a r t im e n t o s d e la c lu la . v e s c u la s lim it a d a s p o r m e m b r a n a q u e c o n tie n e n e n z im a s h id r o ltic a s d e s tin a d a s a la s d ig e s tio n e s in t r a c e lu la r e s

18

Panel 1-1 Clulas eucariotas: esquema de sus principales orgnulos.

NCLEO
El n c le o es el o r g n u lo m s a p a r e n te d e la c lu la . E s t s e p a r a d o d e l c it o p la s m a p o r u n a e n v o lt u r a f o r m a d a p o r d o s m e m b r a n a s T o d o el D N A c r o m o s m ic o se e n c u e n tr a e n el n c le o , e m p a q u e t a d o e n fib r a s d e c r o m a t in a g r a c ia s a su a s o c ia c i n c o n u n a c a n t id a d ig u a l d e p r o te n a s h is to n a s . El c o n te n id o n u c le a r , el n u c le o p la s m a , s e c o m u n ic a c o n el c ito s o l p o r m e d io d e u n a s a b e r tu r a s d e la e n v o ltu r a n u c le a r d e n o m in a d a s p o ro s n u c le a r e s .

3-10 pm

poros nucleares

nuclolo: una fbrica dentro del ncleo, donde se ensamblan los ribosom as de la clula envoltura nuclear m em brana interna mem brana externa

crom atina

CITOESQUELETO
E n el c ito s o l, u n a s a g r u p a c io n e s d e fila m e n t o s p r o te ic o s f o r m a n r e d e s q u e le c o n fie r e n a la c lu la su f o r m a y q u e c o n s tit u y e n la b a s e d e s u s m o v im ie n t o s . Lo s tr e s p r in c ip a le s tip o s d e e le m e n t o s d e l c it o e s q u e le to s o n :

MITOCONDRIAS
A p r o x im a d a m e n t e d e l t a m a o d e la s b a c te r ia s , la s m it o c o n d r ia s s o n la s c e n tr a le s e n e r g tic a s d e t o d a s las c lu la s e u c a r io t a s ; u tiliz a n la e n e r g a o b t e n id a c o m b in a n d o o x g e n o c o n m o l c u la s n u t r it iv a s p a ra p r o d u c ir A T P . ----------- j

1. m ic r o t b u lo s 25 nm d i m e t r o 2. f ila m e n t o s d e a c tin a 8 nm d i m e t r o

m em brana externa m em brana interna plegada form ando crestas ..

// /[

3. f ila m e n t o s in t e r m e d io s 10 n m d i m e t r o

las fases term inales de la oxidacin tienen lugar en la m em brana interna

el espacio de la m atriz contiene una solucin concentrada de muchas enzimas diferentes

ORGANULOS ESPECIALES DE LA CELULA VEGETAL

V a c u o la ; U n a v e s c u la m u y g r a n d e , C lo r o p la s to s : E s to s p la s to s , q u e c o n tie n e n c lo r o f ila , s o n o r g n u lo s r o d e a d o s p o r u n a d o b le m e m b r a n a , y se e n c u e n tr a n e n t o d a s las p la n ta s s u p e r io r e s . U n e la b o r a d o s is te m a d e m e m b r a n a s e n el in te r io r d e l c lo r o p la s to c o n t ie n e el a p a r a to f o t o s in t e tiz a d o r . lim it a d a p o r u n a m e m b r a n a u n it a r ia , q u e o c u p a h a s ta el 9 0 % d e l v o lu m e n c e lu la r ; la v a c u o la a c t a e n la

vacuola

r e g u la c i n d e la p r e s i n o s m tic a y t a m b i n e n la d ig e s ti n in t r a c e lu la r .

m em brana externa m em brana interna

tilacoide grana estrema

P a re d c e lu la r : Las c lu la s v e g e ta le s e s t n r o d e a d a s p o r u n a p a r e d r g id a f o r m a d a p o r fib r illa s d e c e lu lo s a d e p o s it a d a s e n u n a m a tr iz f o r m a d a p o r o tr o s p o lis a c r id o s .

m em brana plasm tica m em brana de la vacuola (tonoplasto)

m em brana plasmtica

19

producen ATP a partir de la energa de la luz solar. En ambos procesos existe una serie de reacciones de transferencia electrnica que genera un gradiente de H+ entre el exterior y el interior de un compartimiento rodeado por una membrana; el gradiente de H+se utiliza luego para impulsar la sntesis del ATP. Actualmente, la respiracin es utilizada por la gran mayora de organismos, incluidos la mayor parte de los procariotas.

Las clulas eucariotas poseen varios orgnulos caractersticos1 4

Qu sucedi con los organismos anaerbicos, con los que haba empezado la vida, en cuanto se fue acumulando oxgeno molecular en la atmsfera? En un mundo rico en oxgeno, que no podan utilizar, se hallaban en franca desventaja. Es indudable que algunos se extinguieron. Otros desarrollaron la capacidad de respirar o encontraron nichos en los que escaseaba el oxgeno y en los que pu dieron continuar un tipo de vida anaerbica. Otros, se transformaron en predadores o parsitos de las clulas aerbicas. Y algunos parece que descubrieron una estrategia de supervivencia ms astuta y ms rica de implicaciones para el futuro: se cree que formaron una asociacin ntima con un tipo aerbico de c lula, viviendo en simbiosis con l. sta es la explicacin ms plausible del origen de las clulas actuales de tipo eucariota (Panel 1-1, pgs. 18-19), que constitu yen el tem a principal de este libro. Por definicin, y a diferencia de las clulas procariotas, las clulas eucario tas tienen un ncleo (caryon en griego), que contiene la mayor parte del DNA celular y que est rodeado por una doble membrana (Figura 1-18). Por consi guiente, el DNA se mantiene en un compartimiento, separado del resto del con tenido celular, el citoplasma, que es donde se producen la mayora de las reac ciones metablicas de la clula. Adems, en el citoplasma se pueden distinguir muchos orgnulos caractersticos. Entre ellos destacan dos pequeos tipos de corpsculos, las mitocondrias y los cloroplastos (Figuras 1-19 y 1-20). Cada uno de ellos est rodeado por su propia doble membrana, que es qumicamente dife rente de la m em brana que envuelve al ncleo. La presencia de mitocondrias

5 pm
Figura I IB El ncleo celular. El ncleo contiene la mayor parte del DNA de la clula eucariota. La figura lo muestra en un corte ultrafino de una clula de mamfero, observada al microscopio electrnico. No sabemos cmo y cundo se gener el ncleo; en la Figura 12-5 se presentan algunas especulaciones sobre este origen. (Por cortesa de Daniel S. Friend.)

grana

1 (Jm
Figura 1-10 Un cloroplasto. Micrografia electrnica de un cloroplasto de una clula de musgo, mostrando su extenso sistema de membranas internas. Los sacos membranosos aplanados contienen clorofila y estn dispuestos en pilas, o gran a. Este cloroplasto contiene tambin grandes acmulos de almidn. (Por cortesa de J. Burgess.)

1 |jm

Figura 1-20 Una m itocondria. En casi

todas las clulas eucariotas, las mitocondrias realizan la degradacin oxidativa de las molculas nutrientes. Tal como se observa en esta micrografa electrnica, presentan una membrana externa lisa y una membrana interna altamente replegada. (Por cortesa de Daniel S. Friend.)

20

Captulo 1 : La evolucin de la clula

constituye un rasgo casi universal de las clulas eucariotas*, mientras que los cloroplastos se encuentran nicamente en aquellas clulas eucariotas que pue den realizar fotosntesis -e s decir, en las plantas, pero no en los animales ni en los hongos. Se cree que ambos orgnulos tienen un origen simbitico.

Las clulas eucariotas dependen de las mitocondrias para su metabolismo oxidativo1 5

Las mitocondrias muestran muchas similitudes con los organismos procariotas de vida libre: por ejemplo, se parecen a menudo a las bacterias en cuanto a tamao y forma, contienen DNA, fabrican protenas y se reproducen dividindose en dos. Rompiendo las clulas eucariotas y separando los elementos que las constituyen, es posible demostrar que las mitocondrias son responsables de la respiracin y que este proceso no se produce en ninguna otra parte de la clula eucariota. Sin las mitocondrias, las clulas de los animales y de los hongos seran organismos anaerbicos que para obtener su energa dependeran del proceso relativamente poco eficaz y antiguo de la glucolisis. Muchas bacterias actuales respiran igual que las mitocondrias, y parece probable que las clulas eucariotas sean descendientes de organismos anaerbicos primitivos que sobrevivieron en un mundo que haba pa sado a ser rico en oxgeno incorporando bacterias anaerbicas -mantenindolas en simbiosis, debido a su capacidad de consumir el oxgeno atmosfrico y produ cir energa. Ciertos microorganismos actuales muestran claras evidencias de la via bilidad de esta secuencia evolutiva. Existen varios cientos de especies unicelulares de organismos eucariotas que se parecen a la hipottica clula eucariota ancestral en que viven en condiciones pobres de oxgeno (por ejemplo, en el intestino de los animales) y no presentan mitocondrias. Recientemente, anlisis comparativos de secuencias nucleotdicas han sugerido que al menos dos grupos de estos organis mos, los diplomonados y los microsporidios, pudieron divergir muy temprana mente del linaje principal de las otras clulas eucariotas (Figura 1-21). Existe otro eucariota, la ameba Pelomyxa palustris que a pesar de que carece de mitocondrias, realiza un metabolismo oxidativo hospedando bacterias aerbicas en su citoplas ma, manteniendo con ellas una relacin simbitica permanente. Por consiguiente, los diplomonados y los microsporidios por una parte y Pelomyxa por otra, parecen dos de los estadios propuestos en la evolucin de los eucariotas.
* (T V . del T.) nicamente los microsporidios, protozoos endoparsitos, carecen de mitocondrias.

Hgiira l-'l El diplomonado Giardia. (A) Dibujo, tal com o se ve al microscopio ptico. (B) Micrografa electrnica de una seccin a travs del aplanado cuerpo de la clula. Se cree que G iardia es uno de los tipos celulares ms primitivos de clula eucariota. Es nucleado (de hecho tiene dos ncleos Idnticos), presenta citoesqueleto con actina y tubulina y se desplaza mediante flagelos tpicos que contienen microtbulos; sin embargo no tiene ni mitocondrias ni cloroplastos ni un retculo endoplasm tico normal ni com plejo de Golgi. Estudios de secuencias de nucletidos indican que est al menos tan relacionado con las bacterias como con otros eucariotas, de los que debi de diverger en etapas tempranas de la evolucin. G iardia vive como un parsito en el intestino y en humanos puede causar enfermedades. (A, segn G.D. Schmidt y L.S. Roberts, Foundations of parasitology, 4th Ed. St. Louis: Times Mirror/Mosby, 1989; B, por cortesa de Dennis Feely.)

De los procariotas a los eucariotas

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La adquisicin de mitocondrias debi de tener muchas repercusiones. La membrana plasmtica, por ejemplo, est fuertemente comprometida en el meta bolismo energtico en las clulas procariotas pero no en las eucariotas, en las que esta funcin crucial ha sido relegada a la mitocondria. Parece probable que la sepa racin de funciones dej libre a la membrana plasmtica eucariota para desarrollar otras caractersticas importantes. Concretamente, dado que las clulas eucariotas no necesitan mantener un marcado gradiente de H+a travs de su membrana plas mtica, tal como requieren las procariotas para la produccin de ATP, fue posible utilizar cambios controlados de la permeabilidad inica de la membrana plasmti ca con finalidad de seales celulares. As, aproximadamente al mismo tiempo en que surgieron las clulas eucariotas, aparecieron en la membrana plasmtica va rios tipos de canales inicos. En la actualidad, en organismos superiores estos ca nales median elaborados procesos de seales elctricas -especialmente en el siste ma nervioso- y controlan gran parte del comportamiento de organismos eucariotas unicelulares de vida libre como los protozoos (ver ms adelante).

clula

surco de segm entacin

Los cloroplastos son descendientes de una clula procariota incorporada 16

Los cloroplastos realizan la fotosntesis de una manera muy parecida a como lo hacen las cianobacterias procariotas, captando la luz solar en la clorofila que est unida a sus membranas. Algunos cloroplastos guardan una estrecha seme janza ultraestructural con las cianobacterias, siendo similares en tamao y en la m anera en que sus m em branas portadoras de clorofila estn apiladas (vase Figura 1-20). Adems, los cloroplastos se reproducen por divisin y contienen DNA, con una secuencia de nucletidos casi idntica a la de fragmentos del cro mosoma bacteriano. Todo ello sugiere claramente que los cloroplastos com par ten un ancestro com n con las cianobacterias y que evolucionaron a partir de procariotas que pasaron a vivir dentro de clulas eucariotas. Estos procariotas realizaron fotosntesis para sus huspedes como contraprestacin por la protec cin y por el am biente nutritivo que estos ltimos les suministraban. De hecho, la simbiosis de clulas fotosintetizadoras con otros tipos celulares es un fenm e no comn, y se pueden encontrar algunas clulas eucariotas actuales que con tienen autnticas cianobacterias (Figura 1-22).

Figura 1-22 Un pariente prxim o de las cianobacterias actuales, que vive en una relacin simbitica perm anente dentro de otra clula. Los dos organismos reciben el nombre conjunto de C y an op h ora p arad ox a. La cianobacteria est en el proceso de divisin. (Por cortesa de Jeremy D. Pickett-Heaps.)

arquebacterias

otras eubacterias

bacterias fotosintetizadoras prpuras no del azufre y sus parientes no fotosintetizadoras

cianobacterias

plantas

'IMK

cloroplastos

eucariota ancestral desconocido ancestro procariota anaerbico de los eucariotas

Figura 1-23 Hipottico origen de los eucariotas actuales, por simbiosis de procariotas aerbicos y anaerbicos. No se conoce la relacin entre el momento en que se origin el ncleo de los eucariotas y el momento en que la lnea de los eucariotas se separaron de las arquebacterias y de las eubacterias.

procariota ancestral

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Captulo 1 : La evolucin de la clula

Tabla 1-1 C o m p araci n e n tre organ ism os p ro ca rio ta s y eu cario tas

P ro ca rio ta s E u cario tas

Organismos bacterias y cianobacterias Tamao celular generalmente de 1 a 10 |xm en dimensin lineal Metabolismo anaerbico o aerbico Orgnulos pocos o ninguno DNA DNA circular en el citoplasma

RNA y protena sintetizados en el mismo compartimiento Citoplasma sin citoesqueleto: corrientes citoplasmticas, endocitosis y exocitosis ausentes Divisin celular separacin de cromosomas por unin a la membrana plasmtica Organizacin principalmente unicelular celular

RNA y protena

protistas, hongos, plantas y animales generalmente de 5 a 100 (j.m en dimensin lineal aerbico ncleo, mitocondrias, cloroplastos, retculo endoplasmtico, etc. molculas lineales de DNA muy largas que contienen muchas regiones no codificantes; organizado en cromosomas y rodeado por la envoltura nuclear RNA sintetizado y procesado en el ncleo; protenas sintetizadas en el citoplasma citoesqueleto compuesto por filamentos proteicos; corrientes citoplasmticas, endocitosis y exocitosis separacin de cromosomas mediante un aparato: el huso mittico principalmente pluricelular, con diferenciacin de muchos tipos celulares

La Figura 1-23 muestra los orgenes evolutivos de los eucariotas, de acuerdo con la teora simbitica. Sin embargo, debemos subrayar que las mitocondrias y los cloroplastos muestran, adems de similitudes, importantes diferencias con respecto a las bacterias aerbicas y a las cianobacterias actuales respectivamen te. Por ejemplo, su cantidad de DNA es muy reducida, de forma que la mayor parte de las molculas a partir de las cuales estn constituidos, son sintetizadas en algn otro lugar de la clula eucariota e importadas al orgnulo. Si bien pare ce que se originaron como bacterias simbiticas, han sufrido importantes cam bios evolutivos y han pasado a ser altamente dependientes de sus huspedes y sujetos a su control. La mayora de los eucariotas actuales tienen en comn las mitocondrias y toda una constelacin de rasgos que los distinguen de los procariotas (Tabla 11). Todos estos rasgos actan conjuntam ente proporcionando a las clulas euca riotas un gran nmero de capacidades diferentes de forma que tan slo es posi ble especular sobre cul de ellos surgi primero. Sin embargo, la adquisicin de mitocondrias por una clula eucariota anaerbica debe de haber sido un paso crucial en el xito de los eucariotas al proporcionarles el medio de utilizar una abundante fuente de energa para la direccin de sus complejas actividades.

Las clulas eucariotas contienen una rica dotacin de m em branas internas

Las clulas eucariotas suelen tener un volumen mucho mayor que las procario tas (por lo general, ms de mil veces superior) y contienen una cantidad propor cionalmente superior de la mayora de materiales celulares; una clula humana, por ejemplo, contiene 1000 veces ms DNA que una bacteria tpica. Este gran ta mao plantea problemas. Puesto que todas las materias primas para las reaccio nes de biosntesis que se producen en el interior de una clula deben entrar y sa lir pasando a travs de la membrana plasmtica que recubre su superficie, y puesto que en la membrana tambin se producen importantes reacciones, un aumento en el volumen celular exige un aumento en la superficie celular. Pero la geometra nos ensea que un aumento simple de la escala de una estructura in crementa el volumen al cubo de la dimensin lineal, mientras que el rea super ficial queda aumentada slo al cuadrado. Por consiguiente, si la gran clula euca riota ha de conservar la misma proporcin de superficie respecto al volumen que presenta la clula procariota, deber suplementar su rea superficial m e diante circunvoluciones, pliegues y otras transformaciones de su membrana.

De los procariotas a los eucariotas

23

ER rugoso

ribosomas

m itocondria

Es probable que esto explique en parte la compleja profusin de m em bra nas internas, que es una caracterstica bsica de todas las clulas eucariotas. Las membranas rodean al ncleo, a las mitocondrias y (en las clulas vegetales) a los cloroplastos. Forman un compartimiento laberntico denominado retculo endoplasmtico (Figura 1-24), donde son sintetizados los lpidos y las protenas de las m embranas celulares, as como el material destinado a ser exportado por la clula. Tambin forman agrupaciones de sculos aplanados, que constituyen el complejo de Golgi (Figura 1-25), que participa en la modificacin y en el trans porte de las molculas fabricadas en el retculo endoplasmtico. Las membranas rodean a los lisosomas, los cuales contienen reservas de las enzimas necesarias para la digestin intracelular, enzimas que de este modo no pueden atacar a las protenas y cidos nucleicos de la propia clula. De la misma manera, las mem branas rodean a los peroxisomas, donde se generan y degradan perxidos peli grosamente reactivos durante la oxidacin por el oxgeno de varios tipos de m o lculas. Las m embranas tambin forman pequeas vesculas y, en las plantas, una gran vacuola llena de lquido. Todas estas estructuras rodeadas de m embra na corresponden a distintos compartimientos intracitoplasmticos. En una c lula animal tpica, estos compartimientos (u orgnulos) ocupan casi la mitad del volumen celular total. El restante compartimiento del citoplasma, que incluye todos los elem entos celulares salvo los orgnulos delimitados por una membra na, suele recibir el nombre de citosol. Todas las estructuras membranosas que acabamos de citar se encuentran dentro de la clula. Por consiguiente, cmo pueden ayudar a solucionar el pro blema mencionado al principio y suministrar a la clula un rea superficial que sea suficiente para su gran volumen? La respuesta es que hay un intercambio con tinuo entre los compartimientos internos delimitados por membrana y el exterior de la clula. Esto se consigue mediante la endocitosis y la exocitosis, procesos que se presentan nicamente en las clulas eucariotas. En la endocitosis, porciones de la membrana superficial externa se invaginan y separan por estrangulacin, for mando unas vesculas citoplasmticas, rodeadas de membrana y que contienen sustancias que se hallaban presentes en el medio externo o que fueron adsorbidas en la superficie celular. Partculas muy grandes o incluso clulas extraas enteras son capturadas por fagocitosis -un a forma especial de endocitosis. La exocitosis es el proceso inverso, por el cual unas vesculas rodeadas de membrana, presentes en el interior de la clula, se fusionan con la membrana plasmtica y liberan su contenido al medio externo. De esta manera, las membranas que limitan a los compartimientos situados dentro de la clula incrementan el rea superficial efectiva de la clula para los intercambios de materia con el medio exterior. Como veremos en captulos posteriores, las diversas membranas y com par timientos rodeados por membrana de las clulas eucariotas han llegado a ser al tamente especializados, algunos para la secrecin, otros para la absorcin, otros para procesos especficos de biosntesis, etc.

Figura ) 24 Retculo endoplasmtico. Micrografa electrnica de un corte ultrafino de una clula de mamfero, mostrando zonas lisas y zonas rugosas del retculo endoplasmtico (ER). Las regiones lisas estn implicadas en el metabolismo lipdico mientras que las regiones rugosas, tapizadas de ribosomas, son lugares de sntesis de protenas destinadas a abandonar el citosol y entrar en otros compartimientos de la clula. (Por cortesa de George Palade.)
c o m p le jo do G olgi

1 |m
El complejo de Golgi. Micrografa electrnica de un corte ultrafino de una clula de mamfero, mostrando el aparato o com plejo de Golgi, que est compuesto por sculos membranosos aplanados dispuestos en mltiples filas (vase tambin el Panel 1-1, pgs. 18-19). El com plejo de Golgi interviene en la sntesis y empaquetamiento de molculas destinadas a ser segregadas por la clula, as como en el transporte de protenas recin sintetizadas hacia el compartimiento celular adecuado. (Por cortesa de Daniel S. Friend.)
Figura I

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Captulo 1 : La evolucin de la clula

Figura 1-26 Actina. En esta micrografia electrnica, preparada por la tcnica de sublimacin, se observa una red de filamentos de actina subyacente a la m embrana plasmtica de una clula animal. (Cortesa de John Heuser.)

I _______ 1
100 nm

Las clulas eucariotas tienen un citoesqueleto

Cuanto mayor es una clula, y cuanto ms complejas y especializadas son sus es tructuras internas, tanto mayor es la necesidad de mantener estas estructuras en sus lugares apropiados y de controlar sus movimientos. Todas las clulas eucario tas tienen un esqueleto interno, el cito esq u eleto , que confiere a la clula su forma, su capacidad de moverse y su habilidad para distribuir sus orgnulos y transportar los de una parte a otra de la clula. El citoesqueleto est compuesto por una red de filamentos proteicos, de los cuales dos de los ms importantes son los filamentos de actina (Figura 1-26) y los microtbulos. Los dos debieron aparecer en una poca muy temprana de la evolucin, ya que se presentan en todos los eucariotas de ma nera casi idntica. Ambos intervienen en la generacin de los movimientos celula res; los filamentos de actina, por ejemplo, permiten a las clulas eucariotas reptar, y participan en la contraccin muscular en los animales; mientras que los microt bulos son los principales elementos estructurales y generadores de fuerza de los ci lios y los flagelos -las largas proyecciones que existen en la superficie de algunas c lulas, que se mueven como ltigos y que sirven de instrumentos de propulsin. Los filamentos de actina y los microtbulos tambin son imprescindibles para los movimientos internos que tienen lugar en el citoplasma de todas las clu las eucariotas. As, los microtbulos del huso mittico son una parte esencial de la maquinaria utilizada habitualmente para distribuir el DNA en dos partes iguales entre las dos clulas hijas, cuando una clula eucariota se divide. Por consiguien te, la clula eucariota no se podra reproducir sin los microtbulos. En este y en otros casos, el movimiento mediante difusin libre sera demasiado lento o dema siado aleatorio para resultar eficaz. De hecho, a menudo los orgnulos de una c lula eucariota parecen estar adheridos de manera directa o indirecta al citoesque leto y cuando se mueven, ser propulsados a lo largo de las vas citoesquelticas.

Entre los protozoos se encuentran las clulas ms com plejas conocidas 17

La complejidad que puede alcanzar una clula eucariota se pone de manifiesto sobre todo en los protistas (Figura 1-27). Se trata de eucariotas unicelulares, de vida generalmente libre, que son evolutivamente diversos (vase Figura 1-16) y que muestran una asombrosa variedad de formas y comportamientos distintos: pueden ser fotosintetizadores o carnvoros, mviles o sedentarios. A menudo su anatoma celular es compleja e incluye estructuras tales como cirros sensoriales, fotorreceptores, flagelos, apndices a modo de patas, piezas bucales, flechas ur ticantes y haces contrctiles parecidos a msculos. Aunque son clulas aisladas, pueden ser tan complicadas y verstiles como muchos organismos pluricelula res. Esto es vlido sobre todo para el grupo de protistas conocido como p ro to z o o s, y est particularmente bien ilustrado en el grupo conocido como ciliad os.

De los procariotas a los eucariotas

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Didinium es un protozoo carnvoro. Tiene un cuerpo globular, de aproxima damente 150 Jim de dimetro rodeado por dos hileras de cilios; su extremo frontal es aplanado salvo una protrusin parecida a un hocico (Figura 1-28). Didinium se desplaza en el agua nadando a gran velocidad mediante el batido sincrnico de sus cilios. Cuando encuentra una presa apropiada, por lo general Paramecium, otro tipo de protozoo, despide desde la regin de su hocico un gran nmero de pequeos dardos paralizantes. Luego Didinium se fija a Paramecium y lo devora, invirtindose como una pelota hueca y rodeando a la otra clula, que es tan gran de como l mismo. La mayor parte de este complejo comportamiento -natacin, paralizacin y captura de la presa- se genera por estructuras citoesquelticas si tuadas inmediatamente por debajo de la membrana plasmtica. En este crtex celular se encuentran, por ejemplo, los haces paralelos de microtbulos que for man la parte central de cada cilio y que le permiten su movimiento de remar. Comportamientos depredadores de este tipo y el conjunto de caractersticas de las que depende -tam ao grande, capacidad de fagocitosis y habilidad para moverse en persecucin de la presa- son tpicas de los eucariotas. De hecho es probable que estas caractersticas aparecieran en un estadio temprano de la evolucin, haciendo posible la captura de bacterias para su domesticacin como mitocondrias y cloroplastos.

Figura 1-27 Grupo de protistas, ilustrando algunas de las enorm es variedades que pueden hallarse entre esta clase de organismos unicelulares. Estos dibujos estn realizados a diferente escala, pero en cada caso la barra representa 10 |im. Los organismos en (A), (B), (E), (F) e (I) son ciliados; (C) es un euglenoide; (D) es una ameba; (G) es un dinoflagelado; (H) es un heliozoo. (De M.A. Sleigh, The Biology of Protozoa. London: Edward Arnold, 1973.)

En las clulas eucariotas el m aterial gentico est empaquetado de form a com pleja
Las clulas eucariotas contienen una gran cantidad de DNA. Como hemos dicho anteriormente, las clulas humanas contienen unas mil veces ms DNA que una bacteria tpica. La longitud del DNA de las clulas eucariotas es tan grande que

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Captulo 1 : La evolucin de la clula

el peligro de enmaraamiento y rotura resulta muy elevado. Probablemente por esta razn, aparecieron unas protenas que slo se encuentran en los eucariotas, las historias, que se unen al DNA y lo enrollan formando cromosomas, compactos y manejables (Figura 1-29). El denso empaquetamiento del DNA en los cromosomas es una parte esencial de los preparativos para la divisin celular en los eucariotas (Figura 1-30). Todos los eucariotas (salvo una pequea excepcin) tienen histonas unidas a su DNA, y la importancia de estas protenas se refleja en su notable con servacin a lo largo de la evolucin: varias de las histonas de una planta de guisante son casi exactamente iguales, aminocido a aminocido, a las de una vaca. Las m embranas que envuelven el ncleo de las clulas eucariotas protegen la estructura del DNA y la delicada maquinaria de control asociada, previenen que se embrollen con el citoesqueleto mvil y las resguardan de muchos de los cam bios qumicos que se producen en el citoplasma. Tambin permiten separar e independizar dos pasos cruciales de la expresin gnica: (1) el copiado de las secuencias de DNA a secuencias de RNA (transcripcin del DNA) y (2) la utiliza cin de estas secuencias de RNA para dirigir la sntesis de protenas especficas (traduccin del RNA). En las clulas procariotas no existe la divisin de estos procesos en compartimientos -la traduccin de las secuencias de RNA a prote nas empieza en cuanto estas secuencias se transcriben, incluso antes de que su sntesis haya terminado. Pero en los eucariotas (salvo en las mitocondrias y en los cloroplastos que en este aspecto, como en otros, se parecen ms a las bacte rias), los dos pasos que conducen desde el gen hasta la protena estn estricta mente separados: la transcripcin ocurre en el ncleo, la traduccin en el cito plasma. El RNA ha de abandonar el ncleo antes de poder ser utilizado para guiar la sntesis proteica. Mientras se halla en el ncleo sufre una serie de com plicadas transformaciones, durante las cuales se eliminan unas zonas determi nadas de la molcula de RNA y otras se modifican (procesamiento del RNA). Debido a estas complejidades, el material gentico de una clula eucariota ofrece muchas ms oportunidades de control que las existentes en las bacterias.

_______________________ ( I
100 iim

Resumen

Las clulas vivas actuales se clasifican en procariotas (bacterias y organismos afi nes) y eucariotas. Aunque presentan estructuras relativamente sencillas, las clulas procariotas pueden ser bioqumicamente verstiles y muy diferentes: por ejemplo, en las bacterias pueden encontrarse todas las vas metablicas principales, incluidos los tres procesos energticos fundamentales, o sea la glucolisis, la respiracin y la fo tosntesis. Las clulas eucariotas son mayores y ms complejas que las clulas proca riotas, y contienen ms DNA, adems de otros componentes que permiten que este DNA sea modificado de manera compleja. El DNA de la clula eucariota est situado en un ncleo rodeado por una doble membrana, mientras que el citoplasma contie ne muchos otros orgnulos tambin delimitados por una doble membrana, entre los que se cuentan las mitocondrias, que realizan la oxidacin de las molculas del ali mento, y en las clulas vegetales, los cloroplastos, que realizan la fotosntesis. Diver sos tipos de pruebas sugieren que las mitocondrias y los cloroplastos son descendien tes de clulas procariotas primitivas que se establecieron como simbiontes dentro de una gran clula anaerbica. Las clulas eucariotas presentan tambin la caracters tica de poseer un citoesqueleto de filamentos proteicos que ayuda a organizar el cito plasma y proporciona la maquinaria para el movimiento. De las clulas simples a los organismos pluricelulares1 8
Los organismos unicelulares, tales como las bacterias y los protozoos, han teni do tanto xito al adaptarse a una gran variedad de ambientes distintos, que constituyen ms de la mitad de la biomasa total de la Tierra. A diferencia de los

Figura 1 -28 Un protozoo devorando a otro. Los ciliados son animales unicelulares que presentan una inmensa diversidad de formas y comportamientos. La fotografa superior muestra D idinium , un protozoo ciliado con posee dos bandas de cilios mviles y una protuberancia a modo de hocico en su extremo anterior, con la que captura sus presas. En la micrografa inferior D idinium est devorando otro protozoo, P aram eciu m . (Por cortesa de D. Barlow.)

De las clulas simples a los organismos pluricelulares

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organismos superiores, muchos de estos organismos unicelulares pueden sinte tizar a partir de unos cuantos nutrientes simples todas las sustancias que necesi tan y algunos de ellos se dividen ms de una vez cada hora. Cul fue entonces la ventaja selectiva que condujo a la evolucin de los organism os pluricelulares? La respuesta ms sencilla es que los organismos pluricelulares pueden ex plotar recursos que ninguna clula aislada podra utilizar tan bien. Este princi pio, aplicado por primera vez a una simple asociacin de clulas, ha llegado al l mite en los organismos pluricelulares que conocem os. La pluricelularidad, por ejemplo, permite que una planta llegue a ser fsicamente grande; que tenga ra ces en el suelo, donde un grupo de clulas pueden absorber agua y nutrientes; y que tenga hojas en el aire, donde otro grupo de clulas puede captar eficazmen te energa radiante del sol. En el tronco de la planta existen clulas especializa das que forman conductos para el transporte del agua y de los nutrientes entre las races y las hojas. Otro grupo de clulas especializadas forma una capa de corteza que impide la prdida de agua y hace posible un ambiente interno pro tegido (vase el Panel 1-2, pgs. 30-31). La planta en conjunto no compite direc tam ente con los organismos unicelulares por su nicho ecolgico; ha encontrado una m anera radicalmente diferente de sobrevivir y multiplicarse. A medida que aparecieron los diferentes tipos de animales y plantas, alte raron el medio am biente en el que se produjo la evolucin posterior. La super vivencia en una jungla exige caractersticas diferentes a las requeridas para so brevivir en mar abierto. Las innovaciones en el movimiento, la percepcin sensorial, la com unicacin, la organizacin social -todo ello permiti a los orga nismos eucariotas competir, propagarse y sobrevivir de manera cada vez ms compleja.

DNA

Figura 1-29 Dibujo esquem tico que ilustra com o las protenas denominadas histonas, de carga positiva, favorecen el plegado del DNA en los crom osom as.

Las clulas se pueden asociar formando colonias

Parece probable que uno de los primeros pasos en la evolucin de los organis mos pluricelulares fuera la asociacin de organismos unicelulares formando co lonias. La manera ms sencilla de conseguirlo consiste en que las clulas hijas permanezcan asociadas despus de cada divisin celular. Algunas clulas proca riotas muestran incluso un comportamiento social semejante, aunque de una manera primitiva. Las mixobacterias, por ejemplo, viven en el suelo y se alimen tan de molculas orgnicas insolubles que degradan mediante las enzimas de gradantes que segregan. Se mantienen unidas en colonias laxas, en las que las enzimas digestivas segregadas por las distintas clulas se ponen en comn, con lo que aumenta la eficiencia de la alimentacin (el efecto flotilla). Estas clulas representan de hecho una sofisticacin mxima entre los procariotas, ya que cuando el alimento disponible se agota, las clulas forman agregados ms den sos y constituyen un cuerpo fructfero pluricelular (Figura 1-31), dentro del cual las bacterias se diferencian a esporas que pueden sobrevivir incluso en condicio nes extremadamente hostiles. Cuando las condiciones vuelven a ser ms favora bles, las esporas del cuerpo fructfero germinan y producen un nuevo enjam bre de bacterias. Las algas verdes (que no deben ser confundidas con las algas azules proca riotas o cianobacterias) son eucariotas que existen en formas unicelulares, for mas coloniales y formas pluricelulares (Figura 1-32). Las diferentes especies de algas verdes se pueden estudiar en orden de complejidad, ilustrndose as el tipo de progresin que ocurri probablemente durante la evolucin de los ani males y plantas superiores. Las algas verdes unicelulares, como por ejemplo Chlamydomonas, se parecen a protozoos flagelados, salvo en que presentan cloroplastos que les permiten realizar la fotosntesis. En gneros estrechamente em parentados, grupos de clulas flageladas viven en colonias, unidas por una m a triz de molculas extracelulares segregadas por las propias clulas. Las especies ms sencillas (las del gnero Gonium ) presentan la forma de un disco cncavo formado por 4, 8, 16 o 32 clulas. Sus flagelos se mueven de manera indepen diente, pero puesto que todos estn orientados en la misma direccin pueden

crom osom a

Figura 1-30 Dibujo esquem tico de clulas eucariotas en mitosis. A la izquierda se muestra una clula animal y a la derecha una clula vegetal. La envoltura nuclear se ha roto, y el DNA, una vez replicado, se ha condensado en dos dotaciones completas de cromosom as. Cada una de las dos clulas en formacin recibe una dotacin de cromosomas, los cuales son desplazados por el huso mittico que est compuesto mayoritariamente por microtbulos.

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Captulo 1 : La evolucin de la clula

Figura 1-31 Micrografa electrnica de barrido, de los cuerpos fructferos formados por un m yxobacterium Cada cuerpo fructfero, empaquetado con esporas, est formado por la agregacin y diferenciacin de aproximadamente un milln de mixobacterias. (De P.L. Grilione y J. Pangborn,/. B acteriol. 124:1558-1565, 1975.)

{Chondromyces crocatus).

0,1 m m

propulsar a la colonia por el agua. Todas las clulas son equivalentes entre s, y cada una de ellas se puede dividir dando lugar a una nueva colonia. En otros g neros se encuentran colonias mayores, siendo las ms espectaculares las del g nero Volvox, algunas de cuyas especies viven en colonias de 50 000 o ms clulas unidas formando una esfera hueca. En Volvox, las distintas clulas que forman una colonia estn conectadas mediante finos puentes citoplasmticos, de modo que el batido de sus flagelos est coordinado para propulsar a toda la colonia como una pelota (Figura 1-32). Dentro de la colonia de Volvox existe un cierto reparto del trabajo entre las clulas; un reducido nmero de ellas se ha especiali zado en la reproduccin, sirviendo de precursoras de nuevas colonias. Las otras clulas son tan dependientes unas de otras que no pueden vivir aisladas, y el or ganismo muere si se destruye la colonia.

Las clulas de un organismo superior se especializan y cooperan

En algunos aspectos, Volvox es ms parecido a un organismo pluricelular que a una simple colonia. Todos sus flagelos se mueven sincrnicam ente cuando la colonia se desplaza en el agua, de forma que la colonia est estructural y funcio nalmente polarizada y puede nadar hacia una fuente lejana de luz. Las clulas reproductoras suelen estar confinadas en un extremo de la colonia, donde se di viden formando nuevas colonias en miniatura que inicialmente permanecen dentro de la esfera madre. As, y aunque de una manera primitiva, Volvox m ues tra los dos rasgos esenciales de todos los organismos pluricelulares: sus clulas se especializan y cooperan. Mediante la especializacin y la cooperacin las clu las se com binan formando un nico organismo coordinado, con capacidades mayores que las de cualquiera de las partes que lo componen. Los esquemas organizados de diferenciacin celular se presentan incluso en algunos procariotas. Por ejemplo, muchos tipos de cianobacterias permanecen agrupados despus de la divisin celular, formando cadenas filamentosas que pueden alcanzar hasta un metro de longitud. A lo largo del filamento, y a inter valos regulares, las distintas clulas adquieren un carcter distintivo y se vuelven capaces de incorporar nitrgeno atmosfrico en molculas orgnicas. Estas es casas clulas especializadas realizan la fijacin del nitrgeno para las clulas ve cinas y comparten con ellas los productos. Pero las clulas eucariotas han llega do mucho ms lejos en este tipo de distribucin organizada del trabajo; ellas, a diferencia de las clulas procariotas, son las unidades vivas a partir de las cuales estn construidos todos los organismos pluricelulares ms complejos.

La llave equivale en cada caso a 50 moi Figura 1 -32 Cuatro gneros de algas verdes, estrecham ente emparentados, mostrando una progresin desde una organizacin unicelular hasta una organizacin colonial y multicelular. (Por cortesa de David Kirk.)

De las clulas simples a los organismos pluricelulares

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LA PLANTA m eristem o apical del brote

HOJA

epiderm is superior nervio principal (del haz) _____ ___/ nervio de la hoja r m esfilo estomas (parnquima) de la epiderm is inferior (del envs) colnquim a

La p la n ta jo v e n c o n flo re s q u e se p r e s e n ta a la izq u ie rd a e s t c o n s titu id a p o r tre s tip o s d e rg a n o s : h o ja s , ta llo s y ra c e s . A su v e z , c a d a r g a n o v e g e ta l e s t f o r m a d o p o r tr e s s is te m a s h is to l g ic o s : el b s ic o , el d r m ic o y el v a s c u la r . En ltim o t r m in o , los tr e s s is te m a s h is to l g ic o s d e r iv a n d e la a c tiv id a d p r o life r a tiv a d e u n a c lu la d e los m e r is t e m o s a p ic a le s d e l b r o te y d e la ra z , y c a d a u n o d e e llo s c o n tie n e un n m e r o r e la tiv a m e n t e r e d u c id o d e tip o s c e lu la r e s e s p e c ia liz a d o s . En e ste P an e l se d e s c rib e n e sto s tre s s is te m a s h is to l g ic o s c o m u n e s , y las c lu la s q u e los f o r m a n .

internudo LOS TRES SISTEMAS HISTOLOGICOS

La d iv is i n c e lu la r, el c re c im ie n to y la d ife re n c ia c i n d an lu g a r a s is te m a s h is to l g ic o s c o n fu n c io n e s e sp e c ia liz a d a s . T E J ID O E P ID R M IC O ( ^ H ) : S e tr a ta del re c u b rim ie n to I""

TALLO

planta joven con flores (dicotilednea)

e x te rn o p ro te c to r d e la p la n ta q u e est en c o n ta c to con | _ el m e d io . Fac ilita la c a p ta c i n d e a g u a y de io n e s en las

haz vascular

races y re g u la el in te rc a m b io g a s e o s o en las h o ja s y en los ta llo s . T E J ID O V A S C U L A R : El flo e m a

(ESI) y el x ile m a

(I

I)

fo r m a n c o n ju n ta m e n te un s is te m a v a s c u la r c o n tin u o a / tra v s de la p la n ta . Este te jid o c o n d u c e a g u a y s o lu to s e n tre los rg a n o s y ta m b i n p ro p o rc io n a s o p o rte

RAZ

m e c n ic o . T E J ID O B S IC O (tZ H I): Este te jid o de e m p a q u e ta m ie n to y de s o p o rte o c u p a la m a y o r p a rte del v o lu m e n d e la p la n ta

endoderm is periciclo m eristem os apicales de la raz

jo v e n . T a m b i n in te rv ie n e en la fa b ric a c i n y a lm a c e n a m ie n to de a lim e n to . _ _

TEJIDO BASICO

El s is te m a h is to l g ic o bs ic o c o n tie n e tre s tip o s c e lu la re s p rin c ip a le s lla m a d o s p a r n q u im a , c o l n q u im a y e s c le r n q u im a .

El c o l n q u im a e st fo r m a d o p o r c lu la s v iv a s s im ila re s a las c lu la s p a r e n q u im tic a s e x c e p to en q u e tie n e n p a re d e s c e lu la re s m u y g ru e s a s y en q u e h a b itu a lm e n te son a la rg a d a s y e st n e m p a q u e ta d a s en fib ra s a m o d o d e c u e rd a s .

Las c lu la s p a r e n q u m tic a s se e n c u e n tra n en to d o s los s is te m a s h is to l g ic o s . S o n c lu la s v iv a s , g e n e r a lm e n te c a p a c e s d e d iv id irs e p o s te r io r m e n te , y q u e p re s e n ta n un a p a re d c e lu la r p r im a ria d e lg a d a . E stas c lu la s tie n e n v a ria s fu n c io n e s . Las c lu la s m e ris te m tic a s a p ic a l y la te ra l d e los b ro te s y d e las rac es s u m in is tra n n u e v a s c lu la s n e c e s a ria s p a ra el c re c im ie n to . La p ro d u c c i n de a lim e n to y de a lm a c n tie n e lu g a r en las c lu la s fo to s in t tic a s d e la h o ja (d e n o m in a d a s c lu la s del m e s filo ) y del ta llo ; el p a r n q u im a de re s e rv a fo r m a el v o lu m e n d e m u c h o s fru to s y v e rd u ra s . A c au s a d e su c a p a c id a d p r o life ra tiv a , las c lu la s p a r e n q u im tic a s a c t a n c o m o c lu la s m a d re c ic a triz a n d o las h e rid a s e in te r v in ie n d o en la re g e n e ra c i n .

rS {
....... Y'" / /

S o n c a p a c e s d e a la rg a rs e y de p ro p o rc io n a r s o p o rte m e c n ic o al s is te m a h is to l g ic o b s ic o de las re g io n e s de la p la n ta en c re c im ie n to . Las c lu la s c o le n q u im a to s a s son e s p e c ia lm e n te a b u n d a n te s en las re g io n e s s u b e p id rm ic a s d e los ta llo s .

^ vacuola cloroplasto

localizaciones tpicas de grupos de soporte de clulas en un tallo fibras esclerenqu imticas haz vascular colnquim a "
El e s c le r n q u im a c o m o el c o l n q u im a , tie n e fu n c io n e s de re fu e rz o y d e s o p o rte . S in e m b a r g o , haz de fibras n o rm a lm e n te e st f o r m a d o p o r c lu la s m u e rta s , con g ru e s a s p a re d e s c e lu la re s s e c u n d a ria s lig n ific a d a s in c a p a c e s de a la rg a rs e c u a n d o la p la n ta cre c e . Los do s tip o s c o m u n e s son las fib ra s , q u e a m e n u d o fo r m a n la rg o s ha c e s, y las e s c le re id a s , q u e son c lu la s m s c o rta s y ra m ific a d a s e x is te n te s en las c u b ie rta s d e la s e m illa y en el fru to .

ncleos clulas del m esfilo de la hoja

clulas m eristem ticas de la raz

/ U n a c lu la d e tra n s fe re n c ia , un a fo rm a e s p e c ia liz a d a de c lu la p a re n q u im tic a , se id e n tific a f c ilm e n te g ra cia s a un as c o m p le ja s in v a g in a c io n e s de la p a re d c e lu la r p r im a ria . El in c re m e n to del re a de la m e m b r a n a p la s m tic a b a jo estas p a re d e s fa c ilita el r p id o tr a n s p o r te de s o lu to s hacia y d e s d e las c lu la s del s is te m a v a s c u la r. I /\ / /

vaso xilem tico clula de transferencia

esclereida

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Panel 1-2 Modelos celulares y tejidos con los que estn construidas las plantas superiores.

TEJIDO DERMICO
La e p id e r m is e s la c u b ie r ta p r im a r ia p r o te c to r a e x t e r n a d e l c u e r p o d e la p la n ta . Las c lu la s d e la e p id e r m is t a m b i n e s t n m o d if ic a d a s f o r m a n d o lo s e s to m a s y v a r io s tip o s d e p e lo s .

Lo s p e lo s (o t r ic o m a s ) s o n a p n d ic e s d e r iv a d o s d e las c lu la s e p id r m ic a s . E x is te u n a g r a n v a r ie d a d d e f o r m a s ; n o r m a lm e n t e se e n c u e n t r a n e n t o d a s la s p a r te s d e la p la n ta . Lo s p e lo s in t e r v ie n e n e n la p r o t e c c i n , a b s o r c i n y s e c r e c i n ; e je m p lo s :

espacio areo
^ 5| a m
Lo s e s t o m a s s o n a b e r t u r a s d e la e p id e r m is , p r in c ip a lm e n t e e n la c a ra in f e r io r d e la h o ja (e n v s ), q u e r e g u la n el in t e r c a m b io g a s e o s o e n la p la n ta . E s t n f o r m a d o s p o r d o s c lu la s e p id r m ic a s e s p e c ia liz a d a s lla m a d a s clu la s g u a rd a , las c u a le s r e g u la n el d i m e t r o d e l p o ro . En c a d a e p id e r m is , lo s e s t o m a s e s t n d is t r ib u id o s s ig u ie n d o d if e r e n t e s o r d e n a c io n e s e s p e c fic a s d e la e s p e c ie .

epiderm is

p e lo s u n ic e lu la r e s j v e n e s d e la e p id e r m is d e la s e m illa d e l a lg o d n . C u a n d o s to s c re c e n , la s p a r e d e s se e n g r u e s a n s e c u n d a r ia m e n t e c o n c e lu lo s a f o r m a n d o la s f ib r a s d e a lg o d n

La e p id e r m is ( n o r m a lm e n t e d e u n a s o la c a p a d e c lu la s d e g r o s o r ) c u b r e c o m p le t a m e n t e el t a llo , la h o ja y la ra z d e la p la n ta jo v e n . Las c lu la s e s t n v iv a s , t ie n e n g r u e s a s p a r e d e s c e lu la r e s p r im a r ia s , y e s t n r e c u b ie r t a s a p ic a lm e n t e p o r u n a c u tc u la e s p e c ia l c o n u n a c a p a e x te r n a d e c e r a . Las c lu la s e s t n n t im a m e n t e u n id a s s ig u ie n d o d ife r e n te s o r d e n a c io n e s .

Haces vasculares
N o r m a lm e n t e e n las ra c e s h a y un s o lo h a z v a s c u la r , p e r o e n lo s ta llo s h a y v a r io s h a c e s . En las d ic o t ile d n e a s e s to s h a c e s e s t n o r d e n a d o s s ig u ie n d o u n a e s tr ic ta s im e tr a r a d ia l, p e r o en las m o n o c o t ile d n e a s e s t n d is p e r s o s d e f o r m a m s ir r e g u la r .

epiderm is

vaina de esclernquima epiderm is del haz de una hoja epiderm is de un tallo floem a

los pelos radiculares desem pean una im portante funcin en la captacin de agua e iones

parenquima TEJIDO VASCULAR

El f lo e m a y el x ile m a f o r m a n c o n ju n t a m e n t e u n s is te m a v a s c u la r c o n tin u o p o r to d a la p la n t a . E n p la n ta s j v e n e s n o r m a lm e n t e j| e s t n a s o c ia d a s a v a r io s t ip o s c e lu la r e s d is tin to s e n los haces vasculares. El f lo e m a y e l x ile m a s o n t e jid o s c o m p le jo s . S u s e le m e n t o s c o n d u c t o r e s e s t n a s o c ia d o s c o n c lu la s

X ilem a

un haz vascular tpico de un tallo joven de un rannculo.

El x ile m a t r a n s p o r t a p o r la p la n ta a g u a e io n e s d is u e lto s . Las p r in c ip a le s c lu la s c o n d u c t o r a s s o n lo s e le m e n t o s d e l v a s o m o s t r a d a s a q u , q u e e n la m a d u r e z s o n c lu la s m u e r t a s q u e h a n p e r d id o la m e m b r a n a p la s m t ic a . La p a r e d c e lu la r se h a e n g r o s a d o s e c u n d a r ia m e n t e y s e h a lig n if ic a d o r V fu e r te m e n te . C o m o se v e e n la f ig u r a , g r a n p a r te d e

p a r e n q u im t ic a s q u e m a n t ie n e n e in t e r c a m b ia n m a te r ia le s c o n e llo s . A d e m s , v a r io s g r u p o s d e c lu la s c o le n q u im t ic a s y e s c le r e n q u im t ic a s p r o p o r c io n a n s o p o r te m e c n ic o .

Floem a

placa cribosa m em brana plasmtica

pequeo elem ento de vaso en el extrem o radicular

p
p

la s p a r e d e s t e r m in h a n e lim in a d o , lo c u a l p e r m it e la f o r m a c i n d e t u b o s c o n t in u o s m u y la r g o s .

f ^ r =====:~ z ^ ? J J C

clula acompaante area cribosa visin externa de un elem ento de tubo criboso

elem ento de tubo criboso en seccin

gran elem ento de vaso m aduro

Lo s e le m e n t o s d e l v a s o e s t n n t im a m e n t e a s o c ia d o s s c o n c lu la s p a r e n q u im t ic a s d e l x ile m a q u e tr a n s p o r t a n a c t iv a m e n t e s o lu to s s e le c c io n a d o s h a c ia d e n t r o y h a c ia fu e r a d e lo s e le m e n t o s a t r a v s d e s u m e m b r a n a p la s m t ic a .

d e lo s tu b o s c rib o s o s m a d u r o s s o n c lu la s v iv a s , in te rc o n e c ta d a s p o r p e r fo r a c io n e s e n s u s p a r e d e s te r m in a le s q u e so n p ia s m o d e s m o s a m p lia d o s y m o d ific a d o s (p la c a s c rib o s a s ). E s ta s c l u l a s m a n tie n e n su m e m b r a n a p la s m tic a p e r o h a n p e r d id o s u s n c le o s y g r a n p a r te d e su c ito p la s m a ; p o r lo t a n t o , p a ra su m a n t e n im ie n t o n e ce sita n el c o n c u r s o d e c lu la s a c o m p a a n te s a s o c ia d a s . E s ta s c lu la s a c o m p a a n te s t ie n e n la fu n c i n a d ic io n a l d e a c tiv a r el t r a n s p o r t e de

El f lo e m a p a r tic ip a e n el t r a n s p o r t e d e lo s s o lu to s o r g n ic o s d e la p la n ta . L as c lu la s c o n d u c t o r a s p r in c ip a le s ( e le m e n to s ) e s t n a lin e a d a s f o r m a n d o tu b o s lla m a d o s tu b o s crib oso s, Los e le m e n to s

clulas parenquim ticas del xilem a elem ento del vaso

'olenlas a lim e n tic ia s

s o lu b le s h a c ia d e n t r o y h a c ia fu e ra d e lo s iicm eriros d e l tu b o c rib o s o a t r a v s d e las r e a s c rib o s a s de la pa red.

La organizacin pluricelular depende de la cohesin entre las clulas

Para formar un organismo pluricelular las clulas han de estar unidas entre s de alguna m anera y los eucariotas han desarrollado diversos sistemas para satisfa cer esta necesidad. Como ya hemos dicho las clulas de Volvox no se separan por com pleto despus de la divisin celular sino que permanecen conectadas mediante puentes citoplasmticos. En las plantas superiores, las clulas no slo perm anecen conectadas por puentes citoplasmticos (denominados plasmodesmos), sino que adems quedan encerradas en un rgido conjunto de cmaras con paredes celulsicas que han segregado las propias clulas (paredes celula

res).
Las clulas de la mayora de los animales carecen de paredes rgidas y los puentes citoplasmticos son poco frecuentes. En lugar de ello, las clulas se ha llan unidas por una red relativamente laxa de grandes molculas orgnicas extracelulares (denominada matriz extracelular ) y por las adherencias entre sus membranas plasmticas. Muy a menudo las uniones lado-a-lado entre clulas las m antienen unidas formando una capa pluricelular o epitelio.

Las capas de clulas epiteliales envuelven un medio interno protegido

De todos los sistemas a travs de los que las clulas animales estn relacionadas formando los tejidos pluricelulares, quizs la disposicin epitelial es la que tiene una importancia ms fundamental. La capa epitelial tiene para la evolucin de los organismos pluricelulares complejos un significado muy parecido al que la mem brana celular tiene para la evolucin de las clulas aisladas complejas. La im portancia de las capas epiteliales est bien ilustrada en otro grupo in ferior de animales, el de los celentreos. Este grupo incluye las anmonas de mar, las medusas y los corales, as como el pequeo organismo de agua dulce Hydra. Los celentreos estn constituidos por dos capas de epitelio, una capa externa, o ectodermo, y una capa interna o endodermo. La capa endodrmica rodea una ca vidad, el celentern, en donde se digiere el alimento (Figura 1-33). Entre las clu las endodrmicas existen algunas que segregan enzimas digestivas al celentern,

Figura 1-33 Organizacin corporal de Hydra. (A) H ydra oligactis en su entorno natural; en estas especies de Hydra los tentculos se retraen para capturar las presas. Las proyecciones que se producen por gemacin del cuerpo son hijos que se separarn del padre. (B) Diagrama de la arquitectura celular del cuerpo de una H ydra tpica. La capa externa de clulas (ectodermo) es esencialm ente protectora, predadora y sensorial, mientras que las clulas de la capa interna (endodermo) desempean fundamentalmente funciones digestivas. Ambas capas epiteliales tienen tambin una funcin contrctil o muscular que permite al animal moverse. Los movimientos estn coordinados por clulas nerviosas que ocupan una posicin protejida en el interior de cada epitelio, formando una malla interconectada. (A, por cortesa de Richard Manuel.)

ENDODERMO

ECTODERMO

clula glandular

clula sensorial clula intersticial clula nerviosa clula epiteliom uscular clula urticante

celentern endoderm o ectoderm o

clula digestiva

capa m uscular transversal (A) (B)

capa m uscular longitudinal

m atriz extracelular (mesoglea)

32

Captulo 1 : La evolucin de la clula

Figura 1-34 Hydra alimentndose. Hydra puede realizar una amplia gama de actividades bastante complejas. Aqu se ha fotografiado un organismo solitario capturando con sus tentculos pequeas pulgas de agua; en el ltimo panel se halla introduciendo estas presas en su celentern para su digestin. (Cortesa de Amata Hornbruch.)

mientras que otras absorben, continuando la digestin de las molculas de nu trientes que aquellas enzimas haban transformado. Al formar una capa epitelial densa y coherente que impide que todas estas molculas se pierdan hacia el ex terior, las clulas endodrmicas crean por s mismas un medio ambiente en el celentern que es apropiado para sus propias tareas digestivas. Las clulas ectodrmicas, orientadas hacia el exterior permanecen especializadas para el con tacto con el mundo exterior. En el ectodermo, por ejemplo, se hallan clulas que contienen una cpsula venenosa con un dardo enrollado que puede ser dispara do para matar los pequeos animales de los que se alimenta Hydra. La mayora de las dems clulas ectodrmicas o endodrmicas tienen propiedades pareci das a las musculares, permitiendo el movimiento de Hydra, tal como debe ha cerlo un predador. Entre la doble capa de ectodermo y endodermo, se encuentra otro com par timiento separado tanto del celentern como del medio exterior. Aqu, se hallan las clulas nerviosas, ocupando estrechos espacios entre las clulas epiteliales, por debajo de la superficie externa donde las uniones celulares ("cell junctions') especializadas entre las clulas epiteliales forman una barrera impermeable. El animal puede cambiar su forma y moverse por medio de contracciones de clu las del epitelio semejantes a las de las clulas musculares, y las clulas nerviosas transmiten seales elctricas controlando y coordinando estas contracciones (Figuras 1-33, 1-34 y 1-35). Como veremos ms adelante, las concentraciones de iones orgnicos simples en el medio que rodea a una clula nerviosa son crucia les para su funcionamiento. La mayora de clulas nerviosas -incluidas las nues tras- estn diseadas para trabajar cuando se hallan en un medio que tenga una composicin inica similar a la del agua de mar. Este hecho probablemente re fleja las condiciones en las que evolucionaron las primeras clulas nerviosas. La mayora de celentreos, aunque no todos, todava viven en el mar. Hydra, con cretamente, vive en el agua dulce. Es evidente que ha sido capaz de colonizar este nuevo hbitat, sobre todo, gracias a que sus clulas nerviosas se hallan con tenidas en un espacio aislado del exterior mediante capas de clulas epiteliales que m antienen el ambiente interno necesario para el funcionamiento de las c lulas nerviosas.

La com unicacin clula-clula controla el esquema espacial de los organismos pluricelulares 19

Las clulas de Hydra no estn nicamente agrupadas m ecnicam ente y conecta das mediante uniones que aslan el interior del ambiente exterior; tambin estn comunicadas entre s a lo largo de todo el cuerpo. Si se secciona un extremo de una Hydra, las clulas restantes reaccionan ante la ausencia de la parte amputaFigura 1-35 Hydra nadando. H ydra puede nadar, deslizarse sobre su base o, como muestra el dibujo, desplazarse dando volteretas.

De las clulas simples a los organismos pluricelulares

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da adaptando sus caractersticas y reordenndose regenerando un animal com pleto. Es evidente que ciertas seales pasan de una parte del organismo a otra, gobernando el desarrollo de su esquema corporal -q u e presenta tentculos y una boca en un extremo y un pie en el otro. Adems, estas seales son indepen dientes del sistem a nervioso. Si una Hydra en desarrollo se trata con una droga que impide la formacin de clulas nerviosas, el animal resulta incapaz de m o verse, de atrapar las presas o de alimentarse. Sin embargo, su sistema digestivo funciona an con normalidad por lo que el animal puede ser mantenido vivo por cualquiera que tenga la paciencia de introducirle su alimento normal en la boca. En estos animales alimentados artificialmente se mantiene el patrn cor poral normal de modo que las zonas perdidas son regeneradas, tal como ocurre en los animales que tienen el sistema nervioso intacto. Los animales superiores ms complejos han evolucionado a partir de unos humildes antepasados parecidos a los celentreos. Estos animales superiores deben su complejidad a un aprovechamiento ms sofisticado de los mismos principios bsicos de cooperacin celular en los que se basa la construccin de Hydra. Las capas de clulas epiteliales, revisten todas las superficies externas e internas del cuerpo, creando compartimientos resguardados y ambientes inter nos controlados en los que las clulas diferenciadas realizan funciones especiali zadas. Las clulas especializadas interaccionan y se comunican entre s estable ciendo seales que determinan el carcter de cada clula de acuerdo con su situacin en el conjunto de la estructura. Pero para mostrar cmo es posible ge nerar organismos pluricelulares con un tamao, una complejidad y una preci sin como las existentes en un rbol, una mosca o un mamfero, es necesario estudiar con mayor detalle la secuencia de procesos que tienen lugar durante el desarrollo.

La m em oria celular perm ite el desarrollo de patrones complejos

Las clulas de casi todos los organismos pluricelulares proceden de la divisin repetida de una nica clula precursora; estas clulas constituyen un clon. A m e dida que contina la proliferacin y el clon crece, algunas de las clulas, como ya hemos visto, se diferencian de las otras en respuesta a los datos que les pro porcionan las clulas vecinas, adoptando normalmente una estructura diferen te, unas caractersticas qumicas diferentes y una funcin diferente. Es notable que las clulas eucariotas y su progenie persistan en sus estados especializados incluso despus de que las influencias que dirigieron originariamente su dife renciacin hayan desaparecido -e n otras palabras, estas clulas tienen una m e moria. Por consiguiente, su Carcter final no est determinado simplemente por su ambiente final, sino ms bien por toda la secuencia de influencias a las que han estado sometidas en el transcurso del desarrollo. As, a medida que el cuer po crece y madura quedan especificados detalles progresivamente ms finos del esquema corporal adulto, creando un organismo de complejidad creciente cuya forma ltima es la expresin de una larga historia de desarrollo que es recordada por las clulas.

Los programas bsicos de desarrollo tienden a ser conservados en la evolucin 20

La estructura final de un animal refleja su historia evolutiva la cual, como el de sarrollo, presenta una crnica de progreso desde lo simple hasta lo complejo. Cul es entonces la conexin entre estas dos perspectivas, la de la evolucin por un lado y la del desarrollo por otro? Durante la evolucin m uchos de los dispositivos de desarrollo que surgieron en los organismos pluricelulares ms sencillos se han conservado como princi pios bsicos para la construccin de sus descendientes ms complejos. Ya he mos mencionado, por ejemplo, la organizacin de las clulas en epitelios. Algu nos de los tipos celulares especializados, como por ejemplo las clulas nerviosas,

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Captulo 1: La evolucin de la clula

F.Fiscli.

A. Salamander. T.Schildkrto.

H.Hului

Kaninchen

M..Mensch

se encuentran a nivel de casi todo el reino animal, desde Hydra hasta el hombre. Estudios moleculares, que discutiremos ms adelante en este libro, revelan un sorprendentemente elevado nmero de parecidos de desarrollo a un nivel gen tico fundamental, incluso entre especies tan remotamente relacionadas como los mamferos y los insectos. Adems, en trminos anatmicos las primeras fases del desarrollo de animales cuyas formas adultas son radicalmente diferentes son a menudo sorprendentemente similares; se necesita experiencia para distinguir, por ejemplo, un embrin temprano de pollo de un embrin temprano humano (Figura 1-36). Observaciones de este tipo no son difciles de comprender. Consideremos el proceso mediante el cual, en el transcurso de la evolucin, aparece un nuevo rasgo anatmico -p or ejemplo, un pico alargado. Se produce una mutacin ale atoria que modifica la secuencia de aminocidos de una protena y, por lo tanto, su actividad biolgica. Esta alteracin puede afectar por casualidad a las clulas responsables de la formacin del pico, de tal manera que produzcan un pico ms largo. Pero la mutacin ha de ser tambin compatible con el desarrollo del resto del organismo: slo entonces ser propagada por la seleccin natural. La formacin de un pico ms largo tendra poca ventaja selectiva si, en el proceso, se perdiera la lengua o no llegaran a desarrollarse los odos. Una catstrofe de este tipo es mucho ms probable si la mutacin afecta a acontecimientos que se producen en las primeras fases del desarrollo que si afecta a los que ocurren cer ca del final. Las primeras clulas de un embrin son como los naipes de la base de un castillo de naipes -casi todo depende de ellas: una pequea alteracin de sus propiedades, probablemente dar como resultado un desastre. Los pasos

Figura 1-36 Com paracin del desarrollo em brionario de un pez, de un anfibio, de un reptil, de un pjaro y de una seleccin de mamferos. Los estadios tempranos (a rr ib a ) son muy similares pero los ltimos estadios {abajo) son ms divergentes. Los estadios tempranos estn dibujados ms o menos a escala y los ltimos estadios no. (De E. Haeckel, Anthropogenie, oder Entwickelungsgeschichte des Menschen. Leipzig: Engelmann, 1874. Por cortesa de the Bodleian Library, Oxford.)

De las clulas simples a los organismos pluricelulares

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fundamentales han sido congelados en procesos de desarrollo, del mismo modo que el cdigo gentico o los mecanismos de sntesis proteica han quedado congelados en la organizacin bioqumica bsica de la clula. En cambio, las c lulas producidas hacia el final del desarrollo (o producidas tempranamente pero que forman estructuras accesorias como la placenta, que no se incorporan al cuerpo adulto) tienen ms libertad para cambiar. Probablemente sta es la ra zn de que los embriones de las diferentes especies se parezcan a menudo entre s en las primeras fases y de que, a medida que se desarrollan, repitan los pasos de la evolucin.

Las clulas som ticas del cuerpo de los vertebrados muestran ms de 200 tipos diferentes de especializacin
La riqueza de especializaciones diferentes que se encuentra en las clulas de un animal superior es incom parablem ente mayor a la que puede presentar cual quier procariota. En un vertebrado se pueden distinguir fcilmente ms de 200 tipos celulares diferentes y es probable que muchos de estos tipos de clulas in cluyan, bajo un mismo nombre, a un elevado nmero de variedades con dife rencias sutiles. El Panel 1-3 (pgs. 38-39) muestra una pequea seleccin de ellos. En esta profusin de comportamientos especializados se puede observar, en un mismo organismo, la asombrosa versatilidad de la clula eucariota. Gran parte de los conocim ientos actuales sobre las propiedades generales de las clu las eucariotas procede del estudio de estos tipos especializados de clulas que muestran individualmente, hasta un grado excepcional, aspectos que son bsi cos para todas las clulas. Cada rasgo y cada orgnulo de cada prototipo celular que hem os esbozado en el Panel 1-1 (pgs. 18-19) est desarrollado hasta un grado extraordinario o revelado con especial claridad en algn tipo celular. Para tomar un ejemplo arbitrario, consideremos la unin neuromuscular, en la que intervienen slo tres tipos de clulas: una clula muscular, una clula nerviosa y una clula de Schwann. Cada una de ellas desempea un papel muy distinto (Fi gura 1-37). 1. La clula muscular se ha especializado en la contraccin. Su citoplasma est lleno de filamentos proteicos, incluido un elevado nmero de fila m entos de actina, dispuestos organizadamente. Existen tambin num e rosas mitocondrias distribuidas entre los filamentos proteicos, que sumi nistran ATP como combustible para el aparato contrctil. 2. La clula nerviosa estimula al msculo a contraerse; transmite al mscu lo una seal excitadora procedente del cerebro o de la mdula espinal. Por consiguiente, la clula nerviosa es extraordinariamente alargada: su cuerpo principal, que contiene el ncleo, puede hallarse a ms de un m e tro de la unin con el msculo. El citoesqueleto est desarrollado de for ma correspondiente manteniendo esta forma poco habitual de la clula y transportando eficazmente los materiales desde un extremo al otro de la misma. Pero la especializacin ms crucial de la clula nerviosa radica en su m em brana plasmtica, la cual contiene protenas que actan como bom bas de iones y como canales inicos, provocando un movimiento de iones que equivale a un flujo de electricidad. Aunque todas las clulas contienen estos canales y bom bas en sus membranas plasmticas, la c lula nerviosa los ha aprovechado de tal manera que un pulso de electrici dad se puede propagar en una fraccin de segundo desde un extremo al otro de la clula, transmitiendo as una seal. 3. Finalmente, las clulas de Schwann estn especializadas en la produc cin masiva de mem brana plasmtica, que disponen alrededor de la por cin alargada de la clula nerviosa, depositando una tras otra sucesivas capas de membrana, como si fuera un rollo de cinta, formando una vaina de mielina que acta de aislante.

soma de la clula nerviosa

prolongacin de la clula nerviosa (axn) clula de Schwann generando la vaina de m ielina 100 |jm

clula de Schwann term inal de a clula

clula m uscular
Figura 1-37 Esquema de una clula nerviosa, con sus clulas de Schwann asociadas, entrando en contacto con una clula m uscular a travs de una unin neurom uscular. Diagrama esquemtico.

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Captulo 1 : La evolucin de la clula

Los genes pueden ser activados y desactivados

Diversos tipos celulares especializados de un mismo animal o planta superior a menudo aparecen tan radicalmente distintos como pueden serlo dos clulas. Esto puede parecer paradjico ya que todas las clulas de un organismo plurice lular estn estrechamente relacionadas al haberse formado recientemente a par tir de una misma clula precursora -e l vulo fecundado. Un linaje comn impli ca genes similares; cmo aparecen entonces las diferencias? En algunos casos la especializacin celular implica la prdida de material gentico. Un ejemplo extremo lo constituyen los eritrocitos de los mamferos, que en el transcurso de la diferenciacin pierden por completo el ncleo. Pero la inmensa mayora de las clulas de la mayor parte de especies animales y vegetales conservan toda la in formacin gentica contenida en el vulo fecundado. La especializacin depen de de alteraciones de la expresin gnica y no de la prdida o adquisicin de ge nes. Incluso las bacterias no producen simultneamente todos sus tipos de pro tenas, sino que son capaces de ajustar el nivel de sntesis a las condiciones ex ternas. Las protenas especficamente necesarias para el metabolismo de la lac tosa, por ejemplo, son producidas por algunas bacterias slo cuando pueden disponer de este azcar. Otras bacterias detienen la mayor parte de los procesos metablicos normales; cuando las condiciones son desfavorables para la prolife racin celular, algunas bacterias detienen la mayor parte de los procesos m eta blicos normales y forman esporas que presentan una pared externa, resistente, impermeable y un citoplasma de composicin alterada. Las clulas eucariotas han desarrollado mecanismos mucho ms complejos para controlar la expresin gnica, y estos mecanismos afectan a sistemas ente ros de productos gnicos interactivos. Los grupos de genes son activados o inhi bidos en respuesta a seales tanto externas como internas. La composicin de las membranas, el citoesqueleto, los productos secretores, incluso el m etabolis mo y otros muchos rasgos, deben variar de manera coordinada cuando las clu las se diferencian. Los controles que hacen posible estos cambios han evolucio nado en los eucariotas hasta un grado no alcanzado por los procariotas, definiendo las complejas reglas del comportamiento celular que pueden generar un organismo pluricelular organizado a partir de un simple huevo.

Comparaciones entre secuencias revelan centenares de familias de genes homlogos 12,21

A parte de las apariencias, la evolucin ha transformado el universo de las cosas vivientes hasta un grado que no tiene parangn. Un ser humano, una mosca, una margarita, un hongo, una bacteria... parecen tan diferentes entre s que dif cilmente tiene sentido compararlos. Todos ellos son descendientes de un ances tro comn y a medida que vamos estudiando su interior, encontramos ms y ms evidencias de sus orgenes comunes. Ahora conocemos que la maquinaria molecular bsica de la vida se ha conservado hasta un grado tal que probable mente habra sorprendido a los padres de la teora de la evolucin. Como hemos visto, todas las formas de vida tienen esencialmente la misma qumica, basada en aminocidos, azcares, cidos grasos y nucletidos; todas sintetizan estos costituyentes qumicos de una manera esencialmente similar; todas almacenan la informacin gentica en el DNA y la expresan a travs del RNA y de las prote nas. El grado de conservacin de la evolucin es todava ms sorprendente cuando examinamos en detalle las secuencias de nucletidos de determinados genes y de aminocidos en determinadas protenas. La suerte es que las enzimas bacterianas que catalizan cualquier reaccin en particular, como la rotura de un azcar de seis carbonos en dos azcares de tres carbonos a travs de la glucolisis, tienen una secuencia de aminocidos (y una estructura tridimensional) in equvocamente similar a la de las enzimas que catalizan la misma reaccin en los seres humanos. Ambas enzimas -y de forma equivalente los genes que las es-

De las clulas simples a los organismos pluricelulares

TIPOS CELULARES
E x is te n m s d e 2 0 0 t ip o s d if e r e n t e s d e c lu la s e n el c u e r p o h u m a n o . S e h a lla n f o r m a n d o d iv e r s o s tip o s d e t e jid o s com o

EPITELIOS
L a s c lu la s e p ite lia le s f o r m a n c a p a s c e lu la r e s c o h e r e n te s d e n o m in a d a s e p ite lio s , q u e r e v is te n las c a r a s in te r n a s y e x te r n a s d e l c u e r p o . E x is te n m u c h o s tip o s e s p e c ia liz a d o s d e e p ite lio s . L a s c lu la s a b s o r b e n t e s (e n te r o c ito s ) t ie n e n m u c h o s m ic r o v illi q u e se p r o y e c ta n a la s u p e r fic ie lib r e a u m e n t a n d o el re a d e a b s o r c i n . C lu la s c ilia d a s : tie n e n c ilio s e n su s u p e r fic ie lib re q u e b a te n s in c r n ic a m e n t e p a r a d e s p la z a r s u s ta n c ia s e n c im a d e la c a p a e p it e lia l. C lu la s s e c r e to r a s : s e h a lla n e n la m a y o r a d e la s c a p a s e p it e lia le s . E s ta s c lu la s e s p e c ia liz a d a s s e g r e g a n s u s ta n c ia s h a c ia la s u p e r fic ie d e la c a p a c e lu la r .

e p ite lio s te jid o c o n ju n tiv o m s c u lo te jid o n e rv io s o

La m a y o r a d e t e jid o s e s t n f o r m a d o s p o r c o m b in a c io n e s d e v a r io s t ip o s c e lu la r e s .

lllllllllDlllDlllllll
------}x----- 'I------a------A----- ------- Jt------

------------ m icrovilli

contacto lmina basal cilios

L as c lu la s e p ite lia le s a d y a c e n te s e s t n u n id a s m e d ia n t e u n io n e s q u e c o n fie r e n a la c a p a c e lu la r su fu e r z a m e c n ic a y q u e la h a c e n t a m b i n im p e r m e a b le a las m o l c u la s p e q u e a s . La c a p a d e s c a n s a s o b r e u n a l m in a b a s a l.

ncleo

TEJIDO CONJUNTIVO
Los e s p a c io s e n tr e r g a n o s y t e jid o s d e l c u e rp o e s t n o c u p a d o s p o r t e jid o c o n ju n tiv o , f o r m a d o p r in c ip a lm e n t e p o r u n a re d d e fib r a s p ro te ic a s r e s is te n te s in m e r s a s e n un g e l p o lis a c r id o . E s ta m a tr iz e x t r a c e lu la r e s t s e g r e g a d a p r in c ip a lm e n t e p o r lo s fib r o b la s to s . El h u e s o e s t p r o d u c id o p o r c lu la s d e n o m in a d a s o s te o b la s to s , q u e s e g re g a n u n a m a tr iz e x tr a c e lu la r e n la q u e m s ta r d e se d e p o s ita r n c ris ta le s d e fo s fa to c lc ic o .

Las sales de calcio se depositan en la m atriz extracelular.

D o s tip o s fu n d a m e n t a le s d e f ib r a p r o te ic a e x t r a c e lu la r s o n la c o l g e n a y la e la s tin a . \

osteoblastos unidos por prolongaciones celulares

matriz extracelular

Las c lu la s a d ip o s a s s o n u n a s d e las m a y o r e s d e l c u e rp o . E s tas c lu la s s o n r e s p o n s a b le s d e la p r o d u c c i n y a lm a c e n a m ie n t o d e g r a s a . El n c le o y el c ito p la s m a e s t n

fibroblastos en tejido conjuntivo laxo

d e s p la z a d o s h a c ia la p e r ife ria d e la c lu la p o r u n a g ra n g o ta d e lp id o .

TEJIDO NERVIOSO dendritas

SALIDAS

axon
El a x n c o n d u c e las s e a le s e l c tric a s p r o c e d e n te s d e l s o m a c e lu la r . E s tas s e a le s s o n p r o d u c id a s p o r un flu jo d e io n e s a t r a v s d e la m e m b r a n a d e la c lu la n e r v io s a

LLEGADAS

cuerpo o soma celular

La s in a p s is es el lu g a r e n el q u e L as c lu la s n e r v io s a s , o n e u r o n a s , e s t n e s p e c ia liz a d a s e n la c o m u n ic a c i n . El c e r e b r o y la m d u la e s p in a l, p o r e je m p lo , e s t n c o m p u e s to s d e u n a re d d e n e u r o n a s c o n c lu la s g lia le s d e s o s t n . la n e u r o n a f o r m a u n a u n i n e s p e c ia liz a d a c o n o tra n e u r o n a (o c o n u n a c lu la m u s c u la r ). En la s in a p s is , las s e a le s p a s a n d e u n a n e u r o n a a o tr a (o d e u n a n e u r o n a a u n a c lu la m u s c u la r ).

U n a s c lu la s e s p e c ia liz a d a s , d e n o m in a d a s c lu la s d e S c h w a n n u o lig o d e n d r o c ito s , se d is p o n e n a lr e d e d o r d e l a x n f o r m a n d o u n a v a in a m u lt ila m in a r .

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Panel 1-3 Algunos de los diferentes tipos de clulas existentes en el cuerpo de un vertebrado.

A m e n u d o la s c lu la s e p ite lia le s s e c r e to r a s e s t n a g r u p a d a s f o r m a n d o u n a g l n d u la q u e se e s p e c ia liz a e n la s e c r e c i n d e u n a s u s ta n c ia p a r tic u la r . T a l c o m o s e ilu s tra , la s g l n d u la s e x o c r in a s s e g r e g a n d e t e r m in a d o s p r o d u c to s ( c o m o l g r im a s , m u c o s id a d e s y ju g o s g s tric o s ) al in te r io r d e c o n d u c to s . Las g l n d u la s e n d o c r in a s s e g r e g a n h o r m o n a s a la sa n g re . conducto _ de ,a

material segregado

MUSCULO
M e d ia n t e su c o n t r a c c i n , la s c lu la s m u s c u la r e s g e n e r a n fu e r z a m e c n ic a . En lo s v e r t e b r a d o s e x is te n t r e s t ip o s p r in c ip a le s :

m s c u lo e s q u e l tic o : m u e v e la s a r t ic u la c io n e s p o r m e d io d e su c o n tr a c c i n p o t e n t e y r p id a . C a d a m s c u lo e s t f o r m a d o p o r u n h a z d e f ib r a s m u s c u la r e s , c a d a u n a d e las c u a le s e s u n a e n o r m e c lu la p lu r in u c le a d a .

glndula

m sculo

ncleo clula m scular con estriaciones transversales

tendn clulas secretoras de la glndula

m s c u lo liso : s e h a lla e n la s p a r e d e s d e l t r a c to

SANGRE
L o s e r itr o c ito s ( g l b u lo s r o jo s ) s o n c lu la s m u y p e q u e a s , n o r m a lm e n t e s in n c le o ni m e m b r a n a s in te r n a s , y c o n t ie n e n h e m o g lo b in a , p r o t e n a q u e s e u n e al o x g e n o .

d ig e s t iv o , la v e jig a , las a r t e r ia s y la s v e n a s ; e s t c o m p u e s t o p o r f in a s c lu la s a la r g a d a s (n o e s t r ia d a s ) , c a d a u n a c o n u n s o lo n c le o .

m s c u lo c a r d a c o : d e c a r c t e r in t e r m e d io e n tr e el m s c u lo e s q u e l t ic o y el m s c u lo lis o .

1 cm de sangre contiene 5000 m illones de eritrocitos

su form a norm al es la de un disco bicncavo

P r o d u c e el la tid o c a r d a c o . Las c lu la s a d y a c e n t e s e s t n a s o c ia d a s p o r u n io n e s e l c t r ic a m e n t e c o n d u c t o r a s , q u e h a c e n q u e las c lu la s se c o n t r a ig a n s in c r n ic a m e n t e

Lo s g l b u lo s b la n c o s (le u c o c ito s ) p r o te g e n d e las in fe c c io n e s . La s a n g r e c o n tie n e a p r o x im a d a m e n t e u n le u c o c ito p o r c a d a 1 0 0 g l b u lo s r o jo s . A u n q u e v ia ja n p o r s a n g r e , p u e d e n p a s a r a t r a v s d e la s p a r e d e s d e lo s v a s o s s a n g u n e o s p a r a r e a liz a r su fu n c i n e n lo s t e jid o s v e c in o s . E x is te n v a r io s tip o s d is t in t o s , e n tr e e llo s : lin fo c ito s : r e s p o n s a b le s d e la s r e s p u e s ta s in m u n it a r ia s , t a le s c o m o la p r o d u c c i n d e a n tic u e r p o s . m a c r fa g o s y n e u tr filo s : s e d e s p la z a n h a c ia lo s fo c o s d e in fe c c i n , d o n d e in g ie r e n b a c te r ia s y r e s id u o s .

CELULAS SENSORIALES
E n tr e las c lu la s m s c o m p le ja s d e l c u e r p o d e lo s v e r t e b r a d o s s e e n c u e n t r a n las q u e d e te c ta n lo s e s t m u lo s e x t e r n o s . Las c lu la s c ilia d a s d e l o d o in t e r n o s o n las d e t e c t o r a s p r im a r ia s d e l s o n id o . S e t r a t a d e c lu la s e p it e lia le s m o d ific a d a s , c o n m ic r o v illi e s p e c ia le s (e s te r e o c ilio s ) e n su s u p e r fic ie . El m o v im ie n t o d e e s to s e s t e r e o c ilio s e n r e s p u e s ta a las v ib r a c io n e s s o n o r a s p r o v o c a u n a s e a l e l c tric a q u e p a s a al c ere b ro . =

los estereocilios son m uy rgidos porque estn em paquetados con filam entos de actina

pared de un pequeo vaso sanguneo infeccin bacteriana en el tejido conjuntivo

clula ciliada

CELULAS GERMINALES
T a n t o los e s p e r m a to z o id e s c o m o lo s v u lo s s o n h a p lo id e s, e s d e c ir , q u e c o n t ie n e n u n a s o la d o t a c i n d e c r o m o s o m a s . U n e s p e r m a to z o id e d e l m a c h o s e u n e a u n v u lo d e la h e m b r a , f o r m a n d o , p o r s u c e s iv a s d iv is io n e s , u n n u e v o o r g a n is m o d ip lo id e .

vulo con un esperm atozoide dibujado a escala

L o s b a s to n e s d e la r e tin a d e l o jo s o n c lu la s e s p e c ia liz a d a s e n la r e s p u e s ta a la lu z. La r e g i n fo t o s e n s ib le c o n t ie n e u n a g r a n c a n t id a d d e d is c o s m e m b r a n o s o s (e n rojo) e n c u y a s m e m b r a n a s s e e n c u e n t r a el p ig m e n t o s e n s ib le a la lu z , la r o d o p s in a . La lu z a c t a c o m o u n a s e a l e l c tric a (fle c h a verde), q u e s e t r a n s m it e a c lu la s n e r v io s a s d e l o jo , las c u a le s c a n a liz a n la s e a l h a s ta el c e r e b r o .

r ffT )

esperm atozoide

Figura 1-38 Relaciones evolutivas entre algunos de los organismos mencionados en este libro. Las ramas del rbol muestran vas de descendencia comn, pero su longitud no indica el paso del tiempo. (Tngase en cuenta as mismo que el eje vertical del diagrama muestra categoras principales de organismos, pero no tiempo.)

40

pecifcan- no slo tienen una funcin similar sino tambin casi con seguridad un origen evolutivo comn. Se pueden utilizar estas relaciones para dibujar los caminos evolutivos ms antiguos; comparando secuencias de genes y recono ciendo homologas se descubren paralelismos ocultos y similitudes entre orga nismos diferentes. A menudo tambin se encuentran parecidos familiares entre genes que co difican protenas que realizan funciones relacionadas en un mismo organismo. Estos genes tambin estn relacionados evolutivamente y su existencia revela una estrategia bsica a travs de la cual se ha originado la complejidad creciente de los organismos: los genes y zonas de genes se duplican y las nuevas copias di vergen de la original mediante mutacin y recombinacin, para realizar nuevas funciones adicionales. De esta manera, partiendo de un nmero relativamente pequeo de genes en las clulas primitivas, la forma de vida ms com pleja ha llegado a desarrollar ms de 50 000 genes, como se cree que presenta un animal o una planta superiores. A partir del estudio de un gen o de una protena, avan zamos en el conocim iento de toda una familia de genes o protenas homlogos a ella. As la biologa molecular subraya la unidad del mundo viviente y nos pro porciona herramientas para descubrir los mecanismos generales que estn en la base de su infinita variedad de invenciones. En el prximo captulo empezaremos la discusin de estos mecanismos con el estudio del com ponente mas bsico del kit de construccin biolgica -las m o lculas pequeas a partir de las que se sintetizan todos los com ponentes mayo res de las clulas vivas.

Resumen
La evolucin de los grandes organismos pluricelulares dependi de la capacidad de las clulas eucariotas para expresar su informacin hereditaria de muchas maneras diferentes y para actuar deform a cooperativa como un colectivo nico. En los ani males uno de los primeros desarrollos fu e probablemente la formacin de capas de clulas epiteliales que separaron del ambiente exterior el espacio interior del cuerpo. Adems de estas clulas epiteliales tambin se desarrollaron clullas nerviosas, clu las musculares y clulas del tejido conjuntivo, todas las cuales se hallan actualmen te en los animales ms sencillos. La evolucin de los animales y de las plantas supe riores (Figura 1 -38) dependi de la produccin de un nmero cada vez mayor de tipos celulares especializados y de mtodos mas sofisticados de coordinacin entre ellos, reflejando un nmero cada vez mayor de elaborados sistemas de control de la expresin de los genes en los distintos tipos celulares.

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Captulo 1: La evolucin de la clula

Pequeas molculas, energa y biosntesis

Los componentes qumicos de una clula Orden biolgico y energa K 1 alimento y la obtencin de la energa celular La biosntesis y la creacin de orden Coordinacin entre catabolismo y biosntesis

Debo anunciarles que puedo preparar urea sin necesidad de ningn rin ni de ningn animal, ya sea un hombre o un perro. Esta frase, escrita hace 165 aos por el joven qumico alemn Whler, signific el final de la creencia en una fuer za vital especial existente en los organismos vivos que da lugar a sus propieda des y productos caractersticos. Pero lo que en la poca de Whler fue una reve lacin, actualmente es de comn conocim iento -las criaturas vivas estn hechas de compuestos qumicos. En la visin contem pornea de la vida no hay lugar para el vitalismo -o para cualquier cosa que quede fuera de las leyes de la qumi ca y de la fsica. Esto no quiere decir que en biologa ya no existan misterios: existen muchas reas de ignorancia, tal como se pondr de manifiesto en cap tulos posteriores. Pero deberamos empezar a subrayar la gran cantidad de fen menos que se conocen. Actualmente, disponemos de informacin detallada sobre las molculas esenciales de la clula -n o slo de un reducido nmero de molculas, sino de miles de ellas. En m uchos casos conocem os sus estructuras qumicas exactas y sabem os con exactitud cmo son producidas y degradadas. En trm inos gene rales, conocem os cmo la energa qumica impulsa las reacciones biosintticas de la clula, cm o actan en las clulas los principios de la term odinm ica ge nerando un orden molecular, y tam bin cm o son controladas y coordinadas las miradas de cambios qumicos que se producen continuamente dentro de las clulas. En este captulo y en el siguiente resumimos brevemente la qumica de la clula viva. Aqu nos ocuparemos de los procesos en los que intervienen las m o lculas pequeas: de aquellos mecanismos a travs de los cuales la clula sinteti za sus com ponentes qumicos fundamentales y obtiene su energa. El Captulo 3 describe las molculas gigantes de la clula, que son polmeros de las molculas pequeas y cuyas propiedades son las responsables de la especificidad de los procesos biolgicos y de la transferencia de la informacin biolgica.

Los componentes qumicos de una clula

La qumica celular se basa en los compuestos de carbono 1
Una clula viva est compuesta por un restringido conjunto de elementos, cua tro de los cuales (C, H, N y O) constituyen aproximadamente el 99 % de su peso. Esta composicin difiere notablem ente de la de la corteza terrestre y pone de re

43

50

Figura 2-1 Abundancia relativa de los elementos qumicos encontrados en la corteza terrestre (el mundo inanimado), comparada con la encontrada en los tejidos blandos de los organismos vivos. La abundancia
relativa se expresa com o el porcentaje del n m ero total de tomos presentes. As, por ejemplo, aproximadamente cerca del 50 % de los tomos de los organismos vivos son tomos de hidrgeno.

Ca y Mg

Na y K

Si

Otros

lieve un tipo caracterstico de qumica (Figura 2-1). Cul es esta qumica espe cial y cmo surgi? La substancia ms abundante de la clula viva es el agua. Constituye aproxi madamente el 70 % del peso de las clulas. La mayora de reacciones intracelulares ocurren en un medio acuoso. La vida en este planeta empez en el mar, y las condiciones que reinaban en aquel ambiente primitivo imprimieron un sello per manente en la qumica de la materia viva. Todos los organismos han sido disea dos en base a las propiedades caractersticas del agua, tales como su carcter po lar, su habilidad para formar enlaces de hidrgeno y su alta tensin superficial. Por ejemplo, el agua rodea completamente a las molculas polares mientras que tiende a reunir las molculas no polares, formando grandes agregados. En el Pa nel 2-1 (pgs. 50-51) se resumen algunas propiedades importantes del agua. Aparte del agua, la gran mayora de las otras molculas de una clula son compuestos de carbono, centro de atencin de la qum ica orgnica. El carbono destaca entre todos los elementos de la Tierra por su capacidad de formar gran des molculas; en este aspecto le sigue el silicio, muy por debajo de l. Debido a su reducido tamao y a los cuatro electrones de la capa externa el tomo de car bono puede formar cuatro enlaces covalentes fuertes con otros tomos. Y, lo que es ms importante, se puede unir a otros tomos de carbono formando cadenas y anillos, generando as molculas grandes y complejas cuyo tamao no tiene un lmite superior obvio. Los otros tomos abundantes en la clula (H, N y O) tam bin son pequeos y capaces de formar enlaces covalentes muy fuertes (Panel 22, pgs. 52-53). Un enlace covalente tpico de una molcula biolgica tiene una energa de entre 15 y 170 kcal/mol, en funcin de los tomos que estn implicados. Como por trmino medio la energa trmica a la temperatura corporal solamente es de 0,6 kcal/mol, incluso una colisin energtica con otra molcula, muy poco pro bable, no ser capaz de romper un enlace covalente. Sin embargo, catalizadores especficos pueden romper o reorganizar rpidamente los enlaces covalentes. La Biologa es posible gracias a la com binacin de estabilidad de los enlaces cova lentes en condiciones fisiolgicas y la capacidad de los catalizadores biolgicos (denominados enzimas ) de romper y reorganizar estos enlaces de una manera controlada y en determinadas molculas. En principio, las simples reglas del enlace covalente entre el carbono y otros elementos permiten un nmero infinitamente elevado de compuestos. Aunque el nmero de compuestos diferentes de carbono de una clula es muy grande, nica

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Captulo 2 : Pequeas molculas, energa y biosnlesis

mente representa una diminuta fraccin de los que son tericamente posibles. En algunos casos podemos encontrar una buena razn para explicar que este o aquel compuesto realiza una funcin biolgica determinada; pero con mayor frecuencia parece que el compuesto elegido fue una alternativa entre otras muchas razona bles, algo as como un accidente (Figura 2-2). Ciertos patrones y elementos de reac cin, una vez establecidos en las clulas ms antiguas, fueron preservados con al gunas variaciones a lo largo de la evolucin. Aparentemente, el desarrollo de nuevas clases de compuestos fue necesario o til en muy contadas ocasiones.

Las clulas utilizan cuatro tipos bsicos de molculas pequeas 2

Ciertas com binaciones simples de tomos -tales como los grupos metilo (-CH3), hidroxilo (-OH), carboxilo (-COOH) y amino (-NH2) - se presentan repetidamen te en las molculas biolgicas. Cada uno de estos grupos tiene propiedades qu micas y fsicas distintas que influyen sobre el comportamiento de cualquier m o lcula en que se presente el grupo. El Panel 2-2 (pgs. 52-53) resume los tipos principales de grupos qumicos y algunas de sus propiedades sobresalientes. Los pesos atmicos de H, C, N y O son 1, 12, 14 y 16 respectivamente. Las molculas orgnicas pequeas de la clula tienen pesos moleculares que osci lan entre 100 y 1000 y contienen hasta unos 30 tomos de carbono. Normalmen te se hallan libres en solucin, donde algunas de ellas forman un acervo de inter mediarios a partir de los cuales se construyen largos polmeros, denominados m acrom olculas. Tambin existen intermediarios esenciales en las reacciones qumicas que transforman la energa derivada de los alimentos en formas tiles de energa (lo cual se discute ms adelante). Las molculas pequeas representan una dcima parte del total de materia orgnica de una clula y (a grandes rasgos) slo existen del orden de un millar de tipos diferentes de ellas (Tabla 2-1). Todas las molculas biolgicas se sintetizan a partir de los mismos compuestos simples y se degradan a estos mismos com puestos, ocurriendo la sntesis y la degradacin a travs de secuencias de cambios qumicos de alcance limitado y siguiendo reglas precisas. Por consiguiente, los compuestos de una clula pueden ser clasificados en un reducido nmero de fa milias distintas. Dado que las macromolculas de una clula, que constituyen el tema del Captulo 3 de este libro, estn formadas a partir de estas mismas m ol culas pequeas, pertenecen a sus mismas familias. A grandes rasgos, podemos decir que las clulas poseen cuatro grandes fami lias de molculas orgnicas pequeas: los azcares simples, los cidos grasos, los aminocidos y los nucletidos. Cada una de estas familias contiene muchos miembros diferentes, que presentan rasgos qumicos comunes. Aunque algunos compuestos celulares no pueden clasificarse en estas categoras, las cuatro fami lias, junto con las macromolculas formadas a partir de ellas, constituyen un por centaje sorprendentemente elevado de la masa celular total (Tabla 2-1). Tabla 2-1 Composicin qumica aproximada de una clula bacteriana Porcentaje del peso celular total Agua Iones inorgnicos Azcares y precursores Aminocidos y precusores Nucletidos y precursores cidos grasos y precursores Otras molculas pequeas Macromolculas (protenas, cidos nucleicos y polisacridos) 70 1 1 0,4 0,4 1 0,2 26,0 Nmero de tipos de cada molcula 1 20 250 100 100 50 -300 -3000

Figura 2-2 Los organism os vivos nicam ente sintetizan un reducido nm ero de las molculas orgnicas, que en principio podran producir. De los seis aminocidos que se muestran en la figura, nicam ente el de la parte superior (el triptfano) es sintetizado por las clulas.

Los componentes qumicos de una clula

45

c h 2o h

'i

C ---- OH H/

CN

Figura 2-3 La estructura del monosacrido glucosa, una hexosa simple. (A) Forma de cadena abierta del azcar, que est en equilibrio con la forma cclica o de anillo, ms estable, que se muestra en (B). (C) y (D) son modelos de espacio lleno y de bolas y varillas, respectivamente, de esta forma cclica (|}-D-glucosa). La forma de silla (E) es una representacin alternativa que se utiliza frecuentem ente debido a que refleja de una forma ms exacta la estructura del azcar. En (A), (B) y (E) las O de color rojo indican el tomo de oxgeno del grupo aldehido. Para una revisin de las estructuras y de las propiedades qumicas de los azcares, vase el Panel 2-3, pgs. 54-55.

Los azcares son las m olculas alim enticias de la clula 3

Los azcares ms sencillos -los m onosacridos- presentan la frmula general (CH20), donde n es un nmero entero comprendido entre 3 y 7. La glucosa, por ejemplo, tiene la frmula C6H1 2 0 6 (Figura 2-3). Como se muestra en la Figura 2-3, los azcares pueden presentarse tanto en forma de anillo como en forma de ca dena abierta. En esta forma de cadena abierta, los azcares presentan un nm e ro variable de grupos hidroxilo y un grupo aldehido ( jj/ C = 0 ) o un grupo cetona (/ C = 0 ) . El grupo aldehido o cetona desempea un papel especial. En primer lugar, pueden reaccionar con un grupo hidroxilo de la misma molcula convir tiendo la molcula en un anillo; en esta forma de anillo, puede reconocerse el carbono del aldehido o de la cetona originales ya que es el nico que est unido a dos tom os de oxgeno. En segundo lugar, una vez formado el anillo, este car bono puede unirse a uno de los carbonos con un grupo hidroxilo de otro azcar, generando un disacrido (Panel 2-3, pgs. 54-55). De esta misma forma la adi cin de ms monosacridos da lugar a oligosacridos de longitud creciente (trisacridos, tetrasacridos, y as sucesivamente), hasta llegar a las grandes m ol culas de polisacridos con miles de unidades de monosacridos. Puesto que cada monosacrido tiene varios grupos hidroxilo libres que pueden formar un enlace con otro monosacrido (o con algn otro compuesto), el nmero de es tructuras posibles de polisacridos es enorm em ente elevado. Incluso un disac rido simple, formado por dos residuos de glucosa, puede existir en 11 variedades diferentes (Figura 2-4), mientras que tres hexosas diferentes (C6Hl20 6) se pueden unir formando varios miles de trisacridos diferentes. Por esta razn resulta muy difcil determinar la estructura de un polisacrido determinado, ya que es nece sario conocer los lugares de unin de cada azcar a sus vecinos. Con los m to dos actuales, por ejemplo, se tarda ms tiempo en determinar la disposicin de media docena de azcares unidos (por ejemplo, los de una glucoprotena), que en determinar la secuencia de nucletidos de una molcula de DNA que conten ga muchos miles de nucletidos en la que cada unidad se une a la siguiente exactam ente de la misma forma). La glucosa es el principal compuesto alimenticio de muchas clulas. Una se rie de reacciones oxidativas (vase pg. 65) conducen desde esta hexosa hasta varios derivados ms pequeos y, finalmente, hasta C 0 2 y H20 . El resultado neto se puede indicar as: CB H l20 6 + 6 0 2 6 C 0 2 + 6H20 + energa

En el transcurso de la degradacin de la glucosa se genera energa y poder re ductor", ambos esenciales para las reacciones de biosntesis, que son captados y 46 Captulo 2 : Pequeas molculas, energa y biosntesis

CH,OH

CH7

CH,OH

iT "

J o

'

(31-6

a1 o c1

a1 2

(31-3
CH2OH
c h 2o h

a1 3
CH tOH

x() .

I ggO

...........
CH tOH vr O CH tOH

(31-2
CH tOH
ch,

a l 4

Figura 2-4 Once disacridos formados por dos unidades de D-glucosa. Aunque se diferencian nicam ente en el tipo de enlace entre las dos unidades de glucosa, son qum icam ente diferentes. Puesto que los oligosacridos asociados a las protenas y a los lpidos pueden tener ms de seis tipos diferentes de azcares unidos, a travs de enlaces com o los ilustrados aqu, en disposiciones lineales y ramificadas, el nmero de tipos distintos posibles de oligosacridos de que puede disponer la clula es extrem adamente elevado.

D_

(31-(31

a1 6

(31 a1

transportados fundamentalmente por dos molculas cruciales, denominadas ATP y NADH, respectivamente. Ms adelante, en este mismo captulo discuti mos la estructura y las funciones de estas dos molculas cruciales. Los polisacridos simples, compuestos slo por residuos de glucosa -p rinci palmente el glucgeno en las clulas animales y el almidn en las clulas vegeta le s- son utilizados para almacenar energa que se utilizar en el futuro. Pero los azcares no se utilizan exclusivamente para la produccin y el almacenamiento de energa. Importantes compuestos estructurales extracelulares (tales como la celulosa) estn formados por polisacridos sencillos, y a menudo secuencias no repetitivas de cadenas de molculas de azcares, ms pequeas pero ms com plejas, estn unidas covalentemente a protenas, formando glucoprotenas, o a lpidos, formando glucolpidos.

O O" % /

ch2

Los cidos grasos son componentes de las m em branas celulares 4

Una molcula de cido graso, como por ejemplo el cido palmtico (Figura 2-5) presenta dos regiones caractersticas: una larga cadena hidrocarbonada hidrofbica (insoluble en agua) y qumicamente no muy reactiva, y un grupo de cido carboxlico, ionizado en solucin (COO~), extremadamente hidroflico (soluble en agua) y que fcilmente reacciona con un grupo hidroxilo o un grupo amino de otra molcula formando steres y amidas. De hecho casi todas las molculas de cido graso de una clula estn unidas covalentemente a otras molculas, mediante su grupo cido carboxlico. El gran nmero de cidos grasos distintos que se encuentran en las clulas difieren en caractersticas qumicas tales como la longitud de la cadena hidrocarbonada y en el nmero y la posicin de los do bles enlaces carbono-carbono que contienen (Panel 2-4, pgs. 56-57). Los cidos grasos son una importante fuente de alimento ya que pueden ser degradados produciendo por unidad de peso ms del doble de energa til que produce la glucosa. Se almacenan en el citoplasma en forma de triacilglicridos, compuestos de tres cadenas de cidos grasos unidas a una molcula de glicerol (Panel 2-4, pgs. 56-57); Estas molculas constituyen las grasas animales que nos Los componentes qumicos de una clula

I 2 I 2 CH, I 2 ch2 I 2
ch2 ch2 ch2

I 2 I 2 CH, I 2
ch2 ch,

I 2 I 2 CH, I 2 CH2 I 2 ch2 I 2

ch2 ch,

CH,

I 2

Figura 2-5 cido palmtico. El grupo cido carboxlico (en rojo) est representado en forma ionizada. En el centro se presenta un modelo de bolas y varillas y a la d erech a un modelo tridimensional de espacio lleno.

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grupo am ino

grupo carboxilo

H2N C COOH CH>

pH 7

H ,N C CH

-COO

form a no ionizada

form a ionizada

Figura 2-6 1 aminocido alanina. En la clula, en la que el pH es cercano a 7, el aminocido se halla en forma ionizada. Sin embargo, al ser incorporado a una cadena polipeptdica las cargas de los grupos amino y carboxilo del aminocido libre desaparecen. A la derecha de las frmulas estructurales se muestran modelos de bolas y varillas y de espacio lleno. En el caso de la alanina, la cadena lateral es un grupo -C H 3.

son familiares en nuestra experiencia diaria. Cuando es necesario obtener ener ga, las cadenas de cido graso pueden ser liberadas de los triacilglicridos y ser degradadas hasta unidades de dos carbonos. A continuacin, estas unidades de dos carbonos, que constituyen el grupo acetilo de una molcula hidrosoluble denominada acetil CoA, son degradadas a travs de varias reacciones que liberan energa y que describiremos ms adelante. Pero la funcin ms importante de los cidos grasos reside en la construc cin de las mem branas de la clula. Estas finas capas semipermeables que limi tan a todas las clulas y envuelven sus orgnulos internos estn compuestas fun damentalmente de fosfolfpidos, pequeas molculas que se parecen a los triaciglicridos en que estn construidas en su mayor parte a partir de cidos grasos y glicerol. En los fosfolfpidos, sin embargo, el glicerol est unido a dos ca denas de cido graso y no a tres. El lugar restante del glicerol est acoplado a un grupo fosfato, que a su vez est unido a otro pequeo compuesto hidrofflico como la etanolam ina , la colina o la serina. Cada molcula de fosfolpido tiene una cola hidrofbica -com puesta por las dos cadenas de cido graso- y una cabeza polar hidroflica en la que se encuen tra el fosfato. Si se coloca una pequea cantidad de fosfolpido en agua, se exten der sobre la superficie formando una monocapa de molculas de fosfolpido; en esta lmina las colas de las molculas quedan densamente empaquetadas unas con otras y dirigidas hacia el aire y las cabezas se hallan en contacto con el agua (Panel 2-4, pgs. 56-57). Dos de estas lminas se pueden combinar, cola contra cola, formando un sandwich de fosfolfpidos, o bicapa lipdica, una es tructura extraordinariamente importante que es la base estructural de todas las membranas celulares (como se discute en el Captulo 10).

extremo amino de iacadena i----- i"-----1 N -H Phe H - C -C H

o=c
Ser

N -H H C CH7OH

o=c I
Glu

N -H

H - C CH2-C H 2-C

Los am inocidos son las subunidades de las protenas 5

Los aminocidos com unes son qumicamente variados, pero todos ellos contie nen un grupo de cido carboxlico y un grupo amino, ambos unidos al mismo tomo de carbono (Figura 2-6). Se utilizan como subunidades en la sntesis de las protenas, que son largos polmeros lineales de aminocidos unidos cabezacola mediante un enlace peptdico entre el grupo carboxlico de un aminocido y el grupo amino del aminocido siguiente (Figura 2-7). Aunque existen muchos aminocidos posibles, en las protenas slo hay 20 aminocidos comunes, cada uno de ellos con una cadena lateral diferente unida al tomo de carbono a (Pa nel 2-5, pgs. 58-59). Estos mismos 20 aminocidos se presentan una y otra vez en todas las protenas, incluidas las producidas por las bacterias, las plantas y los animales. Aunque la seleccin de estos 20 aminocidos probablemente sea un ejemplo de un accidente evolutivo, la versatilidad qumica que proporcionan es de una importancia vital. Por ejemplo, 5 de los 20 aminocidos presentan cade nas laterales que pueden transportar una carga (Figura 2-8) mientras que los otros no estn cargados pero son reactivos de formas diferentes (Panel 2-5, pgs. 58-59). Como veremos, las propiedades de las cadenas laterales de los am inoci dos determinan las propiedades de las protenas y constituyen la base de las dis tintas y sofisticadas funciones desempeadas por ellas.
Lys

0=C
N -H

o=c

H - C - C H 2-C H 2-C H 2 -CH- -N -H 4 XH

extremo carboxilo de ia cadena

Figura 2-7 Pequea parte de una m olcula proteica, mostrando cuatro aminocidos. Cada aminocido est unido al siguiente mediante un enlace covalente que recibe el nombre de en lace p ep td ico. Uno de estos enlaces peptdicos se destaca sombreado de am arillo. Por lo tanto, las protenas se denominan a veces p olip p tid os. Las ca d en as laterales de los aminocidos se representan en rojo y los tomos de un aminocido (el cido glutmico) se destacan mediante el so m b rea d o gris.

48

Captulo 2 : Pequeas molculas, energa y biosntesis

h 2n

\ / c
NH

nh

13
nh2

(ch2)3

(CH2)4
11

HO HN

:N
\ / C I CHi
CH
nh3 +

H.-N

\ ^ C
NH

\H

(CH2)4

(CH2)3

PH

COOch2

CO O II ch2
ch2

t I t

I I
cooh ch2

I I
COOH
ch2 ch2

HC HN \ C

KH '

CH

ch2

Figura 2-8 La carga de las cadenas laterales de los aminocidos depende del pH. En solucin acuosa los cidos carboxlicos pierden fcilm ente un H+ , formando un ion de carga negativa que se nom bra m ediante el sufijo -a to , com o por ejemplo aspartafo o glutamafo. Con las aminas se produce una situacin parecida ya que en solucin acuosa toman H+formando un ion de carga positiva (que no recibe ningn nombre especial). Estas reacciones son rpidamente reversibles, y la cantidad presente de las dos formas, con carga y sin carga, depende del pH de la solucin. A un pH elevado, los cidos carboxlicos tienden a estar cargados y las aminas sin carga; a un pH bajo sucede lo contrario -lo s cidos carboxlicos carecen de carga y las aminas estn cargadas. El pH en el que estn cargados exactam ente la m itad de los residuos de cido carboxlico o amina, recibe el nom bre de pK del aminocido en cuestin. En la clula, el pH es prximo a 7, y casi todos los cidos carboxlicos y las aminas se encuentran en forma cargada.

cido asprtico pK~4,7

cido glutm ico pK~4,7

histidina pK~6,5

lisina pK~10,2

arginina pK~12

Los nucletidos son las subunidades del DNA y del RNA6

En los nucletidos, uno de los diversos compuestos cclicos que contienen nitr geno (denominados a menudo bases porque en soluciones cidas pueden com binarse con H+ ) est unido a un azcar de cinco carbonos (ribosa o desoxirribosa) que tambin contiene un grupo fosfato. Existe un claro parecido entre los dife rentes anillos nitrogenados de los nucletidos. La citosina (C), la timina (T) y el uracilo (U) reciben el nombre de pirimidinas puesto que todos ellos derivan de un anillo de pirimidina hexagonal; la guanina (G) y la adenina (A) son purinas, compuestas por un segundo anillo pentamrico unido al anillo hexamrico.
Figura 2-9 Estructura qum ica del adenosn trifosfato (ATP). Se muestra un modelo de espacios llenos (A), un modelo de bolas y varillas (B) y la frmula estructural (C). Ntese la presencia de cargas negativas en cada uno de los tres fosfatos.

^ P0

nO n\ /O
<| i H

Hv A r /NH, ii i N^ C Cx ; N
P H OH OH H

,
(C)

trifosfato

M ribosa_______ adenina adenosina

Los componentes qumicos de una clula

49

ENLACES DE HIDROGENO
D e b id o a q u e e s t n p o la r iz a d a s , d o s m o l c u la s d e a g u a a d y a c e n te ^ p u e d e n f o r m a r u n a u n i n c o n o c id a c o m o e n la c e d e h id r g e n o . Lo s e n la c e s d e h id r g e n o t ie n e n u n a fu e r z a d e a lr e d e d o r d e 1 /2 0 la d e u n e n la c e c o v a le n te . 0 ,1 0 4 n m e n la c e d e h id r g e n o 0 ,2 8 n m lo n g itu d e s d e e n la c e

enlace de hidrgeno
L o s e n la c e s d e h id r g e n o s o n m s f u e r te s c u a n d o lo s 3 t o m o s se e n c u e n tr a n e n ln e a re c ta .

e n la c e c o v a le n t e

ELAG UA
D o s t o m o s , c o n e c ta d o s p o r u n e n la c e c o v a le n te , p u e d e n e je r c e r a tra c c io n e s d if e r e n t e s s o b r e lo s e le c tr o n e s d e l e n la c e . En e s to s c a s o s el e n la c e e s d ip o la r , c o n u n e x t r e m o c a r g a d o lig e r a m e n t e n e g a t iv o (8~) y o tr o c a r g a d o lig e r a m e n t e p o s itiv o (5 + ). Lo s e n la c e s e n lo s q u e lo s d o s to m o s s o n ig u a le s o e je r c e n a tr a c c io n e s ig u a le s s o b r e lo s e le c tr o n e s s e d e n o m in a n n o p o la re s .

ESTRUCTURA DEL AGUA

Las m o l c u la s d e a g u a se u n e n e n tr e s t r a n s it o r ia m e n t e f o r m a n d o u n a re d a tr a v s d e e n la c e s d e h id r g e n o . In c lu s o a 3 7 C , un 1 5 % d e las m o l c u la s d e a g u a e s t n u n id a s c a d a u n a a a o tra s 4 , e n un e n s a m b la je d e v id a c o rta c o n o c id o c o m o " a g r u p a c i n o s c ila n te " .

region electropositiva

region electronegativa

A u n q u e u n a m o l c u la d e a g u a tie n e u n a c a rg a n e ta to ta l n e u tr a (p o r t e n e r el m is m o n m e r o d e p r o to n e s q u e d e e le c tro n e s ), s us e le c tro n e s e s t n d is tr ib u id o s d e f o r m a a s im tr ic a , lo c u a l h a c e q u e la m o l c u la s ea p o la r. El n c le o d e o x g e n o d e s p la z a a lo s e le c tro n e s d e lo s n c le o s d e h id r g e n o , d e j n d o lo a e s to s n c le o s c o n u n a p e q u e a c a rg a n e ta p o s itiv a . El e x c e s o d e d e n s id a d e le c tr n ic a s o b re el t o m o d e o x g e n o g e n e r a r e g io n e s d b ilm e n t e n e g a tiv a s c e rc a d e l t o m o d e o x g e n o e n lo s o tr o s d o s v r tic e s d e un t e tr a e d r o im a g in a r io .

La n a tu r a le z a c o h e s iv a d e l a g u a e s r e s p o n s a b le d e m u c h a s d e s u s p r o p ie d a d e s e x t r a o r d in a r ia s , ta le s c o m o la e le v a d a t e n s i n s u p e r f ic ia l, el a lto c a lo r e s p e c fic o y el e le v a d o c a lo r d e v a p o r iz a c i n

MOLECULAS HIDROFILICAS E HIDROFOBICAS

D e b id o a su n a t u r a le z a p o la r , la s m o l c u la s d e a g u a se a g r u p a n a lr e d e d o r d e lo s io n e s y d e o tr a s m o l c u la s p o la re s .

Las m o l c u la s n o p o la re s in t e r r u m p e n la e s tr u c tu r a d e l a g u a f o r m a d a p o r e n la c e s d e H , s in f o r m a r in te r a c c io n e s fa v o r a b le s c o n m o l c u la s d e a g u a . P o r lo t a n t o s o n h id r o f b ic a s y c a s i in s o lu b le s en ag u a.

Las m o l c u la s q u e p u e d e n a c o m o d a r s e e n e s tr u c tu r a s d e e s te t ip o , f o r m a d a s p o r m o l c u la s d e a g u a u n id a s p o r e n la c e s d e h id r g e n o , s o n h id r o f lic a s y r e la tiv a m e n t e s o lu b le s e n a g u a .

50

Panel 2-1 Propiedades qumicas del agua y su influencia sobre el comportamiento de las molculas biolgicas.

MOLCULAS HIDROFBICAS Y ESTRUCTURAS ACUOSAS

Las m o l c u la s q u e s o n n o p o la re s y n o p u e d e n f o r m a r e n la c e s d e h id r g e n o - c o m o los h i d r o c a r b o n o s - s lo t ie n e n u n a s o lu b ilid a d e n a g u a lim it a d a , y se d e n o m in a n h id r o f b ic a s . C u a n d o e s ta s m o l c u la s s e e n c u e n tr a n e n a g u a , se f o r m a n a su a lr e d e d o r e s tr u c tu r a s o r d e n a d a s d e m o l c u la s d e a g u a . E s ta s c a ja s s e m e ja n t e s a h ie lo s o n r e la tiv a m e n t e m s o r d e n a d a s q u e el a g u a lib r e y g e n e r a n u n a d is m in u c i n d e e n tr o p a d e l m e d io . En la f ig u r a se m u e s tr a p a r te d e u n a d e e s ta s e s tr u c tu r a s (e n rojo) a lr e d e d o r d e u n h id r o c a r b o n o (e n negro). E n la e s tr u c tu r a in ta c ta c a d a t o m o d e o x g e n o

(c rc u lo s rojos) p u e d e e s ta r c o o r d in a d o
t e t r a d r ic a m e n t e c o n o tr o s c u a tro .

___________

E s te m o v im ie n t o d e l a g u a d e s d e u n a s o lu c i n h ip o t n ic a a u n a s o lu c i n h ip e r t n ic a , p u e d e p r o v o c a r u n a u m e n t o d e la p r e s i n h id r o s t tic a e n el c o m p a r t i m i e n t o h ip e r t n ic o . D o s s o lu c io n e s q u e t e n g a n c o n c e n t r a c io n e s id n tic a s d e s o lu to s , es d e c ir , q u e s e a n o s m t ic a m e n t e e q u ilib r a d a s , s e d ic e q u e s o n is o t n ic a s .

51

ESQUELETOS CARBONADOS
El p a p e l c a r a c te r s tic o d e l c a r b o n o e n la c lu la s e d e b e a su c a p a c id a d d e f o r m a r e n la c e s c o v a le n te s c o n o tr o s t o m o s d e c a r b o n o . A s , lo s to m o s d e c a r b o n o se p u e d e n u n ir f o r m a n d o c a d e n a s . o e s tr u c tu r a s r a m if ic a d a s

C\

c C / \ c c

/ C

representado tambin como

representado tambin como

representado tambin como

ENLACES COVALENTES
U n e n la c e c o v a le n te s e f o r m a c u a n d o d o s to m o s se a c e rc a n s u fic ie n te m e n te y c o m p a r te n u n o o m s d e sus e le c tro n e s . En un e n la c e s e n c illo se c o m p a r te un e le c tr n d e c a d a u n o d e los d o s to m o s ; e n un e n la c e d o b le se c o m p a r t e n un to ta l d e c u a tro e le c tro n e s . C a d a to m o f o r m a un n m e r o d e te r m in a d o d e e n la c e s c o v a le n te s , s ig u ie n d o u n a d is tr ib u c i n e s p a c ia l d e fin id a . P o r e je m p lo , el c a r b o n o f o r m a c u a tro e n la c e s s e n c illo s d is tr ib u id o s h a c ia los v r tic e s d e un t e t r a e d r o m ie n t r a s q u e el n itr g e n o f o r m a tr e s e n la c e s s e n c illo s y el o x g e n o f o r m a d o s e n la c e s s e n c illo s , d is tr ib u id o s c o m o se m u e s tr a e n e s te p a n e l. D o s to m o s u n id o s p o r d o s o m s e n la c e s c o v a le n te s n o p u e d e n ro ta r lib r e m e n te a lr e d e d o r d e l e je d e l e n la c e E sta re s tric c i n c o n s titu y e el fa c to r lim ita n te p rin c ip a l s o b re la d is tr ib u c i n t r id im e n s io n a l d e m u c h a s m a c r o m o l c u la s .

HIDROCARBUROS

El c a r b o n o y el h id r g e n o f o r m a n ju n to s u n o s c o m p u e s to s e s ta b le s d e n o m in a d o s h id r o c a r b u ro s . S o n n o p o la re s , n o f o r m a n e n la c e s d e h id r g e n o y , p o r lo g e n e r a l, s o n in s o lu b le s e n a g u a .

H H C H H C H

Los d o b le s e n la c e s t ie n e n u n a d is tr ib u c i n e s p a c ia l d ife r e n te .

metano

grupo metilo

RESONANCIA Y AROMATICIDAD
La c a d e n a d e c a r b o n o s p u e d e n in c lu ir d o b le s e n la c e s . S i s to s s e e n c u e n tr a n e n t o m o s d e c a r b o n o s a lte r n o s , lo s e le c tr o n e s d e e n la c e s e m u e v e n d e n tr o d e la m o l c u la , e s t a b iliz a n d o la e s tr u c tu r a e n un f e n m e n o c o n o c id o c o m o r e s o n a n c ia . C u a n d o se p r o d u c e r e s o n a n c ia en un c o m p u e s t o c c lic o , se g e n e r a un a n illo a r o m t ic o .

C=

C=C

c= c

la e s tr u c tu r a v e r d a d e r a se h a lla e n tr e e s ta s d o s

\ / cc

representado a menudo como

parte de la cadena de un cido graso

52

Pane! 2-2 Enlaces y grupos qumicos frecuentes en las molculas biolgicas.

COMPUESTOS C O
M u c h o s c o m p u e s to s b io l g ic o s c o n tie n e n un c a r b o n o u n id o a u n o x g e n o . P o r e je m p lo : a lc o h o l

COMPUESTOS C N
Las a m in a s y a m id a s s o n d o s im p o r t a n t e s e je m p lo s d e c o m p u e s t o s q u e c o n t ie n e n u n c a r b o n o u n id o a u n n it r g e n o . En a g u a , la s a m in a s se c o m b in a n c o n un io n H + y q u e d a n El O H re c ib e el n o m b r e d e g r u p o h id r o x ilo . c a r g a d a s p o s it iv a m e n t e .

H -C OH H

----- C N

a ld e h id o

II \ H

+ H+ ;

-C N H1

I \H

P o r c o n s ig u ie n t e , s o n b s ic a s . El C = 0 r e c ib e el n o m b r e c e to n a d e g r u p o c a r b o n ilo . Las a m id a s se f o r m a n p o r la c o m b in a c i n d e u n c id o y u n a a m in a . S o n m s e s ta b le s q u e lo s s te r e s . A d if e r e n c ia d e las a m in a s , e n s o lu c i n a c u o s a n o p o s e e n c a r g a . U n e je m p lo lo c o n s t it u y e el e n la c e p e p td ic o .

c=o
./
cid o c a r b o x lic o

O
OH

O
El C O O H r e c ib e el n o m b r e d e g r u p o c a r b o x ilo . E n el a g u a p ie r d e un i n H + y se c o n v ie r te e n C O C T .

/
OH
h 7n

0
c

H, 0

"n c 1 I
H 1

L o s s te r e s e s t n f o r m a d o s p o r la c o m b in a c i n d e u n c id o y u n a lc o h o l:

El n it r g e n o s e p r e s e n ta t a m b i n e n d iv e r s o s c o m p u e s t o s c c lic o s : p u r in a s y p ir im id in a s

I '-<

o + !
OH HO C-

-C C

O
+ H, 0

NH, ,H
c ito s in a (u n a p ir im id in a )

o C O
s te r

'H

c id o

a lc o h o l

FOSFATOS
El fo s fa to in o r g n ic o e s u n io n e s ta b le f o r m a d o a p a r t ir d e l c id o fo s f r ic o , H 3 P 0 4. A m e n u d o se r e p r e s e n ta c o m o P. S e p u e d e n f o r m a r s te r e s fo s f a t o e n t r e un fo s f a t o y u n g r u p o h id r o x ilo lib re .

O P O OH

O"

La c o m b in a c i n d e u n fo s f a to y u n g r u p o c a r b o x ilo , o d e d o s o m s g r u p o s fo s f a t o , d a lu g a r a u n a n h d r id o c id o .

tambin representado como

n1 O

C OH +

H ,0

53

O I I

H O pO "

| - C o PO 1 1
i

tambin representado como

HEXOSAS n = 6
Las h e x o s a s m s c o m u n e s son

MONOSACARIDOS
L o s m o n o s a c r id o s s o n a ld e h id o s o c e to n a s

PENTOSAS n = 5
U n a p e n to s a f r e c u e n t e es

glucosa H C H C OH HO C H H C OH H C OH H C OH H

.O
-C' H

c=o

H
\ ^

O C

q u e t ie n e n t a m b i n d o s o m s g r u p o s d e

h id r o x ilo . S u f r m u la g e n e r a l e s (C H 20 ) n - Los m s s im p le s s o n las tr io s a s (n = 3 ) t a le s c o m o

H C OH
I

\
C

O
-

H C OH H C OH
I

H C OH H C -OH
I

I I

H CH2OH
g lic e r a ld e h d o (u n a a ld o s a ) rib o s a

CH2OH

c= o
D-glucosa (form a de cadena abierta)
(> c h 2o h d ih id r o x ia c e t o n a (u n a c e to s a )

D-ribosa (forma de cadena abierta)

CH2OH H 4C

5c -

-OH
1 /

> CH2OH H .OH

1// H \OH c'3

H
-C 2

FORMACIN DEL ANILLO

O El g r u p o a ld e h id o o c e to n a d e u n a z c a r p u e d e r e a c c io n a r c o n u n g r u p o h id r o x ilo .

4 H ]COH

1/

\?

OH

-c 1 2

V /c \

H +

OH

// / / c -------- 0 H / \ OH 1/ H \ 1 \ \? 1 H HO 1 H
1

\ ;\?h r
1 1 H

HO C -------- - C OOH CH tOH

O -O

CH ,OH I z

?1/ / 'H 1 OH

H-

En los a z c a re s m a y o r e s (n > 4 ) , e s to p u e d e o c u r r ir d e n t r o d e la m is m a

/
H C* V H OH OH

\
CH2OH
J -

vi C
OH OH

m o l c u la , f o r m n d o s e un a n illo d e 5 o 6 m ie m b r o s .

SISTEMA DE NUMERACIN
L o s t o m o s d e c a r b o n o d e un a z c a r se n u m e r a n a p a r t ir d e l e x t r e m o m s c e r c a n o al a ld e h id o o la c e to n a .

f\!?

C |_i \> u -

s. \

H i I 0 0 -

OH

OH

P-D-glucosa

a -D -c

|3- D-ribosa

cx-D-ribosa

E S T E R E O IS O M E R O S

E S T E R E O IS M E R O S

ISMEROS
Lo s m o n o s a c r id o s t ie n e n m u c h o s is m e r o s q u e n ic a m e n t e se d if e r e n c ia n e n la o r ie n ta c i n d e s u s g r u p o s h id r o x ilo - p o r e je m p lo , la g lu c o s a , la g a la c to s a y la m a o s a s o n is m e r o s e n tr e s.

FO RM AS d

D o s is m e r o s q u e s e a n im g e n e s e s p e c u la r e s u n o d e l o tr o t ie n e n las m is m a s p r o p ie d a d e s q u m ic a s y p o r e llo r e c ib e n el m is m o n o m b r e , d is t in g u i n d o lo s m e d ia n t e e l p r e f ijo d o l .

CH tOH CH,OH HO OH OH HO CH,OH

-o

OH

D-glucosa

.17

Ir
;

:: : .

glucosa

OH ,-H O OH

plano especular
HO OH HO OH OH
a

m
III

L-glucosa

54

Panel 2-3 Algunos de los tipos de azcares encontrados habitualmente en las clulas.

ENLACES a Y (3
El g r u p o h id r o x ilo d e l c a r b o n o q u e p r e s e n te el a ld e h id o o la c e to n a p u e d e p a s a r r p id a m e n t e d e u n a p o s ic i n a o tr a . E s ta s d o s p o s ic io n e s r e c ib e n el n o m b r e d e a y (3.

DERIVADOS DE LOS AZCARES

Lo s g r u p o s h id r o x ilo d e u n m o n o s a c r id o s im p le p u e d e n s e r s u s titu id o s p o r o tr o s g r u p o s . P o r e je m p lo :

CH ,OH COOH

-O
OH.

hidroxilo (3

hidroxilo a
OH
E n c u a n t o u n a z c a r se u n e a o tr o , se c o n g e la la f o r m a a o [3.

DISACARIDOS
El c a r b o n o q u e lle v a el g r u p o a ld e h id o o c e to n a p u e d e r e a c c io n a r c o n c u a lq u ie r g r u p o h id r o x ilo d e o tr a m o l c u la , f o r m a n d o u n e n la c e g lu c o s d ic o . T r e s d is a c r id o s fr e c u e n t e s s o n la m a lto s a (g lu c o s a a 1 , 4 g lu c o s a ), la la c to s a (g a la c to s a p 1 ,4 g lu c o s a ) y la s a c a ro s a (g lu c o s a 1 ,2 fr u c to s a ). La s a c a r o s a se m u e s tr a e n la fig u r a .

a-D-glucosa

CH )OH

sacarosa (glucosa a1,2 fructosa)

OH

OH

OLIGOSACARIDOS Y POLISACRIDOS
C o n u n id a d e s s im p le s r e p e t it iv a s s e p u e d e n f o r m a r g r a n d e s m o l c u la s lin e a le s y r a m ific a d a s . Las c a d e n a s c o r ta s re c ib e n el n o m b r e d e o lig o s a c r id o s , m ie n t r a s q u e las c a d e n a s la r g a s se d e n o m in a n p o lis a c r id o s . El g lu c g e n o , p o r e je m p lo , es un p o lis a c r id o f o r m a d o e n t e r a m e n t e p o r u n id a d e s d e g lu c o s a .

se producen enlaces a1,6 en los puntos de ram ificacin

OLIGOSACRIDOS COMPLEJOS
H C
En m u c h o s c a s o s , u n a s e c u e n c ia d e a z c a re s es n o r e p e titiv a . S o n p o s ib le s m u c h a s m o l c u la s d if e r e n te s . T a le s o lig o s a c r id o s c o m p le jo s s u e le n e s ta r u n id o s a p r o t e n a s o a lp id o s .

CH )OH CHtOH CH,OH

un oligosacrido de grupo sanguneo

OH

55

ACIDOS GRASOS FRECUENTES

S e t r a t a d e c id o s c a r b o x lic o s c o n u n a la r g a c o la h id r o c a r b o n a d a .

E x is te n c e n t e n a r e s d e tip o s d is tin to s d e c id o s g r a s o s . A lg u n o s t ie n e n u n o o m s d o b le s e n la c e s y se d ic e q u e s o n in s a tu r a d o s .

COOH

COOH

COOH

E s te d o b le e n la c e o r ig in a u n a in c lin a c i n e n la c a d e n a h id r o c a r b o n a d a . El re s to d e la c a d e n a p u e d e g ir a r lib r e m e n t e a tr a v s d e lo s o tr o s e n la c e s

cido oleico

cido esterico

m odelo espacial de espacio lleno

esqueleto carbonado

TRIGLICERIDOS

Lo s c id o s g r a s o s s e a lm a c e n a n c o m o r e s e r v a e n e r g tic a (g r a s a ) m e d ia n t e su u n i n al g lic e r o l f o r m a n d o tr ig lic r id o s .

cido palm tico

(Ce)

cido esterico
(Ca)

cido oleico
(C 18)

glicerol

GRUPO CARBOXILO

FOSFOLIPIDOS

Lo s f o s f o lp id o s s o n lo s c o n s t it u y e n t e s p r in c ip a le s d e las m e m b r a n a s c e lu la r e s .

S i e s t lib r e , el g r u p o c a r b o x ilo d e u n c id o g r a s o s e io n iz a .

un fosfolpido

P e ro c o n m a y o r fr e c u e n c ia e s t u n id o a o tr o s g r u p o s f o r m a n d o s te r e s

m odelo de espacio lleno de la fosfatidilcolina

En los fo s fo lp id o s , d o s d e los g ru p o s - O H del g lic e ro l e st n u n id o s a c id o s g ra s o s , m ie n tr a s q u e

"colas" hidrofbicas de cido graso

el te rc e r g ru p o - O H e st u n id o al c id o fo s f ric o . El fo s fa to e st u n id o a d e m s a un p e q u e o g ru p o p o la r (a lc o h o le s ) d e e n tre v a rio s p o s ib le s .

56

Panel 2-4 Algunos de los tipos de cidos grasos encontrados habitualmente en las clulas y las estructuras que forman.

AGREGADOS LIPIDIOOS
Lo s c id o s g r a s o s t ie n e n u n a c a b e z a h id r o flic a y u n a c o la h id r o f b ic a .

POLI ISOPRE NOI DES

la r g o s p o lm e r o s lin e a le s d e is o p r e n o

En el a g u a p u e d e n f o r m a r u n a p e lc u la s u p e r fic ia l o p e q u e a s m ic e la s .

S u s d e r iv a d o s p u e d e n f o r m a r g r a n d e s a g r e g a d o s u n id o s p o r fu e r z a s h id r o f b ic a s : L o s t r ia c ilg lic r id o s f o r m a n g r a n d e s g o ta s e s f r ic a s e n el c ito p la s m a c e lu la r . Lo s fo s fo lp id o s y g lu c o lp id o s f o r m a n b ic a p a s lip d ic a s q u e se c ie r ra n s o b r e s m is m a s y c o n s t it u y e n la b a s e d e to d a s las m e m b r a n a s c e lu la r e s .

o mas

OTROS LIPIDOS

Lo s lp id o s se d e f in e n c o m o c o m p u e s t o s s o lu b le s e n d is o lv e n te s o r g n ic o s . O tr o s d o s tip o s fr e c u e n te s d e lp id o s s o n lo s e s te r o id e s y lo s p o liis o p r e n o id e s . A m b o s e s t n f o r m a d o s p o r u n id a d e s d e is o p r e n o . is o p r e n o

L o s e s t e r o id e s tie n e n u n a e s tr u c tu r a c o m n f o r m a d a p o r m ltip le s a n illo s .

c o le s t e r o l p r e s e n te e n m u c h a s m e m b r a n a s

te s t o s t e r o n a h o r m o n a e s t e r o id e m a s c u lin a

GLUCOLIPIDOS
A l ig u a l q u e lo s f o s f o lp id o s , e s to s c o m p u e s to s e s t n f o r m a d o s p o r u n a r e g i n h id r o f b ic a , q u e c o n tie n e d o s la r g a s c o la s h id r o c a r b o n a d a s , y u n a r e g i n p o la r , q u e c o n tie n e e n e s te c a s o u n o o m s r e s id u o s d e a z c a r, p e r o n o fo s fa to . galactosa

OH
azcar d o lc o l f o s f a t o u t iliz a d o p a ra t r a n s p o r t a r lo s a z c a re s a c tiv a d o s d u r a n t e la s n te s is a s o c ia d a a m e m b r a n a d e las g lu c o p r o t e n a s y d e a lg u n o s p o lis a c r id o s .

I H H

C-NH
r e g i n h id r o f b ic a

u n g lu c o lp id o s im p le

57

EL AMINOACIDO
La f r m u la g e n e r a l d e un a m in o c id o es

ISOMEROS OPTICOS tom o de carbono a

El t o m o d e c a r b o n o a e s a s im t r ic o , p o r lo q u e e x is te n d o s is m e r o s e s p e c u la r e s (o e s t e r e o is m e r o s ) , d y l .

grupo am ino

..... grupo carboxilo grupo de cadena lateral

H a b it u a lm e n t e R e s u n a c a d e n a la te r a l d e e n tr e 2 0 p o s ib le s . A p H 7 el g r u p o a m in o y el g r u p o c a r b o x ilo e s t n io n iz a d o s .

Las p r o te n a s c o n s ta n e x c lu s iv a m e n t e d e a m in o c id o s l.

ENLACES PEPTIDICOS
H a b it u a lm e n t e , lo s a m in o c id o s e s t n u n id o s p o r u n e n la c e a m id a d e n o m i n a d o e n la c e p e p td ic o . e n la c e p e p td ic o : lo s c u a tr o t o m o s d e c a d a re c u a d ro g ris f o r m a n u n a u n id a d p la n a r g id a . N o e x is te lib e r t a d d e r o ta c i n a lr e d e d o r d e l e n la c e C N .

L a s p r o te n a s s o n la r g o s p o lm e r o s d e a m in o c id o s u n id o s p o r e n la c e s p e p td ic o s y s ie m p r e s e e s c r ib e n c o n el e x t e m o /V -te r m in a l h a c ia la iz q u ie r d a . La s e c u e n c ia d e e s te t r ip p t id o e s H is C y s V a l.

extrem o am ino o A/-terminal

\

extrem o carboxilo o C-terminal

E s to s d o s e n la c e s s e n c illo s , a c a d a la d o d e la u n id a d p e p td ic a r g id a , t ie n e n u n a lto g r a d o d e lib e r t a d d e r o ta c i n .

FAMILIAS DE AMINOCIDOS

CADENAS LATERALES BASICAS

lis in a a r g m in a

histidina

Lo s a m in o c id o s c o m u n e s s e c la s ific a n s e g n si s u s c a d e n a s la t e r a le s s o n c id a s b s ic a s p o la re s n o c a r g a d a s n o p o la re s E s te g r u p o e s m u y E s to s 2 0 a m in o c id o s se p u e d e n a b r e v ia r d e d o s f o r m a s : p o r m e d io d e t r e s le tr a s y p o r m e d io d e u n a s o la le tra . A s : a la n in a = A la = A b s ic o , y a q u e su c a r g a p o s itiv a e s t e s ta b iliz a d a po r r e s o n a n c ia .^ E s to s n itr g e n o s tie n e n u n a a fin id a d r e la t iv a m e n t e d b il p o r e l H + y s lo s o n p a r c ia lm e n t e p o s itiv o s a p H n e u tr o .

58

Panel 2-5 Los 20 aminocidos que intervienen en la sntesis de las protenas.

m Km iaim^lfim-

CADENAS LATERALES CIDAS

c id o a s p r tic o (A s p o D ) c id o g lu t m ic o (G lu o E)

CADENAS LATERALES NO POLARES

H O

N C C
H

I I

g lic in a (G ly o G )

H
1

O
II

H
1

O n
1 II

-n

-z

N C C H
CH2

a la n in a (A la o A )

v a lin a (V a l o V )

CH,
CH, 1

C
\

O O

C
\

I I I N C C
O
H CH ;

N C C H

I I

CH ,

/ \

CH

CH,

Los a m in o c id o s c u y a s c a d e n a s la te ra le s n o p o la re s no c a r g a d a s s o n r e la tiv a m e n te h id r o flic o s y n o r m a lm e n te se s it a n e n el e x t e r io r d e las p r o te n a s , m ie n tr a s q u e las c a d e n a s la te ra le s d e a m in o c id o s n o p o la re s tie n d e n a a g r e g a r s e e n el in te r io r d e las p r o te n a s . Los a m in o c id o s c o n c a d e n a s la te ra le s c id a s s o n m u y p o la re s y casi s ie m p r e se h a lla n e n la s u p e r fic ie d e las m o l c u la s p ro te ic a s . El c d ig o d e u n a le tra , e n o r d e n a lfa b tic o :

le u c in a (L e u o L)

is o le u c in a (lle u o I)

N C C H
CH2

N C C H

A = A la C = C ys D= A sp E = G lu F = Phe

G= H= K= L=

G ly H is Lys L eu

1 = lle u

M= M et N = A sn P = P ro Q = G ln
R = A rg

S= T=

Ser Thr

CH3

/ \

CH

CH, CH,

/ \

CH

CH, CH,

V = Val

W = T rp Y = Tyr

p r o lin a (P ro o P)

CADENAS LATERALES POLARES NO CARGADAS

a sp a ra g m a (A s n o N )

N C C
CH,

I I

\
CH,

CH,

(en realidad es un im inocido)

m e t io n in a (M e t o M )

I I I N C C I I
II CH , CH,
A u n q u e la a m id a N n o e s t c a r g a d a a u n p H n e u tr o , es p o la r. s e r in a ( S e r o S)

s ch3

N C C

I I

c is te n a (C y s o C)

CH2 SH

Las c is te rn a s a p a r e a d a s p e r m it e n q u e se f o r m e n e n la c e s d is u lf u r o e n las p r o te n a s .

----- CH2 S S CH2-----

* mSM SSm

i* S

- ' !
59

u r a c lo Las b a s e s s o n c o m p u e s t o s c c lic o s c o n N y a s e a n p u rin a s o p ir im id in a s .

c ito s in a

g u a n in a t im in a P IR IM ID IN A

PURINA

FOSFATOS
N o r m a lm e n t e lo s fo s fa to s e s t n u n id o s al h id r o x ilo C 5 d e la rib o s a o d e la d e s o x ir r ib o s a . S o n fr e c u e n t e s los m o n o f o s f a t o s , d ifo s fa to s y t r ifo s fa to s .

NUCLEOTIDOS
U n n u c le t id o c o n s is te e n u n a b a s e n itr o g e n a d a , un a z c a r d e 5 c a r b o n o s y u n o o v a r io s g r u p o s fo s fa to .

ENLACE BASE-AZCAR

e n la c e BASE A /-g lu c o s d ic o

c o m o en el A M P FO SFATO

c o m o en el A D P

AZCAR

com o en el S o n las s u b u n id a d e s d e lo s cidos n u c le ic o s . El f o s f a t o h a c e q u e un n u c le tid o e s t c a r g a d o n e g a t iv a m e n t e . La b a s e e s t u n id a al m is m o c a r b o n o (C 1 ) u tiliz a d o e n lo s e n la c e s a z c a r-a z c a r. ATP

AZCAR

AZUCARES
HOCH

p -D -R IB O S A u tiliz a d a e n el c id o r ib o n u c le ic o

un a z c a r de 5 c a rb o n o s

HOCH
-D -2 -D E S O X IR R IB O S A C a d a u n o d e lo s c a r b o n o s n u m e r a d o s d e u n a z c a r se e s c r ib e c o n u n a " p r im a " ; a s h a b la m o s d e " c a r b o n o 5 - p r im a " , e tc. u tiliz a d a e n el c id o d e s o x ir r ib o n u c le ic o

60

Panel 2-6 Resumen de los principales tipos de nucletidos y sus derivados existentes en las clulas.

NOMENCLATURA

Lo s n o m b r e s p u e d e n in d u c ir a c o n fu s i n , p e r o las a b r e v ia t u r a s s o n c la ra s .

BASE a d e n in a g u a n in a c ito s in a u r a c ilo tim in a

N U C L E O S ID O a d e n o s in a g u a n o s in a c itid in a u r id in a tim id in a

ABREV. A G C U T

Lo s n u c le tid o s se a b r e v ia n c o n tr e s le tr a s m a y s c u la s , d e la s ig u ie n t e m a n e r a : BASE + A Z C A R = AMP UDP ATP = a d e n o s in a m o n o f o s f a t o = u r id in a d ifo s fa to = a d e n o s in a tr if o s f a t o

NUCLEOSIDO

d A M P = d e s o x ia d e n o s in a m o n o f o s f a t o

BASE + A Z C A R + FO SFA TO =

NUCLEOTIDO

ACIDOS NUCLEICOS
L o s n u c le t id o s e s t n u n id o s m e d ia n te u n e n la c e fo s f o d i s t e r e n tr e lo s c a r b o n o s 5' y 3 ', f o r m a n d o c id o s n u c le ic o s . La s e c u e n c ia lin e a l d e lo s n u c le tid o s d e u n a c a d e n a d e c id o n u c le ic o s e s u e le a b r e v ia r m e d ia n t e u n c d ig o d e u n a le tr a , A G C T T A C A , c o n el e x t r e m o 5 ' d e la c a d e n a a la iz q u ie r d a .

LOS NUCLETIDOS TIENEN OTRAS MUCHAS FUNCIONES

T r a n s p o r t a n e n e r g a e n s u s e n la c e s c id o - a n h d r id o , q u e s o n f c ilm e n t e h id r o liz a b le s .

NH ;

e je m p o : A T P (o Q Q )

OH

OH

OH

+ O
"O P o c h 2

S e c o m b in a n c o n o tr o s g r u p o s f o r m a n d o c o e n z im a s .

N H

o-

,o.

H ( II, H

H S -C - C - N - C - C - C - N - C - C - C C - O P ~ 0 P O CH2 OH H H H H H IH HO CH, H O O

extem o 5' O la cadena

e je m p lo : c o e n z im a A (C o A )

base
3

OH

OH

E n la c lu la s o n u tiliz a d o s c o m o m o l c u la s s e a liz a d o r a s e s p e c fic a s .

NH,
e n la c e f o s f o d i s t e r e je m p lo : A M P c c lic o ( c A M P )

O ------- CH

e je m p lo : D N A

o=pexterno 3' de la cadena

3' OH O"

OH

61

Cada nucletido se nom bra en referencia a la nica base que contiene (Panel 26, pgs. 60-61). Los nucletidos pueden actuar como transportadores de energa qumica. Destaca el ster trifosfato de adenina, ATP (Figura 2-9}, que participa en la trans ferencia de energa en cientos de reacciones celulares distintas. Su fosfato termi nal se aade utilizando la energa de la oxidacin de los alimentos, y puede ser fcilmente separado por hidrlisis liberando energa, la cual es utilizada en cual quier lugar de la clula en reacciones biosintticas energticamente desfavora bles. Como discutiremos ms adelante, otros derivados de nucletidos actan de transportadores de grupos qumicos particulares como tomos de hidrgeno o residuos de azcar, desde una molcula a otra. Adems, un derivado cclico de la adenina que contiene fosfato, el se utiliza como molcula univer sal de sealizacin dentro de las clulas y controla la velocidad de numerosas re acciones intracelulares diferentes. La importancia especial de los nucletidos estriba en el almacenamiento de la informacin biolgica. Los nucletidos constituyen los elementos de cons truccin de los cidos nucleicos, largos polmeros en los que las subunidades de nucletidos estn unidas covalentemente gracias a la formacin de un ster fos fato entre el grupo hidroxilo 3' del residuo de azcar de un nucletido y el grupo fosfato 5 del nucletido siguiente (Figura 2-10). Existen dos tipos principales de cidos nucleicos que se diferencian en el tipo de azcar de su esqueleto polim rico. Los que se basan en el azcar reciben el nombre de cidos ribonu cleicos, o RNA, y contienen las bases A, U, G y C. Los que se basan en la (en la que el hidroxilo de la posicin 2 de la ribosa est sustituido por un hidrgeno) se denominan cidos desoxfrribonucleicos, o DNA y contienen las bases A, T, G y C. La secuencia de las bases de un polmero de DNA o RNA repre senta la informacin gentica de la clula viva. La capacidad de las bases de dife rentes molculas de cido nucleico para reconocerse unas a otras mediante in teracciones no covalentes (denominadas apareamiento de bases) -G con C y A con T (en el DNA) o con U (en el RNA)- constituye, tal como se explicar en el Captulo 3, la base de toda la herencia y la evolucin.

extrem o b' de la cadena

O

AMP cclico,

O PO

ribosa

rribosa

desoxi-

o
O P = o

Resumen

Los organismos vivos son sistemas qumicos autnomos, que se autopropagan. Es tn formados por un conjunto caracterstico pero limitado de pequeas molculas basadas en el carbono que esencialmente son las mismas en todas las especies vi vientes. Las principales categoras son: azcares, cidos grasos, aminocidos y nu cletidos. Los azcares constituyen una fuente primaria de energa qumica para las clulas y son incorporados a polisacridos para el almacenamiento de energa. Los cidos grasos son tambin importantes para el almacenamiento de energa, pero su Juncin ms significativa estriba en la formacin de las membranas de la clula. Los polmeros formados por aminocidos constituyen macromolculas notablemente diversas y verstiles conocidas como protenas. Los nucletidos desempean un pa pel central en la transferencia de energa y tambin son las subunidades a partir de las cuales se construyen las macromolculas de informacin, RNA y DNA. Orden biolgico y energa7
Las clulas han de obedecer las leyes de la fsica y de la qumica. Las reglas de la mecnica y de la transformacin de una forma de energa en otra se aplican a una clula igual que a una mquina de vapor. Sin embargo, es necesario admitir que una clula tiene unos rasgos asombrosos que, a primera vista, parecen colo carla en una categora especial. Es bien conocido que con el tiempo las cosas abandonadas a su suerte pasan a quedar desordenadas: los edificios se derrum ban, los organismos muertos se descomponen, etc. Esta tendencia general se 62 Captulo 2 : Pequeas molculas, energa y biosntesis

extrem o 3' de la cadena

Figura 2-10 Un breve fragmento de cido desoxirribonuclelco (DNA) de cuatro nucletidos. Uno de tos

enlaces fosfodister, que une nucletidos adyacentes, se destaca en amarillo y uno de los nucletidos se destaca sombreado en gris. El DNA y su pariente prximo el RNA son los cidos nucleicos de la clula.

halla expresada en la segunda ley de la termodinmica, que afirma que el grado de desorden del universo (o de cualquier sistema aislado) slo puede aumentar. Lo asombroso es que los organismos vivos mantienen, a todos los niveles, un alto grado de orden; y como se alimentan, se desarrollan y crecen, parece que crean este orden a partir de materiales alimenticios que carecen de l. El orden resulta claramente aparente en grandes estructuras como el ala de una mariposa o el ojo de un pulpo, en estructuras intracitoplasmticas como una mitocondria o un cilio, o en la forma y disposicin de las molculas a partir de las que estn construidas estas estructuras. Los tomos que las constituyen han sido captura dos, en ltimo trmino, desde su estado relativamente desorganizado del medio ambiente y unidos formando una estructura determinada. Incluso una clula que no crezca, requiere para sobrevivir unos procesos constantes de ordena cin, puesto que todas sus estructuras organizadas estn sujetas a alteraciones y deben ser reparadas continuamente. Cmo es esto posible desde el punto de vista termodinmico? Veremos que la respuesta se halla en el hecho de que la clula emite constantem ente calor a su ambiente y, por consiguiente, no es un sistema aislado en el sentido termodinmico del trmino.

entorno

clula
/

El orden biolgico resulta posible gracias a la liberacin de energa calorfica por parte de las clulas 8
Como acabamos de ver, la segunda ley de la termodinmica afirma que la canti dad de orden del universo (es decir, de la clula ms su entorno) siempre debe disminuir. Por consiguiente, el aumento de orden dentro de la clula viva ha de ir acompaado de un aumento an mayor de desorden en el ambiente de la clula. El calor es energa en su forma ms desordenada -e l choque al azar de las m o lculas- y la clula cede calor al medio m ediante reacciones que ordenan las molculas que la clula contiene. El increm ento del movimiento al azar, inclui das las distorsiones de los enlaces, de las molculas del resto de universo genera un desorden que com pensa con creces el incremento de orden en la clula, tal com o requieren las leyes de la termodinmica para los procesos espontneos. De esta forma, la liberacin de calor de una clula al medio le permite ordenarse internamente al mismo tiempo que el universo en su conjunto se vuelve ms des ordenado (Figura 2-11). Es importante precisar que la clula no consigue nada produciendo calor a menos que las reacciones productoras de calor estn asociadas con los procesos que generan orden molecular en la clula. Se dice que las reacciones asociadas de esta forma estn acopladas, tal como explicaremos ms adelante. Lo que dis tingue el metabolismo de una clula de la combustin ruinosa de un fuego es el estrecho acoplamiento que existe entre la produccin de calor y el increm en to de orden. La generacin de orden en el interior de las clulas se produce a expensas de la degradacin de combustible energtico. Para las plantas la energa deriva ini cialmente de la radiacin electromagntica del sol; para los animales deriva de la energa almacenada en los enlaces covalentes de las molculas orgnicas que ingieren. Sin embargo, com o estos nutrientes han sido producidos, a su vez, por organismos fotosintetizadores como las plantas verdes, de hecho el sol es la fuente ltima de energa para ambos tipos de organismos.

/ *

'

P *~m

. 1

X f iV i i 1 ^ z1 W

v /

/ *

<

% IIIc a lo r ) m
p f^V V 1
.

Los organismos fotosintetizadores utilizan la luz solar para sintetizar compuestos orgnicos 9
La energa solar entra en el mundo vivo (la biosfera ) gracias a la fotosntesis que realizan los organismos fotosintetizadores -plantas o bacterias. En la fotosnte sis, la energa electromagntica se transforma en energa de enlace qumico. Al mismo tiempo, una parte de la energa de la luz solar se transforma en energa calorfica, y la liberacin de este calor al entorno increm enta el desorden del universo y, por consiguiente, impulsa el proceso fotosinttico. Orden biolgico y energa

Figura 2-11 Anlisis term odinm ico simple de una clula viva. En el esquema superior las molculas de la clula y del resto del universo (su entorno) se han representado en un estado relativamente desordenado. En el esquema inferior, la clula (gris) ha liberado calor por medio de una reaccin que ordena las molculas de su interior {verde). El calor incrementa el desorden en el entorno de la clula, de forma que aunque la clula crezca y se divida se cumple el segundo principio de la termodinmica.

63

Las reacciones de la fotosntesis se describen con detalle en el Captulo 14. En trminos generales, podemos decir que se pueden distinguir dos etapas distintas. En la primera etapa (la de las reacciones activadas por la luz o fase luminosa), la ra diacin visible captada por una molcula de pigmento impulsa la transferencia de electrones desde el agua hasta el NADPH, y al mismo tiempo proporciona la ener ga necesaria para la sntesis de ATP. En la segunda (la fase oscura), el ATP y el NADPH se utilizan para impulsar una serie de reacciones de fijacin de carbono', en las que el C 0 2 del aire se utiliza para formar molculas de azcar (Figura 2-12), El resultado neto de la fotosntesis, en lo que se refiere a la planta verde, se puede resumir en la siguiente ecuacin: energa + C 0 2 + H20 azcar + 0 2 Esta ecuacin simple esconde la com pleja naturaleza de las reacciones de la fase oscura, que abarcan numerosas reacciones consecutivas. Adems, y aunque la fijacin inicial del C 0 2 da lugar a azcares, las reacciones metablicas subsi guientes los convierten rpidamente en otras molculas, grandes y pequeas, esenciales para la clula vegetal.

SOL

reacciones activadas por la luz

E SI

La energa qum ica pasa de las plantas a los animales

Los animales y otros organismos no fotosintetizadores no pueden capturar di rectam ente la energa de la luz solar y, por ello, han de sobrevivir gracias a la energa de segunda m ano" que obtienen al ingerir plantas o a la de tercera m ano", obtenida al com er otros animales. Las molculas orgnicas producidas por las clulas vegetales suministran a los organismos que se alimentan de ellas tanto elementos estructurales para la construccin como combustible. Todos los tipos de molculas vegetales pueden servir para este propsito -azcares, protenas, polisacridos, lpidos y otros muchos compuestos. No todas las transacciones entre plantas y animales son unidireccionales. Las plantas, los animales y los microorganismos han existido juntos en este pla neta durante tanto tiempo que muchos se han convertido en una parte esencial del medio am biente de los otros. Por ejemplo, el oxgeno liberado durante la fo tosntesis se consum e en la com bustin de las molculas orgnicas realizada por casi todos los organismos, y algunas de las molculas de C 0 2 que hoy se fijan en molculas orgnicas mayores en una hoja verde mediante la fotosntesis, an teayer fueron liberadas a la atmsfera por la respiracin de un animal. As, la uti lizacin del carbono es un proceso cclico que abarca el conjunto de la biosfera y cruza los lmites de los organismos individuales (Figura 2-13). Anlogamente, los

reacciones ce la fase oscura

C02

A Z CA R

Figura 2-12 La fotosntesis. Las dos fases de la fotosntesis en una planta verde.

C 0 2 en la A TM S F E R A y en el A G U A

Figura 2-13 El ciclo del carbono. Los

RESPIRACIN POR MICROORGANISMOS

COMBUSTIN Y EROSIN

tomos de carbono se incorporan a las molculas orgnicas del mundo vivo gracias a la actividad foto sintetizado de las plantas, las bacterias y las algas marinas. Pasan luego a los animales, a los microorganismos y al material orgnico del suelo y de los ocanos, a travs de vas cclicas. El C02vuelve a la atmsfera cuando las molculas orgnicas son oxidadas por las clulas o quemadas por el hombre en forma de combustibles fsiles.

Y COMBUSTIBLES FSILES

64

Captulo 2 : Pequeas molculas, energa y biosntesis

(A)

ATOMO 2

FORMACION DE UN ENLACE COVALENTE

ATOMO 1

este extrem o tiene una carga parcial positiva

MOLECULA

H C H

este extrem o tiene una carga parcial negativa debido a un exceso de electrones

m etano

H H C OH H

Figura 2-14 Oxidacin y reduccin. (A) Cuando dos tomos forman un enlace covalente, uno de los tomos tiene una mayor cantidad de electrones de forma que adquiere una carga negativa parcial: se dice que se ha redu cido, mientras que el otro adquiere una carga positiva parcial y se dice que se ha o x id ad o . (B) El tomo de carbono del metano puede ser convertido en el del dixido de carbono mediante la eliminacin sucesiva de sus tomos de hidrgeno. En cada paso los electrones son alejados del tomo de carbono, y el tomo de carbono se va oxidando progresivamente. Cada una de estas etapas es energticamente favorable dentro de la clula.

m etanol
H

form aldehdo
H

c= o

tomos de nitrgeno, de fsforo y de azufre pueden seguirse, en principio, desde una molcula biolgica a otra, a travs de unos ciclos similares al del carbono.

HO

c= o

cido frm ico

Las clulas obtienen energa mediante la oxidacin de molculas biolgicas 10

Los tomos de carbono y de hidrgeno de las molculas que las clulas toman como alimento pueden utilizarse como combustible porque no se encuentran en su forma ms estable. La atmsfera terrestre contiene una gran cantidad de oxgeno, y en presencia de oxgeno la forma energticamente ms estable del carbono es el C 0 2, y la del hidrgeno es el H20 . Por consiguiente, una clula puede obtener energa de las molculas de glucosa o de las de protena, permi tiendo que sus tomos de carbono e hidrgeno se com binen con oxgeno produ ciendo C 0 2 y H20 , respectivamente. Sin embargo, la clula no oxida las m olcu las en un solo paso, como ocurre en la combustin. A travs de la accin de catlisis especfica mediante enzimas especficas, hace pasar las molculas a tra vs de un gran nmero de reacciones que slo rara vez implican la adicin direc ta de oxgeno. Antes de estudiar estas reacciones y de poder comprender la fuer za impulsora que las mueve, debemos aclarar qu entendemos por un proceso de oxidacin. En el sentido que antes hemos utilizado, la oxidacin no significa nica mente la adicin de tomos de oxgeno: el trmino se aplica de manera ms ge neral a cualquier reaccin en la que se transfieran electrones de un tomo a otro. Oxidacin, en este sentido, hace referencia a la eliminacin de electrones, y re duccin -lo contrario de oxidacin- significa la adicin de electrones. As, el Fe2 + se oxida si pierde un electrn convitindose en Fe3+, y un tomo de cloro se re duce si acepta un electrn convirtindose en CL. Tambin se utilizan estos mis mos trminos cuando slo se produce un desplazamiento parcial de electrones entre tomos unidos por un enlace covalente (Figura 2-14A). Por ejemplo, cando un tomo de carbono forma un enlace covalente con un tomo con una gran afinidad por los electrones, como el oxgeno, el cloro o el azufre, cede ms que su parte correspondiente de electrones, adquiriendo una carga positiva parcial y entonces se dice que se ha oxidado. Contrariamente un tomo de carbono en un enlace C-H tiene una carga de electrones mayor que la que le corresponde y por ello se dice que est reducido (Figura 2-14B). A menudo, cuando una molcula capta un electrn (e ) tambin capta un protn (H+ ) (en solucin acuosa hay una gran cantidad de protones libremente

dixido de carbono

o= c= o

Orden biolgico y energa

asequibles). En este caso el efecto neto es la adicin de un tomo de hidrgeno a la molcula A + e + H+^ AH A pesar de que en esta reaccin participa un protn y un electrn, (en lugar de solamente un electrn), las hidrogenacianes de este tipo son reducciones y las reacciones contrarias , las deshidrogenaciones son oxidaciones. La combustin de los materiales alimenticios en una clula convierte los tomos de C y de H de las molculas orgnicas (en las que se hallan en un estado relativamente rico en electrones, o sea, reducido) en C 0 2 y H20 , compuestos en los que el C y el H han cedido electrones y, por consiguiente, estn altamente oxidados. El paso de electrones desde el carbono y el hidrgeno hasta el oxgeno permite a todos estos tomos alcanzar un estado ms estable, y por ello la trans formacin es energticam ente favorable.
O

energa de activacin

.5

D )

C D C

< D

proceso de la re accin---------
Figura 2-15 El principio de la energa de activacin. El compuesto X se halla en un estado m etaestable ya que si se transforma en el compuesto Y se liberar energa. Sin embargo, esta transicin no ocurrir a menos que X pueda adquirir la en erga d e activacin suficiente de su entorno {mediante colisiones poco habituales con otras molculas) para sufrir la reaccin.

La degradacin de una m olcula orgnica se realiza a travs de una secuencia de reacciones catalizadas enzim ticam ente 11
Aunque la forma energticam ente ms favorable del carbono es el C 0 2 y la del hidrgeno es el H20 , un organismo vivo no desaparece transformndose en humo por la misma razn que este libro no empieza a arder en cualquier m o mento: en ambos casos las molculas existen en niveles energticos metaestables y necesitan una energa de activacin (Figura 2-15) para poder transfor marse en configuraciones ms estables. En el caso del libro, la energa de activacin puede ser suministrada por una cerilla encendida. Para una clula viva, la com bustin se puede obtener de una manera ms controlada. El papel de la cerilla lo realiza una colisin energtica poco habitual de una molcula con otra. Adems, las nicas molculas que reaccionan son las que se hallan unidas a la superficie de las enzimas. Como se explica en el Captulo 3, las enzim as son catalizadores proteicos al tam ente especializados. Como todos los dems tipos de catalizadores, aceleran las reacciones reduciendo la energa de activacin de un cambio qumico deter minado, Las enzimas se unen fuertemente a las molculas de su substrato y las mantienen de tal forma que reducen notablem ente la energa de activacin de una determinada reaccin que reordena algunos enlaces covalentes. Al reducir selectivamente la energa de activacin de una determinada reaccin de las que puede sufrir la molcula unida, las enzimas determinan cul de las diferentes vas alternativas de rotura o formacin de enlaces covalentes se producir (Figu ra 2-16). El producto liberado por la enzima tras la reaccin enzimtica podr unirse a una segunda enzima que catalice otra reaccin. De esta manera, cada pna de las muchas molculas de una clula pasan de una a otra enzima siguien do vas especficas de reacciones, determinando as la qumica celular. Ms ade lante discutiremos algunas vas centrales del metabolismo energtico. El xito de los organismos vivos se puede atribuir a la habilidad de las clu las para producir muchos tipos diferentes de enzimas, cada uno con propieda des especficas. Cada enzima tiene una forma nica y une un conjunto determi nado de molculas (llamadas substratos), de tal manera que la enzima acelera una reaccin determinada normalmente unas 101 4 veces. Como otros cataliza dores, las molculas de la enzima no cambian despus de participar en una re accin y por lo tanto pueden actuar una y otra vez.

Parte de la energa liberada en las reacciones de oxidacin se acopla a la reaccin de form acin de ATP12
Las clulas obtienen energa til a partir de la ''combustin de la glucosa, nicamente porque la queman de una manera muy compleja y controlada. Mediante vas de reaccin dirigidas por enzimas, las reacciones qumicas de snte sis, o reacciones anablicas, que generan el orden biolgico, estn estrechamente

66

Captulo 2 : Pequeas molculas, energa y biosntesis

i n

(A)

no catalizada m olculas con una energa media

catlisis enzimtica de la reaccin 1

muchas m olculas tienen una cantidad de energa suficiente para seguir la reaccin catalizada enzim ticam ente casi no hay molculas que tengan la cantidad de energa tan elevada necesaria para seguir la reaccin en ausencia de enzima

(B)

energa por molcula

acopladas a las reacciones de degradacin, o catablicas, que proporcionan la energa. La diferencia crucial entre una reaccin acoplada y una reaccin no acoplada se ilustra mediante una analoga m ecnica en la Figura 2-17, en la que una reaccin qum ica energticam ente favorable se representa por las ro cas que caen desde un acantilado. Normalmente la energa cintica de las rocas que caen se desperdiciara com pletam ente en forma del calor generado cuan do chocan contra el suelo (seccin A). Pero m ediante un cuidadoso dispositivo parte de la energa cintica podra ser utilizada para accionar una rueda de pa las que eleva un cubo de agua (seccin B). Puesto que en la seccin B las rocas slo pueden llegar al suelo accionando la rueda de palas, decimos que la reac cin espontnea de la cada de las rocas ha sido acoplada directamente a la reac cin no espontnea de elevacin del cubo de agua. Dado que ahora parte de la energa se utiliza para realizar un trabajo, las rocas llegan al suelo con una velo cidad menor que en la seccin A y se pierde menos energa en forma de calor. En las clulas las enzimas desempean el papel de la rueda de palas de nuestra analoga, y acoplan la combustin espontnea de los alimentos a reac ciones que generan el nuclesido trifosfato, ATP. De la misma forma que la energa acumulada en el cubo de agua elevado de la Figura 2-17 se puede utilizar poco a poco para impulsar diversas mquinas hidrulicas (seccin C), el ATP ac ta como dador conveniente y verstil de energa, impulsando muchas reaccio nes qumicas diferentes necesarias para la clula (Figura 2-18).

Figura 2-1 6 Catlisis enzim tica. (A) Un modelo de caja que ilustra de qu forma las enzimas dirigen a las molculas a travs de vas determinadas. En este modelo, la p elo ta verde representa el substrato potencial de una enzima, (compuesto X) el cual se desplaza arriba y abajo de niveles energticos a causa del constante bombardeo de las molculas de agua que colisionan con ella. Las cuatro paredes de la caja representan las barreras de energa de activacin para cuatro reacciones qumicas diferentes energticam ente favorables. En la caja de la izquierda no se produce ninguna de estas reacciones, ya que la energa disponible gracias a las colisiones es insuficiente para superar ninguna de las barreras energticas. En la caja de la derecha, la catlisis enzimtica reduce la energa de activacin nicam ente para la reaccin nmero 1. As permite que, con la energa disponible, se produzca esta reaccin de forma que el com puesto X se transforma en el com puesto Y. Entonces, el com puesto Y se puede unir a otra enzima que lo transforme en el com puesto Z, y as sucesivamente. (B) Distribucin de energas en una poblacin de molculas idnticas. Para que se produzca una reaccin qumica determinada, la energa de la molcula (en forma de movimientos de traslacin, vibracin y rotacin) ha de exceder la energa de activacin; en la mayora de los casos esto nunca ocurre si no se produce una catlisis enzimtica.

La hidrlisis del ATP genera orden en las clulas 13

De qu forma acta el ATP como transportador de energa qumica? En las con diciones existentes en el citoplasma, la hidrlisis del ATP liberando fosfato inor gnico (Pj), se produce gracias a la catlisis de una enzima, y libera una gran can tidad de energa utilizable. Un grupo qumico que se halle unido mediante un Orden biolgico y energa

67

TRABAJO TIL

la energa cintica se transform a nicam ente en energa calorfica

parte de la energia cintica se utiliza elevando un cubo de agua, por lo que se libera menos energia en form a de calor

la energa potencial almacenada en el cubo de agua elevado se puede utilizar para im pulsar diversas m quinas hidrulicas.

enlace reactivo de este tipo ser transferido a otra molcula; por ello se puede considerar que el fosfato terminal del ATP se halla en un estado activado. El enla ce que se rompe en esta reaccin de hidrlisis recibe, a veces, el nombre de en lace de alta energa. Sin embargo, este enlace no tiene nada de especial. Sim plem ente ocurre que en solucin acuosa la hidrlisis del ATP genera dos m o lculas (ADP y P) de energa mucho menor. Muchas de las reacciones qumicas de la clula son energticamente desfa vorables. Estas reacciones son impulsadas por la energa liberada en la hidrlisis del ATP a travs de enzimas que acoplan directamente la reaccin determinada desfavorable con la reaccin favorable de la hidrlisis del ATP. Entre estas reac ciones se encuentran las que intervienen en la sntesis de las molculas biolgi cas, en el transporte activo de las molculas a travs de las membranas celulares y en la generacin de fuerza y de movimiento. Estos procesos desempean un papel vital en el establecim iento del orden biolgico. Por ejemplo, las macromolculas formadas en las reacciones de biosntesis transportan informacin, cata lizan reacciones especficas y son ensambladas en estructuras altamente orde nadas. Unas bom bas situadas en las m embranas mantienen la composicin interna especial de las clulas y permiten que las seales pasen al interior de las

Figura 2-17 Esquema de un modelo mecnico que ilustra el principio de acopiamiento de las reacciones qumicas. La reaccin espontnea mostrada en (A) puede servir como analoga de la oxidacin directa de la glucosa a C 0 2 y H20 , que nicamente produce calor. En (B), la misma reaccin est acoplada a una segunda reaccin; esta segunda reaccin puede servir como analoga de la sntesis de ATP. La energa producida en una forma ms verstil, en (B) puede ser utilizada para impulsar otros procesos celulares, como se ve en (C). El ATP es la forma de energa ms verstil de las clulas.

energa asequible para trabajo celular y para sntesis qumica

Figura 2-18 La molcula de ATP sirve com o transportador de energa en las clulas. Como se indica, la formacin de ATP desde ADP y fosfato inorgnico, energticamente desfavorable, est acoplada a la oxidacin de molculas alimenticias, energticamente favorable (vase la Figura 2-17B). La hidrlisis de este ATP hasta ADP y fosfato inorgnico proporciona la energa necesaria para impulsar muchas reacciones celulares importantes.

68

Captulo 2 : Pequeas molculas, energa y biosntesis

clulas y entre ellas. Finalmente, la produccin de fuerza y de movimiento per mite que el contenido citoplasmtico de la clula sea organizado y que las pro pias clulas se desplacen y se ensamblen formando tejidos.

Resumen
Las clulas vivas estn altamente ordenadas y, por consiguiente, han de generar or den dentro de ellas mismas para sobrevivir y crecer. Desde el punto de vista termodinmico esto slo es posible gracias a una entrada continua de energa, parte de la cual las clulas ceden a su entorno en form a de calor. La energa procede en ltimo trmino de la radiacin electromagntica del sol, que impulsa la formacin de mo lculas orgnicas en los organismos fotosintetizadores como las plantas verdes. Los animales obtienen su energa ingiriendo estas molculas orgnicas y oxidndolas en una serie de reacciones catalizadas enzimticamente y acopladas a la formacin de ATP. En todas las clulas el ATP es un dador general de energa y su hidrlisis, energticamente favorable, est acoplada a otras reacciones, impulsamlo diversos procesos energticamente desfavorables que generan el elevado grado de orden esencial para la vida.

El alimento y la obtencin de la energa celular1 4

Las molculas alim enticias son degradadas en tres etapas, para producir ATP
Las protenas, los lpidos y los polisacridos, que constituyen la mayor parte de los alimentos que comemos, han de ser degradados a molculas menores antes de que nuestras clulas puedan utilizarlos. Se puede considerar que la degrada cin enzimtica, o catabolismo, de estas molculas ocurre en tres etapas (Figura 2-19). Haremos un breve esbozo de estas etapas antes de estudiar con mayor de talle dos de ellas. La fase 1, llamada digestin, ocurre principalmente en el intestino. Las grandes molculas polimricas se escinden en sus subunidades monomricas -las protenas en aminocidos, los polisacridos en azcares y las grasas en ci dos grasos y glicerol- mediante la accin de enzimas segregadas. La fase 2 ocu rre en el citoplasma despus de que las pequeas molculas resultantes de la fase 1 penetren en las clulas, donde sufren una degradacin posterior. La m a yora de los tomos de carbono e hidrgeno de los azcares se transforman en piruvato, que penetra luego en las mitocondrias, donde se transforma en los grupos acetilo del com ponente qumicamente reactivo acetil coenzima A (acetil CoA) (Figura 2-20). Tam bin se producen grandes cantidades de acetil CoA m e diante la oxidacin de los cidos grasos. En la fase 3, el grupo acetilo del acetil CoA se degrada completamente hasta C 0 2 y H20 en la mitocondria. En esta fase final se genera la mayor parte del ATP. Mediante una serie de reacciones qumi cas acopladas, alrededor de la mitad de la energa que tericamente se puede obtener de la combustin de los carbohidratos y de las grasas hasta H20 y C 0 2 se canaliza para impulsar la reaccin energticamente desfavorable P + ADP - ATP. Puesto que el resto de la energa de combustin se cede por la clula en for ma de calor, esta sntesis de ATP crea un desorden neto en el universo, de acuer do con la segunda ley de la termodinmica. A travs de la formacin de ATP, la energa derivada originariamente de la combustin de los carbohidratos y de las grasas se redistribuye en una forma de energa qumica convenientemente empaquetada. Aproximadamente unas 109 molculas de ATP se encuentran en solucin por todo el espacio intracelular de una clula tpica, donde su hidrlisis a ADP y fosfato es energticamente favora ble y proporciona la energa que impulsar un gran nmero de diferentes reac ciones acopladas que, en s mismas, son energticamente desfavorables por lo que de lo contrario no se produciran.

El alimento y la obtencin de la energa celular

alim ento ETAPA 1: transform acin de las grandes m olculas en subunidades sim ples

protenas

polisa ;ndos

gra sas

am ino cidos

azcares sim ples, com o la glucosa

cidos grasos y gii ;erol

Figura 2-19 Diagrama simplificado de las tres etapas del catabolism o que conducen desde el alimento hasta los productos residuales. Esta serie de reacciones produce ATP, que luego es utilizado para impulsar reacciones de biosntesis y otros procesos celulares que requieren energa.

ETAPA 2: degradacin de las subunidades sim ples hasta acetil CoA, acompaada de la produccin de una cantidad lim itada de ATP y de NADH

ETAPA 3: oxidacin com pleta del acetil CoA hasta H2 O y CO 2 , acompaada de la produccin de una gran cantidad de ATP y de NADH

nh3

h 2o

C 02

; residual

La glucolisis puede producir ATP incluso en ausencia de oxgeno

La parte ms importante de la fase 2 del catabolismo es una secuencia de reac ciones conocida como glucolisis -la lisis (rotura) de la glucosa. La glucolisis pue de producir ATP en ausencia de oxgeno, y probablemente apareci pronto en la historia de la vida, antes de que las actividades de los organismos fotosintticos introdujeran oxgeno en la atmsfera. En la glucolisis una molcula de glucosa, de seis tomos de carbono, se transforma en dos molculas de piruvato, de tres tomos de carbono cada una. Esta conversin se produce a travs de una se cuencia de nueve etapas enzimticas que generan intermediarios que contienen fosfato (Figura 2-21). La clula hidroliza dos molculas de ATP para impulsar las primeras etapas, pero produce cuatro molculas de ATP en las etapas finales, de forma que se produce una ganancia neta de ATP. Desde un punto de vista lgico, la secuencia de reacciones se puede dividir en tres partes: (1) en las etapas 1 a 4, la glucosa se transforma en dos molculas de tres tomos de carbono cada una, el gliceraldehdo 3-fosfato, transformacin

70

Captulo 2 : Pequeas molculas, energa y biosntesis

grupo acetilo

coenzima A

ADENINA
H H
H 3 C - C - S - C - C - N - C - C - C - N - C - C c C - O - P - O - P - O - C H t O

Il

O H H

I I I

OH

I I I I
I I I

CH, H

Figura 2-20 El acetil coenzim a A (acetil CoA). Este intermediario m etablico crucial se genera cuando los grupos acetilo producidos en la fase 2 del catabolismo se unen covalentemente al coenzima A (CoA).

H H H

I I I

H H H

I I I

O H C H 3H

O-

O-

aceti I Co A
HtO

H H

H - S - C - C - N - C - C - C - N - C - C C C - O - P - O - P - O - C H , H H H

II

O H H

I I I I

OH

III

CH, H

I 3 I

I I I

I I

I I I

H H H

I I I

OH CH , H

I I I

O"

O"

CoA

que requiere un aporte de energa en forma de hidrlisis de ATP para suminis trar dos fosfatos; (2) en las reacciones 5 y 6, el grupo aldehido del gliceraldehdo 3 -fosfato se oxida a cido carboxlico y la energa de esta reaccin se acopla a la sntesis de ATP a partir de ADP y fosfato inorgnico; y (3), en las reacciones 7, 8 y 9, las mismas molculas de fosfato que fueron aadidas a los azcares en la pri mera secuencia de reacciones son transferidas de nuevo al ADP formando ATP, recuperndose as la inversin original de dos molculas de ATP hidrolizadas en la primera secuencia de reacciones (vase Figura 2-21). Al final de la glucolisis, el balance energtico (por molcula de glucosa) es un beneficio neto de las dos molculas de ATP que fueron producidas en las re acciones 5 y 6. Puesto que estas dos reacciones son las nicas reacciones de la secuencia en las que se forma un enlace fosfato rico en energa a partir de fosfa to inorgnico, constituyen el corazn de la glucolisis. Por otra parte, estas reac ciones constituyen un excelente ejemplo de cmo las reacciones de la clula se pueden acoplar para aprovechar la energa liberada en las oxidaciones (Figura 2-22). El resultado total es que un grupo aldehido de un azcar se oxida a cido carboxlico, que un grupo fosfato inorgnico se transfiere a un enlace de alta energa del ATP y que una molcula de NAD+ se reduce a NADH, una molcula que desempea un papel central en el metabolismo energtico, como discutire mos ms adelante. Este elegante conjunto de reacciones acopladas fue proba blemente una de las primeras etapas metablicas que aparecieron en la clula durante su evolucin. Para la mayora de las clulas animales la glucolisis nicamente es un prelu dio de la fase 3 del catabolismo, ya que el cido pirvico que se forma penetra rpidamente en las mitocondrias donde ser oxidado completamente a C 0 2 y H20 . Sin embargo, en el caso de los organismos anaerbicos (los que no utilizan oxgeno molecular) y para algunos tejidos como el msculo esqueltico que pueden verse sometidos a condiciones anaerbicas, la glucolisis por s sola se puede convertir en la fuente principal de ATP de la clula. Las reacciones pro ductoras de energa y anaerbicas de este tipo, reciben el nombre de ferm enta ciones. En estos casos las molculas de piruvato no son degradadas en la mitocondria sino que permanecen en el citosol y, segn el organismo de que se trate, pueden ser transformadas en etanol y C 0 2 (en las levaduras) o en lactato (en el msculo), compuestos que luego son excretados. Estas reacciones posteriores del piruvato utilizan el potencial reductor producido en la reaccin 5 de la glu colisis, regenerando as el NAD+ que se requiere para que contine la glucolisis, como discutiremos en el Captulo 14.

El alimento y la obtencin de energa celular

71

glucosa

g
glucosa 6-fosfato

fructosa 6*fosfato

jjj-

3
fructosa 1,6-bisfosfato

Figura 2-21 Glucolisis. Cada una de las reacciones mostradas aqu est catalizada por una enzima diferente. En la serie de reacciones designadas como paso 4, un azcar de seis carbonos es transformado en dos azcares de tres carbonos, de modo que a partir de este paso el nmero de molculas es el doble. Las reacciones 5 y 6 (en la zona amarilla) son las responsables de la sntesis neta de molculas de ATP y de NADH (vase Figura 2-22).

dihidroxiacetona fosfato

2x 2x ( P

gliceraldehdo 3-fosfato

O 1,3-bisfosfoglicerato 6 3-fosfoglicerato

gliceraldehdo 3-fosfato

CHOH C H 20

- HS "v
7 2-fosfoglicerato 8 x fosfoeno lpiru vato CHOH
c h

enzima

2o

2 sa
2x piruvato O S "v

NAD+

+ H+
enzim a

REACCIN 5

\ /
C CHOH
c h

2o

Figura 2-22 Reacciones 5 y 6 de la glucolisis. En estas reacciones la oxidacin de un aldehido a un cido carboxlico est acoplada a la formacin de ATP y de NADH (vase tambin Figura 2-21), Como se indica aqu, la reaccin 5 empieza cuando la enzima gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa (vase Figura 3-42) forma un enlace covalente con el carbono del grupo aldehido del gliceraldehdo 3-fosfato. Despus, el hidrgeno (como ion hidruro -un protn con dos electrones) es eliminado del grupo aldehido del gliceraldehdo 3-fosfato y se transfiere al importante transportador de hidrgeno NAD+(vase Figura 2-24). Este paso de oxidacin genera un grupo carbonilo de un azcar unido a la enzima mediante un enlace de alta energa (mostrado en rojo). Entonces, un ion fosfato (P) de la solucin rompe este enlace generando en su lugar un enlace azcar-fosfato de alta energa {enlace rojo). En estas dos ltimas reacciones la enzima ha acoplado el proceso energticamente favorable de oxidacin de un aldehido con la formacin energticamente desfavorable de un enlace fosfato de alta energa, permitiendo que la segunda reaccin sea dirigida por la primera. Finalmente, en el paso 6 de la glucolisis el grupo fosfato reactivo recientemente.creado es transferido al ADP para formar ATP, dejando un grupo carboxlico libre en el azcar oxidado.

HS "v

enzima

\C /
I
CHOH C H ,0 1,3-bisfosfoglicerato

[A D Pj

REACCIN
6

OH

% /
C CHOH
c h

3-fosfoglcerato

2o

72

Captulo 2 : Pequeas molculas, energa y biosntesis

El NADH es el intermediario central en el catabolismo oxidativo

La generacin anaerbica de ATP a partir de glucosa y a travs de las reacciones de la glucolisis es relativamente ineficiente. Los productos finales de la glucolisis anaerbica contienen an una gran cantidad de energa qumica que puede ser liberada mediante su oxidacin posterior. La evolucin del catabolismo oxidati vo (respiracin celular) slo result posible despus de que el oxgeno molecular se hubiera acumulado en la atmsfera terrestre, como resultado de la fotosnte sis realizada por las cianobacterias. Antes de ello, los procesos catablicos anaerbicos haban dominado la vida sobre la Tierra. La adicin al proceso catabli co de una fase dependiente de oxgeno (fase 3 de la Figura 2-19) proporcion a las clulas un mtodo mucho ms potente y eficaz de extraer energa de las m o lculas alimenticias. Esta tercera fase empieza con el ciclo del cido ctrico (de nominado tambin ciclo de los cidos tricarboxlicos o tambin, ciclo de Krebs) y termina con la fosforilacin oxidativa, procesos que se producen tanto en las bacterias aerbicas como en las mitocondrias de las clulas eucariotas. En la Figura 2-23 se presenta una versin simplificada de los dos procesos centrales del catabolismo oxidativo. En primer lugar, en el ciclo del cido ctrico los grupos acetilo de las molculas de acetil CoA son oxidados hasta C 0 2 y NADH. A continuacin, en el proceso de fosforilacin oxidativa el NADH genera do reacciona con el oxgeno molecular ( 0 2) produciendo ATP y H20 , a travs de una complicada serie de etapas que implican un transporte de electrones a tra vs de una membrana.
(A)

Figura 2-2 3 Esquema simplificado de la etapa 3 del catabolism o. El proceso produce primariamente grandes cantidades de ATP a partir de ADP y de fosfato inorgnico (P). El ciclo del cido ctrico produce NADH, que luego es utilizado para dirigir la produccin de ATP a travs de la fosforilacin oxidativa. As pues, el NADH acta com o intermediario central en la oxidacin de grupos acetilo hasta C 0 2 y H20 (tambin juega un papel similar, aunque en menor cantidad, el FADH2).

NAD
O

NADH
l~ k ^i c
NH,

//

o
NH:

anillo de nicotinam ida

Pj-O
RIBOSA V

p)-oRIBOSA

PhO

P h -O

(B)

H -C -O H

; + NAD+ ------ C= 0 + NADH + H+

Figura 2 -24 El NAD+y el NADH. Estas dos molculas son los transportadores de electrones ms importantes en las reacciones catablicas. Sus estructuras se muestran en (A). NAD+es la abre viatura de n icotin am id a ad en in a d in u cletid o, reflejando el hecho de que la mitad derecha de la molcula, tal como se indica en el dibujo, es el monofosfato de adenosina (AMP). La parte de la molcula del NAD+conocida como el anillo de nicotinamida (som breada en gris) es capaz de aceptar dos electrones y un protn (en total un ion hidruro, H ), formando NADH. En esta forma reducida, el anillo de nicotinamida tiene una estabilidad reducida debido a que ya no est estabilizada por resonancia. Como consecuencia de ello, el ion hidruro incorporado est a ctiv a d o en el sentido de que es fcilm ente transferido a otras molculas. (B) Ejemplo de una reaccin en la que participan el NAD+y el NADH. En la oxidacin biolgica de una molcula de substrato, com o un alcohol, el substrato pierde dos tomos de hidrgeno. Uno de ellos se aade como ion hidruro al NAD+ , produciendo NADH, mientras que el otro se libera a la solucin como un protn (H+ ).

El alimento y la obtencin de energa celular

73

El NADH, intermediario central en estos procesos, tambin lo encontramos como un producto de la glucolisis (vase Figura 2-22). Es un imporante trans portador de poder reductor en las clulas. Como se ilustra en la Figura 2-24, est formado por la adicin de un ncleo de hidrgeno y dos electrones (un ion hidruro H ) a la adenina nicotinamida dinucletido (NAD+ ). Debido a que esta adi cin tiene lugar de una forma tal que el ion hidruro queda asociado a travs de una unin rica en energa, el NADH acta en la clula como una fuente adecua da de electrones fcilmente transferibles, de una forma semejante a como el ATP acta com o una fuente adecuada de grupos fosfato fcilmente transferibles.

El metabolism o est dominado por el ciclo del cido ctrico 15

La funcin primaria del ciclo del cido ctrico consiste en oxidar los grupos acetilo que entran en el ciclo en forma de molculas de acetil CoA. Las reacciones forman un ciclo porque el grupo acetilo no se oxida directamente, sino despus de haberse unido covalentemente a una molcula mayor, el oxalacetato, que se regenera al final de cada vuelta del ciclo. Tal como se ilustra en la Figura 2-25, el ciclo empieza con la reaccin que tiene lugar entre el acetil CoA y el oxalacetato, formando una molcula de un cido tricarboxlico denominada cido ctrico (o citrato). Luego se producen una serie de reacciones en las que dos de los seis tomos de carbono del citrato se oxidan a C 0 2, formando otra molcula de oxa lacetato, que inicia de nuevo el ciclo. (Puesto que los carbonos que entran en cada ciclo se incorporan en lugares del citrato diferentes a los que se oxidan a C 0 2, no sern oxidados hasta despus de varias vueltas del ciclo.) El C 0 2 produ cido en estas reacciones sale de la mitocondria (o de la bacteria) por difusin y abandona de la clula. La energa que se libera cuando se oxidan los enlaces C-H y C-C del citrato puede ser capturada de varias maneras diferentes en el transcurso del ciclo del

piruvato
NAD+

3C C 02 2C

4 H' ,

> > acetil CoA

NADH l + H+ -------------------- y
1 7

citrato
....................V

6C
Figura 2-25 El ciclo del cido ctrico. En las mitocondrias y en las bacterias aerbicas los grupos acetiio producidos a partir del piruvato se oxidan posteriormente. Los tomos de carbono de los grupos acetilo se transforman en C 0 2, mientras que los tomos de hidrgeno se transfieren a las molculas transportadoras NAD+y FAD. tomos adicionales de oxgeno e hidrgeno entran en el ciclo en forma de agua en los pasos indicados con un asterisco (*). El nmero de carbonos de cada molcula se indica en el recuadro blan co. Para ms detalles vase Figura 14-14.

isocitrato s
L

6C i NAO+i . i + h4

74

Captulo 2 : Pequeas molculas, energa y biosntesis

cido ctrico. En un paso del ciclo (de succinil CoA a succinato) se genera un en lace fosfato rico en energa mediante un mecanismo parecido al que se ha des crito antes para la glucolisis. El resto de la energa de oxidacin que se captura en el ciclo se canaliza hacia la conversin de molculas transportadoras de hi drgeno -o iones hidruro- en sus formas reducidas; en cada vuelta del ciclo, tres molculas de NAD+ se convierten en NADH y un (FAD) se convierte en FADH2. La energa transportada por el hidrgeno activado de estas molculas transportadoras se utiliza en las reacciones de la (que ser considerada con ms detalle ms adelante), las nicas reac ciones descritas aqu que requieren oxgeno molecular de la atmsfera. Los tomos de oxgeno adicionales necesarios para producir C 0 2 a partir de los grupos acetilo que entran en el ciclo del cido ctrico no son suministrados por el oxgeno molecular, sino por el agua. En cada vuelta del ciclo, tres m olcu las de agua se rompen y sus tomos de oxgeno se utilizan produciendo C 0 2. Al gunos de sus tomos de hidrgeno entran a formar parte de molculas del sus trato y, como los tomos de hidrgeno de los grupos acetilo, finalmente sern transferidos a molculas transportadoras como el NADH. En la clula eucariota, las mitocondrias son el centro donde confluyen todos los procesos catablicos, tanto si empiezan desde azcares, desde grasas o des de protenas. En efecto, adems del piruvato, los cidos grasos y algunos am ino cidos tambin pasan desde el citosol a las mitocondrias, y all son transforma dos a acetil CoA o a alguno de los otros intermediarios del ciclo del cido ctrico. La mitocondria tambin acta como punto de partida de reacciones de biosntesis, al producir unos compuestos de carbono vitales, tales como el y el Estas sustancias pueden ser transferidas de nuevo desde la mitocondria al citosol donde actan como precursoras para la sntesis de m ol culas esenciales, com o por ejemplo algunos aminocidos.

flavn adenn dinucletido

oxidativa

fosforilacin

a-cetoglutarato.

oxalacetato

En la fosforilacin oxidativa, la transferencia de electrones al oxgeno impulsa la formacin de ATP1 0 -1 6

La fosforilacin oxidativa es el ltimo paso del catabolismo y el proceso en que se libera la mayor parte de la energa metablica. En este proceso, las molculas de NADH y de FADH2 transfieren al oxgeno molecular ( 0 2) los electrones que han obtenido de la oxidacin de las molculas alimenticias. La reaccin, que for malmente es equivalente a la combustin del hidrgeno en el aire formando agua, libera una gran cantidad de energa qumica. Parte de esta energa se utili za para producir la mayor parte del ATP de la clula; el resto se libera en forma de calor. Aunque el proceso qumico general de la oxidacin del NADH y del FADH2 implica una transferencia de hidrgeno hasta el oxgeno, cada tomo de hidr y un protn (el ncleo de hidrgeno, H+ ). geno se transfiere como un Esto es posible debido a que el tomo de hidrgeno puede ser fcilmente diso ciado en el electrn y el protn (H+ ) que lo constituyen. Entonces, el electrn puede ser transferido por separado a una molcula que nicamente acepta elec trones, mientras que el protn permanece en la solucin acuosa. Por el mismo razonamiento, si se transfiere un electrn a una molcula que tenga una fuerte afinidad por el hidrgeno, automticamente se reconstituir un tomo de hidr geno tomando un protn de la solucin. En el transcurso de la fosforilacin oxi dativa los electrones del NADH y del FADH2 descienden a lo largo de una cadena de molculas transportadoras, conocida como cadena de transporte electrni co. La presencia o ausencia de tomos de hidrgeno intactos depende de la na turaleza del transportador. En una clula eucariota, esta serie de transferencias electrnicas a lo largo de la cadena de transporte electrnico ocurre en la membrana mitocondrial in terna, en la que se hallan todas las molculas transportadoras. En cada paso de la transferencia, los electrones caen a un nivel energtico ms bajo, hasta que al final son transferidos a las molculas de oxgeno. Cada molcula de oxgeno ( 0 2)

electrn

El alimento y la obtencin de energa celular

toma cuatro electrones de la cadena de transporte de electrones y cuatro proto nes de la solucin acuosa formando dos molculas de agua. Las molculas de oxgeno tienen una gran afinidad por los electrones, por lo que los electrones unidos al oxgeno se encuentran en su estado energtico ms bajo. La cadena de transporte de electrones es importante para la clula porque la energa que se libera cuando estos electrones caen a estados energticos ms bajos se aprovecha de una manera remarcable. Como describimos en el Captu lo 14, transferencias particulares de electrones hacen que se bom been protones a travs de la membrana, desde el compartimiento mitocondrial interno hacia el exterior (Figura 2-26). As, se genera un gradiente electroqumico de protones a travs de la membrana mitocondrial interna. A su vez, este gradiente impulsa un flujo de protones a travs de un com plejo enzimtico especial de la misma membrana mitocondrial haciendo que la enzima (ATP sintasa ) aada un grupo fosfato al ADP, generando por consiguiente ATP dentro de la mitocondria. Final mente, el ATP recin sintetizado se transfiere desde la mitocondria al resto de la clula.

electrn de alta energa

Los aminocidos y los nucletidos forman parte del ciclo del nitrgeno
Hasta aqu hem os centrado nuestra discusin fundamentalmente en el m etabo lismo de los carbohidratos. No hemos hablado an del metabolismo del nitrge no o del azufre. Estos dos elementos son constituyentes de las protenas y de los cidos nucleicos, los cuales son las dos clases de macromolculas ms impor tantes en la clula y constituyen aproximadamente las dos terceras partes de su peso seco. Los tomos de nitrgeno y de azufre pasan desde un compuesto has ta otro y entre los organismos y su ambiente a travs de una serie de ciclos rever sibles. Aunque el nitrgeno molecular es abundante en la atmsfera terrestre, en forma de gas es no reactivo qumicamente. nicam ente algunas especies vivien tes son capaces de incorporarlo a molculas orgnicas, proceso denominado fi jacin del nitrgeno. La fijacin del nitrgeno ocurre en ciertos microorganis mos y en algunos procesos geofsicos, com o por ejemplo en la descarga de un rayo. Es esencial para toda la biosfera, pues sin esta fijacin no existira la vida en este planeta. Pero nicamente una pequea parte de los compuestos nitroge nados de los organismos actuales representa productos frescos de fijacin del nitrgeno atmosfrico. La mayor parte del nitrgeno orgnico ha estado en cir culacin durante m ucho tiempo, pasando de un organismo vivo a otro. Por con siguiente, se puede decir que las reacciones de fijacin del nitrgeno realizan la funcin de mantener llena al mximo la reserva total de nitrgeno. Los vertebrados reciben prcticamente todo su nitrgeno a travs de la in gesta de protenas y de cidos nucleicos. En el cuerpo estas macromolculas se descom ponen en sus com ponentes, aminocidos y nucletidos, los cuales luego son repolimerizados generando nuevas protenas y cidos nucleicos o son utili zados para sintetizar otras molculas. Aproximadamente la mitad de los 20 ami nocidos existentes en las protenas son aminocidos esenciales (Figura 2-27) para los vertebrados: no pueden ser sintetizados a partir de otros ingredientes de la dieta. Los otros aminocidos s que pueden ser sintetizados, utilizando una enorme diversidad de materiales, incluyendo intermediarios del ciclo del cido ctrico. Los aminocidos esenciales son producidos en otros organismos, gene ralmente a travs de rutas largas y energticamente costosas que en el transcur so de la evolucin de los vertebrados se han ido perdiendo. Los nucletidos necesarios para producir RNA y DNA pueden ser sintetiza dos utilizando vas biosintticas especializadas: no existen "nucletidos esencia les"' que deban ser proporcionados por la dieta. Todos los nitrgenos de las b a ses puncas i pirimidnicas (y tam bin algunos de los carbonos) derivan de los abundantes am inocidos glutamina, cido asprtico y glicina, mientras que los azcares ribosa y desoxirribosa derivan de la glucosa. 76 Captulo 2 : Pequeas molculas, energa y biosntesis

H+

electrn de baja energa

Figura 2-26 Generacin de un gradiente de H+a travs de una m em brana, m ediante reacciones de transporte electrnico. Un electrn de alta energa (por ejem plo, derivado de la oxidacin de un metabolito) recorre secuencialm ente los transportadores A, B y C hasta un estado energtico inferior. En este esquema el transportador B est dispuesto en la membrana de tal manera que mientras pasa el electrn toma el H1 de un lado de la membrana y lo libera al otro lado. El gradiente resultante de H+corresponde a una forma de energa almacenada, utilizada por otras protenas de membrana de la mitocondria para favorecer la formacin de ATP, com o se discute en el Captulo 14 .

Los aminocidos que no son utilizados en procesos de biosntesis pueden ser oxidados generando energa metablica. Muchos de sus tomos de carbono y de hidrgeno formarn C 0 2 o H20 mientras que sus tomos de hidrgeno se rn transportados a travs de varias formas y aparecern como urea, que es ex cretada. Cada aminocido es procesado de forma diferente y existe una conste lacin entera de reacciones enzimticas para su catabolismo.

LOS AMINOACIDOS ESENCIALES TREONINA METIONINA ^ USINA VALINA LEUCINA ISOLEUCINA HISTIDINA FENILALANINA TRIPTFANO
i

Resumen

Las clulas animales obtienen la energa a partir del alimento, siguiendo tres fases. En la fase 1 las protenas, los polisacridos y las grasas son transformados a mol culas pequeas mediante reacciones extracelulares. En la fase 2, estas molculas pequeas son degradadas dentro de las clulas, produciendo acetil CoA y una pe quea cantidad de ATP y de NADH. stas son las nicas reacciones que pueden pro porcionar energa en ausencia de oxgeno. En la fase 3, las molculas de acetil CoA son degradadas en las mitocondrias, produciendo COz y tomos de hidrgeno que se unen a molculas transportadoras, como por ejemplo el NADH. Los electrones de los tomos de hidrgeno pasan a travs de una compleja cadena de transportado res, que conduce finalmente a la reduccin del oxgeno molecular formando agua. Impulsados por la energa liberada en estos pasos de transferencia de electrones, los protones (H+ ) son transportados al exterior de la mitocondria. El gradiente elec troqumico de protones resultante a travs de la membrana mitocondrial interna se utiliza para impulsar la sntesis de la mayor parte del ATP celular. La biosntesis y la creacin de orden1 7
En un momento cualquiera en una clula se producen miles de reacciones qumi cas diferentes. Las reacciones estn asociadas formando cadenas y redes, en las que el producto de una reaccin se convierte en el substrato de la reaccin siguien te. La mayora de las reacciones qumicas celulares pueden clasificarse de manera aproximada, segn pertenezcan al catabolismo o a la biosntesis (anabolismo). Ya hemos discutido las reacciones catablicas, por lo que ahora vamos a estudiar las reacciones de biosntesis. Estos procesos empiezan en los compuestos intermedia rios de la glucolisis y del ciclo del cido ctrico (y en otros compuestos relacionados con stos) y generan las mayores y ms complejas molculas de la clula.

Figura 2-2 7 Los nueve aminocidos esenciales. Estos aminocidos no pueden ser sintetizados por las clulas humanas y por lo tanto deben ser suministrados en la dieta.

El cambio de energa libre de una reaccin determina si sta puede producirse o no1 8
A pesar de que las enzimas aceleran las reacciones energticamente favorables, no pueden forzar que las reacciones energticamente desfavorables tengan lu gar. En una analoga con el agua, las enzimas por s solas no pueden hacer que el agua fluya cuesta arriba. Sin embargo las clulas han de hacerlo para poder cre cer y dividirse; han de formar molculas altamente ordenadas y ricas en energa a partir de molculas pequeas y sencillas. Hemos visto que, de una manera ge neral, esto se realiza mediante enzimas que acoplan reacciones energticamente favorables que consumen energa (derivada fundamentalmente del sol) y que producen calor, a reacciones energticamente desfavorables que producen or den. Vamos a examinar en detalle cmo se realiza este acoplamiento. En primer lugar debemos considerar ms cuidadosamente el trmino ener gticamente favorable, que hemos estado utilizando con bastante ligereza sin definirlo. Como se explica al principio, para que una reaccin qumica tenga lu gar espontneam ente nicamente ha de producir un incremento neto de desor den en el universo. El desorden se incrementa cuando la energa til (enega que puede ser derivada para producir trabajo) se disipa en forma de calor; el criterio de incremento de desorden puede expresarse de forma cuantitativa con la ener ga libre, G. sta se define de manera que los cambios de su valor, indicados por La biosntesis y la creacin de orden

77

AG, miden la cantidad de desorden creado en el universo cuando tienen lugar una reaccin. Las reacciones energticamente favorables son, por definicin, aquellas que liberan una gran cantidad de energa libre, o en otras palabras, las que tienen un valor negativo de AG elevado y por tanto crean mucho desorden. Un ejemplo familiar a escala macroscpica puede ser la reaccin por la que un muelle comprimido se relaja hasta su estado expandido, liberando al medio en forma de calor la energa elstica que almacenaba. Las reacciones energtica mente favorables, con un AG < 0, presentan una elevada tendencia a ocurrir es pontneamente, aunque su velocidad depender de otros factores, tales como la existencia de enzimas especficas (vase ms adelante). En cambio, las reacciones energticamente desfavorables, con un valor positivo de AG, como aquellas en las que dos aminocidos se unen entre s formando un enlace peptdico, generan or den en el universo y por lo tanto no se pueden producir espontneamente. Reac ciones energticamente desfavorables como stas slo se producirn si estn acopladas a una segunda reaccin que tenga un valor de AG suficientemente ne gativo como para que el AG del proceso completo tambin resulte negativo. El curso de la mayora de las reacciones puede predecirse cuantitativamen te. Se han recogido una gran cantidad de datos termodinmicos que hacen posi ble calcular los cam bios de energa libre para la mayora de las reacciones ms importantes de la clula. Entonces, el cambio global de energa libre para una va es la simple suma de los cambios de energa libre de cada una de las reaccio nes que la com ponen. Consideremos por ejemplo dos reacciones: X Y y C h >D con valores de AG de +1 y -1 3 kcal/mol respectivamente. (Hay que recordar que un mol son 6 x 1023 molculas de la substancia.) Si estas dos reacciones pueden ser acopladas, el AG de la reaccin acoplada ser de -1 2 kcal/mol. As, la reac cin desfavorable X Y, que no ocurrir espontneamente, puede ser impulsa da por la reaccin favorable C D, siempre que exista un mecanismo mediante el cual las dos reacciones puedan ser acopladas.

A menudo las reacciones de biosntesis estn acopladas directamente a la hidrlisis del ATP
Consideremos una reaccin tpica de biosntesis en la que dos monmeros, A y B, han de unirse a travs de una reaccin de deshidratacin (denominada tam bin de condensacin) en la que se libera agua:
a -h

+ b - o h ^ a - b + h 2o

De forma casi invariable, la reaccin inversa (denominada hidrlisis), en la que el agua rompe el compuesto formado por el enlace covalente A-B, ser la reac cin energticam ente favorable. Por ejemplo, ste es el caso de la hidrlisis a sus subunidades de las protenas, los cidos nucleicos y los polisacridos. La estrategia general que permite a la clula producir A-B a partir de A-H y BOH, implica una secuencia de reacciones a travs de las cuales la sntesis energti camente desfavorable del compuesto deseado se acopla a una reaccin energtica mente ms favorable (vase Figura 2-17). Como se explica en la Figura 2-28 la hidrlisis del ATP tiene un AG muy negativo y es la fuente habitual de energa libre que se utiliza para impulsar las reacciones biosintticas de la clula. En la va aco plada desde A-H y B-OH hasta A-B, la energa de hidrlisis del ATP transforma pri mero B-OH en un compuesto intermedio de mayor energa, que luego reacciona directamente con A-H dando A-B. El mecanismo ms simple consiste en la transfe rencia de un fosfato desde el ATP hasta B-OH formando B-OPOs (o sea, B -O - ), en cuyo caso la va de reacciones nicamente estar formada por dos pasos: 1. B-OH + ATP B - 0 - + ADP

2. A-H + B -0-(P) >A-B + P

78

Captulo 2 : Pequeas molculas, energa y biosntesis

adenosina trifosfato

0
m

- O - P-o - P-o - P-o -c H ,

O
I I I O

o~
I I O

I O

H ,0

O -P -O H

0 1

H ,0

I O

fosfato

Figura 2-28 Hidrlisis del ATP. La hidrlisis del fosfato terminal del ATP libera, dependiendo de las condiciones intracelulares, entre 11 y 13 kcal/mol de energa utilizable. Esta reaccin tiene un AG muy negativo debido a varios factores. La liberacin del grupo fosfato terminal elimina una repulsin desfavorable entre cargas negativas adyacentes. Adems, el ion fosfato inorgnico (P) liberado est estabilizado por resonancia y por la formacin favorable de un enlace de hidrgeno con el agua.

ADP

o
Puesto que el intermediario B -O - se forma slo transitoriamente, las reaccio nes globales que se producen son: A-H + B-OH -> A-B y ATP -> ADP + P La primera reaccin, de por s energticamente desfavorable, es impulsada a producirse acoplndola directamente a la segunda reaccin energticamente fa vorable (la hidrlisis del ATP). Un ejemplo de reaccin biosinttica acoplada de este tipo es la sntesis del aminocido glutamina, mostrada en la Figura 2-29. El AG de la hidrlisis del ATP a ADP y fosfato inorgnico (P) depende de las concentraciones de los tres reactantes, y en las condiciones habituales de una clula es entre -11 y -1 3 kcal/mol. En principio, esta reaccin de hidrlisis pue de utilizarse para impulsar una reaccin desfavorable con un AG de, quizs, +10 kcal/mol, siempre que exista una va de reacciones adecuada. Para algunas reacciones de biosntesis, sin embargo, -1 3 kcal/mol puede ser insuficiente. En estos casos, la reaccin de hidrlisis del ATP puede ser alterada de manera que inicialmente produzca AMP y pirofosfato (PP). El pirofosfato ser hidrolizado en segundo paso (Figura 2-30). En su conjunto el proceso produce un cambio de energa libre total disponible de aproximadamente -2 6 kcal/mol. Cmo se acopla la energa de hidrlisis del pirofosfato a una reaccin bio sinttica? Se puede ilustrar una de las vas considerando de nuevo la sntesis del compuesto A-B a partir de A-H y B-OH. Mediante una enzima apropiada, B-OH puede ser convertido a travs de su reaccin con el ATP en un intermediario de alta energa B - O - - . La reaccin completa consta ahora de tres pasos: 1. B-OH + ATP - B - O - - + AMP 2. A-H + B - O - - 3. PP + H20 -> 2P Y las reacciones globales son A-H + B-OH -> A-B y ATP + H20 AMP + 2P A-B + PP

% /

o p )~
Vp

ch2 ch2 H7N CH COOH

CH ch2 H2N CH COOH

NH,

ch2 ch2 H9N CH COOH

cido glutm ico

glutam ina
Figura 2-29 Ejemplo de reaccin biosinttica de deshidratacin impulsada por la hidrlisis del ATP. En primer lugar, el cido glutmico es transformado en un intermediario fosforilado de alta energa (que corresponde al com puesto B - O - descrito en el texto), el cual reacciona con el amonio formando glutamina. En este ejemplo, ambos pasos tienen lugar en la superficie de la misma enzima, la g lu ta m in a sintasa. Obsrvese que, para mayor claridad, estas molculas se muestran en sus formas no cargadas.

Dado que una enzima acelera por igual las direcciones hacia adelante y hacia atrs de la reaccin que cataliza, el compuesto A-B puede ser destruido por re com binacin con pirofosfato (el inverso del paso 2). Pero la reaccin energtica mente favorable de la hidrlisis del pirofosfato (paso 3) estabiliza el compuesto

La biosntesis y la creacin de orden

79

BB

0 1 -p-p-o -P-0II iil II O o o

Or i Cr 1
adenosina trifo s fa to

\R1B0SA / x

Figura 2-30 Una ruta alternativa para la hidrlisis del ATP, en la que prim ero se form a pirofosfato y luego sehidroliza. Esta ruta p roporciona
aproxim adam ente el doble de energa utilizable que la reaccin de la Figura 2-28. D espus de la hidrlisis, los tom os de hidrgeno p roced en tes del agua ap arecen unidos a los grupos fosfato. Sin em bargo, al pH del citoplasm a celular, la m ayora de ellos se hallan disociad os form ando iones hidrgeno H+libres.

HtO
H ,0 -

AMP

oo I I -O -P -O -P -O

il

pirofosfato

h7 o-

adenosina m onofosfato

h7o 0 1

.P i) + (PO

o-p-o I o
fosfato

I HC-P-O O
fosfato

cr

A-B, m anteniendo la concentracin de pirofosfato muy baja, evitando as la in versin del paso 2. De esta manera, la energa de hidrlisis del pirofosfato se uti liza para impulsar esta reaccin en la direccin hacia adelante. Un ejemplo de una reaccin biosinttica importante de este tipo es la sntesis de polinucletidos, que se muestra en la Figura 2-31.

Las coenzimas intervienen en la transferencia de determinados grupos qumicos

Puesto que la unin del fosfato terminal del ATP puede romperse fcilmente li berando energa libre, el ATP acta como un eficiente dador de fosfatos en un gran nmero de diferentes reacciones de fosforilacin. Tambin actan de esta forma una amplia variedad de tipos de enlaces qumicamente lbiles y a m enu do las molculas que los contienen se unen fuertemente a la superficie de las en zimas de forma que puedan ser utilizadas de forma eficiente como dadoras de su grupo reactivo en las reacciones catalizadas enzimticamente. Estas m olcu las se denominan coenzim as porque son esenciales para la actividad de la enzi ma; la misma coenzima puede participar en muchas reacciones biosintticas di ferentes en las que se necesite su grupo reactivo. En la Tabla 2-2 se presentan algunos ejemplos de coenzimas. Entre ellas la que encontram os primero es el acetil coenzima A (acetil CoA). Consta de un gru po acetilo unido al CoA m ediante un enlace tioster reactivo (vase la Figura 220). Este grupo acetilo se puede transferir fcilmente a otra molcula, como por ejemplo una molcula de cido graso en formacin. Otros importantes ejemplos los constituyen el NADH, que transporta un ion hidruro (Figura 2-24), y la biotina, que transfiere un grupo carboxilo en numerosas reacciones de biosntesis (Figura 2-32) Muchas coenzimas no pueden ser sintetizadas por los animales y deben ser obtenidas de plantas y microorganismos de la dieta. A menudo las vitaminas -factores nutricionales esenciales que los animales necesitan en cantidades tra z a - son precursores de coenzimas necesarias.

80

Captulo 2 : Pequeas molculas, energa y biosntesis

- /M pB Q i ^ i \v i \ ' Kazucaw T - 71
OH

Figura 2-31 La sntesis de un polinucletido, DNA o RNA, es un proceso de mltiples pasos que se halla impulsado por la hidrlisis del ATP. En el p rim er p aso un n u cletid o

2[DP[

nuclesido trifosfato interm ediario de aita energia

PO
\azucapj [basel
p )o

2 BEky
base Kazucar,
N j
OH pp) - j ^ H 20
Y

Y -i Kazucaw

y -/
OH [base T Kazca'rJ ' l l l r

2Pj)

i 1 I o-

cadena de polinucletido que contiene dos nucletidos

nuclesido m onofosfato

1 base

L2 I

m o n ofo sfato es activado por la tran sferen cia secu en cial de grupos fosfato term inales de dos m o lcu las de ATP. El interm ed iario de alta energa form ado - u n nu clesid o trifo sfa to p erm an ece libre en solu cin hasta que reaccion a, co n lib eracin de pirofosfato, con el extrem o en crecim ien to de la cad en a de RNA o de DNA. La hidrlisis del pirofosfato hasta fosfato inorgnico es altam en te favorable y ayuda a im pulsar la reacci n global en d ireccin a la sntesis del p o lin ucletido.

(p ) n ^

cadena de polinucletic que contiene tres nucletidos ('p 'w

M \zcaw ry i

3 J kazcaM

base

!\ p / l
OH

La estructura de las coenzimas sugiere que se formaron en un mundo de RNA

Como se discute en el Captulo 1, los recientes descubrimientos de que las m ol culas de RNA pueden plegarse formando superficies altamente catalticas han llevado a la visin de que los RNA (o compuestos estrechamente relacionados con ellos) probablemente fueron los principales catalizadores en la formas primi tivas de la vida y que las protenas evolucionaron posteriormente. Para desarro llar catlisis eficientes sobre reacciones necesarias en las clulas, parece lgico que estos RNA necesitaran la presencia de una gran variedad de coenzimas que compensaran su propia m onotona qumica (ya que estn construidos nica mente por cuatro subunidades nucleotdicas diferentes). Algunos RNA actuales contienen lugares de unin altamente especficos para nucletidos, que utilizan contactos de enlaces de hidrgeno base-base no de Watson y Crick (vase Figura 3-21). Es posible que las coenzimas se unieran a los RNA iniciales mediante el mismo tipo de asa que se halla presente en la espalda de muchas de las coen-

T abla 2 -2 Algunas de las coen zim as que intervienen en reaccio n es de tran sferen cia de grupos C oenzim a*
A TP NADH, NADPH C o e n z im a A B io tin a S -A d e n o s ilm e tio n in a

Grupo transferido
fo sfato h id r g e n o y e le c tr n (ion h id ru ro) a c e tilo c a rb o x ilo m etilo

*Las coenzimas son pequeas molculas que estn asociadas a algunas enzimas y que son esenciales para la actividad de stas. Cada una de las coenzimas enumeradas aqu es una mol cula transportadora de un pequeo grupo qumico y participa en diversas reacciones en las que este grupo se transfiere a otra molcula. Algunas enzimas estn unidas covalentemente a su en zima; otras se unen mediante un enlace menos fuerte.

La biosntesis y la creacin de orden

81

biotina carboxilada

CH;

c= o c o
#

piruvato

o-

Figura 2-32 Transferencia de un grupo carboxilo mediante la coenzima biotina. La biotina (mostrada en verde) acta como molcula transportadora del grupo carboxilo (en rojo). En la secuencia de reacciones mostradas aqu, la biotina est unida covalentemente a la enzima piruvato carboxilasa. Un grupo carboxilo activado, derivado de un ion bicarbonato (HCOj) se acopla a la biotina a travs de una reaccin que requiere un aporte de energa procedente de la hidrlisis de una molcula de ATP. A continuacin este grupo carboxilo se transfiere al grupo metilo del piruvato formando oxalacetato.

C= o

oxalacetato piruvato carboxilasa

zimas actuales, como el ATP, el acetil CoA y el NADH. De acuerdo con este pun to de vista, estas molculas debieron evolucionar con un nucletido unido covalentem ente debido a la utilidad que supona este nucletido para la unin de la coenzima en un mundo de RNA.

7-DEHIDROCOLESTEROL

La biosntesis necesita poder reductor

Hemos visto como en las clulas se producen continuam ente reacciones de oxi dacin y de reduccin. La energa qumica de las molculas alimenticias se libe ra mediante reacciones de oxidacin, mientras que para producir molculas biolgicas la clula necesita -en tre otras cosas- llevar a cabo una serie de reac ciones de reduccin que requieren un aporte de energa qumica. Aplicando el principio de las reacciones acopladas que hemos descrito en pginas anteriores, las clulas canalizan directamente la energa qumica derivada del catabolismo hacia la sntesis del NADH (por ejemplo, vase Figura 2-22). El enlace de alta energa que se forma entre el hidrgeno y el anillo de nicotinamida, dando lugar al NADH proporciona energa para reacciones enzimticas desfavorables, trans firiendo el hidrgeno (como ion hidruro) a otra molcula. Por ello se dice que el NADH, y tam bin el NADPH (estrechamente relacionado con l y en el que se puede convertir con facilidad) son transportadores de "poder reductor. Ambos se utilizan como coenzimas en numerosos tipos de reacciones de reduccin. Para saber cm o ocurre la transferencia de hidrgeno en la prctica, consi deremos un solo paso de biosntesis: la ltima reaccin de la va de sntesis de la molcula lipdica colesterol. En esta reaccin, dos tomos de hidrgeno se aa den al anillo esteroide policclico, reduciendo un doble enlace carbono-carbono. Como en la mayora de reacciones de biosntesis, los constituyentes de los dos tomos de hidrgeno que son necesarios en esta reaccin son suministrados en forma de ion hidruro del NADPH ms un protn (H+ ) de la solucin (H~ + H+ = 2H) (Figura 2-33). Como en el NADH, el ion hidruro del NADPH que debe ser transferido forma parte de un anillo de nicotinam ida y se separa fcilm ente debido a que el anillo puede adoptar un estado arom tico ms estable si pierde el ion hidruro (vase Figura 2-24). Por consiguiente, tanto el NADH como el NADPH m antienen este ion hidruro a travs de un enlace de alta energa y, a

Figura 2-33 Fase final de una de las rutas de biosntesis que conducen a la formacin del colesterol. La reduccin del enlace C=C se consigue mediante la transferencia de un ion hidruro procedente de la molcula transportadora NADPH, ms un protn (H+ ) de la solucin.

82

Captulo 2 : Pequeas molculas, energa y biosntesis

Figura 2-34 La estructura del NADPH. Se diferencia de ia del NADH (vase Figura 2-24) nicamente por la presencia de un grupo fosfato adicional, el cual permite que el NADPH sea reconocido selectivamente por enzimas implicadas en la biosntesis.

Fk
anillo de nicotinam ida N

//
< "

O
NH,

partir de l, pueden transferirlo a otra molcula siempre que exista la enzima adecuada para catalizar la transferencia. La diferencia entre el NADH y el NADPH es trivial desde el punto de vista qumico: el NADPH tiene un grupo fosfato ms, en una zona de la molcula ale jada de la regin activa (Figura 2-34). Este grupo fosfato extra carece de impor tancia para la reaccin de transferencia del ion hidruro, pero sirve de asa para unir el NADPH como coenzima. Por regla general, el NADH se une a enzimas que catalizan reacciones catablicas, mientras que el NADPH acta con enzimas que catalizan reacciones de biosntesis. Al tener las dos cocnzimas que actan en pro cesos diferentes, la clula puede mantener la relacin NADPH:NADP* alta para aportar el poder reductor necesario para los procesos de biosntesis mientras que, simultneamente, puede mantener la relacin NADH:NAD+ baja para tener NAD+disponible para aceptar electrones durante el catabolismo.

POLISACARIDOS

CIDO S NUCLEICO S

glucosa
CHoOH

glucgeno
C H 2O H c h 7o h

-o
OH HO OH OH

O
CHn .O .

O
CH2

o
OH

-o0 OH

h 2o

energa de la hidrlisis del nuclesido trifosfato

0 1 0 1
CH,

OH

o = poRNA

o = p -O

1 O

C H tO H

C H ?O H

C H ,O H

o
OH HC

CH,

OH

.O .

o
OH

o-

OH
- O -

OH

OH

H20 energa de la hidrlisis del nuclesido trifosfato

OH

- 0 = P - -O

PROTENAS

HO

protena
H O

am inocido
Y
\
OH

o = p- -o o
OH RNA

o
CH,

I I
R

I I I
H

H N C C

---------C C N -

y
\

o
nucletido
CH, .O . OH

O.

OH

H20
H O R

energa de la hidrlisis del nuclesido trifosfato

O H

OH

OH

---------- C C N -

-c c N cH H R

II

I
R

I
H

protena

Figura 2-35 Sntesis de macrom olculas. Esbozo de las reacciones de polimerizacin mediante las cuales se sintetizan tres clases de polmeros biolgicos, mostrando que en cada caso la sntesis implica la prdida de agua (deshidratacin). En la figura no se muestra el consumo de nuclesidos trifosfato altamente energticos, necesaria para OH activar cada monmero antes de su adicin. Por el contrario, la reaccin inversa -la degradacin de los tres tipos de polm eros- se produce mediante la simple adicin de agua (hidrlisis).

La biosntesis y la creacin de orden

83

POLIMERIZACIN POR LA CABEZA (p. ej PROTENAS, CIDOS GRASOS)

' ' ! + n i >

POLIMERIZACIN POR LA COLA (p. ej DNA, RNA, POLISACRIDOS)

mm

' ................................ i

cada m onm ero transporta un enlace rico en energa que ser utilizado para la adicin del m onm ero siguiente

cada m onm ero transporta un enlace rico en energa para su propia adicin

vi
Figura 2-36 Intermediarios activados en reacciones de polimerizacin. Se compara el crecimiento de polmeros por la cabeza y por la cola.

Los polmeros biolgicos se sintetizan mediante la repeticin de reacciones elem entales de deshidratacin
Las principales macromolculas sintetizadas por las clulas son los polinucletidos (DNA y RNA), los polisacridos y las protenas. Son extraordinariamente di versos en cuanto a estructura, e incluyen las molculas ms complejas conoci das. A pesar de ello, se sintetizan a partir de un nmero relativamente reducido de pequeas molculas (denominadas o a travs de una restringida gama de reacciones qumicas. En la Figura 2-35 se muestra un esbozo sobresimplificado del mecanismo de adicin de m onmeros a las protenas, a los polinucletidos y a los polisacri dos. A pesar de que en las reacciones de sntesis de cada polmero participan di ferentes tipos de enlaces covalentes, diferentes enzimas y diferentes coenzimas, existen similitudes bsicas entre ellas. Como se indica por el sombreado en rojo, en cada caso la adicin de subunidades se produce por una reaccin de deshi dratacin que supone la elim inacin de una molcula de agua de las dos m ol culas que reaccionan. Como en el caso general que hem os estudiado en la pgina 79, la formacin de estos polmeros requiere el aporte de energa qumica, la cual se consigue mediante la estrategia estndar de acoplar la reaccin de biosntesis a la hidrli sis energticam ente favorable de un nuclesido trifosfato. En los tres tipos de macromolculas se degrada por lo m enos un nuclesido trifosfato generando pirofosfato, que se hidroliza inm ediatamente aumentando la fuerza impulsora de la reaccin. En la Figura 2-31 ilustramos el m ecanism o utilizado para la sntesis de polinucletidos. Los intermediarios activos de las reacciones de polimerizacin pueden origi narse de dos maneras distintas, producindose la polimerizacin por la cabeza o el enlace activo por la cola de los monmeros. En la est presente en el extremo del polmero en crecimiento, y por lo tanto debe ser regenerado cada vez que se aade un monmero. En este caso, cada monmero contiene el grupo activo que ser utilizado para reaccionar con el siguiente m o nmero de la serie (Figura 2-36). En la el enlace activo transportado por cada monmero se utiliza para la adicin del propio monm e ro. Para la sntesis de macromolculas biolgicas se utilizan ambos tipos de poli merizacin. La sntesis de polinucletidos y de algunos polisacridos simples, por ejemplo, se produce mediante la polimerizacin por la cola, mientras que la sn tesis de las protenas ocurre por el sistema de polimerizacin por la cabeza.

monmeros suburtidades),

polimerizacin por la cabeza, polimerizacin por la cola,

Resumen

Normalmente la hidrlisis del ATP se acopla a reacciones energticamente desfavora bles, como la biosntesis de macromolculas, mediante la transferencia de gruposfosfato formando intermediarios fosforilados reactivos. Como ahora la reaccin energtica mente desfavorable se ha vuelto energticamentefavorable, se dice que el ATP impulsa la reaccin. Las molculas polimricas como las protenas, los cidos nucleicos y los polisa cridos, se ensamblan a partir de pequeas molculas precursoras activadas mediante reacciones repetidas de deshidratacin impulsadas de esta forma. Otras molculas reac84 Captulo 2 : Pequeas molculas, energa y biosntesis

Figura 2-37 (pgina opuesta) Algunas de las reacciones qumicas que se producen en la clula. (A) El esquema muestra unas 500 reacciones metablicas comunes, representando cada especie qumica con un crculo. En rojo se presentan las reacciones centrales de la glucolisis y del ciclo del cido ctrico. Una clula de mamfero tpica sintetiza ms de 10 000 protenas diferentes, la mayor parte de las cuales son enzimas. En el segmento escogido de forma arbitraria en este laberinto metablico (sombreado en amarillo), se sintetiza colesterol a partir del acetil CoA. A la derecha y por debajo del laberinto, este segmento escogido se muestra con mayor detalle (B).

tres m olculas de acetil CoA

2 CoASH

CH2c o c r n i //J c h 3- c - c h 2c x
H S C oA

hidroxim e tilgluta ril CoA

2 NADPH 2 CoASH 2c ~
c h

2 NADP+
c h o o

c h

,-

c h

7-

2o

OH

m evalonato
-2 n u
2 [PP] C H 2C O O

CH 3- C - C H 2 CH 2 O - ( p ) - 0
OH

pirofosfom evalonato
CO
|a d p + Pi

c h

3-

c h

2c

2o - -

isopentenil pirofosfato ISOMERIZACINv

c h

CH 3 -C = C H C H 2 O - 0 - 0

d im etilalil pirofosfato
CHj
c h

CH3
h c h

3-

=c

2c

2-

=c

h c h

2o - 0 - 0

geran'il pirofosfato sopenteml pirofosfato PP

farnesil pirofosfato NADPH -- NADP+ ^ DOS MOLCULAS CONDENSADAS

colesterol

NADP+ NADPH + H+

7-dehidrocolesterol

lanosterol

escualeno

85

tivas, denominadas coenzimas, transfieren otros grupos qumicos en el transcurso de la biosntesis: el NADPH por ejemplo, transfiere hidrgeno en forma de un protn y dos electrones (ion hidruro), mientras que el acetil CoA transfiere grupos acetilo. Coordinacin entre catabolismo y biosntesis1 9
El m etabolism o est organizado y regulado
La Figura 2-37 nos da una idea de lo complicada que resulta una clula cuando se considera como una mquina qumica; la figura es un esquema que tan slo muestra algunas de las etapas enzimticas de una clula. Todas estas reacciones tienen lugar en una clula que tiene menos de 0,1 mm de dimetro, y cada una de ellas requiere la participacin de una enzima, la cual, a su vez, es el producto de una serie de reacciones de transferencia de informacin y de sntesis protei ca. Para una molcula pequea tpica -p o r ejemplo, el aminocido serina- po demos encontrar ms de media docena de enzimas que pueden modificarlo de diferentes maneras: unindolo al AMP (adenilarlo) preparndolo para la sntesis de protenas, degradarlo a glicina, transformarlo en piruvato preparndolo para su oxidacin, acetilarlo mediante acetil CoA o transferirlo a un cido graso pro duciendo fosfatidilserina. Todas estas diferentes vas compiten por la misma molcula de serina. Al mismo tiempo se est produciendo una lucha similar a sta, para miles de pequeas molculas. Se podra pensar que todo el sistema debe estar equilibrado tan finamente que cualquier trastorno menor, tal como un cam bio temporal de la dieta, podra tener resultados desastrosos. De hecho, la clula es asombrosam ente estable. Siempre que es perturbada, reacciona hasta recuperar su estado inicial. Puede adaptarse y continuar su fun cin de una manera coherente durante perodos de ayuno o de enfermedad. Mutaciones de m uchos tipos pueden eliminar una reaccin de una determinada va, y a pesar de ello -siem pre que se cumplan ciertos requisitos m nim os- la c lula sobrevive. Esto es as porque en las clulas existe una elaborada red de m e canismos de control que regulan y coordinan la velocidad de sus reacciones. Al gunos de los niveles superiores de control se estudiarn en captulos posteriores. Aqu nos limitaremos a describir los m ecanismos ms simples que regulan el flujo de pequeas molculas a travs de las diferentes vas metablicas.

Las vas m etablicas estn reguladas a travs de cambios de la actividad enzim tica 20
Las concentraciones de las diversas molculas pequeas de una clula estn amortiguadas frente a cambios importantes, mediante un proceso conocido como regulacin por retroalimentacin (feedback) que adapta el flujo de metabolitos a travs de una va determinada mediante un aumento o una disminucin tempo ral de la actividad de enzimas cruciales. Por ejemplo, la enzima inicial de una se rie de reacciones suele estar inhibida por retroalimentacin negativa del producto final de esta va: si se acumulan grandes cantidades del producto final, automti camente queda inhibida la entrada de ms precursores a la va (Figura 2-38). Cuando las vas se ramifican o se cruzan, cosa que sucede a menudo, general mente existen varios puntos de control mediante diferentes productos finales. La complejidad de estos procesos de control por retroalimentacin queda ilustrada en la Figura 2-39, que muestra el esquema de regulacin enzimtica observado en un grupo de vas metablicas de aminocidos relacionados. La regulacin por retroalim entacin puede actuar casi instantneamente y es reversible; adems, un producto final dado puede activar enzimas conducto ras de otras vas e inhibir enzimas que producen su propia sntesis. Se conoce bien la base molecular de este tipo de control pero debido a que su estudio re quiere unos conocim ientos determinados sobre la estructura de las protenas, no entrarem os en l hasta el Captulo 5.

86

Captulo 2 : Pequeas molculas, energa y biosntesis

Las reacciones catablicas pueden revertirse mediante un aporte de energa 21

Regulando unas cuantas enzimas de puntos clave de la red metabolica pueden conseguirse cambios a gran escala que afecten el metabolismo de toda la clula. Por ejemplo, un patrn especial de regulacin por retroalimentacin permite que una clula pase de la degradacin de glucosa a la biosntesis de glucosa (de nominada gluconeognesis). La necesidad de la gluconeognesis es especialm en te aguda en los perodos de ejercicio violento, cuando la glucosa necesaria para la contraccin muscular debe ser generada por las clulas hepticas, y tambin en perodos de ayuno, en los que, para sobrevivir, la glucosa debe ser sintetizada a partir del glicerol de las grasas y de los aminocidos. La degradacin normal de la glucosa hasta piruvato, por la glucolisis, est catalizada por varias enzimas que actan en serie. La mayora de las reacciones catalizadas por estas enzimas son fcilmente reversibles, pero tres de estas reac ciones (los nmeros 1, 3 y 9 en la secuencia de la Figura 2-21) son claramente irreversibles. De hecho, el importante cambio de energa libre que se produce en estas reacciones es lo que normalmente impulsa la secuencia de reacciones en la direccin de la degradacin de la glucosa. Para que las reacciones se produz can en direccin opuesta y se pueda formar glucosa a partir de piruvato, es ne cesario superar cada una de estas tres reacciones. Ello se consigue mediante tres reacciones alternativas, catalizadas enzimticamente, que son impulsadas cuesta arriba gracias a un aporte de energa qumica (Figura 2-40). As, cuando una molcula de glucosa se degrada a dos molculas de piruvato, se generan dos

Figura 2 -38 Inhibicin por retroalim entacin de una va de biosntesis. Cada letra representa una pequea molcula diferente, y cada fle c h a negra simboliza una reaccin catalizada por una enzima diferente. El producto final Z inhibe la primera enzima que es la nica que lo sintetiza, de forma que Z controla su propio nivel en la clula. Se trata de un ejemplo de retroalim en tacin negativa (feed b a c k negativo).

Figura 2-39 Inhibicin por retroalim entacin en la sntesis de los am inocidos lisina, metionina, treonina e isoleucina, en las bacterias. En este diagrama cada reaccin catalizada por una enzima est representada por una fle c h a negra, mientras que las flechas rojas indican las posiciones en las que los productos retroalim entan inhibiendo las enzimas. Obsrvese que tres enzimas diferentes (denominadas isoen zim as ) catalizan la reaccin inicial, y que cada una de ellas est inhibida por un producto distinto.

Coordinacin entre catabolismo y biosntesis

87

Figura 2-40 Com paracin entre las reacciones que producen glucosa durante la gluconeognesis y las reacciones que degradan la glucosa durante la glucolisis. Las reacciones de degradacin (glucolfticas) son energticamente favorables (el cambio de energa libre es inferior a cero), mientras que las reacciones de sntesis requieren un aporte de energa. Para sintetizar glucosa se necesitan diferentes enzimas de derivacin necesarias para saltar" las reacciones 1,3 y 9 de la glucolisis. El flujo total de compuestos entre la glucosa y el piruvato est determinado por m ecanismos de control por retroalimentacin que actan controlando el metabolismo de las molculas que participan en estos tres pasos.

molculas de ATP pero la reaccin inversa de la gluconeognesis requiere cuatro molculas de ATP y dos molculas de GTP, lo cual, en total, es equivalente a la hidrlisis de seis molculas de ATP por cada molcula de glucosa sintetizada. Las reacciones de desvo de la Figura 2-40 deben estar controladas, de ma nera que se degrade glucosa rpidamente cuando se necesite energa y se sinte tice glucosa cuando la clula est repleta de energa. Si las reacciones pudieran producirse en ambos sentidos sin restricciones, enviaran grandes cantidades de

88

Captulo 2 : Pequeas molculas, energa y biosntesis

metabolitos hacia adelante y hacia atrs, siguiendo unos ciclos ftiles que con sumiran grandes cantidades de ATP sin ningn objetivo concreto. La elegancia de estos mecanismos de control puede ilustrarse con un ejem plo clave. El paso 3 de la glucolisis es una de las reacciones que debe ser supera da durante la formacin de glucosa (vase Figura 2-40). Normalmente el paso implica la adicin a la fructosa 6-fosfato de un grupo fosfato procedente del ATP, y est catalizado por la enzima fosfofructoquinasa. Esta enzima es activada por AMP, ADP y fosfato inorgnico e inhibida por ATP, citrato y cidos grasos. As pues, la enzima se activa por la acumulacin de los productos de la hidrlisis del ATP cuando el aporte de energa es bajo y se inactiva cuando la cantidad de energa (en forma de ATP) o el aporte de alimentos, como pueden ser cidos gra sos o citrato (derivado de los aminocidos) son abundantes. La fructosa bisfosfatasa es la enzima que cataliza la reaccin inversa (la hidrlisis de fructosa 1,6 bisfosfato a fructosa 6-fosfato, que conduce hacia la formacin de glucosa); esta enzima est regulada de manera opuesta por el mismo sistema de retroinhibicin, de forma que se estimula cuando la fosfofructoquinasa se inhibe.

Las enzimas pueden activarse e inhibirse mediante m odificaciones covalentes 22

Los sistemas de control por retroalimentacin que acabamos de describir per miten que las velocidades de las secuencias de reacciones estn reguladas de manera continua y automtica, segundo a segundo, en respuesta a fluctuacio nes del metabolismo. Las clulas disponen de varios dispositivos para regular las enzimas cuando los cambios de su actividad han de ser ms prolongados, del orden de minutos u horas. Estos sistemas implican la modificacin covalen te reversible de las enzimas. Casi siempre estas modificaciones se consiguen mediante la adicin de un grupo fosfato a un residuo determinado de serina, de treonina o de tirosina de la enzima. El fosfato procede del ATP y su transferencia est catalizada por una familia de enzimas conocidas como protena quinasas. En el Captulo 5 describiremos como la fosforilacin puede alterar la forma de una enzima, aumentando o inhibiendo su actividad. La eliminacin posterior del grupo fosfato, que revierte el efecto de la fosforilacin, se consigue mediante una segunda enzima denominada proteina fosfatasa. La modificacin covalente de las enzimas aade otra dimensin al control metabolico, ya que permite que las vas de reaccin especficas sean reguladas por seales (como las hormonas y factores de crecimiento) que no estn relacionadas con los propios intermediarios metablicos.

Las reacciones estn compartimentadas, tanto dentro de las clulas como dentro de los organismos 23
No todas las reacciones m etablicas de una clula se producen dentro del mis mo compartimiento citoplasmtico. Puesto que diferentes enzimas se hallan en diferentes compartimientos de la clula, el flujo de los componentes qumicos est canalizado, tanto fsica como qumicamente.

trm eros de lipoam ida reductasatransacetilasa

8

+ 1 2 m olculas de dihidrolipoil deshidrogenasa

+ 24 molculas de piruvato descarboxilasa

Figura 2-41 Estructura de la piruvato-deshidrogenasa. Este com plejo enzim tico cataliza la conversin de piruvato en acetil CoA. Se trata de un ejemplo de un gran com plejo multienzimtico en el que los intermediarios de la reaccin pasan directam ente de unas enzimas a otras.

Coordinacin entre catabolismo y biosntesis

89

La forma ms simple de esta segregacin espacial se produce cuando dos enzi mas que catalizan reacciones secuenciales forman un complejo enzimtico, y el producto de la primera enzima no ha de difundir a travs del citosol para encontrar la segunda enzima. En cuanto ha terminado la primera reaccin empieza la segun da. Algunos grandes agregados enzimticos realizan toda una serie de reacciones sin perder el contacto con el substrato. Por ejemplo, la transformacin del piruvato en acetil CoA ocurre en tres pasos qumicos que se producen sobre el mismo gran complejo enzimtico (Figura 2-41); en la sntesis de los cidos grasos, una secuen cia de reacciones an ms larga est catalizada por un nico conjunto de enzimas. No resulta sorprendente que algunos de los mayores complejos enzimticos estn destinados a la sntesis de macromolculas como las protenas y el DNA. El siguiente nivel de segregacin espacial en las clulas se refiere al confina miento de enzimas relacionadas funcionalmente dentro de la misma membrana o dentro de los compartimientos acuosos de un orgnulo que est rodeado por una membrana. El metabolismo oxidativo de la glucosa constituye un buen ejemplo de ello. Despus de la glucolisis, el piruvato se transporta activamente desde el citosol hasta el compartimiento interno de la mitocondria, el cual contiene todas las enzi mas y metabolitos que intervienen en el ciclo del cido ctrico (Figura 2-42). Adems la propia membrana mitocondrial interna contiene todas las enzimas que catalizan las reacciones siguientes de la fosforilacin oxidativa, incluidas las enzimas implica das en la transferencia de electrones desde el NADH al 0 2 y las implicadas en la sn tesis del ATP. Por consiguiente, la mitocondria puede ser considerada como una pe quea fbrica productora de ATP. Anlogamente, otros orgnulos celulares, como el ncleo, el complejo de Golgi y los lisosomas, pueden ser considerados como com partimientos especializados donde se encuentran confinadas enzimas relacionadas funcionalmente y que realizan tareas especficas. En cierto sentido, la clula viva es como una ciudad, con muchos servicios especializados concentrados en diferentes reas, intensamente interconectadas por diversas vas de comunicacin. La organizacin espacial de los organismos pluricelulares se extiende ms all de la clula individual. Los diferentes tejidos del cuerpo tienen diferentes grupos de enzimas y realizan contribuciones distintas a la qumica del organismo com pleto. Adems de las diferencias entre los diferentes tipos de clulas de un mismo organismo en cuanto a productos especializados como las hormonas o los anti cuerpos, tambin existen diferencias considerables en cuanto a las vas metablicas habituales. Aunque prcticamente todas las clulas contienen las enzimas de la glucolisis, del ciclo del cido ctrico, de la sntesis y de la degradacin de los lpidos y del m etabolismo de los aminocidos, los niveles de estos procesos en los diferentes tejidos estn regulados de forma diferente. Las clulas nerviosas, que probablemente son las clulas ms exigentes del cuerpo, carecen casi totalmente de reservas de glucgeno y de cidos grasos, dependiendo casi por completo del aporte de glucosa de la sangre. Las clulas hepticas proporcionan glucosa a las fi bras musculares que se contraen activamente, y reciclan de nuevo a glucosa el ci do lctico producido por estas clulas musculares (Figura 2-43). Todos los tipos de clulas tienen sus rasgos metablicos caractersticos y cooperan intensamente, tanto en el estado normal como en la respuesta al ejercicio, al estrs y al hambre.

membrana plasmtica

glucolisis el citosol

ciclo del cido ctrico V fosforilacin oxidativa en la mitocondria

Figura 2 -42 Segregacin de los diversos pasos de la degradacin de la glucosa en la clula eucariota. La glucolisis se produce en el citosol, mientras que las reacciones del ciclo del cido ctrico y de la fosforilacin oxidativa ocurren nicam ente en las mitocondrias.

G A D

Figura 2-43 Representacin esquem tica de la cooperacin m etablica entre las clulas hepticas y las fibras musculares. El principal combustible de las fibras musculares en activa contraccin es la glucosa, gran parte de la cual est suministrada por las clulas hepticas. El cido lctico, producto final de la degradacin anaerbica de la glucosa por glucolisis en el msculo, se transforma de nuevo en glucosa en el hgado mediante el proceso de gluconeognesis.

90

Captulo 2 : Pequeas molculas, energa y biosntesis

Resumen
Los muchos miles de reacciones qumicas distintas realizadas simultneamente por una clula estn estrechamente coordinadas. Diversos mecanismos de control regulan las actividades de las enzimas clave, en respuesta a las condiciones cam biantes de la clula. Una form a muy comn de regulacin estriba en la inhibicin por retroalimentacin, rpidamente reversible, ejercida por el producto final sobre la primera enzima de una va. Una form a ms prolongada de regulacin implica la modificacin qumica de una enzima por otra enzima, a menudo mediante fosfori lacin. Combinaciones de mecanismos reguladores pueden producir cambios im portantes y prolongados en el metabolismo de la clula. No todas las reacciones ce lulares se producen dentro del mismo compartimiento intracelular, de form a que la segregacin espacial, mediante membranas internas, permite que los orgnulos se especialicen en tareas bioqumicas.

Bibliografa
General
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Bibliografa

91

Macromolculas: estructura, forma e informacin

3
Procesas de reconocimiento molecular Acidos nucleicos Estructura de las protenas Las protefnas como catalizadores

Al considerar la transicin desde las pequeas molculas de la clula hasta las ma cromolculas gigantes, asistimos a mucho ms que a un simple aumento de tama o. Aunque las protenas, los cidos nucleicos y los polisacridos estn construidos a partir de una coleccin restringida de aminocidos, nucletidos y azcares res pectivamente, pueden presentar propiedades nicas y realmente sorprendentes, que les confieren unas caractersticas muy lejanas a sus precursores qumicos. Las macromolculas biolgicas estn compuestas de varios cientos -a veces de millo n es- de tomos unidos entre ellos formando disposiciones espaciales definidas de forma muy precisa. Cada una de estas macromolculas contiene una informacin muy especfica. Incorporadas a su estructura, existen series de mensajes biolgicos que pueden ser ledos cuando estas macromolculas interaccionan con otras mol culas, permitindoles desarrollar una funcin determinada. En este captulo examinaremos las estructuras de las macromolculas, dedi cando un inters especial a las protenas y a los cidos nucleicos y explicando cmo, a lo largo de la evolucin, se han adaptado para desarrollar funciones determina das. Consideraremos los principios por los cuales estas macromolculas catalizan transformaciones qumicas, construyen complejas estructuras multimoleculares, generan movimiento y -m ucho ms fundamental que todo esto- almacenan y transmiten informacin hereditaria.

azcares, am inocidos y nucletidos -0,5-1 nm

v fe

protenas globulares ~ 2 - 1 0 nm

Procesos de reconocimiento molecular1

Las macromolculas tienen un peso molecular que normalmente oscila entre 10 000 y 1 milln, y un tamao intermedio entre las molculas orgnicas de la clula, tratadas en el Captulo 2, y los grandes agregados macromoleculares y orgnulos, que sern objeto de estudio de captulos posteriores (Figura 3-1). Una pequea molcula, la del agua, constituye el 70% de la masa total de la clula; casi todo el resto de la masa son macromolculas (Tabla 3-1). Tal com o se ha descrito en el Captulo 2, una macromolcula se ensambla a partir de subunidades de peso molecular menor, que se aaden una tras otra formando un largo polmero a modo de cadena (vase Figura 2-35). General mente, en la construccin de cada cadena participa nicamente una familia de subunidades: los aminocidos se unen a otros aminocidos formando las prote nas, los nucletidos se unen a otros nucletidos formando los cidos nucleicos; y los azcares se unen a otros azcares formando los polisacridos. Puesto que la secuencia exacta de las subunidades es crucial para la funcin de una molcu-

ribosom a -30 nm

Figura 3-1 Com paracin entre el tam ao de las molculas proteicas y el de otros com ponentes celulares. Los ribosomas son importantes agregados macromoleculares com puestos por unas 60 protenas y molculas de RNA.

93

Tabla 3-1 C om p osicin q u m ica ap ro xim ad a de u n a b a cte ria tpica y de u n a cel la de m am fero tpica P o rce n ta je del peso to tal de la clula
E. coli

C om ponente
Ho0 Io n e s in o rg n ic o s (N a+, K+, M g2+, C a2+, Cl~, e tc.) A lgun os m e ta b o lito s p e q u e o s P ro te n a s RNA DNA F o sfo lp id o s O tro s lp id o s P o lisa c rid o s V o lu m e n c e lu la r to tal: V o lu m e n c e lu la r relativ o :

Bacteria
70 1 3 15 6 1 2 2 2 x l0 ~ ,2 c m 3 1

Clula de mamfero
70 1 3 18 1,1 0 ,2 5 3 2 2 4 x 10 9 c m 3 2000

Las protenas, los polisacridos, el DNA y el RNA son macromolculas. Los lpidos generalm en te no se clasifican com o m acrom olculas, a pesar de que tienen algunas de sus caractersticas; por ejemplo, la mayora de ellos se sintetizan com o polmeros lineales de una molcula menor (el grupo acetil de acetil CoA) y se autoensam blan formando grandes estructuras (membranas). Ntese que el agua y las protenas com prenden la mayor parte de la masa tanto de las clulas de mamfero com o de las bacterias.

la, su biosntesis requiere mecanismos que aseguren que cada subunidad ade cuada se coloque en el polmero en la posicin exacta de la cadena.

Las interacciones especficas de una macromolcula dependen de enlaces dbiles no covalentes 2

Una cadena macromolecular se mantiene unida por medio de enlaces covalentes, que son suficientemente fuertes como para preservar la secuencia de subunidades durante largos perodos de tiempo. A pesar de que la secuencia de subunidades de termina la informacin contenida en una macromolcula, la utilizacin de esta in formacin depende en gran medida de otros enlaces mucho ms dbiles, los enlaces no covalentes. Estos enlaces dbiles se forman entre diferentes regiones de la misma macromolcula, y tambin entre diferentes macromolculas. Por ello, estos enlaces determinan en gran medida tanto la estructura tridimensional de las cadenas macromoleculares como la manera en que estas estructuras interaccionan entre s. Los enlaces no covalentes que se presentan en las molculas biolgicas, sue len clasificarse en tres tipos: enlaces Inicos, enlaces de hidrgeno y atraccio nes de van der Waals. Otra importante fuerza dbil se genera por la estructura tridimensional del agua, la cual tiende a unir los grupos hidrofbicos con el fin de minimizar su efecto destructor de la red de molculas de agua unidas por en laces de hidrgeno (vase Panel 2-1, pgs. 50-51). Esta expulsin de la solucin acuosa genera lo que algunas veces se considera como un cuarto tipo de enlace

m ovim iento trm ico m edio CONTENIDO ENERGTICO \Z (kcal/m ol) 0 ,1 enlace no covalente en el agua

hidrlisis de ATP en la clula

enlace C -C

Figura 3-2 Energas com parativas de algunos acontecim ientos moleculares im portantes de la clula. N tese que

10

100
luz verde

1000
oxidacin de la glucosa com pleta

los valores de energa se m u estran en una escala logartm ica.

94

Captulo 3 : Macromolculas: estructura forma e informacin

Tabla 3-2 Enlaces qumicos covalentes y no covalentes Fuerza (kcal/mol)* Tipo de enlace Longitud (nm)
0,15 0,25 0,30 0,35 En e l v a co 90 80 4 0,1 En el a g u a 90 3 1 0,1

Covalente Inico Hidrgeno A tracciones de van der W aals (por tom o)

*La fuerza de un enlace se puede medir como la energa necesaria para romperlo, que aqu se presenta en kaloras por mol (kcal/mol). (Una kilocalora es la cantidad de energa necesaria para incrementar en I o C la temperatura de 1000 g de agua. Una unidad alternativa de uso co mn es el kilojoule, kj, igual a 0,24 kcal.) La fuerza de cada enlace son los tomos que estn im plicados en su formacin, y del ambiente preciso en el que se halla el enlace; los valores de la tabla solamente son, por lo tanto, una gua aproximada. Ntese que el ambiente acuoso de una clula disminuye enormemente la fuerza de los enlaces inicos y de hidrgeno entre molculas diferentes a las de agua (Panel 3-1, pgs. 96-97). La longitud de enlace es la distancia entre los centros de los tomos diferentes al hidrgeno que participan en el enlace.

dbil no covalente. En el Panel 3-1, pginas 96-97, se exponen las caractersticas principales de estos cuatro tipos de enlaces dbiles. En un medio acuoso, los enlaces no covalentes son de 30 a 300 veces ms dbiles que los enlaces covalentes (Tabla 3-2) y slo ligeramente ms fuertes que la energa media de las colisiones trmicas a 37C (Figura 3-2). Por consiguiente, un nico enlace no covalente - a diferencia de lo que ocurre con un enlace cova len te- resulta demasiado dbil para resistir los movimientos trmicos que tien den a separar las molculas, por lo que son necesarios numerosos enlaces no covalentes para mantener unidas dos superficies moleculares. Entre dos superfi cies slo se pueden formar un elevado nmero de enlaces no covalentes si exis ten un elevado nmero de tomos de estas superficies que estn adaptados unos a los otros (Figura 3-3), lo cual determina la especificidad de reconocimiento biolgico, como ocurre entre una enzima y su substrato. Como se explica en la parte superior del Panel 3-1, los tomos se comportan casi como si fueran pesadas esferas de un radio determinado (su radio de van der Waals). El requerimiento de que dos tomos no pueden solaparse limita los ngulos de enlace posibles de una cadena polipeptdica (Figura 3-4). Estas y otras interacciones estricas reducen substancialmente el nmero de disposi ciones tridimensionales (o conform aciones) que son posibles. A pesar de ello, una larga cadena flexible como por ejemplo la de una protena, puede plegarse en un nmero enorme de diferentes posibilidades, teniendo cada conformacin

Figu ra 3 -3 Enlaces no covalentes.

Manera en que los enlaces dbiles median los procesos de reconocim iento entre las macromolculas.

( ^l
( ?,

),

las superficies de las m olculas A y B y A y C se adaptan mal y nicam ente son capaces de form ar unos cuantos enlaces dbiles; el m ovim iento trm ico las separa rpidam ente

la m olcula A encuentra a otras molculas (B, C y D)

las superficies de las m olculas A y D se adaptan bien, por lo que pueden form ar un nm ero suficiente de enlaces dbiles que perm ite resistir el m ovim iento trm ico, perm aneciendo unidas

Procesos de reconocimiento molecular

95

FUERZAS DE VAN DER WAALS

A u n a d is ta n c ia c o r ta , 2 t o m o s c u a le s q u ie r a m u e s t r a n u n a d b il in te r a c c i n d e e n la c e d e b id o a s u s c a r g a s e l c tric a s flu c t u a n t e s . E s ta f u e r z a r e c ib e e l n o m b r e d e a t r a c c i n d e v a n d e r W a a ls . S in e m b a r g o d o s t o m o s s e r e p e le n m u y e n e r g t ic a m e n t e si se lo s a c e r c a d e m a s ia d o . E s ta r e p u ls i n d e v a n d e r W a a ls d e s e m p e a u n p a p e l im p o r t a n t e lim it a n d o la s p o s ib le s c o n f o r m a c io n e s d e u n a m o l c u la . C a d a t ip o d e t o m o t ie n e u n r a d io , c o n o c id o c o m o r a d io d e v a n d e r W a a ls , e n el q u e la s fu e r z a s d e v a n d e r W a a ls e s t n e q u ilib r a d a s .

1,2 A (0 , 1 2 nm)

2,0 A (0 , 2 nm)

1,5 A (0,15 nm)

1,4 A (0,14 nm)

D o s t o m o s se a tr a e n e n t r e s p o r f u e r z a s d e v a n d e r W a a ls h a s ta q u e la d is ta n c ia e n tr e e llo s ig u a le la s u m a d e s u s r a d io s d e v a n d e r W a a ls . A p e s a r d e q u e e s ta s a t r a c c io n e s d e v a n d e r W a a ls s o n in d iv id u a lm e n t e m u y d b ile s , p u e d e n s e r im p o r t a n t e s c u a n d o d o s s u p e r fic ie s m a c r o m o le c u la r e s se a d a p t a n m u y b ie n u n a a o tr a .

ENLACES QUIMICOS DEBILES

Las m o l c u la s o r g n ic a s p u e d e n in t e r a c c io n a r c o n o tr a s m o l c u la s a t r a v s d e fu e r z a s n o c o v a le n t e s d e a lc a n c e r e d u c id o .

ENLACES DE HIDROGENO
U n t o m o d e h id r g e n o e s c o m p a r t id o p o r d o s to m o s ( a m b o s e le c t r o n e g a t iv o s , c o m o el O y el N ) fo r m n d o s e u n e n la c e d e h id r g e n o .

enlace covalente enlace de hidrgeno ~ 0 , 1 nm de largo ~ 0 , 2 nm de largo

L o s e n la c e s d e h id r g e n o s o n m s fu e r te s c u a n d o lo s tr e s t o m o s s e h a lla n e n ln e a re c ta :

T p ic a m e n t e , lo s e n la c e s q u m ic o s d b ile s t ie n e n u n a fu e r z a 2 0 v e c e s in f e r io r a la d e u n e n la c e c o v a le n t e . S lo s o n s u fic ie n te m e n te fu e r te s p a ra f ija r d o s m o l c u la s c u a n d o se f o r m a s im u lt n e a m e n t e u n n m e r o e le v a d o d e e llo s .

I N

n1 1 1 1 1 1 1 1 1 1O

ENLACES DE HIDROGENO EN EL AGUA

Las m o l c u la s q u e p u e d e n f o r m a r e n la c e s d e h id r g e n o c o n o tr a s t a m b i n p u e d e n , a lt e r n a t iv a m e n t e , f o r m a r e n la c e s d e h id r g e n o c o n m o l c u la s d e a g u a . D e b id o a e s ta c o m p e t e n c ia c o n las m o l c u la s d e a g u a lo s e n la c e s d e h id r g e n o f o r m a d o s e n tr e d o s m o l c u la s d is u e lta s e n a g u a s o n r e l a tiv a m e n t e d b ile s .

E je m p lo s e n m a c r o m o l c u la s : D o s c a d e n a s p o lip e p td ic a s d e a m in o c id o s u n id a s p o r e n la c e s d e h id r g e n o .

enlace peptdico
2 H .O

= 0 |||||||||| H N -H H C C

I I i
D o s b a s e s , G y C , u n id a s p o r e n la c e s d e h id r g e n o e n el D N A o e n el R N A . H

-N I LI

O "O I
H \ l 2H ,0

H
\

C // -C

) n- h iiiiiiio c c
n iiiiiiiiiiih N
/

N :C

-c-

O I I

-N H

\
N s

\
/ c N

C " Ns /

O II
-C

N c I
H

O IIIIIIIIH

96

Panel 3 1 Principales tipos de fuerzas no covalentes dbiles que unen las molculas entre s.

INTERACCIONES HIDROFBICAS
El a g u a u n e lo s g r u p o s h id r o f b ic o s c o n o b je t o d e m in im iz a r lo s e fe c to s d e s tr u c to r e s d e e s to s g r u p o s s o b r e la re d d e e n la c e s d e h id r g e n o d e l a g u a . A m e n u d o s e d ic e q u e lo s g r u p o s h id r o f b ic o s q u e s e m a n t ie n e n u n id o s d e e s ta m a n e r a e s t n u n id o s p o r " p u e n te s h id r o f b ic o s " , a p e s a r d e q u e la a t r a c c i n e s t g e n e r a d a e n r e a lid a d p o r u n a r e p u ls i n d e la s m o l c u la s de agua.

*
ENLACES INICOS EN SOLUCIONES ACUOSAS
Lo s g r u p o s c a r g a d o s e s t n p r o t e g id o s p o r s u s in t e r a c c io n e s c o n la s m o l c u la s d e a g u a . P o r e llo , lo s e n la c e s i n ic o s e n s o lu c i n a c u o s a s o n b a s t a n t e d b ile s .

% <
ENLACES IONICOS
Las in te r a c c io n e s i n ic a s s e p r o d u c e n e n tr e g r u p o s t o t a lm e n t e c a r g a d o s (e n la c e i n ic o ) o e n t r e g r u p o s p a r c ia lm e n t e c a r g a d o s .

r Xo H O IIIIIIIH O
\ H H H \

\
iI

O
O P O

,0
H'

O
HO

A d e m s , lo s e n la c e s i n ic o s se d e b ilit a n p o r la p r e s e n c ia d e s a le s , c u y o s t o m o s f o r m a n lo s c o n t r a io n e s q u e se d is t r ib u y e n a lr e d e d o r d e lo s io n e s d e c a r g a o p u e s ta .

La f u e r z a d e a tr a c c i n e n tr e las d o s c a r g a s 8 + y 8 es fu e r z a = -

5+5~
r D

( Le y d e C o u lo m b )

La m e d id a d e la in t e n s id a d d e la d e s e s t a b iliz a c i n d e la in te r a c c i n p o r s a le s s u p o n e u n a e s t im a c u a n t it a t iv a d e l n m e r o to t a l d e e n la c e s i n ic o s im p lic a d o s .

d o n d e D = c o n s ta n te d ie l c tr ic a (1 p a r a el v a c o , 8 0 p a r a el a g u a ) D e t o d o s m o d o s , lo s e n la c e s i n ic o s s o n m u y im p o r t a n t e s e n lo s s is te m a s b io l g ic o s . U n a e n z im a q u e s e u n a a u n s u b s tr a to c a r g a d o p o s it iv a m e n t e En a u s e n c ia d e a g u a , la s fu e r z a s i n ic a s s o n m u y in te n s a s . S o n r e s p o n s a b le s d e la d u r e z a d e m in e r a le s ta le s c o m o el m r m o l y el g a ta . a m e n u d o p r e s e n ta r e n el lu g a r a p r o p ia d o u n re s to d e a m in o c id o c a r g a d o n e g a t iv a m e n t e .

r = d is ta n c ia d e s e p a r a c i n

c ris ta l d e N aC I

97

Figura 3 -4 Limitaciones estricas de los ngulos de enlace en una cadena polipeptdica. (A) Cada aminocido contribuye con

tres enlaces (en rojo) a su cadena polipeptdica. El enlace peptdico es plano (sombreado en gris) y no permite rotacin. Por el contrario, se puede producir rotacin sobre del enlace Ca- C -a este ngulo de rotacin se le denomina psi (y)- y sobre el enlace N- C-a este ngulo de rotacin se le denomina phi ((p). El grupo R representa una cadena lateral de un aminocido. (B) La conformacin de los tomos principales de una cadena proteica viene determinada por un par de ngulos psi y phi para cada aminocido; debido a las colisiones estricas entre los aminocidos, la mayora de los pares de ngulos phi y psi no tienen lugar. En este grfico, llamado de Ramachandran, cada punto representa un par de ngulos observados en protenas. (B, de J. Richardson, Adv. Prot. Chem. 34:, 174-175,1981.)

-ISO"

1 8 0

(8 )

una coleccin diferente de interacciones dbiles dentro de la cadena, y es la fuer za total de estas interacciones lo que determina qu conformaciones se formarn. La mayora de protenas de una clula se pliegan de forma estable de una sola manera: durante el curso de la evolucin la secuencia de subunidades de aminoci dos ha sido seleccionada de forma que una determinada conformacin puede for mar muchas ms interacciones favorables en la propia cadena que cualquier otra.
Figura 3-5 Cuando varias subunidades se unen entre s de una forma regular, se genera una hlice.

En primer trmino se presenta la interaccin entre dos subunidades y detrs aparecen las hlices que resultan de esta interaccin. Las hlices que se presentan aqu son de (A) dos, (B) tres o (C) y (D) seis unidades por vuelta. En la parte superior de la figura se puede observar la disposicin de las subunidades desde la parte superior de cada hlice. Ntese que la hlice (D) tiene un paso de vuelta ms ancho que la hlice (C).

(A)

<B)

ICJ

(D>

98

Captulo 3 : Macromolculas: estructura, forma e informacin

Una hlice es un motivo estructural comn en las estructuras biolgicas generadas a partir de subunidades repetidas 3
A menudo, las estructuras biolgicas estn formadas por subunidades que son muy similares las unas a las otras -com o aminocidos o nucletidos-, formando una larga cadena repetitiva. Si todas las subunidades son idnticas, normalm en te ocurre que las adyacentes en la cadena se unen de una nica manera, ajustando sus posiciones relativas de forma que se minimice la energa libre de contacto entre ellas. En este caso, cada subunidad se colocar exactamente en la misma posicin en relacin a sus subunidades adyacentes, de modo que la subunidad 3 se unir a la subunidad 2 de la misma forma en la que la subunidad 2 se ha uni do a la subunidad 1, y as sucesivamente. Debido a que es muy raro que las sub unidades se unan formando una lnea recta, generalmente estas uniones origi nan una hlice -u n a estructura regular que se parece a una escalera de caracol, como se ilustra en la Figura 3-5. En funcin de la direccin de giro de la escalera de caracol, la hlice se denomina dextrgira o levgira (Figura 3-6). Esta caracte rstica no vara cuando la hlice se coloca cabeza abajo, pero es la inversa cuan do se refleja en un espejo. Las hlices son elementos habituales de las estructuras biolgicas, tanto si las subunidades son molculas pequeas que estn unidas entre s de forma covalente (como en el DNA), como si son grandes molculas proteicas unidas en tre s por fuerzas no covalentes (como en los filamentos de actina). Esto no es sorprendente. Una hlice es una estructura que en absoluto es excepcional, ge nerada simplemente por la unin, una contra otra, de muchas subunidades si milares, de forma que cada una adopta exactamente la misma relacin espacial con la subunidad anterior.

hlice levgira

hlice dextrgira

La difusin es el primer paso hacia el reconocim iento molecular 4

Para que dos molculas se unan entre s deben entrar en estrecho contacto. Esto se consigue gracias a los movimientos trmicos que hacen que las molculas se desplacen, o difundan, desde sus posiciones de partida. Puesto que las m olcu las de un lquido colisionan y se separan rpidamente unas de otras, una deter minada molcula se mueve primero en una direccin y luego en otra, en un movimiento al azar (Figura 3-7). La distancia media que recorre cada tipo de molcula desde su punto de partida es proporcional a la raz cuadrada del tiem po utilizado, es decir, si una molcula determinada necesita por trmino medio 1 segundo para desplazarse 1 |a.m , necesitar 4 segundos para desplazarse 2 (im, 100 segundos para desplazarse 10 |im, etc. Por lo tanto, la difusin es eficaz para que las molculas se desplacen a distancias limitadas, pero no es eficaz para dis tancias largas. Experimentos realizados inyectando a clulas colorantes fluorescentes y otras molculas marcadas demuestran que la difusin en el citoplasma de m ol culas pequeas es casi tan rpida como en el agua. Una molcula del tamao del ATP necesitar slo 0,2 segundos aproximadamente para difundir hasta una dis tancia media de 10 |j.m -e l dimetro de una clula animal pequea. Sin embargo, las grandes macromolculas se desplazan mucho ms lentamente. No slo pre sentan velocidades de difusin intrnsecamente ms lentas sino que adems su movimiento se ve retardado por frecuentes colisiones con otras muchas m acro molculas que se mantienen en su lugar mediante asociaciones moleculares en el citoplasma (Figura 3-8).

Figura 3-6 Com paracin entre una hlice levgira y otra dextrgira. Como referencia, es til recordar que los tornillos habituales, que avanzan cuando se les hace girar en el sentido de las agujas de un reloj, son dextrgiros. Ntese que cualquier hlice conserva el mismo sentido de giro (y por lo tanto su caracterstica de ser dextrgira o levgira) aunque se la coloque boca abajo.

Los movimientos trm icos unen a las molculas y luego las separan 4
Los encuentros entre dos macromolculas o entre una macromolcula y una molcula pequea, se producen al azar, por difusin simple. Un encuentro pue de conducir inmediatamente a la formacin de un complejo (en cuyo caso se

Figura 3-7 Un recorrido al azar. Las molculas de una solucin se desplazan al azar debido a continuas colisiones con otras molculas. Este movimiento permite a las pequeas molculas difundir de una zona a otra de la clula en perodos de tiempo sorprendentemente cortos: pueden difundir a travs de toda una clula tpica de mamfero en menos de un segundo.

Procesos de reconocimiento molecular

99

dice que la velocidad de formacin est limitada por la difusin). Alternativa mente, la velocidad de formacin del complejo puede ser ms lenta, por necesi tar que se produzca un reajuste de la estructura de una o de ambas molculas, antes de que las superficies interactivas puedan adaptarse una a la otra, de for ma que a menudo las dos molculas que colisionan se separarn una de la otra, sin llegar a unirse. En ambos casos, cuando las dos molculas interactivas se han acercado suficientemente una a la otra, forman entre ellas mltiples enlaces d biles, que persisten hasta que el movimiento trmico al azar hace que las mol culas se disocien de nuevo (Figura 3-3). Por regla general, cuanto ms fuerte es la unin de las molculas que forman el complejo, tanto ms baja es su velocidad de disociacin. En un caso extremo, la energa total de los enlaces formados puede ser insignificante en comparacin con la del movimiento trmico, por lo que las dos molculas se disociarn tan r pidamente como se han unido. En el otro caso extremo, la energa total de los en laces es tan alta que la disociacin se produce muy raramente. Las interacciones fuertes se producen en la clula cuando la funcin biolgica requiere que las dos macromolculas permanezcan estrechamente asociadas durante largo tiempo -por ejemplo, en el caso de una protena reguladora que debe permanecer unida al DNA para inhibir la expresin de un gen. Las interacciones dbiles se producen cuando la funcin requiere un cambio rpido de la estructura del complejo -por ejemplo, cuando las dos protenas que interaccionan han de cambiar de pareja, durante los movimientos de una mquina proteica.

100

nm

La constante de equilibrio constituye una medida de la fuerza de interaccin entre dos molculas 5
La fuerza exacta del enlace entre dos molculas es un ndice til de la especifici dad de su interacin. Para ilustrar cmo se mide la fuerza de enlace, considere-

Figura 3 -8 Macromolculas en el citoplasma celular. El dibujo est hecho aproximadamente a escala, e ilustra el abarrotamiento que existe en el citoplasma. nicamente se representan las macromolculas: los RNA se han dibujado en azul, los ribosomas en verde y las protenas en rojo. En el citoplasma las macromolculas difunden de una forma relativamente lenta debido a que interaccionan con muchas otras macromolculas; por el contrario, las molculas pequeas difunden casi tan rpidamente como lo hacen en el agua. (Adaptado a partir de D.S. Goodsell, Trends in Biochem. Sci. 16:203-206, 1991.)

A B

disociacin

velocidad de _ constante concentracin disociacin ~ ~ de disociacin de AB velocidad de disociacin = A r0ff [AB] asociacin
A B

EJEMPLO: La concentracin de una m olcula de la que hay una sola copia en una clula tpica de m am fero (de un volum en aproxim ado de 2000 |im 3) es aproxim adam ente de 10 12 M. Si esta clula contiene 104 copias de la proteina A y 106 copias de la proteina B, [A] = 10 8 M y [B] = 10~6 M concentracin de B Supongam os que la proteina A se une a la proteina B con una K = 107 M-1. La relacin entre el nm ero de molculas de A unidas y el de molculas de A libres ser [AB]/[A], y como [AB] = K[B] = (10/ M )(10 M) = 10 [A] podem os esperar que dentro de la clula de cada diez m olculas de A que se hallen unidas a B, una est libre. Repitiendo los clculos para K = 104 IVT1, observarem os que nicamente alrededor de una de cada cien m olculas de A deben de hallarse unidas a B.

velocidad de constante de concentracin asociacin asociacin de A velocidad de asociacin = kon [A] [B] EN EL EQUILIBRIO:

velocidad de asociacin = velocidad de disociacin kon [A] [B] = kQ f [AB] [AB] C on --------- = ----- = K = constante de equilibrio [A] [B] fcoff

Figura 3 -9 Principio del equilibrio. El equilibrio entre las molculas A y B y el com plejo AB se mantiene gracias al balance entre las dos reacciones opuestas indicadas en (1) y (2). Como se expresa en (3), la relacin entre la constante de asociacin y la de disociacin es igual a la constante de equilibrio (K) para la reaccin. Las molculas A y B han de chocar para poder reaccionar por lo que la velocidad de sntesis del com plejo AB es proporcional al producto de las concentraciones individuales de los reactantes A y B. Por eso en la expresin final de K aparece el producto [A] x [B], donde [ ] indica "concentracin de. Como se ha definido tradicionalm ente, en la ecuacin de un equilibrio qumico las concentraciones de los productos aparecen en el numerador y las de los com puestos que reaccionan, en el denominador. As, la constante de equilibrio en (3) es para la reaccin de asociacin A + B AB, mientras que la inversa de esta fraccin sera la constante de equilibrio para la reaccin de disociacin AB A + B. Sin embargo, al referirse a interacciones de unin sencilla, es menos confuso hablar de constante de afinidad o constante de asociacin (en litros por mol); cuanto mayor es el valor de la constante de asociacin [KJ, mayor es la fuerza de unin entre A y B. El recproco de Ka es la constante de disociacin (en moles por litro); cuanto menor es el valor de la constante de disociacin (Kd) mayor es la fuerza de unin entre A y B.

100

Captulo 3 : Macromolculas: estructura, forma e informacin

mos una reaccin en la que la molcula A se une a la molcula B. Esta reaccin continuar hasta alcanzar un punto de equilibrio, en el cual la velocidad de for macin y la de disociacin son iguales (Figura 3-9). Las concentraciones de A, de B y del complejo AB en este punto de equilibrio se pueden utilizar para determi nar una constante de equilibrio (K) para la reaccin, tal como se explica en la Figura 3-9. Esta constante recibe a veces el nombre de constante de afinidad, y habitualmente se utiliza como medida de la fuerza de enlace entre dos m olcu las; cuanto ms fuerte sea el enlace, tanto ms elevado ser el valor de la cons tante de afinidad. La constante de equilibrio de una reaccin en la que se enlazan dos m olcu las est directamente relacionada con el cambio de energa libre estndar del enlace (AG), mediante la ecuacin descrita en la Tabla 3-3. En esta tabla tam bin se indican los valores de AG correspondientes a varios valores de K. En sis temas biolgicos, las constantes de afinidad para interacciones de enlace senci llo normalmente oscilan entre IO3 y 101 2 litros/mol; esto corresponde a energas de enlace en el intervalo de 4 a 17 kcal/mol, que puede provenir de unos 4 a 17 enlaces de hidrgeno.

Tabla 3-3 La relacin entre las diferencias de energa libre y las constantes de equilibrio Constante de equilibrio
[AB]

Energa libre
de AB m enos energa libre de A + B (kcal/mol)

_K

[A] [B] (litros/mol)

Los tomos y las molculas se mueven rpidamente 6

Las reacciones qumicas de una clula tienen lugar a velocidades asombrosa mente elevadas. Una molcula de una enzima tpica, por ejemplo, cataliza unas 1000 reacciones por segundo y algunas enzimas como la catalasa pueden conse guir velocidades de ms de 106 reacciones por segundo. Cada reaccin requiere que una molcula de enzima se encuentre con otra de substrato, por lo que velo cidades como stas slo son posibles gracias a que las molculas se mueven a velocidades suficientemente rpidas. Los movimientos de las molculas pueden clasificarse de forma general en tres categoras: (1) el movimiento de una m ol cula de un lugar a otro (movimiento de translacin), (2) el rpido movimiento atrs y adelante de los tomos unidos de forma covalente respecto a otro (vibra cin), y (3) las rotaciones. Todos estos movimientos son importantes para unir entre s las superficies de molculas que interaccionan. Las velocidades de los movimientos moleculares pueden medirse por diver sas tcnicas espectroscpicas, que indican que una gran protena globular est girando constantem ente, rotando sobre su eje, alrededor de un milln de veces por segundo. Las velocidades de encuentros por difusin originados por movi mientos de traslacin son proporcionales a la concentracin de la molcula que difunde. Si el ATP, por ejemplo, se halla presente a su concentracin intracelular habitual de 1 mM, cada lugar de una molcula proteica ser bombardeado con molculas de ATP por unas 106 colisiones al azar cada segundo. Para una con centracin de ATP 10 veces menor, el nmero de colisiones descendera a 105, y as sucesivamente. De forma extremadamente rpida, en cuanto dos molculas han colisiona do y se hallan en una orientacin relativa adecuada, puede producirse entre ellas una reaccin qumica. Teniendo en cuenta lo rpidamente que se mueven y reaccionan las molculas, las velocidades de catlisis enzimtica observadas no parecen tan extraordinarias.

105 104 103 102 10 1 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

-7,1 -5,7 -4,3 -2,8 -1,4 0 1,4 2,8 4,3 5,7 7,1

Si se permite que la reaccin A + B ^ lle gue al equilibrio, las cantidades relativas de A, B y AB dependern de las diferen cias de energa libre, AG, entre ellos. Los valores de la tabla corresponden a 37C (310K), y estn calculados a partir de la ecuacin

AG =-RT ln [AB] [A ] [B]

[AB] [A] [B]

_ g-AG / RT _ e -AG/0,6138

Aqu, AG viene dado en kilocaloras por mol y representa la diferencia de energa libre en condiciones estndar (en las que todos los componentes se hallan a con centraciones de 1,0 moles/litro); T es la temperatura en grados Kelvin (K). Principios similares a stos se aplican in cluso al caso ms sencillo de una reac cin A ^ A*, segn el cual una molcula puede interconvertirse entre dos estados A y A* que se diferencian en un cierto va lor de AG. En el equilibrio, la relacin entre el nmero de molculas de ambos tipos es igual a la relacin
__ _ _ = g-AG/RT

[A*]

[A ]

Los procesos de reconocim iento molecular nunca pueden ser perfectos 7

Todas las molculas tienen energa -la energa cintica de sus movimientos de traslacin, de vibracin y de rotacin y la energa potencial almacenada en sus distribuciones electrnicas. A travs de las colisiones moleculares, esta energa se distribuye aleatoriamente a todos los tomos presentes, de forma que la m a yora de tomos tendrn niveles de energa cercanos al valor medio, y tan slo una pequea proporcin de ellos presentarn niveles energticos muy altos. A pesar de que las conformaciones o estados favorables que adopte una molcula Procesos de reconocimiento molecular

As, a partir de esta tabla podemos ver que, si la transicin A A* tiene un cambio de energa libre favorable de 4,3 kcal/mol, en el equilibrio habr ms de 1000 mol culas en el estado A* que en el estado A.

101

sern las que supongan menor energa libre (vanse pgs. 78-79), como conse cuencia de colisiones extraordinariamente violentas se producen estados de alta energa. Es posible calcular la probabilidad de que, a una temperatura dada un tomo o una m olcula est en un estado de una determinada energa (vase Ta bla 3-3). La probabilidad de un estado de alta energa disminuye respecto a la de uno de b aja energa a medida que la diferencia entre los valores de la energa li bre de am bos aumenta. Sin embrago, esta probabilidad nicamente es igual a cero cuando la diferencia de energa es infinita. Debido a que las colisiones moleculares son fortuitas, de vez en cuando ocurren pequeas reacciones secundarias. A consecuencia de ello, una clula com ete errores continuamente. Se producirn ocasionalmente incluso las reac ciones que son energticam ente muy desfavorables. Por ejemplo, dos tomos unidos uno al otro por un enlace covalente, pueden ocasionalm ente estar so metidos a una energa especial de colisin, y separarse. Anlogamente, la espe cificidad de una enzima por su substrato no puede ser absoluta ya que el reco nocimiento de una molcula com o diferente de otra nunca puede ser perfecto. nicamente se podran evitar por completo los errores si la clula desarrollara mecanism os que tuvieran diferencias de energa infinitas entre las alternativas. Puesto que esto no es posible, las clulas se ven forzadas a tolerar un cierto nivel de error, y han desarrollado una gran variedad de reacciones especiales de repa racin para corregir los errores ms perjudiciales. Por otro lado, los errores son esenciales para la vida. Si no fuera por las equi vocaciones ocasionales en el proceso de mantenimiento de las secuencias de DNA, probablem ente la evolucin no habra tenido lugar.

Resumen

La secuencia de subunidades de una macromolcula contiene una informacin que determina el perfil tridimensional de su superficie. Este perfil, a su vez, controla el reconocimiento entre una molcula y otra o entre distintas zonas de una misma molcula, mediante enlaces dbiles, no covalentes. Las fuerzas de atraccin son de cuatro tipos: enlaces inicos, atracciones de van der Waals, enlaces de hidrgeno e interacciones entre grupos no polares causadas por su expulsin hidrofbica del agua. Dos molculas se reconocern una a otra mediante un proceso en el que pri mero se encuentran por difusin al azar, se unen deforma transitoria y luego se di socian. Generalmente, la fuerza de esta interaccin se expresar en forma de una constante de equilibrio. Puesto que la nica manera de conseguir que el reconoci miento sea infalible consiste en hacer que la energa de enlace sea infinitamente grande, las clulas vivas constantemente cometen errores; los que son intolerables son corregidos mediante procesos especiales de reparacin. cidos nucleicos8
Los genes estn formados por DNA9
Desde que el hombre ha sembrado cosechas o criado animales, resulta obvio que cada semilla o cada vulo fecundado debe de contener escondido un plan o dise o para el desarrollo del organismo. En la poca moderna, la ciencia de la gentica se desarroll alrededor de la premisa de que existan unos elementos invisibles portadores de informacin, denominados genes, que son distribuidos a cada una de las clulas hijas cuando la clula madre se divide. Por consiguiente, antes de di vidirse una clula ha de hacer una copia de sus genes para poder ceder a sus clu las hijas una coleccin completa de ellos. Los genes de los espermatozoides y de los vulos transmiten la informacin gentica de una generacin a la siguiente. La herencia de los caracteres biolgicos debe implicar la existencia de es quemas de tom os que sigan las leyes de la fsica y de la qumica: en otras pala bras, los genes deben estar formados por molculas. Al principio, la naturaleza

102

Captulo 3 : Macromolculas: estructura, forma e informacin

de estas molculas resultaba difcil de imaginar. Qu tipo de molcula podra ser almacenada en una clula, dirigir las actividades de un organismo en desa rrollo y adems ser capaz de una replicacin exacta y casi ilimitada? Hacia finales del siglo xix, los bilogos haban reconocido ya que los trans portadores de la informacin hereditaria eran los cromosomas que resultan visi bles en el ncleo cuando una clula empieza a dividirse. Pero la evidencia de que es el cido desoxirribonucleico (DNA) de estos cromosomas la substancia de la que estn formados los genes se obtuvo mucho ms tarde a partir de unos estudios sobre bacterias. En 1944 se demostr que la adicin de DNA purificado de una cepa de bacteria a otra cepa ligeramente diferente, confera a esta segun da cepa propiedades hereditarias caractersticas de la primera. Como hasta en tonces se haba credo que tan slo las protenas presentaban una complejidad conformacional suficiente como para ser portadoras de la informacin gentica, este descubrimiento constituy una sorpresa y no fue aceptado de forma gene ral hasta principio de los aos 1950. Actualmente, la idea de que el DNA contie ne la informacin gentica -alm acenada en su larga cadena de nucletidos- es tan fundamental para el pensamiento biolgico que a veces resulta difcil darse cuenta del enorme abismo intelectual que llen este concepto.

Las m olculas de DNA consisten en dos largas cadenas unidas por pares de bases com plem entarias 10
Al considerar la simplicidad de la qumica del DNA resulta comprensible que los genetistas tuvieran dificultades en aceptar que el DNA es la esencia de los genes. Una cadena de DNA es un largo polmero no ramificado, compuesto nicamente por cuatro tipos de subunidades. Estas subunidades son los desoxirribonucletidos que contienen las bases adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T). Los nucletidos estn unidos por enlaces covalentes fosfodister entre el carbono 5 de un grupo desoxirribosa y el carbono 3 del siguiente (Panel 2-6, pgs. 60-61). Los cuatro tipos de bases estn fijados a esta cadena de azcar fosfato repetitiva, casi como cuatro tipos diferentes de cuentas ensartadas en un collar. Cmo una larga cadena de nucletidos puede codificar las instrucciones para todo un organismo, o incluso nicamente para una sola clula? Y, cmo pueden copiarse estos m ensajes de una generacin de clulas a la siguiente? Las respuestas se hallan en la estructura tridimensional de la molcula de DNA.
Figura 3-10 La doble hlice de DNA. (A) Una corta seccin de la doble hlice del DNA. Se presentan cuatro pares de bases complementarias. Las bases se representan en gris y los azcares desoxiribosa en azul. (B) La hlice vista desde uno de sus extremos. Ntese que las dos hebras del DNA avanzan en direcciones opuestas y que cada par de bases se m antiene unido por dos o tres enlaces de hidrgeno (vase tambin Panel 3-2, pgs. 104105).

final 5' de la cadena bases 5' abajo

extrem o 5' arriba

enlace de hidrgeno

3' arriba

extrem o 3' abajo

cidos nucleicos

103

DNA Y RNA
E n e s ta m it a d d e l p a n e l se p r e s e n ta la e s t r u c t u r a d e l R N A y e n la o tr a m ita d la d e l D N A . T a n t o el D N A c o m o el R N A s o n p o lm e r o s lin e a le s d e n u c le tid o s (v a s e P a n e l 2 -6 , p g s . 6 0 -6 1 ) . El R N A se d ife r e n c ia d e l D N A e n tr e s a s p e c to s : 1. la c o lu m n a v e r t e b r a l d e a z c a r fo s f a to p r e s e n ta rib o s a e n lu g a r d e d e s o x ir r ib o s a 2 . p r e s e n ta la b a s e d e u r a c ilo (U ) e n lu g a r d e t im in a (T ) 3 . e x is te e n f o r m a d e h e b r a s e n c illa e n lu g a r d e u n a h lic e d e d o b le h e b ra .

ESQUELETO DE AZUCAR FOSFATO DEL RNA

G

ribosa

^ O S

enlace fosfodister

't ;

extrem o 3

&

O
LAS CUATRO BASES DEL RNA guanina
O
\ N / \ C ^ N

citosina
NH2

uracilo
O X _
n z

adenina
NH

h, n/

C ^ / C - n'

//

O'

O'

esqueleto azcar fosfato

104

Estructuras del DNA y del RNA.

II ^
^

\\

CH

II

CH

ESQUELETO DE AZUCAR FOSFATO DEL DNA

LAS CUATRO BASES DEL DNA FORMANDO DOS PARES DE BASES

extrem o 5' desoxirribosa

tim in a

citosina

unin 5' enlace fosfodister

enlace de hidrgeno extrem o 3' adenina guanina

ELECTRON MICROGRAFIA DEL DNA esqueleto de azcar fosfato

|re3ra^cif(4
La f o r m a c i n e s p e c fic a d e e n la c e s d e h id r g e n o e n tr e G y C y e n tr e A y T (A y U e n el R N A ) g e n e r a lo s p a r e s d e b a s e s c o m p le m e n t a r ia s .

(Cortesa de Mei Lie W ong.)

DOBLE HELICE DEL DNA

E n u n a m o l c u la d e D N A , se e n c u e n tr a n a p a r e a d a s d o s c a d e n a s a n t ip a r a le ia s c u y a s s e c u e n c ia s d e n u c le t id o s s o n c o m p le m e n t a r ia s , g e n e r a n d o u n a d o b le h lic e d e x tr g ir a d e a p r o x im a d a m e n t e 10 p a r e s d e n u c le t id o s p o r v u e lt a d e la h lic e . E n la p a r te s u p e r io r d e e s ta f ig u r a s e p r e s e n ta u n a ilu s tr a c i n e s q u e m tic a y e n la in f e r io r u n m o d e lo lle n o d e la d o b le h lic e d e l D N A .

esqueleto de azcar fosfato

enlace de hidrgeno una vuelta de hlice = 3,4 nm

estra principal

estra secundaria

105

A principios de los aos 1950, anlisis por difraccin de rayos X de muestras de DNA estiradas hasta conseguir fibras, sugirieron que la molcula de DNA es un polmero helicoidal formado por dos hebras. No era sorprendente que el DNA tuviera una estructura helicoidal pues, como ya hemos visto, es muy fre cuente la form acin de una hlice si cada una de las subunidades vecinas de un polmero est orientada regularmente. Pero el hecho de que el DNA tenga dos hebras fue crucial. Constituy el dato que condujo, en 1953, a la construccin de un modelo que se adaptaba al esquema de difraccin de rayos X observado y, con ello, solucionaba el rompecabezas de la estructura y de la funcin del DNA. Un rasgo esencial del modelo consista en que todas las bases de la molcula de DNA se hallan en el interior de la doble hlice, mientras que los azcares fosfa to se disponen en el exterior. Esta distribucin supone que las bases de una de las hebras deben estar extraordinariamente cerca de las de la otra hebra, y el modelo propuesto requera un apareamiento complementario entre una base prica (A o G, cada una de las cuales presenta dos anillos) de una de las cadenas y una base pirimidnica (T o C, cada una de las cuales presenta un solo anillo, por lo que es de menor tamao que una base prica) de la otra cadena (Figura 3-10). Tanto la evidencia obtenida a partir de los primeros experimentos bioqu micos com o las conclusiones derivadas de los modelos moleculares sugirieron que el apaream iento de bases com plem entarias (tambin llamado pares de ba ses de Watson y Crick) se formaran entre A y T por un lado y entre G y C por otro. Los anlisis bioqum icos de preparaciones de DNA de diferentes especies han demostrado que, a pesar de que la com posicin de nucletidos del DNA vara notablem ente (por ejemplo, desde un 13% a un 36% de residuos de A en el DNA de diferentes tipos de bacterias), se cumple una regla general que dice que, cuantitativamente, [G] = [C] y [A] = [T]. La construccin de modelos moleculares revel que el nmero de enlaces de hidrgeno efectivos que pueden formarse entre G y C o entre A y T era mayor que para otra combinacin cualquiera de es tas bases. As pues, el modelo de doble hlice para el DNA explicaba de forma elegante la bioqumica cuantitativa.

La estructura del DNA proporciona una explicacin del proceso de la herencia 11

Un gen contiene informacin biolgica en una forma que ha de ser copiada exactam ente y transmitida desde cada clula a todas sus clulas hijas. Las impli caciones del descubrimiento de la doble hlice del DNA fueron importantes, ya que la estructura sugiri inmediatamente cmo se efectuaba la transferencia de informacin. Puesto que cada hebra contiene una secuencia de nucletidos que es exactamente complementaria de la secuencia de nucletidos de la otra hebra, en realidad am bas hebras contienen la misma informacin gentica. Si llama mos a las dos hebras A y A, la hebra A puede servir de molde o patrn para pro ducir una nueva hebra A, mientras que de la misma forma la hebra A puede uti lizarse para producir una nueva hebra A. As, la informacin gentica puede ser copiada m ediante un proceso en el cual la hebra A se separa de la hebra A per mitiendo que cada una de am bas hebras sirva de patrn para la produccin de una nueva hebra complementaria. Como consecuencia directa del m ecanismo de apareamiento de bases, re sulta evidente que el DNA contiene informacin gracias a la secuencia lineal de

Figura 3-11 Secuencia del DNA del gen humano que codifica la p-globina. El gen codifica una de las dos subunidades de la molcula de la hemoglobina, que en todos los individuos adultos transporta el oxgeno por la sangre. Solamente se presenta la secuencia de una de las dos hebras del DNA (la cadena codificante"), ya que la otra tiene la secuencia complementaria. La secuencia debe leerse de izquierda a derecha y en lneas sucesivas de arriba a abajo de la pgina, como si se tratara de un texto normal en espaol.

CCCTGTGGAGCCACACCCTAGGGTTGGCCA ATCTACTCCCAGGAGCAGGGAGGGCAGGAG CCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAG CCATCTATTGCTTACATTTGCTTCTGACAC AACTGTGTTCACTAGCAACTCAAACAGACA CCATGGTGCACCTGACTCCTGAGGAGAAGT CTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGA ACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGG GCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGT TTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCATGTG GAGACAGAGAAGACTCTTGGGTTTCTGATA GGCACTGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTAT TTTCCCACCCTTAGGCTGCTGGTGGTCTAC CCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTT GGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATG GGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAG AAAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTG GCTCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTT GCCACACTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAG CTGCACGTGGATCCTGAGAACTTCAGGGTG AGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCC CCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCAT AGGAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACAGTTT AGAATGGGAAACAGACGAATGATTGCATCA GTGTGGAAGTCTCAGGATCGTTTTAGTTTC TTTTATTTGCTGTTCATAACAATTGTTTTC TTTTGTTTAATTCTTGCTTTCTTTTTTTTT CTTCTCCGCAATTTTTACTATTATACTTAA TGCCTTAACATTGTGTATAACAAAAGGAAA TATCTCTGAGATACATTAAGTAACTTAAAA AAAAACTTTACACAGTCTGCCTAGTACATT ACTATTTGGAATATATGTGTGCTTATTTGC ATATTCATAATCTCCCTACTTTATTTTCTT TTATTTTTAATTGATACATAATCATTATAC ATATTTATGGGTTAAAGTGTAATGTTTTAA TATGTGTACACATATTGACCAAATCAGGGT AATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCT TTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATC TTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTC T T TCAGGGCAATAATGATACAATGT ATCAT GCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAG TGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAAT ATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAA ATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTG CTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTC TGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTG GATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTT GCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCT CCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTG TGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATT CACCCCACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAA AGTGGTGGCTGGTGTGGCTAATGCCCTGGC CCACAAGTATCACTAAGCTCGCTTTCTTGC TGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTT CCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATA TTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTG CCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAA TGATGTATTTAAATTATTTCTGAATATTTT ACTAAAAAGGGAATGTGGGAGGTCAGTGCA TTTAAAACATAAAGAAATGATGAGCTGTTC AAACCTTGGGAAAATACACTATATCTTAAA CTCCATGAAAGAAGGTGAGGCTGCAACCAG CTAATGCACATTGGCAACAGCCCCTGATGC CTATGCCTTATTCATCCCTCAGAAAAGGAT TCTTGTAGAGGCTTGATTTGCAGGTTAAAG TTTTGCTATGCTGTATTTTACATTACTTAT TGTTTTAGCTGTCCTCATGAATGTCTTTTC

106

Captulo 3 : Macromolculas: estructura, forma e informacin

cadena patrn
5

cadena recin ' sintetizada

~o-p= o 1 o
H?C ~ 0~ P=0 1
O
Hy C

I 0

BASE

BASE

\A,
BASE
O

O o = p- o ^ ()

BASE
n

H 2

o o=p-o~

Figura 3 -1 2 Sntesis de DNA. La adicin de un desoxirribonucletido al extremo 3 de una cadena polinucleotdica es la reaccin fundamental a travs de la cual se sintetiza el DNA. Como se muestra en la figura, es el apareamiento de bases entre el ribonucletido que se aade y una hebra ya existente de DNA (la hebra patrn ) lo que condiciona que la nueva hebra de DNA tenga una secuencia de nucletidos complementaria.

3
O O0 ( 0

OH
BASE BASE
O

O - P - O - P - O - P - 0 - C H ,

1 O 1 O 1 1/ N
OH
1 T

o= p-o~ I o >
BASE

ki
0

desoxirribonuclesido trifosfato que entra

\ 0^ H 2
o = P -O "

BASE

sus nucletidos. Cada nucletido -A, C ,T o G - puede ser considerado como una letra de un alfabeto sencillo de cuatro letras que es utilizado para escribir los m ensajes biolgicos en forma lineal en una cinta de teleimpresora. Los orga nismos se diferencias entre s porque sus respectivas molculas de DNA poseen diferentes secuencias de nucletidos, y por consiguiente, diferentes mensajes biolgicos. Puesto que el nmero de posibles secuencias diferentes en una cadena de DNA de n nucletidos de largo es de 4n, la variedad biolgica que se puede gene rar utilizando una modesta longitud de DNA es, en principio, enorme. Una clu la animal tpica contiene un metro de DNA (3 x 109 nucletidos). Utilizando un abecedario lineal de cuatro letras, un gen humano extraordinariamente peque o puede llenar una cuarta parte de una pgina de texto (Figura 3-11), mientras que la informacin gentica existente en una clula humana permitira llenar un libro de ms de 500 000 pginas. Aunque el principio en el que se basa la replicacin gnica es elegante y simple, la maquinaria real con la que se realiza esta copia en la clula es com pli cada y est compuesta por un complejo de protenas que forman una mquina de replicacin. La reaccin fundamental es la indicada en la Figura 3-12, en la que la enzima DNA polimerasa cataliza la adicin de un desoxirribonucletido al extremo 3 de una cadena de DNA. Cada nucletido aadido a la cadena es, en realidad, un desoxirribonuclesido trifosfato; la libercin del pirofosfato de este nucletido activado y su hidrlisis posterior proporcionan la energa para la re accin de replicacin del DNA, convirtindola de forma efectiva en una reac cin irreversible.

cidos nucleicos

107

La replicacin de una hlice de DNA empieza por la separacin local de sus dos hebras de DNA complementarias. Cada hebra acta luego como patrn para la formacin de una nueva molcula de DNA, mediante la adicin secuencial de desoxirribonuclesidos trifosfato. El nucletido que debe ser aadido en cada caso se selecciona mediante un proceso durante el cual se forma un par de bases complem entarias con el nucletido siguiente de la hebra patrn madre, gene rndose as una hebra hija de DNA que tiene una secuencia complementaria a la de la hebra patrn (Figura 3-12). La informacin gentica se duplica en su totali dad -e s decir, se llegan a formar dos dobles hlices completas de DNA, cada una de las cuales es idntica en cuanto a secuencia de nucletidos a la hlice de DNA madre que sirvi de patrn. Puesto que al acabar el proceso, cada molcula de DNA hija est formada por una cadena original y otra recin sintetizada, se dice que el mecanismo de replicacin es semiconservativo (Figura 3-13).

doble hlice parterna de DNA

A
i i
a

REPLICACION

i i

Los errores en el proceso de replicacin del DNA generan m utaciones 12

Una de las caractersticas ms impresionantes de la replicacin del DNA es su exactitud. Se utilizan diversos mecanismos correctores de galeradas para eli minar nucletidos situados incorrectamente; como consecuencia de ello, la se cuencia de nucletidos de una molcula de DNA se copia con menos de un error por cada 109 nucletidos aadidos. Sin embargo, de vez en cuando la maquina ria de la replicacin salta o aade algunos nucletidos, o coloca una T donde de bera existir una C, o una A en lugar de una G. Cada uno de los cambios de este tipo en la secuencia de DNA constituye un error gentico llamado m utacin, que ser copiado en todas las generaciones futuras de clulas, ya que las secuen cias de DNA equivocadas se copian tan fielmente como las correctas". La consecuencia de un error de este tipo puede ser muy importante, ya que un solo cambio de un nucletido puede tener grandes efectos sobre la clula, depen diendo del lugar donde haya ocurrido la mutacin. A principios de los aos 1940, los genetistas demostraron de forma conclu yente que los genes especifican la estructura de las protenas. Por eso, una muta cin en un gen causada por una alteracin en la secuencia de su DNA puede acarrear la inactivacin de una protena y no producir ningn efecto, por lo que se le llama mutacin silenciosa . Muy raramente, una mutacin origina un gen con una funcin til, mejorada o nueva. En este caso los organismos portadores de la m utacin tendrn una ventaja, y a travs de la seleccin natural el gen mutado puede llegar a substituir con el tiempo al gen original de la poblacin.

x1
'

REPLICACION

lili
^

REPLICACIN
rx

hlices de DNA hijas

Figura 3-13 La replicacin semiconservativa del DNA. En cada ciclo de replicacin, cada una de las dos hebras de DNA son utilizadas como patrn para la formacin de una hebra com plementaria de DNA. Por consiguiente, las hebras originales permanecen inalteradas a lo largo de muchas generaciones celulares.

La secuencia de nucletidos de un gen determ ina la secuencia de aminocidos de una protena 13

El DNA es relativamente inerte qumicamente. La informacin que contiene se expresa indirectamente a travs de otras molculas: el DNA dirige la sntesis de RNA especficos y de molculas de proteina que, a su vez, determinan las pro piedades fsicas y qumicas de la clula. Aproximadamente al mismo tiempo en que los biofsicos analizaban la es tructura tridimensional del DNA por difraccin de rayos X, los bioqumicos estu diaban intensam ente la estructura qumica de las protenas. Se saba ya que las protenas son cadenas de aminocidos unidos por enlaces peptdicos secuenciales, pero todava no se conoca con certeza que cada tipo de protenas consiste en una secuencia caracterstica de aminocidos; pero a principios de los aos 1950, cuando se lleg a conocer la secuencia de la pequea protena insulina (Figura 3-14), se descubri que cada tipo de protena consiste en una secuencia de aminocidos tpica. Al igual que el conocim iento de la estructura del DNA ejerci una influencia crucial sobre la com posicin de la base molecular de la gentica y de la herencia, la determinacin de la secuencia de la insulina consti tuy la clave para comprender la estructura y la funcin de las protenas. Si la in108 Captulo 3 : Macromolculas: estructura, forma e informacin

C adena A

g _______________

G - I -V-E - Q - C - C - A - S - V - C - S - L -Y-Q-L - E-N -Y -C -N

Cadena B S

P-V-N-Q -H-L-C-G -S-H-L-V-E-A-L-Y-L-V-C-G -E-R-G -F-F-Y-T-P-K-A

sulina tena una secuencia definida, genticamente determinada, lo ms proba ble era que tam bin la tuvieran las dems protenas. Adems, pareca razonable suponer que las propiedades de una protena dependeran del orden exacto en el que se hallaran dispuestos sus aminocidos constituyentes. Tanto el DNA como las protenas estn compuestos por una secuencia lineal de subunidades, y el anlisis bioqumico de las protenas producidas por genes mutantes demostr que las dos secuencias son co-lineales -e s decir, los nucletidos del DNA estn dispuestos en un orden que coresponde al orden de los ami nocidos en la protena que especifican. Result evidente que la secuencia del DNA contiene una especificacin codificada de la secuencia proteica. La pre gunta central de la biologa molecular pas a ser entonces cmo una clula tra duce una secuencia de nucletidos del DNA a una secuencia de aminocidos de una protena.

Figura 3-14 Secuencia de aminocidos de la insulina bovina. La insulina es una protena muy pequea formada por dos cadenas polipeptdicas, una de 21 y la otra de 30 residuos de aminocidos. Cada cadena presenta una secuencia de aminocidos caracterstica determinada genticamente. Los smbolos de una letra utilizados para nombrar los aminocidos son los que se indican en el Panel 2-5, pgs. 58-59; los enlaces S-S indicados en rojo son enlaces disulfuro entre residuos de cisterna. Inicialmente la protena se sintetiza como una nica larga cadena polipeptdica (codificada por un nico gen), la cual se divide posteriormente formando las dos cadenas.

Porciones de la secuencia de DNA se copian en molculas de RNA para guiar la sntesis de protenas 14
La sntesis de una protena implica copiar regiones especficas del DNA (los ge nes) en otro tipo de polinucletido qumica y funcionalmente diferente, conoci do com o cido ribonucleico o RNA. Al igual que el DNA, el RNA est compuesto por una secuencia lineal de nucletidos, pero presenta dos pequeas diferencias qumicas respecto al DNA: (1) el esqueleto de azcar fosfato del RNA contiene ribosa en lugar de desoxirribosa, y (2) la base timina (T) est substituida por uracilo (U), una base muy estrecham ente relacionada que tam bin se aparea con A (vase Panel 3-2, pgs. 104-105). El RNA contiene toda la informacin de la secuencia de DNA de la que ha sido copiado y mantiene las propiedades del DNA de apareamiento de bases. Las molculas de RNA se sintetizan a travs de un proceso conocido como transcripcin del DNA, que en muchos aspectos se parece al de la replicacin del DNA, ya que una de las dos hebras del DNA acta como patrn sobre el que se examinan las posibilidades de apareamiento de bases de los ribonucletidos. Cuando se consigue un buen ajuste con el DNA patrn, el ribonucletido es in corporado como una unidad ligada covalentemente. De esta forma, la cadena de RNA que est creciendo lo hace nucletido a nucletido. La transcripcin del DNA se diferencia de la replicacin el DNA en varios puntos importantes. Por ejemplo, el RNA producido no permanece asociado al DNA. Inmediatamente detrs de la regin en la que se aaden los ribonucleti dos, la hlice original del DNA se forma de nuevo y la molcula de RNA se sepa ra. Por consiguiente, las molculas de RNA tienen una sola hebra. Adems, las molculas de RNA son relativamente cortas en comparacin con las de DNA, ya que son copiadas a partir de una regin limitada del DNA -suficiente para pro ducir una o varias protenas (Figura 3-15). A los transcritos de RNA que dirigen la sntesis de molculas de protena, se les llama molculas de RNA mensajero (mRNA). Otros transcritos de RNA actan como RNA de transferencia (tRNA) o bien forman los componentes del RNA ribosmico (rRNA) o partculas ribonucleoproteicas ms pequeas. La cantidad de RNA sintetizado a partir de una regin determinada de DNA est controlada por protenas reguladoras de la actividad gnica, que se unen a lugares especficos del DNA cerca de las secuencias codificantes de un gen. En cualquier clula y en cualquier momento dado, algunos genes se estn Utilizan-

cidos nucleicos

109

PROCARIOTAS
citoplasm a

Figura 3-15 La transferencia de informacin desde el DNA hasta la protena. La transferencia tiene lugar a

intrn exn TRANSCRIPCIN

m aduracin p o r corte y em palm e del RNA

TRADUCCIN proteina

travs de un intermediario de RNA llamado RNA mensajero (mRNA). En las clulas procariotas el proceso es ms simple que en las clulas eucariotas. En eucariotas, las regiones codificantes del DNA (situadas en los exones, dibujados en color) estn separadas por regiones no codificantes (llamadas intrones}. Tal como se indica en la figura, estos intrones pueden eliminarse a travs de una reaccin, catalizada por enzimas, de maduracin por corte y empalme (spiicing) del RNA, formando as una molcula de mRNA.

do para sintetizar RNA en grandes cantidades mientras que otros genes no se transcriben en absoluto. En cada generacin celular, a partir de un gen activo pueden sintetizarse centenares de transcritos de RNA a partir del mismo seg mento de DNA. Cada molcula de mRNA puede ser traducida dando lugar a mu chos centenares de copias de una cadena polipeptdica, por lo que la informa cin contenida en una pequea regin del DNA puede dirigir la sntesis de millones de copias de una protena determinada. La protena fibroma, por ejem plo, es el com ponente mayoritario de la seda. En cada clula de la glndula de la seda, un solo gen de fibrona genera 104 copias de mRNA, cada una de las cuales dirige la sntesis de 105 molculas de fibrona -producindose un total de 109 molculas de fibrona en slo 4 das.

Las molculas de RNA de eucariotas son cortadas y recombinadas, elim inndose secuencias intrn 15
En las clulas bacterianas la mayora de las protenas estn codificadas por una nica secuencia de DNA, larga e ininterrumpida, que se copia sin ninguna alte racin o modificacin previa, produciendo una molcula de mRNA. En 1977, los bilogos moleculares quedaron asombrados ante el descubrimiento de que la mayora de los genes eucariotas presentan sus secuencias codificantes (llamadas exones) interrumpidas por secuencias no codificantes (llamadas intrones). Para producir una protena, primero se transcribe todo el gen, incluyendo tanto sus intrones como sus exones y generando una molcula de mRNA muy larga -e l transcrito primario. Antes de que esta molcula de RNA abandone el ncleo, un complejo de enzimas procesadoras de RNA elimina todas las secuencias de in trones produciendo as una molcula de RNA mucho ms corta. Despus de que esta maduracin del RNA, llamada m aduracin por corte y empalme del RNA (RNA spiicing) haya concluido, la molcula de RNA se desplaza hasta el citoplas ma constituyendo ahora una molcula de mRNA que dirige la sntesis de una molcula de una protena determinada (Figura 3-15). Este sistema de transferencia de informacin en eucariotas, aparentemente ruinoso, se ha desarrollado probablemente debido a que supone que la sntesis de protena es mucho ms verstil. El transcrito primario de RNA de algunos ge nes, por ejemplo, puede madurar por corte y empalme de diferentes formas, produciendo diferentes mRNA dependiendo del tipo de clula y del estadio de desarrollo. Esto permite sintetizar diferentes protenas a partir del mismo gen. Adems, como la presencia de numerosos intrones facilita los procesos de re-

110

Captulo 3 : Macromolculas: estructura, forma e informacin

.a posicin (extrem o 5')

1

iP i
i i i. J
m % m B Lm L

u
Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu lie lie lie Met Val Val Val Val

c
2

.a posicin

A
Tyr Tyr STOP STOP His His Gln Gln Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu

G
Cys Cys STOP Trp Arg Arg Arg Arg Ser Ser Arg Arg Gly Gly Gly Gly

3.a posicin (extrem o 3')

Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Pro Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala

U C A G

U C A G

Figura 3-1 6 El cdigo gentico. En el transcurso de la sntesis proteica, los grupos de tres nucletidos (c od on es ) de una molcula de mRNA son traducidos a aminocidos de acuerdo con las reglas indicadas aqu. Los codones GUG y GAG, por ejemplo, se traducen a valina y a cido glutmico respectivamente. Obsrvese que los codones que presentan U o C como segundo nucletido tienden a codificar los aminocidos ms hidrofbicos (comprese con el Panel 2-5, pgs. 58-59).

U C A G

U C A G

com binacin gentica entre exones, probablemente este tipo de disposicin gnica ha sido extraordinariamente importante en los albores de la historia de la evolucin de los genes -acelerando los procesos por medio de los cuales los or ganismos desarrollaron nuevas protenas a partir de partes de otras ya existen tes, en lugar de tener que desarrollar completamente nuevas secuencias.

Las secuencias de nucletidos del mRNA son ledas en grupos de tres y traducidas a am inocidos 16
Las reglas a travs de las que se traduce la secuencia nucleotdica a secuencia de aminocidos de una protena, el denominado cdigo gentico, fueron descifra das a principios de los aos 1960. Se demostr que la secuencia de nucletidos de la molcula de mRNA que acta como intermediario, era leda en orden con secutivo, en grupos de tres. Cada triplete de nucletidos, denominado un codn, determina un aminocido. Puesto que el RNA es un polmero lineal de cuatro nucletidos diferentes, existen 43 = 64 tripletes de codn posibles (recurdese que lo importante es la secuencia de nucletidos de un triplete). Habitualmente en las protenas tan slo se encuentran 20 aminocidos diferentes de modo que la mayora de aminocidos deben ser especificados por varios codones; es decir, el cdigo gentico es degenerado. El cdigo (ilustrado en la Figura 3-16) ha sido altamente conservado a travs de la evolucin: con pocas excepciones, es igual en organismos tan diversos como las bacterias, las plantas y el hombre. En principio, cada secuencia de RNA puede ser leda siguiendo una de las tres posibles pautas de lectura diferentes que pueden darse segn el lugar en que empiece el proceso de decodificacin (Figura 3-17). En casi todos los casos ni cam ente una de estas pautas de lectura producir una protena funcional. Pues to que no existen signos de puntuacin salvo al principio y al final del mensaje de RNA, la pauta de lectura se establece en el inicio del proceso de traduccin y se mantiene a partir de entonces.

1C U C II A G C I I G U U II ACC i i A U -LeuSer-V al-T hr -

C J p vA y G C G : L U y . A,. . C C A
Ser-A la-LeuPro-

CU 1 1 CA G 1 1 C G U i i U AC i i C A U GlnA rg-T yrHis-

Las molculas de tRNA em parejan los aminocidos con los grupos de nucletidos 17
Los codones de una molcula de mRNA no reconocen directamente los am ino cidos que especifican, como hacen las enzimas con su substrato. La traduccin de un mRNA a protena depende de una molcula adaptadora que reconoce

Figura 3 -17 Las tres pautas de lectura posibles en la sntesis proteica. En el proceso de traduccin de una secuencia de nucletidos (azul) en una secuencia de aminocidos (verde), la secuencia de nucletidos de un mRNA es leda desde el extremo 5 hacia el extremo 3 , en grupos consecutivos de 3 nucletidos. Por consiguiente, segn cual sea la pauta de lectura utilizada, cada secuencia de RNA puede codificar, en principio, tres secuencias de aminocidos com pletam ente diferentes entre s.

cidos nucleicos

111

unin del am inocido 54-58 55-18 56-19

nucletido 1

nucletido 76 (extrem o 3' con un am inocido unido)

48-15 8-14 22-46 23-9 45-10 44-26

interacciones poco habituales entre bases (B) anticodn

un aminocido y un grupo de tres nucletidos. Estos adaptadores son un grupo de pequeas molculas de RNA conocidas com o RNA de transferencia (tRNA), cada una de las cuales tiene una longitud de unos 80 nucletidos. Una molcula de tRNA presenta una conformacin tridimensional plegada, que se mantiene en parte por interacciones no covalentes de apareamientos de bases como las que mantienen unidas las dos hebras de la hlice de DNA. Sin embargo, en la molcula de tRNA, que es de una sola hebra, los pares de bases complementarios se forman entre residuos de nucletidos de la misma cadena, la cual hace que la molcula de tRNA se pliegue de una forma caracterstica, que es importante para su funcin de adaptador. Cuatro cortos segmentos de la m o lcula presentan una estructura en doble hlice, dando lugar a una molcula que parece un cruce en trbol en dos dimensiones. Este cruce en trbol est ms plegado formando una conformacin en forma de L que se mantiene por interacciones de enlaces de hidrgeno ms complejas (Figura 3-18). En cada ex tremo de la "L existen dos grupos de residuos de nucletidos desapareados, que son especialmente importantes para la funcin de la molcula de tRNA en la sntesis de protenas: uno de los grupos forma el anticodn, cuyas bases pueden aparearse con las de un triplete complementario de una molcula de mRNA (el codn), mientras que la secuencia CCA del extremo 3' de la molcula de tRNA est unido de forma covalente a una secuencia de aminocidos (Figura 3-18A).

El m ensaje de RNA se lee de un extremo al otro por un ribosom a 18

El proceso de reconocim iento de los codones, que transfiere la informacin ge ntica del mRNA va tRNA a la protena, depende de interacciones entre pares de bases del mismo tipo de las que median la transferencia de informacin genti ca del DNA al DNA y del DNA al RNA (Figura 3-19). Sin embargo, la m ecnica de ordenacin de las molculas de tRNA sobre el mRNA es complicada y requiere de la presencia de un ribosoma, que es un com plejo de ms de 50 protenas di ferentes asociadas a varias molculas de RNA estructura] (rRNA). Cada ribosoma es una gran mquina sintetizadora de protenas en la que las molculas de tRNA se colocan por s mismas para leer el mensaje gentico codificado en la secuen cia de las molculas de mRNA. El ribosoma encuentra primero un punto espec fico de inicio en la molcula de mRNA, que establece la pauta de lectura y deter mina el extremo amino terminal de la protena. Luego, a medida que el ribosoma se desplaza a lo largo de la molcula de mRNA, va traduciendo, codn a codn, la secuencia de nucletidos a secuencia de aminocidos, utilizando

Figura 3 -18 tRNA p ara la fenilalanina en levadura. (A) La m olcula est dibujada adoptando una conform acin de cruce en trbol para destacar los pares de bases complementarios (ba rra s grises cortas ) que se forman en regiones helicoidales internas de la molcula. (B) Se muestra en forma de esquema la conform acin real de la molcula, basada en anlisis por difraccin de rayos X. Los pares de bases com plementarios se indican como b a rra s grises largas. Adems, en rojo se presentan los nucletidos que participan en interacciones no habituales de apareamiento de bases y que mantienen unidas diferentes zonas de la molcula. Estas parejas estn numeradas y conectadas por ln eas d e co lor rojo tanto en (A) como en (B). En (B) los pares de bases estn numerados. (C) Una de las interacciones de apareamiento de bases poco habituales. Aqu, una base interacciona a travs de enlaces de hidrgeno con otras dos; algunas de estas triples bases colaboran para mantener plegada esta molcula de tRNA.

112

Captulo 3 : Macromolculas: estructura, forma e informacin

iC lC lA uuuuuuuuuuuuuuu T C G C T A A A G C G T G G A

_____________________________________________ mRNA
U U U U U U U U U U U U LJ u u

CCAUCGCUAAAG_CG__UGGA

G G T A G

G C A C C T DNA

o'" m U U U m x ,

G A T T T C U A A A

v p JK

3'
cadena de mRNA en crecim iento

(A)

(B)

am ino

cadena polipeptdica en crecim iento

tRNA entrante, extrem , , ..o cargado ;arboxilo . , con un am inocido

molculas de tRNA para aadir aminocidos al extremo por el que la cadena polipeptdica est creciendo (Figura 3-20). Cuando un ribosoma llega ai final del mensaje, tanto l com o el extremo carboxilo terminal de la protena recin sinte tizada se liberan del extremo 3 de la molcula de mRNA y quedan libres en el ci toplasma. Los ribosomas actan con una eficiencia notable: en 1 segundo, un solo ri bosom a bacteriano aade aproximadamente unos 20 aminocidos a una cadena polipeptdica en formacin. En el Captulo 6 se ofrecen ms detalles sobre la es tructura de los ribosomas y sobre el mecanismo de la sntesis proteica.

Algunas m olculas de RNA actan como catalizadores 19

Tradicionalmente se ha considerado que las molculas de RNA son simples cade nas de nucletidos, con una qumica relativamente poco interesante. En 1981, esta concepcin qued destrozada por el descubrimiento de una molcula de RNA con actividad cataltica, con un tipo de reactividad qumica tan sofisticada como la que los bioqumicos haban asociado exclusivamente a las protenas. Las molculas de RNA ribosmico de los protozoos ciliados Tetrahymena se sinteti zan inicialmente como un largo precursor, a partir del cual se sintetiza uno de los rRNA por una reaccin de corte y empalme (splicing) del RNA. La sorpresa surgi ante el descubrimiento de que esta reaccin de corte y empalme poda desarro llarse in vitro en ausencia de protenas. Por consiguiente, se demostr que la se cuencia intrn presenta una actividad cataltica, semejante a la de una enzima que lleva a cabo la reaccin de dos etapas que se ilustra en la Figura 3-21. A conti nuacin, se sintetiz en un tubo de ensayo la secuencia de 400 nucletidos de

Figura 3-19 Flujo de informacin en la sntesis proteica. (A) Los nucletidos de la molcula de mRNA se unen formando una copia complementaria de un segmento de una hebra de DNA. (B) Luego, estos nucletidos, en grupos de tres, se unen a conjuntos complementarios de tres nucletidos de la regin anticodn de determinadas molculas de tRNA. En el otro extremo de cada tipo de las molculas de tRNA, un aminocido determinado se mantiene unido a travs de un enlace de alta energa, y cuando se produce el apareamiento, este aminocido es aadido al extremo en crecimiento de la cadena proteica. As, la traduccin de la secuencia de nucletidos del mRNA a una secuencia de aminocidos depende del aparamiento de bases complementarias entre un codn del mRNA y el anticodn correspondiente del tRNA. Por consiguiente, la base molecular de la transferencia de informacin en la traduccin es muy similar a la de la replicacin y a la de la transcripcin del DNA. Ntese que tanto la sntesis como la traduccin del mRNA se inician en el extremo 5 .

subunidades ribosm icas separadas ribosom a extrem o 5 mRNA extrem o 3' stop

p o iip ptid o en crecim iento

Figura 3 -20 Sntesis de una proteia por ribosomas unidos a una molcula de mRNA. Los ribosomas se unen a una seal de iniciacin que se halla cercana al extremo 5 de la molcula de mRNA y luego se desplazan hacia el extremo 3\ sintetizando la protena a medida que avanzan. A menudo varios ribosomas se desplazan simultneamente sobre un mismo mRNA, de forma que cada uno de ellos fabrica una cadena polipeptdica independiente pero idntica a las otras; toda esta estructura recibe el nombre de polirribosom a.

cidos nucleicos

113

5 ': = =

: : : 3'

m olcula de RNA precursora

PASO 1

5 ': : :

: i= 3

interm ediario transitorio

Figura 3-21 Una molcula de RNA automadurativa. El diagrama muestra la reaccin de automaduracin en la que una secuencia intrn cataliza su propia escisin de una molcula de RNA ribosomal en T etrahym ena. Como se muestra en la figura, el proceso se inicia cuando un nucletido G se aade a la secuencia del intrn, y en esta reaccin se rompe la cadena de RNA; entonces, el nuevo extremo 3 de la cadena de RNA ataca al otro extremo del intrn, completndose la reaccin.

PASO 2 5, ___ _ZJ UCUUAAI

+

::I3'

m olcula de RNA madura

secuencia del intrn elim inada

longitud del intrn y se comprob que era capaz de plegarse formando una com pleja superficie y poda actuar como una enzima en reacciones con otras molcu las de RNA. Puede, por ejemplo, juntar dos substratos determinados -u n nucle tido de guanina y una cadena de RNA- y catalizar su unin covalente cortando la cadena de RNA en un lugar especfico (Figura 3-22). En esta reaccin tipo, de la cual el primer paso se presenta simulado en la Figura 3-21, la propia secuencia intrn acta de forma repetitiva cortando nu merosas cadenas de RNA. A pesar de que la maduracin del RNA por corte y em palme se realiza habitualmente por sistemas que no son autocatalticos (vase Captulo 8), en diferentes tipos de clulas, incluyendo hongos y bacterias, se han descrito RNA automadurativos con secuencias intrn relacionadas con la de Te-

productos RNA

Figura 3 -22 Una reaccin catalizada por la secuencia intrnica purificada de T etra h y m en a . En esta reaccin, que corresponde al primer paso de la Figura 3-21, tanto el substrato especfico -u na molcula de RNA- como un nucletido G se mantienen estrechamente unidos a la superficie de la molcula cataltica de RNA. Entonces el nucletido se une covalentemente a la molcula de RNA substrato rompindola en un lugar determinado. La liberacin de las dos cadenas de RNA resultantes deja libre la secuencia del intrn para posteriores ciclos de reaccin.

114

Captulo 3 : Macro molculas: estructura, forma e informacin

OCH,

N -form il met
H2 1

OH OH

n ll H OH 5' m imetiza un tRNA (rojo) unido al C-terminal de un polipptido en crecim iento {azul)

ENLACE PEPTDICO RECIN FORMADO +

trahymena. Este hecho sugiere que estas secuencias de RNA podran haber apa recido antes de que las lneas evolutivas de las clulas procariotas divergieran, hace 1,5 mil millones de aos. Recientem ente se han descubierto algunas otras familias de RNA catalticos. Por ejemplo, la mayora de los tRNA se sintetizan inicialmente como un RNA precursor ms largo, y se ha descrito una molcula de RNA que juega el papel cataltico principal en un complejo RNA-protena que reconoce estos precurso res y los corta en lugares especficos. Se conoce tambin una secuencia cataltica de RNA que desempea una funcin importante en el ciclo vital de numerosos viroides de plantas. Todava es ms destacable que ahora se sospecha que los ribosomas ejercen su funcin principalmente por catlisis basada en molculas de RNA, de forma que las protenas del ribosoma jugaran un papel de apoyo de los RNA ribosmicos (rRNA), que constituyen ms de la mitad de la masa del ri bosoma. El rRNA largo, por ejemplo, tiene una actividad peptidil transferasa que puede catalizar la formacin de nuevos enlaces peptdicos (Figura 3-23). Cmo le es posible a una molcula de RNA actuar como una enzima? El ejemplo del tRNA indica que las molculas de RNA pueden plegarse de formas al tamente especficas. En la Figura 3-24 se presenta una estructura tridimensional propuesta para el ncleo de la secuencia intrn automadurativa de Tetrahymena. Interacciones entre diferentes zonas de esta molcula de tRNA (anlogas a los poco habituales enlaces de hidrgeno en molculas de tRNA -vase Figura 3-18) son responsables de plegados posteriores que generan una compleja superficie

Figura 3-23 Una reaccin peptidil transferasa catalizada por una molcula de RNA ribosmico desproteinizada. La molcula de puromicina mimetiza un tRNA cargado con el aminocido tirosina y en las clulas acta com o un potente inhibidor de la sntesis de protenas aadindose al extremo en crecim iento de una cadena polipeptdica. En este modelo de reaccin el extremo de la cadena polipeptdica en crecim iento est mimetizado por un hexanucletido (en rojo, representando un tRNA) que est unido covalentemente a la N-formil metionina (que representa el polipptido). Una gran molcula de rRNA altamente purificada cataliza la adicin de puromizina a la N-formil metionina, formando un nuevo enlace peptdico y liberando el hexanucletido.

Figura 3-24 Visin tridimensional del ncleo cataltico de la secuencia intrnica de RNA ilustrada en las Figuras 3-21 y 3-22. (A) La molcula plegada, con las interacciones de enlaces de hidrgeno en rojo. Esta molcula, de unos 240 nucletidos, se presenta inmediatamente despus del corte inical del extremo 5 del intrn {am arillo). (B) Dibujo esquemtico de la molcula presentada en (A), en su forma desplegada. (Adaptado de L. Jaeger, E. W esthoff y F. Michel, J. Mol. Biol. 221: 1153-1164, 1991.)

cidos nucleicos

115

tridimensional con actividad cataltica. Una yuxtaposicin de tomos poco fre cuente puede estirar enlaces covalentes y, por lo tanto, conseguir que determina dos tomos de la cadena plegada del RNA sean extraordinariamente reactivos. Como se explica en el Captulo 1, el descubrimiento de las molculas de RNA con actividad cataltica ha cambiado profundamente nuestra visin de cmo aparecieron las primeras clulas.

Resumen

La informacin gentica se halla en la secuencia lineal de nucletidos del DNA. Cada molcula de DNA consiste en una doble hlice formada a partir de dos hebras complementarias de nucletidos, emparejadas mediante enlaces de hidrgeno entre los pares de bases G-C y A-T. La duplicacin ele la informacin gentica se produce mediante la polimerizacin de una nueva hebra complementaria de cada una de las dos hebras primitivas de la doble hlice, durante el proceso de replicacin del DNA. La expresin de la informacin gentica almacenada en el DNA comprende la traduccin de una secuencia lineal de nucletidos del DNA a una secuencia co-lineal de aminocidos de una protena. Un segmento acotado de DNA se copia primero en una hebra complementaria de RNA. Este transcrito primario es cortado y reempalmado (spliced) eliminndose las secuencias de intrortes y generando una molcula de mRNA. Finalmente, el mRNA es traducido a protena a travs de un complejo conjunto de reacciones que tienen lugar en un ribosoma. Los aminocidos utiliza dos para la sntesis proteica son unidos primero a una familia de molculas de tRNA, cada una de las cuales reconoce, mediante interacciones de apareamiento de bases complementarias, grupos determinados de tres nucletidos del mRNA. A continuacin, la secuencia de nucletidos del mRNA es leda de un extremo al otro en grupos de tres, de acuerdo con un cdigo gentico universal. Otras molculas de RNA actan en las clulas como agentes catalticos seme jantes a las enzimas. Estas molculas de RNA se pliegan generando una superficie que contiene nucletidos que han adquirido una reactividad extraordinaria. Uno de estos catalizadores es el rRNA grande del ribosoma, que cataliza la formacin de enlaces peptdicos durante la sntesis proteica. Estructura de las protenas20
Las clulas estn formadas en gran parte por protenas, que constituyen ms de la mitad del peso seco de la clula (Tabla 3-1). Las protenas determinan la forma y la estructura de la clula y tambin actan como los principales instrumentos de re conocimiento molecular y como catalizadores. A pesar de que es cierto que el DNA almacena la informacin para generar una clula entera, tiene poca influencia di recta sobre los procesos celulares. El gen de la hemoglobina, por ejemplo, no puede transportar oxgeno: sta es una propiedad de la protena especificada por el gen. Las molculas de DNA y de RNA son cadenas de nucletidos, qumicamente muy sem ejantes entre s. En cambio, las protenas estn formadas por un con junto de 20 aminocidos muy diferentes, cada uno de los cuales presenta una personalidad qumica distinta (vase Panel 2-5, pgs. 58-59). Esta variedad hace posible la enorm e versatilidad de las propiedades qumicas observada en las dis tintas protenas, y posiblem ente explica por qu durante la evolucin se han se leccionado las protenas en lugar de las molculas de RNA para catalizar la ma yora de las reacciones celulares.

La forma de una molcula proteica est determinada por la secuencia de sus am inocidos 21
Muchos de los enlaces de una larga cadena polipeptdica permiten la libre rota cin de los tomos que unen, lo cual confiere al esqueleto de la protena una gran flexibilidad. Por lo tanto, cualquier molcula proteica puede, en principio,

116

Captulo 3 : Macromolculas: estructura, forma e informacin

adoptar un nmero ilimitado de formas diferentes (conformaciones ). Sin em bar go, la mayora de las cadenas polipeptdicas se pliegan adoptando una sola con formacin particular. Esto es debido a que los esqueletos de los diferentes am i nocidos, a modo de cadenas laterales de la cadena principal, se asocian entre s y con el agua formando varios enlaces no covalentes dbiles (vase Panel 3-1, pgs. 96-97). Siempre que las cadenas laterales apropiadas se encuentren en po siciones cruciales en la cadena, se desarrollarn importantes fuerzas que hacen que una conformacin particular sea especialmente estable. La mayora de las protenas pueden plegarse espontneamente en su forma correcta. Debido al tratamiento con algunos disolventes, puede conseguirse que una protena se despliegue, o desnaturalice, obtenindose una cadena polipeptdica flexible que ha perdido su conformacin nativa. Normalmente cuando se retira el solvente desnaturalizante, la protena se pliega espontneam ente adop tando su conformacin original, lo cual indica que toda la informacin necesaria para determinar el plegamiento se halla contenida exclusivamente la secuencia de aminocidos. Uno de los factores ms importantes que condicionan el plegamiento de una protena es la distribucin de sus cadenas laterales polares y no polares. Las cadenas laterales hidrofbicas, muy abundantes, tienden a agruparse en el inte rior de la molcula, lo cual les permite evitar el contacto con el entorno acuoso (como las gotas de aceite se vuelven a unir despus de haber sido dispersadas m ecnicam ente en el agua). Por el contrario, las cadenas laterales polares tien den a disponerse cerca de la parte externa de la molcula proteica, donde pue den interactuar con el agua y con otras molculas polares (Figura 3-25). Puesto que los enlaces peptdicos tam bin son polares, tienden a interactuar entre s y con las cadenas laterales polares, para formar enlaces de hidrgeno (Figura 3-26); casi todos los residuos polares enterrados dentro de la protena estn apa reados de esta forma (Figura 3-27). As pues, los enlaces de hidrgeno desempe an un papel importante en mantener unidas diferentes regiones de la cadena polipeptdica de una molcula proteica plegada, y son de una importancia cru cial para muchas de las interacciones de enlace observadas en las superficies de las protenas.

polipptido desplegado cadenas laterales polares cadenas laterales no polares

*.
s ,

- m , , ...f u

f - t - r v

la regin central hidrofbica contiene las cadenas laterales no polares

las cadenas laterales polares, situadas en la superficie exterior de la m olcula, pueden form ar enlaces de hidrgeno

conform acin plegada en un am biente acuoso

Figura 3-25 Plegado de una protena adoptando una conform acin globular. Las cadenas laterales de los aminocidos polares tienden a situarse en el exterior de la protena, donde pueden interaccionar con el agua; las cadenas laterales de los aminocidos no polares quedan enterradas en el interior, formando un ncleo hidrofbico escondido del agua.

cido glutam nico

I ------1 ----------1 H O I I
CH2 CH2

-C N C C

O II

O I

-C C N C H

-cc N ('
H

-C
O
H

I
O - c c N C
H

OO

nc c r
H O

r
H
serina

h O Figura 3-26 Enlaces de hidrgeno. Algunos de los enlaces de hidrgeno (indicados en color) que se pueden formar entre los aminocidos de una protena. Los enlaces peptdicos se presentan sombreados en gris.

N C C N -

_______________I
enlace de hidrgeno entre tom os de dos enlaces peptdicos enlace de hidrgeno entre tom os de un enlace peptdico y una cadena lateral de un am inocido enlace de hidrgeno entre dos cadenas laterales de am inocido

Estructura de las protenas

117

Figura 3-27 Detalles de enlaces de hidrgeno en una protena. En esta regin de la enzima lisozima, se forman enlaces de hidrgeno entre dos cadenas laterales {azul}, entre una cadena lateral y un tomo de un enlace peptdico (a m a r illo ) o entre tomos de dos enlaces peptdicos {rojo). Para referencia, vase Figura 3-26. (Segn C.K. Mathews y K.E. van Holde, Biochemistry. Redwood City, CA: Benjamin/Cummings, 1990.)

Las protenas secretadas o las protenas de la superficie celular a menudo forman enlaces covalentes adicionales intracatenarios. De forma ms notable, la formacin de enlaces disulfuro (tambin denominados enlaces S-S) entre los dos grupos -SH de dos cistenas cercanas de una cadena polipeptdica plegada (Figura 3-28) a menudo sirven para estabilizar la estructura tridimensional de protenas extracelulares. Estos enlaces no son necesarios para el plegamiento es pecfico de las protenas ya que el plegamiento de las protenas normalmente tiene lugar en presencia de agentes reductores que impiden la formacin de en laces S-S. De hecho, muy raramente se forman enlaces S-S (si es que se forman alguna vez) en molculas proteicas que se hallen en el citosol, ya que la elevada concentracin de agentes reductores -SH en el citosol rompe estos enlaces. El resultado neto de todas las interacciones individuales entre aminocidos consiste en que la mayora de las molculas proteicas se pliegan espontneamente adoptando conformaciones caractersticas y definidas de forma precisa. Las que sofi compactas y globulares tienen un ncleo interno compuesto de grupos de ca denas laterales hidrofbicas -dispuestas siguiendo una ordenacin densa, casi cris talina- mientras que la superficie exterior, muy compleja e irregular, est formada por las cadenas laterales ms polares. La localizacin y las caractersticas qumicas de los diferentes tomos de esta intrincada superficie, hacen que cada protena sea nica y permiten a la molcula fijarse a otras superficies macromoleculares y a cier tas molculas pequeas (vase ms adelante). Desde los puntos de vista qumico y estructural, las protenas son las molculas conocidas ms sofisticadas.
Figura 3-28 Form acin de un enlace disulfuro. El dibujo ilustra la formacin de un enlace disulfuro (covalente) entre las cadenas laterales de residuos de cisterna vecinos, en una protena.

. . \ / cisterna r / \ N CH2 / H *S H

O. i % /
C 1 oxidantes

H N

X
C \

O. i \ /
C CH2

--------reductores

1
< ^\ /
.C CH,

/ Cx # \ / CH, O C H \ / cisterna

/ /
/

vy

2 H /

i /
/

118

Captulo 3 : Macromolculas: estructura, forma e informacin

Diferentes cadenas proteicas presentan esquemas de plegamiento iguales 22

Aunque toda la informacin necesaria para el plegamiento de una cadena pro teica se halla contenida en su secuencia de aminocidos, an no hemos apren dido a leer esta informacin y as poder predecir la estructura tridimensional detallada de una protena a partir de su secuencia. Por consiguiente, la confor macin plegada slo puede ser determinada mediante un elaborado anlisis por difraccin de rayos X de cristales de la protena, o si la protena es muy pequea por tcnicas de resonancia magntica nuclear (vase Captulo 4). Hasta ahora con estas tcnicas se han analizado completamente ms de 100 tipos de prote nas. Cada una de estas protenas tiene una conformacin especfica tan irregular y complicada que necesitaramos un captulo entero de este libro para describir todos los detalles tridimensionales de cada una de ellas. Al comparar las estructuras tridimensionales de diferentes molculas protei cas, se pone de manifiesto que, aunque la conformacin completa de cada prote na es nica, en diferentes regiones de estas macromolculas aparecen repetidos varios esquemas de plegamiento. Dos de estos esquemas son particularmente fre cuentes, porque resultan de las interacciones regulares por enlaces de hidrgeno entre los propios enlaces peptdicos ms que entre las cadenas laterales de algunos aminocidos. Ambos patrones de plegamiento fueron predichos correctamente en 1951 al estudiar los modelos basados en los diferentes esquemas de difraccin de rayos X de la seda y del cabello. Los dos patrones regulares de plegamiento descu biertos entonces reciben hoy el nombre de lmina p, que se presenta en la fibrona de la seda, y de hlice a, que se presenta en la protena a-queratina de la piel y de sus formaciones tales como el cabello, las uas y las plumas. El ncleo de la mayora (aunque no de todas) de las protenas globulares pre senta extensas regiones de lm ina p. En el ejemplo de la Figura 3-29, que mues tra parte de una molcula de anticuerpo, se forma una lmina (3 antiparalela

HOOC

( : .
~|

.3

nhs

2,5 nm

'\ \ %

A.:: a#

i0

-;> ,y . .. , . >j| ti /

am

cadena lateral de un am inocido-

nitrgeno

carbono /
V i

T
R S R m 4 C :
1

Q -

rv

R
;Sb x

k) ^
O -
^ R

^
%

R
^ r I

enlace de H
v .

IP

Figura 3-29 La lm ina B es una estructura frecuente form ada por zonas de cadenas polipeptdicas en las protenas globulares. En la parte superior se muestra un dominio de 115 aminocidos de una molcula de inmunoglobulina; consiste en una estructura en forma de sandwich de dos lminas (3, una de las cuales se presenta en color. En la parte inferior se muestra en detalle una lmina (3 antiparalela perfecta, siendo R las cadenas laterales de los aminocidos. Obsrvese que cada enlace peptdico est unido a travs de un enlace de hidrgeno a un enlace peptdico vecino. Las estructuras laminares reales de las protenas globulares suelen ser algo menos regulares que la lmina (5 dibujada aqu, y adems la mayora de lminas se hallan ligeramente deformadas (vase Figura 3-31).

R enlace peptdico R

... . hidrogeno

oxigeno

*
R

U --------------------------------------------------- 1,39 nm ---------------------------------------------- !

Estructura de las protenas

119

(A)

(B)

cuando una cadena polipeptdica extendida se pliega sobre s misma hacia ade lante y hacia atrs, de forma que cada seccin de la cadena queda orientada en direccin opuesta a la de las secciones inmediatas. Esto da lugar a una estructu ra muy rgida que se mantiene por enlaces de hidrgeno entre los enlaces peptdicos de las cadenas vecinas. A menudo tanto las lminas (3 antiparalelas como las lminas (3 paralelas, estrechamente relacionadas con las anteriores (forma das por regiones de cadenas polipeptdicas que estn orientadas en la misma di reccin), actan como una trama sobre la que se estructura la pro tena globular. Se genera una hlice a cuando una misma cadena polipeptdica gira regular mente sobre s misma dando lugar a un cilindro rgido en el que cada enlace peptdico est unido regularmente por enlaces de hidrgeno a otros enlaces peptdicos vecinos de la cadena. Muchas protenas globulares contienen breves regiones de estas hlices a (Figura 3-30). Las porciones de las protenas transmembrana que atraviesan la bicapa lipdica casi siempre son hlices a debido a las constric ciones impuestas por el ambiente lipdico hidrofbico (vase Captulo 10). Normalmente, una hlice a aislada no es estable por s sola en ambientes acuosos. Sin embargo, dos hlices a idnticas que presenten una disposicin re petitiva de cadenas laterales no polares se enrollan progresivamente una alrede dor de la otra formando una estructura especialmente estable denominada hli ce superenrollada (vase pg. 132). En muchas protenas fibrosas se presentan largas zonas de hlices superenrolladas semejantes a varillas, como en las fibras intracelulares de a-queratina que refuerzan la piel y sus apndices. En la Figura 3-31 se presentan modelos de espacio lleno de una hlice a y de una lmina (3, con y sin sus cadenas laterales.

Figura 3-30 Una hlice a es otra estructura frecuente form ada por zonas de la cadena polipeptdica de una protena. (A) La molcula de mioglobina, cuya funcin es transportar oxgeno, tiene 153 aminocidos de longitud y presenta una hlice a (dibujada en color). (B) Detalle de una hlice a perfecta. (C) Como en el caso de la lmina p, cada enlace peptdico est unido a un enlace peptdico vecino a travs de un enlace de hidrgeno. Obsrvese que para mayor claridad en (B) se han omitido tanto las cadenas laterales [que sobresalen radialmente a todo lo largo de la hlice y que en (C) se sealan como R] como los tomos de hidrgeno en el carbono a de cada aminocido (vase tambin Figura 3-31).

Las protenas son m olculas asom brosam ente verstiles 23

Debido a la variedad de las cadenas laterales de sus aminocidos, las protenas son notablemente verstiles en cuanto al tipo de estructuras que pueden formar. Veamos, por ejemplo, dos abundantes protenas segregadas por las clulas del tejido conjuntivo -la colgena y la elastina- ambas presentes en la matriz extracelular. En las molculas de colgena, tres cadenas polipeptdicas distintas ricas en el aminocido prolina y con un aminocido glicina de cada tres residuos, es tn enrolladas entre s generando una triple hlice regular. Estas molculas de

120

Captulo 3 : Macromolculas: estructura, forma e informacin

Figura 3-31 Modelos espaciales com pactos de una hlice a y de una lm ina (i con (derecha ) y sin (izquierda) las cadenas laterales de sus am inocidos. (A) Una hlice a (parte de la estructura de la mioglobina). (B) Una regin de lmina (3 (parte de la estructura de un dominio de una inmunoglobulina). En las fotografas de la izquierda, cada cadena lateral est representada por un nico tomo sombreado en negro (los grupos R de las Figuras 3-29 y 3-30), mientras que a la derecha se muestra la cadena lateral entera. (Por cortesa de Richard J. Feldmann.)

colgena estn, a su vez, empaquetadas formando fibrillas en las que las m ol culas de colgena adyacentes estn unidas por enlaces covalentes cruzados en tre los residuos vecinos de lisina, dando a las fibrillas una enorme resistencia a la tensin (Figura 3-32).
fibra elstica

triple hlice de colgena

EXTENSION

RELAJACION
molcula de elastina

Figura 3-32 Contraste entre la colgena y la elastina. (A) La colgena es una triple hlice formada por tres cadenas proteicas extendidas que se enroscan entre s. En el espacio extracelular muchas molculas de colgena, en forma de varilla, estn entrelazadas mediante enlaces cruzados formando fibrillas de colgena inextensibles (arriba) con una resistencia a la atraccin semejante a la del acero. (B) Las cadenas polipeptdicas de elastina estn unidas entre s mediante enlaces cruzados, formando fibras elsticas. Cuando la fibra es estirada, cada molcula de elastina se desenrolla adoptando una conformacin ms extendida. El notable contraste entre las propiedades fsicas de la elastina y las de la colgena radica por completo en que sus secuencias de aminocidos son diferentes.

Estructura de las protenas

121

La elastina es un caso que se encuentra en el extremo opuesto. Sus cadenas polipeptdicas, relativamente libres y desestructuradas, estn unidas por enlaces covalentes cruzados, generando una trama elstica parecida al caucho que per mite que tejidos tales como los de las arterias y de los pulmones se deformen y dilaten sin sufrir ningn dao. Tal como se ilustra en la Figura 3-32, la elastici dad es debida a la capacidad de las distintas molculas proteicas para desenro llarse de manera reversible cada vez que se les aplique una fuerza de tensin. Hay que destacar que la misma estructura qumica bsica -u n a cadena de am inocidos- pueda formar tantas estructuras diferentes: una trama elstica se m ejante al caucho (elastina), un cable inextensible con una resistencia a la ten sin sem ejante a la del acero (colgena) o cualquier otra de entre la amplia va riedad de superficies catalticas de las protenas globulares que actan como enzimas. La Figura 3-33 ilustra y compara la gama de formas que en principio podra adoptar una cadena polipeptdica de 300 aminocidos de longitud. Como ya hemos dicho, la conform acin adoptada realmente por una protena deter minada depende de su secuencia de aminocidos.

triple hlice de colgena de 29 nm de longitud

hlice a de 45 nm de largo

Las protenas presentan diferentes niveles de organizacin estructural 24

Al describir la estructura de una protena, resulta til distinguir varios niveles de organizacin. La secuencia de aminocidos se denomina estructura primara de la protena. Las interacciones regulares de enlaces de hidrgeno entre fragmentos contiguos de la cadena polipeptdica dan lugar a hlices a y a lminas (3, lo cual constituye la estructura secundara de la protena. Adems, ciertas com binacio nes de hlices a y lminas | 3 se empaquetan formando unidades globulares enla zadas de forma compacta, cada una de las cuales se denominan dominio protei co. Normalmente los dominios estn construidos a partir de una zona de una cadena polipeptdica de entre 50 y 350 aminocidos, y parece que son las unida des bsicas a partir de las cuales se construyen las protenas (vase ms adelan te). Mientras que las protenas ms pequeas pueden presentar un solo dominio, las protenas mayores presentan varios de ellos, normalmente conectados por ca denas polipeptdicas de longitud relativamente variable. Finalmente, los polipptidos individuales a menudo se asocian constituyendo subunidades de molculas mayores, a veces denominadas agregados moleculares o complejos proteicos, en los cuales las subunidades estn unidas entre s por un elevado nmero de dbi les interacciones no covalentes; en el caso de protenas extracelulares, a menudo estas interacciones estn estabilizadas por enlaces disulfuro. La estructura tridimensional de una protena puede representarse de dife rentes maneras. Consideremos la extraordinariamente pequea protena inhibi dora de la tripsina pancretica bsica (BPTI, de Basic Pancreatic Trypsin Inhibitor), que contiene 58 residuos de aminocido plegados en un solo dominio. La BPTI puede representarse como una imagen estereoscpica mostrando todos sus tomos a excepcin de los de hidrgeno (Figura 3-34A) o como un modelo molecular espacial en el que la mayora de los detalles no puedan observarse de forma muy clara (Figura 3-34B). Tam bin puede representarse de una forma ms esquemtica, omitiendo todas las cadenas laterales de los residuos de am i nocidos y todos los tomos reales, de forma que sea fcil de seguir el curso de la cadena polipeptdica principal (Figuras 3-34C, D y E). Una protena de tamao medio tiene alrededor de seis veces ms residuos de aminocidos que la BPTI, y muchas protenas son de un tamao ms de 20 veces mayor. Dibujos esquem ticos com o stos son fundamentales para representar la estructura de protenas grandes com o stas. En este libro se utilizarn de forma habitual. La Figura 3-35 muestra cmo se puede resolver la estructura de una gran pro tena en diferentes niveles de organizacin, construyendo cada nivel sobre el ante rior de una forma jerrquica. Estos niveles de complejidad organizativa creciente pueden corresponder a las etapas a travs de las que una protena acabada de sin tetizar se va plegando hasta alcanzar su estructura nativa dentro de la clula.

lm ina p de 7 x 7 x 0,8 nm

esfera de 4,3 nm de dim etro cadena extendida de - 1 0 0 nm de longitud

Figura 3-33 Algunas formas y tam aos que puede presentar una m olcula proteica tpica de 300 residuos de aminocidos de longitud. La estructura adoptada est determinada por la secuencia de aminocidos. (Adaptado de D.E. Metzler, Bioqumica. Barcelona: Ediciones Omega S.A., 1981.)

122

Captulo 3 : Macromolculas: estructura, forma e informacin

Figura 3-34 Protena inhibidora de la tripsina pancretica bsica (BPTI, de Basic Pancreatic Trypsin Inhibitor). Conformacin tridimensional de esta pequea protena, vista en 5 representaciones utilizadas habitualmente. (A) Representacin estereoscpica que muestra la posicin de todos los tomos excepto los de hidrgeno. La cadena principal se presenta en lneas gruesas y las cadenas laterales en lneas finas. (B) Modelo molecular mostrando el radio de van der Waals de todos los tomos (vase Panel 3-1, pgs. 96-97). (C) Modelo de esqueleto de alambre compuesto por lneas que conectan los carbonos a a lo largo del esqueleto polipeptdico. (D) Modelo de cinta que representa todas las regiones de interacciones regulares por enlaces de hidrgeno, en forma de hlices (hlices a) o como grupos de flechas (lminas (3), las cuales apuntan hacia el extremo carboxilo terminal de la cadena. (E) Modelo de tubo que muestra el curso de la cadena polipeptdica omitiendo cualquier detalle de ella. En los tres paneles de la parte inferior de la figura el m otiv o en h o rq u illa b eta se ha dibujado en verde. Tngase en cuenta que el ncleo de todas las protenas globulares est densamente empaquetado de tomos. Por lo tanto, la impresin de una estructura abierta producida por la observacin de los modelos (C), (D) y (E) es engaosa. (B y C por cortesa de Richard J. Feldmann; A y D por cortesa de Jane Richardson.)

123

lmina (3 subunidad proteica (monmero) estructura secundaria estructura terciaria molcula proteica (dmero) estructura cuaternaria

Los dominios estn formados por cadenas polipeptdicas que se pliegan adelante y atrs, generando delgadas circunvoluciones en la superficie de la protena 24
Un dominio proteico puede concebirse como la unidad estructural bsica de una estructura proteica. El ncleo de cada dominio est compuesto fundamen talm ente por un conjunto interconectado de lminas p, hlices a o de ambas co sas. Estas estructuras secundarias regulares estn favorecidas debido a que per miten la formacin de una gran cantidad de enlaces de hidrgeno entre los tomos del esqueleto de la protena, lo cual es esencial para estabilizar el inte rior del dominio, donde el agua no es asequible para formar enlaces de hidrge no con el oxgeno polar del carbonilo o con el hidrgeno de la amida del enlace peptdico. Existe un nmero limitado de maneras de combinar hlices a con lminas p para formar una estructura globular, por lo que determinadas com binaciones de estos elementos, denominadas motivos, se presentan repetidamente en el n cleo de muchas protenas no relacionadas entre s. Un ejemplo de ello lo consti tuye el motivo en horquilla beta encontrado en la BPTI (coloreado en verde en la Figura 3-34D). Consiste en dos cadenas p antiparalelas unidas por una fina vuel ta formada por un asa de la cadena polipeptdica. Otro ejemplo es eL motivo beta-alfa-beta, en el que dos cadenas P paralelas estn conectadas por un tramo de hlice a (Figura 3-36). En el Captulo 9 se com entan otros motivos comunes, como los diferentes motivos asociados a DNA encontrados en diversas familias de protenas reguladoras de genes. Varias com binaciones de motivos forman el dominio proteico, en el cual la cadena polipeptdica tiende a curvarse arriba y abajo a lo largo de toda la estruc tura, a veces formando una lmina P o una hlice a, y cambiando de direccin sbitamente dando una vuelta cerrada cuando llega a la superficie del dominio. Como resultado de ello, un dominio tpico es una estructura compacta, la super ficie de la cual est recubierta de asas protuberantes de cadenas polipeptdicas (Figura 3-37). Las regiones en asa, de longitud variable y superficie irregular, a menudo forman los lugares de unin para otras molculas. Debido a que las re giones en asa estn expuestas al agua, son ricas en aminocidos hidrofflicos, por lo que frecuentemente se pueden predecir sus posiciones a partir de un estudio detallado de la secuencia de aminocidos de la protena. 124 Captulo 3 : Macromolculas: estructura, forma e informacin

Figura 3-35 Tres niveles de organizacin de un a protena. La estructura tridimensional de una protena puede describirse en trminos de diferentes niveles de plegamiento, cada uno de los cuales se construye sobre el nivel precedente de una forma jerrquica. Aqu, estos niveles se ilustran utilizando la protena activadora de catabolito (CAP, de Catabolite Activator Protein), una protena reguladora de genes bacterianos que presenta dos dominios. Cuando el dominio mayor se une a AMP cclico provoca un cam bio de conform acin de la protena que permite al dominio menor unirse a una secuencia especfica de DNA. La secuencia de aminocidos se denomina estructura p rim a ria y el primer nivel de plegamiento estructura secu n daria. Tal com o se indica sombreado en am arillo, la com binacin de los niveles de plegamiento segundo y tercero mostrados aqu, se denomina habitualm ente estructura terciaria y el cuarto nivel (la unin de subunidades) estructura cu atern aria de una protena. (Modificado de un dibujo de Jane Richardson.)

De entre la gran cantidad de cadenas polipeptdicas posibles, nicam ente un nmero relativamente pequeo de ellas llegara a ser til
Puesto que cada uno de los 20 aminocidos es qumicamente distinto y cada uno de ellos puede, en principio, presentarse en cualquier posicin de una cadena proteica, existen 20 x 20 x 20 x 20 =160 000 posibles cadenas polipeptdi cas diferentes de 4 aminocidos de longitud o, anlogamente, 20" posibles cade nas polipeptdicas diferentes de n aminocidos de longitud. As, se podran pro ducir ms de 10390 protenas diferentes de una longitud de 300 aminocidos, es decir, de un tamao normal. Sabemos sin embargo que nicamente un pequeo nmero de estas posi bles protenas adoptara una conformacin tridimensional estable. La gran m a yora de cadenas tendra un gran nmero de conform aciones diferentes de energa aproximadamente igual, cada una de ellas con propiedades qumicas distintas. Estas protenas con propiedades tan variables no seran tiles, y por consiguiente, seran eliminadas por la seleccin natural durante el transcurso de la evolucin. Las protenas actuales tienen una estructura y unas propiedades qumicas sorprendentemente sofisticadas debido a sus propiedades nicas de plegado. No slo sucede que la secuencia de aminocidos es tal que condiciona que slo resulte extremadamente estable una sola de las conformaciones posi bles, sino que adems esta conformacin tiene la forma y las propiedades qu micas adecuadas para permitir que la protena realice una funcin cataltica o estructural determinada en la clula. Las protenas estn construidas de una m a nera tan precisa que el cambio de tan slo unos cuantos tomos de un am ino cido puede trastornar toda la estructura y provocar una alteracin catastrfica de la funcin de la protena.

Figura 3 -36 Ejemplo de un motivo proteico habitual. En el motivo betaalfa-beta, dos cadenas paralelas adyacentes que forman una lmina P estn conectadas a travs de una hlice a. Como en el caso del motivo de horquilla beta, destacado en la Figura 3-34, este motivo se halla en muchas protenas diferentes.

Normalmente las nuevas protenas se desarrollan por alteraciones m enores de protenas antiguas 25
Las clulas disponen de mecanismos genticos que permiten que durante la evolucin los genes se dupliquen, se modifiquen y se recombinen. Por consi guiente, una vez se ha desarrollado una protena con propiedades de superficie tiles, su estructura bsica puede ser incorporada a muchas otras protenas. A menudo, las protenas de funcin relacionada aunque diferente, de organismos

fk

i ' -" '"

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C %

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m
^

(A)

(B)

Figura 3-37 Modelos de cinta de la estructura tridimensional de algunos dominios de protenas organizados de forma diferente. (A) Citocromo b ^ , una protena de dominio nico compuesto casi completamente por hlices a. (B) Dominio que une NAD+de la lctico deshidrogenasa, compuesto por una combinacin de hlices a y de lminas (3. (C) Dominio variable de una cadena ligera de una inmunoglobulina, compuesto por un sandwich de dos lminas p. En estos tres ejemplos las hlices a se presentan en verde mientras que las cadenas organizadas en lminas P se sealan como flech a s rojas. Ntese que generalmente la cadena polipeptdica cruza hacia adelante y hacia atrs a travs de todo el dominio, adoptando curvas cerradas solamente en la superficie de la protena. A menudo las regiones en asa (am arillo) constituyen los lugares de unin de otras molculas. (Dibujos por cortesa de Jane Richardson.)

Estructura de las protenas

125

(A)
QUIMOTRIPSINA --------------------E LASTASA ---------------------

149 186 - A N TP O R LQ Q A S LP LLS N TN C K K - -Y W G T K IK D A M I C A G A S -G Q LA Q TLQ Q A Y LP TV D Y A I C SSSSYW GSTVKNSM VC AG G D G

II II II

III

I III

G V S S C M G D S G G P LVC K KN G A W T L V G I V S W GSS -T C S T S -T P G V Y A R V T A L V N W V Q Q T LA A N V R S G C Q G D S G G P L H C L V N G Q Y A V H G V T S F V S R LG CNVTRKPT V FTR VSAY I S W I N N V I A S N 187 ^ 245 (B) A = C = D = E = F =

Aia Cys Asp Gi Phe = = = = alanina cisteina cido aspartico cido glutm ico feniialanina

I I III I III I I I

I I

II I

G H K L
i

=Giy = giicina = Hs = histidna = He = isoleucna = Lys = lisina = Leu = leucina

= = = = =

M et Asn Pro Gin Arg

= = = = =

m etionna asparagina proiina giutam ina arginina

= = V = W = Y =

S T

Ser Thr Val Trp Tyr

= serina = treoRna = vaiina = trip t fa n o = tirosina

actuales, tienen secuencias de aminocidos similares. Se ha credo que estas fa milias de protenas evolucionaron a partir de un gen ancestral nico que duran te el transcurso de la evolucin se duplic dando lugar a otros genes en los que gradualmente se fueron acumulando diferentes mutaciones, generndose as protenas con funciones nuevas. Consideremos la familia de las enzimas que degradan protenas (enzimas proteolticas) denominadas serina proteasas, que incluye a las enzimas digesti vas quimotripsina, tripsina y elastasa y algunas de las proteasas de la cascada enzimtica de la coagulacin de la sangre y de la fijacin del complemento. Al comparar dos de estas protenas se observa que alrededor de un 40% de las posi ciones de sus secuencias estn ocupadas por el mismo aminocido (vase Figu ra 3-38). La semejanza de sus conform aciones tridimensionales, determinadas mediante cristalografa de rayos X, es an ms notable: la mayor parte de los complicados giros y vueltas de sus cadenas polipeptdicas, de varios cientos de aminocidos, son idnticos (Figura 3-39). El caso de las serina proteasas se repite en centenares de otros casos de fa milias proteicas. En muchos casos, la secuencias de aminocidos han divergido mucho ms que en el caso de las serina proteasas, de forma que no podemos es tar seguros de la relacin familiar entre dos protenas sin determinar sus estruc turas tridimensionales. Por ejemplo, las protenas a 2 de levadura y la protena

Figura 3-38 (A) Comparacin de las secuencias de aminocidos de dos miembros de la familia de enzimas serina proteasas. Se muestran las zonas carboxilo terminales (aminocidos 149 a 245) de las dos protenas. Los aminocidos idnticos se presentan conectados por barras de color y se destaca el residuo de serina del lugar activo de la enzima (posicin 195). En las secciones de la cadena polipeptdica encerradas en cajas a m arillas, cada aminocido ocupa una posicin espacial altamente equivalente en la estructura tridimensional de las dos enzimas (vase Figura 3-39). (B) Los cdigos estndar de una letra y de tres letras que se utilizan para designar los aminocidos. (Modificado de J. Greer, Proc. N a ti Acad. Sci. USA 77:33933397, 1980.)

HOOC HOOC
' V --V / / . 4 '

iw - ;, NHL

m..

fi

NH 2

ELASTASA (A)

QUIMOTRIPSINA (B)

Figura 3-39 Comparacin entre las conform aciones de las dos serina proteasas presentadas en la Figura 3-38. La elastasa se presenta en (A) y la quimotripsina en (B). A pesar de que ambas protenas solamente tienen iguales los aminocidos que se sealan en verde, sus conform aciones son muy similares. El lugar activo, sealado con Un crculo rojo, presenta un residuo activo de serina (vase Figura 3-57). La quimotripsina presenta ms de dos extremos de cadenas polipeptdicas ya que se forma por la rotura proteoltica del quimotripsingeno, un precursor inactivo.

126

Captulo 3 : Macromolculas: estructura, forma e informacin

(A)

(C)
H2N

levadura GHRFTKENVR LE S W FA KN IE N P YL D T KG L E N LM KNT SLSR IQ I RTAFSSEOLARLKREFNEN - - - RYLTERRRQQLSSELGLNEAQI Drosophila

K N W V S N R R R K E K T I COOH K I W F Q N K R A K I K K( S

angrelada de Drosophila son dos protenas reguladoras de genes de la familia homeodominio. Solo son iguales en 17 de sus 60 residuos de aminocidos, de forma que slo resulta evidente la relacin que existe entre ambas cuando se comparan sus estructuras tridimensionales (Figura 3-40). A menudo, los diferentes miembros de una gran familia de protenas tienen funciones bastantes diferentes. Algunos de los cambios de aminocidos que di ferencian estas enzimas fueron seleccionados en el transcurso de la evolucin probablem ente porque daban lugar a cambios en la especificidad del substrato y en las propiedades reguladoras, confirindoles las distintas funciones que pre sentan en la actualidad. Otros cambios de aminocidos parecen ser neutros, no teniendo efectos ni beneficiosos ni perjudcales sobre la estructura y la fun cin bsicas de una protena. Puesto que la mutacin es un proceso aleatorio, tam bin debieron producirse muchos cambios perjudiciales que alteraron la es tructura tridimensional de estas protenas lo suficiente como que resultaran inactivas. Estas protenas inactivas debieron perderse en cuanto los organismos individuales que las producan se encontraron en una situacin de desventaja y fueron eliminados por la seleccin natural. Por consiguiente no debe sorpren dernos que las clulas contengan grupos enteros de cadenas polipeptdicas afi nes que tienen ancestros comunes pero funciones diferentes.

Figura 3 -40 Com paracin de homodominios de unin al DNA de dos organismos separados por m s de mil millones de aos de evolucin.

(A) Estructura esquemtica. (B) Localizacin de las posiciones de los carbonos a. Las estructuras tridimensionales mostradas fueron determinadas por cristalografa de rayos X de la protena oc2 de la levadura {verde) y de la protena angrelada de Drosophila (rojo). (C) Comparacin de las secuencias de aminocidos de la regin de las protenas mostradas en (A) y (B). Los puntos naranja sealan la posicin de un inserto de tres aminocidos de la protena a2. (Adaptado de C. Wolberger et al., Cell 67: 517-528, 1991.)

Las nuevas protenas pueden desarrollarse por recom binacin de dominios polipeptdicos preexistentes 26
Cuando una clula ha producido un cierto nmero de superficies proteicas esta bles, se pueden generar nuevas superficies con diferentes propiedades de unin, mediante la com binacin de dos o ms protenas a travs de interacciones no covalentes, produciendo un complejo proteico. Este proceso de unin de prote nas globulares que genera agregados proteicos mayores y funcionales es habi tual en las clulas. Muchos complejos proteicos tienen pesos moleculares de ms de un milln de daltons, a pesar de que un una cadena polipeptdica tpica tiene un peso molecular de alrededor de 40 000 daltons (entre 300 y 400 am ino cidos) y de que un nmero relativamente reducido de cadenas alcanza un ta mao tres veces superior a ste. Un camino alternativo de generar una nueva protena a partir de cadenas preexistentes consiste en unir las secuencias de DNA correspondientes, produ cindose un gen que codifica una larga cadena polipeptdica nica. Se cree que

Estructura de las protenas

127

las protenas en las que diferentes zonas se pliegan de forma independiente en dominios globulares distintos, han evolucionado de esta forma, quizs despus de existir durante prolongados perodos de tiempo como complejos proteicos formados a partir de polipptidos independientes. Muchas protenas tienen una estructura multidominio de este tipo, y tal como cabra esperar a raz de las consideraciones evolutivas mencionadas antes, a menudo ocurre que un punto importante de unin a otra molcula se encuentra en el lugar en el que se yuxta ponen dos dominios diferentes (Figura 3-41). As, en el caso de la protena multi dominio cuya estructura tridimensional se muestra en la Figura 3-42, la superfi cie proteica de un dominio que une NAD+ aparentemente se combina con la superficie de un segundo dominio que une un azcar, constituyendo parte de un proceso de evolucin de un lugar activo que utiliza NAD+ para catalizar la oxidacin de un azcar. Existe otra manera, especialmente frecuente en las largas protenas fibrosas como la colgena, de reutilizar una secuencia de aminocidos (vase Figura 3-32). En estos casos se forma una estructura a partir de mltiples repeticiones inter nas de una secuencia ancestral de aminocidos. Es evidente que la unin de se cuencias de aminocidos a travs de la unin de secuencias preexistentes de DNA codificante es una estrategia mucho ms eficaz para la clula que la alter nativa de obtener nuevas secuencias proteicas mediante mutacin aleatoria del

Figura 3-41 Evolucin de un nuevo lugar de unin a un ligando. El principio general por el cual la yuxtaposicin en el curso de la evolucin de superficies de protena separadas ha permitido incrementar el nmero de protenas que presentan nuevos lugares de unin para otras molculas (lig an d os , vase pg. 135). Como se indica aqu, a menudo los lugares que interaccionan con los ligandos se localizan en la interfase entre los dos dominios proteicos y estn formados por regiones en asa de la superficie de la protena (vase tambin Figura 3-42).

Figura 3-42 Estructura de la enzima glucoltica gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa. La protena est compuesta por dos dominios, que aqu se presentan en colores diferentes, con regiones de hlice a (representadas por cilindros) y zonas de lmina (3 (representadas como flechas). Los detalles de la reaccin que cataliza esta enzima se muestran en la Figura 2-22. Ntese que los tres substratos que intervienen en la reaccin se unen a la enzima en una regin intermedia entre los dos dominios. (Por cortesa de Alan J. Wonacott.)

-------- NADH

128

Captulo 3 : Macromolculas: estructura, forma e informacin

PROTEINA CAP H2N I h A -

COOH

H2N

REPRESOR LAC --------------------------------------------- COOH

REPRESOR CRO H2N - A PROTEINA QUINASA DEPENDIENTE DE cGMP -r I I I

H2N

COOH

SUBUNIDAD REGULADORA DE LA PROTEINA QUINASA DEPENDIENTE DE cAMP H2N I I I I COOH

H?N' (B)

EGF H2N ^ > COOH QUIMOTRIPSINA H2N -^ P -C O O H UROQUINASA H2N O - O - COOH FACTOR IX H2N - A ----- O -----P < a l- COOH PLASMINGENO E l H E i Ci ^ c o o H

(A)

100 am inocidos

Las homologas estructurales pueden contribuir en la asignacin de funciones a las protenas descubiertas recientem ente 27
El desarrollo de tcnicas de secuenciacin rpida del DNA ha permitido deter minar la secuencia de aminocidos de un gran nmero de protenas a partir de las secuencias de nucletidos de sus genes. As, el disponer de una siempre cre ciente base de datos sobre protenas hace posible realizar de forma rutinaria un estudio exhaustivo por ordenador para buscar posibles secuencias homologas entre la de una protena acabada de sintetizar y las de otras protenas estudiadas previamente. A pesar de que, por ahora, solamente se han secuenciado un pe queo porcentaje del total de protenas de los organismos eucariotas, resulta ha bitual ya encontrar que una protena que se acaba de secuenciar es homologa a alguna regin de otra protena conocida, lo cual indica que la mayora de las protenas pueden descender de un nmero de tipos de protenas ancestrales re lativamente reducido. Como era de esperar, a menudo las secuencias de muchas protenas grandes muestran signos de haber evolucionado a travs de la unin de dominios preexistentes generando nuevas com binaciones de ellos, un proce so conocido como barajado de dominios (domain shuffling) (Figura 3-43). Estos estudios comparativos entre protenas tambin son importantes debi do a que normalmente una relacin estructural supone una relacin funcional. As, el descubrir una homologa entre la secuencia de aminocidos de la prote na estudiada y la de una protena de funcin conocida puede suponer el ahorro de muchos aos de investigacin. Tales homologas entre secuencias indicaron, por ejemplo, que algunos genes reguladores del ciclo celular en clulas de leva dura y otros genes que inducen la transformacin de clulas de mamfero en c lulas cancerosas son protena quinasas. De esta forma se pudo reconocer que muchas de las protenas que controlan la gnesis de la forma de la m osca del vinagre Drosophila son protenas reguladoras de genes, mientras que otras pro tenas tam bin implicadas en este control se pudieron clasificar como serina proteasas. El descubrimiento de homologas entre dominios tambin puede ser til en otro sentido. Resulta mucho ms difcil determinar la estructura tridimensional de una protena que conocer su secuencia de aminocidos. Sin embargo, es po sible intuir la conformacin de un dominio de una protena que se acaba de se cuenciar si este dominio es homlogo a otro dominio de una protena cuya con formacin ha sido determinada anteriormente por difraccin de rayos X. Asumiendo que los giros y torcimientos de las cadenas polipeptdicas estn con servados en ambas protenas a pesar de las diferencias que existan en la secuen cia de aminocidos, a menudo se puede esbozar la estructura de una nueva pro tena con una exactitud razonable (Figura 3-40). Cada ao se aaden muchas nuevas secuencias de protenas a la base de datos, con lo que paulatinamente se incrementa la posibilidad de encontrar ho mologas tiles. La comparacin entre secuencias de protenas es una herra m ienta de la biologa celular cada da ms importante.

Figura 3-43 Barajado de dominios. Durante la evolucin de las protenas se produjo un extenso barajado de bloques de secuencias de protena (m d u los proteicos). En la figura, las zonas sealadas con marcas de la misma forma y color estn relacionadas evolutivamente pero no son idnticas. (A) La protena activadora de gen por catabolitos (CAP, de Catabolite Gen Activator Protein) presenta un dominio (tringulo azul) que se une especficam ente a una secuencia de DNA, y un segundo dominio (rectn gu lo rojo) que une AMP cclico (vase Figura 3-35). El dominio que se une a DNA est relacionado con el de muchas otras protenas reguladoras de genes, com o las protenas represoras lac y ero. Adems, se han encontrado dos copias del dominio que une AMP cclico en protena quinasas de eucariotas reguladas por la unin de nucletidos cclicos. (B) Las serina proteasas sem ejantes a quimotripsina estn formadas por dos dominios (m arrn). En algunas proteasas relacionadas que estn fuertemente reguladas y ms especializadas los dos dominios proteasa estn conectados a uno o ms dominios homlogos a dominios encontrados en el factor de crecim iento epidrmico (h ex g on o verde), a la protena que une calcio (tringulo a m a rillo) o al dominio kringle (c u a d ra d o azu l) que contienen tres enlaces disulfuro internos.

Estructura de las protenas

129

subunidad

dim ero

Figura 3 -44 Form acin de un dimero a partir de un solo tipo de subunidad proteica. Una proteina con un solo lugar de unin que reconozca una zona de s misma, a menudo genera dimeros simtricos. Normalmente, estos dimeros se asocian con otras subunidades formando tetrmeros y agregados mayores (no se muestra).

Las subunidades proteicas pueden ensamblarse formando grandes estructuras 28

Los mismos principios que permiten que varios dominios proteicos se asocien formando lugares de unin, tam bin permiten la formacin de estructuras mu cho mayores en la clula. Las estructuras supramoleculares tales como los com plejos enzimticos, los ribosomas, los filamentos proteicos, los virus y las m em branas no se sintetizan en forma de molculas gigantes unidas covalentemente; en lugar de ello se forman por agregados no covalentes de muchas molculas preformadas, que en la estructura final se denominan subunidades. El uso de subunidades pequeas para construir grandes estructuras presenta varias ventajas: (1) la construccin de una gran estructura a partir de una o algu nas subunidades menores repetidas reduce la cantidad de informacin gentica necesaria; (2) puesto que las subunidades se asocian a travs de mltiples enlaces de energa relativamente baja, tanto el ensamblaje como la disgregacin resultan fciles de controlar; y (3) el ensamblaje de subunidades minimiza los errores en la sntesis de la estructura ya que en el transcurso del ensamblaje pueden actuar mecanismos de correccin que excluyan las subunidades defectuosas.

Figura 3-45 Modelo de cinta de un dmero formado a partir de dos subunidades proteicas idnticas (m onm eros). La protena mostrada es la protena activadora de gen por catabolito (CAP) de bacteria ilustrada previamente en la Figura 3-35. (Por cortesa de Jane Richardson.)

Un solo tipo de subunidad proteica puede interaccionar consigo m ism a formando agregados geomtricos regulares 29
Si una protena tiene un lugar de unin que es complementario de una regin de su propia superficie, se ensamblar espontneamente formando una estructura mayor. En el caso ms sencillo, un centro de unin se reconoce a s mismo y for ma un dmero simtrico. Muchas enzimas y otras protenas forman dmeros de

subunidades libres

estructuras ensambladas

de unin hlice

Figura 3 -46 Cuando un solo tipo de subunidad proteica interacciona consigo m isma, se pueden generar anillos o hlices. En la Figura 3-5 se muestra cmo se forma una hlice; se genera un anillo en lugar de una hlice si las subunidades se unen entre ellas, detenindose el crecim iento de la cadena.

anillo de unin

130

Captulo 3 : Macromolculas: estructura, forma e informacin

hlice de actina

Figura 3-47 Un filamento de actina. En este importante filamento, que se discute en detalle en el Captulo 16, existen aproximadamente dos subunidades proteicas globulares por vuelta.

este tipo, que frecuentem ente actan como subunidades en la formacin de agregados mayores (Figuras 3-44 y 3-45). Si el lugar de unin de una protena es complementario de una regin de su superficie que no incluya al propio lugar de unin, se formar una cadena de sub unidades. Determinadas orientaciones de los dos lugares de unin harn que la cadena se cierre pronto sobre s misma formando un anillo de subunidades (Figura 3-46). Sin embargo es ms frecuente que se produzca un largo polmero de subunidades; cuando cada subunidad se una a la siguiente de forma idntica, las subunidades del polmero se dispondrn siguiendo una hlice prolongada indefinidamente (vase Figura 3-5). Un filam ento de actina, por ejemplo, es una estructura helicoidal formada a partir de una sola subunidad: una protena glo bular denominada actina; los filamentos de actina son componentes mayoritarios del citosol de la mayora de las clulas eucariotas (Figura 3-47). Como discu timos ms adelante las protenas globulares tambin pueden asociarse con molculas sem ejantes formando grandes lminas o tubos (vase Figura 3-49).

A menudo las protenas superenrolladas colaboran en la construccin de grandes estructuras en las clulas 30
Normalmente cuando la resistencia m ecnica es especialmente importante, los agregados supramoleculares se construyen a partir de subunidades fibrosas en lugar de subunidades globulares. Estos agregados pueden estabilizarse por un gran nmero de regiones de contactos protena-protena que se producen cuanFigura 3 -48 Estructura de una hlice superenrollada. En (A) se presenta una hlica a sencilla, con las cadenas laterales de los aminocidos sucesivos sealadas siguiendo la secuencia de siete elementos abcdefg (de abajo a arriba). En esta secuencia los aminocidos a y d coinciden sobre la superficie del cilindro formando una banda (sealada en rojo) que gira lentamente alrededor de la hlice a. Tpicamente, las protenas que forman hlices superenrolladas tienen aminocidos hidrofbicos en las posiciones a y d. Por lo tanto, como se muestra en (B), las dos hlices a pueden enroscarse una sobre la otra de forma que las cadenas laterales hidrofbicas de una hlice a interaccionen con las cadenas laterales hidrofbicas de la otra, mientras que las otras cadenas laterales, ms hidroficas, quedan expuestas libremente al entorno acuoso. (C) La estructura atmica de una hlice superenrollada, determinada por cristalografa de rayos X. Las cadenas laterales en rojo son hidrofbicas. (C, de T. Alber, Curr. Opin. Genet. Devel. 2:205-210,1992. Current Science.)

banda de am inocidos hidrofbicos "a"y"d"

HOOC

COOH

0,5 nm
(A)

Estructura de las protenas

131

lmina empaquetada de form a hexagonal subunidad tubo helicoidal

Figura 3 -49 Las subunidades proteicas globulares empaquetadas de forma hexagonal pueden generar tanto una lm ina plana com o un tubo.

do las subunidades se enrollan una respecto a la otra formando una hlice multihebra. Una unidad estructural particularmente estable utilizada repetidamente en este sentido, es la denominada hlice superenrollada (coiled-coil). Se forma por el apareamiento de dos subunidades de hlice a que tienen una distribu cin repetida de cadenas laterales no polares. Normalmente las dos subunida des de hlice a son idnticas y corren en paralelo (es decir, en la misma direc cin amino-carboxilo terminal). Se enrollan gradualmente una alrededor de la otra generando un filamento rgido de un dimetro de unos 2 nm (Figura 3-48). En algunas familias de protenas reguladoras de genes las hlices superenrolladas actan como dominios de dimerizacin. Ms frecuentemente, una hlice superenrollada puede extenderse ms de 100 nm y actuar como un bloque de construccin de una gran estructura fibrosa, como el filamento fino en la clula muscular.

Las protenas pueden ensam blarse formando lminas, tubos o esferas 31

Algunas subunidades proteicas se ensamblan formando lminas planas en las que las subunidades se disponen siguiendo un patrn de anillos hexagonales. A veces, las protenas especializadas en transporte a travs de membranas pre sentan una disposicin de este tipo en el interior de la bicapa lipdica. Un pe queo cambio de la geometra de las subunidades puede hacer que una lmina hexagonal se convierta en un tubo (Figura 3-49) o, si se producen ms cambios, en una esfera hueca. Molculas proteicas tubulares y esfricas que se unen espe cficam ente al RNA y al DNA forman la cubierta de los virus. La form acin de estructuras cerradas, com o anillos, tubos y esferas, propor ciona una estabilidad adicional al increm entar el nmero de enlaces que se pueden formar entre las subunidades proteicas. Adems, debido a que estructu ras como stas se forman por interaciones cooperativas mutuamente depen dientes entre subunidades, puede inducirse la formacin o la disgregacin del complejo a travs de cam bios relativamente pequeos que afecten a las subuni dades individuales. Estos principios quedan ilustrados de forma espectacular en las protenas cpsides de muchos virus simples que adoptan la forma de una es fera hueca. A menudo, estas cubiertas estn formadas por cientos de subunida des proteicas idnticas que envuelven y protegen el cido nucleico vrico (Figura 3-50). La protena de estas cpsides ha de tener une estructura particularmente adaptable, ya que ha de establecer muchos tipos diferentes de contactos y tam bin alterar su disposicin para permitir la salida del cido nucleico al iniciar la multiplicacin vrica cuando el virus ha entrado en la clula.

Muchas estructuras celulares son capaces de autoensam blarse 32

La informacin necesaria para el ensam blaje de muchos agregados macromoleculares celulares ha de hallarse en las propias subunidades, ya que en condicio-

132

Captulo 3 : Macromolculas: estructura, forma e informacin

tres dmeros dm eros libres dm ero vrico partcula incom pleta

t-

dom inio de proyeccin dom inio de corteza brazo de conexin , dom inio de unin al RNA d im eros libres

m onm ero (en m odelo de cinta)

partcula vrica intacta (90 dmeros)

Figura 3 -5 0 Estructura de un virus esfrico. En muchos virus se em paquetan subunidadades proteicas idnticas generando un caparazn esfrico (una cpside) que contiene el genoma vrico com puesto de RNA o de DNA (vase Figura 6-72). Por razones geomtricas, no se pueden empaquetar de una forma sim trica precisa ms de 60 subunidades idnticas. Sin embargo, cuando pueden existir pequeas irregularidades estructurales, se puede generar una cpside mayor utilizando ms subunidades. Por ejemplo, el virus del tomate achaparrado (TBSV, de Tom ato Bushy Stunt Virus) es esfrico, de unos 33 nm de dimetro, formado por 180 copias idnticas de una protena de la cpside de 386 aminocidos y un genoma de RNA de 4500 nucletidos. Para formar una cpside tan grande, la protena ha de poder colocarse en tres am bientes algo diferentes, cada uno de los cuales se presenta en color en la partcula de la figura. Tam bin se muestra una propuesta sobre el proceso de ensam blaje; la estructura tridimensional precisa se ha determinado por difraccin de rayos X. (Dibujos por cortesa de Steve Harrison.)

nes adecuadas las subunidades aisladas puedes ensamblarse espontneamente en el tubo de ensayo dando lugar a la estructura final. El primer agregado macromolecular del que se demostr que era capaz de autoensamblarse a partir de sus elem entos constituyentes fue el virus del mosaico del tabaco (TMV, de To bacco Mosaic Virus). Este virus es una larga varilla en la que un cilindro de pro tena se halla dispuesto alrededor de un ncleo helicoidal de RNA (Figura 3-51). Si se mezclan en solucin el RNA y las subunidades proteicas disociadas, se ob serva que se recom binan formando partculas vricas completamente activas. El proceso de ensam blaje es sorprendentemente complejo e incluye la formacin de anillos dobles de protena que actan como intermediarios que se aaden a la cubierta vrica en crecimiento. Otro agregado macromolecular complejo que se puede reensamblar a partir de sus elementos constituyentes es el ribosoma bacteriano. Estos ribosomas es tn compuestos por unas 55 molculas proteicas diferentes y 3 molculas dife rentes de rRNA. Si los 58 componentes se incuban en condiciones apropiadas, es pontneamente forman la estructura original. Lo que es ms importante, estos ribosomas reconstruidos son capaces de llevar a cabo sntesis proteica. Como ca ba esperar, el proceso de reensamblaje de los ribosomas sigue una va especfica: primero ciertas protenas se fijan al RNA; luego, este complejo es reconocido por otras protenas, y as sucesivamente hasta que la estructura est completa. Todava no est claro cmo se regulan algunos de los procesos ms compli cados de autoensamblaje. Por ejemplo, parece que muchas estructuras de la c lula tienen una longitud exactamente definida, que es muchas veces superior a

Estructura de las protenas

133

M m m

(A)

50 nm

la de las macromolculas que las componen. En muchos casos todava constitu ye un enigma cmo se consigue esta determinacin de la longitud. En la Figura 3-52 se ilustran tres posibles mecanismos de este proceso. En el caso ms senci llo, un ncleo proteico u otra macromolcula proporciona un soporte que deter mina el tamao final del ensamblaje. ste es el mecanismo que determina la longitud de la partcula TMV en la que el ncleo est constituido por la cadena de RNA. De forma similar se ha demostrado que es una protena de ncleo la que determina la longitud de los filamentos finos del msculo y de las largas co las de algunos virus bacterianos (Figura 3-53).

(B)

No todas las estructuras biolgicas se form an por autoensam blaje 33

Algunas estructuras celulares mantenidas por enlaces no covalentes no son ca paces de autoensamblarse. Una mitocondria, un cilio o una miofibrilla no pue den formarse espontneam ente a partir de una solucin de sus componentes macromoleculares porque parte de la informacin necesaria para el ensamblaje es suministrada por enzimas especiales y por otras protenas celulares que reali zan la funcin de plantilla o patrn y que no aparecen en la estructura final una vez ensamblada. Incluso algunas estructuras pequeas carecen de alguno de los ingredientes necesarios para su ensamblaje. Por ejemplo en la formacin de un pequeo virus bacteriano la estructura de la cabeza, compuesta por un solo tipo de subunidad proteica, se ensam bla sobre un armazn transitorio compuesto por una segunda protena. Puesto que esta segunda protena no aparece en la partcula vrica final, la estructura no puede reensamblarse espontneamente despus de haber sido disgregada. Se conocen otros ejemplos en los que la de gradacin proteoltica es un paso esencial e irreversible del proceso de ensam blaje. ste es el caso de las cpsides de ciertos virus bacterianos e incluso de al gunos agregados proteicos sencillos, como por ejemplo la protena estructural colgena y la horm ona insulina (Figura 3-54). Sobre la base de estos ejemplos re lativamente simples parece muy probable que el ensamblaje de una estructura tan com pleja com o una mitocondria o un cilio implique por un lado una orde nacin espacial y temporal suministrada por otros componentes celulares, y por otro procesos irreversibles catalizados por enzimas degradativas.

Figura 3-51 Estructura del virus del mosaico del tabaco. (A) Micrografa electrnica del virus del mosaico del tabaco (TMV, de Tobacco Mosaic Virus) formado por una nica larga molcula de RNA rodeada por una cubierta proteica cilindrica que est compuesta por una densa disposicin helicoidal de subunidades proteicas idnticas. (B) Modelo que muestra parte de la estructura del TMV. Una molcula de RNA de una sola hebra, de 6000 nucletidos, se empaqueta formando una cubierta helicoidal construida a partir de 2130 copias de una protena de cubierta de 158 residuos de aminocido de longitud. En el tubo de ensayo a partir de RNA purificado y de molculas de protena se pueden autoensamblar partculas del virus con plena capacidad de infeccin. (A por cortesa de Robley Williams; B por cortesa de Richard J. Feldmann.)

i +m

S B
(A) ENSAMBLAJE SOBRE UN NCLEO (B) TENSIN ACUM U LAD A (C) PIE DE REY

Figura 3 -52 Tres posibles sistemas a travs de los que se puede form ar un gran agregado proteico de una longitud determinada. (A) Coensamblaje a lo largo de un ncleo proteico alargado o de otra macromolcula, las cuales actan como dispositivo de medida de longitud. (B) El final del ensam blaje se produce debido a la tensin que se acumula en la estructura polimrica a medida que se van aadiendo ms subunidades, de forma que a partir de una cierta longitud, la energa necesaria para aadir otra subunidad a la cadena es excesiva. (C) Ensamblaje tipo pie de rey", en el cual dos tipos de molculas sem ejantes a un rodillo, de longitud diferente, forman un complejo escalonado que crece hasta que sus finales coinciden exactamente.

134

Captulo 3 : Macromolculas: estructura, forma e informacin

Resumen
La conformacin tridimensional de una molcula proteica est determinada por su secuencia de aminocidos. La estructura plegada est estabilizada por interacciones no covalentes entre diferentes zonas de la cadena polipeptdica. Los aminocidos cuyo residuo es hidrofbico tienden a agruparse en el interior de la molcula; las interaccio nes locales por enlaces de hidrgeno entre los enlaces peptdicos vecinos dan lugar a hlices a y lminas p. Muchas protenas se construyen a partir de unidades modulares que son regiones globulares conocidas como dominios; tpicamente las protenas pe queas presentan un nico dominio mientras que las protenas ms grandes tienen varios dominios unidos entre s a travs de cortas zonas de la cadena polipeptdica. A medida que las protenasfueron evolucionando, los dominios fueron modificndose y combinndose con otros dominios construyndose as nuevas protenas. Las protenas pueden unirse entre sformando grandes estructuras a travs de las mismas fuerzas no covalentes que determinan el plegado de las protenas. Las protenas que presentan lugares de unin para su propia superficie se pueden en samblarformando dmeros, anillos cerrados estructuras esfricas o polmeros heli coidales. Algunas mezclas de protenas y de cidos nucleicos se pueden ensamblar espontneamente en un tubo de ensayo produciendo estructuras complejas pero muchos procesos de ensamblaje presentan pasos irreversibles de modo que no todas las estructuras de la clula son capaces de reensamblarse espontneamente des pus de haber sido disociadas en sus elementos constituyentes.

100 nm

Las protenas como catalizadores34

Las propiedades qumicas de una molcula proteica dependen casi com pleta mente de los residuos de aminocidos que quedan expuestos en su superficie y que son capaces de formar enlaces dbiles no covalentes con otras molculas. Cuando una molcula proteica se une a otra molcula, a esta segunda molcula se la denomina ligando. Puesto que la interaccin eficaz entre una molcula pro teica y un ligando requiere que se formen simultneamente entre ambas molcu las varios enlaces dbiles, los nicos ligandos que se pueden fijar fuertemente a una protena determinada son los que se adaptan exactamente a su superficie. La regin de una protena que se asocia con un ligando recibe el nombre de lugar de unin de dicha protena y suele tener forma de cavidad, constituida por una disposicin especfica de aminocidos en la superficie de la protena. A m e nudo estos aminocidos pertenecen a zonas muy distantes de la cadena poli peptdica (Figura 3-55) y representan una pequea fraccin del nmero total de aminocidos presentes. El resto de la molcula proteica es necesario para m an tener la cadena polipeptdica en posicin correcta y para suministrar lugares de unin adicionales con finalidad reguladora; normalmente el interior de la prote na nicamente es importante en cuanto confiere a la superficie de la molcula una forma y una rigidez adecuadas.

Figura 3-53 Electronmicrografa del bacterifago lambda. La punta de la cola del virus se une especficamente a una protena determinada de la superficie de una clula bacteriana, y a continuacin un DNA densamente empaquetado, situado en la cabeza del virus, es inyectado a la clula a travs de la cola del virus. La cola tiene una longitud precisa, determinada por el mecanismo que se muestra en la Figura 3-52A.

proinsulina

plegam iento especfico estabilizado por enlaces disulfuro

La conform acin de una protena determina sus propiedades qumicas 20

A menudo los residuos superficiales de una protena interaccionan de tal m ane ra que alteran la reactividad qumica de algunos residuos determinados de am i nocidos. Estas interaciones son de diferentes tipos.
Figura 3 -54 La horm ona polipeptdica insulina no puede form arse de nuevo de form a espontnea si se rom pen sus puentes disulfuro. Se sintetiza com o una gran protena (proin su lin a ), la cual es dividida por una enzima despus de que la cadena polipeptdica se haya plegado adoptando una forma especfica. La escisin de parte de la cadena polipeptdica de la proinsulina supone una prdida irreparable de la informacin necesaria para que la protena se pliegue espontneamente adoptando su conform acin normal.

elim inacin del pptido de unin, quedando as una m olcula com pleta de insulina, de dos cadenas insulina

la reduccin separa irreversiblem ente las dos cadenas

SH SH

SH

SH

Las protenas como catalizadores

135

H\ / C\

Ser 83

V H\ /
c
J

O,

/ N

CH? \ 2

\H

enlace de hidrgeno

(CH2)3

XN H
Arg 82 XC = N H ^ 0 \ 2 NH, O-7 ^

SUBUNIDAD 1

Figura 3-55 Lugar de unin a ligando de la protena activadora de un gen por catabolito (CAP, de Catabolite Gene Activator Protein). La unin por enlaces de hidrgeno entre CAP y su ligando, el AMP cclico {verde) se determind por anlisis cristalogrfico de rayos X del com plejo. Como se indica, las dos subunidades idnticas del dmero cooperan formando este lugar de unin (vase tam bin Figura 3-45). (Por cortesa de Tom Steitz.)

SUBUNIDAD 2

En primer lugar, zonas vecinas de la cadena polipeptidica pueden interaccionar de manera que restrinjan el acceso de molculas de agua a otras zonas de la superficie proteica. Puesto que las molculas de agua tienden a forma enlaces de hidrgeno, compiten con los ligandos por ciertos residuos de aminocidos de la superficie proteica (Figura 3-56). Por consiguiente, la intensidad de los enla ces de hidrgeno (y de las interacciones inicas) entre las protenas y sus ligandos queda altamente increm entada cuando las molculas de agua son excluidas. A primera vista resulta difcil imaginar un m ecanismo que pueda excluir de la superficie de una protena una molcula tan pequea como la del agua sin afec tar el acceso del propio ligando. Sin embargo, y debido a su clara tendencia a formar enlaces de hidrgeno, las molculas de agua se hallan formando una am plia red mantenida por estos enlaces (vase Panel 2-1, pgs. 50-51) y a menudo el separarse de la red e introducirse en una grieta de la superficie proteica resul ta energticamente desfavorable para las distintas molculas individuales. En segundo lugar, la agrupacin de residuos de aminocidos polares veci nos puede alterar su reactividad. Por ejemplo, si debido al plegamiento de la protena varias cadenas laterales con carga negativa son inducidas a agruparse, en contra de su repulsin mutua, la afinidad de cada residuo de aminocido por un ion de carga positiva aumenta marcadamente. Determinadas cadenas latera les pueden tam bin interaccionar una con otra a travs de enlaces de hidrgeno, los cuales pueden activar grupos laterales normalmente no reactivos (como el -CH 2OH de la serina, que se muestra en la Figura 3-57) transformndolos en grupos altam ente reactivos capaces de intervenir en reacciones que generan o rompen enlaces covalentes determinados. Por consiguiente, la superficie de cada molcula proteica tiene una reactivi dad qumica caracterstica que depende no slo de las cadenas laterales de ami nocidos que quedan al descubierto, sino que depende tambin de la exacta orientacin de estas cadenas entre s. Por esta razn, dos conformaciones ligera mente diferentes de la misma molcula proteica pueden ser enormemente dife rentes en cuanto a sus propiedades qumicas. A menudo, cuando la reactividad de las cadenas laterales resulta insuficien te, las protenas utilizan la ayuda de determinadas molculas no polipeptdicas que fijan a su superficie. Estos ligandos actan de coenzimas en las reacciones catalizadas enzimticamente y pueden estar tan fuertemente unidas a la prote-

Figura 3 -56 Competencia por la formacin de enlaces de hidrgeno. La habilidad de las molculas de agua para favorecer la formacin de enlaces de hidrgeno con grupos de la superficie de la protena reduce notablem ente la tendencia de estos grupos a unirse unos con otros.

136

Captulo 3 : Macromolculas: estructura, forma e informacin

na que llegan a formar parte efectiva de la propia protena. Ejemplos de este caso los hallamos en los grupos hemo (que contienen hierro) de la hemoglobina y de los citocromos, en la tiamina pirofosfato de las enzimas implicadas en la transferencia de grupos aldehido y en la biotina de las enzimas que participan en la transferencia de grupos carboxilo. La mayora de coenzimas son molculas orgnicas muy complejas, seleccionadas en base a la reactividad qumica que adquieren cuando se unen a la superficie de una protena. Adems de su lugar reactivo, una coenzima tiene otros residuos que la fijan a su protena husped (Figura 3-58). La Figura 3-59A muestra un modelo espacial compacto de una en zima unida a su coenzima.

El primer paso de la catlisis enzim tica es la unin del substrato 35

Una de las funciones ms importantes de las protenas consiste en actuar como enzimas, catalizando reacciones qumicas determinadas. En este caso el ligando es la molcula de substrato y la unin del substrato a la enzima es un preludio esencial de la reaccin qumica (Figura 3-59B). Si denominamos a la enzima E, al substrato S y al producto P, la reaccin bsica es E + S ^ ES ^ EP ^ E + P. A partir de esta simple representacin de una reaccin catalizada por una enzima, podemos ver que existe un lmite a la cantidad de substrato que cada molcula de enzima puede procesar en un tiempo dado. Si se increm enta la concentra cin de substrato, la velocidad a la que se forma el producto tambin se incre menta, hasta alcanzar un valor mximo (Figura 3-60). En este punto la molcula de enzima se halla saturada de substrato y la velocidad de reaccin (denominada V'mJ depende nicamente de la velocidad a la que sea procesada la molcula de substrato. Esta velocidad dividida por la concentracin de la enzima constituye

Figura 3-57 Un aminocido extraordinariam ente reactivo en el lugar activo de una enzima. El ejemplo que se muestra es la trada cataltica que se presenta en la quimotripsina, en la elastasa y en otras serina proteasas (vase Figura 3-39). La cadena lateral del cido asprtico induce a la histidina a eliminar el protn de la serina 195, lo cual activa la serina para formar un enlace covalente con el substrato de la enzima hidrolizando un enlace peptdico com o se ilustra en la Figura 3-64.

coenzima

H ,C , t-N H 2

c/
H E N Z IM A

y *

centro reactivo

H .C -C

p) W / C r'\

-C H ,

-O'

C H ,

o "\

Figura 3 -58 Coenzimas. Las coenzimas, como la tiamina pirofosfato (TPP) mostrada aqu en gris, son pequeas molculas que se unen a la superficie de una enzima permitindole catalizar reacciones especficas. La reactividad del TPP depende de su* tomo de carbono acdico, que intercambia rpidamente su tomo de hidrgeno por un tomo de carbono de una molcula de substrato. Probablemente otras regiones de la molcula de TPP actan como asas mediante las cuales la enzima mantiene a la coenzima en posicin correcta. Probablemente las coenzimas evolucionaron primero en un mundo de RNA, donde se unan a molculas de RNA para colaborar con ellas en los procesos de catlisis (se discute en el Captulo 1).

Las protenas como catalizadores

137

Figura 3-59 Modelos de espacio lleno, generados por ordenador, de dos enzimas. En (A) se p resen ta el
citocro m o c unido a su coen zim a hem o. En (B) se p resenta la lisozim a de la clara de huevo, con un substrato oligosacrido unido. En am bo s casos el ligando unido se p resen ta en rojo. (Por cortesa de Richard J. Feldm ann.)

el nmero de recambio. A menudo el nmero de recambio es de aproximada mente 1000 molculas de substrato procesadas cada segundo por cada molcula de enzima pero puede llegar a alcanzar valores mayores en casos extremos. El otro parmetro cintico utilizado con frecuencia para catacterizar a una enzima es su Kw que es la concentracin de substato que permite alcanzar la mitad de la velocidad mxima de la reaccin (Figura 3-60). Una KMbaja significa que la enzima alcanza su mxima velocidad cataltica a una baja concentracin del substrato, y por lo general indica que la enzima se une a su substrato muy fuertemente.

Las enzimas aceleran las reacciones estabilizando determinados estados de transicin36

Las enzimas consiguen que las reacciones qumicas se produzcan a velocidades extremadamente altas -m ucho ms que a travs de cualquier catlisis sinttica. Esta eficiencia puede ser atribuida a varios factores. En primer lugar, la enzima acta aumentando la concentracin local de las molculas de substrato en el lu gar cataltico y manteniendo los tomos adecuados en una orientacin correcta para la reaccin que se producir a continuacin. Sin embargo, lo ms impor tante es que una parte de la energa de fijacin contribuye directamente a la ca tlisis. Antes de formar los productos finales de la reaccin, las molculas del substrato pasan a travs de una serie de formas intermedias de geometra y dis tribucin electrnica alteradas y son las energas libres de estas formas interm e dias y en especial las de los estados de transicin ms inestables, los principales determinantes de la velocidad de la reaccin. Las enzimas presentan mayor afi nidad por estos estados inestables de transicin de los substratos que por sus

Figura 3-60 Cintica enzimtica. La velocidad de un a reacci n enzim tica

(V) au m en ta cuand o au m en ta la co n ce n traci n del substrato, hasta alcanzar un valor m xim o (Vm ax). En este punto, todos los lugares de u n in al substrato de las m olcu las enzim ticas estn ocupados, y la velocidad de la reacci n est lim itada por la velocidad del p ro ceso de catlisis sobre la superficie de la enzim a. Para la m ayora de las enzim as la co n ce n traci n de substrato a la que la velocidad es igual a la m itad de la velocidad m xim a (KM ) con stituye una m edida de la fuerza co n que la enzim a se une al substrato; cu an to m ayor es el valor de la Kw m en or es la fuerza de unin.

/21 / m a x

/ /

Km concentracin de substrato-

138

Captulo 3 : Macromolculas: estructura, forma e informacin

formas estables, y estas interacciones disminuyen las energas de los estados de transicin acelerando as una reaccin determinada (Figura 3-61). Una clara demostracin de cmo al estabilizar un estado de transicin se pue de incrementar enormemente la velocidad de la reaccin la constituye la produc cin intencionada de anticuerpos que actan como enzimas. Consideremos por ejemplo la hidrlisis de un enlace amida, que es similar al enlace peptdico que une aminocidos adyacentes en las protenas. En una solucin acuosa un enlace amida se hidroliza muy lentamente mediante el mecanismo ilustrado en la Figura 3-62A. En el compuesto intermedio central, o estado de transicin, el carbono carbonilo se halla unido a cuatro tomos situados en los vrtices de un tetraedro. Se puede obtener un anticuerpo que acte como una enzima generando anticuerpos que se unan fuertemente a un anlogo estable de este compuesto intermedio tetra drico, muy inestable, tal como se ilustra en la Figura 3-62B. Este anticuerpo catal tico se une al compuesto intermedio tetradrico y lo estabiliza, incrementando as ms de 10 000 veces la velocidad de hidrlisis espontnea del enlace amida.

energa de activacin para una reaccin no catalizada

energa de activacin para una reaccin catalizada

Figura 3-61 Las enzimas aceleran las reacciones qumicas disminuyendo la energa de activacin. A m en ud o
tan to las re accio n e s no catalizadas (A) com o la catalizada por un a enzim a (B) se prod u cen a travs de diversos estad os de tran sicin . El estad o de tran sici n de m ayor energa (ST y EST) es el que d eterm in a la energa de activ acin y lim ita la velocidad de la re acci n (S=substrato; P=producto de la reacci n ).

Las enzimas pueden facilitar la formacin y la rotura de enlaces covalentes a travs de una catlisis cida y bsica simultnea3 7
Las enzimas son mejores catalizadores que los anticuerpos catalticos. Adems de unirse fuertemente al estado de transicin, el lugar activo de una enzima con tiene tomos situados en el espacio de forma precisa que aceleran la reaccin al terando la distribucin de los electrones de los tomos implicados en la form a cin y la rotura de los enlaces covalentes. Los enlaces peptdicos, por ejemplo, pueden ser hidrolizados en ausencia de una enzima exponiendo un polipptido a una base fuerte o a un cido fuerte, como se explica en la Figura 3-63B y C. Sin embargo, las enzimas son nicas en hacer posible la catlisis cida y bsica si multnea, ya que impiden que los residuos cidos y bsicos necesarios se com binen unos con otros (como ocurrira si estuvieran en solucin) al mantenerlos unidos a la rgida estructura de la protena (Figura 3-63D). Hay que precisar la adecuacin entre una enzima y su substrato. Un pequeo cambio introducido mediante ingeniera gentica en el lugar activo de una enzima puede tener consecuencias extraordinarias. Por ejemplo, al reemplazar un cido glutmico por un cido asprtico en una enzima se desplaza la posicin del ion carboxilato cataltico alrededor de 1 (aproximadamente el radio de un tomo de hidrge no), y ello es suficiente para reducir la actividad de la enzima ms de cien veces.

(A) HIDRLISIS DE UN ENLACE AM IDA

O ( H
c

Figura 3 -62 Anticuerpos catalticos.

La estab ilizacin de un estad o de tran sici n por u n an ticu erp o genera u n a enzim a. (A) La re a cci n de la hidrlisis de un en lace am id a se prod uce a travs de un intermedio tetradrico, que es el estad o de tran sicin de alta energa de la reacci n . (B) La m olcu la m ostrad a a la izquierda se un i co v alen tem en te a un a p ro ten a y se utiliz com o antgeno para gen erar u n anticu erp o que result un irse fu ertem en te a la regin de la m o lcu la se alad a en am arillo. Este anticu erp o tam b i n se une fu ertem en te al estad o de tran sici n en (A), por lo que act a com o u n a enzim a que cataliza e ficien tem en te la h idrlisis del en lace am id a de la m o lcu la que se m u estra a la derecha.

O )
h

HX XH agua

H+ H interm ediario tetradrico

( c) h N ^ P O l l () I I

(B) ANALOGO DEL ESTADO DE TRANSICIN PARA LA HIDRLISIS DE LA AM IDA

O

amida

Las protenas como catalizadores

139

LENTO

o II

RPIDO ----- N II /

/ C\H ----- N C -----H O H / \ H H

H O II

nN'

RPIDO
\
h

O II H C -----H H
O

MUY RPIDO \ H / H / \

( ' -----o II / \ H H

/ C\ ----- N II O / \ H
O

11 O II O

Figura 3 -6 3 Catlisis cida y catlisis bsica. (A) El inicio de la reaccin no

catalizada que se p resenta en la Figura 3-62A se h a dibujado aqu, utilizando el som bread o en azul com o un indicador esqu em tico de la distribucin electr n ica del agua y de los en laces carb onilo . (B) U n cido tiende a dar un p rotn (H+ ) a otros tom os. En co m b in aci n co n el oxgeno del carbonilo, un cido hace que los electrones tiendan a separarse del carb o n o carbonilo, h acien d o que este tom o atraiga m u ch o m s fu ertem ente el oxgeno electronegativo de la m olcu la de agua que ataca el en lace. (C) U na b ase tien d e a cap tar H +; en co m b in aci n co n un hidrgeno de la m olcu la de agua atacante, una base h a ce que los electron es se d esplacen h acia el oxgeno de la m olcu la de agua, h acien d o que constituya un grupo m s reactivo del carbo n o carbonilo. (D) Al p resentar una d isposicin ad ecu ada de tom os en su superficie, un a enzim a puede realizar una catlisis cida y bpsica sim u ltneam ente.

\ \
//

c H H
O

//

(A) no catlisis

(B) catlisis cida

(C)

catlisis bsica

(D)

catlisis cida y bsica

Adems, las enzimas pueden incrementar las velocidades de reaccin formando enlaces covalentes intermedios con sus substratos3 8
Adems de los mecanismos comentados antes, muchas enzimas aceleran la veloci dad de la reaccin que catalizan interactuando de manera covalente con uno de sus substratos, de modo que el substrato queda unido a un residuo de aminocido o a una molcula de coenzima. Generalmente cuando un substrato entra en el lugar de unin de la enzima, se une covalentemente a ella y entonces reacciona con un se gundo substrato sobre la superficie de la enzima que rompe el enlace covalente que se acaba de formar. Al final de cada ciclo de reacciones se regenera la enzima libre. Consideremos, por ejemplo, el mecanismo de accin de las serina proteasas. La reaccin que catalizan, la hidrlisis de un enlace peptdico, est enormemente acelerada debido a la afinidad de la enzima por el compusto intermediario tetradrico de la reaccin. Pero una serina proteasa hace mucho ms que lo que hace un tpico anticuerpo cataltico: en lugar de esperar a que una molcula de oxgeno del agua ataque el carbono carbonilo, hace que la reaccin transcurra mucho ms r pidamente utilizando en primer lugar para este fin una cadena lateral de un amino cido situada en el lugar adecuado (la serina activada de la Figura 3-57). Este paso rompe el enlace peptdico pero libera la enzima unida covalentemente al grupo carboxilo. Entonces, en un segundo paso muy rpido, este compuesto intermedio covalente se destruye por la adicin catalizada enzimticamente de una molcula de agua, lo cual completa la reaccin y regenera la enzima libre (Figura 3-64), A pe sar de que esta reaccin en dos etapas es menos directa que la reaccin en una eta pa (en la que el agua se aade directamente al enlace peptdico), es mucho ms r pida debido a que cada etapa tiene una energa de activacin relativamente baja.

Las enzimas aceleran las reacciones qumicas pero no pueden hacerlas energticamente ms favorables
Por muy sofisticada que sea una enzima, no puede hacer que la reaccin qumica que cataliza resulte ms o menos favorable desde el punto de vista energtico. La enzima no puede alterar la diferencia de energa libre que existe entre los subs tratos iniciales y los productos finales de la reaccin. Como ocurre en las simples interacciones de enlace antes mencionadas, cualquier reaccin qumica tiene un punto de equilibrio en el que los flujos de la reaccin en ambas direcciones son iguales; por consiguiente, en este punto ya no se produce ningn cambio neto de concentracin (vase Figura 3-9). Si una enzima acelera la velocidad de la reac cin en un sentido A + B - AB en un factor de 10, tambin debe acelerar en un factor de 10Bla velocidad de la reaccin contraria AB A + B. El cociente entre las velocidades de una y otra reacciones depende nicamente de las concentracio nes de A, de B y de AB. El punto de equilibrio es siempre exactamente el mismo, independientemente de si la reaccin est catalizada por una enzima o no.

140

Captulo 3 : Macromolculas: estructura, forma e informacin

Ser

CH2

O \/ /\ \ / /

Ser
NH,

interm ediario tetradrico

NH,

Ser
CH^

o- c
NH

H N. His

substrato polipeptdico
3

\ x\ V X C o c
HNH

NH

c -o o h

COOH

His

O COOH

prim er pptido liberado

(A)

(B)

(C)

Ser

\ \ / d > H Oc y \l/

Ser --------- C H ,

interm ediario tetradrico

Ser
NH,

o c /

\\ x C
'H

CH,
O O

/ N. His

H agua His

H N+

C D
C

NH,

His

/ OH

segundo pptido liberado

(D)

(E)

(F)
Figura 3-64 Algunas enzimas forman enlaces covalentes con sus substratos. En el ejemplo mostrado aqu, un grupo carbonilo de una cadena polipeptdica (en verde) forma un enlace covalente con un residuo de serina activado especficam ente (vase Figura 3-57) de una serina proteasa (en gris), el cual rompe la cadena polipeptdica. Cuando la porcin no unida de la cadena polipeptdica se ha alejado por difusin, se produce un segundo paso en el cual una molcula de agua hidroliza el nuevo enlace covalente formado, separando as la porcin de la cadena polipeptdica de la superficie de la enzima y liberando la serina para otro ciclo de reaccin. Ntese que en esta reaccin los intermediarios tetradricos inestables (en a m arillo) son los estados de transicin, y que ambos son estabilizados por la enzima.

Las enzimas pueden determ inar el sentido de una va acoplando determinadas reacciones a la hidrlisis del ATP39
La clula viva es un sistema qumico que se halla lejos del equilibrio. El producto de cada enzima suele actuar com o substrato de otra enzima de la va metabolica y es consumido rpidamente. Lo que es ms importante, por medio de las vas catalizadas enzim ticam ente descritas en el Captulo 2 , muchas reacciones son impulsadas en una direccin gracias a su acoplamiento a la hidrlisis energtica mente favorable del ATP a ADP y fosfato inorgnico. Para que esta estrategia sea efectiva, los niveles de ATP se m antienen en unos valores nada cercanos a los de equilibrio, con un cociente elevado entre ATP y sus productos de hidrlisis (va se Captulo 14). Por consiguiente, este acervo de ATP acta como una batera de reserva manteniendo un flujo continuo de tomos y de energa a travs de la clula a travs de vas determinadas por las enzimas presentes. Para un sistema vivo, la proximidad al equilibrio qumico significa degeneracin y muerte.

Los com plejos multienzimticos ayudan a increm entar la velocidad del m etabolism o celular 4 0
La eficiencia de las enzimas respecto a su funcin aceleradora de las reacciones qumicas es crucial para el m antenimiento de la vida. En efecto, las clulas han de luchar contra procesos inevitables de degeneracin que avanzan inexorable mente hacia el equilibrio qumico. Si las velocidades de las reacciones deseables no fueran superiores a las de las recciones opuestas, la clula pronto morira. Midiendo la velocidad de utilizacin del ATP podemos tener una idea aproxima da de la velocidad a la que se procude el metabolismo celular. Una clula tpica de mamfero recam bia (es decir, degrada por completo y substituye) todo su acervo de ATP, cada 1 o 2 minutos. Para cada clula esta renovacin representa la utilizacin de una 107 molculas de ATP por segundo (y para el cuerpo hum a no, aproximadamente un gramo de ATP cada minuto).

Las protenas como catalizadores

141

La velocidad de las reacciones celulares es elevada gracias a la eficiencia de los catalizadores enzimticos. De hecho, muchas enzimas importantes trabajan de una forma tan eficiente que es imposible mejorarla: en estos casos el factor li mitante de la velocidad de la reaccin no es la velocidad intrnseca de la accin enzimtica sino la frecuencia a la que la enzima interaciona con su substrato. De una reaccin como sta se dice que est limitada por la difusin. Si una reaccin est limitada por la difusin, su velocidad depende de las concentraciones de la enzima y del substrato. As, para que una secuencia de re acciones se produzca con gran rapidez ha de existir una elevada concentracin de cada uno de los intermediarios metablicos y de cada una de las enzimas que intervienen en ella. Dado el enorme nmero de reacciones diferentes que se de sarrollan en una clula, existen lmites a las concentraciones que se pueden al canzar de los substratos. De hecho, la mayora de metabolitos se hallan a con centraciones micromolares (IO-6 M) y las enzimas a concentraciones mucho menores. Cmo es posible m antener velocidades metablicas muy elevadas? La respuesta reside en la organizacin espacial de los componentes celulares. Las velocidades de reaccin pueden ser incrementadas sin aumentar la concentra cin de los substratos, reuniendo las diversas enzimas implicadas en una secuencia de reacciones y formando un gran complejo proteico denominado complejo multienzimtico. De esta manera, el producto de la enzima A es transferido directa mente a la enzima B, y as sucesivamente hasta el producto final, con lo que las ve locidades de difusin no limitan la velocidad de reaccin ni siquiera cuando la concentracin de substrato en toda la clula es muy baja. Estos complejos multienzimticos son muy frecuentes (en la Figura 2-41 se mostraba la estructura de uno de ellos, la piruvato deshidrogenasa) e intervienen en casi todos los aspectos del metabolismo, incluyendo los procesos genticos centrales del DNA y del RNA, y en la sntesis de protenas. De hecho es posible que muy pocas enzimas de las clulas eucariotas difundan libremente en solucin. Por el contrario, la mayora de las en zimas pueden haber desarrollado zonas de unin que les permitan concentrarse con otras protenas de funcin relacionada en determinadas regiones de la clula, incrementndose as la velocidad y la eficiencia de las reacciones que catalizan. Las clulas disponen adems de otro sistema de incrementar la velocidad de las reacciones metablicas. ste depende del enorme sistema de membranas intracelulares de las clulas eucariotas. Estas membranas pueden segregar ciertas substancias y las enzimas que actan sobre ellas, dentro del mismo com parti miento rodeado de membrana, com o el retculo endoplasmtico o el ncleo ce lular. Si, por ejemplo, el compartimiento ocupa un total de un 10% del volumen celular, la concentracin de los reactantes dentro del compartimiento sera 10 veces mayor que en una clula similar no compartimentada (Figura 3-65). Las reacciones que podran estar limitadas por la velocidad de difusin, pueden de esta manera increm entar su velocidad en este mismo factor. En el Captulo 5 se dan ms detalles de la estructura y funcin de las protenas. En l se discute de qu forma las clulas construyen diminutas mquinas proteicas.

Figura 3 -65 Com partim entacin. Se

puede conseguir un gran incremento en la concentracin de las molculas interactuantes al confinarlas en el mismo compartimiento rodeado de membrana, en una clula eucariota.

La Juncin biolgica de una protena depende de las propiedades qumicas detalla das de su superficie. Los lugares de unin para ligandos estn constituidos por cavi dades de la superficie en las cuales diversas cadenas laterales se localizan de una for ma precisa gracias al plegamiento de la protena. De esta forma, las cadenas laterales de aminocidos normalmente no reactivas puede hallarse activadas. Las enzimas aceleran enormemente las velocidades de las reacciones unindose a los estados de transicin de alta energa, de una form a especialmente intensa; tambin desarrollan catlisis deidas y bsicos simultneamente. A menudo, las velocidades de las reaccio nes enzimticas son tan rpidas que nicamente estn limitadas por la difusin; las velocidades pueden incrementarse an ms si las enzimas que actan deform a se cuencia! se halla unidas formando un mismo complejo multienzimdtico o si las enzi mas y sus substratos se hallan confinadas en el mismo compartimiento de la clula.
142 Captulo 3 : Macromolculas: estructura, forma e informacin

Resumen

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Bibliografa

145

Cmo se estudian las clulas

# h J H b
JU L

Observacin de la estructura de las clulas con el microscopio Aislamiento y crecimiento de clulas en cultivo Fraccionamiento de las clulas y anlisis de sus molculas Siguiendo el rastro y cuantificando las molculas

Las clulas son pequeas y complejas. Resulta difcil observar su estructura y descubrir su com posicin molecular, pero todava resulta ms difcil dilucidar cmo funcionan sus componentes. Lo que podemos aprender sobre las clulas depende de las herramientas que tengamos a nuestra disposicin; de hecho, los mayores avances de la ciencia son frecuentem ente fruto de la introduccin de nuevas tcnicas de estudio. Por consiguiente, para entender la biologa celular contem pornea es necesario conocer algo acerca de estos mtodos de estudio. En este captulo vamos a revisar brevemente algunos de los principales mto dos usados para estudiar las clulas. Empezaremos con las tcnicas utilizadas para examinar las clulas como un todo y despus continuaremos con las tcnicas utili zadas para analizar sus constituyentes macromoleculares. Nuestro punto de partida ser la microscopa; la biologa celular empez con la microscopa ptica, la cual to dava es una herramienta esencial, junto con los imaginativos inventos ms recien tes basados en haces de electrones y otras formas de radiacin. Desde la observa cin pasiva, nos desplazaremos hasta la intervencin activa: consideraremos cmo las clulas de diferentes tipos pueden ser separadas de los tejidos y crecer fuera del cuerpo, y cmo se pueden romper las clulas y aislar de forma pura sus orgnulos y constituyentes macromoleculares. Por ltimo, discutiremos cmo podemos detec tar, seguir y cuantificar los tipos individuales de molculas e iones en el interior de la clula. La tecnologa del DNA recombinante ha revolucionado nuestro conocimien to sobre la funcin celular, pero debido a que se trata de un apartado importante en s mismo y depende del conocimiento de los mecanismos genticos bsicos, este conjunto de poderosos mtodos se considera en detalle en el Captulo 7. A pesar de que los mtodos tienen una importancia bsica, lo que resulta real mente interesante es lo que nos permiten descubrir. Por lo tanto, proponemos que el presente captulo se utilice como referencia y se lea en conjuncin con los ltimos captulos del libro, ms que como una introduccin a ellos.

Observacin de la estructura de las clulas con el microscopio1

Una clula animal tpica mide entre 19 y 20 |xm de dimetro, es decir, unas cinco veces menos que la menor partcula visible a simple vista. Por ello, hasta que no se dispuso de buenos microscopios pticos, a principios del siglo xix, no se des cubri que todos los tejidos vegetales y animales son agregados de clulas. Este descubrimiento, propuesto por Schleiden y Schwann en 1838 como la teora ce lular, marca el nacimiento formal de la biologa celular.

147

Las clulas animales no slo son diminutas, sino que tambin son incoloras y traslcidas; por ello, el descubrimiento de las principales caractersticas inter nas de las clulas dependi del hallazgo, a finales del siglo xix, de diversos colo rantes que proporcionaron el contraste suficiente para hacerlas visibles. A prin cipios de los aos 1940 se desarroll el microscopio electrnico, mucho ms poderoso que el ptico. Sin embargo, antes de que su utilizacin permitiera el conocim iento detallado de las complejidades de la estructura interna de la clu la, se hizo necesario el desarrollo de nuevas tcnicas para la preservacin y colo racin de las clulas. Hasta ahora la microscopa depende tanto de las tcnicas para la preparacin del espcim en como del rendimiento del propio m icrosco pio. En las secciones que siguen, vamos a discutir tanto los instrumentos como la preparacin de las muestra, y empezaremos por el microscopio ptico. La Figura 4-1 muestra el grado de detalle que puede alcanzarse con la mi croscopa ptica moderna en comparacin con el de la microscopia electrnica. En la Tabla 4-1 se resumen algunos de los hitos histricos en el desarrollo de la microscopia ptica.

clula vegetal clula animal

bacteria

Tabla 4-1 Algunos descubrimientos en la historia de la microscopia ptica 1611 Kepler sugiri una manera de construir un microscopio compuesto. 1655 Hooke utiliz un microscopio compuesto para descubrir unas pequeas celdillas en cortes de corcho, a las que denomin clulas. 1674 Leeuwenhoek inform de su descubrimiento de los protozoos. Nueve aos ms tarde observ bacterias por primera vez. 1833 Brown public sus observaciones microscpicas de las orqudeas y describi claramente el ncleo celular. 1838 Schleiden y Schwann propusieron la teora celular, afirmando que la clula nucleada es la unidad estructural y funcional de las plantas y de los animales. 1857 Kolliker describi las mitocondrias de las clulas musculares. 1876 Abb analiz los efectos de la difraccin en la formacin de la imagen en el microscopio y mostr la manera de optimizar el diseo de los microscopios. 1879 Flemming describi con gran claridad el comportamiento de los cromosomas durante la mitosis de las clulas animales. 1881 Retzius describi muchos tejidos animales con una precisin que todava no ha sido superada por ningn especialista de microscopia ptica. En las dos dcadas siguientes, tanto l como Cajal y otros histlogos disearon mtodos de tincin y establecieron las bases de la anatoma microscpica. 1882 Koch utiliz colorantes de anilina para teir microorganismos e identific las bacterias que causan la tuberculosis y el clera. En las dos dcadas siguientes otros bacterilogos como KLebs y Pasteur identificaron los agentes causantes de otras muchas enfermedades, examinando al microscopio preparaciones teidas. 1886 Zeiss construy una serie de lentes, siguiendo las leyes de Abb, que permitieron a los especialistas en microscopia la resolucin de estructuras situadas en los lmites tericos de la resolucin de la luz visible. 1898 Golgi observ y descubri por primera vez el complejo de Golgi, impregnando las clulas con nitrato de plata. 1924 Lacassagne y colaboradores desarrollaron la primer tcnica autorradiogrfica para localizar el polonio radiactivo en muestras biolgicas, 1930 Lebedeff dise y construy el primer microscopio de contraste interferencial. En 1932 Zemicke invent el microscopio de contraste de fases. Estos adelantos permitieron observar por primera vez en detalle clulas vivas no teidas, 1941 Coons utiliz anticuerpos acoplados a colorantes fluorescentes para detectar antgenos celulares. 1952 Nomarski ide y patent el sistema de contraste interferencial para el microscopio ptico, que an lleva su nombre. 1981 Alien e Inou perfeccionaron la microscopia ptica de contraste vdeoamplificada. 1988 Se generaliza el uso de los microscopios de rastreo confocal.

virus ribosom a

protena globular m olcula pequea tom o

0 ,1

nm

(1 )

Figura 4 -1 Poder de resolucin. Tamaos de las clulas y de sus componentes, dibujados sobre una escala logartmica, indicando el intervalo de resolucin del ojo humano y de los microscopios ptico y electrnico. En microscopia se utilizan normalmente las siguientes unidades de longitud:
(im (micrmetro) = lO^m nm (nanmetro) = 10'M m (unidad Angstrom) = 10inm

148

Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

2 ONDAS EN FASE

< x x x x >
2 ONDAS DESFASADAS

Figura 4-2 Interferencia entre ondas luminosas. Cuando dos ondas de luz se combinan en fase, la amplitud de la onda resultante es mayor y la luminosidad queda incrementada. Dos ondas de luz desfasadas se anulan parcialmente una a otra, produciendo una onda de menor amplitud, y por consiguiente, de menor intensidad luminosa.

oscuridad

El microscopio ptico puede resolver detalles situados a 0,2 jxm de distancia 2

En general, un haz de una radiacin de una longitud de onda determinada no puede utilizarse para examinar detalles estructurales mucho ms pequeos que su propia longitud de onda: esto supone una limitacin fundamental de los m i croscopios. As pues, el lmite de resolucin de un microscopio ptico est de terminado por la longitud de onda de la luz visible, que abarca desde 0,4 p.m (para el violeta) hasta 0,7 Jim (para el rojo lejano). En la prctica, las bacterias y las mitocondrias, que tienen aproximadamente 500 nm (0,5 |a.m ) de dimetro, son las estructuras ms pequeas que se pueden observar ntidamente al m i croscopio ptico; los detalles ms pequeos que estas dimensiones quedan os curecidos por los efectos de la naturaleza ondulatoria de la luz. Para com pren der el porqu de este efecto, hemos de estudiar lo que le sucede a un haz de ondas luminosas cuando atraviesa las lentes de un microscopio. Dada su naturaleza ondulatoria, la luz no sigue exactamente la lnea recta idealizada de sus rayos predicha por la ptica geomtrica. Por el contrario, cuan do las ondas luminosas viajan a travs de un sistema ptico lo hacen por una di versidad de rutas ligeramente diferentes, de manera que se interfieren entre ellas generando efectos pticos de difraccin. Si dos trenes de ondas que alcan zan el mismo punto por diferentes caminos estn exactamente en fase, con coincidencia de las crestas y de los senos, se refuerzan el uno al otro aumentan do la luminosidad. Por el contrario, si los trenes de ondas estn desfasados, in terfieren uno con otro y se anulan total o parcialmente (Figura 4-2). La inciden cia de la luz sobre un objeto altera las relaciones de fase de las ondas luminosas, produciendo complejos efectos de interferencia. A gran aumento la sombra de un borde recto, por ejemplo, iluminado con una luz de longitud de onda unifor me, aparece como un conjunto de lneas paralelas, mientras que la de una m an cha circular aparece como un conjunto de anillos concntricos (Figura 4-3). Por la misma razn, observado a travs del microscopio un punto aparece como un disco borroso, mientras que dos objetos puntuales prximos entre s ofrecen imgenes superpuestas y pueden llegar a confundirse en una sola imagen. La perfeccin de las lentes, por alta que sea, no puede superar esta limitacin im puesta por la naturaleza ondulatoria de la luz. La separacin lmite a la que dos objetos pueden verse separados -conocida como lm ite de resolucin- depende tanto de la longitud de onda de la luz como de la apertura numrica de las lentes del sistema utilizado (Figura 4-4). En las m e jores condiciones posibles: con luz violeta (longitud de onda, X = 0,4 p.m) y una apertura numrica de 1,4, el lmite de resolucin terico que se puede obtener con el microscopio ptico es tan slo de 0,2 jxm. Esta resolucin ya fue alcanzada por los fabricantes de microscopios a finales del siglo xix y con los microscopios con temporneos producidos en serie, muy raramente se alcanza. Aunque es posible

Figura 4-3 Efectos de borde. Efectos de interferencia observados a gran aumento cuando la luz pasa por el borde de un objeto slido colocado entre la fuente de luz y el observador.

Observacin de la estructura de las clulas con el microscopio

149

LENTES IMAGEN

RESOLUCIN: el poder de resolucin de un m icroscopio depende de la am plitud del cono de ilum inacin y, por lo tanto, de las lentes objetivo y condensador. Se calcula con la frm ula la lente objetivo colecta un cono de luz generando una imagen la lente condensador enfoca un cono de rayos lum inosos en cada uno de los puntos de la m uestra resolucin en donde: 9= m itad de la anchura angular del cono de rayos colectados por la lente objetivo desde un punto tpico de la muestra (como la m axma anchura es de 180, el valor de seno 0 tiene un valor m xim o de 1 ) n = ndice de refraccin del m edio (norm alm ente aire o aceite) que separa la muestra de las lentes objetivo y condensador X = longitud de onda de la luz utilizada (para (uz blanca se utiliza norm alm ente el valor de 0,53 |im ) m ayor es la resolucin y la brillantez de la imagen (la brillantez es im portante en m icroscopa de fluorescencia). Sin em bargo, esta ventaja se obtiene a expensas de distancias de trabajo m uy cortas y de profundidades de cam po m uy pequeas. 0,61
X

Figura 4 -4 Apertura num rica. Paso de los rayos luminosos cuando atraviesan una muestra transparente en un microscopio, ilustrando el concepto de apertura numrica y su relacin con el lmite de resolucin.

muestra

V iW l
)
LUZ |

APERTURA NUMRICA: en la ecuacin anterior, el valor n sen B se denom ina apertura numrica de las lentes (AN) y es una funcin de su capacidad de colectar la luz. Para lentes secas este valor no puede ser m ayor de 1 pero para lentes sum ergidas en aceite puede llegar a ser de 1,4. Cuanto m ayor sea la apertura numrica

m ovim iento del brazo del m icrtom o m uestra incluida en cera o en resina cuchilla de acero

agrandar una imagen tanto como se desee -p . ej., proyectndola sobre una pan
talla- nunca resulta posible resolver al microscopio ptico dos objetos que estn separados menos de 0,2 jim : dichos objetos aparecern como uno solo. Ms adelante podremos ver cmo la interferencia y la difraccin pueden ser utilizadas para estudiar clulas vivas sin teir. En primer lugar vamos a estudiar cmo se pueden hacer preparaciones permanentes de clulas para su observa cin al microscopio y cm o se utilizan los colorantes qumicos en estas prepara ciones para increm entar la visibilidad de las estructuras celulares.

cinta de cortes finos cinta de cortes sobre el portaobjetos, teidos y m ontados con un cubreobjetos

Para la observacin microscpica, norm alm ente los tejidos son fijados y seccionados
Para hacer preparaciones perm anentes que despus puedan ser teidas y visua lizadas al m icroscopio, en primer lugar las clulas se han de tratar con un fijador que las inmovilice, las mate y las preserve. En trminos qumicos, la fijacin hace a las clulas permeables a los colorantes y establece puentes cruzados en tre sus molculas, de modo que stas queden estabilizadas y bloqueadas en su posicin original. Algunos de los primeros procedimientos de fijacin consistan en una breve inmersin en cidos o en disolventes orgnicos tales com o el alco hol. Los procedimientos actuales suelen comprender aldehidos activos, particu larmente el formaldehdo y el glutaraldehdo, que forman enlaces covalentes con los grupos amino libres de las protenas y por lo tanto forman puentes cru zados entre protenas adyacentes. La mayora de las muestras de tejidos son demasiado gruesas para que sus clulas sean examinadas directamente a alta resolucin. Por consiguiente, des pus de la fijacin, los tejidos suelen ser cortados en finas rebanadas (seccio nes), con un micrtomo, una mquina dotada de una cuchilla de metal muy afi lada que funciona de manera parecida a un cortafiambres (Figura 4-5). Las secciones que se utilizan para ser observadas al microscopio ptico, normal mente tienen entre 1 y 10 |j.m de grosor y son extendidas en la superficie de un portaobjetos. Por lo general los tejidos son muy blandos y frgiles, incluso despus de la fijacin, de forma que antes de la obtencin de los cortes, es necesario incluirlos

Figura 4 -5 Obtencin de secciones de un tejido. Un tejido incluido se corta con un micrtomo, como paso previo para su observacin al microscopio ptico.

150

Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

en un medio de soporte. Los medios ms utilizados son ceras o resinas. En esta do lquido, estos medios penetran y rodean todo el tejido; entonces, pueden ser endurecidos (por enfriamiento o por polimerizacin) para formar un bloque s lido que pueda ser cortado fcilmente con el m icrtomo. Existe el grave peligro de que cualquier tratamiento utilizado para la fijacin pueda alterar de manera no deseada la estructura de la clula o sus constituyen tes moleculares. La congelacin rpida proporciona un mtodo alternativo que, de alguna manera, evita este peligro eliminando la necesidad de fijacin y de in clusin. El tejido congelado puede ser cortado directamente con un criostato -u n m icrtomo especial que se mantiene en una cmara fra. Aunque, las sec ciones por congelacin conseguidas de esta manera tienen la ventaja de evitar algunos artefactos, pueden presentar otro tipo de complicaciones: la estructura nativa de algunas molculas com o las protenas est bien conservada pero nor malmente la estructura de las clulas se rompe por los cristales de hielo. Habitualmente, el paso siguiente al de obtencin de las secciones (por cual quier mtodo) es su tincin.

Los diferentes com ponentes de la clula pueden ser teidos selectivamente 3

El contenido de la mayora de las clulas (de las que el agua representa un 70% de su peso) no presenta demasiados elementos que impidan el paso de los rayos de luz. Por ello, casi todas las clulas en su estado natural, aunque estn fijadas y seccionadas, son casi invisibles al microscopio ptico convencional. Una m ane ra de hacerlas visibles es teirlas con colorantes orgnicos selectivos. A principios del siglo xix la demanda de colorantes para teir los productos de la industria textil condujo a un perodo frtil para la qumica orgnica. Se ob serv que algunos de los colorantes tean los tejidos biolgicos y que sorpren dentemente, a menudo m ostraban una preferencia por determinados com po nentes de la clula -e l ncleo o las membranas, por ejem plo- haciendo visibles estas estructuras internas. En la actualidad disponemos de una rica variedad de colorantes orgnicos, con nombres tan pintorescos como verde de malaquita, negro Sudn o azul de Coomassie, cada uno de los cuales presenta una afinidad especfica por ciertos com ponentes celulares. El colorante hematoxilina, por ejemplo, tiene afinidad por las molculas con carga negativa, y por ello revela la distribucin del DNA, del RNA y de las protenas cidas de la clula (Figura 4-6). No obstante, desconocem os la base qumica de la especificidad de muchos colo rantes.
Figura 4-6 Una seccin de tejido teida. Seccin de piel humana,

teida con una combinacin de colorantes, hematoxilina y eosina, que se utilizan habitualmente en histologa.

Observacin de la estructura de las clulas con el microscopio

151

FUENTE DE LUZ

3 segundo filtro de corte elim ina las seales de fluorescencia no deseadas y deja pasar la fluorescencia verde de em isin, de 520 a 560 nm espejo de ranuras ordenadas: refleja la luz de longitud de onda m enor de 510 nm pero transm ite la luz de longitud de onda superior a 510 nm
2

Figura 4-7 Sistema ptico de un moderno microscopio de fluorescencia. El juego de filtros consta de dos filtros de corte (1 y 3) y de un espejo dicroico (de ranuras ordenadas) (2). En este ejemplo se muestra un juego de filtros adecuado para la deteccin de la fluorescencia de la fluorescena. En este tipo de microscopios es especialmente importante que la lente objetivo tenga una elevada apertura numrica, ya que para una amplificacin dada la brillantez de la imagen fluorescente es proporcional a la cuarta potencia de la apertura numrica (vase tambin Figura 4-4).

1 prim er filtro de corte nicamente deja pasar la luz azul de una longitud de onda entre 450 y 490 nm

lente objetivo objecto

La relativa falta de especificidad de estos colorantes a nivel molecular ha esti mulado el diseo de procedimientos de tincin ms racionales y selectivos y ha permitido en particular el desarrollo de mtodos que revelan protenas especficas y otras macromolculas celulares. Existe, sin embargo, el problema de conseguir una sensibilidad adecuada para estos propsitos. Como una clula cualquiera pre senta pocas copias de cada una de la mayora de las macromolculas, a menudo una o dos molculas de colorante unidas a cada macromolcula resultan invisi bles. Una posibilidad de resolver este problema consiste en incrementar el nme ro de molculas de colorante asociadas a cada macromolcula individual. As, al gunas enzimas pueden ser localizadas en las clulas mediante su actividad cataltica: cuando son expuestas a un substrato molecular apropiado, cada mol cula de enzima genera muchas molculas visibles de producto, las cuales pueden ser localizadas. Un mtodo alternativo al problema de la sensibilidad consiste en la utilizacin de compuestos fluorescentes, como explicamos a continuacin.

fluorescena (verde)

Mediante la m icroscopa de fluorescencia se pueden localizar molculas en las clulas de form a especfica 4
Las molculas fluorescentes absorben la luz de una determinada longitud de onda y emiten luz de otra longitud de onda ms larga. Si un componente de este tipo es iluminado a su longitud de onda absorbente y visualizado a travs de un filtro que slo permita pasar la luz de longitud de onda igual a la de la luz emitida, el componente aparece brillante sobre un fondo oscuro. La intensidad y el color de la luz es una propiedad caracterstica de la molcula fluorescente utilizada. Los colorantes fluorescentes utilizados para la tincin celular son detecta dos con la ayuda del m icroscopio de fluorescencia. Este microscopio es similar al m icroscopio convencional, a excepcin de que la luz incidente, procedente de una potente fuente, atraviesa dos series de filtros -u n o para interceptar la luz antes de que llegue a la muestra y otro para filtrar la luz obtenida a partir de la muestra. El primer filtro se selecciona de manera que slo permita el paso de las longitudes de onda que excitan a un determinado colorante fluorescente, m ien tras que el segundo filtro bloquea esta luz y permite el paso de las longitudes de onda emitidas cuando el colorante emite fluorescencia (Figura 4-7). La microscopa de fluorescencia se utiliza habitualmente para detectar es pecficamente protenas u otras molculas en clulas y tejidos. Una tcnica muy

tetram etilrodam ina (roja)

Figura 4-8 Colorantes fluorescentes. Estructura de la fluorescena y de la tetrametilrodamina, dos colorantes utilizados habitualmente en microscopa de fluorescencia. La fluorescena emite luz amarillo-verdosa cuando se activa con luz de una longitud de onda adecuada, mientras que la rodamina emite luz roja. Las zonas de las molculas que se sealan en naran ja indican la posicin de un grupo qumicamente reactivo; normalmente, en esta posicin se forma un enlace covalente entre el colorante y una protena (u otra molcula). Diferentes versiones comerciales de estos colorantes con diferentes tipos de grupos reactivos permite utilizarlos como diana de grupos -SH o de grupos -NH 2 de protenas.

152

Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

t u b u lin a

aditila

DNA

50 (iin

utilizada y potente consiste en acoplar covalentemente un colorante fluorescen te a molculas de un anticuerpo, el cual se puede utilizar entonces como un re activo muy especfico y verstil que se une selectivamente a las macromolculas que reconoce en las clulas o en la matriz extracelular. Con esta finalidad, fre cuentem ente se utilizan dos colorantes fluorescentes: la fluorescena, que cuan do es excitada por luz azul emite una fluorescencia amarillo-verdosa intensa, y la rodamina, que cuando es excitada con una luz verde-amarilla emite una fluo rescencia de color rojo intenso (Figura 4-8). Acoplando una molcula a la fluores cena y otra a la rodamina, en la misma clula puede determinarse la distribu cin de dos molculas diferentes; ambas molculas son detectadas separadamente en el microscopio cambiando las dos series de filtros, uno especfico para cada colorante. Como se muestra en la Figura 4-9, de la misma forma se pueden utili zar tres colorantes fluorescentes para distinguir tres tipos de molculas en la misma clula. Actualmente se han desarrollado importantes mtodos, que explicaremos posteriormente, que capacitan a la microscopia de fluorescencia para seguir cambios en la concentracin y en la localizacin de molculas especficas en el interior de la clula viva (vase pg. 195).

Figura 4-9 M icroscopia de fluorescencia. Micrografas de una zona de la superficie de un embrin temprano de D rosophila, en el que se han marcado los microtbulos con un anticuerpo acoplado a fluorescena {p an el d e la izq u ierd a ) y los filamentos de actina con un anticuerpo acoplado a rodamina (p a n e l central). Adems, los cromosom as se han marcado con un tercer colorante que nicam ente emite fluorescencia cuando se une a DNA (p a n e l d e la d er ec h a ). En este estadio, todos los ncleos del embrin com parten un mismo citoplasma, y estn en el estadio de m etafase de la mitosis. Las tres micrografas fueron tomadas en la mism a regin de un embrin fijado, utilizando tres juegos de filtros diferentes en el microscopio de fluorescencia (vase tam bin Figura 4-7). (Por cortesa de Tim Karr.)

Las clulas vivas se pueden observar con nitidez en un microscopio de contraste de fases o de contraste de fases interferencial 2,5
La posibilidad de que algunos componentes de la clula puedan perderse o dis torsionase durante la preparacin de las muestras no ha dejado de preocupar a los especialistas en microscopia. La nica solucin a este problema es examinar

(A)

luz incidente

(B)

luz incidente

ondas en fase

ondas desfasadas

clula sin teir

Figura 4 -1 0 Dos sistem as para increm en tar el contraste en el m icroscopio ptico. En (A), las zonas teidas de la clula reducen la amplitud de las ondas luminosas de una longitud de onda determinada que pasan a travs de ellas. De esta forma se obtiene una imagen en color de la clula, visible mediante la observacin habitual. En (B), la luz que pasa a travs de la clula viva, no teida, no sufre ningn cambio importante de amplitud y, por consiguiente, muchos de sus detalles no se pueden observar directamente, aunque se amplifique enorm em ente la imagen; sin embargo, se producen cambios de fa s e en las ondas luminosas cuando stas pasan travs de la clula, y estas alteraciones pueden hacerse visibles aprovechando efectos de interferencia utilizando un microscopio de contraste de fases o de contraste de fases interferencial.

Observacin de la estructura de las clulas con el microscopio

153

50

|Jm

las clulas mientras an estn vivas, sin ningn tipo de fijacin ni de congelacin. Para este propsito son tiles microscopios con sistemas pticos especiales. Cuando la luz pasa a travs de una clula viva, la fase de la onda luminosa vara en relacin al ndice de refraccin de la clula: la luz que pasa a travs de una zona relativamente gruesa o densa de la clula, como por ejemplo el ncleo, se retrasa y su fase queda desplazada de forma correspondiente respecto a la de la luz que ha pasado a travs de una regin adyacente de citoplasma, ms fina. El m icroscopio de contraste de fases y el m icroscopio de contraste de fases interferencial aprovechan los efectos de interferencia que se producen cuando se com binan estos dos grupos de ondas, creando de esta forma una imagen de la estructura celular (Figura 4-10). Ambos tipos de microscopios pticos se utilizan habitualm ente para visualizar clulas vivas. Una manera ms sencilla de observar algunas de las caractersticas de una clula no teida consiste en utilizar luz dispersada por sus diversos com ponen tes. En el m icroscopio de cam po oscuro, los rayos luminosos del sistema de ilu minacin son dirigidos desde la parte lateral, por lo que slo penetra en las len tes del microscopio la luz dispersada. Por consiguiente, la clula aparece como un objeto iluminado sobre un fondo negro. La Figura 4-11 muestra imgenes de una misma clula obtenidas mediante cuatro tipos diferentes de microscopios pticos. Una de las grandes ventajas del microscopio de contraste de fases, del m i croscopio de contraste de fases interferencial y del microscopio de campo oscu ro estriba en que los tres permiten observar las clulas en accin y estudiar los movimientos implicados en procesos como la mitosis o la migracin celular. Puesto que muchos movimientos son demasiado lentos para ser observados a tiempo real, norm alm ente resulta til hacer pelculas o vdeos por el sistema de aceleracin de movimiento (microcinematografa ). En estos casos, se toman fo tografas sucesivas, separadas por breves perodos de tiempo, de modo que cuando la pelcula o el video registrados se proyectan a la velocidad normal los acontecim ientos aparecen muy acelerados.

Figura 4-11 Cuatro tipos de microscopio ptico. (A) Imagen de un fibroblasto en cultivo obtenida mediante la transmisin directa de luz a travs de la clula, tcnica conocida como m icroscop a d e ca m p o claro. Las otras imgenes fueron obtenidas utilizando las tcnicas descritas en el texto: (B) microscopa de contraste de fases; (C) microscopa de contraste de fases interferencial de Nomarski; y (D) microscopa de campo oscuro. Con los microscopios ms modernos se pueden obtener los cuatro tipos de imgenes, simplemente cambiando algunos de los sistemas pticos.

Mediante tcnicas electrnicas las imgenes pueden ser amplificadas y analizadas 6

Recientemente, los sistem as electrnicos de im genes y la tecnologa asociada de procesam iento de im genes han tenido un impacto importante en la mi croscopa ptica. No slo han permitido superar ciertas limitaciones prcticas de los microscopios (debidas a limitaciones en el sistema ptico), sino que tam bin han superado dos limitaciones fundamentales del ojo humano: el ojo no

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Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

puede ver luz extremadamente dbil y no puede percibir pequeas diferencias en intensidad de luz sobre un fondo brillante. El primero de estos problemas puede solucionarse adaptando a un microscopio una cmara de vdeo altam en te sensible a la luz (del tipo de las que se utilizan para vigilancia nocturna). Con ello es posible observar clulas durante largos perodos de tiempo y con muy baja intensidad de luz, evitando de esta manera los efectos dainos de la luz in tensa (y caliente) prolongada. Estos sistemas de intensificacin de imgenes son especialmente importantes para visualizar molculas fluorescentes en las clu las vivas. Dado que las imgenes producidas por las cmaras de vdeo son de tipo electrnico, pueden ser digitalizadas, introducidas en un ordenador y procesa das de varios modos para extraer informacin latente en estas imgenes. Este procesamiento de la imagen hace posible la compensacin de los fallos pticos de los microscopios, pudiendo alcanzar el lmite terico de resolucin del m i croscopio ptico. Por otra parte, utilizando sistemas de vdeo acoplados a proce sadores de imgenes puede increm entarse el contraste, superndose las limita ciones del ojo en la deteccin de pequeas diferencias. A pesar de que este procesamiento tam bin increm enta los efectos aleatorios de las irregularidades del sistema ptico, este ruido puede eliminarse electrnicam ente restando una imagen de un rea en blanco del campo de observacin. De esta manera, pequeos objetos transparentes que antes eran imposibles de distinguir del fon do, pueden ser visibles. El alto contraste alcanzable en la microscopia de interferencia asistida por ordenador hace posible la visualizacin de pequeos objetos tales como microtbulos (Figura 4-12), los cuales tienen un dimetro de 0,025 |im, menor de una dcima parte de la longitud de onda de la luz. Los microtbulos individuales tam bin pueden ser vistos en un microscopio de fluorescencia si previamente han sido marcados con fluorescencia (vase Figura 4-62). En ambos casos, sin embargo, los inevitables efectos de difraccin dan una imagen altamente borrosa, de forma que estos microtbulos aparecen con un dimetro de al menos 0,2 Jim, lo cual hace imposible distinguir un microtbulo sencillo de un haz de varios microtbulos.

S pm Figura 4-12 Ampliando los lmites de deteccin. Imgenes al microscopio electrnico de microtbulos no teidos, visualizados por microscopia de contraste de fases interferencial seguida de un procesamiento electrnico de imgenes. (A) Imagen original no procesada. (B) Resultado final del proceso electrnico que incrementa marcadamente el contraste y reduce el ruido. A pesar de que los microtbulos nicamente tienen 0,025 nm de dimetro, aparecen como unos filamentos ms gruesos debido a efectos de difraccin. (Por cortesa de Bruce Schnapp.)

Gracias al microscopio de barrido confocal es posible obtener imgenes de com plejos objetos tridimensionales 7
Como hemos visto, para poder observar un tejido al microscopio ptico conven cional, se ha de cortar en finas secciones; cuanto ms finas sean las secciones ms definidas sern las imgenes. En el proceso de obtencin de las secciones, sin embargo, se pierde informacin respecto a la tercera dimensin. Cmo enton ces se puede obtener una imagen de la arquitectura tridimensional de una clula o de un tejido? Cmo se puede ver la estructura tridimensional de una muestra que por una u otra razn no puede haber sido previamente cortada en seccio nes? Si se observa una muestra fina con un microscopio ptico convencional, la imagen obtenida al enfocar un nivel determinado resulta degradada y borrosa por la informacin que queda fuera de foco de las zonas de la muestra situadas encim a y debajo del plano focal. A pesar de que este problema se puede superar mediante com plejos procesadores de imgenes aplicados a las imgenes de los diferentes planos focales, el mtodo resulta lento y costoso desde el punto de vista informtico. El microscopio de barrido confocal aporta otra solucin, ms directa, para conseguir el mismo resultado final: utiliza mtodos electrnicos de imagen que permiten enfocar un plano escogido de una muestra fina eliminan do la luz que proviene de las zonas fuera de foco superiores e inferiores a este plano. As se obtiene una imagen ntida de una fina seccin ptica. A partir de se ries de secciones pticas de este tipo obtenidas a diferentes profundidades, ar chivadas en un ordenador, resulta sencillo reconstruir una imagen tridimensio nal. El microscopio de barrido confocal es para los microscopistas lo que la TAC (tomografa axial computadorizada) de barrido fue (por diferentes razones) para

Observacin de la estructura de las clulas con el microscopio

155

Figura 4-13 El microscopio de barrido confocal de fluorescencia.

diafragm as confocales espejo dicroico

objectivo m uestra 3-D punto de foco una muestra fluorescente se ilum ina con un punto enfocado de luz procedente de un diafragm a la luz fluorescente em itida por el punto de la m uestra est en foco, se enfoca en el diafragm a y alcanza el detector la luz que procede del resto de puntos de la muestra estn fuera de foco del diafragm a, por lo que sern excluidos casi com pletam ente del detector

Este simple diagrama muestra que la disposicin bsica de los componentes pticos es similar a la del microscopio de fluorescencia estndar mostrado en la Figura 4-7, excepto en que en ste se utiliza un lser para iluminar una pequea mancha de luz cuya imagen se enfoca en un solo punto de la muestra (A). La fluorescencia emitida por este punto de la muestra se enfoca en un segundo (confocal) diafragma (B). La luz emitida por el resto de la muestra no se enfoca en este diafragma, por lo que no contribuir a formar la imagen final (C). Mediante un barrido de la mancha de luz por toda la muestra se obtiene una imagen bidimensional muy fina exactamente del plano de foco, la cual no est degradada significativamente por la luz procedente de otras regiones de la muestra.

los radilogos para estudiar el cuerpo humano: ambos sistemas proporcionan imgenes detalladas de secciones del interior de una estructura intacta. Los detalles pticos del microscopio de barrido confocal son complejos, pero la idea bsica es sencilla, como se ilustra en la Figura 4-13. Generalmente el mi croscopio utiliza una ptica fluorescente (vase Figura 4-7), pero en lugar de ilu minar toda la muestra a la vez, como se hace habitualmente, en cada instante el sistema ptico enfoca un pequeo punto luminoso en una profundidad determi nada de la muestra. Se necesita una fuente de luz que produzca puntos luminosos muy brillantes; habitualmente se utilizan fuentes lser cuya luz haya pasado a tra vs de un diafragma. La fluorescencia emitida por el material iluminado se recoge y produce una imagen a la entrada de un detector de luz adecuado. Se coloca un diafragma en el detector, en el lugar que es confocal con el punto luminoso -que es precisamente donde los rayos luminosos emitidos por el punto iluminado de la muestra estn enfocados. As, la luz de este punto de la muestra converge sobre esta apertura y entra en el detector. Contrariamente, la luz que proviene de las re giones fuera del plano focal del punto luminoso tambin estn fuera de foco en el diafragma, por lo que resulta en gran manera excluida del detector (Figura 4-14). Para obtener una imagen bidimensional se recoge secuencialmente la informa cin de cada punto luminoso del plano focal mediante un barrido por todo el campo a observar (como ocurre en una pantalla de televisin) y se presenta en
Figura 4-14 Com paracin entre la microscopa convencional y la confocal. Estas dos micrografas

proceden del mismo embrin intacto de Drosophila en estado de gstrula, teido con una sonda fluorescente para filamentos de actina. La imagen convencional no procesada (A) resulta borrosa debido a la presencia de estructuras fluorescentes situadas por encima y por debajo del plano focal. En la imagen confocal (B) esta informacin fuera de foco se ha eliminado, resultando una bien definida seccin ptica de la clula del embrin. (Por cortesa de Richard Warn y Peter Shaw.)

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Captulo 4 : Cdmo se estudian las clulas

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una pantalla de vdeo. A pesar de que no se presenta en la Figura 4-13, el barrido se obtiene por reflexin del haz luminoso en un espejo oscilante situado entre el espejo dicroico y las lentes del objetivo de tal forma que el punto luminoso y el diafragma confocal del detector permanezcan estrictamente en registro. El microscopio de barrido confocal se ha utilizado para resolver las estructu ras de numerosos objetos tridimensionales complejos (Figura 4-15), incluyendo las redes de fibras del citoesqueleto del citoplasma y la disposicin de los cro mosomas y de los genes en el ncleo.

Figura 4 -1 5 Reconstruccin tridimensional a p artir de Imgenes del m icroscopio de barrido confocal.

El microscopio electrnico resuelve la estructura fina de la clula 8

La relacin entre el lmite de resolucin y la longitud de onda de la luz que se utili za para iluminar la muestra (vase Figura 4-4) es cierta para cualquier forma de ra diacin, con independencia de que sea un haz de luz o un haz de electrones. Sin embargo, en el caso de los electrones el lmite de resolucin puede hacerse muy pequeo. La longitud de onda de un electrn disminuye a medida que aumenta su velocidad. En un microscopio electrnico que tenga un voltaje de aceleracin de 100 000 voltios, la longitud de onda de un electrn es de 0,004 nm, de forma que en teora, la resolucin de un microscopio de este tipo sera de aproximadamente 0,002 nm, lo cual es unas 10 000 veces mayor que la de un microscopio ptico. Sin embargo, debido a que las aberraciones de las lentes electrnicas son mucho ms difciles de corregir que las de las lentes de cristal, el poder de resolucin real de la mayora de los microscopios electrnicos actuales es, en el mejor de los casos, de 0,1 nm (1 ) (Figura 4-16). Adems, los problemas de preparacin de la muestra, de contrastado y de lesin por la radiacin, limitan claramente la resolucin nor mal para los objetos biolgicos a unos 2 nm (20 ), unas 100 veces mayor a la reso lucin de un microscopio ptico. En la Tabla 4-2 se resumen algunos de los hitos histricos en el desarrollo de la microscopia electrnica. El microscopio electrnico de transmisin (TEM, de Transmission Electron Microscope) es, en sus rasgos generales, parecido a un microscopio ptico, aun que es de mayor tamao e invertido (Figura 4-17). La fuente de iluminacin es un filamento o ctodo situado en la parte superior de una columna cilindrica de unos dos metros de altura, que emite electrones. Puesto que los electrones son dispersados al colisionar con las molculas del aire, se ha de extraer el aire de la columna, para producir el vaco en ella. A continuacin, los electrones son ace lerados desde el filamento mediante un nodo, que pueden atravesar a travs de un diminuto orificio, y forman un haz de electrones que se dirige hacia la parte inferior de la columna. Unas bobinas magnticas situadas a intervalos a lo largo de la columna enfocan el haz de electrones, como las lentes enfocan la luz en un microscopio ptico. La muestra se coloca en el vaco de la columna a travs de una antecmara de compresin, y se sita en el camino del haz de electrones. Como en el caso del microscopio ptico, normalmente la muestra se contrasta; en este caso mediante un material electrodenso, como veremos en la seccin si guiente. Algunos de los electrones que atraviesan la muestra son dispersados por estructuras contrastadas con el material electrodenso; el resto de electrones

Los granos de polen, en este caso de una pasionaria, tienen una pared celular estructurada de forma muy compleja, que contiene compuestos fluorescentes. Las imgenes obtenidas a diferentes profundidades del grano utilizando un microscopio de barrido confocal se pueden combinar obtenindose una imagen tridimensional del grano de polen completo, como se muestra a la derecha. A la izquierda se presentan algunas secciones pticas individuales de un total de 30, cada una de las cuales contribuye ligeramente a formar la imagen final. (Por cortesa de John White.)

Figura 4 -1 6 Lmite de resolucin del microscopio electrnico.

Electronmicrografa de una fina capa de oro, en la que los tomos individuales aparecen como manchas brillantes. La distancia entre los tomos de oro adyacentes es de unos 0,2 nm (2 A). (Por cortesa de Graham Hills.)

Observacin de la estructura de las clulas con el microscopio

157

T abla 4 -2 P rin cip ales a co n tecim ien to s en la evolucin del m icroscop io electr n ico y d e su ap licaci n a la biologa celu lar

1897 J J . T h om so n anunci la existencia de partculas cargadas negativamente, ms tarde denominadas electrones. 1924 de B roglie propuso que un electrn en movimiento tiene un comportamiento ondulante. 1926 B u sch demostr que era posible enfocar un haz de electrones utilizando una lente magntica cilindrica. As estableci los fundamentos de la ptica electrnica. 1931 Ruska y colaboradores construyeron el primer microscopio electrnico de transmisin. 1935 Knoll demostr que era posible construir un microscopio electrnico de barrido. Tres aos ms tarde, Von Ardenne construy un prototipo. 1939 Siem ens construy el primer microscopio electrnico de transmisin comercial. 1944 W illiam s y W yckoff introdujeron la tcnica de la metalizacin de las muestras. 1945 P o rte r, C laude y Fullan utilizaron el microscopio electrnico para observar clulas cultivadas, despus de fijarlas y contrastarlas con 0 s0 4. 1948 P ease y B ak er obtuvieron cortes finos (0,1-0,2 |j.m de grosor) de material biolgico. 1952 Palad e, P o rte r y Sjostrand desarrollaron mtodos de fijacin y de obtencin de cortes ultrafinos que permitieron observar por primera vez muchos orgnulos intracelulares. En una de las primeras aplicaciones de estas tcnicas, H .E. H uxley demostr que el msculo esqueltico contiene ordenaciones superpuestas de filamentos proteicos, apoyando as la hiptesis de los filamentos deslizantes de la contraccin muscular. 1953 P o rte r y B lu m disearon el primer ultramicrtomo que fue ampliamente aceptado, incorporando muchas de las caractersticas introducidas con anterioridad por C laude y Sjostrand. 1956 G lauert y colaboradores demostraron que la resina epoxi Araldite era un medio de inclusin altamente eficaz para la microscopa electrnica. Cinco aos ms tarde, Luft introdujo otra resina Epon para la inclusin. 1957 R obertson describi la estructura trilaminar de la membrana celular, observada por primera vez al microscopio electrnico. 1957 Las tcnicas de criofractura desarrolladas inicialmente por Steere fueron perfeccionadas por M oor y M hlethaler. Ms tarde (1966), B ran to n demostr que la criofractura permite visualizar el interior de la membrana. 1959 Singer utiliz anticuerpos acoplados a ferritina para detectar molculas de la clula al microscopio electrnico. 1959 B ren n er y H orn e desarrollaron la tcnica de la tincin negativa, inventada cuatro aos antes por Hall, convirtindola en una tcnica de aplicacin rutinaria para visualizar virus, bacterias y filamentos proteicos. 1963 Sabatini, B en sch y B a rrn e tt introdujeron el glutaraldehdo (generalmente seguido de 0 s0 4) como fijador ms utilizado en microscopa electrnica. 1965 C am bridge In stru m en ts construy el primer microscopio electrnico de barrido, de tipo comercial. 1968 de R osier y Klug describieron las tcnicas para la reconstruccin de las estructuras tridimensionales a partir de micrografas electrnicas. 1975 H en d erson y Unw in determinaron por primera vez la estructura de una protena de membrana mediante reconstruccin por ordenador de micrografas electrnicas de muestras no teidas. 1979 H euser, Reese y colaboradores desarrollaron una tcnica de grabado profundo con una alta resolucin, basada en una congelacin muy rpida.

son enfocados formando una imagen -d e una manera anloga a como se forma la imagen en el microscopio ptico- sobre una placa fotogrfica o sobre una pantalla fluorescente. Puesto que los electrones que han sido dispersados han desaparecido del haz, las regiones densas de la muestra aparecen como reas de un flujo bajo de electrones, que aparecen negras.

158

Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

fuente luminosa lentes condensador muestra lentes objetivo

filamento -" incandescente (fuente de electrones)

Figura 4 -1 7 Caractersticas principales de un microscopio ptico, de un microscopio electrnico de transm isin y de un m icroscopio electrnico de barrido. El dibujo pone

lente ocular

lente proyector

de relieve las similitudes generales del diseo de estos tipos de microscopios. Mientras que las lentes del microscopio ptico son de vidrio, las del microscopio electrnico son bobinas magnticas. Los dos tipos de microscopios electrnicos requieren que la muestra se coloque en el vaco.

detector

IMAGEN OBSERVADA DIRECTAMENTE MICROSCOPIO PTICO

IMAGEN SOBRE UNA PANTALLA FLUORESCENTE MICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMISIN MICROSCOPIO ELECTRONICO DE BARRIDO
O

CH2
ch2 ch2

I I

o . n \ S o o
^ Os %

-/c \

Para poder ser estudiadas al microscopio electrnico, las muestras biolgicas requieren una preparacin especial 9
En los primeros tiempos de su aplicacin a materiales biolgicos, el microscopio electrnico revel la existencia en las clulas de una gran cantidad de estructu ras inimaginables. Sin embargo, antes de que se pudieran hacer estos descubri mientos, los especialistas en microscopia electrnica tuvieron que desarrollar nuevos procedimientos de inclusin, de corte y de tincin de los tejidos. Puesto que las muestras para m icroscopia electrnica han de ser expuestas a un vaco muy intenso, no es posible la observacin de las muestras vivas y h medas. Normalmente los tejidos son protegidos por fijacin -prim ero con glutaraldehdo, que une covalentemente las molculas proteicas a sus vecinas, y despus con tetrxido de osmio , que une y estabiliza las bicapas lipdicas y tam bin las protenas (Figura 4-18). Puesto que los electrones tienen un poder pe netrante muy limitado, norm alm ente los tejidos fijados son cortados en seccio nes extremadamente finas (de 50 a 100 nm de espesor -aproxim adam ente 1/200 del espesor de una clula) antes de poder observarlos. Esto se logra deshidra tando la m uestra e infiltrndola con una resina m onom rica que polimeriza for mando un bloque slido de plstico; el bloque se puede cortar mediante una cuchilla de vidrio o de diamante, en un micrtomo especial (ultramicrtomo). Estas secciones ultrafinas, libres de agua y de otros solventes voltiles, se reco gen sobre una pequea rejilla m etlica circular para observarlas al microscopio (Figura 4-19). En el microscopio electrnico, el contraste depende del nmero atmico de los tomos de la muestra: cuanto ms elevado sea el nmero atmico mayor n mero de electrones sern dispersados y, por lo tanto, mayor ser el contraste obte nido. Las molculas biolgicas estn compuestas por tomos de nmero atmico muy bajo (fundamentalmente de carbono, oxgeno, nitrgeno e hidrgeno). Para hacerlas visibles, normalmente se contrastan (antes o despus de seccionarlas) con sales de metales pesados tales como el osmio, el uranio y el plomo. Los dife rentes componentes celulares aparecern con diferentes grados de contraste, en funcin de su diferente intensidad de contrastado de teido con estas sales. Los lpidos, por ejemplo, tienden a contrastarse de oscuro con el osmio, revelando as la localizacin de las membranas celulares (Figura 4-20).

glutaraidehdo

tetrxido de osmio

Figura 4 -1 8 Dos fijadores qumicos que se utilizan habitualm ente en m icroscopia electrnica. Los dos

grupos reactivos aldehido del glutaraidehdo le permiten establecer enlaces cruzados entre diversos tipos de molculas, formando uniones covalentes entre ellos. El tetrxido de osmio es reducido por numerosos compuestos orgnicos con los que forma complejos mediante puentes cruzados. Resulta especialmente til para la fijacin de las membranas celulares, ya que reacciona con los dobles enlaces C=C existentes en muchos cidos grasos.

rejilla de cobre recubierta con una pelcula de carbono y/o de plstico cinta de cortes seriados ultrafinos de una muestra

11111111111111111
3 mm-

Figura 4 -1 9 Esquem a de una rejilla de cobre utilizada com o soporte de los cortes ultrafinos de una m uestra, en la m icroscopia electrnica de transm isin.

Observacin de la estructura de las clulas con el microscopio

159

En algunos casos, en secciones ultrafinas se pueden localizar determinadas macromolculas mediante tcnicas adaptadas de la m icroscopa ptica. Ciertas enzimas celulares pueden ser detectadas incubando la muestra con un substrato cuya reaccin conduzca al depsito local de un precipitado denso a los electro nes (Figura 4-21). Alternativamente, como veremos en las pgs. 197-198, dife rentes anticuerpos pueden acoplarse a una enzima indicadora (normalmente

Figu ra 4 -2 0 Seccin ultrafna de una clula apical de la raz de una gramnea, contrastada con osmio y otros iones de metales pesados. Se observan fcilmente la pared celular, el ncleo, las vacuolas, las mitocondrias, el retculo endoplasmtico, el com plejo de Golgi y los ribosomas. (Por cortesa de Brian Gunning.)

Figura 4-21 Electronm icrografa de una clula, mostrando la localizacin de una determ inada enzima (la nucletido difosfatasa) en el complejo de Golgi. Una seccin ultrafna de la clula se incub con un substrato que, al reaccionar con la enzima, form un precipitado electrodenso. (Por cortesa de Daniel S. Friend.)

160

Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

peroxidasa) o a una molcula densa a los electrones (normalmente pequeas es feras de oro metlico, denominadas partculas de oro coloidal) y ser utilizados para localizar las macromolculas que reconocen (vase Figura 4-63).

Mediante la m icroscopa electrnica de barrido se pueden obtener imgenes tridim ensionales 10

Efectivamente, las secciones ultrafinas son cortes bidimensionales de un tejido y no revelan la disposicin tridimensional de los componentes celulares. Aunque la tercera dimensin puede ser reconstruida a partir de cientos de secciones se riadas (Figura 4-22), ello supone un proceso largo y tedioso. Afortunadamente existen sistemas ms directos de obtener una imagen tri dimensional. Uno de estos sistemas consiste en examinar las muestras con un m icroscopio electrnico de barrido (SEM, de Scanning Electron Microscope), que suele ser ms pequeo y sencillo que el microscopio electrnico de transmi sin. Mientras que el microscopio electrnico de transmisin utiliza los electro nes que han atravesado la muestra, el microscopio electrnico de barrido utiliza los electrones dispersados o emitidos a partir de la superficie de la muestra. La muestra a examinar se fija, se seca y se recubre con una capa delgada de un m e tal pesado. A continuacin la muestra es barrida por un haz focalizado de elec trones. La cantidad de electrones dispersados o emitidos cuando este haz pri mario bombardea consecutivamente cada uno de los puntos de la superficie metlica es medido y utilizado para controlar la intensidad del segundo haz, que se mueve sincrnicam ente con el haz primario y forma una imagen sobre una pantalla de televisin. De esta manera se construye una imagen completa y muy ampliada de la superficie de la muestra. La tcnica de SEM proporciona una tremenda profundidad de foco; ade ms, debido a que el grado de dispersin de los electrones depende del ngulo relativo entre el haz y la superficie, la imagen tiene puntos brillantes y sombras oscuras que le confieren un aspecto tridimensional (Figura 4-23). Sin embargo solamente se pueden examinar detalles superficiales, y en la mayora de mode-

F ig u ra4-22 Reconstruccin tridimensional a partir de secciones seriadas. A menudo las secciones ultrafinas individuales conducen a impresiones errneas. En este ejemplo, la mayora de las secciones de una clula que contiene una mitocondria ramificada parecen contener dos o tres mitocondrias diferentes. Adems, a partir de las secciones 4 y 7 se podra deducir que una mitocondria se halla en el proceso de divisin. Sin embargo, a partir de los cortes seriados se puede reconstruir la verdadera forma tridimensional.

Figura 4 -23 M icroscopa electrnica de barrido. Electronmicrografa obtenida con un microscopio de barrido, mostrando la disposicin cnica que adoptan los estereocilios que se proyectan desde la superficie de las clulas ciliadas del odo interno (A). Para comparar, la misma estructura se muestra observada por microscopa ptica de contraste de fases interferencial (B) y por microscopa electrnica de seccin fina (C). (Por cortesa de Richard Jacobs y Jam es Hudspeth.)

I________I 1 jim

i________ I 5| im

Observacin de la estructura de las clulas con el microscopio

161

los de SEM la resolucin alcanzable no es muy elevada (aproximadamente 10 nm, con un aumento efectivo de hasta 20 000 veces); por consiguiente, esta tcnica se utiliza para estudiar clulas enteras o tejidos y no orgnulos celulares (vase Figura 4-32).

El som breado metlico perm ite el examen a alta resolucin de detalles superficiales, mediante el microscopio electrnico de transm isin 11
El microscopio electrnico de transmisin puede ser utilizado para estudiar la superficie de una muestra -y generalmente a mayor resolucin que en un mi croscopio electrnico de barrido- de forma que pueden verse macromolculas individuales. Al igual que para la microscopia electrnica de barrido, sobre la muestra seca se evapora una fina pelcula de un metal pesado, como el platino. El metal se vaporiza desde un ngulo oblicuo de manera que se forma una capa que en algunos lugares es ms gruesa que en otros -u n proceso conocido como sombreado porque se crea un efecto de sombras que da una imagen con apa riencia tridimensional. Algunas muestras cubiertas de esta manera son suficientemente finas o sufi cientem ente pequeas para que el haz de electrones penetre en ellas directamen te; ste es el caso de las molculas, los virus y las paredes celulares (Figura 4-24). Pero para el caso de las muestras ms gruesas, el material orgnico ha de ser eli minado por disolucin despus del sombreado, de forma que tan slo quede la fina rplica m etlica de la superficie de la muestra. La rplica se refuerza con una pelcula de carbono para que pueda ser colocada en una rejilla y examinada al microscopio electrnico de transmisin de la manera habitual (Figura 4-25).

100

nm

Figura 4 -24 Electronmicrografifas de molculas aisladas de la protena miosina que han sido sombreadas con platino. La miosina es uno de los com ponentes principales del aparato contrctil del msculo; como se muestra aqu, se com pone de dos cabezas globulares unidas por un tallo comn. {Por cortesa de Arthur Elliot.)

muestra soporte

La microscopia electrnica de criofractura y la de grabado por congelacin proporcionan una nueva visin del interior celular 12
Otros dos mtodos que utilizan rplicas metlicas han sido particularmente ti les en la biologa celular. Uno de ellos, el de la microscopia electrnica de criofractura, constituye un sistema de visualizar el interior de las membranas celu lares. Las clulas se congelan a la temperatura del nitrgeno lquido (-196C) en presencia de un crioprotector (un anticongelante) para impedir la distorsin pro vocada por la formacin de cristales de hielo, y el bloque se fracciona con la hoja de una cuchilla. A menudo, el plano de fractura pasa a travs del centro hidrofbico de las bicapas lipdicas, exponiendo as el interior de las membranas celula res. Las caras de fractura resultantes se metalizan con platino, y las rplicas se observan al microscopio electrnico (como en la Figura 4-25). Estas rplicas es tn llenas de pequeas protuberancias, llamadas partculas intramembrana , que corresponden a grandes protenas de la membrana. Esta tcnica proporcio na una va adecuada y espectacular para visualizar la distribucin de este tipo de protenas en el plano de la mem brana (Figura 4-26). Otro mtodo importante de rplica es la microscopia de grabado por conge lacin (freeze-etch), que puede ser utilizado para examinar tanto el interior como el exterior de las clulas. En esta tcnica las clulas tambin se congelan muy rpidamente -utilizando por ejemplo un dispositivo especial para colocar la muestra contra un bloque de cobre congelado por ejemplo con helio lquido- y el bloque congelado se fragmenta con la hoja de una cuchilla, como acabamos de describir. Pero en este caso el nivel de hielo disminuye alrededor de las clulas (y en menor medida dentro de las clulas) mediante la sublimacin del agua en el vaco a medida que aumenta la temperatura (un proceso denominado deshidratacin por congelacin) (Figura 4-27). Las zonas de la clula expuestas a este pro ceso de grabado son sombreadas como antes, para conseguir una rplica de pla tino. Esta tcnica expone estructuras del interior de la clula y puede revelar su organizacin tridimensional con una claridad excepcional (Figura 4-28).

el metal pesado evaporado de un filam ento "som brea" la muestra

pelcula protectora de carbono evaporada encima de la m uestra

l i l i

la rplica se coloca sobre la superficie de un potente disolvente a fin de elim inar la muestra

la rplica se lava y recoge con una rejilla de cobre para su examen m icroscpico

Figura 4-25 Preparacin de una rplica metalizada de la superfcie de una muestra. Obsrvese que el grosor del metal refleja los contornos de la superficie de la muestra original.

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Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

Figura 4 -2 6 Electronm icrografa de una criofractura de la m em brana del tilacoide de un cloroplasto de una clula vegetal. Las m em branas del tilacoide, que llevan a cabo la fotosntesis, se encuentran apiladas en mltiples capas (vase Figura 14-39). El plano de fractura se ha desplazado de capa a capa, pasando a travs de cada bicapa lipdica y exponiendo las protenas transm em brana que tienen un tamao en el interior de la bicapa suficiente para hacer sombra y aparecer com o partculas intram em brana en esta rplica de platino. Las partculas mayores que se aprecian en la m em brana son el fotosistema II com pleto -u n com plejo de mltiples protenas. (Por cortesa de L.A. Staehelin.)

0,1 iim
Puesto que lo que se observa al microscopio son las rplicas metlicas sombrea das y no las propias muestras, ambos mtodos, la criofractura y el sombreado por congelacin, pueden utilizarse para estudiar clulas congeladas sin fijar, evitndose pues el riesgo de obtener artefactos producidos por el proceso de la fijacin.

La tincin negativa y la microscopa crioelectrnica permiten observar macromolculas a alta resolucin 13

Aunque las macromolculas aisladas, tales como el DNA o las grandes protenas, pueden ser fcilmente visualizadas con el microscopio electrnico si se vaporizan con un metal pesado para darles contraste (vase Figura 4-24), se pueden visuali zar sus detalles finos utilizando tincin negativa. En este caso, las molculas co locadas sobre una fina pelcula de carbn (que resulta casi transparente a los electrones), se lavan con una solucin concentrada de una sal de un metal pesa do, como el acetato de uranilo. Una vez seca la muestra, una pelcula muy fina de la sal metlica cubre la pelcula de carbn por todas partes excepto por donde ha sido excluida debido a la presencia de una macromolcula adsorbida. Puesto que

Figura 4 -2 7 La m icroscopa electrnica por criofractura. La muestra es rpidamente congelada y el bloque de hielo es fracturado con una cuchilla (A). Entonces, el nivel de hielo se reduce por sublimacin del agua en el vaco, de forma que las estructuras de la clula que se encuentran cerca del plano de fractura quedan al descubierto (B). A continuacin, se prepara una rplica de la superficie todava congelada (tal com o se describe en la Figura 4-25) y se examina al m icroscopio electrnico de transmisin.

(A) FRACTURA

las (-|os caras de fractura de la m em brana externa de la envoltura

GRABADO

partcula hielo grabado interm em brana citoplasm a grabado

superficie externa de la m em brana plasm tica y del orgnulo rodeado de m em brana

Observacin de la estructura de las clulas con el microscopio

163

; <^KA'rx^F^ni^-r^ \ 2 ~ r_'

Figura 4-28 Ordenacin regular de los filamentos proteicos de un msculo de insecto. Para obtener esta imagen, las clulas musculares fueron rpidamente congeladas en helio lquido, fracturadas a travs del citoplasma y sometidas a grabado profundo. Luego, se prepar una rplica metalizada que se examin a gran aumento. (Por cortesa de Roger Cooke y John Heuser.)

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la macromolcula permite que los electrones pasen mucho ms fcilmente que a travs del metal pesado circundante, se crea una imagen inversa o negativa de la macromolcula. La tincin negativa es especialmente til para visualizar grandes agregados macromoleculares, tales como virus o ribosomas, y para observar la estructura en subunidades de los filamentos proteicos (Figura 4-29). Tanto la tincin negativa como el sombreado son capaces de proporcionar visiones de alto contraste de la superficie de pequeos conjuntos m acromolecu lares; ambas tcnicas, sin embargo, tienen una resolucin limitada por el tam a o menor de las partculas metlicas utilizadas en el sombreado o en la tincin. Mtodos ms recientes proporcionan una alternativa que ha permitido la visualizacin directa a alta resolucin de incluso las caractersticas internas de estruc turas tridimensionales tales como los virus. En esta tcnica, llamada m icrosco pia crioelectrnica, sobre una rejilla de microscopia se prepara una capa muy delgada (100 nm) de muestra hidratada que es rpidamente congelada. Se re quiere un porta-objetos especial para colocar esta muestra a -160C en el vaco del microscopio, donde puede ser visualizada directamente sin necesidad de fi jacin, tincin, o secado. La homogeneidad de la capa de agua vitrificada y la utilizacin del contraste de fases bajo foco permite la obtencin de imgenes sorprendentem ente claras de estas muestras no fijadas (Figura 4-30). Independientemente del mtodo utilizado, al microscopio electrnico una molcula de protena nicamente da una imagen, dbil y poco definida. El inten to de obtener una m ejor informacin prolongando el tiempo de inspeccin o la intensidad de iluminacin resulta contraproducente, ya que con ello se daa el objeto a examinar. Por consiguiente, para descubrir los detalles de la estructura

Figura 4-29 Electronm icrografa de filamentos de actina por tincin negativa. Cada filamento tiene aproximadamente 8 nm de dimetro y, al examinarlo detenidamente, se observa que est formado por una cadena helicoidal de molculas globulares de actina. (Por cortesa de Roger Craig.)

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Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

Figura 4-30 Microscopa electrnica de un virus. (A) Virus Semliki forest no teido en un capa fina de agua vitrificada, observado al microscopio crioelectrnico a -160C. Como en microscopia ptica, el contraste de fases se puede utilizar para obtener una imagen de una muestra no teida. Mediante mtodos de procesamiento de imgenes se puede combinar un gran nmero de estas imgenes produciendo una imagen tridimensional de alta resolucin. (Por cortesa de Stephen Fuller.)

molecular es necesario combinar la informacin obtenida de muchas molculas con el fin de eliminar los errores aleatorios de la imgenes individuales. Esto es posible para virus o filamentos proteicos, en los que las subunidades individuales se presentan ordenadas de forma regular y repetida; tambin es posible para cualquier substancia que pueda formar ordenamientos cristalinos en dos dimen siones en los que una gran cantidad de molculas presenten una orientacin idntica y posiciones espaciales regulares. Sobre una microfotografa de un orde namiento de cualquier tipo se pueden aplicar las tcnicas de procesamiento de imgenes para obtener la imagen media de una molcula individual, revelando as detalles oscurecidos por el ruido aleatorio de la fotografa original. Este sistema de reconstruccin de imgenes ha permitido obtener con una resolucin de 3,5 nm la estructura interna de virus recubiertos y obtener la forma de una molcula individual de protena a la extraordinaria resolucin de 0,35 nm (vase Figura 10-31). Sin embargo, la microscopa electrnica, incluso en sus for mas ms sofisticadas, no consigue obtener una descripcin completa de la es tructura molecular, ya que los tomos en una molcula estn separados por dis tancias de tan slo 0,1 o 0,2 nm. Para resolver la estructura molecular a detalle atmico, se necesita otra tcnica que utilice rayos X en lugar de electrones.

Resumen
Actualmente disponemos de muchas tcnicas de microscopa ptica que nos per miten la observacin de las clulas. Las clulas que han sido fijadas y teidas se pueden estudiar al microscopio ptico convencional, mientras que para localizar molculas especficas en las clulas se pueden utilizar anticuerpos marcados y es tudiar su localizacin mediante el microscopio de fluorescencia. El microscopio de barrido confocal proporciona finas secciones pticas y puede utilizarse para re construir imgenes tridimensionales. Las clulas vivas se pueden observar utilizan do tcnicas de contraste de fases, contraste de fases interferencial o pticas de cam po oscuro. Todos los tipos de microscopa ptica son ms fciles utilizando tcnicas electrnicas de procesamiento de imgenes, las cuales amplifican la sensibilidad e incrementan la resolucin. Para determinar la estructura detallada de las membranas y dlos orgnulos celulares se requiere una resolucin mayor, la cual se puede alcanzar con el micros copio electrnico de transmisin. Se pueden obtener imgenes tridimensionales de las superficies de clulas y tejidos mediante microscopa electrnica de barrido, mientras que el interior de las membranas y de las clulas puede observarse, respec tivamente, mediante la criofractura y la microscopa de grabado por congelacin. Tambin puede visualizarse fcilmente la forma de macromolculas aisladas, si han sido previamente sombreadas con un metal pesado o contorneadas por tincin negativa, utilizando la microscopa electrnica.
Observacin de la estructura de las clulas con el microscopio

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Aislamiento y crecimiento de clulas en cultivo1 4

A pesar de que al m icroscopio pueden observarse las estructuras de los orgnulos y de las macromolculas de la clula, la comprensin molecular de la clula requiere un anlisis bioqumico detallado. Desgraciadamente los procedimien tos bioqum icos requieren gran cantidad de clulas y siempre empiezan rom pindolas. Si la muestra es un trozo de tejido, se mezclarn entre s fragmentos de todas sus clulas y si, como ocurre en la mayora de los casos, el tejido tena clulas de varios tipos diferentes, se originar una gran confusin. Con el objeto de preservar toda la informacin que sea posible sobre cada uno de los tipos ce lulares, los bilogos celulares han desarrollado tcnicas de disociacin de clu las a partir de los tejidos y de separacin de los distintos tipos celulares. Como resultado de estas tcnicas, pueden analizarse poblaciones relativamente hom o gneas de clulas -y a sea directamente o despus de que su nmero se haya in crementado notablem ente permitiendo que las clulas proliferen en cultivo.

Las clulas de un tejido pueden ser aisladas y separadas en diversos tipos celulares 15
El primer paso del aislamiento de clulas a partir de un tejido que contiene una mezcla de tipos celulares consiste en romper la matriz extracelular y las uniones intercelulares que m antienen unidas entre s las clulas. Normalmente las m ejo res recuperaciones de clulas disociadas viables son las obtenidas de tejidos fe tales o neonatales, tpicam ente tratndolos con enzimas proteolitcas (como la tripsina y la colagenasa) y con agentes [como el cido etilendiamn tetraactico o EDTA (de ethylendiamintetraacetic acid)] que une, o quela, el Ca2* del que de pende la adhesin clula-clula. Entonces, los tejidos pueden ser disociados en clulas individuales y viables, mediante agitacin suave. Para separar los diferentes tipos celulares a partir de una suspensin celular mixta se utilizan diversos mtodos. Uno de ellos consiste en aprovechar las dife rentes propiedades fsicas de las clulas. Por ejemplo, las clulas grandes pue den separarse de las pequeas y las clulas densas de las ligeras, mediante cen trifugacin. Estas tcnicas se describirn al hablar de la separacin de orgnulos y de m acromolculas, para lo cual fueron desarrolladas originalmente. Otra aproximacin se basa en la tendencia de algunos tipos celulares a adherirse fuertemente al cristal o al plstico, lo cual permite separarlas de clulas que se adhieran m enos fuertemente. Una mejora importante de esta ltima tcnica depende de las propiedades especficas de unin de los anticuerpos. Los anticuerpos que se unen especfica mente a la superficie de un solo tipo celular de un tejido pueden acoplarse a va rios tipos de m atrices -co m o colgeno, esferas de polisacridos o plstico- for mando una superficie de afinidad a la que nicam ente se unirn las clulas reconocidas por los anticuerpos. Las clulas unidas se recuperan ms tarde mediante agitacin suave, m ediante el tratam iento con tripsina para digerir las protenas que median la adhesin, o, en el caso de matrices digeribles (como la colgena), m ediante la degradacin de la propia matriz con enzimas (como la colagenasa). La tcnica ms sofisticada de separacin celular se basa en el mareaje espe cfico de las clulas con anticuerpos acoplados a un colorante fluorescente y posterior separacin de las clulas marcadas de las no marcadas mediante un clasificador celular activado por fluorescencia. En este aparato las clulas pa san en fila india a travs de un haz lser determinndose la fluorescencia de cada clula. Un poco ms adelante de la corriente de clulas, una boquilla vibra toria forma diminutas gotitas, la mayora de las cuales contienen una o ninguna clula. Las gotitas que contienen una sola clula reciben automticamente una carga elctrica positiva o negativa en el momento de formarse, dependiendo de si la clula es fluorescente o no lo es; a continuacin, las gotitas son desviadas por un intenso campo elctrico hacia un contenedor apropiado. Los grupos de

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Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

Figura 4-31 Seleccionador de clulas activado por fluorescencia. Cuando una clula pasa a travs del rayo lser, es seleccionada de acuerdo con su fluorescencia. Las gotitas que contienen una sola clula reciben una carga negativa o positiva, segn sea la clula fluorescente o no. Luego, las gotitas son desviadas mediante un campo elctrico, en funcin de su carga, hacia los tubos de recogida. Tngase en cuenta que la concentracin celular debe ser tal que la mayora de las gotitas no contengan ninguna clula; la mayor parte de las gotitas, pues, fluirn al contenedor residual, junto con las gotitas que contengan ms de una clula. Este mismo aparato se puede utilizar tam bin para separar cromosom as marcados con fluorescencia de otros no marcados, proporcionando un valioso material de partida para el aislamiento y mapaje de genes.

clulas que se forman ocasionalmente son detectados por su mayor dispersin de luz y no reciben carga, de forma que caen en un contenedor residual. Estas mquinas pueden seleccionar 1 clula entre 1000 y clasificar unas 5000 clulas por segundo (Figura 4-31). Cuando, mediante alguno de los mtodos mencionados, se ha obtenido una poblacin uniforme de clulas, esta poblacin puede utilizarse directamente para anlisis bioqumicos. Alternativamente, esta poblacin celular constituye un material de partida adecuado para el cultivo celular, permitiendo estudiar el complejo comportamiento de las clulas bajo las condiciones estrictamente de finidas de una placa de cultivo.

Las clulas pueden cultivarse en una placa de cultivo 16

La mayora de tipos celulares tanto vegetales como animales sobreviven, se mul tiplican e incluso expresan propiedades diferenciales en una placa de cultivo en condiciones adecuadas. Las clulas pueden visualizarse al microscopio o anali zarse bioqumicamente, y se pueden estudiar los efectos de la adicin o elimina cin de molculas determinadas tales como hormonas o factores de crecim ien to. Adems, en cultivos mixtos pueden estudiarse las interacciones entre un tipo celular y otro. A menudo se dice que los experimentos con clulas cultivadas han sido realizados in vitro (literalmente en vidrio) para diferenciarlos de los ex perimentos realizados en organismos intactos, que se dice que han sido realiza dos in vivo (literalmente en el organismo vivo). Estos dos trminos pueden re sultar confusos porque a menudo se utilizan en un sentido diferente por los bioqumicos, para los que in vitro se refiere a las reacciones bioqumicas que se producen fuera de la clula mientras que in vivo se refiere a cualquier reaccin que se produce dentro de una clula viva.

Aislamiento y crecimiento de clulas en cultivo

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El cultivo de tejidos empez en 1907 con un experimento destinado a finali zar una controversia de la neurobiologa. La hiptesis que se examinaba era co nocida bajo el nom bre de teora neuronal, la cual afirmaba que cada fibra ner viosa es una prolongacin de una sola clula nerviosa y no el producto de la fusin de varias clulas. Para dilucidar esta polmica se colocaron pequeos fragmentos de mdula espinal en plasma coagulado en una cmara hmeda y caliente y se observaron al microscopio a intervalos regulares de tiempo. Al cabo de un da ms o menos, se pudo observar que las distintas clulas nerviosas em i tan prolongaciones largas y finas hacia el plasma coagulado. De esta manera qued demostrada la teora neuronal y se establecieron las bases de la revolu cin del cultivo celular. Los experimentos originales de 1907 implicaban el cultivo de pequeos fragmentos de tejido, o explantes. En la actualidad, los cultivos se preparan ha bitualmente a partir de suspensiones de clulas obtenidas por disociacin de te jidos, com o se ha descrito ms arriba. A diferencia de las bacterias, la mayor par te de las clulas de los tejidos no estn adaptadas a crecer en suspensin, de forma que necesitan una superficie slida sobre la que poder crecer y dividirse. Actualmente este soporte lo constituye una superficie de plstico de una placa de cultivo (Figura 4-32). Sin embargo distintos tipos celulares tienen requeri mientos diferentes, de forma que algunos de ellos no crecen o no se diferencian a m enos que la placa de cultivo est recubierta de componentes de matriz extracelular, com o el colgeno o la laminina. Los cultivos preparados directamente a partir de los tejidos de un organis mo, con o sin fraccionam iento previo, reciben el nombre de cultivos primarios. En la mayora de los casos, las clulas de los cultivos primarios pueden recupe rarse de la placa de cultivo y utilizarse para formar un gran nmero de cultivos secundarios. De esta forma las clulas pueden ser subcultivadas repetidamente durante semanas o meses. A menudo estas clulas muestran propiedades dife renciadas tpicas de sus orgenes: los fibroblastos continan segregando colge no; las clulas derivadas del msculo esqueltico embrionario se fusionan for mando fibras musculares gigantes que se contraen espontneamente en la placa de cultivo; las clulas nerviosas emiten axones que son excitables elctricamente y que establecen sinapsis con otras clulas nerviosas; las clulas epiteliales for man extensas lminas con muchas de las propiedades de un epitelio intacto. Puesto que estos fenm enos se producen en los cultivos, resultan accesibles al estudio a travs de sistemas y tcnicas que no se pueden aplicar en los tejidos in tactos.

10 jim
Figura 4-32 Clulas en cultivo.
Electronmicrografa de barrido de fibroblastos de rata creciendo sobre una superficie plstica en cultivo de tejidos. (Por cortesa de Guenter Albrecht-Buehler.)

Los medios definidos qum icam ente, libres de suero, permiten la identificacin de factores de crecim iento especficos 17
Hasta principios de los aos 1970 el cultivo de tejidos era algo as como una mezcla de ciencia y brujera. Aunque los cogulos plasmticos fueron substitui dos por placas de medios lquidos conteniendo cantidades especficas de peque as molculas como sales, glucosa, aminocidos, y vitaminas, la mayora de los medios incluan tam bin una proporcin mal definida de una mezcla de m acro molculas en forma de suero de caballo o de suero fetal de ternera, o un extracto crudo de embrin de pollo. Estos medios todava se utilizan actualmente para la mayora de cultivos rutinarios (Tabla 4-3) pero resultan inadecuados para el es tudio de las necesidades de macromolculas que un tipo celular determinado tiene para prosperar y funcionar normalmente. Esta dificultad ha conducido al desarrollo de medios libres de suero definidos qumicamente. Adems de las pequeas molculas habituales estos medios defi nidos contienen una o ms protenas especficas que la mayora de clulas nece sitan para sobrevivir y proliferar en cultivo. Entre ellas se encuentran los factores de crecim iento que estimulan la proliferacin y la transferrina que transporta hierro al interior de las clulas. La mayora de las molculas sealizadoras protei cas extracelulares esenciales para la supervivencia, desarrollo y proliferacin de

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Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

Tabla 4-3 Composicin de un medio tpico adecuado para el cutivo de clulas de mamfero Protenas (necesarias en medios qumicamente definidos, libres de suero) Insulina Transferrina Factores de crecimiento especfico

Aminocidos Arginina Cisterna Glutamina Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Treonina Triptfano Tirosina Valina

Vitaminas Biotina Colina Folato Nicotinamida Pantotenato Piridoxal Tiamina Riboflavina

Sales NaCl KC1 NaH2 P04 NAHCO3 CaCl2 MgCl2

Varios Glucosa Penicilina Estreptomicina Rojo fenol Suero total

La glucosa se utiliza a concentraciones de 5 a 10 mM. Todos los aminocidos son de la forma l y con una o dos excepciones se utilizan a con centraciones de 0,1 a 0,2 mM; las vitaminas se utilizan a concentraciones 100 veces menores, es decir, alrededor de 1 |j.M . El suero, que gene ralmente es de caballo o de ternera, se aade hasta formar el 10% del volumen total. La penicilina y la estreptomicina son antibiticos que se utilizan para inhibir el crecimiento de las bacterias. El rojo fenol es un colorante indicador del pH, que permite seguir la variacin de color para asegurar que el pH sea de 7,4 aproximadamente. Generalmente los cultivos se mantienen en recipientes de plstico o de vidrio, con una superficie preparada adecuadamente que permi ta la adherencia de las clulas. Los recipientes se conservan en una estufa de cultivo a 37C, en una atmsfera de 5% de C 0 2 y 95% de aire.

determinados tipos celulares se han descubierto a travs de estudios de cultivos celulares y la bsqueda de nuevas molculas ha sido enormemente facilitada por la asequibilidad de medios definidos qumicamente y libres de suero.

Las lneas celulares eucariotas constituyen una fuente ampliamente utilizada para la obtencin de clulas homogneas 18
La mayora de las clulas de los vertebrados mueren tras un nmero finito de di visiones en cultivo: por ejemplo, las clulas cutneas humanas en cultivo sobre viven durante algunos meses, dividindose nicamente entre 50 y 100 veces an tes de morir. Se sugiri que esta vida limitada estaba relacionada con la vida limitada del animal del que derivan las clulas. Sin embargo, en cultivo ocasio nalmente surgen algunas clulas que han sufrido algn cambio gentico que las hace realmente inmortales. Estas clulas proliferan indefinidamente y pueden propagarse com o una lnea celular (Tabla 4-4). Las lneas celulares preparadas a partir de clulas cancerosas difieren de las preparadas a partir de clulas normales, en varios aspectos; por ejemplo, a m e nudo las lneas de clulas cancerosas crecen sin fijarse a ninguna superficie y proliferan en una placa de cultivo hasta una densidad mucho mayor que la de las clulas normales. Experimentalmente pueden inducirse propiedades simila res a stas en clulas normales mediante la transformacin con un virus o con una substancia qumica inductora de tumores. Las lneas celulares transform a das resultantes son capaces de provocar tumores si se inyectan a un animal. Las lneas celulares, tanto transformadas como no transformadas, resultan extrema damente tiles para la investigacin celular como fuente de un nmero muy ele vado de clulas de un tipo uniforme, especialmente porque se pueden guardar en nitrgeno lquido a -196C durante un perodo indefinido de tiempo, y des pus de descongeladas todava son viables. Sin embargo, es importante recono cer que las clulas de ambos tipos de lneas celulares casi siempre difieren de sus clulas progenitoras de los tejidos de las que derivan, en algunas caractersticas importantes. Tabla 4-4 Algunas lneas celulares utilizadas habitualmente Lnea celular* 3T3 BHK 21 MDCK HeLa PtK l L6 PC 12 SP 2 Tipo celular y origen fibroblasto (ratn) fibroblasto (hmster sirio) clula epitelial (perro) clula epitelial (humana) clula epitelial (rata canguro) mioblasto (rata) clula cromafnica (rata) clula plasmtica (ratn)

* Muchas de estas lneas celulares deri van de tumores. Todas ellas son capaces de multiplicarse indefinidamente en cul tivo y expresan por lo menos algunas de las propiedades diferenciales de su ori gen celular. Las clulas BHK 21, HeLa y SP 2 son capaces de crecer en suspen sin; las otras lneas celulares requieren un substrato de cultivo slido para multi plicarse.

Aislamiento y crecimiento de clulas en cultivo

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A pesar de que todas las clulas de una lnea celular son muy similares entre s, a menudo no son idnticas. La uniformidad gentica de una lnea celular puede mejorarse con el clonaje celular, mediante el cual se asla una nica clu la y se le permite proliferar hasta formar una gran colonia. Un clon es cualquier poblacin de clulas derivadas de una nica clula ancestral. Una de las aplica ciones ms importantes del clonaje celular ha sido el aislamiento de lneas celu lares mutantes con defectos en determinados genes. A menudo el estudio de las clulas que son defectuosas en una protena determinada revela muchos datos sobre la funcin que tiene esta protena en las clulas normales.

Las clulas pueden fusionarse formando clulas hbridas 19

Es posible fusionar una clula con otra formando una clula combinada con dos ncleos separados, denominada heterocarionte. La fusin se suele realizar tra tando una suspensin de clulas con ciertos virus inactivados o con polietiln glicol, que altera las m embranas plasmticas de las clulas de tal forma que s tas tienden a fusionarse entre s. Los heterocariontes ofrecen la posibilidad de mezclar los com ponentes de dos clulas diferentes para estudiar sus interaccio nes. Por ejemplo, el ncleo inerte de un eritrocito de pollo cuando es expuesto por fusin celular al citoplasma de una clula en cultivo en crecimiento, se reac tiva produciendo RNA y con el tiempo, replicando su DNA. La primera prueba directa de que las protenas de mem brana son capaces de desplazarse en el pla no de la mem brana plasmtica se obtuvo de un experimento en el que se fusio naron clulas de ratn con clulas humanas: aunque las protenas de superficie de las clulas de ratn y de la clula humana inicialmente estaban confinadas en sus propias mitades de la mem brana plasmtica del heterocarionte, rpidamen te difundieron y se mezclaron por toda la superficie de la clula. Con el tiempo, el heterocarionte sufrir una mitosis, producindose una c lula hbrida en la que las dos envolturas nucleares se han disgregado permitien do que todos los crom osom as se agrupen en un gran ncleo nico (Figura 4-33). Aunque estas clulas hbridas puedan ser clonadas generando lneas celulares hbridas, las clulas hbridas iniciales tienden a ser inestables y a perder crom o somas. Por razones desconocidas estas clulas hbridas hombre-ratn pierden de forma predominante cromosomas humanos. Estos cromosomas se pierden de manera aleatoria, dando lugar a diversas lneas celulares hbridas hombre-ratn diferentes, cada una de las cuales contiene algunos (o uno solo) crom oso mas humanos. Este fenmeno ha permitido determinar la localizacin de genes en el genoma humano. Por ejemplo, nicamente las clulas hbridas que contie nen el crom osom a humano 11 sintetizan la insulina humana, lo cual indica que el gen que codifica la insulina se halla situado en el cromosoma 11. Estas mis-

SUSPENSIN DE DOS TIPOS CELULARES, CENTRIFUGACIN Y ADICIN DE UN AGENTE DE FUSIN FUSIN CELULAR Y FORMACIN DE HETEROCARIONTES, QUE POSTERIORMENTE SON CULTIVADOS

tres clones de clulas hbridas, cada uno de los cuales conserva un nm ero reducido de crom osom as hum anos diferentes junto con toda la dotacin crom osm ica del ratn EL MEDIO SELECTIVO SOLO PERMITE PROLIFERAR A LOS HETEROCARIONTES, LOS CUALES SE CONVIERTEN EN CLULAS HBRIDAS QUE POSTERIORMENTE SERN CLONADAS

fibroblasto clula tum oral hum ano de ratn

heterocarionte

clula hbrida

Figura 4-3 3 Produccin de clulas hbridas. Clulas humanas se fusionan con clulas de ratn, producindose heterocariontes (cada uno de ellos conteniendo dos o ms ncleos) que posteriormente darn lugar a clulas hbridas (cada una de ellas con un nico ncleo fusionado). Estas clulas hbridas en particular resultan tiles para localizar genes humanos en los cromosomas, ya que la mayora de los cromosomas humanos se pierden rpidamente de manera aleatoria, con lo que quedan clones que conservan tan slo uno o unos cuantos genes. A menudo, las clulas hbridas producidas por fusin de otros tipos celulares conservan la mayora de sus cromosomas.

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Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

Tabla 4-5 Algunos de los hitos en el desarrollo del cultivo de tejidos 1885 Roux demostr que las clulas embrionarias de pollo pueden mantenerse vivas en una solucin salina, fuera del cuerpo del animal. 1907 Harrison cultiv mdula espinal de anfibio en un cogulo linftico, demostrando as que los axones se producen como prolongaciones de clulas nerviosas. 1910 Rous indujo un tumor utilizando un extracto filtrado de clulas tumorales de pollo, que ms tarde se demostr que contenan un virus de RNA (virus del sarcoma de Rous). 1913 Carrel demostr que las clulas podan crecer en cultivo durante mucho tiempo, siempre que fueran alimentadas regularmente y bajo condiciones aspticas. 1948 Earle y colaboradores aislaron clulas de la lnea celular L y demostraron que en cultivo tisular forman clones de clulas. 1952 Gey y colaboradores establecieron una lnea continua de clulas derivada de carcinoma cervical humano, que ms tarde se convirti en la conocida lnea celular HeLa. 1954 Levi-Montalcini y colaboradores demostraron que el factor de crecimiento nervioso (NGF, de Nerve Growth Factor) estimula el crecimiento de los axones en cultivo. 1955 Eagle desarroll la primera investigacin sistemtica sobre los requerimientos nutricionales esenciales de las clulas en cultivo y encontr que las clulas animales se pueden propagar en una mezcla definida de pequeas molculas suplementada con una reducida proporcin de protenas sricas. 1956 Puck y colaboradores seleccionaron mutantes con requerimientos de crecimiento alterados a partir de clulas HeLa en cultivo. 1958 Temin y Rubin desarrollaron un mtodo cuantitativo para la infeccin de cultivos de clulas de pollo mediante el virus del sarcoma de Rous purificado. En la dcada siguiente Stoker, Dulbecco, Green y otros virlogos establecieron las caractersticas de sta y de otras transformaciones vricas. 1961 Hayflick y Moorhead demostraron que los fibroblastos humanos en cultivo mueren tras un nmero finito de divisiones. 1964 Littlefeld introdujo el medio HAT para el crecimiento selectivo de hbridos celulares somticos. Junto con la tcnica de la fusin celular, este medio hizo accesible la gentica de las clulas somticas. Kato y Takeuchi obtuvieron una planta completa de zanahoria a partir de una sola clula de raz de zanahoria mantenida en cultivo. 1965 Ham introdujo un medio definido, sin suero, capaz de permitir el crecimiento clonal de ciertas clulas de mamfero. Harris y Watkins produjeron los primeros heterocariontes de clulas de mamfero, mediante la fusin inducida vricamente de clulas humanas y de clulas de ratn. 1968 Augusti-Tocco y Sato adaptaron al cultivo clulas nerviosas tumorales de ratn (neuroblastoma) y aislaron clones que eran excitables elctricamente y producan prolongaciones nerviosas. En esta poca se aislaron otras clulas diferenciadas, entre ellas lneas celulares hepticas y de msculo esqueltico. 1975 Khler y Milstein produjeron las primeras lneas celulares de hibridomas que segregaban anticuerpos monoclonales. 1976 Sato y colaboradores publicaron el primero de una serie de informes, demostrando que para crecer en un medio sin suero, las lneas celulares diferentes requieren mezclas diferentes de hormonas y de factores de crecimiento. 1977 Wigler y Axel y colaboradores desarrollaron un eficiente mtodo para introducir genes humanos de copia nica en el interior de clulas cultivadas, adaptando los mtodos desarrollados inicialmente por Graham y van der Eb.

mas clulas hbridas tam bin se utilizan como fuente de DNA humano para pre parar libreras de DNA de cromosomas humanos. Ms adelante en este captulo aprenderemos de qu forma se han utilizado las clulas hbridas en la produc cin de anticuerpos monoclonales.

Aislamiento y crecimiento de clulas en cultivo

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En la Tabla 4-5 se enumeran algunas de las etapas ms importantes del de sarrollo del cultivo en tejidos.

Resumen
Habitualmente los tejidos de organismos muy jvenes se pueden disociar en sus componentes celulares, a partir de los cuales pueden purificarse diferentes tipos ce lulares individuales, los cuales pueden utilizarse para su anlisis bioqumico o para establecer cultivos celulares. Muchas tipos de clulas animales y vegetales so breviven y proliferan en una placa de cultivo si se les suministra el medio de cultivo adecuado conteniendo nutrientes y factores de crecimiento especficos. Aunque la mayora de las clulas animales mueren despus de un nmero finito de divisiones, en los cultivos surgen espontneamente unas clulas variantes inmortales que pue den ser mantenidas indefinidamente como lneas celulares. Los clones derivados de una nica clula ancestral hacen posible aislar poblaciones uniformes de clulas mulantes con defectos en una sola protena. Pueden fusionarse dos tipos diferentes de clulas formndose heterocariontes (clulas con dos ncleos), que pueden utili zarse para estudiar las interacciones entre los componentes de las dos clulas origi nales. Con el tiempo los heterocariontes forman clulas hbridas (con un ncleo fu sionado), las cuales proporcionan un mtodo muy adecuado para localizar genes en los cromosomas.

Fraccionamiento de las clulas y anlisis de sus molculas20

Aunque los anlisis bioqumicos requieren la disgregacin de la delicada anato ma de la clula, se han desarrollado mtodos suaves de separacin que preser van la funcin de los diversos com ponentes celulares. De la misma forma que un tejido puede ser disgregado en sus diferentes tipos celulares vivos, tam bin la clula puede ser fraccionada en sus orgnulos y macromolculas funcionales. En esta seccin vamos a centrarnos en los mtodos que permiten la purificacin de orgnulos y de macromolculas. En el Captulo 7 se discuten las poderosas tcnicas del DNA recom binante, utilizadas para analizar genes y protenas.

cmara acorazada

m aterial en sedim entacin

Los orgnulos y las macrom olculas pueden separarse por ultracentrifugacin 21

Las clulas pueden disgregarse de varias maneras: pueden someterse a shock os mtico o a vibraciones ultrasnicas, pueden hacerse pasar a travs de un pequeo orificio o pueden molerse. Estos procedimientos rompen muchas de las membra nas de la clula (incluidas la membrana plasmtica y las membranas del retculo endoplasmtico) y los fragmentos se unen inmediatamente formando pequeas vesculas cerradas. Sin embargo, si estos procedimientos de disgregacin se apli can cuidadosamente, dejan fundamentalmente intactos diversos orgnulos como el ncleo, las mitocondrias, el complejo de Golgi, los lisosomas y los peroxisomas. As, la suspensin de clulas queda reducida a un espesa sopa (denominada homogenado o extracto) que contiene una gran diversidad de partculas unidas a membrana, cada una de un tamao, una carga y una densidad caractersticas. Si se ha escogido cuidadosamente el medio de homogeneizacin (mediante el siste ma de prueba y error para cada orgnulo), las diferentes partculas -incluyendo las vesculas derivadas del retculo endoplasmtico, llamadas microsomas- conservan la mayor parte de sus propiedades bioqumicas originales. A continuacin, se pueden separar los diferentes componentes de este homogenado. Esto nicam ente es posible gracias al desarrollo comercial, a princi pios de los aos 1940, de un instrumento conocido con el nombre de ultracentrfuga preparativa, en el que los preparados de clulas rotas se exponen a altas

refrigeracin

m otor

vaco

Figura 4 -34 La ultracentrfiiga preparativa. La muestra se coloca en unos tubos que quedan insertados en un anillo de orificios cilindricos de un rotor metlico. La rpida rotacin del rotor genera unas fuerzas centrfugas enormes, que provocan la sedimentacin de las partculas de la muestra. El vaco disminuye el rozamiento, con lo que el rotor no se calienta tanto y el sistema de refrigeracin puede m antener la muestra a 4C.

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Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

velocidades de giro (Figura 4-34). Este tratamiento separa los componentes ce lulares en funcin de su tamao y su densidad: en general, las unidades mayores experimentan mayores fuerzas centrfugas y se desplazan por el tubo ms rpi damente. A una velocidad relativamente reducida sedimentan los com ponentes de tamao mayor, como los ncleos y las clulas enteras, formando un precipi tado (pellet) en el fondo del tubo de la centrfuga; a una velocidad algo superior se deposita un precipitado de mitocondrias, y a velocidades an ms altas y con perodos de centrifugacin ms prolongados, se pueden recoger primero las pequeas vesculas cerradas y luego los ribosomas (Figura 4-35). Todas estas fracciones son impuras pero se pueden eliminar muchos de sus contam i nantes resuspendiendo de nuevo los precipitados y repitiendo varias veces el procedimiento descrito de centrifugacin. El mtodo de centrifugacin constituye el primer paso de la mayora de fraccionamientos, pero slo separa los com ponentes que son muy diferentes en tamao. Se puede obtener un mayor grado de separacin colocando el homogenado como una estrecha banda en la parte superior de una solucin salina dilui da que llene el tubo de centrfuga. Cuando se centrifuga, los diversos com po nentes de la mezcla se desplazan a travs de la solucin salina como series de bandas distintas, cada una a diferente velocidad, en un proceso denominado ve locidad de sedimentacin (Figura 4-36). Para que el proceso sea efectivo, las bandas deben ser protegidas del mezclado por conveccin, lo cual sucede habi tualmente cuando una solucin densa (por ejemplo, una que contenga orgnulos) se halla en la parte superior de otra de menor densidad (la solucin salina). Esto se consigue rellenando el tubo de centrfuga con un gradiente de sacarosa preparado con un aparato especial de mezclado; el gradiente de densidad resul tante, con la zona ms densa en el fondo del tubo, consigue que cada una de las regiones de la solucin salina sea ms densa que cualquier solucin superior evitando as el mezclado por conveccin que distorsionara la separacin. Cuando el homogenado es sedimentado a travs de estos gradientes de den sidad, los diferentes com ponentes celulares se separan en distintas bandas que pueden ser recolectadas individualmente. La velocidad a la que sedimenta cada uno de los com ponentes depende fundamentalmente de su tamao y de su for ma, y suele expresarse como coeficiente de sedimentacin o valor s. Las ultracentrfugas actuales pueden alcanzar velocidades superiores a 80 000 rpm y produ cir fuerzas de ms de 500 000 veces la de la gravedad. A estas enormes fuerzas se pueden separar entre s en funcin de su tamao incluso las macromolculas pequeas como las molculas de tRNA y las enzimas sencillas. Rutinariamente se utilizan los coeficientes de sedimentacin de los complejos macromoleculares para determinar la masa total del complejo y, por tanto, el nmero de subunidades de cada tipo que presentan. La ultracentrfuga se utiliza tambin para separar los componentes celulares en funcin de su densidad de flotacin, independientemente de su tamao. En este caso, la muestra normalmente se hace sedimentar a travs de un gradiente discontinuo que contiene una concentracin muy elevada de sacarosa o de clo ruro de cesio. Cada com ponente celular empieza a descender por el gradiente com o en la Figura 4-36, hasta que llega a una zona en la que la densidad de la so lucin es igual a su propia densidad. En este lugar del tubo el com ponente flota y ya no puede desplazarse ms. Por consiguiente, en el tubo de la centrfuga se forman series de bandas distintas, siendo las bandas que contienen los com po nentes de mayor densidad de flotacin las que se hallan ms cerca del fondo del tubo de centrfuga. El mtodo, denominado equilibrio de sedimentacin, es su ficientem ente sensible para separar macromolculas que han incorporado is topos pesados, como el 13C o el 15N de las mismas macromolculas no marcadas. De hecho, el mtodo del cloruro de cesio fue desarrollado, en 1957, para separar el DNA marcado del no marcado producido despus de la exposicin de una po blacin de bacterias en crecimiento a precursores de nucletidos con 15 N; este experimento clsico proporcion la prueba directa de la replicacin semiconservativa del DNA.

hom ogenado celular

CENTRIFUGACION A VELOCIDAD BAJA

*

el precipitado contiene clulas SOBRENADANTE SOMETIDO A CENTRIFUGACIN A VELOCIDAD MEDIA

enteras, ncleos y citoesqueleto

el precipitado contiene m itocondrias, lisosom as y peroxisom as SOBRENADANTE SOMETIDO A CENTRIFUGACIN A VELOCIDAD ALTA

el precipitado contiene m icrosom as y pequeas vesculas v_y SOBRENADANTE SOMETIDO A CENTRIFUGACIN A VELOCIDAD MUY ALTA

el precipitado contiene ribosom as, virus y grandes m acrom olculas

Figura 4-35 Fraccionam iento celular por centrifugacin. Centrifugaciones repetidas a velocidades progresivamente mayores fraccionarn los extractos celulares en sus componentes. En general, cuanto menor sea el tamao del componente subcelular mayor ser la fuerza centrfuga necesaria para sedimentarlo. Los valores tpicos de las diversas etapas de centrifugacin mostradas en la figura son las siguientes: vel. baja: 1000 veces la gravedad durante 10 minutos vel. media: 20 000 veces la gravedad durante 20 minutos vel. alta: 80 000 veces la gravedad durante 1 hora vel. muy 150 000 veces la gravedad alta: durante 3 horas

Fraccionamiento de las clulas y anlisis de sus molculas

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(A)
- muestra gradiente de sacarosa estabilizador

(B)

gradiente discontinuo de sacarosa (e.g., 20-70%)

CENTRIFUGACIN

com ponente de sedim entacin lenta com ponente de sedim entacin rpida FRACCIONAMIENTO com ponente de baja densidad

---- com ponente

de alta densidad

Los detalles moleculares de los procesos celulares complejos nicam ente se pueden descifrar en sistemas libres de clulas 22
Los estudios de orgnulos y de otros grandes com ponentes subcelulares obteni dos por ultracentrifugacin han constituido avances muy importante en la de term inacin de la junciones de los diferentes com ponentes de la clula. As por ejemplo, diferentes experimentos sobre mitocondrias y cloroplastos purificados por centrifugacin demostraron la funcin central de estos orgnulos en las in~ terconversiones energticas. Anlogamente, las vesculas formadas de nuevo a partir de fragmentos del retculo endoplasmtico liso y rugoso (microsomas) han sido separadas unas de otras y analizadas como modelos funcionales de es tos mismos com partim entos en las clulas intactas. Una extensin de esta apro ximacin hace posible estudiar otros procesos biolgicos libres de todas las complejas reacciones laterales que ocurren en la clula, y sin las constricciones de tener que m antener las clulas como un todo. Por ello, los extractos celulares fraccionados que mantienen su funcin biolgica (denominados sistemas libres de clulas) son ampliamente utilizados en biologa celular. Uno de los primeros xitos de este sistema de estudio fue la deduccin del mecanismo de sntesis proteica. El punto de partida lo constituy un extracto ce lular crudo que era capaz de traducir las molculas de RNA a protena. El fraccio namiento de este extracto dio lugar a ribosomas, tRNA y varias enzimas, que, en conjunto, constituyen la maquinaria de la sntesis proteica. Una vez se dispuso de los componentes individuales purificados, fue posible ponerlos o quitarlos uno a uno del medio de incubacin, consiguindose as definir el papel exacto de cada uno de estos componentes. Ms tarde se utiliz este mismo sistema de traduccin in vitro para descifrar el cdigo gentico, usando polirribosomas sintticos de se-

Figura 4-36 Comparacin entre los mtodos de velocidad de sedimentacin y equilibrio de sedimentacin. En velocidad de sedimentacin (A), la muestra se coloca sobre una solucin diluida de sacarosa y los componentes subcelulares sedimentan a diferentes velocidades de acuerdo con su tamao. Para estabilizar las bandas que sedimentan y evitar que se mezclen por fenmenos de conveccin originados por pequeas diferencias de temperatura o de concentracin de los solutos, el tubo contiene un gradiente continuo de sacarosa que aumenta de concentracin hacia el fondo del tubo (tpicamente desde 5% a 20% de sacarosa). Despus de la centrifugacin, los diferentes componentes pueden recogerse por separado; el sistema ms sencillo de hacerlo consiste en perforar el tubo de la centrfuga y recoger el medio gota a gota, tal como ilustra la figura. En el equilibrio de sedimentacin (B) cuando los componentes subcelulares se centrifugan en un gradiente, pueden desplazarse arriba y abajo hasta que alcanzan una zona en que su densidad est comprendida entre las densidades vecinas del gradiente. Aunque aqu se presenta un gradiente de sacarosa, para separacin de protenas y de cidos nucleicos se utilizan habitualmente gradientes de densidad preparados con cloruro de cesio. Las bandas finales, en el equilibrio, se pueden recoger como en (A).

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Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

cuencia conocida como RNA mensajero (mRNA) para ser traducido. Hoy en da se utilizan diversos sistemas de traduccin in vitro para determinar cmo las pro tenas recin sintetizadas son clasificadas y dirigidas a diversos compartimentos intracelulares y tambin para identificar las protenas que son codificadas por pre paraciones purificadas de mRNA -u n paso importante en los mtodos de clonaje gnico. En la Tabla 4-6 se presentan algunos de los hitos del desarrollo de los m todos utilizados en el fraccionamiento de extractos celulares. Una gran cantidad de la informacin que hoy en da conocemos acerca de la biologa molecular de la clula, se ha descubierto estudiando sistemas libres de clulas. Para citar algunos de los muchos ejemplos, estudios de este tipo se han utilizado para analizar los detalles moleculares de la replicacin y la transcrip cin del DNA, de la maduracin por corte y empalme del RNA (splicing), de la contraccin muscular y del movimiento de partculas a lo largo de los microtbulos. Los sistemas libres de clulas se han utilizado en estudios de procesos tan complejos y altamente organizados como el ciclo de divisin celular, la separa cin de cromosomas sobre el huso mittico y los procesos de transporte vesicu lar implicados en los desplazamientos de las protenas desde el retculo endoplsmico, a travs del complejo de Golgi hasta la membrana plasmtica. El anlisis de un sistema libre de clulas supone la separacin completa final de to dos sus com ponentes macromoleculares individuales y en particular de todas sus protenas. Ahora consideraremos cmo se puede lograr esta separacin.

Tabla 4-6 Algunos de los principales acontecimientos del desarrollo de la ultracentrifuga y de la preparacin de extractos libres de clulas 1897 Buchner demostr que los extractos de levadura, libres de clulas, pueden fermentar los azcares produciendo dixido de carbono y etanol, con lo que se establecironlas bases de la enzimologa. 1926 Svedberg desarroll la primera ultracentrfuga analtica y la utiliz para estimar el peso molecular de la hemoglobina, que cifr en 68 000 daltons. 1935 Pickels y Beams introdujeron varias caractersticas nuevas en el diseo de la ultracentrfuga, que condujeron a su utilizacin como instrumento preparativo. 1938 Behrens emple la ultracentrifugacin diferencial para separar los ncleos del citoplasma de clulas hepticas, tcnica que luego desarrollaron Claude, Brachet, Hogeboon y otros durante los aos 1940 y principios de los 1950 para el fraccionamiento de orgnulos celulares. 1939 Hill demostr que los cloroplastos aislados, cuando se iluminaban, podan efectuar reacciones de fotosntesis. 1949 Szenz-Gyorgyi demostr que las miofibrillas aisladas de clulas de msculo esqueltico se contraen al aadirles ATP. En 1955 Hofmann-Berling desarroll un sistema libre de clulas similar a ste para estudiar el movimiento ciliar. 1951 Brakke utiliz la centrifugacin en gradiente de densidad en soluciones de sacarosa para purificar un virus vegetal. 1954 de Duve aisl lisosomas por centrifugacin y, ms tarde, peroxisomas. 1954 Zamecnik y colaboradores desarrollaron el primer sistema libre de clulas que realizaba sntesis proteica. A ello sigui una dcada de intensa actividad de investigacin, durante la cual fue dilucidado el cdigo gentico. 1957 Meselson, Stahly Vinograd desarrollaron la centrifugacin en gradiente de densidad en soluciones de cloruro de cesio para separar cidos nucleicos. 1975 Dobberstein y Blobel demostraron la translocacin de protenas a travs de membranas, en sistemas libres de clulas. 1976 Neher y Sakmann desarrollaron el registro de zona para medir la actividad de canales inicos aislados. 1983 Lohkay Masui produjeron extractos concentrados a partir de huevos que in vitro realizaban el ciclo celular completo. 1984 Rothman y colaboradores reconstituyeron in vitro el trfico de vesculas de Golgi utilizando un sistema libre de clulas.

Fraccionamiento de las clulas y anlisis de sus molculas

175

Las protenas pueden separarse mediante cromatografa 23

Uno de los mtodos de utilidad ms general para el fraccionamiento de las pro tenas es el de la crom atografa, tcnica desarrollada para separar pequeas molculas como azcares y aminocidos. Un tipo muy comn de cromatografa, todava muy utilizado actualmente para separar pequeas molculas, es la cro matografa de particin. Tpicamente, una gota de la muestra se aplica como una m ancha en una hoja de material absorbente, que puede ser papel (cromato grafa de papel) o una hoja de plstico o de cristal recubierta de una fina capa de un material absorbente inerte, com o celulosa o gel de slice (cromatografa en capa fina). A continuacin, se deja que una mezcla de disolventes, como por ejemplo el agua y un alcohol, impregne la hoja desde uno de sus extremos; a me dida que el lquido se va desplazando a travs de la hoja, va separando las mol culas de la muestra en funcin de su solubilidad en cada uno de los dos disol ventes. Los disolventes se escogen de forma que uno de ellos se adsorba con mayor intensidad en el material absorbente que el otro formando una capa de disolvente estacionaria en la superficie de la hoja. En cada regin de la hoja las molculas se equilibran entre el disolvente estacionario y el mvil: las que son ms solubles en el disolvente fuertemente adsorbido son relativamente retarda das porque consum en ms tiempo en la capa estacionaria, mientras que las que son ms solubles en el otro disolvente se mueven ms rpidamente. Despus de un cierto nmero de horas, la hoja se seca y se tie para localizar la situacin de las diferentes molculas (Figura 4-37). Las protenas se suelen fraccionar mediante la cromatografa en columna, en la que una mezcla de protenas en solucin se hace pasar a travs de una co-

Figura 4-37 Separacin de molculas pequeas mediante crom atografa sobre papel. Despus de aplicar la muestra en un extremo del papel (el origen) y de secarla, se permite que una solucin que contiene una mezcla de dos disolventes fluya lentam ente a lo largo del papel por capilaridad. Los diferentes com ponentes de la muestra se desplazan sobre el papel a velocidades distintas, en funcin de su solubilidad relativa en el solvente que es adsorbido preferentemente por el papel. El desarrollo de esta tcnica revolucion los anlisis bioqumicos durante los aos 1940.

solvente aplicado de form a aplicacin continua a la parte superior de la de la colum na desde un m uestra gran depsito de solvente

Figura 4-3 8 Separacin de molculas mediante crom atografa en columna. La muestra se aplica en la parte superior de una columna cilindrica de vidrio o de plstico, que contiene una matriz slida permeable, por ejemplo de celulosa, inmersa en un solvente. A continuacin se hace pasar lentamente a travs de la columna una gran cantidad de solvente, recogindolo en tubos separados a medida que sale de la parte inferior de la columna. Los diversos com ponentes de la muestra se desplazan a distintas velocidades a travs de la columna quedando as fraccionados en tubos distintos.

1^

tubo de ensayo tiem po

I
molculas fraccionadas eluidas y recogidas

176

Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

flujo de solvente 1 I
i + -# + + +

flujo de solvente i esfera cargada positivam ente molcula de carga negativa unida m olcula de carga positiva libre

flujo de solvente 1 I ! t esfera con un substrato unido covalentemente m olcula de enzima unida otras protenas pasan a travs de la m atriz

O *C
esferas porosas
*

\ a

+ #. - + + # + + + + v -

molcula pequea retardada m olcula grande no retardada

/ \

(A) CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO INICO

(B) CROMATOGRAFIA DE FILTRACION EN GEL

(C) CROMATOGRAFA DE AFINIDAD

Figura 4-39 Tres tipos de matriz utilizados en crom atografa. En la cromatografa de intercambio inico (A) la matriz insoluble presenta cargas inicas que retardan las molculas de carga opuesta. Las matrices utilizadas habitualm ente para separar protenas son la dietilaminoetilcelulosa (DEAE-celulosa), de carga positiva, y la carboximetilcelulosa (CMcelulosa) y la fosfocelulosa, de carga negativa. La fuerza de unin entre las molculas disueltas y la matriz de intercambio inico depende de la fuerza inica y del pH de la solucin eluyente que atraviesa la columna, parmetros que pueden variarse de una manera sistemtica (como en la Figura 4-40) para conseguir una separacin ms efectiva. En la cromatografa de filtracin en gel (B) la matriz es inerte pero porosa. Las molculas suficientem ente pequeas para penetrar en el interior de la matriz se retrasan y viajan ms lentamente a travs de la columna. En el com ercio existen bolitas de polisacridos con puentes cruzados (dextrano o agarosa) en una amplia gama de tamaos de poro adecuadas para el fraccionamiento de molculas de diversos pesos moleculares, desde menos de 500 hasta ms de 5 x 106 daltons. La cromatografa de afinidad (C) utiliza una matriz insoluble que est unida covalentemente a un ligando especfico, com o por ejemplo una molcula de anticuerpo o un substrato enzimtico, que se unir a una protena determinada de la muestra. Las molculas de enzima que se han unido a substratos inmovilizados en columnas de este tipo se pueden eluir con una solucin concentrada del substrato en forma libre, mientras que molculas que se han unido a anticuerpos inmovilizados pueden eluirse disociando el com plejo antgeno-anticuerpo con soluciones concentradas de sales o con soluciones de pH alto o bajo. A menudo se consiguen purificaciones elevadas con un solo paso a travs de estas columnas.

lumna que contiene una matriz slida porosa. Las diferentes protenas de la mez cla se van retrasando ms o menos a causa de su interaccin con la matriz de la columna y pueden recogerse por separado en su estado funcional nativo a medi da que fluyen por el extremo inferior de la columna (Figura 4-38). En funcin del tipo de matriz que se utilice, las protenas se pueden separar segn su carga (cro matografa de intercambio inico), su hidrofobicidad (cromatografa hidrofbica), su tamao (cromatografa de filtracin), o su capacidad para unirse a deter minados grupos qumicos (cromatografa de afinidad). Actualmente se comercializan un gran nmero de tipos diferentes de matriz para cromatografa (Figura 4-39). Las columnas de intercambio inico estn lle nas de pequeas bolitas que contienen cargas positivas o negativas, de modo que las protenas se separan en funcin de la disposicin de cargas de su super ficie. Las columnas hidrofbicas estn llenas de unas bolitas con cadenas latera les hidrofbicas que sobresalen de ellas, de modo que las protenas que tengan regiones hidrofbicas al descubierto quedan retardadas en su trnsito por la co lumna. Las columnas de filtracin en gel, que separan protenas en funcin de su tamao, contienen diminutas bolitas porosas: a medida que van descendiendo por la columna, las molculas suficientemente pequeas para penetrar en los poros pasan sucesivamente por el interior de estas esferas, mientras que las m o lculas ms grandes permanecen en la solucin fluyendo entre las esferas, y por lo tanto, eluyen ms rpidamente a travs de la columna y salen primero. Ade ms de permitir la separacin de las molculas, la cromatografa de filtracin en gel constituye un buen sistema para determinar el tamao de las molculas. Este tipo de cromatografa en columna no produce fracciones altamente pu rificadas si se parte de una mezcla compleja de protenas: un nico paso a travs de una columna suele incrementar la proporcin en la mezcla de una protena determinada en no ms de veinte veces. Puesto que la mayora de las protenas

Fraccionamiento de las clulas y anlisis de sus molculas

177

(A) CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

nm ero de fracciones 1 -------1 estas fracciones se recogen, se mezclan y se aplican a la colum na siguiente (B) CROMATOGRAFA DE FILTRACIN EN GEL

nm ero de fracciones 1 -------- 1 estas fracciones se recogen, se mezclan y se aplican a la colum na siguiente (C) CROMATOGRAFA DE AFINIDAD protena solucin de elucin aplicada a la colum na actividad

Figura 4 -4 0 Purificacin de protenas por crom atografa. Resultados tpicos que se obtienen cuando se utilizan sucesivamente tres pasos cromatogrficos diferentes para purificar una protena. En este ejemplo se fraccion un extracto completo hacindolo pasar primero a travs de una resina de intercambio inico empaquetada en una columna (A). La columna se lav y las protenas se eluyeron haciendo pasar desde la parte superior de la columna una solucin de sal a una concentracin progresivamente mayor. Las protenas con menor afinidad por la resina de intercambio inico pasaron directamente a travs de la columna y fueron recogidas en las primeras fracciones eluidas que salieron por la parte inferior de la columna. Las restantes protenas fueron eluidas de manera secuencial de acuerdo con su afinidad por la resina -las unidas ms intensam ente necesitaron una concentracin de sal ms elevada para ser eluidas. La protena de inters sali en forma de un pequeo pico y se detect por su actividad enzimtica. Las fracciones con actividad fueron recogidas y aplicadas a una segunda columna de filtracin en gel (B). La posicin de elucin de la protena todava impura fue determinada de nuevo por su actividad enzimtica, y las fracciones activas fueron recogidas y purificadas hasta homogeneidad mediante una colum na de afinidad (C) que contena inmovilizado un substrato de la enzima.

nm ero de fracciones se recogen y mezclan estas fracciones, que ahora contienen la protena altamente purificada
representan individualmente m enos del 1/1000 de la protena celular total, para conseguir purificarlas suele ser necesario utilizar sucesivamente varios tipos di ferentes de columnas para conseguir la pureza suficiente (Figura 4-40). Un pro cedimiento ms eficiente, conocido como crom atografa de afinidad, utiliza in teracciones de enlace, importantes desde el punto de vista biolgico, que se producen en la superficie de las protenas. Por ejemplo, si un substrato enzim tico se acopla covalentemente a una matriz inerte, como pueden ser pequeas esferas de un polisacrido, la enzima especfica de este substrato fijado a la co lumna ser retenida en la matriz y podr ser eluida (lavada) en forma casi pura. De forma similar, puede inmovilizarse un DNA corto de secuencia diseada es pecficamente y utilizarse para purificar protenas que se unan al DNA y que re conozcan esta secuencia de nucletidos en los cromosomas (Figura 9-23). Alter nativamente, se pueden acoplar anticuerpos especficos a una matriz para purificar molculas proteicas reconocidas por los anticuerpos. Debido a la ele vada especificidad de estas columnas de afinidad, algunas veces se pueden con seguir, en un solo paso, purificaciones del orden de 1000 a 10 000 veces. Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

178

La resolucin de las columnas convencionales de cromatografa est limita da por la falta de homogeneidad de las matrices (como la celulosa), la cual gene ra un flujo desigual de los disolventes a travs de la columna. Se han desarrolla do nuevas resinas cromatogrficas (la mayora basadas en compuestos de slice) en forma de diminutas esferas (de 3 a 10 im de dimetro) que pueden ser empa quetadas mediante un aparato especial formando un lecho uniforme en la co lumna. Con estas columnas de crom atografa lquida de alta resolucin (HPLC, de High Performance Liquid Chromatography) se alcanza un alto grado de sepa racin. Como las columnas de HPLC contienen partculas empaquetadas de for ma muy compacta, la velocidad de flujo a travs de ellas es prcticam ente nula a menos que se apliquen altas presiones. Por esta razn, normalmente estas m a trices se empaquetan en cilindros de acero y requieren un sistema sofisticado de bombas y vlvulas para forzar a fluir el disolvente a travs de la columna a la pre sin suficiente para producir un flujo deseado de aproximadamente un volumen de columna por minuto. En la cromatografa en columna convencional, la velo cidad de flujo debe ser lenta (a menudo de aproximadamente un volumen de columna por hora) para dar tiempo a los solutos a que se fraccionen en equili brio con el interior de las grandes partculas de la matriz. En la HPLC los solutos se equilibran rpidamente con el interior de las diminutas esferas, de manera que solutos con diferentes afinidades por la matriz son separados entre s de for ma muy eficiente, siempre a rpida velocidad de flujo. Esto permite que muchos fraccionamientos puedan realizarse en cuestin de minutos, mientras que para obtener una separacin pobre en la cromatografa convencional se requieren horas. Por consiguiente, la HPLC se ha convertido en el mtodo escogido para muchas separaciones de protenas y de pequeas molculas.

CH3
c h c h c h

2 2 2 2 2 2 2 2 2

1
c h c h c h

1
c h

1
c h c h

1 CH2 1 c h 2 1

OH
c h

o j o = s1= o
O SDS N a

7 2

|
c h

SH

p-mercaptoetanol

Mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, pueden determ inarse el tam ao y la composicin de subunidades de una protena 24
Las protenas suelen tener una carga neta positiva o negativa, que refleja la de los aminocidos cargados que contienen. Si se aplica un campo elctrico a una solucin que contenga una molcula proteica, la protena migrar a una veloci dad que depender de su carga neta, de su tamao y de su forma. Esta tcnica, conocida como electroforesis, se utiliz inicialmente para separar mezclas de protenas tanto libres en soluciones acuosas como incluidas en una matriz sli da porosa tal como el almidn. A mediados de los aos 1960 se desarroll una versin modificada de este mtodo -conocid a como electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (o SDS-PAGE, de SDS PolyAcrilamide-Gel Electrophoresis), que ha revolucionado los sistemas de anlisis rutinarios de las protenas. Como matriz inerte a travs de la que migran las protenas, se utiliza un gel de poliacrilamida con numerosos puentes cruzados. Normalmente el gel se prepara inmediatamente antes de uti lizarse mediante la polimerizacin a partir de los monmeros; el tamao del poro del gel puede ajustarse de forma que sea el adecuado para retrasar la m i gracin de las molculas proteicas de inters. Las protenas no se colocan en una solucin acuosa simple, sino en una solucin que contiene un potente detergen te de carga negativa, el dodecil sulfato sdico, o SDS (de Sodium Dodecyl Sulfate) (Figura 4-41). Como este detergente se une a las regiones hidrofbicas de las molculas proteicas, haciendo que se desplieguen las cadenas polipeptdicas, las diferentes molculas proteicas quedan liberadas de sus asociaciones con otras molculas proteicas o lipdicas y se disuelven libremente en la solucin del detergente. Adems, se suele aadir un agente reductor como el mercaptoetanol (Figura 4-41) con objeto de romper los enlaces S-S que pudieran existir en las protenas, de forma que puedan analizarse separadamente todos los polipptidos constitutivos de las molculas que tengan varias subunidades. Qu sucede cuando una mezcla de protenas solubilizadas con SDS se so mete a electroforesis a travs de una lmina de gel de poliacrilamida? Cada mo-

F ig u ra4-41 El detergente dodecil sulfato sdico (SDS) y el agente reductor [-m ercaptoetanol. Estos dos reactivos qumicos se utilizan para solubilizar protenas para electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. El SDS se presenta aqu en su forma ionizada.

Fraccionamiento de las clulas y anlisis de sus molculas

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(A)
ctodo
O

m uestra cargada en el gel m ediante una pipeta caja de plstico

(B)

protena con dos subunidades, A y B, unidas entre s mediante un enlace disulfuro

protena de una sola subunidad

CALENTAMIENTO CON SDS Y MERCAPTOETANOL @ nodo

tam pon
Figura 4 -42 Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE). (A) Aparato. (B) Las distintas cadenas polipeptdicas forman un com plejo con las molculas cargadas negativamente de dodecil sulfato sdico (SDS) y, entonces, migran en forma de com plejo protena-SDS cargado negativamente, a travs de un gel poroso de poliacrilamida. Puesto que la velocidad de migracin en estas condiciones es mayor cuanto menor sea el polipptido, esta tcnica puede utilizarse para determinar de una forma aproximada el peso molecular de una cadena polipeptdica, as como la com posicin de subunidades de una protena. Sin embargo, si la protena contiene una gran cantidad de carbohidratos, se desplazar de forma anmala por el gel, de forma que su peso molecular aparente estimado por la SDS-PAGE ser errneo.

ir

lm ina de gel de poliacrilam ida

lcula de protena se une a una gran cantidad de molculas del detergente, car gadas negativamente, que anulan la carga intrnseca de la protena y hacen que cuando se aplica un voltaje la pro tena migre hacia el electrodo positivo. Las protenas del mismo tamao tienden a comportarse de forma idntica ya que (1) su estructura nativa est com pletam ente desplegada por el SDS, por lo que presentan la misma forma, y (2) unen la misma cantidad de SDS y por tanto tie nen la misma cantidad de carga negativa. Las protenas grandes, con mayor car ga, estn sujetas a grandes fuerzas elctricas pero tambin a mayores resisten cias. En solucin libre, ambos efectos podran contrarrestarse, pero en las redes del gel de poliacrilamida, que acta como un filtro molecular, las grandes prote nas son retardadas mucho ms severamente que las pequeas. En consecuen cia, una mezcla com pleja de protenas es fraccionada en series de bandas protei cas discretas, que se hallan ordenadas en funcin de su peso molecular (Figura 4-42). Las protenas mayoritarias se detectan fcilmente tiiendo el gel con un colorante como el azul de Coomassie, mientras que las protenas minoritarias se pueden visualizar en los geles tratados con una sal de plata (pudindose detectar en cada banda una cantidad tan pequea com o 10 ng de protena). La electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS es un procedimiento ms poderoso que cualquier otro mtodo anterior de anlisis de protenas, principal mente debido a que puede utilizarse para separar todos los tipos de protenas, incluyendo las que sean insolubles en agua. Pueden resolverse protenas de membrana, protenas com ponentes del citoesqueleto y protenas que forman parte de grandes agregados macromoleculares. Debido a que el mtodo separa los polipptidos en funcin de su tamao, tam bin proporciona informacin so bre el peso molecular y la com posicin de subunidades de cualquier complejo

180

Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

Figura 4 -43 Anlisis de muestras proteicas por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. La fotografa muestra un gel que se ha utilizado para detectar las protenas presentes en los sucesivos estadios de la purificacin de una enzima. El carril izquierdo (carril 1) contiene la mezcla com pleja de protenas en el extracto celular de partida, y cada uno de los carriles sucesivos analizan las protenas obtenidas despus de un fraccionamiento cromatogrfico de la muestra de protenas analizada en el carril anterior (vase Figura 4-40). En cada carril se carg la misma cantidad de protena (10 jig). Normalmente, cada pro tena aparece como una fina banda teida; sin embargo, las bandas se ensanchan cuando contienen demasiada protena. (Por cortesa de Tim Formosa.)

poso

. 100 000

m olecular

_ S O000

proteico. En la Figura 4-43 se presenta una fotografa de un gel utilizado para analizar cada una de las sucesivas etapas de la purificacin de una protena.

Mediante electroforesis tridimensional sobre gel de poliacrilamida, se pueden resolver ms de 1000 protenas sobre un mismo gel25
Dado que en un cromatograma las bandas muy prximas tienden a superponer se, cualquier mtodo unidimensional de separacin, como la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS o la cromatografa, slo pueden resolver un n mero relativamente reducido de protenas (por lo general menos de 50). Por el contrario, la electroforesis tridimensional sobre gel, que com bina dos procedi mientos diferentes de separacin, puede ser utilizada para resolver ms de 1000 protenas diferentes, en forma de un mapa proteico bidimensional. En el primer paso, las protenas son separadas en funcin de su carga. La muestra se disuelve en un volumen reducido de una solucin que contenga un de tergente no inico (no cargado) y un reactivo desnaturalizante como la urea o el mercaptoetanol. Esta solucin disuelve, desnaturaliza y disocia todas las cadenas polipeptdicas sin alterar su carga intrnseca. Luego, las cadenas polipeptdicas son fraccionadas mediante un procedimiento denominado enfoque isoelctrico o isoelectroenfoque, que se basa en el hecho de que la carga neta de una molcula proteica varia con el pH de la solucin. Para cada protena existe un pH caracters tico, denominado punto isoelctrico, al que la protena no presenta carga neta y, por lo tanto, no migrar en un campo elctrico. En el isoelectroenfoque las prote nas son sometidas a electroforesis en un tubo estrecho de gel de poliacrilamida en el que se ha establecido un gradiente de pH mediante unas mezclas de amortigua dores especiales. Cada protena se desplaza hasta la zona de gradiente que presen ta un pH igual a su punto isoelctrico, y all permanece inmvil (Figura 4-44). sta es la primera dimensin de la electroforesis bidimensional sobre gel. En el segundo paso, el estrecho gel que contiene las protenas separadas se somete otra vez a electroforesis, pero en una direccin perpendicular a la utiliza da en el primer paso. Esta vez se aade SDS, y las protenas son separadas en

_ 15 000

i9
10

en el p u n to is o e l c tric o la p ro te n a ca re ce de c a rg a n e ta , p o r lo q u e d e ja de d e s p la z a rs e en el c a m p o e l c tric o ; para la p ro te n a d e la ilu s tra c i n el pH is o e l c tric o es 6,5

Figura 4 -4 4 Separacin de molculas proteicas por isoelectroenfoque. A pH bajo (elevada concentracin de H+ ) los grupos cido carboxilo de las protenas tienen tendencia a quedar sin carga (-COOH) y los grupos nitrogenados bsicos, a quedar cargados (por ejemplo, -N H 3+ ) confiriendo a la mayora de las protenas una carga neta positiva. A un pH elevado, los grupos cido carboxilo estn cargados negativamente (-COO-) y los grupos bsicos tienden a estar sin carga (por ejemplo, -N H 2), confiriendo a la mayora de las protenas una carga neta negativa. A su pH isoelctrico una protena carece de carga neta debido a que las cargas positivas y negativas se anulan. As, cuando un tubo que contiene un determinado gradiente de pH se somete a un campo elctrico intenso, cada tipo de protena migra hasta formar una banda bien delimitada en su pH isoelctrico, como se muestra en la ilustracin.

Fraccionamiento de las clulas y anlisis de sus molculas

181

bsico

----------

gradiente estable de pH

cido

Figura 4-45 Electroforesis bidimensional sobre gel de poliacrilamida. En este gel se separan todas las protenas de una bacteria E. coli ; cada mancha corresponde a una cadena polipeptdica diferente. Las protenas fueron separadas primero de acuerdo con sus puntos isoelctricos mediante isoelectroenfoque, de izquierda a derecha. Despus fueron fraccionadas de nuevo segn sus pesos moleculares mediante electroforesis en presencia de SDS, de arriba a abajo. Obsrvese que las distintas protenas se hallan presentes en cantidades muy diferentes. La bacteria fue alimentada con una mezcla de aminocidos marcados con radioistopos, de manera que todas sus protenas resultaron radiactivas y pudieron fcilmente detectarse mediante autorradiografa (vase pg. 191). (Por cortesa de Patrick O'Farrell.) Figura 4 -46 Transferencia de tipo Western (Western blotting) o immunoblotting. Todas las protenas de clulas del tabaco en divisin mantenidas en cultivo se separaron primero mediante electroforesis bidimensional sobre gel de poliacrilamida, como se muestra en la Figura 4-45, y sus posiciones se revelaron mediante una tincin sensible a las protenas (A). Las protenas separadas en un gel idntico al anterior se transfirieron a un papel de nitrocelulosa, el cual se incub con un anticuerpo que reconoce las protenas que durante la mitosis resultan fosforiladas en residuos de treonina. Se revel la posicin de la docena de protenas de este tipo que son reconocidas por este anticuerpo, mediante un segundo anticuerpo unido a una enzima (B). (De J A Traas, A.F. Bevan, J.H. Doonan, J. Cordewener y P J . Shaw. Plant Journal 2:723-732,1992, con permiso de Blackwell Scientific Publ.)

funcin de su tamao, como en el caso de la SDS-PAGE de una dimensin: el es trecho gel original se empapa en SDS y se sita en un borde de una lmina de gel de poliacrilamida-SDS, a travs del cual cada cadena polipeptidica migra for mando una m ancha discreta. sta es la segunda dimensin de la electroforesis bidimensional sobre gel de poliacrilamida. Las nicas protenas que no se resol veran seran las que tuvieran un tamao idntico y un punto isoelctrico idnti co, lo cual es relativamente poco frecuente. Por este sistema pueden detectarse sobre el gel incluso cantidades traza de cada una de las cadenas polipeptdicas, mediante diversos procedimientos de tincin -o por medio de autorradiografa si la muestra estaba marcada con un radioistopo. En un mismo gel bidimensio nal se pueden separar hasta 2000 cadenas polipeptdicas -lo cual constituye la mayor parte de las protenas de una bacteria- (Figura 4-45). Este sistema tiene un poder de resolucin tan elevado que permite diferenciar fcilmente dos pro tenas idnticas entre s que solamente se diferencian en un solo aminocido cargado. Tras su resolucin tanto en geles unidimensionales com o bidimensionales, una determinada protena puede identificarse exponiendo todas las protenas presentes a un anticuerpo especfico que ha sido acoplado a un istopo radiacti vo, a una enzima fcilmente detectable o a un colorante fluorescente. Por conve niencia, normalmente esto se realiza despus de que todas las protenas presen tes en el gel se han transferido (mediante blotting) a una lmina de papel de nitrocelulosa, com o describiremos ms adelante para los cidos nucleicos (va se Figura 7-13). Este mtodo de deteccin de protenas se denomina transferen cia de tipo Western (Western blotting) (Figura 4-46).

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Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

T abla 4 -7 H itos en el d esarrollo de la cro m ato g rafa y de la electroforesis y de su ap licacin a las m olculas biolgicas

1833 F arad ay describi las leyes fundamentales sobre el paso de la electricidad a travs de soluciones inicas. 1850 R unge separ compuestos qumicos inorgnicos en funcin de su adsorcin diferencial sobre el papel, tcnica precursora de las posteriores separaciones cromatogrficas. 1906 Tsw ett invent la cromatografa en columna, pasando extractos de petrleo de hojas de plantas a travs de columnas de greda en polvo. 1933 Tiselius introdujo la electoforesis para separar protenas en solucin. 1942 M artin y Synge desarrollaron la cromatografa de particin, que dos aos ms tarde condujo a la cromatografa en papel. 1946 Stein y M oore determinaron por primera vez la composicin de aminocidos de una protena utilizando inicialmente una columna cromatogrfica de almidn y desarrollando posteriormente la cromatografa sobre resinas intercambiadoras de iones. 1955 Sm ithies utiliz geles preparados con almidn para separar las protenas sricas mediante electroforesis. S anger complet el anlisis de la secuencia de aminocidos de la insulina bovina, que fue la primera pro tena que se secuenci. 1956 In gram produjo las primeras huellas dactilares de protenas, demostrando que la diferencia entre la hemoglobina de la anemia falciforme y la hemoglobina normal radica en la variacin de un solo aminocido. 1959 R aym ond introdujo los geles de poliacrilamida, mejores que los de almidn, para separar protenas por electroforesis; en los aos siguientes, O m stein y Davis desarrollaron mejores sistemas de amortiguadores que permitieron la separacin a elevada resolucin. 1966 Maizel introdujo el uso del dodecil sulfato sdico (SDS) para mejorar la electroforesis en gel de poliacrilamida de las protenas. 1975 OFarrell ide el sistema bidimensional sobre gel para analizar mezclas de protenas; la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS se combin con la separacin segn el punto isoelctrico.

protena nativa

LA INCUBACIN CON TRIPSINA GENERA UNA MEZCLA DE PPTIDOS

En la Tabla 4-7 se presentan algunos hitos en el desarrollo de la cromatogra fa y la electroforesis.

LA CROMATOGRAFA Y LA ELECTROFORESIS PRODUCEN UN MAPA DE DOS DIMENSIONES, O "HUELLA DACTILAR", DIAGNSTICO DE LA PROTEINA

La hidrlisis selectiva de una protena genera un conjunto caracterstico de fragmentos peptdicos 26

Aunque el peso molecular y el punto isoelctrico son rasgos caractersticos de una protena, la identificacin inequvoca de una protena se basa, en ltimo trmino, en la determinacin de su secuencia de aminocidos. La primera fase de este proceso, que consiste en la rotura de la protena en fragmentos ms pe queos, puede proporcionar por s misma mucha informacin til que ayude a caracterizar la molcula. Disponemos de enzimas proteolticas y de reactivos qumicos que rompen las protenas entre determinados residuos de am inoci dos (Tabla 4-8). La enzima tripsina, por ejemplo, corta por el lado carboxilo de los residuos de Usina o de arginina, mientras que el compuesto qumico bromu ro de ciangeno corta los enlaces peptdicos prximos a los residuos de metionina. Puesto que estas enzimas y compuestos qumicos actan en un nmero rela tivamente reducido de lugares de una protena, tienden a producir un nmero relativamente pequeo de pptidos, que son bastante largos. Si una mezcla de pptidos como sta se separa mediante cromatografa o electroforesis, el patrn resultante, o m apa peptdico, tiene un valor de diagnstico de la protena a par tir de la cual fueron generados los pptidos, y a veces recibe el nombre de hue lla dactilar de la protena (Figura 4-47). La determinacin de las huellas dactilares de las protenas fue desarrolla da en 1956 como un sistema para comparar la hemoglobina normal con la forma

------- crom atografa

Figura 4 -47 Confeccin de un m apa peptdico, o huella dactilar, de una protena. En este caso, la protena fue digerida con tripsina, generndose una mezcla de numerosos fragmentos polipeptdicos pequeos diferentes, que luego se fraccionaron en dos dimensiones mediante electroforesis y cromatografa de particin. El patrn de manchas obtenido tiene valor diagnstico para la protena analizada.

Fraccionamiento de las clulas y anlisis de sus molculas

183

T abla 4 -8 A lgunos de los reactiv o s utilizados n o rm alm en te p a ra ro m p e r los en laces p eptfdicos de las p roten as A m inocido 1 A m inocido 2

Enzima
Tripsina Quimotripsina Proteasa V8 Lys o Arg Phe, Trp o Tyr Glu Met cualquiera cualquiera cualquiera cualquiera cualquiera Cys

Compuesto qumico
Bromuro de ciangeno 2-Nitro-5-tiocianobenzoato

Se indica la especificidad por los aminocidos de ambos lados del enlace que se rompe. El gru po carboxilo del aminocido 1 se libera por la rotura; este aminocido queda a la izquierda del enlace peptdico tal como se escribe normalmente (vase Panel 2-5, pgs. 58-59).

mutante de la protena encontrada en pacientes que sufren de anemia falciforme. Se encontr un solo pptido diferente entre ambas formas de hemoglobina, diferencia que ms tarde se atribuy a un solo aminocido cargado, demostrn dose por primera vez que una mutacin puede cambiar un solo aminocido de una protena.

Mediante m quinas automatizadas pueden analizarse secuencias cortas de am inocidos 27

Cuando una protena ha sido fragmentada en pequeos pptidos, el siguiente paso lgico del anlisis consiste en determinar la secuencia de aminocidos de cada fragmento peptdico aislado. Esto se realiza mediante una serie repetida de reacciones qumicas, proceso ideado originalmente en 1967. Primeramente el pptido se expone a un compuesto qumico que nicamente forma un enlace covalente con el grupo amino libre del extremo amino terminal del pptido. Luego, este compuesto qumico es activado mediante su exposicin a un cido dbil, con lo que se rompe especficam ente el enlace peptdico que une el ami nocido amino terminal a la cadena polipeptdica; seguidamente el aminocido que se ha separado se identifica utilizando mtodos cromatogrficos. A conti nuacin, el pptido restante, que tiene un aminocido menos, se somete a la misma secuencia de reacciones, y as sucesivamente hasta que todos los am ino cidos del pptido hayan sido determinados. La naturaleza reiterativa de estas reacciones conduce por s misma a la auto matizacin; existen mquinas comerciales, denominadas s e c u e n c ia d o re s de a m in o c id o s , que permiten la determinacin automtica de la secuencia de aminocidos de fragmentos peptdicos. El paso final del proceso consiste en co locar las secuencias de aminocidos de los diferentes fragmentos peptdicos en el orden en que se presentan en la cadena peptdica intacta. Tradicionalmente esto se realiza comparando y superponiendo las secuencias de diferentes grupos de fragmentos peptdicos obtenidos mediante fraccionamiento de la misma protena utilizando diferentes enzimas proteolticas. Los adelantos tecnolgicos han aumentado marcadamente la velocidad y la sensibilidad de la determinacin de la secuencia de aminocidos de protenas, permitiendo el anlisis de muestras diminutas; en una sola noche y a partir de pocos microgramos de protena -la cantidad disponible a partir de una nica banda en un gel de poliacrilam ida- se puede obtener la secuencia de varias do cenas de aminocidos del extremo amino terminal de un pptido. Este procedi miento ha resultado importante para caracterizar muchas protenas celulares minoritarias, com o los receptores para las hormonas esteroideas y polipeptdi cas. Frecuentem ente la determinacin de tan slo 20 aminocidos de la secuen

184

Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

cia de una protena es suficiente para lograr disear una sonda de DNA que per mita clonar su gen (vase Figura 7-27). Una vez se ha aislado el gen, el resto de la secuencia de aminocidos de la protena se puede deducir en referencia al cdi go gentico. sta es una gran ventaja porque, incluso con automatizacin, la de terminacin directa de la secuencia completa de una protena resulta ser una ta rea difcil. Una protena de 100 residuos puede ser secuenciada en un mes de trabajo intenso, pero la dificultad se increm enta extraordinariamente tanto con la longitud de la cadena polipeptdica como con las particularidades qumicas de los fragmentos peptdicos individuales que impiden que el proceso sea ruti nario. Dado que la secuenciacin del DNA puede hacerse de una forma ms r pida y sencilla (vase Capitulo 7), generalmente las secuencias de la mayora de las protenas se determinan, en la actualidad, a partir de la secuencia de nucletidos de su gen.

La difraccin de rayos X por cristales de protena puede revelar la estructura exacta de una protena 28
A partir de la secuencia de aminocidos de una protena pueden a menudo pre decirse los elementos de la estructura secundaria de la protena, com o las hli ces a que atraviesan la membrana, as como el parecido de la protena con otras protenas conocidas. Sin embargo por ahora no es posible deducir de forma se gura el plegamiento tridimensional de la protena a partir de su secuencia de aminocidos, y sin conocer la estructura detallada no es posible comprender las bases moleculares de su funcin. La principal tcnica que se ha utilizado para determinar la estructura tridimensional de las molculas, incluidas las protenas a nivel atmico, es la cristalografa de rayos X. Los rayos X, como la luz, son una forma de radiacin electromagntica, pero de una longitud de onda mucho menor, tpicamente de alrededor de 0,1 nm (el dimetro de un tomo de hidrgeno). Si se dirige un haz estrecho y paralelo de rayos X a una muestra de una protena pura, la mayora de los rayos X pasarn a su travs. Sin embargo una pequea fraccin de ellos sern dispersados por los tomos de la muestra. Si la muestra es un cristal bien ordenado, los haces dis persados se reforzarn unos a otros en ciertos puntos (vase Figura 4-2) y apare cern como m anchas de difraccin cuando los rayos X sean recogidos sobre un detector (Figura 4-48). La posicin e intensidad de cada m ancha en el patrn de difraccin de ra yos X contiene informacin sobre las posiciones de los tomos en el cristal que intentamos deducir. La deduccin de la estructura tridimensional de una gran molcula a partir del patrn de difraccin de su cristal es una tarea compleja, y no se consigui para una molcula de protena hasta 1960. Recientem ente los anlisis de difraccin de rayos X se han automatizado cada vez ms, y ahora el proceso ms lento es el de la produccin de cristales proteicos adecuados. Ello requiere grandes cantidades de una protena muy pura y a menudo, supone aos de tanteo en la bsqueda de las condiciones de cristalizacin adecuadas. Todava hay muchas protenas, especialmente protenas de membrana, que han resistido todos los intentos de cristalizacin. El producto inmediato de un anlisis de un patrn de difraccin es un com plejo mapa tridimensional de densidades electrnicas. Interpretar este mapa re sulta una tarea complicada, y requiere la secuencia de aminocidos de la prote na. Fundamentalmente mediante prueba y error se consigue correlacionar la secuencia y el mapa de densidades electrnicas mediante un ordenador, inten tando conseguir el m ejor resultado. La fiabilidad del modelo atmico final de pende de la resolucin de los datos cristalogrficos iniciales: una resolucin de 0,5 nm puede producir un mapa de baja resolucin del esqueleto polipeptdico, mientras que una resolucin de 0,15 nm permite situar todos los tomos (excep to los de hidrgeno) en la molcula. A menudo, un modelo atmico completo resulta demasiado complejo para ser observado directamente, pero a partir de l se pueden derivar versiones simplificadas que muestren las caractersticas es-

Fraccionamiento de las clulas y anlisis de sus molculas

185

(A)

Figura 4 -48 Cristalografa de rayos X. (A) Cristal proteico de ribulosa bisfosfato carboxilasa, una enzima que juega un papel crucial en la fijacin de C 0 2 durante la fotosntesis. (B), Patrn de difraccin de rayos X obtenido a partir del cristal. (C) Modelo simplificado de la estructura de la protena obtenido a partir de la informacin de la difraccin de rayos X. El modelo atmico completo es difcil de interpretar, pero esta versin muestra claramente sus caractersticas estructurales (hlices a en verde, lminas P en rojo). (A, por cortesa de C. Branden; B, por cortesa de J. Hajdu e I. Andersson; C, adaptado del original cedido por B. Furugren.)

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tructurales esenciales de la estructura (vase Figura 3-34). Mediante cristalogra fa de rayos X se ha determinado la estructura de varios centenares de protenas, lo cual es suficiente para empezar a entrever familias de estructuras comunes. A menudo, estas estructuras resultan ms conservadas durante la evolucin que las secuencias de aminocidos que las forman.

Tambin se puede determ inar la estructura molecular utilizando espectroscopia de resonancia m agntica nuclear (NMR)29
La espectroscopia de resonancia m agntica nuclear (NMR, de Nuclear Magne tic Resonance) se haba utilizado para analizar la estructura de pequeas mol culas y actualmente se utiliza cada vez ms para estudiar la estructura de peque as protenas o de dominios proteicos. A diferencia de la cristalografa de rayos X, la NMR no requiere tener una muestra cristalizada; simplemente necesita un pequeo volumen de una solucin proteica concentrada, la cual se coloca en un fuerte campo magntico. Algunos ncleos atmicos, particularmente los de hidrgeno, tienen un m o mento magntico o espn: es decir, tienen una magnetizacin intrnseca, como una barra magntica. El espn se alinea en el interior de un fuerte campo m agn tico, pero puede variarse a un estado semialineado al ser excitado en respuesta a una aplicacin de pulsos de radiofrecuencia (RF) de radiacin electromagntica. Cuando los ncleos de hidrgeno excitados se relajan a su estado alineado, em i ten radiacin RF, la cual puede ser medida y expresada en forma de espectro. La naturaleza de la radiacin emitida depende del ambiente de cada ncleo de hidr geno, de forma que si se excita un ncleo influir la absorcin y la emisin de ra-

186

Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

(B)

diacin de otro ncleo que est suficientemente cerca de l. Por tanto es posible, mediante una ingeniosa elaboracin de la tcnica bsica de NMR conocida como NMR bidimensional, distinguir las seales procedentes de ncleos de hidrgeno de diferentes residuos de aminocidos e identificar y medir los pequeos cambios de estas seales que ocurren cuando estos ncleos de hidrgeno se acercan suficien temente como para interactuar entre s: la magnitud del cambio revela la distancia entre el par de tomos de hidrgeno que interactan. De esta forma, la NMR pue de aportar informacin sobre las distancias entre zonas de la molcula de protena. Combinando esta informacin con la de la secuencia de aminocidos, es posible, en principio, descubrir la estructura tridimensional de la protena (Figura 4-49). Por razones tcnicas, por espectroscopia de NMR solamente se pueden de terminar las estructuras de pequeas protenas, como mximo de entre 15 000 y 20 000 daltons, y resulta muy improbable que el mtodo pueda abordar el estu dio de molculas mayores de 30 000-40 000 daltons. Sin embargo, muchos do minios funcionales de protenas son mucho ms pequeos que estos tamaos, y a menudo pueden obtenerse en forma de estructuras estables, analizables por NMR. Ello resulta especialmente til cuando la protena se ha resistido a ser cris talizada. Por ejemplo, de esta forma se han determinado las estructuras de los dominios de unin a DNA de varias protenas reguladoras de genes. La NMR tam bin se utiliza con xito para investigar molculas no proteicas, y por ejem plo resulta valiosa como mtodo para descubrir las estructuras de las complejas cadenas hidrocarbonadas laterales de las glucoprotenas. En la Tabla 4-9 se recogen algunos hitos del desarrollo de la cristalografa de rayos X y de la NMR.

Figura 4-49 Espectroscopia de NMR.

(A), ejemplo de los datos obtenidos a partir de un aparato de NMR. Se trata de un espectro bidimensional de NMR derivado del dominio carboxilo terminal de la enzima celulasa. Las manchas representan interacciones entre tomos de hidrgeno que en la protena son casi vecinos. Diferentes programas de clculo por ordenador junto con la secuencia de aminocidos, que debe ser conocida, permiten derivar posibles estructuras compatibles. En (B) se presentan superpuestas 10 estructuras, cada una de las cuales satisface tan bien como las dems las distancias de constriccin calculadas. El conjunto de estructuras constituye un buen indicador de la estructura tridimensional ms probable. (Por cortesa de P. Kraulis.)

Resumen
Las poblaciones celulares pueden ser analizadas bioqumicamente, disgregndolas y fraccionando su contenido por ultracentrifUgacin. Posteriores fraccionamientos permiten el desarrollo de sistemas libres de clulas; estos sistemas son necesarios para determinar los detalles moleculares de procesos celulares complejos. De esta manera, actualmente se estudian, por ejemplo, la sntesis proteica, la replicacin del DNA, la maduracin del RNA y varios tipos de transporte intracelular. El peso molecular y la composicin de subunidades de incluso muy pequeas cantidades de una protena se pueden determinar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. En electroforesis bidimensional en gel las protenas se resuelven como manchas separadas mediante isoelectroenfoque en una dimensin seguido de elec troforesis en gel de poliacrilamida con SDS en la segunda dimensin. Estas separaFraccionamiento de las clulas y anlisis de sus molculas 187

Tabla 4 -9 H itos del d esarro llo de la cristalografa p o r rayos X y de su aplicacin a las m olcu las biolgicas

1864 H op p e-S eyler cristalizaron y dieron nombre a la protena hemoglobina. 1895 R n tgen observ que cuando los rayos catdicos (electrones) inciden sobre un blanco de metal, se produce una nueva forma de radiacin penetrante, que denomin rayos X. 1912 v on Laue obtuvo los primeros modelos de difraccin de rayos X, haciendo pasar rayos X a travs de un cristal de sulfuro de zinc. W.L. B ragg propuso una relacin simple entre un patrn de difraccin de rayos X y la disposicin de los tomos en el cristal que produce este patrn. 1926 S u m m er obtuvo cristales de la enzima ureasa a partir de extractos de judas, y demostr que las protenas tienen actividad cataltica. 1931 P auling public sus primeros ensayos sobre "la naturaleza del enlace qumico , detallando las reglas del enlace covalente. 1934 B e m a l y C row foot presentaron los primeros modelos detallados de difraccin de rayos X de una protena, obtenidos a partir de cristales de la enzima pepsina. 1935 P atterso n desarroll un mtodo analtico para determinar las distancias interatmicas a partir de los datos de difraccin de rayos X. 1941 A stbury obtuvo el primer patrn de difraccin de rayos X del DNA. 1951 P aulin y C orey propusieron la estructura de una conformacin helicoidal de una cadena de aminocidos l, -la hlice a - y la estructura de la lmina (5, la presencia de las cuales ms tarde fue descrita en numerosas protenas. 1953 W atson y C rick propusieron el modelo de doble hlice del DNA, basndose en los patrones de difraccin de rayos X obtenidos por Franklin y Wilkins. 1954 P eru tz y colaboradores desarrollaron mtodos de tomos pesados para solucionar el problema de fases en la cristalografa de las protenas. 1960 K endrew describi la primera estructura detallada de una protena (la mioglobina de cachalote) hasta una resolucin de 0,2 nm, y P eru tz propuso una estructura de resolucin menor de la hemoglobina, una protena mayor que la anterior. 1966 Phillips describi la estructura de la lisozima, la primera enzima que fue analizada en detalle. 1971 Jeen er propuso la utilizacin de NMR bidimensional, y W u thrich y colaboradores durante los primeros aos de la dcada de 1980 utilizaron por primera vez este mtodo para resolver la estructura de una protena. 1976 Kim y Rich, y Klug y colaboradores describieron la estructura tridimensional del tRNA, determinada mediante difraccin de rayos X. 1977-1978 H olm es y Klug determinaron la estructura del virus del mosaico del tabaco (TMV), y H arriso n y R ossm an determinaron la estructura de dos pequeos virus esfricos. 1985 M ichel y colaboradores determinaron la primera estructura de una protena transmembrana (un lugar de reaccin fotosinttico) mediante cristalografa de rayos X. H en d erson y colaboradores obtuvieron la estructura de la bacteriorrodopsina, una protena transmembrana, mediante mtodos de microscopa electrnica entre 1975 y 1990.

d o n es electroforticas p u ed en aplicarse incluso a protenas qu e norm alm ente son insolubles en agua. Las protenas mayoritarias d e extractos celulares solubles pueden ser purifica das p o r crom atografa en colum na; dependiendo del tipo d e matriz d e la colum na, se p u ed en separa protenas biolgicam ente activas, en fu n ci n d e su peso m olecu lar, d e su hidrofobicidad, d e sus caractersticas d e carga, o d e su afinidad p o r otras molculas. En una purificacin tpica, la m uestra se pasa sucesivamente a travs de varias colum nas diferentes -las fracciones enriquecidas obtenidas en una colum na se aplican a la colum na siguiente. Una vez qu e la protena ha sido purificada hasta hom ogeneidad, se p u ed en estudiar con detalle sus actividades biolgicas. Adems, se p uede d eterm inar una p equ e a porcin d e su secuencia de am inocidos y, sobre ella, se p uede clonar la secuencia d e DNA qu e codifica la protena completa; a p a r

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Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

tir de la secuencia de nucletidos del DNA clonado se puede deducir la secuencia de aminocidos restante. La secuencia de aminocidos es necesaria para determi nar le estructura tridimensional de una protena, pero no es suficiente. Para deter minar esta estructura a una resolucin atmica, las protenas mayores se han de cristalizar y estudiar por difraccin de rayos X. La estructura de pequeas prote nas en solucin se puede determinar utilizando anlisis de resonancia magntica nuclear.

Siguiendo el rastro y cuantificando las molculas del interior de las clulas

Los mtodos clsicos de m icroscopa ofrecen buenas visiones de la arquitectura de la clula, pero no demasiada informacin sobre la qumica celular. En biolo ga celular a menudo resulta importante determinar las cantidades de determi nadas molculas y conocer dnde se hallan localizadas en el interior de la clula y de qu manera cam bia su cantidad o localizacin en respuesta a seales extracelulares. Las molculas de inters varan desde pequeos iones inorgnicos como el Ca2+ o el H+hasta grandes molculas como determinadas protenas, m o lculas de RNA o de DNA. Se han desarrollado mtodos sensibles para cuantificar cada uno de estos ti pos de molculas y para seguir el comportamiento dinmico de la mayora de ellas en las clulas vivas. En esta seccin describimos de qu manera se pueden introducir sondas especficas en el interior de la clula viva para monitorizar las condiciones qumicas del citosol. Adems se presentan otros dos mtodos de deteccin ampliamente utilizados en biologa celular: los que utilizan radiois topos y los que utilizan anticuerpos. Ambos mtodos son capaces de detectar con una gran sensibilidad una molcula determinada en una mezcla compleja: en condiciones ptimas pueden detectar menos de 1000 copias de una molcula en una muestra.

Los tomos radiactivos pueden ser detectados con una gran sensibilidad 30
La mayora de los elementos que se presentan en la naturaleza son una mezcla de istopos ligeramente diferentes. Estos istopos se diferencian entre s por la masa de sus ncleos atmicos, pero com o tienen el mismo nmero de electro nes, tienen las mismas propiedades qumicas. Los ncleos de los istopos ra diactivos, o radioistopos, son inestables y sufren desintegraciones de forma aleatoria en el tiempo, produciendo diferentes tomos. En el transcurso de estas desintegraciones emiten partculas energticas subatmicas como electrones, o radiaciones como los rayos y. Utilizando sistemas de sntesis qumica para incor porar uno o ms tomos radiactivos a pequeas molculas de inters, como un azcar o un aminocido, se puede seguir el destino de esta molcula durante cualquier reaccin biolgica. Aunque los radioistopos naturales son poco frecuentes (a causa de su ines tabilidad), se pueden producir en grandes cantidades en reactores nucleares en los que diferentes tomos se bombardean con partculas de alta energa. Como resultado de ello, hoy disponemos de las formas marcadas radioisotpicamente de muchos compuestos importantes desde el punto de vista biolgico (Tabla 4-10). La radiacin que emiten se detecta de diversas maneras. Los electrones (partculas (3) pueden ser detectados en un contador Geiger por la ionizacin que producen en un gas, o pueden ser cuantificados con un contador de centelleo gracias a las pequeas chispas de luz que generan en un lquido de centelleo. Es tos mtodos hacen posible la medida de la cantidad de un radioistopo determi nado que existe en una muestra biolgica. Tambin es posible determinar la lo calizacin de un radioistopo en una muestra utilizando una autorradiografa, como describiremos posteriormente. Todos estos mtodos de deteccin son ex-

Tabla 4-10 Algunos rad ioistop os

utilizados h ab itu alm en te en la in vestigacin biolgica P erod o d e sem id esin tegracin

Istopo
32p 131J 35S

14 das

8,1 das
87 das 5570 aos 164 das 12,3 aos

1 4 C 45Ca 3H

Los istopos estn enumerados en orden decreciente de la energa de la radiacin p (electrones) que emiten. El 1311 tambin emite radiacin y. El perodo d e semidesintegracin es el tiempo necesario para que se desintegre un 50% de los tomos de un istopo.

Siguiendo el rastro y cuantificando las molculas del interior de las clulas

189

traordinariamente sensibles: en condiciones favorables pueden detectar casi to das las desintegraciones que se producen -y por lo tanto casi todos los tomos radiactivos que se desintegran.

Los radioistopos se utilizan para m arcar las molculas en las clulas y en los organismos y seguirles la pista 31
Una de las primeras aplicaciones de la radiactividad a la biologa consisti en se guir la ruta qumica del carbono durante la fotosntesis. Se mantuvieron algas verdes unicelulares en una atmsfera que contena C 0 2 marcado radiactivamen te (UC 0 2) y, tras perodos variables de tiempo despus de haber sido expuestos a la luz solar, se separaron sus contenidos solubles mediante cromatografa en pa pel. Colocando una hoja de pelcula fotogrfica sobre el cromatograma seco se detectaron las pequeas molculas que contenan 14C derivado del C 0 2. De esta manera se identificaron los principales com ponentes de la va fotosinttica, des de el C 0 2hasta el azcar. Las molculas radiactivas pueden ser utilizadas para seguir el curso de casi todos los procesos celulares. Un experimento tpico puede consistir en aadir a las clulas un precursor en su forma radiactiva. Las molculas radiactivas se mezclarn con las molculas preexistentes no marcadas; ambos tipos de mol culas sern tratados de forma idntica por la clula ya que slo se diferencian en el peso de su ncleo atmico. Se podrn seguir los cambios de la localizacin o de la forma qum ica de las molculas radiactivas en funcin del tiempo. A m e nudo, se puede aumentar la resolucin de estos experimentos utilizando un pro tocolo de m areaje denominado de pulso y caza, en el que el material radiactivo (el pulso ) se aade nicamente durante un perodo de tiempo muy corto y des pus es eliminado mediante lavado y substituido por molculas no radiactivas. A intervalos regulares de tiempo se toman muestras y en cada una de ellas se iden tifica la forma qumica o se localiza la radiactividad (la caza ) (Figura 4-50). Los experimentos de pulso y caza combinados con la autorradiografa (vase ms adelante) han sido importantes por ejemplo para dilucidar el camino seguido por las protenas de secrecin desde el retculo endoplsmico hasta el exterior celular (Figura4-51). El mareaje radioisotpico solamente es valioso como sistema para diferen ciar molculas que son qum icam ente idnticas pero que tienen historias dife rentes -p o r ejemplo, molculas que se diferencian en su momento de sntesis. De esta manera, por ejemplo, se demostr que casi todas las molculas de una clula viva son degradadas y reemplazadas por otras continuamente, incluso cuando la clula no est creciendo y aparentem ente se encuentra en estado es tacionario. Estos procesos de recam bio que algunas veces tiene lugar muy len tamente, seran imposibles de detectar sin el uso de radioistopos. Actualmente casi todas las pequeas molculas comunes estn disponibles com ercialm ente en forma radiactiva y prcticam ente cualquier molcula biol gica, por muy complicada que sea, puede marcarse con radiactividad. Los com puestos se pueden m arcar con radiactividad incorporando tomos radiactivos en posiciones determinadas de su estructura, lo cual permite seguir los diferen-

PULSO

CAZA

Figura 4 -50 Lgica de un experim ento tpico de pulso y caza utilizando radioistopos. Los recipientes marcados con A, B, C y D representan com partimentos diferentes de la clula (detectados mediante tcnicas de autorradiografa o de fraccionam iento celular) o bien compuestos qumicos distintos (detectados mediante cromatografa u otros mtodos qumicos). En la Figura 4-51 se presentan resultados reales de un experimento de pulso y caza.

190

Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

tes destinos de distintas zonas de una misma molcula durante las reacciones biolgicas (Figura 4-52). Una de las aplicaciones importantes de la radiactividad a la biologa celular consiste en la localizacin por autorradiografa de compuestos radiactivos en secciones de clulas enteras o de tejidos. En este procedimiento las clulas vivas son expuestas brevemente a un pulso de un compuesto radiactivo determinado y se incuban durante un perodo variable de tiempo -para permitir que el com puesto se incorpore- antes de fijarlas y tratarlas para microscopia ptica o elec trnica. Cada preparacin es recubierta posteriormente con una fina pelcula de una emulsin fotogrfica y se coloca en la obscuridad varios das durante los cuales parte del radioistopo se desintegra. Entonces la emulsin se revela y se determina la posicin de la radiactividad en cada clula mediante la posicin de los granos oscuros de plata generados (vase Figura 4-51). As por ejemplo, la in cubacin de clulas con un precursor radiactivo del DNA (timidina 3 H), muestra que el DNA se sintetiza en el ncleo y permanece all. En cambio el mareaje de la clulas con un precursor radiactivo de RNA (uridina 3H) revela que el RNA se sintetiza inicialmente en el ncleo de la clula pero que luego se desplaza rpi damente hacia el citoplasma. Las molculas marcadas con radiactividad tam bin pueden ser detectadas por autorradiografa despus de haber sido sepa radas de otras molculas mediante electroforesis en gel: de esta manera se detecta habitualmente la posicin tanto de las protenas (vase Figura 4-45) como de los cidos nucleicos (vase Figura 7-5). Adems cuando se utilizan m o lculas de cidos nucleicos marcadas radiactivamente como sondas para buscar molculas de cidos nucleicos complementarias a ellas, se utiliza la autorra diografa para detectar la posicin y la cantidad de estas molculas que se hibridan con la sonda, tanto sobre un gel como sobre la seccin de un tejido (vase Figura 7-20).

Las concentraciones de los iones se pueden medir mediante electrodos intracelulares 32

Una posibilidad de estudiar la qumica de una clula viva individual consiste en insertar la punta de una fina pipeta de vidrio directamente en el interior de la c lula, una tcnica desarrollada por los electrofisilogos para estudiar voltajes y flujos de corriente a travs de la membrana plasmtica. Para ello se confeccio nan microelectrodos intracelulares a partir de finos tubos de vidrio estirados al fuego hasta que la punta tenga un dimetro de una fraccin de micrmetro. Es tos tubos se llenan con una solucin conductora (normalmente una sal simple como el KC1 en agua). La punta del microelectrodo puede ser introducida en el citoplasma a travs de la membrana plasmtica, la cual se cierra alrededor del

Figura 4-51 Autorradiografa al m icroscopio electrnico. Resultados de un experimento de pulso y caza en el que clulas B pancreticas se mantuvieron durante 5 minutos con leucina 3H (el pulso) y a continuacin se colocaron en un medio con un gran exceso de leucina no marcada (la caza). Una gran cantidad del aminocido se incorpora a la insulina, la cual es una protena de secrecin. Tras 10 minutos de caza, la protena marcada se ha desplazado desde el retculo endoplasm tico rugoso hasta las cisternas del Golgi (A), donde se puede localizar mediante los granos negros de plata de la emulsin fotogrfica. Tras los 45 minutos de caza siguientes la protena marcada se encuentra en los grnulos de secrecin electrodensos (B). Los pequeos granos de plata redondeados que se aprecian aqu se han producido utilizando un revelador fotogrfico especial y no deben confundirse con los puntos negros similares que aparecen en los mtodos de mareaje inmunolgico (por ejemplo, en la Figura 4-63). Experimentos similares a los de la figura resultaron importantes para establecer las rutas intracelulares de las protenas de secrecin recin sintetizadas. (Cortesa de L.Orci, en D iabetes 31:538-565, 1982. 1982 American Diabetes Association Inc.)

Siguiendo el rastro y cuantificando las molculas del interior de las clulas

191

nh2

HC

II

1 1 1 1 1 1 , / ch -o PO PO PO CH, o V I c x N I I I 1^ \ l
O
A TP[

OC

O'

H C
C | OH N H-, X . H

Figura 4-5 2 Molculas m arcadas radioisotdpicamente. Tres formas radiactivas del ATP, disponibles com ercialmente. Los tomos radiactivos se muestran en rojo. Tam bin se indica la nomenclatura utilizada para identificar la posicin y el tipo de los tomos radiactivos.

H C | OH

'^ 5 6 ,N i
O O O H C ^ I 4 7 II

II
o

II

II

9 .^ C ^ 3
N'

~XH

CH2 C H

O-

O-

H i
A T P |2 ,8 - 3H ]
h

OH

NH-, X . N- C ^ 'N

O
y I

O
pi

O
a i CH, i X

HCX
n' c ^ ch

O p o p O p o O" O"
A T P [y -32P]

O"
H ^

___H^C
^ OH H OH

tubo adhirindose ntimam ente al vidrio de forma que la clula se altera relati vamente poco. Los microelectrodos son tiles para estudiar el interior celular de dos m ane ras: pueden ser transformados en sondas para medir las concentraciones intracelulares de iones inorgnicos com unes como el H+, el Na+, el K+ , el Cl_, el Ca2 +y el Mg2+, y pueden utilizarse com o micropipetas para inyectar molculas en las clulas. El principio que permite medir las concentraciones inicas con un microelectrodo es el mismo que el del pHmetro corriente. La tendencia de los iones a difundir a favor de su gradiente de concentracin puede ser equilibrada por un campo elctrico de sentido opuesto; cuanto mayor sea el gradiente de concentracin mayor tendr que ser el campo elctrico. As, la magnitud del campo elctrico necesario para mantener el gradiente de concentracin en un equilibrio estable nos proporciona una medida de la magnitud del gradiente de concentracin. Para determinar la concentracin de un ion determinado se ha de utilizar un material que solamente sea permeable a este ion, formar con este material una lmina o barrera y situarla entre la solucin del ion cuya concen tracin queremos determinar y una solucin patrn de concentracin del ion conocida. La diferencia de potencial elctrico a travs de la membrana selectiva cuando no exista flujo de iones ser directamente proporcional a la relacin de concentraciones del ion determinado a ambos lados de dicha membrana. (La teo ra relacionada con el transporte inico a travs de la membrana plasmtica se explica en el Panel 11 - 2 .) En la prctica, la punta del microelectrodo se llena con un compuesto orgnico apropiado que hace de barrera permeable selectiva al ion escogido cuya concentracin se desea medir. Entonces, se inserta el microelectrodo junto con un microelectrodo de referencia en el interior de una clula, como se muestra en la Figura 4-53.

192

Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

voltm etro electrodo ion-selectivo I I I------- precinto de goma solucin de KCI de concentracin conocida conductor de plata resina intercam biadora de iones nicamente perm eable al K+ barrera permt selectivam ente a un ion determ inado (A) clula (B)

electrodo de referencia

Ms recientem ente la tcnica de microelectrodos se ha adaptado al estudio del transporte inico a travs de canales proteicos especializados (denominados canales inicos) situados en una pequea cantidad de membrana plasmtica. En este caso, un microelectrodo de vidrio de larga punta se presiona suavemen te sobre la m em brana plasmtica de una clula, en lugar de introducirlo en la clula atravesando dicha mem brana (Figura 4-54). Entonces resulta posible es tudiar el comportamiento elctrico de la pequea zona de membrana que queda recubriendo la punta del electrodo, se halle todava unida a la clula o separada de ella (Figura 4-55). Esta tcnica, conocida como registro zonal (patch-clamp recording) ha revolucionado el estudio de los canales inicos. Como se explica en el Captulo 11, constituye una de las pocas tcnicas de biologa celular que permite estudiar a tiempo real la funcin de una sola molcula proteica.

Figura 4 -5 3 M icroelectrodo ionselectivo utilizado para m edir la concentracin intracelular de un determ inado ion. En (A) se muestra el dispositivo experimental. (B) ilustra la construccin de un microelectrodo permeable selectivamente al K\ En general, la punta del microelectrodo ion-selectivo intracelular est construida de un cristal especial o est llena de un com puesto orgnico especial que la hace permeable exclusivamente al ion escogido. El resto del tubo est lleno de una solucin acuosa del ion a una concentracin conocida, en la que se halla sumergido un conductor metlico que est conectado a un terminal de un voltmetro. El otro terminal del voltmetro est conectado de forma similar a un microelectrodo de vidrio, que acta de referencia, el cual tiene la punta abierta y contiene una solucin conductora sencilla. Ambos microelectrodos, empaquetados conjuntam ente, atraviesan la m em brana plasmtica de la clula que se quiere estudiar. El voltaje que mide el voltmetro, que es igual a la diferencia de potencial a travs de la barrera permeable selectivamente, revela la concentracin del ion en la clula.

Los cam bios rpidos en las concentraciones inicas intracelulares se pueden medir mediante indicadores emisores de luz33
Los electrodos sensibles a iones nicamente revelan la concentracin inica de un punto de la clula. Adems, su respuesta es lenta y en ocasiones irregular para iones que se hallen presentes a concentraciones muy bajas, como es el caso del Ca2+. Por ello, estos electrodos no son adecuados para medir los rpidos y transitorios cambios intracelulares de la concentracin de Ca2+ , que tan impor tantes son en la respuesta celular a seales extracelulares. Estos cambios pueden ser analizados mediante la utilizacin de indicadores inicos sensibles, cuya emisin de luz refleja la concentracin local del ion. Algunos de estos indicado res son luminiscentes (emiten luz espontneamente) mientras que otros son fluorescentes (emiten luz cuando son expuestos a la luz). La aecuorina es una protena luminiscente, aislada a partir de ciertas medusas marinas, que emite luz en presencia de Ca2+y responde a los cambios de concentracin de Ca2 + en el

Figura 4 -54 Micropipetas utilizadas para el registro zonal (patch-clam p recording). Se muestra una clula en bastn del ojo de una salamandra, mantenida por una pipeta de succin mientras que una pipeta de vidrio de punta fina, presionada contra la clula de forma que el vidrio se halla en ntimo contacto con la membrana plasmtica, acta de microelectrodo. Generalmente se utiliza un artilugio electrnico para mantener el voltaje constante y a un valor determinado. (De T.D. Lamb, H.R. Matthews y V.Torre, /. Physiol. 37:315-349,1986.)

20 |im

Siguiendo el rastro y cuantificando las molculas del interior de las clulas

193

H*-1 |am-H

Figura 4-55 Las cuatro conguraciones estndar utilizadas para el registro zonal. En primer

(A) ZONA DE LA M EMBRANA UNIDA A LA CLULA

(B) ZONA DE LA (C) CONFIGURACIN MEMBRANA SEPARADA EN "CLULA TOTAL" DE LA CLULA (CON EXPOSICIN DE LA CARA CITO PLASMTICA)

(D) ZONA DE LA MEMBRANA SEPARADA DE LA CLULA (CON EXPOSICIN DE LA CARA EXTRACELULAR)

intervalo de 0,5 a 10 mM. Si por ejemplo se microinyecta en un huevo, la aecuorina emite un destello de luz en respuesta a la sbita y localizada liberacin de Ca2+ que se produce en el interior del citoplasma cuando el huevo es fertilizado (Figura 4-56), Recientem ente se han sintetizado indicadores fluorescentes de Ca2+ que se unen fuertemente al Ca2+ y que cuando estn libres son excitados a longitudes de onda ligeramente ms largas que cuando estn unidos a l. Midiendo la pro porcin de intensidad fluorescente a las dos longitudes de onda de excitacin, puede determinarse la proporcin de concentraciones entre el indicador unido a Ca2+ y el indicador libre. Esta diferencia proporciona una medida precisa de la concentracin de Ca2 + libre. Dos populares indicadores de este tipo, denomina dos quin-2 y fura-2, son tiles para estudiar los cambios de las concentraciones intracelulares de Caz+ en diferentes zonas de la clula, visualizndolas mediante un microscopio de fluorescencia (Figura 4-57). Existen indicadores fluorescentes sem ejantes a stos tiles para medir otros iones; por ejemplo, algunos de ellos se utilizan para medir H+ , y por lo tanto, el pH intracelular. Algunos de estos indica dores pueden entrar en las clulas por difusin, por lo que no se han de microinyectar, lo cual permite controlar al microscopio de fluorescencia un gran nme ro de clulas simultneamente. La construccin de nuevos tipos de indicadores y su utilizacin con los modernos mtodos de anlisis de imgenes pueden ha cer posible el desarrollo de mtodos rpidos y precisos similares a stos que nos permitan analizar las variaciones de las concentraciones intracelulares de dife rentes pequeas molculas.

lugar, la boca de la pipeta de registro se presiona contra la membrana celular de forma que se forme una unin hermtica {arriba}. Entonces se puede registrar la corriente que entra en la pipeta a travs de la zona de membrana (A) unida a la clula o (B) separada de ella, exponiendo la superficie citoplasmtica de la membrana plasmtica. Alternativamente, la zona de membrana se puede romper mediante una succin suave, de forma que el interior del electrodo quede en comunicacin directa con el interior de la clula (C); en esta ltima configuracin en "clula total se puede registrar el comportamiento elctrico de la clula de forma similar a como se hara con un microelectrodo, pero con la opcin adicional de poder alterar la composicin qumica de la clula permitiendo que diferentes compuestos difundan desde la pipeta, de punta relativamente ancha, al citoplasma. La configuracin (D) se obtiene a travs de la configuracin (C) separando la pipeta de la clula de forma que un fragmento de la membrana plasmtica adyacente se repliegue sobre la punta de la pipeta, sellndose a ella. En (D) se halla expuesta no la superficie citoplasmtica de la membrana [como ocurre en (B)] sino la superficie exterior de la membrana.

Existen diferentes sistemas que perm iten introducir molculas en una clula para las que la m em brana celular sea im perm eable34
A menudo resulta til poder introducir en la clula molculas que no puedan atravesar la membrana, como anticuerpos que reconocen determinadas prote nas intracelulares, protenas celulares normales que han sido marcadas con un

194

Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

Figura 4 -5 6 La protena luminiscente aecuorina emite luz en presencia de Ca2+ libre. En esta figura se ha inyectado aecuorina a un huevo de pez medaka, la cual ha difundido por el citosol. A continuacin, el huevo se ha fecundado con un espermatozoide, y se ha examinado con la ayuda de un intensificador de imgenes. Las cuatro fotografas que se presentan aqu fueron tomadas a intervalos de 10 segundos mirando hacia abajo el punto donde entr el espermatozoide. Las imgenes revelan una onda de liberacin de calcio libre en el citosol a partir de reservorios intracelulares justo por debajo del lugar donde entr el espermatozoide, tal como se indica en el diagrama de la izquierda. (Fotografas reproducidas de J.C. Gilkey, L.F. Jaffe, E.B. Ridgway y G.T. Reynolds. /. Cell Biol. 76:448-466,1978. Con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

compuesto fluorescente o molculas que afectan la conducta de la clula. Una aproximacin consiste en microinyectar estos compuestos a la clula a travs de una micropipeta de vidrio. Una tcnica especialmente til es la denominada citoqumica anloga fluorescente, mediante la cual una protena determinada se acopla a un colorante fluorescente y se microinyecta en una clula; de esta for ma, se puede seguir el destino de la protena inyectada con un microscopio de fluorescencia, a medida que la clula crece y se divide. Si se marca tubulina (la subunidad de los microtbulos) por ejemplo con un colorante que emita fluo rescencia en el rojo, se puede seguir la dinmica de los microtbulos segundo a segundo en la clula viva (Figura 4-58). Tam bin se pueden microinyectar anticuerpos en una clula, para bloquear la funcin de la molcula que reconocen. Por ejemplo, la inyeccin de anticuer pos anti-m iosina-II en un huevo fecundado de erizo de mar impide que el huevo se divida en dos, a pesar de que la divisin nuclear se produce normalmente. Esta observacin demostr que la miosina desempea un papel esencial en el proceso contrctil que divide el citoplasma durante la divisin celular, pero que no es necesaria para la divisin nuclear (vase Figura 18-34). A pesar de que la microinyeccin es una tcnica ampliamente utilizada, su pone la inyeccin de cada clula una por una; por esta razn solamente resulta posible estudiar varios cientos de clulas simultneamente. Otras aproximacio nes permiten permeabilizar simultneamente grandes poblaciones de clulas. Por ejemplo, utilizando potentes choques elctricos o agentes qumicos, como bajas concentraciones de detergentes, se puede romper parcialmente la estruc tura de la m em brana plasmtica de la clula, hacindola ms permeable. La tc nica elctrica tiene la ventaja de generar grandes poros en la m embrana plas mtica, sin daar las m embranas intracelulares. Los poros se mantienen abiertos durante intervalos de tiempo que pueden oscilar entre minutos y horas, dependiendo del tipo celular utilizado y de la clase de choque elctrico que se aplique; as, a travs de los poros las macromolculas pueden entrar (y salir) del citosol rpidamente. Si el tratamiento ha sido limitado, un elevado porcentaje de las clulas tratadas consigue reparar sus membranas plasmticas y sobrevive.

30

500 inri

Figura 4 -57 Visualizacin intracelular de la concentracin de Ca2+ utilizando un indicador fluorescente. El ramificado rbol de dendritas de una clula de Purkinje del cerebro recibe ms de 100 000 sinapsis de otras neuronas. La seal de salida de la clula se transporta por un nico axn, que aqu se ve saliendo del cuerpo celular en la parte inferior de la figura. Esta imagen de la concentracin intracelular de calcio de una clula de Purkinje (del cerebro de un cobaya) se obtuvo utilizando una cmara de gran sensibilidad y el indicador fluorescente sensible al Ca2+, fura-2. La concentracin de Ca2 +libre est representada por diferentes colores, siendo la mayor concentracin el color rojo y la menor el azul. Las mayores concentraciones de Ca2+ se presentan en los centenares de ramas de denditras. (Por cortesa de D.W. Tank, J.A. Connor, M. Sugimori y R.R. Llinas.)

Siguiendo el rastro y cuantificando las molculas del interior de las clulas

195

5 |jm
Un tercer mtodo para introducir grandes molculas en la clulas consiste en provocar la fusin con la membrana plasmtica de vesculas de membrana que contengan estas molculas. Estos tres mtodos, ampliamente utilizados en bio loga celular, se ilustran en la Figura 4-59.

Figura 4-58 Citoqumica fluorescente anloga. Micrografa fluorescente del borde conductor de un fibroblasto que ha sido inyectado con tubulina marcada con rodamina. Los microtbulos de toda la clula han incorporado las molculas de tubulina marcadas. As, se puede detectar los microtbulos individualmente y se puede seguir su comportamiento dinmico mediante un sistema de ordenador que incremente la imagen, como se muestra aqu. A pesar de que parece que los microtbulos tienen unos 0,25 jum de grosor, se trata de un efecto ptico; en realidad su dimetro es de tan slo una dcima parte de este valor. (Por cortesa de P. Sammeh y G. Borisy.)

m icropipeta de vidrio conteniendo la substancia

clula colocada en una solucin de la substancia X, entre dos electrodos, y sujeta a shocks elctricos m uy cortos

vescula lim itada por m em brana, conteniendo la substancia X

los poros transitorios practicados en la m em brana perm iten que la substancia X entre en la clula antes de que se vuelvan a soldar

clula diana

la fusin de m em branas inducida, entre las vesculas y la m em brana plasm tica de la clula diana, libera la substancia X en el citoplasm a

/
(A) (B)
(C)

Figura 4 -59 Mtodos utilizados para introducir en una clula una substancia para la cual la m em brana es impermeable. En (A) la substancia es inyectada a travs de una micropipeta, aplicando una presin o, si la substancia est cargada elctricamente, aplicando un voltaje que obligue a la substancia a pasar al interior de la clula como una corriente inica (tcnica denominada iontoforesis). En (B) la membrana celular se hace transitoriamente permeable a la substancia que queremos introducir, rompiendo la estructura de la m em brana mediante un breve pero intenso shock elctrico (por ejemplo de 2000 voltios por centm etro durante 200 microsegundos). En (C) se usa un sistema de fusin de membranas. Se pueden cargar vesculas rodeadas de membrana con la substancia deseada y luego inducirlas a fusionarse con la clula diana.

196

Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

La activacin inducida por la luz de molculas precursoras em paquetadas facilita el estudio de la dinm ica intracelular 35
La complejidad y rapidez de muchos procesos intracelulares, como la accin de las molculas seal o el movimiento de las protenas del citoesqueleto, los hace difciles de estudiar a nivel unicelular. Idealmente, cualquier molcula de inters se puede introducir en una clula viva en un momento preciso y en un lugar de la clula determinado, y posteriormente seguir su comportamiento, as como la respuesta de la clula. Sin embargo, la microinyeccin es limitada debido a la di ficultad de controlar el lugar y el momento de la descarga del compuesto que se microinyecta. Una aproximacin mucho ms poderosa supone sintetizar una forma inactiva de la molcula de inters, introducirla en la clula y activarla s bitamente y en un lugar escogido de la clula enfocando sobre ella un fino haz de luz. Se han sintetizado precursores inactivos fotosensibles de este tipo, deno minados molculas empaquetadas, de una gran variedad de pequeas m olcu las, incluyendo el Ca2+ , el AMP cclico, el GTP y el inositol trifosfato. Las molculas empaquetadas se pueden introducir en las clulas vivas mediante cualquiera de los mtodos descritos en la Figura 4-59, y posteriormente se pueden activar m e diante un fuerte pulso de luz procedente de un lser (Figura 4-60). Se puede uti lizar un microscopio para enfocar el haz de luz sobre cualquier regin de la clu la, de forma que el experimentador puede controlar exactamente dnde y cundo se liberar la molcula. De esta forma, por ejemplo, se pueden estudiar los efectos instantneos de la liberacin en el citosol de una molcula seal in tracelular. Las molculas empaquetadas fluorescentes son herramientas con un gran futuro. Se construyen uniendo un colorante fluorescente fotoactivable a una protena purificada. Es importante que la protena modificada siga siendo biol gicamente activa: a diferencia de lo que ocurre con el mareaje con radioistopos (cuya diferencia nicamente consiste en el nmero de neutrones del ncleo del tomo marcado), el mareaje con colorantes empaquetados fluorescentes aade a la superficie de la protena un gran grupo extra, el cual fcilmente puede alte rar las propiedades de la protena. Mediante prueba y error suele encontrarse f cilmente un protocolo de mareaje satisfactorio. Cuando se dispone de una protena marcada biolgicamente activa, resulta posible seguir su comportamiento en el interior de las clulas vivas. Por ejemplo, se puede introducir tubulina mar cada con fluorescena empaquetada en los microtbulos del huso mittico: cuando se ilumina una pequea regin del huso mittico con un lser, la tubuli na marcada se vuelve fluorescente, de forma que ahora se puede seguir su movi miento a lo largo de los microtbulos del huso (Figura 4-61). En principio, esta misma tcnica se puede aplicar a cualquier protena.

Se pueden utilizar anticuerpos para detectar y aislar molculas determinadas 36

Los anticuerpos son protenas producidas por los vertebrados como defensa contra las infecciones (vase Captulo 23). Se diferencian del resto de las prote nas en que son producidos en millones de formas diferentes, cada una de las
Figura 4 -60 Molculas empaquetadas. Esquema general que
m o l c u la X

R C H

no2

luz UV

derivado inactivo 2-nitrobencil d e la m olcula X (m olcula X "e m p aq u e tad a")

2-nitrobenzaldehdo

m olcula X libre activa

muestra de qu forma un derivado de una molcula empaquetada sensible a la luz (aqu designada X) se puede convertir, mediante un flash de luz UV, en su forma libre activa. Incluso los iones Ca2+ se pueden empaquetar indirectamente; en este caso se utiliza un quelante de Ca2\ el cual se inactiva por fotlisis, liberando as el Ca2t que lleva unido.

Siguiendo el rastro y cuantificando las molculas del interior de las clulas

197

Figura 4-61 Determinacin del flujo de microtbulos en el huso mittico utilizando fluorescena empaquetada unida a tubulina. (A) Un huso en metafase formado in vitro a partir de un extracto de huevos de X enopus ha incorporado tres marcadores fluorescentes: tubulina unida a rodamina (rojo) para marcar todos los microtbulos, un colorante azu l unido al DNA que marca los cromosomas y fluorescena empaquetada unida a tubulina, que tambin se incorpora en todos los microtbulos pero que resulta invisible debido a que no es fluorescente hasta que no haya sido activada por luz ultravioleta. En (B) se utiliza un haz de luz ultravioleta para desempaquetar localmente la fluorescena empaquetada unida a tubulina principalmente en el lado izquierdo de la placa metafsica. Durante los siguientes minutos (despus de un minuto y medio en C y de dos minutos y medio en D) se observa que la seal de tubulina unida a fluorescena desempaquetada se desplaza hacia el polo izquierdo del huso, lo cual indica que la tubulina se desplaza continuamente hacia los polos a pesar de que el huso (visualizado a travs de la fluorescencia de la tubulina marcada con rodamina roja) permanece casi inalterada. (De K.E. Sawin y T.J. Mitchison,/. Cell. Biol. 112:941-954,1991, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

cuales tiene un lugar de unin diferente que reconoce especficamente a una molcula diana (denominada antgen). La exacta especificidad de los anticuer pos frente a los antgenos los convierte en poderosas herramientas para la biolo ga celular. Marcados con colorantes fluorescentes (fluorocromos) resultan muy valiosos para localizar en las clulas determinadas molculas mediante m icros copa de fluorescencia (Figura 4-62); marcados con partculas densas a los elec trones, como pueden ser esferas de oro coloidal, se utilizan para localizar con una alta resolucin molculas determinadas al microscopio electrnico (Figura 4-63). Como herramientas biolgicas se utilizan para detectar y cuantificar m o lculas en extractos celulares y para identificar protenas determinadas, despus de que stas hayan sido aisladas por electroforesis en gel de poliacrilamida (va se Figura 4-46). Los anticuerpos se pueden acoplar a una matriz inerte con el fin de formar una columna de afinidad, la cual se utiliza para purificar macromolculas especficas a partir de un extracto celular, o en el caso de que la molcula se halle en la superficie de la clula, para seleccionar tipos determinados de c lulas vivas a partir de una poblacin heterognea. Frecuentem ente, la sensibilidad de los anticuerpos como sondas para la de teccin de molculas determinadas en las clulas y en los tejidos se incrementa

10 |jm

Figura 4-62 Inmunofluorescencia. (A) Electronmicrografa de la zona cortical de una clula epitelial en cultivo, mostrando la distribucin de los microtbulos y de otros filamentos. (B) La misma rea pero teida con un anticuerpo fluorescente anti-tubulina, la subunidad proteica de los microtbulos, utilizando la tcnica de la inmunocitoqumica indirecta (vase Figura 4-64). Las flechas indican microtbulos individuales fcilmente reconocibles en ambas figuras. (De M. Osborn, R. Webster y K. Weber, J. Cell. Biol. 77:R27-R34, 1978. Reproducido con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

(A)

<B

i------------------------------- 1

10 )im

198

Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

mediante mtodos de amplificacin de seal. Por ejemplo, a pesar de que se puede unir directamente una molcula marcadora, como un colorante fluores cente, a un anticuerpo que ser utilizado para el reconocimiento especfico (el anticuerpo primario ), se consigue una seal mayor utilizando el anticuerpo pri mario y luego detectndolo con un grupo de anticuerpos secundarios que se unan a l (Figura 4-64). Los mtodos de amplificacin ms sensibles utilizan una enzima como m o lcula marcadora, unida al anticuerpo secundario. As por ejemplo, se puede utilizar la fosfatasa alcalina, una enzima que en presencia de los reactivos ade cuados produce fosfato inorgnico que genera un precipitado coloreado. Este precipitado revela la presencia del anticuerpo secundario que est acoplado a la enzima, y por lo tanto, la localizacin del complejo antgeno-anticuerpo al que se ha unido el anticuerpo secundario. Como cada molcula de enzima acta ca talticamente generando varios cientos de molculas de producto, este sistema permite la deteccin de diminutas cantidades de antgeno. Sobre este principio se han desarrollado inmunoensayos unido a una enzima (ELISA, de Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), que se utilizan habitualmente en medicina como test sensibles -p o r ejemplo como prueba de gestacin o de varios tipos de infec ciones. La manera ms sencilla de preparar anticuerpos es inyectando varias veces una muestra de un antgeno a un animal, como un conejo o una cabra, y luego recogiendo suero rico en anticuerpo. Este antisuero contiene una mezcla hetero gnea de anticuerpos, cada uno de los cuales ha sido producido por una clula secretora de anticuerpos diferente (un linfocito B). Los diferentes anticuerpos reconocen diversas zonas de la molcula de antgeno y tambin impurezas de la preparacin de antgeno que se inyect. A veces, la especificidad de un antisuero por un antgeno determinado puede aumentarse eliminando las molculas de anticuerpo que se unen a otras molculas; por ejemplo, un antisuero producido contra una protena X puede hacerse pasar a travs de una columna de afinidad de antgenos Y y Z, para eliminar as todos los anticuerpos anti-Y y anti-Z del an tisuero. Sin embargo, la heterogeneidad de los antisueros a menudo ha.limitado sus aplicaciones.

vescula

see re lo r.i

lisosoma

ncleo denso

1 jim
Figura 4 -6 3 Inmunolocalizacin en m icroscopa electrnica. Micrografa electrnica de una clula secretora de insulina, en la que las molculas de insulina se han marcado con anticuerpos anti-insulina unidos a pequeas esferas de oro coloidal (cada una de las cuales aparecen como puntos negros). La mayor parte de la insulina se halla almacenada en las zonas densas de las vesculas secretoras; adems, algunas de estas zonas densas se degradan va lisosomas. (De L. Orci, D iabetolog ia
28:528-546, 1985.)

Las lneas celulares de hibridomas constituyen una fuente perm anente de anticuerpos m onoclonales 37
En 1976 qued solucionado el problema de la heterogeneidad de los anticuerpos gracias al desarrollo de una nueva tcnica que revolucion el uso de los anti cuerpos como herramientas para la biologa celular. La tcnica se basa en pro pagar un clon de clulas a partir de una nico linfocito B secretor de anticuer pos, con lo que se pueden obtener grandes cantidades de anticuerpos. El problema prctico, sin embargo, es que los linfocitos B tienen una vida limita da en cultivo. Para solucionar esta limitacin, se fusionan linfocitos B individua les productores de anticuerpos, procedentes de un ratn o una rata inmuniza dos, con clulas derivadas de un tumor inm ortal de linfocitos B. De la mezcla heterognea resultante de clulas hbridas se seleccionan aquellos hbridos que presentan tanto la capacidad de producir un determinado anticuerpo como la capacidad de multiplicarse indefinidamente en cultivo. Estos hibridomas se

antgeno A inm ovilizado

anticuerpos prim arios: anticuerpos de conejo dirigidos contra el antgeno A

anticuerpos secundarios: anticuerpos dirigidos contra el anticuerpo de conejo, acoplados con una molcula marcadora

marcador

L
Siguiendo el rastro y cuantificando las molculas del interior de las clulas

Figura 4 -6 4 Inm unocitoqumica indirecta. El mtodo es muy sensible debido a que el anticuerpo primario es a su vez reconocido por muchas molculas del anticuerpo secundario. El anticuerpo secundario est unido covalentemente a una molcula marcadora que lo hace fcilmente detectable. Entre las molculas marcadoras ms utilizadas se encuentran los colorantes fluorescena y rodamina (para m icroscopia de fluorescencia), la enzima peroxidasa de rbano (tanto para microscopia ptica convencional com o para microscopia electrnica), la ferritina (protena que contiene hierro) o esferas de oro coloidal (para microscopia electrnica) y las enzimas fosfatasa alcalina o peroxidasa (para su deteccin bioqumica).

199

ratn inm unizado con el antgeno X

lnea celular m utante derivada de un tum or de linfocitos B

clula productora de anticuerpos anti-X linfocitos B (m orirn a los pocos das de cultivo)

(estas clulas crecern indefinidam ente en un m edio norm al pero m orirn en el m edio selectivo)

FUSIN I productos de la fusin colocados en m ltiples placas de cultivo |

i oOoo

anticuerpo anti-X / ' segregado

o3oo*

30^3

G*o o o3o

Figura 4-65 Preparacin de hibridomas que segreguen anticuerpos monoclonales homogneos con tra un antgeno determ inado (X). El medio de crecim iento selectivo utilizado contiene un inhibidor (la aminopterina) que bloquea las rutas normales de biosntesis a travs de las que se sintetizan los nucletidos. Por consiguiente, las clulas han de utilizar una ruta paralela para sintetizar sus cidos nucleicos, y la lnea celular mutante a la que se fusionan los linfocitos B normales es defectuosa para esta va. Puesto que ninguno de los dos tipos celulares utilizados para la fusin inicial puede vivir separado del otro, tan slo sobreviven las clulas hbridas.

nicam ente los hibridom as crecen en el m edio selectivo

detectar la presencia de anticuerpos anti-X en el sobrenadante y clonar las clulas de las placas positivas con ~ 1 clula por placa

J2

mTTTTTT
3
lo

T I

m 3

im

0 3 <0

pe rm itir que las clulas se m ultipliquen y com probar la existencia de anticuerpos anti-X en el sobrenadante los clones positivos constituyen una fuente continua de anticuerpo anti-X
/ \

propagan com o clones individuales, cada uno de los cuales constituye una fuen te permanente y estable de un anticuerpo monoclonal (Figura 4-65). Este anti cuerpo reconocer un nico tipo de lugar antignico -p o r ejemplo, un grupo de terminado de seis cadenas laterales de aminocidos de la superficie de una protena. El hecho de que la especificidad sea uniforme hace de estos anticuer pos monoclonales una herramienta mucho ms til que los antisueros conven cionales, los cuales normalmente contienen una mezcla de anticuerpos que re conocen una gran variedad de diferentes determinantes antignicos, incluso en macromolculas pequeas. Sin embargo, la mayor ventaja de la tcnica de los hibridomas consiste en que se pueden producir anticuerpos monoclonales contra molculas no purifica das, que nicamente constituyen un componente minoritario de una mezcla compleja. En un antisuero ordinario obtenido contra una mezcla, el nmero de molculas de anticuerpo que reconocen los componentes minoritarios de la mezcla puede ser demasiado pequeo para llegar a ser utilizable. Pero si los linfo citos B que producen todos estos anticuerpos se hallan en hibridomas y se se lecciona un clon hibridmico a partir de esta gran mezcla de clones, este clon de terminado se puede propagar indefinidamente con lo que se producir el anti cuerpo deseado en grandes cantidades. Por lo tanto, en principio se puede ge nerar un anticuerpo monoclonal contra cualquier protena de una mezcla bio lgica; una vez se ha conseguido el anticuerpo, se puede utilizar como sonda

200

Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

especfica tanto para averiguar y localizar la protena que induce su formacin como para purificar esta protena y estudiar su estructura y su funcin. Dado que nicamente se han aislado el 5% de las 10 000 protenas que tiene aproximada mente una clula de mamfero, muchos de los anticuerpos monoclonales genera dos contra mezclas impuras de protenas identifican nuevas protenas en extrac tos celulares fraccionados. Con la utilizacin de los anticuerpos monoclonales y la tecnologa del clonaje gnico (vase ms adelante) no va a ser difcil la identifi cacin y caracterizacin de nuevas protenas y de nuevos genes; el problema ser determinar su funcin, y a menudo el sistema ms potente de hacerlo es utilizan do la tecnologa del DNA recombinante, como se discute en el Captulo 7.

Resumen
Actualmente se dispone de una gran nm ero de tcnicas que perm iten detectar, m e d ir y seguir casi cualquier molcula de inters en el interior de una clula. Cualquier molcula puede ser m arcada mediante la incorporacin de uno o ms tomos ra diactivos. Los ncleos de estos tomos se desintegran, emitiendo una radiacin que perm ite detectar la molcula m arcada y trazar sus movimientos y su metabolismo en la clula. Entre el elevado nm ero de aplicaciones de los radioistopos a la bio loga celular, se puede destacar el anlisis de las vas metablicas m ediante mto dos de pulso y caza y la determ inacin de un elevado nm ero de molculas indivi dualm ente m ediante la autorradiografa. Los colorantes fluorescentes tambin se pueden utilizar para m edir las concen traciones de determ inados iones en clulas individuales, incluso en zonas concretas de una clula. Los microelectrodos de vidrio, que empezaron a ser im prescindibles en el estudio de potenciales de m em brana y de corrientes inicas a travs de la m em brana plasmtica, actualm ente proporcionan una alternativa para m edir las concentraciones intracelulares de iones determinados. Tambin pueden utilizarse como micropipetas para inyectar a las clulas molculas para las que las m em bra nas son im perm eables, como protenas marcadas con fluorescena y anticuerpos. Se puede seguir el comportamiento dinmico y los movimientos de muchos tipos de molculas en una clula viva construyendo un precursor inactivo em paquetado, el cual puede ser introducido en una clula y activado en una regin determ inada de la clula m ediante una reaccin estimulada por la luz. Los anticuerpos tambin son herram ientas verstiles y sensibles para detectar y localizar molculas biolgicas determ inadas. Los vertebrados producen millones de molculas de anticuerpo distintas, cada una de las cuales tiene un lugar de unin que reconoce una regin determ inada de una m acromolcula. La tcnica del hibridom a perm ite la obtencin, en cantidades casi ilimitadas, de anticuerpos mo noclonales, con una especificidad nica. Se pueden obtener anticuerpos monoclo nales contra, en principio, cualquier macromolcula celular; estos anticuerpos mo noclonales pueden ser utilizados para localizar y purificar la molcula que el anticuerpo reconoce y, por lo menos en algunos casos, analizar su funcin.

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204

Captulo 4 : Cmo se estudian las clulas

Gentica molecular

recom binante El ncleo celu lar El con trol de la expresin S tS S l

Electronmicrografa de barrido de cromosomas humanos en metafase. (Por cortesa de Terry D. Alien.)

Serie de seis imgenes de un modelo anatmico de un poliovirus, cuya estructura tridimensional se conoce con exactitud a partir de cristalografa de rayos X. Cada imagen est ampliada tres veces respecto a la anterior, hasta que al final podemos ver una regin del virus a nivel de resolucin atmica. En el centro de la ltima imagen puede verse claramente la cadena lateral del aminocido triptfano. (Por cortesa de James Hogle).

Funcin de las protenas

muerte de las protenas

Las protenas constituyen la mayor parte de la masa seca de la clula y desem pe an las funciones predominantes de la mayora de los procesos biolgicos. Sin embargo, para poder entender lo que son las protenas, primero hay que inten tar entender cmo es una clula. En el Captulo 3 presentamos una introduccin elemental de la estructura de las protenas, junto con una visin general de las macromolculas biolgicas, discutiendo su qumica y su conformacin. Sin em bargo, las protenas no son slo rgidos grumos de material de superficie qumi cam ente reactiva. Disponen de zonas mviles estructuradas de manera muy precisa, cuyas acciones m ecnicas estn acopladas con eventos qumicos. Preci sam ente es este acoplamiento entre qumica y movimiento lo que provee a las protenas de capacidades extraordinarias que estn en la base de todos los pro cesos dinmicos de las clulas vivas. Sin comprender cmo actan las protenas como molculas con zonas mviles resulta difcil apreciar el resto de la biologa celular. En este captulo, que inicia las secciones ms avanzadas del libro, utiliza mos ejemplos seleccionados para mostrar de qu m anera funcionan las prote nas, no slo como catalizadores sino tam bin como sofisticados transductores de movimientos, integradores de seales, y com ponentes de mquinas protei cas compuestas por muchas subunidades. La discusin se basa en avances que han revelado las estructuras tridimensionales detalladas de muchas protenas; resalta los principios generales e intenta sentar las bases de descripciones de estructuras celulares especficas y de procesos que se detallan en captulos pos teriores. En la ltima parte del captulo describimos la vida y la muerte de las prote nas -desde su plegamiento, guiado por chaperones moleculares, hasta su des truccin por proteolisis dirigida- poniendo nfasis en la construccin molecular de la mayora de las protenas y de los complejos proteicos.

Las protenas como mquinas

Empezaremos considerando de qu manera se puede alterar la conformacin de una protena debido a la unin de otra molcula denominada ligando. Demos traremos las profundas implicaciones de este fenmeno aparentemente simple describiendo algunas de las muchas maneras por las que las clulas utilizan las alteraciones de las protenas inducidas por ligandos.

207

hexoquinasa

glucosa

glucosa 6-fosfato

La unin de un ligando puede cam biar la conform acin de una protena 1

El primer ejemplo trata de la enzima hexoquinasa, la cual est presente en casi todas las clulas. Esta enzima cataliza una etapa temprana del metabolismo de los azcares -la transferencia del fosfato terminal de una molcula de ATP a la glucosa, formando glucosa 6-fosfato (como se discute en el Captulo 2). La hexo quinasa se une fuertemente a glucosa, lo cual incrementa notablemente la afini dad de la enzima por el ATP, que se une a un lugar vecino de la protena. Enton ces, algunas cadenas laterales de determinados aminocidos de la protena catalizan la transferencia del fosfato, y los dos productos -la glucosa 6-fosfato y el ADP- se liberan, acabando el ciclo de reaccin (Figura 5-1). La hexoquinasa de levadura est compuesta por dos dominios. Los lugares de unin para la glucosa y para el ATP se hallan en una hendidura situada entre estos dominios, y cuando la glucosa se une, los dominios se desplazan uno hacia el otro cerrando la hendidura (Figura 5-2). Este tipo de desplazamiento de dominios en respuesta a la unin de un li gando es un proceso habitual y fcil de explicar. En el caso de la hexoquinasa, en la cara interna de cada dominio existen lugares de unin para diferentes zonas de la molcula de glucosa. El cambio desfavorable de la energa libre de la prote na que ocurre cuando los dominios se desplazan uno respecto al otro cerrando la hendidura queda ms que compensado por la energa libre liberada cuando la hendidura se cierra sobre la glucosa; en otras palabras, los enlaces no covalentes que forma la glucosa con la protena unen los dos dominios, uno contra otro, haciendo que la protena salte de una conformacin abierta a otra cerrada.

Figura 5-1 La reaccin catalizada por la hexoquinasa. En el primer paso de la degradacin de la glucosa se transfiere un grupo fosfato desde el ATP hasta la glucosa, formando glucosa 6 -fosfato. Entonces la glucosa 6 -fosfato es procesada mediante series de otras enzimas que catalizan la cadena de reacciones conocidas como glucolisis. La glucolisis transforma la glucosa en piruvato y produce una ganancia neta de molculas de ATP para la clula (vase Figura 2-21).

dom inio

yen glucosa

Figura 5-2 El cambio de conform acin de la hexoquinasa causado por la unin de glucosa. Las lneas trazan el curso del esqueleto hidrocarbonado de la hexoquinasa. Estas estructuras fueron determinadas por anlisis de difraccin de rayos X de cristales de la protena, sin y con glucosa. La unin de glucosa cam bia la protena desde una conform acin a b ierta a una conform acin cerrada.

ABIERTA

dom inio

CERRADA
2

208

Captulo 5 : Funcin de las protenas

A menudo cuando dos ligandos se unen a la mism a protena, cada uno de ellos afecta la unin del otro 2
La unin de la glucosa a la hexoquinasa provoca un incremento de cinco veces de la afinidad de la enzima por el ATP. La razn es fcil de entender. Como la glucosa, si la hendidura se cierra el ATP puede formar enlaces no covalentes con aminocidos de las caras internas de los dos dominios. Cuando el ATP, solo, se une a la hexoquinasa, parte de la energa de unin puede utilizarse para cerrar la hendidura; sin embargo, esta energa no se necesita si la unin de la glucosa ha inducido este cambio de conformacin (Figura 5-3). En base a este mismo razo namiento puede predecirse que la glucosa se unir a la hexoquinasa ms fuerte mente en presencia de ATP que en su ausencia, lo cual es lo que se observa (Fi gura 5-4). El ATP y la glucosa se unen a la hexoquinasa en lugares vecinos. Sin em bar go, a veces la unin de un ligando sobre la superficie de una protena puede afectar la unin de un segundo ligando, incluso aunque ambos lugares de unin estn separados. Supongamos por ejemplo que una protena que une glucosa como lo hace la hexoquinasa, tam bin una otra molcula, X, en una zona distan te de su superficie. Si el lugar de unin para X cambia la conformacin como una parte del gran cambio de conformacin inducido por la unin de la glucosa, diremos que los lugares de unin para X y para glucosa estn acoplados. Si por ejemplo la conformacin cerrada hace que el lugar de unin para X enlace mejor la molcula X, la unin de la glucosa incrementar la afinidad de la protena por X, tal como la glucosa increm enta la afinidad de la hexoquinasa por el ATP (Fi gura 5-5).

CERRADA
Figura 5-3 La glucosa favorece que el ATP se una a la hexoquinasa. Como la glucosa, el ATP se une m ejor a la conform acin cerra d a de la enzima, de forma que se une m ejor a ella si la glucosa ya se ha unido previamente. Para simplificar en esta figura y en la siguiente se ha reemplazado la estructura real de la protena (Figura 5-2) por un diagrama.

Figura 5-4 Equilibrio conformacional en la hexoquinasa. Tanto el ATP como la glucosa dirigen la hexoquinasa hacia su conformacin cerrada, por lo que cada ligando colabora con el otro para que se una a la enzima. En cada panel se ha representado el contenido de un tubo de ensayo que contiene 10 molculas de hexoquinasa en solucin acuosa. En el panel A se muestra cmo se comporta la protena cuando no hay ningn ligando presente; a pesar de que un pequeo porcentaje de molculas adoptan espontneamente la forma cerrada, la mayora de ellas estn en la configuracin abierta. Los otros paneles muestran cmo se comportan las 10 molculas de protena con 12 molculas de glucosa (panel B), con 12 molculas de ATP (panel C) o con 12 molculas de glucosa y 12 de ATP (panel D). Los smbolos utilizados para la glucosa y para el ATP son los mismos que los de la Figura 5-3. Cuando se comparan las cantidades de glucosa libre (no ligada) presente en los paneles B y D se puede observar que la adicin de ATP ayuda a la glucosa a unirse, mientras que comparando la cantidad de ATP libre de los paneles C y D se observa que la adicin de glucosa ayuda al ATP a unirse.

Las protenas como mquinas

209

CERRADA

Como discutimos a continuacin, las protenas cuyos cambios de confor macin acoplan dos lugares de unin separados de su molcula, han sido selec cionadas durante la evolucin ya que permiten a la clula relacionar la presencia de una molcula a la presencia o ausencia de cualquier otra molcula. Este tipo de acoplamiento conformacional se denomina alostera. Una protena cuya acti vidad est regulada de esta forma se denomina protena alostrica y la transicin que sufre se denomina transicin alostrica.

Dos ligandos cuyos lugares de unin estn acoplados pueden afectar recprocam ente la unin del otro 2
Cuando dos ligandos prefieren unirse a la misma conformacin de una protena alostrica, consideraciones termodinmicas bsicas aseguran que cada ligando incrementa la afinidad de la protena por el otro ligando. Este concepto se deno mina conexin (linkage). Est bien ilustrado por el ejemplo considerado en la Fi gura 5-5, en el que la unin de la glucosa a la hexoquinasa incrementa la afinidad de la enzima por la molcula X, y viceversa. La relacin de conexin es cuantitati vamente recproca de forma, por ejemplo, que si la glucosa tiene un gran efecto sobre la unin de X, X tambin tendr un gran efecto sobre la unin de glucosa. Si dos ligandos se unen a conform aciones diferentes de una protena alost rica, la conexin ser negativa. Por regla general un ligando estabiliza la confor m acin particular de la protena a la que se une; si esta conformacin es dife rente de la favorecida por el otro ligando, la unin del primer ligando dificultar la unin del segundo ligando. As, si el cambio de conformacin inducido por la glucosa reduce la afinidad de la protena por la molcula X, la unin de X dismi nuir la afinidad de la protena por la glucosa (Figura 5-6). Las relaciones mostradas esquemticamente en las Figuras 5-5 y 5-6 estn en la base de la biologa celular. Parecen tan obvias que hoy las damos por sentadas. Pero su descubrimiento, en 1950, seguido por una descripcin general de la alos tera en 1960, result revolucionario. En estos ejemplos X se une a un lugar que es diferente del lugar donde ocurre la catlisis, por lo que no tiene por qu haber ninguna relacin con la glucosa o con cualquier otro ligando que se una al lugar activo. En el caso de enzimas que estn reguladas de esta manera, la molcula X puede activar (Figura 5-5) o inactivar (Figura 5-6) la enzima. Por mecanismos de este tipo las protenas alostricas pueden actuar como interruptores generales que permiten que una molcula de una clula afecte el destino de otra molcula.

Figura 5-5 Unin cooperativa causada por el acoplamiento conform acional entre dos lugares de unin distantes. En este ejemplo tanto la glucosa como la molcula X se unen m ejor a la conform acin cerrad a de una protena con dos dominios. Tanto la glucosa como la substancia X dirigen la protena hacia su conform acin cerrada, por lo que cada ligando colabora con el otro para que se una a la protena. As pues, se dice que la glucosa y la molcula X se unen de forma cooperativa a la protena. La figura es muy similar a las Figuras 5-3 y 5-4; la nica diferencia es que mientras que el lugar de unin para el ATP se localiza en la hendidura de la hexoquinasa, el lugar de unin para la molcula X se localiza fuera de esta hendidura.

Las transiciones alostricas colaboran en la regulacin del m etabolism o 3

Como describimos en el Captulo 2, a menudo el producto final de una va m eta blica inhibe la enzima que inicia dicha va. Debido a esta retroalimentacin ne-

210

Captulo 5 : Funcin dlas protenas

ABIERTA glucosa m olcula X

CERRADA
Figura 5-6 Unin competitiva generada por el acoplamiento conform acional entre dos lugares de unin distantes entre s. El diseo de esta figura es el mismo que el descrito para la Figura 5-5, pero aqu la molcula X prefiere unirse a la conform acin ab ierta, mientras la glucosa prefiere la cerrada. Ahora la glucosa y la molcula X dirigen la protena hacia conform aciones opuestas (cerra d a y ab ierta respectivamente), por lo que la presencia de uno de los ligandos interfiere con la unin del otro.

(D)

Cx>

50% cerrada

gativa sobre el flujo de la va, la concentracin intracelular del producto final se

mantiene aproximadamente constante a pesar de los grandes cambios de las condiciones qumicas de la clula. En este tipo de regulacin por retroinhibicin las transiciones alostricas son esenciales. Por ejemplo, las enzimas que actan al principio de una va generalmente pueden existir en dos conformaciones. Una de ellas es activa y une al substrato en su lugar activo catalizando su conversin a la nueva substancia de la va. La otra es una conformacin inactiva que une al producto final de la va en un lugar diferente, el lugar regulador. Cuando se acu mula, el producto final se une a la enzima transformndola en su conformacin inactiva (vase Figura 2-38). Una enzima que participa en una va m etablica tambin puede ser activada por una transicin alostrica inducida por la unin de un ligando. En este caso el ligando es una molcula que se acumula cuando la clula es deficiente en un producto de la va; como el ligando se une preferentemente a la forma activa de la protena, dirige la enzima hacia su conformacin activa. Muchas enzimas que participan en procesos catablicos que producen ATP proporcionan ejemplos de esta retroalimentacin positiva ; estas enzimas son estimuladas por un increm en to de la concentracin de ADP, que tiene lugar cuando los niveles de ATP dismi nuyen. Para estas enzimas el ADP tiene un papel puramente regulador, en con traste con el papel de substrato que juega el ATP en la funcin de la hexoquinasa.

concentracin de inhibidorLas protenas como mquinas

Figura 5-7 Cintica de actividad enzim tica respecto a la concentracin de ligando inhibidor, para enzimas alostricas formadas por diferente nm ero de subunidades. En el caso de una enzima con una sola subunidad (ln ea roja), la disminucin desde el 90% hasta el 10 % de actividad (indicada por pu n tos en la curva) requiere un increm ento en la concentracin de inhibidor de unas 100 veces. La actividad enzim tica se calcula a partir de la relacin de equilibrio simple K=[I] [P] /[IP], donde P es la protena activa, I es el inhibidor e IP es la protena inactiva unida al inhibidor. sta es la curva que se aplicara a cualquier unin simple entre dos molculas A y B (vase Figura 3-9). Contrariamente una enzima alostrica formada por varias subunidades puede responder a variaciones de la concentracin de inhibidor de una manera sem ejante a un interruptor: la respuesta escalonada se debe a que el ligando se une a la protena de una forma cooperativa, com o se explica en la Figura 5-8. La ln ea verde representa el resultado terico esperado en el caso de unin cooperativa de dos molculas de inhibidor a una enzima alostrica con 2 subunidades, y la ln ea a zu l el resultado terico esperado de una enzima con 4 subunidades. Como indican los puntos de las curvas, las enzimas ms com plejas caen del 90% al 10 % de actividad con incrementos menores de la concentracin de inhibidor que la enzima com puesta por una sola subunidad.

211

Figura 5-8 U na transicin cooperativa alostrica. Diagrama esquemtico que ilustra de que forma la conformacin de una subunidad puede afectar la de sus vecinas, en una protena simtrica compuesta por dos subunidades alostricas idnticas. La unin de una sola molcula de un ligando inhibidor {amarillo) a una subunidad de la enzima se produce con dificultad debido a que modifica la conformacin de esta subunidad, y por lo tanto destruye la simetra de la enzima. Sin embargo, cuando se ha completado este cambio conformacional, la energa obtenida al recuperar la estructura simtrica de la protena hace que la segunda conformacin una el ligando mucho ms fcilmente, sufriendo el mismo cambio conformacional que la otra subunidad. La unin de la primera molcula de ligando incrementa la afinidad de la otra subunidad por la misma molcula de ligando, por lo que la respuesta de la enzima a variaciones de la concentracin del ligando es mucho ms marcada que la de una enzima monomrica (vase la Figura 5-7).

enzim a activa

A menudo las protenas form an agregados simtricos que sufren transiciones alostricas cooperativas 4
Una enzima que est regulada por retroalimentacin negativa y que conste de una sola subunidad con un nico lugar regulador, puede disminuir desde el 90% hasta el 10% de actividad en respuesta a un incremento de unas 100 veces de la concentracin del ligando inhibidor (Figura 5-7, lnea roja). Aparentemente, las respuestas de este tipo no son suficientemente marcadas para una regulacin celular ptima, y la mayora de enzimas que se activan o inhiben por la unin de un ligando consisten en agregados simtricos de subunidades idnticas. M e diante esta disposicin, la unin de una molcula de ligando al lugar de unin de una de las subunidades puede provocar una alteracin alostrica en esta sub unidad que puede ser transmitida a la otra subunidad vecina, favoreciendo as que sta tam bin una otra molcula de ligando. Como resultado de esta transi cin alostrica cooperativa, una variacin relativamente pequea de la concen tracin del ligando en la clula puede hacer pasar todo el agregado de una con formacin casi completamente activa a otra casi completamente inactiva, o vice versa (Figura 5-7, lnea azul). Los principios que permiten que se produzca una transicin cooperativa del todo o nada son ms fciles de visualizar en el caso de una enzima formada por un dmero simtrico. En el ejemplo mostrado en la Figura 5-8, la primera molcula del ligando inhibidor se une con una gran dificultad ya que su unin destruye una interaccin favorable entre las dos molculas idnticas del dmero. Sin embargo, ahora se une mucho ms fcilmente la segunda molcula de ligan do ya que su unin recupera los contactos monmero-monm ero del dmero si mtrico (y tam bin inactivando completamente la enzima). Puede obtenerse una respuesta incluso ms marcada a la unin de un ligando mediante agrega dos mayores, como en el caso de la enzima formada por 12 cadenas polipeptdicas que discutiremos a continuacin.

La transicin alostrica de la aspartato transcarbam ilasa se conoce a nivel atm ico 5

Una de las enzimas utilizadas en los primeros estudios de retroalimentacin n e gativa es la aspartato transcarbamilasa de E. coli. Cataliza la importante reaccin carbamilfosfato + aspartato - N-carbamilaspartato, que inicia la sntesis del anillo pirimidnico de los nucletidos C, U y T. Uno de los productos finales de esta va, el citosn trifosfato (CTP), se une a la enzima inactivndola cuando las concentraciones de CTP son elevadas. La aspartato transcarbamilasa es un gran complejo formado por seis sub unidades reguladoras y seis subunidades catalticas. Las subunidades catalticas estn dispuestas en forma de dos trmeros, cada uno de ellos dispuesto como un tringulo equiltero. Ambos trmeros se m antienen uno contra otro a travs de

212

Captulo 5 : Funcin de las protenas

ENZIMA INACTIVA: ESTADO T

subunidades catalticas

Figura 5-9 Transicin entre los estados R y T en la enzim a aspartato transcarbam ilasa. La enzima est

6 CTP

6 CTP

compuesta por un complejo de seis subunidades catalticas y seis subunidades reguladoras. La estructura de las formas inactivas (iestado T) y de las formas activas (iestado R) se han determinado por cristalografa de rayos X. La enzima se inhibe cuando aumenta la concentracin de CTP. Cada una de las subunidades reguladoras puede unir una molcula de CTP, el cual es uno de los productos finales de la va. Mediante esta regulacin por retroalimentacin negativa se impide que la va produzca ms cantidad de CTP de la que necesita la clula. (Basado en K.L. Krause, K.W. Volz y W.N. Lipscomb, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:1643-1647, 1985).

ENZIMA ACTIVA: ESTADO R

Figura 5-10 Parte del interruptor si/no de la subunidad cataltica de la aspartato transcarbam ilasa.

Variaciones en las interacciones entre enlaces de hidrgeno indicadas son parcialmente responsables del salto que sufre el lugar activo de esta enzima desde la conformacin activa (iamarilla) a la inactiva. Los enlaces de hidrgeno se indican como finas lneas rojas. Los aminocidos que participan en las interacciones entre las dos subunidades se indican en rojo mientras que los que forman el lugar activo de la enzima se muestran en azul. La parte superior de la figura muestra el lugar cataltico en el interior de la enzima; la parte inferior muestra la superficie externa de la enzima. (Adaptado de E.R. Kantrowitz y W.N. Lipscomb, Trends Biochem. Sci. 15:53-59,1990.)

Las protenas como mquinas

213

las subunidades reguladoras, que hacen de puente entre ellos. La molcula com pleta puede sufrir transiciones alostricas del todo o nada entre dos conforma ciones, los estados T (tenso) y R (relajado) (Figura 5-9). La unin de los substratos (carbamilfosfato y aspartato) a los trmeros cata lticos em puja a la aspartato transcarbamilasa a su estado R, catalticam ente ac tivo, del que entonces se disocian las molculas de CTP, reguladoras. Contraria mente, la unin de CTP a los dmeros reguladores empuja la enzima a su estado T, catalticam ente inactivo, del cual se disocian los substratos. Este tira y afloja entre el CTP y los substratos es idntico, en principio, al descrito previamente en la Figura 5-6 para el caso de una protena alostrica ms sencilla. Sin embargo, aqu el tira y afloja ocurre en una molcula simtrica con muchos lugares de unin, por lo que el efecto es una transicin alostrica cooperativa que puede activar la enzima rpidamente cuando se acumulan los substratos (transfor mndola en su estado R) o inactivarla repentinamente cuando se acumula CTP (transformndola en su estado T). Una com binacin de bioqumica y de cristalografa de rayos X ha revelado una gran cantidad de fascinantes detalles de esta transicin alostrica. Cada sub unidad reguladora tiene dos dominios, y la unin de CTP hace que ambos domi nios se desplacen uno respecto al otro, de forma que actan como un elevador que hace rotar los trmeros catalticos acercndolos entre s, en el estado T (va se Figura 5-9). Cuando esto ocurre se forman enlaces de hidrgeno entre las su bunidades catalticas opuestas que ensanchan la hendidura que forma el lugar activo en cada subunidad cataltica, destruyendo as los lugares de unin para el substrato (Figura 5-10). Aadiendo grandes cantidades de substrato se obtiene el efecto contrario, favoreciendo la formacin del estado R mediante la unin de molculas de substrato en la hendidura de cada subunidad cataltica y oponin dose as al cam bio conformacional descrito. Las conformaciones intermedias entre los estados R y T son inestables, de forma que la enzima fundamentalmen te salta entre las formas R y T, producindose una mezcla de ambas formas, la composicin de la cual vara en funcin de las concentraciones relativas de CTP y de substratos.

La fosforilacin de protenas es un mecanismo habitual de dirigir transiciones alostricas en las clulas eucariotas 6
En una bacteria com o E. coli la actividad de las protenas est regulada funda mentalm ente por una mirada de pequeas molculas de la clula, que se unen especficam ente a determinadas protenas causando transiciones alostricas que controlan la actividad de estas protenas. Muchas de las protenas reguladas de esta manera son enzimas que catalizan reacciones metablicas; otras transducen seales o activan o inactivan genes (como ejemplo, vase la Figura 9-27). Sin embargo, algunas protenas bacterianas estn controladas de forma diferen te -m ediante la unin covalente de un grupo fosfato a una cadena lateral de un aminocido. Cada grupo fosfato tiene dos cargas negativas, por lo cual su unin a una protena puede generar un cam bio estructural, por ejemplo atrayendo en tre s a dos grupos de aminocidos cargados positivamente (Figura 5-11). A su vez, un cam bio de este tipo que ocurra en un lugar de la protena puede alterar la conform acin de otra zona de la protena -p o r ejemplo controlando alostricam ente la actividad de un lugar de unin alejado. La fosforilacin reversible de las protenas es la estrategia ms utilizada para controlar la actividad en las clulas eucariotas. Se cree que ms del 10% de las 10 000 protenas de una clula tpica de mamfero se fosforilan. El fosfato se transfiere desde una molcula de ATP mediante una protena quinasa y es elimi nado mediante una protena fosfatasa. Las clulas eucariotas contienen una gran variedad de estas enzimas, muchas de las cuales juegan un papel central en la sealizacin intracelular (como se discute en al Captulo 15).

21 4

Captulo 5 : Funcin de las protenas

Figura 5- 11 Influencia de un grupo fosfato sobre una protena. El grupo fosfato, cargado negativamente, que se muestra aqu est unido covalentemente a una cadena lateral de una treonina de la protena quinasa dependiente de AMP cclico que se discute en el Captulo 15. Como se determin por cristalografa de rayos X, el fosfato est rodeado de diversas cadenas laterales de aminocidos cargadas positivamente de la propia protena. (Adaptado de S.S. Taylor et al., Annu. Rev. Cell. Biol. 8:429-462, 1992. 1992 Annual Reviews Inc.)

Una clula eucariota contiene muchas protena quinasas y fosfatasas 7

Las protena quinasas que fosforilan protenas en las clulas eucariotas pertene cen a una gran familia de enzimas, las cuales contienen un dominio cataltico de 250 aminocidos (quinasa) similar (Figura 5-12). Los diversos miembros de la fa milia contienen diferentes secuencias de aminocidos a ambos lados del domi nio quinasa y a menudo dentro del dominio tienen diferentes secuencias for mando asas (vanse las cabezas rojas de flecha en la Figura 5-12). Algunas de estas secuencias adicionales de aminocidos permiten que cada quinasa reco nozca especficam ente el conjunto de protenas que fosforila. Otras secuencias nicas permiten que cada quinasa est regulada de forma diferente, de manera que puede ser activada o inhibida en respuesta a diferentes seales especficas, com o describimos ms adelante. Comparando las diferencias en la secuencia de aminocidos entre los miembros de una familia proteica puede construirse un rbol evolutivo, que al parecer refleja el patrn de duplicacin gnica y de divergencia que ha dado lu gar a la familia (vase Figura 8-76). En la Figura 5-13 se presenta un rbol evolu tivo de las protena quinasas. No resulta sorprendente que a menudo las quina sas que tienen funciones relacionadas se localicen en ramas vecinas del rbol: por ejemplo, todas las protena quinasas que participan en procesos de sealiza cin celular fosforilando cadenas laterales de tirosina se hedan agrupadas en la esquina superior izquierda del rbol. Las otras quinasas mostradas fosforilan ca denas laterales de serina o de treonina, y muchas de ellas estn agrupadas, al pa-

Figura 5-12 E structura tridimensional de un dominio protena quinasa. Estructura del dominio quinasa de la quinasa dependiente de AMP cclico. Superpuestas al dibujo de la estructura, las cabezas de flecha rojas indican lugares en que se han encontrado insertos de entre 5 y 100 aminocidos en otros miembros de la familia de protena quinasas. Estos insertos estn localizados en asas sobre la superficie de la enzima, donde otros ligandos interactan con la protena. As, los insertos diferencian las distintas quinasas confirindoles la capacidad de interaccionar con otras protenas. El ATP (dador de un grupo fosfato en la reaccin) y el pptido que ser fosforilado se unen en el lugar activo de la enzima, que abarca desde el asa que une el grupo fosfato (amarillo) hasta el asa cataltica {naranja). (Adaptado de D.R. Knighton et al., Science 235:407-414,1991. 1991 the AAAS.)

asa de unin del fosfato asa cataltica

Las protenas como mquinas

215

Cdc 7

Figura 5- 13 Arbol evolutivo de algunas protena quinasas. A pesar de que las clulas eucariotas superiores contienen centenares de tales enzimas, en la figura slo se muestran algunas de las que se discuten en este libro.

subfam ilia de quinasas de receptores de serina

recer, segn su funcin -e n la sealizacin transmembrana, en la amplificacin de seales, en el control del ciclo celular, etc. En la Figura 5-14 se ilustra la reaccin bsica catalizada por una protena quinasa. Un grupo fosfato es transferido desde una molcula de ATP hasta un grupo hidroxilo de una cadena lateral de una serina, una treonina o una tirosina de una protena. Esta reaccin es esencialm ente unidireccional debido a la gran cantidad de energa libre liberada cuando se rompe el enlace fosfato-fosfato, producindose ADP (vase Figura 2-28). Sin embargo, las fosforilaciones catali zadas por protena quinasas pueden revertirse mediante un segundo grupo de enzimas denominadas protefha fosfatasas, las cuales eliminan el fosfato (vase Figura 5-14). Hay varias familias de protena fosfatasas, algunas de las cuales son muy especficas eliminando grupos fosfato nicamente de una o unas cuantas protenas, mientras que otras son relativamente inespecficas, actuando sobre una gran diversidad de protenas. El nivel de fosforilacin de una protena deter minada en una clula en un momento dado depende de las actividades relativas de las protena quinasas y fosfatasas que actan sobre ella.

La estructura de la protena quinasa Cdk m uestra de qu form a una protena puede actuar como un m icrochip 8
El centenar de protena quinasas diferentes que tiene una clula eucariota estn organizadas en com plejas redes de etapas sealizadoras que ayudan a coordinar

1 adp|

Figura 5-14 Las enzimas que controlan la fosforilacin de las protenas en las clulas. La reaccin catalizada por una protena quinasa aade un fosfato a una cadena lateral de un aminocido, mientras que la reaccin catalizada por una fosfatasa elimina este fosfato.

216

Captulo 5 : Funcin de las protenas

las actividades celulares, dirigen el ciclo celular y transmiten seales extracelulares al interior de la clula. Muchas de las seales implicadas han de ser integra das y amplificadas. Cada protena quinasa (y otras protenas sealizadoras) ac ta como elementos de procesamiento, o m icrochips en los procesos de integracin. Una parte importante de la regulacin de estas protenas proviene del control que ejercen los fosfatos que les aaden otras protena quinasas de la red: determinados grupos fosfato activan la protena mientras que otros grupos la inactivan. Una protena quinasa dependiente de ciclina (Cdk, de Cyclin-Dependent protein Kinase) constituye un buen ejemplo de un elemento de procesamiento de este tipo. Las quinasas de esta clase son los componentes centrales del siste ma de divisin celular de las clulas eucariotas (como se discute en el Captulo 17). En una clula de vertebrado, una enzima Cdk se activa e inhibe sucesiva mente mientras la clula atraviesa las diferentes fases de su ciclo de divisin, y cuando est activada afecta a varios aspectos del comportamiento celular a tra vs de sus efectos sobre las protenas que fosforila. Ahora conocem os la estruc tura tridimensional de las enzimas de esta importante clase de protena quina sas , y la utilizaremos para demostrar de qu forma una protena puede actuar como un microchip. Una protena Cdk slo es activa como protena quinasa cuando est unida a otra protena llamada ciclina. Sin embargo, como se ilustra en la Figura 5-15 la unin de la ciclina slo es una de las tres entradas de informacin necesarias para activar la Cdk: adems, se ha de aadir un fosfato a una cadena lateral de una determinada treonina y se ha de eliminar otro grupo fosfato de la protena (que se halla unido covalentemente a una cadena lateral de una determinada tirosina). As, la Cdk integra un conjunto especfico de componentes celulares

ENTRADAS se ha aadido este fosfato? se ha elim inado este fosfato? est presente la ciclina?

la Cdk quinasa se activa slo si las respuestas a todas las preguntas son s SALIDA
Figura 5-15 Una Cdk com o un elemento integrador. En el Captulo

17 se discute la funcin de estos reguladores centrales sobre el ciclo celular.

lugar de activacin de la fosforilacin

activacin de la fosforilacin sobre treonina substrato pptido

Figura 5-16 Estructura tridimensional de una Cdk. (A ) Diagrama de la estructura detallada, determinada por anlisis de difraccin de rayos X. En rojo claro se muestra el ATP unido, mientras que sus tres fosfatos se representan en amarillo. (B) El proceso sugerido para la activacin de la enzima incluye la fosforilacin de una treonina especfica localizada en la cola de una asa flexible {rojo) que, de no estar fosforilada, bloquea el acceso del substrato proteico al lugar activo del dominio quinasa. Esta activacin tambin requiere la unin de ciclina, como se ilustra en la Figura 5-17. (A, adaptado de H.L. DeBondt et al., Nature 363:595-602,1993. 1993 Macmillan Magazines Ltd.)

fosfotreonina

Las protenas como mquinas

217

-u n a ciclina, una protena quinasa y una protena fosfatasa- y se activa nica mente en el caso de que cada uno de estos componentes adquiera su estado de actividad adecuado. Por ejemplo, algunas ciclinas aumentan y disminuyen de concentracin en determinadas etapas del ciclo celular, incrementando gra dualmente de cantidad hasta que repentinamente empiezan a ser destruidas en un punto determinado del ciclo. La repentina destruccin de una ciclina (por proteolisis dirigida) inmediatamente inhibir una enzima Cdk determinada, lo cual constituye un importante sistema de controlar determinados procesos intracelulares, como por ejemplo la mitosis. La estructura tridimensional de la Cdk (Figura 5-16A) sugiere una explica cin molecular para la regulacin de esta enzima. La protena Cdk en s misma es inactiva, por dos razones: su lugar de unin al ATP est distorsionado y existe una asa de unos 20 aminocidos que bloquea el acceso del substrato al centro activo. La unin de la ciclina por un lado elimina la distorsin y por otro permite la adicin de un grupo fosfato activador a la cola del asa flexible; se cree que este fosfato es atrado por un hueco formado por aminocidos cargados positiva mente, de forma que el asa se estira y baja permitiendo el acceso al lugar activo (Figura 5-16B). Sin embargo, la unin de la ciclina tambin permite la rpida adicin de un fosfato inhibidor, que interfiere con el lugar del ATP, lo cual colo ca la Cdk en un estado inactivo. Finalmente, la quinasa es activada cuando una fosfatasa especfica elimina el fosfato inhibidor (Figura 5-17).

Las protenas que unen e hidrolizan GTP son reguladores celulares ubicuos 9
Hemos descrito de qu forma la clula puede utilizar la adicin o la eliminacin de grupos fosfato de una protena para controlar la actividad de la protena. En los ejemplos discutidos hasta ahora el fosfato es transferido desde una molcula de ATP a una cadena lateral de un aminocido de la protena, a travs de una re accin catalizada por una protena quinasa especfica. Las clulas eucariotas tam bin utilizan otra va para controlar la actividad de las protenas mediante la adicin o eliminacin de fosfatos. En este caso, el fosfato no se aade directa mente a la protena; por el contrario, forma parte del dinucletido de guanina GTP, el cual se une fuertemente a la protena. Cuando la protena est unida a GTP, es activa. La prdida del grupo fosfato ocurre cuando el GTP unido es hidrolizado a GDP, a travs de una reaccin catalizada por la propia protena; cuando la protena est unida a GDP, es inactiva. Las protenas que unen GTP (tambin denominadas GTPasas debido a que tam bin catalizan la hidrlisis de GTP) constituyen una gran familia de prote nas, que tienen un dominio globular de unin a GTP similar. Cuando el GTP unido es hidrolizado a GDP, este dominio sufre un cambio de conformacin que inactiva la protena. En la Figura 5-18 se ilustra la estructura tridimensional de una pequea protena que une GTP, denominada Ras.

Figura 5-17 Modelo detallado de la activacin de la Cdk. Este modelo,

asa que bloquea el lugar del substrato

ciclina i

ENZIMA INACTIVA

P activador LA DEGRADACIN DE LA CICLINA RESTAURA LA ENZIMA INACTIVA

ENZIMA ACTIVA

basado en la estructura tridimensional de la Cdk, explica por qu Cdk se inactiva slo si se cumplen las tres condiciones diferentes que se indican en la Figura 5-15. En el paso A se une una ciclina, lo cual conduce a la unin del fosfato inhibidor en el paso B. La fosforilacin activadora se produce en el paso C, pero la enzima slo se activa despus de que se haya eliminado el fosfato inhibidor, en el paso D. La degradacin repentina de la ciclina, tras el paso D, hace que la enzima se inactive, liberndose el fosfato activador, con lo que el sistema vuelve al estado inactivo inicial.

218

Captulo 5 : Funcin de las protenas

COOH

lugar de hidrlisis del GTP

Figura 5-18 Estructura de la protena Ras, en su forma unida a GTP. Esta protena relativamente pequea ilustra la estructura de un dominio de unin a GTP, que se halla presente en otras protenas que unen GTP (como ejemplo, vase Figura 5-20). Las regiones mostradas en rojo cambian su conformacin cuando la molcula de GTP es hidrolizada a GDP y fosfato inorgnico por la protena; el GDP queda unido a la protena mientras que el fosfato inorgnico es liberado. Ms adelante se explica el papel especial que juega la hlice interruptor en las protenas relacionadas con Ras (vase Figura 5-20).

La protena Ras juega un papel crucial en la sealizacin celular (como se discute en el Captulo 15). Unida a GTP es activa y estimula cascadas de fosfori lacin de protenas en la clula. Sin embargo, generalmente est en su forma inactiva, unida a GDP. Se activa cuando cam bia la molcula de GDP que tiene unida por una de GTP, en respuesta a seales extracelulares como factores de crecimiento, que se unen a receptores de la membrana plasmtica (vase Figura 15-53). As, la protena Ras acta com o un interruptor si-no, cuya actividad est determinada por la presencia o ausencia de un fosfato extra sobre una molcula de GDP, tal como la actividad de la protena Cdk est controlada por la presen cia de uno o ms grupos fosfato sobre determinadas cadenas laterales de am ino cidos (vase Figura 5-17).

Otras protenas controlan la actividad de las protenas que unen GTP, determinando si se une GDP o GTP 10
La actividad de la protena Ras y de otras protenas que unen GTP est controla da por protenas reguladoras que determinan cundo se une GDP y cundo GTP, como la actividad de la protena Cdk est controlada por ciclinas, protena quinasas y protena fosfatasas. Ras se inactiva por una protena activadora de GTPasa (GAP, de GTPase-Activating Protein), la cual se une a la protena Ras in ducindola a hidrolizar la molcula de GTP que lleva unida, formando GDP -q u e queda unido fuertemente a ella- y fosfato inorgnico (P) -q u e es rpidamente liberado. La protena Ras quedar en su conformacin inactiva, unida a GDP, hasta que interacte con una protena liberadora de nucletidos de guanina (GNRP, de Guanine Nucleotide Releasing Protein), la cual se une al complejo GDP-Ras haciendo que Ras libere su GDP. El lugar, ahora vaco, de unin a nu cletidos, es ocupado inmediatamente por una molcula de GTP (el GTP est presente en la clula a concentraciones mucho mayores que las de GDP), por lo que GNRP activa Ras mediante la adicin indirecta del fosfato eliminado por la hidrlisis del GTP. As, en cierto sentido los papeles de GAP y de GNRP son an logos a los de la protena fosfatasa y de la protena quinasa, respectivamente (Fi gura 5-19).

La transicin alostrica de la protema EF-Tii muestra de qu manera pequeas molculas pueden generar grandes movimientos11
La protena Ras es uno de los miembros de una familia de GTPasas reguladoras monomricas, cada una de las cuales est formada por un dominio de unin a

Las protenas como mquinas

219

ENTRADA DE LA SEAL

ENTRADA DE LA SEAL

Figura 5-19 Comparacin entre los dos principales m ecanism os de sealizacin de las clulas eucariotas. En ambos casos una protena de seal es activada mediante la adicin de un grupo fosfato, e inactivada mediante la eliminacin de este fosfato. Para enfatizar las similitudes de ambos procesos, ATP y GTP se han dibujado como APPP y GPPP, y ADP y GDP como APP y GPP respectivamente. Como se muestra en la Figura 5-17, la adicin de un fosfato a una protena tambin puede inhibirla.

SALIDA DE LA SEAL

(A) SEALIZACIN POR FOSFORILACIN

(B) SEALIZACIN POR PROTENA QUE UNE GTP

GTP de unos 200 aminocidos. En el transcurso de la evolucin, este dominio tambin se ha unido a otros dominios proteicos, generando una gran familia de protenas que unen GTP, entre las que se hallan las protenas G trimricas aso ciadas a receptores (discutidas en el Captulo 15), protenas reguladoras del tr fico de vesculas entre compartimientos intracelulares (discutidas en el Captulo 13) y protenas que se unen al RNA de transferencia y que son necesarias para que se produzca la sntesis proteica en los ribosomas (discutidas en el Captulo 6). En cada caso, una importante actividad biolgica est controlada por un cambio en la conform acin de la protena, producido por la hidrlisis de GTP en un dominio sem ejante a Ras. La protena EF-Tu proporciona un buen ejemplo de cmo actan los com ponentes de esta familia de protenas. EF-Tu es una molcula muy abundante en clulas bacterianas, donde acta como un factor de elongacin en la sntesis proteica, cargando en el ribosoma cada molcula aminoacil-tRNA. La molcula de tRNA forma un ntimo complejo con la forma de EF-Tu unida a GTP. En este complejo el aminocido unido al tRNA est enmascarado; su desenmascara miento, necesario para que se produzca la sntesis proteica, tiene lugar sobre el ribosoma cuando el tRNA es liberado tras la hidrlisis del GTP unido a EF-Tu (la Figura 6-31 ilustra el funcionamiento de EF-Tu, preciso como un reloj). La estructura tridimensional de EF-Tu, tanto en su forma unida a GTP como a GDP, se ha determinado por cristalografa de rayos X. Estos estudios revelan cm o ocurre el desenmascaramiento del tRNA. La disociacin del fosfato inor gnico (P), procedente de la reaccin GTP > GDP + P, genera una ligersima de formacin (de unas dcimas de nanmetro) del lugar de unin a GTP, tal como ocurre en la protena Ras. Este ligero movimiento, equivalente nicamente a al gunas veces el dimetro de un tomo de hidrgeno, genera un cambio de con formacin que se propaga a lo largo de una pieza crucial de hlice a, llamada h lice interruptor, en el dominio sem ejante a Ras de la protena. Al parecer la hlice interruptor acta como un pestillo que se une especficamente a una zona de otro dominio de la molcula, manteniendo la protena en una conformacin cerrada. El cambio de conformacin desencadenado por la hidrlisis de GTP hace que la hlice interruptor se desenganche, dejando que los dominios de la protena, ahora separados, se desplacen una distancia de unos 4 nanmetros, li berando as la molcula de tRNA que estaba unida (Figura 5-20). Este ejemplo pone de manifiesto de qu forma las clulas aprovechan cam bios qumicos sencillos que ocurren sobre la superficie de pequeos dominios

220

Captulo 5 : Funcin de las protenas

dom inio 3 hidrlisis de GTP liberacin del tRNA

;g ).,i

v GDP unido COOH

proteicos para modificar grandes protenas con sofisticadas funciones. En la transicin de Ras a EF-Tu hemos entrado en un mundo que huele a biologa.

Protenas que hidrolizan ATP realizan trabajo m ecnico en las clulas 12

Los cambios alostricos de forma pueden utilizarse para regular reacciones qu micas, pero tam bin para generar movimientos ordenados en las clulas. Su pongamos, por ejemplo, que se necesita una protena que cam ine a lo largo de un fino hilo, como es el caso de una molcula de DNA. En la Figura 5-21 se muestra esquemticamente cmo una protena alostrica puede hacerlo adop tando una serie de cambios conformacionales. Sin embargo, si no hubiera nada que dirigiera estas modificaciones para que siguieran una secuencia ordenada, seran perfectam ente reversibles y la protena se desplazara al azar, arriba y abajo, a lo largo del filamento. Podemos considerar la situacin desde otro punto de vista. Como el movi miento direccional de una protena produce trabajo, las leyes de la termodin mica dicen que un movimiento como ste ha de consumir energa libre de otra fuente (de lo contrario la protena podra utilizarse para construir una mquina de movimiento continuo). Por lo tanto, sean cuales fueren las modificaciones que introduzcamos en el modelo mostrado en la Figura 5-21, como aadir ligandos que favorezcan determinadas conformaciones, sin un aporte de energa la molcula proteica deambular sin rumbo. Cmo se puede conseguir que las modificaciones conformacionales sean unidireccionales? Para lograr que todo el ciclo se produzca en una direccin basta con que una cualquiera de sus etapas sea irreversible. Una manera de conseguirlo es utilizar el m ecanismo que acabamos de describir para dirigir las alteraciones alostricas en una molcula proteica mediante la hidrlisis de GTP. Por ejemplo, debido a la gran cantidad de energa libre que se libera cuando se hidroliza el GTP, resulta muy improbable que la protena EF-Tu pueda aadir directamente una molcula de fosfato al GDP, invirtiendo as la hidrlisis de

Figura 5-20 El gran cambio conform acional de EF-Tu est producido por la hidrlisis de GTP. (A) Estructura tridimensional de EF-Tu cuando une GTP. El dominio superior es homlogo a la protena Ras y la hlice en es la hlice interruptor que se desplaza cuando el GTP se ha hidrolizado, como se muestra en la Figura 5-18. (B) El cambio de conformacin de la hlice interruptor en el dominio 1 hace que los dominios 2 y 3 giren, como una sola unidad, unos 90 hacia el observador, liberando el tRNA. (A, adaptado de Berchtold et al., 365:126-132, 1993. 1993, Macmillan Magazines Ltd; B, por cortesa de Mathias Sprinzl y Rolf Hilgenfeld.)

rojo

Nature

Las protenas como mquinas

221

Figura 5-21 Una protem a alostrica que anda. A pesar de que sus tres conformaciones diferentes le permiten desplazarse al azar adelante y atrs mientras se mantiene unida a un filamento, la protena no puede moverse uniformemente en una sola direccin.

11

t i
GTP. Este mismo principio se aplica a la hidrlisis del ATP, y la mayora de las protenas que son capaces de caminar en una direccin recorriendo largas dis tancias (la llamadas motores proteicos ) lo hacen hidrolizando ATP. En el modelo altamente esquemtico de la Figura 5-22, la unin de ATP im pulsa la transformacin del motor proteico de la conformacin 1 a la conforma cin 2. Entonces, el ATP unido se hidroliza produciendo ADP y fosfato inorgni co (P), lo cual genera un cambio de la conformacin 2 a la conformacin 3. Finalmente, la liberacin del ADP y del P, que estaban unidos a la protena, im pulsa a la pro tena de nuevo a adoptar la conformacin 1. Las transiciones 1 >2 3 > 1 estn impulsadas por la energa de hidrlisis del ATP, por lo que estas series de cam bios conformacionales sern efectivamente irreversibles en condi ciones fisiolgicas (es decir, la probabilidad de que el ADP se recombine con P formando ADP por la ruta 1 >3 > 2 - > l e s extremadamente baja). As pues, el ciclo entero de reacciones se producir nicamente en una direccin, haciendo que la molcula proteica se desplace siempre hacia la derecha en este ejemplo. Muchos protenas generan movimientos direccionales a travs de este m ecanis mo, incluyendo las DNA helicasas, enzimas que se impulsan a s mismas a lo lar go del DNA a velocidades tan elevadas como 1000 nucletidos por segundo.

t t

La estructura de la m iosina revela de qu forma los msculos generan fuerza 13

En el Captulo 16 discutimos de qu manera diversos movimientos celulares es tn producidos por motores proteicos que se desplazan rpidamente a lo largo de filamentos proteicos, dirigidos por ciclos repetidos de hidrlisis de ATP (va se Figura 5-22). El m ejor conocido de estos motores proteicos es la m iosina, cu yos movimientos dirigidos a lo largo de filamentos de actina genera movimien tos intracelulares y contraccin muscular. Las estructuras tridimensionales de la miosina (y de la actina) se han determinado mediante anlisis de cristalografa de rayos X, lo cual nos permite vislumbrar el mecanismo interno de un motor biolgico. La estructura del dominio de la cabeza de la miosina (Figura 5-23) su giere de qu forma la hidrlisis de ATP se puede acoplar a la generacin de fuer za. Se cree que la unin y la hidrlisis del ATP generan una serie de cambios de conform acin ordenados que desplazan la punta de la cabeza unos 5 nanmetros, como se ilustra esquem ticam ente en la Figura 5-24). Este movimiento, acoplado a la formacin y rotura de interacciones con la actina, repitindose en cada ciclo de hidrlisis del ATP, propulsa la molcula de miosina unidireccional mente a lo largo del filamento de actina (vase Figura 16-91). As en la miosina, como en la protena EF-Tu discutida anteriormente, una pequea perturbacin del lugar de unin del nucletido, a travs de transiciones alostricas que au m entan el efecto, genera movimientos proteicos ordenados mucho ms acusa dos, que estn en la base de la biologa celular.

HIDROLISIS

3 ^

Figura 5 -22 Una protena alostrica m otor. Una transicin ordenada entre tres conformaciones est impulsada por la hidrlisis de una molcula de ATP unida a ella. Debido a que una de estas transiciones est acoplada a la hidrlisis de ATP, el ciclo es esencialmente irreversible. Al repetirse el ciclo la protena se desplaza siempre en la misma direccin (hacia la derecha en la figura) a lo largo del filamento.

222

Captulo 5 : Funcin de las protenas

Figura 5-23 E structura de la cabeza de la miosina. En este diagrama

estereoscpico del dominio cabeza de la miosina, se produce hidrlisis de ATP en el lugar activo. ELC indica la cadena ligera esencial (de Essential Light Chain) mientras que RLC indica la cadena ligera reguladora (de Regulatory Light Chain); ambas contribuyen, a lo largo de la cadena pesada de la miosina, al dominio cabeza. (De I. Rayment et al., Science 261:50-58, 1993. 1993 the AAAS.)

Protenas alostricas unidas a m em brana y dirigidas por ATP pueden actuar como bom bas inicas o trabajar en sentido inverso, sintetizando ATP14
Adems de generar fuerza mecnica, las protenas alostricas pueden utilizar la energa de la hidrlisis del ATP para realizar otras formas de trabajo, como el bom beo especfico de iones al interior o al exterior de la clula. Un importante ejemplo al respecto es la ATPasa Na+-K+ , que se encuentra en la membrana plas mtica de todas las clulas animales, y que bom bea 3 Na+ hacia el exterior de la clula y 2 K+ hacia el interior en cada ciclo de cambios conformacionales dirigi dos por la hidrlisis del ATP (vase Figura 11-11). En la mayora de las clulas esta bom ba impulsada por ATP consume ms del 30% del total de la energa que requiere la clula. Bombeando continuam ente Na+ hacia el exterior y K+ hacia el interior, mantiene la concentracin de Na+ mucho menor en el interior de la c lula que en el exterior y la de K+ mucho mayor en el interior que en el exterior, generando as dos gradiente inicos (en direcciones opuestas) a travs de la membrana plasmtica. Estos y otros gradientes inicos a travs de diferentes membranas de la clula pueden almacenar energa, tal como lo hace una dife rencia de nivel de agua a cada lado de las paredes de una presa. La energa se utiliza para dirigir cambios conformacionales en una gran variedad de protenas alostricas asociadas a membrana, que realizan trabajo til. El gran gradiente de Na+a travs de la mem brana plasmtica, por ejemplo, dirige muchas otras bom bas proteicas unidas a dicha membrana, que transportan glucosa o determina dos aminocidos hacia el interior de la clula; tanto la glucosa como los am ino cidos son arrastrados hacia el interior mediante el influjo simultneo de Na+que ocurre cuando el Na+se desplaza a favor de su gradiente de concentracin.

Figura 5 -24 Visin conceptual de un gran cambio de conform acin en la miosina, probablemente causado por la unin e hidrlisis de ATP. Este

modelo est basado en la estructura mostrada en la Figura 5-23. En el siguiente paso en el proceso de hidrlisis, la molcula de fosfato inorgnico producida (arriba) se libera a la solucin. (Segn I. Rayment et al., Science 261:58-65, 1993. 1993 the AAAS.)

Las protenas como mquinas

223

Las bom bas alostricas asociadas a membrana dirigidas por la hidrlisis de ATP tam bin pueden actuar en sentido inverso, utilizando la energa del gra diente inico para sintetizar ATP. De hecho, la energa asequible en el gradiente de H+ a travs de la membrana mitocondrial interna se utiliza de esta forma por el com plejo proteico alostrico unido a membrana, ATP sintasa, el cual sintetiza la mayor parte del ATP que necesita la clula animal, tal como discutiremos en el Captulo 14.

Las transiciones alostricas acopladas energticam ente permiten a las protenas actuar como motores, como relojes, como factores de ensam blaje o com o transductores de inform acin 15
Muchas protenas sufren cam bios conformacionales ordenados acoplados a la liberacin de energa que se produce cuando un nuclesido trifosfato (tanto ATP como GTP) se hidroliza a nuclesido difosfato (ADP o GDP respectivamente). Al gunos de estos cam bios comprenden la unin covalente del grupo fosfato a la protena (fosforilacin proteica), pero muchos otros no, como la miosina. Gene ralmente cada cam bio se desencadena por un evento especfico (la unin de la miosina a la actina, por ejemplo, desencadena la hidrlisis de ATP por la miosi na), lo cual marca una direccin y ordena las interacciones de las macromolculas en la clula. La capacidad de utilizar la energa de un nuclesido trifosfato para dirigir cambios alostricos en protenas ha resultado crucial para la evolucin de las clu las, exactamente de la misma forma en que la capacidad de utilizar la energa elc trica ha resultado crucial para el desarrollo de la tecnologa moderna. En ambos casos se han abierto enormes posibilidades para desarrollar aparatos tiles. Por ejemplo, protenas como Cdk actan como interruptores integradores sofisticados (vase Figura 5-15), recibiendo la informacin del entorno de la clula y del estado del ciclo celular y utilizndola para coordinar el comportamiento de la clula. Mo tores proteicos, como la miosina, se desplazan unidireccionalmente a lo largo de filamentos generando varios tipos de movimientos y generando orden en el inte rior de la clula. Protenas como EF-Tu actan como instrumentos medidores de tiempo, mejorando la fidelidad de importantes reacciones biolgicas (vase Figura 6-31). Otras protenas utilizan la energa liberada por la hidrlisis de un nuclesido trifosfato para catalizar el ensamblaje de determinados complejos proteicos. En la Figura 5-25 se recoge un resumen de estas diferentes posibilidades.

Figura 5-25 Algunos dispositivos fabricados con protenas. En estos ejemplos la energa de hidrlisis de nuclesido trifosfato se utiliza para dirigir cambios de conform acin en protenas alostricas. (A) Un transductor de informacin, com o una protena quinasa. (B) Un motor, como la miosina. (C) Un reloj, com o EF-Tu que retrasa el ensam blaje de un com plejo activo para asegurar que los com plejos incorrectos se disocien {ln ea discon tin u a). (D) Un factor de ensam blaje que genera grandes estructuras.

. V
2 ^ 2 |ADP|

TRANSDUCTOR DE INFORMACION

MOTOR

RELOJ

224

Captulo 5 : Funcin de las protenas

Figura 5-26 Una mquina proteica. A menudo, los complejos proteicos contienen una o ms subunidades que pueden moverse de una forma ordenada, dirigidas por un cambio energtico favorable que tiene lugar en una molcula de substrato unida al complejo (vase Figura 5-22). Movimientos proteicos de este tipo son especialmente tiles para la clula si ocurren en un gran complejo proteico en el que, como se ilustra aqu, se pueden coordinar las actividades de varias subunidades.

A menudo las protenas form an grandes complejos que actan como mquinas proteicas 16
En el progreso desde las pequeas protenas hasta las grandes protenas forma das por muchos dominios, las funciones que puede realizar una protena son cada vez ms elaboradas. Sin embargo, las tareas ms imprevisibles las llevan a cabo grandes agregados proteicos formados por muchas subunidades indivi duales. Actualmente es posible reconstruir la mayora de los procesos biolgicos en un sistema libre de clulas en el tubo de ensayo, y como puede observarse cada proceso central de una clula -com o la replicacin del DNA, del RNA o la sntesis de protenas, la formacin de vesculas o la sealizacin transmembran a - est catalizado por un complejo de ms de 10 protenas. En estas m quinas proteicas la hidrlisis de molculas de nuclesidos trifosfato (ATP o GTP) unidas a la propia mquina dirige cambios de conformacin ordenados en las protenas individuales, permitiendo que todas las protenas del complejo se muevan de forma coordinada. De esta forma, por ejemplo, las enzimas apropiadas se des plazan directamente hacia posiciones donde son necesarias para producir reac ciones en serie, en lugar de esperar a que se produzcan colisiones aleatorias de cada uno de los com ponentes necesarios. En la Figura 5-26 se ilustra una analo ga m ecnica sencilla. Las clulas han desarrollado mquinas proteicas por la misma razn que los humanos hem os inventado mquinas m ecnicas y electrnicas: las manipula ciones que estn espacial y temporalmente coordinadas a travs de procesos de unin son mucho ms eficientes desarrollando casi cualquier tarea que la utili zacin secuencial de cada uno de los acontecim ientos individuales.

Resumen
Las protenas alostricas cam bian reversiblem ente d e conform acin cuando d eter m inados ligandos se u n en a su superficie. A m enudo los cam bios producidos p o r un ligando afectan a otro ligando, y este tipo d e relacin en tre dos lugares d e unin d e ligandos proporciona un m ecanism o crucial d e regu la r procesos celulares. Por ejem plo, los procesos m etablicos estn controlados p o r retroalim entacin: a lgu nas m olculas p equ e as inhiben y otras activan a enzim as iniciales d el proceso. G eneralm ente las enzim as reguladas d e esta m anera fo rm a n ensam blajes sim tri cos, perm itiendo q u e se produzcan cam bios conform acionales cooperativos q u e g e n era n respuestas escalonadas a los ligandos.

Las protenas como mquinas

225

Los cambios de conformacin de las protenas pueden estar dirigidos de una manera unidireccional por la utilizacin de energa qumica. Por ejemplo, aco plando cambios alostricos a la hidrlisis de ATP las protenas pueden desarrollar trabajo til, como generar una fuerza mecnica o bombear iones a travs de una membrana. Las estructuras tridimensionales de varias protenas, determinadas por cristalografa de rayos X, han revelado de qu form a un pequeo cambio local generado por la hidrlisis de un nuclesido trifosfato se amplifica dando lugar cambios mayores en otros lugares de la protena; de esta forma estas protenas son capaces de actuar como transductores de informacin, motores, relojes o factores de ensamblaje. Se form an mquinas proteicas altamente eficientes mediante la incorporacin de muchas subunidades proteicas diferentes a un gran agregado, en el cual los movimientos alostricos de cada componente individual estn coordina dos para realizar la mayora, si no todas, las reacciones biolgicas.

Nacimiento, ensamblaje y muerte de las protenas

Hemos descrito algunos de los extraordinarios instrumentos celulares formados por protenas. Ahora consideraremos de qu manera se forman y se destruyen estos instrumentos. El mecanism o de la sntesis proteica se discute en otra par te. Ahora empezaremos considerando cmo se pliega y cmo se ensambla una protena a medida que va abandonando el ribosoma en forma de cadena polipeptdica.

Se cree que las protenas se pliegan a travs de un interm ediario globular fundido 17
Muchas protenas purificadas se pliegan in vitro de forma adecuada despus de haber sido desplegadas, por lo que durante muchos aos se pens que las prote-

PROCESO DE PLEGADO ACTIVADO

PROCESOS DESACTIVADOS

ACCIDENTES IRRECUPERABLES

Figura 5-27 Visin actual del plegamiento proteico. Una pro tena acabada de sintetizar rpidamente adquiere un estado de "glbulo fundido (vase Figura 5-28). Despus, ms lentamente, se producen plegamientos a travs de mltiples etapas, algunas de las cuales produciran la muerte de la protena sin la ayuda de chaperonas moleculares. Algunas molculas pueden no conseguir plegarse correctam ente y sern reconocidas y degradadas por enzimas proteolticas (vase Figura 5-39).

chaperona

protena plegada correctam ente

chaperona

226

Captulo 5 : Funcin de las protenas

Figura 5-28 Estructura de un glbulo fundido. (A) La forma de glbulo fundido del citocromo b562 es ms abierta y menos ordenada que la protena nativa, mostrada en (B). Ntese que el glbulo fundido contiene la mayor parte de la estructura secundaria de la forma nativa, aunque los finales de las hlices a estn deshilacliados y una de estas hlices slo est formada parcialmente. (Por cortesa de Joshua Wand).

(A)

(B)

as pueden adoptar todas las conformaciones posibles mientras se van plegan do, hasta que consiguen adoptar la conformacin de menor energa posible, la cual se supone que es el estado correcto de la protena. Ahora sabemos que esto no es as: a pesar de las altas velocidades que adquieren los movimientos m ole culares en una protena (vase pg. 101), para cualquier protena grande existen muchsimas ms conformaciones posibles de las que se pueden explorar duran te los pocos segundos que tarda la protena en plegarse. Adems, la existencia de protenas mutantes que tienen defectos especficos de plegamiento indica que durante la evolucin se ha ido seleccionando una secuencia de am inoci dos determinada, no slo en funcin de las propiedades de la estructura final sino tam bin por la capacidad de plegarse rpidamente adoptando su confor macin nativa. La capacidad de algunas protenas purificadas y desnaturalizadas de recu perar sus estructuras nativas por s mismas ha hecho posible disecar experimen talmente los procesos del plegamiento de las protenas. Las protenas se pliegan rpidamente formando estructuras en las que se ha formado la mayor parte (aunque no toda) de la estructura secundaria final (hlices a y lminas P) y en las que estos elementos se disponen de una forma extraordinariamente sem ejante a la correcta (Figura 5-27). Esta conformacin extraordinariamente abierta y flexi ble, denominada glbulo fundido (molten globule) (Figura 5-28) es el punto de partida de un proceso relativamente lento en el que se producen muchos ajustes entre cadenas laterales intentando formar correctamente la estructura terciaria. En las etapas posteriores hacia la conformacin final se han de producir diferen tes procesos. Algunos de ellos pueden conducir a plegamientos incorrectos a no ser que se den con la colaboracin de una chaperona molecular, protenas espe ciales de las clulas cuya funcin consiste en ayudar a otras protenas a plegarse y ensamblarse en estructuras estables y activas (Figura 5-27).

Las chaperonas moleculares facilitan el plegamiento de las protenas 18

Las chaperonas moleculares se identificaron por primera vez en las bacterias, cuando se estudiaron mutantes de E. coli que eran incapaces de utilizar bacte rifagos lambda para replicarse. Estos mutantes producen versiones ligeramen te alteradas de dos com ponentes de la maquinaria de chaparones, relacionada con las protenas de estrs por calor 60 y 70 (hsp60 y hsp70, de Heat-Shock Proteins), por lo que resultaban defectuosas en determinadas etapas del ensamblaje de las protenas vricas.

Nacimiento, ensamblaje y muerte de las protenas

227

CX m aquinaria -hspVO

descartada por proteolisis

m aquinaria semejante a hsp60

proteina plegada correctam ente

m aquinaria semejante a hsp60

protena p|egada correctam ente

Las clulas eucariotas tienen familias de protenas hsp60 y hsp70, de forma que diferentes miembros de las familias actan en compartimientos celulares distintos. As, com o discutimos en el Captulo 12, las mitocondrias contienen sus propias molculas hsp60 y hsp70, diferentes de las que actan en el citosol, y en el retculo endoplasmtico existe una hsp especial (llamada BIP) que colabora en el plegamiento de las protenas. Tanto las protenas hsp60 como las hsp70 actan con un reducido nmero de protenas asociadas, cuando colaboran en el plegamiento de otras protenas. Pre sentan afinidad por las zonas hidrofbicas asequibles que muestran las protenas plegadas de forma incompleta e hidrolizan ATP, posiblemente unindose y libern dose de su protena en cada ciclo de hidrlisis del ATP. Originalmente se pens que las chaperonas moleculares slo actuaban impidiendo la agregacin promiscua de las protenas todava no plegadas (de ah su nombre; chaperon significa dama de compaa de seoritas). Sin embargo ahora se cree que tambin interactan ms ntimamente con sus clientes produciendo efectos que podran asemejarse a un masaje proteico. Las chaperonas se unen a las regiones hidrofbicas expuestas, y dan un masaje a las regiones de la protena que estn medio plegadas a partir del intermediario globular fundido, cambiando su estructura de tal manera que pro porciona a la protena otra posibilidad de plegarse (vase Figura 5-27). En otros aspectos los dos tipos de protenas hsp actan de forma diferente. Se cree que la maquinaria hsp70 acta precozmente en la vida de una protena, unin dose a cadenas de unos siete aminocidos hidrofbicos antes de que la protena se libere del ribosoma (Figura 5-29). Por el contrario, las protenas semejantes a hsp60 forman una estructura parecida a un gran barril (Figura 5-30) que acta ms tarde en la vida de la protena; se cree que esta chaperona forma una cmara de aisla miento dentro de la cual se colocan las protenas a medio plegar, y se les facilita un entorno favorable donde puedan intentar volverse a plegar (vase Figura 5-29). Estas chaperonas moleculares se denominan protenas de estrs por calor debido a que su sntesis se increm enta notablemente tras una breve exposicin

Figura 5-29 Dos familias de chaperonas moleculares. Las protenas hsp70 actan de forma temprana, reconociendo pequeas zonas de la superficie de las protenas. Las protenas sem ejantes a hsp60 actan ms tarde y forman una especie de contenedor dentro del cual se transfieren las protenas que todava no se han plegado com pletamente. En ambos casos, ciclos repetidos de hidrlisis de ATP contribuyen a que las protenas hsp sigan ciclos de unin y liberacin de la protena cliente, facilitando su plegamiento.

(A)
100 nm 228 Captulo 5 : Funcin de las protenas

IBI
10

nm

Figura 5-30 Estructura de una chaperona semejante a hsp60, determ inada por microscopia electrnica. En (A) se muestra un gran nmero de partculas contrastadas negativamente y en (B) un modelo tridimensional de una de estas partculas, obtenido por mtodos de procesamiento de imgenes basados en ordenador. Tanto en procariotas como en eucariotas se encuentran estructuras similares, parecidas a un gran barril. A este tipo de protena se le denomina hsp60 en las mitocondrias, groEL en bacterias y TCP-1 en el citosol de las clulas de vertebrados. (A, de B.M. Phipps et al., EMBOJ. 10:1711-1722, 1991; B, de B.M. Phipps et al., N atu re 361:475-477, 1993. Macmillan Magazines Ltd.)

de las clulas a elevadas temperaturas (por ejemplo, 42C). Ello parece reflejar una operacin de retroalimentacin que responde a un incremento de la canti dad de protenas medio desplegadas (como las producidas por las elevadas tem peraturas), de forma que se increm enta la sntesis de chaperonas que ayudan a las protenas a volverse a plegar.

Muchas protenas contienen series de molculas plegadas de form a independiente 19

A menudo el plegamiento de una protena acabada de sintetizar empieza con la formacin de un determinado nmero de dominios estructurales estables, que se corresponden con unidades funcionales, y que parecen tener orgenes evolutivos muy antiguos. En otros apartados del libro discutimos los procesos por los que se cree que han evolucionado las protenas, poniendo de relieve de qu manera se crearon nuevas protenas mediante el barajado de exones que codificaban domi nios conservados de protenas tiles (vanse pgs. 413-424). La evolucin ha preservado algunos de estos dominios en forma de unidades plegadas que retie nen su estructura incluso cuando son separados de la protena -b ien sea por proteolisis selectiva, bien, de manera ms eficiente, por tcnicas de ingeniera gentica. Los dominios proteicos de este tipo, que muy a menudo participan en el barajado evolutivo de exones, se denominan mdulos; ahora que conocem os las secuencias de DNA de centenares de genes, se ha puesto de manifiesto la im portancia de estos mdulos. Los mdulos proteicos tienen tpicamente entre 40 y 100 aminocidos de longitud. Su pequeo tamao y su capacidad de plegarse independientemente han hecho posible determinar la estructura tridimensional de muchos de ellos en solucin, mediante tcnicas de NMR de elevada resolucin, la cual es una alter nativa conveniente a la cristalografa de rayos X. En la Figura 5-31 se ilustran al-

r "'

Figura 5-31 Estructuras tridimensionales de algunos mdulos proteicos. En estos diagramas, las zonas de lmina P se presentan como flechas y los extremos N y C estn marcados como bolas rojas. (Adaptado de M. Barn, D.G. Norman e I.D. Campbell, Trends Biochem. Sci. 16:1317,1991 y DJ. Leahy et al., Science 258:987-991,1992. de AAAS.)

m dulo de com plem ento de control

m dulo de fibronectina tipo 1

m dulo de factor de crecim iento

m dulo de inm unoglobulina

m dulo de fibronectina de tipo 3

m dulo kringle

Nacimiento, ensamblaje y muerte de las protenas

229

COOH

gunos mdulos tpicos. Cada uno de ellos tiene un ncleo con una estructura es table formado por cadenas o por lminas (3, del que salen asas de cadenas polipeptdicas menos ordenadas (mostradas en verde). Idealmente las asas estn si tuadas formando lugares de unin para otras molculas, como se ha demostrado para el plegado de las inmunoglobulinas que fue reconocido primero en las m o lculas de anticuerpo (vase Figura 23-35). Es posible que el xito evolutivo de los mdulos basados en lminas P se deba al hecho de que constituyeron unidades adecuadas para la generacin de nuevos lugares de unin para ligandos, a travs de variaciones en estas asas que sobresalen del ncleo del mdulo.

Figura 5-32 Larga estructura form ada a partir de series de mdulos en lnea. Aqu se muestran cinco mdulos de fbronectina de tipo 3 formando una disposicin repetitiva. Estructuras similares se encuentran en varias molculas de matriz extracelular. Se cree que interacciones entre cadenas laterales de los extremos de los mdulos proporcionan rigidez a las estructuras de este tipo.

Los mdulos confieren versatilidad y a menudo median las interacciones protena-protena 19,20
Una segunda caracterstica de los mdulos proteicos que explica su utilidad es la facilidad con la que pueden ser integrados en otras protenas. Cinco de los seis mdulos que se ilustran en la Figura 5-31 tienen sus extremos C y N (sealados con bolas rojas) en extremos opuestos del mdulo. Estas disposiciones en l nea significan que cuando un DNA que codifica un mdulo de este tipo se du plica en tndem, lo cual es habitual en la evolucin de los genes (como se discu te en el Captulo 8), los mdulos duplicados se pueden acomodar fcilmente en la protena. De esta forma estos mdulos pueden unirse en serie tanto consigo mismos (Figura 5-32) com o con otros mdulos en lnea, formando largas estruc turas. Habitualmente se encuentran estructuras rgidas y largas compuestas por series de mdulos, tanto en molculas de la matriz extracelular como en regio nes de protenas receptoras situadas en la superficie celular. Otros mdulos, como el kringle que se muestra en la Figura 5-31, son de tipo enchufe. Tras redistribuciones genmicas pueden ser fcilmente acom o dados en forma de inserto en una regin de un asa de otra protena. Algunos de estos mdulos actan com o lugares de unin especficos de otras protenas o de otras estructuras celulares. Un ejemplo importante al respecto es el dominio SH2, que puede unirse fuertemente a una regin de una cadena polipeptdica que contenga cadenas laterales fosforiladas de tirosina. Como cada dominio SH2 tam bin reconoce otras caractersticas del polipptido, slo se une al subgrupo de protenas que contienen tirosinas fosforiladas. La presencia de domi nios SH2 en una protena le permite formar complejos con protenas que se fosforilen en tirosinas en respuesta a procesos de sealizacin celular (Figura 5-33).

Figura 5-33 Los dominios SH2 median las reacciones de ensamblaje de las protenas que dependen de fosforilaciones. En la Figura 15-49 se ilustra la estructura de un dominio SH2, que tiene la forma de un mdulo tipo enchufe.

una protena quinasa fosforila la proteina A

las protenas A y B se ensamblan

230

Captulo 5 : Funcin de las protenas

(A) SUPERFICIE-CUERDA

(B) HLICE-HLICE

(C) SUPERFICIE-SUPERFICIE

Estos complejos proteicos que se forman y se deshacen como resultado de cam bios en la fosforilacin de la protena juegan un papel central en la transduccin de seales extracelulares en seales intracelulares, como se describe en el Cap tulo 15.

Figura 5 -3 4 Tres sistemas a travs de los que se pueden unir entre s dos protenas. Slo se muestran las zonas que interactan de las dos protenas. (A) Una superficie rgida de una protena puede unirse a una larga asa de cadena polipeptdica (una cuerda) de otra protena. (B) Dos hlices a pueden unirse entre s formando una hlice superenrollada. (C) A menudo dos superficies rgidas com plementarias unen entre s dos protenas.

Las protenas pueden unirse unas a otras a travs de diferentes tipos de interfases
Las protenas pueden unirse entre s al menos de tres maneras: en muchos casos una porcin de la superficie de una protena contacta con un asa extendida de una cadena polipeptdica (una cuerda) de otra protena (Figura 5-34A). Las in teracciones de este tipo permiten, por ejemplo, que el dominio SH2 reconozca un asa fosforilada de otra protena, y tambin permiten a una protena quinasa reconocer las protenas que fosforilar (vase Figura 5-16B). El segundo tipo de interacciones entre la superficie de dos protenas consis te en apareamiento de dos hlices a, una de cada protena, formando una hlice superenrollada (Figura 5-34B). Este tipo de interacciones entre protenas se halla en algunas familias de protenas reguladoras de genes, como se discute en el Ca ptulo 9. Sin embargo, el sistema ms comn de interaccin entre dos protenas con siste en un acoplamiento preciso entre dos superficies rgidas, una de cada pro tena (Figura 5-34C). Las interacciones de este tipo pueden ser muy fuertes, ya que se puede formar un elevado nmero de enlaces si las superficies se acoplan bien. Por esta misma razn, estas interacciones superficie-superficie pueden ser extraordinariamente especficas, permitiendo que una protena seleccione a otra protena determinada de entre los muchos miles de protenas que presenta una clula eucariota superior.

La conexin y la proteolisis selectiva aseguran los ensam blajes del tipo todo o nada
Muchas protenas forman grandes agregados con otras protenas. Ello requiere que cada protena se una selectivamente a otras protenas simultneamente. Para la clula resulta crucial que cada complejo proteico se forme de modo efiFigura 5-35 La conexin facilita un ensamblaje de tipo todo o nada de los complejos proteicos. Como se indica, cada una de las dos protenas X e Y inducen un cam bio alostrico en una tercera protena (mostrada en azul), que permite la unin de la otra protena. Como resultado de ello, solamente el com plejo formado por las tres protenas es suficientem ente fuerte para existir en la clula, lo cual resulta efectivo en el ensam blaje del tipo todo o nada.

com plejo fuerte

Nacimiento, ensamblaje y muerte de las protenas

231

cente, y que otros complejos parciales, cuya formacin interferira con la fun cin del com plejo final, se formen en cantidades mnimas. Por ello, debe haber mecanismos que aseguren que los ensamblajes se produzcan por sistemas del todo o nada. Un m ecanism o importante radica en el fenmeno de la conexin (linkage), que hem os descrito antes. Gracias a la conexin, si un ligando cambia la confor m acin de una protena alostrica de forma que la protena se una a otro ligan do de forma ms eficiente, el segundo ligando puede, a su vez, incrementar la afinidad de la protena por el primer ligando (vase Figura 5-5). Este mismo principio se aplica a las interacciones protena-protena. Cuando dos protenas se unen entre s, a menudo una de ellas incrementa su afinidad por una tercera protena. Debido a esta conexin el complejo de las tres protenas ser ms esta ble que el complejo de una sola protena. Un m ecanismo de este tipo puede pro ducir un ensam blaje del tipo todo o nada (Figura 3-35). Aunque se produzcan mecanismos de ensamblaje del tipo todo o nada que di rijan la conformacin de complejos proteicos completos, a no ser que la clula pre sente las cantidades exactas de las proporciones adecuadas de cada protena del complejo, sobrarn protenas no ensambladas. De hecho, la clulas no siempre producen sus componentes en las cantidades precisas; sin embargo, las clulas son capaces de degradar selectivamente cualquier complejo proteico mal ensam blado (Figura 5-36). As pues, las clulas necesitan disponer de un sofisticado siste ma para identificar las protenas ensambladas de forma anormal y para destruirlas. Efectivamente, las clulas eucariotas contienen un elaborado conjunto de prote nas que permite dirigir especficamente los ensamblajes incompletos de este tipo hacia la maquinaria de degradacin proteica, como discutiremos a continuacin.

La proteolisis dependiente de ubiquitina es la responsable principal del recam bio proteico selectivo en los eucariotas 21
Una de las funciones de los mecanismos intracelulares de proteolisis es, como acabam os de decir, reconocer y eliminar las protenas no ensambladas. Otra de las funciones consiste en desechar las protenas daadas o mal plegadas (vase Figura 5-27). Otra es conferir una corta vida media a ciertas protenas normales cuya concentracin ha de cam biar rpidamente en respuesta a alteraciones del estado de la clula; muchas de estas protenas de corta vida son degradadas r pidamente de forma habitual, mientras que otras, especialmente las ciclinas, son estables hasta que son degradadas repentinamente en un determinado m o mento del ciclo celular. Aqu discutiremos fundamentalmente cmo se degra dan las protenas en el citosol, pero tam bin se producen procesos importantes de degradacin en el retculo endoplasmtico (ER) y, como se discute en el Cap tulo 13, en los lisosomas. La mayora de las protenas que son degradadas en el citosol son liberadas a grandes com plejos proteicos denominados proteosom as, de los que hay mu-

Figura 5-36 La proteolisis de los com ponentes sobrantes de un complejo proteico impide que se acumulen en la clula. La degradacin mostrada aqu requiere que una protena no ensamblada sea reconocida por enzimas que le agreguen ubiquitina, de forma covalente, como se discute en el texto.

PROTEOLISIS
susceptible de degradacin

232

Captulo 5 : Funcin de las protenas

reconocimiento de substratos y regulacin

maquinaria proteolitica

(A)

IB)
100 nm
10

nm

chas copias dispersas por toda la clula. Cada proteosoma consiste en un cilin dro central formado por mltiples proteasas distintas, cuyos lugares activos, al parecer, forman una cmara central. Cada extremo del cilindro est cerrado por un gran complejo proteico formado por al menos 10 tipos de polipptidos, algunos de los cuales hidrolizan ATP (Figura 5-37). Se cree que estos tapones proteicos seleccionan las protenas que debern ser destruidas, unindose a ellas e introducindolas en la cmara del cilindro; all las protenas son degrada das hasta cortos pptidos, los cuales son liberados al exterior. Los proteosomas actan sobre protenas que han sido marcadas especfica mente para su destruccin, mediante la adicin covalente de una pequea pro tena, la ubiquitina (Figura 5-38). La ubiquitina existe en todas las clulas, libre o unida covalentemente a protenas. La mayora de las protenas ubiquitinadas estn marcadas para ser degradadas. (Algunas protenas de larga vida como las histonas tambin estn ubiquitinadas, pero en estos casos la funcin de la ubiquitina es desconocida.) Diferentes procesos proteolticos dependientes de ubiquitina utilizan enzimas que conjugan ubiquitina, estructuralmente similares entre s pero diferentes, asociadas con subunidades de reconocim iento que las dirigen hacia las protenas que presentan alguna seal determinada de degrada cin. La enzima de conjugacin aade ubiquitina a un residuo de Usina de la protena diana, y posteriormente aade series de ubiquitinas adicionales, for mando una cadena multiubiquitina (Figura 5-39), la cual, al parecer, es recono cida por un receptor proteico especfico del proteosoma. Las protenas desnaturalizadas o mal plegadas, as como las protenas que contienen aminocidos oxidados o anormales, son reconocidas y degradadas por el sistema proteoltico dependiente de ubiquitina. Probablemente, las enzimas que conjugan ubiquitina reconocen seales que estas protenas tienen expuestas al exterior debido a su mal plegamiento o a su alteracin qumica; se cree que es tas seales son secuencias de aminocidos o motivos conformacionales que en las protenas normales se hallan en su interior, es decir, inasequibles. Un proceso proteoltico que reconozca y destruya las protenas anormales ha de poder distinguir entre protenas completas que tienen conformaciones incorrectas y la gran cantidad de polipptidos que estn creciendo sobre los

Figura 5-37 Un proteosom a. En (A) se muestra un gran nmero de partculas contrastadas negativamente. En (B) se presenta un modelo tridimensional de un com plejo de proteosoma completo, obtenido por procesamiento de imgenes en un ordenador. Se presentan muchas copias de estas estructuras, distribuidas por toda la clula, donde actan com o bidn de basura para las protenas celulares no deseadas. (Micrografas electrnicas por cortesa de Wolfgang Baumeister, de J.M. Peters et al., J. Mol. Biol. 234:1993.)

lugar de unin a unas cadenas laterales de lisina de protenas

COOH

Figura 5 -38 Estructura tridimensional de la ubiquitina. Esta protena contiene 76 residuos de aminocido. La adicin de cadenas de ubiquitina a una protena provoca que esta protena sea degradada por el proteosoma (vase Figura 5-39). (Basada en S. Vijay-Kumar, C.E. Bugg, K.D. Wilkinson y W.J. Cook, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:3582-3585, 1985.)

ncleo hidrofbico globular

233

Nacimiento, ensamblaje y muerte de las protenas

proteina citoslica diana

complejo ubiquitina-proteina
P-P;
0 3 |a m p |

grupo am ino e de la cadena lateral de una lisina

1

H -,N -j

cOOh X

>

com plejo enzim tico de ubiquitinacin

COOH ubiquitina

ao\ o

Figura 5-39 Degradacin proteica dependiente de ubiquitina. En el paso 1, una proteina diana (conteniendo una seal de degradacin) es reconocida por el com plejo enzimtico de ubiquitinacin. Entonces, en el paso 2, series repetidas de reacciones bioqumicas unen molculas de ubiquitina entre s, produciendo una cadena de multiubiquitina, unida al grupo amino e de una cadena lateral de una lisina de la protena diana. Finalmente, en el paso 3, el proteosoma corta la protena diana en series de pequeos fragmentos.

pequeos pptidos

ribosomas (as como los polipptidos que acaban de ser liberados de los ribosomas) y que todava no han adoptado su conformacin plegada normal. Puede demostrarse experimentalmente que ste no es un problema trivial: si se aade puromicina a las clulas -u n inhibidor de la sntesis de las protenas- las prote nas que se acaban de forma prematura son eliminadas rpidamente mediante un proceso dependiente de ubiquitina. Una posibilidad es que las protenas for madas norm alm ente estn protegidas temporalmente por la maquinaria de tra duccin o por molculas de chaperones. Otra posibilidad sera que las protenas nacientes y acabadas de sintetizar son de hecho vulnerables a la proteolisis pero se pliegan adoptando su conform acin nativa muy rpidamente, antes de poder ser marcadas para su destruccin por proteolisis.

La vida media de una protena puede ser determinada por enzimas que alteran su extremo N22
Una caracterstica que tiene una influencia importante en la estabilidad de una protena es la naturaleza del primer aminocido (del extremo N) de su cadena polipeptdica. Hay una estrecha relacin, denominada la regla N-terminal entre la vida media in vivo de una protena y la identidad de su aminocido N-termi nal. En todos los organismos estudiados, desde bacterias hasta mamferos, exis ten distintas versiones de la regla N-terminal. Los aminocidos Met, Ser, Thr, Ala, Val, Cys, Gly y Pro, por ejemplo, protegen las protenas en la levadura S. cerevisiae cuando se presentan en el extremo N; estos aminocidos no son recono cidos por los com ponentes de mareaje del proceso de la regla N-terminal m ien tras que los otros 12 aminocidos atraen un ataque proteoltico. Todava se han de identificar la mayora de las protenas que son rpidamente degradadas por el sistema de la regla N-terminal (que acta tanto en el citoplasma como en el ncleo). Sin embargo, se sabe que no es frecuente la presencia de aminocidos desestabilizantes en el extremo N de las protenas del citosol, pero que es habi tual en las protenas que han sido transportadas a otros compartimientos. Por ello, una hipottica funcin del proceso de la regla N-terminal sera degradar las protenas que normalmente actan en el ER, en el complejo de Golgi o en otros compartimientos delimitados por membrana, pero que por alguna razn se han quedado o han vuelto al citosol. No se conoce todava de qu forma se exponen los aminocidos desestabili zantes en el extremo N de las protenas acabadas de sintetizar. Como se discute

234

Captulo 5 : Funcin de las protenas

en el Captulo 6, inicialmente todas las protenas son sintetizadas con una metionina (o con una formil-metionina en las bacterias) en su extremo N. A m enu do esta metionina, que es un aminocido estabilizante en la regla N-terminal, es eliminada por una aminopeptidasa especfica. Sin embargo, las aminopeptidasas conocidas actualmente eliminan la metionina N-terminal si y slo si el se gundo aminocido tambin es un aminocido estabilizante en la regla N-termi nal. Todava no conocem os las proteasas que producen substratos fisiolgicos del proceso de la regla N-terminal, ni las secuencias que son reconocidas como seales de hidrlisis. Algunos aminocidos N-terminales desestabilizantes, como el aspartato y el glutamato, no son reconocidos directamente por el com ponente sealizador del proceso de la regla N-terminal. En lugar de ello, son modificados por la enzima arginil-tRNA-protena transferasa, que une la arginina, uno de los aminocidos desestabilizantes reconocibles directamente, al extremo N de las protenas que presentan aspartato o glutamato como aminocido N-terminal. As, la arginina es un aminocido desestabilizante primario en la regla N-terminal, mientras que el aspartato y el glutamato son aminocidos desestabilizantes secundarios. En los eucariotas existen tambin aminocidos desestabilizantes terciarios -la asparagina y la glutam ina- los cuales desestabilizan a travs de su transforma cin, mediante una amidasa especfica, a los aminocidos desestabilizantes se cundarios aspartato y glutamato. A menudo se da el caso de que el aminocido N-terminal de una protena sea resistente a hidrlisis por los reactivos utilizados en los secuenciadores de protenas. Tales protenas tienen un aminocido N-terminal modificado (blo queado); la modificacin ms frecuente es la acetilacin. Se cree que esta m o dificacin juega un papel protegiendo las protenas de larga vida de ser degrada das. Sin embargo, experimentos recientes con mutantes de levaduras que carecen de las principales especies de acetilasas N-terminales, muestran que la mayora de estas protenas no acetiladas siguen manteniendo vidas largas. As, la funcin de la N-acetilacin de estas protenas est por descifrar.

Resumen
Desde el momento de su nacimiento, en un ribosoma, hasta su m uerte por proteolisis dirigida, las protenas son acompaadas por chaperones moleculares y por otros elementos de supervivencia cuya funcin es dar masajes a su form a, repa rarlas o elim inarlas. Las protenas mal plegadas son inducidas, en prim er lugar, a volverse a plegar correctam ente m ediante la participacin de los chaperones mole culares hsp60 o hsp70; si esto fracasa, son acopladas a ubiquitina y, as, marcadas para ser digeridas en los proteosomas. A m enudo las protenas estn compuestas por dominios m odulares discretos que durante la evolucin se han yuxtapuesto por duplicacin y barajado de las se cuencias de DNA que los codifican. Habitualm ente los mdulos contienen lugares de unin especficos para otras molculas, incluyendo otras protenas, y a m enudo perm iten que las protenas se ensam blen form ando grandes complejos. El principio de conexin explica de qu form a las clulas utilizan las transiciones alostricas para ensam blar estos complejos proteicos, por sistemas del todo o nada.

Bibliografa
General
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236

Captulo 5 : Funcin de las protenas

Mecanismos genticos bsicos

Sntesis de RNA y de protenas Mecanismos de reparacin del Mecanismos de replicacin del Recombinacin gentica Virus, plsmidos y elementos |enticos

La capacidad de las clulas de mantener un elevado grado de orden dentro de un universo catico, depende de la informacin gentica que se expresa, se mantiene y a veces mejora, mediante los procesos genticos bsicos -la sntesis de protenas y del RNA, la reparacin del DNA, la replicacin del DNA y la recom binacin gentica. En estos procesos, que producen y mantienen las protenas y los cidos nucleicos de una clula (Figura 6-1) la informacin de una secuencia lineal de nucletidos se utiliza para especificar otra cadena lineal de nucletidos (una molcula de DNA o de RNA) o una cadena lineal de aminocidos (una m o lcula proteica). Por ello, los acontecim ientos sobre los que se basan los proce sos genticos son unidimensionales y conceptualm ente simples, en compara cin con la mayora de los procesos celulares, los cuales son el resultado de la informacin contenida en las complejas superficies tridimensionales de las m o lculas proteicas. Quiz sta sea la razn de que entendamos mejor los m ecanis mos genticos que muchos otros procesos celulares. En este captulo examinaremos la maquinaria molecular que repara, replica y en ocasiones altera el DNA celular. Veremos que la maquinaria depende de en zimas que cortan, copian y recom binan secuencias de nucletidos. Tambin ve remos que estas y otras enzimas pueden ser parasitadas por virus, plsmidos y elem entos genticos transponibles, los cuales no slo dirigen su propia replica cin sino que tam bin pueden alterar el genoma celular mediante procesos de recom binacin gentica. Sin embargo, en primer lugar reconsideraremos un tpico central m encio nado brevemente en el Captulo 3 -lo s mecanismos de sntesis de RNA y de pro tenas.

replicacin del DNA

y ^1^1 I 1 M A \

replicacin dei DNA reparacin del DNA ' recom binacin gentica
r

DNA

transcripcin del DNA (sntesis de RNA!

RNA
b

codones H2 Nam inocidos

3sis de protenas

PROTEINA COOH

Sntesis de RNA y de protenas

Las protenas constituyen ms de la mitad de la masa seca total de una clula, y su sntesis es de im portancia capital para el mantenimiento, crecimiento y desa rrollo de la clula. Se produce en los ribosomas. Depende de la colaboracin en tre diversos tipos de molculas de RNA y empieza con una serie de etapas prepa ratorias. Primero, sobre el DNA que codifica la protena que se va a sintetizar, se ha de copiar una molcula de RNA mensajero (mRNA). Mientras tanto, en el ci toplasma, cada uno de los 20 aminocidos a partir de los cuales se construir la protena, se han de unir a su molcula especfica de RNA de transferencia (tRNA), y las subunidades del ribosoma sobre el cual se va a generar la nueva protena,

Figura 6-1 Los procesos genticos bsicos. Se cree que los procesos que se muestran aqu se producen en todas las clulas actuales. Probablemente, sin embargo, en etapas muy tempranas de la evolucin de la vida existieron clulas ms sencillas que no tenan ni DNA ni protenas (vase Figura 1-11). Ntese cmo una secuencia de tres ijucletidos (un codn) de una molcula de RNA codifica un aminocido determinado de una protena.

237

se han de volver a cargar con factores proteicos auxiliares. La sntesis de prote nas comienza cuando todos estos componentes se encuentran en el citoplasma y forman un ribosom a funcional. Cuando una molcula de mRNA se desplaza progresivamente a travs de cada ribosoma, la secuencia de nucletidos de la molcula de mRNA es traducida a la secuencia de aminocidos correspondiente, produciendo una cadena proteica determinada, especificada por la secuencia de DNA de su gen. Empezaremos por considerar cmo se sintetizan en la clula las diferentes molculas de RNA.

La RNA polmeras a copia el DNA a RNA: el proceso de la transcripcin del DNA1

El RNA se sintetiza sobre un molde de DNA, a travs de un proceso conocido como transcripcin del DNA. La transcripcin genera los mRNA que transportan la informacin para la sntesis de las protenas, los RNA de transferencia, los RNA ribosomales y otros tipos de molculas de RNA con propiedades estructurales y catalticas. Estas molculas de RNA son sintetizadas por enzimas RNA polimerasa, que generan una copia de RNA de una secuencia de DNA. En clulas eucariotas tres tipos de molculas de RNA polimerasa sintetizan diferentes tipos de RNA,

RNA polimerasa

INICIACIN DE UNA CADENA DE RNA POR UNIN DE LOS DOS PRIMEROS RIBONUCLESIDOS TRIFOSFATO

Figura 6 -2 Sntesis de una m olcula de RNA por la RNA polim erasa. La enzima se une a la secuencia promotor del DNA e inicia la sntesis a partir de esta seal promotor. Completa la sntesis hasta la seal de terminacin. Tras ello, la polimerasa y la cadena com pleta de RNA se liberan. Durante la elongacin de la cadena de RNA, la polimerizacin alcanza una velocidad de 30 nucletidos por segundo a 37C. Por consiguiente, una cadena de RNA de 5000 nucletidos tarda unos tres minutos en sintetizarse.

238

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

cadena patrn de DNA cadena de RNA en crecim iento

Figura 6-3 Reacciones de elongacin de la cadena, catalizada por una enzima RNA polim erasa. En cada

O
"O - P - O - P - O - P - O - C H ,

I O

I O

I O

paso, se selecciona un nuevo ribonuclesido trifosfato en base a su capacidad de formar pares de bases con la cadena de DNA expuesta, que acta como molde o patrn; entonces, un ribonuclesido monofosfato se agrega al extremo 3-OH de la cadena de RNA en crecimiento {flecha de color rojo) y se libera un pirofosfato {tomos dibujados en rojo). As la nueva cadena de RNA crece nucletido a nucletido, en direccin 5-a-3, y su secuencia es complementaria a la de la cadena patrn de DNA. La reaccin est impulsada tanto por la variacin favorable de energa libre que acompaa la liberacin del pirofosfato, como por la subsiguiente hidrlisis del pirofosfato hasta fosfato inorgnico (vase Figura 2-30).

ribonuclesido trifosfato entrante direccin 5' a 3' del crecim iento de la cadena

o= p-cr

como se describe en el Captulo 8. Se cree que estas RNA polimerasas han deri vado durante la evolucin de una nica enzima presente en las bacterias, que media toda la sntesis de RNA bacteriano. La RNA polimerasa bacteriana es una gran enzima formada por mltiples subunidades, asociada con varias subunidades proteicas adicionales que entran y salen del complejo DNA-polimerasa en diferentes m omentos de la transcrip cin. Molculas libres de RNA polimerasa colisionan aleatoriamente con el cro mosom a bacteriano, unindose muy dbilmente a la mayor parte del DNA. Sin embargo, la polimerasa se une muy fuertemente cuando entra en contacto con una secuencia especfica de DNA, llamada el prom otor, que contiene el lugar de iniciacin para la sntesis del RNA, y seala el lugar en el que debe iniciarse la sntesis del RNA. Las reacciones que se producen a continuacin se sealan en la Figura 6-2. Despus de unirse al promotor, la RNA polimerasa abre una regin localizada de la doble hlice, de forma que expone los nucletidos de ambas ca denas de una pequea zona de DNA. Una de las dos cadenas expuestas del DNA acta com o patrn para el apareamiento de bases complementarias con monmeros de ribonuclesido trifosfato entrantes, dos de los cuales son unidos entre s por la polimerasa y se inicia una cadena de RNA. Entonces, la molcula de po limerasa se mueve progresivamente a lo largo del DNA, desenrollando la hlice de DNA lo necesario para exponer una nueva regin de la cadena patrn para el apareamiento de bases. De esta forma, la cadena de RNA va creciendo nucletido a nucletido en direccin 5 '-a -3 (Figura 6-3). El proceso de elongacin de la cadena contina hasta que la enzima encuentra una segunda secuencia especial

Sntesis de RNA y de protenas

239

(A) SEAL DE INICIO -35 -10 +1

5 ------ T A G T G T A T T G A C A T G A T A G A A G C A C T C T A C T A T A T T C T C A A T A G G T C C A C G -------3' 3 ' ------ A T C A C A T A A C T G T A C T A T C T T C G T G A G A T G A T A T A A G A G T T A T C C A G G T G C ------- 5' DNA
/ l u g a r d e in i c i o I

TRANSCRIPCION RNA

cadena patrn de DNA

(B) SEAL DE TERMINACION CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAACTTTCT TTAATGAG G G T G T C G G C G G T C A A G G C G A C C G C C G T A A A A T T G A A A G A A A T T A C Tcadena patrn de D N A ' C C C A C A G C C G C C A G transcrito de RNA c TRANSCRIPCION
Figura 6-4 Seales de inicio y de terminacin para la sntesis de RNA por lina RNA polimerasa bacteriana. Aqu la cadena inferior de DNA es la cadena patrn y la secuencia de la cadena superior corresponde a la del RNA que se sintetiza (ntese la substitucin de U del RNA por T en el DNA). (A) La polimerasa empieza a transcribir en el lugar de inicio. Dos cortas secuencias (som breadas en verde) situadas a entre -3 5 y -10 nucletidos del inicio, determinan dnde se ha de unir la polimerasa; relativamente cercanas a ellas, dos secuencias de hexanucletidos, espaciadas adecuadamente una de otra, especifican el promotor de la mayora de genes de E. cot. (B) Una seal de terminacin (stop). La RNA polimerasa de E. coli se para cuando sintetiza varias U consecutivas (.som breadas en azul) a partir de una serie complementaria de varias A consecutivas de la cadena patrn siempre que haya acabado de sintetizar una secuencia de nucletidos de RNA autocomplementaria (.som breada en verde), la cual rpidamente formar una hlice en horquilla que es crucial para parar la transcripcin. La secuencia de nucletidos de la regin autocomplementaria puede ser muy variable. Figura 6-5 Desenrollamiento y nuevo enrollamiento del DNA por la RNA polimerasa. A medida que la molcula de RNA polimerasa avanza, va desenrollando continuamente la doble hlice de DNA por delante del lugar donde se produce la polimerizacin y volviendo a enrollar las dos cadenas de DNA por detrs de este lugar, desplazando la cadena de RNA acabada de formar. Sin embargo, de forma transitoria se forma una corta regin de hlice RNA-DNA y el RNA final se libera como una molcula de una sola cadena, copia de una de las dos cadenas del DNA.

C i.) G * . i tj
PLEGADO RPIDO DEL RNA

OH 3

A : : u cadena de RNA plegada C ! c G colabora en la term inacin G 1 C de la cadena C- G C G G ;- C

1

OH 3

del DNA, la seal de stop (terminacin), en cuyo momento la polimerasa se para, liberndose tanto del DNA patrn como de la cadena de RNA recin formada. Por convenio, cuando se habla de una secuencia de DNA asociada a un gen, se trata de la secuencia que no es la patrn y se escribe en direccin 5 a 3 . Este convenio se ha adoptado ya que la secuencia que no es la patrn corresponde a la secuencia del RNA que se fabrica. En la Figura 6-4 se presentan las secuencias de nucletidos que actan como lugares de inicio y de term inacin para la RNA polimerasa bacteriana. Las secuencias de nucletidos encontradas en muchos ejemplos de un tipo particular de regin de DNA (como un promotor) se denominan secuencias consenso. En las bacterias, los promotores fuertes (los que estn asociados a genes que producen

lugar de entrada del ribonuclesido trifosfato

corta regin de hlice RNA/DNA

240

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

grandes cantidades de mRNA) tienen secuencias que se aparean fuertemente con las secuencias promotoras consenso (como en la Figura 6-4A) mientras que los promotores dbiles (los que estn asociados con genes que producen canti dades relativamente pequeas de mRNA) se aparean peor con estas secuencias.

si la RNA polimerasa se desplaza de derecha a izquierda, sintetiza un RNA utilizando com o patrn la cadena superior del DNA GGGGGGG
3 ' ' ccccccccccccccc\cccc

Slo se utilizan zonas seleccionadas de un cromosom a para producir molculas de RNA2

A medida que una molcula de RNA polimerasa se va desplazando a lo largo del DNA, en el lugar activo de la enzima se va formando una doble hlice RNA-DNA. Esta hlice es muy corta ya que, en cuanto la polimerasa ha acabado de pasar, se vuelve a formar la doble hlice DNA-DNA que desplaza la cadena de RNA recin formada (Figura 6-5). Como resultado de todo ello, cada cadena completa de RNA se libera del patrn de DNA como una molcula libre de una sola cadena, y de una longitud aproximada de entre 70 y 10 000 nucletidos. En principio, cualquier regin de la doble hlice del DNA podra ser copiada a dos molculas de RNA diferentes -u n a copia de cada una de las dos cadenas del DNA. Sin embargo, en cada regin del DNA nicamente una de las dos cade nas se utiliza como patrn. La cadena de RNA formada tiene una secuencia de nucletidos equivalente a la de la otra cadena no utilizada como patrn. La ca dena que ser copiada vara a lo largo de cada molcula de DNA, y en cada gen viene determinada por el promotor. Como se ilustra en la Figura 6-4 un promo tor es una secuencia de DNA orientada que sita a la RNA polimerasa en una u otra direccin y esta orientacin determina cul de las dos cadenas de DNA ser copiada (Figura 6-6). En genes vecinos la cadena de DNA que ser copiada a RNA puede ser diferente o la misma (Figura 6-7). Tanto la RNA polimerasa bacteriana como las RNA polimerasas de eucariotas son unas molculas complicadas, formadas por mltiples subunidades y una masa total de ms de 500 000 daltons. Sin embargo, algunos virus bacterianos codifican RNA polimerasas de una sola cadena, de una quinta parte de esta masa y que catalizan la sntesis de RNA como mnimo tan bien como la enzima de la clula husped. Posiblemente la presencia de mltiples subunidades es im portante desde el punto de vista de la regulacin de la sntesis de RNA, que toda va no se ha definido completamente. En este breve esquema de la transcripcin del DNA hemos omitido muchos detalles: en muchos casos han de ocurrir otros procesos complejos antes de que se pueda producir una molcula de mRNA. Por ejemplo, las protenas regulado ras de la expresin gnica colaboran en la determinacin de las regiones del DNA que sern transcritas por la RNA polimerasa, desempeando as un papel im portante en cuanto a determinar qu protenas sern sintetizadas por una clu la. Adems, aunque en los procariotas las molculas de mRNA se sintetizan di rectam ente por transcripcin del DNA, en las clulas eucariotas superiores la mayora de transcritos de RNA son considerablemente alterados -m ediante un proceso denominado maduracin por corte y empalme (splicing) del RNA- antes de abandonar al ncleo celular y entrar en el citoplasma como molculas de mRNA. Todos estos aspectos de la produccin de mRNA sern estudiados con detalle en los Captulos 8 y 9, donde consideramos el ncleo celular y el control de la expresin gnica, respectivamente. Ahora supongamos que una clula ha

5'

13

GGGGGGGGGGGGGGGGGGG

doble hlice de DNA

CCCC/CCCCCCCCCCCCCCC
3'

G G G G vG G G G_GG^G G G G G G G G G

si la RNA polimerasa se desplaza de izquierda a derecha, sintetiza un RNA utilizando com o patrn la cadena inferior del DNA
Figura 6-6 La orientacin de la RNA polim erasa determ ina cul de las dos cadenas de DNA actu ar de patrn. Puesto que la cadena de DNA que acta como patrn ha de ser recorrida desde su extremo 3 hasta el extremo 5 (vase Figura 6-3), la direccin en la que se desplace la RNA polimerasa determinar, com o se indica en este diagrama, cul de las dos cadenas de DNA ser utilizada com o patrn para la sntesis de RNA. A su vez, la direccin del movimiento de la RNA polimerasa viene determinada por la orientacin de la secuencia promotor a la que la RNA polimerasa se une inicialmente.

crom osom a de E. coli

5

transcritos de RNA gen d gen e gen f gen g 5'

> gen a gen b gen c

3'

5000 pares de nucletidos

Figura 6 -7 Direcciones de transcripcin a lo largo de una co rta porcin de un crom osom a bacteriano. Ntese cm o algunos genes son transcritos a partir de una cadena de DNA mientras que otros lo son a partir de la otra cadena de DNA. En la figura se muestra aproximadamente el 0 ,2 % del cromosom a de E. coli. (Adaptado de D.L. Daniels et al., Scien ce 257: 771777, 1992.)

Sntesis de RNA y de protenas

241

producido molculas funcionales de mRNA y procedamos a estudiar cmo estas molculas dirigen la sntesis de protenas.

Las m olculas de RNA de transferencia actan com o adaptadores que traducen secuencias de nucletidos a secuencias de protena 3
Todas las clulas contienen un conjunto de molculas de RNA de transferencia (tRNA), cada una de la cuales es una pequea molcula de RNA (la mayora de ellas tienen una longitud de entre 70 y 90 nucletidos). Los tRNA se unen por uno de sus extremos a un codn especfico de la molcula de mRNA y por el otro al aminocido especfico para este codn, y de esta forma permiten que los am i nocidos se alineen de acuerdo con la secuencia de nucletidos del mRNA. Cada tRNA est diseado para transportar uno slo de los 20 aminocidos que se utili zan para la sntesis de protenas: un tRNA que transporta glicina se denomina tRNAG L Y , y as sucesivamente. Cada uno de los 20 aminocidos tiene, como mni mo, un tipo de tRNA asignado, mientras que la mayora de aminocidos dispo nen de varios tipos de tRNA. Antes de que un aminocido se incorpore a una ca dena proteica, se une por su extremo carboxilo al extremo 3 de una molcula apropiada de tRNA. Esta unin cumple dos funciones. La primera y ms impor tante, unir covalentemente cada aminocido con un tRNA que presenta un anticodn adecuado -e l anticodn es la secuencia de tres nucletidos com plem en taria del codn de tres nucletidos de la secuencia de mRNA, especfica de este aminocido. El apareamiento codn-anticodn permite que cada aminocido se coloque en una cadena de protena en crecimiento de acuerdo con lo que se establezca en la secuencia de nucletidos del mRNA, consiguiendo as que el c digo gentico se utilice para traducir la secuencia de nucletidos a secuencia proteica. sta es la funcin adaptadora esencial de la molcula de tRNA: con uno de sus extremos unido a un aminocido y el otro apareado con un codn, el tRNA convierte secuencias de nucletidos en secuencia de aminocidos. La segunda funcin de la unin del aminocido consiste en activar el amino cido, generando en su extremo carboxlico una unin rica en energa, de forma que pueda reaccionar con el grupo amino del aminocido siguiente en la secuen cia formando un enlace peptdico. El proceso de activacin es necesario para la sntesis proteica ya que los aminocidos no activados no se pueden aadir direc tamente a la cadena polipeptdica en crecimiento. (Por el contrario, el proceso re verso, en el cual se hidroliza un enlace peptdico por la adicin de una molcula de agua es energticamente favorable y puede ocurrir espontneamente.) La funcin de una molcula de tRNA depende de su estructura tridimensio nal, que se halla plegada de forma muy precisa. Algunos tRNA se han cristaliza do y por anlisis de difraccin de rayos X se ha podido determinar su estructura

anticodn
Figura 6 -8 La estructura en hoja de trbol del tRNA. Se trata de una visin de la molcula mostrada en la Figura 6-9, despus de desplegarla parcialmente. Existen muchas molculas diferentes de tRNA, incluyendo com o mnimo una por cada aminocido diferente. A pesar de que estas diferentes molculas de tRNA se diferencian en su secuencia de nucletidos, todas presentan los tres tallos acabados en asa y un brazo aceptor de un aminocido. La molcula de tRNA de la figura transporta fenilalanina (Phe), por lo que se denomina tRNAphc. En todas las molculas de tRNA el aminocido se une al residuo A de la secuencia CCA del extremo 3 de la molcula. En barras rojas se presentan apareamientos de bases complementarias.

Figura 6-9 La estructura plegada de una molcula de tRNA tpica. Dos visiones de la conform acin tridimensional de la molcula, determinada por difraccin de rayos X. Ntese que la molcula tiene forma de L, con uno de sus extremos adaptado para aceptar el aminocido, y el otro extremo contiene los tres nucletidos del anticodn. Cada asa est coloreada de acuerdo con la Figura 6 - 8 .

anticodn

242

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

/CH3

H\

/ C H iCH = C

CH

O <^ribosa^

adicin a G de dos grupos m etilo (/V, A/-dimetil G)

adicin a U de dos hidrgenos (dihidro U)

adicin a A de un grupo isopentenil (/V6-isopentenil A)

substitucin de un oxgeno de U por un sulfuro (4-tiouridina)

tridimensional completa. Para plegar una molcula de tRNA se requiere tanto el apareamiento de bases complementarias com o interacciones poco habituales entre bases (vase Figura 3-18). Las secuencias de nucletidos de las molculas de tRNA de muchos organismos diferentes revelan que las molculas de tRNA pueden formar los bucles y las zonas de bases apareadas necesarias para formar una estructura de cruce de carreteras en forma de trbol (Figura 6-8), y que posteriormente esta estructura se pliega adoptando la conform acin en forma de L detectada en los anlisis cristalogrficos. En la estructura nativa, el am ino cido se une a un extremo de la L mientras que el anticodn se localiza en el otro extremo (Figura 6-9). Los nucletidos que forman parte de una cadena de cidos nucleicos com pleta (tal y com o ocurre con los aminocidos de las protenas), pueden ser m o dificados covalentemente, modificndose as la actividad biolgica de la m ol cula de cido nucleico. Modificaciones post-transcripcionales de este tipo son especialmente comunes en las molculas de tRNA, las cuales presentan muchos nucletidos diferentes modificados (Figura 6-10). Algunas de estas modificacio nes de los nucletidos afectan a la conformacin y apareamiento de bases del anticodn, facilitando el reconocim iento del codn del mRNA apropiado por la molcula de tRNA.

Figura 6 -1 0 Algunos de los nucletidos poco usuales encontrados en las molculas de tRNA. Estos nucletidos se producen por modificacin covalente de nucletidos normales, despus de haberse incorporado a la cadena de RNA. En la mayora de las molculas de tRNA, alrededor del 10% de los nucletidos estn modificados (vase Figura 6 - 8 ).

Unas determinadas enzimas acoplan cada aminocido con su molcula apropiada de tRNA4
Es la molcula de tRNA, y no el aminocido que sta lleva unido, la que determ i na el lugar en el que ser aadido el aminocido durante la sntesis de protenas. Esto fue establecido a travs de un ingenioso experimento en el cual un am ino cido (la cisterna) fue transformado qumicamente en otro aminocido diferente

OH

1- C H?N C aminocido I X OH H

R H jN - C - C

''f p V ribosa - adenina

am inocido adenilado

( p ) - ribosa - adenina AMP

Figura 6-11 Activacin de los aminocidos. Las dos etapas del proceso a travs del que se activa un aminocido (cuya cadena lateral aqu se indica com o R) para la sntesis de protena, mediante una enzima aminoacil-tRNA sintetasa. Como se indica, se utiliza la energa de hidrlisis del ATP para unir, mediante un enlace de alta energa, cada aminocido a su molcula de tRNA. En primer lugar el aminocido se activa mediante la unin de su grupo carboxilo a un AMP, formando una a m in o c id o ad en ila d o ; la formacin del enlace con el AMP, que normalm ente es una reaccin desvaforable, est favorecida por la hidrlisis de la molcula de ATP que cede el AMP. Sin abandonar la enzima sintetasa, el grupo carboxilo unido al AMP es transferido a un grupo hidroxilo del azcar del extremo 3 de la molcula de tRNA. Esta transferencia une el aminocido, mediante un enlace ster activado, al tRNA formando la molcula final de aminoacil-tRNA. La enzima sintetasa no se muestra en la figura.

Sntesis de RNA y de protenas

243

(A)

aminoacM tRNA

(B)

I O

NH,

nnn

I X.
,C H

y o O

I I
C

H -C -R NH,

I
H -C -R

I
n h

am inocido

Figura 6 -12 Estructura del enlace aminoacil-tRNA. El extremo carboxilo del aminocido forma un enlace ster con la ribosa. Como la hidrlisis de este enlace ster est asociada con una variacin de energa libre muy favorable, se dice que un aminocido unido de esta forma est activado. (A) Esquema de la estructura. (B) Estructura real correspondiente a la regin recuadrada de (A). Como en la Figura 6-11, el grupo R del aminocido indica una de las 20 cadenas laterales posibles (vase Panel 2-5, pgs. 58 y 59).

(la alanina), y posteriormente fue unido al tRNA especfico de la cistena. Cuan do estas molculas de tRNA hbridas se utilizaron para la sntesis de protenas en un sistema libre de clulas, en cada uno de los puntos en los que se utiliz este tRNA se insert el aminocido incorrecto. As pues, la fidelidad del proceso de sntesis de protenas depende de la fidelidad del mecanismo que normal mente une especficam ente cada uno de los aminocidos activados con sus m o lculas de tRNA correspondientes. De qu manera una molcula de tRNA acaba unida covalentemente a uno de los 20 aminocidos que precisamente es su pareja apropiada? El mecanismo depende de la actividad de las enzimas denominadas aminoacil-tRNA sintetasas, que acoplan cada aminocido a su grupo de molculas de tRNA apropiadas. Existe una enzima sintetasa diferente para cada aminocido (20 sintetasas en to tal): una de ellas une glicina a todas las molculas tRNAly, otra une alanina a to das las molculas tRNAA la, y as sucesivamente. La reaccin de acoplamiento que genera una molcula de amionacil-tRNA est catalizada en dos etapas, tal como ilustra la Figura 6-11. En la Figura 6-12 se muestra la estructura del enlace aminocido-RNA. A pesar de que las molculas de tRNA actan como el adaptador final en la etapa de transformacin de la secuencia de nucletidos a secuencia de aminoci dos, las enzimas aminoacil-tRNA sintetasas son adaptadores de la misma impor tancia para el proceso de decodificacin (Figura 6-13). As, el cdigo gentico es traducido por medio de dos conjuntos de adaptadores que actan secuencialmente, cada uno de los cuales empareja una superficie molecular a otra con una gran especificidad; su accin combinada asocia cada secuencia de tres nucleti dos de la molcula de mRNA -cad a codn- con su aminocido determinado (Fi gura 6-14).

Los aminocidos se van aadiendo al extremo carboxilo terminal de una cadena polipeptdica en crecim iento
La reaccin fundamental de la sntesis proteica es la formacin de un enlace peptdico entre el grupo carboxilo del extremo de una cadena polipeptdica en crecim iento y el grupo amino libre de un aminocido. Por consiguiente, una ca dena proteica se sintetiza paso a paso desde su extremo amino terminal hasta su extremo carboxilo terminal. A lo largo de todo el proceso, el extremo carboxilo de la cadena polipeptdica permanece activado por su unin covalente a una molcula de tRNA (una molcula de peptidil-tRNA). Este enlace covalente rico en energa se rompe en cada ciclo de reacciones, pero inmediatamente es subs tituido por otro enlace idntico con el aminocido que se acaba de aadir a la cadena (Figura 6-15). As, cada aminocido que es aadido lleva consigo la ener ga de activacin necesaria, no para su propia adicin a la cadena sino para la del siguiente aminocido -lo cual constituye un ejemplo de un tipo de polimeri zacin por la cabeza descrito en el Captulo 2 (Figura 2-36).

Figura 6-13 Reconocimiento de una molcula de tRNA por su aminoaciltRNA sintetasa. Para este tRNA (tRNAc;ln), la presencia de determinados nucletidos tanto del anticodn {en la p a rte inferior) como del brazo del tRNA que acepta el aminocido permiten que el tRNA sea reconocido especficam ente por la sintetasa {azul). (Por cortesa de Tom Steitz.)

24 4

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

am inocido (triptfano)

u M C C

H> NC

h 2n

c
c h

c
tRNA especfico del triptfano (tRNATrp) am inoacil tRNA sintetasa especfica del triptfano

unin del triptfano al tRNATrp

el tRNATrp se une al codn UGG

ESULTADO ETO: EL TRIPTFANO E SELECCIONADO POR SU CODN

5' mRNA

El cdigo gentico es degenerado 5

En el transcurso de la sntesis de protenas, la maquinaria de la traduccin se des plaza en direccin 5 -a-3 a lo largo de una molcula de mRNA, y lee la secuencia de nucletidos de este mRNA de tres en tres. Como hemos visto, cada aminoci do est especificado por un triplete de nucletidos (codn) de la molcula de mRNA que se aparea con una secuencia de tres nucletidos complementaria, del extremo anticodn de una molcula de tRNA determinada. Puesto que tan slo uno de las muchos tipos de molculas de tRNA de una clula puede aparearse con cada codn, el codn determina el residuo de aminocido especfico que ser aadido al extremo de la cadena polipeptdica en crecimiento (Figura 6-16). El RNA est compuesto por cuatro tipos de nucletidos, por lo que existen 64 posibles secuencias diferentes de tres nucletidos (4 x 4 x 4), y la mayora de ellas se presentan en algn lugar de la secuencia de la mayora de las molculas de tRNA. Tres de estas 64 secuencias no codifican ningn aminocido sino que determinan el final de una cadena polipeptdica; reciben el nombre de codones

Figura 6 -1 4 El cdigo gentico se traduce por medio de dos adaptadores asociados secuencialmente. El primer adaptador

es la enzima aminoacil-tRNA sintetasa, que acopla un aminocido determinado a su tRNA correspondiente; el segundo adaptador es la molcula de tRNA cuyo anticodn se une a la secuencia de nucletidos apropiada (codn) del mRNA. Un error en cualquiera de estos dos procesos har que el aminocido que se incorpora a la protena sea errneo.

O
H ,N -C I-C -N -C

R4
-N -C -

O O

peptidil tRNA unido al extrem o carboxilo de la cadena polipeptdica en crecim iento

m olcula de tRNA libe de su unin al pptido

Figura 6 -15 Incorporacin de un aminocido a una protena.

Una cadena polipeptdica crece por la adicin progresiva de aminocidos a su extremo carboxilo terminal. La formacin de cada enlace peptdico es energticamente favorable debido a que el carboxilo terminal de la cadena en crecimiento ha sido activado mediante su unin covalente a una molcula de tRNA. La unin peptidil-tRNA que activa el extremo en crecimiento se regenera en cada ciclo. Las cadenas laterales de los aminocidos se han abreviado como Rt R2 R3y R4. Como referencia, todos los tomos del segundo aminocido de la cadena polipeptdica estn sombreados en gris.

nueva molcula de tRNA unida al extrem o carboxilo de la cadena polipeptdica en crecim iento

Sntesis de RNA y de protenas

245

Figura 6 -1 6 Decodificacidn de una molcula de mRNA. Cada aminocido

cadena polipeptdica en crecim iento

que es aadido al extremo en crecimiento de una cadena polipeptdica, es seleccionado mediante el apareamiento de bases complementarias entre el anticodn de la molcula de tRNA que lo transporta y el codn siguiente de la cadena de mRNA.

de terminacin (stop codons). Por lo tanto, quedan 61 codones para especificar nicamente 20 aminocidos diferentes. Por esta razn, la mayora de los am ino cidos estn representados por ms de un codn (Figura 6-17) por lo que se dice que el cdigo gentico es degenerado. Dos aminocidos, metionina y triptfano, tan slo tienen un codn cada uno. Estos aminocidos son los menos abundan tes de las protenas. La degeneracin del cdigo gentico implica o que existe ms de un tRNA para cada aminocido o que una misma molcula de tRNA puede aparearse con ms de un codn. De hecho se producen ambas cosas. Para algunos am inoci dos existe ms de una molcula de tRNA, y algunas molculas de tRNA estn construidas de tal manera que nicamente exigen un apareamiento exacto de las dos primeras posiciones del codn, de forma que pueden tolerar un adapta cin defectuosa (o balanceo) en la tercera. Este balanceo en el apareamiento de bases explica por qu muchos de los codones alternativos para un mismo ami nocido se diferencian entre ellos nicamente en el tercer nucletido (vase Fi gura 6-17). El balanceo estndar de pares de bases hace posible acomodar los 20 aminocidos a 61 codones con tan slo 31 molculas diferentes de tRNA; en una mitocondria animal, un balanceo mayor permite que se produzca sntesis de protenas con tan slo 22 molculas diferentes de t*RNA (vase Captulo 14).

mRNA

Los acontecim ientos de la sntesis proteica estn catalizados sobre el ribosom a 6

Las reacciones de la sntesis de protenas que acabamos de describir necesitan que una com pleja maquinaria cataltica las gue. Por ejemplo, el extremo de la cadena polipeptdica por el que se produce el crecimiento debe mantenerse ali neado con la molcula de mRNA para asegurar que cada codn sucesivo del mRNA encaje de forma precisa con el anticodn de una molcula de tRNA, y no se salte un nucletido, ya que ello cambiara la pauta de lectura (vase Figura 317). ste y todos los dems acontecim ientos de la sntesis de protenas estn ca talizados por los ribosomas, que son grandes complejos de molculas de RNA y de protena. Los ribosomas de procariotas son muy similares a los de eucariotas en cuanto a diseo y funcin. Cada uno de ellos est compuesto por una subunidad pequea y una subunidad grande, que se mantienen juntas formando un com plejo de una masa de varios millones de daltons (Figura 6-18). La subunidad pequea se une al mRNA y a las molculas de tRNA, mientras que la subunidad grande cataliza la formacin de los enlaces peptdicos. Ms de la mitad del peso de un ribosoma es RNA, y cada da es ms evidente que el RNA ribosmico (rRNA) desempea un papel central en las actividades catalticas del ribosoma. A pesar de que la molcula de rRNA de la subunidad pequea del ribosom a tiene un tamao variable en funcin del organismo de que se trate, su complicado plegamiento est muy conservado (Figura 6-19); tam bin existen claras homologas entre las molculas de rRNA de las subunida-

Figura 6-17 El cdigo gentico. Debajo

de la abreviatura de tres letras de cada aminocido, se presenta la abreviatura estndar de una letra. Los codones estn escritos con el nucletido 5 terminal a la izquierda. Obsrvese que la mayora de los aminocidos estn representados por ms de un codn y que normalmente la variacin reside en el tercer nucletido (vase tambin Figura 3-16).

GCA GCC GCG GCU Ala A

AGA AGG CGA CGC CGG CGU Arg R

GAC GAU Asp D

AAC AAU Asn N

UGC GAA UGU GAG Cys C Glu E

GGA GGC CAA GGG CAG GGU Gln Q Gly G

CAC CAU His H

UUA UUG CUA AU A CUC AUC CUG AAA AUU CUU AAG lie
1

AUG Met M

UUC UUU Phe F

CCA CCC CCG CCU Pro P

AGC AGU UCA UCC UCG UCU Ser S

ACA GUA ACC GUC ACG UAC GUG ACU UGG UAU GUU Thr T Trp W Tyr Y Val V

UAA UAG UGA stop

Leu L

Lys K

246

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

25 nm

subunidad pequea

subunidad grande

ribosom a

Figura 6-18 El ribosoma. Modelo tridimensional del ribosoma bacteriano visto desde dos ngulos diferentes. En esta estructura se han determinado las posiciones de muchas protenas ribosomales mediante microscopa electrnica, tanto para visualizar las posiciones en las que se unen anticuerpos especficos como para medir la emisin de neutrones de ribosomas que contienen una o varias protenas deuteradas. (Apartir de JA. Lake, Ann. Rev. Biochem. 54:507530,1985. 1985 por Annual Reviews Inc.)

des grandes de los ribosomas de diferentes organismos. Los ribosomas contienen un elevado nmero de protenas (Figura 6-20), pero muchas de ellas tienen una secuencia muy poco conservada durante la evolucin, e incluso un nmero sor prendente de ellas no parecen ser esenciales para la funcin del ribosoma. Sin embargo se ha sugerido que las protenas ribosomales incrementan la funcin de los rRNA y que son las molculas de RNA y no las molculas de protena del ribosoma las que catalizan la mayora de las reacciones del ribosoma.

El ribosom a se desplaza, paso a paso, a lo largo de la cadena de mRNA7

Un ribosoma contiene tres lugares de unin para molculas de RNA: uno para mRNA y dos para tRNA. Un lugar, llamado el lugar de unin peptidil-tRNA o lu gar P acoge a la molcula de tRNA que est unida al extremo de la cadena polipeptdica en crecimiento. Otro lugar, llamado lugar de unin aminoacil-tRNA o lugar A acoge a la molcula de tRNA entrante cargada con un aminocido. Para que una molcula de tRNA se una fuertemente a cualquiera de estos dos lugares es necesario que su anticodn forme los pares de bases adecuados con el codn complementario de la molcula de mRNA que est unida al ribosoma. Los lugares A y P estn tan cerca el uno del otro que las dos molculas de tRNA se ven forzadas a aparearse con codones adyacentes de la molcula de mRNA (Figura 6-21). El proceso de elongacin de la cadena polipeptdica sobre un ribosoma se puede considerar como un ciclo de tres etapas discretas (Figura 6-22): 1. En la etapa 1, una molcula de aminoacil-tRNA queda unida al lugar A va cante del ribosoma (adyacente al lugar P, que est ocupado) mediante la formacin de pares de bases con los tres nucletidos del mRNA (codn) que estn expuestos en el lugar A. 2. En la etapa 2, el extremo carboxilo de la cadena polipeptdica se desacopla de la molcula de tRNA del lugar P y se une a travs de un enlace peptdico al aminocido que se halla unido a la molcula de tRNA que se halla en el lugar A. Esta reaccin central de la sntesis de protenas (vase Figura 6-15) est catalizada por una enzima peptidil transferasa. Recientes experi mentos de sntesis proteica con ribosomas han demostrado que esta catli sis est mediada no por una protena sino por una regin especfica de la

Figura 6-19 Estructura del rRNA en la subunidad pequea. Este modelo del rRNA 16S de E. coli es indicativo del complejo plegamiento que est en la base de las actividades catalticas de los RNA del ribosoma. La molcula de rRNA 16S contiene 1540 nucletidos, y est plegada en tres dominios: el 5 (azul), el central (rojo) y el 3 (verde). (Adaptado de S. Stem, B. Weiser y H.F. Noller, J. Mol. Biol. 204:447-481,1988)

Sntesis de RNA y de protenas

247

M 2 500 000

M 4 200 000

M 1 600 000

M 900 000

M 2 800 000

M 1 400 000 rRNA 18S

rRNA 5S nucletidos
120

rRNA 23S

2900 nucletidos

34 protenas

21 protenas

-49 protenas

-3 3 protenas

RIBOSOMA DE LA CLULA PROCARIOTA

RIBOSOMA DE LA CLULA EUCARIOTA

Figura 6 -20 Com paracin de las estructuras de los ribosom as de la clula procariota y de la clula eucariota. Normalmente, los com ponentes ribosomales se designan por sus valores de S, los cuales indican su velocidad de sedimentacin en una ultracentrfuga. Vase cmo a pesar de las diferencias en cuanto a nmero y tamao de sus rRNA y de sus protenas, ambos tipos de ribosomas tienen una estructura casi idntica y actan de forma muy similar. Por ejemplo, a pesar de que los rRNA 18S y 28S del ribosoma eucariota contienen muchos nucletidos extra que no se encuentran en sus anlogos bacterianos, estos nucletidos estn presentes en mltiples insertos que al parecer sobresalen como asas, de forma que la estructura bsica de cada rRNA es muy sem ejante.

molcula mayor de rRNA de la subunidad mayor del ribosoma (vase Figu ra 3-23). 3. En la etapa 3 el nuevo peptidil-tRNA del lugar A se transloca al lugar P cuando el ribosoma se desplaza a lo largo de la molcula de mRNA. Esta etapa requiere energa y est impulsada por series de cambios conformacionales de uno de los com ponentes del ribosoma, mediante la hidrlisis de una molcula de GTP. Como una parte del proceso de translocacin de la etapa 3, la molcula libre de tRNA que se ha generado en el lugar P durante la etapa 2 se libera del riboso ma y vuelve a formar parte del acervo citoplasmtico de molculas de tRNA. As, al completarse la etapa 3, el lugar A, que se halla desocupado, puede aceptar una

mRNA
Figura 6-21 Los tres lugares principales de unin de un ribosoma a molculas de RNA. A la izquierda se presenta un ribosoma vaco y a la derecha un ribosoma cargado. La representacin del ribosoma utilizada en sta y en las tres figuras siguientes es muy esquemtica. Para una visin ms exacta, vanse Figuras 6-18 y 6-25.

248

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

Figura 6-22 Fase de elongacin de la sntesis proteica sobre un ribosoma. El ciclo de tres etapas representado aqu se repite una y otra vez durante la sntesis de una cadena de protena. En la etapa 1, una molcula de aminoaciltRNA se une al lugar A del ribosoma; en la etapa 2 se forma un nuevo enlace peptdico; en la etapa 3, el ribosoma se desplaza una distancia de tres nucletidos a lo largo de la cadena de mRNA, liberando la molcula de tRNA anterior y reseteando el ribosoma, de forma que se puede unir el nuevo aminoacil-tRNA. Como se indica en la Figura 6-21, el lugar P se ha dibujado a la izquierda del cromosom a y el lugar A a la derecha.

h 2n '

nueva molcula de tRNA unida al siguiente aminocido, la cual vuelve de nuevo a iniciar el ciclo. En condiciones ptimas, en una bacteria cada ciclo tarda alre dedor de 1/20 de segundo, de forma que la sntesis de una protena de tamao medio de 400 aminocidos se lleva a cabo en unos 20 segundos. Los ribosomas se desplazan a lo largo de una molcula de mRNA en direccin 5-a-3\ la cual tambin es la direccin de la sntesis del RNA (vase Figura 6-3). En la mayora de las clulas, la sntesis de protenas consume ms cantidad de energa que cualquier otro proceso biosinttico. Para sintetizar cada uno de los enlaces peptdicos se utilizan por lo menos cuatro enlaces fosfato ricos en energa: dos de estos enlaces fosfato se requieren para cargar cada molcula de tRNA con su aminocido (vase Figura 6-11) y los otros dos impulsan las etapas del ciclo de reacciones que tienen lugar en el ribosoma durante la sntesis pro piamente dicha -u n o se utiliza en la unin del aminoacil-tRNA en la etapa 1 (vase Figura 6-31) y el otro en la traslocacin del ribosoma en la etapa 3.

H?N'

etapa 2

Cuando se alcanza uno de los tres tipos de codn de term inacin, la cadena proteica se libera del ribosom a 8
Tres de los 64 codones posibles (UAA, UAG y UGA) de una molcula de mRNA son codones de terminacin (stop codons), que finalizan el proceso de la traduc cin. Unas protenas citoplasmticas denominadas factores de liberacin se unen directamente a cualquier codn de terminacin que llegue al lugar A del riboso ma. Esta unin modifica la actividad de la peptidil-transferasa, haciendo que ahora catalice la adicin, al peptidil-tRNA, de una molcula de agua en lugar de la de un grupo amino libre de un aminocido. Como consecuencia de esta reaccin el extremo carboxilo de la cadena polipeptdica en crecimiento queda libre de su unin a una molcula de tRNA. Como normalmente la cadena polipeptdica en crecimiento se hallaba unida al ribosoma exclusivamente a travs de esta unin, inmediatamente queda libre en el citoplasma. Entonces, el ribosoma libera el mRNA y se disocia en sus dos subunidades (Figura 6-23), las cuales podrn volver a ensamblarse sobre otra molcula de mRNA, iniciando as un nuevo proceso de sntesis mediante el proceso que describiremos a continuacin.

etapa 3

GCACUG

El proceso de iniciacin establece la pauta de lectura para la sntesis proteica 9

En principio, una secuencia de RNA puede ser decodificada mediante una de las tres pautas de lectura diferentes posibles, cada una de las cuales determinar una cadena polipeptdica completamente diferente (vase Figura 3-17). Lo que determina cul ser la pauta de lectura utilizada realmente es la unin del ribosoma a la molcula de mRNA. Durante la fase de iniciacin de la sntesis protei ca, las dos subunidades del ribosoma se unen entre s en el punto exacto del mRNA en el que ha de empezar la cadena polipeptdica. El proceso de iniciacin es complicado, y comprende varias etapas cataliza das por protenas denominadas factores de iniciacin (IF, de Initiation Factors), algunos de los cuales est compuesto, a su vez, por varias cadenas polipeptdicas. Debido a la complejidad del proceso, muchos de los detalles de

Sntesis de RNA y de protenas

249

Figura 6-23 Fase final de la sntesis proteica. La unin del factor de liberacin a un codn de terminacin finaliza la traduccin; el polipptido completo se libera } el ribosoma se disocia en sus dos subunidades independientes.

tRNA iniciador subunidad ribosm ica pequea con factores de iniciacin unidos > ACC AU G iAACU G G UAG C!

nmimmii
UNION DEL FACTOR DE LIBERACIN A UN CODN DE TERMINACIN

I
M et
k 'H

UNION DEL mRNA

mRNA AUG

3'

h 2n '

LA BUSQUEDA LE PERMITE RECONOCER ELCODN DE INICIACIN UNIENDO EL tRNA DE INICIACIN

LA SUBUNIDAD MAYOR DEL RIBOSOMA SE UNE

SE UNE UN AMINOACIL tRNA (etapa 1)

AUGAACUGGUAGCGAUCG
..........................- ...............

etc.

iniciacin todava no estn bien establecidos. Sin embargo, est claro que cada ribosoma se ensam bla sobre una molcula de mRNA, siguiendo dos etapas; nicam ente despus de que la subunidad pequea del ribosoma unida a los factores de iniciacin encuentre el codn de iniciacin (AUG, vase a continuacin) se podr unir la subunidad mayor del ribosoma. Antes de que el ribosoma pueda empezar una nueva cadena de protena, ha de unir una molcula de aminoacil-tRNA en su lugar P, donde normalmente nicam ente se hallan unidas molculas de peptidil-tRNA. (Como hemos expli cado previamente, durante la etapa 3 del proceso de elongacin el peptidil-tRNA se transloca al lugar P). Para este proceso se requiere la participacin de una molcula especial de tRNA. Este tRNA iniciador provee el aminocido que inicia

Figura 6-24 Fase de iniciacin de la sntesis proteica. Las etapas 1 y 2 se refieren a las de la reaccin de elongacin mostrada en la Figura 6-22.

250

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

la cadena proteica, y siempre transporta metionina (aminoformil metionina en bacterias). En eucariotas la molcula de tRNA iniciadora se ha de cargar en la subunidad pequea del ribosoma despus de que se haya unido a una molcula de mRNA. Un importante factor de iniciacin llamado factor de iniciacin 2 de euca riotas (eIF-2, de Eucaryotic Initiation Factor 2) es necesario para colocar el tRNA iniciador sobre la subunidad pequea. Una molcula de eIF-2 se une fuertemente a cada molcula de tRNA iniciadora en cuanto este tRNA adquiere la metionina, y en algunas clulas la velocidad de todo el proceso de sntesis de protenas est controlado por este factor de iniciacin (vase Figura 9-82). Como se describe con ms detalle en la prxima seccin, la subunidad pe quea del ribosoma ayuda a la molcula de tRNA iniciadora que lleva unida a encontrar un codn especial AUG (el codn de iniciacin ) en la molcula de mRNA. En cuanto esto ha ocurrido, los diferentes factores de iniciacin que pre viamente se haban asociado con la subunidad pequea del ribosoma se liberan, permitiendo que una subunidad grande de ribosoma se una con la pequea. De bido a que la molcula de tRNA iniciador est unida en el lugar P del ribosoma, la sntesis de la cadena proteica puede iniciarse directamente mediante la unin de una segunda molcula de aminoacil-tRNA al lugar A del ribosoma (Figura 6-24). De esta forma se ensambla un ribosoma completo y funcional con una ca dena de mRNA engarzada (Figura 6-25). A continuacin se desarrollan las etapas posteriores de la fase de elongacin de la sntesis de protenas, tal como hemos descrito anteriormente (vase Figura 6-22). Como todas las cadenas polipeptdicas has sido iniciadas por una molcula de tRNA iniciadora, todas las protenas recin sintetizadas tienen una metionina (el derivado aminoformil de la m etio nina en bacterias) como residuo extremo amino. A menudo, esta metionina es eliminada muy poco despus de que se haya incorporado, mediante la accin de una aminopeptidasa especfica; este proceso de reajuste es importante ya que el aminocido colocado a la izquierda del extremo amino puede determinar la vida media de la protena en la clula mediante su efecto sobre un sistema de degra dacin dependiente de ubiquitina (vase Figura 5-39). Evidentemente, el lugar correcto de iniciacin sobre la molcula de mRNA ha de ser seleccionado por la subunidad pequea en concierto con los factores de iniciacin pero en ausencia de la subunidad grande, por lo cual probable mente los ribosomas se forman a partir de dos subunidades independientes. A continuacin consideraremos cmo se produce este proceso de seleccin.

Figura 6-25 Modelo tridimensional de un ribosom a bacteriano que se halla actuando. La subunidad pequea (verde oscuro) y la subunidad grande [verde claro) forman un com plejo a travs del cual se va deslizando el mRNA. A pesar de que se desconocen las vas exactas por las que transcurren el mRNA y la protena naciente, se sabe que la adicin de un aminocido tiene lugar en la regin general mostrada, con los tRNA unidos al bolsillo formado entre las subunidades mayor y menor. (Modificado a partir de J.A. Lake, Annu. Rev. B ioch em . 54:507-530,1985. 1985 por Annual Reviews Inc.)

7-m etilguanosina
HO OH ' '

extrem o 5' del mRNA

Figura 6 -2 6 E structura de la capucha (cap) del extrem o 5 de las molculas de mRNA eucariotas. Ntese la poco habitual unin 5 -a-5 de la 7-metilguanosina, cargada positivamente, y de la metilacin del grupo 2 hidroxilo de la primera ribosa del RNA. (El segundo azcar no est nunca mediado.)

Sntesis de RNA y de protenas

251

mRNA procariota

AUG
proteina O t

AUG
1 1
proteina [3 ~ ||

AUG
proteina y

mRNA eucariota

g 5-< p X p X p ^ ^*CAUG
5' cap
una proteina

AAAAA

clave: lugares de unin al ribosom a i i secuencias codificantes secuencias no codificantes codones de term inacin

Figura 6 -27 Comparacin entre las estructuras de las molculas de RNA mensajero de procariotas y eucariotas. A pesar de que ambos tipos de mRNA se sintetizan con un grupo trifosfato en el extremo 5', la molcula de mRNA eucariota adquiere rpidamente una capucha en el extremo 5', que es una parte de la estructura que la subunidad pequea del ribosoma reconoce. Por lo tanto, la sntesis proteica empieza en un codn de iniciacin cercano al extremo 5 del mRNA. En los procariotas, por el contrario, el extremo 5' no tiene ningn significado especial. En el interior de una cadena de mRNA pueden existir muchos lugares de unin al ribosoma (denominadas secu en cias Shine-D algarno), cada uno de los cuales dar lugar a la sntesis de una protena diferente.

En clulas eucariotas, norm alm ente slo se sintetiza un tipo de cadena polipeptdica sobre cada molcula de mRNA10
Tpicamente, una molcula de RNA mensajero contiene varias secuencias AUG, cada una de las cuales puede codificar metionina. En eucariotas, sin embargo, normalmente tan slo una de estas secuencias ser reconocida por el tRNA ini ciador, actuando as como c o d n d e in ic ia c i n . Cmo puede el ribosoma dis tinguir este codn de iniciacin? Los RNA de eucariotas (a excepcin de los que se sintetizan en mitocondrias y cloroplastos) son profundamente modificados en el ncleo inmediatamente despus de su transcripcin (vase Captulo 8). Dos de estas modificaciones ms generales son la adicin de una estructura de "capucha" ("cap), compuesta de un residuo de 7-metilguanosina unido al trifosfato del extremo 5 (Figura 6-26), y la adicin de una cadena de unos 200 residuos adenlicos (poli A) al extremo 3'. Todava no est bien establecido el papel que juega el poli A en el proceso de traduccin (vase Figura 9-87). Sin embargo, se sabe que la estructura en "ca pucha del extremo 5 es esencial para la sntesis de protenas. Experimentos lle vados a cabo con extractos de clulas eucariotas han demostrado que la subunidad pequea del ribosoma se une primero al extremo 5 de una cadena de mRNA ayudada por el reconocim iento de la capucha 5' (Figura 6-24). Entonces, esta subunidad se desplaza a lo largo de la cadena de mRNA transportando su molcula de tRNA iniciador en busca de un codn AUG de iniciacin. Aparente mente, los requerimientos de un codn de iniciacin no son muy exigentes, ya que habitualm ente la subunidad pequea selecciona el primer AUG que en cuentra; sin embargo, parece que en este proceso de seleccin son importantes algunos nucletidos cercanos al AUG. En la mayora de los RNA de eucariotas en cuanto se ha seleccionado un codn de iniciacin cercano al extremo 5 ya no se utilizar como codn de iniciacin ninguno de los otros muchos codones AUG ms alejados de la cadena. Como resultado de todo esto, normalmente sobre cada molcula de mRNA tan slo se sintetiza un tipo de cadena polipeptdica (para excepciones, vase pg. 498). En las bacterias el mecanismo de seleccin de codones de iniciacin es dife rente. Los mRNA de bacteria no tienen estructura en capucha en 5. En lugar de ello, presentan una secuencia de iniciacin especfica de ms de 6 nucletidos de longitud, que puede presentarse en mltiples lugares de la misma molcula de mRNA. Estas secuencias estn situadas entre cuatro y siete nucletidos en di reccin 5' a partir del AUG, y generan pares de bases con una regin especfica

2 52

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

Figura 6 -2 8 Un polirribosoma.

Dibujo esquemtico de un polirribosoma mostrando de qu forma una serie de ribosomas pueden traducir simultneamente la misma molcula de mRNA.

del rRNA en el ribosoma, sealando el inicio del proceso de sntesis de protenas en este codn de iniciacin cercano. Los ribosomas bacterianos, a diferencia de los ribosomas de eucariotas, se unen directamente a una zona interna de una molcula de mRNA, reconociendo un codn de iniciacin e iniciando una cade na polipeptdica. Como resultado de ello, normalmente los RNA m ensajeros de bacteria son policistrnicos -lo cual significa que codifican mltiples protenas traducidas por separado a partir de la misma molcula de mRNA. Por el contra rio, los mRNA de eucariotas son tpicamente monocistrnicos, es decir, sobre cada molcula de mensajero nicamente se traduce una nica especie de cade na polipeptdica (vase Figura 6-27).

La unin de varios ribosomas a una mism a molcula de mRNA genera polirribosom as 11

La sntesis completa de una protena dura entre 20 y 60 segundos de promedio. In cluso durante este breve intervalo de tiempo, normalmente tienen lugar mltiples iniciaciones sobre cada molcula de mRNA que est siendo traducida. En cuanto un ribosoma ha traducido una secuencia de aminocidos suficientemente larga como para dejar libre el camino, un nuevo ribosoma salta sobre el extremo 5 de la molcula de mRNA. Las molculas de mRNA como sta, denominadas polirribosomas o polisomas, estn formadas por varios ribosomas colocados sobre el mis mo mRNA y espaciados nicamente unos 80 nucletidos (Figuras 6-28 y 6-29). Los

Figura 6-29 Electronm icrografas de un polirribosoma tpico de una clula eucariota. (A) Sublimacin profunda; (B) seccin ultrafina. Generalmente

el citoplasma celular est lleno de polirribosomas como ste, algunos de los cuales se deben hallar libres en el citosol y otros adheridos a membrana. (A, cortesa de John Heuser; B, cortesa de George Palade.)

< 1 0 0 nm

Sntesis de RNA y de protenas

253

polirribosomas son caractersticos de las clulas. Pueden ser aislados y separados de los ribosomas sencillos del citosol mediante lisis celular y ultracentrifugacin (Figura 6-30). El mRNA purificado a partir de estos polirribosomas puede utilizarse para determinar si la protena codificada por una secuencia determinada de DNA est siendo sintetizada activamente en estas clulas utilizadas para preparar los polirribosomas. Estas molculas de mRNA tambin pueden utilizarse como mate rial de partida para la preparacin de libreras especializadas de cDNA (como se discute en el Captulo 7). En los eucariotas la envoltura nuclear mantiene separados los procesos de transcripcin y de sntesis de protenas. Sin embargo en los procariotas el RNA es accesible a los ribosomas en cuanto se sintetiza. As, los ribosomas empiezan a sintetizar una cadena polipeptdica por el extremo 5' de la molcula de mRNA naciente y van siguiendo detrs de la RNA polimerasa a medida que sta com pleta la cadena de mRNA.

................

------- direccin de ia sedim entacin

..... ..............

ribosom as polirribosom as sencillos 80S

I -------------1 I ------ 1

En los eucariotas, la velocidad general de sntesis de protenas est controlada por factores de iniciacin 12
Como discutiremos en el Captulo 17, las clulas de un organismo pluricelular slo se multiplican cuando se encuentran en un medio en el que son estimula das por factores especficos de crecimiento. A pesar de que los mecanismos a travs de los que actan los factores de crecim iento todava no estn com pleta mente establecidos, uno de sus mayores efectos ha de ser el incrementar la velo cidad de todo el proceso de sntesis proteica, ya que las clulas duplican su con tenido de protena antes de dividirse. Qu es lo que determina la velocidad de sntesis de protenas? Cuando se depriva a clulas eucariotas en cultivo de nu trientes, se produce una marcada reduccin de la velocidad de la iniciacin de la cadena polipeptdica. Esta reduccin es el resultado de la inactivacin del factor de iniciacin de la sntesis eIF-2 (vase Figura 9-82). Los factores de iniciacin necesarios para la sntesis de protenas son mucho ms numerosos y complejos en eucariotas que en procariotas, a pesar de que al parecer realizan la misma funcin bsica en ambos casos. Muchos de los componentes adicionales pue den se protenas reguladoras que responden a diferentes factores de crecim ien to, colaborando en la coordinacin del crecim iento y de la proliferacin en los organismos pluricelulares. En las bacterias son necesarios controles menos com plejos ya que generalmente crecen todo lo rpidamente que les permite la asequibilidad de nutrientes del medio.

Figura 6 -30 Aislamiento de polirribosomas. Los polirribosomas se pueden separar de los ribosomas sencillos (y de sus subunidades) por sedimentacin de una ultracentrifugacin. Este mtodo se basa en el hecho de que en un fuerte campo gravitacional los grandes agregados moleculares se mueven ms rpidamente que los pequeos. Generalmente la sedimentacin se realiza a travs de un gradiente de sacarosa para evitar mezclas por conveccin. Ntese que la mayora de las cadenas polipeptdicas en crecim iento (lnea roja) estn asociadas al polirribosoma.

La fidelidad de la sntesis de protenas est incrementada gracias a dos procesos independientes de correccin de galeradas 13
El porcentaje de errores en la sntesis de protenas puede estimarse siguiendo la frecuencia de incorporacin de un aminocido en una protena que normal mente carece de dicho aminocido. Se pueden observar as porcentajes de error de alrededor de un aminocido incorporado errneamente por cada 104 amino cidos incorporados, lo cual significa que nicamente una de cada 25 molculas de protena de tamao medio (de unos 400 aminocidos) debera contener un error. La fidelidad del proceso decodificador depende de la precisin de los dos principales mecanism os de adaptacin discutidos anteriormente: la unin de cada aminocido a su molcula correspondiente de tRNA y el apareamiento de bases de los codones del mRNA con los anticodones del tRNA (vase Figura 614). No es sorprendente que las clulas hayan desarrollado mecanismos de co rreccin de galeradas o verificacin de lectura (proofreading) que les permi tan reducir el nmero de errores en estos dos procesos cruciales de la sntesis de protenas. Para disminuir el nmero de errores en estos dos procesos, se utilizan dos mecanismos fundamentalmente diferentes, cada uno de los cuales es represen tativo de dos estrategias utilizadas en otros procesos celulares. Ambos suponen

254

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

am inoacil tRNA unido al factor de elongacin cadena polipeptdica en crecim iento unin reversible

factor de elongacin
( J gppI

Figura 6-31 La correccin cintica de pruebas selecciona la molcula correcta de tRNA sobre el ribosoma.
En esta visin ms detallada de la etapa 1 de la fase de elongacin de la sntesis de protenas, se ilustra cmo, en el acontecim iento inicial de unin, una molcula de aminoacil-tRNA unido al factor de elongacin se aparea transitoriamente con el codn del lugar A. Este apareamiento dispara la hidrlisis de GTP por el factor de elongacin, lo cual permite que el factor se disocie de la molcula de aminoacil-tRNA, la cual ahora puede colocarse correctam ente en el lugar A y participar en la elongacin de la cadena (vase Figura 6-22). As en el m ecanism o de sntesis de protenas existe un tiempo de espera entre la unin de la molcula de aminoaciltRNA y su asequibilidad para la sntesis de protena. Como resultado de ello, nicam ente los tRNA que tienen el anticodn correcto pueden perm anecer apareados al mRNA durante un tiempo suficientem ente largo com o para ser aadidos a la cadena polipeptdica en crecim iento. El factor de elongacin, que es una protena abundante, se designa com o EF-Tu en los procariotas y como EF-1 en eucariotas. En la Figura 5-20 se ilustra el extraordinario cam bio de la estructura tridimensional de EF-Tu generado por la hidrlisis de GTP.

elongacin de la cadena (etapas 2 y 3)

RNA m ensajero lugar P lugar A

cam ino de salida de las m olculas de tRNA incorrectas

el consumo de energa libre ya que, como se ha discutido en el Captulo 2, el in cremento del orden en la clula tiene un precio. Para mejorar la exactitud de la unin del aminocido al tRNA se utiliza un mecanismo relativamente sencillo. Muchas aminoacil-tRNA sintetasas tienen dos lugares activos diferentes, uno que lleva a cabo la reaccin de carga mostrada anteriormente (Figura 6-11) y el otro que reconoce un aminocido incorrecto que se halle colocado en una m ol cula de tRNA, y lo libera por hidrlisis. El proceso de correccin es costoso ya que, para ser efectivo, tam bin ha de liberar una fraccin apreciable de am ino cidos colocados correctam ente. En la replicacin del DNA acta un proceso de correccin de galeradas en dos etapas como ste (vase Figura 6-42). Otro proceso ms sutil de correccin cintica de pruebas se utiliza para m e jorar la fidelidad del apareamiento codn-anticodn. De hecho, antes hemos ofre cido una visin simplificada de este acoplamiento. Cuando las molculas de tRNA se han unido a su aminocido, forman un complejo con una protena abundante denominada factor de elongacin (EF, de Elongation Factor), que se une fuerte mente al extremo aminoacdico del tRNA y a una molcula de GTP. Este complejo, y no el tRNA libre, es el que se acopla con el codn apropiado en una molcula de mRNA. El factor de elongacin que se ha unido permite que se produzca un aparea miento correcto codn-anticodn pero impide que el aminocido se incorpore a la cadena polipeptdica en crecimiento. Sin embargo, el reconocimiento inicial del codn activa al factor de elongacin para que hidrolice el GTP que lleva unido (a GDP y fosfato inorgnico), de forma que ahora el factor puede disociarse del ribosoma sin llevarse el tRNA al que estaba unido, y de esta forma permite que se pro duzca la sntesis de la protena. La participacin del factor de elongacin supone un ligero retraso entre el apareamiento de bases codn-anticodn y la elongacin de la cadena polipeptdica, que le proporciona a la molcula de tRNA unida la oportunidad de salir del ribosoma. Una molcula de tRNA colocada incorrecta mente genera un nmero de enlaces de hidrgeno en el apareamiento de bases codn-anticodn mucho menor que un tRNA colocado correctamente; por ello, un tRNA incorrecto se une ms dbilmente al ribosoma y por tanto se disocia con mayor facilidad durante este perodo. Debido a que el retraso introducido por el factor de elongacin hace que la mayora de las molculas de tRNA colocadas incorrectamente abandonen el ribosoma sin ser utilizadas para la sntesis de pro tenas, este factor increm enta la relacin entre los aminocidos incorporados correctamente y los incorporados incorrectamente en la protena (Figura 6-31).

Muchos inhibidores de la sntesis de protenas en procariotas resultan tiles como antibiticos 14

Muchos de los antibiticos ms eficaces utilizados en la m edicina moderna actan inhibiendo la sntesis proteica bacteriana. Algunos de estos frmacos aprovechan las diferencias estructurales y funcionales que existen entre los ribosomas de procariotas y de eucariotas, a fin de afectar preferentemente a los ribosom as de procariotas. Esta selectividad permite utilizar algunos de estos com-

Sntesis de RNA y de protenas

255

Tabla 6-1 Inhibidores de la sntesis de RNA o de la de protenas Inhibidor Tetraciclina Estreptomicina Efectos especficos bloquea la unin de los aminoacil-tRNA al lugar A del ribosoma impide la transicin desde el complejo de iniciacin a la elongacin de la cadena por el ribosoma, y provoca errores de decodificacin bloquea la reaccin de la peptidil transferasa en los ribosomas (etapa 2 de la Figura 6-22) bloquea la reaccin de translocacin en los ribosomas (etapa 3 de la Figura 6-22) bloquea la iniciacin de las cadenas de RNA unindose a la RNA polimerasa (impide la sntesis de RNA) se une al extremo de la cadena en crecimiento provocando la liberacin prematura de las cadenas polipeptdicas en formacin se une al DNA bloqueando el movimiento de la RNA polimerasa (impide la sntesis de RNA) bloquea la reaccin de translocacin en los ribosomas (etapa 3 de la Figura 6-22) bloquea la reaccin de la peptidil transferasa en los ribosomas (etapa 2 de la Figura 6-22) bloquea la sntesis de mRNA preferentemente por medio de la unin a la RNA polimerasa II

Actuando nicamente sobre procariotas*

Cloranfenicol Eritromicina Rifamicina

Actuando sobre procariotas y sobre eucariotas

Puromicina

Actinomicina D

Actuando nicamente sobre eucariotas

Cicloheximida Anisomicina a-Amanitina

*A menudo, los ribosomas de las mitocondrias (y de los cloroplastos) de eucariotas se parecen a los de los procariotas en su sensibilidad frente a los inhibidores. Por ello, algunos de estos an tibiticos pueden tener efectos perjudiciales sobre las mitocondrias de humanos.

puestos en el cuerpo humano a concentraciones relativamente elevadas sin que resulten demasiado txicos. Debido a que los diferentes antibiticos se unen a regiones diferentes de los ribosomas bacterianos, a menudo inhiben pasos dife rentes del proceso de sntesis. En la Tabla 6-1 se muestran algunos de los anti biticos ms habituales de este grupo, indicndose sus efectos especficos. La ta bla tambin presenta otros inhibidores de la sntesis de protenas utilizados habitualmente, algunos de los cuales actan sobre las clulas eucariotas; eviden tem ente estos ltimos no pueden utilizarse como antibiticos. Muchos de los compuestos enumerados en la Tabla 6-1 bloquean especfica mente diferentes pasos del proceso que ocurre desde el DNA hasta la protena, por lo que son tiles en estudios biolgicos. Entre los frmacos utilizados ms ha bitualmente en experimentos de este tipo, estn el cloranfenicol, la cicloheximida y la puromicina, todos los cuales inhiben especficamente la sntesis de protenas. En una clula eucariota, por ejemplo, el cloranfenicol nicamente inhibe la snte sis proteica de los ribosomas de las mitocondrias (y de los cloroplastos en las plantas), lo cual refleja probablemente el origen procariota de estos orgnulos (vase Captulo 14). Por otra parte, la cicloheximida nicamente afecta a los ribosomas del citosol. La diferente sensibilidad a estos frmacos del proceso de snte sis de protena proporciona un poderoso sistema para determinar en qu com partimiento celular se produce la traduccin de una protena determinada. La puromicina es especialmente interesante ya que es un anlogo estructural de una molcula de tRNA unida a un aminocido; el ribosoma la confunde con un ami nocido autntico y la incorpora covalentemente al extremo carboxilo terminal de la cadena polipeptdica en crecimiento, causando as la terminacin prematura y la liberacin de este polipptido (vase Figura 3-23). Como podra esperarse, la puromicina inhibe todos los tipos de sntesis de protenas.

256

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

Cmo evolucion el proceso de la sntesis de protenas ? 15

Los procesos moleculares relacionados con la sntesis de protenas parecen inexplicablemente complejos. A pesar de que podemos describir muchos de ellos, no tienen ningn sentido conceptual respecto a cmo se producen la transcripcin del DNA, la reparacin de DNA y la replicacin del DNA. Tal como hemos visto, en los organismos actuales la sntesis de protenas se centra en una mquina ribonucleoproteica muy grande, el ribosoma, que consiste en una serie de protenas dispuestas alrededor de un ncleo de molculas de rRNA. Por qu existen toda esta serie de molculas de rRNA y cmo llegaron a desempear un papel tan dominante en la estructura y en la funcin del ribosoma? Antes de que se descubriera el mRNA, a principios de los aos 1960, se sos pechaba que la gran cantidad de RNA que existe en los ribosomas actuaba como m ensajero, transportando informacin gentica del DNA a las protenas. Aho ra sabemos, sin embargo, que todos los ribosomas de una clula presentan un juego idntico de molculas de rRNA, las cuales no desempean ninguna fun cin de informacin de este tipo. En los ribosomas bacterianos se ha demostra do que pequeas regiones de algunos rRNA tienen funciones catalticas en el proceso de sntesis de protenas. Como hemos mencionado el rRNA mayor de la subunidad mayor del ribosoma tiene actividad peptidil transferasa; adems, el rRNA de la subunidad pequea del ribosoma forma una pequea hlice por apa reamiento de bases, con la secuencia de iniciacin de las molculas bacterianas de mRNA, la cual permite colocar el codn de iniciacin AUG vecino sobre el lu gar P. Se forman una gran variedad de interacciones de este tipo entre las m ol culas de tRNA y los rRNA de bacterias, a pesar de que en estas interacciones par ticipan bases del rRNA alejadas en la secuencia de nucletidos, lo cual sugiere com plejos conjuntos de interacciones que dependen de la estructura terciaria de los rRNA. La sntesis de protenas tam bin depende, de una forma fundamental, de una gran cantidad de protenas diferentes que se hallan unidas a los rRNA en los ribosomas (vase Figura 6-20). La complejidad de un proceso que depende de un nmero tan elevado de com ponentes diferentes que interactan entre s ha hecho que muchos bilogos hayan perdido la esperanza de poder llegar a cono cer cmo se produjo la evolucin del proceso de sntesis de protenas. Sin em bargo, los descubrimientos recientes acerca de las molculas de RNA con activi dad enzimtica han aportado un nuevo punto de vista sobre el proceso. Como se discute en el Captulo 1, probablemente las primeras reacciones biolgicas utilizaron molculas de RNA, y no de protena, como catalizadores. En las clu las primitivas, las molculas de tRNA debieron de generar superficies catalticas sobre s mismas, que les permitieron unirse especficamente a aminocidos sin necesitar la participacin de las enzimas aminoacil-tRNA sintetasas. De forma parecida, las molculas de rRNA debieron de ser suficientes por s solas para constituirse como un ribosom a completo, plegndose de formas complicadas y generando un intrincado conjunto de superficies que guiaron el apareamiento de los tRNA con los codones del mRNA y catalizaron la polimerizacin de los aminocidos unidos a los tRNA (vase Figura 1-7). A lo largo del curso de la evolucin, se han agregado protenas individuales a esta maquinaria, cada una de ellas haciendo el proceso un poco ms exacto y eficiente, o aadiendo con troles de regulacin. Desde este punto de vista la gran cantidad de RNA de los ribosom as actuales puede ser un rem anente de una etapa muy temprana de la evolucin, antes de que las protenas hubieran llegado a dominar la catlisis biolgica.

Resumen
Antes de que pueda iniciarse la sntesis de una determ inada protena, ha de sinteti zarse el mRNA correspondiente m ediante el proceso de transcripcin del DNA. En tonces, una subunidad pequea del ribosoma se une a la molcula de mRNA en un

Sntesis de RNA y de protenas

257

codn d e iniciacin (AUG) q u e es reconocido p o r u na m olcula determ inada de tRNA. A continuacin u na subunidad m ayor d e ribosom a se u n e com pletando el ri bosom a e inician do la fa se d e elongacin d e la sntesis d e protenas. D urante esta fa se, los am inoacil-tRNA, cada uno d e los cuales transporta un am inocido deter m inado, se u n en secuencialm ente al codn apropiado d el mRNA a travs d e la fo r m acin d e p ares d e bases com plem entarias con el anticodn d el tRNA. Cada uno de los am inocidos es aadido a l extrem o carboxilo term inal d e la cadena polipept d ica en crecim iento, m ediante u n ciclo d e tres etapas secuenciales: unin d el a m i noacil-tRNA, form acin d e un enlace peptdico, y translocacin d el ribosom a. El ri bosom a progresa codn a codn en direccin 5 -a-3 a lo largo d e la m olcula d e mRNA, hasta q u e alcanza uno d e los tres tipos d e codones d e term inacin q u e exis ten. Entonces, u n fa cto r d e liberacin se u n e al codn d e term inacin, con lo q u e se finaliza la traduccin y el polipptido acabado se libera d el ribosom a. Los ribosom as d e las clulas procariotas son m uy hom logos a los d e las clu las eucariotas, a p esa r d e q u e se presentan d iferencias substanciales en tre ellos en cuanto al nm ero y al tam ao d e sus com ponentes d e rRNA y d e protena. E l papel predom inante d e los rRNA en la estructura y Ju n ci n d e los ribosom as p u ed e refle ja r el origen ancestral d el proceso d e sntesis d e protenas, el cu a l p arece q u e evolu cion en un am biente dom inado p o r la catlisis m ediada p o r los RNA.

Mecanismos de reparacin del DNA1 6

La supervivencia a largo plazo de una especie puede aumentar gracias a cambios genticos pero la supervivencia de los individuos requiere estabilidad gentica. El mantenimiento de esta estabilidad gentica no slo requiere que exista un m eca nismo extremadamente exacto de copia de las secuencias de DNA antes de cada divisin celular, sino que tambin requiere que exista un mecanismo que permita reparar las numerosas lesiones accidentales del DNA que ocurren continuamen te. La mayora de los cambios espontneos de este tipo que tienen lugar en el DNA son transitorios ya que inmediatamente son eliminados mediante un proce so de correccin denominado reparacin del DNA. Tan slo muy de vez en cuan do uno de estos procesos de mantenimiento del DNA no se produce o fracasa, lo cual supone la produccin de un cambio permanente en el DNA. Un cambio de este tipo se denomina mutacin. Si una mutacin se produce en una posicin vi tal de la secuencia del DNA puede provocar la muerte del organismo. Antes de pasar a estudiar estos m ecanismos de replicacin y de reparacin del DNA, examinaremos brevemente cmo se van manteniendo las secuencias de DNA de una generacin a la siguiente.

Las secuencias de DNA se m antienen con un elevado grado de fidelidad 17

La velocidad en que se producen cambios estables en las secuencias de DNA (la

frecuencia de mutacin ) slo puede estimarse de forma indirecta. Uno de los sis
temas consiste en comparar la secuencia de aminocidos de una protena deter minada pero procedente de varias especies distintas. El porcentaje de aminoci dos diferentes se puede comparar con el nmero estimado de aos transcurridos desde que las dos especies se separaron de su antepasado comn, tal como se determina a partir de registros fsiles. De esta manera se puede calcular el pro medio de aos que se necesitan para que un cam bio gentico se fije como una alteracin en un aminocido de una protena. Debido a que cada uno de los cambio de este tipo reflejar probablemente la alteracin de un solo nucletido en la secuencia del DNA del gen que codifica esta protena, este valor puede ser utilizado para estimar la media del nmero de aos que han de transcurrir para que se produzca una m utacin estable en el gen. Clculos com o stos siempre subestiman la frecuencia real de mutacin, ya que la mayora de las mutaciones deben afectar a la funcin de la protena, y de-

258

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

ben desaparecer de la poblacin por seleccin natural. Sin embargo, existe una familia de protenas cuya secuencia parece no ser importante, por lo que los ge nes que las codifican pueden acumular mutaciones sin sufrir ningn tipo de se leccin en contra. Estas protenas son los fibrinopptidos -fragm entos de 20 re siduos de aminocidos que son eliminados de la protena fibringeno cuando sta se activa dando lugar a la fibrina, durante el proceso de la coagulacin de la sangre. Dado que la funcin de los fibrinopptidos aparentemente no depende de su secuencia de aminocidos, pueden tolerar cualquier cambio que se pro duzca en su secuencia. El anlisis de la secuencia de los fibrinopptidos indica que una protena de tamao medio de 400 aminocidos puede verse alterada aleatoriamente por una variacin en un aminocido cada 200 000 aos. Ms re cientem ente, la tecnologa de secuenciacin del DNA ha hecho posible com pa rar las secuencias de nucletidos del genoma que no codifican para protena. La comparacin de secuencias de este tipo en varias especies de mamferos ha per mitido obtener clculos de la frecuencia de mutacin durante la evolucin, que estn en estrecho acuerdo con las obtenidas a partir de los estudios de los fibri nopptidos.

Las frecuencias de m utacin observadas en clulas proliferativas son consistentes con los valores evolutivos estim ados 18
La frecuencia de mutacin puede ser estimada de manera ms directa, obser vando la velocidad a la que aparecen cambios genticos espontneos en una gran poblacin de clulas observadas durante un perodo de tiempo relativa mente corto. Ello puede llevarse a cabo estimando la frecuencia con la que apa recen nuevos mutantes en poblaciones muy grandes de animales (por ejemplo, colonias de la m osca del vinagre o colonias de ratones), o estudiando alteracio nes en protenas especficas de clulas que crecen en cultivo. Los valores obteni dos siguiendo ambos tipos de estrategia nicamente son aproximados pero concuerdan con una frecuencia de un cambio en un par de bases por cada 109 pares de bases, en cada generacin celular. Por consiguiente, un gen que codifique una protena de tamao medio (que contenga unos 103 pares de bases codifi cantes) sufrir una mutacin cada 106 generaciones celulares. Este nmero es, al menos aproximadamente, consistente con la frecuencia de mutacin estimada descrita antes, segn la cual se produce una mutacin en un gen de tamao m e dio cada 200 000 aos.

La mayora de mutaciones de las protenas resultan perjudiciales y son elim inadas por seleccin natural 19
Cuando se representa el nmero de aminocidos diferentes de una determinada protena en dos organismos que difieren respecto al tiempo transcurrido desde que estos organismos divergieron durante la evolucin, se obtiene una lnea ra zonablemente recta. Es decir, cuanto ms tiempo haga que los organismos di vergieron, mayor es el nmero de diferencias que existen entre sus protenas. Por conveniencia, la pendiente de esta recta se puede expresar en trminos de unidad de perodo evolutivo para esta protena, es decir, el promedio de tiem po necesario para que en una secuencia de 100 residuos de aminocidos aparez ca un cambio de un aminocido. Cuando se comparan varias protenas, se ob serva que cada una de ellas presenta una velocidad de evolucin diferente pero caracterstica (Figura 6-32). Puesto que se supone que todos los pares de bases del DNA deben estar sujetos a la misma frecuencia aproximada de mutacin al azar, estas diferencias en las frecuencias deben reflejar diferencias en la proba bilidad de que un organismo con una mutacin al azar en la protena de que se trata pueda sobrevivir y propagarse. Evidentemente cambios en la secuencia de aminocidos son mucho ms nocivos para algunas protenas que para otras. A partir de la Tabla 6-2 podemos estimar que aproximadamente 6 de cada 7 cam bios al azar de aminocidos son perjudiciales para la hemoglobina, 29 de cada

200

400

600

800

1000

m illones de aos desde la divergencia de las especies

Figura 6 -3 2 Diferentes protenas evolucionan a velocidades muy diferentes. Comparacin entre las frecuencias de cam bio de aminocidos encontradas en la hemoglobina, en el citocrom o c y en los fibrinopptidos. La hemoglobina y el citocrom o c han variado mucho ms lentam ente durante la evolucin que los fibrinopptidos. Para determinar los ndices de nmero de cambios por ao (como se expresa en la Tabla 6-2), es importante destacar que dos organismos que divergieron de un antepasado com n hace 100 millones de aos se hallan separados entre s por 200 millones de aos de tiempo evolutivo.

Mecanismos de reparacin del DNA

259

Tabla 6-2 Frecuencias observadas de cambio de las secuencias de aminocidos de varias protenas a lo largo del tiempo evolutivo Protena Fibrinopptido Hemoglobina Citocromo c Histona H4 Unidad de tiempo evolutivo* (en millones de aos) 0,7 5 21 500

*La unidad de tiempo evolutivo" se define como el tiempo promedio necesario para que apa rezca el cambio de un aminocido aceptable en la protena indicada, por cada 100 aminocidos de la protena.

30 lo son para el citocromo c, y prcticamente todos son contraproducentes para la histona H4. Puede asumirse que los individuos que fueron portadores de mutaciones perjudiciales de este tipo fueron eliminados de la poblacin por se leccin natural.

Para que exista la vida tal como la conocemos, es necesario que se den bajas frecuencias de m utacin 19
Debido a que la mayora de las mutaciones son perjudiciales, ninguna especie puede permitir que se acumulen en grandes cantidades en sus clulas germina les. Ms adelante discutiremos por qu la frecuencia de mutacin observada, a pesar de ser tan baja, al parecer limita a unas 60 000 el nmero de protenas esenciales que cualquier organismo puede codificar en su lnea germinal. Como extensin de este mismo argumento, una frecuencia de mutacin diez veces su perior limitara a un organismo a unas 6000 protenas esenciales. En este caso, la evolucin probablem ente se habra detenido en un organismo no ms complejo que la m osca del vinagre. Mientras que las clulas germinales han de estar protegidas contra elevadas frecuencias de mutacin para mantener la especie, las otras clulas de un orga nismo pluricelular (sus clulas somticas) han de estar protegidas de cambios genticos para poder salvaguardar el individuo. Los cambios de nucletidos en la clulas somticas pueden facilitar el proceso de seleccin natural que permita la supervivencia de la clula ms adaptada a expensas del resto del organismo. En el caso extremo, la proliferacin celular descontrolada conocida como cncer es la causa de aproximadamente el 30% de las muertes que ocurren en Europa y Amrica. Existen evidencias de que estas muertes son debidas mayoritariamente a la acumulacin de cambios en la secuencia del DNA de las clulas somticas (vase Captulo 24). Probablemente, un incremento del orden de diez veces de la frecuencia de mutacin causara un incremento desastroso de la incidencia de cncer al acelerar la velocidad a la que apareceran variantes de las clulas somticas. As pues los eucariotas dependen de la extraordinaria fidelidad con la que se perpetan las secuencias de DNA, tanto para la perpetuacin de especies con 60 000 protenas (estabilidad de las clulas germinales) como para la pre vencin del proceso canceroso resultante de las mutaciones de las clulas som ticas (estabilidad de las clulas somticas).

El hecho de que las frecuencias de mutacin sean bajas significa que los organismos relacionados han de estar formados esencialm ente por las mism as protenas 20
Los humanos, com o gnero diferenciado de los grandes simios, existen desde hace tan slo unos cuantos millones de aos. Por consiguiente cada gen ha teni-

260

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

Cl T O S I N A

URACILO

por hidrlisis espontnea (p. ej., citosina a uracilo)

DESAMINACION

0 = p

0 1

o CH,:

o-

GUANINA

por hidrlisis espontnea (p. ej., elim inacin de guanina)

DESPURI NACION

0 1 ()= PO----OI j (r

iicar pu rinado

O
cadena de
DNA

o OH

cadena de
DNA

GUANINA

do la posibilidad de acumular un nmero relativamente reducido de cam bios de nucletidos, y la mayora de estos cambios habrn sido eliminados por seleccin natural. Al comparar, por ejemplo, un humano con un mono se observa que las molculas de citocromo c difieren nicamente en un 1% de sus residuos de ami nocidos y las de hemoglobina en un 4%. Una gran parte de nuestra herencia gentica debi de configurarse antes de que apareciera Homo sapiens, durante la evolucin de los mamferos (que se inici hace unos 300 millones de aos), o incluso antes. Debido a que las protenas de mamferos tan diferentes como las ballenas y los hombres son muy similares entre s, los cambios evolutivos que han dado lugar a estas espectaculares diferencias morfolgicas entre los diferentes mamferos han tenido que producirse con un nmero sorprendente mente bajo de cambios en los materiales de que estamos formados. Por el con trario, se cree que los principales responsables de estas diferencias morfolgicas son diferencias en el patrn temporal y espacial de la expresin gnica durante el desarrollo embrionario, que determina el tamao, la forma y otras caracters ticas del adulto. En el Captulo 8 discutiremos los mecanismos que probable mente constituyen la base de estos cambios en la expresin gnica durante la evolucin.

Figura 6 -3 3 D esam inacin y despurinacin. Estas reacciones hidrolticas son dos reacciones qumicas espontneas frecuentes, que originan graves lesiones del DNA de las clulas. La figura slo muestra un ejemplo especfico de cada tipo de reaccin.

Si no fueran corregidas, las alteraciones espontneas del DNA podran cam biar rpidamente las secuencias del DNA21
El fsico Erwin Schroedinger seal en 1945 que, fuese cual fuese la naturaleza qumica del material hereditario (desconocida en aquel momento), un gen tena que ser extremadamente pequeo y estar formado de pocos tomos. En caso contrario, el elevado nmero de genes necesarios para generar un organismo no cabra en el ncleo celular. Por otro lado, y debido a su reducido tamao, caba esperar que un gen sufriera importantes cambios como consecuencia de reac ciones espontneas inducidas por colisiones trmicas aleatorias con molculas del disolvente. Esto planteaba un grave problema, ya que los datos genticos im plican que los genes estn compuestos de una substancia extraordinariamente estable, en la cual los cambios espontneos (mutaciones) se producen con una frecuencia muy baja. Este dilema es real. El DNA sufre cambios importantes debido a fluctuacio nes trmicas. Actualmente sabemos, por ejemplo, que cada da se pierden unas

Mecanismos de reparacin del DNA

261

Figura 6 -34 Resumen de las alteraciones espontneas que requieren reparacin del DNA. (A) Se ind ican los lugares de cada nu cletid o que se
sabe que se m odifican por oxid acin esp on tn ea {flechas rojas), ataque hidroltico {flechas azules) o m etilaci n d escontrolada por el dador de grupos m etilo S-ad enosil m etio n in a {flechas verdes); la frecu en cia de cada p roceso se indica por el grosor de cada flecha. En la Figura 6-33 se ilustran co n m s detalle los dos tipos de p rocesos hidrolticos m s frecu entes. (B) Estructura de un dm ero de tim ina, un tipo de alteracin introd ucid a en el DNA de clulas expuestas a rad iacin ultravioleta (com o la luz solar). Se puede form ar un dm ero sim ilar entre dos b ases de pirim idina vecinas cu alesqu iera (residuos C o T) del DNA. (A, a partir de T. Lindahl, Nature 362: 7 0 9 -7 1 5 ,1 9 9 3 . 1993 M acm illan M agazines Ltd.)

(B)

5000 bases pricas (adenina y guanina) del DNA de cada clula humana debido a la destruccin trm ica de enlaces AT-glucosdicos entre estas bases y la desoxirribosa {despurinacin). Anlogamente, se estima que la desaminacin de citosina a uracilo en el DNA se produce a una velocidad de 100 cambios por genoma y da (Figura 6-33). Las bases del DNA tam bin estn sujetas a cambios debido, por un lado, a la accin de m etabolitos reactivos (como las formas reactivas del oxgeno) que pueden alterar la capacidad de apareamiento de las bases, y por otro, a la accin de la luz ultravioleta del sol, que puede favorecer la formacin de un enlace covalente entre dos bases de pirimidina en el DNA (formndose, por ejemplo, un dmero de timina, com o el que se muestra en la Figura 6-34B). stos son slo algunos de los muchos cam bios que pueden ocurrir en nuestro DNA (Figura 6-34A). Cabra esperar que la mayora de estos cambios condujesen a la eliminacin de uno o ms pares de bases de la cadena hija de DNA despus de la replicacin del DNA, o a la substitucin de un par de bases (por ejemplo, cada desaminacin C U transformara un par de bases C-G en un par de bases T-A, puesto que el U es muy parecido a la T, y forma un par de bases com ple mentarias con A). Como hemos visto, una elevada frecuencia de cambios de este tipo tendra consecuencias desastrosas para los organismos.

262

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

Figura 6-35 Reparacin del DNA. Las tres etapas com u n es de la m ayora de tipos de p rocesos de reparacin del DNA son la escisi n (etapa 1), resntesis (etapa 2) y nueva unin (etapa 3). En la etapa 1 se elim ina la zona alterada; en las etapas 2 y 3 se repone la secu en cia de DNA original. La DNA polimerasa llena el h u eco generado en el proceso de escisin (etapa 2) y la DNA ligasa suelda el extrem o del trozo recin sintetizado al resto de la cad en a (etapa 3). El p roceso de la soldadura con siste en la nueva form acin del en lace fosfod ister roto (vase Figura 6-37).

esqueleto de azcar fosfato copia 1 copia 2

iii!
ALTERACION DE LA COPIA 1

pares de bases unidas por un enlace de hidrgeno

La estabilidad de los genes depende de la reparacin del DNA22

A pesar de los miles de cambios al azar que se producen cada da en el DNA de una clula humana debido a la energa trmica, en una clula promedio slo se acumulan unos cuantos cambios (mutaciones) estables cada ao. Hoy sabemos que menos de uno de cada mil cambios accidentales de las bases del DNA pro voca una mutacin; el resto de los cambios son eliminados, con una eficacia ex traordinaria, mediante el proceso de reparacin del DNA. Existe una amplia va riedad de mecanism os de reparacin, cada uno de ellos catalizados por un conjunto diferente de enzimas. Casi todos dependen de la existencia de dos co pias de la informacin gnica, una en cada cadena de la doble hlice del DNA: si la secuencia de una de las cadenas cambia accidentalmente, la informacin no se pierde irreversiblemente ya que todava queda una segunda copia de la infor macin en la secuencia de nucletidos de la otra cadena. El proceso bsico de la reparacin del DNA se ilustra esquemticamente en la Figura 6-35. Tal como se indica en ella, el proceso supone tres etapas: 1. La porcin alterada de la cadena de DNA es reconocida y eliminada por unas enzimas especiales llamadas nucleasas de reparacin del DNA, que hidrolizan los enlaces fosfodister que unen los nucletidos alterados al resto de la molcula de DNA. Ello produce un hueco en esta regin de la hlice de DNA. 2. Otra enzima, la DNA polimerasa, se une al extremo 3 -OH de la cadena cortada de DNA y va colocando nucletidos, uno a uno, utilizando la infor macin correcta de la otra cadena {patrn). 3. El hueco, o muesca de la cadena daada desaparece cuando el pptido que ha sintetizado la DNA polimerasa se suelda gracias a la accin de una ter cer tipo de enzima, la DNA ligasa, lo cual completa el proceso de restaura cin. Tanto la DNA polimerasa como la DNA ligasa juegan un importantsimo pa pel general en el metabolismo del DNA; ambas actan, por ejemplo, en los pro cesos de la replicacin y de la reparacin del DNA. En las Figuras 6-36 y 6-37 se ilustran las reacciones que catalizan estas dos enzimas.
etapa 1

ELIMINACION DE LA REGIN ALTERADA DE LA COPIA 1

etapa 2

LA DNA POLIMERASA SINTETIZA UNA NUEVA COPIA 1 SOBRE LA COPIA 2, INTACTA, QUE TODAVA SE CONSERVA

copia 1 jff y copia 2

etapa 3

LA DNA LIGASA SUELDA LA MUESCA

copia 1 copia 2

silslis

RESULTADO NETO: SE RECUPERAN DOS COPIAS CORRECTAS

Las alteraciones del DNA pueden ser eliminadas por ms de una va2 3
Los detalles de la etapa de escisin en el proceso de reparacin del DNA depen den del tipo de alteracin de que se trate. Por ejemplo, la despurinacin, que es con diferencia la lesin ms frecuente de las que tienen lugar en el DNA, produ ce un azcar desoxirribosa que ha perdido su base (vase Figura 6-33). Este az car es rpidamente reconocido por la enzima AP endonucleasa, la cual corta el esqueleto fosfodister del DNA en el lado 5 del lugar alterado. Despus de la es cisin de un residuo azcar-fosfato por una enzima fosfodiesterasa, se recupera la secuencia de DNA inalterada mediante la accin de una DNA polimerasa y una DNA ligasa (vase Figura 6-35). Una va de reparacin relacionada con sta, denominada reparacin por eliminacin de bases implica la actuacin de una batera de enzimas diferentes

Mecanismos de reparacin del DNA

263

desoxirribonuclesido 3'(P . trifosfato HO M P! entrante patron

desoxirribonuclesido trifosfato entrante cadena patrn hlice de DNA reparada

- direccin 5' a 3' de crecim iento de la cadena

2P,

muesca de la hlice (B)

Figura 6 -36 La enzima DNA polimerasa. (A) R eaccin catalizada
por la DNA polim erasa. E sta enzim a cataliza la ad icin de un desoxirribonu cletid o al extrem o 3 OH de una cad en a de polin ucletidos (la cadena cebadora) que se halla apareada a un a segunda cadena patrn. La nueva cad en a de DNA cre ce en d ireccin 5 a 3 . D ebido a que cada uno de los desoxirribonu cletid os trifosfato que van entran d o han de aparearse con los de la cad en a p atrn para pod er ser recon o cid os por la polim erasa, esta cad en a d eterm ina cul de los cuatro posibles desoxirribonu cletid os (A, C, G o T) ser aadido en cada m om en to . Com o en el caso de la RNA polim erasa, la reacci n est im pulsada por u n a variacin m uy favorable de energa (vase Figura 6-3). (B) Estru ctu ra de un a m olcu la de DNA p olim erasa de E. coli, d eterm inad a por cristalografa de rayos X. Este dibujo ilustra cm o , al parecer, act a la polim erasa d urante la sntesis del DNA d urante el p ro ceso de reparacin. (B, adaptado de L.S. B eese, V. D erbyshire y T.A. Steitz. Science 260;352-355, 1993. 1993 the AAAS.)

(A)

llamadas DNA glucosilasas. Cada DNA glucosilasa reconoce a un tipo de base de DNA alterada y cataliza su eliminacin hidroltica. Existen como mnimo seis ti pos de estas enzimas, entre las que se encuentran las que eliminan C desanima das, A desaminadas, diferentes tipos de bases alquiladas u oxidadas, bases con anillos abiertos y bases en las que un enlace doble carbono-carbono se ha con vertido accidentalm ente en un enlace sencillo carbono-carbono. Como ejemplo del mecanism o general que acta en todos los casos, en la Figura 6-38A se pre senta la eliminacin de una C desaminada por la uracil DNA glucosilasa. La re accin de la DNA glucosilasa produce un azcar desoxirribosa que ha perdido su base. Dado que este azcar fosfato es el mismo substrato reconocido por la AP endonucleasa, los pasos siguientes en el proceso de reparacin tienen lugar de la misma forma que para los lugares despurinados. La importancia de la elimina cin de las bases de DNA desaminadas accidentalmente ha sido demostrada di rectam ente. En bacterias mutantes que carecen de la enzima uracil DNA gluco silasa, la frecuencia normalmente baja de cambio espontneo de un par de bases C-G a un par de bases T-A aumenta unas veinte veces. Las clulas disponen de una va de reparacin por eliminacin de nucletidos capaz de eliminar casi cualquier tipo de lesin del DNA que genere un cam bio importante en la doble hlice del DNA. Entre las grandes lesiones se en cuentran las que se generan a travs de la reaccin covalente de las bases del DNA con grandes molculas de hidrocarbonos (como el compuesto carcingeno

5'l I
AMP

enlace fosfodister roto

-Z .
PASO 2

Figura 6 -37 Reaccin catalizada por la DNA ligasa. Esta enzim a suelda un
en lace fosfod ister roto. Tal com o se m uestra, la DNA ligasa utiliza una m o lcu la de ATP para activar el extrem o 5 de la m u esca (etapa 1) antes de form ar el nuevo en lace (etapa 2). De esta form a, la reacci n energ ticam en te desfavorable de soldadura de la m u esca est desplazada por el proceso en erg ticam en te favorable de hidrlisis del ATP. En el sndrome de Bloom, u n a enferm ed ad h u m an a hered itaria, los individuos p resentan una d eficien cia parcial de DNA ligasa y, en co n secu en cia, son deficitarios en el p ro ceso de rep araci n del DNA, lo cual supone un in crem en to d ram tico de la in cid en cia de cncer.

264

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

(A) REPARACIN POR EXCISIN DE BASES

C desarrimada

(B) REPARACION POR EXCISIN DE NUCLETIDOS

dm ero de pirim idinas
/ /\

G C T U A T CC

pares de bases | unidas por enlaces de hidrgeno

C T A C G G T C T A C T A T G G

ii iii !
G A T G C C A G NUCLEASA W C T A ^ G G T C T A C T A T GTG A T G A T A C C

pares de bases unidas por enlaces de hidrgeno

CGAGTAGG

URACIL DNA GLUCOSILASA G C T A T C C

C G A G T A G G

hlice de DNA con una base perdida

!
G A T G C C A G DNA HELICASA

A T G A T A C C C G G T C T A C T A T G
/\

LA AP ENDONUCLEASA Y UNA FOSFODIESTERASA ELIMINAN EL AZCAR FOSFATO G C T A T C C hlice de DNA con un hueco de un nucletido C T A

l.-ll
DNA POLIMERASA Y DNA LIGASA

C G A G T A G G

G A T G C C A G A T G A T A C C

hlice de DNA con un hueco de 12 nucletidos

DNA POLIMERASA Y DNA LIGASA G C T C A T C C C G A G T A G G

C T A C G G T C T A C T A T G G

iiii

G A T G C C A G A T G A T A C C

Figura 6 -3 8 Com paracin entre los dos principales sistemas de reparacin del DNA. (A) R ep aracin p o r elim in acin d e bases. Este p ro ceso em pieza co n u n a DNA glucosilasa. En este caso la enzim a u racil DNA g lu cosilasa elim in a un a cito sin a
accid en talm en te desam inad a. Tras la acci n de esta glucosilasa (o otra DNA glu cosilasa que re co n o ce otro tipo de alteracin) el azcar fosfato co n la b ase perdida es elim inado m ed ian te la acci n secu en cial de la AP en d o n u cleasa y de un a fosfod iesterasa, las m ism as enzim as que inician la reparacin de lugares despurinados. E n to n ces, el h u eco de un solo nu cletid o es rellenado por la DNA polim erasa y la DNA ligasa. El resultado neto es que el U que se gener por una d esan im aci n accid en tal h a sido cam biad o, recu p ern d ose un a C. El n o m bre de la AP en d o n u cleasa proviene del h ech o de que re co n o ce cu alquier lugar de la h lice del DNA que con ten g a un azcar desoxirribosa cuya b ase se haya perdido. E stos lugares pu ed en ap arecer tan to por la prdida de un a pu rina (lugares apu rnicos) com o por la prdida de una pirim idina (lugares apirim idn icos). (B) R ep aracin p o r elim in aci n d e n u cletidos. D espus de que un com p lejo m u ltienzim tico reco n o zca u n a gran lesin, com o un dm ero de pirim idinas (vase Figura 6-34B ), se realiza un corte a cada lado de la lesin y una DNA helicasa asociad a elim in a toda la z ona d aad a de la cad ena. El com p lejo m u ltienzim tico de las b acterias d eja el h u eco de 12 nu cletid os que se m u estra en la figura; el que se prod uce en el DNA de hu m an o s es m s del d oble de grande.

benzopireno) o con varios dmeros de pirimidina T-T, T-C y C-C generados por la accin de la luz solar. En estos casos existe un gran complejo multienzimtico que rastrea el DNA buscando, en lugar de un determinado cambio de una base por otra, distorsiones de la doble hlice. Cuando se detecta una gran lesin el es queleto fosfodister de la cadena anormal que contiene la lesin (un oligonucletido) es cortado a cada lado de la distorsin y se elimina de la doble hlice del DNA mediante la accin de una enzima DNA helicasa (como se discute ms ade lante). A continuacin, se repara el pequeo hueco producido en la cadena del DNA, mediante los mtodos habituales, mediante una DNA polimerasa y una DNA ligasa (Figura 6-38B). La importancia de estos procesos de reparacin se refleja en la gran inver sin que realizan las clulas en el m antenimiento de enzimas de reparacin del DNA. Un extenso anlisis gentico de una levadura sugiere que cada clula con-

Mecanismos de reparacin del DNA

265

tiene ms de 50 tipos diferentes de genes que codifican funciones de reparacin del DNA. Se cree que en la especie humana los procesos de reparacin del DNA son al m enos tan com plejos como en la levadura. Los individuos que presentan la anormalidad gentica xeroderma pigmentosum, por ejemplo, son deficitarios en una gran cantidad de procesos de reparacin que, segn puede comprobarse mediante anlisis gentico, requieren com o mnimo siete productos gnicos di ferentes. Estos individuos desarrollan severas lesiones de piel, como el cncer de piel, debido a la acumulacin de dmeros de pirimidina en las clulas que se ha llan expuestas al sol.

Las clulas pueden producir enzimas de reparacin de DNA en respuesta a las alteraciones del DNA24
Las clulas han desarrollado varios m ecanismos que les permiten sobrevivir en un mundo agresivo. A menudo, una agresin ambiental extrema activa una ba tera de genes cuyos productos protegen a la clula de los efectos de la agresin. Uno de los m ecanism os de este tipo que expresan todas las clulas es la respues ta al shock trmico, la cual es evocada por la exposicin de las clulas a tempera turas anorm alm ente altas; entre las protenas de shock trm ico (heat-shockproteins) que se inducen se encuentran algunas de las que al parecer colaboran en la estabilizacin y en la reparacin de las protenas celulares parcialmente desnaturalizadas (vase Figura 5-29). Muchas clulas presentan tam bin mecanismos que les permiten sintetizar enzimas de reparacin del DNA en respuesta a una alteracin severa del DNA. El ejemplo m ejor estudiado es la respuesta SOS en E. coli. En esta bacteria, cual quier bloqueo de la replicacin del DNA genera una seal (al parecer se trata de un exceso de DNA de una sola cadena) que induce un incremento de la trans cripcin de ms de 15 genes diferentes, muchos de los cuales codifican prote nas que actan en la reparacin del DNA. En primer lugar la seal activa la pro tena RecA de E. coli (vase ms adelante) que destruye una protena reguladora de un gen que acta negativamente (un represor), la cual a su vez normalmente suprime la transcripcin de la coleccin completa de genes del SOS. Estudios so bre bacterias m utantes deficitarias en diferentes partes de la respuesta indican que las protenas que se sintetizan en esta respuesta tienen dos efectos. En pri mer lugar, y tal com o era de esperar, la induccin de enzimas de reparacin del DNA increm enta la supervivencia de la clula. Cuando mutantes deficitarios en estos factores de la respuesta SOS son tratados con algn agente que altera el DNA, com o la radiacin ultravioleta, una proporcin extraordinariamente eleva da de ellos mueren. En segundo lugar, increm enta marcadamente el nmero de errores que se producen en la copia de las secuencias del DNA por lo que algu nas de las protenas que se sintetizan en estos momentos aparecen con elevadas frecuencias de mutacin, por lo que tambin aumenta la variabilidad gentica de la poblacin. Esta parte de la respuesta tiene un pequeo efecto en la super vivencia a corto plazo; posiblemente se trata de una ventaja ya que incrementa las probabilidades de que sobreviva una clula mutante m ejor adaptada. El sistema de reparacin del DNA que se activa durante la respuesta SOS no es el nico sistema reparador de DNA inducible que se conoce. Las bacterias tie nen otro sistem a que se activa especficam ente por la presencia de nucletidos metilados en el DNA, y existe com o mnimo un sistema inducible de reparacin del DNA en las clulas de levadura. Tam bin se ha descrito que algunas clulas eucariotas se adaptan a las alteraciones del DNA de una forma similar a la que hemos descrito para bacterias.

La estructura y las propiedades qumicas de la doble hlice del DNA hacen que sea fcil de reparar 25
La doble hlice del DNA parece una estructura ptima para ser reparada. Como se discute en el Captulo 1, se cree que el RNA apareci durante la evolucin an-

266

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

DESAMINACIN DEA

DESAMINACIN DE G

DESAMINACIN DE 5-METILC

tes que el DNA y es probable que inicialmente el cdigo gentico estuviera escri to en los cuatro nucletidos A, C, G y U. Ello plantea por qu se reemplaz la U del RNA por la T (que es 5-m etil U) del DNA. Hemos visto que la desanim a cin espontnea de C la transforma en U, pero que este hecho es inofensivo gracias a la uracil DNA glucosilasa (Figura 6-38A). Podemos imaginar que cual quier enzima de reparacin encargada de detectar y eliminar estos accidentes no podra distinguir estos nucletidos de los nucletidos U normales de una molcula de DNA que contuviera U. Por ello, no es sorprendente que no se uti lice U en el DNA. Esta lnea de argumentacin est corroborada por la observacin de que cada posible proceso de desaminacin en el DNA produce una base no habitual, la cual, por lo tanto, puede ser detectada y eliminada directamente mediante una DNA glucosilasa especfica. La hipoxantina, por ejemplo, es la base prica ms simple que es capaz de aparearse especficamente con C. Sin embargo la hi poxantina es el producto directo de la desaminacin de A. La adicin de un se gundo grupo amino a la hipoxantina genera G, la cual no puede formarse espon tneam ente a partir de A por desaminacin espontnea y cuyo producto de desaminacin es tam bin nico (Figura 6-39A). En el DNA de los vertebrados ocurre una situacin especial, ya que algunos nucletidos C determinados estn metilados en secuencias CG especficas de genes inactivos (lo cual se discute en el Captulo 9). Como se ilustra en la Figura 6-39B, la desaminacin accidental de estos nucletidos C metilados produce el nucletido natural T, el cual forma un apareamiento errneo con el nucletido G de la otra cadena del DNA. Para colaborar en la proteccin de estos nucleti dos C metilados contra estas mutaciones, una DNA glucosilasa especial recono ce los nucletidos de T en las secuencias TG, eliminando T. Sin embargo, este m ecanism o de reparacin del DNA debe ser relativamente ineficiente ya que los nucletidos C metilados son lugares habituales de mutacin en el DNA de los vertebrados. Aunque en el DNA de humanos solam ente alrededor del 3% de los nucletidos C estn metilados, las mutaciones en estos nucletidos consti tuyen aproximadamente una tercera parte de las mutaciones de una sola base que se han observado en enfermedades hereditarias humanas (vase tam bin Figura 9-71). Mientras que las propiedades qumicas de las bases aseguran que los proce sos de desaminacin sern detectados, la reparacin exacta -y la respuesta fun damental del dilema de Schroedinger- depende de la existencia de diferentes copias de la informacin gentica en las dos cadenas de la doble hlice. Tan slo en el caso muy improbable de que ambas copias se lesionen simultneamente en el mismo par de bases, la clula se quedar sin ninguna copia buena para utilizarla como patrn de la reparacin del DNA. Incluso en este caso, se han de sarrollado mecanism os que en algunos casos son capaces de reparar la altera cin. Estos mecanismos de reparacin requieren que en la clula se halle pre sente una segunda hlice de DNA de la misma secuencia, y utilizan mecanismos

Figura 6 -39 Desam inacin de nucletidos de DNA. En cada caso el tomo de oxgeno aadido a partir de la reaccin con el agua est coloreado en rojo. (A) Los productos de desaminacin espontnea de A y de G se pueden reconocer com o no naturales cuando ocurren en el DNA, por lo que son fcilm ente detectados y reparados. La desaminacin de C a U est ilustrada en la Figura 6-33 y T no tiene grupo amino para desaminar. (B) En el DNA de vertebrados un escaso porcentaje de los nucletidos C estn metilados, lo cual contribuye al control de la expresin gnica. Cuando estos 5-m etil nucletidos C se desaminan accidentalm ente, forman T. Esta T se aparear con una G de la cadena opuesta, formando un par de bases equivocado.

Mecanismos de reparacin del DNA

267

de recom binacin gnica para transferir la informacin perdida desde una hli ce de DNA a la otra -u n proceso denominado conversin gnica, tal como discu tiremos ms adelante. nicam ente en algunos virus muy pequeos, cuyos genomas tienen unos pocos cientos de nucletidos, la informacin gentica es almacenada en DNA de una sola cadena o en molculas de RNA. Los tipos de sistemas de reparacin que hem os descrito no pueden actuar en estos casos, y la probabilidad de que en es tos virus ocurra un cam bio de un nucletido es muy elevada. Parece que nica mente los organismos cuyos genomas sean muy pequeos pueden permitirse codificar su informacin gentica en estructuras que no sean una doble hlice de DNA.

Resumen

La fidelidad con la que se mantienen las secuencias del DNA en los eucariotas supe riores puede ser estimada a partir de las frecuencias de cambio durante la evolu cin de las protenas no esenciales y dlas secuencias de DNA no codificante. Esta fidelidad es tan elevada que una lnea germinal de mamfero, con un genoma de 3 x 109 pares de bases, est sujeta a una media de tan slo entre 10 y 20 cambios de pares de bases cada ao. Sin embargo resulta inevitable que en una clula tpica de mamfero los diferentes procesos qumicos lesionen cada da miles de nucleti dos del DNA. La informacin gentica se puede almacenar deforma estable en la secuencias del DNA gracias a que existen numerosos tipos de enzimas de reparacin que patrullancontinuamente el DNA y reemplazan los nucletidos alterados. El proceso de reparacin del DNA depende de la presencia de una copia de la informacin gentica en cada cadena de la doble hlice del DNA. Una lesin acci dental de una de las dos cadenas se puede eliminar mediante la accin de una enzi ma de reparacin, sintetizndose a continuacin la cadena correcta a partir de la informacin de la cadena no alterada. La mayor parte de las alteraciones en las ba ses del DNA son eliminadas mediante uno de dos procesos principales. En la repa racin por eliminacin de bases una base alterada es eliminada mediante una en zima DNA glicosilasa, seguida de la eliminacin del azcar fosfato resultante. En la reparacin por eliminacin de nucletidos, una pequea regin de la cadena veci na a la alteracin es eliminada de la hlice del DNA, como un oligonucletido. En ambos casos el pequeo hueco" que queda en la hlice de DNA es rellenado me diante la accin secuencial de una DNA polimerasay una DNA ligasa. Mecanismos de replicacin del DNA26
Adems de m antener la integridad de las secuencias del DNA mediante los m e canismos de reparacin del DNA, todos los organismos vivos han de duplicar su DNA de una forma muy exacta, antes de cada divisin celular. La replicacin del DNA supone unas velocidades de polimerizacin de aproximadamente 500 nu cletidos por segundo en las bacterias, y de unos 50 nucletidos por segundo en los mamferos. Evidentemente, las enzimas de replicacin han de ser exactas y rpidas. La rapidez y la exactitud se consiguen mediante un complejo multienzimtico de varias protenas que dirige el proceso y constituye una complicada mquina de replicacin.

Tal com o ocurre para el proceso de reparacin del DNA, el fundam ento del proceso de replicacin es el apaream iento de bases 27
La utilizacin del DNA como patrn se refiere al proceso en el que la secuencia de nucletidos del DNA (o de determinadas zonas del DNA) es copiada median te el apareamiento de bases complementarias (A con T o con U y G con C), pro-

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Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

duciendo as una secuencia de cido nucleico (de DNA o de RNA) com plem en taria a la patrn. El proceso comporta el reconocimiento de cada nucletido del DNA por un nucletido complementario no polimerizado y requiere que las dos cadenas de la hlice de DNA se separen por lo menos un momento para que los grupos dadores y aceptores de los enlaces de hidrgeno de cada base queden li bres para el apareamiento de las bases. De esta forma se alinean ordenadamente los nucletidos libres adecuados y polimerizan mediante una reaccin cataliza da enzimaticamente, formando una nueva cadena de cido nucleico. En 1957 se descubri la primera de estas enzimas que catalizan la polimerizacin de nucle tidos, la DNA polimerasa. Se demostr que los substratos de esta enzima son los desoxirribonuclesidos trifosfato, los cuales son polimerizados sobre una cade na patrn de DNA. El m ecanismo de esta reaccin es el que se ha descrito en la Figura 6-36 para la reparacin del DNA. Este descubrimiento llev al posterior aislamiento de la RNA polimerasa, de la que se supuso, correctamente, que utili zaba ribonuclesidos trifosfato como substrato. Durante la replicacin del DNA, cada cadena del DNA antiguo acta com o patrn de la form acin de una nueva cadena entera. Dado que cada una de las dos clulas hijas de una clula que se divide hereda una hlice de DNA que contiene una cadena antigua y otra acabada de sintetizar (vase la Figura 3-13), se dice que el DNA se replica de m anera semiconservativa por la DNA poli merasa.

La horquilla de replicacin del DNA es asim trica 28

Anlisis autorradiogrficos efectuados a principios de los aos 1960 sobre crom o somas enteros en replicacin marcados con un breve pulso de timidina 3H, un pre cursor del DNA, revelaron la existencia de una regin concreta de replicacin que se desplaza a lo largo de la doble hlice paterna de DNA. Debido a su estructura en forma de Y, esta regin activa del DNA recibe el nombre de horquilla de replica cin del DNA. En la horquilla de replicacin se sintetiza el DNA de las dos hlices hijas mediante un complejo multienzimtico que contiene la DNA polimerasa. Inicialmente el mecanismo ms sencillo de replicacin del DNA pareca ser el crecimiento continuo de las dos nuevas cadenas, nucletido a nucletido, a medi da que la horquilla de replicacin se desplazaba de un extremo a otro de la molcu la del DNA. Pero debido a que en la hlice de DNA las dos cadenas se hallan en orientacin antiparalela (vase Figura 3-10 y Panel 3-2, pgs. 104-105), este m eca nismo requerira que una de las cadenas hijas creciera en direccin 5 a 3 y la otra en direccin 3 a 5. Una horquilla de replicacin de este tipo requerira dos enzi mas DNA polimerasa diferentes. Una de ellas polimerizara en direccin 5 a 3, de forma que cada nucletido trifosfato entrante transportara la activacin del trifos fato necesaria para su propia activacin, mientras que la otra enzima debera des plazarse en direccin 3 a 5, actuando segn el mecanismo denominado creci-

Figura 6 -40 Modelo incorrecto de la replicacin del DNA. A pesar de que el m ecanism o que se indica en la figura pueda parecer el m ecanism o ms sencillo para la replicacin del DNA, no es el que utiliza la clula. Ntese que en este esquem a las dos cadenas de DNA hijas creceran de forma continua, utilizando la energa de hidrlisis de los fosfatos a m a rillo s para aadir el nucletido siguiente a cada cadena. Ello requerira que las cadenas pudieran crecer tanto en la direccin 5 a 3 (abajo) y en la direccin 3 a 5 (arriba). Nunca se ha descubierto la existencia de una enzima que catalice la polimerizacin de nucletidos en direccin 3 a 5 .

Mecanismos de replicacin del DNA

269

Figura 6-41 Estructura de una horquilla de replicacin del DNA. Debido a que las dos cadenas de DNA (.colorea d a s ) se sintetizan en la direccin 5' a 3 , el DNA sintetizado sobre la cadena retrasada es producido en forma de cortas molculas de DNA, denominadas fra g m en to s d e O kazaki.

miento por la cabeza" en el que el extremo de la cadena de DNA que est creciendo transporta la activacin del trifosfato necesaria para la adicin del nucletido si guiente. A pesar de que la polimerizacin por la cabeza tiene lugar en diversos procesos bioqumicos (vase Figura 2-36), no ocurre en la sntesis del DNA; nunca se ha encontrado una DNA polimerasa que acte en direccin 3 a 5 (Figura 6-40). Cmo se consigue, pues, la sntesis del DNA en direccin 3 a 5? La respuesta fue sugerida por primera vez a finales de los aos 1960 gracias a experimentos en los que a una preparacin de bacterias en crecimiento se aada durante breves segun dos una preparacin de timidina 3H altamente radiactiva, de forma que nicamente resultaba marcada radiactivamente la zona de DNA que se acababa de replicar, es decir, justo detrs de la horquilla de replicacin. Este sistema selectivo de mareaje revel la existencia de zonas de DNA en la horquilla de crecimiento de la bacteria de entre 1000 y 2000 nucletidos de longitud, que hoy se conocen con el nombre de fragmentos de Okazaki. (Ms tarde se describieron intermediarios de replicacin como stos en eucariotas, pero de una longitud de tan slo entre 100 y 200 nucleti dos.) Se demostr que estos fragmentos de Okazaki se sintetizan nicamente en di reccin 5 a 3', y que despus de su sntesis se unen entre s generando largas cade nas de DNA, mediante la enzima DNA ligasa, la misma enzima que rellena y suelda los huecos durante la reparacin del DNA (vase Figura 6-37). Una horquilla de replicacin tiene una estructura asimtrica. La cadena hija de DNA que se sintetiza de manera continua recibe el nombre de cadena con ductora, y se sintetiza antes que la cadena hija, que se sintetiza de forma discon tinua y que recibe el nombre de cadena retrasada. La sntesis de la cadena retra sada es ms lenta debido a que debe esperar a que la cadena conductora exponga la cadena patrn sobre la que se sintetizar cada uno de los fragmentos de Okazaki (Figura 6-41). La sntesis de la cadena conductora mediante un m e canismo discontinuo de punto hacia atrs significa que para la replicacin del DNA nicamente se necesita la DNA polimerasa 5' a 3J.

El elevado grado de fidelidad del mecanismo de replicacin del DNA requiere la existencia de un mecanismo de correccin de galeradas29
La fidelidad del proceso de copia durante la replicacin del DNA es tan alta que slo se produce, aproximadamente, un error en la replicacin de cada 109 pares de bases, tal com o requiere el m antenim iento del genoma de los mamferos, de 3 x 109 pares de bases de DNA. Esta fidelidad es mucho ms alta que la esperada,

270

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

dado que las parejas estndar de bases complementarias no son las nicas posi bles. Por ejemplo, pequeos cambios en la geometra de la hlice permitirn que se formen dos enlaces de hidrgeno entre G y T en el DNA. Adems, en el DNA normal aparecen transitoriamente formas tautomricas raras de las cuatro bases del DNA, en proporciones de 1 parte por cada 104 o 105. Estas formas no se apa rean correctam ente a no ser que haya cambios en la geometra de la hlice: por ejemplo, la escasa forma tautomrica de C se aparea con A en lugar de con G. Si la DNA polimerasa acepta que se formen apareamientos incorrectos de bases entre un desoxirribonuclesido trifosfato entrante y el patrn de DNA, el ncleotido incorrecto ser incorporado en la nueva cadena de DNA, producindose una mutacin. La elevada fidelidad del proceso de replicacin del DNA depende de mecanismos de correccin de galeradas o verificacin de lectura (proof reading mechanism) que elimina errores generados de esta forma. Un importante proceso de correccin de galeradas depende de las espe ciales propiedades de la enzima DNA polimerasa. A diferencia de las RNA polimerasas, las DNA polimerasas no inician una nueva cadena de nucletidos uniendo entre s dos nucletidos trifosfato: necesitan de forma absoluta la pre sencia de un extremo 3 -OH de una cadena cebadora sobre la que aadir los nu cletidos siguientes (vase Figura 6-36). Adems, las molculas de DNA que pre sentan errores de apareamiento (o con falta de algn apareamiento) de nucletidos en el extremo 3 -OH de la cadena cebadora no son efectivas como cadena patrn. Las molculas de DNA polimerasa son capaces de trabajar con cadenas de DNA defectuosas de este tipo mediante la utilizacin de una subunidad o dominio cataltico que corta cualquier residuo desapareado del final de la cadena cebadora. El proceso de corte mediante esta actividad correctora exonucleasa 3 a 5 contina hasta que se ha eliminado un nmero de nucletidos del extremo 3 suficiente com o para regenerar un extremo con bases apareadas que pueda cebar la sntesis de DNA. De esta forma, la DNA polimerasa acta como una enzima autocorrectora que va eliminando sus propios errores de polime rizacin a medida que avanza por el DNA. La Figura 6-42 ilustra cmo puede es perarse que este proceso de autocorreccin elimine los errores de aparea miento de bases. El requerimiento de la presencia de un extremo de DNA formado por un perfecto apareamiento de bases es esencial para que se den las propiedades de autocorreccin de la DNA polimerasa. Para una enzima de este tipo, aparente mente no es posible iniciar la sntesis en completa ausencia de un cebador sin perder ninguna de sus caractersticas discriminatorias entre bases apareadas y desapareadas del extremo 3 -OH en crecimiento. Por el contrario, las enzimas RNA polimerasas implicadas en la transcripcin gnica no necesitan ser autocorrectoras: los errores en la transcripcin del RNA no pasan a la generacin si guiente, y la existencia ocasional de una molcula defectuosa no es relevante. Las RNA polimerasas son capaces de iniciar una nueva cadena de polinucletidos en ausencia de cebador, y se observa una frecuencia de error de aproxima damente 1 de cada 10, tanto en la sntesis del RNA como en los procesos de tra duccin de las secuencias de mRNA a secuencias de protena.

hebra cebadora

una form a tautom rica rara de C (C*) se aparea con A y as se incorpora a la hebra cebadora por la DNA polimerasa T T T T C*
\ ( pK p)JpK f^ ~ oh

M P M P M P M P M P J (P ) (P) (P) A A A A A A A A A el rpido desplazam iento tautom rico de C* a citosina norm al (C) destruye su apaream iento con A

A A

A A A A A el extrem o 3'-OH no apareado de la hebra cebadora bloquea su alargam iento posterior por accin de la DNA polimerasa

C, .

A A A A A A la actividad de la exonucleasa 3' a 5' unida a la DNA polim erasa, (P ^ O H - genera un extrem o 3'-OH con bases apareadas en la hebra cebadora

A A A

[lM PJ S L E JLEI CmPMJ

la DNA polim erasa contina el proceso de adicin de nucletidos al extrem o 3'-OH de la hebra cebadora

Slo la replicacin del DNA en direccin 5 a 3 permite la existencia de un eficiente proceso de correccin de errores
Probablemente la necesidad de que el proceso sea exacto explica por qu la re plicacin del DNA nicamente tiene lugar en la direccin 5 a 3 de la cadena. Si existiera una DNA polimerasa que aadiera desoxirribonuclesidos trifosfato de forma que produjera el crecimiento de la cadena en direccin 3 a 5, el extremo 5 en crecim iento transportara el trifosfato activador en lugar de hacerlo el mononucletido entrante. En este caso los errores de polimerizacin no seran sim plemente eliminados por hidrlisis ya que la sntesis de un extremo 5 desnudo terminara inmediatamente la sntesis de DNA. Por consiguiente resulta mucho ms fcil corregir una base mal apareada que acaba de ser aadida al extremo 3
Figura 6 -4 2 Correccin de galeradas o verificacin de lectura durante la replicacin del DNA.

Mecanismos de replicacin del DNA

271

que una base que ha sido aadida al extremo 5 de una cadena de DNA. Por lo tanto, aunque el tipo de mecanismo necesario para la replicacin del DNA que se muestra en la Figura 6-41 parece a primera vista mucho ms complejo que el incorrecto mecanism o de la Figura 6-40, resulta mucho ms exacto porque su pone la sntesis de DNA nicamente en direccin 5 a 3 .

5 'IZ DNA primasa

/

13'

Una enzima especial que polimeriza nucletidos sintetiza cortas molculas cebadoras de RNA sobre la cadena retrasada 30
Para el caso de la cadena conductora nicamente es necesario un cebador espe cial al inicio de la replicacin; en cuanto se ha establecido la horquilla de repli cacin, la DNA polimerasa dispone continuamente de un extremo de cadena con bases apareadas sobre el que sintetizar la nueva cadena. Sin embargo la DNA polimerasa del lado retrasado de la horquilla completa un corto fragmento de DNA en tan slo 4 segundos, tras lo cual ha de empezar a sintetizar otro frag m ento com pletam ente nuevo en un punto situado ms adelante de la cadena patrn (Figura 6-41). Para generar estas cadenas cebadoras de bases apareadas que son necesarias para que acte la DNA polimerasa, se necesita un m ecanis mo especial. El m ecanismo incluye una enzima denominada RNA primasa (del ingls primer, cebador, o tam bin enzima generadora de cadenas cebadoras de RNA) que utiliza ribonuclesidos trifosfato para sintetizar cebadores (primers) de RNA cortos (Figura 6-43). En los eucariotas, estos cebadores tienen aproxima damente 10 nucletidos de longitud y son sintetizados a intervalos sobre la ca dena retrasada, para despus ser elongados mediante la DNA polimerasa consti tuyendo los fragmentos de Okazaki. La sntesis de cada fragmento de Okazaki acaba cuando esta DNA polimerasa se encuentra con el RNA cebador unido al extremo 5 del fragmento anterior de DNA. Para producir una cadena continua de DNA a partir del gran nmero de fragmentos sintetizados sobre la cadena re trasada, rpidamente acta un sistema especial de reparacin del DNA que eli mina el RNA cebador y lo substituye por DNA. A continuacin, la ligasa une el extremo 3 de cada fragmento de DNA al extremo 5 del fragmento anterior, completando as el proceso (Figura 6-44). Por qu se ha de sintetizar un RNA cebador, que luego se tendr que elimi nar, en lugar de utilizar un cebador de DNA que no sera necesario eliminar? El argumento de que una polimerasa autocorrectora no puede iniciar cadenas de novo tam bin implica lo contrario: una enzima capaz de iniciar cadenas de novo no puede presentar un sistema eficiente de autocorreccin. Por consiguiente, cualquier enzima que inicie la sntesis de los fragmentos de Okazaki producir, necesariam ente, una copia relativamente incorrecta (con por lo menos un error cada 105 bases). Incluso aunque la cantidad que se conserva de esta copia en el producto final constituye una parte tan pequea como el 5 % del genoma total (por ejemplo 10 nucletidos por cada fragmento de DNA de 200 nucletidos), el increm ento resultante de la frecuencia general de mutacin sera enorme. Por consiguiente, parece razonable concluir que la utilizacin de molculas de RNA como cebador en lugar de molculas de DNA debi suponer una poderosa ven taja, ya que los ribonucletidos del cebador marcan automticamente estas se cuencias como copia m ala que debe ser eliminada.

3' HO
113'
Figura 6-43 Sntesis del cebador de RNA. Representacin esquemtica de la reaccin catalizada por la RNA primasa, la enzima que sintetiza los cebadores de RNA cortos sobre la cadena retrasada. A diferencia de la DNA polimerasa, esta enzima puede iniciar una nueva cadena polinucleotdica uniendo entre s dos nuclesidos trifosfato. La primasa se detiene despus de la sntesis de un polinucletido corto dejando el extremo 3 de este cebador a disposicin de la DNA polimerasa.

RNA
cebador

sntesis de un nuevo cebador de RNA, llevada a cabo por la RNA primasa

cadena retrasada

pa n

la DNA polimerasa se une al nuevo cebador de RNA, iniciando un nuevo fragm ento de Okazaki

la DNA polimerasa acaba el fragm ento de DNA

el viejo cebador de RNA es elim inado y remplazado por DNA

Figura 6 -4 4 Sntesis de uno de los muchos fragmentos de DNA sobre la cadena retrasada. En los eucariotas, los cebadores de RNA sobre la cadena retrasada se presentan a intervalos de unos 200 nucletidos, y cada uno de ellos tiene unos 10 nucletidos de longitud. El cebador es eliminado por una enzima especial de reparacin que reconoce una hebra de RNA de una hlice RNA/DNA y la elimina; ello produce una hendidura que es rellenada por una DNA polimerasa y una DNA ligasa, como hemos visto para el proceso de reparacin de DNA (vase Figura 6-35).

5' la soldadura de las hendiduras m ediante la DNA ligasa une los fragm entos de Okazaki a la nueva cadena de DNA en crecim iento * 5'

272

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

Figura 6-45 Ensayo utilizado para medir la actividad de las DNA helicasas. Un corto fragmento de DNA se hbrida con una larga cadena de DNA de cadena sencilla, formando una regin de doble hlice. A medida que la helicasa va avanzando por la cadena de DNA de cadena sencilla, la doble hlice se va deshaciendo, liberando el fragmento corto de DNA. Esta reaccin requiere la presencia tanto de la protena helicasa como de ATP. El movimiento de la helicasa est alimentado energticamente por la hidrlisis del ATP (vase Figura 5-22).

la DNA helicasa se une

........................ 1 " 1|Y |........1.........

Unas protenas especiales ayudan a abrir la doble hlice del DNA por delante de la horquilla de replicacin 31
La doble hlice de DNA ha de ir abrindose rpidamente por delante de la hor quilla de replicacin, de manera que los desoxirribonclesidos trifosfato entran tes puedan aparearse con los de la cadena patrn. Sin embargo, la doble hlice de DNA es muy estable en condiciones normales: los pares de bases estn tan bien encajados en su lugar, que para separar las dos cadenas en el tubo de en sayo se requieren temperaturas prximas a las de ebullicin del agua. Por esta razn, para poder copiar una molcula de DNA, la mayora de las DNA polimerasas requieren que la cadena patrn se haya separado de su cadena com ple mentaria. Para abrir la doble hlice y poner al descubierto la cadena patrn del DNA que ser copiada por la DNA polimerasa, son necesarias unas protenas adicionales. Dos tipos de protenas de replicacin contribuyen a este proceso -las DNA helicasas y las protenas de unin al DNA de una sola hebra. Las DNA helicasas fueron inicialmente aisladas como protenas que hidrolizan ATP cuando se unen a molculas de DNA de una sola cadena. Como se describe en el Captulo 5, la hidrlisis de ATP puede hacer variar de forma cclica la forma de una molcula proteica, permitiendo a la protena realizar algn trabajo mecnico. Las DNA helicasas utilizan este principio para desplazarse rpidamente a lo largo de cadenas de DNA de una sola cadena; cuando encuentran una regin de doble hlice, continan desplazndose por la misma cadena, desenrollado as la hlice (Figura 6-45). Previamente hemos descrito como acta una helicasa de reparacin especial en la reparacin por eliminacin de nucletidos (vase Figura 6-38B). El desenrollamiento de la hlice de DNA patrn en la horquilla de replica cin puede, en principio, estar catalizada por dos DNA helicasas que actan de forma concertada, una de ellas desplazndose por la cadena conductora y la otra desplazndose por la cadena retrasada. Estas dos helicasas deberan desplazarse en direcciones opuestas a lo largo de una molcula de DNA de cadena sencilla, y por lo tanto, deberan ser dos enzimas diferentes. En efecto, ambos tipos de DNA helicasa existen, pero algunos estudios en bacterias demuestran que la DNA helicasa que desempea el papel principal es la de la cadena conductora, por razones que pronto quedarn aclaradas. Las protenas desestabilizadoras de la hlice -tam bin llamadas protenas de unin a DNA de una sola cadena (SSB, de Single Strand DNA-Binding proteins) se unen a cadenas de DNA abiertas, sin recubrir las bases de la cadena, las cuales, por lo tanto, quedan disponibles para actuar como patrn. Estas prote nas no son capaces de abrir directamente una larga cadena de DNA, pero cola boran con las helicasas estabilizando la conformacin desenrollada de las cade nas sencillas. Adems, su unin cooperativa recubre completamente las regiones de DNA de cadena sencilla de la cadena retrasada previniendo as la formacin de cortas hlices en forma de horquilla que impediran la actuacin de la DNA polimerasa (Figura 6-46).

.................................

Una molcula de DNA polimerasa mvil se m antiene unida al DNA mediante un anillo deslizante 32
La mayora de las DNA polimerasas slo sintetizan, por s mismas, cortas cade nas de nucletidos antes de separarse del DNA patrn. Esta tendencia a dejar r-

Mecanismos de replicacin del DNA

273

regin de una sola cadena de DNA patrn, presentando cortas regiones en form a de "h o rq u illa " por apareamiento de bases m onm eros de protena que desestabilizan la hlice

............................... l i l i ................................................ I I I I I I I I I i I I i I I I I I I I I I U J J .

la unin cooperativa de la protena estira la cadena

pidamente la molcula de DNA permite a la molcula de DNA polimerasa, que acaba de sintetizar un fragmento de Okazaki sobre la hebra retrasada, reciclarse rpidamente, empezando de nuevo a sintetizar el siguiente fragmento de Okaza ki sobre la misma hebra. Sin embargo, esta rpida disociacin supondra una di ficultad para que la polimerasa sintetizara largas cadenas de DNA en la horquilla de replicacin, si no existiera una protena accesoria que acta como una abra zadera regulada. Esta abrazadera mantiene la polimerasa firmemente unida al DNA cuando se desplaza, pero la libera en cuanto la polimerasa separa. Cmo puede impedir una abrazadera que la polimerasa se disocie sin im pedir al mismo tiempo que la polimerasa se desplace rpidamente a lo largo de la molcula de DNA? La estructura tridimensional de la protena abrazadera, de terminada por difraccin de rayos X, indica que esta protena forma un amplio anillo alrededor de la hlice de DNA. Un lado del anillo se une a la DNA polime rasa, y el anillo completo se desliza libremente a medida que la polimerasa se desplaza a lo largo de la cadena de DNA (Figura 6-47). El ensamblaje de la abra zadera alrededor del DNA requiere hidrlisis de ATP por protenas accesorias es peciales que se unen a la abrazadera y al DNA; se desconoce cmo se desensam bla la abrazadera cuando se separa del DNA.

Figura 6 -46 Efecto de las protenas que se unen a una sola hebra sobre la estructura de DNA de una sola hebra. Debido a que cada molcula proteica se une preferentemente a otra molcula que ya se ha unido previamente (unin coop erativa), sobre las cadenas m onocatenarias de DNA se forman largas hileras de estas protenas. Esta unin cooperativa provoca un estiramiento de la cadena patrn de DNA, facilitando el proceso de polimerizacin. Las hlices en horquilla que aparecen en la molcula de DNA de cadena sencilla se producen por apareamiento de bases entre cortas regiones de secuencias complementarias dentro de la propia cadena; son sem ejantes a las pequeas hlices que se forman en todas las molculas de RNA.

Figura 6-47 El anillo deslizante regulado que une la DNA polim erasa al DNA. (A) Estructura del anillo deslizante de E. coli, con una hlice de DNA aadida para indicar cmo se coloca la protena alrededor del DNA. En las clulas eucariotas existe una protena similar. (B) Ilustracin esquemtica de cmo se cree que la abrazadera une una molcula mvil de DNA polimerasa al DNA. (A, de X.-P. Kong et al., Celi 69:425-437, 1992. Celi Press.)

DNA polimerasa
5'7. rrr, T TWwwm'i ........................................ 3,

dos mitades de la abrazadera deslizante

5 'T T T

..............................................................5.

(A)
274 Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

(B)

polimerasa unida al DNA

\^ f\ -

cadena cade conductora patrn

Figura 6 -48 Protenas de la horquilla de replicacin del DNA. Se ilustran los principales tipos de protenas que actan en la horquilla de replicacin, mostrando sus posiciones en el DNA.

hlice de DNA padre

DNA helicasa

DNA polimerasa sobre la cadena retrasada (acabando de sintetizar un fragm ento de Okazaki)

En la horquilla de replicacin, una serie de protenas cooperan entre s formando una mquina de replicacin 33
A pesar de que hemos presentado la replicacin del DNA como un proceso en el que participan una serie de protenas de replicacin que actan independiente mente unas de las otras, en realidad muchas de estas protenas se hallan unidas entre s formando un gran complejo multienzimtico que se desplaza rpida mente a lo largo del DNA. Este complejo puede compararse con una diminuta mquina de coser compuesta por piezas proteicas y accionada por la hidrlisis de molculas de nuclesido trifosfato. A pesar de que este complejo de replica cin slo se ha caracterizado completamente en la bacteria E. coli y en algunos de sus virus, el de los eucariotas es muy similar (vase pg. 383). Las funciones de las subunidades de esta mquina de replicacin se resu men en el diagrama bidimensional de la Figura 6-48 que muestra el com plejo de replicacin completo. En la horquilla de replicacin actan dos molculas de DNA polimerasa idnticas, una en la cadena conductora y la otra en la cadena retrasada. La hlice de DNA se va abriendo mediante la accin de la molcula de DNA polimerasa de la cadena conductora que acta de forma concertada con una molcula de DNA helicasa que se va desplazando por la cadena retrasada; la apertura de la hlice est favorecida por molculas de protenas desestabilizadoras de la doble hlice, que se unen de forma cooperativa. Mientras que la m ol cula de la DNA polimerasa que acta sobre la cadena conductora puede proce der de una forma continua, la molcula de DNA polimerasa que acta sobre la cadena retrasada ha de volver a empezar a intervalos, utilizando como cebador cortos segmentos de RNA sintetizados por una molcula de RNA primasa. La eficiencia de replicacin aumenta notablem ente gracias a la estrecha asociacin de todos estos com ponentes proteicos. La molcula de primasa se une directamente a la DNA helicasa, formando una unidad sobre la cadena con ductora, denominada prim osom a. Alimentado por la DNA helicasa, el primosoma se desplaza con la horquilla y va sintetizando cebadores de RNA a medida de avanza. De forma similar, la molcula de DNA polimerasa que sintetiza DNA so bre la cadena retrasada se desplaza de forma coordinada con el resto de prote nas, sintetizando una sucesin de fragmentos de Okazaki; para acomodar este ordenamiento, se cree que la cadena patrn de DNA se va plegando de nuevo tal como se indica en la Figura 6-49. As pues, las protenas de replicacin se m an tienen unidas entre s formando una gran unidad (masa total > 106 daltons) que

Mecanismos de replicacin del DNA

275

Figura 6-49 Una horquilla de replicacin en tres dimensiones. Visin actual de la situacin de las protenas de replicacin sobre la horquilla de replicacin, cuando la horquilla se desplaza. Se ha modificado la estructura bidimensional de la Figura 6-48, plegando el DNA sobre la cadena conductora de forma que la molcula de la DNA polimerasa de la cadena retrasada y la molcula de la DNA polimerasa de la cadena conductora formen un com plejo enzimtico. Este proceso de plegamiento tambin consigue que el extremo 3 de cada complejo de Okazaki quede situado cerca del lugar de inicio del siguiente fragmento de Okazaki (comprese con la Figura 6-48). Debido a que la DNA polimerasa de la cadena retrasada se une a las otras protenas de replicacin, puede reutilizarse continuamente para sintetizar fragmentos de Okazaki; de esta forma, deja fcilmente el fragmento de DNA que acaba de sintetizar y se desplaza hasta el fragmento de cebador de RNA, necesario para que se inicie la sntesis del nuevo fragmento de DNA. Ntese que una de las hlices de DNA hijas se dirige hacia la parte inferior derecha, mientras que la otra lo hace hacia la parte superior izquierda de la figura.

protenas que se unen a una sola hebra RNA cebador fragm ento de Okazaki

DNA helicasa cadena retrasada patron DNA polim erasa sobre la cadena retrasada
(a c a b a n d o d e s i n t e t i z a r un f r a g m e n t o d e Okazaki )

cadena recin sintetizada

se desplaza rpidamente a lo largo del DNA, permitiendo la sntesis de DNA en las dos direcciones de la horquilla de una forma coordinada y eficiente. Esta mquina de replicacin de DNA va dejando tras de s series de frag m entos de Okazaki sobre la cadena retrasada, los cuales todava contienen en sus extremos 5 los pequeos trozos de RNA que actuaron como cebadores para su sntesis. Estos trozos de RNA debern ser eliminados y los fragmentos de DNA debern ser unidos entre s mediante enzimas reparadoras de DNA que actua rn detrs de la horquilla de replicacin (vase Figura 6-44).

Un sistem a de correccin de galeradas que elim ina los errores de replicacin producidos por la mquina de replicacin 34
Las bacterias como E. coli son capaces de dividirse cada 30 minutos, por lo que es relativamente sencillo estudiar grandes poblaciones buscando raros mutantes que tengan alterados determinados procesos. Una clase interesante de mutantes son los que contienen los llamados genes mutadores que incrementan de forma notable la frecuencia de mutacin espontnea. No es sorprendente que estos genes mutadores codifiquen una forma defectuosa de la exonucleasa co rrectora de pruebas 3 a 5 (discutida antes), que es una subunidad de la enzima DNA polimerasa (vase Figura 6-42). Cuando esta protena es defectuosa, la DNA polimerasa ya no corrige de forma efectiva y en el DNA se van acumulando una serie de errores de replicacin, que normalmente son eliminados. El estudio de otros mutantes de E. coli que presentan proporciones de mu taciones anormalmente elevadas ha permitido descubrir otro sistema de lectura

error de una UNION DE PROTEINAS hebra acabada CORRECTORAS DE ERRORES de sintetizar EL RASTREO DEL DNA DETECTA HUECOS EN , LA NUEVA HEBRA DE DNA

Figura 6 -50 Modelo de la correccin de errores de apaream iento en eucariotas. Las dos protenas que se muestran estn presentes tanto en bacterias como en clulas eucariotas: MutS se une especficamente a una pareja de bases errnea mientras que MutL recorre el DNA vecino buscando una hendidura. Cuando encuentra una hendidura MutL dispara la degradacin de la cadena cortada, a todo lo largo de la hendidura. Como en los eucariotas las hendiduras se encuentran fundamentalmente en las cadenas acabadas de replicar, se eliminan selectivamente los errores de replicacin. En las bacterias el mecanismo es el mismo excepto en que en el complejo otra protena (MutH) corta las secuencias GATC no metiladas (es decir, acabadas de replicar), iniciando el proceso que se ilustra aqu. Conocemos el mecanismo porque estas reacciones se han podido reconstituir en un sistema libre de clulas conteniendo protenas bacterianas purificadas y DNA.

MutS M utL

ELIMINACION DE LA HEBRA

SINTESIS REPARADORA DE DNA

276

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

de pruebas o de verificacin de lectura que normalmente elimina errores de replicacin que no son detectados por el sistema de la exonucleasa. Este sistema de correccin de errores de apaream iento (mismatch proofreading) (tambin denominado sistema de reparacin de errores de apareamiento, mismatch repair system) se diferencia del sistema de reparacin del DNA que hemos descrito previamente en que no depende de la presencia de nucletidos anormales en el DNA que puedan ser reconocidos y eliminados. En lugar de ello, este sistema de tecta la distorsin sobre el exterior de la hlice que resulta de un desajuste entre bases normales que no son complementarias. Si este sistema de correccin de galeradas reconociera simplemente un error de ajuste en una cadena de DNA acabada de replicar y eliminara aleatoriamente uno de los dos nucletidos que no encajan, podra com eter el error de "corregir la cadena patrn original, de forma que una de cada dos ocasiones mantendra el error. Para que un sistema de correccin de galeradas sea realmente efectivo, ha de ser capaz de distinguir cul es el nucletido equivocado y eliminarlo de la cadena (el error de replicacin) de forma especfica. El sistema de reconocim iento utilizado por el sistema de correccin de erro res de apareamiento de E. coli depende de la metilacin de determinados resi duos A del DNA. Transcurrido un cierto tiempo despus de que A se haya incor porado a la cadena de DNA acabada de sintetizar, se aaden grupos metilo a todos los residuos A que se encuentren en la secuencia GATC. Debido a que ni cam ente contendrn secuencias GATC no metiladas las cadenas acabadas de sintetizar y que se hallen justo detrs de la horquilla de replicacin, ser posible distinguir estas cadenas de las originales que se han utilizado como patrn. Ms recientem ente se han descubierto protenas en eucariotas que son homlogas en su secuencia de aminocidos a algunas de las protenas bacterianas que catalizan la correccin de errores. Como era de esperar, cuando en una c lula de levadura se eliminan los genes que codifican estas protenas, la propor cin de mutaciones puede incrementarse en ms de 100 veces. Sin embargo, puede haber algunas diferencias importantes entre los mecanismos de correc cin de errores de bacterias y de eucariotas, ya que el mecanismo para distinguir la cadena acabada de sintetizar de la cadena patrn en donde se halle un error no puede depender de la metilacin del DNA como en las bacterias, pues algu nos eucariotas, com o las levaduras y Drosophila, no metilan ninguna base de su DNA. Se sabe que las cadenas de DNA acabadas de sintetizar estn repletas de muescas en numerosos lugares, y se ha sugerido que en las clulas eucariotas es tas muescas (nicks, roturas de una de las dos cadenas) constituyen la seal que dirige las correcciones a la cadena adecuada (Figura 6-50).

origen de replicacin

APERTURA LOCAL DE LA HLICE DE DNA

SINTESIS DEL RNA CEBADOR ...................... .........."I LA NUEVA CADENA DE DNA INICIA LA SNTESIS DE LA CADENA CONDUCTORA
.................... lili
111111111111111111II111II111 r-

LAS CADENAS CEBADORAS DE RNA INICIAN LA SNTESIS DE CADENAS ADICIONALES DE DNA

111111M 11111111111111111111111 n 1111 rT X

.................. .. i""............. ...............................

horquilla 1 horquilla 2
s e g e n e r a n dos ho rquillas de replicacin

com pletas, una de las cuales se desplaza hacia la izquierda con la cadena conductora e n la parte sup erior y la cadena retrasada e n la parte in fe rio r de la figura, y la otra ho rquilla que se desplaza hacia la derecha, c o n la cadena conductora en la parte i n f e r i o r y la cadena retrasada en la parte
superior

Las horquillas de replicacin se inician en el origen de la replicacin 35

Tanto en las bacterias como en los mamferos, las horquillas de replicacin se ori ginan en una estructura denominada burbuja de replicacin, una regin en la que las dos cadenas de la hlice de DNA se separan una de la otra, actuando como pa trn para la sntesis de DNA (Figura 6-51). Se ha demostrado que en las bacterias, en las levaduras y en varios tipos de virus que crecen sobre clulas eucariotas las burbujas de replicacin se generan en secuencias especiales de DNA que reciben el nombre de orgenes de replicacin y que pueden tener una longitud de 300 nu cletidos. Por razones que no resultan claras, en los cromosomas de mamferos resulta muy difcil caracterizar estos orgenes de replicacin a nivel molecular. En el caso de algunos orgenes de replicacin bien definidos, ha sido posible reproducir in vitro la reaccin de la horquilla de replicacin. Estos estudios in vitro revelan que en bacterias y en virus bacterianos, la formacin de la horquilla se produce como se ilustra en la Figura 6-52. Mltiples copias de unas protenas ini ciadoras se unen a lugares especficos del origen de replicacin enrollando el DNA a su alrededor y formando un gran complejo DNA-protena. Entonces, este com plejo une la DNA helicasa y la coloca sobre una zona de DNA de una sola cadena,

Figura 6-51 Iniciacin de la horquilla de replicacin. La figura ilustra el proceso que participa en la iniciacin de la horquilla de replicacin, en el origen de la replicacin (vase tambin Figura

6-52).

Mecanismos de replicacin del DNA

277

origen de replicacin protenas de Iniciacin

hlice paterna i de DNA UNION DE LA PROTEINA DE INICIACIN AL ORIGEN DE REPLICACIN UNION DE LA DNA HELICASA A LA PROTEINA DE INICIACIN LA HELICASA SE UNE AL DNA

LA HELICASA ABRE LA HELICE Y UNE LA PRIMASA, FORMANDO EL PRIMOSOMA LA SINTESIS DEL CEBADOR PERMITE QUE LA DNA POLIMERASA INICIE LA PRIMERA CADENA DE DNA

Figura 6-5 2 Protenas que inician la replicacin del DNA. Se indican los principales tipos de protenas que participan en la formacin de la horquilla de replicacin en el origen de replicacin de E. coli y del bacterifago lambda. El conocim iento de los mecanismos que aqu se indican se obtuvo de estudios in vitro mediante la utilizacin de mezclas de protenas altamente purificadas. Las etapas posteriores generarn la iniciacin de tres cadenas ms de DNA (vase Figura 6-51) mediante un mecanism o que todava no est aclarado. Para la replicacin de E. coli, la protena de iniciacin es la protena dnaA y el primosoma est compuesto por las protenas dnaB (DNA helicasa) y dnaG (RNA primasa).

DNA polimerasa

en una regin adyacente a la hlice. Tambin se une la DNA primasa formando un primosoma, el cual se desplaza a partir del origen y genera un cebador de RNA que inicia la primera cadena de DNA. Rpidamente, las otras protenas se ensamblan formando dos complejos proteicos de replicacin que se desplazan a partir de este origen en direcciones opuestas (vase Figura 6-51); as, se continua sintetizando DNA hasta que se ha replicado todo el DNA patrn de cada horquilla. En el Captulo 8 se discute en detalle la iniciacin de la horquilla de replica cin en los cromosomas de eucariotas.

Las DNA topoisom erasas evitan que el DNA se enrede durante la replicacin 36
Cuando hemos descrito (de forma incorrecta) la hlice de DNA como una escale ra plana, hemos ignorado el problema del enrollamiento y empaquetamiento que se presenta durante la replicacin del DNA. Cada 10 pares de bases replicadas en la horquilla corresponden a una vuelta completa del DNA que se replica alrede dor del eje de la doble hlice. Por consiguiente, para que la horquilla de replica cin pueda desplazarse, todo el cromosoma que se halla por delante de la horqui lla tendra que girar rpidamente (Figura 6-53), lo cual exigira la utilizacin de grandes cantidades de energa para el caso de los cromosomas largos. Durante la replicacin del DNA se utiliza una estrategia alternativa: unas protenas conocidas como DNA topoisom erasas forman un eslabn giratorio en la hlice del DNA. Puede pensarse que una DNA topoisomerasa es una especie de nucleasa re versible que se une covalentemente a un fosfato del DNA rompiendo un enlace fosfodister de una cadena del DNA. Dado que el enlace covalente que une la to poisomerasa al fosfato del DNA retiene la energa del enlace fosfodister roto, la reaccin de rotura es reversible; la nueva formacin del enlace fosfodister es r pida y no requiere ningn aporte adicional de energa. En este aspecto el m eca nismo de unin es diferente al que presenta la enzima DNA ligasa, que hemos discutido previamente (vase Figura 6-37).

Figura 6-53 El problem a del enrollamiento que aparece durante el proceso de replicacin del DNA. Si se trata de una horquilla de replicacin bacteriana que se desplaza a 500 nucletidos por segundo, la hlice paterna de DNA, anterior a la horquilla, ha de girar a 50 revoluciones por segundo.

278

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

un extrem o de la doble hlice del DNA no puede girar en relacin al otro extrem o

Figura 6 -5 4 Reaccin reversible de form acin de una m uesca en el DNA, catalizada por una enzima DNA topoisom erasa I eucariota. Tal como se indica, estas enzimas forman un enlace covalente transitorio con el DNA, permitiendo as la libre rotacin alrededor del enlace covalente unido al fosfato azul.

DNA topoisom erasa de tipo I con una tirosina en su lugar activo

la DNA topoisom erasa se une de form a covalente con un fosfato del DNA, rom piendo asi un enlace fosfodister de una de las cadenas del DNA

ahora, los dos extrem os de la doble hlice del DNA pueden girar uno respecto al otro, disipando as la tensin acumulada

la energa del enlace fosfodister original se almacena en el enlace fosfotirosina, lo cual hace que la reaccin sea reversible

P < P > |j5<P>

- -lt<p} JL{P)Jfc{>d

(P>

<P)

K p>

espontneam ente se vuelve a form ar el enlace fosfodister, regenerndose tanto la hlice de DNA com o la DNA topoisom erasa no alterada

<pJL ( H M kEH Un tipo de topoisomerasa (la topoisomerasa I) genera una rotura en una sola cadena (o una muesca o nick) que permite a las dos secciones de la hlice del DNA a cada lado de la muesca girar libremente una respecto a otra utilizan do como lugar de giro el enlace fosfodister de la cadena opuesta a la que se ha producido la muesca (Figura 6-54). Cualquier tensin que se genere en la hlice de DNA dirigir la rotacin en la direccin en la que esta tensin se disipe. Como

Mecanismos de replicacin del DNA

2 79

resultado de ello, la replicacin del DNA podr ocurrir con la rotacin de nica mente un corto tramo de hlice -la zona que se halla justo por delante de la hor quilla. El problem a anlogo a ste que aparece durante la transcripcin del DNA, se resuelve de una forma similar a la descrita. Un segundo tipo de DNA topoisomerasa (la topoisomerasa II) forma una unin covalente con ambas cadenas de la hlice de DNA al mismo tiempo, ge nerando transitoriamente una rotura en las dos cadenas del DNA. Estas enzimas se activan por determinadas zonas del cromosoma en las que dos dobles hlices se cruzan entre s. Cuando la topoisomerasa se une a un lugar de cruce como ste, (1) rompe una de las dobles hlices, de forma reversible, generando una puer ta, (2) hace que la otra doble hlice pase a travs de esta rotura, y (3) vuelve a unir las cadenas de DNA que haba roto y se separa del DNA. De esta forma, las DNA topoisomerasas de tipo II pueden separar de forma eficiente dos crculos de DNA entrelazados (Figura 6-55). Esta misma reaccin evita que se generen los graves problemas de embrollamiento que, de otra forma, apareceran durante la replicacin del DNA. Por ejemplo, se han aislado unas clulas de levadura mutantes que producen, en lugar de la topoisomerasa II normal, una versin que se inactiva a 37C. Cuando las levaduras mutantes se calientan hasta esta tem pera tura, sus cromosomas se entrelazan de forma que en el proceso de la mitosis no pueden separarse. La utilidad de la topoisomerasa II para desenmaraar los cro mosomas puede ser fcilmente comprendida por cualquiera que haya intentado deshacer un lo de un hilo de pescar sin la ayuda de unas tijeras.

dos dobles hlices de DNA circular estn entrelazadas

una DNA topoisom erasa de tipo II se une de manera covalente y reversible a las dos cadenas del DNA, interrum piendo la doble hlice verde y generando una "pu erta" proteica

la puerta de la topoisom erasa se abre y se cierra, dejando pasar la otra hlice de DNA

La replicacin del DNA en los eucariotas es bsicam ente similar a la de los procariotas 37
La mayora de lo que conocemos respecto a la replicacin del DNA procede de es tudios sobre sistemas multienzimticos purificados a partir de bacterias y de bac terifagos, que son capaces de realizar in vitro la replicacin del DNA. El desarro llo de estos sistemas en los aos 1970 fue facilitado en gran manera gracias a la disponibilidad de mutantes en diversos genes de replicacin que pudieron utili zarse para identificar y purificar las correspondientes protenas de replicacin. Mucho menos es lo que se conoce acerca de los detalles de la enzimologa de la replicacin del DNA en eucariotas, sobre todo debido a lo difcil que resulta obtener mutantes deficientes en procesos de replicacin. Sin embargo, los m e canismos bsicos de la replicacin del DNA, incluyendo la geometra de la hor quilla de replicacin y los com ponentes de la mquina de replicacin multiproteica, son similares en los eucariotas y en los procariotas (vase Figura 8-35). La principal diferencia estriba en que el DNA eucariota no se replica en forma de DNA desnudo sino en forma de cromatina, en la cual el DNA est estrechamente asociado a unas protenas denominadas histonas. Tal como se describe en el Ca ptulo 8, estas histonas forman unas estructuras parecidas a discos sobre las que se enrolla el DNA eucariota, generando una unidad estructural repetitiva deno minada nucleosoma. Los nucleosomas estn distribuidos a lo largo del DNA, a intervalos de 200 pares de bases, lo cual puede explicar por qu en los eucariotas los fragmentos de Okazaki se sintetizan sobre la cadena retrasada a intervalos de entre 100 y 200 nuclotidos en lugar de a intervalos de entre 1000 y 2000 nucletidos como ocurre en las bacterias. Los nucleosomas tambin pueden actuar como barreras que frenan ligeramente el movimiento de las molculas de DNA polimerasa, lo cual puede explicar por qu las horquillas de replicacin se des plazan a una dcim a parte de la velocidad a la que se desplazan las horquillas de replicacin en las bacterias.

las 2 dobles hlices de DNA circular se han separado

la reacin inversa de la unin covalente de la topoisom erasa restaura una doble hlice intacta

Figura 6 -55 DNA topoisom erasa II. Ejemplo de una reaccin de paso a travs de la hlice de DNA, catalizada por una topoisomerasa de tipo II. A diferencia de la topoisomerasa de tipo I, estas enzimas requieren la hidrlisis de ATP, y algunas de ellas puede introducir en el DNA tensin superhelicoidal (vase pg. 468). En eucariotas las topoisomerasas de tipo II se hallan exclusivamente en clulas proliferantes; en parte por esta razn, se utilizan como populares dianas para frmacos anticancerosos.

Resumen
Una DNA polim erasa autocorrectora cataliza la polim erizacin d e nucletidos en direccin 5 a 3 copiando un patrn d e DNA con una fid elid a d notable. Puesto qu e las dos cadenas d e una doble h lice d e DNA son antiparalelas , esta sntesis 5 a 3

280

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

d el DNA slo p u ed e o cu rrir d efo rm a continua en una d e las dos cadenas (la cadena conductora) d e la horquilla d e replicacin. E n la cadena retrasada se sintetizan p e queos fragm en to s d e DNA m ediante un proceso d e pesp u nte. D ebido a q u e la DNA polim erasa autocorrectora no p u ed e iniciar la sntesis d e una cadena d e DNA, estos fragm en to s d e DNA sobre la cadena retrasada se inician m ediante cortas m o lculas d e cebador d e RNA, las cuales sern elim inadas m s tarde y substituidas p o r DNA. La replicacin d el DNA req u iere la cooperacin d e m uchas protenas, en tre las cuales se en cu en tra n : (1) una DNA polim erasa y una DNA prim asa, q u e catalizan la polim erizacin d e nuclesidos trifosfato, (2) DNA belicosas y protenas desestabilizadoras d e la hlice, q u e colaboran en a b rir la h lice d e DNA q u e se va a copiar, (3) una DNA ligasa y una enzim a q u e degrada los cebadores d e RNA, uniendo los fragm entos d e DNA d e la cadena retrasada sintetizados d e fo rm a discontinua, (4) u na DNA topoisom erasa q u e actan solventando problem as d e enrollam iento y en m araam iento d e la hlice, y (5) protenas iniciadoras q u e se u n en a secuencias d e term inadas d e DNA en el origen d e la replicacin y catalizan la form acin d e una horquilla d e replicacin en este lugar. En el luga r d e origen d e la replicacin, se fo r m a u na estructura protena-DNA especializada q u e entonces carga una DNA b eli cosa sobre el DNA patrn. Entonces se agregan otras protenas fo rm a n d o u na m qu in a d e replicacin m ultienzim tica, q u e cataliza la sntesis d el DNA.

Recombinacin gentica38
En las dos secciones anteriores hemos estudiado los mecanismos a travs de los cuales las secuencias de DNA de las clulas se mantienen con muy pocos cam bios, de generacin en generacin. A pesar de que esta estabilidad gentica es crucial para la supervivencia a corto plazo, a largo plazo la supervivencia de los organismos puede depender de la variacin gentica, mediante la cual la clula puede adaptarse a las variaciones del ambiente. As, una propiedad importante del DNA en las clulas es su capacidad de xperimentar reordenaciones que pueden hacer variar tanto las com binaciones particulares de genes que se hallan presentes en el genoma de cualquier individuo como el programa y el nivel de expresin de estos genes. Estas reordenaciones de DNA estn generadas m e diante la recom binacin gentica. Se conocen dos grandes tipos de procesos de recom binacin gentica: la recom binacin general y la recom binacin especfi ca de lugar. En la recombinacin general, el intercambio gnico se produce entre se cuencias homologas del DNA, generalmente localizadas sobre dos copias del mismo cromosoma. Uno de los ejemplos ms importantes al respecto es el in tercambio de secciones entre cromosomas homlogos en el transcurso de la meiosis. Este entrecruzamiento (crossing-over) se produce entre crom oso mas que se hallan estrechamente superpuestos durante las primeras etapas de la formacin de vulos y espermatozoides (se estudia en el Captulo 20), y per mite que diferentes versiones (alelos ) del mismo gen se presenten y sean proba das en com binacin con otros genes, lo cual increm enta la posibilidad de que por lo menos algunos miembros de una poblacin sobrevivan en un ambiente cambiante. A pesar de que la meiosis slo se produce en los eucariotas, la venta ja de este tipo de intercambio de genes es tan grande que el apareamiento y la reordenacin de los genes mediante la recom binacin general se han extendido tambin a las bacterias. La recombinacin especfica de lugar no se produce nicamente entre DNA homlogos. Por el contrario, el intercambio se produce entre cortas secuencias de nucletidos (sobre una o ambas molculas de DNA que participan) reconoci das especficamente por una enzima de recom binacin especfica de lugar. As pues, la recom binacin especfica de lugar altera las posiciones relativas de las secuencias de nucletidos en los genomas. En algunos casos, estos cambios es tn diseados y organizados, tal como ocurre cuando un virus bacteriano inte-

dos dobles hlices hom ologas de DNA

m olculas de DNA que se han entrecruzado

Figura 6-56 Recombinacin general. La rotura y nueva unin de dos dobles hlices homlogas da lugar a dos molculas de DNA entrecruzadas.

Recombinacin gentica

281

grado en un crom osom a bacteriano es inducido a dejar el cromosoma bajo con diciones de estrs (vase Figura 6-80); en otros casos, los cambios son aleatorios, como sucede cuando la secuencia de DNA de un elemento transponible se in serta de forma aleatoria en un lugar del cromosoma. Al igual que para la replicacin del DNA, la mayor parte de lo que sabemos acerca de la bioqumica de la recom binacin gentica procede de estudios reali zados sobre organismos sencillos, especialmente sobre E. coli y sobre virus.

m olculas de DNA que se han entrecruzado

La recom binacin general est guiada por interacciones de apareamiento de bases entre cadenas complementarias de dos molculas homologas de DNA39
La recom binacin general implica la existencia de unos intermediarios del in tercambio entre cadenas de DNA, difciles de entender. A pesar de que la va exacta que se sigue en el proceso de recom binacin general puede ser ligera mente distinta en organismos diferentes, detallados anlisis genticos de virus sobre el apareamiento de bacterias y de hongos sugieren que el resultado gene ral de este proceso de recom binacin siempre es el mismo: (1) dos molculas homologas de DNA se entrecruzan, es decir, sus dobles hlices se rompen y los dos extremos rotos se unen con los extremos opuestos formando de nuevo dos dobles hlices intactas, pero cada una de ellas compuesta por partes de cada una de las dos molculas iniciales de DNA (Figura 6-56). (2) El lugar de inter cambio (es decir, el lugar de la Figura 6-56 en el que la doble hlice de color rojo se une a la doble hlice verde) se puede producir en cualquier lugar de la secuen cia de nucletidos de las dos molculas de DNA que participan en el proceso. (3) En el lugar de intercambio, una cadena de una de las molculas de DNA queda unida mediante apareamiento de bases a la otra molcula de DNA, generndose

unin heterodplex, donde las cadenas procedentes de dos hlices de DNA diferentes form an Dares de bases
Figura 6-57 Una unin heterodplex. Esta estructura junta dos molculas de DNA en el lugar donde se han entrecruzado. Este tipo de unin tiene, a menudo, varios cientos de nucletidos de longitud.

protena recBCD
+

llllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll iiim im iiiM iiim iiim iiM iiiiim i UNIN AL FINAL DE LA DOBLE HLICE Y POSTERIOR DESPLAZAMIENTO m inim i)' ........ ........m i.............m im m i......................i.......... m im ili.............i..... ninn \ lugar de reconocim iento lazo de cadena sencilla de DNA, que se va desplazando ROTURA POR LA SECUENCIA DE RECONOCIMIENTO
Figura 6 -58 Una form a de iniciar un proceso de recom binacin. La RecBCD es una enzima necesaria para que se produzca la recom binacin general en E. coli. La protena entra en el DNA desde uno de sus extremos y, entonces, utiliza energa derivada de la hidrlisis de molculas de ATP que se hallan unidas para autopropulsarse en una direccin determinada a lo largo del DNA a una velocidad aproximada de unos 300 nucletidos por segundo. En un lugar especial de reconocim iento (una secuencia de DNA de 8 nucletidos desperdigada por el cromosom a de E. coli) se corta el lazo que ha sido generado por la protena recBCD y que se va desplazando, y entonces, tal com o se muestra en la figura, se genera un pelo monocadena que sobresale de la doble hlice. Este pelo puede iniciar el proceso de recom binacin gentica aparendose con una hlice homologa (vase Figura 6-59).

n yr \

........ m im i...............il1" .......m im im i................................m in...... i..... uni.......ninnimi

5'/^
3'

DESPLAZAMIENTO DEL "PELO" DE UNA SOLA CADENA

i........................................... ..................................... 5'

3'
282 Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

EE
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EE
ii muesca ii
____

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____ ____

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ii intercam bio inicial entre cadenas
... _

una de las cadenas queda al descubierto

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-l i n i 1111L

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una unin solapada (que normalmente se denomina unin heterodplex ) entre las dos dobles hlices (Figura 6-57). La regin heterodplex puede tener una longitud de varios cientos de bases apareadas; ms adelante se explicar cmo se forman estas uniones. (4) En el lugar de intercambio no se altera la secuencia de nucletidos; el proceso de rotura y unin ocurre de una forma tan precisa, que ni se pierde ni se gana un slo nucletido. A pesar de esta precisin la re com binacin general crea molculas de DNA cuya secuencia es nueva: la unin heterodplex puede contener un pequeo nmero de errores en el apareamien to de bases, y lo que es ms importante, habitualmente los dos DNA que se en trecruzan no son exactam ente el mismo a cada lado de la unin. El m ecanism o general de recom binacin asegura que slo se produzcan in tercam bios entre dos regiones de doble hlice de DNA que presenten secuencias notablem ente homlogas. La formacin de una unin heterodplex requiere esta homologa ya que en ella participa una larga regin de apareamiento entre bases complementarias entre una cadena de una de las dobles hlices originales y una cadena de la otra doble hlice. Pero, cmo se forma esta regin heterod plex y cmo se reconocen entre s las dos regiones del DNA en la zona de entrecruzamiento? Por lo que sabemos, el proceso de reconocimiento ocurre median te interacciones directas de apareamiento de bases. La formacin de pares de bases entre cadenas complementarias de dos molculas de DNA dirige el proceso de recom binacin general, permitiendo que ste ocurra nicamente entre largas regiones de DNA cuyas secuencias se hallen apareadas.

Figura 6 -59 El intercam bio inicial de cadenas entre dos dobles hlices homlogas de DNA que estn sufriendo un proceso de recom binacin general. La formacin de una muesca en una cadena del DNA libera dicha cadena, la cual invade la segunda hlice y forma una corta regin de apareamiento entre bases. Solamente pueden aparearse de esta forma, y por lo tanto iniciar un proceso de recom binacin general, dos molculas de DNA cuya secuencia de nucletidos sea com plementaria. Se sabe que existen algunas enzimas que pueden catalizar cada uno de los pasos mostrados en la figura (vanse Figuras 6-58 y 6-62).

in n i

La recom binacin general puede iniciarse en una m uesca de una cadena de la doble hlice de DNA4 0
Cada una de las dos cadenas de una molcula de DNA se halla enrollada de for ma helicoidal alrededor de la otra. Por consiguiente, solamente se pueden pro ducir largas interacciones entre bases de dos dobles hlices si primero se genera una muesca (nick) en una cadena de una de ellas que permita los procesos de desenrollamiento y nuevo enrollamiento de las cadenas, procesos necesarios para que se produzca un heterodplex con otra molcula de DNA. Por esta m is ma razn, cualquier intercambio de cadenas entre dos dobles hlices de DNA re quiere al m enos dos muescas, una en una de las cadenas de cada una de las dos dobles hlices que interactan. Finalmente, para que se produzca la unin hete rodplex que se muestra en la Figura 6-57, cada una de las cuatro cadenas pre sentes se ha de cortar para que pueda unirse a otra cadena diferente. En la re com binacin general, estos procesos de formacin de las muescas y nueva unin estn coordinados de forma que nicamente se producen cuando se ha llan presentes dos hlices de DNA que presentan dos largas regiones de secuen cia complementaria. A partir de diferentes fuentes resulta evidente que para que se inicie el pro ceso de recom binacin general es suficiente con que se produzca una sola

Recombinacin gentica

M i M lllll

111 11

m i m i m i m i

.........

m i n

283

muesca en una cadena de una molcula de DNA. Por ejemplo, agentes qumicos o tipos de radiacin que introducen una muesca en una cadena, desencadenan un proceso de recom binacin gentica. Adems, se ha demostrado que una de las protenas especiales que son necesarias para que se produzca la recom bina cin en E. coli -la protena RecBCD- produce muescas en las cadenas sencillas de las molculas de DNA. La protena RecBCD tam bin es una DNA helicasa que hidroliza ATP y se desplaza a lo largo de la hlice de DNA exponiendo tran sitoriamente sus cadenas. Combinando sus actividades nucleasa y helicasa, la protena RecBCD genera un pelo de una sola cadena en la doble hlice de DNA (Figura 6-58). En la Figura 6-59 se muestra de qu forma este pelo puede iniciar una interaccin de apareamiento de bases entre dos dobles hlices com plementarias que se hallen estiradas.

Las reacciones de hibridacin del DNA proporcionan un modelo sencillo para la fase de apareamiento de bases en la recom binacin general 41
En su forma ms sencilla, la reaccin central de apareamiento de bases de la re com binacin general puede ser simulada en un tubo de ensayo permitiendo que una doble hlice de DNA se forme de nuevo a partir de sus cadenas separadas. Este proceso, denominado renaturalizacin del DNA o hibridacin del DNA tie ne lugar cuando una rara colisin al azar yuxtapone secuencias nucleotdicas complementarias de dos cadenas sencillas de DNA, lo cual permite la formacin de una corta zona de doble hlice entre ellas. Este proceso relativamente lento de nucleacin de la hlice viene seguido de un proceso en cremallera muy r pido, en el que la doble hlice crece aumentando al mximo el nmero de inter acciones entre pares de bases (Figura 6-60). La formacin, de esta manera, de una doble hlice requiere que las cadenas de DNA se hallen en una conformacin abierta, desplegada. Por esta razn, las reacciones de hibridacin in vitro se desarrollan a elevadas temperaturas o en presencia de disolventes orgnicos como la formamida; estas condiciones per miten fundir las cortas hlices en horquilla que se forman cuando se producen interacciones entre pares de bases en una cadena que se pliega sobre s misma. Las clulas bacterianas no pueden soportar condiciones tan severas como stas, por lo que para abrir las hlices utilizan una protena desestabilizadora de la h lice, la protena SSB. Esta protena es esencial en E. coli tanto para la replicacin del DNA com o para la recom binacin general; se une fuertemente de forma co operativa al esqueleto de azcar-fosfato de cualquier regin de una sola cadena de DNA, colocndola en una conformacin extendida con sus bases asequibles, (vase Figura 6-46), En esta conformacin extendida, una cadena de DNA puede formar pares de bases tanto con una molcula de nuclesido trifosfato (en el

Figura 6 -60 Hibridacin del DNA. Se vuelven a formar dobles hlices de DNA a partir de sus cadenas separadas a travs de reacciones que dependen de la colisin al azar de dos cadenas complementaras (vase pg. 322). Muchas de estas colisiones no son productivas, com o se muestra a la izquierda, pero algunas de ellas dan lugar a cortas regiones en las que se producen apareamiento entre bases (nucleacin del DNA). Entonces, un rpido proceso en crem allera com pleta cada hlice. Cada cadena de DNA puede utilizar este proceso de prueba y error para encontrar su pareja com plementaria entre los millones de cadenas de DNA no apareadas. Al parecer, todos los procesos de recom binacin general se inician mediante un reconocim iento de cadenas complementarias mediante este sistema de prueba y error.

284

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

Figura 6-61 Estructura de la proteina RecA. Se muestra una cadena de tres monmeros de RecA, con la posicin del ATP marcada en rojo. Las esferas b lan ca s muestran las posiciones posibles que ocupan los filamentos de DNA de cadena sencilla, de forma que cada tres nucletidos (tres esferas) interaccionarian con cada monmero de RecA. (De R.M. Story, I.T. W eber y T.A. Steitz. N ature 256:318-325,1992. 1992 Macmillan Magazines Ltd.)

proceso de replicacin del DNA) como con secciones complementarias de otra cadena de DNA (en el proceso de recom binacin gentica). Cuando las reaccio nes de hibridacin se desarrollan in vitro bajo condiciones que reproducen las del interior de la clula, la pro tena SSB acta a una velocidad 1000 veces supe rior a la de la nucleacin de la hlice de DNA, esto es, a la velocidad general del proceso de formacin de la doble hlice.

La protena RecA permite a una molcula de una sola cadena de DNA aparearse con una regin homloga de una doble hlice en E. c o li 42
El proceso de recom binacin gentica general es algo ms complejo que las sim ples reacciones de hibridacin descritas anteriormente. En el curso de la recom binacin general una hebra de DNA derivada de una doble hlice puede invadir otra doble hlice (vase Figura 6-59). En E. coli, este proceso requiere la partici pacin de la protena RecA, producida por el gen recA, gen que en 1965 fue iden tificado como esencial para la recom binacin entre cromosomas. Largamente perseguido por los bioqumicos, en 1976 este escurridizo producto gnico fue fi nalmente purificado hasta homogeneidad y pudo ser caracterizado en detalle (Figura 6-61). Como protena desestabilizadora de la doble hlice (SSB), la protei na RecA se une fuertemente a una cadena de DNA, formando agregados alta mente cooperativos, dando lugar a un filamento nucleoproteico. Este filamento tiene algunas propiedades caractersticas. Por ejemplo, tiene ms de un lugar de unin al DNA, por lo que puede unirse simultneamente y m antener juntas a una cadena sencilla y a una doble hlice de DNA. Estos lugares permiten a la protena RecA catalizar una reaccin de varias etapas (denominada sinapsis) entre una doble hlice de DNA y una regin homloga de una cadena de DNA. La etapa crucial de la sinapsis ocurre cuando una regin de homologa es identi ficada mediante un apareamiento inicial de bases entre secuencias complemen tarias de nucletidos. En este caso en la etapa de nucleacin participa una es tructura de triple cadena en la que el DNA de cadena sencilla forma aparea mientos no habituales de bases con el surco mayor del DNA de doble hlice (Figura 6-62). Esta interaccin inicia al proceso de apareamiento mostrado previamente en la Figura 6-59, y de esta forma inicia el intercam bio de cadenas entre dos dobles hlices recom binantes de DNA. Diversos estudios in vitro su gieren que la proteina SSB de E. coli coopera con la protena RecA facilitando estas reacciones.

Recombinacin gentica

285

DNA DE ENTRADA

estructura de tres hebras

Una vez se ha producido el proceso de sinapsis, la corta regin heterodplex formada por cadenas procedentes de dos molculas diferentes de DNA se alarga mediante una migracin de las cadenas dirigida por una protena, que tambin est catalizada por la protena RecA. La migracin de la bifurcacin o de las ca denas (branch migration) puede producirse en cualquier punto en el que dos cadenas sencillas de DNA de la misma secuencia intenten emparejarse con la misma cadena complementaria; una regin no apareada de una de las cadenas sencillas de DNA desplazar a otra cadena sencilla que se halle apareada, de for ma que el punto de la bifurcacin se desplazar sin que vare el nmero total de pares de bases del DNA. El punto de bifurcacin tiende a desplazarse espont neam ente en ambas direcciones, de forma que no resultara sencillo que el pro ceso de recom binacin se completara de forma eficiente (Figura 6-63A). Debido a que la protena RecA cataliza la migracin unidireccional del punto de bifurca cin, fcilmente se produce una regin heterodplex de varios cientos de pares de bases de longitud (Figura 6-63B). La catlisis de la migracin de la bifurcacin depende de otra propiedad de la protena RecA. Adems de presentar dos lugares de unin al DNA, la protena RecA es una ATPasa DNA-dependiente con un lugar adicional para unir e hidrolizar ATP. Cuando la protena est unida a ATP se asocia mucho ms fuertemen te con DNA que cuando est unida a ADP. Adems, las molculas RecA unidas a ATP se unen preferentem ente a un extremo de un filamento de protenas RecA, y entonces el ATP se hidroliza a ADP. Los filamentos de protenas RecA que se forman sobre el DNA pueden entonces presentar muchas de las propiedades di nm icas de unin que presentan los filamentos del citoesqueleto formados a partir de actina o de tubulina (discutidas en el Captulo 16); por ejemplo, esta ca dena proteica presenta la habilidad de girar como una noria, de forma unidirec cional, a lo largo de una cadena de DNA, lo cual puede dirigir la reaccin de mi gracin de la bifurcacin, tal como se muestra en la Figura 6-63B.

Figura 6-62 Sinapsis de DNA catalizada por la protena RecA. Experimentos in vitro indican que entre estructuras de una sola cadena de DNA recubierta de protenas RecA {rojo) y una doble hlice {verde), se forman diferentes tipos de complejos. En primer lugar, se forma un complejo sin que se produzca apareamiento de bases que se transforma en un complejo con apareamiento de bases en cuanto se encuentra una regin de secuencia homologa. Probablemente este com plejo es inestable ya que est formado por una forma de DNA poco usual, y genera un DNA heterodplex (una hebra verde y la otra roja) ms una hebra sencilla desplazada de la hlice original {verde); as, la estructura mostrada en este diagrama migra hacia la izquierda enrollando el DNA de entrada y produciendo el DNA de salida. El resultado neto es un intercambio de hebras idntico al descrito anteriorm ente en la Figura 6-59. (Adaptado de S.C. West, Annu. Rev. B iochem . 61:603-640, 1992. Annual Reviews Inc.)

5' 5' 3'

3' 3' 5'

llllllllllllllllllllllllllr.lUIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII

5'

3' ^ rffTTrrn1111rrrnn 111111ntffl direccin del ensamblaje de las protenas RecA 3'

i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i !i i li il i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i

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(A) MIGRACIN ESPONTNEA DE LAS CADENAS

(B) MIGRACIN DIRIGIDA POR PROTENA

Figura 6 -63 Dos tipos de migracin de las cadenas, observados en experimentos in vitro. (A) La migracin espontnea es un tipo de proceso en el que las cadenas se mueven arriba y abajo, de forma aleatoria, con lo que progresa muy poco sobre distancias largas. Por el contrario, la migracin dirigida por la protena RecA (B) se produce a una velocidad uniforme y en una sola direccin; puede estar dirigida por el ensamblaje polarizado del filamento de protenas RecA sobre la cadena sencilla de DNA, la cual ocurre en la direccin indicada. Adems, en la recombinacin participan helicasas que catalizan la migracin de cadenas dirigida por protenas, incluso cn ms eficiencia.

286

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

La recom binacin gentica general habitualm ente supone un intercam bio cruzado de cadenas o entrecruzamiento 43
Parece que el paso ms difcil y ms lento del proceso de recom binacin gnica general es el intercambio de una cadena sencilla entre las dos dobles hlices (vase Figura 6-59). Tras este intercambio inicial, parece que la ampliacin de la regin de apareamiento y el establecimiento de otros intercambios entre cade nas de las dos dobles hlices que se hallan en estrecho contacto son procesos r pidos. Durante estos procesos, a menudo se produce la eliminacin de una pe quea cantidad de nucletidos y la resntesis local de DNA, de forma parecida a como ocurre en los procesos de reparacin del DNA. Debido al elevado nmero de posibilidades que pueden darse, es fcil que diferentes organismos puedan seguir diferentes pasos en este punto. En la mayora de los casos, sin embargo, se forma una importante estructura intermediaria, un in te rc a m b io c ru z a d o d e c a d e n a s o e n tre c r u z a m ie n to (cross-strand exchange), en la que participan las dos hlices de DNA. En la Figura 6-64 se muestra una de las vas ms sencillas a travs de la cual se puede formar esta estructura. En el intercambio cruzado de cadenas (tambin denominado unin de Holliday ) las dos hlices homologas de DNA que inicialmente se aparearon se mantienen unidas mediante el intercambio mutuo de dos de las cuatro cadenas presentes, una de cada hlice. Para mantener esta estructura no es necesario que se rompan pares de bases; la estructura presenta dos propiedades impor tantes: (1) el punto de intercambio entre las dos dobles hlices homologas de DNA (en la Figura 6-64, el lugar donde las dos cadenas se cruzan) puede migrar rpidamente en una u otra direccin siguiendo las hlices, mediante una migra cin de doble cadena; (2) el intercambio cruzado de cadenas consta de dos pares de cadenas: uno de cadenas cruzadas y el otro de cadenas no cruzadas. Sin em bargo, la estructura puede isomerizar al sufrir la serie de movimientos de rota cin que se muestran en la Figura 6-65, de forma que las dos cadenas que origi nalmente no se entrecruzaban ahora s que se entrecruzan, y viceversa. Con el fin de regenerar dos hlices de DNA separadas y de concluir as el proceso de apareamiento, las dos cadenas entrecruzadas se han de cortar. Si las dos cadenas entrecruzadas se cortan antes de la isomerizacin del entrecru zamiento, las dos hlices originales de DNA se separan en forma casi inaltera da, habindose intercam biado un fragmento muy corto de DNA de una sola ca dena. Sin embargo, si las dos cadenas entrecruzadas se cortan despus del proceso de isomerizacin, un trozo de cada una de las dos hlices originales quedar unido, mediante una unin heterodplex, a una zona de la otra hlice de DNA: en otras palabras, las dos hlices de DNA se habrn entrecruzado (va se Figura 6-65). La isomerizacin de las cadenas cruzadas puede ocurrir espontneamente a una cierta velocidad, pero tambin puede estar dirigida enzimaticamente o re gulada por las clulas de alguna otra forma. Probablemente, durante la meiosis se produce algn tipo de control, cuando las dos dobles hlices de DNA que se emparejan se constrien en una elaborada estructura denominada complejo sinaptonmico (como se discute en el Captulo 20).

dos hlices hom ologadas de DNA

i FORMACIN DE UNA I MUESCA E INTERCAMBIO DE CADENAS

FORMACIN DE UNA I MUESCA E INTERCAMBIO DE CADENAS

I UNIN DE LAS CADENAS ROTAS

dos m olculas de DNA unidas por un entrecruzam iento de cadenas

Figura 6 -64 Form acin de un entrecruzam iento de cadenas. Existen muchas vas diferentes que pueden conducir desde un entrecruzamiento entre cadenas (vase Figura 6-59) a un intercambio de cadenas, aunque en la figura se muestre una sola de ellas.

La conversin gnica se produce combinando procesos de recom binacin general y de sntesis limitada de DNA44
Una ley fundamental de la gentica dice que la contribucin gentica de cada uno de los padres al hijo es idntica: se hereda un juego completo de genes del padre y otro de la madre. As, cuando una clula diploide entra en meiosis produciendo cuatro clulas haploides (vase Captulo 20), exactamente la mitad de los genes de estas clulas han de proceder de la madre (los genes que la clula diploide hered de la madre) y la otra mitad, del padre (los genes que la clula di ploide hered del padre). En un animal pluricelular, como es el caso del hombre, no es posible com probar directam ente si se cumple esta prediccin, pero en

Recombinacin gentica

287

Figura 6-6 5 Isomerizacin de un entrecruzam iento de cadenas. Si no se ha producido la isomerizacin, el corte de las dos cadenas cruzadas finaliza el intercam bio sin que se haya producido entrecruzamiento. Si se produce isomerizacin (etapas B y C), el proceso de corte de las dos cadenas produce dos molculas de DNA que se han entrecruzado (abajo). Por consiguiente, se cree que la isomerizacin es necesaria para que el proceso de rotura y nueva unin de dos dobles hlices homlogas de DNA d lugar a una recom binacin general. La etapa A ya se ha ilustrado antes (vase Figura 6-64).

cos crom osom as hom logos

otros organismos, como en los hongos, en los que es posible recuperar y anali zar cada una de las cuatro clulas hijas producidas por meiosis a partir de una nica clula, se pueden encontrar m uchos casos en los que aparentemente se han violado las reglas genticas estndar. Por ejemplo, ocasionalmente la m eio sis produce tres copias de la versin materna (alelos) de un gen y una sola copia del alelo paterno, lo cual pone de manifiesto que una de las dos copias del alelo paterno ha sido cambiada a una copia del alelo materno. Este fenmeno se co noce com o conversin gnica. A menudo ocurre en asociacin con los procesos de recom binacin gentica general, y se cree que es importante en la evolucin de ciertos genes (vase Figura 8-74). Parece ser que la conversin gnica tiene unas consecuencias directas sobre los mecanismos de recombinacin general y de reparacin del DNA. Durante la meiosis, se forman uniones heterodplex en los lugares de entrecruzamiento de crom osom as homlogos maternos y paternos. Si las secuencias m aternas y paternas son ligeramente diferentes, la unin heterodplex puede incluir algunos errores de apareamiento de bases. Estos errores en la doble hli ce pueden ser corregidos por la maquinaria de reparacin del DNA, la cual pue de eliminar los nucletidos de la cadena paterna y reemplazarlos por nucletidos com plem entarios a los de la cadena materna, o viceversa. La consecuencia de ese sistema de reparacin ser una conversin gnica. Tambin se puede dar una conversin gnica mediante otros mecanismos, pero todos ellos requieren la existencia de algn tipo de proceso de recom binacin que una entre s dos co pias de dos secuencias de DNA fuertemente relacionadas. Debido a que se gene ra una copia extra de una de las dos secuencias de DNA, en el proceso tambin ha de participar una pequea parte de biosntesis de DNA. Estudios genticos muestran que norm alm ente la conversin gnica afecta a pequeas zonas de DNA, y que en m uchos casos nicamente se cam bia una parte de un gen. La conversin gnica tam bin puede ocurrir en clulas en mitosis, aunque esto slo se produce raramente. Tal como ocurre en clulas en meiosis, proba blem ente los procesos de conversin gnica que se producen en las clulas en mitosis aparecen com o consecuencia de procesos de reparacin de aparejamiento de bases en el DNA heterodplex. En la Figura 6-66 se ilustra otro m eca nismo que probablem ente se produce en clulas en mitosis y en clulas en meiosis.

FORMACIN DE UNA ESTRUCTURA DE INTERCAMBIO DE CADENAS CRUZADAS

D I CORTE DE LAS DOS j CADENAS DE DNA CRUZADAS

Los m ecanism os de correccin de errores pueden evitar la recom binacin gentica promiscua entre dos secuencias de DNA mal apareadas 45
Como hemos discutido antes, la recom binacin general se dispara cuando dos cadenas de DNA de secuencia complementaria se emparejan formando un hete rodplex entre dos dobles hlices (vase Figura 6-64). Experimentos llevados a cabo in vitro con proteina RecA purificada muestran que puede ocurrir el em pa rejamiento de forma eficiente incluso cuando las secuencias del DNA no se apa reen bien -p or ejemplo, cuando slo un promedio de cuatro de cada cinco nu cletidos formen parejas de bases. Siendo as, de qu forma pueden las clulas de vertebrados evitar la recom binacin general promiscua entre los varios cen

crom osom as que se han entrecruzado

288

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

lugar del gen X en el que los alelos rojo y verde son diferentes muesca 5' 3' hlice de DNA la DNA polimerasa desplaza una cadena de la hlice roja; entonces, esta hebra se aparea con la hlice verde etapa 1
/ _______ 3'

hlice de DNA

la DNA polimerasa se para, el exceso de DNA de cadena sencilla es degradado por nucleasas y todos los cortes reparados

etapa 2

la replicacin norm al del DNA produce tres alelos rojos y un alelo verde del gen X

etapa 3

F ig u ra6-66 Proceso de recom binacin general que puede causar conversin gnica. El proceso empieza cuando se produce una muesca en una de las cadenas de la hlice de DNA roja. En la etapa 1 la DNA polimerasa inicia la sntesis de una copia extra de una de las cadenas de la hlice roja, desplazando la copia original com o una hebra sencilla. Esta hebra sencilla se aparea con la regin homloga de la hlice verde, com o se muestra en la Figura 6-59. En la etapa 2 , la corta regin no apareada de la cadena verde producida en la etapa 1 es degradada, com pletndose la transferencia de secuencias de nucletidos. El resultado normalm ente se observa en el siguiente ciclo celular, despus de que la replicacin del DNA haya separado las dos cadenas no apareadas (etapa 3). Como se describe en el texto, la reparacin de errores de apareamiento de pares de bases en una unin heterodplex tambin produce conversin gnica.

RESULTADO NETO: UN ALELO VERDE DEL GEN X SE HA CONVERTIDO EN UN ALELO ROJO

tenares de copias de DNA de secuencias estrechamente relacionadas que se ha llan repetidas en sus genomas (vase pg. 423) ? A pesar de que no conocemos la respuesta a esta pregunta, diversos estudios en bacterias y levaduras han demostrado que los mismos sistemas de correccin de errores de apareamiento que eliminan los errores de replicacin (vase Figura 6-50) tambin interrumpen los procesos de recombinacin gentica general entre secuencias de DNA que se emparejan de forma imperfecta. Se conoce, por ejem plo, que los genes homlogos de las dos bacterias estrechamente relacionadas Es cherichia coli y Salmonella typhimurium generalmente no se recombinan, a pesar de que, como sabemos, sus secuencias de nucletidos son idnticas en un 80%; sin embargo, cuando el sistema de correccin de errores de apareamiento se halla inactivado por mutacin, la frecuencia de estos procesos de recombinacin interespecies se incrementa unas 1000 veces. As, sabemos que el sistema de correc cin de errores de apareamiento reconoce normalmente las bases mal apareadas de un intercambio de cadenas inicial e impide los pasos posteriores necesarios para que se produzca la rotura y nueva unin de las dos hlices emparejadas. Este mecanismo protege el genoma bacteriano de cambios de secuencia que, de otra forma, se produciran mediante recombinacin con molculas de DNA que oca sionalmente entran en la clula. Se cree que en las clulas de vertebrados, que contienen muchas secuencias de DNA estrechamente relacionadas, este mismo tipo de sistema de correccin ayuda a impedir que se produzcan procesos de re combinacin promiscua que, de otra forma, mezclaran el genoma (Figura 6-67).

Enzimas de recom binacin especfica de lugar ponen y quitan del genoma secuencias especiales de DNA4 6
A diferencia de la recom binacin general, la recombinacin gentica especfica de lugar est guiada por una enzima de recom binacin que reconoce secuen-

Recombinacin gentica

289

,secuencias repetidas, sim ilares pero no idnticas,

c
+

LA DETECCION DE UN ERROR ABORTA EL APAREAMIENTO E IMPIDE LA RECOMBINACIN INTERCAMBIO DE CADENAS

Figura 6 -67 La correccin de errores impide que se produzca recom binacin general a partir de genomas desestabilizados que contienen secuencias repetidas. Estudios en bacterias y levaduras sugieren que el sistema de correccin de errores descrito previamente en la Figura 6-50 tiene la funcin adicional descrita aqu.

OCURRE RECOMBINACION SI LA CORRECCIN DE ERRORES FALLA

cias especficas de nucletidos presentes en una o en ambas molculas de DNA que se recom binan. No es necesario que se produzca un apareamiento de bases entre las molculas de DNA que se recombinan, e incluso cuando ste se produ ce, la unin heterodplex que se forma es tan slo de unos cuantos pares de ba ses de longitud. Separando y volviendo a unir molculas de DNA de doble hebra en lugares determinados, este tipo de recom binacin permite que varios tipos de secuencias de DNA se desplacen dentro y entre cromosomas. La recom binacin especfica de lugar fue descubierta como el sistema m e diante el cual un virus bacteriano, el bacterifago lambda, traslada su genoma dentro y fuera del crom osom a de E. coli. En su estado integrado el virus est es condido en el crom osom a bacteriano y se replica como parte del DNA del hus ped. Cuando el virus entra en una clula, se sintetiza una enzima codificada por el genoma del virus, la llamada integrasa lam bda . Esta enzima cataliza un proce so de recom binacin que se inicia cuando mltiples copias de la protena inte grasa se unen fuertemente a una secuencia especial del DNA del cromosoma cir cular del bacterifago. Ahora, el complejo resultante DNA-protena puede unirse a otra secuencia especial de DNA del cromosoma bacteriano, uniendo estrecha mente entre s el crom osom a de la bacteria y del bacterifago. Entonces, la inte grasa cataliza las reacciones necesarias de corte y empalme, utilizando una corta regin de homologa de secuencia para formar en el punto de unin una dimi nuta unin heterodplex (Figura 6-68). La integrasa se parece a una DNA topoisomerasa en que forma una unin covalente reversible con el DNA en el lugar en el que rompe la cadena de DNA. El mismo tipo de m ecanism o de recom binacin especfica de lugar puede realizarse a la inversa por el bacterifago lambda, permitindole salir de su lu gar de integracin en el crom osom a de E. coli para multiplicarse rpidamente en la clula bacteriana. Esta reaccin de eliminacin est catalizada por un complejo de la enzim a integrasa y otra protena del bacterifago, la cual se sin tetiza por el virus nicam ente cuando la clula husped est estresada. Si los lugares reconocidos por una enzima de recombinacin como sta se sueltan, en tonces el DNA comprendido entre ellos en lugar de ser eliminado ser invertido (vase Figura 9-57). Muchas otras enzimas que catalizan procesos de recombinacin especfica de lugar se parecen a la integrasa lambda en que requieren una corta regin de secuencias idnticas de DNA sobre las dos regiones de la hlice de DNA que se

290

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

crom osom a circular del bacterifago lambda crom osom a bacteriano

secuencias de lugar de unin com plejo proteico de la integrasa lambda

LA INTEGRASA SE UNE

CATALISIS DE ROTURAY NUEVA UNIN DE LA DOBLE HEBRA

LA INTEGRASA SE DISOCIA

Figura 6 -6 8 La insercin de DNA del bacterifago lam bda en el crom osom a bacteriano. En este ejemplo de recom binacin especfica de lugar la enzima integrasa lambda se une a una secuencia de DNA de unin de cada cromosoma, mientras hace cortes que generan cortas secuencias homlogas de DNA; entonces la integrasa cam bia las hebras y las une, formando una unin heterodplex de 7 pares de bases de longitud. Cada una de las reacciones de rotura de cadenas y de unin de cadenas requiere nuevas uniones, que estn producidas por la DNA topoisomerasa, mientras que la energa de rotura de un enlace fosfodister se alm acena en una unin covalente transitoria entre el DNA y la enzima (vase Figura 6-64).

DNA del bacterifago integrado en el crom osom a bacteriano

van a unir. Debido a este requerimiento, cada una de las enzimas de esta clase es relativamente exigente respecto a las secuencias de DNA que recombina, de for ma que puede esperarse que catalice un proceso determinado de unin que sea til para el virus, el plsmido, el elemento transponible o la clula que la presen te. Estas enzimas pueden utilizarse como herramientas en animales transgnicos para estudiar la influencia de determinados genes sobre el comportamiento celular, com o se ilustra en la Figura 6-69. Las enzimas de recom binacin especfica de lugar que cortan y vuelven a unir dos dobles hlices de DNA, a menudo lo hacen de una manera reversible: com o el caso del bacterifago lambda, el mismo sistema enzimtico que une dos molculas de DNA tam bin puede separarlas de nuevo, recuperando de forma precisa la secuencia de ambas molculas originales de DNA. Por ello, este tipo de recom binacin se denomina recombinacin conservativa especfica de lugar para distinguirla de la recombinacin transposicional especfica de lugar, mecansticam ente diferente, que exponemos a continuacin.

La recom binacin transposicional puede insertar un elemento gentico mvil en cualquier secuencia de DNA47
Muchas secuencias mviles de DNA, incluyendo muchos virus y elementos transponibles, codifican integrasas que insertan su DNA en un cromosoma a tra vs de un mecanismo diferente del que utiliza el bacterifago lambda. Como la integrasa lambda, cada una de estas enzimas reconoce una secuencia especfica de DNA del elemento gentico mvil cuya recom binacin cataliza. A diferencia de la enzima de lambda, sin embargo, estas enzimas no requieren una secuencia de DNA diana especfica y no forman ninguna unin heterodplex. En lugar de ello, introducen cortes en ambos extremos de la secuencia lineal de DNA del elemento gentico mvil y catalizan un ataque directo de estos extremos de DNA sobre la molcula de DNA diana, rompiendo dos enlaces fosfodister cer canos de la molcula diana. Debido a como estn construidos estos cortes, en la molcula de DNA recom binante quedan dos pequeos huecos de una sola hli-

Recombinacin gentica

291

unidad de transcripcin

lugares reconocidos por la enzima de recom binacin gen m arcador crom osom a prom otor

gen de inters sin el prom otor

ACTIVACION TEMPORAL DE LA ENZIMA DE

lugar de term inacin el gen de inters activo proteina a pai del gen de inte PROLIFERACION CELULAR
Figura 6 -69 Utilizacin de una enzima de recom binacin especfica de lugar para activar un gen en un grupo de clulas en un animal transgnico. La molcula de DNA mostrada ha sido diseada de forma que el gen de inters slo se transcribe cuando se activa una enzima de recombinacin especfica de lugar, la cual elimina el gen marcador y une el promotor cerca del gen de inters. La enzima de recom binacin est codificada por otra molcula de DNA (no se muestra en la figura) que se ha diseado de forma que slo se produzca la enzima cuando aumenta la temperatura. Ambas molculas de DNA se introducen en los cromosom as del mismo animal transgnico. Cuando la temperatura de este animal se incrementa de forma transitoria, se produce un breve increm ento masivo de la sntesis de la enzima de recombinacin, la cual produce una reorganizacin del DNA en una clula ocasional, eliminndose el gen marcador y activndose simultneamente en gen de inters. (B) La estrategia puede utilizarse para activar perm anentem ente un gen de inters en pequeos clones de clulas de un animal en desarrollo. Los clones pueden ser identificados por la prdida del producto del gen marcador el cual, por ejemplo, puede variar la pigmentacin de la clula. As pues, esta tcnica permite estudiar el efecto de la expresin de cualquier gen de inters en un grupo de clulas de un animal intacto.

(A)

protena marcadora INCREMENTO BREVE DE TEMPERATURA DURANTE EL DESARROLLO EMBRIONARIO

(B)

clulas ocasionales pierden el gen m arcador y expresan el gen de inters

cada una de las clulas de un clon de clulas que ha perdido el gen m arcador expresar el gen de inters

ce, una a cada extremo del elemento mvil; estos huecos son rellenados por una DNA polimerasa, completndose as el proceso de recombinacin. Tal como se ilustra en la Figura 6-70, este mecanismo genera una corta duplicacin de la se cuencia de DNA diana adyacente; estas duplicaciones flanqueantes constituyen el sello que permite reconocer un proceso de recombinacin especfica de lugar, de este tipo. A partir del bacterifago Mu se ha purificado en forma activa una integrasa de este tipo. Como la integrasa del bacterifago lambda, realiza todas las operaciones de corte y empalme sin necesidad de ninguna fuente de energa (como el ATP). Existen enzimas semejantes a sta en organismos tan diversos com o las bacterias, las moscas del vinagre y los humanos -com o discutire mos ms adelante, todos estos organismos contienen elementos genticos m viles.

Resumen
Los m ecanism os d e recom binacin gentica perm iten q u e gra nd es zonas d el DNA d e doble h lice p ueda n desplazarse d e un crom osom a a otro. Existen dos grandes clases d e sistem as d e recom binacin. En la recom binacin gen eral, las reacciones iniciales se basan en extensas interacciones en tre pares d e bases d e cadenas d e las dos dobles hlices d e DNA qu e se recom binan. Como resultado d e ello, solam ente se p rod uce recom binacin gen era l en tre dos m olculas d e DNA q u e sean hom logos, y a u n q u e el proceso traslada secciones d e DNA en tre crom osom as, norm alm ente no altera ni la secuencia n i el orden d e los gen es en el crom osom a. P or otra parte, la re com binacin especfica d e lu ga r altera las posiciones relativas d e las secuencias d e nucletidos en los crom osom as, debido a q u e las reacciones d e apaream iento d e p en d en d el reconocim iento, m ediado p o r una protena, d e las dos secuencias d e DNA q u e se recom binan, d e fo rm a q u e no es necesaria la p resencia d e una larga se cu en cia hom logo. Los m s com unes son dos tipos d e m ecanism os d e recom bina cin especficos d e luga r: (1) recom binacin conservativa especfica d e lugar, que p rod uce un h eterodplex m uy corto y p o r lo tanto req u iere alguna zona d e secu en cia d e DNA q u e sea la m ism a en las dos m olculas d e DNA, y (2) la recom binacin transposicional especfica d e lugar, q u e no prod uce heterodplex y habitualm ente no requ iere n in gu n a secuencia especfica sobre el DNA diana.

292

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

DNA vrico

ntegrasa la ntegrasa corta la secuencia m vil de DNA

HCT crom osom a diana 5'

LOH 5' ataque del DNA vrico sobre el DNA diana

c o O Ci
H

cromosoma

la muesca es rellenada por la reparacin del DNA DNA vrico integrado 3'
3'

5'3'

3' 5' nuevo enlace fosfodister

cO

protn del agua

diana

(A)

cortas repeticiones de la secuencia de DNA diana

0 -C ' ,o
(B)

i oo

Virus, plsmidos y elementos genticos transponibles48

En la descripcin que hemos realizado de los mecanismos genticos bsicos, h e mos destacado su ventaja selectiva para la clula. Hemos visto que la supervi vencia de la clula a corto plazo depende por completo del mantenimiento de la informacin gentica mediante el proceso de reparacin del DNA, mientras que la multiplicacin de la clula requiere que se produzca una replicacin del DNA rpida y exacta. En una escala de tiempo ms larga, la aparicin de variantes ge nticas, de las que depende la evolucin de las especies, est grandemente facili tada por la reordenacin de los genes y las ocasionales redisposiciones de se cuencias del DNA generadas por la recom binacin gentica. Ahora vamos a examinar un grupo de elementos que al parecer actan como parsitos, alteran do en su propio beneficio los mecanismos genticos de la clula. Estos elem en tos genticos son interesantes en s mismos. Adems, como pueden utilizar a fondo el metabolismo de la clula husped para poder multiplicarse, se usan como poderosas herramientas para estudiar la maquinaria normal de la clula. Muchas secuencias de DNA pueden replicarse de forma independiente del resto del genoma. Estas secuencias presentan diferentes grados de independencia de sus clulas husped. De ellas, los cromosomas de los virus son los ms inde pendientes porque tienen un revestimiento proteico que les permite moverse li bremente de una clula a otra. En diferentes grados, los virus estn estrechamente relacionados con los plsmidos y con los elementos transponibles, que son secuen cias de DNA que carecen de revestimiento, por lo que son ms dependientes de las clulas husped y han de replicarse dentro de una nica clula y su descenden cia. Todava ms primitivas son algunas secuencias de DNA, de las que se sospe cha que son mviles porque se encuentran repetidas muchas veces en cada cro mosoma celular. Sin embargo, se desplazan o se multiplican tan raramente que no est claro si deben ser consideradas como elementos genticos independientes. Empezamos la discusin con los virus, que son los elementos mviles mejor conocidos. Seguiremos con las propiedades de los plsmidos y de los elementos transponibles, algunos de los cuales tienen un gran parecido con los virus y, de hecho, pueden haber sido sus antecesores. Las secuencias de DNA muy repetiti vas de los cromosomas de vertebrados, se discuten en el Captulo 8.

Los virus son elem entos genticos mviles 4 9

Los virus fueron descritos por primera vez como agentes causantes de enferm e dades, que se pueden multiplicar nicamente en el interior de clulas y que, en virtud de su diminuto tamao, atraviesan los filtros ultrafinos que retienen in-

Figura 6 -7 0 Recombinacin transposicional especfica de lugar. (A) Generalidades de los procesos de rotura y nueva unin de una hebra que conducen a la integracin del DNA lineal de doble hebra de un retrovirus {rojo) en un crom osom a de una clula animal {azul). En una etapa endonucleasa inicial, la enzima integrasa hace una muesca en una hebra a cada uno de los extremos de la secuencia de DNA vrico, exponiendo un grupo 3 -OH que sobresale. Cada uno de estos extremos 3 -OH dirige el ataque de un enlace fosfodister sobre la cadena opuesta de un lugar seleccionado al azar de un cromosom a diana. Ello inserta la secuencia de DNA vrico en el crom osom a diana, dejando cortas muescas a cada lado, que son rellenadas por procesos de reparacin del DNA. Debido a que la m uesca se llena, este tipo de m ecanism o produce cortas repeticiones de la secuencia de DNA diana (de entre 3 y 12 nucletidos de longitud, en negro, dependiendo de la enzima integrasa) a cada lado del segmento de DNA integrado. (B) Una visin a nivel atmico del ataque por un extremo de una cadena de DNA de (A) a un enlace fosfodister del DNA diana {azul). Este m ecanism o se parece al usado en la maduracin del RNA y es claram ente diferente de la actividad sem ejante a topoisomerasa de la integrasa lambda. (Adaptado de K. Mizuuchi,/. Biol. Chem . 267:2127321276, 1992.)

Virus, plsmidos y elementos genticos transponibles

293

cluso las bacterias ms pequeas. Antes de la utilizacin del microscopio, la na turaleza de los virus era oscura, aunque se sospechaba que podan ser genes desnudos que de alguna manera haban adquirido la capacidad de desplazarse de una clula a otra. El desarrollo de la ultracentrifugacin, hacia los aos 1930, hizo posible la separacin de los virus de los componentes de las clulas hus ped, y a principios de los aos 1940 se generaliz la idea de que todos los virus contienen cidos nucleicos. La idea de que los virus realizan funciones sem ejan tes a las de los genes se confirm gracias a estudios realizados en virus de bacte rias (bacterifagos). En 1952 se demostr que el DNA del bacterifago T4, pero no su protena, penetra en la clula husped bacteriana e inicia los procesos de replicacin que conducen a la produccin de varios cientos de virus dentro de cada clula infectada. Estas observaciones hicieron considerar a los virus como elementos genti cos rodeados de una cubierta protectora que les permite desplazarse de una c lula a otra. A menudo, la multiplicacin vrica per se es letal para las clulas den tro de las que se produce; en muchos casos, la clula infectada, repleta de virus, se rompe (se lisa) permitiendo as a los virus hijos acceder a clulas vecinas. Mu chas de las m anifestaciones clnicas de la infeccin vrica reflejan este efecto citoltico de los virus. Por ejemplo, tanto los granitos de herpes formados por el vi rus del herpes com o las lesiones causadas por la viruela reflejan la rotura de las clulas epiteliales de un rea local de la piel. El tipo de cido nucleico de un virus, la estructura de su envoltura, la mane ra que tiene de entrar en la clula husped y su mecanismo de replicacin den tro de la clula husped, varan considerablemente de un tipo de virus a otro.

La cubierta exterior de un virus puede ser una cpside proteica o una envoltura m em branosa 50
Inicialm ente se pens que la cubierta externa de los virus estaba formada por un slo tipo de molcula proteica. Se crea que las infecciones vricas empezaban por la separacin del crom osom a vrico (su cido nucleico) de la cubierta protei ca, y que a continuacin se produca la replicacin del cromosoma dentro de la clula husped, generndose muchas copias idnticas. Despus de la sntesis de nuevas copias de la envoltura proteica especfica del virus sobre molculas de RNA m ensajero codificadas por el virus, poda producirse la formacin de part culas vricas hijas mediante el ensam blaje espontneo de esta cubierta proteica rodeando los cromosomas vricos hijos (Figura 6-71). Ahora se sabe que estas ideas sobresimplifican extraordinariamente la di versidad de ciclos vitales vricos que existen. Por ejemplo, la protena de cubierta que rodea el cido nucleico de la mayora de los virus (la cpside) contiene ms de un tipo de cadena polipeptdica, a menudo dispuesta en varias capas (Figura 6-72). En muchos virus, adems, la cpside proteica est recubierta a su vez por una m em brana formada por una bicapa lipdica que contiene protenas. Mu chos de estos virus recubiertos adquieren su envoltura durante el proceso de brote de la m em brana plasmtica (Figura 6-73). Este proceso de gemacin per mite a las partculas vricas abandonar la clula sin romper la membrana plas m tica y, por lo tanto, sin matar a la clula. En la Figura 6-74 se presentan electronmicrografas que enfatizan las diferencias que existen entre las envolturas vricas.

DNA ..protena de la cubierta PENETRACIN EN UNA CLULA Y LIBERACIN DEL DNA

clula

TRANSCRIPCIN TRADUCCIN

REPLICACIN

protena de la cubierta ENSAMBLAJE DE LAS PARTCULAS VRICAS HIJAS Y SALIDA DE LA CLULA J

Los genomas vricos se presentan en una gran variedad de form as vricas y pueden ser tanto de DNA como de RNA51
Como hem os visto anteriormente la doble hlice de DNA es estable y fcil de re parar. Si una cadena de un polinucletido se estropea de forma accidental, su cadena complementaria permite que la alteracin pueda ser corregida de forma adecuada. Sin embargo, este proceso de reparacin no es importante para el caso de los pequeos cromosomas vricos que tan slo contienen varios cientos

Figura 6-71 El ciclo vital vrico m s sencillo. El virus hipottico mostrado aqu est formado por una pequea molcula de DNA de doble cadena, que codifica una sola protena de la cpside vrica. Ninguno de los virus conocidos es tan sencillo.

294

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

de nucletidos. La probabilidad de ser alterados accidentalmente es muy peque a comparada con el riesgo que tiene un genoma celular que contiene millones de nucletidos. As pues, la informacin gentica de un virus puede almacenarse y transpor tarse en varios tipos de formas no usuales, como el RNA en lugar del DNA. Un crom osom a vrico puede ser una cadena sencilla de RNA, una hlice de doble

Figura 6 -7 2 Cpsides de algunos virus, a escala. (A) Virus del tomate

cpside que contiene _ el crom osom a vrico (nucleocpside)

protenas transm em brana de la envoltura vrica la nucleocpside induce el ensam blaje de las protenas de envoltura

achaparrado peludo; (B) poliovirus; (C) virus de simio 40 (SV40); (D) virus necrosante satlite del tabaco. Las estructuras de todas estas cpsides han sido determinadas por cristalografa de rayos X y se conocen a nivel atmico. (Por cortesa de Robert Grant, Stephan Crainic y lames M. Hogle.)

Figura 6 -73 Adquisicin de una envoltura vrica. (A) Electron-

GEMACION

bicapa lipidica

100 nm

(B)

micrografia electrnica de un corte ultrafino de una clula animal de la que estn saliendo por gemacin varias copias de un virus con envoltura (virus Semliki forest). (B) Visin esquemtica del ensamblaje de la envoltura y del proceso de gemacin. Mientras que la bicapa lipidica que rodea la cpside es parasitada directamente a partir de la membrana plasmtica de la clula husped, las nicas protenas de esta bicapa lipidica estn codificadas por el genoma vrico. (Por cortesa de M. Olsen y G. Griffiths).

Virus, plsmidos y elementos genticos transponibles

295

Figura 6 -7 4 Las envolturas de los virus. (A) Electronmicrografas con tincin negativa, (todas a la misma escala) de partculas vricas. (A) B acterifag o T4, un virus de DNA, muy grande, que infecta a E. coli. El DNA se halla en la cabeza del bacterifago y es inyectado a la bacteria a travs de la cola cilindrica. (B) Virus X d e la p atata, un virus vegetal filamentoso que contiene un genoma de RNA. (C) A denovirus, un virus de DNA que puede infectar clula humanas. La superficie externa de este virus est formada por una cpside proteica. (D) Virus d e la gripe, un virus animal muy grande que tiene DNA y cuya cpside proteica est rodeada por una envoltura de tipo bicapa lipdica, que contiene una especie de espinas de glucoprotenas vricas. (A por cortesa de James Paulson; B por cortesa de Graham Hills; C por cortesa de Mei Lie Wong; D por cortesa de R.C. Williams y H.W. Fisher.)

cadena de RNA, una cadena circular sencilla o una cadena sencilla y lineal de DNA. Adems, a pesar de que algunos cromosomas vricos son dobles hlices li neales, tam bin son habituales dobles hlices circulares de DNA y dobles hlices lineales ms complejas. Por ejemplo, algunos virus tienen molculas proteicas unidas covalentemente a los extremos 5 de sus cadenas de DNA; las dobles hli ces de DNA de los poxvirus, muy grandes, tienen sus cadenas opuestas unidas covalentemente por sus extremos a travs de uniones fosfodister (Figura 6-75).

Los crom osom as vricos codifican enzimas implicadas en la replicacin de su cido nucleico 52
Cada tipo de genoma requiere trucos enzimticos especiales para su replicacin, y de esta forma, ha de codificar no slo la protena de la envoltura sino tambin una o ms de las enzimas que necesita para la replicacin del cido nucleico vrico. La cantidad de informacin que un virus transporta al interior de una clula para asegurar su replicacin selectiva vara notablemente. Por ejemplo, el DNA del bacterifago T4, un virus relativamente grande, contiene unos 300 genes, en-

RNA de una sola hebra

DNA de una sola hebra

DNA de doble hebra circular

RNA de doble hebra

DNA de una sola hebra circular

DNA de doble hebra

DNA de doble hebra con los extrem os soldados

DNA de doble hebra con protenas term inales unidas covalentem ente

Figura 6-75 Dibujo esquem tico de diversos tipos de genomas vricos. Los virus ms pequeos slo contienen unos cuantos genes, y pueden presentar un genoma de DNA o de RNA; los virus mayores contienen cientos de genes y tienen un genoma de DNA de doble cadena. Algunos ejemplos de estos tipos de virus : h eb ra sen cilla d e RNA -virus del mosaico del tabaco, bacterifago R17, polivirus; d o b le h eb ra d e RNA -reovirus; h eb ra sen cilla d e DNA -parvovirus; h eb ra sen cilla circu lar d e DNA -bacterifagos M 13, <))X174; d o b le h eb ra circu lar d e DNA -SV40 y poliomavirus; DNA d e d o b le h eb ra -bacterifago T4, herpes virus; DNA d e d o b le h eb ra con p roten as term in ales a so cia d a s cov alen tem en te -adenovirus; DNA d e d o b le h eb ra con extrem os so ld a d os cov alen tem en te -poxvirus. Los extremos peculiares de algunas de estas molculas de DNA (as como sus formas circulares) superan la dificultad de la replicacin de los ltimos nucletidos del final de la cadena de DNA (vanse pgs. 362 y 389).

100 nm

296

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

tre los cuales al menos 30 aseguran la rpida replicacin del cromosoma T4 en su clula husped, E. cot (Figura 6-76). La replicacin del DNA de T4 presenta la caracterstica especial de que en su DNA se incorpora 5-hidroximetil-C en lugar de C. La composicin de bases poco usual del DNA de T4 hace que se pueda dis tinguir fcilmente del DNA del husped, y as protegerse selectivamente de la ac cin de nucleasas tam bin codificadas en el genoma de T4, las cuales degradan pues nicamente el DNA de E. cot. Otras protenas alteran las molculas de RNA polimerasa de la clula husped de modo que a diferentes estadios de infeccin transcriben diferentes juegos de genes del bacterifago, de forma apropiada a las necesidades del fago. Los virus ms pequeos de DNA, como el virus del simio SV40 y el diminuto bacterifago M13, transportan una cantidad de informacin gentica mucho menor. Estos virus dependen mucho ms de las enzimas de la clula husped, para llevar a cabo la sntesis de su DNA, parasitando la mayora de las protenas de replicacin del DNA de la clula husped. Sin embargo, la mayora de los vi rus de DNA codifican protenas que inician selectivamente la sntesis de su DNA, reconociendo una secuencia especial de nucletidos en el virus que acta como origen de replicacin. Este hecho es esencial ya que as el virus puede superar las seales celulares de control que, de otro modo, haran que el DNA vrico se re plicara de acuerdo con el DNA de la clula husped, es decir, duplicndose tan slo en cada ciclo celular. Todava no comprendemos cmo las clulas eucariotas consiguen regular la sntesis de su DNA. Los mecanismos utilizados por los virus para escaparse de esta regulacin -lo s cuales resultan mucho ms accesi bles para ser estudiados- pueden suponer avances en el estudio de estos m eca nismos reguladores. Los virus RNA presentan unos requerimientos muy especializados para su replicacin, ya que para reproducir sus genomas, han de copiar las molculas de RNA, lo cual significa polimerizar nuclesidos trifosfato sobre un patrn de RNA. Normalmente las clulas no tienen enzimas que lleven a cabo estas reacciones, por lo que para poder replicarse, incluso los pequeos virus RNA han de codifi car sus propias enzimas polimerasa dependientes de RNA. A continuacin va mos a estudiar con ms detalle algunos mecanismos de replicacin de varios ti pos de virus.

subunidades de la DNA topoisom erasa DNA helicasa DNA primasa DNA helicasa DNA polimerasa subunidades de la DNA polim erasa
50

m iles de pares de nucletidos

100 -

DNA ligasa

150-

protena de unin a DNA de una sola hebra subunidad de la DNA topoisom erasa

Tanto los virus RNA como los virus DNA se replican mediante la form acin de cadenas com plem entarias 53
La replicacin de los genomas de los virus RNA, como en el caso de la replica cin del DNA, tiene lugar a travs de la formacin de cadenas complementarias. En la mayora de los casos de virus RNA, este proceso est catalizado por enzi mas RNA polimerasas RNA-dependientes (replicasas). Estas enzimas estn codi ficadas por el cromosoma RNA vrico y a menudo se incorporan a las partculas vricas hijas, de forma que en cuanto uno de estos virus penetra en una clula, inmediatamente se empieza a replicar el RNA vrico. En todos los casos, las re plicasas se hallan empaquetadas dentro de la cpside de los virus llamados virus RNA de cadena negativa, como es el caso del virus de la gripe y el virus de la esto matitis vesicular. Los virus de cadena negativa se denominan de esta manera porque la cadena que infecta no codifica protenas, sino que es su cadena com plementaria la que transporta las secuencias codificantes. Por ello, la cadena que infecta no puede actuar en ausencia de una replicasa que ya est formada previamente. Por el contrario, el RNA de los virus RNA de cadena positiva, como es el caso de los polivirus, pueden actuar como mRNA, y producir una replicasa en cuanto entra en la clula; por ello el genoma desnudo es, en si mismo, infec cioso. La sntesis del RNA vrico siempre empieza en el extremo 3 del RNA patrn, empezando en el extremo 5 de la nueva molcula de RNA vrico y progresando en direccin 5 a 3 hasta que alcanza el extremo 5 del RNA patrn. Para la snte sis del RNA vrico no existen mecanismos correctores de errores, y las frecuen-

Figura 6 -7 6 El crom osom a del bacterifago T4, m ostrando la situacin de los m s de 30 genes que intervienen en la replicacin del DNA de T4. El genoma del bacterifago T4 est formado por ms de 169 000 pares de nucletidos que codifican ms de 300 protenas diferentes.

Virus, plsmidos y elementos genticos transponibles

297

cias de error son similares a las que se presentan en la transcripcin del DNA (al rededor de un error por cada 104 nucletidos sintetizados). sta no es una defi ciencia demasiado importante ya que el cromosoma RNA es relativamente cor to. Por ello, los genomas de todos los virus RNA son ms cortos que los de los grandes virus DNA. Todos los virus DNA comienzan su replicacin en un origen de replicacin en el que se une una protena iniciadora especial que atrae a las enzimas de re plicacin de la clula husped (Figura 8-34). Sin embargo, existen muchos pro cesos diferentes de replicacin. La complejidad de estos diferentes esquemas de replicacin refleja, en parte, los problemas de replicar los extremos de una mol cula lineal sencilla de DNA, utilizando una DNA polimerasa que no puede em pezar la sntesis sin un cebador (vanse pgs. 270-271). Los virus DNA han solu cionado este problema de maneras muy diversas: algunos tienen genomas circulares de DNA, los cuales, pues, no tienen extremos; otros tienen genomas li neales de DNA que repiten sus secuencias terminales o que acaban en un lazo; otros tienen unas protenas terminales especiales que actan directamente de cebadores de la DNA polimerasa (vase Figura 6-75).

Los virus utilizan la m aquinaria de trfico intracelular de sus clulas husped 54

Todos los virus tienen una cantidad limitada de cido nucleico en su genoma, por lo que han de parasitar procesos de la clula husped para la mayora de las etapas de su produccin. De hecho, debido a que habitualmente los productos vricos se sintetizan en grandes cantidades durante la infeccin y debido tam bin a que durante su ciclo vital los virus siguen una ruta secuencial a travs de los compartimientos de la clula husped, las clulas infectadas por virus se han utilizado como importantes modelos para trazar las rutas de transporte intrace lular y para estudiar qu reacciones biosintticas esenciales estn compartimentalizadas en las clulas eucariotas. Los virus recubiertos que afectan a las clulas animales, en los cuales el ge noma est incluido en una m em brana de bicapa lipidica, han utilizado la compartimentalizacin de la clula hasta un grado especialmente preciso. Seguir el ciclo vital de un virus recubierto es hacer un tour a travs de la clula. Un ejemplo bien estudiado es el virus Semliki forest, que consiste en un genoma de cadena sencilla de RNA rodeado por una cpside formado por una envoltura eicosadrica (20 caras) dispuesta de forma regular y compuesta por muchas copias de una protena (denominada proteina C). La nucleocpside (genoma + cpside) est rodeada por una bicapa lipidica situada muy cerca, que contiene nica mente tres tipos de cadenas polipeptdicas, codificadas por el RNA vrico. Estas protenas de envoltura forman heterotrmeros situados en la bicapa lipidica y

Figura 6 -7 7 Estructura del virus Semliki forest. Dibujo esquem tico de una seccin transversal (A) y visin tridimensional propuesta (B) del virus. (C) Reconstruccin tridimensional de la superficie del virus obtenida por micrografas crioelectrnicas de especm enes no contrastados. El virus tiene una masa total de 46 millones de daltons. (B, adaptado de S.C. Harrison, Curr. Opin. Struct. Biol. 2:293-299, 1992. Current Science; C, por cortesa de Stephen Fuller.)

protenas proteina C de envoltura de la cpside (A)

bicapa lipidica

20 nm

298

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

apside

__

la nucleocpside ensam bla O las protenas de la envuelta

virus hijos

insercin de las protenas de envoltura en la m em brana plasm tica

glucosilacin de las protenas envoltura ha concluido

que interactan con la protena C de la nucleocpside, uniendo la membrana con la nucleocpside (Figura 6-77). Las zonas glucosiladas de las protenas de envoltura siempre estn situadas en el exterior de la bicapa lipdica, y cada tr mero forma una espina que al microscopio electrnico se ve sobresaliendo de la superficie del virus (Figura 6-77C). La infeccin se inicia cuando una protena de envoltura del virus se une a una protena de una clula normal que acta como su receptor en la membrana plasmtica de la clula husped. Entonces el virus utiliza el proceso endoctico normal de la clula para entrar en ella mediante endocitosis mediada por recep tor, y es liberado a los endosomas vecinos (como se discute en el Captulo 13). Sin embargo, en lugar de ser transferido desde los endosomas a los lisosomas, el virus se escapa de los endosomas gracias a las propiedades especiales de una de sus protenas de envoltura. Al pH cido del endosoma esta protena hace que la envoltura vrica se fusione con la mem brana del endosoma, liberando la nucleo cpside desnuda en el citosol. La nucleocpside pierde su cubierta en el citosol, liberando el RNA vrico, que entonces es traducido por los ribosomas de la clula husped produciendo una RNA polimerasa codificada por el virus. Esta enzima, a su vez, produce muchas copias del RNA vrico, algunas de las cuales actan como molculas de mRNA dirigiendo la sntesis de protenas estructurales del virus -la protena C de la cpside y las tres protenas de la envoltura. Las protenas de la cpside y de la envoltura, recin sintetizadas, siguen vas separadas a travs del citoplasma. Las protenas de la envoltura, como las pro tenas de la mem brana plasmtica de la clula husped, son sintetizadas en los ribosomas que se hallan unidos al ER rugoso; por el contrario, la protena de la cpside, como las protenas citoslicas de la clula, se sintetiza por ribosomas que no se hallan unidos a membrana. Las protenas recin sintetizadas de la cpside se unen al RNA vrico recientemente replicado, formando nuevas nucle-

F ig u ra 6 -7 8 Ciclo vital del virus Semlild forest. El virus parasita la clula husped para la mayor parte de sus procesos biosintticos.

Virus, plsmidos y elementos genticos transponibles

299

ocpsides. Las protenas de la envoltura, por el contrario, son insertadas en la mem brana del ER, donde son glucosiladas, transportadas hasta el complejo de Golgi y liberadas a la membrana plasmtica (Figura 6-78). Finalm ente las nucleocpsides vricas y las protenas de la envoltura se en cuentran en la membrana plasmtica. Como resultado de una interaccin espe cfica con un grupo de protenas de envoltura, la nucleocpside forma una gema cuya envoltura contiene protenas de envoltura embebidas en lpidos de la clu la husped. Por ltimo, la gema se libera, de forma que aparece un nuevo virus independiente de la clula. El agrupamiento de las protenas de la envoltura mientras se ensamblan alrededor de la nucleocpside durante la gemacin vri ca hace que las protenas plasmticas de la clula husped queden excluidas de la partcula vrica final.

Diferentes virus recubiertos geman a partir de diferentes m em branas celulares 55

Todas las protenas de envoltura vricas son protenas transmembrana que son sintetizadas en el ER. Como otras protenas del ER, transportan seales que las dirigen a determinadas m embranas de la clula (vase Captulo 13). Su localiza cin final determina el lugar en que se producir la gemacin de los virus. Las l neas celulares epiteliales, por ejemplo, pueden formar lminas celulares polari zadas cuando se cultivan sobre superficies apropiadas como filtros porosos recubiertos de colgena. Cuando estas clulas polarizadas, que mantienen dife rentes dominios de m em brana plasmtica basolateral y apical son infectadas por virus, algunos de ellos (como el virus de la gripe) geman exclusivamente a partir de la m em brana plasmtica apical mientras que otros (como el virus de Semliki forest y el virus de la estomatitis vesicular) geman exclusivamente a par tir de la m em brana plasmtica basolateral (Figura 6-79). Esta polaridad de ge macin indica que las protenas de envoltura presentan seales de direccionamiento apical o basolateral, las cuales dirigen las protenas a un solo dominio de la superficie celular; las protenas, a su vez, hacen que el virus se ensamble en este dominio. Otros virus tienen protenas de envoltura con diferentes tipos de seales de direccionamiento. Por ejemplo, Herpes virus es un virus de DNA que se replica

Figura 6-79 Dos virus recubiertos que geman a partir de dos dominios de la m em brana plasm tica diferentes. Las electronmicrografas muestran que un tipo de virus recubierto gema a partir de la membrana apical mientras que el otro lo hace a partir de la membrana plasmtica basolateral de la misma clula epitelial mantenida en cultivo. Estas clulas crecen con su superficie basai en contacto con la placa de cultivo. El rea marcada en cada esquema corresponde a la electronmicrografa que se indica. (Micrografas por cortesa de E. Rodrguez-Bouland y D.D. Sabatini.)

el virus de la gripe gema nicam ente a partir de la m em brana plasm tica apical

el virus de la estom atitis vesicular gema nicam ente a partir de la m em brana plasmtica basolateral

300

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

en el ncleo, donde se ensambla la nucleocpside, y luego adquiere una envol tura mediante gemacin a travs de la membrana nuclear interna en el lumen del retculo endoplasmtico; as pues, las protenas de la envoltura han de ser transportadas especficamente desde la membrana del retculo endoplasmtico a la m em brana interna nuclear, probablemente va la bicapa lipdica que rodea los poros nucleares. Por el contrario, flavivirus gema directamente en el lumen del retculo endoplasmtico y bunyavirus gema en el complejo de Golgi, lo cual indica que sus protenas de envoltura transportan seales para su retencin en el retculo endoplasmtico y en las membranas del Golgi respectivamente. Tras la gemacin, las partculas recubiertas de los virus herpes, flavivirus y bunyavi rus quedan solubles en el lumen del retculo endoplasmtico y del Golgi, y se desplazan hacia la superficie celular exactamente como si fueran protenas de secrecin; en la red trans del Golgi se incorporan a vesculas de transporte y son secretados de la clula por el proceso de secrecin constitutiva (discutido en el Captulo 13).

Los cromosom as vricos pueden integrarse en los cromosom as del husped 56

No siempre el resultado final de la entrada de un cromosoma vrico en una clula es su inmediata multiplicacin produciendo un gran nmero de virus hijos. Mu chos virus entran en un estado de latencia en el que sus genomas se hallan pre sentes en la clula husped pero en forma inactiva, de forma que no producen progenie. La latencia vrica se descubri cuando se observ que la exposicin de bacterias aparentemente no infectadas por virus a los rayos ultravioleta induca la formacin de progenie de bacterifagos. Experimentos posteriores demostra ron que estas bacterias lisognicas contienen en su cromosoma un cromosoma vrico latente pero completo. Estos cromosomas vricos integrados reciben el nombre de provirus. Los bacterifagos que pueden integrar su DNA en los cromosomas bacteria nos se conocen como bacterifagos temperados. El ejemplo prototpico es el b ac terifago lambda, que ya hemos estudiado. Normalmente, cuando lambda in fecta una clula husped E. coli adecuada, se multiplica produciendo varios cientos de partculas hijas que son liberadas cuando la clula bacteriana se lisa; este proceso se denomina infeccin ltica. Ms raramente, los extremos libres de las molculas de DNA infectantes se unen formando un DNA circular que queda integrado en el cromosoma circular husped de E. coli mediante un proceso de recom binacin especfico de lugar. La bacteria lisognica resultante, que trans porta el crom osom a provrico lambda, se multiplica norm alm ente hasta que se som ete a una agresin am biental, tal com o la exposicin a luz ultravioleta o a radiaciones ionizantes. La debilitacin resultante de la clula induce al virus integrado a dejar el crom osom a del husped y a com enzar un ciclo normal de replicacin vrica. De esta forma, el provirus integrado no ha de perecer n ece sariam ente con la clula husped lesionada sino que tiene la oportunidad de escapar hacia otras clulas de E. coli (Figura 6-80).

La sntesis continuada de algunas protenas vricas puede transform ar a las clulas en cancerosas 57
Las clulas animales, as como las bacterias, pueden ofrecer una alternativa de crecim iento ltico a los virus. Las clulas permisivas permiten a los virus DNA multiplicarse lticamente, lo cual destruye la clula. Las clulas no permisivas permiten entrar a los virus DNA pero no les permiten multiplicarse lticamente; en un pequeo porcentaje de estas clulas, el cromosoma vrico puede integrarse en el genoma de la clula husped, donde es replicado con el cromosoma hus ped, o puede formar un plsmido -u n a molcula circular de DNA- que se replica de una forma controlada sin matar a la clula. Algunas veces estas infecciones no permisivas producen un cambio gentico en la clula husped, llevndola a

Virus, plsmidos y elementos genticos transponibles

301

clula bacteriana crom osom a husped bacterifago lambda

ADSORCION DE LA CELULA HUSPED E INYECCIN DEL DNA

EL DNA ADOPTA FORMA CIRCULAR

INTEGRACION DEL DNA EN EL CROMOSOMA HUSPED

SINTESIS DE LAS PROTENAS VIRICAS NECESARIAS PARA LA FORMACIN DE LOS NUEVOS VIRUS

F ig u ra6-80 Ciclo vital del bacterifago lam bda. El genoma lambda contiene unos 50 000 pares de nucletidos y codifica unas 50 protenas. Su DNA de doble cadena puede presentarse en forma lineal y en forma circular. Tal com o muestra la figura, en la bacteria E. co li el bacterifago se puede multiplicar por va ltica o por va lisognica. Cuando el bacterifago se hace crecer en estado lisognico, una lesin de la clula hace que el DNA vrico integrado (provirus) salga del cromosom a husped e inicie el crecim iento ltico. La entrada y salida del DNA del crom osom a son acontecim ientos de recom binacin gentica especficos de lugar, catalizados por la protena integrasa de lambda (vase Figura 6 -6 8 ).

O
REPLICACION RAPIDA DEL DNA VRICO UBRE Y EMPAQUETAMIENTO EN PARTCULAS VRICAS

A
EL DNA VRICO INTEGRADO SE REPLICA JUNTO CON EL CROMOSOMA HUSPED PRODUCIENDO NUEVAS COPIAS DE DNA VRICO INTEGRADO VIA LISOGENICA

is
?

LA LISIS CELULAR LIBERA UN GRAN NMERO DE VIRUS LIBRES

VIA LITICA

proliferar de una forma descontrolada, transformndose pues en su equivalente canceroso. En este caso, el virus DNA se denomina virus DNA tumoral y el pro ceso transformacin neoplsica mediada por virus. Los virus tumorales de DNA ms extensamente estudiados son dos papovavirus, el SV40 y el polioma. Su ca pacidad transformante se atribuye a algunas protenas vricas que cooperan diri giendo las clulas quiescentes a proliferar -e s decir, dirigen las clulas de la fase G0 a la fase S. En las clulas permisivas, el cambio a la fase S (la fase del ciclo ce lular en la que se sintetiza el DNA) hace que el virus disponga de todas las enzi mas replicantes de la clula husped, enzimas que son necesarias para la sntesis del DNA vrico. La sntesis de estas protena vricas por un provirus en una clula no permisiva se produce superando algunos de los mecanismos normales de control del crecim iento de la clula y de toda su descendencia. De esta manera se sabe que algunos virus de DNA tumorales que infectan a humanos contribuyen al desarrollo de algunos tipos de cnceres humanos (aunque se sabe que en la gran mayora de cnceres humanos no participan virus tumorales).

Los virus tum orales RNA son retrovirus 58

Para uno de los grupos de virus RNA, el de los llamados virus tumorales RNA, la infeccin de una clula permisiva conduce a menudo a una liberacin no letal (por gemacin) de virus hijos a partir de la superficie de la clula y simultnea-

302

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

"dedos"

direccin del desplazam iento de la enzima

hebra de RNA patrn el lugar activo de la imerasa sintetiza una hebra de DNA "pu lg a r"

el lugar activo de la RNAsa H degrada la hebra de RNA (A)

Figura 6-81 Transcriptasa inversa. (A) Estructura tridimensional de la enzima de HIV-1 (el virus del SIDA), determinada por cristalografa de rayos X. (B) Visin esquemtica de un modelo sobre su actividad sobre un RNA patrn. Ntese que el dominio polimerasa RNAsa H {am arillo) tiene un dominio RNAsa {rojo) unido covalentemente que degrada una hebra de RNA en una hlice RNA/DNA. Esta actividad ayuda a la polimerasa a convertir la hlice hbrida inicial en una doble hlice de DNA. (A, por cortesa de hebra Tom Steitz; B, adaptado a partir de L A de DNA Kohlstaedt et al., Science 256:1783-1790, 1992. 1992 theAAAS.)

mente a un cambio gentico en la clula infectada que la transforma en cance rosa. El m ecanismo a travs del cual los virus RNA pueden generar una altera cin gentica permanente no qued aclarado hasta que se descubri la enzima transcriptasa inversa, la cual transcribe las cadenas de RNA de estos virus a DNA com plem entario que se integra en el genoma de la clula husped. Los vi rus tumorales RNA -en tre los que se cuentan el primer virus tumoral bien co nocido, el virus del sarcom a de Rous- son miembros de una gran clase de virus conocida como re tro v iru s . Estos virus se denominan de esta manera porque en una parte de su ciclo vital revierten los procesos normales de transcripcin del DNA a RNA. La enzima tr a n s c r ip ta s a in v e rs a es una DNA polimerasa poco habitual que puede utilizar como patrn tanto RNA como DNA (Figura 6-81); est codificada por el RNA del retrovirus y se halla empaquetada dentro de cada cpside vrica durante la produccin de nuevas partculas vricas. Cuando el RNA de una sola cadena del retrovirus entra en la clula, la transcriptasa inversa transportada en el interior de la cpside primero hace una copia en DNA de la cadena de RNA, dando lugar a una hlice hbrida DNA-RNA que es utilizada por la misma enzi ma para generar una doble hlice de dos cadenas de DNA. Los dos extremos de

Figura 6-82 Ciclo vital de un retrovirus. El genoma del retrovirus consiste en una molcula de RNA de unos 8500 nucletidos; en cada partcula vrica se hallan empaquetadas dos de estas molculas. La enzima transcriptasa inversa es una DNA polimerasa que primero produce una copia de DNA a partir de la molcula del RNA vrico y luego produce una segunda cadena de DNA sobre la primera copia de DNA, generando as una copia de doble hlice de DNA a partir del genoma de RNA. La integracin de este DNA de doble cadena en el cromosoma husped, catalizada por una protena vrica es necesaria para la sntesis de nuevas molculas de RNA vrico por la RNA polimerasa de la clula husped.

DNA DNA LA TRANSCRIPTASA INVERSA PRODUCE UNA DOBLE HLICE DNA/RNA Y UNA DOBLE HLICE DNA/DNA RNA t 1 RNA DNA I 1 RNA

INTEGRACION DE LA COPIA DE DNA EN EL CROMOSOMA

DNA integrado

TRANSCRIPCION muchas

TRADUCCION protena de la cpside 1 protena de la envoltu transcriptasa inversa

/Ti J,

ENSAMBLAJE DE MUCHAS PARTCULAS VRICAS, CADA UNA CONTENIENDO TRANSCRIPTASA INVERSA

DE LA ENVOLTURA

ra

Virus, plsmidos y elementos genticos transponibles

303

la molcula de DNA lineal del virus son reconocidos por una integrasa codifica da por el virus, que cataliza la insercin del DNA vrico en prcticamente cual quier sitio del crom osom a celular del husped (vase Figura 6-70). El siguiente paso del proceso de infeccin es la transcripcin del DNA vrico integrado m e diante una RNA polimerasa de la clula husped, produciendo grandes cantida des de molculas de RNA vricos idnticas al genoma original. Finalmente, estas molculas de RNA son traducidas generando una cpside, una envoltura y pro tenas con actividad transcriptasa inversa. Estas protenas se empaquetan con el RNA generando nuevas partculas vricas que salen de la clula por gemacin de la membrana plasmtica (vase Figura 6-82). Tanto los virus tumorales RNA como los DNA transforman las clulas porque la presencia permanente del DNA vrico en la clula produce la sntesis de nuevas protenas que alteran el control de la proliferacin de la clula husped. Los genes que codifican estas protenas se denominan oncogenes. A diferencia de los virus tumorales DNA, cuyos oncogenes tpicamente codifican protenas vricas esen ciales para la multiplicacin del virus, los oncogenes transportados por los virus tumorales RNA son versiones modificadas de genes normales de la clula hus ped que no son necesarias para la replicacin del virus. Dado que en la cpside del retrovirus nicamente se puede empaquetar una cantidad limitada de RNA, a menudo las secuencias oncognicas adquiridas reemplazan una parte esencial del genoma del retrovirus. En los Captulos 15 y 24 discutiremos de qu forma los oncogenes vricos han proporcionado indicios importantes sobre las causas y sobre la naturaleza del cncer y de los m ecanismos normales que controlan el crecimiento y la divisin en los animales pluricelulares. Tambin discutiremos de qu manera la integracin al azar del DNA vrico en los genomas puede alterar los genes normales, afectando as el comportamiento celular (vase Figura 24-24).

El virus del SIDA es un retrovirus 59

En 1982 apareci una nueva enfermedad de transmisin sexual que fue asociada a una forma no habitual de cncer (el sarcoma de Kaposi) y una gran variedad de infecciones no habituales. Ambos problemas reflejan una severa deficiencia del sistema inmunitario -especficam ente de los linfocitos T colaboradores (T helpers)- por lo que la enfermedad se denomin sndrome de inmunodeficiencia adquirida, SIDA (Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS). Cultivando linfocitos de pacientes en una fase inicial de la enfermedad, se aisl un retrovirus que ahora se sabe que es el agente causal del SIDA, enfermedad que se ha dise minado rpidamente com o una epidemia y que amenaza con causar la muerte de millones de personas en todo el mundo. El retrovirus, llamado virus de la inmunodeficiencia humana (HIV, de Hu man Immunodeficiency Virus) entra en los linfocitos T colaboradores unindose a una protena de membrana plasmtica funcionalmente importante denomi nada CD4 (discutida en el Captulo 23). El virus HIV tiene dos caractersticas que le hacen especialmente mortfero. En primer lugar, el virus acaba matando las clulas T colaboradoras que infecta en lugar de vivir en simbiosis con ellas como hacen la mayora de los dems retrovirus, y las clulas T colaboradoras son de vital im portancia en nuestra defensa contra la infeccin. En segundo lugar, el provirus tiende a permanecer en un estado de latencia en los cromosomas de una clula infectada sin producir virus hasta que es activado por un suceso raro y desconocido; esta habilidad de esconderse complica enorm emente cualquier intento de tratar la infeccin con frmacos antivricos. La mayora de la investigacin actual sobre el SIDA intenta entender el ciclo vital de HIV. Ya se ha determinado la secuencia completa de nucletidos del RNA vrico. Ello ha hecho posible identificar y estudiar cada una de las protenas que codifica. Se est utilizando la estructura tridimensional de su transcriptasa inversa (vase Figura 6-81) para colaborar en el diseo de nuevos frmacos que inhiban la enzima. En la Figura 6-83 se presenta un mapa gentico de HIV que muestra los nueve genes de este retrovirus.

304

Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

v if I vpr I
c a p e ru z a

ne f I vpu
3'

extrem os repetidos

pot

Algunos elementos transponibles estn estrecham ente relacionados con los retrovirus 6 0
Debido a que muchos virus pueden entrar y salir de los cromosomas de sus clu las husped, se cree que cualquier cromosoma grande debe contener varios pro virus. Probablemente estos genomas tam bin contienen diversas secuencias mviles de DNA, que no forman partculas vricas y que no pueden abandonar la clula. Estos elementos transponibles tienen una longitud media que oscila desde algunos cientos a varios miles de pares de bases, y normalmente en cada clula hay mltiples copias de ellos. Estos elementos pueden ser considerados como diminutos parsitos que estn escondidos en los cromosomas. Ocasional mente, cada elemento transponible puede activarse para desplazarse a otro lugar del DNA de la misma clula, un proceso denominado transposicin catalizado por su propia enzima de recom binacin especfica de lugar. Estas integrasas, tambin denominadas transposasas, a menudo estn codificadas en el DNA del propio elemento de transposicin. La mayora de los elementos transponibles se desplazan muy raramente (la mayora de los elementos de las bacterias, tan slo una vez cada 105 generaciones celulares aproximadamente), por lo que a menudo resulta difcil distinguirlos de partes no mviles del cromosoma. No se conoce si la activacin de su desplazamiento es muy rpida o no. Las transposiciones se pueden producir por varios mecanismos. Una gran familia de elementos transponibles utilizan un mecanismo que es indntico a una parte del ciclo vital de un retrovirus. Estos elementos, denominados retrotransposones, estn presentes en organismos tan diversos como las levaduras, las moscas y los mamferos. Uno de los retrotransposones m ejor conocidos es el denominado elemento Tyl de las levaduras. La primera etapa de su transposi cin es la transcripcin de todo el elemento transponible, produciendo una copia RNA del elemento, que tiene una longitud de ms de 5000 nucletidos. Este transcrito codifica una enzima transcriptasa inversa que hace una copia de la molcula de RNA a DNA de doble cadena a travs de un intermediario hbrido RNA/DNA que imita los primeros estadios del proceso de infeccin por un retrovirus (vase Figura 6-82). La analoga contina ya que la molcula de DNA circular utiliza una integrasa para integrarse en un lugar del cromosoma seleccionado al azar. A pesar del enorme parecido con el retrovirus, el elemento Tyl no tiene una envoltura proteica funcional, por lo que slo puede desplazarse por el interior de una clula y de su progenie.

Figura 6-83 Mapa del genoma del HIV. El genoma consta de unos 9000 nucletidos y contiene nueve genes, cuyas localizaciones se sealan en verde y en rojo. Tres de los nueve genes (los verdes) son com unes a todos los retrovirus: g a g codifica protenas de cpside, en v codifica protenas de envoltura y p o l codifica la transcriptasa inversa (vase Figura 6-81) y la integrasa (vase Figura 6-70). El genoma HIV es extraordinariamente com plejo, ya que contiene seis pequeos genes (en rojo) adems de los tres (en verde) que normalmente son necesarios para el ciclo vital del retrovirus. Al m enos algunos de estos pequeos genes codifican protenas que regulan la expresin de genes vricos y es tentador especular que es esta complejidad extra lo que hace a HIV tan mortfero. Como indican las ln eas rojas, para producir las protenas Rev y Tat hace falta que se produzca maduracin del RNA (splicing, vase Figura 8-7).

Otros elem entos transponibles se transfieren directamente a s mismos desde un lugar a otro del genoma 61
A diferencia de lo que ocurre con los retrotransposones, muchos elementos transponibles parecen no poder existir libres fuera del cromosoma del husped; las transposasas que catalizan sus desplazamientos pueden actuar sobre el DNA del elemento transponible siempre que ste est integrado en el cromosoma del husped. La transposasa se une a una corta secuencia que est repetida en una orientacin opuesta a cada extremo del elemento, permitiendo as que estos ex tremos se puedan unir mientras se cataliza el posterior proceso de recombina-

Virus, plsmidos y elementos genticos transponibles

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DNA INICIALES cortas secuencias repetidas invertidas elem ento transponible en el crom osom a dador A 3' crom osom a diana B
k k

DNA PRODUCIDOS

MMMn

interm ediarios transitorios 5'

+

sm m m &sm e

crom osom a dador vuelto a unir 5'

^ -p

3'
-

cortas secuencias repetidas de DNA diana en el crom osom a B

cin. Para el caso de algunos elementos transponibles, el mecanismo de trans posicin difiere nicam ente en que la molcula lineal de DNA que se va a inte grar ha de ser eliminada de una molcula de DNA ms larga, dejando una mues ca en el crom osom a vacante (Figura 6-84). Posteriormente, esta muesca se vuelve a soldar, pero en el proceso a menudo la secuencia de DNA es alterada, lo cual produce una m utacin en el antiguo lugar del cromosoma. Otros elem entos transponibles se replican cuando se desplazan. En el caso mejor estudiado, en primer lugar se genera una conexin covalente entre el ele mento transponible y un lugar diana seleccionado al azar; entonces esta cone xin dispara la sntesis localizada de DNA que genera una copia del elemento transponible replicado insertada en un nuevo lugar del cromosoma, mientras que la otra copia permanece en el lugar original (Figura 6-85). El mecanismo est estrecham ente relacionado con el m ecanismo no replicativo que acabamos de describir y comienza casi de la misma manera; de hecho, algunos elementos transponibles se pueden desplazar mediante ambos sistemas. Adems de desplazarse por s mismos, todos los tipos de elementos transpo nibles pueden, de forma ocasional, desplazar o reordenar secuencias de DNA vecinas del genoma de la clula husped. Por ejemplo, frecuentemente generan deleciones de secuencias adyacentes de nucletidos, o las transportan a otros lugares. La presencia de elementos transponibles hace que las reordenaciones de las secuencias del DNA de los cromosomas sean mucho menos estables de lo que se haba credo previamente, y probablemente los elementos transponibles son responsables de muchos cam bios evolutivos importantes del genoma (como se discute en el Captulo 8). Tambin son importantes los elementos transponibles desde el punto de vista evolutivo como los precursores ms antiguos de los virus? A pesar de que casi con toda seguridad los precursores de los retrovirus fueron retrotransposones, todos los elementos transponibles actuales dependen muy claramente de los mecanismos basados en las reacciones del DNA. Sin embargo, se cree que clulas muy primitivas debieron tener genomas de RNA en lugar de DNA, de forma que hemos de contemplar el metabolismo del RNA como el origen ltimo de los virus.

Figura 6 -84 Desplazamiento directo de un elemento transponible de un lugar a otro de un crom osom a. Los elementos transponibles de este tipo pueden ser reconocidos por sus secuencias de DNA repetidas invertidas (en n a ra n ja ) de sus extremos. Diferentes experimentos demuestran que la repeticin de estas secuencias, las cuales pueden ser de tan slo 20 nucletidos, es todo lo que necesitan para sufrir una transposicin mediante una transposasa especial asociada con el elemento. El m ecanism o mostrado aqu est estrecham ente relacionado con el utilizado por un retrovirus para integrar su DNA de doble hebra en un crom osom a (comprese con la Figura 6-70). A pesar de que la hendidura izquierda del crom osom a dador se llena, a menudo el proceso altera la secuencia de DNA, generando una mutacin en el lugar dador (no se muestra).

Probablem ente la mayora de los virus evolucionaron a partir de plsmidos 62

Incluso los virus ms grandes, dependen en gran medida de sus clulas husped para la biosntesis: por ejemplo, no se conoce ningn virus que sea capaz de sin tetizar sus propios ribosomas o de generar el ATP que necesita. Evidentemente, por tanto, las clulas han debido desarrollarse antes que los virus. Probablemen te, los precursores de los primeros virus fueron pequeos fragmentos de cido nucleico que desarrollaron la capacidad de multiplicarse de forma independien te de los crom osom as de sus clulas husped. Estos elementos de replicacin in dependiente, llamados plsmidos, pueden replicarse indefinidamente fuera del cromosoma husped. Existen plsmidos de DNA y plsmidos de RNA y, como ocurre con los virus, contienen una secuencia especial de nucletidos que acta

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Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

como origen de replicacin. Sin embargo, a diferencia de los virus, los plsmidos no pueden sintetizar una envoltura proteica y por lo tanto no pueden desplazar se fcilmente de una clula a otra. Los primeros plsmidos RNA debieron parecerse a los viroides encontrados en algunas clulas vegetales. Estas pequeas molculas circulares de RNA de tan slo 300 o 400 nucletidos de longitud se replican a pesar de que no codifican ninguna protena. Al no tener envoltura proteica, los viroides existen como m o lculas de RNA desnudo y nicamente pasan de una planta a otra cuando las su perficies de las clulas dadora y aceptora se hallan alteradas, de forma que no existe una barrera de membrana para el paso de los viroides. Puede esperarse que bajo la presin de la seleccin natural, estos elementos de replicacin inde pendiente adquirieran secuencias de nucletidos de la clula husped que les facilitaran su propia multiplicacin, entre las que habra secuencias que codifi can protenas. En efecto, algunos plsmidos actuales son bastante complejos, codificando protenas y molculas de RNA que regulan su replicacin y prote nas que controlan su separacin en clulas hijas. Los mayores plsmidos cono cidos son cadenas circulares de doble hlice de DNA de ms de 100 000 pares de bases de longitud. Probablemente, el primer virus apareci cuando un plsmido RNA adquiri un gen que codificaba una protena de cpside. Sin embargo, una cpside puede contener una pequea cantidad de cido nucleico; as pues, un virus est limita do al nmero de genes que puede contener. Destinados a conseguir la mxima utilidad de su limitado genoma, algunos pequeos virus evolucionaron solapan do genes, estrategia segn la cual una zona de la secuencia de nucletidos que codifica una protena, es utilizada (en la misma o en otra pauta de lectura) para codificar una segunda protena. Otros virus desarrollaron cpsides mayores, con lo que pudieron acomodar mayor nmero de genes. Dotados de su habilidad nica de transferir secuencias de cidos nucleicos a travs de barreras de especie, los virus jugaron casi con toda seguridad un im portante papel en la evolucin de los organismos que infectaron. Muchos de ellos se recom binaron frecuentemente con el genoma de su clula husped y con algn otro genoma, y de esta forma, pudieron tomar al azar pequeas piezas del crom osom a del husped y trasladarlas a otras clulas o a otros organismos. Adems, las copias integradas del DNA vrico (provirus) han llegado a convertir se en una parte normal del genoma de la mayora de los organismos. Como ejemplos de provirus como stos pueden citarse la familia de bacterifagos lambda y el llamado retrovirus endgeno, encontrado en numerosas copias en el genoma de los vertebrados. El DNA vrico integrado puede ser alterado de for ma que ya no pueda producir un virus completo pero que todava pueda codifi car protenas, algunas de las cuales pueden ser tiles para la clula husped. As pues, tal com o ocurre con el proceso de la reproduccin sexual, los virus pueden acelerar la evolucin facilitando el mezclado de los acervos de genes. El proceso por el cual las secuencias de DNA se transfieren entre genomas de diferentes clula husped mediante un virus, se denomina transduccin del DNA. Algunos virus que transducen DNA con frecuencias particularmente altas, son utilizados en investigacin para trasladar genes de una clula a otra. Los vi rus y sus parientes prximos, los plsmidos y los elementos transponibles, tam bin son importantes para la biologa celular en muchos otros aspectos. Gracias a su relativa simplicidad, por ejemplo, los estudios sobre su reproduccin han progresado de una forma extraordinariamente rpida y han iluminado muchos de los mecanismos genticos bsicos de la clula. Adems, tanto los virus como los plsmidos han sido elementos cruciales en el desarrollo de la tecnologa del DNA recombinante, que describiremos en el Captulo 7.

elem ento gentico transponible en un crom osom a

DNA crom osm ico com plejo proteico form ado

serie de com plicados procesos en los cuales la secuencia de DNA transponible es replicada e insertada en un nuevo lu g a r.

disociacin

Resumen
Los virus son partculas infecciosas form adas p o r una m olcula d e DNA o d e RNA (el genom a vrico) em paquetada en una cpside proteica, la cual, en el caso d e los

Figura 6 -85 Desplazamiento replicativo de un elemento transponible en el interior de un crom osom a. El elemento que se muestra se replica durante la transposicin, de forma que su movimiento tiene lugar sin que el elemento se escinda de su lugar original. Las dos secuencias repetidas invertidas de DNA que normalmente flanquean los dos extremos de los elementos transponibles, se indican en n aran ja. Al iniciarse la transposicin, la transposasa corta una de las dos cadenas de DNA a cada extremo del elem ento transponible, y entonces el elemento acta com o patrn para la sntesis de DNA. Esta sntesis empieza por la adicin de nucletidos a los extremos 3 de las secuencias de DNA del cromosoma. Se conocen ms detalles de este proceso, pero son demasiado com plejos para poder ser ilustrados aqu.

Virus, plsmidos y elementos genticos transponibles

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virus recubiertos, est rodeada por una membrana del tipo de una bicapa lipdica. Tanto la estructura del genoma vrico como sus sistema de replicacin vara consi derablemente de un tipo de virus a otro. Un virus puede multiplicarse nicamente en el interior de una clula husped, cuyos mecanismos genticos controla en bene ficio de su propia reproduccin. Un resultado habitual de la infeccin vrica es la lisis de la clula infectada, con liberacin de partculas vricas infecciosas. En algu nos casos, sin embargo, el cromosoma vrico se integra en un cromosoma de la clu la husped, donde es replicado como un provirus con el genoma husped. Se cree que muchos virus han evolucionado a partir de plsmidos, que son molculas de DNA o de RNA autorreplicantes pero sin la capacidad de envolverse por s solas en una cubierta proteica. Los elementos transponibles son secuencias de DNA que se diferencian de los virus en que nicamente son capaces de multiplicarse en el interior de su clula husped y en las clulas descendientes de ella; como los plsmidos, no pueden exis tir deforma establefuera de las clulas pero a diferencia de los plsmidos, normal mente se replican como una parte integrante de un cromosoma. Sin embargo, algu nos elementos transponibles estn estrechamente relacionados con los retrovirus y pueden desplazarse de un sitio a otro del genoma mediante la transcripcin inversa de un intermediario de RNA A pesar de que tanto los virus como los elementos transponibles pueden considerarse como parsitos, muchas de las reordenaciones de las secuencias de DNA que ellos generan son importantes para la evolucin de las clulas y de los organismos.

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Captulo 6 : Mecanismos genticos bsicos

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Bibliografa

311

Tecnologa del DNA recombinante

__________

m'

F rag m en taci n , sep araci n y secuenci acin de m olculas de DNA H ibridacin de cidos nucleicos

V . r '

''

Clonaje de DNA Ingeniera de DNA

Hasta principios de los aos 70, el DNA era la molcula de la clula que planteaba ms dificultades para su anlisis bioqumico. Enormemente larga y qumicamen te montona, la secuencia de nucletidos del DNA tan slo poda ser estudiada a travs de caminos indirectos -tales como la determinacin de la secuencia de las protenas o del RNA, o el anlisis gentico. Actualmente la situacin ha cambiado por completo. De ser la macromolcula celular ms difcil de analizar, el DNA ha pasado a ser la ms fcil de estudiar. Hoy en da es posible separar regiones deter minadas del DNA, obtenerlas en cantidades prcticamente ilimitadas y determi nar su secuencia de nucletidos a una velocidad de varios cientos de nucletidos al da. Mediante variaciones sobre estas mismas tcnicas, un gen puede ser alte rado (sometido a ingeniera) y ser transferido a clulas en cultivo o (con ms difi cultad) a la lnea germinal de animales, donde el gen modificado se incorpora como parte funcional y permanente del genoma. Estos adelantos tcnicos han tenido un impacto espectacular en la biologa celular, permitiendo el estudio de las clulas y sus macromolculas mediante sistemas que antes eran inimaginables. Por ejemplo, han proporcionado la m a nera de determinar las funciones de muchas protenas recin descubiertas y de sus dominios y de desenmaraar los complejos mecanismos que regulan la ex presin gnica en eucariotas. Tambin han hecho posible disponer de grandes cantidades de protenas minoritarias que regulan el desarrollo y la proliferacin celular. A nivel comercial resulta muy prometedor el uso de tcnicas de este tipo para la produccin a gran escala de hormonas proteicas y de vacunas que antes eran disponibles nicamente con un gran coste y trabajo. La tecnologa del DNA recom binante constituye una mezcla de tcnicas, al gunas de las cuales son nuevas y otras han sido adoptadas de otros campos de la ciencia, como la gentica microbiana (vase Tabla 7-1). Las ms importantes son: 1. 2. la rotura especfica del DNA mediante nucleasas de restriccin, que facilita enorm em ente el aislamiento y la manipulacin de los genes individuales; la secuenciacin rpida de todos los nucletidos de un fragmento purifica do de DNA, que hace posible determinar los lmites precisos de un gen y de la secuencia de aminocidos que codifica; la hibridacin de los cidos nucleicos que hace posible localizar secuencias determinadas de DNA o de RNA, con una gran exactitud y sensibilidad, uti lizando la capacidad que tienen estas molculas de unirse a secuencias complementarias de otros cidos nucleicos;

3.

313

4.

el clonaje del DNA, mediante el cual se puede conseguir que un fragmento de DNA se integre en un elemento gnico autorreplicante (plsmido o vi rus) que habita en una bacteria, de tal manera que una molcula simple de DNA puede ser reproducida generando muchos miles de millones de co pias idnticas; y la ingeniera gentica, mediante la cual se pueden alterar secuencias de DNA produciendo versiones modificadas de los genes, los cuales se pue den reinsertar en clulas u organismos. 5' 4 gK i } 0

5.

Hpa I

En este captulo se describir cm o la tecnologa del DNA recombinante ha creado nuevas vas de aproximacin experimental que han revolucionado el es tudio de la biologa celular.

GlH Z H U 3'

CORTE

Fragmentacin, separacin y secuenciacin de molculas de DNA1

Antes de los aos 70 pareca imposible aislar un gen de un cromosoma. A dife rencia de las protenas, los genes no existen en las clulas como entidades inde pendientes, sino como regiones de una molcula de DNA de gran tamao. Aun que las molculas de DNA se pueden fragmentar m ecnicamente al azar en pequeos trozos, un fragmento que contenga un gen aislado ser uno entre cientos de miles de otros fragmentos, indiferenciables por su tamao. Cmo se puede purificar un gen? Debido a que todas las molculas de DNA estn forma das por una m ezcla aproximadamente equivalente de los mismos cuatro ncleotidos no pueden separarse, como se hace con las protenas, segn procedimien-

Eco Rl
0 E H aK x H x H ^ 3' 3' { Z K i K a } Q [ g> 5,
CORTE

Hind III

3'4ZHZ lK^lH]l H 3 & 5

CORTE

T abla 7-1 Algunas d e las e tap as prin cip ales del d esarrollo de la tecn ologa del DNA reco m b in a n te

1869
1944

M iesch er aisl por primera vez el DNA. Avery demostr que es el DNA y no la protena el que contiene la

3 '4 1 ] [ aH I H I H I H } 5'
CORTE

1953

informacin gentica durante la transformacin bacteriana. W atson y C rick propusieron el modelo de la doble hlice para la estructura del DNA, basado en los resultados de rayos X de Franklin y
Wilkins. K o m b erg descubri la DNA polimerasa, la enzima que ahora se utiliza

P stI

1957 1961

para producir sondas de DNA marcadas.

M arm u r y D oty descubrieron la renaturalizacin del DNA, estableciendo

Figura 7-1 Secuencias de nucletidos del DNA reconocidas por cuatro nucleasas de restriccin ampliamente utilizadas. Como ocurre en estos

la especificidad y la posibilidad de las reacciones de hibridacin de los cidos nucleicos. 1962 A rber proporcion la primera evidencia de la existencia de las nucleasas de restriccin del DNA, que condujo a su posterior purrificacin y utilizacin en la caracterizacin de la secuencia del DNA por parte de N athan s y H. Sm ith. 1966 N irenberg, O ch o a y K h oran a dilucidaron el cdigo gentico. 1967 G ellert descubri la DNA ligasa, la enzima utilizada para unir fragmentos de DNA. 1972-1973 Se desarrollaron las tcnicas de clonaje del DNA en los laboratorios de B oyer, C ohen, B erg y colaboradores, en la Universidad de Stanford y en la Universidad de California en San Francisco. 1975 S ou th ern desarroll la hibridacin tras transferencia sobre gel, para la deteccin de secuencias especficas de DNA. 1975-1977 S anger y B arrell y M axam y Gilbert desarrollaron mtodos rpidos de secuenciacin del DNA. 1981-1982 P alm iter y B rin ster produjeron un ratn transgnico; Spradling y Rubin produjeron moscas del vinagre transgnicas. 1985 M ulls y colaboradores inventaron la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR, de Polimerase Chain Reaction).

ejemplos, estas secuencias suelen tener seis pares de bases y ser ''palindrmicas (esto es, las secuencias de ambas hebras son iguales entre s si se gira la hlice 180 grados alrededor del centro de la corta regin de hlice que es reconocida). Las enzimas cortan las dos cadenas de DNA en el lugar de la secuencia de reconocimiento o cerca de ella. En el caso de algunas enzimas como Hpa I, el corte libera extremos romos; en otros casos como por ejemplo Eco RI, Hind III y Pst I, el corte es escalonado y crea extremos cohesivos. Las nucleasas de restriccin se obtienen de varias especies de bacterias: Hpa I de Hemophilus parainfluenzae, Eco RI de Escherichia coli, Hind III de Hemophilus influenzae y Pst I es de

Providencia stuartii.
314 Captulo 7 : Tecnologa del DNA recombinante

tos basados en su diferente carga, composicin o propiedades de unin. Ade ms, aunque fuera posible disear un procedimiento de aislamiento, la cantidad de DNA necesaria para aislar un gen en cantidad til para experimentos poste riores sera muy elevada. La solucin a todos estos problemas apareci con el descubrimiento de las endonucleasas de restriccin. Estas enzimas, que pueden aislarse de bacterias, cor tan la molcula de DNA de doble cadena en lugares discretos definidos por la se cuencia de nucletidos, produciendo fragmentos de DNA de doble cadena de ta maos definidos. Distintas especies de bacteria fabrican diferentes endonucleasas de restriccin con distintas especificidades de secuencia, y es relativamente fcil encontrar una endonucleasa de restriccin que libere un fragmento de DNA que incluya a un determinado gen. El tamao del fragmento liberado puede ser utiliza do para purificar parcialmente el gen de una mezcla. Ms importante an, el frag mento de DNA sirve, frecuentemente, como material de partida para la produc cin del gen muy puro en cantidades ilimitadas mediante clonaje del DNA. Empezaremos esta seccin explicando cmo se utilizan las endonucleasas de restriccin para producir fragmentos de DNA, y cmo estas molculas de DNA (y otras) se separan en funcin de su tamao. A continuacin expondre mos cmo, despus de purificar y amplificar el fragmento de DNA mediante clo naje, se puede determinar la secuencia en que se encuentran los nucletidos en la molcula, mediante la secuenciacin.

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Figura 7-2 Muchos tipos de nucleasas de restriccin producen fragmentos de DNA con extrem os cohesivos. Los fragmentos de DNA que tengan los mismos extremos cohesivos se pueden unir mediante apareamiento de bases complementarias entre sus extremos cohesivos, tal com o se ilustra en la figura. En este ejemplo, los dos fragmentos de DNA que se unen entre s fueron producidos por la nucleasa de restriccin Eco RI (vase Figura 7-1).

Las endonucleasas de restriccin cortan las molculas de DNA en secuencias nucleotdicas especficas 2
Muchas bacterias producen unas enzimas denominadas nucleasas de restric cin, que las protegen, degradando las molculas de DNA que han sido trans portadas al interior de las bacterias por los virus. Cada enzima reconoce una secuencia especfica del DNA de entre cuatro y ocho nucletidos. Cuando estas secuencias se presentan en el genoma de la propia bacteria, estn camufladas gracias a la mediacin de un residuo A o de un residuo C; cuando estas secuen cias se presentan en un DNA extrao, generalmente no se hallan metiladas y son por tanto atacadas por la nucleasa de restriccin. Se han purificado muchas nu cleasas de restriccin de diferentes especies bacterianas y actualmente existen ms de 100 de estas enzimas comercializadas, la mayora de las cuales reconocen diferentes secuencias de nucletidos. Algunas endonucleasas de restriccin cortan el DNA generando secuencias cortas de DNA de cadena sencilla en los extremos del fragmento (Figura 7-1). Este tipo de extremos se denomina cohesivo pues es complementario en secuen cia al que genera la misma endonucleasa de restriccin en cualquier otro frag mento (Figura 7-2). Los extremos cohesivos permiten unir fcilmente fragmentos de DNA obtenidos con la misma endonucleasa de restriccin (o con otra que genere los mismos extremos cohesivos). Las molculas de DNA producidas me diante la unin de dos o ms fragmentos de DNA se denominan molculas de DNA recombinantes, y han hecho posible nuevas aproximaciones al estudio de los procesos biolgicos.

Los mapas de restriccin m uestran la distribucin de pequeas secuencias nucleotdicas a lo largo del cromosom a 3
Una nucleasa de restriccin determinada cortar cualquier doble hlice de DNA extrada de una clula, generando una serie de fragmentos de DNA (conocidos como fragmentos de restriccin). Comparando los tamaos de los fragmentos de restriccin generados a partir de una regin gnica determinada tras el trata miento con una combinacin de diferentes nucleasas de restriccin, se puede construir un m apa de restriccin de esta regin que muestre la localizacin de cada punto de corte (de restriccin) en relacin con los puntos de restriccin ve cinos (Figura 7-3). Dado que cada nucleasa de restriccin reconoce diferentes

Fragmentacin, separacin y secuenciacin de molculas de DNA

315

EXPERIMENTO

m olcula de DNA de 10kb

el corte con las nucleasas de restriccin A y B conjuntam ente genera tres fragm entos 2kb! 3kb! 5kb !
s u m a = 10kb

el corte con la nucleasa de restriccin A genera dos fragm entos

el corte con la nucleasa de restriccin B genera dos fragm entos

CONCLUSIN: La enzima A corta cerca de un extremo de la molcula. La enzima B puede cortar tanto en el mismo extremo como cerca del otro extremo. El tamao de los fragmentos generados por ambas enzimas actuando conjuntamente elimina la primera alternativa y permite concluir que el orden de corte de las nucleasas de restriccin es el que se muestra aqu.

B 2kb 5kb - 10kb 3kb

2kb 8kb
s u m a = 10kb

3kb I 7kb !
s u m a = 10kb

secuencias cortas de DNA, un mapa de restriccin refleja la disposicin de se cuencias de nucletidos especficas en la regin. Esto significa que se pueden comparar diferentes regiones de DNA (comparando sus mapas de restriccin), sin tener que determinar sus secuencias de nucletidos. Por ejemplo, comparando los mapas de restriccin que se presentan en la Figura 7-4, podemos determinar que las regiones del cromosoma que codifican las cadenas de hemoglobina en el hombre, en el orangutn y en el chimpanc han permanecido fundamentalmente inalteradas durante los entre 5 y 10 millones de aos transcurridos desde que es tas especies divergieron por primera vez. Los mapas de restriccin tambin son importantes para el clonaje del DNA y para la ingeniera gentica, permitiendo localizar un gen de inters en un fragmento de restriccin determinado y facili tando as su aislamiento. 01
a b c g d d* mf

Figura 7-3 Mapa de restriccin. Sencillo ejemplo que ilustra cmo se distribuyen los lugares de corte de diferentes nucleasas de restriccin (conocidos como ), unos respecto a otros, sobre molculas de DNA de doble hlice, dando lugar a un (kb = kilobases; una abreviatura que designa tanto 1000 nucletidos como 1000 pares de nucletidos.)

restriccin

dianas de

restriccin,

mapa de

02
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III

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gtall

II

II I

gibn 0

.1 ....1...... , I

c g

................
I

II

M / \

b h c

l i l i

__L _____________ _____________ J

10

20 m iles de pares de nucletidos de DNA

_____ ____ 1_____________ I _____________

30

L__________

40

Figura 7-4 Mapas de restriccin de DNA hum ano y de DNA procedente de varios prim ates, de un grupo de genes que codifican la hemoglobina. En cada mapa, los dos indican las posiciones del DNA que corresponden a los dos genes de la a-globina. Cada letra representa un punto de corte de una nucleasa de restriccin diferente. Como en la Figura 7-3, la localizacin de cada uno de los cortes se determin comparando los tamaos de los fragmentos de DNA generados al tratar los DNA con las diferentes nucleasas de restriccin tanto de forma individual como en distintas combinaciones. Es de destacar que el chimpanc, el primate ms prximo al hombre, presenta el mapa de restriccin ms parecido, mientras que el gibn, que de los considerados es el ms alejado, presenta el mapa ms divergente -incluyendo tres inserciones de DNA. (Por cortesa de Elisabeth Zimmer y Alian Wilson.)

cuadrados rojos

316

Captulo 7 : Tecnologa del DNA recombinante

Figura 7-5 La electroforesis en gel es una poderosa tcnica que permite separar molculas de DNA en funcin de su tam ao. En los tres ejemplos que se presentan aqu, la electroforesis va de arriba a abajo, de forma que las molculas mayores de DNA -y por ello de movimiento ms len to- estn cerca de la parte superior del gel. En (A) se utiliza un gel de poliacrilamida de poros pequeos para fraccionar molculas de DNA de cadena nica. En el rango de tamaos de 10 a 500 nucletidos, pueden separarse unas de otras las molculas cuyo tamao se diferencia en tan slo un nucletido. En este ejemplo, los carriles del 1 al 4 representan los productos de cuatro reacciones diferentes de secuenciacin de DNA. El DNA a secuenciar se ha replicado artificialmente a partir de un extremo fijo hacia un punto variable de terminacin, produciendo una serie de rplicas parciales de longitud variada. (En la Figura 7-8 se explica cmo se obtiene este conjunto de rplicas parciales.) En el carril 1 se encuentran las rplicas parciales que terminan en G; en el carril 2 las que terminan en A; en el carril 3 aquellas terminadas en T; y en el carril 4 las que terminan en C. Debido a que las molculas de DNA del experimento se encuentran marcadas radiactivamente sus posiciones se pueden determinar mediante autorradiografa, como se muestra. En (B) se utiliza un gel de agarosa de poros de tamao medio para separar molculas de DNA de doble hebra. Este mtodo es ms utilizable en el rango de tamaos de 300 a 10 000 pares de nucletidos. Estas molculas de DNA son fragmentos de restriccin producidos a partir del genoma de un virus bacteriano, y se han detectado mediante la fluorescencia que emiten despus de ser teidos con bromuro de etidio. En (C) se ha utilizado la tcnica de electroforesis en gel de agarosa de campo pulsante para separar 16 cromosomas diferentes de levadura (S. cerevisia) cuyo tamao oscila entre 220 000 y 2 500 000 pares de nucletidos. El DNA se ha teido como en (B). Sobre este tipo de geles se pueden separar molculas de DNA de tamaos tan grandes como 107 pares de nucletidos. (A, por cortesa de Leander Lauffer y Peter Walter; B, por cortesa de Ken Kreuzer; C, de D. Vollrath y R.W. Davis, N ucleicA cids Res. 15:7876, 1987. Con autorizacin de Oxford University Press.)

carriles
1 2 3 4

200

-6 0 0 0

1 N -

d i

h b

T/

paros do nucletidos

fnnr 5 9 !*

w L r

m im

I
12 4 157

-1 0 0 0
(B>

jM

2.5

millones

iE r '* iii

Las molculas de DNA de diferentes tamaos pueden separarse mediante la electroforesis en gel4
Durante los primeros aos de la dcada de 1970 se descubri que se poda deter minar con exactitud la longitud y la pureza de las molculas de DNA utilizando los mismos mtodos de electroforesis en gel que se haban demostrado tiles para el anlisis de las cadenas proteicas. Actualmente el proceso es ms sencillo que para las protenas; dado que en las molculas de cido nucleico cada nucle tido presenta una nica carga negativa, no es necesario utilizar el detergente cargado negativamente SDS que se requiere para conseguir que las molculas de protena se muevan de una manera uniforme hacia el electrodo positivo. Para el caso de fragmentos de DNA menores de 500 nucletidos de largo, existen geles de poliacrilamida especialmente diseados que permiten la separacin de m ol culas que se diferencien en un solo nucletido de longitud (Figura 7-5A). No obstante, los poros de los geles de poliacrilamida son demasiado pequeos para permitir que molculas largas de DNA puedan atravesarlos; para separar estas molculas en funcin de su tamao, se utilizan geles mucho ms porosos formados por soluciones diluidas de agarosa (un polisacrido aislado de algas marinas) (Fi gura 7-5B). Ambos mtodos de separacin de DNA son ampliamente utilizados tanto con finalidad analtica como preparativa. Una variacin reciente de la electroforesis en agarosa, llamada electroforesis en gel de campo pulsante, hace posible la separacin de molculas enormes de DNA. La electroforesis en gel ordinaria no consigue separar estas molculas por que el campo elctrico uniforme las extiende adoptando configuraciones ser penteantes que viajan a travs del gel a una velocidad que es independiente de su longitud. Pero, alteraciones frecuentes en la direccin del campo elctrico fuerzan a las molculas a reorientarse para poderse desplazar. Este proceso de reorientacin es ms lento cuanto mayor es la molcula y por ello las molculas progresivamente ms largas se van retrasando respecto a las ms cortas. Por ello,

16 13 1 950 000

5 2|1 4 10*

pares de nucletidos

11p 5-610000

8 -1 9 1

I - 220 000

-5 0
<A>

tC)

Fragmentacin, separacin y secuenciacin de molculas de DNA

317

. 1 II 1 1 1 1 1 1 1 II 1 1 I II 1 1 1 1 1 1 II II 1 1 1 1 1 1 1 II 1 1 1
desnaturaliza e hbrida con una mezcla de nucletidos S iS iS + ,,

fragm ento de restriccin de DNA purificado

fragm ento de restriccin de DNA purificado

32( P P P '

------------- > \

DNA m arcado en los extrem os 5 m ediante la accin de la polinucletido quinasa y ATP marcado con 32P

una nucleasa de restriccin corta la hlice de DNA en dos fragm entos de tam ao diferente aadir DNA polimerasa y nucletidos marcados

1M .1. 1 1
* 3' 5'

1 .1.1.M. 1..

1.1 I I .i.i.T.1. lll.l 1 I..I.I 1 1 1 ).! ! 1 ;1 separacin por electroforesis en gel 3'

........................
+ 5'

................ 3' . .

la DNA polim erasa incorpora nucletidos marcados, de form a que genera una poblacin de m olculas de DNA que contienen ejem plos marcados de todas las secuencias de ambas hebras (A)

el fragm ento deseado de DNA, con una sola hebra marcada en un extrem o (B)

en geles de campo pulsante los cromosomas enteros tanto bacterianos como de levaduras aparecen como bandas discretas y pueden ser aislados e identificados en base a su tamao (Figura 7-5C). Un cromosoma tpico de mamfero, de 108 pa res de bases, es demasiado grande para poderlo aislar aun con este mtodo, pero s que pueden aislarse e identificarse grandes regiones si el DNA cromosmico se corta primero con endonucleasas de restriccin que reconocen secuencias muy poco frecuentes (por ejemplo, una vez cada 106 o 107 pares de bases). Evidentemente, en los geles de agarosa o de poliacrilamida las bandas de DNA sern invisibles a menos que el DNA est marcado o teido de alguna m a nera. Un mtodo sensible de tincin del DNA consiste en sumergir el gel despus de la electroforesis en el colorante bromuro de etidio que, cuando se halla unido al DNA, es fluorescente con luz ultravioleta (Figura 7-5B y C). Un mtodo de de teccin incluso ms sensible que ste consiste en la incorporacin de un radio istopo a la molcula de DNA antes de la electroforesis; habitualmente se utiliza el 32P ya que puede ser incorporado en los fosfatos del DNA y emite partculas p muy energticas que son fciles de detectar por autorradiografa (Figura 7-5A).

Las m olculas purificadas de DNA pueden ser marcadas in vitro con radioistopos o con marcadores qumicos 5
Para aadir distintas marcas a las molculas de DNA aisladas se utilizan funda mentalm ente dos sistemas. El primero utiliza una enzima de E. coli, la DNA poli merasa I , para insertar un gran nmero de nucletidos radiactivos (habitual mente marcados con 32P) o compuestos qumicos en cada molcula de DNA (Figura 7-6A) generando as sondas de DNA altamente marcadas para las reac ciones de hibridacin de cidos nucleicos (vase ms adelante). El segundo m todo utiliza la enzima polinucletido quinasa de bacterifagos para transferir un nico 32P marcado desde el ATP hasta extremo 5 de cada cadena de DNA (Figura 7-6B). Dado que la quinasa incorpora un slo 3 Z P en cada hebra de DNA, estas cadenas de DNA no son lo suficientemente radiactivas como para utilizarlas com o sondas; pero dado que slo estn marcadas en uno de sus extremos, son extraordinariamente tiles para la secuenciacin del DNA y para el estudio de las huellas del DNA (footprinting), tal como explicaremos a continuacin.

Figura 7-6 Para m arcar con radiactividad las molculas de DNA, se utilizan rutinariam ente dos procedimientos. (A) La DNA polimerasa I marca todos los nucletidos de una molcula de DNA, y por lo tanto puede utilizarse para generar sondas de DNA muy marcadas radiactivamente. (B) La polinucletido quinasa marca nicam ente los extremos 5 f de las hebras de DNA; as pues, cuando despus de marcar se fracciona la molcula de DNA mediante nucleasas de restriccin, tal com o se muestra en la figura, pueden obtenerse fcilm ente molculas que contengan una nica hebra marcada en el extremo 5. El mtodo en (A) se emplea para producir tambin molculas de DNA no radiactivo que contienen un marcador qumico especfico que puede ser detectado con un anticuerpo adecuado (vase Figura 7-18).

318

Captulo 7 : Tecnologa del DNA recombinante

fra gm e nto inicial de DNA de una sola hebra m arcado con 3ZP en su extrem o 5' ( p) TGCCTTGAACGCATGCT

lugar de rotura T 18 16 C G A

un procedim iento qum ico que rom pe la cadena por los residuos A genera fragm entos radiactivos de diferentes longitudes

17 15
14 13
12

TGCACTTGAACGC TGCT TGCACTTGA CGCATGCT ( ? ) - TGCAC1TG ACGCATGCT

11

10
9

0 gel

TGC CTTGAACGCATGCT fragm entos no marcados __________ I

I____________

fragm entos radiactivos

(A)

estos fragm entos son separados por electroforesis en gel en funcin estrictam ente de su long itud; por autorradiografa se detectarn nicam ente los fragm entos radiactivos

(B) la secuencia de DNA, leda directam ente desde la parte in fe rio r del gel a la superior, es

TG CACTTGAACGCATG CT
1 18

Los fragmentos aislados de DNA pueden ser rpidamente secuenciados 6

A finales de los aos 70 se desarrollaron mtodos que permitieron determinar de manera simple y rpida la secuencia nucleotdica de cualquier fragmento de DNA purificado. Como resultado de ello, se han obtenido las secuencias de DNA completas de muchos cientos de genes de mamferos, incluyendo los que codi fican la insulina, la hemoglobina, el interfern y el citocromo c. La cantidad de informacin respecto a secuencias de DNA es muy grande (muchos millones de nucletidos) por lo que deben utilizarse ordenadores para almacenarla y anali zarla. Se han determinado varias secuencias continuas de DNA de ms de 105 pares de nucletidos; entre ellas se encuentran el genoma entero del virus de Epstein-Barr (que infecta a humanos y causa la infeccin de mononucleosis) y el genoma entero de cloroplasto vegetal, as como el cromosoma completo de la levadura. Se han descrito dos potentes mtodos de secuenciacin del DNA: en la Figura 7-7 se describe el mtodo qumico, y en la Figura 7-8 el mtodo enzim tico. Este ltimo mtodo, basado en la sntesis in vitro de DNA en presencia de nuclesidos trifosfato terminadores de cadena, se ha convertido en el mtodo ms comn para secuenciar el DNA. Estos dos mtodos de secuenciacin del DNA son tan rpidos y seguros que, tal como se ha indicado anteriormente, el sistema ms fcil y exacto de determi nar la secuencia de aminocidos de una protena consiste en determinar la se cuencia de nucletidos de su gen: se genera un clon de cDNA a partir del mRNA apropiado (ver ms adelante), se determina la secuencia de nucletidos y se uti liza el cdigo gentico como diccionario para traducir esta secuencia en una se cuencia de aminocidos. Aunque en principio existen seis pautas diferentes de lectura por medio de las cuales la secuencia de DNA se puede traducir a protena (tres por cada hebra), generalmente se reconoce la correcta por ser la nica que no presenta un gran nmero de codones de terminacin (Figura 7-9). Habitual mente se determina una pequeo trozo de la secuencia de aminocidos de la protena purificada para confirmar la secuencia determinada a partir del DNA. A medida que se han perfeccionado los mtodos de determinacin de secuen cia de DNA, los cientficos han empezado a vislumbrar la posibilidad de determinar la secuencia completa del genoma humano, unos 3 x 109 pares de bases. Debido a que dicha secuencia contendra la secuencia de todos los RNA y de todas las prote-

Figura7-7 Mtodo qumico de secuenciacin de DNA. (A) El proceso se inicia con la obtencin de un conjunto de molculas de DNA de doble cadena marcadas en un extremo por el mtodo descrito en la Figura 7-6B. En la primera etapa las cadenas de la doble hlice se disocian y se someten a un tratamiento suave con un agente qumico que destruye una de las cuatro bases (en este caso los residuos A). Debido a que el tratamiento es suave slo se rompe una A por molcula, al azar. Esto genera una coleccin de fragmentos de DNA de diferentes longitudes, que reflejan los lugares en que se encontraban las A en el DNA original. Los fragmentos se separan en un gel y se detectan por autorradiografa: solamente los fragmentos que poseen un extremo 5 terminal fosfato 32P aparecen en el gel y su tamao indica la distancia desde el extremo marcado hasta la base A. (B) Para determinar la secuencia completa, se realizan procedimientos similares a cuatro muestras separadas de la misma molcula de DNA marcada en su extremo 5, utilizando compuestos qumicos que rompan el DNA de forma preferente por T en la primera muestra, por C en la segunda, por G en la tercera y por A en la cuarta. Los fragmentos resultantes son separados en carriles paralelos del mismo gel, como los que se muestran en la Figura 7-5A, obtenindose un patrn de bandas de DNA radiactivas a partir de las cuales se lee la secuencia de DNA. El nucletido ms cercano al extremo 5 de la secuencia se determina mirando el gel al nivel 1 (en la parte inferior del gel) y observando en qu carril aparece la banda (T). El mismo procedimiento se utiliza para determinar el nivel 2, luego para el 3 y as sucesivamente, hasta obtener la secuencia completa. La ilustracin presenta el mtodo de manera idealizada; en realidad los tratamientos qumicos son menos especficos de lo que se muestra.

Fragmentacin, separacin y secuenciacin de molculas de DNA

319

(A)

precursores desoxirribonuclesido -----trifosfato normales T-4G C^A" (dATP, dCTP, dGTP y tj A7-G^Ct dTTP) AA a W t
G rG

pequea cantidad de didesoxirribonuclesido trifosfato (ddATP)

Figura 7-8 Mtodo enzimtico de secuenciacin de DNA. (A) El DNA a

secu en ciar se utiliza por la DNA polim erasa com o m olde en la sntesis

cebador para la DNA polimerasa

_GCTACCTGCATGGA CG ATGG ACGTACCTCTG AAGCG ! m olcula de DNA de una sola hebra a secuenciar (B)

la incorporacin (infrecuente) de didesoxirribonuclesido bloquea el crecim iento posterior de la m olcula de DNA

5' GCATATGTCAGTCCAG 3' 3' CGTATACAGTCAGGTC 5'

in vitro, de una serie de rplicas parciales que com ien zan siem pre en el m ism o sitio, pero que term in an en puntos diferentes a lo largo de la cad en a de DNA. La clave de este m tod o radica en la utilizacin de d id esoxirribonuclesid os trifosfato, que no tien en el grupo d esoxirribosa 3 -OH, presente en los nu cletid os
norm ales; cuand o un nu cletid o m odificado de esta form a se incorpora a una cad en a de DNA, b loq u ea la ad icin del nu cletid o siguiente. En el ejem p lo que se m uestra, el didesoxi ATP (ddATP) com p ite co n un exceso de desoxi ATP (dATP), de m odo que cada cad en a de DNA sintetizad a en el tubo de ensayo por la DNA polim erasa I term inar al azar en un a A diferente de la secu en cia. E sta reacci n genera, por tanto, una escalera de fragm entos de DNA sim ilar a la m ostrad a a n terio rm en te por el m tod o qum ico (Figura 7-7); estos fragm entos se d etectarn gracias a un m areaje (qum ico o radiactivo) que incorpora o b ien el oligonucletido (naranja) o uno de los d esoxirribonu clesid o trifosfatos [verde) usados para extend er la cad ena de DNA. (B) Para d eterm inar la secu en cia com p leta, se utilizan cuatro n u clesid o trifosfatos term inad ores de cad en a [rojo) diferentes en cuatro reaccio n es de sntesis separadas, sobre el m ism o m olde de DNA. Cuando los productos de estas cuatro reaccio n es se analizan en cuatro carriles paralelos en un gel de poliacrilam ida, la secu en cia de DNA puede d educirse de un a m anera anloga a com o se hace en el m tod o qum ico d escrito en la Figura 7-7B.

DNA de doble hebra

de una sola 3' CGTATACAGTCAGGTC 5' DNA hebra 5' GCAT 3' cebador marcado + DNA polimerasa + exceso de dATP dTTP dCTP dGTP + ddATP
GCAT A

+ ddTTP
GCAT GCAT GCAT

+ ddCTP
GCAT GCAT GCAT

+ ddGTP
GCAT GCAT GC A T

GCAT GCAT

A TGTCA ATGTCA GTCC A

At ATGT ATG TCAG t

ATGTc ATGTCAGTC ATGTCAGTCC

ATg ATGTCAg ATGTCAGTCCAG

__________ I

as posibles que se necesitan para configurar un ser humano, su conocimiento nos proveera de un diccionario del ser humano, que podra facilitar el futuro estudio de la clula y de los tejidos. La secuenciacin del DNA a esta escaa implica necesa riamente el desarrollo de mtodos de secuenciacin automatizados que reduzcan considerablemente el costo de la secuenciacin al menos en cinco veces.

Las huellas del DNA revelan los lugares donde las protenas se unen a la molcula de DNA7
Se puede utilizar una modificacin de una tcnica de secuenciacin de DNA para determinar las secuencias nucleotdicas reconocidas por las protenas de unin al DNA. Algunas de estas protenas juegan un papel central en la determi nacin de la activacin de algunos genes en una clula determinada, mediante su unin a secuencias de DNA reguladoras, las cuales habitualmente se localizan fuera de la regiones codificadoras del gen. Para entender cmo actan estas pro tenas, es importante identificar las secuencias especficas de DNA a las que se

320

Captulo 7 : Tecnologa del DNA recombinante

(A) direccin de lectura de la secuencia de la cadena superior de DNA * N- ile leu phe arg val ile arg pro thr arg asn phe thr arg -C pautas 3 de 2 N- tyr phe ile ser ser asn ser thr leu asn ala lys leu his leu thr -C lectura 1 N- leu phe tyr phe glu 9 phe asp leu lys arg glu thr ser leu asn -C DNA
5'

Figura 7-9 Localizacin de las regiones de secuencia de DNA que codifican una protena. En principio, cualquier regin

3'

TTATTTTATTTCG AG TAATTCG ACCTTAAACGCG AAACTTCACTTAAC AATAAAATAAAG CTCATTAAG CTG GAATTTGCG CTTTG AAG TG AATTG

5'

lys ile glu leu leu glu val lys phe ala phe ser H I ,YS val N pautas -1 C- B de -2 C- ile lys asn arg thr ile arg gly HI val ar9 phe lys val HI ar9 N lectura jj-3 C- asn ^ ^ | lys ser thr asn ser arg leu arg ser val glu ser leu ser -N -*-----direccin de lectura de la secuencia de la cadena inferior de DNA direccin de lectura de la secuencia de la cadena superior de DNA T ir 3 1 11H H I I .I I TTTT7

<B)

pautas de lectura DNA

IT

I l t I il

pautas de -2 lectura N | || | | direccin de lectura de la secuencia de la cadena inferior de DNA L

500 pares de bases

regin del DNA protegida por la protena que se une al DNA (A)

3| wmhi * *< * * *

ROTURA ALEATORIA POR UNA NUCLEASA O POR DESNATURALIZACIN Y SEPARACIN POSTERIOR DE LAS CADENAS

de la secuencia de DNA puede codificar seis diferentes secuencias de aminocido, dado que cada una de las tres pautas de lectura de cada hebra se puede utilizar para codificar un polipptdo. La secuencia de nucletdos siempre se lee en sentido 5-a-3, y codifica un polipptdo desde su extremo amino (N) a su extremo carboxilo (C). En una secuencia de nucletdos al azar se debera encontrar una secuencia de terminacin para la sntesis de protema cada 21 aminocidos de media (una vez cada 63 nucletdos). En esta muestra de 48 nucletdos cada una de esas seales (codones de terminacin) se han coloreado en verde, nicamente la pauta de lectura 2 no contiene ninguno. (B) Bsqueda en una secuencia de 1700 pares de bases de DNA de una posible secuencia codificante de protena. La informacin se representa como en (A), en verde para cada codn de terminacin. Todas las posibles regiones entre seales de inicio y terminacin de sntesis de protena (vase pg. 249) se representan como barras rojas. Slo la pauta de lectura 1 codifica una protena, de 475 aminocidos de longitud.
Figura 7-10 Tcnica de las huellas de DNA(DNAfootprinting). (A) Este

wmmmmmmmmm

wmmmmmimfflfflm
i

fam ilia de m olculas de DNA de una sola cadena, marcadas en su extrem o 5' SEPARACIN POR ELECTROFORESIS EN GEL

"hu ella " en la que no se observa fragm entacin

<B)

principio del gel

sin la protena
&

con la protena huella

mtodo requiere de una molcula de DNA marcada radiactivamente en un extremo (vase Figura 7-6B). La protena que se muestra se une fuertemente a una secuencia especfica de DNA de siete nucletdos de longitud, protegiendo as a estos siete nucletdos del agente que fragmentar la cadena. Si se desarrolla esta misma reaccin sin la protena que se une al DNA, en el gel se puede observar un escalonado completo de bandas (no se muestra). (B) Un registro real de huella utilizado para determinar el lugar de unin para una protena humana que estimula la transcripcin de determinados genes eucariotas. Estos resultados permiten localizar el lugar de unin unos 60 nucletdos en direccin 5 a partir del lugar de inicio de la sntesis del RNA. El agente que se utiliz para fraccionar la cadena fue una pequea molcula con hierro que normalmente corta en cada enlace fosfodister con aproximadamente la misma frecuencia. (B, por cortesa de Michele Sawadogo y Robert Roeder.)

Fragmentacin, separacin y secuenciacin de molculas de DNA

321

unen. El mtodo estndar utilizado con esta finalidad es el denominado huella en el DNA (DNA footprinting). Se marca con 32P un fragmento puro de DNA por uno de sus extremo (vase Figura 7-6B) y a continuacin se corta con una nucleasa o con un reactivo que produzca cortes al azar en los enlaces fosfodister de la doble hlice del DNA. Los subfragmentos resultantes de la hebra marcada se separan en un gel y se detectan por autorradiografa, de forma que se puede com parar el patrn de bandas de un DNA fragmentado en presencia de una pro teina que se una a l con el patrn del mismo DNA fragmentado en ausencia de tal protena. Cuando la protena se halla presente, cubre los nucletidos de la zona del DNA a la que se une, protegiendo la rotura de los enlaces fosfodister. En consecuencia, los fragmentos marcados que contienen el lugar de unin del DNA a la protena desaparecern, dejando un hueco en el patrn del gel llamado huella (footprint) (Figura 7-10A). En la Figura 7-10B se muestra la huella de una protena que activa la transcripcin de un gen eucariota.

crom osom a que contiene 1 copia del gen A

crom osom a que contiene 5 copias del gen A

Resumen
La tecnologa del DNA recombinante ha revolucionado el estudio de la clula. El desarrollo de esta tecnologa no fu e nunca previsto ni planeado. Por el contrario, es el fruto de la confluencia de multitud de nuevas habilidades de los investigadores trabajando en distintas reas para manipular las secuencias de DNA, que en un momento dado se hacen lo suficientemente poderosas como para permitir a los in vestigadores aislar cualquier gen deseado, y, despus de su amplificacin, determi nar su estructura en detalle, tanto a nivel gnico como de sus productos. Elementos esenciales de esta tecnologa son la capacidad de trocear los cromosomas en fra g mentos con extremos conocidos, y los mtodos de separacin y secuenciacin de di chos fragmentos. La fragmentacin del cromosoma se realiza mediante enzimas producidas por bacterias y que stas usan para destruir las molculas de DNA invasoras. Estas enzimas, denominadas endonucleasas de restriccin, se purifican y se utilizan para cortar el DNA de doble cadena en secuencias cortas especficas. Los fragmentos resultantes de DNA se pueden separar unos de otros en funcin de su tamao mediante electroforesis, desplazando la mezcla de fragmentos a travs de los poros de un geL En ciertas condiciones se pueden separar molculas de DNA que difieran en nicamente una base, y visualizarlas como bandas discretas. Los mtodos de secuenciacin utilizan estos potentes mtodos de separacin: despus de la electroforesis, se determina la secuencia de nucletidos de una molcula de DNA a partir del patrn de bandas de DNA marcado que se observa cuando uno de sus extremos est marcado y el otro termina aleatoriamente en un nucletido se leccionado nico (A, G ,Co T).

fragm entacin y desnaturalizacin del DNA crom osom ico fragm entos de DNA de una sola hebra

adicin de una sonda de DNA ^ clonada y radiactiva, ^ e incubacin para pe rm itir que se produzca la hibridacin

adicin de una nucleasa que destruye toda la sonda de una sola cadena ^ no hibridada

>5*
\ r

Hibridacin de cidos nucleicos8

Cuando una solucin acuosa de DNA se calienta a 100C o se expone a un pH muy alto (pH > 13), se rompen las bases complementarias que normalmente mantienen unidas entre s a las dos cadenas de la doble hlice y la doble hlice se disocia rpidamente en dos hebras separadas. Durante muchos aos se con sider que este proceso, llamado desnaturalizacin del DNA, era irreversible. Sin embargo, en 1961 se descubri que si se mantienen hebras complementarias de DNA a 65C durante un perodo prolongado, forman de nuevo una doble hlice (proceso denominado renaturalizacin o hibridacin del DNA). Reacciones de hibridacin similares a sta se producen entre dos cadenas cualesquiera de ci do nucleico de una sola hebra (DNA:DNA, RNA:RNA o RNA:DNA) siempre que ambas cadenas tengan una secuencia de nucletidos complementaria. En esta seccin se explicar cmo se pueden utilizar estas reacciones especficas de hi bridacin para detectar y caracterizar secuencias nucleotdicas especficas tanto en molculas de RNA com o de DNA.

la cantidad de radiactividad que permanece en las m olculas de doble cadena hbridas constituye una medida del nm ero de copias del gen en el crom osom a original
Figura 7-11 Medida del nm ero de copias de un determ inado gen en una m uestra de DNA, mediante hibridacin de DNA. En estos experimentos se utiliza un fragmento de DNA de una sola hebra, al que habitualm ente se denomina so n d a d e DNA. La sonda puede estar marcada de forma especial de modo que pueda ser distinguida del enorme exceso de DNA cromosm ico. En este ejemplo, la marca es un istopo radiactivo; alternativamente, com o marca se pueden utilizar nucletidos marcados qumicamente (vase Figura 7-18).

322

Captulo 7 : Tecnologa del DNA recombinante

exn 1

ntrn

exn 2

DNA genm ico clonado

3' 5 '1 5'

RNA m ensajero

secuencia intrnica

DESNATURALIZACION DEL DNA E HIBRIDACIN CON RNA 5' DNA 13 RNA

DNA degradado

EL TRATAMIENTO CON LA NUCLEASA S1 DEGRADA LAS MOLCULAS DE CIDO NUCLEICO DE UNA SOLA HEBRA

F ig u ra7-12 Uso de la tcn ica de hibridacin de cidos nucleicos p ara determ inar la regin de un fragmento clonado que est presente en una molcula de RNA. El mtodo mostrado se basa en el uso de una nucleasa que nicamente corte la cadena de DNA no apareada con RNA. Tal como se muestra, se determinan las posiciones de los intrones en los genes eucariotas; de la misma forma se puede determinar el inicio y final de una molcula de RNA.

control de DNA ----- no tratado

. ~ o texwm- exon 2 *5

m m m m - eX n1

gel de agarosa alcalino

La hibridacin de cidos nucleicos proporciona un mtodo sensible para la deteccin de secuencias determinadas de nucletidos9
La velocidad de form acin de la doble hlice est limitada por la velocidad a la que colisionan las dos cadenas com plem entarias del cido nucleico, la cual depende de la concentracin de las cadenas en la solucin. Por lo tanto, la ve locidad de hibridacin puede utilizarse para determinar la concentracin de cualquier secuencia determinada de DNA o de RNA en el seno de una m ezcla de otras secuencias. Este ensayo requiere un fragmento puro de una cadena sencilla de DNA cuya secuencia sea complementaria a la del cido nucleico (DNA o RNA) que se desea detectar; el DNA se puede obtener por clonaje o, si la secuencia es corta, se puede sintetizar por mtodos qumicos. En cualquier caso, el fragmento de DNA debe estar marcado (mediante radioistopo o por un m todo qumico) de forma que durante el curso de la reaccin de hibridacin se pueda seguir su incorporacin a molculas de doble cadena. La molcula de DNA de cadena sencilla utilizada de esta forma como indicador se denomina sonda de DNA (probe); una sonda de DNA puede comprender desde 5 hasta m i les de nucletidos de longitud. Las reacciones de hibridacin mediante sondas de DNA son tan sensibles y selectivas que pueden utilizarse para detectar secuencias complementarias cuya concentracin sea incluso de una sola molcula por clula (Figura 7-11). As, es posible determinar el nmero de copias de una secuencia particular de DNA (la contenida en la sonda) que se hallan presentes en el genoma celular. Se puede utilizar esta misma tcnica para buscar genes relacionados pero no idnticos; por ejemplo, una vez ha sido clonado un gen interesante a partir de ratones o gallinas, se puede utilizar una parte de esta secuencia para localizar el gen co rrespondiente en humanos. Alternativamente, la sondas de DNA pueden utilizarse en reacciones de hibri dacin con RNA en lugar de DNA, para detectar cundo una clula est expresan do un gen determinado. En este caso, se hibrida una sonda de DNA que contiene parte de la secuencia del gen, con RNA purificado a partir de la clula en cuestin, con el fin de determinar si el RNA celular contiene molculas complementarias al

Hibridacin de cidos nucleicos

323

DNA de la sonda, y si es as, qu cantidad. En mtodos ms elaborados, la sonda de DNA se trata con nucleasas especficas despus de la hibridacin para deter minar las regiones exactas de la sonda que se han apareado con molculas de RNA de la clula. De esta forma se pueden determinar los lugares de principio y final para la transcripcin del RNA; de la misma manera se pueden identificar de form a precisa los lmites de las regiones de los transcritos primarios que son cor tadas y eliminadas durante la maduracin por corte y em palm e (splicing) (vase Figura 7-12). Durante el desarrollo embrionario un gran nmero de genes se expresan o se reprimen siguiendo patrones elaborados. La hibridacin de sondas de DNA con RNA de la clula permite determinar cundo un gen particular se expresa o no; adems, cuando la expresin de un gen se altera, se puede determinar si el cam bio es debido a controles que actan sobre la transcripcin, sobre la madu racin del RNA o sobre la traduccin de las molculas de mRNA maduro a prote na. La utilizacin de los mtodos de hibridacin se halla tan extendida en la bio loga celular que es difcil imaginar cm o se podra haber estudiado sin ellos la estructura y la expresin gnica.

Las transferencias Northern y Southern facilitan la hibridacin con molculas de cidos nucleicos separadas electroforticamente 10
A menudo las sondas de DNA se utilizan en com binacin con la electroforesis en gel para detectar molculas de cidos nucleicos que tengan una secuencia com plementaria a toda o a una parte de la sonda. Antes de llevar a cabo la reaccin de hibridacin, la electroforesis separa las diferentes molculas de RNA o de DNA de una mezcla, de acuerdo con su tamao; podremos estar seguros de que la hibridacin fue especfica si con la sonda se marcan molculas de un nico o de muy pocos tamaos. Adems, la informacin obtenida respecto al tamao puede ser muy valiosa en s misma. Un ejemplo servir para ilustrar este punto. Supongamos que se desea determinar la naturaleza del defecto de un ratn mutante que produce cantidades anormalmente bajas de albmina, una prote na que segrega el hgado a la sangre, normalmente en grandes cantidades. En primer lugar, habr que recolectar muestras de tejido heptico idnticas de un ratn m utante y de uno normal (este ltimo servir de control); las clulas se disgregan con un detergente fuerte para inactivar las nucleasas celulares, que en caso contrario podran degradar los cidos nucleicos. A continuacin, se separa el RNA y el DNA de los otros com ponentes celulares: las protenas presentes se desnaturalizan com pletam ente y se eliminan mediante extracciones continua das con fenol -u n potente solvente orgnico que es parcialmente miscible en agua; los cidos nucleicos, que permanecen en la fase acuosa, se precipitan con alcohol para separarlos de las molculas pequeas de la clula. Entonces se se para el DNA del RNA aprovechando su diferente solubilidad en alcohol y se de grada cualquier cido nucleico contam inante de los tipos que no queremos es tudiar, mediante tratamiento con enzimas altamente especficas -tanto RNasas como DNasas. Para analizar los RNA que codifican la albmina, mediante una sonda de DNA que reconozca a este RNA, se utiliza una tcnica llamada transferencia Northern (Northern blotting). Primero, mediante electroforesis en gel las dife rentes molculas de RNA intacto se separan en bandas, tanto de los hgados mutantes com o de los normales. Entonces, para hacer que las molculas de RNA sean accesibles a las sondas de DNA, se hace una rplica del gel mediante la transferencia de las molculas de RNA desde el gel de la electroforesis hasta una hoja de papel de nitrocelulosa o de nailon. Las molculas de RNA que se hibridan con la sonda de DNA radiactiva (por contener parte de la secuencia normal del gen de la albmina) se localizan mediante la incubacin del papel con una solucin que contenga la sonda y detectando la sonda hibridada por autorradio grafa, o mediante mtodos qumicos (Figura 7-13). Dado que las molculas pe queas de cidos nucleicos se desplazan ms rpidamente a travs del gel que

324

Captulo 7 : Tecnologa del DNA recombinante

bloque de papel absorbente RNA o DNA no m arcado filtro de nitrocelulosa

filtro de nitrocelulosa con cidos nucleicos fuertem ente unidos

patrones de RNA marcados, utilizados com o m arcadores de tam ao

gel de agarosa

CIDOS NUCLEICOS SEPARADOS DE ACUERDO CON SU TAM AO, MEDIANTE ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

esponja solucin tam pn CIDOS GRASOS SEPARADOS, TRANSFERIDOS A UN PAPEL DE NITROCELULOSA POR SUCCIN DEL TAMPN A TRAVS DEL GEL Y DEL PAPEL

FILTRO CON LOS CIDOS NUCLEICOS SEPARADOS HIBRIDADOS CON LA SONDA MARCADA bolsa de plstico sellada

Figura 7-1 3 Deteccin de molculas de RNA o de DNA de una secuencia especfica, mediante hibridacin sobre filtro. En un gel de electroforesis se

sonda marcada DESPUS DE ELIMINAR LA SONDA MARCADA, LAS BANDAS COMPLEMENTARIAS A LA SONDA SE REVELAN MEDIANTE MTODOS DE DETECCIN ESPECFICOS DEL MARCAJE

pueden fraccionar tanto mezclas de molculas de RNA de cadena sencilla {transferencia Northern) como molculas de DNA de doble cadena producidas por digestin con una nucleasa de restriccin (transferencia Southern). Todas las molculas, separadas, se transfieren a una membrana di nailon o de nitrocelulosa, por capilaridad. El filtro se expone a la sonda de DNA marcado durante un tiempo prolongado, en condiciones en que se favorece la hibridacin. Posteriormente el filtro es lavado intensamente de forma que slo aquellas molculas de RNA o de DNA que estn inmovilizada en el filtro y que hibridan con la sonda, queden marcadas, las cuales aparecen como bandas en el filtro. En el caso de la transferencia Southern es necesario separar las dos hebras de DNA en el filtro antes del proceso de hibridacin, lo que se consigue exponiendo el DNA a condiciones alcalinas desnaturalizantes despus de la electroforesis.

posicin / de los ( marcadores de tam ao

bandas detectadas

las ms grandes, se puede determinar el tamao de las molculas de RNA de cada una de las bandas que se unen a la sonda, utilizando como referencia la migracin de molculas de RNA de tamao conocido (patrones de RNA). De esta m anera se puede descubrir que las clulas hepticas del ratn afectado fabrican albmina de tamao normal y en cantidades normales; alternativamente podra ocurrir que el RNA de la albmina se detectara en cantidades muy reducidas. Otra posibilidad sera que el RNA de la albmina mutante fuese anormalmente corto, y por lo tanto, se desplazara a travs del gel muy rpidamente. En este caso la transferencia del gel se podra volver a estudiar mediante sondas de DNA ms selectivas que revelasen qu zona del RNA est ausente. Para caracterizar la estructura del gen de la albmina en el ratn afectado se utiliza un mtodo anlogo, llamado transferencia Southern (Southern blotting) que en lugar de analizar en RNA, estudia el DNA. En primer lugar, mediante nucleasas de restriccin se corta el DNA aislado generando fragmentos que se pue dan separar fcilmente. A continuacin, los fragmentos se separan de acuerdo con su tamao mediante electroforesis en gel y mediante transferencia e hibri dacin se identifican los fragmentos que son complementarios a la sonda de DNA para la albmina, tal como se ha descrito para el caso del RNA (vase Figu ra 7-13). Repitiendo este procedimiento pero utilizando diferentes nucleasas de restriccin, se puede construir un m apa de restriccin de la regin del genoma que codifica la albmina. Sobre este mapa se puede determinar si el gen de la al bmina ha sido reordenado en los ratones afectados -p o r ejemplo, mediante la

Hibridacin de cidos nucleicos

325

lugares de corte (dianas) de la nucleasa de restriccin (A) DNA

cortar, desnaturalizar e hibridar cortar, desnaturalizar e hibridar

(B)

(C)

duplicacin de secuencia

en A, B y C, la sonda RFLP ( r detecta fragm entos de DNA de diferentes tam aos

delecin o insercin de una secuencia corta de DNA, pero sin embargo no es po sible detectar de este modo la presencia de sustituciones de una nica base.

El anlisis de los polimorfismos de longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP) facilita el anlisis gentico de los grandes genom as 11
Los genomas de gran tamao se pueden mapar tanto fsica como genticamen te. Los m a p a s fsico s se basan en el anlisis directo de las molculas de DNA que constituyen cada cromosoma. Incluyen tanto mapas de restriccin como colec ciones ordenadas de clones genmicos de DNA (vase Figura 7-29), que se pueden considerar como representaciones incompletas o parciales del mapa fsico com pleto que sera la secuencia lineal continua de todos los nucletidos que forman el genoma. Los m a p a s g e n tico s d e lig a m ie n to , a diferencia de los anteriores, se ba san en la frecuencia de entrecruzamiento de dos o ms caractersticas que sirven de marcadores en el cruzamiento. Un marcador gentico puede ser cualquier lugar en el genoma que, cuando vara, produce variaciones apreciables en el individuo que lo porta hacindolo distinguible del resto de la poblacin. Si la modificacin es muy poco frecuente se la denomina mutacin; si es comn, se la denomina polimorfismo. Los mapas genticos de ligamiento se construyen siguiendo el pa trn de heredabilidad de tales variantes genticas. Tradicionalmente, los mapas de ligamiento han dependido de la identifica cin de m utaciones por sus caractersticas fenotpicas como el color de los ojos o los grupos sanguneos. Recientem ente los mtodos del DNA recombinante han permitido utilizar com o marcadores genticos pequeas secuencias de DNA que pueden diferir entre individuos de la poblacin sin producir ningn efecto detectable en el organismo. Uno de los marcadores genticos de este tipo ms utilizados se basa en que pequeos cambios en la secuencia de DNA pueden modificar los patrones de corte de las endonucleasas de restriccin. Por ejemplo, una substitucin de una base en una regin del cromosoma puede alterar una secuencia de reconocim iento de una endonucleasa de restriccin, produciendo importantes diferencias en las longitudes de ciertos fragmentos de restriccin del DNA en esa zona. Asimismo pueden variar las longitudes de los fragmentos de restriccin debido a pequeas inserciones o delecciones que afecten a un nmero reducido de bases. A estas pequeas diferencias entre individuos se las denom ina p o lim o rfis m o s d e lo n g itu d d e lo s fra g m e n to s d e re s tric c i n (R FL P, de Restriction Fragment Length Polymorphism). Un RFLP es tanto ms til cuan to ms frecuente sea la poblacin, ya que existe una probabilidad mayor de que los padres de un cierto individuo porten marcadores diferenciables. sta es una de las razones de que la base de los marcadores RFLP ms tiles sean las secuen cias cortas repetidas que se encuentran en nmero muy variable en los diferentes individuos (Figura 7-14). Los RFLP son tiles para el mapaje gentico gracias a que las diferencias de tamao de fragmentos que un individuo hereda se detectan con gran facilidad Captulo 7 : Tecnologa del DNA recombinante

Figura 7-14 Algunos de los cambios de la secuencia de DNA que producen un polimorfismo de longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP). (A) En muchos individuos de la poblacin, una nucieasa de restriccin corta en tres lugares distintos el DNA cromosm ico que se muestra, produciendo dos fragmentos de DNA; uno de los cuales puede detectarse por hibridacin con una sonda DNA mediante transferencia Southern. (B) En otros ejemplos del mismo cromosom a se observa que el cambio de un nucletido en la secuencia reconocida por la nucleasa de restriccin evita que sta acte en la diana central. En estos casos la sonda marcada detecta un fragmento de DNA de tamao mayor com o un RFLP. (C) An ms, en otros cromosom as se ha producido una duplicacin de parte de la secuencia de modo que se produce un aumento en el tamao del fragmento de DNA detectado con la sonda marcada. Este tipo de RFLP es comn en regiones que contienen secuencias cortas muy repetidas, tales como GTGTGT....; el nmero de veces que se repite la secuencia corta es muy variable en la poblacin, de forma que cada individuo contiene un nmero diferente (de 4 a 40) de repeticiones en cada locus concreto. A este tipo de repeticiones se las conoce como m icrosatlites o VNl'R (de V ariable N u m ber o f T n d em R epeat: n m ero v ariab le d e repeticion es en tndem ).

326

lugares de corte (dianas) de la nucleasa de restriccin

osom a 3m (crom m aterno)
r~ r

ELECTROFORESIS EN GEL Y TRANSFERENCIA SOUTHERN CON SONDA DE DNA MARCADA

paterno) CORTAR EL DNA CON UNA NUCLEASA DE RESTRICCIN 3p

3m

la diana de restriccin desaparecida crea un RFLP

3m

3p fragm ento detectado por la sonda de DNA

la sonda detecta diferentes fragm entos de DNA para las regiones hom ologas de los crom osom as m aterno y paterno, revelando un RFLP

Figura 7 -15 Deteccin de un RFLP por transferencia Southern. En este ejemplo se utiliza el mtodo para diferenciar los cromosom as paterno y materno en una regin del cromosom a 3 de un individuo. Una variante de este mtodo utiliza PCR (vase Figura 7-32) para amplificar selectivamente la regin de DNA apropiada, antes del tratamiento con la nucleasa de restriccin. En ese caso los fragmentos de restriccin son mucho ms abundantes que otros fragmentos de DNA de la muestra y se pueden visualizar directam ente tiendo el gel, evitando la necesidad de transferencia e hibridacin con sondas marcadas.

mediante transferencia Southern utilizando una sonda DNA complementaria a dicha regin (Figura 7-15). Adems, los RFLP permiten relacionar el mapa gen tico con el mapa fsico: por un lado sirven como verdaderos marcadores genti cos, com o el color de ojos; por otro lado las sondas DNA que permiten detectar los son secuencias DNA que se pueden localizar con relativa facilidad en el mapa fsico mediante hibridacin de DNA. Si se localizan dos marcadores genticos en dos cromosomas diferentes, la heredabilidad de ambos es independiente, es decir la probabilidad de coheredabilidad es de 50:50. Esto tambin es cierto para aquellos marcadores que se encuentren en los extremos opuestos de un mismo cromosoma, debido a la elevada probabilidad de que se separen a causa de la alta frecuencia de entrecruzamiento que tiene lugar en la meiosis, durante la formacin de oocitos y de esperma. Cuanto ms cercanos se encuentren en el cromosoma tanto mayor es la probabilidad de no ser separados por entrecruzamientos entre ellos y por lo tanto ser coheredados por la progenie (ligados). Mediante el estudio de la coheredabilidad en grandes grupos familiares de un gen de inters (por ejemplo, algn gen relacionado con determinada enfer medad) y un gran nmero de RFLP individuales, se pueden identificar ciertos RFLP que cohereden frecuentemente con dicho gen (ello requiere el estudio de gran n mero de individuos, como se explica en la Figura 7-16). Por tanto, se pueden locali zar las secuencias de DNA que rodean a dicho gen. A partir de ah es posible, en al gunos casos, identificar incluso el DNA del propio gen, mediante tcnicas que se describen ms adelante (vase Figura 7-30). De este modo se han conseguido iden tificar los genes responsables de algunas enfermedades humanas, permitiendo que sean analizadas en detalle las protenas que codifican. Est claro (vase Figura 7-16) que cuanto ms prximo se localice un m arca dor RFLP al gen mutante de inters, tanto ms fcil resulta localizar sin am bi gedades dicho gen. Para facilitar dicho estudio se est realizando un gran es fuerzo para establecer un m apa de alta resolucin de distribucin de RFLP del genoma humano, con miles de marcadores RFLP espaciados 106 nucletidos de media. Dos marcadores separados esta distancia deberan coheredarse una media de 99 de cada 100 casos. Con dicho tipo de mapa ser relativamente fcil utilizar en humanos estudios de ligamiento gentico para localizar un gen que ha sido identificado slo por el efecto de su mutacin, permitiendo su localiza cin en uno o en unos cuantos clones genmicos muy grandes de una librera genmica ordenada. Su aislamiento podra realizarse entonces rpidamente.

Las molculas sintticas de DNA facilitan el diagnstico prenatal de enfermedades genticas 12

Al mismo tiempo que los microbilogos desarrollaban las tcnicas de clonaje del DNA, los qumicos orgnicos m ejoraron los mtodos para sintetizar cadenas Hibridacin de cidos nucleicos 327

par de crom osom as m aterno con la enferm edad gen defectuoso causante de la enferm edad m arcador RFLP nicamente en esta copia del crom osom a oocito

par de crom osom as paterno sano

fi H

fi fi

esperma

fi fi

f if i

f if i

fi fi

fi

fi fi

+ +
PRUEBAS REALIZADAS EN 7 NIOS

+ enferm edad m arcador RFLP

CONCLUSION: el gen causante de la enferm edad cohereda con el m arcador RFLP de la madre enferm a en el 75% de la progenie que padece la enferm edad. Si se observa la m isma correlacin en otras fam ilias que sufren esta enferm edad el gen causante de ella se localizar en este crom osom a, en una posicin cercana al m arcador RFLP.
cortas de DNA. Actualmente estos oligonucletidos de DNA se fabrican de forma rutinaria mediante mquinas que, en una noche, pueden construir autom tica mente cualquier secuencia de hasta 120 nucletidos de largo. Esta capacidad para fabricar molculas de DNA de secuencia deseada hace posible redisear genes a voluntad, lo cual constituye una herramienta importante de la ingeniera gentica como se explicar ms adelante. Otro uso importante de dichos oligo nucletidos sintticos es el de sondas marcadas para detectar las secuencias genmicas correspondientes mediante hibridacin de DNA. Mediante el empleo de diferentes temperaturas en la reaccin de hibridacin es posible escoger la severidad de la hibridacin: por encim a de cierta temperatura slo hibridarn aquellas secuencias que sean idnticas, lo que permite detectar genes mutantes, de gran utilidad en el diagnstico prenatal de enfermedades hereditarias. Ms de 3000 enfermedades genticas humanas son atribuibles a defectos en genes. La mayora de estas mutaciones son recesivas: nicamente son perjudi ciales en los individuos que heredan de ambos padres la copia defectuosa del gen. Un objetivo importante de la medicina moderna consiste en la identifica cin, antes del nacimiento, de los fetos que portan las dos copias defectuosas del gen, de forma que si lo desea, la madre puede interrumpir el embarazo. En la anemia falciforme, por ejemplo, se conoce cul es la alteracin exacta de nucle tidos del gen mutante (la secuencia GAG se halla cambiada por GTG en la hebra de DNA que codifica la cadena | 3de la hemoglobina). Para el diagnstico prenatal de esta alteracin se sintetizan dos oligonucletidos de DNA -u n o correspon diente a la secuencia del gen normal en la regin de la mutacin y el otro corres pondiente a la secuencia mutante. Manteniendo esta cortas secuencias (de aproximadamente 20 nucletidos) y seleccionando una temperatura de hibrida cin a la que slo sean estables las hlices perfectamente apareadas, estos oligo nucletidos se pueden utilizar como sondas para distinguir entre las dos formas del gen. As pues dichos oligonucletidos pueden utilizarse como sondas m arca das para diferenciar entre dos formas del gen mediante transferencia Southern del DNA aislado de clulas fetales recolectadas mediante amniocentesis. Un feto portador de dos copias del gen de la cadena p se detectar fcilmente pues slo presentar hibridacin con el oligonucletido complementario a la secuencia de DNA mutante. El diagnstico supone el aislamiento de DNA de clulas fetales obtenidas mediante am niocentesis y la utilizacin de las sondas de oligonucle-

Figu ra7-16 Anlisis de entrecruzam iento gentico utilizando un m arcador RFLP. En el ejemplo se estudia la coheredabilidad de un fenotipo humano (en este caso una enfermedad gentica) con un marcador RFLP. Si los individuos que heredan la enfermedad tambin heredan casi siempre el marcador RFLP, el gen que causa la enfermedad y el marcador RFLP estarn probablemente prximos en el cromosoma, como se muestra en la figura. Para demostrar que un ligamiento es estadsticamente significativo se han de analizar cientos de individuos. Es de destacar que el ligamiento no ser absoluto excepto si el marcador RFLP se localiza en el mismo gen. En los dems casos el RFLP y la enfermedad gentica se separarn con una cierta frecuencia debido al entrecruzamiento meitico durante la formacin del oocto o del esperma: es lo que ha ocurrido en el caso del par de cromosom as de la derecha.

328

Captulo 7 : Tecnologa del DNA recombinante

tidos sobre una transferencia Southern. Un feto afectado se puede reconocer porque su DNA se hibridizar nicamente con el oligonucletido que es com ple mentario de la secuencia del DNA mutante. En el caso de muchas otras anomalas genticas no se conoce la variacin exacta de la secuencia de nucletidos. Sin embargo, es posible el diagnstico prenatal de un nmero cada vez mayor de estas anomalas mediante transferen cia Southern para analizar las variaciones especficas del genoma humano (RFLP en la Figura 7-16) que, segn se sabe, estn ntimamente unidas al gen de fectuoso. Se pueden utilizar mtodos similares para determinar la susceptibilidad in dividual a sufrir una determinada enfermedad. Por ejemplo, individuos que han heredado copias anmalas de ciertos genes presentan un riesgo superior de pa decer ciertas formas de cncer, por lo que deben tomar medidas preventivas para incrementar en lo posible sus posibilidades de disfrutar de una vida sana.

La hibridacin poco rigurosa permite identificar genes relacionados de forma indirecta 13

Durante la evolucin aparecen nuevos genes mediante m ecanism os de dupli cacin y divergencia de genes antiguos y mediante la reutilizacin de regiones de genes antiguos para generar nuevas com binaciones. Por esta razn, muchos genes tienen una familia de parientes prximos en alguna parte del genoma, y es probable que algunos de ellos tengan una funcin relacionada. Se requieren mtodos laboriosos para aislar los clones de DNA correspondientes al primer miembro de una fam ilia gnica de este tipo. Sin embargo, utilizando las secuen cias de este primer gen como sondas de DNA, se pueden aislar de una forma re lativamente sencilla otros genes que producen protenas que tienen funciones relacionadas. Dado que es improbable que los nuevos genes tengan secuencias

sonda de DNA de cadena sencilla^ para el gen A

mezcla de m olculas de DNA de una sola hebra

JL
hibridacin en form am ida al 50%, a 42C hibridacin en form am ida al 50%, a 35C

Figura 7-1 7 Com paracin de las condiciones de hibridacin rigurosas (stringent) y poco rigurosas (reduced stringency). En la reaccin de la izquierda (condiciones rigurosas), la solucin se ha colocado pocos grados por debajo de la temperatura a la que desnaturaliza una hlice de DNA perfecta (su tem p eratu ra d e fu sin ), de forma que las hlices imperfectas que se pueden formar bajo las condiciones poco rigurosas de hibridacin de la derecha son inestables. Para encontrar genes que no son idnticos pero que estn relacionados con el gen A, se utilizan las condiciones de hibridacin poco rigurosa de la derecha.

nicam ente A form a una doble hlice estable HIBRIDACION RIGUROSA

tanto A com o C y E form an dobles hlices estables HIBRIDACION POCO RIGUROSA

Hibridacin de cidos nucleicos

329

espaciador

O P O P O P O

O"

O-

O"
OH H

nuclesido trifosfato m odificad o

Figura 7-18 Un m arcador qumico para las sondas de DNA. El nucletido modificado que se muestra puede ser incorporado al DNA por la DNA polimerasa, de forma que la molcula de DNA se puede utilizar como sonda y detectarse de forma eficiente. La base del nucletido que se muestra es un anlogo de la timina, en la que se ha reemplazado el grupo metilo en T con un espaciador unido al esteriode vegetal digoxigenina. Se puede visualizar mediante un anticuerpo especfico unido a un marcador visible como un colorante fluorescente. Otras molculas, com o la biotina por ejemplo, se pueden unir a los nucletidos, y se detectan de un modo similar.

idnticas, las hibridaciones con la sonda de DNA se realizan en condiciones poco rigurosas (reduced stringency) -definidas como aquellas condiciones que permiten apareamientos imperfectos con la secuencia de la sonda, forman do una doble hlice estable (Figura 7-17). A pesar de que la utilizacin de condi ciones poco rigurosas de hibridacin conlleva el riesgo de obtener una seal fal sa de una regin aleatoria que presente una corta secuencia homologa en una secuencia de DNA no relacionada, estos falsos positivos se pueden eliminar m e diante una investigacin ms profunda. Este mtodo constituye una de las utilidades ms potentes de la tecnologa del DNA recom binante. Por ejemplo, esta aproximacin ha permitido aislar una familia com pleta de protenas de unin al DNA que actan como directores de la expresin gnica durante el desarrollo embrionario en Drosophila. Esta tcni ca tam bin ha hecho posible el aislamiento de miembros de esta misma familia gnica de otros organismos, incluyendo el hombre.

Las tcnicas de hibridacin in situ perm iten localizar secuencias especficas de cidos nucleicos en los crom osom as y en las clulas 14
Los cidos nucleicos, como otras macromolculas, ocupan posiciones muy de terminadas en las clulas y en los tejidos, de forma que cuando estas molculas se extraen por homogeneizacin, se pierde una gran cantidad de informacin potencial. Por ello, se han desarrollado tcnicas en las que, de forma similar a como se utilizan los anticuerpos marcados, se utilizan in situ sondas de cido nucleico para localizar secuencias determinadas de cidos nucleicos, tanto en cromosomas com o en determinados tipos celulares. Estas tcnicas se denomi nan hibridacin in situ. Sondas altamente marcadas con istopos radiactivos pueden ser hibridadas con cromosomas que hayan sido expuestos brevemente a un pH muy elevado para romper los pares de bases de su DNA. As pueden vi sualizarse las regiones crom osm icas que han fijado la sonda durante la hibrida cin. Originalmente estos mtodos se desarrollaron utilizando sondas DNA muy radiactivas, que se detectaban mediante autorradiografa. Sin embargo es posi ble mejorar la resolucin espacial del mtodo si se utilizan sondas de DNA mar cadas qum icam ente en lugar de radiactivamente. Para ello las sondas se sinteti zan con nucletidos especiales que incorporan cierta cadena lateral (Figura 7-18), y las sondas hibridadas se detectan mediante anticuerpos (u otros ligandos) que reconocen especificam ente dicha cadena lateral (Figura 7-19). Tambin se han desarrollado mtodos de hibridacin in situ para poner de manifiesto la distribucin de molculas de RNA determinadas en clulas en el in-

Figura 7-19 Hibridacin in situ para localizar genes especficos en los crom osom as. En la figura se han utilizado seis sondas diferentes para determinar la posicin de su secuencia nucleotdica en el cromosoma 5 en metafase. Las sondas estaban marcadas qumicamente y se han detectado mediante anticuerpos marcados con fluorocromos. Se muestran las dos copias del cromosoma 5 alineadas. Cada sonda detecta dos puntos en cada cromosoma dado que un cromosoma metafsico tiene su DNA replicado y por ello contiene dos hlices de DNA idnticas (vase Figura 8-4). (Cortesa de David C. Ward.)

330

Captulo 7 : Tecnologa del DNA recombinante

Figura 7-2 0 Hibridacin in situ para la localizacin de RNA en los tejidos. Autorradiografa de una seccin de un embrin muy joven de D rosop h ila que se ha sometido a hibridacin in situ utilizando una sonda radiactiva de DNA com plem entaria de un gen que participa en el desarrollo de los segmentos. La sonda se ha hibridado con el RNA del embrin, y el patrn de distribucin de los granos de plata expuestos revela que el RNA sintetizado sobre el gen (llamado ftz) se localiza en bandas alternas de tres o cuatro clulas de grosor, a lo largo del embrin. En este estadio del desarrollo (blastodermo celular), el embrin contiene unas 6000 clulas. (De E. Hafen, A. Kurioway W.J. Gehring, Cell 37:833-841,1984 Cell Press.)

100 pin

terior de tejidos. En este caso los tejidos no se exponen a pH alto para que el DNA cromosomico se mantenga en forma de doble hebra y no pueda unirse a la sonda. En lugar de ello, el tejido se fija suavemente de manera que el RNA se mantenga de tal forma que pueda hibridarse cuando el tejido se incube con una sonda de DNA complementaria. De esta forma se pueden observar los cambios de patrn de ex presin gnica en los tejidos. Por ejemplo, en el embrin de Drosophila estos pa trones han proporcionado nuevas ideas sobre los mecanismos que diferencian las clulas que se hallan en posiciones diferentes durante el desarrollo (Figura 7-20).

Resumen
En las reacciones de hibridacin de cidos nucleicos, las cadenas sencillas de DNA o de RNA colisionan al azar unas con otras, probando rpidamente miles de millones de posibles apareamientos. En condiciones severas de hibridacin (una combinacin de solvente y temperatura en las que una doble hlice perfecta es estable), dos cadenas se aparearn form ando una molcula "hbrida solamente si sus secuencias son muy complementarias. La enorm e especificidad de la reaccin de hibridacin perm ite que se pueda m arcar cualquier molcula sencilla de DNA o RNA y utilizarla como sonda para encontrar su cadena complementaria incluso en una clula o extracto celular que contenga millones secuencias de DNA o RNA diferentes. Frecuentemente se utili zan sondas de este tipo para detectar los cidos nucleicos que corresponden a genes determinados, tanto para facilitar su purificacin y caracterizacin a partir de ex tractos celulares, como para localizarlos en el interior de las clulas, tejidos y organis mos. Asimismo, utilizando reacciones de hibridacin poco rigurosas, se puede utili zar una sonda preparada a partir de un gen de un organismo dado para detectar los genes que estn relacionados evolutivamente -tanto en el mismo organismo, donde los genes relacionados form aran parte de una fam ilia gnica, como en otros organis mos, donde pondra de manifiesto la historia evolutiva de dicha secuencia.

Clonaje de DNA1 5
Mediante las tcnicas de clonaje de DNA un fragmento de DNA que contiene un gen de inters se inserta en el genoma de DNA purificado de un elemento gen tico autorreplicante -generalm ente un virus o un plsmido. Por ejemplo, es po sible unir, en el tubo de ensayo, un fragmento de DNA que contiene un gen hu mano con el cromosoma de un virus bacteriano, e introducir la nueva molcula de DNA recombinante en una clula bacteriana. A partir de una nica molcula recom binante que infecta a una nica bacteria, los mecanismos de replicacin normales del virus pueden producir ms de 101 2 molculas de DNA vrico idnti cas cada da, amplificando as el DNA humano insertado. El plsmido o virus usado de esta forma se conoce como vector de clonaje, y se dice que el DNA pro pagado mediante insercin en l se ha clonado.

Clonaje de DNA

331

plsm ido de DNA circular A A TT

plsm ido de DNA lineal con los extrem os cohesivos

CORTE MEDIANTE UNA NUCLEASA DE RESTRICCIN TTA A uno de los muchos fragm entos de DNA producidos al cortar un crom osom a de DNA con la m isma nucleasa de restriccin

UNION COVALENTE POR ACCIN DE LA DNA LIGASA plsm ido que contiene un inserto de DNA crom osom ico

Se puede construir una librera de DNA utilizando vectores vricos o vectores plasm dicos 16
Para clonar un gen se empieza construyendo una librera de DNA (una genoteca) -u n a coleccin de fragmentos de DNA clonado, incluyendo (probablemente) al menos un fragmento que contenga el gen de inters. La genoteca puede cons truirse utilizando como vector tanto virus como plsmidos, y en general se m an tiene en una poblacin de clulas bacterianas. Los principios bsicos de los m todos utilizados para clonar genes son los mismos para cualquier tipo de vector utilizado, aunque pueden diferir en algunos detalles. Para simplificar, en este ca ptulo ignoraremos estas diferencias, e ilustraremos los mtodos en referencia al clonaje en plsmidos. Los vectores plasm dicos utilizados para el clonaje de genes son pequeas molculas circulares de DNA de doble cadena, derivadas de grandes plsmidos que aparecen de forma natural en bacterias. Generalmente suponen una peque a parte del total del DNA de la clula husped, pero pueden ser separados fcil mente gracias a su m enor tamao respecto a las molculas de DNA de los cro mosomas, las cuales son mucho mayores y sedimentan por centrifugacin. Para utilizar los plsmidos circulares de DNA como vectores de clonaje, una vez puri ficados se cortan con una nucleasa de restriccin para generar molculas linea les. El DNA de la clula que se va a utilizar en la construccin de la genoteca tam bin es cortado con la misma nucleasa de restriccin, y los fragmentos de restriccin resultantes (entre los que se encuentran los que contienen el DNA que va a ser clonado) se aaden a los plsmidos cortados y se cierran, formando molculas circulares de DNA recombinante. Estas molculas recombinantes, que contienen insertos de DNA ajeno, son unidas covalentemente mediante la enzima DNA ligasa (Figura 7-21). El siguiente paso en la preparacin de la genoteca consiste en introducir las molculas circulares de DNA recombinante en bacterias que se han hecho tem poralmente permeables al DNA; se dice que estas clulas han sido transfectadas con el plsmido. A medida que estas clulas crecen y se dividen, los plsmidos recombinantes tambin se van replicando y produciendo un nmero enorme de copias de DNA circulares que contienen el DNA ajeno (Figura 7-22). Muchos pls midos bacterianos transportan genes que les confieren resistencia a los antibiti cos, una propiedad que puede utilizarse para seleccionar las clulas que han sido
Figura 7 -22 Purificacin y amplificacin de una secuencia especfica de DNA por clonaje de DNA en una bacteria. Cada bacteria que contiene un plsmido recom binante se desarrolla en una colonia de clulas idnticas, visible como un punto sobre placas de agar nutritivo. Inoculando la colonia de inters en un cultivo lquido se puede obtener un gran nmero de molculas de DNA plasmdicas, cada una de las cuales contiene el mismo fragmento de DNA insertado.

molcula de DNA recom binante. Los extremos cohesivos producidos por muchas nucleasas de restriccin permiten que dos fragmentos de DNA se unan mediante interacciones entre pares de bases complementarias (vase Figura 7-2). Los fragmentos de DNA unidos de esta manera pueden soldarse de forma covalente a travs de una reaccin muy eficiente catalizada por la enzima DNA ligasa. En este ejemplo, se forma un plsmido recombinante que contiene un inserto de DNA cromosmico.

un gran nm ero de plsm idos, cada uno de los cuales contiene un inserto de DNA
d ife r e n te n n n H e In e m a l e s

clulas bacterianas captacin del DNA bacterias sembradas en un m edio que contiene antibitico

solam ente son resistentes al antibitico y crecen las bacterias que portan un plsm ido

ensayo para las colonias que contienen el clon de DNA que interesa. Estas colonias se inoculan en un gran cultivo

purificacin del DNA plasm dico

332

Captulo 7 : Tecnologa del DNA recombinante

mRNA -A A A A A A A UNION DEL CEBADOR 3 SE HACE UNA COPIA EN DNA MEDIANTE LA TRANSCRIPTAS A INVERSA TTTTTTT 3' 5' TTTTTTT TRATAMIENTO CON ALCALI PARA DEGRADAR EL RNA
d .

el extrem o 3' del cDNA form a lazos en horquilla

TTTTTTT 5' LA DNA POLIMERASA UTILIZA ESTOS BUCLES EN HORQUILLA COMO CEBADORES PARA SINTETIZAR UNA CADENA COMPLEMENTARIA

m m 'f
TRATAMIENTO CON NUCLEASA S1 PARA ROMPER EL BUCLE

TTTTTTT

/X A A A /^A A TTTTTTT copia de cDNA de doble cadena realizada a partir de un mRNA original

Figura 7-23 Sntesis de cDNA. Se obtiene una copia en DNA (cDNA) de una molcula de mRNA mediante la enzima transcriptasa inversa (vase pg. 303), formndose as una hlice hbrida DNA/RNA. El tratamiento del hbrido DNA/RNA con lcali degrada selectivamente el RNA hasta nucletidos. La cadena sencilla de cDNA que perm anece es copiada por la DNA polimerasa formando una doble hlice de cDNA. Tal com o se indica, tanto la transcriptasa inversa como la DNA polimerasa requieren un cebador para poder iniciar la sntesis. En el caso de la transcripcin inversa se utiliza un pequeo oligonucletido, en este ejemplo se ha hibridado un oligo(dT) con la larga cola poli-A caracterstica del extremo 3 de la mayora de mRNA. Es de destacar que la mayor parte de las molculas de cDNA producidas carecen de extremos cohesivos; las molculas que poseen extremos romos se pueden clonar mediante diferentes procedimientos que son similares (pero menos eficientes) a los descritos en la Figura 7-21.

transfectadas con xito; si la bacteria se hace crecer en presencia del antibitico, solamente sobrevivirn las clulas que contengan los plsmidos. Cada una de las bacterias que fue transfectada contendr, en general, un fragmento de DNA inser tado diferente; este inserto ser heredado por toda las clulas de la progenie de la bacteria que formarn una pequea colonia en una placa de cultivo. La coleccin de muchas pequeas bacterias supervivientes contiene la li brera de DNA, formada por un gran nmero de insertos de DNA diferentes. El problema es que slo unas cuantas de ellas tendrn insertos de DNA con el gen de inters. Es necesario identificar dichas bacterias a fin de recuperar el DNA de inters en forma pura y en cantidades tiles. Antes de describir cmo puede ha cerse esto, es necesario describir una segunda estrategia en la construccin de libreras de DNA muy utilizada en el clonaje de genes.

Dos tipos de libreras de DNA cumplen diferentes propsitos 17

El procedimiento de cortar el genoma completo de una clula mediante una nucleasa de restriccin, tal como se acaba de describir, en ocasiones recibe el nombre de aproximacin de la perdigonada al clonaje de genes. Produce una gran cantidad de fragmentos de DNA -para una clula de mamfero, del orden de un milln- que generarn por tanto millones de colonias diferentes de clulas transfectadas. Cada una de estas colonias estar compuesta por un clon derivado de una sola clula an tecesora, y por lo tanto, contendr un plsmido recombinante con un inserto de la misma secuencia de DNA genmico. Se dice que un plsmido como ste contiene un clon de DNA genmico, y la coleccin completa de plsmidos se denomina una librera de DNA genmico. Sin embargo, debido a que el DNA genmico se ha cortado al azar en pequeos fragmentos, nicamente algunos de estos frag mentos contendrn genes enteros; muchos de ellos tan slo contendrn una parte de un gen y la mayora de los clones de DNA genmico obtenidos del DNA de una clula eucariota superior contendrn DNA no codificante, el cual, como se ver en el Captulo 8, constituye la mayor parte del DNA de estos genomas.

Clonaje de DNA

333

gen A exn ntrn

gen B DNA no transcrito

DNA. cromosomico

gen A
i

gen B
i i i i i i i i i i 1H H E H H H 1 111

1 ____ * % & & & & ___I

TRANSCRIPCION transcritos deRNA 1 MADURACION DEL RNA mRNA

DIGESTION POR UNA NUCLEASA DE RESTRICCIN fragm entos de DNA

1111 ;1 JJJJ

1 1 1 1 1

1 1 J JJJJjj J iiM 1

CLONAJE DE DNA TRANSCRIPCIN INVERSA Y CLONAJE

I I

\
, 1 ^
f ilil ......j jin n

Figura 7-24 Diferencias entre clones de cDNA y clones genmicos. En este ejemplo, el gen A se transcribe muy poco mientras que el gen B lo hace frecuentemente, y ambos genes contienen intrones [verde). En los clones de DNA genmicos se incluyen tanto los intrones com o el DNA no transcrito, de forma que muchos clones contendrn slo una parte de la secuencia codificante de un gen. En los clones de cDNA no hay secuencias de intrones ya que se han eliminado en el proceso de maduracin del RNA para formar el mRNA, y por ello contienen una secuencia codificante continua.

clones de DNA genmico

clones de cDNA

Una estrategia alternativa consiste en iniciar el proceso de clonaje seleccio nando las secuencias de DNA que se transcriben a RNA, y que, por lo tanto, pro bablem ente corresponden a genes. Ello se realiza mediante la extraccin del mRNA (o de una subfraccin purificada del mRNA) de las clulas, y a continua cin, haciendo una copia de DNA com plem entario (cDNA) de cada una de las molculas de mRNA presentes; esta reaccin est catalizada por la enzima transcriptasa inversa de retrovirus, la cual sintetiza una cadena de DNA sobre un mol de de RNA, Las molculas de DNA de una sola cadena sintetizadas por la transcriptasa inversa se transforman en molculas de DNA de doble cadena mediante la DNA polimerasa, y estas molculas se insertan en vectores vricos o plasmdi cos y se clonan (Figura 7-23). Cada uno de los clones obtenidos de esta forma se denom ina clon de cDNA, y la coleccin com pleta de clones derivados de una preparacin de mRNA constituye una librera de cDNA. Existen importantes diferencias entre los clones de DNA genmico y los clones de cDNA. Los clones genmicos representan una muestra al azar de todas las se cuencias de DNA de un organismo, y salvo muy raras excepciones, ser el mismo independientemente del tipo celular que se haya utilizado para prepararlo. Por el contrario, los clones de cDNA slo contienen las regiones del genoma que se han transcrito a mRNA; las clulas de diferentes tejidos contienen diferentes juegos de molculas de mRNA, por lo que se obtendr una librera de cDNA diferente en fun cin del tipo celular empleado para su construccin.

Los clones de cDNA contienen secuencias codificantes continuas 18

La utilizacin de una librera de cDNA para el clonaje de genes tiene varias ventajas. As, algunas clulas especializadas producen grandes cantidades de determinadas protenas y en estos casos la cantidad de mRNA que codifica esta protena se pro duce en un exceso tal que la librera de cDNA preparada a partir de estas clulas estar muy enriquecida en las molculas cDNA que codifican esta protena, lo cual facilita la identificacin del clon deseado en la librera (Figura 7-24). Por ejemplo, la hemoglobina se fabrica en grandes cantidades en los eritrocitos en de sarrollo; por ello los genes de globinas fueron de los primeros en ser clonados.

334

Captulo 7 : Tecnologa del DNA recombinante

La caracterstica ms importante de los clones de cDNA es que contienen la secuencia ininterrumpida de un gen. Frecuentemente los genes eucariotas con sisten en pequeas secuencias cortas de DNA codificante (exones) separadas por regiones largas de DNA no codificante (intrones); la produccin del mRNA supo ne la eliminacin de las secuencias no codificantes del transcrito de RNA inicial y la unin entre s de todas las secuencias codificantes. Ni las clulas bacterianas ni las levaduras realizan estas modificaciones sobre el RNA producido a partir de un gen de una clula eucariota. As pues, si la intencin del proceso de clonaje estri ba tanto en deducir la secuencia de aminocidos de una protena a partir de la del DNA, como en producir grandes cantidades de la protena expresando el gen clonado en una bacteria o en una levadura, es mucho mejor partir del cDNA. Las libreras genmicas (genotecas) y las libreras de cDNA constituyen re cursos inagotables ampliamente utilizados en investigacin. Hoy en da, muchas de estas libreras son tam bin asequibles comercialmente.

linfocitos T

linfocitos B

()
mRNA de los linfocitos T LA TRANSCRIPTASA ^5 = 1 = ^ INVERSA SINTETIZA DNA

im

mRNA de los linfocitos B

Pueden prepararse libreras de cDNA a partir de poblaciones seleccionadas de m olculas de mRNA19

Cuando se prepara cDNA a partir de clulas que expresan el gen de inters a ni veles extremadamente altos, la mayora de los clones pueden contener la se cuencia del gen, la cual puede as seleccionarse con un esfuerzo mnimo. Para el caso de genes transcritos de forma menos abundante, antes de hacer la librera de cDNA pueden utilizarse diversos mtodos para enriquecer la poblacin de RNA con el mRNA de inters. Por ejemplo, si se dispone de un anticuerpo contra la protena, puede utilizarse para precipitar selectivamente los polirribosomas aislados (vanse pgs. 253-254) que contengan las cadenas en crecim iento del polipptido de que se trate. Como estos ribosomas tambin contienen el mRNA que codifica la protena, el precipitado estar enriquecido en el mRNA deseado, en un factor de aproximadamente 1000 veces. El procedimiento de la hibridacin substractiva supone una potente alter nativa para enriquecer la mezcla con una secuencia particular de nucletidos, antes de proceder al clonaje de los cDNA. Este procedimiento de seleccin puede utilizarse, por ejemplo, si se dispone de dos tipos celulares estrechamente rela cionados procedentes de organismos de la misma especie, pero tales que slo uno de ellos produzca la protena o protenas de inters. Fue utilizado inicial mente para identificar protenas receptoras de superficie presentes en los linfocitos T y no presentes en los linfocitos B. Tambin puede utilizarse cuando una c lula que expresa la protena tiene una mutante que no la expresa. El primer paso del proceso consiste en sintetizar las molculas de cDNA utilizando el mRNA del tipo celular que fabrica la protena de inters. A continuacin, estos cDNA se hibridan con un gran exceso de molculas de mRNA del segundo tipo celular. El es caso nmero de secuencias de cDNA que no encuentran pareja de mRNA com plementaria, y que por lo tanto probablemente representan las secuencias de mRNA que nicamente estn presentes en el primer tipo celular, son purificadas por un procedimiento bioqumico sencillo (una columna de hidroxiapatita) que separa las molculas de cidos nucleicos de cadena sencilla de las de doble cade na (Figura 7-25). Adems de constituir un poderoso sistema para clonar los genes cuyos productos estn restringidos a un determinado tipo celular especializado, las libreras de cDNA preparadas tras hibridacin substractiva son tiles para de finir las diferencias de expresin gnica entre dos tipos celulares relacionados.

I DEGRADACIN ^ = 1 = = ^ ALCALINA DEL mRNA copias de cDNA

HIBRIDACION CON EXCESO DE m RNA PROCEDENTE DE LOS LINFOCITOS B cDNA de los escasos mRNA presentes nicam ente en los linfocitos T

UNA COLUMNA DE HIDROXIAPATITA ELIMINA TODOS LOS HBRIDOS DNA/RNA

cDNA purificados que corresponden a los mRNA caractersticos de los linfocitos T

Figura 7-25 Hibridacin substractiva. Aqu la tcnica se utiliza para purificar clones de cDNA raros que corresponden a mRNA, presentes en linfocitos T pero no en linfocitos B. Como ambos tipos celulares estn muy relacionados, muchos de los mRNA sern comunes a ambos tipos celulares; el mtodo de hibridacin substractiva es, por ello, una potente herramienta para obtener preparaciones enriquecidas en las molculas especializadas que diferencian ambas clulas.

Para identificar los clones de inters en una librera de DNA puede utilizarse tanto una sonda de DNA como un ensayo para la protena expresada 20
A menudo la etapa ms difcil del proceso de clonaje de genes consiste en iden tificar las escasas colonias de la librera que contienen los fragmentos de DNA de inters. Esto es especialmente cierto en el caso de libreras genmicas, en las

Clonaje de DNA

335

disco de papel absorbente

INCUBAR CON LA SONDA Y LAVAR colonias que contienen el plsmido de inters EXPONER EL PAPEL A LA PELCULA FOTOGRFICA

sonda de DNA marcada

placa de petri con colonias de bacterias que contienen plsmidos recombinantes

DNA unido al papel

RECOGER EL DISCO DE PAPEL DE LA PLACA PARA OBTENER LA RPLICA DE LAS COLONIAS

LISADO DE LAS BACTERIAS Y DESNATURALIZACIN DEL DNA

posicin de las colonias deseadas detectadas por autorradiog rafia

Figura 7-26 Una tcnica eficiente que norm alm ente se utiliza para
en contrar las colonias bacterianas que contienen un clon de cDNA determ inado. Se hace una rplica del cultivo presionando un disco de papel

absorbente contra la superficie. Esta rplica se trata con lcali (para romper las clulas y desnaturalizar el DNA plasmdico) y se hbrida con una sonda radiactiva de DNA. Las colonias que se han hibridado con la sonda se detectan por autorradiograffa (vase tambin Figura 7-22). que para identificar un determinado gen de mamfero se ha de identificar una clula bacteriana de entre un milln de clulas. La tcnica utilizada ms frecuen tem ente consiste en una forma de hibridacin in situ, que aprovecha la exquisita especificidad de las interacciones entre pares de bases que se producen entre dos molculas complementarias de cidos nucleicos. Se transfieren (blotting) a un fil tro colonias crecidas en placas de cultivo, de forma que quedan adheridos algu nos miembros de cada colonia bacteriana. Estas colonias adheridas, conocidas como rplicas, se tratan con lcali y se incuban con una sonda radiactiva de DNA que contiene parte de la secuencia del gen que va a ser seleccionado (Figura 7-26). Si es necesario, de esta forma se pueden estudiar millones de clones bacterianos hasta encontrar uno que hibride con la sonda. Para encontrar el clon que interesa es necesario disponer de la sonda ade cuada. Cmo construirla depender de la informacin de que se disponga del gen a clonar. En muchos casos, la protena de inters ha sido identificada m e diante estudios bioqumicos y purificada en pequeas cantidades. Una cantidad tan pequea como unos cuantos microgramos de la protena pura es suficiente para determinar la secuencia de los 30 primeros aminocidos. Utilizando el cdigo gentico, a partir de esta secuencia de aminocidos se puede deducir la secuencia correspondiente de nucletidos (con algunas ambigedades que corresponden a aquellos aminocidos que son codificados por diferentes codones). Entonces, utili zando mtodos qumicos, se sintetizan dos juegos de oligonucletidos escogidos para reconocer diferentes zonas de la secuencia de nucletidos predicha del gen (Figura 7-27). Aquellas colonias de clulas que hibriden con ambos nucletidos son buenos candidatos para contener el gen deseado, y se aslan para una carac terizacin posterior (vase ms adelante). Las sondas tam bin se pueden obtener de otras formas. Si se dispone de an ticuerpos que reconozcan la protena producida por el gen, es posible marcarlos y utilizarlos com o sonda para encontrar aquel clon que sea productor de la pro tena, y por ello que contendr el gen buscado. Tambin se puede usar como sonda cualquier otro ligando capaz de unirse a la protena codificada por el gen:

336

Captulo 7 : Tecnologa del DNA recombinante

regin conocida de una secuencia de am inocidos H2N Gly Val Arg M et Asp Trp Asn Tyr Glu Pro Leu Ser Thr Trp Glu M et Asn Gln Trp Phe Val Arg Ala - COOH codones posibles 5' GGA GGC GGG GGU GUA GUC GUG GUU AGA AUG GAC UGG AAC UAC GAA CCA UUA AGC AAU UAU GAG CCC UUG AGU AGG GAU CCG CUA UCA CGA ccu CUC ucc CGC CUG UCG CGG CUU UCU CGU ACA UGG GAA AUG AAC CAA UGG UUC GUA AGA UUU GUC AGG AAU CAG ACC GAG GUG CGA ACG GUU CGC ACU CGG CGU GCA GCC GCG GCU

regiones de secuencia codificante con m enor am bigedad oligonucletidos sintticos usados com o sondas

A U G G A y U G G A A jU A yG A Q C C

UG GGA q AUGAA[|CA q UGGUU

(16 posibilidades)

(8 posibilidades)
Figura 7 -27 Seleccin de regiones de una secuencia de am inocidos conocida p ara h acer sondas sintticas de oligonucletidos. De hecho, una secuencia de nucletidos determinada codifica una sola protena, pero la degeneracin del cdigo gentico significa que varias secuencias de nucletidos diferentes codifican la misma protena, y es imposible anticipar cul de ellas ser la correcta. Debido a que es deseable utilizar como sonda una mezcla de oligonucletidos con una proporcin de la secuencia correcta de nucletidos tan alta com o sea posible, se escogen las secuencias con menos indeterminaciones, como se muestra en la figura. En este ejemplo se deben sintetizar los 8 oligonucletidos muy similares que se indican, que se usarn com o sonda sobre una librera de DNA, y la mezcla de los 16 oligonucletidos se utilizar para verificar por hibridacin todos los posibles clones positivos de la primera bsqueda, a fin de encontrar los que codifican la protena deseada. Cada oligonucletido se m arca en el extremo 5 despus de ser sintetizado por mtodos qumicos (vase Figura 7-6B); alternativamente, el oligonucletido se puede marcar en el propio proceso de sntesis mediante la incorporacin de un nucletido modificado (vase Figura 7-18).

si codifica un protena receptora, por ejemplo, el ligando que normalmente se une es un buen candidato a sonda especfica. Siempre que sea necesario detectar la protena codificada por el gen y el propio gen, es necesario construir un tipo de librera de cDNA especial. Se pre para utilizando vectores vricos o plasmdicos especiales, denominados vectores de expresin, que permiten la sntesis de grandes cantidades de la protena codi ficada por el DNA exgeno en las bacterias transfectadas.

La traduccin in vitro facilita la identificacin del clon de DNA correcto 21

Cualquier mtodo que se utilice para aislar clones especficos a partir de libreras genmicas o libreras de cDNA detecta muchos falsos positivos. Se necesita, pues, una dosis suplementaria de ingenio para discriminar entre estos clones y los autnticam ente positivos. La tarea se facilita cuando el clon deseado codifica una protena que ha sido bien caracterizada mediante otros sistemas. En este caso, se comprobar, mediante diferentes mtodos, si alguno de los fragmentos de DNA clonados codifica la protena apropiada. Por ejemplo, el DNA clonado se puede insertar en un vector de expresin, de modo que la protena se produzca en grandes cantidades en bacterias. Asimismo se puede obtener la molcula de RNA correspondiente del DNA clonado, ya sea mediante sntesis in vitro con RNA polimerasa purificada (vase Figura 7-36), o mediante una tcnica denominada seleccin de hbridos. En este ltimo mtodo se mezcla RNA celular en un gran exceso con molculas de una sola hebra del DNA candidato, y los hbridos DNA/RNA se utilizan para poder aislar las molculas de mRNA complementarias de la mezcla. El mRNA purificado de esta forma se utiliza para la sntesis de prote na en un sistema libre de clulas con aminocidos radiactivos, y la protena ra diactiva producida se caracteriza y se compara con la esperada a partir del clon DNA buscado. La coincidencia de resultados en alguna de estas aproximaciones es la que nos permitir concluir que el fragmento de DNA clonado codifica la protena buscada.

La seleccin de clones de DNA solapados permite cam inar por el crom osom a hasta un gen vecino de inters 22
Muchos de los genes ms interesantes -p or ejemplo los que controlan el desarro llo- se conocen tan slo a travs de anlisis genticos de imitantes en organismos tales como la mosca del vinagre Drosophila y el nemtodo Caenorhabditis elegans. Los productos proteicos de estos genes son conocidos y pueden hallarse en canti dades muy pequeas en unas cuantas clulas, o producirse nicamente durante un determinado estadio del desarrollo. Sin embargo, es posible establecer mapas cromosmicos que reflejen las posiciones relativas de los diferentes genes en el

Clonaje de DNA

337

clon A

PREPARAR UNA SONDA DEL EXTREMO DEL CLON A EMPLEAR LA SONDA PARA IDENTIFICAR EL NUEVO CLON clon B PREPARAR UNA SONDA DEL EXTREMO DEL CLON B t EMPLEAR LA SONDA PARA IDENTIFICAR EL NUEVO CLON SU S-----------------------------n ___ ; etc. clon C

Figura 7 -28 Utilizacin del solapamiento de clones de DNA para encontrar un nuevo gen, mediante la tcnica de cam inar por el crom osom a. Para aumentar la

RESULTADO: UNA COLECCION DE CLONES DE DNA SOLAPADOS Y ORDENADOS QUE CUBREN TODA LA REGIN CROMOSOMICA

clon D gen clonado previam ente o m arcador gentico

I

etc.

DNA crom osom ico direccin del "paseo" por el crom osom a

nuevo gen de inters

cromosoma a partir de estudios de ligamiento (vase Figura 7-16). Cuando un gen mapado se ha clonado, se pueden identificar los clones de una librera de DNA genm ico que corresponden a genes vecinos, utilizando una tcnica co nocida como 'cam in ar por el crom osom a. Una vez identificados stos, se ca racterizan m ediante las tcnicas descritas en este captulo a fin de identificar su estructura y su funcin. El proceso de caminar por el cromosoma se inicia a partir de un clon de DNA o un marcador RFLP del que se sabe que est muy prximo al gen de inters. Un extremo de este clon se utiliza para preparar una sonda DNA que se usar para localizar clones genmicos mediante hibridacin. Despus de aislar este segundo clon se utiliza el extremo ms alejado del anterior para preparar una se gunda sonda DNA, que tambin se utilizar para aislar nuevos clones genmicos. De este modo se puede ir caminando por el cromosoma, clon a clon, en pasos de unos 30 000 pares de bases o ms, en ambas direcciones {Figura 7-28). Pero, cmo se puede determinar cundo se ha acabado el gen de inters (identificado originalmente mediante una mutacin deletrea), dado que el cam i no recorrido generalmente es demasiado largo para poder determinar la secuencia completa de DNA? En el caso de organismos muy utilizados en experimentacin como moscas del vinagre, nemtodos, Arabidopsis, levaduras y ratones, la prueba definitiva se obtiene al introducir la forma correcta del gen en un individuo mu ante, produciendo un organismo transgnico (vase Figuras 7-45 y 7-49). Si la mutacin original era recesiva, el individuo transgnico debe recuperar la funcin normal. En otras ocasiones, como en el caso del estudio de los genes humanos, no es posible obtener transgnicos y por ello se aplican criterios menos severos, como se describe ms adelante (vase Figura 7-30).

velocidad del proceso, resulta ptimo utilizar molculas de DNA clonadas muy largas. Para localizar el clon siguiente mediante el procedimiento de caminar por el DNA, se purifica un fragmento corto de DNA (y se marca radiactiva o qumicamente) de uno de los extremos del clon identificado anteriormente: si se utiliza el extremo derecho, por ejemplo, el avance se realizar hacia la derecha, como se ilustra en el ejemplo. La utilizacin de pequeos fragmentos del extremo del clon reduce la probabilidad de que la sonda contenga secuencias de DNA repetidas que hibridaran con numerosos clones de diferentes regiones del genoma, con lo que se interrumpira el paseo.

clones en vectores csm idos

Figura 7-29 Clones de DNA genmicos solapados. La coleccin de

clones en YAC
::=

crom osom a 3

sup5

unc-32 300 000 pares de bases

clones que se muestran cubren una pequea regin del cromosoma del gusano nemtodo Caenorhabditis elegans y representa un 0,3 % del genoma total. (Adaptado de J. Sulston et al., Nature 356:37-41,1992. 1992 MacMillan Magazines Ltd.)

338

Captulo 7 : Tecnologa del DNA recombinante

gen hum ano m utado, localizado en algn lugar de este m illn de pares de bases ETAPA 1 m arcador RFLP X solapam iento de clones de DNA m arcador RFLP Y

Figura 7-30 Clonaje posicional. El procedimiento requiere la utilizacin de un gen humano mutante cuya herencia pueda detectarse en muchos grupos familiares gracias al fenotipo que causa dicha mutacin. Etapa 1, mapaje gentico: se identifican marcadores RFLP, que coheredan con el fenotipo mutante, y se utilizan para posicionar el gen en margen de unas 106 pares de bases (una megabase, alrededor del 1% de la longitud de un cromosoma humano tpico). Etapa 2,

secuencias de DNA conservadas en el ratn

/ ' \ \ \ \

ensamblaje de una librera de clones ordenados: se obtienen clones de DNA

genmico que cubran la totalidad de la regin comprendida entre dos marcadores RFLP que flanquean el gen. Etapa 3, bsqueda de secuencias de DNA conservadas: se identifican las porciones de cada clon DNA que hibridan con DNA de ratn; nicamente las regiones del cromosoma humano cuya secuencia de nucletidos sea importante, estarn suficientemente conservadas durante la evolucin para formar una hlice hbrida de DNA (una de las hebras de DNA humano y la otra de DNA de ratn). Etapa 4, bsqueda de mRNA adecuados: las secuencias de DNA que ms probablemente contienen el gen mutante son el subconjunto de secuencias de DNA conservadas que codifican mRNA en los tejidos en los que se expresa el fenotipo mutante. Etapa 5, bsqueda de diferencias entre

secuencias de DNA conservadas que codifican un mRNA adecuado ETAPA 4' (-_____H II II

gen cuya secuencia est alterada en los hum anos que presentan el fenotipo m utante
etapa

Se estn construyendo libreras genmicas de clones ordenados para organismos seleccionados 23

Ser mucho ms sencillo identificar genes mutantes a medida que se conozca ms completa y sistemticamente la secuencia del genoma normal. Utilizando mtodos relacionados con los descritos para caminar por el cromosoma, ha sido posible or denar (mapar) un juego casi completo de grandes clones genmicos a lo largo de los cromosomas de la bacteria E. coli, la levadura Saccharomyces cerevisiae, la mosca del vinagre Drosophila, la planta Arabidopsis y el nemtodo C. elegans. Estos grandes clones, cada uno de los cuales tiene aproximadamente 30 000 pares de bases de lon gitud, se han preparado en vectores del bacterifago lambda llamados csmidos, los cuales se han diseado especialmente para aceptar nicamente grandes insertos de DNA. Son necesarios algunos miles de clones csmidos para cubrir todo el genoma de un organismo como C. elegans o Drosophila. Para mapar todo el genoma huma no siguiendo este sistema, se tendran que ordenar ms de 100 000 de estos clones csmidos, lo cual, aunque es tcnicamente posible, llevara mucho tiempo. Adems, se pueden clonar fragmentos de DNA humano ms de 10 veces ms largos que los clones csmidos (300 000 hasta 1,5 millones de pares de bases) en forma de cromo somas artificiales en clulas de levadura {YAC, de Yeast Artificial Chromosomes, cro mosomas artificiales de levadura); en principio el genoma humano se puede mapar con 10 000 clones de este tipo (vase Figura 8-5). Sin duda, en un futuro prximo sern asequibles un conjunto de clones ge nmicos de libreras de DNA centralizadas para el uso de todos los investigado res. Para cada organismo de los que se estudian habitualmente existir una li brera completa, en la que cada inserto de DNA estar catalogado de acuerdo con su cromosoma de origen, y numerado secuencialmente con respecto a la posicin de todos los dems fragmentos de DNA derivados del mismo crom oso ma. As, se podr empezar a caminar por un cromosoma, simplemente obte niendo de la librera todos los clones que cubren la regin del genoma que con tiene el gen mutante de inters.

las secuencias de DNA de los genes mutantes. Cuando se analizan las

mutaciones deletreas de un gen humano tpico, alrededor de 1 de cada 10 resulta ser una deleccin fcilmente detectable por anlisis Southern como una cambio del tamao de un fragmento de restriccin. Por esta razn, generalmente se empieza estudiando el DNA de muchos pacientes humanos que padezcan la misma enfermedad, utilizando sondas identificadas en la etapa 4, buscando cambios de este tipo. Si la mutacin no es detectable como una deleccin, para identificar al gen de inters se debern utilizar otros mtodos ms laboriosos que sean capaces de detectar cambios de una sola base.

Clonaje de DNA

339

El clonaje posicional de DNA revela la presencia de genes de funciones imprevistas 24

Miles de enfermedades genticas humanas son debidas a alteraciones en un solo gen. La comprensin que tenemos de dichas enfermedades est siendo revolu cionada por la tecnologa del DNA, que permite clonarlo y secuenciarlo, revelan do los defectos precisos de cada paciente. De esta forma se ha podido demostrar que la causa de la distrofia muscular de Duchennne es una protena anmala del citoesqueleto en las clulas musculares, y que la fibrosis qustica es debida a un canal de cloro anmalo en las clulas epiteliales. Estos conocimientos permiten afinar el diagnstico, y disear nuevos tratamientos. A pesar de que las tcnicas que se han utilizado para aislar diferentes genes humanos han diferido dependiendo de la enfermedad que producen, reciente mente se ha desarrollado una aproximacin que permitir aislar cualquier gen humano responsable de un rasgo o causante de una enfermedad. Se ha denomi nado clonaje posicional pues parte de un mapa de ligamiento que permite loca lizar el gen en el genoma (Figura 7-30). Cuando esta aproximacin es directa puede suponer la dedicacin de 10 a 100 personas en un ao para aislar un gen. Ser mucho ms sencillo una vez que se disponga de tecnologas de secuenciacin de DNA mucho ms rpidas y automticas, y que se conozca la secuencia completa del DNA del genoma humano: el mapaje gentico indicar inmediata mente qu genes son los primeros candidatos, permitiendo su anlisis directo en los pacientes individuales. Es probable que se puedan analizar de este modo las funciones de miles de genes humanos.

Mediante una reaccin de polimerizacin en cadena se pueden clonar segmentos de DNA en un tubo de ensayo 25
La asequibilidad de DNA polimerasas purificadas y de oligonucletidos de DNA sintetizados qum icam ente ha hecho posible clonar rpidamente secuencias determinadas de DNA, sin necesidad de utilizar ninguna clula viva. La tcnica, denominada reaccin en cadena de la polim erasa (PCR, de Polymerase Chain Reaction) permite amplificar ms de mil millones de veces un DNA obtenido a partir de una regin seleccionada de un genoma, siempre y cuando previamente se conozca al m enos una parte de su secuencia de nucletidos. En primer lugar se utilizan porciones de la secuencia que rodean la regin que va a ser amplifica da, para disear dos oligonucletidos sintticos de DNA, cada uno de los cuales es com plem entario de cada una de las cadenas de la doble hlice de DNA, y que corresponden a sitios opuestos de la regin a amplificar. Estos oligonucletidos se utilizan como cebadores para la sntesis in vitro de DNA, catalizada por una DNA polimerasa, y determinan los extremos del fragmento final de DNA que se obtiene (Figura 7-31). El principio de la tcnica PCR se ilustra en la Figura 7-32. Cada ciclo de re accin requiere un breve calentam iento para separar las dos cadenas del DNA genm ico de doble hlice (etapa 1). El xito de la tcnica depende del uso de una DNA polimerasa especial aislada de una bacteria termfila y que es mucho ms estable a temperaturas elevadas que la polimerasa comn, de modo que no se desnaturaliza por calentam ientos repetidos. El enfriamiento posterior del DNA en presencia de un gran exceso de los dos oligonucletidos permite su hi bridacin especfica con las secuencias complementarias de DNA (etapa 2). La mezcla se incuba con DNA polimerasa y los cuatro desoxirribonuclesidos tri fosfato, de forma que las regiones del DNA que se hallan en direccin 3' de los cebadores, se sintetizan selectivamente (etapa 3). Para conseguir una amplifica cin especfica del DNA se requieren 20 o 30 ciclos de reacciones. Cada ciclo dura aproximadamente 5 minutos, y un procedimiento automtico permite el clonaje en un sistema libre de clulas de un fragmento de DNA, en pocas horas, comparado con el tiempo de varios das que se requiere para el clonaje por los mtodos estndar.

cadenas de DNA com plem entarias separadas

si

m z z2 Z ~ z iz 3 3'

X pares de nucletidos
Figura 7-31 Inicio de la reaccin en cadena de la polim erasa (PCR) para la amplificacin de secuencias especficas de nucletidos in vitro. El DNA aislado de clulas se calienta para separar su dos cadenas complementarias. Estas cadenas se hibridan con un gran exceso de dos oligonucletidos (de 15 a 20 nucletidos de longitud) sintetizados por mtodos qumicos y que son idnticos a secuencias que distan entre s X nucletidos (donde X vara generalmente entre 50 y 2000 nucletidos). Los dos oligonucletidos actan como cebadores para la sntesis in vitro de DNA catalizada por la DNA polimerasa, que copia la secuencia de DNA que hay entre ambos oligonucletidos.

340

Captulo 7 : Tecnologa del DNA recombinante

separacin de las cadenas de DNA y unin del cebador

separacin de las cadenas de DNA y unin del cebador

sntesis de DNA

separacin de las cadenas de DNA y unin del cebador /

^3

etc.

'

etc.

fragm ento de DNA crom osm ico

PRIMER CICLO (2 m olculas de DNA de doble cadena)

SEGUNDO CICLO (4 m olculas de DNA de doble cadena)

TERCER CICLO (8 m olculas de DNA de doble cadena)

Figura 7-3 2 Amplificacin por PCR. El mtodo PCR produce, en cada ciclo de sntesis de DNA, una cantidad doble de la precedente, de una molcula de tamao nico. Cada ciclo est formado por tres etapas, como se describe en el texto. Despus de muchos ciclos de reaccin la poblacin de molculas de DNA est dominada por un fragmento de DNA nico, de X pares de bases, siempre que la muestra de DNA original contenga la secuencia que se esperaba que existiera entre los dos oligonucletidos. En el ejemplo, tres ciclos de reaccin han producido 16 cadenas de DNA, 8 de las cuales tienen la misma longitud {amarillo); pero despus de tres ciclos ms, 240 de las 256 cadenas sern de X nucletidos de longitud.

El mtodo PCR es extremadamente sensible: en una muestra puede detectar una sola molcula de DNA. De una forma similar se pueden analizar cantidades traza de RNA, transformando este RNA en secuencias DNA mediante la accin de la transcriptasa inversa. La tcnica de clonaje mediante PCR est substituyen do con rapidez a la de transferencia Southern para el diagnstico de enfermeda des genticas y para la deteccin de infecciones vricas muy tenues. Tambin constituye una tcnica prometedora para la medicina forense, ya que permite analizar cantidades pequeas de sangre u otros tejidos -tan pequeas como una sola clula- e identificar a la persona de la que procede por sus caractersticas genticas (Figura 7-33).

Resumen
E l clonaje d e DNA perm ite seleccionar u na copia d e cu a lq u ier secuencia d e RNA o d e DNA en tre m illones d e otras secuencias d e u na clula, produciendo cantidades ilim itadas d e ella en fo rm a p u ra . Las secuencias d e DNA son am plificadas despus d e corta r el DNA crom osm ico con u na nucleasa d e restriccin e insertar los fra g m entos d e DNA resultantes en el crom osom a d e u n elem ento gentico autorreplicante (un plsm ido o u n virus). Cuando se utiliza u n plsm ido com o vector, la li b rera genm ica d e DNA resultante se m antiene en el in terior d e m illones d e clulas bacterianas, cada u na d e las cuales porta u n fragm en to d iferen te d e DNA clonado. La colonia portadora d el fragm en to d e inters se identifica m ediante h i bridacin con u na sonda DNA, o, despus d e exp resa r el g en o el fragm en to gnico clonado en la clula husped, m ediante un sistem a q u e detecte el producto gnico deseado. Las clulas d e la colonia identificada se d ejan p ro lifera r produciendo gra nd es cantidades d el fragm en to d e DNA deseado.

Clonaje de DNA

341

huella gentica por PCR VNTR1 VNTR2 VNTR3

II
1

II

|1
i

individuo A

Figura 7-33 Uso de PCR en m edicina forense. (A) Si se utilizan dos oligonucletidos que flanquean un microsatlite particular, o secuencia VNTR (vase Figura 7-14C), para amplificar un DNA por PCR, se obtienen diferentes bandas de DNA para cada individuo. Una de estas bandas contiene la secuencia VNTR repetida que fue heredada de la madre y la otra contiene la secuencia VNTR repetida que fue heredada del padre. (B) La gran cantidad de bandas de DNA obtenidas de un conjunto de diferentes reacciones PCR, cada una de las cuales amplifica el DNA de una secuencia VNTR diferente, pueden utilizarse como huella gentica para identificar a cada individuo de forma casi exclusiva. El material de partida en la reaccin PCR puede ser un simple cabello olvidado en la escena de un crimen.

____ I I

(B)

3 pares de crom osom as hom logos

I ____ I

I ____ I

El procedimiento que se utiliza para aislar clones de DNA cuya secuencia co rresponda a la de un mRNA es el mismo, con la excepcin de que, en vez de utilizar fragmentos genmicos al azar, el material de partida es un DNA obtenido mediante copia de un mRNA, denominado cDNA. A diferencia de los clones genmicos, los clones de cDNA carecen de secuencias intrnicas, siendo por ello los clones de elec cin para expresar y caracterizar el producto proteico de un gen. El mtodo PCR es una nueva form a de clonaje de DNA que se realiza en un sis tema libre de clulas, utilizando una DNA polimerasa termoestable purificada. Este tipo de amplificacin de DNA supone un conocimiento previo de la secuencia gnica pues son necesarios dos oligonucletidos sintticos que flanqueen la secuen cia a amplificar. Sin embargo, el mtodo de clonaje por PCR tiene la ventaja de ser mucho ms rpido y sencillo que los mtodos de clonaje estndar.

Ingeniera de DNA26
Los mtodos que se han descrito hasta el momento en este captulo permiten en principio determinar la organizacin y la secuencia nucleotdica de cualquier cromosoma, incluyendo aquellos que forman el genoma humano. En esta sec cin se describirn variaciones y modificaciones de dichos mtodos que han re volucionado el estudio de las funciones de los genes, los RNA y las protenas.

342

Captulo 7 : Tecnologa del DNA recombinante

Se pueden construir molculas de DNA de cualquier secuencia uniendo fragmentos de DNA27

Como hemos visto, las molculas de DNA recombinante se obtienen general mente usando la enzima DNA ligasa para unir dos molculas de DNA con extre mos cohesivos compatibles. En el caso de la construccin de una librera de DNA, uno de los fragmentos de DNA es el vector, derivado de un plsmido bacte riano o de un virus, mientras que el otro es un fragmento cromosmico o una molcula de cDNA (vase Figura 7-21). Esta molcula de DNA recombinante puede, a su vez, ser usada como vector para clonar molculas de DNA adiciona les y, paso a paso, repitiendo el proceso de clonaje, es posible unir diferentes molculas de DNA. As es posible construir molculas de DNA que son distintas de cualquiera que exista de forma natural (Figura 7-34). Los sintetizadores automticos de oligonucletidos son capaces de producir cualquier molcula de DNA de hasta 100 nucletidos. Su secuencia es determinada por el experimentador; estas molculas pueden unirse unas con otras por medio de etapas de clonaje sucesivas en diferentes com binaciones, a fin de producir largas molculas de DNA. Sin embargo, en la mayor parte de los casos las secuen cias de DNA de inters para el bilogo celular son las que codifican dominios pro teicos que ya existen en la naturaleza. Es posible usar la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) tanto para amplificar secuencias nucleotdicas naturales como para redisear sus extremos, de forma que puedan amplificarse y unirse eficientemente dos secuencias naturales cualquiera (Figura 7-35). Actualmente en muchos casos es ms fcil producir nuevas molculas de DNA mediante PCR y clonajes sucesivos que unan segmentos de DNA seleccionados que a partir de fragmentos sintetizados qumicamente.

Es posible producir grandes cantidades de molculas de RNA homogneas mediante transcripcin de DNA in vitro 28
Las molculas de RNA puras son de utilidad en numerosos estudios de biologa celular. En el caso de que el RNA codifique una protena, disponer de grandes

secuencia codificante A

secuencias codificantes a unir secuencia codificante B

SEPARACIN DE HEBRAS Y UNION DE CEBADORES PCR CON COLAS 5' ( < i ) QUE CONTIENEN DIANAS DE RESTRICCIN
51 i 'l ; "

3' 5'

Figura 7 -3 4 El clonaje seriado de DNA puede utilizarse para unir una serie de fragmentos de DNA procedentes de diferentes genes. Todas las molculas que se representan son de doble hebra. Despus de cada etapa de insercin de DNA, el plsmido es clonado para purificar y amplificar la nueva molcula recom binante. El plsmido recom binante es cortado con una nucleasa de restriccin y utilizado como vector para el siguiente fragmento de DNA.

3*

MUCHOS CICLOS DE PCR PRODUCEN COPIAS DE LAS SECUENCIAS A Y B CON LOS EXTREMOS MODIFICADOS DESEADOS
Figura 7 -35 La m anufactura de los extrem os de los fragmentos de DNA facilita la precisin de su unin. La reaccin PCR permite modificar los extremos de cualquier fragmento de DNA que va a ser amplificado, para facilitar su clonaje. Los oligonucletidos sintticos usados aqu com o cebadores contienen extremos 5 elegidos para crear una diana de corte para una nucleasa de restriccin particular.

CORTAR LOS EXTREMOS CON LA NUCLEASA DE RESTRICCIN

UNION DE LOS FRAGMENTOS.

unin exacta de la secuencia codificante A con la secuencia codificante B

Ingeniera de DNA

34 3

cantidades de esa especie pura facilitar el estudio, por ejemplo, de la madura cin del RNA y de la sntesis de la protena; si el RNA tiene una funcin cataltica, esta actividad podr ser analizada en sistemas libres de clulas. Sin embargo, un gran nm ero de los RNA celulares se encuentran en pequeas cantidades, y es muy difcil su purificacin de los muchos miles de otros RNA presentes en un ex tracto celular. La ingeniera gentica proporciona el mejor sistema de purificar especies puras de RNA, gracias a hacer accesible moldes de DNA puros que per m iten producir cualquier molcula de RNA. Esta tcnica utiliza RNA polimerasas vricas que son especialmente eficientes. Para preparar el molde de DNA apropiado, se clona el DNA que codifica el RNA de forma que se una a un segundo fragmento de DNA que contenga la seal de inicio (promotor) para la RNA polimerasa vrica. Esta molcula de DNA recombinante pura se mezcla con la RNA polimerasa vrica y los cuatro ribonuclesidos trifosfato utilizados en la sntesis de RNA. Durante una incubacin a 37C se produce gran cantidad del RNA deseado mediante transcripcin in vitro (Figura 7-36).

molcula de DNA de doble hebra, construida por ingeniera gentica

prom otor vrco

secuencia que especifica el RNA CORTE CON UNA NUCLEASA DE RESTRICCIN

INCUBACIN CON RNA POLIMERASA MS NUCLESIDO TRIFOSFATOS

Utilizando vectores de expresin es posible producir grandes cantidades de protenas celulares m inoritarias 29
Hasta hace muy poco, las nicas protenas de una clula que podan estudiarse con facilidad eran las relativamente ms abundantes. A partir de varios cientos de gramos de clulas se puede purificar una protena abundante -q u e constitu ya el 1% o ms de la protena total mediante pasos cromatogrficos secuenciales, llegando a obtener quizs 0,1 g (100 mg) de proteina pura. Esta cantidad de protena es suficiente para realizar una secuenciacin de aminocidos conven cional, para desarrollar un anlisis detallado de su actividad biolgica o enzim tica (si es conocida) y para generar anticuerpos que puedan ser utilizados para localizar la protena en el interior de la clula. Adems, si se consigue obtener cristales apropiados (lo cual normalmente constituye una tarea difcil), ser po sible determinar la estructura tridimensional de la protena mediante tcnicas de difraccin de rayos X. De esta manera, se han analizado la estructura y la fun cin de muchas protenas abundantes, entre las que se hedan la hemoglobina, la tripsina, algunas inmunoglobulinas y la lisozima. La inm ensa mayora de los miles de protenas diferentes de una sola clula eucariota, incluidas algunas de las protenas ms interesantes, se hallan presen tes en cantidades muy reducidas. Resulta extremadamente difcil, cuando no es imposible, obtener ms de unos cuantos miligramos de material puro de la m a yora de estas protenas minoritarias. Una de las contribuciones ms trascen dentales del clonaje del DNA y de la ingeniera gentica a la biologa celular es que han hecho posible la manufactura en grandes cantidades de cualquiera de las protenas celulares, incluyendo las minoritarias. En principio es posible producir grandes cantidades de una proteina pura si se sintetiza gran cantidad de mRNA que codifica dicha protena y despus se traduce en un sistema libre de clulas que contenga los numerosos componentes necesa rios para la sntesis de protenas, incluyendo ribosomas, RNA de transferencia, en zimas de traduccin, etc. Esta aproximacin se usa en ocasiones aunque es mucho ms eficiente producir tanto el mRNA como la proteina en una clula viva, utilizan do un vector de expresin (Figura 7-37). Este vector est diseado para producir grandes cantidades de mRNA estable que ser traducido eficientemente a protena en el interior de la bacteria, levadura, o clula de mamfero. A fin de evitar que la elevada sntesis de la protena extraa interfiera con el crecimiento de la clula transfectada, los vectores de expresin se suelen disear de modo que la sntesis de la protena extraa se inicie poco antes de recolectar las clulas (Figura 7-38). Debido a que la protena deseada fabricada por un vector de expresin se pro duce en el interior de la clula, ha de purificarse del resto de las protenas de la c lula husped mediante cromatografa, tras la lisis celular; pero debido a que se halla en cantidades importantes (entre un 1% y un 10% del total de la protena celular), habitualmente la purificacin puede conseguirse fcilmente en unas cuantas eta-

3' I ELIMINAR EL DNA I Y LA PROTENA de RNA

molculas

puraS

Figura 7-36 Se pueden obtener in vitro grandes cantidades de cualquier molcula de RNA usando una RNA polim erasa vrica. Para utilizar estas enzimas extraordinariamente eficientes es necesario que en el molde de DNA est construido de forma que la corta secuencia de DNA que especifica el promotor vrica sea adyacente a la secuencia de DNA que codifica la molcula de RNA que se va a sintetizar. Como se indica, el extremo 3' del RNA se determina al cortar el molde DNA con una nucleasa de restriccin de diana nica.

344

Captulo 7 : Tecnologa del DNA recombinante

Figura 7 -37 Produccin de grandes cantidades de una protena por clonaje de una secuencia codificante de una protena en un vector de expresin plasmdico. El plsmido se ha construido de forma que contiene un promotor muy activo, capaz de dirigir la sntesis de una gran cantidad del mRNA que codifica la protena, en las clulas transfectadas.

vector de expresin plasm dico, DNA de doble hebra

pas. Existe una gran variedad de vectores de expresin, cada uno de los cuales est construido para que acte en el tipo celular en el que se va a producir la protena. De esta forma, las clulas pueden ser inducidas a fabricar grandes cantidades de protenas tiles desde el punto de vista mdico -com o insulina y hormona del cre cimiento humanas, interfern y antgenos vricos para producir vacunas. De forma ms general, estos mtodos hacen posible producir protenas en cantidades sufi cientemente grandes para poder estudiar detalles de su estructura y de su funcin, que antes estaban reservados nicamente a unas cuantas protenas.

secuencia lugar de dl p ro m o to r. clonaje CORTAR CON UNA NUCLEASA DE RESTRICCION

INSERTAR LA SECUENCIA DE DNA QUE CODIFICA LA PROTENA

Los genes marcadores perm iten analizar la funcin de las secuencias de DNA reguladoras 30
La transcripcin de un gen est controlada por secuencias de DNA reguladoras que no se transcriben. Estas secuencias determinan qu clulas expresarn el gen y bajo qu condiciones, como se explica en el Captulo 9. En eucariotas superiores dichas secuencias se pueden encontrar situadas a muchos miles de pares de bases por delante o por detrs de las secuencias que se transcriben, y actan en dife rentes com binaciones controlando la expresin gnica. Las secuencias de DNA reguladoras de un gen se pueden identificar mediante una manipulacin que supone reemplazar parte de la secuencia codificante por otra diferente (denomi nada secuencia marcadora ) seleccionada, debido a que la protena que codifica se detecta con facilidad mediante tincin citologica simple o ensayo enzimtico. Las secuencias reguladoras se identificarn uniendo diferentes regiones de se cuencia anterior o posterior del gen a la secuencia marcadora. Cuando se transfecten clulas con estas molculas de DNA recombinante el nivel de expresin de la protena marcadora, el momento en que se produce sta y la especificidad celular, reflejarn la funcin de las secuencias reguladoras que contiene cada construccin de DNA (Figura 7-39).

TRANSFECTAR CELULAS CON EL DNA RECOMBINANTE

RNA sobre-expresado

protena sobre-expresada

tiem po a

Los organismos im itantes revelan m ejor la funcin de un gen 31

Supongamos que se ha clonado un gen que codifica una protena recin descu bierta. Cmo podremos descubrir la funcin que desarrolla esta protena en la clula? ste es un problem a actualm ente muy habitual en biologa celular, pero sorprendentem ente difcil de resolver, ya que ni la estructura tridim ensio nal de la protena ni la secuencia com pleta de nucletidos de su gen son sufi cientes para determ inar la funcin de la protena. Adems, muchas protenas -tales com o las que tienen funciones estructurales en la clula o las que nor m alm ente forman parte de un gran com plejo enzim tico- carecen de una acti vidad obvia cuando estn separadas de los otros com ponentes de su unidad funcional.

?.SC

NA

M licas^

Figura 7 -38 Produccin de grandes cantidades de una protena utilizando un vector de expresin plasmdico. En este ejemplo se han transfectado bacterias con la secuencia codificante de una enzima, la DNA helicasa (flecha); la transcripcin de esta secuencia codificante se encuentra bajo el control de un promotor vrico que es activo nicam ente a temperaturas de 37C o superiores. Se ha analizado la protena celular total por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, tanto de bacterias cultivadas a 25C (no se produce helicasa), com o de las mismas bacterias cultivadas a 42C durante dos horas. (Fotografa cortesa de Jack Barry.)

Ingeniera de DNA

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(A) MOLCULAS DE DNA ORIGINALES secuencia codificante de la proteina X lugar inicio de la . * de . de . DMA sntesis RNA

norm al 1 . / secuencias . . reguladoras que determ inan la expresin del gen X recom binada BE 1 2 \

PATRN DE EXPRESIN DEL GEN X clulas ___ 'A B C D E F patrn norm al de expresin del gen X PATRN DE EXPRESIN DEL GEN MARCADOR Y

CM

secuencia codificante de la protena m arcadora Y 1 i g g l j S p v P 1 ' 1 1 3

(B) MOLCULAS DNA RECOMBINANTES A ANALIZAR 3 2 1 i 1 1

PATRON DE EXPRESION DEL GEN MARCADOR Y

Figura 7-39 Uso de una proteina m arcadora para localizar las regiones de DNA reguladoras que determinan el patrn de expresin de un gen. En este ejemplo la secuencia codificante de la proteina X se reemplaza por la secuencia codificante de la protena Y, y se le aaden diferentes com binaciones de fragmentos de DNA que contienen secuencias candidatas a ser reguladoras. Se mide la capacidad de expresin de las molculas recom binantes en una coleccin de clulas de mamfero transfectadas. En los estudios sobre clulas eucariotas se suelen utilizar dos genes marcadores, la enzima (3-galactosidasa (|3-gtf) y la cloranfenicol acetil transferasa (CAT). Ambas son enzimas bacterianas y su presencia se mide fcilmente mediante ensayos de actividad enzimtica simples y muy sensibles sin que interfieran las enzimas del husped.

(C) CONCLUSIONES

-la secuencia reguladora 3 activa el gen X en las clulas B -la secuencia reguladora 2 activa el gen X en las clulas D, E y F -la secuencia reguladora 1 inactiva el gen X en las clulas D

Una aproximacin que ya hemos com entado (vase Captulo 4), consiste en inactivar la protena a estudiar mediante un anticuerpo especfico y observar cmo esto afecta a las clulas. A pesar de que esta estrategia proporciona una poderosa va para estudiar la funcin proteica, para el caso de un protena intracelular el efecto es transitorio ya que el anticuerpo microinyectado se diluye du rante la proliferacin celular o es destruido por degradacin intracelular. Asi mismo, muchos anticuerpos -incluso los que se unen fuertemente a alguna regin de la protena diana- son incapaces de bloquear la funcin de la protena. Las aproximaciones genticas proporcionan una solucin convincente a este problema. Los organismos mutantes que carecen de una determinada pro tena pueden indicar rpidamente cul es la funcin de la molcula normal. Aun son ms tiles los m utantes que sintetizan una versin de la protena que es sen sible a la temperatura, es decir, que se inactiva por un pequeo aumento (o dis minucin) de la temperatura del medio, pues en esos mutantes la anomala pue de ser manifestada o no simplemente modificando la temperatura. Antes del desarrollo de la tecnologa del clonaje de DNA se identificaron numerosos genes mediante esta aproximacin, determinando los procesos afectados por la muta cin. La aproximacin gentica ha sido aplicable de forma ms general a los or ganismos que se reproducen muy rpidamente -co m o las bacterias, las levadu ras, los gusanos nem todos y las moscas del vinagre. Tratando estos organismos con agentes que alteran su DNA (mutgenos ), se pueden aislar rpidamente un gran nmero de m utantes y detectar y aislar los que presentan un defecto parti cular que interese. Por ejemplo, mediante el estudio de poblaciones de bacterias tratadas con un mutgeno que detenga la sntesis de DNA cuando las bacterias se transfieren desde 30C hasta 42C, se aislaron m uchos mutantes sensibles a la temperatura en los genes que codifican las protenas bacterianas necesarias para la replicacin del DNA. Posteriormente, estos mutantes fueron utilizados para identificar y caracterizar las protenas correspondientes responsables de la replicacin del DNA. De una forma similar se ha utilizado la aproximacin gen tica para demostrar la funcin de las enzimas implicadas en las principales rutas

346

Captulo 7 : Tecnologa del DNA recombinante

metablicas de bacterias, as como para descubrir numerosos productos gnicos responsables del desarrollo ordenado del embrin de Drosophila. Los humanos no nos reproducimos rpidamente, ni tampoco somos tratados intencionadamente con mutgenos. Adems, cualquier humano que presente un defecto serio en algn proceso esencial, como el de la replicacin del DNA, morir antes de nacer. No obstante, en la poblacin humana aparecen espontneamente algunas mutaciones que son compatibles con la vida -por ejemplo defectos en lisosomas o en receptores de la superficie celular, especficos de tejido. El anlisis de los fenotipos de los individuos afectados, conjuntamente con estudios de sus clulas cultivadas, han aportado pruebas nicas sobre importantes funciones celulares. A pesar de que estos imitantes son extremadamente escasos, se ponen de manifiesto de forma muy eficaz debido a una caracterstica especfica de los humanos: los indi viduos imitantes llaman la atencin sobre s mismos buscando cuidados mdicos especiales.

Pueden fabricarse a medida clulas y organismos que contengan genes alterados 32

A pesar de que normalmente no resulta difcil obtener mutantes deficientes en un determinado proceso, como pueden ser los procesos de la replicacin del DNA o del desarrollo del ojo, el encontrar una mutacin que suponga el defecto de una protena determinada puede suponer muchos aos de trabajo. Recientemente la tecnologa del DNA recombinante ha hecho posible una aproximacin gentica di ferente a este problema, mediante la cual se parte de una protena y se genera una clula o un organismo mutante en el que la protena (o su expresin) sea anmala. Dado que esta nueva aproximacin invierte la direccin tradicional del anlisis ge ntico (del gen a la protena), habitualmente se la denomina gentica inversa. La gentica inversa parte de una protena que haya sido aislada de una clula y que presente propiedades interesantes. Si el punto de partida es una protena, se clona el gen que la codifica y se determina su secuencia de nucletidos. Posterior mente se altera la secuencia bioqumicamente, creando un gen mutante que codi fique una versin alterada de la protena. El gen mutante se transfiere a un clula, en la que puede integrarse a un cromosoma mediante recombinacin gentica y pasar a formar parte de la dotacin permanente del genoma celular. Si el gen se expresa, la clula y todos sus descendientes sintetizarn una protena alterada. Si la clula original utilizada para la transferencia del gen es un huevo fe cundado, se podr obtener un organismo completo que contenga el gen m utan te. Algunos de estos organismos transgenicos transmitirn el gen alterado a su progenie com o una parte de su lnea germinal. Actualmente se realizan de forma rutinaria transformaciones genticas de este tipo sobre organismo tan complejos como la m osca del vinagre y algunos mamferos (Figura 7-45). De hecho es tc nicam ente posible transformar de esta forma incluso organismos humanos, si bien estos experimentos no se realizan por temor a las aberraciones imprevisi bles que pueden darse en tales individuos.

Los genes se pueden redisear para que produzcan protenas de cualquier secuencia que se desee 33
Con la finalidad de facilitar los estudios de gentica inversa, es posible modificar tanto la secuencia codificante de un gen como sus regiones de regulacin de modo que se modifiquen tanto las propiedades de la protena, como la cantidad de ella que se sintetiza o el tipo celular en que se produce. Para alterar los genes de forma ms sutil (a menudo es deseable que la protena que codifican difiera de la original en un solo o en unos cuantos am inoci dos) son necesarias tcnicas especiales. El primer paso consiste en la sntesis qumica de una corta molcula de DNA que contenga la porcin alterada de la secuencia nucleotdica del gen. Este oligonucletido sinttico de DNA se hbrida con un plsmido de DNA de una sola cadena que contenga la secuencia de DNA

Ingeniera de DNA

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cebador sinttico constituido por un oligonuclotido sinttico que contiene la secuencia mutante deseada
cadena sencilla del gen norm al SUSTITUCION DE NUCLETIDOS plsm ido de DNA INSERCIN DE NUCLETIDOS

LA CADENA SE COMPLETA MEDIANTE LA ACCIN DE LA DNA POLIMERASA Y LA DNA LIGASA I t

OOOOOOOIOOOOOOOO

0000000000000000

00000000 # 1100000000
protena con am inocidos suplem entarios insertados

protena con un am inocido cam biado

protena norm al

que se quiera alterar, utilizando condiciones que permitan el apareamiento im perfecto de cadenas de DNA (Figura 7-40). El oligonuclotido sinttico se utiliza ahora como cebador para la sntesis de DNA mediante la DNA polimerasa, gene rndose as una doble hlice de DNA que incorpora al gen la secuencia alterada. A continuacin, el gen modificado se inserta en un vector de expresin de forma que la protena rediseada se pueda sintetizar en gran cantidad, suficiente para estudios detallados. Utilizando esta tcnica se pueden cambiar determinados aminocidos de una protena y analizar qu parte de la cadena polipeptdica es importante en procesos tan importantes como su plegamiento, las interacciones protena-ligando o la catlisis enzimtica.

Habitualmente las protenas de fusin son de gran utilidad para analizar la funcin proteica 34
En una protena se suelen encontrar regiones de pocos aminocidos que son res ponsables de determinar su localizacin en la clula, o su estabilidad despus de ser sintetizada. Estas regiones especficas de la protena se pueden identificar fu sionndolas con una protena marcadora, fcilmente detectable, que carezca de dichas regiones, y siguiendo su comportamiento en la clula (Figura 7-41). Estas protenas de fusin se producen mediante las tcnicas del DNA recombinante que se han descrito previamente. Por ejemplo, numerosas protenas nucleares contie nen una o ms secuencias cortas especficas que actan de seal para su importa cin por el ncleo, despus de ser sintetizadas en el citosol. Se han conseguido identificar dichas regiones uniendo artificialmente, mediante la tcnica de fusin gnica, diferentes regiones de protenas nucleares a una proteina citoplasmtica.

Figura 7-40 Utilizacin de oligonucletidos sintticos para modificar las regiones de los genes que codifican protenas. nicamente se muestran dos de los muchos tipos de cambios que se pueden generar mediante la ingeniera gentica, utilizando sistemas com o ste. Por ejemplo, con un oligonuclotido apropiado se puede substituir ms de un aminocido cada vez, o se pueden eliminar uno o ms aminocidos. Como se indica, dado que por este procedimiento slo se altera una de las dos cadenas del DNA del plsmido recombinante, nicam ente la mitad de las clulas transfectadas acabarn conteniendo el plsmido que presente el gen mutante deseado. Ntese que en la figura no se ilustra la mayora de la secuencia del plsmido.

348

Captulo 7 : Tecnologa del DNA recombinante

regin funcional de la proteina X

Figura 7-41 Dos estrategias p ara el estudio de la funcin de las protenas que utilizan ingeniera gentica. En la

eptopo aadido a la proteina X protena marcadora

1 1 r x i 1
\

regin funcional de la proteina X aadida a la protena marcadora ESTRATEGIA A: AADIR UNA FUNCIN A UNA PROTENA MARCADORA el estudio del efecto de la regin transferida sobre la protena marcadora perm ite determ inar la funcin de dicha regin

eptopo aadido a la proteina X ESTRATEGIA B: ELIMINAR UNA FUNCIN DE UNA PROTENA NORMAL la determ inacin del com portam iento del eptopo en la clula perm ite estudiar la funcin de la regin mutada de la protena

estrategia A, se aade una nueva funcin a una protena marcadora mediante su unin a un pequeo fragmento de la protena normal X. En la estrategia B, se realizan pequeas modificaciones a la protena normal X, y su comportamiento es seguido, a fin de compararlo con el de la protena normal, gracias a la deteccin de un pequeo eptopo aadido en uno de sus extremos. Ambas estrategias se han utilizado para analizar la estructura y la funcin de las seales de transporte al ncleo que se encuentran en las protenas nucleares (vase Captulo 12).

Sin embargo, no es posible transferir en forma de una secuencia corta de aminocidos todas las seales importantes que contienen las protenas, a una protena marcadora. Por ejemplo, la seal responsable del transporte al lisosoma desde el complejo de Golgi, de las enzimas lisosomales recin sintetizadas consiste en una regin seal, cuya formacin requiere que la enzima lisosomal se pliegue correctam ente de forma que zonas distantes en la secuencia queden localizadas prximas en el espacio. Para identificar estos casos se puede utilizar la estrategia de m areaje de eptopos. Tambin se ha de producir una protena de fusin, pero en este caso a la protena normal se le aade un pptido corto de 8 a 12 aminocidos (el eptopo) que es reconocido por un anticuerpo -d e ah su nombre. As, mediante el uso del anticuerpo anti-eptopo, es posible seguir las protenas de fusin en las clulas incluso en presencia de una gran cantidad de protena normal, siendo por tanto posible determinar el efecto sobre la locali zacin celular de cualquier alteracin de aminocidos en la protena de fusin (estrategia B en la Figura 7-41).

Los genes normales son fcilm ente reemplazables por imitantes, tanto en bacterias como en algunos eucariotas inferiores 35
A diferencia de los eucariotas superiores (que son pluricelulares y diploides), las bacterias, las levaduras y el hongo filamentoso Dictyostelium existen general mente como clulas individuales haploides. En estos organismos es posible substituir, con elevada frecuencia, un gen normal por otro introducido en forma de molcula de DNA artificial, mediante recombinacin homloga (vase pg. 281), de forma que es fcil producir clulas en las que el gen mutante substituya al gen normal (Figura 7-42A). De esta forma es posible que las clulas produzcan

Figura 7 -4 2 Reemplazamiento y adicin gnicos. Es posible reinsertar,

gen norm al X (A) REEMPLAZAMIENTO GNICO EL GEN MUTANTE REEMPLAZA EL GEN NORMAL

I I I crom osom a (B) ADICION GNICA

gen m utante X

EL GEN MUTANTE SE INSERTA EN UN NUEVO LUGAR DEL CROMOSOMA

slo es activo el gen m utante

i 1 ambos genes son activos

en los cromosomas de un organismo, un gen que ha sido alterado. En bacterias y en organismos haploides como la levadura, frecuentemente se reemplaza el gen normal, en un proceso denominado reemplazamiento gnico (A); en estos casos slo permanece en la clula el gen mutante. En los eucariotas superiores es ms frecuente el fenmeno de adicin gnica que el de reemplazamiento gnico; en esos casos la clula u organismo transformados contienen el gen mutado adems del gen normal.

Ingeniera de DNA

349

una forma alterada de la proteina o de la molcula de RNA en lugar de la forma normal de la molcula. Si el gen mutante es completamente inactivo y su pro ducto gnico realiza una funcin esencial, la clula morir; pero en aquellos ca sos en los que la mutacin sea menos severa, pueden usarse para reemplazar al gen normal, de forma que la clula mutante sobreviva, aunque el proceso para el que se requiere el gen sea anmalo. Con frecuencia el mutante de eleccin es uno que presente un producto sensible a la temperatura, que funcione normal m ente a una temperatura pero que se inactive cuando las clulas sean colocadas a una temperatura superior o inferior. La capacidad de realizar reemplazamientos gnicos en eucariotas superiores, unido a la potencia del anlisis gnico estndar en estos organismos haploides, es la causa que explica en gran parte por qu los estudios sobre estos organis mos han sido tan importantes para desentraar aquellos procesos que son co munes a todos los eucariotas. Los reemplazamientos gnicos son mucho menos frecuentes en eucariotas superiores por razones que an se desconocen.

Genes desarrollados por ingeniera gentica pueden crear m utaciones dom inantes especficas en los organismos diploides 36
Los eucariotas superiores, como los mamferos o la mosca del vinagre, son di ploides, es decir, tienen dos copias de cada cromosoma. Adems, la transfeccin con un gen modificado conduce generalmente a una adicin gnica ms que a un reemplazamientg gnico: el gen modificado se inserta en una posicin al azar en el genoma, de modo que la clula (o el organismo) acaba con un gen mutado adems de sus copias normales (Figura 7 -42B). Dado que en el caso de eucariotas superiores es mucho ms fcil obtener una adicin gnica que un reemplazamiento gnico, podra ser enormemente til el poder generar m u ta c io n e s d o m in a n te s n e g a tiv a s, de forma que un gen modificado fuera capaz de inactivar a sus copias normales en la clula. Una aproximacin ingeniosa y prometedora consigue este objetivo aprovechando la especificidad de la reaccin de hibridacin entre dos cadenas complementarias de cido nucleico. Normalmente slo se transcribe a RNA una de las dos hebras de una zona determinada de la doble hlice de DNA, siempre la misma para cada gen. Si m ediante la ingeniera gentica se fabrica un gen clonado de tal m a nera que slo se transcriba la hebra opuesta del DNA, el resultado ser un RNA a n tise n tid o que presentar una secuencia complementaria a la de los transcri tos de RNA normales. Cuando se sintetiza en cantidades suficientes, a menudo

gen norm al X

crom osom a

figura 7-43 Estrategia del RNA .uitisentido para obtener muanles jiegativos dominantes. Los genes rnutantes que se han construido de forma que se produzca RNA ntisentido, es decir la secuencia de I*NA complementaria a la producida jjor el gen normal X, pueden hacer que e forme RNA de doble cadena en el interior de la clula. Si se produce una ^ran cantidad de RNA antisentido, j>odr hibridar -e inactivar- una gran piarte del RNA normal del gen X. Ji pesar de que en el futudo es posible ue de esta forma se puedan inactivar ^enes en la actualidad ha dado buenos resultados con algunos genes
i

ADICION GNICA

gen X alterado para producir RNA antisentido

TRANSCRIPCION RNA norm al RNA antisentido

T
350 Captulo 7 : Tecnologa del DNA recombinante

doble hlice de RNA

LA FORMACIN DE UNA DOBLE HLICE RNA/RNA IMPIDE LA SNTESIS DE LA PROTENA PRODUCTO DEL GEN NORMAL X

n o con otros.

com plejo de proteina norm al

com plejo de proteina m utante

com plejo de protena norm al y m utante

ACTIVO

INACTIVO

INACTIVO

el RNA antisentido se hibridar con el RNA con sentido fabricado por los genes normales, inhibiendo as la sntesis de la protena correspondiente (Figura 7-43). Un mtodo similar consiste en sintetizar cortas molculas de cido nucleico por mtodos qumicos o enzimticos, e inyectarlas (o introducirlas de alguna otra forma) en la clula, bloqueando de nuevo (aunque slo temporalmente) la pro duccin de la protena correspondiente. Por razones desconocidas la aproximacin del RNA antisentido frecuente mente fracasa en la inactivacin del gen deseado. Una estrategia alternativa para obtener una mutacin dominante negativa se basa en el hecho de que muchas protenas actan como parte de grandes complejos proteicos. Para inactivar es tos complejos basta incluir en ellos un elemento no funcional. As pues, disean do un gen que produzca grandes cantidades de una protena mutante que sea inactiva pero que se una al complejo, es posible conseguir una clula en que todos los complejos sean inactivos a pesar de la presencia tanto de formas normales como imitantes de la protena (Figura 7-44). Si una protena es necesaria para la supervivencia de la clula (o del organis mo), un mutante dominante negativo morir, haciendo imposible analizar la funcin de la protena. Para evitar este problema, se puede acoplar el gen mutan te a secuencias de control que permitan la produccin de la protena mutante slo en ciertas condiciones -p or ejemplo, en respuesta a un incremento de tem peratura o a la presencia de molculas seal especficas. Aquellas clulas o orga nismos que contengan mutantes dominantes negativos inducibles pueden ser privados de la funcin de la protena normal en cualquier momento y estudiar el efecto producido. Es muy probable que en el futuro, las tcnicas para producir mutantes dominantes negativos para inactivar genes especficos sean utilizadas ampliamente para determinar las funciones de las protenas en los organismos superiores.

Figura 7 -44 Efecto dominante negativo de una proteina. En el ejemplo, un gen se modifica para producir una protena mutante que impida que las copias normales de la misma protena realicen su funcin. En este caso la protena normal ha de formar un com plejo de varias subunidades para ser activo, y la protena mutante bloquea la funcin, pues al unirse al com plejo lo hace inactivo. De esta forma una nica copia de un gen mutante localizado en cualquier parte del genoma puede inactivar los productos normales producidos por otras copias gnicas.

Genes sometidos a ingeniera gentica se pueden insertar de form a perm anente en la lnea germinal de un ratn o de la m osca del vinagre, produciendo animales transgnicos 37
La ltima prueba de la funcin de un gen alterado consiste en reinsertarlo en un organismo y estudiar qu efectos produce. Idealmente, parece que lo m ejor sera reemplazar el gen normal por el gen alterado, de forma que pueda analizarse la funcin de la protena mutante en ausencia de la protena normal. Como se ha descrito previamente, esto slo puede conseguirse plenam ente en el caso de algunos organismos haploides, pero en el caso de los eucariotas superiores, los fenm enos de integracin que conduzcan a un reemplazamiento de genes ocurren muy raramente. El DNA extrao puede, por el contrario, integrarse f cilm ente al azar en el genoma. Por ejemplo, en mamferos los fragmentos linea les de DNA introducidos son rpidamente unidos por sus extremos mediante enzimas celulares, formando largos tndems que normalmente son integrados en el crom osom a aleatoriamente. A este respecto, los oocitos fecundados de m a mfero se comportan como las dems clulas de mamfero. Un oocito de ratn al

Ingeniera de DNA

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RATN

DROSOPHILA

oocito fecundado [O

em brin tem prano

MICROINYECCION DEL GEN DE INTERS, EN FORMA DE DNA LINEAL, EN EL PRONCLEO MASCULINO em brin INTRODUCCIN DE VARIOS EMBRIONES DE ESTE TIPO EN UN RATN PSEUDOPREADO

MICROINYECCION DEL GEN DE INTERS INSERTADO EN LA SECUENCIA DE DNA DE UN ELEMENTO TRANSPONIBLE

Figura 7-45 Comparacin entre los procesos estndar utilizados para obtener ratones y Drosophila transgnicos. En estos ejemplos, el gen inyectado en el oocito del ratn da lugar a un cambio en el color de la piel mientras que el gen inyectado en el embrin de la mosca da lugar a un cambio de color en el ojo. En ambos organismos se ha encontrado que algunos de los animales transgnicos tienen insertos de DNA en ms de un lugar del cromosoma.

clulas germ inales prim ordiales ALGUNOS EMBRIONES SE CONVIERTEN EN MOSCAS CUYAS CLULAS GERMINALES CONTIENEN EL GEN DE INTERS

embrin normal

TRAS UNA BIOPSIA, SE ESTUDIA LA PRESENCIA DEL GEN EN LAS CLULAS SOMTICAS DE LOS DESCENDIENTES, Y EN LOS RATONES SELECCIONADOS QUE SE HAN CRUZADO, SE ESTUDIA LA PRESENCIA DEL GEN EN SUS CLULAS GERMINALES

TODAS LAS MOSCAS SUPERVIVIENTES SE CRUZAN PARA BUSCAR EL GEN EN LAS CLULAS GERMINALES
embrin to " transformado con

el yen f;s

I_________

200 iim

RATON TRANSGENICO copias del gen, ordenadas en tndem , se insertan al azar en un crom osom a de cada clula gen gen gen gen cadena de genes ordenados en tndem

DROSOPHILA TRANSGENICA una copia sencilla del gen se inserta al azar en un crom osom a de cada clula gen extrem os DNA del elem ento transponible
/ ------------------

que se le han inyectado 200 copias de una molcula lineal de DNA, probable mente dar lugar a un ratn que contendr en algn lugar aleatorio de uno de sus cromosomas un tndem de copias del gen inyectado (Figura 7-45). Si el cro mosoma modificado tam bin se halla presente en las clulas de la lnea germi nal (oocitos y espermatozoides), el ratn pasar a su descendencia los genes que ha adoptado: los animales que han sido alterados de forma permanente de esta manera se denominan o rg a n is m o s tra n s g n ic o s , y a los genes extraos, tr a n s g en es. Generalmente el gen normal tam bin est presente, por lo que slo se manifestarn los efectos dominantes de la modificacin. A pesar de ello, los ani males transgnicos han aportado informacin muy valiosa para entender cmo

Figura 7 -46 Rescate gentico. Comparacin entre una larva de D rosop h ila normal y dos larvas mutantes que contienen genes ftz defectuosos. Una de las larvas con un gen defectuoso iftz~) ha sido transformada mediante la inyeccin, en un huevo de uno de sus ancestros, de un clon de DNA que contiene el gen ftz de secuencia normal. Esta secuencia de DNA aadida se ha integrado de forma permanente en uno de los cromosom as de la mosca, de forma que se hereda y expresa fielmente. El gen ftz es necesario para el desarrollo normal de la mosca, y la adicin de este gen al genoma provoca la recuperacin de los segmentos de la larva, que haban desaparecido en el organismo ftz Para detalles de la tcnica utilizada para conseguir animales transgnicos, vase Figura 7-45. (Por cortesa de Walter Gehring.)

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Captulo 7 : Tecnologa del DNA recombinante

preparacin del gen m odificado por ingeniera gentica DNA clonado del gen diana
I

ELIMINAR LA REGIN CENTRAL Y REEMPLAZARLA " CON EL GEN neo

i

w m ~m
| AADIR EL GEN tk

el gen neo confiere el gen tk confiere resistencia a la droga X sensibilidad a la droga Y (A) fenm eno frecuente de recom binacin no hom ologa (B) fenm eno infrecuente de recom binacin hom ologa

CULTIVAR CLULAS EN PRESENCIA DE AM BAS DROGAS X E Y gen diana inactivado resistencia a' la droga X sensibilidad a la droga Y
___ J

, i ; ............

; . .i

resistencia a / la ausencia del gen tk la droga X confiere a la clulas resistencia a la droga Y LA CELULA SOBREVIVE

Figura 7-47 Inactivacin gnica selectiva por recom binacin homloga en el ratn. DNA clonado de ratn se modifica por ingeniera gentica de modo que se le inserta un gen bacteriano, denominado neo, que, tras integracin en un crom osom a de ratn, confiere a las clulas la resistencia a una droga (droga X) que en caso contrario resultara letal. En un extremo del DNA clonado de ratn se aade un gen vrico, el gen tk. La integracin de tk en un crom osom a de ratn hace sen sibles a las clulas a otra droga (droga Y). La mayor parte de las inserciones que tienen lugar en el crom osom a son al azar, y casi siempre incluyen am bos extremos del DNA modificado (A). Si se seleccionan las clulas, poco frecuentes, capaces de crecer en presencia de a m b a s drogas, se obtendrn colonias de clulas en las que se ha incorporado, por recom binacin homloga, el centro del DNA modificado sin los extremos; muchas de estas clulas mostrarn un reemplazamiento gnico similar al mostrado en (B).

LA CELULA MUERE

se regulan los genes de mamfero y cmo ciertos genes (denominados oncoge nes) producen cncer. Tam bin es posible producir moscas del vinagre transgnicas, en las que co pias nicas de un gen se han insertado al azar en el genoma de Drosophila. En este caso la estrategia consiste en insertar primero el fragmento de DNA entre las dos secuencias terminales de un elemento transponible particular de Dro sophila, denominado elemento P. Las secuencias terminales del elemento P le permiten integrarse en los cromosomas de Drosophila si la enzima transposasa del elemento P tam bin se halla presente (vase pg. 305). Por lo tanto, para ha cer moscas del vinagre transgnicas, el DNA adecuadamente modificado se in yecta en un embrin muy joven de la m osca del vinagre con un plsmido que contenga el gen que codifica la transposasa. Normalmente, cuando se hace esto y com o resultado del proceso de transposicin, el gen inyectado entra en la lnea germinal en forma de una copia nica (Figuras 7-45 y 7-46).

cerebro m edio

cerebelo

El direccionamiento gnico hace posible obtener ratones transgnicos que carecen de determinados genes38
Si se introduce una molcula de DNA que contiene un gen de ratn mutado en una clula de ratn, frecuentemente se inserta al azar en el cromosoma, pero una vez de cada mil, reemplazar una de las dos copias del gen normal por re com binacin homologa. Aprovechando estos fenmenos infrecuentes de direc cionam iento gnico (gene targeting) es posible inactivar cualquier gen en una clula de ratn por reemplazamiento gnico. Este mtodo se completa con el proceso en dos etapas que se describe a continuacin, permitiendo la obtencin de un ratn con un gen defectuoso. En primer lugar, el fragmento de DNA que contiene el gen mutante deseado (o parte del gen) se transfecta en una lnea especial de clulas germinales pluriFigura 7 -48 Ratn transgnico en que se han eliminado, por recom binacin homloga, am bas copias de un gen del factor de crecim iento Wnt-1. (A) Seccin de cerebro de un embrin normal. (B) Seccin de cerebro de un embrin mutante, que carece de cerebelo y de la mayor parte del cerebro medio, y morir in tero. (Fotografas cortesa de Mario Capecchi.)

Ingeniera de DNA

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discos tom ados de hoja de tabaco

discos de hoja incubados con Agrobacteria m odificada por ingeniera gentica durante 24 h.

callos

el m edio selectivo slo perm ite proliferar a las clulas vegetales que han adquirido el DNA de la bacteria

tallos m edio inductor de tallos crecim iento de la plntula enraizada planta adulta que porta el transgn que estaba originalm ente en la bacteria clula bacteriana clula vegetal

transgen de nteres plsm ido recom binante en A grobacterium

gen m arcador seleccionable

citoplasm a

Flgura 7 -49 Procedimiento utilizado para obtener una planta transgnica. (A) Esquema del proceso. Se corta un disco de una hoja y se cultiva en presencia de A grobacteria portadora de un plsmido que contiene tanto un marcador seleccionable com o el transgn deseado. Las clulas de la periferia del disco, heridas, secretan substancias que atraen A grobacteria, la cual les inyecta el DNA. Slo sobreviven aquellas clulas que expresan el marcador selectivo, es decir aquellas que han recibido el DNA adecuado, y formarn un callo. Manipulando los factores de crecim iento que recibe el callo se puede inducir la formacin de tallos que enraizarn y se desarrollarn dando lugar a una planta adulta portadora del transgn. (B) Preparacin del plsmido recom binante y su transferencia a la clula de la planta. Un plsmido de A grobacterium , portador de la secuencia de T-DNA se modifica para incluir un marcador seleccionable (por ejemplo, el gen de resistencia a kanamicina) y el transgn deseado, entre los 25 pares de bases repetidos del T-DNA. Cuando A grobacteriu m reconoce una clula vegetal, inyecta una cadena de DNA en ef citoplasma de la clula utilizando el mecanismo que normalm ente transfiere la secuencia de T-DNA.

repeticiones de 25 pares de nucletidos del T-DNA

crom osom a vegetal

(B)

EL DNA SE EXTRAE DEL PLSMIDO EN FORMA LINEAL Y SE TRANSFIERE DIRECTAMENTE A LA CLULA VEGETAL, DONDE SE INTEGRAR EN EL CROMOSOMA VEGETAL

potentes derivadas del embrin (denominadas clulas madre embrionarias o c lulas ES -d e Embrionic Stem Cells), que crecen en cultivo celular. Tras un pero do de proliferacin celular, las escasas colonias de clulas en las que se ha podi do producir un reemplazamiento gnico, se aslan mediante doble seleccin con drogas (Figura 7-47). De entre ellas se identifican las colonias correctas median te PCR o transferencia Southern: contendrn secuencias de DNA recombinante en las que el fragmento insertado ha reemplazado todo o parte de una copia del gen normal. En la segunda etapa, clulas individuales de la colonia identificada se recogen con una micropipeta y se inyectan en un embrin temprano de ra tn. Las clulas madre embrionarias transfectadas colaboran con las clulas del embrin husped para formar el ratn de apariencia normal (vase Figura 2132); una gran parte de estos animales quimricos, incluyendo en casos favora bles clulas de la lnea germinal, proceden de las clulas madre modificadas arti-

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Captulo 7 : Tecnologa del DNA recombinante

ficialmente. Estos animales se cruzan para obtener machos y hembras, cada uno de los cuales son heterocigotos para el reemplazamiento gnico (es decir, tienen una copia normal y una copia mutante del gen). Cuando se cruzan estos dos ra tones, una cuarta parte de su descendencia debe ser homocigota respecto al gen modificado. El estudio de estos homocigotos permite examinar la funcin del gen modificado en ausencia del gen normal. La capacidad de preparar ratones transgnicos que carecen de un gen normal conocido ha sido un gran avance, y actualmente esta tcnica se utiliza ampliamente para analizar las funciones de diversos genes de mamfero (Figu ra 7-48).

Las plantas transgnicas son importantes tanto para la biologa celular como para la agricultura 39
Cuando una planta sufre un dao en muchos casos puede reparar el dao m e diante un proceso por el cual clulas diferenciadas se desdiferencian, proliferan y rediferencian en otros tipos celulares. En algunos casos las clulas desdife renciadas pueden llegar a formar un meristemo apical, que puede generar una planta completamente nueva, incluyendo los gametos. Esta notable plasticidad de las clulas vegetales puede ser utilizada para generar plantas transgnicas a partir de clulas cultivadas. Cuando se cultiva un trozo de tejido de una planta en un medio estril que contiene nutrientes y factores de crecimiento adecuados, muchas de las clulas son estimuladas a crecer indefinidamente de una forma desorganizada, produ ciendo una masa de clulas relativamente indiferenciadas denominada callo. Si se manipulan adecuadamente los nutrientes y los reguladores del crecimiento, es posible inducir la formacin de meristemos apicales y radiculares en el callo, pudiendo, en muchas especies, regenerar la planta completa. Los cultivos de callos se pueden disociar tambin m ecnicam ente en clulas aisladas, que crecern y se dividirn como un cultivo en suspensin. En un gran nmero de plantas -en tre las que se incluyen el tabaco, la petunia, la zanahoria, la patata y Arabidopsis- a partir de clulas aisladas se pueden obtener pequeos grupos de clulas (un clon), a partir de los cuales se puede regenerar una planta completa. Del mismo modo que se puede obtener un ratn transgnico por m a nipulacin gentica de clulas embrionarias en cultivo, pueden obtenerse plan tas transgnicas a partir de clulas vegetales aisladas cultivadas, transfectadas con DNA (Figura 7-49). La capacidad de producir plantas transgnicas ha acelerado el progreso en muchas reas de la biologa celular vegetal. Ha jugado un papel importante, por ejemplo, en el aislamiento de receptores para los reguladores del crecimiento y en el anlisis de los mecanismos de morfognesis y de expresin gnica en plan tas. Ha abierto nuevas posibilidades en agricultura que pueden beneficiar tanto al agricultor como al consumidor. Ha hecho posible, por ejemplo, modificar el contenido de lpidos, almidn y protenas de reserva almacenadas en las sem i llas, aumentar la resistencia de las plantas a plagas y virus, y crear plantas modi ficadas que toleran hbitats extremos como mrgenes de concentracin de sal o suelos encharcados. La mayor parte de los avances en la comprensin del desarrollo animal pro cede de estudios sobre la mosca del vinagre Drosophila y del nemtodo Caenorhabditis elegans, que son abordables para el anlisis gentico extensivo as como para la manipulacin experimental. Los progresos en la biologa del desarrollo de las plantas han sido mucho ms lentos comparativamente. La mayor parte de los organismos que se han encontrado ms adecuados para el anlisis gentico tie nen ciclos vitales largos y genomas enormes, lo cual ha hecho de su estudio gen tico clsico y molecular una labor que requiere mucho tiempo y esfuerzo. Por ello se ha dedicado especial atencin a una planta pequea de crecimiento rpi do, Arabidopsis thaliana, que tiene grandes ventajas para ser escogida como planta modelo (vase Figura 21-93).

Ingeniera de DNA

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Resumen
La tecnologa del DNA recombinante ha revolucionado el estudio de la clula. Las tcnicas de ingeniera del DNA pueden utilizarse para crear cualquier gen mutante e insertarlo en el cromosoma de las clulas, de forma que pase a ser una parte per manente del genoma. Si la clula utilizada para esta transferencia de genes es un huevo fecundado (para un animal) o una clula vegetal totipotente en cultivo, se obtendrn organismos transgnicos que expresarn el gen mutante y lo pasarn a su progenie. Es especialmente importante para el bilogo celular la posibilidad que proporciona esta tecnologa de alterar clulas de manera especfica -permitiendo discernir el efecto que tiene sobre una clula el cambio de una sola proteina que ha sido mutada intencionadamente por tcnicas de gentica inversa. Las consecuencias prcticas de la tecnologa del DNA recombinante tambin abarcan otras posibilidades. Se pueden utilizar las bacterias, las levaduras o inclu so clulas de mamfero para, mediante ingeniera gentica, producir una protena en grandes cantidades, lo cual hace posible analizar en detalle la estructura y la Juncin de esta protena, o utilizar la protena como una vacuna o como un frm a co con finalidad mdica.

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Captulo 7 : Tecnologa del DNA recombinante

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358

Capitulo 7 : Tecnologia del DNA recombinante

El ncleo celular
n .

ii

m ,

t-'t

* ~

El DNA cromosmico y su empaquetamiento La estructura global de los cromosomas Replicacin del cromosoma Sntesis v procesamiento del RNA Organizacin y evolucin del genoma nuclear

El DNA de una clula eucariota se halla confinado en el ncleo, que ocupa alre dedor del 10% del volumen celular. El ncleo est delimitado por una envoltura nuclear formada por dos membranas concntricas. Estas membranas estn per foradas a intervalos por poros nucleares, a travs de los cuales se produce el transporte activo de determinadas molculas entre el ncleo y el citoplasma. La envoltura nuclear est conectada directamente con la membrana del retculo endoplsmico y se mantiene por dos redes de filamentos intermedios: una de nominada lmina nuclear, formada por una fina lmina que recubre la m em brana nuclear interna, mientras que la otra, organizada de forma m enos regular, rodea la mem brana nuclear externa (Figura 8-1) Como ocurre con los procariotas actuales, muy probablemente los ances tros de las clulas eucariotas carecan de ncleo; slo podemos especular por qu apareci durante la evolucin un compartimiento nuclear separado, que asla al DNA de la actividad del citoplasma. Dos caractersticas especiales de las clulas eucariotas nos sugieren posibles explicaciones. Una de ellas es la existen cia del citoesqueleto, compuesto principalmente por microtbulos y filamentos de actina, responsable del movimiento de la clula. Las bacterias, cuyo DNA se encuentra en contacto directo con el citoplasma, carecen de dichos filamentos y

DNA y protenas asociadas (crom atina) retculo endoplasm tico nuclolo

centrosom a filam entos interm edios m icrotbulos

poro nuclear

lm ina nuclear m em brana nuclear externa envoltura nuclear mem brana nuclear interna

18-1 Seccin transversal de un a celular tpico. La envoltura ir est formada por dos ranas de las cuales la exterior es iua con la membrana del retculo lasmtico (vase tambin Figura Las bicapas lipdicas de las ranas nucleares interna y ia estn asociadas en los poros ires. Dos redes de filamentos edios [verde) proporcionan te mecnico a la envoltura ir; los filamentos del interior del ) forman una fina lmina ir. El espacio interior del retculo ilasmtico (lumen del ER) se ha ado en amarillo.

359

se desplazan m ediante estructuras externas como los flagelos. Por ello, una de las funciones de la envoltura nuclear de los eucariotas podra ser la de proteger las largas y frgiles molculas de DNA de las fuerzas mecnicas generadas por los filamentos citoplasmticos. U na segunda caracterstica diferencial de las clulas eucariotas es la existen cia de un procesamiento del RNA previo a su traduccin a protena. En las clu las procariotas la sntesis del RNA (transcripcin) y la sntesis de protenas (tra duccin ) tienen lugar simultneamente: los ribosomas traducen el extremo 5 de la molcula de RNA mientras todava se est transcribiendo su extremo 3 . Por ello existen pocas oportunidades de modificar el RNA antes de ser traducido a protena. En eucariotas, por el contrario, la transcripcin (nuclear) est separada tanto temporal com o espacialmente de la traduccin (citoplasmtica). Los transcritos de RNA en el ncleo se empaquetan inmediatamente en complejos ribonucleoproteicos y son sometidos al proceso de maduracin ( splicing ) del RNA, en el cual se eliminan algunas zonas de la secuencia de nucletidos. Las protenas de em paquetamiento se desprenden cuando ha finalizado la madura cin del RNA, y ste es transportado desde el ncleo al citosol, donde los riboso mas empiezan a traducir el RNA a protena (vase Figura 8-2). Tal como se ver ms adelante, el proceso de maduracin del RNA es una etapa intermedia im portante en la transmisin de informacin gentica en eucariotas. Para la clula supone un cierto nmero de ventajas, incluyendo la capacidad de permitir que un mismo gen codifique ms de una protena. Todo ello podra ayudar a explicar por qu las clulas eucariotas tienen un ncleo en el que se puede desarrollar la maduracin del RNA en ausencia de interferencias por parte de los ribosomas (Figura 8-3). En este captulo se describir cmo las protenas empaquetan el DNA en cromosomas, cm o stos se pliegan y se organizan en el ncleo, y cmo se repli can durante cada ciclo de divisin celular. Posteriormente se discutir la sntesis y el procesam iento de RNA, y finalmente se describir cmo se organiza la infor m acin en el genoma eucariota, y cm o se ha alcanzado dicha organizacin du rante la evolucin. La envoltura nuclear se analiza en detalle en el Captulo 12 en relacin con el transporte selectivo de macromolculas desde y hacia el ncleo. All tam bin se presenta un esquema hipottico de cmo podra haber evolucio nado el compartimiento nuclear (vase Figura 12-5).

m em brana plasmtica

NCLEO

TRANSCRIP CIN DEL DNA RNA

V
r\ M a

,1

MADURACIN POR CORTE Y EMPALME DEL,

TRANSPORTE DELRNA TRADUCCIN DEL RNA MENSAJERO

Figura 8-2 Sntesis de protenas (DNA RNA >protena) en eucariotas. Las

clulas eucariotas han desarrollado numerosos compartimientos rodeados de membrana que separan los diferentes grupos de reacciones enzimticas, lo que las hace ms eficientes. El ncleo es uno de estos compartimientos. La envoltura nuclear mantiene a los ribosomas funcionales fuera del ncleo, evitando que los transcritos de RNA sean traducidos a protenas, hasta que hayan sido procesados extensamente y transportados al exterior del ncleo, al citosol. As pues, las etapas de maduracin y de transporte del RNA se interponen entre la transcripcin del DNA y la traduccin del RNA.

Figura 8-3 La envoltura nuclear m antiene el com partim iento nuclear libre de orgnulos citoplasmticos.

2| im 360 Captulo 8 : El ncleo celular

Esta imagen obtenida con el microscopio electrnico muestra una seccin ultrafina de un huevo de erizo de mar, con un ncleo contrastado de una forma extraordinariamente uniforme y un citoplasma densamente lleno de orgnulos. (Por cortesa de David Begg y Tim Hunt.)

El DNA cromosmico y su empaquetamiento1

Durante los primeros 40 aos de este siglo los bilogos descartaban la posibili dad de que el DNA de los cromosomas eucariotas contuviera la informacin ge ntica, debido fundamentalmente a que crean que los cidos nucleicos estaban formados nicamente por una secuencia repetida de cuatro nucletidos (tal como AGCTAGCTAGCT...). Sin embargo, actualmente sabemos que una m ol cula de DNA es un polmero lineal extraordinariamente largo y no ramificado, que contiene muchos millones de nucletidos organizados siguiendo una se cuencia regular pero no al azar, y que la informacin gentica de una clula est contenida en el orden lineal de los nucletidos de su DNA. El cdigo gentico est escrito con palabras de tres nucletidos (codones, cada uno de los cuales especifica un aminocido, como se describe en Captulo 6) que solventan el pro blema de acumular una gran cantidad de informacin gentica en un reducido espacio: cada milln de letras (nucletidos) ocupa una distancia lineal de slo 3.4 x 105 nm (0,034 cm) y un volumen de alrededor de 106 nm3 (10~1 5 cm 3). Cada molcula de DNA se empaqueta en un c ro m o s o m a ; el total de infor macin gentica contenida en los cromosomas de un organismo constituye su g e n o m a . El genoma de la bacteria E. coli est formado por 4,7 x 106 parejas de nucletidos de DNA, en una nica molcula de DNA de doble hlice (un crom o soma). Por el contrario, el genoma humano est formado por 3 x 109 parejas de nucletidos, en 24 cromosomas (22 autosomas diferentes y 2 cromosomas se xuales diferentes), es decir est formado por 24 molculas de DNA distintas -cad a una de las cuales contiene entre 50 x 106 y 250 x 106 pares de bases de DNA. Las molculas de DNA de ese tamao tienen una longitud de entre 1,7 y 8.5 cm cuando estn desenrolladas, y una vez se han eliminado las protenas crom osm icas pueden romperse debido al menor efecto mecnico. En los organismos diploides, como nosotros mismos, existen dos copias de cada tipo de cromosoma, uno heredado de la madre y el otro procedente del pa dre (con la excepcin de los cromosomas sexuales en los machos, en los que el crom osom a Y procede del padre y el X de la madre). As, una clula humana tpi ca contiene 46 cromosomas y 6 x 109 parejas de nucletidos de DNA. Otros ma mferos presentan genomas de un tamao similar a ste. Tericamente, esta cantidad de DNA se podra empaquetar en un cubo de 1,9 |m de lado. A efectos comparativos, 6 x 109 letras en este libro podran ocupar ms de un milln de pginas, y sera necesario un espacio unas 101 7veces mayor. En esta seccin se considerarn las relaciones que existen entre las m olcu las de DNA, los genes y los cromosomas, analizando cmo se pliega el DNA for mando una estructura com pacta y ordenada -e l crom osom a- que an as per mite el acceso a su informacin gentica. Es importante recordar que los cromosomas de una clula cambian su estructura y actividad en funcin de la fase del ciclo celular: en mitosis, o fase M, se encuentran muy condensados y son transcripcionalmente inactivos; en la otra fase, mucho ms larga, del ciclo celu lar, denominada interfase, estn mucho menos condensados y son activos diri giendo continuam ente la sntesis de RNA.

Cada molcula de DNA que form a un cromosom a ha de contener un centrmero, dos telmeros y varios orgenes de replicacin 2
Para que una molcula de DNA forme un cromosoma funcional debe ser capaz de algo ms que de dirigir la sntesis de RNA: ha de ser capaz de propagarse, transmitindose eficazmente de una generacin a la siguiente. Ello requiere tres tipos de secuencias especializadas en el DNA, cada una de las cuales sirve para unir las protenas que guan los mecanismos de replicacin y la segregacin de los cromosomas. Estudiando levaduras, cuyos cromosomas de pequeo tamao son sencillos de manipular con los mtodos del DNA recombinante, se han po dido identificar las secuencias de DNA mnimas necesarias para estas funciones. Se han identificado dos de los tres elementos anteriores estudiando pequeas

El DNA cromosmico y su empaquetamiento

361

molculas de DNA circular que se pueden replicar como plsmidos en clulas de la levadura Saccharomyces cereuisiae. Para poderse replicar, estas molculas necesitan una secuencia de nucletidos especfica que acta como o rig e n de re p lic a c i n d el DNA; como se ver ms adelante, es posible identificar los nu merosos orgenes de replicacin presentes en cada cromosoma de levadura por la capacidad que confieren a una molcula de DNA que contenga uno de ellos, de replicarse independientemente del crom osoma husped. Un segundo ele mento de secuencia denominado c e n tr m e r o es el responsable de unir la m ol cula de DNA que lo contiene al huso mittico durante la divisin celular. Cada uno de los cromosomas de levadura contiene un solo centrmero. Cuando esta secuencia se inserta en un plsmido, asegura que cuando la clula se divida, cada una de las clulas hijas recibir una de las dos rplicas de la molcula de DNA del plsmido recin duplicado. El tercer elem ento imprescindible es el te l m e ro ; es necesario que exista uno de ellos en cada extremo del cromosoma lineal. Si un cromosoma circular que contenga un centrm ero y un origen de replicacin se rompe en un punto, de forma que aparecen dos extremos de DNA libres, contina teniendo la capa cidad de duplicarse y de unirse al huso mittico, pero puede llegar a perderse en las clulas de la progenie. Ello es debido a que la replicacin de ambas cadenas en la horquilla de replicacin requiere la presencia de una secuencia adyacente a la secuencia a replicar que acte de molde para un cebador de RNA (vase Fi gura 6-44). Dado que nunca podr haber un patrn de este tipo para los ltimos nucletidos de una molcula de DNA lineal, sern necesarios mecanismos espe ciales para impedir que en cada ciclo celular estas hebras de DNA se vayan acor tando. Este problema de la replicacin del extrem o, lo han resuelto las bacte rias y muchos virus teniendo como cromosoma una molcula circular de DNA. Las clulas eucariotas han desarrollado una secuencia telomrica especial situa da en los extremos de cada cromosoma. Esta secuencia repetida sencilla es am plificada peridicamente por una enzima especial, denominada telomerasa, lo cual com pensa la prdida de algunos nucletidos del DNA telomrico que se produce en cada ciclo celular y permite que el cromosoma lineal se replique completamente. En la Figura 8-4 se resumen las funciones de los tres elementos de secuencia del DNA que son necesarios para que un cromosoma lineal de levadura se trans mita ntegro de generacin en generacin. Estos elementos de secuencia son re lativamente cortos (tpicamente menos de 1000 pares de bases cada uno) y por ello solamente utilizan una pequea fraccin de la capacidad de almacenar in formacin del cromosoma. Son los tres mismos tipos de elementos que al pare cer son necesarios para mantener un crom osoma en las clulas humanas, a pe-

secuencia^ telom rica secuencia del origen de replicacin

Gi

RI

91

G II

secuencia _ centrom rica

11

li

II

li

II

burbuja de replicacin
362 Captulo 8 : El ncleo celular

cinetocoro

crom osom as hijos en clulas separadas

Figura 8-4 Funciones de las tres secuencias de DNA necesarias para producir un crom osom a eucariota lineal estable. Cada crom osom a tiene muchos orgenes de replicacin, un centrmero y dos telmeros. El centrmero mantiene unidas las dos copias del cromosom a y las une -a travs de un com plejo de protenas denominado cinetocoro- al huso mittico, de forma que durante la mitosis se distribuye una copia a cada clula hija. En la parte superior de los diagramas se indican las fases del ciclo celular correspondientes a las diferentes fases de replicacin y segregacin del cromosoma.

VECTOR CROMOSOMICO ARTIFICIAL DE LEVADURA A ORI CEN t * S , EcoR1

DNA HUMANO

BamH1 BamH1 DIGESTION CON Bam HI Y EcoR1

brazo izquierdo

brazo derecho

fragm entos crom osm icos grandes

Figura 8-5 Construccin de un crom osom a artificial de levadura (YAC, de yeast artificial chrom osom e). Un vector YAC permite el clonaje de molculas de DNA de gran tamao. TEL, CEN y ORI son respectivamente las secuencias del telmero, centrm ero y del origen de replicacin de DNA de la levadura Saccharom yces cerevisiae. Bam HI y EcoRl son las nucleasas de restriccin que cortan la doble hlice de DNA. Las secuencias denominadas A y B codifican enzimas que se utilizan como marcadores que se pueden seleccionar para permitir el aislamiento rpido de las clulas de levadura transformadas portadoras de un crom osom a artificial. (Adaptado de D.T. Burke, G.F. Carie y M.V. Olson. Science 2 3 6 : 806-812, 1987. 1987 AAAS.)

Jl________ : _________________ II_________________ I

5,6 x 103 pares de nucletidos

hasta 106 pares de nucletidos 3,9 x 103 pares de nucletidos

CROMOSOMA ARTIFICIAL DE LEVADURA CON DNA HUMANO INSERTADO

sar de que hasta el momento en el hombre slo se han caracterizado bien las se cuencias telomricas. Aunque la versin de levadura de dichas secuencias no es funcional en clulas de eucariotas superiores, los mtodos de DNA recombinante han permitido unir los elementos de secuencia de levadura a molculas de DNA humano, que entonces pueden replicarse en clulas de levadura como cro m osom as artificiales. De esta forma se pueden utilizar clulas de levadura para preparar libreras de DNA genmico humano (vase pg. 339) en las que cada clon DNA (propagado como un cromosoma artificial) puede contener alrededor de 1 milln de pares de bases de secuencia de DNA humano (Figura 8-5).

La mayor parte del DNA cromosm ico no codifica protenas esenciales ni RNA3
Parece que en los genomas de los organismos superiores existe un gran exceso de DNA. Desde mucho tiempo antes de que fuera posible examinar directamen te la secuencias de nucletidos del DNA fue evidente que las cantidades relativas de DNA del genoma haploide de diferentes organismos no estaban sistem tica mente relacionadas con la complejidad del organismo. Las clulas humanas, por ejemplo, contienen alrededor de 700 veces ms DNA que la bacteria E. coli mientras que algunos anfibios y clulas de plantas contienen 30 veces ms DNA que las clulas humanas (vase Figura 8-6). Adems el contenido de DNA de los genomas de diferentes especies de anfibios puede variar hasta 100 veces. Los genetistas de poblaciones intentaron estimar qu cantidad del DNA de los organismos superiores codifica protenas esenciales o molculas de RNA, b a sndose en la siguiente aproximacin indirecta. Cualquier gen est, inevitable mente, sometido a un riesgo de mutacin -u n fenmeno accidental que altera, al azar, determinados nucletidos. Mientras mayor sea el nmero de genes de un organismo tanto mayor ser la probabilidad de que se produzca una muta cin en al m enos uno de ellos. Debido a que muchas mutaciones destruyen la funcin del gen en el que se producen, la tasa de mutacin fija un lmite del n mero de genes esenciales de los que cualquier organismo puede depender para

El DNA cromosmico y su empaquetamiento

363

m icoplasm a BACTERIAS 1

E. co li levadura h o n g o s km m m m m PLANTAS
in s e c t o s

D rosophila

guisante azucena I I

MOLUSCOS

tiburn PECES CARTILAGINOSOS f l l f i i f i tritn

t e le s t e o s m m m m im m m m rana
a n f ib io s

Figura 8 -6 No existe relacin entre la cantidad de DNA y la complejidad del organismo. La cantidad de DNA del genoma haploide vara en un rango de 100 000 veces desde el procariota de menor tamao -e l m icoplasm a- a las clulas ms voluminosas de algunas plantas y anfibios. Es de destacar que el tamao del genoma humano (3 x 109 pares de nucletidos) es mucho menor que el de muchos organismos que parecen ser ms sencillos.

REPTILES ^ PJAROS hum ano MAMFEROS l

I Mi l !

105

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106

I I I ! I I

nm ero de pares de nucletidos por genom a haploide

107

I NI !

108

109

I I f i I l

101 0

i"" i I ' I ! II

101 1

su supervivencia: si son demasiados, el desastre es casi seguro, como sera el caso de una com pleja mquina que dependiera de muchos componentes que pueden fallar. Con este argumento y con la velocidad de mutacin observada se concluye que slo un pequeo porcentaje del genoma de los mamferos est im plicado en la regulacin o codificacin de protenas esenciales. Posteriormente veremos que esta conclusin est apoyada por otras evidencias. La consecuencia ms importante de la argumentacin anterior es que, aun que el genoma de mamfero contiene en principio una cantidad de DNA sufi ciente para codificar alrededor de 3 millones de protenas de tamao medio (3 x 109 nucletidos), la fidelidad limitada con la que se mantienen las secuencias de DNA implica que ningn mamfero (ni cualquier otro organismo) puede estar formado por ms de unas 60 000 protenas esenciales. As pues, desde el punto de vista gentico, los humanos no pueden ser ms de 10 veces ms complejos que la mosca del vinagre Drosophila, de la que se ha estimado que tiene unos 5000 genes esenciales. Cualquiera que sea la misin del DNA no esencial que se halla presente en los crom osom as de los organismos superiores (se discutir ms adelante), los datos que se muestran en la Figura 8-6 dejan claro que, para una clula, el pre sentar una gran cantidad de DNA extra no representa ninguna limitacin impor tante. Ms an, frecuentem ente las regiones codificantes esenciales estn inte rrumpidas por largas secuencias de DNA no codificante.

Cada gen produce una molcula de RNA4

La funcin primaria del genoma es codificar molculas de RNA. Regiones selec cionadas de la secuencia de nucletidos de DNA son copiadas en forma de se cuencias complementarias de RNA, el cual o bien codifica una protena (si es mRNA), o forma un RNA "estructural, como las molculas de RNA de transpor te (tRNA) o de RNA ribosomal (rRNA). Cada regin de la hlice de DNA que pro duce una molcula de RNA funcional constituye un gen. En los eucariotas superiores son habituales los genes de ms de 100 000 pa res de nucletidos, y algunos contienen ms de 2 millones de pares de nucleti dos (Tabla 8-1); sin embargo, para codificar una protena de tamao medio (for mada por 300 o 400 aminocidos) solamente son necesarios 1000 pares de bases. La mayor parte del DNA extra est formado por largas secuencias de DNA no codificante interrumpidas por fragmentos relativamente cortos de DNA codi-

364

Captulo 8 : El ncleo celular

Tabla 8-1 Tamao de algunos genes humanos en miles de nucletidos Tamao del gen P-globina Insulina Proteina quinasa C Albmina Catalasa Receptor LDL Factor VIII Tiroglobulina Distrofina* 1,5 1,7 11 25 34 45 186 300 ms de 2000 Tamao del mRNA 0,6 0,4 1,4 2,1 1,6 5,5 9 8,7 17 Nmero de intrones 2 2 7 14 12 17 25 36 ms de 50

* Una forma anmala de este gen causa la distrofia muscular de Duchenne. El tamao del gen especificado corresponde tanto a la regin que se transcribe como a las re giones de DNA reguladoras prximas (compilado de datos suministrados por Victor McKusick).

ficante. Las secuencias codificantes se denominan exones y las secuencias inter medias (no codificantes) se denominan intrones. Durante el proceso de conver sin de las molculas de RNA (transcritas desde un gen y por ello denominadas transcritos primarios de RNA), a molculas de mRNA, se eliminan las secuencias intrnicas (vase Figura 8-2); este proceso se denomina maduracin del RNA (RNA splicing), que se discutir ms adelante. Los grandes genes estn formados por una larga secuencia de exones e in trones alternos; la mayor parte del gen est formado por secuencias intrnicas. Adems, cada gen contiene secuencias reguladoras que son responsables de ase gurar que el gen se transcribe en el momento y en el tipo celular adecuado. En el Captulo 9 se discutir el funcionamiento de dichas secuencias reguladoras. Mu chas secuencias reguladoras se encuentran localizadas por delante (upstream, en direccin 5 ) del lugar donde se inicia la transcripcin del RNA, pero tambin se pueden localizar por debajo, (downstream, en direccin 3 ) del lugar donde finaliza la transcripcin del RNA, o incluso en los intrones y exones. En la Figura 8-7 se ilustra esquem ticam ente un cromosoma tpico de vertebrados, y se deta lla la organizacin de uno de sus muchos genes.
Figura 8-7 Organizacin de los genes en un crom osom a tpico de vertebrado. Unas protenas que se unen a las regiones reguladoras del DNA condicionan que un determinado gen se transcriba o no; aunque en el esquema se han representado las secuencias reguladoras en direccin 5 del gen, tambin pueden localizarse en el interior de los intrones, en los exones o en la regin situada en direccin 3 del gen. Las secuencias de los intrones son eliminadas del transcrito primario de RNA que codifica una protena, producindose una molcula de RNA m ensajero (mRNA). Los valores que se indican en la figura acerca del nmero de genes por cromosom a son una estima mnima.

crom osom a de 1,5 x 108 pares de nucletidos; contiene aproxim adam ente 3000 genes JL 1 0,5% del cromosoma; contiene 15 genes 1 H 1 II I 1 1

J
l 1 1 regin de DNA reguladora 1 1 1 I I I 1 1

L_
" '1 1 1 1 1 1 1 JL I l . 1 II 1 ..... 1

un gen de 105 pares de nucletidos

exon TRANSCRIPCIN DEL DNA

| \

transcrito prim ario de RNA

MADURACIN DEL RNA mRNA

secuencia intrnica secuencia exnica

El DNA cromosmico y su empaquetamiento

365

La com paracin entre secuencias de DNA de organismos relacionados perm ite diferenciar entre regiones de DNA de secuencia conservada y no conservada 5
Las m ejoras tcnicas en la determinacin de la secuencia de nucletidos de lar gas cadenas de DNA permiten esperar que en un plazo no muy largo se podr disponer de la secuencia completa de los 3 x 109 nucletidos del genoma huma no. Como el 90% de esta secuencia no es importante puede ser crucial disponer de algn medio para identificar la pequea proporcin de secuencia que s lo es. Una aproximacin al problema se basa en la observacin de que las secuencias importantes han sido conservadas durante la evolucin, mientras que las no im portantes son libres de mutar al azar. La estrategia, entonces, sera comparar las secuencias humanas con aquellas regiones homologas de genomas relaciona dos, como por ejemplo el de ratn. Se cree que los seres humanos y los ratones divergieron a partir de un ancestro comn hace alrededor de 80 x 106 aos, tiem po suficiente para que se hayan producido por mutaciones aleatorias el cambio de aproximadamente dos de cada tres nucletidos. De este modo las nicas re giones que se habran mantenido similares en ambos organismos (regiones con servadas) seran aquellas en las que una mutacin producira la prdida de una funcin importante, haciendo que los animales que la portaran estuvieran en desventaja y fueran eliminados de la poblacin por seleccin natural. As pues, en general, las regiones no conservadas representan DNA no codificante -tanto entre genes com o entre secuencias intrnicas- cuya secuencia no es crtica para ninguna funcin, mientras que las regiones conservadas representan exones funcionalmente importantes y regiones reguladoras. El estudio comparativo de las secuencias de DNA revela los resultados de un largo experimento natural, y permite detectar las regiones de mayor inters de los genomas. Los resultados obtenidos apoyan la conclusin de que solamente el 10% de las secuencias del genoma de vertebrados son vitales para el organismo.

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Las histonas son las principales protenas estructurales en los crom osom as eucariotas 6
Si un crom osom a estuviera formado nicamente por DNA extendido, sera dif cil de imaginar cmo se podra replicar o segregar entre clulas hijas sin ser da ado severamente. De hecho, el DNA de todos los cromosomas se encuentra empaquetado en una estructura muy com pacta con la ayuda de protenas espe cializadas. Tradicionalmente las protenas de los eucariotas que se unen al DNA se clsifican en dos grupos: las histonas y las protenas cromosmicas no-histonas. El com plejo formado por el DNA crom osm ico y las dos clases de protenas se denomina crom atina. Las histonas estn presentes en grandes cantidades (al rededor de 60 millones de molculas de cada tipo por clula, en comparacin con las aproximadamente 10 000 molculas por clula de cada una de las prote na de unin al DNA) de forma que en la cromatina la masa total de histonas es aproximadamente igual a la de DNA. Las histonas son protenas relativamente pequeas, con una proporcin muy elevada de aminocidos cargados positivamente (lisina y arginina). La car ga positiva ayuda a las histonas a unirse firmemente al DNA, el cual est muy cargado negativamente, independientemente de su secuencia de nucletidos. Es probable que las histonas no se disocien casi nunca del DNA; parece que deben influir sobre cualquier reaccin que se produzca en los cromosomas. Los cinco tipos de histonas de las clulas eucariotas se clasifican en dos gru pos principales -la s histonas nucleosmicas y las histonas Hl. Las histonas nucleosmicas son pequeas protenas (102-135 aminocidos) responsables del plegado del DNA en los nucleosomas, como se discute ms adelante. Estas cua tro histonas se denominan H2A, H2B, H3 y H4. H3 y H4 se cuentan entre las protenas ms conservadas de las conocidas (Figura 8-8). Este grado de conser vacin sugiere que en la funcin de estas histonas participan casi todos sus ami-

SG

L , Y E E T R GVL K VA

ETY T

RIv N

n W YAL KTVT AMu iK R Q G G 102

f

Gy l t r g

e x t r e m o c a r b o x ilo

Figura 8-8 Secuencia de aminocidos de la histona H4. Los aminocidos se han designado por sus abreviaciones de una sola letra, y los que estn cargados positivamente se han sealado en color. Como ocurre con las otras tres histonas nucleosmicas, en la clula se modifica de forma reversible una cola del extremo amino terminal mediante la acetilacin de determinadas Usinas, lo que elimina la carga positiva de la lisina. Se muestra la secuencia del gen de vaca, aunque en el guisante la secuencia es la misma excepto por una valina que est sustituida por una isoleucina y una lisina por una arginina.

366

Captulo 8 : El ncleo celular

nocidos, de modo que cualquier cambio en cualquier posicin resulta delet reo para la clula. Esta suposicin se ha podido verificar en levaduras, en las que es posible mutar in vitro una histona dada e introducirla en el genoma de la le vadura en lugar del gen normal. Como se predijo, se observ que la mayor parte de las mutaciones eran letales; algunas que no lo eran producan cambios en el patrn normal de expresin gnica (discutido en el Captulo 9). Las histonas H1 son mayores (formadas por unos 220 aminocidos) y han sido menos conserva das evolutivamente que las histonas nucleosmicas.

La asociacin de las histonas con el DNA conduce a la form acin de los nucleosomas, las partculas unitarias de la crom atina 7
Si se desenrollara la doble hlice de DNA de cada uno de los cromosomas huma nos, la cadena resultante podra rodear el ncleo de la clula miles de veces. Las histonas cumplen un papel primordial en el empaquetamiento de forma orde nada de esta enorm em ente larga molcula de DNA en el interior de un ncleo de tan slo unos cuantos micrmetros de dimetro. Su papel en el empaqueta miento del DNA es importante por una segunda razn. Como se ha podido ver, no todo el DNA del crom osom a est empaquetado de la misma forma; parece que la manera en la que se encuentra empaquetada una determinada regin del genoma en la cromatina de un determinado tipo celular influye en la actividad de los genes que contiene. Nuestra comprensin de la estructura de la cromatina recibi un fuerte im pulso con la descripcin de la unidad fundamental de empaquetamiento, cono cida por nucleosoma, que confiere a sta el aspecto de una cadena de cuentas cuando se observa al microscopio electrnico despus de tratamientos que des hacen los empaquetamientos de orden superior (Figura 8-9). La larga cadena de DNA puede romperse en cuentas de nucleosoma por digestin mediante enzimas que degradan el DNA, como por ejemplo con la enzima bacteriana nucleasa m icrococal (las enzimas que degradan tanto el DNA como el RNA se de nominan nucleasas, las enzimas que solamente degradan el DNA se denominan desoxirribonucleasas, o DNasas). Una digestin corta con nucleasa micrococal slo degrada el DNA existente entre los nucleosomas. El resto se encuentra pro tegido de la digestin y permanece como fragmentos de DNA de doble cadena de unos 146 pares de nucletidos de longitud, unidos a un complejo especfico de 8 histonas nucleosmicas (el octmero de histonas). Los nucleosomas obteni dos por este mtodo se han conseguido cristalizar y analizar mediante difrac cin de rayos X. Cada partcula tiene una forma de disco, con un dimetro de al rededor de 11 nm y contiene dos copias de cada una de las 4 histonas nucleosmicas, H2A, H2B, H3 y H4. Este octm ero de histonas forma un ncleo proteico alrededor del cual la hlice de DNA de doble cadena da dos vueltas (va se Figura 8-10).

50 mn
El DNA cromosmico y su empaquetamiento

Figura 8-9 Nucleosomas observados al m icroscopio electrnico. Estas electronmicrograffas muestran fibras de cromatina, antes y despus de ser expuestas a tratamientos que descomprimen o descondensan la estructura nativa, produciendo la forma de cadena de cuentas. La estructura nativa conocida com o fibra de 30 nm (se discute ms adelante) se muestra en (A). La forma descondensada de cadena de cuentas de la crom atina se muestra en (B), a los mismos aumentos. En la Figura 8-30 se presentan dibujos esquemticos de las relaciones existentes entre estas dos formas de la cromatina. Estas electronmicrograffas fueron tomadas por medio de modificaciones del procedimiento explicado en la Figura 8-45. (A, por cortesa de Barbara Hamlako; B, por cortesa de Victoria Foe.)

367

(B)

DNA espaciador

historias de centro del nucleosoma

form a en "cadena de cuentas" de la crom atina

LA NUCLEASA DIGIERE EL DNA ESPACIADOR

unidad repetida de 200 pares de nucletidos cuenta nucleosm ica liberada

ti

11 nm
1

ncleo histnico octam rico *

DISOCIACION A ELEVADA CONCENTRACIN DE SAL

DISOCIACIN

DNA dplex de 146 pares de bases

^3
r
H3

i
H2A

JL

\
H2B

F ig u ra8-10 Naturaleza del nucleosoma. En (A) se observan dos orientaciones de la estructura tridimensional del octmero de histonas; el modo en que el DNA se enrolla a su alrededor se representa por un tubo azul (su p erior ) y por una serie de lneas paralelas {inferior). Dos dmeros H2A-H2B {azul} flanquean un tetrmeros H3-H4. As, el octmero de histonas est compuesto por dos de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4, con una masa total de 100 000 daltons. (B) El nucleosoma est formado por dos vueltas com pletas de DNA (83 pares de bases por vuelta) alrededor de un ncleo octam rico de histonas, ms el DNA separador adyacente. La parte del nucleosoma que hasta ahora hemos denominado cuenta nucleosm ica se libera de la cromatina por digestin del DNA con nucleasa micrococal. En cada cuenta de nucleosoma, alrededor de 146 pares de nucletidos de doble hlice de DNA (alrededor de 1,8 vueltas) permanecen enrollados alrededor de un ncleo octamrico de histonas. (A, cortesa de Evangelos Moudrianakis.)

H4

En la crom atina no digerida, el DNA se extiende como una doble hlice con tinua entre los nucleosomas. Cada nucleosoma est separado del siguiente por una regin de DNA espaciador, de longitud variable entre 0 y 80 pares de nucle tidos. Los nucleosomas se repiten a intervalos de 200 pares de nucletidos (va se Figura 8-10). As pues, un gen eucariota de 10 000 nucletidos de longitud po dra estar asociado a 50 nucleosomas, y cada clula humana, con 6 x 109 pares de bases, puede contener unos 3 x 107 nucleosomas.

La posicin de los nucleosom as en el DNA viene determinada por la tendencia del DNA a form ar bucles estrechos y por la presencia de otras protenas de unin al DNA8
Experimentos in vitro con cromatina aislada sugieren que en condiciones fisio lgicas los octm eros de histonas generalmente permanecen fijos en una posi cin determinada del DNA, puesto que su intensa unin al DNA evita su desliza miento a uno y otro lado a lo largo de la hlice del DNA. Existen dos factores principales que determinan la posicin de los nucleosomas sobre el DNA. Uno es la dificultad de doblar la doble hlice en dos vueltas cerradas alrededor del octmero de histonas, un proceso que requiere una compresin importante del surco estrecho de la hlice. Dado que las secuencias ricas en A-T en el surco estrecho se comprimen ms fcilmente que las ricas en G-C, cada octmero de histona tiende a colocarse por s mismo en el DNA de forma que incremente al mximo la riqueza en A-T del surco estrecho de la hlice de DNA (Figura 8-11). As pues, un segmento de DNA que contenga regiones cortas ricas en A-T, sepa radas por vueltas enteras de DNA, ser mucho ms fcil de doblar alrededor del nucleosom a que una regin de DNA que no tenga estas propiedades. Esto pro368 Captulo 8 : El ncleo celular

Figura 8-11 Curvatura del DNA en un nucleosoma. La hlice de DNA da dos vueltas alrededor del octm ero de histonas. Este diagrama est dibujado aproximadamente a escala para ilustrar cm o se comprime el surco m enor en la parte interior del giro. Debido a ciertas caractersticas estructurales de la molcula de DNA, las parejas A-T tienden a acomodarse preferencialmente en el surco menor.

pares AT preferentem ente aqu (surco m enor interno) ncleo de histonas del nucleosom a (octm ero de histonas)

DNA de nuc eosoma

bablem ente explica el caso de localizaciones muy precisas de nucleosomas so bre el DNA, como es el caso de los genes de rRNA 5S, cada uno de los cuales tie ne un nico nucleosoma en una posicin nica. Si se mezcla in vitro el DNA de genes rRNA 5S con una mezcla de las cuatro histonas nucleosmicas puras, se produce la formacin de nucleosomas en la misma posicin en que se encuen tran in vivo. Sin embargo, parece que para la mayor parte de las secuencias de DNA del cromosoma no existe una localizacin preferencial de los nucleosomas; el nucleosoma puede ocupar cualquiera de una serie de posiciones posibles en la secuencia de DNA. El segundo factor que influye en el posicionamiento de los nucleosomas es la presencia de otras protenas unidas ntimamente al DNA que evitan la forma cin de nucleosomas. Por esta razn algunas regiones del DNA carecen de nu cleosomas, incluso en regiones de miles de pares de bases de longitud. Estas re giones pueden detectarse mediante el tratamiento del ncleo celular con cantidades muy pequeas de una desoxirribonucleasa I (DNasa I), enzima que a estas bajas concentraciones slo digiere las secuencias de DNA libres de nucleo somas y no los cortos segmentos de DNA espaciador que se hallan entre ellos. Frecuentem ente estos lugares hipersensibles a nucleasas coinciden con las re giones reguladoras de los genes (Figura 8-12). La primera evidencia que apoy esta hiptesis procedi de experimentos realizados con el virus de simio SV40, cuyo cromosoma, circular, est organizado utilizando las histonas producidas por la clula husped. En el cromosoma de SV40 se localiza frecuentemente una regin de 300 pares de bases libre de nucleosomas situada muy cerca de las se cuencias en las que se inicia la sntesis del DNA y RNA vrico. Aunque en esta re gin se unen varias protenas de unin a DNA especficas de secuencia, no lo protegen de la degradacin por nucleasas como lo hace el nucleosoma, razn por la cual es una zona sensible a DNasa I. Por defecto el DNA en las clulas eucariotas se encuentra asociado com ple tam ente con nucleosomas, y muchas de las regiones libres de nucleosomas es tn generadas por accin de las protenas de regulacin gnica como parte del proceso de activacin de la transcripcin del DNA (discutida en el Captulo 9). En aquellos lugares en los que los nucleosomas se sitan de forma precisa, po dra haber existido una presin selectiva para mantener el DNA espaciador ad yacente libre de nucleosomas, para facilitar su reconocimiento por las protenas de unin a DNA especficas de secuencia.

I______

J\

^
H1

H1

H3 H4 H2AH2B 103 pares de nucletidos

Habitualmente los nucleosomas se empaquetan con la histona H 1 formando estructuras regulares de orden superior 9
El DNA espaciador que conecta nucleosomas adyacentes puede ser de longitud variada dado que los nucleosomas se posicionan en funcin de la flexibilidad lo cal de la hlice de DNA y de la distribucin de otras protenas unidas a secuen-

Figura 8 -1 2 Localizacin de los sitios hipersensibles a nucleasas de las regiones reguladoras de los genes activos. Los genes mostrados codifican histonas (H l, H2A, H2B, H3 y H4) en D rosophila. Las fle c h a s h orizon tales representan cada uno de los genes en la direccin de la transcripcin del DNA, que siempre tiene lugar desde el extremo 5 al extremo 3 del transcrito. Aunque los lugares hipersensibles a la nucleasa {flechas rojas verticales) se suelen presentar en los extremos 5 de un gen, como se ilustra aqu, pueden encontrarse en cualquier otra posicin (vase Figura 9-34).

El DNA cromosmico y su empaquetamiento

36 9

30 nm

(B) 2

d as especficas del DNA. A pesar de que en la mayor parte del DNA crom osomi co se forman largas cadenas de nucleosomas, en una clula viva es poco proba ble que la cromatina se disponga en la forma de collar de cuentas. En lugar de ello, los nucleosomas se empaquetan uno sobre otro adoptando disposiciones regulares en las que el DNA se encuentra incluso ms condensado. As pues, si se observan al m icroscopio electrnico ncleos celulares sometidos a lisis suave, se aprecia cmo la mayor parte de la cromatina se encuentra organizada en fi bras de un dimetro de alrededor de 30 nm, que es considerablemente superior al dimetro de la cromatina en forma de collar de cuentas. En la Figura 8-13 se representa uno de los modelos que se han propuesto para explicar de qu forma los nucleosomas estn empaquetados en la fibra de cromatina de 30 nm. Tales modelos representan una estructura idealizada, dado que tanto la variacin de longitud del DNA espaciador producida por las preferencias de situacin de los nucleosomas, como la presencia ocasional de secuencias de DNA libres de nu cleosomas producirn irregularidades en la estructura de la fibra de 30 nm (va se Figura 8-14). Se cree que las molculas de histona H l, de las que existen seis subtipos muy relacionados en una clula de mamfero, son responsables del em paqueta miento de los nucleosomas formando la estructura de fibra de 30 nm. En la m o lcula de la histona H l se puede diferenciar una regin globular central, muy conservada evolutivamente, unida a los brazos amino y carboxilo terminales, menos conservados. Cada molcula de histona H l se une a travs de su regin globular a un lugar nico del nucleosoma, mientras que los brazos entran en contacto con otros lugares de las histonas del ncleo o de los nucleosomas adya centes, permitiendo que se empaqueten de forma repetida regularmente (Figura 8-15).

Figura 8-13 La bra de crom atina de 3 0 nm . Modelo propuesto para explicar cmo la forma de cadena de cuentas de la cromatina se empaqueta en la fibra de 30 nm, observada en microscopia electrnica (vase Figura 8-9A) en (A) vista superior, y en (B) vista lateral. Este tipo de empaquetamiento slo requiere una molcula de histona H l por nucleosoma (no mostrado en la figura). Aunque se conoce la posicin en que se une la histona H l al nucleosoma (vase Figura 8-15), se desconoce su posicin en esta fibra. (Vase tam bin Figura 8-14.)

Resumen
Un gen se d efin e com o una secuencia nucleotdica en una m olcula d e DNA q u e a c ta com o u na u nida d fu n cio n a l p ara la produccin d e una m olcula d e RNA. Un crom osom a est fo rm a d o p o r una m olcula nica d e DNA lineal m uy larga qu e contiene una serie num erosa d e genes. Una m olcula d e DNA crom osm ico contie n e asim ism o otros tres tipos d e secuencias d e nucletidos fu n cion alm en te im por tantes: orgenes d e replicacin y telm eros, q u e perm iten la correcta replicacin del DNA, y el centrm ero, q u e es necesario p ara u n ir la m olcula d e DNA al huso mittico, asegurando su segregacin precisa en las clulas hijas. E l genom a haploide hum ano contiene 3 x 109 p ares d e nucletidos, distribuidos en 2 2 autosom as y 2

Figura 8 -14 Regiones libres de nucleosomas en la fibra de 30 nm. Seccin esquemtica de la cromatina mostrando la interrupcin de su estructura regular por regiones cortas en las que el DNA cromosm ico es extraordinariamente sensible a la digestin por DNasa I. En cada uno de esos sitios hipersensibles a nucleasas, parece que un nucleosom a ha sido desplazado del DNA por una o ms protenas de unin a DNA especficas de secuencia. En el Captulo 9 se discute de qu forma son capaces estas protenas de unirse fuertemente al DNA.

protenas de unin a DNA especficas

370

Captulo 8 : El ncleo celular

crom osom as sexuales. Se cree qu e slo una p equ e a parte d e este DNA codifica p ro tenas. En clulas eucariotas el DNA se en cu en tra unido a una m asa igual d e histonas, fo rm a n d o una unida d repetitiva d e partculas d e DNA y protena denom inadas nucleosom as. El nucleosom a est form ad o p o r un ncleo octam rico d e protenas his tonas a lrededo r d el cual el DNA da dos vueltas. La fa cilid a d con la q u e u n segm ento d e DNA p u ed e doblarse suficientem ente p ara envolver el ncleo d e histonas d ep en d e d e su secuencia nucleotdica. A unque hay excepciones, los nucleosom as se suelen em paquetar jun tos, con la ayuda d e m olculas d e la histona H l, adoptando dispo siciones regulares qu e fo rm a n una fib ra d e 3 0 nm

ncleo globular COOH

h 2n

histona H1

La estructura global de los cromosomas

Habiendo descrito el DNA y las protenas a partir de las que se organiza el cro mosoma, a continuacin abordaremos la organizacin del cromosoma en una escala mayor. Si un cromosoma humano se estirara de forma que llegara a pre sentar en toda su longitud la estructura de fibra de 30 nm, alcanzara aproxima damente 0,1 cm de longitud, y podra rodear el ncleo celular ms de 100 veces. Es evidente que debe existir un nivel de com pactacin superior. El DNA no slo se empaqueta con histonas en nucleosomas espaciados regularmente, que a su vez se empaquetan en la fibra de 30 nm, sino que es empaquetado y organizado por otras protena en una serie de subdominios de diferente naturaleza. Este em paquetamiento de orden superior es uno de los aspectos ms fascinantes y menos conocidos de la cromatina. Aunque las bases moleculares son an un misterio, se cree que este empaquetamiento tiene un papel crucial en la regula cin de la transcripcin gnica. En esta seccin se explicar lo que se conoce de la estructura de nivel superior de la cromatina y se examinarn las evidencias que demuestran su importancia funcional.

nucleosom a H l SE UNE A UNA REGIN ESPECFICA DEL NUCLEOSOMA

EL EMPAQUETAMIENTO DE LOS NUCLEOSOMAS EST MEDIADO POR LA HISTONA H1

Los cromosom as plumulados contienen bucles de crom atina descondensada 10

Aunque empaquetados en forma de cromatina, la mayor parte de los crom oso mas en las clulas interfsicas (no en mitosis) son demasiado finos y enm araa dos para que se puedan visualizar con claridad. Sin embargo, en algunos casos excepcionales, es posible observar la estructura completa de un cromosoma in terfsico. Por ejemplo, los cromosomas de los oocitos en crecimiento apareados en la meiosis (huevos inmaduros) son muy activos en cuanto a sntesis de RNA, y suelen presentar grandes y esponjosos bucles de cromatina recubiertos de RNA recin transcrito empaquetado en complejos de RNA-protena. Debido a este forro del DNA, estos c ro m o s o m a s p lu m u la d o s son claramente visibles in cluso al microscopio ptico, con el que se ve que estn organizados en una serie de grandes bucles de cromatina que se extienden a partir de un eje cromosmico lineal (Figura 8-16). En la Figura 8-17 se representa esquemticamente la estructura del cromoso ma plumulado. Desde el eje del cromosoma se extienden grandes bucles de cro matina descondensada. Mediante experimentos de hibridacin de cidos nuclei cos se ha podido demostrar que cada bucle siempre contiene los mismos genes, y que permanece extendido de la misma forma durante el crecimiento del oocito. Otros experimentos han demostrado que la mayor parte del DNA del bucle se est transcribiendo activamente en RNA. Sin embargo, la mayor parte de la cro matina no se encuentra en los bucles sino que permanece muy condensada en los crommeros, que generalmente no se transcriben. Se ha propuesto un modelo general de cromosoma basado en estos estudios, en el que las fibras de 30 nm se extenderan perpendicularmente al eje mayor del cromosoma (Figura 8-18). Los cromosomas plumulados son un buen ejemplo de una caracterstica re currente de la cromatina que se analizar en esta seccin -cuando la cromatina

Figura 8-1 5 Mecanismo por el cual se cree que la histona H l ayuda a em paquetar los nucleosomas adyacentes. El ncleo globular de Hl se une a cada nucleosom a cerca del lugar donde la doble hlice de DNA entra y sale del octm ero de histonas. Cuando est presente la histona H l, quedan protegidos de la digestin con nucleasa micrococal 166 pares de bases del DNA, respecto a los 146 pares de bases de los nucleosom as que carecen de Hl (vase Figura 8-10).

La estructura global de los cromosomas

371

v . -fV j

p w

Figura 8 -16 Micrografia ptica de un crom osom a piumuiado de un oocito de anfibio. En una fase inicial de la diferenciacin, cada cromosom a se replica para empezar la meiosis, y los cromosomas homlogos replicados se aparean formando esta estructura muy extendida que contiene un total de cuatro cromtidas. El estado de cromosomas en escobilln puede persistir durante meses o aos mientras el oocito elabora posteriormente un acmulo de mRNA y de otros materiales que sern utilizados para su desarrollo en un nuevo individuo. (Cortesa de Joseph G. Gali.)

i__

__ _ ___ ________ j

0,1 mm

se transcribe activamente se encuentra en una estructura extendida; cuando la crom atina est condensada, es inactiva; y las unidades estructurales de regula cin son regiones grandes, dominios bien definidos.

H------------------------------------------- 0,5 mm CROMOSOMAS PLUMULADOS APAREADOS

quiasma

bucle

REGIN DE UN SOLO CROMOSOMA

Figura 8 -17 Estructura de un crom osom a plumulado. El conjunto de cromosom as plumulados en muchos anfibios contiene un total de aproximadamente 10 000 bucles cromatnicos diferentes, quedando el DNA restante muy condensado en los crom m eros. Cada bucle corresponde a una secuencia particular de DNA. Cada clula contiene cuatro copias de cada bucle, dado que cada uno de los cromosom as consiste en dos cromtidas hermanas muy juntas, como se muestra en la parte superior del esquema. Esta estructura en cuatro hebras es muy caracterstica de esta fase del desarrollo del oocito (la fase diplotnica de la meiosis, vase Figura

20-9).

PEQUEA REGION DEL CROMOSOMA MOSTRANDO LAS CROMTIDAS HERMANAS crom atina espadadora entre diferentes crom m eros crom m ero form ado de crom atina m uy condensada

372

Captulo 8 : El ncleo celular

Tambin se pueden apreciar dominios estructurales organizados en la crom atina interfsica en los cromosomas politnicos 11
Por una especializacin (diferente a la descrita en los cromosomas plumulados), tam bin es posible visualizar la estructura de la cromatina en ciertas clulas de insectos. Muchas de las clulas de las larvas de mosca crecen hasta alcanzar ta maos enormes despus de repetidos ciclos de sntesis de DNA que no van se guidos de divisin celular. Las clulas gigantes resultantes contienen miles de veces la dotacin normal de DNA. Una clula con una dotacin de DNA mayor de la normal, y, como es habitual, con ms cromosomas de lo normal, se deno mina poliploide. Sin embargo en algunos tipos celulares de la larva de la mosca, todas las copias de los cromosomas se disponen de forma contigua formando un nico cromosoma politnico gigante. El hecho observado en algunas clulas gi-

do m in io en bucle

protenas que form an el eje del cro m osom a

brazo derecho del crom osom a 3

Figura 8 -1 8 Modelo de estructura del crom osom a. Se muestra una seccin de un crom osom a plegado formando una serie de dominios en bucle, cada uno de los cuales posiblemente contiene entre 20 000 y 100 000 pares de nucletidos en forma de DNA de doble cadena condensado en la fibra de cromatina de 30 nm.

cro m osom a X crom osom as m itticos norm ales a la m ism a escala

regin en que los dos crom osom as hom logos se han separado

brazo izquierdo del fruy 1 cro m o so m a 3 ;

brazo izquierdo del cro m osom a 2

brazo derecho d e ll cro m o so m a 2

JV*

M L

20 pm

fe

Figura 8 -19 Dibujo detallado de todo el conjunto de crom osom as politnicos de una glndula salival de Drosophila. Estos cromosom as han sido extendidos para su visualizacin, aplastndolos contra un portaobjetos. D rosop h ila tiene cuatro pares de cromosomas, y en el esquem a se encuentran las cuatro parejas. Pero cada cromosom a est ntim am ente apareado con su homlogo, (de modo que aparece com o una estructura nica), lo cual no ocurre en la mayor parte de los ncleos (excepto en meiosis). Normalmente los cuatro cromosom as politnicos se encuentran unidos por regiones prximas a los centrm eros que se agregan formando un crom ocentro nico de gran tamao (regin coloreada)-, en esta preparacin, sin embargo, el crom ocentro se ha roto en dos partes por efecto del proceso de extensin empleado. (Modificado de T. S. Painter,/. Hered. 25 : 465-476,1934.)

La estructura global de los cromosomas

373

gantes de insectos que pasan directamente de un estado politnico a un estado poliploide demuestra que la estructura bsica de un cromosoma politnico debe ser similar a la de un cromosoma normal. Los crom osom as politnicos son fcilm ente visibles al microscopio ptico debido a su gran tamao y a que al disponerse las diferentes cadenas de cro m atina una al lado de otra con gran precisin, aumenta mucho el dimetro del crom osom a y evita el enrollam iento. Son cromosomas interfsicos activos transcripcionalmente, com o los cromosomas plumulados. La politenia se ha es tudiado especialmnte en las clulas de las glndulas salivares de la larva Dro sophila, en las cuales el DNA se ha replicado a lo largo de 10 ciclos sin separa cin de las cromtidas hermanas de forma que se alinean 1024 (= 210) cadenas idnticas (Figura 8-19). En los cromosomas politnicos observados con microscopia ptica son visi bles bandas oscuras e interbandas claras (Figura 8-20). Cada una de las bandas e interbandas corresponde a un conjunto de 1024 secuencias idnticas de DNA dispuestas en paralelo. Alrededor del 85% del DNA de los cromosomas politni cos corresponde a las bandas, y el 15% restante a las interbandas. La cromatina de las bandas se tie ms que la de las interbandas debido a su mayor grado de empaquetamiento (Figura 8-21). Se estima que, dependiendo de su tamao, cada una de las bandas contiene de 3000 a 300 000 pares de bases por fibra de cromatina. Dado que cada una de las bandas puede reconocerse por su tamao y su posicin, se han numerado para disponer de un mapa del cromosoma poli tnico. En el genoma de Drosophila se conocen aproximadamente 5000 bandas y 5000 interbandas.

Los diferentes dominios de la crom atina de los cromosomas politnicos pueden em paquetarse y desempaquetarse como una unidad 12
Mucho antes de que se conociera la estructura de la cromatina, estudios sobre los cromosomas politnicos revelaron que la transcripcin gnica va acom paa da de un cam bio importante en el em paquetamiento del DNA, dado que es fre cuente que bandas crom osm icas concretas se descondensen cuando los genes que contienen se activan, y se vuelvan a condensar cuando estos genes se hacen quiescentes. En cada mom ento se pueden identificar las regiones de un cromosoma poli tnico que son transcritas, marcando las clulas durante un corto perodo de tiempo con el precursor radiactivo uridina-3H y localizando por autorradiografa los RNA transcritos (Figura 8-22). Este anlisis revela que las regiones cromos micas ms activas estn descondensadas, formando los puffs cromosmicos, fcilmente observables.

10 nm
Figura 8 -20 Micrografa obtenida con el m icroscopio ptico de una porcin de crom osom a politnico de una glndula salival de D r o so p h ila . Se pueden apreciar con claridad los diferentes patrones reconocibles en bandas cromosmicas. Las bandas son regiones que presentan elevadas concentraciones de cromatina. Se encuentran en los cromosomas interfsicos y constituyen una caracterstica especial de los cromosomas politnicos gigantes. (Por cortesa de Joseph G. Gall.)

Figura 8-21 Electronm icrografa de un corte ultraflno de una pequea porcin de un crom osom a politnico de D r o so p h ila . Se pueden distinguir claramente unas bandas de distinto grosor (B) separadas por interbandas (I) formadas por cromatina menos condensada. (Por cortesa de Viekko Sorsa.)

374

Captulo 8 : El ncleo celular

Uno de los principales factores que controlan la actividad de los genes de los cromosomas politnicos de Drosophila es la hormona esteroidea ecdisona, cuyos niveles aumentan y disminuyen peridicamente durante el desarrollo lar vario, induciendo la transcripcin de los diferentes genes que codifican las pro tenas que necesita la larva del insecto para cada muda y para la fase de pupa. A medida que el organismo pasa a travs de las distintas fases del desarrollo, surgen nuevos puffs y desaparecen los anteriores, al ser activadas y desactivadas las unidades de transcripcin, y se producen diferentes RNA y protenas (Figura 8-23). Del estudio de los puffs, especialmente cuando son relativamente peque os y an se pueden distinguir las bandas de los cromosomas, parece deducirse que la mayora de puffs provienen del desenrollamiento de una nica banda crom osm ica (Figura 8-24). El estudio de electronmicrografas de secciones ultrafinas de estos puffs muestra cmo el DNA de la cromatina est mucho menos condensado que en la fibra de cromatina de 30 nm. Estas observaciones sugie ren que la cromatina de una banda puede descondensar como una unidad du rante la transcripcin.

Es probable que tanto las bandas como las interbandas de los cromosom as politnicos contengan genes 13
El hecho de que el patrn de las bandas e interbandas de los cromosomas polit nicos de Drosophila sea fijo sugiri a los primeros citogenetistas que cada banda podra corresponder a un gen nico. Los estudios de frecuencia mutacional que han permitido a los genetistas estimar que Drosophila tendra alrededor de 5000 genes, un nmero aproximadamente igual al nmero de bandas cromosmicas, apoyan esta hiptesis. Adems, cuando se realizaron experimentos intensivos de aislamiento de mutantes correspondientes a una pequea regin de cromosoma que contiene alrededor de 50 bandas, se aislaron 50 genes esenciales. Aunque con estas tcnicas no es posible determinar si un determinado gen se encuentra en una banda o en una interbanda, las observaciones sugieren que una banda de tamao medio podra contener las secuencias de DNA codificantes de una protena esencial. Resultados ms recientes, y el hecho de que en los anlisis genticos descri tos anteriormente no se habran tenido en cuenta aquellos genes que no son

50 pm

Figura 8 -2 2 Sntesis de RNA a lo largo de un crom osom a politnico gigante. En esta autorradiografa de un cromosom a (de la glndula salival del insecto C hiron om u s tentans) marcado con uridina-3H, se aprecian los lugares de sntesis de RNA com o zonas cubiertas con granos de plata oscuros, en proporcin a su actividad. (De C. Pelling, C h ro m o so m a 15:71-122, 1964.)

Figura 8 -23 Puffs crom osm icos. Serie temporal de fotografas que muestran cmo se forman y desaparecen los puffs en los cromosomas politnicos de D rosop h ila m elan ogaster, durante el desarrollo larvario. Se muestra una regin del brazo izquierdo del cromosom a 3. Presenta 5 grandes puffs en las clulas de la glndula salival, cada uno de los cuales es activo durante un corto perodo de tiempo. La serie de cambios que se muestran en la figura tienen lugar durante un perodo de 22 horas, y siguen un patrn reproducible durante el desarrollo del organismo. (Por cortesa de Michael Ashburner.)

La estructura global de los cromosomas

375

esenciales para la supervivencia en el laboratorio (donde los depredadores no existen y se facilitan tanto la comida como el apareamiento), hacen improbable la veracidad de la hiptesis una banda un gen. Por ejemplo, se ha clonado un fragmento continuo de 315 000 pares de bases del genoma de Drosophila, y se han usado zonas de este fragmentos para localizar todos aquellos mRNA produ cidos en esta regin. As se localizaron 3 veces ms mRNA que bandas corres pondan a esa regin del genoma, indicando que cada banda contiene probable m ente varios genes. Adems, en los cromosomas politnicos se ha mostrado directamente que se produce mRNA tanto de bandas como de interbandas. Aunque an s motivo de controversia, se ha propuesto que en los cromoso mas politnicos el DNA se organiza en bucles de forma similar a como lo hace en los cromosomas plumulados. De acuerdo con este modelo la formacin de puffs correspondera a la descondensacin de uno o ms de los dominios en bucle. Independientemente de que este modelo sea correcto o no, los resultados ante riores muestran que al menos algunos cromosomas interfsicos se encuentran organizados en una estructura de dominios secuenciales perfectamente defini dos, cada uno de los cuales contendra tpicamente un pequeo nmero de ge nes cuya transcripcin estara regulada de forma coordinada. Podra ser que to dos los cromosomas interfsicos se encontraran empaquetados en estructuras ordenadas de acuerdo con los mismos principios.

sntesis de RNA

t_______!

10 |im

Figura 8-2 4 Autorradiografa de un puff aislado de un crom osom a politnico. En la porcin de cromosoma que se destaca se est produciendo sntesis de RNA, por lo cual presenta mareaje con uridina- H. (Por cortesa de Jos Bonner.)

La crom atina est menos condensada en las regiones que son transcripcionalm ente activas 14
Estudios de los puffs de los cromosomas politnicos sugieren que la estructura de la cromatina de los genes transcritos se encuentra descondensada selectiva mente. Apoyan esta sugerencia experimentos de diferente naturaleza. Cuando se aslan ncleos de clulas de vertebrados y se exponen a la enzima DNasa I, al rededor del 10 % del genoma se degrada preferencialmente. Aunque una peque a parte de estas secuencias degradadas corresponden a los lugares hipersensibles que se han descrito anteriormente, la mayor parte corresponde a genes que se estaban transcribiendo: por ejemplo, en diferentes tipos celulares del mismo

Figura 8-25 Digestin de la crom atina con DNasa I. La enzima corta en primer lugar por los lugares hipersensibles a las nucleasas (no visibles aqu, vase Figura 8-12) y luego degrada de forma selectiva DNA tanto de los genes que se transcriben activamente como de los que han sido activados pero an no han comenzado a transcribirse.

crom atina condensada norm alm ente

376

Captulo 8 : El ncleo celular

organismo se degradan diferentes secuencias de DNA en funcin de qu genes se estaban transcribiendo en estos tipos celulares. Cabe remarcar que incluso aquellos genes que se transcriben muy pocas veces en cada generacin celular, son sensibles a la accin de la nucleasa, lo que indicara que es ms un estado especial de la cromatina que el proceso de transcripcin de DNA en s mismo lo que hace a estas regiones especialmente accesibles a la digestin (Figura 8-25). La crom atina en este estado accesible se denomina crom atina activa, y parece que su estructura est alterada de forma que el empaquetamiento de los ncleosomas es menor.

La crom atina activa es bioqum icam ente diferente 15

Qu diferencia la cromatina activa de la inactiva? La respuesta a esta pregunta requerir la purificacin y caracterizacin de las protenas cromosmicas que son propias de cada una de ellas. Se han realizado algunos avances hacia esa meta con el desarrollo de mtodos bioqumicos diseados para aislar cromatina activa basndose en su estado relativamente descondensado. El anlisis de las protenas cromosmicas de la fraccin de cromatina activa sugiere lo siguiente: (1) la histona H1 parece unirse con menos fuerza a al menos algn tipo de cro matina activa; algunos subtipos particulares de esta histona podran estar repre sentados preferentemente. (2) Aunque en la cromatina activa las cuatro histonas nucleosmicos estn presentes en cantidades normales, parecen estar altamente acetiladas cuando se comparan con las mismas histonas de la cromatina inactiva. (3) La histona nucleosm ica H2B parece estar menos fosforilada en la cromatina inactiva. (4) La cromatina activa est muy enriquecida en una forma variante menor de la histona H2A que se encuentra en muchas especies, incluida Drosophila y el hombre. (5) Los nucleosomas de la cromatina activa se unen se lectivamente a dos pequeas protenas cromosmicas similares, denominadas HMG 14 y HMG 17. De acuerdo con su presencia exclusivamente en la crom ati na activa estas protenas del grupo de elevada movilidad (HMG, de High-Mobility-Group) se encuentran en cantidad suficiente para unirse a 1 de cada 10 nucleosomas de la crom atina total; adems, su secuencia de aminocidos ha sido muy conservada durante la evolucin, lo que implica que cumplen funcio nes importantes.

heterocromatina perifrica

2 im i

Figura 8 -2 6 La heterocrom atina es inactiva transcripcionalm ente. Autorradiografa de una seccin ultrafina de un ncleo celular de una clula que ha sido marcada con un pulso de uridina-3H para marcar los lugares donde se produce la sntesis del RNA (granos de plata). Las reas b lan cas son regiones de heterocromatina, que tiende a empaquetarse en la regin interior de la envoltura nuclear. Normalmente la heterocromatina suele teirse de oscuro en las electronmicrografas (por ejemplo, vase Figura 8-71), pero debido al mtodo especial de preparacin de esta muestra han quedado de color claro. Como se puede observar, la mayor parte de la sntesis de RNA tiene lugar en la eucromatina que rodea las reas de heterocromatina. (Por cortesa de Stan Fakan.)

La estructura global de los cromosomas

377

Todos o alguno de estos cambios podran jugar un papel importante en el desem paquetam iento de la cromatina de los genes activos, contribuyendo a ha cer el DNA accesible como molde para la sntesis de RNA; sin embargo son nece sarios ms resultados experimentales para poder comprobar esta idea. En el Ca ptulo 9 se exponen los mecanismos que pueden controlar la transicin entre crom atina activa e inactiva.

l ------------- 1

crom osom a

centrom ero

La heterocrom atina est muy condensada y es transcripcionalm ente inactiva 16

Los estudios realizados en los aos 30 con microcopia ptica diferenciaron entre dos tipos de cromatina en el ncleo interfsico: una forma altamente condensa da denominada heterocrom atina y todo el resto, que est menos condensada, denominada eucrom atina. La heterocromatina fue identificada originalmente porque permanece extraordinariamente compactada durante la interfase; pos teriormente se encontr que era transcripcionalmente inactiva (Figura 8-26). En una clula tpica en interfase, aproximadamente el 10% del genoma se encuen tra empaquetado en heterocromatina. Actualmente parece claro, por lo que se ha descrito anteriormente, que la eucromatina existe al menos bajo dos formas: alrededor del 10% est en la forma de crom atina activa, que es la menos conden sada, mientras el resto es eucrom atina inactiva, que est ms condensada que la eucromatina activa pero menos que la heterocromatina. As pues se cree que la heterocromatina podra ser una clase especial de cromatina inactiva en trans cripcin que podra tener otras funciones. Por ejemplo, en mamferos y en muchos otros eucariotas superiores el DNA que rodea a cada centrmero est formado por secuencias de nucletidos simples y repetidas. Este DNA satlite constituye la mayor parte de la heterocromatina en dichos organismos.

crom tida
Figura 8 -27 Dibujo de un crom osom a metafsico tpico. Cada cromtida hija contiene una de las dos molculas hijas idnticas de DNA que se han generado previamente en el ciclo celular por la replicacin del DNA.

Los crom osom as m itticos estn formados por crom atina en su form a ms condensada 17
Con excepcin de unos cuantos casos muy especializados, como son los crom o somas plumulados y politnicos descritos anteriormente, la mayor parte de los cromosomas en interfase estn demasiado extendidos, son tan delgados, y estn tan entremezclados que no son detectables. Por el contrario, los cromosomas de casi todas las clulas son perfectam ente visibles durante la mitosis, cuando se empaquetan formando unas estructuras mucho ms condensadas. Este empa quetamiento, que reduce una longitud de DNA de 0,5 cm a alrededor de 5 |im, hace posible que el huso mittico segregue los cromosomas en las clulas hijas sin romperlos. Esta condensacin est acompaada de la fosforilacin de todas las histonas H1 de la clula en cinco de sus residuos de serina. Debido a que la histona H1 colabora en el em paquetamiento de los nucleosomas (vase Figura 8-15), parece probable que su fosforilacin desempee un papel causal en la condensacin de los cromosomas. La Figura 8-27 muestra un crom osom a m ittico tpico durante la metafase m ittica. Las dos molculas de DNA hijas producidas por replicacin del DNA durante la fase S del ciclo de divisin celular, estn plegadas por separado, for mando dos crom osom as herm anos (denominados cromtidas hermanas) m an tenidos juntos por sus centrmeros. Normalmente, estos cromosomas mitticos estn cubiertos por diversas molculas, entre las que se cuentan grandes cantidades de ribonucleoprotenas. Una vez eliminada esta envoltura, en las electronmicrografas se puede observar que cada cromtida est organizada en bucles de crom atina que proceden de un eje central (Figuras 8-28 y 8-29). Algu nos experim entos demuestran que el orden en que aparecen determinadas ca ractersticas visibles de un crom osom a m ittico representa, aproximadamente, el orden de los genes a lo largo de la molcula de DNA. Para ilustrar el modo tan organizado com o se pliega y em paqueta la larga hlice de DNA, en la Figura 8-30 se ha representado cada cromtida como una serie de dominios en bucle

cromtida 1

Figura 8-2 8 Electronm icrografa de barrido de una regin cercan a a un extrem o de un crom osom a m ittico tpico. Se cree que cada protuberancia representa la parte superior de un dominio en forma de bucle. Es de destacar que es posible diferenciar claramente las dos cromtidas hermanas tal como se han representado en la Figura 8-27. (De M.P. Marsden y U.K. Laemmli, Cell 17: 849-858, 1979, Cell Press.)

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Captulo 8 : El ncleo celular

Figura 8 -2 9 ElectronmicrografTa de una sola crom tida de un crom osom a m ittico. El crom osom a (de un insecto) fue tratado para revelar los bucles de fibras crom atnicas que proceden de un eje central de la cromtida. Estas micrografas apoyan la idea de que en todos los cromosom as la crom atina est doblada en series de dominios en forma de bucle (vase Figura 8-18). (Por cortesa de Victoria Foe.)

crom atina en la form a de "cadena de cuentas" o "cuentas ensartadas

Figura 8 -3 0 Modelo del em paquetamiento de la crom atina. Ilustracin esquem tica de algunos de los muchos grados de empaquetamiento de la crom atina que se han postulado para explicar el alto grado de em paquetamiento del cromosom a metafsico.

nucleosom as com pactados en form a de fibra de crom atina de 30 nm

30 nm

seccin del crom osom a en una form a extendida

300 nm
i

seccin condensada de un crom osom a metafsico

700 nm

crom osom a metafsico com pleto

1400 nm

La estructura global de los cromosomas

379

tVi

at

Il
*

II
1

16

16

muy prximos, organizados en una hlice compacta; tambin se representan es quemticam ente todas las etapas de empaquetamiento que podran preceder a esta estructura. Se cree que la forma condensada de la cromatina que constituye los crom o somas mitticos es similar a la de la heterocromatina en su grado de compactacin. No es sorprendente que se haya determinado que los cromosomas m itti cos son inactivos transcripcionalmente: la sntesis de RNA cesa cuando el cromosoma se condensa. Probablemente la condensacin de la cromatina impi de el acceso de la RNA polimerasa al DNA, aunque tambin podran estar impli cados otros factores.

Cada uno de los crom osom as m itticos presenta un patrn caracterstico de grandes dominios estructurales 18
El conjunto de los 46 crom osom as humanos en mitosis se denomina el cariotipo humano. Mtodos de tincin ideados durante los ltimos 25 aos han per mitido la identificacin inequvoca de cada uno de los cromosomas. Algunos de estos mtodos requieren la tincin de los cromosomas mitticos con colorantes que son fluorescentes nicam ente cuando se fijan a ciertos tipos de secuencias de DNA. Aunque estos colorantes tienen una especificidad muy baja y parecen distinguir sobre todo entre el DNA rico en pares de bases A-T (bandas G) y el DNA rico en pares de bases G-C (bandas R), dan lugar en cada crom osoma mittico a un atractivo patrn reproducible de finas bandas (vase Figura 8-31). De esta forma cada crom osom a se puede identificar y numerar, como se ilustra en la Figura 8-32. Se sabe que tanto las bandas G como las R contienen genes. Estas bandas no estn relacionadas con las descritas previamente en los crom o somas politnicos de insectos, que se cree corresponden a regiones de cromati na condensada; en los cromosomas mitticos humanos, toda la cromatina est condensada y las bandas se forman por la unin selectiva de ciertos colorantes. Mientras que en una banda de un cromosoma politnico parece haber slo unos cuantos genes, una banda tpica de un cariotipo humano contiene algunos cen tenares de ellos. Examinando los cromosomas humanos durante las primeras etapas de la mitosis, cuando estn m enos condensados que en la metafase, ha sido posible establecer que la dotacin haploide total contiene por lo menos 2000 bandas di feren ciabas de DNA rico en pares de bases A-T. Estas bandas se fusionan pro gresivamente a medida que avanza la condensacin durante la mitosis, dando lugar a un nmero menor de bandas ms gruesas. Las bandas de los cromosomas mitticos se han detectado en especies tan diversas como la mosca y el hombre. Adems, el patrn de bandas exacto de un determinado crom osom a ha permanecido inalterado durante largos perodos de tiempo; por ejemplo, se han localizado cromosomas con un patrn de bandas com parable al humano, en chimpancs, en gorilas y en orangutanes (aunque en

Figura 8-31 Micrografas de fluorescencia de tres parejas de crom osom as hum anos mostrando el patrn de bandas. En (A) los cromosomas fueron teidos con el colorante Hoescht 33258 especfico del par de bases A-T que tie las bandas G, y en (B) con el colorante olivomicina, especfico del par de bases G-C que tie las bandas R. Las barras indican la posicin del centrmero. Obsrvese que estos patrones de las bandas son el reverso el uno del otro, ya que las bandas que son claras en (A) son oscuras en (B), y viceversa. Las bandas G tambin se tien con el mtodo de Giemsa -d e ah su n om bre- mientras que las bandas R deben su nombre al hecho de ser el patrn reverso de las bandas G. (De K.F. Jorgenson, J.H. Van de Sande, y C.C. Lin, C h rom osom a 6 8 : 287-302, 1978.)

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Captulo 8 : El ncleo celular

Figura 8 -32 Mapa estndar del patrn de bandas de cada crom osom a del cariotipo hum ano. Este mapa se determin en la etapa de prometafase mittica. Los cromosom as del 1 al 22 estn ordenados segn su tamao; una clula diploide contiene dos de cada uno de estos cromosom as, adems de dos cromosom as X (hembra) o un X y un Y (macho). Las 850 bandas que se muestran en el esquema son bandas G, que se tien con reactivos que parecen ser especficos para las secuencias ricas en A-T. Las p rotu b eran cias co lo rea d a s en verde sobre los cromosom as 13, 14, 15, 21 y 22 indican la posicin de los genes que codifican los RNA ribosmicos grandes; las ln eas verdes marcan la posicin de cada centrmero. (Adaptado de U. Franke, Cytogenet. Celi Genet. 3 1 :2 4 32, 1981.)

el hombre se ha producido la fusin de dos cromosomas, lo cual ha dado lugar a los 46 cromosomas que presenta a diferencia de los 48 de las otras especies cita das). Esto sugiere que la organizacin espacial de los cromosomas que ponen de manifiesto las bandas puede ser de gran importancia para la funcin cromosmica. El porqu de la existencia de estas bandas constituye un misterio. Incluso las ms finas de ellas representadas en la Figura 8-32 podran contener ms de un milln de pares de nucletidos, que es casi el tamao de un genoma bacte riano, y es de esperar que la composicin media de pares de bases sea aleatoria en estos grandes fragmentos de DNA.

Resumen
Los cromosomas se descondensan generalm ente d urante la interfase, d efo rm a qu e es difcil discernir su estructura. Existen notables excepciones, como p or ejemplo los especializados cromosomas plum ulados de los oocitos d e vertebrados o los crom o somas polifnicos d e clulas secretoras gigantes de insectos. Los estudios de ambos tipos d e cromosomas interfsicos sugieren q u e cada una d e las largas molculas de DNA d e un cromosoma est dividida en un gra n nm ero d e dom inios discretos q ue se pliegan d e m anera diferente. Tanto en los cromosomas plum ulados como en los politnicos las regiones qu e estn sintetizando activamente RNA son las m enos condensadas. De fo rm a similar, como se estima p o r la sensibilidad a ncleos as, alrede d o r del 10% del DNA de las clulas en interfase d e vertebrados se encuentran en una conform acin relativamente deseondensada qu e se correlaciona con la transcrip cin del DNA en dichas zonas. Esta 4 crom atina activa es bioqum icam ente distinta d e las regiones ms condensadas, inactivas, d e la cromatina.

La estructura global de los cromosomas

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Todos los cromosomas adquieren una conformacin altamente condensada durante la mitosis. Cuando se tien deforma especfica, los cromosomas mitticos presentan una estructura en bandas que permite reconocer sin ambigedades a cada uno de los cromosomas; estas bandas contienen millones de pares de nucletidosyson el reflejo de una hetereogeneidad de la estructura del cromosoma que an no se comprende.

Replicacin del cromosoma

Antes de que una clula se divida, ha de realizar una copia de cada uno de sus cromosomas, proceso que realiza durante una parte de la interfase denominada fase de sntesis de DNA o fase S del ciclo celular; a la parte del ciclo celular que precede a la fase S se le denomina Gap 1 (de intervalo) o Gp y a la que le sigue Gap 2, o G2 (vase Figura 17-3). En una clula eucariota tpica la fase S dura apro ximadamente 8 horas. Al final, cada cromosoma se ha replicado produciendo dos copias completas, que permanecen unidas por sus centrmeros hasta la fase M que le sigue poco despus (Figura 8-27). La duplicacin de los cromosomas re quiere tanto la replicacin de la larga molcula de DNA de cada cromosoma como el ensamblaje de un nuevo conjunto de protenas cromosmicas sobre este DNA, formando la cromatina. En el Captulo 6 se discute la enzimologa de la re plicacin del DNA y se describe la estructura de la horquilla de replicacin, en la que se produce la sntesis de DNA siguiendo un mecanismo semiconservativo (vanse Figuras 6-48 y 6-49). En el Captulo 17 se considera cmo est regulado el inicio de la fase S, en el seno de una discusin ms general sobre el control del ci clo celular. En la presente seccin describimos el patrn de fases de la replicacin de los cromosomas eucariotas y su relacin con la estructura del cromosoma.

Secuencias especficas de DNA actan como orgenes de replicacin1 9

En el Captulo 6 se vio que se han caracterizado los orgenes de replicacin en bacterias com o secuencias especficas de DNA que permiten a la maquinaria de replicacin del DNA unirse a la doble hlice y desplazarse en direcciones opues tas, formando las horquillas de replicacin. Por analoga, es de esperar que los orgenes de replicacin eucariota tambin sean secuencias especficas de DNA. Como se m encion previamente, la bsqueda de orgenes de replicacin en los cromosomas eucariotas ha sido especialmente fructfera en las clulas de la le vadura Saccharomyces cerevisiae. Los potentes mtodos que se han desarrollado para su aislamiento se basan en el uso de unas clulas mutantes de levadura que carecen de un gen esencial, de forma que slo sobrevivirn en el medio selectivo si se les agrega un plsmido que porte una copia funcional del gen perdido. Cuando se introduce en la clula de levadura un plsmido bacteriano que porta el gen esencial, no ser capaz de replicarse independientemente del cromosoma husped porque el origen de replicacin bacteriano no funciona en la clula de levadura. Si se insertan fragmentos al azar de genoma de levadura en un plsmi do bacteriano, una pequea fraccin de las molculas recom binantes portar un origen de replicacin de levadura, y por ello ser capaz de replicarse en clulas de levadura. Aquellas clulas mutantes de levadura que porten dicho plsmido podrn proliferar en medio selectivo pues se les ha aportado una copia funcio nal del gen normal (Figura 8-33). Las secuencias de DNA identificadas por su presencia en plsmidos aislados de estas clulas se han denominado secuencias de replicacin autnom a (ARS, de Autonomously Replicating Sequences). Re cientem ente se han aislado un cierto nmero de ARS, demostrndose que se tra ta de autnticos orgenes de replicacin cromosmicos, justificando la estrategia que se ha seguido en su aislamiento. Se ha demostrado que una secuencia de 11 nucletidos, la secuencia central consenso, es esencial para la funcin de origen de replicacin en levadura; todos

382

Captulo 8 : El ncleo celular

fragm ento de DNA de levadura, seleccionado al azar vector plam dico que contiene el gen de la histidina

segm ento de DNA de levadura que contiene una secuencia ARS

ARS /

Figura 8-33 Estrategia utilizada para identificar secuencias de replicacin autnoma en levaduras. U na
secu en cia de DNA id entificad a de esta form a se d en om in in icialm en te secu en cia de rep licaci n au tn om a o ARS, pues c ap acita al plsm ido que la co n tien e a replicarse lib rem en te en la clula hu sped sin n ecesid ad de incorp orarse en sus crom o som as.

V HIS

introduccin del DNA plasm dico en clulas de levadura que carecen del gen de histidina y que, por lo tanto, no pueden crecer en ausencia de histidina m edio selectivo sin histidina

clulas transform adas obtenidas con una frecuencia baja en las que ei DNA del plsm ido se ha integrado en el crom osom a de la levadura

clulas transform adas obtenidas con una frecuencia elevada en las que los crculos de DNA plasm dico se replican independientem ente del crom osom a husped DNA

origen de replicacin de SV40

1\ ' . {i:::-.:
los orgenes de replicacin conocidos contienen copias casi idnticas de dicha secuencia, espaciadas en una regin de unos 100 nucletidos. Estas secuencias de DNA son reconocida por un gran complejo de protenas que parece que est implicado en el proceso de iniciacin. Aunque se han identificado algunas pro bables secuencias de origen de replicacin en eucariotas, hasta el momento no se conocen las protenas que se unen a ellas. aSS

---- -

00
m

antgeno T

CAMBIO CON FORM ACION AL EN EL ANTGENO T

Un sistema eucariota libre de clulas replica el cromosoma de un virus de simio20

En una bacteria un complejo multienzimtico que incluye la DNA polimerasa, la DNA primasa y la DNA helicasa desplaza la horquilla de replicacin (vase Figu ras 6-48 y 6-49); este complejo se ensambla en el origen de replicacin a travs de una reaccin que requiere la presencia de una protena iniciadora que se une especficam ente al origen de replicacin en el DNA (vase Figura 6-52). Se han hechos numerosos intentos para reconstruir el sistema de replica cin eucariota en el tubo de ensayo. Para ello sera necesario identificar todas las enzimas necesarias y describir la funcin de cada una de ellas en la horquilla de replicacin. El sistema de replicacin in vitro que m ejor ha funcionado por el momento permite la replicacin del virus de simio SV40. Este virus parasita la clula husped, usando de esta clula todo lo necesario para su replicacin, con excepcin de una protena, el antgeno T de SV40, una protena multifuncional de gran tamao que permite al virus evitar los controles normales y por ello re plicarse ms deprisa que la clula husped. Al origen de replicacin de SV40 se unen dos hexmeros del antgeno T, reconociendo el exterior de la doble hlice. Despus, en un proceso que no se comprende bien, el antgeno T unido cambia de conformacin separando las dos hebras de DNA del origen. Esta interesante protena tiene una tercera funcin: utilizando la energa de hidrlisis del ATP ac ta como DNA helicasa, desplazndose a lo largo del DNA y separando las dos hebras a su paso, formando una burbuja de replicacin (Figura 8-34). Los com ponentes celulares de la maquinaria de replicacin se ensamblan en la burbuja formando dos horquillas de replicacin que se desplazan desde el origen en di recciones opuestas. 2 A D P]

Figura 8-34 Iniciacin de la replicacin del DNA del genoma del virus SV40. La p roten a de in iciaci n
(antgeno T) es cod ificad a por el virus, y reco n o ce e sp ecficam en te los orgenes de rep licaci n vricos. D espus de abrir la d oble h lice de DNA en el origen, el antgeno T acta com o u n a DNA helicasa, d esplaznd ose desde el origen y al m ism o tiem p o abriend o la doble h lice. A con tin u aci n los co m p o n en tes celu lares de la m aqu inaria de rep licacin se en sam blan en la b u rb u ja de rep licacin form ando las horqu illas de rep licacin (vase Figura 8-35).

Replicacin del cromosoma

383

patrn de la cadena gua DNA polimerasa 5 (sobre el patrn de la cadena gua)

DNA helicasa (antgeno T u hom logo celular) protenas de unin a la cadena sencilla de DNA

DNA polim erasa a (sobre el patrn de la cadena retrasada)

Aunque la horquilla de replicacin es similar a la que se encuentra en proca riotas, los experimentos con SV40 han mostrado que en eucariotas existen al menos dos tipos diferentes de DNA polimerasa: DNA polimerasa a (alfa) en la cadena retrasada, y la DNA polimerasa delta 8 (delta) en la cadena gua (Figura 8-35). En los procariotas, sin embargo, en ambas hebras de la horquilla de repli cacin acta un mismo tipo de DNA polimerasa (vase Figura 6-48). Todava no se ha descubierto la protena que normalmente inicia la replica cin de los cromosomas de mamfero. Por ello se desconoce si acta en la hor quilla com o el antgeno T, a modo de DNA helicasa, o bien, si como en los pro cariotas, se necesita una protena iniciadora especfica y la DNA helicasa.

Figura 8-35 Horquilla de replicacin en mamferos. Esta horquilla se ha esquematizado de forma que destaque la homologa con la horquilla de replicacin bacteriana descrita en el Captulo 6 . Aunque ambas horquillas utilizan los mismos componentes bsicos, la horquilla de mamferos difiere en dos aspectos importantes. En primer lugar, se emplean dos DNA polimerasas, una para la cadena gua y otra para la retrasada. Es bastante probable que la polimerasa de la cadena gua est adaptada a mantener una unin fuerte con el DNA, mientras que la polimerasa de la cadena retrasada debe ser capaz de soltarse del molde y volverse a unir cuando se sintetiza el nuevo fragmento de Okazaki. En segundo lugar, la DNA primasa de mamferos es una subunidad de la DNA polimerasa de la cadena retrasada, mientras que en bacterias est asociada con la DNA helicasa.

Los orgenes de replicacin de los cromosomas eucariotas se activan en grupos 21

En el Captulo 6 se describe cmo, en las bacterias, se inician dos horquillas de replicacin en cada origen y cmo avanzan en direcciones opuestas, desplazn dose a una velocidad de alrededor de 500 nucletidos por segundo hasta que se ha replicado la totalidad del DNA circular del cromosoma. El tamao del genoma bacteriano es pequeo, de modo que las dos horquillas permiten duplicar todo el crom osom a en menos de 40 minutos. Dado el tamao muy superior de la mayor parte de los cromosomas eucariotas, parece poco probable que su re plicacin se inicie en un nico origen. En los primeros aos de la dcada de 1960 se desarroll un mtodo que per miti el estudio del m ecanismo general de replicacin del cromosoma eucariota. Se hacen crecer clulas humanas en cultivo, exponindolas durante perodos cortos de tiempo a timidina-3H, con lo que se consigue que el DNA sintetizado durante ese tiempo sea fuertemente radiactivo. La distribucin del DNA radiac tivo se determina por autorradiografa: se obtiene el DNA de las clulas median te lisis suave, se extiende sobre un portaobjetos de vidrio y se recubre con una emulsin fotogrfica. Los tiempos de mareaje utilizados son cortos, de modo que la horquilla de replicacin recorre slo unos cuantos micrmetros, lo cual se pone de manifiesto al microscopio ptico en forma de lneas de granos de plata a lo largo de la molcula de DNA, a pesar de que sta no es visible al microscopio ptico. De este modo es posible determinar tanto la velocidad de replicacin como la direccin en la que se desplazan las horquillas de replicacin (Figura 8-36). A partir de las velocidades estimadas mediante diferentes tiempos de

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Captulo 8 : El ncleo celular

 50 p m ------------------------ ] ____________________ r'- - ^ DNA

origen de replicacin
PULSO DE 10 MINUTOS DE MARCAJE CON TIMIDINA-3H (A)

granos de plata

LA "C AZA" EN EL MEDIO NO MARCADO DURANTE 10 MINUTOS REDUCE LOS NIVELES DE PRECURSOR INCORPORADO

burbuja de replicacin

burbuja de replicacin

mareaje, se deduce que la horquilla de replicacin se desplaza a unos 50 nucletidos por segundo. Esta velocidad es una dcima parte de la velocidad estimada de desplazamiento de la horquilla de replicacin en bacterias, lo cual probable mente refleja la dificultad que supone replicar el DNA estrechamente empaque tado en la cromatina. Tal como se ha comentado anteriormente, se cree que un cromosoma hu mano de tamao medio est formado por una molcula de DNA de unos 150 m i llones de pares de nucletidos. La replicacin de una molcula de este tamao a partir de una horquilla de replicacin que se desplazara a una velocidad de 50 nucletidos por segundo, requerira 0,02 x 150 x 106 = 3 x 106 segundos (alrede dor de 800 horas). Como se esperaba, los experimentos antes descritos revelaron que en cada crom osom a eucariota en replicacin actan numerosas horquillas de replicacin que se desplazan simultneamente. Ms an, existen regiones del cromosoma que presentan numerosas horquillas de replicacin muy juntas, mientras que otras regiones del mismo cromosoma no presenta ninguna. Otros experimentos posteriores han demostrado lo siguiente: (1) los orgenes de repli cacin tienden a ser activados en grupos de entre 20 y 80 unidades (denomina dos unidades de replicacin ). (2) A lo largo de la fase S se van activando nuevas unidades de replicacin hasta que todo el DNA est replicado; (3) Dentro de una unidad de replicacin, los orgenes de replicacin estn espaciados a intervalos de entre 30 000 y 300 000 pares de nucletidos; posiblemente exista un nico origen de replicacin por bucle de la cromatina. (4) Como ocurre en las bacte rias, las horquillas de replicacin se forman por parejas y se desplazan en senti dos opuestos desde un punto de origen comn dando lugar a una burbuja de re plicacin; dichas horquillas se detienen slo cuando se encuentran con otra burbuja de replicacin en crecimiento o cuando alcanzan un extremo del cro mosoma. De esta manera muchas horquillas de replicacin pueden actuar de forma independiente sobre cada cromosoma y formar de este modo dos hlices hermanas completas de DNA (vase Figura 8-36).

Figura 8 -36 Los experim entos que dem ostraron el patrn de desplazamiento de las horquillas de replicacin durante la fase S. El DNA de nueva sntesis en las clulas humanas en cultivo se marc brevemente con un pulso de timidina tritiada (timidina-3H) de elevada actividad especfica. En el experimento que se ilustra en (A) las clulas se Usaron y el DNA se extendi sobre un portaobjetos de vidrio que fue recubierto por una emulsin fotogrfica. Tras algunos meses de exposicin se revel la emulsin, y apareci una lnea de granos de plata sobre el DNA radiactivo. El experimento en (B) es igual que el de A pero despus del mareaje las clulas se incubaron en un medio libre de radiactividad, con lo cual el DNA sintetizado qued marcado menos intensam ente. Se observ que las parejas de trazas oscuras en (B) presentaban regiones de menor mareaje en direcciones opuestas, demostrando el desplazamiento bidireccional de la horquilla de replicacin a partir de un origen de replicacin com n (vase Figura 6-51). En esta figura se presenta el DNA coloreado en rojo nicam ente como una ayuda para la interpretacin del autorradiograma; el DNA no marcado no es visible en estos experimentos. Se cree que una horquilla de replicacin slo se detiene cuando encuentra otra horquilla desplazndose en direccin opuesta o cuando alcanza el extremo de un cromosoma; de esta forma se replica la totalidad del DNA.

Regiones distintas del mismo cromosom a se replican en diferente m om ento 22

La replicacin del DNA en la regin situada entre dos orgenes de replicacin, requiere tan slo alrededor de 1 hora para completarse, segn las estimas reali zadas de las mayores distancias conocidas entre orgenes de replicacin y la ve locidad de desplazamiento de la horquilla de replicacin. Sin embargo, en las clulas de mamfero la fase S dura alrededor de 8 horas. Esto implica que no to dos los orgenes de replicacin son activados simultneamente y que cada uni dad de replicacin (que contiene un grupo de entre 20 y 80 orgenes de replica cin) est replicando slo durante una pequea parte de la fase S.

Replicacin del cromosoma

385

Existe una activacin al azar de las diferentes unidades de replicacin, o bien existe un orden definido de replicacin de las diferentes regiones del genoma? Un experimento que puede responder a esta pregunta consiste en el marea je de poblaciones celulares sincronizadas, con el anlogo de la timidina bromodesoxiuridina (BrdU), durante diferentes perodos de tiempo a lo largo de la fase S. Posteriormente, en la fase M, se pueden reconocer las regiones del crom oso ma mittico que han incorporado BrdU en su DNA gracias a su distintas propie dades de tincin, o mediante el uso de anticuerpos anti-BrdU. Los resultados muestran que diferentes regiones de cada cromosoma se replican en un orden reproducible durante la fase S (Figura 8-37). Adems, como era de esperar a partir de la observacin de grupos de horquillas de replicacin visualizados por autorradiografa, el momento en que se realiza la replicacin est coordinado en grandes regiones de cromosoma.

5 |im

La crom atina muy condensada se replica tardamente en la fase S, m ientras que la crom atina activa se replica tem prano 23
Parece que el orden en que se activan los orgenes de replicacin depende, al menos en parte, de la estructura de la cromatina en la que se encuentren. Se describi, por ejemplo, que durante la interfase la heterocromatina permanece en una conform acin muy condensada (similar a la cromatina mittica), m ien tras que la crom atina activa adquiere una conformacin descondensada que probablem ente es necesaria para permitir la sntesis de RNA. La heterocromati na se replica muy tardamente en la fase S, sugiriendo que el orden de replica cin est relacionado con el empaquetamiento del DNA en la cromatina. Esta sugerencia est de acuerdo con el orden en que se replican los dos cromosomas X en una clula de hem bra de mamfero. A pesar de que ambos cromosomas contienen esencialm ente las mismas secuencias de DNA, nicamente uno de ellos es activo transcripcionalm ente mientras que el otro no lo es (se discute en el Captulo 9). Casi todo el crom osom a X inactivo se encuentra condensado en heterocromatina y su DNA se replica tardamente al final de la fase S, mientras que su homlogo activo est menos condensado y se replica a lo largo de toda la fase S. Estos hechos apoyan la hiptesis de que las regiones del genoma cuya cromatina est m enos condensada durante la interfase, y por ello son ms acce sibles a la maquinaria de replicacin, se replican primero. Experimentos de autorradiografa muestran que las horquillas de replicacin se desplazan a velocida des similares a lo largo de toda la fase S, de forma que el grado de condensacin de la crom atina afectara al tiempo de iniciacin de las horquillas de replicacin pero no a su velocidad una vez formadas. La relacin que se ha sugerido entre la estructura de la cromatina y el m o mento en el que se produce la replicacin del DNA se apoya asimismo en estu dios en los que se ha medido el momento en el que se replican determinados ge nes. Los resultados muestran que en todas las clulas estudiadas, los genes constitutivos, que estn siempre activos, se replican muy temprano en la fase S en todas las clulas estudiadas. Por el contrario, los genes que slo son activos en unos cuantos tipos celulares generalmente se replican temprano en la fase S en las clulas en que son activos y ms tarde en las que son inactivos.

Figura 8 -37 Diferentes regiones de un crom osom a se replican en diferentes mom entos de la fase S. Estas micrografas, obtenidas con el microscopio ptico, muestran cromosomas mitticos teidos en los que se ha marcado de forma diferencial el DNA en replicacin durante intervalos definidos de la fase S. En estos experimentos, las clulas se hicieron crecer en presencia de BrdU (un anlogo de timidina) y en ausencia de timidina para marcar el DNA uniformemente. Despus las clulas fueron expuestas a pulsos breves de timidina en ausencia de BrdU durante la fase S temprana, media o tarda. Dado que el DNA sintetizado durante el pulso con timidina es DNA de doble hlice con timidina en una cadena y BrdU en la otra, se tie ms intensam ente que el otro DNA (que contiene BrdU en las dos cadenas) y se visualiza com o bandas brillantes (flec h a s) en estos negativos. Las lneas discontinuas conectan posiciones similares de las tres copias del cromosom a mostrado. (Por cortesa de Elton Stubblefield.)

Las unidades de replicacin tardas coinciden con las bandas ricas en A-T en los cromosom as m etafsicos 24
Parece que muchas de las unidades de replicacin corresponden a distintas bandas crom osm icas que se hacen visibles mediante varios procesos de fija cin y tincin usados para obtener los cariotipos. Como se ha descrito previa mente, en el com plem ento haploide de cromosomas de una clula de mamfero, durante las primeras fases de la mitosis se pueden distinguir unas 2000 bandas oscuras, las bandas ricas en A-T (bandas G), separadas por un nmero igual de bandas claras ricas en G-C (bandas R). Es curioso que las bandas ricas en A-T y

386

Captulo 8 : El ncleo celular

las bandas ricas en G-C se repliquen en diferentes momentos de la fase S. Expe rimentos como el descrito en la Figura 8-37 sugieren que la mayor parte de las bandas ricas en G-C se replican durante la primera mitad de la fase S mientras que la mayor parte de las bandas ricas en A-T lo hacen en la segunda mitad de la fase S. Se ha sugerido que los genes de expresin constitutiva se encuentran localizados fundamentalmente en las bandas ricas en G-C, mientras que los ge nes de expresin especfica de tipo celular -la gran mayora de los cuales sern inactivos en muchas clulas- estn situados en las bandas ricas en A-T. Como se com ent previamente, actualmente constituye un completo misterio por qu el genoma de los mamferos ha de estar segregado en estos grandes bloques al ternos de cromatina -m uchos de ellos de un tamao similar a un genoma bacte riano. Tambin se desconoce cuntos de los orgenes de replicacin presentes en una unidad de replicacin se activan al mismo tiempo. Un posibilidad es que la cromatina de las unidades de replicacin tardas permanezca condensada an despus del final de la fase M, y slo se descondense en la segunda mitad de la fase S, permitiendo slo entonces el acceso simultneo a todos sus orgenes de replicacin. En este caso, la replicacin todo o nada del DNA de una unidad de replicacin podra ser el reflejo de la descondensacin en bloque de grandes dominios de cromatina.

El patrn ordenado de activacin de los orgenes de replicacin puede contribuir a la mem oria de la clula 25
En huevos en divisin de muchas especies, en los cuales se encuentran alm ace nadas grandes cantidades de los com ponentes de la cromatina (como las histonas) que se precisan para fabricar un nuevo ncleo, la fase S es extremadamente breve. Como se ilustra en la Figura 8-38, una corta fase S implica el uso de un nmero excepcionalmente grande de orgenes de replicacin espaciados a inter valos de slo unos cuantos miles de pares de nucletidos (a diferencia de las de cenas o centenares de miles de pares de nucletidos que separan los orgenes de replicacin durante el desarrollo ms tardo). El hecho de que cualquier DNA ex trao introducido en el interior de un huevo de rana fecundado se replique, pa rece indicar que posiblemente en ese modelo celular no se requiera una secuen cia especfica de DNA para formar un origen de replicacin. As pues, la replicacin del DNA puede considerarse como un proceso po tencialm ente muy rpido que en algunas clulas est sujeto a un complejo siste ma de regulacin que restringe la iniciacin de las horquillas de replicacin, de modo que diferentes regiones del genoma se replican en diferentes momentos. Se ha sugerido, por ejemplo, que la cromatina que se replica temprano se en sambla en parte con una serie de protenas cromosmicas especiales que se han producido durante la fase G1 ( de modo que cuando una regin cromosmica se ha descondensado formando cromatina activa, su replicacin temprana hace que reclute protenas que le ayudarn a m antener su estado descondensado de una generacin a la siguiente. Desde este punto de vista, el momento en que se produce la replicacin del DNA contribuira al proceso de la memoria celular que facilita la transcripcin continua de los genes expresados.

Figura 8 -38 En ncleos embrionarios en divisin rpida actan un gran nm ero de orgenes de replicacin. En estas electronmicrografas de cromatina descondensada de un embrin temprano de D rosophila, se observa que las burbujas de replicacin [flechas ) estn muy prximas. En este embrin los perodos entre algunas divisiones nucleares sucesivas son de unos 10 minutos. Debido a que los orgenes de replicacin utilizados son muy prximos (distan slo unos cuantos miles de nucletidos), slo se requiere alrededor de un minuto para replicar el DNA existente entre ellos. (Por cortesa de Victoria Foe.)

Replicacin del cromosoma

387

Factores unidos a la crom atina aseguran que cada regin del DNA slo se replique una vez 26
En una fase S normal, el genoma se ha de replicar completo y una sola vez. Tal com o se ha descrito previamente, en muchas clulas eucariotas el proceso de replicacin del DNA es asincrnico y puede durar bastante tiempo. Debido a que los orgenes de replicacin se activan en diferentes momentos en diferentes regiones del cromosoma, hacia la parte media y final de la fase S, algunos ya han sido replicados completamente mientras otros an no han empezado a hacerlo. As pues se plantea un importante problema de registro durante las etapas media y final de la fase S. Aquellos orgenes de replicacin ya utilizados se han duplicado, y son, al menos respecto a sus secuencias de DNA, esencialmente iguales a los que an no se han activado. Sin embargo, en cada fase S cada ori gen de replicacin debe ser utilizado una sola vez. Cmo se puede controlar este proceso? Algunos experimentos de fusin celular han aportado importantes claves para la com prensin del problema. Cuando se fusionan clulas en fase S con clulas en fase G,, se induce la sntesis de DNA en el ncleo de las clulas en fase Gp lo cual sugiere que la transicin de fase G, a S est mediada por un activador de la sntesis de DNA, que difunde. Por el contrario, cuando las clulas en fase S se fusionan con clulas en fase G2 (es decir, clulas que acaban de completar la fase S), en el ncleo G2 no se induce la sntesis de DNA. Dado que la sntesis de DNA contina inalterada en el ncleo en fase S, implica que el ncleo en G2 es incapaz de iniciar nuevos procesos de replicacin porque todo su DNA se en cuentra bloqueado de alguna forma. Por ejemplo, un inhibidor que no difunde de la replicacin puede haberse unido fuertemente al DNA. Un inhibidor de es tas caractersticas que se uniera a la crom atina recin formada en la cola de las horquillas de replicacin podra explicar el hecho de que el DNA replicado una vez no volviera a hacerlo dentro de la misma fase S (vase Figura 8-39A). Otra alternativa igualmente plausible consistira en la existencia de unas protenas iniciadoras o factores permisivos, unidas dbilmente al DNA, que seran nece sarias para la replicacin y que se destruiran o inactivaran por el paso de la horquilla de replicacin (Figura 8-39B). Sea cual sea la naturaleza del bloqueo de la re-replicacin del DNA, ha de ser eliminado en el momento de la mitosis (o un poco antes), ya que tras la divisin celular, el DNA del ncleo G, que aparece en las clulas hijas ya no est protegido de la replicacin. Se ha podido observar que los fragmentos de DNA bacteriano que se repli can cuando se inyectan en un huevo fertilizado de rana pueden quedar afecta-

Figura 8 -39 Dos m ecanism os que se han propuesto para explicar el bloqueo de la re-replicacidn. Este bloqueo, que protege al DNA replicado de una posterior replicacin en el mismo ciclo celular, es crucial para marcar las zonas ya replicadas, pero se desconoce su naturaleza molecular. Normalmente, el bloqueo termina durante la mitosis, aunque en algunos tipos celulares especializados (las clulas salivares gigantes de D rosophila, por ejemplo) se elimina el bloqueo sin necesidad de mitosis, haciendo posible la formacin de cromosomas p olitn icos gigantes. (A) Modelo basado en la adicin de un inhibidor a toda la cromatina ya replicada; (B) modelo basado en la presencia de una protena iniciadora, o factores permisivos, que actuaran una nica vez y que deberan unirse al DNA slo durante la mitosis.

(A)

MODELO DE UNIN DE UN INHIBIDOR

(B)

MODELO DE SUPRESION DE UN ACTIVADOR protenas iniciadoras unidas dbilm ente

DNA

DNA

Sy
hlices de DNA hijas de la crom atina protegida
G2

protena iniciadora inactiva

DNA sin protenas iniciadoras

LA MITOSIS ELIMINA EL INHIBIDOR

LA MITOSIS PERMITE QUE SE UNAN AL DNA OTRAS PROTENAS INICIADORAS

= - # 4 = 1
el DNA del ncleo en fase Gi se puede volver a replicar el DNA del ncleo en fase Gi se puede volver a replicar

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Captulo 8 : El ncleo celular

dos por un bloqueo de la re-replicacin. As pues, el mecanismo responsable del bloqueo no puede depender de un origen de replicacin altamente especfico. El bloqueo no afecta al virus SV40, probablemente debido a que su antgeno T su ministra tanto las funciones de iniciador com o de DNA helicasa, substituyendo a los com ponentes celulares anlogos y evadiendo de este modo los controles a los que estn sujetos.

A medida que el DNA se replica, se van ensamblando nuevas histonas en la crom atina 27
En cada ciclo celular son necesarias una gran cantidad de histonas, aproximada mente la misma cantidad en masa que el DNA sintetizado, para formar la nueva cromatina. Por esta razn, muchos organismos poseen varias copias de cada uno de los genes de las histonas. Por ejemplo, en las clulas de vertebrado se en cuentran alrededor de 20 copias de un grupo de secuencias, cada uno de los cuales contiene los cinco genes de las histonas. A diferencia de lo que sucede con m uchas protenas, que se sintetizan conti nuam ente a lo largo de toda la interfase, las histonas se sintetizan mayoritariam ente en la fase S, durante la que el nivel de los mRNA de histonas se increm en ta unas 50 veces com o resultado del efecto combinado de un aumento de la velocidad de transcripcin y una reduccin de su velocidad de degradacin. De bido a un m ecanismo que depende de las propiedades especiales de su extremo 3 (se discute en el Captulo 9) cuando la sntesis de DNA termina al final de la fase S (o cuando se aaden inhibidores que detienen la sntesis de DNA prema turamente), los mRNA de las histonas mayores se degradan en cuestin de m i nutos. Por el contrario, las molculas de histona son notablemente estables y pueden sobrevivir toda la vida de la clula. La estrecha relacin entre la sntesis de DNA y la de histonas puede ser debida a un mecanismo de retroalimentacin que controle los niveles de histonas libres asegurando que ste sea el adecuado para la cantidad de DNA de nueva sntesis. Cuando las histonas se han ensamblado en nucleosomas, raramente, o nun ca, liberan el DNA al que estn unidas. Sin embargo, a medida que la horquilla de replicacin avanza, ha de atravesar de alguna forma los nucleosomas pater nos, los cuales parecen estar adaptados a permitir el paso a su travs tanto para la transcripcin como para la replicacin. Segn una de las hiptesis propues tas, cada nucleosom a se dividira durante la replicacin del DNA en dos medios nucleosom as, permitiendo el acceso de la DNA polimerasa al DNA nucleosmico desenrollado (Figura 8-40). El DNA de nueva sntesis cercano a una horquilla de replicacin hereda las histonas paternas, pero tam bin necesita de una cierta cantidad de histonas de nueva sntesis para completar su empaquetamiento en cromatina (vase Figura 8-40). Existen algunas evidencias que sugieren que un ensamblador de nucleo somas viajara con la horquilla de replicacin, empaquetando el DNA recin sin tetizado, en cuanto emerge de la maquinaria de replicacin. La cromatina de nueva sntesis requiere, sin embargo, al menos una hora para estar completa mente madura; hasta este momento, por ejemplo, las histonas nuevas son ms sensibles de lo normal a enzimas que son capaces de modificarlas. Desconoce mos cules son las diferencias qumicas entre la cromatina madura y la inmadu ra, pero se cree que la maduracin implica tanto modificaciones covalentes de las histonas com o unin de otras protenas a la cromatina.

Los telmeros son secuencias cortas, repetidas, ricas en G, que se aaden al extremo de los cromosomas por accin de la telomerasa 28
Como ya se ha descrito, la DNA polimerasa no puede replicar completamente el extremo de una molcula lineal de DNA de un modo ordinario, y ello ha conduciclo al desarrollo de unas secuencias de DNA especiales llamadas telmeros, situadas en el extremo de los cromosomas eucariotas. Estas secuencias que son similares

Replicacin del cromosoma

389

r e g i n c e n tr a l d e l n u c le o s o m a

D N A de d o b le cadena

EL N U C L E O S O M A SE D IV ID E Y L A S D O S V A L V A S ( M IT A D E S ) DE S U N C L E O SE S E P A R A N

C U A N D O P A S A L A H O R Q U IL L A DE R E P L IC A C I N SE F A B R IC A N N U E V A S C A D E N A S DE D N A

n ue vas cade nas de D N A

r e p lic a c i n

la s d o s m ita d e s d e la z o n a c e n tr a l d e l n u c le o s o m a s e e n c u e n tr a n u n id a s a u n a d e la s m o l c u la s h ija s d e D N A E L N U C L E O S O M A SE V U E L V E A E N S A M B L A R

Figura 8 -40 Modelo especulativo que m uestra cm o se podra abrir un nucleosoma para perm itir la replicacin del DNA. Despus de que pase la horquilla de replicacin, el nucleosom a se reensamblara. De este modo las histonas del ncleo permaneceran en todo momento unidas al DNA. A pesar de que segn el diagrama los viejos nucleosom as se heredan intactos por la hlice de DNA sintetizada sobre la cadena conductora, existen evidencias de que el nucleosom a se ha heredado intacto por cualquiera de las dos hebras hermanas de la molcula de DNA. Asimismo, ste es solamente uno de los muchos modelos diferentes posibles.

p ro n to o tro o c t m e ro de h is to n a s se u n ir a e s ta m o l c u la d e D N A h ija fo rm a n d o un n u e v o n u c le o s o m a

entre s en organismos tan diferentes como los protozoos, los hongos, las plantas y los mamferos, consisten en muchas copias de secuencias cortas, en tndem, que contienen bloques de G. En humanos esta secuencia es GGGTTA. El problema de replicar los extremos de los cromosomas est resuelto de manera ingeniosa por accin de la enzima telom erasa. Esta enzima reconoce la cadena rica en G de una secuencia telomrica repetida y la alarga en direccin 5 a 3 . En ausencia de una cadena de DNA complementario, la telomerasa sinteti za una copia de la secuencia repetida empleando un molde RNA que es un com ponente de la propia enzima. La enzima contiene, por tanto, la informacin ne cesaria para m antener las caractersticas de la secuencia telomrica. Despus de varios ciclos de extensin por la telomerasa, se puede completar la replicacin del extremo del crom osom a empleando dichas extensiones como molde para la sntesis de la cadena complementaria por la DNA polimerasa (Figura 8-41). Dado que el proceso de recorte y recuperacin de las secuencias del telmero est equilibrado slo aproximadamente, cada extremo de cromosoma contiene un nmero variable de repeticiones en tndem, que, en general, son de varios cientos de pares de bases de longitud.

Resumen

Estudios in v itro del virus de simio SV40 como sistema modelo sugieren que tanto en las clulas eucariotas como en las procariotas la replicacin del DNA se inicia con la unin al DNA de una DNA helicasa, mediada por una protena iniciadora que, a su vez, se halla unida al origen de replicacin. En el origen de replicacin se forma una burbuja de replicacin por efecto de dos horquillas de replicacin que se alejan una de la otra. En los eucariotas superiores, parece que durante la fase S los orgenes de replicacin vecinos se activan en grupos, denominados unidades de re plicacin, cuyos orgenes se hallan separados unos 100 000 nucletidos de media. Dado que la horquilla de replicacin se desplaza a unos 50 nucletidos por segun do, slo se necesitara una hora para la sntesis de DNA de una unidad de replica cin. A travs de una fase S tpica de 8 horas se van activando las diferentes unida390 Captulo 8 : El ncleo celular

cadena paterna ] TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG ] AACCCCx 5' cadena recin sintetizada, incompleta LA TELOMERASA SE UNE TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG sntesis por AACCCC ^A C ( accin de la 5' telomerasa LA TELOMERASA ALARGA LOS EXTREMOS 3 telomerasa con RNA patrn unido (sntesis de DNA sobre un molde RNA)
rG G G G T T G G G G T T G G G G T T G G G G T T G G G G AACCCC

5'

TERMINACION DE LA CADENA RETRASADA POR LA DNA POLIMERASA (sntesis de DNA sobre un molde DNA) J TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG GGGTTGGGGTTG
UAACCCC CCCCAACCCCAACCCC

DNA polimerasa

des de replicacin siguiendo una secuencia determinada en parte por la estructura de su cromatina, siendo las regiones ms condensadas de la cromatina las ltimas en iniciar su replicacin. La correspondencia entre unidades de replicacin y las bandas que contienen millones de pares de bases observadas en los cromosomas mitticos eucariotas sugieren que las unidades de replicacin podran correspon der a dominios estructurales diferentes de la cromatina interfsica. Despus de que pase la horquilla de replicacin, la estructura de la cromatina se recupera mediante la adicin a las antiguas histonas heredadas por las molcu las de DNA hijas, de nuevas histonas y de otras protenas cromosmicas. Se produce un bloqueo local de la re-replicacin, de naturaleza desconocida, que impide que se produzca una nueva replicacin de las regiones ya replicadas, hasta que el cromo soma pase por una mitosis; este bloqueo es necesario para asegurar que cada re gin de DNA se replique una sola vez en cada fase S. La replicacin de los extremos de los cromosomas se resuelve con una estructu ra terminal especializada (el telmero) y una enzima (la telomerasa) que extiende esta estructura utilizando un molde RNA que es parte de la propia telomerasa.

Figura 8-41 R eplicacin del telm ero. La figura resume las reacciones implicadas en la formacin de las secuencias repetidas ricas en G que forman los extremos de los cromosomas (telmeros) de diversos organismos eucariotas, tal como sugieren los experimentos realizados en el ciliado T etrahym en a. La cadena incompleta recin sintetizada es copiada en la cadena retrasada de la horquilla de replicacin (vase Figura 6-41). Como se ha indicado, la telomerasa es un com plejo de protena y RNA que contiene un patrn de RNA para la sntesis de una secuencia telomrica rica en G. Estas repeticiones son GGGTTG en T etrahym ena, pero son GGGTTA en humanos y G,.3A en la levadura S accharom yces cerevisiae. Se cree que la cadena retrasada se com pleta con la accin de la DNA polimerasa a, que porta la actividad primasa en una de sus subunidades (vase Figura 8-35).

Sntesis y procesamiento del RNA

Hasta aqu hemos considerado de qu forma se organizan los cromosomas en grandes complejos de DNA y protenas, y cmo se duplican estos complejos an tes de que una clula se divida. Sin embargo, la principal funcin de un crom o soma es actuar como un molde para la sntesis de molculas de RNA, ya que slo as la clula puede utilizar la informacin gentica almacenada en los crom oso mas. En la clula se produce una gran cantidad de sntesis de RNA: la velocidad a la que se incorporan los nucletidos al RNA durante la interfase es 20 veces m a yor que la velocidad a la que se incorporan al DNA durante la fase S. La sntesis de RNA, tambin denominada transcripcin del DNA, es un pro ceso muy selectivo. En la mayora de las clulas de mamfero slo se copian a se cuencias de RNA funcionales (RNA mensajero maduro o RNA estructural) alrede dor del 1% de las secuencias de nucletidos del DNA. La seleccin tiene lugar a dos niveles, que se abordarn, por ese orden en esta seccin: (1) se transcribe slo una parte de la secuencia de DNA, produciendo RNA nucleares, y (2) tan slo una pequea porcin de las secuencias de nucletidos de los RNA nucleares so brevive todas las etapas del proceso de maduracin del RNA que preceden a la exportacin de las molculas de RNA al citoplasma. Comenzaremos describiendo las RNA polimerasas, las enzimas que catalizan toda la transcripcin del DNA.

Sntesis y procesamiento del RNA

391

subunidad ' de E. co li (1407 am inocidos)

h 2n I

II I M lib -1 DE

lili

COOH COOH

H2N H2N

levadura D rosophila

1 B U .

__

EDOOO3000 cooH

Las RNA polmerasas intercam bian subunidades cuando inician cada cadena de RNA29
Como se describi someram ente en el Captulo 6, la transcripcin se inicia cuando la molcula de RNA polimerasa se une a una secuencia prom otora del DNA de doble hlice. A continuacin, en una etapa de iniciacin compleja no bien comprendida, las dos cadenas de DNA se separan localmente formando un complejo abierto. En esta etapa la cadena molde queda expuesta, y puede ini ciarse la sntesis del RNA complementario. Entonces la polimerasa empieza a desplazarse a lo largo de la cadena molde, extendiendo la cadena de RNA en cre cimiento en la direccin 5 a 3 mediante la adicin secuencial de ribonucletidos trifosfato, hasta que alcanza una seal de paro (terminacin o stop) momento en el que la cadena de RNA formada y la molcula de RNA polimerasa se separan del DNA. Cada molcula de RNA representa, pues, una copia en cadena sencilla de la secuencia nucleotdica de una cadena de DNA de una regin relativamente pequea del genoma (vase Figura 6-2). Este segmento transcrito de DNA se de nomina unidad de transcripcin. Generalmente las RNA polmerasas estn formadas por mltiples cadenas polipeptdicas de pesos moleculares de 500 000 daltons o ms. Las enzimas de bacterias y de eucariotas estn relacionadas evolutivamente (Figura 8-42). Debido a que la enzima bacteriana ha resultado ms fcil de estudiar, sus propiedades proporcionan una base para la comprensin de sus enzimas homologas euca riotas. La enzima de E. coli contiene 4 subunidades diferentes: a, p, P, y o; existen dos copias de la subunidad a y una de cada una de las dems. Se ha determinado la secuencia de aminocidos de cada una de estas subunidades a partir de la de term inacin de la secuencia de nucletidos de su gen. La subunidad sigma (a) de la polimerasa de E. coli juega un papel especfico en la iniciacin de la transcripcin; permite a la enzima encontrar las secuencias promotoras a las que se ha de unir. Despus de que se sinteticen alrededor de 8 nucletidos de una molcula de RNA, la subunidad o se libera (etapa 4 en la Fi gura 8-43), y en su lugar se unen a la polimerasa una serie de factores de elonga-

Figura 8-4 2 Origen com n de las RNA polm erasas bacterianas y eucariotas. La similitud de las secuencias de aminocidos entre la subunidad de la RNA polimerasa de E. coli y la subunidad mayor de la RNA polimerasa II eucariota sugiere un origen evolutivo com n para las enzimas de bacterias y de clulas eucariotas. Se cree que la subunidad se une al DNA. Las secuencias de las regiones destacadas com o b arras verdes tienen una homologa superior al 70% entre levadura y D rosophila, y ms del 40% entre D rosop h ila y E. coli. Una secuencia nica de funcin desconocida (de siete aminocidos) se repite 26 veces en el extremo carboxilo de la subunidad de levadura y ms de 40 veces en la subunidad de D rosop h ila (lo cual se indica aqu mediante crcu los verdes). Estas repeticiones se fosforilan com o parte del proceso que inicia la sntesis de una cadena de RNA en eucariotas (vase Figura 9-30). (De A.L. Greenleaf et al., en RNA Polymerases and the Regulation of Transcription [W.S. Reznikoff et al., eds.l, pp. 459-464, New Yorl, Elsevier, 1987.)

subunidad o form a inicial de la RNA polimerasa DNA com plejo cerrado

com plejo abierto

Figura 8-43 Diagrama esquemtico de las etapas de la iniciacin de la sntesis de RNA (transcripcin del DNA) catalizada por la RNA polimerasa. Las etapas que se indican se han descrito gracias a estudios realizados sobre la enzima de E. coli. Se muestra una molcula de DNA que contiene una secuencia promotora para la polimerasa de E. coli. La enzima forma en primer lugar un com plejo cerrado en el que las dos cadenas de DNA permanecen completamente apareadas. En la siguiente etapa, la enzima cataliza la separacin de las dos cadenas un poco ms de una vuelta de la hlice de DNA, formando un com plejo abierto en el que el molde queda expuesto para el inicio de la cadena de RNA. Sin embargo la polimerasa que lleva unida la subunidad c se comporta como si estuviera fijada al promotor: parece incapaz de avanzar con la elongacin de la cadena de RNA y frecuentemente revierte al complejo cerrado liberando una corta cadena de RNA. Tal como se indica, la conversin a una polimerasa activa que alarga la cadena de RNA requiere la liberacin de los factores de iniciacin (la subunidad o en el caso de la enzima de E. coli) y generalmente supone la unin de otras protenas que actan como factores de elongacin.

UNION DE LOS FACTORES DE ELONGACIN form a de la RNA polimerasa en fase de elongacin 4

LIBERACION DE LA SUBUNIDAD g

SINTESIS M ASIVA DE RNA

392

Captulo 8 : El ncleo celular

cin -q u e son importantes para el crecimiento y la terminacin de la cadena.

Los factores de elongacin incluyen algunas protenas que, aunque bien carac terizadas, tienen funciones an no comprendidas completamente. El inicio de la transcripcin es un punto de control importante mediante el cual la clula pue de regular la expresin de un gen; por esta razn se discutir en detalle en el Ca ptulo 9.

En las clulas eucariotas, el RNA se sintetiza por tres RNA polim erasas diferentes 30
El mecanismo de la transcripcin del DNA es similar en clulas eucariotas y en clulas procariotas como E. coli, pero la maquinaria es considerablemente ms compleja en los eucariotas. En eucariotas tan diversos como levadura y el hom bre, por ejemplo, hay tres tipos de RNA polimerasas, cada uno de los cuales es responsable de la transcripcin de diferentes grupos de genes. Estas enzimas -denom inadas RNA polimerasas I, II y III- son estructuralmente similares entre s y tienen algunas subunidades en comn aunque otras subunidades son caracte rsticas de cada una de ellas. Cada una de estas enzimas es ms compleja que la RNA polimerasa de E. coli y se cree que estn formadas por 10 o ms cadenas polipeptdicas. Otra diferencia importante entre la enzima bacteriana y la eucariota es que, mientras la enzima bacteriana purificada puede unirse directamente al promotor, las polimerasas eucariotas requieren la presencia de protenas de ini ciacin adicionales que se unan al DNA antes de que la enzima pueda hacerlo. Es por ello que hasta 1979 no fueron accesibles sistemas con todos los componentes necesarios para hacer posible el estudio in vitro de los mecanismos de iniciacin en clulas eucariotas. Dado que las protenas de iniciacin y sus interacciones con las polimerasas estn ntimamente relacionadas con el control del inicio de la transcripcin, se discutirn en detalle en el Captulo 9. Inicialmente, las tres RNA polimerasas eucariotas se diferenciaron entre s por sus diferencias qumicas durante la purificacin as como por su sensibilidad a a-amanitina, una toxina aislada a partir del hongo venenoso Amanita phalloides. La RNA polimerasa I no se ve afectada por la a-am anitina, la RNA polimerasa II es muy sensible a la toxina y la RNA polimerasa III es moderadamente sensible. La sensibilidad de la sntesis de RNA a la a-am anitina es todava un mtodo habi tual para determinar qu polimerasa es la responsable de la transcripcin de un determinado gen. Estos estudios indican que todos los genes cuyos mRNA sern traducidos posteriormente a protena, son transcritos por la RNA polim erasa II. Las otras dos polimerasas transcriben exclusivamente RNA que tiene funciones catalticas o estructurales principalmente como parte de la maquinaria de snte sis de protenas: la polim erasa I produce los RNA ribosmicos de gran tamao y la polim erasa III produce una cierta variedad de RNA de pequeo tamao y muy estables -incluyendo el pequeo RNA ribosmico 5S y los RNA de transferencia. Sin embargo, la mayor parte de los RNA pequeos que forman las snRNP, que sern descritas ms adelante cuando se considere el procesamiento de RNA, son transcritos por la RNA polimerasa II. Las clulas de mamfero contienen tpicamente alrededor de 20 000 a 40 000 molculas de cada una de las RNA polimerasas, y los resultados de estudios rea lizados con clulas en cultivo muestran que las concentraciones de dichas enzi mas estn reguladas individualmente de acuerdo con la velocidad de crecim ien to celular.

lo pm
Figura 8 -4 4 Un ncleo celular tpico visualizado m ediante microscopa electrnica utilizando el procedimiento descrito en la Figura 8-45. Se puede observar cm o sale del ncleo Usado una gran cantidad de cromatina. Slo la cromatina ms externa de esta maraa estar suficientem ente descondensada como para que sea posible observarla con detalle a mayor aumento. (Por cortesa de Victoria Foe.)

La RNA polim erasa II transcribe algunas secuencias de DNA m ucho ms frecuentem ente que otras 31
Dado que la RNA polimerasa II es la que sintetiza todos los precursores de mRNA y por ello determina qu protenas sintetizar una clula, la mayor parte de la descripcin que sigue se centrar en sus actividades y en las caractersticas de sus productos. Aunque los experimentos realizados con polimerasas purifca

Sntesis y procesamiento del RNA

393

das y factores de transcripcin in vitro son esenciales para establecer el m eca nismo de la transcripcin, tambin se pueden aprender muchos aspectos del patrn de transcripcin de una clula, observando al microscopio electrnico genes en accin, con su RNA polimerasa cazada en el acto de transcripcin. Electronmicrografas de secciones ultrafnas de ncleos interfsicos mues tran acmulos granulares de cromatina (vase Figura 8-71), pero revelan muy poco acerca de cmo son transcritos los genes. Se obtienen imgenes mucho ms informativas si se rompe el ncleo y se extiende la cromatina sobre una reji lla portamuestras del microscopio electrnico (Figuras 8-44 y 8-45). En el punto ms alejado del ncleo Usado la cromatina est lo suficientemente descondensada como para poder observar las estructuras de fibras de cromatina en cuen tas ensartadas que se mostr previamente en la Figura 8-9B. Las molculas de RNA polimerasa implicadas en la transcripcin aparecen como partculas globulares unidas a una molcula de RNA. Habitualmente las partculas que representan molculas de RNA polimerasa II activas se observan como unidades individuales, sin molculas vecinas. Esto indica que la mayora de los genes se transcriben con poca frecuencia a precursores de mRNA, de modo que la RNA polimerasa finaliza completamente la transcripcin antes de que otra molcula la inicie de nuevo. Sin embargo, en ocasiones se ha observado que mu chas molculas de RNA polimerasa (y sus transcritos de RNA asociados) se hallan juntas, formando un grupo. Estos grupos aparecen sobre los relativamente pocos genes que se transcriben con gran frecuencia (Figura 8-46). La longitud de las molculas de RNA que se unen a estos grupos se incrementa en el sentido de la transcripcin, produciendo un patrn caracterstico. Este patrn define el lugar de inicio y de paro de la RNA polimerasa II para una unidad transcripcional espe cfica (Figura 8-47). Estudios bioqumicos han confirmado y ampliado los resultados obtenidos con la microscopa electrnica, llegndose a tres conclusiones principales : 1. Las molculas de RNA polimerasa de clulas eucariotas, como ocurre con las de los procariotas, inician y terminan la transcripcin en lugares espec ficos del cromosoma. 2. La longitud media de la molcula de RNA ya terminada, producida por la RNA polimerasa II en una unidad de transcripcin, es de aproximadamente 7000 nucletidos, aunque son bastante frecuentes las molculas de RNA de longitudes que oscilan entre 10 000 y 20 000 nucletidos. Estas longitudes, superiores a los 1200 nucletidos de RNA necesarios para codificar una protena media de 400 aminocidos, ponen de manifiesto que la estructura de los genes eucariotas es peculiar, particularmente debido a la presencia de largos intrones, que, como se ver ms adelante, son eliminados posterior mente del RNA. 3. Aunque la velocidad de crecimiento de la cadena observada para todos los RNA es de alrededor de 30 nucletidos por segundo, diferentes sitios de i .

gota que contiene clulas a baja concentracin de sales

+ detergente + polianin

rpidam ente se recubren con una solucin concentrada de sacarosa recipiente / " d e plstico isado celular

los ncleos se lisan lentam ente y la crom atina se descondensa centrifugacin restos celulares ncleos lisados lim pios

rejilla con los ncleos lisados

contrastado y i'T'Tm som breado con metales pesados

o b se rv a ci n de la cro m atin a ai rr1i c r o s c o j i o e e c t r' o ri e o

Figura 8-45 Mtodo para exam inar la crom atina de un ncleo celular mediante m icroscopia electrnica. Los ncleos son primero lisados, se eliminan los restos celulares y la cromatina se extiende sobre una rejilla.

1 Jim

Figura 8-46 Electronmicrografa de una regin de crom atina portadora de un gen que est siendo transcrito a una frecuencia extraordinariamente elevada. Se pueden observar muchas molculas de RNA polimerasa II con sus transcritos en crecimiento. La direccin de la transcripcin es de izquierda a derecha (vase Figura 8-47). (De V.E. Foe, L. E. Wilkinson y C.D. Laird, Cell 9:131-146,1976. 1976 Cell Press.)

394

Captulo 8 : El ncleo celular

Tabla 8-2 Poblacin de molculas de mRNA de una clula de mamfero tpica

Copias p o r clu la de ca d a secu en cia de mRNA N m ero de secu en cias de mRNA diferentes de ca d a clase N m ero total de m olculas de mRNA de ca d a clase

transcrito de RNA unido direccin de desplazam iento \ de la polim erasa y de crecim iento de la cadena de RNA

Clase abundante Clase intermedia Clase poco frecuente

12 000 300 15

X X X

4 500 11000

=
=
=

48 000 150 000 165 000

RNA poli JPfe

La clasificacin de los mRNA en slo tres clases discretas es bastante arbitraria; en muchas c lulas se observa una distribucin ms continua en cuanto a abundancia se refiere. Sin embargo, en una clula se pueden observar un total de 10 000 a 20 000 especies diferentes de mRNA, es tando la mayor parte de ellas presentes a concentraciones muy bajas (de 5 a 15 molculas por clula). La mayor parte del RNA citoplasmtico es rRNA, y slo del 3 al 5% es mRNA, una rela cin consistente con la presencia de alrededor de 10 ribosomas por molcula de mRNA. Este tipo particular de clula de mamfero contiene en su citoplasma alrededor de 360 000 molcu las de mRNA.

rr
\

seal inicio

D N A de de
Figura 8 -47 Unidad de transcripcin idealizada. El esquema muestra cmo la imagen obtenida con el microscopio electrnico (vase Figura 8-46) demuestra tanto la direccin de la transcripcin com o los lugares de inicio y final de la unidad.

inicio para RNA polimerasa II tienen diferentes frecuencias de iniciacin, de forma que ciertos genes se transcriben con frecuencias ms elevadas que otros. Como se indica en la Tabla 8-2, la mayora de los genes que se transcriben slo forman unas cuantas molculas de mRNA.

Los precursores de los RNA m ensajeros son modificados covalentemente en sus dos extremos 32
En las clulas eucariotas el mRNA se produce en varias etapas. Las molculas de RNA recin sintetizadas en el ncleo por la RNA polimerasa II se denominan transcritos primarios-, a todos estos transcritos se les dio el nombre de RNA hete rogneo nuclear (hnRNA) por la gran variabilidad que exista en el tamao del RNA, en contraste con el menor tamao y ms uniforme de las secuencias de RNA que codifican protenas. En seguida veremos que la mayor parte de esta va riabilidad se debe a la presencia de largas secuencias intrnicas en los transcri tos primarios. Estos transcritos son modificados en sus extremos 5 y 3 a medida que se sintetizan, de una forma caracterstica que los diferencia claramente de los producidos por las otras RNA polimerasas. Estas modificaciones se utilizars posteriormente en el citoplasma como seales de que dichos transcritos han de ser traducidos a protenas. En primer lugar, al extremo 5 de la m olcula de RNA (el primer extremo sin tetizado durante la transcripcin) se le aade una caperuza (cap) mediante la adicin de un nucletido G metilado. Esta modificacin (capping) ocurre casi inmediatamente, despus de que se hayan sintetizado tan slo unos 30 nucletidos, y supone la condensacin del grupo trifosfato de una molcula de GTP con un difosfato del extremo 5 del transcrito inicial (Figura 8-48). Posteriormente, esta caperuza 5 jugar un papel importante en la iniciacin de la sntesis de
Figura 8 -48 Reacciones de formacin de la caperuza en el extrem o 5 de los transcritos de la RNA polim erasa II. El extremo en caperuza final contiene un nuevo enlace 5 -5 entre el residuo 7-metil G cargado positivamente y el extremo 5 del transcrito RNA (vase Figura 6-26). Se cree que al menos algunas de las enzimas necesarias para este proceso estn unidas a la RNA polimerasa II, ya que a los transcritos de las RNA polimerasas I y III no se les aaden caperuzas, y a que esta reaccin tiene lugar muy poco despus de iniciarse la transcripcin de la cadena de RNA. La letra N se utiliza para representar cualquiera de los cuatro ribonucletidos, aunque el nucletido que suele iniciar una cadena de RNA suele ser una purina (A o G). (De A.J. Shatkin, B ioessays 7 :2 1 5 -2 1 1 , 1987. ICSU Press.)

extrem o 5' del transcrito mRNA 5' 3' pppNpNp ""i

p p N p N pi
a

E33
pp

G pppN pN pi aadir un grupo de m etilo a la base CH 3 GpppNpNp

CH3

-G pppN pN p
I
CH3

aadir un grupo de m etilo a la ribosa

Sntesis y procesamiento del RNA

395

factor de elongacin RNA polimerasa II | 7 lugar de inicio del RNA

lugar de unin de las colas poli-A FORMACION DE LA CAPERUZA

Figura 8-49 Sntesis de un transcrito prim ario de RNA (un precursor de mRNA) por la RNA polim erasa II. Este

DNA

transcrito de RNA naciente

ELONGACION DE LA CADENA 5' cap EL CRECIMIENTO DE LA CADENA CONTINA, PERO EL TRANSCRITO CARECE DE CAPERUZA EN EL EXTREMO 5' Y ES DEGRADADO RPIDAMENTE

Gppp

CORTE

Gppp
ADICION DE COLAS POLI-A

Gppp
! ____ I

TERMINACION
.AP^AA A AA4 oh

5' cap

3' l____________________ poli A

diagrama se inicia con una polimerasa que acaba de empezar la sntesis de una cadena de RNA (etapa 4 de la Figura 8-43). El reconocimiento de una seal de poliadenilacin provoca el corte de la cadena en crecimiento y la poliadenilacin. En las levaduras, la polimerasa termina la sntesis poco despus, pero en las clulas eucariotas superiores frecuentemente contina la transcripcin durante miles de nucletidos ms. Parece que cuando la RNA polimerasa ha poliadenilado el transcrito, cambia sus propiedades; ya no es capaz de seguir cortando y poliadenilando las secuencias posteriores, y tiene una mayor probabilidad de responder a las seales de terminacin de la cadena y de liberarse. La hiptesis ms simple, que se presenta en la figura, es que despus del corte del transcrito se libere un factor de elongacin (o ms de uno) de la polimerasa.

transcrito prim ario de RNA (precursor de mRNA)

protenas; adems, parece que esta caperuza proteje al transcrito de RNA en cre cimiento de su degradacin. En muchos transcritos de RNA polimerasa II, el extremo 3 se define no por el final de la transcripcin sino por una segunda modificacin, segn la cual el transcrito en crecimiento es cortado en un lugar especfico y al extremo 3 cortado se le aade una c a d e n a d e poli-A mediante la accin de una polimerasa diferente. La seal para el corte consiste en la aparicin en la cadena de RNA de la secuen cia AAUAAA localizada entre 10 y 30 nucletidos por delante del lugar de corte, adems de unas secuencias poco caracterizadas por detrs del lugar de corte. In mediatamente despus del corte, una enzima polimerasa de poli-A aade de 100 a 200 residuos de cido adenlico (en forma de poli-A) al extremo 3 de la cadena de RNA completando el tr a n s c r ito p rim a rio d e RNA. Sin embargo, la polimerasa contina transcribiendo de forma infructuosa durante cientos o miles de nu cletidos, hasta que se produce el final de la transcripcin en alguno de los lu gares de term inacin posteriores; probablem ente, la molcula extra de RNA generada de esta forma carecer de la caperuza en 5 y ser degradada rpida mente (Figura 8-49). La cola poli-A parece tener varias funciones. (1) Como se describir des pus, colabora en la exportacin del mRNA maduro desde el ncleo; (2) se cree que influye en la estabilidad de al menos algunos mRNA en el citoplasma; (3) pa rece servir como una seal de reconocim iento para el ribosoma que se requiere para una traduccin eficiente del mRNA. Esta ltima funcin -e n combinacin con la caperuza 5 - podra permitir a un ribosoma determinar si el mRNA est intacto antes de consumir energa y precursores al iniciar su traduccin. Aunque los transcritos de la RNA polimerasa II suponen ms de la mitad del RNA que sintetiza una clula, como se ver ms adelante estos transcritos son

396

Captulo 8 : El ncleo celular

Tabla 8-3 Datos seleccionados sobre cantidades de RNA en una clula de mamfero tpica Cantidad constante (porcentaje del RNA celular total)
Precursores del rRNA nuclear 4

Porcentaje de la sntesis de RNA total

39

1
rRNA citoplasm tico hnRNA nuclear 71 7 - 58

mRNA citoplasm tico RNA pequeos estables (la m ayor parte tRNA)

3 15

Los datos incluidos en la tabla proceden del anlisis de una lnea celular de fibroblastos de ra tn (clulas L) en cultivo. Cada clula contiene 26 pg de RNA (5 x 1010 nucletidos de RNA), de los cuales alrededor del 14% estn localizados en el ncleo celular. (As pues, el ncleo contie ne unas dos veces ms DNA que RNA.) Durante la interfase, cada minuto polimerizan a RNA una media de 200 x 106 nucletidos, lo cual corresponde aproximadamente a 20 veces la veloci dad de sntesis de DNA durante la fase S. Hay que destacar que aunque la mayor parte del RNA sintetizado sea hnRNA, la mayor parte se degrada en el ncleo. Como resultado de ello, el mRNA producido a partir del hnRNA es slo una fraccin minoritaria del RNA total de la clula. (Modificado de B.P. Brandhorst y E.H. McConkey,/. Mol. Biol. 85:451-563,1974.)

inestables, y por lo tanto de vida corta. As pues, el hnRNA del ncleo celular y el mRNA citoplasmtico, derivado de l, slo constituyen una pequea parte del total de RNA de una clula (Tabla 8-3). A pesar de que su concentracin es relati vamente baja, estas molculas de RNA se pueden purificar de forma eficiente gracias a la presencia de sus largas colas de poli-A. Cuando se hace pasar una mezcla de RNA celular total a travs de una columna cromatogrfica llena de poli dT unido a un soporte slido, el apareamiento complementario de las bases entre T y A hace que las molculas que presentan colas poli-A queden retenidas en la columna; posteriormente, estas molculas unidas pueden liberarse para su anlisis. Este procedimiento se utiliza ampliamente para separar las molculas de hnRNA y de mRNA de las de RNA ribosmico y de RNA de transferencia, pre dominantes en la clula. nicam ente tienen caperuzas 5 y colas poli-A los transcritos de la RNA polimerasa II. Esto parece deberse a que tanto la reaccin de formacin de la cape ruza como la de adicin de poli A son llevadas a cabo por enzimas que se unen selectivamente a la RNA polimerasa II. As pues, si un gen que normalmente se transcribe por la polimerasa II, se separa de su promotor mediante mtodos de DNA recom binante y se une a un promotor reconocido por la RNA polimerasa I o por la polimerasa III, los transcritos de RNA producidos por dichas polimerasas no sern modificados por adicin de caperuzas o poliadenilados. Los requeri mientos para la formacin de la caperuza y para la poliadenilacin de los pre cursores de los mRNA podra explicar por qu en los eucariotas estos RNA son sintetizados por un tipo especfico de RNA polimerasa.

El procesamiento del RNA elim ina largas secuencias nucleotdicas del interior de las molculas de RNA33
El descubrimiento en 1977 de los genes interrumpidos fue completamente ines perado. Estudios previos realizados en bacterias mostraron que sus genes esta ban formados por una cadena continua de nucletidos, necesarios para codifi car la secuencia de aminocidos de una protena, y no pareca existir ninguna

Sntesis y procesamiento del RNA

397

razn obvia para que un gen tuviera que estar organizado de otra manera. Los primeros indicios de que los genes de clulas eucariotas no eran continuos como los genes bacterianos se produjeron cuando los nuevos mtodos que permitieron comparar con precisin las secuencias de DNA y de mRNA se aplicaron a los mRNA producidos por un adenovirus humano (un virus DNA de gran tamao). La regin del DNA vrico responsable de la codificacin de estos RNA contena secuencias que no se encontraban en los RNA maduros. Rpidamente se descar t la posibilidad de que sta fuera una caracterstica propia de los virus, ya que se encontraron resultado similares en el gen de la (3-globina y en el de la ovoalbmina de vertebrados. Como se ha citado previamente, las secuencias presentes en el DNA y omitidas en el RNA se conocen como intrones, mientras que las presentes en ambas molculas se denominan exones (vanse Figuras 8-50 y 8-51). Antes del descubrimiento de los intrones era un misterio el significado del hnRNA y su relacin con el mRNA. Se conoca desde haca tiempo que la mayor parte del RNA sintetizado por la RNA polimerasa II era degradado con rapidez en el ncleo. Las molculas de hnRNA de clulas en cultivo pueden ser m arca das radiactivamente por exposicin breve a uridina-3H y seguidas durante un largo perodo de tiempo. Este tipo de experimento mostr que el tamao medio de las molculas de hnRNA en la poblacin marcada decrece con rapidez, desde una media de 7000 nucletidos, hasta alcanzar el tamao de las molculas de mRNA citoplasmticas (una media de 1500 nucletidos) despus de slo 30 m i nutos; aproximadamente al mismo tiempo, molculas de RNA marcadas radiac tivamente empezaban a abandonar el ncleo como molculas de mRNA. Sin embargo, tan slo el 5% de la masa del hnRNA marcado alcanzaba alguna vez el citoplasma; el resto se degradaba en pequeos fragmentos en el ncleo a lo lar go de un perodo de una hora. Pareca un extrao derroche. El misterio se hizo an mayor cuando se supo que a pesar de que las molculas de hnRNA se ha can cada vez ms cortas, m antenan su caperuza 5 y su cola poli-A en 3 . El descubrimiento de los intrones aport la explicacin de este misterio; el transcrito primario de RNA es una copia completa del gen, que contiene tanto las secuencias de los exones como de los intrones, y estas ltimas se eliminan del interior del transcrito de RNA produciendo una molcula de mRNA que co difica directamente una protena (vase Figura 3-15). Las secuencias codifican tes de RNA de cada extremo de la secuencia de un exn se unen con las del exn adyacente eliminado las secuencias de intrn comprendidas entre ellas, siguien do una reaccin denominada m aduracin del RNA por corte y empalme (RNA splicing). La maduracin del RNA tiene lugar en el ncleo, fuera del alcance de los ribosomas; el RNA se exporta al citoplasma nicamente cuando el procesa miento ya ha terminado. Debido a que muchos genes de mamfero contienen mucha ms cantidad de secuencia de intrones que de exones (vase Tabla 8-1, pg. 365), la madura cin del RNA puede explicar la conversin de molculas de hnRNA muy largas en molculas de mRNA citoplasmtico mucho menores. Antes de discutir la distribucin de los intrones en los genes eucariotas y al gunas de sus consecuencias para la funcin celular, es necesario explicar de qu forma la maquinaria enzimtica de la maduracin del RNA reconoce y elimina las secuencias de los intrones.

Figura 8 -50 Prim era evidencia de la existencia de intrones en los genes eucariotas. La evidencia fue aportada

por la tcnica de los bucles R mediante la cual al microscopio electrnico se visualizan complejos de mRNA y DNA apareados. Se purifica un mRNA extraordinariamente abundante, como el de la (3-globina o el de la ovoalbmina, a partir de las clulas especializadas que lo producen. Cuando esta preparacin de mRNA de cadena sencilla se hbrida, en una solucin apropiada, con un fragmento de DNA clonado de doble cadena que contiene el gen que codifica el mRNA, el RNA puede desplazar una de las cadenas del DNA e hibridarse en las regiones en las que exista una complementariedad de secuencia, formando regiones de hlice DNA-RNA. Las regiones de DNA que no se hibridan con las secuencias de RNA se visualizan claramente como bucles de DNA de doble cadena. Cada uno de estos bucles (numerados del 1 al 6) corresponden a un intrn de la secuencia del gen.

Los transcritos hnRNA son inm ediatam ente recubiertos por protenas y snRNP 34
A diferencia de lo que ocurre en las bacterias, en los eucariotas parece que el RNA recin sintetizado se condensa inmediatamente formando una serie de partculas ribonucleoproteicas muy prximas. Cada una de ellas est formada por unos 500 nucletidos de RNA recubiertos de un abundante complejo de pro tenas que acta empaquetando y condensando todos los transcritos de RNA en crecimiento, de una forma que recuerda a los complejos de DNA y protenas de los nucleosomas. Estas partculas hnRNP (de Heterogeneous Nuclear Ribonu-

398

Captulo 8 : El ncleo celular

Figura 8-51 Regin transcrita del gen de la (3-globina hum ana. Se indica la secuencia de la cadena de DNA que corresponde a la secuencia de mRNA, con la secuencia correspondiente al transcrito primario limitada por una lnea de color verde y los nucletidos de las tres regiones codificantes (exones) som b rea d o s en am a rillo . Es de destacar que el exn 1 comprende una secu en cia ld er 5 , y que el exn 3 comprende una secu en cia 3 no trad u cid a ; aunque estas secuencias se hallan en el mRNA no codifican aminocidos. Se han recuadrado los nucletidos GT y AG, muy conservados, en el inicio y final de los intrones (vase Figura 8-53); tambin se seala con un recuadro el lugar de corte del transcrito primario y la seal de poliadenilacin cerca del extremo 3 del gen (AATAAA, vase Figura 8-49).

CCCTGTGGAGCCACACCCTAGGGTTGGCCA ATCTACTCCCAGGAGCAGGGAGGGCAGGAG CCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAG CCATCTATTGCTTACATTTGCTTCTGACAC AACTGTGTTCACTAGCAACTCAAACAGACA CCATGGTGCACCTGACTCCTGAGGAGAAGT CTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGA ACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGG

IgIgGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGT TTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCATGTG

GAGACAGAGAAGACTCTTGGGTTTCTGATA GGCACTGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTAT TTTCCCACCCTTAGGCTGCTGGTGGTCTAC

CCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTT GGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATG GGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAG AAAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTG GCTCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTT GCCACACTGftGTGAGCTGCACTGTGACAAG

cleoprotein Partiles, partculas ribonucleoproteicas nucleares heterogneas) re sultantes pueden ser purificadas despus de tratar ligeramente los ncleos con ribonucleasas a concentraciones suficientes para degradar slo el RNA espacia dor que existe entre ellas. Cada partcula tiene un dimetro de unos 20 nm, que es el doble del de un nucleosoma, y el ncleo proteico, mucho ms complejo y menos caracterizado, est formado al menos por ocho protenas distintas. A ex cepcin de las histonas, las protenas que forman este ncleo son las ms abun dantes del ncleo de la clula. Algunas de ellas contienen un dominio de unos 80 aminocidos, repetido frecuentemente, y comn a muchas otras protenas de unin a RNA. Las partculas hnRNP suelen distorsionarse por las tcnicas clsicas de pre paracin de extensiones de cromatina para la observacin al microscopio elec trnico de genes en fase de transcripcin (vase Figura 8-45). Sin embargo estas micrografas revelan la existencia sobre muchos transcritos de RNA de unas par tculas especialmente estables y menos frecuentes, cuya posicin sugiere que juegan un papel en la maduracin del RNA. Estas partculas se generan muy r pidamente sobre secuencias especficas de RNA -e n las uniones intrn-exn o cerca de ellas- y, cuando el transcrito crece, estas partculas se unen en parejas dando lugar a un complejo mayor que se cree es el espliceosoma (de splicing, maduracin), que cataliza la maduracin del RNA (Figura 8-52). Anlisis bioqumicos han revelado que en el ncleo se encuentran muchos com plejos de protenas con pequeas molculas de RNA (generalmente RNA de 250 nucletidos o menos). A estos complejos se les denomina arbitrariamente RNA U l, U 2 ,..., U12. Estos com plejos conocidos como ribonucleoprotenas nu cleares pequeas (snRNP, de Small Nuclear RiboNucleoProteins y pronunciado snurps) recuerdan a los ribosomas, pues cada uno de ellos contiene un con junto de protenas que est acomplejado con una molcula de RNA estable. Sin embargo son mucho menores que los ribosomas -250 000 daltons frente a los 4,5 millones de daltons de un ribosom a- y tienen una relacin protena/RNA algo superior. Algunas protenas se encuentran en diferentes partculas mientras que otras son especficas de un solo tipo de ellas. Este hecho se pudo demostrar por primera vez en el suero de enfermos de lupus eritomatoso sistmico, enfer medad en la que se fabrican anticuerpos dirigidos contra una o ms protenas de sus snRNP: por ejemplo, se localiz un anticuerpo que reconoca las partculas snRNP U l, U2, U5 y U4/U6, y ahora sabemos que todas estas partculas tienen una protena en comn. Parece que las snRNP individuales reconocen secuencias especficas del ci do nucleico mediante la complementariedad de bases RNA-RNA. Algunas estn implicadas en la maduracin del RNA; se sabe que una de ellas est implicada en la reaccin de corte que genera el extremo 3 de los RNA de histonas recin sintetizados, mientras que las funciones de las otras es desconocida. La eviden cia de que las snRNP participan en la maduracin del RNA procede de experi mentos de procesamiento de RNA in vitro, as como de anlisis de levaduras mutantes en alguno de los com ponentes de la snRNP.

CTGCACGTGGATCKTGAGRACTTCAGGrlTG AGTCTATGGGACCCTTGATGTTTTCTTTCC CCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCAT AGGAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACAGTTT AGAATGGGAAACAGACGAATGATTGCATCA GTGTGGAAGTCTCAGGATCGTTTTAGTTTC TTTTATTTGCTGTTCATAACAATTGTTTTC TTTTGTTTAATTCTTGCTTTCTTTTTTTTT CTTCTCCGCAATTTTTACTATTATACTTAA TGCCTTAACATTGTGTATAACAAAAGGAAA TATCTCTGAGATACATTAAGTAACTTAAAA AAAAACTTTACACAGTCTGCCTAGTACATT ACTATTTGGAATATATGTGTGCTTATTTGC ATATTCATAATCTCCCTACTTTATTTTCTT TTATTTTTAATTGATACATAATCATTATAC ATATTTATGGGTTAAAGTGTAATGTTTTAA TATGTGTACACATATTGACCAAATCAGGGT AATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCT TTCTTCTTTTAATATACTTTTTTGTTTATC TTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTC TTTCAGGGCAATAATGATACAATGTATCAT GCCTCTTTGCACCATTCTAAAGAATAACAG TGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAAT ATTTCTGCATATAAATATTTCTGCATATAA ATTGTAACTGATGTAAGAGGTTTCATATTG CTAATAGCAGCTACAATCCAGCTACCATTC TGCTTTTATTTTATGGTTGGGATAAGGCTG GATTATTCTGAGTCCAAGCTAGGCCCTTTT GCTAATCATGTTCATACCTCTTATCTTCCT CCCACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTCTG
TGTGCTGGCCX^TCACTTTGGCAAAGAATT CACCCCACCAGTGCAGGCTGCCTATCAGAA AGTGGTGGCTGGTGTGGCTAATGCCCTGGC

CCACAAGTATCACTAAGCTCGCTTTCTTGC TGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTT CCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATA TTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTG CCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAA TGATGTATTTAAATTATTTCTGAATATTTT ACTAAAAAGGGAATGTGGGAGGTCAGTGCA TTTAAAACATAAAGAAATGATGAGCTGTTC AAACCTTGGGAAAATACACTATATCTTAAA CTCCATGAAAGAAGGTGAGGCTGCAACCAG CTAATGCACATTGGCAACAGCCCCTGATGC CTATGCCTTATTCATCCCTCAGAAAAGGAT TCTTGTAGAGGCTTGATTTGCAGGTTAAAG TTTTGCTATGCTGTATTTTACATTACTTAT TGTTTTAGCTGTCCTCATGAATGTCTTTTC

Sntesis y procesamiento del RNA

(A)

I-----------------1 200 nm

(B) 5' p | \ exn intrn

\ exn

DNA

Las secuencias intrnicas se elim inan de las molculas de RNA en form a de lazo 35
Los intrones tienen un tamao que oscila desde 80 hasta ms de 10 000 nucleti dos. A diferencia de los exones, su secuencia de nucletidos exacta no parece ser importante. As pues los intrones han acumulado una gran cantidad de muta ciones durante la evolucin; en muchos casos es posible alterar la mayor parte de la secuencia de un intrn sin que la funcionalidad del gen se vea afectada. Todo ello ha llevado a la idea de que las secuencias intrnicas no tienen ninguna funcin sino que son "chatarra gentica, hiptesis que se discutir con detalle al final del captulo. Las nicas secuencias de los intrones que estn muy conser vadas son las que son necesarias para su eliminacin. As pues, en cada uno de los extremos de un intrn existen secuencias consenso que son casi idnticas en todos los intrones conocidos, y que no se pueden alterar sin afectar gravemente el proceso de maduracin normal del transcrito de RNA. En la Figura 8-53 se muestran estas secuencias de frontera del lugar de corte 5 (lugar dador) y del lugar de corte 3' (lugar aceptor) de los intrones de eucariotas superiores. Las re acciones de corte y posterior empalme se han de realizar con una gran precisin, ya que un error en un solo nucletido hara variar la pauta de lectura de la se cuencia del mRNA resultante, produciendo un m ensaje sin sentido. La va por la que se eliminan las secuencias intrnicas de los transcritos pri marios de RNA se ha deducido mediante estudios in vitro en los cuales se prepa ra, mediante la transcripcin con RNA polimerasa purificada de un fragmento de DNA adecuado, una especie nica de RNA que contiene un nico intrn (va se Figura 7-36). Cuando se aaden estas molculas de RNA a un extracto celular, empieza la maduracin a travs de una reaccin enzimtica en dos etapas, las cuales requieren una incubacin prolongada con ATP, la presencia de determi nadas protenas en el extracto, las partculas snRNP U l, U2, U5, y U4/U6, y una serie de protenas adicionales; estos com ponentes se ensamblan formando un gran com plejo ribonucleoproteico, el espliceosoma. La caracterizacin de las especies de RNA que aparecen como intermediarios durante la reaccin y de las partculas snRNP necesarias llev al descubrimiento de que el intrn se escinde en forma de lazo, siguiendo las vas de maduracin que se muestran en las Figu ras 8-54 y 8-55. Se han descrito algunas funciones individuales para algunas de las snRNP. Por ejemplo snRNP U l se une al lugar de corte 5 del intrn guiado por la complementariedad de secuencia del RNA U l con la secuencia de nueve nucletidos consenso (vase Figura 8-53). Debido a que el RNA es capaz de actuar como una
secuencia 5' del exn ir secuencia del intrn secuencia 3' del exn

Figura 8 -5 2 Espliceosom as. (A) Electronmicrografas de cromatina descondensada mostrando grandes com plejos ribonucleoproteicos ensamblados en los lugares de corte 5 y 3 formando el espliceosoma. A partir de un gen codificante de una protena del corion de Drosophila, se estn produciendo transcritos RNA, de modo que se han determinado las posiciones de los lugares de corte sobre el transcrito primario de RNA. Como se observa en el esquema (B) la mayor parte de los transcritos de RNA tienen una o dos grandes partculas RNP cerca de sus extremos 5 . En la parte inferior se muestra un esquema del gen. Cuando en un transcrito se presentan dos partculas [crculos abiertos de (B)], tienen un tamao medio de 25 nm y se presentan en las proximidades de los lugares de corte 5 y 3 de la pequea secuencia intrnica (228 nucletidos), cerca del extremo 5 de los transcritos. Frecuentem ente, los transcritos ms maduros, y ms largos de los dos genes presentan una partcula de mayor tamao [crculos verdes en (B)] en la regin del intrn, que probablem ente es el resultado de la asociacin estable de las dos partculas menores y que representa el espliceosoma ensamblado. Dado que en algunas ocasiones (incluyendo el ejemplo mostrado en esta figura) el proceso de corte y eliminacin de los intrones tiene lugar mientras el extremo 3 de la molcula est siendo transcrito, probablem ente para que se d este proceso no es necesaria la presencia de la cola poli-A en el extremo 3 . Debido a las condiciones utilizadas para la obtencin de la cromatina, la mayor parte de las protenas hnRNP han sido eliminadas de los transcritos de la micrografa. (Adaptado de Y.N. Osheim, O.L. Miller y A.L. Beyer, Cell 4 3 :1 4 3 -1 5 1 ,1985. Cell Press.)

C A 5' o A G GU o A G U A G secuencia consenso 5' para el lugar de corte 5' ("lu gar dador"
400

U U U U U U U U U U U C G o o o o o o o o o o o N o AG o 3' C C C C C C C C C C C U A punto de ram ificacin A secuencia consenso 3' para el lugar de corte 3' ("lugar aceptor")

-------------- 11--------------

Figura 8-53 Secuencia consenso para los lugares de corte 5 y 3 usados en la maduracin del RNA en los eucariotas superiores. La secuencia indicada corresponde a la de la cadena de RNA; los dinucletidos casi invariantes, GU y AG, de ambos extremos del intrn se han destacado en amarillo (vase tambin Figura 8-51).

Captulo 8 : El ncleo celular

lugar de corte 5' U1 snRNP

U2 u z ssnRNP rm rc r

lugar de corte 3'

E , APA 2 CORTE POR EL LUGAR DE CORTE 3' V UNIN DE LOS EXONES secuencia del ntrn liberado en form a de lazo (ser 13' degradado del ncleo) OH mRNA m aduro (secuencias exnicas unidas)

enzima, tanto el RNA como los com ponentes proteicos del espliceosoma po dran ser los responsables de catalizar el corte y la formacin de las uniones covalentes necesarios en la maduracin del RNA.

Figura 8-54 Mecanismo de m aduracin por corte y empalm e del RNA La maduracin del RNA est catalizada por el espliceosoma formado por la unin de las snRNP U l, U2, U5 y U4/U6 (mostradas como crcu los verdes) y de otros com ponentes (no mostrados). Despus del ensam blaje del espliceosoma, la reaccin tiene lugar en dos etapas: en la etapa 1 un nucletido A especial de la secuencia intrnica situado cerca del lugar de corte 3 reacciona con la secuencia de corte del lugar 5 , la cual es cortada; el extremo 5 cortado de la secuencia del intrn se une covalentem ente a este nucletido A, formando un nucletido ramificado, com o se aprecia en la Figura 8-55. En la etapa 2, el extremo 3 -OH del primer exn que estaba expuesto en la primera etapa, se aade al inicio del segundo exn, cortando la molcula por el lugar de corte 3 ; las dos secuencias exnicas quedan unidas y el intrn se libera en forma de lazo. El com plejo com pleto del espliceosom a sedim enta a 60S, lo que indica que es casi tan grande com o un ribosoma. Estas reacciones de maduracin tienen lugar en el ncleo y producen molculas de mRNA a partir de los transcritos primarios de RNA (molculas precursoras de los mRNA).

Habitualmente de cada transcrito de RNA se elim inan muchas secuencias intrnicas 36

Debido a que el espliceosoma parece reconocer fundamentalmente una secuen cia consenso que delimita la frontera del intrn (y estas secuencias consenso son similares para todas las secuencias de intrn), el lugar de corte 5 (lugar dador) del extremo de un intrn se puede unir al lugar de corte 3 (lugar aceptor) de cual quier otro intrn. As pues, cuando se crea artificialmente una molcula de RNA, con lugares dadores y aceptores de diferentes intrones insertados, frecuentemen te el RNA existente entre ellos es reconocido por el espliceosoma y eliminado. A la vista de este resultado, es sorprendente que los genes de los vertebrados contengan hasta 50 intrones (vase Tabla 8-1, pg. 365). Si durante la madura cin del RNA se desaparea cualquiera de los lugares de corte 5 con cualquiera de los 3 , podran perderse algunas secuencias codificantes del mRNA, con con secuencias desastrosas. Sin embargo la maquinaria de maduracin del RNA pre viene, de alguna forma, estos errores, garantizando que cada lugar de corte 5 slo se aparee con el lugar de corte 3 ms prximo situado en sentido 5-3 en la

Figura 8-55 Estructura de la cadena ramificada de RNA que se form a durante la m aduracin del RNA. El nucletido A mostrado en a m a r illo en la figura es el nucletido que se destaca en la Figura 8-54. La ramificacin se forma en la primera etapa de la reaccin de maduracin ilustrada all, cuando el extremo 5 del intrn se acopla covalentemente al 2 -OH de la ribosa del nucletido A localizado a unos 30 nucletidos del extremo 3 de la secuencia del intrn. La cadena ramificada permanece en el intrn escindido y es responsable de su forma en lazo (vase Figura 8-54).

extrem o 3' de la secuencia del intrn

401

Sntesis y procesamiento del RNA

inicio AUG

transcrito prim ario de RNA secuencia secuencia paro de un exn de un intrn D5 A5 D6 A6 D7 im i |i| A A A - OH A7

D3 A3 D1 A l D2 A2 D4 A4

^ ----------------------------- -8000 nucle tido s-----------------------------------^ SECUENCIAS INTRONICAS ELIMINADAS POR LA MADURACIN DEL RNA inicio paro mRNA
I_____ I

Figura 8 -56 M aduracin del transcrito prim ario de RNA del gen de la ovoalbmina de gallina. El esquema muestra la eliminacin ordenada de siete intrones, necesaria para obtener una molcula de mRNA funcional. El lugar de corte 5 (lugar dador) se seala con una D y el lugar de corte 3 (lugar aceptor) con una A.

(+ )G p p p - I ^ ^ M M A A A -O H 5' 3' TRADUCCION

H2N ~ | ! COOH ovoalbm ina

protena

secuencia lineal del RNA (Figura 8-56). Se desconoce cmo se produce este apa reamiento secuencial de los lugares de corte, aunque se cree que el ensamblaje del espliceosoma, ya durante el crecim iento del transcrito de RNA (vase Figura 8-52), juega un papel importante en cuanto a asegurar el apareamiento correcto de los lugares de corte. Adems, existen evidencias de que la conformacin tridi mensional adoptada por las secuencias de intrones y exones en el transcrito de RNA es importante. Sin embargo, se ver en el Captulo 9 que este patrn de m a duracin sencillo 5 -3 puede modificarse por mecanismos de control especiali zados que permitiran a un gen nico producir diferentes mRNA y de esta forma diferentes protenas.

El estudio de la talasem ia revela de qu form a la maduracin del RNA puede perm itir que las protenas evolucionen 37
Las tcnicas del DNA recombinante han hecho de los mutantes humanos un re curso cada vez ms importante para los estudios genticos de los mecanismos ce lulares. Por ejemplo, existe un grupo de enfermedades genticas humanas deno minadas sndrom es de talasem ia, que en el individuo afectado producen un nivel anormalmente bajo de hemoglobina -la protena transportadora del oxgeno en la sangre. En ms de 50 de estos mutantes se ha determinado la alteracin de la secuencia del DNA; en una gran parte de ellos se presentan alteraciones en el pa trn de la maduracin del RNA. As, se ha detectado que un cambio de un ncleotido puede inactivar un lugar de corte. Sorprendentemente, a partir del anlisis de los mRNA producidos en estos individuos mutantes se ha observado que la prdi da de un lugar de corte no evita la eliminacin de ese intrn sino que en muchos casos el lugar de corte complementario se une a un lugar de corte crptico situa do en las proximidades; frecuentemente se generan una serie de maduraciones alternativas, de modo que en lugar de producirse una sola protena se generan una serie de protenas alteradas (vase Figura 8-57). Otros cambios de un nucletido crean un nuevo lugar de corte cambiando una secuencia de un intrn o exn en una secuencia consenso de maduracin. Estos resultados apoyan la idea de que en los eucariotas superiores la maduracin del RNA es un proceso flexible, y sugieren que las variaciones del patrn de maduracin causadas por mutaciones al azar podran ser una va importante en la evolucin de genes y organismos.

402

Captulo 8 : El ncleo celular

(A) TRANSCRITO PRIMARIO DE LA -GLOBINA DE UN ADULTO NORMAL

exon exon

(B) EL CAMBIO DE UN NUCLETIDO GENERA OTRO LUGAR DE CORTE

2
intrones

AAAA

X \

_____

A mRNA con el exn 2 m ayor

A

' AAAA

se form a un m RNA norm al a partir de los tres exones

.n

/\

(C) CAMBIO DE UN SOLO NUCLETIDO QUE DESTRUYE UN LUGAR DE CORTE NORMAL Y PERMITE LA APARICIN DE LUGARES DE CORTE "CRPTICOS" ALTERNATIVOS
I II I T

m RNA con un exn extra insertado entre los exones 2 y 3

AAAA

AAAA

(D) CAMBIO DE UN NUCLEOTIDO QUE DESTRUYE UNA SEAL DE POLIADENILACIN AAAA mRNA con una regin 3' no traducida anorm alm ente larga

varios m RNA con un exn 1 acortado o alargado

__

i i

AAAA mRNA con el exn 3 alargado

Probablem ente la maduracin del RNA catalizada por el espliceosom a evolucion a partir de mecanismos de automaduracin 38
El descubrimiento del intermediario en lazo en la maduracin nuclear de los RNA confundi inicialmente a los bilogos moleculares. Por qu se utiliza esta va com pleja cuando aparentemente parece ms simple unir los lugares de corte 5 y 3 en una primera etapa, y luego cortar y volver a unir? La respuesta parece encontrarse en la manera como evolucion el espliceosoma. Como se ha explicado en el Captulo 1, se cree que las primeras clulas utili zaban molculas de RNA -e n lugar de protenas- como catalizadores principales y que alm acenaban la informacin gentica en molculas de RNA -e n lugar de molculas de DNA. Posiblemente, en aquellos tiempos las reacciones de corte y empalme de RNA catalizadas por RNA jugaron un importante papel; an existen algunos intrones que presentan capacidad de autorrecorte -p or ejemplo, en los genes nucleares de rRNA de Tetrahymena, en el bacterifago T4, y en algunos genes mitocondriales y de cloroplastos. Una secuencia intrnica con automadu racin se puede identificar en el tubo de ensayo incubando una molcula de RNA pura que contenga la secuencia intrnica y observando la reaccin de m a duracin; tambin se puede identificar a partir de la propia secuencia del RNA, dado que una gran parte de sta ha de ser conservada para que al plegarse forme una superficie cataltica en la molcula del RNA. Se pueden diferenciar dos gru pos principales de intrones con capacidad de automaduracin. Los intrones del grupo /, que inician la reaccin de automaduracin uniendo un nucletido G a la secuencia del intrn; la G es activada formando el grupo que romper el pri mero de los enlaces fosfodister cortado durante el proceso de maduracin (el enlace del lugar de corte 5 ). En los intrones del grupo II el grupo atacante es un residuo A especialmente reactivo, y se genera un intermediario en lazo. El resto de los mecanismos de la reaccin son similares. Se cree que ambos representan vestigios de mecanismos muy primitivos (Figura 8-58). Al parecer durante la evolucin del proceso de maduracin del RNA nuclear, se ha conservado la va de reaccin utilizada por los intrones de automaduracin del tipo II, siendo reemplazada la funcin cataltica por un espliceosoma independien te. As, los pequeos RNA U1 y U2 podran ser, por ejemplo, los remanentes de las

Figura 8 -57 Ejemplos de procesam iento anorm al del transcrito prim ario de la (i-globina en hum anos con (3-talasemia. El lugar afectado por la mutacin se ha sealado con una ca b e z a negra d e flec h a . Las ca ja s co lo rea d a s en azu l oscu ro representan los tres exones normales, mostrados previamente en la Figura 8-51, y las ln eas con tin u as rojas unen los lugares de corte 5 y 3 utilizados en la maduracin del transcrito primario de RNA producido por el gen. Las ca jas c o lo rea d a s d e a zu l claro indican nuevas secuencias que debido a la mutacin quedan incluidas en la molcula final de mRNA. Hay que destacar que cuando una mutacin elimina un lugar de corte normal, aparecen uno o ms lugares de corte crpticos alternativos, que se aparean con el lugar de corte remanente, com o ocurre en (C). (De S.H. Orkin en The Molecular Basis of Blood Diseases [G. Stanatoyannopoulos et al. eds.], pp. 106-126. Philadelphia: Saunders, 1987.)

Sntesis y procesamiento del RNA

403

Grupo I de intrones de automaduracin

Grupo II de intrones de automaduracin

secuencia 5' de un exn

secuencia \ del intrn secuencia secuencia 3' de un exn T 5' de un exn' \ HCRA m olcula de RNA 5^ precursora

interm ediario transitorio

\\

//

U 3'

OH

secuencia intrnica escindida secuencia de los exones unidos

/, ( \ \

Figura 8-5 8 Las dos clases conocidas de intrones de autom aduracin. Los intrones del grupo I unen un nucledtido G libre a un lugar especfico para iniciar el proceso (vase Figura 3secuencia 21). Los intrones del grupo II usan, 3 de un exn para el mismo propsito, un nucletido A especialm ente reactivo I .. .I 31 de la propia secuencia del intrn. Se han dibujado los dos mecanism os resaltando sus similitudes. En ambos mecanism os participan protenas que contribuyen a acelerar la reaccin, pero la catlisis est producida por el RNA del intrn. El mecanism o utilizado por los intrones del grupo II forma un lazo, recordando la va catalizada por el espliceosoma (comparar con la Figura 8-54). (De T.R. Cech, Cell 4 4 :2 0 7 -2 1 0 ,1 9 86. Cell lazo Press.)

A V

5T

secuencias catalticas que originalmente estuvieron presentes en los intrones. Pro bablemente al desaparecer las funciones catalticas de los intrones y pasar al espli ceosoma desaparecieron tambin las limitaciones a la evolucin de las secuencias intrnicas, permitiendo que muchas de ellas evolucionaran rpidamente.

El transporte de los mRNA al citoplasm a se retrasa hasta que la m aduracin se ha completado 39

Se cree que las molculas de mRNA maduras son reconocidas por protenas re ceptoras del com plejo del poro nuclear y transportadas activamente al citoplas ma (discutido en el Captulo 12). Por el contrario, las principales protenas de las partculas hnRNP y varias de las molculas de procesamiento unidas al RNA es tn confinadas en el ncleo, aunque ocasionalm ente algunas de ellas pasan al citoplasma con el mRNA antes de ser separadas rpidamente y devueltas al n cleo (Figura 8-59).

ribosom a
C ITO SO L

protenas citoplasm ticas de unin al RNA

poro nuclear

iteri am bii de

__________ i
200 nm

Figura 8-59 Transporte de molculas de mRNA a travs de los poros nucleares. (A) Ilustracin esquemtica del cam bio que al parecer ocurre en las protenas unidas a la molcula de RNA cuando se desplazan hacia el exterior del ncleo. (B) Electronmicrografa de una gran molcula de mRNA producida en una glndula salival de insecto; aparentemente, esta molcula (flecha) ha sido cazada en el mom ento en que sala del ncleo al citoplasma. (B, de B J. Stevens y H. Swift, /. Cell B iol 3 1 :5 5 -7 7 ,1 9 6 6 , con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

404

Captulo 8 : El ncleo celular

Estudios realizados en mutantes de levadura sugieren que para los RNA que contienen intrones este proceso slo es posible cuando ha finalizado com pleta mente la maduracin del RNA. Cuando una mutacin crea un defecto en la m a quinaria de maduracin, los precursores del mRNA no procesados permanecen en el ncleo, mientras que los mRNA que no necesitan maduracin (lo que in cluye la mayor parte de los mRNA en esta sencilla clula eucariota), son trans portados normalmente al citoplasma. Esta observacin es consistente con la idea de que los RNA son retenidos por los com ponentes de los espliceosomas, que al parecer forman grandes agregados en el interior de los ncleos eucariotas. Estos agregados podran actuar com o islas de maduracin (Figura 8-60); aunque se desconoce cmo estn formados y cmo funcionan, podran ser an logos al nuclolo, una estructura nuclear mucho mayor en tamao y ms conspi cua, y de la que se conoce m ejor su organizacin y su funcin. El nuclolo es el lugar donde se procesan las molculas de RNA ribosmico (rRNA) a partir de un precursor de mayor tamao, las cuales se ensamblan en los ribosomas por unin de protenas ribosomales. Antes de discutir la estructura del nuclolo, es necesario considerar cmo se sintetizan los precursores de los rRNA a partir de los genes de rRNA.

i_____________ i 10 Jim Figura 8-60 Posibles islas de

m aduracin (splicingislands). Inmunofluorescencia de un ncleo de fibroblasto humano con un anticuerpo monoclonal que detecta las partculas snRNP implicadas en la maduracin de los precursores de las molculas de mRNA. Las partculas snRNP se presentan com o grandes agregados, que podran actuar com o islas de maduracin. El anticuerpo detecta protenas especficas que estn presentes en algunas de las snRNP que actan en el espliceosoma. (Por cortesa de N. Ringertz.)

Los RNA ribosmicos y los RNA de transferencia se sintetizan sobre conjuntos de genes idnticos dispuestos en tndem 4 0
Muchas de las protenas mayoritarias de una clula diferenciada, como por ejemplo la hemoglobina de los eritrocitos o la mioglobina de la fibra muscular, son sintetizados a partir de genes que estn presentes en una sola copia por genoma haploide. Estas protenas son abundantes porque cada una de las muchas molculas de mRNA transcritas a partir del gen puede ser traducida generando unas 10 molculas por minuto. Normalmente esto producir en cada nueva ge neracin celular ms de 10 000 molculas de pro tena por molcula de mRNA. Sin embargo, este proceso de amplificacin no es posible para la sntesis de los RNA que forman los ribosomas, ya que las molculas de RNA son el producto fi nal del gen. Para poder construir sus 10 millones de ribosomas, cada clula euca riota superior ha de sintetizar en cada generacin celular ms de 10 millones de copias de cada uno de los tipos de molculas RNA ribosmicas. De hecho la c lula puede producir cantidades adecuadas de estos rRNA gracias a que dispone de mltiples copias de los genes rRNA que codifican RNA ribosmicos. Incluso E. coli necesita siete copias de los genes rRNA para mantener las ne cesidades celulares de ribosomas. Las clulas humanas contienen alrededor de 200 copias de genes rRNA por genoma haploide, dispersas en pequeos grupos sobre cinco cromosomas diferentes, mientras que Xenopus contiene alrededor de 600 copias en un grupo nico situado en un solo cromosoma. En las clulas eucariotas, las copias mltiples de cada uno de los genes de rRNA, altamente conservados, se localizan organizadas en tndem en las que cada gen (de 8000 a 13 000 nucletidos de longitud, dependiendo del organismo) se encuentra sepa rado del adyacente por una secuencia de DNA no transcrita denominada DNA espaciador, el cual puede variar mucho en cuanto a tamao y a secuencia. Como se ver posteriormente las copias mltiples de los genes organizados en tndem tienden a coevolucionar. La organizacin en tndem de los genes rRNA es fcil de visualizar en pre paraciones de cromatina extendida, debido a su organizacin repetida y a que son transcritos con gran frecuencia. Las molculas de RNA polimerasa y los transcritos asociados a ellas estn tan densamente empaquetados (aproximada mente 100 por gen) que los transcritos se observan situados perpendicularmen te al eje de la molcula de DNA, de forma que cada unidad de transcripcin pre senta el aspecto de un rbol de navidad (Figura 8-61). Tal como se ha citado anteriormente (vase Figura 8-47), la parte ms estrecha de dichos rboles co rresponde al lugar donde se inicia la transcripcin, donde los transcritos son ms cortos, mientras que el otro extremo de la unidad de transcripcin del gen

Sntesis y procesamiento del RNA

405

Figura 8-61 Transcripcin de los genes rRNA organizados en tndem, visualizados con el m icroscopio electrnico. En la im agen superior, a menor aumento, se observa claramente el patrn alterno de genes en transcripcin activa y de DNA espaciador no transcrito. Al parecer las partculas mayores del extremo 5 de cada uno de los transcritos de cada rRNA (im agen in ferior ) representan el inicio del ensam blaje del ribosoma; las molculas de RNA polimerasa tambin son claramente visibles como series de puntos a lo largo del DNA. (Fotografa superior de V.E. Foe, C oid Spring H arbor Symp. Quant. Biol. 42: 723-740, 1978; fotografa inferior por cortesa de Ulrich Scheer.)

wam18
rRNA queda claramente definido por la desaparicin sbita de las molculas de RNA polimerasa y de sus transcritos. Los genes rRNA son transcritos por la RNA polimerasa / ; cada gen produce el mismo transcrito. En humanos, este transcrito se conoce como rRNA 45S y tiene una longitud de 13 000 nucletidos. Antes de que abandone el ncleo formando parte de partculas ribosmicas ensambladas, el rRNA 45S es cortado producien do una copia de cada uno de los rRNA 28S (alrededor de 5000 nucletidos), de los rRNA 18S (alrededor de 2000 nucletidos) y de los rRNA 5,8S (aproximadamente 160 nucletidos). Al obtenerse los tres rRNA a partir del mismo transcrito se ase gura una produccin equilibrada de ellos. La secuencia remanente de cada trans crito primario (unos 6000 nucletidos) se degrada en el ncleo (Figura 8-62). Se cree que estas secuencias extra podran jugar un papel temporal en el ensamblaje del ribosoma, que se inicia rpidamente con la unin de algunas protenas al transcrito rRNA 45S en el ncleo. Otro conjunto de genes organizados en tndem y separados por DNA espa ciador no transcrito es el que codifica el rRNA 5S de la subunidad ribosmica grande (el nico rRNA que se transcribe de forma aislada). Los genes de rRNA 5S slo tienen 120 pares de nucletidos de longitud y, como ocurre con un gran n-

RNA 45S precursor del rRNA pppI - OH

-13 000 nucletidos_^ regiones de la secuencia PROCESAMIENTO nucleotdica que se DEL RNA degradan rRNA 18S rRNA 5,8S 5' 3' - rRNA 5S producido 5' 3' en otro lugar incorporado en la subunidad ribosm ica pequea
406 Captulo 8 : El ncleo celular

Figura 8 -62 Patrn de procesam iento de la molcula precursora RNA 45S en tres RNA ribosmicos separados. Casi la mitad de las secuencias nucleotdicas de este precursor se degradan en el ncleo.

rRNA 28S

incorporado en la subunidad ribosm ica grande

mero de genes que codifican RNA de pequeo tamao (especialmente los genes de tRNA), son transcritos por la RNA polimerasa III. En el hombre existen alrede dor de 2000 genes de rRNA 5S organizados en tndem en un nico grupo situado lejos de los otros genes rRNA. Se desconoce la razn de que este tipo de rRNA se transcriba de forma aislada.

El nuclolo es una m quina productora de ribosom as 4 0

La transcripcin continua de mltiples copias gnicas asegura un aporte adecua do de molculas de rRNA, que son rpidamente empaquetadas con las protenas ribosomales formando ribosomas. El empaquetamiento se realiza en el ncleo, en una estructura de gran tamao y bien diferenciada denominada el nuclolo. El nuclolo contiene grandes bucles de DNA procedentes de varios cromosomas, cada uno de los cuales contiene uno o ms grupos de genes rRNA. Cada uno de estos grupos se denomina regin organizadora nucleolar. Los genes son trans critos con gran frecuencia por la RNA polimerasa I. El inicio del empaquetamien to de los rRNA puede observarse al microscopio electrnico: el extremo 5 de cada transcrito se une a un grnulo rico en protena (vase Figura 8-61). Estos grnulos, los cuales no se ha observado que interaccionen con ningn otro tipo de transcrito, representan probablemente la primera interaccin RNA-protena que tiene lugar en el nuclolo. La funcin biosinttica del nuclolo se puede poner de manifiesto por marea je radiactivo mediante pulsos cortos con uridina-3H. Despus de varios pulsos, se parados por intervalos en los que se incuba con un medio no marcado, se pueden separar los genes rRNA del cromosoma mediante fraccionamiento subcelular, y se puede conseguir un aislamiento del nuclolo marcado, en forma bastante pura (Figura 8-63). Estos experimentos han mostrado que el transcrito de 45S es empa quetado formando un gran complejo con protenas procedentes del citoplasma donde se sintetizan todas las protenas de la clula. En esta etapa se incorporan tanto la mayor parte de las 80 protenas que forman el ribosoma como el rRNA 5S. Para el procesamiento del rRNA 45S y para dirigir el proceso de ensamblaje son necesarias otras molculas. As pues, el nuclolo contiene otras protenas de unin al RNA y ciertas partculas ribonucleoproteicas (incluyendo snRNP U3), las cuales, segn parece, colaboran en la construccin de los ribosomas. Cuando las subunidades ribosmicas son exportadas al citoplasma en su forma definitiva, es tos componentes permanecen en el ncleo. Un componente especialmente nota ble de estos complejos es la nucleolina, una protena de unin a RNA, abundante y bien caracterizada, que al parecer slo recubre transcritos ribosmicos; esta prote na se tie con plata, tal como ocurre con el nuclolo. A medida que se procesa, la molcula de rRNA 45S va perdiendo algo de RNA y de protena y luego se divide formando los diferentes precursores de las

10 crom osom as nterfsicos descondensados contribuyen a la form acin del nuclolo con sus bucles de DNA productores de rRNA

Figura 8-63 El nuclolo.

Representacin muy esquemtica de una clula humana, en la que se muestran las aportaciones a un nico gran nuclolo de los bucles de cromatina que contienen los genes de rRNA de 10 cromosom as diferentes. Los nuclolos purificados resultan muy tiles para los estudios bioqum icos de la funcin nucleolar; para obtener estos nuclolos, los bucles de la crom atina se han de separar m ecnicam ente de sus cromosomas, tal com o se muestra en el dibujo.

ROTURA MECNICA ncleo aislado con bucles crom osm icos rotos envoltura nuclear
Sntesis y procesamiento del RNA

nuclolo

407

Figura 8 -6 4 Funcin del nuclolo en la sntesis de los ribosomas. El

bucle de DNA organizador nucleolar gen rRNA TRANSCRIPCIN precursor de rRNA 45S ?

protenas ribosmicas producidas en el citoplasma rRNA 5S producido fuera del nuclolo

partcula ribonucleo-^'"' proteica mayor Oo

&

*
NUCLOLO

fe Vw/s
>

* ;% -
RNA y protena reciclados, implicados en el procesamiento

transcrito rRNA 45S se empaqueta en una gran partcula ribonucleoproteica que contiene muchas protenas ribosmicas procedentes del citoplasma. Mientras permanece en el nuclolo, ciertas regiones de esta partcula son eliminadas a medida que se transforma en las subunidades ribosmicas inmaduras mayor y menor. Se cree que estas dos subunidades slo alcanzan su forma funcional final cuando son transportadas individualmente a travs de los poros nucleares hacia el citoplasma celular.

NUCLEO

subunidad mayor; inmadura / subunidad mayor /

CITOSOL

subunidad menor

EL TRANSPORTE Y LA ACTIVACIN GENERAN RIBOSOMAS FUNCIONALES rRNA 18S subunidad 40S rRNA 5,8S rRNA 5S rRNA 28S subunidad 60S

subunidades ribosmicas: mayor y m enor (Figura 8-64). A los 30 minutos del pulso de m areaje radiactivo, emergen del ncleo y aparecen en el citoplasma ce lular las primeras subunidades ribosmicas pequeas maduras, con su rRNA 18S. El ensam blaje de la subunidad ribosmica mayor madura, con sus rRNA 28S, 5,8S y 5S, tarda alrededor de una hora en aparecer; por ello, el nuclolo con tiene ms subunidades ribosmicas grandes incompletas que subunidades pe queas incompletas. Las ltimas etapas de la maduracin ribosmicas slo se producen cuando estas subunidades son transferidas al citoplasma. Este retraso evita que ribosomas funcionales puedan tener acceso en el ncleo a las molculas de hnRNA, to dava procesadas de forma incompleta.

El nuclolo es un subcom partim iento nuclear muy organizado 41

A la vista de lo que se conoce actualmente sobre la funcin del nuclolo, es posi ble explicar parte de su estructura. Al microscopio ptico, el gran nuclolo esfe roidal es la estructura ms patente del ncleo de una clula no mittica. Fue es tudiado con detenimiento por los primeros citlogos de tal modo que en una revisin aparecida en 1898 ya se pudieron citar unas 700 referencias. En la dca da de 1940, los citlogos haban demostrado que el nuclolo contiene elevadas concentraciones de RNA y de protenas; pero su funcin principal en la sntesis del RNA ribosm ico y en el ensam blaje de los ribosomas no fue descubierta has ta los aos 60.

408

Captulo 8 : El ncleo celular

heterocromatina perifrica
envoltura nuclear

nuclolo

com ponente fib rila r denso com ponente granular centro fib rila r (A) 2 (jm (B) 1 pm

Al microscopio electrnico se pueden observar algunos de los detalles de la organizacin nucleolar. A diferencia de los orgnulos citoplasmticos, el nuclo lo carece de membrana que lo delimite; en vez de ello, parece estar constituido por la unin especfica que forman entre s, como una gran malla y de una m a nera an desconocida, los precursores ribosmicos no terminados. En una electronmicrografa representativa en el ncleo se pueden distinguir tres regiones parcialmente diferenciadas (Figura 8-65): (1) un componente dbilmente con trastado, el centro fibrilar, que contiene DNA que no est siendo transcrito acti vamente, (2) un componente fibrilar denso que contiene molculas de RNA en proceso de transcripcin; y (3) un componente granular, que contiene precurso res de las partculas ribosomales maduras. El tamao del nuclolo refleja su actividad, y por ello vara notablemente en los diferentes tipos celulares y puede variar dentro de una misma clula. Por ejemplo, el nuclolo es muy pequeo en ciertas clulas vegetales en estado de latencia, pero puede ocupar hasta el 25% del volumen nuclear total en clulas que estn produciendo cantidades de protena anormalmente elevadas. Las di ferencias de tamao se deben en gran medida a las variaciones del componente granular, que probablemente est regulada a nivel de la transcripcin gnica ribosmica: la cromatina extendida observada con el microscopio electrnico muestra que tanto la fraccin de genes ribosmicos activados como la velocidad a la que se transcribe cada gen pueden variar segn las circunstancias.

Figura 8 -65 Electronm icrografa de una seccin ultrafina de un nuclolo de un fibroblasto hum ano, mostrando sus tres zonas diferentes. (A) Vista del ncleo entero. (B) Imagen a mayor aumento del nuclolo. (Por cortesa de E.G. Jordn y M.J. McGovern.)

Despus de cada mitosis, el nuclolo se ensam bla de nuevo en determinados cromosom as 42

El aspecto del nuclolo cam bia espectacularmente durante las distintas fases del ciclo celular. A medida que la clula se aproxima a la mitosis, el nuclolo dismi nuye de tamao y luego, cuando los cromosomas se condensan y se detiene to talmente la sntesis de RNA, desaparece: en general las clulas metafsicas no tienen nuclolo. Cuando se inicia de nuevo la sntesis de RNA ribosmico, al fi nal de la mitosis (en la telofase), reaparecen diminutos nuclolos en las localiza ciones cromosmicas de los genes de RNA ribosmico (Figura 8-66). En el hombre, los genes de RNA ribosmico estn localizados cerca del ex tremo de cada uno de los 5 cromosomas distintos que se muestran en la Figura

Sntesis y procesamiento del RNA

409

8-32 (es decir, en 10 de los 46 cromosomas de una clula diploide). Por consi guiente, despus de la mitosis de una clula humana se forman 10 pequeos nu clolos aunque rara vez se pueden observar ya que crecen rpidamente y se fu sionan formando el gran nuclolo tpico de la clula interfsica (Figura 8-67). Qu sucede con el RNA y con las protenas componentes del nuclolo que se ha disgregado durante la mitosis? Parece que por lo menos una parte de estos com ponentes queda distribuida sobre la superficie de todos los cromosomas metafsicos y es transportada a los ncleos de las dos clulas hijas. Cuando, du rante la telofase, los cromosomas se descondensan, estos componentes ncleolares viejos ayudan a restablecer los nuclolos que aparecen nuevamente.

Los crom osom as ocupan territorios discretos en el ncleo interfsico 43

Como acabam os de ver, cuando se forma el nuclolo, determinados genes, loca lizados en diferentes cromosomas, se encuentran reunidos. Estn las otras par tes del crom osom a tam bin ordenadas no-al azar en el ncleo? Esta pregunta, planteada por los cientficos de finales del siglo diecinueve, todava no ha sido respondida satisfactoriamente. Existe un cierto orden en la configuracin que siempre tienen los cromoso mas al finalizar la mitosis. Justo antes de que la clula se divida, los cromosomas son atrados hacia cada uno de los dos polos de huso mittico, mediante microtbulos unidos a los centrmeros; as pues, los centrmeros marcan el camino, y los brazos distales de los cromosomas (terminados en los telmeros) lo siguen des pus. En muchos ncleos interfsicos, los cromosomas tienden a retener esta orientacin, denominada orientacin Rab, durante toda la interfase, con sus cen trmeros dirigidos hacia un polo del ncleo y sus telmeros dirigidos hacia el polo opuesto (Figura 8-68A). En algunos casos, el ncleo est orientado de forma espe cfica en la clula: en el embrin temprano de Drosophila, por ejemplo, todos los centrmeros se dirigen hacia la cara apical (Figura 8-68B). Estas orientaciones nu cleares fijas podran tener importantes efectos sobre la polaridad celular, aunque es difcil disear experimentos que permitan estudiar esta posibilidad. En muchas clulas los cromosomas no se pueden distinguir entre s durante la interfase. Por ello, es difcil asegurar cmo estn realmente dispuestos. Sin embargo, los cromosomas politnicos gigantes de la larva de Drosophila son una excepcin de este principio. En este caso, las bandas cromosmicas se pueden observar con la suficiente claridad com o para determinar las posiciones espec ficas de determinados genes en los ncleos intactos, mediante secciones pticas y tcnicas de reconstruccin. Los resultados de estos anlisis sugieren que el conjunto de los cromosomas interfsicos no estn muy ordenados: aunque se tiende a m antener la orientacin Rab, frecuentemente ocurre que dos clulas aparentem ente idnticas presentan distribuciones diferentes de cromosomas.

Figura 8 -66 Cambios morfolgicos del nuclolo de una clula hum ana durante el ciclo celular. En este diagrama slo se ha representado el ncleo celular. En muchas clulas eucariotas la membrana nuclear se rompe durante la mitosis, lo cual se ha indicado con lneas discontinuas.

50(ftt
41 0 Captulo 8 : El ncleo celular

Figura 8-67 Fusin nucleolar. Micrografas obtenidas con el microscopio ptico, de fibroblastos humanos en cultivo, mostrando varias etapas de la fusin de los nuclolos. (Por cortesa de E.G. Jordn y J. McGovern.)

Figura 8 -6 8 Orientacin polarizada de los crom osom as en las clulas interfsicas del embrin tem prano de D r o so p h ila . (A) Diagramas de la orientacin Rab, con todos los telmeros apuntando hacia el polo opuesto. En el embrin, cada ncleo se alarga, tal como se muestra en la figura. (B) Micrografa a poco aumento del embrin de Drosophila en el estado de blastodermo celular. Los cromosomas de cada ncleo interfsico se han teido con un colorante fluorescente. Hay que destacar que la regin ms teida (el cromocentro), que contiene las regiones centromricas de cada uno de los cuatro cromosom as (vase Figura 8-19), est orientada hacia la superficie exterior del embrin y por ello se dirige hacia la membrana apical de cada una de las clulas. (Por cortesa de John Sedat.)

VISTA LATERAL DEL NCLEO

VISTA DESDE EL EXTREMO DEL CENTRMERO

telm eros j centrm eros envoltura nuclear (A)

El anlisis de los cromosomas politnicos indica tambin que cada crom o soma ocupa su propio territorio en el ncleo interfsico -e s decir, que los dife rentes cromosomas no estn entremezclados completamente (Figura 8-69). Otros experimentos han mostrado que los cromosomas no politnicos tambin tienden a ocupar regiones concretas y restringidas en el ncleo interfsico. Ex perimentos de hibridacin in situ con una sonda de DNA apropiada, por ejem plo, pueden seguir un solo cromosoma en clulas hbridas de mamfero en culti vo (Figura 8-70). Parece que la mayor parte del DNA de cada cromosoma ocupa nicamente una pequea porcin del ncleo interfsico, lo cual sugiere que cada crom osom a permanece condensado y organizado mientras permite que al gunas zonas de su DNA sean activas en la sntesis de RNA.

em brin

Est muy ordenado el ncleo ?44

El interior del ncleo no es una mezcla al azar de todos sus componentes: RNA, DNA y protenas. Ya hemos descrito que el nuclolo est organizado como una mquina eficiente de construccin de ribosomas, y que aparentemente algunos grupos de com ponentes de espliceosomas estn organizados en islas de madu racin del RNA (vase Figura 8-60). El orden tambin es apreciable al observar electronmicrografas de las regiones situadas alrededor de los poros nucleares: la cromatina que se encuentra unida a la membrana nuclear interna (cromatina extraordinariamente condensada y por ello claramente Visible en las electronmi crografas) est excluida de una regin considerable de las proximidades y alrede dor de los poros nucleares, delimitando una va entre el citoplasma y el ncleoplasma (vase Figura 8-71). Adems, en algunos casos se ha encontrado que los poros nucleares estn bien organizados en la envoltura nuclear (vase Figura 8-72). Este orden podra ser el reflejo de la organizacin propia de la lmina nuclear a la que el poro est unido. Existe en el interior del ncleo un esqueleto, anlogo al citoesqueleto, sobre el que se organicen los componentes nucleares? Muchos bilogos celulares creen

(B)

40 am

Figura 8 -69 Pareja de imgenes estereoscpicas tridimensionales de la disposicin de los crom osom as politnicos de un ncleo sencillo de las glndulas salivales de D r o so p h ila . La estructura esfrica es el nuclolo; la posicin de cada crom osom a se representa por una lnea que recorrera el eje del cromosom a. Los telmeros tienden a situarse en la superficie de la envoltura nuclear opuesta a la zona en la que se sita el nuclolo, donde se agrupan todos los centrmeros. Los cromosom as de estos ncleos no quedan enmaraados nunca, pero sus pliegues precisos y su disposicin respecto a los cromosomas vecinos vara de un ncleo a otro. Aparte de esto, los ncleos son idnticos. (Para ser miradas con los ojos cruzados; por cortesa de Mark Hochstrasser y John Sedat.)

Sntesis y procesamiento del RNA

411

IAl

6 niii

(C)

que s. La matriz nuclear o andamio se ha definido como el material insoluble que permanece en el ncleo despus de una serie de etapas bioqumicas de ex traccin. Se ha demostrado que algunas de las protenas que lo constituyen unen secuencias de DNA denominadas regiones SAR o MAR (de regiones asociadas a la matriz (Matrix-Associated Regions) o regiones asociadas al andamio (ScaffoldAssociated Regions). Se ha postulado que estas secuencias de DNA seran las que forman la base de los bucles de los cromosomas (vase Figura 8-18). Mediante es tos lugares de unin de los cromosomas, la matriz podra ayudar a ordenar los cromosomas, localizando genes, y regular la transcripcin y replicacin del DNA dentro del ncleo. Sin embargo an se debate si la matriz celular es una estructu ra presente o no en clulas intactas, debido a que sus componentes estructurales todava no se han podido identificar completamente.

Figura 8 -70 Mareaje selectivo de un crom osom a en el ncleo de una clula de mamfero en cultivo, durante la interfase. En (A) y (B), a la derecha se muestra un ncleo interfsico libre de restos citoplasmticos, mientras que a la izquierda se ven cromosom as mitticos procedentes de una segunda clula. (A) Resultados de la hibridacin in situ (usando una sonda fluorescente) para detectar un cromosoma humano en una lnea celular hbrida hom bre-hm ster. En (B) se muestra la misma preparacin pero con todo el DNA marcado con un segundo colorante fluorescente. (C) Dibujo esquemtico del cromosoma humano en el ncleo interfsico mostrado en (A), a una escala ligeramente superior. (A y B por cortesa de Joyce A. Kobori y David R. Cox.)

Resumen
La RNA polim erasa, enzim a q u e cataliza la transcripcin del DNA, es una molcula com pleja fo rm a d a p o r m uchas cadenas polipeptdicas. En las clulas eucariotas existen tres RNA polim erasas denom inadas I, II y III, relacionadas evolutivamente entre s y con la RNA polim erasa bacteriana, y q u e presentan algunas subunidades en com n. Se cree qu e despus d e iniciar la transcripcin, cada enzim a libera una o m s subunidades y se u n e a otras enzimas necesarias p ara el crecimiento, la term i nacin y la m odificacin d e la cadena d e RNA. La m ayor parte del mRNA d e las clulas se produce p o r un proceso complejo q u e se inicia con la sntesis del RNA heterogneo nuclear (hnRNA). La RNA polim e rasa II produce el transcrito prim ario hnRNA. Posteriormente se le aade un nucle-

envoltura nuclear

poro

Figura 8-71 Electronm icrografa del ncleo de una clula de m am fero. Es de destacar que la cromatina condensada que rodea la envoltura nuclear est excluida de las regiones prximas a los poros nucleares. (Por cortesa de Larry Gerace.)

nuclear

Tminu
cromatina condensada

ncleo
412 Captulo 8 : El ncleo celular

tido especial a su extremo 5 ' y es cortado y poliadenilado en su extrem o 3 . H abi tualmente, las m olculas d e RNA modificadas estn sujetas a uno o ms procesos de recorte d e las secuencias intrnicas, en los cuales estas secuencias son eliminadas del hnRNA p o r una reaccin catalizada p o r una gran partcula ribonucleoproteica denom inada espliceosoma. En este proceso d e m aduracin, se elim ina la mayor parte d e la masa del transcrito prim ario de RNA, y se degrada en el ncleo. Como resultado d e ello, a u n qu e la tasa de produccin d e hnRNA supone tpicamente la m itad d e la sntesis del RNA total, el mRNA producido representa slo alrededor del 3% d e la cantidad de RNA presente en cualquier mom ento en la clula. A diferencia d e los genes qu e codifican protenas, transcritos p o r la RNA polim erasa II, los genes qu e codifican la mayor parte de los RNA estructurales son transcritos p or las RNA polim erasas I y III. Generalm ente estos genes estn p resen tes en el genom a en mltiples copias y estn organizados en grupos de genes en tn dem . La RNA polim erasa III produce una gam a de molculas de RNA pequeos y es tables, entre las qu e se hallan los tRNA y el pequeo RNA 5S del ribosoma. La RNA polim erasa I produce la gra n molcula precursora d e rRNA (RNA 45S) qu e contiene los rRNA mayores. Con la excepcin de los ribosomas de cloroplastos y mitocondrias, todos los ribosomas celulares se ensam blan en el nuclolo -u n orgnulo in tranuclear form ad o alrededor de los genes d e rRNA organizados en tndem, qu e se encuentran reunidos a pesar de estar situados en diferentes cromosomas.

______________ ! I

1 |tm

Organizacin y evolucin del genoma nuclear

Gran parte de la historia evolutiva se halla grabada en los genomas de los orga nismos actuales y se puede descifrar a partir de un anlisis cuidadoso de sus se cuencias de DNA. Hasta el momento se han secuenciado decenas de millones de nucletidos y ya podemos empezar a intuir cmo han evolucionado durante cientos de millones de aos los genes que codifican ciertas protenas. Los estu dios sobre cambios ocasionales que ocurren en los cromosomas actuales pro porcionan claves adicionales para comprender los mecanismos que se han pro ducido por un cambio evolutivo en el pasado. En esta seccin se considerarn algunos de los principios generales que han surgido a partir de estos estudios de gentica molecular, haciendo nfasis en la organizacin y evolucin del genoma nuclear de los eucariotas superiores.

Figura 8-7 2 Electronm icrograffa obtenida por criofractura de la envoltura nuclear alargada de una espora de helecho. Se destaca la

disposicin ordenada en lneas paralelas de los complejos de poros nucleares. En las envolturas nucleares de otras clulas se han descrito tanto grupos concentrados de poros nucleares como reas extraordinariamente libres de ellos, especialmente orientados con respecto a otras estructuras de la clula. (Por cortesa de Don H. Northcote; de K. Roberts y D. H. Northcote, Microsc.

Acta 7 1 :1 0 2 -1 2 0 ,1 9 7 1 .)

Los genomas se van ajustando de forma precisa por mutaciones puntuales y se remodelan radicalmente o aum entan de tamao por recom binacin gentica 45
Las secuencias de nucletidos del DNA se han de replicar con precisin, y se han de conservar. En el Captulo 6 se explican los elaborados mecanismos de la replicacin y de la reparacin del DNA que permiten que las secuencias de DNA se hereden con una fidelidad extraordinaria; slo cambian al azar aproximadamen te un par de nucletidos por mil cada 200 000 aos. Pero incluso siendo as, en una poblacin de 10 000 individuos cada substitucin posible de nucletidos ser ensayada unas 50 veces en el transcurso de un milln de aos, lo cual es un corto lapso de tiempo en relacin al de evolucin de las especies. La mayor parte de la variabilidad creada de esta forma ser desventajosa para el organismo y en la poblacin ser seleccionada en contra. Por el contrario, cuando una variante poco frecuente sea ventajosa ser rpidamente propagada por seleccin natural. En consecuencia, puede esperarse que en cualquier especie dada la funcin de la mayora de los genes se ir optimizando por mutacin puntual al azar y selec cin. Las mutaciones puntuales son un mecanismo eficiente para el ajuste preciso del genoma, y los progresos evolutivos a largo plazo han de depender de cam bios genticos ms radicales. La recom binacin gentica provoca grandes re ajustes del genoma con una frecuencia sorprendente: el genoma puede expan-

Organizacin y evolucin del genoma nuclear

413

dirse o contraerse por duplicacin o delecin; sus diferentes zonas se pueden translocar de una regin a otra generando nuevas combinaciones. Las zonas que com ponen los genes -lo s exones y los elementos reguladores- se pueden mez clar com o si fueran mdulos independientes generando protenas que tienen funciones completamente nuevas. Adems, las copias duplicadas de los genes tienden a divergir por mutaciones posteriores y se especializan en funciones su tilm ente diferentes. Por estos sistemas el genoma puede evolucionar volvindose cada vez ms complejo y sofisticado. En un mamfero, por ejemplo, existen m l tiples formas variantes de casi todos los genes: diferentes genes de actinas para los diferentes tipos de clulas contrctiles, diferentes genes de opsinas para la percepcin de las luces de diferentes colores, diferentes genes de la colgena para los diferentes tipos de tejidos conjuntivos, etc. La expresin de cada gen est regulada de acuerdo a sus funciones precisas y especficas. Adems, la secuenciacin del DNA pone de manifiesto que muchos genes comparten segm en tos modulares parecidos, pero aparte de ello, son muy diferentes: se encuentran con frecuencia motivos de secuencia comunes en protenas no relacionadas de otra forma. La recom binacin gentica, proceso en el que un cromosoma intercambia material gentico con otro, es fundamental para crear estas familias de genes y de segmentos gnicos. En el Captulo 6 se discutieron los mecanismos molecula res tanto de la recom binacin general como de la recombinacin especfica. Aqu se considerarn algunos de sus efectos sobre el genoma.

Las secuencias repetidas en tndem de DNA tienden a perm anecer inalteradas 4 6

Habitualmente las duplicaciones gnicas se atribuyen a raros accidentes catali zados por alguna de las enzimas que median procesos recombinantes. Sin em bargo, los eucariotas superiores poseen un eficiente sistema enzimtico capaz de unir los dos extremos de una molcula de DNA rota, por lo que tanto las du plicaciones com o las inversiones, deleciones y translocaciones de segmentos de DNA tam bin pueden ocurrir como consecuencia de una unin errtica de frag mentos de cromosomas que se haban roto, de alguna forma, en ms de un lu gar. Cuando varias secuencias duplicadas de DNA se unen cabeza con cola, se dice que estn repetidas en tndem. Cuando aparece una primera repeticin en tndem, se puede extender rpidamente a grandes series de repeticiones en tn dem mediante fenm enos de entrecruzamiento desigual an entre cromtidas hermanas, dado que la gran cantidad de secuencias apareables es un substrato ideal para la recom binacin general (Figura 8-73). La duplicacin de DNA segui da de entrecruzamiento secuencial desigual produce la amplificacin del DNA, un proceso que frecuentem ente contribuye a la formacin de cncer increm en tando el nmero de copias de ciertos genes (proto-oncogenes) que facilitan la aparicin de cncer (vase Figura 24-27). Los genes repetidos en tndem aumentan y disminuyen de nmero debido a entrecruzamiento desigual (vase Figura 8-73). Por lo tanto, podra esperarse que slo se mantengan en grandes cantidades por seleccin natural si las copias extra son beneficiosas para el organismo. Ya hemos hablado de los cientos de genes repetidos en tndem que codifican el precursor mayor del RNA ribosmico; estas copias de genes son necesarias para mantener la demanda de nuevos ribosomas de las clulas en crecimiento. De manera similar, los vertebrados tie nen grupos de genes repetidos en tndem que codifican otros RNA estructura les, incluyendo el rRNA 5S, los snRNA U1 y U2, y algunos grupos de genes repeti dos de las histonas que producen grandes cantidades de las histonas necesarias durante cada fase S. Se podra esperar que en el transcurso de la evolucin las secuencias de los genes que m antienen una disposicin en tndem -y del DNA espaciador no transcrito entre ellos- podran derivar de forma especial. Al existir muchas co pias del mismo gen, podra existir poca seleccin contra mutaciones al azar que

DNA repetido en tndem

Figura 8-73 Una familia de genes repetidos organizados en tndem gana y pierde copias con frecuencia debido a procesos de entrecruzam iento desigual entre los crom osom as herm anos que contienen los genes. Este fenm eno es frecuente debido a que las largas regiones de secuencia de DNA homlogo son un buen substrato para el proceso de recom binacin gentica general (discutido en el Captulo 6 ).

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Captulo 8 : El ncleo celular

genes - repetidos en tndem expansin expansion contraccin m utacin

conversion
I

)
conversion conversion conversion

etc. (A) HOMOGENEIZACIN POR RECOMBINACIN DESIGUAL ENTRE CROMOSOMAS HERMANOS (B) HOMOGENEIZACION POR CONVERSIN GNICA

alterasen una o algunas de las copias del gen; adems, muchos de los cambios de nucletidos ocurridos en las largas regiones no transcritas podran no tener consecuencias funcionales. Sin embargo, generalmente las secuencias de los ge nes repetidos en tndem y sus DNA espaciadores son casi idnticos. Se cree que dos son los mecanismos responsables de este hecho. Primero, fenmenos recu rrentes de entrecruzamiento desigual pueden causar la expansin o la contrac cin de las disposiciones en tndem, y simulaciones por ordenador demuestran que esto tiende a mantener las mismas secuencias (Figura 8-74A). Segundo, la conversin gnica -proceso por el cual una porcin de secuencia de DNA cambia al copiar una secuencia similar presente en un lugar diferente del genoma, como se describe en el Captulo 6 (Figura 8-74B )- puede actuar homogeneizando las secuencias de DNA relacionadas. Aunque la conversin gnica no requiere que los genes estn repetidos en tndem, en los eucariotas superiores parece que es ms frecuente entre aquellos que se encuentran prximos. El desplazamiento de una copia de un gen dispuesto en tndem hasta otra localizacin crom osm ica lo proteger de ambas influencias homogeneizadoras. As pues, la translocacin gnica accidental es una etapa importante en la evolucin de nuevos genes: permite a la secuencia translocada evolucionar in dependientemente, de modo que pueda adquirir nuevas funciones que puedan beneficiar al organismo.

Figura 8 -7 4 Dos procesos que contribuyen a m antener iguales entre s a todas las secuencias de DNA organizadas en tndem . (A) El continuo increm ento y reduccin del nmero de copias gnicas en una organizacin en tndem, producidos por la recom binacin desigual (vase Figura 8-73) tiende a homogenizar todas las secuencias gnicas asociadas. (B) En la conversin gnica una copia del gen acta como molde, pasando la totalidad o parte de su secuencia a una segunda copia del gen. En los eucariotas superiores este proceso se presenta casi exclusivamente entre copias de genes situadas prximas en el cromosoma; en los eucariotas inferiores com o hongos, donde se ha estudiado con mayor detalle, no est restringido a genes prximos.

La evolucin de la fam ilia de los genes de la globina muestra que las duplicaciones al azar contribuyen a la evolucin de los organismos 47
Adems de generar nuevos conjuntos de genes repetidos en tndem, las dupli caciones de DNA han jugado un papel general ms importante en la evolucin de nuevas protenas. La familia de los genes de las globinas proporciona un buen ejemplo de ello, pues su historia evolutiva ha sido especialmente estudia da. Las inconfundibles homologas en cuanto a la secuencia de aminocidos y a la estructura que existe entre los genes actuales de globina indican que todos ellos han de derivar de un gen ancestral comn a pesar de que algunos de ellos ocupen ahora localizaciones ampliamente separadas en el genoma de los m am feros. Considerando las diferentes formas de la protena en organismos pertene cientes a diferentes niveles de la escala filogentica, podemos reconstruir algu nos de los fenmenos del pasado que han dado lugar a las diversas formas de hemoglobina transportadoras de oxgeno. Una molcula como la hemoglobina debe necesariam ente permitir a los organismos pluricelulares que la posean cre cer hasta adquirir un gran tamao, puesto que los grandes animales no pueden

Organizacin y evolucin del genoma nuclear

4 15

confiar la oxigenacin adecuada de sus tejidos exclusivamente a la difusin del oxgeno a travs de la superficie corporal. A consecuencia de ello se encuentran molculas similares a la hemoglobina en todos los vertebrados y en algunos in vertebrados. La molcula transportadora de oxgeno ms primitiva es una cade na polipeptdica de globina de unos 150 aminocidos, que se encuentra en mu chos gusanos marinos, en insectos y en peces primitivos. Sin embargo, la molcula de hemoglobina de los vertebrados superiores est compuesta por dos tipos de cadenas de globina. Parece que hace unos 500 millones de aos, duran te la evolucin de los peces superiores ocurrieron unas mutaciones y duplicacio nes gnicas. Estos fenm enos establecieron inicialmente dos genes de globinas ligeramente diferentes, que codificaban las cadenas de hemoglobina a y (3 en el genoma de cada individuo. En los vertebrados superiores cada molcula de he moglobina es un complejo de dos cadenas a y dos cadenas p (Figura 8-75). Esta estructura es mucho ms eficiente que una sola molcula de globina. Los cuatro lugares de unin al oxgeno de la molcula a 2$ interaccionan entre s. Esta inte raccin provoca un cambio alostrico cooperativo en la molcula cuando capta y libera oxgeno, que permite a la hemoglobina tomar y liberar el oxgeno con una eficiencia muy superior a la de la versin de cadena nica. Ms tarde, durante la evolucin de los mamferos, aparentemente el gen de la cadena P sufri una mutacin y duplicacin, dando lugar a una segunda cade na del tipo P que se sintetiza especficamente en el feto. La molcula de hemoglo bina resultante tiene una afinidad superior por el oxgeno que la hemoglobina del adulto y, por lo tanto, colabora en la transferencia de oxgeno desde la madre al feto. Posteriormente, el gen de esta nueva cadena de tipo p mut y nuevamente se duplic, produciendo dos nuevos genes, e y y, producindose la cadena e de forma ms temprana durante el desarrollo (formando a ^ ) que la cadena y fetal, que forma a 2y2 (vase Figura 9-52). An ms tarde, durante la evolucin de los primates, hubo una duplicacin de la cadena p, dando lugar al gen 8 de la globina y con l a una forma minoritaria de la hemoglobina (cc282) que slo se encuentra en los primates adultos (Figura 8-76). Cada uno de estos genes duplicados se ha ido modificando por mutaciones puntuales que afectan a las propiedades de la molcula final de la hemoglobina, y por cambios en las regiones reguladoras que determinan el momento y el nivel de expresin del gen. El resultado final de los procesos de duplicacin gnica que han dado lugar a la variedad de cadenas de globina se puede ver claramente en los genes que surgieron a partir del gen p original, los cuales estn dispuestos como series de secuencias homologas de DNA localizadas a unos 50 000 pares de nucletidos una de otra. En otro crom osom a humano se localiza una agrupacin similar pero para los genes derivados del gen a globina. Dado que los grupos de los ge nes a y P de las globinas se encuentran en cromosomas diferentes en aves y m a mferos pero en el mismo crom osom a en la rana Xenopus, se cree que el fen meno de translocacin separ los genes hace aproximadamente 300 millones de aos (vase Figura 8-76). Probablemente estas translocaciones contribuyeron a la estabilizacin de los genes duplicados con funciones distintas mediante su proteccin de los procesos homogeneizadores que actan sobre genes muy pr ximos y de secuencia similar (vase Figura 8-74). En los conjuntos gnicos de la a y P globina existen varias secuencias de DNA de la globina duplicadas que no son genes funcionales. Son ejemplos de pseudogenes. Tienen una gran semejanza con genes funcionales pero han sido inutiliza dos mediante mutaciones que impiden su expresin. La existencia de dichos pseudogenes no es sorprendente, pues no es de esperar que cada duplicacin g nica conduzca al desarrollo de un nuevo gen funcional. Adems, las secuencias de DNA no funcional no se eliminan rpidamente del DNA, como indica la gran cantidad de DNA no codificante presente en los genomas de mamferos, tal como se ha descrito previamente. Cuando se hayan comparado las secuencias de DNA de muchas familias g nicas en muchos animales de complejidad creciente, podremos conocer una parte importante de nuestra historia evolutiva (vase tambin la Figura 7-4).

la globina de cadena nica une una m olcula de oxgeno

lugar de u del oxgeno al grupo hemo

EVOLUCION DE UNA SEGUNDA CADENA DE GLOBINA POR DUPLICACIN GNICA SEGUIDA DE MUTACIN

globina de cuatro cadenas que une cuatro m olculas de oxgeno de form a cooperativa
Figura 8-75 Com paracin de la estructura de las globinas de cadena nica y de cuatro cadenas. La globina de cuatro cadenas mostrada es la hemoglobina, que es un com plejo de dos cadenas de globina a y dos (3. La globina de cadena sencilla forma, en algunos invertebrados, un dmero que se asocia cuando une oxgeno, lo que representara un intermediario en la evolucin de las globinas de cuatro cadenas.

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Captulo 8 : El ncleo celular

Los genes que codifican nuevas protenas se pueden crear mediante la recom binacin de exones 4 5
El papel de la duplicacin de DNA en la evolucin no est limitado a la gene racin de grandes familias gnicas. Tambin puede ser importante en la genera cin de genes sencillos. La protenas codificadas por los genes creados de esta forma pueden ser reconocidos por la presencia de dominios proteicos similares repetidos, los cuales pueden estar unidos covalentemente entre s, formando se ries. Por ejemplo, las inmunoglobulinas (Figura 8-77) y las albminas, as como muchas protenas fibrosas (como las colgenas) estn codificadas por genes que han evolucionado por duplicaciones repetidas de una secuencia de DNA pri mordial. En genes que han evolucionado de esta manera, y tambin en muchos otros genes, a menudo ocurre que cada exn codifica una unidad proteica plegada in dividual, o dominio. Se cree que la organizacin de las secuencias codificantes del DNA en forma de estos exones separados por largos intrones, ha facilitado de forma notable la evolucin de nuevas protenas. Por ejemplo, las duplicaciones necesarias para formar un solo gen codificante de una protena con dominios re petidos pueden ocurrir por rotura y reunin del DNA en cualquiera de los largos intrones o en cualquier punto de un exn codificante de un dominio proteico til; si no hubiera intrones, en el gen original slo podra haber unos cuantos lu gares en los cuales un intercambio por recombinacin entre molculas hermanas de DNA podra duplicar el dominio. Los intrones, al permitir que la duplicacin tenga lugar potencialmente en muchos puntos en lugar de tan slo unos cuantos, incrementan en gran medida la probabilidad de que ocurra un fenmeno de du plicacin favorable. Por esta misma razn, la presencia de intrones incrementa en gran medida la probabilidad de que un fenmeno de recombinacin fortuito genere un hbrido funcional al unir dos secuencias de DNA inicialmente separadas que codifican distintos dominios proteicos de forma que ambos dominios se conserven en la protena hbrida que codifica el nuevo gen (vase Figura 8-81, por ejemplo). En muchas protenas actuales se pueden ver los resultados esperados de estas re combinaciones (vase Figura 3-43). As, se cree que la gran separacin entre los exones que codifican dominios individuales en los eucariotas superiores acelera el proceso por el cual los fenmenos de recombinacin gentica al azar generan nuevas protenas tiles. Esto podra ayudar a explicar el xito de la evolucin de estos organismos tan complejos.

crom osom a 16
I

crom osom a 11
l i

varios genes a
\

YG YA
l

7/

Figura 8-76 Esquema evolutivo de las cadenas de globina portadoras de oxgeno en la sangre de los animales. El esquema hace nfasis en la familia de las globinas (i. Una duplicacin reciente del gen de la cadena y produjo Y ; y y\ que son cadenas fetales de tipo (3 con funciones idnticas. En la parte superior de la figura se muestran las localizaciones de los genes de globina en el genoma humano.

cadena pesada

La mayora de las protenas se han originado probablemente a partir de genes altam ente fragmentados 4 8
El descubrimiento, en 1977, de los genes fragmentados, fue inesperado. Hasta entonces todos los genes que se haban analizado con detalle eran genes bacte rianos, los cuales no tienen intrones. Las bacterias tampoco tienen ncleo ni sis temas de membranas internas, tienen genomas ms pequeos que el de las c lulas eucariotas y tradicionalmente se considera que se parecen a las clulas ms sencillas a partir de las que han derivado las clulas eucariotas. No es sorpren dente que la mayora de los bilogos pensaran inicialmente que los intrones eran un rasgo extrao y aparecido tardamente en la lnea de los eucariotas. Sin embargo, ahora parece ms probable que los genes fragmentados tengan un ori gen muy antiguo y que las bacterias hayan perdido sus intrones despus de que hayan evolucionado sus protenas. La idea de que los intrones son muy antiguos es compatible con los concep tos actuales de la evolucin proteica mediante recombinacin de prueba y error de exones que codifican distintos dominios proteicos. Adems, se han obtenido evidencias del antiguo origen de los intrones mediante el examen del gen que codifica la ubicua triosafosfato isomerasa. La triosafosfato isomerasa desempea un papel esencial en el metabolismo de todas las clulas, catalizando la inter-

Figura 8 -77 Esquema representando una molcula de anticuerpo (inmunoglobulina). Esta molcula es un com plejo de dos cadenas pesadas y dos ligeras, idnticas entre s. Cada una de las cadenas pesadas contiene cuatro dominios similares unidos covalentemente, mientras que las cadenas ligeras contienen dos de estos dominios. Cada dominio est codificado por un exn diferente, y se cree que todos ellos han evolucionado por duplicaciones seriadas a partir de un exn ancestral nico.

Organizacin y evolucin del genoma nuclear

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(A)

posicin de los intrones en el maz H2N T I

50 am inocidos ? I T I T II T I Y I COOH

f I

? I

posicin de los intrones en los vertebrados

(B)

progenote

eubacterias que form aron los cloroplastos y las m itocondrias

M I

S. cerevisiae (levadura)

A spergillus (hongo)

maz (planta)

vertebrados (animales)

conversin entre el gliceraldehdo-3 fosfato y la dihidroxiacetona fosfato -u n paso central en la glucolisis y en la gluconeognesis (vase Figura 2-21). Compa rando la secuencia de aminocidos de esta enzima de varios organismos es posi ble deducir que la enzima evolucion antes de la divergencia de los procariotas y los eucariotas, a partir de un ancestro comn; las secuencias de aminocidos humanas y bacterianas son idnticas en un 46%. El gen que codifica la enzima tiene 6 intrones en los vertebrados (pollo y humano) cinco de los cuales estn precisamente en la misma posicin que en el maz. Esto implica que estos cinco intrones estaban presentes en el gen antes de que se separaran las plantas y los animales en la genealoga eucariota, hace un tiempo estimado de 109 aos (Figu ra 8-78). En general, los diminutos organismos unicelulares estn sometidos a una fuerte presin selectiva para reproducirse mediante divisin celular a la mxima velocidad permitida por las concentraciones de nutrientes y por el entorno. Por esto, han de minimizar la cantidad de DNA innecesario que deben sintetizar en cada ciclo de divisin. Para grandes organismos que viven de la depredacin -e n los que el tamao es una ventaja- y para los organismos pluricelulares en ge neral -e n los que las velocidad de divisin celular est limitada por otros requeri m ientos- no existe esta fuerte presin selectiva para eliminar el DNA superfluo del genoma. Este argumento puede ayudar a explicar por qu las bacterias han perdido sus intrones mientras que los eucariotas los han mantenido. Esto tam bin explica por qu el hongo pluricelular Aspergillus tiene cinco intrones en el gen de la triosafosfato isomerasa mientras que Saccharomyces, muy similar, no tiene ninguno. Cul es el m ecanism o por el que se pierden los intrones? La prdida preci sa de intrones por deleciones al azar de pequeos fragmentos de DNA debe ocurrir muy raramente, mientras que la prdida precisa y selectiva de intrones no es rara en las clulas eucariotas (y posiblem ente fue tambin frecuente en los ancestros de las bacterias actuales). Mientras que la mayora de los vertebrados tienen slo un gen de la insulina, con dos intrones, las ratas poseen un segundo gen, vecino al anterior, con un slo intrn. Este segundo gen parece surgir m e diante duplicacin gnica, relativamente reciente y con la consiguiente prdida

Figura 8-7 8 El antiguo origen de los genes fragmentados. (A) Comparacin entre la estructura de los exones del gen de la triosafosfato isomerasa de las plantas y de los animales. Las posiciones de los intrones que son idnticas en el maz (grano) y en los vertebrados se han marcado con cabezas de flecha verdes, y las que son diferentes, con cabezas de flecha azules. Dado que se estima el tiempo de divergencia entre plantas y animales en mil millones de aos, los intrones deben compartir el mismo origen. (B) Esbozo de cm o puede haber evolucionado un gen determinado. Las secuencias exnicas se muestran en rojo y las intrnicas en gris. El gen ilustrado codifica una hipottica protena necesaria para todas las clulas. Como la triosa fosfato isomerasa, esta protena debe haber evolucionado alcanzando su estructura tridimensional final antes de que los linajes de las eubacterias, arquebacterias y eucariotas se separaran de una clula antecesora comn -designada como progenote. La lnea discontinua verde m arca los momentos aproximados en que se produjeron fenm enos de endosimbiosis que dieron lugar a las mitocondrias y a los cloroplastos (vanse pgs. 21-22). (A, de W. Gilbert, M. Marchionni y G. McKnight, Cell 46: 151-154, 1987. Cell Press.)

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Captulo 8 : El ncleo celular

Tabla 8-4 Las tres familias principales de elementos transponibles Estructura Genes en el elemento completo codifica transposasa cortas repeticiones invertidas en cada extremo codifica una transcriptasa inversa y se parece a un retrovirus Sistemas de desplazamiento se desplaza como DNA, ya sea por escisin o siguiendo la va replicativa Ejemplos elemento P (Drosophila) Ac-Ds (maz) Tn3 e ISl (E. coli) Tam3 (dragn) Copia (Drosophila) Ty (levadura) THE-1 (humanos) Bsl (maz) elemento F (Drosophila) L1 (humanos) Cin4 (maz)

repeticiones terminales largas y repetidas de forma directa (LTR*) en los extremos i rrl Poli-A en el extremo 3 del transcrito de RNA; a menudo en el extremo 5 est truncado

se desplaza va un intermediario de RNA producido por el promotor en el LTR

codifica una transcriptasa inversa

se desplaza va un intermediario de RNA que probablemente est producido por un promotor vecino

Estos elementos tienen una longitud de entre 2000 y 12 000 pares de nucletidos; cada familia contiene muchos miembros, de los que en esta tabla se relacionan algunos. *LTR, de long Terminal repeats.

de uno de sus intrones. Dado que la prdida de intrones requiere la unin exacta de las secuencias de DNA codificantes, se supone que este nuevo gen surgi a partir de una incorporacin poco frecuente en el genoma de una copia de DNA del mRNA del gen apropiado, del cual se haban eliminado con precisin los in trones. Actualmente sabemos que los RNA mensajeros se pueden copiar en DNA a travs de la actividad de la transcriptasa inversa (vase pg. 303), y se cree que las enzimas de recom binacin podran permitir ocasionalmente que estas co pias se aparearan con la secuencia original, la cual luego sera corregida a una forma libre de intrones por un proceso de conversin gnica. Este mecanismo de prdida de intrones se ha podido demostrar en el laboratorio empleado las potentes tcnicas de anlisis gentico disponibles en S. cerevisiae. Las transcriptasas inversas no se requieren en las vas genticas ms impor tantes, pero son producidas en las clulas por elementos transponibles especfi cos (vase Tabla 8-4), as como por todos los retrovirus. Como se ver ms ade lante, la produccin de copias DNA de fragmentos de genoma mediante transcripcin inversa ha contribuido de diferentes formas a la evolucin de los genomas de los organismos superiores.

Una fraccin mayoritaria del DNA de los eucariotas superiores est formada por secuencias de nucletidos repetidas y no codificantes 4 9
Los genomas de las clulas eucariotas no slo contienen intrones, sino que tam bin presentan un gran nmero de copias de otras secuencias de DNA, aparen temente no esenciales, que no codifican protenas. La presencia de estas se cuencias repetidas de DNA en los eucariotas superiores se puso de manifiesto en primer lugar mediante una tcnica de hibridacin que mide el nmero de copias gnicas. En este proceso el genoma se rompe m ecnicamente en cortos frag mentos de DNA de doble hlice, de aproximadamente 1000 pares de nucleti dos, y estos fragmentos se desnaturalizan producindose cadenas sencillas de DNA. La velocidad con la cual los fragmentos de DNA de cadena sencilla de la mezcla se vuelven a unir formando fragmentos de doble hebra, en condiciones en las que la conformacin de la doble hlice es estable, depende de cunto tiempo tarde cada fragmento en encontrar una secuencia complementaria con la que aparearse, lo que a su vez depende de la concentracin de los fragmentos

Organizacin y evolucin del genoma nuclear

41 9

5' 3'

A T A A A C T A T A A A C T A T A A A C T I. . . . ._ J ...... .. I: , ........ J 1 ........... "I [ ......... I T A T T T G A T A T T T G A T A T T T G A

DNA 3' 5'

Figura 8-79 DNA satlite. Se muestra

una secuencia sencilla de DNA satlite de D rosophila. Consiste en muchas repeticiones de una secuencia de siete nucletidos organizadas en serie, y se presentan en millones de copias por genoma haploide de D rosophila.

adecuados en la mezcla. Generalmente esta reaccin es muy lenta. Por ejemplo, el genoma haploide de una clula de mamfero formar aproximadamente 6 mi llones de fragmentos de 1000 nucletidos cada uno; cualquier fragmento cuya secuencia se halle en una sola copia tendr que colisionar al azar con 6 millones de cadenas no complementarias para encontrar la suya. Cuando el DNA de una clula humana se analiza de esta forma en condicio nes que requieran un emparejamiento perfecto (condiciones de elevada severi dad, vase Figura 7-17), alrededor del 70 % de las hebras de DNA se aparean tan lentam ente com o se podra esperar para una gran coleccin de fragmentos de secuencia nica (no repetida), requiriendo varios das para un apareamiento completo. Pero el 30% restante de las hebras se unen mucho ms rpidamente. Estas hebras contienen secuencias que estn repetidas muchas veces en el geno ma, y por lo tanto colisionan con una hebra complementaria de una forma rela tivamente rpida. La mayora de estas secuencias de DNA altamente repetidas no codifican protenas, y son de dos tipos: aproximadamente una tercera parte son DNA satlites repetidos en tndem, de los que trataremos a continuacin, y el resto son DNA repetidos intercalados. La mayora de estas ltimas secuencias de DNA derivan de unas cuantas secuencias de DNA transponibles que se han multiplicado hasta dar lugar a un alto nmero de copias en el genoma humano.

Las secuencias de DNA satlite no tienen ninguna funcin conocida 59

Normalmente, las hebras de DNA que en un experimento tipo como el que se acaba de describir forman doble hebra ms rpidamente son repeticiones en tndem muy largas de una secuencia de nucletidos corta (Figura 8-79). La uni dad repetitiva de una secuencia de este tipo puede estar compuesta de tan slo uno o dos nucletidos; sin embargo, muchas de las repeticiones son largas, y en mamferos estn formadas tpicam ente por variantes de una corta secuencia or ganizada en repeticiones de unos cuantos centenares de nucletidos. Estas re peticiones en tndem de una secuencia sencilla se denominan DNA satlites de bido a que las primeras secuencias de este tipo que fueron descubiertas tenan una proporcin poco habitual de nucletidos, lo que hizo posible su aislamiento del grueso del DNA celular como un com ponente minoritario (o satlite). Ge neralmente las secuencias de DNA satlite no se transcriben y muy a menudo estn localizadas en la heterocromatina asociada con las regiones centromricas de los cromosomas. En algunos mamferos, un solo tipo de secuencia satlite constituye el 10% o ms del DNA, e incluso puede llegar a ocupar un brazo ente ro de un cromosoma, de tal modo que la clula contiene millones de copias de la secuencia repetida bsica. Parece que las secuencias satlite de DNA han cambiado en el curso de la evolucin de una forma extraordinariamente rpida, e incluso han cambiado sus posiciones en los cromosomas. Por ejemplo, cuando se comparan dos cro mosomas mitticos homlogos de cualquier humano, algunas de las secuencias de DNA satlite se encuentran dispuestas de manera notablemente diferente en los dos cromosomas. Adems, en contraste con el alto grado de conservacin de las secuencias de DNA de cualquier parte del genoma, generalmente existen marcadas diferencias en las secuencias del DNA satlite de dos especies ntima mente relacionadas. Todava no se ha encontrado ninguna funcin para las se cuencias de DNA satlite: por el momento, los experimentos diseados para de mostrar que estas secuencias participan en el apareamiento de cromosomas o en la organizacin nuclear no han conseguido revelar ningn tipo de evidencia 420 Captulo 8 : El ncleo celular

en este sentido. Por lo tanto se ha sugerido que estas secuencias repetidas son una forma extrema de secuencias de DNA egosta, cuyas propiedades asegu ran su propia retencin en el genoma pero que no hacen nada para ayudar a la supervivencia de las clulas que los contienen. Otras secuencias que habitual mente se consideran como egostas son los elementos transponibles, que expli camos a continuacin.

La evolucin de los genomas se ha acelerado mediante al menos tres tipos de elem entos transponibles 51
Generalmente los genomas contienen muchas variedades de elementos trans ponibles. Estos segmentos de DNA fueron descritos por primera vez en el maz, y varios de ellos han sido secuenciados y caracterizados. Los elementos trans ponibles de eucariotas se han estudiado muy ampliamente en Drosophila, don de se conocen ms de 30 variedades, que oscilan entre 2000 y 10 000 pares de nucletidos de longitud y estn presentes en nmero de entre 5 y 10 copias por clula diploide. Se pueden distinguir al menos tres grandes clases de elementos transponi bles en funcin de las peculiaridades de organizacin de su secuencia (Tabla 8-4). Algunos elementos se desplazan de un lugar a otro entre cromosomas, en forma de DNA, mientras que muchos otros se mueven va un intermediario de RNA, como se describe en el Captulo 6. En cualquier caso se pueden multiplicar y extender desde un lugar de un genoma a multitud de otros puntos, compor tndose algunas veces como parsitos perjudiciales para la salud. Parece que los elementos transponibles constituyen al m enos el 10% de los genomas de los eucariotas superiores. Aunque la mayora de estos elementos se desplazan slo muy raramente, el movimiento de otros elementos tiene un im portante efecto sobre la variabilidad de las especies. Por ejemplo, ms de la m i tad de las mutaciones espontneas examinadas en Drosophila son debidas a la insercin de un elemento transponible en o cerca del gen mutado. Las mutaciones pueden ocurrir cuando un elemento se inserta en un gen o cuando se desplaza a cualquier otro lugar. Todos los elementos transponibles conocidos provocan una duplicacin especfica de lugar corta, a consecuencia de su propio m ecanismo de insercin (vase Figura 6-70); generalmente cuando los elem entos transponibles salen, dejan parte de esta duplicacin - a menudo acompaado de otros cambios locales en la secuencia (Figura 8-80). As, un ele m ento transponible entra y sale de los cromosomas, provocando una variedad de adiciones y deleciones de secuencias cortas de nucletidos. Los elem entos transponibles tam bin contribuyen a la diversidad del geno m a de otro modo. Cuando dos elem entos transponibles que son reconocidos por la misma enzima de recom binacin especfica de lugar (transposasa ), se in tegran en puntos vecinos del cromosoma, el DNA situado entre ellos puede ser un substrato para la transposicin de la transposasa. Ello proporciona una va particularm ente efectiva para la duplicacin y barajado de los exones (exon

crom osom a 123456789

elem ento transponible + A BCDEF

INSERCIN DEL ELEMENTO TRANSPONIBLE EN UN NUEVO LUGAR DEL CROMOSOMA 123456ABCDEF56789 duplicacin de la secuencia del lugar de insercin 1 2 3 4 5 8 A 5 6789 escisin incom pleta del elem ento transponible CAMBIOS DE SECUENCIA PROVOCADOS POR EL ELEMENTO TRANSPONIBLE 1234566556789 escisin con secuencia extra invertida 12 5 6 7 8 9 escisin con delecin

1 2 3 4 5 6 5 6 7 89 escisin precisa dejando la duplicacin

Figura 8-80 Algunos cambios producidos en el DNA cromosmico por los elementos transponibles. La insercin de los elementos transponibles siempre provoca una pequea duplicacin de la secuencia del lugar de insercin, de entre 3 a 12 pares de bases, dependiendo del elemento transponible. Las enzimas de recombinacin especfica de lugar asociadas con el elemento transponible pueden producir su eliminacin del cromosoma, proceso en el que frecuentemente no se recupera la secuencia del DNA cromosmico original, como se muestra en los cuatro ejemplos.

Organizacin y evolucin del genoma nuclear

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elem entos transponibles exn 1A exn 3A GEN A que contiene dos elem entos transponibles sim ilares en los intrones term inales repetidos ESCISION ANO M ALA DEL EXON 2A POR UNA TRANSPOSASA QUE RECONOCE LOS TERMINALES REPETIDOS exn 2A exn 1B exn 2B exn 3B \ / fragm ento h I I 1 i del GEN B INSERCION EN EL INTERIOR DEL GEN B exn 1B exn 2B

fragm ento del GEN A

exn 2A
I +

exn 3B
/

GEN B con un exn extra

Figura 8-81 Ejemplo de barajado de exones que puede estar provocado por los elementos transponibles. Cuando ocurre que dos elementos del mismo tipo (DNA rojo ) se insertan uno cerca del otro en el cromosoma, los m ecanismos de transposicin pueden usar los extremos de dos elementos diferentes (en lugar de los dos extremos del mismo elemento) y de esta forma se desplazar el DNA que haba entre ellos a un nuevo sitio del cromosoma. Dado que los intrones son relativamente ms largos que los exones, es frecuente la insercin de un nuevo exn en el interior de un intrn preexistente.

shuffling), por lo que estos elementos pueden ayudar a crear nuevos genes (Fi gura 8-81).

Los elem entos transponibles afectan frecuentem ente a la regulacin gnica 52

Se ha observado que, con frecuencia, las redistribuciones de las secuencias de DNA provocadas por los elem entos transponibles alteran el momento, el nivel, o el patrn espacial de expresin de los genes cercanos, sin afectar la secuencia de la protena o del RNA que codifica el gen. Esto puede cambiar un aspecto sutil del desarrollo del animal o planta, como la forma de un ojo o de una flor. Podra esperarse que la mayora de estos cam bios en la regulacin gnica fueran perju diciales para un organismo, pero algunos de ellos podran aportar nuevos bene ficios y de esta manera se extenderan en la poblacin por seleccin natural. Los efectos sobre la regulacin gnica son comunes, en parte, debido a que el movimiento de un elemento transponible suele arrastrar con l nuevas se cuencias que actan como lugares de unin para protenas de unin a DNA es pecficas de secuencia, incluyendo transposasas y las protenas que regulan la transcripcin del DNA del elemento transponible. Por lo tanto, estas secuencias pueden actuar como secuencias reguladoras denominadas increm entadores o activadores (enhancers) (vase pg. 451), y afectar la transcripcin de genes lo calizados en las proximidades. Frecuentem ente estos efectos son la causa de la evolucin de las clulas cancerosas, en las que se pueden crear oncogenes por la transposicin de tales secuencias reguladoras en las proximidades de un protooncogn, com o se describir en el Captulo 24. La organizacin de los genomas de los eucariota superiores, con largas se cuencias de DNA no codificante intercaladas con secuencias comparativamente cortas de DNA codificante, proporciona un cmodo campo de juego para la integracin y supresin de secuencias de DNA mviles. Dado que la transcrip cin gnica puede estar regulada desde distancias de decenas o miles de pares de nucletidos de un promotor, podra esperarse que muchos de los cambios resultantes en el genoma afectaran a la expresin gnica; por el contrario, cabe esperar que relativamente pocos cam bios rompieran los cortos exones que con tienen las secuencias codificantes. Este gran exceso de DNA no codificante de los eucariota superiores puede haberse visto favorecido por la seleccin durante la evolucin a consecuencia de la flexibilidad reguladora que proporciona a los organismos que presentan una gran variedad de elementos transponibles? Lo que se conoce sobre los sistemas reguladores que controlan los genes de los organismos eucariotas superiores es consistente con esta posibilidad. Al parecer los amplificadores, como los exones,

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Captulo 8 : El ncleo celular

actan como mdulos diferentes; la actividad de un gen depende de la suma de influencias recibidas por su promotor a partir de un conjunto de amplificadores (vase Figura 9-44). Al desplazar estos mdulos activadores por todo el genoma, los elem entos transponibles pueden permitir que la regulacin gnica sea opti mizada para la supervivencia de los organismos a largo plazo.

Las explosiones de transposicin provocan cambios catastrficos en los genomas e incrementan la diversidad biolgica 53
Otro rasgo nico que caracteriza a los elementos transponibles como mutgenos es su tendencia a sufrir largos perodos quiescentes durante los cuales permane cen fijos en sus posiciones cromosmicas, seguidos por un perodo de intenso movimiento. Su transposicin, y por consiguiente su accin mutagnica, se activa de vez en cuando en unos cuantos individuos de una poblacin de organismos. Estos cambios catastrficos en los genomas, denominados explosiones de trans posicin (transposition bursts), pueden implicar transposiciones casi simultneas de varios tipos de elementos transponibles. Las explosiones de transposicin fueron observadas por vez primera en las plantas de maz que estaban sujetas a rotura crom osm ica repetida. Tam bin fueron observadas en cruces entre cier tas cepas de moscas -u n fenmeno conocido como disgnesis hbrida. Cuando ocurren en la lnea germinal, inducen mltiples cambios en el genoma de la pro genie individual de la m osca o la planta. Mediante el cambio simultneo de varias propiedades de un organismo, las explosiones de transposicin increm entan la probabilidad de que dos nuevos rasgos que son tiles conjuntam ente pero de nulo valor selectivo por s mismos, aparezcan en un individuo de una poblacin. En varios tipos de plantas existen evidencias de que las explosiones de transposicin pueden ser activadas por es trs ambiental severo, creando una variedad de organismos de la progenie m o dificados al azar, algunos de los cuales pueden adaptarse mejor a las nuevas condiciones que sus padres. Parece que, al m enos en estas plantas, ha evolucio nado un m ecanismo de activacin de los elementos transponibles para que ac ten com o mutgenos y creen un amplio rango de organismos variantes cuando esta variacin es ms necesaria. As, los elementos transponibles no son necesa riamente parsitos desorganizadores; por el contrario, ocasionalmente pueden actuar como simbiontes tiles que colaboran en la supervivencia, a largo plazo, de las especies cuyos genomas habitan.

Aproximadamente un 10% del genoma humano consiste en dos familias de elementos transponibles 54
El DNA de los primates es especial, al menos en un aspecto: contiene un elevado nmero de copias de dos secuencias de DNA transponibles que parecen haber invadido nuestros cromosomas. Ambas secuencias se desplazan mediante un proceso mediado por RNA que requiere de la presencia de una transcriptasa in versa. Uno de ellos es el elem ento transponible L l, que se parece al elemento F de Drosophila, y al elemento Cin4 del maz; al parecer codifica una transcriptasa inversa (vase Tabla 8-4, pg. 419). Los elementos transponibles han evoluciona do en general con sistemas de control por retroalimentacin que limitan severa m ente su nmero en cada clula (salvando por lo tanto a la clula de un desastre potencial); sin embargo, el elemento L l en los humanos constituye aproximada mente un 4 % de la m asa total del genoma. Menos habitual incluso es la secuencia Alu, que es muy corta (aproximada mente 300 pares de nucletidos) y que se desplaza igual que un elemento trans ponible, creando duplicaciones especficas de lugar cuando se inserta. Sin em bargo, deriv a partir de un gen de RNA 7SL, internamente delecionado de una clula husped, el cual codifica el com ponente RNA de la partcula de reconoci miento de seal (SRP) que acta en la sntesis proteica (vase Figura 12-39); por lo tanto no est claro si la secuencia Alu se tiene que considerar como un eleOrganizacin y evolucin del genoma nuclear

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ment transponible o com o un pseudogn mvil, poco habitual. Est presente en aproximadamente 500 000 copias por genoma haploide y constituye un 5% del DNA humano; por lo tanto est presente, en promedio, una vez cada 5000 pares de nucletidos. El DNA Alu es transcrito a partir del promotor del RNA 7SL, un promotor de la polimerasa III que es interno al transcrito, de tal modo que cuando se desplaza transporta la informacin necesaria para su propia transcripcin. Sin embargo, para poder desplazarse precisa tomar prestada una actividad transcriptasa inversa. Las comparaciones de la secuencia y de las posiciones de las secuencias se mejantes a L1 y Alu en diferentes mamferos sugieren que estas secuencias se han multiplicado hasta el elevado nmero de copias actuales, bastante recientemente (Figura 8-82). Es difcil imaginar que estas secuencias tan abundantemente repe tidas en nuestro genoma no tengan efectos importantes en la expresin de los muchos genes cercanos. Por ejemplo, cuntas de nuestras cualidades exclusiva mente humanas se deben a estos elementos parsitos?

secuencias A lu humanas 500 000 copias

secuencias B1 de ratn

100 000
copias

'C 2 0

40

60

Resumen
Las secuencias d e DNA fun cion ales d e los genom as de los eucariotas superiores p a recen estar construidas a partir de pequeos mdulos genticos de al m enos dos ti pos. Los mdulos d e secuencias codificantes estn com binados en m ultitud d e f o r m as produciendo protenas, m ientras q u e los mdulos d e secuencias reguladoras estn repartidos a lo largo d e grandes extensiones d e secuencias no codificantes y regulan la expresin d e los genes. Tanto las secuencias codificantes como las regu ladoras tpicam ente se organizan en mdulos, m enores a unos cuantos cientos de nucletidos, y en conjunto slo suponen una p equ e a fraccin del total d e DNA. En los genom as se produce una gra n variedad de procesos d e recom binacin gentica, q u e provocan la duplicacin y translocacin al azar d e las secuencias de DNA. Algunos d e estos cam bios crean duplicados d e genes enteros, de los qu e p u e d en evolucionar nuevas funciones. Otros producen nuevas protenas mezclando exones o m odificando la expresin de viejos genes al exponerlos a nuevas secuen cias reguladoras. Este tipo d e m ezcla de secuencias, d e gra n importancia para la evolucin d e los organismos, se ve m uy facilitada p o r la estructura partida d e los genes d e los eucariotas superiores y p o r el hecho d e q u e estos genes estn frecu en te m ente controlados p o r secuencias reguladoras alejadas. En los genom as existen m uchos tipos d e elementos transponibles. Colectiva mente, constituyen m s del 10% de la m asa del genom a d e Drosophila y d e los ver tebrados. Ocasionalmente, en las clulas germ inales ocurren explosiones d e trans posicin q u e provocan m uchos cam bios hereditarios en la expresin gnica del individuo. Se cree qu e los elementos transponibles han jugado un papel evolutivo especial en la generacin de la diversidad d e los organismos.

Figura 8-82 Patrn de evolucin propuesto para las abundantes secuencias Alu humanas. En el genoma de ratn se encuentra Bl, un elemento transponible similar a Alu. Se cree que ambas secuencias de DNA transponibles han evolucionado a partir del gen RNA 7SL. Sin embargo, basados en la distribucin y homologa de secuencia de estos elementos altamente repetidos, se cree que el mayor incremento del nmero de copias ha tenido lugar independientemente en el ratn y en el hombre. (Adaptado de P.L. Deininger y G.R. Daniels, Trends Gen. 2:76-80, 1986.)

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Bibliografa

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Patrones de expresin gnica dependientes de posicin, en cuatro embriones transgnicos diferentes de D rosophila. Cada embrin tiene, insertada en su genoma, una sola copia de una gen de la p-galactosidasa bacteriana. Dependiendo del crom osom a en el que se haya producido la insercin, distintos activadores cercanos de D rosop h ila hacen que el gen se exprese siguiendo un patrn que corresponde a (A) trquea y mesoectodermo, (B) sistema nervioso, (C) clulas gliales del sistema nervioso central ms un patrn repetitivo en cada segmento, o (D) msculo. (Por cortesa de Yuh-Nung Jan.)

El control de la expresin genica

Motivos estructurales de unin a DNA en las protenas de fea Cmo funcionan los , y, * interruptores geneticos Estructura de la cromatina A i i * / y el control de la expresin gnica Mecanismos genticos qi originan tipos celulares
mtnnntnli I

El DNA de un organismo codifica todas las molculas de RNA y de protena n e cesarias para la construccin de sus clulas. Sin embargo, la descripcin com pleta de la secuencia de DNA de un genoma -tanto los pocos millones de nucletidos de una bacteria como los escasos miles de millones de nucletidos del genoma hum ano- no nos permitira reconstruir un organismo, como tampoco podramos reconstruir una obra de Shakespeare a partir de una lista de palabras inglesas. En ambos casos el problema radica en saber cmo se utilizan los ele mentos de secuencia de DNA o las palabras de la lista. En qu condiciones se produce cada uno de los productos gnicos y, una vez producido, qu hace? En este captulo se abordar la primera parte de este problema -las reglas que determinan que en cada clula slo se expresen especficamente una selec cin de genes. Los mecanismos que controlan la expresin de los genes actan a varios niveles, que trataremos aqu. Sin embargo, el captulo se inicia con una introduccin a algunos de los principios bsicos del control gnico en los orga nismos pluricelulares.

Controles i . * po st -transcnpcionales MI -'ral

Introduccin al control gnico

Los distintos tipos celulares de un organismo superior suelen diferir profunda mente tanto en estructura como en funcin. Si comparamos, por ejemplo, una neurona de mamfero con un linfocito, observaremos que las diferencias son tan grandes que se hace difcil imaginar que ambas clulas contienen el mismo genoma. Por esta razn y porque la diferenciacin celular suele ser irreversible, los bilogos inicialmente sospecharon que durante el proceso de diferenciacin de las clulas los genes se deberan perder de modo selectivo. Sin embargo, actual mente sabemos que la diferenciacin celular depende generalmente de cambios en la expresin gnica y no de la prdida de genes.

Los distintos tipos celulares de un organismo pluricelular contienen el mismo DNA1

Los tipos celulares de un organismo pluricelular se diferencian unos de otros porque sintetizan y acumulan distintos juegos de molculas de RNA y de prote nas. Ello lo consiguen sin alterar de modo irreversible su DNA. La mejor eviden cia de la conservacin del genoma durante la diferenciacin celular proviene de una serie de experimentos clsicos con ranas. Cuando se inyecta el ncleo de una

42$

seccin de zanahoria

masa celular en proliferacin

clulas separadas en un m edio lquido enriquecido

clon organizado de clulas en divisin

em brin joven

planta joven

zanahoria

clula totalm ente diferenciada de rana en un huevo cuyo ncleo ha sido elimi nado, el ncleo dador inyectado es capaz de programar el huevo receptor para que produzca un renacuajo normal. El renacuajo contiene un espectro completo de clulas diferenciadas, las cuales han adquirido sus secuencias de DNA a partir del ncleo de la clula dadora original, lo cual significa que la clula dadora dife renciada no ha perdido ninguna secuencia importante de DNA. En experimen tos realizados con varias plantas se ha llegado a una conclusin similar. En estos experimentos se cultivaron fragmentos de tejido diferenciado en un medio de cultivo sinttico y de estos fragmentos se disociaron clulas individuales. A m e nudo cada una de estas clulas es capaz de regenerar una planta adulta entera (Figura 9-1). Otra prueba de que durante el desarrollo de los vertebrados ni se pierden ni se reorganizan grandes bloques de DNA proviene de la comparacin de los pa trones de bandas que se detectan en los cromosomas mitticos condensados de distintos tipos celulares (vase Figura 8-32). Segn este criterio, parece que los conjuntos de cromosomas de todas las clulas diferenciadas del cuerpo humano son idnticos. Adems, la comparacin de los genomas de diferentes clulas, ba sados en tcnicas de DNA recombinante, muestran, por lo general, que los cam bios de expresin gnica que subyacen al desarrollo de los organismos pluricelu lares no van acompaados de cam bios en las secuencias de DNA de los genes correspondientes (para una excepcin importante de este principio, vase Figu ra 23-27).

Figura 9-1 Regeneracin de una planta com pleta a partir de una nica clula diferenciada. En muchos tipos de plantas, las clulas diferenciadas retienen la capacidad de desdiferenciacin de modo que una sola clula puede generar un clon de clulas descendientes, que despus podr dar lugar a una planta entera.

Distintos tipos celulares sintetizan distintos conjuntos de protenas 2

Un primer paso para tratar de entender la diferenciacin celular podra consistir en averiguar cuntas diferencias existen entre dos tipos celulares dados. Aunque la respuesta a esta cuestin fundamental todava se nos escapa, podemos hacer algunas afirmaciones generales: 1. Muchos procesos son comunes a todas las clulas. Por lo tanto, dos clulas cualesquiera de un organismo presentarn muchas protenas en comn. Entre ellas se encuentran algunas protenas abundantes que suelen ser f ciles de analizar, como por ejemplo las protenas estructurales principales del citoesqueleto y de los cromosomas, algunas de las protenas esenciales para las m embranas del retculo endoplasmtico y del complejo de Golgi y las protenas ribosomales. Muchas protenas poco abundantes, como las distintas enzimas implicadas en las reacciones centrales del metabolismo, tambin son com unes a todos los tipos celulares. 2. Algunas protenas son abundantes en las clulas especializadas en las que actan pero no se pueden detectar en ningn otro tipo celular, aunque se utilicen mtodos muy sensibles. La hemoglobina, por ejemplo, slo se pue de detectar en los eritrocitos. 3. Si se comparan las, aproximadamente, 2000 protenas ms abundantes (las que se hallan presentes en ms de 50 000 copias por clula) de distintos ti pos celulares del mismo organismo, utilizando electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida, sorprendentemente se detectan muy pocas

430

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

diferencias. Tanto si se comparan dos lneas celulares en cultivo (por ejem plo lneas de clulas musculares y nerviosas) como si se escogen clulas de dos tejidos de roedor (por ejemplo el hgado y el pulmn), la inmensa m a yora de las protenas que se detectan en ambos tipos celulares se sinteti zan en proporciones que difieren en menos de cinco veces; en los dos tipos celulares slo aparecen en cantidades muy diferentes un pequeo porcen taje de las protenas. Estudios sobre el nmero de secuencias de mRNA distintas de una clula sugieren que cada clula tpica de un eucariota superior sintetiza entre 10 000 y 20 000 protenas distintas. La mayora de ellas son demasiado escasas para que puedan ser detectadas a partir de extractos celulares mediante electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida. Si estas protenas celulares menores difie ren entre las diferentes tipos celulares en la misma magnitud en la que difieren las protenas abundantes, lo cual es lo ms probable, es posible que el nmero de protenas diferentes suficientes para crear grandes diferencias de morfologa y comportamiento celular sea bastante pequeo (quiz slo de varios cientos).

Una clula puede cam biar la expresin de sus genes como respuesta a seales externas 3
La mayor parte de las clulas especializadas de un organismo pluricelular son capaces de alterar su patrn de expresin gnica como respuesta a seales extracelulares. Por ejemplo, si se expone una clula del hgado a una hormona glucocorticoide, se increm enta dramticamente el nivel de produccin de algunas protenas especficas. Los glucocorticoides se liberan durante perodos de ayuno o de ejercicio intenso e indican al hgado la necesidad de producir ms glucosa a partir de aminocidos u otras pequeas molculas; el conjunto de las protenas cuya produccin se induce incluye enzimas como la tirosina aminotransferasa, que contribuye a convertir tirosina en glucosa. La produccin de estas protenas recupera sus niveles normales cuando la hormona desaparece. Otros tipos celulares responden a los glucocorticoides de diferente manera. Por ejemplo, los adipocitos reducen la produccin de tirosina aminotransferasa, mientras que otros tipos celulares no responden a los glucocorticoides de ningu na forma. Estos ejemplos ilustran una caracterstica general de la especializacin celular -frecuentem ente diferentes tipos celulares responden en diferente forma a la misma seal extracelular. Subyaciendo a esta especializacin existe una serie de rasgos que no cambian, y que confieren a cada tipo celular sus pro piedades caractersticas. Estos rasgos reflejan la expresin constante de diferen tes conjuntos de genes.

La expresin gnica se puede regular en muchas de las etapas de la va que conduce desde el DNA al RNA y a las protenas 4
Si las diferencias que existen entre los distintos tipos de clulas dependen de los genes concretos que estas clulas expresan, a qu nivel se ejerce el control de la expresin gnica? La va que conduce desde el DNA a las protenas est formada por muchas etapas, y en principio todas ellas se pueden regular. As, las clulas pueden controlar la sntesis de protenas (1) regulando el momento y la frecuen cia de la transcripcin de genes concretos (control transcripcional), (2) contro lando el modo de maduracin o procesamiento de los transcritos primarios de RNA (control del procesamiento del RNA), (3) seleccionando los mRNA madu ros que van a ser exportados al citoplasma (control del transporte de RNA), (4) seleccionando los mRNA citoplasmticos que van a ser traducidos por ribosomas (control traduccional), (5) desestabilizando selectivamente algunas m ol culas de mRNA citoplasmtico (control de la degradacin de los mRNA), o (6) activando, inactivando o ubicando de modo selectivo las protenas ya sintetiza das (control de la actividad proteica) (Figura 9-2).

Introduccin al control gnico

431

m R N A inactivo

NUCLEO
transcritos prim arios . de RNA _

CITOPLASMA control de la degradacin de los mRNA

mRNA

DNA.

1 control transcripcional

mRNA

control del procesam iento del RNA

I transporte I del RNA

3 del I control

control traduccional

control de la actividad proteica

Figura 9-2 Seis etapas en las que se puede controlar la expresin gnica en los eucariotas. En este captulo slo se com entan las etapas de la 1 a la 5. La regulacin de la actividad proteica (etapa 6 ) se describe en el Captulo 5; sta incluye activacin e inactivacin reversible por fosforilacin proteica as com o inactivacin irreversible por degradacin proteoltica.

proteina

proteina inactiva

Para la mayora de genes, los controles transcripcionales son los ms impor tantes. Esto tiene sentido ya que de todos los posibles puntos de control ilustra dos en la Figura 9-2 solamente el control transcripcional asegura que no se sinte ticen intermediarios superfluos. A continuacin se describirn los componentes de DNA y protenas que regulan la iniciacin de la transcripcin gnica. Al final del captulo se describirn los otros mecanismos que permiten regular la expre sin de los genes.

Resumen
El genoma de una clula contiene en la secuencia de su DNA la informacin para producir miles de protenas y molculas de RNA diferentes. Una clula expresa, t picamente, slo algunos de sus genes, y los diferentes tipos celulares de los organis mos pluricelulares se forman porque expresan diferentes conjuntos de genes. Ade ms, las clulas pueden cambiar el patrn de expresin de sus genes en respuesta a cambios en su ambiente, tales como seales que provengan de otras clulas. Aun que todas las etapas implicadas en la expresin de un gen pueden en principio estar reguladas, el punto de control ms importante en la mayora de los genes es la ini ciacin de la trascripcin a RNA.

Motivos estructurales de unin a DNA en las protenas de regulacin gnica5

Cmo puede una clula determinar cules de sus miles de genes se han de transcribir? Como se ha expuesto en el Captulo 8, la transcripcin de cada gen est controlada por una regin de DNA prxima al lugar donde se inicia la trans cripcin. Algunas regiones reguladoras son simples y actan como interruptores activados por una seal nica. Otras regiones reguladoras son complejas y actan a modo de minsculos microprocesadores, respondiendo a una variedad de se ales, que interpretan e integran para decidir si activan o no el gen vecino. Sean simples o complejos, estos dispositivos interruptores constan de dos tipos de com ponentes fundamentales : (1) cortas secuencias de DNA definidas, y (2) pro tenas de regulacin gnica que las reconocen y se unen a ellas. Iniciaremos la discusin de las protenas de regulacin gnica describiendo cm o fueron descubiertas.

Las protenas de regulacin gnica se descubrieron utilizando tcnicas de gentica bacteriana 6

Los anlisis genticos realizados en bacterias durante los aos cincuenta aporta ron las primeras evidencias de la existencia de protenas de regulacin gnica capaces de activar o desactivar conjuntos especficos de genes. Unos de estos re guladores, el represor lambda, est codificado por un virus bacteriano, el bacte rifago lambda. El represor inactiva los genes del virus que codifican los compo-

432

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

nentes proteicos de las nuevas partculas vricas y por ello capacitan al genoma vrico para permanecer en el cromosoma bacteriano como un pasajero silencioso, multiplicndose con la bacteria cuando las condiciones son favorables al creci miento bacteriano (vase Figura 6-80). El represor lambda fue de las primeras protenas de regulacin gnica que se caracterizaron, y contina siendo una de las mejor conocidas como se ver ms adelante. Otros reguladores bactrianos responden a condiciones nutricionales inactivando conjuntos de genes que co difican grupos de enzimas del metabolismo que ya no se necesitan. Por ejemplo, el represor lac, la primera de estas protenas bacterianas que se descubri, inac tiva la produccin de protenas implicadas en el metabolismo de la lactosa cuando sta no se encuentra disponible en el medio. La primera etapa hacia la comprensin de la regulacin de los genes fue el aislamiento de cepas de bacteria y de bacterifago lambda imitantes incapaces de inactivar determinados grupos de genes. En aquel tiempo se propuso, y pos teriormente se demostr, que la mayora de esos imitantes eran deficitarios en protenas que actuaran como represores especficos de esos grupos de genes. Debido a que estas protenas, como la mayora de las protenas reguladoras, se encuentran en pequeas cantidades, su aislamiento fue muy difcil y largo. Se purificaron mediante fraccionamiento de extractos celulares en series de colum nas cromatogrficas (vanse pgs. 176-179). Una vez aisladas, se observ que las protenas se unan a secuencias de DNA prximas a los genes que regulaban. Las secuencias de DNA que reconocan fueron determinadas mediante una combi nacin de gentica clsica, secuenciacin de DNA y experimentos de huella en el DNA (descritos en el Captulo 7).

El exterior de la hlice de DNA puede ser ledo por protenas 7

Tal como se ha descrito en el Captulo 3, el DNA de un cromosoma est formado por una doble hlice muy larga (Figura 9-3). Las protenas reguladoras deben re conocer secuencias especficas en el interior de esta estructura. En un principio se pens que para ser capaces de distinguir una secuencia de DNA de la otra, es tas protenas deberan acceder a los enlaces de hidrgeno entre pares de bases en el interior de la doble hlice. Sin embargo, actualmente se sabe que las prote nas reguladoras pueden reconocer la informacin acerca de la secuencia de DNA desde el exterior de la doble hlice, sin necesidad de abrirla. El borde de cada par de bases est expuesto en la superficie de la doble hlice, presentando un patrn caracterstico de aceptores y dadores de enlaces de hidrgeno y parches hidrofbicos reconocibles por protenas, tanto en el surco mayor como en el menor (Figura 9-4). Pero, nicamente en el surco mayor los patrones son nicos para cada uno de los cuatro apareamientos de bases (Figura 9-5). sta es la ra zn de que la mayora de las protenas de regulacin gnica se unan al surco m a yor, como se ver. A pesar de que los rasgos ms importantes reconocidos por las protenas re guladoras son los grupos dadores y aceptores de enlaces de hidrgeno, no son los nicos; la secuencia de nucletidos determina asimismo la geometra global de la doble hlice.

* !-"

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-i m m -4* * *'
7

surco m enor

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surco m ayor

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La geom etra de la doble hlice de DNA depende de la secuencia de nucletidos 8

Durante los 20 aos siguientes al descubrimiento de la doble hlice del DNA en 1953, se pens que el DNA tena siempre la misma estructura montona, con exactamente 36 de giro de hlice entre pares de nucletidos adyacentes (10 pa res de bases por vuelta de la hlice) y una geometra helicoidal uniforme. Sin embargo esta visin, que proceda del estudio estructural de mezclas de DNA heterogneo, cambi cuando se resolvieron las primeras estructuras tridimen sionales de secuencias cortas de DNA mediante cristalografa de rayos X y espec troscopia NMR. Mientras que los primeros estudios mostraban una imagen meFigura 9 -3 Estructura de doble hlice del DNA. Se seala el surco

mayor y el menor en el exterior de la doble hlice. Los tomos se han coloreado como sigue: carbono, azul oscuro; nitrgeno, azul claro; hidrgeno, blanco; oxgeno, rojo; fsforo, amarillo.

Motivos estructurales de unin a DNA en las protenas de regulacin gnica

433

surco mayo/-

surco menor surco m ayor

CH'

OP'H-N

Figura 9-4 Cmo es posible reconocer los apaream ientos de bases a partir de sus bordes sin necesidad de abrir la doble hlice. Se muestran las cuatro configuraciones posibles de pares de bases, con los dadores de enlaces de hidrgeno indicados en azul, los aceptores de enlace de hidrgeno en rojo y los propios enlaces de hidrgeno como series de lneas rojas cortas y paralelas. Los grupos metilo que forman protuberancias hidrofbicas se han indicado en a m arillo, y los tomos de hidrgeno que estn unidos a carbono y son por tanto inaccesibles a los enlaces de hidrgeno se sealan en b lan co.

surco m enor

dia de una molcula de DNA idealizada, los ltimos mostraron que cualquier se cuencia nucleotdica presenta irregularidades locales, como pares de bases incli nados o ngulos de giro mayores o menores a 36. Estos rasgos nicos pueden ser reconocidos por las protenas reguladoras. Un caso especialmente remarcable de estructura distinta a la ms comn es la que se observa en el caso de secuencias nucleotdicas que producen la curva tura de la doble hlice. Algunas secuencias (por ejemplo, AAAANNN, donde N puede ser cualquier base excepto A) forman una doble hlice con una irregulari dad pronunciada que produce una curvatura moderada; si esta secuencia se re pite a intervalos de 10 nucletidos en una larga molcula de DNA las curvaturas se suman y estas molculas aparecen inusualmente curvadas cuando se obser van con el m icroscopio electrnico (Figura 9-6).

surco m ayor

surco m enor CLAVE: = H aceptor de enlaces de hidrgeno = H dador de enlaces de hidrgeno ( ^ ) = tom o de hidrgeno = grupo m etilo

Figura 9-5 Un cdigo de reconocim iento del DNA. El borde de cada base, visto directam ente desde el surco mayor o desde el surco menor, contiene un patrn distintivo de aceptores y dadores de enlaces de hidrgeno y de grupos metilo. Cada uno de los cuatro apareamientos de bases posibles proyecta un patrn de rasgos nicos. Sin embargo desde el surco menor se confunden los patrones para G-C y C-G y para A-T y T-A. El cdigo de colores es el mismo que se ha utilizado en la Figura 9-4.

434

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

Fig u ra9-6 Electronm icrografa de fragmentos de hlices de DNA muy curvadas. Los fragmentos de DNA

300 nm

proceden del pequeo DNA circular mitocondrial de un tripanosoma. A pesar de que los fragmentos slo tienen unos 200 pares de bases, muchos de ellos se han doblado hasta formar un crculo completo. Un DNA normal de este tamao slo podra doblarse hasta producir arcos de una cuarta parte de una estas circunferencias (una curvatura ligera y uniforme hacia la derecha). (De J. Griffith, M. Bleyman, C.A. Rauch, P.A. Kitchin y P.T. Englund, Celi 46:717724, 1986. Celi Press.)

Un rasgo relacionado e igualmente importante de la estructura del DNA es la deformabilidad de la doble hlice. Para una proteina que debe reconocer y unirse a una secuencia concreta de DNA, debe existir un apareamiento estrecho entre el DNA y la protena, y frecuentemente la conformacin normal del DNA se distorsiona para aumentar este apareamiento (Figura 9-7). El coste energtico de tal distorsin depende de la secuencia nucleotdica. En el Captulo 8 ya se dis cuti un caso similar en relacin con el ensamblaje del nucleosoma: algunas se cuencias de DNA soportan m ejor que otras la curvatura que se requiere para ro dear el nucleosoma. De una manera similar, algunas protenas reguladoras inducen una curvatura brusca en el DNA cuando se unen a l (Figura 9-8). En general, dichas protenas reconocen secuencias de DNA que se curvan con faci lidad.

Figura 9-7 Deformacin del DNA inducida por la unin de protenas.

Secuencias cortas de DNA son componentes fundamentales de los interruptores genticos9

Ya hemos visto cmo se puede detectar una secuencia nucleotdica especfica como un patrn de rasgos estructurales en la superficie de la doble hlice del DNA. Secuencias nucleotdicas particulares, cada una de ellas con una longitud de m enos de 20 pares de bases, actan como componentes fundamentales de los interruptores genticos, al actuar como lugares de reconocim iento para la unin de protenas de regulacin gnica especficas. Se han identificado cente nares de estas secuencias de DNA, cada una de ellas reconocida por una nica protena reguladora o por una serie de ellas muy relacionadas. En la Tabla 9-1 se listan algunos ejemplos de estas protenas junto con las secuencias que recono cen. Ahora volvamos a las protenas de regulacin gnica -e l segundo com po nente fundamental de los interruptores genticos- que reconocen cortas se cuencias de DNA especficas contenidas en una doble hlice mucho mayor.

La figura muestra los cambios en la estructura del DNA, desde la forma regular de B-DNA (A) a una forma distorsionada de B-DNA (B), que se observa cuando una proteina reguladora bien conocida (el represor del bacterifago 434) se une a secuencias especficas de DNA. La facilidad con la que esta secuencia de DNA se deforma afecta frecuentemente a la afinidad con la que la protena se une a ella.

Las protenas de regulacin gnica contienen motivos estructurales que pueden leer secuencias de DNA1 0
En biologa, el reconocimiento molecular generalmente se basa en el ajuste exacto entre las superficies de dos molculas, y el estudio de las protenas de re gulacin gnica ha suministrado algunos de los ejemplos ms evidentes de este principio. Una protena de regulacin gnica reconoce una secuencia de DNA especfica porque la superficie de la protena es complementaria a la superficie de la molcula de DNA, con sus rasgos estructurales caractersticos en esa re gin. En la mayora de los casos la protena establece un gran nmero de contac tos con el DNA, incluyendo enlaces de hidrgeno, enlaces inicos e interaccio.f#
Figura 9 -8 Curvatura del DNA inducida por la unin de la proteina activada por catabolito (CAP). CAP es

una protena reguladora de E. coli. Si la protena no est unida la hlice de DNA es recta.

Motivos estructurales de unin a DNA en las protenas de regulacin gnica

435

Tabla 9-1 Algunas protenas reguladoras y las secuencias de DNA que reconocen
N om bre S ecuen cia de DNA recon ocid a*

Bacterias

represorlac CAP represor lambda

Levaduras

GAL4 MAT oc2 GCN4

Drosophila

Krppel Bicoid

Mamferos

Spl Oct-1 GATA-1

AATTGTGAGCGGATAACAATT TT AACACT CGCCT AT T GT T AA T GT GAGT T AGCT CAC T ACACTCAATCGAGTGA T AT CACCGCCAGAGGT A AT AG T GG C G GT C T C C AT C GGAG G A C T G T C C T C C G GC C T C C T G AC A G GAG GC CATGTAATT GTACATTAA ATGACTCAT TACTGAGTA AACGGGTTAA T T GCCCAAT T GGGATTAGA CCCTAATCT GG GC GG C CC GC C ATGCAAAT T ACGT TT A TGATAG ACTATC

* Cada una de las protenas de esta tabla puede reconocer un conjunto de secuencias de DNA estrechamente relacionadas entre s, pero por conveniencia en la tabla slo se indica una se cuencia para cada protena.

nes hidrofbicas. Aunque cada uno de los contactos es dbil, los 20 o ms con tactos que se establecen en la interfase DNA-protena actan conjuntam ente asegurando una interaccin que es altamente especfica y muy fuerte (Figura 9-9). De hecho, las interacciones DNA-protena se encuentran entre las interac ciones moleculares ms fuertes y especficas de las conocidas en biologa. Aunque cada uno de los ejemplos de reconocimiento protena-DNA es ni co en sus detalles, los estudios de cristalografa de rayos X y de espectroscopia

protena de unin a DNA

Figura 9-9 Unin de una protena reguladora al surco m ayor del DNA.

Slo se muestra un tipo de contacto sencillo. Tpicamente la superficie de interaccin entre la protena y el DNA ha de presentar 20 o ms de estos contactos, implicando diferentes aminocidos, de forma que cada uno de ellos contribuye a la energa de unin de la interaccin protena-DNA.

azcar-fosfato de la doble hlice

436

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

Figura 9-1 0 El motivo estructural de unin a DNA hlice-giro-hlice. El

f
V X

/V

/
V , %

/ f.V \ \ hlice de reconocim iento

nh2

/
COOH (A)
i

motivo se muestra en (A), donde cada crculo blanco representa el carbono central de un aminocido. La hlice a carboxilo terminal {rojo) se denomina hlice de reconocimiento ya que participa en el reconocimiento de las secuencias especficas en el DNA. Como se muestra en (B) esta hlice se ajusta al surco mayor del DNA donde entra en contacto con las bases apareadas (vase tambin Figura 9-4).

(B)

NMR de alrededor de 30 complejos de protenas reguladoras con sus secuencias especficas han mostrado que la mayor parte de dichas protenas contienen uno de entre una pequea serie de motivos estructurales de unin a DNA. Cada uno de estos motivos utiliza tanto hlices a como lminas (3 para unirse al surco mayor del DNA; este surco, como ya se ha visto, contiene suficiente informacin para permitir distinguir una secuencia de DNA de cualquier otra. El ajuste es tan bue no que es tentador especular que las dimensiones de las unidades estructurales bsicas de los cidos nucleicos y de las protenas evolucionaron juntas para per mitir que estas molculas se pudieran ajustar mejor.

El motivo hlice-giro-hlice es uno de los motivos de unin a DNA ms simples y comunes1 1

El primer motivo estructural de unin a DNA que se descubri fue el hlice-girohlice. Identificado originalmente en protenas bacterianas, se ha encontrado en centenares de protenas de unin a DNA tanto eucariotas como procariotas. Consta de dos hlices a conectadas por una corta cadena de aminocidos, que forma el giro. Las dos hlices se mantienen en un cierto ngulo fundamental mente por interacciones entre ambas hlices. La hlice ms prxima al extremo carboxilo se denomina la hlice de reconocimiento pues se adapta al surco mayor del DNA; las cadenas laterales de sus aminocidos, que difieren de una protena a otra, juegan un papel muy importante en el reconocimiento de las secuencias de DNA especficas a las que se une la protena (Figura 9-10). Aparte de la regin de hlice-giro-hlice la estructura de las protenas que contienen este motivo vara enormemente (Figura 9-11). As pues, cada protena

Figura 9-11 Algunas protenas hlice-giro-hlice de unin al DNA.

Todas las protenas se unen al DNA como dmeros en los que las dos copias de la hlice de reconocimiento (cilindro rojo) estn separadas por exactamente una vuelta de la doble hlice (3,4 nm). La segunda hlice del motivo hlice-giro-hlice se ha coloreado en azul, como en la Figura 9-10. El represor lambda y la protena ero controlan la expresin de genes del bacterifago lambda, y el represor de triptfano y la protena activadora de catabolito (CAP), controlan grupos de genes de E. coli.

3,4 nm

represor del triptfano

protena ero de lambda

fragm ento de la protena represora de lambda

fragm ento de CAP

DNA

Motivos estructurales de unin a DNA en las protenas de regulacin gnica

presenta su motivo hlice-giro-hlice al DNA de una forma nica, un rasgo que se cree que aumenta la versatilidad del motivo hlice-giro-hlice al aumentar el nmero de secuencias de DNA con el motivo se pueden reconocer. Adems, en la mayora de estas protenas partes de la cadena polipeptdica que estn fuera del dominio hlice-giro-hlice tam bin establecen contactos importantes con el DNA, ayudando a obtener interacciones ajustadas muy finamente. El grupo de protenas hlice-giro-hlice que aparece en la Figura 9-11 de muestra un rasgo comn a muchas protenas de unin a secuencias especficas de DNA. Se unen com o dmeros simtricos a secuencias de DNA que estn for madas por dos medios-lugares muy similares, tambin organizados simtrica mente (Figura 9-12). Esta disposicin permite que cada monmero proteico es tablezca un conjunto casi idntico de contactos e incrementa enormemente la afinidad de unin: como primera aproximacin, al duplicar el nmero de con tactos se duplica la energa libre de la interaccin pero se eleva al cuadrado la constante de afinidad.

5' T

CGTGCGTGTTG
II I I I I I I I I

3'

3' A T T G T G G C A C G

I I I I I II

A C 5'

Figura 9-12 Una secuencia especfica de DNA reconocida por la protena ero del bacterifago lambda. Los

nucletidos coloreados en verde se encuentran dispuestos simtricamente, permitiendo que cada mitad de la secuencia especfica sea reconocida de la misma manera por una subunidad de una protena dimrica, tambin mostrada en verde.

Las protenas de homeodominios son una clase especial de protenas hlice-giro-hlice1 2

Poco despus de que se descubrieran las primeras protenas de regulacin gnica en bacterias, anlisis genticos en la m osca del vinagre Drosophila permitie ron descubrir una clase de genes importantes, los genes selectores hometicos, que juegan un papel importante organizando el desarrollo de la mosca. Como se describir en el Captulo 21, se ha demostrado que estos genes tambin partici pan de forma destacada en el control del desarrollo de animales superiores. Mu taciones en estos genes producen el cambio de una parte del cuerpo de una m osca en otra parte, demostrando que las protenas que codifican controlan in terruptores del desarrollo. Cuando se determinaron las secuencias de algunos de los genes selectores hom eticos a principios de la dcada de 1980, se demostr que cada uno de ellos contena una secuencia casi idntica de unos 60 aminocidos que defina este tipo de protena y a la que se denomin homeodominio. Al resolverse la es tructura tridimensional del homeodominio se descubri que sostena un motivo hlice-giro-hlice similar al de las protenas reguladoras bacterianas, aportando una de las primeras indicaciones de que los principios de la regulacin gnica establecidos en bacterias tam bin son vlidos para los organismos superiores. Slo en Drosophila, se han descrito ms de 60 protenas homeodominio y se han identificado protenas con homeodominio en prcticamente todos los organis mos que se han estudiado, desde la levadura hasta el hombre. En la Figura 9-13 se muestra la estructura del homeodominio unido a su se cuencia de DNA especfica. Mientras que el motivo hlice-giro-hlice de las pro-

Figura 9-13 Un homeodominio unido a su secuencia especfica en el DNA. El homeodominio se pliega en

tres hlices que se empaquetan estrechamente por interacciones hidrofbicas (A). La regin que contiene las hlices 2 y 3 se parece mucho al motivo estructural hlicegiro-hlice, con la hlice de reconocimiento (rojo) estableciendo contactos importantes con el surco mayor (B). Por ejemplo, la asparagina de la hlice 3 entra en contacto con una adenina tal como se muestra en la Figura 9-9. Tambin se establecen contactos con pares de bases en el surco menor mediante un brazo flexible unido a la hlice 1. El homeodominio mostrado aqu procede de una protena reguladora de levadura, pero es casi idntico a dos homeodominios de Drosophila que interaccionan con el DNA de forma similar. (Adaptado de C. Wolberger et al., Cell 67: 517-528,1991. Cell Press.)

438

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

25 H O O C Nv
r:

1 K 23 3
C(

25

.K

NH2

HOOC

Figura 9 -1 4 Un tipo de protena con dedo de zinc. Esta protena pertenece

,v Q.

>v
19
C

;
E R S
/

F 10

\ /

(A)

E 12

tenas reguladoras bacterianas est frecuentem ente inmerso en diferentes regio nes estructurales, el motivo hlice-giro-hlice de los homeodominios est siem pre rodeado por la misma estructura (que forma el resto del homeodominio), lo cual sugiere que el motivo es presentado al DNA siempre de la misma forma b sica. Adems, estudios estructurales muestran que protenas de levaduras y de Drosophila con homeodominio reconocen el DNA casi de la misma forma, a pe sar de que existe una identidad entre ellos de slo 17 de los 60 aminocidos.

a la familia de protenas con dedos de zinc Cys-Cys-His-His, llamadas as por los aminocidos que unen el zinc. Este dedo de zinc procede de una protena de rana, de funcin desconocida. (A) Dibujo esquemtico de la secuencia de aminocidos del dedo de zinc. (B) La estructura tridimensional del dedo de zinc est formada por una lmina p antiparalela (aminocidos 1 al 10), seguida de una hlice a (aminocidos 12 al 24). Los cuatro aminocidos que unen el zinc (Cys 3, Cys 6, His 19 e His 23) mantienen fuertemente unido un extremo de la hlice a al otro extremo de la lmina p. (Adaptado de M.S. Lee et al., Science 245: 635-637,1989. 1989 the AASS.)

Figura 9-1 5 Unin a DNA de una proteina con dedo de zinc. (A) La

Existen diferentes tipos de motivos de unin a DNA en forma de dedos de zinc1 3

El motivo hlice-giro-hlice est formado exclusivamente por aminocidos. Sin embargo, un segundo grupo importante de motivos de unin a DNA utiliza una o ms molculas de zinc como elem ento estructural. Aunque todos los motivos que utilizan zinc se han denominado dedos de zinc (zinc fingers), esto se refie re slo a su aspecto en diagramas esquem ticos que datan de su descubrim ien to inicial (Figura 9-14A). Estudios estructurales posteriores han permitido de mostrar que realm ente se trata de diferentes grupos, de entre los que slo se describiremos. El primer tipo fue descubierto inicialm ente en la protena que activa la transcripcin del RNA ribosomal eucariota. Se trata de una estructura

estructura de un fragmento de una protena reguladora del ratn unida a su secuencia especfica en el DNA. Esta protena reconoce el DNA a travs de tres dedos de zinc del tipo Cys-CysHis-His (vase Figura 9-14) organizados en repeticin directa. (B) Los tres dedos de zinc tienen secuencias de aminocidos similares y entran en contacto con el DNA de forma similar. Tanto en (A) como en (B) el tomo de zinc de cada dedo se ha representado como una pequea esfera. (Adaptado de N. Pavletich y C. Pabo, Science 252: 819-817,1991. 1991 th AAAS.)

COOH COOH

(A)

(B)

Motivos estructurales de unin a DNA en las protenas de regulacin gnica

439

Figura 9 -16 Una proteina con dedo de zinc de la familia de los receptores intracelulares, unida a su secuencia especfica de DNA. ste es un ejemplo

de una proteina con dedo de zinc del tipo Cys-Cys-Cys-Cys, denominada as por los aminocidos que unen el tomo de zinc. Se muestra un dmero de la protena de unin al DNA (rojo), y se han eliminado todas las cadenas laterales excepto las coloreadas en amarillo, que forman contactos con el DNA (verde). (Adaptado de B.F. Luisi et al., Nature 352:497-505,1991. 1991 Macmillan Magazines Ltd.; fotografa cortesa de Jay Thomas.)

simple, formada por una hlice a y una lmina (3, mantenidas unidas por el zinc (Figura 9-14B). Este tipo de dedo de zinc se encuentra frecuentem ente agrupa do con otros dedos de zinc adicionales, organizados uno detrs de otro de modo que la hlice a pueda contactar con el surco mayor del DNA, formando una serie casi continua de hlice a a lo largo del surco. De esta forma se obtiene una interaccin DNA-protena fuerte y especfica a travs de la repeticin de una unidad estructural bsica (Figura 9-15). Una ventaja particular de este m o tivo es que la fuerza y especificidad de la interaccin DNA-protena se pudo ajustar durante la evolucin m ediante cam bios en el nmero de repeticiones de los dedos de zinc. Resulta difcil de imaginar cm o podran organizarse en for ma de dominios repetidos cualquiera de los otros motivos que se discuten en esta seccin. El otro tipo de dedos de zinc se encuentra en la gran familia de protenas re ceptoras intracelulares (descritas en el Captulo 15). Forma una estructura dife rente (similar al motivo procariota hlice-giro-hlice) en el que dos hlices a se m antienen juntas m ediante dos tomos de zinc. De forma similar a las protenas hlice-giro-hlice, forman dmeros que permiten a una de las dos hlices a de cada subunidad interaccionar con el surco mayor del DNA (Figura 9-16). Aun que la estructura de los dos tipos de dedos de zinc es diferente, comparten dos rasgos importantes: ambas utilizan zinc como elemento estructural y ambas uti lizan la hlice a para reconocer el surco mayor del DNA.

Las lminas p tambin pueden reconocer el DNA1 4

En los motivos de unin a DNA descritos hasta el momento tan slo se utiliza ban hlices a como estructura capaz de reconocer secuencias especficas de DNA. Sin embargo, un grupo de protenas reguladoras ha desarrollado una es trategia de reconocim iento diferente y no menos ingeniosa. En este caso la in formacin sobre la superficie del surco mayor es leda por una lmina (3 de dos hebras, con las cadenas laterales de los aminocidos extendidas desde la lmina hacia el DNA, com o se muestra en la Figura 9-17. Como en el caso del reconoci miento mediante hlice a, este motivo en lmina (3 puede reconocer muchas se cuencias de DNA diferentes; la secuencia de DNA exacta reconocida depende de los aminocidos que formen la lmina (3.

El motivo cremallera de leucina est implicado tanto en el reconocimiento del DNA como en la dimerizacin1 5
Muchas protenas reguladoras reconocen el DNA como dmeros, probablemen te debido a que, como se ha visto, se trata de una forma simple de alcanzar una elevada especificidad de unin (vase Figura 9-12). Habitualmente, la regin de

440

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

Figura 9 -17 La protena represora bacteriana met. La protena represora

00 H

HOOC

la protena responsable de la dimerizacin es diferente a la que es responsable de la unin al DNA (vase Figura 9-11). Sin embargo, un motivo com bina ambas funciones de una forma elegante y econm ica, el motivo del cremallera de leu cina. Se denomina as por la forma en que dos hlices a, una de cada monmero, se m antienen unidas formando un corto enrollamiento (descrito en el Cap tulo 3). Las hlices se m antienen unidas por interacciones entre las cadenas laterales hidrofbicas de algunos aminocidos (frecuentemente leucinas), que se extienden desde un lado de cada hlice. Exactamente despus del dominio de dimerizacin, las dos hlices a se separan una de otra formando una estructura en forma de Y, lo que permite a sus cadenas laterales contactar con el surco m a yor del DNA. As pues el dmero pinza la doble hlice como una pinza de tender ropa en un tendedero (Figura 9-18). Las protenas reguladoras que contienen una cremallera de leucina pueden formar tanto homodmeros, en los que los dos monmeros son idnticos, como heterodmeros, en los que los monmeros son diferentes. Debido a que los heterodmeros se forman tpicamente a partir de protenas con especificidad de unin al DNA diferente, la capacidad de la cremallera de leucina de formar heterodmeros increm enta enormemente el repertorio de especificidades de unin a DNA que pueden presentar estas protenas. Por ejemplo, en la Figura 9-19 se muestran tres posibles especificidades de secuencia que se podran obtener con slo dos monmeros, mientras que se podran obtener seis a partir de nica mente tres m onmeros, y as sucesivamente. ste es un ejemplo de control com binatorio, en el que son las com binaciones de protenas, ms que las protenas individuales, las que controlan un proceso celular. Es uno de los mecanismos ms importantes que utilizan las clulas eucariotas para controlar la expresin gnica. Como se discutir ms adelante, la formacin de complejos heterodimricos entre protenas reguladoras es uno de los varios posibles mecanismos com binatorios para el control de la expresin gnica. Existen numerosos tipos de protenas con cremalleras de leucina, y no todas ellas pueden formar heterodmeros con cualquier otra. De otra manera, la canti dad de interrelaciones entre los circuitos de regulacin gnica de una clula se ra tan grande com o para producir el caos. Que un heterodmero se forme o no Figura 9-18 Un dmero en crem allera de leucina unido al DNA. Dos dominios de unin al DNA en forma de hlice a {abajo) dimerizan a travs de la regin de la cremallera de leucina (leucine zipper) (arriba) formando una estructura en Y invertida. Cada uno de los brazos de la Y est formado por una hlice a simple, una de cada monmero, que entr en contacto con la secuencia especfica de DNA en el surco mayor. Cada una de las hlices a se une a una mitad de la estructura simtrica del DNA. (Adaptado de T.E. Ellenberger et al., Cell 71:1223-1237,1992. Cell Press.)

bacteriana met regula los genes que catalizan la sntesis de metionina. Cuando este aminocido es abundante, se une al represor causando un cambio en la estructura de la protena que le permite unirse fuertemente al DNA, inactivando la sntesis de las enzimas. (A) Para poder unirse fuertemente al DNA, el represor met ha de estar acomplejado con S-adenosil metionina, mostrada en rojo. Se muestra en verde una subunidad de la protena dimrica, y la otra se muestra en azul. Las dos lminas p que se unen al DNA estn formadas por una cadena de cada subunidad, mostradas en azul oscuro y verde oscuro. (B) Diagrama simplificado del represor met unido al DNA, que muestra cmo las lminas P de doble hebra del represor se unen al surco mayor del DNA. Para una mayor claridad se han omitido las otras regiones del represor (A, adaptado de W. Somers y S. Phillips, Curr. Opin. Struc. Biol. 1: 89-98,1991, Current Sciences; B, adaptado de S. Phillips, Nature 359: 387-393,1992. 1992 Macmillan Magazines Ltd.)

Motivos estructurales de unin a DNA en las protenas de regulacin gnica

441

DNA

depende de cmo se ajusten las superficies hidrofbicas de las dos hlices a que forman la cremallera, lo que a su vez depende de la secuencia de aminocidos de las dos regiones de la cremallera. As, cada protena de la clula que tenga una cremallera de leucina slo podr formar dmeros con una pequea fraccin de otras protenas con cremalleras de leucina.

El motivo hlice-bucle-hlice tambin est implicado en la dimerizacin y la unin al DNA1 6

Otro motivo importante de unin al DNA, relacionado con el dedo de leucina, es el motivo hlice-bucle-hlice (HLH, de Helix-Loop-Helix), que no se ha de con fundir con el hlice-giro-hlice descrito previamente. Un motivo HLH est for mado por una hlice a corta conectada por un bucle a una hlice a ms larga, La flexibilidad del bucle permite que una de las hlices se doble y quede alineada con la otra. Como se observa en la Figura 9-20, esta estructura de dos hlices se une tanto al DNA com o al motivo HLH de otra protena con motivo HLH. Del mismo modo que las protenas con dedo de leucina, esta segunda protena pue de ser la misma (obtenindose un homodmero) o diferente (obtenindose un heterodmero), y es la hlice a que sale de la superficie de dimerizacin la que establece contactos especficos con el DNA. Algunas de las protenas HLH carecen de la extensin de hlice a responsa ble de la unin al DNA. Estas protenas truncadas pueden formar heterodmeros con protenas con motivo HLH completo, pero los heterodmeros son incapaces de unirse estrecham ente al DNA ya que slo pueden formar la mitad de los con tactos necesarios, As pues, la heterodimerizacin aporta a la clula tanto un medio de crear dmeros con una especificidad de secuencia de DNA hbrida, como un til m ecanism o de control que permitira a una clula inactivar prote nas reguladoras especficas (Figura 9-21).

Figura 9-19 La heterodimerizacin de protenas con crem alleras de leucina perm ite alterar su especificidad de unin al DNA. Los homodmeros de cremallera de leucina se unen a secuencias de DNA simtricas, como se muestra en los dibujos de la izquierda y del centro. Estas dos protenas reconocen diferentes secuencias de DNA, como se indica por las regiones coloreada en rojo y azu l en el DNA. Estos dos monmeros diferentes se pueden com binar formando un heterodmero que ahora reconoce una molcula de DNA hbrida com puesta por una regin roja y una azul.

An no es posible predecir la secuencia de DNA que es reconocida por una protena reguladora1 7
Los motivos de unin a DNA que se han descrito previamente aportan un sopor te estructural desde el que se extienden las cadenas laterales de los aminocidos contactando con pares de bases especficos en el DNA. Sera razonable pregun-

mm
UBI!

Mm
jg?

Figura 9-2 0 Un dmero de protena hlice-bucle-hlice unido al DNA. Los cuatro monmeros se mantienen unidos en un haz de cuatro hlices: cada monmero contribuye con dos hlices a conectadas mediante un bucle flexible de pro tena [rojo). A las dos hlices a que se proyectan desde el ovillo se une una secuencia de DNA especfica. (Adaptado de FerreDAmare et al., N ature 363:38-45,1993. 1993 Macmillan Magazines Ltd.)

442

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

hom odm ero HLH activo

heterodm ero HLH inactivo

Figura 9-21 Regulacin inhibidora por las protenas HLH truncadas. El

tarse si se trata de un cdigo de apareamiento aminocido-par de bases sencillo: por ejemplo, es siempre el par de bases G-C el que se une a un cierto am inoci do? La respuesta parece ser no. En el Captulo 3 se describi que a partir de slo 20 aminocidos era posible obtener superficies de prcticamente cualquier for ma y naturaleza qumica, y una protena reguladora utiliza diferentes com bina ciones de las cadenas laterales de sus aminocidos para crear una superficie que sea exactam ente complementaria a la de la secuencia de DNA que reconoce. Pa rece por lo tanto que un mismo par de bases puede ser reconocido de muchas formas. Sin embargo, es posible que pronto los bilogos moleculares puedan entender suficientemente bien el reconocim iento de DNA-protena como para poder disear protenas que reconozcan cualquier secuencia de DNA.

motivo HLH es responsable tanto de la dimerizacin como de la unin a DNA. A la izquierda, un homodmero HLH reconoce una secuencia simtrica de DNA. A la derecha, la unin de una protena HLH completa a una protena HLH truncada que carece de la hlice a de unin al DNA forma un heterodmero incapaz de unirse fuertemente al DNA. Si la proteina truncada est presente en exceso puede bloquear la homodimerizacin de la protena completa y de este modo impedir su unin al DNA.

Un ensayo de movilidad en gel permite detectar con gran facilidad protenas que se unen a una secuencia especfica de DNA1 8
Los anlisis genticos que fueron la clave para aislar las protenas reguladoras de bacterias, levaduras y Drosophila son muchas veces imposibles de llevar a cabo en vertebrados. Por ello, el aislamiento de las protenas de regulacin gnica de los vertebrados tuvo que esperar al desarrollo de diferentes aproximaciones ex perimentales. Muchas de ellas se basan en la deteccin en un extracto celular de una protena de unin a DNA que reconoce especficamente una secuencia de la que se sabe es importante para controlar la expresin de un gen particular. La forma ms comn de detectar protenas de unin a secuencias especficas de DNA es usar una tcnica que se basa en el efecto que tiene la unin de una pro tena sobre la migracin de molculas de DNA en un gel, bajo un campo elctriUna molcula de DNA est fuertemente cargada negativamente, por lo que cuando se somete a un campo elctrico se desplaza con rapidez hacia el electro do positivo. En geles de poliacrilamida las molculas de DNA se separan en base a su tamao debido a que las molculas menores son capaces de penetrar con mayor facilidad que las mayores en la fina malla del gel. La presencia de m olcu las de protena unidas a las molculas de DNA provocarn un desplazamiento ms lento del DNA a travs del gel; en general la movilidad del DNA se reducir tanto ms cuanto mayor sea el tamao de la molcula de protena unida. Este fe nmeno es la base del anlisis de retraso en gel (gel-mobility shift assay), que per mite detectar incluso trazas de protenas de unin a DNA especficas de secuen cia. En este ensayo se utiliza un fragmento corto de DNA, de longitud y secuencia determinadas (producido por clonaje de DNA o por sntesis qumica) que es marcado radiactivamente y se mezcla con un extracto celular; la mezcla se carga en un gel de poliacrilamida y se analiza por electroforesis. Si el fragmento de DNA corresponde a una regin cromosmica en la que, por ejemplo, se unen va rias protenas de unin a secuencias especficas, la autorradiografa revelar una serie de bandas de DNA, cada una de las cuales sufrir un retraso distinto, lo que representa diferentes complejos DNA-protena. Las protenas responsables de

Motivos estructurales de unin a DNA en las protenas de regulacin gnica

443

fragm ento de DNA frag m e nto de DNA radiactivo + extracto radiactivo celular

**
O

C1 C4 C2 C5 " C3

C1 C2 C3 i****: , i mwitw C4 C5 C6 - DNA libre

(A)

resultado del gel

C6 DNA libre

(B) nmero de fraccin eluida de la columna con una concentracin creciente de sales

cada una de las bandas de retraso en el gel se pueden ir separando unas de otras mediante fraccionam iento del extracto celular (vase Figura 9-22).

La cromatografa de afinidad de DNA facilita la purificacin de protenas de unin a secuencias especficas de DNA1 9
Una vez se conoce la secuencia de DNA reconocida por una protena regulado ra, es posible utilizar un mtodo de purificacin particularmente potente, deno minado crom atografa de afinidad de DNA. Por mtodos qumicos se sintetiza un oligonucletido de doble cadena de la secuencia adecuada, y se une a una matriz porosa insoluble, com o por ejemplo la agarosa; la matriz con el oligonu cletido unido se utiliza para construir una columna que unir selectivamente las protenas que reconozcan la secuencia de DNA (Figura 9-23). De esta forma se han conseguido sin gran esfuerzo purificaciones tan grandes como de 10 000 veces. Aunque en los eucariotas superiores muchas de las protenas que se unen a secuencias especficas de DNA estn presentes en unos cuantos miles de copias en cada clula (y generalmente slo representan un 1/50 000 de la protena total de la clula), mediante cromatografa de afinidad es posible aislar suficiente can tidad de protena pura como para obtener una secuencia parcial del extremo amino terminal. A partir de esta secuencia se puede sintetizar un oligonucletido que puede utilizarse como sonda para identificar el clon de cDNA correspondien te, ya que hibridar especificamente con la secuencia que codifica la protena (descrito en el Captulo 7). El clon permite conocer la secuencia de aminocidos completa y producir la protena en cantidades ilimitadas. En algunos casos, el clon cDNA que codifica una protena de unin a DNA especfica de secuencia, se ha obtenido de una forma ms directa utilizando un segundo mtodo an ms potente que la cromatografa de afinidad a DNA. Este mtodo se inicia con una genoteca de cDNA construida con un vector de expre sin apropiado (descrito en el Captulo 7). Una colonia individual d bacterias (si el vector de expresin es un plsmido), o una placa de lisis (si el vector usado es un virus) producir grandes cantidades de la protena que codifica el cDNA

Figura 9 -22 Anlisis de retraso en gel. El principio del ensayo se muestra esquemticamente en (A). Se mezcla un extracto de una lnea celular productora de anticuerpos con un fragmento de DNA marcado radiactivamente, que contiene alrededor de 160 nucletidos de una secuencia de DNA reguladora de un gen que codifica la cadena ligera del anticuerpo producida por la lnea celular. El efecto de las protenas del extracto sobre la movilidad del fragmento de DNA se analiza por electroforesis seguida de autorradiografa. Los fragmentos de DNA libres se desplazan rpidamente hacia la base del gel, mientras que los que se unen a protenas son retardados; la observacin de 6 bandas de retraso sugiere que en el extracto existen 6 diferentes protenas de unin a DNA especficas de secuencia (indicadas como C1 a C6). (Para una mayor simplicidad los fragmentos de DNA con ms de una protena unida se han omitido en la figura.) En (B), el extracto fue fraccionado por una tcnica cromatogrfica estndar y cada fraccin se mezcl con el fragmento radiactivo de DNA y se carg en un carril de un gel de poliacrilamida, analizndose como en (A). (B, modificado de C. Scheidereit, A. Heguy y R.G. Roeder. 51: 783793,1987. Cell Press.)

{arriba)

Cell,

444

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

todas las protenas celulares ETAPA 1 ETAPA 2

protenas de unin a DNA de la etapa 1

columna con una matriz que contiene DNA de muchas secuencias diferentes

columna con una matriz que contiene slo GGGCCC CCCGGG

el lavado con soluciones de baja salinidad eluye las protenas que no se unen a DNA

el lavado con soluciones de salinidad media eluye todas las protenas no especficas para GGGCCC CCCGGG el lavado con soluciones de salinidad elevada eluye las escasas protenas que reconocen especficamente GGGCCC CCCGGG

el lavado con soluciones de salinidad media eluye muchas protenas que se unen a DNA

que contiene. Para localizar la colonia que produce la protena buscada se utiliza como sonda el oligonucletido que contiene la secuencia de unin especfica, marcado radiactivamente, para hibridar rplicas en filtros de miles de colonias individuales (vase Figura 7-26). Se seleccionan las pocas colonias que produz can la protena que se une especficamente al oligonucletido marcado, se puri fican y se analizan para localizar la que produce la protena buscada. Debido a que estas tcnicas han sido desarrolladas recientemente, slo se han podido caracterizar algunos de los muchos cientos de protenas de unin a DNA especficas de secuencia que se cree estn presentes en las clulas de los eucariotas superiores.

Figura 9-23 Cromatografa de afinidad de DNA. En la primera etapa todas las protenas que pueden unir DNA se separan del resto de las protenas celulares en una columna que contiene una gran cantidad de secuencias diferentes de DNA La mayora de las protenas de unin a secuencias especficas de DNA tienen en general una afinidad dbil por el DNA (no especfica) y son retenidas en la columna. Esta afinidad es debida fundamentalmente a interacciones inicas, de forma que las protenas pueden ser eluidas de la columna mediante soluciones de una concentracin salina moderada. En una segunda etapa, la mezcla de protenas de unin a DNA se pasa a travs de una columna que contiene exclusivamente DNA de una secuencia particular. Tpicamente la mayora de protenas de unin a DNA se unirn, dbilmente, mediante interacciones inespecficas. stas sern eluidas de nuevo mediante soluciones de salinidad moderada, dejando en la columna aquellas protenas (generalmente una o muy pocas) que se unen especficamente, y por ello firmemente, a la secuencia de DNA particular. Estas protenas retenidas se pueden eluir utilizando soluciones de elevada concentracin de sales.

Resumen
Las protenas de regulacin gnica reconocen cortas secuencias especficas de DNA de doble hlice y de ese modo determinan cules de los miles de genes de una clula se han de transcribir. Se han identificado centenares de protenas de regulacin gnica en un amplia variedad de organismos. Aunque cada una de estas protenas tiene una serie de rasgos nicos, muchas se unen al DNA como homodmeros o heterodmeros que reconocen al DNA mediante uno de entre un pequeo nmero de motivos estructurales, que incluyen el motivo hlice-giro-hlice, el homeodominio, los dedos de zinc, las cremalleras de leucina y el motivo hlice-bucle-hlice. La secuencia de aminocidos que se pliega en el dominio de reconocimiento determina la secuencia de DNA que ser reconocida. Se han desarrollado algunas potentes tcnicas para identificar y purificar las protenas de unin a secuencias especficas de DNA.

Cmo funcionan los interruptores genticos20

En la seccin anterior se han descrito los componentes bsicos de los interrup tores genticos -las protenas de regulacin gnica y las secuencias especficas de DNA que estas protema reconocen. En esta seccin se discutir cmo actan estos componentes para activar e inactivar genes como respuesta a una variedad de seales.
Cmo funcionan los interruptores genticos

445

Hace slo 40 aos la idea de que los genes se podan activar e inactivar fue revolucionaria. Este concepto fue un gran avance, y naci del estudio de cmo las bacterias eran capaces de adaptarse a cambios en la composicin del medio de crecim iento. Estudios paralelos realizados con el bacterifago lambda llega ron a muchas conclusiones similares y contribuyeron a establecer las bases de lo que sabemos actualmente respecto a cmo se regula la expresin de los genes. A las clulas eucariotas se aplican los mismos principios aunque la enorme com plejidad de la regulacin gnica en los organismos superiores, combinada con la complicacin de que el DNA en dichos organismos se encuentra empaquetado en forma de cromatina, crea nuevas posibilidades para el control, como se ver ms adelante. Comenzaremos, sin embargo, con el ejemplo ms sencillo -u n in terruptor abierto/cerrado en bacterias que responde a una seal nica.

El represor de triptfano es un interruptor simple que activa y desactiva genes en bacterias2 1

El crom osom a de la bacteria E. coli, un organismo unicelular, est formado por una molcula de DNA circular de alrededor de 5 x 106 pares de nucletidos. Este DNA es suficiente para codificar 4000 protenas, aunque simultneamente slo se fabrican algunas de estas protenas. E. coli regula la expresin de muchos de sus genes de acuerdo con la disponibilidad de fuentes de alimento que son acce sibles en el medio. Son cinco los genes que en E. coli codifican la produccin del aminocido triptfano, y estn organizados en un grupo en el cromosoma, transcribindose desde un nico promotor como una larga molcula de mRNA (Figura 9-24). Tal como se ha descrito en el Captulo 6, el promotor es la secuen cia de DNA especfica que dirige la unin de la RNA polimerasa al DNA, abrien do la doble hlice e iniciando la sntesis de una molcula de RNA. Sin embargo, cuando hay triptfano presente en el medio y ste penetra en la clula (por ejemplo cuando la bacteria se encuentra en el tracto digestivo de un animal que acaba de ingerir protenas), estas enzimas ya no se necesitan y su produccin se detiene. Actualmente conocem os con gran detalle las bases moleculares de este in terruptor. Dentro del promotor que dirige la transcripcin de los genes biosintticos de triptfano se encuentra un o p e ra d o r. Este operador es simplemente una corta secuencia de DNA regulador, de secuencia definida, que es reconoci da por una protena reguladora hlice-giro-hlice denominada r e p r e s o r del tr ip t fa n o (vase Figura 9-11). El promotor y el operador se encuentran organi zados de forma que cuando el operador est unido al represor del triptfano se bloquea el acceso de la RNA polimerasa al promotor, de modo que se impide la expresin de las enzimas productoras de triptfano (Figura 9-25). Este bloqueo est regulado de una forma ingeniosa: la protena represora slo puede unirse al DNA del operador cuando se ha unido a su vez a dos molculas del am inoci do triptfano. Como se ve en la Figura 9-26, la unin de triptfano desplaza los motivos hlice-giro-hlice del represor de modo que se pueden presentar de manera apropiada en el surco mayor del DNA; sin triptfano, los motivos que dan en el interior de la protena y la protena es incapaz de unirse al operador. As pues, el represor del triptfano es un dispositivo simple que controla la pro duccin de las enzimas biosintticas del triptfano, activando o desactivando dicha produccin en funcin de la disponibilidad de triptfano libre. A este
p ro m o to r I ---------- 1 1 11 I

Figura 9-24 Los genes agrupados que codifican la sntesis del triptfano en

A crom osom a de E. c o li

E. coli. Estos cinco genes se

transcriben como una sola molcula de mRNA, rasgo que permite que su expresin sea regulada de manera coordinada. Los grupos de genes transcritos como un nico mRNA son comunes en bacterias. A cada uno de esos grupos se le denomina un opern.

I
1' m olcula de mRNA

I \ # _______ #

\
A

\
#

enzim as de la biosntesis del trip t fa n o

446

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

prom otor - 35 operador

+1

inicio de transcripcin

Figura 9 -25 Activacin y desactivacin de los genes para el triptfano. Si el nivel de triptfano en

A
#
represor inactivo RNA polimerasa

triptfano

________ represor activo

m RNA! LOS GENES ESTN ACTIVOS LOS GENES ESTAN INACTIVOS

el interior de la clula es bajo, la RNA polimerasa se une al promotor y transcribe los cinco genes del opern de triptfano (trp). Sin embargo, si el nivel de triptfano es alto, el represor de triptfano se activa unindose al operador, impidiendo la unin de la RNA polimerasa al promotor. Siempre que el nivel de triptfano se reduzca, el represor libera su triptfano y se inactiva, permitiendo que la polimerasa inicie la transcripcin de estos genes.

modo de regulacin se le denomina control negativo ya que la forma activa de la protena de unin a DNA desactiva los genes, y a las protenas reguladoras que actan de este modo se las denomina represores transcripcionales o prote

nas represoras gnicas.

Figura 9 -2 6 La unin del triptfano a la protena represora del triptfano cam bia la conform acin del represor.

Los activadores transcripcionales activan los genes22

En el Captulo 6 se vio que la RNA polimerasa de E. coli puede unirse a un pro motor e iniciar la transcripcin del DNA Sin embargo, algunos promotores bac terianos son poco funcionales por s mismos, ya sea porque son poco reconoci dos por la RNA polimerasa o porque sta tiene dificultades en abrir la hlice de DNA en el inicio de la transcripcin. En cualquier caso estos promotores de es casa funcin pueden recuperar la funcin normal mediante protenas regulado ras que se unen en un lugar prximo del DNA, contactando con la RNA polime rasa de forma que increm entan enorm em ente la probabilidad de que se inicie el transcrito. Este modo de regulacin se denomina control positivo porque la for ma activa de la protena de unin al DNA activa los genes, y las protena regula doras que funcionan de este modo se denominan activadores transcripcionales o

protenas activadoras gnicas.

Como en el caso del control negativo por un represor transcripcional, un ac tivador transcripcional puede actuar como un interruptor gentico simple. Por ejemplo, la protena activadora bacteriana CAP (de Catabolite Activator Protein, protena activadora por catabolito), activa los genes que capacitan a E. coli para

El cambio conformacional capacita a esta protena reguladora para unirse fuertemente a una secuencia especfica de DNA y bloquear la transcripcin de los genes que codifican las enzimas necesarias para la produccin de triptfano (el opern trp). En la figura se muestra la estructura tridimensional de esta protena bacteriana con motivos hlice-giro-hlice, tanto unida al triptfano como libre, determinada por difraccin de rayos X. La unin del triptfano aumenta la distancia entre las dos hlices de reconocimiento del homodmero, permitiendo al represor adaptarse estrechamente al operador. (Adaptado de R. Zhang y et al., Nature 327:591-597,1987. 1987 Macmillan Magazines Ltd.)

triptfano

Cmo funcionan los interruptores genticos

447

(A)

una proteina activadora unida impide la transcripcin

REGULACIN NEGATIVA

(B)

una proteina activadora unida permite la transcripcin proteina activadora unida RNA polimerasa

REGULACION POSITIVA

proteina represora unida

GEN INACTIVO UN LIGANDO SE UNE A LA
p r o t e n a

REGULADORA Y LA SEPARA DEL DNA

LA ADICION DEL LIGANDO ACTIVA EL GEN PORQUE SEPARA LA PROTENA REPRESORA

proteina
LA ADICIN DEL LIGANDO DESACTIVA EL GEN PORQUE SEPARA LA PROTENA ACTIVADORA

GEN INACTIVO UN LIGANDO SE UNE A LA PROTENA REGULADORA CAPACITNDOLA PARA UNIRSE AL DNA

LA ELIMINACION DEL LIGANDO ACTIVA EL GEN PORQUE SEPARA LA PROTENA REPRESORA

represor inactivo
LA ELIMINACION DEL LIGANDO DESACTIVA EL GEN PORQUE SEPARA LA PROTENA ACTIVADORA

proteina

usar fuentes alternativas de carbono cuando la glucosa, su fuente preferida, no es accesible. La disminucin de los niveles de glucosa en el medio induce un in crem ento del nivel de la molcula sealizadora intracelular AMP cclico (cAMP), que se une a la protena CAP, capacitndola para unirse a secuencias de DNA es pecficas prximas a ciertos promotores, y de este modo activa los genes adecua dos. En este caso la expresin del gen diana es inducida o reprimida en funcin de que los niveles de cAMP sean altos o bajos respectivamente. En la Figura 9-27 se resumen las diferentes maneras en que se puede controlar un gen por control positivo o negativo. Los activadores y los represores transcripcionales tienen un diseo similar en muchos aspectos. Por ejemplo, tanto el represor del triptfano como el acti vador transcripcional CAP presentan un motivo hlice-giro-hlice y requieren la presencia de un pequeo cofactor para unirse al DNA. De hecho, se sabe que al gunas protenas bacterianas (incluyendo CAP y el represor del bacterifago lambda) actan com o activadoras o como represoras en funcin de la posicin exacta de la secuencia de DNA que reconocen en relacin al promotor: si el lugar de unin a la protena solapa el promotor, la polimerasa no puede unirse y la pro tena acta com o represor (Figura 9-28).

Figura 9-27 Resumen de los m ecanism os que utilizan las protenas reguladoras de genes p ara controlar la transcripcin en los procariotas. (A) Regulacin negativa; (B) regulacin positiva. Obsrvese que la adicin de un ligando inductor puede activar un gen ya sea separando del DNA a una protena represora de genes (panel superior izquierdo), o capacitando a una protena activadora de genes para que se una al DNA {panel inferior derecho). Del mismo modo, la adicin de un ligando inhibidor puede desactivar un gen separando del DNA a una protena activadora de genes (panel superior derecho) o capacitando a una protena represora de genes para que se una al DNA (panel inferior izquierdo).

Un activador transcripcional y un represor transcripcional controlan el opern lac2 3

Es posible disear interruptores genticos ms complicados combinando con troles negativos y positivos. Por ejemplo, el opern lac en E. coli, a diferencia del opern trp, est controlado por controles transcripcionales negativos y po sitivos: el represor lac y la protena CAP respectivamente. El opern lac codifica las protenas necesarias para transportar el disacrido lactosa al interior de la clula para su utilizacin m etablica. CAP, com o ya se ha visto, capacita a la

448

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

Figura 9-28 Algunas protenas reguladores bacterianas actan bien activadores o como represores de la transcripcin dependiendo del emplazamiento concreto de sus secuencias de unin al DNA. Un ejemplo de ello es el represor del bacterifago lambda. La protena acta como un activador transcripcional aportando un contacto favorable a la RNA polimerasa [arriba). En la parte inferior de la figura el operador se localiza un par de bases ms prximo al promotor, y en vez de ayudar a la polimerasa, ahora compite con sta por la unin al DNA. El represor lambda reconoce a su operador mediante un motivo hlice-giro-hlice, como se muestra en la Figura 9-11.

represor de lam bda

RNA polim erasa

operador

prom otor la transcripcin es activada por el represor de lambda

bacteria para utilizar fuentes de carbono alternativas a la glucosa, como por ejemplo la lactosa. Sera sin embargo intil para CAP inducir el opern lac si no hubiera lactosa disponible, y el represor lac asegura que el opern lac est inac tivo en ausencia de lactosa. Esta organizacin permite al opern lac responder integrando dos seales diferentes, de forma que slo se activa cuando las condi ciones son las adecuadas: no debe de haber glucosa pero s lactosa. Cualquier otra de las tres combinaciones posibles de seales mantiene al opern inactivo (Figura 9-29). La lgica simple de este interruptor gentico atrajo la atencin de los bilo gos desde hace 50 aos. Como se ha explicado anteriormente, las bases molecu lares de este interruptor fueron descubiertas gracias a una combinacin de ge ntica y bioqumica y aport los primeros detalles sobre cmo se realiza el control de la expresin de los genes. Aunque en los organismos superiores se utilizan las mismas estrategias para controlar la expresin gnica, los interrupto res genticos son mucho ms complejos.

-------------- 1 -------operador 1 prom otor la transcripcin es reprim ida por el represor de lam bda

La regulacin de la transcripcin en las clulas eucariotas es compleja24

El mecanismo de interruptor sensible a dos seales que controla el opern lac es elegante y sencillo. Sin embargo, es difcil imaginar la complejidad que se aade al sistema cuando se han de tener en cuenta muchas ms seales que pueden

lugar de unin lugar de de la RNA unin polimerasa de CAP (prom otor)

lugar de inicio para la sntesis de RNA

operador

gen lacZ

-80 -40 1 40 80 i_____ ,_____ i_____ ,_____ i_____ ,_____ i_____ ,_____ i pares de nucletidos + GLUCOSA + LACTOSA + GLUCOSA - LACTOSA GLUCOSA LACTOSA -G LU C O S A + LACTOSA 1 represor Stti i C A P ^ ^ i^ pp CAP i RNA I j RNA polimerasa OPERON ACTIVO OPERN INACTIVO tanto porque el represor lac est unido com o porque la protena CAP no lo est OPERN INACTIVO porque el represor lac est unido OPERN INACTIVO porque CAP no est unida

represor

Figura 9-29 Control dual del opern loe. Los niveles de glucosa y de lactosa controlan el inicio de la transcripcin del opern lac a travs de sus efectos sobre la protena represora de lac y sobre CAP. La adicin de lactosa incrementa la concentracin de alolactosa, que se une a la protema represora y la separa del DNA. La adicin de glucosa reduce el nivel de AMP cclico; como la protena represora CAP ya no tiene AMP cclico unido, la protena CAP se libera del DNA y el opern se activa. En la Figura 9-8 se muestra cmo la protena CAP induce una curvatura en el DNA al unirse; aqu no se muestra para simplificar el esquema. LacZ, el primer gen del opern lac, codifica la enzima P-galactosidasa, que rompe la lactosa en galactosa y glucosa.

Cmo funcionan los interruptores genticos

440

regular la transcripcin del opern: el espacio necesario para colocar secuencias reguladoras desbordara rpidamente todo el espacio disponible Cmo han conseguido los eucariotas superar estas limitaciones y crear interruptores gen ticos ms complejos? La regulacin de la transcripcin en los eucariotas difiere de la de las bacte rias en dos aspectos fundamentales. En primer lugar, las RNA polimerasas euca riotas no pueden iniciar la transcripcin por s mismas. Requieren la presencia de una serie de protenas, denominadas factores generales de transcripcin, que han de ensamblarse en el promotor antes de que la transcripcin pueda iniciar se. Este proceso de ensam blaje presenta mltiples etapas en las que la velocidad de inicio de la transcripcin puede aumentar o disminuir como respuesta a se ales de regulacin, y m uchos protenas reguladoras eucariotas actan influyen do en estas etapas. En segundo lugar, muchas protenas reguladoras de eucario tas pueden actuar incluso cuando se encuentran unidas al DNA a miles de nucletidos de distancia del promotor que regulan, lo que significa que un de terminado promotor puede estar controlado por un nmero casi ilimitado de se cuencias reguladoras dispersas por el DNA. A continuacin consideraremos es tas dos caractersticas de la regulacin gnica eucariota.

Las RNA polimerasas eucariotas requieren factores de transcripcin generales2 5

El descubrimiento inicial de que las RNA polimerasas eucariotas purificadas no podan iniciar la transcripcin in vitro llev al descubrimiento y purificacin de protenas adicionales, los denominados fa c to re s g e n e ra le s d e tra n s c rip c i n , necesarios para este proceso. Estas protenas no son simplemente subunidades perdidas de la polimerasa; tienen que ensamblarse formando un complejo so bre el DNA en el lugar promotor con el fin de poder reclutar a la RNA polimerasa en ese lugar. La Figura 9-30 muestra cmo se cree que se ensamblan los factores genera les de transcripcin en los promotores utilizados por la RNA polimerasa II (Pol II), la polimerasa que transcribe la gran mayora de los genes eucariotas. El proceso de ensam blaje se inicia con la unin de TFIID a la secuencia TATA, una secuencia corta de DNA de doble cadena formada esencialmente por nucleti dos T y A. La secuencia TATA es un com ponente de casi todos los promotores utilizados por Pol II y se encuentra localizada tpicamente 25 nucletidos por delante del lugar de inicio de transcripcin. TFIID est compuesto por muchas subunidades; la responsable de reconocer la secuencia TATA se denomina TBP (de TATA Binding Protein) (Figura 9-31). Una vez se ha unido TFIID a su lugar de unin en el DNA, los dems factores de transcripcin y la RNA Pol II tambin se unen. Despus de que la RNA Pol II se haya unido al promotor, se ha de separar del com plejo de factores generales de transcripcin para poder iniciar la trans-

inicio de la transcripcin TATA A

TFIID

TFIIB

Figura 9-30 Ensamblaje de los factores generales de transcripcin necesarios para la iniciacin de la transcripcin por la RNA polim erasa II. En la primera etapa TFIID se une especficam ente a la secuencia TATA. A continuacin TFIIB se une al com plejo, seguido por la RNA polimerasa II (Pol II) acom paada de TFIIF. A continuacin TFIIE y TFIIH se unen al com plejo. En presencia de ATP, TFIIH fosforila Pol II, con lo que se activa la funcin polimerasa y se inicia la transcripcin. El lugar de fosforilacin es una larga cola polipeptdica que se extiende desde la subunidad mayor de Pol II. En los mamferos est formada por 52 repeticiones de la secuencia de aminocidos YSPTSPS (vase Figura 8-42) y las que son fosforiladas son las cadenas laterales de los aminocidos serina (S) y treonina (T) de esta secuencia. Los factores generales de transcripcin han sido muy conservados evolutivamente: por ejemplo, algunos de ellos, aislados a partir de clulas humanas, pueden ser reemplazados por los equivalentes de levadura.

actividad protena quinasa (TFIIH)

SE INICIA LA TRANSCRIPCION

450

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

h 2n

Figura 9-31 Estructura tridimensional de TBP. La estructura

COOH

cripcin. Una etapa clave en el inicio de la transcripcin es la realizada por TFIIH, una subunidad de la cual es una quinasa que fosforila Pol II. Al menos en algunos promotores parece que esta fosforilacin libera la polimerasa y permite que se inicie la transcripcin. Las otras dos RNA polimerasas que se encuentran en eucariotas, RNA poli merasa I (Pol I) y RNA polimerasa III (Pol III), tam bin requieren una serie de factores generales de transcripcin. Aunque TBP es necesario para las tres poli merasas, los dems factores son diferentes de los que se ensamblan en los pro motores Pol II, y la unin de TBP en los promotores Pol I y Pol III no depende de una secuencia TATA en el DNA.

de esta subunidad de TFIID recuerda una silla de montar que se adapta a la doble hlice de DNA. Aunque la protena presenta una gran simetra, est formada por una nica cadena polipeptdica. Es probable que originalmente esta protena fuera un dmero, y que el gen codificante del monmero original se duplicara y fusionara a lo largo de la evolucin. TBP reconoce el DNA mediante un motivo diferente a los discutidos en este captulo. No se conoce ninguna otra protena que se una al DNA de la misma forma, lo que quizs sea un reflejo del papel nico de TBP en la clula: participa en el inicio de la transcripcin de todos los genes. Aunque no se muestra en la figura, el DNA es deformado severamente por la unin de TBP. Esta deformacin -dos rizos separados por una zona de DNA desenrollado- puede ser una marca que ayude a atraer a los dems factores generales de transcripcin. (Adaptado de D.B. Nikolov et al., Nature 360:4045,1992. 1992 Macmillan Magazines Ltd.)

Los incrementadores o activadores controlan los genes a distancia26

Result una gran sorpresa para muchos bilogos la demostracin, en 1979, de que DNA situado a miles de nucletidos de distancia de un promotor eucariota puede activar la transcripcin desde el promotor. Actualmente se sabe que estas secuencias increm entadoras o activadoras (enhancers) actan como lugares de unin de protenas reguladoras que activan o incrementan la transcripcin y que este tipo de accin a distancia es ms la regla que la excepcin para las protenas reguladoras en las clulas eucariotas. Este fenmeno tam bin ocurre,
Figura 9 -3 2 Activacin gnica a distancia. (A) NtrC es una protena de

NtrC increm entador o activador

RNA polimerasa bacteriana en un com plejo cerrado

'*?

prom otor
^

i* *

m
V% v* : ^

i . *
1

}&*)

V * ,* -

interm ediario de activacin en bucle

(A)

GEN ACTIVO

20 nm

regulacin gnica bacteriana que activa la transcripcin facilitando la transicin entre el complejo cerrado y el abierto de la RNA polimerasa (descrito en el Captulo 8). Aunque no es frecuente en las RNA polimerasas bacterianas, la transicin que estimula NtrC requiere la hidrlisis de ATP. (B) Se puede ver en las micrografas de microscopia electrnica la interaccin de NtrC y RNA polimerasa, as como el bucle de DNA que las separa. Aunque la activacin gnica mediante bucles de DNA es poco frecuente en bacterias, es tpica de las protenas reguladoras eucariotas. (B, cortesa de Harrison Echols.)

Cmo funcionan los interruptores genticos

451

aunque con menor frecuencia, en procariotas. Cmo pueden ejercer su funcin estas protenas a tales distancias? Se han propuesto muchos modelos, pero parece que el ms simple sera el ms correcto. El DNA existente entre el incrementador y el promotor se doblara permitiendo que las protenas unidas al increm enta dor interactuaran directamente con uno de los factores generales de transcrip cin o con la propia RNA polimerasa (Figura 9-32). El DNA actuara como una cuerda, provocando que las protenas unidas al incrementador, incluso a miles de nucletidos de distancia, colisionen repetidamente con las protenas unidas al promotor. ste es el mismo efecto que se esperara obtener incrementando la concentracin local de protena en el promotor (Figura 9-33).

F ig u ra9-33 La unin de dos protenas a lugares distantes de la doble hlice de DNA puede aum entar considerablemente la probabilidad de que ambas protenas interacten.

Una regin de control eucariota est formada por un promotor y por las secuencias de DNA reguladoras2 7
Debido a que las protenas reguladoras pueden controlar la transcripcin inclu so cuando se encuentran unidas al DNA lejos del promotor, las secuencias de DNA que controlan la expresin de un gen pueden estar dispersas sobre largas extensiones de DNA. Aqu se utiliza el trmino regin de control del gen para in dicar las secuencias de DNA necesarias para iniciar la transcripcin del gen, y las necesarias para regular la frecuencia con que tiene lugar esa iniciacin. As pues, un promotor eucariota consta de un prom otor, donde se ensamblan los factores generales de transcripcin y la polimerasa, ms todas las secuencias regulado ras a las que se unen las protenas reguladoras para controlar la velocidad de ese proceso de ensam blaje sobre el promotor (Figura 9-34). En eucariotas superiores no es inusual encontrar las secuencias reguladoras a distancias tan largas com o 50 000 pares de bases, aunque la mayor parte de las secuencias de DNA actan com o DNA espaciador y no son reconocidas por ninguna protena reguladora. En este captulo utilizamos el trmino gen para in dicar el DNA que se transcribe en RNA (vase Figura 9-34), aunque segn la idea clsica de gen debera incluir tam bin la regin de control. Las diferentes defini ciones proceden de los modos distintos en que histricamente se han ido identi ficando los genes, y los descubrimientos modernos han complicado el sentido de este trm ino -m s adelante, en este mismo captulo, volveremos a esta idea. Aunque muchas protenas reguladoras se unen a secuencias incrementadoras y activan la transcripcin gnica, algunas actan como reguladores negati vos, como se ver ms adelante. En contraste con el pequeo nmero de facto res generales de transcripcin, que son protenas abundantes y se ensamblan en los promotores de todos los genes transcritos por Pol II, existen miles de diferen-

(A) La unin de una proteina a la otra mediante una asa de DNA de 500 pares de nucletidos aumenta su frecuencia de colisin. En la figura, la intensidad de azul refleja la probabilidad de que la protena roja se encuentre en cada una de las posiciones del espacio respecto de la protena blanca. (B) La flexibilidad del DNA es tal que una secuencia cualquiera forma un pliegue de 90, de vrtice redondeado, cada 200 pares de nucletidos aproximadamente. As, cuando dos protenas estn unidas por slo 100 pares de nucletidos, su contacto queda relativamente restringido. En estos casos, la interaccin proteica es mucho ms fcil si los dos lugares de unin para las protenas estn separados por una distancia mltiple de 10 pares de nucletidos, la cual sita a ambas protenas sobre la misma cara de la hlice de DNA (que contiene 10 nucletidos por vuelta) y, por lo tanto, en el interior del bucle de DNA, donde ms fcilmente pueden interactuar. (C) Concentracin efectiva terica de la protena roja en la posicin donde est unida la protena blanca, en funcin de la separacin entre ambas. (C, cortesa de Gregory Bellomy, modificacin de M.C. Mossing y M.T. Record, Science 233:889-892,1986. 1986 th AAAS.)

452

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

factores generales de protenas de regulacin gnica transcripcin

pQ|

protenas de regulacin gnica

DNA espaciador

TATA i prom otor

i >

transcrito de RNA la regin de control del gen X

tes protenas reguladoras. Estas protenas varan de gen a gen, y cada una se en cuentra presente en cantidades muy pequeas en cada clula. Muchas de ellas reconocen su secuencia especfica de unin utilizando uno de los motivos es tructurales de unin a DNA que hemos descrito previamente. Estas protenas permiten que cada gen pueda ser activado o desactivado especficamente. En cada tipo celular de un eucariota superior existe una coleccin diferente de pro tenas reguladoras.

Muchas protenas activadoras aceleran el ensamblaje de los factores generales de transcripcin28

La mayora de las protenas reguladoras que activan la transcripcin de los ge nes -e s decir la mayor parte de las protenas activadoras gn icas- tienen un di seo modular que consta de al m enos dos dominios. Habitualmente uno de ellos contiene uno de los motivos estructurales capaces de reconocer una se cuencia reguladora especfica en el DNA que hemos descrito previamente. En el caso ms sencillo existe slo otro dominio que entra en contacto con la m aqui naria de transcripcin y acelera la frecuencia de inicio de transcripcin. Este tipo de diseo modular fue demostrado mediante experimentos en los cuales me-

Figura 9-34 Regin de control de un gen eucariota tpico. El promotor es la secuencia de DNA donde se ensamblan los factores generales de transcripcin y la polimerasa. El rasgo ms importante del promotor es la caja TATA, una corta secuencia de pares de bases A-T y T-A que es reconocida por el factor general de transcripcin TFIID. El punto de inicio de la transcripcin est localizado tpicamente a 25 pares de bases por debajo de la secuencia TATA. Las secuencias reguladoras actan como lugares de unin para las protenas reguladoras, cuya presencia en el DNA afecta la velocidad de iniciacin de la transcripcin. Estas secuencias se pueden encontrar adyacentes al promotor, muy lejanas por delante de l o incluso por detrs. Se cree que los bucles de DNA permitiran que las protenas situadas en cualquiera de estas posiciones interactuaran con las protenas que se ensamblan en el promotor. Mientras que los factores generales de transcripcin son similares para todos los genes transcritos por la RNA polimerasa II, las protenas reguladoras y las posiciones de sus secuencias de unin en relacin con el promotor son distintas para cada gen.

(A) protena GAL4 dom inio acdico activador dom inio de GAL4 de unin al DNA TATA (B) protena quim rica lexAGAL4 RNA
>

gen lacZ

lugar de unin al DNA de GAL4

TATA

GEN INACTIVO

lugar de unin al DNA de lexA

TATA RNA

Figura 9-35 Estructura modular de una proteina de activacin gnica. Esquema de un experimento de cambio de dominios proteicos que revela que las funciones de unin a DNA y de activacin de la transcripcin residen en diferentes dominios de la proteina activadora gnica GAL4 de levaduras. Es posible reconstituir un activador funcional a partir de una porcin del extremo carboxilo de la protena GAL4 si se fusiona, mediante tcnicas de fusin gnica, con el dominio de unin a DNA de ima proteina reguladora bacteriana (la protena lexA). Cuando la proteina hbrida resultante, levadura-bacteria, es producida en clulas de levadura, activar la transcripcin de los genes de levadura que presenten insertada en su proximidad la secuencia de reconocimiento de la protena bacteriana. (A) La activacin normal del gen por la proteina GAL4. (B) La protena reguladora quimrica requiere la secuencia de unin a DNA de lexA para su actividad. Normalmente GAL4 es responsable de activar la transcripcin de los genes de levadura que codifican las enzimas que convierten galactosa en glucosa. Para los experimentos que se muestran en la figura se fusionaron la regin de control de esos genes con el gen lacZ de E coli, que codifica la enzima P-galactosidasa (vase Figura 9-29). (3-galactosidasa es una enzima muy fcil de detectar, y por ello es un marcador conveniente para seguir los niveles de expresin determinados por una regin de control gnico; lacZsirve como un gen marcador (vase pg. 345).

Cmo funcionan los interruptores genticos

453

Figura 9 -36 Modelo para la accin de los activadores acdicos. La protena activadora gnica GAL4, unida al DNA en la vecindad del promotor, facilita la incorporacin de TFIIB al naciente com plejo de factores generales de transcripcin. Las protenas activadoras unidas al DNA incrementan la velocidad de transcripcin hasta 1000 veces, lo que es consistente con una afinidad dbil y no especfica entre el activador y los factores generales de transcripcin (un cam bio en la afinidad de 1000 veces corresponde a un AG de ~4 kcal/mol, que puede alcanzarse por unos cuantos enlaces no covalentes dbiles).

diante tcnicas de ingeniera gentica se crearon protenas hbridas que conte nan el dominio de activacin de una protena fusionado con el dominio de unin a DNA de otra protena diferente (Figura 9-35). En una de las clases de protenas activadoras gnicas, el dominio de activa cin presenta en su superficie un grupo de aminocidos cargados negativamen te (acdicos). Estos activadores acdicos actan acelerando el ensamblaje de los factores generales de transcripcin en el promotor. En principio, cualquiera de las etapas de ensam blaje que se muestran en la Figura 9-30 puede ser la etapa li mitante en el proceso de inicio de la transcripcin. En algunos promotores la etapa limitante es la entrada de TFIIB en el complejo, y se cree que los activado res acdicos contribuyen a superar esta limitacin facilitando al ensamblaje de TFIIB en el complejo (Figura 9-36). Otras protenas activadoras parecen actuar uniendo TFIID al DNA, mientras que otras pueden activar la transcripcin por diferentes mecanismos. En principio, el proceso de ensam blaje en el promotor podra tener ms de una etapa limitante, y el nivel mximo de transcripcin podra depender de va rios activadores gnicos unidos a la regin anterior, de modo que cada uno de ellos acelerara una etapa diferente. As, no resulta difcil comprender cmo va rias protenas reguladoras, cada una de ellas unida a una secuencia reguladora diferente, podran controlar la transcripcin de un gen eucariota. Pero, indepen dientemente de cul sea el m ecanismo preciso de accin, para que una protena reguladora pueda influir en la transcripcin de su promotor diana ha de estar unida directa o indirectamente al DNA.

Las protenas represoras pueden inhibir la transcripcin de diferentes formas2 9

Las protenas activadoras eucariotas actan de una manera similar en principio a la que hemos descrito para los activadores gnicos bacterianos: catalizan la ac cin de la polimerasa contactando con la maquinaria de transcripcin. Sin em bargo, no todas las protenas reguladoras eucariotas activan la transcripcin. Tal como hemos indicado, muchas de ellas actan como protenas represoras gni cas impidiendo la transcripcin. A diferencia de los represores bacterianos mu chas de estas protenas no actan compitiendo con la polimerasa por el acceso al DNA. A pesar de que su mecanismo preciso an no est completamente esta blecido, parece que diferentes represores tienen diferentes mecanismos de ac cin, tres de los cuales se describen en la Figura 9-37. Adems de las protenas represoras que actan sobre genes individuales, las clulas eucariotas pueden utilizar otros mecanismos para impedir la expresin de los genes en grandes regiones del cromosoma. Este mecanismo se basa en la modificacin de la estructura de la cromatina, lo cual se discutir ms adelante.

Las protenas reguladoras de genes de clulas eucariotas frecuentemente se ensamblan formando pequeos complejos sobre el DNA3 0
Aunque algunas protenas reguladoras de clulas eucariotas puede actuar inde pendientemente, la mayora de ellas forman parte de un complejo formado por 454 Captulo 9 : El control de la expresin gnica

(A)
union com petitiva al DNA

Figura 9 -37 Tres m aneras de actuar de las protenas represoras eucariotas. En el primero (A) las

del activador (B) bloqueo de la superficie de activacin

1
lugar de unin lugar de unin del activador del represor lugar de unin del represor

TATA lugar de unin del activador

protenas activadoras y represoras compiten por la unin a la misma secuencia de DNA regulador. En la segunda (B) ambas protenas pueden unir DNA, pero el represor forma un complejo con el dominio de activacin del activador, evitando que entre en contacto con la maquinaria de transcripcin. En el tercero (C) el represor interacciona con un naciente complejo de factores generales de transcripcin, impidiendo que el proceso de ensamblaje contine. En la Figura 9-21 se ilustra un cuarto mecanismo de control negativo: la inactivacin de activadores gnicos por heterodimerizacin.

(C) interaccin directa con los factores generales de transcripcin TATA

diferentes polipptidos, cada uno de los cuales tiene una funcin distinta. Fre cuentem ente el complejo se ensambla nicamente en presencia de la secuencia de DNA adecuada. Por ejemplo, en algunos casos bien estudiados, dos protenas reguladoras con una baja afinidad una de la otra cooperan para unirse a una se cuencia de DNA, secuencia a la que son incapaces de unirse por s mismas inde pendientemente. Una vez unidas al DNA, el dmero expone una superficie que es reconocida por una tercera protena portadora de un dominio de activacin que activa la transcripcin (Figura 9-38). Este ejemplo ilustra un principio gene ral importante: interacciones protena-protena que son demasiado dbiles para ensamblar las protenas en solucin pueden ser suficientes para producir el en sam blaje sobre el DNA; de esta forma la secuencia de DNA actuara como un centro de nucleacin para el ensamblaje de complejos de protenas. Una protena reguladora determinada puede participar en ms de un tipo de complejo regulador. Una protena puede actuar en un caso como parte de un complejo que activa la transcripcin, y en otro caso como parte de un complejo que la inhibe (vase Figura 9-38). As pues, individualmente las protenas regula doras eucariotas no tienen ninguna funcin activadora o represora pero actan como unidades reguladoras que se utilizan para construir complejos cuya fun cin final depender del ensamblaje de todos sus componentes. Ya hemos visto cmo la formacin de los heterodmeros de protenas regu ladoras en solucin supona un mecanismo de control combinatorio de la ex presin de los genes. El ensam blaje de pequeos complejos de protenas regula doras sobre el DNA es un segundo mecanismo de control com binatorio (vase Figura 9-38).

Figura 9 -3 8 A menudo, las protenas reguladoras de genes eucariotas se ensamblan sobre el DNA formando pequeos complejos. En (A) se

(A) EN SOLUCIN

(B) EN DNA TRANSCRIPCION REPRESORA GEN ACTIVO GEN INACTIVO

muestran cinco protenas reguladoras de genes. La naturaleza de la funcin del complejo que forman depende de la especificidad de la secuencia de DNA que nuclea su ensamblaje. En (B) un complejo activa la transcripcin gnica mientras que otro complejo reprime la transcripcin. Ntese que la protena dibujada en verde forma parte tanto del complejo de activacin como del de represin.

Cmo funcionan los interruptores genticos

455

anterior

posterior

T o

^Soo oooofl <555oooo oooo

Figura 9-39 Distribucin no uniforme de cuatro protenas reguladoras en un embrin tem prano de Drosophila. En este estadio el

Bicoid

*0000000000

embrin es un sincitio, con muchos ncleos en un citoplasma comn. Aunque no est claro en estos dibujos, todas las protenas se concentran en los ncleos.

Hunchback

Los complejos interruptores genticos que regulan el desarrollo de Drosophila estn formados por mdulos menores3 1
Dado que las protenas reguladoras se pueden situar en muchos lugares a lo lar go de largas distancias en el DNA, que pueden ensamblarse formando com ple jos en cada uno de estos lugares y que los complejos pueden influir de diferentes maneras sobre el ensam blaje ordenado de los factores generales de transcrip cin en el promotor, podra existir un nmero casi ilimitado de posibilidades de crear interruptores genticos com plejos para el control de la expresin de los ge nes eucariotas. Un ejemplo especialmente interesante de un complejo de ese tipo, un inte rruptor gentico de mltiples com ponentes, es el que controla la transcripcin del gen de Drosophila even-skipped (eve), la expresin del cual juega un papel importante en el desarrollo del embrin de Drosophila. Si el gen se inactiva por mutacin, muchas partes del embrin no se forman, y el embrin muere en una fase temprana del desarrollo. Tal com o se discute en el Captulo 21, en la etapa ms temprana del desarrollo en la que se expresa eve, el embrin es una nica clula gigante que contiene mltiples ncleos y un solo citoplasma comn. El ci toplasma no es uniforme, sino que contiene una mezcla de protenas regulado ras que se distribuyen no uniformemente a lo largo del eje del embrin, suminis trando informacin posicional para distinguir entre una parte del embrin y otra (Figura 9-39). (En el Captulo 21 se describe cmo se establecen estas diferen cias.) Aunque inicialm ente los ncleos son idnticos, rpidamente empiezan a expresar genes diferentes ya que estn expuestos a diferentes protenas regula doras. Por ejemplo, el ncleo prximo al extremo anterior del embrin en desa rrollo est expuesto a un conjunto de protenas reguladoras diferente al que in fluye en el ncleo del extremo posterior del embrin. Las secuencias de DNA regulador del gen eve estn diseadas para leer" las concentraciones de las protenas reguladoras en cada posicin a lo largo del eje del embrin, interpretando esta informacin, de forma que el gen eve se expre sa en siete franjas, cada una de las cuales tiene una anchura de cinco a seis n cleos, y situadas con precisin sobre el eje anteroposterior del embrin (Figura 9-40). Cmo se ha podido procesar esta informacin? A pesar de que los deta lles moleculares an no son conocidos, del estudio de eve y de otros genes de Drosophila con una regulacin similar ya se han podido extraer algunos princi pios generales. La regin reguladora del gen eve es muy larga (aproximadamente 20 000 pa res de nucletidos). Est formada por una serie de mdulos reguladores simples, cada uno de los cuales contiene mltiples secuencias reguladoras y es responsa ble de una franja de expresin de eve en el embrin. Esta organizacin modular se demuestra en experimentos en los que un mdulo concreto (por ejemplo, el que especifica la franja 2) se extrae de su posicin normal delante del gen, se si ta delante de un gen marcador y se reintroduce en el genoma de Drosophila (Figura 9-41A). Cuando se examinan embriones en desarrollo derivados de las

Figura 9-40 Las siete franjas de la protena codificada por el gen evenskipped (eve) en un embrin de Drosophila en desarrollo. Dos horas y media despus de la fecundacin, el huevo se fij y ti con anticuerpos que reconocen la protena Eve [verde) y anticuerpos que reconocen la protena Giant [rojo). Cuando las protenas Eve y Giant se encuentran presentes a la vez, la tincin aparece amarilla. En este momento del desarrollo el huevo contiene aproximadamente 4000 ncleos. Tanto la protena Eve como Giant se encuentran situadas en el ncleo, y las franjas de eve tienen una anchura de unos cuatro ncleos. En la Figura 9-39 se muestra el patrn de tincin de la protena Giant. (Cortesa de Michael Levine).

456

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

m dulo de la franja 3

m dulo de m dulo de la franja 2 la franja 7 TATA gen eve

(A)

m dulo de la franja 2

TATA

gen lacZ

m oscas portadoras de la construccin de DNA, se observa la expresin del gen marcador exactam ente en la posicin de la franja 2 (Figura 9 -4 IB). Experimen tos similares a ste demuestran la existencia de otros mdulos reguladores, cada uno de los cuales especifica una de las otras seis franjas.

Figura 9-41 Experimento demostrativo de la construccin m odular de la regin reguladora de

eve. (A) Se tom una regin de 480

pares de nucletidos de la regin reguladora de eve y se insert por delante de un promotor que controla la sntesis de |}-galactosidasa (el producto del gen lacZ de E. cot). (B) Cuando se introdujo esta construccin artificial en el genoma de embriones de Drosophila, los embriones expresaron P-galactosidasa (detectable mediante tincin histoqumica) precisamente en la posicin de la segunda de las siete franjas de eve (C). (B y C, cortesa de Stephen Small y Michael Levine.)

El gen eve de Drosophila est regulado por controles combinatorios3 2

El estudio detallado del mdulo regulador de la franja 2 ha dado indicios de cmo lee e interpreta la informacin posicional. Esta regin contiene secuen cias de reconocim iento para dos protenas reguladoras (Bicoid y Hunchback) que activan la transcripcin de eve, y para otras dos protenas reguladoras (Krppel y Giant) que reprimen su transcripcin (Figura 9-42). (Las protenas re guladoras de Drosophila suelen tener nombres descriptivos que reflejan el feno tipo que resulta de la inactivacin por mutacin del gen que las codifica.) Las concentraciones relativas de estas cuatro protenas determinan qu complejos se formarn en el mdulo de la franja 2 que activan la transcripcin del gen eve. La Figura 9-43 muestra las distribuciones de las cuatro protenas reguladoras en la regin del embrin de Drosophila donde se forma la franja 2. Aunque no se conocen los detalles exactos, es probable que para inactivar el mdulo de la franja 2 sea suficiente que cualquiera de los dos represores est unido al DNA, mientras que para activarlo al mximo sea necesario que se unan am bos activa dores Bicoid y Hunchback. As pues, esta unidad integra las cuatro inform acio nes posicionales de forma que el mdulo de la franja 2 se activa (y en conse cuencia se activa la transcripcin del gen eve) slo en aquellos ncleos en los que los niveles tanto de Hunchback como de Bicoid son elevados y no exista ni Krppel ni Giant. Esta com binacin de activadores y represores slo ocurre en una regin del embrin temprano; as pues, en cualquier otro caso el mdulo de la franja 2 est inactivo (y por ello es silencioso). Previamente hemos descrito dos mecanismos de control combinatorio de la expresin gnica -heterodim erizacin de las protenas reguladoras en solucin (vase Figura 9-19) y ensam blaje de com binaciones de protenas reguladoras en pequeos com plejos en el DNA (vase Figura 9-38). Es bastante probable que ambos mecanism os participen en la compleja regulacin de la expresin de eve.

Figura 9-42 Detalle del mdulo de la franja 2 de eve. El segmento de la regin

y
m dulo de la franja 2: 480 pares de nucletidos Krppel y su lugar de unin Giant y su lugar de unin Bicoid y su lugar de unin Hunchback y su lugar de unin

de control de eve identificado en la figura anterior contiene secuencias reguladoras, cada una de las cuales une alguna de cuatro protenas reguladoras. A partir de experimentos genticos sabemos que estas cuatro protenas son responsables de la expresin correcta de la franja 2 de eve. Por ejemplo, las moscas deficientes en ls dos activadores Bicoid y Hunchback no expresan la franja 2 de eve de forma eficiente. Cuando las moscas son deficientes en cualquiera de los dos represores, Giant y Krppel, la franja 2 se hace ms amplia cubriendo una zona anormalmente grande del embrin. Las regiones de unin a DNA para estas protenas se han determinado a partir de su clonaje, sobrexpresin en E. cot, purificacin y experimentos de determinacin de huella en el DNA (footprinting), tal como se ha descrito en el Captulo 7. El diagrama superior muestra que en algunos casos las secuencias de unin se pueden solapar de forma que las protenas pueden competir por su unin al DNA Por ejemplo, se cree que la unin de Krppel y Bicoid en el lugar situado ms a la derecha es mutuamente excluyente.

Cmo funcionan los interruptores genticos

457

aqu se form a la franja 2 de eve __ Giant \ H unchback

I ----------------1

Krppel
0

Bicoid

anterior posicin a lo largo del em brin

p o s te rio r-*-

Adems, la regulacin del mdulo de la franja 2 descrita ilustra un tercer tipo de control combinatorio. Dado que las secuencias reguladoras del mdulo de la franja 2 se encuentran repetidas y dispersas por todo el DNA, se pueden unir si multneamente muchos conjuntos de protenas reguladoras, influyendo as al promotor del gen. El promotor integra sobre la transcripcin las influencias de todas las protenas unidas (Figura 9-44). La regulacin de la expresin de eve es un ejemplo extremo de control com binatorio. Siete com binaciones de protenas reguladoras -u n a combinacin para cada fran ja- activan la expresin de eve, mientras que muchas otras com bi naciones (todas las que se encuentran en las regiones entre franjas) mantienen el gen silencioso. Se cree que los otros mdulos de franja tienen un diseo simi lar al descrito para el mdulo de franja 2, siendo capaces de leer informacin posicional suministrada por otras com binaciones de protenas reguladoras. La re gin de control completa ocupa 20 000 pares de nucletidos y es capaz de unir ms de 20 protenas distintas. As pues, una regin compleja y grande est cons truida a partir de una serie de mdulos de menor tamao, cada uno de los cua les est formado por una serie de secuencias cortas de DNA reconocidas por protenas reguladoras especficas. Un requerimiento importante de esta estrate gia es la ausencia de relaciones entre los mdulos: el estado de uno de los mdu los no influye sobre el de los restantes. Se desconoce cmo se consigue este ais lamiento molecular. Sin embargo, de esta forma un nico gen puede responder a una enorme cantidad de seales combinadas.

Figura 9-43 Distribucin de las protenas reguladoras responsables de asegurar que eve se exprese en la franja 2. La distribucin de estas protenas se determin mediante tincin de un embrin de D rosophila con anticuerpos dirigidos contra cada una de las cuatro protenas (Figura 939). La expresin de ev e en la franja 2 ocurre slo en la posicin donde los dos activadores (Bicoid y Hunchback) estn presentes y los dos represores (Giant y Krppel) ausentes. Por ejemplo, en embriones de moscas que carecen de Krppel la franja 2 se expande en direccin posterior. De una manera similar, la franja 2 se expande en direccin posterior si las secuencias de unin a DNA de Krppel se inactivan mediante mutacin y esta regin se reintroduce en el genoma. El propio gen eve codifica una protena reguladora que, despus de que se establezca su patrn de distribucin en siete franjas, regula a su vez la expresin de otros genes de D rosophila. A medida que progresa el desarrollo, el embrin se subdivide en regiones cada vez ms finas que darn lugar finalmente a las diferentes partes del cuerpo de una m osca adulta, tal com o se describe en el Captulo 21.

En mamferos las regiones de control tambin estn formadas a partir de mdulos reguladores sencillos3 3
Se ha estimado que un cierto porcentaje de la capacidad de codificacin de un genoma de mamfero est dedicado a la sntesis de protenas que actan como

com plejo activador fuerte

com plejo de protenas reguladoras silencioso

c o m p le jo \V ^ J dbil de ' protenas activadoras

RNA polimerasa y factores generales de transcripcin

Figura 9-44 Integracin en un prom otor. Varios grupos de protenas reguladoras pueden actuar conjuntam ente influyendo sobre un promotor, como hacen en el mdulo de la franja 2 de eve ilustrada previamente en la Figura 9-42. An no se conoce en detalle cmo se consigue la integracin de numerosas seales.

TATA

458

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

reguladores de la transcripcin gnica. Esto es un reflejo de los complejos con troles que regulan la expresin de los genes en los mamferos. Por ejemplo, es frecuente encontrar un gen con una regin de control con una longitud de 50 000 pares de nucletidos, en la que muchos mdulos, cada uno de los cuales contiene un cierto nmero de secuencias reguladoras que unen protenas regu ladoras, se encuentran separados por largas secuencias de DNA espaciador. Uno de los ejemplos m ejor conocidos de regin reguladora com pleja en m a mferos es la del gen de P-globina humano, que se expresa exclusivamente en los eritrocitos y en un momento determinado de su desarrollo. La expresin del gen est controlada por un conjunto complejo de protenas reguladoras, algunas de las cuales actan como activadores y otras como represores (Figura 9-45). Se cree que las concentraciones (o actividades) de muchas de estas protenas regu ladoras cam bian durante el desarrollo, y que slo una com binacin particular de todas ellas induce la transcripcin del gen. Como se ver ms adelante, el gen de la P-globina se encuentra sometido a un segundo nivel de control, superior, que implica cambios en la estructura de la cromatina.

A su vez, la actividad de una protena de regulacin gnica puede estar regulada3 4

La estrategias de regulacin del gen eve y del gen humano de la P-globina son si milares en cuanto a que la regin de control responde a una amplia serie de pro tenas reguladoras. Sin embargo, el caso de Drosophila es poco frecuente en cuanto a que es la distribucin espacial de las protenas reguladoras en el cito plasma la responsable de controlar la expresin del gen. Ya se ha dicho que el em brin temprano de Drosophila es una nica clula gigante que contiene miles de ncleos en un citoplasma comn y que las protenas reguladoras se encuentran distribuidas en complejos patrones espaciales de forma que distintos ncleos es tn expuestos a diferentes concentraciones de las protenas. Estas protenas regu ladoras entran al ncleo activando o reprimiendo directamente la transcripcin de sus genes diana. En muchos embriones de otros organismos los diferentes n cleos se hallan en clulas diferentes, y la informacin posicional extracelular debe o bien pasar a travs de la membrana plasmtica o bien, ms a menudo, generar seales en el citosol que puedan llegar a influir en el genoma. El mecanism o por el que las seales extracelulares comunican su m ensaje a travs de la m em brana plasmtica se describe en el Captulo 15. Aqu slo abor daremos las etapas finales de las cascadas de sealizacin intracelular activada por seales extracelulares -la s etapas en las que se modifican las protenas regu ladoras. En m uchos casos la protena reguladora se encuentra en el interior de la clula en una forma inactiva, que otra seal puede modificar, activndola. Por

Figura 9-45 Modelo para el control del gen de p-globina humano. El diagrama muestra algunas de las protenas reguladoras que se cree que controlan la expresin durante el desarrollo de los eritrocitos (vase Figura 9-52). Algunas de las protenas mostradas, como CP1, se encuentran en muchos tipos celulares, mientras que otras, como GATA-1, son propias de algunos tipos celulares, incluyendo a los eritrocitos, y por ello se cree que contribuyen a la expresin especfica de tipo celular de los genes de P globina. Tal como se indica con las flechas de dos cabezas, algunas de las secuencias de GATA-1 se solapan con las de otras protenas reguladoras; se cree que la ocupacin de estos lugares por GATA-1 excluye la unin de otras protenas. (Adaptado de B. Emerson, En Gene Expression: General and Cell-Type Specific [M. Karin ed.] pp. 116-161. Boston: Birkhauser, 1993.)

Cmo funcionan los interruptores genticos

459

SNTESIS DE LA PROTEINA INACTIVA

UNION A U N LIGANDO

DESENMASCARAMIENTO FOSFORILACIN DE ADICIN DE UNA LA PROTEINA SEGUNDA SUBUNIDAD inhibidor

ESTIMULACIN DE LA ENTRADA AL NCLEO proteina inhibidora

h'
ACTIVA (A) (B) (C)

1 subunidad de unin al DNA subunidad de activacin (D)

O U /1 Q
1 \ ___ /
c /m> v

ncleo

(E)

(F)
Figura 9-46 Algunos mecanism os de regulacin de la actividad de las protenas reguladoras en las clulas eucariotas. (A) La protena reguladora de genes slo se sintetiza cuando es necesaria y sufre una proteolisis rpida que evita su acumulacin. (B) Activacin por unin a un ligando. (C) Activacin por fosforilacin. (D) Formacin de un com plejo con otra protena que acta com o dominio activador de la transcripcin. (E) Desenmascaram iento de un dominio de activacin por fosforilacin de una protena inhibidora. (F) Estimulacin de la entrada al ncleo por eliminacin de una protena inhibidora que m antena a la protena incapaz de entrar al ncleo.

ejemplo, la protena puede ser activada por fosforilacin catalizada por una pro tena quinasa, o puede liberarse de un complejo que de otro modo mantendra a la protena reguladora secuestrada en el citosol impidiendo su entrada al ncleo. En la Figura 9-46 se ilustran estas y otras formas de controlar la actividad de las protenas reguladoras.

Las bacterias utilizan subunidades intercambiables de la RNA polimerasa para colaborar en el control de la transcripcin gnica3 5
Ya hemos resaltado la importancia de las protenas reguladoras que se unen a las secuencias reguladoras de DNA e indican al aparato transcripcional si se ha de iniciar o no la sntesis de la cadena de RNA. Aunque ste es el principal m ecanis mo de control del inicio de la transcripcin tanto en eucariotas como en proca riotas, algunas bacterias y sus virus utilizan una estrategia adicional basada en las subunidades de la RNA polimerasa intercambiables. Como se describi ya en el Captulo 8 , la subunidad sigma (a) es necesaria para que la RNA polimerasa reco nozca un promotor. Algunas bacterias producen diferentes subunidades sigma, cada una de las cuales puede interactuar con el ncleo de la RNA polimerasa y di rigirla especficamente hacia diferentes promotores. Esta estrategia permite des activar un gran grupo de genes y activar otro simplemente reemplazando una subunidad sigma por otra. La estrategia es eficiente pues evita la necesidad de ac tuar sobre los genes uno a uno, y es utilizada frecuentemente por los virus para activar conjuntos de genes rpida y secuencialmente (Figura 9-47).

RNA polim erasa con el factor sigm a de la bacteria

RNA polim erasa con la subunidad vrica semejante a sigma

I ________________________I

28

genes tem pranos

_______________________ I I

34

genes medios

I _____________ ___________ I

genes tardos

Figura 9-47 Subunidades intercambiables de la RNA polim erasa com o estrategia de control de la expresin gnica en virus bacterianos. El virus bacteriano SPO l, que infecta a la bacteria B. subtilis, utiliza la polimerasa bacteriana para transcribir sus genes tempranos. Uno de los genes tempranos, denominado 28, codifica un factor similar a la subunidad sigma que se une a la RNA polimerasa, desplazando a la subunidad sigma bacteriana. Esta nueva forma de polimerasa inicia especficam ente la transcripcin de los genes medios de SPO l. Uno de los genes medios codifica otra subunidad similar a la subunidad sigma, desplazando a su vez al factor producto del gen 28 y dirigiendo ahora la RNA polimerasa a la transcripcin de los genes tardos. Este ltimo grupo de genes codifica las protenas que empaquetarn el crom osom a vrico en una cubierta vrica y lisarn la clula. As pues, esta estrategia permite que se expresen una serie de genes vricos en un orden particular, permitiendo un control rpido, controlado temporalm ente, de la replicacin vrica.

460

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

CAGATT GAAACGT CGCGGCQ3AAAACAAAATCAACAAA CAGATT GAAACGT CGTGGCC4 AAAACAAAATCAACAAA

En un cierto sentido, los eucariotas utilizan una estrategia similar al dispo ner de tres RNA polimerasas (I, II, y III), que comparten algunas de sus subunidades. Por contraste, los procariotas utilizan el mismo ncleo bsico de RNA polimerasa, que modifican con diferentes subunidades sigma.

Figura 9 -48 Com paracin entre partes de la regin reguladora situada en direccin 5 a p artir del gen engrailed de dos especies de

Drosophila. Se presenta la
comparacin de las secuencias de

Los interruptores genticos han evolucionado gradualmente

Hemos visto que las regiones de control de los genes eucariotas se distribuyen so bre largos fragmentos del DNA, mientras que las de los procariotas estn prxi mas al inicio de transcripcin. Sin embargo, algunas protenas reguladoras proca riotas reconocen secuencias de DNA localizadas a muchos pares de nucletidos del promotor. El ejemplo del bucle de DNA en E. coli mostrado en la Figura 9-32 se parece al mecanismo por el cual las protenas reguladoras eucariotas actan a distancia. De hecho, ste caso fue uno de los primeros ejemplos de formacin de bucles en el DNA implicados en la regulacin de los genes e influy en gran medi da en los estudios posteriores de las protenas de regulacin gnica eucariotas. Parece probable que el desarrollo de los interruptores gnicos en estructu ras densamente empaquetadas a partir de interruptores mayores sea la respues ta a una presin evolutiva de las bacterias hacia el m antenimiento de un genoma de pequeo tamao. (Este mismo argumento se ha utilizado para justificar la ausencia de intrones en las bacterias, como se ha visto en el Captulo 8.) Sin em bargo, esta compresin tiene un coste, y es el de imaginar cmo pueden modifi carse con facilidad para incluir nuevos niveles de control. La forma extendida de las regiones de control eucariota, con mdulos reguladores discretos separados por largas secuencias de DNA espaciados, podran facilitar el mezclado de los mdulos durante la evolucin, tanto para crear nuevos circuitos reguladores como para modificar los ya existentes. Desentraar la historia evolutiva de las regiones de control representa un reto fascinante, y muchas de las claves podrn encontrarse el las secuencias de DNA actuales (Figura 9-48).

Drosophila melanogastery de Drosophila virilis, sealndose en rojo

las secuencias con un 90% de identidad. En la parte superior se indica a modo de ejemplo la secuencia real de un fragmento comparado. Las secuencias conservadas sealan posiblemente los lugares donde se deben unir importantes protenas reguladoras, mientras que los bucles indican lugares donde han ocurrido inserciones o deleciones de nucletidos, ya que estas dos especies han evolucionado desde un ancestro comn hace alrededor de 60 millones de aos. (Por cortesa de ludith A. Kassis y Patrick H. OFarrell.)

Resumen
La transcripcin d e cada uno d e los genes en las clulas es activada o desactivada p o r protenas d e regulacin gnica. E n procariotas estas protenas se u n en h a bi tualm ente a secuencias especficas d e DNA prxim as al luga r d e inicio d e la trans cripcin p o r la RNA polim erasa y, dependiendo d e la naturaleza d e la protena re guladora y d e la localizacin precisa d e su secuencia d e unin, p u ed en tanto

Cmo funcionan los interruptores genticos

461

activar com o rep rim ir la transcripcin d el gen. Sin em bargo, la flexib ilid a d d e la d oble h lice d e DNA p erm ite q u e protenas unidas en lugares distantes influyan en la RNA polim erasa en el luga r prom otor, a l doblarse el DNA q u e los separa. Esta a c cin a distancia es m uy com n en las clulas eucariotas, en las q u e protenas regu ladoras unidas a secuencias distantes m iles d e nucletidos del prom otor controlan la expresin d el gen. A unque las RNA polim erasas procariotas pueden iniciar la transcripcin p o r s m ism as, las polim erasas eucariotas requieren el ensam blaje previo sobre el lugar prom otor d e factores generales d e transcripcin. Estos factores se ensam blan en un cierto orden, q u e se inicia con la unin d el TFIID a la secuencia TATA, una secuencia d e DNA situada justo p o r delante d e m uchos lugares d e inicio d e la RNA polim erasa. E l proceso d e ensam blaje ordenado d e los factores gen erales d e transcripcin p re senta varias etapas en las q u e se p u ed e regu la r la iniciacin d e la transcripcin, y se cree q u e m uchas protenas reguladoras d e los genes eucariotas actan facilitando (control positivo) o lim itando (control negativo) este proceso d e ensam blaje. M ientras q u e la transcripcin d e u n determ inado gen procariota slo est con trolada p o r u na o dos protenas reguladoras, la regulacin de los gen es eucariotas es m ucho m s com pleja, d e acuerdo con el gra n tam ao d e su genom a y la gra n va ried a d d e tipos celulares q u e presentan. P or ejem plo, la regin d e control d el gen eve d e D rosophila com prende 2 0 000 pares d e nucletidos d e DNA y tiene secu en cias d e unin p ara m s d e 2 0 protenas reguladoras. A lgunas d e estas protenas son activadores transcripcionales, m ientras q u e otras son represores transcripcionales. Estas protenas se u n en a secuencias reguladoras organizadas en una serie d e m dulos reguladores dispersos a lo largo d el DNA.

Estructura de la cromatina y el control de la expresin gnica36

Como se describi en el Captulo 8, los genomas de las clulas eucariotas se en cuentran muy compactados, consiguindose que las largas molculas de DNA quepan en el interior de la clula y puedan ser m anejadas fcilmente. El primer nivel de com pactacin es el enrollamiento del DNA alrededor de las histonas formando los nucleosomas. El segundo nivel de compactacin consiste en que los nucleosomas se empaquetan en fibras de 30 nm. Finalmente, en la heterocromatina, confinada a determinadas regiones del genoma que en interfase muestran una estructura extraordinariamente condensada, se observa un orden de empaquetamiento todava superior. Cmo pueden acceder al DNA del interior de esta estructura densamente empaquetada los factores generales de transcripcin y las protenas regulado ras? Y, cmo afecta el empaquetamiento de la cromatina al control de la expre sin gnica? En esta seccin veremos que de los estudios de la estructura de la cromatina y sus efectos sobre la expresin gnica se han podido extraer dos principios generales. En primer lugar, los nucleosomas no son ningn obstculo serio ni para las protenas reguladoras ni para las RNA polimerasas. Los incrementadores pueden actuar a pesar de ellos, las histonas que bloquean un pro motor pueden ser desplazadas y, una vez ha comenzado la transcripcin, Poi II puede transcribir a travs de los nucleosomas sin desorganizarlos. Incluso las polimerasas bacterianas, que no encuentran nucleosomas in vivo, pueden transcribir a su travs, lo cual sugiere que el nucleosoma est construido de modo que pueda ser atravesado con facilidad (Figura 9-49). El segundo principio general es que algunas formas de em paquetamiento del DNA de orden superior hacen el DNA inaccesible tanto para las protenas reguladoras como para los factores generales de transcripcin. As el empaquetamiento del DNA en estruc turas de orden superior juega un papel clave en el control de la expresin gnica en eucariotas, sirviendo para m antener silenciosas grandes secciones del geno ma -e n algunos casos de forma reversible y en otros de forma irreversible.

462

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

DNA

RNA polimerasa entrando en el /e / nucleosoma n

dim ero H2A-H2B

J
(B) dim ero H3-H4 (C)

Figura 9-49 Modelo hipottico para explicar la capacidad de las RNA polim erasas p ara transcribir a travs de los nucleosom as sin provocar su desplazamiento. La polimerasa

(A)

(D)

RNA polimerasa abandonando el nucleosom a

primero desplaza un dmero H2A-H2B (vase Figura 8-10), lo que permite su entrada en el nucleosoma. En la siguiente etapa, la polimerasa empujara el DNA, alejndolo del dmero H3-H4 que se encuentra a continuacin, continuando la transcripcin. El dmero H2A-H2B desplazado es recapturado por el nucleosoma, y se desplaza el otro dmero H2A-H2B situado simtricamente, permitiendo repetir el proceso y la salida de la polimerasa del nucleosoma. (De K.E. van Holde et al., /. Biol. Chem. 267:2837-2840,1992.)

La transcripcin del DNA que est empaquetado en nucleosomas se puede activar37

En la seccin anterior vimos un modelo sencillo de cmo la transcripcin de un gen era activada por una protena reguladora (vase Figura 9-36). Cmo se ha de modificar dicho modelo para tener en cuenta la presencia de los nucleosomas ? Para empezar por el principio, de qu forma afectan los nucleosomas la unin de las protenas activadoras a las secuencias reguladoras en el DNA? En algunos casos las secuencias reguladoras se encuentran en cortas regiones libres de nu cleosomas, de forma que no existe ningn impedimento para esta interaccin. No se sabe cmo ciertas regiones se m antienen libres de nucleosomas, aunque, como ya se describi en el Captulo 8, ciertas regiones de DNA son demasiado r gidas y no admiten la torsin necesaria para la formacin del nucleosoma. Sin embargo, en otros casos la secuencia reguladora se encuentra empaquetada en un nucleosoma, lo cual no impide que al menos algunas protenas activadoras puedan reconocerla y unirse a ella. La protena reguladora, una vez unida, parece desestabilizar el nucleosoma, que entonces se desensambla al menos parcial mente. An se desconoce qu tipos de protenas reguladoras pueden conseguir este efecto y cmo tiene lugar. En cambio, los factores generales de transcripcin parecen incapaces de en samblarse sobre un promotor empaquetado en un nucleosoma. De hecho, este grado de empaquetamiento podra haber evolucionado al menos en parte en el sentido de asegurar que no se produzca una iniciacin de la transcripcin, dbil o banal (es decir iniciacin sin la unin previa de una pro tena activadora). Sin embargo, parece que la unin de una protena activadora a miles de nucletidos de distancia podra desplazar, aparentemente, un nucleosoma del promotor y entonces sera posible el ensam blaje de los factores generales de transcripcin. El desplazamiento podra ocurrir bien como consecuencia de una actividad dis tinta de la protena activadora, o ser una consecuencia indirecta de los contactos que la protena activadora establece con los factores generales de transcripcin para facilitar su ensam blaje en el DNA (Figura 9-50).

Algunas formas de la cromatina impiden la transcripcin38

Aunque se puede transcribir DNA empaquetado en nucleosomas, en algunas formas especiales de cromatina el DNA parece ser inaccesible a las protenas ac tivadoras. Se cree que estas formas inactivas de la cromatina, que incluyen a la

Estructura de la cromatina y control de la expresin gnica

463

lugar de unin del activador

proteina activadora

Figura 9-5 0 Un modelo que explicara el desplazamiento de los nucleosomas durante la iniciacin de la transcripcin en eucariotas. Una protena activadora unida poseera una segunda actividad de eliminacin de los nucleosomas del promotor, exponindolo a los factores generales de transcripcin que podran ensamblarse. En un modelo distinto, no mostrado aqu, el desplazamiento de los nucleosomas ocurre como consecuencia de la induccin del ensamblaje de los factores generales de transcripcin; la protena activadora, por ejemplo, puede permitir el ensam blaje inicial de los factores generales de transcripcin en presencia de un nucleosom a y, una vez ensamblados, estos factores desestabilizaran el nucleosoma. Se conoce muy poco el mecanismo subyacente al desplazamiento de los nucleosomas. Las histonas pueden sencillam ente soltarse del DNA, o, de acuerdo con un modelo alternativo, permanecer unidas a l (vase Figura 8-40).

cromatina especialmente condensada denominada heterocromatina (descrita en el Captulo 8), contienen protenas especiales que hacen que su DNA sea es pecialm ente inaccesible. Observaciones realizadas en la levadura S. cerevisiae ilustran cmo algunos tipos de crom atina pueden impedir la transcripcin de un gen. El gen ADE2, cuya expresin es fcilm ente detectable, se expresa constantem ente en su posi cin normal del cromosoma. Sin embargo, cuando se transloca experimental mente al extremo de un crom osom a su transcripcin se detiene, aunque la clu la contenga todas las protenas que se requieren para transcribirlo. El DNA prximo al extremo de los cromosomas (los telmeros) est empaquetado en una forma de crom atina especialmente inaccesible, y se cree que ese tipo de empaquetam iento es el responsable de m antener al gen ADE2 translocado inac tivo, proceso denominado silenciamiento. El silenciamiento de genes localiza dos cerca del extremo del cromosoma se extiende por unos 10 000 pares de nucletidos y se ha observado en muchos genes adems de ADE2; el efecto de silenciam iento parece reducirse gradualmente a medida que se incrementa la distancia desde el telmero. El m ecanismo de silenciamiento no es conocido, pero parece que supone un ensam blaje cooperativo de protenas en el DNA que, una vez establecido, es heredable a travs de la replicacin del DNA (vase Figu ra 9-51A). El silenciamiento del gen ADE2 es un ejemplo de un efecto de posicin, en el que la actividad de un gen es dependiente de su posicin en el genoma. Los efectos de posicin se detectaron en primer lugar en Drosophila (Figura 9- 5IB), pero en la actualidad ya se han descrito en muchos otros organismos, y se cree que son un reflejo de los diferentes grados de empaquetamiento de la cromatina en diferentes puntos del cromosoma, y de la tendencia de estos estados a exten derse incluyendo a los genes situados en las proximidades. Posteriormente, cuando analicemos los mecanismos de la memoria celular, volveremos a esta idea.

464

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

telm ero
I

telm ero

colonia bianca de clulas de levadura

gen A D E 2e n su posicin norm al en el crom osom a

c olonia roja de clulas de levadura con sectores blancos

gen ADE2 prxim o al telm ero

Antes de que los genes de globina de mamfero puedan transcribirse, puede ser necesaria una etapa de descondensacin3 9
Otro ejemplo de cmo la crom atina condensada puede evitar la expresin gnica procede de los estudios de los grupos de genes de (3 globina de pollos y de hu manos. Los cinco genes del grupo, que se extienden sobre 50 000 pares de nucletidos de DNA, se transcriben exclusivamente en clulas eritroblsticas (es decir, clulas sanguneas del linaje de los eritrocitos). Asimismo, cada gen es activado en una etapa diferente del desarrollo (Figura 9-52) y en diferentes rganos: el gen de e globina se expresa en el saco vitelino embrionario, el y en el saco vitelino y en el hgado fetal, y el 8 y el (3 inicialmente en la mdula sea adulta. Previa mente hemos descrito (vase Figura 9-45) una serie de protenas necesarias para activar al gen humano de la (3 globina en el momento y lugar adecuados; cada uno de los otros genes de globina tiene una serie de protenas reguladoras simi lares, muchas de las cuales son comunes a varios de ellos. Sin embargo, adems de la regulacin individual de cada uno de los genes de globina, parece que el grupo de genes est sujeto a otro control de activacin/inhibicin que supone cambios globales en la estructura de la cromatina. Algunas de las primeras evidencias de estos cambios proceden de estudios de los genes de globina a digestin por DNasal en ncleos aislados. En clulas en las que los genes de globina no se expresan, el DNA de dichos genes es resis tente a DNasal, lo cual indica que se encuentra empaquetado en forma de cro matina condensada. En cambio, en clulas eritroblsticas todo el grupo es sensi ble a la DNasal, lo que es un indicio de que la estructura de la cromatina localm ente ha cambiado, haciendo al DNA ms accesible a la enzima. El DNA se encuentra an empaquetado en nucleosomas, pero se han perdido los niveles de em paquetamiento de orden superior. Este cambio en el grado de empaqueta-

Figura 9-51 Efectos de posicin en la expresin gnica. (A) El gen ADE2 de levadura en su posicin cromosm ica normal se expresa en todas las clulas de levadura. Cuando se desplaza a una posicin prxima al extremo del cromosom a de levadura, el gen se silencia en muchas pero no en todas las clulas de la poblacin. La ausencia del producto gnico de ADE2 provoca un bloqueo en la va biosinttica de adenina, con lo que se acumula un pigmento rojo. La clula fundadora de la colonia que presenta varios sectores tena el gen ADE2 inactivo, por lo que la mayor parte de la colonia es roja. Normalmente las colonias de levadura son blancas. Las secciones b lan cas en los bordes de la colonia roja son clones de clulas en las que el gen ADE2 se ha activado espontneam ente. La presencia de estos sectores indica que los estados activos o inactivos del gen ADE2 son heredables cuando el gen se encuentra prximo al telmero, un tem a que se discute en la prxima seccin. (B) Los efectos de posicin se pueden observar tambin en el caso del gen w hite de D rosophila. Las m oscas salvajes poseedoras de un gen w hite tienen los ojos rojos. Si el gen w hite se inactiva por mutacin, los ojos se vuelven blancos (de ah el nom bre del gen). En moscas con una inversin crom osm ica que desplaza al gen w hite cerca de la regin heterocrom atnica, las m oscas tienen los ojos moteados, con manchas rojas y blancas. Las m anchas blancas representan clulas en las que el gen w hite es silencioso, y las manchas rojas representan reas en las que se expresa el gen w hite. Se cree que las diferencias se deben a lo lejos que se expanda la heterocrom atina durante el desarrollo temprano del ojo. Como en el caso del gen ADE2 de levadura, una vez establecido, el estado de expresin de w hite es heredable, produciendo grupos de muchas clulas que expresan w hite y grupos de clulas en las que w hite es silencioso. (De L.L. Sandell y V.A. Zakian, Trends Cell Biol. 2: 10-14, 1992.)

Estructura de la cromatina y control de la expresin gnica

465

100 000 pares de nucletidos locus de grupo de genes del tipo control de la de la p globina regin '
'A iG 1 m

m ii

5 p

gen de la (3 globina (A)

12

24

36 | 12 NACIMIENTO

24 36 48 edad en semanas

miento del DNA ocurre aun antes de que se inicie la transcripcin de los genes de globinas, sugiriendo que los genes estn regulados en dos etapas. En la pri mera etapa, la crom atina que contiene el grupo de genes de globina se descon densa, lo cual al parecer facilita el acceso de algunas de las protenas reguladoras al DNA. En la segunda etapa, las protenas reguladoras restantes se ensamblan en el DNA y dirigen la transcripcin de cada uno de los genes (Figura 9-53). Se cree que los cambios extensos que sufre la estructura de la cromatina pro pios de la primera etapa requieren una regin de DNA denominada regin de control del locus o LCR (de Locus Control Regin), que se encuentran a bastante distancia por delante del grupo de genes (vase Figura 9-52). Ha sido posible es tablecer la importancia de la LCR a partir del estudio de ciertos pacientes con un tipo concreto de talasemia, una forma severa de anemia. Se ha visto que en estos pacientes el locus de p globina se mantiene silencioso en las clulas eritroblsticas, a pesar de tener el gen de p globina y las regiones reguladores intactas; el de fecto consiste en la delecin de ciertas zonas que eliminan total o parcialmente la LCR. Asimismo, el gen de P globina en las clulas eritroblsticas se mantiene re sistente a DNasal, lo que indica que es incapaz de seguir el proceso normal de descondensacin propio del desarrollo de las clulas eritroblsticas. Experimentos posteriores utilizando ratones transgnicos han confirmado el gran efecto que LCR tiene sobre la expresin de los genes de globina. Por ejemplo, cuando el gen de P globina humano y sus regiones reguladoras (las mostradas en la Figura 9-45) se insertan en diferentes regiones del genoma del ratn, el gen se expresa en un nivel bajo, dependiendo del lugar de insercin. Este com portam iento es tpico de los genes de mamfero, e indica que la posi cin del gen afecta su expresin (Tabla 9-2). Cuando se incluye la LCR con el gen, el gen de P globina se expresa a un nivel elevado en las clulas eritroblsti cas independientemente del lugar de insercin, indicando que la LCR puede su perar los efectos de posicin. Aunque se han identificado algunas protenas que se unen a LCR, se desco noce cul es el mecanism o que modifica la estructura del locus completo de la p globina. En la siguiente seccin exponemos algunas de las ideas que podran ex plicar cmo se producen estos cambios.

Figura 9-52 El grupo de los genes del tipo de la (3 globina de hum anos. (A) La regin crom osm ica grande comprende 100 000 pares de nucletidos, y contiene los cinco genes de globina y una regin de control del locus (descrita en el texto). (B) Variaciones de la expresin de los genes del tipo de la p globina durante varias fases del desarrollo de los humanos. Cada una de las cadenas de globina codificadas por estos genes se com bina con una cadena de la a globina formando la hemoglobina de los glbulos rojos. (A, segn F. Grosveld, G.B. van Assendelft, D.R. Greaves, y G. Kollias, Cell 51:975-985, 1987. Cell Press.)

ETAPA 1 SE ALTERA LA ESTRUCTURA DE LA CROMATINA

ETAPA 2 SE ACTIVA EL GEN RNA polimerasa

protena reguladora

No se conocen los mecanismos que forman la cromatina activa

El modelo hipottico para explicar la activacin global de las globinas, que se es quematiza en la Figura 9-53, implica que en los eucariotas existen protenas de unin a secuencias especficas de DNA que actan descondensando la cromatina en un rea local del cromosoma que podra tener decenas de miles de pares de nucletidos de longitud. Alternativamente, los cambios en la estructura de la cro matina observados en los genes activos podran ser una consecuencia automti ca, ms que un requisito previo, del ensamblaje de factores de transcripcin, de la RNA polimerasa, o de ambos, en un promotor. Hemos visto que el ensamblaje de los factores generales de transcripcin en los promotores parece acompaarse de cambios en la distribucin de los nucleosomas en el lugar de ensamblaje; po siblemente esta pequea perturbacin se pueda transmitir a largas distancias por algn mecanismo de propagacin desconocido.

RNA

Figura 9-53 Las dos etapas por las cuales se activan algunos genes, incluidos los del grupo de genes de las globinas. En la etapa 1 se modifica la estructura de una gran regin de la cromatina, descondensndose en preparacin para la transcripcin. En la etapa 2 , las protenas reguladoras (representadas en este esquema simplificado por una nica protena) se unen a lugares especficos de la cromatina induciendo la sntesis del RNA (transcripcin).

466

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

T abla 9 -2 L a exp resin de u n gen transferid o a u n ra t n gen eralm en te p resen ta efectos de posicin del cro m o so m a , co n diferentes niveles de actividad g n ica en an im ales tran sgn ico s derivados de fo rm a independiente P o rce n ta je del to tal de mRNA en Saco vitelino Hgado E st m ag o C ereb ro C opias gnicas p o r clu la

Gen endgeno Animal transgnico 1 Animal transgnico 2 Animal transgnico 3 Animal transgnico 4

20 3,4 4,8 4,4 0,4

5 1 30 13 0,4

0,1 0,1 1,3 4,7 0

0 0 0 0 0

2 4 4 4 12

En estos experimentos llevados a cabo con el gen de la alfa--fetoprotena de ratn, el fragmento de DNA inyectado en el huevo del ratn fertilizado incluye 14 000 pares de nucletidos de secuencia 5-flanqueante, donde se localizan tres incrementadores (enhancers) que afectan la expresin de este gen. Se utiliz la tcnica de hibridizacin para comparar el nivel de mRNA producido por el gen inyectado con el que normalmente produce el gen endgeno de la alfa-fetoprotena en los teji dos fetales indicados. (Datos de R.E. Hammer et al., Science 235:53,1987.)

Tengan o no los eucariotas protenas capaces de descondensar dominios de la cromatina, es valioso especular acerca de cmo podran hacerlo estas prote nas. Actualmente slo podemos imaginar este mecanismo. En la Figura 9-54 se esquematizan tres posibilidades. Se trata de tres modelos muy distintos, lo cual es un indicio de lo lejos que estamos de comprender la transicin entre la cro matina activa e inactiva.

La tensin superhelicoidal del DNA permite la accin a distancia40

Uno de los tres modelos que se recogen en la Figura 9-54 implica la existencia de cambios topolgicos en un bucle cerrado de DNA de doble cadena que conduce a

crom atina norm al en el dom inio en bucle

P U N T O DE E N T R A D A DE L A P R O T E N A Q UE SE D E S P L A Z A

P U N T O DE GIRO A C T IV O D E L D O M I N I O DE CRO M ATIN A CO NSTREID A

L U G A R DE L A N U C L E A C I O N P A R A EL E N S A M B L A J E O DESENSAM BLAJE DE P R O T E N A S DE C U B IERT A S O B R E LA CRO M ATIN A

Figura 9-5 4 Tres modelos propuestos p ara explicar la influencia a gran distancia de una regin dominio de control sobre la actividad gnica. Se postula que el bucle de crom atina mostrado representa un dominio crom osm ico en bucle completo (descrito en el Captulo 8 ), que puede contener ms de 100 000 pares de nucletidos de DNA. Cada modelo propone una funcin diferente para el lugar LCR. El m ecanism o actual causante de los efectos a gran distancia es desconocido, y se podran proponer otros mecanism os.

A L T E R A C I N DE L A CRO M ATIN A, CA TA LIZA D A POR PRO TENA

LA TENSI N SUPERH ELICO IDAL ALTER A LA CRO M ATIN A

LA G A N A N C IA O P R D ID A DE P R O T E N A S DE C U B IE R T A A L T E R A L A E S T R U C T U R A DE L A CRO M ATIN A

crom atina activa

Estructura de la cromatina y control de la expresin gnica

467

DNA con un extrem o libre

DNA con los extrem os fijos

desenrollam iento de 10 pares de bases del DNA (una vuelta de la hlice)

desenrollam iento de 10 pares de bases del DNA (una vuelta de la hlice)

(A)

la hlice de DNA ha de girar una vuelta

<B)

la hlice de DNA form a un sobreenrollam iento

la formacin de DNA sobreenrollado, una conformacin que adopta el DNA en res puesta a una tensin superhelicoidal. El DNA sobreenrollado se ha podido estudiar especialmente en pequeas molculas circulares, como los cromosomas de algu nos virus y plsmidos. Sin embargo, estas mismas consideraciones se pueden apli car a cualquier regin de DNA cuyos extremos sean incapaces de rotar libremente -com o por ejemplo en un bucle de cromatina anclado firmemente a la base. En la Figura 9-55 se ilustra una manera sencilla de visualizar las limitaciones topolgicas que provoca el sobreenrollamiento del DNA. En un DNA de doble cadena cuyos extremos estn fijos se forma un sobreenrollamiento para com pensar cada 10 pares de nucletidos que se han abierto (desenrollado) en la hli ce; la formacin de este sobreenrollamiento es favorable energticamente pues permite al resto de las regiones en las que las bases an permanecen apareadas recuperar el giro normal de la hlice. En bacterias como E. coli existe un tipo especial de DNA topoisomerasa II, de nominada DNA girasa, que, empleando la energa de hidrlisis del ATP, sobreenro11a constantemente el DNA, mantenindolo siempre bajo tensin. Estos sobreenrollamientos son sobreenrollamientos negativos, y tienen el sentido de giro opuesto a los sobreenrollamientos positivos que se muestran en la Figura 9-55 y que se for man cuando una regin de la doble hlice se abre. As, cuando se abre una regin de la doble hlice de DNA en una bacteria, ms que crearse un sobreenrollamiento positivo, lo que ocurre es que se elimina un sobreenrollamiento negativo. Dado que durante este proceso se reduce la tensin superhelicoidal del DNA, la apertura de la doble hlice de DNA en E. coli es energticamente favorable comparada con la apertura de la doble hlice de un DNA que no est sobreenrollado. Las DNA topoisomerasas de tipo II eucariotas eliminan tensin superheli coidal ms que producirla (se describe en el Captulo 8). Por ello, la mayor parte del DNA de una clula eucariota no est bajo tensin. Sin embargo el desenrolla miento de la doble hlice est asociado con la etapa de iniciacin de la trans cripcin. Adems, una molcula de RNA polimerasa en movimiento (as como otras protenas que desenrollan el DNA) tender a generar tensin superhelicoi dal positiva en el DNA por delante y tensin superhelicoidal negativa por detrs (Figura 9-56). As, estos efectos topolgicos podran generar tales fuerzas en un

Figura 9-55 La tensin superhelicoidal del DNA origina su sobreenrollamiento. (A) En el caso de una molcula de DNA con un extremo libre (o con un corte que acte como un pivote de giro), la doble hlice de DNA gira una vuelta cada 10 pares de nucletidos que se abren. (B) Si se impide la rotacin, la tensin superhelicoidal que se genera en el DNA abre la hlice. Una forma de acomodar esta tensin es incrementar el giro de la hlice de forma que haya 11 pares de nucletidos en vez de 10 por vuelta de hlice, como en el ejemplo; sin embargo, la doble hlice de DNA resiste dicha deformacin doblndose en bucles sobreenrollados. De este modo se forma un sobreenrollamiento en el DNA por cada 10 pares de bases abiertas. El sobreenrollamiento formado aqu es un sobreen ro lla m ien to positivo (vase Figura 9-56).

DNA

f j

molcula de protena

SOBREENROLLAMIENTO NEGATIVO se facilita la apertura de la hlice

468 Captulo 9 : El control de la expresin gnica

SOBREENROLLAMIENTO POSITIVO se dificulta la apertura de la hlice

Figura 9-56 Sobreenrollamiento de un segmento de DNA debido a una protena que patrulla la doble hlice de DNA. Los dos extremos del DNA que se muestran son incapaces de rotar uno respecto al otro libremente, y se asume que la protena que se desplaza tam bin es incapaz de rotar libremente. En estas condiciones el movimiento de la protena causar la acumulacin de un exceso de vueltas de hlice por delante y un dficit de vueltas por detrs, como se muestra en la figura. Las evidencias experimentales sugieren que una molcula de RNA polimerasa en movimiento produce sobreenrollamiento de este modo; la tensin superhelicoidal que genera por delante hace ms difcil abrir la doble hlice, pero esta tensin ha de facilitar la liberacin del DNA de los nucleosomas ya que la separacin del DNA de las histonas del ncleo del nucleosoma ayuda a relajar la tensin superhelicoidal positiva.

lugar concreto que se propagaran a travs de todo un dominio de la cromatina. Sin embargo an se desconoce si algn fenmeno de este tipo est implicado en los cambios a gran escala de la estructura de la cromatina.

Resumen
Los genomas de los organismos eucariotas estn empaquetados en la cromatina. Algunas formas de cromatina estn tan condensadas que los genes que contienen son silenciosos transcripcionalmente. A pesar de que se desconocen los detalles de este tipo de empaquetamiento, se cree que podra tratarse de un mecanismo utiliza do por las clulas para silenciar grandes regiones de sus genomas. En algunos casos es posible revertir este silenciamiento, activndose los genes que contenan, pero la manera en que ocurre es tambin desconocida. En formas de cromatina menos condensada el DNA se encuentra an empa quetado en forma de nucleosomas. Los nucleosomas posicionados en el punto de inicio de la transcripcin bloquean el ensamblaje de losfactores generales de trans cripcin. Estos nucleosomas parecen desplazarse, por un mecanismo desconocido, cuando la transcripcin se activa por protenas reguladoras.

Mecanismos genticos que originan tipos celulares especializados41

Aunque los organismos unicelulares han de ser capaces de activar y desactivar genes, los organismos pluricelulares adems requieren interruptores genticos capaces de generar y mantener sus diferentes tipos celulares. En particular, cuando una clula de un organismo pluricelular se diferencia hacia un tipo celu lar determinado, generalmente la eleccin de destino se mantiene a lo largo de muchas generaciones celulares, lo que significa que los cambios de expresin gnica implicados en la eleccin deben recordarse. Este fenmeno de memoria celular es un requisito previo para la creacin de tejidos organizados y para el mantenim iento de tipos celulares diferenciados. Por el contrario, los cambios simples de la expresin de los genes tanto en eucariotas como en procariotas son temporales; por ejemplo, el represor de triptfano reprime la expresin de los genes del triptfano en la bacteria nicamente en presencia de triptfano; en cuanto desaparece del medio los genes son activados de nuevo, y los descen dientes no tendrn memoria de que sus antecesores fueron expuestos al tript fano. Sin embargo, incluso en los procariotas es posible heredar algunos cam bios en la expresin gnica. En esta seccin examinaremos de qu forma los mecanismos de regulacin gnica pueden combinarse entre s para formar interruptores que, una vez acti vados, sean recordados por las sucesivas generaciones celulares. Empezaremos considerando algunos de los mecanismos genticos m ejor conocidos de diferen ciacin celular que actan en bacterias y en levaduras.

Los cambios de fase de las bacterias son provocados por reorganizaciones del DNA4 2
Hemos visto que en las clulas eucariotas la diferenciacin generalmente no im plica cambios detectables en las secuencias de DNA. En cambio, en algunos pro cariotas se pueden alcanzar patrones de regulacin gnica hereditarios a base de reorganizaciones especficas del DNA que activan o desactivan a genes concre tos. Dado que todos los cambios que se producen en una secuencia de DNA son copiados con exactitud en las replicaciones posteriores del DNA, cualquier esta do de actividad gnica alterado se heredar por toda la progenie de la clula en la que se ha dado la reorganizacin. En principio, algunas de estas reorganiza ciones son reversibles y en tales casos, si consideramos perodos de tiempo sufi cientem ente largos, se establecen patrones de actividad gnica alternante.

Mecanismos genticos que originan tipos celulares especializados

469

segm ento que se invierte prom otor H2 represor prom otor H1

protena H1
En la bacteria Salmonella se presenta un mecanismo de diferenciacin celu lar de este tipo, conocido por cam bio de fase, que ha sido muy estudiado. Aun que en eucariotas superiores no existe el modo de diferenciacin equivalente, s tiene un efecto importante sobre ellos, ya que es el mecanismo que utilizan algu nas de las bacterias causantes de enfermedades para no ser detectadas por el sis tema inmune. El cambio de la expresin gnica en Salmonella se produce por la inversin espordica de un segmento especfico de DNA de 1000 pares de nucletidos que afecta la expresin de la protena de la superficie celular flagelina, para la que la bacteria tiene dos genes. La inversin est catalizada por una enzi ma de recom binacin especfica de lugar, lo que cambia la orientacin de un promotor situado en el interior de los 1000 pares de nucletidos que se invierten. Con el promotor en una de las orientaciones la bacteria sintetiza un tipo de flage lina; con el promotor en la otra orientacin la bacteria sintetiza el otro tipo de fla gelina (Figura 9-57). Dado que las inversiones se dan muy raramente, cuando se producen se generan clones enteros de bacterias con un tipo u otro de flagelina. Probablem ente este fenm eno del cambio de fase evolucion porque pro tege a la poblacin bacteriana contra la respuesta inmune de sus huspedes ver tebrados. Si el husped fabrica anticuerpos contra un tipo de flagelina, las esca sas bacterias cuya flagelina sea distinta debido a una inversin gnica podrn sobrevivir y multiplicarse. Las bacterias que se aslan de los medios naturales suelen presentar cambios de fase para uno o varios rasgos fenotpicos, pero generalmente estas inestabili dades se eliminan en las cepas estndar del laboratorio. Slo se han estudiado unos cuantos mecanismos subyacentes a este proceso y no todos consisten en in versiones de segmentos de DNA. Por ejemplo, una bacteria que provoca una en fermedad humana de transmisin sexual comn (Neisseria gonorrhoeae) evita el ataque inmune mediante una variacin hereditaria de las propiedades de su su perficie, que se genera por conversin gnica (descrito en el Captulo 6) ms que por inversin gnica. Este mecanismo depende de la protena de recombinacin RecA, y transfiere secuencias de DNA desde cassettes gnicas silenciosas a un gen que se expresa; este mecanismo tiene la ventaja de que genera ms de 100 va riantes de una protena mayoritaria de la superficie bacteriana.

Figura 9-57 Cambios en la expresin gnica mediante inversiones de DNA en bacterias. Transcripcin alternante de dos genes de flagelina en una bacteria S alm on ella, causada por un suceso sencillo de recombinacin especfica de lugar que invierte un pequeo segmento de DNA que contiene un promotor, de modo que en la orientacin (A) activa la transcripcin del gen H2 de flagelina as como la protena represora que bloquea la expresin del gen de flagelina H l. Cuando el promotor se invierte (B), deja de activar al gen H2 y al represor, y el gen H l que ahora est libre de represin, se expresa. El mecanism o de recom binacin se activa raramente (alrededor de una vez en 105 divisiones celulares). As, la produccin de uno u otro tipo de flagelina tiende a ser hereditaria en cada clon de clulas.

En levaduras, algunas protenas reguladoras determinan la identidad del tipo celular4 3

Debido fundamentalmente a su gran facilidad de crecimiento y de manipula cin gentica, las levaduras se han analizado con gran detalle como organismo

470

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

modelo para el estudio de los mecanismos de control gnico en eucariotas. La levadura com n de panadero, Saccharomyces cerevisiae, ha sido especialmente til por su capacidad de diferenciarse en tres tipos celulares, aunque el m ecanis mo difiere en algunos aspectos bsicos del que usan las clulas de plantas y ani males. S. cerevisiae es un eucariota unicelular que puede existir tanto en estado haploide como diploide. Las clulas diploides se forman por un proceso deno minado apaream iento, en el que dos clulas haploides se fusionan. Para que dos clulas haploides se puedan aparear han de diferir en su tipo de aparea miento (sexo). En Saccharomyces cerevisiae, existen dos tipos de apareamiento, a y a, especializados en el apareamiento mutuo. Cada uno de allos produce un molcula seal especfica (factor de apareamiento) que difunde, y una protena receptora. Estas molculas capacitan a la levadura, respectivamente, para com u nicarse y para reconocerse y fusionarse con clulas del tipo contrario. Las clu las diploides resultantes, denominadas a / a, presentan caractersticas propias que las distinguen de los tipos parentales: no son aptas para el apareamiento pero pueden formar esporas (esporular), generando clulas haploides por meiosis en situaciones de carencia de nutrientes. Los m ecanismos por los cuales se establecen y mantienen estos tres tipos de clulas ilustran algunas de las estrategias que se han descrito previamente para cambiar el patrn de expresin gnica. El tipo de apareamiento de la clula ha ploide viene determinado por un nico locus gentico, el locus del tipo de apa reamiento (MAT, de Mating-Type Locus), que en la clula de tipo a codifica una nica protena reguladora, a l, y en una clula de tipo a codifica dos protenas reguladoras, a l y a2. La protena a l no tiene ningn efecto sobre la propia clu la de tipo a, pero lo tendr sobre la clula diploide resultante del apareamiento: mientras tanto la clula de tipo a fabrica la protena reguladora por defecto. En cambio, la protena a2 acta en la clula a como un represor transcripcional que reprime los genes especficos de a, mientras que a l acta como un activador transcripcional que activa los genes especficos de a. Cuando se fusionan las c-

Figura 9-5 8 Control del tipo celular en levadura. El tipo celular en

protenas reguladoras producidas por el locus M AT

tipo celular

conjunto de genes controlados por M A T MCM1 aSG ACTIVO | INACTIVO H ACTIVO

(haploide) (sin efecto)

/------- IVI'

xSG hSG MCM1

2

a1

m
I I

aSG MCM1

1 INACTIVO

(haploide)
a2

aq

r
a1

f m

aSG hSG ACTIVO

MCM1 t 1 t. 1 C T a/a (diploide) a2

EH a2

aSG xSG

INACTIVO INACTIVO

> i
a2

a1

a1

hSG

INACTIVO

levaduras est controlado por tres protenas reguladoras (al, a2 y al) producidas por el locus MAT. Se transcriben diferentes grupos de genes en las clulas haploides de tipo a, a y diploides (tipo a / a). Las clulas haploides expresan una serie de genes especficos de clula haploide (hSG) y o bien un grupo de genes especficos de a (aSG) o de a (aSG). Las clulas diploides no expresan ninguno de estos genes. Las protenas a l, a2, y al controlan muchos genes diana en cada tipo de clula mediante su unin, en diferentes combinaciones, a las secuencias reguladoras situadas por delante de estos genes. Es de destacar que la protena a l es activadora, mientras que a2 es represora, y ambas actan en combinacin con una protena reguladora ubicua denominada MCM1. En la clula diploide, a2 y al forman un heterodmero que desactiva un grupo distinto de genes (entre los que se incluye el gen que codifica la protena activadora al) de los que inactivaba a2 y MCM1. Este ejemplo relativamente simple de control gnico es un buen ejemplo de control combinatorio de la expresin gnica (vase Figura 9-38). Las protenas al y a2 reconocen en ambos casos su secuencia de unin mediante un homeodominio (vase Figura 9-13).

Mecanismos genticos que originan tipos celulares especializados

471

lulas de los dos tipos de apareamiento la com binacin de las protenas regula doras a l y x2 genera un patrn de expresin gnica completamente distinto al de cualquiera de las clulas progenitoras. En la Figura 9-58 se esquematiza el mecanism o por el cual los genes especficos del tipo de apareamiento se expre san en cada uno de los tres tipos celulares. Se trata de uno de los primeros ejem plos de control gnico combinatorio y an es uno de los mejor conocidos a nivel molecular. Aunque en muchos laboratorios las cepas de S. cerevisiae se mantienen es tables durante muchas generaciones, algunas cepas aisladas del medio natural cambian repetidamente entre los tipos celulares a y a por un mecanismo de re organizacin gnica que recuerda el de cambio de fase en N. gonorrhoeae, aun que el m ecanism o en detalle parece ser particular de levadura. En cada uno de los extremos del locus MAT del crom osom a de la levadura existe un locus silen cioso que codifica las protenas reguladoras especficas del tipo de apareamien to: en un lado codifica a l y a2, y en el otro a l. En cada divisin celular sucesiva el gen activo en el locus MAT es eliminado y substituido por una nueva copia del locus silencioso del tipo de apareamiento opuesto. Este mecanismo se ha deno minado mecanismo cassette pues el cambio supone eliminar un gen de la posi cin activa y su substitucin por otro. El cambio es reversible porque aunque el gen original en el locus MAT se elimina, queda siempre una copia silenciosa en el genoma. Nuevas copias de DNA realizadas a partir de los genes silenciosos actan como cassettes desechables que sern insertadas alternativamente en el locus MAT que acta com o cabezal lector (Figura 9-59). Resultados de tests genticos sugieren que las cassettes silenciosas se m an tienen inactivas por el mismo mecanism o que silencia los genes localizados en el extremo de los cromosomas de levadura (vase Figura 9-51 A): el DNA en un locus silencioso parece estar empaquetado en forma de cromatina inactiva.

Dos protenas fgicas que se reprimen mutuamente su sntesis determinan el estado del bacterifago lambda4 4
La observacin de que a partir de la informacin gnica de un slo ncleo som tico se pueda desarrollar un vertebrado o una planta elimina la posibilidad de que los cam bios irreversibles en el DNA sean la causa principal de la diferencia cin de las clulas eucariotas superiores (a pesar de que stos constituyen una parte esencial del proceso de diferenciacin de los linfocitos -descrito en el Ca-

----------------- 1

gen silencioso tip o a

I ----------------- 1

locus M A T

I ----------------- 1

gen silencioso tipo a

se inserta la cassette a nueva

Figura 9-59 Modelo de las cassettes para la alternancia de tipo de apaream iento en la levadura. El cambio de cassettes se da por un proceso de conversin gnica que se dispara cuando la nucleasa realiza un corte de doble cadena en una secuencia especfica del DNA en el locus MAT. A continuacin se elimina el DNA cerca del corte y se substituye por una copia de la cassette silenciosa del tipo de apareamiento opuesto.

se inserta una cassette a nueva

472 Captulo 9 : El control de la expresin gnica

ptulo 23). Aunque, en principio, los cambios reversibles de secuencias de DNA, similares a los descritos en los casos de Salmonella y de las levaduras, pueden ser responsables de algunos de los cambios hereditarios de expresin gnica que se observan en los organismos eucariotas superiores, actualmente no dispone mos de ninguna evidencia que demuestre su existencia. Sin embargo, existen otros mecanismos, como los que ya se han descrito en este captulo, que son capaces de producir un patrn de expresin gnica here ditario que presente una serie de estados discretos estables. En las clulas euca riotas no se comprende completamente ninguno de estos mecanismos, pero los estudios sobre el bacterifago lambda han aportado mucha informacin a nivel molecular, de un interruptor gentico que puede alternar, flip-flop", entre dos estados estables, lo que podra ser un modelo de interruptor que tambin actua ra en el desarrollo de los eucariotas superiores. Previamente hemos descrito que este virus bacteriano puede permanecer integrado en el DNA de una clula de E. coli en condiciones favorables, de forma que se replica automticamente cada vez que la bacteria se divide, en lugar de multiplicarse en el citoplasma y matar a su husped. El cambio entre estos dos estados viene mediado por dos protenas codificadas por el genoma vrico. El genoma consta de unos 50 genes que en los dos estados se transcriben siguiendo patrones muy diferentes. Por ejemplo, en un virus que se ha de integrar se pro ducir la protena integrasa, necesaria para insertar el DNA del virus en el geno ma de la bacteria y al mismo tiempo se han de reprimir la produccin de las pro tenas vricas implicadas en la replicacin del virus. Una vez se ha escogido entre uno de los dos patrones de expresin, ste se m antiene estable. No podemos aqu detenernos en los detalles de este complejo sistema regu lador de la expresin gnica, pero destacaremos algunas de sus caractersticas generales. En el corazn del sistema se encuentran dos protenas reguladoras de genes sintetizadas por el virus: la protena represora lam bda (protena el), des crita anteriormente, y la protena ero. Estas protenas bloquean cada una de ellas la sntesis de la otra, organizacin que permite nicamente dos estados po sibles. En el estado 1 (el estado de profago ) el represor lambda ocupa el opera dor, bloqueando la sntesis de represor y tam bin activando su propia sntesis. En el estado 2 (el estado Utico) la protena ero ocupa un lugar diferente en el ope rador, bloqueando la sntesis del represor y activando su propia sntesis (Figura 9-60). En el estado de profago la mayor parte del DNA del virus integrado de for ma estable no se transcribe; en el estado ltico este DNA se transcribe extensa mente, se replica, se empaqueta en nuevos bacterifagos, y se libera cuando se lisa la clula husped. Cuando la bacteria husped va creciendo bien, el virus tiende a adoptar el estado 1, permitiendo que el DNA del virus se vaya multiplicando rpidamente, conjuntam ente con el cromosoma husped. Cuando se daa la clula husped, un virus integrado se transforma del estado 1 al estado 2, se multiplica en el cito plasma de la clula y se escapa rpidamente de ella. Esta conversin est induci da por protenas reguladoras bacterianas que inactivan la protena represora. Sin embargo, en ausencia de tales interferencias el represor de lambda bloquea tanto la produccin de la protena ero como activa su propia sntesis, y este bu cle de retroalimentacin positiva es el que ayuda a mantener el estado de profa-

estado estable 1: estado de profago se sintetiza la protena represora de lambda

estado estable 2: estado ltico se sintetiza la protena ero

11
\ ACTIVO operador INACTIVO
^ U H H H B R N A

INACTIVO

operador RNA

i ACTIVO

represor de lambda

protena Q _ @ ero W

Figura 9-60 Versin simplificada del sistema regulador de tipo interruptor, que determina el estilo de crecimiento del bacterifago lambda en la clula husped E. coli. En el estado estable 1 (estado de profago) el bacterifago sintetiza la protena represora en grandes cantidades, que activa su propia sntesis e inactiva la sntesis de varias protenas del fago, entre las que se cuenta la protena ero. En el estado estable 2 (estado ltico) el bacterifago sintetiza la protena ero en grandes cantidades, la cual inactiva la sntesis del represor, de forma que se sintetizan muchas protenas vricas y comienza la replicacin libre del DNA del virus en la clula de E. coli, produciendo finalmente numerosas partculas vricas y matando la clula. Este ejemplo muestra cmo dos protenas reguladoras pueden combinarse en un circuito produciendo dos estados estables. Como se muestra en la Figura 9-11, tanto el represor lambda como la protena ero reconocen el operador mediante un motivo hlice-giro-hlice.

Mecanismos genticos que originan tipos celulares especializados

473

el efecto de la seal puntual es recordado por todas las clulas descendientes una seal puntual activa la expresin la protena A de la proteina A no se sintetiza ya que norm alm ente es necesaria para su propia transcripcin

Figura 9-61 Diagrama esquemtico que m uestra cm o un bucle de retroalim entacin positiva puede generar m em oria celular. La protena A es una protena reguladora que activa su propia transcripcin. Todos los descendientes de la clula original recordarn que la clula progenitora recibi la seal que inici la produccin de la protena.

go estable. Los bucles de retroalimentacin positiva son un rasgo caracterstico de muchos circuitos de memoria celular (Figura 9-61). Un principio general importante que se deriva del caso del bacterifago lambda es que se puede conseguir un sofisticado patrn de comportamiento con un escaso nmero de protenas reguladoras de genes que afectan recprocam en te su sntesis y su actividad. Sabemos que las clulas eucariotas utilizan variacio nes de esta sencilla estrategia para establecer y mantener patrones de expresin gnica hereditarios. Por ejemplo, algunas protenas reguladoras implicadas en el establecim iento del plan de desarrollo de Drosophila (descrito en el Captulo 21), estimulan su propia transcripcin, de modo que se crea un bucle de retroali mentacin positiva que estimula su sntesis continuada; al mismo tiempo estas protenas reprimen la transcripcin de los genes que codifican otras protenas reguladoras importantes.

La expresin de una protena reguladora crtica puede disparar la expresin de una batera de genes situados por debajo (en direccin 3)4 5
En general se trata de una com binacin de protenas reguladoras, ms que de una protena nica, la que determina dnde y cundo se ha de transcribir un gen eucariota. Pero aunque el control sea combinatorio, una nica protena puede ser decisiva para cam biar una clula de una va de desarrollo o estado de dife renciacin a otro. Un ejemplo notable procede de los estudios de diferenciacin de una fibra muscular in vitro. Una fibra muscular esqueltica de mamfero tpica es extremadamente lar ga y contiene m uchos ncleos. Se forma por fusin de muchas clulas precurso ras denominadas mioblastos. La fibra muscular madura se diferencia de otras clulas por un gran nmero de protenas caractersticas, que incluyen tipos es pecficos de actina, miosina, tropomiosina y troponina (todas ellas forman parte del sistema contrctil), creatina fosfoquinasa (propia del metabolismo tpico de las clulas musculares), y receptores de acetilcolina (que hacen a la membrana sensible a la estimulacin nerviosa). En mioblastos proliferantes estas protenas especficas de msculo y sus mRNA estn ausentes o se encuentran presentes en baja concentracin. Cuando los mioblastos empiezan a fusionarse unos con otros, todos estos genes se activan en un proceso coordinado que es parte de la transformacin general que presenta su patrn de expresin gnica. Todo este programa de diferenciacin del msculo puede desencadenarse en fibroblastos de la piel en cultivo y en algunos otros tipos celulares introdu-

F ig u ra9-62 Efecto de la expresin de la protena MyoD en fibroblastos. Como se muestra en la micrografa de inmunofluorescencia, los fibroblastos de la piel se han convertido en clulas musculares por efecto de la expresin inducida experimentalmente del gen myoD. Los fibroblastos crecieron en cultivo, y fueron transfectados tres das antes de la observacin con un 20 pm plsmido recombinante que contiene la secuencia codificante de myoD. Aunque slo un porcentaje pequeo de los fibroblastos incorpora el DNA y produce la protena MyoD, estas clulas se fusionan formando miotbulos alargados, que se muestran teidos con anticuerpos que detectan una protena especfica del msculo. Las clulas teidas estn mezcladas con una capa confluente de fibroblastos, cuyos ncleos se pueden apreciar en la imagen. Cultivos control transfectados con otro plsmido no contienen clulas musculares.

474

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

ciendo cualquier gen que codifica uno de los miembros de una familia de prote nas hlice-bucle-hlice -las denominadas protenas miognicas (por ejemplo MyoD, Myf5 o m iogenina)- que normalmente se expresan nicamente en fibras musculares (Figura 9-62). En el DNA adyacente a muchos genes especficos de msculo se pueden detectar secuencias de unin a estas protenas. A partir de estudios con ratones transgnicos parece que el modo de accin de MyoD y Myf5 implica la activacin de miogenina: si se elimina el gen de miogenina por insercin genmica dirigida, las clulas musculares no pueden diferenciarse. Es probable que tanto los fibroblastos como otros tipos celulares que se convierten en fibras musculares por las protenas miognicas hayan acumulado una serie de protenas reguladoras que pueden cooperar con las protenas m io gnicas activando los genes especficos del msculo. Desde este punto de vista sera una combinacin de protenas reguladoras, ms que una simple protena, la que determinara la diferenciacin celular. Esta idea es consistente con el h e cho de que algunos tipos celulares no se convierten en fibras musculares por ac cin de miogenina o protenas relacionadas; dichas clulas, probablemente no habran acumulado las otras protenas reguladoras necesarias. A continuacin veremos cmo el control combinatorio tiene implicaciones importantes tanto para la evolucin como para el desarrollo de los organismos pluricelulares.

El control gnico combinatorio es la norma en los eucariotas46

Ya hem os discutido cmo pueden actuar de modo combinado mltiples prote nas reguladoras controlando la expresin de un determinado gen. Sin embargo,

clula em brionaria

Figura 9 -6 3 La im portancia p ara el desarrollo del control com binatorio.

IZQUIERDA

V/
clula A clula B

DERECHA

INDUCCIN DE LAS PROTENAS REGULADORAS ( 4 )

A @ ; . ' A @ ....A ...

Y ( 5)
A

Este esquema muestra cmo las combinaciones de unas cuantas protenas reguladoras pueden generar muchos tipos celulares diferentes durante el desarrollo. En este esquema simple la decisin de sintetizar una de un par de protenas reguladoras (representadas por crculos numerados) se toma despus de cada divisin celular. Siendo conscientes de su posicin en el embrin, la clula hija situada hacia la izquierda del embrin siempre escoge sintetizar la protena par, mientras que la situada hacia la derecha en el embrin sintetizarn la impar. Se asume que la produccin de cada protena reguladora es autoperpetuante (contribuyendo as a la memoria celular). As pues, las clulas en un clon en crecimiento contendran un nmero creciente de protenas reguladoras. Es de destacar que en este ejemplo, puramente hipottico, se han generado ocho tipos celulares (G a N) con cinco protenas reguladoras diferentes. Si se contina el esquema, se pueden llegar a especificar 10 000 tipos celulares con slo 25 protenas reguladoras diferentes.

clula G

clula H

clula I

clula J

clula K

clula L

clula M

clula N

Mecanismos genticos que originan tipos celulares especializados

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com o demuestra el ejemplo de las protenas miognicas, el control com binato rio significa an ms: no slo cada uno de los genes est regulado por la accin de numerosas protenas reguladoras, sino que cada protena reguladora partici pa en el control de muchos genes. Adems, aunque algunas protenas regulado ras com o MyoD o miogenina son especficas de un nico tipo celular, es ms frecuente que una protena reguladora determinada est activa en una variedad de tipos celulares, en diferentes partes del cuerpo y en distintos momentos del desarrollo. En la Figura 9-63 se ilustra esquem ticam ente cmo el control gnico combinatorio hace posible generar una gran cantidad de complejidad biolgica con un nmero relativamente reducido de protenas reguladoras. El control combinatorio permite que una protena reguladora dada no tenga necesariam ente una funcin nica y claramente definida, como por ejemplo la de activacin de un grupo determinado de genes o la de determinacin de un cierto tipo celular. En lugar de ello, puede tener diferentes funciones que se sola pan con las de las otras protenas reguladoras. Estas protenas se podran com parar con las palabras de un idioma: se utilizan con diferentes sentidos en una variedad de contextos y raramente se utilizan aisladas; una combinacin ade cuada es la que contiene la informacin necesaria para especificar un proceso de regulacin gnica. Una consecuencia del control gnico com binatorio es que el efecto de aa dir una nueva protena reguladora a una clula depender de la historia anterior de la clula, pues esta historia determina qu protenas reguladoras se encuen tran ya presentes en la clula. As durante el desarrollo una clula puede acumu lar una serie de protenas reguladoras que pueden no alterar la expresin gnica. Cuando se expresa el ltimo miembro de la com binacin requerida de protenas reguladoras, se completa el m ensaje regulador, provocando grandes cambios en el patrn de expresin gnica. Este modelo, como ya hemos visto, puede expli car el fenm eno de transformacin dramtico de un fibroblasto en una fibra muscular por la adicin de una nica protena reguladora. Asimismo podra ju s tificar la diferencia, descrita en el Captulo 21, entre los procesos de determina cin celular, por los cuales una clula queda determinada a seguir una cierta ruta de diferenciacin y un destino, y el proceso de diferenciacin celular por el cual una clula determinada expresa su carcter especializado. Un rasgo esen cial de estas ideas es que, una vez que se empieza a expresar una protena regu ladora, puede actuar manteniendo su propia expresin, contribuyendo de este modo a la memoria celular como se discutir de nuevo ms adelante. El control gnico combinatorio tiene otra importante consecuencia para la evolucin. Dado que las protenas reguladoras no son exclusivas de un circuito de regulacin o de un gen diana particular, cambio sutiles en ellas pueden pro ducir cam bios substanciales en el comportamiento de las clulas.

Se hereda un cromosoma X inactivo4 7

Hemos visto anteriormente que las protenas reguladoras pueden producir pa trones de expresin gnica heredables tanto en clulas eucariotas como proca riotas. En la Figura 9-61 se ilustra un posible mecanismo, basado en un bucle de retroalimentacin positiva en el control de la expresin de un gen. Exclusiva mente en eucariotas existe un mecanismo adicional, que permite que se herede el patrn de organizacin de la cromatina. Posiblemente el ejemplo ms dram tico al respecto sea la inactivacin de uno de los dos cromosomas X en las clu las de las hembras de mamfero. Los cromosomas X e Y son los cromosomas sexuales de los mamferos: todas las clulas femeninas contienen dos cromosomas X, mientras que las masculi nas contienen un cromosoma X y un cromosoma Y. Probablemente debido a que una dosis doble de los productos del cromosoma X podra resultar letal, las clulas femeninas han desarrollado un m ecanismo para mantener inactivado perm anentem ente en cada clula uno de los dos cromosomas X. En el ratn esto ocurre entre el tercero y el sexto das de desarrollo, cuando, en cada clula uno

476

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

clula de un em brin tem prano X . Xm

Figura 9-64 Inactivacin del X. Herencia clonal de un cromosoma X condensado e inactivo, que tiene lugar en las hembras de los mamferos.

en este clon slo es activo el crom osom a X m

en este clon slo es activo el crom osom a Xp

de los dos cromosomas X, al azar, se condensa en forma de heterocromatina. Este cromosoma se puede ver al microscopio ptico durante la interfase como una estructura diferente conocida como corpsculo de Barr, localizado cerca de la membrana nuclear, y se replica al final de la fase S. La mayor parte de su DNA no se transcribe. Este cromosoma X inactivo se hereda fielmente, por lo que cada hembra es un mosaico compuesto de grupos clnales de clulas en los que slo es activo el cromosoma X heredado del padre (Xp) y otro nmero aproxima damente igual de grupos de clulas en las que nicamente es activo el cromoso ma X heredado de la madre ( X J . En general, en el animal adulto tanto las clulas que expresan Xp como las que expresan X,,, se distribuyen en pequeos grupos, lo cual refleja la tendencia de las clulas hijas de permanecer cerca unas de las otras durante las ltimas etapas del desarrollo embrionario y del crecimiento (Figura 9-64). El proceso de condensacin que forma la cromatina condensada (hetero cromatina) en un cromosoma X tiene la tendencia a producirse de forma conti nua a lo largo del cromosoma. Ello se ha demostrado mediante estudios utili zando animales imitantes en los que uno de los cromosomas X se ha unido a una porcin de un autosoma (un cromosoma no sexual). En estos cromosomas hbridos a menudo sucede que algunas regiones del autosoma que son adyacen tes al cromosoma X inactivado se encuentran condensadas en heterocromatina de forma que los genes que contienen se encuentran inactivados de una manera hereditaria. Esto sugiere que la inactivacin del cromosoma X se produce m e diante un proceso cooperativo, que puede imaginarse como una especie de cristalizacin de la cromatina que se extiende desde un lugar de nucleacin si tuado en el cromosoma X De hecho, se ha localizado genticamente un nico

Mecanismos genticos que originan tipos celulares especializados

477

1 2 3 4 5 lm ite

...l....... ........ ....... ......... .......

pronto en el em brin en desarrollo, se form a la heterocrom atina y se extiende sobre la eucrom atina vecina hasta distancias diferentes en diferentes clulas 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 proliferacin de la clula
' " I I "

I I I I ] I

1 2 3 4 5
I

1 2 3 4 5
I

2 3 4 5

heterocrom atina eucrom atina clon de clulas con el gen 1 inactivo (A) (B) clon de clulas con los genes 1, 2 y 3 inactivos clon de clulas sin ningn gen inactivo

centro de inactivacin en el crom osom a X: fragmentos rotos de cromosoma X no sufren inactivacin a menos que incluyan dicho centro. Una vez se ha establecido la estructura condensada de la cromatina, un pro ceso desconocido hace que la estructura sea heredada de esta forma durante to das las sucesivas replicaciones del DNA. Sin embargo este cambio no es absolu tam ente permanente ya que el crom osom a X inactivado se reactiva en el proceso de formacin de las clulas germinales en la hembra.

Los genes de Drosophila y de levadura tambin pueden inactivarse por caractersticas hereditarias de su estructura cromatnica4 8
Hemos descrito dos ejemplos de efectos de posicin sobre la expresin gnica -u n o en Drosophila y otro en levadura- que se parecen en diferentes aspectos a la inactivacin del crom osom a X (vase Figura 9-51). En ambos casos, una forma especficam ente condensada de crom atina impide la expresin de algunos ge nes, y en am bos casos el estado de condensacin de la cromatina es hereditario. En las moscas que presentan reordenaciones cromosmicas, fenmenos de separacin y reagrupamiento que sitan la mitad de una regin de heterocro matina cerca de una regin de eucromatina tienden a inactivar los genes eucromatnicos cercanos. La situacin es anloga a la fusin de un autosoma de m a mfero con un crom osom a X inactivado, tal como se acaba de describir; los fenmenos de inactivacin son muy similares a stos: la zona de inactivacin se expande desde el punto de separacin del crom osoma hasta cubrir uno o ms genes. Adems, mientras que el grado del efecto de expansin es diferente en di ferentes clulas, la zona inactivada establecida en una clula embrionaria se he reda de una manera estable por toda la progenie celular (Figura 9-65). El ejem plo de efecto de posicin que se describe en la Figura 9-51 tambin comparte algunos rasgos con la inactivacin del crom osom a X, como son el efecto de ex pansin y la heredabilidad del estado de condensacin de la cromatina. An no ha sido probado que la inactivacin del cromosoma X y los efectos de posicin observados en m oscas tengan un m ecanismo comn, pero el para lelismo entre ellos es notable. La identificacin y clonaje recientemente de algu nos genes de Drosophila y de levadura necesarios para el efecto de posicin per mitir descubrir, probablemente, los mecanismos moleculares implicados en estos fenmenos. En la Figura 9-66 se muestra un esquema hipottico de cmo podra explicarse el efecto de expansin y la naturaleza hereditaria del estado de condensacin de la cromatina. Independientemente de su base molecular, el empaquetamiento de deter minadas regiones del genoma formando cromatina condensada es un tipo de mecanismo regulador que no se presenta en las bacterias. El fenmeno crucial de esta forma de regulacin gnica exclusiva de los eucariotas es el almacn de

Figura 9-65 Fenm eno de variegacin por efecto de posicin en D r o so p h ila . (A) Normalmente, la heterocromatina (rojo) no ocupa las regiones adyacentes de eucromatina [verde] debido a la existencia de lmites especiales de secuencias, de naturaleza desconocida. Sin embargo, en algunas moscas que heredan ciertas translocaciones cromosm icas, este lmite no est presente. (B) Durante las primeras fases del desarrollo de estas moscas, la heterocromatina se extiende sobre el DNA cromosm ico vecino, alcanzando diferentes distancias en clulas diferentes. Pronto, esta expansin se detiene, pero el patrn establecido de heterocromatina se hereda, de tal modo que se producen grandes clones de clulas descendientes que presentan los mismos genes vecinos condensados en forma de heterocromatina, y por lo tanto, inactivos (de aqu la apariencia variegada de algunas de estas moscas; vase Figura 9-51B). Este fenmeno se asem eja en muchos aspectos a la inactivacin del cromosom a X que se produce en los mamferos.

478

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

gen inactivo

gen activo REPLICACION DEL DNA

Ae

REPLICACION DEL DNA

Figura 9 -6 6 Esquema general que perm ite la herencia directa de estados de expresin de genes durante la replicacin del DNA. En este modelo

se agregan mas protenas m ediante una unin cooperativa

' y o protena libre

no se unen protenas

LOS DOS GENES HIJOS SON INACTIVOS

LOS DOS GENES HIJOS SON ACTIVOS

una memoria estable de estados gnicos en una estructura cromatnica heredi taria, en lugar de tratarse de un mecanismo de retroalimentacin estable de ge nes autorreguladores de protenas reguladoras que pueden difundir de un lado a otro del ncleo. Se desconoce si los m ecanismos de este tipo actan slo en grandes regiones inactivas de los cromosomas o si tambin pueden hacerlo a n i vel de uno o de unos cuantos genes.

Cuando las clulas de vertebrados se dividen, pueden heredar el patrn de metilacin del DNA4 9
Los nucletidos del DNA pueden ser modificados de forma covalente, y en verte brados la metilacin de citosina parece constituir un mecanism o importante para distinguir genes activos de los que no lo son. La molcula de 5-metilcitosina (5-metil C), tiene la misma relacin con la citosina que la timidina con el uracilo, y de m anera similar no afecta al apareamiento de bases (Figura 9-67). La metila cin en el DNA de vertebrados est restringida a los nucletidos citosina (C) en la secuencia CG, que est apareada exactamente con la misma secuencia (en di reccin opuesta) de la otra hebra de la hlice del DNA. Consecuentemente, un sencillo mecanism o permite que un patrn preexistente de m etilacin del DNA se herede directamente por las molculas de DNA hijas. Una enzima llamada metilasa de mantenimiento acta preferentemente sobre las secuencias CG apa readas previamente con una secuencia CG metilada. A consecuencia de ello, el patrn preexistente de metilacin de la cadena parental de DNA acta como un molde para la metilacin de las cadenas de DNA hijas, haciendo que el patrn sea heredado directamente a travs de la replicacin del DNA (Figura 9-68). Las bacterias producen enzimas que han sido muy tiles para el estudio de la metilacin en las clulas de vertebrados. Utilizan la metilacin en A o en C en una secuencia especfica a fin de protegerse de la accin de sus propias nucleasas de restriccin. Por ejemplo, la nucleasa de restriccin Hpall, corta la secuen cia CCGG siempre y cuando la C central no est metilada. As la susceptibilidad de una molcula de DNA a ser cortada por la Hpall puede utilizarse para detec tar si determinados puntos del DNA estn mediados o no. La heredabilidad de los patrones de metilacin en vertebrados se puede estudiar en clulas en culti vo utilizando en primer lugar enzimas metiladoras bacterianas para introducir grupos metilo en las citosinas, y despus utilizando nucleasas de restriccin para seguir la heredabilidad de dichos grupos. La enzima utilizada normalmente para introducir bases 5-metil C en secuencias determinadas CG es la enzima Hpall metilasa, que normalmente protege a la bacteria contra su propia nuclea-

hipottico, porciones de un grupo de protenas reguladoras de la expresin gnica, que se unen entre s de forma cooperativa, se transfieren directamente desde la hlice paterna de DNA (arriba a la izquierda) a ambas hlices hijas. Entonces, el grupo de protenas heredado de cada una de las hlices hijas provoca que se unan a l otras copias de la misma protena reguladora. Como la unin es cooperativa, el DNA sintetizado a partir de una hlice paterna de DNA idntica a la anterior, pero que no presenta las protenas unidas (arriba a la derecha), permanecer libre de ellas. Si estas protenas unidas inactivan la transcripcin de un determinado gen, el estado inactivo del gen se heredar directamente, como en el ejemplo. Si la unin cooperativa de las protenas requiere secuencias especficas de DNA, estos fenmenos estarn limitados a regiones de control gnico especficas; sin embargo, si la unin se puede propagar a todo lo largo del cromosoma, podra explicar el efecto de expansin asociado con los estados heredables de la cromatina que se discute en el texto.

citosina

5-m etilcitosina

Figura 9-67 Form acin de 5-m etilcitosina por metilacin de una citosina en la doble hlice del DNA. En los vertebrados este fenmeno est

restringido a citosinas (C) escogidas que forman parte de la secuencia CG.

Mecanismos genticos que originan tipos celulares especializados

479

CH3
m etilacin 3' T G C A T A G C A 5' 5' 3' A C G T A T C G T

3' 5'

T G C A T A G C A
ch3

no reconocido por una enzima m etilante de m antenim iento 5' 3'

reconocido por una enzima m etilante de m antenim iento 3' 5. m etilacin

ch3

A C G T A T C G T T G C A T A G C A
CH '

s - 3' HHHHHHIHSHHI5'

A C G T A T C G T 5' _

3'

T G C A T A G C A

CH3

sa de restriccin. Si se utiliza esta enzima para metilar la C central de la secuen cia CCGG de una molcula clonada de DNA que luego se introduce en una clu la de vertebrado, se puede demostrar que el patrn de metilacin se mantiene como hemos descrito: cada secuencia individual mediada CG se mantiene a lo largo de muchas divisiones, mientras que las secuencias CG no metiladas per m anecen sin metilar. La existencia de la metilasa de m antenimiento explica la herencia automti ca de nucletidos 5-metil C, pero dado que normalmente no metila DNA no m e diado previamente, no puede explicar cmo se aadi el primer grupo metilo a un organismo vertebrado. Si se inyecta DNA completamente carente de metila cin a un huevo de ratn fertilizado, se aadirn grupos metilo a casi cada se cuencia CG (con una importante excepcin que se discutir ms adelante). Se cree que este efecto es debido a otra actividad metilasa de establecimiento pre sente en el huevo. Como se ver, la metilacin de novo tambin ocurre durante los procesos de diferenciacin de clulas especializadas, aunque se desconoce cmo se realiza.

Figura 9 -68 De qu form a se pueden heredar con precisin los patrones de metilacin del DNA. En los DNA de vertebrados, una gran cantidad de las bases de citosina de la secuencia CG estn metiladas (vase Figura 9-67). Dada la existencia de una enzima metilante dirigida por grupos metilo (la metilasa de m antenimiento), una vez se ha establecido un determinado patrn de m etilacin del DNA, cada punto de metilacin se hereda en el DNA descendiente, tal como se muestra en esta figura. Esto implica que los cambios en los patrones de m etilacin del DNA se pueden perpetuar en toda la progenie de una clula.

En las clulas de los vertebrados la metilacin del DNA refuerza las decisiones del desarrollo5 0
Aunque en un principio se propuso que la metilacin del DNA podra jugar un papel dominante en la generacin de los diferentes tipos celulares de mamfe ros, actualmente se le reconoce un papel ms sutil. En algunos invertebrados, incluyendo a Drosophila, el DNA no est metilado y sin embargo el proceso de diversificacin de los diferentes tipos celulares parece ser similar entre Droso phila y los vertebrados. Algunas observaciones apoyan la idea de que la metila cin del DNA en vertebrados est relacionada con la inactivacin gnica, pero que slo es un mecanism o de refuerzo de una decisin adoptada previamente por otro m ecanismo. As pues experimentos con la enzima Hpall demuestran que en general el DNA de los genes inactivos est ms fuertemente metilado que el de los genes activos. Sin embargo, cuando un gen que estaba inactivo se activa durante el desarrollo pierde parte de su metilacin nicamente despus de ha ber sido activado. De manera similar, el crom osom a X femenino descrito ante riormente, primero se condensa e inactiva, y slo posteriormente incrementa el nivel de metilacin de sus genes. Entonces, qu hace la metilacin? Y, cul es su utilidad para el organismo? Tenemos al menos dos indicios importantes al respecto. Primero, se puede pre parar el DNA correspondiente a un gen de actina especfico de msculo en dos formas, una completamente metilada y otra sin metilar. Cuando estas dos versio nes del gen se introducen en clulas musculares en cultivo, ambas se transcriben

480

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

protenas

factores generales

GEN ACTIVO

GEN INACTIVO PERO "EN GOTEO"

Figura 9-69 De qu forma la metilacin del DNA puede ayudar a inactivar genes. La unin de las protenas reguladoras y de los factores generales de transcripcin cerca de un promotor activo impide la metilacin del DNA por un mecanismo desconocido. Si la mayora de estas protenas de unin al DNA especficas de secuencia se disocian, como ocurre cuando el gen se inactiva, la secuencia de DNA puede metilarse, lo que impedir que se unan otras protenas e inactivar completamente el gen.

GEN COMPLETAMENTE INACTIVO

a la misma elevada velocidad. Sin embargo, cuando se introducen en fibroblas tos, que normalmente no transcriben el gen, el gen no metilado es transcrito a ni vel bajo pero mucho ms alto que el del gen exgeno metilado o que el del gen endgeno del fibroblasto (que tambin est metilado), que no se transcriben en absoluto. Segundo, a partir de experimentos bioqumicos se ha podido identificar en vertebrados una protena que se une fuertemente al DNA y que contiene nucletidos 5-metil C agrupados. Se cree que la unin de esta protena empaqueta el DNA metilado de tal forma que lo hace especialmente resistente a la activacin por la maquinaria de transcripcin . Estos experimentos sugieren que la metila cin del DNA se utiliza en vertebrados fundamentalmente para asegurar que cuando un gen se inactiva quede completamente inactivado (Figura 9-69). Los experimentos realizados para comprobar si una secuencia de DNA que se transcribe con gran frecuencia en un tipo celular determinado de vertebrado lo hace o no en otro tipo celular han demostrado diferencias de velocidad de transcripcin entre dos tipos celulares del orden de ms de 106 veces. Genes inac tivos de vertebrados se transcriben mucho m enos que genes inactivos de bacte rias, en los que las mayores diferencias conocidas en cuanto a la velocidad de transcripcin entre genes expresados y no expresados son de aproximadamente 1000 veces. La metilacin del DNA podra ser la responsable de al menos una parte de esta diferencia. Adems, com o se ver ms adelante, la metilacin del DNA es necesaria para al m enos un tipo de memoria celular.

La actividad genmica heredable requiere la metilacin del DNA5 1

La clulas de mamferos son diploides, conteniendo un grupo de genes heredado del padre y otro de la madre. Se han encontrado pocos casos en los que la expre sin de un gen dependa de si se ha heredado del padre o de la madre. Este fen meno se ha denominado actividad genmica heredable o mareaje del genoma (genomic imprinting). Aunque no fue descubierto de ese modo, se han observado ejemplos notables en experimentos con ratones transgnicos. Por ejemplo, es po sible obtener ratones transgnicos en los que una de las dos copias normales del gen que codifica el factor de crecimiento similar a la insulina-2 (IGF-2, de Insulinlike Growth Factor-2) se ha inactivado por mutacin. Este ratn, heterocigoto, se

Mecanismos genticos que originan tipos celulares especializados

481

desarrolla normalmente si el gen defectivo Igf-2 procede de la madre, pero pre sentan graves anomalas, creciendo solamente la mitad de lo que es normal, si el gen defectivo Igf-2 procede del padre. La explicacin se obtuvo del anlisis poste rior de estos ratones transgnicos y de ratones normales. Tanto en los ratones normales como en los transgnicos slo se transcribe la copia del gen Igf-2 pater no, mientras que el gen obtenido de la madre es silencioso: se dice en este caso que el gen obtenido de la madre ha sido marcado fimprintedj. Aunque los mecanismos de mareaje del genoma no estn claros, es muy pro bable que participe la metilacin del DNA. As, en ratones transgnicos defectivos en la metilasa de mantenimiento, el mareaje del gen Igf-2 materno no se produce lo que nos indica que el mecanismo que permite diferenciar las copias materna y paterna del gen Igf-2 implica la metilacin del DNA. Tambin es muy interesante el hecho de que los ratones que carecen de metilasa de mantenimiento mueran en el estado de embriones tempranos. Esto podra ser la consecuencia de un mareaje del genoma defectuoso, pero tambin se podra argir que el fallo primario fuese la imposibilidad de reforzar las decisiones del desarrollo por metilacin del DNA, lo que conducira a que los miles de genes inactivos que existen en una clula de vertebrados mantuvieran una velocidad de transcripcin mnima.

En los mamferos, las islas ricas en CG estn asociadas con alrededor de 40 000 genes5 2
Debido al funcionamiento de la va de reparacin de DNA, los residuos C media dos en el genoma tienden a ser eliminados en el curso de la evolucin. La des anim acin accidental de una C no metilada da lugar a U, base que habitualmen te no est presente en el DNA, por lo que es reconocida fcilmente por la enzima de reparacin de DNA, la uracilo DNA glucosilasa, eliminada y luego reemplaza da por una C (se describe en el Captulo 6). Pero la desaminacin accidental de una 5-m etil C no puede ser reparada de este modo, porque el producto de la desam inacin es una T que, por lo tanto, no se puede diferenciar de los otros re siduos T no m utantes del DNA. Aunque existe un sistema especial de reparacin para eliminar estos mutantes T (vase pg. 267), muchas de estas desanimacio nes no son detectadas, por lo que los residuos C del genoma que estn mediados tienden a mutar a T durante la evolucin. A lo largo de la evolucin ms de tres de cada cuatro CG se han perdido por este sistema, dejando a los vertebrados con una deficiencia notable en este dinucletido. Las secuencias CG que todava existen estn distribuidas de una for ma desigual por el genoma; en determinadas regiones, de 1000 a 2000 pares de bases de longitud, las secuencias CG estn presentes a densidades de entre 10 y 20 veces su densidad media en todo el genoma; estas zonas reciben el nombre de islas CG. Estas islas, con algunas notables excepciones, parecen mantenerse no mediadas en todos los tipos celulares. Se ha observado que rodean los pro motores de los llamados genes de mantenimiento (housekeeping genes) -genes

isla CG RNA

ntrones

gen de la dihidrofolato reductasa

3'

DNA

gen de la hipoxantina fosforribosil transferasa

X

RNA gen de protena ribosom al

1 1 1 ~

DNA
3'

Figura 9 -70 Las islas CG que rodean a los prom otores en tres genes constitutivos de mam feros. Los recuadros a m a rillo s muestran la longitud de cada isla. Obsrvese tam bin que, com o ocurre con la mayora de los genes de mamfero, los exones (rojo oscu ro) son cortos en relacin con los intrones (rojo claro). (Adaptado de A.P. Bird, Trends Genet.

&
LJ

3:342-347, 1987.)

DNA

^RN A_^ ^

10 000 pares de nucletidos

482

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

DNA DE UN ANCESTRO DE LOS INVERTEBRADOS M ili! i ; :11! 1 ! I lil'liif llll 1:1111 =I lllit lilljilll'll ll! I flilP lili!jll<! lliiillMMI11118:1 lillltiilllltm l jiiWlii iTjj i iBl .............. ; 5' a s a M m etilacin de la mayora RNA de secuencias CG en la lnea germ inal lili l i l i III !l N M i!iirti!^ rH Itlli IIKGI'lIlfrVIlLlIII SMIIil !IS | c; 1 S * S S B S M g a D muchos m illones de aos de evolucin DNA DE LOS VERTEBRADOS r IT TT | I i Ti i !flmnuTllt! 98H SBUllt ii Htsm iIBi8U 8iJlljni|PI|:: u I! L i i ._..... AL..... l.i_
5'

Figura 9-71 Un m ecanism o que explica tanto las m arcadas deficiencias de secuencia CG com o la presencia de islas CG en los genomas de los vertebrados. Las lneas negras

marcan la localizacin de un dinucletido CG no metilado en la secuencia de DNA, mientras que las lneas rojas marcan la localizacin de un dinucletido CG metilado.

1000 pares de nucletidos

isla CG

que codifican el elevado nmero de protenas que son esenciales para la viabilidad celular y que, por lo tanto, se expresan en muchas clulas (Figura 9-70). Adems, muchos de los genes especficos de tejidos, que codifican protenas necesarias slo en determinados tipos de clulas, tambin estn asociados con las islas CG. La distribucin de las islas CG puede explicarse si se asume que la metilacin CG fue adoptada en vertebrados como un mecanismo de evitar el inicio de la transcripcin en los segmentos inactivos del genoma (Figura 9-71). En clulas de la lnea germinal de vertebrados -e l linaje celular que da lugar a oocitos y a esperm atozoides- la mayor parte del genoma est inactivo y metilado. Durante largos perodos de tiempo de evolucin, sus secuencias CG metiladas se han perdido por medio de fenmenos de desaminacin accidental que no han sido reparados correctam ente. Sin embargo, las secuencias CG de las regiones que rodean los promotores de muchos genes, incluyendo sus genes de m anteni miento, se m antienen no metiladas en las clulas de la lnea germinal, y por lo tanto pueden ser reparadas despus de fenmenos de desaminacin espont nea. Estas regiones se han conservado como islas CG. El genoma de mamfero (aproximadamente 3 x 109 pares de nucletidos) contiene un nmero estimado de 40 000 islas CG. La mayora de las islas marcan los extremos 5 de la unidad de transcripcin y por lo tanto, probablemente del gen. Puesto que es posible clonar especficamente el DNA situado alrededor de las islas CG, esta tcnica proporciona un buen mtodo para encontrar nuevos genes.

Resumen
La gran cantidad de tipos celulares de los animales y de las plantas se genera por medio de mecanismos que provocan que en diferentes clulas se transcriban dife rentes genes. Muchas clulas animales especializadas pueden mantener sus carac teres tpicos cuando crecen en cultivo, por lo que los mecanismos reguladores de la expresin gnica que estn implicados en la generacin de estos tipos celulares han de ser estables y heredables, dotando a la clula de una memoria de la historia de su desarrollo. Los procariotas y las levaduras proporcionan modelos de sistemas que son accesibles para estudiar los mecanismos de la regulacin gnica. Algunos de estos mecanismos pueden ser relevantes en la generacin de tipos celulares espe cializados de los eucariotas superiores. Uno de estos mecanismos implica una interaccin competitiva entre dos (o ms) protenas patrn de regulacin gnica, cada una de las cuales estimula su propia sntesis e inhibe la sntesis de la otra: esto crea un mecanismo de flip-flop que hace alternar a la clula entre dos patrones de expresin alternativos. Los bucles de retroalimentacin positiva directa o indirecta, que permiten a las protenas reguladoras mantener su propia sntesis, son un me canismo general de la memoria celular. En los eucariotas la transcripcin est controlada generalmente por combina ciones de protenas reguladoras. Se cree que cada tipo celular en un eucariota supe rior contiene una combinacin especial de protenas reguladoras que aseguran la
Mecanismos genticos que originan tipos celulares especializados

483

expresin de exclusivamente los genes apropiados para ese tipo de clula. Una pro tena reguladora se puede expresar en diferentes circunstancias y en general est implicada en el control de muchos genes. Adems de las protenas de regulacin que difunden, en los eucariotas tambin se utilizan ciertos estados de compactacin de la cromatina, heredables, para regu lar la expresin gnica. En vertebrados tambin participa la metilacin del DNA, especialmente para reforzar las decisiones sobre expresin de los genes que se han tomado previamente por otros mecanismos.

Controles post-transcripcionales
Aunque las formas predominantes de regulacin de la mayora de los genes son los controles de la iniciacin de la transcripcin gnica, otros controles pueden actuar posteriormente en la va del RNA a la protena modulando la cantidad de producto gnico que se produce. Aunque estos c o n tro le s p o s t-tra n s c rip c io n a le s, que actan despus de que la RNA polimerasa se haya unido al promotor y haya iniciado la transcripcin, son m enos frecuentes que los controles transcripcionales, son cruciales para muchos genes. Parece como si cada una de las etapas que pueda ser regulada en la expresin gnica, ser regulada en alguna circunstancia para algunos genes. Consideraremos las variantes de regulacin post-transcripcional en un or den temporal, de acuerdo con la secuencia de procesos con los que se va encon trando una molcula de RNA desde que comienza la transcripcin (Figura 9-72).

La atenuacin de la transcripcin causa una terminacin temprana de algunas molculas de RNA5 3

En bacterias la expresin de ciertos genes es inhibida por la terminacin prema tura de la transcripcin, en un fenmeno denominado a te n u a c i n d e la tr a n s c rip c i n . En algunos de estos casos la cadena de RNA naciente adopta una es tructura que provoca interacciones con la RNA polimerasa que abortan su transcripcin. Cuando se requiere el producto gnico, ciertas protenas regula doras se unen a la cadena de RNA naciente e interfieren con la atenuacin, per mitiendo de ese modo que se termine la transcripcin. En los eucariotas la atenuacin de la transcripcin ocurre segn una varie dad de mecanismos. Por ejemplo, tanto en adenovirus como en HIV (el virus causante del SIDA), las protenas que se ensamblan en el promotor parecen po der determinar si la polimerasa puede pasar a travs de ciertos lugares de ate nuacin ms adelante. Estas protenas pueden diferir de una clula a otra, y la clula puede controlar el grado de atenuacin para genes particulares.

INICIO DE LA TRANSCRIPCIN POSIBLE ATENUACIN MADURACIN Y CORTE DEL EXTREMO 3' EXPORTACIN DESDE EL NCLEO LOCALIZACION ESPACIAL EN EL CITOPLASMA POSIBLE EDICIN DEL RNA INICIO DE LA TRADUCCIN POSIBLE RECODIFICACIN TRADUCCIONAL POSIBLE ESTABILIZACIN DEL RNA
tra d u c ci n b lo q u e a d a la t r a n s c r i p c i n se d etiene

s e cu e n c ia s " de m R N A no funcionales r e te n c i n en el n c l e o

La maduracin alternativa del RNA puede producir diferentes formas de protena a partir de un mismo gen54
Tal como se ha descrito en el Captulo 8, muchos genes se transcriben en primer lugar en forma de precursores largos de mRNA que son recortados por una serie de etapas de procesamiento, al final de las cuales se obtiene la molcula madura de mRNA. Una de esas etapas es la maduracin del RNA por corte y empalme (RNA splicing), en la que se eliminan las secuencias intrnicas del precursor del mRNA. Frecuentem ente una clula puede madurar un precursor de diferentes formas, de modo que se pueden obtener polipptidos finales diferentes a partir de un mismo gen -segn un proceso que se denomina m a d u ra c i n a lte rn a tiv a d el RNA (Figura 9-73). Una proporcin substancial de los genes de los eucariotas superiores produce mltiples protenas de este modo. Cuando existen diferentes posibilidades de maduracin en varias posiciones del transcrito, un nico gen puede producir docenas de protenas diferentes. Sin embargo, las alternativas en el proceso de maduracin son frecuentem ente mucho ms limitadas, y slo

R N A degradado

CONTINUA LA SNTESIS DE PROTENA

Figura 9-7 2 Posibles controles posttranscripcionales de la expresin gnica. Es probable que en un gen

determinado slo se utilice alguno de estos controles.

484

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

exn opcional

Figura 9-73 Cuatro patrones de

m aduracin alternativa de RNA. En

exones m utuam ente excluyentes

punto de m aduracin interno

cada caso madura un solo tipo de transcrito de RNA de dos formas alternativas, produciendo dos mRNA distintos (1 y 2). Los recuadros azul oscuro indican secuencias exnicas que se presentan en ambos mRNA. Los recuadros azul claro indican secuencias exnicas que slo se presentan en uno de los mRNA; estos recuadros estn unidos por lneas rojas para indicar dnde se eliminan las secuencias intrnicas (amarillas). (Adaptado con permiso de A. Andreadis, M. E. Gallego, y B. NadalGinard, Annu. Rev.CellBiol. 3:207-242, 1987. 1987 Annual Reviews, Inc.)

se pueden obtener algunos tipos de protenas a partir de cada unidad de trans cripcin. En algunos casos la maduracin alternativa del RNA ocurre porque existe una ambigedad de intrn: el mecanismo estndar de espliceosoma que eli mina los intrones (descrito en el Captulo 8) es incapaz de distinguir claramente entre dos o ms apareamientos alternativos de puntos de maduracin 5 y 3, de tal modo que en diferentes ocasiones se toman diferentes decisiones de forma fortuita. Cuando ocurre este fenmeno de maduracin alternativa constitutiva, se producen varias versiones de protena codificada por el gen en todas las clu las en las que ste se expresa. Sin embargo, en m uchos casos la maduracin alternativa del RNA no es constitutiva sino que est regulada. En los casos ms simples la maduracin al ternativa permite pasar de sintetizar protenas no funcionales a protenas fun cionales. Por ejemplo, la transposasa que cataliza la transposicin del elemento P de Drosophila se produce en una forma funcional en clulas germinales y en una forma no funcional en clulas somticas de la mosca, permitiendo al ele mento P extenderse por el genoma de la m osca sin causar daos en las clulas somticas. La diferencia en la actividad del elemento transponible viene provo cada por una secuencia intrnica del RNA de la transposasa que slo se elimina en la clulas germinales. La maduracin del RNA se puede regular tanto negativamente, mediante una molcula reguladora que evita que la maquinaria de maduracin acceda a una secuencia de maduracin determinada en el RNA, o positivamente, m e diante una protena reguladora que dirige la maquinaria de maduracin hacia una secuencia de procesamiento que de otra forma quedara oculta (Figura 9-74). En el caso de la transposasa de Drosophila, la etapa clave del procesa miento est bloqueada en las clulas somticas por regulacin negativa. Adems de cambiar la produccin de una protena funcional por otra no funcional, o a la inversa, la regulacin de la maduracin del RNA puede generar versiones diferentes de la protena en diferentes tipos celulares, de acuerdo con las necesidades de la clula. Por ejemplo, de este modo se produce en las clulas nerviosas una variante especializada de la protena tirosina quinasa codificada por el proto-oncogn src (Figura 9-75). Las variantes especficas de tipo celular de otras protenas se producen del mismo modo.

La determinacin del sexo en Drosophila depende de una serie de procesos de maduracin alternativa regulada del RNA55
En Drosophila la seal primaria que determina si a mosca se desarrollar como macho o hembra es la relacin cromosomas X/autosomas. Individuos con una re-

Controles post-transcripcionales

485

TEJIDO 1 (A) CONTROL NEGATIVO transcrito prim ario m aduracin mRNA

TEJIDO 2 represor

CO
\ / m aduracin bloqueada

mRNA

activador (B) CONTROL POSITIVO transcrito prim ario sin m aduracin mRNA m aduracin mRNA

Figura 9 -74 Control negativo y positivo de la maduracin alternativa del RNA. (A) Control negativo, en el que un represor se une a un transcrito primario en el tejido 2, evitando de ese modo que la maquinaria de maduracin elimine la secuencia del intrn. (B) Control positivo, en el que la maquinaria de maduracin es incapaz de eliminar una secuencia intrnica particular sin ayuda de una protena activadora.

lacin cromosomas X/autosomas de 1 (normalmente dos cromosomas X y dos se ries de autosomas) se desarrollan como hembras, mientras que los que presentan una relacin de 0,5 (normalmente un cromosoma X y dos series de autosomas) se desarrollan como machos. Esta relacin parece determinarse de algn modo en las primeras fases del desarrollo y desde entonces es recordada por cada clula. Hay tres productos gnicos cruciales que estn implicados en la transmisin de la informacin sobre esta relacin a muchos otros genes que especificarn los rasgos propios de machos y hembras (Figura 9-76). En la Figura 9-77 se indica que la de terminacin del sexo en Drosophila depende de una cascada de fenmenos de maduracin regulada del RNA, que implican a estos tres productos gnicos. La determ inacin del sexo en Drosophila aporta el ejemplo mejor conocido de una cascada de regulacin basada en la maduracin del RNA. No est claro por qu la m osca utiliza esta estrategia. Otros organismos (nemtodos, por ejemplo) utilizan un sistema com pletamente diferente para la determinacin del sexo -basado en controles transcripcionales y traduccionales. Adems, la va de determinacin de macho en Drosophila requiere que se produzcan continua m ente una serie de molculas de RNA no funcionales, lo que parece ser un gasto innecesario. Se especula que esta cascada de maduracin del RNA es un antiguo mecanism o de control, procedente de una etapa evolutiva en la que el RNA era la molcula biolgica predominante y los controles de la expresin gnica deban basarse com pletam ente en interacciones RNA-RNA.

Un cambio en el punto de rotura del transcrito de RNA y la adicin de poli A pueden cambiar el extremo carboxilo terminal de una protena5 6
En eucariotas el extremo 3 de una molcula de mRNA no est determinado, como en bacterias, por la finalizacin de la sntesis de RNA por la RNA polimerasa. Por el contrario, est determinado por una reaccin de rotura del RNA que

1 :: j 2 3
1

disposicin de los exones que codifican protena del gen src A

I l 4

pares de nucletidos m ayora de las clulas H2N COOH H2N 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 protena Src de 533 am inocidos
486 Captulo 9 : El control de la expresin gnica

1000

5 1

ni m u 6 7 8 9 10 1112
clulas nerviosas

DNA

COOH 2 3 A4 5 6 7 8 9 10 11 12 protena Src de 539 am inocidos

Figura 9-75 La m aduracin alternativa regulada del RNA produce formas especficas del tipo celular de un producto gnico. Aqu se representa el proceso de generacin de dos protena quinasas ligeramente distintas a partir del gen src, porque la secuencia del exn A slo se incluye en la forma propia de las clulas nerviosas. La forma neural de la protena Src contiene un lugar de fosforilacin extra y se cree que adems tiene una actividad especfica superior. En el esquema slo se muestran los exones que codifican protena (c o lo rea d os ) (el exn 1, que forma la secuencia 5 lder del mRNA, no se muestra). (Segn J.B. Levy et al., Mol. C ellB iol. 7:4142-4145, 1987.)

est catalizada por otros factores mientras el transcrito se esta alargando (vase Figura 8-49). Una clula puede controlar el lugar de corte de modo que cambie el extremo carboxilo de la protena resultante (que est codificado por el extre mo 3 del mRNA). Un cambio de este tipo que ha sido bien estudiado es el que media el cam bio en la sntesis de molculas de anticuerpo, de unidas a la mem brana a secre tadas, durante el desarrollo de los linfocitos B. Muy pronto durante la vida de una clula B, el anticuerpo que produce dicha clula se ancla en la membrana plasmtica, y all acta com o receptor del antgeno. La estimulacin por el antgeno hace que estas clulas se multipliquen y em piecen a secretar su anticuer po. La forma secretada del anticuerpo es idntica a la forma unida a la m em bra na, excepto en cuanto a su extremo carboxilo terminal. En el caso de la forma unida a la membrana, en este extremo la protena tiene una larga cadena de aminocidos hidrofbicos que atraviesa la bicapa lipdica de la membrana, mientras que en el caso de la forma secretada, presenta una cadena mucho ms corta de aminocidos hidroflicos. Por lo tanto, el cambio de la forma unida a la membrana a la forma secretada requiere una secuencia diferente de nucletidos en el extremo 3 del mRNA; esta diferencia se consigue a travs del cambio en la longitud del transcrito primario de RNA causado por un cambio en el lugar de corte del RNA, como se describe en la Figura 9-78.

relacin crom osom as X autosom as

1 I
producto gnico
Sxl

M
producto gnico
tra

i
producto gnico
dsx

mosca m acho o hembra

Figura 9-76 Determinacin del sexo en Drosophila. Los productos gnicos que se muestran actan en una cascada secuencial para determinar el sexo de una mosca de acuerdo con la relacin entre cromosomas X y autosomas. Los genes se denominan sex-lethal (Sxl), transformer (tra) y doublesex (dsx) debido a los fenotipos que resultan cuando son inactivados por mutacin. La funcin de estos productos gnicos es transmitir la informacin acerca de la relacin cromosomas X/autosomas a los muchos otros genes que estn implicados en la generacin de los fenotipos relacionados con el sexo. Estos otros genes actan como dos juegos alternativos: aquellos que especifican rasgos de hembra y aquellos que especifican los rasgos de macho (vase Figura 9-77).

La definicin de gen se ha de modificar debido al descubrimiento de la maduracin alternativa del RNA5 7

El descubrimiento de que habitualmente los genes eucariotas contienen intrones y de que sus secuencias codificantes se pueden unir de varias formas ha planteado nuevas cuestiones sobre la definicin de lo que es un gen. El gen fue definido por primera vez en trminos moleculares a principios de los aos 40, a partir del trabajo sobre gentica bioqumica del hongo Neurospora. Desde en tonces, un gen ha sido definido operacionalmente como una regin del genoma que se segrega durante la meiosis como una sola unidad y que da lugar a un ras go definible en trminos fenotpicos, tal como ojos rojos o blancos en Drosophi la o semillas lisas o rugosas en los guisantes. Los trabajos en Neurospora m ostra ron que la mayora de genes corresponden a una regin del genoma que dirige la sntesis de una sola enzima. Esto permiti enunciar la hiptesis de que un gen codifica una cadena polipeptdica. La hiptesis result ser extremadamente pro vechosa para la investigacin posterior; a medida que se iban descubriendo ms detalles sobre los mecanismos de la expresin gnica, durante los aos 60, se fue identificando un gen como una porcin de DNA que es transcrito en RNA y que codifica una sola cadena polipeptdica (o un solo RNA estructural, como m ol culas de tRNA o de rRNA). El descubrimiento de los genes partidos a finales de los aos 70 se pudo encajar fcilmente en la definicin original de gen a condi cin de que se considerara que una cadena polipeptdica estuviera especificada por el RNA transcrito a partir de alguna secuencia de DNA. Sin embargo, ahora est claro que muchas secuencias de DNA de las clulas de los eucariotas superio res producen dos o ms protenas distintas mediante la maduracin alternativa del RNA. Entonces, cmo se tiene que definir un gen? En los casos relativamente raros en los que a partir de una sola unidad de transcripcin se produzcan dos protenas eucariotas muy diferentes, se conside ra que las dos protenas estn codificadas por genes distintos que se solapan en el cromosoma. Sin embargo, parece complicar la cuestin de forma innecesaria el considerar que la mayora de las protenas modificadas producidas por madu racin alternativa del RNA derivan de genes solapados. Una alternativa ms ra zonable es la de modificar la definicin original de gen y considerar como gen a cualquier secuencia de DNA que es transcrita como una nica unidad y que co difica un conjunto de cadenas polipeptdicas relacionadas (isoformas proteicas). Esta definicin de gen tam bin comprende a aquellas secuencias de DNA que codifican variantes producidas por procesos post-transcripcionales diferentes a

Controles post-transcripcionales

487

GEN

transcrito prim ario de RNA de MACHO X : A = 0,5 lugar de corte regulado 3'

transcrito prim ario de RNA de HEMBRA X : A = 1 lugar de corte bloqueado

Sex-lethal (S>
protena producida no funcional

j_
protena Sxl funcional

lugar de corte regulado 3'

tramformmi
protena producida no funcional

lugar de corte \fssw bloqueado a

a n

I proteina Tra funcional Tra-2

lugar de corte regulado 3' doublesex (dsx) protena Dsx

lugar de corte activado

400 aa

REPRIME LOS GENES DE DIFERENCIACIN DE HEMBRA DESARROLLO DE MACHO

150 aa que son especficos de macho

protena Dsx

wm c
400 aa

REPRIME LOS GENES DE DIFERENCIACIN DE MACHO DESARROLLO DE HEMBRA

30 aa que son especficos de hembra

la maduracin alternativa de RNA, tales como el desplazamiento de pauta en los ribosomas (ribosomal frameshifting), y la edicin del RNA (RNA editing), que se describirn ms adelante.

El transporte de RNA desde el ncleo puede ser regulado5 8

Parece ser que un transcrito primario de RNA es al menos diez veces ms largo que la molcula de mRNA madura que se genera a partir de l por maduracin por corte y empalme del RNA. Se ha estimado incluso que slo una veinteava parte aproximadamente de la masa total del RNA fabricado abandona el ncleo celular. Por lo tanto, parece que una fraccin substancial de los transcritos pri marios (quizs la mitad) pueden ser completamente degradados en el ncleo sin llegar a generar ninguna molcula de RNA que alcance el citoplasma. Los RNA descartados pueden ser aquellos a partir de cuya secuencia no se pueda fabricar ninguna molcula de mRNA; por otro lado, algunos RNA pueden representar molculas potenciales de mRNA, funcionales nicamente en algunos tipos celu lares, no llegando en los otros a alcanzar el citoplasma. Esto puede conseguirse mediante su direccionam iento selectivo hacia la degradacin intranuclear, o porque se les bloquea selectivamente la salida del ncleo. A pesar de que existen pocas evidencias slidas para cualquiera de estos ti pos de control, cada uno de ellos es una posibilidad real. En particular, se sabe que la exportacin de RNA a travs de los poros nucleares es un proceso activo que requiere en muchos casos que los RNA tengan una caperuza especial en el extremo 5 y una cadena poli-A en el extremo 3 (descrito en el Captulo 8). Re querimientos de este tipo tienen sentido pues mantienen lejos del citoplasma una serie de molculas de RNA desechables (como por ejemplo las secuencias

Figura 9-77 La cascada de cambios en la expresin de genes que determ inan el sexo de una m osca depende de la maduracin alternativa del RNA. Una relacin entre cromosomas X y autosomas de 0,5 produce el desarrollo de un macho. Ser macho es la salida por defecto en la que ambos genes Sxl y ira se transcriben pero sus RNA son procesados constitutivamente para producir molculas de RNA no funcionales, y el transcrito dsx madura para producir una protena que inactiva los genes que especifican los rasgos de hembra. Una relacin entre cromosomas X y autosoma de 1 dispara la va de diferenciacin en el embrin al activar temporalm ente un promotor en el gen Sxl que controla la sntesis de una protena Sxl funcional. Sxl es una protena reguladora de la maduracin con dos lugares de accin: (1) se une a un transcrito Sxl producido constitutivamente, produciendo una maduracin especfica de hembra que contribuye a la produccin continua de una protena Sxl funcional, y (2) se une al RNA de ira que se produce constitutivamente, produciendo una maduracin alternativa del transcrito, de forma que se produce una protena reguladora Tra inactiva. La protena Tra acta como la protena constitutiva Tra-2 produciendo la forma de maduracin del RNA de dsx especfica de hembra; ste codifica una forma femenina de la protena Dsx, que inactiva especficamente los rasgos masculinos. Los com ponentes de esta va fueron identificados inicialm ente a travs del estudio de mutantes de D rosop h ila que tenan alterado su desarrollo sexual. El gen dsx obtuvo su nom bre (sexo doble o doublesex) de la observacin de que las moscas que carecen de este producto gnico expresan rasgos tanto masculinos como femeninos. Obsrvese que cuando tanto la protena Sxl como Tra se unen a los lugares especficos en el RNA, Sxl es un represor que acta negativamente bloqueando un corte, mientras que Tra acta positivamente como activador que induce un corte (vase Figura 9-74).

488

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

DNA 5'

el RNA se corta por el RNA se corta por aqu, dando lugar al aqu, dando lugar al transcrito largo transcrito corto punto de m aduracin 5' punto de m aduracin 3' (aceptor) \ (dador) | \\ | 1 1 TRANSCRIPCIN _______ ; i ______

3' 5'

TRANSCRITO LARGO DE RNA

codn de paro I codn de paro II

3'

TRANSCRITO CORTO DE RNA codn de paro I dador | lA A A A A A

dador Bt&rL>- - X , J

aceptor 1

lA A A A A A 3'

... _

secuencia intrnica elim inada por procesam iento del RNA mRNA
codn de paro II

no se elim ina la secuencia intrn porque se ha perdido la unin del aceptor de m aduracin m RNA
3'

]A A A A A A

dador 1 ;

lA A A A A A 3'

TRADUCCION ANTICUERPO UNIDO A MEMBRANA l-C O O H pptido term inal hidrofbico

TRADUCCIN ANTICUERPO SECRETADO [ } - COOH pptido hidroflico term inal

intrnicas eliminadas en el proceso de maduracin). Sin embargo, tener los ex tremos adecuados no es suficiente para el transporte: cada molcula de mRNA permanece confinada en el ncleo hasta que todos los componentes del espliceosoma se han separado de l (Figura 8-54). As pues, cualquier mecanismo que evite que se termine el proceso de maduracin del RNA puede, en principio, blo quear la salida de estos RNA del ncleo.

F ig u ra9-78 La regulacin del punto de segm entacin del RNA y la adicin de poli A determ inan si la molcula de anticuerpo ser secretada o perm anecer unida a la m em brana.

Algunos RNA estn localizados en regiones especficas del citoplasma59

Cuando una nueva molcula de mRNA eucariota pasa a travs de un poro nu clear y alcanza el citoplasma, se encuentra con ribosomas que lo traducen en una cadena polipeptdica. Si la cadena de mRNA codifica una protena que est destinada a la secrecin o a expresarse en la superficie celular, ser dirigida ha cia el retculo endoplasmtico (ER) por una secuencia seal situada en el extre mo amino de la protena; la secuencia seal ser reconocida por el mecanismo de clasificacin de protenas de la clula en cuanto sea sintetizada. Este m eca nismo direcciona todo el com plejo, mRNA, ribosom a y protena naciente, hacia la m em brana del ER, donde se sintetizar el resto de la cadena polipeptdica, com o se describe en el Captulo 12. En los dems casos la protena es sintetizada en ribosomas libres en el citoplasma, donde las seales presentes en la propia secuencia del polipptido la pueden dirigir hacia otros compartimientos del in terior de la clula. Adems existen otros casos en los que los mRNA son dirigidos hacia posicio nes intracelulares especficas por seales existentes en la propia secuencia de mRNA y antes de que sea traducida en una secuencia de aminocidos. Estas se-

En los linfocitos B no estimulados {izquierda) se produce un largo transcrito de RNA; la secuencia intrnica que se halla cerca de su extremo 3 es eliminada por maduracin del RNA dando lugar a una molcula de mRNA que codifica una molcula de anticuerpo que se unir a membrana. Por el contrario, despus de la estimulacin por el antgeno (derecha) el transcrito primario de RNA es cortado por delante del lugar de maduracin, junto a la secuencia del ltimo exn. Como resultado de ello, algunas secuencias del intrn que es eliminado del transcrito largo permanecen como secuencias codificantes en el transcrito corto. stas son las secuencias que codifican la porcin hidroflica del extremo carboxilo terminal de la molcula de anticuerpo secretada.

Controles post-transcripcionales

ales se localizan generalmente en la regin 3 no traducida (UTR) de la molcu la de mRNA -la regin comprendida entre el codn de paro de la traduccin y el punto de inicio de la cadena poli-A (vase Figura 9-78). Un ejemplo notable de ello se produce en el huevo de Drosophila, en el que el mRNA que codifica la protema gnica bicoide se une al citoesqueleto cortical del extremo anterior del huevo en desarrollo. Cuando se dispara la traduccin de este transcrito por la fe cundacin, se genera un gradiente de la protena bicoide que tendr un papel fundamental en el control del desarrollo de la parte anterior del embrin (mos trado en la Figura 9-39 y descrito con mayor detalle en el Captulo 21). Algunos mRNA de las clulas somticas se sitan de manera similar. Por ejemplo, en los fibroblastos de mamfero en cultivo, el mRNA que codifica actina se localiza en el crtex rico en filamentos de actina debido a una seal UTR 3 , posiblemente debido a que es ventajoso para la clula situar los mRNA prximos a los lugares en los que se van a necesitar las protenas que codifican. Esta forma de control gnico post-transcripcional, donde el mRNA se sita en una parte de la clula, se ha conocido recientem ente y an no est claro cuntos mRNA se sitan de este modo. En la Figura 9-79 se ilustra el papel de las UTR en el localizacin de los mRNA en regiones particulares del citoplasma.

La edicin del RNA puede cambiar el sentido del mensaje del RNA6 0
Los m ecanism os moleculares utilizados por las clulas han sido una continua fuente de sorpresas. Un ejemplo de ello es el fenmeno de m aduracin trans de RNA, que ocurre en todos los transcritos en tripanosomas (el protozoo parsito responsable de la enfermedad del sueo). Todos los mRNA de los tripanosomas poseen una secuencia lder 5 con caperuza que se transcribe aparte y que luego se aade al extremo 5 de los transcritos RNA mediante maduracin del RNA por corte y empalme de dos molculas inicialmente no relacionadas entre s. Esta maduracin trans tam bin se utiliza para aadir un lder 5 a varios mRNA de los nemtodos y para com binar los transcritos de RNA separados que forman la se cuencia codificante de algunas protenas de mitocondrias y cloroplastos en las clulas de las plantas. La maduracin por corte y empalme entre transcritos puede proporcionar un atajo para la evolucin de nuevas protenas; los pocos casos que se conocen de unin de exones de este modo pueden ser remanentes evolutivos de un proceso ms extenso que predomin en las clulas ancestrales.

regin reguladora de D rosophila

gen bacteriano para y j p 3 ' -galactosidasa a potnHiar (gen acZ)

SECUENCIA DE DNA RECOMBINANTE INSERTADA EN EL GENOMA DE DROSOPHILA transcrito de RNA sonda com plem entaria empleada para la hibridacin in situ

(A) tres posibles destinos para la localizacin de m RNA en las clulas epiteliales de un em brin tem prano de Drosophila

UTR 3' deslocalizada

UTR 3' basal

UTR 3' apical

(C)

Figura 9-79 Im portancia de la UTR en la localizacin de mRNA en regiones especficas del citoplasma. D rosop h ila puede ser transfectada con una molcula de DNA recom binante que codifica un mRNA en el que una secuencia marcadora bacteriana (codificando -galactosidasa) est unida a una secuencia UTR 3 escogida. De acuerdo con la eleccin de la UTR 3 , en las clulas embrionarias el mRNA puede estar deslocalizado, localizado en su regin basal o en su regin apical. (A) La molcula de DNA recom binante utilizada para analizar los efectos de los diferentes UTR 3 . (B) La hibridacin in situ (para las secuencias de -galactosidasa) muestra que la regin UTR 3 determina la localizacin del mRNA en la clula embrionaria. (C) Fotografa de un mRNA localizado apicalmente detectado por hibridacin in situ. Las clulas que contienen este mRNA estn organizadas en franjas a lo largo del eje del embrin (C, cortesa de David Ish-Horowitz).

490

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

Otro m ecanism o sorprendente es el proceso denominado edicin del RNA que altera enorm em ente los transcritos de RNA. En este proceso, descubierto en transcritos que codifican protenas en las mitocondrias de los tripanosomas, se insertan uno o ms U (o se eliminan, aunque con m enor frecuencia) en re giones seleccionadas del transcrito, provocando grandes modificaciones tanto en la pauta de lectura original como en la secuencia, con lo que cam bia el senti do del m ensaje. En el caso de algunos genes, la edicin es tan extensa que ms de la mitad de la secuencia son nucletidos U que se han insertado durante el proceso de edicin. La inform acin que especifica exactamente cm o se ha de editar el transcrito inicial de RNA est contenida en las molculas de RNA de 40 a 80 nucletidos de longitud que se transcriben por separado. Los denominados RNA gua tienen un extremo 5 que es complementario en secuencia a un extre mo de la regin del transcrito que se ha de editar; a continuacin existe una se cuencia que especifica el conjunto de nucletidos que se han de insertar en el transcrito y posteriormente una serie continua de nucletidos U. El m ecanism o de edicin es sorprendentem ente complejo, transfiriendo los nucletidos U del extremo 3 del RNA gua directam ente al transcrito, tal como se ilustra en la Fi gura 9-80. Tam bin se ha encontrado edicin extensa de secuencias de RNA en las m i tocondrias de muchas plantas, de modo que casi cada mRNA se edita de una forma u otra. Sin embargo, en este caso las bases se cambian de C a U en el RNA, sin inserciones ni deleciones de nucletidos. Frecuentem ente muchas de las C presentes en la molcula de mRNA estn afectadas por la edicin, cambindose el 10 % o ms de los aminocidos que codifica el mRNA. Slo podemos especular acerca de las razones que justifican que el tripanosoma o las mitocondrias de plantas hagan un uso tan extenso de la edicin del RNA. Las sugerencias que parecen ms razonables parten de la premisa de que el sistema gentico mitocondrial es primitivo. Existen evidencias de que la edi cin est regulada de forma que se produzcan diferentes mRNA en diferentes condiciones, de modo que la edicin del RNA debera entenderse como una for ma primitiva de cam biar la expresin de los genes. Los tripanosomas son euca-

RNA gua

C l cola poli-U

RNA gua 2 3' RNA gua 1

c
I l

Figura 9 -80 Edicin del RNA en la m itocondria de los tripanosom as. Los

transcrito de RNA
I I I I III I I

lugares con nucletidos U ausentes

I

APAREAMIENTO CON EL RNA GUA 1

nucletidos en el RNA gua especificando nucletidos U ausentes

I I I

I I I I II I

EDICIN SEGUIDA POR EL APAREAMIENTO AL RNA GUA 2

RNA gua tienen en su extremo 3 una serie de poly U, que ceden los nucletidos U a determinados lugares del transcrito de RNA que no se aparean con el RNA gua; as la cola poly-U se va acortando a medida que se va produciendo la edicin del RNA (no se muestra). La edicin se inicia generalmente cerca del extremo 3 y progresa hacia el extremo 5 del transcrito de RNA, como se muestra, debido a que la secuencia de anclaje en el extremo 5 de muchos RNA gua puede aparearse slo con las secuencias editadas.

C
I

3'
I I I II

EDICIN

nucletidos U insertados

m RNA com pletam ente editado

Controles post-transcripcionales

491

riotas unicelulares muy antiguos que se separaron muy pronto de la lnea evolu tiva que conduce a las plantas, a los animales y a las levaduras (vase Figura 116). Posiblemente, la versin extremada de la edicin del RNA que tiene lugar en sus mitocondrias es un rasgo de las clulas primitivas de las que procede, en las cuales es probable que la mayor parte de la catlisis fuera realizada por molcu las de RNA en vez de por protenas. La edicin del RNA, en una versin mucho ms reducida, tambin se produ ce en los mamferos. El primer caso descrito corresponde al gen de la apolipoprotena B, en el que el proceso de edicin del RNA crea dos tipos de transcritos: en uno de ellos el cam bio de C por U crea un codn de paro que produce una forma truncada de esta protena de gran tamao, y que se expresa de forma es pecfica de tejido. En otro caso un cambio en el centro de la molcula de mRNA cambia un solo aminocido en un canal inico del cerebro, alterando la permea bilidad del canal al Ca2+. En el caso de la apolipoprotena B la edicin se realiza de una forma muy directa: una protena se une a una secuencia especfica del mRNA y cataliza la desaminacin de C a U. Se desconoce si en los otros casos de edicin del RNA en mamferos y plantas este proceso est catalizado por prote nas en esta misma forma, o si se utilizan cortos moldes de RNA como en tripa nosomas. A continuacin describimos los controles que actan sobre la traduccin de los mRNA a protenas.

Las clulas eucariotas y procariotas utilizan estrategias diferentes para especificar el lugar de inicio de la traduccin en una molcula de mRNA6 1
En el mRNA de bacterias siempre se encuentra, unos cuantos nucletidos por delante del codn de inicio AUG, una secuencia de seis nucletidos muy conser vada, la secuencia Shine-Dalgarno. Esta secuencia se aparea con el RNA 16S de la subunidad ribosm ica pequea situando correctamente el codn de iniciacin AUG en el ribosoma. Esta interaccin es muy importante para una buena efi ciencia de iniciacin y aporta a la clula bacteriana un mecanismo sencillo para regular la sntesis de protenas. Muchos de los mecanismos de control traduccional en bacterias suponen el bloqueo de la secuencia Shine-Dalgarno, ya sea cubrindola con una protena unida o bien incorporndola en una regin de apareamiento de bases en la molcula de mRNA. Los mRNA de eucariotas no contienen secuencias Shine-Dalgarno. En su lu gar, la seleccin de un codn AUG como inicio de la traduccin viene determi nada fundamentalmente por la proximidad al extremo caperuza 5 de la m olcu la de mRNA, que es el lugar por el que la subunidad ribosmica pequea se une al mRNA e inicia la bsqueda de un codn de inicio AUG (descrito en el Captulo 6). Los nucletidos que rodean inmediatamente el lugar de inicio de la traduc cin tam bin influyen en la eficiencia con que ser reconocido el codn AUG durante el proceso de bsqueda. Si este lugar de reconocimiento es suficiente m ente dbil, las subunidades ribosmicas buscadoras ignorarn el primer co dn AUG y podrn escoger el segundo codn AUG en su lugar. Este fenmeno, denominado barrido impreciso (leaky scanning) es una estrategia empleada fre cuentem ente para producir dos o ms protenas a partir del mismo mRNA, que difieran en su extremo amino terminal. Por ejemplo, permite a algunos genes producir la misma protena con y sin pptido seal unido a su extremo amino, de forma que la misma protena se pueda dirigir a dos compartimientos celula res diferentes. Otra importante diferencia entre la traduccin procariota y eucariota es que los ribosomas eucariotas se disocian rpidamente del mRNA cuando termina la traduccin. As, la reiniciacin en un codn AUG interno de una pauta de lectu ra abierta es mucho m enos eficiente en eucariotas que en procariotas, juntando estas dos diferencias -la bsqueda que se realiza a partir del extremo 5 y la ca pacidad limitada que tienen de empezar la traduccin a partir de un codn AUG

492

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

m etionil-tR N A iniciador
n

mRNA

subunidad ribosmica 60S

1
elF-2 / activo \

SINTESIS PROTEICA

subunidad ribosm ica 40S

elF-2 inactivo

G D P

interno- se podra explicar por qu la inm ensa mayora de los mRNA eucariotas codifican una nica protena y por qu habitualmente el primer codn AUG desde el extremo 5 es el lugar de inicio de la traduccin. Unos cuantos mRNA eucariotas y vricos inician su traduccin mediante un mecanismo ligeramente diferente que supone la iniciacin en el interior ms que una bsqueda a partir del extremo. Estos mRNA contiene secuencias nucleotdicas complejas, denominadas lugares de entrada del ribosoma internos, donde se unen los ribosomas independientemente de la estructura caperuza 5, ini ciando la transcripcin en el primer codn AUG que encuentran. Los detalles de este m ecanismo son desconocidos.

Figura 9-81 El papel de eIF-2 en la iniciacin de la sntesis de protenas,

La fosforilacin de un factor de iniciacin regula la sntesis de protenas6 2

Las clulas eucariotas reducen su velocidad de sntesis de protenas en respuesta a una gran variedad de situaciones, que incluyen la carencia de factores de creci miento, la infeccin por virus, el choque trmico y la entrada en la fase M del ci clo celular. Se cree que la mayor parte de esta regulacin es responsabilidad del factor de iniciacin eIF-2, el cual es fosforilado por protena quinasas especfi cas, lo que reduce la velocidad de sntesis de protenas. En la Figura 9-81 se esquematiza la funcin normal de eIF-2. Esta protena forma un complejo con GTP e interviene en la unin del metionil-tRNA inicia dor a la subunidad ribosmica pequea, que a su vez se unir al extremo cape ruza 5 y comenzar el barrido a lo largo del mRNA. Cuando se reconoce el co dn AUG, el GTP unido se hidroliza a GDP por accin de la protena eIF-2, provocndose un cambio conformacional de sta y liberndose de la subunidad ribosm ica pequea. En ese momento se une una subunidad ribosmica grande formando un ribosoma completo capaz de iniciar la sntesis de protenas. Debido a que eIF-2 se une fuertemente a GDP, es necesaria la accin de una protena de liberacin del nucletido de guanina (vase Figura 15-50), denomina da eIF-2B, para liberar el GDP de forma que eIF-2 pueda unir una nueva molcula de GTP y ser reutilizada (Figura 9-82A). La reutilizacin del eIF-2 no es posible cuando est fosforilado, pues en ese caso la unin de eIF-2 y eIF-2B es especial mente fuerte, lo que impide que se realice el intercambio de nucletidos. En una clula existe mucha ms cantidad de eIF-2 que de eIF-2B, de forma que incluso una pequea fraccin de eIF-2 puede atrapar a casi todo el eIF-2B accesible, con lo cual se evitara la reutilizacin incluso del eIF-2 no fosforilado, lo que reduce en gran medida la sntesis de protenas (Figura 9-82B). Cuando se reduce la actividad de un factor general de traduccin, com o elF2, sera de esperar una reduccin de la traduccin de todos los mRNA por igual. Sin embargo, al contrario de lo esperado, la fosforilacin de eIF-2 tiene efectos

Controles post-transcripcionales

493

proteina liberadora de nucletido guanina, elF-2B elF-2 activo

O
elF-2B EN AUSENCIA DE elF-2B ACTIVO, eIF-2 EN EXCESO PERMANECE EN LA FORMA INACTIVA, UNIDA A GDP, Y LA SINTESIS DE PROTENAS SE REDUCE MARCADAMENTE

Figura 9-82 El ciclo de eIF-2. (A) El reciclaje del factor eIF-2 mediante una enzima liberadora del nucletido de guanina (eIF-2B). (B) La fosforilacin de eIF-2 controla la sntesis de protenas al secuestrar eIF-2B.

(B)

eIF-2

EL elF-2B, FORMANDO UN COMPLEJO INACTIVO

selectivos, y se observa incluso activacin de la traduccin de mRNA especficos. Por ejemplo, este m ecanism o permite a las levaduras adaptarse al ayuno de cier tos nutrientes, m ediante la reduccin de la sntesis de todas las protenas excep to de aquellas que se necesitan para la sntesis de los nutrientes ausentes. Los detalles de este proceso se han estudiado en un mRNA especfico de levaduras que codifica una protena denominada GCN4, protena reguladora necesaria para la activacin de muchos genes que codifican protenas importantes para la sntesis de aminocidos. La protena GCN4 se produce por una activacin espe cfica de la traduccin de su mRNA producida por una deficiencia de am inoci dos en el medio, inducida por la fosforilacin de eIF-2. La reduccin de la activi dad de eIF-2 produce un aumento de la sntesis de la protena GCN4 por un mecanism o com plejo basado en la com peticin entre lugares de inicio de tra duccin correctos e incorrectos cerca del extremo 5 del mRNA de GCN4. La regulacin del nivel de eIF-2 tam bin es importante para las clulas de mamfero como parte del mecanismo por el cual pueden ser inducidas a entrar en un estado estable no proliferativo (denominado G0) en el que la velocidad de sntesis de protenas de reduce a alrededor de una quinta parte de la velocidad habitual en las clulas proliferantes (descrito en el Captulo 17).

Las protenas que se unen a la regin 5 lder de los mRNA intervienen en el control traduccional negativo63
Algunas molculas de mRNA ven bloqueada su traduccin por protenas repre soras de la traduccin que se unen al extremo 5 del mRNA cerca del extremo, donde debera iniciarse la traduccin. Este tipo de mecanismo se denomina c o n tr o l tr a d u c c io n a l n e g a tiv o (Figura 9-83). Fue descubierto por vez primera en

Figura 9-83 Control traduccional negativo. Esta forma de control es ejercida por una protena de unin a una secuencia especfica de RNA que acta com o un represor de la traduccin. La unin de la proteina a una molcula de mRNA reduce la velocidad de traduccin de este mRNA. Se conocen algunos casos de este tipo de control traduccional; la ilustracin se refiere al mecanism o que induce la sntesis de ferritina (una protena de almacenamiento de hierro) cuando la concentracin de hierro libre en el citosol se reduce; la protena represora de la traduccin sensible a los niveles de hierro se denomina aconitasa (vase tambin Figura 9-86).

mRNA PARO ZZ3COOH ACTIVO

-1 -3 '

AUG H2N protena

PARO AUG -2 -3 ' no se sintetiza protena INACTIVO protena represora de la traduccin

494

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

LA ESTABILIDAD DE LOS m RNA NATURALES secuencia codificante 3' UTR ESTABLE 1 AAA 3 mRNA de (3 globina H AAA 3' mRNA de factor INESTABLE de crecim iento VIDA MEDIA > 10 horas 30 m inutos 1 hora cuando la clula est sintetizando DNA, pero 12 m inutos cuando la clula no sintetiza DNA

mRNA de histona

LA SNTESIS DEL DNA MODULA SU ESTABILIDAD

bacterias en las que permite a las protenas ribosmicas presentes en exceso re primir la traduccin de sus propios mRNA -constituyendo un mecanismo de re gulacin por retroalimentacin negativa. En las clulas eucariotas una forma de control negativo traduccional parti cularmente bie estudiada permite que la sntesis de la protena ferritina, de al m acenam iento de hierro, se ajuste rpidamente al nivel de iones de hierro solu bles. La regulacin por hierro depende de una secuencia de aproximadamente 30 nucletidos en la secuencia lder 5 de la molcula de mRNA de la ferritina. Este elemento de respuesta al hierro se pliega formando una estructura en forma de bucle que se une a una protena represora de la traduccin denominada aconitasa, que bloquea la traduccin de cualquier secuencia de RNA que se encuentre por detrs (vase Figura 9-83). La aconitasa es una protena que une hierro y la exposicin de la clula al hierro produce su disociacin del mRNA de la ferritina, liberando el bloqueo de la traduccin e incrementando la produccin de ferriti na hasta 100 veces.

Figura 9-84 Estabilidad del RNA. Tres RNA distintos con vidas medias muy diferentes. La degradacin continua y rpida de las molculas de mRNA que codifican varios factores de crecimiento permite que su concentracin vare con rapidez en respuesta a seales extracelulares. La vida media del RNA del factor de crecimiento viene determinada por una seal, que condiciona su rpida degradacin, en la regin 3 no traducida (UTR 3) (vase Figura 9-85). Las histonas son necesarias especialmente para construir la nueva cromatina formada durante la sntesis del DNA; un cambio notable en su estabilidad ayuda a confinar la sntesis de histonas a la fase S del ciclo celular.

La expresin gnica puede estar controlada por variaciones de la estabilidad del mRNA6 4
La mayora de los RNA de una clula bacteriana son muy inestables: tienen un perodo de vida media de aproximadamente 3 minutos. Debido a que los mRNA bacterianos se sintetizan y degradan con rapidez, las bacterias pueden adaptarse rpidamente a los cambios ambientales. Los mRNA de las clulas eucariotas son ms estables. Algunos, como los que codifican la p-globina, tienen un perodo de vida media de ms de 10 horas. Sin embargo, otros tienen un perodo de vida media de menos de 30 minutos. A m e nudo, los mRNA inestables codifican protenas reguladoras, tales como factores de crecim iento y protenas de regulacin gnica, cuyos niveles cam bian rpida m ente en las clulas (Figura 9-84). Muchos de estos mRNA son inestables debido a que contienen secuencias especficas que estimulan su degradacin. Por ejem plo, cuando mediante tcnicas de DNA recom binante se transfiere la secuencia larga rica en nucletidos A y U en la regin 3 no traducida (UTR) de algunos mRNA inestables, a otros mRNA estables, stos se vuelven inestables. Esta se cuencia rica en AU parece acelerar la degradacin del mRNA estimulando la eli m inacin de la cola poli-A que se encuentra en el extremo 3 de muchos mRNA eucariotas. Contrariamente, otros mRNA inestables contienen lugares de reco nocim iento para endonucleasas especficas que cortan el mRNA en sus regiones UTR 3 (Figura 9-85). La estabilidad de un mRNA puede cam biar en respuesta a seales extracelulares. As por ejemplo, las hormonas esteroideas afectan a una clula no slo in crementando la transcripcin de determinados genes sino tam bin increm en tando la estabilidad de varios de sus mRNA. Por el contrario, la adicin de iones hierro a las clulas reduce la estabilidad del mRNA que codifica la protena re ceptora que se une a la protena de unin al hierro transferrina, con lo que se re duce la produccin del receptor. Parece ser que la desestabilizacin del mRNA del receptor de transferrina est mediada por la misma protena de unin al

Controles post-transcripcionales

49

DOS MECANISMOS EUCARIOTAS PARA LA DEGRADACION DEL mRNA

secuencia codificante 3' UTR 1------ 1AAAAA 3' secuencia rica en AU

M A 3'

5' E

il 111 IKB ilW AAAAA 3' m .iiij::::::::;ia a a a a 3'

degradacin una secuencia de 50 nucletidos rica en AU y conservada evolutivam ente en la regin UTR 3' favorece la elim inacin de la cola poli-A, lo que hace que el mRNA sea inestable

degradacin una secuencia repetida en la secuencia UTR 3' perm ite el corte de la regin UTR 3' por una endonucleasa especfica. Los fragm entos son degradados con rapidez

Figura 9-85 Control de la degradacin del RNA. Determinadas secuencias especiales en la regin 3 no traducida (UTR) de los mRNA inestables son las responsables de su rpida degradacin. Como se ha indicado, las secuencias ricas en AU que se encuentran en las UTR 3 de muchos mRNA de vida corta son las responsables de la eliminacin rpida de la cola poli-A, lo que hace inestable al mRNA. Otros mRNA contienen secuencias en su UTR 3 que actan como lugares de corte para endonucleasas especficas.

RNA que controla la traduccin del mRNA de la ferritina. En este caso, la aconitasa se une a la UTR 3 del mRNA del receptor de transferrina provocando un in cremento en la produccin de receptor, probablemente al impedir la accin de secuencias que, de otra manera, activaran la degradacin del mRNA. Cuando se aade hierro la aconitasa es liberada del mRNA con lo que se reduce la estabili dad de ste (Figura 9-86).

La degradacin selectiva del mRNA est acoplada a la traduccin 6 5

El control de la estabilidad del mRNA en clulas eucariotas se comprende m ejor para el caso de los mRNA que codifican histonas. Estos mRNA tienen una vida media de aproximadamente 1 hora durante la fase S del ciclo celular (cuando se necesitan nuevas histonas) pero se degradan en cuestin de minutos cuando se detiene la sntesis de DNA. Si se inhibe la sntesis de DNA con una droga durante la fase S, los mRNA de las histonas se vuelven inestables inmediatamente, quizs porque la acumulacin de histonas libres en ausencia de DNA que unir aumenta la velocidad de su degradacin. La regulacin de la estabilidad de las histonas depende de un corto tallo y un bucle 3 que reemplaza la cola poli-A del extremo 3 de otros mRNA (vase Fi gura 9-84). Despus de que el mRNA de las histonas se haya sintetizado por la

CARENCIA DE HIERRO

aconitasa citoslica mRNA de ferritina

aconitasa citoslica mRNA del receptor \ de transferrina

AAA 3' | bloqueo de la traduccin NO SE SINTETIZA FERRITINA

AAA 3' | el mRNA es estable y se traduce

SE SINTETIZA RECEPTOR DE TRANSFERRINA

SE SINTETIZA FERRITINA (A)

496

NO SE SINTETIZA RECEPTOR DE TRANSFERRINA (B)

Figura 9-86 Dos controles posttraduccionales controlados por hierro. En respuesta a un incremento en la concentracin citoslica de hierro, una clula aumenta su sntesis de ferritina para unir el hierro extra (A) y reduce la sntesis de receptores de transferrina para reducir la importacin de hierro (B). Ambas respuestas estn mediadas por la misma protena reguladora de respuesta al hierro, la aconitasa, que reconoce rasgos comunes en las estructuras en tallo y bucle de los mRNA que codifican la ferritina y el receptor de transferrina. Cuando la aconitasa une hierro, se disocia del mRNA. Debido a que el receptor de transferrina y la ferritina estn reguladas por diferentes tipos de mecanismos, sus niveles responden de forma opuesta a las concentraciones de hierro, a pesar de estar regulados por la misma protena sensible al hierro. (Adaptado de M.W. Hentze et al., Science 238:1570-1573, 1987; J.L. Casey et al., Science, 240: 924-928, 1988.)

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

RNA polimerasa II, una reaccin de segmentacin especial, que requiere un apareamiento de bases con un pequeo RNA de una partcula ribonucleoproteica crea este extremo 3 . Si por mtodos de DNA recombinante se transfiere este extremo 3 a otros mRNA, tam bin se vuelven inestables cuando se para la snte sis de DNA. Por lo tanto, como ocurre en otros tipos de mRNA, la velocidad de degradacin est fuertemente influida por seales prximas al extremo 3 , don de se cree que empieza la degradacin del RNA. Si en medio de una secuencia codificante de un mRNA de una histona se in serta un codn de paro, el mRNA ya no se degrada rpidamente. Por lo tanto se ha sugerido que la nucleasa responsable de la degradacin de los mRNA se une al ribosoma y que la mayor parte del mRNA de la histona ha de ser traducido an tes de que la nucleasa pueda empezar a digerir el extremo 3 del mRNA. Esta h i ptesis podra explicar por qu la mayora de los mRNA inestables se estabilizan selectivamente cuando las clulas se tratan con el inhibidor de la sntesis protei ca cicloheximida. El acoplamiento de la degradacin del mRNA a la traduccin puede ser un m ecanismo para asegurar que las molculas de mRNA recin sin tetizadas en una clula eucariota no sean destruidas hasta que se hayan traduci do al m enos una vez.

El control citoplasmtico de la longitud de las cadenas de poli-A puede afectar tanto a la traduccin como a la estabilidad del mRNA6 6
La poliadenilacin inicial de una molcula de RNA (descrita en el Captulo 8) tiene lugar en el ncleo aparentemente de forma automtica para casi todos los precur sores de mRNA eucariotas (siendo una excepcin los mRNA de las histonas descri tos previamente). Una vez en el citoplasma, las colas poli-A de 200 nucletidos de longitud de muchos transcritos, son recortadas paulatinamente durante algunos das. No se han observado colas poli-A ms cortas de 30 residuos A, lo que sugiere que sta sera la longitud mnima necesaria para la estabilidad del mRNA. Asimis mo, la longitud de algunas colas poli A est controlada especficamente, bien por adicin selectiva de poli-A bien por eliminacin selectiva de poli A (Figura 9-87A). Oocitos y huevos en maduracin constituyen un ejemplo notable de control de la expresin gnica mediante adicin de poli A a mRNA especficos. En estas clulas gigantes parecen estar inactivas muchas de las vas de degradacin de mRNA, de forma que las clulas puedan fabricar grandes cantidades de mRNA como preparacin para la fertilizacin. Muchos de los mRNA se almacenan con

Figura 9-87 El control de la longitud de la cola poli-A afecta tanto a la estabilidad como a la traduccin del mRNA. (A) la mayora de los mRNA tiene colas poli-A que exceden la longitud mnima de 30 residuos A. Las colas de determinados mRNA pueden alargarse o cortarse especficamente en el citosol, lo cual influye en la traduccin de estos mRNA. (B) Se ha propuesto un modelo para explicar la estimulacin de la traduccin que se observa al incrementar la longitud de la cola poli-A. Las subunidades ribosmicas grandes pueden ser recicladas directamente, una vez han acabado la cadena proteica, desde cerca del extremo 3 de una molcula de mRNA al extremo 5 para iniciar de nuevo la sntesis de una molcula de protena, por protenas especiales de unin a la secuencia poli-A {rojo).

corte y adicin de la cola poli-A mRNA NCLEO CITOSOL | alargam iento de la cola poli-A

subunidad ribosm ica pequea en el codn de iniciacin

readicin de poli-A a determ inados mRNA

conjunto de mRNA traducibles

prdida gradual de poli-A de todos los mRNA

elim inacin rpida de poli-A de determ inados mRNA

subunidad ribosm ica grande LAS PROTENAS UNIDAS A LA COLA POLI-A CATALIZAN LA ENTRADA DE LA SUBUNIDAD RIBOSMICA GRANDE

| degradacin rpida de mRNA (A) (B)

3' inicio de la traduccin por el ribosom a com pleto

Controles post-transcripcionales

497

colas poli-A de slo 10 a 30 residuos A en sus extremos 3 y en esta forma no se traducen. En ciertos momentos del desarrollo, cuando son necesarios los pro ductos codificados por estos mensajeros, se les aade poli A al extremo 3 , lo que estimula notablem ente la iniciacin de su traduccin. En la Figura 9-87B se ex plica cm o la adicin de poli A al extremo 3 puede afectar al inicio de la traduc cin prximo al extremo 5 del mRNA.

Algunos mRNA contienen seales de reconocim iento que interrumpen el proceso norm al de la traduccin 6 7
Los controles traduccionales descritos hasta el momento afectan la velocidad con la cual se inician las nuevas cadenas de protena sobre una molcula de RNA. Normalmente, la traduccin, una vez se ha iniciado, llega automticamen te hasta el final, Sin embargo, existen casos especiales, en los que por un proceso denominado recodificacin traduccional se puede modificar la protena que fi nalm ente se produce. La forma de recodificacin observada con mayor frecuencia es la de cambio de pauta de lectura traduccional. Este tipo de recodificacin es muy frecuente en retrovirus, permitindoles sintetizar ms de una protena a partir de un mismo mRNA. Estos virus suelen producir tanto las protenas de la cpside (protenas Gag) como la transcriptasa inversa y la integrasa (protenas Pol) a partir del mis mo transcrito de mRNA. Los virus necesitan muchas ms copias de la protena Gag que de la protena Pol, y muchos de ellos consiguen ajustar sus produccio nes relativas teniendo los genes gag y pol en pautas de lectura diferentes, con un codn de paro al final de las secuencias codificantes de gag que puede ser elimi nado por un cam bio de pauta de lectura traduccional poco frecuente. El cambio de pauta de lectura ocurre exclusivamente en un codn particular y requiere una seal de recodificacin, que parece que es un rasgo estructural de la secuen cia de RNA siguiente a este lugar (Figura 9-88) Principios similares a ste se utilizan en algunas otras formas de recodifica cin en lugares especficos del mRNA. As pues, se han descrito seales de reco dificacin que provocan un cambio de pauta de lectura de +1 en lugar del -1 que acta en los RNA vricos y que se muestra en la Figura 9-88. En otras ocasiones la secuencia nucleotdica que rodea al codn de paro lo hace ser dbil, de forma que se aaden aminocidos adicionales al final de la cadena polipeptdica. Ms sorprendente an es el mecanism o descubierto recientemente que inserta el aminocido modificado selenocistena en una cadena proteica. La selenocistena, que es esencial para la funcin de algunas enzimas, contiene un tomo de selenio en lugar del tomo de azufre de la cisterna y se encuentra unida a una molcula de tRNA especial. El tRNA tiene afinidad hacia una seal de recodifica cin presente en las molculas de mRNA que codifican protenas que utilizan selenocistena. La selenocistena se incorpora en codones UGA especiales, que en muchos otros casos podran haber servido como codones de paro deteniendo la sntesis de protenas.

Figura 9-88 El cambio de pauta de lectura traduccional es necesario para producir la transcriptasa inversa y la integrasa de un retrovirus. La
transcriptasa inversa vrica y la integrasa se producen por el corte de la gran protena de fusin Gag-Pol, mientras que las protenas de la cpside del virus se producen a partir del corte de la protena Gag, ms abundante. Tanto la protena Gag como la protena de fusin se inician en el mismo punto, pero la protena Gag termina en un codn de paro de la misma pauta de lectura (no mostrado); el cambio de pauta de lectura indicado elimina este codn de paro, permitiendo la sntesis de la protena de fusin ms larga. El cambio de pauta de lectura ocurre debido a que ciertos rasgos de la estructura local del RNA (incluyendo un bucle de RNA que no se muestra) hacen que el tRNAL eu unido al extremo carboxilo del polipptido en crecim iento se deslice un nucletido hacia atrs sobre el ribosoma, de modo que ya no se aparea con el codn UUA que ha especificado su incorporacin, sino con el codn UUU; el siguiente codn en la nueva pauta de lectura (AGG) especifica una arginina en lugar de una glicina. La secuencia que se muestra procede del virus del SIDA, HIV. (Adaptado de T. Jacks et al., N ature 331:280-283, 1988.)

RNA vrico RNA de RNA Q bucle b

5 ' - | U U U U U A G G G h

|----------5 ' - - jU U U U U A G G 6

- 3'

H2N - -| phe | leu | gty j *- etc COOH

h 2n

HvN

cam bio de pauta i r TT* de lectura d e -1 phe leu ara etc. .. , a .la L.-----1 D-a M continuacin de incorporacin de leu protena de fusin Gag-Pol bCOOH

f.

proteina Gag

SIN CAMBIO DE PAUTA DE LECTURA (90% de los ribosom as)

CON CAMBIO DE PAUTA DE LECTURA (10% de los ribosom as)

498

Captulo 9 : El control de la expresin gnica

4
5'

cola

3
regin activa EL RNA I Y , EL RNA II FORMAN UNA HLICE PERFECTA
73' 5'

EL RI REGULA UNE AL
3'

RNA i

RNA II

form a activa de! RNA II

Figura 9-89 Estrategia del RNA antisentido para regular el nmero de plsmidos en una bacteria. La interaccin reguladora entre dos molculas de RNA mantiene constante el nmero de copias de plsmido en la familia ColEl de los plsmidos de DNA bacteriano. El RNA I (de aproximadamente 100 nucletidos de largo) es un RNA regulador que inhibe la actividad del RNA II (de aproximadamente 500 nucletidos de largo) en la iniciacin de la replicacin del DNA del plsmido. La concentracin del RNA I se incrementa en proporcin al nmero de molculas de DNA plasmdico en la clula, de modo que a medida que el nmero aumenta se inhibe su replicacin. El RNA I tiene una secuencia complementaria a la del extremo 5 del RNA II. En el RNA II, la secuencia 2 es complementaria tanto de la secuencia 1 como de la secuencia 3, y se desplaza de una a la otra mediante su unin al RNA I; por lo tanto el RNA I altera la conformacin de la secuencia 4 inactivando el RNA II. (Segn H. Masukata y J. Tomizawa, Cell 44:125136,1986.)

Es muy probable que las reacciones catalizadas por RNA tengan un origen muy antiguo 6 8
Todos los mecanismos de control post-transcripcional descritos en esta seccin dependen de que una determinada molcula de RNA sea reconocida especfica mente para un tratamiento especial, como la maduracin edicin o degrada cin. En algunos casos este reconocim iento est realizado por protenas espe cializadas de unin al RNA. Sin embargo, en otros casos, el reconocimiento de secuencias de RNA especficas es llevado a cabo por otras molculas de RNA que utilizan el apareamiento RNA-RNA como parte de su mecanismo de reconoci miento. Por ejemplo, se sabe que los apareamientos RNA-RNA juegan un papel importante en la traduccin, en la maduracin del RNA en otras formas de pro cesam iento del RNA y en la edicin del RNA que tiene lugar en tripanosomas. Intentando diseccionar los mecanismos de control post-transcripcional se ha entrado de lleno en el mundo del RNA. Las molculas de RNA tienen otros papeles reguladores en la clulas. La es trategia del RNA antisentido para la manipulacin experimental de clulas con siste en impedir que las clulas expresen un gen determinado (vase pg. 350) mimetizando un mecanismo normal del que se sabe que regula la expresin de algunos genes seleccionados en bacterias, y puede ser que la clula lo utilice ms ampliamente de lo que hasta ahora se haba credo. Un ejemplo bien conocido de este tipo de mecanism o es el que forma el control por retroalimentacin de la iniciacin de la replicacin del DNA de una gran familia de plsmidos de DNA bacterianos. Este control limita el nmero de copias de plsmido que una clula puede contener, evitando que el plsmido mate a la clula por un exceso de re plicacin (Figura 9-89). Los estudios de las reacciones catalizadas por el RNA son de un gran inters desde el punto de vista evolutivo. Tal como describimos en el Captulo 1, parece que las primeras clulas carecan de DNA y podran haber contenido pocas o ninguna protena. Muchas de las reacciones catalizadas por RNA parecen ser f siles moleculares -descendientes de la com pleja red de reacciones catalizadas por RNA que se cree dominaron el metabolismo hace 3,5 mil millones de aos. La tecnologa del DNA recom binante ha permitido que, utilizando RNA polimerasas, se puedan producir in vitro grandes cantidades de RNA puros de una se cuencia determinada cualquiera (vase Figura 7-36), haciendo posible estudiar la qumica detallada de las reacciones catalizadas por RNA. A partir de la com prensin de muchas de estas reacciones, los bilogos tienen la esperanza de ser capaces de trazar la va por la cual evolucion la primera clula viva.

Resumen
Muchos d e los pasos de la ruta qu e va desde el RNA hasta la protena estn regula dos p o r las clulas p ara controlar la expresin gnica. Se cree qu e la mayora d e los genes estn regulados en mltiples niveles, a u n qu e habitualm ente predom ina el

Controles post-transcripcionales

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control la iniciacin la transcripcin (control transcripcional). Sin embargo, algunos genes son transcritos a un nivel constante y activados y desactivados exclu sivam ente p o r mecanismos reguladores post-transcripcionales. Estos procesos in cluyen (1) la atenuacin del transcrito p o r su prem atura finalizacin, (2) seleccin alternativa del punto d e m aduracin, (3) control d e la form acin del extremo 3 p or ruptura y adicin d e poli-A, (4) control del transporte desde el ncleo al citoplasma, (5) localizacin d e mRNA en lugares particulares d e la clula, (6) edicin del RNA, (7) control d e la iniciacin d e la traduccin, (8) degradacin regulada del mRNA, y (9) recodificacin traduccional. La mayora d e estos procesos d e control requieren el reconocimiento secuencias especficas o estructuras que sean reguladas en la m olcula d e RNA. Este reconocimiento se p u ed e llevar a cabo ya sea p o r una pro tena reguladora o p o r una m olcula reguladora de RNA.

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Bibliografa

505

Organizacin interna de la clula

10 E stru ctu ra de la
m em b ran a : T ran sp orte de m olculas pequeas a travs de la m em b ran a y base inica de la excitabilidad de la m em b ran a 2 C om partim ientos intracelulares y clasificacin de protenas 13 Trfico vesicular m ediante las ru tas se creto ra y end octica 14 Conversin energtica: m itocondrias y cloroplastos 15 Transm isin de seales en tre clulas

16 El citoesqueleto
El ciclo de divisin celular

18 Los m ecan ism os de la

divisin celular

Electronmicrografa de vesculas sencillas y recubiertas de la cara interna de la membrana plasmtica de una clula heptica de ratn. Tambin se pueden observar numerosos filamentos de queratina. (De N. HirokawayJ. Heuser, Cell 30:395-406,1982.)

Simulacin por ordenador de una bicapa de fosfolpidos de 0,8 nm en el agua. Los tomos de fsforo se muestran en verde, los de nitrgeno en azul oscuro, los de oxgeno lipdico en rojo, los grupos terminales de las cadenas en magenta y otros tomos de carbono en gris; los tomos de hidrgeno del carbono se han omitido. Las molculas de agua se muestran en amarillo (oxgeno) y blanco (hidrgeno). (De R.M. Venable, Y. Zhang, B.J. Hardyy R.W. Pastor, Science262:223-228,1993.)

Estructura de la membrana

1 0
1.a bicapa lipidica
Protenas de membrana

Las membranas celulares son cruciales para la vida celular. La membrana plasm tica rodea a la clula, definiendo su extensin y manteniendo las diferencias esen ciales entre el contenido de la clula y su entorno. Dentro de la clula eucariota, las membranas del retculo endoplsmico, del complejo de Golgi, de las mitocondrias y de otros orgnulos delimitados por membrana mantienen las diferencias carac tersticas entre los contenidos de cada orgnulo y el citosol. Los gradientes inicos que se establecen a travs de las membranas, generados por la actividad de prote nas de membrana especializadas, pueden ser usados para sintetizar ATP, dirigir el movimiento transmembranoso de solutos seleccionados o, en clulas nerviosas y musculares, para producir y transmitir seales elctricas. En todas las clulas, la membrana plasmtica contiene tambin protenas que actan como sensores de seales externas, permitiendo que la clula cambie en respuesta a indicaciones ambientales; estas protenas sensoras, o receptores, transfieren informacin, en lu gar de iones o de molculas, a travs de la membrana. Aunque realicen diferentes funciones, todas las membranas biolgicas tie nen una estructura bsica comn: una finsima capa de molculas lipdicas y proteicas, que se mantienen unidas fundamentalmente por interacciones no covalentes. Las membranas celulares son estructuras dinmicas, fluidas y la mayo ra de sus molculas son capaces de desplazarse en el plano de la membrana.

Figura 10-1 Tres visiones de una membrana celular. (A) Electronmicrografa de una membrana plasmtica (de un eritrocito humano) en seccin transversal. (B y C) Dibujos esquemticos que muestran en dos y tres dimensiones la membrana celular. (A, por cortesa de Daniel S. Friend.)

5 nm bicapa lipidica

(A)

molcula de proteina

(B)

molcula de lpido

molcula de protena
(C)

509

Las molculas lipdicas estn dispuestas en forma de una doble capa continua de unos 5 nm de grosor (Figura 10-1). Esta bicapa lipdica constituye la estructu ra bsica de la m em brana y acta de barrera relativamente impermeable al paso de la mayora de molculas hidrosolubles. Las molculas proteicas, que normal m ente se hallan "disueltas en la bicapa lipdica, median la mayora del resto de funciones de la membrana, por ejemplo transportando molculas especficas a travs de ella o catalizando reacciones asociadas a la membrana, como la snte sis de ATP. Algunas protenas de mem brana actan de eslabones estructurales que relacionan la m em brana plasmtica con el citoesqueleto y/o con la matriz extracelular de las clulas adyacentes, mientras que otras protenas actan como receptores que reciben y transducen las seales qumicas procedentes del entorno celular. Como podra esperarse, las membranas son estructuras asim tricas: la com posicin lipdica y proteica de sus caras interna y externa es dife rente reflejando las diferentes funciones realizadas por ambas superficies. En este captulo consideraremos la estructura y la organizacin de los dos constituyentes principales de las m embranas biolgicas -lo s lpidos y las prote nas. Si bien prestaremos especial atencin a la membrana plasmtica, muchos de los conceptos son aplicables a las membranas internas. Las funciones de las membranas celulares se considerarn posteriormente. Su papel en la sntesis del ATP ser discutido en el Captulo 14; su papel en el transporte transmembranoso de pequeas molculas, en el Captulo 11 y su papel en la transmisin celular de seales y en la adhesin celular, en los Captulos 15 y 19. En los Captulos 12 y 13 se discutirn las caractersticas de las m embranas internas de la clula (endomembranas) y el trfico de protenas a travs y entre ellas.

La bicapa lipdica1
La bicapa lipdica ha sido establecida como la base universal de la estructura de la membrana celular. Es fcil de observar en una electronmicrografa convencio nal, aunque son necesarias tcnicas especializadas, como difraccin de rayos X y tcnicas de criofractura, para revelar los detalles de su organizacin. La estructura en bicapa puede atribuirse a las propiedades especiales de las molculas lipdicas, que hacen que dichas molculas se ensamblen espontneamente formando bicapas, incluso en sencillas condiciones artificiales.

Los lpidos de las membranas son molculas antipticas que espontneamente forman bicapas1
Las molculas lipdicas son insolubles en agua pero se disuelven fcilmente en disolventes orgnicos. Constituyen aproximadamente un 50 % de la masa de la mayora de las membranas plasmticas de las clulas animales, siendo casi todo el resto protenas. Existen unas 5 x 106 molculas lipdicas en una seccin de bi capa lipdica de 1 |a.m x 1 |im, o aproximadamente 109 molculas lipdicas en la m em brana plasmtica de una clula animal pequea. Todas las molculas lipdi cas en las membranas celulares son anfipticas (o anfiflicas) -e s decir, tienen un extremo hidroflico ("que se siente atrado por el agua o polar) y un extremo hidrofbico (que rehuye el agua o no polar). Las ms abundantes de estas mol culas son los fosfolpidos. Los fosfolpidos tienen una cabeza polar y dos colas hidrocarbonadas hidrofbicas (Figura 10-2). Las colas suelen ser cidos grasos, y pueden tener diferente longitud (normalmente contienen de 14 a 24 tomos de carbono). Normalmente una de las colas presenta uno o ms dobles enlaces cis (es decir, es insaturada) mientras que la otra normalmente no tiene dobles enla ces (es decir, es saturada). Como se muestra en la Figura 10-2, cada doble enlace cis genera una suave curvatura en la cadena. Las diferencias de longitud y de gra do de saturacin entre las colas hidrocarbonadas son importantes porque afec tan la capacidad de las molculas de fosfolpidos para empaquetarse una contra otra y, por lo tanto, afectan la fluidez de la membrana (vase ms adelante).

510

Captulo 10: Estructura de la membrana

C O L IN A

grupo polar (hidroflico) de la cabeza

I
FO SFATO

I
GU C ERO L

. 1 0 1 O P O [ 0 1 -C H C H , I
c

I I ' CH, I CH, I

CH, CH, CH,

C=

CH2

I I ' CH, I CH, I "

CH, CH, CH, CH,

grupo no polar (hidrofbico) de la cola

I I ' CH, I
CH, CH, CH,

I I " CH, I "

CH CH

doble enlace

cis

CH,

CH, CH,

I I '

CH, \ CH ,

\ ' CH,
\

CH,

I CH, I " CH, I CH, I

CH,

\ CH, \ CH, \ CH,

\ CH,

(A )

(B)

(C)

Figura 10-2 Las zonas de una molcula de fosfolpido. La fosfatidilcolina, representada de forma esquemtica (A), como frmula qumica (B), como modelo espacial compacto (C) y en forma de smbolo (D). La curvatura debida al doble enlace cis est exagerada en los dibujos para hacerla ms visible.

La forma y la naturaleza anfiptica de las molculas lipdicas es lo que deter mina que estas molculas formen espontneamente bicapas lipdicas en solu cin acuosa. Cuando las molculas anfipticas se encuentran rodeadas por to das partes por un ambiente acuoso, tienden a agregarse de tal manera que sus colas hidrofbicas se esconden en el interior y sus cabezas hidroflicas quedan expuestas al agua. Dependiendo de su forma, pueden conseguir esta disposi cin, de una de dos maneras: pueden formar micelas esfricas, con las colas ha cia el interior, o pueden formar lminas bimoleculares, o bicapas, con las colas hidrofbicas escondidas entre dos capas de cabezas hidroflicas (Figura 10-3). Debido a su forma cilindrica, la mayora de los fosfolpidos de membrana for man espontneamente bicapas en un entorno acuoso. Adems, estas bicapas lip dicas tienden a cerrarse sobre s mismas formando compartimientos hermticos, eliminando as los bordes libres en los que las colas hidrofbicas podran estar en contacto con el agua. Por esta misma razn, los compartimientos formados por bi capas lipdicas tienden a cerrarse de nuevo despus de haber sido rotos. Adems de sus propiedades de autoensamblaje y de autosellado, una bicapa lipdica tiene otras caractersticas que hacen de ella una estructura ideal para constituir las membranas celulares. Una de las ms importantes es su fluidez, que, como veremos, es crucial para muchas de sus funciones.

micela lipdica

agua

i
bicapa lipdica

La bicapa lipdica es un fluido tridimensional2

Sorprendentemente, no fue hasta principios de los aos 1970 que los investigadores reconocieron por primera vez que las distintas molculas lipdicas pueden difundir libremente dentro de las bicapas lipdicas. La demostracin inicial procede de unos estudios sobre bicapas lipdicas sintticas. Dos tipos de estas bicapas sintticas han

Figura 10-3 Micela de lpidos y bicapa lipdica vistas en seccin transversal. Las molculas de lpido forman, espontneamente, estructuras como stas en el agua. La forma de la molcula lipdica determina cul de estas estructuras se forma. Las molculas lipdicas en forma de cua {arriba) forman micelas, mientras que las molculas de fosfolpidos de forma cilindrica {abajo) forman bicapas.

La bicapa lipdica

511

resultado muy tiles en los estudios experimentales: ( 1) bicapas producidas en for ma de vesculas esfricas, denominadas liposomas, cuyo tamao puede variar de 25 nm a 1 [im de dimetro segn cual sea el sistema de preparacin (Figura 10-4), y (2) bicapas planas, denominadas membranas negras, formadas a travs de un agujero situado en una separacin entre dos compartimientos acuosos (Figura 10-5). Se han utilizado diversas tcnicas para medir el desplazamiento de las mol culas lipdicas y de sus diferentes regiones. Por ejemplo, se puede construir una molcula lipdica cuyo grupo de cabeza polar lleve una marca de espn, tal como un grupo nitroxilo (>N -0), que contiene un electrn desapareado cuyo es pn genera una seal paramagntica que se puede medir mediante espectrosco pia de resonancia de espn electrnico (ESR, de Electron Spin Resonance). (Los principios de esta tcnica son similares a los de la resonancia magntica nuclear, que se discuten en el Captulo 4). Mediante el espectro ESR se puede medir el movimiento y la orientacin de un lpido marcado dentro de una bicapa. Estos estudios demuestran que las molculas de fosfolpido de las bicapas artificiales raramente migran de un lado a otro de la monocapa. Este proceso, denominado flip-flop, se produce menos de una vez al mes en cualquier molcula lipdica. Por otro lado, las molculas lipdicas intercambian fcilmente su lugar con el de las molculas vecinas dentro de una m onocapa (~107 veces por segundo). Ello da lugar a una rpida difusin lateral, con un coeficiente de difusin (D) de aproxi madamente lO-8 cm 2/segundo, lo cual significa que una molcula lipdica pro medio difunde la longitud de una gran clula bacteriana (~2 |m) en aproxima damente 1 segundo. Adems, estos estudios indican que las molculas lipdicas giran con gran rapidez alrededor de sus ejes longitudinales y que sus cadenas hidrocarbonadas son flexibles (Figura 10-6). Unos estudios similares han sido realizados con molculas lipdicas m arca das, en m embranas biolgicas aisladas y en clulas enteras relativamente senci llas com o micoplasmas, bacterias y glbulos rojos (eritrocitos) anucleados. En general, los resultados de estos estudios son los mismos que los que se obtienen con bicapas artificiales, y demuestran que el componente lipdico de las m em branas biolgicas es un lquido bidimensional en el que las molculas constitu yentes son libres de moverse lateralmente; al igual que en las bicapas sintticas, las molculas de fosfolpido se hallan restringidas a su propia monocapa. Este confinam iento crea un problema para su sntesis. Los fosfolpidos son sintetiza dos slo en una de las monocapas de la membrana, la cual se sintetiza principal mente en la m onocapa citoslica de la membrana del retculo endoplasmtico (ER, de Endoplasmic Reticulum); si ninguna de estas molculas recientemente formadas pudiera migrar hacia la otra mitad de la bicapa lipdica, no se podra formar ms bicapa. Este problema se soluciona gracias a un tipo especial de en zimas unidas al ER llamadas translocadoras de fosfolpidos, que catalizan un r pido flip-flop de fosfolpidos especficos desde la monocapa donde han sido sin tetizados hasta la m onocapa opuesta, como se discute en el Captulo 12.

(A i

100 nm

25 nm
Figura 10-4 Liposomas.
(A) E lectronm icrografa de vesculas de fosfolpidos (liposom as) en agua, sin fijar ni teir. N tese que la estructura bilam in ar de las vesculas es claram en te aparen te. (B) D ibujo de un pequeo liposom a esfrico visto en secci n transversal. N orm alm ente los liposom as se utilizan com o m odelo de m em bran a en estudios experim entales. (A, por cortesa de Jean Lepault.)

difusin lateral

flip-flop (rara vez ocurre)

O
bicapa lipdica (membrana negra)
Figura 10-5 Representacin en seccin transversal de una bicapa lipdica sinttica, denom inada m em brana negra. E sta b icap a planar se form a a
travs de un pequ e o agujero en u n a pared que separa dos com p artim iento s acu osos. Las m em branas negras se utilizan para m edir las propiedades de p erm eabilid ad de las m em bran as artificiales.

flexin

rotacin

Figura 10-6 Movilidad de los fosfolpidos. Los tipos de m ovim ientos

p osibles de las m olcu las de fosfolpido en un a b icap a lipdica.

512

Captulo 10: Estructura dla membrana

La uidez de una bicapa lipdica depende de su composicin3

La fluidez de las m embranas celulares es biolgicamente importante. Algunos procesos de transporte y algunas actividades enzimticas, por ejemplo, pueden detenerse cuando la viscosidad de la bicapa se incrementa experimentalmente mas all de un nivel umbral. La fluidez de una bicapa lipdica depende tanto de su com posicin como de la temperatura, como ha sido demostrado por estudios en bicapas sintticas. Una bicapa sinttica, producida a partir de un nico tipo de fosfolpido, pasa de un estado lquido a un estado cristalino rgido (o gel) en un punto de congelacin caracterstico. Este cambio de estado recibe el nombre de transicin de fase, y la temperatura a la que se produce es ms baja (es decir, la mem brana resulta ms difcil de congelar) si las cadenas hidrocarbonadas son cortas o tienen dobles enlaces cis. Una menor longitud de la cadena reduce la tendencia de las colas hidrocarbonadas a interaccionar entre s, y los dobles en laces cis producen pliegues en las cadenas hidrocarbonadas que dificultan su empaquetamiento, de forma que las membranas permanecen fluidas a tem pe raturas ms bajas (Figura 10-7). Bacterias, levaduras y otros organismos cuyas temperaturas varan con la de su entorno, controlan la composicin de los ci dos grasos de sus lpidos de mem brana para mantener una fluidez relativamente constante; en caso de que la temperatura disminuya se sintetizan cidos grasos con ms dobles enlaces cis, de manera que evitan una prdida de fluidez de la bicapa por efecto de la disminucin de la temperatura. Sin embargo, la bicapa lipdica de muchas membranas celulares no est compuesta exclusivamente por fosfolpidos; habitualmente contienen adems, colesterol y glucolpidos. Las membranas plasmticas de eucariotas contienen cantidades especialmente elevadas de colesterol (Figura 10-8) -h asta una pro porcin de ms de una molcula de colesterol por cada molcula de fosfolpido. Las molculas de colesterol refuerzan el carcter de barrera permeable de la b i capa lipdica. Se orientan en la bicapa con sus grupos hidroxilo prximos a las cabezas polares de las molculas de fosfolpidos; sus anillos esteroides, planos y rgidos, interactan con -y en parte inmovilizan- las regiones de las cadenas hi drocarbonadas que son ms cercanas a los grupos polares de la cabeza, dejando el resto de la cadena ms flexible (Figura 10-9). Al disminuir la movilidad de los primeros grupos CH2 de las cadenas hidrocarbonadas de las molculas de fosfo lpidos, el colesterol hace a la bicapa lipdica ms rgida en esta regin y de ese modo disminuye la permeabilidad de la bicapa a molculas solubles pequeas. Aunque de esta manera el colesterol tiende a hacer menos fluidas las bicapas lipdicas, a las altas concentraciones en que se presenta en la mayora de las membranas plasmticas de eucariotas tam bin impide que las cadenas hidro carbonadas se junten y cristalicen. De esta manera, el colesterol inhibe posibles transiciones de fase.

cadenas hidrocarbonadas insaturadas con dobles enlaces cis

cadenas hidrocarbonadas saturadas rectas

Figura 10-7 Influencia de los dobles enlaces cis en las cadenas hidrocarbonadas. La presencia de

dobles enlaces hace ms difcil el empaquetamiento de las cadenas, lo cual hace que la bicapa lipdica sea ms difcil de congelar.

Figura 10-8 Estructura del colesterol.

La molcula de colesterol, representada mediante su frmula (A), mediante un esquema (B) y mediante un modelo espacial compacto (C).

(A)

La bicapa lipdica

En la Tabla 10-1 se compara la composicin lipdica de distintas membranas biolgicas. Obsrvese que a menudo las membranas plasmticas bacterianas es tn com puestas principalmente por un nico tipo de fosfolpido y no contienen colesterol; la estabilidad m ecnica de estas membranas est asegurada por la pared celular que las recubre (vase Figura 11-14). Contrariamente, la com posi cin de la membrana celular de la mayora de las clulas eucariotas es ms va riada, conteniendo no slo grandes cantidades de colesterol, sino tambin una mezcla de diferentes fosfolpidos. Cuatro grupos de fosfolpidos predominan en la membrana plasmtica de muchas clulas de mamferos: fosfatidilcolina, esfingomielina, fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina. Las estructuras de estas molculas se muestran en la Figura 10-10. Ntese que tan slo la fosfatidilserina tiene una carga neta negativa, cuya importancia trataremos posteriormente; las otras tres molculas son elctricam ente neutras a pH fisiolgico, presentando una carga negativa y otra positiva. En conjunto, estos cuatro fosfolpidos consti tuyen ms de la mitad de la masa de lpidos de la mayora de las membranas (vase Tabla 10-1). Otros fosfolpidos, tales como los fosfolpidos de inositol, son funcionalm ente importantes pero se hallan en cantidades relativamente peque as. En el Captulo 15 se describe el papel crucial que desempean los fosfolpi dos de inositol en las sealizacin celular. Cabe preguntarse por qu la membrana plasmtica eucariota contiene tal variedad de fosfolpidos, con grupos de cabeza que difieren en tamao, forma y carga. Podemos empezar a comprender este porqu si pensamos en los lpidos de la m em brana como en un disolvente bidimensional de las protenas de la membrana, al igual que el agua constituye un disolvente tridimensional para las protenas en una solucin acuosa. Como veremos, ciertas protenas de m embra na nicam ente puedan actuar en presencia de grupos de cabeza de determina dos fosfolpidos, de la misma forma que muchas enzimas en solucin acuosa re quieren un ion determinado para presentar actividad.

ifii w

grupos polares de cabeza regin endurecida por el colesterol region ms fluida

Figura 10-9 El colesterol en una bicapa lipdica. Dibujo esquemtico de una molcula de colesterol interactuando con dos molculas de fosfolpido en una de las lminas de una bicapa lipdica.

La bicapa lipdica es asimtrica4

En las m embranas plasmticas que han sido analizadas, la composicin lipdica de las dos mitades de la bicapa lipdica es m arcadamente diferente. En la m em brana del glbulo rojo humano, la mayora de las molculas lipdicas que tienen colina -(C H 3)3N+ CH2 CH2 OH- en su grupo de cabeza (que es, fosfatidilcolina y es-

Tabla 10-1 Composicin lipdica aproximada de diferentes membranas celulares Porcentaje de lpido total en peso v c d iS a cd cd , 6 0 ) S'
23 18 7 17 18 3 13

'Cd

S c n JO "E, 3 G rt cd Lpido
Colesterol Fosfatid il etan olam in a Fosfatidilserina Fosfatidilcolina Esfingom ielina Glucolipidos Otros

03 03 TD G 03 , o3

X < D 2 X
nj
17 7 4 24 19 7

O O + 5 < U2 X '*5 s "

3 'S. o o

o 'c3 S C / 3 OC O

3 < u -a c a >

22
15 9

3 35

6
17 5 40 5 trazas 27

0
70 trazas

10 8 8

39

22

28

trazas

21

0 0 0

30

514

Captulo 10 : Estructura de la membrana

Ci) \ H $

,o

KH;

CH CH ^ l -CH
(C-> i

CH3 L H ^ 1^ C H
q

CH_; I CH;
O 0 = P O O O
c h

H C. C..O o ; l CHj
O

CHj ch2
O = p O O O
1

CH 2 CH;

Figura 10-10 Cuatro de los principales fosfolpidos de las m em branas plasm ticas de las clulas de m am fero. Obsrvese que

0= o
c h

o, O O

'~ 'i

o=
OH

2 C H C H 2

2 C H C H 2

c h

2 -C H

c h

C H -- C H | CH

tanto en esta figura como en las siguientes, los diferentes grupos de la cabeza se representan mediante smbolos diferentes. Todas las molculas lipdicas que se presentan derivan del glicerol excepto la esfingomielina que deriva de la serina.

o O c= o c = o
o co < oc O O o o < tu Q < O O co < cc

O O c = o c= o
o (O < C C O o Q O < L U Q < O O co < cc o O Q O < U J O < O O

O O c= o C==o
cc o
o co < < oc C D o O O -< U J Q < O o

NH

CH

I 1

O
o

O co
m
w < o Q Q. < UJ < O

O co
O
O Q U < U J o < O u < ir

O Q O '< 1 X 1 O < O o

O Q O < U J Q < O o

fosfatidiletanolam ina

fosfatidilserina

fosfatidilcolina

esfingom ielina

fingomielina) se encuentran en la mitad exterior de la bicapa lipidica, mientras que la mayora de molculas de fosfolpido que contienen un grupo cimino pri mario terminal (fosfatidiletanolamina y fosfatidilserina) se hallan en la mitad in terior (Figura 10-11). Dado que la fosfatidilserina, de carga negativa, est locali zada en la m onocapa interior, existe una importante diferencia de carga entre las dos monocapas. La mayora de las membranas de una clula eucariota, incluyendo la m em brana plasmtica, se sintetizan en el retculo endoplasmtico (ER) y es all donde se genera la asimetra de los fosfolpidos por translocadores que trasladan especificamente molculas de fosfolpidos de una monocapa a otra (se discute en el Captulo 12). Esta asimetra lipidica puede ser funcionalmente importante. La enzima proteina quinasa C, por ejemplo, se activa en respuesta a variadas sea les extracelulares; se une a la cara citoplasmtica de la membrana, donde se ha lla concentrada la fosfatidilserina, y requiere este fosfolpido cargado negativa mente para actuar. De modo similar los fosfolpidos de inositol se concentran en la cara citoplasmtica de la mem brana plasmtica de la clula eucariota. Estos fosfolpidos minoritarios son escindidos en dos fragmentos por enzimas espec ficas que son activadas por seales extracelulares. Ambos fragmentos actan luego dentro de la clula como mensajeros solubles que permiten la difusin de la seal hacia el interior de la clula, como se discutir en el Captulo 15.

ESPACIO EXTRACELULAR

Figura 10-11 La distribucin asim trica de los fosfolpidos y de los glucolpidos en la bicapa lipdica de los glbulos rojos hum anos. Los

T rT tT H H tT
CITOSOL
La bicapa lipdica

smbolos utilizados para los fosfolpidos son los introducidos en la Figura 10-10. Adems, los glucolpidos se han dibujado con grupos de cabeza polar de forma hexagonal (azul). Se cree que el colesterol (no dibujado) se distribuye casi a partes iguales en ambas monocapas.

En la superfcie de todas las m em brana plasmticas hay glucolpidos 5

Las molculas lipdicas que presentan una asimetra ms marcada en cuanto a su distribucin en las mem branas celulares son las molculas lipdicas que contienen azcares denominadas g lu co lp id o s. Estas asombrosas molculas se encuentran exclusivamente en la mitad no citoplasmtica de la bicapa lipidica, donde al parecer se autoasocian formando microagregados mediante la form a cin de enlaces de hidrgeno entre ellas. En la m em brana plasmtica sus gru pos azcar quedan al descubierto en la superficie de la clula (Figura 10-11), lo cual sugiere que deben desempear alguna funcin en las interacciones de la clula con su entorno. La distribucin asim trica de los glucolpidos en la bica pa resulta de la adicin de grupos azcar a las molculas lipdicas en el lumen del com plejo de Golgi, el cual es topogrficamente equivalente al exterior de la clula (se discute en el Captulo 13). Los glucolpidos se presentan probablemente en las membranas plasmti cas de todas las clulas animales, constituyendo aproximadamente un 5% de las molculas lipdicas de la m onocapa exterior. Adems se encuentran en algunas membranas intracelulares. Los glucolpidos ms complejos, los g an g li sid o s, contienen oligosacridos con uno o ms residuos de cido silico, lo que les pro porciona una carga neta negativa (Figura 10-12). Los ganglisidos son ms abundantes en la mem brana plasmtica de las clulas nerviosas, en donde cons tituyen aproximadamente un 5-10% de la masa lipidica total, aunque tambin se encuentran en casi todos los tipos celulares en cantidades mucho ms reduci das. Hasta el momento se han identificado ms de 40 ganglisidos diferentes. Por ahora no se dispone ms que de indicios acerca de cules podran ser las funciones de los glucolpidos. Una posible pista procede de su localizacin: en la m embrana plasmtica de las clulas epiteliales, por ejemplo, los glucolpidos se encuentran confinados en la superficie apical, donde podran ayudar a proteger la m em brana de las condiciones adversas que frecuentemente existen all (como pH bajo y enzimas degradativas). Los glucolpidos con carga, como los ganglisi dos, pueden tener im portancia debido a sus efectos elctricos: su presencia alte rara el campo elctrico a travs de la membrana y la concentracin de iones -especialm ente Ca2+ - en su superficie externa. Los glucolpidos pueden tambin

Gal JkalNAcj

|n A N A )-I Gal J

[O le ]

OH

CH C H C H 2 CH CH NH C O

I I

(A) galactocerebrsido

(B) ganglisido G mi

(C) cido silico (NANA)

Figura 10-12 M olculas de glucolpidos. Los galactocerebrsidos (A) son llamados g lu colp id os neutros porque el azcar que forma su grupo de cabeza no est cargado. Un ganglisido (B) siempre contiene uno o ms residuos de cido silico (tambin llamado cido iV-acetil neuramnico o NANA) cargados negativamente, cuya estructura se muestra en (C). Mientras que en bacterias y en plantas casi todos los glucolpidos derivan del glicerol, como la mayora de fosfolpidos, en las clulas animales casi siempre se generan a partir de esfingosina, un alcohol amino derivado de la serina, com o en el caso del fosfolpido esfingomielina (vase Figura 10-10). Gal = galactosa; Glc = glucosa, GalNAc = Af-acetil galactosamina; estos tres azcares no estn cargados.

516

Captulo 10 : Estructura de la membrana

desempear un papel en el aislamiento elctrico, ya que se hallan en gran canti dad en la mitad no citoplasmtica de la bicapa de la membrana mielnica, que asla elctricamente los axones de la clula nerviosa. Adems se cree que desem pean alguna funcin en los procesos de reconocimiento celular. El ganglisido GM 1 (vase Figura 10-12), por ejemplo, acta como receptor de superficie celular para la toxina bacteriana que provoca la diarrea debilitante del clera. La toxina del clera nicamente se fija y penetra en aquellas clulas que tienen G M 1 en su superficie, incluidas las clulas del epitelio intestinal. Su ingreso en la clula pro voca un incremento prolongado de la concentracin intracelular de AMP cclico (se discute en el Captulo 15), la cual genera, en el intestino, un gran eflujo de Na+ y de agua. Aunque la fijacin de las toxinas bacterianas no puede ser la funcin normal de los ganglisidos, estas observaciones sugieren que estos glucolpidos tambin pueden actuar como receptores de molculas extracelulares habituales. Esta suposicin se apoya en la evidencia creciente de que los glucolpidos pue den ayudar a las clulas a unirse a la matriz extracelular y a otras clulas, como discutiremos ms adelante.

Resumen
Las membranas biolgicas estn formadas por una doble capa continua de mol culas lipidicas, en la que estn inmersas varias protenas de membrana. Esta bica pa lipdica es fluida, y las distintas molculas lipidicas pueden difundir rpida mente dentro de su propia monocapa. La mayora de las molculas lipidicas, sin embargo, casi nunca realizan deform a espontnea flip-flop de una monocapa a la otra. Las molculas lipidicas de las membranas son anfipticas y algunas de ellas (losfosfolpidos), cuando se colocan en agua, se unen espontneamente entre sfo r mando bicapas; las bicapasforman compartimientos cerrados que tienen una gran tendencia a volverse a unir si se rompen. Existen tres clases principales de molcu las lipidicas de membrana -los fosfolpidos, el colesterol y los glucolpidos- y la composicin lipdica de la monocapa externa es diferente a la de la interna, lo que refleja las diferentes funciones de las dos caras de una membrana celular. En las membranas plasmticas de los diferentes tipos de clulas, al igual que en los diver sos compartimientos membranosos internos de las clulas eucariotas, se presentan diferentes mezclas de lpidos. Algunas protenas unidas a la membrana necesitan lpidos con grupos polares especficos para actuar, lo que al parecer explicara, al menos en parte, por qu las membranas eucariotas contienen tipos tan diversos de molculas lipidicas.

Protenas de membrana6
Aunque la estructura bsica de las membranas biolgicas est determinada por la bicapa lipdica, la mayora de sus funciones especficas estn desempeadas por protenas. Por consiguiente, la cantidad y el tipo de protenas de una m em brana son muy variables: en la vaina de mielina, cuya funcin principal consiste en aislar los axones nerviosos, m enos de un 25% de la masa de la mem brana es protena, mientras que en las membranas dedicadas a la transduccin energti ca (tales como las m embranas internas de las mitocondrias y de los cloroplastos) aproximadamente un 75% de su masa es protena. La mem brana plasmtica normal est situada entre ambos extremos, con aproximadamente un 50% de la masa total en forma de protena. Debido a que las molculas lipidicas son pe queas en comparacin con las proteicas, en todos los casos hay ms molculas lipidicas que proteicas -alrededor de 50 molculas de lpidos por cada molcula de protena en una mem brana que contenga un 50% de protena en masa. Como los lpidos de membrana, es comn que las protenas de membrana lleven ado sadas cadenas de oligosacridos. As la superficie que la clula presenta al exte rior posee una gran cantidad de carbohidratos, lo que forma un glucocliz o cu bierta celular (discutido ms adelante). Protenas de membrana

517

Las protenas de m em brana pueden estar asociadas a la bicapa lipidica de varias m aneras 7
Las distintas protenas de membrana estn asociadas a las membranas de dife rentes maneras, como se ilustra en la Figura 10-13. Muchas protenas de m em brana atraviesan la bicapa lipidica, de forma que parte de su masa se sita a cada lado de la mem brana (ejemplos 1 y 2 de la Figura 10-13). Como sus vecinas lipdicas, estas protenas transm em brana son antipticas, tienen regiones que son hidrofbicas y regiones hidroflicas. Las regiones hidrofbicas se sitan en el interior de la m em brana y se relacionan con las colas hidrofbicas de las mol culas lipdicas del interior de la bicapa. Las regiones hidroflicas se hallan ex puestas al medio acuoso de ambos lados de la membrana. El carcter hidrofbico de algunas de estas protenas aumenta por la unin covalente de una o ms cadenas de cido graso que se encuentren insertadas en la mitad citoplasmtica de la bicapa (vase el ejemplo 1 de la Figura 10-13). Otras protenas de m embra na se localizan en el citosol y se asocian con la bicapa tan slo a travs de una o ms cadenas de cidos grasos a las que estn unidas covalentemente, o por otro tipo de cadenas lipdicas llamadas grupos prenil (vase el ejemplo 3 de la Figura 10-13 y la Figura 10-14). Existen otras protenas completamente expuestas a la superficie celular externa, ancladas a la bicapa nicamente por medio de una unin covalente (va un oligosacrido especfico) al fosfatidilinositol de la monocapa lipidica externa de la m em brana plasmtica (vase el ejemplo 4 de la Figura 10-13). Las protenas unidas a lpidos del ejemplo 3 se han generado como pro tenas solubles en el citosol y posteriormente se han trasladado directamente hacia las mem branas unindolas covalentemente a un grupo lipidico (Figura 1014). Las protenas del ejemplo 4, sin embargo, se sintetizan como protenas transm em brana de paso nico en el ER; mientras permanecen en el ER, el seg mento transm em branoso de la protena se escinde y se le aade un glucosilfosfatidilinositol (GPI, de glycosylphosphatidylinositol), de forma que la protena queda unida a la superficie no citoplasmtica de la membrana slo por medio de este anclaje (vase Captulo 12). Las protenas que se unen a la membrana con un GPI de anclaje se distinguen fcilmente mediante el uso de la enzima fosfolipasa C especfica para fosfatidilinositol, que separa especficamente estas protenas de sus anclajes, separndolas as de la membrana. Algunas protenas que no ocupan totalmente el interior hidrofbico de la bi capa lipidica estn unidas a una u otra cara de la membrana mediante interac ciones no covalentes con otras protenas de membrana (vanse los ejemplos 5 y 6 de la Figura 10-13). Muchas de ellas pueden ser liberadas de la membrana m e diante procedimientos de extraccin relativamente suaves, como la exposicin a

Figura 10-13 Seis sistemas de asociacin de las protenas con la m em brana lipdica. Se cree que la mayora de protenas transm embrana atraviesan la bicapa com o una hlice a nica ( 1 ) o en forma de mltiples hlices a (2 ); algunas de estas protenas de paso nico y de paso mltiple estn unidas covalentemente a cadenas de cidos grasos insertados en la monocapa citoplasmtica (1). Otras protenas de membrana estn unidas a la membrana nicam ente a travs de su unin covalente a un lpido, como una cadena de cido graso o un grupo prenil de la m onocapa citoplasmtica (3) o bien, menos habitualm ente, a travs de un oligosacrido a un fosfolpido minoritario, el fosfatidilinositol, en la m onocapa nocitoplasmtica (4). Finalmente, muchas protenas estn unidas a la m embrana tan slo mediante interacciones no covalentes con otras protenas de membrana (5) y (6 ). En la Figura 10-14 se ilustra cmo se forma la estructura de (3). Los detalles de estos diversos sistemas a travs de los cuales las protenas de m em brana se asocian con la bicapa lipdica, se discuten en el Captulo 12.

bicapa lipidica

518

Captulo 10 : Estructura de la membrana

(A)

protena unida a la m em brana por una cadena de cido graso

(B)

protena unida a la m em brana por un grupo prenil

CH3

CITOSOL bicapa lipidica

=o

enlace am ida entre un grupo am ino term inal y un cido graso

enlace tioter entre una cisterna y un grupo prenil

c O (C) anclaje m iristil (D) anclaje farnesil

Figura 10-14 La unin covalente de cualquiera de los dos tipos de grupos lipdicos puede ayudar a localizar una protena soluble dentro de una membrana, despus de su sntesis en el citosol. (A) Una cadena de cido graso (mirstico o palmtico) se une a un grupo amino terminal de una glicina por medio de un enlace amida. (B) Un grupo prenil (sea farnesil o un grupo geranilgeranil ms largo -ambos relacionados con el colesterol) se halla unido, mediante un enlace tioter, a un residuo cistena situado a cuatro residuos del carboxilo terminal. Tras esta prenilacin, los tres aminocidos terminales son separados de la cadena y el nuevo carboxilo terminal se metila antes de ser insertado en la membrana. Las estructuras de los dos lpidos que sirven de anclaje, se ilustran en la parte inferior: (C) un anclaje miristil (una cadena de cido graso saturado de 14 carbonos), y (D) un anclaje farnesil (una cadena hidrocarbonada insaturada de 15 carbonos).

soluciones de muy alta o baja fuerza inica o de pH extremo, que interfieren con las interacciones proteicas pero mantienen intacta la bicapa lipdica. De manera operacional a estas protenas se les denomina protenas perifricas de m em brana. Por el contrario las protenas transmembrana, varias protenas unidas a la bicapa por cadenas de cidos grasos y algunas otras protenas ntimamente unidas a la m embrana, no pueden ser liberadas por estos mtodos, por lo que se les denomina protenas integrales de membrana. Habitualmente la manera en que una protena se asocia a la bicapa lipdica es un indicativo de la funcin de la protena. As, slo las protenas transm em brana pueden actuar en ambos lados de la bicapa o transportar molculas a tra vs de ella. Algunos receptores celulares de superficie, por ejemplo, son prote nas transm em brana que se unen a las molculas seal en el espacio extracelular y generan diferentes seales intracelulares en el lado opuesto de la membrana plasmtica. Por el contrario, las protenas que slo actan en un lado de la b ica pa lipdica, generalmente estn asociadas con la m onocapa lipdica o con el do minio proteico de aquel lado de la membrana. Por ejemplo, un grupo de prote nas relacionadas con la sealizacin intracelular estn unidas a la cara citoslica de la m em brana plasmtica por uno o ms grupos lipdicos a los que estn covalentem ente unidas.

Se considera que, en la mayora de protenas transm em brana, las regiones de la cadena polipeptdica que cruzan la bicapa lipdica presentan una conform acin en hlice a 6,8
Una protena transmembrana se orienta siempre en un nico sentido dentro de la membrana. Este hecho refleja tanto la asimetra del sistema mediante el cual la protena se ha sintetizado e insertado en la bicapa lipdica en el ER, como la diferencia entre las funciones que desempean los dominios citoplasmtico y no citoplasmtico de la protena. Estos dominios estn separados por segmentos de la cadena polipeptdica que atraviesan la membrana, se hedan en contacto con el ambiente hidrofbico de la bicapa lipdica y estn compuestos, en gran parte, por residuos de aminocidos de cadena lateral no polar. Debido a que las uniones peptdicas son en s mismas polares y dado que el agua no est presente

Protenas de membrana

519

en este ambiente, todas las uniones peptdicas pertenecientes a la porcin de la cadena embebida en la bicapa tienden a formar enlaces de hidrgeno entre s. Este tipo de uniones se maximiza si la cadena polipeptdica forma una hlice a re gular al cruzar la bicapa; se cree que la mayora de los segmentos de las cadenas polipeptdicas que atraviesan la membrana se hallan en esta conformacin (Figu ra 10-15): en las p ro te n a s tr a n s m e m b ra n a d e p a so n ico la cadena polipeptdica cruza una sola vez (vase el ejemplo 1 de la Figura 10-13), mientras que en las p ro te n a s tr a n s m e m b ra n a d e m u ltip a so la cadena polipeptdica cruza mltiples veces la bicapa (vase el ejemplo 2 de la Figura 10-13). Una manera alternativa de que las uniones peptdicas puedan satisfacer sus requerimientos de enlaces de hi drgeno es que las mltiples hebras transmembrana de la cadena polipeptdica se dispongan en lmina P formando un barril cerrado (denominado barril p).

(A) GLUCOFORINA

(B) BACTERIORRODOPSINA COOH

50 100 nm ero de am inocido

nm ero de am inocido

100

200

Figura 10-16 Localizacin en una cadena polipeptdica, mediante el uso de grficos de hidropata, de potenciales segmentos en hlice a que atraviesan la membrana. La energa libre necesaria para transferir segmentos sucesivos de una cadena polipeptdica de un solvente no polar al agua se calcula a partir de la composicin aminoacdica de cada segmento usando los datos de un modelo de componentes. Estos clculos se realizan para segmentos de un tamao fijo, (usualmente alrededor de 10 residuos de aminocidos), comenzando con cada aminocido sucesivo de la cadena. El ndice de hidropata del segmento se esquematiza en el eje Y como funcin de su localizacin en la cadena. Un valor positivo indica que se necesita energa libre para la transferencia hacia el agua (es decir, que el segmento es hidrofbico) y el valor asignado es un ndice de la cantidad de energa que se necesita. Los picos del ndice de hidropata aparecen en la posicin de los segmentos hidrofbicos de la secuencia de aminocidos. Se ilustran dos ejemplos de las protenas de membrana que se discuten posteriormente en este captulo: (A) la glucoforina tiene un nico segmento que atraviesa la membrana en hlice a y un pico correspondiente en el test de hidropata; (B) la bacteriorrodopsina tiene siete segmentos que atraviesan la membrana en hlice a y siete picos correspondientes en el grfico de hidropata. (Adaptado de D. Eisenberg, Arinu. Rev. Biochem . 53:595-624,1984.)

520

Captulo 10: Estructura de la membrana

ncleo hidrofbico de la bicapa lipdica

Figura 10-15 Un segmento de una cadena polipeptdica que atraviesa la bicapa lipdica en form a de hlice a . En la figura slo se ha dibujado el esqueleto del carbono a de la cadena polipeptdica, con los aminocidos hidrofbicos en verde y am arillo . El segmento polipeptdico que se muestra en la figura es una parte del centro de reaccin fotosinttico bacteriano que se ilustra en la Figura 10-33, cuya estructura fue determinada por anlisis de difraccin de rayos X. (Basado en datos de J. Deisenhofer et al., N ature 318:618-624,1985, y de H. Michel et al., EM BOJ. 5:1149-1158,1986.)

Esta estructura de multipaso transmembrana se observa en las porinas, unas protenas que trataremos ms adelante. La fuerte tendencia a formar el mximo nmero de enlaces de hidrgeno en ausencia del agua tambin implica que pro bablem ente la cadena polipeptdica que entra en la bicapa la atraviesa comple tamente antes de cambiar de direccin, ya que la curvatura de la cadena supon dra una disminucin de las interacciones regulares de enlaces de hidrgeno. Probablemente por esta razn es por lo que todava no se ha establecido ningn ejemplo de una protena de membrana cuya cadena polipeptdica atraviese tan slo parcialmente la bicapa lipdica. Como es muy difcil lograr que las protenas transmembrana cristalicen, slo unas cuantas han sido estudiadas en su totalidad por cristalografa de rayos X (discutida ms adelante); pero de todas las dems protenas transmembrana conocem os las estructuras tridimensionales plegadas. Las tcnicas de clonaje y secuenciacin del DNA, sin embargo, han revelado las secuencias de am inoci dos de muchas protenas transmembrana, y a partir de un anlisis de la secuen cia proteica a menudo es posible predecir qu partes de la cadena polipeptdica atraviesan la bicapa lipdica en forma de hlice a. Los segmentos que contienen cerca de 20-30 residuos de aminocidos con un alto grado de hidrofobicidad son bastante largos para atravesar la membrana de esta manera y a menudo pueden ser identificados por medio de un test de hidropata (Figura 10-16). Como son suficientes 10 o menos residuos para atravesar una bicapa lipdica a modo de una hebra p extendida, la misma estrategia se usa para identificar los segmentos que atraviesan la m embrana formando un barril p. La gran mayora de las protenas transmembrana se hallan glucosiladas. En el caso de los glucolpidos, los residuos de azcar se aaden en la luz del retculo endoplasmtico y en la del complejo de Golgi (vanse Captulos 12 y 13) por lo que las cadenas de oligosacrido se hallan siempre en el lado no citoplasmtico de la membrana. Otro tipo de asimetra resulta del caracterstico ambiente re ductor del citosol, que impide la formacin de enlaces disulfuro (S S) inter o intracatenarios entre los residuos cisterna del dominio citoslico. Estos enlaces se forman en el lado no citoslico de la membrana, donde pueden tener un pa pel importante estabilizando la estructura plegada de la cadena polipeptdica (Figura 10-17) o bien asociando la cadena con otras cadenas polipeptdicas.

COOH

oligosacridos hlice a transm em brana bicapa lipdica grupo sulfhidrilo

Figura 10-17 U na tpica protena transm em brana de paso nico.

Las protenas de m em brana pueden solubilizarse y purificarse mediante detergentes 9

En general, las protenas transmembrana (y tambin algunas otras protenas fuertemente unidas a la membrana) pueden ser solubilizadas nicamente por medio de agentes que rompan las asociaciones hidrofbicas y destruyan la bica pa lipdica. De entre estos compuestos que alteran las propiedades bioqumicas de la membrana, los ms tiles son los detergentes, pequeas molculas antip ticas que tienden a formar micelas en el agua (Figura 10-18). Al mezclarlos con las membranas, los extremos hidrofbicos de las molculas de detergente se unen a las regiones hidrofbicas de la zona externa de las protenas de m em bra na, desplazando as las molculas lipdicas. Puesto que el otro extremo de las molcula de detergente es polar, la unin detergente-protena tiende a disolver en agua a las protenas de mem brana (a pesar de que algunas molculas lipdi cas intensamente asociadas a las protenas quedan unidas a estos complejos; va se Figura 10-19). Los extremos polares (hidrofflicos) de los detergentes pueden estar cargados (ser inicos) como en el caso del dodecil sulfato sdico (SDS, de Sodium Dodecyl Sulfate) o no cargados (ser no inicos) como en el caso de los detergentes de tipo Tritn. En la Figura 10-20 se presenta la estructura de estos detergentes de uso comn. Con detergentes inicos fuertes como el SDS, pueden solubilizarse incluso las protenas de membrana ms hidrofbicas, lo cual permite su anlisis m e diante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (vase Captulo 4), un pro cedimiento que ha revolucionado el estudio de las protenas de membrana. Al

Ntese que la cadena polipeptdica atraviesa la bicapa lipdica en forma de hlice a dextrgira y que tanto las cadenas de oligosacrido como los enlaces disulfuro se hallan en la superficie no citoslica de la membrana. No se forman enlaces disulfuro entre los grupos sulfhidrilo localizados en el domino citoplasmtico de la protena, debido a que el ambiente reductor del citosol mantiene estos grupos en su forma reducida (-SH).

cola hidrofbica 1L _ar grupo de cabeza hidroflico

Figura 10-18 Micela de detergente en el agua, vista en seccin transversal.

Las molculas de detergente son antipticas debido a que tienen un extremo polar y otro extremo no polar.

Protenas de membrana

521

proteina de mem brana en una bicapa lipidica

micelas de detergente

m onom eros de detergente

Figura 10-19 Solubilizacin de protenas de m em brana con un detergente suave. El detergente desbarata la estructura de la bicapa lipidica y coloca las protenas en solucin en forma de complejos protena-lpido-detergente. Los fosfolpidos de la mem brana tambin se solubilizan por el detergente.

III

li
com plejo hidrosoluble de protena-lpido-detergente micelas solubles m ixtas de lpido-detergente

unirse a sus ncleos hidrofbicos, estos detergentes fuertes despliegan (des naturalizan) las protenas, inactivndolas y por tanto, hacindolas no utilizables para estudios funcionales. No obstante, las protenas pueden ser fcilmente pu rificadas en su forma desnaturalizada por el SDS, y en algunos casos, al eliminar el detergente, las protenas purificadas pueden ser renaturalizadas, con recupe racin de su actividad funcional. Muchas protenas hidrofbicas de mem brana pueden ser solubilizadas y posteriormente purificadas en forma activa, a veces completamente normal, mediante el uso de detergentes suaves, com o el Tritn X-100, que se une a los segmentos de la protena que atraviesan la membrana. De esta manera se pue den reconstruir sistemas de protenas de m em brana funcionalmente activos a partir de sus com ponentes purificados, lo que proporciona un poderoso medio de anlisis de la actividad de dichos sistemas.

( !I C H 3 c CH cu,
ch2

CH2 CH i C CH

CH;> CH, CH? CHj CH.;: CH'

ch2

hc^C \ : i
! ! IC X XH

i!

ch2
1

El lado citoplasm tico de las protenas de m em brana se puede estudiar en fantasm as de eritrocito 10
Se tiene ms informacin de la membrana plasmtica del glbulo rojo humano (Figura 10- 22) que de cualquier otra membrana eucariota, lo cual es debido a dis tintas causas. Los glbulos rojos se pueden obtener en gran nmero (por ejemplo de los bancos de sangre) y estn relativamente poco contaminados por otros ti pos celulares. Dado que no tienen ni ncleo ni orgnulos intracelulares, la nica membrana que poseen es la membrana plasmtica, de forma que puede ser ais lada sin contam inacin de membranas internas, lo cual evita un grave problema que se presenta en las preparaciones de membrana de otros tipos celulares en los que la mem brana plasmtica constituye menos del 5% del total de membrana de la clula. Exponiendo las clulas a un medio en el que la concentracin de sal sea menor que la del interior celular, resulta fcil preparar membranas celulares de eritrocito, vacas o fantasmas. En estas condiciones el agua fluye hacia el inte rior de los eritrocitos, hinchndolos y rompindolos (lisis), liberando la hemoglo bina (la principal protena no perteneciente a la membrana). Los fantasmas de membrana pueden ser estudiados mientras todava estn abiertos (en cuyo caso cualquier reactivo puede interaccionar con las molculas por ambas caras de la membrana) o puede dejarse que se suelden de nuevo de modo que los reactivos que se utilizarn slo puedan actuar sobre la cara externa. Adems, y puesto que a partir de fantasmas de eritrocitos tambin se pueden preparar vesculas solda522 Captulo 10 : Estructura de la membrana

CHj CHj CHj

ch2
1
i

1
=S

CH

G
jlfa to sdico (SDS)

Tritn X-100

Figura 10-20 Estructura de dos detergentes utilizados habitualmente. El dodecil sulfato sdico (SDS), un detergente aninico, y el Tritn X-100, un detergente no inico. La porcin hidrofbica de cada detergente se muestra en verde, y la porcin hidroflica en azul. Obsrvese que la zona marcada entre corchetes del Tritn X-100 se repite unas ocho veces.

Figura 10-21 Uso de detergentes suaves para solubilizar, purificar y reconstituir sistemas de protenas de membrana funcionales. En este ejemplo se purifican molculas funcionales de la ATPasa Na+ -K+y se incorporan a vesculas de fosfolpidos. La ATPasa Na+ -K+es una bomba inica que se halla presente en la membrana plasmtica de la mayora de las clulas animales; utiliza la energa de hidrlisis del ATP para bombear Na+ hacia fuera de la clula y K+hacia el interior, como se discute en el Captulo 11.

(Q 00 ,0
000

ELIMINACION DEL DETERGENTE

ADICIN DE FOSFOLPIDOS (mezclados con detergente)

00o

'

micelas de detergente + m onm eros

O 0 0000000

ATPasa Na+-K+ incorporada a una vescula de fosfolipidos

das invertidas (Figura 10-23), es posible estudiar por separado los lados externo e interno (citoplasmtico) de la membrana. El uso de los fantasmas de eritrocito soldados y no soldados hizo posible demostrar por primera vez que algunas pro tenas de membrana atraviesan la bicapa lipdica (vase ms adelante) y que la composicin lipdica de las dos mitades de la bicapa es diferente. Estos hechos, al igual que muchos principios bsicos demostrados inicialmente en membranas de eritrocito, se han generalizado a las membranas de las clulas nucleadas. Figura 10-22 Electronmicrografa de barrido de eritrocitos humanos. Las clulas tienen una forma bicncava y carecen de ncleo. (Por cortesa de Bernadette Chailley.)

Protenas de membrana

523

Figura 10-23 Preparacin de fantasmas de eritrocito, soldados y no soldados, y de vesculas del derecho y del revs. Tal como se ha

fantasm a soldado
LISIS HIPOTNICA

vesculas del derecho

Oq O

O vesculas vueltas del revs

indicado, los eritrocitos se rompen en un nico punto, produciendo fantasmas con un solo agujero. Las vesculas ms pequeas se producen rompiendo mecnicamente los fantasmas; la orientacin de la membrana en estas vesculas puede ser tanto con la cara exterior original hacia el exterior o vuelta del revs, dependiendo de las condiciones inicas utilizadas durante el procedimiento de rotura.

La orientacin de una protena de membrana puede determinarse de va rias maneras. Una de ellas consiste en utilizar un reactivo marcador (por ejem plo, uno que contenga una marca radiactiva o fluorescente) que se una covalen tem ente, y que sea soluble en agua, es decir, que no pueda penetrar en la bicapa, por lo que slo se unir a grupos especficos del lado asequible de la membrana. A continuacin, se solubilizan las membranas con un detergente, se separan las protenas por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. Las protenas marcadas se detectan ya sea por su radiactividad (mediante autorradiografa sobre gel) o por su fluorescencia (exponiendo el gel a luz ultravioleta). Utilizando este sistema de mareaje vectorial es posible determinar cmo se halla orientada una protena de m em brana en dicha membrana, detectada como una banda sobre el gel: por ejemplo, si se marca tanto desde el lado externo (cuando se marcan clulas intactas o fantasmas con la mem brana soldada) como desde el lado interno (citoplasmtico, cuando se marcan vesculas invertidas), debe tratarse de una proteina transmembrana. Una va alternativa a sta consiste en exponer tanto la superficie externa como la superficie interna a enzimas proteolticas que no atraviesen la membrana: si una protena queda parcialmente dige rida por este tratamiento de ambas superficies, debe tratarse de una protena transmembrana. Adems, para determinar si una zona especfica de una protei na transm em brana est expuesta a un lado u otro de la membrana, se pueden utilizar anticuerpos marcados que se unen nicamente a una determinada re gin de la protena. Al estudiar las protenas de la mem brana plasmtica del glbulo rojo huma no mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, se detectan aproxi madamente 15 bandas proteicas principales, cuyos pesos moleculares oscilan entre 15 000 y 250 000. Tres de estas protenas -la espectrina, la glucoforina y la banda 3- constituyen ms del 60% (en peso) de la protena total de la membra na (Figura 10-24). Cada una de estas tres protenas est dispuesta en la mem brana de diferente manera. Por ello las utilizaremos como ejemplo de las tres maneras principales conocidas en que las protenas se asocian con las m embra nas, no slo en los glbulos rojos, sino tambin en otros tipos celulares.

peso aproxim ado . espectrina a espectrina (3 anquirina

molecular

100 oooS E

30 000 82 000

proteina ' banda 3 glucoforina proteina banda 4,1

43 000

actina

(B)

Figura 10-24 Patrn de electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS de las protenas de la mem brana de glbulos rojos humanos. El gel en (A) est teido

La espectrina es una proteina del citoesqueleto asociada no covalentemente a la cara citoplasm tica de la m em brana del eritrocito 11
Muchas de las molculas de protena asociadas con la membrana del eritrocito humano son protenas perifricas de membrana asociadas con el lado citoplas mtico de la bicapa lipidica. La ms abundante de estas protenas es la espectri na, una barra larga, delgada y flexible, de aproximadamente 100 nm de longitud, que constituye aproximadamente el 25% de la masa total de las protenas aso ciadas a la membrana (unas 2,5 x 105 copias por clula). Constituye el principal com ponente del entramado proteico (el citoesqueleto) que se extiende por el in-

con azul de Coomassie. El dibujo (B) indica la posicin en el gel de algunas de las protenas mayoritarias; la glucoforina se muestra en color rojo para distinguirla de la protena banda 3. En el dibujo se han omitido otras bandas del gel. La gran cantidad de carbohidratos de las molculas de glucoforina retarda su migracin, por lo que se desplazan casi tan lentamente como las molculas de la protena banda 3, que son mucho mayores. (A , por cortesa de Ted Steck.)

524

Captulo 10 : Estructura de la membrana

CADENA a
H2N HOOC

COOH

yJ . I \
unin flexible entre dom inios CADENA p (A )

j.^ d M JLsgJ^* N H 2
dom inio de 106 am inocidos de longitud

Figura 10-25 Molculas de espectrina de eritrocitos hum anos. La protena

est dibujada esquemticamente en (A) y tal como se ve al microscopio electrnico en (B). Cada heterodmero de espectrina consiste en dos cadenas polipeptdicas antiparalelas, flexibles y ligeramente entrelazadas, llamadas a y p, que se unen entre s mediante mltiples enlaces no covalentes que se presentan incluso en ambos extremos. A la izquierda est el extremo cabeza fosforilado, donde se asocian dos dmeros, formando un tetrmero. Tanto la cadena a como la cadena P estn compuestas principalmente de dominios repetidos de 106 aminocidos de longitud. En (B) las molculas de espectrina se han sombreado con platino. (A, adaptado de D.W. Speicher y V.T. Marchesi, Nature 311:177-180,1984; B, por cortesa de D.M. Shotton, con permiso de D.M. Shotton, B.E. Burkey D. Branton,/. Mol. Biol. 131:303-329, 1979, Academic Press Inc. [London] Ltd.)

terior de la mem brana celular del eritrocito, manteniendo la integridad estructu ral y la forma bicncava de su mem brana (vase Figura 10-22): si se extrae el citoesqueleto de los fantasmas de eritrocito en soluciones de baja fuerza inica, la mem brana se fragmenta formando pequeas vesculas. La espectrina es un heterodmero formado por dos grandes subunidades es tructuralmente similares (Figura 10-25). Los heterodmeros se autoasocian cabeza con cabeza, formando tetrmeros de 200 nm de largo. Las colas de cinco o seis tetrm eros se enlazan entre s mediante su unin a filamentos cortos de actina y a otras protenas citoesquelticas (entre ellas, la proteina banda 4,1) formando un com plejo de unin. El resultado final es una red deformable que se extiende por toda la superficie citoplasm tica de la m embrana (vase Figura 10-26). Este citoesqueleto basado en la espectrina permite al eritrocito resistir el estrs que sufre su m em brana a medida que es empujado a travs de los estre chos capilares. Ratones y humanos que poseen anomalas genticas en la espec trina, presentan anemia y sus glbulos rojos son esfricos (en lugar de cncavos) y anormalmente frgiles; la severidad de la anemia se increm enta con el grado de deficiencia de la espectrina. La protena que es la principal responsable de sujetar el citoesqueleto de es pectrina a la m em brana plasmtica del eritrocito se identific mediante la unin de espectrina marcada radiactivamente a m embranas de glbulos rojos de las que se haban retirado espectrina y otras protenas perifricas. Estos experimen tos demostraron que la unin de la espectrina depende de una gran protena intracelular de unin llamada anquirina, que se une tanto a la espectrina como al dominio citoplasmtico de la proteina transmembrana banda 3 (vase Figura 10-26). La anquirina conecta algunas molculas de la protena banda 3 a la es pectrina, uniendo as la red de espectrina a la membrana; tambin reduce nota blem ente la velocidad de difusin de las molculas de banda 3 en la bicapa lipi dica. El citoesqueleto de espectrina tam bin se une a la membrana a travs de otro m ecanismo que depende de la protena banda 4,1 mencionada con anterio ridad. Esta protena, que se une a la espectrina y a la actina, tambin se une al dominio citoplasmtico de la protena banda 3 y a la glucoforina, la otra protei na transm em brana mayoritaria en los eritrocitos. Por debajo de la mem brana plasmtica de las clulas nucleadas existe una red de citoesqueleto anloga a la descrita, pero mucho ms elaborada y com pli cada. Esta red, que constituye la regin cortical (o crtex) del citoplasma, es rica

Protenas de membrana

actina

aducira

com plejo de unin dim ero de espectrina actina

proteina banda 4,1 (A)

espectrina anquirina proteina banda 4,1 100 nm

tropom iosina

proteina

glucoforina

Figura 10-26 El citoesqueleto basado en la espectrina del lado citoplasm tico de la m em brana del eritrocito hum ano. Dibujo esquemtico (A) y electronmicrografa (B). La disposicin que se muestra en (A) se ha deducido principalm ente a partir de estudios sobre las interacciones in vitro de protenas purificadas. Los dmeros de espectrina asociados cabeza-concabeza forman tetrmeros que se hallan unidos formando una red por medio de com plejos de unin com puestos de cortos filamentos de actina (que contienen unos 13 monm eros de actina), tropomiosina que probablemente determina la longitud de los filamentos de actina, protena banda 4,1 y aducina (aumentado en la casilla de la iz q u ierd a ). El citoesqueleto est unido a la m em brana mediante la unin indirecta de los tetrmeros de espectrina a algunas protenas banda 3, a travs de molculas de anquirina y tambin por medio de la unin de la protena banda 4,1 a la glucoforina (no se muestra). La electronmicrografa de (B) muestra el citoesqueleto de la cara citoplasm tica de la m embrana del eritrocito despus de su fijacin y tincin negativa. La red de espectrina se ha estirado a propsito para permitir observar los detalles de su estructura; en la clula normal, la trama mostrada debe ocupar nicam ente una dcima parte de esta rea. (B, por cortesa de T. Byers y D. Branton, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:6153-6157,1985.)

CSpeMriniJ:

en filamentos de actina que al parecer se unen a la membrana plasmtica de nu merosas maneras. En el crtex de clulas nucleadas tambin existen protenas estructuralmente homologas a la espectrina, a la anquitina y a la protema banda 4,1, pero su organizacin y funcin no son tan conocidas como lo son en los eri trocitos. El citoesqueleto cortical de clulas nucleadas y su interaccin con la m em brana plasmtica se discuten en el Captulo 16.

La glucoforina atraviesa la bicapa lipdica del glbulo rojo, formando una hlice a sencilla 10
La glucoforina es una de las dos protenas mayoritarias que se hallan expuestas en la superficie externa del glbulo rojo humano y fue la primera protena de mem brana de la que se pudo determinar su secuencia completa de am inoci dos. Como la protena modelo transm em brana de la Figura 10-17, la glucoforina es una pequea glucoprotena transm em brana (131 residuos de aminocido) de paso nico que se halla colocada con la mayora de su masa en la superficie ex terna de la membrana, donde se localiza su cola amino terminal hidroflica. En esta zona de la protena se hallan unidos todos los carbohidratos (aproximada mente unos 100 residuos de azcar distribuidos en 16 cadenas laterales distintas de oligosacridos), que representan el 60% de la masa total de la molcula. De hecho, la gran mayora del total de carbohidratos de superficie del eritrocito (in cluyendo ms del 90% del cido silico, y por lo tanto la mayor parte de la carga

526

Captulo 10 : Estructura de la membrana

negativa de superficie de la clula) estn unidos a m olculas de glucoforina. El extrem o carboxilo term inal hidroflico de la glucoforina est expuesto ha cia el citoplasm a, m ientras que existe un segm ento a-helicoidal hidrofbico de unos 23 am inocidos de longitud, que atraviesa la bicapa no polar (vase Figura 10-16A). A pesar de que en cada clula hay ms de un milln de molculas de gluco forina, todava se desconoce la funcin de esta glucoprotena. De hecho, los in dividuos cuyos eritrocitos carecen de esta protena parecen estar perfectamente sanos. Aunque la glucoforina es exclusiva de los glbulos rojos, su estructura es representativa de una clase frecuente de protenas de membrana que atraviesan la bicapa lipdica en forma de hlice oc. Por ejemplo, muchos receptores de su perficie pertenecen a esta clase de protenas.

protena transm em brana

/

hielo

- bicapa lipdica FRACTURA CON CUCHILLA

La banda 3 de la m em brana celular del eritrocito es una protena de m em brana multipaso que cataliza el cotransporte am nico 12
A diferencia de lo que sucede con la glucoforina, se sabe que la protena banda 3 desempea un papel importante en la funcin de la clula. Su nombre deriva de la posicin relativa que ocupa respecto a las otras protenas de m embrana en una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (vase Figura 10-24). Como la glucoforina, la banda 3 es una protena transmembrana, pero de mltiple paso, que atraviesa la mem brana en una conformacin altamente plegada: al parecer la cadena polipeptdica (aproximadamente 930 residuos de aminocido de longitud) atraviesa la bicapa hasta 14 veces. Cada glbulo rojo contiene apro ximadamente 106 cadenas polipeptdicas banda 3, que forman dmeros en la membrana. La principal funcin de los glbulos rojos es la de transportar 0 2 desde los pulmones hasta los tejidos y ayudar al transporte de C 0 2 desde los tejidos hasta los pulmones. La protena banda 3 es de importancia crucial en la segunda de estas funciones. El C 0 2es slo levemente soluble en agua y por ello es transpor tado por el plasma sanguneo en forma de bicarbonato (HCO), que se forma y se rompe dentro de los glbulos rojos por una enzima que cataliza la reaccin H20 + C 0 2 <-> HCO + H\ La protena banda 3 acta como un transportador de aniones, que permite que el HCO3 cruce la mem brana intercambindose con Cl_. Al hacer que la mem brana del eritrocito sea libremente permeable al HCO3, este transportador increm enta la cantidad de C 0 2que la sangre puede llevar hasta los pulmones. Tras aplicar la tcnica de la criofractura (por la cual las clulas son congela das en nitrgeno lquido y el bloque resultante de hielo se fractura con una cu chilla) pueden verse al microscopio electrnico las protenas banda 3 como par-

O
cara de fractura E al descubierto cara de fractura P al descubierto

Figura 10-27 Electronm icrografa obtenida tras criofractura. El dibujo

muestra cmo esta tcnica ofrece imgenes del interior hidrofbico de la mitad citoplasmtica (o protoplasmtica) de la bicapa (denominada cara P) y de la mitad externa de la bicapa (denominada cara E). Despus del proceso de criofractura ilustrado aqu, las caras de fractura se metalizan con platino y carbn, por digestin se elimina el material orgnico y la rplica de platino resultante se observa al microscopio electrnico (vase tambin Figura 4-27).

cara P

Figura 10-28 Electronm icrografa de criofractura de glbulos rojos hum anos. Obsrvese que la densidad

de las partculas intramembrana es superior en la cara protoplasmtica (P) que en la cara externa (E). (Por cortesa de L. Engstrom y D. Branton.)

cara E

11 I1

Protenas de membrana

5 27

plano de la fractura agua extracelular congelada citoplasm a congelado m olcula de glucoforina

cara de fractura P M M IM IH M I I t t O t l CITOSOL

bicapa lipidica

cara de fractura E M I I I 1 M M M M IM M M AG UA EXTRACELULAR

tculas intramembrana diferenciadas. El plano de la fractura tiende a pasar a tra vs de la mitad hidrofbica de los lpidos de la membrana, separando las m em branas en sus dos monocapas (Figura 10-27). Las caras de fractura expuestas se metalizan con platino, y la rplica de platino resultante se observa al m icrosco pio electrnico. Cuando se estudian de esta manera, las membranas celulares de los eritrocitos humanos aparecen salpicadas de partculas intermembrana de ta mao relativamente homogneo (7,5 nm de dimetro) y distribuidas al azar (Fi gura 10-28). Se cree que estas partculas son principalmente molculas de banda 3: cuando se reconstituyen bicapas lipdicas sintticas con molculas de prote na banda 3 y las bicapas se fracturan, se observan estas tpicas partculas inter membrana de 7,5 nm. La Figura 10-29 ilustra la razn por la que por criofractura de membranas celulares de glbulos rojos se observan las molculas de banda 3 pero probablem ente no las molculas de glucoforina. En el Captulo 11 se considera cmo una protena transmembrana como la banda 3 puede, en principio, permitir el transporte pasivo de molculas polares a travs de la bicapa no polar. Pero para un detallado conocim iento de cmo funciona realmente una protena transportadora se necesita la informacin exacta sobre su disposicin tridimensional en la bicapa. La primera protena de transporte en la mem brana plasmtica de la que se conocieron estos detalles es una protena denominada bacteriorrodopsina, que en la membrana plasmtica de ciertas bacterias acta como una bom ba de protones (H+ ) activada por la luz. La estructura de la bacteriorrodopsina es similar a la de muchas otras protenas de m em brana y m erece que se le dedique un breve parntesis aqu.

Figura 10-29 Probables destinos de las molculas de glucoforina y de la protena banda 3 de la m em brana del eritrocito durante la criofractura. Cuando la bicapa lipidica se parte, o la mitad interior o la mitad exterior de cada proteina transm embrana es extrada de la m onocapa congelada a la que est asociada; la protena tiende a permanecer en la m onocapa en la que se halla la mayor parte de su volumen. Por esta razn, las molculas de la protena banda 3 normalmente quedan asociadas a la cara de fractura interna (P); puesto que tienen suficiente masa por encim a del plano de fractura, pueden observarse como partculas intramembrana. Normalmente las molculas de glucoforina perm anecen unidas a la cara de fractura exterior (E), pero se cree que sus colas citoplasmticas tienen una masa insuficiente para que sean vistas.

La bacteriorrodopsina es una bom ba de protones que atraviesa la bicapa en form a de siete hlices a 13
La mem brana prpura de la bacteria Halobacterium halobium es una mancha especializada de la m em brana plasmtica que contiene un nico tipo de mol cula proteica, la bacteriorrodopsina (Figura 10-30). Cada molcula de bacterio rrodopsina contiene un nico grupo que absorbe la luz, o cromforo (denomi nado retinal], que da a la pro tena su color prpura; el retinal est relacionado con la vitamina A y es idntico al cromforo encontrado en la rodopsina del bastoncito retiniano de los vertebrados (se discute en el Captulo 15). El retinal est unido covalentemente a un residuo de lisina de la protena; cuando es activado por un fotn de luz, el cromforo excitado cambia inmediatamente de forma provocando una serie de pequeos cambios conformacionales en la protena, lo que da lugar a la transferencia de uno o dos H+ desde el interior hasta el exterior

Figura 10-30 Dibujo esquem tico de la bacteria Halobacterium halobium que m uestra las m anchas prpura de m em brana que contienen las molculas de bacteriorrodopsina. Estas bacterias, que viven en aguas salobres donde se hallan expuestas a grandes cantidades de luz solar, han desarrollado una gran cantidad de protenas activadas por la luz, incluyendo la bacteriorrodopsina que es una bom ba de protones activada por la luz presente en su membrana plasmtica.

528

Captulo 10 : Estructura de la membrana

Figura 10-31 Estructura tridimensional de una molcula de bacteriorrodopsina. La cadena

CITOPLASMA
N C LEO HIDRO FBICO DE LA BICAPA LIPDICA

3 nm crom foro retinal

polipeptdica cruza la bicapa en forma de siete hlices a. Se muestra la localizacin del cromforo y el probable camino que siguen los protones durante el ciclo de bombeo activado por la luz. Se cree que al ser activado por un fotn, el cromforo pasa un H+ a la cadena lateral del cido asprtico 85 (esfera rosa marcada 85). Posteriormente, se cree que otras tres transferencias de H+ completan el ciclo -desde el cido asprtico 85 al espacio extracelular, desde el cido asprtico 96 (esfera rosa marcada 96) al cromforo y desde el citosol al cido asprtico 96 (vase Figura 14-36). (Adaptado de R. Henderson et al. /. Mol. Biol. 213:899929,1990.)

ESPACIO EXTRACELULAR

de la clula (vase Figura 14-36). Bajo luz brillante cada molcula de bacteriorrodopsina puede bom bear varios cientos de protones por segundo. La transferen cia de protones impulsada por la luz establece un gradiente de H+ a travs de la membrana plasmtica, que a su vez impulsa la sntesis de ATP por una segunda protema de la m em brana plasmtica de la clula. As la bacteriorrodopsina es parte de un transductor de energa solar que provee a la clula bacteriana de energa. Para poder comprender la funcin de una protena transmembrana multipaso a nivel molecular, ser necesario localizar con precisin cada uno de sus tomos, lo cual generalmente requiere estudios de difraccin de rayos X de grandes cristales tridimensionales de la protena. Dada s naturaleza anfiptica, estas protenas son extremadamente difciles de cristalizar. Sin embargo, las nu merosas molculas de bacteriorrodopsina de la membrana prpura estn orde nadas en forma de un cristal bidimensional planar, lo que ha hecho posible de terminar su estructura tridimensional y su orientacin en la membrana, hasta una resolucin de 0,3 nm, por medio de una aproximacin alternativa que usa una com binacin de microscopa electrnica y anlisis de difraccin electrni ca. Este procedimiento (denominado cristalografa electrnica) es anlogo al es tudio de los cristales tridimensionales de protenas solubles mediante el anlisis de la difraccin de rayos X, aunque por dicho mtodo se obtienen menos deta lles estructurales. Como se ilustra en la Figura 10-31, estos estudios han demos trado que cada molcula de bacteriorrodopsina est plegada en siete hlices a densamente empaquetadas (cada una de unos 25 aminocidos) que pasan en ngulo ms o m enos recto a travs de la bicapa lipdica. La bacteriorrodopsina es un miembro de una gran superfamilia de protenas de membrana, de estructuras similares pero con funciones diferentes. As por ejemplo, la protena receptora de luz, rodopsina, de los bastones de la retina de vertebrados y m uchos receptores proteicos celulares de superficie que se unen a molculas mensajeras extracelulares, tam bin estn plegados en siete hlices a

Protenas de membrana

529

(B) m onm eros de porina

m em brana bacteriana externa

COOH

transmembrana. Estas protenas no actan como transportadores sino como transductores de seales; cada una responde a una seal extracelular activando otra protena dentro de la clula, la cual genera una seal qumica en el citosol, como se discute en el Captulo 15.

Figura 10-32 Estructura tridimensional de un trm ero de porina de Rhodobacter capsulatus determ inado por cristalografa de rayos X. (A) Cada monmero consiste

Las porinas son protenas transm em brana formadoras de canales que cruzan la m em brana en form a de un barril p 14
Como se discuti con anterioridad, algunas protenas transmembrana multipaso no tienen sus segmentos transmembrana organizados en forma de hlices a sino de una lmina (3 cerrada (un barril (3). Los ejemplos mejor estudiados de este tipo de protenas son las porinas, que se encuentran en la membrana exter na de muchas bacterias. Estas protenas pertenecen a un pequeo grupo de pro tenas transm em brana cuya estructura atm ica ha sido determinada completa mente m ediante cristalografa de rayos X. Muchas bacterias, entre ellas E. coli, tienen una membrana externa que rodea su membrana plasmtica (vase Figura 11-14). La membrana externa est perfora da por varias porinas formadoras de canales, lo que permite a determinados solu tos hidroflicos de hasta 600 daltons difundir a travs de la bicapa lipdica externa. Las porinas (y las protenas formadoras de canales relacionadas estructuralmente con ellas de la membrana de mitocondrias y cloroplastos) tienen una lmina (3 en lugar de una hlice a como estructura transmembranosa primordial. La estructura atm ica de una porina aislada de la membrana externa de una bacteria fotosinttica se determin mediante cristalografa de rayos X en 1990. Consiste de un trmero en el que cada monmero forma un barril (3 tubular, que atraviesa la bicapa lipdica y contiene un canal lleno de agua en su centro. El ba rril est formado a partir de 16 cadenas antiparalelas de lmina p, que se curvan lo suficiente como para formar una estructura cilindrica (Figura 10-32). Cadenas polares laterales revisten el interior del canal acuoso, mientras que cadenas no polares se proyectan desde el exterior del barril interactuando con el ncleo hidrofbico de la bicapa lipdica.

en un barril P de 16 cadenas antiparalelas que forman un canal transmembrana lleno de agua. (B) Los monmeros se asocian apretadamente formando trmeros, los cuales poseen tres canales separados para la difusin de solutos pequeos a travs de la membrana bacteriana externa. Una larga espiral de la cadena polipeptdica (se muestra en rojo), que conecta dos cadenas p, se proyecta hacia el interior del lumen de cada canal, estrechndolo hasta formar una seccin transversal de 0,6 x 1 nm. (Adaptado de M.S. Weiss et al., FEBS Lett. 280: 379-382,1991.)

530

Captulo 10: Estructura de la membrana

Figura 10-33 Estructura tridimensional del centro de reaccin fotosinttico de la bacteria

Rhodopseudomonas viridis. La
citocrom o
estructura se determin por anlisis de difraccin de rayos X de cristales de este complejo proteico transmembrana. El complejo est formado por cuatro subunidades, L, M, H y un citocromo. Las subunidades L y M forman el ncleo del centro de reaccin y cada una contiene cinco hlices a que atraviesan la bicapa lipdica. La localizacin de varias coenzimas transportadoras de electrones se muestra en negro. (Adaptado de un dibujo de J. Richardson, basado en datos de J. Deisenhofer, O. Epp, K. Miki, R. Huber y H. Michel, Nature 318:618-624,1985.)

subunidad M

subunidad L

ncleo hidrofbico de la bicapa lipidica

CITOSOL

subunidad H

Las protenas de m em brana actan a menudo como grandes com plejos 15

Hasta la fecha la ms compleja estructura de una protema transmembrana que ja ms ha sido estudiada mediante cristalografa de rayos X es el centro de reaccin fotosinttico bacteriano, cuya estructura atmica se defini en 1985. Los resultados de este anlisis fueron de importancia general en la biologa de membranas por que demostraron por primera vez que mltiples polipptidos pueden asociarse en una membrana formando una compleja maquinaria proteica (Figura 10-33). En el Captulo 14 discutimos cmo actan estos complejos fotosintticos capturando la energa lumnica y usndola para bombear H+a travs de la membrana. A menudo las protenas de membrana estn dispuestas formando grandes complejos, no slo para captar varias formas de energa, sino tambin para transducir las seales extracelulares en intracelulares (lo cual se discute en el Captulo 15).

Muchas protenas de m em brana difunden en el plano de la m em brana 16

Como ocurre con los lpidos de membrana, las protenas no saltan (flip-flop ) a travs de la bicapa, sino que giran alrededor de un eje aproximadamente per pendicular al plano de la bicapa (difusin rotacional). Adems, muchas prote nas de m em brana son capaces de desplazarse lateralmente por la membrana {difusin lateral). La primera evidencia de que algunas protenas de la m em bra na plasmtica son mviles en el plano de la membrana fue obtenida en 1970 mediante un experimento en el que se fusionaron artificialmente clulas de ra tn con clulas humanas, produciendo clulas hbridas (heterocariontes). Para

Protenas de membrana

531

distinguir las protenas de membrana plasmtica de ratn de las humanas se utilizaron dos anticuerpos con distinto mareaje. Aunque al principio las prote nas de ratn y las humanas estaban confinadas a su propia mitad del heterocarionte recin formado, las dos clases de protenas difundieron y se mezclaron ocupando, a la media hora, toda la superficie del heterocarionte (Figura 10-34). Poco despus se obtuvieron otras evidencias de la movilidad proteica de la membrana gracias al descubrimiento de los procesos llamados agrupamiento (patching) y form acin de caperuza (capping). Cuando los ligandos, como los anticuerpos, que tienen ms de un lugar de unin (por ello llamados ligandos multivalentes) se unen a protenas especficas de la superficie celular, las prote nas tienden a agregarse, mediante enlaces cruzados, formando grandes grupos (patches), lo cual indica que las protenas son capaces de desplazarse lateral mente por la bicapa lipdica. Una vez formados los agregados en la superficie de una clula capaz de moverse, como un leucocito, son trasladados activamente a uno de los polos celulares, formando una caperuza (o cap, Figura 10-35).

CLULA DE RATN

CLULA HUMANA

protena Y de m em brana proteina X de m embrana

protena de m em brana

protena de FUSION CELULAR m em brana AGRUPAMIENTO HETEROCARIONTE

adicin de anticuerpos anti-X grupo de protenas X

anticuerpos ( A ) contra protena de m em brana de ratn, marcados con fluorescencia ( )

anticuerpos (a ) contra protenas de mem brana humana, marcados con rodam ina ( )

FORMACION DE UNA CAPERUZA

INCUBACIN A 37C

\ v
'j

caperuza de protenas X

tiem po = 40 m inutos
Figura 10-34 Experim ento que m uestra la m ezcla de protenas de m em brana plasm tica que se produce en clulas hbridas ratn-hum anas. Inicialmente las protenas de ratn y las protenas humanas estn confinadas a sus propias mitades de la m em brana plasmtica del heterocarionte recin formado, pero se van entremezclando. Los dos anticuerpos que se usan para visualizar las protenas se pueden distinguir en un microscopio de fluorescencia dado que la fluorescena es verde y la rodamina es roja. (Basado en observaciones de L.D. Frye y M. Edidin, J. Cell Sci. 7:319-335,1970, con la autorizacin de The Company of Biologists.)

Figura 10-35 Agrupamiento y form acin de una caperuza de una protena de la superficie celular en un leucocito. Los anticuerpos bivalentes entrecruzan las molculas proteicas a las que se unen. Esto hace que estas molculas formen grandes grupos, los cuales son arrastrados activamente hacia el extremo posterior de la clula y forman una caperuza. El centrosoma, que gobierna la polaridad antero-posterior de la clula, se muestra en n aran ja.

532

Captulo 10 : Estructura de la membrana

BLANQUEO

MARCA

tiempo
(C)

BLANQUEO CON LSER rea de blanqueo

Figura 10-36 Medicin de la velocidad de difusin lateral de una protena de m em brana plasm tica, mediante la tcnica FRAP. Una

aiiiiiiiiin
RECUPERACIN (A) (B)

La velocidad de difusin lateral de las protenas de membrana puede medir se utilizando la tcnica de recuperacin de fluorescencia despus de fotoblanqueamiento (FRAP, de Fluorescence Recovery After Photobleaching). Habitualmente este mtodo comporta el mareaje de la protena de superficie que se pretende estudiar, con un ligando especfico fluorescente, como un anticuerpo fluores cente. (Es importante que se utilicen los fragmentos monovalentes de los anti cuerpos, que slo poseen un lugar de unin al antgeno, para evitar la formacin de enlaces cruzados entre molculas vecinas.) Luego, el ligando fluorescente es blanqueado en una pequea rea mediante un rayo lser, y se mide el tiempo que tardan las protenas de membrana adyacentes que transportan molculas de anticuerpo fluorescente no blanqueadas, hasta difundir en el rea blanquea da (Figura 10-36). A partir de estas mediciones se pueden calcular los coeficien tes de difusin de la protena de superficie celular que haba sido marcada. Los valores de los coeficientes de difusin para las diferentes protenas de membra na en clulas diferentes son muy variables, pero estn tpicamente comprendi dos entre una dcima o una centsima parte de los valores correspondientes para las molculas de fosfolpidos de la misma membrana.

protena especfica se marca, sobre la superficie de la clula, con un anticuerpo monovalente fluorescente que se une solamente a esta protena (para simplificar, no se muestran otras protenas). Luego se blanquean los anticuerpos de una pequea rea utilizando un lser, la intensidad de la fluorescencia se va recuperando a medida que la molculas blanqueadas difunden hacia el resto de la superficie celular y que las molculas no blanqueadas difunden a la zona iluminada con el lser. (Vista lateral en Ay superficial en B.) (C) Grfico que muestra la velocidad de recuperacin. Cuanto mayor es el coeficiente de difusin de la protena de membrana, mayor es la velocidad de recuperacin.

Figura 10-37 Diagrama de una clula epitelial en el que se m uestra com o una proteina de m em brana plasm tica se halla confinada en un dominio particular de la m em brana. La proteina A (en la zona

proteina A

apical de la membrana) y la proteina B (en la zona basai y basolateral) pueden difundir lateralmente en sus dominios respectivos pero no pueden entrar en el otro, en parte debido a la unin celular especial denominada unin estrecha o estanca. Igualmente, las molculas lipdicas de la monocapa exterior (no citoplasmtica) de la membrana plasmtica, tampoco pueden difundir entre ambos dominios, pero los lpidos de la monocapa interior (citoplasmtica) s pueden hacerlo (no se muestra).

membrana plasmtica apical membrana plasmtica lateral

unin estrecha

protena

lmina basal

Protenas de membrana

533

Figura 10-38 Tres dominios de la mem brana plasm tica de esperm a de cobaya, definidos m ediante anticuerpos monoclonales. (A) es

un esquema de esperma de cobaya y cada uno de los tres pares de micrografas (B), (C) y (D) muestra una tincin inmunofluorescente de superficie celular utilizando diferentes anticuerpos monoclonales (a la derecha) junto a una micrografa de contraste de fase de la misma clula (a la izquierda). El anticuerpo utilizado en (B) slo marca la cabeza anterior del espermatozoide, el de (C) slo marca la parte posterior de la cabeza y el de (D) slo marca la cola. (Cortesa de Selena Carroll y Diana Myles.)

parte anterior de la cabeza parte posterior de la cabeza

cola

(A)

Las clulas pueden confinar a lpidos y a protenas en dominios especficos de la m em brana 17

El reconocim iento de que las membranas biolgicas son fluidos bidimensionales constituy un gran avance en la comprensin de la estructura y de la funcin de la membrana. Ha quedado claro, sin embargo, que la representacin de la m em brana como un mar lipdico en el cual todas las protenas flotan librem en te, es una sobresimplificacin. Muchas clulas tienen sistemas que les permiten limitar sus protenas de m em brana en dominios especficos de la bicapa lipdica continua. Por ejemplo, en clulas epiteliales como las que revisten el intestino o los tbulos del rin, ciertas enzimas de la membrana plasmtica y algunas pro tenas de transporte estn limitadas a la superficie apical de la clulas mientras que otras protenas se hallan confinadas a las superficies basal y lateral (Figura 10-37). Esta distribucin asimtrica de las protenas es a menudo esencial para la funcin del epitelio, como se discute en el Captulo 11. La composicin lipdi ca de estos dos dominios de membrana tambin es diferente, lo cual demuestra que las clulas epiteliales pueden evitar la difusin de las molculas lipdicas y proteicas entre los dominios. Experimentos con lpidos marcados, no obstante, sugieren que slo estn confinadas de esta manera las molculas lipdicas de la m onocapa externa. Se cree que la separacin tanto de molculas de protena como de molculas lipdicas se mantiene, al menos en parte, por las barreras formadas por un tipo especfico de uniones intercelulares (llamadas uniones es trechas o estancas, discutidas en el Captulo 19). Est claro que las protenas de m em brana que forman estas uniones intercelulares no pueden difundir lateral mente entre las m em branas que estn interactuando Una clula tam bin puede crear dominios de membrana sin utilizar uniones intercelulares. El espermatozoide de mamferos, por ejemplo, es una clula aisla da que presenta varias zonas estructural y funcionalmente distintas delimitadas por una membrana plasmtica continua. Cuando se observa un espermatozoide por microscopa de inmunofluorescencia utilizando diferentes anticuerpos que reaccionen con antgenos de superficie, se constata que la membrana plasmtica presenta al menos tres dominios diferentes (Figura 10-38). En algunos casos, los antgenos son capaces de difundir dentro de los lmites de su propio dominio; se desconoce cmo se evita que abandonen dichos dominios. En los dos ejemplos que se acaban de considerar, tanto la difusin de las molculas de lpidos como la de protenas estn confinada a dominios especiali zados dentro de una mem brana plasmtica continua. Las clulas tambin tie nen sistemas ms drsticos para inmovilizar ciertas protenas de membrana. Uno de ellos est claram ente representado en la membrana prpura de Halobacterium. All las molculas de bacteriorrodopsina se ensamblan formando grandes cristales bidimensionales en los que las molculas proteicas individua les estn relativamente fijas unas respecto a las otras; los grandes agregados de

534

Captulo 10 : Estructura de la membrana

Figura 10-39 Cuatro sistemas mediante los cuales se puede restringir la movilidad lateral de determ inadas protenas de m em brana plasmtica. Las protenas pueden autoensamblarse formando grandes agregados (como en el caso de la bacteriorrodopsina en la membrana prpura de Halobacterium) (A); pueden estar trabadas por interacciones con agregados macromoleculares del exterior (B) o del interior (C) de la clula, o pueden interactuar con protenas de la superficie de otra clula (D).

este tipo difunden muy lentamente. Un sistema ms comn de restringir la m o vilidad lateral de protenas de mem brana especficas consiste en unirlas a en samblajes macromoleculares del interior o del exterior de la clula. Hemos visto cmo algunas protenas de la mem brana del eritrocito estn ancladas al citoesqueleto interior; en otros tipos celulares, las protenas de la membrana plasmti ca pueden anclarse al citoesqueleto o a la matriz extracelular o a ambos. En la Figura 10-39 se resumen los cuatro sistemas de inmovilizar protenas especficas de membrana.

La superficie celular est recubierta con residuos de azcar 18

Las protenas de membrana, por regla general, no sobresalen desnudas al exte rior celular, sino que estn decoradas, cubiertas o escondidas por carbohidratos presentes en la superficie de todas las clulas eucariotas. Estos carbohidratos se encuentran en forma de cadenas de oligosacrido unidas covalentemente a las protenas de mem brana (glucoprotenas) y a lpidos (glucolpidos) y como cade nas de polisacridos de molculas proteoglucanos integrales de membrana. Los proteoglucanos, que consisten en largas cadenas de polisacridos unidas cova lentem ente a un ncleo proteico, se encuentran principalmente en el exterior celular como parte de la matriz extracelular (discutida en el Captulo 19); pero en el caso de los proteoglucanos integrales de membrana, el ncleo proteico se extiende a travs de la bicapa lipdica o est anclado a la bicapa mediante un glucosilfosfatidilinositol (GPI). El trmino cubierta celular o glucocliz se utiliza a menudo para describir la zona de la superficie celular rica en carbohidratos. Esta zona puede ser visuali zada por medio de diversos colorantes, como el rojo de rutenio (Figura 10-40), o tam bin por su afinidad a protenas que se unen a carbohidratos, llamadas lectinas, que pueden ser marcadas con una tincin fluorescente u otro marcador vi sible. A pesar de que la mayor parte de los carbohidratos estn unidos a m olcu las intrnsecas de la membrana plasmtica, habitualmente el glucocliz contiene adems glucoprotenas y proteoglucanos que han sido secretados al espacio ex-

glucocliz

citoplasm a

ncleo

m em b ra n a plasm tica

Figura 10-40 La cubierta celular, o glucocliz. Electromicrografa de la superficie de un linfocito contrastado con rojo de rutenio para mostrar la cubierta celular. (Por cortesa de A. M. Glauert y G. M. W. Cook.)

i_______ )
200 nm

Protenas de membrana

535

glucoprotena transm em brana 4 = residuo de azcar cubierta celular (glucocliz)

glucoprotena adsorbida

Figura 10-41 Diagrama simplificado de la cubierta celular (glucocliz). La

bicapa lipidica

cubierta celular est formada por las cadenas laterales de oligosacridos de los glucolpidos y de las glucoprotenas integrales de membrana y por cadenas de polisacridos de proteoglucanos integrales de membrana. Adems, en muchas clulas los proteoglucanos y glucoprotenas adsorbidos (no mostrados aqu) contribuyen a la formacin del glucocliz. Ntese que todos los carbohidratos se hallan en la superficie no citoplasmtica de la membrana.

tracelular y que luego son adsorbidos en la superficie celular (Figura 10-41). Mu chas de estas macromolculas adsorbidas son com ponentes de la matriz extracelular, de forma que el lmite donde termina la membrana plasmtica y donde se inicia la matriz extracelular es slo una cuestin semntica. Las cadenas laterales de oligosacridos de las glucoprotenas y de los glucolpidos son extremadamente diversas en cuanto a la organizacin de sus azcares. A pesar de que habitualmente contienen menos de 15 residuos glucdicos, estos residuos estn a menudo ramificados y los azcares pueden estar unidos entre s mediante diversos enlaces covalentes. Esta distribucin es claramente diferente de la de los residuos de aminocidos de una cadena polipeptdica, que estn unidos por uniones peptdicas idnticas. Al unirse entre s, tres residuos glucdi cos pueden incluso formar cientos de trisacridos diferentes. En principio la di versidad y la posicin expuesta de estos polisacridos en la superficie celular les hace especialmente indicados para tomar parte en procesos de reconocimiento celular, pero durante m uchos aos ha existido poca evidencia de esta presunta funcin. Pareca ser que el papel de la cubierta celular poda ser meramente de proteccin frente a dao m ecnico y qumico y de m antener objetos extraos y otras clulas a distancia, impidiendo indeseables interacciones protena-protena. De hecho, es probable que sta sea una parte importante de su funcin. Re cientem ente, sin embargo, se ha determinado que las lectinas unidas a m em bra na plasmtica reconocen oligosacridos especficos de glucolpidos de la superficie celular, mediando as diversos procesos transitorios de adhesin clu la-clula, entre los cuales se cuentan los que ocurren en las interacciones esper ma-vulo, coagulacin sangunea, recirculacin de linfocitos y respuestas infla matorias.

Las selectinas son protenas de m em brana que se unen a carbohidratos de la superficie celular y que median adhesiones celulares transitorias en el torrente sanguneo 19
Uno de los ejemplos m ejor comprendidos del reconocimiento protena-carbohi drato se da en las respuestas inflamatorias, cuando los linfocitos (de la clase de nominada neutrfilos) son reclutados desde la sangre hacia una zona de infla macin en un tejido, usualmente para ayudar a combatir una infeccin local. Inicialmente, los neutrfilos se adhieren suavemente a las clulas endoteliales que limitan los vasos sanguneos de la zona y posteriormente se adhieren ms fuertemente y migran fuera de los vasos sanguneos, arrastrndose entre las c lulas endoteliales adyacentes. El inicio del proceso de adhesin implica el reco nocim iento protena-carbohidrato. Los mediadores qumicos locales liberados 536 Captulo 10 : Estructura de la membrana

neutrfilo glucoprotena glucolpido oligosacrido dom inio lectina dom inio semejante a EGF dom inios repetidos SELECTINA P
proteina

o lpido

clula endotelial

(A)
Figura 10-42 La interaccin protena-carbohidrato que inicia la adhesin transitoria de neutrfilos a las clulas endoteliales en las zonas de inflamacin.

(A) El dominio lectina de una P-selectina se une al oligosacrido especfico mostrado en (B), que est presente tanto en la glucoprotena de la superficie celular como en las molculas de glucolpido. El dominio lectina de las selectinas es homlogo a los dominios lectina encontrados en muchas otras protenas animales que se unen a carbohidratos; dado que la unin a sus ligandos glucdicos requiere Ca2+ , se les llama lectinas de tipo C. En (C) se muestra la estructura tridimensional de uno de estos dominios lectina, determinado por cristalografa de rayos X; su enlace glucdico aparece de color azul. Gal = galactosa; GlcNAc = Nacetilglucosamina; Fue = fucosa; NANA = cido silico.

COOH

por las clulas en el lugar de la inflamacin sealizan a las clulas endoteliales de la regin para que expresen una glucoprotena transmembrana denominada P-selectina, que pertenece a la familia de molculas de adhesin clula-clula llamada selectinas. Las selectinas contienen un dominio lectina de unin a car bohidratos, en el extremo de un ensanchado tallo proteico que se extiende desde la superficie celular (Figura 10-42A). El dominio de lectina de la P-selecti na reconoce el oligosacrido especfico, como se muestra en la Figura 10-42B. Dado que este oligosacrido se expresa en las molculas de glucolpido y de glu coprotena de la superficie de los neutrfilos, stos se adhieren especficamente a las clulas endoteliales que limitan los vasos sanguneos de la zona inflamada. La unin de cada dominio de lectina a su oligosacrido especfico es de rela tivamente baja actividad y al parecer tanto la asociacin como la posterior diso ciacin de dicha unin, ocurren rpidamente. Ello permite a las selectinas unir a las paredes de los capilares las clulas sanguneas en trnsito, permitiendo al mismo tiempo que las clulas adheridas, impulsadas por el flujo sanguneo, se desplacen a lo largo del endotelio hacia la zona inflamada. Este desplazamiento contina hasta que otro m ecanismo de adhesin clula-clula, mediado por un tipo distinto de protenas transmembrana, denominadas integrinas (discutidas en el Captulo 19), se activa y refuerza la adhesin, permitiendo a los neutrfilos detener sus movimiento y arrastrarse fuera de los capilares sanguneos hacia el tejido. Cuando los linfocitos migran fuera del torrente sanguneo hacia el ndulo linftico tiene lugar una secuencia de eventos de adhesin similar mediada por selectinas e integrinas (vase Figura 23-9). Diversas selectinas se expresan en la superficie de los leucocitos, plaquetas y clulas endoteliales, participando en una amplia gama de interacciones transi torias clula-clula dentro del torrente sanguneo.

Protenas de membrana

5 37

Resumen
Mientras que la bicapa lipidien determina la estructura bsica de las membranas biolgicas, las protenas son las responsables de la mayora de las funciones de las membranas, actuando de receptores especficos, enzimas o protenas de transporte y otras muchas Junciones. Muchas protenas de membrana atraviesan la bicapa li pdica: en algunas de estas protenas transmembrana la cadena de polipptidos cruza la bicapa como una hlice a nica (protenas de paso nico); en otras, inclui das las responsables del transporte transmembrana de iones y otras pequeas mo lculas solubles en agua, la cadena polipeptdica cruza la bicapa varias veces, ya sea en series de hlices a o como lminas P en forma de un barril cerrado (protenas de paso mltiple). Otras protenas asociadas a la membrana no atraviesan la bica pa pero en cambio se hallan unidas a una cara u otra de la membrana. Muchas de estas protenas se unen a protenas transmembrana mediante interacciones no covalentes, pero otras estn unidas por medio de la unin covalente a grupos lipid eos. Como ocurre con las molculas lipdicas de la bicapa, muchas protenas de membrana son capaces de difundir rpidamente en el plano de la membrana. Por otro lado, las clulas tienen sistemas para inmovilizar protenas especficas de membrana y para confinar tanto protenas de membrana como molculas lipdicas a dominios particulares de una bicapa lipdica continua. En la membrana plasmtica de todas las clulas eucariotas, la mayora de las protenas que quedan al descubierto sobre la superficie celular y algunas de las molculas lipdicas de la monocapa lipdica externa tienen cadenas de oligosacri dos unidas covalentemente. Algunas membranas plasmticas tambin contienen molculas integrales de proteoglucanos con cadenas de polisacridos expuestas a la superficie. Esta cubierta de azcares ayuda a proteger la superficie celular del dao mecnico y qumico, y algunas de las cadenas de oligosacridos son reconoci das por protenas que se unen a carbohidratos de la superficie celular (lectinas) que intervienen en procesos de adhesin clula-clula especficos y transitorios.

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540

Capitulo 10 : Estructura de la membrana

Transporte de molculas pequeas a travs de la membrana y base inica de la excitabilidad de la membrana

'?s !!14SrS

Principios de transporte a travs de membrana Protenas transportadora y transporte activo a travs i de membrana Canales inicos y propiedadt ct ricas de las membi i ranas

Debido a su interior hidrofbico, la bicapa lipdica de una clula constituye una barrera altamente impermeable a la mayora de las molculas polares. Esta fun cin de barrera es de una im portancia crucial ya que permite a la clula m ante ner en su citosol ciertos solutos a concentraciones diferentes a las que estn en el fluido extracelular y en cada uno de los compartimientos intracelulares en vueltos por una m embrana. Sin embargo, para poder utilizar esta barrera las c lulas han tenido que desarrollar sistemas para transportar especficamente m o lculas hidrosolubles a travs de sus membranas y as poder ingerir los nutrientes esenciales, excretar los productos residuales del metabolismo y regu lar las concentraciones intracelulares de iones. El transporte de iones inorgni cos y de pequeas m olculas orgnicas hidrosolubles a travs de la bicapa lipdi ca se consigue mediante protenas transmembrana especializadas, cada una de las cuales es responsable de la transferencia de una molcula o un ion especfi cos o de un grupo de molculas o iones afines. Las clulas tambin pueden transportar a travs de sus m embranas macromolculas e incluso grandes part culas, pero los mecanismos que intervienen en estos casos son muy diferentes de los utilizados para transferir pequeas molculas, por lo que se estudian en los Captulos 12 y 13. La im portancia del transporte a travs de las m embranas queda puesta de manifiesto por el hecho de que casi el 20% de los genes identifi cados hasta ahora en E. cot estn asociados a estos procesos de transporte. Iniciamos esta captulo considerando algunos principios generales que guiarn nuestra discusin sobre la manera en que las pequeas molculas cru zan las m embranas celulares. Por lo tanto consideraremos las dos clases princi pales de protenas de mem brana que median el transporte: las protenas trans portadoras, las cuales tienen partes mviles que les permiten transportar molculas especficas a travs de la membrana, y las protenas de canal, que for man un estrecho poro hidrofbico que permite el desplazamiento pasivo de pe queos iones inorgnicos. Las protenas transportadoras pueden acoplarse a una fuente de energa y catalizan un transporte activo; la com binacin de una permeabilidad selectiva pasiva y un transporte activo genera grandes diferencias de com posicin del citosol respecto al fluido extracelular (Tabla 11-1) o al fluido del interior de los orgnulos envueltos en membrana. Concretamente, generan do diferencias de concentracin inica a travs de la bicapa lipdica, las m em branas celulares son capaces de almacenar energa potencial en forma de gra dientes electroqumicos, los cuales se utilizan para impulsar varios procesos de transporte, para transportar seales elctricas en clulas excitables elctrica mente y (en mitocondrias, cloroplastos y bacterias) para fabricar la mayor parte 541

Tabla 11 -1 Comparacin de las concentraciones inicas en el interior y el exterior de una clula de mamfero
C om p on en te C o n cen traci n in tracelu lar (mM) C o n cen traci n extracelu lar (mM)

Cationes Na+ K+ Mg2 + Ca2 + H+ Aniones* Cl-

5-15 140 0,5 10-4 7 x 10-5 (10-72 M o pH 7,2)

145 5

1-2

1-2 4 x IO-5 (IO74 M o pH 7,4)

5-15

110

* Puesto que la clula debe tener la misma cantidad de cargas + que - (es decir, ha de ser elctri camente neutra), adems de Cl- la clula contiene muchos otros aniones que no se presentan en esta tabla; de hecho, la mayora de los constituyenes celulares estn cargados negativamente (HCOj, PO,,3-, protenas, cidos nucleicos, metabolitos que contienen grupos fosfato y carboxilo, etc.). Las concentraciones dadas para Ca2 + y Mg2t corresponden a las de los iones libres. En las clulas, hay un total de aproximadamente 20 mM Mg2 + y 1-2 mM Ca2 + pero en su mayor parte ambos cationes estn unidos a protenas y a otras substancias; en el caso del Ca2+ , una elevada cantidad se encuentra almacenada en varios orgnulos.

del ATP celular. Centramos la discusin principalmente en el transporte a travs de la m em brana plasmtica pero, com o discutiremos en captulos posteriores, en las otras m embranas de la clula eucariota existen mecanismos similares a los que describiremos. En la ltima parte de este captulo centramos la atencin principalmente en las funciones de los canales inicos de las clulas nerviosas, ya que es en estas clulas donde las protenas de canal adquieren el mximo ni vel de sofisticacin, permitiendo que redes de clulas nerviosas desarrollen las extraordinarias caractersticas de las que es capaz el cerebro humano.

o2

MOLCULAS C 0 2 HIDROFBICAS n 2 benceno PEQUEAS MOLCULAS POLARES NO CARGADAS GRANDES MOLCULAS POLARES NO CARGADAS IONES H20 urea L glicerol glucosa sacarosa
*

Principios de transporte a travs de membrana1

Iniciamos esta seccin describiendo las propiedades de permeabilidad de bicapas lipdicas sintticas, libres de protena. A continuacin, introducimos algunos trminos utilizados para describir los diversos tipos de transporte a travs de m em brana y algunas estrategias para caracterizar las protenas y los procesos que participan en ellos.

<0
H+, Na- i j HCO3 , K+ Ca2\ Cl ! M g2+

Las bicapas lipdicas libres de protena son altam ente im perm eables a los iones 2
Con tiempo suficiente, prcticam ente cualquier molcula acabar difundiendo a travs de una bicapa lipdica libre de protena a favor de su gradiente de con centracin. Sin embargo, la velocidad a la que se produce esta difusin varia enorm em ente, dependiendo en parte del tamao de la molcula y, principal mente, de su solubilidad relativa en aceite. En general, cuanto menor es la m ol cula y cuanto ms soluble en aceite (es decir, cuanto ms hidrofbica o no polar es) ms rpidamente difunde a travs de una bicapa. Las molculas pequeas no polares tales como el 0 2 (32 daltons) y el C 0 2 (44 daltons), se disuelven fcil mente en las bicapas lipdicas y por lo tanto difunden con rapidez a travs de ellas. Las molculas polares no cargadas tam bin difunden rpidamente a travs de una bicapa si su tamao es suficientemente reducido. Por ejemplo, el agua (18 daltons), el etanol (46 daltons) y la urea (60 daltons) atraviesan rpidamente una bicapa; el glicerol (92 daltons) lo hace con menor rapidez, y la glucosa (180 daltons) prcticam ente no la atraviesa (Figura 11-1).

bicapa lipdica artificial

Figura 11-1 Permeabilidad relativa de una bicapa lipdica sinttica a diferentes tipos de molculas. Cuanto menor sea la molcula y, lo que es ms importante, cuanto m enor sea el nmero de enlaces de hidrgeno que establezca con el agua, ms rpidamente difundir a travs de la membrana.

542

Captulo 11: Transporte de molculas pequeas a travs de la membrana

Por el contrario, las bicapas lipdicas son altamente impermeables a todas las molculas cargadas (iones), por muy pequeas que sean: la carga y el elevado grado de hidratacin de tales molculas les impiden penetrar en la fase hidrocarbonada de la bicapa. As, las bicapas sintticas son 109 veces ms permeables al agua que a los iones, incluso a los de reducido tamao como el Na+ o el K+ (Fi gura 11-2).

perm eabilidad elevada

A
h 2o

-----

- -

10 2

10 4
urea glicerol ----- triptfano ----- glucosa -----
- - 10"8

Existen dos clases principales de protenas de transporte a travs de m em brana: protenas transportadoras y protenas de canal 1
Como las bicapas lipdicas sintticas, las membranas celulares permiten el paso por simple difusin del agua y de las molculas no polares. Sin embargo, las membranas celulares tam bin son permeables a diversas molculas polares que atraviesan con gran lentitud las bicapas lipdicas sintticas, tales como iones, azcares, aminocidos, nucletidos y muchos metabolitos celulares. Unas pro tenas de mem brana especiales son las responsables de la transferencia de estos solutos a travs de las membranas celulares. Estas protenas, que reciben el nombre de protenas de transporte a travs de membrana, se presentan en m u chas formas y en todos los tipos de m embranas biolgicas. Cada protena est destinada al transporte de un tipo particular de molculas (tales como iones, azcares o aminocidos) y con frecuencia nicamente de una cierta especie m o lecular de la clase. La especificidad de las protenas de transporte fue sugerida por primera vez a mediados de los aos 1950 gracias a unos estudios en los que se encontr que unas mutaciones en un solo gen supriman la capacidad de las bacterias para transportar unos azcares determinados a travs de su membrana plasmtica. Actualmente se han descubierto mutaciones similares en personas que sufren diversas enfermedades hereditarias, las cuales afectan al transporte de un soluto determinado en el rin, en el intestino o en ambos tejidos. Por ejemplo, los individuos que presentan la enfermedad gentica cistinuria son in capaces de transportar ciertos aminocidos (incluyendo la cistina, el dmero for mado por la unin, a travs de un enlace disulfuro, de dos cisternas) tanto desde la orina como desde el intestino hacia la sangre; de la acumulacin de cistina en la orina resulta la formacin de piedras de cistina en los riones. Todas las protenas de transporte a travs de membrana que han sido estu diadas con detalle suficiente para poder establecer su orientacin en la membra na, son protenas transmembrana multipaso -e s decir, su cadena polipeptdica atraviesa la membrana varias veces. Se cree que estas protenas establecen una va continua de protena a travs de la membrana, permitiendo as el transporte de solutos especficos sin que lleguen a entrar en contacto directo con el interior hidrofbico de la bicapa lipdica. Existen dos clases mayoritarias de protenas de transporte de membranas: las protenas transportadoras y las protenas de canal. Las protenas transporta doras (tambin denominadas transportadores, carriers o permeasas ) se unen al soluto especfico que va a ser transportado y sufren una serie de cambios conformacionales que permiten la transferencia del soluto a travs de la membrana. Por otro lado, las protenas de canal no se unen al soluto sino que forman poros hidrofflicos que atraviesan la bicapa lipdica; cuando estos poros estn abiertos permiten que determinados solutos (habitualmente iones inorgnicos de tamao y carga apropiados) puedan pasar a su travs, y por lo tanto atravesar la m embra na (Figura 11-3). No sorprende que el transporte a travs de las protenas de canal se produzca a velocidad mucho mayor que a travs de protenas de transporte.

U-io-1 4

perm eabilidad baja

Figura 11-2 Coeficientes de permeabilidad (cm/seg) p ara el paso de diversas molculas a travs de bicapas lipdicas sintticas. El flujo de

un soluto a travs de la bicapa es directamente proporcional a la diferencia de sus concentraciones a los dos lados de la membrana. Multiplicando esta diferencia de concentracin (en moles /cm3) por el coeficiente de permeabilidad (cm/seg) se obtiene el flujo del soluto en moles por segundo por centmetro cuadrado de membrana. Por ejemplo, una diferencia de concentracin de triptfano de 10-4 moles/cm3 (O^/IO'3 L = 0,1 M) producira un flujo de 10-4 mol/cm3x 10~7 cm/seg = 10~u moles/seg a travs de 1 cm2 de membrana, es decir, de 6 x 104 molculas/seg a travs de 1 |j.m 2 de membrana.

El transporte activo est mediado por protenas transportadoras acopladas a una fuente energtica 1,3
Todas las protenas de canal y muchas protenas de transporte tan slo permi ten que los solutos atraviesen la mem brana de forma pasiva (cuesta abajo) -u n proceso llamado transporte pasivo (o difusin facilitada). Si la molcula

Principios de transporte a travs de membrana

543

bicapa lipidica lugar de unin al soluto (A) PROTENA TRANSPORTADORA

transportada carece de carga, la direccin del transporte pasivo viene determi nada tan slo por la diferencia de concentracin a los dos lados de la membrana (su gradiente de concentracin). Sin embargo, si el soluto tiene una carga neta, su transporte se ve influido tanto por su gradiente de concentracin como por el gradiente elctrico a travs de la m em brana (el potencial de membrana). El gra diente de concentracin y el gradiente elctrico pueden combinarse para calcu lar la fuerza neta de direccin del flujo, o gradiente electroqumico, para cada soluto cargado. En el Captulo 14 discutimos este aspecto ms detalladamente. De hecho, casi todas la m em branas plasmticas tienen una diferencia de poten cial (gradiente de voltaje) a travs de ellas, siendo habitualmente el interior ne gativo con respecto al exterior. Esta diferencia de potencial favorece la entrada a las clulas de iones cargados positivamente y se opone a la entrada de iones car gados negativamente. Las clulas tam bin necesitan protenas de transporte que bom been activa m ente ciertos solutos a travs de la membrana en contra de su gradiente electro qumico (cuesta arriba); este proceso, conocido como transporte activo, est siempre mediado por protenas transportadoras. En el transporte activo la acti vidad bom beadora de la protena de transporte es direccional ya que, tal como explicaremos ms adelante, est acoplada a una fuente de energa metablica como la hidrlisis del ATP o a un gradiente inico. As pues, el transporte media do por protenas de transporte puede ser activo o pasivo, mientras que el trans porte mediado por protenas de canal siempre es pasivo (Figura 11-4).

poro acuoso (B) PROTENA DE CANAL

Figura 11-3 Visin esquem tica de dos clases de protenas de transporte a travs de m em brana. Se cree que las p roten as tran sp ortad oras alternan dos conform aciones de forma que el lugar de unin al soluto es accesible secuencialm ente desde un lado de la bicapa, y luego desde el otro lado. Por el contrario, una p ro ten a d e c a n a l forma un poro lleno de agua que atraviesa la bicapa, a travs del cual pueden difundir determinados iones.

La tecnologa del DNA recom binante ha revolucionado el estudio de las protenas de transporte a travs de m em brana 4
Debido a la dificultad de obtener cristales tridimensionales de las protenas que atraviesan la m em brana varias veces para estudios de cristalografa de rayos X, no conocem os la estructura tridimensional detallada de las protenas de trans porte a travs de mem brana a las que nos referiremos. Por ello, no entendemos los mecanismos moleculares que estas protenas utilizan para transportar deterFigura 11-4 Com paracin entre un transporte pasivo a favor de un gradiente electroqumico y un transporte activo 'en con tra de un gradiente electroqumico. Mientras que la difusin simple y el transporte pasivo mediados por protenas de transporte (difusin facilitada) ocurren espontneamente, el transporte activo requiere de una entrada de energa metablica. nicam ente las protenas transportadoras pueden realizar transporte activo, mientras que tanto las protenas transportadoras com o las protenas de canal pueden mediar difusin facilitada.

m olcula transportada O "" O

( de canal

protena

"O

proteina transportadora / \ \ /

cgcgo ogogo
/ '\ 1 gradiente electroqum ico o o

bicapa lipidica

/ ( ~ \ ") \ I c -' I

difusin sim ple

difusin difusin mediada m ediada por i por canal transportador. TRANSPORTE PASIVO (DIFUSIN FACILITADA)

TRANSPORTE ACTIVO

544

Captulo 11: Transporte de molculas pequeas a travs de la membrana

minados solutos a travs de la bicapa lipdica. Sin embargo mediante otros m todos se han obtenido importantes datos, especialmente mediante la tecnologa del DNA recombinante. Una vez se ha clonado y secuenciado el DNA que codifica una protena transportadora, se puede deducir la secuencia de aminocidos de la cadena polipeptdica y se puede estimar el nmero de hlices a transmembrana mediante el anlisis de grficos de hidropata (se discute en el Captulo 10). Se pueden utilizar anticuerpos desarrollados contra pptidos sintticos que corresponden a deter minados segmentos de la cadena polipeptdica para determinar qu segmentos se hallan expuestos a uno y otro lado de la membrana. Adems, se puede alterar la secuencia de DNA que codifica zonas especficas de la protena mediante mutagnesis especfica de lugar, y el mRNA mutante correspondiente se puede in yectar a clulas de mamfero mantenidas en cultivo o a oocitos de Xenopus, donde dirigir la sntesis de protenas mutantes cuya actividad transportadora puede entonces estudiarse fcilmente. De esta forma, se pueden identificar los residuos de aminocido y los segmentos de protena que son funcionalmente importantes. Sin embargo, los resultados de estos estudios deben interpretarse con precaucin ya que a veces una pequea carga en una zona de la protena puede tener grandes efectos en la conformacin de toda la protena y, por lo tanto, en su funcin, incluso aunque la zona alterada no participe directamente en la funcin estudiada. Sin embargo, como veremos, esta estrategia ha resulta do ser de una gran utilidad. La tecnologa del DNA recombinante tambin ha contribuido de otra m ane ra al conocimiento de las protenas de transporte a travs de membrana. Cuando se ha aislado el DNA que codifica una protena, generalmente resulta relativa mente sencillo utilizar este DNA como sonda para aislar secuencias de DNA re lacionadas que codifican protenas homlogas. Estos estudios han revelado que el transporte a travs de membrana est mediado por un nmero sorprenden temente pequeo de familias de protenas, cuyos miembros tienen estructuras relacionadas entre s y, probablemente, mecanismos de accin relacionados y un origen evolutivo comn. Sin embargo una familia determinada puede con tener un gran nmero de protenas diferentes, e incluso a menudo los miem bros de una familia pueden presentar muchas variantes (denominadas isoformas) producidas tanto por genes diferentes a travs de transcritos de RNA procesados de forma diferente a partir de un mismo gen. En algunos casos las isoformas difieren en su actividad transportadora, en su momento de expresin durante el desarrollo, en su distribucin tisular, en su localizacin en la clula o en cualquier combinacin de estas propiedades. En otros casos, el sentido de esta heterogeneidad resulta poco claro. Antes de discutir con detalle las diferentes clases de protenas transporta doras a travs de membrana y los conocimientos conseguidos mediante estas tcnicas, consideraremos brevemente otra clase de molculas que pueden in crementar selectivamente la permeabilidad de las bicapas lipdicas. Estas mol culas proporcionan un ejemplo sencillo de alguno de los principios discutidos anteriormente.

ion transportado

Se pueden utilizar ionforos como herramientas para incrementar la permeabilidad de las membranas a determinados iones 5
Los iondforos son pequeas molculas hidrofbicas que se disuelven en las bi capas lipdicas e incrementan su permeabilidad a determinados iones inorg nicos. La mayora de ellos estn sintetizados por microorganismos (probable mente como armas contra competidores o contra presas). Son ampliamente utilizados por los bilogos celulares en estudios sobre membranas sintticas, c lulas o orgnulos celulares, como herramientas para incrementar la permeabili dad inica de la membrana. Existen dos clases de ionforos -transportadores mviles y form adores de canal (Figura 11-5). Ambos tipos actan rodeando la carga del ion transportado de forma que pueda atravesar el interior hidrofbico

form ador del canal

transportador m vil

Figura 11-5 Un transportador inico mvil y un ionforo formador de canal. En ambos casos el flujo neto de

iones se produce nicamente a favor de gradiente electroqumico.

Principios de transporte a travs de membrana

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de la bicapa lipdica. Dado que los ionforos no estn acoplados a fuentes de energa, slo permiten el movimiento neto de iones a favor de su gradiente elec troqumico. La valinomicina es un ejemplo de un transportador mvil. Se trata de un polmero en forma de anillo que transporta K+a favor de su gradiente electroqu mico, tomando K+ de un lado de la membrana, difundiendo a travs de la bica pa, y liberando el K+al otro. El ionforo A23187 constituye otro ejemplo de trans portador inico mvil, pero transporta cationes divalentes como Ca2 + y Mg2+ . Normalmente acta como una lanzadera intercambiadora de iones, transpor tando dos H+ hacia el exterior de la clula por cada catin divalente que trans porta hacia el interior celular. Cuando una clula se expone a A23187, el Ca2+ en tra al citosol desde el lquido extracelular a favor de su enorme gradiente electroqumico. Por ello, este ionforo se utiliza ampliamente en biologa celular para increm entar las concentraciones de Ca2+ libre en el citosol, mimetizando as algunos mecanism os de sealizacin celular (discutidos en el Captulo 15). La gramicidina A es un ejemplo de ionforo formador de canal. Se trata de un pptido lineal de nicamente 15 residuos de aminocido, todos ellos con una cadena lateral hidrofbica, por lo que constituye el canal inico ms sencillo y m ejor caracterizado de los conocidos. Se cree que dos molculas de gramicidina se unen, cola con cola, a travs de la bicapa lipdica formando un canal trans membrana (Figura 11-6), que permite selectivamente que los iones monovalen tes fluyan a favor de sus gradientes electroqumicos. Estos dmeros son inesta bles y se estn formando y disociando constantem ente, de forma que el tiempo medio de apertura de estos canales es alrededor de 1 segundo. Con un elevado gradiente electroqumico la gramicidina A puede transportar unos 20 000 catio nes por canal abierto cada milisegundo, lo cual es 1000 veces ms de lo que pue de transportar una molcula de transportador mvil en el mismo tiempo. La gramicidina es sintetizada por ciertas bacterias, quizs para matar otros m icro organismos colapsando los gradientes de H\ Na+y K+ , que son esenciales para la supervivencia de la clula; ha sido utilizada con xito como antibitico.

Figura 11-6 Estructura de un canal de gramicidina. El canal est formado por la asociacin de dos pptidos idnticos por sus extremos amino terminales. Cada cadena est plegada formando una hlice P como una lmina p enrollada. (A) Vista lateral y (B) vista superior. Los esqueletos peptdicos que rodean el canal se muestran en a z u l y en verde oscuro mientras que en verde claro se representa el espacio ocupado por las cadenas laterales hidrofbicas que sobresalen. La bicapa lipdica se muestra en gris. (C) muestra el tamao de los iones K+no hidratados mientras que (D) muestra una vista superior de una hlice a que atraviesa la membrana, para compararla con la hlice p. Ntese que la hlice a no forma poro, de manera que por s sola no puede formar canal. (De S. Weinstein, B.A. Wallace, E.R. Blout, J.S. Morrow y W. Veatch, Proc. Nati. Acad. Sci. 76:4230, 1979.)

Resumen
Las bicapas lipdicas son altamente impermeables a la mayora de molculas pola res. Para transportar pequeas molculas solubles en agua hacia el interior o hacia el exterior de las clulas o de los compartimientos intracelulares delimitados por membrana, las membranas celulares contienen varias protenas de transporte, cada una de las cuales es responsable de transferir un determinado soluto o clase de solutos a travs de la membrana. Existen dos clases de protenas de transporte a travs de membrana -transportadoras y de canal; ambas forman vas continuas de transporte a travs de la bicapa lipdica. Mientras que el transporte mediado por protenas transportadoras puede ser activo o pasivo, el mediado por protenas de

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Captulo 11: Transporte de molculas pequeas a travs de la membrana

canal es siempre pasivo. Los ionforos, pequeas molculas hidrofbicas sintetiza das por microorganismos, pueden utilizarse en estudios de clulas u orgnulos como herramientas para incrementar la permeabilidad de las membranas celula res a determinados iones inorgnicos.

Protenas transportadoras y transporte activo a travs de membrana1,6

Km

El proceso por el cual una protena transportadora transfiere una molcula de soluto a travs de la bicapa lipdica se parece a una reaccin enzima-substrato, y los transportadores implicados en este proceso se comportan com o enzimas es pecializadas ligadas a la membrana. Cada tipo de protena transportadora tiene uno o ms lugares de unin especficos para su soluto (substrato). Cuando el transportador est saturado (es decir, cuando todos estos lugares de unin estn ocupados), la velocidad de transporte es mxima. Esta velocidad, indicada como Vm ax, es caracterstica del transportador. Cada protena transportadora tiene ade ms una constante caracterstica de unin para su soluto, Kw igual a la concen tracin del soluto cuando la velocidad de transporte es la mitad del valor mxi mo (Figura 11-7). Como con las enzimas, la unin del soluto puede ser bloqueada especficam ente por inhibidores competitivos (que compiten por el mismo lugar de unin y que pueden ser transportados o no por el transportador) o por inhibidores no competitivos (que se unen a algn otro lugar y que alteran especficam ente la estructura del transportador). Sin embargo, a diferencia de las reacciones enzima-substrato normales, el soluto transportado no suele ser modificado covalentemente por la protena transportadora. Algunas protenas de transporte simplemente transportan un soluto de un lado a otro de la membrana a una velocidad determinada por la Vm ax y la KM ; re ciben el nombre de transportadores sencillos o uniportes (uniporters). Otras, de cintica ms compleja, actan como transportadores acoplados (coupled transporters), en los que la transferencia de un soluto depende de la transferen cia simultnea o secuencial de un segundo soluto, ya sea en la misma direccin [transporte unidireccional o simporte (symport)] o en direccin opuesta [transporte de intercambio o antiporte (antiport)] (Figura 11-8). La mayora de las clulas animales, por ejemplo, toman glucosa del fluido extracelular, donde la concentracin del azcar es alta en relacin a la del citosol, mediante un trans porte pasivo a travs de transportadores de glucosa que actan como transporta dores sencillos. Existen varios de estos transportadores de glucosa, todos ellos pertenecientes a la misma familia de protenas homlogas con 12 posibles hlices a transmembrana. En cambio, las clulas intestinales y las renales captan glucosa de la luz del intestino y de los tbulos del rin respectivamente, donde la con centracin del azcar es baja. Estas clulas transportan la glucosa a travs de su membrana plasmtica mediante un transporte unidireccional con Na+ . Como se

concentracin de la molcula transportada

Figura 11-7 Comparacin entre la cintica de la difusin simple y la de difusin mediada por transportador. Mientras que la velocidad de la primera siempre es proporcional a la concentracin de soluto, la de la segunda alcanza un mximo (Vm a x ) cuando la protena de transporte est saturada. Cuando el transporte se produce a mitad de la velocidad mxima, la concentracin de soluto se aproxima a la constante de unin (KM ) del transportador para el soluto y es anloga a la KM de una enzima para su substrato. La grfica se refiere a un transportador que transporta un soluto; las cinticas del transporte acoplado de dos o ms solutos (vase el texto) son ms complejas, aunque muestran bsicamente el mismo fenmeno.

ion cotransportado

bicapa lipdica

Figura 11-8 Tres tipos de transporte mediado por transportadores. El diagrama esquemtico muestra protenas transportadoras actuando como un transportador sencillo (uniporte), como un transportador acoplado unidireccional (simporte) y como un transportador acoplado de intercambio (antiporte).

UNIPORTE

| SIMPORTE

ANTIPORTE

transporte acoplado

Protenas transportadoras y transporte activo a travs de membrana

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soluto bicapa lipidica pong

proteina transportadora que media la difusin facilitada

discute en el Captulo 10, la protena banda 3, del eritrocito humano es un trans portador aninico que intercam bia Cl~ por HCOj. Aunque se desconocen los detalles moleculares, se cree que las protenas transportadoras transfieren los solutos a travs de la bicapa mediante un cambio conform acional reversible que alternativamente expone primero el lugar de unin al soluto a una cara de la m em brana y luego a la otra. En la Figura 11-9 se muestra un modelo esquemtico de cmo puede actuar una protena transpor tadora de este tipo. Actualmente se sabe que los transportadores son protenas transm em brana de multipaso, por lo que es altamente improbable que acten girando en el interior de la mem brana o como una lanzadera de una cara a otra a travs de la membrana, com o se crea antes. Tal com o se explica ms adelante, una m odificacin relativamente peque a del modelo mostrado en la Figura 11-9 es suficiente para unir la protena transportadora a una fuente de energa (como la hidrlisis del ATP [vase Figu ra 11-11] o un gradiente inico), y poder bom bear un soluto cuesta arriba, en contra de su gradiente electroqum ico. De hecho, el estudio comparado de al gunas protenas transportadoras de bacteria y de clulas de mamfero coincide con la idea de que las diferencias necesarias en el diseo molecular entre una protena transportadora que media un transporte activo y otra que trabaja de forma pasiva, son mnimas. Algunos transportadores, que en las bacterias utili zan energa almacenada en un gradiente de H+ a travs de la membrana plas m tica bacteriana para dirigir la captacin activa de diferentes azcares, son estructuralm ente sim ilares a los transportadores pasivos de glucosa de las c lulas anim ales; dada la im portancia de los azcares com o fuente energtica no resulta sorprendente que esta superfam ilia de transportadores de azcares sea muy antigua. Empezamos nuestra discusin sobre el transporte activo considerando una protena transportadora que desempea un papel crucial en la generacin y el mantenim iento de los gradientes de Na+ y de K+ a travs de la membrana plas m tica de las clulas animales.

Figura 11-9 Modelo hipottico que muestra de qu forma un cambio de conformacin de una protena transportadora podra mediar la difusin facilitada de un soluto. La protena transportadora puede existir en dos estados de conformacin diferentes: en el estado pong los lugares de unin para el soluto A son accesibles desde el exterior de la bicapa; en el estado ping estos mismos lugares de unin son accesibles desde el otro lado de la bicapa. Se propone que las transiciones entre ambos estados se producen al azar, de forma completamente reversible. Por lo tanto, si la concentracin de A es mayor en el exterior de la bicapa, se unir una mayor cantidad de A a la protena transportadora de conformacin pong, producindose un transporte neto de A a favor de su gradiente electroqumico.

La bom ba de Na+-K+de la m em brana plasm tica es una ATPasa7

La concentracin de K+ en el interior celular es tpicamente de 10 a 20 veces ms alta que en el exterior, mientras que ocurre lo contrario para el Na+ (vase Tabla 11-1, pg. 542). Estas diferencias de concentracin se mantienen mediante una bom ba de Na+ -K+ que se halla en la m em brana plasmtica de prcticamente to das las clulas animales. La bom ba acta como un transportador de intercambio (antiporte), bom beando de forma activa Na+hacia el exterior de la clula en con tra de su gradiente electroqumico y K+ hacia el interior. Como se explica ms adelante, el gradiente de Na+ debido a la bom ba regula el volumen celular a tra vs de sus efectos osmticos y tam bin se utiliza para dirigir el transporte de azcares y de aminocidos hacia el interior de la clula. Casi una tercera parte de toda la energa que consum e una clula animal tpica se utiliza para impulsar esta bomba. En las clulas nerviosas elctricam ente activas que, como veremos

548

Captulo 11: Transporte de molculas pequeas a travs de la membrana

lugar de unin al K+ y a la ouabana gradiente electroqumico de sodio lugar de unin al IMa+ CITOSOL

gradiente electroqumico de potasio

Figura 11-10 La ATPasa de Na+ -K+ . Esta protena transportadora bombea activamente Na* hacia el exterior y K+ hacia el interior de la clula, en contra de sus gradientes electroqumicos. Por cada molcula de ATP hidrolizada dentro de la clula, se bombean tres Na+hacia el exterior y dos K+hacia el interior. La ouabana, inhibidor especfico de la bomba, y el K+ compiten por el mismo lugar del lado externo de la ATPasa.

ms adelante, durante la propagacin del impulso nervioso ganan continua mente pequeas cantidades de Na+y pierden pequeas cantidades de K+ , la can tidad de energa utilizada en la bom ba de Na+ -K+ se acerca a los dos tercios de los requerimientos totales energticos de la clula. Un progreso importante en el conocim iento de la bom ba de Na+-K+ se reali z en 1957 gracias al descubrimiento de una enzima que hidroliza el ATP a ADP y fosfato y que necesita Na+ y K+ para su actividad ptima. Un dato importante que relacion esta ATPasa de Na+ -K+ con la bom ba de Na+-K+ fue la observacin de que un inhibidor conocido de la bomba, la ouabana, tambin inhibe la ATP asa. Pero la prueba crucial de que la hidrlisis del ATP proporciona de alguna manera la energa para impulsar la bom ba se obtuvo en unos estudios efectua dos con fantasmas de eritrocito en los que podan variarse las concentraciones de iones, ATP y frmacos a ambos lados de la membrana, observndose luego los efectos sobre el transporte inico y sobre la hidrlisis del ATP. Se encontr que (1) el transporte de Na+ y de K+ est estrechamente acoplado a la hidrlisis del ATP, de tal modo que un proceso no puede producirse sin el otro; (2) el transporte inico y la hidrlisis del ATP slo pueden ocurrir cuando existe Na+y ATP dentro de los fantasmas, y K+ en el exterior; (3) la ouabana nicamente tie ne efectos inhibidores cuando se encuentra fuera de los fantasmas, donde com pite por el centro de unin del K+ ; y (4) por cada molcula de ATP hidrolizada (cada molcula de ATPasa puede hidrolizar 100 molculas de ATP por segundo), se bom bean tres Na+hacia el exterior y dos K+hacia el interior (Figura 11-10). Aunque estos experimentos suministraron evidencias concluyentes de que el ATP proporciona la energa necesaria para el bombeo de iones Na+y K+ a tra vs de la mem brana plasmtica, no explicaban cmo se halla acoplada la hidr lisis del ATP al transporte inico. Una explicacin parcial se obtuvo con el ha llazgo de que durante el ciclo de bom beo el grupo fosfato terminal del ATP se transfiere a un residuo de cido asprtico de la ATPasa y luego este grupo fosfato se hidroliza, com o se explica en la Figura 11-11. En fantasmas de eritrocito la bom ba Na+ -K+ puede revertirse, produciendo ATP: cuando experimentalmente se increm entan los gradientes de Na+ y de K+ hasta el punto en que la energa almacenada en estos gradientes electroqumi cos es mayor que la energa qumica de la hidrlisis dei m r , estos iones se des plazan a favor de sus gradientes electroqumicos y se sintetiza ATP a partir de ADP y fosfato por la ATPasa de Na+-K+ . As pues, la forma fosforilada de la ATPa sa (paso 2 en la Figura 11-11) puede relajarse ya sea donando su fosfato al ADP (del paso 2 al paso 1) o cambiando su conformacin (del paso 2 al paso 3). El h e cho de que el exceso de la variacin de energa libre se utilice para sintetizar ATP o para bombear Na+ hacia afuera del fantasma depende de las concentraciones relativas de ATP, ADP y fosfato y de los gradientes electroqumicos de Na+y de K\ La ATPasa de Na+-K+ se ha purificado y se ha visto que consiste en una gran subunidad cataltica transmembrana de multipaso (aproximadamente de 1000

Protenas transportadoras y transporte activo a travs de membrana

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ESPACIO EXTRACELULAR | app| @

CITOSOL

<K+ Figura 11-11 Modelo esquemtico del ciclo de bombeo de la ATPasa de Na+ -K+ . La unin del Na+ (1) y la
posterior fosforilacin por ATP (2) en la cara citoplasmtica de la ATPasa inducen a la protena a un cam bio de conform acin que transfiere el Na+a travs de la membrana y lo libera al exterior (3). A continuacin, la unin de K* sobre la superficie exterior (4) y la consiguiente desfosforilacin (5) devuelven a la protena a su conform acin original, transfiriendo el K+ a travs de la m em brana y liberndolo en el citosol (6). Estos cambios de conform acin son anlogos a las transiciones ping pong que se muestran en la Figura 11-9, a excepcin de que en este caso la fosforilacin dependiente de Na+y la desfosforilacin dependiente de K+de la protena, que ocurren de una manera ordenada, permiten a la protena realizar un trabajo til. A pesar de que, para simplificar, se ha dibujado un solo lugar de unin al Na+y un solo lugar de unin al K+ , en realidad la bom ba presenta tres lugares de unin al Na+y dos al K+ . Adems, aunque se ha demostrado que la ATPasa salta entre dos estados conform acionales, existen evidencias de que ello ocurre a travs de series de cambios conform acionales ms com plejos durante el ciclo real de bombeo.

residuos de aminocido de longitud) y en una glucoprotena ms pequea, de paso nico, asociada a ella. La subunidad cataltica tiene centros de unin para Na+y para ATP en su superficie citoplasmtica, y para K+en su superficie externa y durante el ciclo de bom beo se fosforila y desfosforila de forma reversible. La funcin de la glucoprotena es incierta, aunque se sabe que es necesaria para el transporte intracelular de la subunidad cataltica hasta la membrana plasmtica. Se puede reconstituir una bom ba Na+ -K+ funcional a partir del complejo purifi cado: la ATPasa se solubiliza en detergente, se purifica y se mezcla con los fosfolpidos adecuados; cuando se elimina el detergente, se han formado vesculas de m em brana que en presencia de ATP bom bean Na+ y K+ en direcciones opuestas (vase Figura 10-22).

La ATPasa de Na+-K+es necesaria para m antener el equilibrio osm tico y estabilizar el volumen celular 8
Debido a que la ATPasa de Na+-K+ bom bea tres iones cargados positivamente hacia el exterior de la clula por cada dos que bom bea hacia el interior, es electrognica ; es decir, dirige una corriente neta a travs de la membrana tendiendo a crear un potencial elctrico, con el interior negativo en relacin al exterior. Sin embargo, este efecto de la bom ba en s mismo no contribuye ms de un 10% al potencial de membrana. Como veremos, el 90 % restante depende tan slo indi rectam ente de la bomba. Por otra parte, la ATPasa de Na+-K+ desempea un papel ms directo en la regulacin del volumen celular: controla las concentraciones de solutos dentro de la clula, y por consiguiente regula las fuerzas osmticas que pueden hacer que la clula se hinche o se retraiga (Figura 11-12). Como se explica en el Panel 11-1, las clulas contienen una gran concentracin de solutos incluyendo nume rosas molculas orgnicas cargadas negativamente (los denominados aniones 550 Captulo 11: Transporte de molculas pequeas a travs de la membrana

crenado ERITROCITO concentracin inica del espacio extracelular

norm al

hinchado

lisado

Figura 11-12 Respuesta de un eritrocito hum ano a cambios de la osmolaridad (tambin denominada tonicidad) del fluido extracelular.

HIPERTNICA

ISOTONICA

HIPOTONICA

MUY HIPOTNICA

fijos ) y los cationes que las acompaan y que son necesarios para equilibrar la
carga, todos los cuales generan un elevado gradiente osmtico que tiende a chu par agua hacia el interior de la clula. En las clulas animales este efecto es con trarrestado por un gradiente osmtico opuesto generado a causa de las elevadas concentraciones de iones inorgnicos -sobre todo de Na+y de Cl_- del medio ex tracelular. La ATPasa de Na+-K+ mantiene el equilibrio osmtico bombeando Na+ hacia el exterior, que vuelve a entrar a favor de su gradiente electroqumico; el Cl~ se mantiene en el exterior debido al potencial de membrana. La importancia de la ATPasa de Na+-K+ en el control del volumen celular se pone de manifiesto por el hecho de que las clulas animales se hinchan y pue den llegar a reventar si se tratan con ouabana, que inhibe la ATPasa de Na+-K+. Evidentemente, las clulas disponen de otros sistemas de solucionar sus proble mas osmticos. Las clulas vegetales y muchas bacterias estn protegidas contra el hinchamiento excesivo y la rotura mediante paredes celulares semirrgidas que rodean sus membranas plasmticas; en las amebas el exceso de agua que penetra por smosis se recoge en unas vacuolas contrctiles que vierten peridi cam ente su contenido al exterior (vase Panel 11-1). Pero para la mayora de las clulas de los animales, la ATPasa de Na+ -K+resulta crucial.

Debido a que la membrana plasmtica es libremente permeable al agua, el agua se desplazar hacia el interior o hacia el exterior de las clulas a favor de su gradiente de concentracin, un proceso denominado smosis. Si las clulas se colocan en una solucin hipotnica (por ejemplo, una solucin que contenga una baja concentracin de soluto, y por lo tanto una elevada concentracin de agua), se producir un movimiento neto de agua hacia el interior de las clulas, originando su hinchamiento y explosin (lisado). Contrariamente, si las clulas se colocan en una solucin hipertnica, se encogern.

Algunas bom bas de Ca2+ tam bin son ATPasas unidas a m em brana 9
Las clulas eucariotas mantienen unas concentraciones de Ca2+ muy bajas en el citosol (-1 0 -7 M), en comparacin con las concentraciones extracelulares de Ca2+, mucho ms elevadas (~10~3 M). As, una entrada de Ca2+, aunque sea pe quea, a la clula, increm enta significativamente la concentracin de Ca2+ libre en el citosol. El flujo de Ca2+ a favor de gradiente de concentracin en respuesta a seales extracelulares constituye una forma rpida de transmisin de estas se ales a travs de la m em brana plasmtica. Por lo tanto el mantenimiento de un elevado gradiente de Ca2+ es importante para la clula. El gradiente de Ca2+ se mantiene en parte por la accin de bom bas de Ca2+ que existen en la membrana plasmtica, las cuales transportan Ca2+ de forma activa hacia el exterior de la c lula. Se sabe que una de estas bom bas es una ATPasa, mientras que la otra es un transportador de intercambio (antiporte) impulsada por el gradiente electroqu mico de Na+ . La bom ba de Ca2+ m ejor conocida es una ATPasa unida a la membrana del retculo sarcoplasmtico de las fibras musculares. El retculo sarcoplasmtico -u n a tipo especializado de retculo endoplasm tico- forma una red de sacos tu bulares en el citoplasma de las clulas musculares que acta como reservorio intracelular de Ca2+. (Cuando un potencial de accin despolariza la membrana de la clula muscular, se libera Ca2+ del retculo sarcoplasmtico hacia el citosol, es timulando la contraccin muscular, como se discute en el Captulo 16.) La bom ba de Ca2+, que constituye alrededor del 90% de la protena de membrana del orgnulo, es la responsable del bom beo del Ca2+ desde el citosol hacia el interior del retculo sarcoplasmtico. (El retculo endoplasmtico de las clulas no mus culares contiene una ATPasa dependiente de Ca2+ similar a sta, aunque en m e nor cantidad, por lo que es ms difcil de purificar.) Protenas transportadoras y transporte activo a travs de membrana

551

ORIGEN DE LA OSMOLARIDAD INTRACELULAR

&

0 3

L a s m a c r o m o l c u la s p o r s m is m a s c o n t r ib u y e n m u y p o c o a la o s m o la r id a d d e l in t e r io r c e lu la r y a q u e , a p e s a r d e su g r a n t a m a o , c a d a u n a d e e lla s c u e n ta c o m o u n a s o la m o l c u la y h a y r e la tiv a m e n t e p o c a s d e e lla s e n c o m p a r a c i n c o n el n m e r o d e p e q u e a s m o l c u la s q u e h a y e n la c lu la . S in e m b a r g o , la m a y o r a d e m a c r o m o l c u la s b io l g ic a s e s t n m u y c a r g a d a s y a t r a e n m u c h o s io n e s in o r g n ic o s d e c a r g a o p u e s ta . D e b id o a su e le v a d o n m e r o , e s to s c o n tr a io n e s c o n t r ib u y e n d e f o r m a im p o r t a n t e a la o s m o la r id a d in tr a c e lu la r .

C o m o r e s u lta d o d e l t r a n s p o r t e a c tiv o y d e lo s p r o c e s o s m e t a b lic o s , la c lu la c o n tie n e u n a e le v a d a c o n c e n t r a c i n d e p e q u e a s m o l c u la s o r g n ic a s , ta le s c o m o a z c a r e s , a m in o c id o s y n u c le tid o s , p a r a las c u a le s la m e m b r a n a p la s m t ic a e s im p e r m e a b le . C o m o la m a y o r a d e e s to s m e t a b o lit o s e s t n c a r g a d o s , t a m b i n a t r a e n c o n t r a io n e s . T a n t o lo s p e q u e o s m e t a b o lit o s c o m o s u s c o n t r a io n e s t ie n e n u n a r e p e r c u s i n im p o r t a n t e e n la o s m o la r id a d in tr a c e lu la r .

N o r m a lm e n t e la o s m o la r id a d d e l lq u id o e x tr a c e lu la r e s d e b id a p r in c ip a lm e n te a p e q u e o s io n e s in o rg n ic o s . E s to s io n e s se filtra n le n ta m e n te a tr a v s d e la m e m b r a n a p la s m tic a hac ia el in te r io r d e la c lu la . Si n o so n b o m b e a d o s hacia el e x te r io r y si n o e x is te n o tra s m o l c u la s en el in te r io r d e la c lu la q u e in te ra c t e n c on e llo s in flu y e n d o en su d is trib u c i n , p u e d e n lle g a r a e q u ilib ra r s e m a n te n ie n d o la m is m a c o n c e n tra ci n d e n tr o y fu e r a d e la c lu la . P e ro la p re s e n c ia en la c lu la d e m a c r o m o l c u la s c a rg a d a s y d e m e ta b o lito s q u e a tra e n a e s to s io n e s g e n e ra el e fe c to D o n n a n : h a c e q u e e n el e q u ilib rio , la c o n c e n tra c i n to ta l d e io n e s in o rg n ic o s (y p o r ta n to , su c o n trib u c i n a la o s m o la rid a d ) s ea m a y o r d e n tr o q u e fu e ra d e la c lu la .

EL PROBLEMA
D e b id o a lo s f a c to r e s e n u n c ia d o s m s a r r ib a , u n a c lu la q u e n o c o n t r o le su o s m o la r id a d t e n d r e n su in t e r io r u n a c o n c e n tr a c i n t o t a l d e s o lu to s m a y o r q u e e n e l e x te r io r . C o m o r e s u lta d o d e e llo , la c o n c e n tr a c i n d e a g u a s e r m a y o r e n e l e x t e r io r q u e en e l in te r io r d e la c lu la . E s ta d ife r e n c ia e n la c o n c e n tr a c i n d e a g u a a t r a v s d e la m e m b r a n a p la s m tic a h a r q u e el a g u a s e d e s p la c e c o n t in u a m e n t e h a c ia el in te r io r d e la c lu la d e b id o a l p r o c e s o d e o s m o s is , c a u s a n d o su r o tu r a .

LA SOLUCIN
L a s c lu la s a n im a le s y la s b a c te r ia s c o n tr o la n su o s m o la r id a d in t r a c e lu la r b o m b e a n d o a c t iv a m e n t e h a c ia e l e x t e r io r io n e s in o r g n ic o s , c o m o e l N a +, d e f o r m a q u e su c ito s o l c o n t ie n e u n a c o n c e n t r a c i n to ta l d e io n e s in o r g n ic o s m e n o r q u e la d e l flu id o e x t r a c e lu la r , c o m p e n s a n d o a s su e x c e s o d e s o lu to s o r g n ic o s . L a s c lu la s v e g e ta le s e v ita n su h in c h a m ie n t o m e d ia n t e su p a r e d r g id a , d e f o r m a q u e p u e d e n t o le r a r d ife r e n c ia s o s m t ic a s a t r a v s d e s u s m e m b r a n a s p la s m tic a s : a p a r e c e u n a p r e s i n in t e r io r q u e , e n e l e q u ilib r io , im p id e q u e e n t r e m s agua. M u c h o s p r o to z o o s c o n s ig u e n n o h in c h a rs e d e a g u a a p e s a r d e q u e m a n t ie n e n u n a d if e r e n c ia o s m tic a a t r a v s d e la m e m b r a n a p la s m t ic a , e x p u ls a n d o a g u a p e r i d ic a m e n te m e d ia n t e v a c u o la s c o n tr c tile s e s p e c ia le s .

l0NES

552

Panel 11*1 Equilibrio del agua intracelular: el problema y su solucin.

La ATPasa de Ca2+ puede ser analizada bioqumicamente mediante los mis mos mtodos que los utilizados para la ATPasa de Na+-K+y se ha encontrado que ambas bombas actan de una forma muy similar. En efecto, estudios de secuenciacin de DNA indican que las ATPasas de Na+-K+ y de Ca2+ son protenas homlogas. En cada caso, la gran subunidad cataltica se presenta en varias isoformas, se cree que tiene alrededor de 10 posibles hlices a que atraviesan la membrana y que se fosforila y desfosforila durante el ciclo de bombeo.

Algunas enzimas ligadas a membrana que sintetizan ATP son ATPasas de transporte que actan en sentido opuesto1 0
Tanto la membrana plasmtica de las bacterias como la membrana interna de las mitocondrias y la membrana tilacoidal de los cloroplastos presentan una enzima anloga a las dos ATPasas de transporte mencionadas anteriormente, pero que normalmente acta en sentido opuesto. En lugar de ser la hidrlisis del ATP la que impulsa el transporte inico, en este caso es un gradiente de H+ a travs de estas membranas el que dirige la sntesis de ATP a partir de ADP y fos fato. Este gradiente de H+ se genera durante el proceso de transporte de electro nes de la fosforilacin oxidativa (en bacterias aerbicas y en mitocondrias) o mediante la bomba de H+ activada por la luz (bacteriorrodopsina) en Halobacterium. Como ocurre con las ATPasas de transporte, la enzima que normalmen te sintetiza ATP, llamada ATP sintasa, puede trabajar en ambas direcciones de pendiendo de las condiciones: puede hidrolizar ATP y bombear H+ a travs de la membrana o puede sintetizar ATP cuando fluyen H+ a travs de la enzima en la direccin opuesta. En la mayora de las clulas, la ATP sintasa es responsable de la generacin de la mayora del ATP celular, como se discute en detalle en el Captulo 14.

El transporte activo puede ser impulsado por gradientes inicos1 1

Muchos sistemas de transporte activo no son impulsados directamente por la hidrlisis del ATP sino por la energa almacenada en gradientes inicos. La ener ga libre liberada durante el desplazamiento de un ion inorgnico a favor de su gradiente electroqumico se utiliza como fuerza impulsora para bombear otros solutos en contra de sus gradientes electroqumicos. As pues, todas estas prote nas actan como transportadores acoplados -algunos como transportadores unidireccionales, otros como transportadores de intercambio. En la membrana plasmtica de las clulas animales el ion cotransportado cuyo gradiente electro qumico proporciona la fuerza impulsora para el transporte activo de una se gunda molcula normalmente es el Na+ . El Na+ que entra en la clula durante este transporte es bombeado hacia el exterior mediante la ATPasa de Na+ -K+ , la cual, al mantener el gradiente de Na+ , impulsa indirectamente el transporte de las otras molculas que se cotransportan con el Na+ . (Por esta razn se dice que los transportadores impulsados por iones median transportes activos secunda rios, mientras que se dice que las ATPasas median transportes activos primarios.) Las clulas epiteliales del intestino y del rin, por ejemplo, contienen varios sistemas de transporte unidireccional a travs de la membrana plasmtica que son impulsados por el gradiente de Na+ . Cada sistema importa especficamente a la clula un pequeo grupo de azcares o de aminocidos relacionados. En es tos sistemas el soluto y el Na+ se unen a diferentes lugares de la protena trans portadora; el Na+ tiende a entrar a la clula a favor de su gradiente electroqumi co, por lo que, en cierto sentido, arrastra al azcar o al aminocido hacia el interior de la clula. Cuanto mayor sea el gradiente electroqumico de Na+ , m a yor ser la velocidad de entrada del soluto a la clula; por el contrario, si la con centracin de Na+ en el fluido extracelular se reduce fuertemente, el transporte de soluto se detiene. En bacterias y en levaduras, as como en muchos orgnulos envueltos por membrana de las clulas animales, la mayora de los sistemas de transporte acti

Protenas transportadoras y transporte activo a travs de membrana

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vo impulsados por gradientes inicos dependen del gradiente de H+y no del de Na+, lo cual refleja la predominancia en estas membranas de las ATPasas de H+ respecto a la prctica ausencia de ATPasas de Na+ . El transporte activo de mu chos azcares y aminocidos en bacterias, por ejemplo, est impulsado por el gradiente de H+a travs de la m em brana plasmtica.

Las protenas de transporte impulsado por Na+de la m em brana plasm tica regulan el pH citoslico 12
La estructura y la funcin de la mayora de las macromolculas estn notable mente influenciadas por el pH, y la mayora de ellas actan de forma ptima a un pH determinado. Por ejemplo, las enzimas lisosomales actan mejor al bajo pH (~5) de los lisosomas mientras que las enzimas citoslicas actan mejor a pH casi neutro (-7,2) del citosol. Por lo tanto, resulta crucial que las clulas contro len el pH de sus compartimientos intracelulares. La mayora de la clulas tienen en su mem brana plasmtica uno a varios ti pos de sistemas de transporte de intercambio impulsados por Na+ , que regulan el pH intracelular (citoslico) (pH) mantenindolo alrededor de 7,2. Estas prote nas usan la energa almacenada en el gradiente de Na+ para reducir la acidez eli minando el exceso de iones H+ consumidos o producidos en la clula a conse cuencia de las reacciones que producen H+. Se utilizan dos mecanismos: los H+ son transportados directamente al exterior de la clula o se importa H C 03_ al in terior de la clula para neutralizar los H+del citosol. Uno de estos transportadores de intercambio que utiliza el primer mecanismo es un intercambiador de Na+ -H+ que acopla la entrada de Na+a la salida de H+. Otro transportador, que utiliza una com binacin de ambos mecanismos, es un intercambiador de Cl~-HCO~3 impul sado por Na+que acopla la entrada de Na+ y de H C 03 a la salida de Cl~ y H+ (de forma que entra NaHC03 y sale HC1). El transportador C1~-HC03 impulsado por Na+es dos veces ms efectivo que el transportador de Na+ -K+ , en el sentido de que por cada Na+ que entra en la clula bom bea hacia el exterior un H+y neutra liza otro H+ . Si existe HCOj asequible, como ocurre habitualmente, este trans portador es el ms importante en la regulacin del pH. Ambos transportado res de intercam bio estn regulados por el pH, incrementando su actividad cuando el pH desciende. En algunas clulas existe un tercer transportador dependiente de Na+ que desempea un papel importante en la regulacin del pH. Este transportador unidireccional de Na'-HCOj transporta un Na+ al interior de la clula con uno o varios iones H C 03. En contraste con los otros dos transportadores que acaba mos de describir, este simporte es electrognico ya que su efecto neto es trans portar cargas negativas al interior de la clula. Cuanto menor es el voltaje en el interior de la clula, mayor es su transporte. En consecuencia, en las clulas que presentan este transportador -principalm ente las clulas de la glia del sistema nervioso- el pH es sensible a cambios en el potencial de membrana. Parece que esta sensibilidad permite a estas clulas colaborar en la regulacin del pH extracelular local del cerebro en respuesta a cambios de su actividad elctrica. Un intercambiador de Ct-HCOj independiente de Na+ , similar a la protena banda 3 de la mem brana de los eritrocitos discutida en al Captulo 10, tambin juega un papel importante en la regulacin del pH de algunas clulas nucleadas. Como los transportadores dependientes de Na+, el intercambiador de CL-HCOj est regulado por el pH, pero en este caso el desplazamiento de H C 03 se produ ce norm alm ente hacia el exterior de la clula, a favor de su gradiente de concen tracin. La velocidad de eflujo de H C 03 y de influjo de Cl" incrementa cuando el pHj aumenta, disminuyendo as el pH cuando el citosol empieza a ser demasia do alcalino. Como se discute en el Captulo 13, el bajo pH de los lisosomas, as como el de los endosomas y de las vesculas de secrecin, se mantiene por ATPasas de pendientes de H+que utilizan energa de hidrlisis de ATP para bombear H+desde el citosol hacia el interior de estos orgnulos.

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Captulo 11: Transporte de molculas pequeas a travs de la membrana

En las clulas epiteliales, la distribucin asim trica de protenas transportadoras perm ite el transporte transcelular de solutos 13
En las clulas epiteliales, como las que participan en la absorcin de los nutrien tes del intestino, las protenas transportadoras se hallan distribuidas de manera asimtrica en la membrana plasmtica y gracias a ello contribuyen al transporte transcelular de los solutos absorbidos. Tal como muestra la Figura 11-13, los transportadores unidireccionales acoplados a Na+localizados en el dominio apical (absortivo) de la membrana plasmtica transportan nutrientes de forma activa hacia el interior de la clula, generando marcados gradientes de concentracin, mientras que en el dominio basal y lateral (basolateral) existen otras protenas de transporte, independientes de Na+ , que permiten que los nutrientes abandonen la clula a favor de su gradiente de concentracin. La ATPasa de Na+ -K+que mantiene el gradiente de Na+a travs de la membrana plasmtica de estas clulas est locali zada en el dominio basolateral. Se cree que tanto las clulas renales como las intes tinales utilizan unos mecanismos parecidos a ste para bombear el agua desde un espacio extracelular a otro. En muchas de estas clulas epiteliales, la superficie de la mem brana plas mtica se halla notablem ente incrementada mediante la formacin de miles de microvilli, que se proyectan en forma de finas evaginaciones digitiformes de la superficie apical de cada clula (Figura 11-13). Estos microvilli pueden aumentar el rea total de absorcin de una clula ms de 25 veces, incrementando as en gran medida su capacidad de transporte.

Figura 11-13 La distribucin asim trica de las protenas transportadoras en la m em brana plasm tica de una clula epitelial intestinal da lugar al transporte transcelular de glucosa a travs del epitelio intestinal. El proceso que se muestra genera el transporte de glucosa desde la luz del intestino hasta el fluido extracelular (desde donde pasa a la sangre). La glucosa se bombea hacia el interior de la clula a travs del dominio apical de la membrana por un cotransporte unidireccional de glucosa impulsado por el Na+ , y la glucosa pasa al exterior de la clula (a favor de su gradiente de concentracin) mediante difusin facilitada, por una protena transportadora de glucosa diferente, existente en los dominios basal y lateral. El gradiente de Na+que impulsa el transporte acoplado unidireccional (simporte) de glucosa se mantiene mediante la ATPasa de Na+ -K+del dominio basolateral de la membrana plasmtica, que mantiene baja la concentracin intracelular de Na+ . Las clulas adyacentes estn conectadas entre s mediante uniones impermeables (llamadas uniones estrechas o estancas), las cuales desempean una funcin dual en el proceso de transporte ilustrado aqu: impiden que los solutos atraviesen los epitelios entre las clulas, permitiendo as que el gradiente de concentracin de glucosa se mantenga a travs de la lmina de clulas, y tambin actan como barreras de difusin en la membrana plasmtica, confinando las diversas protenas transportadoras a sus respectivos dominios de membrana (vase Figura 10-37).

Algunas ATPasas transportadoras de m em brana son homlogas a las ATPasas transportadoras de eucariotas, que participan en la resistencia a drogas y en la fbrosis qustica: la superfamilia de transportadores ABC14
El ltimo tipo de protenas transportadoras que presentaremos es una familia de ATPasas transportadoras de una gran importancia clnica, a pesar de que sus

lum en del intestino

BAJO

m icrovilli del dom inio apical transporte unidireccional de glucosa dirigido por Na+ dom inio lateral protena transportadora que perm ite la difusin facilitada de glucosa dom inio basal fluido extracelular BAJO unin estrecha epitelio intestinal

Protenas transportadoras y transporte activo a travs de membrana

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bicapa lip id ica , externa 25 nm espacio peri- ------plasm tico bicapa / lip id ica ^ interna

lipopolisacrido porina lipoprotena peptidoglucano proteina soluble en el espacio periplasm tico proteina de transporte

Figura 11-14 Visin esquemtica de una pequea seccin de la doble membrana de una bacteria E. coli. La

funciones normales en las clulas eucariotas se han descrito muy recientem en te. La primera de estas protenas en ser caracterizada se encontr en bacterias. Ya hem os mencionado que la membrana plasmtica de todas las bacterias con tiene protenas transportadoras que utilizan el gradiente de H+ a travs de la m em brana para bom bear varios nutrientes hacia el interior de la clula. Muchas de ellas tambin tienen ATPasas de transporte que utilizan la energa de hidrli sis del ATP para importar varios tipos de azcares, aminocidos y pequeos pptidos. En bacterias como E. coli, que tienen doble membrana (Figura 11-14), las ATPasas de transporte se hallan localizadas en la membrana interna; existen m ecanism os auxiliares que permiten captar los nutrientes y cederlos a los trans portadores (Figura 11-15). Las ATPasas de transporte de la mem brana plasmtica de las bacterias per tenecen a la familia de protenas de transporte ms amplia y diversa de las co nocidas. Se denom ina superfam ilia de transportadores ABC porque cada uno de sus miembros contiene un cassette de unin al ATP (ATP-Mnding cassette) altam ente conservado (Figura 11-16). Se han descrito ms de 50 transportadores ABC y, aunque habitualm ente cada uno de ellos es especfico de un substrato o de una clase de substratos determinados, la variedad de substratos transporta dos por esta superfamilia es enorme, incluyendo aminocidos, azcares, polisacridos, pptidos e incluso protenas. Mientras que la mayora de los miembros de esta familia han sido descritos en procariotas, el nmero de transportadores

membrana interna es la membrana plasmtica de la clula. Entre las bicapas lipdicas interna y externa existe un peptidoglucano rgido y muy poroso, compuesto de protenas y polisacridos, que constituye la pared celular bacteriana; est unido a molculas lipoproteicas de la membrana externa y llena el espacio periplasmtico (slo se muestra una pequea parte del peptidoglucano). Este espacio tambin contiene diversas molculas proteicas solubles. Los filamentos dibujados a trazos verdes de la parte superior de la figura representan las cadenas de polisacrido de unas molculas especiales de polisacrido que forman una monocapa externa en la membrana externa; para mayor claridad nicamente se han dibujado algunas de estas cadenas. Las bacterias que presentan doble membrana se denominan gram negativas porque no retienen el colorante azul oscuro utilizado en este procedimiento de tincin. Las bacterias que presentan una sola membrana (y finas paredes celulares), como los estafilococos y los estreptococos, retienen el colorante azul, por lo que son denominadas gram positivas; su nica membrana es anloga a la membrana interna (plasmtica) de las bacterias gram negativas.

EX TER OR CELULAR MEMBRANA EXTERNA

protena form adora de canal (porina)

Figura 11-15 Sistema auxiliar de transporte asociado con las ATPasas de transporte de bacterias con doble m em brana. El soluto difunde a travs de protenas formadoras de canal (llamadas porinas) de la membrana exterior y se unen a una protena

p r o t e in a p e r ip la s m t ic a u n id a a u n s o lu to O

p r o t e in a p e r ip la s m t ic a e n f o r m a lib r e

periplasmtica que se une a substratos.

Como resultado de ello, la protena que se une al substrato sufre un cambio de conformacin que le permite unirse a una protena transportadora de la membrana plasmtica, la cual toma el soluto y lo transfiere activamente a travs de la bicapa mediante una reaccin dirigida por la hidrlisis del ATP. Para mayor sencillez del dibujo, se ha omitido el peptidoglucano; su porosa estructura permite que tanto las protenas que se unen a los substratos como los solutos solubles en agua se desplacen por difusin simple a travs de l.

q u s e u n e a s u b s t r a to s , Y q u e s e u n e a s u b s tr a to s ,

E S P A C IO P E R IP L A S M T IC O

M EMBRANA IN T E R N A (P L A S M T IC A )

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Captulo 11: Transporte de molculas pequeas a travs de la membrana

T abla 11-2 Algunas fam ilias de p ro ten as tran sp o rtad o ras Fam ilia* M iem bros rep resen tativos

Transportadores de azcares

ATPasas de transporte de cationes Transportadores ABC

transportadores pasivos de glucosa en clulas de mamfero algunos transportadores de azcares impulsados por H+ , en bacterias ATPasas de Na+ -K+ ATPasas de Ca2 + ATPasa de resistencia a mltiples drogas (MDR) en clulas de mamfero ATPasas dependientes de protenas de unin a substratos periplasmticos, en bacteria ATPasa de resistencia a la cloroquina, en

dom inios de unin al ATP

Figura 11-16 Dibujo esquem tico de un transportador ABC tpico.

P. falciparum
exportadores de feromonas de acoplamiento sexual, en levadura bomba de pptidos, en la membrana del ER de vertebrados protena reguladora transmembrana de fibrosis qustica (CFTR) protena banda 3 en eritrocitos intercambiador de aniones, en otras clulas intercambiador de Na+ -H+ intercambiador de C1-HCOj dependiente de Na Transportador unidireccional de glucosa y Na+ , en clulas intestinales Transportador unidireccional de prolina y Na+ , en bacterias Transportador unidireccional de Na+ -HCOj, en clulas gliales

Transportadores de intercambio (antiporters) de aniones

(CI--HCO3)
Transportadores de intercambio de cationes Transportadores de intercambio de cationes/aniones Transportadores unidireccionales impulsados por Na+

(A) Diagrama topolgico. (B) Disposicin hipottica de la cadena polipeptdica en la membrana. El transportador est compuesto por cuatro dominios: dos dominios muy hidrofbicos, cada uno de ellos con seis posibles segmentos intramembrana que de alguna forma deben participar en el proceso de translocacin, y dos dominios catalticos que unen ATP (o cassettes). El algunos casos las dos mitades del transportador estn formadas por un mismo polipptido {como en la figura) mientras que en otros estn formados por dos polipptidos diferentes.

* Los miembros de una misma familia son similares entre s en cuanto a secuencia de amino cidos y, por lo tanto, se cree que han evolucionado a partir de una protena ancestral comn.

descritos en eucariotas es cada vez mayor. El primero en ser identificado se des cubri gracias a su capacidad de bom bear drogas hidrofbicas hacia el exterior de clulas eucariotas. Uno de estos transportadores es la proteia de resistencia a m ltiples drogas (MDR, de MultiDrug Resistance) cuya sobreexpresin en c lulas cancerosas humanas puede hacerlas simultneamente resistentes a una gran variedad de drogas citotxicas no relacionadas qumicamente que son am pliamente utilizadas en la terapia del cncer. El tratamiento con una de estas drogas puede provocar la seleccin de las clulas que sobreexpresan la protena transportadora MDR; el transportador bom bea la droga hacia el exterior de la clula, reduciendo as su toxicidad y confiriendo resistencia a la clula contra una gran variedad de agentes teraputicos. En el protozoo Plasmodium falciparum se produce un fenmeno relacionado con ste e igualmente siniestro, que causa la malaria. Ms de 200 millones de personas han sido infectadas por este parsito, que sigue siendo la mayor causa de muerte en humanos, matando ms de un milln de personas cada ao. El control de la malaria se ve entorpecido por el desarrollo de resistencia a la droga antimalrica cloroquina; se ha detecta do un P. falciparum resistente que ha amplificado el gen que codifica el trans portador ABC que transporta cloroquina hacia el exterior de la clula. El nmero de miembros conocidos de la superfamilia ABC de transportadores en las clulas eucariotas crece rpidamente, y la funcin normal de algunos de ellos va siendo cada vez ms clara. En levaduras, un transportador ABC es el responsable

Protenas transportadoras y transporte activo a travs de membrana

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de exportar una feromona de acoplamiento sexual (un pptido de 13 am inoci dos) a travs de la membrana plasmtica de la clula de levadura. En la mayora de las clulas de vertebrados, un transportador ABC de la membrana del retculo endoplasmtico (ER) transporta activamente desde el citosol hasta el interior del ER una gran variedad de pptidos producidos por la degradacin de protenas. Se trata de la primera etapa de un proceso de gran importancia en la supervisin de las clulas por el sistema inmune (se discute en el Captulo 23). Los fragmen tos de protena transportados, una vez han entrado al ER, pueden ser transpor tados a la superficie celular donde son presentados para que los linfocitos T citotxicos puedan reconocerlos; si resultan ser extraos al individuo (como por ejemplo si derivan de un virus del interior de la clula), los linfocitos T matan a la clula que los presenta. Otro miembro de la familia ABC ha sido descubierto mediante estudios de la enfermedad gentica comn denominada fibrosis qustica. Esta enfermedad est causada por una mutacin en un gen que codifica un transportador ABC que acta como un canal de Cl~ en la membrana plasmtica de las clulas epiteliales. El canal es poco habitual en cuanto a que para abrirse requiere la hidrlisis de ATP y la fosforilacin dependiente de AMP cclico. Debi do a que existen evidencias de que la protena MDR tambin puede actuar como canal de Cl~ en algunas clulas (en este caso, no regulado por AMP cclico sino por el volumen celular), parece claro que al menos algunos transportadores ABC pueden actuar como transportadores y como canales inicos. Sin embargo, to dava resulta un misterio de qu forma los transportadores ABC pueden actuar de estas dos maneras tan diferentes y transferir a travs de la membrana estos ti pos de molculas tan distintos. En la Tabla 11-2 se resumen algunas de las familias de las protenas trans portadoras de las que hemos tratado.

Resumen
Las protenas transportadoras se unen a determinados solutos y los transportan a travs de la bicapa lipdica, mediante cambios conformacionales que exponen el lugar de unin al soluto secuencialmente a uno y luego al otro lado de la membra na. Algunas protenas transportadoras simplemente transportan un soluto cuesta abajo" mientras que otras pueden actuar como bombas transportando un soluto cuesta arriba en contra de su gradiente electroqumico, utilizando para ello ener ga de hidrlisis del ATP o un jlujo cuesta abajo de otro soluto (como el Na+ ) para impulsar las series de cambios de conformacin necesarios. Estudios de clonaje y secuenciacin de DNA muestran que las protenas transportadoras pertenecen a un pequeo nmero de familias, cada una de las cuales contiene protenas de secuen cias de aminocidos similares que probablemente han evolucionado a partir de una protena ancestral comn, y que actan a travs de un mecanismo similar. La familia de ATPasas transportadoras de cationes, que incluye la ubicua bomba Na+ K+, constituye un ejemplo importante de ello; cada una de estas ATPasas contiene una gran subunidad cataltica que secuencialmente es fosforilada y desfosforilada durante el ciclo de bombeo. La superfamilia de transportadores ABC es especial mente importante desde el punto de vista clnico: incluye protenas que son respon sables de la fibrosis qustica, y tambin protenas que confieren resistencia a drogas en clulas cancerosas y en parsitos causantes de la malaria.

Canales inicos y propiedades elctricas de las membranas1 5

A diferencia de las protenas transportadoras, las p ro te n a s d e c a n a l forman po ros hidroflicos que atraviesan la membrana. Una clase de protenas de canal que se encuentra en prcticam ente todos los grupos de animales forma las unio nes comunicantes (gap junctions ) entre dos clulas adyacentes; cada membrana

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Captulo 11: Transporte de molculas pequeas a travs de la membrana

plasmtica contribuye de la misma forma a la formacin del canal, que conecta los citoplasmas de ambas clulas. Estos canilles se discuten en el Captulo 19, por lo que aqu no trataremos de ellos. Tanto las uniones comunicantes como las porinas, las protenas formadoras de canal de las membranas externas de las bacterias, mitocondrias y cloroplastos (discutidas en el Captulo 10), tienen po ros relativamente grandes y permisivos, que resultaran desastrosos si conecta ran directamente el interior de una clula con el espacio extracelular. Por el con trario, la mayora de protenas de canal de la membrana plasmtica de las clulas animales y vegetales conectan el citosol con el exterior celular, por lo que necesariam ente han de tener poros estrechos altamente selectivos. Estas prote nas estn relacionadas especficamente con el transporte de iones inorgnicos, por lo que se denominan canales inicos. Respecto a la eficiencia de transporte, los canales tienen ventaja sobre los transportadores ya que a travs de cada ca nal pueden pasar ms de 1 milln de iones cada segundo, lo cual es una veloci dad ms de 1000 veces superior que el transporte mediado por cualquier trans portador conocido. Por otro lado, los canales inicos no pueden estar acoplados a una fuente energtica, de forma que el transporte que median siempre es pasi vo (cuesta abajo). As, la funcin de los canales inicos es permitir que iones inorgnicos especficos, mayoritariamente Na+ , K+ , Ca2+ , o Cl~, puedan difundir a favor de su gradiente electroqumico a travs de la bicapa lipdica. Esto no quie re decir, sin embargo, que el transporte a travs de canales inicos no est regu lado. Por el contrario, veremos que la capacidad de regular el flujo de iones es esencial para la funcin de muchos tipos celulares. Concretamente, las clulas nerviosas se han especializado en la utilizacin de canales inicos, y considera remos de qu forma utilizan una gran variedad de tales canales para recibir, conducir y transmitir seales.

Los canales inicos son selectivos para el ion y fluctan entre estados abiertos y cerrados 15
Dos propiedades importantes diferencian los canales inicos de los simples po ros acuosos. En primer lugar, presentan selectividad inica, es decir, permiten que algunos iones puedan pasar y otros no. Esto sugiere que sus poros deben ser suficientemente estrechos en algunos lugares como para permitir que los iones entren en contacto ntimo con las paredes del canal, de tal manera que slo los iones de tamao y carga adecuados puedan atravesarlos. Se cree que para poder pasar a travs de la parte ms estrecha del canal, los iones que atraviesan los ca nales (en fila) tienen que deshacerse de la mayor parte o de todas las molculas de agua que llevan asociadas; este hecho limita la velocidad mxima de paso. As, cuando aumenta la concentracin de un ion, el flujo de tal ion a travs del canal aumenta proporcionalmente hasta que se alcanzan los niveles de satura cin, momento en que se llega a la velocidad mxima de transporte. La segunda diferencia importante entre los canales inicos y los simples po ros acuosos consiste en que los canales inicos no estn abiertos continuam en te. En lugar de ello, tienen puertas que se abren brevemente y luego se cierran de nuevo, tal como se muestra esquemticamente en la Figura 11-17. En la ma-

Figura 11-17 Dibujo esquem tico de un canal inico tpico, que flucta entre las conform aciones cerrada y abierta. Una protena

ABIERTO CERRADO

bicapa lipdica

superficie hidrofbica

superficie hidroflica

filtro selectivo a iones en el poro acuoso

transmembrana, vista en seccin transversal, forma un poro acuoso a travs de la bicapa lipdica, nicamente cuando la compuerta est abierta. Se cree que las paredes internas del poro se hallan recubiertas de cadenas laterales de aminocidos polares, mientras que las cadenas laterales hidrofbicas interactan con la bicapa lipdica. El poro se estrecha hasta alcanzar, en una regin determinada, dimensiones atmicas (el filtro selectivo de iones); esta regin determina principalmente la selectividad inica del canal.

Canales inicos y propiedades elctricas de las membranas

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regulados por voltaje

regulados por ligando (ligando extracelular)

regulados por ligando (ligando intracelular)

regulados m ecnicam ente

Figura 11-18 Canales inicos regulados. Dibujo esquemtico de los diferentes sistemas a travs de los cuales se pueden regular los canales inicos.

CERRADOS

A B IE R T O S C IT O S O L

yora de los casos las puertas se abren en respuesta a estmulos especficos. Los principales tipos de estmulos que se sabe que causan la abertura de los canales inicos son cambios en el voltaje a travs de la membrana (canales regulados por voltaje), estimulaciones mecnicas (canales regulados mecnicamente) y la unin de un ligando (canales regulados por ligando). El ligando puede ser un mediador extracelular -especficam ente un neurotransmisor (canales regulados por trans misor) o un mediador intracelular, como un ion (canales regulados por ion), o un nucletido (canales regulados por nucletido ) (Figura 11-18). La actividad de muchos canales inicos est regulada, adems, por fosforilacin y desfosforila cin de protenas; este tipo de regulacin se discute en el caso de los canales re gulados por nucletido, en el Captulo 15. Hasta ahora se han descrito ms de 100 tipos de canales inicos, y todava se estn descubriendo ms. Son responsables de la excitabilidad elctrica del ms culo y median la mayora de formas de seales elctricas en el sistema nervioso. Una clula nerviosa tpica contiene 10 tipos diferentes o ms de canales inicos, localizados en diferentes dominios de su mem brana plasmtica. Sin embargo, estos canales no slo se presentan en clulas excitables elctricamente, sino que tam bin se hallan en todas las clulas animales y vegetales y tambin en m icro organismos: por ejemplo, los canales inicos son los responsables de propagar la respuesta de cerrar las hojas de la mimosa, y permiten que los paramecios unicelulares cam bien de direccin despus de colisionar. Quizs los canales inicos ms comunes son los permeables principalmente al K+ , que se encuentran en la membrana plasmtica de casi todas las clulas ani males. Un importante subconjunto de estos canales se abre incluso en clulas no estimuladas (en reposo) por lo que habitualmente se les denomina canales de fuga de K+ . Aunque este trmino se refiere a una gran variedad de canales de K+ diferentes, dependiendo del tipo celular de que se trate, tienen una funcin co mn: haciendo que la membrana plasmtica sea mucho ms permeable al K+que a cualquier otro ion, juegan un papel crtico en el mantenimiento del potencial de membrana -la diferencia de potencial que se presenta a travs de todas las m em branas plasmticas.

El potencial de m em brana de las clulas animales depende principalm ente de los canales de fuga de K+y del gradiente de K+ a travs de la m em brana plasm tica 15,16
Cuando existe una diferencia de carga elctrica entre ambos lados de una m em brana, debido a un ligero exceso de iones positivos sobre los negativos en uno de los lados y un ligero defecto en el otro lado, aparece un p o te n c ia l d e m e m b ra n a .

560

Captulo 11: Transporte de molculas pequeas a travs de la membrana

Estas diferencias de carga pueden producirse tanto por un transporte activo electrognico (vase pg. 550) como por difusin inica pasiva. Veremos en el Captulo 14 que la mayor parte del potencial de membrana de la mitocondria est generado por la bom ba electrognica de H+ de la membrana interna de la mitocondria. Las bombas electrognicas tam bin generan las mayor parte del potencial elctrico a travs de la mem brana plasmtica de las clulas vegetales y de hongos. Sin embargo en las clulas animales tpicas son los movimientos pa sivos de los iones los principales responsables del potencial elctrico a travs de la mem brana plasmtica. Como se ha explicado anteriormente, la ATPasa de Na+-K+ ayuda a mantener el equilibrio osmtico a travs de la mem brana plasmtica, manteniendo baja la concentracin intracelular de Na+. Como en el interior celular hay poco Na+ , tie nen que existir otros cationes en cantidades abundantes que equilibren la carga de los aniones fijos celulares -las molculas cargadas negativamente que estn confinadas en el interior celular. Este papel de equilibrador de cargas est des empeado principalmente por el K+ , que es bombeado activamente al interior celular por la ATPasa de Na+ -K+y que tambin puede desplazarse libremente h a cia el interior o el exterior de la clula a travs de los canales de fuga de K+ . Debi do a la presencia de estos canales, el K+ se mantiene prcticamente en un equili brio en el que la fuerza elctrica, ejercida por un exceso de cargas negativas del interior de la clula, atrayendo el K+hacia el interior de la clula, equilibra la ten dencia del K+ a salir a favor de su gradiente de concentracin. El potencial de m em brana es la manifestacin de esta fuerza elctrica y se puede calcular su va lor de equilibrio a partir del valor del gradiente de concentracin del K\ Los ar gumentos siguientes pueden ayudar a aclarar este concepto. Supongamos que inicialmente no existe gradiente de voltaje a travs de la membrana plasmtica (el potencial de m embrana es cero) pero que la concentra cin de K+es elevada en el interior de la clula y baja en el exterior. El K+tender a salir de la clula a travs de los canales de fuga del K+ , impulsado por su gradiente de concentracin. A medida que el K+vaya fluyendo hacia el exterior de la clula, dejar detrs suyo una carga neta negativa, creando as un campo elctrico o po tencial de membrana que tender a impulsar de nuevo el K+hacia el interior de la clula. El reflujo neto de K+ cesar cuando el potencial de membrana alcance un valor tal que la fuerza elctrica que genere sobre el K+ equilibre exactamente el efecto del gradiente de concentracin de este ion -e s decir, cuando su gradiente electroqumico de K+ sea cero. Al mismo tiempo, los iones Cl_ se equilibran de manera similar a como ocurre con el K+ , pero dado que su carga es negativa, el potencial de membrana mantiene la mayora de estos iones fuera de la clula. Esta condicin de equilibrio en la que no hay flujo neto de corriente elctrica a travs de la membrana, define el potencial de reposo de la membrana para esta clula ideal. Una frmula sencilla pero muy importante, la ecuacin de Nemst, expresa la condicin de equilibrio de manera cuantitativa y, tal como se explica en el Panel 11-2, permite calcular el potencial de reposo terico de la membrana si se conoce la relacin de concentraciones inicas interna y externa. Sin embar go, como la membrana plasmtica de una clula real no es exclusivamente per meable a K+ y a Cl~, el potencial de reposo real generalmente no es exactamente igual al que predice la ecuacin de Nemst para el K+y el Cl_.

Cuando se para la bom ba de Na+-K+ , el potencial de reposo slo decae lentam ente 15 16
El nmero de iones que se han de desplazar a travs de la membrana para gene rar el potencial de membrana es insignificante. As se puede pensar que el po tencial de mem brana aparece debido a movimientos de carga que mantienen las concentraciones de los iones prcticam ente inalteradas, y que se produce por di ferencias muy leves del nmero de iones negativos y positivos que hay a las dos lados de la mem brana (Figura 11-19). Adems, generalmente estos movimientos de carga son rpidos, del orden de tan slo unos cuantos milisegundos o menos.

Canales inicos y propiedades elctricas de las membranas

561

LA ECUACION DE NERNST Y EL FLUJO DE IONES

E l f l u j o d e c u a l q u i e r io n a t r a v s d e u n a p r o t e n a c a n a l d e m e m b r a n a e s t d i r i g i d o p o r e l g r a d i e n t e e l e c t r o q u m i c o d e e s t e io n . E s te g r a d i e n t e r e p r e s e n t a la c o m b i n a c i n d e d o s fa c to re s : e l g r a d ie n te d e v o lta je y el g r a d ie n te d e c o n c e n tr a c i n d e l io n a t r a v s d e la m e m b r a n a . C u a n d o e s t a s d o s in f lu e n c ia s s e e q u i l i b r a n u n a c o n o t r a , e l g r a d i e n t e e l e c t r o q u m i c o d e l io n e s c e r o y n o s e p r o d u c e f l u j o n e to d e l io n a t r a v s d e l c a n a l. El g r a d ie n t e d e v o lt a je (p o te n c ia l d e m e m b r a n a ) e n e l q u e s e a lc a n z a e s t e e q u i l i b r i o , s e d e n o m i n a p o t e n c i a l d e e q u i l i b r i o d e l io n . P u e d e c a l c u la r s e m e d i a n t e u n a e c u a c i n q u e s e r d e d u c id a a c o n tin u a c i n , lla m a d a e c u a c i n d e N e r n s t.

La e c u a c i n d e N e r n s t e s :

v .B I m S ?
zF
C

donde

V = p o t e n c i a l d e e q u i l i b r i o e n v o lt i o s
( p o t e n c i a l in t e r n o m e n o s e l p o te n c ia l e x te r n o )

C0 y C

= c o n c e n tr a c io n e s e x te r n a (d e " o u ts id e " ) e i n t e r n a d e l io n , r e s p e c t i v a m e n t e

R = c o n s t a n t e d e lo s g a s e s (2 c a l m o l 1 K 1) T = t e m p e r a t u r a a b s o lu t a ( K ) F = c o n s t a n t e d e F a r a d a y ( 2 ,3 x 1 0 4 c a l V ' 1
m o l-1 )

z=

v a l e n c ia ( c a r g a ) d e l io n

ln = l o g a r i t m o d e b a s e e

La e c u a c i n d e N e r n s t p u e d e d e d u c ir s e d e la s ig u ie n t e f o r m a : U n a m o l c u la e n s o lu c i n (u n s o lu to ) s ie m p r e s e m u e v e d e s d e u n a r e g i n d e e le v a d a c o n c e n t r a c i n h a c ia u n a r e g i n d e b a ja c o n c e n tr a c i n , s im p le m e n t e d e b id o a la p r e s i n d e lo s n m e r o s . C o n s e c u e n te m e n t e , el m o v im ie n t o a f a v o r d e g r a d ie n t e d e c o n c e n t r a c i n v ie n e a c o m p a a d o d e u n a v a r ia c i n fa v o r a b le d e e n e r g a lib r e (AG < 0 ), m ie n tr a s q u e el m o v im ie n t o e n c o n tr a d e g r a d ie n t e d e c o n c e n tr a c i n v ie n e a c o m p a a d o d e u n a v a r ia c i n d e s f a v o r a b le d e e n e r g a lib r e

P a ra u n io n m o n o v a le n t e ,

RT
2 ,3

= 5 8 m V a 2 0 C

6 1 ,5 m V a 3 7 C

A s p u e s , p a r a u n io n d a d o a 3 7 C , V = + 6 1 ,5 m V p a ra C 0 / C = 1 0 , m ie n t r a s q u e V = 0 p a r a C 0 / C = 1. P o r e je m p lo , el p o t e n c ia l d e e q u ilib r io d e l K ' ( V K) es d e 6 1 ,5 lo g 10( [ K * ] o / [K *]) m iliv o lt io s ( - 8 9 m V p a r a u n a c lu la tp ic a c u a n d o [ K * ] 0 = 5 m M y [K *] = 1 4 0 m M ) . A V K, n o e x is t e f lu jo n e to d e K * a t r a v s d e la m e m b r a n a . D e f o r m a s im ila r , c u a n d o el p o te n c ia l d e m e m b r a n a a lc a n z a un v a lo r d e 6 1 ,5 lo g 10( ( N a ' ] u / [ N a *]), el p o te n c ia l d e e q u ilib r io d e l N a * ( l / Na), n o e x is tir f lu jo n e to d e N a * . P a ra c u a lq u ie r p o te n c ia l d e m e m b r a n a p a r t ic u la r , l/M , la f u e r z a n e ta q u e t ie n d e a e m p u ja r h a c ia el e x t e r io r d e la c lu la a un d e t e r m in a d o t ip o d e io n e s p r o p o r c io n a l a la d if e r e n c ia e n t r e l/ M y e l p o te n c ia l d e e q u ilib r io d e l io n : a s , p a r a e l K 4 e s l/ M - VK y p a r a el N a * e s l/ M - l / Na. El n m e r o d e io n e s q u e f o r m a n la l m in a d e c a r g a a d y a c e n t e a la m e m b r a n a e s d e s p r e c ia b le c o m p a r a d o c o n el n m e r o to t a l d e io n e s d e l in t e r io r d e la c lu la . P o r e je m p lo , el d e s p la z a m ie n t o d e 6 0 0 0 io n e s N a * a t r a v s d e 1 ii m 2 d e m e m b r a n a t r a n s p o r t a r s u fic ie n te c a r g a p a r a c a m b ia r el p o te n c ia l d e m e m b r a n a u n o s

(AG > 0 ). (El c o n c e p to d e e n e r g a lib r e s e in t r o d u c e y d is c u te

e n e l P a n e l 1 4 -1 , p g s . 7 1 4 - 7 1 5 .) La v a r ia c i n d e e n e r g a lib r e p o r m o l d e s o lu to q u e s e h a d e s p la z a d o a t r a v s d e la m e m b r a n a p la s m tic a (AGconc) e s ig u a l a - f T I n C 0 / C. S i el s o lu to e s u n io n , a l m o v e r s e h a c ia el in t e r io r d e u n a c lu la a t r a v s d e u n a m e m b r a n a e n la q u e s e m a n t ie n e u n v o lt a je V e n el in t e r io r r e s p e c to al e x te r io r , g e n e r a r u n a v a r ia c i n a d ic io n a l d e e n e r g a lib r e (p o r m o l d e s o lu t o q u e s e h a y a d e s p la z a d o ) d e AGV0| t = zFV. E n el p u n to e n el q u e el g r a d ie n t e d e c o n c e n tr a c i n y el d e v o lt a je s e h a lle n c o m p e n s a d o s e x a c t a m e n t e , AGconc + AGVO | t = 0 y la d is t r ib u c i n d e l io n se h a lla r e n e q u ilib r io a t r a v s d e la m e m b r a n a . A s

z F V - R T ln = 0
C; y p o r ta n to l/= |n - ^ = 2 ,3 lo g 10 C zF 10

1 0 0 m V . C o m o e x is t e n u n o s 3 x 1 0 7 io n e s N a * e n 1 u m 3 d e c ito s o l, e s te d e s p la z a m ie n t o d e c a r g a t e n d r u n e fe c to d e s p r e c ia b le s o b r e lo s g r a d ie n t e s d e c o n c e n t r a c i n a t r a v s d e la m e m b r a n a .

zF

562

Panel 11-2 Deduccin de la ecuacin de Nernst.

+
+

+
+

+
+

- + 1

+ + -

+
+

+
+

- +

+
+

- - .
+ -

-:J
ji 6

+ _ + _
+ *

+
+

- + - + - + - jfl
- + i j +

- + - + - + . 1 !? |_ - + - + - +
+

- + - + - + - L* - + - + - + -| ijS - + - * - * + - * - + - + ^ ^ + - + - +
+ + - + - ^ ijj + + -

+ - - + - + *'f

- + _ + _ + +l|ti - + + * + +-+- + -+

- + - + - + '?| Ef + + "
_ + _ + _ +

- + - + - +

+ -

- + + _ + -fL jb j~

~ _ + _ + _ + ;" + + " +

- + _ + - + + - + - + -

+- + - + -+ , V i + - + - + - +

- + _ + - + + ** + - +
- + - + - +-

+ - + - + - *:i

_ + + + + _ + _ +. _ + ^

~ + ""+ + ~ + _ + _ + _ + " + . +

- + - + - + -

---SIN..
una pequea cantidad de iones positivos (rojo) atraviesan la membrana de izquierda a derecha, dejando tras de s sus contraiones negativos {rojo): este hecho provoca la aparicin de un potencial de membrana diferente de cero

equilibrio exacto de cargas a cada lado de la membrana; potencial de membrana 0

Resulta clarificador considerar qu le ocurre al potencial de m embrana si la ATPasa de Na+ -K+ se inactiva de repente. Primero, se produce un bajada suave e inm ediata del potencial de mem brana. Esto se debe a que la bom ba es electrognica y cuando se m antiene activa contribuye ligeramente a m antener el po tencial de m em brana ya que extrae tres Na+ por cada dos K+ que introduce en la clula. Sin embargo, al cerrar la bom ba no se elim inan los com ponentes principales del potencial de reposo, que com o se ha esbozado anteriorm ente est generado por un mecanismo de equilibrio del K+ . Este desequilibrio persiste mientras se mantenga baja la concentracin de Na+ en el interior de la clula y alta la de K+ en el exterior -norm alm ente varios minutos. No obstante, la m em brana plasmtica es algo permeable a todos los iones pequeos, incluido el Na+ . As pues, si no funciona la ATPasa de Na+ -K+ los gradientes inicos mantenidos por la bom ba irn disminuyendo y el potencial de membrana establecido por la difusin a travs de los canales de fuga de K+tambin ir disminuyendo. Cuando entra Na+ el equilibrio osmtico aumenta y entra agua a la clula (vase Panel 11-1, pg. 552). Pero si la clula no explota, se alcanzar un nuevo estado de re poso en el que el Na+ , el K+ y el Cl~ se encontrarn en equilibrio a travs de la membrana. En este estado el potencial de membrana es mucho menor que en la clula normal, con una bom ba Na+ -K+activa. La diferencia de potencial a travs de la membrana plasmtica de una clula animal en reposo vara entre -20m V y -200m V, dependiendo del organismo y del tipo celular. A pesar de que el gradiente de K+ siempre tiene una influencia principal en este potencial, el gradiente de otros iones (y el efecto desequilibran te de las bom bas de iones) tam bin tiene un efecto significativo: cuanto ms permeable sea la mem brana para un ion, mayor ser la tendencia del potencial de m em brana a alcanzar el valor de equilibrio de este ion. En consecuencia, casi cualquier cambio de la permeabilidad de la membrana provocar un cambio en el potencial de la membrana. sta es la clave principal que relaciona la excitabi lidad elctrica de las clulas con las actividades de los canales inicos. Las clulas nerviosas o neuronas son especialistas de la excitabilidad elctrica; la mayor parte de nuestros conocimientos sobre este tema proviene de estudios sobre estas clulas extraordinarias. Por lo tanto, para poder situar la excitabilidad elctrica en su contexto, hemos de hacer una breve disgresin para revisar breve mente cmo est organizada una neurona tpica.

Figura 11-19 Un pequeo flujo de iones transporta suficiente cantidad de carga para generar una gran variacin del potencial de membrana. Los iones que incrementan el potencial de membrana se hallan situados en una fina capa superficial (< 1 nm) muy cerca de la membrana, que se mantiene unida a ella debido a su atraccin elctrica con los iones de carga opuesta (contraiones) del otro lado de la membrana. Para una clula tpica, 1 microculombio de carga (6 x 101 2iones monovalentes) por centmetro cuadrado de membrana transferidos de un lado a otro de la membrana genera una carga de aproximadamente 1V. Esto significa, por ejemplo, que en una clula esfrica de 10 (im de dimetro, el nmero de iones K+que han de fluir hacia el exterior de la clula para generar una variacin del potencial de membrana de 100 mV, nicamente es de 1/100 000 parte del total de iones K+ del citosol.

La funcin de una clula nerviosa depende de su estructura alargada 15

La tarea fundamental de la neurona es recibir, conducir y transmitir seales. Para realizar estas funciones, normalmente las neuronas son extremadamente alargadas: una clula nerviosa de un ser humano, que se extienda desde la m dula espinal hasta un msculo del pie, puede tener un metro de largo. Cada

Canales inicos y propiedades elctricas de las membranas

563

cuerpo o soma celular

dendritas

axn (desde menos de 1 mm hasta ms de 1 m de largo)

ramificaciones terminales del axn

Figura 11 -20 Diagrama esquemtico de una neurona tpica de vertebrado. Las flechas indican la direccin en la que se transportan las seales. El axn conduce las seales en sentido de alejarse del soma celular mientras que las mltiples dendritas reciben seales de los axones de otras neuronas. Las terminales nerviosas acaban sobre las dendritas o el soma celular de otras neuronas o sobre otros tipos celulares, como fibras musculares o clulas glandulares.

neurona consta de un cuerpo o soma celular (que contiene el ncleo) y un cierto nmero de largas y delgadas proyecciones que irradian desde este soma hacia el exterior. Generalmente tienen un largo axn, que conduce las seales desde el soma celular hacia dianas distantes y varias dendritas, ms cortas y ramificadas, que se extienden desde el soma celular como antenas, proporcionando una ex tensa superficie que le permite a la neurona recibir seales procedentes de los axones de otras clulas nerviosas (Figura 11-20). Las seales tambin se reciben en el propio soma celular. Habitualmente el axn se divide en su extremo distal en numerosas ramas de forma que puede transmitir su m ensaje a muchas clu las diana simultneamente. Adems, la extensin de las ramificaciones de las dendritas puede ser muy grande -e n algunos casos lo suficiente como para que una sola neurona reciba hasta 100 000 contactos. A pesar del variado significado de las seales transportadas por las diferen tes clases de neuronas, la form a de estas seales es siempre la misma: cambios del potencial elctrico a travs de la mem brana plasmtica de la neurona. La co m unicacin tiene lugar debido a que una alteracin elctrica producida en una zona de la clula se propaga hacia otras zonas. Esta alteracin se ira debilitando al aumentar la distancia a la que se propaga a partir del origen, a no ser que se gaste energa para amplificarla a medida que se propaga. En distancias cortas esta atenuacin carece de importancia; de hecho muchas neuronas pequeas conducen sus seales de m anera pasiva, sin amplificacin. Para com unicacio nes a largas distancias, sin embargo, esta propagacin pasiva es inadecuada. As, las neuronas mayores utilizan un mecanism o de sealizacin activo que consti tuye uno de sus rasgos ms sorprendentes: un estmulo elctrico que sobrepasa una cierta intensidad umbral desencadena una explosin de actividad elctrica que se propaga rpidamente a lo largo de la membrana plasmtica de la neuro na y que se m antiene por una amplificacin automtica a lo largo de todo el re corrido. Esta onda viajera de excitacin elctrica, conocida como potencial de accin o impulso nervioso, puede transportar un mensaje sin atenuacin desde un extremo de una neurona hasta el otro, a velocidades tan rpidas como 100 m/ seg o ms. Los potenciales de accin son consecuencia directa de la accin de los canales regulados por voltaje, com o veremos a continuacin

membrana polarizada

yS

cerrado

membrana despolarizada

Figura 11-21 El canal de Na+ regulado por voltaje puede adoptar como mnimo tres conformaciones (estados). Fuerzas internas, representadas aqu como atracciones entre cargas de diferentes zonas del canal, estabilizan cada uno de los estados contra pequeas desestabilizaciones, pero una colisin suficientemente violenta con otras molculas puede ocasionar que el canal salte de uno a otro de estos estados. El estado de menor energa depende del potencial de membrana ya que las diferentes conformaciones tienen diferentes distribuciones de cargas. Cuando la membrana est en reposo (muy polarizada) la conformacin de menor energa libre, y por tanto la ms estable, es la cerrada. Cuando la membrana se encuentra despolarizada, la conformacin abierta tiene una energa menor, por lo que el canal tiene una alta probabilidad de abrirse. Sin embargo, la energa libre de la conformacin inactivada es todava menor, por lo que, despus de un perodo de tiempo aleatorio dedicado a este estado abierto, el canal se inactiva. As pues, la conformacin abierta corresponde a un estado metaestable que nicamente puede existir de forma transitoria. Las flechas en rojo indican la secuencia de alteraciones que se producen como consecuencia de una despolarizacin sbita mientras que la flecha en negro indica el retorno a la conformacin original ya que es el estado de menor energa despus de que la membrana se ha repolarizado.

564

Captulo 11: Transporte de molculas pequeas a travs de la membrana

< DO

C D

||i O D t>d trf 2

ro < / )O cerrados

abiertos nactivados

cerrados

D
2

1
tiempo (milisegundos)

Los canales inicos regulados por voltaje son los responsables d la generacin de potenciales de accin en clulas excitables elctricam ente 15,17
La membrana plasmtica de todas las clulas excitables elctricamente (no slo de las neuronas sino tambin de las fibras musculares, clulas endocrinas y oocitos) presentan canales inicos regulados por voltaje, que son los responsables de la generacin de los potenciales de accin. Un potencial de accin se dispara por una despolarizacin de la mem brana -e s decir, por una variacin del poten cial de membrana hasta un valor menos negativo. (Veremos ms adelante de qu forma esta variacin puede estar causada por la accin de un neurotransmisor). En las clulas nerviosas y en las fibras musculares esquelticas, un estmulo que provoca una despolarizacin parcial de la membrana genera inmediatamente la apertura de los canales de Na+regulados por voltaje, lo cual permite que entre en la clula una pequea cantidad de Na+ a favor de su gradiente electroqumico. El influjo de cargas positivas despolariza an ms la membrana, por lo que se abren ms canales de Na+ , que admiten ms iones Na+ , cuya entrada genera una mayor despolarizacin de la membrana. Este proceso contina de una manera auto-amplificante hasta que el potencial de la regin determinada de la m em brana haya variado desde su valor de reposo -d e aproximadamente -7 0 m Vhasta el potencial de equilibrio del Na+ -d e aproximadamente +50 m V- (vase Panel 11-2, pg. 562). En este punto, cuando la fuerza electroqumica neta im pulsora del flujo de Na+es casi cero, la clula podra alcanzar un nuevo estado de reposo con todos sus canales de Na+ abiertos permanentemente si la conform a cin abierta de los canales de Na+fuese estable. La clula se salva de este tipo de espasmo elctrico permanente porque los canales de Na+ tienen un mecanismo de inactivacin automtica que hace que los canales se cierren rpidamente incluso cuando la membrana todava est despolarizada. Los canales de Na+ permanecen en este estado inactivado, en el que no pueden volverse a abrir, hasta pasados algunos milisegundos despus que el potencial de mem brana recupere su valor negativo inicial. En la Figura 11-21 se ilustran esquemticamente estos tres estados distintos del canal de Na+ regulado por voltaje -cerrado, abierto, e inactivado. En la Figura 11-22 se indica la contribucin de estas variaciones al aumento y la disminucin del potencial de accin.

Figura 11 -22 Un potencial de accin. Un potencial de accin se dispara por un breve pulso de corriente (mostrado en el grfico superior) que despolariza parcialmente la membrana, como se muestra en el grfico de potencial de membrana respecto al tiempo {grfico intermedio). La curva en verde muestra que el potencial de membrana puede simplemente relajarse de nuevo hacia el potencial de reposo tras el estmulo despolarizador si la membrana no tuviera canales inicos regulados por voltaje; este retorno relativamente suave del potencial de membrana a su valor inicial de -70 mV en ausencia de canales de Na+es automtico debido al eflujo de K+a travs de los canales de K+ , el cual lleva a la membrana de nuevo al potencial de equilibrio de K+ . La curva en rojo muestra el curso del potencial de accin causado por la apertura y posterior inactivacin de los canales de Na+regulados por voltaje, cuyo estado se muestra en la parte inferior de la figura. La membrana no puede disparar un segundo potencial de accin hasta que los canales de Na+ hayan vuelto a la conformacin cerrada (vase Figura 11-21); hasta este momento, la membrana se encuentra en un estado refractario a la estimulacin.

Canales inicos y propiedades elctricas de las membranas

565

(A)

propagacin

1
tiempo (milisegundos)

Figura 11 -23 Propagacin de un potencial de accin a lo largo de un axn. (A) muestra los voltajes que se registraran en un conjunto de electrodos intracelulares colocados a intervalos en el axn. (B) muestra los cambios en los canales de Na+y los flujos de corriente (ln eas d e color m arrn) que dan lugar a la perturbacin migratoria del potencial de membrana. La regin del axn que presenta la m embrana despolarizada, est coloreada en rojo. Ntese que un potencial de accin slo puede viajar a partir del lugar donde se produce la despolarizacin porque la inactivacin de los canales de Na+impide que la despolarizacin se extienda hacia atrs. (Vase tam bin Figura 11-22.)

(B) vista instantnea a f = 0 propagacin canales de Na+ cerrado inactivado abierto cerrado

+
membrana repolarizada despolarizada

+
reposo

vista instantnea a f= 1 milisegundo propagacin canales de Na+ cerrado inactivado abierto cerrado

+
membrana

+
repolarizada despolarizada

+
reposo

La descripcin que hemos hecho hasta aqu del potencial de accin nica mente afecta a una pequea porcin de la membrana plasmtica. Sin embargo, la despolarizacin auto-amplificante de esta porcin es suficiente para despola rizar regiones vecinas, en las cuales se produce este mismo ciclo. De esta m ane ra el potencial de accin se propaga desde un punto inicial de despolarizacin por toda la m em brana plasmtica, como se muestra en la Figura 11-23. Adems de la inactivacin de los canales de Na+, en muchas clulas nervio sas acta un segundo mecanism o que ayuda a la membrana plasmtica activada

566

Captulo 11: Transporte de molculas pequeas a travs de la membrana

a recuperar ms rpidamente su potencial negativo original, y as poder trans mitir un segundo impulso. Los canales de K+ regulados por voltaje se abren, de forma que el influjo transitorio de Na+ es rpidamente contrarrestado por un eflujo de K+ , que en muy poco tiempo sita a la membrana en el potencial de equilibrio del K+ incluso antes de que se haya completado la inactivacin de los canales de Na+. Estos canales de K+ responden a cambios del potencial de mem brana de forma muy semejante a como lo hacen los canales de Na+ , aunque con una cintica ligeramente ms lenta; por esta razn, a menudo se les denomina

canales de K+retardados.
Los mecanismos electroqumicos del potencial de accin fueron estableci dos por primera vez gracias a unas famosas series de experimentos realizados en las dcadas de 1940 y 1950. Debido a que las tcnicas de estudio de los procesos elctricos en clulas pequeas todava no se haban desarrollado, los experi mentos utilizaron las neuronas gigantes del calamar. A pesar de los muchos avances tcnicos realizados desde entonces, la lgica de los anlisis originales todava contina sirviendo de modelo hoy en da. En el Panel 11-3 se resumen algunos de los experimentos clave originales.

La mielinizacin incrementa la velocidad y la eficiencia de la propagacin de los potenciales de accin en las clulas nerviosas15,1 8
Los axones de muchas neuronas de vertebrados se hallan aislados por una vaina de mielina, la cual incrementa notablemente la velocidad a la que el axn con duce un potencial de accin. La importancia de la mielinizacin se pone dram ticamente de manifiesto por la enfermedad desmielinizante de la esclerosis ml tiple, en la que la vaina de mielina de algunas regiones del sistema nervioso centred se halla destruida por un mecanismo todava desconocido; cuando esto ocurre, la velocidad de propagacin de los impulsos nerviosos se reduce nota blemente, a menudo con consecuencias neurolgicas devastadoras. La mielina est formada por clulas accesorias especializadas, denominadas clulas gliales -clulas de Schwann en los nervios perifricos y oligodendrocitos en el sistema nervioso central. Estas clulas gliales depositan, una sobre otra, capas de su propia membrana plasmtica formando una apretada espiral alrededor del axn (Figura 11-24), aislando as la membrana del axn de forma que a su travs casi no se escapa corriente. La vaina est interrumpida a intervalos regulares por ndulos de Ranvier, donde se concentran casi todos los canales de Na+ del axn. Debido a que las porciones del axn que estn recubiertas por la vaina tienen excelentes propiedades de cable (se comportan elctricamente mucho mejor que los extraordinariamente bien diseados cables submarinos telegrficos), la despolarizacin de la membrana en un ndulo se transmite de forma pasiva casi inmediatamente hasta el ndulo siguiente, un proceso denominado conduccin saltatoria. Este tipo de conduccin tiene dos ventajas principales: los potencia les de accin viajan ms rpidamente y se ahorra energa metablica ya que la excitacin activa queda restringida a las reducidas regiones de la membrana plasmtica del axn situadas en los ndulos de Ranvier.

El registro de zona indica que cada uno de los canales de Na* se abre siguiendo la ley del todo o nada15,1 9
Las membranas plasmticas de las neuronas y de las fibras musculares esquelti cas contienen muchos miles de canales de Na+regulados por voltaje, y la corrien te que atraviesa la membrana es la suma de las corrientes que fluyen a travs de todos ellos. Esta corriente agregada puede ser registrada con un microelectrodo, tal como se describe en la Figura 11-23. Sin embargo, tambin es posible regis trar las corrientes que fluyen a travs de canales individuales. Ello se consigue mediante la tcnica del registro de zona (patch-clamp recording), un mtodo que revolucion el estudio de los canales inicos permitiendo estudiar el trans-

Canales inicos y propiedades elctricas de las membranas

1. L o s p o t e n c ia le s d e a c c i n s e r e g is tr a n c o n u n e le c t r o d o in t r a c e lu la r El a x n g ig a n t e d e c a l a m a r t ie n e u n d i m e t r o a p r o x im a d o d e 0 ,5 -1 m m y u n a lo n g itu d d e v a r io s c e n t m e tr o s . E n el e je d e la c lu la s e p u e d e in t r o d u c ir un e le c t r o d o e n f o r m a d e t u b o c a p ila r d e v id r io q u e c o n t ie n e u n a s o lu c i n c o n d u c t o r a , d e m a n e r a q u e s u p u n ta q u e d e s itu a d a d e n t r o d e l c it o p la s m a . C o n s u a y u d a , s e p u e d e m e d ir la d ife r e n c ia d e v o lt a je e n t r e e l in t e r io r y e l e x t e r io r d e la c lu la e s d e c ir , e l p o te n c ia l d e m e m b r a n a c u a n d o u n p o te n c ia l d e a c c i n p a s a r p id a m e n t e p o r el e le c tr o d o . El p o te n c ia l d e a c c i n s e d e s e n c a d e n a p o r u n a b r e v e d e s c a r g a e l c tric a e n u n e x t r e m o d e l a x n . N o im p o r t a d e q u e x t r e m o s e t r a t e , y a q u e la e x c ita c i n p u e d e v ia ja r e n c u a lq u ie r d ir e c c i n ; t a m p o c o im p o r t a la in te n s id a d d e la d e s c a r g a m ie n t r a s e x c e d a u n c ie r to u m b r a l: e l p o t e n c ia l d e a c c i n e s " t o d o o n a d a " .

m em brana plasm tica

electrodo intracelular

potencial de accin

----- .--------------- axon

I _____ I

1 mm

2 . El p o te n c ia l d e a c c i n s lo d e p e n d e d e la m e m b r a n a p la s m tic a d e la n e u r o n a y d e lo s g r a d ie n t e s d e N a + y K+ a tr a v s d e e lla L o s tr e s io n e s m s a b u n d a n t e s , t a n t o e n el in t e r io r c o m o e n el e x t e r io r d e l a x n , s o n N a +, K+ y C l_. C o m o e n o tr a s c lu la s , la b o m b a d e N a +-K + m a n t ie n e u n g r a d ie n t e d e c o n c e n tr a c i n : la c o n c e n tr a c i n d e N a + e s u n a s 9 v e c e s m e n o r e n el in t e r io r d e l a x n q u e e n e l e x t e r io r , m ie n t r a s q u e la c o n c e n t r a c i n d e K + e s 2 0 v e c e s m a y o r e n el in te r io r . Q u io n e s s o n im p o r t a n t e s p a r a lo s p o te n c ia le s d e a c c i n ? El a x n g ig a n t e d e l c a la m a r e s ta n g r a n d e y r o b u s to q u e e s p o s ib le e x t r a e r su c it o p la s m a , c o m o s e h a c e c o n la p a s ta d e n tf r ic a d e u n t u b o

y d e s p u s r e lle n a r lo c o n s o lu c io n e s a r t ific ia le s p u ra s d e N a +, K+ y C l_ o S 0 42 -. D e m a n e r a n o t a b le , si (y s lo si) la s c o n c e n t r a c io n e s d e N a + y K + e n el in t e r io r y el e x t e r io r d e l a x n s e a p r o x im a n a las e n c o n t r a d a s d e m a n e r a n a t u r a l, el a x n p r o p a g a p o t e n c ia le s d e a c c i n d e f o r m a n o r m a l. La p a r te im p o r t a n t e d e la c lu la e n la s e a liz a c i n e l c tr ic a , p o r lo t a n t o , h a d e s e r la m e m b r a n a ; lo s io n e s im p o r t a n t e s s o n el N a + y K+; s u s g r a d ie n te s d e c o n c e n tr a c i n a tr a v s d e la m e m b r a n a h a n d e p r o p o r c io n a r u n a f u e n t e d e e n e r g a lib r e s u fic ie n te p a r a im p u ls a r el p o te n c ia l d e a c c i n , y a q u e s e s u p o n e q u e la s d e m s f u e n t e s d e e n e r g a m e t a b lic a h a n s id o e lim in a d a s m e d ia n t e la p e r fu s i n .

cnula para la perfusin \

axn gigante /

rodillo elstico

axoplasma alfom brilla elastica cnula

de ^ perfusin flu jo de liquido de perfusin t . lquido y m em brana del axn gigante

3 . En r e p o s o , la m e m b r a n a e s p r in c ip a lm e n t e p e r m e a b le al K +; s e v u e lv e t r a n s i t o r ia m e n t e p e r m e a b le al N a + d u r a n t e el p o te n c ia l d e a c c i n E n r e p o s o , el p o t e n c ia l d e m e m b r a n a e s c e r c a n o al p o te n c ia l d e e q u ilib r io p a r a el K +. C u a n d o s e c a m b ia la c o n c e n tr a c i n e x t e r n a d e K+, el p o te n c ia l d e r e p o s o c a m b ia b r u s c a m e n t e d e a c u e r d o c o n la e c u a c i n d e N e r n s t p a r a el K+ (v a s e P a n e l 1 1 - 2 ) . E n r e p o s o , p o r t a n t o , la m e m b r a n a e s p r in c ip a lm e n t e p e r m e a b le al K +: lo s c a n a le s d e f u g a d e K + c o n s tit u y e n la p r in c ip a l ru ta i n ic a a t r a v s d e la m e m b r a n a . S i s e v a r a la c o n c e n t r a c i n e x te r n a d e N a +, n o s e a lt e r a el p o te n c ia l d e r e p o s o . S in e m b a r g o , la a ltu r a d e l p ic o d e l p o te n c ia l d e a c c i n v a r a m a r c a d a m e n t e , d e a c u e r d o c o n la e c u a c i n d e N e r n s t p a r a el N a +. D u r a n te e l p o te n c ia l d e a c c i n , p o r lo ta n t o , la m e m b r a n a p a r e c e s e r p e r m e a b le p r in c ip a lm e n t e a l N a +: s e a b r e n lo s c a n a le s d e N a +. E n la s e g u n d a p a r te d e l p o te n c ia l d e a c c i n , el p o te n c ia l d e m e m b r a n a v u e lv e a u n v a lo r n e g a t iv o q u e d e p e n d e d e la c o n c e n t r a c i n e x t e r n a

d e K + , y s e s it a in c lu s o m s c e rc a d e l p o te n c ia l d e e q u ilib r io p a r a el K + q u e el p r o p io p o te n c ia l d e re p o s o : la m e m b r a n a ha p e r d id o su p e r m e a b ilid a d p a r a el N a + y t o d a v a s e h a v u e lt o m s p e r m e a b le al K+ q u e a n te s e s d e c ir , lo s c a n a le s d e N a + se h a n c e r r a d o , y s e h a n a b ie r t o c a n a le s a d ic io n a le s d e K +.

,100%

Forma del potencial de accin cuando el m edio externo contiene el 100%, 50%, o el 33% de la concentracin norm al de Na+.

4 . El v o lt a je c o n s t a n t e r e v e la c m o el p o te n c ia l d e m e m b r a n a c o n tr o la la a p e r t u r a y el c ie r r e d e lo s c a n a le s i n ic o s El p o te n c ia l d e m e m b r a n a s e m a n tie n e c o n s ta n te e n el a x n , h a c ie n d o p a s a r u n a c o r r ie n te e l c tr ic a a tr a v s d e u n h ilo m e t lic o d e s c u b ie r to y c o lo c a d o e n el e je d e l a x n ; c o n o tr o e le c tr o d o in tr a c e lu la r se p u e d e n s e g u ir las v a r ia c io n e s d e l p o te n c ia l d e la m e m b r a n a . C u a n d o la m e m b r a n a s e d e s p la z a b r u s c a m e n te d e su p o te n c ia l d e r e p o s o y se m a n t ie n e e n u n e s t a d o d e s p o la r iz a d o (A ), lo s c a n a le s d e N a + s e a b r e n r p id a m e n t e h a s ta q u e la p e r m e a b ilid a d d e la m e m b r a n a p a r a el N a + e s m u c h o m a y o r q u e p a r a e l K +; e n to n c e s s e c ie r r a n d e n u e v o d e m a n e r a e s p o n t n e a . L o s c a n a le s d e K + t a m b i n s e a b r e n p e r o c o n un c ie r to r e tr a s o , d e m a n e r a q u e la p e r m e a b ilid a d p a r a el K + a u m e n t a c u a n d o c a e la p e r m e a b ilid a d p a r a el N a + (B ). S i a h o r a s e r e p ite m u y r p id a m e n t e el e x p e r i m e n t o , h a c ie n d o v o lv e r b r e v e m e n t e la m e m b r a n a al p o te n c ia l d e r e p o s o y d e s p o la r iz n d o la d e n u e v o , la r e s p u e s ta e s d ife r e n te : la d e s p o la r iz a c i n p r o lo n g a d a h a h e c h o q u e lo s c a n a le s d e N a + e n tr e n e n u n e s t a d o in a c t iv a d o y la s e g u n d a d e s p o la r iz a c i n n o p r o d u c e u n a s u b id a y u n a b a ja d a d e l p o te n c ia l d e m e m b r a n a s im ila r a la p r im e r a . La r e c u p e r a c i n d e lo.s c a n a le s d e e s te e s t a d o s u p o n e u n in te r v a lo d e t ie m p o r e la tiv a m e n t e la r g o - d e

10 m ili s e g u n d o s - q u e tr a n s c u r r e m ie n t r a s el p o te n c ia l d e m e m b r a n a s e m a n t ie n e r e p o la r iz a d o (e n r e p o s o ). En u n a x n s in v o lt a je c o n s t a n t e , la e s p ig a d e l p o te n c ia l d e a c c i n e s t p r o d u c id a p o r un a v a la n c h a d e N a + a t r a v s d e lo s c a n a le s d e N a + a b ie r to s ; la in a c tiv a c i n d e s to s y la a p e r t u r a d e lo s d e K+ d e v u e lv e la m e m b r a n a al p o te n c ia l d e r e p o s o .

potencial de m em brana

ab ierto

20 e o < / ) 10 E 0
cerrado

conductancia al K+

conductancia al Na+

lISilliiPi
568 Panel 11-3 Algunos experimentos clsicos realizados en el axn gigante del calamar.

1 mm

vaina de m ielina capas de m ielina ndulo de Ranvier

axon

ncleo
axoV , Figura 11-24 Mielinizacin. (A) Esquema de un axn mielinizado de un nervio perifrico. Cada clula de Schwann deposita su membrana plasmtica de forma concntrica alrededor del axn, formando un segmento de vaina de mielina de aproximadamente 1 mm de longitud. Para mayor claridad las capas de mielina no se han dibujado tan densamente compactadas como lo estn en realidad (vase B). (B) Electronmicrografa de un corte de un nervio de la pata de una rata joven. Se observan dos clulas de Schwann: una {abajo) est empezando a mielinizar su axn, mientras que la otra ya ha formado una vaina de mielina casi madura. (B. de C. Raine, en Myelin [P. Morell, ed.]. New York: Plenum, 1976.)

porte a travs de una nica molcula proteica de canal situada en una pequea porcin de membrana que se halle cubriendo la punta de una micropipeta (Fi gura 11-25). Esta simple pero poderosa tcnica permite estudiar las propiedades detalladas de los canales inicos de cualquier tipo celular, y ello ha llevado a descubrir que incluso las clulas que no son excitables elctricamente tienen ha bitualmente en su mem brana plasmtica varios canales inicos regulados. Mu chas de estas clulas, como las levaduras, son demasiado pequeas para poder ser estudiadas por el mtodo electrofsiolgico tradicional de implantar un microelectrodo en el interior de la clula. El registro de zona indica que cada uno de los canales de Na+ regulados por voltaje se abre siguiendo la ley de todo o nada: los tiempos de apertura y cierre son aleatorios pero cuando el canal est abierto, siempre tiene la misma con ductancia, permitiendo que pasen unos 8000 iones por segundo a su travs. Por lo tanto, la corriente agregada que atraviesa la membrana de una clula entera, a travs de una gran poblacin de canales de Na+ , no indica el grado de apertura de un canal tpico individual sino el nmero total de canales de su membrana que se hallan abiertos en un momento dado (Figura 11-26). El fenmeno de regulacin por voltaje puede ser entendido en trminos de simples principios fsicos elementales. El interior de una neurona o de una fibra muscular en reposo tiene un potencial elctrico de unos 50-100 mV ms negati vo que el medio externo. Esta diferencia de potencial puede parecer pequea, pero dado que se produce a travs de una membrana plasmtica de tan slo 5 nm de grosor, el gradiente de voltaje resultante es de aproximadamente 100 000 V/cm. Por lo tanto, las protenas de la mem brana estn sujetas a un campo elctrico muy grande. Estas protenas, como todas las dems, presentan en su superficie varios grupos cargados y diversas uniones polarizadas entre sus tomos. Por consiguiente, el campo elctrico genera fuerzas sobre su estructura molecular.

Canales inicos y propiedades elctricas de las membranas

569

succion suave (A) m icropipeta de vidrio unin ntim a canales i n ic o s \ mem brana celular
IB)

Figura 11 -25 Tcnica de registro de zona. Debido a que la unin entre la

separar la m icropipeta de la clula para arrancar la zona de la m em brana

fi-li.
CITOSOL

1/

Probablemente las variaciones del campo elctrico de la membrana afectan de forma insignificante a muchas de las protenas de membrana. Sin embargo, los canales inicos regulados por voltaje pueden adoptar varias conformaciones al ternativas cuyas estabilidades dependen de la intensidad del campo elctrico. Cada conform acin es estable frente a pequeas alteraciones, pero puede saltar (flip) a otra conform acin si sufre una sacudida suficiente por los movimien tos trm icos aleatorios del entorno, alterndose la estabilidad relativa de las conform aciones abierta, cerrada e inactivada (vase Figura 11-21).

boca de la micropipeta y la membrana es muy intensa, la corriente nicam ente puede entrar o salir de la micropipeta atravesando los canales de la z o n a de membrana que recubre la boca de la micropipeta. Se utiliza un dispositivo electrnico que permite m antener el potencial de m embrana a un valor constante predeterminado mientras se registra la corriente inica que atraviesa los canales individuales. La ventaja de trabajar con la zona de m embrana separada de la clula es que resulta ms fcil alterar la com posicin de la solucin a cada lado de la membrana, para estudiar el efecto de diferentes solutos sobre el com portamiento del canal. La zona de membrana separada del resto de la clula tambin puede colocarse en la orientacin opuesta, con la cara citoplasmtica de la m em brana hacia el lumen de la pipeta (vanse tambin Figuras 4-54 y 4-55).

Los canales catinicos regulados por voltaje estn relacionados evolutiva y estructuralm ente 20
Los canales de Na+ no constituyen el nico tipo de canal catinico regulado por voltaje que puede generar un potencial de accin: por ejemplo, los potenciales de accin de algunas fibras musculares, oocitos y clulas endocrinas no depen den de canales de Na+ sino de canales de Ca2 + regulados por voltaje. Adems, en algunos tipos de clulas que norm alm ente no son elctricamente activas se ha llan canales de Na+ , de K+ o de Ca2 + regulados por voltaje, cuya funcin es desco nocida. En cada una de estas tres clases de canales catinicos regulados por vol taje existe una sorprendente diversidad estructural y funcional, generada tanto

Figura 11 -26 Registros de corriente a travs de un nico canal de Na* regulado por voltaje. Se utiliza una diminuta zona de m embrana plasmtica separada de una
clula muscular de embrin de rata (vase Figura 11-25). La membrana fue despolarizada por un abrupto incremento de potencial, como se indica en (A). Los tres registros de corriente que se presentan en (B) provienen de tres experimentos realizados sobre la misma zona de membrana. Cada una de las variaciones mayores de corriente de (B) representan la apertura y el cierre de un solo canal. El estudio comparativo de los tres registros muestra que, a pesar de que los tiempos de apertura y cierre del canal varan considerablemente, la velocidad a la que la corriente fluye a travs del canal abierto es prcticam ente constante. Las fluctuaciones menores del registro de corriente provienen principalmente de ruido elctrico de fondo del aparato de medida. En (C) se muestra la suma de corrientes medidas en 144 repeticiones del mismo experimento. Esta corriente agregada es equivalente a la corriente de Na+habitual que se podra observar a travs de una zona de membrana que contuviera 144 canales. Comparando (B) y (C) se puede observar que la variacin temporal de voltaje de la corriente agregada refleja la probabilidad de que cualquier canal individual se encuentre en el estado abierto; esta probabilidad disminuye con el tiempo a medida que los canales de la membrana despolarizada adoptan su conform acin inactivada. (Datos de J. PatlakyR. Horn,/. Gen. Physiol. 79:333-351, 1982, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

(A) potencial de -40 m em brana -90 (mV) (B) corriente de la zona de m em brana (pA)
y*". U w s s A 1 W A

(C)

corriente agregada 0 40 80 tiem po (m ilisegundos)

570

Captulo 11: Transporte de molculas pequeas a travs de la membrana

bicapa lipidica COOH

HOOC

HOOC

(B)

por mltiples genes como por maduracin alternativa de los transcritos de RNA producidos a partir de un mismo gen. Sin embargo, la secuencias de am inoci dos conocidas de los canales de Na+ , K+ y Ca2+regulados por voltaje muestran elevados grados de similitud, lo cual sugiere que todos ellos pertenecen a una gran superfamilia de protenas relacionadas evolutiva y estructuralmente. Cada tipo de canal catinico regulado por voltaje est compuesto de cuatro dominios proteicos homlogos (en el caso de los canales de Na+ y de Ca2+ ) o de cuatro subunidades idnticas (en el caso de los canales de K+ ). Se cree que estos cuatro dominios o subunidades se disponen a modo de costillas de un barril, ro deando un poro central, como se ilustra en la Figura 11-27. Los canales de K+ son especialmente adecuados para estudiar las relaciones entre la estructura y la fun cin de los canales catinicos regulados por voltaje, ya que no estn formados por una gran cadena polipeptdica sino por subunidades idnticas relativamente pequeas. La secuencia de aminocidos sugiere que cada una de las subunidades de un canal de K+ contiene seis hlices a que atraviesan la membrana, aunque, de forma sorprendente, parece que ninguna de ellas forma el poro que conduce los iones. Diversos estudios utilizando tcnicas de DNA recom binante sobre protenas de canal de K+ modificadas sugieren que un segmento de una cadena polipeptdica de 20 aminocidos se extiende a travs de la mem brana formando una lmina (3 antiparalela que bordea el poro: cuando se intercambia este ele m ento entre dos canales de K+ con diferentes propiedades de permeabilidad, se observa que las caractersticas de permeabilidad dependen nicamente de este segmento. Se ha utilizado una aproximacin similar para identificar otras dos impor tantes regiones funcionales de las protenas de canal de K+ . Los 19 residuos amino terminales de al menos una de estas protenas participan en la rpida inacti vacin del canal. Si se altera esta regin, la cintica de inactivacin del canal cambia, y si la regin se elimina completamente, se elimina la inactivacin. Asombrosamente, en este ltimo caso se puede recuperar la inactivacin expo-

Figura 11 -27 Modelo de la estructura dal canal de K + regulado por voltaje. (A) Diagrama topolgico mostrando los principales dominios funcionales de la cadena polipeptdica de una subunidad, con las seis posibles hlices a transmembrana marcadas del 1 al 6. Se cree que las subunidades, cada una de unos 600 aminocidos, se ensamblan formando un poro transmembrana; en (B) slo se muestran dos de ellas. En los canales de Na+y de Ca2 +regulados por voltaje las 4 subunidades son dominios de una nica larga cadena polipeptdica, pero se cree que su estructura general es similar a sta. Parece que el segmento de 20 aminocidos (que se muestra en rojo) situado en la regin de unin entre las hlices 5 y 6 se extiende a travs de la membrana como dos lminas P antiparalelas formando el poro, como se muestra en la figura. La cuarta hlice a (azul) tiene residuos cargados positivamente en casi cada tercera posicin, lo cual al parecer le permite actuar como un sensor al voltaje. Al menos en algunos canales de K+el dominio amino terminal participa en la rpida inactivacin del canal, como se ilustra en la Figura 11-28.

Canales inicos y propiedades elctricas de las membranas

571

niendo la cara citoplasmtica de la membrana plasmtica a un pequeo pptido sinttico correspondiente al amino terminal eliminado. Estos resultados sugieren que la regin amino terminal de cada canal de K+ acta como una pelota anclada mediante una corta cadena, que ocluye el extremo citoplasmtico del poro en cuanto ste se abre (Figura 11-28); se cree que un mecanismo similar a ste acta en la rpida inactivacin de los canales de Na+ regulados por voltaje, aunque pa rece que en este caso participa un segmento diferente de la proteina. Finalmente, una de las hlices a transmembrana altamente conservadas en todos los canales catinicos regulados por voltaje conocidos contiene residuos de aminocido car gados positivamente, distribuidos de una forma espaciada regularmente (vase Figura 11-27A). Se cree que esta hlice podra actuar como sensor al voltaje en es tos canales: si se altera alguno de estos residuos cargados, tambin se altera la respuesta del canal al potencial de membrana. Se ha utilizado el mismo tipo de anlisis, combinando la tecnologa del DNA recom binante y las tcnicas de electrofisiologa, para caracterizar otras clase de canales inicos. Estos canales no se abren en respuesta a cambios del potencial de mem brana sino a la unin de un neurotransmisor especfico.

Figura 11 -28 El modelo de bola y cadena para la rpida inactivacin de un canal de K+regulado por voltaje. Cuando la membrana se despolariza el canal se abre y empieza a conducir iones. Entonces, el canal abierto es susceptible de ocluirse (inactivarse) por la bola de 19 aminocidos del extremo amino terminal, que est unida al propio canal mediante un segmento de cadena polipeptdica desplegado que acta como una cadena. Para simplificar slo se muestran dos bolas; de hecho existen 4 de ellas, una de cada subunidad. Se cree que un mecanismo similar a ste, utilizando un segmento diferente de la cadena polipeptdica, acta en la inactivacin del canal de Na+ .

term inal nervioso neurotransm isor en vesculas hendidura sinptica _ canal regulado por * transm isor __clula diana postsinptica SINAPSIS QUMICA EN REPOSO

En las sinapsis qum icas los canales inicos regulados por transm isor transform an seales qumicas en seales elctricas 15
Las seales neuronales se transm iten de una clula a otra a travs de lugares especializados de contacto conocidos como sinapsis. El m ecanismo habitual de transmisin es indirecto. Las clulas se hallan aisladas elctricamente una de otra, estando la clula presinptica separada de la clula postsinptica por una estrecha hendidura sinptica. Un cambio del potencial elctrico en la clula pre sinptica desencadena la liberacin de una pequea molcula seal conocida como neurotransm isor, el cual se almacena en vesculas sinpticas rodeadas de m em brana y se libera por exocitosis. El neurotransmisor difunde rpidamente a travs de la hendidura sinptica y provoca un cambio elctrico en la clula post sinptica a travs de un canal inico regulado por transmisor (Figura 11-29). Una vez el neurotransmisor ha sido secretado, es rpidamente eliminado, bien por enzimas especficas de la hendidura sinptica bien por recaptacin -tanto por la terminal nerviosa que lo ha liberado como por las clulas gliales vecinas. La re captacin est mediada por varios tipos de protenas transportadoras de neuro transmisor dependientes de Na+ . La rpida eliminacin asegura la precisin es pacial y temporal de la sealizacin en la sinapsis: evita que el neurotransmisor afecte a las clulas vecinas y limpia la hendidura sinptica antes de que se pro duzca el nuevo pulso de liberacin de neurotransmisor, de forma que a la clula postsinptica se le puede com unicar el ritmo, repetido y rpido, de los procesos sealizadores. Como veremos, la sealizacin a travs de sinapsis qumicas de este tipo es mucho ms verstil y adaptable que el acoplamiento elctrico direc to a travs de uniones com unicantes en las sinapsis elctricas (discutidas en el Captulo 19), tam bin utilizadas por las neuronas aunque mucho menos fre cuentem ente.
t *

m em brana plasmtica de la clula diana

SINAPSIS QUMICA ACTIVA

Figura 11 -29 U na sinapsis qumica. Cuando un potencial de accin alcanza al terminal nervioso, estimula a dicho terminal a liberar su neurotransmisor; el neurotransmisor se halla contenido en vesculas sinpticas y se libera al exterior celular cuando las vesculas se fusionan con la membrana plasmtica del terminal nervioso. El neurotransmisor liberado se une a los canales inicos regulados por transmisor concentrados en la zona sinptica de la membrana plasmtica de la clula diana, abrindolos. El flujo de iones resultante altera el potencial de membrana de la clula diana, transmitiendo as una seal desde el nervio excitador.

572

Captulo 11 : Transporte de molculas pequeas a travs de la membrana

Los canales inicos regulados por transm isor estn especializados en la rpida conversin de seales qumicas extracelulares en seales elctricas, en las sinapsis qumicas. Los canales se hallan concentrados en la membrana plasmtica de la clula postsinptica en la regin de la sinapsis, y se abren transitoriamente en respuesta a la unin de molculas de neurotransmisor, produciendo as un breve cambio de permeabilidad de la membrana (vase Fi gura 11-29). A diferencia de los canales regulados por voltaje responsables de los potenciales de accin, los canales regulados por transmisor son relativa mente insensibles al potencial de membrana y por ello no pueden por s mis mos producir una excitacin auto-amplificante. En lugar de ello producen cambios locales de permeabilidad y por tanto cambios del potencial de m em brana, de intensidad proporcional al nmero de molculas de neurotransmisor liberadas en la sinapsis y al tiempo en que estas molculas persistan en ella. Solamente se puede generar un potencial de accin a partir de este lugar si el potencial de membrana local se incrementa suficientemente como para abrir un nmero suficiente de canales catinicos regulados por voltaje presentes en la misma membrana de la clula diana.

Las sinapsis qumicas pueden ser excitadoras o inhibidoras15,21

Los canales inicos regulados por transmisor difieren en algunos aspectos im portantes. En primer lugar, como los receptores, tienen un lugar de unin alta mente selectivo para el neurotransmisor liberado desde el terminal nervioso presinptico. En segundo lugar, como los canales, son selectivos al tipo de ion que dejan pasar a travs de la membrana; ello determina la naturaleza de la res puesta postsinptica. Los neurotransm isores excitadores, como la acetilcolina, el glutamato y la serotonina, abren canales catinicos que generan un influjo de Na+ que despolariza la membrana postsinptica hacia el potencial umbral que dispara un potencial de accin. Los neurotransm isores inhibidores como el cido y-aminobutrico (GABA) y la glicina, por el contrario, abren canales de CL, lo cual suprime el disparo, polarizando la membrana postsinptica. Ya hemos discutido cmo la apertura de los canales inicos despolariza una membrana. El efecto de la apertura de los canales de Cl puede entenderse de la siguiente manera. La concentracin de Cl- es mucho mayor fuera que dentro de la clula (vase Tabla 11-1, pg. 542). Por esta razn, la apertura de los canales de Cl- tender a hiperpolarizar la membrana al entrar ms iones cloro cargados negativamente l interior de la clula, a no ser que el potencial de membrana sea tan negativo que sea insuficiente para contrarrestar el elevado gradiente de Cl'. (De hecho, en muchas neuronas el potencial de equilibrio para el Cl- es cercano al potencial de reposo, o incluso es ms negativo.) En aquel caso, la apertura de los canales de Cl- hace ms difcil despolarizar la membrana y, por lo tanto, exci tar la clula. La importancia de los neurotransmisores inhibidores se demuestra por los efectos de las toxinas que bloquean su accin: la estricnina, por ejemplo, se une a los receptores de glicina bloqueands la accin de la glicina, lo cual cau sa espasmos, convulsiones y la muerte. No todas las seales qumicas del sistema nervioso, sin embargo, actan a travs de canales inicos regulados por ligando. Muchas de las molculas seal que son secretadas por los terminales nerviosos, incluidos una gran variedad de neuropptidos, se unen a receptores que regulan, indirectamente, canales inicos. Estos receptores, denominados receptores relacionados con protena G y receptores relacionados con enzimas se discuten en detalle en el Captulo 15. Mientras que la sealizacin mediada por neurotransmisores excitadores e inhibidores que se unen a canales inicos regulados por transmisor generalmente es inmediata, sim ple y breve, la sealizacin mediada por receptores relacionados con protenas G y por receptores relacionados con enzimas tiende a ser mucho ms lenta y ms compleja, as como de consecuencias ms duraderas.

Canales inicos y propiedades elctricas de las membranas

573

Los receptores de acetilcolina de las uniones neuromusculares son canales catinicos regulados por transm isor 22
El ejemplo m ejor estudiado de canales inicos regulados por transmisor es el re ceptor de acetilcolina de las fibras musculares esquelticas. Este canal se abre transitoriamente por la liberacin de acetilcolina del terminal nervioso, en una sinapsis neurom uscular -u n a sinapsis especializada entre una neurona motora y una fibra muscular esqueltica (Figura 11-30). Este tipo de sinapsis ha sido es tudiada intensam ente ya que es fcilmente accesible a los estudios electrofisiolgicos, a diferencia de la mayora de sinapsis del sistema nervioso central. El receptor de acetilcolina ocupa un lugar especial en la historia de los ca nales inicos. Fue el primer canal inico que fue purificado, el primero del que se conoci la secuencia com pleta de aminocidos, el primero en ser reconstitui do funcionalm ente en bicapas lipdicas sintticas y el primero para el que se re gistr la seal elctrica de un solo canal abierto. Su gen tambin fue el primer gen de una protena de canal que fue clonado y secuenciado. Al menos existen dos razones que explican el rpido progreso en la purificacin y caracterizacin de este receptor. En primer lugar, existe una fuente extraordinariamente rica de este receptor en los rganos elctricos de los peces elctricos y de las rayas (estos rganos son msculos modificados diseados para descargar un gran shock elctrico sobre su presa). En segundo lugar, existen neurotoxinas (como la abungarotoxina ) en el veneno de ciertas serpientes, que se unen a dicho receptor con una elevada afinidad ( T a= 109 litros/mol) y especificidad, por lo que pueden ser utilizadas para purificarlo por cromatografa de afinidad. Tambin se puede utilizar a-bungarotoxina fluorescente o marcada con radiactividad para localizar y cuantificar los receptores de acetilcolina. De esta forma, se ha visto que el re ceptor se halla densamente empaquetado en la zona de la sinapsis neuromuscu lar de la m em brana plasmtica de las fibras musculares (unos 20 000 receptores/pm2), mientras que existen relativamente pocos de tales receptores en otros lugares de esta membrana. El receptor de acetilcolina de la fibra muscular esqueltica est compuesto por cinco polipptidos transmembrana, dos de un tipo y otros tres, codificados por cuatro genes diferentes. Los cuatro genes tienen una secuencia muy similar, lo cual implica que probablem ente han evolucionado a partir de un gen ances tral comn. Cada uno de los dos polipptidos idnticos del pentmero tiene lu gares de unin a la acetilcolina. Cuando dos molculas de acetilcolina se unen al com plejo pentamrico, inducen un cam bio de conformacin que abre el canal. El canal permanece abierto durante aproximadamente 1 milisegundo y enton ces se cierra; como los canales de Na+ regulados por voltaje, la forma abierta del canal receptor de acetilcolina tiene una vida media corta, y rpidamente salta a un estado cerrado, de menor energa libre (Figura 11-31). Posteriormente, las molculas de acetilcolina se disocian del receptor y son hidrolizadas por una en zima especfica (la acetilcolinesterasa) localizada en la sinapsis neuromuscular.

fibra muscular

axn mielinizado

nervio

de Schwann

terminales axnicos

10 lift*
Figura 11 -30 Electronm icrografa de barrido a bajo aum ento de una sinapsis neurom uscular de rana. Se muestra la terminacin de un nico axn sobre una fibra muscular esqueltica. (De J. Desaki y Y. Uehara, 10:101-110,1981, con permiso de Chapman & Hall.)

J. Neurocytol

ocupado y cerrado
574

ocupado y abierto

Figura 11 - 31 Tres conform aciones del receptor de acetilcolina. La unin de dos molculas de acetilcolina abre este canal inico regulado por transmisor. Sin embargo, incluso cuando se halla unido a acetilcolina, el receptor slo se halla en la conformacin abierta muy brevemente, antes de que el canal se vuelva a cerrar. Entonces la acetilcolina se disocia del receptor, lo cual permite al receptor volver a su conformacin original.

Captulo 11: Transporte de molculas pequeas a travs de la membrana

lugares de acetilcolina bicapa lipidica canal

poro 4 nm CITOSOL com puerta

Una vez se ha liberado del neurotransmisor al que se haba unido, el receptor de acetilcolina revierte a su estado inicial de reposo. Se ha determinado la forma general del receptor de acetilcolina y la dispo sicin de sus subunidades, m ediante una com binacin de m icroscopa electr nica y difraccin de rayos X de ngulo pequeo sobre cristales bidim ensionales: las cinco subunidades estn dispuestas en anillo formando un canal transm em brana lleno de agua, que consiste en un estrecho poro a travs de la bicapa lipdica rodeado por zonas cilindricas de la molcula (Figura 11-32). En cada uno de los extremos del poro, unos grupos de residuos de aminocido car gados negativamente ayudan a excluir los iones negativos y facilitan que los iones positivos de dimetro menor de 0,65 nm atraviesen el poro. El trfico nor mal consiste principalmente en iones Na+ y K+ , y algunos iones Ca2+ . As, a dife rencia de los canales catinicos regulados por voltaje, este canal tiene una baja selectividad a los cationes y la contribucin relativa de los diferentes cationes a la corriente a travs de los canales depende fundamentalmente de sus concen traciones y de las fuerzas electroqumicas que los impulsan. Cuando la m em bra na de la fibra muscular se halla en su potencial de reposo, la fuerza neta de im pulso del K+ es cercana a cero ya que el gradiente de voltaje equilibra casi totalm ente el gradiente de concentracin de K+a travs de la m embrana (vase Panel 11-2, pg. 562). Para el Na\ por el contrario, el gradiente de voltaje y el gradiente de concentracin actan en la misma direccin, impulsando el ion al interior de la clula. (Lo mismo es vlido para el Ca2+ , pero la concentracin extracelular de Ca2+ es mucho menor que la de Na+, de forma que el Ca2+ contribu ye muy ligeramente a la corriente de entrada total.) As pues, la apertura de los canales receptores de acetilcolina provoca un gran influjo neto de iones Na+ (unos 30 000 iones por canal cada milisegundo). Este influjo causa una despola rizacin de la mem brana que sealiza al msculo a contraerse, como discutire mos ms adelante.

Figura 11-32 Modelo de la estructura del receptor de acetilcolina. Cinco subunidades homlogas (a, a, p, y y 8) se combinan formando un poro acuoso transmembrana. El poro est constituido por un anillo de cinco hlices a transmembrana, una de cada subunidad. Probablemente el anillo de hlices a est rodeado por un aro de lmina (3 transmembrana formada por los otros segmentos transmembrana de las cinco subunidades. Parece que en su conformacin cerrada el poro se halla ocluido por las cadenas laterales hidrofbicas de cinco residuos de leucina, uno de cada hlice a, que forman una compuerta cerca del centro de la bicapa lipdica. Las cadenas laterales cargadas negativamente situadas a cada lado del poro aseguran que nicamente atravesarn el poro iones cargados positivamente. Las dos subunidades a contienen un lugar de unin a la acetilcolina; cuando la acetilcolina se une a los dos lugares de unin, el canal sufre un cambio de conformacin que abre la compuerta, posiblemente gracias a un desplazamiento de los residuos de leucina. (Adaptado de N. Unwin, Cell/Neuron 72/10 [Supl.] 3141,1993 Cell Press.)

Los canales inicos regulados por transm isor son las dianas principales de la accin de drogas psicoactivas 23
Los canales inicos que se abren directamente en respuesta a los neurotransmisores acetilcolina, serotonina, GABA y glicina, contienen subunidades que son estructuralmente similares entre s, lo cual sugiere que estn relacionadas evolu tivamente y que probablemente forman poros transmembrana de la misma m a nera, aunque su especificidad para el neurotransmisor y su selectividad para el ion sean distintas. Los canales inicos regulados por glutamato estn formados por una familia distinta de subunidades, pero al parecer tienen un estructura ge neral similar. En cada caso, el canal est formado por subunidades polipeptdicas homlogas, las cuales probablemente forman un pentmero que se asemeja al receptor de acetilcolina (vase Figura 11-32). La comparacin de las Figuras

Canales inicos y propiedades elctricas de las membranas

575

canales catinicos regulados por voltaje

canales inicos regulados por transm isor

uniones com unicantes (o de tipo "gap")

Figura 11 -33 Tres clases de protenas de canal. Posible relacin entre el nmero de subunidades proteicas y el dimetro del poro. (Adaptado de B. Hille, Ionic Channels of Excitable Membranes, 2a. ed. Sunderland, MA: Sinauer, 1992.)

11 -27 y 11 -32 pone de manifiesto las diferencias entre estos canales y los canales catinicos regulados por voltaje, los cuales estn formados por un anillo de cua tro subunidades (o dominios). Quiz como resultado de ello, los canales regula dos por transmisor tienen poros ms anchos y, por tanto, son menos estrictos en su selectividad a iones. Las uniones comunicantes, formadas por un anillo de seis subunidades, tienen poros ms anchos que permiten el paso de iones inor gnicos y de pequeas molculas orgnicas (se discute en el Captulo 19). Esta posible relacin entre nmero de subunidades y la amplitud del poro se ilustra en la Figura 11-33. Cada uno de los tipos de canales inicos regulados por transmisor tienen for mas alternativas de cada subunidad, codificadas por genes diferentes o genera das por la maduracin alternativa del RNA del mismo producto gnico. Todo ello se combina de diferente forma generando un conjunto de subtipos de canales ex traordinariamente diverso, con diferentes afinidades para el ligando, diferentes conductancias de canal, diferentes velocidades de apertura y cierre y diferentes sensibilidades a drogas y toxinas. Las neuronas de los vertebrados, por ejemplo, tienen canales inicos regulados por acetilcolina que se diferencian de los de las fibras musculares en que habitualmente estn formados por dos subunidades de un tipo y tres de otro; sin embargo existen al menos siete genes que codifican di ferentes versiones del primer tipo de subunidades y al menos tres que codifican diferentes versiones del segundo, con una diversidad aadida debida a la madu racin alternativa del RNA. Se pueden caracterizar diferentes subconjuntos de neuronas sensibles a acetilcolina, con diferentes funciones en el cerebro, debido a diferentes combinaciones de estas subunidades. Ello, en principio y con alguna utilizacin en la prctica, permite disear drogas que tengan como diana reduci dos grupos de neuronas o de sinapsis, influyendo as especficamente determina das funciones cerebrales. De hecho, los canales inicos regulados por transmisor han sido durante mucho tiempo importantes dianas para las drogas. Un cirujano, por ejemplo, puede hacer que los msculos se relajen durante una operacin blo queando los receptores de acetilcolina de las fibras musculares esquelticas con curare, una droga vegetal que se utiliz originariamente por los indios sudameri canos para envenenar sus flechas. La mayora de drogas utilizadas en el trata miento del insomnio, de la ansiedad, de la depresin y de la esquizofrenia, ejercen sus efectos sobre las sinapsis qumicas y muchas de ellas actan unindose a ca nales inicos regulados por transmisor: tanto los barbituratos como los tranquili zantes, como el Valium y el Librium, por ejemplo, se unen a los receptores de GABA potenciando su accin inhibidora al permitir que concentraciones ms ba jas de GABA abran los canales de Cl~. La nueva biologa molecular de los canales revela la diversidad y los detalles de su estructura, permitiendo as disear una nueva generacin de drogas psicoactivas que actuarn ms selectivamente alige rando el sufrimiento de las enfermedades mentales. Los canales inicos son los com ponentes moleculares bsicos a partir de los cuales se construyen los elementos neuronales de la computacin y la sealiza cin biolgica. Para poder entrever como pueden llegar a ser de sofisticadas las funciones de estos elementos, consideramos ahora varios ejemplos que de muestran cm o actan conjuntam ente varios grupos de canales en la comuni cacin sinptica entre clulas excitables elctricamente. 576 Captulo 11: Transporte de molculas pequeas a travs de la membrana

La transm isin neuromuscular implica la activacin secuencial de al m enos cuatro grupos de canales inicos regulados 15
La importancia que tienen para las clulas excitables elctricamente los canales inicos regulados puede ilustrarse siguiendo el proceso por el cual un impulso nervioso estimula la contraccin de una clula muscular. Esta respuesta aparen tem ente simple requiere la activacin secuencial de al menos cuatro grupos de canales inicos regulados -todos ellos en pocos milisegundos (Figura 11-34). 1. El proceso se inicia cuando un impulso nervioso llega al terminal nervioso y despolariza la membrana plasmtica. La despolarizacin abre transito riamente los canales de Ca2 + regulados por voltaje de esta membrana. Dado que la concentracin de Ca2 + fuera de la clulas es ms de 1000 veces mayor que la concentracin libre del interior de las clulas, el Ca2+ fluye hacia el interior del terminal nervioso. El incremento de la concentracin de Ca2+ en el citoplasma del terminal dispara la liberacin localizada de acetilcolina en la hendidura sinptica. 2. La acetilcolina liberada se une a los receptores de acetilcolina de la membra na plasmtica postsinptica de la fibra muscular, abriendo transitoriamente los canales catinicos que se hedan asociados a estos receptores. El influjo de Na+que se genera provoca una despolarizacin localizada de la membrana. 3. La despolarizacin de la membrana plasmtica de la fibra muscular abre los canales de Na+regulados por voltaje de esta membrana, permitiendo la entrada de ms Na+ , el cual despolariza la membrana. A su vez, esta despo larizacin abre ms canales de Na+ regulados por voltaje, de forma que se forma una despolarizacin auto-propagante (un potencial de accin) que se extiende por toda la membrana plasmtica (vase Figura 11-23). La despolarizacin generalizada de la membrana plasmtica de la fibra muscular provoca la apertura transitoria de canales inicos de regiones es pecializadas (los tbulos transversos [T] -discutidos en el Captulo 16) de esta membrana. Esta apertura causa la apertura transitoria de canales de liberacin de Ca2 +de regiones adyacentes de la membrana del retculo sarcoplasmtico, la cual provoca la liberacin al citosol de Ca2+ almacenado en el retculo sarcoplasmtico. Este incremento repentino en la concentra cin citoslica de Ca2+ provoca la contraccin de las miofibrillas de la fibra muscular. Todava no conocem os cul es el mecanismo mediante el cual la activacin de los canales de Ca2+ regulados por voltaje de la membrana del tbulo T conduce a la apertura de los canales de liberacin de Ca2+ de

4.

Figura 11 -34 Sistema de canales inicos de una sinapsis neuromuscular. Estos canales inicos regulados son esenciales para la estimulacin de la contraccin muscular por un impulso nervioso. Los diferentes canales estn numerados siguiendo la secuencia en la que se abren, tal como se describe en el texto.

SINAPSIS NEUROMUSCULAR EN REPOSO CANAL DE Ca2+ REGULADO POR VOLTAJE CANAL CATINICO REGULADO POR ACETILCOLINA CANAL DE Na+ REGULADO POR VOLTAJE term inal nerviosa acetilcolina CANAL DE Ca2+ REGULADO POR VOLTAJE

UNION NEUROMUSCULAR ACTIVADA 1 ( I Impulso

retculo sarcoplasm tico

m em brana plasmtica m uscular

CANAL REGULADO DE LIBERACIN DE Ca2+

Canales inicos y propiedades elctricas de las membranas

5 77

dendritas

Figura 11-35 Soma celular de una motoneurona de la mdula espinal. Sobre el soma celular y las dendritas existen muchos miles de sinapsis formadas por terminaciones nerviosas. Estas sinapsis suministran seales de otras zonas del organismo controlando el desencadenamiento de potenciales de accin a lo largo del axn de esta gran clula.

0,1 mm dendrita

term inaciones presinpticas cono o colina axnica vaina de m ielina

axn

la m em brana del retculo sarcoplasmtico. Sin embargo, ambas m embra nas se hallan en ntimo contacto y ambos tipos de canales se hallan juntos formando una estructura especializada (vase Figura 16-92). Por lo tanto, es posible que un cambio de conform acin inducido por voltaje del canal de Ca2+ de la m em brana plasmtica abra directamente el canal de libera cin de Ca2+ del retculo sarcoplasmtico a travs de un acoplamiento m e cnico (se discute en el Captulo 16). La activacin de la contraccin muscular por una neurona motora es comple ja, pero para que una neurona integre un elevado nmero de seales de entrada y las integre generando una seal de salida adecuada se requiere una interaccin de canales inicos incluso ms sofisticada, como discutiremos a continuacin.

El potencial postsinptico principal de una neurona representa la suma espacial y temporal de muchos pequeos potenciales postsinpticos 15,24
En el sistema nervioso central una sola neurona puede recibir seales de miles de otras neuronas. Por ejemplo, sobre una neurona motora media de la mdula es pinal realizan sinapsis varios miles de terminales nerviosos; su soma celular y sus dendritas estn casi completamente cubiertos por ellas (Figura 11-35). Algunas de estas sinapsis transmiten seales desde el cerebro o desde la mdula espinal; otras transportan informacin sensorial desde los msculos o desde la piel. La motoneurona puede com binar la informacin que recibe de todas estas fuentes y reacciona generando potenciales de accin o permaneciendo en reposo. De las muchas sinapsis que existen sobre una neurona, algunas tienden a excitarla y otras a inhibirla. El neurotransmisor liberado en una sinapsis excita dora causa una ligera despolarizacin de la mem brana postsinptica denomina da potencial postsinptico excitador (PSP, de postsinaptic potencial) mientras que el neurotransmisor liberado en una sinapsis inhibidora generalmente causa una pequea hiperpolarizacin denominada PSP inhibidor. Como la membrana de las dendritas y del soma celular de la neurona contiene pocos canales de Na+

578

Captulo 11: Transporte de molculas pequeas a travs de la membrana

200 potenciales de accin presinpticos por segundo

tiem po (m ilisegundos) 400 potenciales de accin presinpticos por segundo

Figura 11 -36 Principio de la suma temporal. Cada potencial de accin presinptico que llega a una sinapsis produce un pequeo potencial postsinptico (PSP) {lineas negras). Cuando llegan sucesivamente varios potenciales de accin a una misma sinapsis, cada PSP producido se aade a la cola del PSP precedente, generando un PSP combinado principal {lneas verdes). Cuanto mayor es la frecuencia de llegada de potenciales de accin, mayor es el tamao del PSP combinado.

tiem po (m ilisegundos) 800 potenciales de accin presinpticos por segundo

tiem po (m ilisegundos)

regulados por voltaje, generalmente un solo PSP no es suficiente para desenca denar un potencial de accin. Por el contrario, cada seal aferente queda refleja da fielmente en un PSP de una magnitud graduada, que decrece con la distancia a partir del lugar de la sinapsis. Si las seales llegan simultneamente a varias sinapsis de la misma regin del rbol dendrtico, el PSP total de esta zona ser, a grandes rasgos, la suma de los PSP individuales, de forma que los PSP inhibido res contribuyen de manera negativa a esta suma total. Los PSP de las regiones vecinas se propagan pasivamente a otras regiones y convergen en el soma celu lar. Como el soma celular es relativamente pequeo comparado con el rbol dendrtico, el potencial de mem brana del soma celular y de sus alrededores in mediatos ser ms o m enos uniforme y estar compuesto por los efectos de to das las seales que llegan a la clula, cuya importancia depender de la distancia a la que se encuentra la sinapsis del soma celular. Se dice, por lo tanto, que el potencial postsinptico principal (PSP principal) del soma celular representa una sum a espacial de todos los estmulos recibidos. Si predominan las seales excitadoras, se generar una despolarizacin; si predominan las seales inhibi doras, se producir una hiperpolarizacin. Mientras que la suma espacial com bina los efectos de las seales recibidas en diferentes lugares de la membrana, la sum a tem poral com bina los efectos de las seales recibidas en m omentos distintos. Si un potencial de accin llega a una sinapsis y desencadena la liberacin de un neurotransmisor antes de que un PSP haya decado completamente, el segundo PSP se aade a la cola remanente del primero. Si llegan muchos potenciales de accin siguiendo una sucesin r pida, cada PSP se aade a la cola del PSP precedente construyendo un PSP prin cipal mantenido cuya magnitud refleja la velocidad de disparo de la neurona presinptica (Figura 11-36). sta es la esencia de la sumacin temporal: traduce la frecuencia de las seales de entrada en magnitud de un PSP neto.

Canales inicos y propiedades elctricas de las membranas

579

(A)

(B)

"a

<c >

100

200

100

200

-70 tiem po (m ilisegundos) tiem po (m ilisegundos)

Figura 11 -37 Codificacin del PSP

principal en forma de frecuencia de descarga de potenciales de accin en un axn. Comparando (A) con (B) se
observa que la frecuencia de descarga de cada axn aum enta con el increm ento del PSP principal; en (C) se resume la relacin general entre ambos parmetros.

Conjuntamente, las sumaciones temporal y espacial proporcionan los m e dios mediante los cuales las velocidades de descarga de muchas neuronas presinpticas controlan el potencial de mem brana (el PSP principal) del soma de una sola clula postsinptica. El ltimo paso en la integracin neuronal realizado por la clula postsinptica es la generacin de una seal de salida, normalmente en forma de potenciales de accin, con el fin de retransmitir una seal a otras clu las. La seal de salida es un reflejo de la magnitud del PSP principal del soma ce lular. Sin embargo, mientras que el PSP principal es una variable graduada de manera continua, los potenciales de accin son de tipo todo o nada y de tamao uniforme. La nica variable existente en la sealizacin mediante potenciales de accin es el intervalo de tiempo entre un potencial de accin y el siguiente. Por lo tanto, para la transmisin a grandes distancias, la magnitud del PSP principal se traduce, o se codifica, en la frecuencia de descarga de los potenciales de ac cin (Figura 11-37). Esta codificacin se consigue gracias a un grupo especial de canales inicos regulados que se encuentran presentes a una densidad elevada en la base del axn, en un punto adyacente al soma celular, en una regin cono cida como el cono o colina axnica (vase Figura 11-35).

La integracin neuronal requiere la com binacin de al menos tres tipos de canales de K+diferentes 15,25
Hemos visto que la intensidad de la estimulacin recibida por una neurona se codifica, en las transmisiones a larga distancia, como frecuencia de potenciales de accin que dispara la neurona: cuanto mayor sea la estimulacin mayor es la frecuencia de los potenciales de accin. Los potenciales de accin se inician en el cono axnico, nica regin de cada neurona en la que los canales de Na+ re gulados por voltaje son completos. Sin embargo, para realizar esta funcin espe cial de codificacin, la mem brana del cono axnico contiene como mnimo otros cuatro tipos de canales inicos -tres de ellos selectivos para el K+y uno se lectivo para el Ca2+. Las tres variedades de canales de K+ presentan propiedades diferentes; nos referiremos a ellos con los nombres de canales de K+activados re tardados, tempranos y activados por Ca2+ . Para comprender por qu son necesa rios varios tipos de canal, consideremos primero el comportamiento que se ob servara si los nicos canales regulados por voltaje que existieran en la clula nerviosa fueran los canales de Na+ . Por debajo de un cierto umbral de estimula cin sinptica, la despolarizacin de la mem brana del cono axnico sera insufi ciente para desencadenar un potencial de accin. Al aumentar gradualmente la estimulacin, se cruzara el umbral; los canales de Na+ se abriran y se disparara un potencial de accin. El potencial de accin terminara de la manera habitual, por inactivacin de los canales de Na+ . Antes de que se pudiera disparar otro po tencial de accin, estos canales deberan recuperarse de su inactivacin. Pero esto requerira que el voltaje de la membrana volviera a un valor muy negativo,

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Captulo 11: Transporte de molculas pequeas a travs de la membrana

cosa que no se producira mientras se mantuviera el intenso estmulo despolari zante (del PSP). Por consiguiente, se necesita otro tipo de canal para repolarizar la membrana despus de cada potencial de accin y preparar a la clula para que inicie otro potencial de accin. Esta tarea la llevan a cabo los canales de K+ retardados, que ya vimos previamente al estudiar la propagacin del potencial de accin (vase pg. 565). Estos canales estn regulados por voltaje pero debido a la lentitud de su cintica slo se abren durante la fase de descenso del poten cial de accin, cuando los canales de Na+estn inactivos. Su apertura permite una salida de K+ que conduce la membrana de nuevo al potencial de equilibrio del K+. Este potencial es tan negativo que los canales de Na+se recuperan rpida mente de su estado inactivado. La repolarizacin de la membrana provoca tam bin el cierre de los propios canales de K+ retardados. Ahora el cono axnico se halla en condiciones basales, de forma que el estmulo despolarizante proceden te de las seales sinpticas aferentes es capaz de generar un nuevo potencial de accin. De esta manera la estimulacin sostenida de las dendritas y del soma ce lular conduce a la descarga repetitiva del axn. Sin embargo, la descarga repetitiva no es suficiente por s sola. La frecuencia de descarga tiene que reflejar la intensidad de la estimulacin y un simple siste ma de canales de Na+ y de canales de K+ retardados es insuficiente para ello. Por debajo de un cierto nivel umbral de estimulacin constante la clula no produci r descargas en absoluto; por encima de este umbral empezar bruscamente a producir descargas a una velocidad relativamente rpida. Los canales de K+tem pranos solucionan este problema. Estos canales tambin estn regulados por voltaje y se abren cuando se despolariza la membrana, pero su sensibilidad es pecfica al voltaje y las cinticas de inactivacin son tales que actan reduciendo la velocidad de descarga a unos niveles de estimulacin que estn inmediata mente por encima del umbral necesario para generar la descarga. As, ayudan a eliminar la discontinuidad en la relacin entre la velocidad de descarga y la in tensidad de la estimulacin. El resultado de ello es una velocidad de descarga que es proporcional a la intensidad del estmulo despolarizante dentro de un margen muy amplio (vase Figura 11-37). Normalmente, el proceso de codificacin se modula posteriormente por los otros dos tipos de canales inicos del cono axnico que se mencionaron al princi pio -los canales de Ca?+regulados por voltaje y los canales de K+activados por Ca?+. Estos canales actan conjuntamente disminuyendo la respuesta de la clula a una estimulacin constante invariable -u n proceso denominado adaptacin. Los ca nales de Ca2+ son similares a los canales de Ca2+ que intervienen en la liberacin del neurotransmisor de los terminales axnicos presinpticos; se abren cuando se dispara un potencial de accin, permitiendo la entrada de Ca2+al interior del axn. El canal de K+activado por Ca2 +es estructural y funcionalmente diferente de cual quier otro tipo de canal descrito anteriormente. Se abre en respuesta a una eleva cin de la concentracin de Ca2+ en la cara citoplasmtica de la membrana de la clula nerviosa. Supongamos que se aplica un intenso estmulo despolarizante durante un largo perodo de tiempo, que desencadena un largo tren de potencia les de accin. Cada potencial de accin permite una breve entrada de Ca2+a travs de los canales de Ca2+ regulados por voltaje, de modo que la concentracin intracelular de Ca2+ aumenta gradualmente hasta un nivel elevado suficiente para abrir los canales de K+ activados por Ca2+ . El aumento resultante de la permeabilidad de la membrana al K+ hace que la membrana sea ms difcil de despolarizar, incre mentando el retraso entre un potencial de accin y el siguiente. De esta manera, una neurona que es estimulada continuamente durante un perodo de tiempo prolongado, disminuye gradualmente su capacidad de respuesta al estmulo cons tante. Este fenmeno, que tambin puede aparecer por otros mecanismos, permi te a una neurona, y de hecho al sistema nervioso en general, reaccionar de forma sensible a un cambio, incluso cuando el nivel basal de estimulacin es muy eleva do. sta es una de las estrategias que nos permite, por ejemplo, sentir un contacto sobre el hombro e ignorar, en cambio, la presin constante de nuestros vestidos. En el Captulo 15 discutimos con ms detalle los procesos de la adaptacin.

Canales inicos y propiedades elctricas de las membranas

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Otras neuronas realizan integraciones diferentes, reaccionando a sus sea les de entrada de miles de maneras diferentes, lo cual refleja el diferente surtido de m iem bros de diferentes familias de canales inicos que presentan en sus membranas. Por ejemplo, en el sistema nervioso de los vertebrados existen al m enos cinco tipos conocidos de canales de Ca2+ regulados por voltaje. La multi plicidad de genes permite generar una multitud de diferentes tipos de neuronas cuyo comportamiento elctrico corresponda perfectamente a la tarea particular que ejecutan. Una de las propiedades cruciales de los sistemas nerviosos es la capacidad de aprender y de recordar, lo cual parece depender fundamentalmente de cam bios a largo plazo de determinadas sinapsis. Concluimos este captulo conside rando un rem arcable tipo de canal inico que participa de forma especial en al gunas formas de aprendizaje y memoria. Se halla localizado en muchas sinapsis del sistema nervioso central, donde est regulado tanto por voltaje como por el glutamato, neurotransmisor excitador. Tam bin es el lugar de accin de la droga psicoactiva fenciclidina, o polvo de ngel.

La potenciacin a largo plazo en el hipocampo de los mamferos depende de la entrada de Ca2+ a travs de canales receptores de NMDA26
Prcticamente todos los animales pueden aprender, pero parece que los mamfe ros pueden hacerlo excepcionalmente bien (o eso es lo que a nosotros nos gusta creer). En el cerebro de los mamferos, el hipocampo, una regin del crtex cere bral, juega un papel especial en el aprendizaje: cuando es destruido en ambos la dos del cerebro se pierde notablemente la capacidad de generar nuevos recuer dos, aunque los que se establecieron previamente hace tiempo, permanecen. De manera correspondiente, algunas sinapsis del hipocampo presentan dramticas alteraciones funcionales cuando se estimulan repetidamente. Potenciales de ac cin ocasionales y aislados de las clulas presinpticas no dejan vestigios durade ros, pero un corto estallido de descargas repetitivas provoca la potenciacin a largo plazo (LTP, de Long-Term Potentiation), de manera que los siguientes po tenciales de accin aislados de las clulas presinpticas provocan una respuesta enorm em ente aumentada en las clulas postsinpticas. El efecto dura horas, das o semanas, dependiendo del nmero e intensidad de los trenes de descargas re petitivas. Solamente presentan este efecto de potenciacin las sinapsis que fue ron activadas; las sinapsis de la misma clula postsinptica que permanecieron en reposo, no estn afectadas. Sin embargo, si en el instante en el que la clula est recibiendo un tren de estimulacin repetitiva a travs de un conjunto de si napsis, un potencial de accin alcanza otra sinapsis de su superficie, esta sinap sis tam bin sufrir una potenciacin a largo plazo, incluso aunque un potencial de accin aislado que alcanzara esta misma sinapsis en otro momento no dejara tales huellas. La regla fundamental en el hipocampo parece ser que la potenciacin a lar

go plazo ocurre siempre que una clula presinptica descarga (una o ms veces) en el instante en que la membrana postsinptica se encuentra intensamente des polarizada (tanto por descargas repetitivas recientes sobre la misma clula post
sinptica com o por otros motivos). Existen claras evidencias de que esta regla refleja el com portam iento de una clase particular de canales inicos presentes en la m em brana postsinptica. El glutamato es el principal neurotransmisor ex citador del sistema nervioso central y en el hipocampo, como en otros lugares, la mayora de las corrientes despolarizantes responsables de los PSP excitadores son debidas a canales inicos regulados por ligando que actan de una forma estndar. Sin embargo, la corriente tiene, adems, un segundo componente mu cho ms intrigante, mediado por una subclase distinta de canales inicos regu lados por glutamato conocidos com o receptores NMDA debido a que se activan selectivamente por un anlogo artificial del glutamato, el N-metil-D-aspartato. Los canales receptores NMDA estn regulados de forma doble, abrindose slo

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Captulo 11: Transporte de molculas pequeas a travs de la membrana

el glutam ato liberado por un term inal nervioso presinptico activado abre canales receptores de glutam ato no de NMDA, perm itiendo un influjo de Na+ que despolariza la m em brana postsinptica m em brana polarizada

la despolarizacin elim ina el Mg que bloquea los canales receptores de NMDA, lo cual (unidos a glutam ato) perm ite que entre Ca2+ a la clula postsinptica

Mg receptor NMDA

receptor de glutam ato no de NMDA

m em brana despolarizada

el increm ento de Ca2+ en el citosol induce a la clula postsinptica a producir una seal retrgrada que acta sobre el term inal nervioso presinptico

cuando se satisfacen simultneamente dos condiciones: el receptor ha de estar unido al neurotransmisor glutamato y la mem brana ha de estar intensamente despolarizada. La segunda condicin es necesaria para liberar Mg2+ , que normal mente bloquea el canal en reposo, y significa que los receptores NMDA slo se activan cuando los canales convencionales regulados por glutamato se hallan activados y la mem brana despolarizada. Los receptores NMDA son crticos para la potenciacin a largo plazo. Cuando se bloquean selectivamente mediante un inhibidor especfico, la potenciacin a largo plazo no aparece, aunque la trans misin sinptica contina normalmente. Un animal tratado con este inhibidor se comporta normalmente pero es incapaz de aprender tareas del tipo que, se gn se cree, depende del hipocampo. Cmo intervienen los receptores NMDA en estos efectos extraordinarios? La respuesta radica en que estos canales, cuando estn abiertos, son altamente permeables al Ca2+ , que acta como mensajero intracelular cerca de su lugar de entrada al interior de la clula postsinptica, desencadenando los cambios loca les responsables de la potenciacin a largo plazo. La potenciacin a largo plazo se previene cuando se mantienen los niveles de Ca2+ artificialmente bajos en la clula postsinptica inyectando el quelante de Ca2+ EGTA, y puede ser inducida elevando transitoriamente la concentracin extracelular de Ca2+hasta niveles ar tificialmente altos. La naturaleza de los cambios a largo plazo desencadenados por el Ca2+ es incierta, aunque parece que implican alteraciones estructurales de la sinapsis. Los cambios a largo plazo se inician en la clula postsinptica pero tambin afectan a la clula presinptica de forma que liberan ms glutamato del normal cuando se activan posteriormente. La naturaleza de estos ltimos cambios en la clula presinptica es incierta, pero parece claro que algn m ensaje puede pasar de forma retrgrada de la clula postsinptica a la presinptica cuando se indu ce la potenciacin a largo plazo. La naturaleza de la seal retrgrada todava es desconocida, aunque como candidatos se han sugerido el xido ntrico y el monxido de carbono. En la Figura 11-38 se presenta un modelo tentativo de algu nas de las etapas de la induccin de la potenciacin a largo plazo. Adems de los cambios a largo plazo de las clulas presinpticas, ilustrados en la Figura 11-38, tam bin se producen cambios a largo plazo en la clula postsinptica que con tribuyen a la potenciacin a largo plazo. Existen evidencias de que los receptores NMDA juegan un papel importante en el fenm eno relacionado con el aprendizaje, no slo en el hipocampo sino tam bin en otras zonas del cerebro. En el Captulo 21 veremos, adems, que los receptores NMDA juegan un papel crucial en el ajuste del patrn anatmico de conexiones sinpticas en base a la experiencia durante el desarrollo del sistema nervioso. As, los neurotransmisores liberados en las sinapsis, adems de provocar se ales elctricas transitorias, tam bin pueden alterar las concentraciones de me-

la seal retrgrada produce un cam bio a largo plazo que perm ite al term inal liberar una m ayor cantidad de glutam ato cuando sea activado de nuevo

Figura 11 -38 Eventos de sealizacin en la potenciacin a largo plazo.

Canales inicos y propiedades elctricas de las membranas

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Tabla 11-3 Algunas familias de canales inicos Familia* Canales catinicos regulados por voltaje Subfamilias representativas canal de Na+regulado por voltaje canales de K+regulados por voltaje (incluyendo los retardados y los tempranos) voltajes de Ca2 +regulados por canal canales catinicos regulados por acetilcolina canales catinicos regulados por serotonina canales catinicos regulados por glutamato** canales de Cl~ regulados por GABA canales de Cl" regulados por glicina

Canales inicos regulados por transmisor

'

excitadores

inhibidores

* Los miembros de una misma familia son similares en secuencia de aminocidos y, por lo tan to, se cree que derivan de un ancestro comn; dentro de las subfamilias, el parecido es habi tualmente mayor. ** Estos canales estn formados por distintas familias de subunidades pero se cree que tienen una estructura global similar a la de los otros canales inicos regulados por transmisor.

diadores intracelulares que conllevan cambios a largo plazo en la eficacia de la transmisin sinptica. Todava no conocem os, sin embargo, de qu forma estos cambios se prolongan durante semanas, meses o durante toda la vida, a pesar del recambio normal de los constituyentes de la clula. En la Tabla 11-3 se resumen algunas de las familias de canales de las que h e mos tratado en este captulo.

Resumen
Las protenas de canal forman poros acuosos a travs de la bicapa lipdica y permi ten a los iones inorgnicos de un tamao y carga adecuados atravesarla a favor de su gradiente electroqumico, a velocidades que son unas 1000 veces superiores a las conseguidas por cualquier transportador conocido. Estos canales inicos estn re gulados y habitualmente se abren deform a transitoria en respuesta a perturbacio nes especficas de la membrana, como un cambio en el potencial de membrana (ca nales regulados por voltaje) o la unin de un neurotransmisor (canales regulados por transmisor). En la mayora de las clulas de animales, el canal retardado de K+desempea un papel importante en la generacin del potencial de reposo en la membrana plasmtica. Los canales catinicos regulados por voltaje son responsables de la ge neracin de los potenciales de accin auto-amplificantes en las clulas excitables elctricamente, como las neuronas yfibras musculares esquelticas. Los canales inicos regulados por transmisor convierten seales qumicas en elctricas en las sinapsis qumicas: los neurotransmisores excitadores, como la acetilcolina y el glutamato, abren de forma transitoria canales catinicos regulados por transmisor, despolarizando as la membrana postsinptica hacia el potencial de disparo, para iniciar un potencial de accin; los neurotransmisores inhibidores, como el GABA y la glicina, abren canales de Cl~ regulados por transmisor, suprimen la generacin del potencial de accin al hacer la membrana postsinptica ms pola rizada. Se cree que una subclase especial de canales inicos regulados por glutama to, denominados canales receptores NMDA, son muy permeables al Ca2 + , el cual puede desencadenar cambios a largo plazo en las sinapsis, los cuales al parecer participan en algunas formas de aprendizaje y de memoria. Los canales inicos actan juntos de formas muy complejas, controlando el comportamiento de las clulas elctricas excitables. Una neurona tpica, por ejem584 Captulo 11 : Transporte de molculas pequeas a travs de la membrana

po, recibe miles de seales excitadoras e inhibidoras, combinndolas mediante sumacin temporal y espacial y produciendo un potencial postsinptico (PSP) princi pal en el soma celular. La magnitud del PSP principal se traduce en velocidad de generacin de potenciales de accin por medio de canales catinicos de la membra na del cono axnico.

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Bibliografa

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Seccin ultrafina de una clula exocrina de pncreas de perro. En la parte inferior izquierda se observa una porcin del ncleo y de la envoltura nuclear. EL citosol est lleno de lminas densamente empaquetadas de retculo endoplasmtico, recubierto de ribosomas. (Por cortesa de Lelio Orci.)

Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas

jL m

La compartimentacin de las clulas superiores El transporte de molculas hacia dentro y hacia fuera del ncleo * El transporte de protenas al . r, r , . j interior de niitocondrias y de cloroplastos Peroxisomas El retculo endoplasmtico

A diferencia de las bacterias, que generalmente constan de un nico comparti miento rodeado por una mem brana plasmtica, la clula eucariota est subdividida en compartimientos rodeados por membrana, que son funcionalmente dis tintos. Cada compartimiento u orgnulo contiene su propia coleccin de enzimas, otras molculas especializadas y un complejo sistema de distribucin que transporta especficam ente los compuestos de un compartimiento a otro. Para entender la clula eucariota es necesario conocer lo que sucede en cada uno de estos compartimientos, cmo se desplazan las molculas entre ellos y cmo se generan los compartimientos a s mismos y se conservan. Las protenas juegan un papel central en la compartimentacin de una clula eucariota. Catalizan las reacciones que tienen lugar en cada orgnulo y transpor tan selectivamente pequeas molculas hacia dentro y hacia fuera de su interior o lumen. Tambin actan como marcadores especficos de superficie de los orgnulos que dirigen el destino de protenas y de lpidos al orgnulo apropiado. Una clula de mamfero contiene aproximadamente 10 mil millones (1010) de molcu las de protena, de unos 10 000 tipos distintos. La sntesis de la mayora de todas estas protenas empieza en el citosol, el espacio comn que engloba a los orgnulos. Una vez sintetizada, cada protena es transportada especficamente al com partimiento celular que la necesita. Por ello el tema central de este captulo y tambin del siguiente ser el trfico intracelular de protenas. El conocimiento de este trfico de protenas desde un compartimiento a otro permite empezar a comprender el desconcertarte laberinto de membranas intracelulares.

La compartimentacin de las clulas superiores

En esta seccin introductoria vamos a dar una visin general de los distintos compartimientos de la clulas y de las relaciones que existen entre ellos. Para poder hacerlo, hemos organizado los orgnulos conceptualmente en un peque o nmero de familias, revisando cmo las protenas se dirigen a orgnulos es pecficos y cmo atraviesan las membranas de los orgnulos.

Todas las clulas eucariotas tienen la mism a coleccin bsica de orgnulos rodeados de m em brana 1
Muchos procesos bioqumicos vitales ocurren en o sobre superficies de m em brana. As, el metabolismo lipdico est catalizado mayoritariamente por enzi-

5 89

endosoma

citosol lisosoma

peroxisom a

com plejo de Golgi m itocondria retculo endoplasm tico con polirribosom as unidos a su m em brana

Figura 12-1 Los principales compartimientos intracelulares de una clula animal. El citosol [gris), el retculo endoplasmtico, el complejo de Golgi, el ncleo, las mitocondrias, los endosomas, los lisosomas y los peroxisomas son diferentes compartimientos que se hallan aislados del resto de la clula mediante, al menos, una membrana dotada de permeabilidad selectiva.

polirribosom c libres

ncleo m em brana plasmtica

15 (xm

mas unidas a m em branas y la fosforilacin oxidativa y la fotosntesis requieren una m em brana semipermeable para acoplar el transporte de H+ con la sntesis de ATP. Adems, los sistemas de m embranas intracelulares no slo proporcio nan un rea extra de membrana, sino que crean compartimientos que estn se parados del citosol, dando a la clula espacios acuosos funcionalmente especia lizados. Como la bicapa lipdica de los orgnulos de membrana es impermeable a la mayora de las molculas hidroflicas, la mem brana de cada orgnulo ha de disponer de protenas transportadoras que son responsables de la importacin o exportacin de metabolitos especficos. Cada mem brana de un orgnulo ha de tener tam bin un m ecanismo de importacin y de incorporacin al orgnulo de las protenas especficas que hacen que dicho orgnulo sea nico. En la Figura 12-1 se ilustran los compartimientos ms importantes comunes a todas las clulas eucariotas. El ncleo contiene el genoma principal y es el lu gar ms importante de sntesis de DNA y de RNA. El citoplasma que lo circunda consiste en el citosol y los orgnulos citoplasmticos suspendidos en l. El citosol constituye un poco ms de la mitad del volumen total de la clula y es el lugar donde no slo tiene lugar la sntesis de protenas sino tambin donde se desa rrollan la mayora de las reacciones del metabolismo intermediario celular -e s decir, el elevado nmero de reacciones mediante las cuales algunas molculas pequeas son degradadas y otras son sintetizadas proporcionando los elem en tos para la construccin de las macromolculas (se explica en el Captulo 2). Aproximadamente la mitad del rea total de membrana de una clula se uti liza para englobar los espacios labernticos del retculo endoplasmtico (ER). El ER presenta muchos ribosomas unidos a su superficie citoplasmtica, los cuales sintetizan protenas integrales de membrana y protenas solubles destinadas a ser segregadas o a ser transportadas a otros orgnulos. Veremos que existe una diferencia importante entre el sistema a travs del cual las protenas son dirigidas al ER o a otros orgnulos citoplasmticos: mientras que las protenas son translocadas a otros orgnulos solamente cuando su sntesis ha concluido, son translocadas al ER durante su sntesis, por lo que los ribosomas sobre los que se estn produciendo estn unidos a la membrana del ER. El ER tambin produce los lpidos del resto de la clula y tam bin acta como almacn de iones Ca2+ . El comple jo de Golgi consiste en una serie de compartimientos organizados en forma de sa cos discoidales llamados cisternas del Golgi; recibe lpidos y protenas del ER y las distribuye hacia diferentes destinos intracelulares, generalmente modificndolas covalentemente durante el viaje. Las mitocondrias y (en las plantas) los cloroplastos, generan la mayor parte del ATP que se utiliza para desplazar las reacciones biosintticas que requieren un aporte de energa libre. Los lisosomas presentan enzimas digestivas que de-

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Captulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas

Tabla 12-1 Volmenes relativos ocupados por los principales compartimientos intracelulares en una clula heptica tpica (hepatocito) Compartimiento intracelular Citosol Mitocondria Vesculas del ER rugoso Vesculas del ER liso y de Golgi Ncleos Peroxisomas Lisosomas Endosomas Porcentaje del volumen celular total 54 22 9 6 6 1 1 1 Nmero aproximado por clula* 1 1700 1 1 400 300 200

* Se cree que todas las cisternas del retculo endoplasmtico liso y rugoso estn conectadas, for mando un nico gran compartimiento. En cada clula el complejo de Golgi est organizado en un nmero discreto de grupos de cisternas apiladas (dictiosomas) y todava no se ha establecido claramente el grado de interconexin entre ellos.

gradan tanto orgnulos muertos como macromolculas y partculas captadas del exterior de la clula por endocitosis. En su camino hacia los lisosomas, las macromolculas y las partculas endocitadas primero han de pasar por una serie de compartimientos llamados endosomas. Los peroxisomas (tambin conocidos como microcuerpos) son pequeos compartimientos vesiculares que contienen enzimas que participan en diversas reacciones oxidativas. En general, cada orgnulo rodeado por m em brana realiza el mismo tipo de funciones bsicas en to dos los tipos celulares pero vara en abundancia y puede tener propiedades adi cionales que difieren de un tipo celular a otro de acuerdo con las funciones especializadas de las clulas diferenciadas. En su conjunto, estos orgnulos ocupan casi la mitad del volumen celular (Ta bla 12-1), y se requiere una gran cantidad de membranas intracelulares para fabri carlos todos. As, en las dos clulas de mamfero que se analizan en la Tabla 12-2,

Tabla 12-2 Cantidades relativas de tipos de membrana en dos clulas eucariotas Porcentaje de membrana celular total Tipo de membrana Membrana plasmtica Membrana del ER rugoso Membrana del ER liso Membrana del complejo de Golgi Mitocondrias Membrana externa Membrana interna Ncleo Membrana interna Membrana de las vesculas secretoras Membrana de los lisosomas Membrana de los peroxisomas Membrana del endosoma Hepatocito* 2 35 16 7 7 32 0,2 no determinado 0,4 0,4 0,4 Clula exocrina pancretica* 5 60 <1 10 4 17 0,7 3 no determinado no determinado no determinado

* Estas dos clulas son de tamao muy diferente, ya que el hepatocito tiene como promedio un volumen de 5000 (im3, en comparacin a los 1000 fm3 de la clula exocrina pancretica. Las reas totales de membrana celular se estiman en 110 000 nm2 y 13 000 |xm 2, respectivamente.

La compartimentacin de las clulas superiores

591

retculo cndo plsm atico rugoso

ncleo

lisosom as

Figural2-2 Electronmicrografa de una parte de una clula heptica vista en seccin transversal. Se indican
ejemplos de la mayora de los principales compartimientos intracelulares. (Por cortesa de Daniel S. Friend.)

poroxisom as

m itocondrias

el retculo endoplasmtico tiene una superficie de membrana total que es 25 y 12 veces mayor respectivamente que la mem brana plasmtica. En trminos de su perficie y de masa, pues, en la mayora de la clulas eucariotas la membrana plasmtica es slo una mem brana minoritaria (Figura 12-2). Los orgnulos rodeados de mem brana no se hallan distribuidos al azar en el citosol; por el contrario, a menudo ocupan posiciones caractersticas. As, en la mayora de clulas el complejo de Golgi est cerca del ncleo mientras que la red de tbulos del ER se extiende a partir del ncleo por todo el citosol. Estas dis tribuciones caractersticas parecen depender de las interacciones de los orgnu los con el citoesqueleto: por ejemplo, la localizacin del ER y del complejo de Golgi depende de la red de microtbulos. Si se despolimerizan experimental mente los microtbulos con una droga, el complejo de Golgi se fragmenta y se dispersa por toda la clula y la red del ER se colapsa hacia el centro celular, o centrosoma, a partir del cual emerge la red de microtbulos (vase Captulo 16).

(C)

Figura 12-3 Organizacin de membranas especializadas en las bacterias. (A) Zonas (patches) de la
superficie celular, consistentes en protenas especializadas de membrana. (B) Zonas invaginadas de membrana plasmtica que incrementan la cantidad de membrana disponible para funciones especializadas, com o por ejemplo, para fotosntesis. (C) Internalizacin de las zonas invaginadas de membrana, formando vesculas cuya cara interior es topolgicamente equivalente a la cara exterior de la clula. En algunos tipos de bacterias fotosintticas se presentan vesculas de membrana de este tipo; su relacin topolgica con la superficie de la clula es similar a la del ER, la del complejo de Golgi, la de los endosomas y la de los lisosomas en las clulas eucariotas.

La relacin topolgica de los orgnulos rodeados de mem brana puede ser interpretada en trm inos de sus orgenes evolutivos2
Para entender la relacin que existe entre los compartimientos de la clula, re sulta til considerar cmo pueden haber evolucionado. Se cree que los precur sores de las primeras clulas eucariotas fueron organismos parecidos a bacte rias, los cuales generalmente tienen mem brana plasmtica pero no membranas internas. En estas clulas, por lo tanto, la membrana plasmtica realiza todas las funciones dependientes de membrana, com o el bom beo de protones, la sntesis de ATP, y la sntesis de lpidos. No obstante, las clulas eucariotas actuales tie-

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Captulo 12 : Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas

nen una dimensin lineal entre 10 y 30 veces mayor y un volumen entre 1000 y 10 000 veces mayor que una bacteria tpica como E. cot. Se puede proponer que la profusin de m embranas internas responde en parte a una adaptacin a este increm ento en tamao: las clulas eucariotas tienen una relacin entre superfi cie y volumen mucho menor, de forma que probablemente el rea de su m em brana plasmtica es demasiado pequea para contener la gran cantidad de fun ciones vitales ligadas a m em brana que presenta una clula. Evidentemente, la evolucin de las membranas internas ha sido paralela a la especializacin de la funcin de las membranas. En algunas bacterias actuales existen zonas (patches) especializadas de la membrana plasmtica en las que se presentan una coleccin determinada de protenas de membrana que realizan una serie de funciones relacionadas (Figura 12-3A). Estas porciones especializadas de membrana, tales como la membrana prpura en Halobacterium que contie ne bacteriorrodopsina (se discute en el Captulo 10) o los cromatforos en las bac terias fotosintticas (se discute en el Captulo 14), representan orgnulos primiti vos. En algunas bacterias fotosintticas, estas zonas de membrana se han transformado en zonas ms elaboradas concretndose en invaginaciones de la membrana plasmtica (Figura 12-3B), mientras que en otras bacterias parece que estas invaginaciones se han separado completamente de la membrana plasmtica formando vesculas cerradas intracelulares rodeadas de membrana, especializa das en la fotosntesis (Figura 12-3C). Puede esperarse que un orgnulo eucariota que se haya originado por el procedimiento que se ilustra en la Figura 12-3 tenga un interior topolgicamente equivalente al exterior de la clula. Veremos que ste es el caso del ER, del complejo de Golgi, del endosoma y del lisosoma -a s como del gran nmero de intermediarios vesiculares de las vas secretora y endoctica (vesculas de trans porte). Podemos por tanto pensar que todos estos orgnulos son miembros de la misma familia y que, tal como veremos en detalle en el prximo captulo, sus in teriores se com unican intensam ente entre s y con el exterior de la clula va ve sculas de transporte que emergen por gemacin de un orgnulo y se fusionan con otro (Figura 12-4). En bacterias los ribosomas se hallan unidos a la cara citoslica de la m em brana plasmtica por lo que el origen evolutivo de la membrana del ER a partir de la mem brana plasmtica puede explicar por qu en las clulas eucariotas los ribosomas se encuentran unidos a la mem brana del ER. Este esquem a evolutivo tam bin ofrece una explicacin razonable para la arquitectura del ncleo, con su doble membrana. En las bacterias un nico cro m osom a est unido a puntos especiales del interior de la m em brana plasm ti ca. Es por lo tanto posible que la doble envoltura nuclear se originara com o una invaginacin profunda de la m em brana plasmtica, tal como se muestra en la Figura 12-5A. Este esquem a podra explicar por qu el compartimiento nuclear es topolgicam ente equivalente al citosol. De hecho, en las clulas eucariotas superiores la envoltura nuclear se rompe durante la mitosis, permitiendo que el contenido nuclear se disperse por el citosol, una situacin que nunca sucede con el contenido de ningn otro orgnulo delimitado por membrana. Tal y

lisosom a

m em brana envoltura interna nuclear m em brana externa

com plejo de Golgi

vescula de secreccin

Figura 12-4 Relaciones topoldgicas entre los compartimientos de una clula eucariota. Los espacios topolgicamente equivalentes se presentan en rojo. Los ciclos de gemacin y fusin permiten en principio que cualquier lumen se comunique con cualquier otro y con el exterior celular. La flechas azules indican la direccin de salida del trfico de vesculas desde el ER hasta el complejo de Golgi y la membrana plasmtica (o los lisosomas) y los puntos negros representan protenas que son segregadas por la clula. Algunos orgnulos sin embargo -de forma ms notable las mitocondrias y (en plantas) los cloroplastos- no participan en esta comunicacin vesicular por lo que estn aislados del trfico entre orgnulos que se muestra aqu.

La compartimentacin de las clulas superiores

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(A) VA EVOLUTIVA PROPUESTA PARA EL NCLEO Y PARA EL RETCULO ENDOPLASMTICO

clula procariota ancestral

retculo

citosol

ncleo m em brana nuclear interna mem brana nuclear externa

Figura 12-5 Hiptesis sobre el origen evolutivo de algunos orgnulos rodeados de membrana. Los orgenes de las mitocondrias, de los cloroplastos, del ER y del ncleo celular pueden explicar las relaciones topolgicas existentes entre estos com partimientos intracelulares en clulas eucariotas. (A) Posible va para la evolucin del ER y del ncleo. En algunas bacterias el DNA se halla unido a una invaginacin de la m embrana plasmtica llamada m esosom a. En clulas procariotas muy primitivas, una invaginacin de este tipo pudo dar lugar a una envoltura alrededor del DNA permitiendo todava el acceso del DNA al citosol celular (necesaria para permitir que el DNA pueda dirigir la sntesis de protenas). Probablem ente esta envoltura se gener com pletam ente a partir de la membrana plasmtica, produciendo un compartimiento limitado por una doble membrana. Tal como se ilustra, la envoltura nuclear est organizada mediante una capa fibrosa denominada l m in a nuclear, que est atravesada por canales de com unicacin denominados com p lejos d e p o ro nucleares. Dado que el ncleo est rodeado por dos membranas que continan donde son atravesadas por estos poros, el lumen del ncleo es topolgicamente equivalente al citosol. El lumen del ER es continuo con el espacio que se halla entre las membranas nucleares interna y externa, y es topolgicamente equivalente con el espacio extracelular. (B) Se cree que las mitocondrias (y los cloroplastos) se originaron mediante la incorporacin de una bacteria a una clula eucariota. Estas bacterias retuvieron su autonoma. Esta hiptesis puede explicar por qu el lumen de estos orgnulos perm anece aislado del extenso trfico de vesculas que interconecta el lumen de muchos otros com partimientos intracelulares.

a m em brana

mesosoma com plejo de poro nuclear lam ina nuclear

(B) VA EVOLUTIVA PROPUESTA PARA LA MITOCONDRIA

clula procariota

clula eucariota ancestral

como tam bin predice el esquema de la Figura 12-5A, el espacio entre las dos m embranas nucleares es topolgicamente equivalente al exterior de la clula y es continuo con el lumen del ER. Como se discute en el Captulo 14, las mitocondrias y los cloroplastos difie ren de los otros orgnulos rodeados de membrana en que presentan su propio genoma. La naturaleza de estos genomas y la estrecha similitud existente entre las protenas de estos orgnulos y las de algunas bacterias actuales sugiere clara mente que las mitocondrias y los cloroplastos evolucionaron a partir de bacte rias que fueron engullidas por otras clulas con las que inicialmente vivieron en simbiosis (se explica en los Captulos 1 y 14). De acuerdo con el esquema hi pottico de la Figura 12-5B, la mem brana interna de las mitocondrias y de los cloroplastos corresponde a la mem brana plasmtica original de las bacterias, mientras que el lumen de estos orgnulos evolucion a partir del citoplasma bacteriano. Como podra esperarse de sus orgenes, estos orgnulos permane cen aislados del extenso trfico de vesculas que conecta el interior de la mayora de los orgnulos entre s y con el exterior de la clula. Este esquema evolutivo agrupa los principales compartimientos intracelulares de la clulas eucariotas en cinco grupos: (1) el ncleo y el citosol, que se co munican entre s a travs de los poros nucleares, por lo que son topolgicamente continuos (a pesar de ser funcionalmente diferentes): (2) todos los orgnulos que actan en las rutas de secrecin y de endocitosis -incluyendo el ER, el com plejo de Golgi, los endosomas, los lisosomas, y numerosas clases de vesculas de transporte; (3) las mitocondrias; (4) los plastos (slo en plantas); y (5) los peroxisomas (cuyos orgenes evolutivos sern explicados ms adelante).

Las protenas pueden desplazarse entre compartimientos de diferentes m aneras 3

Todas las protenas empiezan a ser sintetizadas en el citosol, excepto las que son sintetizadas en los ribosomas de las mitocondrias y de los plastos. Su destino si guiente depende de su secuencia de aminocidos, que puede presentar seales de clasificacin que dirigen su reparto hacia posiciones fuera del citosol. Mu chas protenas no presentan seales de clasificacin y, en consecuencia, perma necen en el citosol como residentes permanentes. Sin embargo, muchas otras tienen seales de clasificacin especficas que las dirigen desde el citosol hacia el ncleo, el ER, las mitocondrias, los plastos (en plantas), o los peroxisomas; las

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Captulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas

Figura 12-6 Durante el transporte de las vesculas se mantiene la polaridad de la membrana. Ntese que tanto para las protenas como para los lpidos la orientacin original del compartimiento dador se mantiene en la membrana del compartimiento diana y que los materiales solubles son transferidos de lumen a lumen.

bcapa lipidica proteina de m em brana contenido del lum en

seales de clasificacin tam bin pueden dirigir el transporte desde el ER hacia otros destinos celulares. Para entender los principios generales por los que actan las seales de cla sificacin, es importante distinguir tres sistemas fundamentales diferentes m e diante los cuales las protenas se desplazan desde un compartimiento a otro. (1) El trfico de protenas entre el citosol y el ncleo tiene lugar entre espacios topolgicamente equivalentes, los cuales estn en continuidad a travs de los complejos de poro nucleares. Este proceso se llama transporte regulado porque el complejo de poro nuclear acta como puertas selectivas que pueden trans portar activamente macromolculas especficas y ensamblajes macromoleculares, aunque tam bin permiten difusin libre de molculas pequeas. (2) En el transporte transm em brana, translocadores proteicos unidos a la membrana di rigen el transporte especfico de protenas a travs de la membrana desde el ci tosol hacia un espacio que es topolgicamente distinto. Generalmente, la m ol cula de protena transportada ha de desplegarse para poder deslizarse a travs de la membrana. Por ejemplo el transporte inicial de determinadas protenas desde el citosol hacia el lumen del ER o hacia el interior de las mitocondrias tie ne lugar de este modo. (3) En el transporte vesicular, las vesculas de transporte cargan protenas desde un compartimiento a otro. A medida que la membrana de un compartimiento va produciendo vesculas por gemacin, estas vesculas capturan un cargamento de molculas del lumen del compartimiento. Tras el transporte y la fusin con la m em brana de otro compartimiento, estas vesculas descargan su cargamento en el interior de este otro compartimiento. Por ejem plo la transferencia de protenas solubles desde el ER al complejo de Golgi tiene lugar por este m ecanismo. Dado que las protenas transportadas no atraviesan la membrana, slo se desplazan entre compartimientos que son topolgicamen te equivalentes (Figura 12-6). En el Captulo 13 explicaremos con ms detalle el transporte vesicular. Los tres sistemas mediante los que se transportan las prote nas entre distintos compartimientos se resumen en la Figura 12-7. Cada uno de los tres sistemas de transferencia proteica generalmente estn guiados selectivamente por protenas receptoras complementarias que se hallan

COMPARTIMIENTO DADOR

GEMACION

vescula que se produce por gem acin, cuyo contenido va a ser transportado

Figura 12-7 Mapa de carreteras simplificado del trfico proteico. Las protenas pueden desplazarse de un compartimiento a otro por medio de un transporte regulado (en rojo), por medio de transporte transmembrana (azul), o por medio de transporte vesicular (verde). Las seales que dirigen el camino de una protena determinada a travs del sistema, determinando su localizacin definitiva en la clula, estn contenidas en la secuencia de aminocidos de la protena. El viaje comienza con la sntesis de una protena sobre un ribosoma y termina cuando se ha alcanzado el destino final. En cada una de las estaciones intermedias (recuadros) se toma una decisin respecto a si la protena ser retenida en el compartimiento o bien continuar el viaje. En principio, se requiere una seal determinada tanto para retener la protena en el compartimiento como para no retenerla. El destino alternativo es la ruta por defecto (en ausencia de seal). Por ejemplo, el transporte vesicular de protenas desde el ER, a travs del complejo de Golgi, hasta la superficie celular, parece que no necesita ninguna seal especfica; las seales de retencin especficas se requieren por consiguiente para retener las protenas en el ER y en el complejo de Golgi, cuyas protenas especializadas residen all. Utilizaremos repetidamente esta figura como gua a travs de este captulo y del siguiente, destacando la ruta particular que ser explicada.

CITOSOL

-^ T P
NUCLEO U MITOCONDRIA | |

PEROXISOMA PE

PLASTIDOS PL

RETICULO ENDOPLASMATICO

CLAVE: H H = transporte m = transporte transm em brana I cfaM.j = transporte vesicular

La compartimentacin de las clulas superiores

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PROTEINA DESPLEGADA

PROTEINA PLEGADA NH2 pptido seal

H 2 N

------------------------------------ ----------------

__--->COOH

(A)

en el orgnulo de destino. Por ejemplo, si una protena grande ha de ser impor tada hacia el ncleo, ha de tener una seal de clasificacin que sea reconocida por protenas receptoras asociadas con el complejo de poro nuclear. Si una pro tena ha de ser transferida directamente a travs de una membrana, ha de tener una seal de clasificacin que sea reconocida por el translocador de la m em bra na que tiene que atravesar. Del mismo modo, si una protena ha de ser incorpo rada en cierto tipo de vesculas de transporte o retenida en ciertos orgnulos, sus seales de clasificacin han de ser reconocidas por un receptor complementario de la m em brana apropiada.

Los pptidos seal y la regin seal determ inan el destino celular correcto de las.protenas 4
Existen al menos dos tipos de seales de clasificacin en las protenas. Uno de ellos reside en una regin continua de la secuencia de aminocidos, tpicamente de 15-60 residuos de largo. Este pptido seal es a menudo (pero no siempre) eliminado de la protena por una peptidasa de seal especializada, una vez se ha ejecutado la decisin de clasificacin. El otro tipo de seal consiste en una disposicin tridimensional caracterstica de los tomos de la superficie de la protena, que se forma cuando se pliega la protena. Los restos de aminocidos que constituyen la regin seal pueden ser bastante distantes el uno del otro en la secuencia lineal de aminocidos, y generalmente permanecen en la protena madura (Figura 12-8). Los pptidos seal son utilizados para dirigir las protenas desde el citosol al ER, a las mitocondrias, a los cloroplastos, a los peroxisomas y al ncleo y tam bin son utilizados para retener las protenas en el ER. Las regio nes seal identifican ciertas enzimas que han de ser marcadas con residuos de azcar especficos que luego dirigen a las protenas desde el complejo de Golgi a los lisosomas; las regiones seal tam bin se utilizan en otros pasos de clasifica cin que estn m enos caracterizados. Para especificar los diferentes destinos celulares se utilizan diferentes tipos de pptidos seal. En general, las protenas que estn destinadas a ser transferi das al ER tienen, en su extremo amino terminal, pptidos seal que en la parte central de su secuencia presentan entre 5 y 10 residuos de aminocidos hidrofbicos. La mayora de estas protenas pasarn despus desde el ER al complejo de Golgi; no obstante, las protenas que presentan en su extremo carboxilo terminal una secuencia determinada de cuatro aminocidos son retenidas permanente mente en el ER. Las protenas destinadas a las mitocondrias tienen pptidos se al en los que se alternan restos de aminocidos cargados positivamente con restos de aminocidos hidrofbicos. Las protenas destinadas a los peroxisomas tienen habitualmente una secuencia de tres aminocidos en su extremo carboxi lo. Muchas protenas destinadas al ncleo tienen pptidos seal formados por una agrupacin de residuos de aminocidos cargados positivamente, la cual se

Figura 12-8 Los dos sistemas mediante los que se puede codificar una seal de transporte en una proteha. (A) La seal se halla en una secuencia sencilla y discreta de aminocidos, llamada pptido seal, que se halla expuesta en la protena plegada. A menudo los pptidos seal se presentan en uno de los extremos de la cadena polipeptdica (tal como se presenta en la figura), pero tambin se pueden localizar en cualquier otro lugar de la protena. (B) Se puede formar una regin seal mediante la yuxtaposicin de aminocidos procedentes de regiones que se hallaban fsicamente separadas antes de que la protena se plegara (como se muestra en la figura); alternativamente, la seal puede estar formada por zonas separadas de la superficie de la protena plegada que se hallan separadas entre s por distancias fijas. En cualquier caso, la seal de transporte depende de la conformacin tridimensional de la protena. Por esta razn, este tipo de seal resulta difcil el localizar de forma precisa.

596

Captulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas

Tabla 12-3 Algunas secuencias tpicas de pptidos seal Funcin del pptido seal
Im p o rtacin al ER

Ejemplo de pptido seal

+ H 3N -M et-M et-Ser-P h e-V al-Ser- Leu-Leu-Leu-V al Gly-Ile-Leu-Phe-Trp-A la -Thr-Glu-A la-GluG ln-Leu-Thr-Lys-Cys-G lu-V al-Phe-G ln-

R eten cin en el lum en del ER Im p o rtacin a la m itocond ria

-Lys-Asp -Gl u-Leu-COO +H 3N -M et-Leu-Ser-Leu-A rg-G ln-Ser-Ile-A rg-PhePhe-Lys-Pro-A la-Thr-A rg-Thr-Leu-Cys-SerSer-A rg-Tyr-Leu-Leu-

Im p o rtacin al ncleo Im p o rtacin a los peroxisom as

- Pro - Pro - Ly s - Ly s -Ly s -Ar g - Ly s -Val -Ser-Lys-Leu-

+ H 3N -Gly-Ser-Ser-Lys-Ser-Lys-Pro-LysU n in a m em b ran a a travs de la un in covalente del extrem o am ino term inal al cido m irstico Los residuos de aminocidos cargados positivamente se muestran en rojo y los cargados negati vamente en verde. En el recuadro am arillo se indica un gran bloque de aminocidos hidrofbicos. H3N+indica el extremo amino terminal de la protena y COO' el carboxilo terminal.

encuentra habitualmente en lugares internos de la cadena polipeptdica. En la Tabla 12-3 se muestran algunos pptidos seal tpicos. La importancia de cada uno de estos pptidos seal en el destino de las pro tenas se ha visto en experimentos en los que el pptido ha sido transferido des de una protena a otra mediante tcnicas de ingeniera gentica: por ejemplo, colocando el pptido seal amino terminal que especifica para el ER, al princi pio de una protena citoslica, se consigue que ahora la protena se dirija al ER. Todos los pptidos seal que se hallan unidos a protenas que tienen el mismo destino son funcionalmente intercambiables aunque sus secuencias de am ino cidos puedan variar mucho. A menudo, parece que para los procesos de reco nocimiento, las propiedades fsicas de estos pptidos seal, tales como la hidrofobicidad, son ms importantes que la secuencia exacta de aminocidos. Las regiones seal son mucho ms difciles de analizar que los pptidos se al; en consecuencia, se conoce mucho m enos sobre su estructura. Debido a que resultan de un patrn complejo de plegamiento proteico tridimensional, no pueden simplemente transferirse de una protena a otra. En el Panel 12-1 (pg. 598) se ilustran los principales mtodos para estudiar cmo se dirigen las protenas desde el citosol a un compartimiento especfico y c mo se translocan a travs de las membranas.

Las clulas no pueden construir d e novo sus orgnulos rodeados de m em brana: necesitan inform acin del propio orgnulo 5
Cuando una clula se reproduce y se divide, tiene que duplicar sus orgnulos ro deados de membrana. Normalmente las clulas realizan esta duplicacin agran dando los orgnulos mediante la incorporacin en ellos de nuevas molculas, y la posterior divisin de estos orgnulos agrandados. Posteriormente, los orgnulos hijos son distribuidos entre las dos clulas hijas. Esta herencia es esencial ya que una clula no puede fabricar de novo estas membranas. Por ejemplo, si se elimina completamente el ER de la clula, cmo puede reconstruirlo la clula? Las prote nas de membrana que definen el ER y realizan muchas de su funciones clave son productos del propio ER. No se puede fabricar un nuevo ER sin la existencia pre via de un ER, o al menos de una membrana que contenga los translocadores n e cesarios para importar protenas especficas hacia el ER (y que carezca de los translocadores de otros orgnulos, necesarios para importar protenas). As, parece que la informacin necesaria para construir un orgnulo rodeado de membrana no reside slo en el DNA que especifica las protenas del orgnulo.

La compartimentacin de las clulas superiores

597

Aproximacin por transfeccin para definir secuencias seal

U n s is te m a d e m o s t r a r q u e u n a s e c u e n c ia s e a l es n e c e s a r ia y s u fic ie n te p a r a d ir ig ir u n a p r o te n a h a c ia u n c o m p a r t i m i e n t o in tr a c e lu la r d e te rm in a d o c o n s is te e n c r e a r u n a p r o t e n a d e fu s i n e n la q u e la s e c u e n c ia s e a l s e h a lle u n id a , m e d ia n t e t c n ic a s d e in g e n ie r a g e n tic a , a u n a p r o te n a q u e n o r m a lm e n t e e s r e s id e n te e n el c ito s o l. D e s p u s d e t r a n s f e c t u a r c lu la s c o n el c D N A q u e c o d ific a e s ta p r o te n a , s e d e t e r m in a la lo c a liz a c i n d e la p r o te n a d e fu s i n m e d ia n te in m u n o m a r c a je o p o r f r a c c io n a m ie n t o c e lu la r .

Aproximacin bioqumica para estudiar el mecanismo de translocacin de la protena

En e s te c a s o , u n a p r o te n a m a r c a d a q u e c o n t ie n e u n a s e c u e n c ia s e a l e s p e c fic a e s t r a n s p o r t a d a in v itro al in t e r io r d e o r g n u lo s a is la d o s . G e n e r a lm e n t e la p r o t e n a m a r c a d a e s p r o d u c id a p o r t r a d u c c i n e n un s is te m a lib r e d e c lu la s d e un m R N A q u e c o d ific a la p r o t e n a ; s e u tiliz a n a m in o c id o s r a d ia c tiv o s p a r a m a r c a r la p r o t e n a a c a b a d a d e s in t e t iz a r d e f o r m a q u e p u e d a d is tin g u ir s e d e la s m u c h a s o tr a s p r o t e n a s q u e s e h a lla n p r e s e n te s e n el s is te m a d e t r a d u c c i n in vitro. H a b it u a lm e n t e se u tiliz a n tr e s m t o d o s p a r a d e t e r m in a r si la p r o t e n a m a r c a d a s e ha tr a n s lo c a d o al o r g n u lo : 1. La p r o t e n a m a r c a d a c o f r a c c io n a c o n e l o r g n u lo e n u n a c e n t r if u g a c i n 2. La s e c u e n c ia s e a l e s e lim in a d a m e d ia n t e u n a p r o t e a s a e s p e c fic a q u e s e h a lla p r e s e n te e n e l in te r io r d e l o r g n u lo

secuencia seal a o b

gen que codifica una protena citoslica

incubacin sin el orgnulo incubacin con el orgnulo plsm ido utilizado para transfectar clulas
/ \ *

con radiactividad

protena ^transportada al orgnulo

3 . La p r o t e n a e s t p r o t e g id a d e la

protenas radiactivas en gel SDS proteasa

la secuencia seal a ( ) dirige la protena de fusin al orgnulo A

la secuencia seal b ( ) dirige la protena de fusin al orgnulo B

d ig e s t i n c u a n d o s e a a d e n p r o te a s a s al m e d io d e in c u b a c i n , p e r o e s s u s c e p tib le a e lla si p r im e r o s e a a d e n d e t e r g e n t e s

proteina
sin dete rg en te con deterg en te

A lt e r a n d o la s e c u e n c ia s e a l u tiliz a n d o m u ta g n e s is d ir ig id a p u e d e d e t e r m in a r s e q u c a r a c te r s tic a s e s t r u c tu r a le s s o n im p o r t a n t e s p a r a su f u n c i n .

q u e r o m p e n la m e m b r a n a d e l o r g n u lo

U t iliz a n d o e s to s e n s a y o s in v itro p u e d e d e t e r m in a r s e q u c o m p o n e n t e s (p r o t e n a s , A T P , G T P , e tc .) s o n n e c e s a r io s p a r a p r o c e s o s d e t r a n s c r ip c i n .

Aproximacin gentica para el estudio del mecanismo de translocacin de protenas

clula de levadura salvaje

P a ra e s t u d ia r la t r a n s lo c a c i n d e p r o t e n a s h a b it u a lm e n t e s e u tiliz a n c lu la s d e le v a d u r a c o n m u t a c io n e s e n g e n e s q u e c o d ific a n c o m p o n e n t e s d e la m a q u in a r ia d e t r a n s lo c a c i n . D e b id o a q u e la s c lu la s m u t a n t e s q u e n o p u e d e n t r a n s lo c a r p r o t e n a s a t r a v s d e s u s m e m b r a n a s m o r ir n , el tr u c o c o n s is te e n d is e a r u n a e s t r a t e g ia q u e p e r m it a a is la r las m u t a c io n e s q u e n ic a m e n t e c a u s a n u n d e fe c to p a r c ia l e n la t r a n s lo c a c i n d e p r o te n a s . U n a v a c o n s is te e n u tiliz a r la in g e n ie r a g e n tic a p a r a d is e a r c lu la s e s p e c ia le s d e le v a d u r a . P o r e je m p lo , la e n z im a h is tid in o l d e s h id r o g e n a s a r e s id e n o r m a lm e n t e e n el c ito s o l, d o n d e e s n e c e s a r ia p a r a p r o d u c ir el a m in a c id o e s e n c ia l h is tid in a a p a r t ir d e su p r e c u r s o r h is tid in o l. S e c o n s tr u y e u n a c e p a d e le v a d u r a e n la q u e el g e n d e la h is tid in o l r e d u c ta s a e s t s u b s t it u id o p o r u n g e n c o n s t r u id o d e f o r m a q u e c o d if iq u e u n a p r o t e n a d e fu s i n c o n u n a s e c u e n c ia s e a l e x tr a q u e d ir ig e la p r o t e n a al in t e r io r d e l r e tc u lo e n d o p la s m t ic o (E R ). C u a n d o e s ta s c lu la s s e h a c e n c re c e r e n a u s e n c ia

__ w oo 0

histidina

enzima en el citosol: la clula vive sin necesitar histidina com o nutriente

aparato de translocacin
clula de levadura ob ten ida por in geniera gentica

histidinol o o ooo u oO

la enzima se ha dirigido ----- al ER: la clula muere al colocarla en un m edio sin histidina

d e h is tid in a , m u e r e n d e b id o a q u e to d a la h is tid in o l d e s h id r o g e n a s a e s t s e c u e s tr a d a e n el ER , d o n d e n o e s f u n c io n a l. S in e m b a r g o , las c lu la s c o n m u t a c io n e s q u e in a c tiv a n p a r c ia lm e n t e el m e c a n is m o d e tr a n s to c a c i n d e p r o t e n a s d e s d e el c ito s o l al ER s o b r e v iv ir n d e b id o a q u e h a b r s u fic ie n te c a n t id a d d e d e s h id r o g e n a s a r e te n id a e n el c ito s o l p a r a p r o d u c ir la h is tid in a n e c e s a r ia . A m e n u d o s e o b t ie n e n c lu la s e n la s q u e la p r o t e n a m u t a n t e t o d a v a a c t a p a r c ia lm e n t e a t e m p e r a t u r a n o r m a l p e r o q u e e s c o m p le t a m e n t e

clula som etida a in geniera gnetica m utada

in a c tiv a a t e m p e r a t u r a s

e le v a d a s . U n a c lu la q u e t r a n s p o r t e u n a d e e s ta s

m u t a c io n e s s e n s ib le s a la t e m p e r a t u r a m u e r e a t e m p e r a t u r a s e le v a d a s , t e n g a o

histidinol ooo.
oO

n o h is tid in a , y a q u e n o p u e d e t r a n s p o r t a r n in g u n a p r o t e n a al ER . E llo p e r m it e

no toda la enzima se ----- halla en el ER: la clula vive aunque se coloque en ausencia de histidina

id e n t if ic a r el g e n n o r m a l q u e f u e m o d if ic a d o p o r la m u t a c i n , m e d ia n t e la t r a n s f e c c i n d e la c lu la m u t a n t e c o n u n v e c t o r p la s m d ic o d e le v a d u r a e n el q u e s e h a n c lo n a d o f r a g m e n t o s al a z a r d e D N A g e n m ic o : e l f r a g m e n t o e s p e c fic o d e D N A q u e r e c u p e r a la c lu la m u t a n t e c u a n d o s e h a c e c r e c e r a u n a t e m p e r a t u r a e le v a d a s e r el q u e c o d ific a la v e r s i n s a lv a je d e l g e n m u t a n t e .

aparato de translocacin, m utante

598

Panel 12-1 Estudio de las secuencias seal y de la translocacin de protenas a travs de membranas.

Tambin se requiere la informacin epigentica en forma de al menos una pro tena caracterstica en la membrana del orgnulo, y esta informacin es transm i tida desde la clula padre a las de la progenie en forma del propio orgnulo. Pro bablem ente esta informacin es esencial para la propagacin de la organizacin celular en compartimientos, al igual que la informacin en DNA es esencial para la propagacin de las secuencias de nucletidos y de aminocidos.

Resumen
Las clulas eucariotas contienen membranas intracelulares que encierran casi la mi tad de su volumen total en compartimientos intracelulares individualizados llama dos orgnulos. En todas las clulas eucariotas los principales tipos de orgnulos ro deados de membrana son el retculo endoplasmtico, el complejo de Golgi, el ncleo, las mitocondrias, los lisosomas, los endosomasy los peroxisomas; las clulas vegeta les contienen, adems, plastos, como por ejemplo los cloroplastos. Cada orgnulo contiene protenas caractersticas que desarrollan susjunciones caractersticas. Cuando la protena de un orgnulo acaba de ser sintetizada, encuentra el ca mino especfico que ha de seguir desde el ribosoma donde ha sido sintetizada hasta el orgnulo donde actuar, guiada por una seal especfica que se halla presente en su secuencia de aminocidos y que acta como un pptido seal o como una re gin seal. Los pptidos y las regiones seal son reconocidos por protenas recepto ras complementarias presentes en los orgnulos de destino. Las protenas que actan en el citosol no presentan pptidos o regiones seal y por lo tanto permanecen en el citosol despus de ser sintetizados.

El transporte de molculas hacia dentro y hacia fuera del ncleo6

La envoltura nuclear encierra el DNA y define el compartimiento nuclear. Est formada por dos membranas concntricas que, tal como hemos visto, son conti nuas con el retculo endoplasmtico. A pesar de que la membrana nuclear inter na y la externa son continuas, las dos membranas presentan distinta com posi cin proteica. La m em brana nuclear interna contiene protenas especficas que actan como lugares de unin de la lmina nuclear que la soporta. Esta m em brana est rodeada por la m em brana nuclear externa, la cual se parece enor memente a la membrana del retculo endoplasmtico, que forma un continuo con ella (Figura 12-9). Como la mem brana del ER rugoso, esta membrana exter na est generalmente tapizada por ribosomas que se hallan trabajando en la sn tesis de protenas. Las protenas fabricadas en estos ribosomas son transporta das al espacio entre las m embranas interna y externa (el espacio perinuclear), el cual a su vez es continuo con la luz del ER (vase Figura 12-9), Existe un trfico bidireccional continuo entre el citosol y el ncleo. La gran cantidad de protenas que actan en el ncleo -incluyendo las histonas, las DNA y RNA polimerasas, las protenas reguladoras de genes y las protenas de procesam iento del RNA- son importadas de forma selectiva desde el citosol hacia el compartimiento nuclear, donde son fabricadas. Al mismo tiempo, los tRNA y mRNA son sintetizados en el com partim iento nuclear y luego son ex portados al citosol. Al igual que el proceso de importacin, el proceso de ex portacin es selectivo; por ejemplo, los mRNA slo son exportados si han sido modificados correctam ente en el ncleo por reacciones de procesam iento de RNA. En algunos casos el proceso de transporte es com plejo: por ejemplo, las protenas ribosm icas son fabricadas en el citosol, importadas al ncleo -d o n de se ensam blan con RNA ribosm icos recin fabricados, formando partculasy luego son exportadas de nuevo al citosol com o parte de la subunidad ribosmica, cada uno de estos pasos implica transporte selectivo a travs de la envol tura nuclear.

CITOSOL NUCLEO MITOCONDRIA PEROXISOMA PLASTIDOS

____________

RETICULO ENDOPLASMATICO

&

El transporte de molculas hacia dentro y hacia fuera del ncleo

599

envoltura | , m em brana nuclear nuclear interna .

m em brana nuclear externa m em brana del ER - lum en del ER

Figura 12-9 La envoltura nuclear. La

envoltura nuclear de doble membrana est atravesada por poros nucleares y es continua con el retculo endoplasmtico. No se muestran los ribosomas que se hallan unidos en la cara citoslica de la m embrana del ER y en la m em brana externa del ncleo.

Figura 12-10 Disposicin de los complejos de poro nucleares en la envoltura nuclear. (A) Esbozo que
muestra una pequea regin de la envoltura nuclear. En una seccin transversal el com plejo de poro nuclear aparece compuesto de tres partes: (1) un com ponente columnar que forma el grueso de la pared del poro; (2) un com ponente anular, que extiende radios hacia el centro del poro; y (3) un com ponente luminal, que est formado por una gran glucoprotena transm em brana que se cree que participa en el anclaje del complejo a la m em brana nuclear. Adems, existen fibrillas que sobresalen desde la cara citoslica o desde la cara nuclear del com plejo. En la parte nuclear las fibrillas convergen formando estructuras en forma de jaula, las cuales se muestran en una fotografa de m icroscopa electrnica de la cara nuclear de la envoltura nuclear de un oocito (B). (B, de M.W. Goldberg y T.D. Alien. J. Cell Biol. 119:1429-1440, 1992, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

Los poros nucleares atraviesan la envoltura nuclear 7

En todas las clulas eucariotas, desde las levaduras hasta las humanas, la envol tura nuclear est perforada por los poros nucleares. Cada poro est constituido por en una gran estructura discoidal conocida como el com plejo del poro n u clear, que se ha estimado que tiene un peso molecular de alrededor de 125 m i llones de daltons y se cree que est compuesto por ms de 100 protenas dife rentes, ordenadas segn una sorprendente simetra ortogonal (Figuras 12-10 y
12- 11).

Cada complejo de poro presenta uno o ms canales acuosos abiertos, a tra vs de los cuales pueden difundir pasivamente las molculas solubles en agua que son ms pequeas de un determinado tamao. El tamao efectivo de estos canales ha sido determinado inyectando molculas marcadas (que no son com ponentes nucleares) en el citosol y midiendo luego la velocidad de difusin hacia el ncleo. Las molculas pequeas (5000 daltons o menos) difunden tan rpida mente que puede considerarse que la envoltura nuclear es libremente permea ble a ellas. Una protena de 17 000 daltons tarda 2 minutos en equilibrarse entre el citoplasma y el ncleo; una protena de 44 000 daltons tarda 30 minutos. Una protena globular mayor de 60 000 daltons parece que es completamente inca paz de entrar en el ncleo. Un anlisis cuantitativo de estos datos sugiere que el poro nuclear tiene un canal cilindrico lleno de agua de aproximadamente 9 nm

fib rilla

m em brana nuclear externa

subunidad anular subunidad lum inal subunidad colum nar subunidad del anillo

CITOSOL envoltura nuclear NCLEO lm ina nuclear jaula nuclear L m em brana nuclear interna 50 nm

(8)

600

Captulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas

Figura 12-11 Electronm icrografa y reconstruccin inform tica de complejos de poro nuclear. (A) y (B): diferentes perspectivas de com plejos de poros nucleares liberados de la envoltura con detergente y contrastados por tincin negativa. En (B) algunos com plejos de poro pueden verse de lado. (C) Reconstrucciones tridimensionales mediante ordenador que muestran vistas desde arriba, inclinada y de lado de com plejos de poro. (De J.E. Hinshawy R. Milligan, Cell 69:1133-1141, 1992. Cell Press.)

de dimetro y 15 nm de largo; este canal puede ocupar slo una pequea frac cin del volumen total del poro (Figura 12-12). Dado que muchas protenas celulares son demasiado grandes para pasar por difusin a travs de los poros nucleares, la envoltura nuclear permite que el compartimiento nuclear y el citosol mantengan diferentes conjuntos de prote nas. Por ejemplo, los ribosomas citoplasmticos maduros tienen un dimetro de 30 nm, por lo que no pueden difundir a travs de los canales de 9 nm; su exclu sin del ncleo asegura que toda la sntesis proteica estar limitada en el citosol. Pero, cmo importa el ncleo las grandes molculas que necesita, como las DNA y RNA polimerasas cuyas subunidades tienen pesos moleculares de entre 100 000 y 200 000 daltons? Como explicaremos ms adelante, estas y muchas otras molculas de protena y de RNA se unen a protenas receptoras localizadas en los complejos de poro y luego son transportadas activamente a travs de la envoltura nuclear mediante los complejos de poro.

Unas seales de localizacin nuclear dirigen las protenas nucleares hacia el ncleo 8
En general, cuanto ms activa sea la transcripcin nuclear, mayor ser el nm e ro de complejos de poro presentes en la envoltura nuclear. La envoltura nuclear

CITOSOL

o
o tam ao de las protenas que entran en el ncleo por difusin libre tam ao de las protenas que entran en el ncleo mediante transporte activo

50 nm

Figura 12-12 Posibles vas de difusin libre a travs del complejo de poro nuclear. El dibujo muestra un hipottico diafragma insertado en el interior del poro para restringir el tamao del poro del canal abierto a 9 nm, que es el tamao de poro estimado a partir de medidas de difusin. Nueve nanmetros es un dimetro menor que la abertura central observada en las imgenes de los com plejos de poro nuclear obtenidas a partir de electronmicrografas (o a partir de medidas durante el transporte activo cuando se dilata el poro para permitir el transporte de partculas de hasta 26 nm de dimetro). Por lo tanto es probable que algunos com ponentes del poro se pierdan durante la preparacin de las muestras para microscopa electrnica y que stos sean los que en condiciones normales limiten la libre difusin a travs de la abertura central. Estos com ponentes pueden formar un diafragma (o un tapn) que se abra o se cierre permitiendo el paso de grandes objetos durante el transporte activo, que est mediado por una seal de clasificacin (se explica ms adelante). A pesar de que en algunas preparaciones pueden observarse unos tapones, no est claro si son com ponentes del com plejo de poro o material que est siendo transportado a travs suyo. Las reconstrucciones tridimensionales por ordenador sugieren que los canales que permiten la libre difusin podran no estar localizados en el centro del com plejo de poro pero s cerca del borde entre los com ponentes columnares (vase Figura 12-10A); esto podra significar que la difusin pasiva y el transporte activo tienen lugar a travs de diferentes partes del com plejo de poro.

El transporte de molculas hacia dentro y hacia fuera del ncleo

601

(A) LOCALIZACIN DEL ANTGENO T QUE PRESENTA LA SEAL DE IMPORTACIN NUCLEAR DEL TIPO SALVAJE

(B) LOCALIZACIN DEL ANTGENO T QUE PRESENTA UNA SEAL DE IMPORTACIN NUCLEAR MUTADA
< N \ I/ / >

Figura 12-13 La funcin de la seal de localizacin nuclear. Fotografas de

inmunofluorescencia que muestran la localizacin celular del antgeno T del SV40 conteniendo o no un pptido corto que acta como seal de localizacin nulear. La forma salvaje de la protena del antgeno T contiene la secuencia rica en lisina que se indica y que es importada a su lugar de accin en el ncleo, como se demuestra mediante una tincin inmunofluorescente con un anticuerpo contra el antgeno T (A). Si el antgeno T presenta una seal de localizacin nuclear alterada (una treonina que reemplaza a una lisina) perm anece en el citosol (B). (De D. Kalderon, B. Roberts, W. Richardson y A. Smith, Cell 39:499-509,1984 Cell Press.)

de una clula tpica de mamfero contiene entre 3000 y 4000 complejos de poro. Si la clula est sintetizando DNA, necesita importar aproximadamente 106 m o lculas de histona desde el citoplasma cada 3 minutos para poder empaquetar el DNA recin sintetizado en forma de cromatina, lo cual significa que, por trm i no medio, cada poro ha de transportar alrededor de 100 molculas de histona por minuto. Si la clula est creciendo rpidamente, cada poro tambin ha de transportar por trmino medio 6 subunidades ribosmicas mayores y menores recin ensambladas por minuto, desde el ncleo, donde son producidas, hasta el citosol, donde son utilizadas. Y esto es slo una muy pequea parte del trfico total que pasa a travs de los poros nucleares. Cuando las protenas del ncleo son extradas experimentalmente y microinyectadas de nuevo en el citosol, incluso las ms grandes se vuelven a acu mular en el ncleo de una forma eficiente. La selectividad de esta importacin nuclear reside en las seales de localizacin nuclear, que slo estn presentes en las protenas nucleares. Estas seales se han definido con precisin en mu chas protenas nucleares utilizando la tecnologa del DNA recombinante. Pue den estar situadas en cualquier lugar de la secuencia de aminocidos y general mente consisten en una secuencia corta (tpicamente de entre cuatro y ocho aminocidos), que es diferente en diferentes protenas nucleares pero que es rica en los aminocidos cargados positivamente lisina y arginina, y generalmen te presenta prolina. En muchas protenas nucleares esta secuencia est partida en dos bloques de dos a cuatro aminocidos cada uno, con los bloques separa dos uno del otro por aproximadamente diez aminocidos. Se cree que las sea les forman bucles en la superficie de las protenas. Las seales de localizacin nuclear fueron identificadas en primer lugar en la protena codificada por el virus SV40 llamada antgeno T, la cual es necesaria para la replicacin del DNA vrico en el ncleo de la clula husped. Normal mente el antgeno T se acumula en el ncleo poco tiempo despus de ser sinteti zado en el citosol. No obstante, una mutacin en un nico aminocido impide el transporte al ncleo (Figura 12-13). Asumiendo que esta mutacin se localiza en una secuencia seal de importacin al ncleo, se fusionaron cortas secuencias de DNA que codifican esta regin del antgeno T normal, con un gen que codifi ca una protena citoslica. Se determinaron las secuencias ms cortas que hacan que la protena de fusin resultante fuera importada al ncleo, y as se pudo demostrar que la seal de importacin nuclear del antgeno T era una secuencia de ocho aminocidos contiguos localizados en una regin interna de la cadena polipeptdica (vase Figura 12-13). Experimentos posteriores demostraron que la secuencia seal tam bin puede ser funcional si es sintetizada como un peque o pptido y unida qum icam ente a una lisina seleccionada al azar de una pro tena, la cual, en caso de no recibir este pptido, permanecera en el citoplasma, lo cual sugiere que la localizacin precisa en la protena de la seal de importa cin al ncleo, no es importante. De hecho, muchas protenas nucleares presen tan ms de una seal de localizacin nuclear.

602

Captulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas

proteolisis lim itada cola cabeza ncleoplasm ina radiactiva

oro coloidal

cabezas radiactivas

,\
' colas radiactivas
s

partculas de oro coloidal com plejadas con las colas de la ncleoplasm ina

MICROINYECCIN EN EL CITOPLASMA DE OOCITOS DE X E N O P U S

O
I I

iO
I I

INCUBACIN

I I
DETECCIN POR EM

DETECCIN MEDIANTE AUTORRADIOGRAFA

t
citoplasm a

I
poro

nucleo

w ^

CAPTACION EN LOS NCLEOS

NO CAPTACION

CAPTACION EN LOS NCLEOS

CAPTACION EN LOS NCLEOS A TRAVS DE LOS POROS NUCLEARES

Las macrom olculas son transportadas activamente hacia dentro y hacia fuera del ncleo a travs de los poros nucleares 9
El transporte activo de protenas nucleares a travs de los poros nucleares puede ser visualizado directamente recubriendo partculas de oro con una protena nuclear, inyectando estas partculas en el citosol, y siguiendo su destino por electronmicroscopia (Figuras 12-14 y 12-15). La interaccin inicial de una protena nuclear con el complejo de poro nu clear requiere una o ms protenas citoslicas que se unen a las seales de loca lizacin nuclear y colaboran dirigiendo a la pro tena nuclear hacia el complejo de poro, donde parece que se une a las fibrillas que se proyectan a partir del ani llo del complejo. Entonces, la protena nuclear se desplaza hacia el centro del complejo de poro, donde es activamente transportada a travs de la envoltura nuclear mediante un proceso que requiere la hidrlisis de ATP (Figura 12-16).
Figura 12-15 Visualizacin del proceso de im portacin especfica de una protena a travs de los poros nucleares. Electronmicrografa que muestra las esferas de oro coloidal revistiendo ncleoplasmina (vase Figura 12-14) entrando en el ncleo a travs de los poros nucleares (indicados mediante corchetes rojos). Cuando las esferas de oro coloidal se recubren con la regin de la cola de molculas de ncleoplasmina se obtienen resultados similares a stos. Estas partculas de oro tienen un dimetro mayor que el canal de difusin del com plejo de poro, lo cual implica que, para permitir su paso, se ha inducido a abrirse un poro. Dado que las partculas de oro se alinean en el citosol antes de entrar en contacto y de entrar en el com plejo de poro, se ha sugerido que las fibrillas que se extienden hacia el citosol a partir del com plejo de poro (vase Figura 12-10A) guan a las partculas hacia su destino. (De C. Feldherr, E. Kallenbach y N. Schultz, /. C ell Biol. 99:22162222, 1984, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

Figura 12-14 Captacin de protenas nucleares a travs de los complejos de poro nucleares. La n cleop lasm in a es una gran protena pentamrica del ncleo, que presenta dominios diferentes en la cabeza y en la cola. Las cabezas pueden ser separadas de las colas mediante fragmentacin proteoltica limitada. Cuando se inyectan molculas intactas de ncleoplasmina en el citoplasma de un oocito de rana, se acumulan rpidamente en el ncleo a pesar de que al parecer son demasiado voluminosas com o para poder difundir pasivamente a travs del com plejo de poro nuclear. La seal necesaria para esta importacin nuclear reside en el dominio de la cola, ya que el ncleo capta rpidamente las colas de la protena pero no las cabezas. El papel de los poros nucleares en esta importacin dirigida por seal se puede demostrar mediante electronm icroscopia utilizando colas de ncleoplasmina acopladas a esferas de oro coloidal, que son fcilm ente visualizables debido a su elevada electrodensidad. La unin de las colas de ncleoplasmina dirigen la entrada de las partculas de oro a travs de los poros nucleares (vase Figura 12-15).

El transporte de molculas hacia dentro y hacia fuera del ncleo

603

proteina factores nuclear citosohcos com plejo del poro dilatado

CITOSOL

i PASO 1 | ,___________ PASO 2___________! UNIN: NO SE TRANSPORTE: REQUIERE ATP SE REQUIERE ATP

NCLEO

Estudios realizados con varios tamaos de partculas de oro indican que durante el proceso de transporte la abertura se puede dilatar hasta alcanzar 26 nm de dimetro: parece que una estructura muy poco definida en el centro del com ple jo de poro acta igual que un diafragma de apertura controlada (close-fitting), abrindose lo necesario cuando es activado por una seal de una protena de grandes dimensiones (vase Figura 12-12). La base molecular de este m ecanis mo y el m ecanism o a travs del que acta bombeando macromolculas hacia dentro y hacia fuera del ncleo todava constituye un misterio. Parece probable que la exportacin de nuevas subunidades ribosomales y de RNA m ensajero a travs de los poros nucleares dependa de un sistema de transporte selectivo. Si se utilizan esferas de oro de 20 nm de dimetro similares a las utilizadas en la Figura 12-15, se recubren con pequeas molculas de RNA (tRNA o RNA 5S) de forma similar a como se realiz en los experimentos de nucleoplasmina, y luego se inyectan en el ncleo de un oocito de rana, son rpida mente transportadas a travs de los poros hacia el citoplasma. Si, por otro lado, estas partculas son inyectadas en el citoplasma del oocito, no son transportadas hacia el ncleo sino que permanecen en el citoplasma. Parece que, adems de contener receptores que reconocen las seales de importacin nuclear, el poro contiene uno o ms receptores que reconocen molculas de RNA (o las prote nas unidas a ellas) destinadas al citosol. Utilizando diferentes tamaos de part culas de oro, unas cubiertas por RNA e inyectadas en el ncleo y otras recubier tas con seales proteicas de importacin nuclear, se puede observar que un mismo com plejo de poro permite el trfico en ambas direcciones. El mecanismo de transporte macromolecular a travs de los poros nucleares es fundamentalmente distinto a los mecanismos de transporte implicados en la transferencia de protenas a travs de las membranas de otros orgnulos. La prin cipal diferencia radica en el hecho que el transporte nuclear no tiene lugar a tra vs de un transportador proteico que atraviesa una o ms bicapacas lipdicas sino a travs de un gran poro acuoso regulado. Parece que las protenas nuclea res son transportadas a travs de los poros, manteniendo dichas protenas su conform acin com pletamente plegada, com o ocurre con una subunidad ribosomal que es transportada com o una partcula ensamblada; por el contrario, para ser transportadas a otros orgnulos, las protenas tienen que desplegarse duran te su transporte, com o explicaremos ms adelante.

Figura 12-16 Representacin altamente esquemtica del mecanismo de transporte activo a travs de los poros nucleares. Las protenas y las estructuras implicadas en el proceso de transporte activo no son conocidas. Sin embargo, sabemos que para la unin inicial de las protenas nucleares al complejo se necesitan una coleccin diversa de protenas citoslicas relacionadas. Estas protenas, llamadas nucleoporinas, contienen un azcar simple (la AT-acetilglucosamina) que ayuda a su identificacin mediante el uso de lectinas y de anticuerpos especficos. No se muestran las fibrillas que se proyectan a partir del complejo de poro y que se cree que ayudan a guiar a las protenas nucleares al centro del poro.

i___________ i
1 jim
Figura 12-17 La lm ina nuclear. Electronmicrografas de porciones de la lmina nuclear en un oocito de X enopus preparado por sublimacin y sombreado metlico. La lmina est formada por una red regular de filamentos intermedios especializados. (Por cortesa de Ueli Aebi.)

La envoltura nuclear se desorganiza durante la m itosis 10

La lm ina nuclear es una red de subunidades proteicas interconectadas deno minadas lamininas nucleares. Son un tipo especial de filamentos intermedios (explicado en el Captulo 16) que polimerizan formando una red bidimensional (Figura 12-17). Se cree que la lmina nuclear da forma y estabilidad la envoltura nuclear, a la cual se halla anclada por la unin de los poros nucleares y la m em brana nuclear interna. Tam bin se cree que la cromatina interacciona directa mente con la lmina nuclear, por lo que la lmina proporciona un unin estruc tural entre el DNA y la envoltura nuclear.

604

Captulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas

poro nuclear

Cuando el ncleo se desorganiza durante la mitosis, la lmina nuclear se despolimeriza, al menos parcialmente, como consecuencia de la fosforilacin de las lamininas nucleares en el inicio de la mitosis. Al mismo tiempo, los poros nu cleares se desorganizan en sus diversos componentes. La despolimerizacin de la lmina nuclear es probablemente un requisito previo para que la envoltura nu clear se rompa formando vesculas de membrana las cuales, con el contenido nuclear, se dispersan por todo el citosol. La reorganizacin de la lmina nuclear tienen lugar cuando las lamininas nucleares son desfosforiladas y, como resulta do de ello, repolimerizan en las superficie de los cromosomas; entonces, la lmi na nuclear reorganizada une las vesculas de la envoltura membranosa nuclear, las cuales se fusionan entre s formando de nuevo una envoltura alrededor de cada cromosoma o grupo de cromosomas. Durante este proceso los complejos de poro nucleares tam bin se reorganizan. Los cromosomas envueltos se agru pan y sus membranas se fusionan formando una sola envoltura nuclear, la cual importa activamente todas las protenas que presentan seales de localizacin nuclear (Figura 12-18). Dado que la nueva envoltura nuclear est situada muy cerca de la superficie de los cromosomas, excluye todas las protenas de la clula excepto las que estn unidas a los cromosomas mitticos. Por lo tanto, las prote nas grandes se mantienen fuera del ncleo interfsico a menos que presenten seales de localizacin nuclear. Las seales de localizacin nuclear no son eliminadas despus del transpor te hacia el ncleo. Se supone que esto es as porque las protenas nucleares han de ser importadas al ncleo varias veces, despus de cada divisin celular. Por el contrario, cuando una molcula de protena ha sido importada a cualquier otro orgnulo rodeado de membrana, se transmite de generacin a generacin en el interior del compartimiento y nunca ha de ser translocada de nuevo. En este caso el pptido seal de estas molculas es a menudo eliminado despus de la translocacin proteica.

Figura 12-18 Rotura y nueva form acin de la envoltura nuclear durante la mitosis. Se cree que la fosforilacin de las lamininas ayuda a disparar el desensam blaje de la lmina nuclear, lo cual a su vez causa la rotura en forma de vesculas de la envoltura nuclear. Parece que la desfosforilacin de la lminas ayuda a revertir el proceso.

El transporte entre el ncleo y el citosol puede ser regulado evitando el acceso a la m aquinaria transportadora 11
Como se explica en el Captulo 9, la actividad de algunas protenas de regulacin gnica est controlada manteniendo estas protenas fuera del compartimiento

El transporte de molculas hacia dentro y hacia fuera del ncleo

605

seal de localizacin nuclear lugar de unin \ horm ona de la horm ona \ esteroidea

envoltura nuclear CITOSOL NUCLEO DNA

dom inio de unin al DNA COMPLEJO RECEPTOR INACTIVO EN EL CITOSOL

hsp90

transcripcin

LA UNION DE LA HORMONA LIBERA LA hsp90 Y EXPONE LA SEAL DE LOCALIZACIN NUCLEAR

UNION DEL RECEPTOR ACTIVO AL DNA ACTIVANDO LA TRANSCRIPCIN

nuclear hasta que son necesarias en dicho compartimiento. La seal de localiza cin nuclear de estas protenas puede ser inactivada por fosforilacin. Otras, se unen a protenas citoslicas inhibidoras que o bien las retienen en el citosol -p ro bablem ente mediante interacciones con el citoesqueleto o con orgnulos espec ficos- o bien enmascaran sus seales de localizacin nuclear. Cuando la clula recibe el estmulo apropiado, la protena es liberada de su anclaje citoslico o de sus sistema de enmascaramiento y es transportada hacia el ncleo (Figura 12-19). La exportacin de RNA desde el ncleo puede estar controlada de una m a nera similar. Como la importacin activa hacia el ncleo, la exportacin tambin requiere una seal: en el caso de la mayora de molculas de RNA mensajero, esta seal la proporciona una modificacin caracterstica, la estructura de cape ruza (cap) en el extremo 5 del RNA (se explica en el Captulo 8). Los RNA premensajeros procesados de forma incompleta tienen esta caperuza, pero estn unidos a la maquinaria nuclear de transcripcin y de maduracin, la cual slo li bera la molcula de RNA cuando se ha completado su procesamiento: estudios genticos realizados en levaduras han demostrado que las mutaciones que evitan que el RNA pre-mensajero se relacione correctamente con la maquinaria de m a duracin provocan la exportacin de RNA no maduro. Otros RNA, como el RNA de transferencia o el RNA ribosmico, que no presentan la estructura en caperu za en el extremo 5 , primero han de ensamblarse con protenas y entonces son exportados com o parte de estos complejos. Posiblemente las seales de exporta cin nuclear se encuentran en las subunidades proteicas de estos complejos, y estas seales se activan despus del ensamblaje correcto con los componentes de RNA. Sin embargo, no conocem os todava la naturaleza de estas seales.

Figura 12-19 La importacin nuclear del receptor de glucocorticoides. El receptor de glucocorticoides es una protena reguladora de genes que en las clulas no tratadas con hormonas se halla en el citosol unida a la protena chaperona hsp90. Cuando se activa por la unin de la hormona esteroidea apropiada, la protena hsp90 se libera y el receptor se dirige al ncleo gracias a una seal de localizacin nuclear; una vez se halla en el ncleo, se une a secuencias especficas de DNA y regula la transcripcin de una coleccin de genes discreta. (Se explica en los Captulos 9 y 15.)

Resumen
La envoltura nuclear est formada por una membrana nuclear interna y otra ex terna. La membrana nuclear externa es continua con la membrana del ER, y el es pacio entre sta y la membrana nuclear interna es continuo con el lumen del ER. Las molculas de RNA, que son fabricadas en el ncleo, y las subunidades ribosmicas, que son ensambladas tambin en el ncleo, son exportadas al citosol, mientras que todas las protenas que son funcionales en el ncleo han sido sintetizadas en el citosol e importadas. El intercambio de materiales entre el ncleo y el citosol tiene lugar a travs de los poros nucleares que proporcionan una va de paso a travs de la envoltura nuclear. Las protenas que presentan seales de importacin nuclear son transportadas activamente hacia el ncleo a travs de los poros, mientras que las molculas de RNA y las subunidades ribosomles recin fabricadas son transportadas activamente ha cia afuera, a travs de los poros. Dado que este pptido seal no es eliminado, las protenas nucleares pueden ser importadas varias veces, tal como se requiere cada vez que el ncleo se desorganiza en la mitosis. El transporte de las protenas nuclea res y dlas molculas de RNA a travs de los poros se puede regular evitando el acce so de estas molculas a la maquinaria de transporte de los poros nucleares.

606

Captulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas

El transporte de protenas al interior de mitocondrias y de cloroplastos1 2

Tal como se explica en el Captulo 14, las mitocondrias y los cloroplastos son orgnulos de doble mem brana que se especializan en la sntesis de ATP, utilizan do la energa producida mediante el transporte electrnico y la fosforilacin oxidativa en las mitocondrias y mediante la fosforilacin fotosinttica en los cloroplastos. A pesar de que ambos orgnulos contienen su propio DNA y su maquinaria para la sntesis proteica, la mayora de sus protenas estn codifica das en el ncleo celular y son importadas desde el citosol. Adems, cada prote na importada ha de alcanzar el subcompartimiento determinado en el que es funcional. En las mitocondrias existen dos subcompartimientos: el espacio de la m atriz y el espacio interm em brana. Estos compartimientos estn definidos por las dos membranas mitocondriales: la m em brana interna, que encierra el espacio de la matriz y la m em brana externa que se halla en contacto con el ci tosol (Figura 12-20A). En los cloroplastos existen estos dos subcompartimientos ms otro adicional, el llamado espacio tilacoidal, que est delimitado por la membrana tilacoidal (Figura 12-20B). Cada uno de estos subcompartimientos contiene una coleccin especfica de protenas. Por lo tanto, el crecim iento de las mitocondrias y de los cloroplastos mediante la importacin de protenas citoplasmticas constituye una proeza, que implica la traslocacin selectiva de estas protenas a travs de varias membranas sucesivamente hasta alcanzar el lugar apropiado. Las protenas codificadas por los genomas de estos orgnulos, que son rela tivamente pocas, estn localizadas principalmente en la membrana interna de las mitocondrias y en la membrana tilacoidal de los cloroplastos. Generalmente los polipptidos codificados por los orgnulos forman subunidades de com ple jos proteicos cuyas otras subunidades estn codificadas por genes nucleares y, por lo tanto, son importadas desde el citosol. La formacin de estos complejos proteicos hbridos requiere una sntesis equilibrada de los dos tipos de subuni dades; el mecanismo a travs del cual est coordinada la sntesis proteica en dos tipos diferentes de ribosomas localizados en dos membranas separadas, consti tuye actualmente un misterio.

La translocacin hacia la matriz mitocondrial depende de una seal tpica de la matriz 13

Generalmente, las protenas importadas a la matriz mitocondrial son captadas desde el citosol uno o dos minutos despus de su liberacin desde los polirribosomas libres. Casi siempre estas protenas precursoras mitocondriales poseen un pptido seal (de entre 20 y 80 residuos de aminocidos) en su extremo ami-

(A) MITOCONDRIA

(B) CLOROPLASTO

espacio de la matriz espacio entre mem branas

m em brana interna espacio entre mem branas

espacio tilacoidal m em brana tilacoidal

espacio de la m atriz (estroma)

El transporte de protenas al interior de mitocondrias y de cloroplastos

Figura 12-20 Los subcom partim ientos de la m itocondria y del cloroplasto. La topologa del cloroplasto puede derivarse de la topologa de la mitocondria de una forma sencilla: pellizcando las invaginaciones de la membrana mitocondrial interna para dar lugar a vesculas, se puede generar un com partimiento que es topologicamente equivalente al de las vesculas del tilacoide de los cloroplastos. Las vesculas del tilacoide podran haber evolucionado de este modo.

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Figura 12-21 Un pptido seal para la importacin de protenas a la mitocondria. La citocromo oxidasa es un gran complejo multiproteico
localizado en la membrana mitocondrial interna, donde acta como la enzima terminal de la cadena de transporte electrnico (se explica en el Captulo 14). (A) Los 12 primeros aminocidos del precursor de la subunidad IV de esta enzima son suficientes como pptido seal para dirigir el transporte de esta subunidad a la mitocondria. (B) Cuando el pptido seal se pliega en forma de hlice a de 3,6 residuos por vuelta, y se observa desde arriba de la hlice, se observa que los residuos de aminocidos cargados positivamente (en rojo ) se agrupan en una cara de la hlice mientras que los residuos de aminocidos no polares (en verde ) se hallan agrupados en la cara opuesta. Todas las secuencias de los pptidos seal mitocondriales pueden potencialm ente formar una hlice antiptica como sta. Se cree que una hlice de este tipo es reconocida por protenas receptoras especficas de la superficie mitocondrial.

18
Leu

no. Cuando las protenas han sido importadas, el pptido seal es rpidamente eliminado por una proteasa especfica (una peptidasa de seal) de la matriz mi tocondrial y probablem ente degradado hasta aminocidos en la matriz. El ppti do seal puede ser extraordinariamente sencillo. Experimentos de gentica m o lecular en los que se utiliza un pptido seal de longitud progresivamente menor, han demostrado que para sealizar la importacin mitocondrial slo son necesarios 12 aminocidos en su extremo amino terminal. La unin experi mental de estos 12 residuos a cualquier protena citoplasmtica hace que la pro tena resultante sea dirigida a la matriz mitocondrial. Estudios de la fsica de pptidos seal completos sugieren que estos pptidos seal pueden formar es tructuras anfipticas de hlice a, en las que todos los restos cargados positiva mente se localizan en un lado de la hlice y todos los restos hidrofbicos se dis tribuyen en el lado opuesto (Figura 12-21). Se cree que esta configuracin es reconocida por protenas receptoras especficas de la superficie mitocondrial.

La translocacin hacia la matriz mitocondrial depende del gradiente electroqum ico a travs de la m em brana interna y de la hidrlisis de ATP14
Casi todo lo que conocem os acerca de los mecanismos moleculares de la impor tacin proteica a las mitocondrias lo hemos aprendido del anlisis de sistemas de transporte reconstituidos en sistemas libres de clulas. En primer lugar, se purifican mitocondrias por centrifugacin diferencial a partir de un homogeneizado de clulas. A continuacin, estas mitocondrias se incuban con protenas precursoras mitocondriales marcadas radiactivamente. Generalmente las prote nas precursoras purificadas son transportadas hacia el interior de estas mito condrias de forma rpida y eficiente durante una breve incubacin in vitro. Cambiando las condiciones de estos experimentos in vitro, es posible establecer los requerimientos bioqumicos del transporte de. protenas hacia el interior de las mitocondrias. Todas las formas de transporte y de desplazamiento vectorial requieren energa. En muchos sistemas biolgicos la energa est suministrada por la hi drlisis de ATP. No obstante, en el caso de la importacin mitocondrial tambin se requiere un gradiente electroqum ico a travs de la mem brana mitocondrial interna. Este gradiente se m antiene por el bom beo de H+ desde la matriz al es pacio interm em brana durante el transporte electrnico, impulsado por los pro cesos de transporte electrnico en la m em brana interna. La m embrana mito condrial externa al igual que las bacterias gram negativas (vase Figura 11-14), presentan grandes cantidades de una protena formadora de poros llamada porina, por que son librem ente permeables a los iones orgnicos y a los metabolitos (aunque no a la mayora de protenas) de modo que no es necesario mante ner ningn gradiente a su travs. La energa del gradiente electroqumico a

608

Captulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas

travs de la m em brana interna se utiliza com o una batera para impulsar la biosntesis de la mayor parte del ATP de la clula, pero tam bin se utiliza para ayudar a impulsar la importacin de protenas dotadas del pptido seal de importacin mitocondrial, que est cargado positivamente: cuando se aaden ionforos que disipan el potencial de mem brana mitocondrial, se bloquea la im portacin de protenas a la mitocondria. Todava no conocem os de qu for ma el gradiente electroqum ico colabora impulsando la translocacin proteica. La funcin de la hidrlisis del ATP se conoce mucho mejor, como veremos ms adelante.

Las protenas m itocondriales son importadas hacia la matriz m ediante un proceso de dos etapas, a travs de lugares de contacto que unen las m em branas externa e interna 15
Como primer paso en la importacin mitocondrial, las protenas precursoras mitocondriales tienen que unirse a protenas receptoras que se encuentran en la membrana mitocondrial externa y reconocen los pptidos seal mitocondriales. La etapa siguiente es el proceso de translocacin en s mismo. La protena puede alcanzar la matriz mitocondrial cruzando las dos m em branas una por una, o pasando a travs de ambas membranas a la vez. Para dis tinguir entre estas dos posibilidades, un sistema de importacin libre de clulas se enfra hasta temperaturas bajas, atrapando las protenas en algn paso inter medio del proceso de translocacin. Las protenas que se detectan en este paso tienen su extremo amino terminal en el espacio de la matriz (como lo indica el hecho de que su pptido seal ya haya sido eliminados por la proteasa de matriz), pero la mayor parte de la protena todava puede ser atacada desde el exterior de la mitocondria por enzimas proteolticas aadidas externamente (Figura 12-22). Este resultado demuestra que para entrar en la matriz las protenas precursoras pasan a travs de ambas membranas mitocondriales a la vez. Se cree que existen dos protenas transportadoras, una en la membrana externa y la otra en la inter na, y que sus funciones habitualmente se hallan acopladas permitiendo el trans porte a travs de ambas membranas al mismo tiempo. Los electronmicroscopistas han detectado numerosos puntos de contacto en los cuales parece que se unen las membranas mitocondriales externa e interna, lo cual sugiere que los procesos de translocacin se producen en o cerca de estos puntos. Aunque las protenas precursoras son transportadas a travs de ambas membranas a la vez, est claro a partir de los experimentos descritos en la Figura 12-22 que el proceso de importacin tiene lugar en dos etapas distintas y que slo la segunda se bloquea por temperaturas bajas. De ambas, la penetracin inicial, que no se afecta por las bajas temperaturas, es la que requiere el poten cial de membrana: cuando una preparacin enfriada de mitocondrias que con tienen intermediarios parcialmente translocados, se vuelven a calentar, el pro-

Figura 12-22 Las protenas que son transportadas a la matriz mitocondrial atraviesan de forma transitoria tanto la m em brana externa com o la interna de la m itocondria. Cuando se incuban mitocondrias aisladas a 5 C con un precursor de una protena, el precursor slo se transloca parcialmente. En la matriz mitocondrial se elimina el pptido seal amino terminal (en rojo); la mayor parte de la cadena polipeptdica permanece fuera de la mitocondria donde es accesible a enzimas proteolticas. Al volver a calentar la preparacin a 25 C, el proceso de translocacin se completa. Una vez se halla en el interior de la mitocondria, la cadena polipeptdica est protegida de las enzimas proteolticas aadidas desde el exterior a menos que tambin se aada un detergente para romper las membranas mitocondriales, lo que permite la digestin de las protenas importadas.

El transporte de protenas al interior de mitocondrias y de cloroplastos

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INSERCIN EN LA MEMBRANA, IMPULSADA POR EL GRADIENTE ELECTROQUMICO precursor de la protena pptido seal RECONOCIMIENTO protena receptora

m em brana m itocondrial externa m em brana m itocondrial interna CITOSOL

lugar de s. contacto entre las m em branas LA TRANSLOCACION A LA MATRIZ REQUIERE ATP

ROTURA MEDANTE UNA PEPI! DAS A . DE SEAL

MATRIZ

protena m itocondrial madura j pptido seal elim inado

ceso de importacin se com pleta rpidamente (Figura 12-22), incluso aunque el potencial de m em brana a travs de la membrana interna se haya disipado. Sin embargo, esta segunda etapa del proceso de transporte requiere ATP. Por lo tan to la primera etapa, que implica la insercin del pptido seal y de las secuen cias adyacente en el interior de ambas membranas mitocondriales, es impulsada por el gradiente electroqumico, y la segunda fase, en la cual el resto de cadena polipeptdica se desplaza hacia la matriz, requiere tanto hidrlisis de ATP como una temperatura fisiolgica (Figura 12-23).

Figura 12-23 Im portacin de protenas por la mitocondria. El pptido seal amino terminal del precursor proteico es reconocido por receptores que al parecer existen en la membrana externa de la mitocondria. Se cree que la protena es translocada a travs de ambas membranas mitocondriales, a travs de lugares especiales de contacto o muy cerca de ellos. Este transporte est impulsado inicialm ente por el gradiente electroqumico existente a travs de la membrana interna, y despus por la hidrlisis de ATP. En la matriz mitocondrial, el pptido seal es eliminado por una peptidasa de seal, formndose la protena madura. El pptido seal libre es rpidamente degradado.

Las protenas son importadas hacia el interior de la matriz m itocondrial, en un estado desplegado 16
El transporte de las protenas precursoras mitocondriales a travs de los puntos de contacto de las m embranas mitocondriales est guiado por los miembros de la familia de las protenas chaperonas, las cuales se explican en el Captulo 5. Es difcil de imaginar cmo una protena plegada soluble en agua puede pasar a travs de dos (o incluso a travs de una) bicapas lipdicas mientras mantiene su conform acin tridimensional nativa. Se sabe que las protenas citoslicas de tipo chaperona (llamadas chaperoninas ) pertenecientes a la familia de las hsp70, adems de asegurar el correcto plegamiento de protenas citoslicas, tienen una funcin importante en la importacin de protenas tanto hacia el interior de las mitocondrias como hacia el ER, mediante su unin a los precursores en su esta do desplegado durante la translocacin. Como se explica en el Captulo 5, la li beracin de los polipptidos recin sintetizados de la familia de protenas cha peronas hsp70 requiere la hidrlisis de ATP, lo cual supone parcialmente la dependencia del ATP de las ltimas fases de la importacin mitocondrial. Las primeras evidencias sobre la funcin esencial de las protenas chapero nas en la translocacin a travs de las membranas celulares internas se obtuvie ron en estudios genticos de levaduras. Cuando se inactivan los genes que codi fican ciertos m iembros de la familia hsp70 de las protenas chaperonas, los precursores mitocondriales no son importados hacia las mitocondrias y se acu mulan en el citosol. Se cree que los precursores recin sintetizados, a medida que son liberados de los polirribosomas en el citosol, se unen a las protenas hsp70, las cuales evitan la agregacin o el plegamiento espontneo de las prote nas precursoras antes de que se unan a los translocadores proteicos de la m em brana de destino. La energa liberada por la hidrlisis de ATP se utiliza para libe rar a las protenas hsp70 unidas a medida que las protenas translocadas pasan a travs de la membrana. Experimentalmente, la necesidad de hsp70 y de ATP en el citosol puede evitarse si las protenas se m antienen desplegadas artificialmen te, por ejemplo, mediante un paso de desnaturalizacin en una solucin con centrada de urea.

610

Captulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas

hsp70 m em brana m itocondrial externa espacio interm em brana m em brana m itocondrial a interna hsp70 m itocondrial

La unin secuencial de las protenas importadas a las protenas mitocondriales hsp70 y hsp60 impulsa su translocacin y ayuda el plegamiento proteico 17
Las protenas importadas no slo son dirigidas a las mitocondrias por las prote nas chaperonas: una vez han sido liberadas en el interior, son recibidas en la matriz por protenas estrecham ente relacionadas con las hsp70. La hsp70 mito condrial es crucial en procesos de importacin ya que las mitocondrias que con tienen formas mutantes de la protena no son capaces de importar protenas precursoras. Al igual que su pariente citoslico, la hsp70 mitocondrial tiene una alta afinidad para las cadenas polipeptdicas no plegadas, y se une fuertemente a las protenas importadas a medida que emergen de los translocadores. A conti nuacin la hsp70 libera la protena mediante una reaccin dependiente de ATP. Este ciclo de unin y posterior liberacin dependiente de energa puede propor cionar la fuerza impulsora para la importacin proteica despus de que la pro tena se haya insertado inicialmente en el translocador (Figura 12-24): la unin secuencial de muchas hsp70 mitocondriales puede empujar la protena desple gada a travs del canal transmembrana hacia la matriz. Despus de la interaccin inicial con la hsp70 mitocondrial, muchas prote nas importadas son transferidas a otra protena chaperona, la hsp60 mitocondrial. Tal como se explica en el Captulo 5, la hsp60 se pega a las cadenas poli peptdicas no plegadas facilitando su plegamiento mediante una reaccin dependiente de ATP. La mayor parte de nuestro conocimiento actual sobre la funcin de la hsp60 como protena facilitadora del plegamiento deriva de estu dios sobre la importacin de protenas en las mitocondrias.

Figura 12-24 La im portacin de protenas hacia la matriz m itocondrial requiere protenas hsp70 en ambos lados de la doble m em brana m itocondrial. Despus de la insercin inicial del pptido seal y de las porciones adyacentes de la cadena polipeptdica, la cadena desplegada se desliza a travs de un canal que atraviesa ambas membranas. La hsp70 citoslica unida se libera de la protena por medio de una reaccin que depende de la hidrlisis de ATP. De forma concom itante, la h sp70 m ito con d rial se une a regiones de la cadena polipeptdica que se hallan expuestas en la matriz, estirando as la protena hacia el interior de la mitocondria.

El transporte de protenas al espacio interm em brana m itocondrial requiere dos seales 18

Muchas de las funciones de las mitocondrias requieren protenas que estn inte gradas en la membrana mitocondrial interna o bien que actan en el espacio in termembrana. Estas protenas son transportadas desde el citosol mediante los mismos mecanismos que transportan protenas hacia la matriz, pero mediante varios sistemas se evita que finalicen su viaje en la matriz. En muchos casos las protenas precursoras son inicialmente transferidas hacia la matriz, tal como se ilustra en la Figura 12-23. No obstante, estas protenas presentan una secuencia de aminocidos muy hidrofbica, situada muy estratgicamente despus del pptido seal amino terminal que inicia la importacin. Una vez el pptido se al ha sido eliminado por la proteasa de la matriz, la secuencia hidrofbica ac ta como un pptido seal para volver a translocar la protena de nuevo desde la matriz a travs de la membrana interna. Posiblemente el paso final de esta ruta implica un mecanismo similar al utilizado para dirigir protenas codificadas por las mitocondrias a travs de la membrana interna (Figura 12-25A). Ms adelante veremos que un mecanismo parecido se utiliza para translocar protenas hacia o

El transporte de protenas al interior de mitocondrias y de cloroplastos

611

CITOSOL

proteina de la m em brana interna

proteina de la rotura por proteina del espacio m em brana interna proteasa interm em brana

lugar de rotura pptido seal (A)

ir
>& segundo
pptido seal / SINTESIS PROTEICA MITOCONDRI AL

lugar de / rotura / pptido seal (B)

pptido de paro de la transferencia

(C)

n o

T
MATRIZ

a travs de la m em brana del ER y de la membrana plasmtica procariota, donde ha sido estudiado ms intensamente. Una ruta alternativa hacia la membrana interna puede evitar la excursin hacia la matriz. El translocador en la membrana interna se une a la secuencia hidrofbica que sigue al pptido seal amino terminal que inicia la importacin y evita translocaciones posteriores a travs de la membrana interna. Los dos translocadores en las m embranas externa e interna se desacoplan, lo cual provo ca que el resto de la protena sea empujada hacia el espacio intermembrana (Fi gura 12-25B). Diferentes protenas pueden utilizar una u otra de estas dos rutas hacia la mem brana interna o hacia el espacio intermembrana. No est claro cul de ellas es la ms utilizada. Despus de que las protenas destinadas a la membrana interna hayan sido insertadas en la membrana, una proteasa intermembrana las fracciona, liberan do la cadena polipeptdica madura como una protena soluble (Figura 12-25C). Finalmente, muchas de estas protenas se encuentran unidas, como protenas de membranas perifricas, a la superficie externa de la membrana mitocondrial interna, donde forman subunidades de com plejos proteicos que tambin con tienen protenas transmembrana.

Para dirigir el transporte de protenas a la membrana tilacoidal de los cloroplastos se necesita la participacin de dos pptidos seal19
El transporte de protenas hacia el interior de los cloroplastos se parece en mu chos aspectos al transporte hacia el interior de las mitocondrias: ambos trans portes se producen de manera post-transcripcional, ambos requieren energa, y ambos utilizan pptidos seal hidrofbicos amino terminales que se eliminan despus de haber sido utilizados. Si embargo, existe al menos una diferencia im portante: las mitocondrias utilizan el gradiente electroqumico a travs de su membrana interna para ayudar a impulsar el transporte, mientras que los cloro plastos, que tienen un gradiente electroqumico a travs de sus tilacoides pero no de su mem brana interna, parece que slo utilizan la hidrlisis de ATP como aporte energtico para la importacin a travs de su envoltura externa de doble membrana. A pesar de que los pptidos seal para el transporte al interior de los cloro plastos son sem ejantes a los descritos anteriormente para el transporte a m ito condrias, en las clulas vegetales se hallan presentes tanto mitocondrias como cloroplastos, y las protenas han de escoger de manera adecuada entre ellos. En plantas, por ejemplo, si una enzima bacteriana se une experimentalmente a una secuencia amino terminal de una protena mitocondrial, es dirigida especfica mente a las mitocondrias mientras que si se une experimentalmente a una se cuencia amino terminal de una protena de cloroplasto, penetra en los cloro plastos. Por lo tanto, probablemente los receptores de importacin de cada orgnulo pueden reconocer las diferentes secuencias seal. Los cloroplastos tienen un compartimiento extra rodeado de membrana, el tilacoide. Muchas protenas de los cloroplastos, entre las que se encuentran las subunidades proteicas del sistema fotosinttico y de la ATP sintasa, son trans-

Figura 12-25 La im portacin de protenas desde el citosol al espacio interm em brana o a la m em brana interna de la m itocondria. (A) Se cree algunas protenas, para desplazarse desde el citosol a la membrana interna, siguen una ruta que requiere la participacin de dos pptidos seal y de dos fenm enos de translocacin. En primer lugar, la protena es transportada al espacio de la matriz, como muestra la Figura 12-23. Sin embargo, la eliminacin del pptido seal (en rojo ) utilizado para este transporte inicial desenmascara un pptido seal hidrofbico (en n a ra n ja ) adyacente situado en el nuevo extremo amino. Esta seal hace que la protena se inserte en la membrana interna mediante el mismo sistema por el que se insertan en esta membrana las protenas codificadas por el genoma mitocondrial. (B) Segn un mecanismo alternativo, la secuencia hidrofbica que sigue a la seal que dirige hacia la matriz se une a un translocador y detiene la translocacin a travs de la membrana interna. Entonces el resto de la protena es empujada hacia el espacio intermembrana y la secuencia hidrofbica se libera en el interior de la membrana interna. Este mecanism o se denomina la ruta de paro de transferencia y se explica en detalle ms adelante. (C) Algunas protenas solubles del espacio intermembrana pueden utilizar tambin las rutas mostradas en (A) y en (B) antes de ser liberadas al espacio intermembrana por una segunda peptidasa de seal (con su lugar activo en el espacio intermembrana), la cual elimina el pptido seal hidrofbico.

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Captulo 12 : Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas

pptido seal de cloroplasto pptido seal de tilacoide ELIMINACIN DEL PPTIDO SEAL DE CLOROPLASTO TRANSLOCACIN AL ESTROMA DEPENDIENTE DE ATP m em brana interna TRANgLOCACIN AL ESPACIO TILACDAL m em brana del tilacoide

CITOSOL

Figura 12-26 La translocacin al espacio tilacoidal de los cloroplastos.

La cadena polipeptdica precursora contiene un pptido seal amino terminal de cloroplasto {en rojo), seguido inmediatamente por un pptido seal de tilacoide (en n aran ja). El pptido seal de cloroplasto inicia la translocacin al estroma a travs de un lugar de contacto entre membranas, mediante un m ecanism o similar al utilizado para la translocacin a la matriz mitocondrial. Entonces, este pptido seal es eliminado, desenmascarando el pptido seal de tilacoide, el cual inicia la translocacin a travs de la m em brana del tilacoide.

ESTROMA

pptido seal de tilacoide, accesible

receptor cuya existencia se propone mem brana externa

proteina madura en el espacio del tilacoide

portadas desde el citosol hasta la membrana tilacoidal. Como en el caso de algu nos precursores mitocondriales, estas protenas son transportadas a su destino final a travs de un proceso en dos pasos. Primero pasan a travs de la envoltura de doble membrana hacia el espacio de la matriz del cloroplasto (llamado el estrom a) y luego son translocadas hacia la membrana tilacoidal (o a travs de esta membrana hacia el espacio tilacoidal). Los precursores de estas protenas tie nen, a continuacin del pptido seal amino terminal del cloroplasto, un ppti do seal hidrofbico del tilacoide. Despus de que el pptido seal amino term i nal haya sido utilizado para importar a la protena al estroma, es eliminado por una proteasa seal del estroma (anloga a la proteasa seal de la matriz mitocondrial). Esta hidrlisis desenmascara el pptido seal del tilacoide, el cual en tonces inicia el transporte a travs de la membrana tilacoidal (Figura 12-26). Igual que en el caso de las mitocondrias, el segundo paso es la va utilizada para insertar las protenas codificadas por el cloroplasto en la membrana tilacoidal; probablemente el translocador proteico que se utiliza es originario del antecesor bacteriano de los cloroplastos.

Resumen
A pesar de que las mitocondrias y los cloroplastos tienen sus propios sistemas ge nticos, slo producen una pequea proporcin de sus propias protenas. De he cho, ambos orgnulos importan desde el citosol la mayora de sus protenas, utili zando en ambos casos mecanismos similares. Los procesos de transporte han sido muy estudiados en mitocondrias, especialmente en levaduras. Una protena es translocada al espacio de la matriz mitocondrial mediante el paso a travs de lu gares de adhesin entre las membranas externa e interna, llamados lugares de contacto. La translocacin en las mitocondrias est impulsada por la hidrlisis de ATP y por el gradiente electroqumico a travs de la membrana interna, mientras que la translocacin en los cloroplastos slo est impulsada por la hidrlisis del ATP. La protena transportada atraviesa las membranas de las mitocondrias y de los cloroplastos en estado desplegado. Las protenas chaperonas de la familia de las hsp70 citoslicas mantienen las protenas precursoras en un estado desplegado competente con la translocacin. La hsp70 mitocondrial se une a la cadena polipetdica que est llegando a la matriz y parece que la impulsa hacia el interior. Una vez que la protena se halla en la matriz, otra protena de estrs, la hsp60, ayuda al plegamiento de la protena. Slo las protenas que contienen un pptido seal es pecfico son translocadas hacia el interior de las mitocondrias y los cloroplastos. El pptido seal se halla generalmente en el extremo amino terminal y es elimina do despus de la importacin. El transporte a la membrana interna puede tener lugar como un segundo paso si en la protena importada se halla presente un ppEl transporte de protenas al interior de mitocondrias y de cloroplastos 61 3

tido seal hidrofbico; este segundo pptido seal es desenmascarado cuando se eli mina el primer pptido seal. De igual forma, en el caso de los cloroplastos la im portacin desde el estroma hasta el tilacoide requiere un segundo pptido seal.

Peroxisomas20
Los peroxisom as se diferencian de las mitocondrias y de los cloroplastos en mu chos aspectos, entre los que cabe destacar que estos orgnulos estn rodeados por una nica membrana, y no presentan ni DNA ni ribosomas. A pesar de estas diferencias, se cree que los peroxisomas estn formados por un proceso similar de importacin especfica de protenas (y de lpidos) del citosol. No obstante, dado que los peroxisomas no poseen genoma, todas sus protenas han de proce der del citosol. Por ello, los peroxisomas se parecen al ER en que son orgnulos autorreplicantes, delimitados por una mem brana unitaria y que existen sin ge nom a propio. Dado que no volveremos a tratar de los peroxisomas en otro lugar de este li bro, vamos ahora a detenernos a considerar las funciones de esta familia diversa de orgnulos, antes de hablar de su biosntesis. Los peroxisomas se encuentran en todas las clulas eucariotas. Presentan enzimas oxidativas, como la catalasa y la urato oxidasa, a tan altas concentraciones que en algunas clulas los peroxiso mas se reconocen en electronmicrografas por la presencia de un nucleoide cris talino, principalmente compuesto de urato oxidasa (Figura 12-27). Como en el caso de las mitocondrias, los peroxisomas son los principales lu gares de utilizacin de oxgeno. Una hiptesis es que los peroxisomas son un vestigio de un orgnulo antiguo, que en los antecesores primitivos de las clulas eucariotas realizaba todo el metabolismo del oxgeno. Cuando el oxgeno produ cido por las bacterias fotosintticas empez a acumularse en la atmsfera podra haber resultado altamente txico para la mayora de las clulas. Los peroxisomas pudieron haber contribuido a disminuir la concentracin de oxgeno en estas clulas, a la vez que permitan utilizar su reactividad qumica para realizar reac ciones oxidativas tiles. De acuerdo con este punto de vista, el desarrollo poste rior de las mitocondrias hizo que los peroxisomas se volvieran altamente obsole tos, dado que muchas de las reacciones que ellos realizaban sin producir energa fueron acopladas a la formacin de ATP por medio de la fosforilacin oxidativa. Por lo tanto, las reacciones oxidativas que realizan actualmente los peroxisomas podran ser las que siguen siendo tiles a pesar de la presencia de las m itocon drias.

Los peroxisomas utilizan el oxgeno molecular y el perxido de hidrgeno para realizar reacciones oxidativas 21
Los peroxisomas se denominan as porque generalmente contienen una o ms enzimas que utilizan oxgeno molecular para eliminar tomos de hidrgeno a partir de substratos orgnicos especficos (aqu designados como R) a travs de una reaccin oxidativa que produce perxido de hidrgeno (H20 2): RH2 + 0 2 R + H20 2 La catalasa utiliza el H20 2 generado por otras enzimas del orgnulo para oxidar diversas substancias -com o fenoles, cido frmico, formaldehdo, y alco h o l- mediante una reaccin de peroxidacin: H20 2 + RH2 R+ 2H20 . Este tipo de reaccin oxidativa es particularmente importante en el hgado y en las clulas de rin, cuyos peroxisomas destoxifican una gran variedad de m olcu las txicas que entran en la circulacin. Casi la mitad del etanol que bebemos es oxidado a acetaldehdo de esta manera. Adems, cuando se acumula un exceso de H20 2 en la clula, la catalasa transforma H20 2 a H20 (2H20 2 >2H20 + 0 2). Una de las funciones principales de las reacciones oxidativas realizadas en los peroxisomas es la hidrlisis de las molculas de cidos grasos. En un proceso

200 nm
Figura 12-27 Electronm icrograffa de tres peroxisom as de una clula de hgado de rata. Las inclusiones paracristalinas electrodensas corresponden a la enzima urato oxidasa. (Por cortesa de Daniel S. Friend.)

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Captulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas

Figura 1 2 -2 8 Electronm icrografas de dos tipos de peroxisomas encontrados en clulas vegetales. (A) P eroxisom a de las hojas, con un n cleo p aracristalino, de una clula del m esfilo de un a h o ja de tab aco . Se cree que la estrech a asociaci n del peroxisom a con el cloroplasto facilita el in tercam bio de m ateriales entre estos orgnulos d urante la fo torrespiracin. (B) Peroxisom as de una clu la de un cotiled on alm acen ad o ra de lpidos, de un a sem illa de tom ate, 4 das despus de germ inar. En este caso, los peroxisom as [glioxisomas) estn asociad os con los cu erp os lipdicos en los que se alm acen an los lpidos, lo cual refleja el papel cen tral de estos glioxisom as en la m ovilizacin de los lpidos y en su utilizacin para glu coneogn esis d urante la germ inacin de la sem illa. (A por cortesa de P.J. G ruber y E.H. N ew com b; B, por cortesa de S.E. F red erick y E.H. N ew com b.)

llamado p oxidacin, las cadenas alquilo de los cidos grasos son acortadas secuencialm ente en bloques de dos tomos de carbono que son convertidos en acetil CoA y exportados desde los peroxisomas al citosol para su reutilizacin en reacciones biosintticas. La (3 oxidacin en clulas de mamfero tiene lugar tanto en mitocondrias como en peroxisomas, sin embargo en levaduras y clulas vege tales esta importante reaccin se encuentra exclusivamente en los peroxisomas. Los peroxisomas son orgnulos extraordinariamente diversos: en distintas clulas de un mismo organismo pueden contener incluso muy distintos tipos de enzimas. Tam bin pueden adaptarse de manera remarcable a condiciones cam biantes. Por ejemplo, las clulas de levadura que crecen con azcar tienen peroxisomas pequeos, pero cuando crecen en metanol desarrollan grandes peroxisomas capaces de degradar cidos grasos hasta acetil CoA por jn ed io de la (3 oxidacin. En las plantas, los peroxisomas tienen funciones importantes. Se han estu diado intensam ente dos tipos muy diferentes. Un tipo de peroxisomas est pre sente en las hojas, donde cataliza la oxidacin de un producto colateral de la re accin crucial que transforma el C 0 2 en carbohidratos (Figura 12-28A). Este proceso se denomina fotorrespiracin porque utiliza 0 2 y libera C 0 2. El otro tipo de peroxisomas se halla presente en las semillas en germinacin, donde desem-

Peroxisomas

615

pean una funcin esencial transformando los cidos grasos almacenados en los lpidos de las semillas en azcares necesarios para el crecimiento de la planta joven. Dado que esta conversin de grasas en azcares se realiza a travs de una serie de reacciones conocidas como el ciclo del glioxilato, estos peroxisomas son tam bin denominados glioxisomas (Figura 12-28B). En el ciclo del glioxilato, dos molculas de acetil CoA producidas por la degradacin de un cido graso en el peroxisoma, son utilizadas para fabricar cido succnico, el cual sale del peroxisoma y es transformado en glucosa. El ciclo del glioxilato no tiene lugar en la c lulas animales, y por ello los animales son incapaces de transformar los cidos grasos en carbohidratos.

Una corta secuencia seal dirige la im portacin de protenas hacia los peroxisomas 22
Una secuencia especfica de tres aminocidos localizada cerca del extremo carboxilo de muchas protenas peroxisomales acta como seal de importacin (vase Tabla 12-3). Si esta secuencia se une experimentalmente a una protena citoslica, la protena es importada a los peroxisomas. La importancia de este proceso de importacin y de los peroxisomas se pone dramticamente de mani fiesto en la enfermedad hereditaria hum ana llamada el sndrome Zellweger, en el que un defecto en las protenas de importacin a los peroxisomas conduce a una deficiencia peroxisomal grave. Estos individuos, cuyas clulas presentan peroxisomas vacos, tienen severas anomalas en el cerebro, hgado, y riones, y mueren pronto despus del nacim iento. Se ha demostrado que una forma de esta enfermedad es debida a una mutacin en el gen que codifica una protena integral de la m em brana de los peroxisomas, llamada factor-1 de ensam blaje de peroxisomas. Probablem ente los peroxisomas tienen al menos una protena expuesta en su cara citoslica, que acta como receptor que reconoce la seal de las prote nas que se importan al orgnulo. Anteriormente se pens que la cubierta m em branosa del peroxisoma se formaba por gemacin desde el ER, mientras que el contenido era importado desde el citosol. No obstante, actualmente existen evidencias que sugieren que los peroxisomas siempre se forman a partir de otros peroxisomas preexistentes mediante el crecimiento y la fisin del org nulo, tal como se ha descrito previamente para las mitocondrias y plastos y para el propio ER (Figura 12-29).

Resumen
Los peroxisomas estn especializados en la realizacin de reacciones oxidativas que utilizan oxgeno molecular. Generan perxido de hidrgeno, que es utilizado con fi nes oxidativos, y destruyen el exceso de perxido de hidrgeno por medio de la catalasa que contienen. Como en el caso de las mitocondrias y de los cloroplastos, los peroxisomas son orgnulos autorreplicantes. Dado que no presentan ni DNA ni ribosomas, tienen que importar todas sus protenas desde el citosol. Una secuencia especfica de tres aminocidos situada cerca del extremo carboxilo de muchas de estas protenas acta como una seal de importacin peroxisomal.
Figura 12-29 Modelo del proceso a travs del cual se ensamblan los peroxisom as. La m em b ran a de los peroxisom as co n tien e protenas
recep to ras de im p ortacin . Todas las protenas peroxisom ales, incluyendo las nuevas cop ias del propio recep to r de im portacin , estn sintetizadas por los rib osom as cito slicos y despus son transportad as hasta el orgnulo. As pues, los peroxisom as se form an n icam en te a partir de otros peroxisom as ya form ados, m ed ian te un p ro ceso de crecim ien to y fisin. P ro bablem en te los lpidos n ecesarios para form ar las nuevas m em b ranas peroxisom ales tam bin son im portad os. M s ad elante explicarem os cm o los lpidos fabricad os en el E R p ued en ser transportad os a travs del citosol hasta los orgnulos.
perpxisom a protena receptora especfica que catal la im portacin de protenas

N 9 s

CRECIMIENTO POR CAPTACIN DE PROTENAS CITOSLICAS ESPECFICAS

peroxisom as hijos

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Captulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas

El retculo endoplasmtico23
Todas las clulas eucariotas tienen un retculo endoplasm tico (ER de Endo plasmic Reticulum). Su mem brana constituye normalmente ms de la mitad del total de la m em brana de la clula (vase Tabla 12-2). Est organizado en forma de una red laberntica de tbulos ramificados y de sculos aplanados que se ex tiende por todo el citoplasma (Figura 12-30). Se cree que los tbulos y sculos estn interconectados, de modo que la mem brana del ER forma una lmina continua que define un nico espacio interno. Este espacio, altamente intrinca do, se denomina el lum en del ER o tam bin el espacio de las vesculas del ER, y a menudo ocupa ms del 10% del volumen celular total (vase Tabla 12-1). La membrana del ER separa el lumen del ER del citosol, y media la transferencia se lectiva de determinados compuestos entre estos dos compartimientos. El ER juega un papel central en la biosntesis celular. Su membrana es el lu gar de produccin de todas las protenas transmembrana y lpidos de la mayora de los orgnulos celulares, incluyendo el propio ER, el complejo de Golgi, los lisosomas, los endosomas, las vesculas secretoras y la membrana plasmtica. La membrana del ER tambin contribuye de forma importante a la formacin de las membranas de las mitocondrias y de los peroxisomas, ya que produce los l pidos de estos orgnulos. Adems, todas las protenas que sern secretadas al exterior celular -y tam bin las que acabarn en el lumen del RE, en el complejo de Golgi o en los lisosom as- son inicialmente transportadas al lumen del ER.

Los ribosomas adheridos a las membranas definen el ER rugoso 24

El ER extrae determinadas protenas desde el citosol a medida que son sintetiza das. Estas protenas son de dos tipos: (1) protenas transmembrana, que slo son parcialmente translocadas a travs de la membrana del ER y que, por tanto, se mantienen incluidas en ella, y (2) protenas solubles en agua, que son completa mente translocadas a travs de la membrana del ER y liberadas al lumen. Algunas de las protenas transmembrana se mantienen en el ER, pero muchas otras estn destinadas a residir en la membrana plasmtica o en la membrana de otro orgnulo, mientras que las protenas solubles en agua estn destinadas al lumen de un orgnulo o a ser segregadas. Todas estas protenas, independientemente de su destino posterior, son dirigidas a la membrana del ER por el mismo tipo de pptido seal y translocadas a travs de la membrana mediante el mismo mecanismo. En las clulas de mamfero la importacin de protenas al ER empieza antes de que la cadena polipeptdica se haya acabado de sintetizar -e s decir, tiene lugar a nivel cotraduccional. Este hecho diferencia este proceso del de la importacin a las mitocondrias, a los cloroplastos, al ncleo, y a los peroxisomas, en los cuales la importacin es post-traduccional y requiere diferentes tipos de pptidos se al. Dado que habitualmente un extremo de la protena est translocado en el in terior del ER mientras el resto de la cadena polipeptdica se est fabricando, la
F ig u ra 1 2 -3 0 El retculo endoplasmtico. M icrografa flu o rescen te de u n a clu la cultivada de m am fero, teid a co n un anticu erpo que se un e a u n a p ro ten a reten id a en el ER. El ER se extiend e com o un a red por todo el cito p lasm a de la clula, de form a que todas las regiones del citosol se hallan cercan as a alguna p o rcin de la m em b ran a del ER. (Por co rtesa de Hugh Pelham .)

10 pm
El retculo endoplasmtico 617

Figu ra 12-31 E l E R ru goso. E lectronm icrografa que m u estra el ER rugoso, el cual recib e su n om bre de los ribosom as que se hallan en la superficie citoslica. (Cortesa de L. Orci.)

I ____________ I
0,2 pm

protena nunca es liberada al citosol y por consiguiente no existe el peligro de que se pliegue antes de alcanzar el translocador de la membrana. Contrariamen te al caso de importacin post-traduccional de protenas hacia el interior de las mitocondrias y de los cloroplastos, en el caso de la importacin de protenas al ER las chaperoninas citoslicas no son necesarias para m antener a la protena desplegada. El ribosoma que est sintetizando la protena est unido directa mente a la m em brana del ER. Estos ribosomas unidos a membrana recubren la superficie de la m em brana del ER, dando lugar a las regiones llamadas retculo endoplasm tico rugoso (Figura 12-31). Por lo tanto, en el citosol existen dos poblaciones de ribosomas, separadas espacialmente. Los ribosom as unidos a m em brana, unidos a la cara citoslica de la mem brana del ER, se dedican a la sntesis de protenas que simultnea mente se translocan al interior del ER. Los ribosom as libres, no unidos a ningu na membrana, fabrican todas las dems protenas codificadas por el genoma nu clear. Los ribosomas unidos a mem brana y los ribosomas libres son estructural y funcionalmente idnticos. Difieren slo en las protenas que estn fabricando en un momento dado. Cuando un ribosoma empieza a fabricar una protena con un pptido seal para el ER, la propia seal dirige al ribosoma a la membrana del ER. Dado que muchos ribosomas pueden unirse simultneamente a una misma molcula de mRNA, normalmente se forma un polirribosom a, el cual se une a la mem brana de ER a travs de mltiples cadenas polipeptdicas en crecimiento (Figura 12-32). Cada uno de los ribosomas asociados con una molcula de mRNA de este tipo puede volver al citosol en cuanto termina la traduccin, cerca del ex tremo 3 de la molcula de mRNA. No obstante, el mRNA por s mismo tiende a permanecer unido a la membrana del ER debido a la interaccin de una pobla cin cam biante de ribosomas que se mantienen unidos a la membrana mediante un receptor ribosmico que los ayudan a mantenerse all. Por el contrario, si una molcula de mRNA codifica una protena que no tiene el pptido seal para el ER, el polirribosoma que forma permanece libre en el citosol y la protena pro ducto de esta sntesis es liberada en el propio citosol. Por lo tanto, slo se unen a las m embranas rugosas del ER las molculas de mRNA que codifican protenas que tienen un pptido seal para el ER; las molculas de mRNA que codifican to das la dems protenas, permanecen libres en el citosol. Se cree que cada riboso ma individual se mueve al azar entre estas dos poblaciones de molculas de mRNA segregadas (Figura 12-33).

i__________i
00 mVi

El ER liso es abundante en algunas clulas especializadas 25

Las regiones del ER que carecen de ribosomas unidos se denominan retculo en doplasm tico liso, o ER liso. En una gran mayora de clulas estas regiones son escasas, y slo existe una pequea regin del ER que es parcialmente lisa y par-

F ig u ra 1 2 -3 2 P o lirrib o so m a s. E lectronm icrografa de una secci n ultrafina de polirribosom as unidos a la m em b ran a del ER. En algunos lugares el plano de la secci n corta a travs del ER en paralelo a la m em b ran a, dando un a visin del patrn en roseta de los p olirribosom as. (Por cortesa de G eorge Palade.)

618

Captulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas

los mRNA que codifican una protena citoslica permanecen libres en el citosol >

polirribosom a libre en el citosol

acervo com n de subumdades de ribosom a, en el citosol pptido seal de ER

los m R N A que codifican protenas que sern dirigidas hacia el % ER perm anecen unidos a Ia m em brana polirribosom a unido a la m em brana del ER, a travs de m ltiples cadenas nacientes

m em brana del ER

F igu ra 1 2 -3 3 R ib o so m a s lib re s y u n id os a m e m b ra n a . T an to para sin tetizar las p ro tenas que p erm an ecern en el cito sol com o para sin tetizar las que sern transportad as al ER, se utiliza el m ism a acervo de ribosom as. Lo que dirige al ribo so m a corresp on d ien te a la m em b ran a del ER es la p resen cia del p ptido se al para ER en la cad en a polip ep td ica que se e st sintetizand o. La m o lcu la de mRNA pu ed e p erm an ecer unid a al ER, form ando parte de un p olirribosom a, m ientras que los ribo so m as q u e se van d esplazando sob re ella son reciclados; al final de cad a ciclo de sntesis de protem a, las subun id ad es del ribosom a se liberan volvindose a incorporar al acervo co m n del citosol.

cialmente rugosa. Esta regin se denomina elem entos transicionales porque de ella emergen las vesculas que transportan protenas y lpidos recin sintetizados hacia el complejo de Golgi. No obstante, en determinadas clulas especializadas el ER liso es abundante y tiene otras funciones. Concretamente, es particular mente predominante en clulas especializadas en el metabolismo lipdico. Por ejemplo, las clulas que sintetizan hormonas esteroideas a partir del colesterol tienen un ER liso muy amplio que contiene las enzimas necesarias para fabricar colesterol y para modificarlo dando lugar a las hormonas (vase Figura 12-34). El principal tipo celular del hgado, el hepatocito, nos proporciona otro ejemplo. Es el principal lugar de produccin de partculas lipoproteicas para la exportacin; estas partculas transportan los lpidos por la corriente sangunea a otros lugares del organismo. Las enzimas que sintetizan los componentes lipid eos de las lipoprotenas estn localizadas en la membrana del ER liso, la cual tam bin contiene enzimas que catalizan una serie de reacciones que destoxifican las drogas liposolubles y compuestos producidos por el metabolismo que resultan perjudiciales. Las reacciones de destoxificacin ms estudiadas estn ca talizadas por la familia de enzimas de la familia de la citocromo P450, las cuales catalizan una serie de reacciones sobre drogas solubles en lpidos o sobre metabolitos que de otro modo podran acumularse a niveles txicos en las m embra nas celulares, y las convierten en molculas suficientemente hidrosolubles como para abandonar la clula y ser secretadas por la orina. Puesto que el ER rugoso no puede albergar por s mismo un nmero suficientemente elevado de stas y de otras enzimas necesarias para estos procesos, una proporcin importante de la membrana del hepatocito consiste normalmente en ER liso (Figura 12-35 y va se Tabla 12-2).
F ig u ra 1 2 -3 4 A b u n d an te E R liso e n u n a c lu la se c re to ra d e h o rm o n a s e ste ro id ea s. E sta electronm icrog rafa es de una clu la de Leydig secreto ra de testo stero n a de los testcu los hu m anos.

El retculo endoplasmtico

619

Figura 12-35 Reconstruccin tridimensional del ER rugoso y liso de una clula heptica. El ER rugoso
form a ord enad os m o n ton es de cistern as planas, cada u n a de las cuales tien e un esp acio lum inal de en te 20 y 30 nm de ancho. La m em b ran a del ER liso est con e ctad a a estas cisternas y form a un a fina red de tbu los de en tre 30 y 60 n m de d im etro. (De R.V. K rstic, U ltrastru ctu re o f the M am m alian Cell. New York: Springer-Verlag, 1979.)

Cuando la circulacin recibe grandes cantidades de ciertos compuestos, ta les com o la droga fenobarbital, el hgado sintetiza en cantidades extraordinaria m ente elevadas las enzimas de destoxificacin, y en unos cuantos das el ER liso duplica su rea superficial. Tras la eliminacin de la droga, el exceso de m em branas del ER liso parece eliminarse especficam ente a travs de un proceso de pendiente de lisosomas llamado autofagocitosis (explicado en el Captulo 13). Se desconoce cm o se regulan estos espectaculares cambios. Otra funcin del ER en la mayora de clulas eucariotas es la de secuestrar Ca2+ del citosol. La liberacin de Ca2+ en el citosol a partir del ER, y su posterior recaptura, median muchas respuestas rpidas a las seales extracelulares, como se explica en el Captulo 15. El almacenamiento de Ca2+ en el lumen del ER esta facilitado por las altas concentraciones de protenas de unin a Ca2+ presentes en el ER. En algunos tipos celulares, quizs en la mayora de ellos, existen regio nes especficas del ER especializadas en el almacenamiento de Ca2+ . Por ejem plo, las clulas musculares tienen una abundante regin especializada del ER + del citosol por m e liso, llamada retculo sarcoplasmtico, la cual secuestra Ca2 dio de una ATPasa de Ca2 +que bom bea Ca2+ ; la liberacin de Ca2 + y la posterior recaptacin del Ca2+ por el retculo sarcoplasmtico median la contraccin rpi da y la relajacin de la miofibrillas durante cada ciclo de contraccin muscular (explicado en el Captulo 16). A continuacin explicaremos las dos funciones ms importantes del ER: la sntesis y modificacin de protenas, y la sntesis de lpidos.

Las regiones lisas del ER pueden separarse de las rugosas mediante centrifugacin 26
Para estudiar las funciones y las caractersticas bioqumicas del retculo endoplasmtico, es necesario aislar su membrana. A primera vista, esto puede pare cer una tarea imposible ya que el ER est extraordinariamente entremezclado con otros com ponentes del citoplasma. Afortunadamente, cuando se rompen por homogeneizacin los tejidos o clulas, el ER se fragmenta en numerosas ve sculas pequeas y cerradas (-100 nm de dimetro), denominadas m icrosom as, que resultan relativamente fciles de purificar. Los microsomas derivados del ER rugoso estn tapizados de ribosomas, y reciben el nombre de microsomas rugo sos. Los ribosomas se encuentran siempre en la superficie exterior de dichos m i crosomas, siendo su interior bioqum icam ente equivalente al espacio luminal del ER (Figura 12-36). Dado que pueden ser purificados en su forma funcional, los microsomas rugosos son especialmente tiles para el estudio de muchos procesos que realiza el ER rugoso. Para el bioqumico representan autnticas pe queas versiones del ER rugoso, todava capaces de sintetizar protenas, glucosilar protenas y sintetizar lpidos.

620

Captulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas

!A

200 nm

(0)

200 nm

En estos homogenados tambin se encuentran muchas vesculas de tamao similar al de los microsomas rugosos, pero sin ribosomas unidos a ellas. Estos microsomas lisos derivan en parte de porciones lisas del ER y en parte de frag mentos vesiculados de la membrana plasmtica, del complejo de Golgi, de los endosomas y de las mitocondrias (la proporcin depende del tipo de tejido de que se trate). Por consiguiente, mientras que los microsomas rugosos pueden ser equiparados a porciones rugosas del ER, los orgenes de los microsomas lisos no resultan fciles de determinar. Una excepcin importante la constituye el h gado. Debido a las enormes cantidades de ER liso existentes en el hepatocito, la mayor parte de los microsomas lisos de los homogenados hepticos derivan del ER liso. Como los ribosomas contienen grandes cantidades de RNA, los microsomas rugosos son ms densos que los microsomas lisos. Por consiguiente, los microsomas rugosos pueden separarse de los dems mediante una centrifugacin en equilibrio (Figura 12-37). Cuando se comparan propiedades tales como la activi dad enzimtica o la composicin polipeptdica de los microsomas rugosos con las de los lisos obtenidos de un tejido como el hgado, se observa que son nota blem ente similares, aunque no idnticas: aparentemente la mayora de los com ponentes de la membrana del ER pueden difundir libremente entre las regiones rugosa y lisa de la membrana, tal como cabra esperar de un sistema de flujo continuo de membrana. No obstante, los microsomas rugosos presentan ms de 20 protenas que no estn presentes en los microsomas lisos, demostrando que debe de existir algn mecanismo restrictivo para un conjunto de protenas de la

F igu ra 1 2 -3 6 E le c tro n m ic ro g ra fa s d e rib o so m a s. C uando se rom pen clu las por h o m og en eizaci n , las cistern as del ER rugoso (A) se fragm entan form ando p equ e as vesculas cerrad as, d en o m inad as microsomas rugosos (B). D e form a sim ilar, el ER liso se fragm enta form ando p equ e as vesculas que c arecen de ribosom as, y qu e se d en o m in an microsomas lisos. (A, cortesa de D aniel S. Friend; B, cortesa de George Palade.)

ER rugoso

O0 O

o o ;:oO O -

centri fugacin o o

A00
Y o 0

los m icrosomas lisos tienen m enor densidad, o por lo que dejan de sedim entar y flotan a o ? concentraciones menores de sacarosa

Figu ra 1 2 -3 7 P ro ce d im ie n to d e a isla m ie n to u tilizad o p a ra p u rific a r m ic ro so m a s ru g o so s y liso s a p a rtir d el ER. C uando los dos tipos de m icrosom as se sed im en tan hasta el equilibrio a travs de un gradiente de sacarosa, se sep ararn uno de otro en b ase a sus d iferentes densidades.

m icrosom as lisos y m icrosom as rugosos

O OO

oo

o o o

los m icrosomas rugosos tienen una elevada densidad, por lo que dejan de sedim entar y flotan a concentraciones de sacarosa elevadas

tubo con un gradiente de concentraciones crecientes de sacarosa

El retculo endoplasmtico

621

subum dades r ib o s m ic a s lib r e s

p r o te n a r e c e p to r a a s o c ia d a a u n p o r o

mRNA

CITOSOL

pptido seal en la cadena polipeptdica en crecimiento

COOH

ELIMINACIN DEL PPTIDO SEAL

LUMEN DEL ER cadena 1 polipeptdica madura

membrana del ER. Algunas de las protenas de este conjunto ayudan a mantener unidos los ribosomas al ER rugoso, mientras que otras posiblemente producen la forma aplanada de esta parte del ER (vase Figura 12-35). No est claro si estas protenas de m em brana son retenidas formando grandes agregados bidimensionales en la bicapa lipdica o por el contrario son mantenidas en su lugar median te interacciones con una red de protenas estructurales en una u otra cara de la m em brana del ER.

Figura 12-38 La hiptesis seal original. Visin simplificada de la translocacin de una protena a travs de la membrana del ER, tal com o se propuso originalmente. Cuando el pptido seal emerge del ribosoma, dirige al ribosoma hacia un receptor proteico de la m embrana del ER. Se postula que a medida que va siendo sintetizado, el polipptido se va translocando a travs de la membrana del ER rugoso, atravesando un poro proteico asociado con el receptor. El pptido seal es eliminado durante el proceso de traduccin y la protena madura es liberada al lumen del ER inmediatamente despus de ser sintetizada. En la actualidad sabemos que en trminos generales la hiptesis es correcta, pero adems de los com ponentes que se muestran en esta figura, son necesarios otros. Por ejemplo, la peptidasa de seal es un com plejo formado por cinco diferentes cadenas polipeptdicas unidas a la membrana, con un com plejo aparentemente asociado con cada poro de translocacin.

Los pptidos seal fueron descubiertos por primera vez en protenas importadas al ER2 7
Los pptidos seal (y con ellos la estrategia basada en la utilizacin de un pptido seal para dirigir el transporte de protenas) fueron descubiertos por primera vez, a principios de los aos 70, en protenas de secrecin que son translocadas a travs de la m em brana del ER com o primer paso hacia su final descarga de la clula. En el experimento clave el mRNA codificante de una protena de secre cin fue traducido mediante ribosomas in vitro. Cuando de este sistema libre de clulas se omitan los microsomas, la protena sintetizada era ligeramente m a yor que la protena normal secretada; esta longitud extra era debida a la presen cia de un pptido lder amino terminal. No obstante, en presencia de microso mas derivados del retculo endoplasmtico rugoso se produca una protena de tamao correcto. Estos resultados fueron explicados mediante la hiptesis de la seal, la cual postulaba que la secuencia lder acta de pptido seal dirigiendo la protena de secrecin hacia la membrana del ER; una vez en ella y antes de que la cadena polipeptdica est completa, el pptido es hidrolizado por una peptidasa de seal de la m em brana del ER (Figura 12-38). De acuerdo con la hiptesis de la seal, la protena secretada ha de ser em pujada al lumen del microsoma durante su sntesis in vitro. Esto puede ser de mostrado mediante un tratamiento con proteasas: una protena recin sintetiza da fabricada en ausencia de microsomas es degradada al aadir una proteasa, mientras que la misma protena pero fabricada en presencia de microsomas permanece intacta, a consecuencia de la proteccin que le proporciona la m em brana microsomal. Cuando en un sistema in vitro similar a ste se traducen pro tenas que carecen de pptido seal, estas protenas no son importadas a los mi crosom as y por lo tanto permanecen susceptibles al tratamiento con proteasas. La hiptesis de la seal ha sido comprobada cuidadosamente mediante ex perimentos genticos y bioqumicos, y puede aplicarse tanto a clulas vegetales

622

Captulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas

como animales, a translocaciones proteicas a travs de membranas plasmticas de procariotas y, como hemos visto, a las membranas de mitocondrias, cloroplastos y peroxisomas. Adems, los pptidos lder amino terminales guan no slo las protenas de secrecin sino tambin los precursores de todas las prote nas fabricadas en el ER, incluyendo las protenas solubles y las protenas de membrana. La funcin de sealizacin de estos pptidos lder ha sido demostra da directamente mediante la utilizacin de tcnicas de DNA recombinante, uniendo secuencias seal a protenas que normalmente no las presentan; las protenas de fusin resultantes son dirigidas al ER. Los sistemas libres de clulas en los que se produce transporte de protenas han proporcionado poderosos procedimientos de ensayo para identificar, puri ficar y estudiar los diversos com ponentes de la maquinaria molecular responsa ble del proceso de importacin de protenas al ER.

Una partcula de reconocimiento de seal (SRP) dirige los pptidos seal para el ER a un receptor especfico de la membrana del ER2 8
El pptido seal es dirigido a la membrana del ER por lo menos mediante dos componentes: una partcula de reconocimiento de la seal (SRP, de Signal-Recognition Particle), que se une al pptido seal y viaja de forma cclica entre la membrana del ER y el citosol, y un receptor de SRP, tambin conocido como pro tena desembarcadero (docking), presente en la membrana del ER. La SRP fue descubierta al observarse que lavando microsomas con solucin salina se elimi naba su capacidad de importar protenas de secrecin. Esta capacidad de impor tacin puede restablecerse aadiendo a la preparacin de microsomas el sobre nadante que contiene el extracto salino. A partir de este extracto se purific el factor de translocacin y se determin que era una partcula compleja formada por seis cadenas polipeptdicas unidas a una pequea molcula de RNA (Figura 12-39). La SRP y el receptor de SRP estn presentes en todas las clulas eucariotas y tambin posiblemente en las clulas procariotas. A medida que el pptido va emergiendo del ribosoma, la SRP se va uniendo al pptido seal. Esto provoca una pausa en la sntesis proteica, lo que posible mente da al ribosoma tiempo suficiente para unirse a la membrana del ER antes de que se complete la sntesis de la cadena polipeptdica, asegurando as que la protena no se liberar al citosol. Esto puede proporcionar un mecanismo de se guridad ya que muchas protenas de secrecin y protenas lisosomales son hidrolasas que pueden provocar estragos en el citosol. Las clulas que secretan grandes cantidades de hidrolasas toman la precaucin aadida de disponer de altas concentraciones de inhibidores de hidrolasas en su citosol. Una vez formado, el complejo ribosoma-SRP se une al receptor de SRP, el cual es una protena integral de membrana expuesta en la superficie citoslica de la mem brana del ER rugoso. Entonces la SRP es liberada, y un aparato de translocacin todava poco caracterizado transfiere la cadena polipeptdica na ciente a travs de la mem brana (Figura 12-40). Dado que una de las protenas SRP y ambas cadenas del receptor de SRP contienen dominios de unin a GTP, se cree que los cambios conformacionales que tienen lugar durante los ciclos de unin de GTP e hidrlisis (explicado en el Captulo 5) aseguran que la liberacin de la SRP tenga lugar slo despus de que el ribosoma se haya acoplado correc tam ente con el aparato de translocacin en la membrana del ER.

SRP RNA

dominio de reconocimiento del pptido seal

dominio de paro de la traduccin lugar de unin SRP-receptor 25 nm

La translocacin a travs de la membrana del ER no siempre requiere que se est produciendo el crecimiento de la cadena polipeptdica2 9
Como hemos visto, la translocacin de protenas al interior de las mitocondrias, de los cloroplastos y de los peroxisomas es post-traduccional, es decir que se produce despus de que la protena haya sido sintetizada completamente y se haya liberado al citosol, mientras que normalmente la translocacin a travs de

Figura 12-39 Dibujo muy esquem tico de la partcula de reconocim iento de la seal (SRP). Una SRP es un com plejo alargado que contiene seis subunidades proteicas y una molcula de RNA (SRP RNA). Un extremo de la SRP se une a un pptido seal de la cadena polipeptdica en crecim iento, mientras que el otro extremo se une al ribosoma y frena la traduccin. El RNA de la partcula puede interactuar con el RNA ribosmica. (Adaptado de V. Siegel y P. Walter, N atu re 320:82-84, 1986.)

El retculo endoplasmtico

623

partcula de reconocimiento de la seal (SRP)

SRP DESPLAZADA Y RECICLADA

mRNA tRNA

LA UNION DE LA SRP CAUSA UNA PAUSA EN LA TRADUCCIN

LA SRP UNIDA AL IBOSOMA SE UNE AL RECEPTOR DE SRP DE LA MEMBRANA DEL ER SELECTIVAMENTE!

/ CONTINA LA i TRADUCCIN Y \ EMPIEZA LA TRANSLOCACIN CITOSOL

pptido seal en la cadena polipeptdica naciente LUMEN DELER receptor ribosmico protena receptora de la SRP en la membrana del ER rugoso translocador proteico

Figura 12 -40 De qu form a los pptidos seal y la SRP dirigen los ribosomas a la m em brana del ER. Se cree que la SRP y el receptor de SRP actan de forma concertada. La SRP se une al pptido seal que se halla expuesto y al ribosoma, induciendo una pausa en la traduccin. El receptor de SRP de la membrana del ER, que est formado por dos cadenas polipeptdicas, une el com plejo SRP-ribosoma. A travs de una com pleja reaccin todava muy poco conocida que implica mltiples protenas de unin a GTP, la SRP es liberada dejando al ribosoma sobre la m embrana del ER. Entonces un aparato de translocacin de la membrana del ER formado por varias subunidades proteicas inserta la cadena polipeptdica en la m em brana y la transfiere a travs de la bicapa lipdica.

la m em brana del ER sucede durante la traduccin (es decir, es cotraduccional). Esto explica por qu los ribosomas se unen a la membrana del ER pero no a la cara citoplasm tica de otros orgnulos. Un ribosoma unido al ER rugoso puede utilizar la energa de la sntesis proteica para forzar a la cadena polipeptdica en crecim iento a travs del canal formado por el translocador en la membrana del ER. No obstante, estudios recientes de translocacin in vitro en el ER han de mostrado que una pequea minora de determinados precursores proteicos pueden ser importados al interior del ER despus de que se haya terminado su sntesis, demostrando as que la translocacin no siempre requiere de la traduc cin continua. La translocacin proteica post-traduccional puede tener lugar in cluso de modo ms frecuente a travs de la membrana del ER en clulas de leva duras y a travs de la m em brana plasmtica bacteriana (la cual se cree est evolutivamente relacionada con el ER; vase Figura 12-5). En ambos casos la translocacin requiere hidrlisis de ATP, y en bacterias tambin es necesario un gradiente electroqumico. A partir de com ponentes bacterianos se ha reconsti tuido un aparato de translocacin; uno de estos componentes es una ATPasa que se cree que ayuda a ensartar la protena en la membrana (Figura 12-41). Dado que las protenas que utilizan una ruta de translocacin post-traduccional son liberadas primero en el citosol, su plegamiento se evita mediante su unin a protenas chaperonas citoslicas, tal como hemos visto que sucede en la impor tacin post-traduccional hacia el interior de mitocondrias y cloroplastos.

La cadena polipeptdica pasa a travs de un poro acuoso en el aparato de translocacin3 0

Durante mucho tiempo se ha discutido si las cadenas polipeptdicas son transfe ridas a travs de la mem brana del ER, en contacto directo con la bicapa lipdica o a travs de un poro de un translocador proteico. En la actualidad existen fuer tes evidencias de la existencia de un translocador proteico. Normalmente, el

624

Captulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas

COOH

COOH COOH

LUMEN
c o m p le jo d e tr a n s lo c a c i n im p u ls a d o p o r e n e rg a

Figura 12-41 Translocacin de una protena a travs de la m em brana plasm tica bacteriana. En este modelo esquemtico, despus de que un receptor del aparato de translocacin se haya unido al pptido seal amino terminal de una protena, un translocador proteico impulsado por energa empuja la protena a travs de la membrana, desplegando la cadena polipeptdica durante el proceso. La energa es proporcionada por la hidrlisis de ATP y por un gradiente electroqumico a travs de la membrana.

poro del translocador est tapado con la cadena polipeptdica que est en trn sito a travs de la membrana. Sin embargo, cuando experimentalmente las cade nas nacientes se liberan de los ribosomas mediante la droga puromicina, los po ros pueden ser detectados mediante corrientes inicas que fluyen a travs suyo. A pesar de que los poros son lo suficientemente grandes para permitir el paso de una cadena polipeptdica desplegada, se cierran cuando el ribosoma es elimina do de la mem brana (Figura 12-42). Por lo tanto el poro parece ser una estructura dinmica, abrindose cuando un ribosoma con una cadena polipeptdica na ciente se une a la mem brana y cerrndose cuando el ribosoma se libera despus de que la sntesis de la protena haya finalizado.

El pptido seal del ER es eliminado de la mayora de protenas solubles despus de la translocacin3 1

Hemos visto que en los cloroplastos y en las mitocondrias los pptidos seal son eliminados de las protenas precursoras despus de cruzar la membrana. De modo parecido, los pptidos amino terminales seal para el ER son eliminados mediante una peptidasa seal situada en la cara luminal de la membrana del ER. Sin embargo, el pptido por s mismo no es suficiente para que se produzca la hidrlisis de la seal por la peptidasa: se requiere un punto de hidrlisis adya cente que es reconocido por la peptidasa. Ms adelante veremos que los ppti dos seal del ER no se encuentran en el extremo amino terminal sino en el inte rior de la cadena polipeptdica, no presentan estos puntos de reconocimiento y nunca son eliminados. Por el contrario, sirven para retener protenas transm em brana en la bicapa lipdica despus de que se ha terminado el proceso de trans locacin. El pptido amino terminal seal para el ER de una protena soluble tiene por s mismo dos funciones de sealizacin: adems de dirigir la protena a la membrana del ER, se cree que acta como seal de inicio de transferencia, per maneciendo unido al aparato de translocacin, mientras que el resto de la pro-

CONTROL LOS IONES NO PUEDE PASAR A TRAVS DEL TRANSLOCADOR PROTEICO

EXPERIMENTAL LOS IONES PASAN LIBREMENTE A TRAVS DEL TRANSLOCADOR PROTEICO CITOSOL
la p u r o m ic in a lib e r a la c a d e n a p o lip e p td ic a d e l r ib o s o m a

LUMEN
t r a n s lo c a d o r p r o te ic o

Figura 12-42 Dem ostracin de la existencia de poros acuosos de translocacin proteica en la m em brana del ER. El diseo experimental es similar al mostrado en la Figura 10-5, con una bicapa lipdica que separa dos com partimientos acuosos. Cuando se aaden microsomas rugosos a uno de los compartimientos, ocasionalm ente se fusionan con la bicapa lipdica incorporando una porcin de la m em brana del ER (con ribosomas) a la bicapa. Cuando se aade la droga puromicina (en a z u l oscu ro ) a este mismo compartimiento, se une covalentemente al extremo carboxilo terminal de la cadena polipeptdica y la libera del ribosoma; en estas condiciones se pueden detectar poros de tamao uniforme debido a increm entos puntuales en la conductancia elctrica a travs de la membrana (el flujo inico responsable del incremento en la conductancia elctrica se indica con la fle c h a a m a rilla). Si los ribosomas se eliminan de la membrana mediante lavados con soluciones de concentracin elevada de una sal, los poros no se detectan, lo cual indica que la unin de los ribosomas son necesarios para abrir (o ensamblar) el poro (no se muestra).

El retculo endoplasmtico

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CITOSOL

LUMEN
tr a n s lo c a d o r p r o t e ic o in a c tiv o t r a n s lo c a d o r p r o t e ic o a c t iv o

COOH

COOH LA PEPTIDASA DE SEAL LIBERA LA PROTENA MADURA AL INTERIOR DEL LUMEN DEL ER

tena va atravesando la membrana y formando un gran bucle en el lumen del ER. Una vez que el extremo carboxilo ha pasado a travs de la membrana, el pptido seal es liberado del poro de translocacin, hidrolizado por la peptidasa de seal, y rpidamente degradado hasta aminocidos mediante otras proteasas del ER, mientras que la protena es liberada al interior del lumen del ER (Figura 12-43).

Figura 12-43 Translocacin de una protena soluble a travs de la m em brana del ER. En este modelo hipottico se postula que el translocador proteico de la membrana puede estar en dos estados alternativos -activo e inactivo. Cuando se une un pptido seal para el ER (que acta como iniciador de la transferencia) el translocador adopta un estado activo y comienza a transferir la cadena polipeptdica a travs de la m embrana lipdica, como un bucle. Es este estado forma un poro acuoso a travs de la m em brana que puede ser detectado electrofisiolgicamente si la cadena polipeptdica es liberada (vase Figura 12-42). Cuando la protena ha sido translocada com pletamente, el translocador revierte a una conform acin inactiva que ya no puede conducir iones a travs de la membrana, pero que est abierto a la bicapa lipdica, permitiendo que el pptido seal hidrofbico difunda hacia el exterior de la bicapa, donde es rpidamente degradado. Para mayor claridad, en sta y en las dos figuras siguientes los ribosomas se han omitido del dibujo.

En las protenas transmembrana de un solo paso, un pptido seal interno permanece en la bicapa lipdica como una hlice a que atraviesa la membrana3 2
El proceso de translocacin de las protenas destinadas a permanecer en la membrana es ms com plejo que el de las protenas solubles, ya que algunas zo nas de la cadena polipeptdica son translocadas a travs de la bicapa lipdica mientras que otras no lo son. Sin embargo, todos los tipos de insercin de las protenas de mem brana pueden ser consideradas como variantes de la secuen cia de fenm enos que acabam os de describir para la transferencia de protenas solubles en la luz del ER. Empezaremos describiendo las tres vas a travs de las cuales las protenas transm em brana de paso nico (vase Figura 10-13) son in sertadas en el ER. En el caso ms simple, un pptido seal amino terminal inicia la transloca cin igual que para el caso de una protena soluble, pero un segmento adicional hidrofbico de la cadena polipeptdica frena el proceso de transferencia antes de que toda la cadena polipeptdica se haya translocado. Este pptido de paro de transferencia ancla la protena en la membrana despus de que el pptido seal del ER (iniciador de transferencia) sea liberado del translocador y eliminado (Figu ra 12-44). El pptido de paro de transferencia forma un solo segmento a helicoidal que atraviesa la membrana, con el extremo amino terminal de la protena en la cara luminal de la membrana y el extremo carboxilo en la cara citoslica. En los otros dos casos el pptido seal no se hallar en el extremo amino terminal de la protena sino que es interno. Al igual que los pptidos seal am i no terminales, el pptido seal interno es reconocido por la SRP, la cual sirve de puente entre el ribosoma que fabrica la protena y la membrana del ER y acta como seal de inicio de transferencia que empieza la translocacin de la prote na. Despus de liberarse del translocador, el pptido interno de inicio de trans-

626

Captulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas

lugar de unin del lugar de unin del pptido hidrofbico pptido hidrofbico de paro de de inicio de i transferencia_______ transferencia protena translocadora

Figura 12-44 Cmo se integra en la m em brana del ER una protena transm em brana de un solo paso con un pptido seal cortado. En este modelo hipottico el proceso de translocacin cotranslocacin se inicia por un pptido seal amino terminal de ER {rojo) que acta com o una seal de inicio de transferencia, com o en la Figura 12-43. Sin embargo, adems del pptido de inicio de transferencia la protena contiene un pptido de paro de transferencia (n aran ja). Cuando el protena madura pptido seal de paro de transferencia en la membrana entra en el translocador e interacta del ER con un lugar de unin determinado, el NH2 translocador pasa a su estado inactivo y descarga la protena lateralmente en la bicapa lipdica.

ferencia permanece en la bicapa lipdica como una hlice a que atraviesa la membrana. Sin embargo los pptidos internos de inicio de transferencia se pue den unir al aparato de translocacin en cualquiera de las dos direcciones, y la orientacin del pptido de inicio de transferencia insertado determina, a su vez, qu segmento proteico (el que precede o el que sigue al pptido de inicio de transferencia) se desplazar a travs de la membrana hacia el lumen del ER. En un caso la protena de membrana resultante tendr su extremo carboxilo en la cara luminal (Figura 12-45A) mientras que en el otro en el lado luminal estar su extremo amino (Figura 12-45B). La orientacin del pptido de inicio de transfe rencia depende de la distribucin de los aminocidos cargados vecinos, tal como se describe en el pie de la figura.

Combinaciones de seales de inicio y de paro de transferencia determinan la topologa de las protenas transmembrana de multipaso3 3
En las protenas transm em brana de multipaso la cadena polipeptdica atravie sa repetidamente, de una parte a otra, la bicapa lipdica (vase Figura 10-13). Se cree que en estas protenas un pptido seal interno acta como seal de inicio de transferencia iniciando la translocacin, la cual contina hasta que se alcan za un pptido de paro de transferencia. En las protenas de doble paso, por ejemplo, el polipptido se libera de la bicapa en este estadio (Figura 12-46). Las protenas multipaso ms complejas, en las cuales existen muchas hlices a hidrofbicas que atraviesan la bicapa, un segundo pptido de inicio de transferen cia reinicia la translocacin de la cadena, la cual se produce hasta que se alcanza el siguiente pptido de final de transferencia, y as sucesivamente para posterio res pptidos de inicio y de paro de transferencia (Figura 12-47). Una secuencia seal hidrofbica determinada actuar como un pptido de inicio o de paro dependiendo de su localizacin en la cadena polipeptdica, ya que se puede cam biar su funcin si se modifica su localizacin en la protena utilizando tcnicas de DNA recombinante. As la distincin entre pptidos de inicio y de paro de transferencia depende, fundamentalmente, del orden en el que se suceden en la cadena polipeptdica naciente. Parece que la SRP empieza buscando los segmentos hidrofbicos de la cadena polipeptdica desplegada empezando por su extremo amino terminal, y va progresando hacia el extremo carboxilo terminal, en la misma direccin en la que se sintetiza la protena. La SRP reconoce el primer segmento apropiado y por lo tanto fija la pauta de lectu ra: si se ha iniciado la translocacin, el prximo segmento hidrofbico adeca -

El retculo endoplasmtico

627

pptido interno de inicio de transferencia CITOSOL

LUMEN

COOH

proteina madura en la membrana del ER

COOH la secuencia seal se inserta en direccin opuesta

CITOSOL

LUMEN

proteina madura la membrana del

do ser reconocido com o un pptido de paro de transferencia, lo cual originar que la regin de la cadena polipeptdica comprendida entre ambos segmentos hidrofbicos resulte ensartada a travs de la membrana. Un proceso similar de bsqueda contina hasta que todas las regiones hidrofbicas de la protena se insertan en la membrana. Puesto que las protenas de mem brana siempre son insertadas a partir de la cara citoslica del ER y siguiendo este sistema programado, todas las copias de la misma cadena polipeptdica tendrn la misma orientacin general en la bicapa. Esto gene'ra una m em brana del ER asimtrica en la que los dominios de pro tena expuestos en una cara son diferentes de los que estn expuestos en la otra. Esta asimetra se mantiene durante los diversos procesos de gemacin y fusin de mem brana que se producen al transportar las protenas fabricadas en el ER a otras membranas celulares (explicado en el Captulo 13). Por lo tanto la va por la cual una protena recin sintetizada es insertada en la membrana del ER de termina la orientacin de la protena tam bin en otras membranas. Cuando en el laboratorio se disocian protenas de una membrana y se re constituyen en vesculas lipdicas artificiales, generalmente se obtiene una mez cla al azar de orientaciones dentro-fuera de las protenas. Por ello, parece que la asimetra de las protenas que se observa en las membranas celulares no es debi da a las propiedades inherentes de la protena sino que es el resultado del proce so por el que las protenas son insertadas en la membrana del ER desde el cito-

Figura 12-45 Cmo una protena transm em brana de un solo paso con un pptido seal interno se integra en la m em brana del ER. En este modelo hipottico un pptido seal ER interno que acta como seal de inicio de transferencia se une al translocador de tal forma que su extremo cargado ms positivamente perm anece en el citosol. Si en la cadena existen ms aminocidos cargados positivamente inmediatamente antes del ncleo hidrofbico del pptido de inicio de transferencia de los que hay despus de l, en el extremo carboxilo terminal, el pptido de inicio de transferencia se inserta en el translocador en la orientacin mostrada en (A) y el brazo carboxilo terminal del bucle insertado se desliza a travs de la membrana. Sin embargo, si existen ms aminocidos cargados positivamente inmediatamente despus del ncleo hidrofbico del pptido de inicio de transferencia de los que hay antes de l, en su extremo amino terminal, el pptido de inicio de transferencia se inserta en el translocador en la orientacin mostrada en (B), y ser el brazo amino terminal del bucle insertado el que se deslizar a travs de la membrana. Debido a que la translocacin no puede iniciarse antes de que salga del ribosoma una secuencia de inicio de translocacin, la translocacin de la porcin amino terminal de la protena mostrada en (B) solamente puede ocurrir despus de que se haya sintetizado com pletam ente esta secuencia. Ntese que existen dos caminos para insertar una protena transm em brana de un solo paso cuyos aminocidos amino terminales se localicen en el lumen del ER: el que se muestra en la Figura 12-44 y el que se muestra aqu.

628

Captulo 12 : Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas

pptido de paro de transferencia pptido de inicio de transferencia

COOH NH2

CITOSOL

Figura 12-46 Cmo se integra en la m em brana del ER una protena de doble paso con una secuencia seal interna. En este modelo hipottico un pptido seal para el ER interno acta como una seal de inicio de transferencia (como en la Figura 1245) e inicia la transferencia del brazo carboxilo terminal de la cadena polipeptdica. Cuando entra en el translocador un pptido seal de paro de transferencia, descarga lateralmente la protena en la m embrana.

LUMEN

proteina madura de doble paso a travs de la membrana

Las cadenas polipeptdicas translocadas se pliegan y se ensamblan en el lumen del ER rugoso3 4

Muchas de las protenas presentes el lumen del ER solamente estn en trnsito, en ruta hacia otros destinos; sin embrago, otras residen normalm ente en el ER y se hallan en elevadas concentraciones. Estas protenas residentes del ER pre sentan en su extremo carboxilo terminal una seal de retencin del ER, de cua tro aminocidos, que es responsable de que la protena quede retenida en el ER (vase Tabla 12-3). Algunas de estas protenas actan como catalizadores que ayudan a otras muchas protenas que son translocadas al ER a plegarse y a en samblarse de forma correcta. Una de estas protenas residentes del ER es la pro tena disulfuro isomerasa (PDI), la cual cataliza la oxidacin de los grupos sulfhidrilo libres (SH) formando enlaces disulfuro (S-S). La mayora de los residuos cistena de los dominios proteicos expuestos al espacio extracelular o al lumen de los orgnulos estn unidos por puentes disulfuro. Sin embargo, los enlaces disulfuro no se forman en los dominios expuestos al citosol debido al ambiente reductor de este ambiente.

COOH CITOSOL

LUMEN

100
(A) nmero de aminocidos

200
(C)

H2N(B)

1M-COOH

inicio

paro

inicio

paro

paro

Figura 12-47 Insercin de la protena multipaso de m em brana rodopsina en la m em brana del ER. La rodopsina es la protena sensible a la luz de los fotorreceptores de las clulas en bastn de la retina de los mamferos. (A) Un grfico de hidrofobicidad identifica siete cortas regiones hidrofbicas en la rodopsina. (B) La regin amino terminal acta como pptido de inicio de transferencia, responsable de que la regin amino terminal anterior atraviese la m em brana del ER. Los pptidos hidrofbicos siguientes actuarn alternativamente de inicio de transferencia y de paro de transferencia. (C) La rodopsina madura, una vez integrada, tiene su extremo amino terminal localizado en el lumen del ER y su extremo amino terminal localizado en el citosol. Los h ex g on os azu les representan oligosacridos unidos covalentemente.

El retculo endoplasmtico

629

Otra proteina residente del ER es una protena chaperona conocida como protena de unin (BiP, de binding protein), que estructuralmente est relacio nada con las protenas hsp70, y como ellas reconoce protenas plegadas incorrec tamente, y tambin subunidades proteicas que no han sido ensambladas en sus complejos oligomricos finales. Se cree que BiP, al igual que otras protenas chaperonas, se une a secuencias de aminocidos expuestos que normalmente estn escondidos en el interior de las cadenas polipeptdicas que estn correctamente plegadas o ensambladas. Cuando BiP se ha unido evita la agregacin de las pro tenas y ayuda a m antener las protenas en el ER (y por tanto fuera del complejo de Golgi y de otras etapas posteriores de la ruta se secrecin); tambin ayuda a que las protenas se plieguen correctamente. Como en el caso de las protenas de la familia hsp70, las cuales unen protenas no plegadas en el citosol y facilitan su importacin hacia las mitocondrias y hacia los cloroplastos, la protena BiP hidroliza ATP para obtener la energa necesaria para plegar las protenas. Como hemos visto anteriormente para la hsp70 mitocondrial (vase Figura 12-24), la unin de BiP a una cadena polipeptdica que est emergiendo en el lu men del ER puede ayudar a estirar la protena hacia el interior del ER. Este proce so puede ser particularmente importante en protenas que entran en el ER tras su traduccin, ya que en este caso no existen ribosomas unidos a la membrana que empujen a la protena naciente a travs del translocador durante su sntesis.

COOH

1i

cadena lateral de asparagina

La mayora de protenas sintetizadas en el ER rugoso son glucosiladas por la adicin de un iV-oligosacrido com n 35
La adicin covalente de azcares a las protenas es una de las principales funcio nes biosintticas del ER. La mayora de las protenas solubles y unidas a la m em brana que son fabricadas en el lumen del ER, incluyendo las destinadas a ser transportadas al com plejo de Golgi, a los lisosomas, a la membrana plasmtica o al espacio extracelular, son glucoprotenas. Por el contrario, muy pocas prote nas del citosol estn glucosiladas, y las que lo estn contienen una modificacin de azcares muy simple: la adicin de un grupo Af-acetilglucosamina a un resi duo serina o treonina de la protena. Un avance importante en la comprensin del proceso de glucosilacin pro teica fue el descubrimiento de que en el ER se transfiere en bloque a las protenas un oligosacrido preformado (compuesto de Af-acetilglucosamina, manosa y glu cosa y conteniendo un total de 14 residuos de azcar). Dado que este oligosacrido siempre es transferido al grupo NH2 de la cadena lateral de un residuo de asparagina, se le denomina N-oligosacrido (N-linked) o unido a asparagina (Figura 12-48). La transferencia est catalizada por una enzima, una transferasa de oligo sacrido que se halla unida a la membrana, y cuyo lugar activo est expuesto a la superficie luminal de la mem brana del ER, lo cual explica por qu las protenas citoslicas no son glucosiladas de esta manera. El oligosacrido precursor se mantiene en la m em brana del ER mediante una molcula lipidica especial lla mada dolicol y es transferido a la asparagina diana a travs de una sola etapa en zimtica inm ediatamente despus de que este aminocido aparezca en el lumen del ER durante la translocacin de la protena (Figura 12-49). Dado que muchas protenas son importadas al ER de forma cotraduccional, casi siempre los 7V-oligosacridos son aadidos durante la sntesis proteica. El oligosacrido precursor unido a lpido se une al dolicol mediante un enla ce fosfato de alta energa, el cual proporciona la energa de activacin necesaria para la reaccin de glucosilacin ilustrada en la Figura 12-49. El oligosacrido se va construyendo antes de ser transferido a la protena, azcar a azcar, unido a esta molcula de lpido que, a su vez, est unido a la membrana. Los azcares son activados primero en el citosol mediante la formacin de intermediarios azcar-nucletido, que ceden su azcar (directa o indirectamente) al lpido, si guiendo una secuencia ordenada. En parte a travs de este proceso, el oligosac rido unido al lpido es translocado desde la cara citoslica a la luminal de la m em brana del ER (Figura 12-50).

N -acetil glucosam ina

Figura 12-48 Estructura del oligosacrido unido a asparagina (unido a N) que es aadido a la m ayora de las protenas en la m em brana del ER rugoso. Los cinco residuos de azcar mostrados en el forman la regin central de este oligosacrido. En el complejo de Golgi se produce una profunda reordenacin y recorte de los azcares y en muchas protenas nicamente sobreviven a este proceso estos cinco residuos. Solamente se glucosilan las asparaginas que se hallan en la secuencia o siendo X cualquier aminocido que no sea la prolina. Estas dos secuencias se presentan en frecuencias mucho menores en glucoprotenas que en protenas citoslicas no glucosiladas; evidentemente ha habido una presin selectiva en contra de estas secuencias durante la evolucin de las protenas, probablemente porque la glucosilacin en demasiados residuos podra interferir con el plegamiento de la protena.

recuadro gris

X-Thr,

Asn-X-Ser Asn-

630

Captulo 12 : Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas

CITOSOL

LUMEN

Figura 12-49 Glucosilacidn de una protena en el ER. Casi inmediatamente despus de que la cadena polipeptdica entre en el lumen, se glucosila sobre los residuos de asparaguina diana. El oligosacrido que se muestra en la Figura 12-48 se transfiere a la asparaguina como una unidad intacta, a travs de una reaccin catalizada por la una enzima unida a membrana. Existe una copia de esta enzima asociada con cada translocador proteico de la membrana del ER.

transferasa,

oligosacaril

oligosacrido unido a lpido

bicapa lipidica de la m em brana del ER LUMEN CITOSOL

I d o U c o P K P X P > (GIcNA c)2 5 |GDP|-M an 5 |g D p ] "SALTO" ("FLIP-FLOP") ( ' doifcol ) - ( p) - ( p )-(G lcNAc)2(M an)5 EN LA MEMBRANA j (M an)5(GlcNAc)2-(F )-(p > dolicol ' J / \ / ...dador de manosa, construido ------Man VPX dolicol a pa rtir de d 0 |iC0| fosfato y 4X --------------- (? )- ( doIicoI ) de GDP-manosa (Man)9(GlcNAc)2-(p )-(p > -( d o lic o P ) 3X Glc -\P~)-( dol icol ) (p ^ dolicol ) dador de glucosa construido a partir de dolicol fosfato y UDP-glucosa
(

(Glc)3(M an)9(GlcNAc)2-( p ) -( p ) _ cjolicol _ I

Figura 12-50 Sntesis del precursor del oligosacrido unido a lpido de la de la m em brana del ER rugoso. El oligosacrido se va construyendo azcar a azcar, sobre el lpido transportador dolicol (un poliisoprenoide, vase Panel 2-4). El dolicol es largo y muy hidrofbico: sus 22 unidades de cinco carbonos pueden atravesar el grosor de la bicapa lipdica ms de tres veces, de forma que el oligosacrido que se une al l queda firmemente anclado a la membrana. El primer grupo de azcar se une al dolicol a travs de un enlace pirofosfato. Este enlace de alta energa activa el oligosacrido para su transferencia desde el lpido hasta una cadena lateral de la asparagina de un polipptido naciente sobre la cara luminal del ER rugoso. La sntesis del oligonucletido comienza en la cara citoslica de la membrana del ER, y contina sobre la cara luminal, despus de que el lpido intermediario (Man)5 (G1cNAc)2 haya sido transferido (por flip-flop) a travs de la membrana. Todas las reacciones posteriores de transferencia de glucosilos que se producen en la cara luminal del ER se producen a partir de dolicol-P-glucosa y de dolicol-Pmanosa; estos monosacridos, unidos a lpidos, que se hallan activados, se sintetizan a partir de dolicol fosfato y de UDP-glucosa o GDP-manosa sobre la cara citoslica del ER, y posteriormente, segn parece, son transportados (por flip-flop) a travs de la membrana del ER. Abreviaturas: GlcNAc = TV-acetilglucosamina; Man = maosa; Glc = glucosa.

El retculo endoplasmtico

631

Toda la diversidad de estructuras de iV-oligosacridos que se presentan en las glucoprotenas maduras se produce por modificacin posterior de la estruc tura de oligosacrido precursora. Todava en el ER, se eliminan de los oligosacridos de muchas glucoprotenas tres residuos de glucosa y uno de maosa (va se Figura 12-48). Estos recortes o procesam iento del oligosacrido continan en el complejo de Golgi, y se explican en el Captulo 13. Los 7V-oligosacridos son, con gran diferencia, los oligosacridos ms com u nes de los que se encuentran en las glucoprotenas. Menos frecuentemente, los oligosacridos estn unidos al grupo hidroxilo de la cadena lateral de un residuo de serina, de treonina o de hidroxilisina. Estos O-oligosacridos se forman en el complejo de Golgi a travs de vas que an no son conocidas completamente (se discute en el Captulo 13).

Algunas protenas de membrana, poco despus de entrar en el ER, intercam bian una cola transm em brana carboxilo term inal por un glucosilfosfatidilinositol (GPI) unido de form a covalente 36
Como hem os explicado en el Captulo 10, algunas enzimas citoslicas catalizan la adicin covalente de un cido graso a determinadas protenas, colaborando en la direccionalidad de estas protenas hacia las membranas celulares. En el ER rugoso se produce un proceso catalizado por enzimas relacionado con ste: el extremo carboxilo de algunas protenas de mem brana destinadas a la m em bra na plasmtica se unen de forma covalente a un residuo de azcar de un glucolpido. Esta unin se forma en el lumen del ER a travs del mecanismo ilustrado en la Figura 12-51, y aade a la protena un anclaje de glucosilfosfatidilinositol (GPI, de glycosylphosphatidilinositol) que contiene dos cidos grasos. En el m is mo proceso se elimina el segmento transm em brana de las protenas. Cada vez es mayor el nmero de protenas conocidas de la membrana plasmtica que son modificadas de esta manera. Dado que estas protenas estn unidas al exterior de la mem brana plasmtica exclusivamente a travs de su anclaje GPI, en princi pio pueden ser liberadas de las clulas en forma soluble en respuesta a seales que activen una fosfolipasa de la m em brana plasmtica. Por ejemplo, los parsi tos tripanosoma utilizan este m ecanismo para liberar su cubierta de protenas unidas a GPI si son atacados por el sistema inmunitario.

La mayora de las bicapas lipdicas de m em brana son ensam bladas en el ER 37

La mem brana del ER produce casi todos los lpidos de membrana necesarios para la elaboracin de nuevas membranas celulares, incluyendo los fosfolpidos y el colesterol. El principal fosfolpido fabricado es la fosfatidilcolina (tambin

CITOSOL

COOH

glucosil fosfatidiIinositol

pptido C-terminal elim inado

LUMEN

Figura 12-51 Unin a un anclaje de glucosilfosfatidilinositol. En cuanto la sntesis de la protena ha finalizado, la protena precursora permanece unida a le membrana del ER a travs de una secuencia hidrofbica carboxilo terminal de entre 15 y 20 residuos de aminocido, de forma que el resto de la protena queda en el lumen del ER. En menos de un minuto, una enzima del ER corta la protena, liberndola de su extremo carboxilo terminal, que la una a la membrana, y simultneamente une el nuevo extremo carboxilo terminal a un grupo amino de un intermediario glucosil fosfatidilinositol preformado. La seal que especifica esta modificacin se halla contenida en la secuencia hidrofbica carboxilo terminal y en algunos aminocidos adyacentes a ella sobre la cara luminal de la membrana del ER; si esta seal es aadida a otras protenas, stas tambin son modificadas de esta forma. Debido a este anclaje lipdico al que se une de forma covalente, la protena permanece unida a la membrana; todos sus restos de aminocido se hallan expuestos a la cara luminal del ER y, por lo tanto, sobresaldrn hacia el exterior celular si la protena es transportada a la membrana plasmtica.

632

Captulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas

acil transferasa

colina

CITOSOL

C H 2 C H C H 2

C H 7 C H C H 2

C H 2 C H C H 2

bicapa lipidica del ER cido fosfatdico diacilglicerol fosfatidilcolina

LUMEN

llamado lecitina), que puede formarse en tres etapas a partir de dos cidos gra sos, glicerofosfato y colina. Cada etapa est catalizada por enzimas de la m em brana del ER que tienen sus lugares activos dispuestos hacia el citosol, donde se encuentran los metabolitos necesarios. Por lo tanto las sntesis de fosfolpidos tiene lugar exclusivamente en la mitad citoslica de la bicapa lipdica. El la pri mera etapa, las acil transferasas aaden consecutivamente dos cidos grasos al glicerofosfato produciendo cido fosfatdico, un compuesto que es suficiente mente insoluble en agua com o para permanecer en la bicapa lipdica despus de ser sintetizado. Esta etapa es la que hace crecer la bicapa lipdica. Las otras eta pas posteriores determinan el grupo de cabeza de la molcula lipdica recin sintetizada, y por lo tanto la naturaleza qumica de la bicapa, pero no suponen un crecim iento neto de la mem brana (Figura 12-52). Los otros dos fosfolpidos mayoritarios de membrana -la fosfatidiletanolamina (PE) y la fosfatidilserina (PS)- al igual que el fosfolpido minoritario fosfatidilinositol (PI), son sintetiza dos de esta manera. Como la sntesis de fosfolpidos tiene lugar en la mitad citoslica de la bicapa lipdica, ha de existir un mecanismo que transfiera alguna de las molculas de fosfolpido recin sintetizados hacia la otra mitad de la bicapa. En bicapas lipdicas sintticas, los lpidos no son capaces de saltar (flip, de flip-flop) de esta manera. En el ER, sin embargo, los fosfolpidos se equilibran a travs de la mem brana en cuestin de minutos, lo cual es al menos unas 100 000 veces ms rpido de lo que puede representar el flip-flop espontneo. Se cree que este movimien to rpido transbicapa est mediado por translocadores de fosfolpidos especfi cos de grupos de cabeza. Concretamente, parece que la membrana del ER con tiene un translocador (una flipasa) que transfiere, entre la cara citoplasmtica

Figura 12-52 Sntesis de fosfatidilcolina. Este fosfolpido es sintetizado a partir de acil coenzima A (acil graso CoA), glicerol 3-fosfato y citidn-bisfosfocolina (CDP-colina).

El retculo endoplasmtico

633

y la cara luminal, fosfolpidos que contengan colina -pero no etanolam ina-, serina, o fosfolpidos que contengan inositol. Esto significa que la fosfatidilcolina alcanza la cara luminal mucho ms rpidamente que los otros fosfolpidos. De esta forma el translocador mantiene la bicapa y es responsable de la distribucin asim trica de los lpidos en la bicapa (Figura 12-53). El ER tam bin produce colesterol y ceramida. La ceramida es fabricada por condensacin del aminocido serina con un cido graso hasta forma el amino alcohol esfingosina; luego se aade un segundo cido graso, formndose la ceramida. La ceramida es exportada al complejo de Golgi, donde acta como precur sor de la sntesis de dos tipos de lpidos: se aaden cadenas de oligosacridos formando los glucoesfingolpidos (glucolpidos), y se transfieren los grupos de cabeza de la fosfocolina desde la fosfatidilcolina a otras molculas de ceramida, formando esfingomielina. As, ambos glucolpidos y la esfingomielina son pro ducidos relativamente tarde en el proceso de sntesis de membrana. Dado que son producidos por enzimas expuestas al lumen del complejo de Golgi, se en cuentran exclusivamente en la mitad no citoslica de las bicapas lipdicas que los presentan.

M ili

000000
0101

bicapa lipidica asimtrica del retculo endoplasmtico

LA SINTESIS DE LIPIDOS AADE FOSFOLPIDOS A LA MITAD CITOSLICA DE LA BICAPA

M0MM0M
0 0 0 0 0

CITOSOL

UNA PROTENA ESPECFICA CATALIZA EL "SALTO " ("FLIP") DE DETERMINADAS MOLCULAS DE FOSFOLPIDO DESDE LA MITAD CITOSLICA A LA MITAD LUMINAL

Las protenas de intercam bio de fosfolpidos pueden transportar fosfolpidos desde el ER a las m itocondrias y a los peroxisomas 38
Como se discute en el Captulo 13, la mem brana plasmtica y las membranas del com plejo de Golgi, de los lisosomas y de los endosomas forman parte de un sistema de m embranas que se com unica con el ER por medio de vesculas de transporte que transfieren tanto las protenas como los lpidos. Las m itocon drias, los plastos y los peroxisomas no forman parte de este sistema, por lo que requieren m ecanism os diferentes para la importacin de protenas y de lpidos necesaria para su crecim iento. Ya hemos visto que la mayora de las protenas de mitocondrias y plastos y todas las de los peroxisomas son importadas post-traduccionalm ente desde el citosol. Aunque las mitocondrias modifican algunos de los lpidos que importan, no sintetizan lpidos de novo ; en cambio, tienen que obtener estos lpidos por transferencia desde el ER, donde son sintetizados, o tienen que obtenerlos de forma menos directa desde el ER por medio de otras membranas celulares. En cualquier caso son necesarios mecanismos especiales para que se produzca la transferencia. En experimentos in vitro se ha demostrado que unas protenas de transporte solubles en agua -llam adas protenas de intercam bio de fosfolpidos (o prote nas de transferencia de fosfolpidos)- tienen la capacidad de transferir molculas individuales de fosfolpidos entre membranas. Cada protena de intercambio re conoce slo determinados tipos especficos de fosfolpido. La transferencia entre bicapas lipdicas se produce cuando la protena extrae una molcula de fosfol pido de una membrana y luego difunde por la clula con el lpido enterrado en su lugar de unin. Cuando encuentra otra membrana, la protena de intercambio tiende a descargar la molcula de fosfolpido en la nueva bicapa (Figura 12-54). Se ha propuesto que la fosfatidilserina es importada a la mitocondria de esta ma nera, siendo luego descarboxilada para recuperar la fosfatidiletanolamina, mien tras que la fosfatidilcolina es importada intacta. Las protenas de intercambio actan distribuyendo fosfolpidos al azar entre todas las m embranas de la clula. En principio, de este proceso de intercambio al azar puede resultar un transporte neto de lpidos desde una membrana rica en determinados lpidos a otra pobre en ellos, permitiendo que las molculas de fosfatidilcolina y fosfatidilserina, por ejemplo, sean transferidas desde el ER, donde son sintetizadas, hasta la membrana mitocondrial o hasta la membrana peroxisomal. Puede ser que las mitocondrias y los peroxisomas sean los nicos orgnulos pobres en lpidos del citoplasma y que un intercambio de este tipo sea suficiente, aunque pueden existir otros mecanismos ms especficos que transporten fosfolpidos a estos orgnulos.

LUMEN DELER

00000000

crecimiento de ambas mitades de la bicapa

Figura 12-53 Papel de los translocadores lipdicos en la biosntesis de la bicapa lipdica. Las

nuevas molculas lipdicas se van aadiendo exclusivamente a la mitad citoslica de la bicapa y no pueden saltar" (flip) de forma espontnea de una monocapa lipdica a la otra. Por ello, para que se produzca la transferencia de determinadas molculas a la mitad luminal y as la membrana pueda crecer como una bicapa, se hace necesaria la participacin de protenas translocadoras de fosfolpidos (flipasas). Debido a que la flipasa de la membrana del ER reconoce preferentemente y transfiere grupos de cabeza que contengan colina, se genera una membrana asimtrica con la monocapa luminal (la cual produce la mitad exterior de la bicapa de la membrana plasmtica) altamente enriquecida en fosfatidilcolina.

634

Captulo 12: Compartimientos intracelulares y clasificacin de protenas

Figura 12-54 Protenas intercambiadoras de fosfolpidos. Debido a que los fosfolpidos son insolubles en agua, su transferencia entre membranas requiere la participacin de una protena transportadora. Las protenas de intercambio de fosfolpidos son molculas hidrosolubles que transportan una sola molcula de fosfolpido a la vez; pueden tomar una molcula lipdica de una membrana y liberarla en otra membrana, redistribuyendo as los fosfolpidos entre los compartimientos rodeados de membrana. La transferencia de fosfatidilcolina (PC) desde el ER hacia la mitocondria puede ocurrir, en principio, sin aporte exterior de energa debido a que la concentracin de PC es alta en la membrana del ER (donde se sintetiza) y baja en la membrana mitocondrial externa. Puede predecirse que debe existir una flipasa en la membrana mitocondrial externa que equilibre las concentraciones de lpidos entre las dos mitades de la membranas externa, y un mecanismo de transferencia de lpidos entre la membrana mitocondrial externa y la interna. Sin embargo, estos procesos todava no se han descubierto.

m em brana del ER

citosol

m em brana m itocondrial externa

t \ ~ /
grupo de cabeza de la fosfatidilcolina

protena intercam biadora de fosfolpidos

Resumen
La extensa red del ER acta de fbrica de produccin de casi todos los lpidos celula res. Adems, la mayor parte de la sntesis proteica celular tiene lugar en la superficie citoslica del ER: todas las protenas destinadas a la secrecin y todas las protenas destinadas al propio ER, al complejo de Golgi, a los lisosomas, a los endosamos y a la membrana plasmtica, primero son importadas al interior del ER desde el citosol. En el lumen del ER las protenas se pliegan y oligomerizan, seforman los enlaces di sulfuro y se aaden los N-oligosacridos. Slo son importadas al interior del ER las protenas que presentan un pptido seal hidrofbico. El pptido seal es reconocido por una partcula de reconoci miento de seal (SRP, de Signal Recognition Particle) que se une a la cadena polipeptdica naciente y al ribosoma y dirige todo el conjunto a una protena receptora de la superficie de la membrana del ER. Esta unin a la membrana inicia un proce so de translocacin que arrastra un bucle de la cadena polipeptdica a travs de la membrana del ER a travs de un poro hidroflico de una protena translocadora. Las protenas solubles destinadas al lumen del ER, a ser secretadas o a ser transferidas al lumen de otros orgnulos, primero pasan completamente al interior del lumen del ER. Las protenas transmembrana destinadas al ER o a otras mem branas de la clula, son translocadas a travs de la membrana del ER pero no son liberadas al interior del lumen sino que permanecen ancladas a la bicapa a travs de una o ms regiones de su cadena polipeptdica, a-helicoidales, que atraviesan la membrana. Estas porciones hidrofbicas de la protena pueden actuar durante el proceso de translocacin, bien como pptido de inicio de transferencia o bien como seal de paro de transferencia. Cuando un polipptido contiene varios pptidos de inicio de transferencia y de paro de transferencia, atravesar muchas veces la bicapa. La asimetra de la sntesis de lpidos, insercin proteica y glucosilacin en el ER establece la polaridad de las membranas de todos los dems orgnulos que son abastecidos con lpidos y protenas de membrana por el ER.

El retculo endoplasmtico

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Transporte desde el ER al complejo de Golgi Transporte , , desde , ,. la red del trans Golgi a los lisosomas Transporte desde la membrana i / > i plasmatica va endosomas: endocitoss

Mecanismos moleculares del . . . transporte vesicular y mantenimiento de la diversidad de compartimientos Todas las clulas han de comunicarse con su entorno. En una clula procariota esta comunicacin tiene lugar a travs de su membrana plasmtica: as, por ejemplo, las enzimas digestivas son secretadas hacia el exterior celular y los pe queos metabolitos generados por la digestin son captados por protenas de transporte presentes en la membrana plasmtica. Por el contrario, las clulas eucariotas han adquirido un elaborado sistema membranoso interno que les permite captar las macromolculas por un proceso denominado endocitosis, y ponerlas en contacto con enzimas digestivas que se almacenan intracelularmente en los lisosomas; como consecuencia de ello, a medida que se van produciendo, los m e tabolitos de la digestin van saliendo de los lisosomas directamente hacia el citosol. Adems de proporcionar un sistema de regulacin de la digestin de las macromolculas mediante la va endoctica, el sistema membranoso interno per mite que las clulas eucariotas puedan regular la liberacin al exterior de las pro tenas y glcidos acabados de sintetizar. Todas las molculas que viajan a lo largo de esta va biosinttica y secretora pasan por numerosos compartimientos, por lo que la clula puede modificar esta molcula en varios pasos controlados, almace narla hasta que se necesite, y entonces descargarla en un dominio de la superficie celular determinado mediante un proceso llamado exocitosis. En la Figura 13-1 se muestran las rutas endoctica y la biosinttica-secretora.

CITOSOL NUCLEO MITOCONDRIA

Sz:

PEROXISOMA PLASTIDOS

____________

RETCULO ENDOPLASMATICO

LISOSOMA

---------------

ENDOSOMA

GOLGI VESICULAS SECRETORAS

.Sz:

31

SUPERFICIE CELULAR

CITOSOL

Figura 13-1 Las rutas secretora y endoctica. En este mapa de carreteras sobre el trfico de las protenas biosintetizadas, que fue introducido en el Captulo 12, aparecen coloreadas tanto la ruta secretora como la endoctica.

FUSIN

GEMACIN
Figura 13-2 Transporte vesicular. Las vesculas de transporte emergen por gemacin de un compartimiento y se fusionan con otro.

641

com plejo de Golgi

El lumen de cada uno de los compartimientos que participan en la ruta biosinttica-secretora y en la endoctica es topolgicamente equivalente al exterior de la clula. Adems, todos los compartimientos estn en comunicacin perma nente entre s, por lo menos mediante las numerosas vesculas de transporte que continuamente emergen por gemacin de una membrana y se fusionan con otra (Figura 13-2). El trfico est altamente organizado: la va biosinttica-secretora va hacia afuera desde el ER al complejo de Golgi y a la superficie celular, con una ruta lateral que va a los lisosomas; por otro lado, la va endoctica va hacia aden tro, desde la membrana plasmtica a los endosomas y lisosomas (Figura 13-3). Para poder realizar su funcin, cada vescula de transporte que emerge de un compartimiento ha de tomar slo las protenas apropiadas y nicamente ha de fusionarse con la membrana diana apropiada. As, por ejemplo, una vescula que va del complejo de Golgi a la membrana plasmtica no puede llevarse prote nas que deben residir en el com plejo de Golgi, y slo ha de fusionarse con la mem brana plasmtica y no con otros orgnulos. Asimismo, a pesar de participar en este flujo constante de com ponentes de membrana, cada orgnulo ha de mantener su propia identidad diferencial. En este captulo consideraremos la funcin del com plejo de Golgi, de los lisosomas, de las vesculas de secrecin y de los endosomas, y veremos las vas por las cuales estos orgnulos estn interconectados. En la parte final consideraremos los mecanismos moleculares de la gemacin y fusin que se dan en todo transporte vesicular, y discutiremos el problema fundamental de cmo, a pesar de este transporte, se mantienen las di ferencias en los compartimientos.

Figura 13-3 Los compartimientos intracelulares de una clula eucariota implicados en la ruta biosintticasecretora y en la va endoctica. Cada compartimiento limita un espacio que es topolgicamente equivalente al exterior de la clula. Un lumen cualquiera se comunica con otro cualquiera mediante vesculas de transporte. En la ruta biosintticasecretora (flechas rojas) las protenas son transportadas desde el ER a la membrana plasmtica o (va endosomas tardos) a los lisosomas. En la ruta endoctica (flechas verdes) las molculas son ingeridas mediante vesculas formadas a partir de la membrana plasmtica, conducidas a los endosomas tempranos y, va endosomas tardos, a los lisosomas. Muchas molculas endocitadas son recuperadas de los endosomas tempranos y retornadas a la superficie celular para ser reutilizadas; de forma similar, algunas molculas son recuperadas de los endosomas tardos y devueltas al complejo de Golgi, y algunas son recuperadas del Golgi y devueltas al ER. Todas estas rutas de recuperacin se muestran con las

flechas azules.

CITOSOL NUCLEO MITOCONDRIA PEROXISOMA PLASTIDOS

Transporte desde el ER al complejo de Golgi1

Como ya hemos visto en el Captulo 12, las protenas sintetizadas de novo entran en la ruta biosinttica-secretora cuando atraviesan la membrana del ER desde el citosol. El transporte posterior, desde el ER al complejo de Golgi y desde ste a la superficie celular o a cualquier otro sitio, tiene lugar a travs de vesculas. Estas vesculas transfieren las protenas de una membrana a otra o de un lumen a otro, mediante ciclos de gemacin y fusin (vase Figura 12-7). La va que va desde el ER, pasando por el complejo de Golgi, hasta la superficie celular se lla ma a menudo va por defecto ya que parece que las protenas no necesitan pre-

RETICULO ENDOPLASMATICO GOLGI LISOSOMA ENDOSOMA SUPERFICIE CELULAR VESICULAS SECRETORAS

642

Captulo 13 : Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

sentar determinadas seales para seguirla: cualquier protema que entre en el ER (y se pliegue y se forme correctamente) ser transportada automticamente a travs del complejo de Golgi hacia la superficie celular, a menos que contenga seales que o bien la detengan en algn compartimiento de la ruta o bien la des ven, pasando por el complejo de Golgi, hacia los lisosomas o las vesculas de se crecin. En esta seccin vamos a centrarnos en el com plejo de Golgi, que es un im portante punto de sntesis glucdica y un lugar de clasificacin y distribucin de los productos del ER. Muchos de los polisacridos celulares son sintetizados en el complejo de Golgi, entre ellos la pectina y la hemicelulosa de la pared celular de las plantas y la mayora de los glucosaminoglucanos de la matriz extracelular de las clulas animales (vase Captulo 19). Pero el complejo de Golgi tambin constituye una zona de paso de los productos del ER, de manera que una gran parte de los glcidos que fabrica el Golgi se unen como cadenas de oligosacridos a las protenas y lpidos que el ER le enva. Algunos oligosacridos actan como seales que dirigen determinadas protenas hacia vesculas que las envia rn a los lisosomas; otras protenas y lpidos, una vez adquiridos los oligosacri dos apropiados en el complejo de Golgi, son distribuidas mediante vesculas de transporte a otras partes de la clula.

El com plejo de Golgi est formado por una serie de com partim ientos ordenados 2
El com plejo de Golgi se localiza normalmente cerca del ncleo celular, y en una clula animal a menudo est cerca del centrosoma, o centro celular. Est forma do por una serie de cisternas limitadas por una membrana y de forma aplanada que se parecen a un m ontn de platos. Normalmente estos dictiosom as del Gol gi presentan entre cuatro y seis cisternas (Figura 13-4). El nmero de dictioso mas del Golgi por clula vara enormemente en funcin del tipo celular: algunas clulas animales tienen un gran dictiosoma, mientras que ciertas clulas vegeta les presentan cientos de dictiosomas muy pequeos. Multitud de pequeas vesculas se hallan asociadas a los dictiosomas del Golgi, agrupadas en la cara contigua al ER y a lo largo de los anillos dilatados de cada cisterna (vase Figura 13-4). Se cree que estas vesculas del Golgi son ves culas de transporte de protenas y de lpidos hacia y desde el Golgi y entre las cisternas del Golgi. Durante su paso a travs del complejo de Golgi, las m olcu las transportadas sufren una serie de modificaciones covalentes ordenadas.

Figura 13-4 El complejo de Golgi. (A) Dibujo tridimensional del complejo de Golgi, a partir de micrografas de una clula secretora animal. (B) Electronmicrografa de un complejo de Golgi de una clula vegetal (del alga verde Chlamydomonas), visto en seccin transversal. Se pueden observar dos dictiosomas. Generalmente, en las clulas vegetales el complejo de Golgi es ms diferenciado y est ms claramente separado de los otros sistemas membranosos intracelulares que en las clulas animales. (A, a partir de A. Rambourg e Y. Clermont, Eur. J. CellBiol. 51:189-200, 1990; B, por cortesa de George Palade.)

cara cis

red del cis Golgi cisterna cis cisterna m edial cisterna trans red del trans Golgi

Vescula del Golgi

vescula de secrecin cara trans (B )

i____________ i
20 fim

(A)

Transporte desde el ER al complejo de Golgi

643

Figura 13-5 Clula caliciforme del intestino delgado. Esta clula est especializada en la secrecin de mucus, una mezcla de glucoprotenas y de proteoglucanos sintetizados en el ER y en el complejo de Golgi. El complejo de Golgi est altamente polarizado, lo cual facilita la descarga del mucus mediante exocitosis en la superficie apical de la clula. (De R.V.Krstic, Ilustrated Encyclopedia of Human Histology. New York: Springer-Verlag, 1984.)

secrecin de m ucus a travs de la superficie apical

Los dictiosomas del Golgi tienen dos caras distintas: una cara cis (o cara de entrada) y una cara trans (o cara de salida). Ambas caras estn conectadas a unos compartimientos especiales, formados por una red de estructuras tubula res y cisternas, que son, respectivamente, la red del cis Golgi (tambin llamada compartimiento intermediario o de salvamento) y la red del trans Golgi. Las protenas y lpidos entran por la red del cis Golgi en vesculas de transporte que provienen del ER y salen por la red del trans Golgi en vesculas de transporte con destino a la superficie celular o a otro compartimiento. Se cree que ambas redes son importantes en la clasificacin de las protenas: las protenas que entran en la red cis pueden seguir a travs del Golgi o bien volver al ER; las protenas que salen de la red trans estn clasificadas segn su destino sea los lisosomas, las ve sculas de secrecin o la superficie celular. El complejo de Golgi es prominente en las clulas que estn especializadas en la secrecin, tales como las clulas caliciformes del epitelio intestinal, las cua les secretan al intestino grandes cantidades de moco rico en polisacridos. En clulas de este tipo, se forman grandes vesculas a partir de la cara trans del complejo de Golgi, el cual se encara hacia el dominio de la membrana plasmti ca por el que tiene lugar la secrecin (Figura 13-5).

Las protenas residentes en el ER son selectivamente recuperadas de la red del cis Golgi3
Las vesculas destinadas al complejo de Golgi emergen desde regiones especiali zadas del ER llamadas elementos transicionales, cuya membrana no tiene ribosomas adheridos y se encuentra a menudo entre el ER rugoso y el complejo de Golgi (Figura 13-6). Se cree que estas vesculas no son selectivas. Transportan cualquier protena desde el ER al complejo de Golgi, aunque puede haber seales que favorezcan este proceso. No obstante, existe un requerimiento esencial para que una protena salga del ER: ha de estar correctamente plegada y formada. Las protenas que no tienen la conformacin correcta o que estn incompletas son retenidas, o bien unidas a la protena de unin especial BiP (discutido en el Cap tulo 12) o bien formando agregados que no pueden ser empaquetados, y final!_________ 1 10 v irn

m om brana
nuclear

ER rugoso

elementos transicionales red det

cis Golgi

Figura 13-6 Electronmicrografa de los elementos transicionales y de la red del cis Golgi. De los elementos transicionales del ER emergen vesculas de transporte por gemacin; estos elementos transicionales estn casi completamente libres de ribosomas y se fusionan con la red del cis Golgi, transfiriendo as protenas y lpidos acabados de sintetizar desde el ER hasta el complejo de Golgi. (Por cortesa de Brij J. Gupta.)

I _________________________i 1 iim

644

Captulo 13 : Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

red del cis Golgi

dictiosom a

red del trans Golgi

mente son degradadas en el propio ER. As pues, la salida desde el ER puede ser considerada como un control de calidad: si la protena no se pliega o no se forma correctamente, es descartada. De hecho, el ER parece que es uno de los principa les lugares de la clula donde se degradan protenas (los otros son los lisosomas, como veremos ms adelante, y el citosol, como vimos en el Captulo 5). Las protenas que estn bien plegadas no necesitan ninguna seal especfica para que sean transportadas fuera del ER, pero aquellas que, como la protena BiP, se encuentran en el lumen del ER necesitan una seal para quedarse en l. Esta retencin de las protenas solubles residentes en el ER est mediada por una seal de clasificacin constituida por una corta secuencia, de cuatro am inoci dos: KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) u otra similar (vase Tabla 12-3). Si, por ejemplo, mediante ingeniera gentica se elimina esta seal de retencin en ER de la prote na BiP, se observa cmo esta protena es secretada al exterior de la clula; y si la seal se transfiere a una protena que normalmente es secretada, ahora queda re tenida en el ER. Esta seal de retencin no consiste en un anclaje de las protenas residentes en el lumen del ER sino en una recuperacin selectiva despus de que hayan sido transportadas en vesculas y descargadas en la red del cis Golgi. En la red del cis Golgi, un receptor de membrana especfico une a todas las protenas que presentan la seal de retencin en ER y las empaqueta en vesculas de trans porte especiales que las devuelve al ER. As pues, para estas protenas residentes el ER es como una prisin abierta: no hay nada que impida que salgan, pero si lo hacen, son transportadas de nuevo al interior del ER (Figura 13-7).

Figura 13-7 Mecanismo utilizado para retener las protenas residentes en el ER. Las protenas residentes en el ER que se escapan hacia la red del cis Golgi son devueltas al ER mediante transporte vesicular. Un receptor de membrana en la red cis Golgi captura las protenas y las conduce, en vesculas de transporte, hacia el ER. Las condiciones inicas presentes en el ER separan las protenas de su receptor, de forma que el receptor regresa a la red del cis Golgi para ser reutilizado. Se han encontrado tambin receptores que reconocen la seal de retencin en ER en las cisternas cis, medial y trans del Golgi. De esta manera, la recuperacin de protenas del ER empieza en la red del cis Golgi, pero la ruta de retomo tambin funciona en las cisternas ms trans del Golgi. En el lumen del ER se producen interacciones entre las protenas residentes en el ER, que ayudan a su retencin. Estas interacciones retardan la salida de las protenas del ER en relacin con las protenas que han de ser secretadas (protenas de secrecin). En experimentos en los que se ha eliminado la seal de retencin de ER de la protena BiP, se observa cmo la BiP abandona el ER y es secretada por las clulas; ahora bien, su salida del ER tiene lugar ms lentamente que las protenas de secrecin bona fide, lo cual indica que BiP es parcialmente retenida en el ER mediante interacciones dbiles con otras protenas.

Las protenas del Golgi vuelven al ER cuando las clulas se tratan con la droga brefeldina A4
El continuo retorno de las protenas residentes en el ER desde la red del cis Golgi implica que el transporte entre estos dos orgnulos tiene lugar en ambas direc ciones. Como ya se menciona en el pie de la Figura 13-7, los receptores que reco nocen la seal de retencin en ER se encuentran tambin en los compartimien tos ms trans del Golgi, de manera que quiz existe una ruta de retomo desde ellos al ER. La importancia de esta ruta de retomo se ilustra muy bien usando la droga brefeldina A, la cual bloquea la secrecin de protenas ya que desorganiza el complejo de Golgi. En clulas tratadas con brefeldina A, el complejo de Golgi desaparece y sus protenas se acaban encontrando en el ER, donde se mezclan con las propias del ER. Cuando se elimina la droga, el complejo de Golgi se vuelve a organizar y sus protenas retoman a sus compartimientos (Figura 13-8). Para explicar estas observaciones, se ha propuesto que la brefeldina A blo quea el transporte hacia delante -desde el ER al complejo de Golgi- sin afectar

Transporte desde el ER al complejo de Golgi

645

Figura 13-8 Electronmicrografas que muestran el efecto del tratam iento con brefeldina A sobre el complejo de Golgi. Una tincin histoqumica permite ver la localizacin de una enzima del Golgi (una manosidasa) antes (A) y dos horas despus (B) del tratamiento con brefeldina A sobre fibroblastos en cultivo. Ntese que despus del tratamiento, la enzima pasa de las cisternas cis y m e d ia l del Golgi al ER y a la membrana nuclear, que es continua con el ER. (Por cortesa de Jennifer Lippincott-Schwartz y Lydia Yuan.)

al transporte de retorno -desde el Golgi al ER (Figura 13-9). En este sentido, la droga provocara que las protenas del complejo de Golgi se vaciasen al ER m e diante la ruta de retorno y, cuando la droga desapareciese, la va hacia delante se encargara de devolver las protenas del Golgi a sus compartimientos.

En el com plejo de Golgi se procesan las cadenas de oligosacrido 5

Como se ha descrito en el Captulo 12, en el ER se aade un mismo tipo de Noligosacrido a muchas protenas diferentes, y este oligosacrido se modifica profundamente mientras las protenas todava estn en el ER. En el complejo de Golgi se producen modificaciones posteriores, dependiendo de la protena. El resultado es que en las glucoprotenas de mamfero se encuentran dos grandes tipos de N-oligosacridos, los oligosacridos complejos y los oligosacridos ricos en maosa. Algunas veces ambos tipos de oligosacridos estn unidos (en luga res diferentes) a la misma cadena polipeptdica. Los oligosacridos ricos en m a osa no presentan azcares que hayan sido aadidos en el complejo de Golgi. Slo contienen dos iV-acetilglucosaminas y muchos residuos de maosa, cuyo nmero a menudo se acerca al nmero de residuos que se hallan presentes en el precursor del oligosacrido original unido a lpido, del ER. Por el contrario, los oligosacridos complejos pueden tener ms de las dos molculas de iV-acetilglucosamina originales y tam bin pueden presentar un nmero variable d ga-

Figura 13-9 Ruta de retorno propuesta que va desde el complejo de Golgi al ER. Mientras que la ruta hacia delante precisa de vesculas de transporte y tiene lugar independientemente de los microtbulos, se cree que la ruta de retorno precisa de unos tbulos membranosos que emergen del complejo de Golgi hacia el ER siguiendo los microtbulos (los cuales son fragmentados por drogas como el nocodazol). Como ya hemos dicho anteriormente, la brefeldina A evita la unin de las cubiertas que son necesarias para la gemacin de las vesculas de transporte, de manera que bloquea los pasos del transporte vesicular hacia delante y m antiene intacto el proceso de transporte hacia atrs, dependiente de tbulos de membrana.

646

Captulo 13: Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

NH Asn Ser o Thr (A) CO CLAVE ( ^ y = /V-acetilglucosamina (GIcNAc) = manosa (Man) ( ~ \ = galactosa (Ga (B)

= cido A/-acetilneuramnico (cido silico, o NANA)

lactosas y de residuos de cido silico, y en algunos casos, de fucosa. El cido silico tiene una importancia especial porque es el nico residuo de azcar de las glucoprotenas con una carga negativa neta (Figura 13-10). Los oligosacridos complejos se generan mediante una combinacin de modificaciones posteriores del oligosacrido original, aadido en el ER, y por la adicin de nuevos azcares. El hecho de que un determinado oligosacrido se mantenga rico en maosa o sea procesado viene determinado fundamental mente por su configuracin sobre la protena a la cual se halla unido: si el oligo sacrido es estricamente accesible a las enzimas procesadoras del Golgi, es pro bable que se convierta en una forma compleja; si es inaccesible a ellas, es probable que se mantenga como una forma rica en maosa. El proceso que ge nera cadenas de oligosacridos complejos sigue la va altamente ordenada que se muestra en las Figuras 13-11 y 13-12.

Las cisternas del Golgi estn organizadas en form a de series secuenciales de com partim ientos de procesam iento 6
Las protenas exportadas desde el ER entran al primero de los compartimientos del Golgi (el com partim iento cis), que se cree que es continuo con la red del cis Golgi; luego se desplazan al siguiente compartimiento (el com partim iento m e dial, formado por la cisterna central del dictiosoma), y finalmente se desplazan al com partim iento trans, donde se completa la glucosilacin. Se cree que el lu men del compartimiento trans contina con la red del trans Golgi, donde las protenas se segregan en diferentes vesculas de transporte y se liberan a sus destinos finales -la membrana plasmtica, los lisosomas, o las vesculas de se crecin. Estas rutas de procesamiento de oligosacridos tienen lugar segn una se cuencia ordenada en el dictiosoma, en el que cada cisterna contiene sus propias enzimas. Las protenas se modifican a travs de sucesivas etapas a medida que van de cisterna en cisterna a travs del dictiosoma, de forma que las cisternas constituyen una unidad de procesamiento mltiple. Esta compartimentacin podra parecer innecesaria, ya que cada enzima slo acta sobre su glucoprotena despus de que haya sido convenientemente procesada por la enzima ante rior. Sin embargo, parece claro que el procesamiento tiene lugar tanto en una secuencia espacial como en una secuencia bioqumica: as, las enzimas que ca talizan las primeras etapas se localizan en las cisternas ms cis del dictiosoma, mientras que las que catalizan las ltimas etapas se encuentran en las cisternas ms trans.

Figura 13-10 Ejemplos de las dos clases principales de oligosacridos unidos a asparagina (AT-oligosacridos) encontrados en glucoprotenas maduras. En (B) se muestra un oligosacrido complejo y en (C) un oligosacrido rico en maosa. Todo oligosacrido complejo consta de una regin central (en color en A) que deriva del Af-oligosacrido original aadido en el ER y que consta de forma caracterstica de dos Af-acetilglucosaminas (GlcNAc) y tres maosas (Man). Adems, existe una regin terminal que contiene un nmero variable de unidades de trisacridos (Af-acetilglucosaminagalactosa-cido silico) unidas al ncleo de maosas. Frecuentemente la regin terminal est truncada y contiene slo GlcNAc y galactosa (Gal) o slo GlcNAc. Normalmente se puede aadir un residuo de fucosa al ncleo de GlcNAc unido a la asparagina (Asn). As pues, aunque las etapas de procesamiento y posterior adicin de azcares estn ordenadas estrictamente, los oligosacridos complejos pueden ser heterogneos: por ejemplo, mientras que el oligosacrido complejo que se muestra en la figura tiene tres ramas terminales, tambin es habitual encontrar oligosacridos con dos o con cuatro ramas, en funcin de la glucoprotena de que se trate y de la clula en la que se fabrique. Tambin se encuentran oligosacridos hbridos con una rama de Man y otra de GlcNAc-Gal. Los tres aminocidos que en esta figura se presentan en color constituyen la secuencia reconocida por la enzima oligosacaril transferasa que aade el oligosacrido inicial a la protena. Abreviaturas: Ser = serina; Thr = treonina; X = cualquier aminocido.

Transporte desde el ER al complejo de Golgi

647

glucosidasa I glucosidasa II manosidasa del ER

000

manosidasa del Golgi

/v-acetilgl ucosa mina transferasa I O - UDP UDP

manosjdasa del Goigi

se obtiene el oligosacrido com pleto al aadir dos GlcNAc, tres Gal y tres NANA O el prxim o se aade aqu LUMEN DEL ER LUMEN DEL GOLGI sensibles a Endo-H resistentes a Endo-Hi

CLAVE: O = /V-acetilglucosamina (GlcNAc)

Q = manosa (Man)

0 = glucosa (Glc)

Figura 13-11 Procesam iento de los oligosacridos en el ER y en el complejo de Golgi. El proceso es altamente ordenado, de forma que cada uno de los pasos depende de las reacciones anteriores de cada serie. El procesamiento comienza en el ER con la eliminacin de los residuos de glucosa del oligosacrido inicialmente transferido a la protena. A continuacin, una manosidasa de la membrana del ER elimina un determinado residuo de maosa. En los dictiosomas del Golgi, la manosidasa I elimina tres residuos ms de maosa y la iV-acetilglucosamina transferasa I aade un residuo de GlcNAc, lo cual permite que la manosidasa II elimine dos residuos ms de maosa. As, se obtiene el ncleo final de tres residuos de maosa que se presenta en un oligosacrido complejo. En este estadio, el enlace que existe entre los dos residuos de GlcNAc del ncleo del oligosacrido se vuelve resistente al ataque de una endoglucosidasa altamente especfica [Endo-H). Todas las estructuras posteriores son resistentes a Endo-H, por lo que se utiliza el tratamiento con esta enzima para distinguir los complejos de oligosacridos ricos en maosa. Por ltimo, como se muestra en la Figura 13-10, se aaden residuos de GlcNAc, de galactosa y de cido silico. Algunos oligosacridos pueden escaparse del procesamiento del complejo de Golgi, mientras que otros seguirn el proceso que se muestra, con algunas variantes. La complejidad del proceso depende del tipo de protena y de la localizacin en la protena del residuo de asparagina al que se halla unido el oligosacrido.

UDP-GIcNAc

UDP-Gal

CMP-IMANA

Figura 13-12 Etapas finales en la

sntesis de un oligosacrido complejo. L

OH

OH CMP glucoprotena

"regin central" del oligosacrido UMP

nucleosido difosfatasa UMP CMP

adicin progresiva de residuos de azcar se produce en los compartimientos de las cisternas del complejo de Golgi. Tres tipos de enzimas glucosil transferasa actan de forma secuencial, utilizando como substrato azcares que han sido activados mediante su unin a determinados nucletidos (los que se indican en la figura). Las membranas de las cisternas del Golgi contienen protenas transportadoras transmembrana especficas que permiter a cada azcar-nucletido entrar por intercambio con su producto nucletido monofosfato, que es liberado despus de que el azcar se una a la protena en la cara luminal (no se muestra). En la parte superior de la figura se muestra la estructura de los compuestos azcarnucletido UDP-AT-acetilglucosamina, UDP-galactosa y CMP-AT-cido acetilneuramnico.

648

Captulo 13: Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

Figura 13-13 Contrastado histoqumico que dem uestra que el complejo de Golgi est bioqumicamente polarizado. La serie de electronmicrografas muestra el com plejo de Golgi sin contrastar (A), contrastado con osmio (B), el cual es reducido preferentemente por las cisternas del compartimiento cis, y contrastado revelando la localizacin de una enzima especfica (C y D). La enzima nuclesido difosfatasa (vase Figura 13-12) se halla en las cisternas del trans Golgi (C), mientras que la enzima fosfatasa cida marca la red del trans Golgi (D). (Por cortesa de Daniel S. Friend.)

Se cree que el transporte de protenas entre las diferentes cisternas del Golgi tiene lugar mediante vesculas de transporte, las cuales surgen por gemacin de una cisterna y se fusionan con la siguiente. Se supone que las vesculas que se desplazan entre las cisternas del Golgi no seleccionan la carga, como ya suceda con las que viajan desde el ER al complejo de Golgi. As, cualquier protena solu ble o de membrana que no sea considerada residente puede entrar en las vescu las de transporte y desplazarse a travs de la ruta biosinttica-secretora desde la cisterna cis a la trans pasando por la medial. Casi todo lo que sabemos sobre el mecanismo molecular del transporte vesicular fue descrito originalmente utili zando sistemas in vitro para medir el transporte proteico entre las cisternas del Golgi (vase Panel 13-1, pgs. 682-683). Los electronmicroscopistas han visto pe queos tbulos membranosos que parecen interconectar algunos dictiosomas, y es posible que a travs de estas estructuras tenga lugar algn tipo de transfe rencia de material desde una cisterna a la siguiente. Las diferencias funcionales entre las subdivisiones cis, medial y trans del com plejo de Golgi fueron descubiertas mediante la localizacin, tanto por fracciona miento fsico del orgnulo como por electronmicroscopia marcando con anticuer pos las enzimas implicadas en el procesamiento de los AT-oligosacridos en distintas regiones del orgnulo. Por ejemplo, se encontr que la separacin de los residuos de maosa y la adicin de iV-acetilglucosamina tena lugar en el compar timiento medial, mientras que la adicin de galactosa y de cido silico ocurra en el compartimiento trans y en la red del trans Golgi (Figura 13-13). La compartimentacin funcional del complejo de Golgi est resumida en la Figura 13-14.

Los proteoglucanos son ensamblados en el complejo de Golgi7

No slo son las cadenas de Af-oligosacrido de las protenas las que son alteradas a medida que las protenas pasan a travs de las cisternas del Golgi, en su camino desde el ER a sus destinos finales; muchas protenas tambin son modificadas de otras formas. Por ejemplo, algunas protenas tienen azcares aadidos a los grupos OH de las cadenas laterales de determinadas serinas o treoninas. Como el creci miento de las cadenas de Af-oligosacridos, esta O-glucosilacin est catalizada por series de enzimas glucosiltransferasas que utilizan compuestos azcar-nucletido en el lumen del Golgi para aadir residuos de azcar, uno a uno, a una prote na. Habitualmente primero se aade la Af-acetilgalactosamina, y a continuacin un nmero variable (desde unos pocos a 10 o ms) de residuos de azcar. De todas las protenas glucosiladas, las que lo estn ms son algunas prote nas nucleares de proteoglucanos, las cuales son modificadas en el complejo de Golgi produciendo proteoglucanos. Tal como se explica en el Captulo 19, esto implica la polimerizacin de una o ms cadenas de glucosaminoglucano (largos polmeros no ramificados compuestos por unidades repetidas de disacridos) va una unin a xilosa en las serinas de las protenas nucleares. Muchos proteo glucanos son secretados y pasan a ser componentes de la matriz extracelular, mientras que otros permanecen anclados a la membrana plasmtica. Otros constituyen el com ponente principal de substancias como el moco que es secre tado formando una cubierta protectora sobre muchos epitelios. Los azcares incorporados a los glucosaminoglucanos son altamente sulfata dos inmediatamente despus de que los polmeros se hayan formado en el com plejo de Golgi, lo cual ayuda a dar la elevada carga negativa que presentan los pro-

1 tini

Transporte desde el ER al complejo de Golgi

649

SINTESIS PROTEICA ER

Un r'/%
(
y fosforilacin de oligosacridos lisosom ales
eliminacin de manosa

L J'

'

red del cis Golgi cisterna cis cisterna dictiosom a m edial

eliminacin de manosa

com plejo de Goigi

ii-r
adicin de

.M /-;
G c I

red del trans Golgi

m em brana plasmtica
teoglucanos. Algunos residuos de tirosina tambin son sulfatados en este estadio. En ambos casos la sulfatacin depende de un dador de sulfato (3-fosfoadenosina5-fosfosulfato, o PAPS, de 3 -phosphoadenosine-5-phosphosulfate), que es trans portado desde el citosol al lumen del compartimiento trans del Golgi.

Figura 13-14 Compartimentacin funcional del complejo de Golgi. La localizacin de cada una de las etapas de procesamiento que se muestran en la figura ha sido determinada por medio de la combinacin de tcnicas, entre las que se encuentran el subfraccionamiento de las membranas del complejo de Golgi y la electronmicroscopia tras la tincin con anticuerpos especficos contra algunas de las enzimas especficas de procesamiento. La localizacin de muchas otras reacciones de procesamiento todava no ha sido determinada. A pesar de que slo se ha podido demostrar la existencia de tres compartimientos de cisternas, a veces cada uno de ellos est formado por un grupo de dos o ms cisternas secuenciales, y es posible que haya subdivisiones an por descubrir. Tambin podra ser que hubiese slo tres compartimientos funcionalmente distintos y que las cisternas extra representasen mltiples copias de uno de las tres unidades funcionales. No obstante, no est claro si cada enzima est restringida a una cisterna concreta o si su distribucin vara a lo largo del dictiosoma -de manera que las enzimas que actan primero estn presentes mayoritariamente en las cisternas cis del Golgi, mientras que las que actan ms tarde estn sobretodo en las cisternas trans del Golgi.

Los carbohidratos de las m em branas celulares se encuentran en la cara de la m em brana que es topolgicamente equivalente al exterior de la clula 8
Dado que todos los oligosacridos son incorporados en el lado luminal del ER y del com plejo de Golgi, la distribucin de carbohidratos en las protenas de membrana y en los lpidos es asimtrica. Tal como ocurre con la asimetra de la bicapa lipidica, la orientacin asimtrica de estas molculas glucosiladas se mantiene durante su transporte a la m em brana plasmtica, a las vesculas de secrecin, o a los lisosomas. Por lo tanto, los oligosacridos de todas las glucoprotenas y glucolpidos de las m embranas intracelulares correspondientes se encuentran encarados hacia el lado luminal, mientras que en la membrana plasmtica se encuentran encarados hacia el exterior de la clula (Figura 13-15).

Cul es el propsito de la glucosilacin ? 9

Existe una diferencia importante entre la construccin de un oligosacrido y la sntesis de otras macromolculas como el DNA, el RNA o las protenas. Mientras que los cidos nucleicos y las protenas son copiados de un molde a travs de una serie repetida de pasos idnticos y utilizando la(s) misma(s) enzima(s), los car bohidratos complejos requieren una enzima diferente en cada paso, de forma que cada producto de una reaccin es reconocido como el substrato exclusivo por la siguiente enzima de la serie. Dado lo complicadas que son las vas que han tenido que evolucionar para sintetizar estos oligosacridos, parece probable que

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Captulo 13: Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

ESPA CIO

m em brana plasm tica

Figura 13-15 Los azcares de las glucoprotenas de membrana y de los glucolpidos estn orientados hacia afuera del citosol. La orientacin que tiene una protena transmembrana en la membrana del ER se mantiene cuando esta protena es transportada a otras membranas. Los puntos coloreados del final de cada molcula de glucoprotena representan el 7V-oligosacrido aadido a las protenas en el lumen del ER. Ntese que estos residuos de azcar estn confinados en el lumen de cada uno de los orgnulos internos de la clula, y que despus de que la vescula de transporte se haya fusionado con la membrana plasmtica aparecen expuestos hacia el espacio extracelular. Lo mismo sirve para los residuos de azcar de los glucolpidos y los O-oligosacridos producidos en el complejo de Golgi.

formando parte de los glucolpidos y de las glucoprotenas desempeen funcio nes importantes, aunque todava se desconocen la mayora de estas funciones. La iV-glucosilacin, por ejemplo, es predominante en todos los eucariotas, incluyendo las levaduras, pero no se presenta en procariotas. En la mayora de las protenas transportadas a travs del ER y del complejo de Golgi -u n proceso que es exclusivo de las clulas eucariotas- se hallan presentes uno o ms TV-oligosacridos, por lo que se crey que su funcin era la de colaborar en los proce sos de transporte. No obstante, por regla general las drogas que bloquean deter minados pasos de la glucosilacin no interfieren con el transporte (con la importante excepcin del transporte a los lisosomas, que se explicar ms ade lante). Adems, las clulas mutantes que tienen bloqueados varios pasos de glu cosilacin del Golgi son viables en cultivo y transportan protenas normalmente. En ausencia de glucosilacin la mayora de la protenas retienen sus actividades normales, aunque algunas no se pliegan correctam ente sin sus oligosacridos normales, y por lo tanto precipitan en el ER y no son transportadas.

(A)

(B)

Figura 13-16 Estructura tridimensional de un pequeo iV-oligosacrido. La estructura fue determinada por anlisis cristalogrfico de rayos X de una glucoprotena. Este oligosacrido tan slo contiene 6 residuos de azcar, mientras que el iV-oligosacrido transferido inicialmente a las protenas en el ER tiene 14 residuos de azcar (vase Figura 12-48). (A) Modelo del esqueleto del compuesto, en el que se muestran todos los tomos excepto los de hidrgeno; (B) modelo espacial en el que la asparagina se presenta en negro. (Por cortesa de Richard Feldmann.)

Transporte desde el ER al complejo de Golgi

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Dado que las cadenas de azcar tienen una flexibilidad limitada, incluso los Af-oligosacridos ms pequeos sobresalen de la superficie de las glucoprotenas (Figura 13-16), de forma que pueden limitar la aproximacin de otras macromolculas a la superficie de la glucoprotena. De esta manera, por ejemplo, la presencia de oligosacridos tiende a hacer que una glucoprotena sea relativa mente resistente a la digestin por proteasas. Podra ser que los oligosacridos provinieran originalmente de una clula eucariota ancestral que tuviera una cu bierta protectora, la cual, a diferencia de la rgida pared celular bacteriana, per mitiera a la clula una cierta libertad para cambiar de forma y para moverse. Desde entonces los oligosacridos pueden haber sido modificados en el sentido de que tam bin sean tiles para otros fines: por ejemplo, las selectinas -polisacridos unidos a las protenas de la superficie celular- intervienen en la adhe sin entre dos clulas, como ya se vio en el Captulo 10.

Resumen
El complejo de Golgi recibe las protenas recin sintetizadas y los lpidos del ER, y los distribuye a la membrana plasmtica, a los lisosomas y a la s vesculas de secre cin. Se trata de una estructura polarizada, form ada por una o ms hileras de cis ternas en form a de disco, organizadas como series de por lo menos tres comparti mientos secuenciales distintos bioqumica y funcionalmente, llamados cis, medial y trans. Las cisternas cis y trans estn conectadas a estaciones de clasificacin, lla madas la red del cis y trans Golgi, respectivamente. Las protenas bien plegadas son transportadas indiscriminadamente desde el lumen y la membrana del ER a la red del cis Golgi, pero las residentes del ER son devueltas. Las protenas destinadas a las vesculas secretoras, a la membrana plasmtica y a los lisosomas se desplazan a travs del dictiosoma en la direccin cis a trans, pasando desde una cisterna a la si guiente, en serie. Finalmente, las protenas alcanzan la red del trans Golgi, desde donde cada tipo de protena parte a su destino final. Todas estas etapas de trans porte tienen lugar mediante vesculas, las cuales surgen por gemacin de una mem brana y se fusionan con otra. El complejo de Golgi, a diferencia del ER, contiene muchos compuestos azcarnucletido; una diversidad de enzimas glucosil transferasas utilizan estos substra tos para realizar reacciones de glucosilacin, tanto en molculas de lpido como de protena, a medida que stas van pasando a travs del complejo de Golgi. Los N-oli gosacridos, por ejemplo, que se aaden a las protenas en el ER, son a menudo mo dificados por eliminacin de residuos de maosa y por adicin de azcares adicio nales -como la N-acetilglucosamina, la galactosa y el cido silico. Adems, el Golgi es el lugar donde se produce la O-glucosilacin y donde las cadenas de glucosaminoglucanos se aaden a las protenas centrales de proteoglucano form ando proteoglucanos. En el ltimo compartimiento del Golgi tambin tiene lugar la sulfatacin de azcares de proteoglucanos y de determinadas tirosinas de las protenas.
CITOSOL

Transporte desde la red del t r a n s Golgi a los lisosomas

Al parecer, todas las protenas que pasan a travs del complejo de Golgi, excepto las que son retenidas en l como residentes permanentes, son clasificadas en la red del trans Golgi de acuerdo con su destino final. El mecanismo de clasifica cin est especialmente bien estudiado para el caso de las protenas destinadas al lumen de los lisosomas. En esta seccin vamos a considerar este proceso de transporte selectivo. Empezaremos con una breve descripcin de la estructura y de la funcin de los lisosomas.

NUCLEO MITOCONDRIA

PEROXISOMA PLASTIDOS

RETICULO ENDOPLASMATICO

LISOSOMA t ENDOSOMA

Los lisosomas son el lugar principal de digestin intracelular 10

Los lisosom as son vesculas membranosas que contienen enzimas hidrolticas utilizadas para la digestin intracelular controlada de macromolculas. Contie-

GOLGI VESICULAS SECRETORAS

IE

SUPERFICIE CELULAR

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Captulo 13 : Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

0,05-0,5 um

Figura 13-17 Lisosomas. Las hidrolasas cidas son enzimas hidrolticas que estn activas en condiciones cidas. El lumen se mantiene a un pH cido mediante la accin de una bomba de H+situada en la membrana, la cual utiliza la energa de hidrlisis del ATP para bombear H+ al interior del lisosoma.

nen alrededor de 40 tipos de enzimas hidrolticas, entre las que se encuentran proteasas, nucleasas, glucosidasas, lipasas, fosfolipasas, fosfatasas, y sulfatasas. Todas ellas son hidrolasas cidas, cuya actividad ptima se expresa a un pH cer cano a 5, que es el pH que se mantiene en el interior de los lisosomas. En este sentido el citosol est doblemente protegido contra el ataque de su propio siste ma digestivo. Normalmente, la membrana del lisosoma mantiene las enzimas alejadas del citosol, pero en el caso incluso de que se produzca alguna fuga, la dependencia cida de la actividad de estas enzimas protege el contenido del ci tosol (cuyo pH es de aproximadamente 7,2). Como en el caso de otros orgnulos intracelulares, el lisosoma no slo con tiene una dotacin caracterstica de enzimas sino una membrana envolvente tambin caracterstica. La membrana lisosomal contiene, por ejemplo, prote nas de transporte que permiten que se escapen los productos finales de la diges tin de macromolculas, como los aminocidos, azcares y nucletidos, de tal manera que estos productos puedan ser excretados o reutilizados por la clula. Tam bin contiene una bom ba de protones que utiliza la energa de hidrlisis del ATP para bom bear H+ al interior del lisosoma, manteniendo as el lumen a un pH cido (Figura 13-17). La mayora de las protenas de la membrana lisosomal estn altamente glucosiladas, lo cual puede ayudar a protegerlas de las proteasas lisosomales del lumen. Como veremos ms adelante, los materiales endocitados son inicialmente descargados a unos orgnulos llamados endosomas antes de ser liberados a los lisosomas. Los endosomas tambin tienen bom bas de H+ que mantienen su lu men a un pH bajo, aunque no tan bajo como el de los lisosomas (Figura 13-18). Veremos cmo estas diferencias de pH son a menudo usadas para unir o separar las molculas de sus receptores durante el transporte vesicular a lo largo de la ruta endoctica.

Figura 13-18 El bajo pH de los lisosomas y endosomas. Las protenas marcadas con una sonda fluorescente sensible al pH (fluorescena) y que son endocitadas por las clulas, pueden ser utilizadas para medir el pH en endosomas y lisosomas. Los diferentes colores son una muestra del pH que la sonda fluorescente encuentra en estos orgnulos. El pH en los lisosomas [rojo) es alrededor de 5, mientras que el pH en los diversos tipos de endosomas (azul y verde) va de 5,5 a 6,5. Este mtodo fue usado originalmente en la dcada de 1890 por Metchnikoff, quien alimentaba clulas fagocticas mediante partculas de tornasol y observaba cmo variaba su color del azul al rojo despus de la ingestin. (Por cortesa de Fred Maxfield y Kenneth Dunn.) Transporte desde la red del trans Golgi a los lisosomas

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Figura 13-19 Visualizacin histoqumica de los lisosomas. Electronmicrografa de dos secciones de una clula contrastadas para poner de manifiesto la localizacin de la fosfatasa cida, una enzima marcadora de lisosomas. Los grandes orgnulos rodeados de membrana, que contienen precipitados densos de fosfato de plomo son lisosomas. Su diversa morfologa refleja variaciones de la cantidad y de la naturaleza del material que estn digiriendo. Los precipitados se producen cuando el tejido fijado con glutaraldehdo (para fijar las enzimas en su sitio) se incuba con un substrato de la fosfatasa en presencia de iones plomo. En el panel superior se indican mediante flechas rojas dos pequeas vesculas que probablemente transportan hidrolasas desde el complejo de Golgi. (Por cortesa de Daniel S. Friend.)

Los lisosomas son heterogneos 11

Los lisosomas fueron inicialmente descubiertos mediante el fraccionamiento bioqumico de extractos celulares, y ms tarde fueron observados al microscopio electrnico. Son extraordinariamente diversos en cuanto a forma y tamao, pero por procesos histoqumicos pueden ser identificados como miembros de una fa milia nica de orgnulos, utilizando el precipitado producido por la accin de una hidrolasa cida sobre su substrato, para mostrar qu orgnulos contienen la enzima (Figura 13-19). Utilizando este criterio, los lisosomas se hallan en todas las clulas eucariotas. La heterogeneidad de la morfologa lisosomal contrasta con la uniformidad relativa de la mayora de los dems orgnulos celulares. La diversidad refleja la amplia variedad de funciones digestivas mediadas por las hidrolasas cidas, com o la digestin de desechos intra y extracelulares, la digestin de microorga nismos fagocitados, e incluso la nutricin celular. Por esta razn, a veces se considera a los lisosomas como una coleccin heterognea de orgnulos distintos cuya caracterstica comn es un elevado contenido de enzimas hidrolticas. Como veremos a continuacin, es especialmente difcil aplicar una definicin ms ajustada que sta en las clulas vegetales.

200 nm

Las vacuolas de las plantas y de los hongos son lisosomas muy verstiles 12
La mayora de clulas vegetales y hongos (incluyendo las levaduras) tienen una o varias vesculas muy grandes y llenas de fluido, llamadas vacuolas, que ocupan ms del 30% del volumen celular -cerca del 90% en algunos tipos celulares (Fi gura 13-20). Las vacuolas se parecen a los lisosomas de las clulas animales por que tienen numerosas enzimas hidrolticas, pero sus funciones son muy diver sas. Las vacuolas vegetales pueden actuar como alm acn de nutrientes y de productos de desecho, como compartimiento de degradacin, incrementando el volumen celular de una forma econm ica (Figura 13-21), y controlando la pre sin de turgencia (la presin osmtica que empuja hacia afuera la pared celular y que impide que la planta se marchite). En una misma clula se encuentran a menudo diferentes vacuolas con diferentes funciones (por ejemplo, digestin y alm acenam iento). La vacuola es im portante como aparato homeosttico, permitiendo a las c lulas vegetales resistir grandes variaciones de su entorno. Por ejemplo, cuando el pH del medio disminuye, el flujo de H+ hacia el citosol es controlado, al menos en parte, aumentando el transporte de H+ a la vacuola, de manera que el pH del citosol se m antiene constante. De forma parecida, muchas clulas vegetales m antienen una presin de turgencia casi constante a pesar de grandes cambios en la osmolaridad del fluido que les rodea. Esto lo consiguen cambiando la pre sin osmtica del citosol y de la vacuola -e n parte por la hidrlisis y resntesis controlada en la vacuola de algunos polmeros como el polifosfato, y en parte por la alteracin del transporte de azcares, aminocidos y otros metabolitos a

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Captulo 13: Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

cloroplastos

vacuola

Figura 13-20 Las vacuolas de una clula vegetal. Esta electronmicrografa de clulas de una hoja joven de tabaco muestra cmo el citoplasma est reducido, debido a la enorme vacuola, a una delgada capa que contiene numerosos cloroplastos dispuestos contra la pared celular. La membrana de la vacuola recibe el nombre de tonoplasto. (Por cortesa de J. Burgess.)

pared celular]

tonoplastos

i__________________ i 10 Jim

travs de las m embranas plasmtica y vacuolar. La presin de turgencia controla estos flujos regulando las actividades de los diferentes transportadores de cada bicapa lipidica. Las substancias almacenadas en las vacuolas vegetales varan entre las dife rentes especies, desde la goma al opio y al aromatizante del ajo. A menudo, los productos almacenados tienen una funcin metablica. Por ejemplo, las prote nas pueden ser guardadas durante aos en las vacuolas de algunas clulas de muchas semillas, como los guisantes y las judas. Cuando estas semillas germi nan, las protenas son hidrolizadas y los aminocidos que se movilizan propor cionan alimento al embrin. Los antocianos, pigmentos que se encuentran en las vacuolas, dan color a los ptalos de muchas flores atrayendo los insectos polinizadores, mientras que las molculas nocivas que se liberan de las vacuolas cuando una planta es comida o daada, proporcionan un sistema de defensa contra los depredadores. Figura 13-21 El papel de la vacuola en el control del tamao de las clulas vegetales. Es posible conseguir un aumento del volumen celular sin que se produzca un aumento del volumen del citosol. La relajacin local de la pared permite una expansin celular impulsada por la turgencia que conlleva la captacin de agua en el interior de una vacuola en expansin (vase Figura 19-67). Finalmente el citoplasma queda confinado a un delgado estrato perifrico, comunicado con la regin perinuclear mediante cordones citoplasmticos transvacuolares que contienen haces de filamentos de actina (no se muestran).

ncleo

Transporte desde la red del trans Golgi a los lisosomas

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Los m ateriales son transportados hasta los lisosomas a travs de varias rutas 13
En general, los lisosomas son puntos de encuentro donde convergen diferentes corrientes del trfico intracelular. Las enzimas digestivas son descargadas a ellos mediante una ruta que va por el ER y el complejo de Golgi, mientras que las subs tancias que deben ser digeridas llegan a ellos a travs de por lo menos tres vas. De estas tres vas, la m ejor estudiada es la que siguen las macromolculas que son endocitadas. De forma breve (ms adelante discutiremos los detalles), las molculas endocitadas son inicialmente transferidas a unas vesculas intracelulares pequeas e irregulares, llamadas endosomas tempranos. Desde ellos, algunas de las molculas endocitadas son seleccionadas y recicladas a la m em brana plasmtica, mientras que otras se dirigen a los endosomas tardos. All, los materiales que van a ser digeridos se encuentran con las hidrolasas lisosomales que provienen del complejo de Golgi, debido a la fusin de las vesculas de transporte de ambas rutas. El interior de los endosomas tardos es medianamen te cido (pH ~6), y se cree que es el lugar donde empieza la digestin hidroltica de las molculas endocitadas. A partir de los endosomas tardos se forman los li sosomas, a pesar de que no se sabe exactam ente cmo ocurre. Durante este pro ceso de conversin, algunas molculas de la membrana de los endosomas son eliminadas y se produce una disminucin del pH interno. Todas las clulas disponen de una segunda ruta que aporta materiales a los lisosomas para su degradacin, mediante la cual pueden ser destruidas partes obsoletas de la propia clula -u n proceso denominado autofagia. En una clula heptica, por ejemplo, una mitocondria tiene una vida media de 10 das. En las imgenes de microscopa electrnica de clulas normales se pueden observar li sosomas conteniendo (y probablemente digiriendo) mitocondrias as como otros orgnulos. Al parecer, el proceso de digestin supone que el orgnulo sea envuelto por membranas derivadas del ER, generndose un autofagosoma. Se cree que el autofagosoma se fusiona con un lisosoma (o un endosoma tardo). El proceso est altamente regulado, de forma que durante la remodelacin celular se pueden seleccionar diferentes com ponentes celulares y ser destinados a su destruccin: por ejemplo, el ER liso que prolifera en una clula heptica en res puesta a la droga pentobarbital (discutido en el Captulo 12) es eliminado selec tivamente por medio de la autofagia cuando esta droga es retirada. Como veremos ms adelante, la tercera ruta que proporciona materiales a los lisosomas slo tiene lugar en clulas que estn especializadas en la fagocitosis de grandes partculas y de microorganismos. Estas clulas (macrfagos y neutrflos en vertebrados) pueden ingerir grandes objetos y formar un fagosoma. Se cree que el fagosoma se transforma en lisosoma de la misma forma que hemos explicado para el caso del autofagosoma. Estas tres rutas se resumen en la Figura 13-22.

Algunas protenas citoslicas son transportadas directamente a los lisosomas para ser degradadas 14
Podra existir una cuarta ruta de degradacin proteica que condujese hasta los li sosomas: algunas protenas poseen ciertas seales en su superficie [llamadas se cuencias KFERQ, de lisina (K), fenilalanina (F), glutamato (E), arginina (R) y gluta mina (Q)] que son responsables de su seleccin para ser descargadas en los lisosomas y degradadas. Es posible que las secuencias KFERQ unan estas prote nas a determinados orgnulos que vayan a ser autofagocitados, de manera que de forma indirecta tambin seran destruidas. Alternativamente, puede existir un transportador especfico en la membrana del lisosoma que reconozca estas sea les y transfiera directamente las protenas a travs de la membrana lisosomal. Se conocen antecedentes de mecanismos no convencionales que desplazan protenas a travs de las membranas. Algunas de las protenas que son secretadas al exterior de la clula, como el factor bsico de crecimiento de los fibroblastos o la interleuquina-1, llegan a la superficie celular sin haber pasado nunca por la ruta

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Captulo 13 : Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

Figura 13-22 Tres rutas de degradacin en los lisosomas. Cada

bacteria fagocitosis

fagosom a mem brana / plasmtica

endosoma tem prano endocitosis

ENDOSOMA TARDO m itocondria

LISOSOMA

ruta conduce a la digestin intracelular de materiales derivados de diferentes orgenes. Los compartimientos resultantes de estas tres rutas pueden, a veces, ser diferenciados morfolgicamente -a ello se deben los trminos autofagolisosoma, fagolisosoma, etc. No obstante, estos lisosomas slo pueden diferenciarse por los diferentes materiales que estn digiriendo.

retculo endoplasm tico

autofagosom a autofagia

clsica a travs del ER y del complejo de Golgi. En la mayora de los casos no se co noce qu membrana es atravesada por la protena o cmo se cataliza su transporte transmembrana. En el caso de un pequeo pptido de levaduras, el factor feromona a, se sabe que el transporte tiene lugar directamente a travs de la membrana plasmtica mediante una bomba proteica impulsada por ATP que pertenece a la familia proteica de los transportadores ABC (discutido en el Captulo 11). As, es posible que bombas parecidas a sta proporcionen sistemas de transporte priva dos, cada uno de ellos especializado en la transferencia de un pequeo y especfi co grupo de protenas a travs de una membrana en particular.

Las enzimas lisosomales son clasificadas en la red del tran s Golgi por un receptor proteico unido a m em brana que reconoce la m aosa 6 -fosfato 15
Ahora consideraremos con ms detalle el sistema que conduce la otra mitad del trfico hasta los lisosomas -las hidrolasas lisosomales especializadas y las prote nas de membrana. Ambos tipos de protenas se sintetizan en el ER rugoso y son transportadas a travs del complejo de Golgi. Las vesculas de transporte que conducen estas protenas hasta los endosomas tardos -lo s cuales forman ms tarde los lisosom as- parten de la red del trans Golgi, incorporando las protenas lisosomales y excluyendo todas las dems protenas, que sern empaquetadas en otras vesculas de transporte y sern descargadas en otros lugares. Cmo son reconocidas y seleccionadas las protenas lisosomales con la precisin necesaria? Para las hidrolasas lisosomales la respuesta es conocida. Es tas hidrolasas presentan un solo marcador en forma de grupos de m aosa 6-fos fato (M6P), los cuales son aadidos exclusivamente a los Af-oligosacridos de es tas enzimas lisosomales solubles, probablemente mientras estn en el lumen de la red del cis Golgi. Los grupos M6P son reconocidos por los receptores M6P, que son protenas transmembrana presentes en la red del trans Golgi. Estos re ceptores unen a las hidrolasas lisosomales y ayudan a concentrarlas en vesculas de transporte especficas que surgen por gemacin de la red del trans Golgi y acaban fusionndose con los endosomas tardos, descargando su contenido en el lumen de estos orgnulos. Como veremos ms adelante, los receptores M6P son empaquetados en vesculas de transporte especficas en la red del trans Gol gi mediante unas protenas de recubrimiento especiales que se ensamblan en la superficie citoslica de la membrana y permiten la gemacin de las vesculas desde la red del trans Golgi. Transporte desde la red del trans Golgi a los lisosomas

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precursor de una hidrolasa lisosom al TRANSPORTE DEPENDIENTE DE RECEPTOR

DISOCIACION A pH CIDO

ELIMINACION DEL FOSFATO

RECICLAJE DEL RECEPTOR red del trans Golgi

receptor M6P en las vesculas recubiertas de clatrina que emergen por gemacin

El receptor de m aosa 6 -fosfato viaja como una lanzadera, adelante y atrs, entre determinadas m em branas 16
El receptor de la maosa 6-fosfato une su oligosacrido especfico a pH 7 en la red del trans Golgi y lo libera a pH 6, que es el pH del interior de los endosomas tardos. As en cuanto llegan al interior de estos endosomas tardos, las enzimas lisosomales se disocian de los receptores M6P y empiezan a digerir el material endocitado transferido desde los endosomas tempranos. Una vez han liberado las enzimas, los receptores son recuperados y devueltos a la membrana de la red del trans Golgi, mediante vesculas de transporte que surgen por gemacin de los endosomas tardos (Figura 13-23). No se sabe si el transporte de vuelta al complejo de Golgi requiere un pptido seal especfico en la cola citoplasmtica del receptor M6P o si tiene lugar por defecto. Este proceso de reciclaje de m em brana desde el endosom a tardo hacia el complejo de Golgi es similar al reciclaje que ocurre entre otros subcompartimientos de las rutas secretora y endoctica que veremos ms adelante. El proceso de clasificacin de las hidrolasas lisosomales es el modelo mejor conocido de los diversos fenm enos de clasificacin mediados por vesculas de transporte que tienen lugar en las clulas eucariotas. Aunque no es probable que en todos los casos se utilice un marcador oligosacrido, la estrategia general es seguramente tpica de otros procesos de clasificacin mediados por vesculas. La carga es reconocida y recogida por los receptores de carga unidos a la m embra na, durante el proceso de gemacin de vesculas especficas recubiertas de cla trina. Estas vesculas cargadas se fusionan con una membrana diana especfica, la carga es liberada en el compartimiento diana y los receptores vacos vuelven a su compartimiento original. No toda la carga que est destinada a acabar en los lisosomas llega a su des tino. Parece que algunas de las hidrolasas lisosomales consiguen escapar del proceso de empaquetamiento en la red del trans Golgi y son transportadas, va la ruta por defecto, a la superficie celular, desde donde son secretadas al fluido extracelular. No obstante, algunos receptores M6P tambin van a la membrana plasmtica para recapturar a las hidrolasas lisosomales escapadas y devolverlas mediante endocitosis m ediada por receptor a los lisosomas va endosomas tem pranos y tardos. Esta ruta basurero fue originalmente descubierta en clulas humanas que eran genticamente defectuosas en una hidrolasa lisosomal especfica. Un ejem-

Figura 13-23 Transporte de las hidrolasas lisosomales recin sintetizadas a los lisosomas. Los
precursores de las hidrolasas son etiquetados con grupos maosa 6 -fosfato (M 6 P) en la red del cis Golgi, y separados de todas las dems protenas en la red del trans Golgi. Esta separacin ocurre porque las vesculas recubiertas con clatrina que emergen por gemacin de la red del trans Golgi presentan elevadas concentraciones de receptores especficos de maosa 6 -fosfato, los cuales unen las hidrolasas lisosomales. Estas vesculas se fusionan con los endosomas tardos. Al bajo pH de los endosomas tardos, las hidrolasas se disocian de sus receptores, los cuales se reciclan hacia el com plejo de Golgi para ser reutilizados en siguientes rondas de transporte. La posterior eliminacin del fosfato de la maosa de las hidrolasas disminuye la probabilidad de que las hidrolasas vuelvan de nuevo al com plejo de Golgi, unidas al receptor.

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Captulo 13 : Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

po de ello es la enfermedad de Hurler, en la cual la enzima necesaria para la ro tura de los glucosaminoglucanos no es funcional. En estos individuos mutantes se acumulan en los lisosomas grandes cantidades de compuestos no digeridos. Por esta razn estas enfermedades se conocen con el nombre de enfermedades de acmulo lisosomal . Cuando se cultivan las clulas de individuos mutantes, se observan los mismos defectos intracelulares. No obstante, si se hace un cocultivo entre las clulas mutantes y clulas de un individuo normal, dejan de obser varse los defectos. Las clulas mutantes son rescatadas porque pueden captar del medio de cultivo la hidrolasa lisosomal que no tienen. Ms adelante veremos cmo el estudio de estas enfermedades han permitido conocer una parte impor tante del m ecanismo de clasificacin de las hidrolasas lisosomales.

Una regin seal en la cadena polipeptdica proporciona la clave para m arcar una enzima lisosomal con la m aosa 6 -fosfato 17
El sistema de clasificacin que segrega las hidrolasas lisosomales y las dirige ha cia los endosomas tardos funciona porque en el complejo de Golgi se aaden grupos de maosa 6-fosfato tan slo a las glucoprotenas adecuadas. Este m ar eaje especfico requiere un reconocimiento tambin especfico de las hidrolasas por la enzima del Golgi responsable de aadir los grupos M6P. Dado que todas las glucoprotenas abandonan el ER con las cadenas de Af-oligosacridos idnti cas, la seal para aadir las unidades M6P a los oligosacridos ha de residir en alguna parte de la cadena polipeptdica de cada hidrolasa. La adicin de grupos M6P a las hidrolasas lisosomales est catalizada por dos enzimas que actan de manera secuencial (Figura 13-24). La primera es una fosfotransferasa con un lugar de reconocimiento que une especficamente la hi drolasa, y un lugar cataltico ; la seal reconocida por el lugar de reconocimiento no es un pptido seal sino una regin seal dependiente de conformacin (va se Figura 12-8). Cuando la hidrolasa est unida, la fosfotransferasa aade grupos GlcNAc-P a una o dos de las maosas de cada cadena de oligosacrido (Figura 13-25). Entonces una segunda enzima elimina el residuo GlcNAc, creando el marcador de la maosa 6-fosfato (vase Figura 13-24). La mayora de las hidrolasas lisosomales tienen varios oligosacridos, por lo que adquieren muchos residuos de M6P, lo cual amplifica enormem ente la se al. As, mientras que una hidrolasa lisosomal se une al sitio de reconocimiento de la fosfotransferasa con una constante de afinidad (KJ de aproximadamente 105 litros/mol, la hidrolasa multifosforilada se une al receptor M6P con una Ka de aproximadamente 109 litros/mol, lo cual supone un incremento en la afinidad de 10 000 veces.

Los defectos en la GlcNAc-fosfotransferasa causan una enfermedad de acmulo lisosomal en hum anos 18
Las enfermedades de acmulo lisosomal estn causadas por defectos genticos que afectan a una o ms de las hidrolasas lisosomales, lo cual provoca una acu mulacin en los lisosomas de sus substratos no digeridos. Este acmulo tiene

GlcNAc fosfotransferasa
^ -Hump|
GlcNAc - { p ) - 0 - C H 2

G lc N A c

HO

OH \ |

OH, 1 / O

Figura 13-24 Sntesis del marcador maosa 6-fosfato sobre una hidrolasa lisosomal. La sntesis ocurre en dos pasos. En primer lugar, la GlcNAc

fosfotransferasa transfiere residuos de GlcNAc-P a la posicin 6 de diversos residuos de maosa de los AT-oligosacridos de la hidrolasa lisosomal. En segundo lugar, una fosfoglucosidasa elimina el residuo GlcNAc, generando el marcador maosa 6 -fosfato. La primera enzima est activada especficamente por una zona seal presente en las hidrolasas lisosomales (vase Figura 13-25), mientras que la fosfoglucosidasa es una enzima no especfica. Esta modificacin de determinados residuos de maosa en la red del cis Golgi protege las maosas de ser eliminadas por las manosidasas que ms tarde encontrarn en el compartimiento m ed ia l del Golgi.

GlcNAc fosfoglucosidasa
GlcNAc

( \
HO \

OH
I

OH,
1 / O

maosa 6-fosfato

Transporte desde la red del trans Golgi a los lisosomas

659

hidrolasa lisosomal
/V-oligosacrido con un residuo term inal de manosa TRANSFERENCIA DEL GRUPO G Ic N A c - A UNA MANOSA DEL LUGAR CATALTICO

D < pX p>

UDP-GIcNAc GIcNAc fosfotransferasa

~ r
UMP

no
lugar cataltico lugar de reconocim iento oligosacrido

consecuencias patolgicas profundas. Habitualmente, se producen como con secuencia de una mutacin en un gen estructural que codifica una hidrolasa li sosomal; ste es el caso de la enfermedad de Hurler, mencionada anteriormente. No obstante, la forma ms dramtica de una enfermedad de acmulo lisosomal es una alteracin muy poco frecuente denominada enfermedad de inclusin ce lular (enfermedad celular-I). En esta enfermedad la mayora de las enzimas hidrolticas han desaparecido de los lisosomas de los fibroblastos y sus substratos no digeridos se acumulan formando grandes inclusiones en las clulas de los pacientes. La enfermedad celular-I es debida a un solo defecto gnico que, como en el caso de la mayora de las deficiencias genticas, es recesivo -e s decir, slo presentan la enfermedad los individuos que tienen defectuosas las dos copias del gen. En la enfermedad celular-I todas las hidrolasas que han desaparecido de los lisosomas se hallan en la sangre; la anomala se produce por un error en el proce so de clasificacin de estas hidrolasas en el complejo de Golgi, error que provoca que las hidrolasas sean secretadas en lugar de ser transportadas a los lisosomas. Este error de clasificacin es debido a una GlcNAc-fosfotransferasa defectuosa o ausente. En este caso, las enzimas lisosomales no son fosforiladas en la red del cis Golgi, por lo que no son captadas por los receptores M6P ni empaquetadas en las vesculas de transporte apropiadas en la red del trans Golgi. Por el contrario, las hidrolasas son transportadas a la superficie celular y son secretadas por la ruta por defecto. En realidad sta fue la primera evidencia de la existencia de una ruta por defecto; y comparando bioqumicamente las hidrolasas lisosomales con las de los pacientes de la enfermedad celular-I se descubri que la maosa 6-fosfato era la seal de clasificacin lisosomal y se comprendi toda la ruta de clasifica cin de las hidrolasas lisosomales. En la enfermedad celular-I los lisosomas de algunos tipos celulares, como los hepatocitos, contienen una dotacin normal de enzimas lisosomales. Este hecho implica que tiene que existir otra va para dirigir las hidrolasas a los liso somas, la cual se utiliza en algunos tipos celulares pero no en otros. Se descono ce la naturaleza de esta va independiente de M6P. De manera similar, las prote nas de la mem brana lisosomal son clasificadas en todas las clulas desde la red del trans Golgi hasta los endosomas tardos, a travs de una va independiente de M6P. No est claro todava por qu las clulas necesitan ms de una va de clasificacin para construir un lisosoma, aunque quiz no sea sorprendente que en protenas solubles y unidas a mem brana acten mecanismos diferentes.

Figura 13-25 Reconocimiento de una hidrolasa lisosomal. La enzima GIcNAc fosfotransferasa, que reconoce las hidrolasas lisosomales en el complejo de Golgi, tiene un lugar cataltico y un lugar de reconocim iento separados. El lugar cataltico une AT-oligosacridos ricos en maosa y UDP-GlcNAc. El lugar de reconocim iento se une a una zona seal que nicamente se encuentra sobre la superficie de las hidrolasas lisosomales.

Resumen
Los lisosomas estn especializados en la digestin intracelular. Contienen prote nas de membrana caractersticas y una amplia variedad de enzimas hidrolticas que trabajan mejor a pH 5, que es el pH interno de los lisosomas. El pH cido de los
660 Captulo 13 : Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

lisosomas se mantiene por una bomba de ATP de su membrana, que impulsa proto nes. Las protenas lisosomales recin sintetizadas son transferidas al lumen del ER, son transportadas a travs del complejo de Golgi, y luego conducidas por medio de vesculas de transporte desde la red del trans Golgi a los endosomas tardos. Las hidrolasas lisosomales contienen N-oligosacridos que son modificados covalentemente de una forma caracterstica en la red del cis Golgi, de manera que sus residuos de maosa son fosforilados. Estos grupos de maosa 6-fosfato (M6P) son reconocidos por un receptor de la red del trans Golgi, el cual separa las hidrola sas del resto de las molculas y ayuda a empaquetarlas en el interior de vesculas de transporte, las cuales descargan su contenido en los endosomas tardos y despus en los lisosomas. Estas vesculas de transporte actan como un servicio de trans porte que desplaza el receptor M6P de un lugar a otro, entre la red del trans Golgi y los endosomas tardos. El bajo pH de los endosomas tardos disocia las hidrolasas lisosomales de su receptor, haciendo que el transporte de las hidrolasas sea unidi reccional.

Transporte desde la membrana plasmtica va endosomas: endocitosis1 9

Las rutas que llevan hacia los lisosomas desde la superficie celular empiezan con la endocitosis, mediante la cual las clulas captan macromolculas, sustancias particuladas y, en casos especiales, otras clulas. La substancia que va a ser ingerida es rodeada progresivamente por una pe quea porcin de la membrana plasmtica, que primero se invagina y luego se es trangula formando una vescula intracelular que contiene el material ingerido. En funcin del tipo de vesculas que se forman, se pueden distinguir dos tipos de en docitosis: la pinocitosis (bebida de la clula), que implica la ingestin de fluidos y de solutos va pequeas vesculas (<150 nm de dimetro); y la fagocitosis (comida de la clula) que comporta la ingestin de grandes partculas tales como microor ganismos o restos celulares, mediante grandes vesculas llamadas fagosomas, gene ralmente de dimetro superior a 250 nm. Aunque la mayora de las clulas eucariotas ingieren continuamente fluidos y solutos por pinocitosis, las grandes partculas son ingeridas principalmente por clulas fagocticas especializadas.

CITOSOL NUCLEO MITOCONDRIA

SZ.

PEROXISOMA

PLASTIDOS

RETCULO ENDOPLASMATICO

J L
LISOSOMA

--------------

ENDOSOMA

GOLGI VESICULAS SECRETORAS

SUPERFICIE CELULAR

Clulas fagocticas especializadas pueden ingerir grandes partculas20

La fagocitosis es una forma especial de endocitosis en la que se ingieren grandes partculas, tales como microorganismos y restos de clulas, va grandes vesculas de endocitosis llamadas fagosomas. En los protozoos, la fagocitosis constituye un sistema de alimentacin: las grandes partculas atrapadas en los fagosomas acaban en los lisosomas, y los productos de los procesos digestivos posteriores pasan al citoplasma donde son utilizados como alimento. La mayora de las c lulas de los organismos pluricelulares son incapaces de ingerir grandes partcu las de forma eficaz. En el intestino, las grandes partculas de alimento son frac cionadas fuera de las clulas antes de ser captadas por ellas. En la mayora de los animales la fagocitosis es importante en otros procesos diferentes al de la nutri cin, y la llevan a cabo clulas especializadas que son fagocitos profesionales. En los mamferos existen dos tipos de glbulos blancos que actan como fagoci tos: los m acrfagos (que adems de encontrarse en la sangre, se hallan amplia mente distribuidos en los tejidos) y los neutrfilos. Estos dos tipos de clulas proceden de un precursor comn (discutido en Captulo 22), y nos defienden contra las infecciones mediante la ingestin de los microorganismos invasores. Los macrfagos tambin desempean un importante papel en la eliminacin tanto de clulas viejas y lesionadas como de restos celulares. En trminos cuan titativos, esta ltima funcin es la ms importante: en cada uno de nosotros los macrfagos fagocitan ms de 10u eritrocitos viejos cada da.

Transporte desde la membrana plasmtica va endosomas: endocitosis

661

Mientras que las vesculas endocticas implicadas en la pinocitosis son pe queas y uniformes, el dimetro de los fagosom as est determinado por el tipo de partculas que ingieren, y pueden llegar a ser tan grandes como la propia c lula fagoctica (Figura 13-26). Los fagosomas se fusionan con los lisosomas, y el material ingerido es degradado; en los lisosomas permanecen substancias no digeribles, formando cuerpos residuales. Algunos de los componentes de la m em brana plasmtica internalizada son recuperados del fagosoma mediante vesculas de transporte y devueltos a la m em brana plasmtica. Para que una partcula sea fagocitada, primero ha de unirse a la superficie del fagocito. No obstante, no se ingieren todas las partculas que pueden unirse. Los fagocitos tienen toda una gama de receptores de superficie especializados que se encuentran unidos funcionalmente a la maquinaria fagoctica de la clu la. A diferencia de la pinocitosis, que es un proceso constitutivo que ocurre con tinuamente, la fagocitosis es un proceso regulado en el que los receptores acti vados transmiten la seal al interior de la clula, inicindose la respuesta. Los reguladores m ejor caracterizados de este proceso son los anticuerpos, que nos protegen contra los microorganismos infecciosos unindose a su superficie for mando una cubierta en la que las colas de los anticuerpos (llamadas regiones Fe) se hallan expuestas al exterior. Esta cubierta de anticuerpos es reconocida en tonces por los receptores Fe de la superficie de los macrfagos y de los neutrfilos (vase Figura 23-20). La unin de partculas recubiertas por anticuerpos a estos receptores induce a la clula fagoctica a extender pseudpodos que engullen a la partcula, formando un fagosoma (Figura 13-27). Se han caracterizado algunas otras clases de receptores que provocan fago citosis: por ejemplo, los que reconocen el complemento (una clase de molculas que circulan por la sangre y que colaboran con los anticuerpos marcando las c lulas indeseables para ser destruidas, discutido en Captulo 23), y los que reco nocen directam ente oligosacridos de la superficie de ciertos microorganismos. No se sabe qu receptores de los macrfagos reconocen las clulas viejas o da adas, aunque se sospecha que en algunos casos estn implicadas las protenas de adhesin celular de la familia de las integrinas (discutido en Captulo 22).

i _________) 5 Jim
Figura 13-26 Fagocitosis por un macrfago. Electronmicrografa de barrido de un macrfago de ratn fagocitando dos eritrocitos modificados qumicamente. Las fle c h a s rojas indican los bordes de las finas extensiones (pseudpodos) del macrfago que se proyectan como collares engullendo los eritrocitos. (Por cortesa de Jean Paul Revel.)

Las vesculas de pinocitosis se form an en la m em brana plasm tica a partir de depresiones revestidas 21
Prcticam ente todas la clulas eucariotas ingieren continuam ente zonas de su m em brana plasm tica en forma de pequeas vesculas pinocticas (endocticas)
Figura 13-27 Fagocitosis por un neutrlo. Electronmicrografa de un neutrfilo fagocitando una bacteria que se hallaba en proceso de divisin. (Por cortesa de Dorothy F. Bainton.)

pseudpodo

^ membrana plasmtica

g lbu lo blanco agocitico

1 jim

662

Captulo 13 : Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

0.1

|JI1>

que posteriormente retornan a la superficie de la clula. La velocidad a la que se internaliza la mem brana plasmtica en este proceso de pinocitosis vara de un tipo celular a otro, pero normalmente es bastante elevada. Por ejemplo, un macrfago ingiere cada hora una cantidad de fluido igual al 25% de su propio volu men. Esto significa que cada minuto ha de ingerir un 3% de su mem brana plas mtica, o un 100% en media hora. Los fibroblastos presentan una velocidad menor, mientras que algunas amebas ingieren la membrana plasmtica todava ms rpidamente. Dado que el rea de la superficie y el volumen celular no varan durante este proceso, est claro que toda la membrana que desaparece por endocitosis se ha de ir aadiendo por exocitosis (el proceso contrario, discutido ms adelante). En este sentido, endocitosis y exocitosis son procesos ligados que se puede considerar que constituyen un ciclo endoctico-exoctico. Normalmente, la parte endoctica de este ciclo empieza en regiones espe cializadas de la mem brana plasmtica llamadas depresiones revestidas de clatrina (clathrin-coated pits), que ocupan aproximadamente un 2% del rea total de la m em brana plasmtica. En electronmicrografas de las membranas plasm ticas estudiadas mediante las tcnicas de congelacin rpida por sublimacin (rapid freeze, deep-etch) estas depresiones aparecen como invaginaciones de la mem brana plasmtica revestidas en su superficie interna (citoslica) con estruc turas densas. Estos revestimientos estn formados por clatrina, la cual, junto con otras protenas, forma una estructura caracterstica que discutiremos ms adelante. La vida media de las depresiones revestidas de clatrina es corta: un m i nuto despus de haber sido formadas, se invaginan hacia en interior de la clula y se separan de la membrana formando las vesculas revestidas de clatrina (Fi gura 13-28). En fibroblastos aislados se ha estimado que aproximadamente cada minuto, 2500 vesculas revestidas de clatrina abandonan la membrana plasmti ca. Estas vesculas revestidas son ms transitorias incluso que las depresiones revestidas: segundos ms tarde de ser formadas, se despojan de su revestimiento siendo as capaces de fusionarse con los endosomas tempranos. Dado que las depresiones revestidas de clatrina estn llenas de fluido extracelular, cuando se invaginan formando vesculas revestidas tambin se internalizan las substancias disueltas en el fluido extracelular -u n proceso denominado endocitosis de la fase fluida.

Figura 13-28 Formacin de vesculas revestidas de clatrina a partir de la membrana plasmtica. Electronmicrografas que ilustran la probable secuencia de acontecimientos durante la formacin de una vescula revestida de clatrina a partir de una depresin revestida de clatrina. Las depresiones y las vesculas revestidas que aparecen en las fotografas son mucho mayores que las que se presentan en las clulas de tamao normal. Intervienen en la captacin de lipoprotenas en un gran oocito de gallina, formando la yema del huevo. En la superficie extracelular de la membrana plasmtica puede verse una capa electrodensa que corresponde a las lipoprotenas asociadas a su receptores. (Por cortesa de M.M. Perry yA.B. Gilbert, de /. Cell Sci. 39:257-272, 1979, con permiso de The Company of Biologists.)

Las depresiones revestidas de clatrina pueden actuar como un mecanism o concentrador internalizando macromolculas extracelulares especficas 22
En la mayora de clulas animales, las depresiones y las vesculas revestidas de clatrina proporcionan una ruta eficiente para captar macromolculas especfi-

Transporte desde la membrana plasmtica va endosomas: endocitosis

66 3

cas del fluido extracelular, un proceso llamado endocitosis mediada por recep tor. Las macromolculas se unen a receptores complementarios de la superficie celular (protenas transmembrana), se acumulan en depresiones revestidas, y entran en la clula en forma de complejos receptor-macromolcula en vesculas recubiertas de clatrina. El proceso es muy similar al empaquetamiento de las hidrolasas lisosomales en el complejo de Golgi. All, como hemos visto, las molcu las que han de ser transportadas tambin se unen a receptores especficos de la membrana (receptores M6P) y son capturadas en vesculas de membrana que abandonan el compartimiento y se desplazan por el citosol. Adems, la gemacin desde el complejo de Golgi de vesculas cargadas con las enzimas lisosomales tambin tienen lugar mediante un revestimiento de clatrina (vase Figura 13-23). Como discutiremos ms adelante, se supone que, tanto para la membrana plas mtica como para la del Golgi, la formacin del recubrimiento en la cara citoslica es la responsable de la invaginacin. La endocitosis mediada por receptores proporciona un mecanismo de con centracin selectivo que increm enta la eficiencia de la internalizacin de deter minados ligandos ms de 1000 veces. De esta manera se pueden captar especfi cam ente y en grandes cantidades com ponentes incluso minoritarios del fluido extracelular, sin internalizar el gran volumen correspondiente de fluido extrace lular. Un ejemplo bien conocido y fisiolgicamente importante es el proceso mediante el cual las clulas de los mamferos captan el colesterol.

22 nm
m olcula de colesterol

lcula de :olpdo ster protrusin superficial de la m olcula proteica

Figura 13-29 Lipoprotena de baja densidad (LDL). Cada partcula esfrica tiene una masa de 3 x 10 6 daltons. En la regin central contiene alrededor de 1500 molculas de steres de colesterol esterificado con cidos grasos de cadena larga. Esta regin central est rodeada de una monocapa lipidica de unas 800 molculas de fosfolpido y unas 500 de colesterol no esterificado. Adems presenta una nica molcula de protena, de unos 500 000 daltons, que organiza la partcula y que es la responsable de la unin especfica de las LDL a las protenas receptoras de la superficie de las clulas.

Las clulas im portan colesterol por endocitosis mediada por receptor 23

Muchas clulas animales captan colesterol por endocitosis mediada por recep tor y as adquieren la mayor parte del colesterol que necesitan para la sntesis de las membranas. Si esta ingestin se bloquea, el colesterol se acumula en la san gre y puede contribuir a la formacin en las paredes de los vasos sanguneos de placas aterosclerticas (depsitos de lpidos y de tejido fibroso que causan apo plejas e infartos de miocardio al impedir la circulacin sangunea). De hecho, fue a travs del estudio de humanos con una alta predisposicin gentica por la aterosclerosis que se conoci por primera vez el mecanismo de endocitosis m e diada por receptor. La mayor parte del colesterol se transporta en la sangre unido a protenas, formando unas partculas conocidas como lipoprotenas de baja densidad, o LDL (de Low Density Lipoproteins; Figura 13-29). Cuando la clula necesita co lesterol para la sntesis de m embranas, produce protenas receptoras de LDL y las inserta en su m em brana plasmtica. Una vez en la membrana, los receptores de LDL difunden hasta asociarse con depresiones revestidas de clatrina que se hallan en proceso de formacin (Figura 13-30A). Dado que las depresiones re-

lugar de unin de las LDL (A)

l_Q|_

clatrina y otras protenas asociadas depresin CITOSOL

receptor proteico de LDL lugar de unin L a la depresin depresin revestida revestida de clatrina

(B) receptor proteico de LDL con el lugar de unin a la depresin revestida defectuoso
664

m em brana plasmtica

Figura 13-30 Receptores norm ales y m utantes de LDL. (A) Protenas receptoras de LDL unidas a una depresin revestida de la membrana plasmtica de una clula normal. El receptor humano de LDL es una glucoprotena transm embrana de paso nico compuesta de unos 840 residuos de aminocido, de los cuales nicam ente 50 se hallan en el lado citoplasmtico de la membrana. (B) Clula mutante en la que las protenas receptoras de LDL son anormales porque carecen del dominio citoplasmtico que les permite unirse a las vesculas revestidas. Estas clulas unen LDL pero no pueden captarlas. En la mayora de poblaciones humanas, uno de cada 500 individuos tiene un gen que codifica un receptor de LDL alterado, y como consecuencia de ello, tiene una elevada probabilidad de morir prematuramente de un infarto de miocardio debido a la aterosclerosis.

Captulo 13: Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

vestidas se separan constantem ente de la membrana formando vesculas reves tidas, cualquier partcula de LDL que se halle unida a los receptores en las de presiones revestidas es rpidamente internalizada. Despus de desprenderse de su cubierta de clatrina, las vesculas de endocitosis liberan su contenido en los endosomas tempranos, que se encuentran cerca de la periferia celular. Una vez en el compartimiento endosomal, las LDL pasan a los endosomas tardos y de ellos a los lisosomas, donde se hidrolizan los esteres de colesterol dando lugar a colesterol libre, que de esta forma queda a disposicin de la clula para la biosntesis de membrana. Si se acumula demasiado colesterol libre en la clula, sta detiene tanto la sntesis de colesterol como la sntesis de protenas receptoras de LDL, con lo que la clula produce y absorbe menos colesterol. Esta va regulada para la absorcin del colesterol est perturbada en algunos individuos que heredan unos genes defectuosos para la produccin de protenas receptoras de LDL y, por consiguiente, sus clulas no pueden captar LDL de la sangre. Los niveles elevados de colesterol en sangre resultantes predisponen a estos individuos a una aterosclerosis prematura, y la mayora de ellos mueren a una edad temprana de un infarto de miocardio como consecuencia de alteracio nes de las arterias coronarias. La anomala se puede atribuir al receptor de LDL, el cual puede estar ausente o ser defectuoso -b ien en su lugar de unin extracelular para las LDL o bien en el lugar de unin intracelular que fija el receptor al revestimiento de las depresiones revestidas de clatrina (vase Figura 13-30B). En este ltimo caso, el nmero de protenas receptoras que unen las LDL es nor mal, pero no pueden localizarse en las regiones revestidas con clatrina de la membrana plasmtica. Aunque las LDL se unen a la superficie de estas clulas mutantes, no se incorporan a la clula. Este hecho demuestra directamente la importancia que tienen las depresiones revestidas de clatrina respecto a la en docitosis mediada por receptor del colesterol. Se han descrito ms de 25 receptores diferentes que participan en la endoci tosis mediada por receptor de diferentes tipos de molculas, y todos ellos apa rentemente utilizan la misma ruta de las depresiones revestidas de clatrina. Mu chos de estos receptores, como el receptor de las LDL, entran en las depresiones revestidas independientemente de si se han unido o no a sus ligandos especfi cos; otros entran slo si se han unido a su ligando especfico, lo cual sugiere que es necesario un cambio conformacional induido por el ligando para llegar a las depresiones. No obstante, no todas las protenas de la membrana plasmtica se acumulan en depresiones revestidas de clatrina, lo cual indica que estas depre siones actan como filtros moleculares recogiendo ciertas protenas de la m em brana plasmtica (receptores) y excluyendo a otras. Estudios de electronmicroscopia de clulas cultivadas expuestas a diferentes ligandos (que se han marcado para hacerlos ms visibles al microscopio electrnico) han demostrado que en una misma depresin revestida se agrupan muchas clases de receptores. La membrana plasmtica de una depresin revestida de clatrina puede acumular probablemente unos 1000 receptores de varias clases. Aunque todos los comple jos receptor-ligando que utilizan esta ruta endoctica terminan aparentemente en el mismo compartimiento endosomal, el destino posterior de las molculas endocitadas vara, como veremos ahora.

El material endocitado termina frecuentemente en los lisosomas 24

El com partim iento endosom al puede ser reconocido al microscopio electrnico aadiendo al medio extracelular una molcula fcilmente detectable, como la en zima peroxidasa, y permitiendo que las clulas la capten por endocitosis a dife rentes tiempos. La distribucin de la molcula despus de ser captada revela que el compartimiento endosomal es como una serie de tbulos heterogneos rodea dos de membrana y vesculas que se distribuyen desde la periferia de la clula hasta la regin perinuclear, donde a menudo se observan cerca, aunque fsica mente separados, del complejo de Golgi. Mediante estos experimentos de marea je pueden distinguirse rpidamente dos series de endosomas: al cabo de un mi-

Transporte desde la membrana plasmtica va endosomas: endocitosis

665

uto, las molculas endocitadas aparecen en los endosomas tempranos, justo por debajo de la mem brana plasmtica, y al cabo de 5-15 minutos en los endosom as tardos, al lado del complejo de Golgi y cerca del ncleo (Figura 13-31). Como ya m encionam os, el interior del compartimiento endosomal es cido (pH ~6) debido a la presencia en la m em brana del endosoma de bom bas dirigi das por ATP que bom bean H+desde el citosol hacia el lumen. En general, los en dosomas tardos son ms cidos que los tempranos. Este ambiente cido juega un papel crucial en la funcin de estos orgnulos. Se cree que una ATPasa de H+ vacuolar similar o idntica a sta es la responsable de la acidificacin de todos los orgnulos endocticos y exocticos, incluyendo fagosomas, lisosomas, deter minados com partim ientos del com plejo de Golgi y muchas vesculas secretoras y de transporte. Ya hem os visto cm o los materiales endocitados que llegan a los endosomas tardos se mezclan con hidrolasas lisosomales recin sintetizadas y acaban en los lisosomas. No obstante, muchas molculas se salvan especficamente de su destruccin y son recicladas desde los endosomas tempranos hacia la m em bra na plasmtica, m ediante vesculas de transporte. Como resultado de ello, slo se degradan las molculas endocitadas que no son recuperadas de los endosomas.

Figura 13-31 Relacin entre los endosomas tardos y otros compartimientos membranosos. (A) Clulas cultivadas de rin de hmster joven (BHK, de Baby Hmster Kidney) fueron incubadas en una solucin conteniendo la enzima peroxidasa, durante 15 minutos, lo cual es suficiente para que la peroxidasa sea captada por endocitosis de fase fluida y transportada hasta los endosomas tardos, pero no suficiente para que haya llegado a los lisosomas. Despus de que las clulas fuesen fijadas y expuestas a un substrato de la peroxidasa, el producto de la reaccin se hizo denso a los electrones mediante la fijacin con tetrxido de osmio. (B) Reconstrucciones seriadas de endosomas tardos [azul), ER (iamarillo), y complejo de Golgi {rojo) a partir de electronmicrografas, una de las cuales se muestra en (A). La reconstruccin fue dibujada a partir de 18 secciones ultrafinas seriadas. En (A) el ncleo se indica con una N y en (B) se muestra en verde. (A, de M. Marsh, G. Griffiths, G. Dean, I. Mellman y A. Helenius, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:2899-2903,1986; B, por cortesa de Mark Marsh.)

Determinadas protenas son recuperadas de los endosomas tem pranos y devueltas a la m em brana plasm tica 25
El compartimiento endosomal primario acta com o la principal estacin de cla sificacin en la ruta endoctica, tal com o lo hace la red del trans Golgi en la va biosinttica-secretora. En el am biente cido del endosoma temprano, muchos receptores internalizados cam bian su conform acin y liberan su ligando, como tam bin ocurre en los receptores M6P con sus hidrolasas lisosomales en los an ms cidos endosomas tardos. Normalmente, los ligandos endocitados que se disocian de sus receptores en el endosoma temprano estn predestinados a ser destruidos en los lisosomas, conjuntam ente con los otros contenidos del endo soma no unidos a membrana. No obstante, algunos otros ligandos endocitados permanecen unidos a sus receptores y comparten su destino. El destino de los receptores -y de algunos ligandos unidos a ellos- vara se gn el tipo de receptor de que se trate: (1) la mayora de ellos retornan al mismo dominio de la m em brana plasmtica de donde proceden; (2) algunos viajan has-

666

Captulo 13 : Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

Figura 13-32 Posibles destinos de los receptores transmembrana que han sido endocitados. Se muestran tres rutas que parten del compartimiento
endosomal en una clula epitelial. Los receptores que no son recuperados especficamente de los endosomas siguen la ruta desde el compartimiento endosomal hasta los lisosomas, donde son degradados. Los receptores recuperados pueden retornar tanto al mismo dominio de la membrana plasmtica del que partieron (reciclaje ) como a un dominio diferente de la m embrana plasmtica (transcitosis ). Si el ligando que es endocitado con su receptor sigue unido a l en el entorno cido del endosoma, seguir la misma ruta que el receptor; en caso contrario, ser descargado en los lisosomas.

1. reciclaje

m em b ra n a plasm tica apical v

endosoma temprano^ vesculas : de transporte^

3. transcitosis

u n io n / estrecha 2. degradacin lisosom a

ta los lisosomas, donde son degradados; y (3) otros retornan a un dominio dife rente de la m em brana plasmtica, mediando as un proceso llamado transcitosis (Figura 13-32). El receptor de LDL sigue la primera de estas rutas. Se disocia de su ligando LDL en el endosoma y es reciclado hacia la membrana plasmtica para su reutili zacin, mientras que la LDL descargada es transportada a los lisosomas (Figura 13-33). Un reciclaje similar a ste, aunque ms complejo, tiene lugar despus de la endocitosis de la transferrina, una protena que transporta hierro por la sangre. El receptor de la transferrina de la superficie celular descarga la transferrina, con el hierro unido, en los endosomas tempranos mediante un proceso de endocitosis mediada por receptor. El bajo pH del endosoma hace que la transferrina libere el hierro que transporta. La transferrina libre de hierro (llamada apotransferrina) permanece unida a su receptor y es reciclada a la membrana plasmtica como un complejo receptor-apotransferrina. Cuando retorna al pH neutro del fluido extracelular, la apotransferrina se disocia del receptor, por lo que puede volver a unir hierro y empezar de nuevo el ciclo. De esta forma, la transferrina acta como una lanzadera entre el fluido extracelular y el compartimiento endosomal, evitando entrar en contacto con los lisosomas y repartiendo el hierro que las clulas necesi tan para crecer. La segunda ruta que pueden seguir a partir de los endosomas los receptores endocitados es la que sigue el receptor que une al factor de crecimiento epidrmi co (EGF, de Epidemial Growth Factor), una pequea protena que estimula la di visin de las clulas de la epidermis y de otros tipos celulares. A diferencia de los receptores de LDL, estos receptores nicamente se acumulan en depresiones re vestidas despus de haber unido EGF. Adems, muchos de ellos no se reciclan

m em brana plasm tica basolateral

ncleo

Figura 13-33 Endocitosis de LDL mediada por receptor. Ntese que en

/ LDL

receptores de LDL

m em brana plasmtica

vescula revestida

/
endosoma tem prano

RETORNO DE LOS RECEPTORES DE LDL A LA MEMBRANA PLASMTICA

APARICION DE VESICULAS DE TRANSPORTE

enzimas hidrolticas

el am biente cido del endosoma, la LDL se disocia de su receptor. Despus de una serie de pasos (vase Figura 13-34), la LDL acaba en los lisosomas, donde se degrada y se libera en forma libre el colesterol que contena. El receptor proteico de LDL vuelve a la m embrana plasmtica va transporte de vesculas que, tal com o se muestra en la figura, brotan de la regin tubular del endosoma. Para simplificar el dibujo, se muestra un solo receptor de LDL que entra en la clula y que retorna a la membrana plasmtica. Est ocupado o no, tpicam ente cada receptor de LDL realiza un ciclo completo, hacia adentro y de nuevo hacia la m embrana de la clula, cada 10 minutos, dando un total de varios cientos de vueltas en su vida media de 20 horas.

Transporte desde la membrana plasmtica va endosomas: endocitosis

667

Figura 13-34 La va endoctica desde la membrana plasmtica a los lisosomas. El transporte desde los endosomas tempranos a los endosomas tardos tiene lugar mediante grandes vesculas d e transporte en d osom al, las cuales contienen una gran cantidad de membrana invaginada y por ello reciben el nom bre de cu erpos m ultivesiculares. No est claro si deben ser considerados com o endosomas de mediana edad que se desplazan hacia el interior celular a medida que maduran, o bien como unos compartimientos de transporte distintos. Su movimiento tiene lugar mediante microtbulos y puede ser experimentalmente bloqueado con drogas que los despolimericen. Finalmente, puede que los endosomas tardos se conviertan en lisosomas. Entre los endosomas tempranos y la superficie celular existen unas vesculas de transporte que reciclan material, mientras que otro tipo de vesculas hacen lo mismo entre los endosomas tardos y la red del trans Golgi.

membrana plasmtica

TRANSPORTE MEDIADO POR MICROTBULOS endosoma tardo

sino que acaban en los lisosomas, donde son degradados con el EGF. Por consi guiente, la unin de EGF conlleva un descenso en la concentracin de los recep tores de EGF en la superficie celular -u n proceso llamado regulacin por dismi nucin (down regulation). Como resultado de ello, la concentracin del ligando seal en el medio extracelular regula el nmero de molculas de receptor com plementario de la superficie de la clula diana (discutido en Captulo 15).

lisosoma

red del trans Golgi

La relacin entre endosomas tempranos y tardos es incierta 26

No est claro cm o se desplazan las molculas endocitadas de un comparti miento endosomal a otro y acaban en los lisosomas. Una hiptesis sera que los endosomas tempranos van desplazndose lentamente hacia el interior de la c lula y pasan a ser endosomas tardos; stos se convierten en lisosomas com o re sultado de su fusin con las vesculas que transportan hidrolasas desde la red del trans Golgi, de su continuo reciclaje de la membrana y de su incremento de la acidificacin. Otra hiptesis sera que los endosomas tempranos y tardos son dos compartimientos separados y que el transporte entre ellos tiene lugar a tra vs de un com partim iento intermediario de transporte -m ediante una red din mica de tbulos o mediante el desprendimiento de trozos del endosoma tem prano que son transportados al interior celular, donde se fusionan con los endosomas tardos (Figura 13-34). Los endosomas tempranos y tardos se dife rencian, en realidad, en su com posicin proteica: concretamente, estn asocia dos con diferentes protenas rab, las cuales son importantes para dirigir el trans porte vesicular, como veremos ms adelante (vase Tabla 13-1, pg. 689).

Las m acrom olculas pueden ser transferidas a travs de las lm inas de clulas epiteliales mediante transcitosis 27
Algunos receptores de la superficie de las clulas epiteliales polarizadas transfie ren macromolculas especficas desde un espacio extracelular a otro, mediante un proceso llamado transcitosis. Estos receptores siguen la tercera va descrita a partir de los endosomas (vase Figura 13-32). Las ratas recin nacidas, por ejem plo, obtienen anticuerpos de la leche materna (que les ayudan a protegerse de las infecciones) transportndolos a travs de su epitelio intestinal. El lumen del intestino es algo cido, y a este bajo pH los anticuerpos de la leche se unen a re ceptores especficos de la superficie apical (absortiva) de la clulas epiteliales del intestino y son internalizados va depresiones y vesculas revestidas de clatrina, y transferidos a los endosomas tempranos. Los complejos receptor-anticuerpo permanecen intactos en los endosomas y son recuperados en vesculas de trans porte que se fusionan con el dominio basolateral de la membrana plasmtica. Al ser expuestos al pH neutro del fluido extracelular, los anticuerpos se disocian de sus receptores y entran en el torrente circulatorio de los recin nacidos. En la madre, la secrecin de estos anticuerpos a la leche tambin tiene lugar por transcitosis, pero en direccin opuesta, desde la sangre hasta la leche. Otros ma

668

Captulo 13: Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

Figura 13-35 Dos compartimientos endosomales tempranos distintos en una clula epitelial. Los dominios
basolateral y apical de la m embrana plasmtica com unican con distintos com partimientos endosomales tempranos, a pesar de que las molculas endocitadas en ambos dominios que no tienen seales para su reciclaje o transcitosis se encuentran en un com partimiento endosomal tardo com n antes de ser digeridas en los lisosomas.

mferos, incluidos los humanos, tam bin transportan anticuerpos a la leche de esta manera, pero los anticuerpos permanecen en el intestino del recin nacido y no entran, como pasa en las ratas, en el torrente circulatorio. El hecho de que los diferentes receptores puedan seguir diferentes caminos a partir de los endosomas implica que, adems de un lugar de unin para el li gando y otro para la depresin revestida, muchos receptores tambin han de presentar seales de clasificacin que los guen desde el endosoma hasta la ves cula de transporte apropiada, y por lo tanto a la membrana adecuada de la clu la. Se desconoce todava la naturaleza de estas seales.

Las clulas epiteliales tienen dos com partim ientos endosomales tem pranos distintos pero un solo com partim iento endosomal tardo com n 28
En clulas epiteliales polarizadas, la endocitosis ocurre tanto en el dominio basolateral de la mem brana plasmtica como en el apical. El material endocitado en cada dominio entra primero en un compartimiento endosomal temprano que es nico en este dominio. Esto permite que los receptores endocitados sean reciclados a su dominio original de membrana, a menos que contengan seales que les obliguen a transitar al otro dominio. Las molculas endocitadas desde cada dominio que no son recuperadas en los endosomas tempranos son trans portadas a un compartimiento endosomal tardo comn, situado cerca del cen tro de la clula, y acaban siendo degradadas en los lisosomas (Figura 13-35).

Resumen
Las clulas ingieren macromolculas por endocitosis: determinadas regiones de la membrana plasmtica se invaginan y se desprenden formando vesculas endocticas; muchas de las partculas y molculas endocitadas acaban en los lisosomas, donde son degradadas. La endocitosis tiene lugar tanto constitutivamente como en respuesta a seales extracelulares. La endocitosis es tan frecuente en muchas clulas que una importante fraccin de la membrana plasmtica es internalizada cada hora. Los componentes de la membrana plasmtica (protenas y lpidos) son continuamente devueltos a la su perficie celular mediante un gran ciclo endoctico-exoctico mediado principal

Transporte desde la membrana plasmtica va endosomas: endocitosis

669

mente por depresiones y vesculas revestidas de clatrina. Muchos receptores de la superficie celular que se unen a macromolculas extracelulares especficas acaban localizndose en las depresiones revestidas de clatrina y, por lo tanto, son internali zados en vesculas recubiertas de clatrina -un proceso denominado endocitosis me diada por receptor. Las vesculas endocticas revestidas pierden rpidamente su cu bierta de clatrina y se fusionan con los endosomas tempranos. La mayora de Ugandos se separan de sus receptores en el ambiente cido de los endosomas y aca ban en los lisosomas, mientras que la mayora de receptores son reciclados a la su perficie celular mediante vesculas de transporte, y son reutilizados. Pero los comple jos receptor-ligando pueden seguir otras rutas desde el compartimiento endosomal En algunos casos tanto el receptor como el ligando acaban degradndose en los liso somas, dando lugar a la U regulaci6n por disminucin del receptor. En otros casos, ambos son transferidos a un dominio de la membrana plasmtica diferente y, por lo tanto, el ligando es liberado por exocitosis en una superficie de la clula diferente de la de origen -un proceso llamado transcitosis.

Transporte desde la red del t r a n s Golgi hasta la superficie celular: exocitosis29

Habiendo considerado el sistema digestivo interno de la clula y los diversos ti pos de trfico de mem branas que convergen en los lisosomas, ahora volveremos al com plejo de Golgi y examinaremos las rutas secretoras que conducen al exte rior celular. Normalmente, las vesculas de transporte destinadas a la membrana plasmtica abandonan el trans Golgi siguiendo un flujo constante. Las protenas de m em brana y los lpidos de estas vesculas aportan nuevos com ponente a la m em brana plasmtica celular, mientras que las protenas solubles de estas ves culas son secretadas al espacio extracelular. La fusin de las vesculas con la m em brana plasmtica se llama exocitosis. De esta forma, por ejemplo, las clu las producen y secretan la mayora de los proteoglucanos y glucoprotenas de la matriz extracelular, como se discute en el Captulo 19. Todas las clulas necesitan esta ruta de secrecin constitutiva. No obstante, las clulas especializadas en la secrecin disponen de una segunda ruta secreto ra en la que las protenas solubles y otras substancias se almacenan primero en vesculas de secrecin y son segregadas ms tarde. sta es la ruta de secrecin re gulada, que se encuentra principalmente en clulas especializadas en secretar rpidamente productos com o las hormonas, neurotransmisores o enzimas di gestivas, cuando es necesario (Figura 13-36). En esta seccin consideraremos el papel del com plejo de Golgi en estas dos rutas de secrecin y compararemos los mecanism os que intervienen en ambas.

"TV

CITOSOL PEROXISOMA PLASTIDOS

NUCLEO MITOCONDRIA

____________

RETICULO ENDOPLASMATICO

Parece que muchas protenas y lpidos son transportados autom ticam ente desde el ER y el com plejo de Golgi a la superficie celular 30
En una clula capaz de realizar secrecin regulada, antes de abandonar la red del trans Golgi se han de separar por lo m enos tres tipos de protenas: las desti nadas a los lisosomas (va endosomas tardos), las destinadas a las vesculas de secrecin y las destinadas a ser descargadas inmediatamente en la superficie ce lular. Ya hem os visto que las protenas destinadas a los lisosomas son seleccio nadas para su empaquetam iento en vesculas de transporte especficas (me diante la M6P en el caso de las hidrolasas lisosomales), y se cree que seales anlogas a stas dirigen las protenas empaquetadas al interior de las vesculas de secrecin. La mayora de las otras protenas son transportadas directamente a la superficie celular mediante una ruta por defecto no selectiva (las protenas que deben ser selectivamente dirigidas a un dominio de la superficie celular o a otro son excepciones) (Figura 13-37). As, se ha propuesto que en una clula no

670

Captulo 13: Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

protenas recin sintetizadas para su secrecin constitutiva

lpidos de m em brana plasm tica recin SECRECIN CONSTITUTIVA fusin de m em brana no regulada protenas de m em brana plasmtica recin sintetizadas CITOSOL red de trans transduccin de seal SECRECIN REGULADA fusin de vescula de secrecin m em brana que almacena protenas regulada de secreccin y otras substancias

m em b ra n a plasm tica

seal de tipo h o rm onal o de n eurotransm isor

com plejo de Golgi

polarizada, tal como las clulas de la serie blanca de la sangre o los fibroblastos, si las protenas del lumen del ER no son especficamente retenidas como resi dentes del ER o del complejo de Golgi o no son seleccionadas para las rutas que llevan a la secrecin regulada o a los lisosomas, sern automticamente trans portadas a travs del complejo de Golgi hasta la superficie celular mediante la va secretora constitutiva. Veremos que en clulas polarizadas, en las que se han de transferir diferentes productos a diferentes dominios de la superficie celular, las opciones son un poco ms complejas.

Figura 13-36 La ruta de secrecin regulada y constitutiva. Las dos rutas divergen en la red del trans Golgi. Muchas protenas solubles son segregadas continuamente de la clula a travs de la ruta de secrecin constitutiva (tambin llamada ruta por defecto), que acta en todas las clulas. Esta va tambin nutre a la membrana plasmtica con protenas y lpidos acabados de sintetizar. Las clulas especializadas en la secrecin tambin disponen de una ruta de secrecin regulada, mediante la cual determinadas protenas de la red del trans Golgi son conducidas en vesculas de secrecin, donde las protenas son empaquetadas y concentradas hasta que una seal extracelular estimula su secrecin. La secrecin regulada de pequeas molculas, como la histamina, tiene lugar de forma similar: estas molculas son activamente transportadas desde el citosol a vesculas de secrecin ya formadas. All, a menudo, se complejan con determinadas macromolculas (proteoglucanos en el caso de la histamina), de manera que pueden ser almacenadas en grandes cantidades sin producir una presin osmtica excesivamente elevada.

Las vesculas de secrecin emergen por gemacin desde la red del tran s Golgi31
Las clulas que estn especializadas en secretar rpidamente algunos de sus productos en respuesta a una seal concentran y almacenan estos productos en vesculas de secrecin (frecuentemente denominadas grnulos de secrecin o vesculas de ncleo denso porque se observan ncleos densos cuando se miran al microscopio electrnico). Las vesculas de secrecin se forman por gemacin de vesculas recubiertas de clatrina, a partir de la red del trans Golgi, y liberan su

mezcla de protenas

clasificacin DESVIO MEDIADO POR UNA SEAL HACIA LOS LISOSOMAS receptor de manosa 6-fosfato
SECRECIN C O N S TIT U T IV A

flujo hacia la superficie celular red del red del trans cis m edial Golgi trans com plejo de Golgi

mem brana plasmtica

DESVO M E D IA D O POR U N A SE AL HAC IA VESIC U LA S

DE SECRECIN {PARA LA SECRECIN REGULADA)

Figura 13-37 Los procesos de clasificacin de protenas en la red del trans Golgi mejor conocidos. Las protenas marcadas con maosa 6-fosfato son dirigidas hacia los lisosomas (va endosomas tardos) mediante vesculas de transporte recubiertas de clatrina (vase Figura 13-23). Las protenas cuyas seales les dirigen hacia vesculas de secrecin son concentradas en grandes vesculas recubiertas de clatrina, que rpidamente pierden su recubrimiento transformndose en vesculas de secrecin -un proceso que nicamente tiene lugar en clulas secretoras especializadas. Al parecer, en clulas no polarizadas, las protenas que no presentan caractersticas especiales son transportadas hacia la superficie celular por defecto a travs de la ruta de secrecin constitutiva. En clulas polarizadas, sin embargo, las protenas de secrecin y las de membrana plasmtica son dirigidas selectivamente hacia el dominio apical o hacia el dominio basolateral de la membrana plasmtica, de forma que al menos una de estas dos rutas ha de estar mediada por una seal, como veremos ms adelante.

Transporte desde la red del trans Golgi hasta la superficie celular: exocitosis

671

contenido al exterior celular en respuesta a una seal extracelular. El producto secretado puede ser tanto una molcula pequea (como la histamina) como una protena (como una hormona o una enzima digestiva). Las protenas destinadas a las vesculas de secrecin (a menudo denomina das protenas de secrecin ) son empaquetadas en vesculas adecuadas en la red del trans Golgi. En este caso, parece que el mecanismo implica la agregacin se lectiva de las protenas de secrecin. Estos agregados se pueden detectar al mi croscopio electrnico com o material electrodenso en el lumen de la red del trans Golgi. Se desconoce cul es la seal de clasificacin que dirige a las pro tenas de secrecin a estos agregados, pero se cree que es una zona seal que presentan muchas protenas de esta clase. Si un gen que codifica una protena de secrecin se transfiere a una clula secretora de otro tipo, que normalmente no fabrica esta protena, la protena extraa se empaqueta de manera apropiada en vesculas de secrecin. Tam poco se conoce cm o se segregan los agregados de las protenas de se crecin en las vesculas secretoras. Las vesculas de secrecin contienen prote nas de m em brana especiales, algunas de las cuales pueden actuar como recep tores uniendo el material agregado en la red del trans Golgi. No obstante, los agregados son demasiado grandes para que cada molcula de la protena secre tada pueda unirse a su propio receptor, como se propone para el transporte de enzimas lisosomales. La captura de los agregados en las vesculas de secrecin puede parecerse ms a la captacin de partculas por fagocitosis en la superficie celular, la cual tam bin puede estar mediada por membranas revestidas de clatrina. Despus de que las vesculas de secrecin inmaduras emerjan de la red del trans Golgi, su cubierta de clatrina es eliminada y su contenido se condensa an ms -h asta unas 200 veces respecto a su concentracin en el lumen del Golgi (Figura 13-38). La condensacin tiene lugar de repente y parece que es debida a la acidificacin del lumen de la vescula, inducida por una bomba de H+ impul sada por ATP de la m em brana de la vescula. Debido a que las vesculas maduras son tan densas, la clula secretora libera grandes cantidades de material por exocitosis en cuanto es necesario (Figura 13-39).

Figura 13-38 Form acin de vesculas de secrecin. Esta electronmicrografa

A menudo las protenas son procesadas proteolticam ente durante la form acin de las vesculas de secrecin 32
La condensacin no es el nico proceso por el que se ven afectadas las protenas de secrecin a medida que las vesculas de secrecin maduran. Muchas hormo nas polipeptdicas y neuropptidos, as como muchas enzimas hidrolticas secre tadas, se sintetizan como protenas precursoras inactivas, a partir de las cuales tienen que ser liberadas las molculas activas por proteolisis. Se cree que esta hi-

muestra algunas vesculas de secrecin formndose a partir de la red del trans Golgi en una clula P del pncreas secretora de insulina. Para localizar las molculas de clatrina se ha utilizado un anticuerpo conjugado con esferas de oro coloidal (puntos negros). Las vesculas de secrecin inmaduras (.cabezas de flecha negras), que contienen la protena precursora de la insulina (proinsulina), se hallan revestidas de clatrina. En cuanto la vescula se ha formado, este recubrimiento de clatrina es rpidamente eliminado, ya que no se encuentra en las vesculas de secrecin maduras, las cuales tienen un ncleo muy denso (cabezas de flecha vacas). (Por cortesa de Lelio Orci.)

Figura 13-39 Exocitosis de vesculas de secrecin. La electronmicrografa

muestra la liberacin de insulina desde una vescula de secrecin de una clula | 3pancretica. (Por cortesa de Lelio Orci, de L. Orci, J-D. Vassali, y A. Perrelet, Sci.Am. 256: 85-94,1988.)

I______l 0,2 |jm

672

Captulo 13 : Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

pro-opiocortina H2N pptido seal corticotropina | (ACTH) ot-MSH y-lipotropina COOH

I
(J-lipotropina

I
p-MSH (3-endorfina

drlisis empieza en la red del trans Golgi, y contina en las vesculas de secrecin y a veces en el fluido extracelular despus de que haya ocurrido la secrecin. Mu chos polipptidos secretados tienen, por ejemplo, una prosecuencia amino termi nal que es eliminada justo antes de la secrecin, formndose la protena madura. Estas protenas se sintetizan, pues, como preproprotenas, en las que la presecuencia consiste en el pptido seal del ER que se elimina en el ER rugoso. En otros casos las molculas peptdicas seal se sintetizan como poliprotenas que contienen mltiples copias de una misma secuencia aminoacdica. En casos an ms complejos una variedad de molculas peptdicas seal son sintetizadas como partes de una nica poliprotena que es la precursora de los mltiples pro ductos finales, los cuales son cortados individualmente a partir de la cadena polipeptdica inicial; la misma poliprotena puede ser procesada de formas diferentes produciendo diferentes pptidos en diferentes tipos celulares (Figura 13-40). Por qu es tan comn el procesamiento proteoltico en la ruta de secrecin? Algunos de los pptidos producidos as, como las encefalinas (neuropptidos de cinco aminocidos con una actividad parecida a la morfina), son demasiado cor tos en sus formas maduras para ser cotransportados hacia el lumen del ER o para poder tener las seales necesarias para empaquetarse en las vesculas secretoras. En el caso de las enzimas hidrolticas secretadas, o de cualquier protena cuya ac tividad pueda ser peligrosa en el interior de la clula, el retraso en la activacin por rotura hasta que la protena llega a una vescula de secrecin o hasta que ha sido secretada, proporciona una clara ventaja en la prevencin de que acte pre maturamente dentro de la clula en la que ha sido sintetizada.

Figura 13-40 Rutas alternativas de procesamiento de la prohormona pro-opiocortina. Los cortes iniciales son realizados por proteasas unidas a la membrana que cortan cerca de pares de residuos aminocidos cargados positivamente (Lys-Arg, LysLys, Arg-Lys, o Arg-Arg). Mediante reacciones accesorias se obtienen los productos de secrecin finales. Diferentes tipos celulares tienen diferentes tipos de enzimas, de manera que el mismo precursor prohormonal puede ser usado para producir diferentes hormonas peptdicas. Por ejemplo, en el lbulo anterior de la hipfisis a partir de la pro-opiocortina slo se producen la corticitropina (ACTH) y la P-lipotropina, mientras que en el lbulo intermedio se producen principalmente a-MSH, y-lipotropina, P-MSH y P-endorfina.

Las vesculas de secrecin perm anecen cerca de la m em brana plasm tica hasta que una seal les hace liberar su contenido 33
Una vez cargada, una vescula secretora tiene que ir al lugar de secrecin, don de debe esperar hasta que la clula reciba la seal de secrecin. En algunas c lulas el lugar de secrecin est lejos del complejo de Golgi. Las clulas nerviosas proporcionan el ejemplo ms extremo. Las protenas de secrecin, como los neurotransmisores peptdicos que deben ser liberados al final del axn, son sin tetizadas y empaquetadas en vesculas del cuerpo celular, donde se sitan los ribosomas, el ER y el complejo de Golgi. Entonces deben viajar a lo largo del axn hasta alcanzar el terminal axnico -u n a distancia muy corta o de ms de un m e tro. Como se vio en el Captulo 16, las vesculas utilizan protenas motoras uni das a su superficie para propulsarse a lo largo de los microtbulos axonales, la orientacin de los cuales gua este trfico a lo largo del axn en la direccin apropiada. En las clulas epiteliales polarizadas los microtbulos pueden tener un papel similar dirigiendo las vesculas de secrecin hacia la superficie que co rresponda. La ltima etapa de la ruta secretora regulada es la liberacin del producto por exocitosis. La seal de secrecin es a menudo un mensajero qumico, como una hormona, que se une a los receptores de la superficie celular. La activacin de estos receptores genera seales intracelulares, que incluyen a menudo un in cremento transitorio de la concentracin de Ca2+ libre en el citosol. En el caso de un axn nervioso, la seal de exocitosis normalmente es una excitacin elctrica Transporte desde la red del trans Golgi hasta la superfcie celular: exocitosis

673

Figura 13-41 Electronmicrograffas que m uestran el proceso de exocitosis en clulas cebadas de rata. La clula

!______ r

5 uni

-u n potencial de accin - que se ha producido por la unin de un transmisor qumico a los receptores de la superficie celular. El potencial de accin provoca una entrada de Ca2 + en el terminal axnico a travs de canales de Ca2+ depen dientes de voltaje. Mediante un mecanism o desconocido, la repentina entrada de Ca2+ , o algn otro tipo de seal intracelular en la clula secretora, dispara la exocitosis, provocando que las vesculas de secrecin se fusionen con la m em brana plasmtica y liberen su contenido al espacio extracelular.

La exocitosis regulada es una respuesta localizada de la m em brana plasm tica y del citoplasm a subyacente 34
La histamina es una pequea molcula segregada por las clulas cebadas, m e diante la ruta regulada, com o respuesta a ligandos especficos que se unen a los receptores de su superficie. La histamina es la responsable de muchos sntomas desagradables, tales com o el prurito o los estornudos, que acompaan a las re acciones alrgicas. Si se incuban clulas cebadas en un medio que contenga un estimulante soluble, se observa que la exocitosis se produce por toda la superfi cie celular (Figura 13-41). Sin embargo, sta no es una respuesta generalizada de toda la clula, ya que si el ligando estimulador est artificialmente fijado a una superficie slida de modo que slo puede interaccionar con una regin localiza da de la superficie de la clula cebada, la exocitosis queda restringida a la regin en la que la clula entra en contacto con el ligando (Figura 13-42). Claramente, distintos segmentos de la m em brana plasmtica pueden actuar con indepen dencia del resto de la membrana. Como resultado de ello, la clula cebada, a di ferencia de una clula nerviosa, no responde como un todo cuando est estimu lada; la activacin de los receptores, las seales intracelulares resultantes y la exocitosis posterior estn localizadas en la regin particular de la clula que ha sido excitada.

de (A) no ha sido estimulada. La clula de (B) ha sido activada, por un ligando extracelular soluble, para segregar la histamina que tena almacenada. Las vesculas que contienen histamina aparecen oscuras, mientras que las que la han liberado son claras. El material que queda en las vesculas vacas consiste en una red de proteoglucanos a la que normalmente se halla unida la histamina almacenada. Cuando la vescula secretora se ha fusionado con la membrana plasmtica, la membrana de la vescula secretora acta normalmente como diana a la cual se unen otras vesculas de secrecin. As, la clula de (B) presenta grandes cavidades delimitadas por las membranas fusionadas de muchas vesculas secretoras vacas, que ahora se hallan en continuidad con la membrana plasmtica. Esta continuidad no siempre es patente en el plano del corte realizado a travs de la clula. (De D. Lawson, C. Fewtrell, B. Gomperts y M. Raff. /. Exp. Med. 142:391-402,1975, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

ncteo

Los com ponentes de la m em brana de las vesculas de secrecin se reciclan 35

Cuando una vescula secretora se fusiona con la membrana plasmtica, su con tenido se descarga desde la clula por exocitosis y su membrana pasa a formar
Figura 13-42 La exocitosis como una respuesta localizada.

Electronmicrografia de una clula cebada que ha sido estimulada para segregar histamina por un estimulante acoplado a una amplia esfera slida. La exocitosis se ha producido nicamente en la regin de la clula que se halla en contacto con esta superficie. (De D. Lawson, C. Fewtrell y M. Raff. / . Celi. Biol. 79:394-400, 1978, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

superficie

regin de exocitosis

674

Captulo 13: Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

parte de la membrana plasmtica. Este hecho podra incrementar notablemente el rea de la superficie de la membrana plasmtica, pero slo ocurre de forma transitoria ya que constantem ente son eliminados de la superficie celular com ponentes de membrana mediante endocitosis, y este proceso es por lo menos tan rpido com o lo ha sido el de adicin de com ponentes por exocitosis. Esta eliminacin devuelve las protenas de la membrana de la vescula secretora a la red del trans Golgi (probablemente va endosomas), donde pueden ser utiliza das de nuevo. Este reciclaje mantiene un estado estacionario de distribucin de com ponentes de membrana entre los diversos compartimientos celulares. La cantidad de membrana vesicular que se aade temporalmente a la membrana plasmtica puede ser enorme: cuando una clula acinar del pncreas es estimu lada para secretar sus enzimas digestivas, en la membrana plasmtica apical (cuya rea es de slo 30 jim 2) se insertan aproximadamente 900 (im 2 de m em brana vesicular.

Las vesculas sinpticas se forman a partir de los endosomas 36

Las clulas nerviosas (y algunas clulas endocrinas) tienen dos tipos de vesculas secretoras. Como acabamos de ver, estas clulas empaquetan protenas y pptidos en vesculas de secrecin de contenido denso por la ruta tpica, y son libera das mediante la ruta de secrecin regulada. No obstante, estas clulas utilizan adems otra clase especializada de pequeas vesculas de secrecin (-50 nm de dimetro) que se forman de manera diferente. Estas vesculas sinpticas alm a cenan neurotransmisores pequeos, como la acetilcolina, el glutamato y el ci do Y-aminobutrico (GABA), que se usan en las sinapsis qumicas para que dos clulas se comuniquen rpidamente (y, en algunos tejidos endocrinos, en com u nicaciones locales). Cuando un potencial de accin llega al terminal nervioso, las vesculas liberan su contenido en una fraccin de un milisegundo -algunas neuronas disparan ms de 1000 veces por segundo- liberando vesculas sinpti cas cada vez. Esto precisa un rpido relleno de las vesculas, que al parecer no se generan a partir de la membrana del Golgi, sino mediante reciclaje local de la membrana plasmtica, como se indica a continuacin. Se supone que los com ponentes de la membrana de las vesculas sinpticas son descargados inicial mente a la membrana plasmtica mediante la ruta de secrecin constitutiva y entonces son recuperados por endocitosis y transferidos a los endosomas, desde los cuales se agrupan y surgen por gemacin para formar las vesculas sinpti cas. Los com ponentes de la membrana de las vesculas incluyen transportadores especializados en la captacin de neurotransmisores del citosol, donde son sin tetizados. Una vez llenas con el neurotransmisor, las vesculas vuelven a la membrana plasmtica, donde esperan hasta que la clula es estimulada. Des pus de que liberen su contenido, los com ponentes de su membrana son recu perados de la misma manera y reutilizados otra vez (Figura 13-43). Se puede ob servar el ciclo completo, desde la endocitosis hasta la exocitosis, aadiendo un marcador, como la peroxidasa, al medio externo y siguiendo su paso a los endo somas y su vuelta a la superficie celular en vesculas sinpticas.

Las clulas polarizadas dirigen las protenas desde la red del trans Golgi hasta el dominio apropiado de la membrana plasmtica 37
La mayora de las clulas de los tejidos estn polarizadas y tienen dos (y a veces ms) dominios de mem brana diferentes hacia los cuales van dirigidos diferen tes tipos de vesculas secretoras. Aparece, pues, el problema general de cmo se organiza la salida del complejo de Golgi para que se mantengan las diferencias entre un dominio membranoso y otro. Una clula epitelial tpica, por ejemplo, tiene un dominio apical, que da al lumen y que a menudo tiene estructuras es pecializadas como los cilios o los microvilli, y un dominio basolateral, que com prende el resto de la clula. Los dos dominios estn separados por un anillo de uniones estrechas o estancas (vase Figura 23-35). Estas uniones especializadas Transporte desde la red del trans Golgi hasta la superficie celular: exocitosis

675

 LIB E R A C I N DE LOS COMPONENTES DE LA VESCULA SINPTICA EN LA MEMBRANA PLASMTICA EN D O C ITO S IS DE LOS COMPONENTES DE LA VESCULA SINPTICA Y LIBERACIN EN EL ENDOSOMA G E M A C I N DE LA VESCULA SINPTICA DESDE EL ENDOSOMA C A R G A DEL NEUROTRANSMISOR A LA VESCULA SINPTICA SEC R EC I N DEL NEUROTRANSMISOR POR EXOCITOSIS EN RESPUESTA A LA ACTIVACIN CELULAR

entre clulas (discutidas en el Captulo 19) impiden que las protenas, y los lpidos en la hem im em brana exterior, se desplacen entre las regiones apical y basolateral, de m anera que no slo la com posicin proteica sino tambin la lipdica de los dos dominios de m em brana son diferentes. Concretamente, la regin de la m em brana apical est muy enriquecida en glucolpidos, los cuales se piensa que protegen a esta superficie del dao que puedan producir, por ejemplo, las enzimas digestivas y el bajo pH que se encuentra en lugares como el lumen del intestino. Las protenas de la m em brana plasmtica que estn unidas a la bicapa lipdica mediante un glucosilfosfatidilinositol (GPI) tambin se encuentran ex clusivamente en la m em brana plasmtica apical. Si a una protena que normal mente es transferida a la superficie basolateral se le aade, mediante manipula cin gentica, una secuencia de unin a un GPI, se observa que la protena es descargada en la superficie apical. Las protenas unidas a GPI parecen asociarse con glucolpidos y pueden ser transportadas a la misma regin de la superficie celular como resultado de esta asociacin. Sin embargo, se desconoce cmo tie ne lugar esta seleccin. En principio, las diferencias entre los dominios de la membrana plasmtica no son las que determinan la descarga de los componentes de la mem brana apropiados. Lo que ocurrira sera que los com ponentes de la mem brana po dran ser descargados en cualquier punto de la superficie celular y entonces ser estabilizados selectivamente en algunas posiciones y eliminados selectivamente en otras. Esta estrategia de descarga al azar y retencin o eliminacin selectiva parece.que funciona en determinados casos; no obstante, hay ejemplos muy claros donde la transferencia est dirigida especficamente. As, a menudo, las clulas epiteliales secretan una serie de productos en su superficie apical -com o las enzimas digestivas o el moco, en el caso de las clulas que se encuentran en el intestino- y otra serie de productos en la superficie basolateral -com o la laminina y otros com ponentes de la lmina basal. Este tipo de clulas deben tener m ecanism os para dirigir las vesculas que llevan cargas distintas, rodeadas de distintos tipos de membranas, a diferentes dominios de la membrana plasmti ca. Examinando clulas polarizadas en cultivo, se ha visto cmo las protenas que salen del ER destinadas a los diferentes dominios viajan juntas hasta que lle gan a la red del trans Golgi. All son separadas y enviadas mediante vesculas de secrecin o de transporte al dominio de la mem brana plasmtica apropiado. En algunos casos las protenas basolaterales y las apicales tienen distintas seales de clasificacin que las dirigen al dominio correspondiente -o directamente o

Figura 13-43 La form acin de vesculas sinpticas. Estas vesculas

diminutas y uniformes se encuentran slo en clulas nerviosas y en algunas clulas endocrinas, donde almacenan y secretan pequeos neurotransmisores.

676

Captulo 13: Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

vescula de transporte basolateral

vescula de transporte apical unin estrecha

endosoma tem prano basolateral

Figura 13-44 Clasificacin de las protenas de la m em brana plasmtica en una clula epitelial polarizada. Las

% y *)

protenas recin sintetizadas pueden alcanzar su dominio de la membrana plasmtica apropiado mediante una va directa (A) o indirecta (B). En la va indirecta una protena es recuperada del dominio de la membrana plasmtica inapropiado por endocitosis y luego transportada al dominio correcto va endosomas tempranos -es decir, por transcitosis.

(A) CLASIFICACIN DIRECTA DE LAS PROTENAS DE MEMBRANA EN LA RED DEL TRANS GOLGI

(B) CLASIFICACIN INDIRECTA VA ENDOSOMAS

term inales

indirectamente va endosomas (Figura 13-44); en otros casos slo las protenas destinadas a uno de los dos dominios membranosos tienen una seal de clasifi cacin, mientras que el otro dominio no requiere de ninguna seal (y es alcan zado por una ruta por defecto). Una clula nerviosa es un ejemplo lmite de clula polarizada: la membrana plasmtica de su terminal axnico est especializada en enviar seales a otras clulas, y la mem brana plasmtica de su soma celular y dendritas est especiali zada en recibir seales de otras clulas nerviosas. Estos dos tipos de dominios de la m em brana plasmtica no son slo funcionalmente distintos sino que tambin tienen una composicin proteica distinta. Estudios del trfico de protenas en clulas nerviosas en cultivo indican que, en lo que respecta a transporte vesicu lar desde la red del trans Golgi a la superficie celular, la mem brana plasmtica del soma celular nervioso y de las dendritas es equivalente a la membrana baso lateral de una clula epitelial polarizada, mientras que la membrana plasmtica del axn y de los terminales nerviosos es equivalente a la mem brana apical de la misma clula (Figura 13-45). As, una protena que est destinada a un dominio especfico en una clula epitelial, tambin lo est, y en el dominio equivalente, en una clula nerviosa.

m em brana plasmtica apical

celular ncleo

plasmtica basolateral dendritas clulas epiteliales clula nerviosa

Resumen
Las protenas pueden ser secretadas de una clula por exocitosis a travs de una ruta regulada o constitutiva. En las rutas reguladas las molculas son almacena das en vesculas de secrecin o en vesculas sinpticas, las cuales no se fusionan con la membrana plasmtica liberando su contenido, hasta que se recibe una seal extracelular. Este empaquetamiento dentro de estas vesculas, que tiene lugar en la red del trans Golgi, es precedido por una condensacin selectiva de las protenas. Las vesculas sinpticas son propias de las clulas nerviosas y de algunas clulas endocrinas; se forman a partir de los endosomas y son responsables de la secrecin regulada de pequeos neurotransmisores. Mientras que las rutas reguladas slo actan en clulas secretoras especializadas, en todas las clulas existe una ruta de secrecin constitutiva: hay un transporte vesicular continuo desde la red del trans Golgi a la membrana plasmtica.
Transporte desde la red del trans Golgi hasta la superficie celular: exocitosis

Figura 13-45 Com paracin entre dos tipos de clulas polarizadas. Teniendo

slo en cuenta los mecanismos utilizados para dirigir las protenas hacia los diferentes dominios de una clula, la membrana plasmtica del soma celular nervioso y las dendritas parecen ser equivalentes al dominio basolateral de una clula epitelial polarizada, mientras que la membrana plasmtica de una axn y los terminales nerviosos actuaran como el dominio apical de una clula epitelial.

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Las protenas fabricadas en el ER son automticamente transferidas a la red del trans Golgi y despus a la membrana plasmtica a travs de la ruta constituti va, por defecto, a menos que sean captadas en otras rutas o retenidas por seales de clasificacin especficas. No obstante, en las clulas polarizadas las rutas de trans porte desde la red del trans Golgi a la membrana plasmtica presentan un control selectivo asegurando que diferentes tipos de protenas de membrana y lpidos sean transferidos a los dominios de la membrana plasmtica apropiados.

Mecanismos moleculares del transporte vesicular y mantenimiento de la diversidad de compartimientos38

Ahora vamos a tratar la cuestin ms importante del trfico vesicular. Hemos visto que la clula contiene 10 o ms compartimientos, limitados por membrana, qu micamente distintos y que el transporte vesicular media un intercambio continuo de componentes entre ellos (vase Figura 13-3). En presencia de este intercambio masivo, cmo mantiene su carcter especializado cada compartimiento? Para contestar a esta pregunta primero hay que considerar qu es lo que de fine el carcter de un compartimiento. Por encim a de todo, parece que es la na turaleza de la membrana que lo delimita: los marcadores expuestos en la super ficie citoslica de la mem brana guan la direccin de las vesculas, asegurando que slo se fusionen con el compartimiento adecuado, dictando por lo tanto el patrn del trfico entre un compartimiento y otro. Una vez determinada la presencia de distintos marcadores para cada com partimiento, el problema radica en explicar cmo se mantienen componentes especficos de m em brana a una concentracin elevada en un compartimiento y baja en otro. La respuesta depende, fundamentalmente, del mecanismo de for m acin de las vesculas de transporte y de fusin, por el cual zonas de la m em brana, enriquecidas o no de com ponentes especficos, son transferidas de un compartimiento a otro. Ya hemos visto cm o la generacin de una vescula de transporte conlleva el ensam blaje de una cubierta especial en la cara citoslica de la membrana que genera la vescula. Estas cubierta actan como un dispositivo que chupa la m em brana rica en ciertas protenas y pobre en otras hacia afuera del comparti miento, de forma que las protenas pueden ser transportadas de forma especfi ca a otro compartimiento. Consideraremos cmo se forman estas cubiertas y de qu estn compuestas. Tambin comentarem os cmo llegan las protenas a la m em brana diana correcta y cmo se fusionan entonces descargando su conteni do en el rgano correspondiente. Veremos cmo una combinacin de gentica y bioqum ica ha descubierto una variedad de protenas de unin a GTP que ayu dan a controlar el transporte vesicular. Acoplando la hidrlisis de GTP a otros procesos catalticos, ayudan a controlar la direccin del transporte vesicular uniendo la liberacin y la fusin de vesculas al gasto de energa libre, y garanti zan su fidelidad velando por la precisin con la que la vescula de transporte re conoce su m em brana diana especfica. Las estrategias genticas y bioqumicas bsicas que se han utilizado para estudiar la maquinaria molecular implicada en el transporte vesicular estn perfiladas en el Panel 13-1, pginas 682-683. De todos modos, antes de com entar los detalles de la maquinaria, es til tra tar el problema desde su base, estudiando los principios bsicos generales que se deben aplicar a cualquier proceso de transporte vesicular unidireccional.

CITOSOL NUCLEO MITOCONDRIA

.SZ.

PEROXISOMA PLASTIDOS

RETICULO ENDOPLASMATICO

LISOSOMA

--------------

ENDOSOMA

GOLGI

VESICULAS SECRETORAS

SUPERFICIE CELULAR

El m antenim iento de las diferencias entre compartimientos requiere un aporte de energa libre 38
Supongamos que tenem os dos compartimientos, delimitados por membrana, conectados por vesculas de transporte que circulan de uno a otro, y que la dife rencia entre ambos compartimientos radica slo en la concentracin de un ni-

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Captulo 13 : Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

com partim iento A

lanzadera de vesculas de transporte

com partim iento B

ir

Figura 13-46 La energa qumica es utilizada para conseguir que en el transporte vesicular sea unidireccional. En este ejemplo

-proteina P

lA D P j

flujo unidireccional de la proteina P

na

co tipo P de protena unida a membrana. Si el sistema se deja que tienda al equi librio, a travs del trfico de vesculas de transporte entre los compartimientos las concentraciones de P se equilibraran y la diferencia entre compartimientos desaparecera. La diferencia puede ser mantenida utilizando energa libre para transferir activamente molculas de P en una direccin, en contra de su gradien te de concentracin. La protena P podra ser secuestrada en la membrana formadora de vesculas de transporte del compartimiento en el cual est a baja concentracin, por ejemplo, y mantenerse fuera de las vesculas en formacin de los compartimientos en los que est en concentracin elevada. Esto sera po sible gracias a un cambio de conformacin de la protena conducido directa o indirectamente por la hidrlisis de ATP o GTP en la membrana generadora de vesculas por gemacin (Figura 13-46). Aunque este ejemplo es mucho ms sim ple que cualquier sistema conocido usado por las clulas, ilustrar por qu tiene que haber un aporte de energa libre que medie el transporte direccional selecti vo de vesculas de transporte, entre compartimientos rodeados de membrana. El transporte direccional selectivo es de una importancia central en la orga nizacin de la clula eucariota. Empezaremos nuestra discusin de los m ecanis mos moleculares que le sirven de base considerando cmo se forman las vescu las de transporte.

Existe ms de un tipo de vesculas revestidas39

La mayora de vesculas de transporte se forman a partir de regiones revestidas especializadas de la membrana, por lo que generan vesculas revestidas de una red de protenas distintas de las que recubren la superficie citoslica. Antes de que la vescula se fusione con la membrana receptora, este recubrimiento ha de eliminarse para permitir que las dos membranas interaccionen directamente. Existen dos tipos de vesculas revestidas bien caracterizadas -las revestidas de clatrina y las revestidas de coatmero (de coat, cubierta) (Figura 13-47). Las

hipottico, la protena P es una bomba de H+dependiente de ATP. La concentracin de protones en el compartimiento A es baja y alta en el compartimiento B. Debido a la alta concentracin de P en el compartimiento B, el lumen de este orgnulo poseer un pH mucho menor que el compartimiento A. Si P sufre un cambio de conformacin dependiente de pH que le permita entrar en las vesculas que se forman a partir del compartimiento A (pH elevado) pero que a su vez le impide entrar en las vesculas que se producen a partir del compartimiento B (pH bajo), el flujo de P es unidireccional. Mientras se mantenga la diferencia de pH entre ambos compartimientos debido a la utilizacin continua de energa libre en forma de hidrlisis de ATP para mantener la bomba de H+ , se conservar el gradiente de concentracin de P entre los dos compartimientos. Como comentamos en el Captulo 12, la mayora de las membranas nunca se crean de novo sino que crecen por expansin de membrana ya existente. Por lo tanto, aunque este modelo simple no explica cmo se form inicialmente el gradiente de P entre los compartimientos, proporciona un ejemplo de cmo la clula puede utilizar energa para mantener el carcter de sus compartimientos.

Figura 13-47 Com paracin entre las vesculas revestidas de clatrina y las revestidas de coatm ero. (A)

Electronmicrografa de vesculas revestidas de clatrina. (B) Electronmicrografa de cisternas del Golgi de un sistema libre de clulas en el cual aparecen por gemacin vesculas revestidas de coatmero en el tubo de ensayo. Obsrvese cmo las vesculas revestidas de clatrina tienen una estructura regular ms obvia. (Cortesa de Lelio Orci, de L. Orci, B. GlickyJ. Rothman, Cell46:171-184, 1986 Cell Press.)

Mecanismos moleculares del transporte vesicular y mantenimiento de la diversidad de compartimientos

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Figura 13-48 Caveolas en la m em brana plasm tica de un fibroblasto hum ano.

(A)

(A) Electronmicrografa de fibroblastos en seccin transversal mostrando las caveolas como indentaciones profundas de la membrana plasmtica. (B) Electronmicrografa de gravado por congelacin que muestra numerosas caveolas en la cara citoplasmtica de la membrana plasmtica. Su cubierta parece que est constituida por hebras distribuidas concntricamente, que contienen la protena caveolina. Obsrvese que las caveolas difieren en tamao y estructura de las depresiones revestidas de clatrina, una de las cuales se observa en la parte superior derecha de (B). (Cortesa de R.G.W. Anderson, de K.G. Rothberg et al., Celi 68:673-682,1992. Celi Press.)

vesculas revestidas de clatrina, como hemos visto anteriormente, median el transporte selectivo de los receptores transmembrana, como el receptor M 6P desde la red del trans Golgi, o el receptor de LDL desde la membrana plasmtica, ambos con cualquier m olcula soluble que se haya unido a ellos, quedando atra pada en el lumen de la vescula. Las vesculas revestidas de coatmero, por el contrario, median el transporte vesicular no selectivo desde el ER y las cisternas del Golgi. Puede haber un tercer tipo de vescula revestida. La membrana plasmtica de la mayora de clulas presenta invaginaciones morfolgica y bioqum icam en te diferenciadas, denominadas caveolas (Figura 13-48); aunque su funcin es in cierta, una posibilidad sera que estas caveolas generaran vesculas revestidas de caveolina. Si esto es as, no est claro qu transportaran estas vesculas ni cul sera su destino, y por ahora no se pude decir nada ms de ellas. Parece que las vesculas revestidas median la transferencia direccional de ti pos especficos de membrana. Normalmente esta transferencia est equilibrada por un flujo de m em brana en direccin opuesta, tanto en forma de vesculas de tipos no tan caracterizados, como por medio de sacos alargados o tbulos de m em brana que avanzan a lo largo de los microtbulos (vase Figura 13-9).

El ensam blaje del revestimiento de clatrina conduce a la form acin de la vescula 4 0

__________ i i 0.2 jim

El principal com ponente proteico de las vesculas recubiertas de clatrina es la Figura 13-49 Depresiones propia clatrina, un com plejo proteico altamente conservado a lo largo de la evo revestidas de clatrina y vesculas. Esta electronmicrografa por grabado por lucin. Consiste en tres cadenas polipeptdicas grandes y tres pequeas que ju n congelacin muestra numerosas tas forman una estructura de tres patas denominada trisquelion. Los trisquelions depresiones revestidas de clatrina y de clatrina se unen dando lugar a un esqueleto en forma de cesto convexo for vesculas en la superficie interior de la mado por hexgonos y pentgonos, generando depresiones revestidas en la cara membrana plasmtica de fibroblastos citoplasm tica de las m embranas (Figura 13-49). Bajo condiciones adecuadas en en cultivo. Las clulas se congelan el tubo de ensayo, los trisquelions aislados se reasocian espontneamente for rpidamente en helio lquido, se mando agregados tpicam ente polidricos, incluso en ausencia de las vesculas fracturan y se graban por congelacin de mem brana que estos cestos normalmente incluyen (Figura 13-50). para exponer la superficie de la Se cree que la form acin de una yema revestida de clatrina se produce por membrana plasmtica. (De J.Heuser, fuerzas generadas por el ensam blaje de las protenas de la cubierta sobre la su / . CellBiol. 84:560-683,1980, con perficie citoslica de la m em brana (Figura 13-51). No se conoce qu inicia el permiso de copyright de The proceso de unin a una regin particular de la m embrana ni cmo se libera la Rockefeller University Press.)

680

Captulo 13 : Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

 * :i-'. .* :

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cadena pesada

^ S JF M :

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(A) 50 nm (B) (C) 50 nm

Figura 13-50 Estructura de la cubierta de clatrina. (A) Electronmicrografa de trisquelions de clatrina sombreados con platino. Aunque no puede observarse en las micrografas, cada trisquelion est compuesto por 3 cadenas pesadas y 3 cadenas ligeras de clatrina. (B) Dibujo esquemtico de la distribucin probable de los trisquelions en la superficie de las vesculas revestidas de clatrina. Se muestran dos trisquelions, las cadenas pesadas de uno se han dibujado en rojo y las del otro en gris; las cadenas ligeras de ambos se presentan en amarillo. La distribucin superpuesta del los brazos flexibles del trisquelion proporciona fuerza mecnica y flexibilidad. Obsrvese que el final de cada brazo del trisquelion se dobla hacia dentro, por lo que su dominio amino terminal forma una cubierta intermedia. (C) Reconstruccin tridimensional de la cubierta de clatrina compuesta por 36 trisquelions organizados en una red de 12 pentgonos y 6 hexgonos. La cubierta poligonal exterior, en rojo, representa las patas superpuestas de los trisquelions de clatrina; la cubierta intermedia, en verde, est formada por los dominios amino terminales de los trisquelions; y la cubierta interior, en azul, representa las protenas adaptadoras que comentaremos ms adelante. Aunque la cubierta mostrada es demasiado pequea para incluir una vescula de membrana, los revestimientos de clatrina de las vesculas estn construidos de forma similar a sta, a partir de 12 pentgonos y un nmero superior de hexgonos. (A, de E. Ungewickell y D. Branton, Nature 289:420-422,1981, 1981 Macmillan Journals Ltd.; B, de I.S.Nathke et al., Cell 68:899-910,1992. Cell Press; C, de G.P.A. Vigers, R.A. Crowther y B.M.F. Pearse, EMBOJ. 5:2079-2085,1986.)

subunidades de cubierta

vesculas de transporte com pletas

mem brana

regin de la m em brana recubierta

DESENSAMBLAJE DE LA CUBIERTA

lum en del orgnulo

ENSAMBLAJE DE LA CUBIERTA

FORMACIN DE LA YEMA

FORMACIN DE LA VESCULA

Figura 13-51 Ensamblaje y desensamblaje de la cubierta de clatrina. Parece que el ensamblaje de la cubierta de clatrina induce una curvatura en la membrana que conduce a la formacin de yemas revestidas de tamao uniforme. El desprendimiento de la yema formando una vescula supone el proceso ms complejo de fusin de membrana, que comentaremos ms adelante. Aunque las cubiertas estn constituidas por muchos componentes proteicos, en este esquema simplificado slo se muestra la clatrina. El revestimiento de las vesculas recubiertas de clatrina se elimina inmediatamente despus de la formacin de la vescula, mientras que, como veremos ms adelante, la cubierta de coatmero se elimina despus de que las vesculas entren en contacto con su membrana diana.

Mecanismos moleculares del transporte vesicular y mantenimiento de la diversidad de compartimientos

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SISTEMAS LIBRES DE CLULAS PARA EL ESTUDIO DE LOS COMPONENTES Y DEL MECANISMO DEL TRANSPORTE VESICULAR
El tr a n s p o r t e v e s ic u la r p u e d e s e r r e c o n s titu id o e n s is te m a s lib r e s d e c lu la s . La p r im e r a v e z q u e se c o n s ig u i f u e p a r a el c a s o d e lo s d ic tio s o m a s d e l c o m p le jo d e G o lg i. C u a n d o se a s la n lo s d ic t io s o m a s y se in c u b a n e n p r e s e n c ia d e c ito s o l y d e A T P c o m o f u e n t e d e e n e r g a , la s v e s c u la s e m e r g e n p o r g e m a c i n d e s d e lo s b o rd e s d e lo s d ic t io s o m a s y p a r e c e q u e t r a n s p o r t e n p r o t e n a s e n tr e la s c is te rn a s . S ig u ie n d o el p r o c e s a m ie n t o p r o g r e s iv o d e los o lig o s a c r id o s d e u n a g lu c o p r o t e n a y su d e s p la z a m ie n t o e n tr e u n c o m p a r t im ie n t o d e l G o lg i y el s ig u ie n t e , e s p o s ib le s e g u ir el p r o c e s o d e l t r a n s p o r t e v e s ic u la r . P a ra s e g u ir el t r a n s p o r t e , se in c u b a n ju n ta s d o s p o b la c io n e s d e d ic t io s o m a s d e G o lg i. La p o b la c i n " d a d o r a " s e a s la a p a r t ir d e c lu la s m u t a n t e s q u e c a r e c e n d e la e n z im a /V -a c e tilg lu c o s a m in a ( G Ic N A c ) t r a n s f e r a s a I y q u e h a n s id o in fe c ta d a s c o n un v ir u s ; d e b id o a la m u ta c i n , la p r in c ip a l g lu c o p r o t e n a v r ic a n o p u e d e s e r m o d if ic a d a c o n G Ic N A c e n el c o m p le jo d e G o lg i d e la c lu la s . El d ic tio s o m a d e l G o lg i " a c e p t o r " e s t a is la d o d e la c lu la s s a lv a je s n o in fe c ta d a s y q u e p o r lo t a n t o c o n t ie n e n u n a c o p ia c o r re c ta d e G Ic N A c t r a n s fe r a s a I, p e r o c a r e c e n d e la g lu c o p r o t e n a v r ic a . En la m e z c la d e d ic t io s o m a s d e l G o lg i la p r o t e n a v r ic a a d q u ie r e G Ic N A c , lo c u a l in d ic a q u e el G o lg i d a d o r se f u s io n a c o n el c o m p a r t im ie n t o m e d ia l d e l G o lg i a c e p to r . E s te t r a n s p o r t e d e p e n d ie n t e d e g lu c o s ila c i n p u e d e s e g u ir s e m id ie n d o la tr a n s f e r e n c ia d e 3H - G lc N A c d e s d e U D P - 3 H - G lc N A c a la g lu c o p r o te n a v r ic a . El tr a n s p o r t e s lo se p r o d u c e e n p r e s e n c ia d e A T P y d e c ito s o l. F r a c c io n a n d o el c ito s o l, s e h a n id e n tific a d o p r o te n a s e s p e c fic a s c ito s lic a s n e c e s a r ia s p a r a la f o r m a c i n y la fu s i n d e las v e s c u la s d e tr a n s p o r t e .

SE INCUBAN JUNTOS + CITOSOL + ATP + 3H-GlcNAc

D IC T IO S O M A D E L G O L G I D A D O R D IC T IO S O M A D E L G O L G I A C E P T O R

glucoprotena vrica

en la cisterna m edial

S is te m a s lib r e s d e c lu la s s im ila r e s a s te se h a n u tiliz a d o p a r a e s t u d ia r el t r a n s p o r t e d e s d e la re d m e d ia l h a s ta la re d d e l

tra n s G o lg i, d e s d e la re d d e l tra n s G o lg i h a s ta la m e m b r a n a p la s m t ic a , d e s d e lo s e n d o s o m a s h a s ta lo s lis o s o m a s y d e s d e la

re d d e l tra n s G o lg i h a s ta lo s e n d o s o m a s ta r d o s .

APROXIMACIONES GENTICAS AL ESTUDIO DEL TRANSPORTE VESICULAR

L o s e s tu d io s g e n tic o s d e c lu la s d e le v a d u r a m u t a n t e s d e fic ie n te s e n la s e c r e c c i n a t e m p e r a t u r a e le v a d a h a n p e r m it id o id e n tific a r m s d e 2 5 g e n e s q u e p a r tic ip a n e n la v a d e s e c r e c i n . M u c h o s d e e s to s g e n e s m u t a n t e s c o d ific a n p r o t e n a s

s e n s ib le s a te m p e ra tu ra , las c u a le s a 2 5 C a c t a n n o r m a lm e n t e , p e r o c u a n d o s e e le v a la t e m p e r a t u r a a 3 5 C , a lg u n a s d e e lla s
fr a c a s a n e n el t r a n s p o r t e d e p r o te n a s d e s d e el ER h a s ta el c o m p le jo d e G o lg i, o tr a s d e s d e u n a c is te rn a a o tr a d e l G o lg i, y o tr a s d e s d e el c o m p le jo d e G o lg i h a s ta la v a c u o la (e l lis o s o m a d e las le v a d u r a s ) o h a s ta la m e m b r a n a p la s m tic a . U n a v e z s e id e n tif ic a n , p o r e s te s is te m a , a lg u n a s p r o t e n a s n e c e s a r ia s p a r a q u e se p r o d u z c a la s e c r e c i n , s e p u e d e n id e n t if ic a r g e n e s q u e c o d ific a n p r o t e n a s q u e in t e r a c c io n a n c o n e lla s m e d ia n t e u n f e n m e n o lla m a d o s u p re s i n m u ltic o p ia . U n a p r o te n a m u a n t e s e n s ib le a la t e m p e r a t u r a e le v a d a a m e n u d o t ie n e u n a a f in id a d d e m a s ia d o b a ja p o r las p r o t e n a s c o n la s q u e h a b i t u a lm e n t e in te r a c c io n a y s e u n e . S in e m b a r g o , si las p r o t e n a s d e in te r a c c i n s e p r o d u c e n a u n a c o n c e n t r a c i n m u y s u p e r io r a la n o r m a l, s e d a u n a u n i n s u fic ie n te p a r a p a lia r el d e fe c to . P a ra e llo , c lu la s d e le v a d u r a c o n u n a m u t a c i n s e n s ib le a la t e m p e r a t u r a e n u n g e n q u e p a r tic ip a e n el t r a n s p o r t e d e v e s c u la s , se t r a n s f e c t a n c o n u n v e c t o r p la s m d ic o d e le v a d u r a e n la c u a l se h a n c lo n a d o f r a g m e n t o s al a z a r d e D N A g e n m ic o d e le v a d u r a . C o m o el p l s m id o se m a n t ie n e e n las c lu la s e n un n m e r o d e c o p ia s e le v a d o , lo s q u e p o r te n g e n e s in ta c to s s o b r e p r o d u c ir n el p r o d u c to n o r m a l d e l g e n y p e r m it ir n a un r e d u c id o n m e r o d e c lu la s s o b r e v iv ir a t e m p e r a t u r a e le v a d a . L o s f r a g m e n t o s d e D N A r e le v a n t e s , q u e p r o b a b le m e n t e c o d ific a n p r o te n a s q u e in te r a c c io n a n c o n la p r o t e n a m u ta d a o r ig in a l, p u e d e n s e r a is la d o s d e las c lu la s s u p e r v iv ie n t e s . L as a p r o x im a c io n e s g e n tic a s y b io q u m ic a s s e c o m p le m e n t a n , y m u c h a s d e la s p r o te n a s im p lic a d a s e n el t r a n s p o r t e v e s ic u la r h a n s id o id e n tific a d a s in d e p e n d ie n t e m e n t e a t r a v s d e e s tu d io s b io q u m ic o s d e s is te m a s lib r e s d e c lu la s d e m a m f e r o s y a t r a v s d e e s tu d io s g e n tic o s e n le v a d u r a s .

682

Panel 13-1 Estrategias utilizadas para estudiar los mecanismos moleculares implicados en el transporte vesicular.38

SISTEMAS DE CELULAS SEMI-INTACTAS PARA EL ESTUDIO DEL TRANSPORTE VESICULAR

(A ) El t r a n s p o r t e d e v e s c u la s t a m b i n p u e d e e s tu d ia r s e en c lu la s c u y a m e m b r a n a p la s m t ic a h a y a s id o p r e v ia m e n t e p e r m e a b iliz a d a p a r a p e r m it ir lib r e m e n t e el p a s o , h a c ia d e n tr o o h a c ia fu e r a , d e m o l c u la s p e q u e a s y d e m a c r o m o l c u la s . La p e r m e a b iliz a c i n se c o n s ig u e m e d ia n t e r o tu r a fs ic a o m e d ia n t e el t r a t a m ie n t o c o n t o x in a s b a c t e r ia n a s q u e a b r e n g r a n d e s o r ific io s e n la m e m b r a n a p la s m tic a . E s ta s c lu la s s e m i-in ta c t a s s o n p a r t ic u la r m e n t e tile s p a r a e s tu d ia r el t r a n s p o r te d e s d e s is t e m a s d e m e m b r a n a e x te n d id a q u e se fr a g m e n t a n d u r a n t e lo s p r o c e d im ie n to s d e h o m o g e n e iz a c i n c o n v e n c io n a le s , c o m o e s el c a s o d e l ER y d e la re d d e l 2 o c 9 ,u c o P r o te in a V S V b lo q u e a d a e n la re d d e l tra n s G o lg i

tra n s G o lg i.
Las c lu la s s e m i-in t a c ta s s e h a n u tiliz a d o p a r a a is la r v e s c u la s d e t r a n s p o r t e q u e m e d ia n el t r a n s p o r t e d e s d e la re d d e l tra n s G o lg i h a s ta la m e m b r a n a p la m t ic a a p ic a l. Las c lu la s se c u ltiv a n a u n a t e m p e r a t u r a b a ja (2 0 C ) d e m a n e r a q u e el tr f ic o d e m e m b r a n a d e s d e la re d d e l tran s G o lg i h a s ta la s u p e r fic ie d e la c lu la e s t b lo q u e a d o , y p o r lo t a n t o la p r o te n a v r ic a p r in c ip a l s e h a lla a tr a p a d a e n el

m em brana plasm tica apical agujereada m ediante papel de nitrocelulosa

tra n s G o lg i (A ). C u a n d o la s c lu la s se p e r m e a b iliz a n
( d e p o s ita n d o u n tr o z o d e p a p e l d e n itr o c e lu lo s a s o b re e lla s y p o s t e r io r m e n t e r e tir n d o lo p a ra r o m p e r la m e m b r a n a ) , el c ito s o l s a le d e la s c lu la s d e ja n d o los s is te m a s d e m e m b r a n a (B ). E n to n c e s s e le v a n ta el b lo q u e o p o r t e m p e r a t u r a y s e a a d e c ito s o l fr e s c o y A T P , lo c u a l h a c e q u e la s v e s c u la s q u e c o n t ie n e n la g lu c o p r o t e n a v r ic a s e d e s p r e n d a n d e la re d d e l tra n s G o lg i p o r g e m a c i n y s a lg a n d e las c lu la s s e m i-in ta c t a s a t r a v s d e lo s o r ific io s d e la m e m b r a n a p la s m tic a (C ). Las v e s c u la s s e r e c o g e n y se p u r ific a n u s a n d o u n a n tic u e r p o q u e r e c o n o z c a la c o la c it o p la s m tic a d e la g lu c o p r o te n a t r a n s m e m b r a n a d e l v ir u s , lo c u a l p e r m it e id e n tific a r las p r o te n a s q u e c o n fig u r a n las v e s c u la s d e tr a n s p o r te . (C ) + c ito s o l +ATP

anticuerpo contra la cola clstoslica de la glucoprotena vrica

b lo q u e a d o p o r m u ta n t e s
A ,B ,C

b lo q u e a d o p o r m u ta n te s
D ,E ,F

las p r o t e n a s d e t r a n s p o r t e a p ic a l s e p u r ific a n m e d ia n t e su u n i n a u n a c o lu m n a c o n u n a n t ic u e r p o e s p e c fic o

yema formando la vescula revestida. Una vez la vescula se desprende, la cu bierta se pierde rpidamente. El mecanismo por el cual se desprende tampoco se conoce, pero se ha demostrado que in vitro una protena chaperona de la fa milia hsp70 acta como una ATPasa de eliminacin de la cubierta que utiliza la energa de la hidrlisis de ATP para eliminar la cubierta de las vesculas revestidas de clatrina. Sin embargo, en la clula ha de actuar algn mecanismo de control adicional para evitar que la cubierta de clatrina se elimine de la yema revestida de clatrina antes de que tenga tiempo de formar una vescula, a pesar de que la cu bierta persiste ms tiempo en la yema que en la vescula. Una posibilidad es que la prdida de la cubierta est controlada por Ca2+ , el cual puede unirse a las ca denas ligeras de clatrina y desestabilizar la cubierta de clatrina. Las bombas de Ca2+de la m em brana plasmtica bom bean Ca2+ hacia el exterior de la clula y por lo tanto la concentracin de Ca2+ se mantiene extremadamente baja en la cara citoslica de la membrana, lo cual permite que las depresiones se m anten gan revestidas; pero una vez las vesculas revestidas se forman y migran alejn dose de la membrana, se encuentran con concentraciones de Ca2+ mayores, que podran desencadenar la prdida del revestimiento. Normalmente las vesculas pinocticas revestidas de clatrina son de tamao pequeo y uniforme, pero la clatrina tam bin est implicada en la formacin de vesculas mayores, tanto de vesculas de secrecin que contienen grandes agre gados de protena como de fagosomas que contienen grandes partculas. En es tos casos la clatrina no forma revestimientos completos sino que se concentra en determinadas zonas de las vesculas que se forman. Parece que la formacin de los parches de clatrina ayudan a que la m em brana se doble, pero el gran ta mao de la carga unida a los receptores evita que la membrana se pliegue lo su ficiente com o para permitir que se forme un revestimiento completo.

Las adaptinas reconocen protenas transmembrana especficas y las unen ai revestimiento de clatrina4 1
Se cree que el ensam blaje de la cubierta de las vesculas revestidas tiene dos fun ciones com o mnimo: proporciona la fuerza m ecnica para estirar hacia el ex terior la membrana, formando una yema, y ayuda a capturar receptores de m em brana especficos junto con las molculas a las que estn unidos. Una se

Figura 13-52 Transporte selectivo mediado por vesculas revestidas de clatrina. Las adaptinas se unen tanto a los trisquelions de clatrina como a los receptores de carga.

ELIMINACIN DE VESCULAS

FORMACIN DE VESCULAS receptor de carga clatrina adaptina

684

Captulo 13 : Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

gunda molcula principal de recubrimiento presente en estas vesculas, un com plejo formado por muchas subunidades llamado adaptina, participa en ambas funciones. Las adaptinas son necesarias tanto para unir el revestimiento de clatrina a la membrana como para atrapar diversos receptores proteicos trans membrana, los cuales capturan molculas especficas en el interior de la vescu la. De este modo un grupo seleccionado de molculas a transportar, unidas a sus receptores de carga especficos, se incorporan al lumen de cada una de las vescu las de transporte revestidas de clatrina acabadas de formar (Figura 13-52). Las vesculas revestidas de clatrina no son todas iguales. Hemos visto, por ejemplo, que algunas de ellas, las que participan en el trnsito desde el complejo de Golgi hasta los endosomas tardos, son ricas en receptores M 6P; otras, que participan en la ruta desde la membrana plasmtica a los endosomas tempra nos, son ricas en receptores de compuestos extracelulares como las LDL. Aun que parece que el revestimiento de clatrina en s mismo es el mismo en cada caso, las adaptinas son diferentes y median la captura de diferentes receptores. Las adaptinas reconocen pptidos seal en la cola citoplasmtica de los re ceptores. Una secuencia caracterstica de cuatro residuos de aminocido, que pa rece que forma un giro brusco en la cadena polipeptdica, es una parte esencial de la seal de endocitosis compartida por los receptores de la superficie celular que participan en la endocitosis mediada por receptor a partir de la membrana plasmtica (Figura 13-53). Por el contrario, en la red del trans Golgi las adaptinas reconocen una secuencia de aminocidos fosforilados en la zona carboxilo termi nal de los receptores M 6P.

adaptina

Las vesculas revestidas de coatmero median el transporte vesicular no selectivo 42

Se cree que las vesculas revestidas de coatm ero median el transporte vesicu lar no selectivo de la ruta por defecto, que incluye el transporte desde el retculo endoplasmtico al complejo de Golgi, de una cisterna del Golgi a otra y desde la red del trans Golgi a la membrana plasmtica (Figura 13-54). Ninguno de estos procesos de transporte requieren que las vesculas que se forman capturen una carga especfica en su lumen. El revestimiento de estas vesculas consiste en parte en un gran complejo proteico llamado coatm ero, formado por siete subunidades proteicas de reves timiento (llamadas COP, de coat protein). Por lo menos una de ellas, presenta homologa de secuencia con las adaptinas de las vesculas revestidas de clatrina, pero existen importantes diferencias de comportamiento entre el revestimiento de coatmero y el de clatrina. Al contrario que las cubiertas de clatrina, las de coatmeros no se autoensamblan sino que necesitan ATP que dirija su forma

Figura 13-53 Pptido seal para la endocitosis. Se cree que los diversos receptores proteicos de superficie celular que son endocitados en las vesculas de clatrina com parten esta seal, la cual es reconocida por las adaptinas que actan en la endocitosis mediada por receptor desde la m embrana plasmtica. Los aminocidos mostrados aqu son una parte esencial de la seal.

endosom a tardo

Figura 13-54 Transporte vesicular selectivo y no selectivo en clulas no polarizadas. Se postula que el transporte no selectivo (constitutivo) (fle c h a s azu les) est mediado por vesculas revestidas de coatmero, mientras que diversas formas de transporte selectivo (mediado por seal) (flechas rojas) se lleva a cabo mediante vesculas revestidas de clatrina. En clulas polarizadas se requiere una va adicional desde la red del trans Golgi mediada por seal.

Golgi

Golgi

Mecanismos moleculares del transporte vesicular y mantenimiento de la diversidad de compartimientos

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cin y en lugar de separarse en cuanto la vescula se desprende de la membrana dadora, la cubierta de coatmero se mantiene hasta que la vescula alcanza su m em brana diana. Parece que tanto el ensamblaje com o el desensamblaje del revestimiento de coatm ero depende de una protena denominada ARF, que tambin podra participar en el ensamblaje de las cubiertas de clatrina. Es una de las muchas protenas de unin a GTP que son com ponentes clave en el control del trans porte vesicular. Antes de com entar las particularidades de ARF, nos detendre mos a revisar algunas propiedades de regulacin generales de las protenas de unin a GTP.

El transporte vesicular depende de protenas reguladoras que unen GTP 43

Como se com enta en el Captulo 5, las clulas contienen extensas familias de protenas reguladoras que unen GTP. Estas protenas actan como interruptores moleculares que pueden alternar entre dos estados conformacionales -u n o acti vo, unido a GTP y otro inactivo, unido a GDP- y actan como reguladores de muchos procesos celulares complejos. Las protenas de unin a GTP actan en un ciclo que depende tpicam ente de dos com ponentes auxiliares: una protena liberadora de nucletidos de guanina (GNRP, de Guanine Nucleotide Releasing Protein) que cataliza el intercambio de GDP por GTP y una protena activadora de GTPasa (GAP, de GTPase Activating Protein) que desencadena la hidrlisis del GTP unido. Muchas protenas reguladoras que unen GTP tienen un grupo lipdico uni do covalentemente que les permite unirse a la membrana, y participan en una gran variedad de procesos dependientes de membrana en la clula. Se han des crito dos clases estructuralmente distintas: las protenas de unin a GTP monomricas (tambin llamadas GTPasa monomricas) , constituidas por una sola ca dena polipeptdica, y las protenas de unin a GTP trimricas (tambin llamadas protenas G), constituidas por tres subunidades distintas. Aunque estudios con inhibidores muestran que ambas clases de protenas juegan un papel esencial en el transporte vesicular, las funciones de las GTPasas monomricas estn ms claras, por lo que trataremos de ellas aqu.

Parece que ARF sealiza el ensam blaje y el desensamblaje del revestimiento de coatm ero 44
ARF es una GTPasa m onom rica con una cola de cido graso, y se cree que juega un papel crucial en el ensam blaje y desensamblaje del revestimiento de coat mero. En el citosol se encuentra altamente concentrada en la forma descargada, unida a GDP. Parece que la mem brana dadora desde donde va a generarse una vescula revestida de coatmero contiene una protena especfica liberadora de nucletidos de guanina que hace que ARF libere su GDP y una GTP en su lugar (la concentracin de GTP en el citosol es mayor que la de GDP). Se cree que la unin de GTP hace que ARF exponga la cola de cido graso, que se inserta en la bicapa lipdica de la m em brana dadora. Cuando ARF se ha unido, recluta las subunidades del coatmero, que se unen a l. El ensamblaje de la cubierta de coatmero, formado por ARF con GTP y por las protenas de coatmero, estira la membrana inducindola a que forme una yema, que entonces se desprende como lo hace una vescula revestida (Figura 13-55). Cuando la vescula revestida de coatmero alcanza su membrana de desti no, una protena especfica de la mem brana diana, activadora de GTPasa, activa ARF para que hidrolice el GTP que lleva unido hasta GDP. Se cree que esto pro voca un cambio de conform acin en la protena ARF de manera que la cadena de cido graso se desprende de la membrana, causando el desensamblaje del re vestimiento y permitiendo que se produzca la fusin de la membrana, como ve remos. Por lo tanto ARF puede considerarse como una protena que detecta las

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Captulo 13 : Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

vescula recubierta de coatm ero

ARF-GDP inactiva y soluble

coatm ero

protena liberadora de nucletidos de guanina (GNRP) (A) (B)

circunstancias y genera la seal apropiada, tanto para el ensamblaje de la cu bierta y la gemacin de la vescula como para el desprendimiento de la cubierta y su fusin a la membrana, como ser el caso. An ms importante, si existe una protena liberadora de nucletidos de guanina en la membrana dadora y una protena activadora de GTPasa en la membrana receptora, la direccin de trans porte est definida: mediante el ciclo de hidrlisis de GTP y el intercambio GDP/GTP, ARF facilita la transferencia en una nica direccin.

Figura 13-55 Modelo actual sobre la formacin de las vesculas revestidas de coatmero. (A) La protena ARFGDP, soluble e inactiva, se une a una protena liberadora de nucletidos de guanina (GNRP) en la membrana dadora, lo cual provoca que ARF libere su GDP y se una a GTP. El GTP desencadena un cambio conformacional en ARF dejando expuesta su cadena de cido graso, que se inserta en la membrana dadora. (B) Ahora, la protena ARF-GTP activa unida a la membrana recluta subunidades de coatmero de la membrana. Esto hace que la membrana forme una yema. El posterior acontecimiento de fusin de membrana separa y libera la vescula revestida. La droga brefeldina A bloquea la formacin de la cubierta de coatmero inhibiendo la reaccin de intercambio de GDP por GTP. Ello bloquea el trfico de las vesculas revestidas de clatrina desde el ER a travs del complejo de Golgi, haciendo que el complejo de Golgi vace su contenido en el ER, como se explica en la pgina 646.

Marcadores proteicos de orgnulo, llamados SNARE, colaboran en la direccin del transporte de vesculas 4 5
Las vesculas de transporte, sean o no selectivas al tomar la carga del comparti miento dador, han de ser altamente selectivas en cuanto a la m em brana diana a la que se fusionan. Esto sugiere que todos los tipos de vesculas de transporte de la clula han de expresar marcadores de superficie que las identifiquen segn su origen y su carga, y que sean reconocidos por receptores de las membranas diana. Aunque el m ecanism o de este reconocim iento no se conoce, existe una hiptesis atractiva que supone la participacin de unas protenas denominadas SNARE (por razones que se com entan ms adelante), de las cuales existen gru pos com plem entarios v-SNARE en la membrana de la vescula y t-SNARE en la membrana diana {t de target. diana) (Figura 13-56). Las protenas SNARE estn bien caracterizadas en las clulas nerviosas, en las cuales se cree que median la unin de las vesculas sinpticas a la mem brana plasmtica del terminal nervioFigura 13-56 Papel propuesto para las protenas SNARE en la direccin del transporte vesicular. Grupos complementarios de SNARE en las vesculas (v-SNARE) y de SNARE en las membranas diana (t-SNARE) determinan la selectividad del contacto de las vesculas de transporte con su membrana diana. Las protenas v-SNARE, que estn coempaquetadas con las protenas de la cubierta durante la formacin por gemacin de las vesculas de transporte desde la membrana dadora, se unen a las t-SNARE complementarias de la membrana diana.

ORGNULO DADOR

ORGNULO DIANA

t-SNARE COMPARTIMIENTO B

Mecanismos moleculares del transporte vesicular y mantenimiento de la diversidad de compartimientos

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Rab-GTP

v-SNARE vescula de transporte

so en preparacin para la exocitosis: en la vescula sinptica existe una v-SNARE y en la cara citoplasmtica de la mem brana plasmtica existe una t-SNARE com plementaria.

Figura 13-57 Papel propuesto para las protenas Rab garantizando la especificidad de la unin entre las vesculas de transporte y la membrana diana. La protena liberadora de nucletidos de guanina en la membrana dadora reconoce una protena Rab especfica y la induce a intercambiar su GDP por GTP. Este cambio altera la conformacin de la protena Rab, exponiendo su grupo lipidico unido covalentemente, el cual ancla la proteina Rab a la membrana. La protena Rab-GTP permanece unida a la superficie de la vescula de transporte despus de que sta se separe de la membrana dadora. Una protena v-SNARE de la superficie de la vescula se une a una t-SNARE de la membrana diana, inmovilizando parcialmente la vescula. Entonces, la protena Rab hidroliza su GTP anclando la vescula a la membrana diana y liberndose al citosol como Rab-GDP, desde donde puede ser reutilizada en una nueva ronda de transporte. La vescula se fusiona entonces con la membrana diana. Ntese que los revestimientos de la vescula han sido omitidos del esquema para mayor claridad.

Se cree que las protenas Rab aseguran la especificidad de la unin de las vesculas 4 6
En la clula existen muchos sistemas de mem brana por lo que el proceso de unin de las distintas vesculas ha de ser altamente selectivo. Una vescula pue de inspeccionar muchas m embranas potencialmente diana antes de que su v-SNARE encuentre una t-SNARE complementaria. Segn un punto de vista, este proceso crucial de reconocim iento est controlado por miembros de una familia de protenas GTPasas monomricas llamadas protenas Rab, que con trolan que la interaccin entre v-SNARE y t-SNARE sea correcta. Segn este en foque, las protenas Rab estn unidas a la superficie de las vesculas revestidas que se estn formando en la m em brana dadora. Cuando una vescula encuentra la m em brana diana adecuada, la unin de v-SNARE a t-SNARE permite que la vescula permanezca unida durante el tiempo necesario para que la protena Rab hidrolice el GTP que lleva unido, lo cual bloquea a la vescula en la m em bra na diana, preparndola para la fusin posterior con ella (Figura 13-57). Las clulas eucariotas tienen muchos tipos de protenas Rab, cada una de las cuales est asociada con un orgnulo rodeado de membrana particular que participa en la va de secrecin o en la va endoctica. Cada uno de estos orgnulos presenta por lo menos una protena Rab en la superficie citoslica (Tabla 131). La primera protena Rab (llamada Sec4) fue descubierta en levaduras m e diante la seleccin de mutaciones (llamadas mutaciones SEQ que interfieren en el proceso de secrecin. Posteriormente se vio que se trataba de un componente de las vesculas de secrecin necesario para su unin a la membrana plasmtica; las mutaciones que los modifican evitan que las vesculas de secrecin viertan su contenido al exterior. Las secuencias de aminocidos de estas protenas Rab son ms diferentes entre s en su zona carboxilo terminal; experimentos de inter-

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Captulo 13: Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

Tabla 13-1 Localizaciones subcelulares de algunas protenas Rab Protena* Rab (YPT1) Rab2 Rab3A Rab4 Rab5 Rab6 Rab7 Rab9 Sec4 Orgnulo ER y complejo de Golgi ER transicional, red del cis Golgi vesculas de secrecin endosomas tempranos membrana plasmtica cisternas del trans y del medial Golgi endosomas tardos endosomas tardos, red del trans Golgi vesculas de secrecin

* Todas estas protenas se han hallado en clulas de mamfero excepto Sec4 e YPT1, que son protenas de levadura.

cambio de extremos usando tcnicas de ingeniera gentica indican que es pre cisamente este extremo el que determina la localizacin intracelular de cada miembro de la familia, probablemente permitindole que se una a un factor da dor de nucletidos de guanina complementario, situado en la superficie del orgnulo particular (vase Figura 13-57). Antes de que las SNARE fueran las candidatas como las protenas marcadoras de orgnulos que guan el transporte de vesculas, se crea que las protenas Rab ejercan esta funcin por su notable dis tribucin especfica entre los orgnulos. Sin embargo, actualmente se sabe que algunas protenas Rab son funcionalmente intercambiables, ya que mediante experimentos de ingeniera se ha podido localizarlas en otros orgnulos. Por lo tanto no pueden constituir la nica explicacin de la selectividad del transporte vesicular.

La fusin de vesculas est catalizada por una m aquinaria de fusin de m em brana "47
Cuando la vescula de transporte ha reconocido su mem brana diana y se ha uni do a ella, la vescula ha de liberar su carga mediante la fusin de membrana. Sin embargo, la fusin de la membrana no se produce siempre inmediatamente. Como hemos visto, en la exocitosis regulada la fusin no ocurre hasta que es des encadenada por una seal extracelular. La unin y la fusin son dos procesos distintos y separables. Es posible, por ejemplo, evitar la fusin pero no la unin, m anteniendo los niveles de Ca2+ citoslico muy bajos. Ello provoca la acum ulacin de vesculas unidas, pero no fusionadas, con su m em brana diana. La unin slo requiere que las dos mem-

SNAP vescula de transporte inm ovilizada Rab-GTP

NSF GDPta Rab-GDP

t-SNARE

v-SNARE ENSAMBLAJE DE LA M AQUINARIA DE FUSIN MEMBRANA DE FUSIN

Figura 13-58 Modelo actual sobre la fusin de vesculas mediada por protena. Una compleja maquinaria de fusin cataliza la fusin de una vescula de transporte con su membrana diana. Slo han sido caracterizados dos de los componentes proteicos del complejo de fusin: NSF (protena de fusin sensible a iV-etilmaleimida, de Nethylmaleimide-sensitive/usion protein) y SNAP (protenas solubles de acoplamiento a NSF, de soluble NSF ttachment proteins). (NEM es un compuesto qumico que modifica los grupos libres SH expuestos en las superficies proteicas y por lo tanto inactiva protenas cuyos grupos SH expuestos sean necesarios para su actividad.) Las protenas SNARE fueron identificadas por primera vez como receptores de SNAP (de aqu su nombre): unen tanto v-SNARE como t-SNARE. La unin de SNAP permite que NSF se una. Este complejo, con la ayuda de acil Coa y protenas an no identificadas, cataliza la fusin de las dos bicapas lipdicas. NSF es una ATPasa que hidroliza ATP liberando el complejo una vez ha realizado su trabajo (no se muestra).

Mecanismos moleculares del transporte vesicular y mantenimiento de la diversidad de compartimientos

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cido nucleico vrico cpside cubierta dei virus

de fusin ENDOCITOSIS DE UN VIRUS RECUBIERTO Y TRANSPORTE HASTA UN ENDOSOMA. LA DISMINUCIN DEL pH EXPONE LOS LUGARES HIDROFBICOS DE LAS PROTENAS DE FUSIN
Figura 13-59 Entrada en las clulas de una plaga de virus de ave.

endosoma
w k.

(A) Electronmicrografas que muestran cmo es endocitado un virus en una vescula revestida de clatrina, cmo es conducido a un endosoma, y cmo se escapa de l fusionndose con la membrana del endosoma. (B) Dibujo esquemtico de la forma en qu unas protenas de fusin de la superficie del virus median su salida del endosoma. (A, cortesa de Karl Matlin y Hubert Reggio, de K.S. Matlin et al.,/. CellBiol. 91:601-613,1981, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

LAS REGIONES HIDROFOBICAS DE LAS PROTENAS DE FUSIN SE INSERTAN EN LA MEMBRANA DE ENDOSOMA

branas se acerquen lo suficiente com o para permitir que las protenas que so bresalen de la bicapa lipdica interaccionen entre s y se adhieran. La fusin requiere una aproximacin mayor, quedando las membranas a 1,5 nm una de otra de manera que puedan juntarse. Para que se produzca esta aproximacin, se ha de desplazar el agua de la superficie hidroflica de la membrana -proceso que es altamente desfavorable desde el punto de vista energtico. Parece proba ble que todas las fusiones de m em brana en las clulas sean catalizadas por pro tenas de fusin especializadas que proporcionen un camino para atravesar esta barrera energtica. El m ecanismo todava se conoce muy mal. En el caso de las vesculas de transporte revestidas de coatmero, por lo menos, la fusin con la mem brana diana requiere ATP, GTP, acil CoA, y diversos com ponentes protei cos. Se conocen dos com ponentes proteicos, denominadas NSF y SNAP (por ra zones que se explican en el pie de la Figura 13-58), que reaccionan de forma c clica con las m embranas que se van a fusionar y el citosol. Las SNAP se unen tanto a v-SNARE de la mem brana de la vescula como a t-SNARE de la m embra na diana, iniciando el ensam blaje del aparato de fusin, el cual cataliza la fusin de las dos bicapas lipdicas en la interfase membranosa de la vescula diana (Fi gura 13-58).

FUSION DE LAS BICAPAS Y LIBERACIN DEL CIDO NUCLEICO EN EL CITOSOL

(B)

La protena de fusin de m em brana m ejor caracterizada est sintetizada por un virus 4 8

La fusin de membranas es importante en otros procesos adems de serlo en el transporte de vesculas; se conocen con detalle las fusiones de membrana ms simples, que son las catalizadas por protenas vricas de fusin vricas. Las prote nas vricas de fusin juegan un papel crucial permitiendo la entrada de los virus recubiertos (los cuales tienen una cubierta membranosa de tipo bicapa lipdica) al interior de las clulas que infectan (comentado en el Captulo 6). Los virus como el virus de la gripe, por ejemplo, entran en la clula por endocitosis media da por receptor y son transportados hasta los endosomas. El bajo pH de los endosomas activa una protenas de fusin de la cubierta del virus que cataliza la fusin del virus con las membranas del endosoma, permitiendo as al cido nucleico v rico escapar al citosol, donde se puede replicar (Figura 13-59).

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Captulo 13 : Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

proteina de fusin de la gripe en la m em brana , .. . de la clula 1 peptidos hidrofbicos de fusin, escondidos pH bajo

CAMBIO CONFORMACION AL QUE EXPONE LOS PPTIDOS DE FUSIN HIDROFBICOS

mem brana plasmtica de la clula 2 CITOSOL DE LA CELULA 2

(A)

anclaje transm em brana

(C)

CITOSOL DE LA CLULA 1

Figura 13-60 Modelo para explicar cmo una proteina de fusin de membrana cataliza la fusin de la bicapa lipidica. Una clula que expresa en su superficie la proteina de fusin de la gripe se fusiona rpidamente con sus clulas vecinas una vez se ha expuesto a pH bajo. Los procesos de fusin se producen a travs de un paso intermedio (D y E) en el que slo se fusionan las capas lipdicas exteriores de la membrana, mientras que las dos capas internas se mantienen separadas. Incluso se han obtenido formas mutantes de la protena de fusin que permiten que la reaccin se desarrolle slo hasta este estado intermedio.

Se han clonado los genes que codifican varias protenas de fusin y se han utilizado para transfectar clulas eucariotas en cultivo. Estas clulas transfectadas expresan las protenas vricas en su superficie, y bajo condiciones adecuadas se fusionan entre s formando clulas gigantes multinucleadas. En el caso mejor estudiado, el del virus de la gripe, la estructura tridimensional de la protena de fusin ha sido determinada por cristalografa de rayos X. Se ha demostrado que el pH bajo induce un cambio de conformacin importante en la protena de fu sin, que expone una regin hidrofbica, antes escondida, en la superficie de la protena, que ahora puede interaccionar con la bicapa lipdica de la membrana diana. Parece que una agrupacin de regiones hidrofbicas de este tipo en pro tenas de fusin muy cercanas une las dos bicapas lipdicas mantenindolas muy cerca una de la otra, de forma que se desestabilizan y se fusionan (Figura 13-60). Recientem ente, en mamfero se ha identificado una protena sem ejante a las vricas, y se cree que media la fusin de las m em branas plasm ticas del esperma y del huevo que se produce en la fecundacin (se com enta en el Cap tulo 20). Como resaltan todos estos ejemplos, bajo circunstancias normales las membranas no se fusionan fcilmente. La fusin de membranas requiere la par ticipacin de protenas especiales y est sometida a controles selectivos -u n a restriccin que es crucial tanto para m antener la identidad de la clula en s m is ma como para mantener la individualidad de cada uno de los compartimientos intracelulares.

Resumen
Las diferencias entre los compartimientos membranosos de una clula se mantie nen gracias a un aporte de energa libre, que impulsa el transporte selectivo y diri gido de componentes particulares de membrana desde un compartimiento a otro. Las vesculas de transporte se generan a partir de regiones revestidas especializadas de la membrana dadora. El ensamblaje de la cubierta colabora en la formacin de la vescula. Existen dos tipos bien caracterizados de vesculas revestidas: las vescu las revestidas de clatrina, que median el transporte vesicular selectivo desde la membrana plasmtica y la red del trans Golgi, y las vesculas revestidas de coatmero, que permiten el transporte vesicular no selectivo desde el ER a las cisternas del Golgi. Las adaptinas proporcionan una unin molecular entre las cubiertas de clatrina y los receptores especficos de membrana y por lo tanto median la capta cin selectiva de molculas a transportar por las vesculas revestidas de clatrina. Las vesculas revestidas han de perder su cubierta para fusionarse con la membra

Mecanismos moleculares del transporte vesicular y mantenimiento de la diversidad de compartimientos

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na diana apropiada: en cuanto las vesculas entran en contacto con su membrana diana, los revestimientos de clatrina se pierden. Diversos tipos de GTPasas monomricas, incluyendo ARF y las protenas Rab, participan en la regulacin de varias etapas del transporte vesicular, incluyendo la gemacin de las vesculas, el contacto con la membrana diana y la fusin. Las pro tenas ARF, Rab, y v-SNARE se incorporan a las vesculas de transporte durante la gemacin y aseguran que las vesculas slo entreguen su contenido al comparti miento rodeado de membrana apropiado: se cree que ARF media el ensamblaje de la cubierta de coatmero (y probablemente el de clatrina) y el desensamblaje de la cubierta de coatmero, mientras que las protenas Rab parece que aseguran la es pecificidad de unin anclando la vescula a la membrana diana cuando interaccionan SNARE complementarias de la membrana diana y de la vescula. Por lo tan to, la fusin de membranas est catalizada por varias protenas citoslicas, incluyendo SNAPyNSF, que se unen entre sformando un complejo de fusin en el lugar de anclaje.

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Captulo 13 : Trfico vesicular mediante las rutas secretora y endoctica

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Bibliografa

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Mitocondrias parecidas a caracoles de una clula epitelial de caracol, visualizada por electronmicroscopia de alto voltaje.

Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

Evolucin de las cadei transporte de electror Los genomas de las mitocondrias y de los cloroplastos *

Las mitocondrias, que estn presentes en todas las clulas, y los plastos (espe cialmente los cloroplastos) que se presentan exclusivamente en las plantas, transforman la energa en formas utilizables para impulsar reacciones celulares. De acuerdo con su importancia en el metabolismo, generalmente constituyen una parte importante del volumen celular total. En electronmicrografas una de las caractersticas morfolgicas de las mitocondrias y de los cloroplastos es la gran cantidad de membrana interna que contienen. Como veremos, esta m em brana juega un papel crucial en la funcin de estos orgnulos transformadores de energa mediante la provisin de un substrato estructural para los procesos de transporte de electrones. Aunque las mitocondrias convierten la energa derivada de combustibles qumicos y los cloroplastos convierten la energa derivada de la luz solar, los dos tipos de orgnulos se organizan de manera similar; adems, ambos producen grandes cantidades de ATP a travs del mismo mecanismo. Esta destacada con clusin surgi de los detallados estudios llevados a cabo durante los ltimos treinta aos. La ruta comn mediante la cual las mitocondrias, los cloroplastos y hasta las bacterias se proveen de energa para sus funciones biolgicas acta a travs de un proceso conocido como el acoplamiento quimiosmtico. La energa de los nutrientes y de la luz solar es utilizada para impulsar una bom ba de protones (bom ba de H+ ) unida a la membrana que transfiere protones de un lado al otro de la membrana. Estas bom bas generan un gradiente electroqumico de protones a travs de la membrana que es utilizado en varias reacciones que requieren energa cuando los protones son captados por protenas asociadas a la m em bra na (Figura 14-1). Concretamente, entre estas mquinas se encuentra la enzima ATP sintasa, que utiliza la energa del flujo de protones para sintetizar ATP a par tir de ADP y P. Otras protenas acoplan el flujo de protones al transporte de de terminados metabolitos dentro y fuera de los orgnulos. En las bacterias el gra diente electroqumico de protones es por s solo tan importante como almacn de energa directamente utilizable como por el ATP que ste genera: el gradiente no slo impulsa muchos procesos de transporte sino que tambin impulsa la ro tacin rpida del flagelo bacteriano, lo que permite la motilidad bacteriana en medio acuoso. De qu forma la energa derivada de los nutrientes o de la luz impulsa las bom bas de H+ que estn en el ncleo del mecanismo quimiosmtico? La res puesta radica en las reacciones en las que los electrones son transferidos de un com ponente a otro. En la mitocondria, por ejemplo, los electrones liberados de

luz solar

electrones de elevada energa

gradiente electroqum ico de protones transm em brana

transporte sntesis activo a de travs de la B H m em brana

rotacin del flagelo bacteriano

Figura 14-1 Acoplamiento quimiosmtico. La energa procedente de la luz solar o de la oxidacin de los alimentos, se utiliza en primer lugar para generar un

gradiente electroqumico de protones a

travs de la membrana. Este gradiente constituye un almacn verstil de energa y se utiliza para impulsar diversas reacciones de la mitocondria, de los cloroplastos y de las bacterias.

697

MITOCONDRIA gradiente de H+

CLOROPLASTO gradiente de H+

t
'bomba

de

H+

bomba de s
H+

bomba de v.
I

molculas de grasa y de carbohidrato

ciclo del cido citrico

CO, H20 (B)

CO,

molculas de carbohidrato

(A)

productos

productos

una molcula glucdica en el curso de su degradacin hasta C 0 2 son transferidos hasta el 0 2 a travs de una ruta complicada, reduciendo el 0 2 hasta formar agua. La energa libre liberada cuando los electrones pierden energa por esta va de un estado de alta energa a un estado de baja energa es utilizada para impulsar las bom bas de protones com o parte de un elaborado proceso de transporte de electrones que tiene lugar en la mem brana mitocondrial principal. El m ecanis mo es anlogo al de una clula elctrica que impulsa corriente elctrica a travs de un conjunto de motores elctricos. Pero en los sistemas biolgicos los elec trones no son transportados de un lugar a otro mediante hilos conductores, sino por molculas difusibles que pueden recoger electrones en un lugar y entregar los en otro. Uno de los ms importantes de estos transportadores de electrones es el NAD+ , que puede captar dos electrones (ms un H+ ) para convertirse en NADH, que es una pequea molcula soluble en agua que transporta electrones desde los lugares en que se degradan las molculas hasta el primero de una serie de transportadores incluidos en la mem brana mitocondrial. Estos transportado res difunden en el plano de la mem brana y transportan su carga de electrones desde una bom ba de H+ a otra. La tercera bom ba de H+ de la serie cataliza la transferencia final de los electrones al 0 2 (Figura 14-2A). El conjunto completo de protenas y molculas pequeas implicadas en esta secuencia ordenada de transportadores de electrones en la mem brana se denomina cadena de trans

Figura 14-2 La mitocondria y el cloroplasto como aparatos de transformacin de energa. Las entradas se indican con flechas verde claro, los productos en azul y el sentido del flujo electrnico con flechas rojas. Ntese que la fuerza electromotriz generada por los dos fotosistemas de los cloroplastos permite al cloroplasto (B) impulsar una transferencia electrnica desde el H20 al carbohidrato, en sentido contrario al de la transferencia electrnica de las mitocondrias.

porte de electrones.
Aunque el cloroplasto puede ser descrito en trminos similares y algunos de sus com ponentes principales son muy similares a los de la mitocondria, la m em brana del cloroplasto contiene algunos componentes cruciales no encontrados en la membrana mitocondrial. Es ms, entre esos componentes estn los fotosistemas, en los que la energa luminosa es capturada y preparada para la transfe rencia de electrones, de manera anloga a como hacen las fotoclulas fabricadas por el hombre en paneles solares, absorbiendo la energa luminosa y utilizndola para impulsar corriente elctrica. La fuerza motriz del electrn generada por los fotosistemas del cloroplasto impulsa el transporte de electrones en direccin opuesta a la que hemos descrito para el caso de las mitocondrias: los electrones son recogidos desde la molcula del agua produciendo 0 2 y son donados (va NADPH) al C 0 2, para sintetizar carbohidratos. De esta forma el cloroplasto gene ra 0 2y carbohidratos, mientras que la mitocondria los consume (Figura 14-2B). Generalmente, se cree que los orgnulos de eucariotas transformadores de energa evolucionaron desde procariotas que fueron endocitados por clulas euca riotas primitivas y desarrollaron una relacin simbitica con ellos, hace aproxi madamente 1,5 x 10 9aos. Esto explicara por qu las mitocondrias y los cloroplastos contienen su propio DNA, que codifica algunas de sus protenas. Desde \!

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20 minutos
Figura 14-3 Plasticidad mitocondrial. Cuando se observa una mitocondria en una clula viva, se aprecian en ella rpidos cambios de forma.

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Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

(A)

C B )

10 Jim
Figura 14-4 Relaciones entre las m itocondrias y los microtbulos. (A) Micrografa ptica de cadenas de mitocondrias alargadas observadas en una clula viva de mamfero mantenida en cultivo. La clula fue contrastada con un colorante vital fluorescente (la rodamina 123) que marca especficam ente las mitocondrias. (B) Micrografa de inmunofluorescencia de la misma clula anterior pero fijada y contrastada con anticuerpos fluorescentes que se unen a los microtbulos. Ntese que las mitocondrias tienden a alinearse a lo largo de los microtbulos. (Por cortesa de Lan Bo Chen.)

su captacin inicial por una clula husped estos orgnulos han perdido gran parte de su genoma y han llegado a depender notablem ente de protenas que son codificadas por genes en el ncleo celular, sintetizadas en el citosol y enton ces importadas al orgnulo. De forma recproca, las clulas husped han llegado a depender de estos orgnulos tanto por la gran cantidad de ATP que necesitan para llevar a cabo la biosntesis, el bom beo de iones, y la motilidad como por de terminadas reacciones biosintticas que ocurren dentro de ellos.

La mitocondria1
La mitocondria ocupa una parte substancial del volumen citoplasmtico de las clulas eucariotas, y han sido esenciales para la evolucin de los animales pluri celulares. Sin las mitocondrias las clulas animales actuales dependeran de la gluclisis anaerbica para formar ATP. Sin embargo, cuando la glucosa es con vertida en piruvato a travs de la gluclisis, slo se libera una pequea fraccin del total de la energa libre potencialmente disponible de la glucosa. En las mito condrias el metabolismo de los azcares est integrado: el piruvato es importado dentro de la mitocondria y oxidado por el oxgeno molecular ( 0 2) a C 0 2y H2 0 . La energa liberada es almacenada de una forma tan eficiente que por cada molcu la de glucosa oxidada se producen aproximadamente 30 molculas de ATP. Por el contrario, slo dos molculas de ATP son producidas a partir de la gluclisis. Las mitocondrias suelen describirse como cilindros alargados y rgidos, de un dimetro comprendido entre 0,5 y 1 pm y parecidos a bacterias. Sin embargo, la microcinematografa a intervalos de tiempo de las clulas vivas revela que las mitocondrias son orgnulos claramente mviles y plsticos, que cambian cons tantem ente de forma (Figura 14-3) e incluso que se fusionan unos con otros y se vuelven a separar. Cuando se desplazan por el citoplasma, las mitocondrias apa recen a menudo asociadas a los microtbulos (Figura 14-4), lo que quizs deter mina la orientacin y la distribucin tpica de las mitocondrias en los diferentes tipos celulares. As, las mitocondrias de algunas clulas forman largos filamentos o cadenas mviles, mientras que otras se mantienen en una posicin fija en la que pueden proporcionar ATP directamente en lugares de consumo anormal mente elevado de ATP -p or ejemplo, existen un gran nmero de mitocondrias empaquetadas entre las miofibrillas adyacentes en las clulas del msculo carda co, o mitocondrias densamente agrupadas alrededor del flagelo en los esperma tozoides (Figura 14-5). Aunque su tamao es suficiente como para ser observadas al microscopio ptico -fueron identificadas por primera vez en el siglo xix- el verdadero progre so en el conocim iento de su funcin dependi de procedimientos para aislar mi-

La mitocondria

699

m itocondria

MITOCONDRIA INTACTA

m atriz m em brana externa m em brana interna espacio interm em brana

Figura 14-5 Localizacin de las mitocondrias en el msculo cardaco y en la cola del espermatozoide, cerca de los lugares en los que se u ra n grandes cantidades de ATP. Dur ite el desarrollo del flagelo de la cola^respermatozoide, unos microtbul|^^enroscan de forma helicoidal alr^flror del axonema, donde al parecer (^PQcionan la localizacin de las mitc^flrclrias en la cola; despus, estos^Krotbulos desaparecen.

tocondrias intactas, d l^ r o lla d o s en de los estudios bioqum iW Lse han re gado; cada clula h e p tic^ ^ n tie n e cuales ocupan aproxim adam ^fct una

en un m edio de baja osm olaridad, el influjo de agua hace que la m itocondria se hinche y que la m em brana externa se rompa, liberando el contenido del espacio interm em brana; la m em brana interna permanece intacta

m atriz m em brana ext m em brana intt -espacio nterm em bran: en un m edio de baja osm olaridad, i influjo de agua hace que la m itocondria se hinche y que la m em brana externa se rompa, liberando el contenido del espacio interm em brana; la m em brana inter permanece intacta

La mitocondria presenta u n ? m em brana interna que define

Cada mitocondria est limitada por i que desempean membranas defin de la matriz, inter rior. c ' 1------ nan sus distintos cin bioqum ica c como se presenta da de protenas. La membran; porte, llamada po travs de la bicaps todas las molcule tas molculas pue m s c u lo c a r d a c o de ellas no pueden atravesar la memb nifca que, mientras que el espacio ir lente al citosol respecto a las peque
matriz rnntipnp nn aninn r l< = >npnnpai

la centrifugacin consigue que el contenido del espacio interm em brana quede en la fraccin no sedimentada

ESPACIO INTERMEMBRANA la transferencia a un m edio de osm olaridad elevada provoca la retraccin

jgacin consigue que el d del espacio interm em bre i la fraccin no sedim entat

de la m itocondria desde el punto d^ interna que lo delimita. La membi pecializada. Contiene una elevad A r e na, que contiene cuatro cidos g p o s la m em brana sea especialm ent^m pt versas protenas de transporM que h

A M H fH M lIfflC -

la centrifugacin en gradiente de densidad separa la m em brana externa de la m itocondria de la m atriz y la m em brana que la rodea

ESPACIO INTERMEMBRANA EL ESPERMATOZOIDE la transterencia a un m edio de osm olaridad elevada provoca la retraccin

la rotura y centrifugacin separa la m em brana interna de los com ponentes de la matriz

en gradiente separa la na externa de la m ito c B d ra de la m atriz y la m e m IB n a que la rodea

o r* , Figura 14-6 Fr^Konamient 0 o o o#^ OT tk d o componentes, tas tcnicas 0 . V O 0 ^ y protenas de T a compartim MEMBRANA MATRIZ MEMBRANA permite el pj*esam iento de i INTERNA EXTERNA tiempo, apivecha el hecho d,. U n uu,u.u ^u.. U n baja, el agwfluye hacia dentro de la mitocondria y dilata el espacio matricial {amarillo'mAientras que las crestas de la membrana mitocondrial interna la permiter jsplegarse para acomodarse a la expansin, la membrana externa -que noj ne pliegues- se rompe, liberando una estructura compuesta slo por la brana interna y la matriz.
700 Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

la rotura y ce ifugacin separa la m e m m a interna de los c o m p o n e n te ^ la m atriz

OO O =

MEMBRANA INTERNA

MATRIZ

Figura 14-7 Organizacin general de una mitocondria. En el hgado se estima que un 67% de la totalidad de las protenas mitocondriales se encuentran en la matriz, un 21% se encuentran en la membrana mitocondrial interna, un 6% en la membrana externa y otro 6% en el espacio intermembranoso. Como se indica a continuacin, cada una de estas cuatro regiones contiene un equipo especial de protenas que interviene en distintas funciones. (Cortesa de Daniel S. Friend.)

[..............
100 nm

M a tr iz . La matriz contiene una mezcla altamente concentrada de cientos de enzimas, incluyendo las que son necesarias para la oxidacin del piruvato y los cidos grasos y para el ciclo de cido ctrico. La matriz tambin contiene diversas copias idnticas del genoma de DNA mitocondrial, ribosomas mitocondriales especiales, tRNA y varias enzimas requeridas para la expresin de los genes mitocondriales. M e m b ra n a in te rn a . La membrana interna se encuentra replegada en numerosas crestas, que aumentan considerablemente su superficie total. Contiene protenas con tres tipos de funciones: (1) aquellas que realizan las reacciones de oxidacin de la cadena respiratoria, (2) un complejo enzimtico llamado ATP sintasa que produce ATP en la matriz, y (3) protenas de transporte especficas que regulan el paso de metabolitos dentro y fuera de la matriz. Dado que se establece un gradiente electroqumico a travs de esta membrana por la cadena respiratoria que impulsa la ATP sintasa, es importante que la membrana sea impermeable a la mayora de iones. M e m b ra n a e x te rn a . Gracias a que sta contiene una gran protena formadora de canales (llamada porina), la membrana externa es permeable a todas las molculas con un peso molecular inferior a 5000 daltons. Otras protenas de esta membrana son las enzimas implicadas en la sntesis mitocondrial de lpidos y las enzimas que transforman en la matriz los substratos lipdicos en formas metabolizables. Espacio in te rm e m b ra n a . Este espacio contiene varias enzimas que utilizan la salida de ATP de la matriz para fosforilar otros nucletidos.

La mitocondria

701

m ente a las pequeas molculas que son metabolizadas o que son necesarias por las numerosas enzimas mitocondriales que se hallan concentradas en el es pacio de la matriz. Entre estas enzimas se encuentran las que metabolizan el piruvato y los cidos grasos hasta acetil CoA y las que oxidan el acetil CoA en el ci clo del cido ctrico. Los principales productos finales de esta oxidacin son el C 0 2, que es eliminado de la clula, y el NADH, que constituye la principal fuente de electrones que sern transportados a travs de la cadena respiratoria -n o m bre que recibe la cadena de transporte de electrones de la mitocondria. Las enzi mas de la cadena respiratoria estn situadas en la membrana mitocondrial in terna y son esenciales para todo el proceso de la fosforilacin oxidativa, que genera la mayora del ATP de la clula animal. La membrana mitocondrial interna suele estar muy replegada en el espacio de la matriz, formando una serie de dobleces denominados crestas. Estas inva ginaciones aumentan notablem ente el rea de la membrana interna, de forma que en las clulas de hgado, por ejemplo, constituyen alrededor de una tercera parte del total de la membrana de la clula. El nmero de crestas de las mitocondrias de las clulas del msculo cardaco es tres veces mayor que el de las mitocondrias de una clula heptica, debido probablemente a la mayor demanda de ATP de la clulas del corazn. Adems de las diferencias morfolgicas, tambin existen diferencias substanciales en las enzimas mitocondriales de diferentes ti pos celulares. Sin embargo, en este captulo prescindiremos de estas diferencias y centrarem os nuestra atencin en las enzimas y en las propiedades que son co munes a todas las mitocondrias.

La oxidacin mitocondrial empieza cuando se generan grandes cantidades de acetil CoA a partir de piruvato y de cidos grasos en el espacio de la m atriz 3
El metabolism o oxidativo de las mitocondrias utiliza como combustibles mayoritarios el piruvato y los cidos grasos producido en el citosol a travs de la glucolisis. Estos com puestos son transportados selectivamente desde el citosol hasta la matriz mitocondrial, donde son degradados hasta el grupo acetilo, de dos carbonos, de la molcula del acetil coenzim a A (acetil CoA) (Figura 14-8); a continuacin, el grupo acetilo es introducido en el ciclo del cido ctrico para su degradacin posterior, y el proceso term ina con el paso de los electrones de alta energa derivados del grupo acetilo, a lo largo de la cadena respiratoria. Figura 14-8 El acetil coenzima A (acetil CoA). Este intermediario central es producido durante la transformacin de los alimentos en la mitocondria. En la figura se muestra un modelo espacial de una abreviacin comn del acetil CoA (vase tambin Figura 2-20). El tomo sealado con una S es un tomo de azufre que forma una unin tioster con el acetato. Debido a que este enlace es rico en energa, el grupo acetato puede ser fcilmente transferido a otras molculas, como el oxalacetato (vase Figura 14-14).

CHq CoA
'V

702

Captulo 14: Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

CHi O C cola de cido graso

O II

O
il CU O C cola de cido graso

Figura 14-9 Grasa. (A) Fotografa obtenida con el microscopio electrnico de una inclusin lipidica en el citoplasma que contiene triacilglicridos, la principal forma de reserva de grasa. (B) Estructura de un triacilglicrido, con su porcin de glicerol en co lor verde. (A, por cortesa de Daniel S. Friend.)

(Ai

L __.___________ __ ___ J 1 pm

CH > O C cola do cido graso

O I!

(0>

Para asegurar un aporte continuado de combustible para el metabolismo oxidativo, las clulas animales almacenan cidos grasos en forma de grasas y glucosa en forma de glucgeno. Desde el punto de vista cuantitativo, las grasas son, con diferencia, ms importantes que el glucgeno, por una parte debido a que la oxidacin de las grasas libera una cantidad de energa ms de seis veces superior a la que libera una masa igual de glucgeno en forma hidratada. Un in dividuo humano adulto medio almacena una cantidad de glucgeno suficiente aproximadamente para un solo da de actividad normal, pero almacena una cantidad de grasa suficiente para casi un mes de actividad normal. Si nuestra re serva mayoritaria de energa fuese el glucgeno en lugar de las grasas, nuestro peso corporal aumentara en unos 25 kilos de promedio. La mayor parte de nuestra grasa est almacenada en el tejido adiposo, del cual pasa al torrente sanguneo cuando otras clulas la necesitan. Esta necesidad surge tras un perodo de ayuno; incluso el ayuno nocturno normal da lugar a la movilizacin de grasa, de forma que por la maana, la mayor parte del acetil CoA que entra en el ciclo del cido ctrico deriva de los cidos grasos y no de la glucosa. Sin embargo, despus de una comida la mayor parte del acetil CoA que entra en el ciclo del cido ctrico procede de la glucosa derivada de los alim en tos, y toda la glucosa que se halla en exceso es utilizada o para restablecer las agotadas reservas de glucgeno o para sintetizar grasas. (Tngase en cuenta que en las clulas animales los azcares son fcilmente convertidos en grasa pero que la grasa no puede ser convertida en azcares.) Una molcula de grasa est compuesta por tres molculas de cido graso unidas a una de glicerol, a travs de enlaces ster. Estos triacilglicridos (triglicridos) carecen de carga y son prcticam ente insolubles en agua, formando pe queas gotitas en el citosol (Figura 14-9). En los adipocitos, las grandes clulas especializadas en el almacenamiento de grasa en el tejido adiposo, existe una gran gota nica de grasa que ocupa casi todo el volumen de la clula. En otras clulas que obtienen la energa a partir de la transformacin de los cidos gra sos, como por ejemplo las fibras del msculo cardaco, normalmente se presen tan unas gotas de grasas mucho ms pequeas, a menudo estrechamente aso ciadas a la mitocondrias (Figura 14-10). En todas las clulas, las enzimas de las membranas mitocondriales externa e interna median el paso de los cidos gra sos derivados de las molculas de grasa, hacia la matriz mitocondrial. En la ma triz, cada molcula de cido graso (en forma de acil graso CoA) es degradada completamente gracias a un ciclo de reacciones que en cada vuelta elimina los dos carbonos del extremo carboxilo terminal del acil graso CoA, dando lugar a una molcula de acetil CoA (Figura 14-11). Este acetil CoA producido entra en el ciclo del cido ctrico para ser oxidado. El glucgeno, es un polmero de glucosa, grande y ramificado, que se halla en forma de grnulos en el citoplasma celular (Figura 14-12); su sntesis y degra dacin estn altamente reguladas de acuerdo con las necesidades de la clula.

m iofibrilla m itocondria

gota de grasa

Figura 14-10 Gotas de grasa de una clula de msculo cardaco. Las gotas estn rodeadas de mitocondrias, las cuales oxidan los cidos grasos derivados de los triacilglicridos de la gota.

La mitocondria

703

Figura 14-11 Ciclo de oxidacin de los cidos grasos. El ciclo est

catalizado por series de cuatro enzimas, en la matriz mitocondrial. Tal como se indica en la figura, cada vuelta del ciclo acorta el cido graso en dos carbonos (que se muestran en color rojo ) y genera una molcula de acetil CoA, una molcula de NADH y una de FADH2. El NADH es soluble en la matriz. Por el contrario, el FADH2 permanece fuertemente unido a la enzima a c il graso CoA d esh id rog en asa ; sus dos electrones pueden ser transferidos rpidamente a la cadena respiratoria de la membrana mitocondrial interna, con lo que se regenera FAD.

Figura 14-12 Electronmicrografa y dibujo esquemtico de un grnulo de glucgeno. El glucgeno es la forma +H

principal de reserva de carbohidratos de las clulas de los vertebrados. Es un polmero de glucosa, y cada grnulo de glucgeno es una sola molcula muy ramificada. La sntesis y la degradacin del glucgeno estn catalizadas por enzimas unidas a la superficie de los grnulos: la enzima de biosntesis o glu cgen o sin tasa y la enzima de degradacin o glu cgen o fosforilasa. (Por cortesa de Robert Fletterick y Daniel S. Friend.)

Cuando las necesidades aumentan, el glucgeno es hidrolizado liberando gluco sa 1-fosfato, substrato de la glucolisis. Las reacciones de la glucolisis convierten las molculas de la glucosa, de seis tomos de carbono, (y tambin de otros az cares relacionados) en dos molculas de piruvato, de tres carbonos, las cuales todava contienen la mayor parte de la energa que se puede obtener de la oxida cin de los azcares. Esta energa slo se obtiene despus de que el piruvato haya sido transportado desde el citosol hasta la matriz de la mitocondria, donde

35 nm

dom inio cataltico

\

cadenas ramificadas form adas por residuos de glucosa de una m olcula de glucgeno

dom inio regulador

grnulos de glucgeno en el citoplasm a de una clula del hgado

m onocapa de m olculas de enzima cubriendo un grnulo de glucgeno

dim ero de glucgeno fosforilasa

704

Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

CHtC

//
\

CoASH

piruvato
C H ,C

\ ...

SCoA

Figura 14-13 Reacciones que cataliza el complejo de la piruvato deshidrogenasa. El complejo transforma el piruvato en acetil CoA, en la matriz mitocondrial; en esta reaccin tambin se produce NADH. A,B, y C son las tres enzimas piruvato

acetil CoA

descarboxilasa, lipoamida reductasa transacetilasa y dihidrolipoil deshidrogenasa, cuyas actividades

estn acopladas tal como se muestra en la figura. En la Figura 2-41 se muestra la estructura del complejo enzimtico; este complejo tambin presenta una protena quinasa y una protena fosfatasa que regulan la actividad de la piruvato deshidrogenasa, inhibindola cuando los niveles de ATP son altos.

se encuentra con un gran complejo multienzimtico, el complejo de la piruvato deshidrogenasa. Este complejo -q u e contiene mltiples copias de tres enzimas, cinco coenzimas y dos protenas reguladoras- transforma rpidamente el piru vato hasta acetil CoA, liberando C 0 2 como subproducto (Figura 14-13). Este ace til CoA, junto con el acetil CoA producido a partir de los cidos grasos, alimenta el ciclo del cido ctrico.

El ciclo del cido ctrico oxida el grupo acetilo del acetil CoA, generando NADH y FADH2 para la cadena respiratoria 4
En el siglo xix, unos bilogos observaron que en ausencia de aire (en condiciones anaerbicas) las clulas producen cido lctico (o etanol) mientras que en pre sencia de aire (en condiciones aerbicas) utilizan 0 2 y producen C 0 2 y H2 0 . Los esfuerzos que se realizaron para definir las vas del metabolismo aerbico se centraron en el estudio de la oxidacin del piruvato y condujeron al descubri miento, en 1937, del ciclo del cido ctrico, tambin conocido como el ciclo de los cidos tricarboxlicos o ciclo de Krebs. En la mayora de las clulas, el ciclo del cido ctrico es el responsable de la oxidacin total de aproximadamente dos terceras partes de los compuestos de carbono, y sus principales productos fina les son el C 0 2 y electrones ricos en energa, los cuales pasan va NADH y FADH2 a la cadena respiratoria. El C 0 2 es eliminado como producto de desecho m ien tras que los electrones ricos en energa se desplazan a lo largo de la cadena res piratoria y finalmente se combinan con el 0 2formando H2 0. El ciclo del cido ctrico empieza cuando el acetil CoA formado a partir de los cidos grasos o del piruvato reacciona con el compuesto de cuatro carbonos oxalacetato produciendo cido ctrico, molcula de seis tomos de carbono que da nombre al ciclo. A continuacin, como resultado de siete reacciones conse cutivas, catalizadas por enzimas, se eliminan en forma de C 0 2 dos tomos de carbono y se regenera en oxalacetato. En cada una de estas vueltas del ciclo se producen dos molculas de C 0 2 a partir de dos tomos de carbono que entraron en ciclos anteriores (Figura 14-14); por lo que respecta al grupo acetilo del acetil CoA, el resultado neto es el siguiente: CH3COOH (como acetil CoA) + 2H20 + 3NAD+ + FAD unido a protena -> 2 C 0 2+ 3H+ + 3NADH + FADH2unido a protena Esta reaccin produce tambin una molcula de ATP (va GTP) a travs de una transferencia directa de un fosfato del azcar fosfato intermediario al GDP; reaccin de fosforilacin a nivel de substrato del mismo tipo de las que se produ cen en la glucolisis, como se explic en el Captulo 2. Sin embargo, la contribucin ms importante del ciclo del cido ctrico al metabolismo consiste en la extraccin de electrones de alta energa durante la oxidacin de los dos tomos de carbono del grupo acetilo, hasta C 0 2. Estos elec trones, que son transportados de forma transitoria por el NADH y por el FADH2, son rpidamente transferidos a la cadena respiratoria en la membrana mitocondrial interna. El FADH2, que forma parte del complejo de la succinato deshidro genasa de la membrana interna, cede sus electrones directamente a la cadena La mitocondria 705

acetil CoA
C H >C

Figura 14-14 El ciclo del cido ctrico.

Los intermediarios se muestran en forma de cidos libres, aunque en realidad los grupos carboxilo estn ionizados. Cada una de las reacciones indicadas est catalizada por una enzima diferente, localizada en la membrana mitocondrial. Los dos carbonos procedentes del acetil CoA que entran en esta vuelta del ciclo (sombreados en co lor rojo) sern transformados en C 0 2 en posteriores vueltas del ciclo. Los dos tomos de carbono que son transformados en C 0 2 en esta vuelta del ciclo se sealan con una C de co lor azu l. En cada vuelta se forman tres molculas de NADH y una de GTP, la cual se puede transformar en ATP mediante la reaccin de intercambio GTP + ADP GDP + ATP. Adems, se forma una molcula de FADH2, que permanece unida a una protena formando parte del co m p lejo d e la su ccin ato d esh id rog en asa en la membrana mitocondrial interna; este complejo transfiere directam ente los electrones transportados por el FADH2 a la ubiquinona (vase ms adelante).

://

siguiente ciclo

C O O II

m alato
COOH

I CH, I
c

isocitrato

il

c o o ii

CO,

respiratoria. Por el contrario, el NADH forma un acervo de equivalentes reduci dos en la matriz mitocondrial y transfiere sus electrones despus de que se pro duzca una colisin al azar con una enzima deshidrogenasa unida a la m em bra na. Ahora vamos a considerar de qu forma se utiliza para sintetizar ATP la energa alm acenada en estos electrones.

En la m em brana mitocondrial interna, un proceso quim iosm tico convierte la energa de oxidacin en ATP5
Aunque el ciclo del cido ctrico forma parte del metabolismo aerbico, ninguna de las reacciones que llevan a la produccin de NADH y FADH2 utilizan directa mente oxgeno molecular. Casi toda la energa disponible a partir de la com bus tin de los carbohidratos, grasas y otros nutrientes, obtenidos de los substratos por el NAD+ y el FAD, se alm acena inicialmente en forma de electrones de alta energa. Estos electrones, transportados por el NADH y el FADH2, reaccionan con el oxgeno molecular a travs de la cadena respiratoria. Para describir estas ltimas reacciones se utiliza el trmino de fosforilacin oxidativa ya que la gran cantidad de energa que se libera de ellas es utilizada por las enzimas de la mem-

706

Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

brana interna de la mitocondria para impulsar la transformacin de ADP + P hasta ATP (Figura 14-15). Como ya hemos mencionado, la produccin de ATP por la fosforilacin oxidativa en la cadena respiratoria depende de un proceso quimiosmtico. Cuando fue propuesto por primera vez en 1961, este mecanismo resolvi un antiguo rom pecabezas de la biologa celular. No obstante, la idea resultaba tan original que fueron necesarios varios aos para acumular las pruebas suficientes para que fue ra aceptada de forma general. Anteriormente se crea que la energa para la snte sis del ATP va la cadena respiratoria era suministrada por el mismo proceso que acta durante las fosforilaciones a nivel de substrato: es decir, se crea que la energa de oxidacin era utilizada para producir un enlace de alta energa entre un grupo fosfato y algn compuesto intermedio, y que la conversin de ADP en ATP era impulsada por la energa que se liberaba al romperse este enlace. Sin embargo, a pesar de los intensos esfuerzos que se realizaron, nunca se pudieron llegar a detectar estos intermediarios. Un resumen de nuestra visin actual del metabolismo energtico m itocondrial se representa en la Figura 14-16. Segn la hiptesis quimiosmtica, los in termediarios qumicos de alta energa son substituidos por una conexin entre procesos qumicos (quim io) y procesos de transporte (osm tico, del griego osmos, empujar) -d e ah el nombre de acoplam iento quim iosm tico (Tabla 14-1). Cuando los electrones de alta energa de los hidrgenos del NADH y del FADH2 son transferidos a lo largo de la cadena respiratoria de la m em brana mitocondrial interna, la energa que se libera cada vez que pasan de una molcula transportadora a la siguiente es utilizada para bom bear protones (H+ ) a travs de la m em brana interna, desde la matriz mitocondrial hasta el espacio inter membranoso. Esto genera un gradiente electroqumico de protones a travs de la mem brana mitocondrial interna, y el flujo de H+ a favor de este gradiente es utilizado, m ediante una enzima ligada a la membrana, la ATP sintasa, para im pulsar la conversin de ADP + P en ATP, completando as el proceso de la fosfo rilacin oxidativa. En lo que queda de esta seccin vamos a esbozar brevemente el tipo de re acciones que hacen posible la fosforilacin oxidativa, dejando los detalles para ms tarde.

E H 3 J |+ H+ + < o2

|n a d +|+ h 2o

^
f
iappi+Pj

J procesos de transform acin energtica

FOSFORILACIN OXIDATIVA A ^

n a +H 2o

Figura 14-15 Principal red de transform acin energtica catalizada p or la m itocondria. En este proceso d e fo sfo rila c i n ox id ativ a, la membrana mitocondrial interna acta com o una mquina de interconversin energtica, transformando parte de la energa de oxidacin del NADH (y del FADHZ ) en energa de enlace fosfato del ATP.

piruvato

cidos grasos m em brana interna m em brana externa

o2

Figura 14-16 Resumen del metabolismo energtico mitocondrial. El piruvato y los cidos grasos que entran en la mitocondria son procesados a acetil CoA y son metabolizados por el ciclo del cido ctrico, producindose NADH (y FADH2, que no se muestra en la figura). En el proceso de la fosforilacin oxidativa, los electrones de alta energa del NADH (y del FADH2) se transfieren al oxgeno mediante la cadena respiratoria de la membrana mitocondrial interna, producindose ATP mediante un mecanismo quimiosmtico. El NADH generado en el citosol por la glucolisis tambin transfiere electrones a la cadena respiratoria (no se muestra en la figura). Dado que el NADH no puede pasar a travs de la membrana mitocondrial interna, la transferencia electrnica desde el NADH citoslico se ha de efectuar de manera indirecta por medio de un (de entre varios) sistema de lanzadera, que transporta otros compuestos reducidos al interior de la mitocondria; despus de ser oxidado, este compuesto vuelve al citosol, donde es reducido de nuevo por el NADH.

La mitocondria

707

T abla 14-1 Acoplamiento quimiosmtico La hiptesis quimiosmtica, tal como fue propuesta a principios de la dcada de 1960, consiste en cuatro postulados independientes. En trminos de funcin mitocondrial, fueron: 1. La cadena respiratoria mitocondrial de la membrana interna transloca protones; cuando se transportan electrones a travs de la cadena, bombea H+ hacia afuera del espacio de la matriz. 2. El complejo mitocondrial ATP sintasa tambin transloca protones a travs de la membrana interna: al ser reversible, puede utilizar energa de la hidrlisis del ATP para bombear H+a travs de la membrana, pero si existe un gradiente electroqumico de protones suficiente, los protones fluyen en direccin opuesta a travs del complejo impulsando la sntesis de ATP. 3. La membrana mitocondrial interna est equipada con una serie de protenas transportadoras que median la entrada y la salida de metabolitos esenciales y de determinados iones inorgnicos. 4. La membrana mitocondrial interna es impermeable a H+ , OH- y, en general, a cationes y aniones

Los electrones son transferidos desde el NADH hasta el oxgeno, a travs de tres grandes com plejos enzimticos respiratorios 6
Aunque el m ecanismo a travs del que se aprovecha la energa por la cadena res piratoria difiere del de otras reacciones metablicas, el principio es el mismo. Se consigue que la reaccin energticamente favorable H2 + 1 / 202 >H20 se produz ca a travs de muchos pequeos pasos, de forma que la mayor parte de la ener ga de esta reaccin pueda ser transformada en una forma de almacenamiento en vez de ser liberada al medio en forma de calor. Tal y como ocurre en la forma cin de ATP y de NADH en la glucolisis o en el ciclo del cido ctrico, esto impli ca que la reaccin debe realizarse a travs de una va indirecta. La cadena respi ratoria es una va nica en cuanto a que en ella los tomos de hidrgeno son escindidos en protones y electrones. Los electrones pasan a travs de una serie

(A)

(B)

H 2

y iC > 2

escisin en protones y electrones 2H+

2q

LIBERACION EXPLOSIVA DE ENERGA CALORFICA

Hr

la m ayor parte de la energa se aprovecha y se transform a en una form a de alm acenam iento

Figura 14-17 Comparacin de las oxidaciones biolgicas con la combustin. En esta ilustracin se muestra cmo la mayor parte de la energa que se liberara en forma de calor si se quemara el hidrgeno (A) se utiliza y se almacena en forma til por medio de la cadena de transporte electrnico de la membrana mitocondrial interna (B). El resto de la energa de oxidacin se libera por la mitocondria en forma de calor. En realidad, los protones y los electrones que se muestran aqu se obtienen de los tomos de hidrgeno que se hallan unidos covalentemente a molculas de NADH o de FADH2 (vase Figura

14-18).

H20

h 2o

708

Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

alcohol
H R c-^c/ H H H /C -N H 2 H R C- 5 - d* H H

interm ediarios transitorios

H4 '
H Ct O '
h: h

aldehido
H R C #0

H C H-

H\
H

C I I

-C NH?

I I

I I o

c nh 7 I 'c % Q ' I o

'C f
N'

'H

I I

.C -N H , O
'H II

I I

'H

NAD+

RESUMEN: substrato

+ NAD H + NAD+ ----------- -- C O substrato oxidado

de transportadores de electrones de la membrana mitocondrial interna. En algu nos pasos a lo largo de esta cadena los protones y los electrones se recombinan temporalmente. Pero slo cuando los electrones alcanzan el final de esta cadena de transporte electrnico, se devuelven los protones para neutralizar las cargas negativas creadas por la adicin final de electrones a la molcula de oxgeno (Fi gura 14-17). Estudiaremos el proceso de oxidacin empezando por el NADH, el ms im portante colector de electrones derivados de la oxidacin de las molculas de los nutrientes. Cada tomo de hidrgeno consta de un electrn (er) y un protn (H+ ). En el Captulo 2, ya explicamos el mecanismo por el que el NADH capta los electrones, lo cual se muestra con ms detalle en la Figura 14-18. Como cla rifica este ejemplo, cada molcula de NADH no transporta un ion hidrgeno sino un ion hidruro (un tomo de hidrgeno ms un electrn adicional, al que podemos indicar como H r, ilustrando como un punto cada uno de sus dos elec trones). Sin embargo, y puesto que en las soluciones acuosas los protones estn disponibles libremente, el transporte de un ion hidruro por el NADH equivale a transportar dos tomos de hidrgeno, es decir, una molcula de hidrgeno (H: + H+ >H2). El transporte de electrones empieza en el momento en que el ion hidruro se libera del NADH, regenerndose NAD+ , y se convierte en un protn y dos elec trones (H r H+ + 2e~). Estos dos electrones son transferidos al primero de una serie de ms de 15 transportadores diferentes de electrones que se hallan en la cadena respiratoria. Los electrones empiezan con una energa muy alta, que van perdiendo a medida que pasan a lo largo de la cadena. La mayor parte de las ve ces los electrones pasan de un tomo metlico a otro, cada uno de los cuales est estrechamente unido a una molcula de protena que altera la afinidad electrnica del tomo metlico. Ms adelante se explicarn con detalle los dife rentes tipos de transportadores electrnicos de la cadena respiratoria. Pero lo que es ms importante es el elevado nmero de enzimas implicadas en este pro ceso que se encuentran agrupadas en tres grandes complejos enzimticos respi ratorios, cada uno de los cuales presenta protenas transmembrana que sostie nen firmemente el complejo en la membrana mitocondrial interna. Cada complejo de la cadena tiene mayor afinidad por los electrones que su predece sor, de forma que los electrones pasan secuencialmente de un complejo al otro hasta que finalmente son transferidos al oxgeno, el cual tiene una afinidad por los electrones mayor que la de cualquier complejo de la cadena.

Figura 14-18 La oxidacin biolgica de un alcohol a un aldehido. Del

alcohol se eliminan los com ponentes de dos tomos de hidrgeno completos: un ion hidruro es transferido al NAD+y un protn escapa a la solucin acuosa. En la figura se muestra nicam ente la porcin del anillo de nicotinamida de las molculas de NAD+y de NADH (vase Figura 2-24). Las reacciones que se ilustran aqu se desarrollan sobre la superficie de una protena, y estn catalizadas por grupos qumicos especficos de la enzima alcohol deshidrogenasa (que no se muestra). (Modificado con permiso de P.F. Cook, N.J. Oppenheimer y W.W. Cleland, B iochem istry 20:1817-1825, 1981. 1981 American Chemical Society.)

La mitocondria

709

La energa liberada por el paso de los electrones a lo largo de la cadena respiratoria se alm acena en form a de gradiente electroqum ico de protones a travs de la m em brana m itocondrial interna 7
La ntima asociacin existente entre los transportadores de electrones y las m o lculas de protena hace posible la fosforilacin oxidativa. Las protenas guan a los electrones a lo largo de la cadena respiratoria, de tal manera que los electro nes se desplazan secuencialm ente de un complejo enzimtico al otro -sin que haya cortocircuitos. Es importante que la transferencia de electrones est aco plada a la captacin y liberacin de protones y a los cambios alostricos de de terminadas molculas de protena, de tal manera que el flujo energticamente favorable de electrones bom bea protones (H+ ) a travs de la membrana interna desde el com partim iento de la matriz hasta el espacio intermembrana. Este des plazamiento de protones tiene dos consecuencias principales. (1) Genera un gradiente de pH a travs de la m em brana mitocondrial interna, con un valor de pH mayor en la matriz que en el citosol en donde suele ser cercano a 7. (El pH del espacio interm em brana es equivalente al del citosol ya que las molculas pe queas se equilibran librem ente a travs de la membrana externa de la mitocondria.) (2) Genera un gradiente de voltaje (potencial de membrana) a travs de la m em brana mitocondrial interna, negativo en el interior y positivo en el exterior (que es el resultado del flujo neto de salida de iones positivos). El gradiente de pH (ApH) empuja a los H+ de nuevo hacia adentro y a los OH- hacia afuera de la matriz, reforzando as el efecto del potencial de m embra na (AV) que acta atrayendo hacia la matriz a cualquier ion positivo y em pujan do hacia el exterior a cualquier ion negativo. En conjunto, estas dos fuerzas constituyen un gradiente electroqumico de protones (Figura 14-19). El gradiente electroqumico de protones ejerce una feiza protn-motriz, la cual puede medirse en unidades de milivoltios (mV). Cada ApH de una unidad de pH tiene un efecto equivalente a un potencial de membrana de aproximadamente 60 mV, por lo que la fuerza protn-motriz total es igual a AV- 60(ApH). En una clu la tpica, la fuerza protn-motriz a travs de la membrana interna de una mitocondria en respiracin es de unos 200 mV y est constituida por un potencial de mem brana de unos 140 mV y de un gradiente de pH de alrededor de -1 unidad de pH.

La energa alm acenada en el gradiente electroqumico de protones se utiliza para producir ATP y para transportar m etabolitos e iones inorgnicos hacia el espacio de la matriz 8
La membrana mitocondrial interna contiene una extraordinaria cantidad de protei na: un 70% de su peso seco son protenas mientras que el otro 30% son fosfolpidos. Muchas de estas protenas forman parte de la cadena de transporte electrnico, la cual establece el gradiente electroqumico de protones a travs de la membrana. Otro Figura 14-19 Los dos componentes del gradiente electroqumico de protones. La fuerza protn-motriz total a travs de la membrana mitocondrial interna est compuesta por una gran fuerza debida al potencial de membrana (designada tradicionalmente como AT por los expertos, pero que en este libro se indica como AV) y por una pequea fuerza debida al gradiente de concentracin de protones (ApH). Ambas fuerzas actan en el sentido de impulsar protones hacia el espacio de la matriz mitocondrial.

m em brana m itocondrial interna

/ & \ fuerza Pr t0 "- , Potencial de m otriz debida al mem brana ESPACIO DE LA MATRIZ

++++++++

AV

H+ m em brana m itocondrial interna fuerza protngradiente de . j m otriz debida al conc. de protones X p n ESPACIO DE LA MATRIZ

H + cido H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+

H+ H+ alcalino

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Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

componente mayoritario de la membrana mitocondrial es la enzima ATP sintasa, que cataliza la sntesis de ATP. Se trata de un gran complejo proteico a travs del cual los protones fluyen hacia la matriz a favor de su gradiente electroqumico. Como si se tratara de una turbina, este complejo proteico transforma una forma de energa en otra, sintetizando ATP a partir de ADP y P en la matriz mitocondrial, a travs de una reaccin que est acoplada al flujo de protones hacia la matriz (Figura 14-20). La sntesis de ATP no es, sin embargo, el nico proceso que est impulsado por el gradiente electroqumico de protones. Las enzimas de la matriz m itocon drial, donde tienen lugar el ciclo del cido ctrico y otras reacciones metablicas, han de abastecerse con elevadas concentraciones de substratos, y la ATP sintasa se ha de abastecer con ADP y fosfato. As pues, han de ser transportados a travs de la mem brana mitocondrial interna un elevado nmero de substratos carga dos. Este transporte se realiza gracias a la accin de varios transportadores pro teicos de membrana, muchos de los cuales transportan activamente molculas especficas en contra de sus gradientes electroqumicos, procesos que requieren un aporte de energa. Como se explic en el Captulo 11 , a menudo esta energa procede del cotransporte de otra molcula a favor de su gradiente electroqum i co. El transporte de ADP hacia el espacio de la matriz, por ejemplo, est media do por un sistema antiporte de ADP-ATP: por cada molcula de ADP que entra, sale una molcula de ATP a favor de su gradiente electroqumico (la salida de una carga negativa es favorable). El transporte de fosfato hacia la matriz est mediado por una protena transportadora que acopla el movimiento de fosfato hacia adentro con el flujo de protones hacia adentro, a favor de su gradiente electroqumico, de tal manera que el fosfato es arrastrado con ellos. El piruvato es transportado hacia la matriz de la misma manera (Figura 14-21). El gradiente electroqumico de protones se utiliza tambin para importar Ca2+ , el cual se cree que es importante en la regulacin de algunas enzimas mitocondriales; la im portacin de Ca2+ hacia la mitocondria puede ser importante para eliminarlo del citosol cuando sus niveles empiezan a ser peligrosos. Se utiliza mayor cantidad de energa del gradiente electroqumico de proto nes, para transportar molculas e iones hacia la mitocondria, que para impulsar la ATP sintasa. Si por ejemplo se incuban mitocondrias aisladas en presencia de elevadas concentraciones de Ca2+ , la produccin de ATP cesa completamente; toda la energa de su gradiente electroqumico de protones se utiliza para bom bear Ca2+ hacia la matriz. De forma similar, en unas clulas especializadas el gra diente electroqumico de protones se cortocircuita, de tal manera que sus m ito condrias producen calor en lugar de ATP com o se explica ms adelante. La utilizacin de energa almacenada en el gradiente electroqumico de protones puede regularse por las clulas de tal manera que, en un momento dado, se pue de dirigir hacia aquellas actividades que sean ms necesarias.

interna

externa

La rpida conversin de ADP en ATP en las mitocondrias m antiene una elevada relacin ATP-ADP en las clulas 8
A consecuencia del antiporte de la membrana interna que bombea ADP hacia la matriz mitocondrial intercambindolo con ATP (vase Figura 14-21), las m olcu las de ADP producidas en el citosol por la hidrlisis del ATP, penetran rpida mente en las mitocondrias para ser recargadas a ATP, mientras que las molculas de ATP formadas en la matriz mitocondrial mediante la fosforilacin oxidativa son rpidamente bombeadas hacia el citosol, que es donde son necesarias. Una molcula tpica de ATP del cuerpo humano entra y sale de la mitocondria miles de veces al da (tal como ocurre tambin con el ADP), manteniendo la concentra cin de ATP en la clula unas 10 veces superior a la de ADP. Como hemos discutido en el Captulo 2, las enzimas biosintticas de las clu las guan a sus substratos a lo largo de cadenas de reacciones especficas, impul sando a menudo reacciones energticamente desfavorables al acoplarlas con la hidrlisis del ATP, que es energticamente favorable (vase Figura 2-29). De esta forma, los elevados niveles de ATP se utilizan para impulsar procesos celulares, de

Figura 14-20 Mecanismo general de la fosforilacin oxidativa. Cuando un electrn de alta energa es transferido a lo largo de la cadena de transporte electrnico, parte de la energa liberada se utiliza para impulsar la accin de tres complejos enzimticos respiratorios que bombean protones hacia el exterior del espacio de la matriz. Estos protones generan un gradiente electroqumico de protones a travs de la membrana mitocondrial interna que impulsa a los protones a volver hacia la matriz a travs de la ATP sintasa, un complejo proteico transmembrana que utiliza la energa del flujo de protones para sintetizar ATP a partir de ADP y P en la matriz.

La mitocondria

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ADP

ATP

\
MATRIZ
5 E el gradiente de pH im pulsa la entrada de piruvato h * y/ ' piruv ato (Fj)

Figura 14-21 Algunos procesos de trasporte activo impulsados por el gradiente electroqumico a travs de la m em brana mitocondrial interna.

La carga de cada una de las molculas transportadas se indica con respecto al potencial de membrana, que es negativo en el interior. La membrana mitocondrial externa es permeable a todos estos compuestos. Para una discusin sobre los mecanismos de transporte de membrana, vase el Captulo 11.

el gradiente de pH im pulsa la entrada de fosfato

piruvato

la misma forma como se puede utilizar una batera para accionar mquinas elc tricas: si la actividad de las mitocondrias se detiene, el nivel de ATP disminuye y la batera celular se descarga, de forma que, finalmente, las reacciones energtica mente desfavorables ya no pueden ser impulsadas por la hidrlisis del ATP. Podra parecer que esta situacin no se alcanza hasta que la concentracin de ATP es cero. Sin embargo, se alcanza a concentraciones de ATP que depen den de la concentracin de ADP y de P. Para explicar el porqu, hemos de consi derar algunos principios elementales de la termodinmica.

La diferencia entre AG y AG: para que la hidrlisis de ATP sea til para la clula es necesario que tenga un valor muy negativo de AG 9
La segunda ley de la termodinmica dice que las reacciones qumicas discurren espontneam ente en la direccin que corresponde a un aumento del desorden del universo. En el Captulo 2 ya indicamos que las reacciones que liberan ener ga al medio en forma de calor (tales como la hidrlisis del ATP) tienden a aumentar el desorden del universo al increm entar los movimientos aleatorios de las molculas. Por esta razn, las reacciones discurren convirtiendo la energa li bre (energa disponible para realizar un trabajo) en calor. As, la reaccin A ^ B discurrir en la direccin A - B cuando el cambio de energa libre asociado, AG, es negativo, del mismo modo que cuando un muelle tensado se deja sbitamen te de estirar libera su energa almacenada en forma de calor. Sin embargo, para una reaccin qumica, AG no slo depende de la energa almacenada en cada molcula individual, sino tambin de las concentraciones de las molculas en la mezcla de reaccin. Esto es porque, para una reaccin reversible A ^ B, un ex ceso de B sobre A tender a impulsar la reaccin en direccin B - A; es decir, habr ms molculas haciendo la transicin B > A que molculas haciendo la transicin en sentido contrario. No est claro cul es valor de la diferencia de concentracin necesario para compensar una cantidad de calor liberada dada; esto depende de cambios en la entropa que pueden ser calculados como se des cribi en el Panel 14-1, pgs. 714-715. Para una reaccin dada, el AG se descompone en la suma de dos partes: la primera, denominada variacin de energa libre estndar, AG, depende de las caractersticas intrnsecas de las molculas que reaccionan; la segunda depende de sus concentraciones. Para la reaccin simple A B, AG = AG+ RT\n ^ [A]

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Captulo 14: Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

hidrlisis velocidad de hidrlisis

m-

relacin constante de hidrlisis sntesis relacin constante de sntesis

concentracin de ATP

1a d p | velocidad de sntesis

conc. de fosfato

conc. de ADP

EN EL EQUILIBRIO: velocidad de sntesis = velocidad de hidrlisis relacin relacin conc. de conc. de conc. de constante constante ADP fosfato ATP de sntesis de hidrlisis relacin conc. de conc. de constante ADP fosfato de hidrlisis = constante de equilibrio K relacin concentracin constante de ATP de sntesis abreviando, [ADP] [ ] = K ATP]

Para la reaccin
QQ [adp! +

En el equilibrio, la reaccin no tiene un efecto neto en el desorden del universo, as que A G = 0. Por esta razn, en el equilibrio, [ADP] I ] - fT In ------------ = A G [ATP] Pero las concentraciones de los reactivos en el equilibrio deben satisfacer la reaccin de equilibrio: [ADP] [ @ ] [ATP] Por esta razn, en el equilibrio, AG = - f7 ln K Vemos as, que A G indica el punto de equilibrio para una reaccin, y AG indica lo alejada que est una reaccin del equilibrio. A G es una medida de la "fuerza im pulsora" de una reaccin qum ica, com o la fuerza protn m otriz lo es para la translocacin de protones.

se utiliza la siguiente ecuacin: AG = A G + fT In [ADP] [ ] [ATP]

Donde A G y A G estn expresados en kilocaloras por m ol, R es la constante de los gases (2 x 10 3 kcal/mol K), Tes la tem peratura absoluta (K), y todas las concentraciones estn expresadas en m oles por litro. Cuando las concentraciones de todos los com puestos reaccionantes son iguales a 1 M, A G = A G (ya que fT In 1 = 0). Por consiguiente, AG es una constante definida com o la variacin de energa libre estndar para la reaccin.

donde [A] y [B] representan las concentraciones de A y de B, y ln es el logaritmo neperiano. De esta manera, AG iguala el valor de AG cuando las concentracio nes molares de A y de B son iguales (ln 1= 0). El equilibrio qumico se alcanza cuando el efecto de la concentracin est equilibrado por el efecto de AG, as que no se produce un cambio neto de energa libre para impulsar la reaccin en cualquier direccin; entonces AG = 0, y las concentraciones de A y B son tales que

-RT ln

[A]

= AG

lo que significa que hay un equilibrio qumico cuando [B] _ g-A G "/ / ? '/ ' A] Cuando el ATP se hidroliza a ADP y P , a las condiciones que normalmente existen en la clula, la variacin de energa libre del proceso est entre -11 y -1 3 kcal/mol. Este AG es extremadamente favorable y requiere que la concentracin de ATP en la clula se mantenga alta en relacin a la de ADP y a la de P. En con diciones estndar, en las que tanto el ATP como el ADP y el P se hallan presen tes a la misma concentracin de 1 mol por litro, el AG para la hidrlisis del ATP -llam ada variacin de energa libre estndar o AG de la reaccin- es nicamente de -7 ,3 kcal/mol. A concentraciones de ATP todava ms bajas en relacin con las de ADP y P , el AG llegar a ser igual a cero. En este punto, la velocidad a la que se unirn el ADP i el P formando ATP ser igual a la velocidad a la que se hidrolizar el ATP formando ADP y P. En otras palabras, cuando AG = 0 la reaccin se halla en equilibrio (Figura 14-22). Es AG y no AG el valor que indica lo lejos que una reaccin dada est del equilibrio y lo que determina si una reaccin puede ser utilizada o no para im-

Figura 14-22 Relacin bsica entre las variaciones de energa libre y el equilibrio, ilustradas para la reaccin de hidrlisis del ATP. Las constantes de velocidad en los recuadros ( 1 ) y (2 ) se determinan en experimentos en los que se mide la acumulacin del producto en funcin del tiempo. La constante de equilibrio que se muestra aqu, K, viene dada en moles por litro. (Para una discusin sobre la energa libre, vase Panel 14-1, pgs. 714-715, y para una definicin de la constante de equilibrio, vase Figura 3-9.)

La mitocondria

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LA IMPORTANCIA DE LA ENERGA LIBRE PARA LAS CLULAS

La v id a e s p o s ib le g r a c ia s a u n a c o m p le ja re d d e r e a c c io n e s q u m ic a s in t e r a c tu a n te s q u e t ie n e n lu g a r e n to d a s la s c lu la s . O b s e r v a n d o la s r e a c c io n e s m e ta b lic a s q u e c o m p o n e n e s ta re d , u n o p u e d e s u p o n e r q u e la c lu la d e b e t e n e r la h a b ilid a d d e d e s a r r o lla r e n z im a s c a p a c e s d e lle v a r a c a b o c u a lq u ie r r e a c c i n q u e la c lu la n e c e s ite . P e ro e n r e a lid a d e s to n o e s a s . A p e s a r d e q u e las e n z im a s s o n p o d e r o s o s c a ta liz a d o r e s , n ic a m e n t e p u e d e n a c e le r a r la s r e a c c io n e s q u e s e a n t e r m o d in m ic a m e n t e p o s ib le s . L a s o tr a s r e a c c io n e s n ic a m e n te s o n p o s ib le s p o r q u e s e a c o p la n a r e a c c io n e s m u y f a v o r a b le s q u e la s im p u ls a n . La c u e s ti n d e si u n a r e a c c i n p u e d e o c u r r ir e s p o n t n e a m e n t e , o p o r el c o n t r a r io , n e c e s ita a c o p la r s e a o tr a re a c c i n , e s d e u n a im p o r t a n c ia c a p ita l p a r a la b io lo g a c e lu la r . La r e s p u e s ta s e o b t ie n e e n re la c i n a u n a c a n tid a d lla m a d a la ene rg a Ubre: la v a r ia c i n to ta l d e e n e rg a lib re q u e se p r o d u c e a tr a v s d e un c o n ju n to d e re a c c io n e s d e t e r m in a si e s te g r u p o d e r e a c c io n e s p u e d e o n o t e n e r lu g a r . En e s te P a n e l e x p lic a r e m o s a lg u n a s d e la s d e a s f u n d a m e n t a le s - d e r iv a d a s d e u n a r a m a e s p e c ia l d e la q u m ic a y d e la fs ic a , lla m a d a

te rm o d in m ic a - q u e s o n n e c e s a r ia s p a r a e n t e n d e r lo q u e e s la
e n e r g a lib r e y p o r q u e s ta n im p o r t a n t e p a r a la s c lu la s .

H iiiM ia M a B iK i
LA ENERGIA LIBERADA POR CAMBIOS EN LOS ENLACES QUMICOS ES TRANSFORMADA EN CALOR
s e r ie s d e c o lis io n e s m o le c u la r e s q u e e n p r im e r lu g a r c a le n t a r n las p a r e d e s d e la c a ja y p o s t e r io r m e n t e el m u n d o e x t e r io r (r e p r e s e n t a d o e n n u e s tr o e je m p lo p o r el m a r ) . A l fin a l, el s is t e m a v u e lv e a su t e m p e r a t u r a in ic ia l, e n el m o m e n t o e n el q u e t o d a la e n e r g a d e e n la c e q u m ic o ha s id o t r a n s f o r m a d a e n e n e r g a c a lo r fic a y CAJA MAR t r a n s f e r id a f u e r a d e la c a ja al m e d io e x t e r io r . D e a c u e r d o c o n la p r im e r le y , la v a r ia c i n d e la e n e r g a e n la c a ja CLULA^

(A Fcaja, q u e

in d ic a r e m o s c o m o A E) d e b e s e r ig u a l y d e s ig n o c o n t r a r io a la v a r ia c i n d e e n e r g a c a lo r fic a tr a n s f e r id a , la c u a l p o d e m o s in d ic a r c o m o h\ es d e c ir , A E = ~h. A s p u e s , c u a n d o el c a lo r a b a n d o n a el s is t e m a , la c a n tid a d d e e n e r g a d is m in u y e e n la c a ja .

E t a m b i n p u e d e v a r ia r d u r a n t e u n a r e a c c i n d e b id o al t r a b a jo
r e a liz a d o e n el m u n d o e x t e r io r . S u p o n g a m o s p o r e je m p lo q u e U N IV E R S O d u r a n t e u n a re a c c i n d e t e r m in a d a s e p r o d u c e u n p e q u e o in c r e m e n t o d e l v o lu m e n (AV) d e la c a ja . D a d o q u e p a r a p o d e r e x p a n d ir s e , la s p a r e d e s d e la c a ja d e b e n e m p u ja r c o n tr a la p r e s i n U n s is te m a c e rra d o s e d e f in e c o m o u n c o n ju n t o d e m o l c u la s q u e n o in t e r c a m b ia n m a t e r ia c o n el re s to d e l u n iv e r s o (p o r e je m p lo , la " c lu la -c a ja " q u e s e m u e s tr a m s a r r ib a ). C u a lq u ie r s is t e m a c o m o s te p r e s e n ta m o l c u la s c o n u n a e n e r g a to t a l E. E s ta e n e r g a se d is tr ib u y e e n t r e d if e r e n te s f o r m a s : c o m o e n e r g a d e t r a n s la c i n d e la s m o l c u la s , c o m o su e n e r g a d e v ib r a c i n , c o m o su e n e r g a d e e n la c e e n tr e lo s t o m o s in d iv id u a le s q u e f o r m a n la s m o l c u la s . S u p o n g a m o s q u e e n el s is t e m a tie n e lu g a r u n a re a c c i n . La p r im e r a le y d e la t e r m o d in m ic a r e s tr in g e el tip o d e r e a c c i n q u e p u e d e t e n e r lu g a r e n el s is te m a : e s ta b le c e q u e " e n c u a lq u ie r p r o c e s o , la e n e r g a to t a l d e l s is te m a se m a n t ie n e c o n s t a n t e " . P o r e je m p lo , s u p o n g a m o s q u e e n el s is te m a c e r r a d o tie n e lu g a r la re a c c i n A > B, y q u e e s ta r e a c c i n lib e r a u n a g r a n c a n t id a d d e e n e r g a q u m ic a d e e n la c e . In ic ia lm e n te , e s ta e n e r g a in c r e m e n t a r la in t e n s id a d d e lo s m o v im ie n t o s m o le c u la r e s (d e t r a n s la c i n , d e v ib r a c i n y d e r o ta c i n ) e n e l s is t e m a , lo c u a l e q u iv a le a un a u m e n t o d e la t e m p e r a t u r a . S in e m b a r g o , e s te in c r e m e n t o d e los m o v im ie n t o s p r o n to s e r t r a n s f e r id o fu e r a d e l s is te m a a tr a v s d e c o n s t a n t e (P ) d e l m e d io e x t e r io r , e s ta e x p a n s i n s u p o n e la r e a liz a c i n d e un t r a b a jo e n el m u n d o e x t e r io r y r e q u ie r e e n e r g a . La e n e r g a u tiliz a d a e s P ( AV) q u e , d e a c u e r d o c o n la p r im e r a le y , d e b e r e d u c ir la e n e r g a d e la c a ja ( E ) e n u n a c a n t id a d ig u a l a la u tiliz a d a p a ra p r o d u c ir e s te t r a b a jo . En m u c h a s r e a c c io n e s , la e n e r g a q u m ic a d e e n la c e e s t r a n s f o r m a d a e n t r a b a jo y c a lo r . La

111

e n ta lp ia (H )e s u n a f u n c i n c o m p u e s t a q u e in c lu y e a m b a s f o r m a s d e
e n e r g a (H = E + P V ) . P a ra s e r r ig u r o s o s , e n u n s is t e m a c e r r a d o , es la v a r ia c i n d e la e n t a lp ia {A H ), y n o la v a r ia c i n d e la e n e r g a , la q u e es ig u a l a la c a n tid a d d e c a lo r t r a n s f e r id a al m u n d o e x t e r io r d u r a n t e u n a r e a c c i n . Las r e a c c io n e s e n las q u e /- / d is m in u y e lib e r a n c a lo r al m e d io y se d e n o m in a n " e x o t r m ic a s " m ie n t r a s q u e las r e a c c io n e s e n las c u a le s H in c r e m e n t a a b s o r b e n c a lo r d e l m e d io y se d e n o m in a n " e n d o t r m ic a s " . A s , ~h = AH. S in e m b a r g o , d e b id o a q u e la v a r ia c i n d e v o lu m e n q u e o c u r r e d u r a n t e la m a y o r a d e la r e a c c io n e s b io l g ic a s , e s d e s p r e c ia b le , p u e d e a p r o x im a r s e :

- h = AH = AE

LA SEGUNDA LEY DE LA TERMODINMICA

C o n s id e r e m o s u n r e c ip ie n te e n el q u e h a y 1 0 0 0 m o n e d a s , d is p u e s ta s to d a s e lla s d e c a r a h a c ia a r r ib a . S i el r e c ip ie n te s e a g ita v ig o r o s a m e n t e , s o m e t ie n d o a las m o n e d a s a m o v im ie n t o s a le a to r io s d e l m is m o t ip o d e lo s q u e e x p e r im e n t a n to d a s las m o l c u la s d e b id o a s u s f r e c u e n t e s c o lis io n e s c o n o tr a s m o l c u la s , p u e d e e s p e r a r s e q u e al fin a l, a p r o x im a d a m e n t e la m it a d d e las m o n e d a s s e e n c o n t r a r n o r ie n t a d a s d e c a ra h a c ia a b a jo . El m o t iv o d e e s ta r e o r ie n t a c i n e s q u e ta n s lo e x is te u n c a m in o p a ra r e in s ta u r a r el e s t a d o in ic ia l (c a d a m o n e d a c o n la c a ra h a c ia a r r ib a ), m ie n t r a s q u e e x is te n m u c h o s c a m in o s d ife r e n te s ( a p r o x im a d a m e n t e u n o s 1 0 298) p a r a a lc a n z a r u n e s t a d o c o m p u e s t o p o r el m is m o n m e r o d e c a r a s y d e c ru c e s ; d e h e c h o , h a y m u c h o s m s c a m in o s p a r a a lc a n z a r un e s ta d o 5 0 :5 0 q u e p a r a c o n s e g u ir c u a lq u ie r o tr o e s ta d o . C a d a e s ta d o t ie n e u n a p o s ib ilid a d d e s u c e d e r, q u e es p r o p o r c io n a l al n m e r o d e v a s p o r las q u e d ic h o e s t a d o se p u e d e a lc a n z a r. La s e g u n d a le y d e la t e r m o d in m ic a e s t a b le c e q u e " lo s s is te m a s c a m b ia r n e s p o n t n e a m e n t e d e s d e e s ta d o s d e p r o b a b ilid a d b a ja d e o c u r r ir , h a c ia e s ta d o s d e p r o b a b ilid a d e le v a d a " . D a d o q u e lo s e s ta d o s d e b a ja p r o b a b ilid a d s o n m s " o r d e n a d o s " q u e lo s e s ta d o s d e a lta p r o b a b ilid a d , la s e g u n d a le y ta m b i n se p u e d e e x p r e s a r c o m o : " e l u n iv e r s o c a m b ia c o n s t a n t e m e n te e n el s e n tid o d e c o n v e r tir s e e n m s d e s o r d e n a d o " .

... 714 Panel 14- i Energa libre y reacciones biolgicas.

------------------- _

LA ENTROPA, S
La s e g u n d a le y (a d ife r e n c ia d e la p r im e r a ) p e r m it e p r e d e c ir la

m o n e d a s c u a n d o la c a ja e s a g it a d a v ig o r o s a m e n t e y s e o b t ie n e el m is m o n m e r o d e c a r a s q u e d e c ru c e s , e s R In ( 1 0 298), e s d e c ir , a p r o x im a d a m e n t e ig u a l a 1 3 7 0 u e p o r m o l d e c a ja s d e e s te t ip o (6 x 1 0 23 c a ja s ). A s p u e s , d e b id o a q u e a n t e r i o r m e n t e s e ha d e f in id o A S c o m o p o s itiv a p a r a la tr a n s ic i n d e l e s t a d o A al e s ta d o B ( p B / p A > 1), las r e a c c io n e s c o n u n g r a n in c re m e n to d e S (e s to es, las r e a c c io n e s q u e t e n g a n u n a A S > 0 ) s e h a lla n f a v o r e c id a s , es d e c ir , s e p r o d u c ir n e s p o n t n e a m e n t e . C o m o se d is c u te e n el C a p t u lo 2 , la e n e r g a c a lo r f ic a p r o v o c a u n a c o n m o c i n a le a t o r ia d e la s m o l c u la s . D a d o q u e la A S = R In p B / p A t r a n s f e r e n c ia d e c a lo r d e s d e u n s is t e m a c e r r a d o al m e d io in c r e m e n t a el n m e r o d e d is p o s ic io n e s d if e r e n t e s q u e p u e d e n a d o p t a r la s m o l c u la s d e l m e d io e x t e r io r , in c r e m e n t a la e n t r o p a d e l m e d io . S e p u e d e d e m o s t r a r q u e la lib e r a c i n d e u n a d e t e r m in a d a c a n t id a d d e e n e r g a c a lo r f ic a t ie n e u n e fe c to d e d e s o r d e n m a y o r a t e m p e r a t u r a s b a ja s q u e a a lta s , y q u e , c o m o se d e f in i a n t e r io r m e n t e , el v a lo r p a r a la A S d e l m e d io (A S mar), es ig u a l a la c a n t id a d d e c a lo r t r a n s f e r id a d e s d e el s is t e m a ( h ) al m e d io d iv id id a p o r la t e m p e r a t u r a ( T ):

d ire c c i n d e u n a r e a c c i n d e t e r m in a d a . S in e m b a r g o , p a r a p o d e r
u tiliz a r la e n e s te s e n tid o , e s n e c e s a r io d is p o n e r d e u n a m e d id a d e la p r o b a b ilid a d d e u n e s ta d o , e s d e c ir , d e su g r a d o d e d e s o r d e n . E s ta m e d id a e s la e n t r o p a (S ). La e n tr o p a e s u n a fu n c i n lo g a r t m ic a d e la p r o b a b ilid a d ta l q u e la v a ria c i n de e n tro p a ( A S ) q u e s e p r o d u c e c u a n d o la r e a c c i n A B c o n v ie r te u n m o l d e A e n u n m o l d e B, es:

d o n d e p A y p B s o n las p o s ib ilid a d e s d e lo s d o s e s ta d o s A y B, R es la c o n s ta n te d e los g a s e s (2 cal g r a d o 1 m o l 1), y A S se m id e en u n id a d e s d e e n tr o p a (u e ). En n u e s tro e je m p lo in ic ia l d e las m il m o n e d a s , la p r o b a b ilid a d re la tiv a d e q u e se p re s e n te n to d a s las c a ra s (e s ta d o A ) re s p e c to a la s itu a c i n d e m ita d d e c a ra s y m ita d d e c ru c e s (e s ta d o B) es ig u a l al n m e r o d e c a m in o s d ife r e n te s a tra v s d e lo s q u e se p u e d e n a lc a n z a r c a d a u n o d e e s to s d o s e s ta d o s . S e p u e d e c a lc u la r q u e p A = 1 y p B = 1 0 0 0 1 (5 0 0 ! x 5 0 0 !) = 1 0 298. A s p u es , la v a r ia c i n d e e n t r o p a p r o d u c id a p o r la r e o r ie n t a c i n d e las

A S mar = h / T

LA ENERGA LIBRE DE GIBBS, G

A l t r a b a ja r c o n u n s is te m a b io l g ic o c e r r a d o , n o s p u e d e in te r e s a r d is p o n e r d e un s is te m a s e n c illo d e p r e d e c ir si u n a re a c c i n v a a t e n e r lu g a r o n o e n el s is te m a . H e m o s v is to q u e la c u e s ti n c ru c ia l es si, al p r o d u c ir s e la re a c c i n , la v a r ia c i n d e e n tr o p a d e l u n iv e r s o e s p o s itiv a o n e g a tiv a . En n u e s tr o s is te m a id e a liz a d o d e la c lu la c a ja , la v a r ia c i n d e e n tr o p a e n el u n iv e r s o t ie n e d o s c o m p o n e n te s la v a r ia c i n d e e n tr o p a p a ra el s is te m a c e r r a d o d e la c a ja y la v a r ia c i n d e e n tr o p a e n el m a r c ir c u n d a n te y a m b o s c o m p o n e n t e s d e b e n s e r c o n s id e r a d o s c o n ju n t a m e n te p a ra c u a lq u ie r tip o d e p r e d ic c i n q u e se h a g a . P o r e je m p lo , es p o s ib le q u e u n a re a c c i n a b s o r b a c a lo r , h a g a d is m in u ir la e n tr o p a d e l m a r P e ro c o m o h /T e s ig u a l a la v a r ia c i n d e e n t r o p a d e l m a r (A S mar), y A S e n la r e a c c i n a n t e r io r e s A S caja, te n e m o s A t e m p e r a t u r a c o n s t a n t e , la v a r ia c i n d e e n e r g a lib r e (A G) d u r a n t e la r e a c c i n e s ig u a l a A H - TAS. C o m o A H = - h , el c a lo r a b s o r b id o d e l m a r , t e n e m o s

-A G = -A H + TAS

-A G - h + TAS y -A G /T = h /T + AS

(A S mar < 0 ) y c a u s e u n g r a n in c r e m e n to d e l d e s o r d e n e n el in te r io r
d e la c a ja (A Scaja > 0 ), d e m a n e r a q u e la v a r ia c i n to ta l A S unverso =

-A G/T-- A S mar + A S caja A S unverso

P o d e m o s c o n c lu ir q u e u n a r e a c c i n s e p r o d u c ir e n la d ir e c c i n e n la q u e s u p o n g a q u e la v a r ia c i n d e e n e r g a lib r e (A G) s e a m e n o r q u e c e r o , p o r q u e e n e s te c a s o , c u a n d o t e n g a lu g a r la r e a c c i n se p r o d u c ir u n a v a r ia c i n p o s itiv a d e la e n t r o p a d e l u n iv e r s o . A s , la v a r ia c i n d e la energa libre e s u n a m edida directa de la variacin

A S mar + A S caja se a m a y o r q u e 0. En e s te c a s o la re a c c i n s u c e d e r
e s p o n t n e a m e n te s ie m p r e q u e d u r a n te la re a c c i n el m a r c e d a c a lo r a la c a ja . U n e je m p lo d e re a c c i n d e e s te tip o es la d is o lu c i n d e c lo r u r o s d ic o e n u n v a s o d e p r e c ip ita d o s c o n te n ie n d o a g u a (la " c a ja " ). E sta re a c c i n t ie n e lu g a r e s p o n t n e a m e n te a p e s a r d e q u e la t e m p e r a t u r a d e l a g u a s u b e c u a n d o la sal se d is u e lv e . Lo s q u m ic o s h a n e n c o n tr a d o til d e fin ir n u e v a s " fu n c io n e s c o m p u e s ta s " q u e d e s c rib e n co m b in a cio n e s d e p r o p ie d a d e s fs ic a s d e l s is te m a . Las p r o p ie d a d e s q u e se p u e d e n c o m b in a r s o n : la t e m p e r a t u r a ( T ) , la p re s i n (P), el v o lu m e n (V), la e n e r g a ( E ), y la e n tr o p a ( S ) . La e n ta lp ia (H ) e s u n a d e e s ta s fu n c io n e s c o m p u e s ta s . P e ro la fu n c i n c o m p u e s ta m s til p a ra lo s b i lo g o s e s , c o n d ife r e n c ia , la energa lib re de G ibbs, G. E sta fu n c i n e s til c o m o e s tr a te g ia d e c o n ta je q u e p e r m ite d e d u c ir los c a m b io s d e e n tr o p a d e l u n iv e r s o r e s u lta n te s d e re a c c io n e s q u m ic a s e n la c a ja , e v ita n d o c u a lq u ie r c o n s id e r a c i n s o b re lo s c a m b io s d e e n tr o p a e n el m a r. P a ra u n a c a ja d e v o lu m e n V a p r e s i n P, la d e fin ic i n d e G es

de la entropa del universo.

P a ra u n a s e r ie c o m p le ja d e r e a c c io n e s a c o p la d a s e n la s q u e p a r tic ip e n m u c h a s m o l c u la s d if e r e n t e s , la v a r ia c i n to t a l d e e n e r g a lib r e se p u e d e m e d ir s im p le m e n t e s u m a n d o la e n e r g a lib r e d e t o d a s las e s p e c ie s m o le c u la r e s d e s p u s d e la r e a c c i n y c o m p a r a n d o e s te v a lo r c o n la s u m a d e la e n e r g a lib r e a n te s d e la re a c c i n ; lo s v a lo r e s d e e n e r g a lib r e d e lo s c o m p u e s t o s m s c o m u n e s s e p u e d e n e n c o n t r a r e n ta b la s p u b lic a d a s . D e e s ta m a n e r a s e p u e d e p r e d e c ir la d ir e c c i n d e u n a re a c c i n d e t e r m in a d a y , e n c o n s e c u e n c ia , r e f u t a r f c ilm e n t e c u a lq u ie r m e c a n is m o p r o p u e s to . A s , p o r e je m p lo , d e lo s v a lo r e s o b s e r v a d o s p a r a la m a g n it u d d e l g r a d ie n t e e le c t r o q u m ic o d e p r o t o n e s a tr a v s d e la m e m b r a n a m it o c o n d r ia l in t e r n a , s e p u e d e a s e g u r a r q u e la e n z im a A T P s in te ta s a r e q u ie r e el p a s o d e m s d e u n p r o t n p o r c a d a m o l c u la d e A T P q u e s in te tiz a . El v a lo r d e A G d e u n a re a c c i n es u n a m e d id a d ire c ta d e l g r a d o d e d e s p la z a m ie n t o d e l e q u ilib r io d e d ic h a r e a c c i n . El e le v a d o v a lo r n e g a tiv o q u e p r e s e n ta la c lu la p a ra la h id r lis is d e A T P s im p le m e n t e re fle ja el h e c h o d e q u e las c lu la s m a n t ie n e n la r e a c c i n d e h id r lis is d e l A T P u n a s 10 v e c e s a le ja d a d e l v a lo r d e e q u ilib r io . S i u n a re a c c i n a lc a n z a el e q u ilib r io , A G = 0 , la re a c c i n tie n e lu g a r a la m is m a v e lo c id a d e n un s e n tid o q u e e n el o tro . P a ra la h id r lis is d e l A T P , el e q u ilib r io s e a lc a n z a c u a n d o la g r a n m a y o r a d e l A T P ha s id o h id r o liz a d o , ta l c o m o o c u r r e e n u n a c lu la m u e r ta .

G = H -T S

d o n d e H e s la e n ta lp ia d e s c rita a n te s (E + P V ), T e s la t e m p e r a t u r a a b s o lu ta y S e s la e n tr o p a . C a d a u n o d e e s to s p a r m e t r o s e s t r e f e r id o n ic a m e n t e al in t e r io r d e la c a ja . D u r a n te u n a re a c c i n q u e se p r o d u z c a e n la c a ja , la v a r ia c i n d e la e n e r g a lib r e (la G d e lo s p r o d u c to s m e n o s la G d e lo s s u b s tr a to s in ic ia le s ) se s e a la c o m o A G, y c o m o a h o r a d e m o s t r a r e m o s , e s u n a m e d id a d ire c ta d e la c a n tid a d d e d e s o r d e n g e n e r a d o e n el u n iv e r s o c u a n d o tie n e lu g a r la r e a c c i n .

715

pulsar otras reacciones. Debido a que la eficiente conversin de ADP en ATP en la m itocondria mantiene una concentracin de ATP elevada en relacin a la de ADP y de P , la reaccin de hidrlisis del ATP se mantiene muy lejos del equili brio, por lo que AG tiene un valor muy negativo. Si no existiera este desequili brio, la hidrlisis del ATP no se podra utilizar para impulsar las reacciones de la clula, de forma que muchas reacciones biosintticas se produciran hacia atrs en lugar de hacia adelante.

La respiracin celular es notablem ente eficiente 10

Por medio de la fosforilacin oxidativa, cada par de electrones del NADH propor cionan energa para la formacin de aproximadamente 2,5 molculas de ATP. El par de electrones del FADH2, que tiene una energa algo ms baja, nicamente ge nera aproximadamente 1,5 molculas de ATP. En total, a partir de cada molcula de acetil CoA que entra en el ciclo del cido ctrico se forman aproximadamente 10 molculas de ATP, lo que significa que a partir de una molcula de glucosa se producen unas 20 molculas de ATP y 84 a partir de una molcula de palmitato, un cido graso de 16 tomos de carbono. Si tambin se incluyen las reacciones energticas que se producen antes de que se forme el acetil CoA, la oxidacin completa de una molcula de glucosa produce un rendimiento neto aproximado de 30 molculas de ATP, mientras que a partir de la oxidacin completa de una mo lcula de palmitato se producen aproximadamente 110 molculas de ATP netas. Estas cifras son valores mximos aproximados, ya que la cantidad de ATP produ cido en la mitocondria depende del porcentaje de energa del gradiente electro qumico que se utilice para otros fines diferentes a la sntesis de ATP. Cuando se comparan las variaciones de energa libre de la combustin di recta de grasas y de hidratos de carbono hasta C 0 2y H20 con la cantidad total de energa almacenada en enlaces fosfato del ATP durante las correspondientes oxidaciones biolgicas, se observa que a menudo la eficiencia con que se trans forma la energa de oxidacin en energa de enlace de fosfato del ATP es superior al 40%. Este valor es considerablemente superior al de la eficiencia de la mayora de los aparatos de conversin energtica no biolgica. Si las clulas trabajaran con un rendimiento igual al que tienen un motor elctrico o un motor de gasoli na (entre 10% y 20%), un organismo debera comer de una forma voraz para mantenerse vivo. Adems, puesto que la energa no utilizada se libera en forma de calor, los organismos de gran volumen tendran que desarrollar mecanismos ms eficientes para poder ceder este calor al medio. Los estudiantes a veces se preguntan por qu las interconversiones celulares siguen estas vas tan complejas. De hecho, la oxidacin de los azcares hasta C 0 2 y H20 podra realizarse ms directamente, eliminando el ciclo del cido c trico y muchos de las pasos de la cadena respiratoria. De esta forma, la respira cin hubiera resultado ms fcil de estudiar pero el resultado habra sido desas troso para la clula. La oxidacin produce inmensas cantidades de energa libre que slo a pequeas dosis puede ser utilizada de forma eficiente. Las vas oxidativas complejas implican muchos intermediarios, cada uno de los cuales se dife rencia de su predecesor en algunos detalles. Como resultado de ello, la energa liberada se fracciona en pequeos paquetes que pueden ser convertidos de for ma eficiente en enlaces de alta energa de molculas tiles, como el ATP y el NADH mediante reacciones acopladas (vase Figura 2-17).

Resumen
La mitocondria realiza la mayora de las oxidaciones que se producen en la clula y genera la mayor parte del ATP que se genera en las clulas animales. La matriz mi tocondrial contiene una gran variedad de enzimas, entre las que se hallan las que oxidan el piruvato y los cidos grasos hasta acetil CoA, y las enzimas del ciclo del cido ctrico, que oxidan este acetil CoA hasta CO.. En estas reacciones se producen grandes cantidades de NADH (y de FADH.J. La energa disponible resultante de la

716

Captulo 14: Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

combinacin del oxgeno con los electrones reactivos transportados por el NADHy el FADH# se utiliza mediante una cadena de transporte electrnico que se halla in cluida en la membrana interna de la mitocondria y que recibe el nombre de cadena respiratoria. La cadena respiratoria bombea protones hacia el exterior de la matriz mitocondrial, generando as un gradiente electroqumico de protones al que contri buyen tanto el potencial de membrana como la diferencia de pH. Este gradiente transmembrana se utiliza, a su vez, para sintetizar ATP y para impulsar el trans porte activo de determinados metabolitos a travs de la membrana mitocondrial interna. La combinacin de estas reacciones es la responsable de un eficiente inter cambio de ATP-ADP entre la mitocondria y el citosol que mantiene el acervo celular de ATP altamente cargado, deform a que el ATP puede ser utilizado para impulsar muchas de las reacciones celulares que requieren energa.

m em brana interna

m em brana externa

MITOCONDRIA DISGREGADA POR ULTRASONIDOS

pO

0
w

^
# < ~ / vtj.
-

5 ^ ****** 3* t i
o

La cadena respiratoria y la ATP sintasa i i

Despus de estas consideraciones generales sobre la funcin de las m itocon drias, pasemos a estudiar con mayor detalle la cadena respiratoria -la cadena de transporte de electrones que es tan crucial para todo el metabolismo oxidativo. La mayora de los elementos de la cadena son com ponentes intrnsecos de la membrana mitocondrial interna, y suministran algunos de los ejemplos ms cla ros de las complejas interacciones que puedan tener lugar entre protenas indi viduales en una membrana biolgica.

u
t
o

VESCULAS CON LA CARA INTERNA EN CONTACTO CON EL EXTERIOR OBTENIDAS A PARTIR DE FRAGMENTOS DE MEMBRANA INTERNA REFUSIONADOS

,V A avsy

% JV*
$

%v i'

A partir de las mitocondrias se pueden aislar partculas invertidas funcionales 12

La cadena respiratoria es relativamente inaccesible a la manipulacin experi mental en las mitocondrias intactas. Fragmentando las mitocondrias mediante ultrasonidos, es posible aislar partculas submitocondriales que estn formadas por crestas rotas que se han fusionado de nuevo, constituyendo pequeas ves culas cerradas de unos 100 nm de dimetro (Figura 14-23). Cuando estas part culas submitocondriales se examinan al microscopio electrnico, se aprecia que su superficie est recubierta de pequeas esferas que se hallan unidas a la m em brana mediante unos finos pednculos (Figura 14-24). En las mitocondrias in tactas se observa que estas estructuras semejantes a un chupa-chups se hallan localizadas en la superficie interna (de la matriz) de la membrana interna. As pues, las partculas submitocondriales son vesculas de membrana interna re vertidas, de forma que la superficie que inicialmente estaba dirigida hacia la m a triz ahora est expuesta al medio circundante. Por consiguiente, fcilmente se les puede suministrar metabolitos para los que la membrana es impermeable, que normalmente se encuentran en el compartimiento de la matriz. Cuando se les aade NADH, ADP y fosfato inorgnico, estas partculas transportan electro nes desde el NADH hasta el 0 2 y acoplan esta oxidacin a la sntesis de ATP, ca talizando la reaccin ADP + P >ATP. Este sistema libre de clulas proporciona un sistema de ensayo que hace posible la purificacin, en su forma funcional, de muchas protenas responsables de la fosforilacin oxidativa.

partculas subm itocondriales purificadas

Figura 14-23 Preparacin de partculas submitocondriales a partir de m itocondrias purificadas. Las partculas son trozos de crestas disgregadas que forman vesculas cerradas.

La ATP sintasa puede ser purificada y de nuevo incorporada a las m em branas 13

Los primeros experimentos que demostraron que las diferentes protenas de la m em brana que catalizan la fosforilacin oxidativa pueden ser separadas unas de otras sin perder actividad, fueron realizados en 1960. Las minsculas esferas proteicas que recubren la superficie de las partculas submitocondriales fueron separadas de las partculas, dejando el palo del chupa-chups y las otras prote nas intrnsecas de membrana en la membrana de la partcula. Las partculas desnudas de esferas podan todava oxidar NADH en presencia de oxgeno, pero

100 nm
Figura 14-24 Electronm icrografa de partculas submitocondriales. Esta preparacin se ha contrastado en negativo. (Cortesa de Efraim Racker.)

La cadena respiratoria y la ATP sintasa

717

ya no podan sintetizar ATP. Por otro lado, las esferas purificadas podan actuar com o ATPasas, hidrolizando ATP a ADP y P. Cuando las esferas purificadas (de nom inadas ATPasasFj) se aadieron de nuevo a las partculas submitocondriales desnudas, las partculas reconstituidas volvieron a sintetizar ATP a partir de ADP y P. Estudios posteriores demostraron que la ATPasaFj forma parte de un com plejo transm em brana mayor (de unos 500 000 daltons) que contiene, por lo m e nos, nueve cadenas polipeptdicas diferentes (Figura 14-25) y que actualmente se denomina ATP sintasa (o tam bin ATPasaFj). La ATP sintasa supone apro ximadamente un 15% de la protena total de la membrana interna; en m em bra nas de cloroplastos y de bacterias se hallan presentes complejos enzimticos muy similares a ste. . La porcin transm em brana del complejo proteico acta como un transpor tador de H+ y la porcin ATPasaF, (la cabeza del chupa-chups) sintetiza ATP cuando los protones pasan a travs suyo a favor de gradiente electroqumico. Cuando la ATPasaF, se separa del transportador de H+ , slo acta en sentido in verso, catalizando la hidrlisis de ATP. Una de las demostraciones ms convincentes de la funcin de la ATP sinta sa se obtuvo en un experimento realizado en 1974. En aquel momento ya se ha ban desarrollado algunos mtodos que permitan transferir protenas integra les de m em brana solubilizadas con detergente a vesculas lipdicas (liposomas) formadas a partir de fosfolpidos purificados. As, fue posible formar una m em brana hbrida que contena ATP sintasa mitocondrial purificada y bacteriorrodopsina -u n a bom ba de protones activada por la luz, estudiada en el Captulo 10- pero ninguna de las protenas de la cadena respiratoria mitocondrial. Cuan do estas vesculas eran expuestas a la luz, los protones bom beados hacia el inte rior del lumen de la vescula por la bacteriorrodopsina, fluan de nuevo hacia el exterior a travs de la ATP sintasa, produciendo ATP en el medio externo (Figu ra 14-26). Puesto que la interaccin directa entre una bom ba bacteriana de protones y una ATP sintasa de mamfero pareca altamente improbable, este experimento sugiri claram ente que en las mitocondrias la traslocacin de protones impulsa da por el transporte de electrones por un lado y la sntesis de ATP por otro, son dos acontecim ientos diferentes.

transportador de H+ transm em brana

Figura 14-25 La ATP sintasa. Como ya se ha indicado, la porcin ATPasaF 1 se forma de subunidades mltiples (letras griegas), como ocurre con el transportador de H+transm embrana.

bacteriorrodopsina purificada detergente +

ATP sintasa purificada

ADICIN DE FOSFOLPIDOS Y ELIMINACIN DEL DETERGENTE

vescula cerrada (liposoma)

[ADP] + <

Figura 14-26 Esquema de un experimento que dem uestra de qu forma un flujo simple de protones puede im pulsar la accin de la ATP sintasa. Combinando una bom ba bacteriana de protones activada por la luz (la bacteriorrodopsina), una ATP sintasa purificada a partir de mitocondrias de corazn de buey y fosfolpidos, se produjeron vesculas que sintetizaban ATP en respuesta a un estmulo luminoso.

718

Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

HIDROLISIS DE ATP

ESPACIO DE LA MATRIZ

9 nm

u y f2

La ATP sintasa puede funcionar de m anera reversible, hidrolizando ATP y bombeando H+13
La ATP sintasa puede utilizar un flujo de protones a favor de gradiente electro qumico para sintetizar ATP, pero tambin puede utilizar la energa de hidrlisis del ATP para bom bear H+ a travs de la membrana mitocondrial interna (Figura 14-27). As pues, acta como un elemento de acoplamiento reversible, interconvirtiendo un gradiente electroqumico de protones en energas qumicas de en lace y viceversa. La direccin en que acta depende del balance entre el valor del gradiente electroqumico de protones y el AG local para la hidrlisis de ATP. El com plejo enzimtico se denomina ATP sintasa porque normalmente sintetiza ATP gracias al impulso del gran gradiente electroqum ico de protones que se mantiene por la cadena respiratoria (Figura 14-20). El nmero exacto de protones necesarios para sintetizar una molcula de ATP no se conoce con exactitud. De todas formas, para facilitar los clculos que describiremos ms adelante, asumiremos que la ATP sintasa sintetiza una molcula de ATP por cada 3 protones impulsados a travs de ella. En un momento dado, el que la ATP sintasa sintetize o hidrolize ATP depen de del balance exacto entre la variacin de energa libre favorable para que los tres protones atraviesen la membrana, hacia la matriz (AG3H +, que es negativa) y la variacin de energa libre desfavorable para la sntesis de ATP en la matriz (AGsntesisd eA T P> que es positiva). Como ya discutimos, el valor de AGs(ntesisdeA TP de pende de las concentraciones exactas de los tres compuestos que reaccionan ATP, ADP y P en la matriz mitocondrial (vase Figura 14-22). Por otra parte, el valor de AG3H + es proporcional al valor de la fuerza protn-motriz a travs de la membrana mitocondrial interna. El siguiente ejemplo ayudar a explicar de qu forma afecta a la ATP sintasa el equilibrio entre estas dos variaciones de energa libre. Como se explica en el pie de la Figura 14-27, un nico protn que penetra en la matriz a favor de un gradiente de 200 mV, libera una energa libre de 4,6 kcal/mol; la energa libre liberada para el movimiento de tres protones es el tri ple (AG3H + = -13,8 kcal/mol). As, si la fuerza protn-motriz se mantiene constan te a 200 mV, la ATP sintasa sintetizar ATP hasta que se alcance una relacin de ATP respecto con ADP i P tal que AGsntesjs d eA T P sea igual a +13,8 kcal/mol (aqu AGS fn tesis d eatp + AG3H + =0). En este punto, no existir ni sntesis ni hidrlisis neta de ATP mediada por la ATP sintasa. Supongamos que, de pronto, se hidroliza una gran cantidad de ATP debido a reacciones que requieren energa en el citosol -cayendo la relacin ATP/ADP de la matriz. En esta situacin el valor de AGs(n tesis d eA T P disminuir (vase Figura 14-22), y la ATP sintasa comenzar a sintetizar de nuevo ATP, para restablecer la relacin ATP/ADP original. Alternativamente, si de pronto la fuerza protn-mo-

Figura 14-27 La ATP sintasa es un mecanismo acoplador reversible que interconvierte las energas del gradiente electroqumico de protones y los enlaces qumicos. La ATP sintasa puede sintetizar ATP mediante la utilizacin de la fuerza protn-motriz {izquierda) y tambin puede bombear protones en contra de su gradinte electroqumico mediante la hidrlisis de ATP {derecha). Como se ha explicado en el texto, en un cada momento la direccin de su actuacin depende de la variacin de energa libre neta para los procesos acoplados de translocacin de H+a travs de la membrana y la sntesis de ATP a partir de ADP y P. Previamente, mostramos cmo la variacin de la energa libre (AG) para la hidrlisis de ATP depende de las concentraciones de los tres reactivos ATP, ADP y P (Figura 14-22); el AG para la translocacin de los protones a travs de la membrana es proporcional a la fuerza protn-motriz. El factor de conversin entre ellos es el faraday. As, AGh += -0,023 (fuerza protnmotriz), donde AGh + se expresa en kilocaloras por mol (kcal/mol) y la fuerza protn-motriz en milivoltios (mV). Para un gradiente electroqumico de H+de 200 mV tendremos un AGH += -4,6 kcal/mol.

La cadena respiratoria y la ATP sintasa

719

triz disminuye y entonces se mantiene constante pero a un valor de 160 mV, en tonces AG3H + variar a -11,0 kcal/mol. Como resultado de ello, la ATP sintasa co menzar a hidrolizar una parte del ATP de la matriz hasta que se alcance un nuevo equilibrio de ATP a ADP y P (donde AGsntesisdeA TP= +11 kcal/mol), etc. Como veremos ms adelante, en muchas bacterias la ATP sintasa revierte el sentido de su accin durante la transicin entre el metabolismo aerbico y anaerbico. La reversibilidad de la ATP sintasa es una propiedad compartida por otras protenas de membrana que acoplan el bombeo de iones con la sntesis o hidrli sis de ATP. Por ejemplo, tanto la bomba de Na+ -K+como la de Ca2+, descritas en el Captulo 11, hidrolizan ATP y utilizan la energa liberada para bombear los iones a travs de la membrana. Si cualquiera de estas bombas estuviera expuesta a un valor anormalmente elevado del gradiente de los iones que transporta, actuara en sentido contrario -sintetizando ATP a partir de ADP y P en lugar de hidrolizarlo. De esta manera, como ocurre con la ATP sintasa, estas bombas son capaces de convertir directamente la energa electroqumica almacenada en un gradiente inico transmembrana en energa de enlace fosfato del ATP.

La cadena respiratoria bom bea H+a travs de la m em brana m itocondrial interna 14

La cadena respiratoria incluida en la mem brana mitocondrial interna normal mente genera el gradiente electroqumico de protones que impulsa la sntesis de ATP. La capacidad de la cadena respiratoria para traslocar H+ hacia afuera de la matriz se puede poner de manifiesto experimentalmente bajo ciertas condicio nes. Por ejemplo, se puede tratar una suspensin de mitocondrias aisladas con un substrato adecuado para la oxidacin y se puede bloquear el flujo de proto nes a travs de la ATP sintasa. En ausencia de aire, la administracin de una pe quea cantidad de oxgeno a esta preparacin causa una breve incremento de la respiracin, de 1 o 2 segundos antes de que todo el oxgeno haya sido consumi do. Durante este brusco increm ento de la respiracin se puede medir con un sensible electrodo de pH la sbita acidificacin del medio que resulta de la sali da de H+desde el espacio de la matriz. En un experimento similar llevado a cabo con una suspensin de partculas submitocondriales, el medio se alcaliniza cuando se agrega el oxgeno, ya que los H+ son bombeados hacia dentro de cada vescula debido a su orientacin in vertida.

Se han utilizado mtodos espectroscpicos para identificar muchos transportadores de electrones de la cadena respiratoria 15
Muchos de los transportadores de electrones de la cadena respiratoria absorben la luz visible y cam bian de color cuando son oxidados o reducidos. En general, cada uno de ellos tiene su propio espectro de absorcin y su reactividad, sufi cientem ente caractersticos como para poder seguir espectroscpicam ente su comportamiento incluso en mezclas crudas. Gracias a esta caracterstica, fue posible purificar estos com ponentes mucho antes de que se conocieran sus fun ciones exactas. As, los citocromos fueron descubiertos en 1925 como com pues tos que sufren una rpida oxidacin y reduccin, en organismos vivos tan dispa res como las bacterias, levaduras e insectos. Mediante la observacin de clulas y tejidos con un espectroscopio, se identificaron tres tipos de citocromos en base a su espectro de absorcin caracterstico y fueron denominados citocromos a, b y c. Esta nom enclatura se mantiene en la actualidad a pesar de que se sabe que las clulas contienen varios citocromos de cada tipo, y que la clasificacin en tipos no es funcionalmente importante. Los citocrom os constituyen una familia de protenas coloreadas que tienen en comn la presencia de un grupo hemo, cuyo tomo de hierro pasa del estado frrico (Fe III) al estado ferroso (Fe II) cada vez que acepta un electrn. El grupo hemo consiste en un anillo de porflrina con un tomo de hierro fuertemente en-

720

Captulo 14: Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

lazado y sostenido por cuatro tomos de nitrgeno de las esquinas de un cua drado (Figura 14-28). Un anillo de porfrina relacionado con ste, unido a hierro en la hemoglobina y a magnesio en la clorofila, es el responsable del color rojo de la sangre y del color verde de las hojas. El citocromo que se conoce mejor de la cadena respiratoria es el citocromo c, cuya estructura tridimensional ha sido determinada por cristalografa de rayos X (Figura 14-29). Las protenas de hierro-azufre constituyen otra familia de transportadores de electrones. Estas protenas presentan entre dos y cuatro tomos de hierro unidos a un nmero igual de tomos de azufre y a cadenas laterales de cisterna, formando un centro de hierro-azufre en la protena (Figura 14-30). En la cadena respiratoria existen ms centros de hierro-azufre que citocromos, pero su detec cin espectroscpica requiere la utilizacin de espectroscopia de resonancia de espn electrnico (ESR, de Electron Spin Resonance), por lo que estn menos ca racterizados que los citocromos. El ms sencillo de los transportadores de electrones es una pequea m ol cula hidrofbica disuelta en la bicapa lipdica conocida como ubiquinona o co enzima Q. Una quinona (Q) puede aceptar o ceder uno o dos electrones, y por cada electrn que transporta acepta temporalmente un protn del medio (Figu ra 14-31). Adems de los seis grupos hemo diferentes unidos a citocromos, de ms de seis centros de hierro-azufre y de la ubiquinona, tambin actan como transpor tadores de electrones desde el NADH hasta el oxgeno, dos tomos de cobre y una flavina que se hallan fuertemente unidos a protenas de la cadena respiratoria. La va implica aproximadamente 40 protenas diferentes en total. El orden de los transportadores de electrones ha sido determinado mediante sofisticados mto dos espectroscpicos (Figura 14-32), y muchas de las protenas fueron inicialmen te aisladas y purificadas como polipptidos individuales. No obstante, para com prender el funcionamiento real de la cadena respiratoria hay que tener en cuenta que las protenas estn organizadas en tres grandes complejos enzimticos.

COOH CH2

COOH
c h

c h

HC S
c h

protena
Figura 14-28 Estructura del grupo hemo unido covalentem ente al citocrom o c. El anillo de porfrina se muestra en azu l. En la cadena respiratoria hay 5 citocrom os diferentes. Dado que en citocrom os diferentes los grupos hemo presentan algunas diferencias estructurales y estn unidos a sus respectivas protenas de m anera diferente, cada uno de los citocrom os tiene diferente afinidad por los electrones.

La cadena respiratoria contiene tres grandes complejos enzim ticos incluidos en la m em brana interna 16
Las protenas de membrana son difciles de purificar en forma de complejos in tactos, porque son insolubles en la mayora de soluciones acuosas, y algunos de
Figura 14-29 Estructura tridimensional del citocrom o c, un transportador de electrones de la cadena de transporte electrnico. Esta pequea protena contiene algo ms de 100 aminocidos y se une a la membrana de m anera bastante laxa, mediante interacciones inicas (vase Figura 14-33). El tomo de hierro {en co lo r n a ra n ja ) colocado sobre el grupo hemo {en colo r azul) puede transportar un solo electrn (vase tambin Figura 3-59).

La cadena respiratoria y la ATP sintasa

721

Figura 14-30 Estructura de dos tipos de centros de hierro-azufre. (A) Un centro del tipo 2Fe2S. (B) Un centro del tipo 4Fe4S. Aunque contienen muchos tomos de hierro, cada centro de hierro-azufre slo puede transportar un electrn a la vez. En la cadena respiratoria existen ms de seis centros de hierro-azufre diferentes.

los detergentes que se requieren para solubilizarlas pueden destruir las interac ciones normales proteina-proteina. Sin embargo, a principios de la dcada de 1960 se descubri que los detergentes inicos relativamente suaves como el desoxicolato pueden solubilizar, en forma nativa, com ponentes determinados de la mem brana mitocondrial interna. Esto permiti identificar y purificar los tres principales complejos enzimticos respiratorios, unidos a la membrana, de la va que va desde el NADH hasta el oxgeno (Figura 14-33). Como veremos, cada uno de estos com plejos acta com o una bom ba de H+ impulsada por un trans porte de electrones; sin embargo, estos complejos fueron caracterizados inicial mente en funcin de los transportadores de electrones que contienen y con los que interactan. 1. El complejo NADH deshidrogenasa es el mayor de los complejos enzimti cos respiratorios, con una masa de aproximadamente 800 000 daltons y ms de 22 cadenas polipeptdicas. Acepta electrones del NADH y los trans fiere a travs de una flavina y al m enos cinco centros de hierro-azufre a la ubiquinona, que transfiere sus electrones a un segundo complejo enzim tico respiratorio, el complejo b-c. El complejo citocrom o b -q contiene por lo menos 8 cadenas polipeptdicas diferentes, y parece que se presenta en forma de dmero de unos 500 000 daltons. Cada monmero contiene tres grupos hemo unidos a citocromos, y una protena hierro-azufre. El complejo acepta electrones de la ubiquinona y los transfiere al citocromo c, que transporta su electrn hasta el complejo

2.

de la citocromo oxidasa.
3. El complejo de la citocrom o oxidasa (citocromo aa3) es el complejo mejor caracterizado de los tres. Est formado por, al menos, 9 cadenas polipept dicas diferentes, y se asla como un dmero de unos 300 000 daltons; cada m onmero contiene dos citocromos y dos tomos de cobre. El complejo acepta electrones del citocromo c y los cede al oxgeno. Figura 14-31 Las quinonas. Cada uno de estos transportadores de electrones capta un protn del ambiente acuoso por cada electrn que acepta, y puede transportar uno o dos electrones como parte de un tomo de hidrgeno (color amarillo). Cuando cede sus electrones al siguiente transportador de la cadena, estos protones se liberan. En las mitocondrias la quinona es la ubiquinona (coenzima Q), que se muestra aqu; la larga cola hidrofbica que ancla la ubiquinona a la membrana consta generalmente de 6 a 10 unidades de isopreno (de cinco carbonos cada una). En las plantas, el transportador de electrones correspondiente es la plastoquinona, casi idntica a la ubiquinona. Para simplificar, tanto a la ubiquinona como a la plastoquinona se les denomina quinona, abreviada como Q.

H4

-C H ,

-C H

cola hidrofbica hidrocarbonada

u b iq u in o n a

u b is e m iq u in o n a (ra dica ! lib re )

u b iq u in o l (d ih id ro u b iq u in o n a )

722

Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

(A) CONDICIONES NORMALES

(B) CONDICIONES ANAEROBICAS

parcialm ente oxidados inhibidor a 1 ( b reducido

C U ,oxidado

02

control

e- - 0

- ~ 0

~ ,

com pletam ente reducido

d ) - 0 2

adicin repentina de oxigeno e- - 0 Q - 0 0 - 0 2

se produce una ola de oxidacin que se va desplazando de izquierda a derecha

Los citocromos, los centros de hierro-azufre y los tomos de cobre, slo pueden transportar un electrn a la vez. Sin embargo, cada NADH cede dos elec trones y cada molcula de 0 2 debe recibir cuatro electrones para producir agua. Existen varios puntos de recoleccin y de dispersin de electrones a lo largo de la cadena de transporte de electrones en los que se reajustan estas diferencias en el nmero de electrones.

En la citocromo oxidasa, un centro de hierro-cobre cataliza de form a eficiente la reduccin del 0 217
Debido a que el oxgeno tiene una gran afinidad por los electrones, libera una gran cantidad de energa libre cuando es reducido formando agua. De esta m a nera, la evolucin de la respiracin celular, en la que el 0 2 es convertido en agua, capacit a los organismos para obtener mucha ms energa que la que podan obtener a partir del metabolismo anaerbico. Es por ello por lo que probable mente todos los organismos superiores respiran. En cualquier caso, para poder utilizar el 0 2 de este modo, los sistemas biolgicos requieren disponer de unos procesos qumicos muy sofisticados. Podemos tolerar el 0 2 en el aire que respi ramos porque le cuesta captar el primer electrn, por lo que su reaccin inicial en las clulas est finamente controlada por la catlisis enzimtica. Pero un vez que una molcula de 0 2 haya captado un electrn, formando un radical superxido (0 2~), ste se convierte en peligrosamente reactivo y captar tres electro nes adicionales de donde sea. La clula puede utilizar el 0 2 para la respiracin slo porque la citocromo oxidasa sita el 0 2 en un centro bimetlico especial (Figura 14-34B), donde se mantiene unido entre un tomo de hierro ligado a un grupo hemo y a un tomo de cobre, hasta que se captan un total de cuatro elec-

Figura 14-32 Mtodos generales utilizados para determ inar la trayectoria de los electrones a lo largo de la cadena de transporte electrnico. El grado de oxidacin de los transportadores electrnicos a, b, c, y d se puede seguir de forma continua estudiando su espectro, ya que el del estado oxidado es diferente al del estado reducido. En este esquema un aumento en el grado de oxidacin se indica en co lo r rojo oscuro. (A) En condiciones normales, todos los transportadores se hallan en un estado parcialmente oxidado. La adicin de un inhibidor especfico hace que los transportadores situados a favor de la corriente de electrones se oxiden ms (rojo claro) y los transportadores situados en direccin contraria de la corriente de electrones se reduzcan. (B) En ausencia de oxgeno, todos los transportadores se hallan en estado com pletam ente reducido (gris). La adicin sbita de oxgeno hace que cada transportador se transforme en su forma parcialmente oxidada, con un retraso que es mayor para la mayora de los transportadores situados a favor de la corriente de electrones.

ESPACIO INTERMEMBRANA

m em brana m itocondrial interna H20 ESPACIO DE LA MATRIZ

IJM>lil+ H +

ubiquinona 10 nm NAD+ com plejo NADH deshidrogenasa com plejo b-ci

2H + + 1/ 2 O 2

com plejo citocrom o oxidasa (dmero)

Figura 14-33 Paso de los electrones a travs de los tres complejos enzimticos respiratorios. En la figura se observan las formas y tamaos relativos de tres com plejos enzimticos respiratorios. Estas estructuras tridimensionales de baja resolucin fueron obtenidas a partir de imgenes de cristales bidimensionales (hojas cristalinas) visualizadas al microscopio electrnico a varios ngulos de inclinacin. Durante la transferencia de dos electrones del NADH al oxgeno (ln eas rojas), la ubiquinona y el citocromo c hacen la funcin de transportadores entre los complejos.

La cadena respiratoria y la ATP sintasa

723

entrada de electrones 4e_

paso de electrones

bom beo de P atones

mem brana m itocondrial interna ESPACIO DE LA MATRIZ 2H20 (B) subunidad I subunidad com plejo de la citocrom o oxidasa
Figura 14-34 La reaccin del 0 2 con los electrones en la citocrom o oxidasa. (A) Disposicin de los transportadores de electrones en la citocromo oxidasa. La subunidad I, que tiene 12 hlices a transmembrana, contiene 2 tomos de hierro unidos a 2 grupos hemo; uno de stos acta como un punto captador de electrones que los transfiere al centro bimetlico (.en m a rcad o en un rectn gu lo blan co), formado por el otro tomo de hierro y por un tomo de cobre opuesto muy cercano. Hay que destacar que por cada molcula de 0 2 que reacciona son bombeados fuera de la matriz 4 H+y que esto requiere un total de 4 electrones. (B) Una visin ampliada del centro bimetlico de hierro-cobre con el 0 2 unido. (C) Un esquema de la va utilizada para la reduccin del oxgeno, dando una idea de la complejidad de las reacciones implicadas. Los electrones se representan com o p u n tos rojos hasta que se incorporan a los tomos de hidrgeno (am arillo). (Basado en el modelo de G. T. Babcock y M. Wikstrom, N ature 356:301-309,1992. 1992. Macmillan Magazines Ltd.)

trones; slo entonces los dos tomos de la molcula de oxgeno sern liberados como dos molculas de agua, sin ningn peligro (Figura 14-34C). Aunque la citocromo oxidasa contiene muchas subunidades proteicas, la mayora de ellas tienen un papel secundario, ayudando a regular tanto la activi dad com o el ensam blaje de las tres subunidades que forman el ncleo de la en zima. Una de las subunidades de este ncleo contiene el centro bimetlico don de se une el oxgeno, y es responsable del bombeo de cuatro protones que se transfieren a travs de la m em brana mitocondrial interna por cada molcula de oxgeno que se reduce a agua (Figura 14-34).

724

Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

Se estima que la reaccin de la citocromo oxidasa utiliza un 90% del consu mo total de oxgeno de la mayora de las clulas. La toxicidad de venenos como el cianuro y la azida se basa en su capacidad de unirse fuertemente a este com plejo, bloqueando as cualquier tipo de transporte electrnico.

Las transferencias de electrones estn mediadas por colisiones aleatorias que se producen entre los dadores y los aceptores que difunden en la m em brana m itocondrial interna 18
Los dos componentes que transportan los electrones entre los tres complejos enzimticos principales de la cadena respiratoria -la ubiquinona y el citocromo c difunden rpidamente en el plano de la membrana. Las colisiones que se pueden esperar entre estos dos transportadores mviles y los complejos enzimticos pue den explicar las velocidades observadas de transferencia de electrones (cada complejo cede y recibe un electrn cada 5 a 20 milisegundos). As pues, para ex plicar la transferencia de electrones en la bicapa lipdica no es necesario postular la existencia de una cadena de protenas ordenada estructuralmente; de hecho, parece que los tres complejos enzimticos existen en el plano de la membrana in terna como entidades independientes, de forma que la transferencia ordenada de electrones se debe a la especificidad de las interacciones funcionales entre los componentes de la cadena. Esta idea se ve reforzada por la observacin de que varios de los com ponen tes de la cadena respiratoria se hallan presentes en cantidades bastante diferen tes. En las mitocondrias de corazn, por ejemplo, se estima que por cada m ol cula del complejo de la NADH deshidrogenasa existen 3 molculas de complejo b-Cp 7 molculas de complejo de la citocromo oxidasa, 9 molculas de citocro mo c, y 50 molculas de ubiquinona; en otros tipos celulares se presentan pro porciones muy diferentes. Estos com ponentes forman una cadena en la que cada uno interacta especficamente con el transportador adyacente en la se cuencia mostrada en la Figura 14-33, y hay un flujo neto de electrones desde la NADH deshidrogenasa a la citocromo oxidasa porque cada uno de los complejos enzimticos de la secuencia presenta una afinidad mayor por los electrones que su predecesor. La afinidad que presenta una molcula por los electrones es su potencial redox. Como estudiaremos a continuacin, las diferencias de potencial redox de un transportador de electrones y el siguiente se utiliza para bombear protones fuera de la matriz mitocondrial.

Una gran cada del potencial redox a travs de cada uno de los tres com plejos enzimticos respiratorios aporta energa para el bom beo de H+19
A los pares de componentes, tales como el H20 y V 202 o el NADH y el NAD+se les denomina pares redox conjugados, ya que uno de los componentes se convierte en el otro mediante la adicin de uno o ms electrones ms uno o ms protones -lo s protones estn ya disponibles en cualquier solucin acuosa. As, por ejemplo, i/ 202+ 2e~ + 2H+ H20

Muchos lectores sabrn que una mezcla equimolar de los miembros de un par conjugado cido-base acta como tampn, manteniendo una presin de H+ definida, o pH, que es una medida de la constante de disociacin del cido. De la misma forma, una mezcla equimolar de los miembros de un par conjugado redox mantiene una presin de electrones definida, o potencial redox (reduccin-oxidacin), E, que es una medida de la afinidad del transportador de elec trones por los electrones. Colocando electrodos en contacto con soluciones que contengan los pares redox conjugados apropiados, uno puede medir el potencial redox de cada uno de los diversos transportadores de electrones que participan en las reacciones biolgicas de oxidacin-reduccin. En los sistemas biolgicos el potencial redox

La cadena respiratoria y la ATP sintasa

725

se determina a pH 7,0, al que [H+ ] = IO-7 M. Los pares de compuestos que pre sentan un potencial redox ms negativo tienen menor afinidad por los electro nes y por esta razn contienen transportadores con una fuerte tendencia a do nar electrones, mientras que los pares que presentan potenciales redox ms positivos tienen mayor afinidad por los electrones y, consecuentem ente, contie nen transportadores con una fuerte tendencia a aceptar electrones. De esta m a nera, una mezcla 50-50 de NADH y NAD+ tiene un potencial redox de -320 mV, lo cual indica que el NADH tiene una fuerte tendencia a donar electrones; una mezcla 50-50 de H20 y llz02 tiene un potencial redox de +820 mV, lo cual indica que el 0 2tiene una fuerte tendencia a aceptar electrones. Se pueden determinar los potenciales redox de todos los transportadores de electrones de la cadena respiratoria que se puedan distinguir por su espectro, y se observa que van aumentando a medida que uno va pasando por la cadena de transportadores de electrones. Dado que la mayora de citocromos presentan unos potenciales redox ms altos que los de los centros de hierro-azufre, gene ralmente actan como transportadores de electrones cerca del extremo del 0 2 de la cadena respiratoria, mientras que las protenas hierro-azufre actan como transportadores cerca del extremo del NADH. En la Figura 14-35 se muestra un esquema de los potenciales redox medidos a lo largo de la cadena respiratoria. Los potenciales caen en tres grandes escalo nes, uno a travs de cada complejo enzimtico principal. La variacin de poten cial redox entre cada dos transportadores de electrones es directamente propor cional a la energa libre liberada por cada electrn transferido entre ellos (vase Figura 14-35). Cada complejo acta como un elemento transformador de ener ga, utilizando esta variacin en energa libre para bom bear protones a travs de la m em brana interna, creando de esta manera un gradiente electroqumico de protones a travs de la membrana. Esta transformacin se puede poner de m a nifiesto mediante la incorporacin a liposomas de cada uno de los complejos purificados: cuando se aaden un dador y un aceptor de electrones apropiados, de forma que los electrones atraviesen el complejo, los H+ se traslocarn a travs de la m em brana del liposoma.

El m ecanism o del bom beo de H+se conoce m ejor en bacteriorrodopsina 20

Debido a que algunos com plejos enzimticos de la cadena respiratoria bombean un protn por electrn a travs de la mem brana mitocondrial interna mientras

-4 00 -3 00
-2 0 0

25
20

-100 0 com plejo de la NADH 100 deshldrogenasa 200

300 400 500 600 700 800 com plejo de la b-ci

nH 4

t
h 2o

15
10

com plejo de la citocrom o oxidasa 2H + + V2O 2 d ire cci n del flu jo de e lectro nes

Figura 14-35 El potencial redox (indicado como E 0o Eh) aumenta a medida que los electrones fluyen hacia abajo de la cadena respiratoria, hacia el oxgeno. La variacin de energa libre estndard, AG0, para la transferencia de cada uno de los dos electrones cedidos por la molcula de NADH puede obtenerse en la escala de ordenadas de la derecha (AG = -n(0,023) AE, donde n es el nmero de electrones transferidos a travs de una variacin de potencial redox de AE mV). Los electrones fluyen a travs de un complejo enzimtico pasando de manera secuencial a los cuatro o ms transportadores de electrones de cada complejo. Como se indica, parte de la variacin favorable de energa libre es utilizada por cada complejo enzimtico para bombear protones a travs de la membrana mitocondrial interna. No se conoce con exactitud cul es el nmero de protones bombeados por electrn (n); se estima que la NADH deshidrogenasa y los complejos b-ct bombean dos H+por electrn, mientras que el complejo de la citocromo oxidasa slo bombea uno. Los dos electrones transportados desde el FADH2, generados a partir de la oxidacin de los cidos grasos (vase Figura 14-11) y del ciclo del cido ctrico (vase Figura 14-14), pasan directamente a la ubiquinona. Por esta razn, inducen menos bombeo de H+ que los dos electrones que provienen del NADH (no mostrado).

726

Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

CONFORMACIN C

CONFORMACIN A captacin de protones DENTRO ENERGA liberacin de ' acoplam iento energtico protones AUMENTO DE LA AFINIDAD' POR LOS H' DISMINUCIN (baja - alta) DE LA AFINIDAD POR LOS H+ (alta baja)

CONFORMACIN A captacin de protones

ERA

CONFORMACIN B

que otros bom bean dos, el mecanismo molecular mediante el que el transporte de electrones se acopla al bom beo de protones parece ser diferente para cada uno de los tres complejos enzimticos. Se desconocen los detalles del m ecanis mo por el que actan. En el caso del complejo b -cp las quinonas claramente par ticipan en este mecanismo. Como mencionamos anteriormente, una quinona capta un protn del medio acuoso por cada electrn que transporta y lo libera cuando libera el electrn (vase Figura 14-31). El libre desplazamiento de la ubiquinona por la bicapa lipdica le permite aceptar electrones cerca de la superfi cie interna de la mem brana y donarlos al complejo b-c, cerca de la superficie ex terna, transfirindose as un protn a travs de la bicapa por cada electrn transportado. Sin embargo, por cada electrn se bom bean dos protones a travs del complejo b-Cji existen evidencias del llamado ciclo Q, en el que la ubiquinona se recicla a travs del complejo en un sentido determinado, que hace posible esta transferencia dos por uno. Los cambios alostricos de las conformaciones proteicas determinados por el transporte electrnico tambin pueden bombear H+, tal como la ATP sintasa trabajando en sentido inverso bom bea H+ hidrolizando ATP. Tanto para el com plejo de la NADH deshidrogenasa como para el complejo de la citocromo oxidasa, parece probable que el transporte de electrones determine de manera ordena da los cambios alostricos de conformacin de las protenas que provocan que una parte de la protena bombee H+ a travs de la membrana mitocondrial inter na. Este tipo de bombeo de protones est bien estudiado para la bacteriorrodopsina, una bom ba protnica impulsada por luz que se encuentra en la membrana plasmtica de ciertas bacterias altamente especializadas (vase Figura 10-32). En la Figura 14-36 se presenta un mecanismo general para el bom beo de H+ basado en estudios estructurales y funcionales de esta protena.

Figura 14-36 Bombeo de protones. Este modelo general del bombeo de H+ impulsado por energa se basa en el mecanismo que parece que utiliza la bacteriorrodopsina. La protena transmembrana mostrada es impulsada a seguir cambios ordenados de conformaciones, designadas aqu como A, B y C. En la conformacin C la protena tiene una baja afinidad para los H+causando la liberacin de un H+ al exterior de la bicapa lipdica; en la conformacin A, la protena tiene una afinidad muy alta por los H+ , favoreciendo su captacin hacia dentro de la bicapa lipdica. Como se indica, la transicin de la conformacin B a la C es energticamente desfavorable, pero est impulsada a realizarse por el acoplamiento con una reaccin energticamente favorable que ocurre en algn sitio de la protena {flecha azul). Los otros cambios conformacionales, conducen a estados de menor energa y discurren espontneamente. De este modo, el ciclo A >B >C A slo va en un sentido, favoreciendo el bombeo de los H+desde dentro hacia fuera. En el caso de la bacteriorrodopsina, la energa para la transicin B - C est proporcionada por la luz, mientras que en la mitocondria esta energa est proporcionada por el transporte electrnico.

Los ionforos de H+disipan el gradiente de H+ , desacoplando as el transporte de electrones de la sntesis de ATP 21

Desde los aos 1940 se sabe que varias substancias, como el 2,4-dinitrofenol, ac tan como agentes desacoplantes, desacoplando el transporte de electrones de la sntesis de ATP. La adicin de estos compuestos orgnicos de bajo peso m olecu lar a las clulas detiene la sntesis de ATP en las mitocondrias, sin bloquear el

La cadena respiratoria y la ATP sintasa

727

consumo de oxgeno. En presencia de este agente desacoplante, el transporte de electrones contina a gran velocidad pero no se genera ningn tipo de gradiente de H+. La explicacin de esto es tan elegante como sencilla: los agentes desaco plantes actan como transportadores de H+ (ionforos de H+ ), constituyendo una va para el flujo de H+ a travs de la membrana mitocondrial interna alterna tiva a la de la ATP sintasa. Como consecuencia de este cortocircuito, la fuerza protn-motriz se disipa completamente por lo que ya no se puede sintetizar ATP.

Normalmente el control respiratorio restringe el flujo de electrones a travs de la cadena 22

Cuando se aade un desacoplador tal como el dinitrofenol a las clulas, las mitocondrias aumentan substancialmente la captacin de oxgeno debido a un aumen to en la velocidad de transporte de electrones. Este aumento refleja la existencia de un control respiratorio. Se cree que el control acta a travs del efecto inhi bidor directo que tiene el gradiente electroqumico de protones sobre la veloci dad de transporte de electrones. Cuando el gradiente se elimina por accin de un desacoplador, el transporte de electrones discurre a la mxima velocidad po sible, de una manera descontrolada. A medida que el gradiente aumenta, el transporte de electrones se vuelve ms difcil y el proceso se vuelve ms lento. Adems, si experimentalmente se genera un fuerte gradiente electroqumico ar tificial de protones a travs de la mem brana interna, el transporte normal de electrones se para por completo y se detecta un flujo inverso de electrones en al gunas secciones de la cadena respiratoria. Esta observacin sugiere que el con trol respiratorio refleja un equilibrio simple entre la variacin de energa libre del bom beo de protones ligado al transporte de electrones y la variacin de energa libre del transporte de electrones -e s decir, la magnitud del gradiente electroqumico de protones afecta tanto a la velocidad como a la direccin del transporte de electrones, tal com o afecta a la direccionalidad de la ATP sintasa (vase Figura 14-27). El control respiratorio es slo una parte de un sistema compartimentado muy elaborado de controles por retroalimentacin que coordina las velocidades de la glucolisis, la hidrlisis de los cidos grasos, el ciclo del cido ctrico y el transporte de electrones. Las velocidades de todos estos procesos se ajustan a la relacin ATP/ADP, aumentando cuando se produce un aumento de la utiliza cin de ATP que provoca una disminucin de esta relacin. La ATP sintasa de la mem brana mitocondrial interna, por ejemplo, trabaja a velocidad mayor cuan do aumenta la concentracin de sus dos substratos ADP y P. Al aumentar la acti vidad de la enzima, aumenta el flujo de protones hacia en interior de la matriz, disipndose ms rpidamente el gradiente electroqumico de protones. A su vez, el descenso de este gradiente activa la velocidad del transporte electrnico. Sistemas de control similares a ste, incluida la retroinhibicin negativa por ATP de varias enzimas clave (para un ejemplo, vase Figura 14-13), adaptan por ejemplo la velocidad de produccin de NADH a la de utilizacin de NADH en la cadena respiratoria. Como resultado de todos estos mecanismos de control, du rante un perodo de ejercicio intenso, el cuerpo oxida grasas y azcares a una ve locidad entre 5 y 10 veces superior a la que se produce durante un perodo de re poso.

Existen desacoplantes naturales que transform an las mitocondrias del tejido adiposo m arrn en m quinas generadoras de calor 23
En algunas clulas adiposas especializadas la respiracin mitocondrial est des acoplada de la sntesis de ATP de forma natural. En estas clulas, conocidas como adipocitos del tejido adiposo marrn o de la grasa parda, la mayor parte de la energa de oxidacin se disipa en forma de calor en lugar de ser transfor-

728

Captulo 14: Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

mada en ATP. La mem brana interna de las grandes mitocondrias de estas clu las, contienen una protena de transporte que permite a los protones fluir a tra vs de la mem brana a favor de su gradiente electroqumico, sin activar la ATP sintasa. A consecuencia de ello, las clulas oxidan sus reservas de grasa a una gran velocidad, produciendo ms calor que ATP. Por ello, los tejidos que contie nen tejido adiposo marrn actan como almohadillas calefactoras que reani man a los animales hibernantes y que protegen del fro las reas sensibles el re cin nacido humano.

(A) CONDICIONES AERBICAS cadena respiratoria

Todas las bacterias utilizan m ecanism os quimiosmticos para ahorrar energa 24

Las bacterias utilizan fuentes de energa enormemente diversas. Como las clu las eucariotas, algunas bacterias sintetizan ATP a partir de azcares, oxidndolos hasta C 0 2 y H20 a travs de la glucolisis y del ciclo del cido ctrico; estas bacte rias tienen en su mem brana plasmtica una cadena respiratoria muy similar a la de la membrana mitocondrial interna. Otras bacterias son anaerbicas estrictas por lo que obtienen la energa exclusivamente de la glucolisis (fermentacin) o de una cadena electrnica que utiliza como aceptor final de electrones una m o lcula diferente al oxgeno. Estos aceptores alternativos pueden ser un com puesto nitrogenado (nitratos o nitritos), un compuesto de azufre (sulfatos o sulfitos) o un compuesto orgnico (fumaratos o carbonatos). Los electrones son transferidos a estos aceptores mediante una serie de transportadores de electro nes que se hallan en la membrana plasmtica, semejantes a los que se encuen tran en las cadenas respiratorias mitocondriales. A pesar de esta diversidad, la mem brana plasmtica de la mayora de las bacterias presenta una ATP sintasa muy similar a la de las mitocondrias (y a la de los cloroplastos). En las bacterias aerbicas, existe una cadena de transporte de electrones que establece la fuerza protn-motriz que impulsa la ATP sintasa a generar ATP. En las bacterias anaerbicas que carecen de cadena de transporte electrnico, esta ATP sintasa acta en sentido inverso, utilizando el ATP produ cido en la glucolisis para generar una fuerza protn- motriz a travs de la m em brana plasmtica bacteriana. As, la mayora de las bacterias, incluidas las anaerbicas estrictas, m antie nen una fuerza protn-motriz a travs de su membrana plasmtica. El gradiente electroqumico de protones se utiliza para impulsar el motor flagelar que permi te la motilidad de la bacteria; el Na+ es bombeado afuera de las bacterias por un sistema de antiporte de Na+-H+ que desempea la funcin de la ATPasa de Na+ K+ de la clulas eucariotas; la mayora de aminocidos y azcares son transpor tados de esta manera en las bacterias: el transporte activo de nutrientes tiende a estar mediado por un sistema de simporte impulsado por H+ (Figura 14-37) en el que el metabolito deseado es arrastrado hacia el interior de la clula juntam ente con uno o ms protones. En las clulas animales, por el contrario, la mayora del transporte hacia el interior a travs de la membrana plasmtica es impulsado por el gradiente de Na+establecido por la ATPasa de Na+ -K+ . Entre los distintos tipos de bacterias, existen algunas que son capaces de adaptarse a vivir en ambientes muy alcalinos y deben mantener su citoplasma a un pH fisiolgico. Para estas clulas, cualquier intento de generar un gradiente electroqumico de protones sera opuesto al elevado gradiente de concentracin de protones en direccin contraria (ms H+en el interior que en el exterior). Pro bablem ente por esta razn, al algunas de estas bacterias substituy el Na+por H+ en todos sus mecanismos quimiosmticos. Su cadena respiratoria bombea Na+ hacia el exterior de la clula, sus sistemas de transporte estn acoplados a un simporte de Na+ hacia adentro, su motor flagelar est impulsado por un flujo de Na+hacia adentro, y la responsable de la mayor parte de su sntesis de ATP pare ce ser una ATP sintasa impulsada por Na+ . La existencia de estas bacterias de muestra que el principio de la quimiosmosis es ms fundamental que el gra diente electroqumico de protones en el que se basa normalmente.

B) C O N D IC IO N E S A N A ER B IC A S

Figura 14-37 Transporte impulsado por protones en las bacterias. Una fuerza protn-motriz generada a travs de la m em brana plasmtica bom bea nutrientes hacia el interior de la clula y sodio hacia el exterior. En (A), se est generando un gradiente electroqumico de protones en una bacteria anaerbica, mediante una cadena respiratoria. Luego, este gradiente ser utilizado por la ATP sintasa para producir ATP. Tam bin ser utilizado para transportar algunos nutrientes al interior de la bacteria. En (B), la m isma bacteria pero en condiciones anaerbicas, obtendr el ATP de la glucolisis. Parte de este ATP ser hidrolizado por la ATP sintasa generando una fuerza protn-motriz transm embrana que impulsar los procesos de transporte.

La cadena respiratoria y la ATP sintasa

729

Resumen
La cadena respiratoria de la membrana mitocondrial interna contiene tres comple jos enzimticos principales, implicados en la transferencia de electrones desde el NADH hasta el 0. Cada uno de estos complejos puede ser purificado e insertado en vesculas lipdicas sintticas, demostrndose as que bombean protones cuando se transportan electrones a su travs. En la membrana nativa, la ubiquinonay el cito cromo c son transportadores mviles de electrones que van y vienen de uno a otro complejo enzimtico, completando la cadena de transporte electrnico. La va del flujo de electrones es: NADH - complejo de la NADH deshidrogenasa - ubiquinona - complejo b-c - citocromo c complejo de la citocromo oxidasa oxgeno molecular (O2). Los complejos enzimticos respiratorios acoplan el transporte de electrones, energticamente favorable, al bombeo de protones hacia el exterior de la matriz. El gradiente electroqumico resultante se utiliza para fabricar ATP mediante otro complejo proteico transmembrana, la ATP sintasa, a travs del cual los protones fluyen de nuevo hacia la matriz. La ATP sintasa es un mecanismo acoplador rever sible que normalmente transforma el flujo de protones hacia adentro de la mitocondria en energa de enlace fosfato del ATP, catalizando la reaccin ADP + P -> ATP, pero que, si se reduce el gradiente electroqumico de protones, tambin puede hidrolizar ATP y bombear electrones en direccin opuesta. Su presencia universal en mitocondrias, cloroplastos y bacterias testifica su importancia central en los me canismos quimiosmticos de las clulas.

Cloroplastos y fotosntesis25
Todos los animales y la mayora de los microorganismos confan en una conti nuada captacin de grandes cantidades de compuestos orgnicos de su am biente. Estos compuestos aportan los esqueletos carbonados para la biosntesis y la energa m etabolica que impulsa todos los procesos celulares. Se cree que los primeros organismos de la Tierra primitiva tenan acceso a una abundancia de compuestos orgnicos de origen geoqumico (vase Captulo 1), pero la mayora de estos compuestos originales se agotaron hace miles de millones de aos. Desde ese perodo prcticam ente todos los materiales orgnicos que han nece sitado las clulas vivas han sido producidos por organismos fotosintticos, inclu yendo muchos tipos de bacterias fotosintticas. Las cianobacterias, que son las bacterias fotosintticas ms evolucionadas, tienen unos requerimientos nutricionales mnimos. Estas bacterias utilizan los electrones del agua y la energa de la luz solar para convertir el C 0 2 atmosfrico en compuestos orgnicos. En el curso de la hidrlisis del agua [en la reaccin nW20 + n C 0 2 ini, (CH2 0) + n 0 2], liberan a la atmsfera el oxgeno necesario para la fosforilacin oxidativa. Como veremos se cree que la evolucin de las cianobacterias a partir de bacterias fotosintticas ms primitivas hizo posible por primera vez el desarrollo de las formas aerbicas de vida. En las plantas, que se desarrollaron ms tarde, la fotosntesis se realiza en un orgnulo intracelular especializado -e l cloroplasto. Los cloroplastos realizan la fotosntesis durante las horas de luz solar. Los productos de la fotosntesis son utilizados directamente por las clulas fotosintticas para la biosntesis y tam bin son transformados en azcares de bajo peso molecular (normalmente saca rosa) que son exportados para satisfacer las necesidades metablicas de muchas de las clulas no fotosintticas de la planta. Alternativamente, los productos pue den ser almacenados como polisacridos osmticamente inertes (normalmente almidn) que se guardan disponible como una fuente de azcar para una utili zacin futura. Las evidencias bioqumicas sugieren que los cloroplastos son descendientes de bacterias fotosintticas productoras de oxgeno que fueron endocitadas y vi vieron en simbiosis con clulas primitivas eucariotas. Tam bin se cree que, en

730

Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

granos de_ almidn

general, las mitocondrias son descendientes de bacterias endocitadas. Probable mente, la gran cantidad de diferencias que hay entre cloroplastos y mitocondrias refleja tanto el hecho de que provienen de antecesores bacterianos diferentes com o su posterior divergencia evolutiva. Sin embargo, los mecanismos funda mentales implicados en la sntesis de ATP impulsada por la luz, en los cloroplas tos, y los que estn implicados en la sntesis de ATP impulsada por la respiracin, en las mitocondrias, son muy parecidos.

El cloroplasto es un miembro de una familia de orgnulos exclusivos de las plantas -lo s plastidios 26
El cloroplasto es el miembro ms prominente de la familia de los plastidios. Los plastidios se presentan en todas las clulas vivas de las plantas, cada tipo celular tiene su propio complemento caracterstico. Todos los plastidios tienen una se rie de caractersticas comunes. Lo ms notable de ellas es que todos los plasti dios de una especie de planta concreta contienen mltiples copias del mismo genoma, relativamente corto (vase Tabla 14-3, pg. 754) y estn rodeados por una envoltura compuesta por dos membranas concntricas. Todos los plastidios se desarrollan a partir de los proplastidios, que son unos orgnulos relativamente pequeos presentes en las clulas inmaduras de los meristemos de la planta (Figura 14-38A). Los proplastidios se desarrollan en fun cin de los requerimientos de cada clula diferenciada y el tipo de proplastidio viene determinado en gran parte por el genoma nuclear. Si se hace crecer una hoja en la oscuridad, sus proplastidios aumentaran de tamao y se transforma ran en etioplastos, los cuales presentan un eje semicristalino de membranas in ternas que contiene una clorofila amarilla precursora en lugar de la clorofila. Cuando son expuestos a la luz, los etioplastos rpidamente se transforman en cloroplastos mediante la conversin de este precursor a clorofila y sintetizando nuevas membranas, pigmentos, enzimas fotosintticos y componentes de la ca dena de transporte electrnico. Los leucoplastos son plastidios que aparecen en la epidermis y en muchos tejidos internos que no se vuelven verdes ni fotosintticos. Son ligeramente ms grandes que los proplastidios. El amiloplasto es una forma comn de leucoplasto (Figura 14-38B), que acumula almidn en los tejidos de reserva. En alguna plantas, tales como las patatas, los amiloplastos pueden llegar a ser tan grandes como una clula animal de tamao medio. Es importante darse cuenta que los plastidios no slo son lugares en los que tiene lugar la fotosntesis ni la deposicin de materiales de reserva. Las plantas han utilizado sus plastidios para la compartimentacin celular del metabolismo intermediario. Los plastidios producen mucha ms energa y ms poder reduc tor (en forma de ATP y NADPH) que los que son utilizados para las reacciones biosintticas de la planta. La sntesis de las purinas y pirimidinas, la mayora de

Figura 14-38 Diversidad de los plastidios. (A) Un proplastidio de una clula de raz de una planta de judas. Obsrvese la doble membrana; la membrana interna resalta la relativa escasez de membranas internas. (B) Tres amiloplastos (un forma de leucoplasto) o plastidios almacenadores de almidn, en una punta de la raz de soja. (De B. Gunning y M. Steer, Ultrastructure and the Biology of Plant Cells. Londres: Arnold, 1975.)

Cloroplastos y fotosntesis

731

2 iim ---- *h
HOJA
epiderm is superior

CLOROPLASTO
c su 0 ma

grana

epiderm is inferior m embrana

m embrana tilacoidal

ospacro
tilacoidal

membrana
in t e r n a

exlerna

espacio interm embranoso

Figura 14-39 El cloroplasto. Este orgnulo fotosinttico presenta tres membranas distintas (la membrana extema, la membrana interna y la membrana tilacoidal) que delimitan tres compartimientos internos diferentes (el espacio intermembranoso, el estroma y el espacio tilacoidal). La membrana tilacoidal contiene todos los sistemas generadores de energa del cloroplasto. En las electronmicrografas, esta membrana aparece formando unidades separadas que delimitan vesculas aplanadas (vase Figura 14-40), pero probablemente estn unidas formando una sola membrana muy plegada en cada cloroplasto. Como se indica en la figura, los distintos tilacoides estn interconectados, y tienden a agruparse formando agregados denominados grana.

espacio de airi

ncleo

pared celular

v ;ic Lila

cloroplasto

citosol

< C )
envoltura del cloroplasto vacuola

tilacoides

almidn

grana
pared celular

Figura 14-40 Electronmicrografa de cloroplastos. (A ) Una hoja de trigo en la que existe una gran vacuola rodeada por una fina franja de citoplasma con cloroplastos. (B) Seccin ultrafina de un solo cloroplasto, mostrando los grnulos de almidn y gotas lipdicas que se han acumulado en el estroma como resultado de los procesos de biosntesis que se producen en este lugar. (C) Una visin a mayor aumento de los grana, mostrando las membranas tilacoidales aplanadas. (Por cortesa de K. Plaskitt.)

732

Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

Figura 14-41 Comparacin entre una mitocondria y un cloroplasto. El cloroplasto suele ser mucho mayor y contiene una membrana tilacoidal y un espacio tilacoidal. La membrana interna de la mitocondria est plegada formando crestas.

los aminocidos y de todos los cidos grasos de las plantas tiene lugar en los plastidios, mientras que en las clulas animales todos estos compuestos son producidos en el citosol.

Los cloroplastos se parecen a las mitocondrias, pero tienen un com partim iento adicional27
Los cloroplastos realizan sus interconversiones energticas mediante m ecanis mos quimiosmticos, tal como lo hacen las mitocondrias, y su organizacin se basa en los mismos principios (Figuras 14-39 y 14-40). Ambos tipos presentan una m em brana externa altamente permeable, una membrana interna mucho menos permeable, en la que estn incluidas protenas transportadoras especia les, y un estrecho espacio intermembrana. La membrana interna envuelve un gran espacio llamado estrom a, que es anlogo a la matriz mitocondrial y contie ne varias enzimas, ribosomas, RNA y DNA. En cualquier caso, existe una importante diferencia entre la organizacin de las mitocondrias y de los cloroplastos. Generalmente la membrana interna del cloroplasto no est plegada en crestas y no contiene una cadena transportadora de electrones. En lugar de ello, tanto la cadena de transporte de electrones como el sistema fotosinttico de absorcin de la luz y una ATP sintasa se localizan en una tercera m em brana distinta que forma un conjunto de sacos planos apilados, los tilacoides (vase Figura 14-39). Se cree que el lumen de cada tilacoide est conectado con el lumen de los otros tilacoides, definiendo as un tercer com par timiento interno llamado el espacio tilacoidal que delimita con el estroma m e diante la membrana tilacoidal. En la Figura 14-41 se ilustran las similitudes y diferencias ultraestructurales entre las mitocondrias y los cloroplastos. En general, se puede imaginar el cloro plasto como una mitocondria ms grande en la que las crestas se han convertido en series de partculas submitocondriales interconectadas situadas en el espacio de la matriz. El extremo prominente de la ATP sintasa del cloroplasto, donde se sintetiza el ATP, sobresale de la membrana tilacoidal hacia el estroma, como si sobresaliera de la matriz desde la membrana de cada cresta mitocondrial.

Dos reacciones caractersticas de los cloroplastos: la produccin de ATP y de NADPH, impulsada por la luz, y la conversin de C 0 2 en carbohidratos 25
La gran cantidad de reacciones que se producen durante la fotosntesis, se pue den agrupar en dos grandes categoras. (1) En las reacciones fotosintticas de transferencia de electrones (algunas veces llamadas las reacciones de la fase luminosa), la energa derivada de la luz solar activa un electrn de la clorofila, Cloroplastos y fotosntesis 733

lo cual permite que este electrn se desplace a lo largo de una cadena de oxida cin de la m em brana tilacoidal, de manera anloga a como se desplazan los electrones a lo largo de la cadena respiratoria de las mitocondrias. La clorofila obtiene sus electrones del agua, con la liberacin de 0 2. Este proceso de trans porte electrnico bom bea protones a travs de la m embrana tilacoidal, y la fuer za protn-m otriz resultante impulsa el proceso de sntesis de ATP en el estroma. Al m ismo tiempo, las reacciones de transporte electrnico generan electrones de alta energa (junto con H+ ) que transforman el NADP+ en NADPH. Todas es tas reacciones se producen en el cloroplasto. (2) En las reacciones de fijacin del carbono (llamadas tam bin reacciones de la fase oscura), el ATP y el NADPH producidos en las reacciones fotosintticas de transferencia de electro nes se utilizan como fuente de energa y de poder reductor, respectivamente, para impulsar la transformacin de C 0 2 en carbohidratos. Las reacciones de fi jacin de carbono, que empiezan en el estroma del cloroplasto y continan en el citosol celular, producen sacarosa en las hojas de la planta; desde donde es exportada a otros tejidos como fuente de molculas orgnicas y de energa para el crecimiento. As, la formacin de oxgeno (que necesita directamente la energa de la luz) y la conversin del dixido de carbono en carbohidratos (que necesita, tan slo indirectamente, la energa de la luz), son dos procesos fotosintticos claramente separados el uno del otro (Figura 14-42). No obstante, como veremos, existen elaborados mecanism os de retroalimentacin que interconectan ambos proce sos, equilibrando la biosntesis. Por ejemplo, las variaciones en los requerimien tos celulares de ATP y de NADPH regulan la produccin de estas molculas en la m em brana del tilacoide; tam bin ocurre que varias de las enzimas del cloroplas to que son necesarias para la fijacin del carbono se inactivan en la oscuridad y se reactivan por los procesos de transporte electrnico estimulados por la luz.

CITOSOL CLOROPLASTO reacciones fotosintticas de transferencia de electrones

H20

02

C02

reacciones de fijacin del carbono gliceraldehdo 3-fosfato (precursor de los azcares, am inocidos y cidos grasos para la clula)

Figura 14-42 El proceso de la fotosntesis en un cloroplasto. En la primera serie de reacciones, el agua se oxida y se libera oxgeno, mientras que en la segunda serie de reacciones el dixido de carbono es asimilado (fijado) produciendo carbohidratos.

La fijacin del carbono est catalizada por la ribulosa bisfosfato carboxilasa 28

En este captulo hemos visto que las clulas producen ATP aprovechando la gran cantidad de energa libre que se libera cuando los carbohidratos son oxidados hasta C 0 2 y H2 0 . Por consiguiente, es evidente que la reaccin inversa en la que el C 0 2 y el H20 se com binan formando carbohidratos ha de ser una reaccin muy desfavorable. En consecuencia, esta sntesis debe estar acoplada a otras re acciones muy favorables que la impulsen. La Figura 14-43 ilustra la reaccin central en la que un tomo de carbono inorgnico se transforma en un carbono orgnico: el C 0 2 de la atmsfera se com bina con el compuesto de cinco carbonos, la ribulosa 1,5-bisfosfato, y con agua, para dar dos molculas de tres carbonos, el 3-fosfoglicerato. Esta reaccin de fijacin del carbono, que fue descubierta en 1948, se produce en el estroma del cloroplasto y est catalizada por una gran enzima llamada ribulosa bisfosfato carboxilasa (-500 000 daltons). Puesto que cada molcula de enzima trabaja con Figura 14-43 La reaccin inicial de la fijacin del carbono. Esta reaccin, en la que el dixido de carbono se transforma en carbono orgnico, se desarrolla en el estroma del cloroplasto y est catalizada por la enzima ribulosa bisfosfato carboxilasa, que es muy abundante. El producto, 3-fosfoglicerato, el cual tambin es un importante intermediario de la glucolisis: cuando la enzima adiciona oxgeno en lugar de C02, los dos tomos de carbono que se presentan en color azul se utilizan para generar fosfoglicolato (vase ms adelante).

o=c =o

c 2 c=o
h o

c h 2o

H c OH H C OH
c h

I c c / I

OH +
h

c=o

9o

H c OH
c h 2o

2o (

p)

dixido de carbono
734

ribulosa 1,5 bisfosfato

producto interm ediario

dos m olculas de 3-fosfoglicerato

Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

bastante lentitud (transforma unas 3 molculas de substrato por segundo, en comparacin con las 1000 molculas por segundo de una enzima tpica), es n e cesario que en cada cloroplasto existan muchas copias de ella. A menudo, la ribulosa bisfosfato carboxilasa representa ms del 50% del total de protena del cloroplasto, y se cree que es la protena ms abundante de la Tierra.

En el ciclo de fijacin del carbono se consum en tres molculas de ATP y dos molculas de NADPH por cada molcula de C 0 2 fijada 29
La reaccin de fijacin del C 0 2 es energticamente favorable gracias a la reacti vidad del compuesto rico en energa ribulosa 1,5-bisfosfato al que se aade cada molcula de C 0 2 (Figura 14-43). Pero para que se produzca un aporte de ribulo sa 1,5-bisfosfato se requieren una serie de reacciones que consuman grandes cantidades de NADPH y ATP. La elaborada va a travs de la cual se regenera este compuesto se descubri gracias a un experimento que constituye uno de los mayores xitos en el uso de los radioistopos. Como se muestra en la Figura 1444, gracias a la ribulosa bisfosfato carboxilasa se fijan 3 molculas de C 0 2 produ cindose 6 molculas de 3-fosfoglicerato (con un total de 6 x 3 = 18 tomos de carbono: 3 procedentes del C 0 2y 15 de la ribulosa 1,5-bisfosfato). Los 18 tomos de carbono recorren entonces un ciclo de reacciones que regeneran las 3 m ol culas de ribulosa 1,5-bisfosfato que fueron utilizadas en el primer paso de fija cin del carbono (3 x 5 = 15 tomos de carbono). As, el proceso genera una m o lcula de glicerldehdo 3-fosfato (3 tomos de carbono) como ganancia neta. En este ciclo de fijacin del carbono (o ciclo de Calvin-Benson), se consumen 3

tres m olculas C 02 1C

Figura 14-44 Ciclo de fijacin del carbono, que forma molculas orgnicas a partir de COzy de H20 . El
nmero de tomos de carbono de cada tipo de molcula se indica en los recu adros blan cos. Entre el glicerldehdo 3-fosfato y la ribulosa 5-fosfato hay una gran cantidad de intermediarios, que en este esquema se han omitido en aras de una mayor claridad. Tam poco se representa la entrada de agua en el ciclo.

----- - seis m oiecuias ribulosa 1,5-bisfosfato

3 |a d p |6

5C

3-fosfoglicerato

3C

3 ^ -

tres m olculas ribulosa 5C 5-fosfato

6|ADP|

seis m olculas' 1,3-difosfoglicerato 3C

2 P

6
6 P

cinco molculas glicerldehdo 3C 3-fosfato

seis m olculas glicerldehdo 3-fosfato 3C

tres molculas de CO2 fijadas dan un rendimiento neto de una molcula de glicerldehdo 3-fosfato lo que supone un gasto neto de nueve molculas de ATP y seis molculas de NADPH

una m olcula
glicerldehdo 3-fosfato

3C

H C =0 I H C OH
c h 2o

AZUCARES, ACIDOS GRASOS, AMINOACIDOS

Cloroplastos y fotosntesis

735

molculas de ATP y 2 molculas de NADPH por cada molcula de C 0 2 que se transform a en carbohidrato. La ecuacin neta es 3 C 0 2 + 9ATP + 6NADPH + agua gliceraldehdo 3-fosfato + 8P + 9ADP + 6NADP+ En consecuencia, para la formacin de molculas orgnicas a partir de C 0 2 y H2 0 , se requiere energa de enlace fosfato (en forma de ATP) y poder reductor (en forma de NADPH). Ms adelante volveremos sobre este punto. El gliceraldehdo 3-fosfato producido en los cloroplastos a travs del ciclo de fijacin del carbono es un azcar de tres carbonos que tambin se utiliza com o intermediario central en la glucolisis. Gran parte de este azcar es expor tado al citosol donde puede ser rpidamente transformado en fructosa 6-fosfato y glucosa 1-fosfato mediante la inversin de varias reacciones en la glucolisis (vase Figura 2-21). Luego, la glucosa 1-fosfato es transformada en el azcarnucletido UDP-glucosa, que se com bina con la fructosa 6-fosfato formando sacarosa fosfato, el intermediario precursor del disacrido sacarosa. La sacarosa es la forma principal de transporte de azcares en las clulas vegetales, como lo es la glucosa en las clulas animales: al igual que la glucosa, que es transportada en la sangre de los animales, la sacarosa es exportada desde las hojas a travs de los haces vasculares, proporcionando los carbohidratos requeridos por el resto de la planta. La mayor parte del gliceraldehdo 3-fosfato que permanece en el cloroplasto es transformado en almidn en el estroma. Al igual que el glucgeno en las clu las animales, el almidn es un gran polmero de glucosa que se utiliza como re serva de carbohidratos. La produccin de almidn est regulada de tal manera que se produce y almacena en grandes granos en el estroma del cloroplasto (va se Figura 14-38B) durante perodos de exceso de capacidad fotosinttica. Esto sucede a travs de reacciones que se producen en el estroma, inversas de las que tienen lugar en la glucolisis: transforman el gliceraldehdo 3-fosfato en glucosa 1-fosfato, que entonces se utiliza para producir el azcar-nucletido ADP-glucosa, el precursor inmediato del almidn. Durante la noche, el almidn es hidrolizado para proveer de energa a las necesidades metablicas de la planta.

En algunas plantas, la fijacin del carbono est compartimentada para facilitar el crecimiento a concentraciones bajas de C 0 230
Aunque la ribulosa bisfosfato carboxilasa aade preferentemente una molcula de C 0 2 a la ribulosa 1,5-bisfosfato, puede tam bin utilizar 0 2 adems de C 0 2, y si la concentracin de C 0 2 es baja, aadir 0 2. ste es el primer paso de una va lla mada fotorrespiracin, cuyo efecto es consumir 0 2 y liberar C 0 2 sin la produc cin de alm acenes de energa til. En muchas plantas, aproximadamente una tercera parte del C 0 2 fijado se pierde de nuevo como resultado de la fotorrespi racin. La fotorrespiracin resulta dominante en condiciones secas y calurosas en las que las plantas se ven forzadas a cerrar sus estomas (los poros de intercam bio gaseoso de su hojas) con el fin de evitar un prdida excesiva de agua. Esto provoca una cada extraordinaria de los niveles de C 0 2 en la hoja, favoreciendo la fotorrespiracin. No obstante, en las hojas de muchas plantas que viven en am bientes clidos y secos, com o ocurre con los cereales y con la caa de azcar, tiene lugar una adaptacin especial. En estas plantas, el ciclo de fijacin del car bono mostrado en la Figura 14-44 tiene lugar slo en los cloroplastos de las clu las tnico-vasculares, que contienen toda la ribulosa bisfosfato carboxilasa de la planta. Estas clulas estn protegidas del aire y rodeadas por una capa especiali zada de clulas del mesfilo que bom bean C 0 2 hacia las clulas tnico-vascu lares, abasteciendo a la ribulosa bisfosfato carboxilasa con una alta concentra cin de C 0 2, que disminuye en gran medida la fotorrespiracin. La bom ba de C 0 2 es un ciclo de reacciones que empieza con un paso espe cial de fijacin del C 0 2, catalizado en el citosol de las clulas del mesfilo por

736

Captulo 14: Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

HOJAS C3

HOJAS C4

cloroplasto

epiderm is

clulas del m esfilo

clulas tnico-vasculares

Figura 14-45 Comparacin de la anatoma de la hoja de una planta C3 y de una planta C4. Las clulas
dibujadas en co lo r verde contienen cloroplastos que llevan a cabo el ciclo normal de fijacin del carbono. En las plantas C4, las clulas del mesfilo no fijan carbono sino que estn especializadas en el bom beo de C 0 2, y generan una elevada relacin C 0 2:0 2 en las clulas tnico-vasculares, que son las nicas clulas de estas plantas en las que tiene lugar el ciclo de fijacin del carbono. Los haces vasculares transportan la sacarosa producida en la hoja hasta otros tejidos.
ch

haz vascular

haz vascular

estoma clulas del m esfilo

clulas tnico-vasculares

estoma

epiderm is

cloroplasto

una enzima que une dixido de carbono (en forma de bicarbonato) con alta afi nidad y lo com bina con una molcula activada de tres carbonos formando una molcula de cuatro carbonos. La molcula de cuatro carbonos difunde a las c lulas tnico-vasculares, donde es transformado liberando el C 0 2 y generando una molcula de tres carbonos. El ciclo de bom beo se completa cuando este compuesto de tres carbonos vuelve a las clulas del mesfilo y es transformado en su forma original activada. Las plantas que fijan C 0 2 en las que el C 0 2 es ini cialmente capturado mediante su conversin en un compuesto que contiene cuatro carbonos, reciben el nombre de plantas C4. Todas las dems plantas reci ben el nombre de plantas C3 (Figura 14-45) porque capturan el C 0 2 directamen te en un compuesto de tres carbonos, el 3-fosfoglicerato. Como sucede en cualquier proceso de transporte vectorial, el bom beo de C 0 2 en las clulas tnico-vasculares de las plantas C4 cuesta energa. En los am bientes secos y calurosos, este coste es normalmente muy inferior a la prdida por fotorrespiracin de las plantas C3, por lo que las plantas C4tienen una venta ja potencial. Adems, dado que las plantas C4 pueden realizar la fotosntesis en el interior de las hojas a concentraciones de C 0 2 ms bajas, necesitan abrir m e nos sus estomas y por lo tanto pueden fijar aproximadamente el doble de carbo no neto por unidad de agua perdida que las plantas C3.

La fotosntesis depende de la fotoqumica de las molculas de clorofila 31

Habiendo estudiado las reacciones de fijacin del carbono, vamos a retornar a la cuestin de cmo las reacciones fotosintticas de transferencia de electrones ge neran el ATP y el NADH necesarios para impulsar la produccin de los carbohi dratos en la planta a partir de C 0 2y H20 (vase Figura 14-42). La energa necesa ria deriva de la luz solar captada por las molculas de clorofila (Figura 14-46). El proceso de conversin energtica empieza cuando una molcula de clorofila es excitada por un cuanto de luz (un fotn) y un electrn se desplaza de un orbital molecular a otro de mayor energa. Esta molcula excitada es inestable y tiende a volver a su estado original no excitado por una de estas tres posibles vas: ( 1) mediante la conversin de la energa extra en calor (movimientos moleculares) o por alguna com binacin de calor y luz de una longitud de onda ms larga (fluo rescencia), tal como ocurre cuando la energa lumnica es absorbida por una molcula aislada de clorofila en solucin; (2) mediante la transferencia de ener ga -pero no del electrn- directamente a una molcula de clorofila vecina, por un proceso denominado transferencia de energa por resonancia ; o (3) mediante la transferencia del electrn de alta energa a otra molcula cercana (un aceptor de electrones) y retornando a su estado original tomando un electrn de baja

CH3

/ \
ch

CH

Figura 14-46 Estructura de la clorofila. Un tomo de magnesio est

unido a un anillo de porfirina, que est relacionado con el anillo de porfirina que une hierro en el grupo hemo (comparar con la Figura 14-28). En los enlaces sealados en color, los electrones estn deslocalizados.

Cloroplastos y fotosntesis

737

m olcula excitada de clorofila luz

molcula excitada de luz clorofila

caor

m olcula excitada de clorofila

m olcula vecina de clorofila

aceptor reducido

< & U (,
*

electrn EXCITACION

P O S IB L E S V A S DE D E C A IM IE N T O

decaim iento por liberacin de luz y de calor

decaim iento por 2 transferencia energtica por resonancia

decaim iento por transferencias sucesivas de electrones

energa de alguna otra molcula (un dador de electrones, Figura 14-47). Los dos ltimos mecanismos desempean un papel esencial en la fotosntesis.

Un fotosistem a contiene un centro de reaccin y un com plejo antena 32

Ciertos complejos multiproteicos, llamados fotosistemas, catalizan la transfor macin de la energa lumnica capturada por molculas excitadas de clorofila, en formas tiles de energa. Un fotosistema consiste en dos componentes estrecha mente unidos: un centro de reaccin fotoqumico, que consiste en un complejo de protenas y molculas de clorofila que captan la energa solar convirtindola en energa qumica, y un complejo antena, que consiste en molculas de pigmento que capturan la energa solar y la canalizan al centro de reaccin. El complejo antena es importante para el aprovechamiento de la luz. En los cloroplastos, los com plejos antena consisten en agrupaciones de varios cientos de molculas de clorofila unidas entre s por protenas que las fijan fuertemente sobre la mem brana tilacoidal. Segn la planta de que se trate, en cada complejo tam bin existen cantidades variables de pigmentos accesorios, denominados carotenoides, que ayudan a captar la luz de otras longitudes de onda, y que tam bin se hallan localizados en cada complejo. Cuando una molcula de clorofila del complejo antena es excitada, la energa es rpidamente transferida desde una molcula a la otra, mediante transferencia energtica por resonancia, hasta que alcanza un par especial de molculas de clorofila en el centro fotoqumico de reaccin. Por lo tanto cada complejo antena acta a modo de embudo, que recoge la energa luminosa y la dirige hacia un nico centro de reaccin especfi co que la puede utilizar con eficiencia (Figura 14-48).

Figura 14-47 Tres posibles vas que puede seguir una molcula excitada de clorofila para volver a su estado original, no excitado. Mediante el proceso 1 , la energa luminosa absorbida por una molcula de clorofila se libera com pletam ente en forma de luz y calor. Por el contrario, en la fotosntesis las molculas de clorofila siguen el proceso 2 en el complejo antena y el proceso 3 en el centro de reaccin, com o se describe en el texto.

molculas de clorofila en el com plejo proteico de la antena

Figura 14-48 Un fotosistema consta de en un centro de reaccin y una antena. Las molculas A (dadores de electrones) y las molculas B (aceptores de electrones) difieren de acuerdo con el fotosistema.

ENTRADA D E LA M OLCULAA \ TRANSPORTANDO Ul ELECTR ND E "BAJA ENERGA" j

SALIDA DELA M OLCULA B TRANSPORTANDO U N ELECTR ND E "ALTA ENERGA" m em brana

"pa r especial" de m olculas de clorofila del centro de reaccin

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com plejo protenapigm ento del centro de reaccin

Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

par especial de m olculas de clorofila

Figura 14-49 Disposicin de los transportadores de electrones en un centro de reaccin fotosinttico bacteriano, determinada por cristalografa de rayos X. Tal com o se
indica en la figura, las molculas de pigmento estn colocadas en el interior de una protena transm em brana y envueltas por la bicapa lipdica. Un electrn en el par especial es excitado por resonancia desde un com plejo antena cloroflico (proceso 2 en la Figura 14-47), y luego, el electrn excitado es transferido desde el par especial a la quinona (vase Figura 14-50).

El centro de reaccin fotoqumico es un pigmento proteico transmem bra na que se halla en el corazn de la fotosntesis. Se cree que se origin hace ms de 3 mil millones de aos en una bacteria fotosinttica primitiva. El par especial de molculas de clorofila del centro de reaccin acta como una trampa de cuantos de excitacin porque su electrn excitado pasa inmediatamente a una cadena de aceptores de electrones que se hallan situados de forma precisa en el mismo complejo proteico (Figura 14-49). Mediante el rpido desplazamiento del electrn de alta energa lejos de las clorofilas, el centro de reaccin lo transfiere a un ambiente donde es mucho ms estable. Por consiguiente, el electrn es resta blecido convenientem ente para reacciones fotoqumicas posteriores que requie ren ms tiempo para llevarse a cabo.

En un centro de reaccin, la energa capturada por la clorofila genera un dador fuerte de electrones a partir de uno dbil 33
Las transferencias de electrones implicadas en las reacciones fotoqumicas des critas recientem ente han sido analizadas exhaustivamente mediante mtodos espectroscpicos rpidos, especialmente en el fotosistema de la bacteria prpu ra, que es ms sencillo que el fotosistema evolutivamente emparentado de los cloroplastos. El centro de reaccin bacteriano es un gran complejo pigmentoprotena que puede solubilizarse con detergentes y purificarse en forma activa. En 1985 se determin su estructura tridimensional completa mediante cristalo grafa de rayos X (vanse Figura 10-33 y Figura 14-49). Su estructura, combinada con los datos cinticos, proporciona la mejor representacin de que se dispone de las reacciones iniciales de transferencia de electrones en que se basa la foto sntesis. En la Figura 14-50 se muestra un diagrama de la secuencia de transferencias que tienen lugar en el centro de reaccin de la batera prpura. Como esquema tizamos anteriormente (Figura 14-48), en un centro de reaccin, la luz provoca la transferencia neta de un electrn desde un dador dbil de electrones a una molcula que es un dador fuerte de electrones en su forma reducida. De esta manera la energa de excitacin, que podra ser liberada en forma de fluorescen cia y/o de calor, es utilizada para aumentar la energa de un electrn y generar un dador fuerte de electrones donde no lo haba antes. En esta bacteria el dador dbil de electrones es un citocromo (recuadro naranja ), y el dador fuerte de electrones es una quinona (recuadro amarillo). Tal como veremos, en los cloro plastos de las plantas superiores, es el agua (en lugar de un citocromo) la que ac ta como dador inicial de electrones, por lo que en la fotosntesis de las plantas se libera oxgeno.

Cloroplastos y fotosntesis

739

Figura 14-50 Transferencia electrnica que tiene lugar en el centro de reaccin fotoqumico de la bacteria prpura. Se cree que en el fotosistema II de las plantas,
relacionado evolutivamente tiene lugar una serie de reacciones similar a sta. En la parte superior derecha de la figura se muestra un diagrama esquemtico que indica las molculas que transportan electrones, las cuales son las de la Figura 14-49 ms una quinona intercam biable (QB ) y una quinona librem ente mvil (Q) disuelta en la bicapa lipdica. Los transportadores de electrones del 1 al 5 se unen en una posicin especfica de una protena transm embrana de 596 aminocidos, formada por dos subunidades diferentes (vase Figura 10-33). Tras la excitacin por un fotn de luz, un electrn de alta energa pasa de una molcula de pigmento a otra, generando una carga de separacin tal com o se muestra debajo en los pasos de la secuencia de A hasta D, en la que la molcula de pigmento que transporta electrones de alta energa est indicada en co lor verde. La etapa E se desarrolla muy lentam ente. Una vez liberada en la bicapa, la quinona con dos electrones acepta dos protones y pierde su carga (vase Figura 14-31).

par especial de molculas de clorofila

clorofila

intercam biable (Q b) quinona reducida que transporta dos electrones de alta energa

los electrones dbiles del dado r rellenan el hueco

" ----- C " ----- ^ D "-------E A "------B 3 picosegundos <1 picosegundos 230 picosegundos 270 nanosegundos 100 m icrosegundos repeticin de intercam bio de (3 x 10-12 segundos) los pasos desde la quinona en A hasta E el lugar Q b

En plantas y en cianobacterias, la fotofosforilacin no cclica produce NADPH y ATP31,34

En las plantas y en las cianobacterias la fotosntesis produce directamente tanto ATP com o NADH mediante un proceso en dos pasos llamado fotofosforilacin no cclica. Dado que se utilizan dos fotosistemas en serie para dar energa a un electrn, este electrn puede ser transferido por toda la va desde el agua hasta NADPH. Debido a que los electrones de alta energa pasan a travs de fotosiste mas acoplados generando NADPH, parte de su energa es desviada para la snte sis de ATP. En el primero de los dos fotosistemas -denom inado fotosistema II por razo nes histricas- los oxgenos de dos molculas de agua se unen a un grupo de tomos de manganeso de una enzima hidroltica, todava poco estudiada, que posibilita que los electrones sean eliminados uno a uno rellenando los agujeros generados por la luz en el centro de reaccin de las molculas de clorofila. En cuanto los cuatro electrones de las dos molculas de agua se han eliminado (lo que requiere cuatro quantos de luz), la enzima libera el 0 2. As pues, el fotosiste m a II cataliza la reaccin 2H20 + 4 fotones >4H++ 4e~+ 0 2. El ncleo del centro de reaccin del fotosistema II es homlogo al centro de reaccin bacteriano descrito anteriormente, y tambin produce fuertes dadores de electrones en forma de molculas de quinona reducida en la membrana. Las quinonas ceden sus electrones a una bom ba de protones llamada complejo b6-f que se parece notablemente al complejo b-Cj de la cadena respiratoria mitocondrial y a un complejo emparentado en las bacterias. Como en las mitocondrias, el complejo bom bea H+ al espacio tilacoidal a travs de la membrana del tilacoide (o fuera del citosol a travs de la membrana plasmtica en cianobacterias), y el gradiente electroqumico resultante impulsa la sntesis de ATP por la ATP sintasa (Figuras 14-51 y 14-52). El aceptor final de electrones de esta cadena de transpor te electrnico es el segundo fotosistema {fotosistema I), que acepta el electrn del agujero dejado por la luz en el centro de reaccin de su molcula de clorofila. Cada electrn que entra el fotosistema I es elevado a un nivel energtico ms alto, lo que le permitir pasar al centro de hierro-azufre de la ferrodoxina e impulsar la reduccin de NADP+ hasta NADPH; este ltimo paso tambin implica la captura de un protn del medio (Figura 14-52).

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Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

Figura 14-51 Flujo de electrones que se produce en la membrana tilacoidal durante la fotosntesis. Los
transportadores de electrones mviles de la cadena son la plastoquinona (que se parece a la ubiquinona de las mitocondria), la plastocianina (una pequea protena que contiene cobre) y la ferrodoxina (una pequea protena que contiene un centro de hierroazufre). El co m p lejo b 6- f e s muy similar al com plejo b-c, de la mitocondria y al complejo b -c de las bacterias (vase Figura 14-61): los tres com plejos aceptan electrones desde quinonas y bom bean protones. Obsrvese que tanto los H+liberados en la oxidacin del agua como el H+captado durante la formacin del NADPH, tambin contribuyen a la generacin del gradiente electroqum ico de protones que impulsa la sntesis de ATP mediante una sintasa presente en esta misma m embrena (no se muestra).

ESTROMA mem brana tilacoidal enzima que descom pone el agua 0 ~ + 4H+ ESPACIO TILACOIDAL fotosistem a II plastocianina ferredoxina gradiente electroqum ico de protones

complejo be-f

fotosistem a I

NADP reductasa

El esquema de la fotosntesis que se presenta en la Figura 14-52 se conoce como el esquema Z. Por medio de sus dos pasos de activacin electrnica, catali zados cada uno por un fotosistema, un electrn es transferido desde el agua, que normalmente fija sus electrones muy fuertemente (potencial redox = +820 mV), hasta el NADPH, que normalmente fija sus electrones de forma ms dbil (po tencial redox = -3 2 0 mV). Un solo cuanto de luz visible no dispone de suficiente energa para activar un electrn desde la base del fotosistema II hasta el extremo superior del fotosistema I, la cual representa probablemente la variacin de energa necesaria para transferir un electrn desde el agua hasta el NADP+. El uso de dos fotosistemas separados supone que queda suficiente cantidad de energa para que la cadena de transporte electrnico que une los dos fotosiste mas bom bee H+ a travs de la membrana tilacoidal (o la membrana plasmtica

fotosistema I

Figura 14-52 Variaciones del potencial redox para el paso de electrones durante la fotosntesis.
El potencial redox de cada especie molecular se indica por su posicin a lo largo del eje vertical. El fotosistema II es similar al centro de reaccin de las bacterias prpura. El fotosistema I es diferente: transfiere electrones desde su clorofila excitada a travs de series de centros de reaccin de hierro-azufre fuertemente unidos. El flujo neto de electrones a travs de los dos fotosistemas unidos en serie va desde el agua hasta el NADP+ ,y produce NADPH y ATP, que se sintetiza por una ATP sintasa (no indicada aqu) que utiliza el gradiente electroqumico de protones producido por los tres lugares de actividad de protones que se resaltan en la Figura 14-51. Este esq u em a Z para la produccin de ATP se denomina fo to fosforilacin no cclica, para distinguirlo del esquema cclico que slo utiliza el fotosistema I (vase texto).

Cloroplastos y fotosntesis

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de las cianobacterias), lo cual permite a la ATP sintasa aprovechar parte de la energa electrnica derivada de la luz para producir ATP.

MITOCONDRIA

Los cloroplastos pueden producir ATP por fotofosforilacin cclica sin generar NADPH31,35
En el esquema de fotofosforilacin no cclica que acabamos de mencionar, los electrones altamente energticos que dejan el fotosistema II son utilizados para generar ATP y son transferidos al fotosistema I para impulsar la produccin de NADPH. Esto produce un poco ms de una molcula de ATP por cada par de elec trones que pasan del agua hasta el NADP+ generando una molcula de NADPH. Pero para la fijacin del carbono se necesita 1,5 molculas de ATP por NADPH (vase Figura 14-44). Para producir ms ATP, en algunas especies los cloroplas tos pueden utilizar el fotosistema I de un modo cclico, de forma que se produz ca ATP en lugar de NADPH. En este proceso, llamado fotofosforilacin cclica, los electrones de alta energa del fotosistema I son transferidos de nuevo al comple jo b6-f en lugar de ser transferidos al NADP+ , y el electrn con una energa infe rior es entonces reciclado hacia el fotosistema I. El nico resultado neto, al igual que la conversin de una parte de la energa lumnica en calor, es que el H+ es bombeado a travs de la mem brana tilacoidal mediante el complejo b6-f aumen tando el gradiente electroqumico de protones que impulsa la ATP sintasa. En resumen, la fotofosforilacin cclica implica slo el fotosistema I, que produce ATP sin la formacin de NADPH ni de 0 2. De esta manera, las activida des relativas de los flujos cclicos y no cclicos de electrones pueden determinar cunta energa lumnica se transforma en poder reductor (NADPH) y cunta en enlaces fosfato de alta energa (ATP).

matriz estroma

membrana interna

membrana externa

membrana tilacoidal
CLOROPLASTO

El gradiente electroqumico de protones es similar en las mitocondrias y los cloroplastos3 6

La presencia del espacio tilacoidal divide el cloroplasto en tres compartimientos internos, en lugar de dos como ocurre en la mitocondria. En cualquier caso, el efecto neto de la translocacin de H+en los dos orgnulos es similar. En la Figura 14-53 se ilustra cmo se bom bea el H+ desde el estroma (pH 8) hasta el espacio tilacoidal en los cloroplastos (pH aproximadamente 5), creando un gradiente de 3 a 3,5 unidades de pH. Esto representa una fuerza protn-motriz de aproxima damente 200 mV a travs de la m em brana tilacoidal (la mayor parte del cual es debida al gradiente de pH ms que al potencial de membrana), que impulsa la sntesis de ATP mediante la ATP sintasa integrada en esta membrana. Como el estroma, la matriz mitocondrial tiene un pH de aproximadamente 8, pero en este caso est generado por el bom beo de protones de la mitocondria hacia el citosol (pH de aproximadamente 7), en lugar de hacia un espacio inte rior del orgnulo. As, el gradiente de pH es relativamente pequeo, y la mayora de la fuerza protn-motriz a travs de la mem brana mitocondrial interna, que es aproximadamente la misma que la de la membrana tilacoidal del cloroplasto, est generada por el potencial de mem brana resultante. En cualquier caso, tanto para las mitocondrias como para los cloroplastos, el lugar cataltico de la ATP sintasa se encuentra a un pH de aproximadamente 8 y se localiza en un gran compartimiento del orgnulo (matriz o estroma) donde se incluyen enzimas so lubles. Consecuentemente, es all donde se produce todo el ATP del orgnulo (Figura 14-53). Aunque hay muchas similitudes entre las mitocondrias y los cloroplastos, la estructura de los cloroplastos hace que el estudio de sus procesos de transporte de electrones y protones sea ms fcil: a travs de la rotura de las membranas in terna y externa de un cloroplasto, los discos tilacoidales aislados pueden obte nerse intactos. Estos tilacoides se parecen a las partculas submitocondriales que contienen una m em brana en la que la cadena de transporte de electrones tiene sus lugares de utilizacin para el NADP+ , ADP, y fosfato libremente accesiFigura 14-53 Comparacin de los flujos de protones y de la orientacin de la ATP sintasa que se presentan en las mitocondrias y en los cloroplastos.
Los com p artim ien to s que tien en un pH sim ilar se rep resentan en el m ism o color. La fuerza p rot n -m o triz a travs de la m em b ran a tilacoid al con siste m ayoritariam ente en un gradiente de pH; la alta perm eabilid ad de esta m em bran a al Mg2+ y a los iones CL perm ite que el flujo de estos iones disipe la m ayora del p o ten cial de m em brana. P robablem en te, las m itocon d rias no pu ed en tolerar un pH de 10 en su m atriz, y por ello requ ieren generar fuerzas p ro t n -m o trices sin que exista p o ten cial de m em brana.

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Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

bles al exterior. Pero los tilacoides aislados mantienen su estructura nativa intac ta y son mucho ms activos que las partculas submitocondriales aisladas. Por esta razn varios de los experimentos que en un principio demostraron el papel central de los mecanismos quimiosmticos se realizaron con cloroplastos y no con mitocondrias.

Como la membrana mitocondrial interna, la membrana interna del cloroplasto contiene protenas transportadoras que facilitan el intercambio de metabolitos con el citosol3 7
Si los cloroplastos se aslan de manera que se dejan intactas sus membranas in ternas, se puede demostrar que esta membrana tiene una permeabilidad selecti va, reflejando la presencia de protenas transportadoras especficas. Adems, la mayor parte del gliceraldehdo 3-fosfato producido por la fijacin de C 0 2 en el estroma del cloroplasto es transportado fuera del cloroplasto por un eficiente sistema antiporte que intercambia azcares-fosfato de 3 tomos de carbono por fosfato inorgnico. Normalmente, el gliceraldehdo 3-fosfato suministra al citosol una abun dante fuente de carbohidratos que es utilizada por la clula como punto de partida de otros muchos procesos de biosntesis -incluyendo la produccin de sacarosa para su exportacin. Pero su utilidad no term ina aqu. Cuando el gli ceraldehdo 3-fosfato llega al citosol, es rpidamente transformado (mediante parte de la va glucoltica) de nuevo en 3-fosfoglicerato, generando una m ol cula de ATP y otra de NADH. (Una reaccin de dos pasos en sentido inverso, muy similar, que forma el gliceraldehdo 3-fosfato en el ciclo de fijacin del carbono -vase la Figura 14-44.) Por consiguiente, la exportacin de gliceralde hdo 3-fosfato del cloroplasto suministra al resto de la clula, no slo la princi pal fuente de carbono fijado sino tam bin el poder reductor y el ATP necesa rios para el m etabolism o fuera del cloroplasto.

Los cloroplastos llevan a cabo otros procesos biosintticos

Adems de la fotosntesis, el cloroplasto tambin realiza otros procesos biosint ticos. Todos los cidos grasos de la clula y un nmero determinado de amino cidos, por ejemplo, estn sintetizados por enzimas del estroma del cloroplasto. En el cloroplasto, el poder reductor de los electrones activados por la luz impulsa la reduccin de los nitritos (NO2) a amonaco (NH3); este amonaco proporciona a la planta el nitrgeno necesario para la sntesis de aminocidos y de nucletidos. Por consiguiente, la importancia metablica del cloroplasto para las plantas y las algas es mucho ms amplia que su papel en el proceso de la fotosntesis.

Resumen
Los cloroplastos y las bacterias fotosintticas obtienen los electrones d e alta energa p o r m edio d e fotosistem as q u e capturan los electrones excitados cuando la luz solar es absorbida p o r las m olculas d e clorofila. Los fotosistem as estn com puestos p o r u n com plejo antena unido a un centro d e reaccin fotoqum ico, q u e es precisam en te un com plejo ordenado d e protenas y pigm entos en donde tiene luga r la fo to qu m ica d e la fotosntesis. El m ejor centro d e reaccin fotoqum ica conocido es, con d i feren cia , el d e la bacteria p rp u ra fotosinttica, d el q u e se conoce la estructura tridim ensional com pleta. M ientras qu e estas bacterias slo contienen un nico fo tosistema, en cloroplastos y cianobacterias existen dos tipos d e fotosistem as. Los dos fotosistem as estn norm alm ente ligados en serie y transfieren los electrones desde el agua hasta el NADP+form an d o NADPH, con la produccin concom itante d e un gradiente electroqum ico transm em brana; el oxgeno m olecular (O J se g en e ra com o producto secundario. E n com paracin con las m itocondrias, los cloroplastos tienen una m em brana a dicional (la m em brana tilacoidal) y un espacio interno (el espacio tilacoidal). To

Cloroplastos y fotosntesis

743

dos los procesos d e transporte electrnico tienen lu ga r en la m em brana tilacoidal: p a ra p ro d u cir ATP, el protn es bom beado hacia el espacio tilacoidal; un flu jo in verso d e protones a travs d e una ATP sintasa p rod uce el ATP en el estrom a d el clo roplasto. Este ATP se utiliza en conjuncin con el NADPH producido en la fotosnte sis p a ra im pulsar un gra n nm ero d e reacciones biosintticas en el estrom a d el cloroplasto, incluyendo el im portante ciclo d e fija ci n d el carbono, q u e gen era ca r bohidratos a p a rtir d e COr Junto con otros productos d el cloroplasto, este carbohi drato se exporta a l citosol d e la clula, d on de -e n fo rm a d e gliceraldehdo 3-fo sfa to - p roporcionan carbono orgnico, ATP, y p o d er redu cto r al resto d e la clula.

Evolucin de las cadenas de transporte de electrones38

Mucho de lo que se conoce sobre la estructura, funcin y evolucin de las clu las y organismos puede relacionarse con sus necesidades energticas. Hemos visto que los m ecanism os fundamentales para utilizar energa de fuentes tan dispares como la luz y la oxidacin de la glucosa son los mismos. Aparentemen te un mtodo efectivo para sintetizar ATP surgi en una evolucin temprana y desde entonces ha sido conservado con slo pequeas variaciones. Cmo sur gieron los primeros com ponentes individuales cruciales tales como la ATP sin tasa, las bom bas protnicas generadoras de poder reductor y los fotosistemas? Las hiptesis sobre acontecim ientos que sucedieron en una escala temporal evolutiva son difciles de probar. Pero disponemos de pistas, tanto respecto a las muy diferentes cadenas de transporte electrnico primitivas que sobreviven ac tualmente en algunas bacterias como respecto a evidencias geolgicas en rela cin al am biente de la Tierra de hace miles de millones de aos.

Probablemente las clulas ms primitivas producan ATP mediante fermentacin39

Como explicamos en el Captulo 1, se cree que las primeras clulas vivas apare cieron hace ms de 3,5 x 109 aos, cuando la Tierra no tena ms de 109 aos. Probablem ente las vas metablicas ms primitivas que producan ATP se pare can a las actuales formas de ferm entacin debido a la falta de oxgeno en el am biente y a la presencia de molculas orgnicas producidas geoqumicamente. En el proceso de la ferm entacin el ATP se produce mediante un proceso de fosforilacin que utiliza la energa liberada cuando una molcula orgnica rica en hidrgeno, tal como la glucosa, se oxida parcialmente (vase Figura 2-14). Al no disponer de oxgeno com o aceptor, los electrones que provienen de las m ol culas orgnicas oxidadas tienen que ser transferidos (va NADH o NADPH) a una molcula orgnica diferente (o a una parte diferente de la misma molcula), que consecuentem ente se reduce. Al final del proceso fermentativo, una (o varias) de las molculas orgnicas producidas se excretan al medio como productos metablicos residuales; otros, tales como el piruvato, son retenidos por la clula para la biosntesis. Los productos excretados son distintos en diferentes organismos, pero tien den a ser cidos orgnicos (compuestos carbonados con un grupo COOH). En las clulas bacterianas los ms importantes son el cido lctico (que tambin se acumula en la glucolisis anaerbica en los mamferos) y cidos como el frmico, el actico, el propinico, el butrico y el succnico. En la Figura 14-54 se ilustran dos vas fermentativas de las bacterias actuales.

La evolucin de la cadena de transporte electrnico conservadora de energa capacit a las bacterias anaerbicas para utilizar compuestos orgnicos no fermentables como fuente de energa40
Los procesos de ferm entacin primitivos no slo habran generado el ATP sino tam bin el poder reductor (en forma de NADH o de NADPH) necesarios para la 744 Captulo 14: Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

(A) FERMENTACIN QUE PRODUCE LA EXCRECIN DE CIDO LCTICO

^glucosa)

Figura 14-54 Dos tipos de procesos de ferm entacin. Los productos

finales se d estacan en recuadros de color verde. En am b o s caso s se utilizan dos m olcu las de NAD+ por cada m olcu la de glu cosa que sufre la glucolisis y stas son regeneradas m ed iante la tran sferen cia de iones hidruro desde el NADH. En (A) los iones hidruro son transferidos hasta el piruvato, p rod ucien do dos m olcu las de cid o lctico que es excretad o. En (B) los dos io n es hidruros se transfieren su cesivam en te desde dos m olcu las de NADH hasta com p u esto s derivados del piruvato, prod uciendo cido su ccn ico . Por cad a m o lcu la de cido su ccn ico excretad a, se guarda un a m olcu la de piruvato {rojo) para p rocesos de b io sn tesis en el interior celular. T an to en (A) com o en (B) se ha de excretar un cid o orgnico para pod er volver a sin tetizar NAD+y p erm itir q ue la glucolisis co n tin e en au sen cia de oxgeno.

(B) FERMENTACIN QUE PRODUCE LA EXCRECIN DE CIDO SUCCNICO

<^glucosa)

2NAD+ H:

piruvato

T
co 2

cido succnico

biosntesis esencial, y probablemente algunas de las principales vas metablicas evolucionaron mientras la fermentacin era la nica forma de produccin de energa. Sin embargo, con el tiempo, las actividades m etablicas de esos or ganismos procariotas cambiaron el medio ambiente circundante, forzando a los organismos a desarrollar nuevas vas bioqumicas. La acumulacin de productos residuales de fermentacin, por ejemplo, pudo provocar la siguiente serie de cambios:

Estadio 1. La excrecin continua de cidos orgnicos disminuy el pH del m e

dio ambiente, favoreciendo la evolucin de protenas que actuaban como bom bas transmembrana de H+que bom beaban H+hacia el ex terior de la clula con el objetivo de protegerla de los efectos peligro sos de la acidificacin intracelular. Una de esas bombas pudo haber utilizado la energa procedente de la hidrlisis del ATP y as mismo pudo haber sido la antecesora de la ATP sintasa actual. Estadio 2. Al mismo tiempo que los cidos orgnicos no fermentables se acu mulaban en el medio ambiente y favorecan la evolucin de una bom ba de H+ consumidora de ATP, el aporte de nutrientes fermen tables de origen geoqumico, que suministraba la energa a las bom bas y a otros procesos celulares, fue disminuyendo. Ello favoreci a las bacterias que podan excretar H+ sin hidrolizar ATP, lo que les permita conservar el ATP para otras actividades celulares. De este tipo de presiones selectivas pudieron haber surgido las primeras protenas unidas a membrana que utilizaron el transporte de elec trones entre molculas de diferente potencial redox como fuente de energa para transportar H+ a travs de la membrana plasmtica. Al gunas de esas protenas debieron encontrar sus dadores y aceptores de electrones entre los cidos orgnicos no fermentables que acu mulaban. Muchas de esas protenas transportadoras de electrones se encuentran en las bacterias actuales: por ejemplo, algunas bacte rias que crecen en cido frmico bom bean H+utilizando una peque a cantidad de energa redox derivada de la transferencia de electro-

Evolucin de las cadenas de transporte de electrones

745

cido frmico
gradiente electroqum ico EXTERIOR de protones CELULAR
H-COOH

2H + + CO.i

Figura 1 4 -5 5 La oxidacin del cido frmico de algunas bacterias actuales. En tales b acterias
anaerb icas, incluyendo E. coli, la oxid acin de cido frm ico est m ediada por una cad ena de transporte de electron es conservad ora de energa, de la m em b ran a celular. Tal com o se indica en la figura, los reactivos de este proceso son cido frm ico y fum arato y los productos, su ccin ato y C 0 2. N tese que los H+se generan fuera de la clula y se utilizan d entro de la clula, lo cual equivale a b o m b ear H+ hacia el exterior celular. As pus, este sistem a de transporte de electro n es ligado a m em b ran a puede gen erar un gradiente electro qu m ico de protones a travs de la m em brana. El potencial redox del par cido f rm ic o -C 0 2 es de - 4 2 0 mV, m ientras que el del par fu m arato-su ccin ato es de +30 mV.

f^ r x

CITOSOL

nes desde el cido frmico al fumarato (Figura 14-55). Otras tienen com ponentes transportadores de electrones similares dedicados so lamente a la oxidacin y reduccin de substratos inorgnicos (vase Figura 14-57, por ejemplo). Estadio 3. A la larga, algunas bacterias desarrollaron sistemas de transporte electrnico que bom beaban H+ , que fueron suficientemente eficien tes para obtener ms energa redox de la que necesitaban para m an tener su pH interno. Ahora bien, las bacterias que disponan de los dos tipos de bom bas de H+ presentaban una ventaja. En esas clulas un gran gradiente electroqumico de protones generado por un ex cesivo bom beo de H+permita el retorno de los protones a la clula a travs de bom bas de H+ impulsadas por ATP, hacindolas actuar al revs, ya que funcionaban como ATP sintasas produciendo ATP. De bido a que estas bacterias requeran cada vez menos aporte de nu trientes fermentables, proliferaron a expensas de sus vecinos. En la Figura 14-56 se resumen estos tres estadios hipotticos en la evolucin de los m ecanism os de la fosforilacin oxidativa.

H+

Las bacterias fotosintticas, suministrando una fuente inagotable de poder reductor, superaron el mayor obstculo de la evolucin de las clulas4 1
Las etapas evolutivas que hemos mencionado habran resuelto el problema de m antener un pH intracelular neutro y una fuente abundante de energa, pero habran dejado sin solucin otro problema tambin muy grave. La disminucin de la cantidad de nutrientes orgnicos fermentables significaba que se deba en contrar una fuente de carbono alternativa, para producir los azcares que se uti lizaban como precursores de otras muchas molculas de la clula. El dixido de carbono de la atmsfera constitua una abundante fuente potencial de carbono. Sin embargo, la conversin de dixido de carbono en una molcula orgnica, como por ejemplo un carbohidrato, requiere que el dixido de carbono fijado sea reducido por un fuerte dador electrnico, como el NADH o el NADPH, capaz de suministrar los dos electrones necesarios para generar una unidad de (CH2 0) a partir de cada C 0 2 (vase Figura 14-44). En las primeras etapas de la evolucin celular debieron abundar agentes reductores fuertes como stos, procedentes de los procesos de fermentacin. Pero a medida que el aporte de nutrientes fer mentables disminua, y empez a actuar una ATP sintasa unida a membrana produciendo la mayor parte del ATP de las clulas, tam bin debi empezar a disminuir el aporte abundante de NADH y de otros agentes reductores. Por ello, result imprescindible que las clulas desarrollaran un nuevo sistema de gene rar una fuente de poder reductor. 746 Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

ESTADIO 2 H+ H+ H+

ESTADIO 3
Figura 14-56 Evolucin de los m ecanism os de fosforilacin oxidativa. Se m u estra una posible
secu en cia.

poder reductor formado aqu debido al flujo inverso de electrones impulsado por el gradiente de H+ EXTERIOR CELULAR

gradiente de H+ formado por el bombeo de H+ hacia el exterior de la clula durante la transferencia de electrones

Figura 14-57 Algunas de las vas del transporte de electrones de las bacterias actuales. Estas vas generan
todo el ATP y el pod er red uctor celu lar a partir de la oxid acin de m olcu las inorgnicas tales com o hierro, am on io, nitritos y com p u esto s de azufre. Tal com o se indica, algunas esp ecies pueden cre ce r de form a an aer b ica utilizando nitratos com o acep tor final de electron es en lugar de oxgeno. La m ayora de estas b acterias utilizan el ciclo de fijaci n del carb o n o y sin tetizan sus m olcu las org nicas a partir de dixido de carb on o . El flujo de electron es h ace que se b o m b een protones h acia el exterior de la clula, y el gradiente de p rotones resultante dirige la p rod u ccin de ATP m ed iante un a ATP sin tasa (no m ostrad a aqu). Adem s, el NADPH n ecesario para la fijaci n del carb o n o se produce m ed iante un flujo inverso de electron es que es tam b in im pulsado por el gradiente de H+, com o se indica.

CITOSOL NADP

citocromo
m v il

O o NO
2

NADH (NADPH) deshidrogenasa

complejo de tipo b-c

complejo de tipo citocromo oxidasa

Probablemente, los principales dadores disponibles de electrones fueron los cidos orgnicos producidos por el metabolismo anaerbico de los carbohidra tos, algunas molculas inorgnicas como el sulfuro de hidrgeno (H2 S) generadas geoqumicamente, y el agua. Sin embargo, el poder reductor de estas molculas resulta demasiado dbil para poder ser utilizado en la fijacin del dixido de car bono. Probablemente, la utilizacin de un gradiente electroqumico de electro nes a travs de la membrana plasmtica para impulsar un flujo inverso de elec trones, gener un suministro temprano de dadores fuertes de electrones. Este proceso requiri la evolucin de complejos enzimticos unidos a membrana se m ejantes a la NADH deshidrogenasa; mecanismos de este tipo sobreviven toda va en el metabolismo anaerbico de algunas bacterias actuales (Figura 14-57). El principal avance en el metabolismo energtico fue, sin embargo, el desarrollo de centros de reaccin fotoqumicos que pueden utilizar energa solar para pro ducir directamente molculas como el NADH. Se cree que esto sucedi hace ms de 3 x 109 aos en los organismos ancestrales de las bacterias verdes del azufre. Actualmente, las bacterias verdes del azufre utilizan energa luminosa para transferir tomos de hidrgeno (como un electrn ms un protn) desde el H2S al NADPH; de esta forma, se crea el fuerte poder reductor necesario para la fijacin de carbono (Figura 14-58). Como los electrones eliminados del H2S se hallan a un potencial redox ms negativo que los del H20 (-230 mV comparados a +820 mV del H2 0 ), un cuanto de luz absorbida por el nico fotosistema de esas bacterias es suficiente para conseguir un potencial redox suficientemente alto para generar NADPH a travs de una cadena de transporte de electrones fotosinttica relativamente sencilla.

-400

NADP reductasa
CD-

Figura 14-58 Flujo general de electrones en una forma relativamente primitiva de fotosntesis observada en bacterias verdes del azufre actuales. El
foto sistem a de un a b acteria verde se parece al foto sistem a I de las plantas y de las cian ob acterias en que utiliza series de cen tro s de hierro-azu fre com o acep tores prim arios de electro n es, los cuales ced en finalm ente sus electron es de alta energa a la ferrodoxina (Fd).

-300

H* 4 'J A d H T O !? ? ! L.---- - ___BSHi58l3i$8seB@

-200

S + 2 H+ direccin del flujo de electrones

Evolucin de las cadenas de transporte de electrones

747

Las cadenas de transporte electrnico de los complejos fotosintticos de las cianobacterias produjeron oxgeno atmosfrico y permitieron nuevas formas de vida4 2
Parece ser que el siguiente paso que se produjo con el desarrollo de las cianobacte rias hace unos 3 x 109 aos consisti en la evolucin de organismos capaces de uti lizar agua como fuente de electrones para reducir el C 0 2. Esto permiti la evolu cin de una enzima hidrolizadora de la molcula del agua y tambin requiri un segundo fotosistema que actuara en serie con el primero haciendo de puente por encima de la enorme diferencia de potencial redox existente entre el H20 y el NADPH. Las homologas estructurales que existen entre fotosistemas actuales su gieren que este cambio implic la cooperacin de un fotosistema derivado de las bacterias verdes (fotosistema I) con un fotosistema derivado de las bacterias pr puras (fotosistema II). Las consecuencias biolgicas de este paso evolutivo se m a nifestaron hace mucho tiempo. Al principio, haba organismos cuyas demandas qumicas a su medio ambiente eran mnimas, por lo que se extendan y evolucio naban por vas que las bacterias fotosintticas primitivas, que necesitaban H2S o cidos orgnicos como fuentes de electrones, no podan seguir. Consecuentemen te se acumulaban grandes cantidades de materiales orgnicos reducidos, sintetiza dos biolgicamente. Adems, el oxgeno por primera vez entr en la atmsfera. El oxgeno es altam ente txico porque las reacciones de oxidacin que cata liza pueden alterar al azar molculas biolgicas. Por ejemplo, muchas bacterias anaerbicas actuales mueren rpidamente cuando son expuestas al aire. Por lo tanto, los organismos de la Tierra primitiva tuvieron que desarrollar m ecanis mos de proteccin contra el increm ento de los niveles de 0 2 en el ambiente. Los recin llegados evolutivamente, como nosotros mismos, presentan numerosos m ecanism os de destoxificacin que protegen las enzimas de los efectos adversos del oxgeno. El increm ento de los niveles del oxgeno atmosfrico fue inicialmente muy lento y permiti una evolucin gradual de medidas protectoras. Los mares pri mitivos tenan grandes cantidades de hierro ferroso (Fe [II]), y casi todo el oxge no producido por las bacterias fotosintticas primitivas fue utilizado en transfor mar el Fe(II) en Fe(III). Esta conversin caus la precipitacin de enormes cantidades de xidos frricos. Los extensos acmulos de hierro, que nacieron hace aproximadamente 2,7 x 109 aos, permiten datar el incremento evolutivo de las cianobacterias. Hace aproximadamente 2 x 109 aos, el suministro de hie rro ferroso se agot, y ces la deposicin de precipitaciones de hierro. Las evi dencias geolgicas sugieren que entonces empezaron a aumentar los niveles de oxgeno en la atmsfera, alcanzando los niveles actuales hace entre 0,5 y 1,5 x 109aos (Figura 14-59).

Figura 14-59 Relacin entre las variaciones de los niveles atmosfricos de oxgeno y algunos de los principales estadios que se debieron producir durante la evolucin de los organismos vivos sobre la Tierra. Tal com o se indica en la figura, existen evidencias geolgicas que sugieren que hubo ms de mil millones de aos de intervalo entre la aparicin de las cianobacterias (las cuales, segn se cree, fueron los primeros organismos que liberaron oxgeno) y el momento en que el oxgeno se empez a acumular en las atmsfera en grandes cantidades. Este retraso fue debido principalmente a las grandes cantidades de hierro ferroso disuelto en los ocanos, que reaccion con el oxgeno liberado formando enormes depsitos de xidos de hierro.

NIVELES DE OXGENO EN LA ATMSFERA

(% )

10

TIEMPO (MILES DE MILLONES DE AOS)

formacin de los ocanos y de los continentes formacin de la Tierra

actualmente primeras primeros procesos clulas fotosintticos que liberaron O2 del agua vivas primeras clulas fotosintticas origen de las clulas primeros fotosintticas vertebrados eucariotas la respiracin aerbica primeras plantas y se generaliza animales multicelulares

748

Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

CLOROPLASTOS DE PLANTAS Y DE ALGAS

V E R D ES

MTOCONDRA
EUCARIOTAS PROCARIOTAS

f
cianobacterias 1
V

\ bacterias deslizantes

J
prdida de la fotosntesis
bacterias verdes filamentosas

A
1 prdida de la fotosntesis bacterias prpuras no sulfricas

ATMSFERA OXIDANTE ATMSFERA REDUCTORA

respiracin O2

respiracin O2

bacterias prpuras sulfricas

fotosntesis H20 ciclo fijador del carbono

f
bacterias verdes sulfricas
V

fotosntesis H2S
bacterias termentadoras ancestrales

La disponibilidad de oxgeno hizo posible el desarrollo de bacterias que de pendan del metabolismo aerbico para producir ATP. Como hemos explicado anteriormente, estos organismos pudieron utilizar la gran cantidad de energa li berada en la degradacin de carbohidratos y de otras molculas orgnicas redu cidas hasta C 0 2y H2 0 . Los componentes de los complejos de transporte electr nico preexistentes fueron modificados, generndose una citocromo oxidasa, de forma que los electrones obtenidos a partir de substratos orgnicos e inorgni cos pudieron ser transportados hasta el 0 2, como aceptor final de electrones. Muchas bacterias prpura fotosintticas actuales pueden alternar entre la foto sntesis y la respiracin, dependiendo de la disponibilidad de luz y de oxgeno, mediante sorprendentes reorganizaciones secundarias en sus cadenas de trans porte de electrones. Como resultado de la fotosntesis se acumularon materiales orgnicos en la Tierra, lo que provoc que algunas bacterias fotosintticas (incluyendo las pre cursoras de E. coli) perdieran su capacidad de sobrevivir slo de la energa de la luz y se volvieran enteram ente dependientes de la respiracin. Se cree que las primeras mitocondrias surgieron hace 1,5 x 109 aos, cuando estas bacterias de pendientes de la respiracin se transformaron en endosimbiontes de clulas pri mitivas eucariotas. Posteriormente, los descendientes de estas clulas eucariotas aerbicas primitivas endocitaron una bacteria fotosinttica que se convirti en el precursor de los cloroplastos; no obstante, los cloroplastos actuales proceden tes de diferentes tipos de algas son suficientemente distintos entre s como para sugerir que evolucionaron separadamente en diferentes linajes. La Figura 14-60 esboza algunas de estas vas evolutivas. La evolucin siempre es conservativa utilizando partes antiguas y constru yendo sobre ellas nuevos procesos. Por ello, probablemente todava sobreviven,

Figura 14-60 Arbol filogentico de la probable evolucin de las m itocondrias y los cloroplastos y de sus ancestros bacterianos. Parece que la respiracin de oxgeno com enz su desarrollo hace 2 x 109 aos; tal como se indica, parece ser que evolucion independientemente en las lneas verde, prpura y azul-verdosas (cianobacterias) de bacterias fotosintticas. Se cree que una bacteria prpura aerbica que debi de perder su capacidad para realizar fotosntesis, dio lugar a las mitocondrias, mientras que algunas bacterias azul-verdosas diferentes dieron lugar a los cloroplastos. Anlisis detallados de secuencias de nucletidos sugieren que las mitocondrias surgieron de bacterias parecidas a las rizobacterias, las agrobacterias y a las rickettsias -tres especies estrechamente relacionadas que generan asociaciones ntimas con las clulas eucariotas actuales.

Evolucin de las cadenas de transporte de electrones

749

Figura 14-61 Comparacin de los tres tipos de cadenas transportadoras de electrones, que se discuten en este captulo. Las bacterias, los
cloroplastos y las mitocondrias contienen un com plejo enzimtico unido a membrana que es muy sem ejante al com plejo b-c, de las mitocondrias. Estos com plejos captan electrones del transportador quinona (designado como Q) y bom bean H+a travs de sus respectivas membranas. Adems, en sistemas in vitro reconstituidos, los diferentes complejos pueden substituirse uno por otro y las secuencias de aminocidos de sus com ponentes proteicos indican que estn relacionados evolutivamente.

CLOROPLASTOS VEGETALES Y CIANOBACTERIAS

EB23

l NAp,l

NADH deshidrogenasa

MITOCONDRIA

02

H20

aunque en forma alterada, en los eucariotas superiores actuales partes de la ca dena de transporte electrnico de las bacterias anaerbicas de hace ms de tres a cuatro mil millones de aos. Por ejemplo, existe una notable homologa en cuanto a estructura y funcin entre un complejo enzimtico que bombea proto nes en el segmento central de la cadena respiratoria mitocondrial (el complejo b-Cj) y los segmentos correspondientes de las cadenas de transporte electrnico de las bacterias y de los cloroplastos actuales (Figura 14-61).

Resumen
Al parecer, las clulas primitivas fueron organismos parecidos a las bacterias ac tuales, que vivan en un medio rico en molculas orgnicas altamente reducidas, de origen geoqumico, en el transcurso de cientos de millones de aos. Probablemente, estas clulas primitivas obtenan la mayor parte de su ATP mediante la transfor macin de estas molculas orgnicas reducidas en diversos cidos orgnicos, que eran excretados como productos de desecho. As pues, estas fermentaciones acidifi caron el medio, lo cual pudo haber sido la causa de la evolucin de las primeras bombas de H* unidas a membrana, que permitieron mantener un pH neutro en el interior de la clula. Las propiedades de las bacterias actuales sugieren que en este ambiente anaerbico aparecieron una bomba de H* impulsada por el transporte electrnico y una bomba de H* impulsada por ATP. La inversin del sentido del funcionamiento de la bomba de H* impulsada por ATP pudo permitir que funcio nase como una ATP sintasa. Al desarrollarse cadenas de transporte electrnico ms efectivas, se pudo utilizar para generar ATP la energa liberada por las reacciones

750

Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

redox entre molculas inorgnicas y/o la energa acumulada en compuestos nofermentables. La proliferacin de bacterias que utilizaban molculas orgnicas preformadas como fuente de carbono y de poder reductor, no pudo llegar muy lejos, ya que estas molculas orgnicas eran generadas con una gran lentitud por los procesos geoqu micos. Por consiguiente, el agotamiento de los nutrientes orgnicos fermentables condicion probablemente la evolucin de las bacterias fotosintticas, que podan utilizar dixido de carbono para producir carbohidratos. Combinando fragmentos de las cadenas de transporte electrnico desarrolladas con anterioridad, las bacte rias fotosintticas llegaron a desarrollar un fotosistema que utilizaba energa lu minosa para generar el NADPH necesario para la fijacin del carbono. La posterior aparicin en las cianobacterias, de cadenas fotosintticas de transporte electrnico ms complejas, permiti que se pudiera utilizar el agua, en lugar de dadores de electrones menos abundantes y que eran utilizados por otras bacterias fotosintti cas, como dador de electrones para la formacin del NADPH. De esta forma, la vida pudo proliferar en grandes reas de la Tierra, por lo que se volvieron a acumular molculas orgnicas reducidas. Hace aproximadamente 2 mil millones de aos el oxgeno liberado por la fotosntesis de las cianobacterias empez a acumularse en la atmsfera. Cuando tanto las molculas orgnicas como el oxgeno llegaron a ser abundantes, las cadenas de transporte electrnico se adaptaron a transportar elec trones desde el NADH hasta el oxgeno, y en muchas bacterias se desarroll un me tabolismo aerbico eficiente. En las mitocondrias de los eucariotas se presentan exactamente estos mismos mecanismos aerbicos, y existen considerables eviden cias de que tanto las mitocondrias como los cloroplastos evolucionaron a partir de bacterias aerbicas que fueron endocitadas por clulas eucariotas primitivas.

Los genomas de las mitocondrias y de los cloroplastos

Para poder seguir el ritmo de crecimiento y divisin celular, las clulas han de generar nuevos orgnulos citoplasmticos. Tambin han de reponer los orgnulos que son degradados como parte del proceso continuo de recambio de org nulos que se produce en las clulas no proliferativas. La biosntesis de orgnulos supone la sntesis ordenada de las protenas y de los lpidos necesarios, as como el transporte de cada com ponente al subcompartimiento del orgnulo adecua do. En el Captulo 12 explicbamos la transferencia de protenas y lpidos hacia el interior de las mitocondrias y de los cloroplastos desde cualquier sitio de la c lula. Aqu describimos las contribuciones que hacen estos orgnulos transfor madores de energa a su propia biognesis.

La biosntesis de las m itocondrias y de los cloroplastos supone la contribucin de dos sistemas genticos diferentes 4 3
Mientras que la mayora de las protenas de las mitocondrias y de los cloroplas tos estn codificadas por el DNA nuclear y son importadas hacia el orgnulo desde el citosol despus de haber sido sintetizadas en los ribosomas citoslicos, otras protenas estn codificadas por el DNA del propio orgnulo y son sintetiza das sobre los ribosomas del interior del orgnulo. Parece que el trfico de prote nas entre el citoplasma y los orgnulos es unidireccional, ya que no se conoce ninguna protena que sea exportada desde las mitocondrias o desde los cloro plastos hacia el citosol. Las contribuciones de ambos sistemas genticos a la formacin de las m ito condrias y de los cloroplastos estn estrechamente coordinadas en la clula. Aunque slo durante un perodo de tiempo breve, los orgnulos aislados en un tubo de ensayo continan produciendo DNA, RNA y protenas, lo cual ha permi tido determinar cules son las protenas que estn codificadas en el DNA del or gnulo y cules lo estn en el DNA nuclear. Otra forma de abordar este estudio consiste en utilizar inhibidores especficos sobre clulas intactas. La droga cicloLos genomas de las mitocondrias y de los cloroplastos

751

Figura 14-62 Resumen de la biosntesis de las protenas en las mitocondrias y en los cloroplastos.

NUCLEO DNA
gen m ico

CITOSOL RNA ciclohexim ida proteina precursora

Cada fle c h a roja indica el lugar de accin de un inhibidor que es especfico para la sntesis de protenas, en los orgnulos o en el citosol.

MITOCONDRIA O CLOROPLASTO DNA del orgnulo acridinas o etidio RNA

proteina im po rtada

protein a sintetiza' en el orgnu lo

cloranfenicol, eritrom icina o tetraciclina

heximida, por ejemplo, inhibe la sntesis citoslica de protenas, pero no inhibe la sntesis proteica de los orgnulos. Por el contrario, varios antibiticos (como el cloranfenicol, la tetraciclina y la eritromicina) inhiben la sntesis de protenas en las mitocondrias y en los cloroplastos, pero tienen poco efecto sobre la snte sis de protenas citoslica (Figura 14-62). Estos inhibidores se utilizan amplia mente en los estudios sobre la funcin de estos orgnulos.

El crecim iento y la divisin de los orgnulos m antiene el nmero de mitocondrias y de cloroplastos en la clula 4 4
Las mitocondrias y los cloroplastos no se sintetizan nunca de novo. Siempre surgen por crecim iento y divisin de cloroplastos y mitocondrias ya existentes. Las observaciones de clulas vivas indican que las mitocondrias no slo se divi den, sino que tam bin se fusionan una con otra. Sin embargo, cada orgnulo ha de duplicar su masa y luego dividirse por la mitad un promedio de una vez por cada generacin celular. Estudios con el m icroscopio electrnico sugieren que la divisin de estos orgnulos empieza con la invaginacin de la m embrana in terna, tal como ocurre en la divisin celular de muchas bacterias (Figuras 14-63 y 14-64), lo cual implica que se trata de un proceso controlado y no de un acon tecim iento causado por un estrangulamiento casual. En la mayora de las clulas, los diferentes orgnulos transformadores de ener ga se dividen durante la interfase, en desfase con el proceso de divisin celular o con el de la divisin de los otros orgnulos. De forma anloga, la replicacin del DNA de los orgnulos no se produce nicamente durante la fase S, cuando se reali za la replicacin del DNA nuclear, sino a lo largo de todo el ciclo celular. Parece que las molculas de DNA de los orgnulos individuales se seleccionan al azar para su replicacin, de manera que durante un ciclo celular determinado algunas de ellas pueden replicarse ms de una vez y otras no llegar a replicarse. De cualquier modo, en condiciones constantes el proceso est regulado asegurando que el nmero to tal de molculas de DNA se duplique en cada ciclo celular, de tal manera que cada tipo celular mantiene una cantidad constante de DNA de los orgnulos.

Figura 14-63 Diagrama de una divisin mitocondrial. La va

mostrada aqu ha sido postulada a partir de fotografas estticas de mitocondrias en divisin, com o la de la Figura 14-64.

752

Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

Figura 14-65 Electronmicrografa de una molcula de DNA mitocondrial animal durante el proceso de replicacidn del DNA. El genoma de
DNA circular se ha replicado nicamente entre los dos puntos sealados con flechas (hebras amarillas). (Cortesa de David Clayton.)

I _____________ !
1 jj n i

Figura 14-64 Electronmicrografa de una mitocondria en divisin de una clula heptica. (Cortesa de Daniel S.
Friend.)

i________________________ i
1 un

El nmero de orgnulos que se presentan en cada clula puede estar regula do de acuerdo a las necesidades de la clula; por ejemplo, si un msculo esque ltico en reposo se estimula repetidamente durante un perodo prolongado de tiempo, se observa un gran incremento de la cantidad total de mitocondrias (del orden de 5 a 10 veces). Por otra parte, en circunstancias especiales, la divisin de los orgnulos est controlada con precisin por la clulas: as en algunas algas que contienen un solo o unos cuantos cloroplastos, el orgnulo se divide justo antes de la citocinesis, en un plano que es idntico al futuro plano de la divisin.

Generalmente los genomas de los cloroplastos y de las m itocondrias son molculas de DNA circulares 45
Las molculas de DNA de los orgnulos son relativamente pequeas y simples, y excepto en los genomas mitocondriales de algunas algas y protozoos, son circu-

Tabla 14-2 Tamao de los genomas de los orgnulos* Tipo de DNA DNA de cloroplastos
Plantas superiores Chlamydomonas (alga verde) 120-200 180

Tamao (en miles de pares de nucledtidos)

DNA de mitocondrias
Animales (incluyendo los gusanos platelmintos, los insectos y los mamferos) Plantas superiores Hongos Schizosaccharomyces pombe (levaduras de fisin) 16-19 150-2500 17 32 60 78 16 (molcula lineal) 22 40 (molcula lineal)

Aspergillus nidulans Neurospora crassa Saccharomyces cerevisiae (levadura de gem acin) Chlamydomonas (alga verde)
Protozoos

Trypanosoma brucei Paramecium

* Estos genomas son molculas de DNA circular a menos que se indique lo contrario.

Los genomas de las mitocondrias y de los cloroplastos

753

Tabla 14-3 Cantidades relativas de DNA de los orgnulos de diferentes clulas y tejidos Molculas de DNA Tejido o por tipo celular orgnulo hgado vegetativo huevo vegetativo hojas 5-10 2-50 5-10 80 20-40 DNA de los orgnulos como porcentaje del DNA celular 1 15 99 7 15

Organismo DNA mitocondrial Rata Levadura* Rana DNA del cloroplasto

Orgnulos por clula

1000
1-50 IO7 1 20-40

Chlamydomonas
Maiz

* La gran variacin del nmero y tamao de las mitocondrias por clula en las levaduras es de bida a la fusin y fragmentacin de mitocondrias.

lares. El genoma de los cloroplastos (que es idntico al genoma de los otros plastidios de la planta) tiene un tamao similar en todos los organismos examina dos, pero el genoma mitocondrial es mucho mayor en las plantas que en los ani males (Tabla 14-2). Muchas molculas de DNA de los orgnulos tienen aproximadamente el mismo tam ao que el DNA tpico de los virus. En los mamferos, por ejemplo, el genoma m itocondrial es un DNA circular de unos 16 500 pares de bases (me nos de 10~ 5 veces el tamao del genoma nuclear). En animales tan diversos como Drosophila y el erizo de mar, el genoma mitocondrial es aproximadamen te del mismo tam ao (Figura 14-65). No obstante, las plantas tienen un genoma mitocondrial circular que es entre 10 y 150 veces ms grande, dependiendo de la planta. Los ms grandes de estos genomas son aproximadamente la mitad del tamao de los genomas bacterianos tpicos, que tambin son molculas circula res de DNA. Todas las mitocondrias y los cloroplastos contienen mltiples copias de la molcula de DNA del orgnulo (Tabla 14-3). Normalmente, estas molculas de DNA estn distribuidas en varios grupos separados, situados en la matriz de la mitocondria o en el estroma del cloroplasto, donde al parecer estn unidos a la mem brana interna. A pesar de que no se conoce cmo est empaquetado este DNA, es probable que la estructura del genoma se parezca ms a la de las bacterias que a la de la cromatina eucariota. Por ejemplo, como en el caso de las bacterias, en los cloroplastos y en las mitocondrias no hay histonas. En las clulas de mamfero el DNA mitocondrial constituye menos del 1% del DNA celular total. Sin embargo, en otras clulas -com o en las de las hojas de las plantas superiores o en los grandes oocitos de los anfibios- los orgnulos transformadores de energa pueden contener una proporcin mucho mayor del DNA total de la clula (vase Tabla 14-3) y, por consiguiente, en ellos se produce una mayor proporcin de RNA y sntesis proteica total.

Las mitocondrias y los cloroplastos contienen sistemas genticos completos 4 6

A pesar del reducido nmero de protenas codificadas en su genoma, las mito condrias y los plastidios llevan a cabo replicacin de su DNA, transcripcin del DNA y sntesis proteica. Estos procesos se producen en la matriz de las m itocon drias y en el estroma de los cloroplastos. Aunque las protenas que llevan a cabo estos procesos genticos son exclusivas del orgnulo, la mayora de ellas estn codificadas en el genoma nuclear. Este hecho es tanto ms sorprendente por

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Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

cuanto que la maquinaria de sntesis proteica de los orgnulos se parece ms a la de las bacterias que a la de los eucariotas. Esta similitud es particularmente grande en el caso de los cloroplastos: 1. Los ribosomas de los cloroplastos son muy similares a los ribosomas de E. coli, tanto respecto a su sensibilidad frente a diversos antibiticos (tales como el cloranfenicol, la estreptomicina, la eritromicina y la tetraciclina), como respecto a su estructura. No slo son extremadamente parecidas las secuencias de nucletidos de los RNA ribosmicos respecto a las de los clo roplastos y de E. coli, sino que los ribosomas del cloroplasto son capaces de utilizar los tRNA ribosomales para realizar sntesis proteica. En todos los aspectos, los ribosomas de los cloroplastos difieren de los que se hallan en el citosol de la misma clula de la planta. En los cloroplastos la sntesis proteica empieza con la iV-formilmetionina, al igual que en las bacterias, y no con la metionina como ocurre en el citosol de las clulas eucariotas. A diferencia del DNA nuclear, el DNA del cloroplasto puede ser transcrito por la enzima RNA polimerasa de E. coli, produciendo molculas de mRNA del cloroplasto, que pueden se traducidas de forma eficiente por un siste ma sintetizador de protenas de E. coli.

2.

3.

Aunque los sistemas genticos mitocondriales son menos similares a los de las bacterias actuales de lo que lo son los sistemas genticos de los cloroplastos, sus ribosomas son tambin sensibles a los antibiticos antibacterianos y la sn tesis proteica en mitocondrias tambin empieza con la AT-formilmetionina.

El genoma del cloroplasto de las plantas superiores contiene aproximadamente 120 genes 47
Los genomas de cloroplastos m ejor estudiados son los de las plantas y de las al gas verdes, molculas de DNA circular muy similares entre s. Se ha determinado la secuencia completa de nucletidos de los cloroplastos del tabaco y de las he pticas. Los resultados indican que estas dos plantas superiores lejanam ente emparentadas contienen en sus cloroplastos genes casi idnticos. Adems de cuatro RNA ribosmicos, estos genomas codifican aproximadamente 20 prote nas ribosomales del cloroplasto, determinadas subunidades de la RNA polime rasa del cloroplasto, varias protenas que forman parte de los fotosistemas I y II, subunidades de la ATP sintasa, porciones de complejos enzimticos de la cade na de transporte de electrones, una de las dos subunidades de la ribulosa bisfosfato carboxilasa y 30 molculas de tRNA (Figura 14-66). Adems, parece que las secuencias de DNA presentes codifican al menos 40 protenas cuyas funciones son desconocidas. Paradjicamente, todas las protenas conocidas codificadas en el cloroplasto forman parte de grandes complejos proteicos que tambin contienen una o ms subunidades codificadas en el ncleo. Las posibles razones de este hecho se discutirn ms adelante. Las similitudes entre los genomas de los cloroplastos y de las bacterias son notables. Las secuencias reguladoras bsicas, como los promotores de la trans cripcin y los terminadores, son prcticamente idnticas en los dos casos. Las secuencias proteicas codificadas en cloroplastos son claramente reconocibles como bacterianas, y varias agrupaciones de genes con funciones relacionadas (por ejemplo, los que codifican para protenas ribosomales) estn organizados de la misma manera en los genomas de los cloroplastos, de E. coli y de las cianobacterias. Son necesarios detallados estudios comparativos de un gran nmero de se cuencias nucleotdicas homologas para trazar la va evolutiva desde las bacterias hasta los cloroplastos, pero ya pueden esbozarse varias conclusiones. (1) Los clo roplastos de las plantas superiores evolucionaron a partir de bacterias fotosintticas. (2) El genoma del cloroplasto se ha mantenido estable al menos durante va-

Los genomas de las mitocondrias y de los cloroplastos

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CLAVE: 23S 16S ....... o genes tRNA genes de protenas ribosm icas genes del fotosistem a I genes del fotosistem a II genes de la ATP sintasa genes del com plejo b6-f genes de la RNA polimerasa genes que codifican el com plejo de la NADH deshidrogenasa

longitud total del genom a = 121 024 pares de nucletidos

Figura 14-66 Organizacin del genoma de los cloroplastos de hepticas. Se ha determinado la

secuencia completa de nucletidos. La organizacin del genoma del cloroplasto es muy similar en todas las plantas superiores, pero el tamao vara entre especies, dependiendo de la cantidad que haya presente en las dos copias de DNA que flanquea los genes que codifican los RNA ribosmicos 16S y 23S de los cloroplastos.

//

ribulosa bisfosfato carboxilasa (subunidad grande) o

irm\
rios miles de millones de aos, el momento estimado en el que se produjo la di vergencia entre las hepticas y el tabaco. (3) Muchos de los genes de la bacteria original pueden ser identificados en el genoma nuclear, donde fueron transferi dos y mantenidos de forma estable. En plantas superiores, por ejemplo, dos ter cios de las casi 60 protenas ribosomales del cloroplasto estn codificadas en el ncleo celular, aunque los genes tienen un claro ancestro bacteriano, y los ribosomas del cloroplasto retienen todava sus propiedades bacterianas originales.

Los genomas mitocondriales presentan varias caractersticas sorprendentes 4 8

El genoma del cloroplasto no fue el primer genoma de un orgnulo que fue com pletamente secuenciado. El tamao relativamente pequeo del genoma mitocondrial humano lo convirti en un material atractivo para los genetistas mole culares equipados con las tcnicas recin desarrolladas de secuenciacin de DNA, y en 1981 se public la secuencia completa de sus 16 569 nucletidos. Comparando esta secuencia con las de tRNA mitocondriales conocidas y con las secuencias parciales de aminocidos disponibles de las protenas codificadas por el DNA mitocondrial, fue posible localizar todos los genes mitocondriales humanos en la molcula circular de DNA (Figura 14-67). Figura 14-67 Organizacin del genoma mitocondrial humano. El
genoma contiene 2 genes rRNA, 22 genes tRNA y 13 secuencias que codifican protenas. Tambin se han secuenciado com pletamente los DNA de otros genomas mitocondriales de algunos animales, y tienen los mismos genes y la misma organizacin de genes.

subunidades de la ATP sintasa subunidades de la citocrom o oxidasa subunidades de la NADH ~7 deshidrogenasa regin que codifica protena (13 en total) gen tRNA (22 en total) subunidades de la NADH deshidrogenasa

longitud total del genom a = 16 569 pares de bases

rRNA 16S

rRNA 12S

origen y replicacin

citocrom o b

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Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

Tabla 14-4 Algunas diferencias entre el cdigo gentico universal y algunos cdigos genticos mitocondriales* Cdigos mitocondriales Codn UGA AUA CUA AGA 1 AGG J Cdigo universal STOP lie Leu Arg Mamferos

{jrosophila
Trp 'Met
Leu

Levaduras

Plantas STOP lie Leu Arg

Trp Met
Leu

Trp Met Thr

Arg

STOP

: Ser j

* En cursiva y en color se sealan los cdigos que difieren del cdigo universal.

Comparando los genomas del ncleo, de los cloroplastos y de las bacterias con el genoma m itocondrial humano se pueden observar varios rasgos sorpren dentes. (1) A diferencia de otros genomas, casi todos los nucletidos parecen formar parte de secuencias que codifican, ya sea para protenas o para m olcu las de rRNA o de tRNA. Dado que estas secuencias codificantes estn prctica mente una a continuacin de otra, queda muy poco espacio para las secuencias de DNA reguladoras. (2) Aunque en el citosol y en los cloroplastos existen al menos 30 o ms molculas de tRNA diferentes que especifican aminocidos, slo se requieren 22 molculas de tRNA para la sntesis proteica mitocondrial. Las reglas normales de apareamiento codn-anticodn estn relajadas en las mitocondrias, de modo que muchas molculas de tRNA reconocen cualquiera de los cuatro nucletidos de la tercera posicin (fluctuante o de balanceo). Esta lectura de 2 de cada 3 permite que un tRNA se aparee con uno cualquiera de los cuatro codones y permita la sntesis proteica con menos molculas de tRNA. (3) Quizs lo ms sorprendente aparezca al comparar las secuencias gnicas m i tocondriales y las secuencias de aminocidos de las protenas correspondientes, ya que se concluye que en las mitocondrias el cdigo gentico est alterado, de modo que 4 de los 64 codones tienen significados diferentes de los que tienen en otros genomas (Tabla 14-4). La observacin de que el cdigo gentico es casi el mismo en todos los orga nismos proporciona fuertes evidencias de que todas la clulas evolucionaron a partir de un antepasado comn. Entonces, cmo pueden explicarse las diferen cias en el cdigo gentico de las mitocondrias? Una indicacin procede del re ciente descubrimiento de que el cdigo gentico mitocondrial es diferente en diferentes organismos. As UGA, que en todos las clulas es un codn de term i nacin, se lee como triptfano en las mitocondrias de mamferos, de hongos y de protozoos, pero es una seal de stop en las mitocondrias de las plantas. De m a nera similar, el codn AGG que normalmente codifica arginina, codifica parada en las mitocondrias de los mamferos y codifica serina en Drosophila (vase Ta bla 14-4). Esta variacin sugiere que en el cdigo gentico de las mitocondrias aparece una variacin al azar. Seguramente, el extraordinariamente pequeo nmero de protenas codificadas por el genoma mitocondrial hace que un cam bio ocasional en el significado de un codn raro sea tolerable, mientras que un cambio de este tipo en un gran genoma podra alterar la funcin de muchas pro tenas y por lo tanto destruir la clula.

Las mitocondrias de animales contienen el sistema gentico ms simple de los conocidos 4 9

Estudios comparativos entre las secuencias de DNA de diferentes organismos revelan que la velocidad de substitucin de nucletidos durante la evolucin ha

Los genomas de las mitocondrias y de los cloroplastos

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sido 10 veces mayor en los genomas mitocondriales que en los nucleares, lo cual posiblemente se deba a la reducida fidelidad de los sistema de replicacin y/o reparacin en el DNA mitocondrial. Dado que en las mitocondrias de las clulas animales slo se han de replicar y expresar en forma de RNA y de protena unos 16 500 nucletidos de DNA aproximadamente, la tasa de errores por nucletido copiado por la replicacin de DNA, mantenido por la reparacin de DNA, trans crito por la RNA polimerasa, o traducido a protena por los ribosomas m itocon driales, puede ser relativamente alta sin que se altere ninguno de los relativa mente pocos productos gnicos. Esto puede explicar por qu los mecanismos que realizan estos procesos son relativamente simples comparados con los utili zados con el mismo propsito en otras partes de la clula. Por ejemplo, aunque no se ha probado adecuadamente, se puede esperar que la presencia de tan slo 22 tipos de tRNA y el extraordinariamente pequeo tamao de los rRNA (inferior a dos tercios del tamao de los rRNA de E. coli) pueden reducir la fidelidad de la sntesis proteica en la mitocondria. La relativamente elevada velocidad de la evolucin de los genes m itocon driales hace que las comparaciones entre las secuencias de DNA mitocondriales sean especialmente tiles para estimar -as fechas de sucesos evolutivos relativa mente recientes, tales como las fases del desarrollo de los primates.

Por qu los genomas m itocondriales en las plantas son tan grandes ? 50

Los genomas mitocondriales de las plantas son mucho ms grandes que los de las clulas animales, y su contenido en DNA vara de forma importante, oscilan do desde aproximadamente 150 000 hasta aproximadamente 2,5 x 106 pares de nucletidos. Sin embargo, al parecer estos genomas mitocondriales de las plan tas codifican muy pocas protenas ms que los genomas mitocondriales de ani males. La paradoja se complica con la observacin de que en una familia de plantas, las cucurbitceas, el tamao de los genomas mitocondriales vara tanto como siete veces. Adems, el alga verde Chlamydomonas tiene un genoma m ito condrial lineal de tan slo 16 000 pares de nucletidos, el mismo tamao que el presente en animales. Aunque todava se dispone de poca informacin sobre las secuencias de las molculas de DNA mitocondriales de las plantas superiores, se han secuenciado casi todos los 70 000 pares de nucletidos del gran genoma mitocondrial de la le vadura Saccharomyces cerevisiae, del que slo una tercera parte aproximada mente codifica protena. Estos hallazgos suscitan la posibilidad de que gran par te del DNA extra de las mitocondrias de levadura, y posiblemente tambin de las mitocondrias vegetales en general, sea un DNA de desecho de poca importan cia para el organismo.

Algunos genes de orgnulos contienen intrones 51

El procesamiento de los RNA precursores desempea un papel importante en los dos sistemas mitocondriales estudiados con ms detalle -e l humano y el de levadura. En clulas humanas, las dos hebras del DNA mitocondrial son trans critas a la misma velocidad a partir de una sola regin promotora en cada hebra, produciendo dos molculas diferentes de RNA gigantes, cada una de las cuales contiene una copia completa de cada hebra del DNA. Por lo tanto, la transcrip cin es com pletamente simtrica. Los transcritos hechos sobre una hebra -lla mada la hebra pesada (hebra H, de heavy) debido a su densidad en CsCl- son procesados com pletamente mediante la accin de nucleasas que los fragmen tan, produciendo las dos molculas de rRNA, la mayora de las molculas de tRNA y unas 10 molculas de RNA que presentan poli-A. Por el contrario, el pro cesam iento del transcrito de la hebra ligera (hebra L, de lightJ produce slo ocho molculas de tRNA y un pequeo RNA que contiene poli-A; aparentemen te, el 90 % restante de este transcrito (que es complementario de las secuencias

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Captulo 14: Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

codificantes sintetizadas en la otra hebra) contiene informacin no til, y es de gradado. Los RNA que presentan poli-A son los mRNA mitocondriales: aunque les falta la estructura de capucha (cap) en su extremo 5, tienen una cola de poli-A en su extremo 3 que se aade despus de la transcripcin mediante una polimerasa de poli-A mitocondrial. A diferencia de los genes humanos mitocondriales, algunos genes m itocon driales de plantas y de hongos (incluyendo las levaduras) presentan intrones, que deben ser eliminados por maduracin por corte y empalme (splicing) del RNA. Tambin se presentan intrones en unos 20 genes de cloroplastos vegetales. Muchos de los intrones de genes de orgnulos consisten en secuencias de nucletidos emparentadas que son capaces de madurar por s solos fuera de los transcritos de RNA, mediante catlisis mediada por RNA (vase pg. 113), aun que generalmente estas reacciones de automaduracin (self-splicing) estn faci litadas por protenas. La presencia de intrones en los genes de orgnulos es sor prendente, ya que en los genes de las bacterias, cuyos antepasados se cree que dieron lugar a las mitocondrias y a los cloroplastos de las plantas, no se hallan intrones similares a stos. En las levaduras es posible que un mismo gen mitocondrial tenga un intrn en una cadena pero no en la otra. Al parecer, estos intrones opcionales son ca paces de desplazarse, entrando o saliendo de los genomas, igual que los elem en tos transponibles. Por otro lado, en otros genes mitocondriales de levadura se han hallado intrones en una posicin correspondiente del genoma de las m ito condrias de Aspergillus y de Neurospora, lo que implica que estos intrones fue ron heredados a partir de un antepasado comn de estos tres hongos. Parece probable que las secuencias de los intrones tengan un origen muy antiguo y que se hayan perdido en muchas bacterias pero que se hayan conservado preferencialmente en aquellos genomas de orgnulos en los que la maduracin del RNA est regulada, colaborando en el control de la expresin gnica.

Los genes mitocondriales se pueden distinguir de los genes nucleares gracias a su herencia no mendeliana (citoplasm tica )52
La mayora de experimentos realizados sobre los m ecanismos de la biognesis mitocondrial han sido realizados en Saccharomyces cerevisiae (levadura del pan). Existen diversas razones para ello. En primer lugar, estas levaduras tienen la capacidad de sobrevivir exclusivamente de la glucolisis si se cultivan en pre sencia de glucosa y, por lo tanto, sin utilizar las mitocondrias, las cuales son necesarias para la fosforilacin oxidativa. Este hecho permite a estas clulas so brevivir con mutaciones de su DNA mitocondrial o nuclear que afectan drsti cam ente la biognesis mitocondrial; este tipo de mutaciones resulta letal en casi todos los eucariotas. En segundo lugar, las levaduras son eucariotas unice lulares simples, fciles de cultivar y de caracterizar bioqumicamente. Por lti mo, norm alm ente estas clulas de la levadura se reproducen asexualmente m e diante gemacin (mitosis asimtrica), pero tam bin se pueden reproducir sexualmente. Durante su reproduccin sexual, dos clulas haploides se fusio nan formando un zigoto diploide que puede crecer m itticam ente o bien divi dirse por meiosis produciendo de nuevo clulas haploides. La capacidad de controlar en el laboratorio la alternancia entre reproduccin sexual y asexual fa cilita enorm em ente su anlisis gentico. Dado que las mutaciones en los genes mitocondriales no se heredan de acuerdo a las leyes mendelianas que gobier nan la herencia de los genes nucleares, los estudios genticos revelan cules de los genes implicados en la funcin mitocondrial se localizan en el ncleo y cu les en la mitocondria. En la Figura 14-68 se ilustra un ejemplo de herencia no mendeliana (cito plasmtica) de los genes mitocondriales en una clula haploide de levadura. En este ejemplo, el gen mutante hace que la sntesis de protena sea resistente al cloranfenicol. Cuando una clula haploide resistente al cloranfenicol se aparea con con una clula de fenotipo salvaje sensible al cloranfenicol, el zigoto diploi-

Los genomas de las mitocondrias y de los cloroplastos

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m utante de levadura haploide resistente a cloranfenicol

levadura haploide salvaje

Figura 14-68 Diferencias entre los patrones de herencia de los genes mitocondriales y nucleares en la levadura. Para cada gen nuclear, dos
de las cuatro clulas que resultan de la meiosis heredan el gen procedente de una de las clulas haploides parenterales originales, y las otras dos clulas heredan el gen procedente de la otra clula (h eren cia m en d elian a). En cambio, y debido a la segregacin mittica de las mitocondrias durante el crecim iento vegetativo (vase texto), es posible que las cuatro clulas que resultan de la meiosis hereden los genes mitocondriales de una de las dos clulas haploides originales (h eren cia cito p la sm tica o n o m en d elian a). En este ejemplo, el gen mitocondrial puede mutar haciendo que la sntesis de protenas en la mitocondria sea resistente al cloranfenicol, un inhibidor de la sntesis de protenas que acta especficamente sobre los orgnulos transformadores de energa y sobre las bacterias. Las clulas de levadura que contienen el gen mutado pueden ser detectadas por su capacidad de crecim iento en presencia de cloranfenicol sobre un substrato, como por ejemplo el glicerol, que no se utiliza en la glucolisis. Con la glucolisis bloqueada, la mitocondria funcional ha de proporcionar ATP y, por tanto, slo crecern las clulas que contengan mitocondrias resistentes al cloranfenicol.

CONJUGACION levadura diploide SEGREGACION MITOTICA GRADUAL DE LAS MITOCONDRIAS DURANTE MUCHOS CICLOS DEL CRECIMIENTO VEGETATIVO

MEIOSIS DURANTE LA ESPORULACIN DE LAS CLULAS DIPLOIDES

toda la progenie es resistente al cloranfenicol

toda la progenie es sensible al cloranfenicol

de resultante contendr una mezcla de mitocondrias mutantes y salvajes. Pero cuando sufra la mitosis para producir una clula hija diploide, las mitocondrias mutantes y salvajes sern distribuidas al azar entre la clula madre y la hija, por lo que cada clula hija es probable que herede ms mitocondrias mutantes o ms salvajes. En sucesivas divisiones mitticas, tanto las mitocondrias mutantes como las salvajes sern gradualmente eliminadas de algunas clulas hijas m e diante el mismo proceso aleatorio, dejando mitocondrias de un solo tipo. A par tir de entonces, toda la progenie de esta clula hija tendr mitocondrias genti cam ente idnticas. Con el tiempo, este proceso aleatorio, llamado segregacin mittica, produce una progenie diploide de clulas de levadura con un slo tipo de DNA mitocondrial. Cuando estas clulas diploides sufren meiosis y forman cuatro clulas haploides hijas, cada una de estas clulas hijas recibir los mis mos genes mitocondriales. Este tipo de herencia se denomina no mendeliana o citoplasmtica, en contraposicin con la herencia mendeliana de los genes nu cleares (vase Figura 14-68). Cuando esto ocurre, se demuestra que el gen en cuestin se localiza fuera de los cromosomas nucleares y por lo tanto, est situa do probablem ente en las mitocondrias.

En muchos organismos, los genes de los orgnulos se heredan de la madre 53

Las consecuencias de la herencia citoplasmtica son ms profundas para algu nos organismos, incluido el hombre, que para las levaduras. En las levaduras,

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Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

cuando dos clulas haploides se aparean, ambas son de igual tamao y por lo tanto contribuyen por igual a la dotacin del DNA mitocondrial del zigoto (va se Figura 14-68). Por consiguiente, en la levadura la herencia mitocondrial es biparental : ambos progenitores contribuyen por igual al acervo de genes mitocondriales de la progenie (aunque, como hemos visto, tras varias generaciones de crecim iento vegetativo, a menudo la progenie individual contiene mitocondrias procedentes de uno solo de los progenitores). En los animales superiores, en cambio, el vulo aporta siempre al zigoto mucho ms citoplasma que el esper matozoide -e n algunos animales, el espermatozoide no aporta nada de citoplas ma al zigoto. Por consiguiente, cabe esperar que en los animales superiores, la herencia mitocondrial sea uniparental (ms exactamente, materna). En algunos animales de laboratorio se ha podido demostrar esta herencia materna, utilizan do dos cepas que se diferencian en su DNA mitocondrial. Cuando los animales que presentan DNA mitocondrial del tipo A se cruzan con animales del tipo B, la progenie presenta slo DNA mitocondrial del tipo materno. De forma similar, siguiendo en grandes familias la distribucin de secuencias variantes de DNA mitocondrial, se ha demostrado que el DNA mitocondrial humano se hereda por va materna. En aproximadamente dos terceras partes de las plantas superiores, los cloroplastos paternos masculinos (contenidos en los granos de polen) no entran en el zigoto, de tal manera que tanto el DNA de los cloroplastos como el de las mi tocondrias se heredan por va materna. En otras plantas, los cloroplastos del po len entran en el zigoto, haciendo que la herencia de los cloroplastos sea biparental. En estas plantas, la presencia de cloroplastos defectivos son la causa de la variegacin: mediante la segregacin mittica se puede producir una mezcla de cloroplastos normales y defectuosos en un zigoto durante el crecimiento y desa rrollo de la planta, produciendo por lo tanto porciones alternantes verdes y blancas en las hojas. Las porciones verdes contienen los cloroplastos normales, mientras que las blancas contienen los cloroplastos defectuosos.

Los mutantes diminutos en levadura demuestran la extraordinaria importancia del ncleo celular en la biognesis mitocondrial54
Diversos estudios genticos en levadura han resultado de una gran importancia para el anlisis de la biognesis mitocondrial. Un ejemplo notable de esto lo constituyen los estudios de mutantes de levadura que contienen grandes deleciones en su DNA mitocondrial, de manera que toda la sntesis proteica m ito condrial se halla anulada. Como era de esperar, estos mutantes no pueden pro ducir mitocondrias funcionales en la respiracin. A algunos de estos mutantes les falta todo el DNA mitocondrial. Dado que estos mutantes forman colonias extraordinariamente pequeas cuando crecen en un medio con baja cantidad de glucosa, todos los mutantes con estas mitocondrias defectuosas se denomi nan mutantes diminutos citoplasmticos. Los mutantes diminutos no pueden sintetizar protenas en sus mitocondrias y, por lo tanto, no pueden tener mitocondrias que produzcan ATP, pero a pesar de todo tienen mitocondrias. Estas mitocondrias tienen una membrana externa normal y una membrana interna que presenta crestas pobremente desarrolladas (Figura 14-69) y contienen prcticamente todas las protenas mitocondriales que estn codificadas por los genes nucleares importados desde el citosol - in cluyendo las DNA y RNA polimerasas, todas las enzimas del ciclo del cido ctri co y muchas protenas de la membrana interna- demostrando claramente la ex traordinaria importancia del ncleo en la biognesis mitocondrial. Los mutantes diminutos tam bin demuestran que un orgnulo que se divide por fisin puede replicarse indefinidamente en el citoplasma de clulas eucariotas proliferantes, incluso en ausencia completa de su propio genoma. Muchos bilogos creen que normalmente los peroxisomas se replican de esta manera (vase Figura 12-29). Para el caso de los cloroplastos, los equivalentes ms cercanos a los mutan tes diminutos mitocondriales de las levaduras son los mutantes de algas unice

1 (jm
Figura 14-69 Electronmicrografas de secciones ultrafinas de clulas de levadura, mostrando la estructura de mitocondrias normales (A) y de mitocondrias de un muante diminuto que carece de todos los productos gnicos codificados por las mitocondrias (B). En los mutantes diminutos todos los productos gnicos codificados en la mitocondria se pierden, y por ello, el orgnulo est formado exclusivamente a partir de protenas codificadas en el ncleo de la clula. (Por cortesa de Barbara Stevens.)

Los genomas de las mitocondrias y de los cloroplastos

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lulares como la Euglena. Clulas de este tipo, en las que no tiene lugar la sntesis proteica en los cloroplastos, presentan cloroplastos y son perfectamente viables si se les proporcionan substratos oxidables. No obstante, si en las plantas se blo quea el desarrollo de los cloroplastos maduros, ya sea situando las plantas en la oscuridad o bien debido a que el DNA del cloroplasto es defectuoso o est ausen te, las plantas mueren en cuanto se agotan sus reservas de alimento.

Las m itocondrias y los cloroplastos contienen protenas especficas de tejido 55

En determinados tipos celulares las mitocondrias pueden tener funciones espe cializadas. El ciclo de la urea, por ejemplo, es la va metablica central de que disponen los mamferos para la degradacin de los compuestos que contienen nitrgeno. Estos productos son secretados por la orina en forma de urea. Varios pasos de este ciclo estn catalizados, en la matriz mitocondrial, por enzimas co dificadas en el ncleo. La sntesis de urea slo se realiza en algunos tejidos, como el hgado, y slo en estos tejidos se produce la sntesis y el transporte hasta la mitocondria de estas enzimas. Adems, los complejos enzimticos respirato rios de la membrana mitocondrial interna de los mamferos contienen varias subunidades codificadas por el ncleo que son especficas de tejido y que al parecer actan como reguladoras del transporte electrnico. As, algunos humanos que padecen una determinada enfermedad muscular gentica tienen una subunidad defectuosa de la citocromo oxidasa; dado que esta subunidad es especfica de la clulas del msculo esqueltico, las clulas musculares de corazn funcionan normalmente, permitiendo que los individuos sobrevivan. Tal como cabra es perar, tam bin se encuentran diferencias especficas de tejido en protenas de cloroplastos codificadas por el ncleo celular.

Las m itocondrias im portan la mayor parte de sus lpidos m ientras que los cloroplastos producen la mayor parte de ellos 56
La biosntesis de nuevos cloroplastos y de mitocondrias requiere lpidos, cidos nucleicos y protenas. Los cloroplastos tienden a producir los lpidos que necesi tan. En las hojas de la espinaca, por ejemplo, toda la sntesis celular de cidos grasos tiene lugar en los cloroplastos, mientras que su desaturacin tiene lugar en otro lugar de la clula. Los grandes glucolpidos del cloroplasto tambin se producen localmente. Las mitocondrias, por el contrario, importan la mayor parte de sus lpidos. En las clulas animales, los fosfolpidos fosfatidilcolina y fosfatidilserina, se sin tetizan en el retculo endoplasmtico y luego se transfieren a la membrana ex terna de la mitocondria. Adems de descarboxilar la fosfatidilserina importada transformndola en fosfatidiletanolamina, la principal reaccin de la biosntesis de lpidos catalizada por la mitocondria es la transformacin de los lpidos im portados hasta cardiolipina (bisfosfatidilglicerol). La cardiolipina es un fosfolpido doble que contiene cuatro colas de cidos grasos; se halla principalmente en la m em brana mitocondrial interna y constituye aproximadamente un 20% de su contenido lipidico total. En el Captulo 12 ya se estudi en detalle la importante cuestin de cmo protenas citoslicas especficas son importadas a las mitocondrias y a los clo roplastos.

Probablem ente, tanto las mitocondrias como los cloroplastos han evolucionado a partir de bacterias endosimbiticas 57
Como vimos en el Captulo 1, el carcter procariota de los sistemas genticos de los orgnulos celulares, especialmente notable en el caso de los cloroplastos, su giere que las mitocondrias y los cloroplastos evolucionaron a partir de bacterias que fueron endocitadas hace ms de mil millones de aos. De acuerdo con la hi-

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Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

clula procariota anaerbica prim itiva

Figura 14-70 Ruta evolutiva sugerida sobre origen de la mitocondria.

Microsporidia y Giardia son dos

J
procariota aerbico UNA CLULA EUCARIOTA INCORPOR UNA CLULA PROCARIOTA AERBICA MEDIANTE ENDOCITOSIS

eucariotas unicelulares anaerbicos actuales (protozoos) que carecen de mitocondrias. Su secuencia de rRNA sugiere que existe una gran distancia evolutiva entre ellos y resto de los eucariotas, por lo que se ha postulado que sus parientes ancestrales tambin Fueron anaerbicos y parecidos a los primeros eucariotas que incorporaron los precursores de las mitocondrias.

clula eucariota con un procariota endosim bionte aerbico TRANSFERENCIA DE GENES DEL PROCARIOTA AL NCLEO DEL EUCARIOTA clula eucariota actual clula eucariota anaerbica actual

m itocondria

ncleo

ptesis endosimbidtica, las clulas eucariotas aparecieron en forma de organis mos anaerbicos sin mitocondrias ni cloroplastos, y luego establecieron una rela cin endosimbitica estable con un tipo de bacterias, utilizando su sistema de fosforilacin oxidativa (Figura 14-70). El proceso de endocitosis que condujo al desarrollo de las mitocondrias se produjo cuando el oxgeno apareci en la at msfera en cantidades substanciales, hace aproximadamente 1,5 x 109 aos, an tes de que los animales y las plantas se separaran (vase Figura 14-59). Al parecer, los cloroplastos de las plantas y de las algas han derivado posteriormente a partir de un suceso endoctico que implic a una bacteria fotosinttica productora de oxgeno. Para explicar los diferentes pigmentos y propiedades de los cloroplastos que se encuentran en las actuales plantas superiores y en las algas verdes, se asu me que por los menos tuvieron lugar tres sucesos separados de este tipo. Dado que la mayora de los genes que codifican las protenas actuales se h a llan en el ncleo celular, parece probable que durante la evolucin eucariota se produjera una extensa transferencia de genes desde el orgnulo al DNA del n cleo. Esto explicara por qu algunos de los genes del ncleo que codifican pro tenas mitocondriales se parecen a los genes bacterianos: por ejemplo, la secuen cia de aminocidos del extremo amino terminal de la enzima mitocondrial superxido dismutasa de gallina se parece mucho ms al segmento correspon diente de la misma enzima de una bacteria que a la superxido dismutasa del citosol de las mismas clulas eucariotas. Ms evidencias de que este tipo de trans ferencias de DNA sucedieron durante la evolucin surge del descubrimiento de algunas secuencias de DNA no codificantes del DNA nuclear que parecen ser de origen mitocondrial reciente; aparentemente se han integrado dentro del genoma nuclear como DNA de desecho. Qu tipo de bacteria dio lugar a las mitocondrias? Anlisis ms recientes de secuencias de protenas y nucletidos proporcionan la principal evidencia para

Los genomas de las mitocondrias y de los cloroplastos

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DNA m itocondrial transcritos de RNA m em brana m itocondrial mem brana m itocondrial interna externa

transcripcin
tRNAs

R NA p o lim e ra s a m ito c o n d ria l

rRNA pequeo rRNA grande subunidad subunidad ribosmica ribosomica grande pequea mRNA

am inoacil tRNA

Figura 14-71 Orgenes de las protenas y RNA mitocondriales. Las protenas importadas del citosol desempean una importante funcin en el sistema gentico de la mitocondria y constituyen la mayor parte de las protenas del orgnulo. La mitocondria slo contribuye a su sistema gentico con los mRNA, los rRNA y los tRNA. En este diagrama no se indican las protenas adicionales codificades por el ncleo que regulan la expresin de los genes mitocondriales individuales a niveles post-transcripcionales.

IIS I

protenas sintetizadas DNA m itocondrial replicando

en/im as solubles riel ciclo de cido

ctrico, le.

unidos a la membrana/

a m in o a c l-tR N A sin ta sa s m ito c o n d ria ie s

e n zim a s m ito c o n d ria le s de ia re p lic a c i n dei D N A

protenas sintetizadas en el citosol

p ro te n a s m ito c o n d ria le s rib o s m ic a s

configurar el rbol evolutivo presentado previamente en la Figura 14-60. Parece que las mitocondrias descienden de un tipo particular de bacteria prpura fotosinttica que previamente perdi la capacidad de realizar fotosntesis y que que d nicam ente con una cadena respiratoria. Sin embargo, igual que para los cloroplastos, no est claro si todas las mitocondrias se originaron a partir de un slo suceso endosimbitico o no. Por ejemplo, las mitocondrias de los proto zoos tienen rasgos procariotas distintivos, pero algunas de ellas son suficiente mente diferentes de las mitocondrias de las plantas y de los animales como para sugerir un origen diferente.

Por qu los cloroplastos y las m itocondrias tienen sus propios sistemas genticos ?58
Por qu las mitocondrias y los cloroplastos necesitan sus propios sistemas ge nticos, si otros orgnulos, como los peroxisomas y los lisosomas, no los tienen? La pregunta no es trivial, ya que m antener un sistema gentico diferente resulta costoso: ms de 90 protenas -incluyendo las protenas ribosmicas, las aminoacil-tRNA sintasas, las DNA y RNA polimerasas, y las enzimas de procesamiento y de m odificacin del RNA- se han de codificar por genes nucleares, especial mente para este fin (Figura 14-71). Las secuencias de aminocidos de la mayora de las protenas de mitocondrias y cloroplastos difieren de las secuencias de las protenas correspondientes del ncleo y del citosol y no existe ninguna razn

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Captulo 14 : Conversin energtica: mitocondrias y cloroplastos

para pensar que estos orgnulos tengan relativamente pocas protenas en co mn con el resto de la clula. Esto significa que el ncleo debe suministrar como mnimo 90 genes para mantener el sistema gentico de cada orgnulo. La razn de este arreglo tan costoso no est clara, y la esperanza de que el conocim iento de la secuencia de nucletidos del genoma de las mitocondrias y de los cloroplastos proporcione la respuesta definitiva, ha resultado fallida. No se nos ocu rren razones imperiosas por las que las protenas de las mitocondrias tengan que estar producidas en las propias mitocondrias y no puedan estar sintetizadas en el citosol. En cierto momento se sugiri que algunas protenas tienen que estar sinteti zadas en el interior del orgnulo, ya que son demasiado hidrofbicas para poder llegar desde el citosol hasta su lugar en la membrana mitocondrial. No obstante, estudios ms recientes hacen que esta explicacin sea inverosmil. En muchos casos, subunidades incluso altamente hidrofbicas estn sintetizadas en el citosol. Adems, aunque las distintas subunidades proteicas de los diferentes com plejos enzimticos mitocondriales estn altamente conservadas a lo largo de la evolucin, no est conservado su lugar de sntesis. La diversidad en la localiza cin de los genes que codifican subunidades de protenas funcionalmente equi valentes en diferentes organismos es difcil de explicar por cualquier hiptesis que postule una ventaja evolutiva especfica de los sistemas genticos de las mi tocondrias o de los cloroplastos actuales. Quizs el sistema gentico de los orgnulos sea un callejn evolutivo sin sa lida. En trminos de la hiptesis endosimbitica, esto podra significar que los procesos por los que los endosimbiontes transfirieron la mayora de sus genes al ncleo se pararon antes de completarse. Posteriores transformaciones se han podido descartar, en el caso de las mitocondrias, por recientes alteraciones en el cdigo gentico mitocondrial que convirtieron los genes mitocondriales rem a nentes en no funcionales si eran transferidos al ncleo.

Resumen
Las mitocondrias y los cloroplastos crecen y se dividen mediante procesos coordina dos que requieren la contribucin de dos sistemas genticos diferentes -el del org nulo y el del ncleo celular. La mayora de las protenas de estos orgnulos estn codificadas por el DNA nuclear, estn sintetizadas en el citosol y luego son trans portadas individualmente al orgnulo. Sin embargo, algunas protenas del org nulo y algunos RNA estn codificados por el DNA del orgnulo y son sintetizados en el propio orgnulo. El genoma mitocondrial humano contiene aproximadamente 16 500 nucletidos y codifica 2 molculas de RNA ribosmico, 22 molculas de RNA de transferencia y 13 cadenas polipeptdicas diferentes. El genoma de los cloroplas tos es aproximadamente 10 veces mayor que el de las mitocondrias y contiene unos 120 genes. Sin embargo, en mutantes en los que el genoma del orgnulo no es fu n cional, se pueden form ar orgnulos parcialmente funcionales y en cantidades nor males, lo cual demuestra la extraordinaria importancia que tiene el ncleo en la biognesis de ambos orgnulos. Los ribosomas de los cloroplastos se parecen enormemente a los ribosomas bacterianos, mientras que los ribosomas mitocondriales muestran similitudes y di ferencias que dificultan mucho ms el estudio de su origen. Algunas similitudes proteicas sugieren que las mitocondrias y los cloroplastos se originaron cuando una clula eucariota primitiva estableci una relacin endosimbitica estable con una bacteria: se cree que una bacteria prpura dio lugar a las mitocondrias y que, ms tarde, un pariente de una cianobacteria dio lugar a los cloroplastos de las plantas. Aunque muchos de los genes de estas antiguas bacterias todava son fu n cionales para producir protenas del orgnulo, muchos de ellos han quedado inte grados en el genoma nuclear, donde codifican enzimas semejantes a las de las bac terias, que son sintetizadas en los ribosomas del citosol y luego transportadas al orgnulo.
Los genomas de las mitocondrias y de los cloroplastos

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Bibliografa

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Transmisin de seales entre clulas

-------------- L, -

i! ' 5

I I ,

Principios generales de la sealizacin celular Sealizacin va receptores de superficie celular asociados a protenas G Sealizacin va receptores de superficie celular asociados a enzimas Adaptacin de las clulas diana La lgica de la sealizacin intracelular: lecciones de redes neuronales basadas en los -y ordenadores El registro fsil sugiere que hace 3,5 mil millones de aos ya existan sofisticados or ganismos unicelulares parecidos a las bacterias actuales, pero que al parecer fueron necesarios otros 2,5 mil millones de aos para que apareciera el primer organismo pluricelular (vase Figura 1-17). Por qu la pluricelularidad tard tanto en evolu cionar? Aunque no podemos conocer la respuesta parece que esta cuestin est re lacionada con la necesidad de los organismos pluricelulares de elaborar seales que permitieran a sus clulas comunicarse entre s, de forma que pudieran coordi nar su comportamiento en beneficio del organismo como un todo. Las seales in tercelulares, interpretadas por complejas maquinarias de la clula que responde a ellas, permite a cada clula determinar su posicin y su papel especializado en el cuerpo y, por ejemplo, asegurar que cada clula se divida nicamente cuando sus vecinas dicten que ello puede ser posible. La importancia de estos controles socia les sobre la divisin celular se hace aparente cuando el control falla, dando lugar a un cncer, que habitualmente mata el organismo pluricelular. A medida que vamos disponiendo de tcnicas sofisticadas y potentes que nos permiten estudiar las clulas y los mecanismos que utilizan para com uni carse entre s, lentamente vamos comprendiendo los procesos de sealizacin que utilizan los eucariotas superiores. Una clula animal contiene un elaborado sistema de protenas que le permite responder a seales que provienen de otras clulas. El sistema incluye protenas receptoras de la superficie celular, prote nas receptoras intracelulares, protena quinasas, protena fosfatasas, protenas que unen GTP y el enorme nmero de protenas intracelulares con las que interactan estas protenas de seal. En este captulo discutimos en primer lugar los principios generales de la sealizacin intercelular. En las dos secciones siguien tes consideramos las dos principales familias de protenas receptoras de la super ficie celular, y cmo generan seales intracelulares. A continuacin examinamos de qu forma las clulas se adaptan continuamente para responder de forma sen sible a pequeos cambios de concentracin de molculas seal extracelulares. Fi nalmente consideramos una analoga de las redes neuronales, basada en los or denadores, que nos proporciona sugerencias sobre la forma en que trabajan las complejas redes de seales intracelulares.

Principios generales de la sealizacin celular1

Casi con toda seguridad los mecanismos que permiten a una clula influir en el comportamiento de otra clula ya existan en el mundo de los organismos unice-

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SEALIZACION POR MOLECULAS SEGREGADAS

\

CELULA | SEAL I
'

m olcula seal

Figura 15-1 Sealizacin intercelular en animales. Se ilustran dos sistemas a travs de los que las clulas animales se comunican entre s.

receptor

SEALIZACIN POR MOLCULAS UNIDAS A MEMBRANA PLASMTICA

CELULA SEAL m olcula seal receptor

RECEPTORES DE SUPERFICIE CELULAR receptor de la superficie celular \ m em brana plasmtica

lulares mucho antes de que los organismos pluricelulares aparecieran sobre la Tierra. Algunas evidencias de ello provienen de estudios realizados en eucariotas unicelulares actuales, como las levaduras. A pesar de que normalmente estas c lulas llevan una vida independiente, pueden comunicarse entre s, y cada una de ellas puede influir en la proliferacin de otra, en preparacin del acoplamiento sexual. En la levadura de gemacin Saccharomyces cerevisiae, por ejemplo, cuan do un individuo haploide est preparado para el acoplamiento, segrega un pptido denominado factor de acoplamiento que constituye una seal para que las c lulas cuyo tipo de acoplamiento es el contrario dejen de proliferar y se preparen para la conjugacin; la fusin de dos clulas haploides de tipo de acoplamiento contrario produce una clula diploide, la cual entonces puede sufrir una meiosis y esporular, generando clulas haploides con una nueva dotacin de genes. Estudios sobre levaduras mutantes que son incapaces de acoplarse han per mitido identificar muchas protenas que son necesarias para este proceso de se alizacin. Estas protenas forman una red de sealizacin que incluye recepto res de superficie celular, protenas que unen GTP y protena quinasas, cada una de las cuales tiene parientes cercanos entre las protenas que participan en la se alizacin de las clulas animales. Sin embargo, a travs de la duplicacin gnica y de la divergencia, los sistemas de sealizacin de los animales se han vuelto mucho ms elaborados que los de las levaduras.

m olcula seal hidroflica RECEPTORES INTRACELULARES pequea m olcula ^seal hidrofbica proteina ' transportadora/
*

receptor intracelular
Figura 15-2 Las molculas seal extracelulares se unen a receptores de la superficie celular o a receptores intracelulares. La mayora de las molculas seal son hidroflicas, por lo que son incapaces de atravesar directamente la membrana plasmtica; en lugar de ello, se unen a receptores de la superficie de la clula los cuales, a su vez, generan una o varias seales en el interior de la clula diana. Por el contrario, algunas pequeas molculas seal difunden a travs de la membrana plasmtica y se unen a receptores situados en el interior de la clula diana -en el citosol o en el ncleo (como se observa en la figura). Muchas de estas pequeas molculas seal son hidrofbicas y casi insolubles en soluciones acuosas; por ello, son transportadas a travs del torrente sanguneo y de otros fluidos extracelulares, unidas a protenas transportadoras, de las que han de disociarse antes de entrar a la clula diana.

Las molculas seal extracelulares son reconocidas por receptores especficos de la superficie o del interior de las clulas diana 2
Mientras que las clulas de levadura se comunican entre ellas para acoplarse, se cretando diversos tipos de pequeos pptidos, las clulas de los animales superio res se comunican mediante centenares de tipos de molculas seal, incluyendo protenas, pequeos pptidos, aminocidos, nucletidos, esteroides, retinoides, derivados de cidos grasos, e incluso gases disueltos como el xido ntrico y el monxido de carbono. La mayora de estas molculas seal estn secretadas por las clulas seal mediante exocitosis (vase Captulo 13). Otras se liberan por difu sin a travs de la membrana plasmtica y slo influyen en las clulas que estn en contacto con la clula sealizadora (Figura 15-1). Sea cual sea la naturaleza de la molcula seal, la clula diana responde m e diante una protena especfica denominada receptor. Se une especficamente a la molcula seal, y entonces inicia una respuesta en la clula diana. Muchas de las molculas seal extracelulares actan a concentraciones muy bajas (tpica mente <10~8 M), y los receptores que las reconocen usualmente se unen a ellas con una elevada afinidad (constante de afinidad Ka > 108litros/mol; vase Figura 3-9). En la mayora de los casos los receptores son protenas transmembrana de

772

Captulo 15 : Transmisin de seales entre clulas

las superficie de las clulas diana; cuando se unen a una molcula seal extracelular (un ligando) se vuelven activos, de forma que generan una cascada de sea les intracelulares que alteran el comportamiento de la clula. En algunos casos, sin embargo, los receptores estn situados en el interior de la clula diana, y el li gando seal entra a la clula para activarlos: estas molculas seal, por lo tanto, han de ser suficientemente pequeas e hidrofbicas para poder difundir a travs de la m em brana plasmtica (Figura 15-2). En este captulo nos centraremos fundamentalmente en el estudio de la co municacin entre clulas animales mediada por seales qumicas segregadas. Este nfasis refleja el estado actual de conocimientos sobre el tema: las molculas segregadas son mucho ms fciles de estudiar que las molculas unidas a m em brana, por lo que conocemos muchos ms detalles de su actuacin. La sealiza cin dependiente de contacto, va molculas unidas a membrana, es mucho ms difcil de estudiar y por ello mucho peor conocida, pero es de crucial importancia especialmente durante el desarrollo y en la respuesta inmune; como veremos ms adelante, la base molecular de este sistema de comunicacin puede ser simi lar a la de la sealizacin a distancia.

Las molculas secretadas median tres formas de sealizacin: la paracrina, la sinptica y la endocrina 2
Las molculas seal que segrega una clula pueden ser transportadas a largas distancias para que acten sobre clulas diana muy alejadas, o pueden actuar com o mediadores locales afectando nicamente las clulas del ambiente inm e diato de la clula seal. Este ltimo proceso se denomina sealizacin p aracri na (Figura 15-3A). Para que las seales paracrinas solamente afecten a las clu las diana ms cercanas, es necesario que las molculas seal segregadas no puedan difundir mucho; por esta razn habitualmente son captadas rpidamen te por las clulas diana vecinas, destruidas por enzimas extracelulares o inmovi lizadas por la matriz extracelular. Para un organismo pluricelular, grande y complejo, la sealizacin de corto alcance no es suficiente para coordinar el comportamiento de sus clulas. Por ello han evolucionado conjuntos de clulas especializadas en la sealizacin en tre partes del cuerpo muy separadas entre s. Las ms sofisticadas de ellas son las clulas nerviosas, o neuronas, las cuales tpicamente emiten largas prolonga ciones (axones) que entran en contacto con clulas diana alejadas. Cuando es activada por seales del ambiente o de otras clulas nerviosas, la neurona enva impulsos elctricos (potenciales de accin) a lo largo de su axn; cuando uno de estos impulsos llega al terminal nervioso, en el extremo del axn, estimula al ter minal para que segregue una seal qumica denominada neurotransmisor. El terminal nervioso entra en contacto con su clula diana a travs de uniones ce lulares especiales denominadas sinapsis qumicas, las cuales parecen estar dise adas para asegurar que el neurotransmisor sea liberado sobre la membrana postsinptica de la clula diana, rpida y especficamente (Figura 15-3B). Este

Figura 15-3 Tres formas de sealizacin mediadas por molculas segregadas. En las sealizaciones paracrina, sinptica y endocrina se utilizan muchos tipos iguales de molculas seal. Las diferencias cruciales radican en la velocidad y en la selectividad con las que son liberadas las seales a sus clulas diana.

(C) ENDOCRINA clula endocrina

clula diana
Principios generales de la sealizacin celular

773

Figura 15-4 Contraste entre las sealizacin endocrina y la sinptica. Las clulas endocrinas y las clulas nerviosas actan conjuntamente coordinando las diversas actividades de los miles de millones de clulas de un animal superior. Las clulas endocrinas segregan a la circulacin muchos tipos diferentes de hormonas, para sealizar clulas diana especficas. Las clulas diana tienen receptores que se unen especficamente a las hormonas, de forma que tienen que atrapar del lquido extracelular las hormonas adecuadas. En la sealizacin sinptica, por el contrario, la especificidad reside en los contactos entre las prolongaciones nerviosas y las clulas nerviosas determinadas que sealizan: habitualmente slo la clula diana que se halla en contacto sinptico con la clula nerviosa est expuesta al neurotransmisor liberado por el terminal nervioso (a pesar de que algunos neurotransmisores actan de una manera paracrina como mediadores locales que influyen sobre muchas clulas diana en una cierta rea). Mientras que diferentes clulas endocrinas han de utilizar diferentes hormonas para conseguir comunicarse especficamente con sus clulas diana, muchas clulas nerviosas pueden utilizar el mismo neurotransmisor y, a pesar de ello, comunicarse tambin de una forma especfica.

(A) SEALIZACIN ENDOCRINA

varias clulas endocrinas

varias horm onas

proceso de sealizacin sinptica se trata en detalle en el Captulo 11, por lo que no ser considerado aqu. Las otras clulas seal especializadas que controlan el comportamiento del organismo como un todo son las clulas endocrinas. Segregan sus molculas se al, denominadas hormonas, en el torrente sanguneo (de un animal) o en la savia (de una planta), los cuales transportan la seal hasta las clulas diana distribuidas ampliamente por todo el cuerpo (Figura 15-3C). En la Figura 15-4 se contrastan los diferentes sistemas a travs de los cuales las clulas endocrinas y las clulas ner viosas coordinan el comportamiento celular en los animales. Como la sealizacin endocrina depende de la difusin y del flujo sangu neo, es relativamente lenta. Las clulas nerviosas, por el contrario, pueden al canzar una velocidad y una precisin mucho ms elevadas. Pueden transmitir informacin a grandes distancias mediante impulsos elctricos que transportan la seal a lo largo de las prolongaciones nerviosas, a velocidades de hasta 100 metros por segundo. Una vez liberado por un terminal nervioso, un neurotrans misor difunde no ms de 100 nm de la clula diana, un proceso que dura menos de un milisegundo. Otra diferencia entre la transmisin endocrina y la sinptica es que, mientras que las hormonas se diluyen enormem ente en la sangre circu lante y en el lquido intersticial, por lo que han de poder actuar a concentracio nes muy bajas (tpicamente < 10_8M), los neurotransmisores se diluyen mucho menos, pudiendo llegar a alcanzar concentraciones locales altas. Por ejemplo, la concentracin del neurotransmisor acetilcolina en la hendidura sinptica de una unin neuromuscular activa es de alrededor de 5 x 10-4M. Por lo tanto, en la sealizacin sinptica los receptores de los neurotransmisores tienen una afini dad relativamente baja para sus ligandos, lo cual significa que el neurotransmi sor puede disociarse rpidamente del receptor, con lo que acaba la respuesta. (Los neurotransmisores son rpidamente retirados de la hendidura sinptica, tanto por enzimas hidrolticas especficas como por protenas de mem brana que transportan especficam ente el neurotransmisor, bombendolo de nuevo hacia el terminal nervioso o hacia las clulas gliales vecinas.)

(B) SEALIZACIN SINPTICA varias neuronas

varias clulas diana

La sealizacin autocrina puede coordinar decisiones de grupos de clulas idnticas 3

Todas las formas de sealizacin que hemos descrito permiten a un tipo celular influir sobre otro tipo celular. Sin embargo, mediante el mismo mecanismo las c lulas pueden enviar seales a otras clulas del mismo tipo, de lo que se deduce que pueden enviarse incluso seales a ellas mismas. En una sealizacin de este tipo, denominada autocrina, una clula segrega molculas seal que pueden

774

Captulo 15 : Transmisin de seales entre clulas

 (.
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v~* S- .. V

Figura 15-5 Sealizacin autocrina. Un grupo de clulas idnticas produce concentraciones de molcula seal ms elevadas que una clula sola.

'&
Figura 15-6 La sntesis de un eicosanoide. Los eicosanoides son continuamente sintetizados en las membranas, a partir de cadenas de cidos grasos de 20 carbonos que contengan, al menos, tres dobles enlaces, como se muestra en (A) para el caso de la sntesis de prostaglandina PGE2. El subndice se refiere a los dos dobles enlaces carbono-carbono situados fuera del anillo de PGE2. Existen cuatro clases principales de eicosanoides -las prostaglandinas, las prostaciclinas, los tromboxanos y los leucotrienos- y todas ellas estn sintetizadas a partir del cido araquidnico. La sntesis de todas ellas, excepto de los leucotrienos, se produce por la accin de la ciclooxigenasa; la sntesis de los leucotrienos se produce por la accin de la lipoxigenasa (B). Estas etapas biosintticas son diana de una gran cantidad de drogas teraputicas, ya que los eicosanoides son importantes en procesos de dolor, fiebre e inflamacin. Por ejemplo, las hormonas corticoesteroideas, como el cortisol, inhiben la actividad de la fosfolipasa de la primera etapa de la sntesis de eicosanoides, por lo que son ampliamente utilizadas clnicamente para tratar enfermedades inflamatorias no infecciosas, como son algunas formas de artritis. Por el contrario, drogas antiinflamatorias no esteroideas, como la aspirina y el ibupofrn, bloquean la primera etapa de oxidacin, catalizada por la ciclooxigenasa. Algunas prostaglandinas producidas en grandes cantidades en el tero en el momento del parto y que estimulan la contraccin del msculo liso uterino, se utilizan para inducir abortos.

t % A

UNA SOLA CELULA SEAL RECIBE UNA SEAL AUTOCRINA MS DBIL

EN UN GRUPO DE CELULAS SEAL IDNTICAS, CADA CLULA RECIBE UNA SEAL AUTOCRINA MAYOR

unirse a receptores de la propia clula. Durante el desarrollo, por ejemplo, cuando una clula ha sido dirigida a una etapa determinada de diferenciacin, puede co menzar a segregar seales autocrinas que refuercen esta decisin de desarrollo. La sealizacin autocrina es ms efectiva cuando se lleva a cabo simultnea mente por varias clulas vecinas del mismo tipo, por lo que puede utilizarse para estimular a grupos de clulas idnticas para que tom en las mismas decisiones de desarrollo (Figura 15-5). As, se cree que la sealizacin autocrina constituye un posible m ecanismo sobre el que se basa el efecto comunitario observado en las primeras etapas del desarrollo, segn el cual un grupo de clulas idnticas puede responder a seales que inducen diferenciacin mientras que una clula aislada no puede hacerlo. Pero, la sealizacin autocrina no se produce slo durante el desarrollo. Los eicosanoides son molculas seal que a menudo actan de una forma autocrina en los mamferos maduros. Estos derivados de cidos grasos estn sintetizados por clulas de todos los tejidos de mamfero. Se sintetizan continuamente en la membrana plasmtica y se liberan al exterior celular, donde son rpidamente de gradados por enzimas del medio extracelular. Sintetizados a partir de precursores (principalmente de cido araquidnico) liberados a partir de los fosfolpidos de la membrana celular mediante la accin de fosfolipasas (Figura 15-6), tienen una gran variedad de actividades biolgicas; por ejemplo influyen sobre la contrac cin del msculo liso y la agregacin de las plaquetas y participan en las respues-

fosfolpido de m em brana

'C - O - C H ,

I I O

-O -C H

C h U O P O X

fosfolipasa A 2 cido araquidnico (20 carbonos) en co nfo rm ac Io n exte n d id a

/= w = \
a

/C O O H

cido araquidnico cido araquidnico en conform acin plegada

COOH

ETAPA DEPENDIENTE DE LA CICLOOXIGENASA

E TA PA DEPENDIE

DE LA LIPOXIGENASA

p r o st a g Ia n dina (PG E2) (A) (B)

prostaglandinas, prostaciclinas, trom boxanos

leucotrienos

Principios generales de la sealizacin celular

775

tas inflamatorias y febriles. Cuando las clulas se activan por dao tisular o por algn tipo de seales qumicas, se incrementa la velocidad de sntesis de ecosanoides; el incremento resultante de los niveles locales de eicosanoides influye tanto sobre las clulas que los sintetizan como sobre sus vecinas inmediatas.

Las uniones com unicantes perm iten que la inform acin de sealizacin sea compartida por las clulas vecinas 4
Otra va para coordinar las actividades de las clulas vecinas consiste en las unio nes com unicantes o de tipo gap. Se trata de uniones especializadas clula-clula que pueden formarse entre membranas plasmticas situadas en estrecho contac to, y que conectan directamente los citoplasmas de las clulas que unen, a travs de estrechos canales llenos de agua (vase Figura 19-15). Los canales permiten el intercambio de pequeas molculas seal intracelulares (mediadores intracelula res), como el Ca2+y el AMP cclico, pero no el de macromolculas como protenas y cidos nucleicos. As pues, las clulas conectadas por uniones de tipo gap pue den comunicarse entre ellas directamente, sin tener la dificultad de la barrera que supone la presencia de las m embranas plasmticas (Figura 15-7). Como se discute en el Captulo 19, el patrn de distribucin de las conexio nes com unicantes en un tejido puede ponerse de manifiesto tanto elctricam en te, con electrodos intracelulares, com o visualmente, tras la microinyeccin de colorantes solubles en agua. Estudios de este tipo indican que las clulas de un embrin en desarrollo forman y deshacen uniones com unicantes siguiendo pa trones especficos y muy interesantes, lo cual sugiere que estas uniones juegan un importante papel en los procesos de sealizacin que tienen lugar entre estas clulas. Puede sospecharse que, com o en el caso de la sealizacin autocrina descrita con anterioridad, las uniones com unicantes colaboran en la coordina cin del comportamiento de las clulas vecinas de tipo similar. Sin embargo, no sabemos qu pequeas molculas en particular son importantes transportado res de seales a travs de las uniones comunicantes; tampoco se ha definido con precisin cul es la funcin precisa de la com unicacin a travs de las uniones de tipo gap en el desarrollo animal.

Figura 15-7 Sealizacin a travs de uniones comunicantes. Las clulas que estn conectadas por uniones comunicantes comparten las pequeas molculas, incluidas las pequeas molculas seal intracelulares, por lo que pueden responder a seales extracelulares de una forma coordinada.

Cada clula est programada para responder a com binaciones especficas de m olculas seal 5
Cualquier clula dada de un organismo pluricelular est expuesta a muchas -quizs cien tos- seales diferentes de su entorno. Estas seales pueden ser solu bles, estar unidas a la matriz extracelular o estar unidas a la superficie de las c lulas vecinas, y pueden actuar en varios millones de combinaciones posibles. La clula responder a esta selectividad de babel, de acuerdo con su carcter espe cfico adquirido mediante la progresiva especializacin celular, en el curso del desarrollo. As pues, una clula puede estar programada para responder a un conjunto de seales, diferencindose, a otro conjunto de seales, proliferando, y a un tercer grupo de seales, desarrollando algunas funciones especializadas. La mayora de las clulas de los animales superiores, sin embargo, estn programadas para depender de un grupo especfico de seales simplemente para sobrevivir: cuando son deprivadas de las seales adecuadas (por ejemplo, en una placa de cultivo), las clulas inician un programa suicida y se autodestruyen -u n proceso denominado muerte celular programada, que se discute ms extensam ente en el Captulo 21 (Figura 15-8). Diferentes tipos de clulas requie ren diferentes conjuntos de seales de supervivencia, y por ello su localizacin est restringida a diferentes ambientes en el cuerpo. Debido a que generalmente las molculas seal actan en combinaciones de ellas, un animal puede controlar el comportamiento de sus clulas de una manera altamente especfica, utilizando una diversidad limitada de tales m ol culas: cientos de molculas seal pueden utilizarse en millones de com binacio nes diferentes.

776

Captulo 15 : Transmisin de seales entre clulas

MUERTE CELULAR PROGRAMADA

Ax

I -

SOBREVIVE

PROLIFERA C D

Figura 15-8 Sealizacin combinatoria. Cada tipo de clula presenta un conjunto de receptores que le permite responder a un conjunto correspondiente de molculas seal producidas por otras clulas. Varias de estas molculas seal actan de forma combinada, regulando el comportamiento de la clula. Como se muestra aqu, muchas clulas requieren mltiples seales {flechas verdes) para sobrevivir y seales adicionales {flechas rojas) para proliferar; si se depriva a las clulas de todas esas seales, inician un programa de muerte celular.

(A) fibra m uscular esqueltica

Diferentes clulas pueden responder de form a diferente a la m ism a seal qum ica 6
La manera especfica en que una clula reacciona con su entorno, vara, en pri mer lugar, de acuerdo con el conjunto de protenas receptoras que posee la clu la y a travs de las que detecta un conjunto particular de todas las seales que le son asequibles y, en segundo lugar, de acuerdo con la maquinaria intracelular a travs de la cual la clula integra e interpreta la informacin que recibe. As, a menudo una misma molcula seal tiene efectos diferentes sobre clulas diana diferentes. Por ejemplo, el neurotransmisor acetilcolina estimula la concentra cin de las clulas del msculo esqueltico pero disminuye la frecuencia y la fuerza de contraccin de las clulas musculares del corazn. Ello es debido a que las protenas receptoras de acetilcolina de las clulas musculares esquelticas son diferentes de las de las fibras musculares del corazn. Sin embargo, no siem pre son las diferencias entre los receptores lo que explica las diferencias de efec tos. En muchos casos la misma molcula seal se une a protenas receptoras idnticas y produce respuestas muy diferentes en diferentes tipos de clulas dia na, lo cual refleja diferencias en la maquinaria enzimtica a la que estn acopla dos los receptores (Figura 15-9).

La concentracin de una m olcula puede ajustarse rpidamente slo si la vida media de la m olcula es corta 6
Es natural pensar en los sistemas de sealizacin en trminos de los cambios que se producen cuando se libera una seal. Pero tam bin resulta importante considerar qu ocurre cuando se elimina una seal. Durante el desarrollo a m e nudo seales transitorias producen efectos duraderos: pueden desencadenar un cambio que persiste indefinidamente, a travs de mecanismos de memoria celu lar como los discutidos en los Captulos 9 y 21 . Sin embargo, en la mayora de los casos, especialmente en los tejidos adultos, la respuesta se desvanece cuando cesa una seal. La seal acta sobre un sistema de molculas que estn en conti-

RELAJACIN

(C) clula secretora

SECRECIN
Figura 15-9 Una misma molcula seal puede inducir respuestas diferentes en clulas diana diferentes. En algunos casos, ello es debido a que la molcula seal se une a protenas receptoras diferentes, tal como se ilustra en (A) y (B). En otros casos, la molcula seal se une a protenas receptoras idnticas pero stas activan respuestas diferentes en clulas diferentes, tal como se ilustra en (B) y (C). En todos los casos mostrados aqu la molcula seal es la acetilcolina (D).

(D) acetilcolina O
h 3c

CH,
o

Il

c h 2 c h 2 n

+ c h 3 , 777

ch

Principios generales de la sealizacin celular

2 4 6 8 10 m inutos despus de que la velocidad de sntesis haya dism inuido en un factor de 10 (A)

2 4 6 8 10 m inutos despus de que la velocidad de sntesis haya aum entado en un factor de 10 (B)

Figura 15-10 La im portancia de un recam bio rpido. La figura muestra predicciones de las velocidades relativas de cam bio de las concentraciones intracelulares de molculas que tienen diferentes velocidades de recambio, cuando sus velocidades de sntesis disminuyen (A) o aumentan (B) repentinamente en un factor de 10. En ambos casos la concentracin de las molculas que normalmente son degradadas rpidamente en la clula (ln eas rojas) cambia rpidamente mientras que la concentracin de las molculas que normalmente son degradadas ms lentamente (ln eas verdes) cambia proporcionalmente ms despacio. Los nmeros (en azul) del lado derecho de las grficas son las vidas medias asumidas para cada una de las diferentes molculas.

nuo recambio, de forma que cuando la seal cesa el reemplazamiento de las molculas viejas por molculas nuevas borra las trazas de su accin. De ello se deduce que la velocidad de la reaccin para eliminar los efectos de la seal de pende de la velocidad del recambio de las molculas a las que afecta la seal. Puede no resultar tan obvio que esta velocidad de recambio tambin determine la prontitud de la respuesta cuando la seal se activa. Consideremos por ejemplo dos molculas intracelulares X e Y, y que ambas se mantienen normalmente a una concentracin de 1000 molculas por clula. La molcula X tiene una velocidad de recambio baja: es sintetizada y degradada a una velocidad de 10 molculas por segundo, de forma que cada molcula tiene una vida media de 100 segundos. A su vez, la molcula Y se recambia 10 veces ms rpidamente: es sintetizada y degradada a una velocidad de 100 molculas por segundo, de forma que cada molcula tiene una vida media de 10 segundos. Si una seal que acta sobre la clula increm enta 10 veces las velocidades de sntesis tanto de X com o de Y sin alterar las vidas medias, al final del primer se gundo la concentracin de Y se habr incrementado unas 900 molculas en cada clula (10 x 100 - 100) mientras que la concentracin de X slo se habr incre mentado 90 molculas por clula. De hecho, despus de que su velocidad de sntesis haya aumentado o disminuido abruptamente, el tiempo necesario para que una molcula llegue a medio camino entre su concentracin antigua y su nueva concentracin de equilibrio es igual a su vida media -e s decir, es igual al tiempo que sera necesario para que su concentracin bajara a la mitad si se pa rara com pletam ente su sntesis (Figura 15-10). El mismo principio se aplica tanto a protenas como a pequeas molculas, y tanto a molculas del espacio extracelular como intracelulares. Muchas prote nas intracelulares que son degradadas rpidamente tienen vidas medias cortas; algunas de ellas sobreviven m enos de 10 minutos; en la mayora de los casos se trata de protenas cuyo papel regulador es clave, y cuyas concentraciones celula res estn reguladas rpidamente mediante cambios en la velocidad de su snte sis. De la misma forma, cualquier modificacin covalente de una protena, que tenga lugar como parte de un proceso de rpido de sealizacin -habitualm ente la adicin de un grupo fosfato a una cadena lateral de un am inocido- ha de ser eliminada continuam ente a una gran velocidad para hacer posible tal sealiza

778

Captulo 15 : Transmisin de seales entre clulas

cin. Ms adelante discutimos en detalle algunos de estos procesos moleculares, para el caso de procesos de sealizacin que trabajan va receptores de superfi cie celular. Sin embargo, los principios se aplican de forma general, como ilus tran los siguientes ejemplos.

El gas xido ntrico acta como una seal, unindose directam ente a una enzima en el interior de la clula diana 7
A pesar de que la mayora de las seales extracelulares estn mediadas por m ol culas hidroflicas que se unen a receptores situados en la superficie de la m em brana de la clula diana, algunas molculas seal son suficientemente hidrofbicas y/o suficientemente pequeas para atravesar fcilmente la membrana de la clula diana; una vez en el interior, regulan directamente la actividad o la especi ficidad de una protena intracelular. Un ejemplo remarcable lo constituye el gas xido ntrico (NO), el cual recientemente ha sido reconocido como una m olcu la seal en los vertebrados. Por ejemplo, cuando la acetilcolina es liberada por nervios autnomos a las paredes de los vasos sanguneos, hace que las fibras musculares lisas se relajen. La acetilcolina acta indirectamente induciendo a las clulas endoteliales a sintetizar y liberar NO, el cual hace que las clulas m uscu lares lisas se relajen. El efecto de NO sobre los vasos sanguneos proporciona una explicacin del mecanismo de accin de la nitroglicerina, que ha sido utilizada durante ms de 100 aos para tratar pacientes con angina de pecho (dolor debi do a un flujo sanguneo inadecuado en el msculo cardaco). La nitroglicerina es transformada en NO, que relaja los vasos sanguneos, reduciendo el trabajo del corazn y, en consecuencia, el requerimiento de oxgeno del msculo cardaco. Tambin se produce NO como mediador local por macrfagos y neutrfilos acti vados para colaborar en el proceso de eliminacin de microorganismos invaso res. Adems, se utiliza por muchos tipos de clulas nerviosas para sealizar clu las vecinas: el NO liberado por nervios autnomos en el pene, por ejemplo, hace que se dilaten los vasos sanguneos locales que son responsables de la ereccin. El NO es sintetizado por la enzima NO sintasa mediante la desaminacin del aminocido arginina. Como difunde fcilmente a travs de las membranas, el NO difunde fuera de la clula que lo sintetiza, y entra directamente en las clulas vecinas. Slo acta localmente debido a que en el espacio extracelular su vida media es muy corta -en tre 5 y 10 segundos- transformndose en nitratos y nitri tos al com binarse con oxgeno y agua. En muchas clulas diana, como las clulas endoteliales, el NO reacciona un tomo de hierro del lugar activo de la enzima guanilato ciclasa, estimulndola para que produzca el mediador intracelular GMP cclico, del que hablaremos ms adelante. Los efectos del NO pueden ser rpidos, ocurriendo en cuestin de segundos, debido a que la velocidad de re cambio del GMP cclico es alta: la rpida produccin de GMP cclico a partir de GTP por la guanilato ciclasa est compensada por la rpida degradacin a GMP por una fosfodiesterasa. Existen evidencias recientes de que el monxido de car bono (CO) tambin se utiliza como una seal intracelular, y de que puede actuar de la misma forma que el NO, estimulando la guanilato ciclasa. Los gases como el NO y el CO no son las nicas molculas seal que pueden pasar directamente a travs de la membrana plasmtica de la clula diana. Tam bin entran en la clula diana, de esta forma, un grupo de hormonas no gaseo sas, pequeas e hidrofbicas, y varios mediadores locales; sin embargo, en lugar de unirse directamente a enzimas, se unen a receptores intracelulares que regu lan directamente la transcripcin gnica.

Las horm onas esteroideas, las horm onas tiroideas, los retinoides y la vitam ina D se unen a receptores intracelulares que son protenas reguladoras de genes activadas por ligando 8
Las hormonas esteroideas, las hormonas tiroideas, los retinoides y la vitamina D son pequeas molculas hidrofbicas, muy diferentes entre s tanto en estructu-

Principios generales de la sealizacin celular

779

c h 2o h

c=o
OH

cortisol

estradiol

testosterona

tiroxina

ra qumica (Figura 15-11) com o en funcin. Sin embargo, todas ellas actan a travs de un mecanismo similar. Difunden directamente a travs de la membrana plasmtica de las clulas diana y se unen a protenas receptoras intracelulares. La unin del ligando activa los receptores, los cuales entonces regulan directamente la transcripcin de determinados genes. Estos receptores tienen estructuras rela cionadas entre s y constituyen la superfamilia de receptores intracelulares (o superfamilia de receptores de hormonas esteroideas) (Figura 15-12). Todas las horm onas esteroideas, incluyendo el cortisol, las hormonas se xuales, la vitamina D (en los vertebrados) y la hormona de la muda ecdisona (en los insectos), estn sintetizadas a partir del colesterol. El cortisol se produce en el crtex de las glndulas adrenales y afecta el metabolismo de muchos tipos celu lares. Las hormonas esteroideas sexuales se sintetizan en los testculos y en los ovarios y son responsables de las caractersticas sexuales secundarias que distin guen los m achos de las hembras. La vitamina D se sintetiza en la piel en res puesta a la luz solar; despus de transformarse en una forma activa en el rin o en el hgado, regula el m etabolismo del Ca2+ , favoreciendo la captacin de Ca2 + en el intestino y reduciendo su excrecin por el rin. Las horm onas tiroideas, que son sintetizadas a partir del aminocido tirosina, incrementan el m etabolis mo de una gran variedad de tipos celulares, mientras que los retinoides, como el cido retinoico, que se sintetizan a partir de la vitamina A, juegan un importante papel como mediadores locales durante el desarrollo de los vertebrados. A pesar de que todas estas molculas seal son relativamente insolubles en agua, se ha

cido retinoico

Figura 15-11 Algunas molculas seal que se unen a receptores intracelulares. Ntese que todas ellas son pequeas e hidrofbicas. Se muestra la forma activa, hidroxilada, de la vitamina D3.

com plejo proteico lugar de unin a la horm ona inhibidor C0QH I dom inio de activacin de la transcripcin /A ( 1

dominio de unin , al DNA

receptor de cortisol receptor de estrgeno

dom inio de unin al DNA horm ona esteroidea

regin bisagra receptor de progesterona N ---------------------------- C receptor de vitam ina D N ------ m --------------------C receptor de horm onas tiroideas Nreceptor de cido retinoico

lugar de unin al DNA expuesto

(A)

(B)

Figura 15-12 La superfamilia de receptores intracelulares. (A) Modelo de protena receptora de hormonas esteroideas. En su estado inactivo el receptor se halla unido a un complejo proteico inhibidor que contiene una protena activada por estrs calorfico (heat shock protein) denominada Hsp90 (se discute en el Captulo 5). La unin del ligando al receptor hace que la protena inhibidora se disocie, de forma que el receptor se activa exponiendo su lugar de unin al DNA. El modelo que se presenta en la figura se basa en el receptor para el cortisol (glucocorticoides), pero todos los receptores de la superfamilia tienen una estructura similar a sta, como se muestra en (B), donde se han dibujado en verde los cortos dominios de unin al DNA de cada receptor. Experimentos de intercambio de dominios sugieren que en estos receptores la mayora de los dominios de unin a la hormona, de activacin de la transcripcin y de unin al DNA pueden actuar como mdulos intercambiables. Se cree que todos los receptores intracelulares se unen al DNA como homodmeros o como heterodmeros.

780

Captulo 15: Transmisin de seales entre clulas

cen solubles para su transporte por el torrente sanguneo y otros lquidos extracelulares mediante su unin a protenas transportadoras especficas, de las que se disocian antes de entrar en la clula diana (vase Figura 15-2). Adems de la diferencia fundamental en la manera en que sealizan a sus clulas diana, la mayora de las molculas insolubles en agua se diferencian de las solubles en agua en cuanto al tiempo que se mantienen en el torrente sangu neo y en los tejidos. La mayora de las hormonas solubles en agua se eliminan y lo degradan en cuestin de minutos despus de entrar en la sangre y los m e diadores locales y los neurotransmisores son eliminados del espacio extracelular incluso ms rpidamente -e n cuestin de segundos o de milisegundos. Las hor monas esteroideas, por el contrario, persisten en la sangre durante horas, y las hormonas tiroideas durante das. En consecuencia, las molculas seal solubles en agua habitualmente median respuestas de duracin corta mientras que las insolubles en agua tienden a mediar respuestas ms duraderas. Todos los receptores intracelulares para las hormonas esteroideas, para las hormonas tiroideas, para los retinoides y para la vitamina D, se unen a secuen cias especficas del DNA adyacentes a los genes que estn regulados por el ligan do correspondiente. Algunos de ellos, como los receptores de cortisol, se locali zan principalmente en el citoplasma y slo se unen al DNA despus de unirse al ligando (vase Figura 15-12); otros, com o los receptores de retinoides, se locali zan principalmente en el ncleo y se unen al DNA incluso en ausencia de ligan do. En cualquier caso, la unin del ligando altera la conformacin de la protena receptora, la cual entonces activa (u ocasionalmente inhibe) la transcripcin gnica. En m uchos casos la respuesta tiene lugar en dos etapas: en primer lugar la induccin directa de la transcripcin de un pequeo nmero de genes especfi cos, en cuestin de 30 minutos, y que se conoce como la respuesta prim aria ; los productos de estos genes, a su vez, activan otros genes, produciendo una res puesta retardada, denominada respuesta secundaria. As, un simple incremento hormonal puede generar un complejo cambio del patrn de expresin gnica (Figura 15-13). La respuesta a las hormonas tiroideas y esteroideas, a la vitamina D y a los retinoides, como en el caso de las respuestas a seales extracelulares en general, est determinada tanto por la naturaleza de la clula diana como por la natura leza de la m olcula seal. A pesar de que diferentes tipos celulares tengan recep tores intracelulares idnticos, el conjunto de genes que regula el receptor es di-

Figura 15-13 Respuesta primara temprana (A) y respuesta secundaria retardada (B) que resulta de la activacin de receptores proteicos intracelulares. Se ilustra la respuesta a una hormona esteroidea, pero estos mismos principios se pueden aplicar a todos los ligandos que activan alguno de los componentes de esta familia de protenas receptoras. Algunas de las protenas de la respuesta primaria activan a los genes de la respuesta secundaria, mientras que otras inactivan a los genes de la respuesta primaria. El nmero real de genes implicados en las respuestas primaria y secundaria es mayor que el que se indica en este dibujo. Como era de esperar, las drogas que inhiben la sntesis proteica suprimen la transcripcin de los genes de la respuesta secundaria pero no los de la respuesta primaria.

(A) RESPUESTA PRIMARIA TEMPRANA A LA HORMONA ESTEROIDEA horm ona receptor de horm ona esteroidea esteroidea

(B) RESPUESTA SECUNDARIA RETARDADA A LA HORMONA ESTEROIDEA

AA
protenas de la respuesta secundaria
los com plejo s ho rm on a esteroidea-recepto r activan los genes de la respuesta prim aria

DNA

induccin de la sntesis de algunas protenas diferentes en la respuesta prim aria

una protena de la respuesta prim aria inactiva los genes de la respuesta prim aria

una protena de la respuesta prim aria activa los genes de la respuesta secundaria

Principios generales de la sealizacin celular

781

ferente en cada caso. Ello es debido a que generalmente a cada gen eucariota se le ha de unir ms de un tipo de protena reguladora de genes, para activar su transcripcin. Por ello, un receptor intracelular puede activar un gen slo si exis te la com binacin adecuada de otras protenas reguladoras de genes, y algunas de ellas son especficas del tipo celular. As, las hormonas tiroideas, la vitamina D y cada una de las hormonas esteroideas y de retinoides inducen un conjunto caracterstico de respuestas en los animales, debido a que: ( 1) nicamente ciertos tipos celulares tienen receptores para ello; y (2) cada uno de estos tipos celulares contienen una combinacin diferente de otras protenas reguladoras de genes, que colaboran con el receptor activado influyendo en la transcripcin de conjun tos especficos de genes. En el Captulo 9 se discuten los detalles moleculares so bre cmo los receptores intracelulares y otras protenas reguladoras controlan la transcripcin de genes de forma especfica.

Se conocen tres clases de protenas receptoras de superficie celular: las asociadas a canales inicos, las asociadas a protenas G y las asociadas a enzimas 9
Las tcnicas de DNA recom binante han revolucionado el estudio de los recepto res y de las protenas intracelulares que participan en la sealizacin celular. Es tas protenas a menudo constituyen menos del 0,01% de la masa proteica total de una clula, por lo que ha resultado extremadamente difcil purificarlas. El clonaje de las secuencias de DNA que codifican las protenas ha acelerado enorm e mente el proceso de caracterizacin; la mayora de las protenas seal discutidas en este captulo se han caracterizado de esta forma. Una contribucin funda mental de estos estudios de clonaje y de secuenciacin de DNA ha consistido en revelar que la increble diversidad de protenas receptoras conocidas puede re ducirse a un nmero mucho menor de grandes familias. Los receptores intrace lulares de los que acabam os de tratar constituyen una de estas familias. Ahora consideraremos los grupos de familias que pueden identificarse como pertene cientes a una gran clase de receptores de seal: los receptores localizados en la superficie de la clula. Todas las molculas seal solubles en agua (incluyendo los neurotransmisores, las hormonas proteicas y los factores de crecimiento) y algunas molculas seal liposolubles, se unen a receptores proteicos especficos situados en la su perficie de las clulas diana que afectan. Estos receptores proteicos de superficie actan com o transductores de seal: unen la molcula seal (el ligando) con una alta afinidad, y transforman este evento extracelular en una o ms seales intracelulares, las cuales alteran el comportamiento de la clula diana. La mayora de los receptores de la superficie celular pertenecen a una de es tas tres clases, que se definen en funcin del mecanismo de transduccin que uti lizan. Los receptores asociados a canales, tambin conocidos como canales ini cos regulados por transmisor, participan principalmente en la rpida sealizacin sinptica entre clulas excitables elctricamente. Este tipo de sealizacin est mediada por un pequeo nmero de neurotransmisores que abren o cierran transitoriamente el canal inico al que estn unidos, alterando as brevemente la permeabilidad inica de la membrana plasmtica y, por lo tanto, modificando la excitabilidad de la clula postsinptica (Figura 15-14A). Estos receptores relacio nados con un canal pertenecen a una familia de protenas transmembrana que la atraviesan varias veces (multipaso) y que son homlogas entre s. En el Captulo 11 se estudian estos receptores, de forma que aqu no se tratarn en mayor pro fundidad. Los receptores asociados a protenas G actan indirectamente regulando la actividad de una enzima ligada a la membrana plasmtica o un canal inico, se parados del receptor. La interaccin entre el receptor y la protena diana est mediada por una tercera protena, llamada protena reguladora que une GTP (o protena G) (Figura 15-14B). La activacin de la protena diana altera la concen tracin de una o ms pequeas molculas seal intracelulares (si la protena

782

Captulo 15 : Transmisin de seales entre clulas

(A) RECEPTOR RELACIONADO CON CANALES INICOS

Figura 15-14 Las tres clases de receptores de superficie. A pesar de

ligando

que muchos receptores asociados a enzimas tienen una actividad enzimtica intrnseca, como se muestra en (C), muchos otros actan sobre enzimas asociadas (no se muestra).

(B) RECEPTOR RELACIONADO CON PROTENAS G ligando

proteina G

enzima o canal inico

proteina G activada

enzima activada o canal inico

(C) RECEPTOR RELACIONADO CON ENZIMAS ligando

dom inio cataltico inactivo

dom inio cataltico activo

diana es una enzima) o altera la permeabilidad de la membrana plasmtica (si la protena diana es un canal inico). A su vez, los m ensajeros intracelulares ac tan alterando el comportamiento de otras protenas diana de la clula. Todos los receptores relacionados con protenas G pertenecen a una gran superfamilia de protenas homlogas, que atraviesan siete veces la membrana Cuando son activados por su ligando, los receptores asociados a enzimas actan directamente como enzimas o estn asociados a enzimas (Figura 15-14C). La mayora de ellos son protenas que atraviesan la membrana una sola vez y que tienen el lugar de unin al ligando en el exterior de la clula y el lugar cataltico en el interior. Comparados con las otras dos clases, los receptores relacionados con enzimas son heterogneos, a pesar de que la gran mayora de ellos son protena quinasas o estn asociados con protena quinasas, que fosforilan conjuntos espe cficos de protenas en la clula diana.

Los receptores de superficie celular, una vez activados, desencadenan la adicin de grupos fosfato a una red de protenas intracelulares 9,10
La mayora de lo que se tratar en este captulo a partir de aqu se refiere a cmo trabajan los receptores relacionados con protenas G y los receptores relacionados con enzimas. A menudo las seales recibidas en la superficie de la clula por estas dos clases de receptores son transmitidas hasta el ncleo, donde alteran la expre sin de determinados genes modificando as el comportamiento de la clula. El sistema de transmisin de la seal est formado por elaborados conjuntos de pro tenas seal intracelulares. La mayora de estas protenas son: o bien protenas que cuando llega la seal se fosforilan mediante protena quinasas o bien protenas que cuando llega la seal se unen a GTP. En ambos casos las protenas ganan uno

Principios generales de la sealizacin celular

783

ENTRADA DE LA SEAL

SALIDA DE LA SEAL

(A) SEALIZACIN MEDIANTE FOSFORILACIN

(B) SEALIZACIN MEDIANTE UNA PROTENA QUE UNE GTP

Figura 15-15 Los dos mecanismos principales de sealizacin intracelular comparten caractersticas comunes. En ambos casos una protena seal es activada por la adicin de un grupo fosfato, e inactivada por la eliminacin del grupo fosfato. En (A) el fosfato es aadido de forma covalente a la protena seal, mediante una protena quinasa; en (B) una protena sealizadora es inducida a cambiar su GDP por un GTP. Para poner de manifiesto las similitudes entre ambos mecanismos, el ATP se muestra como APP(P) el ADP como APP, el GTP como GPP(P)y el GDP como GPP.

o ms fosfatos en su estado activado y pierden los fosfatos cuando la seal decae (Figura 15-15). A su vez, estas protenas generalmente causan la fosforilacin de otras protenas, generando una cascada de fosforilaciones. Las cascadas de fosforilaciones estn mediadas por dos tipos principales de protena quinasas: las serina/treonina quinasas, que fosforilan protenas sobre cadenas laterales de serina y (menos a menudo) de treonina, y las tirosina qui nasas que fosforilan protenas sobre cadenas laterales de tirosina. Una quinasa ocasional puede hacer ambas cosas. Se estima que alrededor del 1% de nuestros genes codifican protena quinasas, y que una sola clula de mamfero puede contener ms de 100 tipos distintos de estas enzimas, la mayora de las cuales son serina/treonina quinasas. A pesar de que menos del 0,1% de las protenas fosforiladas celulares contienen fosfotirosinas, veremos que esta pequea m ino ra juega un papel crucial en la sealizacin de la mayora de los receptores rela cionados con enzimas. Como hemos tratado previamente, generalmente los comportamientos ce lulares complejos, com o la supervivencia o la proliferacin, no estn estimula dos por una sola seal que acta sola sino por com binaciones especficas de se ales (Figura 15-8). La clula ha de integrar la informacin que proviene de seales diferentes, para generar una respuesta adecuada -para vivir o morir, o para proliferar o permanecer quiescente. La integracin parece depender de in teracciones entre las diversas cascadas de fosforilacin de protenas que se acti van por diferentes seales extracelulares. En particular, algunas de las protenas seal en las cascadas actan como elementos integradores, equivalentes a los microprocesadores de un ordenador: en respuesta a mltiples seales de entra da producen una salida calibrada para generar el efecto biolgico deseado. En la Figura 15-16 se presentan dos ejemplos sobre cmo pueden actuar estas prote nas integradoras. La complejidad de estos sistemas de respuesta a seales, compuestos por mltiples cadenas de protenas seal que interactan entre s, intimida. Sin em bargo, la tecnologa de DNA recombinante combinada con los anlisis genticos bsicos en Drosophila, en el nemtodo C. elegans y en levaduras, as como otros mtodos bioqumicos y farmacolgicos convencionales nos permiten descubrir rpidamente los intrincados detalles de estos mecanismos mediante los cuales las protenas receptoras activadas cambian el comportamiento de la clula.

Resumen
Cada una de las clulas de un animal pluricelular est programada durante el de sarrollo para responder a un conjunto especfico de seales que actan en diversas combinaciones regulando el comportamiento de la clula y determinando si la c-

784

Captulo 15 : Transmisin de seales entre clulas

(A)

(B)

=4 1= \
Q \
V

/
l

ElU

r *-[Anpl

PROCESO DE PRODUCCION DE SEAL

PROCESO DE PRODUCCION DE SEAL

lula debe vivir o morir o si debe proliferar o permanecer quiescente. La mayora de estas seales median sealizaciones paracrinas en las que los mediadores locales son rpidamente captados, destruidos o inmovilizados, de forma que nicamente pueden actuar sobre las clulas vecinas. Adems, existe un control centralizado que est ejercido tanto por la sealizacin endocrina, en la que las hormonas segrega das por las clulas endocrinas son transportadas por la sangre hasta las clulas diana de todo el cuerpo, como por la sealizacin sinptica en la cual los neurotransmisores segregados por las clulas nerviosas actan localmente sobre las clu las postsinpticas con las que contactan sus axones. La sealizacin celular requiere tanto molculas seal extracelulares como un conjunto complementario de protenas receptoras en cada clula, que les permiten unirlas y responder a ellas de una forma programada y caracterstica. Algunas pe queas molculas hidrofbicas, incluyendo las hormonas esteroideas y tiroideas y los retinoides, difunden a travs de la membrana plasmtica de la clula diana y activan protenas receptoras intracelulares, las cuales regulan directamente la transcripcin de determinados genes. Algunos gases en solucin, como el xido n trico y el monxido de carbono, actan como mediadores locales difundiendo a tra vs de la membrana de la clula diana y activando una enzima intracelular -habi tualmente la guanilato ciclasa, que produce GMP cclico en la clula diana. Sin embargo, la mayora de las molculas seal extracelulares son hidroficas y slo son capaces de activar protenas receptoras de la superficie de la clula diana; estos receptores actan como transductores de seal, convirtiendo el evento de unin extracelular en seales intracelulares que alteran el comportamiento de la clula dia na. Existen tres familias principales de receptores de superficie celular, los compo nentes de cada una de las cuales transducen las seales extracelulares de una manera diferente. Los receptores asociados a canales inicos son canales inicos re gulados por transmisor que se abren o se cierran brevemente como respuesta a la unin de un neurotransmisor. Los receptores asociados a protenas G activan o inactivan indirectamente enzimas unidas a membrana plasmtica o canales ini cos, a travs de protenas trimricas que unen GTP (protenas G). Los receptores asociados a enzimas actan directamente como enzimas o estn asociados a enzi mas; habitualmente las enzimas son protena quinasas que fosforilan protenas determinadas de la clula diana. A travs de cascadas de fosforilaciones de prote nas, muy bien reguladas, conjuntos elaborados de protenas que interactan entre ellas transportan la mayora de las seales desde la superficie hasta el ncleo, alte rando as el patrn de expresin gnica y, como consecuencia de ello, el comporta miento de la clula. La interaccin entre diferentes cascadas permite a la clula in tegrar la informacin que proviene de las mltiples seales que recibe.

Figura 15-16 Integracin de seales. En (A) las seales A y B activan diferentes cascadas de fosforilacin de protenas, cada una de las cuales produce la fosforilacin de la protena Y, pero en diferentes lugares de la protena. La protena Y se activa nicam ente cuando ambos lugares estn fosforilados, por lo que nicam ente es activa cuando las seales A y B se hallan presentes simultneamente. En (B) las seales A y B producen la fosforilacin de dos protenas, a y b, las cuales entonces se unen entre s dando lugar a una protena activa ab. En ambos ejemplos las protenas se fosforilan. Sin embargo, una forma equivalente de control puede ocurrir con el intercambio de GTP por GDP sobre una protena que une GTP (vase Figura 15-15).

Principios generales de la sealizacin celular

785

Sealizacin va receptores de superficie celular asociados a protenas G1 1

Los receptores asociados a protenas G constituyen la mayor familia de recep tores de la superficie celular. En mamferos se han descrito ms de 100 m iem bros de esta familia. La mayora de ellos han sido identificados mediante clonaje de homologa, en el que se utiliza la hibridacin a baja estringencia con sondas de cDNA preexistentes para detectar secuencias de DNA relacionadas (vase Fi gura 7-17). Otros miembros de la familia se han encontrado mediante clonaje de expresin, utilizando sus propiedades de unin de ligandos o de activacin celu lar para identificarlos. Una forma de esta aproximacin consiste en copiar en molculas de RNA una librera de molculas de cDNA preparada a partir de c lulas o de tejidos que expresan el receptor en cuestin, e inyectarlas en oocitos de Xenopus. Los oocitos traducen las molculas de RNA a protena. Estas prote nas se insertan en la membrana plasmtica, donde pueden detectarse gracias a sus propiedades de unin de un ligando determinado o de activacin celular. Los receptores asociados a protenas G median las respuestas celulares de una enorme diversidad de molculas seal, incluyendo hormonas, neurotransmisores y mediadores locales, de estructura tan variada como lo es su funcin: la lista incluye protenas y pequeos pptidos, aminocidos y derivados de cidos grasos. Un mismo ligando puede activar muchos miembros diferentes de la fa milia. Por ejemplo, la adrenalina puede activar por lo menos 9 miembros dife rentes de receptores asociados a protenas G, la acetilcolina a 5 o ms y la serotonina por lo menos a 15 de ellos. A pesar de la diversidad qumica y funcional de las molculas seal que se unen a ellos, todos los receptores asociados a protena G de los que se conoce su secuencia de aminocidos a partir de estudios de secuenciacin de DNA, tienen una estructura similar y estn, casi con toda seguridad, relacionados evolutiva mente. Estn formados por una sola cadena polipeptdica que atraviesa siete ve ces, arriba y abajo, la bicapa lipdica (Figura 15-17). Como discutiremos ms adelante, esta superfamilia de protenas receptoras transmembrana que atravie san la mem brana siete veces incluye la rodopsina, la protena localizada en los ojos de los vertebrados y que es activada por la luz, as como los receptores olfa tivos de los vertebrados. En los organismos unicelulares tambin se encuentran miembros de esta familia: un ejemplo de ellos son los receptores de levaduras que reconocen los factores de acoplamiento de las levaduras. Este motivo es tructural tan antiguo tam bin lo presenta la bacteriorrodopsina, una bomba bacteriana de H+ activada por la luz, que se discute en el Captulo 10, a pesar de que, a diferencia de los miembros de la familia, la bacteriorrodopsina no es un receptor y no acta a travs de ninguna protena G. En su conjunto, estos hechos sugieren que los receptores asociados a protenas G que median la sealizacin clula-clula en los organismos pluricelulares deben haber evolucionado a par tir de receptores sensoriales de sus antepasados unicelulares. Los miembros de esta familia de receptores han conservado no slo su secuencia de aminocidos sino tambin su relacin funcional con una protena G a travs de la cual trans miten al interior celular la seal que ha transportado un ligando extracelular. En esta seccin trataremos principalmente de esta cadena de acontecim ientos que se inician con la activacin de las protenas G.

Figura 15-17 Dibujo esquemtico de un receptor asociado a protenas G. Los receptores que unen ligandos proteicos tienen un gran dominio extracelular de unin formado por la parte de la cadena polipeptdica que se muestra en verde claro. Los receptores para ligandos pequeos, como es la adrenalina, tienen dominios extracelulares pequeos y habitualmente el lugar de unin se halla incrustado en el plano de la membrana, formado por aminocidos de varios de los segmentos transmembrana. Las regiones de los dominios transmembrana que son responsables principales de unirse a las protenas G trimricas se muestran en naranja, y los que se fosforilan durante la desensibilizacin del receptor (lo cual se discute ms adelante) se muestran en rojo.

Las protenas G trim ricas transm iten la seal intracelular desde los receptores asociados a protenas G 11,12
Las protenas trim ricas que unen GTP (protenas G) que acoplan funcional mente estos receptores a sus enzimas diana o a canales inicos en la membrana plasmtica son estructuralmente diferentes de las protenas que unen GTP, de una sola cadena (denominadas protenas monomricas que unen GTP o GTPasas monomricas), las cuales transm iten las seales intracelulares y regulan el trfi-

786

Captulo 15: Transmisin de seales entre clulas

m olcula seal

-----------------------

Figura 15-18 Los dos procesos principales mediante los cuales la protena G relacionada con los receptores de superficie de la clula genera mensajeros intracelulares. En ambos casos, la unin de un ligando extracelular altera la conformacin del dominio citoplasmtico del receptor, de forma que ahora puede unirse a una protena G, la cual a su vez activa (o inactiva) una enzima de la membrana plasmtica. En el proceso del AMP cclico (cAMP), la enzima produce AMP cclico directamente. En el proceso del Ca2+ , la enzima produce un mediador soluble (el inositol trisfosfato, se discute ms adelante) que libera Ca2 +desde el retculo endoplasmtico. Como otros pequeos mediadores intracelulares, tanto el AMP cclico como el Ca2 + transmiten la seal actuando como efectores alostricos: se unen especficamente a protenas de la clula, alterando su conformacin y, por lo tanto, su actividad.

co de vesculas y muchos otros procesos de las clulas eucariotas. Las GTPasas monomricas sern tratadas ms tarde en este y en otros captulos. Sin em bar go, ambas clases de protenas que unen GTP son GTPasas y actan como inte rruptores moleculares que pueden saltar entre dos estados: uno activo, cuando estn unidas a GTP, y otro inactivo, cuando estn unidas a GDP. En el contexto habitual, activo significa que la molcula acta como una seal desencade nando otros procesos celulares. Cuando un ligando extracelular se une a un re ceptor asociado a protena G, el receptor cambia de conformacin modificando la pro tena G trimrica a la que est asociado, haciendo que se desprenda del GDP y lo reemplace por GTP. Este cambio revierte cuando la protena G hidroliza el GTP que lleva unido, transformndolo de nuevo en GDP. Pero mientras ello ocurre, la protena (activa) tiene la oportunidad de difundir lejos del receptor y de transmitir su m ensaje por la clula, durante un perodo de tiempo ms o m e nos prolongado. La mayora de receptores asociados a protenas G activan una cadena de acontecimientos que modifican la concentracin de una o ms molculas seal intracelulares. A su vez, estas pequeas molculas, a menudo denominadas m e diadores intracelulares (o tambin mensajeros intracelulares o segundos mensaje ros), transfieren la seal alterando el comportamiento de determinadas protenas de la clula. Dos de los mediadores intracelulares ms ampliamente utilizados son el AMP cclico (cAMP) y el Ca2+ : en la mayora de las clulas animales existen diferentes mecanismos que modifican sus concentraciones y la mayora de los re ceptores asociados a protenas G regulan uno de los dos mediadores, como se in dica en la Figura 15-18.

Algunos receptores increm entan los niveles intracelulares de AMP cclico activando la adenil ciclasa a travs de una protena G estimuladora (Gs)13
El AMP cclico (Figura 15-19) fue identificado por primera vez en 1959 como un mediador intracelular de la accin hormonal. Ahora sabemos que acta como una molcula seal intracelular en todas las clulas procariotas y animales en que se ha estudiado. Para que el AMP cclico acte como un mediador intracelu-

Sealizacin va receptores de superficie celular asociados a protenas G

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ADENINA
NH,

-o P

FOSFATO
lar, su concentracin (que normalmente es < 10~7M) ha de poder variar, aumen tando o disminuyendo, en respuesta a seales extracelulares: bajo la influencia de hormonas los niveles de AMP cclico pueden variar hasta valores cinco veces superiores, en cuestin de segundos. Como hemos explicado antes (vase Figura 15-10), una capacidad de respuesta como sta requiere que la rpida sntesis de la molcula est compensada por una rpida degradacin o eliminacin de ella. El AMP cclico se sintetiza a partir de ATP mediante una enzima unida a m em brana, la adenil ciclasa, y es rpida y continuam ente destruido mediante una o varias fosfodiesterasas de AMP cclico, que hidrolizan el AMP cclico hasta adenosina 5 -monofosfato (5-AMP) (Figura 15-20). Mudhas molculas seal extracelulares actan controlando los niveles de AMP cclico, alterando la actividad de la adenil ciclasa (Figura 15-21) y no la acti vidad de la fosfodiesterasa. De la misma forma en que la misma hormona esteroidea produce efectos diferentes en clulas diana diferentes, distintas clulas diana responden de forma muy diferente a seales extracelulares que alteran los niveles intracelulares de AMP cclico (Tabla 15-1). Sin embargo, habitualmente todos los ligandos que activan la adenil ciclasa en un determinado tipo de clula diana causan siempre el mismo efecto: por ejemplo, por lo menos cuatro hormonas ac tivan la adenil ciclasa en las clulas del tejido adiposo y todas ellas estimulan la degradacin de triacilglicridos (la forma de almacenamiento de las grasas) hasta cidos grasos (vase Tabla 15-1). Los diferentes receptores para estas hormonas activan un acervo comn de molculas de adenil ciclasa, a las que estn acopla das mediante una protena G trimrica. Como esta protena participa en la acti vacin de la enzima, se denomina protena G estimuladora (Gs de stimulating). Los individuos que son genticamente deficientes en Gs presentan respuestas disminuidas a ciertas hormonas y, por lo tanto, tienen anomalas metablicas, anomalas en el desarrollo de los huesos y retraso mental. Los receptores acoplados a la activacin de la adenil ciclasa mejor estudia dos son los receptores p adrenrgicos, los cuales median algunas de las accio nes de la adrenalina y de la noradrenalina (Figura 15-22 y vase la Tabla 15-1). Puede reconstruirse un sistema adenil ciclasa activable por adrenalina en ves culas de fosfolpidos sintticas, utilizando receptores (3-adrenrgicos purifica dos, Gs y molculas de adenil ciclasa, lo cual indica que no se requiere ninguna otra protena para este proceso de activacin. De qu forma la protena Gs m e dia este acoplamiento? La respuesta depende de la estructura trimrica de la protena G, tal como discutiremos a continuacin.

Figura 15-19 El AMP cclico. Se muestra su frmula, un modelo espacial de varilla y un modelo de espacio lleno. (C, H, N, O y P indican tomos de carbono, hidrgeno, nitrgeno, oxgeno y fsforo, respectivamente.)

0
0~

0
O

0
o

'O-P-O-P-O-P-O-CH, n

fosfodiesterasa de AMP cclico

OH

OH

Se cree que las protenas G trim ricas se desensamblan cuando son activadas 11,12,14
Una protena G est com puesta por tres cadenas polipeptdicas diferentes, de nominadas a, (3 y y: La cadena a de las protenas Gs (as) se une e hidroliza GTP y

Figura 15-20 Sntesis y degradacin del AMP cclico (cAMP). Una pirofosfatasa hace que la sntesis de AMP cclico sea un proceso irreversible, hidrolizando el pirofosfato (P)(P)que se libera en esta reaccin (no se muestra).

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Captulo 15: Transmisin de seales entre clulas

catalticos
Figura 15-21 La adenil ciclasa. En los vertebrados, la enzima est formada habitualm ente por unos 1100 residuos de aminocido y se cree que tiene dos grupos de seis segmentos transm embrana que separan dos dominios catalticos citoplasmticos similares. En mamferos existen como mnimo seis tipos de estas formas de adenil ciclasa (tipos I-VI). Todos ellos estn estimulados por Gs, aunque el tipo I, que se encuentra principalmente en el cerebro, tam bin se estimula por com plejos de Ca2+ unidos a la protena que une Ca2+, la calmodulina (de la que trataremos ms adelante).

activa la adenil ciclasa. La cadena (3 y la cadena y de las protenas Gs forman un ntimo complejo (fty) que ancla el complejo Gs a la cara citoplasmtica de la mem brana plasmtica al menos en parte mediante una cadena lipdica (un gru po prenilo) que est anclado covalentemente a la subunidad y. En su forma inac tiva, Gs est en forma de trmero con una molcula de GDP unida a a s. Cuando Gs es activada por la unin de un receptor activado por un ligando, a s cambia su GDP por GTP. Se cree que ello hace que a s se disocie de (fy permitiendo que a s se una a una molcula de adenil ciclasa, a la que activa a producir cAMP cclico. Si las clulas son capaces de responder rpidamente a cambios en la concen tracin de una molcula seal extracelular, la activacin de la adenil ciclasa pue de ser revertida rpidamente en cuanto el ligando seal se disocia del receptor. Esta capacidad para responder rpidamente a cambios est asegurada debido a que la vida media de la forma activa de cxs es corta: la actividad GTPasa de a s se estimula cuando a s se une a la adenil ciclasa, de forma que el GTP unido a ella se hidroliza a GDP, generando ocsy la adenil ciclasa inactiva. Entonces, a s se vuelve a asociar con (3y dando lugar de nuevo a una molcula Gs inactiva (Figura 15-23). La importancia de la actividad GTPasa en el proceso de finalizacin de la respuesta puede ponerse de manifiesto en el tubo de ensayo. Si se toman clu las, se rompen, se abren y se exponen a un anlogo del GTP (GTPyS) cuyo fosfato terminal no es hidrolizable, la produccin de AMP cclico tras el tratamiento con

adrenalina

Tabla 15-1 Algunas respuestas celulares inducidas por hormonas a travs del AMP cclico Tejido diana Hormona Respuesta principal sntesis y secrecin de hormonas tiroideas secrecin de cortisol secrecin de progesterona degradacin de glucgeno resorcin del hueso incremento de la frecuencia cardaca y de la fuerza de contraccin del corazn degradacin de glucgeno resorcin de agua degradacin de triacilglicridos

Glndula tiroides hormona estimuladora de la tiroides (TSH) Corteza adrenal hormona adrenocorticotropa (ACTH) hormona luteinizante (LH) Ovario Msculo adrenalina Hueso parathormona Corazn adrenalina

Figura 15-22 La adrenalina. Esta hormona (tambin denominada epinefrina) se sintetiza a partir de tirosina y es segregada por la glndula adrenal cuando un mamfero se estresa.

Hgado Rin Tejido adiposo

glucagn vasopresina adrenalina, ACTH, glucagn, TSH

Sealizacin va receptores de superficie celular asociados a protenas G

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ESPACIO EXTRACELULAR CITOSOL ligando seal

protena receptora A A

I --------------1
PY 0 C s

protena Gs

adenil ciclasa m em brana asmtica

la unin del ligando altera la conform acin del receptor haciendo asequible un lugar para la unin de la protena Gs

Figura 15-23 Modelo actual que ilustra de qu forma Gsacopla la activacin del receptor a la activacin de la adenil ciclasa. Mientras el ligando seal permanece unido, el receptor proteico puede continuar activando molculas de protena Gs, con lo que se produce una amplificacin de la respuesta. Lo que es ms importante, despus de que el ligando seal se haya disociado del receptor, la protena o cs puede permanecer activa y seguir estimulando una molcula de ciclasa durante muchos segundos, lo cual proporciona una amplificacin todava mayor.

la difusin en la bicapa perm ite la asociacin de los com plejos ligando-receptor con protenas

el GDP se disocia, perm itiendo que se una GTP; ello hace que la subunidad a se disocie del com plejo Gs, exponiendo su lugar de unin para la adenil ciclasa

la subunidad a se une a la adenil ciclasa, activndola para producir muchas m olculas de cAMP; m ientras tanto, la disociacin del ligando hace que el receptor recupere su conform acin original

la hidrlisis del GTP por la subunidad a hace que esta subunidad recupere su conform acin original, disocindose de la adenil ciclasa (que se vuelve inactiva) y se reasocie con un com plejo Pyform ando de nuevo un com plejo Gs

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Captulo 15: Transmisin de seales entre clulas

una horm ona se prolonga enormemente. Un fenmeno similar se observa en pacientes que sufren de clera, en los que la toxina bacteriana responsable de los sntomas de esta enfermedad inhibe el mecanismo de autoinactivacin de a s. La toxina colrica es una enzima que cataliza la transferencia de ADP ribosa desde NAD+ intracelular a ocs. La ADP ribosilacin altera ocs de forma que pierde la capacidad de hidrolizar el GTP que tiene unido. Las molculas de adenil ciclasa activadas por estas a s alteradas permanecen activas indefinidamente. La ele vacin prolongada de los niveles de AMP cclico en las clulas epiteliales intesti nales provoca un gran eflujo de Na+y de agua en el intestino, que es responsable de la severa diarrea caracterstica del clera.

Algunos receptores disminuyen los niveles de AMP cclico inhibiendo la adenil ciclasa va una protena G trim rica inhibidora (Gj)11,12,15
Una misma molcula seal puede incrementar o disminuir la concentracin in tracelular de AMP cclico, en funcin del tipo de receptor al que se una. Cuando la adrenalina, por ejemplo, se une a un receptor p adrenrgico, activa la adenil ci clasa mientras que cuando se une a un receptor a2 adrenrgico inhibe a la enzi ma. La diferencia entre ambos radica en la protena G que acopla en cada caso estos receptores a la ciclasa. Los receptores P-adrenrgicos se acoplan funcio nalmente a la adenil ciclasa a travs de una protena Gs mientras que los recep tores a 2 adrenrgicos se acoplan a la misma enzima a travs de una protena G inhibidora (G,). Una G puede contener el mismo complejo P/que una Gs pero tiene una subunidad a diferente (a). Cuando son activados, los receptores a 2 adrenrgicos se unen a la protena G provocando que a se una a GTP y se diso cie del complejo Py. Se cree que tanto la a como el Py contribuyen a la inhibicin de la adenil ciclasa: a inhibe la adenil ciclasa, probablemente de forma directa mientras que Py puede inhibir la sntesis de AMP cclico de dos maneras -d irec tamente, unindose a la ciclasa, e indirectamente unindose a algunas subunidades a s libres de la misma clula, impidiendo as que activen molculas de ade nil ciclasa. Ms adelante veremos que G tam bin acta abriendo canales de K+ de la m em brana plasmtica, y parece probable que esta funcin sea ms impor tante que la inhibicin de la adenil ciclasa. Mientras que la toxina colrica cataliza la ADP ribosilacin de cxs y de esta forma inactiva la actividad GTPasa de ocs, la toxina pertsica, sintetizada por la bacteria que causa la tos ferina, cataliza la ADP ribosilacin de a. La ADP ribosi lacin de a impide que el complejo G pueda interactuar con los receptores, por lo que permanece unido a GDP y pierde la capacidad de inhibir la adenil ciclasa o de abrir los canales de K+. Las protenas G trimricas son molculas seal extraordinariamente versti les. En los ejemplos considerados anteriormente tanto la subunidad a como el complejo Py son com ponentes activos, pero en otros casos los receptores se ha llan acoplados a sus protenas diana nicamente a travs de la liberacin del complejo Py. Adems, los complejos Py tam bin pueden actuar como regulado res condicionales de protenas efectoras: por ejemplo pueden incrementar la ac tivacin de algunas formas de adenil ciclasa, pero nicamente si la ciclasa ha sido activada previamente por a s.

La protena quinasa dependiente de AMP cclico (quinasa A) media los efectos del AMP cclico 16
El AMP cclico ejerce sus efectos en las clulas animales principalmente activan do la enzima protena quinasa dependiente de AMP cclico (quinasa A), la cual cataliza la transferencia de un grupo fosfato terminal desde el ATP a un residuo especfico de serina o de treonina de determinadas protenas de la clula diana. Los residuos de aminocido que son fosforilados por la quinasa A se caracteri zan por estar unidos, por su lado amino terminal, a dos o ms aminocidos bsi-

Sealizacin va receptores de superficie celular asociados a protenas G

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AMP cclico

V
quinasa A inactiva

c?
subunidades catalticas activas
/ /M \X

subunidad reguladora

subunidad cataltica inactiva

com plejo de AMP cclico y de las subunidades reguladoras

cos. A su vez, la fosforilacin covalente de los residuos de aminocido adecua dos regula la actividad de la protena. La quinasa A se encuentra en todas las clulas animales y se cree que es la responsable de todos los efectos del AMP cclico en la mayora de las clulas. (La nica funcin conocida diferente del AMP cclico en mamferos consiste en re gular una clase especial de canales inicos en neuronas olfativas sensibles al olor.) Los substratos de la quinasa A son diferentes en diferentes tipos celulares, lo cual explica por qu los efectos del AMP cclico varan en funcin de la clulas diana de que se trate. En su estado inactivo, la quinasa A es un complejo formado por dos subuni dades catalticas y dos subunidades reguladoras que unen AMP cclico. La unin de AMP cclico altera la conform acin de las subunidades reguladoras, haciendo que se disocien del complejo. Las subunidades catalticas liberadas resultan ac tivas para fosforilar especficam ente determinadas molculas proteicas (Figura 15-24). La fosforilacin de protenas mediada por AMP cclico fue demostrada por primera vez en estudios del m etabolismo del glucgeno en clulas de msculo esqueltico. El glucgeno constituye la principal reserva de glucosa, y tanto su sntesis com o su degradacin en el msculo esqueltico estn reguladas por la adrenalina. Por ejemplo, cuando por cualquier causa un animal se halla asusta do o en tensin, su glndula suprarrenal segrega adrenalina a la sangre, ponien do en estado de alerta a diversos tejidos del cuerpo. Entre otros efectos, la adrenalina circulante induce a las clulas musculares a degradar su glucgeno hasta glucosa 1-fosfato y a detener la sntesis de glucgeno. La glucosa se oxida a travs de la glucolisis suministrando ATP para la contraccin muscular sosteni da. De esta forma, la adrenalina prepara a las clulas musculares para una activi dad intensa. La adrenalina se une a receptores P adrenrgicos de la superficie de la clula muscular, incrementando los niveles citoslicos de AMP cclico. A su vez, el AMP cclico activa la quinasa A, la cual fosforila otras dos enzimas. La pri mera de ellas, la fosforilasa quinasa es la primera protena quinasa que fue des cubierta (1956) y a su vez, fosforila la enzima glucgeno fosforilasa, activndola para que libere residuos de glucosa a partir de la molcula de glucgeno (Figura 15-25). La otra enzima que resulta fosforilada por la accin de la quinasa A es la glucgeno sintasa, la cual cataliza el ltimo paso de la sntesis de glucgeno a partir de glucosa. Mediante esta cascada de interacciones, un incremento de los niveles de AMP cclico estimula la degradacin de glucgeno e inhibe su sntesis, con lo que aum enta al mximo la cantidad de glucosa disponible para la clula. En algunas clulas animales, un incremento de los niveles de AMP cclico activa la transcripcin de determinados genes. Por ejemplo, en las clulas que segregan la horm ona somatostatina, el AMP cclico activa los genes que codifi can esta hormona. La regin reguladora del gen de la somatostatina contiene una corta secuencia de DNA, denominada elemento respuesta al AMP cclico

Figura 15-24 Activacin de la proteina quinasa dependiente de AMP cclico (quinasa A). La unin de AMP cclico a las subunidades reguladoras induce en ellas un cambio de conformacin que las hace disociarse del complejo, activando as las subunidades catalticas. Cada subunidad reguladora tiene dos lugares de unin para AMP cclico, y la liberacin de las subunidades catalticas es un proceso cooperativo que requiere la unin de ms de dos molculas de AMP cclico al tetrmero. Este hecho hace que la respuesta de la quinasa a los cambios en la concentracin de AMP cclico sea aguda, como discutimos ms tarde. En la mayora de las clulas de mamfero existen al menos dos tipos de quinasas A: la del tipo I se halla fundamentalmente en el citosol mientras que la de tipo II se halla unida a travs de su subunidad reguladora a la membrana plasmtica, a la membrana nuclear y a los microtbulos. En ambos casos, sin embargo, cuando las subunidades catalticas son liberadas y activadas, pueden migrar al ncleo (donde pueden fosforilar protenas reguladoras de genes) mientras que las subunidades reguladoras permanecen en el citoplasma. La estructura tridimensional del dominio protena quinasa de la subunidad cataltica de la quinasa A se muestra en la Figura 5-12.

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Captulo 15 : Transmisin de seales entre clulas

quinasa A inactiva

Figura 15-25 Estimulacin de la degradacin de glucgeno por AMP cclico en clulas de msculo esqueltico. La unin de AMP cclico a
la quinasa A activa a esta enzima a fosforilar, y por tanto activar, a la fosforilasa quinasa, la cual, a su vez, fosforila y activa la glucgeno fosforilasa, la enzima que degrada el glucgeno. La quinasa A tambin incrementa, directa e indirectamente, la fosforilacin de la glucgeno sintasa inhibindola, inactivando as la sntesis de glucgeno (no se muestra).

GLUCGENO

GLUCOSA 1-FOSFATO

I
GLUCOLISIS

(CRE, de Cyclic AMP Response ElementJ, que tambin se encuentra en las regio nes reguladoras de otros genes activados por el AMP cclico. Esta secuencia es reconocida por una protena especfica reguladora de genes denominada prote na de unin a CRE (CREB, de CRE-Binding). Cuando CREB es fosforilada por la quinasa A sobre un residuo de serina, adquiere la capacidad de activar la trans cripcin de estos genes; la fosforilacin estimula la actividad transcripcional de CREB sin afectar sus propiedades de unin al DNA. Si este residuo de serina se modifica por mutacin, CREB resulta inactiva y ya no puede estimular la trans cripcin de ningn gen en respuesta a un incremento de los niveles de AMP c clico.

Diversas protena serina/treonina fosfatasas revierten rpidamente los efectos de la quinasa A17
Normalmente es importante que los efectos del AMP cclico sean transitorios, por lo que es evidente que las clulas han de desfosforilar las protenas que han sido fosforiladas por la quinasa A. En general la desfosforilacin de las serinas y las treoninas fosforiladas est catalizada por cuatro grupos de fosfoprotena serina/treonina fosfatasas -la s protena fosfatasas I, ILA, IIB y IIC. Excepto para el caso de la protena fosfatasa IIC (que es una fosfatasa poco importante, no relacionada con las otras), las dems fosfatasas estn compuestas por una subunidad cataltica homologa que forma un complejo con una o ms subunidades reguladoras. La protena fosfatasa I juega un importante papel en la res puesta al AMP cclico, como veremos a continuacin. La protena fosfatasa ILA tiene una especificidad muy amplia y parece ser la principal fosfatasa responsable de revertir muchas de las fosforilaciones catalizadas por serina/treonina quinasas; juega un papel importante en la regulacin del ciclo celular. La protena fosfatasa IIB, tambin denominada calcineurina, es activada por Ca2+ y es especialmente abundante en el cerebro. La actividad de cualquier protena regulada por fosforilacin depende del balance en un instante dado entre las actividades de las quinasas que la fosforilan y de las fosfatasas que constantem ente la estn desfosforilando. La protena fosfatasa I es responsable de la desfosforilacin de muchas de las protenas que son fosforiladas por la quinasa A. Por ejemplo, inactiva la CREB eliminando su

Sealizacin va receptores de superficie celular asociados a protenas G

793

fosfato activador, inactivando as la respuesta transcripcional causada por un increm ento de los niveles de AMP cclico. En las clulas del msculo esqueltico, la protena fosfatasa I desfosforila cada una de las tres enzimas clave del m etabo lismo del glucgeno que, como hemos mencionado antes, resultan fosforiladas por la quinasa A en respuesta a la adrenalina, y hacen que la clula cambie de una situacin de sntesis de glucgeno a otra de degradacin. La protena fosfa tasa I tiende a contrarrestar estas fosforilaciones, pero en las clulas musculares activadas por adrenalina su actividad est suprimida por otra enzima diana de la quinasa A, que es una protena inhibidora defosfatasas especfica. Cuando esta protena inhibidora es fosforilada por la quinasa A, se une a la protena fosfatasa I inactivndola (Figura 15-26). Activando la fosforilasa quinasa e inhibiendo si multneamente la accin opuesta de la protena fosfatasa I, la quinasa A genera un cambio mucho mayor en el metabolismo del glucgeno del que podra obtener mediante su accin a travs de una sola de estas enzimas. Habiendo discutido de qu forma las protenas G trimricas acoplan los re ceptores a la adenil ciclasa alterando los niveles de AMP cclico en las clulas, ahora considerarem os de qu form a las protenas G acoplan los receptores a otra enzima crucial -la fosfolipasa C. La activacin de esta enzima conduce a un increm ento de la concentracin de Ca2+ en el citosol, y el Ca2+ es utilizado, de una forma incluso ms general que el AMP cclico, como mediador intracelular.

Para utilizar el Ca2+ como seal intracelular, las clulas han de m antener los niveles basales de Ca2+ muy bajos 18
La concentracin de Ca2+ libre en el citosol de cualquier clula es extrem ada m ente baja (< 10- 7 M), m ientras que su concentracin en el fluido extracelular (~10~3M) y en el retculo endoplasm tico (ER) es alta. As pues, existe un enor me gradiente de Ca2+ que tiende a llevar Ca2+ hacia el citosol, tanto a travs de la m em brana plasm tica com o a travs de la m em brana de ER. Cuando una seal abre transitoriam ente los canales de Ca2+ en alguna de estas dos m em branas, el Ca2+ fluye precipitadam ente al citosol, increm entando dram tica m ente la concentracin local de Ca2+ y activando m ecanism os celulares sensi bles a Ca2+. Para que este m ecanism o de sealizacin sea funcional, es necesario que la concentracin de Ca2+ en el citosol se mantenga baja, lo cual se consigue de dife-

quinasa A inactiva cAMP uinasa A activa

inhibidora de la fosfatasa V inactiva

^ p ro te in a

/''proteina

inhibidora de la fosfatasa activa !

Figura 15-26 Papel de la protena fosfatasa I en la regulacin del metabolismo del glucgeno por el AMP cclico. El AMP cclico inhibe la protena fosfatasa I, que en caso contrario podra oponerse a la reaccin de fosforilacin estimulada por el AMP cclico. Ello ocurre ya que la quinasa A fosforila a la protena inhibidora de la fosfatasa, la cual entonces se une a la fosfatasa I, inhibindola.

UNION DE LA ______ INA INHIBIDORA FOSFORILADA INHIBE LA PROTENA FOSFATASA

794

Captulo 15 : Transmisin de seales entre clulas

rentes formas. Todas las clulas eucariotas tienen en su membrana plasmtica una ATPasa que utiliza la energa de la hidrlisis del ATP para bombear Ca2 + ha cia el exterior del citosol. Las clulas tales com o las musculares y las nerviosas, que utilizan de forma intensa el sistema de sealizacin del Ca2+ , disponen en su membrana plasmtica de otra bom ba de Ca2 + adicional, que acopla el eflujo de Ca2+ a un influjo de Na+. Este intercambiador Ca2 + -Na+ tiene una afinidad por el Ca2+ relativamente baja, por lo cual nicamente acta de forma eficiente cuando los niveles citoplasmticos de Ca2+ aumentan 10 veces por encim a de sus valores normales, tal como ocurre despus de que una clula nerviosa o una clula mus cular hayan sido estimuladas repetidamente. En la membrana de ER existe otra bom ba que tambin desempea un papel importante en el mantenimiento de una concentracin baja de Ca2+ en el citosol: esta ATPasa dependiente de Ca2 + permite al ER captar grandes cantidades de Ca2 + del citosol, en contra del gra diente de concentracin y aunque los niveles de Ca2 + en el citosol sean bajos. Habitualmente, la concentracin de Ca2 + libre en el citosol vara desde 10~ 7 M cuando la clula est en reposo, hasta alrededor de 5 x 10-6 M cuando est ac tivada por una seal extracelular. Sin embargo, cuando la clula est daada y no puede extraer Ca2+ del citosol de forma eficiente, la concentracin de Ca2 + puede aumentar de forma peligrosa (>10-5 M). En estas circunstancias, comienza a actuar una bom ba de Ca2 + de baja actividad pero gran capacidad, situada en la membrana interna de la mitocondria, y utiliza el gradiente electroqumico gene rado a travs de esta membrana durante las etapas de transferencia de electro nes de la fosforilacin oxidativa, para extraer Ca2 + del citosol importndolo a la mitocondria. En la Figura 15-27 se resume este mecanismo.

Figura 15-27 Controles de la concentracin citoslica de Ca2+. El dibujo muestra un esquema de los mecanismos principales a travs de los cuales la clula mantiene muy bajas las concentraciones de Ca2 +en el citosol, en contra de elevadas concentraciones de Ca2 +en el fluido extracelular. El Ca2 +es bombeado activamente desde el citosol al exterior de la clula (A) y al interior de ER (B). Adems, en la clula existen varios tipos de molculas que unen Ca2 +libre. La mitocondria tambin puede bombear Ca2 +extrayndolo del citosol, pero slo lo hace de forma eficiente cuando los niveles de Ca2 +son extremadamente altos -habitualmente como resultado de una alteracin de la clula.

El Ca2+ acta com o un m ensajero intracelular ubicuo 19

La primera evidencia directa de que el Ca2+ acta como un mediador intracelular proviene de un experimento realizado en 1947, que demostr que la inyeccin intracelular de una pequea cantidad de Ca2+ provoca la contraccin de las fi bras musculares esquelticas. Recientem ente se ha puesto claramente de m ani fiesto que el Ca2 + acta com o un mensajero intracelular en una amplia gama de respuestas celulares, entre las que se pueden destacar la secrecin y la prolifera-

ATPasa dependiente de Ca2+ en la membrana del retculo endoplasmtico

molculas del citoplasma que unen Ca2+

importacin activa de Ca2+ en la mitocondria

transporte de intercam bio de Ca2+ im pulsado por Na+

ATPasa dependiente de Ca2+ m olcula que une calcio

retculo endoplasm tico CITOSOL CITOSOL

m itocondria

Sealizacin va receptores de superficie celular asociados a protenas G

795

m em brana plasmtica polarizada

m em brana plasm tica despolarizada

Figura 15-28 Dos procesos com unes a travs de los cuales el Ca2+ puede entrar en el citosol en respuesta a seales extracelulares. En (A) el Ca2 +

entra a un terminal nervioso desde el fluido extracelular a travs de canales de Ca2 +regulados por voltaje, cuando la membrana del terminal nervioso es despolarizada por un potencial de accin. En (B), la unin de una molcula seal extracelular a un receptor de superficie celular genera inositol trisfosfato, el cual estimula la liberacin de Ca2 +desde el ER.

cin celular. Se han definido dos procesos en la sealizacin por Ca2+ , uno de ellos utilizado principalmente por clulas con actividad elctrica (excitables) y el otro utilizado por casi todas las clulas eucariotas. El primero de estos procesos ha sido particularmente bien estudiado en las clulas nerviosas, en las cuales la despolarizacin de la m em brana plasmtica provoca un influjo de Ca2 + al inte rior del terminal nervioso inicindose la secrecin de un neurotransmisor; el Ca2+ entra a travs de canales regulados por voltaje que se abren cuando la m em brana plasmtica del terminal nervioso se despolariza por un potencial de accin que llega hasta el terminal (vase Figura 11-34). En el segundo proceso, que es ubicuo, la unin de molculas seal extracelulares a receptores de super ficie celular provoca la liberacin de Ca2+ del ER; los acontecim ientos que ocu rren en la superficie celular estn acoplados a la apertura de los canales de Ca2+ del ER a travs de otra molcula m ensajera intracelular, el inositol trisfosfato (Fi gura 15-28), como discutiremos despus.

Algunos receptores relacionados con protenas G activan el proceso de sealizacin de fosfolpidos de inositol activando la fosfolipasa C-(J20
En 1953 se sugiri por primera vez que los fosfolpidos de inositol (fosfoinostidos ) desempean un cierto papel en la transduccin de la seal extracelular, cuando se descubri que algunas molculas seal extracelulares estimulan la in corporacin de fosfato radiactivo a fosfatidilinositol (PI, de phosphatidylinositol), una clase minoritaria de fosfolpidos de las m embranas celulares. Ms tarde se descubri que esta incorporacin se produce por la degradacin y posterior sntesis de fosfolpidos de inositol. Se encontr que los fosfolpidos de inositol ms importantes en la transduccin de la seal son dos derivados fosforilados del PI, el PI-fosfato (PIP, de Pl-phosphate y el Pl-bisfosfato (PIP2). Se cree que ambos compuestos se hallan localizados principalmente en la cara interna de la m em brana plasmtica (Figura 15-29). A pesar de que en las membranas de las clulas animales el PIP 2 es m enos abundante que el PI, es la hidrlisis de PIP2 la que es realmente importante en el proceso de sealizacin. La cadena de acontecim ientos que lleva a la rotura de PIP2, empieza con la unin de una molcula seal a un receptor unido a la protena G de la m em bra na plasmtica. Se ha demostrado que ms de 25 receptores de superficie diferen tes utilizan esta va de transduccin; en la Tabla 15-2 se presentan varios ejem-

796

Captulo 15: Transmisin de seales entre clulas

Figura 15-29 Los fosfolpidos de inositol (fosfoinostidos). Los

cadenas de cidos grasos del exterior de la m onocapa lipidica de la m em brana plasm tica

3 J S s < c o

< <

y
> / c o

cadenas de cidos grasos del interior de la monocapa lipdica de la m em brana plasmtica

3 J j s <

<

J 3 1

y <
<

y y
> /

c=o c o

ch -ch -ch

O \

O i

c h ?- c h - c h

o o \ I

< > c=o c o 1 1

fosfoinostidos (PIP y PIP2) se producen por fosforilacin del fosfatidilinositol (Pl). A pesar de que los tres fosfolpidos de inositol pueden degradarse en el proceso de respuesta a una seal, la degradacin ms crtica es la de PIP2, a pesar de que es el menos abundante, ya que constituye menos del 10% del total de lpidos de inositol y menos del 1% del total de fosfolpidos.

O CITOSOL

CH - C H - C H ,

0 'O

?"

1 , o o OH \j

OHHO/1 r ?i

inositol fosfatidilinositol (Pl) PI 4-fosfato (PIP)

o=p-cr I cr

Pl 4,5-bisfosfato (PIP2)

pos de respuestas mediadas de esta forma. Los detalles del proceso de activa cin no son tan bien conocidos como los del AMP cclico, pero existen eviden cias crecientes de que en la membrana plasmtica acta el mismo tipo de m eca nismo constituido por varias etapas. Un receptor activado estimula a una protena G denominada Gq, la cual, a su vez, activa una fosfolipasa C especfica de fosfoinositoles, denominada fosfolipasa C-(J. En menos de un segundo, esta en zima degrada el PIP 2generando dos productos: inositol trisfosfato y diacilglicerol (Figura 15-30). En este punto, el proceso de sealizacin se bifurca en dos ra mas. Ambas molculas juegan papeles cruciales en la sealizacin celular, por lo que las consideraremos por separado.

El inositol trisfosfato (IP3) acopla la activacin del receptor con la liberacin de Ca2+ del E R 21
El inositol trisfosfato (IP3) producido por la hidrlisis de PIP 2 es una pequea molcula hidrosoluble que se libera de la membrana plasmtica y difunde rpi damente por todo el citosol. All, libera Ca2+ del ER unindose a canales liberado res de Ca2+ sensibles a IP3 de la membrana del ER. Los canales son estructural-

Tabla 15-2 Algunas resp u estas celu lares m ed iad as p o r recep to res unidos a p roten as G, acop lad os al p ro ceso de sealizacin de los fosfolpidos de inositol Tejido dian a M olcula seal R espu esta prin cip al

Hgado Pncreas Msculo liso Clula cebada Plaquetas sanguneas

vasopresina acetilcolina acetilcolina antgeno trombina

degradacin del glucgeno secrecin de amilasa contraccin secrecin de histamina agregacin

Sealizacin va receptores de superfcie celular asociados a protenas G

7 97

Figura 15-30 Hidrlisis de PIP2. La

cadenas de cidos grasos del exterior de la monocapa lipidica de la m em brana plasm tica

cadenas de cidos grasos del interior de la m onocapa lipidica de la m em brana plasm tica

c=o c=o I 1
o o
ch -ch -ch

CITOSOL

hidrlisis de PIP2produce dos mediadores intracelulares: el inositol trisfosfato (IP3 ), el cual difunde a travs del citosol y provoca la liberacin de Ca2 +desde el ER, y el diacilglicerol, que permanece en la membrana y colabora en la activacin de la enzima protena quinasa C (vase ms adelante). Al menos existen tres clases de fosfolipasas C -0, y y 5- y es la de clase P la que se activa por receptores unidos a protena G. Ms adelante veremos que la clase y es activada por otra clase de receptores, denominados receptores tirosina quinasa, que activan el proceso de sealizacin de fosfolpidos de inositol sin ninguna protena G intermediaria.

PI 4,5-bisfosfato (PIP2 )

LIBERA Ca DESDE EL RETCULO ENDOPLASMTICO

inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3)

mente similares a los canales de liberacin de Ca2+ (receptores de rianodina ) del retculo sarcoplasmtico de las clulas musculares, los cuales liberan el Ca2 +que desencadena el proceso de contraccin muscular (vase Figura 16-92). Ambos tipos de canales estn regulados por retroalimentacin positiva, ya que el Ca2 +li berado puede unirse a los canales incrementando an ms la liberacin de Ca2+. Ello hace que la liberacin de Ca2+ ocurra de una manera repentina, tipo todo o nada. En muchas clulas incluyendo las clulas musculares, se encuentran am bos tipos de canales liberadores de Ca2+. Para acabar la respuesta inicial de Ca2 + actan dos mecanismos: (1) el IP3 es rpidamente desfosforilado (y as inactivado) m ediante fosfatasas especficas, y (2) el Ca2+ que entra en el citosol es rpidamente bombeado hacia el exterior, principalmente hacia el exterior de la clula. Sin embargo no todo el IP 3 es desfosforilado: algunas molculas son fosforiladas hasta 1,3,4,5-tetraquisfosfato (IP4), el cual puede mediar respuestas lentas pero ms prolongadas en la clula o facilitar la recuperacin de las reservas intracelulares de Ca2 + a partir del fluido extracelular. La enzima que cataliza la pro duccin de IP 4 se activa por un incremento de la concentracin citoslica de Ca2+ inducida por IP3, lo cual constituye una forma de retroalimentacin negati va de los niveles de IP3.

A menudo las oscilaciones de Ca2+prolongan la respuesta inicial de Ca2+inducida por IP 322

Cuando se utilizan indicadores fluorescentes sensibles a Ca2+ , como la aecuorina o fura-2 (se discute en el Captulo 4) para estudiar las variaciones de los niveles citoslicos de Ca2+ en clulas individuales en las que se ha activado el proceso de sealizacin de fosfolpidos de inositol, a menudo se observa que la seal inicial de Ca2+ se propaga com o una ola a travs del citosol desde una zona localizada 798 Captulo 15 : Transmisin de seales entre clulas

concentraciones de vasopresina 0,4 nM 0,6 nM 0,9 nM

Figura 15-31 Induccin de oscilaciones de Ca2+ en una clula heptica por vasopresina. La clula fue cargada con la protena sensible a Ca2+ , aecuorina, y a continuacin fue expuesta a concentraciones crecientes de vasopresina. Ntese que la frecuencia de las espigas de Ca2+ aum enta a medida que aum enta la concentracin de vasopresina, pero que la amplitud de las espigas no se ve afectada. (Adaptado de N.M. Woods, K.S.R. Cuthbertson y P.H. Cobbold, N atu re 319:600-602,1986. 1986 Macmillan Magazines Ltd.)

tiem po (minutos)

de la clula. Adems, a menudo el incremento transitorio inicial de la concentra cin de Ca2+ viene seguido por series de espigas de concentracin de Ca2+ , cada una de las cuales tarda en producirse del orden de segundos o minutos; es tas oscilaciones de Ca2+ pueden persistir mientras los receptores se mantengan activados en la superficie de la clula (Figura 15-31). El mecanismo responsble de la propagacin de las olas de Ca2 + y de la ge neracin de las oscilaciones no es conocido con certeza, a pesar de que se han propuesto una gran cantidad de modelos para explicarlo. En la mayora de estos modelos tanto la propagacin como las oscilaciones dependen de una retroalim entacin positiva, en la que el Ca2+ activa su propia liberacin produciendo una espiga de Ca2+ del todo o nada. Los modelos se diferencian entre s princi palmente en considerar si el Ca2 + acta directamente sobre los canales de libera cin de Ca2+ del ER estimulando su propia liberacin, o bien si acta indirecta mente incrementando la actividad de la fosfolipasa C, generando as oleadas de IP3 que, a su vez, induciran oleadas de liberacin de Ca2+ . El significado biolgico de las oscilaciones de Ca2+ tambin es incierto. A menudo su frecuencia depende de las concentracin del ligando seal extracelular (Figura 15-31) y puede, en principio, traducirse a respuesta celular de pendiente de frecuencia. En clulas de la hipfisis secretoras de horm ona, por ejemplo, la estim ulacin por una m olcula seal extracelular induce espigas repetidas de Ca2+, cada una de las cuales est asociada con un pulso de secre cin de horm ona. Se ha sugerido que este hecho puede maximizar la secrecin impidiendo los efectos txicos de un increm ento sostenido de la concentra cin citoslica de Ca2+.

El diacilglicerol activa la protena quinasa C (quinasa C)23

Al mismo tiempo que el IP3 producido por la hidrlisis del PIP2 incrementa la con centracin de Ca2 + en el citosol, el otro producto de hidrlisis -e l diacilglicerolejerce efectos bastantes diferentes. Tiene dos papeles funcionales potenciales. En primer lugar, puede ser posteriormente degradado, liberando cido araquidnico que puede actuar como mensajero o ser utilizado en la sntesis de eicosanoides (vase Figura 15-6); En segundo lugar, y mucho ms importante, activa una prote na serina/treonina quinasa que fosforila varias protenas de la clula diana.

Sealizacin va receptores de superficie celular asociados a protenas G

799

La enzima activada por el diacilglicerol se denomina proteina quinasa C (quinasa C o PKC de Protein Kinase C), debido a que es dependiente de Ca2+. Se cree que el increm ento inicial de la concentracin citoslica de Ca2 + inducido por IP 3 altera la quinasa C, trastocndola de la cara citoslica de la membrana plasmtica a la cara citoplasmtica. Se activa por la com binacin de Ca2+ , diacil glicerol y el fosfolipido de m em brana cargado negativamente, fosfatidilserina. De las ocho o ms isoformas diferentes de la quinasa C en mamferos, al menos cuatro son activadas por diacilglicerol. Como el diacilglicerol producido inicialmente por la rotura de PIP2 es rpi damente metabolizado, no puede mantener la actividad de la quinasa C como sera necesario para obtener respuestas mantenidas como la proliferacin o la diferenciacin. La activacin prolongada de la quinasa C depende de una segun da ola de produccin de diacilglicerol catalizada por fosfolipasas que rompen el fosfolpido principal de la mem brana fosfatidilcolina. No se conoce cmo resul tan activadas estas fosfolipasas que actan retrasadas. Cuando la quinasa C es activada fosforila residuos determinados de serina o de treonina de protenas diana, las cuales varan en funcin del tipo de clula de que se trate. Las mayores concentraciones de quinasa C se han encontrado en el cerebro, donde (entre otras cosas) fosforila canales inicos de las clulas nervio sas alterando sus propiedades y, por lo tanto, variando la excitabilidad de las m em brana plasmtica de las clulas nerviosas. En muchas clulas la activacin de la quinasa C incrementa la transcripcin de determinados genes. Se conocen por lo menos dos procesos. En uno de ellos, la qui nasa C activa una cascada de protenas quinasa que conduce a la fosforilacin, y ac tivacin, de una protena reguladora de genes unida a DNA; en el otro proceso, la activacin de la quinasa C conduce a la fosforilacin de una protena inhibidora, li berando as una proteina citoplasmtica reguladora de genes que puede migrar al ncleo y estimular la transcripcin especfica de determinados genes (Figura 15-32).

QUINASA C INACTIVA MEMBRANA PLASMTICA (^quinasa c ) MAP

quinasa

QUINASA C ACTIVA

A
CITOSOL NF-KB

MAP
quinasa

Figura 15-32 Dos procesos intracelulares mediante los cuales la quinasa C activa puede activar la transcripcin especfica de determinados genes. En uno de ellos {flechas rojas), la quinasa C activa una cascada de fosforilaciones que conduce a la fosforilacin de una protena quinasa clave, denominada MAP quinasa (se discute ms adelante), la cual, a su vez, fosforila y activa la protena reguladora de genes Elk-1. Elk-1 se halla unida a cortas secuencias de DNA (denominadas

elementos de respuesta srica, SRE, de Serum Response

Elements) en asociacin con otra protena de unin al DNA (denominada factor de respuesta srica, SRF, de Serum Response Factor). En el otro proceso (flechas verdes) la activacin de la quinasa C conduce a la fosforilacin de Ik-B, la cual libera la protena reguladora de genes NF-kB de forma que ahora puede migrar hasta el ncleo y all activar la transcripcin de determinados genes.

NO HAY TRANSCRIPCION DE LOS GENES 1 Y 2

TRANSCRIPCION ACTIVADA DE LOS GENES 1 Y 2

800

Captulo 15 : Transmisin de seales entre clulas

m olcula seal extracelular fosfolipasa C-(3 activada diacilglicerol

ESPACIO EXTRACELULAR MEMBRANA PLASMTICA CITOSOL quinasa C activada

receptor activado
i & n ^ i

steres de forbol protena Gq activada m im etizado por ionforos de Ca2 UBERA Ca;;: DEL RETCULO ENDOPLASMTICO

FOSFORILA PROTENAS CELULARES

En la Figura 15-33 se muestra cada una de las dos ramas del proceso de se alizacin de fosfolpidos de inositol. Como se indica en la figura, cada rama del proceso puede ser mimetizada mediante la adicin a clulas intactas de agentes farmacolgicos especficos . Los efectos de IP3 pueden ser mimetizados utilizan do un ionforo de Ca2+ , com o el A23187 o la ionomicina, los cuales permiten que el Ca2+ entre al citosol desde el lquido extracelular (se discute en el Captulo 11). Los efectos del diacilglicerol se pueden mimetizar por steres de forbol, produc tos vegetales que se unen a la quinasa C y la activan directamente. Utilizando es tos reactivos, se ha podido demostrar que, a menudo, las dos ramas del proceso colaboran produciendo una respuesta celular completa. Por ejemplo, algunos ti pos celulares pueden ser estimulados a proliferar en cultivo cuando son tratados con ionforos de calcio y con un activador de la quinasa C, pero no si se tratan con uno solo de ambos reactivos.

La calmodulina es un receptor intracelular de Ca2 +ubicuo24

Habitualmente la concentracin de Ca2 + libre en el citoplasma es < 10~ 7 M y ge neralmente no aumenta por encim a de 6 x 10-6 M, incluso aunque la clula est activada por un influjo de Ca2+. As, cualquiera que sea la estructura de la clula que acte directamente como diana para la regulacin dependiente de Ca2+ de ber tener una constante de afinidad (Ka) para el Ca2+ de unos 106 litros/mol. Adems, como la concentracin de Mg2 + en el citosol es relativamente constante (alrededor de 10~ 3 M), estos lugares de unin al Ca2+ debern presentar una se lectividad para el Ca2+ sobre el Mg2+ de unas 1000 veces como mnimo. Se cono cen varias protenas que unen Ca2+ , que cumplen estos requisitos. La primera protena de este tipo que se descubri es la troponina C de las clulas del msculo esqueltico; en el Captulo 16 se discute el papel de esta pro tena en la contraccin muscular. En todas las clulas animales y vegetales en que se ha estudiado, se ha encontrado otra protena que une Ca2+, estrecham en te relacionada con la troponina C, denominada calmodulina. Una clula animal tpica contiene ms de 107 molculas de calmodulina, lo cual significa aproxima damente el 1% de la masa total de protena de la clula. La calmodulina acta como un receptor intracelular polivalente de Ca2+ que media la mayora de los procesos regulados por Ca2+ . Se trata de una cadena polipeptdica altamente conservada, de unos 150 residuos de aminocido, con cuatro lugares de unin con una alta afinidad para el Ca2+ . Cuando une calcio, la calmodulina sufre un importante cambio de conformacin (Figura 15-34A).

Figura 15-33 Las dos ram as del proceso de los fosfolpidos de inositol. El receptor, una vez activado, se une a una protena G trimrica especfica (Gq) haciendo que la subunidad a se disocie y active la fosfolipasa C-0, la cual rompe el PIP2 generando IP 3 y diacilglicerol. El diacilglicerol (junto con el Ca2+ que lleva unido y con fosfatidilserina -n o se muestra en el dibujo), activa la quinasa C. Tanto la fosfolipasa C-P com o la quinasa C son enzimas solubles en agua que, al activarse, se translocan desde el citosol hasta la cara interna de la m embrana plasmtica. Los efectos de IP3 pueden ser mimetizados experimentalmente en clulas intactas mediante el tratamiento con ionforos de Ca2 + mientras que los efectos del diacilglicerol pueden ser mimetizados mediante el tratamiento con steres de forbol, los cuales se unen a la quinasa C activndola.

Sealizacin va receptores de superficie celular asociados a protenas G

801

La activacin alostrica de la calmodulina por el Ca2+ es anloga a la activa cin alostrica de la quinasa A por el AMP ciclico, con la diferencia de que el com plejo Ca2+-calmodulina no tiene actividad enzimtica sino que acta unin dose a otras protenas. En algunos casos, la calmodulina acta como una subunidad reguladora permanente de un complejo enzimtico, pero en la mayora de los casos la unin del Ca2+ induce a la calmodulina a unirse a varias protenas diana de la clula, alterando su actividad. Cuando el complejo Ca2+-calmodulina se une a su protena diana puede sufrir un cambio de conformacin posterior mucho ms importante (Figura 15-34B). De entre las protenas diana reguladas por el complejo Ca2 + -calmodulina, va rias de ellas son enzimas o protenas de transporte a travs de la membrana. En muchas clulas, por ejemplo, el complejo Ca2+-calmodulina se une, activando, la Ca2+ -ATPasa de la membrana plasmtica, la cual bom bea Ca2+ hacia el exterior de la clula. As, si la concentracin de Ca2+ en el citosol aumenta, la bomba se acti va, lo cual contribuye a que los niveles citoslicos de Ca2+ vuelvan a los valores normales. Sin embargo, la mayor parte de los efectos del complejo Ca2 + -calmodulina son ms directos y estn mediados por proteina quinasas dependientes de

Ca2+ -calmodulina.

En las clulas animales la mayora de acciones del Ca2 + se producen a travs de proteina quinasas dependientes de Ca2+ -calmodulina (quinasas CaM)2 5
La mayora de los efectos de Ca2+ en las clulas animales estn mediados por fos forilaciones de protenas catalizadas por una familia de protena quinasas de pendientes de Ca2+-calm odulina (quinasas CaM). Estas quinasas fosforilan resi duos de serina o de treonina de determinadas protenas y, como en el caso del AMP cclico, la respuesta de una clula diana a un incremnto de la concentra cin de Ca2+ libre en el citosol depende del tipo de quinasas CaM reguladas de que disponga la clula. Las primeras quinasas CaM que se descubrieron -la qui nasa de la cadena ligera de la miosina, que activa la contraccin del msculo liso, y la fosforilasa quinasa, que activa la degradacin del glucgeno- presentan una especificidad de substrato muy alta. Ms recientemente, sin embargo, se han identificado algunas quinasas CaM con una especificidad ms amplia, y que parecen ser las responsables de mediar muchas de las acciones del Ca2 + en las clulas animales. El ejemplo m ejor estudiado de una quinasa multifuncional Ca2+ -calmodulina es la quinasa-CaM II, que se encuentra en todas las clulas animales pero

Figura 15-34 Estructura del complejo Ca2+-calmodulina, basada sobre estudios de difraccin de rayos X y de resonancia m agntica nuclear (NMR, de Nuclear Magnetic Reso nance). (A) La molcula parece una pesa de gimnasia, con dos cabezas globulares conectadas mediante una larga hlice a expuesta. Cada una de las dos cabezas tiene dos dominios de unin al Ca2+ , cada uno de los cuales est constituido por un lazo de 12 residuos de aminocidos en el que algunas cadenas laterales de cido asprtico y de cido glutmico forman enlaces inicos con el Ca2+. Los dos lugares de unin al Ca2 + del extremo carboxilo terminal de la molcula tienen una afinidad por el Ca2+ diez veces superior a la del extremo amino terminal. En solucin la molcula es flexible, mostrando un abanico de formas, desde formas extendidas (como la de la figura) hasta formas ms compactas. (B) Cambios estructurales del complejo Ca2+-calmodulina que ocurren cuando ste se une a una protena diana (en este ejemplo, un pptido que contiene un dominio de unin para Ca2+-calmodulina de una protena quinasa dependiente de Ca2+calmodulina [la quinasa de la cadena ligera de la miosina, tratada ms adelante]). Ntese que el complejo Ca2+ -calmodulina se dobla com o una navaja de bolsillo abrazando al pptido. (A, basado en datos de cristalografa de rayos X de Y.S. Babu et al., N ature 315:37-40,1985. 1985 Macmillan Magazines Ltd.; B, basado en datos de cristalografa de rayos X de W.E. Quiocho, Science 257:1251-1255, 1992, y en datos de NMR de M. Ikura et al., Science 256:632-638,1992. the AAAS.)

802

Captulo 15 : Transmisin de seales entre clulas

dom inio inhibidor proteina fosfatasa INDEPENDIENTE DE Ca: (50-80% ACTIVO) dom inio cataltico COOH INACTIVO

calm odulina

Ca2+-calm odulina

autofosforilacin COMPLETAMENTE ACTIVO ACTIVADO

especialmente enriquecida en el sistema nervioso. Constituye hasta el 2% de la masa total de protena en algunas regiones del cerebro, altamente concentradas en sinapsis. Por ejemplo, cuando las neuronas que utilizan catecolaminas (dopamina, noradrenalina o adrenalina) como neurotransmisores) son activadas, el influjo de Ca2+ a travs de canales de Ca2+ regulados en sus membranas plasmti cas induce a la clula a segregar su neurotransmisor. El influjo de Ca2+ tambin hace que la quinasa CaM II se fosforile, activndose, y activando a la tirosina hidroxilasa, la cual es la enzima reguladora de flujo de la sntesis de catecolam i nas. De esta forma, cuando la clula se activa se estimula tanto la secrecin como la sntesis del neurotransmisor. La quinasa CaM II tiene una propiedad destacable: puede actuar como un dispositivo de memoria molecular, colocndose en un estado activo cuando es expuesta a Ca2+ -calmodulina y permaneciendo activa incluso despus de que la concentracin de Ca2+ haya bajado. Ello es debido a que la quinasa se fosforila a ella misma (un proceso denominado autofosforilacin), tal como fosforila a otras protenas celulares cuando es activada por Ca2 + -calmodulina. En su estado autofosforilado la enzima permanece activa en ausencia de Ca2+, prolongando as la duracin de la actividad de la quinasa despus de que acabe la seal inicial activadora de Ca2+ ; la actividad se mantiene hasta que las fosfatasas abaten la activi dad autofosforilativa de la enzima, inhibindola (Figura 15-35). Debido a estas propiedades, la activacin de la quinasa CaM II puede ser utilizada como una memoria traza de un pulso de Ca2+ anterior, y al parecer ju e ga un importante papel en algunos tipos de memoria y de aprendizaje del siste ma nervioso de los vertebrados. Ratones mutantes que carecen de la subunidad especfica de cerebro que se ilustra en la Figura 15-35 tienen defectos especficos en su capacidad de recordar la localizacin de un objeto -e s decir, de aprendiza je espacial.

Figura 15-35 Activacin de la quinasa CaM II. La enzim a es un com plejo proteico de unas 12 subunidades. Las subunidades son de cuatro tipos homlogos (a, P, y y 8 ) que se expresan en diferentes tipos celulares en proporciones diferentes. En la figura se presenta nicam ente la subunidad a (en gris), que se expresa slo en el cerebro. En ausencia de Ca2+-calmodulina la enzim a es inactiva com o consecuencia de una interaccin entre el dominio inhibidor y del dominio cataltico. La unin de Ca2+-calmodulina altera la conform acin de la protena, permitiendo que el dominio cataltico fosforile el dominio inhibidor de subunidades vecinas del com plejo as com o otras protenas de la clula (no se muestran). La autofosforilacin del com plejo enzim tico (por fosforilacin mutua de sus subunidades) prolonga la actividad de la enzima de dos maneras: ( 1 ) atrapa el com plejo Ca2+-calmodulina unido, de forma que no se disocia del com plejo enzim tico hasta que los niveles citoslicos de Ca2+vuelven a los valores basales, unos 10 segundos despus (no se muestra); (2 ) convierte la enzima en una forma independiente de Ca2+ ya que la quinasa se m antiene activa incluso despus de que el com plejo Ca2+-calmodulina se disocie de ella. La actividad contina hasta que el proceso de autofosforilacin es contrarestado por una protena fosfatasa.

Los procesos de Ca2 +y de AMP cclico interaccionan entre s26

Los procesos de sealizacin a travs de calcio y de AMP cclico interaccionan en diversos niveles en la jerarqua de control. En primer lugar, los niveles citos-

Sealizacin va receptores de superficie celular asociados a protenas G

803

licos de Ca2 + y de AMP cclico pueden influirse respectivamente. Por ejemplo, al gunas formas de las enzimas pueden sintetizar y degradar AMP cclico -la adenil ciclasa y la fosfodiesterasa respectivam ente- estn reguladas por complejos Ca2+ calmodulina. De forma inversa, la quinasa A puede fosforilar algunos canales y bom bas de Ca2+, modificando su actividad; por ejemplo, la quinasa A fosforila el receptor de IP3 del ER, lo cual puede inhibir o activar la liberacin de Ca2 + induci da por IP3, dependiendo del tipo celular. En segundo lugar, las enzimas regula das directamente por Ca2+ y por AMP cclico pueden influirse mutuamente. Por ejemplo, algunas quinasas CaM son fosforiladas por la quinasa A. En tercer lugar, estas enzimas pueden tener efectos interactivos sobre las mismas molculas dia na del metabolismo. As, frecuentemente la quinasa A y la quinasa CaM fosforilan lugares diferentes de la misma protena la cual, por lo tanto, est regulada tanto por el AMP cclico como por el Ca2+ ; la protena reguladora del gen CREB, de la que hemos tratado anteriormente (vase pg. 793), constituye un ejemplo de ello. Como ejemplo de cmo pueden interactuar el Ca2 + y al AMP cclico, consi deremos la fosforilasa quinasa del msculo esqueltico, cuyo papel en la degra dacin de glucgeno ya hemos explicado. Esta quinasa fosforila la glucgeno fosforilasa, la cual cataliza la degradacin del glucgeno (vase Figura 15-25). Se trata de una enzima formada por cuatro subunidades aunque tan slo una de ellas cataliza la reaccin de fosforilacin: las otras tres son reguladoras y permi ten que el com plejo enzimtico sea activado por AMP cclico y por Ca2+. Las cua tro subunidades se designan como a, (3, y y 5. La subunidad y es la que presenta la actividad cataltica; la subunidad 8 es la calmodulina y es la principal respon sable de la dependencia de la enzima por el Ca2+. Las subunidades a y (3 son las dianas de la regulacin por el AMP cclico, siendo ambas fosforiladas por la qui nasa A (Figura 15-36). La misma seal de Ca2+ que inicia la contraccin muscular tambin asegura que exista suficiente cantidad de glucosa que aporte la energa necesaria para la contraccin. El gran influjo de Ca2+ al interior del citosol (se discute en el Captu lo 16) altera la conform acin de la subunidad de calmodulina de la fosforilasa quinasa, incrementando su actividad quinasa, con lo que se incrementa la velo cidad de degradacin de glucgeno varios centenares de veces. Adems, el influ jo de Ca2+ tam bin activa dos quinasas CaM que fosforilan (inhibindola) la glu cgeno sintasa, con lo que se inhibe la sntesis de glucgeno. Por el contrario, las fosforilaciones de la quinasa A inducidas por la adrenalina que hemos descrito ajustan el m etabolismo de la clula muscular anticipndose al incremento de la demanda energtica permitiendo a la enzima ser activada cuando existen m e nos iones calcio unidos a la calmodulina, con lo que la enzima se hace ms sen sible al Ca2+.

lugar activo subunidad cataltica

Ca2+-calm odulna

lugares fosforilados por quinasa A

Figura 15-36 La fosforilasa quinasa. Dibujo muy esquemtico que muestra las cuatro subunidades de la enzima de msculo de mamfero. La subunidad y presenta la actividad cataltica de la enzima activa; las subunidades a y P y la subunidad 8 (la calmodulina) median la regulacin de la enzima por AMP cclico y por Ca2+ , respectivamente. El complejo enzimtico final contiene cuatro copias de cada subunidad.

Algunas protenas G trimricas regulan directamente canales inicos2 7

Las protenas G trimricas no actan exclusivamente regulando la actividad de enzimas y alterando la concentracin de nucletidos cclicos o de Ca2 + en el citosol. En algunos casos activan o inactivan directamente canales inicos de la m em brana plasmtica de la clula diana, alterando as su permeabilidad inica y, por lo tanto, la excitabilidad de la membrana. Por ejemplo, la acetilcolina libe rada por el nervio vago reduce tanto la frecuencia como la fuerza de la contrac cin de la clula muscular del corazn. El efecto est mediado por una clase es pecial de receptores de acetilcolina que activan la proteina G inhibidora Gi( de la que hemos tratado previamente. (Estos receptores, que pueden ser activados por el alcaloide de hongos muscarina, se denominan receptores muscarnicos de acetilcolina para distinguirlos de otros receptores, muy diferentes a stos, deno minados receptores nicotnicos de acetilcolina, que son receptores relacionados con canales inicos de las clulas del msculo esqueltico y de clulas nerviosas que pueden ser activadas por nicotina.) Una vez activada, la subunidad a de G

804

Captulo 15 : Transmisin de seales entre clulas

cilios m odificados neurona olfativa clula de sostn clula basal lm ina basal axn (A) B)

no slo inhibe la adenil ciclasa (como hemos descrito previamente) sino que tambin abre directamente canales de K+de la membrana plasmtica de la clu la muscular. La apertura de estos canales de K+ hace que la clula sea ms difcil de despolarizar, lo cual contribuye al efecto inhibidor de la acetilcolina sobre el corazn. Otras protenas G trimricas regulan la actividad de canales inicos de una forma menos directa, bien regulando la fosforilacin de canales (mediante, por ejemplo, la quinasa A, la quinasa C o la quinasa CaM) o bien causando la pro duccin o la destruccin de nucletidos cclicos que activan o inactivan directa mente canales inicos. Estos canales inicos regulados por nucletidos juegan un papel crucial en los procesos de la visin y de la olfaccin.

Figura 15-37 Receptores de neuronas olfativas. (A) Dibujo esquem tico del epitelio olfativo de la nariz. El receptor olfativo de las neuronas poseen cilios modificados que se proyectan desde la superficie del epitelio y contienen los receptores olfativos y la maquinaria para la transduccin de la seal. El axn, que se extiende desde el extremo opuesto de la neurona receptora, conduce las seales elctricas hasta el cerebro cuando la clula es activada por un odorante. Las clulas basales actan como clulas madre, produciendo nuevas neuronas receptoras durante toda la vida. (B) Electronmicrografa de barrido de cilios de la superficie de una neurona olfativa. (B, de E.E. Morrison y R.M. C o s t a n z o Com p. Neurol. 297: 1-13, 1990 Wiley-Liss, Inc.)

La olfaccin y la visin dependen de receptores asociados a protenas Gy de canales inicos regulados por nucletidos cclicos28
Los humanos podemos distinguir ms de 10 000 olores diferentes (odorantes ), los cuales son detectados por neuronas con receptores olfativos especializados en el revestimiento de la nariz. Estas clulas reconocen odorantes mediante re ceptores olfativos relacionados con una protena G especfica, que se presentan en la superficie de cilios modificados que sobresalen de las clulas (Figura 1537). Muchos de estos receptores actan a travs de AMP cclico; cuando son esti mulados por la unin del odorante, activan una protena G trimrica olfativa es pecfica (Go / ), la cual, a su vez, activa la adenil ciclasa; el incremento resultante de los niveles de AMP cclico abre canales catinicos regulados por AMP cclico, lo cual permite que se produzca un influjo de Na+ que despolariza la clula e ini cia un impulso nervioso que viaja a lo largo del axn, hasta el cerebro. Otros re ceptores olfativos actan a travs del proceso de fosfolpidos de inositol y cana les de Ca2 + regulados por IP3 de la mem brana plasmtica, pero respecto a su mecanismo de transduccin existe todava poca informacin. Se cree que existen centenares de receptores olfativos diferentes; cada uno est codificado por un gen diferente y reconoce odorantes diferentes, pero todos ellos pertenecen a la superfamilia de receptores asociados a protenas G. A pesar de que sabemos que cada clula olfativa responde a un conjunto determinado de odorantes, no est claro si cada clula contiene nicamente un tipo de recep tor que reconoce toda la serie de odorantes a los que la clula es sensible o si cada clula contiene un juego de receptores, cada uno de los cuales es especfico de un solo odorante. Los receptores relacionados con protenas G tambin m e dian algunas formas de deteccin de sabor, pero respecto a ello se conoce toda va muy poca cosa. Los canales inicos regulados por nucletidos cclicos tambin participan en la transduccin de seales en la visin de los vertebrados, pero el nucletido crucial en este caso es el GMP cclico (Figura 15-38) en lugar de ser el AMP ccli-

GUANINA
O

Figura 15-38 El GMP cclico.

Sealizacin va receptores de superficie celular asociados a protenas G

805

co. Como el AMP cclico, las concentraciones celulares de GMP cclico estn controladas por una rpida velocidad de sntesis (por la guanilato ciclasa ) y una rpida degradacin (por la fosfodiesterasa de GMP cclico). En la transduccin visual, la activacin de los receptores est producida por la luz, y conduce a una disminucin, en lugar de un incremento, de los niveles del nucletido cclico. El proceso se ha estudiado especialmente bien en el caso de la respuesta a la luz de los fotorreceptores en form a de bastn (bastones) de la retina de los vertebrados. Los bastones son responsables de la visin m ono crom tica con luz tenue, mientras que los fotorreceptores en form a de cono (co nos) son responsables de la visin crom tica con luz brillante. Un fotorreceptor en forma de bastn es una clula altamente especializada con un segmento ex terior y otro interior, un cuerpo celular y una regin sinptica a travs de la cual el bastn pasa una seal qumica a una clula nerviosa retiniana, la cual trans fiere la seal a lo largo del proceso visual (Figura 15-39), El aparato fototransductor se halla en el segmento exterior, que contiene discos apilados, cada uno de los cuales est formado por una especie de saco de membrana en la que se ha llan embebidas las molculas fotosensibles de rodopsina. La membrana plas m tica que rodea el segmento exterior contiene canales de Na+ regulados por GMP cclico. Estos canales de Na+ se mantienen abiertos en la oscuridad m e diante molculas de GMP cclico unidas al canal. Paradjicamente, la luz no causa una despolarizacin de la membrana plasmtica (que podra estimular la sealizacin sinptica) sino una hiperpolarizacin de la membrana plasmtica (que inhibe la seal sinptica), porqu la activacin de las molculas de rodopsi na por la luz en la m em brana de los discos conduce a que los canales de Na+ de la m em brana circundante se cierren (Figura 15-40). Como hemos indicado anteriormente, la rodopsina es una molcula trans m em brana que atraviesa la m em brana siete veces, homologa de otros miembros de la familia de receptores asociados a protenas G y, como sus primas, acta a travs de una protena G trimrica. Sin embargo, la seal activadora extracelular no es una molcula sino un fotn de luz. Cada molcula de rodopsina contiene el cromforo, 11-cis retinal, unido covalentemente, el cual se isomeriza casi ins tantneam ente a todo-trans retinal cuando absorbe un solo fotn. La isomerizacin altera la conform acin del retinal, induciendo un cambio de conformacin ms lento en la protena (opsina). Entonces, la protena activada se une a la pro tena G trimrica transducina (Gt) haciendo que la subunidad a (at) se disocie y active una fosfodiesterasa de GMP cclico, la cual hidroliza el GMP cclico, de forma que los niveles de GMP cclico del citosol disminuyen. Como consecuen cia de ello, el GMP cclico se disocia de los canales de Na+ de la membrana plas mtica, permitiendo que se cierren. De esta forma la seal pasa de la membrana de los discos a la membrana plasmtica, y la seal luminosa se transforma en una seal elctrica. Los canales de Na+ tam bin son permeables al Ca2+, de forma que cuando se cierran el influjo normal de calcio se inhibe, haciendo que la concentracin de Ca2+ en el citosol disminuya; esta disminucin estimula a la guanilato cicla sa, la cual sintetiza GMP cclico recuperando los niveles y haciendo que la clu la rpidamente recobre el estado en el que estaba antes de que la luz la activara. La activacin de la guanilato ciclasa por la disminucin de los niveles de Ca2+ est mediada por una protena sensible al Ca2+ denominada recoverina la cual, contrariam ente a la calmodulina, es inactiva cuando se halla unida a Ca2+ y ac tiva cuando est libre de Ca2+ ; estimula la ciclasa cuando los niveles de Ca2+ son bajos tras la respuesta a la luz. Este m ecanism o dependiente de Ca2+ es de im portancia crucial, en dos aspectos. En primer lugar, permite al fotorreceptor re vertir rpidamente hasta su estado de reposo, tpico de la oscuridad, tras un flash de luz, haciendo posible que el fotorreceptor pueda ser sensible a la corta duracin del flash. En segundo lugar, contribuye a permitir que el fotorreceptor se adapte, disminuyendo la intensidad de la respuesta cuando se expone a la luz continuam ente. Como explicaremos ms adelante, la adaptacin significa que la clula receptora puede actuar como un detector sensible a cambios de la

d is c o s ci

seg m en to exterio r ~

m em b ra n a fotorreceptora

m em brana plasm tica

seg m en to

interior

ncleo

CU(!f|)0
sinptico

Figura 15-39 Dibujo de una clula fotorreceptora en bastn. En el segmento exterior existen unos 1000 discos; las membranas de cada disco no se hallan conectadas a la membrana plasmtica.

806

Captulo 15 : Transmisin de seales entre clulas

:::: i j T O l . r0d0pSna

segmento exterior

jO

inactiva

I *

rodopsina

activa

I CHS X -cana les de Na+ P X abiertos

I I
t

~L

X<3S* cerrados t O ' o 1

-canales de Na+

l O

1
clula despolarizada clula hiperpolarizada

segmento interior regin nuclear regin sinptica

Figura 15-40 La respuesta a la luz de una clula fotorreceptora en bastn. Los fotones son absorbidos por las molculas de rodopsina situadas en los discos del segmento exterior. Ello determina que los canales de Na+de la membrana plasmtica se cierren, lo cual hiperpolariza la m em brana y reduce la velocidad de liberacin del neurotransmisor desde la regin sinptica. Debido a que el neurotransmisor acta inhibiendo muchas de las neuronas retinianas postsinpticas, la iluminacin frena la inhibicin y, de esta forma, de hecho, las activa.

alta velocidad de liberacin de transm isor

baja velocidad de liberacin de transm isor

OSCURIDAD

ILUMINACION

intensidad del estmulo en un enormemente amplio abanico de niveles basales de estimulacin. En la Tabla 15-3 se recogen datos de las principales protenas G tratadas en este captulo.

Las seales extracelulares son notablem ente amplificadas mediante la utilizacin de m ensajeros intracelulares y de cascadas enzim ticas 29
A pesar de diferencias en detalles moleculares, todos los sistemas sealizadores iniciados por receptores dependientes de protenas G comparten ciertas carac tersticas y estn gobernados por principios generales similares. Todos ellos, por ejemplo, dependen de complejas cascadas o inician cadenas de mensajeros in tracelulares. A diferencia de lo que ocurre con sistemas de sealizacin ms di rectos utilizados por los receptores intracelulares discutidos antes y por recepto res relacionados con canales inicos, tratados en el Captulo 11, las cascadas catalticas de mediadores intracelulares proporcionan numerosas oportunida des de amplificar y de regular las respuestas a seales extracelulares. En la casca da de la transduccin visual que acabamos de describir, por ejemplo, una sola molcula de rodopsina activada cataliza la activacin de cientos de molculas de transducina a una velocidad de unas 1000 molculas de transducina por segun do. Cada molcula de transducina activada activa una molcula de fosfodiesterasa de GMP cclico, cada una de las cuales hidroliza unas 4000 molculas de GMP cclico por segundo. Esta cascada cataltica se mantiene durante aproxima damente un segundo, produciendo la hidrlisis de ms de 105 molculas de GMP cclico por cada cuanto de luz absorbida, que cierra transitoriamente cen tenares de canales de Na+de la membrana plasmtica (Figura 15-41). De forma similar, cuando una molcula seal extracelular se une a un re ceptor que indirectamente activa la adenil ciclasa va protena Gs, cada protena receptora puede activar muchas molculas de protena Gs, cada una de las cua les puede activar a una molcula de adenil ciclasa. Como cada molcula de Gs permanece activa durante algunos segundos antes de hidrolizar su GTP unido,

Sealizacin va receptores de superficie celular asociados a protenas G

807

T abla 1 5-3 Las p rin cip ales fam ilias de p ro ten as G trim ricas* Algunos m iem bros Subunidades a Fam ilia de la fam ilia

Funciones

Modificado por toxina bacteriana

Gs G0if G, G0

as
ir
-

II

G, (transducina)

a.

III

Gq

activa adenil ciclasa; activa canales de Ca2 + activa adenil ciclasa en neuronas sensoriales al olfato inhibe adenil ciclasa; activa canales de K+ activa canales de K+ ; inactiva canales de Ca2+ ; activa fosfolipasa C-p activa fosfodiesterasa de GMP cclico en fotorreceptores en bastn de vertebrado activa fosfolipasa C-P

colrica activa colrica activa

pertsica inhibe pertsica inhibe

colrica activa y pertsica inhibe no tiene efecto

* Las familias se determinan por la relacin entre las secuencias de aminocidos de las subunidades a. nicamente se presentan ejemplos seleccionados. En mamferos se han descrito unas 20 subunidades a y al menos 4 subunidades p y 7 subunidades y.

puede m antener activa a la ciclasa a la que se halla unida durante algunos se gundos, de forma que la ciclasa puede catalizar la conversin de un gran nm e ro de molculas de ATP a AMP cclico (Figura 15-42). Un tipo de amplificacin como ste se presenta en la ruta de los fosfolpidos de inositol. Como resultado de ella, una seal extracelular a concentracin nanomolar (10~ 9 M) induce a m e nudo concentraciones micromolares (IO-6 M) de un segundo mensajero intracelular como el AMP cclico o el Ca2+ . Estas molculas actan como efectores alostricos activando enzimas determinadas, por lo que una nica molcula seal extracelular puede provocar la alteracin de varios miles de molculas en la c lula diana. Adems, cada una de las protenas reguladoras de la cadena de pro cesos que se han activado puede ser una diana independiente de la regulacin, tal como ocurre por ejemplo en la cascada metablica que produce la degrada cin del glucgeno en las fibras del msculo esqueltico. Estas cascadas m etablicas explosivas han de estar reguladas por m ecanis mos muy eficientes y sensibles. Por consiguiente, no resulta sorprendente que las clulas presenten m ecanism os eficaces para la degradacin rpida del AMP cclico y para el amortiguamiento y secuestro del Ca2+, as com o para la inactiva cin de las enzimas que responden y para las protenas transportadoras, una vez se han activado. Todo esto es claram ente esencial para parar la respuesta y para definir el estado estacionario a partir del cual la clula ha de responder. Como hemos visto antes (vase pg. 777), en general la respuesta a la estimula cin puede ser frenada rpidamente nicamente si los mecanism os tambin son rpidos.

una m olcula de rodopsina absorbe un fotn

se activan 500 m olculas de trasducina se activan 500 m olculas de fosfodiesterasa

se hidrolizan 105 m olculas de GMP cclico

l
se cierran 250 canales de Na+ se im pide que entre 106 y 107 iones Na+ entren a la clula por segundo, durante un perodo de ~1 segundo

Las clulas pueden responder de form a sbita a incrementos graduales de la concentracin de una seal extracelular 30
Algunas respuestas celulares a ligandos de sealizacin aumentan gradualmen te de forma proporcional a la concentracin del ligando. La respuesta primaria a las horm onas esteroideas (vase Figura 15-13) sigue a menudo este patrn, posiblem ente porque cada receptor hormonal une una sola molcula de hor mona, y cada secuencia de DNA de reconocim iento especfico de un gen que responde a las horm onas esteroideas acta de forma independiente. A medida

la m em brana de la clula bastn se hiperpolariza 1 mV

Figura 15-41 Amplificacin de la cascada cataltica inducida por la luz, en bastones de vertebrados. Las flechas divergentes indican las etapas en las que se produce amplificacin.

I.

808

Captulo 15 : Transmisin de seales entre clulas

cada protena receptora activada puede activar muchas molculas de proteina Gs, cada una de las cuales libera una subunidad a que puede activar una m olcula de adenil ciclasa durante un perodo de tiem po prolongado

AMPLIFICACION

subunidad a de la protena Gs adem ciclasa activada

Figura 15-42 Amplificacin en una cascada cataltica inducida por un ligando. La primera etapa de amplificacin requiere que el ligando seal permanezca unido al receptor el tiempo necesario para que el receptor active varias molculas Gs ; en muchos casos el ligando se disociar muy lentam ente para que se produzca esta amplificacin.

cada m olcula de adenil ciclasa activada genera muchas m olculas de cAMP

AMPLIFICACIN

9
las m olculas de cAMP activan la quinasa A

I l
#

1
#

I
# cAM P

100

/
cada m olcula de quinasa A puede fosforilar, activando muchas copias de la enzima X

AMPLIFICACIN

\ \

quinasa A )n a lb m in a

/
I

/
fH

\
I

\
'
o v a lb m i na

cada copia de la enzima X produce muchas m olculas de producto

AMPLIFICACIN

100

% de receptores activados
Figura 15-43 Respuesta que presentan las clulas del oviducto de gallina ante la estimulacin por la horm ona esteroidea estradiol. Una vez activados, los receptores de estradiol activan la transcripcin de varios genes diferentes. La grfica muestra las curvas dosis-respuesta para dos de estos genes, que codifican las protenas del huevo co n a lb m in a uno y o v o a lb m in a el otro. La cintica lineal de respuesta para la conalbm ina indica que cada molcula de receptor activado que se une al gen de la conalbm ina increm enta la actividad del gen en la misma cantidad. Por el contrario, el retraso seguido del abrupto increm ento en la cintica de respuesta para la ovoalbmina sugiere qe para iniciar la transcripcin de este gen se le han de unir sim ultneamente ms de un receptor activado (en este caso son 2 receptores). (Adaptado de E.R. Mulvihill y R.D. Palmiter, J. Biol. Chem . 252:2060-2068, 1977.)

productos de la enzim a X

que aumenta la concentracin de la hormona, la concentracin de los com ple jos horm ona-receptor aumenta de forma proporcional, y tam bin aumenta pro porcionalmente el nmero de complejos unidos a secuencias especficas de re conocim iento de los genes que responden; as pues, la clula responde de una manera lineal. Sin embargo, otras respuestas a ligandos de sealizacin empiezan de m a nera ms sbita cuando aumenta la concentracin del ligando. Algunas de ellas pueden ocurrir incluso de una forma que casi es del todo o nada, siendo indetectable por debajo de una concentracin umbral de ligando y aumentando has ta un mximo en cuanto esta concentracin umbral se sobrepasa. Algunos facto res de crecimiento, por ejemplo, actan como seales de todo o nada indicando a las clulas que deben empezar a replicar su DNA como preludio de una divi sin celular. Cul puede ser la base molecular de una respuesta abrupta como sta, casi a modo de interruptor, ante una seal gradual ? Un posible m ecanismo para escalonar la respuesta consiste en que para que se produzca la respuesta haga falta que a una macromolcula diana se le una una molcula o un complejo intracelular. Por ejemplo, en algunas respuestas in-

Sealizacin va receptores de superficie celular asociados a protenas G

809

Figura 15-44 Cinticas de activacin en funcin de la concentracin de la molcula seal. Las curvas muestran

cmo se incrementa la pendiente de la respuesta a medida que se incrementa el nmero de molculas de efector que se han de unir simultneamente para activar una macromolcula diana. Las curvas de la grfica son las que cabe esperar si la activacin necesitara la unin simultnea de 1, 2,8 o 16 molculas de efector, respectivamente.

subunidades proteicas inactivas

ligando seal"S "

cntlB
0,5 1,0 1,5 concentracin relativa de molculas de efector
2,0

,0

ducidas por hormonas esteroideas parece que han de unirse simultneamente ms de un com plejo horm ona-receptor a una secuencia de DNA especfica de reconocim iento para conseguir activar un gen determinado. Como resultado de ello, la activacin del gen empieza de forma ms abrupta que si fuera suficiente la unin de un solo com plejo para producir esta activacin (Figura 15-43). Un m ecanism o similar a ste acta en las activaciones mediadas por la quinasa A y por la calmodulina, como hem os discutido antes. Por ejemplo, se han de unir dos o ms iones Ca2+para conseguir que la calmodulina adopte su conformacin activa; com o resultado de ello, se produce un incremento de cincuenta veces en la activacin del proceso cuando la concentracin de Ca2+ tan slo se increm en ta diez veces. Este tipo de respuestas son tanto ms abruptas cuanto mayor sea el nmero de molculas que cooperan, de forma que si el nmero es suficiente m ente elevado se pueden conseguir respuestas cercanas al todo o nada (Figu ras 15-44 y 15-45). Tam bin se consiguen respuestas sbitas cuando un ligando activa a una enzima y al mismo tiempo inhibe otra enzima que cataliza la reaccin opuesta a la de la primera enzima. Ya hemos hablado de un ejemplo de este habitual siste m a de regulacin en la estimulacin de la degradacin del glucgeno en las c lulas del msculo esqueltico, en las cuales un incremento en la concentracin intracelular de AMP cclico activa la fosforilasa quinasa e inhibe la accin opues ta de la fosfoprotena fosfatasa. Este mecanism o puede producir respuestas muy abruptas, pero en todo caso ligeramente graduales de acuerdo con la variacin de la concentracin del ligando seal. Sin embargo, existe otro m ecanismo por el cual una clula puede responder de forma todo o nada de modo que en cuanto la seal sobrepasa un valor umbral se produce una respuesta rpida y mxima. Todas las respuestas todo o nada de este tipo dependen generalmente de la retroalimentacin posi tiva. Por este m ecanismo, las clulas nerviosas y musculares generan potenciales de accin siguiendo la ley del todo o nada, en respuesta a neurotransmisores (se discute en el Captulo 11). La activacin de los receptores de acetilcolina en una unin neuromuscular, por ejemplo, abre los canales catinicos de la mem brana plasmtica de la clula muscular. El resultado de ello es un influjo neto de Na+ que despolariza localm ente la mem brana plasmtica. Esto hace que los ca nales de Na+ controlados por voltaje situados en esta regin de la membrana se abran, produciendo un nuevo influjo de Na+ , el cual despolariza an ms la

com plejos proteicos activos ensam blados de form a cooperativa

Figura 15-45 Un tipo de m ecanism o de sealizacin del que cabe esperar que presente una respuesta sbita.

Aqu se requiere la unin de ocho molculas de un ligando seal sobre un complejo proteico para activarlo: la capacidad de las subunidades para ensamblarse formando el complejo activo depende del cambio alostrico de conformacin que sufre cada subunidad cuando se une a su ligando. La unin de un ligando formando un complejo de este tipo es generalmente un proceso cooperativo, que genera una respuesta escalonada cuando cambia la concentracin del ligando, como se explica en el Captulo 5. A bajas concentraciones del ligando, el nmero de complejos activos se incrementar sbitamente en proporcin a la octava potencia de la concentracin del ligando.

810

Captulo 15 : Transmisin de seales entre clulas

mem brana por lo que los canales de Na+todava se abren ms, etc. Si la despola rizacin inicial excede un cierto umbral, esta retroalimentacin positiva tiene un efecto explosivo, produciendo un potencial de accin que se propaga por toda la mem brana del msculo. Como hemos discutido antes, tiene lugar un m eca nismo de retroalimentacin positivo como ste cuando el Ca2+ es liberado del ER o del retculo sarcoplasmtico a travs de canales de Ca2+: el Ca2 + liberado puede unirse a los canales de Ca2+ incrementando ms la liberacin de Ca2+, producien do as una espiga de Ca2 + tipo "todo o nada".

enzima inactiva

ligando seal lugar de unin para el producto de la enzima lugar activo enzima activa

El efecto de algunas seales puede ser recordado por la clula 31

Un m ecanismo de aceleracin por retroalimentacin positiva puede establecer se entre protenas seal que en lugar de ser canales inicos presenten actividad enzimtica. Supongamos por ejemplo que un ligando seal determinado activa una enzima localizada a mitad de la cadena de acontecim ientos que transmiten la seal, y que dos o ms molculas del producto de esta reaccin enzimtica se unen a la enzima activndola an ms (Figura 15-46). La consecuencia ser que en ausencia del ligando se producir una velocidad muy pequea de sntesis del producto enzimtico, y que esta velocidad aumentar muy lentamente cuando aumente la concentracin del ligando hasta que, a un determinado valor umbral de concentracin del ligando, se formar suficiente cantidad de producto para activar la enzima, establecindose entonces un sistema de autoaceleracin. En tonces, la concentracin del producto enzimtico aumentar sbitamente hasta el nivel ms alto posible. De esta forma, la clula puede traducir una variacin gradual de la concentracin de un ligando seal en un cambio de tipo interrup tor" de los niveles de un producto enzimtico determinado, generando una res puesta de tipo todo o nada en la clula. Este tipo de m ecanism o tiene una importante propiedad que lo hace inutilizable para determinados propsitos y nicamente til para otros. Si un siste ma como ste ha sido activado aumentando la concentracin del ligando seal por encim a del umbral, generalmente permanecer activo cuando la seal vuelva a descender por debajo del valor umbral: en lugar de reflejar fielmente los niveles reales de seal en cada momento, este sistema de respuesta tiene memoria. Ya hem os discutido el ejemplo de la CaM quinasa II, la cual es activa da por Ca2+-calmodulina a autofosforilarse y a fosforilar otras protenas. La autofosforilacin m antiene activa la quinasa cuando los niveles de Ca2+ ya han vuelto a la normalidad y el com plejo Ca2+ -calmodulina se ha disociado de la en zima (vase Figura 15-35). Tam bin puede actuar un m ecanism o de autoactivacin de memoria ms abajo en un proceso de sealizacin, a nivel de la trans cripcin gnica. Por ejemplo, la seal que desencadena la determinacin de la fibra muscular activa una serie protenas reguladoras de genes especficos de clula muscular que estimulan tanto la transcripcin de estos mismos genes como de otros genes que producen muchas otras protenas de clula muscular (vase pg. 475).

de la enzima UNIN DE DOS MOLCULAS DEL PRODUCTO DE LA ENZIMA producto de la enzima

enzima m uy activa

Figura 15-46 Un m ecanism o de retroalim entacin positiva acelerante. La unin inicial del

ligando seal activa la enzima para generar un producto, el cual se une a la propia enzima, incrementado an ms su actividad enzimtica.

Resumen
Los receptores asociados con protenas G activan o inactivan indirectam ente enzi m as unidas a la m em brana plasmtica o canales inicos, a travs d e protenas re guladoras G trimricas (protenas G), qu e se inactivan a s mismas m ediante la h i drlisis del GTP q u e llevan unido. Algunos receptores asociados a protenas G activan o inactivan la adenil ciclasa, alterando as la concentracin intracelular del m ediador intracelular AMP cclico. Otros activan una fosfolipasa C especfica d e fosfolpidos d e inositol (la fosfolipasa C-pj, la cual hidroliza elfosfatidilinositol bisfosfato (P IP J generando dos m ediadores intracelulares -el inositol trisfosfato (IP J, qu e libera Ca2* desde el ER increm entando as la concentracin d e Ca2+ en el citosol, y el diacilglicerol, qu e perm anece en la m em brana plasmtica y activa la quinasa C. Un increm ento d e los niveles de AMP cclico o d e Ca2* afecta la clula es

Sealizacin va receptores de superficie celular asociados a protenas G

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timulando la quinasa A y la quinasa CaM, respectivamente. La quinasa C, la qui nasa A y la quinasa CaMfosforilan protenas diana determinadas sobre residuos de serina y de treonina, alterando la actividad de estas protenas. Cada tipo de c lula tiene conjuntos caractersticos de protenas diana que son reguladas de esta forma, lo cual permite a la clula presentar su respuesta propia y caracterstica a cambios de los niveles intracelulares de AMP cclico o de Ca2+libre. A travs de las cascadas mediadas por el AMP cclico o por el Ca2+, las respuestas a las seales extracelulares pueden ser enormemente amplificadas. Las diferentes respuestas mediadas por estos receptores son rpidamente frena das cuando el ligando seal extracelular es eliminado. Ello es debido a que las prote nas G se autoinactivan hidrolizando el GTP que llevan unido, el IP3 es rpidamente desfosforilado mediante una fosfatasa (o fosforilado por una quinasa), el diacilglicerol es rpidamente degradado, los nucletidos cclicos son rpidamente hidrolizados por una fosfodiesterasa, el Ca2+es rpidamente bombeado hacia juera del citosol y las protenas son rpidamente desfosforiladas por protena fosfatasas. El continuo y rpido recambio de estos mediadores intracelulares hace posible que se produzca un rpido incremento de sus concentraciones cuando las clulas respon den a seales extracelulares. Adems, las clulas pueden utilizar la cooperatividady la retroalimentacin positiva para hacer que sus respuestas sean ms sbitas.

Sealizacin va receptores de superficie celular asociados a enzimas

Como los receptores asociados a protenas G, los receptores asociados a enzi mas son protenas transm em brana cuyo dominio de unin al ligando se halla sobre la superficie exterior de la membrana plasmtica. En lugar de tener un do minio citoslico que se asocia a una proteina G trimrica, sus dominios citoslicos tienen una actividad enzimtica asociada o estn asociados directamente a una enzima. Mientras que los receptores asociados a protenas G atraviesan sie te veces la membrana, habitualm ente cada subunidad de los receptores catalti cos la atraviesan una sola vez. Existen cinco clases conocidas de receptores asociados a enzimas: (1) el re ceptor guanilato ciclasa, que catalizan la produccin de GMP cclico en el citosol; (2) los receptores tirosina quinasa, que fosforilan determinados residuos de tirosina de un pequeo grupo de protenas seal intracelulares; (3) los receptores asociados a tirosina quinasas, que estn asociados a protenas que tienen activi dad tirosina quinasa; (4) los receptores tirosina fosfatasa, que eliminan grupos fosfato de residuos de tirosina de determinadas protenas seal intracelulares, y (5) los receptores serina/treonina quinasa, que fosforilan determinados residuos serina o treonina de algunas protenas intracelulares. Empezaremos nuestra discusin con el receptor guanilato ciclasa.

Los receptores guanilato ciclasa generan GMP cclico directamente31

Los pptidos natriurticos atriales (ANP, de Atrial Natriuretic Peptides) constitu yen una familia de hormonas peptdicas, muy relacionadas entre s, que son se gregadas por clulas musculares del atrium del corazn cuando se incrementa la presin de la sangre. Los ANP estimulan el rin para que segregue Na+y agua e inducen a las clulas musculares lisas de las paredes de los vasos sanguneos a que se relajen. Ambos efectos tienden a disminuir la presin sangunea. El re ceptor de ANP que media estas respuestas se halla presente en las clulas del ri n y en las clulas de la musculatura lisa de los vasos sanguneos; se trata de una protena que atraviesa una sola vez la membrana plasmtica, que tiene un lugar extracelular de unin a ANP y un dominio intracelular con actividad guani lato ciclasa. La unin de ANP activa la ciclasa para producir GMP cclico, el cual, a su vez, se une y activa una proteina quinasa dependiente de GMP cclico (qui nasa G), la cual fosforila determinadas protenas sobre residuos de serina o treo-

812

Captulo 15 : Transmisin de seales entre clulas

dom inio rico en cistenas

dom inio semejante a una nm unoglobulm a

m em brana CITOSOL P'asmtica dom inio tirosina quinasa receptor receptor de receptor de EGF insulina, de NGF receptor receptor de IGF-1 de PDGF, receptor de M-CSF regin insertada en la quinasa

Figura 15-47 Seis subfamilias de receptores tirosina quinasa. Solamente se indican uno o dos miembros de cada subfamilia. Ntese que en algunas subfamilias el dominio tirosina quinasa se halla interrumpido por una regin insertada en la quinasa. No se conoce el significado funcional de los dominios ricos en cisterna y de los dominios sem ejantes a una inmunoglobulina.

receptor de VEGF

nina. As, los re c e p to r e s g u a n ila to c ic la s a utilizan el GMP cclico como media dor intracelular de la misma forma que algunos receptores asociados con prote nas G utilizan el AMP cclico, con la diferencia de que la unin entre el ligando y la actividad ciclasa se produce directamente en lugar de suceder va una prote na G trimrica. A pesar de que conocem os relativamente pocos receptores que pertenezcan a la familia guanilato ciclasa, muchos receptores conocidos pertenecen a la fa milia tirosina quinasa, de la que trataremos a continuacin.

Los receptores para la mayora de los factores de crecim iento son protenas transm em brana que presentan actividad protena tirosina quinasa especfica 32
La primera protena receptora que se reconoci que presentaba a ctiv id a d p ro te n a tiro s in a q u in a s a e s p e c fic a (en 1982) fue el receptor para el factor de creci

miento epidrmico (EGF, de Epidermal Growth Factor). El EGF es una pequea protena (53 residuos de aminocido) que estimula la proliferacin de las clulas epidrmicas y de una gran variedad de otros tipos celulares. Su receptor es una protena transmembrana, que atraviesa la membrana una sola vez, de unos 1200 residuos de aminocido y que presenta una larga zona extracelular glucosilada que se une a EGF. Cuando el EGF se une a esta porcin, se activa un dominio in tracelular con actividad tirosina quinasa. Una vez activado, el receptor transfiere un grupo fosfato del ATP a determinadas cadenas laterales de tirosina, tanto de la propia protena receptora como de otras protenas celulares determinadas. Muchos otros receptores para factores de crecimiento y diferenciacin tambin son re c e p to r e s tiro s in a q u in a s a . Entre ellos, cabe destacar los receptores para el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF, de Platelet-Derived Growth Factor), para los factores de crecimiento de los fibroblastos (FGF, de Fibroblast Growth Factors), para el factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF, de Hepatocyte Growth Factor), para el factor de crecimiento-1 para insulina y compuestos anlogos (IGF-1, de Insulin, insulinlike Growth Factor-1), para el factor de creci miento neuronal (NGF, de Nerve Growth Factor), para el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF, de Vascular Endothelial Growth Factor), y para el fa c tor estimulador de la formacin de colonias de macrfagos (M-CSF, de Macrophage Colony Stimulating Factor), todos los cuales son protenas. Como se muestra
en la Figura 15-47, la familia de receptores con actividad tirosina quinasa puede subdividirse en un determinado nmero de subfamilias estructurales; en cada

Sealizacin va receptores de superficie celular asociados a enzimas

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COOH dm ero de PDGF

2 nm

HOOC (B)
caso los receptores se fosforilan a s mismos para iniciar la cascada de sealiza cin intracelular. De qu forma la unin de una protena especfica del dominio extracelular de un receptor tirosina quinasa activa el dominio cataltico que se halla situado al otro lado de la m em brana plasmtica? Resulta difcil de imaginar que un cam bio de conform acin pueda propagarse a travs de la bicapa lipdica a travs de una hlice a sencilla que atraviesa la membrana. El problema qued resuelto cuando se demostr que la unin de un ligando hace que el receptor de EGF for me dmeros, lo cual permite a los dos dominios citoplasmticos fosforilarse uno al otro sobre varios residuos tirosina. Esta fosforilacin cruzada se denomina autofosforilacin porque se produce dentro del receptor dimrico. En el caso de los receptores de PDGF el ligando es un dmero que reacciona con dos receptores a la vez (Figura 15-48). El EGF, por el contrario, es un monmero que al parecer induce un cam bio de conform acin en el dominio extracelular de su receptor, lo cual induce la dimerizacin del receptor. Se cree que la dimerizacin del recep tor es un m ecanism o general de la activacin de los receptores asociados a enzi ma que tienen un nico dominio transmembrana. La dimerizacin del receptor puede utilizarse experimentalmente para inactivar especficam ente determinados receptores, en un intento de determinar su importancia en una respuesta celular particular. La estrategia supone la transfeccin de clulas con un DNA que codifica una forma mutante de un receptor tirosina quinasa que dimeriza norm alm ente pero que tiene un dominio quinasa inactivo. Cuando se coexpresan a elevado nivel con receptores normales, los re ceptores mutantes actan de una manera dominante negativa (vase Figura 744), inhabilitando los receptores normales al formar dmeros inactivos con ellos. Los procesos de sealizacin desencadenados por los receptores de EGF, PDGF y de FGF se han analizado con gran detalle. En cada caso las tirosinas de autofosforilacin se utilizan como lugares de unin, de alta afinidad, para prote nas seal intracelulares de la clula diana. Cada una de estas protenas se une a diferentes lugares fosforilados del receptor activado, reconociendo adems de la fosfotirosina, determinadas caractersticas del entorno de la cadena polipeptdica. Una vez se han unido al receptor, muchas de estas protenas resultan fosforiladas sobre tirosinas, y as son activadas. De esta forma se cree que la autofosfo rilacin en tirosinas acta com o una especie de interruptor que desencadena el ensam blaje transitorio de un complejo seal intracelular, el cual libera la seal al interior de la clula. Los receptores de insulina y de IGF-1 actan de una forma ligeramente dife rente. En primer lugar, dado que los receptores son tetrmeros (vase Figura 1547), se cree que la unin del ligando no induce una dimerizacin sino una inter accin alostrica entre las dos mitades del receptor. En segundo lugar, la unin de insulina hace que el receptor fosforile su dominio cataltico, el cual activa la capacidad de fosforilar otra protena (denominada substrato-1 del receptor de in sulina o IRS-1, de Insulin Receptor Substrate-1) sobre mltiples tirosinas. Las fosfotirosinas de IRS-1 actan como lugares de unin de alta afinidad para el aco plamiento y activacin de protenas seal intracelulares, muchas de las cuales tambin se unen directamente a otros receptores tirosina quinasa activados.

receptor de PDGF

Figura 15-48 Factor de crecim iento derivado de las plaquetas (PDGF).

(A) Estructura dimrica de la protena, con las regiones de unin al receptor sombreadas en amarillo. El dmero se mantiene por tres enlaces disulfuro (no se muestran). (B) Debido a que PDGF es un dmero con dos lugares de unin, puede unirse a dos receptores adyacentes, iniciando as el proceso de sealizacin intracelular. El factor de crecimiento neuronal (NGF), como las dems protenas de la familia de las neurotrofinas (discutida en el Captulo 21), tambin acta como dmeros que entrecruzan sus tirosina quinasas.

814

Captulo 15: Transmisin de seales entre clulas

m em brana plasmatica CITOSOL

receptor de PDGF

Figura 15-49 Unin de protenas seal Intracelulares que contienen SH2, a un receptor activado de PDGF.

Pl 3-quinasa (subunidad reguladora) protena activadora de GTPasa (GAP) fosfolipasa C-y (PLC-y) (A) dom inio SH2 dom inio SH3

(p)| ty r
71

dom inio tirosina quinasa dividido

1009

1021

dom inio de unin dom inio de unin para la cadena lateral para la fosfotirosina de un am inocido

nh2 cooh
(C)

(B)

Los residuos tirosina fosforilados son reconocidos por protenas con dominios SH2 33
Se ha encontrado una coleccin completa de protenas seal intracelulares que se unen a las fosfotirosinas de receptores tirosina quinasa activados. Algunas de estas protenas -u n a protena activadora de una GTPasa (GAP, de GTPase-Activating Protein), la fosfolipasa C-y (PLC-y, de phospholipase C-y) y las protena tirosina quinasas no receptoras, semejantes a Src- tienen funciones ms o menos conoci das, como veremos en las prximas pginas. La fosfolipasa C-y, por ejemplo, acta de la misma forma que la fosfolipasa C-p, activando el proceso de sealizacin de los fosfolpidos de inositol, del que hemos tratado anteriormente en conexin con la sealizacin va protenas G. Otras protenas que se unen a receptores tirosina quinasa activados constituyen un misterio. La enzima fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3-quinasa), por ejemplo, parece ser importante en la regulacin de la prolifera cin celular; su accin inmediata es fosforilar el anillo de inositol del fosfatidilino sitol en la posicin 3 (vase Figura 15-29), pero las funciones de los fosfoinostidos especiales generados de esta forma son desconocidas. A pesar de que las protenas seal intracelulares que se unen a residuos de fosfotirosina de receptores activados tirosina quinasa (y a IRS-1) tienen estructuras y funciones muy variadas, habitualmente comparten dos dominios no catalticos al tamente conservados, denominados SH2 y SH3 por regiones homologas Src 2 y 3 , ya que encontraron por primera vez en la protena Src (famosa por su papel en el estudio de cncer, como se discute en el Captulo 24). Los dominios SH2 recono cen tirosinas fosforiladas y permiten a las protenas que los presentan unirse a los receptores tirosina quinasa activados as como a otras protenas seal intracelula res que hayan sido fosforiladas transitoriamente sobre tirosinas (Figura 15-49). La

(a) Dibujo esquemtico de un receptor de PDGF mostrando cinco lugares de autofosforilacin en tirosinas, tres en la regin insertada en la quinasa y cinco en la cola carboxilo terminal; a estos lugares se unen las tres protenas seal que se indican a su izquierda. (Existen otros dos lugares de autofosforilacin en tirosinas del receptor, que no se indican en el dibujo, localizados entre el dominio que atraviesa la membrana y el principio del domjnio quinasa, que actan como lugares de unin para tirosina quinasas no receptoras semejantes a Src.) Los nmeros de la derecha indican las posiciones de las tirosinas en la cadena polipeptdica. Estos lugares de unin han sido identificados utilizando la tecnologa del DNA recombinante para mutar determinadas protenas del receptor: la mutacin de las tirosinas 1009 y 1021, por ejemplo, impide la unin y la activacin de PLC-y, de forma que la activacin del receptor no estimula el proceso de sealizacin de fosfolpidos de inositol. Se indica la localizacin de los dominios SH2 (en rojo) y SH3 (en azul) en las tres protenas seal. (B) Estructura tridimensional de un dominio SH2, determinada por cristalografa de rayos X. En amarillo a la derecha, se muestra el bolsillo para la fosfotirosina y en amarillo a la izquierda se muestra un bolsillo de unin especfica a una cadena lateral de un aminocido. (C) El dominio SH2 es un mdulo compacto que puede ser insertado en casi cualquier sitio de una protena sin alterar ni el plegamiento ni la funcin de dicha protena. Debido a que cada dominio tiene diferentes lugares de unin que reconocen fosfotirosinas y determinadas cadenas laterales de aminocidos, los diferentes dominios SH2 reconocen fosfotirosinas en el contexto de diferentes secuencias de aminocidos flanqueantes. (B, basado en datos de G. Waksman et al., Cell 72:1-20,1993. Cell Press.)

Sealizacin va receptores de superfcie celular asociados a enzimas

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funcin del dominio SH3 es menos clara, pero parece ser que se une a otras prote nas celulares. Los estudios sobre una clase de pequeas protenas adaptadoras que sola mente constan de un dominio SH2 y otro SH3 han permitido sugerir que el do minio SH3 debe tener una funcin de unin. Estas pequeas protenas SH adap tadoras no presentan actividad cataltica intrnseca y actan acoplando protenas fosforiladas en tirosinas, como los receptores tirosina quinasa activa dos, con otras protenas que no tienen dominios SH2 o SH3 propios. Una de es tas protenas SH adaptadoras, denominada Sem-5, fue descubierta a travs de estudios genticos en el gusano nemtodo C. elegans, como se discute en el Ca ptulo 21. Determinadas mutaciones en el gen sem-5 bloquean el proceso de se alizacin que parte desde varios receptores tirosina quinasa y tiene profundos efectos sobre el desarrollo del gusano. Los procesos de sealizacin son bloquea dos con la misma efectividad por mutaciones que afectan al dominio SH2 o a cualquiera de los dos dominios SH3 de la molcula, lo cual sugiere que ambos dominios SH3 son necesarios para unir un com ponente seal del proceso (vase Figura 15-53). De hecho, parece que en la mayora de las clulas animales se ha llan presentes protenas homologas a Sem-5, y existen evidencias tanto genti cas como bioqumicas de que estas protenas acoplan los receptores protena quinasa activados con Ras, la importante protena del proceso de sealizacin, sobre la que volveremos enseguida.

Las protenas Ras constituyen un eslabn crucial en la cascada intracelular de sealizacin activada por receptores protena quinasa 34
Las protenas Ras pertenecen a la gran superfam ilia Ras de GTPasas m onom ricas, que tam bin contiene otras dos superfamilias: (1) las protenas Rho y Rae, implicadas en la transmisin de seales desde receptores de la superficie celular hasta el citoesqueleto de actina (discutidas en el Captulo 16), y (2) la fam ilia Rab, implicada en la regulacin del trfico del transporte intracelular de vescu las (discutidas en el Captulo 13). Como casi todas estas protenas GTPasa monomricas, las protenas Ras contienen un grupo fenil, unido covalentemente, que participa en el anclaje de la protena a la membrana, en este caso a la cara citoplasmtica de la m em brana plasmtica donde acta esta protena. Las protenas Ras participan en la transmisin de seales desde receptores tirosina quinasa hasta el ncleo, estimulando la proliferacin o la diferenciacin celular. Si se inhibe la funcin de Ras mediante la microinyeccin de anticuer pos anti-Ras o mediante formas mutantes dominantes negativas de Ras, deja de producirse la respuesta de proliferacin o de diferenciacin normalmente indu cida por receptores protena quinasa activados; contrariamente, si un mutante hiperactivo de protena Ras es introducido en una clula, el efecto sobre la proli feracin o la diferenciacin es habitualmente el mismo que el inducido por la unin de un ligando a los receptores de la superficie celular. De hecho, las prote nas Ras fueron descubiertas como los productos hiperactivos de genes ras mu tantes, que producen cncer al romper los controles normales sobre la prolifera cin y la diferenciacin; alrededor del 30% de los cnceres humanos presentan estas mutaciones en un gen ras. Como otras GTPasas monomricas y las protenas G trimricas, las prote nas Ras actan com o interruptores, alternando entre dos estados conformacionales diferentes -activo cuando unen GTP (vase Figura 15-18) e inactivo cuan do unen GDP. Ras hidroliza GTP al menos 100 veces ms lentamente que la subunidad a de la protena G trimrica estimuladora Gs de la que hemos tratado anteriormente, y debido a que en el citosol las concentraciones de GTP son unas 10 veces ms altas que las de GDP, en ausencia de otros estmulos, mientras el GTP se halla unido a ella Ras permanece constantem ente activa. Sin embargo, en la clula existen dos clases de protenas seal que regulan la actividad de Ras influyendo en la transicin entre el estado activo y el inactivo. Las protenas ac-

816

Captulo 15: Transmisin de seales entre clulas

INACTIVA

ACTIVA

tivadoras de GTPasa (GAP, de GTPase-Activating Proteins) incrementan la velo cidad de hidrlisis del GTP unido a Ras, de forma que la inactivan. Estos regula dores negativos estn compensados por las protenas liberadoras de nucleti dos de guanina (GNRP, de Guanine Nucleotide Releasing Proteins), las cuales estimulan el intercambio de los nucletidos unidos estimulando la prdida de GDP y la posterior captacin de GTP del citosol; as, tienden a activar Ras (Figura 15-50). En principio, pues, los receptores tirosina quinasa pueden activar Ras ac tivando una GNRP o inhibiendo una GAP. Los receptores tirosina quinasa acti vados se unen a GAP directamente, como hemos dicho antes, y se unen a GNRP slo indirectamente, como discutiremos despus. Sin embargo, es la unin indi recta a GNRP la que habitualmente es la responsable de conducir a la protena Ras a su estado activo, unido a GTP. Las protenas Ras y las protenas que regulan la actividad de Ras han sido muy conservadas durante la evolucin; anlisis genticos realizados en Drosop hila y en C. elegans han proporcionado los primeros indicios sobre cmo los re ceptores tirosina quinasa activan Ras. Han sido particularmente informativos los estudios sobre el desarrollo de la clula fotorreceptora del ojo de Drosophila.

Figura 15-50 Regulacin de la actividad Ras. Las protenas activadoras de GTPasa (GAP) inactivan Ras al estimularlas a que hidrolizen el GTP que llevan unido. Las protenas liberadoras de nucletidos de guanina (GNRP) activan Ras al estimularlas a que liberen el GDP que llevan unido; dado que la concentracin de GTP en el citosol es 10 veces mayor que la de GDP, Ras tendr tendencia a unir GTP cuando se haya liberado de su GDP. En clulas de mamfero se han identificado hasta ahora dos GAP reguladoras de Ras (Ras GAP) - p l 2 ( f ,A P y n eu ro fib ro m in a (denominada as porque est codificada por el gen que se halla mutado en la mayora de la enfermedad humana com n llamada neurofibromatosis, asociada con tumores de los nervios). A pesar de que las dos Ras GAP se expresan de forma ubicua, parece que en los diferentes tipos celulares una de las dos domina al m antener la mayora de las protenas Ras (-95% ) en su estado inactivo, unido a GDP.

Una protena SH adaptadora acopla los receptores tirosina quinasa con Ras: evidencias que provienen del desarrollo del ojo de D roso p h ila 35
El ojo compuesto de Drosophila est formado por unas 800 unidades idnti cas denominadas omatidios, cada una de las cuales est formada por 8 clulas fotorreceptoras (R1-R8) y 12 clulas accesorias (Figura 15-51). El ojo se desarrolla a partir de una lmina epitelial simple, y las clulas que forman cada omatidio son reclutadas desde toda la lmina a travs de una secuencia fija mediante una serie de interacciones clula-clula. Empezando con el desarrollo de R8, cada clula diferenciada induce a su clula vecina inmediata, hasta este momento no comprometida, a adoptar un destino y a ensamblarse de una manera especial en el desarrollo del omatidio (Figura 15-52). El desarrollo del fotorreceptor R7, necesario para la deteccin de la luz ul travioleta, ha sido estudiado ms intensamente, empezando en 1976 con la des cripcin de una m osca mutante denominada sevenless (sev, de sin el siete) en la que el nico defecto observado es que R7 no se desarrolla. Estos mutantes son fciles de seleccionar sobre la base de su ceguera a la luz ultravioleta. El gen sev fue aislado y se observ que codifica un receptor tirosina quinasa que se expresa en las clulas precursoras de R7. Posteriores anlisis genticos de mutantes en los que se halla bloqueado el desarrollo de R7 pero en los que la protena R7 no est afectada, llevaron a la identificacin del gen bride-of-sevenless (boss, o compaero de sevenless), que codifica el ligando de la protena receptora Sev. Sealizacin va receptores de superfcie celular asociados a enzimas

i________ i
100 |jm

Figura 15-51 Electronmicrografa de barrido de un ojo compuesto de Drosophila. El ojo est compuesto de unas 800 unidades idnticas (omatidios), cada una de las cuales tiene una lente independiente que enfoca la luz sobre las ocho clulas fotorreceptoras de su base. (Por cortesa de Em st Hafen.)

817

Boss es una protena que atraviesa 7 veces la membrana, que exclusivamente se expresa en la superficie de la clula adyacente R8, y que cuando se une a una Sev la activa induciendo a la clula precursora de R7 a diferenciarse en un fotorreceptor R7. La protena Sev tam bin se expresa en algunas otras clulas precurso ras del omatidio en desarrollo, pero ninguna de estas clulas entran en contacto con R8, por lo que la protena Sev no es activada y las clulas no se diferencian a fotorreceptores R7. A pesar de que puede sospecharse que los organismos pluri celulares hacen un uso muy extendido de ligandos seal unidos a la superficie celular com o Boss, tales molculas han sido muy difciles de identificar y carac terizar mediante tcnicas bioqumicas tpicas. La identificacin de Boss ilustra el poder de las aproximaciones genticas. Ha resultado ms difcil identificar los componentes del proceso intracelular de sealizacin activado por Sev en la clula precursora de R7 que el receptor o su ligando, debido a que estos com ponentes son utilizados por clulas de una gran cantidad de rganos en desarrollo adems del ojo, y las mutaciones que inactivan el proceso son letales. Sin embargo, algunas de estas mutaciones son letales nicam ente cuando estn afectadas ambas copias del gen, por lo que pueden m antenerse en animales heterozigotos que presentan una copia del gen mutante y la otra normal. Aislando estos mutantes as como utilizando otras es trategias genticas, se han podido identificar algunos genes que codifican pro tenas de sealizacin intracelular. Uno de ellos codifica la protena Ras. Mien tras que las moscas en las que ambas copias del gen ras estn inactivadas por mutacin mueren, las que presentan nicam ente una copia inactivada sobrevi ven aunque carecen de R7. Contrariamente, si uno de los genes ras se hace hiperactivo mediante m utacin, R7 se desarrolla incluso en mutantes en los que tanto sev com o boss son inactivos. As pues, la activacin de Ras parece ser nece saria y suficiente para inducir la diferenciacin de R7. Un segundo gen, el llama do hijo-de-sevenless (sos, de son-of-sevenless) codifica una protena liberadora de nucletidos de guanina (GNRP), que es necesaria para que el receptor tirosina quinasa Sev active a Ras. Un tercer gen codifica una protena semejante a Sem -5 denominada Drk (de downstream o f receptor kinases, ms adelante de los receptores quinasa) que acopla el receptor Sev a la protena Sos; el dominio SH2 de Drk se une a Sev, activndola, mientras que parece que los dos dominios SH3 se unen a Sos. Un cuarto gen codifica una protena activadora de GTPasa (GAP). Si este gen es inactivado, R7 se desarrolla incluso aunque sev haya sido inactivado, probablem ente porque Ras es hiperactivo cuando GAP no lo inhibe (Figura 15-53). En este sistema de sealizacin, sin embargo, y en muchos otros sistemas estudiados, la activacin de Ras por receptores tirosina quinasa depen de de la activacin de GNRP ms que de la inactivacin de GAP. Una vez activada, Ras transmite la seal activando una cascada de fosforila cin serina/treonina, que est altam ente conservada en las clulas eucariotas, desde las levaduras hasta los humanos, Un com ponente crucial en esta cascada es un nuevo tipo de protena quinasa denominado MAP-quinasa, que conside raremos a continuacin.

Figura 15-52 Ensamblaje de las clulas de un fotorreceptor en un omatidio en desarrollo de D ro so p h ila . Dibujo esquemtico del reclutamiento secuencial de fotorreceptores, empezando con R8 y acabando con R7, que es la ltima clula fotorreceptora que se desarrolla.

Ras activa una cascada de fosforilaciones serina/treonina que activa la MAP-quinasa 36

Las fosforilaciones en tirosina y la activacin de Ras, estimuladas por receptores quinasa de la superficie citoplasm tica de la membrana plasmtica, tienen una vida muy corta: las fosforilaciones son revertidas rpidamente por protena tiro sina fosfatasas especficas (discutidas ms adelante), y Ras cuando est activa se inactiva a s misma hidrolizando el GTP que tiene unido, a GDP. Para poder esti-

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Captulo 15: Transmisin de seales entre clulas

clula R8 CITOSOL mem branas plasmaticas CITOSOL clula R7

inhibicin de GAP

SIGUE EL PROCESO DE SEALIZACIN

mular las clulas para proliferar o para diferenciarse, estos cortos eventos seal han de convertirse en eventos ms duraderos que puedan mantener la seal y transmitirla hacia el ncleo. El sistema de transmisin est formado por mlti ples cascadas de fosforilacin en serinas/treoninas, que interactan entre s, las cuales son procesos ms duraderos que las fosforilaciones en tirosinas. En estas cascadas participan muchas serina/treonina quinasas, pero una familia que contiene al m enos cinco miembros parece desempear un papel especialmente importante -la s p ro te n a q u in a s a s a c tiv a d a s p o r m it g e n o s (MAP, de Mitogen Activated Proteins) (tambin denominadas quinasas reguladas por seales extracelulares, [ERK, de Extracellular Signal Regulated Kinases]). Estas quinasas son activadas por una gran variedad de seales inductoras de proliferacin y dife renciacin celular, algunas de las cuales activan receptores tirosina quinasa mientras que otras activan receptores asociados con protenas G. Una caracterstica extraordinaria de las MAP-quinasas es que para que se produzca su activacin completa hace falta que se fosforilen sobre una treonina y sobre una tirosina que en la protena se hallan separadas por un solo am ino cido. La protena quinasa que cataliza ambas fosforilaciones se denomina MAP-quinasa-quinasa. Los requerimientos de fosforilacin sobre tirosina y treo nina aseguran que MAP-quinasa se mantenga inactiva mientras no se active es pecficamente la MAP-quinasa-quinasa, cuyos nicos substratos conocidos son las MAP-quinasas. A su vez, la MAP-quinasa-quinasa se activa por fosforilacin en serinas/treoninas catalizada por una MAP-quinasa-quinasa-quinasa, que al parecer se activa por unin a Ras activa (Figura 15-54). Cuando MAP-quinasa se halla activada, transmite seales fosforilando va rias protenas celulares, incluyendo otras protena quinasas y protenas regula doras de genes. A menudo, en cuestin de minutos despus de que la clula haya sido estimulada por un factor de crecimiento, se activa la transcripcin de un conjunto de genes tempranos inmediatos. Un complejo proteico que desem pea un importante papel en esta activacin de la transcripcin es el complejo discutido anteriormente formado por el factor de respuesta srica (SRF, de Se rum Response Factor) y Elk-1. El complejo se halla unido constitutivamente a una secuencia determinada de DNA (el elemento de respuesta srica) que se ha lla en la regin reguladora de un gen denominado fos y de otros genes (vase Fi gura 15-32). Adems, las MAP-quinasas pueden fosforilar la protena Jun, que se com bina con la protena recin formada Fos formando una protena activa regu ladora de genes denominada AP-1. Entonces, esta protena AP-1 activa otros ge-

Figura 15-53 Procesos de sealizacin celular tem pranos en el desarrollo de R7. La activacin del receptor tirosina quinasa Sev de la superficie de la clula precursora de R7 por la protena Boss de la superficie de R8 est acoplada con la activacin de la protena liberadora de nucletidos de guanina Sos, a travs de la pequea protena adaptadora SH, Drk. Drk reconoce una determinada tirosina autofosforilada de la protena Sev mediante un dominio SH2 e interacta con Sos mediante dos dominios SH3. Sos estimula la protena inactiva Ras para eliminar el GDP que tiene unido y as a captar GTP, lo cual activa a Ras para transmitir la seal siguiendo el curso del proceso de sealizacin. (A pesar de que no se muestra aqu, Ras se halla unida a la cara citoslica de la membrana plasmtica.) Se cree que Sev activa tam bin inhibe GAP, la cual podra, caso de estar activa, contrarrestar la funcin de Sos estimulando a Ras para hidrolizar el GTP que llevara unido, inactivndose. Parece que el acoplamiento del receptor tirosina quinasa con Ras ocurre a travs del mismo m ecanism o que en las clulas de mamfero.

Sealizacin va receptores de superfcie celular asociados a enzimas

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m em brana plasmtica

nes, aunque no se conoce con total exactitud cul es el papel que desempea en la proliferacin celular. La quinasa C tam bin puede fosforilar Jun y, como se ilustra en la Figura 1554, puede activar la MAP-quinasa-quinasa-quinasa, de forma que tanto Jun como MAP-quinasa-quinasa-quinasa constituyen ejemplos de puntos de inte gracin donde convergen varios procesos de sealizacin.

Figura 15-54 Cascada de fosforilaciones serina/treonina activada por Ras y quinasa C. En el proceso activado por receptores tirosina quinasa a travs de Ras, a menudo MAP-quinasa-quinasaquinasa es una serina treonina quinasa denominada Raf, que al parecer se activa por la unin de una Ras activada. En el proceso activado por receptores asociados a protenas G a travs de quinasa C, MAP-quinasaquinasa-quinasa puede ser tanto Raf como otra protena serina/treonina quinasa. En levaduras y en todos los animales en que se ha estudiado, se ha encontrado una cascada de fosforilaciones serina/treonina sem ejante a sta, en la que participan protenas relacionadas estructural y funcionalmente con stas. Estas cascadas de fosforilacin integran y amplifican seales que provienen de diferentes estmulos extracelulares. Los receptores tirosina quinasa tambin pueden activar un proceso de sealizacin ms directo hacia el ncleo mediante la fosforilacin directa de protenas reguladoras de genes, que as se activan, que contienen dominios SH2.

La actividad de los receptores asociados a tirosina quinasa depende de tirosina quinasas que no son receptores 37
Muchas de las protenas receptoras de la superficie celular que han sido aisladas y caracterizadas no encajan en ninguna de las familias principales de receptores que hemos descrito hasta aqu: no estn asociadas a canales inicos ni a prote nas G, y carecen de dominio cataltico evidente. Este gran y heterogneo surtido de receptores incluye receptores para la mayora de los mediadores locales (de nominados citoquinas ) que regulan la proliferacin y diferenciacin en el siste ma hematopoytico, as como receptores para algunas hormonas (por ejemplo, horm ona de crecimiento y prolactina) y los receptores especficos de antgenos de los linfocitos T y B. Muchos de los receptores de esta categora trabajan a tra vs de tirosina quinasas asociadas que fosforilan varias protenas diana cuando el receptor se une a su ligando. La mayora de las quinasas asociadas con estos receptores asociados a tirosina quinasa son miembros de la bien caracterizada fam ilia Src de protena tirosina quinasas no receptoras mencionadas anterior mente, o de la recientem ente descrita fam ilia Janus tambin de protena tirosi na quinasas no receptoras. Se cree que estos receptores actan casi de la misma forma que los receptores tirosina quinasa, excepto en que su dominio quinasa est codificado por otro gen y se halla asociado no covalentemente con la cade na polipeptdica del receptor. Como los receptores tirosina quinasa, parece que a menudo en su activacin participa una dimerizacin del receptor inducida por el ligando (Figura 15-55).

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Captulo 15 : Transmisin de seales entre clulas

En mamferos existen al menos ocho miembros de la fa m ilia Sre de protei na tirosina quinasas no receptoras: Src, Yes, Fgr, Fyn, Lek, Lyn, H cky Blk. Contie nen dominios SH2 y SH3 y todos ellos se hallan localizados en la cara citoplas mtica de la membrana plasmtica, unidos a ella en parte a travs de su interaccin con protenas receptoras transmembrana y en parte por su unin covalente a cadenas lipdicas. Varios miembros de la familia se hallan asociados con diferentes receptores y fosforilan de forma solapada distintos juegos de pro tenas diana. Por ejemplo, Lyn, Fyn y Lek se hallan asociadas a diferentes juegos de receptores en los linfocitos. Todos los miembros de la familia Src tirosina quinasa se activan cuando un ligando extracelular se une a una protena receptora adecuada. Los miembros de esta familia Src quinasa pueden asociarse tanto a recepto res que no tienen actividad tirosina quinasa intrnseca como a receptores que s la tienen. En varias clulas no-linfocticas, por ejemplo, Fyn se une va su domi nio SH2 a receptores PDGF activados, los cuales fosforilan a Fyn en residuos ti rosina, activando as su actividad quinasa. Por ello no resulta sorprendente que los receptores tirosina quinasa y los receptores de la familia Src de receptores asociados a actividad tirosina quinasa, en algunos casos activen los mismos pro cesos de sealizacin. De mucha menos informacin disponemos sobre la fa m ilia Ja n u s de protei na tirosina quinasas no receptoras, que incluye JAK1, JAK2 y Tyk2. Participan en la sealizacin a partir de varios receptores asociados a tirosina quinasa, inclu yendo los de hormona de crecimiento, prolactina y varias citoquinas que actan sobre clulas hematopoyticas (se discuten en el Captulo 22). En muchos receptores asociados a tirosina quinasa, la unin del ligando ge nera el ensam blaje de dos o ms subunidades receptoras transmembrana dife rentes. Un ejemplo de ello, bien estudiado, es el receptor para interleucina-2 (IL-2), un mediador local segregado por los linfocitos T que estimula la prolife racin de los linfocitos (se discute en el Captulo 23). El re c e p to r IL -2 est com puesto de tres cadenas polipeptdicas (a, (3 y y), que al parecer se ensamblan des pus de que el ligando se una a un complejo receptor funcional, como se ilustra en la Figura 15-56.

Algunos receptores son protena tirosina fosfatasas 38

Como hemos mencionado previamente, los residuos de tirosina que son fosforilados por protena tirosina quinasas son rpidamente desfosforilados por p ro te i n a tiro s in a fo sfa ta sa s. Desde el punto de vista estructural, estas enzimas no es tn relacionadas con las protena serina/treonina fosfatasas de las que hemos tratado antes, y nicamente eliminan un grupo fosfato de determinados grupos fosfotirosina de determinados tipos de protenas. Estas fosfatasas se encuentran tanto en formas solubles como unidas a membrana, y de ellas existen muchas ms variedades que de serina/treonina fosfatasas. Su elevada especificidad ase gura que las fosforilaciones en tirosina tengan una vida media muy corta y que el nivel de fosforilacin en tirosinas que presentan las clulas en reposo sea muy

Figura 15-55 Estructura tridimensional de la horm ona de crecim iento hum ana unida a su receptor. La hormona (en rojo ) se ha unido, entrecruzndolos, a dos receptores idnticos (uno se muestra en verde y el otro en azul), formando un receptor homodmero. (No poda preverse en absoluto que un ligando monomrico com o la hormona de crecim iento pudiera unirse, entrecruzndolos, a dos receptores, ya que ello supone que los dos receptores idnticos han de reconocer zonas diferentes de la hormona.) Se cree que la dimerizacin inducida por la unin de un ligando une los dominios citoplasmticos de las dos protenas receptoras transm embrana de un solo paso. Ello, a su vez, activa una tirosina quinasa no receptora (no se muestra). Las estructuras mostradas aqu han sido determinadas por estudios de cristalografa de rayos X de complejos formados entre la hormona y los dominios extracelulares del receptor producidos por la tecnologa del DNA recom binante. (De A.M. deVos, M. Ultrech y A.A. Kossiakoff, Science 255:306-312, 1992. the AAAS.)

quinasa Lek activada

Figura 15-56 Ensamblaje inducido por ligando en un receptor IL-2. Parece que la unin de baja afinidad de IL-2 a la cadena a desencadena el ensamblaje del receptor heterotrimrico, de alta afinidad, el cual entonces se une, activndola, a la tirosina quinasa Lek, interaccionando con ella a travs de la cola citoplasmtica de la subunidad (3.

Sealizacin va receptores de superficie celular asociados a enzimas

821

bajo. Las protena tirosina fosfatasas no actan simplemente revertiendo conti nuam ente el efecto de las protena tirosina quinasas, sino que pueden estar re guladas y desempear funciones especficas en la sealizacin celular, as como en el control del ciclo celular (se discute en el Captulo 17). Un importante ejemplo de protena tirosina fosfatasa regulada es la protena CD45, que se encuentra sobre la superficie de los linfocitos y juega un papel esencial en la activacin tanto de los linfocitos B como de los linfocitos T por antgenos extraos. CD45 es una glucoprotena que atraviesa la mem brana una sola vez, cuyo dominio tirosina fosfatasa se halla expuesto sobre la cara citoplasm tica de la m em brana plasmtica. Cuando se activa por la reaccin de un anti cuerpo extracelular (su ligando normal no es conocido), su dominio cataltico se activa eliminando grupos fosfato de residuos de tirosina de determinadas pro tenas diana de la clula. Se cree que una de estas protenas es la tirosina quina sa Lck m encionada anteriormente. Cuando es desfosforilada por CD45, Lck se activa fosforilando otras protenas de la clula.

La utilizacin de oncogenes que provocan cncer ha permitido identificar muchos com ponentes del proceso de sealizacin de los receptores tirosina quinasa 39
Normalmente, las clulas de los animales superiores se dividen nicamente cuando son estimuladas por factores de crecimiento, producidos por otras clu las y que habitualmente actan unindose a receptores tirosina quinasa. Las c lulas cancerosas proliferan excesivamente principalmente porque, como resul tado de mutaciones acumuladas, son capaces de dividirse sin ser estimuladas por otras clulas, por lo que no se hedan sujetas al control social normal de la proliferacin celular (se discute en el Captulo 17). No es sorprendente que m u chas de estas mutaciones afecten a genes que codifican protenas que participan en los procesos de sealizacin utilizados por los receptores tirosina quinasa. De hecho, muchos de los genes que codifican las protenas seal discutidas en esta seccin, incluyendo Ras, Src (y los otros miembros de la familia Src), Raf, Fos y Jun, fueron identificadas por primera vez como formas mutantes en clulas can cerosas o en virus tumorales productores de cncer. Como se discute en el Cap tulo 24, los genes mutantes se denominaron oncogenes antes de que se com prendiera su origen a partir de genes normales; por ello, a los genes normales habitualm ente se les denomina proto-oncogenes. En principio podra esperarse que cualquier mutacin que provocara la pro duccin de una protena anormalmente activa de cualquier paso del proceso de sealizacin que va desde el factor de crecimiento hasta el ncleo pudiera pro ducir cncer al estimular a la clula a proliferar en ausencia de las seales extracelulares apropiadas. Las evidencias de que disponemos corroboran esta idea. El oncogn sis, por ejemplo, codifica un forma funcionalmente activa de PDGF que se expresa de forma inadecuada; las clulas que presentan el oncogn sis y tam bin expresan receptores para PDGF, continuamente se autoestimulan a prolife rar. El oncogn erbB codifica una forma truncada del receptor de EGF que tiene un dominio intracelular tirosina quinasa que se halla activo continuamente; las clulas que expresan este oncogn se comportan como si estuvieran estimula das continuam ente a proliferar por un factor de crecimiento. Las clulas se com portan de una forma similar a como lo haran si hubieran estado infectadas por un virus que transportara el oncogn v-src, que codifica una forma constitutiva mente activa de la pro tena tirosina quinasa Src, o como si expresara un onco gn ras, que codifica una forma anormal de una protena Ras que no puede inactivarse a s misma ya que ha perdido la capacidad de hidrolizar GTP. De for m a similar, las clulas proliferan de forma anormal si expresan un oncogn que codifica una forma constitutivamente activa de una protena reguladora de un gen activado por factores de crecimiento, como Jun o Fos. Los estudios sobre oncogenes de este tipo no slo han iluminado los mecanismos moleculares que estn en la base del cncer, sino que tambin han descubierto muchas protenas

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Captulo 15: Transmisin de seales entre clulas

desconocidas de los procesos de sealizacin activados por factores de creci miento. Algunas hormonas que estimulan sus clulas diana a proliferar se unen a re ceptores asociados a protenas G en lugar de unirse a receptores tirosina quinasa. Por ejemplo, el factor liberador de hormona de crecimiento (GHF, de Growth Hormone Releasing Factor) estimula las clulas secretoras de hormona de creci miento de la glndula hipfisis a proliferar; GHF se une a los receptores de GHF que activan la adenil ciclasa a travs de una protena G estimuladora Gs. El incre mento resultante de los niveles de AMP cclico induce a las clulas de la hipfisis a dividirse. Como era de esperar, las mutaciones del gen a s que inactivan la acti vidad GTPasa de la subunidad a de Gs (y por lo tanto hacen que la protena est activa de forma constitutiva) producen un oncogn que se halla frecuentemente en los tumores humanos de hipfisis.

Las protenas de la superfamilia TGF-p activan receptores que son protena serina/treonina quinasas 40
Los factores-p transformantes del crecimiento (TGF-p, de Transforming Growth Factors-P) constituyen una familia de mediadores locales que regulan la prolife racin y otras funciones de la mayora de tipos celulares de los vertebrados. Los cinco miembros de la familia (TGF-pi al (35) son protenas de estructuras y fun ciones similares. Sus efectos sobre las clulas son variados. Dependiendo del tipo celular, pueden suprimir la proliferacin, estimular la sntesis de matriz extracelular, estimular la formacin del hueso y atraer clulas por quimiotaxis. Los TGF-P son sintetizados como largos precursores y secretados como complejos inactivos que ms tarde son activados por procesamiento proteoltico. Algunas otras protenas seal extracelulares estn estructuralmente relacio nadas con los TGF-p. Entre ellas, encontramos las activinas, que juegan un papel importante en la induccin del mesodermo en el desarrollo de los vertebrados (se discute en el Captulo 21), y las protenas de morfognesis del hueso, que esti mulan la formacin del hueso. En conjunto, estas protenas constituyen la su perfamilia TGF- p. Recientem ente se han clonado y secuenciado los cDNA que codifican algu nos receptores de miembros de esta superfamilia. Estos receptores son prote nas que atraviesan una vez la mem brana y con dominios serina/treonina quinasa sobre la cara citoslica de la mem brana plasmtica. Se trata de los primeros receptores serina/treonina quinasa que se han identificado, y todava conoce mos muy poca cosa acerca de los procesos de sealizacin que ellos activan. En la Figura 15-57 se resumen algunas de las protena quinasas especficas de tirosina o especficas de serina/treonina de que hemos tratado en este cap tulo.

El receptor transm em brana Notch media la inhibicin lateral mediante un m ecanism o desconocido 41
La clase de receptores de superficie celular asociados a enzimas es grande y va riada. Incluye, adems de los que ya hemos considerado, las integrinas, que se unen a com ponentes de la matriz extracelular. Como se discute en el Captulo 19, estas protenas transmembrana no slo unen clulas a la matriz a travs de contactos focales sino que tam bin generan seales intracelulares en estos luga res de unin, probablemente desencadenando el ensamblaje de un complejo se al intracelular (vase Figura 17-42). El m ecanismo de sealizacin utilizado por algunas protenas receptoras es todava tan desconocido que resulta difcil clasificar tales receptores. Un ejem plo importante de ello lo constituye la protena de Drosophila Notch. Como se explica en el Captulo 21 , esta protena transmembrana que la atraviesa una sola vez juega un papel crucial en las interacciones clula-clula que controlan el de licado patrn de diversificacin celular durante el desarrollo de la mosca. Tpi-

Sealizacin va receptores de superficie celular asociados a enzimas

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PROTEINA QUINASAS ESPECFICAS DE TIROSINA

PROTEINA QUINASAS ESPECFICAS DE SERINA/TREONINA

cam ente, una clula que carece de Notch no responde a la inhibicin lateral -s e ales inhibidoras que provienen de sus vecinas inmediatas y que normalmente haran que se diferenciara siguiendo un camino diferente a ellas. En un embrin normal de mosca, por ejemplo, un precursor de clula nerviosa inhibe a sus ve cinas para impedir que tam bin se transformen en clulas nerviosas, por lo que dichas clulas se transforman en clulas epiteliales; en mutantes Notch esta in hibicin no se produce y todas las clulas se transforman en clulas nerviosas. Como en el caso de la protena Sev de la que hemos tratado anteriormente, Notch se activa al unirse no a molculas seal solubles sino a protenas que se presentan sobre la superficie de las clulas adyacentes. Aunque se conoce la se cuencia de Notch y se han identificado algunas de las protenas del proceso de se alizacin, mediante anlisis genticos, todava no est claro de qu forma Notch transmite la seal al interior de la clula. Otras protenas semejantes a Notch tam bin desempean papeles importantes en el desarrollo de los vertebrados, pero en estos casos, los mecanismos que participan en los procesos de sealizacin tambin resultan un misterio.

Figura 15-57 Algunas de las protena quinasas discutidas en este captulo.

Se muestra el tamao y la localizacin de sus dominios catalticos (en verde oscuro). En cada caso el dominio cataltico es de unos 250 residuos de aminocidos de longitud. Todos estos dominios tienen una secuencia similar, lo cual sugiere que todos ellos han evolucionado a partir de una quinasa primordial comn. Ntese que todas las tirosina quinasas mostradas se hallan unidas a la membrana plasmtica, mientras que la mayora de las serina/treonina quinasas se hallan en el citosol.

Resumen
Se conocen cinco clases d e receptores asociados a enzimas: (1) receptores guanilato ciclasa transm em brana, q u e gen eran GMP cclico directam ente; (2) receptores tiro sina fosfatasa, q u e elim inan fosfatos d e cadenas laterales d e fosfotirosina d e deter m inadas protenas; (3) receptores serina/treonina quinasa transm em brana, que a a den un gru po fosfato a cadenas laterales d e serina o d e treonina de protenas

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Captulo 15 : Transmisin de seales entre clulas

diana; (4) receptores tirosina quinasa, y (5) receptores asociados a tirosina quinasas. Los dos ltimos tipos de receptores son, con diferencia, los ms num erosos y al p arecer actan d e una m anera sim ilar: habitualm ente la unin del ligando induce la dim erizacin del receptor, lo cual activa la actividad tirosina quinasa del propio receptor o d e la enzim a tirosina quinasa asociada al receptor. Una vez activada, habitualm ente la actividad tirosina quinasa se autofosforila a s m isma sobre m l tiples residuos tirosina, q u e entonces actan como lugares d e unin p ara un red u cido nm ero d e protenas seal intracelulares las cuales, a travs de sus dom inios SH2, se u nen especficam ente a determ inados residuos fosfotirosina. De esta fo rm a se activa un complejo seal multiprotena, a partir del cual la seal se transmite al interior celular. Las protenas Ras actan como uniones cruciales del sistema intracelular de transmisin de seales. Son GTPasas m onom ricas q u e actan como interruptores m oleculares; son activadas p o r protenas q u e liberan nucletidos d e gu an in a e inactivadas p o r GAP. Cuando las protenas Ras son activadas, inician una cascada d e fosforilaciones serinaJtreonina qu e convergen sobre MAP-quinasas, las cuales colaboran en la transmisin d e la seal al ncleo. Muchos d e los genes qu e codifi can protenas d e las cascadas intracelulares d e sealizacin qu e son activados p or receptores tirosina quinasas fu ero n identificados como oncogenes en clulas cance rosas o como virus tumorales, ya qu e su activacin inadecuada hace qu e la clula prolifere excesivamente.

Adaptacin de las clulas diana

Normalmente, cuando las clulas y los organismos responden a algn estmulo, pueden detectar el mismo porcentaje de variacin de la seal en una gama muy amplia de intensidades del estmulo. A nivel celular, esto requiere que las clulas diana sufran un proceso de adaptacin o desensibilizacin, mediante el cual su respuesta va disminuyendo cuando se halla expuesta a un estmulo durante un perodo prolongado de tiempo. De esta forma, la clula ajusta de forma reversible su sensibilidad al nivel del estmulo. En el caso de la sealizacin qumica, la de sensibilizacin permite a la clula responder a cambios de la concentracin de la molcula ligando (en lugar de responder a concentraciones absolutas del ligan do) en un amplio margen de concentraciones absolutas. El principio general es sencillo: la adaptacin se consigue a travs de una retroalimentacin negativa que acta con un cierto retraso. La retroalimentacin negativa significa que una respuesta fuerte modifica la maquinaria que produce dicha respuesta, de forma que se inhibe a s misma; pero gracias al retraso, un cambio repentino del nivel de estmulo es capaz de producir una respuesta intensa durante un perodo de tiempo corto, antes de que la retroalimentacin negativa tenga tiempo de actuar. La adaptacin a seales qumicas puede producirse de diferentes formas. En algunos casos, se produce por la disminucin progresiva del nmero de pro tenas receptoras especficas de superficie, la cual normalmente se produce en un intervalo de horas. En otros casos se produce por una rpida inactivacin de estos receptores, lo cual se produce en cuestin de minutos. En otros casos es debida a cambios en las protenas que participan en la transduccin de la seal tras la activacin de los receptores, los cuales se producen habitualmente a unas escalas de tiempo intermedias.

La adaptacin lenta depende de la regulacin por disminucin del nmero de receptores 42

A menudo, despus de que una hormona o un factor de crecimiento se haya unido a su receptor de la superficie de las clulas diana, son ingeridos por la c lula por endocitosis mediada por receptor y liberados a los endosomas (se discu te en el Captulo 13). La mayora de los receptores descargan su ligando en el am biente cido de los endosomas y se reciclan de nuevo hacia la membrana,

Adaptacin de las clulas diana

825

adrenalina

receptor desensibilizado

UN INCREMENTO DE LA CONCENTRACIN DE AMP CCLICO ACTIVA LA QUI NASA A PARA QUE FOSFORILE EL RECEPTOR EN UN SOLO LUGAR quinasa A activa receptor desensibilizado

Figura 15-58 Dos m ecanism os de la rpida desensibilizacidn del receptor P2 adrenrgico. Ambos dependen de la fosforilacin del receptor. Tanto la fosforilacin en (A) com o la unin de arrestina en (B) inhiben la capacidad del receptor para interactuar con Gs, disminuyendo as la respuesta a la adrenalina.

LA QUINASA (3 ADRENRGICA FOSFORILA EL RECEPTOR ACTIVADO EN MUCHOS LUGARES

LA p ARRESTINA SE UNE AL RECEPTOR FOSFORILADO

quinasa (3 adrenrgica activa

P arrestina

mientras que el ligando es transferido a los lisosomas y es degradado. Este pro ceso, por lo tanto, constituye el principal mecanismo de degradacin de muchas protenas seal. A pesar de que muchas molculas de receptor son recuperadas del endosoma y recicladas, una cierta proporcin de ellas no se liberan de su li gando y acaban en los lisosomas, donde son degradadas con el ligando. As, cuando una clula es expuesta continuam ente a elevadas concentraciones de un ligando, el nmero de receptores de su superficie va disminuyendo progresiva mente, con una disminucin concom itante de la sensibilidad de la clula diana al ligando. Mediante este tipo de mecanismos, conocido com o regulacin por disminucin del nm ero de receptores (receptor down-regulation), las clulas pueden, lentam ente (durante horas) ajustar su sensibilidad a la concentracin de un ligando estimulador.

A menudo la adaptacin rpida se produce por fosforilacin de los receptores 43

Frecuentem ente en la adaptacin de la clula diana participa, adems de la lenta regulacin por disminucin del nmero de receptores, una rpida fosforilacin del receptor inducida por el ligando. El ejemplo m ejor conocido es el receptor P2 adrenrgico, que activa la adenil ciclasa a travs de las protena G estimulado ra Gs. Cuando las clulas son expuestas a elevadas concentraciones de adrenali na, pueden desensibilizarse en cuestin de minutos, a travs de dos procesos que dependen de la fosforilacin del receptor P2 adrenrgico. En uno de ellos, el increm ento de los niveles de AMP cclico causado por la unin de la adrenalina activa la quinasa A, la cual fosforila el receptor P2 sobre un residuo de serina, in terfiriendo as con la habilidad del receptor de activar Gs. En el otro proceso, el receptor p2 una vez activado se convierte en substrato de otra protena quinasa ms especfica (denominada quinasa P adrenrgica) que fosforila el extremo carboxilo de la cola citoplasm tica del receptor activado, sobre mltiples residuos de serina y treonina; esta cola fosforilada se une a una protena inhibidora deno minada p arrestina (del ingls arrest: parar), la cual bloquea la capacidad del receptor para activar Gs (Figura 15-58). En las clulas fotorreceptoras de los ver tebrados, la rodopsina, que com o hemos visto est estructuralmente relaciona da con los receptores p adrenrgicos, se inactiva mediante un mecanismo alta mente relacionado al descrito basado en la accin de la arrestina, despus de haber sido activado por la accin de un fotn. Estas clulas tienen una capaci-

826

Captulo 15 : Transmisin de seales entre clulas

dad de adaptacin excepcionalmente rpida y sofisticada, en la que participan, adems del m ecanism o basado en la arrestina, muchos otros; uno de ellos fue discutido anteriormente, en la pgina 806. El m ecanism o de desensibilizacin del receptor P2 adrenrgico dependiente de la quinasa A acta cuando los niveles de AMP cclico aumentan en la clula. As, la activacin de cualquier tipo de receptor de la clula diana que active la adenil ciclasa puede desensibilizar el receptor P2 -lo cual constituye un ejemplo de desensibilizacin heterloga, mediante el cual un ligando desensibiliza la c lula diana a otro ligando. El mecanism o dependiente de la P arrestina, por el contrario, nicamente acta cuando los receptores P2 han sido activados por la unin de un ligando -u n ejemplo de desensibilizacin homologa, mediante el cual un ligando desensibiliza la clula diana nicamente a s mismo.

m orfina
Figura 15-59 Estructura de la morfina. Por qu algunas de nuestras clulas tienen receptores para una droga com o la morfina, que proviene de las semillas de la adormidera? Durante mucho tiempo los farmaclogos han sospechado que la morfina puede mimetizar alguna molcula seal intracelular que regule el humor y la percepcin del dolor. En 1975 se aislaron a partir de cerebro de cerdo dos pentapptidos con actividad sem ejante a la morfina denominados encefalinas, y poco ms tarde a partir de hipfisis y de otros tejidos se aislaron unos polipptidos ms grandes con actividad sem ejante, denominados endorfinas. Todas estas substancias, denominadas op i c eo s en dgen os, presentan una secuencia com n de cuatro aminocidos y se unen al mismo tipo de receptores de la superficie celular al que se une la morfina (y otros narcticos relacionados con ella). A diferencia de la morfina, sin embargo, estos compuestos son rpidamente degradados tras ser segregados, de forma que nunca se acumulan en cantidades suficientes com o para inducir la tolerancia que se observa en los adictos a la morfina.

Algunas form as de adaptacin son debidas a cambios en el proceso de sealizacin 44

A pesar de que la mayora de los m ecanismos conocidos de adaptacin suponen cam bios en la protena receptora, en principio la adaptacin puede producirse por m odificaciones de cualquier com ponente del proceso de sealizacin. Se conocen varios casos en los que la adaptacin de la clula diana se produce por modificacin de una protena G trimrica. Ello ocurre, por ejemplo, en la res puesta de las clulas de levadura a feromonas de apareamiento. Las alteraciones ms adelante de la protena G en el proceso de sealizacin tambin pueden contribuir a la adaptacin de las clulas diana, como en el caso de los fotorreceptores (vase pg. 806). En los adictos a la morfina, por ejemplo, las neuronas sensibles a los opiceos del cerebro se desensibilizan a la morfina, de forma que los adictos necesitan dosis de morfina muy superiores a las que requie ren los individuos normales para eliminar el dolor o para causar sensacin de euforia (Figura 15-59). Las clulas adaptadas, sin embargo, tienen niveles norma les de receptores de superficie celular funcionales contra la morfina (opiceos). Los mecanismos de adaptacin se han estudiado tanto en rata como en lneas ce lulares neurales sensibles a la morfina, mantenidas en cultivo. Los receptores a la morfina de la superficie de estas clulas activan la protena G inhibidora G, que inhibe la adenil ciclasa, causando as una disminucin de los niveles intracelulares de AMP cclico. Ello disminuye la actividad de la quinasa A y, por lo tanto, la fosfo rilacin de varios tipos de canales inicos, lo cual disminuye la excitabilidad elc trica de las neuronas. Las clulas cultivadas mantenidas durante mucho tiempo en presencia de elevadas concentraciones de morfina se adaptan mediante un in cremento compensatorio de la expresin de los genes de quinasa A y de adenil ci clasa, lo cual hace que los niveles tanto de actividad adenil ciclasa como de AMP cclico vuelvan a los valores normales aunque los receptores de la superficie celu lar estn ocupados por morfina. Sin embargo, como las clulas adaptadas tienen niveles incrementados de adenil ciclasa y de quinasa A, cuando se elimina la mor fina se produce un marcado incremento de la actividad adenil ciclasa y de la acti vidad quinasa A, que provoca que los niveles de AMP cclico aumenten hasta al canzar valores anormalmente elevados. Ello incrementa la excitabilidad de las neuronas y conduce a los sntomas extremadamente desagradables de la depriva cin, (ansiedad, sudoracin, temblores, alucinaciones, etc.) que experimentan los adictos a la morfina cuando tienen el mono.

La adaptacin desempea un papel crucial en la quimiotaxis bacteriana 45

Muchos de los mecanismos que participan en la sealizacin qumica entre c lulas en los animales pluricelulares han evolucionado a partir de mecanismos utilizados por organismos unicelulares para responder a cambios qumicos de su entorno. De hecho, ambos tipos de organismos utilizan algunos mediadores intracelulares comunes. Entre las reacciones de los organismos unicelulares me-

Adaptacin de las clulas diana

827

jor estudiadas frente a seales extracelulares, se encuentran las respuestas quimiotcticas, en las cuales el movimiento celular se dirige hacia o escapa de una fuente de algn compuesto qumico del medio. Concluimos este captulo con una descripcin de la quimiotaxis bacteriana la cual, a travs de la potencia del anlisis gentico, nos proporciona una ilustracin clara y elegante del papel cru cial que supone la adaptacin en respuesta a seales qumicas. En el Captulo 16 se discute la quimiotaxis de las clulas eucariotas. Las bacterias mviles han de nadar hacia los lugares donde haya elevadas concentraciones de nutrientes (atrayentes), como los azcares, los aminocidos y pequeos pptidos, y alejarse de lugares donde haya elevadas concentraciones de productos qumicos nocivos (repelentes) (Figura 15-60). Este comportamiento quimiotctico, relativamente simple pero claramente adaptativo, se ha estudiado especialmente en E. coli y en Salmonella typhimurium. Aqu nos centraremos principalmente en la quimiotaxis hacia los atrayentes; la quimiotaxis que huye de los repelentes se produce esencialm ente por los mismos mecanismos, ac tuando a la inversa. Las bacterias nadan gracias a los flagelos, que son completamente diferen tes de los flagelos de las clulas eucariotas. Los flagelos bacterianos consisten en un cilindro helicoidal que contiene un solo tipo de subunidad proteica, llamada flagelina. Cada flagelo est unido por su base, gracias a un corto codo flexible, a un pequeo disco proteico localizado a nivel de la membrana de la bacteria. Por increble que pueda parecer, este disco forma parte de un diminuto motor que

Figura 15-60 Quimiotaxis bacteriana. Las fotografas muestran bacterias S alm o n ella typhim uriu m atradas hacia un pequeo tubo capilar de vidrio que contiene el aminocido serina (A) y repelidas por un tubo capilar que contiene fenol (B). Las fotografas fueron tomadas a los cinco minutos de haber introducido los tubos capilares en las placas de cultivo en que se encontraban las bacterias. Esta prueba del tubo capilar es un mtodo sencillo para demostrar la existencia de quimiotaxis bacteriana (De B.A. Rubik y D.E. Koshland, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:2820-2824, 1978.)

codo
Figura 15-61 Dibujo esquem tico del m otor del flagelo bacteriano. El flagelo est unido a un codo flexible. El codo est unido a varias protenas circulares (mostradas en rojo ) que se hallan integradas en las membranas interior y exterior (plasmtica), y giran con el flagelo aproximadamente a 150 revoluciones por segundo. Se cree que la rotacin est dirigida por un flujo de protones a travs de un anillo exterior de protenas (el estator), que tambin contiene las protenas responsables de cambiar la direccin de giro. (Basado en datos de T. Kubori et al., /. Mol. Biol. 226:433-446, 1992 y N.R.Francis et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:63046308, 1992.)

flagelo

27 nm

I membrana J externa capa de peptidoglucano en el espacio periplasmtico membrana _ interna estator

828

Captulo 15: Transmisin de seales entre clulas

utiliza la energa almacenada en el gradiente transmembrana de H+ girando r pidamente y moviendo el flagelo helicoidal (Figura 15-61). Debido a que los flagelos de la superficie bacteriana tienen una orienta cin intrnseca, diferentes direcciones de rotacin tienen efectos distintos so bre el movimiento. La rotacin en el sentido opuesto a las agujas del reloj hace que los flagelos se unan formando un haz, con lo que la bacteria nada de forma uniforme en una direccin. Pero la rotacin en el sentido de las agujas del reloj hace que los flagelos se separen unos de otros, con lo que la bacteria se mueve de forma catica sin avanzar (Figura 15-62). En ausencia de estmulos am bienta les, la direccin de giro de los flagelos se revierte cada pocos segundos produ ciendo un patrn caracterstico de movimientos en el que la natacin suave en lnea recta se halla interrumpida por cambios abruptos de direccin (Figura 1563A). Este patrn normal de natacin de la bacteria se modifica por atrayentes o por repelentes quimiotcticos, los cuales se unen a protenas receptoras espec ficas afectando la frecuencia de cambios de direccin, incrementando o dismi nuyendo la duracin de los intervalos de tiempo entre los cambios sucesivos de direccin de giro de los flagelos. Cuando las bacterias estn nadando en una di reccin favorable (hacia concentraciones elevadas de un atrayente o huyendo de concentraciones elevadas de un repelente), cambian de direccin menos fre cuentem ente que cuando estn nadando en una direccin desfavorable (o cuan do no existe ningn gradiente). Como los perodos de natacin suave son ms largos cuando la bacteria se desplaza en una direccin favorable, gradualmente progresar en esta direccin -h acia un atrayente (Figura 15-63B) o apartndose de un repelente. En su ambiente natural, una bacteria detecta un gradiente espacial de atra yentes o de repelentes en el medio, nadando a una velocidad constante y com parando la concentracin de compuestos qumicos en funcin del tiempo (no monitoriza los cambios de concentracin utilizando receptores separados en el espacio a lo largo de su longitud; ello sera extremadamente difcil dado el pe quesimo tamao de la bacteria). En el laboratorio se pueden generar artificial mente variaciones de concentracin en funcin del tiempo, mediante la adicin o la eliminacin de productos qumicos del medio de cultivo. Cuando se aade, de esta forma, un atrayente al medio, la bacteria, tal como era de esperar, cesa de cambiar de direccin durante algunos segundos. Pero transcurrido este tiem po, incluso aunque se mantenga la presencia de atrayente en el medio, la fre cuencia de cambio de direccin de la bacteria se recupera hasta valores norma-

(A)

(B)
Figura 15-62 Posiciones de los flagelos de E. coli durante la natacin. Cuando los flagelos giran en sentido opuesto al de las agujas del reloj (A) quedan unidos en un solo haz que ' acta com o hlice, dando lugar a una natacin suave. Cuando los flagelos giran en el sentido de las agujas del reloj (B) se separan entre s, generando un movimiento catico.

Figura 15-63 Caminos recorridos por una bacteria al nadar. En ausencia de seales quimiotcticas (A), los perodos de natacin suave se interrumpen con breves movimientos caticos que modifican al azar la direccin del desplazamiento. As pues, la bacteria se desplaza en tres dimensiones de una forma catica, con continuos cambios de direccin que alternan con perodos de natacin suave. En presencia de un atrayente quimiotctico (B), el movimiento catico queda parcialmente suprimido mientras la bacteria se desplaza hacia una concentracin ms alta del atrayente, de modo que se va acercando gradualmente al atrayente -u n desplazamiento al azar sesgado.

(B)

Adaptacin de las clulas diana

829

Figura 15-64 Modelo de la estructura homodimrica de la protena receptora quimiotctica del aspartato. La estructura tridimensional del dominio extracelular ha sido obtenida por difraccin de rayos X. Los dominios intracelulares superenrollados son una prediccin a partir del anlisis de la secuencia de aminocidos. Contienen los lugares de metilacin (mostrados como puntos negros), de los que hay cuatro en cada una de las dos cadenas polipeptdicas (los lugares de una de las cadenas estn fuera de visin en la figura). Se cree que la unin del ligando, en el espacio periplasmtico, induce un cambio de conformacin en el receptor que se propaga por toda la membrana mediante un movimiento de toda la molcula semejante al de una tijera. (Basado en M.V. Milbum et al., Science 254:13421347,1991 1991 the AAAS; y J.B. Stock et al.,/. Biol. Chem. 267:19753-19756, 1992, publica ASBMB.)

ligando unido

les. La bacteria se mantiene en este estado adaptado mientras no se produzca ninguna disminucin o aumento de la concentracin de atrayente en el medio; la adicin de ms atrayente de nuevo suprimir durante unos segundos los cam bios de direccin de la bacteria mientras que la eliminacin de atrayente en el medio incrementar, tam bin durante unos segundos, la frecuencia de cambios de direccin, hasta que la bacteria se haya vuelto a adaptar al nuevo nivel. La adaptacin constituye una parte crucial de la respuesta quimiotctica en tanto que permite a la bacteria responder a cambios de concentracin en lugar de res ponder a niveles estacionarios de un atrayente, y responde a estos cambios en un extraordinariamente amplio rango de concentraciones del atrayente (en al gunos casos desde menos de 10~10M hasta ms de 10-3 M).

dom inio de sealizacin

La quimiotaxis bacteriana est mediada por una familia de cuatro receptores transm em brana homlogos y por un sistem a de fosforilacin que transm ite la seal 4 6
El desenmaraamiento de los mecanism os moleculares responsables de la qui miotaxis bacteriana ha dependido fundamentalmente del aislamiento y anlisis de m utantes con comportamiento quimiotctico defectuoso. De esta forma, se ha demostrado que la quimiotaxis a varios compuestos depende de una peque a familia de protenas receptoras transm em brana relacionadas entre s, que son responsables de la transmisin de seales quimiotcticas a travs de la m em brana plasmtica. Estos receptores quim iotcticos se metilan durante la adaptacin (vase ms adelante), por lo que a menudo se les denomina prote nas de quimiotaxis aceptoras de metilos (MCP, de Methyl-Accepting Chemotaxis Proteins). Como veremos, la actividad del receptor se estimula por un incre mento de la concentracin de atrayente: un solo receptor se afecta por ambos ti pos de molculas, con consecuencias opuestas. Existen cuatro tipos de receptores quimiotcticos de membrana, cada uno de los cuales est relacionado con la respuesta a un pequeo grupo de com pues tos qumicos. Los receptores de tipo 1 y de tipo 2 median la respuesta a la serina y al aspartato, respectivamente, unindose a estos aminocidos directamente y transduciendo el evento unin en forma de seal en el citosol. En la Figura 15-64 se presenta un modelo de la estructura de uno de estos receptores. Los recepto res de tipo 3 y 4 median la respuesta a azcares y a dipptidos, respectivamente, de una m anera ligeramente menos directa (Figura 15-65). Estudios genticos indican que cuatro protenas citoplasmticas -CheA, CheW, CheY y CheZ- participan en el proceso de sealizacin que acopla el re ceptor quimiotctico con el motor bacteriano. CheY acta en el final efector del proceso, controlando la direccin de giro del flagelo. Cuando est activada, se une al motor haciendo que gire en el sentido de las agujas del reloj, lo cual pro duce cambios de direccin del movimiento de la bacteria; los mutantes que ca recen de esta protena nadan de forma continua sin cambiar de direccin. CheA es una histidina protena quinasa. Cuando est unida tanto al receptor quimio-

7 nm

830

Captulo 15: Transmisin de seales entre clulas

am inocidos

dipptidos atrayentes

ESPACIO PERI PLASMTICO mem brana exterior

protenas receptoras periplasm ticas protenas receptoras quim iotcticas

m em brana plasmtica
CITOSOL /

procesos seal intracelulares

m otor del flagelo

tctico como a CheW, y activada por ellos, se autofosforila sobre un residuo de histidina y casi inmediatamente transfiere el fosfato a un residuo de cido asprtico de CheY. La fosforilacin de CheY activa la protena de manera que se une al motor flagelar y genera una rotacin en el sentido de las agujas del reloj, y cam bios de direccin. CheZ rpidamente inactiva a la CheY fosforilada, estimulando su desfosforilacin (Figura 15-66). La unin de un repelente a un receptor quimiotctico increm enta la activi dad del receptor, el cual, a su vez, increm enta la actividad de CheAy por lo tanto la fosforilacin de CheY, que genera cambios de direccin. Estas fosforilaciones se producen rpidamente: el tiempo necesario para que se produzca la respues ta de cambios de direccin tras la adicin de un repelente es de alrededor de 200 milisegundos. La unin de un atrayente tiene el efecto opuesto. Disminuye la actividad del receptor, el cual disminuye la actividad de CheA, de forma que CheY permanece desfosforilada, el motor continuar girando en sentido contra rio al de las agujas del reloj y la bacteria nadar de manera continua. La funcin de CheY en la quimiotaxis bacteriana es anloga a la funcin de las protenas Ras en la sealizacin de las clulas animales. Como Ras, CheY ac ta com o un interruptor de encendido/apagado: se halla activa cuando est fos forilada e inactiva cuando est desfosforilada, tal como ocurre con Ras, que est activa cuando tiene unido GTP e inactiva cuando tiene unido GDP. CheY se acti va por CheA y se inactiva por CheZ, tal como Ras se activa por GNRP y se inacti va por GAP (vase Figura 15-50). En efecto, las estructuras tridimensionales de CheY y de Ras son similares.

Figura 15-65 Diferentes tipos de receptores quimiotcticos. Los atrayentes qumicos se unen a los receptores quimiotcticos de la membrana plasmtica de tipo 1 o de tipo 2 o a protenas receptoras especficas del espacio periplasmtico (entre las membranas exterior e interior de la bacteria), las cuales entonces se unen a receptores quimiotcticos de tipo 3 o de tipo 4. La unin de un atrayente disminuye la actividad del receptor quimiotctico, inhibiendo la cascada de sealizacin intracelular y haciendo que el motor del flagelo contine girando en sentido opuesto al de las agujas del reloj, suprimiendo pues los cambios de direccin del desplazamiento de la bacteria y generando un movimiento suave y continuado. Los atrayentes difunden en el espacio periplasmtico desde el exterior de la clula, a travs de grandes canales situados en la membrana exterior (no mostrados aqu).

En la quimiotaxis bacteriana, la m etilacin del receptor es responsable de la adaptacin 4 6

En la quimiotaxis bacteriana la adaptacin resulta de la metilacin covalente de las protenas receptoras quimiotcticas. Si se bloquea el proceso de metilacin mediante una mutacin, la adaptacin se inhibe m arcadamente y la exposicin de la bacteria mutante a un atrayente produce el cese de los cambios de direc cin de su movimiento durante das, en lugar de durante algunos segundos o un minuto. As pues, la activacin de los receptores quimiotcticos por un quimio-

Adaptacin de las clulas diana

831

Figura 15-66 Sistema de transferencia de fosforilacin que permite a los receptores quimiotcticos controlar el m otor del flagelo. La unin de un repelente increm enta la actividad el receptor, el cual se une a CheW y a CheA, estimulando as CheA a que se autofosforile. Rpidamente CheA transfiere el grupo fosfato que tiene unido de forma covalente a travs de un enlace de alta energa, directamente a CheY generando CheY-fosfato, el cual se une al motor del flagelo hacindolo girar en el sentido de las agujas del reloj, lo cual hace que la bacteria entre en un movimiento anrquico, con constantes cambios de direccin. La unin de un atrayente tiene los efectos contrarios. Disminuye la actividad del receptor con los que produce una disminucin del grado de fosforilacin de CheA y de CheY, lo cual provoca que el motor flagelar gire en sentido opuesto al de las agujas del reloj, y por lo tanto la bacteria nade con un movimiento suave y continuo. CheZ acelera la desfosforilacin de CheY-fosfato, antagonizando as la accin de CheY. Cada uno de estos intermediarios fosforilados se desfosforila en cuestin de unos 10 segundos, lo cual le permite a la bacteria responder de una forma muy rpida a cambios de su entorno (vase Figura 15-10).

repelente

receptor de quim iotaxis

atrayente tiene dos consecuencias diferentes: ( 1) rpidamente disminuye la acti vidad del receptor, disminuyendo la actividad de CheA y de CheY y haciendo que el m otor flagelar contine rotando en sentido contrario al de las agujas del reloj, lo cual hace que cesen los cambios de direccin; (2) se produce una adap tacin ya que, mientras el atrayente est unido al receptor, el receptor es media do por una enzima del citoplasma, lo cual revierte la activacin durante un pero do de algunos minutos (Figura 15-67). La mediacin del receptor est catalizada por una enzima soluble (la metil transferasa ) que acta sobre la protena receptora. Se pueden llegar a transferir ocho grupos metilo a cada receptor, por lo que el grado de mediacin se incre menta a elevadas concentraciones del atrayente (cuando cada receptor est uni do al ligando durante perodos de tiempo prolongados). Cuando el atrayente se elimina del medio, el receptor es desmetilado mediante una enzima desmedan te soluble (metil esterasa). A pesar de que el nivel de mediacin vara durante la respuesta quimiotctica, permanece constante mientras la bacteria est adapta da, ya que se alcanza un balance exacto entre las velocidades de metilacin y de desmetilacin. La metil esterasa que elimina los grupos metilo de los receptores quimiotcticos tam bin est regulada mediante fosforilacin mediada por CheA, lo cual proporciona otra forma de regulacin por retroalimentacin nega tiva que tam bin contribuye al proceso de adaptacin. Probablemente quedan otras interacciones y retroalimentaciones por des cubrir en la quimiotaxis bacteriana. Sin embargo, ya se han identificado todos los genes y todas las protenas que participan en este comportamiento altam en te adaptativo, y en la mayora de los casos se conocen las secuencias de las pro tenas, y estas protenas se encuentran disponibles en grandes cantidades. Por ello, parece que la quimiotaxis bacteriana ser el primer sistema de sealizacin

m otor del flagelo giro en el sentido de las agujas del reloj MOVIMIENTO ANARQUICO CON CONTINUOS CAMBIOS DE DIRECCIN

lugar de unin del ligando lugar de m etilacin m em brana plasmatica

lugar activo del receptor " /

receptor en reposo LAUNIN DELATRAYENTE DISMINUYE LAACTIVIDAD DEL RECEPTOR Y HACE ASEQUIBLES LOS LUGARES D E METILACIN A LA METIL TRANSFERASA

Figura 1 5-67 Activacin secuencial y adaptacin (va metilacin) de un receptor quim iotctico. Ntese que la actividad del receptor, y por lo tanto la frecuencia de cambios de direccin de la bacteria, es la misma en el estado basal que en el estado de adaptacin. El receptor se ha representado con dos lugares de metilacin, para simplificar el dibujo; en realidad existen ocho lugares de metilacin en cada receptor. A medida que la concentracin del atrayente va aumentando, la fraccin de tiempo durante la cual el receptor est ocupado por el ligando tambin aumenta. A elevados niveles del atrayente pues, se producir un cambio de conform acin del receptor mayor que a bajos niveles de ligando, empujando an ms al receptor hacia su estado com pletam ente alterado. Sin embargo, se produce un ligero grado de metilacin, de forma que en cuestin de algunos minutos la alteracin conform acional del receptor se habr revertido com pletamente y la actividad del receptor se incrementar hasta su nivel anterior. El receptor se ha adaptado.

LA METILACION LENTA D E LOS LUGARES EXPUESTOS HACE QUE LAACTIVIDAD DEL RECEPTOR RECUPERE LOS NIVELES ANTERIORES

H,CO

-CH3

receptor adaptado

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Captulo 15 : Transmisin de seales entre clulas

celular que ser comprendido completamente en trminos moleculares. Pero incluso cuando se hayan definido todas las molculas y sus interacciones, resul tar todava difcil comprender de qu forma actan los procesos de sealiza cin de una red integrada, como discutiremos a continuacin.

Resumen
M ediante la adaptacin a altas concentraciones d e un ligando seal, de una form a reversible y dependiente del tiempo, las clulas pueden ajustar su sensibilidad al nivel de estmulo, respondiendo pues a cambios de la concentracin en un rango amplsimo, y no a concentraciones absolutas de ligando. La adaptacin se puede prod ucir d e diferentes form as: (1) la unin del ligando p uede inducir la intem alizacin d e los receptores, algunos de los cuales sern degradados en los lisosomas - u n proceso denom inado regulacin por dism inucin del nm ero d e receptores (re ceptor do wn-regulation); (2) los receptores activados p ueden ser inactivados d e fo r m a reversible siendo fosforilados o metilados; (3) las protenas G p ueden ser inactivadas d efo rm a reversible; y (4) las protenas de etapas ms avanzadas del proceso d e sealizacin p ueden ser reguladas p o r increm ento (up-regulation) o p or dism i nucin (down-regulation). A nivel molecular, el ejemplo m ejor conocido d e adapta cin tiene lugar en las quimiotaxis bacteriana, en la cual la metilacin reversible d e protenas clave en la transduccin de la seal, qu e se hallan en la m em brana plasmtica, perm ite a la clula nad ar hacia los am bientes ptimos.

La lgica de la sealizacin intracelular: lecciones de redes neuronales basadas en los ordenadores

Cada una de las clulas de un organismo pluricelular est bombardeada con se ales qumicas que han sido producidas por otras clulas -seales que regulan su metabolismo, seales que alteran o mantienen su estado de diferenciacin, seales que determinan cundo se han de dividir las clulas y seales que dictan cundo la clula ha de vivir o morir. En general, estas seales se unen a recepto res de la superficie extracelular, los cuales activan varios procesos intracelulares de sealizacin, de forma que las seales intracelulares generadas por recepto res diferentes interactan entre s de maneras muy complejas. De qu forma una clula integra toda esta informacin de modo que puede comportarse de la manera que es ptima para el organismo en su conjunto? La tarea de entender de qu manera la clula controla su magia parece abrumado ra. Incluso en el caso relativamente sencillo de la quimiotaxis bacteriana, en el que existen relativamente pocos componentes, y probablemente todos ellos co nocidos, las complejidades de las integraciones es demasiado enorme para po derse visualizar fcilmente y comprender completamente, por el momento. To dava no podemos predecir realmente, por ejemplo, el comportamiento de un mutante bacteriano en el que se hayan alterado los niveles de un receptor de membrana o de una protena citoplasmtica, especialmente si el estmulo quimiotctico incluye ms de un atrayente o repelente o si el estmulo cambia rpi damente con el tiempo. De qu forma podemos esperar, entonces, entender las redes mucho ms complejas de sealizacin intracelular de las clulas animales, en las que participan cientos de componentes, muchos de los cuales todava no conocemos? A medida que vamos disponiendo de ms informacin, resulta ms eviden te que las simulaciones basadas en los ordenadores debern jugar un papel cada vez ms importante en nuestros intentos de entender de qu forma actan estos procesos de sealizacin. Construyendo un modelo del proceso en un ordena dor, se puede visualizar y manipular la red de componentes interactivos, de for mas que son imposibles de estudiar en las clulas.

La lgica de la sealizacin celular: lecciones de redes neuronales basadas en los ordenadores

833

Los anlisis basados en el ordenador son tiles desde otro punto de vista -q u e no depende del conocim iento cuantitativo detallado de las reacciones que participan. Los procesos de sealizacin intracelular, vistos como un todo, for man una red altamente interconectada en la que las seales son procesadas a travs de mltiples rutas paralelas que interactan una con otra. As, uno puede aprender acerca del comportamiento de las redes de sealizacin comparndo las con otras redes altamente interconectadas. Las redes basadas en el ordena dor, a menudo denominadas redes neuronales, se desarrollaron originalmente para comprender de qu forma las clulas nerviosas transmiten y procesan la in formacin en el cerebro, pero existen propiedades que tambin son relevantes para la sealizacin intracelular.

Las redes neuronales basadas en el ordenador pueden ser entrenadas47

Uno de los tipos ms sencillos de redes neuronales basadas en el ordenador est compuesto de tres niveles de unidades interconectadas -u n nivel de entrada (input), un nivel escondido y un nivel de salida (output). Cada una de las muchas unidades de la red acta como un modelo de clula nerviosa (neurona), cuya sa lida individual est controlada por mltiples seales de entrada. Las conexiones entre las unidades son anlogas a las sinapsis y tienen pesos de conexin modificables, que controlan la fuerza con la que una unidad influye en otra unidad. La actividad de la red com o un todo depende tanto de los valores de estos pesos de conexin como de las reglas matem ticas mediante las cuales cada unidad suma sus seales de entrada para generar una seal de salida. Un patrn de seales de entrada recibido por las unidades de entrada es transformado segn estos pesos y reglas en otros patrones diferentes de actividad en las unidades de salida, va conexiones a travs de las unidades escondidas (Figura 15-68). La caracterstica ms remarcable y ms til de las redes neuronales basadas en el ordenador es que pueden ser entrenadas para reconocer patrones especficos de seales de entrada, y para responder a cada uno de ellos con un patrn de acti vidad de salida determinado. El entrenamiento se consigue confrontando la red con ejemplos de entrenamiento en forma de series de seales de entrada acompa adas de los correspondientes patrones deseados de seales de salida. Por ejem plo, las entradas pueden ser series de letras presentadas en una orientacin deter minada en la pantalla, y la salida deseada puede ser simplemente la identificacin correcta de cada letra. La entrada tambin puede ser las secuencias de aminoci dos de varias cadenas polipeptdicas y la salida los tipos de estructuras secunda rias que forma cada cadena polipeptdica. Cualquiera que sea la tarea, cuando se ha presentado un ejemplo concreto de entrenamiento, la salida que propone la red se compara con la salida deseada y se asigna un valor de error basado en lo cerca que estn las seales real y deseada. Tras procesar todos los ejemplos de la serie de entrenamiento, se calcula una medida general de realizacin, que caracte riza lo bien que ha trabajado la red en toda la serie de entrenamiento.

ENTRADA NIVEL DE ENTRADA

Figura 15-68 Una red neuronal sencilla. La actividad de cada unidad

NIVEL E SC O N DIDO

N IVEL DE SA LID A

SALIDA

neuronal (mostrada como crculos) se determina por las unidades de entrada. Habitualmente la salida de cada unidad es una funcin no lineal de las unidades de entrada. Cada una de las conexiones entre unidades tiene una fuerza particular o peso, que se indica por las diferencias de grosor de las flechas que las conectan.

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Captulo 15: Transmisin de seales entre clulas

La ventaja del entrenamiento es que pueden cambiarse los valores de peso de la red, de forma que su realizacin m ejore en presentaciones posteriores de series de entrenamiento. Se han diseado varios algoritmos de entrenamiento para realizar estos cambios de los pesos de las conexiones. Uno de los mtodos conceptualm ente ms sencillos, y quizs el ms relevante para la sealizacin celular (como se discute ms adelante), es aquel en el que los pesos de las cone xiones se cam bian al azar, y los cambios que producen una mejora de la realiza cin de la red tienden a mantenerse. Sea cual fuere el algoritmo utilizado, el pro ceso de entrenam iento se repite una y otra vez hasta que la salida real de la red se asemeja a la salida deseada. Los pesos finales de la red no est predetermina dos por el algoritmo sino que emergen de una forma autnoma como resultado de la presentacin repetida de los ejemplos de entrenamiento. Cuando la red ha "aprendido la tarea deseada, a menudo puede reconocer y dar la respuesta co rrecta de patrones de entrada nuevos, que no formaron parte de los ejemplos de entrenamiento.

Las redes de sealizacin celular pueden observarse como redes neuronales entrenadas por la evolucin 4 8
A pesar de que las redes neurales se utilizaron originalmente para estudiar siste mas de neuronas interconectadas, no existe ninguna razn para que las unida des de estas redes tengan que representar nicamente neuronas; por ejemplo pueden ser enzimas u otro tipo de molculas seal intracelulares. Consideremos las protena quinasas que participan en la sealizacin celular. Estas enzimas re ciben seales de entrada (en forma de fosforilaciones o de sencillas uniones de protenas) a partir de com ponentes de varios procesos intracelulares de seali zacin, y estas seales de entrada, colectivamente, regulan la actividad cataltica de la quinasa. A su vez, cada quinasa genera una seal de salida (la fosforilacin de otras protenas) que regula la actividad de determinadas protenas diana, las cuales pueden ser com ponentes ms alejados del propio proceso de sealiza cin o procesos de sealizacin paralelos. En trminos de una red, en este ejem plo las quinasas actan exactamente como lo hacen las neuronas: integran va rias seales de entrada y responden con una seal de salida adecuada. Al menos en principio, puede entrenarse una red altamente interconectada de reacciones seal intracelulares para que reconozcan ciertos patrones de se ales de entrada y respondan con patrones de salida especficos, de una forma similar a como hemos descrito para las redes neuronales basadas en ordenador. En este esquema, el entrenamiento debi de ocurrir durante la evolucin, m e diante mutacin y seleccin natural, de forma que mutaciones al azar en los ge nes que codifican protenas seal ejercieron la misma funcin que las variacio nes al azar en los pesos de las conexiones introducidas por el ordenador. Una mutacin que cam bie la actividad de una protena quinasa seal, por ejemplo, puede increm entar el peso de una o ms conexiones de la red, mientras que un cambio de la especificidad de unin de una protena SH adaptadora puede aadir nuevas conexiones. Las mutaciones que mejoran la realizacin de una red de se alizacin, por ejemplo, al permitirle reconocer una nueva combinacin de facto res de crecimiento o discriminar entre dos seales extracelulares que previamente la clula era incapaz de distinguir, pueden proporcionar al organismo una ventaja selectiva y por ello, ser retenidas para ser mejoradas posteriormente. De esta for ma, pudo evolucionar una red de sealizacin cada vez ms compleja.

Las redes de sealizacin capacitan a las clulas para responder a complejos patrones de seales extracelulares 47,4 9
Cuando se analizan las redes neuronales entrenadas para determinar como reco nocen complejos patrones de seales de entrada, se encuentra que las unidades individuales del nivel escondido (vase Figura 15-68) han quedado fuertemente

La lgica de la sealizacin celular: lecciones de redes neuronales basadas en los ordenadores

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ENTRADA m olculas de la matriz factores de crecim iento

Jquinasa 3 SALIDA
interconectadas a conjuntos significativos de unidades del nivel de entrada, de forma que las unidades escondidas pasan a representar caractersticas significati vas del patrn de entrada aplicado a la red. En una red entrenada para reconocer letras representadas en cualquier orientacin sobre la pantalla, por ejemplo, de terminadas unidades escondidas pueden empezar para reconocer lneas curvas o pares de lneas en ngulo recto, mientras que en una red entrenada para pronun ciar palabras escritas, determinadas unidades escondidas pueden representar so nidos de vocales o de consonantes. De una forma similar, molculas determinadas de sealizacin intracelular de una clula pueden haber evolucionado para reconocer com binaciones deter minadas de seales extracelulares, contribuyendo as a traducir estas com bina ciones de seales en una respuesta celular particular. Consideremos la hipotti ca red mostrada en la Figura 15-69, que casi con toda seguridad es mucho ms sencilla que cualquier red de sealizacin encontrada en una clula. Consta de seis tipos de receptores de superficie que estn acoplados funcionalmente a tres protena quinasas citoslicas. Cada uno de los receptores I, II y III reconocen di ferentes com ponentes de la matriz extracelular, mientras que cada uno de los receptores A, B y C reconocen diferentes factores de crecimiento. La quinasa 3 trabaja en una etapa posterior del proceso que las quinasas 1 y 2 y acta como salida de la red, quizs estimulando a la clula a proliferar al fosforilar un con junto de protenas reguladoras de genes. Debido a las diferentes fuerzas de las conexiones de la red, algunas de las cuales son excitadoras y otras inhibidoras, cada una de las tres quinasas sern estimuladas de forma ptima por diferentes com binaciones de seales extracelulares. La quinasa 1 es ms activa cuando la clula encuentra los com ponentes I y II de matriz y no encuentra los com ponen tes III, mientras que la quinasa 2 es ms activa cuando la clula encuentra facto res de crecim iento A, B y C y no el com ponente III de matriz. Los requerimientos para la actividad ptima de la quinasa 3 son ms complejos, ya que es sensible al entorno extracelular nicamente a travs de las quinasas 1 y 2 . Presentar mxi ma actividad, y estimular a la clula a proliferar, cuando las quinasas 1 y 2 sean activas sim ultneamente -e s decir, cuando la clula haya encontrado los facto res de crecim iento A, B y C y las molculas de matriz I y II, y no la molcula de matriz III, lo cual constituye un patrn sorprendentemente complejo si conside ramos la sencillez de la red. De acuerdo con este punto de vista, la quinasa 3 ha aprendido a lo largo de la evolucin a asociar esta particular combinacin de estmulos extracelulares con la necesidad de la clula para proliferar. De la m is ma forma algunas de las importantes molculas seal de una clula real han aprendido a reconocer y responder a com binaciones relevantes de caractersti cas del entorno celular.

Figura 15-69 Una hipottica red de sealizacin sencilla. La red consta de seis receptores y tres protena quinasas citoslicas. Cada receptor activa (flechas verdes) o inhibe (lneas negras) la quinasa 1, la quinasa 2 o ambas, mediante un mecanismo no especfico. Dado que las seales convergen en la quinasa 3 (la quinasa de salida), esta red ser activa al mximo nicamente cuando se presenten las combinaciones especficas de estmulos extracelulares. A pesar de que esta red es mucho ms sencilla que cualquiera de las que se halla en una clula viva, puede formar parte de un proceso de sealizacin ms complejo.

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Captulo 15 : Transmisin de seales entre clulas

Las redes seal son robustas

Una importante consecuencia de la arquitectura altamente interconectada de una red neuronal es que, una vez ha sido entrenada para realizar una tarea, su realizacin no es fcilmente destruida por la modificacin o la eliminacin de unidades de la red. Si una determinada unidad responde de forma ptima cuan do recibe seales de entrada de otras seis unidades, tambin responder, aunque no tan bien, a tan slo cinco de estas seales. Si por ejemplo se introducen cam bios al azar en el peso de las conexiones en una red neuronal entrenada para re conocer letras, la capacidad para realizar esta tarea no se suprime, sino que ni camente se degrada ligeramente. De una forma similar, una respuesta celular que depende de procesos de se alizacin intracelular altamente interconectados no ser fcilmente alterada si se elimina o se cam bia un solo elemento seal de uno de estos procesos. Por ello, no debemos sorprendernos demasiado de encontrar que una clula eucariota pueda actuar casi con normalidad aunque una protena quinasa haya sido inactivada por mutacin, incluso si esta protena quinasa ha sido muy conserva da durante la evolucin. Probablemente esta estabilidad de las redes de seali zacin es importante para clulas perfectamente normales y para clula que no contienen nmeros determinados de forma precisa de protenas intracelulares; adems, las concentraciones de metabolitos importantes pueden fluctuar con el estado metablico de la clula. El extenso entrecruzamiento entre los procesos seal en las clulas animales puede haber evolucionado, en parte, para permitir que los procesos funcionen normalmente en el seno de estas fluctuaciones. Las propiedades semejantes a las de redes neuronales de los sistemas alta mente interconectados de protenas, puede ayudarnos a entender otros aspec tos de la biologa celular, adems de la sealizacin celular. Estas mismas consi deraciones se pueden aplicar, por ejemplo, a las complejas redes de protenas que interaccionan entre s, que forman el citoesqueleto, que es el tema del prxi mo captulo.

Resumen
La construccin de modelos en el ordenador p uede ayudam os a ilum inar los com plejos comportamientos d e las cascadas d e sealizacin qu e se encuentran en las c lulas. En particular, las redes neuronales basadas en el ordenador tienen una serie d e propiedades qu e es posible qu e las redes de sealizacin intracelular compartan. Tal como las redes neuronales pueden ser entrenadas para responder d efo rm a a d e cuada a determ inados patrones de seales d e entrada, estas redes de sealizacin, m ediante procesos darw inianos de cambio aleatorio y seleccin p ueden haber desa rrollado la capacidad d e responder d efo rm a apropiada a complejas combinaciones de seales extracelulares. La arquitectura altamente interactiva d e las redes n eu ro nales est mimetizada p or las redes de protenas seal intracelulares. Ambas redes pueden, en principio, actuar como elementos de reconocimiento de patrones, que responden de fo rm a ptima a com binaciones seleccionadas de estmulos de entra da. Las redes de este tipo tambin son relativamente resistentes a las fluctuaciones de fondo o a las alteraciones, de fo rm a que elim inando uno d e sus com ponentes no se altere com pletam ente la red.

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Captulo 15: Transmisin de seales entre clulas

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Bibliografa

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Micrografia de fluorescencia de la bacteria Listeria m onocytogenes. La bacteria (en rojo ) se desplaza induciendo la formacin de filamentos de actina (en verde ) en el citosol de las clulas husped. Las regiones en las que se superpone la fluorescencia verde y la roja aparecen de color a m arillo . (Por cortesa de Tim Mitchison y Julie Theriot.)

El citoesqueleto
Filamentos intermedios Microtbulos Cilios y cenrfolos Filamentos de actina Protenas de unin a la actina * El musculo

La capacidad de las clulas eucariotas de adoptar una gran variedad de formas y llevar a cabo movimientos direccionales y coordinados depende de una red muy com pleja de filamentos proteicos que se extienden a travs del citoplasma (Figu ra 16-1). Esta red recibe el nombre de citoesqueleto, aunque, a diferencia del esqueleto seo, es una estructura sumamente dinmica que se reorganiza con tinuamente mientras la clula cam bia de forma, se divide, y responde a su en torno. De hecho, el citoesqueleto podra llamarse tambin citomusculatura ya que es el responsable directo de movimientos tales como el deslizamiento de las clulas sobre un substrato, la contraccin muscular, y todos los cambios de for ma que ocurren durante el desarrollo embrionario de los vertebrados; tambin proporciona la maquinaria para los movimientos intracelulares, tales como el transporte de los orgnulos desde un lugar a otro del citoplasma y la segregacin de los cromosomas durante la mitosis. Las bacterias carecen, aparentemente, de citoesqueleto, por lo que podra haber sido un factor decisivo en la evolucin de las clulas eucariotas. Las diversas actividades del citoesqueleto dependen de tres tipos de fila mentos proteicos -los filamentos de actina, los microtbulos y los filamentos in termedios. Cada tipo de filamento est formado por una subunidad proteica dis tinta: actina para los filamentos de actina, tubulina para los microtbulos, y una familia de protenas fibrosas relacionadas, tales como vimentina o lminas, para los filamentos intermedios. La actina y la tubulina han sido altamente conservadas a lo largo de la evo lucin de los eucariotas; sus filamentos proteicos se unen a una gran variedad de protenas accesorias, las cuales capacitan al mismo filamento para participar en distintas funciones en regiones diferentes de la clula. Empezaremos este captulo con una introduccin sobre los tres principales tipos de filamentos del citoesqueleto e ilustrando algunos de los principios ge nerales que rigen su funcionamiento. Despus de ello, consideraremos cada tipo de filamento por separado: en primer lugar, los filamentos intermedios, cuya estructura a modo de cuerda pa rece tener la funcin relativamente simple de proveer a las clulas de fuerza m e cnica; en segundo lugar, los microtbulos, los cuales se consideran los organi zadores primarios del citoesqueleto; y finalmente, los filamentos de actina, que son esenciales para muchos de los movimientos celulares, especialmente los que se llevan a cabo en la superficie celular.

Figura 16-1 El citoesqueleto. Clula en cultivo fijada y marcada con el azul de Coomassie, colorante especfico de protenas. Podemos observar la gran variedad de estructuras filamentosas que se extienden a travs de la clula. (Por cortesa de Colin Smith.)

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La naturaleza del citoesqueleto

Una clula eucariota dispone de miles de millones de molculas proteicas, las cuales constituyen cerca del 60% de su peso seco. Se cree que una clula indivi dual de un vertebrado tiene aproximadamente 10 000 tipos de protenas distin tas, la mayora de las cuales se encuentran organizadas en el espacio. Encontra mos esta organizacin a distintos niveles. En todas las clulas, las protenas forman com plejos funcionales, la mayora de los cuales estn formados quizs por 5 a 10 protenas, aunque otros complejos pueden ser tan grandes o incluso ms que los ribosomas. El siguiente nivel de organizacin incluye la disposicin de protenas localizadas funcionalmente en la misma m em brana o en el mismo compartimiento acuoso de un orgnulo limitado por una membrana, como por ejemplo el ncleo, las mitocondrias o el complejo de Golgi. El citoesqueleto es el encargado de crear y m antener un nivel de organizacin todava ms elevado. Convierte la clula viva en una cosa muy parecida a una ciudad, con servicios especializados concentrados en reas distintas pero totalmente interconectados mediante vas de comunicacin. En esta seccin, revisaremos algunas de las es trategias bsicas que capacitan al citoesqueleto para controlar la localizacin de los com plejos proteicos y los orgnulos as como para crear las vas de com uni cacin entre ellos.

El citoplasm a de una clula eucariota est organizado espacialm ente por los filam entos de actina, los microtbulos y los filam entos interm edios 1
De qu formas una clula eucariota, de dimetro de 10 pm o ms, puede estar espacialmente organizada por molculas de proteina del citoesqueleto que son claramente ms pequeas (unas 2000 veces ms pequeas en dimensiones linea les)? La respuesta radica en la polimerizacin. En cada uno de los tres principa les tipos de protenas de citoesqueleto, miles de molculas proteicas idnticas se ensamblan formando un filamento lineal, que puede ser lo suficientemente lar go como para ir de un lado de la clula hasta el lado opuesto. Estos filamentos conectan com plejos proteicos y orgnulos de regiones distintas de la clula y ac tan a modo de rales para el transporte entre ellos. Adems, forman el soporte m ecnico, que es especialmente importante en las clulas animales, las cuales no disponen de rgidas paredes celulares externas. El citoesqueleto forma una armazn interno que mantiene todo el volumen citoplasmtico, de igual modo com o el esqueleto formado por vigas contribuye a mantener un edificio. Resulta sencillo determinar cm o aparecen los filamentos durante la evolu cin: cualquier protena que disponga en su superficie de pares orientados de lugares de autounin complementarios puede formar un largo filamento heli coidal (vase pg. 131). Cada uno de los tres tipos principales de filamentos pro teicos que forman el citoesqueleto es un polmero helicoidal que tiene una dis posicin diferente en la clula y una funcin distinta (Figura 16-2). Sin embargo, los tres tipos de filamentos, por s mismos, no pueden ser responsables ni de la forma ni de la longitud de la clula. Sus funciones dependen de un gran squito de protenas accesorias que unen los filamentos a otros filamentos y a otros com ponentes celulares. Las protenas accesorias son esenciales para el control del ensam blaje de los filamentos proteicos en lugares particulares, y proporcio nan los motores que, o bien mueven los orgnulos a lo largo de los filamentos, o bien mueven los filamentos unos respecto a otros.

La dinm ica de los microtbulos em ana del centrosom a 2

Los microtbulos son estructuras polares: un extremo (el extremo ms ) es capaz de crecer a gran velocidad mientras que el otro extremo (el extremo menos) tiene tendencia a perder subunidades si no est estabilizado. En la mayora de clulas,

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Captulo 16 : El citoesqueleto

FILAMENTOS DE ACTINA

Los filamentos de actina (tambin conocidos com o son polm eros helicoidales, enroscados de dos en dos, de la protefna actina. Aparecen com o estructuras flexibles, con un dimetro de 5 a 9 nm, que estn organizadas en una gran variedad de haces, de redes bidim ensionales y de geles tridimensionales. Aunque los filamentos de actina estn dispersos por el citoplasma de la clula, estn altamente concentrados en el justo por debajo de la m embrana plasmtica.

microfUamentos)

crtex,

25 nm MICROTUBULOS

I _______ I

25 |jm

Los microtbulos son cilindros largos y huecos form ados por una protema tubulina. Su dimetro externo es de 25 nm y son m ucho ms rgidos que los filam entos de actina. Los m icrotbulos son largos y rectos y tpicamente disponen de un extremo unido a un centro organizador de microtbulos (M TOC, de microtubule organizing center) llam ado tal com o puede observarse en la imagen.

centrosoma

25 nm FILAMENTOS INTERMEDIOS

25 }jm

Los filamentos intermedios son estructuras parecidas a cuerdas, de un dimetro de aproxim adamente 10 nm; estn form ados por las protenas de los filamentos intermedios, que constituyen una gran familia heterognea de protenas. Uno de los tipos de filamentos intermedios forma una red llamada lmina nuclear que se localiza debajo de la membrana nuclear interna. Otros filamentos interm edios se extienden a lo largo del citoplasma proporcionando a las clulas resistencia mecnica y sosteniendo la tensin mecnica de los tejidos epiteliales mediante la unin de los citoplasmas de las clulas vecinas a travs de las uniones celulares.

25 nm

25 |jm

el extremo menos de los microtbulos est estabilizado mediante la unin a una estructura que recibe el nombre de centrosom a, y los extremos con crecim ien to rpido estn entonces libres para aadir molculas de tubulina (Figura 16-3). El centrosoma suele estar localizado cerca del ncleo, en la zona central de la clula. En un momento determinado, centenares de microtbulos crecen a partir de un centrosoma, alargndose muchas mieras, con su extremo m s dirigido hacia la periferia celular. Cada uno de estos microtbulos es una estructura di nm ica que tanto puede acortarse como alargarse: despus de unos minutos de crecim iento durante los cuales se produce la adicin de subunidades, su extre mo ms puede sufrir una repentina transicin que implica una prdida de tales subunidades, de forma que la longitud del microtbulo disminuye rpidamente y puede llegar incluso a desaparecer. La red microtubular que emerge a partir del centrosoma est enviando constantem ente nuevos microtbulos que reemplazan a los viejos que se han despolimerizado (Figura 16-4).

Figura 16-2 Los tres tipos de filamentos proteicos que constituyen el citoesqueleto. Se muestra una

electronmicrografia de cada tipo de filamento y un diagrama esquemtico de cmo estn formados a partir de subunidades. Tambin puede observarse esquemticamente la distribucin de cada filamento en un tipo de clula epitelial. Los colores utilizados para cada tipo de filamento se utilizan tambin en el resto del captulo. (Las micrografas de los filamentos de actina, de los microtbulos y de los filamentos intermedios por cortesa de Roger Craig, Richard Wade y Roy Quinlan, respectivamente.)

La naturaleza del citoesqueleto

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Figura 16-3 Un centrosom a con microtbulos adheridos. Como hemos

indicado, el extremo menos, de crecimiento lento, de cada microtbulo se encuentra inmerso en la matriz del centrosoma (verde claro) que rodea a un par de estructuras que reciben el nombre de centrolos. Esta matriz colabora en la determinacin del nmero de microtbulos de una clula mediante la nucleacin del crecimiento de los microtbulos de nueva formacin.

+ n

La red microtubular puede encontrar el centro de la clula 3

Qu es lo que determina que las hileras de microtbulos tengan una posicin determinada en la clula? Experimentos en los cuales se utilizan clulas pigmen tarias aisladas a partir de las escamas de peces han proporcionado datos muy importantes: en la clula existen grandes clulas alargadas que contienen grnulos llenos de pigmento. Los grnulos, que pueden ser marrn oscuro, amarillos, rojos, o iridiscentes, dependiendo de la especie, estn unidos a los microtbulos y pueden agregarse en el centro de la clula o dispersarse a travs del citoplas ma. El movimiento de los grnulos de pigmento se produce a lo largo de los m i crotbulos y puede ser controlado por el pez; de esta forma pueden cambiar el color de su piel. En una clula pigmentaria mantenida en cultivo, el movimiento puede ser controlado convenientem ente mediante la aplicacin de hormonas u otros reactivos, que hacen variar las concentraciones de AMP cclico del citosol: un increm ento de la concentracin de AMP cclico provoca la dispersin de los grnulos, mientras que una disminucin implica una agregacin de los mismos. Los grnulos de pigmento pueden ser utilizados como marcadores de la disposi cin de los microtbulos en la clula (Figura 16-5). Si cortamos, con una aguja, una porcin de una clula pigmentaria, el frag mento celular restante puede sobrevivir durante largos perodos de tiempo in cluso aunque desaparezca su ncleo. Si realizamos la misma operacin cuando los grnulos pigmentarios se encuentran dispersos por el citoplasma, algunos de estos grnulos quedan atrapados en el fragmento celular. Si, inmediatamente despus de la operacin inducimos una agregacin de los grnulos de pigmento en este fragmento celular mediante tratamientos hormonales, stos se mueven hacia el lugar donde se ha producido el corte. Pero si esta agregacin se induce 4 horas despus de la operacin, los grnulos en vez de moverse hacia la zona donde se ha producido la lesin, se mueven exactamente hacia el centro del fragmento celular. Investigaciones posteriores muestran que este cambio impli ca una redistribucin importante de los microtbulos dentro del fragmento, de forma que ahora su extremo menos se encuentra en el centro del fragmento, com o si estuvieran en el centro de una clula intacta. En efecto, el fragmento ce lular aislado se ha convertido en una miniclula respecto a la organizacin de sus microtbulos; los microtbulos se han reorganizado alrededor de un nuevo centro organizador de microtbulos (Figura 16-6).

Figura 16-4 Crecimiento y acortam iento de un haz de microtbulos. El haz de microtbulos

anclados en un centrosoma est en cambio continuo, mientras los nuevos microtbulos crecen {flechas rojas) y los microtbulos antiguos se acortan

(flechas azules).

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Captulo 16 : El citoesqueleto

dism inucin de cAMP aum ento de cAMP

(A)

DISPERSOS

AGREGADOS

50 (ini
Figura 16-5 Clulas pigmentarias de peces. Estas clulas gigantes, responsables de los cambios de coloracin de algunas especies de peces, disponen de grandes grnulos de pigmento {m arrn), los cuales pueden cam biar su localizacin en respuesta a estmulos neuronales u hormonales. (A) Visin esquemtica de una clula pigmentaria, que muestra la dispersin y la agregacin de los grnulos de pigmento, que se producen a lo largo de los microtbulos. (B) Electronmicrografa de barrido de una clula pigmentaria despus de una breve exposicin a un detergente. La membrana plasmtica y el contenido soluble del citoplasma han sido eliminados y pueden observarse los haces de microtbulos as como los grnulos de pigmento asociados. (C y D) Imgenes en campo claro de la misma clula en una escam a de un pez cclido africano, que muestra sus grnulos de pigmento dispersos por el citoplasma o agregados en el centro de la clula. (E) Una imagen de inmunofluorescencia de otra clula del mismo ejemplar marcada con anticuerpos contra tubulina, que muestra largos haces de microtbulos paralelos extendindose a partir del centrosom a hacia la periferia celular. (B, deM.A. McNiven and K.R. Porter,/. C ellB iol. 103:1547-1555), 1986, reproducida con permiso de copyright de The Rockefeller University Press; C, D, y E, por cortesa de Leah Haimo.)

centrosom a un par de centrolos

ESPERA DE 4 HORAS cortado t* por aqu con una aguja fragm ento celular separado nuevo centro organizador de m icrotbulos sin centrolos

'igura 16-6 Un experim ento que nuestra de qu form a un haz de nicrotbulos puede encontrar el entro de la clula. Despus de que el xtremo de una clula pigmentaria de in pez se corte con una aguja, los nicrotbulos situados el fragmento elular aislado se reorientan, situando u extremo menos cercano al centro iel fragmento.

fragm ento celular con m icrotbulos reorganizados

clula m elanfora

La naturaleza del citoesqueleto

847

Este experimento tan sencillo sugiere que las hileras citoplasmticas de mi crotbulos que emergen del centrosom a pueden actuar como un mecanismo de supervivencia que es capaz de encontrar el centro de la clula. Esta posibilidad es muy importante puesto que implica que la red microtubular puede organizar el interior de la clula. Pero esto slo es el punto de inicio; tal y como veremos ms adelante en esta seccin de introduccin, una clula puede posicionar la red moviendo especficam ente su centrosoma a un lugar desplazado del centro celular.

Determinadas protenas motoras utilizan la red microtubular como gua para posicionar los orgnulos rodeados de membrana 4
Como acabam os de ver en las clulas pigmentarias de determinadas especies de peces, los filamentos del citoesqueleto pueden utilizarse no slo como soporte estructural sino com o lneas de transporte. Si con el microscopio ptico obser vamos una clula viva de un vertebrado, podemos contemplar su citoplasma en continuo movimiento. Despus de unos minutos, las mitocondrias y otros org nulos mem branosos ms pequeos cam bian sus posiciones mediante movi mientos saltatorios peridicos, mucho ms sostenidos y direccionados que el continuo y pequeo movimiento browniano, provocado por el movimiento tr mico al azar. stos y otros movimientos intracelulares en las clulas eucariotas son generados por protenas m otoras, las cuales se unen a los microtbulos o a los filamentos de actina y utilizan la energa producida a partir de ciclos repeti dos de hidrlisis de ATP para moverse a lo largo de estos filamentos (vase pg. 221). Actualmente han sido identificadas docenas de protenas motoras distin tas. Se diferencian en el tipo de filamento al cual se unen, en la direccin en la que se mueven a lo largo de este filamento y en la carga que transportan. La primera protena motora descubierta fue la miosina, una protena que se desliza a lo largo de los filamentos de actina y que es especialmente abundante en el msculo esqueltico donde constituye la parte ms importante del aparato contrctil. Posteriormente se descubrieron otros tipos de miosinas en las clulas no musculares. Todas las miosinas tienen dominios motores semejantes (la par te de la protena responsable del movimiento), pero presentan diferencias muy marcadas en los dominios a travs de los cuales la molcula de miosina se une a otros com ponentes de la clula. Las protenas motoras que se mueven a lo largo de los microtbulos son dis tintas a las miosinas y pertenecen a dos familias: las quinesinas, que generalmen te se mueven hacia el extremo ms de los microtbulos (a partir del centrosoma), y las dinenas, que se desplazan hacia el extremo menos (hacia el centrosoma). Al igual que las miosinas, cada tipo de protena motora dependiente de microtbu los transporta una carga determinada con la cual se desplaza (Figura 16-7). Las protenas motoras m icrotbulo-dependientes juegan un papel muy im portante en el posicionamiento de los orgnulos membranosos dentro de la c lula eucariota. Los tbulos membranosos del retculo endoplasmtico (ER), por ejemplo, estn alineados con los microtbulos y se extienden casi hasta la peri feria celular; el complejo de Golgi, en cambio, est localizado cerca del centrosoFigura 16-7 Protenas m otoras que se mueven a lo largo de los microtbulos. Las quinesinas se mueven hacia el extremo ms de los microtbulos, mientras que las dinenas se mueven hacia el extremo menos. Como hemos indicado, pueden existir diversas formas de ambas protenas motoras microtubulares, y se cree que cada una de ellas transporta un tipo distinto de carga.

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Captulo 16: El citoesqueleto

(A)

10 M rn

ma. Cuando tratamos las clulas con una droga que despolimeriza los microt bulos, ambos orgnulos cambian su localizacin: el ER se colapsa hacia el centro de la clula, mientras que el complejo de Golgi se fragmenta en mltiples vescu las de pequeo tamao que se dispersan por todo el citoplasma. Cuando la dro ga es eliminada, los orgnulos recuperan su posicin inicial, conducidos por protenas motoras que se desplazan a lo largo de los microtbulos nuevamente formados. Se cree que la posicin de cada uno de estos orgnulos viene determi nada por una protena receptora que se encuentra localizada en la superficie citoslica de la membrana del orgnulo, la cual se une a una protena motora microtbulo-dependiente especfica -u n a quinesina para el ER y una dinena para el complejo de Golgi (Figura 16-8).

El crtex de actina puede generar y mantener la polaridad celular 5

En general, los microtbulos funcionan como entidades individuales, mientras que los filamentos de actina actan formando redes o haces. Los filamentos de actina que descansan debajo de la membrana plasmtica, por ejemplo, estn asociados a una red de protenas que se unen a la actina formando el crtex ce lular. Como discutiremos ms adelante, la red es altamente dinmica y funciona con diversos tipos de miosinas que controlan los movimientos de la superficie celular. La localizacin y orientacin de los filamentos de actina corticales est controlada mediante lugares de nucleacin en la membrana plasmtica; distin tas regiones de la membrana dirigen la formacin de diferentes estructuras ba sadas en los filamentos de actina. Determinadas seales extracelulares que afectan a una parte de la superficie celular pueden provocar reestructuraciones locales del crtex de actina debajo de la zona correspondiente de la membrana plasmtica. De manera recproca, la organizacin del crtex de actina puede tener una influencia determinada en el comportamiento de la membrana plasmtica que est por encima. Mecanismos basados en los filamentos de actina corticales, pueden, por ejemplo, empujar la mem brana plasmtica hacia fuera formando largas y finas microespinas o exten sos lamelipodios, o pueden invaginar la membrana durante la divisin celular (Figura 16-9). En casos extremos el crtex de actina puede integrar los movimientos de una clula animal sobre su superficie completa y mantener la polaridad celular

Figura 16-8 Distribucin de los orgnulos por los microtbulos. (A) Diagrama esquemtico de una clula que muestra la disposicin tpica de los microtbulos {verde), el retculo endoplasmtico {azul), y el complejo de Golgi {am arillo). Se muestra el ncleo en m arrn y el centrosoma en verde claro. (B) Clula marcada con anticuerpos contra el retculo endoplasmtico {pan el superior) o contra los microtbulos {p an el inferior). Las protenas motoras empujan al retculo endoplasmtico a lo largo de los microtbulos, tirando de ellos desde su localizacin hacia la membrana nuclear. (C) Clula marcada con anticuerpos contra el complejo de Golgi {p an el superior) o contra los microtbulos {pan el inferior). En este caso las protenas motoras mueven el com plejo de Golgi hacia su posicin cerca del centrosoma. (B, por cortesa de Mark Terasaki y Lan Bo Chen; C, por cortesa de Viki Alian y Thomas Kreis.)

La naturaleza del citoesqueleto

8 49

independientemente de la red microtubular. Esto ha sido ilustrado mediante ex perimentos en los cuales se han utilizado clulas no pigmentadas de las escamas de los peces. Estas clulas epidrmicas, conocidas como queratinocitos, migran en cultivo rpidamente y de una manera poco corriente, viajando a velocidades iguales o superiores a 30 pm/minuto. Inmunomarcajes utilizando anticuerpos demuestran que los filamentos intermedios y los microtbulos se encuentran slo en la regin posterior alrededor del ncleo, mientras que el extremo exten dido de la clula es rico en filamentos de actina (Figura 16-10). Adems, las clu las tratadas con una droga que despolimeriza los microtbulos migran a la mis ma velocidad que las no tratadas, mientras que la migracin se detiene totalm ente si las clulas son tratadas con agentes que interfieren con los fila mentos de actina. Evidentemente, los filamentos de actina (actuando con otras protenas) son capaces de provocar el movimiento de los queratinocitos sobre una superficie y tam bin de mantener su morfologa diferencial y su polaridad; los detalles del mecanism o implicado no estn an totalmente esclarecidos.

Figura 16-9 A menudo los filamentos de actina configuran la m em brana plasm tica de las clulas animales. Tres ejemplos de cambios en la membrana plasmtica provocados por la red cortical de filamentos de actina. (A) Protrusiones delgadas y puntiagudas como las microespinas se forman en la superficie de las clulas por el ensam blaje de haces de filamentos de actina anclados en el crtex celular. (B) Extensiones parecidas a sbanas, llamadas lamelipodios, tam bin se forman en la superficie, en este caso sostenidas por redes alargadas de filamentos de actina en vez de haces discretos. (C) Invaginaciones de la superficie celular, iguales que las que se producen durante la divisin de la clula, producidas por un haz contrctil de filamentos de actina asociado con la protena motora miosina.

Normalmente los filam entos de actina y los microtbulos actan juntos polarizando la clula 6
En una clula viva los tres tipos mayoritarios de filamentos del citoesqueleto es tn conectados los unos con los otros y sus funciones estn coordinadas. La dis tribucin de los filamentos intermedios en una clula epitelial en cultivo, por
Figura 16-10 La epidermis de los peces est formada por clulas migratorias. (A) Micrografas pticas de un queratinocito en cultivo tomadas a intervalos de 15 segundos. La clula est migrando aproximadamente a 15 pm/segundo. (B) Queratinocito observado con el microscopio electrnico de barrido, que muestra su extremo en avance altamente extendido, y con el cuerpo celular que contiene el ncleo cerca del extremo final de la clula. (D) Distribucin de los filamentos del citoesqueleto en este tipo inusual de clula. Los filamentos de actina {rojo) llenan el margen extendido de la clula y son los responsables de su migracin. Los microtbulos (verde) y los filamentos intermedios (azul) estn restringidos en la zona prxima al ncleo. (Micrografa por cortesa de Juliet Lee.)

10 Jim
850 Captulo 16: El citoesqueleto

clula T
// w

\J
clula diana del crtex

(A)

seal localizada

I igura It-ll La polarizacin de una clula T citotxica despus del reconocim iento de una clula diana. (A) Cambios en el citoesqueleto de una clula T citotxica despus del contacto con una clula diana. (B) Micrografa de inmunofluorescencia en que la clula T (a rrib a ) y su clula diana {abajo) han sido marcadas con un anticuerpo contra los microtbulos. En la clula T el centrosoma y los microtbulos que irradian a partir de l estn orientados hacia el punto de contacto entre ambas clulas. En la clula diana el haz de microtbulos no est polarizado. (B, reproducida de B. Geiger, D. Rosen, y G. Berk e ,J . C ellB iol. 95:137-143, 1982, reproducido con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

10 imi

ejemplo, puede verse radicalmente alterada si tratamos las clulas con una dro ga que provoca una despolimerizacin de los microtbulos: los filamentos inter medios, que normalmente se distribuyen a lo largo del citoplasma, se agrupan en la regin cercana al ncleo. Existen diversas situaciones en las cuales los mi crotbulos y los filamentos de actina actan de una manera coordinada polari zando la clula entera. Discutiremos nicamente un ejemplo: la muerte de una clula diana mediatizada por los linfocitos T citotxicos. Las clulas T citotxicas matan a otras clulas que llevan antgenos extraos en su superficie. Esto constituye una parte importante de la respuesta inmune de los vertebrados a una infeccin, como se discute en el Captulo 23. Cuando los receptores en la superficie de la clula T reconocen un antgeno en la superfi cie de la clula diana, la seal de los receptores hacia el crtex subyacente de la clula T altera el citoesqueleto de diversas maneras. Primero, las protenas aso ciadas con los filamentos de actina en la clula T reorganizan la zona de contac to entre las dos clulas. Entonces, el centrosoma se reorienta y se mueve junto a los microtbulos hacia la zona de contacto entre la clula T y la clula diana (Fi gura 16-11A). Los microtbulos, colocan el complejo de Golgi correctamente de bajo de la zona de contacto, dirigiendo la maquinaria asesina -q u e est asociada con una secrecin del complejo de Golgi- hacia la clula diana. En este ejemplo y en muchos otros, una clula se convierte en polarizada de la m anera siguiente. Primero, la membrana plasmtica detecta alguna diferencia en un lado de la clula y genera una seal transmembrana. El crtex de actina se reorganiza localmente debajo de la membrana afectada, con lo cual el centroso ma se desplaza hacia esta zona de la clula, probablemente con un movimiento de los microtbulos. Entonces, el centrosoma posiciona los sistemas endomembranosos de una manera polarizada. El resultado final es una clula con un foco direccional muy marcado (Figura 16-1 IB).

Las funciones del citoesqueleto son difciles de estudiar

Aunque las principales subunidades de los tres tipos de polmeros del citoesque leto, as como los muchos cientos de protenas que se asocian con ellos, han sido aislados y su secuencia de aminocidos determinada, ha sido difcil establecer cmo funcionan estas protenas dentro de la clula. Independientemente de la complejidad que implica la existencia de un nmero enorme de protenas impli cadas, la comprensin del citoesqueleto se ve dificultada por dos hechos princi

La naturaleza del citoesqueleto

851

pales. Primero, el funcionamiento del citoesqueleto depende de un ensamblaje complejo de protenas, que se unen en grupos cooperativos a los filamentos del citoesqueleto. Es relativamente sencillo estudiar el efecto sobre un filamento de una nica protena accesoria, pero es mucho ms complejo analizar los efectos de un conjunto de muchas protenas distintas. Este problema no se encuentra nicamente en el estudio del citoesqueleto, pero aqu es mucho ms acusado. En segundo lugar, las funciones del citoesqueleto son mucho ms difciles de analizar que las funciones de otros grandes grupos de complejos proteicos. El proceso de sntesis del RNA y del DNA, por ejemplo, que incluye la formacin de nuevos polmeros unidos mediante enlaces covalentes, puede ser fcilmente analizado in vitro, en parte porque los productos de las reacciones in vitro se pueden medir de una manera fcil y comparar con los productos correspon dientes fabricados en la clula. El citoesqueleto, por el contrario, ejerce fuerzas y provoca movimientos sin cambios qumicos importantes. Esto hace que sea es pecialmente difcil estudiar la funcin de un sistema citoesqueltico reconstitui do in vitro a partir de los com ponentes purificados.

Resumen

Una red de protenas filamentosas conocidas con el nombre de citoesqueleto orga nizan espacialmente el citoplasma de las clulas eucariotas. Esta red est formada por tres tipos de filamentos principales: microtbulos, filamentos de actina y fila mentos intermedios. Los microtbulos son estructuras rgidas que, generalmente, disponen de un extremo unido al centrosoma y otro extremo libre en el citoplasma. En la mayora de clulas los microtbulos son estructuras altamente dinmicas que alternativamente crecen y se acortan mediante la adicin y la prdida de subunidades de tubulina. Algunas protenas motoras se desplazan en ambas direccio nes a lo largo de los microtbulos, transportando orgnulos membranosos especfi cos hacia sus localizaciones determinadas en la clula. Los filamentos de actina son tambin estructuras dinmicas, pero normalmente forman haces o redes y no fila mentos simples. Una capa llamada crtex se forma justo debajo de la membrana plasmtica a partir de los filamentos de actina y de una variedad importante de protenas que se unen a la actina. Esta capa rica en actina controla la forma y los movimientos superficiales de la mayora de las clulas animales. Los filamentos in termedios son relativamente resistentes, estructuras a modo de cuerdas que propor cionan una estabilidad mecnica a la clulas y tejidos. Los tres tipos de filamentos estn interconectadosy sus funciones coordinadas.

Filamentos intermedios7
Los filamentos intermedios son fibras proteicas resistentes y duraderas que se encuentran en el citoplasma de la mayora de las clulas eucariotas superiores. Reciben el nombre de interm edios porque en las micrografas electrnicas su dimetro aparente (8-10 nm) se encuentra entre el de los finos filamentos de actina y el de los gruesos filamentos de miosina de las clulas musculares, don de se descubrieron por vez primera (su dimetro es tam bin intermedio entre el de los filamentos de actina y el de los microtbulos). En la mayora de clulas animales, una extensa red de filamentos intermedios rodea al ncleo y se ex tiende desde esta zona hacia la periferia celular, donde interacciona con la m em brana plasm tica (Figura 16-12). Adems, un armazn densamente tejido de filamentos intermedios -la lmina nuclear- se encuentra debajo de la envol tura del ncleo. Los filamentos intermedios son particularmente abundantes en las clulas que estn sometidas a importantes tensiones mecnicas. Son muy abundantes, por ejemplo, en los epitelios, donde forman parte de las uniones especializadas entre dos clulas vecinas, a lo largo de los axones de las clulas nerviosas, y en todos los tipos de clulas musculares. Cuando las clulas se tratan con solucio-

i_________!
20 litn

Figura 16-12 Filamentos intermedios en el citoplasm a de una clula de un tejido en cultivo. Se marcaron clulas epiteliales de rata canguro (clulas PtK2) en interfase, con anticuerpos contra uno de los tipos de filamentos intermedios (llamados queratinas) y se observaron al microscopio de fluorescencia. (Por cortesa de Mary Osborn.)

852

Captulo 16: El citoesqueleto

dominio central en hlice a

regiones que contienen las "secuencias en heptada" (heptad repeats)

nes salinas concentradas o bien con detergentes no inicos, los filamentos inter medios se conservan mientras que los elementos restantes del citoesqueleto son solubilizados. De hecho, el trmino citoesqueleto se utiliz originalmente para describir a este sistema fibroso tan estable e insoluble.

Figura 16-13 Organizacin de los dominios de los m onm eros proteicos de los filamentos intermedios. La mayora de las

Los filam entos intermedios son polmeros de protenas fibrosas 8

A diferencia de la actina y la tubulina, que son protenas globulares, los tipos principales de monmeros proteicos de los filamentos intermedios son m olcu las fibrosas muy alargadas que tienen una cabeza amino terminal, una cola carboxilo terminal, y un dominio central a modo de varilla. Este dominio central consta de una regin extensa de hlice a que contiene largos tndems repetidos de secuencias aminoacdicas distintas, que reciben el nombre de repeticiones en heptada. Como discutimos en el Captulo 3, esta secuencia de 7 aminocidos permite la formacin de dmeros enrollados entre dos hlices a paralelas (vase Figura 3-48). Otros tipos de protenas alargadas del citoesqueleto con estructu ras dimricas enrolladas, como por ejemplo la tropomiosina y la cola de la miosina, contienen largas tiras de repeticiones en heptada, como discutiremos ms adelante. En la siguiente etapa del ensamblaje, dos de los dmeros enrollados interaccionan antiparalelamente formando un tetrmero (Figura 16-14). Se encuentran pequeas cantidades de tetrmeros solubles en las clulas, lo cual sugiere que la subunidad tetramrica constituye la unidad fundamental para el ensam blaje de los filamentos intermedios. La disposicin antiparalela de los dmeros implica que el tetrmero y, por consiguiente, el filamento que forma, es una estructura no polarizada -esto es, es la misma estructura en ambos extremos y es simtrica en toda su longitud. Esto distingue los filamentos intermedios de los microtbulos y los filamentos de actina, que son estructuras polarizadas, cuya funcin de pende de esta polaridad. La etapa final del ensamblaje de los filamentos interm e dios no est an completamente caracterizada, pero parece que los tetrmeros se aaden al filamento intermedio en crecimiento mediante una reaccin de unin sencilla, alinendose a lo largo del eje del filamento y unindose siguiendo un patrn helicoidal (vase Figura 16-14). El dominio central a modo de varilla, cuya estructura es parecida en todos los tipos de filamentos intermedios, interviene en las interacciones laterales que forma el filamento ensamblado. Los dominios globulares de la cabeza y de la cola pueden variar significativamente tanto en el tamao como en la secuencia de aminocidos, sin que esto afecte la estructura axial bsica del filamento; a menudo se proyectan desde la superficie del filamento e intervienen en las unio nes con otros componentes. Este diseo experimental implica la existencia de una sorprendente variedad de tamaos de las protenas que los forman (desde 40 000 a 200 000 daltons). En la mayora de clulas, casi todas las protenas de los filamentos interm e dios se encuentran totalmente polimerizadas, con muy pocas subunidades te-

protenas de los filamentos intermedios disponen de una regin central similar que tiene generalmente unos 310 aminocidos y que forma una larga hlice a. Los dominios amino terminal y carboxilo terminal no presentan esta estructura en hlice a y son variables en cuanto a tamao y secuencia en los distintos tipos de filamentos intermedios.

Filamentos intermedios

853

NH2

COOH

& m
r'

48 nm ---------------------------------H
COOH
(C)

i'i i".F 1

nh2

COOH

0,5

COOH tetrm ero de dos dim eros sobreenrollados

COOH

10 nm
tramricas libres. Sin embargo, una clula puede controlar el ensamblaje de sus filamentos intermedios y decidir su cantidad, longitud y posicin. Uno de los mecanismos de control se basa en la fosforilacin de residuos de serina en el do minio amino terminal de las protenas de los filamentos intermedios. En un caso extremo, la fosforilacin de las subunidades proteicas que forman la lmina nu clear provoca un desensamblaje total de los filamentos durante la mitosis; cuan do sta termina, las serinas especficas son desfosforiladas y se produce la for macin de novo de la lmina nuclear (vase Figura 12-18). Los filamentos intermedios citoplasmticos pueden sufrir tambin una reorganizacin radical durante la mitosis como respuesta a algn tipo de seal extracelular. Aunque es tos cambios suelen ir acompaados de un incremento en la fosforilacin de las subunidades, otros factores pueden intervenir tambin en este proceso.
Figura 16-14 Modelo habitual de ensamblaje de un filamento intermedio. El monmero mostrado en (A) se empareja con un monmero idntico a l, formando un dimero (B), de forma que la regin central -conservada- se alinea en paralelo y se empaqueta conjuntamente formando un sobreenrollamiento. Entonces, dos dmeros se alinean, lado contra lado, y forman un tetrmero antiparalelo de cuatro cadenas polipeptdicas (C). Dentro de cada tetrmero los dmeros estn distanciados suficientemente uno con respecto a otro permitiendo la asociacin con otro tetrmero, como puede observarse en (D). En el filamento intermedio final de 19 nm los tetrmeros estn unidos formando un haz helicoidal (E). Se muestra una electronmicrografa del filamento final en el margen superior izquierdo. (Diagrama basado en datos de Murray Stewart; micrografia por cortesa de Roy Quinlan.)

Las clulas epiteliales presentan una familia muy diversa de filamentos de queratina 9
En las clulas de los vertebrados, los filamentos intermedios citoplasmticos pueden agruparse en tres clases: ( 1) filamentos de queratina, (2) filamentos de vimentina y filamentos relacionados con la vimentina y (3) neurofilamentos, cada uno de los cuales est formado por la polimerizacin de sus correspondientes

854

Captulo 16 : El citoesqueleto

T abla 16-1 Prin cip ales tipos de p ro ten as de filam entos in term ed ios en las clulas de los v erteb rad os Tipo de filam ento in term ed io C om p onen te polipeptdico (m asa en daltons)

L ocalizacin celu lar

Lminas nucleares

lamininas A, B, y C (65 000 - 75 000)

lmina nuclear de las clulas eucariotas muchas clulas de origen mesenquimtico, a menudo expresada transitoriamente durante el desarrollo msculo clulas gliales (astrocitos y clulas de Schwann) neuronas clulas epiteliales y sus derivados (p. ej., el pelo y las uas) neuronas

vimentina (54 000) Protenas relacionadas con la vimentina desmina (53 000) protena glial acdica fibrilar (50 000) periferina (66 000) Queratinas tipo I (cidas) \ (40 000 - 70 000) 1 tipo II (neutras/bsicas) | (40 000 - 70 000)

Filamentos intermedios neuronales

protenas de los neurofilamentos NF-L, NF-M y NF-H (60 000 - 130 000)

subunidades proteicas (Tabla 16-1). La familia ms diversa de subunidades pro teicas la constituyen las q u e ra tin a s (tambin llamadas citoqueratinas), que for man fila m e n to s d e q u e ra tin a , principalmente en las clulas epiteliales. Hay ms de 20 tipos distintos de queratinas en los epitelios humanos. Al menos, otras 8 queratinas, llamadas queratinas duras, son especficas del pelo y de las uas. (Las queratinas de las clulas epiteliales, pelo, y uas reciben tambin el nombre de a-queratinas para distinguirlas de las p-queratinas, evolutivamente distintas, que se encuentran en las plumas de las aves y que presentan una estructura to talmente distinta que no discutiremos en este captulo). Las queratinas se subdividen en dos tipos, si nos basamos en su secuencia de aminocidos: queratinas del tipo I (cidos) y queratinas del tipo II (neutras/bsi cas). Mediante experimentos de reensamblaje se ha encontrado que los heterodmeros formados por queratinas del tipo I y del tipo II pueden formar filamentos mientras que los homodmeros no los forman, hecho que permite explicar por qu los filamentos de queratina son siempre heteropolmeros formados por la misma cantidad de polipptidos de queratina del tipo I y del tipo II. Cualquier clula epitelial puede disponer de una gran variedad de querati nas, todas ellas copolimerizando en un nico sistema filamentoso de queratina. Los epitelios ms simples, como los que encontramos en los embriones tempra nos o en algunos tejidos adultos como por ejemplo el hgado, disponen de un solo tipo de queratina del tipo I y uno solo tambin de queratina del tipo II. Otros epitelios, como el de la lengua, el de la vejiga, y el de las glndulas sudor paras, contienen 6 o ms tipos de queratinas -cuya combinacin particular de pende de la localizacin de la clula dentro del rgano. Esta diversidad es an ms pronunciada en la piel, donde en las clulas de las distintas capas de la epi dermis se expresan mediante distintos tipos de queratinas (vase Figura 22-19). Existen tambin queratinas que son caractersticas de los epitelios en prolifera cin. Esta heterogeneidad de queratinas es muy til clnicamente: en el diagns tico de los cnceres epiteliales (carcinomas ), el tipo concreto de queratinas que se expresa puede ser utilizado para determinar el tejido epitelial a partir del cual se ha originado el tumor, lo cual puede servir de ayuda en el momento de deci dir el tipo de tratamiento que resultar ms efectivo.

Filamentos intermedios

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Muchas clulas no epiteliales presentan sus propios filamentos intermedios citoplasm ticos diferenciales 10
A diferencia de las queratinas, la vimentina y las protenas relacionadas con la vi mentina, pueden formar filamentos intermedios que son polmeros de un nico tipo de especie proteica. La vimentina es la protena de los filamentos interm e dios citoplasmticos ms abundante y se encuentra en la mayora de clulas de origen mesodrmico, incluyendo fibroblastos, clulas endoteliales, y clulas sanguneas de la lnea blanca; adems muchas clulas expresan la vimentina transitoriamente durante el desarrollo. La desmina se encuentra principalmente en las fibras musculares: se encuentra distribuida por todo el citoplasma de las fibras musculares lisas, y se une a las miofibrillas adyacentes (haces ordenados de actina y miosina filamentosas que discutiremos ms adelante) en las fibras del msculo esqueltico y cardaco. La protena glial acdica fibrilar forma los fi lamentos gliales en los astrocitos del sistema nervioso central y en algunas clu las de Schwann de los nervios perifricos (Figura 16-15). Todas estas protenas pueden polimerizar correctam ente entre ellas; en algunos tipos celulares adul tos se han encontrado copolmeros formados por vimentina y por protenas re lacionadas con la vimentina. Por el contrario, ninguna de estas protenas copolimeriza con las queratinas: cuando queratinas y protenas relacionadas con la vimentina se expresan en la misma clula, forman sistemas filamentosos inde pendientes. Las clulas nerviosas disponen de una variedad nica de filamentos inter medios, que se expresan en distintas regiones del sistema nervioso central en es tadios especficos del desarrollo. Los neurofilamentos son los ms abundantes; se extienden a lo largo del axn y forman su componente citoesqueltico prima rio, especialmente en las clulas nerviosas maduras. En los mamferos, se han descrito tres tipos de protenas de los neurofilamentos : llamadas NF-L, NF-M y NF-H, debido a diferencias en su peso molecular (L de bajo, low, M de medio, middle y H de alto, high, respectivamente). Normalmente los tres tipos de protenas se encuentran en cada neurofilamento. NF-M y NF-H tienen largas co las carboxilo terminales; se cree que se proyectan desde el eje del neurofilamen to y contribuyen a regular el espaciamiento lateral de los neurofilamentos en el axn (Figura 16-16). Si marcamos una clula en cultivo con un anticuerpo contra las protenas de los filamentos intermedios del citoplasma, podremos observar una red deli cada de filamentos fibrosos que envuelve el ncleo y se extiende a travs del ci toplasma hasta la m em brana plasmtica (vase Figura 16-12). En las clulas epi-

Figura 16-15 Micrografa de inmunofluorescencia de filamentos gliales en astrocitos cultivados. Los haces de filamentos intermedios {verde) se han marcado con anticuerpos contra la protena glial acdica fibrilar. Los ncleos se han marcado con un colorante azu l de unin al DNA. (Por cortesa de Nancy L. Kedersha.)

100

| jm

856

Captulo 16: El citoesqueleto

, . '7 . . . "T1

::v.

microtbulos

neurofilamentos

teliales, los filamentos de queratina estn unidos a las uniones celulares espe cializadas -lo s desmosomas que unen clulas vecinas y los hemidesmosomas, que unen las clulas a la lmina basal (se discuten en el Captulo 19). Dado que en cada clula los filamentos de queratina estn conectados a travs de los des mosomas con las clulas vecinas, forman una red continua a travs de todo el epitelio (Figura 16-17). De forma parecida, los filamentos de desmina se en cuentran a menudo anclados en las uniones celulares especializadas de las fi bras musculares.

La lm ina nuclear est constituida por un tipo especial de protenas de filam entos intermedios: las lam ininas 11
La lm ina nuclear es una red proteica que limita la superficie interna de la mem brana nuclear interna en las clulas eucariotas (Figura 16-18). Presenta un grosor tpico de 10-20 nm y est interrumpida en la zona de los poros nucleares, permitiendo la libre entrada y salida de macromolculas del ncleo. En los m a mferos la lmina nuclear est formada por las lamininas, protenas homlogas a las de los filamentos intermedios, de las cuales difieren al menos en cuatro puntos: (1) el dominio central en forma de varilla es algo ms largo (vase Figura

Figura 16-16 Electronm icrografas de dos tipos de filamentos intermedios en clulas del sistem a nervioso. (A) Imagen de neurofilamentos preparados mediante congelacin rpida y sublimacin profunda de un axn de una clula nerviosa, mostrando el extraordinario entrecruzamiento de los haces a travs de puentes de protena -u n a configuracin que probablem ente proporciona una gran resistencia a la tensin en este largo apndice celular. Las uniones cruzadas estn formadas por largas extensiones no helicoidales dei extremo carboxilo terminal de las protenas ms grandes del neurofilamento. (B) Imagen de filamentos gliales en una clula glial obtenida mediante congelacin rpida y sublimacin profunda ilustrando que estos filamentos son lisos y tienen menos puentes cruzados. (C) Electromicrografa convencional de un corte de un axn que muestra la distancia de separacin regular de los neurofilamentos, mucho ms abundantes que los microtbulos. (A y B, por cortesa de Nobutaka Hirokawa; C, por cortesa de John Hopkins.)

!------------------- 1 20 [im Filamentos intermedios

Figura 16-17 Los filamentos de queratina m antienen unidas las clulas, formando las capas celulares. Micrografa de inmunofluorescencia de una red de filamentos de queratina en una m onocapa de clulas epiteliales en cultivo. Los filamentos de cada clula estn conectados indirectamente con los de las clulas vecinas, a travs de los desmosomas. (Por cortesa de Michael Klymkowsky.)

857

com plejo del poro nuclear

CITOSOL

m em brana nuclear

lm ina nuclear
NUCLEO

Figura 16-18 La lm ina nuclear. (A) Dibujo esquemtico que muestra la lmina nuclear a travs de un corte en la regin del poro nuclear. La lmina est asociada con la cromatina y con la membrana nuclear interna. (B) Electronmicrografa de una porcin de la lmina nuclear de un oocito de rana preparado por liofilizacin y sombreado metlico. La lmina est formada por una red cuadrangular altamente organizada de filamentos intermedios, compuesta por lamininas nucleares (no siempre tan altamente organizada com o aqu se presenta). (C) Electronmicrografa de dmeros aislados de laminina, sombreados m etlicam ente (marcados como L). Presentan una forma general sem ejante a la miosina muscular (marcados com o M), con una cola en forma de varilla y dos cabezas globulares. Sin embargo, son mucho menores que las molculas de miosina. Las cabezas globulares estn formadas por los dos largos dominios carboxilo terminales. (B y C, por cortesa de Ueli Aebi).

16-13). (2) Presentan una seal de transporte hacia el ncleo que las dirige desde el citosol, donde son sintetizadas, hasta el ncleo. (3) Se ensamblan formando una red bidimensional parecida a una lmina y necesitan de la asociacin de otras protenas para el ensam blaje. (4) La red que forman es extraordinariamen te dinmica y rpidamente se produce el desensamblaje al iniciarse la mitosis y el reensam blaje cuando sta ha terminado; como ya hemos mencionado, el des ensam blaje y reensam blaje vienen determinados por la fosforilacin y desfosfo rilacin de algunos residuos de serina en las lamininas. A diferencia de los microtbulos y de los filamentos de actina, que se en cuentran en todas las clulas eucariotas, los filamentos intermedios citoplasmticos han sido descritos slo en animales pluricelulares, y en ellos no son nece sarios en cada uno de los tipos celulares que los forman. Por ejemplo, las clulas gliales especializadas del sistema nervioso central que fabrican mielina no dis ponen de filamentos intermedios. Adems, si desorganizamos los filamentos in termedios de fibras musculares, fibroblastos o clulas epiteliales en cultivo, no se produce ningn efecto en el comportamiento celular. Parece ser que la primera clase de protenas de los filamentos intermedios que apareci en la evolucin fueron las lamininas nucleares y los diversos tipos de filamentos intermedios citoplasmticos aparecieron ms adelante como adaptaciones de esta forma primitiva. Las protenas de los filamentos interm e dios en los invertebrados, por ejemplo, se parecen mucho ms a las lamininas que a las protenas de los filamentos intermedios citoplasmticos de los verte brados.

Los filam entos intermedios proporcionan estabilidad m ecnica a las clulas anim ales 12
Cada da disponemos de mayor nmero de evidencias de que la funcin princi pal de los filamentos intermedios es la de soportar la tensin mecnica. En la enfermedad gentica humana epidermolisis hullosa simple, las mutaciones en los genes de las queratinas que se expresan norm alm ente en la capa basal de la epidermis desorganizan la red de filamentos de citoqueratina en estas clulas, transformndolas en clulas extremadamente sensibles a las lesiones m ecni cas: una ligera presin puede provocar la rotura de las clulas basales mutantes, y la piel se llena de ampollas en la zona afectada. Podemos provocar una situa cin parecida en monos transgnicos que expresan queratinas mutantes de este tipo (Figura 16-19). Tanto en humanos com o en monos la epidermis puede ser

858

Captulo 16 : El citoesqueleto

clula basal de la epiderm is

(A)

I _____ | 40 jim

(B)
Figura 16-19 Aparicin de ampollas en la piel provocadas por un gen mutante de queratina. Un gen mutante que codifica una queratina truncada (sin dominios amino y carboxilo terminales) ha sido expresado en un ratn transgnico. La protena defectuosa se ensambla con las molculas de queratina normales y desorganiza la red de filamentos de queratina en las capas celulares basales. Micrografas pticas de piel normal (A) y mutante (B) muestran que las ampollas se producen a partir de la ruptura de las clulas en la capa basal de la epidermis mutante. El dibujo en (C) de tres clulas de la capa basal de la epidermis mutante observadas mediante microscopa electrnica muestra que las clulas se rompen entre el ncleo y los hemidesmosomas, que conectan los filamentos de queratina con la lmina basal subyacente. (De PA. Coulombe, M.E. Hutton, R. Vassar y E. Fuchs, J. Cell Biol. 115:1661-1674,1991, reproducido con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

tan frgil que el individuo mutante puede morir por un trauma mecnico. Se cree que los filamentos intermedios citoplasmticos juegan un papel semejante en las clulas no epiteliales. La estructura que presentan los filamentos intermedios es la ideal para de sarrollar este tipo de funciones mecnicas. Las subunidades fibrosas se asocian de manera paralela formando haces superpuestos, lo cual les permite resistir tensiones mecnicas mucho ms intensas que las que resisten los microtbulos o los filamentos de actina (Figura 16-20). En la piel, los filamentos de queratina de las capas ms 'externas de la epidermis se entrecruzan covalentemente entre s y con protenas asociadas, y a medida que las clulas de la capa exterior van muriendo, las queratinas entrecruzadas persisten como la parte principal de la capa protectora externa del animal. Las clulas epiteliales especializadas de lu gares especficos de la piel proporcionan variaciones regionales, y generan apndices superficiales tales como los pelos y las uas. Sin embargo, si la funcin de los filamentos intermedios es simplemente la de resistir las tensiones m ecnicas en las clulas y tejidos, por qu existen tan tos tipos de subunidades proteicas? Adems, cul es la funcin de los dominios variables de la cabeza y de la cola de estas protenas? En la actualidad estas pre guntas no pueden contestarse detalladamente, pero est claro que la manera en que los filamentos intermedios se unen a otros componentes de la clula varia de un tipo celular a otro. Los filamentos de desmina que unen entre s los bordes de las miofibrillas en las clulas del msculo esqueltico deben presentar luga res de unin para protenas especficas asociadas a las miofibrillas. Los neurofilamentos en los axones estn unidos entre s a travs de sus dominios carboxilo terminales y forman un haz continuo de filamentos, a modo de cuerda de un metro o ms de longitud. Algunas queratinas estn especializadas en la forma-

Figura 16-20 Propiedades m ecnicas de los polmeros de actina, tubulina y vimentina. Redes formadas por microtbulos o filamentos de actina o filamentos de vimentina, todas a la misma concentracin, fueron expuestas a una fuerza en un viscmetro, y se calcul el grado de tensin resultante. Los resultados muestran que la red de microtbulos se deforma fcilmente pero que cuando la tensin sobrepasa el 50% de su longitud original (indicada mediante la estrella roja q u e estalla) se rompen y empiezan a fluir sin lmite. Los filamentos de actina son mucho ms rgidos, pero se rompen fcilmente. Las redes de vimentina, al contrario, se deforman fcilmente, pero a diferencia de los microtbulos, soportan tensiones y esfuerzos muy grandes sin romperse. Los filamentos de vimentina son muy necesarios para el mantenimiento de la integridad celular. (Adaptado de P. Jamney et al., /. Cell Biol. 113:155-160,1991, reproducido con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

Filamentos intermedios

85 9

cin de la capa extem a protectora de la piel, dura y resistente, mientras que otras simplemente mantienen las tensiones que sufren los epitelios en los cam bios de forma que se producen durante la morfognesis. Estas funciones dife renciales han de ser desarrolladas por las regiones variables de las distintas pro tenas de los filamentos intermedios, que se proyectan desde la superficie del filamento y determinan su capacidad de unin a otros com ponentes de la clula. En este sentido, las regiones variables de las protenas de los filamentos interme dios realizan funciones parecidas a las de las protenas accesorias de los fila mentos de actina y de los microtbulos. La diferencia estriba en que las regiones variables son parte integral de la subunidad del filamento intermedio mientras que las otras constituyen una protena independiente.

Resumen
Los filamentos intermedios son fuertes polmeros de polipptidos fibrosos, a modo de cuerda, que resisten tensiones y desempean un papel estructural o mecnico en la clula. Se conocen distintasformas especficas de filamentos intermedios que di fieren en el tipo de polipptido que los form a: entre las que se encuentran los fila mentos de queratina de las clulas epiteliales, los neurofilamentos de las clulas nerviosas, los filamentos gliales de los astrocitos y las clulas de Schwann, los fila mentos de desmina de lasfibras musculares, y losfilamentos de vimentina de losfi broblastos y de otros muchos tipos celulares. Las lamininas nucleares, que forman la lmina fibrosa subyacente a la envoltura nuclear, son una familia diferente de protenas de losfilamentos intermedios. Los monmeros de los distintos tipos de filamentos intermedios tienen secuen cias de aminocidos distintas y difieren en sus pesos moleculares. Sin embargo, to dos ellos presentan un dominio central homlogo que, cuando dimeriza, forma una estructura de sobreenrollamiento rgido. Estas subunidades dimricas se aso cian unas con otras formando tetrmeros simtricos, los cuales se ensamblan en haces superpuestos formando el filamento intermedio no polarizado. Los dominios fibrosos de las subunidades forman el eje estructural de losfilamentos intermedios, mientras que los dominios globulares se proyectan hacia el exterior. Una funcin de estos dominios variables puede ser la de permitir a cada tipo de filamento inter medio la asociacin con otros componentes especficos de la clula y la de posicionar estosfilamentos en el lugar adecuado dentro de la clula.

Microtbulos1 3
Los microtbulos, como hemos visto, son polmeros largos y rgidos que se ex tienden a travs del citoplasma y dirigen la localizacin de los orgnulos delimi tados de membrana y de otros com ponentes celulares. En este apartado discuti remos el ensam blaje de estas importantes estructuras a partir de molculas de tubulina y explicaremos cm o su polimerizacin y despolimerizacin est con trolada por el nucletido GTP. A continuacin examinaremos cmo algunos mi crotbulos previamente seleccionados son estabilizados en la clula mediante su asociacin a protenas accesorias especficas. Finalmente, discutiremos la im portancia de los motores dependientes de microtbulos que transportan vescu las m em branosas y diversos com plejos proteicos a lo largo de los microtbulos.

Los microtbulos son cilindros huecos formados por tubulina 14

Los microtbulos estn constituidos por molculas de tu b u lin a , cada una de las cuales es un heterodmero formado por dos subunidades globulares fuertemen te unidas entre s, llamadas a-tubulina y fi-tubulina. Aunque la tubulina est presente en casi todas las clulas eucariotas, la fuente ms abundante para los estudios bioqumicos es el cerebro de los vertebrados. Los procedimientos de extraccin recuperan de un 10 a un 20% de la protena soluble total del cerebro

860

Captulo 16: El citoesqueleto

Figura 16-21 Microtbulos. (A) Electronmicrografa de un microtbulo visto en seccin transversal, con su anillo de 13 subunidades, cada una de las cuales corresponde a una molcula de tubulina diferente (un heterodmero a/(3). (B) Crioelectronmicrografa de un microtbulo ensamblado in vitro. (C y D) Diagramas esquemticos de un microtbulo, en los que se muestra la forma en que las molculas de tubulina se empaquetan entre s formando la pared cilindrica. (C) muestra las 13 molculas vistas en seccin transversal. (D) muestra una visin lateral de una corta seccin de un microtbulo, con las molculas de tubulina alineadas formando largas hileras paralelas o protofilam en tos. Cada uno de los 13 protofilamentos est compuesto por series de molculas de tubulina, cada una de las cuales es un heterodmero a/|3. Un microtbulo es una estructura polar, ya que cada uno de sus extremos tiene una molcula de tubulina (a o (3) diferente. (A, por cortesa de Richard Linck; B, por cortesa de Richard Wade; D, dibujado a partir de datos proporcionados por Joe Howard.)

,A}

< C )

25 nm

en forma de tubulina, lo cual refleja la elevada y poco usual densidad de m icro tbulos que existe en los apndices alargados de las clulas nerviosas. Las molculas de tubulina, en s mismas, son diversas. En los mamferos existen com o mnimo seis formas de a-tubulina y un nmero parecido de for mas de (3-tubulina, cada una de las cuales est codificada por un gen distinto. Las distintas formas de tubulina son muy parecidas, y todas ellas copolimerizan en ensayos in vitro, formando un mismo microtbulo, aunque pueden encon trarse en distintas regiones de la clula y llevar a cabo funciones sutilmente dis tintas. Por ejemplo, en seis neuronas especializadas que presentan sensibilidad por contacto del nemtodo Caenorhabditis elegans, los microtbulos estn for mados por una forma especfica de P-tubulina; las mutaciones en el gen que co difica esta protena implican la prdida de la sensibilidad por contacto especfi ca, sin ningn efecto aparente en otras funciones celulares. Un microtbulo puede ser considerado como una estructura cilindrica en la cual los heterodmeros de tubulina estn empaquetados alrededor de un ncleo central, que aparece vaco en las micrografas electrnicas. De una forma quizs ms detallada, uno puede observar cmo esta estructura se construye a partir de 13 protofilamentos lineales, cada uno de los cuales est formado por subunida des alternadas de a- y P-tubulina, dispuestos paralelamente formando un cilin dro (Figura 16-21). Dado que los 13 protofilamentos estn alineados en paralelo con la misma polaridad, los microtbulos son estructuras polares, y es posible distinguir un extremo ms (de crecimiento rpido) y un extremo menos (de cre cimiento lento).

molcula de tubulina

Los microtbulos son estructuras muy lbiles, sensibles a drogas antim itticas especficas 15
Muchas de las disposiciones de los microtbulos celulares son lbiles y esta labi lidad es imprescindible para que puedan desarrollar su funcin. Uno de los ejemplos ms notables de este hecho es el huso mittico, que se forma despus del desensamblaje de los microtbulos al comienzo de la mitosis. El huso mitti co es la diana de una gran variedad de drogas antimitticas especficas que actan interfiriendo en el recambio entre las subunidades de tubulina de los m icrot bulos y el acervo de tubulina libre. Una de estas drogas es la colchicina (Figura 16-22), alcaloide que se extrae del azafrn silvestre y que ha sido utilizada como planta medicinal para el tratamiento de la gota desde la poca de los antiguos egipcios. Cada molcula de colchicina se une fuertemente a una molcula de tu bulina e impide su polimerizacin, pero no puede unirse a la tubulina una vez la tubulina ha polimerizado formando un microtbulo. La exposicin de una clu la en divisin a la colchicina, o a la colcemida, droga ntimamente relacionada con ella, produce una desaparicin rpida del huso mittico, e indica que el equilibrio qumico se mantiene mediante el recambio continuo de subunidades

Microtbulos

861

entre los microtbulos del huso mittico y el acervo de tubulina libre. Debido a que la interrupcin temporal de los microtbulos del huso mittico provoca preferentemente la muerte de clulas que se dividen de forma anormal, las dro gas antimitticas, como la vinblastina y la vincristina (cuyos efectos son pareci dos a los de la colchicina), han sido ampliamente utilizadas en el tratamiento del cncer. La droga taxol (Figura 16-22), que se extrae de la corteza del tejo, tiene un efecto opuesto. Se une fuertemente a los microtbulos y los estabiliza; cuando se aade a clulas, provoca que m uchas de las molculas de tubulina libre se en samblen formando microtbulos. La estabilizacin de los microtbulos con ta xol detiene la mitosis de las clulas en divisin, lo cual indica que durante la mitosis los microtbulos deben ser capaces no slo de polimerizar sino tam bin de despolimerizar. El taxol ha sido tam bin ampliamente utilizado como droga an ticancerosa.

Figura 16-22 Estructuras qumicas de la colchicina y del taxol. La colcemida, una tercera droga, est ntimamente relacionada con la colchicina y en ella el grupo que se muestra en a m a r illo est substituido por un -C H 3. Se une a la tubulina, pero a diferencia de la colchicina, su unin es fcilmente reversible.

El alargam iento de un microtbulo es un proceso rpido, m ientras que la nucleacin de un nuevo microtbulo es un proceso lento 16
La polimerizacin y despolimerizacin de los microtbulos es com pleja e inter viene en procesos interesantes con importantes papeles biolgicos. Una buena parte de los conocim ientos actuales acerca del comportamiento dinmico de los microtbulos ha sido obtenida en estudios de polimerizacin in vitro a partir de molculas de tubulina purificadas. La tubulina pura polimeriza a 37C en el tubo de ensayo, formando microtbulos, siempre y cuando estn presentes tanto Mg2+ com o GTP. Si seguimos la polimerizacin ya sea midiendo la luz dispersada o a travs del microscopio, podremos observar una fase inicial (fase lag), des pus de la cual los microtbulos se forman rpidamente hasta llegar a un nivel de polimerizacin determinado. La fase inicial se produce porque es mucho ms fcil aadir molculas de tubulina a un microtbulo existente, proceso llamado alargamiento, que iniciar un nuevo microtbulo de novo, proceso llamado nu

cleacin.
Durante la fase de polimerizacin rpida, las concentraciones elevadas de tubulina libre provocan que la polimerizacin de los microtbulos sea ms rpi da que la despolimerizacin (vase ms adelante). Sin embargo, cuando se ha lle gado al nivel de polimerizacin ms elevado, no toda la tubulina habr polimerizado puesto que las subunidades se estn disociando (despolimerizando) a partir de los extremos de los microtbulos y, al mismo tiempo, aadindose a ellos. La velocidad de polimerizacin decae con el tiempo porque es proporcional a la concentracin de tubulina libre; la concentracin de tubulina libre en el nivel ms alto, en el cual las velocidades de polimerizacin y despolimerizacin se en cuentran en equilibrio, recibe el nombre de concentracin crtica (Figura 16-23). Al iniciar este captulo vimos que normalmente en una clula los microt bulos crecen a partir de un lugar especfico de nucleacin (generalmente el cen862 Captulo 16: El citoesqueleto

100

a la rg a m ie n to

estado estacion a rio

Figura 16-23 Polimerizacin de tubulina pura. Una mezcla de tubulina, tampn y GTP se coloca a 37C en el tiempo cero. La cantidad de microtbulo polimerizado, medida mediante dispersin de luz, sigue una curva sigmoidal. Durante la fase inicial (fase lag) las molculas individuales de tubulina se asocian formando agregados metaestables, algunos de los cuales continan y nuclean microtbulos. La fase lag refleja una barrera cintica para este proceso de nucleacin. Durante la fase rpida de alargamiento, las subunidades se aaden a los extremos libres de los microtbulos existentes. Durante la fase de meseta, la polimerizacin y la despolimerizacin estn en equilibrio ya que la cantidad de tubulina libre ha llegado al punto en que se ha conseguido la con cen tracin crtica. Para simplificar, las subunidades que se aaden y que se pierden de un microtbulo se muestran siempre en el mismo extremo.

m icrotbulo con subunidades entrando y saliendo

m icrotbulo en crecim iento

= 3 _Q 3 -O '= J T 3 U subunidades
ss'E

individuales

0 - 8

' d cP oligm eros tiem po a 37C

coco

trosoma); puesto que existe una barrera cintica para la nucleacin en solucin, la polimerizacin de la tubulina se produce nicamente en este lugar. Como en el tubo de ensayo, no toda la tubulina de la clula se encuentra polimerizada. Una fibroblasto tpico dispone aproximadamente de una concentracin de tu bulina 20 micromolar (2 mg/ml), de la cual un 50% est en los microtbulos y el 50% restante se encuentra libre.

Los dos extremos de un microtbulo son diferentes y crecen a velocidades diferentes 17

La polaridad estructural de un microtbulo, reflejo de la orientacin regular de las subunidades de tubulina, hace que los dos extremos del polmero sean dis tintos, lo cual tiene un efecto profundo en su velocidad de crecimiento. Si se permite que molculas de tubulina purificada polimericen durante un corto pe-

microtbulo formado

/e novo

extremo, ms"

Figura 16-24 Electronm icrografa que m uestra la polimerizacin preferencial de tubulina en los extrem os m s de los microtbulos. Un haz estable de microtbulos obtenido del ncleo de un cilio (se discute ms adelante) se incuba con subunidades de tubulina en condiciones de polimerizacin. Los microtbulos crecen ms rpidamente en el extremo m s del haz de microtbulos (extremo que se encuentra sobre el haz en esta figura). (Por cortesa de Gary Borisy.)

extrepio monos".

Microtbulos

863

Figura 16-25 Polaridad de los microtbulos puesta de manifiesto por el mtodo de decoracin con ganchos. En esta electronmicrografa todos los
microtbulos (vistos en seccin transversal) tienen la misma orientacin. Los pequeos ganchos, formados por la tubulina que se ha aadido, se curvan siguiendo el sentido de las agujas del reloj, lo cual indica que los microtbulos se estn observando desde el extremo m s hacia el extremo m enos. La polaridad de los microtbulos tambin se puede determinar mediante la decoracin con molculas de dinena (no se muestra aqu). (Por cortesa de Ursula Euteneuer.)

rodo de tiempo en los extremos de fragmentos de microtbulos estables y en tonces se examina la mezcla al microscopio electrnico puede observarse que un extremo se alarga al menos a una velocidad tres veces superior a la del otro (Figura 16-24). Por ello, el extremo de crecimiento rpido se defini entonces como el extrem o m s y el otro como el extrem o m enos. Es posible detectar la polaridad de los microtbulos en seccin transversal aadiendo molculas de tubulina libre a microtbulos preexistentes: en condi ciones especiales los monmeros de tubulina no se incorporan a los extremos de los microtbulos sino a los lados, formando lminas de protofilamentos curva dos. Estas lminas observadas en seccin transversal parecen pequeos ganchos y, dependiendo de la orientacin del microtbulo, siguen la misma direccin de las agujas del reloj o van en sentido contrario (Figura 16-25). De esta forma se ha demostrado que en una clula, los extremos ms de los microtbulos se extien den a partir de los lugares de nucleacin de los microtbulos como por ejemplo el centrosoma, los polos del huso mittico o el corpsculo basal de un cilio (Fi gura 16-26).

0,2 Jim

clula en interfase

Los centrosomas son el lugar primario de nucleacin de los microtbulos en las clulas animales1 8
En el citoplasma de una clula interfsica podemos observar los microtbulos mediante tincin de la clula con anticuerpos anti-tubulina fluorescentes, des pus de que las clulas hayan sido fijadas. Se observa una elevada densidad de microtbulos alrededor del ncleo, desde donde irradian hacia la periferia celu lar, en forma de finas hebras (Figura 16-27). El origen de los microtbulos se pede observar claramente si stos se despolimerizan primero con colcemida y luego se permite su repolimerizacin despus del lavado de la droga. Los nuevos microtbulos crecen a partir del centrosoma y forman una estructura con apa riencia de estrella llamada ster y entonces se alargan hacia la periferia celular hasta que se restablece su distribucin inicial (Figura 16-28). Si los microtbulos de clulas en cultivo se decoran con ganchos de tubulina para determinar su polaridad, se observa que todos tienen sus extremos m s, alejado del centroso ma, lo cual indica que este centro organizador tiene la capacidad de nuclear la polimerizacin de los microtbulos con una polaridad especfica. En la mayora de clulas animales el centrosom a es el centro organizador de microtbulos ms importante. Durante la interfase se localiza en la proximidad del ncleo, muy cercano a la superficie externa de la envoltura nuclear. Inmer sas en el centrosom a se encuentran un par de estructuras cilindricas, dispuestas en ngulo recto una respecto a otra, en un configuracin en forma de L. Son los centrolos, que discutiremos ms adelante. El centrosoma se duplica y se divide en dos partes iguales durante la interfase de manera que cada mitad contiene un

centrosom a clula ciliada cilio/flagelo

corpsculo basal

clula en divisin

polo del huso

centrosom a
Figura 16-26 Orientacin de los microtbulos en las clulas. Normalmente
los extremos m enos de los microtbulos se hallan embebidos en un centro organizador de microtbulos, mientras que los extremos m s se hallan cerca de la m embrana plasmtica.

864

Captulo 16 : El citoesqueleto

Figura 16-27 Distribucin interfsica de los microtbulos en un fibroblasto en cultivo. Los microtbulos (en
verde ) han sido marcados con un anticuerpo contra la tubulina; el ncleo celular (en azul) se ha marcado con un colorante fluorescente que se une al DNA. (Por cortesa de Nancy L. Kedersha.)

10 |jm

par de centrolos duplicados. Estos dos centrosomas hijos se dirigen hacia lados opuestos del ncleo al empezar la mitosis, y forman los dos polos del huso mittico (vase Figura 18-5). Durante la interfase y la metafase se distingue una regin de citoplasma mucho ms oscura rodeando cada par de centrolos; en las mejores electronmicrografas se puede distinguir en esta regin una red de pequeas fibras (Figura 16-29A). Es el m aterial pericentriolar, o m atriz del centrosom a, y es la regin del centrosom a que nuclea la polimerizacin de los microtbulos. La com posi cin proteica de la matriz del centrosoma slo es parcialmente conocida, igual que el m ecanismo a partir del cual se produce la nucleacin de los microtbu los. Sin embargo, sabemos que est formada por protenas especficas del cen trosoma, incluyendo una forma minoritaria de la tubulina, llamada y-tubulina (Figura 16-29B), que puede interactuar con el dmero a/p-tubulina colaborando en la nucleacin de los microtbulos. No todos los centros organizadores de microtbulos contienen centrolos. En las clulas mitticas de plantas superiores, por ejemplo, los microtbulos terminan en regiones electrodensas pobrem ente definidas, completamente des provistas de centrolos. El huso meitico de los oocitos de ratn tampoco pre senta centrolos, aunque stos aparecen ms tarde en el embrin en desarrollo. En hongos y diatomeas el centro organizador de microtbulos es una placa lla mada corpsculo polar del huso, que se encuentra en la envoltura nuclear. A pe sar de las diferencias morfolgicas (Figura 16-30), todos los centros organizado res contienen una matriz que nuclea la polimerizacin de los microtbulos, y que norm alm ente est formada por y-tubulina y otras protenas especficas del centrosoma. As pues, parece que el m ecanismo molecular de la nucleacin de los microtbulos se ha conservado notablem ente durante la evolucin.

Figura 16-28 Microtbulos creciendo a partir del centrosoma despus de retirar la colcemida. Micrografas de inmunofluorescencia que muestran la
distribucin de los microtbulos en clulas cultivadas, detectados mediante tincin con anticuerpos contra tubulina. En (A) se muestra una clula normal de un tejido en cultivo. Las clulas que se muestran en (B) fueron tratadas con colcemida durante 1 hora para despolimerizar sus microtbulos, y posteriormente se permiti que se recuperaran; los microtbulos aparecen en primer lugar en una estructura en forma de estrella, y luego se alargan hacia la periferia de la clula. (A, por cortesa de Eric Karsenti y Marc Kirschner; B, de M. Osborn y K. Weber, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 73:867-871, 1976.)

20 iim
865

Microtbulos

Figura 16-29 La matriz del centrosoma. (A) Electronmicrografa

de un centrosoma en una preparacin purificada. La matriz envuelve un centrolo en forma de barril y aparece com o un material fibroso que contiene grnulos finos. (B) Micrografa ptica de una clula humana dividindose en cultivo, teida con un anticuerpo contra la P-tubulina (verde) y con un anticuerpo contra la y-tubulina (rojo), una protena que se localiza en el centrosom a de las clulas de una gran variedad de organismos. La superposicin del mareaje rojo y verde provoca que las regiones que contienen la y-tubulina en los polos del huso sean amarillas. (A, cortesa de Stephen Fuller; B, cortesa de M. Katherine Jung y Berl R. Oakley.)

Z O O nm

En las clulas animales los microtbulos se despolimerizan y repolimerizan continuamente1 9

En una clula, com o por ejemplo un fibroblasto en cultivo, se produce un re cambio continuo de la red de microtbulos. La vida media de un microtbulo individual es aproximadamente de 10 minutos, mientras que la vida media de una molcula de tubulina, desde su sntesis hasta su degradacin proteoltica, es de ms de 20 horas. As pues cada molcula de tubulina participa en la forma cin y desmantelamiento de muchos microtbulos durante su perodo de vida, proceso que puede ser estudiado mediante la observacin directa de clulas vi vas. As por ejemplo, a una clula podemos inyectarle tubulina que ha sido uni da covalentemente a un colorante fluorescente y seguir, utilizando un m icrosco pio de fluorescencia, el comportamiento de los microtbulos que incorporan la tubulina marcada. Alternativamente, en algunas clulas muy extendidas los mi crotbulos pueden observarse directamente, sin necesidad de ningn tipo de mareaje, utilizando la microscopia de contraste interferencial-diferencial vdeo amplificada (vase Figura 4-12). Cuando se sigue el comportamiento de los mi crotbulos m ediante alguno de estos mtodos, se observa un fenmeno impor tante. Los microtbulos individuales crecen hacia la periferia celular a una velo cidad constante durante un cierto perodo de tiempo y entonces de repente se

Figura 16-30 Un centro organizador de microtbulos en una clula de un hongo. Electronmicrografa del corpsculo polar del huso en la levadura. (Cortesa de John Kilmartin.)

866

Captulo 16: El citoesqueleto

Figura 16-31 Dinmica de los microtbulos en una clula viva. Se ha

inyectado tubulina a un fibroblasto, que ha sido ligada covalentemente a rodamina, de manera que aproximadamente una subunidad de tubulina de cada 10 de la clula est marcada con el colorante fluorescente. Se observa entonces la fluorescencia en un extremo de la clula mediante un sistema de imagen electrnica extremadamente sensible. Debajo de las micrografias se muestran trazos que permiten ver los microtbulos seleccionados ms detalladamente. Podemos observar, por ejemplo, cmo el microtbulo 1 crece primero y luego se acorta rpidamente, mientras que el microtbulo 4 crece continuamente. (De P.J. Sammaky G.C. Borisy, Nature 332:724-736,1988. 1988 Macmillan Joumals Ltd.)

acortan rpidamente hacia el centrosoma. Pueden acortarse parcialmente y en tonces continuar el crecimiento, o desaparecer por completo, siendo substitui dos por un microtbulo distinto (Figura 16-31). Estas fluctuaciones de tamao pueden abarcar algunos micrmetros de longitud e incluyen la polimerizacin y despus la despolimerizacin de miles de subunidades de tubulina. Cuando se han estudiado en un tubo de ensayo microtbulos purificados, se han podido observar transiciones entre perodos prolongados de polimerizacin y despoli merizacin (Figura 16-32). Este comportamiento, llamado inestabilidad dinmi ca, juega un papel muy importante en el posicionamiento de los microtbulos en la clula, tal como discutiremos ms adelante.

La hidrlisis de GTP puede explicar la inestabilidad dinmica de los microtbulos individuales2 0

La inestabilidad dinm ica de los microtbulos necesita un aporte de energa para equilibrar el balance qumico entre la polimerizacin y la despolimeriza cin -energa que proviene de la hidrlisis de GTP. El GTP se une a la subunidad P-tubulina de la molcula de tubulina heterodimrica y, cuando la molcula de tubulina se incorpora al extremo de un microtbulo, esta molcula de GTP es hidrolizada a GDP. (La subunidad a-tbulina tambin transporta GTP, pero no puede ser intercambiado por GTP libre y no es hidrolizado, por lo cual puede considerarse como una parte fija de la estructura proteica de la tubulina.) Se ha estudiado el papel de la hidrlisis del GTP en la polimerizacin de los microtbulos, utilizando anlogos no hidrolizables del GTP. Las molculas de tubulina que contienen estos anlogos no hidrolizables de GTP forman microt bulos normalmente, lo cual indica que la unin del nucletido es necesaria para la polimerizacin del microtbulo, pero su hidrlisis no lo es. Sin embargo, es tos microtbulos son anormalmente estables y no se despolimerizan igual que los microtbulos normales cuando la concentracin de tubulina en el fluido que los rodea es menor o cuando se tratan con colchicina. As pues, aparentemente el papel normal de la hidrlisis del GTP es el de permitir la despolimerizacin de los microtbulos debilitando las uniones entre las subunidades de tubulina. f ' ^ 5 l'm t
extremo rns extremo menos

Figura 16-32 La inestabilidad dinmica del crecimiento de los microtbulos.

Fluctuaciones de la longitud de un microtbulo en una solucin de tubulina pura observadas mediante microscopa de campo oscuro vdeo-amplificada. Se recogieron imgenes del mismo microtbulo a intervalos de 1 o 2 minutos y se presentaron siguiendo una secuencia ordenada en la pantalla del monitor. Los dos extremos del microtbulo estuvieron sometidos a ciclos de acortamiento y alargamiento, de forma independiente, siendo el extremo ms el que experi ment las mayores fluctuaciones. (De T. Horio y H. Hotani, N ature 321:605-607, 1986. 1986 Macmillan Joumals Ltd.)

Microtbulos

867

Se cree que la inestabilidad dinmica es una consecuencia de la hidrlisis re trasada del GTP despus del ensamblaje de la tubulina. Cuando un microtbulo crece rpidamente, la incorporacin de molculas de tubulina en el extremo del polmero es ms rpida que la velocidad de hidrlisis del GTP que transportan. Esto implica la formacin de un casquete de GTP en el extremo del microtbulo y, puesto que las molculas de tubulina que contienen GTP se unen unas a otras con mayor afinidad que las que contienen GDP, el casquete de GTP estimula al microtbulo a continuar su crecimiento. Por el contrario, cuando un microtbulo ha perdido su casquete de GTP -p or ejemplo, si la velocidad de polimerizacin baja lentam ente- empezar a acortarse y luego tender a seguir acortndose. En la Figura 16-33 se muestra un modelo esquemtico de los cambios es tructurales que acom paan a la inestabilidad dinmica. Algunos principios ge nerales que pueden aplicarse tanto a los filamentos de actina como a los microtbulos se discuten en el Panel 16-1, pginas 882-883. Las clulas pueden modificar la inestabilidad dinmica de sus microtbulos para propsitos especficos. En cada fase M del ciclo celular, por ejemplo, la ra pidez con la que los microtbulos se forman y se rompen se ve incrementada, de forma que los cromosomas pueden ser fcilmente capturados por los microt bulos en crecimiento y el huso mittico se forma con una gran rapidez (discuti do en el Captulo 18). Contrariamente, cuando un clula se diferencia y adopta una morfologa definida, la inestabilidad dinmica de sus microtbulos se supri me mediante protenas que se unen a los microtbulos y los estabilizan, impi diendo su despolimerizacin. La capacidad de estabilizar a los microtbulos en una configuracin particular proporciona un mecanismo muy importante m e diante el cual la clula puede organizar su citoplasma.

Figura 16-33 La hidrlisis del GTP despus de la polimerizacin desestabiliza los microtbulos. El anlisis
del crecimiento y acortamiento de los microtbulos in vitro sugiere el siguiente modelo para la inestabilidad dinmica. (A) La adicin de los heterodmeros de tubulina transportando GTP a un extremo del protofilamento provoca su crecimiento en una conformacin lineal, lo cual favorece el empaquetamiento en la pared cilindrica del microtbulo, es decir, lo convierte en estabilizado. La hidrlisis del GTP despus del ensamblaje cambia la conformacin de las subunidades y el protofilamento tiende a deformarse en un forma curvada que es menos capaz de empaquetarse en la pared del microtbulo. (B) En un microtbulo intacto, los protofilamentos formados por subunidades que contienen GDP son forzados a adoptar una conformacin lineal mediante los muchos enlaces laterales de la pared del microtbulo, especialmente en el casquete estable de subunidades que contienen GTP. La prdida del casquete de GTP permite que los protofilamentos que contienen GDP se relajen y adopten su conformacin curvada. Esto conduce a una disrupcin progresiva del microtbulo y al desensamblaje final de los protofilamentos, formando dmeros de tubulina libres.

La inestabilidad dinmica de los microtbulos proporciona un principio organizador para la morfognesis celular2 1
En las clulas animales los microtbulos citoplasmticos tienden a irradiar en todas direcciones a partir del centrosoma, donde estn anclados sus extremos m enos. No obstante, la mayora de las clulas animales estn polarizadas, y el

dm ero de tubulina

GTP intercam biable

casquete de GTP

protofilam ento recto la hidrlisis del GTP cambia la conform acin de la subunidad y debilita el enlace en el polm ero
I

protofilam ento curvado | despolim erizacin

regin menos estable del m icrotbulo que contiene dm eros de tubulina unidos a GDP

CRECIMIENTO (A)
868 Captulo 16: El citoesqueleto

ACORTAMIENTO

(B)

ncleo

centrosoma

protena que form a un casquete

Figura 16-34 La estabilizacin selectiva de los microtbulos puede polarizar una clula. Un microtbulo
acabado de formar slo persistir si sus dos extremos estn protegidos de la despolimerizacin. En las clulas, los extremos menos de los microtbulos generalmente estn protegidos por los centros organizadores, a partir de los cuales crecen. Los extremos ms son inicialm ente libres pero pueden ser estabilizados por otras protenas. Aqu por ejemplo en (A) se representa una clula no polarizada con nuevos microtbulos creciendo y rompindose en todas direcciones. Los haces de microtbulos encuentran entonces estructuras hipotticas en una regin especfica del crtex celular que pueden unir (estabilizar) los extremos ms de los microtbulos (B). La estabilizacin selectiva de estos microtbulos, que sucede al encontrar estas estructuras, comportar una redistribucin rpida de los haces de microtbulos y convertir a la clula en una forma polarizada (C y D).

/ g

l
4 ''-

(A)

ensam blaje y desensamblaje de las molculas de tubulina estn controlados es pacialmente de manera que predomina la extensin de los microtbulos hacia regiones especficas de la clula. Se desconoce como se consigue esta distribu cin, pero se cree que los mecanismos dependen de la inestabilidad dinmica de los microtbulos. Hemos visto como in vitro los microtbulos individuales tienden a existir en uno de los dos estados posibles -d e crecimiento regular o rpido, y de desen samblaje catastrfico- y que los microtbulos en las clulas tambin existen en una de estas dos formas. La inestabilidad inherente de los microtbulos con tribuye a explicar cmo pueden ser inducidos a crecer en direcciones especficas de la clula -p or ejemplo, hacia el borde frontal de avance de la clula que se arrastra. La red de microtbulos que irradia a partir del centrosoma est cam biando continuam ente ya que crecen nuevos microtbulos y reemplazan a otros que se estn despolimerizando. Un microtbulo que crece desde un centrosoma puede ser estabilizado si su extremo m s es estabilizado, o si se forma un cas quete, de manera que se impida su despolimerizacin. Si es recubierto por una estructura de una regin particular de la clula, se establecer un punto de unin relativamente estable entre esta estructura y el centrosoma. As pues, los microtbulos originados en el centro organizador pueden estabilizarse selecti vamente por diferentes fenmenos en cualquier lugar de la clula. Se cree que la polaridad celular est determinada de esta manera, por medio de estructuras o factores desconocidos localizados en regiones particulares del crtex celular que capturan los extremos ms de los microtbulos (Figura 16-34). Tal como discutiremos a continuacin, en muchas clulas la estabilizacin inicial de los extremos ms de los microtbulos se consolida, producindose una polarizacin ms permanente de la misma.

Los microtbulos sufren una lenta maduracin como resultado de modificaciones post-traduccionales de sus subunidades de tubulina2 2
Las subunidades de tubulina pueden ser modificadas covalentemente despus de su polimerizacin. Dos de estas modificaciones son especialmente interesan tes puesto que proporcionan una forma de reloj molecular, que puede usarse para explicar cunto tiempo ha transcurrido desde que un microtbulo determi nado ha polimerizado. Estas modificaciones son la acetilacin de la a-tubulina en un residuo determinado de Usina y la eliminacin de un residuo de tirosina del extremo carboxilo terminal de la a-tubulina. Ambas, acetilacin y destirosinacin, son reacciones enzimticas lentas que tienen lugar slo en los m icrot bulos y no se producen sobre molculas de tubulina libres; adems, su accin revierte rpidamente cuando la molcula de tubulina se despolimeriza. As pues, cuanto ms tiempo haga que un microtbulo particular ha polimerizado, mayor ser el porcentaje de sus subunidades que estn acetiladas y destirosinadas. Las modificaciones tardan diversas horas en producirse, de forma que en los fibro blastos, donde los microtbulos se recambian rpidamente, relativamente po cos de ellos estn modificados. Al contrario, en los axones de las clulas nervio sas, la mayora de los microtbulos son estables por lo que muchos de ellos se hallan modificados.

Microtbulos

869

La acetilacin y la destirosinacin pueden ser detectadas mediante anti cuerpos especficos, y proporcionan un indicio til de la estabilidad de los microtbulos en aquellas clulas en que es difcil estudiar directamente la dinmi ca de los microtbulos. Se desconoce an el papel de estas modificaciones, pero se cree que proporcionan lugares de unin para protenas especficas asociadas a microtbulos que podran estabilizar los microtbulos maduros.

Las protenas asociadas a microtbulos (MAP) se unen a los microtbulos y modifican sus propiedades23
Mientras la modificacin post-traduccional de la tubulina marca ciertos m icro tbulos como maduros y puede aumentar su estabilidad, las modificaciones ms extendidas y verstiles de los microtbulos son las conferidas por la unin de otras protenas. Estas protenas asociadas a los m icrotbulos (MAP, de Microtubule-Associated Proteins), actan tanto estabilizando los microtbulos contra el desensamblaje como mediando su interaccin con otros componentes celulares. Como cabra esperar de la diversidad de funciones de los microtbu los, hay muchos tipos de MAP; algunas de ellas estn ampliamente distribuidas en la mayora de clulas, mientras que otras se encuentran tan slo en algunos tipos celulares especficos. Los dos principales tipos de MAP se pueden aislar a partir de cerebro, asocia das a microtbulos: las protenas HMW (protenas de alto peso molecular, de High Molecular Weight), que tienen pesos moleculares de 200 000 a 300 000 daltons o ms; y las protenas tau, de pesos moleculares entre 55 000 y 62 000 daltons. Am bos tipos de protenas tienen dos dominios, y slo uno de ellos se une a los micro tbulos; se cree que el otro dominio permite a los microtbulos unirse a otros componentes celulares (Figura 16-35). Puesto que este dominio de unin a los microtbulos se une simultneamente a varias molculas de tubulina no polimerizada, estas MAP aceleran in vitro el proceso de nucleacin durante la polimeri zacin de la tubulina. Mucho ms importante es el hecho que estas MAP inhiben la disociacin de la tubulina de los extremos de los microtbulos, por lo cual estas protenas los estabilizan una vez formados. Anticuerpos contra la MAP-2 y contra tau muestran que ambas protenas se unen a lo largo de toda la extensin de los microtbulos citoplasmticos. Se han aislado muchas otras MAP. Algunas actan como componentes es tructurales y proporcionan uniones permanentes con otros componentes celu lares, incluyendo otras partes del citoesqueleto. Otras son motores microtubulares, y utilizan la energa que proporciona la hidrlisis del ATP para desplazarse a lo largo de los microtbulos, tal y como discutiremos ms adelante.

Las MAP colaboran en la generacin de regiones citoplasmticas funcionalmente distintas2 4

Muchos tipos celulares estabilizan especficamente los microtbulos en regio nes especializadas del citoplasma. Un ejemplo especialmente bien estudiado es Figura 16-35 Una protena asociada a los microtbulos.
(A) Electronmicrograa que muestra los brazos laterales distribuidos uniformemente a lo largo de un microtbulo, y formados por una gran proteina asociada a los microtbulos (denominada MAP-2) aislada a partir del cerebro de los vertebrados. Porciones de la protena se proyectan hacia el exterior del microtbulo, como se muestra esquemticamente en (B). (Micrografia electrnica por cortesa de William Voter y Harold Erickson.)

m icrotbulo MAP-2

25 nm At 100 nm

870

Captulo 16 : El citoesqueleto

el de las clulas nerviosas, que disponen de dos tipos de apndices -axones y den dritas. Los axones, uniformes en cuanto a su dimetro y que pueden tener varios centmetros de longitud, son los responsables de la propagacin de las seales elctricas a partir del soma celular, mientras que las dendritas, que se distribuyen radialmente a partir del soma celular y que raramente sobrepasan los 500 pm de longitud, son las responsables de recibir la informacin elctrica de otras neuro nas y retransmitirla al soma celular. La mayora de clulas nerviosas disponen de varias dendritas pero tienen solamente un nico axn (vase Figura 11-20). Ambos, axones y dendritas, estn formados por microtbulos, aunque con disposiciones distintas. En los axones, los microtbulos son muy largos y todos estn orientados con su extremo m s alejado del cuerpo celular. En las dendri tas, los microtbulos son ms cortos y su polaridad es mixta: algunos de los ex tremos m s se alejan del cuerpo celular, mientras que otros dirigen su extremo m s hacia este cuerpo celular. Cuando se estudia la distribucin de las MAP en neuronas cultivadas mediante anticuerpos especficos, se observa cmo ciertas formas de la protena tau se encuentran solamente en los axones; por otro lado, la MAP-2 se encuentra slo en las dendritas y en el soma celular y est totalm en te ausente en los axones (Figura 16-36). Axones y dendritas se diferencian tam bin en otros aspectos: por ejemplo, en las dendritas y en el soma celular, pero no en los axones, se encuentran las molculas de mRNA, los ribosomas y algu nos tipos de canales inicos mientras que ciertos tipos de molculas implicadas en la adhesin celular y los canales de sodio implicados en la generacin de po tenciales de accin estn localizados selectivamente en los axones. De este modo tanto el citoplasma como la mem brana plasmtica de las clulas nervio sas se dividen en compartimientos axonales y dendrticos. Estos compartimien tos en una clula individual se diferencian de los compartimientos delimitados por membrana, tales como el retculo endoplasmtico o las mitocondrias, en que no estn separados los unos de los otros por membranas; de hecho, la dife rencia radica en la organizacin estructural y en los tipos de protenas que se en cuentran presentes. La formacin de los axones y de las dendritas durante la diferenciacin de las clulas nerviosas se discute en el Captulo 21. Aunque todava no conocem os cm o se compartimentan el citoplasma y la membrana plasmtica de una clula nerviosa, las MAP podran ser esenciales en este proceso. Cuando se inhibe la produccin de la protena tau en neuronas cultivadas mediante tratamiento con oligonucletidos antisentido especficos, se suprime la formacin de los axones mientras que no se ve afectada la de las dendritas. Contrariamente, cuando clu las no neuronales son manipuladas genticamente de manera que se expresa en ellas la protena tau (que normalmente se expresa solamente en las clulas ner viosas), forman largos apndices parecidos a los axones, que estn formados por haces de microtbulos dispuestos con sus extremos m s partiendo hacia fuera del cuerpo celular, al igual que en las clulas nerviosas. Debido a que diferentes com ponentes de la clula se desplazan en distintas direcciones a lo largo de los microtbulos, se puede postular que una diferencia inicial en la polaridad de los microtbulos est generada por la distribucin dife rencial de las MAP, que comportar una diferencia posterior entre axones y den dritas. Las vesculas secretoras, por ejemplo, se desplazan hacia el extremo ms de los microtbulos y son transportadas desde el axn hasta los terminales ner viosos donde desarrollan su funcin; contrariamente, si los ribosomas y los mRNA se desplazan hacia el extremo menos de los microtbulos, podran ser ex cluidos de los axones.

Figura 16-36 Un ejemplo de la compartimentacin citoplasmtica de una clula nerviosa. Esta

micrografa muestra la distribucin de la protena tau [verde) y de la MAP-2 (n a ra n ja ) en una neurona de hipocampo, en cultivo. Mientras que tau se encuentra confinada al axn, MAP-2 se encuentra localizada en el soma celular y en las dendritas. El anticuerpo que se ha utilizado para detectar tau se une nicam ente a tau desfosforilada, que se encuentra en el axn; otros datos muestran que tau fosforilada tam bin puede encontrarse en las dendritas. (Por cortesa de James W. Mandell y Gary A. Banker.)

La quinesina y la dinena dirigen el movimiento de los orgnulos a lo largo de los microtbulos2 5

A menudo ocurre que la aparicin de una nueva tcnica experimental ha com portado avances muy importantes en la biologa celular. Con la microscopa p tica vdeo-amplificada se ha mejorado la capacidad de observacin de objetos

Microtbulos

871

extrem o ms

extrem o menos

(A)

quinesina

dineina

dbiles y diminutos, lo cual ha conducido al descubrimiento de los motores de los microtbulos responsables del transporte de los orgnulos. Cuando fue posi ble visualizar los microtbulos simples en un espcimen no fijado, los investiga dores pudieron seguir el movimiento de los orgnulos y otras partculas a lo lar go de los microtbulos in vitro. Alternativamente, pudieron observar y medir el deslizamiento de microtbulos individuales sobre superficies de cristal recu biertas con extractos celulares. Estos estudios in vitro sirvieron para identificar y aislar dos tipos de prote nas motoras dependientes de microtbulos -las quinesinas y las dinenas citoplasmticas. Las dinenas citoplasmticas estn implicadas en el transporte de los orgnulos y en la mitosis y estn muy ntimamente relacionadas con la dinena ciliar, protena motora de los cilios y flagelos (se discute ms adelante). Las quinesinas son m ucho ms diversas que las dinenas; algunos miembros de esta familia estn implicados en el transporte de los orgnulos en la mitosis y en la meiosis y en el transporte de las vesculas sinpticas a lo largo de los axones. Tanto las dinenas citoplasmticas como las quinesinas estn formadas por dos cadenas pesadas y algunas cadenas ligeras. Cada cadena pesada contiene una cabeza globular muy conservada de unin al ATP y una cola formada por domi nios a modo de varillas. Las dos cabezas globulares son motores ATPasa que se unen a los microtbulos, mientras que las colas generalmente se unen a com po nentes celulares especficos, determinando as la carga que cada protena trans porta (Figura 16-37).

Figura 16-37 Protenas m otoras de los microtbulos. Las qu inesin as y las

dinenas citop lasm ticas son protenas m otoras de los m icrotbu los que gen eralm ente se desplazan en d irecciones opu estas a lo largo de un m icrotbu lo (A). Estas p rotenas (aqu dibujadas a escala) son com p lejo s com p u estos por dos cad enas pesadas idnticas y algunas cad en as ligeras m s pequeas. Cada cad en a pesada form a un a cabeza globular que une la proteina a los m icrotbu los de form a d ep en diente de ATP. (B y C) E lectronm icrografas de grabado por con gelaci n de un a m olcu la de qu inesin a (B) y de una m o lcu la de d in ena cito p lasm tica (C). M ientras la quinesin a y la d in ena cito p lasm tica tien en dos cabezas, la d in ena ciliar (D) tien e tres, (vase Figura 16-44). (Las m icrografas e lectr n icas de grabado por con gelaci n fueron preparadas por Jo h n H euser.)

La velocidad y la direccin de desplazamiento a lo largo de los microtbulos son especficos del dominio globular de las protenas motoras2 6
La mayora de protenas motoras conocidas se mueven nicamente en una di reccin a lo largo de los microtbulos -h acia su extremo ms o hacia su extremo menos. Esta direccionalidad se puede analizar in vitro si se permite que bolas de poliestireno recubiertas con protenas motoras se desplacen a lo largo de micro tbulos polimerizados en centrosomas. Los microtbulos as dispuestos tienen su extremo ms dirigido hacia al exterior y es fcil determinar la direccin del movimiento con un microscopio ptico. Mientras que las bolas de poliestireno que han sido recubiertas con extractos crudos de citoplasma se mueven en am bas direcciones, las que han sido recubiertas con quinesina aislada de axones se mueven nicamente hacia el extremo ms de los microtbulos. Al contrario, bo litas recubiertas con dinenas citoplasmticas se mueven hacia los extremos m e nos de los microtbulos, embebidos en el centrosoma. Estudios con axones nerviosos intactos han confirmado los resultados ob tenidos en los experimentos in vitro: la quinesina conduce, principalmente, el movimiento de los orgnulos hacia el exterior del soma celular, mientras que la dinena citoplasmtica conduce el movimiento de los orgnulos desde los extre

872

Captulo 16 : El citoesqueleto

Figu ra 16 -3 8 Transporte vesicular en dos direcciones. La qu inesin a y la d in ena citop lasm tica transp ortan su carga en d ireccion es opuestas a lo largo de los m icrotbu los, tal y com o se m uestra en un fibroblasto (A) y en el axn de una n eu ro n a (B).

m m icrotbulo

mos del terminal nervioso hacia el soma celular (Figura 16-38). La dinena citoplasmtica se sintetiza, igual que el resto de protenas, en el soma celular nervio so, y entonces debe ser transportada en un estado no funcional hacia el terminal nervioso antes de que empiece su funcin transportando orgnulos de regreso al cuerpo celular. Sorprendentemente no todas las quinesinas desplazan los orgnulos hacia el extremo ms de los microtbulos. Por ejemplo en Drosophila, una quinesina llamada Ncd, que es necesaria para la meiosis normal, se diferencia de la quine sina axonal tanto en la direccin como en la velocidad a la que se desplaza a lo largo de los microtbulos: mientras que la quinesina axonal se dirige hacia el ex tremo ms a una velocidad aproximada de 2 pm/segundo, la pro tena Ncd lo hace hacia el extremo menos a 0,1 pm/segundo, aproximadamente. Se desconoce el mecanismo mediante el cual estas protenas convierten la energa de la hidrlisis del ATP en movimiento vectorial. Sern necesarios estu dios estructurales ms detallados para determinar cmo las cabezas globulares tan ntimamente relacionadas de estas protenas pueden desplazarse en direc ciones opuestas a lo largo de los microtbulos y quizs esto aporte algn conoci miento sobre el proceso de transduccin de energa.

Resumen

Los microtbulos son polmeros rgidos de molculas de tubulina. El ensamblaje se produce mediante la adicin al extremo libre de los microtbulos de molculas de tubulina que contienen GTP y que disponen de un extremo (el extremo ms) que crece ms rpidamente que el otro extremo (el menos) . Despus del ensamblaje se produce la hidrlisis del GTP y debilita los enlaces que mantienen unidos a los mi crotbulos. Los microtbulos de crecimiento lento son muy inestables y estn suje tos a un desensamblaje catastrfico; pueden estabilizarse dentro de la clula si se asocian con otras estructuras que recubren sus dos extremos. Los centros organiza dores de microtbulos, tales como los centrosomas, protegen los extremos menos y continuamente nuclean nuevos microtbulos, que crecen en tocias direcciones. Si un microtbulo encuentra una estructura que estabiliza su extremo ms libre, ser selectivamente retenido, mientras que otro microtbulo se despolimerizar. Se cree que este proceso selectivo determina la posicin de los haces de microtbulos dentro de la clula. Las subunidades de tubulina de los microtbulos que han sido selectivamente estabilizadas se modifican mediante acetilacin y destirosinacin. Se cree que estas alteraciones marcan a los microtbulos como maduros y proporcionan lugares de unin para las protenas especficas de unin a los microtbulos (MAP), lo cual tambin estabiliza al microtbulo frente al desensamblaje. Las protenas motoras microtubulares constituyen una clase importante de MAP que utilizan la energa de la hidrlisis del ATP para desplazarse unidireccionalmente a lo largo de los mi crotbulos, llevando una carga especfica. En general, las dinenas desplazan su
Microtbulos 873

carga hacia los extremos menos de los microtbulos, mientras que la mayora de las quinesinas lo hacen hacia los extremos ms. Estas protenas motoras son las responsables de la organizacin espacial y del movimiento dirigido de los orgnulos del citoplasma. Cilios y centrolos27
El batido de los cilios es una de las formas del movimiento celular ms estudia das. Los cilios son evaginaciones delgadas, a modo de pelos, de unos 0,25 pm de dimetro, con un haz de microtbulos en su interior; sobresalen desde la super ficie de muchos tipos celulares y se encuentran en la mayora de especies ani males, muchos protozoos, y algunas plantas inferiores. Su principal funcin es triba en desplazar fluidos sobre la superficie de la clula o en propulsar a una clula aislada a travs de un lquido. Los protozoos, por ejemplo, utilizan los ci lios tanto para capturar partculas alimenticias como para la locomocin. En las clulas epiteliales del tracto respiratorio humano, grandes cantidades de cilios ( 109/cm2 o ms) trasladan hacia la boca capas de mucus que contienen partcu las atrapadas de polvo o clulas muertas. En la boca son engullidas y eliminadas. Los cilios participan en el proceso de trasladar los oocitos a lo largo del oviducto. Una estructura relacionada, el flagelo, propulsa el espermatozoide humano.

Los cilios se mueven por el batido de un axonema -un complejo haz de microtbulos2 7
Los campos de cilios se inclinan siguiendo ondas coordinadas, unidireccionales (Figura 16-39). El movimiento de cada cilio es semejante al de un ltigo: un gol pe activo hacia adelante, durante el cual el cilio est totalm ente extendido y es capaz de ejercer una fuerza mxima sobre el lquido circundante, seguido de una fase de recuperacin, durante la cual el cilio recupera su posicin original gracias a un movimiento de desenrollamiento que minimiza la resistencia visco sa (Figura 16-40A). Los ciclos de los cilios adyacentes son casi sincrnicos, aun que no los son totalmente. Este sincronismo da lugar a unos patrones parecidos a olas, que se pueden observar al microscopio ptico. El nico flagelo de los espermatozoides y de muchos protozoos es muy pa recido a los cilios en cuanto a su ultraestructura interna, pero normalmente los flagelos son mucho ms largos que los cilios. Los flagelos no presentan un movi miento parecido al de un ltigo, sino que generalmente propagan ondas casi si nusoidales (Figura 16-40B). Sin embargo, la base molecular de su movimiento es

Figura 16-39 Cilios.

E lectronm icrografa de barrido de un rea ciliar del intestin o de un gusano m arino. (De J.S. M ellor y J.S. Hyams, Micron 9 :9 1 -9 4 ,1 9 7 8 . 1978, con autorizacin de Pergam on Press Ltd.)

i----------2 pm

874

Captulo 16: El citoesqueleto

Figura 16-40 Contraste entre los movimientos de batido de un cilio y de un flagelo. (A) El batido de un cilio de una clu la epitelial del tracto respiratorio
h u m ano p arece una brazada de un nadador. El golpe de una brazada (estadios 1 y 2), d urante el cual el fluido es em pu jad o sobre la superficie de la clula, va seguido de un lento movimiento de recuperacin (estadios 3 ,4 y 5). T p icam en te, cada ciclo tarda entre 0,1 y 0,2 segundos y genera una fuerza perpendicu lar al e je del axonem a. Para efecto s com parativos en (B) se m u estra el m ovim iento ond ulante del flagelo de un esp erm atozoid e de un tunicad o. La clu la se fotografi sobre una pelcu la en m ovim iento co n una ilu m inacin estrob o scp ica de 400 destellos por segundo. N tese que las ondas de am plitud co n stan te se desplazan desde la base del flagelo hasta su punta. E ntonces, la clula es em pu jad a d irectam en te desde su axonem a, un efecto m uy d iferente del que produce un cilio. (B, por cortesa de C.J. Brokaw.)

la misma que la de los cilios. Los flagelos de las bacterias, sin embargo, (descri tos en el Captulo 15) son completamente diferentes a los cilios y a los flagelos de las clulas eucariotas. El movimiento de un cilio o de un flagelo est producido por la flexin de su eje, llamado axonema. El axonema est formado totalmente por microtbulos y por sus protenas asociadas. Los microtbulos estn modificados y se hallan dis puestos siguiendo un patrn cuyo aspecto curioso y caracterstico fue una de las ms notables revelaciones de los inicios de la microscopa electrnica: nueve dobletes de microtbulos especiales estn dispuestos en crculo alrededor de un par de microtbulos sencillos (Figura 16-41). Esta disposicin de 9 + 2 es ca racterstica de casi todas las formas de cilios y de flagelos eucariotas, desde los protozoos hasta los que existen en los humanos. Los microtbulos se extienden ininterrumpidamente en toda la longitud del axonema, que suele ser de 10 |im, aunque en algunas clulas puede alcanzar los 200 pm. Cada miembro del par de microtbulos sencillos (el par central) es un microtbulo completo pero cada uno de los dobletes exteriores est compuesto por un microtbulo completo y un microtbulo parcial fusionados, de tal forma que ambos comparten una pared comn. En secciones transversales, cada mi-

r ,

(A)

C B >

brazo exterior de dinena espina radial vaina interior par central de m icrotbulos sencillos

membrana plasmtica brazo interior de dinena , A tbulo B tbulo, doblete externo de m icrotbulo

A)

!________________I

100 nm

Figura 16-41 La disposicin de los microtbulos en un cilio o en un flagelo.

(A) E lectronm icrografa que m uestra una secci n transversal del flagelo de un alga verde ( Chlamydomonas) en la que se puede observar la disposicin caracterstica de 9 + 2 de los m icrotbulos. (B) D iagram a de las partes. Las diversas p royecciones de los m icrotbulos los m an tienen unidos y se p rod ucen a intervalos regulares a lo largo del axonem a. (A, por cortesa de Lewis Tilney.)

Cilios y centrolos

875

Figura 16-42 Microtbulo deslizndose en un axonema. Electronmicrografa de un axonema aislado (a partir de un cilio de Tetrahymena) que ha sido brevemente expuesto a la enzima proteoltica tripsina para romper las uniones proteicas que normalmente lo mantienen unido. Tras el tratamiento con ATP, los distintos dobletes de microtbulos se deslizan unos respecto a los otros, tal y como se muestra esquemticamente en la Figura 16-43A. Como hay nueve dobletes de microtbulos en el axonema, la estructura original puede alargarse hasta nueve veces su longitud inicial. (De F.D. Warner y D. R. Mitchell, / . Cell Biol. 89:35-44,1981. Reproducido con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

ero tbulo aparece formado por un anillo de 13 subunidades, mientras que el tu bulo incompleto de los dobletes exteriores est formado slo por 11 subunida des.

La dinena dirige el movimiento de los cilios y de los flagelos 28

Los microtbulos del axonema estn asociados a numerosas protenas, que se encuentran en posiciones regulares a lo largo de los microtbulos. Algunas sir ven como puntos de unin que mantienen juntos los haces de microtbulos. Otras generan fuerzas que dirigen el movimiento de flexin, mientras que otras forman un sistema de transmisin activado m ecnicam ente que controla el m o vimiento, produciendo la forma de onda deseada. La ms importante de estas protenas accesorias es la dinena ciliar, cuyas cabezas interaccionan con los microtbulos adyacentes y generan una fuerza de deslizamiento entre microt bulos. A causa de las mltiples uniones que mantienen unidos los dobletes de microtbulos adyacentes, lo que sera un movimiento deslizante entre microt bulos libres (Figura 16-42) se convierte en un movimiento de flexin en el cilio (Figura 16-43). Como la dinena citoplasmtica, la dinena ciliar tiene un dominio motor que hidroliza ATP para desplazarse a lo largo del microtbulo hacia su extremo menos, y una cola que transporta la carga, la cual en este caso es un microtbulo adyacente. La dinena ciliar es considerablemente ms larga que la dinena cito plasmtica, tanto en la medida de sus cabezas pesadas como en el nmero y complejidad de sus cadenas polipeptdicas. En los flagelos del alga verde unice lular Chlamydomonas, por ejemplo, la dinena est formada por 2 o 3 cadenas pesadas (hay mltiples formas de dinena en los flagelos) y 10 o ms polipptidos ms pequeos (Figura 16-44). Podemos observar cmo la cola de la dinena ciliar se une slo al tbulo A y no al tbulo B, que tiene una estructura ligera mente distinta. Esta asimetra, resultado de la disposicin de las molculas de dinena, es necesaria para prevenir una lucha de estirar la cuerda sin sentido

__.___ J L 2 imi

(A) DESPUES DE LA PROTEOLISIS: DESPLAZAMIENTO TELESCPICO

Figura 16-43 Flexin de un axonem a.

(B) ESTRUCTURA INTACTA: FLEXIN

(A) Si las protenas que mantienen unidos los dobletes son eliminadas mediante proteolisis, el deslizamiento de los dobletes de microtbulos externos, unos respecto a los otros, provoca el alargamiento del axonema. (B) Si los dobletes se encuentran unidos entre s, el axonema se flexiona.

dobletes libres (los puentes cruzados se han elim inado m ediante proteolisis)

los dobletes se deslizan

C dobletes unidos de un cilio m ediante puentes cruzados

el deslizamiento de los dobletes provoca la flexin de la estructura

876

Captulo 16 : El citoesqueleto

< B )
50 nm
entre microtbulos vecinos, lo cual posiblemente explicara por qu cada uno de los nueve microtbulos externos es un doblete A-B.

|___________ i
100 rm

Cilios y flagelos crecen a partir de corpsculos basales que estn muy ntim am ente relacionados con los centrolos 29
Si los dos flagelos del alga verde Chlamydomonas se separan de la clula, vuel ven a formarse rpidamente por elongacin a partir de unas estructuras llama das corpsculos basales. Los corpsculos basales poseen la misma estructura que los centrolos que encontramos inmersos en el centro de los centrosomas animales. De hecho, en algunos organismos, corpsculos basales y centrolos parecen tener funciones intercambiables: durante cada una de las mitosis en Chlamydomonas, por ejemplo, los flagelos son reabsorbidos y los corpsculos basales se mueven hacia el interior de la clula y se convierten en los generado res de los polos del huso mittico. Centrolos y corpsculos basales son estructuras cilindricas de aproximada mente 0,2 pm de ancho y 0,4 pm de longitud. La pared del centrolo est forma da por nueve grupos de tres microtbulos, distribuidos en tripletes. Cada triplete est inclinado hacia el eje central, como las aletas de una turbina (Figura 16-45). Los tripletes adyacentes estn unidos a intervalos a lo largo de su longi tud. En electronmicrografas se pueden observar finos radios proteicos irradiando desde un ncleo central hasta cada triplete y dando lugar a un patrn semejante a una rueda de carro (vase Figura 16-45A).

Figura 16-44 La dinena ciliar. La dinena ciliar es un gran complejo proteico (cerca de 2 millones de daltons) compuesto por entre 9 y 12 cadenas polipeptdicas, la mayor de las cuales tiene unos 512 000 daltons. (A) Se cree que las cadenas pesadas constituyen la mayor parte de la cabeza globular y de los dominios del tallo, y muchas de las cadenas ms pequeas se encuentran agrupadas alrededor de la base del tallo. La base de la molcula se une fuertemente a un microtbulo A, a travs de una reaccin dependiente de ATP, mientras que las cabezas globulares mayores tienen un lugar de unin dependiente de ATP para un microtbulo B (vase Figura 16-41). Cuando las cabezas hidrolizan el ATP que tienen unido, se desplazan hacia el extremo menos de este segundo microtbulo, produciendo as una fuerza de deslizamiento entre los dobletes de microtbulos adyacentes de un cilio o de un flagelo (vase Figura 16-43). Aqu se ilustra la forma de tres cabezas de la dinena ciliar, formada por tres cadenas pesadas. (B) Electronmicrografa de un cilio sometido a criofractura, mostrando los brazos de dinena proyectndose a intervalos regulares a partir de los dobletes de microtbulos. (B, por cortesa de John Heuser.)

i----------- 1

100 nm

Figura 16-45 Corpsculos basales. (A) Electronmicrografa de una seccin transversal a travs de tres centrolos del crtex de un protozoo. (B) Diagrama de un corpsculo basal visto lateralmente. Cada corpsculo basal constituye la porcin inferior de un axonema ciliar, y est formado por nueve tripletes de microtbulos, cada uno de los cuales tiene un microtbulo completo (el tbulo A) fusionado con dos microtbulos incompletos (los tbulos B y C). Otras protenas [marcada en rojo en (B)] forman puentes que mantienen unida la disposicin cilindrica de microtbulos. La estructura del centrolo es esencialmente la misma. (A, por cortesa de D.T. Woodrow y R.W. Linck.)

(B)
877

Cilios y centrolos

Durante la formacin o regeneracin del cilio, cada doblete de microtbulos del axonema crece a partir de dos de los microtbulos del triplete del corpsculo basal, de manera que se preserva la simetra nonagonal de los microtbulos del axonema ciliar. Los estudios autorradiogrficos sugieren que la incorporacin de tubulina y de otras protenas del axonema tiene lugar en la punta distal de la estructura, en el extremo ms de los microtbulos. Se desconoce cmo se forma el par central de microtbulos aislados del axonema, ya que en el centrolo y en los corpsculos basales no existe ningn par central. Se desconoce cmo se determina la longitud de los cilios y de los flagelos. La longitud es constante para unas clulas determinadas, y no est limitada por la disponibilidad de com ponentes o por la cintica del alargamiento. Si separa mos uno de los dos flagelos de Chlamydomonas, por ejemplo, el flagelo restante empieza a reabsorberse mientras que, simultneamente, el flagelo perdido se regenera. Una vez el flagelo que se reabsorbe alcanza la misma longitud que el flagelo que se regenera, los dos crecen juntos hasta conseguir la longitud final caracterstica. Este experimento sugiere que la longitud flagelar est constante mente controlada de la misma forma (Figura 16-46).

(B)

I_______________ 10 |jm

Los centrolos suelen aparecer por duplicacin de los centrolos preexistentes 30

El incremento continuo de la masa celular a lo largo de todo el ciclo celular ani mal presenta dos acontecim ientos discretos de duplicacin: la replicacin del DNA y la duplicacin del centrosoma, que normalmente tiene un par de centro los en su interior. Los dos centrolos del par estn dispuestos perpendicularmen te uno respecto al otro (Figura 16-47). En los fibroblastos en cultivo la duplica cin del centrolo empieza casi al mismo tiempo que empieza la sntesis de DNA: primero se separan los dos miembros de un par y entonces se forma un centrolo hijo perpendicular a cada centrolo original (vase Figura 18-4). Un centrolo inmaduro muestra una disposicin en simetra nonagonal de microt-

Figura 16-46 La longitud del flagelo est controlada mediante un proceso activo. (A) Cuando se separa fsicamente uno de los flagelos (a sp a azul), empieza a crecer mediante polimerizacin a partir del corpsculo basal {rojo). Al mismo tiempo, el flagelo restante empieza a reabsorberse. Cuando ambos miden la mitad de su longitud original, empiezan a crecer juntos. El crecim iento se detiene cuando ambos flagelos han conseguido la longitud final, cuidadosamente especificada. (B) Fotografa en color del alga C hlam ydom on as, donde el color a n a ra n ja d o es el resultado de la autofluorescencia de la clorofila y el verde proviene de la unin de un anticuerpo fluorescente contra una protena de la membrana plasmtica. (B, por cortesa de Robert A. Bloodgood.)

Figura 16-47 Electronm icrografa m ostrando un par de centrolos recin replicados. Un centrolo de cada par ha sido cortado transversalmente y el otro cortado en sentido longitudinal, lo cual indica que los dos miembros de cada par estn colocados formando un ngulo recto. (De M. McGill, D.P. Highfield, T.M. Monahan, and B.R. Brinkley, /. Ultrastruct. Res. 57:43-53, 1976.)

1 |im
878 Captulo 16 : El citoesqueleto

las hileras de cilios baten todas en la m isma direccin

PARAMECIUMNORMAL
, las hileras de cilios invertidas baten en direcciones opuestas

20 pm

PARAMECIUMALTERADO

Figura 16-48 Herencia cortical del patrn en un protozoo ciliado. (A) Electronmicrografa de barrido de un P aram eciu m , que nada mediante el batido sincrnico de sus cilios. (B) Dibujo esquemtico de las hileras de cilios de la superficie de un P aram eciu m normal y de un P aram eciu m en el que se han invertido algunas hileras de cilios, con lo cual baten en direcciones opuestas. Estos patrones alterados se propagan indefinidamente mientras el P aram eciu m se divida, aunque la informacin a nivel de DNA no haya cambiado. (A, por cortesa de Sidney Tamm.)

bulos sencillos; probablemente cada microtbulo acta como plantilla para el ensam blaje de los tripletes de microtbulos tpicos de los centrolos maduros. Los dos centrolos que forman un par no son idnticos: el centrolo hijo no sola mente tiene una orientacin distinta sino que tambin se diferencia en detalles con cretos de su morfologa y de su funcin. En muchos tipos celulares de los vertebra dos, por ejemplo, uno de los dos centrolos se distingue por su capacidad para nuclear el llamado cilio primario -cilio aislado inmvil cuya funcin es desconocida. Estas diferencias padres/hijos tambin se presentan en los corpsculos basales, lo cual puede conducir a las asimetras del citoesqueleto. En los protozoos ciliados, la replicacin de los corpsculos basales est coordinada con la divisin celular y se cree que la estereoespecificidad del proceso de duplicacin puede ser impor tante para mantener la orientacin del cilio en la superficie celular. Esto fue clara mente demostrado en un experimento clsico llevado a cabo durante los aos 1960 en Paramecium, protozoo cuya superficie esta cubierta por hileras de cilios mviles. Normalmente, todas las hileras estn alineadas con la misma polaridad a travs de la replicacin coordinada de los corpsculos basales, los cuales producen corpsculos basales hijos con la misma orientacin relativa respecto a la superficie celular. Los haces de cilios que crecen a partir de los corpsculos basales propor cionan a la clula la capacidad para nadar con una gran eficiencia. Mediante expe rimentos de microinyeccin, es posible alterar este patrn y producir hileras de ci lios invertidos que baten en direcciones opuestas a las de sus vecinos (Figura 16-48). Una vez establecidas, estas alteraciones pasan de padres a hijos en el Para mecium durante ms de 100 generaciones. Este tipo de herencia no tiene nada que ver con el DNA: las clulas modificadas heredan un patrn particular de hileras de cilios gracias a la replicacin estereoespecfica de sus corpsculos basales.

Resumen
El axonema del cilio y del flagelo eucariota contiene un haz cilindrico de nueve do bletes de microtbulos perifricos. Entre los dobletes de microtbulos adyacentes se extienden brazos laterales de dinena que hidrolizan ATP y generan fuerza de desli zamiento entre los dobletes. Diversas protenas accesorias mantienen unido el anillo de dobletes de microtbulos y convierten la fuerza de deslizamiento en un movi miento inclinado que genera el batido de los cilios. La compleja estructura del axo nema ciliar seforma por un autoensamblaje de sus componentes proteicos y est nucleada por un centrolo (corpsculo basal), que sirve de plantilla para el patrn caracterstico de 9 + 2 microtbulos que forman el ncleo del axonema. Los centro los se duplican mediante un proceso altamente controlado en el cual el centrolo hijo se nuclea a partir de un centrolo padre que se encuentra a su lado y crece per pendicularmente a l. La replicacin orientada de los corpsculos basales comporta un patrn heredable de batido de los cilios en la superficie de protozoos ciliados.
Cilios y centrolos 879

Filamentos de actina3 1
Todas las especies eucariotas contienen actina. Esta protena del citoesqueleto es la protena ms abundante en muchas clulas eucariotas, y a menudo consti tuye el 5% o ms de la protena celular total. Las fibras del msculo esqueltico de los vertebrados son la fuente ms comn de actina para los experimentos que se realizan in vitro, puesto que la actina constituye el 20% de su masa. Si se trata polvo seco de msculo con una solucin salina muy diluida, los filamentos de actina se disocian en sus subunidades de actina. Cada molcula de actina es un nico polipptido de 375 aminocidos de longitud y est asociada muy ntima mente con una molcula de ATP. En las clulas los filamentos de actina pueden formar estructuras estables y estructuras lbiles. Los filamentos estables de actina forman el eje de los microvilli y son un com ponente crucial del aparato contrctil de las clulas muscula res. Sin embargo, muchos de los movimientos celulares dependen de estructu ras lbiles formadas por filamentos de actina. Dedicaremos esta seccin a ver cmo la clula controla el ensamblaje de los filamentos dinmicos de actina a partir de subunidades de actina solubles en el citosol.

Los filam entos de actina son delgados y flexibles 32

En las electronmicrografas los filamentos de actina aparecen como hebras de 8 nm de dimetro. Estn formados por una apretada hlice de monmeros de ac tina orientados uniformemente (tambin conocida como actina globular, o acti na G) (Figura 16-49). Al igual que los microtbulos, un filamento de actina es una estructura polar, con dos extremos estructuralmente distintos -u n extremo m enos, relativamente inerte y de crecimiento lento y un extremo m s, de crecim iento rpido. A causa de la apariencia de flecha del complejo formado en tre los filamentos de actina y la protena motora miosina, que describiremos ms adelante, el extremo m enos se conoce tambin como el extremo en punta y el extremo ms como extremo ancho o barbado. La estructura tridimensional de la molcula de actina ha sido analizada mediante anlisis de difraccin de rayos X, y esta informacin ha sido utilizada para deducir la estructura de un filamen to de actina a nivel de sus aminocidos individuales (Figura 16-50). Algunos eucariotas inferiores, como las levaduras, tienen un nico gen para la actina, que codifica una nica protena. Sin embargo, todos los eucariotas su periores tienen algunas isoformas codificadas por una familia de genes de acti na. Al menos hay seis tipos distintos de actina en los tejidos de los mamferos; se agrupan en tres clases, dependiendo de su punto isoelctrico. Las alfa actinas se encuentran en diversos tipos de msculo, mientras que las beta y las gamma son los constituyentes principales de las clulas no musculares. Aunque las distintas formas de actina presentan sutiles diferencias en sus propiedades, las secuen cias de aminocidos han sido altamente conservadas durante la evolucin, y to das se ensamblan en filamentos que son esencialmente idnticos en la mayora de estudios llevados a cabo in vitro. La longitud total de todos los filamentos de actina de una clula es al menos 30 veces mayor que la longitud total de los microtbulos, lo cual refleja una dife rencia fundamental en la manera como estos polmeros del citoesqueleto estn organizados y funcionan en la clula. Los filamentos de actina son ms delgados y ms flexibles, y normalmente ms cortos, que los microtbulos. Veremos que rara mente los filamentos de actina se encuentran aislados en la clula, sino que gene ralmente forman agregados y haces, con puentes entrecruzados, que son mucho ms fuertes que los filamentos individuales.

(A)

i----------- 1

50 nm

(B)

Figura 16-49 Filamentos de actina. (A) Electronmicrografa de filamentos de actina contrastados negativamente. (B) Disposicin helicoidal de las molculas de actina en un filamento. (A, por cortesa de Roger Craig.)

La actina y la tubulina polimerizan por mecanismos parecidos 33

La polimerizacin de la actina pura in vitro necesita ATP y tambin cationes m o novalentes y divalentes, que normalmente son el K+y el Mg2+ . La reaccin puede

880

Captulo 16: El citoesqueleto

extrem o menos extrem o menos

extrem o ms ^ extrem o ms

estudiarse mediante la observacin del cambio de luz emitida desde una sonda fluorescente que ha sido covalentemente unida a la actina o mediante el segui miento del gran incremento de viscosidad provocado por la polimerizacin. Cuando se aade K+y Mg2 + a la actina monomrica en presencia de ATP, se pro duce una fase lenta (lag), mientras se nuclean los nuevos filamentos, y luego una fase de polimerizacin rpida, mientras los cortos filamentos se alargan. La fase lag que encontramos en la polimerizacin de la actina pura es debida a la misma barrera cintica para la nucleacin que discutimos para la polimerizacin de la tubulina (vase Figura 16-23). Para la actina, la velocidad de nucleacin es pro porcional al cubo de la concentracin de actina, lo cual sugiere que la estructura de nucleacin para la polimerizacin espontnea de la actina pura es un trmero de molculas de actina. Al contrario, la velocidad con la cual un filamento se alarga es proporcional, igual que para los microtbulos, a la concentracin de la subunidad libre indicando que el filamento se alarga mediante adicin de m ol culas de actina, de una en una. La velocidad de polimerizacin es distinta en los dos extremos del filamento de actina, y esta diferencia es mucho mayor que en los microtbulos: el extremo m s o barbado, la actina polimeriza unas 10 veces ms rpidamente que el extremo m enos o puntiagudo. La concentracin crtica para la polimeriza cin de la actina -esto es, la concentracin del monmero de actina libre en la cual la proporcin de actina polimerizada detiene su increm ento- est alrededor de 0,2 micromolar (alrededor de 8 jig/ml). Esta concentracin es mucho ms baja que la concentracin de actina no polimerizada de la clula, por lo que la clula ha desarrollado mecanismos especiales para impedir que la mayora de esta actina monomrica se ensamble formando filamentos, tal y como discutire mos ms adelante. Rpidamente despus de la polimerizacin, el fosfato terminal del ATP uni do a la molcula de actina es hidrolizado, quedando un ADP atrapado en el pol mero. La hidrlisis del ATP durante la polimerizacin de la actina es anloga a la hidrlisis del GTP que acompaa el ensamblaje de los microtbulos, pero en el caso de la actina podemos comprender los cambios conformacionales implica dos puesto que conocem os la estructura tridimensional de la protena. La m ol cula de actina tiene forma de almeja y el ATP se halla situado en la charnela si tuada entre las dos mitades; como la concha de una almeja, puede abrirse y cerrarse. Cuando la actina polimeriza, la concha est totalmente cerrada por in-

Figura 16-50 Estructura de la actina. (A) Estructura tridimensional de la molcula de actina, deducida mediante anlisis de difraccin de rayos X. Una molcula aislada de ATP {am arillo) est estrecham ente unida en una fisura entre los dos dominios de la protena. (B) Dibujo esquemtico de una molcula de actina que pone de manifiesto sus dos dominios y el lugar de unin al ATP que se encuentra entre ellos. (C) Dibujo esquemtico del filamento de actina que muestra cmo las molculas de actina interactan unas con otras formando el polmero helicoidal. Advirtase que de la misma manera que las molculas de actina se ensamblan en el polmero, hidrolizan sus molculas de ATP estrecham ente unidas (vase Figura 16-51). (D) Estructura de la molcula de actina basada en la imagen de un filamento obtenida mediante microscopa electrnica. Cada bola del modelo representa a un aminocido; los que interactan con la miosina (se discute ms adelante) se han marcado en verde. La diferencia entre los extremos ms y menos es aparente. (A, adaptado de W. Kabsch et al., N a tu re 347:37-44, 1990. 1990 Macmillan Magazines Ltd.; B, de K.C. Holmes et al., N ature 347;44-49, 1990. Macmillan Magazines Ltd.)

Filamentos de actina

881

VELOCIDADES DE CRECIMIENTO Y DE ACORTAMIENTO

Un polmero lineal de molculas de protena, como por ejemplo un filamento de actina o un microtbulo, se ensambla (polimeriza) y se desensambla (despolimeriza) mediante la adicin y la prdida de subunidades de los extremos del filamento. La velocidad de adicin de monmeros viene dada por la constante kon, cuyas unidades son de M-1 seg-1. La velocidad de prdida viene dada por la constante kof (unidades de seg1).
subunidad
+

NUCLEACION y n polmero helicoidal est estabilizado mediante mltiples contactos entre subunidades adyacentes. Para la actina, dos molculas de actina se unen mediante enlaces relativamente dbiles, pero la unin de un tercer monmero de actina formando un trmero proporciona una mayor estabilidad al conjunto.

L
monomero

dm ero

polm ero (con n subunidades)

kon

| ^off

polm ero (con n + 1 subunidades)

La adicin posterior puede tener lugar sobre este trmero, que entonces acta como lugar de nucleacin para la polimerizacin. El lugar de nucleacin de la tubulina es mucho ms grande y tiene una estructura ms compleja (posiblemente un anillo de 13 o ms molculas), pero el principio es el mismo. El ensamblaje del lugar de nucleacin es relativamente lento, lo cual explica la fase inicial lenta (fase lag) producida durante la polimerizacin. La fase lenta puede ser reducida o eliminada del todo si se aaden lugares de nucleacin prefabricados, tales como fragmentos de microtbulos o filamentos de actina previamente polimerizados.

LA CONCENTRACION CRTICA

POLIMERACION EN FUNCION DEL TIEMPO

El nmero de subunidades que se adicionan por segundo al polmero (filamento de actina o microtbulo) ser proporcional a la concentracin de las subunidades libres (/ron[C]), pero las subunidades abandonarn el extremo del polmero a una velocidad constante (kof) que no depende de [C], A medida que el polmero va creciendo, las subunidades se van incorporando de forma que [C] cae hasta alcanzar un valor constante, llamado concentracin crtica (Cc). A esta concentracin la velocidad de adicin de subunidades se iguala a la velocidad a la que el polmero pierde subunidades. En este punto de equilibrio, kon IC] = froff de forma que p uoff ,, _ _i

El ensamblaje de una protena en un largo polmero helicoidal, (p. ej., un filamento del citoesqueleto o un flagelo bacteriano) muestran esta curva dependiente del tiempo:

F A SE DE CRECIM IEN TO

C" knn

(donde K es la constante de equilibrio para la adicin de subunidades, vase Figura 3-9).

La fase inicial lenta (fase lag) es debida a la barrera cintica para la nucleacin. La fase de crecimiento se produce mientras los monmeros se aaden a los extremos expuestos del polmero en crecimiento. La fase de equilibrio se consigue cuando el crecimiento del polmero debido a la adicin de monmeros est precisamente en equilibrio con el acortamiento del polmero debido a la prdida de monmeros.

tie m p o -----

EXTREMO MAS Y EXTREMO MENOS

Los dos extremos de un filamento de actina o de un microtbulo polimerizan a velocidades distintas. El extremo de crecimiento rpido se llama extremo ms, y el de crecimiento lento se llama extremo menos. La diferencia de velocidad de crecimiento de ambos extremos se debe a cambios conformacionales de cada subunidad cuando se incorpora al polmero.
s u b u n d a d \~ libre / | | *" / \ / subunidad en el polm ero

extremo \ menos /
/ ^ / ^

/
/

/
/

/
/

\
I LENTO

\ /

\ extremo ms

RPIDO

/ / / / / ' -------------------- ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ '

) _______ ) > > > >

Este cambio conformacional afecta a la velocidad a la cual las subunidades se aaden a los dos extremos. Aunque kor y fc0ff tendrn valores distintos para el extremo menos del polmero, la relacin koff/kon y, por tanto, Cc debe ser igual en ambos extremos. Ello es debido a que cuando se pierde una subunidad en uno de los extremos se rompen exactamente el mismo nmero de interacciones entre subunidades, y el estado final de la
882 Panel 16-1 Polimerizacin de la actina y la tubulina.

subunidad despus de la disociacin es idntico. As pues, la AG de la subunidad perdida, que determina la constante de equilibrio para su asociacin al extremo (vase Tabla 3-3, pgina 101), es idntica en ambos extremos; si el extremo ms crece cuatro veces ms rpidamente que el extremo menos, tambin debe disociarse cuatro veces ms rpidamente. Por tanto, para [C] > Cc ambos extremos crecen; para [C] < Cc, ambos extremos decrecen.

INTERCAMBIO ROTATORIO (TREADMILLING)

Una consecuencia de la hidrlisis del nucletido que acompaa la form acin de un polm ero es el cam bio de la concentracin crtica en los dos extrem os del polm ero. Debido a que fcoff y k J o n se refieren a reacciones diferentes, la relacin ^ 0 n / k T 0 n no tiene por qu ser necesariamente la misma en los dos extrem os del polm ero, de form a que: Cc (extrem o menos) > Cc (extrem o ms) A sum iendo que am bos extrem os del polm ero se hallan asequibles, la polim erizacin proceder hasta que la concentracin del m onm ero libre supere el valor de Cc para el extrem o ms, pero est por debajo de Cc para el extrem o menos. En este estado estacionario, las subunidades se ensam blarn al extrem o ms y se desensamblarn del extrem o menos a velocidades idnticas. El polm ero m antendr una longitud constante, aunque exista un flu jo neto de subunidades a travs del polm ero que se conoce como intercam bio rotatorio (treadm illing).

HIDROLISIS DE NUCLEOTIDOS
Cada molcula de actina transporta una molcula de ATP fuertemente unida, la cual, en cuanto se produce el cambio de conformacin que acompaa al ensamblaje de subunidades formando el polmero, es hidrolizada hasta una molcula de ADP. De manera similar, cada molcula de tubulina transporta una molcula de GTP fuertemente unida, que se convierte en una molcula de GDP cuando la molcula se ensambla en el polmero.

) T/
monmero libre

7)

(T = ATP o GTP) (D = ADP o GDP)

subunidad en el polmero

La INESTABILIDAD DINMICA y el INTERCAMBIO ROTATORIO son dos com portam ientos observados en los polm eros del citoesqueleto. Am bos procesos estn asociados a la hidrlisis de nucletidos trifosfato. Se cree que la inestabilidad dinm ica predom ina en los m icrotbulos m ientras que el intercam bio rotatorio podra predom inar en los filam entos de actina

La hidrlisis del nucletido unido reduce la afinidad de unin de cada subunidad respecto a la subunidad vecina, hacindola ms fcilm ente disociable de cada uno de los extrem os del fila m en to (vase Figura 16-33 para el posible mecanismo). Es habitual que la form a y?"] se aada al fila m en to y que la form a ) D ) se disgregue del filam ento. Considerem os slo los acontecim ientos del extrem o ms: ) )
d d

CASQUETES DE ATP Y DE GTP

La velocidad de adicin de subunidades a un fila m en to de actina o a un m icro t bu lo en crecim iento puede ser ms rpida que la velocidad a la cual se hidroliza el nucletido que llevan unido. En estas condiciones, las subunidades de los extrem os del fila m en to form an un casquete de subunidades que tienen unido el nuclesido trifosfato un casquete de ATP en el fila m en to de actina y un casquete de GTP en el m icrotbulo.

)
d

)
d

)
d

)
d

)
d

Como antes, el polm ero crecer hasta que [C] = Cc. Por m otivos didcticos, podemos considerar que k on y k J o f son insignificantes, de form a que podem os decir que el crecim iento del polm ero cesa cuando

k on Es un estado estacionario y no un e q uilib rio ya que el ATP o el GTP hidrolizados pueden ser reemplazados por una reaccin intercam biadora de nucletidos sobre la subunidad libre ^ |~p~~) ^

a on ^ r ip off ^ *

n O

r -

tPoff

< d <d <d <t <t < <D<D<D<T<T<

INESTABILIDAD DINAMICA
Los m icrotbulos se despolim erizan unas 100 veces ms rpidam ente del extrem o que contiene tub ulina GDP que del que contiene tubulina GTP. Un casquete de GTP favorece el crecim iento, pero si se pierde, entonces se produce la despolim erizacin. casquete de GTP

casquete de ATP/GTP

-------- 1 i

cc>

CRECIMIENTO

ACORTAMIENTO

Los m icrotbulos individuales pueden alternar perodos de crecim iento lento y de desensamblaje rpido, fenm eno llam ado inestabilidad dinmica.

883

Figura 16-51 La tram pa de ADP en un filamento de actina. Una molcula de actina tiene una estructura que est relacionada con la de la ubicua enzima hexoquinasa (vase Figura 5-2), con dos dominios que forman una bisagra alrededor del lugar de unin al ATP. El ATP es hidrolizado a ADP inmediatamente despus de que la molcula se ha incorporado a un filamento de actina. Para que el ADP sea reemplazado por un ATP, la bisagra debera abrirse, pero en el filamento de actina los dos dominios de cada molcula de actina estn unidos entre s por interacciones con las subunidades vecinas, de manera que la bisagra se mantiene cerrada y acta de trampa para el ADP, hasta que el filamento se despolimeriza.

teracciones entre aminocidos de las dos valvas de la almeja y la zona posterior de la siguiente subunidad en el polmero. Se cree que la hidrlisis del ATP se des encadena por el cierre de la concha mientras cada molcula de actina se incor pora al filamento, y deja el ADP atrapado dentro (Figura 16-51).

El com portam iento dinmico de los filam entos de actina requiere la hidrlisis del ATP34
En la polimerizacin de la actina, la hidrlisis del ATP juega un papel parecido al de la hidrlisis del GTP en la polimerizacin de la tubulina, como explicamos en el Panel 16-1 (pgs. 882-883). Para formar el filamento no es necesaria la hidrli sis del ATP: de hecho, debilita los enlaces del polmero y de esta forma facilita la despolimerizacin. Sin embargo, existen diferencias importantes en los com por tamientos del nucletido que est unido a las subunidades de estos dos polme ros. Una diferencia especialmente interesante es que el recambio ATP-ADP (la substitucin del ADP unido por ATP) es relativamente lenta para la actina libre (del orden de minutos), mientras que el recambio GTP-GDP es muy rpido para la tubulina libre (del orden de segundos); as pues, cuando las molculas de acti na son liberadas por el desensamblaje de un filamento, tardan mucho tiempo en poder a volver a ser reutilizadas en el ensamblaje de un filamento. En principio, esta propiedad de la actina permite a la clula mantener una elevada concentra cin citoslica de molculas de actina no polimerizadas en forma ADP-actina; adems, el monmero ADP-actina puede ser estabilizado en la clula mediante su unin a otra protena, lo cual podra proporcionar una manera para regular la polimerizacin de la actina. El efecto que la hidrlisis del ATP tiene sobre la actina es sutil, y quedan mu chas preguntas sin responder sobre las consecuencias precisas de tiene este pro ceso para la clula. Los filamentos de actina, a diferencia de los microtbulos, no parecen mostrar una inestabilidad dinmica drstica in vitro. De hecho, pueden intervenir en un comportamiento dinmico interesante denominado intercambio rotatorio (treadmilling), que se produce cuando se aaden continuamente m ol culas de actina al extremo ms del filamento y se pierden continuamente por el extremo menos, sin que haya un cambio neto de longitud en el filamento (vase Panel 16-1, pgs. .882-883). El intercambio rotatorio, al igual que la inestabilidad dinmica, es un comportamiento de no equilibrio que requiere un aporte de energa, el cual proviene de la hidrlisis de ATP que acompaa a la polimeriza cin. Se cree que este fenmeno contribuye al recambio rpido de subunidades de filamentos de actina que se produce en la clula. Es remarcable que tanto la actina como la tubulina estn implicadas en la hidrlisis de nuclesidos trifosfato por la misma razn bsica -para poder, una vez polimerizadas, despolimerizarse fcilmente. Actina y tubulina no estn ab solutamente relacionadas en cuanto a su secuencia de aminocidos: la actina est relacionada relativamente, en cuanto a estructura, a la enzima glucoltica hexoquinasa, mientras que la tubulina esta distantemente relacionada con una gran familia de GTPasas que incluye la protena G heterotrimrica y GTPasas monomricas como la protena Ras. (Ambos tipos de estructura se discuten con detalle en el Captulo 5.) La evolucin convergente de la capacidad de hidrlisis

884

Captulo 16: El citoesqueleto

H j C CH

H ,C

CH, CHOH

borde frontal de avance de la clula

de un nucletido en la actina y en la tubulina demuestra lo importante que re sulta la funcin de los microtbulos y de los filamentos de actina: el ensamblaje y desensamblaje dinmicos de estos polmeros del citoesqueleto en los que la hidrlisis hace posible que se encuentren en el corazn de la organizacin citoplasmtica.

c ito c a la s in a B

Las funciones de los filam entos de actina son inhibidas por drogas estabilizadoras y desestabilizadoras del polmero 35
Las drogas que estabilizan o desestabilizan los filamentos de actina constituyen herramientas importantes para investigar el comportamiento dinmico de estos filamentos en las clulas. Las citocalasinas son productos sintetizados por hon gos, que impiden la polimerizacin de la actina ya que se unen al extremo ms de los filamentos de actina. Las faloidinas son toxinas aisladas del hongo Amanita, que se unen muy fuertemente a los lados de los filamentos de actina y los es tabilizan, impidiendo su despolimerizacin. (Un remedio contra el veneno del hongo Amanita es comer una gran cantidad de carne cruda: la elevada cantidad de filamentos de actina del tejido muscular se une a la faloidina y reduce su toxi cidad.) Ambas drogas provocan cambios dramticos en el citoesqueleto de acti na. Anteriormente vimos, al referirnos a los microtbulos, que tanto las drogas desestabilizadoras del polmero, por ejemplo la colchicina, como las drogas que los estabilizan, por ejemplo el taxol, son txicas para las clulas. Lo mismo suce de con las drogas que afectan la estabilidad de los filamentos de actina, lo cual indica que la funcin de los filamentos de actina tambin depende de un equili brio dinmico entre el filamento y el monmero de actina. La citocalasina es de gran utilidad para el estudio del movimiento celular. En particular, el borde frontal de avance de una clula en movimiento contiene filamentos de actina que continuamente polimerizan y son muy sensibles a la ci tocalasina. En la mayora de clulas en movimiento la citocalasina provoca la re traccin de este borde frontal de avance. Sin embargo, si la membrana plasmtica de este borde est fuertemente unida al substrato, la citocalasina provoca la re traccin de los filamentos de actina pero deja la membrana pegada al substrato (Figura 16-52). La faloidina tambin se utiliza ampliamente, como derivado fluorescente, para marcar los filamentos de actina de clulas fijadas, y tiene tambin un efecto profundo en las clulas vivas. Si se microinyecta faloidina a un fibroblasto vivo, por ejemplo, los m onmeros de actina polimerizan formando filamentos situa dos al azar en el citoplasma, lo cual provoca una contraccin brusca que destru ye la clula.

Figura 16-52 El efecto de la citocalasina sobre el borde frontal del cono en crecim iento de una clula nerviosa en cultivo. Observacin de un cono vivo en crecim iento mediante microscopia de contraste interferencial de Nomarsky antes (A) y despus (B) del tratamiento con citocalasina. La clula en (B) ha sido marcada despus con faloidina ligada a rodamina para revelar los filamentos de actina (C). Puede observarse cmo la regin detrs del borde frontal de avance del cono en crecim iento tratado con citocalasina est desprovista de filamentos de actina. La estructura qumica de la citocalasina B se muestra en (D). (A, B, y C, por cortesa de Paul Forscher.)

La molcula de actina se une a pequeas protenas que ayudan a controlar su polim erizacin 36
En un fibroblasto, aproximadamente el 50% de la actina se encuentra en forma de filamentos, mientras que el 50% restante est monomerizada. En una gran

Filamentos de actina

885

la protena se une y mantiene la actina en la form a de unin al ADP

ES 3

n
lugar de unin al filam ento de actina PUEDE POLIMERiZAR protena cubriendo el lugar de unin a la actina NO PUEDE POLIMERiZAR

Figura 16-53 Dos m ecanism os posibles mediante los cuales im a proteina de unin al m onm ero de actina puede inhibir la polimerizacin de la actina. Se cree que la timosina inhibe la polimerizacin de la actina mediante uno de estos dos mecanismos.

variedad de tipos celulares la concentracin del monmero es tpicamente de 50-200 micromolar (2-8 mg/ml). Esta concentracin es sorprendentemente ele vada dada la baja concentracin crtica de actina pura (menos de 1 micromo lar), y refleja la presencia de protenas especiales que se unen a la molcula de actina e inhiben su unin en los extremos de los filamentos de actina. La ms abundante de estas protenas de unin al monmero de actina en muchos tipos celulares es la timosina, una pequea protena poco comn, de un peso mole cular de aproximadamente 5000 daltons. En las clulas en que ha sido cuidado sam ente estudiada (las plaquetas sanguneas y los neutrfilos), se encuentra a una concentracin que es suficiente para secuestrar toda la actina monomrica. Se desconoce cm o esta protena inhibe la polimerizacin de la actina: podra bloquear estricam ente la polimerizacin cubriendo el lugar donde un m on mero se une al otro, o podra secuestrar el ADP unido a la actina impidiendo el recambio ADP-ATP, con lo cual la molcula de actina no podra polimerizar (Fi gura 16-53). Otra protena de unin al monmero de actina es la proflina, que se en cuentra en todas las clulas y se cree que controla la polimerizacin de la actina com o respuesta a estmulos extracelulares. La proflina, que en muchas clulas est asociada a la mem brana plasmtica, acelera el recambio de ATP por ADP cuando se une a la actina monomrica y se cree que facilita la polimerizacin re gulada de actina durante el movimiento celular, aunque esto es tema de contro versia. Un mutante de levadura deficiente en proflina tiene un dficit de fila mentos de actina, lo cual apoya el papel de esta molcula en la estimulacin de la polimerizacin de la actina.

Figura 16-54 Filamentos de actina en el borde frontal de avance de un fibroblasto en cultivo. (A) Electronmicrografa del extremo delantero de avance de una clula en cultivo, tratada con un detergente no inico para eliminar la membrana plasmtica y la mayora de las protenas solubles. Ntese la trama orientada de los filamentos de actina que se presenta en el lamelipodio, en el que se halla incrustada la microespina. En (B) se presenta una visin esquemtica de los filamentos de actina de un lamelipodio. (A, de J.V. Small, J. C ellB iol. 91:695-705, 1981. Reproducido con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

extrem o menos de los filam entos de actina

lugares de nucleacin de actina unidos a m em brana (extrem os ms de los filam entos de actina)

lam elipodio contacto estrecho con el substrato

0,2 fim

- substrato protenas que entrecruzan la actina

886

Captulo 16 : El citoesqueleto

Adems de la timosina y de la profilina, las clulas disponen de otras mu chas protenas capaces de unirse a los monmeros de actina, y algunas de estas protenas, como el factor despolimerizador de la actina (ADF, de Actin-Depolymerizing Factor), inhibe el ensam blaje de los filamentos de actina. Evidente mente las clulas disponen de una gran variedad de mecanismos, cuyos detalles no comprendemos todava, mediante los cuales la clula controla el ensam blaje de los filamentos de actina slo, cundo y dnde es necesario.

Muchas clulas emiten, desde su borde frontal de avance, microespinas y lamelipodios dinmicos que contienen actina 37
Las expansiones superficiales dinmicas que contienen filamentos de actina son una caracterstica comn de las clulas animales, especialmente cuando las c lulas estn migrando o cambiando de forma. Las voluminosas clulas vivas de Amoeba proteus, por ejemplo, producen pseudpodos -extensiones cortas y gruesas del crtex de actin a- con los cuales se mueven sobre las superficies. En los tejidos de los vertebrados, muchas clulas tambin son capaces de despla zarse sobre una superficie, especialmente cuando se cultivan. El borde frontal de avance de un fibroblasto que se arrastra extiende regularmente delgadas protu berancias laminares conocidas como lamelipodios, que poseen una densa red de filamentos de actina. Muchas clulas emiten tambin protrusiones delgadas y rgidas llamadas microespinas, de aproximadamente 0,1 pm de dimetro y entre 5 y 10 pm de largo y que contienen un haz laxo de aproximadamente 20 filamen tos de actina orientado con su extremos ms hacia el exterior (vase Figura 169). El extremo en crecimiento (ncleo de crecimiento) de un axn nervioso ex tiende microespinas incluso ms largas, llamadas filopodios, que pueden tener hasta 50 pm de largo. Un lamelipodio puede ser considerado como una versin bidimensional de una microespina; de hecho, a menudo este borde de la clula est delimitado por cortas microespinas. Cuando una clula en movimiento es fijada y contras tada cuidadosamente para ser examinada al microscopio electrnico, se observa cmo los filamentos de actina de los lamelipodios parecer estar ms organiza dos que en otras regiones de la corteza celular. Muchos de los filamentos se pro yectan hacia el exterior siguiendo una disposicin ordenada, con sus extremos m s insertados en el borde frontal de avance de la membrana plasmtica (Fi gura 16-54). Los lamelipodios se comportan com o una unidad estructural; si se pierde su adhesin al substrato, normalmente se retraen rpidamente hacia atrs y se enrollan de nuevo sobre la clula como un rizo (Figura 16-55).

Figura 16-55 Lamelipodios y microespinas del borde frontal de avance de un fibroblasto humano en cultivo que est migrando. La flecha indica la direccin del desplazamiento de la clula. A medida que la clula va avanzando, los lamelipodios y las microespinas pierden su unin a la placa de cultivo y se enrollan sobre la superficie dorsal -un movimiento conocido como rizado (rufling). (Por cortesa de Julin Heath.)

T>

Y . .

5 )im

Filamentos de actina

887

Tanto los lamelipodios como las microespinas son estructuras mviles que pueden formarse y retraerse a una gran velocidad. Tal como discutiremos ms adelante, se cree que estas microespinas y lamelipodios son generados por la po limerizacin de la actina local en la membrana plasmtica y que esta actina pue de rpidamente empujar la membrana plasmtica hacia adelante sin rasgarla.

Figura 16-56 Dinmica de un

filamento de actina en el lamelipodio de un fibroblasto en cultivo. Las

molculas de actina marcadas con el colorante fluorescente rodamina fueron microinyectadas en una clula, donde fueron incorporadas a los filamentos de actina. Utilizando un rayo lser se produce una pequea mancha (por eliminacin del mareaje fluorescente) sobre los filamentos de actina en el extremo anterior de la clula. Entonces la clula se fotografa a intervalos de tiempo utilizando un microscopio fluorescente equipado con un intensificador de imgenes. El rpido movimiento hacia atrs de la mancha sugiere que las molculas de actina polimerizan continuamente en el extremo del borde frontal de avance y se despolimerizan en su base. (Por cortesa de Y.L. Wang.) Figura 16-57 El extremo del borde

El borde frontal de avance de las clulas mviles nuclea la polim erizacin de la actina 38
Cuando se estudia el comportamiento de los filamentos de actina en el borde frontal de avance, marcando una pequea parte de la actina y siguiendo su m o vimiento, puede verse cmo la actina se mueve continuam ente de regreso hacia el cuerpo celular a una velocidad de aproximadamente 1 pm/minuto, lo que su giere que esta actina est continuam ente polimerizando cerca del borde frontal de avance y continuam ente despolimerizndose en lugares ms internos (Figura 16-56). Se cree que este comportamiento altamente dinmico de los filamentos de actina en el borde frontal de avance es crucial para procesos tales como la lo com ocin celular y la quimiotaxis. La impresin general es que el borde frontal de avance se impulsa a s mismo hacia delante empujando los filamentos de ac tina hacia atrs. Parece que el borde frontal de avance de una clula organiza los filamentos de actina al igual que un centrosoma organiza los microtbulos, pero con una diferencia crucial: no nuclea nicamente el crecimiento de nuevos filamentos sino que tam bin parece ser el lugar en que los monmeros se van aadiendo, permitiendo el alargamiento de los filamentos. Esta funcin puede demostrarse si lisamos ligeramente un fibroblasto y entonces aadimos monmeros de acti na unidos a rodamina, los cuales se ha visto que polimerizan preferentemente en el lmite del borde frontal de avance (Figura 16-57). Ademas, si se marcan los

frontal de avance nuclea filamentos de actina. Fibroblastos en cultivo se

permeabilizaron ligeramente con un detergente no inico y entonces se incubaron con molculas de actina marcadas con rodamina {rojo). Al cabo de 5 minutos se fijaron las clulas y se marcaron con faloidina marcada con fluorescena (verde). (A) Todos los filamentos de actina, la mayora de ellos formados antes de la lisis, se marcan en verde. (B) La localizacin de los filamentos de actina nuevamente formados (rojo) polimerizados a partir de la actina marcada con rodamina aadida permite observar que el borde frontal de avance es el lugar predomnate de nucleacin de filamentos de actina en la clula. (De M.H. Sym onsyT .J. Mitchison,/. Cell Biol. 114:503-513,1991, reproducido con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

(A)

(B)

5 (jm

888

Captulo 16: El citoesqueleto

polim erizacin de la actina en el borde frontal de avance

. rotatorio * * m odelo del intercam bio los filam entos de actina se nuclean en el borde frontal de avance

araos filam entos de actina despolim erizan a en ^ ^ . . .se la parte trasera del lam elipodio

filam entos cortos de actina liberados

Figura 16-58 Dos modelos que podran explicar el flujo retrgrado de actina en un lamelipodio. Las fle c h a s azu les indican la direccin del movimiento de la clula. Aunque aqu se muestran las diferencias entre los dos modelos, ambos procesos pueden darse sim ultneamente en la clula. (Adaptado de J.A. Theriot y T.J. Mitchison, N atu re 352:126-131, 1991. Reproducido con el permiso de N ature. 1991 Macmillan Magazines Ltd.)

m odelo de liberacin de la nucleacin

e|

la red de filam entos de actina liberados en frontal de avance se desplaza hacia la parte posterior del lam elipodio

filamentos de actina para poder observar su polaridad, se encuentra que en cada filamento de actina, el extremo ms de rpido crecimiento se encuentra unido a la mem brana en el borde frontal de avance. Hay an muchas cuestiones sin respuesta acerca del m ecanismo mediante el cual el borde frontal de avance nuclea la polimerizacin de los filamentos de actina. El borde frontal de avance se une al extremo ms del filamento que nu clea, o nuclea un nuevo filamento y rpidamente se libera de l? A causa del m o vimiento retrgrado de la actina (vase Figura 16-56), algn modelo postula que, para que el borde frontal de avance se agarre a los extremos de los filamento de actina se necesitara que los filamentos del lamelipodio estuvieran en continuo intercambio rotatorio mediante la insercin de monmeros de actina en los lu gares donde los filamentos estn unidos a la membrana. En un modelo alternati vo, los filamentos de actina individuales seran liberados en cuanto se formaran y se desplazaran alejndose de la membrana (seguramente como una red de puentes cruzados) (Figura 16-58). El rpido ensamblaje de los filamentos de actina en el borde frontal de avan ce de una clula en movimiento implica la liberacin de los monmeros de acti na de las protenas de unin al monmero, que normalmente impiden la poli merizacin de los filamentos de actina. Discutiremos ms adelante cmo las seales del ambiente celular externo pueden regular esta liberacin y permitir la polimerizacin de los monmeros de actina en el extremo del borde frontal de avance.

Algunas bacterias patgenas utilizan la actina para moverse dentro y entre las clulas 39
Listeria monocytogenes, una bacteria que provoca una forma aguda de envene
namiento alimentario, ha proporcionado datos inesperados acerca del m ecanis mo mediante el cual la clula controla la polimerizacin local de la actina. Esta bacteria patgena penetra por fagocitosis en la clula; entonces secreta enzimas que rompen la membrana del fagosoma y se libera en el citosol de la clula husped. Una vez en el citosol, no solamente crece y se divide, sino que se des plaza hacia las clulas adyacentes movilizando el sistema de motilidad basado en los filamentos de actina de la clula husped. Mediante la nucleacin de los filamentos de actina en una regin de su superficie, una bacteria individual se desplaza por el citosol a una velocidad de 10 pm por minuto o ms, dejando tras ella una cola de filamentos de actina. Cuando colisiona con la membrana plas mtica de la clula husped, se desplaza hacia el exterior induciendo la forma-

Filamentos de actina

889

bacteria libre

fagocitosis bacteria /~ ) escapndose ( / ensam blaje de

engullim iento por una clula husped vecina (A) (B) 10 pm

Figura 16-59 Movimiento basado en la actina de una bacteria dentro y entre clulas de mam fero. (A) La bacteria L isteria m on ocytogenes viaja de una clula a otra induciendo el ensamblaje de filamentos de actina en el citosol de la clula husped. (B) Micrografa de fluorescencia de la bacteria desplazndose en el interior de una clula que ha sido marcada para poder observar tanto a la bacteria como a los filamentos de actina. Ntese la cola, parecida a un cometa, de los filamentos de actina (verde) detrs de cada bacteria en movimiento (rojo). Las regiones en las que ambas fluorescencias se superponen, se observan en am arillo. (B, por cortesa de Tim Mitchison y Julie Theriot.)

cin de una larga y fina microespina, en cuyo extremo se sita la bacteria. A m e nudo esta proyeccin es engullida por una clula vecina, con lo cual la bacteria puede entrar en su citoplasma sin exponerse al ambiente extracelular donde po dra ser reconocida por anticuerpos producidos por el organismo husped (Fi gura 16-59). Este tipo de movimiento sugiere que la bacteria puede estar usando la actina para impulsarse, de la misma forma en que la membrana plasmtica de una clula eucariota la utiliza para impulsarse durante la formacin de una m icroes pina normal o un lamelipodio. Si marcamos con fluorescencia los filamentos de actina de la cola que deja atrs la bacteria Listeria cuando migra por el citosol y los observamos con el mi croscopio de fluorescencia, podremos observar que son estacionarios. Los fila mentos se forman en la parte trasera de la bacteria y se quedan atrs como la cola de un cohete mientras la bacteria avanza, despolimerizndose de nuevo al cabo de aproximadamente un minuto o en cuanto encuentran factores despolimerizantes en el citosol. El ensam blaje se induce por una protena especfica de la superficie de la bacteria que acta indirectamente secuestrando las protenas de la clula husped, incluida la profilina. Si el movimiento inducido por la bac teria pudiera ser reproducido en un extracto libre de clulas concentrado, se po dran conocer los detalles del mecanism o a partir de estudios bioqumicos. Estos detalles ayudaran a comprender cmo se producen la nucleacin de la actina y la polimerizacin en las microespinas y lamelipodios de una clula normal, no infectada, y cmo estos procesos capacitan a la clula para avanzar.

La polim erizacin de la actina en el crtex celular est controlada por receptores de la superficie celular 4 0
La produccin de movimiento es poco til a menos que est de acuerdo directa y adecuadamente con el ambiente. Como hemos discutido anteriormente, la red

890

Captulo 16 : El citoesqueleto

cortical dinmica de filamentos de actina se ordena de nuevo rpidamente como respuesta a seales que vienen del exterior de la clula y que inciden sobre la membrana plasmtica. Por lo tanto, el citoesqueleto de actina puede ser con siderado como una parte de los sistemas de transduccin de seales celular, dis cutidos en el Captulo 15: cuando se aaden determinados factores de creci miento al medio de cultivo de clulas quiescentes, por ejemplo, inmediatamente se forman lamelipodios que contienen actina y se mueven sobre la superficie ce lular. La respuesta del crtex de actina a las seales externas que llevan informa cin espacial puede ser altamente localizada. Anteriormente consideramos un ejemplo cuando discutimos la polarizacin de una clula T citotxica inducida por el contacto con su clula diana, a la que seguidamente matar (vase Figura 16-11). En las clulas animales capacitadas para la quimiotaxis tambin se pro duce una polarizacin del crtex de actina inducida por una seal, que se define com o un movimiento en una direccin controlado por un gradiente de una substancia qumica difusible al que la clula es sensible. Un ejemplo muy bien estudiado es el movimiento quimiotctico de ciertas clulas de la serie blanca (neutrfilos) hacia la fuente de infeccin bacteriana. Los neutrfilos tienen pro tenas receptoras en su superficie que les permiten detectar muy bajas concen traciones de pptidos N-formilados derivados de protenas bacterianas (slo los procariotas empiezan la sntesis proteica con una N-formil-metionina). Los neu trfilos pueden ser guiados hacia sus dianas con slo una diferencia de concen tracin de un 1% de estos pptidos difundibles, entre un lado de la clula y el otro. Otro ejemplo de quimiotaxis es el proporcionado por el moho del cieno, Dictyostelium discoideum. Estos eucariotas viven en el suelo de los bosques como clulas mviles independientes llamadas am oebae (amebas). Se alimentan de bacterias y de levaduras y, en condiciones ptimas, se dividen cada pocas ho ras. Cuando su suministro alimentario se agota, la ameba interrumpe su divisin y se agrupa formando estructuras minsculas ( 1-2 mm), pluricelulares, parecidas a gusanos, que se arrastran como babosas y dejan rastros de cieno detrs de ellas (Figura 16-60). Mientras la babosa migra, las clulas comienzan a diferenciarse e inician un proceso que finaliza con la produccin de una estructura muy peque a parecida a una planta que consiste en un tallo y un cuerpo fructfero unas 30 horas despus de haberse iniciado la agregacin (Figura 16-61). El cuerpo fruct fero contiene un nmero muy grande de esporas, que pueden sobrevivir largos perodos de tiempo en condiciones ambientales extremadamente hostiles. Slo cuando las condiciones son favorables, las esporas germinan y producen las amebas libres que empiezan el ciclo de nuevo. Las amebas Dictyostelium se agregan mediante quimiotaxis migrando hacia una fuente de AMP cclico, secretada por las amebas hambrientas. Al igual que los neutrfilos, las amebas reorientan su borde frontal de avance para migrar hacia el gradiente quimioatrayente superficial. Y cuando se exponen a una fuente local de AMP cclico que sale de una micropipeta, las amebas extienden apndices que contienen actina, directamente hacia la pipeta (Figura 16-62). Este experimento demuestra que la quimiotaxis eucariota implica la deteccin directamente de un gradiente espacial de una concentracin de atrayente, a diferencia de la quimiota xis bacteriana, que utiliza una variacin de la concentracin dependiente del tiem po para detectar los gradientes, como discutimos en el Captulo 15. La reaccin del citoesqueleto de Dictyostelium al AMP cclico puede exami narse mediante Usados de estas clulas poco despus de su estimulacin con una solucin rica en AMP cclico. Como se muestra en la Figura 16-63, a los 5-10 segundos de aadir el AMP cclico se produce una estallido dramtico de poli merizacin de actina, que corresponde al tiempo necesario para la extensin de la clula en el substrato. Entre los 20 y 40 segundos despus del pulso de AMP c clico, la actina se despolimeriza y la clula se redondea. Entonces se produce un estallido de polimerizacin de actina ms prolongado, en forma de un recluta miento en el citoesqueleto de protenas de unin a la actina a partir de acervos

t__________ i 1 mm
Figura 16-60 Micrografa ptica de una babosa del moho del cieno Dictyostelium discoideum migrando. (Por cortesa de David Francis.)

i___________ i 2 mui
Figura 16-61 Micrografa ptica del cuerpo fructfero de Dictyostelium discoideum. (Por cortesa de John Bonner.)

Filamentos de actina

891

Figura 16-62 Respuesta quimiotctica de la ameba

Dictyostelium discoideum. La ameba

tiene receptores para el AMP cclico en su membrana plasmtica, que la capacitan para arrastrarse hacia una fuente extracelular de AMP cclico. En este experimento se libera AMP cclico desde la punta de una micropipeta, que puede verse en la parte inferior de las micrografas; la respuesta que se muestra se produce en menos de un minuto. (Por cortesa de Gnther Gerisch.)

I-----------

50 jim

solubles; durante este ltimo perodo las clulas que responden al AMP cclico empiezan a formar lamelipodios y otras expansiones ricas en actina.

Protenas G heterotrim ricas y pequeas GTPasas transm iten seales desde la superficie celular al crtex de actina 41
De qu forma la unin del AMP cclico a su receptor desencadena la polimeri zacin masiva de actina en la am eba de Dictyostelium? Se sabe que el receptor activa una protena G heterotrimrica. El citoplasma contiene una reserva de monm eros de actina, los cuales, tal y como vimos anteriormente, estn estabi lizados m ediante protenas de unin al monmero de actina. La estimulacin de la polimerizacin de la actina supone que estas molculas de actina tienen que estar disponibles para polimerizar y tam bin ser necesario superar la barrera cintica para la nucleacin. La protena de unin al monmero de actina, proflina, se une estrecham ente a los fosfolpidos de inositol de la mem brana plas mtica, que generan seales intracelulares como respuesta a ligandos extracelulares (vase Figura 15-30). De acuerdo con una hiptesis, la activacin de esta va de seal (que se produce a travs de una protena G heterotrimrica) podra liberar la profilina de la m em brana plasmtica y dejarla libre en el citosol. La profilina puede catalizar el recam bio ATP-ADP de la actina in vitro, as que cuando es liberada desde la m em brana plasmtica puede, rpidamente, conver tir la actina inactiva unida a ADP en actina activa unida a ATP, induciendo la formacin local de filamentos de actina. Las protenas G tam bin estn implicadas en los procesos de sealizacin que activan el crtex de actina durante la respuesta quimiotctica de los neutr-

estirada

Figura 16-63 Efecto del AMP cclico sobre el crtex de actina de la ameba Dictyostelium discoideum. La grfica (lnea verde) muestra las cantidades relativas de actina filamentosa asociada con el citoesqueleto a distintos tiempos de la adicin repentina de AMP cclico.

aadido 0 30 60 90 tiem po de adicin de cAMP (seg)

cAM P

892

Captulo 16: El citoesqueleto

filos y en la activacin de las plaquetas sanguneas. Disponemos de datos evi dentes de que dos pequeas GTPasas relacionadas con la protena Ras conoci das como Rho y Rae, intervienen en este proceso; se ha visto que estas protenas tienen diversos efectos sobre el citoesqueleto de actina en los fibroblastos. La m icroinyeccin de la protena Rae en clulas en cultivo provoca, al cabo de 5 mi nutos, un incremento dramtico de la formacin de lamelipodios. Adems, un mutante dominante negativo de Rae inhibe la formacin de lamelipodios indu cida normalmente por diversos factores de crecimiento. Esto indica que la res puesta a los factores de crecimiento es dependiente de la protena Rae. La mi croinyeccin de la protena Rho comporta la aparicin de grandes haces de filamentos de actina conocidos como fibras de estrs y el incremento de contac tos focales, lugares donde la clula se une al substrato externamente y donde las fibras de estrs estn ancladas interiormente (como veremos ms adelante). Se cree que la protena Rho tambin es necesaria para la formacin del anillo con trctil durante la divisin celular. Sin embargo, Rae y Rho no slo controlan la polimerizacin de los filamentos de actina sino que tambin dirigen la organiza cin de estos filam entos formando algunos tipos determinados de estructuras.

Los m ecanism os de polarizacin celular pueden ser analizados en las clulas de levadura 42
Se han obtenido indicaciones adicionales sobre cmo las clulas pueden orien tar las actividades de su citoesqueleto, a partir del estudio del comportamiento de las clulas de levadura. La facilidad de realizar un anlisis gentico en las le vaduras ha proporcionado una fuente importante de informacin fundamental acerca de los mecanismos biolgicos comunes a todas las clulas eucariotas. Concretamente, estudios acerca de las interacciones entre levaduras durante el apareamiento han iniciado la identificacin de mecanismos mediante los cuales las clulas eucariotas se convierten en estructuras polarizadas. En la levadura de gemacin Saccharomyces cerevisiae, clulas con dos tipos de apareamiento dis tintos, a y a , secretan hormonas conocidas como factor a y factor a, respectiva mente. Estas hormonas actan a travs de su unin a receptores de la superficie celular que pertenecen a la gran familia de receptores relacionados con protena G, discutidos en el Captulo 15. Una consecuencia de la unin del factor a a su receptor en una clula a es la conversin de la clula en una clula polarizada que adopta una forma conocida como shm oo (Figura 16-64). Si existe un gra diente de factor a, el extremo de shm oo se dirige hacia la zona donde se en cuentra la concentracin ms elevada de esta molcula. Durante esta polarizacin la levadura sufre reorganizaciones del citoesque leto que son paralelas a las que aparecen en las clulas animales cuando se con vierten en polarizadas. Los filamentos de actina se congregan en la punta del borde shm oo, desde donde se cree que dirigen la secrecin local de com po nentes de la pared celular -dirigiendo posiblemente el transporte de vesculas portadoras de estos com ponentes hacia el borde de shm oo. Al mismo tiempo, el centro organizador de microtbulos [en este caso, el corpsculo polar del huso (spindle pole body)], vase Figura 17-24) se desplaza hacia el lado del ncleo que est muy relacionado con el borde de shm oo, y los microtbulos se extienden

(A)
Filamentos de actina

(B)

(C)

Figura 16-64 Polarizacin morfolgica de las clulas de levadura. Normalmente las clulas de Saccharomyces cerevisiae son esfricas (A), pero pueden convertirse en polarizadas cuando se tratan con un factor de apareamiento (B). Las clulas polarizadas se llaman shmoos, debido al famoso personaje de cmic de Al Capp (C). (Ay B, cortesa de Michael Snyder; C, 1948 Capp Enterprises, Inc., reservados todos los derechos.)

893

desde all hacia el borde de la clula. Mediante la observacin de clulas mutantes que no forman shmoo durante el apareamiento, se han identificado muchos de los genes implicados en la polarizacin de las levaduras. Parece que algunas de las protenas que codifican estos genes estaran implicadas en la polarizacin en las clulas animales.

Resumen
La actina es una proteina del citoesqueleto altamente conservada que se encuentra a concentraciones elevadas en casi todas las clulas eucariotas. La actina purifica da se encuentra en forma de monmero en soluciones de baja fuerza inica y al aadir una sal que contenga ATP se ensambla espontneamente formando fila mentos de actina. Al igual que la tubulina, la polimerizacin de la actina es un pro ceso dinmico que se encuentra regulado por la hidrlisis de un nucletido al que cada molcula est estrechamente unida (el ATP en este caso). En las clulas, apro ximadamente la mitad de la actina se encuentra en forma monomrica gracias a su unin a determinadas protenas de bajo peso molecular como la timosina. En el crtex de las clulas animales, las molculas de actina polimerizan y despolimerizan continuamente generando protrusiones en la superficie celular tales como los lamelipodios y las microespinas. La polimerizacin puede ser regulada por seales extracelulares que se unen a receptores de la superficie celular y que actan a travs de protenas G heterotrimricas y de pequeas GTPasas como RacyRho.

Protenas de unin a la actina43

La actina est implicada en un abanico notablem ente amplio de estructuras, desde extensiones rgidas y relativamente permanentes de la superficie celular hasta redes tridimensionales dinmicas en el borde frontal de avance de una c lula que est migrando. En cada clula viva coexisten estructuras muy distintas, basadas en la actina. En cada caso la estructura fundamental del filamento de actina es la misma. Lo que varia es la longitud de estos filamentos, su estabilidad y el nmero y la geometra de sus uniones (tanto las uniones de unos filamentos con otros como las uniones con otros com ponentes celulares). Estas propieda des dependen, a su vez, de una gran grupo de protenas de unin a la actina, que se unen a la actina y modulan sus propiedades y sus funciones. En este apartado describimos algunas de las protenas de unin a la actina ms importantes y las estructuras que forman. Muchas de estas protenas se en cuentran en el permetro celular, en la capa rica en actina que se encuentra justo debajo de la mem brana plasmtica, llamada crtex celul ir. Esta capa proporcio na fuerza m ecnica a la clula animal y le permite llevar a cabo una gran varie dad de movimientos superficiales, tales como la fagocitosis, la citocinesis (divi sin celular), y el movimiento celular.

Un citoesqueleto unido de m anera sencilla a la m em brana proporciona soporte m ecnico a la m em brana plasmtica de los eritrocitos 4 4
Como se explic en el Captulo 10, las protenas espectrina y anquirina fueron descubiertas como com ponentes importantes del citoesqueleto que se halla asociado a la mem brana de los glbulos rojos sanguneos (eritrocitos). Estas c lulas excepcionales han perdido el ncleo y los compartimentos membranosos internos de tal manera que la nica mem brana de la clula es la membrana plas mtica. Esta mem brana est sostenida por una red bidimensional de tetrmeros de espectrina conectados por sus extremos por filamentos muy cortos de actina. La espectrina est unida a la cola citoplasmtica de una protena transportadora transmembrana muy abundante (banda 3) a travs de puentes de anquirina (va se Figura 10-26). En la superficie de muchas clulas de vertebrados se encuen

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Captulo 16 : El citoesqueleto

tran parientes muy prximos de la espectrina (tambin llamada fodrina ) y de la anquirina. As, la disposicin detallada de las protenas en la corteza del eritroci to tambin proporciona un modelo simplificado de la red del citoesqueleto ba sado en actina que sostiene la membrana plasmtica en todas las dems clulas animales. Los filamentos de actina en el crtex del eritrocito son muy cortos, y tan slo actan como elementos de entrecruzamiento entre los tetrmeros de espectri na. Al contrario, en el crtex de una clula ms tpica, son mucho ms largos y as se proyectan hacia el citoplasma, donde forman la base de una red tridimen sional de filamentos de actina. No est nada claro si las molculas parecidas a la anquirina serviran de anclaje a la membrana plasmtica para esta disposicin cortical ms tpica, aunque se cree que en algunas clulas epiteliales la ATPasa de Na+-K+ transmembrana (discutida en el Captulo 11) unira esta red cortical de actina a la membrana plasmtica a travs de este tipo de protenas. Generalmente la red cortical de filamentos de actina determina la forma y las propiedades m ecnicas de la membrana plasmtica. Muchos tipos de unio nes a mem brana necesitan de los filamentos de actina para llevar a cabo sus di versas funciones en el crtex; el acoplamiento a protenas transmembrana a tra vs de la anquirina es nicamente uno de ellos. Existen otros tipos de uniones ms dinmicas, pero tan slo empiezan a ser caracterizadas las protenas que los median.

Protenas de entrecruzamiento con diferentes propiedades organizan ensam blajes particulares de actina 43
En las clulas animales los filamentos de actina corticales estn organizados en tres tipos generales de disposiciones (Figura 16-65). En haces paralelos, tal como se encuentran en las microespinas y en los filopodios: los filamentos estn orientados con la misma polaridad y estn espaciados muy regularmente (sepa rados 10-20 nm). En haces contrctiles, encontrados en las fibras de estrs y en el anillo contrctil que divide la clula en dos durante la mitosis: los filamentos se encuentran orientados con polaridades opuestas, mucho ms espaciados (sepa rados 30-60 nm) y presentan la protena motora miosina-II (se discute ms ade lante). En las redes parecidas a geles del crtex celular: los filamentos estn dis puestos de forma relativamente ms relajada, en disposiciones abiertas con interconexiones ortogonales. Cmo se generan y se mantienen estas diferentes disposiciones del mismo filamento de actina en una misma clula? Aunque no

Figura 16-65 Tres tipos de disposiciones corticales de los filamentos de actina. Se muestra una clula arrastrndose, con tres reas ampliadas para evidenciar la disposicin de los filamentos de actina dibujados a escala. Las puntas de flecha apuntan hacia el extremo ms de los filamentos.

haz contrctil

red a m odo de gel

_______ I I

haz paralelo denso

100 nm

Protenas de unin a la actina

895

filam entos de actina y a-actinina

filam entos de actina y ibrina

L haz contrctil em paquetam iento laxo que perm ite a la m olcula de m iosina-ll entrar en el haz

50 nm haces paralelos em paquetam iento apretado que im pide la entrada de m iosina-ll en el haz IB) 100 nm

(A)

conozcam os totalm ente la respuesta, las protenas de entrecruzamiento de los f i lamentos de actina tienen claram ente una gran importancia. Las protenas de entrecruzamiento pueden dividirse en dos clases -prote nas que form an haces y protenas que form an geles- de acuerdo con su efecto in vitro sobre los filamentos de actina puros. Las protenas que forman haces en trecruzan los filamentos de actina en disposiciones paralelas y son importantes en la formacin tanto de las ntimas disposiciones paralelas como de los haces contrctiles ms espaciados descritos anteriormente. Al contrario, las protenas que forman geles entrecruzan los filamentos de actina en intersecciones en dia gonal, creando los geles laxos. La fim brina y la a-actinina son protenas formadoras de haces ampliamente distribuidas. La fimbrina se encuentra en los haces de filamentos paralelos del borde frontal de las clulas, particularmente en las microespinas y en los filopodios, y se cree que es la responsable de la asociacin ntima de los filamentos de actina en estas disposiciones. La segunda protena formadora de haces, la a -actinina, se concentra en las fibras de estrs, donde se cree que es la responsable, en parte, de los entrecruzamientos relajados de los filamentos de actina en estos haces contrctiles; tam bin interviene en el anclaje de los extremos de las fibras de estrs en los contactos focales. Tal y como explicaremos ms adelante, la miosina es la protena motora en las fibras de estrs y en otras disposiciones con trctiles y es la responsable de su contractibilidad. Parece que el ntimo em pa quetamiento de los filamentos de actina causado por la fimbrina excluye a la miosina, mientras que el empaquetamiento relajado provocado por la a-actin i na permitira la entrada de las molculas de miosina; de todas formas, el dife rente espaciamiento provoca que cada una de las dos protenas formadoras de haces excluya a la otra (Figura 16-66). La filamina es una protena formadora de geles ampliamente distribuida. Aunque no se encuentra ni en las fibras de estrs ni en el borde delantero, se en cuentra enriquecida en el crtex. La filamina es un homodmero que permite la formacin de redes laxas y altamente viscosas al unir dos filamentos de actina y entrecruzarlos uno con otro (Figura 16-67). Es una protena abundante en mu-

Figura 16-66 La formacin de dos tipos de haces de filamentos de actina. (A) La a-actinina, que es un
homodmero, entrecruza los filamentos de actina en haces laxos, que permiten a la protena motora miosina-II (no se muestra) participar en el ensamblaje. La fimbrina entrecruza los filamentos de actina en haces apretados, que excluyen a esta protena. La fimbrina y la a-actinina tienden a excluirse la una a la otra a causa del espaciado de los diferentes haces de filamentos de actina que forman. (B) Electronmicrografa de molculas de a-actinina purificadas. (B, por cortesa de John Heuser.)

dm ero de

Figura 16-67 La filamina entrecruza los filamentos de actina formando una red tridimensional con las propiedades fsicas de un gel. Cada
homodmero de filamina tiene cerca de 160 nm de longitud cuando est totalm ente extendido y forma una unin flexible con un ngulo elevado entre dos filamentos de actina adyacentes. La filamina puede constituir un 1% de la protena total de la clula. Hay una molcula de filamina por cada 50 m onmeros de actina.

50 nm

896

Captulo 16: El citoesqueleto

espectrina (tetrmero)
''--/v--''/'''-''V '-''a'~ -'/'^--''V '-> ;''^ ^ ^
-----< *vA-----A-----A-----A----A-----A---------------------------------------------------------------------------------- )

Figura 16-68 Estructuras modulares de cuatro protenas de unin a la actina. Cada una de las protenas mostrada tiene dos lugares de unin a la actina (en rojo ) que estn relacionados entre s en cuanto a su secuencia. La fimbrina tiene dos lugares de unin a la actina, adyacentes, de forma que une sus dos filamentos de actina muy juntos (14 nm de separacin), alineados con la misma polaridad (vase Figura 16-66). Los dos lugares de unin a la actina de la molcula de a-actinina estn ms separados, conectados por un espaciador flexible de 30 nm de longitud, con lo cual forman haces de filamentos de actina con una mayor separacin entre los filamentos (40 nm de separacin). La filamina tiene dos lugares de unin a la actina que estn muy separados, con una unin en forma de V entre ellos, y as entrecruza filamentos de actina formando una red con los filamentos orientados casi en ngulo recto el uno respecto al otro (vase Figura 16-67). La espectrina es un tetrmero de dos subunidades a y dos subunidades p, y el tetrmero tiene dos lugares de unin a la actina separados unos 200 nm. Las regiones espaciadoras de estas protenas se construyen de manera modular a partir de unidades de repeticin que incluyen zonas en hlice a (verde claro), zonas de lmina (3 {verde oscuro), y dominios de unin al Ca2 + (valos azules).

o cH

fim brina (m onm ero)

cccooo o o cccc*
a-actinina (dimero) filam ina (dimero) 50 nm

chas clulas animales, lo cual refleja el predominio de las redes laxas en la orga nizacin de la actina.

Las protenas de unin a la actina con propiedades diferentes estn construidas a partir de mdulos sem ejantes 45
La fimbrina, la a-actinina, la filamina y la espectrina presentan todas ellas dos dominios de unin al filamento de actina, con lo cual no es de extraar que cada una necesite entrecruzar dos filamentos. Sorprendentemente, la estructura de los dominios de unin a la actina de estas protenas es parecida. En estas cuatro protenas, la longitud y la flexibilidad de las secuencias espaciadoras que sepa ran los dos lugares de unin a la actina son distintas, y estas diferencias determi nan las propiedades diferenciales de los cuatro entrecruzamientos. Evidente mente, estas protenas han derivado a partir de una protena de unin a la actina ancestral comn mediante la adicin de secuencias espaciadoras distintas (Fi gura 16-68).

La gelsolina, cuando se activa por Ca2+ , fragmenta los filamentos de actina 4 6

Cuando se calientan a 37C en presencia de ATP extractos preparados a partir de alguno de entre muchos tipos celulares, forman un gel. Aunque esta gelificacin depende tanto de los filamentos de actina como de una protena de entrecruzamiento como la filamina, el gel presenta un comportamiento ms complejo que las mezclas simples de filamentos de actina y de filamina. Por ejemplo, si se in 7 M, el gel semislido de ac crementa la concentracin de Ca2 + por encima de 10~ tina empieza a licuar -proceso conocido como solacin. Al microscopio se pue de observar que algunas regiones del gel solante presentan vigorosas corrientes locales. As pues, es evidente que, adems de la actina y de la filamina, en el ex tracto celular han de existir otros componentes responsables de este comporta miento. Es probable que estos componentes estn implicados en las corrientes citoplasmticas observadas en algunas clulas grandes, en las que se requieren vigorosos movimientos de flujo para mantener una distribucin determinada de metabolitos y de otros componentes citoplasmticos. Al parecer estos movi mientos estn asociados a un cambio local repentino del citoplasma desde una consistencia gelificada a un estado ms fluido. A partir de extractos se han aislado algunas protenas celulares que cuando se aaden a un gel de filamentos de actina y filamina provocan que, en presencia de Ca2+ , el gel cambie a un estado ms fluido. La mejor caracterizada de estas pro tenas es la gelsolina, que, cuando se activa por la unin al Ca2+ , separa los fila mentos de actina y forma un casquete en el extremo ms del filamento que ahora est asequible, deshaciendo as la red entrecruzada de filamentos de actina. En la corteza de muchos tipos de clulas de los vertebrados se han encontrado prote nas similares a sta; estas protenas fragmentadoras se activan por concentracio nes de Ca2+ (aproximadamente 10-6 M) que se alcanzan slo temporalmente en el citosol.

Protenas de unin a la actina

897

Una de las funciones que se postula para estas protenas fragmentadoras es la de ayudar a la relajacin o licuacin local del crtex celular, permitiendo que se produzcan procesos de fusin de membrana. Por ejemplo, cuando una clula fagoctica sangunea engulle a un microorganismo, el fagosoma que se forma est inicialmente cubierto, por el lado citoplasmtico, por una gruesa red de fila mentos de actina originados a partir del crtex. Para que este fagosoma pueda fusionarse con los lisosomas, estos filamentos de actina han de despolimerizarse para permitir el contacto ntimo entre las membranas del fagosoma y la del lisosoma. Esta desaparicin de la actina puede prevenirse reduciendo artificialmen te la concentracin del ion Ca2+ , a travs de la accin de la gelsolina (o de una protena similar). Se cree que la gelsolina tambin es necesaria para que la clula se arrastre a lo largo de un substrato, aunque se desconoce su papel exacto en este proceso. Una mezcla de filamentos de actina purificada, filamina, y gelsolina es ca paz de experimentar transiciones de gel a sol dependientes de Ca2+ , pero no pue de contraerse ni presentar los movimientos de flujo que presentan los geles cru dos ricos en actina obtenidos a partir de la clula. Estas actividades requieren la presencia de otro tipo de protena de unin a la actina -la protena motora m io sina. Si la miosina se elimina selectivamente de los geles crudos ricos en actina, desaparecen com pletamente las contracciones y las corrientes, lo cual sugiere que la fuerza que provoca las corrientes citoplasmticas est generada por una interaccin entre la actina y la miosina.

En las clulas eucariotas se han encontrado mltiples tipos de m iosina 47

La cinematografa a intervalos de tiempo revela que el crtex de las clulas est en continuo movimiento. En la seccin anterior remarcamos la importancia de la polimerizacin y despolimerizacin de la actina en estos movimientos, pero, al igual que en los microtbulos, las protenas motoras tambin son muy impor tantes. Todas las protenas motoras de los filamentos de actina que han sido identificadas pertenecen a la familia de las miosinas. Las m iosinas fueron aisla das originalmente gracias a su capacidad para hidrolizar el ATP a ADP i P cuan do se unen a la actina, y esto se ha mantenido como criterio bioqumico til para su identificacin. Esta actividad motora de las miosinas tambin se puede ob servar directam ente si son adsorbidas encim a de un cubreobjetos de cristal: cuando se aade ATP a una preparacin de filamentos de actina fluorescentes, se puede observar con un microscopio de fluorescencia cmo los filamentos se deslizan sobre la superficie del cristal cubierta por la miosina. Las miosinas des cubiertas ms recientem ente tambin se han identificado mediante la secuenciacin de su DNA antes incluso de su caracterizacin funcional o bioqumica. La miosina, distribuida a lo largo de la actina, fue descubierta en el msculo esqueltico, y es en este tejido donde se ha aprendido la mayor parte de lo que se conoce acerca de la interaccin entre estas dos protenas. La miosina muscu lar pertenece a la subfamilia m iosina-II de las miosinas. Todas ellas tienen dos cabezas y una larga cola, parecida a una varilla: cada cabeza presenta tanto la actividad ATPasa como la motora. Una protena del tipo miosina-II est formada por dos cadenas pesadas idnticas, cada una de las cuales est complejada a un par de cadenas ligeras. El fragmento amino terminal de la cadena pesada forma el dominio motor mientras que la mitad del extremo carboxilo terminal de la ca dena pesada se extiende en forma de hlice a. Dos cadenas pesadas se entrela zan a travs de sus dominios de cola en hlice a formando un sobreenrollamiento que da lugar a un dmero estable formado por dos cabezas y una nica cola parecida a una varilla (Figura 16-69). La funcin ms importante de la cola semejante a una varilla de la miosina-II es la de permitir la polimerizacin de las molculas formando filamentos bipola res. Esta polimerizacin es crucial para el desarrollo de la funcin de la miosinaII, es decir, la de mover grupos de filamentos de actina opuestos, tal y como su-

898

Captulo 16: El citoesqueleto

Figura 16-69 M iosina-II. (A) Una molcula de miosina est compuesta por dos cadenas pesadas (cada una de las cuales tiene alrededor de 2000 residuos de aminocido de longitud) y cuatro cadenas ligeras. Las cadenas ligeras son de dos tipos (unas contienen alrededor de 190 residuos de aminocidos y las otras alrededor de 170). En cada cabeza de miosina se halla presente una molcula de cada tipo (vase Figura 5-23). La dimerizacin se produce cuando las dos hlices a se enroscan la una alrededor de la otra formando un sobreenrollamiento en hlice a mediado por la asociacin de aminocidos hidrofbicos separados regularmente. La disposicin en sobreenrollamiento produce en solucin una extensa cuerda; esta parte de la molcula se denomina el dominio de cuerda, o cola. Este tipo de estructura se encuentra en otras protenas del citoesqueleto y les permite formar una estructura extendida. (B) Las dos cabeza globulares y la cola pueden observarse claramente en electronmicrografas de molculas de miosina sombreadas con platino. (B, por cortesa de David Shotton.)

cede durante la contraccin muscular. La miosina es relativamente abundante en el crtex celular; en los fibroblastos, por ejemplo, existe una molcula de miosina-II por cada 100 molculas de actina. En el anillo contrctil los filamen tos de miosina son los responsables del movimiento de la membrana en el surco central durante la divisin celular, como discutimos en el Captulo 18. Se cree que estos filamentos generan tensin en las fibras de estrs y tambin mucha tensin cortical que comportara el tensamiento de la superficie celular. Su pa pel en la contraccin muscular se describe al final de este captulo. Adems de la miosina-II, que generalmente es la miosina ms abundante de la clula, las clulas no musculares disponen de diversas miosinas ms peque as, la m ejor caracterizada de las cuales es la llamada m iosina-I (Figura 16-70). Se cree que la miosina-I es ms parecida a la original, a una miosina ms primiti va a partir de la cual habra evolucionado la miosina-II. Una nica clula puede disponer de mltiples miosinas ms pequeas, cada una de las cuales est codi ficada por un gen distinto y tambin lleva a cabo una funcin diferente; la clula del moho del cieno Dictyostelium, por ejemplo, tiene al menos nueve de ellas. La caracterstica ms comn de todas las miosinas es la de presentar un dominio motor muy conservado; el resto de dominios varan de una miosina a otra y deter minan el papel especfico de la molcula en la clula. Adems, las colas de miosi na pueden presentar un lugar de unin a la membrana y/o un lugar de unin a un segundo filamento de actina independientemente del dominio de cabeza. Depen diendo de su cola, una molcula de miosina puede mover una vescula a lo largo de un filamento de actina, unir un filamento de actina a la membrana plasmtica, o hacer que dos filamentos de actina queden ntimamente alineados y entonces se deslicen uno con respecto al otro (Figura 16-71). Todas las miosinas conocidas hidrolizan ATP para deslizarse a lo largo de los filamentos de actina desde el extremo menos hacia el extremo ms. Dada la importancia de las protenas motoras que se desplazan en direcciones opuestas Figura 16-70 Dos miembros de la familia de las miosinas. A la izquierda,
se muestran la miosina-I y la miosinaII, dibujadas a escala, y alineadas respecto a sus lugares de unin al ATP y a la actina, altamente conservados. Las formas relativas de las protenas completas se muestran a la derecha.

Protenas de unin a la actina

899

m em brana plasmtica

Figura 16-71 Posibles funciones de la miosina-I y la miosina-II en una clula eucariota tpica. Las colas cortas de una molcula de miosina-I contienen lugares que unen los filamentos de actina a la membrana. Esto permite al dominio de cabeza desplazarse de un filamento de actina a otro (1), desplazar una vescula a lo largo de un filamento de actina (2) o desplazar un filamento de actina hacia la membrana respecto a otro filamento de actina (4). Adems, los pequeos ensamblajes antiparalelos de las molculas de miosina pueden deslizar unos filamentos de actina sobre los otros, con lo cual median contracciones locales en un haz de filamentos de actina (3). En todos los casos el grupo de cabeza cam ina hacia el extremo ms del filamento de actina con el que contacta.

a lo largo de los microtbulos (vase Figura 16-37), no sera sorprendente descu brir un tipo adicional de protenas motoras que se desplazaran hacia el extremo menos de los filamentos de actina.

En clulas no musculares pueden form arse transitoriam ente ensam blajes sem ejantes a los musculares 4 8
En las clulas eucariotas superiores se forman transitoriamente haces contrcti les organizados de filamentos de actina y de filamentos de miosina para realizar una funcin especfica y luego se deshacen. Ms destacado an, la divisin celu lar en las clulas animales es posible gracias a un haz a modo de cinturn de fila mentos de actina y de miosina, conocido como el anillo contrctil. Este anillo aparece justo debajo de la mem brana plasmtica durante la fase M del ciclo de divisin celular; las fuerzas generadas por este anillo constrien la mitad de la clula conduciendo a la eventual separacin de las dos clulas hijas mediante un proceso conocido como citocinesis (Figura 16-72). El anillo contrctil se forma al iniciarse la divisin celular a partir de actina, miosina y otras protenas. Este pro ceso puede seguirse mediante la tincin con anticuerpos fluorescentes antimiosina de las clulas en divisin. Por ejemplo, en los huevos del erizo de mar que estn prximos a dividirse, las molculas de miosina estn al principio dis tribuidas uniformemente por debajo de la mem brana plasmtica y luego, a m e dida que se forma el anillo contrctil, se desplazan a la regin ecuatorial de la c lula. Una vez se ha completado la divisin celular, las molculas de miosina se dispersan de nuevo. Se desconoce cmo se controla este proceso, pero parece que estara implicado el catin Ca2 + ya que la fosforilacin de la miosina-II es de pendiente de Ca2+ y tanto el Ca2 + como la fosforilacin increm entan la interac cin de la m iosina con la actina lo cual comporta la formacin de filamentos bi polares cortos (Figura 16-73). Otro ejemplo de haces contrctiles temporales de filamentos de actina y de miosina son las fibras de estrs, que son com ponentes mayoritarios del citoesqueleto de los fibroblastos en cultivo (Figura 16-72). Aunque mucho ms peque as y m enos organizadas, las fibras de estrs presentan un cierto parecido con

CE l JL A .

anillo contrctil

n 'L U A l t II LIA!

cinturn adhesivo

F 3R B LA S TO E f Cl

\O

Figura 16-72 Haces contrctiles parecidos al del msculo en clulas no m usculares. Cada haz contiene filamentos de miosina-II adems de filamentos de actina.

900

Captulo 16 : El citoesqueleto

cadenas ligeras de m iosina

[ adp|

lugar de unin a la actina

FOSFORILACIN

ESPONTNEO cola de m iosina liberada

filam ento bipolar de 15-20 m olculas

ESTADO INACTIVO: (cadenas ligeras no fosforiladas)

ESTADO ACTIVO: (cadena ligera fosforilada)

Figura 16-73 Ensamblaje controlado de la miosina-II, formando filamentos. (A) La fosforilacin controlada de una de las dos cadenas ligeras tiene al menos dos efectos in vitro : provoca un cambio en la conform acin de la cabeza de miosina, exponiendo su lugar de unin a la actina, y libera la cola de miosina de la "zona pegajosa de la cabeza de miosina, permitiendo as a la molcula de miosina ensamblarse formando cortos filamentos bipolares. La enzima responsable de esta fosforilacin (la quinasa de la cadena ligera de la miosina) se describe en relacin con el msculo liso (vase Figura 16-98). (B) Tincin negativa de filamentos cortos de miosina-II que han sido inducidos a ensamblarse por fosforilacin de sus cadenas ligeras. (Por cortesa de John Kendrick-Jones.)

las minsculas miofibrillas del msculo (discutido ms adelante) en cuanto a su estructura y a su funcin. Por uno de sus extremos se insertan en la membrana plasmtica, mediante unas uniones especiales llamadas contactos focales, lugar donde la cara externa de la clula est ntimamente unida a la matriz extracelular (Figura 16-74); por el otro extremo se insertan en un segundo contacto focal o en una red de filamentos intermedios que rodea el ncleo celular. Las fibras de estrs se forman en respuesta a la tensin generada a travs de la clula y se des ensamblan durante la mitosis cuando la clula se redondea y pierde sus uniones al substrato. Tambin desaparecen rpidamente si se libera la tensin mediante un rayo lser, separando sbitamente un extremo de la fibra del contacto focal. Se cree que las fibras de tensin de los fibroblastos tisulares se contraen permi tiendo a las clulas ejercer tensin sobre la matriz de colgeno que las rodea -u n proceso esencial en la curacin de las heridas y en la morfognesis (vase Figura 19-48). En los epitelios, los haces de filamentos de actina que se extienden desde el citoplasma de una clula hasta el citoplasma de la clula vecina a travs de las uniones celulares pueden aparecer y desaparecer de una manera semejante; es tos haces de filamentos, ligados de extremo a extremo a travs de las uniones clula-clula, pueden formar cables y generar tensin a lo largo de lneas de estrs particulares en las lminas multicelulares.

Figura 16-74 Relacin entre los contactos focales y las fibras de estrs en fibroblastos en cultivo. Los contactos focales puede observarse de forma ptima en clulas vivas mediante microscopio de contraste interdiferencial (A). En esta tcnica, la luz se refleja a partir de la superficie inferior de una clula unida a un soporte de vidrio, y los contactos focales aparecen com o manchas negras. (B) La tincin de la misma clula (tras su fijacin) con anticuerpos anti-actina muestra que la mayora de los haces de filamentos de actina de la clula (o fibras de estrs) acaban en o cerca de un contacto focal. (Por cortesa de Grenham Ireland.)

Protenas de unin a la actina

901

No todos los ensam blajes contrctiles de los filamentos de actina de las c lulas no musculares son transitorios. Por ejemplo, los que estn asociados a uniones de anclaje intercelulares, los llamados cinturones de adhesin, son ms permanentes. Los cinturones de adhesin (discutidos en el Captulo 19), se en cuentran prximos a la superficie apical de las clulas epiteliales (vase Figura 16-72). Se cree que, entre otras funciones, desempean un papel importante en el plegamiento de las capas de clulas epiteliales durante la embriognesis. El mecanism o de contraccin de todos estos haces del citoesqueleto se basa en un deslizamiento interdigitado de los filamentos de actina y miosina impul sado por el ATP. Se cree que es necesario un tipo particular de ensamblaje orde nado, que explicaremos ms adelante cuando tratemos del msculo.

Los contactos focales perm iten que los filam entos de actina se extiendan hacia el substrato 4 9
Para extenderse sobre la matriz extracelular o sobre la superficie de otra clula, una fibra de estrs ha de estar firmemente unida a un lugar adecuado de la m em brana plasmtica. Los anclajes entre los filamentos de actina del interior de la clula y la matriz extracelular exterior estn mediados por protenas trans mem brana unidas a glucoprotenas de la membrana plasmtica. Los anclajes m ejor caracterizados son los que forman los fibroblastos en cultivo. Cuando los fibroblastos crecen en una placa de cultivo, la mayora de su superficie est se parada del substrato por un espacio de ms de 50 nm; pero en las zonas de los contactos focales (placas de adhesin), este espacio se reduce a entre 10 y 15 nm. En estas zonas la m em brana plasmtica est unida a componentes de la matriz extracelular que se han adsorbido en la placa de cultivo. Mediante tincin con anticuerpos anti-actina, puede observarse cmo estas regiones son los lugares donde los extremos de las fibras de estrs se unen a la membrana plasmtica (vase Figura 16-74). Las principales protenas de unin transmembrana de los contactos focales pertenecen a la familia de las integrinas, cuyo dominio externo se une a un com ponente de la matriz extracelular mientras que el dominio citoplasmtico se une a los filamentos de actina de las fibras de estrs. La unin es indirecta y est me diada por mltiples protenas de anclaje (Figura 16-75). El dominio citoplasmti co de la integrina se une a una protena llamada talina, que a su vez se une a la vinculina, protena que se encuentra tambin en otras uniones que contienen fi lamentos de actina, como por ejemplo las uniones adherentes (discutido en el Captulo 19). La vinculina se une a la a-actinina que tam bin est unida a un fi lamento de actina. Aunque la topologa exacta de las interacciones proteicas en los contactos focales no est establecida, en la Figura 16-75B se muestra una po sible disposicin de todas estas protenas. Adems de su papel como anclas para la clula, los contactos focales pue den tam bin transmitir seales desde la matriz hasta el citoesqueleto. Algunas protena quinasas, incluyendo la tirosina quinasa codificada por el gen src, se lo calizan en los contactos focales, y existen indicios de que su actividad cambia con el tipo de substrato sobre el cual la clula descansa. Estas quinasas pueden fosforilar diversas protenas diana, incluyendo algunos componentes del citoes queleto, y as regular la supervivencia, el crecimiento, la morfologa, el movi miento, y la diferenciacin de las clulas como respuesta a la matriz extracelular de su entorno.

Los microvilli ilustran de qu form a los haces de filamentos entrecruzados de actina pueden estabilizar zonas locales de la m em brana plasm tica 50
Los m icrovilli son extensiones digitiformes que se encuentran en la superficie de muchas clulas animales. Son especialmente abundantes en las clulas epite liales que para funcionar de una manera eficiente han de presentar una gran

902

Captulo 16: El citoesqueleto

(A)

(B)

filam ento de actina a-actinina

protena d capucha

vinculina paxilina talina receptor de fibronectina

UNIN DE LA CLULA A UNA MATRIZ EXTRACELULAR

50 nm
Figura 16-75 Modelo que explica de qu form a las integrinas de la m em brana plasm tica conectan los filamentos de actina intracelulares con la matriz extracelular en los contactos focales. La formacin de un contacto focal tiene lugar cuando la unin de glucoprotenas de la matriz (tales como la fibronectina) de la superficie exterior de la clula hace que las molculas de integrina se agreguen en el lugar de contacto, tal como se ilustra esquem ticam ente en (A). En (B) se muestra una posible disposicin de las protenas de unin intracelular que median la unin entre una integrina y un filamento de actina.

CITOSOL

MATRIZ EXTRACELULAR
rea superficial. Por ejemplo, una sola clula epitelial del intestino delgado hu mano tiene varios miles de microvilli en su superficie apical. Cada uno de ellos tiene aproximadamente 0,08 pm de ancho y 1 pm de largo, de forma que la su perficie de absorcin de la clula es 20 veces mayor de lo que sera sin los m icro villi. La membrana plasmtica que recubre estos microvilli est altamente espe cializada, y contiene una gruesa cubierta extracelular de polisacridos y de enzimas digestivas. El citoesqueleto de los microvilli ha sido estudiado con deta lle -labor que no ha sido difcil ya que se trata de una estructura altamente espe cializada, comparada con las regiones menos especializadas del crtex celular. La zona central de cada microvillus intestinal contiene un haz rgido de entre 20 y 30 filamentos paralelos de actina que se extiende desde la punta del microvi llus hasta el interior de la corteza celular. Todos los filamentos de actina del haz estn orientados de forma que sus extremos ms apuntan hacia fuera del cuerpo celular y se mantienen unidos a intervalos regulares mediante protenas formadoras de haces de actina. Aunque la fimbrina, la protena formadora de haces de actina en las microespinas y los filopodios, interviene en la formacin de los fila mentos de actina en los microvilli, la protena formadora de haces de actina ms importante es la villina, que se encuentra nicamente en los microvilli (Figura 16-76). La villina, igual que la fimbrina, entrecruza filamentos de actina en haces paralelos, pero tiene una secuencia de unin a la actina diferente. Cuando se in troduce villina en un cultivo de fibroblastos, los cuales normalmente no presen tan villina y slo tienen unos cuantos microvilli pequeos, los microvilli existen tes se convierten en microvilli alargados y estabilizados e incluso se puede inducir la aparicin de nuevos microvilli. Estos datos sugieren que la villina es principalmente la responsable de la formacin de los largos microvilli de las c lulas epiteliales.

Protenas de unin a la actina

903

Figura 16-76 Un microvillus. Un haz de filamentos de actina paralelos, que se m antienen mediante las protenas formadoras de haces de actina -villina y fim brina- forman la parte central de un microvillus. Los brazos laterales (formados de miosina-I y la protena de unin al Ca2+, calmodulina) conectan los lados del haz de filamentos de actina a la m embrana plasmtica contigua. Los extremos ms de los filamentos de actina se hallan en el extremo del microvillus, donde estn inmersos en una sustancia amorfa, muy electrodensa, de com posicin desconocida.

regin am orfa teida densam ente extrem os ms de los filam entos de actina

La parte inferior del haz de filamentos de actina del microvillus est anclada en la corteza especializada de la regin apical de la clula epitelial intestinal. Esta cor teza, conocida como la red terminal, contiene una densa trama de molculas de espectrina que cubre una capa de filamentos intermedios (Figura 16-77). Se cree que la espectrina da rigidez y estabilidad al crtex, manteniendo los haces de actina en una proyeccin en ngulo recto hacia la superficie apical de la clula. El haz de filamentos de actina est unido a la membrana plasmtica del mi crovillus mediante puentes laterales que pueden ser observados mediante electronmicrografas. Los puentes estn formados por una forma de la miosina-I que tiene algunas calmodulinas unidas en la regin de su cola (discutido en el Captu lo 15). La miosina est orientada de forma que su cola est inmersa en la mem brana y su cabeza, unida a un ATP activo, contacta con los filamentos de actina. Resulta un misterio por qu una protena motora es utilizada para unir los fila mentos de actina a la membrana de los microvilli. Si la miosina-I de la membrana de los microvilli fuera mvil, debera desplazarse hacia el extremo ms del fila mento de actina en la punta del microvillus. Esto ha conducido a especular que posiblemente la miosina-I ayudara a transportar membrana desde el extremo de los microvilli hacia su regin central, formando vesculas en su extremo que seran entonces liberadas en el lumen del intestino, donde las enzimas digestivas que transportan continan su accin.

m em brana plasmtica

brazos laterales (m iosina-I y calm odulina)

entrecruzam ientos (villina, fim brina)

El com portam iento de la corteza celular depende de un equilibrio de interacciones cooperativas y competitivas entre una gran coleccin de protenas de unin a la actina
Los ejemplos precedentes muestran que un mismo filamento de actina puede unirse a diferentes tipos de protenas de unin a la actina, localizadas en distinpuentes do espectrina

hir tic filamentos de actina

membrana pas mtica

ret
terminal

Figura 16-77 Electronmicrografa por congelacin de una clula epitelial intestinal, en la que se m uestra la red terminal por debajo de la m em brana plasm tica apical. Los haces de filamentos de actina que forman el ncleo del microvillus se extienden entre la red terminal, donde se unen conjuntam ente mediante un grupo complejo de protenas del citoesqueleto, que incluyen la espectrina y la miosina-II. Por debajo de la red terminal se encuentra una capa de filamentos intermedios. (De N. Hirokawa y J.E. Heuser, J. Cell Biol. 91:399-409, 1981. Reproducido con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

0,2 ijm
904 Captulo 16 : El citoesqueleto

intermedios

ENSAMBLAJE A

filam ina

la filam ina excluye tanto a la tropom iosina com o a la a-actinina

la unin de filam ina com pite con la m iosina-ll tram a de filam entos de actina entrecruzados

la tropom iosina excluye a la filam ina y perm ite que la a-actinina se una slo al extrem o ms

la tropom iosina increm enta la unin de m iosina-ll

ENSAMBLAJE B

tropom iosina

form acin de haces de filam entos contrctiles de actina

tas regiones del crtex, y que estas protenas pueden ser segregadas en zonas distintas de la clula. Qu impide que las distintas colecciones de protenas se mezclen en el citoplasma? Parece probable que sean importantes las interaccio nes cooperativas y competitivas entre estas protenas. Por ejemplo, un tipo de protenas de unin a la actina que an no hemos discutido se une a lo largo de los filamentos de actina. El ejemplo ms extendido de esta clase son las tropom iosinas, que son protenas rgidas en forma de varilla, denominadas as por sus similitudes con la miosina-II en cuanto a su patrn de difraccin de rayos X. Al igual que la cola de la miosina-II, la tropomiosina es un dmero con dos cade nas en hlice a idnticas que se enrollan una sobre la otra formando un sobreenrollamiento. Al unirse a lo largo del filamento de actina, lo estabilizan y le dan consistencia. Tambin inhiben la unin de la filamina a los filamentos de actina, lo cual explica probablemente por qu la tropimiosina y la filamina estn distri buidas de forma diferencial en la clula. Por el contrario, la unin de la tropo miosina al filamento de actina incremente la unin de la miosina-II al filamento -u n ejemplo de interaccin cooperativa (Figura 16-78). As ahora podemos empezar a comprender cmo las fibras de estrs y las re des corticales de filamentos de actina pueden coexistir en un mismo citoplasma. En un lado de la clula -quizs nucleados en las adhesiones focales que se for man por la influencia de la protena Rho activada- la tropomiosina, la miosinaII, y la a-actinina se asocian con los filamentos de actina e impiden la unin de la filamina; entonces, la actividad contrctil de la miosina-II favorece cambios en la organizacin que comportan la produccin de las fibras de estrs. En otro lugar de la clula los filamentos de actina, deficientes en tropomiosina, se unen a la filamina, y producen una red laxa que proporciona un bajo nmero de luga res donde la a-actinina puede unirse a dos filamentos a la vez, con lo cual queda excluida; la inclinacin de los filamentos en una red laxa tam bin puede impedir la unin de la tropomiosina, que prefiere los filamentos rgidos. Aunque esta ex plicacin es parcialmente especulativa, puede ilustrar la va bsica por la cual una com binacin de interacciones cooperativas y competitivas puede producir disposiciones de los filamentos de actina espacialmente diferenciadas en un mismo citoplasma. Se desconoce cmo se establecen estas diferencias locales postuladas que inician la formacin de estos ensamblajes. Tambin se descono ce cuntos tipos distintos de disposiciones de los filamentos de actina pueden coexistir en una clula -hay ciertamente algunos ms de los dos que hemos mencionado. En la Figura 16-79 se resumen algunas de las protenas de unin a la actina discutidas en esta seccin.

Figura 16-78 Algunos ejemplos de interacciones com petitivas y cooperativas entre protenas de unin a la actina. La punta de flecha en el extremo de cada filamento indica el extremo menos. Tanto la tropomiosina com o la filamina se unen fuertem ente a los filamentos de actina, pero su unin es competitiva. Debido a que la tropom iosina se une a los filamentos de actina de forma cooperativa, tanto la tropomiosina com o la filamina predominan sobre largas zonas de la red de filamentos de actina. Otras protenas de unin a la actina, com o la a-actinina y la miosina, sern excluidas de sus lugares especficos por interacciones competitivas. As, por ejemplo, la a-actinina se une in vitro a todo lo largo de los filamentos purificados de actina pero en la clula, debido a la com petencia con otras protenas, solamente se une de forma muy dbil a los filamentos de actina, en los que est confinada a lugares cercanos a los extremos ms. Alternativamente, la unin puede verse reforzada a travs de uniones cooperativas; as, la tropomiosina increm enta la unin de la miosina a los filamentos de actina. Se cree que las mltiples interacciones que se producen entre los diferentes tipos de protenas de unin a actina son los responsables de la com pleja variedad de redes de actina encontradas en todas las clulas eucariotas (vase Figura 16-79 para las claves de los smbolos).

Protenas de unin a la actina

905

FUNCIN DE LA PROTEINA
Forma filam entos

EJEMPLO DE PROTENA a c tin a tro p o m io s in a fim b rin a i.

FORMAS, TAMAOS Y MASAS MOLECULARES COMPARATIVAS 50 nm i 370 x 43 kD/nm

Fortalece los filam entos

* 2 X 35 kD O 68 kD 2 x in o k n 2 x 270 kD

INTERACCION ESQUEMTICA CON LA ACTINA extrem o extrem o menos ms . subunidad que se adiciona prefe rentemente ] 14 nm

Genera haces de filam entos

a act i 14;! 1l i 1! ti

-------- - Q

ll

140 nr

Entrecruza los filam entos form ando un gel

Fragm enta filam entos

(JliU il!
h i i osi na-II

90 kD 2 x 260 kD ATP 150 kD 2 X 265 kD ms 2 X 260 kD ATP

Hace deslizar los filam entos Desplaza vesculas por encim a de los filam entos Une los lados de los filam entos a la m em brana plasm tica Secuestra monmeros de actina

m io fi'.. - :

espt- ;i tim o s in a |3

P
a
0

O 5 kD

* *'

La m igracin de las clulas animales com porta tres subprocesos distintos dependientes de actina 51
Los movimientos de deslizamiento de las clulas animales son de muy difcil ex plicacin a nivel molecular. Diferentes partes de la clula cambian a la vez, y adems no hay un nico orgnulo locomotor fcilmente identificable (anlogo al flagelo, por ejemplo). Aunque la actina es la base de la migracin celular animal, puede sufrir diferentes tipos de modificaciones mientras la clula migra, ensam blndose en forma de lamelipodios o microespinas, asocindose con los contac tos focales, formando las fibras de estrs y otras muchas estructuras. Un informe completo tendra que dar una explicacin molecular a estas transformaciones, explicar cmo estn coordinadas en el tiempo y en el espacio y tambin informar de parmetros bioqumicos importantes tales como el desarrollo de la tensin cortical y la formacin de fuertes uniones entre la clula y el substrato. Hay, a grandes rasgos, tres procesos distintos que pueden identificarse en los movimientos deslizantes de las clulas animales: la protrusin, en que los la melipodios y las microespinas (o filopodios) se extienden desde la parte anterior de la clula; la adhesin, en que el citoesqueleto de actina conecta con el subs trato; y la traccin, en que el cuerpo celular se mueve hacia adelante. La protrusin es una funcin del borde frontal de avance de la clula. Los la melipodios y las microespinas (o filopodios) ricos en actina se extienden hacia adelante sobre el substrato, proceso que va acompaado de la polimerizacin de la actina, descrita anteriormente. Parece probable que la protrusin sea condu cida por la polimerizacin de la actina en el borde frontal (Figura 16-58), pero ello an es discutido. Los motores proteicos del tipo miosina-I se adhieren a la mem brana plasmtica y podran conducir a la clula hacia adelante movindose activamente a lo largo de los filamentos de actina. An existe otra posibilidad,

Figura 16-79 Algunos de los tres tipos de protenas que se unen a la actina hallados en la m ayora de clulas de los vertebrados. La actina se muestra en rojo, mientras que las protenas de unin a la actina se muestran en verde. El peso molecular de cada protena se da en quilodaltons (kD).

906

Captulo 16 : El citoesqueleto

cortex de actina

lam elipodio

substrato

crtex som etido a tensin

la polim erizacin de la 1 actina en los extremos ms extiende el lam elipodio

m ovim iento de la actina no polimerizada retraim iento

contactos focales

Figura 16-80 Modelo que explica cm o las fuerzas generadas en el crtex rico en actina podran desplazar la clula hacia adelante. La extensin dependiente de actina y la fijacin de un lamelipodio en el borde frontal de avance estiraran el crtex de actina. La tensin cortical dirigira el cuerpo de la clula hacia adelante disipando parte de la tensin. Se forman nuevos contactos focales y los viejos se desensamblan mientras la clula se mueve hacia adelante. Este mismo ciclo se repetira una y otra vez, desplazando la clula hacia adelante de una forma gradual. Se muestra en rojo la actina cortical polimerizada nuevamente.

que ha sido sugerida a partir del movimiento de amebas gigantes, y es que las protrusiones aparezcan en el frente celular mediante la presin hidrosttica ge nerada por la contraccin del crtex celular. La adhesin al substrato de los filamentos de actina corticales se ha discuti do anteriormente cuando se describan los contactos focales, aunque hay es tructuras de adhesin especializadas presentes en los fibroblastos en cultivo que estn asociadas a los extremos de las fibras de estrs. Rpidamente las clulas mviles -com o las amebas Dictyostelium y los glbulos blancos- realizan ms contactos difusos con el substrato. Se cree que a estos contactos pueden aplicar se principios similares: receptores transmembrana de protenas de la matriz extracelular unen la membrana plasmtica con el substrato, y los filamentos de ac tina del citoplasma interactan con los dominios citoplasmticos de estos receptores a travs de las protenas de unin a la actina. Se desconocen an al gunos de los detalles de estas interacciones tan importantes, pero est claro que los contactos celulares con el substrato deben estar formndose y rompindose continuam ente mientras la clula se mueve. La traccin es quizs la parte ms enigmtica del movimiento celular. En muchos casos se cree que la fuerza para la locomocin celular se genera cerca del extremo anterior de la clula y que el ncleo y el volumen citoplasmtico son arrastrados pasivamente en este movimiento. Se puede observar esta fuerza ge neradora de distintas formas. El extremo anterior de una clula puede contraer se activamente igual que una fibra muscular y entonces tirar de la parte trasera de la clula. Desde otro punto de vista, la polimerizacin de los filamentos de ac tina en el borde frontal de avance de la clula extiende tambin el crtex de acti na hacia adelante, y la parte trasera de la clula es entonces arrastrada hacia adelante por la fuerza contrctil resultante de la tensin cortical (Figura 16-80).

El m ecanism o de la locom ocin celular puede ser diseccionado genticam ente 52

Una de las vas ms poderosas para analizar el mecanismo de procesos celulares complejos es examinar el efecto de las mutaciones que resultan de supresiones, sobreexpresiones, o modificaciones de protenas especficas. En el caso del movi miento de las clulas animales, las clulas ameboides del moho del cieno Dictyos telium son particularmente adecuadas para los anlisis genticos. Estas clulas tienen una forma y una manera de desplazarse que est ntimamente relacionada con la de las clulas de los organismos superiores. Adems son haploides y, por

Protenas de unin a la actina

907

tanto, son fcilmente manipulables mediante mtodos de gentica inversa. Por tanto, en estas clulas ha sido posible suprimir un nmero importante de prote nas de unin a la actina y examinar su efecto sobre la locomocin celular. Por ejemplo, el papel de la miosina-II ha sido comprobado genticamente mediante dos mtodos. En uno, se ha substituido el gen de la miosina-II por una forma defectiva de este gen, mediante recom binacin homologa (vase Figura 747), comportando la aparicin de un mutante sin miosina-II. La segunda estrate gia es la de utilizar RNA antisentido (vase Figura 7-43) para inactivar el mRNA de la miosina-II, lo cual tiene esencialmente el mismo efecto que la estrategia ante rior. En un Dictyostelium normal que se desliza, la miosina-II est concentrada cerca de la parte trasera de la clula mientras que la miosina-I se concentra en el extremo anterior (Figura 16-81). En los mutantes, la miosina-I no ha cambiado pero no existe la miosina-II. Es de destacar que las clulas de Dictyostelium sin miosina-II pueden despla zarse todava sobre el substrato y responder quimiotcticamente a una fuente de AMP cclico, aunque ambos procesos estn algo alterados. Por tanto, la miosinaII no es absolutamente imprescindible para la locomocin celular. La actividad protrusiva del extremo anterior de tales mutantes es bastante normal, pero el movimiento del cuerpo celular hacia adelante no es tan normal, lo cual sugiere que la miosina-II puede jugar un papel en la generacin de la traccin. De todas formas, la miosina-I y la polimerizacin de la actina pueden conducir la clula hacia adelante a una velocidad razonable sin la ayuda de la miosina-II. Como era de esperar, las clula mutantes son incapaces de formar el anillo contrctil despus de la mitosis y entonces se forma una clula gigante multinucleada. Estas clulas se dividen finalmente utilizando la locomocin celular que las rompe en dos partes. Es interesante especular que esta citocinesis depen diente del movimiento puede representar un m ecanismo de divisin celular pri mitivo y que la miosina-II podra haber evolucionado a partir de la miosina-I mediante seleccin natural, formando un aparato citocintico ms eficiente.

5 |jm
Figura 16-81 La localizacin de la miosina-I y de la miosina-II en una ameba deslizante normal de Dictyostelium. Se han marcado las dos formas de la miosina con anticuerpos especficos, cada uno acoplado a un marcador fluorescente distinto, y se han observado con el microscopio de fluorescencia. La miosina-II {rojo) se presenta a una elevada acumulacin en el crtex posterior, mientras que la miosina-I {verde) est principalmente restringida al extremo anterior. Tambin puede verse algo de miosina en vesculas endocticas dentro del citoplasma. (Por cortesa de Yoshio Fukui.)

Resumen
Las mltiples formas y variadas funciones de la actina en las clulas eucariotas de penden de un repertorio verstil de protenas de unin a la actina que entrecruzan los filamentos de actina formando geles laxos, los unen en forma de haces rgidos, los adhieren a la membrana plasmtica, o los desplazan a la fuerza uno respecto al otro. Por ejemplo, la tropomiosina se une a lo largo de los filamentos de actina, convirtindolos en estructuras ms rgidas y alterando su afinidad hacia otras pro tenas. La filam ina entrecruza los filamentos de actina formando geles laxos. La fim brinay la a-actininia form an haces de filamentos de actina paralelos. La gelsolina media una fragmentacin dependiente de Ca2+ de los filamentos de actina, lo que provoca la solacin de los geles de actina. Diversas formas de miosina utilizan la energa de la hidrlisis del ATP para desplazarse a lo largo de los filamentos de actina, transportando orgnulos rodeados de membrana de una regin a otra de la clula o desplazando filamentos de actina adyacentes, uno contra otro. Se cree que colecciones de protenas de unin a la actina actan cooperativamente generando movimientos de la superficie celular, incluyendo la citocinesis, la fagocitosis y la lo comocin celular. Estos movimientos son difciles de analizar a causa de los mu chos componentes implicados en ellos, pero aproximaciones genticas, en las cuales se han mutado los genes que codifican protenas de unin a la actina especficas, pueden mostrar la juncin individual de las protenas en cada proceso.

El msculo53
Muchas de las protenas que se asocian a los filamentos de actina en las clulas eucariotas fueron descubiertas por primera vez en el msculo. La contraccin muscular es el movimiento ms familiar y mejor conocido de todos los tipos de

908

Captulo 16: El citoesqueleto

ncleo

m iofibrilla

Figura 16-82 Clulas del msculo esqueltico (tambin denominadas fibras musculares). (A) En un individuo humano adulto, estas enormes
clulas plurinucleadas tienen tpicamente 50 pm de dimetro y pueden llegar a tener algunos centmetros de longitud. (B) Micrografa fluorescente que muestra la localizacin perifrica del ncleo en el msculo de la rata (azul). (B, por cortesa de Nancy L. Kedersha.)

50 |jm
movimiento de que son capaces los animales. En los vertebrados, por ejemplo, el correr, el andar, el nadar y el volar son dependientes de la capacidad del ms culo esqueltico de contraerse rpidamente en su andamiaje de hueso, mientras que los movimientos involuntarios tales como el latido del corazn y el peristaltismo del intestino, dependen de la contraccin del msculo cardaco y del ms culo liso, respectivamente. Figura 16-83 Miofibrillas del msculo esqueltico. (A) Electronmicrografa a bajos
aumentos de una seccin longitudinal de una fibra muscular esqueltica de conejo, mostrando el patrn regular de bandas transversales. La clula contiene numerosas miofibrillas alineadas en paralelo (vase Figura 16-82). (B) Detalle de la fibra muscular esqueltica de (A), mostrando porciones de dos miofibrillas adyacentes y la definicin de sarcmero. (C) Diagrama esquemtico de un sarcmero, mostrando el origen de las bandas oscuras y de las bandas claras observadas en las electronmicrografas. Los discos Z, en cada extremo del sarcmero, son los lugares de unin de los filamentos delgados (filamentos de actina); la lnea M, o lnea media, es el lugar donde se localizan las protenas especficas que unen los filamentos gruesos adyacentes (filamentos de miosina-II) unos con otros. Las b an d as verdes an chas, que marcan la localizacin de los filamentos gruesos, son denominadas a veces b a n d as A, porque aparecen como anistropas a la luz polarizada (es decir, su ndice de refraccin vara con el plano de polarizacin). Las b an d as rojas delgadas, formadas nicamente por filamentos delgados y con una densidad de protenas menor, son relativamente isotrpicas a la luz polarizada, y a veces se denominan b an d as I. (A y B, por cortesa de Roger Craig.)

disco Z f

banda oscura banda clara --------------) I-------------- 1 miofibrilla miofibrilla

(B)

sarcmero -2.2 um

- --

banda clara banda oscura banda clara

filam ento grueso (m iosina) filam ento delgado (actina)

(C )

El msculo

909

Figura 16-84 Electronmicrografa de una seccin transversal del msculo de vuelo de un insecto. Los filamentos
de actina y de miosina estn dispuestos siguiendo una regularidad cristalina. A diferencia de lo que ocurre en los vertebrados, los filamentos gruesos son huecos, tal com o se observa en la ampliacin de la derecha. En la Figura 16-86 se muestra una seccin longitudinal del msculo. La geometra de la trama hexagonal es ligeramente diferente en el msculo de los vertebrados. (De J. Auber, J. d e M icrosc. 8:197-232,1969.)

t____________________ I 1 ijm

Aunque el msculo es el ejemplo m ejor comprendido del movimiento basa do en la actina, fue desarrollado relativamente tarde en la evolucin y est alta mente especializado si lo comparamos en las diversas clulas animales. En par ticular, las unidades contrctiles de las clulas musculares, basadas en la actina y en la miosina, las miofibrillas, no son lbiles como las estructuras basadas en la actina y en la miosina de las clulas no musculares.

Las m iofibrillas estn formadas por ensam blajes repetitivos de filam entos gruesos y delgados 54
Las esbeltas fibras musculares del msculo esqueltico son enormes clulas in dividuales formadas durante el desarrollo embrionario, resultantes de la fusin de clulas individuales (discutido en el Captulo 22). El ncleo de las clulas in tegrantes permanece en esta gran clula y se dispone justo debajo de la m em brana plasmtica. Pero la mayor parte del citoplasma (unas dos terceras partes de su masa) est formado por m iofibrillas, que son los elementos contrctiles de la clula muscular. Las miofibrillas son estructuras cilindricas de 1 a 2 pm de dimetro, que a menudo son tan largos com o la clula muscular (Figura 16-82). Cada miofibrilla est formada por una cadena de minsculas unidades con trctiles, o sarcm eros, cada uno de ellos de unas 2,2 pm de longitud, que confie ren a la miofibrilla de los vertebrados su apariencia estriada. A gran aumento, en cada sarcmero puede verse una serie de anchas bandas claras y oscuras; cada sarcmero est separado del siguiente por una lnea electrodensa, situada en el centro de cada banda clara, denominada lnea Z o disco Z (Figura 16-83). Cada sarcmero contiene un ensam blaje de filamentos parcialmente super puestos y paralelos. Los filam entos delgados estn formados por actina con pro tenas asociadas que estn unidas a los discos Z en uno de los extremos del sar cmero. Se extienden hacia el interior del sarcmero, donde se superponen con los filamentos grueso, que son polmeros de isoformas de la miosina-II especfi cas del msculo (Figura 16-83C). Cuando se observa al microscopio electrnico un corte transversal de esta regin de superposicin, se puede ver que los fila mentos gruesos se hallan dispuestos siguiendo una trama hexagonal regular, con los filam entos delgados dispuestos regularmente entre ellos (Figura 16-84).

La contraccin se produce por el deslizamiento de los filam entos de m iosina y de actina entre s
El acortam iento del sarcmero se produce por el deslizamiento de los filamen tos de miosina sobre los de actina, sin que se produzca ningn cambio en la Ion-

910

Captulo 16: El citoesqueleto

filam ento delgado

filam ento grueso

Figura 16-85 Modelo de deslizamiento de los filamentos de la contraccin muscular. Los filamentos
de actina y de miosina se deslizan unos sobre otros, sin que se reduzca su longitud.

gitud de cada tipo de filamento (Figura 16-85). Este modelo de deslizamiento de los filamentos, propuesto por primera vez en 1954, fue crucial para entender el mecanismo de la contraccin muscular. En las micrografas electrnicas a gran aumento se puede observar la base ultraestructural de la interaccin generadora de la fuerza. Se puede observar cm o los filamentos de m iosina presentan numerosos brazos laterales dimi nutos, o puentes cruzados, que atraviesan la separacin de unos 13 nm, en trando en contacto con los filam entos de actina adyacentes (Figura 16-86). Es tos puentes cruzados son las cabezas de la miosina-II, y cuando el msculo se contrae, los filam entos de actina y de miosina se em pujan los unos a los otros mediante la accin cclica de los puentes cruzados, a modo de bateras de di minutos remos. Como ya hemos mencionado anteriormente, la cabeza globular, o dominio motor, de la molcula de miosina-II se une a los filamentos de actina e hidroliza ATP. Las cabezas de miosina-II aisladas, que pueden prepararse mediante diges tin con papana, retienen tanto la actividad ATPasa como las propiedades de unin al filamento de actina y pueden utilizarse para analizar la interaccin en tre la actina y la miosina. Cada molcula de actina de un filamento es capaz de unir una cabeza de miosina-II formando un complejo que permite ver la polaridad estructural del filamento de actina. Mediante tinciones negativas, estos complejos se pueden observar al microscopio electrnico y tienen una forma regular y caracterstica: cada cabeza de miosina forma una proyeccin lateral y la imagen superpuesta de muchas de estas proyecciones toma la apariencia de unas cabezas de flecha a lo largo de los filamentos de actina. El extremo puntiagudo creado por estas fle-

discoZ

ac,ina

miosina

linea M

Figura 16-86 Electronmicrografa de una seccin longitudinal del msculo de vuelo de un insecto. Esta seccin
ultrafina muestra claramente la alternancia entre los filamentos de actina y de miosina, as com o los puentes que los unen. Vase que el msculo de vuelo de un insecto tienen un elevado grado de superposicin inusual entre los dos tipos de filamentos. (Por cortesa de Mary C. Reedy.)

100 nm
El msculo 911

extremo menos

exlrcmo ms

extrem o menos

(A) extremo ms
100 nm

extremo menos

(B)

extrem o ms

i____ _____________ 1

Figura 16-87 Filamentos de actina decorados con cabezas aisladas de miosina. (A) En la electronmicrografa la disposicin helicoidal de las cabezas de miosina unidas, inclinadas siguiendo una sola direccin, confiere al conjunto una apariencia de puntas de flecha y pone de manifiesto la polaridad del filamento de actina. El extremo de la punta corresponde al extrem o m enos, mientras que el extremo ancho corresponde al extrem o m s. (B) Reconstruccin tridimensional a partir de las micrografas electrnicas, de un filamento de actina decorado de una manera parecida. La regin que se muestra corresponde al rea marcada en (A). El filamento de actina se muestra en rojo, las cabezas de miosina son am arillas, las cadenas ligeras de miosina son grises, y la posicin de la tropomiosina se muestra en m ora d o. (A, por cortesa de Roger Craig; B, por cortesa de Ron Milligan.)

chas de miosina corresponde al extremo m enos, de crecimiento lento, del fila mento de actina descrito anteriormente (vase pg. 880). El otro, el extremo bar bado, corresponde al extremo m s, de crecimiento rpido (Figura 16-87). Como se muestra en la Figura 16-88, las cabezas de miosina se orientan en direcciones opuestas a cada lado de la zona central desnuda del filamento de

cabezas de m iosina

I____________________

500 nm

10 nm

Figura 16-88 El filamento grueso de miosina. (A) Electronmicrografa de un filamento grueso de miosina-II aislado de un msculo de rana. Ntese la zona central desnuda. (B) Diagrama esquemtico, no dibujado a escala. Las molculas de miosina-II se agregan conjuntam ente a travs de sus colas, de forma que sus cabezas se proyectan hacia el exterior. La zona desnuda del centro del filamento est formada enteram ente por colas de miosina-II. (C) Pequea seccin de un filamento de miosina-II, reconstruido a partir de electronmicrografas. Se ha dibujado en verde una molcula individual de miosina. (A, por cortesa de Murray Stewart; C, basado en R.A. Crowther, R. Padrn, y R. Craig, /. Mol. Biol. 184:429-439, 1985.)

912

Captulo 16: El citoesqueleto

sarcm ero

los filam entos gruesos de m iosina invierten su polaridad

sobre el extrem o del disco Z

miosina-II. Dado que las cabezas deben interactuar con los filamentos de actina en la regin de solapamiento, los filamentos de actina han de tener polaridades opuestas a cada lado del sarcmero. Esto ha sido demostrado utilizando cabezas de miosina para decorar los filamentos de actina unidos a discos Z aislados. Se encontr que todas las puntas de flecha de la miosina apuntaban en direccin opuesta a las bandas Z mientras que los extremos menos apuntaban hacia los fi lamentos de miosina (Figura 16-89).

Figura 16-89 A cada lado de la lnea media de un sarcmero los filamentos de miosina y de actina se solapan con la misma polaridad relativa.

Las cabezas de m iosina cam inan hacia el extremo menos de los filam entos de actina 55
La contraccin muscular est impulsada por la interaccin entre las cabezas de miosina y los filamentos de actina adyacentes. Durante esta interaccin, la cabe za de miosina hidroliza ATP. La hidrlisis del ATP y la disociacin consiguiente de los productos fuertemente unidos (ADP i P) producen una serie ordenada de cambios alostricos en la conformacin de la miosina. Como resultado de todo ello, parte de la energa liberada se acopla a la produccin de movimiento. Un mayor avance en la comprensin de estos cambios en la estructura proteica y tam bin en la comprensin de cmo la hidrlisis del ATP est acoplada al movi miento direccionado de la molcula de miosina, se obtuvo con la determinacin de la estructura tridimensional de la cabeza de la miosina mediante difraccin de rayos X (Figura 16-90). Con stos y otros datos, esta estructura sugiere que el movimiento unidireccional se genera mediante la secuencia de acontecim ientos ilustrada en la Figura 16-91. Dado que cada vuelta del ciclo que se ilustra en la Figura 16-91 resulta de la hidrlisis y liberacin de una molcula de ATP, las series de cambios conformacionales que acabamos de describir estn impulsados por un cambio de energa libre muy favorable, que los hace unidireccionales. Por consiguiente, cada m ol cula de miosina cam ina en una nica direccin a lo largo del filamento de acti na adyacente, desplazndose siempre hacia el extremo ms del filamento (vase Figura 16-89). Al sufrir un cambio cclico de conformacin, la cabeza de miosina va estirando el filamento de actina, haciendo que ste se deslice sobre el fila mento de miosina. Cuando una cabeza individual de miosina se ha separado del filamento de actina, es arrastrada por la accin de las otras cabezas de miosina del mismo filamento de miosina, de modo que una fotografa instantnea de todo un filamento de miosina de un msculo en contraccin mostrara algunas de las cabezas de miosina unidas a los filamentos de actina, mientras que otras estaran separadas. (Para que esto suceda es esencial que exista un cierto grado de elasticidad en el salto de las molculas de miosina.) Cada filamento de miosi na tiene aproximadamente unas 300 cabezas de miosina (294 en el msculo de la rana); en una contraccin rpida cada una de ellas realiza unos 5 ciclos por se gundo -e l deslizamiento de los filamentos de miosina sobre los de actina tiene lugar a velocidades superiores a 15 pm/segundo.

El msculo

913

Figura 16-90 Modelo espacial de la cabeza de la miosina muscular. El modelo est orientado de manera que la superficie de unin a la actina se encuentra en la esquina derecha de la parte inferior. Los tres dominios de la cadena pesada de la miosina se han marcado en verde, rojo y azul, respectivamente, mientras que las dos cadenas ligeras se han marcado en amarillo y morado. (De I. Rayment et al., Science, 261:50-58,1993. 1993 the AAAS.)

filamento de actina
UNINAl iniciarse el ciclo que se muestra en la figura,

extremo menos cabeza de miosina

extremo ms

UNION

una cabeza de miosina, sin ningn nucletido unido, se une fuertemente a un filamento de actina en una configuracin d e r i g o r (as llamada porque es la responsable del r i g o r m o r t i s , la rigidez de la muerte). En un msculo en contraccin activa este estado es de corta duracin y finaliza rpidamente mediante la unin de una molcula de ATP.

LIBERACIN

filamento grueso de miosina

LIBERACIN Una molcula de ATP se une en el surco de la "parte trasera" de la cabeza (es decir, en la parte ms alejada del filamento de actina) e inmediatamente provoca un cambio ligero en la conformacin de los dominios, que libera el lugar de unin a la actina (vase Figura 16-90). Esto reduce la afinidad de la cabeza por la actina y le permite desplazarse a lo largo del filamento. (El espacio aqu dibujado entre la cabeza y la actina enfatiza este cambio, aunque en la realidad probablemente se mantiene muy cerca de la actina.)

HIDRLISIS
MOVIMIENTOEl surco se cierra como la concha de una

almeja alrededor de la molcula de ATP, induciendo un gran cambio morfolgico que provoca el desplazamiento de la cabeza a lo largo del filamento a una distancia de unos 5 nm. Se produce la hidrlisis del ATP, pero el ADP y el P producidos se mantienen ntimamente unidos a la protena.

MOVIMIENTO

GENERACIN DE LA FUERZALa unin dbil de la

GENERACIN DE LA FUERZA

cabeza de miosina a un nuevo lugar en el filamento de actina provoca la liberacin del fosfato inorgnico producido por la hidrlisis del ATP, con lo cual se refuerza la unin de la cabeza con la actina. Esta liberacin proporciona el golpe de potencia el cambio de forma generado por la fuerza durante el cual la cabeza recupera su conformacin original. Durante el golpe de potencia, la cabeza pierde el ADP unido y se inicia un nuevo ciclo.

GOLPE DE POTENCIA

UNINAl final del ciclo, la cabeza de miosina se encuentra de nuevo ntimamente unida al filamento de actina en la configuracin de rigor. Ntese que la cabeza se ha desplazado hacia una nueva posicin en el filamento de actina.

UNION

Figura 16-91 El ciclo de cambios por los cuales una molcula de miosina camina a lo largo de un filamento de actina. (Basado en I. Rayment et al., Science 261:50-58, 1993. 1993 the AAAS.)

914

Captulo 16 : El ctoesqueleto

La contraccin muscular se inicia por un aumento repentino de la concentracin de Ca2+ citoslico 56

La fuerza que genera la interaccin molecular que acabamos de describir slo tiene lugar cuando una seal procedente del nervio motor pasa al msculo es queltico. La seal procedente del nervio dispara un potencial de accin en la membrana plasmtica de la clula muscular, y esta excitacin elctrica se trans mite rpidamente a travs de una serie de pliegues membranosos, los tbulos transversales, o tbulos T, que son invaginaciones de la membrana plasmtica de la fibra muscular que penetran hacia el interior de la clula. A continuacin, la seal se transfiere, de alguna manera, al retculo endoplasm tico, una capa adyacente de vesculas aplanadas y anastomosadas que rodea cada miofibrilla como una funda (Figura 16-92A). En la regin de unin, grandes canales de liberacin de Ca2 + se extienden como pilares desde la mem brana del retculo endoplasmtico contactando con la m em brana del tbulo T del otro lado (Figura 16-92C). Cuando diversas prote nas sensibles al voltaje en la membrana del tbulo T se activan por el increm en to del potencial de accin, desencadena la apertura de alguno de los canales de liberacin de calcio, probablemente mediante un acoplamiento m ecnico di recto. Entonces, los iones Ca2 + se escapan del retculo endoplasmtico (donde se alm acenan en grandes cantidades) al lugar de la unin, provocando que se abran ms canales de liberacin de calcio, con lo cual se amplifica la respuesta. El flujo de iones Ca2 + en direccin al citosol, inicia la contraccin de cada una de las miofibrillas. La seal se transmite desde la membrana plasmtica de la fibra muscular hasta cada sarcmero, en cuestin de milisegundos (va los tbulos T y el retcu lo endoplasmtico), por lo que todas las miofibrillas se contraen simultnea mente. El incremento de la concentracin de Ca2+ es transitorio, ya que el Ca2 + es rpidamente bombeado de nuevo hacia el retculo endoplasmtico mediante una ATPasa dependiente de Ca2+ , presente en cantidades abundantes en la mem brana de este retculo sarcoplasmtico (discutido en el Captulo 11). Tpi camente, la concentracin de Ca?+ citoslico se restablece hasta sus niveles de reposo, en unos 30 milisegundos, lo cual provoca la relajacin de las miofibrillas.

Figura 16-92 Los tbulos T y el retculo sarcoplasm tico. (A) Dibujo

esquemtico de los dos sistemas de membrana que transmiten la seal de contraccin desde la membrana plasmtica de la fibra muscular a todas las miofibrillas de la clula. (B) Electronmicrografa que ilustra dos tbulos T. Ntese la posicin de los grandes canales liberadores de Ca2 +en la membrana del retculo sarcoplasmtico; parecen pies de forma cuadrangular que estn conectados a la membrana del tbulo T adyacente. (C) Diagrama esquemtico que muestra cmo puede abrirse un canal liberador de Ca2 +de la membrana del retculo sarcoplasmtico mediante una protena transmembrana sensible al voltaje localizada en la membrana del tbulo T adyacente. (B, por cortesa de Clara Franzini-Armstrong.)

m em brana plasmtica m iofibrilla canales liberadores de Ca2+ tbulos transversales (T) form ados a partir de invaginaciones de la mem brana plasmtica retculo sarcoplasm tii m em brana despolarizada del tbulo T

(B)

|__________________ 0,5 pm protena sensible al voltaje

m em brana r polarizada L del tbulo T CITOSOL mem brana del retculo sarcoplasm tico canales liberadores de Ca

potencial de accin

35 nm

(A)

El msculo

915

com plejo de troponina tropom iosina I ----------------1 I C T

bloqueo del lugar de unin de la m iosina a la actina por la tropom iosina

el m ovim iento de la tropom iosina m ediado por el Ca2+ deja expuesto el lugar de unin a la m iosina

actina + Qa 2+

(A)

10 nm

(B)
Figura 16-93 El control de la contraccin del msculo esqueltico por la troponina. (A) Filamento

La troponina y la tropomiosina median la regulacin de la contraccin del msculo esqueltico por el Ca2+57
La dependencia respecto al Ca2 + de la contraccin muscular de los vertebrados, y por consiguiente su dependencia respecto a las rdenes motoras transmitidas a travs de los nervios, es debida exclusivamente a un grupo de protenas accesorias especializadas, estrechamente asociadas con los filamentos de actina. Si en un tubo de ensayo se mezcla miosina con filamentos de actina purificada, la ATPasa de la miosina se activa tanto si existe Ca2+ en el medio como si no; por otro lado, en una miofibrilla normal, en la que los filamentos de actina estn asociados a protenas accesorias, la activacin de la ATPasa de la miosina es dependiente de Ca2+ . Una de estas protenas accesorias es una forma muscular de la tropomio sina, la molcula en forma de varilla que hemos introducido anteriormente y que se une al surco de la hlice de actina (vase Figura 16-78). La otra protena acce soria principal implicada en la regulacin del msculo esqueltico de los verte brados por el Ca2+ es la troponina, un complejo de tres polipptidos -troponinas T, I, y C (llamadas as por sus actividades de unin a la 7Yopomiosina, actividad Inhibidora, y de unin al Calcio, respectivamente). El complejo de la troponina tiene forma alargada, con las subunidades C e I formando una regin de cabeza globular y la subunidad T formando una cola larga. La cola de troponina T se une a la tropomiosina y, al parecer, es la responsable de situar el complejo sobre el fi lamento delgado (Figura 16-93A). La troponina I se une a la actina, y cuando se aade a la troponina T y a la tropomiosina, el complejo inhibe la interaccin en tre la actina y la miosina, incluso en presencia de Ca2+ . La posterior adicin de troponina C completa el complejo y lo hace sensible al Ca2+. Cada molcula de troponina C une hasta cuatro molculas de Ca2+ ; con el Ca2+ unido se suprime la inhibicin de la unin de la miosina a la actina pro ducida por los otros com ponentes de la troponina. La troponina C est estrecha mente relacionada con la calmodulina, la cual media respuestas sealizadas por Ca2 + en todas las clulas, incluyendo la activacin de la miosina del msculo liso. Por lo tanto, la troponina C puede ser considerada como una forma especializa da de calmodulina que ha desarrollado de forma permanente un lugar de unin a la troponina I y T, asegurando as que la miofibrilla responda de manera extre madamente rpida a un increm ento en la concentracin de Ca2+. En un filamento de actina existe una sola molcula del complejo de troponi na por cada siete m onmeros de actina (vase Figura 16-93A). Estudios estructu rales sugieren que en un msculo en reposo la unin de la troponina I a la actina desplaza las molculas de tropomiosina a una posicin que en un msculo en contraccin activa est ocupada por las cabezas de miosina, inhibiendo as la in teraccin entre la actina y la miosina. Cuando los niveles de Ca2 + aumentan, la troponina C provoca que la troponina I se libere de la actina, permitiendo a las molculas de tropomiosina desplazarse liberamente de tal manera que las cabe zas de miosina puedan unirse al filamento de actina (Figura 16-93B).

delgado que muestra la posicin de la tropomiosina y de la troponina a lo largo del filamento de actina. Cada molcula de tropomiosina tiene siete regiones de secuencias homlogas, espaciadas regularmente. Se cree que cada una de estas secuencias se une a un monmero de actina, tal como se muestra en el dibujo. (B) Un filamento delgado que ilustra cmo la unin del Ca2 +a la troponina se cree que libera el bloqueo de la interaccin de la cabeza de la miosina con la actina. (A, adaptada de G.N. Phillips, J.P. Fillers, y C. Cohn,/. Mol. Biol. 192:111-131, 1986.)

Otras protenas accesorias m antienen la arquitectura de la miofibrilla y le proporcionan su elasticidad 58

La notable velocidad y potencia de la contraccin muscular depende de que los filamentos de actina y de miosina de cada miofibrilla estn dispuestos uno res-

916

Captulo 16: El citoesqueleto

pecto al otro a una distancia ptima y en una alineacin correcta. La organiza cin exacta de la miofibrilla se mantiene gracias a ms de una docena de prote nas estructurales: el orden en que se ensamblan y los controles sobre el proceso son temas importantes de la investigacin contempornea. Los filamentos de actina estn anclados por sus extremos ms en el disco Z, donde se mantienen mediante protenas que forman una trama cuadrangular. Una de las protenas ms importantes de esta regin es la a-actinina, protena que entrecruza la actina, que hemos discutido anteriormente y que es abundante en la mayora de clulas animales. Se concentra en la regin del disco Z de la miofibrilla (Figura 16-94). Los filamentos de miosina estn tambin mantenidos mediante una trama regular -e n este caso, hexagonal- a travs de protenas asociadas que se unen en la zona media, a lo largo de los filamentos gruesos bipolares. Las clulas del msculo esqueltico contienen dos protenas extraordinaria mente abundantes, llamadas titina y nebulina, que forman una red de fibras asociada con los filamentos de actina y de miosina. La titina, que tiene un peso molecular de 3 x 106, es el polipptido ms grande descrito hasta ahora. Las m o lculas de titina, a modo de cuerdas, se extienden desde los filamentos gruesos del disco Z; se cree que actan a modo de muelles manteniendo los filamentos de miosina centrados en el sarcmero (Figura 16-95). Al contrario, la nebulina, que tambin es muy grande, est ntimamente asociada con los delgados fila mentos de actina, y est formada casi enteramente en una secuencia repetida de 35 aminocidos que se unen a la actina. El nmero de estos motivos, y por tanto la longitud total de la molcula de tubulina, es el necesario para extenderse des de un extremo del filamentos de actina hasta el otro. De este modo, la nebulina podra actuar como una regla molecular para regular el ensamblaje de actina y la longitud de los filamentos de actina durante el desarrollo del msculo (vase Figura 3-52). Las miofibrillas se unen unas a las otras, lado a lado, mediante un sistema de filamentos intermedios de desmina, y toda esta disposicin se ancla entonces en la membrana plasmtica de la clula muscular mediante diversas protenas, incluyendo una protena de unin a la actina alargada y flexible, llamada distrofina. Esta protena, que se encuentra ausente en aquellos pacientes con distrofia muscular, tienen un enorme parecido con la espectrina, y puede unir protenas especficas de la membrana muscular a los filamentos de actina de la miofibrilla.

5 |jm
Figura 16-94 Localizacin de la a-actinina en el msculo. Imagen de inmunofluorescencia confocal que muestra un grupo de miofibrillas de clulas del msculo cardaco cultivadas. La actina se ha marcado en rojo con faloidina unida a rodamina, y la a-actinina se ha marcado en verde, con un anticuerpo ligado a fluorescena, pero como la actina y la a-actinina se colocalizan en el disco Z, esta regin aparece realmente como amarilla. (De M.H. Lu et al.,/. CellBiol. 117:1017-1022,1992, con el permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

Figura 16-95 Localizacin de la titina y

de la nebulina en un sarcmero del msculo esqueltico. Cada molcula

La mism a m aquinaria contrctil, en una forma modificada, se encuentra en el msculo cardaco y en el msculo liso 59
Hasta ahora slo hemos explicado uno de los tres tipos principales de msculo presentes en los vertebrados -e l msculo esqueltico. Los otros tipos son el ms culo del corazn (o msculo cardaco ), que se contrae unos 3 mil millones de ve ces en el curso de una vida humana de duracin media, y el msculo liso, que produce las contracciones lentas y prolongadas tpicas de rganos tales como el intestino. Los tres tipos de fibras musculares, conjuntamente con otro tipo de clulas contrctiles conocidas como clulas mioepiteliales (vase Figura 22-36E),

gigante de titina se extiende desde el disco Z hasta la lnea M -una distancia superior a 1 pm. Una parte de cada molcula de titina est ntimamente asociada con las molculas de miosina de los filamentos gruesos; el resto de la molcula es elstico y cambia de longitud mientras el msculo se contrae y se relaja. Cada molcula de nebulina se extiende desde el disco Z a lo largo de la longitud de un filamento de actina delgado y podra determinar la longitud de ste.

disco Z titina lnea M m iosina (filam ento grueso)

nebulina

actina (filam ento delgado)

El msculo

917

disco intercalar

disco Z

Figura 16-96 Estructura del msculo cardaco. Diagrama esquemtico del

CLULA 1

disco Z

\ / disco intercalar m itocondria

CLULA 2

msculo cardaco que muestra dos clulas unidas, extremo con extremo, mediante uniones especializadas conocidas como discos intercalares. Los filamentos de actina de los sarcmeros de clulas adyacentes se insertan en el denso material asociado con la membrana plasmtica de la regin de cada disco intercalar, como si se tratara de discos Z. As, las miofibrillas continan a travs del ncleo, sin tener en cuenta los lmites celulares.

se contraen mediante un m ecanismo de deslizamiento de filamentos de actina y filamentos de miosina. Al igual que el msculo esqueltico, el m sculo del corazn es estriado, re flejando una organizacin de filamentos de actina y de miosina muy similar. Tam bin es estimulado a contraerse mediante un mecanismo parecido: un po tencial de accin de los tbulos T dispara de alguna manera la liberacin de Ca2 + del retculo sarcoplasmtico, lo cual activa la contraccin por medio de un com plejo troponina-tropomiosina. No obstante, las clulas musculares del corazn no son plurinucleadas, y estn unidas por sus extremos mediante unas estructu ras especiales llamadas discos intercalares (Figura 16-96). Los discos intercalares realizan al m enos tres funciones. (1) Unen una clula a la siguiente por medio de desmosomas (discutido en el Captulo 19). (2) Conectan los filamentos delgados de las miofibrillas de las clulas adyacentes (realizando una funcin anloga a la que desempean los discos Z en el interior de las clulas). (3) Presentan uniones de tipo gap que permiten la transmisin rpida del potencial de accin desde una clula a la siguiente, sincronizando las contracciones de las clulas muscu lares cardacas. El tipo de msculo ms primitivo, en el sentido de ser ms parecido a las clulas no musculares, no presenta estriaciones por lo que se le denomina m s culo liso. Forma la porcin contrctil del estmago, del intestino y del tero, las paredes de las arterias, los conductos de las glndulas secretoras y muchas otras regiones en las que es necesaria una contraccin lenta y sostenida. Est formado por capas de clulas alargadas y fusiformes, cada una de las cuales presenta un solo ncleo. Las clulas contienen filamentos de miosina y de actina, pero estos filamentos no estn dispuestos siguiendo la distribucin altamente ordenada del msculo esqueltico y del msculo cardaco, y no forman miofibrillas. Por el contrario, los filamentos forman un aparato contrctil dispuesto de forma ms laxa, que se halla alineado, aproximadamente, con el eje largo de la clula pero que est anclado oblicuam ente a la mem brana plasmtica en uniones discoida les que agrupan conjuntos de clulas. Aunque el aparato contrctil del msculo liso no se contrae tan rpidamen te como las miofibrillas del msculo estriado, tiene la ventaja de permitir un m a yor grado de acortamiento, y por lo tanto, puede producir grandes movimientos a pesar de que no disponga del sistema de palancas que proporciona el anclaje a los huesos. Actualmente se conoce muy poco todava acerca de la organizacin de los filamentos de actina y de los de miosina que hacen esto posible; en la Fi gura 16-97 se presenta un posible modelo al respecto.

En muchas clulas, la activacin de la m iosina depende de la fosforilacin de la cadena ligera de la m iosina 6 0

Los mecanism os contrctiles altamente especializados que acabamos de descri bir en fibras musculares evolucionaron a partir de unos simples mecanismos de

918

Captulo 16 : El citoesqueleto

fibras contrctiles que contienen actina y miosina

fibras de soporte que contienen filam entos interm edios

Figura 16-97 Modelo del aparato contrctil de una clula del msculo liso. Segn esta hiptesis, haces de

lugares de unin de la m em brana plasmtica densam ente teidos

cuerpos densos citoplasm ticos

generacin de fuerza que se encuentran en todas las clulas eucariotas. No es sorprendente que la miosina-II de las clulas no musculares se parezca a la miosina-II de las clulas musculares lisas, el tipo menos especializado de m s culo. Como en el msculo esqueltico y en el cardaco, la contraccin en las c lulas musculares lisas se dispara por un incremento del Ca2 + citoslico; pero, al contrario que en el m ecanism o del msculo esqueltico y del cardaco, la con traccin se inicia principalmente por la fosforilacin de una de las dos cadenas ligeras de la miosina-II, la cual a su vez controla la interaccin de la miosina con la actina. Un m ecanism o parecido regula la actividad de la miosina-II no muscular. Las dos cadenas ligeras de cada cabeza de la molcula de miosina-II (vase Figura 5-23) son diferentes, y slo una de ellas es fosforilada durante la contrac cin no muscular y durante la contraccin del msculo liso. Cuando esta cadena ligera se fosforila, la cabeza de miosina interacta con un filamento de actina por lo que se genera la contraccin; cuando la cadena se desfosforila, la cabeza de mosina tiende a disociarse de la actina y se vuelve inactiva. La fosforilacin est catalizada por la enzima quinasa de la cadena ligera de la miosina, cuya unin requiere la unin de un complejo Ca2 + -calmodulina. Como resultado de ello, la contraccin est controlada por los niveles de Ca2+ citoslicos, tal como ocurre en el msculo esqueltico y en el msculo cardaco (Figura 16-98). La fosforilacin de la cadena ligera puede tener influencia sobre el estado de agregacin de las molculas de miosina-II en la clula, mencionado anterior mente en relacin con la motilidad de las clulas no musculares (vase Figura 16-73). La fosforilacin de la miosina-II se produce de una manera relativamen te lenta, de modo que a menudo la contraccin mxima se alcanza aproximada mente un segundo despus del estmulo (respecto a los pocos milisegundos n e cesarios para el caso de la clula del msculo estriado). Sin embargo, en las clulas musculares lisas y en las no-musculares, la activacin rpida de la con traccin no es importante: en estas clulas las miosinas-II hidrolizan ATP apro-

filamentos contrctiles que contienen actina y miosina [rojo) se hallan anclados por un extremo a los cuerpos densos de la membrana plasmtica, y por el otro extremo, atravesando los cuerpos densos citoplasmticos, se hallan unidos a haces no contrctiles de filamentos intermedios [azul). Los haces contrctiles de actina-miosina se hallan orientados de forma oblicua al eje longitudinal de la clula (el cual, generalmente, es mucho ms largo de lo que aqu se muestra), de forma que su contraccin acorta notablemente la clula. En la figura se presentan nicamente unos cuantos de los haces existentes.

quinasa de la

m iosina con la PROTEINAS INACTIVAS

Figura 16-98 Regulacin de la contraccin del msculo liso por el Ca2+. La contraccin se activa con la

PROTEINAS ACTIVADAS

presencia de Ca2\ por la quinasa de la cadena ligera de la miosina, que cataliza la fosforilacin de un lugar particular en uno de los dos tipos de cadenas ligeras de la miosina. Las molculas de miosina no muscular estn reguladas por el mismo mecanismo (vase Figura 16-73).

El msculo

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rim adam ente 10 veces ms lentam ente que la miosina del msculo esqueltico, lo cual produce un ciclo de unin lento que supone que estas clulas slo pue den contraerse lentamente.

Resumen
La contraccin muscular se produce mediante el deslizamiento de los filamentos de actina respecto los de miosina. La regiones de la cabeza de las molculas de miosina, que se proyectan desde losfilamentos de miosina, inician un ciclo condu cido por el ATP en que se unen a los filamentos de actina adyacentes, y se produce un cambio conformacional que empuja el filamento de miosina contra el filam en to de actina, y entonces se separan. Diversas protenas accesorias especficas facili tan este ciclo en el msculo y mantienen los filamentos de actina y de miosina en disposiciones superpuestas y paralelas con la orientacin correcta para que se produzca el deslizamiento. Otras dos protenas accesorias -troponina y tropomiosina- permiten que la contraccin del msculo esqueltico y del msculo cardaco est regulada por el Ca2+ . En lasfibras del msculo liso, y en la mayora de clulas no musculares, la acti na y la miosina producen la contraccin de una forma similar a la del msculo es queltico y cardaco. Sin embargo, las unidades contrctiles son ms pequeas y menos organizadas en estas clulas; tanto su actividad como su estado de ensam blaje estn controlados por una fosforilacin de la cadena ligera de la miosina de pendiente de Ca2+ .

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Bibliografa

923

Clulas del pice de una raz de una planta, en diferentes estadios del ciclo celular. (Por cortesa de John McLeish.)

El ciclo de divisin celular

im

La general del ciclo . .. i estrategia ... i _ ..

El ciclo celular de los embriones tempranos y la funcin del MPr Las levaduras y la gentica molecular del sistema de control del ciclo celular Controles de la divisin celular en los animales pluricelulares

Las clulas se reproducen duplicando su contenido y luego dividindose en dos. El ciclo de divisin es el medio fundamental a travs del cual todos los seres vi vos se propagan. En especies unicelulares como las bacterias y levaduras, cada divisin de la clula produce un nuevo organismo. En especies pluricelulares se requieren muchas secuencias de divisiones celulares para crear un nuevo indivi duo; la divisin celular tambin es necesaria en el cuerpo adulto para reempla zar las clulas perdidas por desgaste, deterioro o por muerte celular programa da. As, un humano adulto debe producir muchos millones de nuevas clulas cada segundo simplemente para mantener el status quo y, si la divisin celular se detiene - a causa por ejemplo de una dosis elevada de radiacin ionizante- el individuo morir en pocos das. Los detalles de la divisin celular pueden variar, pero existen algunos reque rimientos universales. Lo primero y principal para que se produzcan un par de clulas hijas genticamente idnticas es que el DNA se replique exactamente y que los cromosomas replicados se segreguen en dos clulas distintas (Figura 171). El ciclo celular comprende, como mnimo, el conjunto de procesos que una clula debe llevar a cabo para cumplir estas funciones. La gran mayora de las clulas tambin doblan su masa y duplican todos sus orgnulos citoplasmticos en cada ciclo celular. De este modo, durante el ciclo celular un conjunto com plejo de procesos citoplasmticos y nucleares tienen que coordinarse unos con otros. El problema central es explicar cmo se consigue esta coordinacin. Nuestro conocimiento de la clula ha avanzado muchsimo en los ltimos aos. En el pasado se estudiaba el ciclo celular observando los pasos de la segrega cin cromosmica con un microscopio ptico y siguiendo la replicacin del DNA mediante la medicin de precursores radiactivos incorporados al DNA. El centro de atencin, por lo tanto, eran los cromosomas, y parecan existir grandes diferen cias entre los ciclos celulares de distintos organismos y tipos de clulas. Experi mentos recientes han aportado perspectivas nuevas y ms sencillas, revelando un sistem a de control del ciclo celular que coordina el ciclo en su totalidad. Las pro tenas de este sistema de control aparecieron por primera vez hace ms de mil mi llones de aos y se han conservado tan bien durante su evolucin que muchas de ellas funcionan perfectamente cuando se transfieren de una clula humana a una clula de levadura. Por lo tanto podemos estudiar el sistema de control en una gran variedad de organismos eucariotas y utilizar los descubrimientos de todos ellos para dar una visin unificada de cmo las clulas crecen y se dividen. Este captulo trata de cmo se coordinan y controlan unos con otros los pro cesos del ciclo celular. Otros captulos explican detalladamente estos mismos

SEGREGACION CROMOSMICA REPLICACION CROMOSMICA

Figura 17-1 El ciclo de divisin celular.

925

mitosis transicin de !a metafase a la anafase

replicacin del DNA

procesos pero por separado: Los Captulos 6 y 8 tratan del mecanismo de repli cacin del DNA, y el Captulo 18 describe el aparato citoesqueltico que segrega los cromosomas y divide la clula en dos. Aqu, tras describir brevemente las eta pas del ciclo celular, tratamos los experimentos efectuados en embriones tem pranos de animales y de levaduras que han proporcionado los mayores avances sobre el sistema de control bsico. Luego consideramos cmo actan las seales extracelulares sobre el sistema de control regulando la divisin celular en los or ganismos pluricelulares.

Figura 17-2 Las etapas de la divisin celular vistas al m icroscopio.

La estrategia general del ciclo celular

La duracin del ciclo celular cam bia mucho de un tipo de clula a otro. Los em briones de m osca tienen los ciclos celulares ms cortos que se conocen, cada uno solamente dura 8 minutos, mientras que el ciclo celular de las clulas del h gado de un mamfero puede durar ms de un ao. Sin embargo, comenzamos nuestro tratado con un ejemplo ms tpico y describimos la secuencia de proce sos en una clula de mamfero que se divide bastante ms deprisa, con una du racin del ciclo de unas 24 horas. El ciclo celular se divide tradicionalm ente en varias fases distintas, de las cuales la ms importante es la m itosis, el proceso de divisin nuclear, que nos conducir hasta el mismo mom ento de la divisin celular. Tal como se trata de talladamente en el Captulo 18, durante la mitosis la envoltura del ncleo se descompone, los contenidos del ncleo se condensan formando cromosomas visibles, y los microtbulos se reorganizan formando el huso mittico que final mente separar los cromosomas. Mientras tiene lugar el proceso de la mitosis, la clula parece detenerse brevemente en un estado llamado metafase, en el cual los cromosomas, ya duplicados, se alinean en el huso mittico, preparados para la segregacin. La separacin de los cromosomas duplicados seala el ini cio de la anafase, durante la cual los cromosomas se trasladan a los polos del huso, donde se descondensan y forman un nuevo ncleo. Entonces la clula se divide por el centro en dos mediante un proceso llamado citocinesis, que tradi cionalmente se considera el fin de la fase mittica, o fase M, del ciclo celular (va se Figura 17-2). En la mayora de las clulas, toda la fase M slo dura una hora aproximada mente, lo cual es slo una pequea fraccin de la duracin total del ciclo. El pe rodo que transcurre entre una fase M y la fase siguiente es mucho ms largo y se conoce como la interfase. Al microscopio parece, engaosamente, como un in terludio tranquilo durante el cual la clula aumenta de tamao. Pero otras tcni-

Normalmente, los procesos fcilmente visibles de divisin nuclear (mitosis) y fisin celular (citocinesis), que juntos forman la llamada fase M, ocupan una fraccin pequea del ciclo celular total. La otra parte del ciclo, mucho ms larga, se conoce con el nombre de interfase. En la fase M durante la transicin de la metafase a la anafase tiene lugar un cambio brusco en el estado bioqumico de la clula; una clula puede detenerse en la metafase antes del punto de transicin, pero una vez ha sobrepasado este punto, la clula continuar sin detenerse hasta el fin de la mitosis y a travs de la citocinesis a la interfase.

926

Captulo 17 : El ciclo de divisin celular

Figura 17-3 Las cuatro fases sucesivas del ciclo de una clula eucariota tpica. Durante la interfase

la clula crece continuamente; durante la fase M se divide. La replicacin del DNA se produce nicamente durante la parte de la interfase conocida como la fase S. La fase Gj es un intervalo de tiempo entre la fase M y la fase S; G2es el intervalo entre la fase S y la fase M.

cas demuestran que en realidad la interfase es un perodo muy activo para la c lula en divisin, durante el cual tienen lugar, siguiendo una secuencia muy orde nada, complicados procesos de preparacin para la divisin celular. Particular mente, en el transcurso de la interfase tiene lugar la replicacin del DNA en el ncleo.

La replicacin del DNA nuclear ocurre durante una fase especfica de la interfase: la fase S 1
La replicacin del DNA nuclear slo suele ocupar una parte de la interfase lla mada fase S del ciclo celular (S = sntesis). El intervalo entre la consumacin de la mitosis y el comienzo de la sntesis del DNA se llama la fase G, (G = gap, in tervalo, lapso) y el intervalo entre el final de la sntesis del DNA y el principio de la mitosis se denomina fase G2. G! y G2 proporcionan un tiempo adicional para el crecimiento: si la interfase slo durara lo necesario para que se produjera la replicacin del DNA, la clula no tendra tiempo suficiente para duplicar su masa antes de dividirse. Durante G! la clula supervisa su entorno y su propio tamao y, cuando llega el momento, da un paso decisivo que le conducir a la replicacin del DNA y a la consumacin del ciclo de divisin celular. La fase G2 proporciona un lapso de seguridad, que permite a la clula asegurarse de que la replicacin del DNA se ha completado, antes de lanzarse a la mitosis. Gp S, G2 y M son las subdivisiones tradicionales del ciclo celular tpico (Figura 17-3). Vere mos que la mayora de los ciclos celulares, aunque no todos, se ajustan a este es quema tpico. Debido a que las clulas necesitan un cierto tiempo para crecer antes de separarse, norm alm ente el ciclo celular tpico es bastante largo -p o r ejemplo, 12 horas o ms para tejidos de crecim iento rpido en mamfero. Aunque la du racin de las fases del ciclo son variables dentro de unos mrgenes, en la ma yora de los casos estudiados la variacin ms grande ocurre durante G^ Las clulas en Gj pueden, si no han iniciado la replicacin del DNA, detener su progresin en el ciclo y entrar en un estado de reposo especial, a menudo lla mado G0 (G cero), donde pueden perm anecer durante das, semanas o incluso aos antes de volver a proliferar.

La estrategia general del ciclo celular

92 7

ciclo celular norm al G,

G2

g2

Figura 17-4 El ciclo celular tpico com parado con el ciclo celular del embrin tem prano. En el ciclo del

ciclo celular del em brin tem prano S M S M S M S M S

embrin temprano no ocurre crecimiento, por lo que cada una de las dos clulas hijas producto de cada divisin tiene un tamao de la mitad del de la clula progenitora. La duracin del ciclo es extremadamente corta, las fases M y S se alternan sin que tengan lugar las fases Gi y G2.

Los ciclos de divisin ms breves de todos en eucariotas -m s breves incluso que los de muchas bacterias- son los ciclos celulares de embriones tempranos que tienen lugar en algunos embriones animales poco despus de la fecundacin, y que sirven para subdividir una clula huevo gigante en muchas clulas ms pe queas, tan rpidamente como sea posible. En estos ciclos no hay crecimiento, las fases G, y G2 se acortan drsticamente, y el perodo entre una divisin y la si guiente oscila entre 8 y 60 minutos, de los cuales la mitad se dedican a la fase S y la otra mitad a la fase M (Figura 17-4). Ms adelante trataremos sobre estos ci clos de embriones tempranos. Cmo podemos saber en qu fase del ciclo se encuentra una clula? Las c lulas en fase S son reconocibles si les suministramos molculas marcadas de timidina -u n compuesto que las clulas utilizan exclusivamente para la sntesis del DNA. Las marca puede ser radiactiva, normalmente en la forma de timidina- 3H, o qumica, generalmente en forma de bromodeoxiuridina (BrdU), un anlogo artifi cial de la timidina. Los ncleos celulares que han incorporado dichos compuestos se reconocen mediante autorradiografa (Figura 17-5) o aadiendo anticuerpos anti-BrdU, respectivamente. Generalmente, en una poblacin de clulas en creci miento que estn proliferando rpida pero asincrnicamente, cerca del 30% de ellas se encuentra en algn momento de la fase S y, por lo tanto, quedarn m arca das por un breve pulso del precursor del DNA. Partiendo de la fraccin de clulas que queden marcadas (el ndice de mareaje ), se puede calcular la duracin de la fase S como una fraccin del ciclo completo. Igualmente, partiendo de la fraccin de clulas detectadas en mitosis (el ndice mittico ), se puede calcular la duracin de la fase M como una fraccin del ciclo completo. En resumen, aadiendo un pulso de timidina-3H o BrdU y permitiendo continuar a las clulas dentro del ci clo durante perodos de tiempo determinados, podemos establecer cunto tarda una clula en fase S en progresar por G2hasta la fase M, a travs de la fase M hasta G, y, finalmente a travs de Gj hasta volver a la fase S. Alternativamente, se puede establecer en qu fase del ciclo est una clula midiendo su contenido de DNA, que se dobla durante la fase S. Esta operacin
Figura 17-5 Mareaje de las clulas en fase S por autorradiografa. El tejido

20 |jm
928 Captulo 17 : El ciclo de divisin celular

ha sido expuesto durante un perodo corto de tiempo a timidina-3H. La presencia de granos de plata (puntos negros) en la emulsin fotogrfica sobre el ncleo indica que la clula ha incorporado timidina-3H al DNA del ncleo, y que esto ocurri en la fase S, en algn momento durante el perodo de mareaje. En esta preparacin del epitelio sensorial del odo interno, la presencia de una clula en fase S evidencia la proliferacin de clulas que tiene lugar como respuesta al dao sufrido. (Cortesa de Mark Warchol y Jeffrey Corwin.)

Figura 17-6 Anlisis del contenidos de DNA con un citofluormetro de flujo separador. El grfico muestra los resultados caractersticos obtenidos sobre

una poblacin celular en crecimiento cuando se determina el contenido de DNA de sus clulas. En este caso el citofluormetro de flujo separador (vase Figura 4-31) no se utiliza para clasificar las clulas sino slo para realizar mediciones de ellas. Las clulas se tifien con un colorante que se hace fluorescente cuando se une al DNA, por lo tanto la cantidad de fluorescencia es directamente proporcional a la cantidad de DNA en cada clula. Las clulas se reparten en tres categoras: aquellas que tienen todo su DNA sin replicar de nuevo (una unidad arbitraria) y, por lo tanto, estn en fase G,, aquellas que tienen todo su DNA replicado por completo (dos unidades arbitrarias), y por lo tanto estn en fase G2o fase M, y aquellas que tienen una cantidad intermedia de DNA, por lo que estn en fase S. En el caso que se ilustra, la distribucin de clulas indica que el nmero de clulas en Gt es mayor que el de clulas en G2+ M, lo cual implica que en este caso la poblacin es mayor en Gj que en G2+ M.

clulas en fase Gi

j |

2
e

clulas en fase G2 y fase M

se ve facilitada en gran manera con la utilizacin de un citofluormetro de flujo separador (Figura 17-6), el cual permite analizar grandes cantidades de clulas automticamente. Se puede ir ms all y establecer la duracin de G,, y de las fases S y G2 + M estudiando una poblacin seleccionada de clulas por estar to das en una misma fase y, utilizando las mediciones de contenido de DNA, para seguir el proceso posterior de estas clulas a lo largo del ciclo.

cantidad relativa de d n a por clula (unidades arbitrarias)

Paralelamente al crecim iento continuo de la clula, durante el ciclo celular se producen una serie de procesos discretos 2
En condiciones que favorezcan el crecimiento, el total de protena contenido en una clula normal aumenta ms o menos continuam ente durante el ciclo. De la misma forma, la sntesis del RNA contina a una frecuencia regular, excepto du rante la fase M, cuando los cromosomas estn aparentem ente demasiado condensados para permitir su transcripcin. Si se analiza el patrn de sntesis de las protenas individuales, se ve que la gran mayora de ellas se sintetizan durante todo el ciclo. Por lo tanto, el crecim iento de la mayora de los com ponentes de la clula es un proceso tranquilo y continuo, slo interrumpido brevemente por la fase M, cuando el ncleo y la clula se dividen en dos. La sntesis del DNA y los pasos visibles de la mitosis no son, sin embargo, los nicos procesos discontinuos que tienen lugar, frente a este crecim iento continuo generalizado. El centrosoma, por ejemplo, ha de ser duplicado duran te la preparacin de la mitosis, de forma que pueda formar los dos polos del huso mittico (vase Figura 17-2). La produccin de unas cuantas -aunque muy p ocas- protenas clave para el proceso, se acelera enormem ente en una fase de terminada del ciclo. Por ejemplo las histonas, que se requieren para la forma cin de cromatina, se forman a una velocidad muy alta slo durante la fase S, y lo mismo ocurre con algunas enzimas que sintetizan los desoxirribonucletidos y replican el DNA. La activacin e inhibicin de la expresin de genes y el comienzo y la deten cin de procesos tales como la sntesis del DNA y la mitosis son las consecuencias evidentes de una serie de transiciones repentinas en el control del ciclo celular, mucho ms difciles de observar, cuyos principios discutimos a continuacin.

Un sistem a de control central desencadena los procesos esenciales del ciclo celular 3
En lo que refiere a su control, el ciclo celular acta como una lavadora automti ca. Las funciones de una lavadora automtica son introducir agua y detergente, lavar la ropa, aclararla y centrifugarla hasta secarla. Los procesos bsicos del ci clo de una lavadora son anlogos a los procesos esenciales de: replicacin del

La estrategia general del ciclo celular

92 9

M A Q U I N A R I A D E L A M I T O S I S - v e a s e C a p it u lo 18

puesta en marcha de la m aquinaria de la m itosis

progresin a travs de la transicin de la metafase a la anafase

Figura 17-7 El control del ciclo celular. Los procesos bsicos tales

como la replicacin del DNA, la mitosis y la citocinesis, se ponen en marcha mediante un sistema de control central del ciclo celular. Si efectuamos una analoga con una lavadora automtica, el sistema de control se equiparara a un indicador que gira en la direccin de las agujas del reloj, desencadenando los procesos bsicos cuando alcanza puntos determinados del dial exterior.

puesta en marcha de la m aquinaria de la replicacin

I
MAQUINARIA DE LA REPLICACIN DEL DNA - veanse Captulos 6 y 8

DNA, mitosis etc., del ciclo celular (Figura 17-7). En ambos casos un controlador central inicia cada proceso en el momento oportuno, siguiendo una secuencia especfica. Aunque el controlador podra en principio actuar como un simple re loj que asignara un tiempo fijo a cada proceso, tanto en la lavadora automtica com o en el ciclo celular, normalmente el propio controlador est regulado por retroalimentacin, en ciertos m omentos crticos del ciclo, por los procesos que se estn efectuando. Dentro de la lavadora, unos sensores miden el nivel del agua, y envan seales de retorno al controlador para evitar que el siguiente pro ceso com ience antes de que el anterior haya terminado. Sin esta retroalimenta cin el retraso o la interrupcin en cualquiera de estos procesos podra provocar un desastre. La distincin entre el sistema de control y la maquinaria que lleva a cabo los procesos bsicos del ciclo celular no fue admitida mayoritariamente hasta hace poco. Por el contrario, se crea que cada uno de los procesos principales poda, de alguna manera, desencadenar por s mismo el siguiente proceso, como en una cadena de fichas de domin cayndose (Figura 17-8). El punto de inflexin en nuestro conocim iento vino con la identificacin de los componentes funda mentales del sistema de control central del ciclo celular y el reconocim iento de que eran distintos de las molculas que efectan los procesos bsicos de la repli cacin del DNA, la segregacin cromosmica, etc. El sistem a de control del ciclo celular es un dispositivo bioqumico que ac ta cclicam ente, compuesto por un conjunto de protenas interactivas que in ducen y coordinan los procesos subordinados bsicos que duplican y dividen los contenidos de la clula (subordinados en este contexto simplemente significa

Figura 17-8 Dos concepciones alternativas del control del ciclo de control celular. Las fichas verdes

representan los procesos bsicos del ciclo celular, tales como la replicacin del DNA, la condensacin cromosmica, la formacin del huso, etc. En (A) la ejecucin de un proceso desencadena la del siguiente, como en una cadena de fichas de domin que se van cayendo. En (B) los procesos no se acoplan directamente sino que se suceden consecutivamente debido a un mecanismo de control que funciona independientemente. El mecanismo mostrado en (B) corresponde mejor al ciclo celular real, en el que un mecanismo de control cclico, que denominaremos el sistema de control del ciclo celular, pone en marcha los procesos subordinados del ciclo.

930

Captulo 17: El ciclo de divisin celular

m aquinaria de la replicacin del DNA entorno Est todo el DNA replicado? Es favorable el entorno? Es la clula bastante grande? crecim iento celular PUNTO DE CONTROL G2 I ENTRADA EN M Estn todos los crom osom as alineados en el huso?

m aquinaria de la m itosis

Figura 17-9 Puntos de control y entradas de informacin reguladora al sistema de control del ciclo celular.

PUNTO DE CONTROL DE LA METAFASE SALIDA DE M

La retroalimentacin de los procesos subordinados y las seales del entorno pueden impedir que el sistema de control pase por ciertos puntos de control especficos. Los puntos de control ms importantes estn donde el sistema activa los procesos marcados en recuadros amarillos.

PUNTO DE CONTROL Gi Es la clula bastante grande? Es favorable el entorno?

crecim iento celular

entorno

que dichos procesos ocupan una posicin inferior en la jerarqua del control del ciclo celular). Durante el ciclo celular tpico, el sistema de control est regulado por unos factores de retraso que pueden parar el ciclo en unos puntos de control determinados. En ellos, las seales de retroalimentacin que contienen informa cin sobre los procesos subordinados pueden retrasar el avance del propio siste ma de control, evitando que ste desencadene el proceso siguiente sin que el an terior haya terminado. Los factores de retraso tambin son importantes en otro aspecto: sirven para que el sistema de control celular est regulado por seales de su entorno. Normalmente estas seales de control ambiental actan en uno o dos de los puntos de control cruciales del sistema de control del ciclo -u n o en G,, justo an tes de entrar en fase S; y el otro en G2, al comenzar la mitosis. En clulas eucariotas ms desarrolladas las seales que retrasan el ciclo acostumbran a actuar en punto de control de G^ Este punto de control se llama Inicio en las levaduras, y en las clulas de mamfero simplemente lo llamaremos punto de control Gt (Fi gura 17-9). Si las circunstancias impiden la divisin celular, ser en este punto del ciclo donde muchas clulas se detendrn. En una clula de ciclo continuo, el punto de control Gt es aquel en el cual el sistema de control de la clula pondr en marcha un proceso que inicia la fase S, y el punto de control G2 aquel que pone en marcha un proceso que dar comienzo a la fase M.

El control del ciclo celular es un mecanismo basado en una protena quinasa 3

Por razones histricas la mayora de lo que sabemos sobre el mecanismo del sis tema de control proviene de estudios sobre el punto de control G2 al comienzo de la mitosis. En nuestra descripcin inicial de este sistema de control, conse cuentemente, nos centramos en los mecanismos que conducen a la clula una vez pasado el punto de control G2 dentro de la fase M. Parece probable que un mecanismo similar a ste acte en el punto de control Gp aunque los com po nentes precisos sean diferentes.

La estrategia general del ciclo celular

931

El sistema de control del ciclo celular se basa en dos familias clave de prote nas. La primera es la familia de las protena quinasas dependientes de ciclina (Cdk, de Cyclin-Dependent protein Kinases), las cuales inducen los procesos sub ordinados fosforilando protenas seleccionadas sobre serinas y treoninas. La se gunda es una familia de protenas activadoras especializadas, las ciclinas, que se unen a las molculas Cdk y controlan su capacidad para fosforilar protenas diana adecuadas (Figura 17-10). El ensamblaje cclico de compuestos de ciclina y Cdk, su activacin, y desensamblaje, son los procesos centrales que dirigen el ciclo ce lular. Las ciclinas se llaman as porque sufren un ciclo de sntesis y degradacin en cada ciclo de divisin de la clula. Hay dos clases principales de ciclinas: las ci clinas mitticas, las cuales se unen a las molculas de Cdk durante G2 y son ne cesarias para entrar en la mitosis, y las ciclinas Gp las cuales se unen a m olcu las Cdk durante G: y son necesarias para entrar en la fase S (Figura 17-11). En las clulas de levadura, que han jugado un papel fundamental en la investigacin del ciclo celular, el mismo miembro de la familia Cdk proporciona la actividad quinasa en ambos puntos de control; en clulas de mamfero hay al menos dos protenas Cdk diferentes, una para cada punto de control. En resumen, los procesos que llevan a la clula a la mitosis son los siguientes: la ciclina mittica se acumula gradualmente durante G2y se une al Cdk formando un compuesto conocido como factor promotor de la fase M (MPF, de M-Phasepromoting Factor). Este compuesto inicialmente permanece inactivo, pero a tra vs de la accin de otras enzimas que lo fosforilan y desfosforilan, se convierte en un factor activo. La activacin final del MPF es casi explosiva, probablemente de bido a un mecanismo de retroalimentacin positiva por el cual el MPF activo in crementa la accin de las enzimas que lo activan: de este modo la concentracin de MPF activo aumnta a ritmo acelerado hasta que se llega a la explosin cru cial, despus de la cual un flujo de MPF activos desencadena una serie de sucesos que impulsan a la clula hacia la mitosis. El MPF tambin se desactiva de repente por la degradacin de la ciclina mittica en la metafase-anafase que sucede a continuacin, permitiendo a la clula salir de la mitosis. Cada paso de la activacin o desactivacin de Cdk marca una transicin del ciclo celular y probablem ente tiene algn efecto sobre el propio sistema de con

ciclina quinasa dependiente (Cdk)

Figura 17-10 Dos componentes fundamentales del sistema de control del ciclo celular. Un com plejo de
ciclina y Cdk acta como una protena quinasa para desencadenar los procesos subordinados. Sin la ciclina, la Cdk es inactiva.

pone en marcha el mecanismo de la mitosis

t
f a c t o r p r o m o t o r d e la f a s e M

Figura 17-11 El corazn del sistema de control del ciclo celular. Se cree
que Cdk se asocia sucesivamente a diferentes ciclinas desencadenando los distintos procesos subordinados del ciclo. La actividad de Cdk se termina con la degradacin de la ciclina.

la quinasa empieza a actuar pone en marcha el mecanismo de replicacn del DNA

932

Captulo 17: El ciclo de divisin celular

trol celular, iniciando reacciones que finalmente lo conducirn a poner en m ar cha el proceso subordinado siguiente. El mecanismo que acta en el punto de control Gj es mucho m enos conocido, pero se cree que lo hace de manera simi lar: del mismo modo que el ensam blaje del MPF desencadena finalmente los procesos de la mitosis, el ensam blaje de un compuesto parecido constituido por protena Cdk y ciclina G! conducira a la clula ms all del punto de control G1 ( desencadenando los procesos que nos llevarn a la replicacin del DNA. Los procesos subordinados inducidos por la activacin de Cdk en los puntos de control Gj y G2 son com pletamente diferentes, aunque en la levadura la misma protena sirva para ambos procesos. Por lo tanto se cree que las protenas que en cada caso se fosforilan, y son activadas por la protena Cdk, dependen del com ponente de ciclina del complejo. Ahora volvamos a las evidencias en las que se basa esta visin del ciclo celular.

Resumen
En cada ciclo de divisin la clula tiene que replicar su DNA. La mayora de las clu las tambin aumentan y duplican todo su contenido. Durante la fase M los cromo somas replicados se segregan (por mitosis) en ncleos separados y la clula se divide en dos (por citocinesis). La otra parte del ciclo conocida por interfase es mucho ms larga. Este perodo de crecimiento continuo comprende la fase S, en la cual tiene lu gar la replicacin del DNA, y dos lapsos de tiempo, las fases G, y G2 , entre la fase S y la fase M. La secuencia de procesos del ciclo celular est regulada por un sistema de control del ciclo celular que cclicamente pondr en marcha los procesos bsicos de la reproduccin celular, tales como la replicacin del DNA y la segregacin cromosmica. En el corazn del sistema encontramos un conjunto de compuestos protei cos formado bsicamente por dos clases de componentes: subunidades de protena quinasas (llamadas protenas Cdk) y unas protenas activadoras llamadas ciclinas. El ciclo celular normal est regulado al menos por dos compuestos proteicos -uno un punto de control alfinal de la fase G, poco antes de la fase S, y otro al final de la fase G2 poco antes de la fase M. Estos complejos proteicos ejercen su control a travs de sus actividades quinasa, que se activan y desactivan de repente en puntos concre tos del ciclo.

El ciclo celular de los embriones tempranos y la funcin del MPF4

En un ciclo caracterstico la clula pasa, antes de poder dividirse, por un perodo de crecimiento con el objetivo de duplicar todo su DNA y todos los com ponen tes de su citoplasma. Esto supone tiempo -u n perodo variable de tiempo si el entorno es variable. As pues el ciclo celular tpico se prolonga, y se requieren mecanismos de control que garanticen que todos los preparativos indispensa bles previos a la divisin se hayan completado en la secuencia correcta. Los embriones tempranos de muchos animales experimentan ciclos de divi sin celular que son atpicos: tienen lugar sin crecimiento y se suceden a una ve locidad extraordinaria y sin la mayora de controles yTevisiones habituales. Es tos ciclos celulares de embriones tempranos nos muestran cmo trabaja el sistema de control celular, desnudo y simplificado hasta los mnimos necesarios para conseguir el requerimiento ms fundamental -la duplicacin del genoma y su segregacin en dos clulas hijas. Aunque estos ciclos celulares son excepcio nales, iluminan los mecanismos del ciclo de divisin en todas las clulas eucariotas. En esta seccin veremos cmo estudios de ciclos de embriones tem pra nos de la rana Xenopus nos llevan a la identificacin del MPF como componente central del sistema de control celular; trataremos cmo el sistema de control simplificado efecta sus ciclos repetidos de activacin y desactivacin del MPF y tambin veremos cmo cada uno de estos ciclos del sistema de control conduce precisamente a una ronda de replicacin y segregacin cromosmica.

El ciclo celular de los embriones tempranos y la funcin del MPF

9 33

El crecimiento del oocito de Xenopus est equilibrado por la divisin del huevo5
El huevo de Xenopus, como el de muchas otras especies, es una clula esfrica gigante (Figura 17-12), de un poco ms de un milmetro de dimetro. Por lo tan to su citoplasma es 100 000 veces mayor que el de una clula de tamao media no, pero contiene un nico ncleo. El citoplasma se llena de materiales de reser va que necesitar para la formacin del renacuajo. Estos materiales se han acumulado durante un largo perodo de crecimiento del huevo inmaduro, cono cido com o oocito, mientras est en el ovario de la madre. De esta manera el em brin temprano se ve relevado de la necesidad de encontrar alimento y puede desarrollarse rpidamente en un organismo vivo independiente capaz de arre glrselas solo (Figura 17-13). Para preparase para su fusin con un espermatozoide, el oocito en creci miento se ha embarcado tam bin en un proceso de meiosis, al final del cual ver reducido su nmero de cromosomas a la mitad de lo normal. La reduccin se consigue a travs de una sola etapa de replicacin del DNA seguida de dos divi siones celulares especiales en las que no hay ms replicaciones del DNA (tal como se explica en el Captulo 20). El crecimiento del oocito se produce a lo lar go de un amplio perodo, durante el cual la progresin meitica se detiene en un estadio llamado tradicionalmente profase meitica, pero m ejor descrito como fase G2 del primer ciclo de divisin meitica: este punto de detencin, justo an tes de entrar en la fase M, corresponde al punto de control G2 del ciclo celular caracterstico. Para que se produzca un huevo maduro, diversas hormonas actan en el oocito, desbloqueando la detencin de G2y provocando que el oocito progrese a travs de la meiosis hasta que llegue a detenerse en otro punto no habitual de parada, en la fase M de su segunda divisin meitica (Figura 17-14). En este es tado el huevo desciende por el oviducto, es fecundado y puesto. La fecundacin desencadena una serie sorprendente de divisiones celula res en las cuales la clula gigante se divide, sin crecer, generando un embrin que consiste en miles de clulas ms pequeas (vase Figura 17-13). En este proceso prcticam ente las nicas macrom olculas sintetizadas son de DNA -necesarias para producir los miles de ncleos- junto con una pequea canti dad de protena. Despus de la primera divisin, que dura unos 90 minutos, las 11 divisiones siguientes se suceden, ms o menos sincrnicam ente, a intervalos de 30 minutos, producindose alrededor de 4096 (212) clulas en unas 7 horas. Cada ciclo consta de aproximadamente 15 minutos de fase M y 15 minutos de interfase ocupada principalm ente por la sntesis de DNA. No se han detectado fases G! o G2.

0,5 mm

Figura 17-12 Un huevo maduro de

X en op u s listo para la fecundacin. La mancha plida cerca del pice nos indica la colocacin del ncleo, el cual ha desplazado el pigmento pardo de la capa de la superficie del citoplasma del huevo y cuya envoltura se ha roto durante el proceso de maduracin del huevo. (Cortesa de Tony Mills.)

Figura 17-13 El crecimiento del oocito y las segmentaciones en un huevo de

Xenopus. El oocito crece durante muchos meses en el ovario de una rana hembra, sin dividirse, y finalmente madura en forma de huevo. En la fecundacin, el huevo se divide muy rpidamente -inicialmente a una velocidad de un ciclo de divisin cada 30 minutos- formando un renacuajo pluricelular en uno o dos das. Las clulas se hacen progresivamente ms pequeas con cada divisin ya que no existe crecimiento alguno hasta que el renacuajo empieza a alimentarse. Los dibujos de la lnea superior estn todos a la misma escala (pero no el sapo del nivel inferior).

el oocito crece sin dividirse (meses)

el huevo fecundado se divide sin crecimiento (horas)

934

Captulo 17 : El ciclo de divisin celular

oocito

--------------------------------------------------------

MADURACION

u.._ _

huevo

----------------------- embrin ncleo diploide

ACTIVACION

Figura 17-14 Maduracin y activacin del huevo deX en o p u s. Las

actuacin de diversas hormonas sobre el oocito cuando ste ha completado su crecim iento, lo conducen de su estado de reposo en G2 a la fase M de meiosis: com pleta su primera divisin meitica y se queda en reposo en la metafase de su segunda divisin meitica. Ahora, en este nuevo estado, se denomina huevo maduro, y es puesto. Las dos divisiones meiticas se suceden una a otra rpidamente, sin que intervenga la fase S; los cromosomas continan condensados a lo largo de todo este perodo. La fecundacin saca al huevo del reposo de la metafase, de manera que ste com pleta su segunda divisin meitica y entra en la interfase de su primer ciclo celular embrionario. Cada una de las dos divisiones m eiticas genera un clula grande -u n futuro huevo- y una clula pequea, llamada corpsculo polar, que finalmente degenera.

ncleo (vescula germinal) MEIOSIS I

FECUNDACIN

DIVISIN

oocito parado en fase G2 de la meiosis I corpsculo fase M de polar oocito la meiosis I parado en fase M de la meiosis II corpsculo polar

huevo fecundado en interfase

Un regulador citoplasmtico, el MPF, controla la entrada en la mitosis6,7

Dos experimentos cruciales establecieron la existencia de un mecanismo de control citoplasmtico que acta en todas las clulas que se estn dividiendo para empezar la mitosis. El primero se bas en una tcnica de ensayo sobre un oocito de Xenopus, que ha tenido una importancia crucial en la identificacin de los com ponentes del sistema de control del ciclo celular. El oocito de Xenopus, tal como hemos visto, se detiene en la fase G2 meitica, mientras que el huevo se detiene en fase M meitica. Por lo tanto, el oocito y el huevo de Xenopus constituyen fuentes abundantes de citoplasma de estos es tadios definidos del ciclo celular. Adems, al ser tan grandes, es fcil inyectar substancias en su citoplasma. Si se inyecta citoplasma en fase M de un huevo maduro no fecundado en un oocito en fase G2, el oocito receptor avanza hasta la fase M y com pleta su maduracin (Figura 17-15). De esta forma se identific en el citoplasma del huevo una actividad que se inicialmente se denomin factor promotor de la maduracin porque induce la maduracin de un oocito inm a duro a un huevo maduro. El otro experimento crucial se realiz con clulas cultivadas de mamfero. Las clulas de mamfero normalmente no son suficientemente grandes como para poderles inyectar citoplasma, pero lgicamente se puede efectuar un test equivalente fusionando una clula mittica con una clula en interfase: de este modo se expone el ncleo de la clula en interfase a cualquier com ponente acti vo que pueda estar presente en el citoplasma de la clula mittica. En tales expe rimentos la clula en interfase progresa directamente hasta la mitosis, tanto si ha replicado su DNA como si no lo ha hecho (Figura 17-16). Posteriormente se demostr que la actividad que conduce el oocito hasta la maduracin y a la clula en interfase hasta la mitosis, era la misma: el factor pro motor de maduracin es idntico al factor promotor de la fase M -d os nombres para una mismas sustancia, MPF.

INYECCIN DE CITOPLASMA DE UNA CLULA EN FASE M ncleo

huso fcilmente detectable en la superficie de la clula

INYECCIN DE CITOPLASMA DE UNA CLULA EN INTERFASE

Figura 17-15 Ensayo de MPF mediante inyeccin en un oocito de

X en op u s. El MPF puede ser detectado porque conduce al oocito hasta la fase M. El gran ncleo (o vescula germinal) del oocito se rompe cuando se forma el huso mittico.

EL OOCITO ES CONDUCIDO HASTA LA FASE M

EL OOCITO PERMANECE EN FASE G2

El ciclo celular de los embriones tempranos y la funcin del MPF

935

clula mittica

clula en fase Gi

clula mittica

clula en fase S

clula mittica

clula en fase G2

induccin de la condensacin de cromosomas de una clula en fase Gi

induccin de la condensacin de cromosomas de una clula en fase S

induccin de la condensacin de cromosomas de una clula en fase G?

u
20

iim
cromosomas humanos en metafase

cromosomas humanos en metafase

cromosomas humanos en metafase

Figura 17-16 Resultados obtenidos al fusionar una clula de mamfero en mitosis con una clula de mamfero en interfase. Las clulas son inducidas a
fusionarse, aadiendo al medio de cultivo un agente apropiado (vase pg. 170). El ncleo en interfase es conducido directamente hasta el estado de mitosis, con crom osom as condensados, independientemente de su estado de replicacin. Las fotografas muestran fusiones de clulas humanas con clulas de marsupiales (clulas PtK) en interfase. En (A) la clula PtK estaba en fase G ,; consecuentem ente sus cromosomas, condensados prematuramente, todava son cromtidas. En (B) la clula PtK estaba en fase S y su cromatina adopta un aspecto plumulado. En (C) la clula PtK estaba en fase G2 y ahora las cromtidas, aunque muy largas en com paracin con los cromosomas metafsicos normales (humanos), son dobles. (De K. Sperlingy P. Rao, H u m an gen etik 23:235-258,1974.)

Las oscilaciones de la actividad MPF controlan el ciclo de divisin celular8

Los huevos y oocitos de Xenopus suministran una gran fuente de material tanto para purificar el MPF como para com probar su actividad. Una vez purificado, se descubri que el MPF era una protena quinasa que fosforila protenas sobre

936

Captulo 17 : El ciclo de divisin celular

residuos de serina y treonina y que est compuesta de dos unidades bsicas -u n a quinasa dependiente de ciclina (Cdk) denominada Cdc2 y una ciclina mittica (Figura 17-17). Sin embargo, incluso antes de ser purificado y caraterizado bioqum icam ente fue posible demostrar el papel decisivo que desempea el MPF en el ciclo celular. Experimentos utilizando el ensayo del oocito con muestras de citoplasma de ciclos celulares de embriones tempranos, as como de oocitos maduros y de huevos, muestran que la actividad del MPF es alta durante toda la mitosis y baja durante la interfase, alcanzando un mximo cada 30 minutos en un huevo en di visin. Es ms, sabemos que la actividad del MPF es un rasgo universal del ciclo celular eucariota: en todas las especies, desde las levaduras a los mamferos, las clulas que estn en mitosis contienen actividad MPF que puede ser detectada con un ensayo de inoculacin de oocitos. Rpidamente se estableci que los incrementos de actividad MPF que se pro ducen cada 30 minutos provocando la escisin del embrin de Xenopus, se gene ran debido a un oscilador citoplasmtico que acta incluso en ausencia de un ncleo. Comprimiendo un huevo activado antes de que haya completado su pri mera divisin, se puede separar en dos partes -u n a con un ncleo y la otra sin n cleo. Como era de esperar, la parte con ncleo sigue la programacin normal de rpidas divisiones. Sorprendentemente, la parte sin ncleo tambin experimenta una serie de oscilaciones, en forma de ciclos repetidos de contracciones y endure cimientos de la corteza citoplasmtica. Estos espasmos recurrentes ocurren en sincrona casi perfecta con las divisiones por escisin de la mitad del huevo con ncleo (Figura 17-18). Un huevo de estrella de mar cuyo ncleo ha sido extrado, todava va ms all: en el caso de que retenga un centrosoma, se escindir repeti damente formando clulas cada vez ms pequeas, todas ellas sin ncleo. Si tomamos muestras de citoplasma a diferentes tiempos, de la clula de Xe nopus sin ncleo y se ensayan por inyeccin en oocitos, se puede demostrar que las oscilaciones visibles reflejan oscilaciones de la actividad MPF. Evidentemen te en estas clulas gigantes las oscilaciones que dirigen los ciclos de divisin se producen de forma independiente a cualquier seal que pueda emitir la relati vamente pequea cantidad de DNA que normalmente se halla presente en la c lula. Luego veremos que no ocurre lo mismo en los ciclos celulares tpicos, en los que actan estrictos mecanismos de control asegurando que la replicacin cromosm ica y la divisin celular se acoplen correctamente.

quinasa dependiente de ciclina Cdc2

___________________ I I

MPF

Figura 17-17 Las dos subunidades clave del MPF. La subunidad Cdk se
llama Cdc2 debido al gen de la levadura de fisin que lo codifica.

La acum ulacin y la destruccin de ciclina controla la activacin y la inactivacin de MPF 9

Aunque los ciclos de divisin en el embrin en escisin pueden tener lugar en ausencia de DNA, no pueden ocurrir en ausencia de sntesis de protenas: si blo queamos la sntesis de protenas al inicio de la interfase evitamos tanto la activa cin del MPF como la mitosis siguiente. La explicacin de esta observacin que d clara con la identificacin de la ciclina.

Figura 17-18 Un huevo deXenopus se divide en dos partes -una con ncleo y la otra sin l. Se tensa un cabello
humano alrededor del huevo para partirlo en dos. La mitad que contiene el ncleo contina dividindose: la otra mitad, sin ncleo, no se divide. Las instantneas cinematogrficas, sin embargo, muestran que la parte sin ncleo cambia de tamao peridicamente mediante cambios en la dureza de su corteza celular, oscilando en clara sincrona con las divisiones de la mitad del huevo que tiene ncleo. (De K. Hara, P. Tydeman y M. Kirschner, 77:462-466, 1980.)

45 minutos tiempo tras la fecundacin

90 minutos

116 minutos

" l mm

USA

Proc. Nati. Acad. Sci.

El ciclo celular de los embriones tempranos y la funcin del MPF

interfase

m itosis

interfase

Figura 17-19 Incremento y decremento de los niveles de ciclina y de MPF durante el ciclo celular de embriones tempranos. Las
mediciones de ciclina se han hecho principalmente en huevos de invertebrados marinos, donde la ciclina representa el 5% de la protena sintetizada durante un breve pulso con aminocidos radiactivos. Los geles de la parte inferior del grfico muestran las cantidades de dos variedades, A y B, de ciclina marcada en diferentes estadios del ciclo de un huevo de almeja. La lnea inferior de los geles muestra la sntesis de una enzima constitutiva, como una estndar de referencia. (Adaptado de T. Hunt, F.C. Luca y J.V. Ruderman, 116:707-724, 1992.)

cicli na A ciclina B ribonucletido reductasa

>%

i -i

i.?

m -
7

Se estudi la sntesis de protenas en huevos fecundados de erizos de mar (cuyo ciclo celular es similar al de los embriones de Xenopus) fecundando un conjunto de huevos en agua de mar que contena un aminocido radiactivo (metionina-35S), extrayendo muestras peridicamente, y corrindolas sobre un gel. Una vez separadas en el gel, se podan detectar las protenas recin sinteti zadas gracias a su radiactividad. Estos experimentos revelaron que mientras que la mayora de la protenas se acumulan continuamente despus de la fecunda cin, un tipo de protenas sigue un patrn peridico: se acumulan de manera continua durante cada interfase hasta la transicin de la metafase-anafase, y en tonces se destruyen de repente (Figura 17-19). Esta secuencia de procesos ha motivado que a dichas protenas se les denomine ciclinas y ha conducido a la hi ptesis de que para activar el MPF una o ms ciclinas tienen que alcanzar un umbral de concentracin, y que la destruccin de la ciclina est acoplada a la inactivacin del MPF y la salida de la clula de la mitosis. El desarrollo de extractos libres de clulas que siguen el ciclo celular in vitro fue crucial para dilucidar el papel de la ciclina. Estos extractos se prepararon centrifugando huevos de rana para romperlos y as abrirlos y poder recoger su citoplasma. El ncleo de un espermatozoide aadido a dicho extracto de cito plasma puede hincharse, replicar su DNA y experimentar la mitosis tal como ha ra en un huevo fecundado: de este modo nos sirven de indicadores de la fase del ciclo celular en la que se encuentra el extracto (Figura 17-20). Si entonces se des truye todo el mRNA existente en el extracto, el ciclo celular se detiene en la inter fase, tal como ocurre cuando se inhibe la sntesis de protenas en un embrin.

1 1 !

J. Cell Biol.

Figura 17-20 Ciclos en un sistema libre de clulas. Se fracciona un gran

citoplasma de huevos de rana activados

ncleo del espermatozoide de rana

ciclo celular libre de clulas; duracin entre 40 y 60 minutos

nmero de huevos de rana activados, mediante una centrifugacin suave, la cual tambin separa el citoplasma de otros componentes. Se recoge el citoplasma no diluido y se le aade un ncleo de espermatozoide y ATP. El ncleo del espermatozoide se descondensa y experimenta ciclos repetidos de mitosis y replicacin del DNA, lo cual indica que en este extracto citoplasmtico libre de clulas acta el sistema de control celular.

938

Captulo 17 : El ciclo de divisin celular

Hay que destacar que basta con aadir mRNA de ciclina purificado para resta blecer la capacidad del extracto para activar el MPF e inducir la mitosis, lo cual indica que la falta de sntesis de ciclina en el extracto vaciado de mRNA es sufi ciente para detener el ciclo. La hiptesis ms simple sera que normalmente, en cuanto la concentracin de ciclina alcanza el umbral necesario, se desencadena la activacin del MPF. En realidad, tal como ya se ha dicho, el momento de acti vacin del MPF no se regula exclusivamente mediante la ciclina sin que depen de tam bin de la regulacin de la subunidad de Cdk del MPF por parte de otras protenas. Estos otros controles son difciles de investigar en el embrin de Xenopus, pero pueden ser descifrados mediante los conocim ientos de la gentica de las levaduras, tal como trataremos ms adelante.

La degradacin de la ciclina desencadena la salida de la m itosis 10

La destruccin de la ciclina es tan importante para la salida de la mitosis como su sntesis lo es para entrar en ella. Normalmente la ciclina se destruye de repen te por proteolisis en la transicin metafase-anafase. Este proceso necesita una secuencia seal en la cadena polipeptdica de ciclina que dirige a la molcula a su degradacin (proporcionando un lugar para la unin de la ubiquitina -vase pg. 232), y depende de la activacin del MPF. La funcin de la degradacin de la ciclina ha sido estudiada construyendo una forma truncada de ciclina que es capaz de estimular la activacin del MPF pero que no puede ser degradada porque carece de la secuencia seal adecuada. Si se aade mRNA de la ciclina indestructible a un extracto del ciclo celular de rana, el extracto entra en mitosis pero no puede salir de ella. As pues, la activacin de MPF que induce la mitosis necesita la sntesis de la ciclina, y la inactivacin del MPF que nos conduce a la prxima interfase necesita la degradacin de la ciclina. La ciclina es un com ponente esencial de MPF y se encuentra en todas las c lulas eucariotas. Tal como mencionbam os anteriormente, hay muchas varieda des de ciclina, fabricadas por una familia de genes relacionados. La ciclina mittica ms grande se conoce como ciclina B. Los ciclos celulares tpicos tambin dependen de otras ciclinas diferentes: las ciclinas Gp particularmente, parecen desempear un papel central en la activacin de la protena quinasa que saca a las clulas de y las conduce de lleno a la replicacin del DNA. Las principales evidencias de que disponemos sobre estos hechos tambin provienen de estu dios genticos de levaduras y se tratarn ms adelante.

El MPF puede actuar como autocataltico, estimulando su propia activacin 6

Experimentos efectuados en oocitos de Xenopus sugieren una explicacin para una caracterstica ms del MPF -esta vez sobre su repentina activacin todo o nada en el comienzo de la mitosis. Si se inyecta una pequea cantidad de MPF activo a un oocito en reposo, el oocito genera ms MPF activo, lo cual implica que la produccin de MPF activo es un proceso autocataltico. En resumen el sistema de control del ciclo celular acta de la siguiente forma: la gradual acu mulacin de ciclina acta como una m echa retardada, la cual finalmente provo car la explosin autocataltica de la actividad del MPF que pondr en marcha los primeros procesos de la mitosis que iniciarn la destruccin de ciclina. Con la destruccin de la ciclina termina la actividad MPF, y empieza un nuevo proce so de acumulacin de ciclina.

El MPF activo induce los procesos subordinados de la m itosis 11

El MPF tiene que causar muchos cambios radicales dentro de la clula para conducirla a la mitosis. Los cromosomas han de condensarse, la envoltura del ncleo ha de romperse y el citoesqueleto ha de reorganizarse formando un huso mittico. El MPF induce todos estos procesos bsicos mediante su activi

E1 ciclo celular de los embriones tempranos y la funcin del MPF

939

dad protena quinasa. Produce directam ente algunos cambios mediante la fos forilacin de algunos elem entos esenciales de la arquitectura celular. Otros pro cesos pueden inducirse indirectam ente -p o r ejemplo, mediante fosforilaciones que activan otras protena quinasas que actan en cascada alterando conside rablem ente el estado celular. La rotura del ncleo requiere la desorganizacin de la lmina nuclear -la cu bierta de filamentos polimerizados de laminina (tratada en el Captulo 12). El MPF cataliza este proceso directamente, forzando a las molculas de laminina a desensamblarse al fosforilarlas en residuos clave de serina (vase Figura 12-18). En clulas que contengan lamininas mutantes, obtenidas mediante ingeniera gentica, en las que no existen lugares para la fosforilacin del MPF, la lmina nuclear es incapaz de desmantelarse durante la mitosis, aunque la envoltura del ncleo se rompa en vesculas y otros procesos de la mitosis ocurran casi con normalidad. Otra de las molculas que puede fosforilar directamente el MPF es la histona H l, la cual interviene en el em paquetamiento del DNA en los nucleosomas. Es posible, pero no est probado, que la fosforilacin ayude a la induccin de la condensacin cromosmica. El MPF cambia el comportamiento de los microtbulos en mitosis fosforilando las protenas asociadas a los microtbulos. Durante la interfase el centrosoma nuclea largos microtbulos que se extienden por todo el citoplasma. En la mitosis esta formacin citoplasmtica de microtbulos se desmonta y los centrosomas nuclean un gran nmero de microtbulos ms pequeos y menos estables, los cuales interactan unos con otros formando el huso mittico (tratado en el Cap tulo 18). Esta transformacin refleja un cambio qumico en el centrosoma, en los microtbulos o en ambos a la vez, y esta transformacin puede ser reproducida in vitro aadiendo MPF a un sistema de libre de clulas que contenga centroso mas, tubulina y otros componentes del citoplasma en interfase. Los dos compo nentes de MPF -la ciclina m ittica y la quinasa C dc2- pueden encontrarse fuerte mente unidos a los centrosomas de la clula viva: se cree que la ciclina mittica reconoce los com ponentes del centrosoma y atrae la quinasa Cdc2. Aunque los procesos no se conocen con detalle, est claro que el MPF indu ce directa o indirectamente las fosforilaciones de muchas protenas. Para salir de la mitosis las clulas tienen que invertir estas fosforilaciones; se ha demostrado en m oscas y levaduras de fisin que las mutaciones que inactivan la protena fosfatasa I -u n a de las mayores fosfatasas de uso general en la clula- evitar o retrasar en gran m anera los procesos subordinados que normalmente siguen a la inactivacin del MPF, tales como la reconstruccin de la envoltura nuclear.

El sistem a de control del ciclo celular permite tiempo suficiente para que se produzca una ronda de replicacin del DNA en cada interfase 12
Hasta ahora hemos visto de manera resumida cmo se activan e inactivan peri dicamente los com ponentes del sistema de control celular, haciendo que la c lula entre y salga de la mitosis, y cm o los componentes activados desencade nan los procesos subordinados. Sin embargo los procesos subordinados requieren un intervalo de tiempo para producirse. Cmo asegura el sistema de control que existe tiempo suficiente para que cada uno de estos procesos se lle ven a cabo completamente, antes de poner en marcha el siguiente proceso? El ms crtico de los procesos a los que hay que concederles un tiempo ade cuado para que se produzcan, es la replicacin del DNA. Si el sistema de control activa la puesta en m archa de la fase M antes de que la replicacin del DNA se complete, la clula entra en una mitosis suicida, con sus cromosomas slo par cialm ente replicados. Luego veremos que en los ciclos celulares tpicos la seal de retroalimentacin de un DNA replicado de forma incompleta detiene la pro gresin del sistema de control, protegiendo a la clula de este tipo de un desas tre de este tipo.

940

Captulo 17: El ciclo de divisin celular

Durante los primeros ciclos embrionarios del desarrollo de una rana, sin embargo, estas seales de retroalimentacin no existen. En este caso el tiempo necesario para que se produzca cada proceso subordinado es predecible e inva riable, gracias a las reservas nutritivas del huevo y al entorno protegido del em brin; por lo tanto es suficiente que el sistema de control programe atravesar el ciclo a una velocidad adecuada, con descansos adecuados programados entre la puesta en marcha de un proceso y del siguiente. La DNA polimerasa y otros com ponentes necesarios para la replicacin del DNA estn permanentemente a punto y pueden completar una ronda de replicacin del DNA antes de que el sis tema de control pueda completar su ciclo. De hecho, el sistema de control en el embrin temprano no es consciente de la progresin del proceso de replicacin del DNA, de forma que si la replicacin del DNA se detiene artificialmente m e diante un inhibidor de la sntesis del DNA, la clula entra en una mitosis desas trosa. Parece que durante las primeras escisiones del embrin la cantidad de DNA es sencillamente demasiado escasa en relacin con la cantidad de citoplas ma para que las seales dependientes del DNA puedan afectar el sistema de control. En los 12 primeros ciclos de divisin, mientras el huevo se subdivide y se forman nuevos ncleos, la proporcin entre el DNA nuclear y el citoplasma aumenta por un factor superior a 4000, y hacia el final de este perodo los con troles de retroalimentacin del ciclo celular tpico empiezan a actuar.

Un bloqueo de la re-replicacin asegura que ningn segmento de DNA se replique ms de una vez en cada ciclo celular 7
Es necesario otro tipo de control para solucionar un problema complementario: al igual que es esencial que en cada ciclo celular se replique todo el DNA celular, es igualmente importante que ningn DNA celular se replique ms de una vez. La clula no soluciona este problema mediante la regulacin de la retroalimen tacin del sistema de control del ciclo celular sino mediante un dispositivo autolimitante dentro del propio proceso de replicacin del DNA: como se trata en el Captulo 8, en cuanto se ha replicado, cada segmento de cromatina queda modi ficado de alguna forma tal que impide que se vuelva a replicar durante el ciclo celular actual. Aunque la naturaleza de este bloqueo de las re-replicaciones todava es desconocida, existe una evidencia clara de su existencia, y parece fundamental para el funcionamiento del ciclo celular en todos los eucariotas. Experimentos realizados en cultivos de clulas de mamfero que estn pasando por ciclos de divisin caractersticos lo demuestran claramente. Como observamos anterior mente en la Figura 17-16, dos clulas que estn en diferentes fases del ciclo pue den fusionarse una con otra. Cuando una clula en Gp con el DNA todava por replicar, se fusiona con una clula en fase S, el ncleo en Gj en el citoplasma h brido es inducido a comenzar la sntesis del DNA inmediatamente. Evidente mente la clula en fase S contiene en su citoplasma inductores de la sntesis de DNA, y el ncleo en G! es susceptible a ellos. Por el contrario, si una clula en G2, es decir que acaba de terminar la sntesis del DNA, se fusiona con una clula en fase S, el ncleo en G2 no reinicia la sntesis del DNA, a pesar de que en el ncleo en fase S del citoplasma compartido, la sntesis del DNA contina. Parece que la clula hbrida contiene la maquinaria para la replicacin del DNA, pero que n cleo en G2 es refractario a su actuacin (Figura 17-21). Al pasar de Gt hasta G2va S se ha creado un bloqueo de posteriores replicaciones del DNA.

El paso por la mitosis hace desaparecer el bloqueo a las re-replicaciones 13

El bloqueo a las re-replicaciones tiene que desaparecer en algn momento entre el final de G2 y el comienzo de la siguiente fase S, para que se pueda iniciar el prximo ciclo de replicaciones del DNA. No se conoce de forma precisa ni cun do ni cmo se elimina el bloqueo pero, al menos en el ciclo celular de embriones

El ciclo celular de los embriones tempranos y la funcin del MPF

941

el ncleo en fase Gi entra inmediatamente en la fase S; el ncleo en fase S contina la replicacin del DNA

el ncleo en fase G2 permanece en fase G2; el ncleo en fase S contina la replicacin del DNA

el ncleo en fase G2 permanece en fase G2; el ncleo en fase G1 entra en la fase S siguiendo su programa temporal
(C)

(A)

(B)

tempranos, este cam bio parece depender del desmantelamiento de la envoltura del ncleo, en la mitosis. Los experimentos que lo demuestran tambin ilustran cmo el sistema de control del ciclo celular conduce los cromosomas a travs de ciclos de replicacin y segregacin, en estricta alternancia. Como hem os discutido previamente, el sistema de control del ciclo celular de em briones tempranos puede actuar en extractos de huevo de rana libres de clula, donde puede detenerse en la interfase al bloquear la sntesis de protenas o conducirse hasta la fase M, aadiendo MPF. Un ncleo de espermatozoide aadido a un extracto detenido en la interfase sufrir exactam ente una ronda de replicaciones del DNA y se detendr. Esto es as no porque haya habido al gn cam bio en el extracto (el cual todava puede provocar la replicacin de otro ncleo, aadido posteriormente) sino porque se ha producido un bloqueo de re-replicaciones en el ncleo del espermatozoide. Si se aade MPF al extracto, el ncleo se desmonta y cuando se recom pone (tras la inactivacin del MPF), solam ente experim entar una ronda adicional de replicaciones del DNA y se detendr de nuevo. De este modo cada increm ento de actividad MPF concede al ncleo una licencia para experimentar una ronda de replicacin. Aunque la naturaleza de esta licencia no se conoce, existen pruebas que sugieren que de pende de un factor citoplasm tico que para actuar ha de introducirse en el n cleo, y que slo es capaz de hacerlo cuando se rompe la envoltura nuclear du rante la mitosis. As pues, la replicacin del DNA en los embriones tempranos se podra resu mir de la manera siguiente. El desencadenamiento de la mitosis se activa a inter valos temporales fijos y en cada mitosis el DNA recibe una licencia para su repli cacin. La maquinaria de replicacin del DNA dispone del tiempo necesario para efectuar una ronda de replicacin antes de que empiece la mitosis siguien te, y se impide que se produzca ms de una replicacin mediante un bloqueo de re-replicaciones. Esto es suficiente para asegurar que en las fases S se repliquen los cromosomas de forma precisa y se alternen de forma regular con las fases M, en las cuales se segregan los cromosomas en clulas separadas. En los ciclos estndar de divisin celular, el sistema de control es mucho ms complejo, pero el bloqueo de las re-replicaciones acta de forma similar, garantizando que el DNA se replique solamente una vez en cada ciclo. Como en la mayora de reglas del ciclo celular, el bloqueo de las re-replicaciones tiene algunas excepciones. En la mosca, por ejemplo, muchas de las clulas de la larva experimentan muchas rondas de replicacin de sus cromosomas sin que se pro duzca la mitosis o la divisin celular, formndose as cromosomas politnicos gigantes en los cuales cientos o miles de copias del genoma se disponen en para lelo (vase Figura 8-19). En este caso especial, el bloqueo de re-replicaciones se elimina sin que se rompa la envoltura nuclear.

Figura 17-21 El bloqueo de las rereplicaciones: evidencias a partir de experimentos de fusin celular con clulas de mamfero cultivadas. Los resultados muestran que los citoplasmas en fase S contienen factores que hacen que los ncleos en Gj entren directamente en proceso de sntesis del DNA (A); sin embargo, los ncleos en G2, que ya ha replicado su DNA, son refractarios a dichos factores (B). Ntese que la fusin de una clula en G2con una clula en Gj no hace que el ncleo Gj inicie la sntesis de su DNA (C); por lo tanto, los factores citoplasmticos para la replicacin del DNA que estaban presentes en la clula en fase S desaparecen cuando la clula se traslada de la fase S a la fase G2.

942

Captulo 17: El ciclo de divisin celular

Para avanzar en la explicacin sobre el sistema de control celular, y para ver de qu forma las clulas coordinan procesos ms complejos del ciclo celular t pico, tenemos que pasar desde los embriones tempranos de rana a las levaduras, en las que se puede tratar el problema desde el punto de vista gentico.

Resumen
Los embriones tempranos de muchas especies animales experimentan ciclos celula res excepcionalmente rpidos, a travs de los cuales el gran huevo se subdivide en muchas clulas ms pequeas, sin aumentar de tamao. Estos ciclos celulares de embriones tempranos, en los cuales las fases SyM se alternan y se suceden rpida mente sin que se produzcan fases G y G# nos muestran como acta el sistema de control del ciclo celular en su forma ms simple. El componente fundamental del sistema de control del ciclo celular es una protena quinasa, llamada MPF, cuya ac tivacin, mediante un explosivo proceso autocataltico, conduce a la clula a la mitosis; la inactivacin de MPF permite a la clula salir de la mitosis y replicar su DNA. El MPF se activa e inactiva cclicamente en los ciclos embrionarios tempranos inde pendientemente del ncleo. Consta de dos subunidades principales -una quinasa dependiente de ciclina, denominada Cdc2, y ciclina. Cdc2 tiene que asociarse con ciclina para adquirir actividad MPF. La destruccin de la ciclina inactiva el MPF en el punto de salida de la mitosis, y la acumulacin de ciclina acabada de sintetizar per mite la reactivacin de MPF en el ciclo siguiente. En estos embriones tempranos, el tiempo necesario para reactivar el MPF es suficiente para permitir una nica ronda de replicacin del DNA. Tras ser replicado, sobre cada segmento de DNA acta un mecanismo de bloqueo de re-replicaciones, el cual solamente se elimina cuando la clula atraviesa la mitosis. De esta forma, el sistema de control celular dirige rondas alternas de replicacin del DNA y de segregacin cromosmica.

Las levaduras y la gentica molecular del sistema de control del ciclo celular1 4
Las levaduras son hongos unicelulares -u n grupo amplio y heterogneo de orga nismos eucariotas. Son ideales para el estudio gentico de la biologa celular de los eucariotas porque se reproducen casi tan rpidamente como las bacterias y tienen un genoma cuyo tamao es menor de 1/100 parte que el de un mamfero. Las levaduras y las ranas presentan ventajas complementarias para el estudio del ciclo celular pero tam bin desventajas. Las levaduras son muy adecuadas para la identificacin, el clonaje, y la caracterizacin de genes que controlan el ciclo celular, pero son demasiado pequeas para poder efectuar microinyecciones, y sus ciclos celulares son ms complejos y todava no pueden ser reproduci dos en sistemas libres de clulas in vitro. De todas formas estos dos organismos, muy diferentes entre s, utilizan maquinarias del ciclo celulares bsicam ente si milares y, conjuntam ente, nos han permitido diseccionar los distintos com po nentes del sistema del control celular. Las dos especies que trataremos son la levadura de gem acin Saccharomyces cerevisiae, utilizada por cerveceros y panaderos, y la levadura de fisin Schizosaccharomyces pombe, cuyo segundo nombre se debe a la cerveza africana en cuya fabricacin se usa. Aunque los linajes evolutivos que conducen a las leva duras de gemacin y las levaduras de fisin divergieron hace muchos cientos de miles de aos, ambos organismos tienen ciclos celulares parecidos. Ambas leva duras pueden proliferar tanto en estado diploide como haploide: las clulas diploides pueden experimentar meiosis formando clulas haploides, como una al ternativa a la divisin habitual (vase Captulo 20); las clulas haploides, como una alternativa a la divisin, pueden conjugarse unas con otras formando clulas diploides (Figura 17-22). La fase haploide facilita el aislamiento y el estudio de mutaciones que inactivan un gen, sin la complicacin de tener una segunda co pia de dicho gen en la clula. En ambas especies de levadura, la nutricin y el

Las levaduras y la gentica molecular del sistema de control del ciclo celular

943

( p ro life ra c i n ^ I de clulas I

vS)V

/ v O \ C2n)
, . m eiosis y esporulacion (desencadenadas por las condiciones de ayuno)

2n algunas cepas / pueden p ro life ra r/ com o clulas ( diploides \

n m eiosis y esporulacin (norm alm ente justo despus de la conjugacin)^

w

conjugacin (norm alm ente justo despus de la eclosin de las esporas)

/

conjugacin (desencadenada por las condiciones de ayuno) eclosin de esporas algunas cepas de las clulas haploides am pliam ente utilizadas proliferan com o clulas haploides / p ro life ra ci n \ I de clulas J eclosin de esporas

CICLO VITAL DE LAS LEVADURAS DE GEMACIN

CICLO VITAL DE LAS LEVADURAS DE FISIN

sexo juegan partes importantes en el control del ciclo de divisin celular, por lo que estos organismos pueden ser utilizados para investigar la generalidades de la regulacin del ciclo de divisin por parte de factores ambientales y de las inte racciones clula-clula.

El crecim iento celular requiere una interfase prolongada con puntos de control del ciclo celular 3,15
El ciclo celular de la levadura es ms com plejo que el del embrin temprano de rana porque una levadura, com o la inm ensa mayora de las clulas, tiene que crecer antes de dividirse. Como una clula necesita ms tiempo para duplicar el total de su m asa que para replicar su DNA y segregar sus cromosom as, el ci clo celular de clulas en crecim iento consta de interludios G, y G2 -G , entre el final de la fase M y el com ienzo de la sntesis del DNA, y G2 entre el final de la sntesis del DNA y el com ienzo de la fase M. Tanto G, com o G2 permiten la exis tencia de controles que acoplen la duracin del ciclo celular al ritmo de creci m iento celular. Para m antener constante el tamao de la clula, la duracin del ciclo celu lar tiene que encajar perfectam ente con el tiempo que necesita la clula para doblar su tamao. Si el tiempo del ciclo es ms corto que el tiempo que necesita la clula para doblar su tamao, las clulas sern ms pequeas en cada nueva generacin; y a la inversa, si el tiempo del ciclo celular es ms largo que el tiem po que necesita la clula para doblar su tamao, las clulas sern ms grandes en cada generacin. Debido a que el ritmo de crecim iento de una clula est a la merced del entorno, y variar segn el suministro de alimentos y otros factores, necesariam ente la duracin del ciclo celular ser ajustable (Figura 17-23). Para conseguir esta coordinacin, el control del ciclo celular tiene puntos de control de tamao especficos en los cuales el sistema de control se detiene y espera hasta que la clula ha alcanzado su tamao crtico. Estos puntos de control tie nen lugar tanto en Gv permitiendo al sistema detenerse antes de una nueva ronda de replicacin del DNA, com o en G2, permitiendo la detencin del siste ma antes de que se desencadene la mitosis. Aunque ambos puntos de control actan en todas las clulas, el punto de control Gi es ms importante en algunas clulas y el punto de control G2 en

Figura 17-22 Ciclos vitales de una levadura de gemacin (Saccharomyces cerevisiae) y de una levadura de fisin (Schizosaccharomyces pom b). La proporcin del ciclo vital destinada a los estados diploide y haploide vara con las especies y depende del entorno. Cuando en el medio hay mucho alimento, las variedades salvajes normales de la levadura de gemacin proliferan como clulas diploides, y la duracin de su ciclo celular es aproximadamente de 2 horas. Si se colocan en situacin de ayuno, entran en meiosis y forman esporas haploides, las cuales germinan cuando las condiciones mejoran y forman clulas haploides que pueden proliferar o fusionarse sexualmente (conjugarse) en fase Gj formando clulas diploides, dependiendo del entorno y de otros factores. Las levaduras de fisin, por el contrario, normalmente proliferan como clulas haploides, y en condiciones de ayuno se fusionan formando clulas diploides que atraviesan rpidamente la meiosis y la esporulacin y regeneran clulas haploides. Las cepas de levaduras de gemacin ms utilizadas en el laboratorio son clulas mutantes que pueden proliferar, igual que las levaduras de fisin, como clulas haploides.

944

Captulo 17 : El ciclo de divisin celular

(A) SIN CONTROL NUTRICIONAL DEL CICLO CELULAR

(B) CON CONTROL NUTRICIONAL DEL CICLO CELULAR

reduccin de la nutricin

unidades de tie m p o ----- *-

otras, dependiendo de dnde se apliquen el control de tamao o la mayora de los controles ambientales. As pues en la levadura de gemacin el punto de con trol Gj, llamado Inicio, es el punto de control de tamao ms importante, y una clula que sea lo bastante grande para superar este punto de control norm al mente superar el punto de control G2; el punto de control G! tambin es en el que actan la mayora de los controles ambientales en las clulas de levadura y en los mamferos. En la levadura de fisin, en cambio, es el punto G2, o entrada mittica, el punto de control de tamao ms riguroso.

Las levaduras de fisin y de gemacin cam bian de form a a medida que van progresando a lo largo del ciclo celular 14
Aunque las levaduras son modelos tiles para el estudio del ciclo celular tpico, sus ciclos difieren en algunos aspectos de los de una clula animal o vegetal. Como todos los hongos, m antienen su ncleo celular intacto a lo largo de la mitosis: se forma un huso mittico dentro del ncleo, y despus de que la segrega cin crom osm ica se ha completado, el ncleo se divide por la mitad. Adems, ambas clases de levaduras presentan algunos detalles diferentes en su ciclo celular. Las levaduras de fisin son clulas en forma de bastn y crecen por el alargamiento de sus extremos. Despus de la mitosis la clula se divide en dos mediante un septo en el centro del bastn. Las levaduras de gemacin, por el contrario, se dividen formando una yema. La yema se inicia durante Gp crece despacio, y finalmente se separa de su madre despus de la mitosis (Figura 1724). La existencia de la yema es una seal de que la clula ha pasado el Inicio y se ha embarcado en un ciclo de divisin, y el tamao de la yema indica lo que la c lula ha progresado dentro del ciclo.

Figura 17-23 Control del tamao celular mediante el control del ciclo celular. Los diagramas muestran la relacin entre el ritmo de crecimiento de la clula, el tamao celular y el ciclo de divisin celular, en un organismo de vida libre como la levadura. (A) Si la divisin celular continuara a un mismo ritmo cuando las clulas estn desnutridas, las clulas hijas resultado de cada divisin seran cada vez ms pequeas, quedando reducidas a la cantidad de material que su clula madre pudiera sintetizar en un solo ciclo celular. (B) La respuesta de las clulas de la levadura frente a condiciones desfavorables de nutricin es la disminucin del ritmo de divisin celular: como una clula no puede proseguir ms all de un cierto punto del ciclo celular si no ha alcanzado un tamao determinado, el ritmo de divisin celular se ralentiza y el tamao de la clula contina ms o menos invariable. (En el diagrama, una unidad de tiempo representa la parte de ciclo observada en condiciones de un exceso de alimentos.)

Las mutaciones del ciclo de divisin celular detienen el ciclo en puntos especficos; las mutaciones w ee permiten al ciclo saltarse un punto de control de tam ao 16
Los fundamentos de nuestro conocim iento actual sobre el ciclo celular de las le vaduras provienen de un estudio sistemtico de las mutaciones en los genes que codifican com ponentes de la maquinaria del ciclo celular. Para identificar los genes que controlan directamente el ciclo celular, la in vestigacin se centr en dos fenotipos mutantes. En el primero de ellos, todas las clulas mutantes se detenan en el mismo punto del ciclo celular. Los genes de estas clulas mutantes se llaman genes cdc (de Cell-Division Cycle, ciclo de divisin celular); normalmente cada cdc mutante es deficiente en la fabricacin de un producto necesario para que la clula supere el punto especfico del ciclo en el cual se detienen las clulas mutantes. La segunda clase de mutacin es la que llamamos wee (pequeo en escocs), debido a que la divisin de dichas clulas mutantes da lugar a clulas de un tamao ms pequeo de lo normal. Se espera que las clulas mutantes wee sean deficientes en un producto que nor malmente inhibe el paso por un punto de control de tamao.

Las levaduras y la gentica molecular del sistema de control del ciclo celular

945

LEVA D UR A DE FISI N (Schizosaccharomyces pombe)

(TD
PUNTO DE CONTROL DE INICIO

( O ) C ra )CWJW)
PUNTO DE CONTROL DE LA ENTRADA MITTICA

LEVA D UR A DE G E M A C I N (Saccharomyces cerevisiae)

O
Gi

M PUNTO DE CONTROL DE LA ENTRADA MITTICA

PUNTO DE CONTROL DE INICIO

Al no poder completar un ciclo de divisin celular las clulas mutantes no pueden propagarse, las clulas mutantes cdc slo pueden ser seleccionadas y conservadas si su fenotipo es condicional, es decir, solamente si el producto gnico no funciona solamente en algunas condiciones especficas. La mayora de las clulas mutantes condicionales son mutantes sensibles a la temperatura en las cuales la protena mutante no funciona a altas temperaturas pero a bajas tem pe raturas funciona lo suficientemente bien para permitir que se produzca el ciclo celular. Una linaje de clulas mutantes cdc sensibles a la temperatura puede ha cerse crecer a baja temperatura (condicin permisiva) y entonces puede subirse la temperatura (condicin restrictiva) para desactivar la funcin del gen afectado. Todas las clulas seguirn su ciclo hasta que alcancen el punto en el que la fun cin del gen mutante se hace necesaria para continuar progresando, punto en el que todas las clulas se detendrn (Figura 17-25). En las levaduras de gemacin una detencin uniforme del ciclo celular de este tipo se puede detectar simple mente observando las clulas; la presencia o ausencia de una yema y su tamao proporcionan una fcil indicacin del punto del ciclo en el que se encuentran bloqueadas las clulas mutantes. En las levaduras de fisin se necesitan unos es tudios ms laboriosos para identificar el proceso del ciclo celular que ha fallado. Actualmente se conocen cerca de 70 genes del ciclo de divisin celular, mu chos de los cuales se han clonado y secuenciado. Varios de ellos codifican prote-

Figura 17-24 Comparacin entre los ciclos celulares de una levadura de fisin y una levadura de gemacin. La levadura defisin mostrada en el panel superior tiene el ciclo celular normal eucariota con fases G,, S, G2y M. A diferencia de lo que ocurre en las clulas eucariotas superiores, sin embargo, la envoltura nuclear de las clulas de levadura no se desmonta: los microtbulos del huso mittico se forman dentro del ncleo y se adhieren a los corpsculos polares del huso (verde oscuro) en su periferia. La clula se divide formando una tabicacin (conocida como la placa celular) y dividindose en dos. La levadura de gemacin tiene fases G, y S normales. No obstante, muy temprano en el ciclo, durante la fase S, se empieza a formar un huso formado por microtbulos; de este modo parece no haber una fase S normal. A diferencia de la levadura de fisin, la clula se divide mediante yemas. Como en las levaduras de fisin, pero a diferencia de las clulas eucariotas ms desarrolladas, la envoltura nuclear permanece intacta durante la mitosis. Los cromosomas mitticos condensados (rojo) son fciles de ver en la levadura de fisin, pero ms difciles de observar en la levadura de gemacin. Figura 17-25 Comportamiento de un mutante de ciclo de divisin celular (cdc) sensible a la temperatura. A una temperatura permisiva (baja) las clulas se dividen ms o menos con normalidad, de forma que se encuentran clulas en todas las fases del ciclo (la fase celular viene indicada por su color). Si elevamos la temperatura hasta que sea restrictiva (alta), a la que el producto del gen mutante deja de funcionar con normalidad, la clula continuar progresando por el ciclo pero slo hasta alcanzar un punto determinado que ser incapaz de superar (en este caso dicho punto ser el inicio de la fase S). Debido a que las clulas cdc mutantes continan creciendo de todas formas, sern anormalmente grandes (no se muestra). Por el contrario, las clulas no mutantes cdc que tengan deficiencias en algn proceso (por ejemplo la produccin de ATP) necesario a lo largo del ciclo para la biosntesis y el crecimiento, se detendrn al azar en cualquier estadio del ciclo, en cuanto se les terminen sus reservas bioqumicas.

detencin debida a la elevada tem peratura

detencin debida a la elevada tem peratura

Gi

poblacin de clulas escogida al azar antes de que se eleve la tem peratura

( 9)
(9 y f

(?)

946

Captulo 17: El ciclo de divisin celular

as ya conocidas que participan en los procesos subordinados del ciclo celular, tales como las DNA polimerasas que intervienen en la formacin de los precur sores de la sntesis del DNA, que son necesarios para el paso a travs de la fase S. Sin embargo, un nmero substancial de genes cdc y un gen wee clave, codifican com ponentes y reguladores del propio sistema de control del ciclo celular.

Las subunidades del MPF en las levaduras son homlogas a las del MPF en anim ales 17
Tal como mencionbamos anteriormente, el punto de control de tamao ms im portante en el ciclo de S. pombe es el punto de control de entrada en la mitosis, si tuado al final de G2. En este punto es donde normalmente se detiene el sistema de control de la levadura de fisin, cuando la clula es ms pequea de lo convenien te, para conceder tiempo para el crecimiento: una vez pasado este punto de con trol la clula se ve abocada a la mitosis. As pues, estudios de la levadura de fisin nos proporcionan una ruta natural para la identificacin de los genes que codifi can los componentes del sistema de control celular que conducen la clula a la mitosis, as como de los reguladores que actan en el sistema en este punto. El momento de entrada en la mitosis tambin es el punto en el que se activa el MPF en los ciclos celulares de los embriones tempranos de Xenopus, y ahora veremos que los estudios genticos sobre la levadura de fisin convergen con los estudios bioqumicos sobre Xenopus y nos permiten identificar el gen que codifica la subunidad de Cdk del MPF y clarificar el mecanismo de activacin del MPF. El homlogo de la subunidad protena quinasa del MPF en la levadura de fi sin est codificado por un gen llamado cdc2. Estudios del ciclo celular de un mutante de esta levadura revelaron que el producto gnico de cdc2 resulta ser un com ponente decisivo y fundamental para conducir la clula a la mitosis: si es defectuoso, la mitosis no tiene lugar; si se libera del control normal, la mitosis ocurre prematuramente. Los tests genticos identificaron tres genes ms, wee 1, cdc25, y cdcl3, cuyos productos regulan el funcionamiento del producto gnico cdc2 (Figura 17-26). Como discutimos a continuacin, la caracterizacin de estos productos gnicos reguladores nos ha llevado al conocimiento actual sobre la regulacin del MPF. El descubrimiento de la relacin entre MPF y el producto gnico cdc2 se produjo gracias al clonaje de cdc2. Existe una estrategia, sencilla y poderosa, para clonar el gen normal correspondiente a cualquier gen cdc mutante. Clulas mutantes, incapaces de dividirse a elevadas temperaturas (la condicin de res triccin), son transfectadas con plsmidos que contienen fragmentos de DNA, al azar, de clulas normales. Ocasionalmente, algunas clulas mutantes recibirn un fragmento de DNA que contendr una copia del gen cdc normal que falta en el mutante, y estas escasas clulas podrn dividirse bajo las condiciones de res triccin. De la progenie de estas clulas se puede recuperar el DNA del plsmido y obtener el gen cdc. Dicho gen puede ser secuenciado y caracterizado y se pue den generar anticuerpos contra su producto gnico. La secuenciacin ha revelado que el gen cdc2 de la levadura de fisin codifi ca una protena quinasa. Los anticuerpos contra esta quinasa reconocen la sub unidad quinasa dependiente de ciclina purificada a partir de MPF de una rana. La secuenciacin posterior del gen demostr que la protena Cdcl3 de la levaduLas levaduras y la gentica molecular del sistema de control del ciclo celular

Figura 17-26 Comparacin del ciclo de divisin celular de algunas levaduras de fisin mutantes con una clula normal. En el mutante cdc2~, con un fenotipo recesivo, el gen cdc2 est inactivado de forma que la clula no puede superar el punto de control de la entrada mittica, por lo que contina creciendo y su tamao final es enorme. Inversamente, el mutante cdc2 dominante, cdc2D , en el que el producto del gen cdc2 es hiperactivo, tiene un fenotipo wee: sobrepasa el punto de control prematuramente y su tamao celular es anormalmente pequeo. El mutante cdc25 acta como el mutante cdc2~, y el mutante wee1 como un mutante cdc2D : cdc25 y wee1 afectan la activacin de la quinasa codificada por cdc2. (Fotografas cortesa de Sergio Moreno.)

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ra de fisin es homloga a la ciclina mittica (ciclina B) de animales. La similitud fundamental entre las levaduras y los vertebrados se puso de manifiesto de una forma todava ms dramtica mediante un tercer hecho: cuando se transfectaron clulas im itantes de levadura deficientes en cdc2 con plsmidos que conte nan fragmentos de DNA humano, algunas de ellas fueron capaces de dividirse normalmente. Una vez clonado y secuenciado, se comprob que el fragmento de estas clulas contena un gen humano homlogo al gen cdc2 de las levaduras de fisin. A partir de estas y de otras evidencias resulta claro que la entrada en la mitosis tanto de levaduras como de vertebrados est dirigida esencialmente por la misma quinasa y que, para que adquiera actividad MPF, esta quinasa ha de formar un com plejo con ciclina. Por razones histricas la subunidad quinasa de pendiente de ciclina de MPF se denomina Cdc2 tanto en las levaduras de fisin como en las clulas animales.

La actividad del MPF est regulada por fosforilacin y desfosforilaciii 18,19

Volvamos a las protenas reguladoras identificadas mediante mutaciones cdcy wee y examinemos cmo controlan la activacin y la inactivacin del MPF. Anterior mente vimos que la ciclina, aunque necesaria, no es suficiente para activar la Cdc2; sin embargo, una vez adherida a la ciclina B durante la interfase, Cdc2 se convierte en substrato para dos protenas quinasa. La primera quinasa es la protena W eel, la cual fosforila un residuo tirosina cerca del lugar cataltico de Cdc2, bloqueando su actividad quinasa e impidiendo que acte prematuramente como MPF. La segun da quinasa, llamada M 015 (identificada en la rana), fosforila un residuo treonina en otra regin de la molcula de Cdc2. Esta fosforilacin finalmente activar el MPF, pero mientras el residuo tirosina tambin est fosforilado, el complejo de ci clina Cdc2 ser inactivo. Tanto en ranas como en levaduras es la supresin de la ti rosina fosfato inhibidora lo que finalmente activa el MPF. En las levaduras de fisin dicha supresin est cataliza por la protena Cdc25, que es una protena fosfatasa (Figura 17-27). En la Figura 5-16 se presentan las series de cambios conformacionales en la protena Cdc2 que acompaan este mecanismo de activacin. Probablemente, el equilibrio de la actividad de W eel y de Cdc25 es tal que al principio slo se crea una pequea cantidad de MPF activo. Pero se cree que este MPF activo estimula la activacin de ms MPF, probablemente a travs de la actividad de la fosfatasa Cdc25, y la inhibicin de la actividad de la quinasa W eel, o de am bas cosas a la vez, creando un efecto de retroalimentacin positi va. As, durante la fase G2la ciclina se acumula de forma gradual, que provoca un lento increm ento de la actividad MPF hasta que, finalmente, se produzca una explosin autocataltica. Al superar el umbral crtico, los niveles de actividad MPF conducirn irreversiblemente a la clula hacia la mitosis.

El m ecanism o de activacin del MPF controla el tamao de las levaduras de fisin 15,18,19,20,21
Aunque la informacin anterior sobre la activacin del MPF parece ser vlida para todos los eucariotas, existen variantes. Por ejemplo, en algunos organismos

Figura 17-27 Gnesis de la actividad MPF. A medida que el nivel de ciclina va aumentando gradualmente, Cdc2 se va asociando con la ciclina; esto permite que Cdc2 sea fosforilada tanto por una quinasa activadora en un lugar de activacin como por la quinasa Weel en el lugar cataltico de Cdc2. Esta ltima fosforilacin inhibe la actividad de Cdc2 hasta que este grupo fosfato sea eliminado por la fosfatasa Cdc25. Se cree que el MPF activo estimula su propia activacin activando Cdc25 e inhibiendo Weel, tanto directa como indirectamente.

Cdc2 ciclina

MPF inactivo

quinasa activadora | MQ15 |

in h ib id o r

MPF inactivo

fosfatasa

MPF activo

(Weel

quinasa inhibidora

948

Captulo 17: El ciclo de divisin celular

el ritmo de activacin del MPF puede depender principalmente del ritmo de acumulacin de la ciclina, mientras que en otros puede depender de la actividad Cdc25. Adems en diferentes organismos y en distintas clases de clulas dentro de un mismo organismo, el mecanismo de activacin del MPF es aprovechado con fines reguladores diferentes. En el embrin temprano sirve sencillamente para establecer el tiempo entre una mitosis y la siguiente. En las levaduras de fi sin, por el contrario, retrasa el final de la fase S y el comienzo de la mitosis, y concede una oportunidad al control de tamao celular. Todava no se conoce con exactitud cmo acta el mecanismo de control de tamao en las levaduras de fisin, pero podemos hacernos una idea general de cm o podra funcionar. La activacin del MPF se controla equilibrando su inhi bicin mediante la protena W eel y su activacin mediante la protena Cdc25, adems de otros posibles reguladores. Las concentraciones y las actividades de estas molculas se alterarn de manera diferente a medida que la clula vaya creciendo. Si, por ejemplo, la protena W eel se diluyera en relacin con la prote na Cdc25 como consecuencia del crecimiento de la clula, dicho crecimiento inclinara el equilibrio en favor de la activacin del MPF, y un crecim iento supe rior a un tamao crtico desencadenara la explosin autocataltica del MPF. Que el tamao celular sea un regulador crucial en activacin del MPF (como en las levaduras de fisin) o no (como en casi todas las dems clulas) no depende del modo bsico de actuacin del mecanismo de activacin sino de los detalles cuantitativos de dicho mecanismo y de los reguladores que lo afecten. Aunque existen pruebas de la existencia de control del tamao en muchas otras clases de clulas, el mecanismo parece incluso ms oscuro que en las leva duras de fisin. Una pista posible vendra de las comparacin entre clulas que difieren en el grado de ploida (es decir, en el nmero de copias del genoma que contienen) pero que en cambio tienen similitudes bioqumicas y genticas (va se Figura 17-49). Parece una regla general que el tamao celular es de alguna manera proporcional a la ploida, lo cual sugiere, a su vez, que el mecanismo de control depende de algn tipo de titulacin -directa o indirecta- de la cantidad de un com ponente citoslico frente a la cantidad de DNA.

Para la mayora de las clulas el punto de control principal del ciclo celular se encuentra en el Inicio de G L 14 15
Para las levaduras de gemacin y para los ciclos de divisin caractersticos de la mayora de las clulas de los eucariotas pluricelulares ms estudiadas, el punto de control principal donde se detiene el ciclo celular para conceder el tiempo necesario para el crecimiento, no es G2, como en las levaduras de fisin, sino al final de Gv Este punto de control de G! se llama Inicio. Normalmente, si la clula de levadura de gemacin puede superar dicho Inicio, tambin superar el punto de control de entrada a la mitosis una vez ha completado la fase S. As pues, para la levadura de gemacin, como para la mayora de las clulas animales , el punto de control Gt es el punto de no retorno ms all del cual la clula completar el ciclo incluso aunque las condiciones cambien. Estudios genticos de la levadura de gemacin han demostrado que el paso por este punto, como el paso por el punto de control G2, depende de la actividad de una protena quinasa depen diente de ciclina.

La protena Cdc2 se asocia con la ciclina Gl para conducir a la clula ms all del Inicio 14,18,22
Para una colonia de clulas, el crecer libremente no es suficiente para superar el Inicio: es fundamental superar este punto en el momento adecuado. En las leva duras de gemacin son necesarias al menos tres condiciones para que ello ocurra -e l tamao de la clula, la disponibilidad de alimento, y las demandas sexuales. Si la clula es demasiado pequea, el sistema de control se detiene para proporcio nar tiempo para el crecimiento. Si la clula est en condiciones de ayuno, el siste

Las levaduras y la gentica molecular del sistema de control del ciclo celular

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ma de control tambin se detiene, retrasando el intento de la clula de duplicar se. Cuando a la clula se le requiere que se aparee, un factor peptdico de aparea miento secretado por una clula vecina detiene el ciclo celular en Gj y prepara la clula para la fusin con una pareja haploide (vase Figura 17-22). De este modo, tamao, alimento y sexo regulan de forma tripartita que la clula se aproximarse al Inicio (Figura 17-28). Mutaciones que afectan la respuesta de las levaduras de gemacin a estas influencias han identificado los componentes del control del ci clo celular que dirigen el progreso desde G, hasta S. La bsqueda de genes cdc en la levadura de gemacin revel algunos genes que la clula necesita para superar el Inicio. Una clula mutante deficiente en cualquiera de esto genes se detendr en G} aunque sea suficientemente grande para superar el Inicio. Uno de los genes cdc identificados de esta forma, llamado CDC28 en las levaduras de gemacin, result ser homlogo al gen cdc2 de las le vaduras de fisin: ambos genes tienen secuencias similares y son intercambiables funcionalmente. Este descubrimiento puso de manifiesto el vnculo remarcable entre el Inicio (el punto de control predominante en la levadura de gemacin) y la entrada m ittica (el punto de control predominante en la levadura de fisin). Ahora sabemos que los ciclos celulares de ambos tipos de levadura incluyen los tipos de punto de control, y que en ambos tipos de levadura el producto del mis mo gen sirve tanto para conducir a la clula a la mitosis y superar el Inicio como para iniciar la replicacin del DNA. En este captulo, para clarificar y enfatizar su papel universal, a este gen lo denominaremos gen cdc2, sin tener en cuenta la es pecie de la que estemos tratando. La protena Cdc2 tiene distintas actividades en los dos puntos de control y se asocia con diferentes tipos de ciclina. En G2, como se ha visto, se asocia con ciclina m ittica formando el MPF; en G, se asocia con ciclina G, formando un com plejo al que nos referiremos com o quinasa de Inicio. Probablemente la quinasa de Inicio y el MPF fosforilan diferentes series de protenas diana, las fosforilan distintamente, o ambas cosas a la vez. Por lo tanto, parece que la especifici dad de Cdc2 depende de la clase de ciclina con la que se asocia (Figura 17-29). La clase de protenas ciclina G! fue descubierta en las levaduras de gema cin mediante estudios sobre clulas mutantes que superaron el Inicio prematu ramente o bajo condiciones en las cuales las clulas no mutantes no lo habran hecho. Los tres genes identificados mediante estas mutaciones resultaron codifi car protenas lejanam ente relacionadas con las ciclinas mitticas. Esto hizo que a estas protenas se las denominara ciclinas G/ y de inmediato se sugiri que podan desempear un papel activo en el Inicio, anlogo al que desempeaban la ciclina mittica en el punto de control G2 (Figura 17-30). Se podra probar que los fenotipos mutantes son resultado de un exceso de actividad de la ciclina G,. Sorprendentemente, sin embargo, la delecin de uno solo de estos genes de ciclina G, no tiene ningn efecto prctico; las clulas slo se detienen en G1 ( incapaces de superar el Inicio, si los tres genes desaparecen simultneamente. Por lo tanto parece que en una clula de levadura corriente por lo menos existen tres clases de ciclinas Gp que la clula requiere su actua cin para superar el Inicio, y que son, al menos hasta cierto punto, funcional

Figura 17-28 Las tres opciones de que dispone una clula haploide de levadura de sin cuando se acerca al Inicio. Ntese que una clula diploide, en lugar de aparearse, tendra la opcin de entrar en la meiosis y formar esporas.

Cdc2

ciclina Gi

factor prom otor de la fase M (MPF)

substratos que se fosforilan en la m itosis

(gj

quinasa de Inicio

substratos que se fosforilan en el Inicio

Figura 17-29 Com paracin entre la quinasa de Inicio y el MPF. Ambos disponen de Cdc2, pero se asocian con diferentes tipos de ciclina. Ello sugiere que la ciclina determina la especificidad de substrato de la quinasa Cdc2, tanto porque se une a los substratos (como se muestra) como porque conduce a la quinasa a su localizacin adecuada en la clula (no se muestra).

950

Captulo 17: El ciclo de divisin celular

Figura 17-30 El ciclo de Cdc2 en levaduras. Cdc2 est presente de forma permanente, pero cambia su estado de asociacin con la ciclina, lo cual define las fases del ciclo de divisin de la clula.

ciclina Gi

mente intercambiables de forma que la clula puede seguir adelante si uno o dos de los tres genes se han perdido. Se cree que en un ciclo habitual las tres ciclinas G{ colaboran asegurando que las clulas sobrepasen el Inicio de una manera rpida, decisiva e irreversi ble, mediante una activacin explosiva de la quinasa de Inicio anloga a la acti vacin explosiva del MPF al comienzo de la mitosis. Aunque todava quedan muchas lagunas en el conocim iento de estos procesos, de nuevo parece que el mecanismo depende de una retroalimentacin positiva, aunque por un proceso distinto: cuando la quinasa Cdc2 se une a una de las ciclinas G! forma un com plejo activo que induce la transcripcin de genes que codifican las otras dos ci clinas Gp las cuales, a su vez, se unen a Cdc2 e incrementan su produccin hasta que se alcanza el umbral del complejo activo. Cuando la clula ya ha pasado por el Inicio, las ciclinas Gp como las ciclinas G2 en la mitosis, desaparecen de la clula y, por lo que se sabe hasta ahora, no desempean ningn otro papel hasta la fase G, del siguiente ciclo.

Las ciclinas GLmedian muchos de los controles que actan en el Inicio 15,22,23
El sistema de control del ciclo celular de las levaduras de gemacin est regulado ampliamente en el Inicio, mediante frenos y aceleradores que controlan la pro duccin de las diversas ciclinas Gv Las clulas de levadura de gemacin regulan su tamao, haciendo que la adquisicin de una talla determinada sea la condicin indispensable para supe rar el Inicio -u n a estrategia que probablemente utilizan tambin la mayora de las dems clulas. As pues, las clulas que comienzan G! cuando son anormal mente pequeas utilizarn un tiempo extra para crecer antes de superar el Ini cio, mientras que las clulas anormalmente grandes al comenzar G! superarn el Inicio antes de lo habitual. Ya hemos discutido de qu forma el tamao celular puede controlar el paso de la clula a travs del punto de control G2 en las leva duras de fisin, modificando las concentraciones relativas o las actividades de las molculas reguladoras. Principios similares podran aplicarse al mecanismo a travs del cual tamao de la clula regula el paso a travs del Inicio. Los mecanismos a travs de los cuales los factores ambientales regulan el paso por el Inicio se comprenden algo mejor. Una deficiencia de alimento redu ce la velocidad de sntesis de ciclinas respecto a la de su degradacin, por lo que reduce la concentracin de ciclinas en la clula. Como consecuencia de ello, la clula podra no alcanzar el umbral de concentracin de ciclinas Gj necesario para desencadenar la explosin de quinasa de Inicio. Tambin se cree que las feromonas de apareamiento bloquean el paso por el Inicio al hacer disminuir los

Las levaduras y la gentica molecular del sistema de control del ciclo celular

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niveles de ciclinas G,, pero en este caso sto se consigue haciendo que las cicli nas Gj se mantengan inactivas y degradadas.

La quinasa de Inicio pone en m archa la fabricacin de los com ponentes necesarios para la replicacin del DNA2 24
La actividad de la quinasa de Inicio tiene que inducir directa o indirectamente la replicacin cromosmica, tal como la actividad del MPF tiene que inducir al fi nal de G2 la mitosis. La replicacin crom osmica requiere un equipamiento com plejo -enzim as tales como la DNA polimerasa, la ligasa, y la topoisomerasa, as com o enzimas necesarias para la sntesis de nucletidos, protenas estructu rales com o las histonas, y factores de iniciacin que actan en los orgenes de la replicacin iniciando la sntesis del DNA (se discute en el Captulo 6). Los genes de al m enos algunas de estas protenas se transcriben cclicam ente durante cada fase S, y existen evidencias circunstanciales de que su transcripcin est activa da por la quinasa de Inicio. Exceptuando las histonas, parece que la mayora de estas protenas subsisten (al menos en las levaduras) a travs de todo el ciclo. Sin embargo no est claro si la quinasa de Inicio pone en marcha la fase S mediante la fosforilacin de com ponentes reguladores permitiendo la actividad de la m a quinaria de replicacin que ya est presente, o desencadena la fase S mediante la fabricacin de los elementos de la maquinaria que se haban perdido. En los ciclos celulares de embriones tempranos la situacin es mucho ms simple. El embrin dispone de abundantes reservas de transcritos de RNA deri vados de la madre, y todo el aparato para la replicacin cromosmica permanece disponible a lo largo de todo el ciclo incluyendo, al parecer, la quinasa de Inicio. El paso a travs de la fase M, eliminando el bloqueo de re-replicaciones, es sufi ciente para permitir una nueva replicacin del DNA.

Los controles por retroalim entacin aseguran que las clulas com pleten un proceso de ciclo celular antes de com enzar el siguiente 3,25
Cada una de las acciones principales del sistema de control del ciclo celular -la activacin del MPF al inicio de la mitosis, su inactivacin en la transicin de la anafase a la metafase, la activacin de la quinasa de Inicio en el Inicio- desenca denan un com plejo proceso subordinado que requiere un cierto intervalo de tiempo para completarse. Si el sistema de control inicia la siguiente accin sin que cada uno de estos procesos subordinados se haya completado, es probable que las consecuencias sean fatales o mutagnicas para la clula. As, si se condu ce a la clula a la mitosis antes de que haya terminado la replicacin de su DNA, transmitir a sus clulas hijas una serie de cromosomas rotos e incompletos; si progresa hasta la anafase y comienza a dividirse en dos antes de que todos sus cromosomas estn alineados en el huso mittico, los cromosomas no quedarn repartidos por igual en las clulas hijas. En la mayora de las clulas tales desas tres se evitan mediante controles de retroalimentacin que actan en ciertos puntos de control deteniendo el sistema de control celular hasta que el proceso requerido se haya completado. El control por retroalim entacin m ejor estudiado es el que retrasa la mitosis hasta que se com pleta la replicacin del DNA. El fenm eno es fcil de poner de manifiesto en clulas de mamfero que tengan ciclos celulares tpicos. Si mien tras estas clulas estn en fase S se tratan con un inhibidor de la sntesis del DNA, como la afidicolina (que inhibe especficam ente la DNA polimerasa) o como la hidroxiurea (que bloquea la sntesis de los desoxirribonucletidos), la clula se detiene en fase S y no progresa hacia la mitosis hasta que el inhibidor sea suprimido y se com plete la replicacin del DNA. No obstante, si las clulas en las cuales se inhibe la sntesis del DNA reciben cafena junto con el inhibidor, las clulas progresan de forma suicida hacia la mitosis con su DNA replicado de

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Captulo 17: El ciclo de divisin celular

control + cafena + hidroxiurea

G2

M M

MITOSIS NORMAL MITOSIS NORMAL

Figura 17-31 El DNA replicado de forma incompleta bloquea el comienzo de la mitosis. En los experimentos esquematizados aqu se trataron clulas de mamfero en cultivo con cafena y con hidroxiurea, por separado o conjuntam ente. La hidroxiurea bloquea la sntesis del DNA, deteniendo las clulas en la fase S y retrasando la mitosis. Pero si adems de hidroxiurea se aade cafena, el m ecanism o de retraso falla y las clulas entran en la mitosis siguiendo con su ciclo tpico pero con un DNA replicado incompletamente.

m
+ hidroxiurea + cafena M

l
{

DETENCION EN LA FASE S ))+( MITOSIS SUICIDA

manera incompleta. Ante la ausencia de un inhibidor del DNA la cafena no causa ningn dao: el sistema de control contina siguiendo el programa tpico, lo cual permite a las clulas finalizar la replicacin del DNA antes de que la mitosis com ience (Figura 17-31). Por lo tanto parece que las clulas poseen un mecanism o de control por retroalimentacin que se inactiva (de manera desco nocida) con la cafena. El control de retroalim entacin acta como un m ecanis mo de seguridad. En circunstancias normales el dispositivo de seguridad no ser necesario ya que el DNA tiene tiempo suficiente para replicarse com pleta mente antes de que se inicie la mitosis. Es ms, como mencionbam os ante riormente, en los primeros ciclos celulares del embrin de una rana no existe tal dispositivo de seguridad, y la inhibicin de la replicacin del DNA no retrasa la entrada en la mitosis.

El DNA daado genera una seal que retrasa la m itosis 25,26

Adems, actan otras seales de retroalimentacin reprimiendo el sistema de control celular hasta que se hayan satisfecho algunas condiciones particulares. Tal como hemos mencionado anteriormente, los cromosomas que no estn ad heridos al huso mittico generan una seal de retroalimentacin que bloquea la inactivacin del MPF (se discute en el Captulo 18). Otro control por retroali m entacin bien caracterizado acta en el punto de control de la entrada mittica evitando que las clulas cuyo DNA est daado entren en la mitosis antes de que dicha alteracin est reparada. Normalmente la respuesta al DNA daado se estudia con lesiones de DNA inducidas experimentalmente, como las infringidas por rayos X. Se han aislado muchas mutaciones debidas a radiaciones (rad) en la levadura de gemacin, y al menos una, llamada radS, codifica un componente fundamental del mecanismo de control de retroalimentacin. Las clulas mutantes que carecen de radd po seen la maquinaria de reparacin del DNA pero no pueden retrasar G2 tras ser irradiadas. Como consecuencia de ello, progresan hacia la mitosis con los cro mosomas daados: no es sorprendente, por lo tanto, que mueran debido a unas dosis de radiacin a las que las clulas normales sobrevivan. En la Tabla 17-1 se resumen varios de estos genes cuyas funciones estn implicadas en la regula cin del ciclo celular de las levaduras. En las clulas de los mamferos acta un dispositivo de seguridad adicional reprimiendo la entrada en la fase S cuando el DNA est daado. El m ecanismo parece depender de una protena llamada p53, que se acumula en la clula como respuesta a las alteraciones del DNA y detiene al sistema de control del ciclo celular en Gr. Las mutaciones del gen p53 juegan un papel crucial en la gnesis de una amplia proporcin de los cnceres humanos, aparentem ente incapacitando el control por retroalim entacin y, por lo tanto, aumentando la frecuencia de alteraciones genticas promotoras de cncer, como discutimos en el Captulo 24. Las levaduras y la gentica molecular del sistema de control del ciclo celular 953

Tabla 17-1 Algunos genes del ciclo de divisin celular de las levaduras y sus funciones Nombre del gen en levaduras de gemacin Nombre del gen en levaduras de fisin Producto gnico Fenotipo del imitante que ha perdido la funcin del gen paro en la fase S paro en G2con DNA replicado de forma imperfecta paro en el Inicio o en el punto de control de la entrada a la mitosis (G2) no entra en la fase S

CDC2
CDC9 CDC28

pot cdc 17 cdc2 cdclO

subunidad cataltica de la DNA polimerasa 8 DNA ligasa protena serina/ treonina quinasa protena reguladora de genes necesaria para la transcripcin de las ciclinas G, ciclinas G, ciclinas mitticas protena tirosina quinasa

SW16

CLN 1,2,3 CLB 1,2,3,4 WEE1

? cdcl3 wee 1

cdc25 RAD9 ?

protena tirosina fosfatasa protena de funcin desconocida

DIS2 SI

dis2

protena fosfatasa I

paro en el Inicio (si los tres genes son inactivos) paro en el punto de control de entrada a la mitosis (G2) paso prematuro por el punto de control de la entrada a la mitosis (G2), y por ello tamao pequeo paro en el punto de control de entrada a la mitosis (G2) no se retrasa la mitosis cuando el DNA est daado (prdida del control por retroalimentacin) parada en la mitosis

La tabla slo muestra una pequea seleccin de genes cdc y de genes relacionados que han sido identificados. La terminologa es confusa. En cada especie de levadura, los genes cdc se nume ran por orden de descubrimiento -CDC1, CDC2, CDC3,. . . en levaduras de gemacin; cdcl, cdc2, cdc3 , . .. en levaduras de fisin. Por lo tanto las secuencias numricas no se corresponden, de manera que el equivalente al gen c d c l de la levadura de fisin se llama CDC28 en la levadura de gemacin (ambos genes codifican la quinasa dependiente de ciclina del sistema de control del ciclo celular). Para empeorar las cosas an ms, no existe ningn convenio que regule cmo se llaman los homlogos de estos genes en otros organismos.

Generalmente los controles por retroalim entacin en el ciclo celular dependen de seales inhibidoras 27
Un argumento general nos sugiere por qu los controles por retroalimentacin como los que hem os m encionado se basan en una seal negativa que detiene el sistema de control del ciclo celular, en vez de basarse en una seal positiva que haga progresar al sistema de control hacia adelante cuando el proceso subordi nado se haya completado. Consideremos, por ejemplo, la observacin de la adhesin de los crom oso mas al huso mittico. Una clula necesita ser capaz de detectar la adhesin del ltimo crom osom a a los microtbulos del huso: si la clula comienza la anafase y empieza a segregar sus crom osom as en las clulas hijas antes de que esto haya sucedido, una clula hija recibir una dotacin incompleta de cromosomas mientras que la otra clula hija recibir un exceso de cromosomas. En una clula con muchos cromosomas, si cada uno de ellos enva una seal positiva al siste ma de control una vez se ha adherido, cuando lo hiciera el ltimo cromosoma su seal sera difcil de detectar porque slo supondra una pequea fraccin de

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Captulo 17 : El ciclo de divisin celular

quinasa de Inicio activada

quinasa de Inicio inactivada

clula de tam ao m enor al m nim o

DNA alterado (p53)

DNA replicado de form a incom pleta

preparacin para activar M PF

----------------

M PF activado

M PF inactivado

clula de tam ao m enor al m nim o

DNA alterado (rad9)

crom osom a separado del huso

cambio de la intensidad total de la seal de ponerse en marcha. Por otra parte, si cada cromosoma no adherido al huso enva una seal negativa que inhiba el progreso del sistema de control del ciclo celular, la adhesin del ltimo crom o soma ser fcilmente detectable porque significar la desaparicin de las sea les de parada. Un argumento similar a ste implicara que la mitosis depende de la consum acin de la replicacin del DNA, no porque se requiera una seal positiva de DNA replicado en su totalidad sino porque el DNA no replicado o las horquillas de replicacin envan una seal negativa mientras todava se replican los cromosomas. En la Figura 17-32 se resumen algunos de los controles que actan en el ci clo celular.

Figura 17-32 Resumen de los controles de retroalimentacin, tamao y dao en el ciclo celular. Las barras rojas en forma de T representan los puntos de control en la progresin del sistema de control del ciclo celular, que provienen de procesos intracelulares que son incompletos o alterados.

Resumen
Las levaduras son un modelo de organismo genticamente prctico para el estudio de los ciclos celulares tpicos en los cuales la clula crece y se divide. En las clulas normales el ciclo de divisin corre paralelo al crecimiento de la clula, de forma que se mantenga un tamao medio tpico, mediante controles que actan en dos puntos del ciclo celular de control de tamao -uno en G llamado Inicio (ms im portante en las levaduras de gemacin y en clulas de animales superiores), y el otro en G2 llamado el punto de control de la entrada mittica (ms importante en las levaduras de fisin). Si la clula todava no ha alcanzado su tamao crtico, el sistema de control del ciclo celular se detiene en estos puntos. Los genes que codifi can los componentes del sistema de control del ciclo celular pueden ser identifica dos mediante mutaciones que detienen a la clula en un punto especfico del ciclo o le permiten proseguir ms all del punto de control y dividirse dando lugar a clu las de tamaos anormalmente reducidos. Uno de estos genes, identificado en la le vadura de fisin como cdc2, codifica una protena homloga y funcionalmente in tercambiable con la subunidad de MPF quinasa dependiente de ciclina de los vertebrados. Dicho gen juega un papel central a lo largo del ciclo celular de la leva dura: en G2 se asocia con la ciclina mittica formando el MPF y conduciendo a la clula ms all del control de entrada a la mitosis; en G, se asocia con la ciclina G, formando la quinasa de Inicio y conduciendo a la clula a pasar el Inicio. Se cree que cada una de estas activaciones quinasa se producen mediante un mecanismo de explosin autocataltico que implica otros componentes reguladores, haciendo que el sistema de control del ciclo celular responda a mltiples controles. Estos con troles incluyen seales por retroalimentacin de DNA replicado deform a deficiente o daado que impedirn que se supere el siguiente punto de control hasta que se complete la replicacin o se repare el dao.

Controles de la divisin celular en los animales pluricelulares

En los organismos unicelulares, en los cuales cada divisin celular genera un nuevo individuo, la seleccin natural favorece a las clulas que crecen y se divi den ms rpidamente y a las que sobreviven ms tiempo. Su proliferacin slo

Controles de la divisin celular en los animales pluricelulares

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se ve frenada por la disponibilidad de alimento y por las demandas ocasionales del sexo. Por el contrario, en las especies pluricelulares la seleccin natural no acta en cada clula sino en el conjunto del organismo. Para producir y m ante ner la intrincada organizacin del cuerpo los com ponentes celulares tienen que estar sometidos a controles estrictos que limiten su proliferacin. La mayor par te del tiempo, la mayora de las clulas de un adulto no estn creciendo ni divi dindose, sino que se encuentran en estado de reposo, llevando acabo su fun cin especializada mientras se encuentran fuera del ciclo de divisin. Debido a que los alimentos son abundantes en los tejidos corporales, las clulas tienen que frenar su proliferacin en condiciones en las cuales las levaduras o las bac terias se lanzaran a proliferar. A qu se debe esta diferencia? Veremos que para las clulas de un animal pluricelular la abundancia de ali m ento no es suficiente para poner en marcha la divisin; una clula necesita re cibir seales positivas especficas de otras clulas. Muchas de estas seales son factores de crecimiento proteicos que se unen a receptores complementarios de la mem brana plasmtica estimulando la proliferacin celular. Estas seales po sitivas actan inhibiendo controles intracelulares negativos que, en caso contra rio, frenaran el crecim iento y bloquearan el progreso por el sistema de control celular. As pues, mientras que una clula de levadura bien alimentada puede proliferar hasta que reciba una seal negativa (por ejemplo, un factor de aparea m iento), una clula animal permanece en reposo a menos que reciba una seal positiva que ponga en marcha su proliferacin. En esta seccin nos centraremos en las clulas de mamfero y en cuatro pre guntas: ( 1) Cul es la naturaleza del sistema de control del ciclo celular en las clulas de los mamferos? (2) Cmo se regula la proliferacin en las clulas de los mamferos, y cm o se estudia? (3) Cules son las seales extracelulares que determinan si la clula debe crecer o dividirse? (4) Cmo inhiben estas seales los controles intracelulares negativos y actan sobre el sistema de control del ci clo celular? La ltima pregunta es, con diferencia, la ms difcil de responder. La dejaremos para el final y empezaremos examinando de cerca los componentes del sistema de control del ciclo celular comparndolos con los del sistema de control del ciclo celular de las levaduras.

El sistem a de control del ciclo celular es ms elaborado que el de las levaduras 28

Todos los genes del ciclo celular que hemos visto en las levaduras, incluyendo cdcl, las ciclinas, cdc25, y wee 1, tam bin aparecen en las clulas de mamfero. Se ha demostrado que todos ellos actan de forma similar a sus equivalentes de las levaduras, hasta el punto de que una levadura mutante a la cual le falte su copia de gen funcional puede salvarse con la transferencia de un gen de mamfero. Como apuntbamos antes, esto ha proporcionado un camino eficiente para el clonaje de genes del ciclo celular de los mamferos. Sin embargo, el sistema de control celular de la mayora de los organismos pluricelulares es m ucho ms complejo que el de las levaduras. Aparentemente la duplicacin y divergencia de genes ha generado mltiples variantes de los genes fundamentales del ciclo celular y estas variantes, que coexisten en una misma clula, se especializan en funciones ligeramente diferentes. De este modo, m ien tras que en las levaduras un gen de quinasa dependiente de ciclina es suficiente para todos los pasos del ciclo celular, las clulas humanas necesitan al menos dos o probablem ente ms de ellos. Se sabe que dos de estas protenas -cdc2 y un gen relacionado llamado cdk2- estn presentes en la rana Xenopus y tam bin en Drosophila; ambos codifican quinasas cuya activacin depende de su unin a ci clinas. Como en las levaduras, los animales superiores tambin tienen mltiples ciclinas: se han encontrado al menos seis tipos diferentes de ciclina, llamadas ci clina A, B, C, D, E, y F; algunas de ellas son familias de molculas estrechamente relacionadas entre s. La induccin de la mitosis en las clulas de los vertebrados depende de una protena Cdc2 complejada con ciclina B; existen evidencias de

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Captulo 17: El ciclo de divisin celular

Cdc2

Figura 17-33 Las ciclinas y la protena Cdk en un ciclo celular norm al de vertebrados. Los vertebrados tienen muchos genes ciclina y muchos genes cd k distintos. Sus productos actan en varias com binaciones de ciclina/Cdk en diferentes estadios del ciclo. El diagrama, que es especulativo, muestra algunas de estas ciclinas. Las funciones de la Cdk2 y de la ciclina A, en particular, son an inciertas.

que la protena Cdk2 complejada con la ciclina E pueden inducir la superacin del punto de control Gj (el equivalente al Inicio en los vertebrados), y que la ci clina A complejada con la protena Cdk2 puede ser necesaria para activar la m a quinaria de replicacin del DNA (Figura 17-33). Parece, por lo tanto, que en los mamferos diferentes protenas Cdk efectan varias funciones que en las levadu ras son llevadas a cabo por una nica protena. En clulas que poseen ciclos regulares, la concentracin de la mayora de las ciclinas que tom an parte en ellos sube y baja en diferentes momentos del ciclo celular, mientras que las concentraciones de las quinasas dependientes de cicli na se mantienen aproximadamente constantes, como ocurre en las levaduras. Actualmente todava no se conocen en detalle las funciones precisas de la mayo ra de las protenas del sistema de control del ciclo celular de las clulas de los mamferos.

La regulacin del crecim iento y de la proliferacin de las clulas de mamfero se estudia norm alm ente en lneas celulares cultivadas 29
La observacin detallada de las clulas de mamfero en un animal intacto no es fcilmente accesible. Por ello, la mayora de los estudios realizados sobre la pro liferacin de clulas de mamfero utilizan clulas que se hacen crecer en cultivo (Figura 17-34). Sin embargo, esto produce una complicacin adicional. Si las c lulas de los tejidos normales de mamfero se cultivan en condiciones estndar, normalmente slo podrn propagarse hasta un nmero determinado de ciclos de divisin -aproxim adam ente 50 para las clulas normales del cuerpo humano, por ejemplo; despus, las divisiones cesan y la clula finalmente muere; este proceso recibe el nombre de senescencia celular, de la cual trataremos ms ade lante. Pero durante la proliferacin de algunas clulas cultivadas, especialmente de roedores, algunas clulas escapan de la senescencia y se dividen indefinida mente como lneas celulares. Aunque dichas clulas parecen normales en mu chos aspectos, su inmortalidad refleja la presencia de una o ms mutaciones que han alterado sus propiedades de proliferacin. De todas formas, a pesar de sus ligeras anomalas, las lneas celulares se usan habitualmente en los estudios so bre el ciclo celular -y en toda la biologa celular en general- porque aportan una fuente ilimitada de clulas estandarizadas y genticamente homogneas.

Los factores de crecim iento estim ulan la proliferacin de clulas de m am fero 30

Al principio las clulas de mamfero se cultivaron en cogulos sanguneos, y du rante muchas dcadas todos los esfuerzos dedicados a la definicin de los re querimientos mnimos para la proliferacin de las clulas fueron vanos; incluso en un medio que contuviera los nutrientes tpicos definidos qumicamente, inFigura 17-34 Electronm icrografa de barrido de clulas de mamfero proliferando en cultivo. Las clulas son fibroblastos de rata. (Cortesa de Guenter Albrecht-Buehler.)

Controles de la divisin celular en los animales pluricelulares

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cluyendo glucosa, aminocidos y vitaminas, las clulas slo crecan si al medio se le aada suero, el lquido que queda despus de que la sangre se haya coagu lado. Al igual que las levaduras cuando se quedan sin nutrientes, las clulas de mamfero sin suero dejan de crecer y quedan detenidas, normalmente entre la mitosis y la fase S, en un estado de reposo llamado G0. Finalmente se demostr que los com ponentes fundamentales aportados por el suero son unas protenas muy especficas llamadas factores de crecim iento, la mayora de las cuales se necesitan slo en proporciones muy pequeas (del orden de 10 -9 a 1 0 1 1M). Uno de los primeros de estos factores en ser identificados fue el factor de crecim iento derivado de las plaquetas, o PDGF (de Platelet-Derived Growth Fac tor) y es caracterstico de muchos otros descubiertos despus. El camino hacia su aislamiento empez observando que los fibroblastos cultivados proliferan si se les suministraba suero pero no si se les suministraba plasma -e l lquido prepara do mediante la extraccin de las clulas de la sangre sin permitir que se produzca la coagulacin. Cuando la sangre se coagula, las plaquetas incorporadas al cogu lo se ponen en marcha liberando los contenidos de sus vesculas secretoras (Figu ra 17-35). La capacidad superior del suero para facilitar la proliferacin sugiere que las plaquetas contienen uno o ms factores de crecimiento. Esta hiptesis se confirm mostrando que los extractos de plaqueta pueden utilizarse en lugar del suero para la proliferacin de fibroblastos. Se demostr que el factor crucial de crecimiento es una protena, que posteriormente fue purificada y llamada PDGF. Probablemente en el cuerpo la protena PDGF liberada de cogulos sanguneos juega un papel importante en la estimulacin de la divisin celular (y en otros procesos) durante la curacin de las heridas. El PDGF solam ente es 1 de las aproximadamente 50 protenas que actan com o factores de crecim iento. Para cada clase de factor de crecimiento existe un receptor o un conjunto de receptores especficos, cada uno de los cuales algunas clulas presentan en su superficie y otras no. Las clulas responden a un factor de crecim iento slo si disponen de la protena receptora apropiada (se trata en el Captulo 15). Adems de las protenas, otras molculas pueden actuar como factores de crecim iento; un ejemplo de ellas son las hormonas esteroideas, que actan sobre protenas receptoras intracelulares. Los factores de crecimiento se pueden dividir en clases de especificidad amplia o reducida. Los factores de es pecificidad amplios, com o el PDGF y el factor de crecimiento epidrmico (EGF, de Epidemial Growth Factor) actan sobre muchas clases de clulas. As, el PDGF acta sobre una amplia variedad de clulas diana, entre las cuales se in cluyen fibroblastos, fibras musculares lisas, y clulas neurogliales, mientras que el EGF no slo acta sobre clulas epidrmicas sino tambin sobre muchos otros tipos de clulas, tanto epiteliales como no epiteliales. En el otro extremo encontram os los factores de especialidad reducida como la eritropoyetina, que solam ente induce proliferacin de precursores celulares de los glbulos rojos. Debido a que estos factores se presentan en pequeas cantidades, son dif ciles de aislar; sin embargo, una vez que el DNA que codifica un factor de creci m iento ha sido identificado y clonado, puede utilizarse para identificar y aislar a una familia entera de genes relacionados con l que codifican otros miembros de la misma familia de factores de crecim iento. Un ejemplo es la familia de fa c tores de crecimiento de fibroblastos (FGF, de Fibroblast Growth Factor) que in cluye al m enos siete miembros. Hoy en da, cuando se asla un nuevo factor de crecim iento mediante un ensayo biolgico, frecuentem ente se encuentra que es idntico o est em parentado muy de cerca, a otro factor de crecim iento ya conocido. En los animales intactos la proliferacin de la mayora de las clulas depen de de una combinacin especfica de factores de crecimiento, ms que de un solo factor. De este modo un nmero pequeo de factores de crecimiento pue den servir, en com binaciones diferentes, para regular selectivamente la prolife racin de cada una de las diferentes clases de clulas de un animal superior. Aunque algunos factores estn presentes en la circulacin, la mayora de ellos se originan en clulas vecinas de la clula afectada y actan de mediadores

m icrotbulo

I ___________I
1 |jm

Figura 17-35 Una plaqueta. Las plaquetas son clulas en miniatura, sin ncleo, que circulan por la sangre facilitando la coagulacin sangunea en los lugares daados. Tambin liberan varios factores que estimulan la curacin de las heridas. La plaqueta del diagrama est abierta por la mitad para mostrar las vesculas secretoras que contiene; algunas de ellas contienen el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF).

958

Captulo 17: El ciclo de divisin celular

Tabla 17-2 Algunos factores de crecimiento proteicos y sus funciones Miembros de la familia relacionados Especificidad amplia o limitada Actividades representativas amplia estimula la proliferacin de clulas del tejido conjuntivo y de algunas clulas neurogliales estimula la proliferacin de muchos tipos celulares; acta como seal inductora durante el desarrollo embrionario estimula la supervivencia celular; estimula el metabolismo celular; colabora con otros factores de crecimiento estimulando la proliferacin celular potencia o inhibe la respuesta de la mayora de las clulas a otros factores de crecimiento, dependiendo del tipo celular; regula la diferenciacin de algunos tipos celulares; acta como seal inductora durante el desarrollo embrionario estimula la proliferacin de muchos tipos celulares; inhibe la diferenciacin de varios tipos de clulas madre; acta como seal inductora durante el desarrollo del embrin estimula la proliferacin de los linfocitos T activados estimula la supervivencia y los procesos de prolongacin de las ramificaciones nerviosas de algunas clases especficas de neuronas estimula la proliferacin, la diferenciacin y la supervivencia de precursores de los glbulos rojos de la sangre estimula la proliferacin y la supervivencia de varios tipos precursores celulares sanguneos

Factor

Factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) -tres subtipos factor de crecimiento de Factor de crecimiento transformacin a (TGF- a); epidrmico (EGF) protena Lin-3 (en C. elegans) factor de crecimiento semejante a la Factor de crecimiento insulina II (IGF-II); insulina semejante a la insulina I (IGF-I) activinas; protenas morfognicas Factor de crecimiento de transformacin (3 de hueso (BMP); protena decapentaplgica (en Drosophila)-, (TGF-[3) -mltiples protena Vgl {en Xenopus) subtipos

amplia

amplia

amplia

Factor de crecimiento de los fibroblastos (FGF) -mltiples subtipos Interleuquina-2 (IL-2) Factor de crecimiento neuronal (NGF) Eritropoyetina factor neurotrfico derivado del cerebro (BDNF); neurotrofina-3 (NT-3); neurotrofina-4 (NT-4)

amplia

limitada limitada

limitada

Interleuquina-3 (IL-3)

factores estimuladores de colonias hematopoyticas (CSF) -mltiples tipos

limitada

locales. Adems de los factores de crecimiento que estimulan la divisin celular, existen factores, como algunos miembros de la familia de factores de crecimiento de transformacin beta (TGF-$) (de Transforming Growth Factors), que en algu nas clulas estimulan la proliferacin celular y en otras la inhiben. La mayora de factores de crecimiento efectan muchas otras acciones adems de la regulacin del crecimiento y la divisin celular: pueden controlar la proliferacin, la super vivencia, la migracin o el funcionamiento de las clulas, dependiendo de las circunstancias. En la Tabla 17-2 aparece una muestra de los muchos factores de crecim ien to tratados en este libro.

El crecim iento celular y la divisin celular pueden ser regulados independientem ente 31
Una funcin importante de los factores de crecimiento consiste en la regulacin de la sntesis de protenas y, por consiguiente, del ritmo al que las clulas crecen. La mayora de los factores que estimulan la proliferacin celular tam bin esti mulan su crecimiento, pero la correspondencia no es siempre exacta. Algunos factores harn crecer a clulas de una cierta clase pero no las llevarn ms all del punto de control G, de su ciclo, mientras que otros factores las llevarn ms all del punto de control G! pero no las harn crecer. Parece ser que en mam fe ros no es tan estricta la regla que relaciona el tamao de la clula con su divi sin, como lo es en las levaduras.

Controles de la divisin celular en los animales pluricelulares

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Los factores de crecim iento que actan independientemente sobre el creci miento y la proliferacin celulares son importantes para el animal completo. Las diferentes clulas especializadas tienen proporciones entre citoplasma y DNA enorm em ente variadas, y algunas clulas en G0, como las neuronas, pueden ha cerse muy grandes si haberse dividido nunca (Figura 17-36). Variaciones de ta mao celular com o stas se controlan en parte mediante mecanismos intracelulares que dependen del ciclo celular. Por ejemplo, el crecimiento de ciertos tipos de neuronas depende del factor de crecimiento neuronal (NGF, de Nerve Growth Factor) secretado por el conjunto de clulas que estn en contacto con la neuro na: cuanto mayor sea la cantidad de NGF a la que la neurona tiene acceso, m a yor ser su tamao.

Las clulas pueden retrasar su divisin entrando en un estado especializado de no-crecim iento 32
Si privamos de suero a las clulas que estn proliferando en un cultivo, deten drn su crecimiento pero continuarn progresando en el ciclo celular hasta que hayan alcanzado la fase Gr Al llegar a esta parte del ciclo, se detienen en un esta do de no-crecim iento, especializado -e l estado de reposo G 0 (G cero) al que nos habamos referido anteriormente. El estado G0es diferente a todos los dems estados de la proliferacin que la clula experimenta a lo largo del ciclo. La velo cidad de sntesis de protenas, por ejemplo, se reduce drsticamente, a menudo hasta el 20% del valor que presentan clulas que estn proliferando. As pues, la ausencia de factores de crecimiento apropiados lleva a las clulas a una especie de sueo del ciclo celular, en el cual el sistema de control del ciclo celular es in capaz de progresar ms all del punto de control Gj. Si privamos a una clula de sus nutrientes, com o los aminocidos, tam bin se detendr su crecimiento y se bloquear el paso ms all del punto de control Gp pero desde el punto de vista de la clula esta desnutricin es una experiencia muy diferente a la de no recibir las seales de avanzar por el ciclo de los factores de crecimiento. De hecho est en discusin si en ambas situaciones est implicado el mismo mecanismo de control y resulta dudoso el estrecho parecido entre el tipo de parada de las clu las de mamfero y el punto de control Inicio de las levaduras (por lo cual se han utilizado diferentes nombres, com o punto de restriccin y punto de com pro m iso, para referirse al punto de control Gj de las clulas mamfero). En los teji dos, los nutrientes son abundantes pero los factores de crecimiento son escasos; por lo tanto se cree que los factores de crecimiento ejercen un control crtico. La capacidad de entrar en G0 es lo que determina las enormes diferencias en la duracin del ciclo celular en los diferentes tipos celulares de los organismos pluricelulares. Por ejemplo, en el cuerpo humano algunas clulas como las neu ronas y las fibras musculares esquelticas no se dividen en absoluto; otras, como las clulas del hgado, generalmente se dividen una vez cada uno o dos aos; mientras que algunas clulas epiteliales del intestino se dividen ms de dos ve ces al da, renovando continuam ente su tejido de revestimiento (Figura 17-37). La mayora de las clulas de los vertebrados se sitan entre estos extremos: pue den dividirse si surge la necesidad pero lo hacen con poca frecuencia. El ritmo al que se divide la clula vara segn las circunstancias externas y segn las carac tersticas internas de cada tipo celular particular. Un dao importante en el h gado hace que las clulas supervivientes proliferen hasta que se subsane el dao, con una duracin de ciclo celular no superior a un da o dos; las clulas vecinas a una herida estimulan su divisin para reparar la lesin. Casi todas las variaciones de la velocidad de proliferaciones del cuerpo adulto se producen en el intrvalo de tiempo que las clulas pasan en reposo en tre la mitosis y el punto de control G,, de forma que las clulas de divisin lenta se hallan estacionadas en el estado G0 durante semanas o incluso aos. Por el contrario, norm alm ente el tiempo que tarda una clula en progresar desde el co mienzo de la fase S a travs de la mitosis es breve (de 12 a 24 horas en los m am feros) y notoriam ente constante, sin tener en cuenta el intrvalo de tiempo que

neurona

linfocito
Figura 17-36 Comparacin entre el tamao de un linfocito y el de una neurona de mamfero (extrada de la retina). Ambas clulas contienen la misma cantidad de DNA. Una neurona se hace progresivamente ms grande durante su desarrollo, mientras permanece en estado G0. Durante este perodo la proporcin entre la cantidad de citoplasma y de DNA aumenta enormemente (por un factor mayor a IO5para algunas neuronas). (Neurona de B.B. Boycott en Essays on th nervous system [R. Bellairs y E.G. Gray, eds.]. Oxford, U.K.: Clarendon Press, 1974.)

960

Captulo 17 : El ciclo de divisin celular

m igracin de las clulas epiteliales desde su nacim iento en el fondo de la cripta hasta su desprendim iento en lo alto de la vellosidad (duracin del trnsito: de 3 a 5 das) clulas epiteliales cripta tejido conjuntivo laxo

LUMEN DEL INTESTINO vellosidad (sin divisin celular) seccin transversal de la vellosidad

seccin transversal de la cripta

clulas diferenciadas que no se dividen direccin del m ovim iento celular

clulas de divisin rpida (duracin del ciclo = 11 horas)

clulas madre de divisin lenta (duracin del ciclo > 24 horas) clulas diferenciadas que no se dividen

Figura 17-37 Divisin y migracin celular en el epitelio de revestimiento del intestino delgado de un ratn. Toda la actividad de divisin celular se concentra en la parte inferior de los pliegues epiteliales de forma tubular, conocida como cripta. La generacin de clulas nuevas se desplazan hacia arriba formando el epitelio que cubre las vellosidades, donde trabajan en la digestin y absorcin de los alimentos desde el lumen intestinal. La mayora de las clulas epiteliales tienen una vida muy corta desprendindose de la punta de la vellosidad cinco das despus de su ascensin desde la cripta. Sin embargo, un anillo de aproximadamente 20 clulas inmortales de divisin lenta (en rojo) contina anclado cerca de la base de cada cripta. Cada una de estas clulas madre se dividir formando dos clulas hijas. Por trmino medio, una clula hija permanece en dicho lugar como una clula madre indiferenciada mientras que la otra acostumbra a migrar hacia arriba diferencindose y formando parte de la vellosidad epitelial. (Adaptado de C.S. Potten, R. Schofield y L.G. Lajtha, Biochim. Biophys. Acta 560:281-299,1979.)

transcurre entre una divisin y la siguiente. Ahora debemos centrarnos en la prueba experimental que identific el punto de control G! como un punto espe cfico del ciclo as como considerar lo que significa la entrada en G0 en trminos moleculares.

La ausencia de suero evita el paso por el punto de control G ^ 2-33

Las clulas en cultivo pueden ser observadas al microscopio por cinematografa a intervalos de tiempo. De esta forma resulta fcil determinar el tiempo que cada clula necesita entre una divisin y la siguiente. Si se ha filmado al menos todo un ciclo celular del cultivo antes de aplicar un tratamiento experimental, tam bin es posible establecer el tiempo transcurrido desde la ltima mitosis de cada clula en el momento del tratamiento. As pues se pueden estudiar los efectos de diferentes manipulaciones con condicionantes externos sobre diferentes esta dios del ciclo de divisin. Estos estudios se han realizado principalmente con fi broblastos. Con un experimento sencillo de este tipo fue suficiente para demos trar que la privacin de suero (y por lo tanto de factores de crecimiento) durante al menos 1 hora tiene unas consecuencias dramticas para las clulas. Todas las clulas a las que se les retir el suero antes de transcurridas 3,5 horas despus de haber pasado la mitosis, necesitan 8 horas extra para alcanzar la mitosis despus de que se les aada suero nuevamente al medio. Por el contrario, las clulas de ms de 3,5 horas no mostraron ningn retraso y continuaron con el ciclo normal (Figura 17-38). Este comportamiento sita el punto de control Gj unas 3,5 horas despus de la mitosis, en el caso de la lnea celular escogida. Ms all de este punto, las clulas entran de forma irrevocable en la replicacin de su DNA y completan el ciclo de divisin normal, pero las clulas que se hallan entre la m i tosis y el punto de control se detienen en el punto de control si echan en falta los factores de crecimiento adecuados. El retraso extra que transcurre antes de que estas clulas efecten la mitosis despus de que se les haya suministrado suero

Controles de la divisin celular en los animales pluricelulares

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Figura 17-38 Efecto de una breve deprivacin de suero en varios momentos del ciclo celular. Si deprivamos de suero los fibroblastos durante 1 hora mientras se encuentran en el intervalo comprendido entre la mitosis y el punto de control G, (barra amarilla) dichas clulas se retrasan cerca de 8 horas en su trayecto hacia la mitosis siguiente; las clulas que sufren una deprivacin similar despus del punto de control G, (barra verde oscuro) no sufren tal retraso (aunque se puedan retrasar en el ciclo siguiente).

clulas susceptibles de retraso 25

20
E 15

nuevamente sugiere que una privacin de 1 hora de suero entre las 0 y las 3,5 horas las coloca en un estado alterado -G 0- del que necesitan 8 horas para salir. El efecto de la deprivacin de suero es deprimir la sntesis de protena y el crecim iento celular y se puede simular mediante pequeas dosis de inhibidores de la sntesis de protena, tales como la cicloheximida. Los experimentos utili zando tanto la deprivacin de suero como la cicloheximida han demostrado que deprimiendo brevemente la sntesis de protena al final de G2 tam bin se puede inducir la entrada en G0, pero en este caso las clulas primero pasan por la mitosis y luego se detienen en G0 cuando alcanzan el punto de control Gj. Por otra parte, las clulas a las que se depriva brevemente de suero durante la fase S o al comienzo de G2 prosiguen a travs del punto de control G! con poco o ningn retraso, probablemente porque ya estn a ms de 8 horas del punto de control. Por lo tanto, los m ecanism os que responden tan dramticamente a una breve deprivacin de suero deben de tener las siguientes propiedades: es imprescindi ble haber pasado el punto de control G, pero sin haber entrado en la mitosis, y aunque se pueden inhibir rpidamente, se necesitan del orden de 8 horas para regenerarse tras la nueva adicin de factores de crecimiento o desinhibicin de la sntesis de protenas.

punto de control Gi
G M

5 10 punto del ciclo en el que se depriva brevem ente a la clula de suero

El sistem a de control del ciclo celular puede desensamblarse rpidamente pero slo puede ensam blarse de nuevo lentam ente 34
Qu relacin tienen estos fenm enos con el comportamiento del sistema de control del ciclo celular? Una interpretacin simple sera que cuando se retira el suero algunos com ponentes moleculares del sistema de control del ciclo celular desaparecen rpidamente -e n una hora- pero necesitan un perodo mucho ms largo -8 h oras- para reaparecer cuando se restaura el suero. La desaparicin y reaparicin pueden ocurrir en cualquier momento del ciclo de divisin, pero nicamente es en el punto de control Gj donde se necesita dicho componente molecular. Una especulacin obvia es que el com ponente crtico sea la propia protena Cdk y que las clulas de mamfero necesiten esta protena para superar el punto de control Gv al igual que las clulas de levadura necesitan la protena Cdc2 para superar el Inicio. De hecho, si comparamos las clulas quiescentes G0 con clu las efectuando el ciclo de divisin, encontram os que las clulas en G0tienen can tidades muy bajas tanto de protena Cdk (o al menos de una o ms clases distin tas de protena Cdk) y de todas las ciclinas G,, aunque la presencia de protenas Cdk y de alguna de las ciclinas Gj (ciclinas C y D) tiene un nivel prcticamente constante a lo largo durante todas las fases del ciclo. Por lo tanto, las clulas G0 no solamente detienen su control del ciclo celular, sin que lo desmantelan. Cuando se suministra suero a las clulas en G0, se produce un retraso de va rias horas hasta que las concentraciones de Cdk y ciclinas Gj alcanzan de nuevo los niveles normales del ciclo; este retraso se corresponde con el que experimen tan las clulas antes de reincorporarse al ciclo. Si la privacin de suero detiene la proliferacin celular desensamblando rpidamente el sistema de control del ciclo ms que detenindolo, no es sorprendente que cuando el entorno sea favorable de nuevo, las clulas necesiten un cierto tiempo para reensamblar lentamente el sistema de control antes de reincorporarse y continuar el ciclo de nuevo.

962

Captulo 17 : El ciclo de divisin celular

Ya hemos visto cmo responde el sistema de control del ciclo celular a los factores de crecimiento; a continuacin estudiaremos cmo los factores de crecimiento y otras influencias ajustan el comportamiento de proliferacin de las clulas en los tejidos, de forma que se mantenga la forma y la funcin del cuerpo.

Las clulas vecinas com piten por los factores de crecim iento 35
La proliferacin de clulas en el cuerpo tiene que estar regulada de forma que se mantenga el nmero de clulas y su organizacin espacial. Esta regulacin de pende de interacciones de unas clulas con otras y con la matriz extracelular. Consideremos por ejemplo una lmina epitelial de un mamfero adulto. A medi da que las clulas van muriendo tienen que producirse clulas nuevas para ocu par su lugar. La proliferacin celular tiene que estar controlada de forma precisa para equilibrar la prdida de clulas, de forma que el epitelio ni crezca ni decrez ca. Las nuevas clulas han de encajar perfectamente en la estructura, de forma que no se desorganice la arquitectura del epitelio. De hecho, en la mayora de los epitelios slo se dividen las clulas que continan en contacto con la lmina basal subyacente. Las clulas situadas sobre la lmina basal son sensibles al me nos a dos tipos de seales que rigen su disposicin a dividirse: un tipo de seal es la que transporta informacin referente a la densidad de poblacin local de la clula, y el otro tipo de seal es el que refleja las adhesiones a otras clulas y a la lmina basal. Ambos tipos de control se pueden comprobar y analizar en las condiciones simplificadas de un cultivo celular, aunque la mayora de los estu dios se han efectuado con fibroblastos y no est claro cmo se relacionan estos descubrimientos con conjuntos de clulas organizadas como las epiteliales o las de un rgano tridimensional. Si colocam os clulas disociadas sobre una placa en presencia de suero, se adherirn a la superficie, se extendern, y se dividirn hasta que se forme un m onocapa confluente en la cual cada clula se adherir a la placa y contactar con las clulas vecinas a todo su alrededor. En este punto las clulas normales, a diferencia de las clulas cancerosas (transformadas), dejan de dividirse -u n fe nm eno conocido como inhibicin de la divisin celular dependiente de la den sidad. Si una monocapa de este tipo se rasga con una aguja de forma que se genera una franja libre de clulas sobre la placa, las clulas de los bordes ocupa rn el espacio vaco y se dividirn (Figura 17-39). Este fenmeno se describi inicialm ente en trminos de inhibicin por contacto de la divisin celular, pero probablem ente es engaoso que el nico responsable del fenmeno sea la interaccin clula-clula. La densidad de la poblacin celular a la que se detiene la proliferacin celular en la monocapa confluente se increm enta al aumentar la concentracin de los factores de crecimiento en el medio. Al hacer circular un flujo de medio fresco sobre la capa confluente de fibroblastos se reduce la limi tacin de la difusin para el aporte de factores de crecimiento, e induce a las c lulas que estn en contacto directamente con el flujo del medio a dividirse en unas densidades a las que habitualmente estaran inhibidas (Figura 17-40). As pues la inhibicin de la proliferacin celular dependiente de la densidad parece

Figura 17-39 Regulacin de la divisin celular de una monocapa celular rasgada. Habitualmente, las
clulas situadas en la superficie de una placa de cultivo proliferan hasta que se tocan unas con otras, formando una monocapa confluente. El diagrama muestra lo que ocurre si se rasga la monocapa eliminando una hilera de clulas. Las clulas que quedan en los mrgenes de la zona vaca de la herida se aplanan y empiezan a crecer y a dividirse, hasta que la herida esta curada. Cuando la monocapa vuelve a ser confluente, la proliferacin celular cesa casi completamente.

capa confluente de clulas en la que falta hilera de clulas que se han elim inado rascando con una aguja

las clulas de los mrgenes se extienden y se aplanan, aum entando la velocidad de sntesis de protenas

capa confluente de clulas reconstruida mediante divisin celular

Controles de la divisin celular en los animales pluricelulares

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monocapa confluente: las clulas no proliferan ms

m edio nuevo aplicado a travs de las clulas

el flujo de m edio estim ula la proliferacin celular

reflejar, al menos en parte, la capacidad de una clula para reducir localmente la concentracin de factores de crecim iento en el medio, privando as a las clulas vecinas de ellos. Clculos basados en las concentraciones conocidas de factores de creci miento en el suero y la velocidad a la que las clulas eliminan los factores del medio de cultivo apoyan esta hiptesis. Por ejemplo, el PDGF normalmente se halla en el medio a un concentracin de 10 1 0 M (aproximadamente una m ol cula por cada esfera de 3 pm de dimetro de medio). Un fibroblasto tiene cerca de 105 receptores de PDGF, cada uno con una afinidad muy alta por el factor de crecim iento. Por lo tanto cada clula tiene receptores suficientes para unir todas las molculas de PDGF que se hallan en una esfera de dimetro -150 pm. As pues es obvio que las clulas vecinas compiten por cantidades diminutas de fac tores de crecim iento. Este tipo de com petencia podra ser tan importante para las clulas de los tejidos como para las clulas en cultivo, impidiendo que proliferen ms all de una cierta densidad de poblacin, la cual esta determinada por la cantidad de factor de crecim iento asequible.

Figura 17-40 Consecuencias de la presencia de un medio nuevo sobre la monocapa confluente celular. Las clulas de una monocapa confluente no se dividen (se indican en gris). Las clulas (en verde) vuelven a dividirse si se las expone directamente a un medio fresco. Aparentemente, la monocapa confluente ha dejado de dividirse porque en el medio cercano a las clulas ha disminuido la concentracin de factores de crecimiento, por los cuales compiten las clulas.

Las clulas anim ales norm ales en cultivo necesitan anclarse para superar el Inicio 36
La com petencia por los factores de crecim iento no es el nico factor que altera el ritmo de la divisin celular en un cultivo de clulas. La forma de una clula mientras sta se extiende y se arrastra sobre el substrato para ocupar el espacio vaco tam bin afecta notablem ente su capacidad para dividirse. Cuando se cultivan fibroblastos normales o clulas epiteliales en suspensin, sin contacto alguno con superficies slidas, casi nunca se dividen -u n fenmeno conocido como dependencia de anclaje de la divisin celular. La relacin entre la propagacin de las clulas y su proliferacin se puede demostrar cultivando clu las en substratos de grosores variables o permitiendo que las clulas se establez can en una superficie no pegajosa donde se han puesto previamente pequeos parches pegajosos sobre los que se puede adherir una sola clula pero sin que pueda extenderse mas all del parche. La frecuencia con la que la clula se divi de aumenta ^ medida que la clula se extiende. Quizs ocurre que las clulas ms extendidas al tener una superficie mayor, pueden capturar ms molculas de factores de crecim iento y conseguir cantidades de nutrientes mayores. Sin embargo, algunas lneas celulares de fibroblastos son prcticamente incapaces de proliferar en suspensin pero se dividen rpidamente si consiguen un punto de anclaje en alguna superficie formando un contacto focal. Ello ocurre incluso si el lugar de adhesin es un parche pequeo en el cual la clula no dispone de espacio suficiente para extenderse (Figura 17-41). Los contactos focales son lu gares de anclaje para los filamentos de actina intracelulares y para las molculas de la matriz extracelular; stas y otras observaciones nos indican insistentem en te que el control de la divisin celular est de alguna forma acoplado con la or ganizacin del citoesqueleto o depende de seales intracelulares generadas en los lugares de adhesin, o de ambas cosas (Figura 17-42). De hecho, en algunos tipos celulares algunas molculas de la matriz extracelular especficas, tales

964

Captulo 17 : El ciclo de divisin celular

suspendida en agar

colocada sobre un parche adhesivo pequeo

extendida sobre un parche adhesivo grande

tB >

< C 1

50

como la laminina o la fibronectina, pueden actuar como factores de crecim ien to. Las clulas basales de la epidermis de la piel proporcionan un ejemplo que se trata en el Captulo 22. Como para otros controles de la proliferacin celular, el control del anclaje acta en el punto de control las clulas necesitan el anclaje para superar este punto pero no para completar el resto del ciclo. De hecho, mientras progresan por la fase M normalmente aflojan sus uniones y se redondean. Este ciclo de unin y posterior desuni probablemente permite a las clulas reorganizar sus contactos con otras clulas y con la matriz extracelular, as como acomodar las clulas hijas producidas por la divisin celular y despus unirlas fuertemente al tejido antes que se les permita iniciar el prximo ciclo de divisin. Aunque el m ecanismo de dependencia del anclaje es poco conocido y algu nos de los detalles del fenmeno que acabamos de describir pueden ser peculia ridades de los fibroblastos en cultivo, es bastante probable que las seales intracelulares generadas en los sitios de adhesin jueguen un papel importante en el sistema de control del ciclo celular en muchas clases diferentes de clulas.

Figura 17-41 La divisin celular depende de la form a de la clula y de su anclaje. En el experimento que se muestra aqu, las clulas se mantienen en suspensin o se permite que se fijen sobre parches de un material adherente (paladio) o sobre un substrato no adherente; el dimetro del parche, que es variable, determina el rea sobre la que se puede extender la clula y la probabilidad de que se divida. Al medio de cultivo se le aade timidina-3H y se realiza una autorradiografa para descubrir el porcentaje de clulas que han entrado en fase S. (A) Las clulas de la lnea celular 3T3 raramente se dividen cuando se mantienen, redondeadas, en suspensin, pero la adherencia a un parche, aunque sea tan pequeo que no permita que la clula se extienda, las capacita para que se dividan ms frecuentemente. (B, C) Electronmicrografas de barrido que muestran una clula extendida sobre un parche grande comparado con una clula colocada sobre un parche pequeo. (Micrografas de C. ONeill, P. Jordn y G. Ireland, C ell 44:489-496, 1986. Cell Press.)

Figura 17-42 Contactos focales como lugares de emisin de seales intracelulares. Esta micrografa fluorescente muestra un fibroblasto en cultivo sobre un substrato recubierto con fibronectina, molcula de la matriz extracelular. Los filamentos de actina se han marcado de manera que emiten fluorescencia verde, mientras que las protenas que contienen fosfotirosina se han marcado con un anticuerpo que emite fluorescencia roja. Donde los dos colores se superponen, el color resultante es amarillo. Los filamentos de actina terminan en los contactos focales, en los que la clula se adhiere al substrato. Las protenas que contienen fosfotirosina tambin se concentran en estos lugares. Se cree que esto refleja la actuacin de un mecanismo de seales intracelulares de tirosina quinasa activado mediante las protenas transmembrana integrinas que se unen a la fibronectina extracelular y (indirectamente) a los filamentos de actina intracelulares (vase pg. 1071). Se cree que las seales generadas en estos lugares de adhesin facilitan la regulacin de la proliferacin celular, tanto en fibroblastos como en clulas epiteliales. (Cortesa de Keith Burridge.)

Controles de la divisin celular en los animales pluricelulares

9 65

Estudios en clulas cancerosas revelan la existencia de genes implicados en el control de la proliferacin celular 37
De qu forma las diferentes influencias externas que hemos examinado afectan el interior de la clula regulando la proliferacin celular? Concretamente, cmo influye la adhesin de un factor de crecimiento a los receptores de la superficie celular en el funcionamiento del sistema de control del ciclo celular? Mucho de lo que sabemos sobre este aspecto proviene del estudio de clulas cancerosas, en las cuales el control de la proliferacin celular se ha roto. Estas clulas son mutantes, y debido a que proliferan excesivamente y producen tumores, atraen nuestra atencin sobre sus genes mutantes. Como discutimos en el Captulo 24, el anlisis de las alteraciones genticas en clulas cancerosas ha revelado un gran nmero de genes que codifican prote nas implicadas en el control de la proliferacin celular. Dichos genes se podran clasificar inadecuadamente como genes de proliferacin y genes de antiprolifera cin. El producto de los primeros facilita el increm ento del crecimiento celular y el ensam blaje de la maquinaria de control del ciclo celular y conduce a la c lula ms all del punto de control el producto de los segundos facilita la apli cacin de frenos que detendrn todo el sistema de control celular y provocarn su desm antelam iento. Si una m utacin en un gen de proliferacin causa la sobreexpresin o la hiperactividad de su producto, tendremos como resultado una proliferacin celular excesiva caracterstica del cncer. En estos casos se clasifica el gen m utante com o un oncogn (es decir un gen que provoca cncer) y el gen de proliferacin normal se denominar proto-oncogn. Inversamente, una clula puede verse liberada de las restricciones normales de una prolifera cin normal y ser capaz de dividirse como una clula cancerosa si un gen de an tiproliferacin sufre una m utacin que lo inactiva. Por ello, a menudo los genes de antiproliferacin de las clulas normales se denominan genes supresores de tum ores. En una clula diploide normal, para que se provoque la prdida del control de crecim iento (es decir que el fenotipo mutante sea recesivo) tienen que desaparecer o inactivarse las dos copias de un gen supresor de tumores, m ientras que la activacin de una sola copia de proto-oncogn es suficiente para provocar un efecto similar (es decir que el fenotipo mutante sea dom inan te) (Figura 17-43). Debido a que han sido ms fciles de aislar, se conocen ms genes de proli feracin que genes de antiproliferacin y probablemente entre los primeros se incluyen genes que codifican protenas representativas de todas las clases im portantes de protenas implicadas en la transmisin de las seales estimulado ras desde los receptores de factores de crecim iento hacia el interior de la clula.

dos copias de gen supresor de tum ores

ambos genes supresores de tum ores inactivados

>
t dos copias de proto-oncogn RESULTADO PROLIFERACIN CELULAR NORMAL PROLIFERACIN CELULAR EXCESIVA PROLIFERACIN CELULAR EXCESIVA la m utacin provoca la sobreactivacin de un solo proto-oncogn (oncognico) t

Figura 17-43 Genes supresores de tumores respecto a proto-oncogenes. El producto de un gen supresor de tumores inhibe el ensamblaje y la activacin del sistema de control del ciclo celular; el producto de un protooncogn hace todo lo contrario. La proliferacin incontrolada puede resultar de mutaciones que inactiven ambas copias del gen supresor de tumores o que provoquen una fuerte sobreactivacin de una copia del proto-oncogn.

966

Captulo 17 : El ciclo de divisin celular

Los factores de crecim iento desencadenan cascadas de seales intracelulares 30 38

El primer paso en la accin de un factor de crecimiento proteico es su unin a un receptor transmembrana de la superficie de la clula diana. Entonces la por cin intracelular del receptor cataliza la produccin de molculas que actan como seales intracelulares, transmitiendo el estmulo a otras molculas. Los detalles de los pasos iniciales de varias de estas cascadas de sealizacin han sido estudiados a fondo para el caso de diferentes tipos de receptores (se descri ben en el Captulo 15). La complejidad del sistema aparece porque generalmen te las cascadas no son simples cadenas lineales de transmisin sino que se ram i fican activando muchos componentes interactivos que actan en paralelo, formando una red de seales altamente interconectada. Vimos en el Captulo 15 que los receptores de los factores de crecimiento ac tivan cascadas de fosforilacin intracelular que provocan cambios en la expre sin de los genes. Los genes inducidos por los factores de crecimiento son de dos clases: los genes de respuesta rpida inducidos dentro de los 15 minutos si guientes a la actuacin del factor de crecimiento y sin que se necesaria la sntesis de protenas, y los genes de respuesta retardada, que no se inducen hasta al menos una hora despus de la actuacin del factor de crecimiento y de forma dependiente de la sntesis de protenas. Parece que los genes de respuesta retar dada se inducen a causa de los productos de los genes de respuesta rpida, va rios de los cuales se sabe que son protenas reguladoras de genes (Figura 17-44). Ambas clases de genes son silenciosos y no se transcriben en las clulas en G0 pero se inducen a elevados niveles cuando se aaden factores de crecimiento al medio. Si entonces se mantiene la exposicin a los factores de crecimiento, el nivel de expresin de los genes cae gradualmente -para algunos genes aparente mente hasta cero y para otros hasta un nuevo valor estable diferente de cero. Por lo tanto el producto de la segunda clase de estos genes se halla presente a unos niveles bajos pero constantes en las clulas de ciclo normal (Figura 17-45). As pues la transcripcin de estos genes indica la presencia de factores de creci miento en el medio, y un elevado nivel de expresin indica una subida repentina de la concentracin de factores de crecimiento. Las seales que recibimos por nuestros sentidos (el olfato, por ejemplo) se comportan de una forma parecida. Los genes de respuesta rpida m ejor estudiados son los proto-oncogenes myc, fos y jun. Los tres genes codifican protenas reguladoras de genes que ac tan como homo- o heterodmeros (se discuten en el Captulo 9). Si en ciertos tipos celulares estos genes se sobreexpresan o hiperactivan por efecto de m uta ciones, todos ellos pueden provocar una proliferacin incontrolada. Existen evidencias que sugieren que particularmente myc podra tener un papel crtico en el control normal de la proliferacin celular. Las clulas en las que se impide especficam ente la expresin de myc no se dividen incluso en presencia de fac tores de crecim iento. En cambio, las clulas en las que se activa especialmente

factor de crecim iento

prim era quinasa activada segunda quinasa activada 15 min

NCLEO

gen regulador de protenas activado genes de respuesta rpida

genes de respuesta retardada >1 h sistema de control del ciclo celular activado
Figura 17-44 Ruta normal que siguen las seales estimuladoras de la proliferacin celular provocadas por un factor de crecimiento. Este
diagrama muestra algunas de las etapas principales. Omite las etapas intermedias del sistema de liberacin. Las rutas de las seales intracelulares se tratan en el Captulo 15.

Figura 17-45 La respuesta de Myc a un factor de crecimiento. Myc es el producto

de un gen myc de respuesta rpida El grfico muestra los cambios de concentracin de la protena Myc tras un incremento repentino de la concentracin de factor de crecimiento hacia un nuevo estado estacionario, lo que provocar la salida de la clula de G0y su proliferacin. Los cambios en la concentracin de Myc reflejan cambios en la transcripcin del gen myc, estimulados mediante la exposicin de la clula al factor de crecimiento. La propia protena Myc inhibe la transcripcin de myc, y se cree que su retroalimentacin negativa explica por qu el nivel de Myc disminuye desde su valor mximo inicial hasta un valor ms bajo pero estable.

t [Myc]

Controles de la divisin celular en los animales pluricelulares

967

la expresin de myc independientemente de factores de crecimiento, no pueden entrar en G0, y si estn en G0 cuando se les proporciona la protena Myc, aban donarn G0 y empezarn a dividirse incluso en ausencia de factores de creci miento -u n com portam iento que finalmente las llevar a la muerte celular pro gramada.

Las ciclinas y la Cdk son inducidas por factores de crecimiento tras un largo retraso 34
Los genes de respuesta retardada no empiezan a transcribirse hasta bastante despus de la adicin de un factor de crecimiento, y su transcripcin requiere la presencia de productos de genes de respuesta rpida como myc. Entre los pro ductos de los genes de respuesta retardada se cuentan algunos de los com po nentes bsicos del propio sistema de control del ciclo celular, incluyendo las protenas Cdk y varias ciclinas, de las cuales se sospecha que desde el momento de su expresin estn implicadas junto con las protenas Cdk en la conduccin de las clulas ms all del punto de control G,, en la iniciacin de la fase S, o en ambos procesos. As pues podemos trazar de forma tentativa una cadena de efectos estimula dores que nos conducirn desde la unin de un factor de crecimiento hasta el inicio de la replicacin del DNA. Se cree que estas seales estimuladoras actan superando dispositivos inhibidores especficos que reprimen la proliferacin en ausencia de seales positivas. Los mecanismos inhibidores son protenas codifi cadas por los genes de antiproliferacin de los que hemos tratado, y que se des cubrieron como genes supresores de tumores en cnceres humanos. El gen de antiproliferacin m ejor conocido es el gen retinoblastoma.

La protena retinoblastom a acta m anteniendo la proliferacin bajo control 39

El gen retinoblastom a (Rb) fue inicialmente identificado a travs de estudios sobre una predisposicin hereditaria para un cncer poco conocido, que se pro duce en los ojos de algunos nios (se discute en el Captulo 24). La prdida de las dos copias de este gen conduce a una proliferacin celular excesiva en la retina inmadura, lo cual sugiere que normalmente el producto del gen ayuda a m ante ner controlada la proliferacin celular. La clonacin del gen retinoblastoma po sibilita explorar cmo ejerce este efecto el producto de gen. La protena Rb en una molcula abundantes en el ncleo de clulas de m a mfero. Se une a muchas otras protenas, incluyendo algunas importantes prote nas reguladoras de genes, pero su capacidad de unin depende de su estado de fosforilacin. Cuando Rb se desfosforila, se une a un conjunto de protenas regu ladoras que favorecen la proliferacin celular, mantenindolas secuestradas y fuera de accin; la fosforilacin de Rb facilita la liberacin de estas protenas, permitiendo que acten (Figura 17-46). En clulas normales Rb est siempre presente, independientemente de si las clulas estn en G0 o progresando en el

CLULA EN Go protena Rb activa

CLULA PROLIFERANTE protena Rb P) fosforilada inactiva protena reguladora de genes activa transcripcin gentica gen diana

Figura 17-46 Actuacin de la protena retinoblastoma (Rb). La

protena Rb desfosforilada se une a protenas reguladoras de genes que estimulan la transcripcin de determinados genes (tales como myc) necesarios para la proliferacin celular, y los mantiene inactivos. Cuando est fosforilada, Rb se separa de dichas protenas estimuladoras, permitiendo que activen la proliferacin.

protena reguladora de genes inactiva gen diana

968

Captulo 17 : El ciclo de divisin celular

Figura 17-47 Cambios en la fosforilacin de Rb en una clula que progresa a travs del ciclo. Rb se
desfosforila cuando la clula sale de la mitosis y se refosforila al final de Gp cuando la clula se prepara para superar el Inicio.

Rb inactiva

Rb activa

ciclo, aunque su estado de fosforilacin es variable. La clula en G0 contiene poco fosfato y parece impedir la transcripcin de genes como fos y myc, que son necesarios para la proliferacin. Estos genes se transcriben a un ritmo elevado en clulas mutantes que no tienen una copia funcional del gen Rb y a un ritmo mucho ms bajo cuando a estas mismas clulas se les aade, mediante transfeccin, una copia funcional del gen Rb. Los factores de crecimiento anulan la inhibicin ejercida por Rb haciendo que la protena se fosforile en mltiples serinas y treoninas. Ahora las clulas empezarn a expresar la protena Cdk, superarn el punto de control G,, y co menzarn a sintetizar DNA. En las clulas proliferantes el grado de fosforilacin de la protena Rb aumenta y disminuye en cada ciclo: aumenta al final de G,, contina alto en S y G2 y disminuye hasta un estado de desfosforilacin cuando la clula est en mitosis (Figura 17-47). In vitro la protena Rb es un buen subs trato para la fosforilacin mediante protena quinasas de la familia Cdk, lo cual sugiere un posible camino en el cual el estado de fosforilacin de Rb podra rela cionarse estrecham ente con el estado del sistema de control del ciclo celular. Se cree que la protena Rb desfosforilada (activa) acta en Gx como parte del mecanismo de freno que inhibe el paso ms all del Inicio; tambin podra per mitir a la clula la entrada en G0 mediante la interrupcin de la produccin de com ponentes fundamentales del sistema de control del ciclo celular -com o ha cen otras protenas- cuando el ambiente se vuelve hostil para la proliferacin. Pero en la mayora de las clulas la situacin se complica por la presencia de ms de una protena similar a Rb, y parece que mucho tipos celulares tienen un comportamiento normal incluso en ausencia de la propia protena Rb. (El ratn transgnico al que le falta el gen Rb progresa de forma casi normal a travs de la primera mitad de su desarrollo embrionario, pero entonces muere, mostrando defectos solamente en algunos tejidos determinados.) Mejorar nuestro conoci miento sobre los genes de antiproliferacin tales como Rb es una tarea impor tante, ya que deficiencias en estos genes juegan un papel crucial en una gran cantidad de cnceres humanos.

La probabilidad de entrar en G0 aumenta con el nmero de divisiones celulares: la senescencia celular 4 0

La proliferacin celular de un animal superior no se regula sencillamente m e diante el entorno de la clula sino que depende de la historia de la clula a largo plazo de una manera compleja: cada tipo celular diferenciado, en cada estadio de desarrollo animal obedece a unas leyes ligeramente distintas, lo cual refleja diferencias en su maquinaria de control interno. Quiz el ejemplo ms simple pero tambin el ms misterioso de los efectos a largo plazo sobre la divisin ce lular es el fenmeno de la senescencia celular. La mayora de las clulas del cuerpo de un mamfero o de un pjaro mues tran una gran reticencia a continuar proliferando indefinidamente, incluso aun que se las alimente cuidadosamente in vitro. Esto las distingue de las clulas de la lnea germinal y de lneas celulares establecidas en cultivo, las cuales se cree que han sufrido un cambio gentico que las hace inmortales. Por ejemplo, los fibroblastos extrados de un feto humano normal nicamente duplicarn su poControles de la divisin celular en los animales pluricelulares

96 9

progenitor del clon

(
W

Figura 17-48 Evidencia de la variacin celular respecto a la herencia de la capacidad de divisin.

Las clulas de un clon varan en el nmero de divisiones celulares que experimenta cada una de ellas. Aqu, se han estudiado varios pares de clulas hermanas del mismo clon, y los histogramas muestran el nmero de clulas que se dividen un determinado nmero de veces. Si una clula hermana no se divide ni una sola vez, a la otra hermana le ocurre lo mismo o se divide muy pocas veces {a la izq u ierd a ); y si una se duplica ocho veces o ms la otra hace lo mismo (a la d erech a). Esto muestra que existen caractersticas hereditarias entre las clulas del mismo clon respecto al nmero de ciclos de divisin que son capaces de realizar. No obstante, los distintos estados hereditarios no son perfectamente estables; as pues algunas veces clulas hermanas se comportan de manera distinta. Estudios posteriores muestran que a medida que la poblacin celular envejece, las clulas sufren transiciones casuales hacia estadios en los que la capacidad de divisin es ms reducida. (Datos de J.R. Smith y R.G. Whitney, Science 207:82-84,1980.)

no se duplican

-cu 40

L li
! .11
0 1 2 3 4 5 6 7 >8 nm ero de duplicaciones de clulas hermanas

aj 40 ocho duplicaciones o ms . 22, 2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 >8 nm ero de duplicaciones de clulas hermanas

blacin unas cincuenta veces si las cultivamos en un medio estndar de creci miento. Hacia el final de este perodo, la proliferacin se ralentiza y finalmente se detiene, y las clulas entran en un estado G0 del que nunca se recuperarn. Clulas similares extradas de un adulto de cuarenta aos dejan de dividirse tras aproximadamente cuarenta duplicaciones, mientras que las clulas de un adulto de ochenta aos se detienen tras treinta duplicaciones. Los fibroblastos de ani males con una esperanza de vida ms corta dejan de dividirse en cultivo tras un nmero ms reducido de ciclos de divisin. Este fenmeno se ha denominado senescencia celular debido a la correspondencia con el envejecimiento del cuer po. Su relacin con la edad del organismo, sin embargo, no est clara. La senescencia celular sorprende por varias razones y ni su funcin, si es que tiene alguna, ni su mecanismo, estn claros. Se han propuesto muchas teo ras para explicar este fenmeno. Algunas sugieren, por ejemplo, que es el resul tado de una acumulacin de mutaciones aleatorias nocivas que reflejan simple mente la imprecisin del m ecanismo de reproduccin celular; otras sugieren que es el resultado de un mecanismo que se ha desarrollado para protegernos del cncer mediante la limitacin del crecimiento de tumores. Sin embargo se sabe que para algunas clases de clulas la velocidad de aparicin de la senescen cia depende estrecham ente de la concentracin de factores de crecimiento en el medio. Aparentemente el proceso refleja cambios del potencial de proliferacin que pueden ser regulados por el entorno de la clula. Una caracterstica habitual del desarrollo embrionario son las cortas secuen cias de divisiones celulares que terminan en diferenciacin, pero es difcil de imaginar cmo una clula puede calcular a largo plazo de forma precisa el nme ro de sus ciclos de divisin y detenerse al acabar el ciclo nmero 50. De hecho, aunque la senescencia ocurre en un momento predecible para una poblacin ce lular determinada, no est programada estrictamente a nivel de las clulas indivi duales. En un clon de fibroblastos normales aparentemente idnticos que se es tudie en condiciones de cultivo estndar, algunas clulas se dividen muchas veces y otras, en cambio, slo unas cuantas. Parece que cada una de las clulas deja de dividirse como resultado de una transicin aleatoria. Las probabilidades de que esta transicin ocurra aumentan con cada generacin celular sucesiva hasta que no quedan clulas proliferantes en la poblacin (Figura 17-48). Una posible interpretacin de este fenmeno radica en el comportamiento de los telmeros -la s secuencias de DNA repetitivo especiales necesarias en los extremos de los cromosomas. Como tratamos en el Captulo 8, cuando una clu la se divide, estas secuencias no se replican de la misma forma que el resto del genoma sino que son sintetizadas mediante una enzima, la telomerasa, que ac ta con m enos precisin, creando una variacin aleatoria en el nmero de repe ticiones de la secuencia telomrica del DNA. La senescencia celular est muy re lacionada con la reduccin progresiva del nmero de estas repeticiones, lo cual

970

Captulo 17: El ciclo de divisin celular

10 pm

Figura 17-49 Dibujos de secciones representativas de tbulos de rin de larvas de salamandra de diferente grado de ploida. Las salamandras
pentaploides tienen clulas que son ms grandes que las de las salamandras haploides, pero los animales y sus rganos individuales tienen el mismo tamao porque cada tejido del animal pentaploide tiene menos clulas. Esto indica que el nmero de clulas se regula mediante un mecanismo que se basa en el tamao y en la distancia en vez de en el nmero de divisiones celulares o en la cantidad de clulas. (Segn G. Fankhauser, en Analysis of Development [B.H. Willer, P.A. Weiss, y V. Hamburger, eds.], pp.126-150. Philadelphia: Sanders, 1955.)

HAPLOIDE 11 crom osom as

DIPLOIDE 22 crom osom as

PENTAPLOIDE 55 crom osom as

sugiere que la senescencia puede estar provocada por la incapacidad de m ante ner la longitud de los telmeros, quizs porque las clulas somticas (en con traste con las clulas de la lnea germinal) son deficientes en telomerasa.

El cuerpo se genera y se m antiene mediante complicados patrones reguladores de la divisin celular41

Mientras que la vida puede terminar mediante un proceso de senescencia for tuito, comienza con una serie de ciclos de divisin regulados segn unas leyes precisas y complicadas. Esto ocurre as en todos los organismos pluricelulares pero est ilustrado de una forma ms llamativa en un gusano nemtodo, Caenorhabditis elegans. El huevo fecundado de C. elegans se divide produciendo un adulto con exactam ente 959 clulas somticas nucleadas, cada una de las cuales est generada mediante su propia secuencia de divisiones celulares caractersti ca y absolutam ente predecible. En general estos fenmenos no son simplemen te una cuestin de llevar el recuento de las divisiones celulares segn un patrn temporal. Por ejemplo, salamandras de distinta ploida tienen el mismo tamao pero diferente nmero de clulas; cada una de las clulas de un animal pentaploide tiene un volumen cinco veces mayor que las de un animal haploide, y en cada rgano los animales pentaploides slo han generado una quinta parte de las clulas de sus parientes haploides, de manera que los rganos son aproxi madam ente del mismo tamao en las dos clases de animales (Figuras 17-49 y 17-50). Evidentemente, en este caso (y de hecho en la mayora de los otros casos) el tamao de los rganos no se regula mediante el recuento de clulas o de ciclos celulares sino mediante algn mecanismo que en realidad calcula distancias. Tales mecanismos requieren controles posicionales complejos en los cuales los factores de crecimiento pueden jugar un papel importante. Tal como veremos en el Captulo 21, se empiezan a caracterizar algunos de los genes que rigen los programas de proliferacin en el embrin. En el embrin temprano de Droso phila empieza a ser posible explicar los patrones de la divisin celular segn las actividades de com ponentes identificados del sistema de control del ciclo celu-

Figura 17-50 Micrograffas que comparan las clulas de los cerebros de salamandras haploides y tetraploides. (A) Seccin transversal del cerebro de
una salamandra haploide. (B) Seccin transversal correspondiente a la parte posterior del cerebro de una salamandra tetraploide mostrando que una reducida cantidad de clulas es compensada por un mayor tamao celular. (De G. Frankhauser, Int. Rev. CfoZ. 1:165-193,1952.)

Controles de la divisin celular en los animales pluricelulares

971

lar. Sin embargo, los bilogos que estudian el desarrollo todava estn lejos de saber con detalle de qu forma las quinasas dependientes de ciclina, las ciclinas, los factores de crecimiento, los contactos celulares, los genes de proliferacin y antiproliferacin -todos los tornillos y las tuercas del control de la divisin celu lar de los que hemos tratado hasta aqu- trabajan juntos llevando a cabo los com plejos programas de la divisin celular en desarrollo. As pues, hasta ahora nuestro conocim iento de la compleja red de controles que rigen la divisin celular en la sociedad de clulas que forman un cuerpo adulto es slo fragmentario. Por ejemplo, cuando se cura una herida en la piel de un vertebrado, cerca de una docena de tipos celulares -desde fibroblastos a c lulas de Schw ann- tienen que regenerarse en cantidades y posiciones adecuadas para reconstruir el tejido perdido. Estas cuestiones sobre la divisin celular en los tejidos, que se tratar en profundidad en el Captulo 22, son bsicas para el conocim iento del cncer, en el que los controles sociales funcionan mal, y en muchsimas otras enfermedades. En el centro mismo de la cuestin tenemos la funcin del propio ciclo celular -e l mecanismo de reproduccin celular del que depende cualquier forma de vida. Los descubrimientos procedentes de los estu dios en ranas y levaduras ya estn empezando a aportar nuevas soluciones a problemas urgentes del ser humano.

Resumen
Las clulas de los animales pluricelulares, como por ejemplo los mamferos, pare cen tener bsicamente el mismo sistema de control del ciclo celular que presentan las levaduras, con el principal punto de control en G. Sin embargo, a diferencia de las levaduras, normalmente retrasan su proliferacin a menos que reciban seales especficas de otras clulas para llevarla a cabo. Si a una clula normal de mam fero en cultivo se le priva de estas seales, se detendr en una variante quiescente del estado G, en la que no hay crecimiento alguno -denominada G0- en la que se inactiva la produccin de componentes del sistema de control del ciclo celular y de muchas otras protenas. Los factores proteicos de crecimiento ejercen influencias extracelulares importantes sobre la proliferacin celular. Dichos factores estn presentes a concentraciones muy bajas y parece que la competencia por ellos limi ta la densidad de la poblacin celular. Adems del requerimiento de factores de crecimiento especficos, la mayora de las clulas tienen que estar ancladas a un substrato para poder dividirse. Los factores de crecimiento regulan la proliferacin celular a travs de una compleja red de cascadas de seales intracelulares, que finalmente regulan la transcripcin de genes y el ensamblaje y la activacin del sistema de control del ci clo celular. Se han identificado muchos de los componentes proteicos de estas vas sealizadoras mediante el estudio de clulas cancerosas, en las cuales se han pro ducido mutaciones que han activado genes cuyo producto estimula la proliferacin (proto-oncogenes) o que han inactivado genes cuyo producto normalmente retrasa la proliferacin (genes supresores de tumores). Entre los proto-oncogenes existen algunas protenas reguladoras de genes, como Myc, que en algunos tipos celulares son necesarias y suficientes para inducir la proliferacin celular. Contrariamente, existen genes supresores de tumores, como Rb, cuyos productos bloquean la prolife racin unindose y secuestrando protenas reguladoras de genes. Aparte de estos controles a corto plazo de la proliferacin celular de los organismos pluricelulares, se producen controles a largo plazo, como son los responsables de la progresiva dis minucin del potencial de proliferacin a medida que las clulas envejecen o los complicados programas de divisin celular necesarios durante el desarrollo del em brin. Por ahora, nuestro conocimiento sobre estos controles es bastante limitado.

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Captulo 17: El ciclo de divisin celular

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Captulo 17 : El ciclo de divisin celular

Los mecanismos de la divisin celular

1 "f -

8 - ' < -

Visin de conjunto de la fase M Mitosis Citocinesis

En este cap tu lo verem o s los m eca n ism o s de los aco n te cim ie n to s de la fase M (o divisin celular) del ciclo celular. E sta fase, que incluye los diferentes estad ios de la divisin n u clear ( ) y de la divisin cito p lasm tica ( ), es la cu l

clula en interfase citoplasma ncleo

fase G1

mitosis

citocinesis

m in aci n del ciclo celular. En un perod o relativam en te breve, los co n ten id o s de la clu la m ad re, que se h an duplicado m ed ian te las actividades b iosin tticas de la interfase p reced en te, se segregan en dos clulas hijas (Figura 18-1). A nivel m o lecu la r la fase M se in icia m ed ian te u n a c a s ca d a de fosforilacio nes de p ro ten as d e se n c a d e n a d a p o r la a ctiv a ci n de la p ro te n a q u in asa

replicacin cromosmica (fase S)

fase G2

MPF

que in d u ce la m itosis, y se te rm in a m ed ian te las desfosforilacion es que siguen a la in activ aci n de M PF a travs de la p roteolisis de sus su bu n id ad es de ciclin a (tratad as en el C aptulo 17). Las d esfosforilacion es de p ro ten a que o cu rre n d u ran te la fase M son las ca u sa n te s de la m ay o ra de ca m b io s m o rfolgicos que a c o m p a a n a la m itosis: los cro m o so m a s se co n d e n sa n , la en voltu ra n u cle a r se ro m p e, el retcu lo e n d o p la sm tico y el co m p lejo de Golgi se frag m en tan , la c lu la afloja sus ad h esio n es a otras clu las y a la m atriz extracelu lar, y el cito esq u eleto se tran sfo rm a facilitando la co m p lica d a o rg an izaci n de m o v im ien to s que s e greg arn los cro m o s o m a s y la divisin celular. D ebido a que la fase M con lleva u n a reo rg an izaci n co m p le ta del in terior celular, se c re e que el n m e ro de p ro ten as que se fosforilan es m u y am p lio, y que p r ctica m e n te to d as las zo n as de la clu la q u ed an afecta d a s de algu n a m an era.

MITOSIS

profase, prometafase, metafase, anafase, telofase fase M

fase Gi

Visin de conjunto de la fase M1

Salvo p eq u e as variacio n es, los p ro ce so s que tien en lugar en la fase M p a ra divi dir u n a clu la en dos siguen la m ism a se cu e n cia en to d o s los e u ca rio ta s. Dirigi d as p o r la reo rg an izaci n del cito esq u eleto , las clu las aco p lan , utilizan y d e s m o n ta n los m e ca n ism o s n e ce sa rio s p ara se p a ra r las series de c ro m o so m a s d u p licad os y dividir el cito p la sm a en dos m itad es.

Figura 18-1 La fase M del ciclo celular. La fase M em pieza al final de

la fase G2 y finaliza al co m en zar la prxim a fase G P Incluye los cin co estadios de la divisin nu clear (m itosis), y la divisin citop lasm tica (citocin esis).

Tres caractersticas son exclusivas de la fase M: la condensacin cromosm ica, el huso mittico y el anillo contrctil
La p rim era m an ifestaci n ap reciab le de la fase M es la p rogresiva c o m p a cta c i n de la d isp ersa cro m a tin a in terfsica, fo rm an d o u nos c ro m o so m a s en fo rm a de hilo. E sta condensacin crom osm ica es n e ce sa ria p ara la seg reg aci n o rg an i z ad a de cro m o so m a s en dos clu las hijas que te n d r lugar a co n tin u a ci n , y se

977

Figura 18-2 El citoesqueleto en fase

M. El hu so m it tico se en sam b la y

microtbulos del
h u s o m it t ic o

PROGRESIN A TRAVS DE LA FASE M

segrega los cro m osom as. El anillo con trctil se en sam b la m s tarde y divide la clu la en dos.

filamentos de actina del a n illo c o n t r c til

ve a c o m p a a d a p o r la e x te n sa fosforilacin de m o lcu las de h isto n a H1 (h asta seis fosfatos p o r m o l cu la ). Se cre e que la fosforilacin de la h isto n a H l, en el c o m ien zo de la fase M, co n trib u y e a la co n d e n sa ci n c ro m o s m ica , ya que su c o n c e n tra c i n es de a p ro x im a d a m e n te u n a m o l cu la p o r n u cle o so m a y se sabe q ue p articip a en la c o n d e n sa ci n de los c ro m o so m a s. La co n d e n sa ci n c ro m o s m ic a es el preludio de d os p ro ce so s m e c n ic a m e n te d istintos: (1) - l a seg reg aci n de cro m o so m a s y la fo rm aci n de

mitosis

d os n cleo s en lu gar de u n o - y (2) - l a divisin de la totalid ad de la c lula en dos. E sto s p ro ce so s se e fe ct a n p o r d os e stru ctu ra s cito esq u elticas dife ren tes que a p a re ce n fu g azm en te d u ran te la fase M. La p rim era en fo rm arse es un huso mittico b ipolar, c o m p u e sto p o r m icro t b u lo s y p o r sus p ro te n a a s o ciad as. El h u so m it tico alin ea los c ro m o s o m a s rep licad o s en un p lan o que s e c cio n a la clu la en dos; e n to n c e s c a d a cro m o s o m a se se p a ra en dos c ro m o so m a s hijos, que so n d esp lazad os h a cia los p olos o p u esto s del m ism o h uso. La seg u n d a e stru ctu ra cito esq u e l tica n e ce sa ria en la fase M de las clu las an im ales es el anillo contrctil de filam en tos de a ctin a y de m io sin a II, que se fo rm a ligera m e n te m s tard e ju sto d eb ajo de la m e m b ra n a p lasm tica, en u n plano p e rp e n d icu lar al eje del h uso (Figura 1 8 -2 ); al m ism o tiem p o que se co n tra e el anillo se c o n tra e la m e m b ra n a h a cia d e n tro dividiendo la clu la en dos, aseg u ran d o as que c a d a clu la hija re cib a no ta n slo un serie c o m p le ta de c ro m o so m a s sino tam b in la m itad de los co n stitu y e n te s cito p la sm tico s de la clu la m ad re. Las dos e stru ctu ra s cito e sq u e l tica s co n tie n e n diferentes series de p ro ten as y, en algu n as clu las esp ecializad as, se p u ed en fo rm ar de m a n e ra in d ep en d ien te. No o b stan te, su fo rm a ci n n o rm a lm e n te est e s tre ch a m e n te co o rd in a d a de form a que la divisin cito p la sm tica (citocin esis) tien e lu gar ju sto d esp u s del final de la divisin n u cle a r (m itosis). En la clu las v egetales o cu rre la m ism a secu e n cia , au n q u e sus p ared es rgidas req u ieren un m e ca n ism o d iferente p ara la cito cin e sis, tal c o m o v erem o s m s ad elan te. La d escrip ci n de la fase M que a ca b a m o s de h a ce r slo es aplicable a las clu las e u cario tas. Las clu las b a cte ria n a s no co n tie n e n filam en tos de a ctin a ni m icro t b u lo s. N o rm a lm e n te p o se e n un solo c ro m o so m a , cu yas co p ias rep lica das se segregan en las clu las hijas, sin n in g u n a c o n d e n sa ci n esp ecial, m e d ia n te un m e ca n ism o que im p lica la a d h e re n cia del c ro m o s o m a a la m e m b ra n a p lasm tica de la b a cte ria . P ro b a b le m e n te la n ecesid ad de u n o s m e ca n ism o s m it tico s co m p lejo s su rge so la m e n te co n la ev o lu ci n de clulas que co n tie n e n g ran d es can tid ad e s de DNA e m p a q u e ta d o en un n m ero de cro m o so m a s v a ria ble. La fu n ci n p rim ord ial de tales m e ca n ism o s es rep artir los cro m o s o m a s re p licad os de fo rm a p re cisa e n tre las dos clu las hijas: en las clu las de levadura, en las q ue se h a d eterm in ad o co n e xactitu d , se p ro d u ce un e rro r en la seg reg a ci n cro m o s m ic a ta n slo ca d a 105 divisiones celu lares.

citocinesis

La divisin celular depende de la duplicacin del centrosom a 2

C o m o se vio en el C ap tu lo 16 en la m a y o ra de clu las a n im ales el centrosom a es el p rin cip al de M icro tu b u le Organ izin g C en ter), u n a n u b e de m a te ria l p e rice n trio la r p o c o definido (la

1 ___________________ !

centro organizador de microtbulos (MTOC,

200 nm

del centrosoma ) a s o c ia d o c o n un p a r de centrolos (F ig u ra 1 8 -3 ). D u ran te la in-

matriz

I igura 18-3 Un centrosoma.

E lectronm icrografa de una secci n gruesa de cen tro so m a de un a clu la de m am fero en cultivo. (C ortesa de P. W itt y G. Borisy.)

terfase la m atriz del c e n tro s o m a n u c le a u n a serie de m icro t b u lo s c ito p la s m tico s, q u e se p ro y e c ta n h a c ia el e x te rio r en d ire cc i n al p e rm e tro ce lu la r co n

978

Captulo 18 : Los mecanismos de la divisin celular

Figura 18-4 La replicacin de los centrolos. La pareja de centrolos se

- '

sus extremos menos adheridos al centrosoma. Antes de que la clula eucariota se divida, su centrosoma ha de duplicarse para que cada una de sus dos clu las hijas tenga uno. De hecho, los centrosomas duplicados son necesarios para crear las dos clulas hijas, ya que los centrosomas forman los dos extremos del huso mittico. Los centrosomas de la mayora de las especies animales comparten una ca racterstica estructural notoria y distintiva: un par de centrolos (tratados en el Captulo 16). Los centrolos, sin embargo, que se asocian con la matriz del cen trosoma, no son necesarios para la nucleacin de los microtbulos: los centrosomas vegetales no tienen centrolos; los centrolos tambin faltan durante las primeras divisiones del huevo de ratn; adems, clulas de mamfero en cultivo tratadas con drogas pueden crear husos mitticos tripolares, en los que un polo del huso carece de centrolos, y sin embargo parece funcionar con normalidad. Por lo tanto, se cree que la matriz del centrosoma, que contiene una serie de protenas especficas del centrosoma, es la parte fundamental del centrosoma. Si estn presentes, los centrolos asociados con la matriz se duplican segn un or den estricto, y su comportamiento puede ayudar a la creacin de los dos centrosomas mientras la clula entra en la fase M (Figura 18-4). Los procesos de la duplicacin y separacin del centrosoma se conocen como ciclo del centrosoma. Durante la interfase de cada ciclo celular, los centro-

asocia a la matriz del centrosoma En un cierto punto de la fase G, los dos centrolos se separan unos cuantos micrmetros. Durante la fase S, cerca de la base de cada centriolo empieza a crecer un centriolo hijo, en ngulo recto respecto a l. El estiramiento del centriolo hijo acostumbra a completarse a lo largo de la fase G2. Los dos pares de centrolos permanecen juntos, en un complejo centrosmico nico, hasta el comienzo de la fase M, cuando el centrosoma se parte en dos y las dos mitades empiezan a separarse. La estructura del centriolo es ilustrada en la Figuras 16-45 y 16-47.

verde).

(en

citocinesis

profase temprana metafase

profase

Figura 18-5 El ciclo del centrosoma de una clula animal. El centrosoma de una clula en interfase se duplica formando los dos polos del huso mittico. En la mayora de las clulas animales el par de centrosomas (ilustrado aqu como un par de se asocia con la matriz del centrosoma que nuclea los microtbulos. (En este diagrama el volumen de la matriz del centrosoma est exagerado para facilitar su identificacin; en la Figura 18-4 se ilustra una representacin ms exacta.) La duplicacin del centriolo empieza en G! y se completa en G2 (vase Figura 18-4). Inicialmente, los dos pares de centrolos y la matriz de centrosoma asociada permanecen juntos como un complejo nico. En los inicios de la fase M este complejo se separa en dos y cada centrosoma nuclea una formacin de microtbulos radiales, llamada ster. Los dos steres, que inicialmente permanecen uno al lado del otro cerca de la envoltura nuclear, se separan. Al final de la profase el haz de que interactan preferentemente entre los dos steres, se alarga mientras los dos centros se separan siguiendo caminos opuestos a lo largo de la parte exterior del ncleo. De esta forma se forma rpidamente el huso mittico. En la metafase la envoltura nuclear se rompe, permitiendo que los microtbulos del huso interacten con los cromosomas; en la citocinesis la envoltura nuclear se forma de nuevo alrededor de los dos conjuntos de cromosomas segregados, excluyendo los centrosomas.

verde oscuro)

barras

(verde claro)

microtbulos polares

Visin de conjunto de la fase M

97 9

^n 3s
/K -7fc

" /f

Figura 18-6 Organizacin citoplasmtica mediante los centrosomas y sus steres. Si se

inyecta afidicolina en un em brin tem prano de Drosophila para bloqu ear la divisin nuclear, los cen tro so m as y los steres que nu clean se sep aran del ncleo en esta clula sincitial y m igran hacia la superficie celular. En el polo posterior, donde n o rm alm en te se form an las clu las germ inales, los brotes de la m em b ran a se organizan gracias a los cen troso m as desplazados, obtenien d o com o resultado la form acin de las clu las germ inales sin ncleo. (A) E squ em a ilustrativo del proceso de yem as que provoca el ster. (B-D) M icrografas flu o rescentes de clu las germ inales sin n cleo: (B) tin ci n para ver el DNA, m ostrand o que no hay n cleo; (C) tin ci n co n un anticu erpo para los cen trosom as; (D) tincin para m ostrar los m icrotbu los asociados con los cen trosom as. (B-D, co rtesa de Jordn Raff.)

(A)

.- i

los y o tro s co m p o n e n te s del c e n tro s o m a se d up lican p ero p e rm a n e ce n ju n to s co m o un n ico co m p lejo en u n a c a ra del n cleo . Al in iciarse la m itosis, este co m p lejo se divide en d os y c a d a p areja de cen tro lo s fo rm a p arte de un ce n tro o rg an izad o r de m icro t b u lo s d istinto que n u cle a u n a fo rm a ci n de m icro t b u los rad iales llam ad a ster. Los d os steres se d esp lazan a ca ra s o p u estas del n cleo fo rm an d o los dos e x tre m o s de h u so m it tico . M ien tras finaliza la m itosis y la en voltu ra n u cle a r se reco n stitu y e alred ed o r de los cro m o s o m a s sep arad o s, ca d a clu la hija recib e u n c e n tro so m a (el an tigu o polo del huso) co n sus c ro m o so m as aso ciad o s (Figura 18 -5 ). El ciclo del c e n tro s o m a p u ed e a c tu a r c o n un grad o de in d ep en d en cia s o r p ren d en te de los o tro s p ro ce so s del ciclo celular. As pues, si se e xtrae fsicam en te el n cleo de u n h u ev o de erizo de m ar, o si se b lo q u ea la sntesis de DNA m e d ian te afidicolina, que inhibe la sntesis de DNA, los ciclos de d u p licaci n y divisin del c e n tro so m a p ro ce d e n casi co n n orm alid ad , p rim ero p ro d u cien d o d os ce n tro so m a s, luego cu a tro , d esp u s o ch o , etc. En em b rio n es te m p ra n o s de

afidicolina, los c e n tro so m a s prolife ran tes del in terior del em b ri n se d iso cian de su n cleo b loq uead o y se d esp la zan a travs del cito p la sm a h a cia la m e m b ra n a p lasm tica; cu a n d o a lcan zan esta m e m b ra n a , m e d ia n te sus steres, p u ed en m o d ificar la fo rm a de la m e m b ra n a y de su c o rte z a su b y acen te, g en eran d o clu las que co n tie n e n ce n tro so m a s p ero sin n cleo (Figura 1 8 -6 ). Los h uevos en divisin, co n sus reservas de c o m p o n en tes celu lares que los liberan de la d e p e n d e n cia de la tra n scrip ci n gn ica, tien en un co m p o rta m ie n to m a rc a d a m e n te e x cep cio n al; en o tra s clulas el ciclo del c e n tro so m a d ep en d e de la p re se n cia de un n cleo celu lar fu n cion al. E st claro , sin em b arg o , que el ciclo de divisin de la clu la en su globalidad d ep en d e de - o al m e n o s e st o rg an izad o en p arte p o r - el ste r m icro tu b u lar, el cu al a su vez est org an izad o p o r el ce n tro so m a . Los ce n tro so m a s , y los ce n tro lo s que n o rm a lm e n te se hallan aso cia d o s a ellos h an d ejad o p erp lejo s y h an o b se sio n a d o a los b ilogos celu lares d u ran te m s de cien a o s. De q u e st n h e ch o s, c m o se rep lican , y c m o se o rig in a ro n d u ran te el cu rso de la ev o lu ci n ? E stas cu e stio n e s b sica s c o n tin a n sin resp u esta.

Drosophila tra ta d o s de fo rm a p a re cid a co n

Tradicionalmente la fase M se divide en seis estadios

La estrateg ia de la divisin celu lar es extra o rd in a ria m en te co n sta n te en tre los o r g an ism os eu ca rio ta s. Los cin co p rim ero s estad io s de la fase M co n stitu y en la m i tosis (definida in icialm en te c o m o el p ero d o d u ran te el cu al los c ro m o so m a s se h allan co n d e n sa d o s de m a n e ra visible); el sexto estad io, que se so lap a co n el fi-

980

Captulo 18: Los mecanismos de la divisin celular

CITOCINESIS MITOSIS G2 G1

Figura 18-7 Cronologa normal de la mitosis y la citocinesis de una clula de mamfero. Los perodos
varan de unas clases de clulas a otras, y son mucho ms cortos en los ciclos celulares embrionarios. Ntese que la citocinesis empieza antes de la finalizacin de la mitosis. El comienzo de la profase (y por tanto de toda la fase M) se define como el punto del ciclo celular en que los cromosomas condensados son visibles por primera vez -segn un criterio arbitrario, ya que la condensacin de cromosomas parece incrementarse continuamente durante el final de G2. El comienzo de la prometafase se define como el momento en que la envoltura nuclear se rompe.

& $

&

r &

rS> n?
>0 ?

20

tiiempo (minutos)

40

60

80

interfase

10 |jm

Figura 18-8 El curso de la mitosis en una clula de mamfero tpica. En estas micrografas de clulas en cultivo de pulmn de tritn, se han visualizado los microtbulos mediante inmunofluorescencia indirecta, mientras que la cromatina se tie con un colorante azul fluorescente. Durante la el centrosoma, compuesto por una matriz asociada con un par de centrolos, forma el foco necesario para las series de microtbulos de la interfase. En la el nico centrosoma contiene dos pares de centrolos (no visibles); en la el centrosoma se divide y los dos steres resultantes se separan. La envoltura nuclear se rompe en la permitiendo que los microtbulos del huso interacten con los cromosomas. En la la estructura bipolar del huso se clarifica y todos los cromosomas se alinean en la mitad del huso. Las parejas de cromosomas hijos, llamados se separan sincrnicamente en la y, bajo la influencia de los microtbulos, van desplazndose hacia los polos. En la los polos del huso se han desplazado an ms lejos, aumentando la separacin de los dos grupos de cromosomas. En la el ncleo hijo se recompone, y en la la citocinesis es casi completa, con el cuerpo medio persistiendo entre las dos clulas hijas. (Fotografas cortesa de C.L. Rieder, J.C. Waters y R.W. Col.)

interfase

prometafase,

profase tarda

profase temprana

metafase

cromtidas,

anafase tarda telofase

anafase temprana

telofase tarda,

Visin de conjunto de la fase M

981

1 PROFASE
c ito p la s m a m e m b r a n a p la s m tic a

c e n tro s o m a s s e p a ra d o s q u e fo r m a r n lo s p o lo s d e l h u s o

1 PROFASE

n u c l o lo e n d is p e r s i n

c e n tr m e ro c o n c in e to c o r o s u n id o s

e n v o lt u r a n u c le a r in ta c ta

c r o m o s o m a e n c o n d e n s a c i n c o n d o s c r o m tid a s u n id a s a l c e n tr m e ro

LA EN VOLTURA NUCLEAR S E ROM PE

2 PROMETAFASE

Tal como se ve al microscopio, la transicin de la fase G2 a la fase M del ciclo celular no es un proceso estrictamente definido. La cromatina, que en la interfase se halla difusa, se condensa lentamente formando cromosomas bien definidos, cuyo nmero exacto es caracterstico de la especie en cuestin. Cada cromosoma se ha duplicado durante la fase S precedente y ahora consta de dos cromtidas hermanas, cada una de las cuales contiene una secuencia de DNA especfica conocida como un centrmero, necesaria para la correcta segregacin del cromosoma. Hacia el final de la profase los microtbulos citoplasmticos que forman parte del citoesqueleto interfsico se despolimerizan y empieza a formarse el principal componente del aparato mittico, el huso mittico. Se trata de una estructura bipolar compuesta de microtbulos y protenas asociadas. Inicialmente, el huso se ensambla fuera del ncleo entre los centrosomas en separacin.
2 PROMETAFASE

LO S C R O M O S O M A S S E DESPLAZAN H ASTA LA PLACA M ETA F SICA

3 METAFASE

La prometafase se inicia bruscamente con la desintegracin de la envoltura nuclear, que se rompe originando vesculas de membrana indiferenciables de las vesculas del retculo endoplasmtico. Estas vesculas permanecern visibles alrededor del huso durante la mitosis. Los microtbulos del huso, que hasta este momento se hallaban fuera del ncleo, pueden entrar en la regin nuclear. En cada centrmero maduran complejos proteicos especializados, llamados cinetocoros, y se unen a algunos de los microtbulos del huso, que entonces recibirn el nombre de microtbulos cinetocricos. Los microtbulos remanentes del huso se llaman microtbulos polares, mientras que los que son exteriores al huso se llaman microtbulos astrales. Los microtbulos cinetocricos ejercen tensin sobre los cromosomas, los cuales, por tanto, se ven sometidos a movimientos agitados.

3 METAFASE

LO S C IN ETO C O RO S H ERM AN OS S E SEPA RA N REPEN TIN AM EN TE AL INICIO DE LA A N AFASE

Finalmente los microtbulos cinetocricos alinean los cromosomas en un plano situado a medio camino de los polos del huso. Cada cromosoma se mantiene en tensin en esta placa metafsica por los cinetocoros apareados y por sus microtbulos asociados, los cuales estn unidos a los polos opuestos del huso.

982

Panel 18-1 Los seis estadios de la divisin celular.

4 ANAFASE
lo s m ic r o t b u lo s c in e to c r ic o s se a c o r ta n a m e d id a q u e la c r o m tid a ( c r o m o s o m a ) e s a r r a s tr a d a h a c ia e l p o lo s in c r e m e n t o d e la s e p a r a c i n d e lo s p o lo s d e l h u s o

4 ANAFASE

m ic r o t b u lo p o la r a la r g n d o s e

m ic r o t b u lo c in e to c r ic o a c o r t n d o s e

m ic r o t b u lo a s tra l

S E VUELVE A FORM AR UNA EN VOLTURA NUCLEAR

Impulsada por una seal especfica, la anafase empieza bruscamente cuando los cinetocoros apareados de cada cromosoma se separan, permitiendo que cada cromtida (ahora denominada cromosoma) sea arrastrada lentamente hacia un polo del huso. Todos los cromosomas que se acaban de separar se desplazan a la misma velocidad, que es de aproximadamente 1 |jm por minuto. Se pueden distinguir dos categoras de movimiento. Durante la anafase A, los microtbulos cinetocricos se acortan a medida que los cromosomas se aproximan a los polos. Durante la anafase B, los microtbulos polares se alargan y los dos polos del huso se separan. Normalmente la anafase slo dura unos minutos.

5 TELOFASE

En la telofase (telos, fin) los cromosomas hijos separados llegan a los polos y los microtbulos cinetocricos desaparecen. Los microtbulos polares se alargan an ms y se vuelve a formar una envoltura nuclear. La cromatina condensada se expande de nuevo, los nuclolos que haban desaparecido en la profase empiezan a reaparecer; la mitosis ha llegado a su fin.

EL SU R C O DE LA SEG M EN TACIN DIVIDE LA CLULA EN D O S

6 CITOCINESIS
e n v o lt u r a n u c le a r c o m p le ta q u e r o d e a lo s c r o m o s o m a s en d e s c o n d e n s a c i n

a n illo c o n t r c til q u e g e n e ra el s u r c o d e s e g m e n t a c i n

El citoplasma se divide mediante un proceso conocido como segmentacin, que por lo general empieza en algn momento de la anafase. Este ejemplo ilustra cmo ocurre este proceso en clulas animales. La membrana de la zona central de la clula, perpendicular al eje del huso y situada en medio de los dos ncleos hijos, se desplaza hacia dentro originando el surco de segmentacin que gradualmente se vuelve ms profundo, hasta que entra en contacto con los estrechos restos del huso mittico que quedan entre los dos ncleos. Este estrecho puente, o cuerpo medio, puede persistir durante un cierto tiempo antes de estrecharse an ms y llegar a romperse por cada extremo, produciendo as dos clulas hijas completas y separadas.

983

(A)

O minutos

(B)

15 m inutos

(C)

17 m inutos

<D) 54 minutos

Figura 18-9 El proceso de la mitosis en una clula vegetal tpica. Estas micrografas de una
clula viva de (lirio) fueron tomadas a los tiempos indicados, utilizando microscopa de contraste de fases interdiferencial. Habitualmente estas clulas presentan cromosomas grandes, de manera que son fciles de ver. Al nivel microscpico mostrado aqu, las principales fases de la divisin celular hace ms de 100 aos que se conocen. (A) los cromosomas estn condensados y son claramente visibles en el ncleo celular. (B) y (C) la envoltura nuclear se ha roto y los cromosomas estn interactuando con microtbulos que emergen de los dos polos del huso. Las plantas no tienen centrolos, pero los polos de sus husos contienen protenas relacionadas con las que se encuentran en la matriz centrosmica de las clulas animales. Ntese que entre los estadios ilustrados por (B) y (C) slo han transcurrido 2 minutos. (D) los cromosomas se han alineado en la placa metafsica con sus cinetocoros situados a medio camino entre los dos polos del huso. (E) los cromosomas se han separado en sus cromtidas hermanas, las cuales se desplazan hacia polos opuestos. (F) los cromosomas se descondensan formando los dos ncleos que ms tarde sern visibles [indicados con N en (G)]. (G) y (H) se muestran dos estadios sucesivos en la formacin del el cual aparece como una lnea cuya direccin de crecimiento se indica con flechas en (H). (Cortesa de Andrew Bajer.)

Haemanthus

Profase:

Prometafase:

(E) 83 minutos

(F)

124 minutos

(G)

169 minutos

(H)

199 minutos

n al de la m itosis, es la cito cin esis. E sto s seis estad ios fo rm an u n a se cu e n cia d i n m ica cu y a co m p lejid ad y b elleza son difciles de a p re cia r en d escrip cio n es e s critas o a p artir de un co n ju n to de fotografas estticas. La d escrip ci n de la divisin celu lar se b a sa en o b serv acio n es de dos fu en tes: el estu d io de an im ales vivos m e d ia n te el uso del m icro sco p io p tico (a m e n u d o co m b in a d o c o n la m icro cin em ato g rafa) y el estu d io de clulas fijadas y te idas ta n to co n el m icro sco p io p tico c o m o co n el ele ctr n ico . En el P anel 18-1 se resu m en b rev em e n te los diferentes estad io s de la divisin celular. Los cin co estad io s de la m itosis y tien en lu gar en un o rd en se cu e n cia l e stricto , m ien tras que la cito cin esis em p ieza d u ran te la an afase y c o n tin u a h a sta el fin de la fase M (Figura 1 8 -7 ). En las Figuras 1 8-8 y 18-9 se m u estran m icrografas p ticas de divisiones celu lares de u n a clula an im al tp ica y de u n a clu la vegetal tpica, resp ectiv am en te. E xisten in con tab les varian tes de to d o s los estad ios de la divisin celular, m o strad o s esq u e m tica m e n te en el Panel 18-1, ta n to en el reino an im al co m o en el vegetal. M en cio n are m o s algu n as de ellas d espu s de que h ay am o s visto m s de c e rc a los m ecan ism o s gen erales de la divisin celular.

Metafase:

Anafase:

-profase, prometafase, metafase, anafase telofase-

Telofase:

Citocinesis:

plano celular,

Los orgnulos citoplasm ticos grandes se fragmentan durante la fase M asegurando que se heredan correctam ente 3
Los p ro ceso s de la divisin celular tienen que aseg u rar que ca d a clula hija h ered a tod os los co m p o n e n te s celulares fu n dam entales. C om o vim os en el Captulo 12, los orgnulos co m o las m ito co n d rias y los cloroplastos, p or ejem plo, no pueden en sam b larse esp o n t n e a m e n te a p artir de sus co m p o n en tes individuales; slo p u ed en form arse m ed ian te el crecim ien to y la fisin del orgnulo correspon d ien te preexistente, de fo rm a que la clula hija no p od r co n te n e r ninguno a m en o s que h aya h ered ad o u no o m s de ellos. De la m ism a form a, no es posible h a ce r nuevas cop ias del com p lejo de Golgi y del retculo en d o p lasm tico sin la p resen cia previa de al m en o s p arte de la e stru ctu ra corresp on d ien te. C m o se segregan los dife ren tes orgnulos adheridos a la m e m b ra n a cu an d o u n a clula eu cario ta superior

984

Captulo 18: Los mecanismos de la divisin celular

se divide? Los orgnulos que se p resen ten en grandes can tid ad es se h ered arn co n seguridad si, co m o m ed ia, su n m ero se duplica en ca d a g en eraci n celular. O tros orgnulos, tales c o m o el com p lejo de Golgi y el retculo en d o p lasm tico (ER), se fraccion an d uran te la m itosis en un con ju n to de fragm en tos y de v escu las m s p equ e os, p ro b ab lem en te p o rq ue en esta form a altam en te vesiculada se p u ed en distribuir de m a n e ra m s equitativa cu an d o la clula se divida. P arece que las vesculas del ER se aso cian co n los m icrot b ulos del huso m ittico, lo que p u ed e ayu dar a distribuirlos eq uitativam en te en tre las dos clulas hijas.

Resumen

Los procesos de la divisin celular (la fase M del ciclo celular) consisten en divisio nes nucleares (mitosis) seguidas de divisiones citoplasmdticas (citocinesis). La divi sin nuclear se efecta mediante un huso mittico compuesto por microtbulos, que separan los cromosomas, mientras que la divisin citoplasmdtica se efecta mediante un anillo contrctil compuesto por filamentos de actina. La mitosis se or ganiza fundamentalmente mediante el ster microtubular que se forma alrededor de cada uno de los dos centrosomas producidos por duplicacin de centrosoma. La duplicacin del centrosoma comienza durante las fases SyG 2 del ciclo celular, y en el inicio de la fase M los centrosomas duplicados se separan y se desplazan hacia caras opuestas del ncleo, formando los dos polos del huso mittico. Los grandes orgnulos membranosos, tales como el complejo de Golgi y el retculo endoplasm tico, se rompen en muchos fragmentos ms pequeos durante la fase M, lo que ase gura su distribucin equitativa entre las clulas hijas durante la citocinesis. Mitosis4
La seg reg aci n del c ro m o so m a se lleva a ca b o m ed ian te u n a m aq u in aria c o m pleja que tien e m u ch a s p artes m viles. E sta m q u in a, el h uso m it tico , est co m p u e sta p rin cip alm en te p o r m icro t b u lo s, que se utilizan ta n to p a ra e m p u jar co m o p a ra arra stra r: sep ara los p olos del h uso tiran do de ellos, y em p u jan d o a los cro m o so m a s los c o n d u ce h a cia los polos. C o m o h em o s visto, el h u so em p ieza a fo rm arse fu era del n cleo m ien tras los cro m o so m a s se c o n d e n sa n d u ran te la profase. C uan d o se ro m p e la en voltu ra n u clear, en la p rofase, los m icro t b u lo s del h uso son c a p a c e s de c a p tu ra r los cro m o so m a s, que finalm en te se alinean en este p u n to m ed io , fo rm an d o la lla m ada (vase P anel 1 8 -1 ). En la an afase las cro m tid a s h e rm a n as se sep aran b ru sca m e n te y son co n d u cid as a los polos o p u esto s del h uso, m ien tras q ue el alarg am ien to del h u so a u m e n ta la se p a ra ci n en tre los polos. El Figura 18-10 Las tres clases de microtbulos de un huso mittico completamente formado. (A) Imagen confocal del huso mittico en la metafase de un embrin de con sus microtbulos marcados con fluorescencia. (B) Diagrama esquemtico que identifica las tres clases de microtbulos del huso. En realidad, los cromosomas son mucho ms grandes de lo que aqu se muestra, y a cada cinetocoro se unen muchos microtbulos. (A, cortesa de William Theurkauf.)

Drosophila,

placa metafsica

h u so co n tin u a alarg n d o se d u ran te la telofase m ien tras los c ro m o so m a s van lle-

c e n tro s o m a ( p o lo d e l h u s o )

c in e to c o r o

m ic ro t b u lo s astrales

m ic ro t b u lo s c in e to c ric o s

m ic ro t b u lo s p o la re s

(B)

Mitosis

985

gan d o a los p olos y se liberan de los m icro t b u lo s del h uso; finalm en te, en to rn o a ellos se, reco n stru y e la en v o ltu ra n u clear. El en sam b laje del h u so , la ca p tu ra de cro m o s o m a s y su alin eaci n en la p la c a m etafsica, y el p o sterio r alarg am ien to del h uso co n el d esp lazam ien to de los c ro m o so m a s a los p olos, d ep en d en c rtica m e n te de u n a serie de p ro ce so s que o cu rre n en o c e r c a de los e x tre m o s de los m icro t b u lo s: los m icro t b u lo s n o son ta n slo el lu gar d o n d e se localiza el en sam b laje y d esen sam b laje de los m ic ro t bulos sino tam b in d o n d e se p ro d u ce la fuerza. V erem o s que se p u ed en distin guir tres tipos d e m icro t b u lo s del h uso: los microtbulos polares, que se so la p an en la lnea m ed ia del h u so y so n los resp o n sab les de e m p u jar a los p olos del h u so ca u sa n d o su se p a ra ci n ; los microtbulos cinetocricos, que se ad hieren al esp ecializad o que fo rm a el ce n tr m e ro de c a d a c ro m o s o m a dupli ca d o y c o n d u ce los c ro m o s o m a s en el h uso; y los microtbulos astrales, que p a rte n en to d as d ire ccio n e s d esd e los c e n tro so m a s y se cre e que co n trib u y en a

:o c u

c_

'cu 3

g-jj 100 (D Q .C U 3 O'o < 5 C D W R f) "O OO

Q )

INIEFFASE
ti/2 =

5 m in u t o s

C M_

C D^ 3

O -S Q.

0
t ie m p o ( m in u t o s )

cinetocoro

Figura 18-11 En la fase M los microtbulos son mucho ms dinmicos, por trmino medio, que en la interfase. Se inyecta tubulina, unida de forma covalente a un colorante fluorescente, a clulas de mamfero mantenidas en cultivo. Despus de que la tubulina fluorescente se incorpore a los microtbulos celulares, se blanquea toda la fluorescencia de una pequea regin mediante un rayo lser intenso. Se estudia la recuperacin de la fluorescencia en la regin blanqueada de microtbulos en funcin del tiempo, la cual se produce por recambio por microtbulos formados por tubulina fluorescente no blanqueada procedente de la solucin. Se cree que el tiempo necesario para que se produzca el 50% de la recuperacin de la fluorescencia (ti/2) es igual al tiempo necesario para que la mitad de los microtbulos de la regin se despolimericen y se vuelvan a formar. (Resultados de W.M. Saxton et al.,/. 99:2175-2187,1984, permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

g en erar las fu erzas q ue se p a ra n los p olos y los sit an en relaci n al resto de la clu la (Figura 1 8 -1 0 ). El co m p o rta m ie n to de ca d a u n a de estas clases de m ic ro t b ulos es distinto d ebido a las d iferentes estru ctu ra s co n las que e n tran en c o n ta c to sus extre m o s y, p o r tan to , a los diferentes p ro ce so s que all tien en lugar.

La form acin del huso m ittico en una clula en fase M se acom paa de cam bios sorprendentes en las propiedades dinm icas de los m icrotbulos 5
El que p arten del ce n tro so m a en tod as di re ccio n e s se halla en un estad o de inestabilidad d in m ica, en la que los m icro t bulos se p olim erizan y d espolim erizan sin ce sa r y co n tin u a m e n te se n u clean n uevos m icrot b u lo s p a ra equilibrar las p rdidas de los que d esa p a re ce n p or co m p leto m ed ian te la d esp olim erizacin (se tra ta en el C aptulo 16). D u ran te la p rofase tard a el ritm o de esto s p ro ce so s ca m b ia d ra m tica m e n te . La vida m ed ia de un m icro t b u lo co rrie n te d e c re c e ap ro x im a d a m e n te veinte v eces (de 5 m in u tos a tan slo 15 segu nd os) (Figura 1 8 -1 1 ), y se cre e que esto refleja un au m en to b ru sco de la p robabilidad de que un m icro t b u lo tpico en crecim ien to se c o n vierta en un m icrot b u lo que se e n co g e, debido a alguna v ariaci n en su extrem o m s (vase pg. 8 6 8 ). Al m ism o tiem p o se p ro d u ce un gran a u m e n to del n m e ro de m icro t b u lo s que p arten del ce n tro so m a , ap a re n te m en te debido a u n a alteraci n del prop io ce n tro so m a , a celeran d o el ritm o al que se n u clean m icro t bulos n uevos: se p u ed e d e m o stra r m ed ian te un cultivo que los c e n tro s o m as p rofsicos p re se n ta n un in cre m e n to n otab le en su ca p a cid a d p a ra n u clear el crecim ien to de m icro t b u lo s. E stos dos cam b io s son suficientes p a ra exp licar p or qu el inicio de la fase M se ca ra cte riz a p o r u n a rp id a tran sici n desde u nos cu an to s m icro t b u lo s largos que se extiend en desde el ce n tro so m a a la periferia celu lar (la fo rm aci n de m icro t b u lo s interfsicos) h asta u n a gran can tid ad de p eq u e os m icro t b u lo s que ro d ean c a d a ce n tro so m a (los m icrot b u los astrales). En algu n as clulas tam b in p u ed e a c tu a r un te rce r m e ca n ism o : la d e sco m p o si cin de los m icrot b u lo s in terfsicos p u ed e ser ace le ra d a p o r u n as p ro ten as que los dividen. La b ase m o lecu lar de esto s cam b io s en la d in m ica de los m icro t b u los es in cierta, p ero p a re ce p rob ab le que im plique la fosforilacin p o r M PF de u n a o m s p roten as que in te ra ct a n co n los m icrot b ulos. Los m icro t b u lo s q ue c re c e n y se e n co g e n r p id a m e n te e m a n a n en to d as d ireccio n e s a p artir los ce n tro s o m a s p ro fsico s. S u b fo rm acio n es de esto s m ic ro t b u los astrales se estab ilizan se le ctiv a m e n te de d iferentes m o d o s, fo rm an d o as un h u so m it tico org an izad o .

conjunto de microtbulos interfsicos

CellBiol.

in vitro

Las interacciones entre microtbulos orientados en direcciones opuestas conducen el ensam blaje del huso 6
D u ran te la p rofase, m ien tras la en v o ltu ra n u cle a r e st to d av a in tacta, p a re ce q ue algu n os de los m icro t b u lo s que se salen de ca d a ce n tro so m a en tra n en

986

Captulo 18 : Los mecanismos de la divisin celular

Figura 18-12 Modelo de cmo se podra formar un huso mittico bipolar mediante la estabilizacin selectiva de microtbulos que interactan entre s. Los nuevos microtbulos crecen hacia afuera, en direcciones aleatorias, a
partir de dos centrosomas cercanos. Se hallan anclados a los centrosomas por sus extremos menos. Sus extremos m s son dinmicamente inestables y pueden pasar de repente de un crecimiento uniforme [flechas rojas orientadas al exterior) a un acortamiento rpido [flechas rojas orientadas hacia el interior durante el cual, a menudo, se despolimeriza todo el microtbulo. Si dos microtbulos de centrosomas opuestos interactan en una zona de solapamiento, las protenas asociadas a los microtbulos entrecruzan los microtbulos [puntos negros), cubriendo sus extremos m s y estabilizndolos, con lo que disminuye la probabilidad de que despolimericen. Existen pruebas de que las protenas entrecruzadoras son molculas motoras de microtbulos orientadas hacia el extremo m s, que tienden a conducir los microtbulos en direccin de separar los polos del huso.

c o n ta c to co n m icro t b u lo s de polaridad o p u e sta que cre c e n d esd e el o tro ce n tro so m a (Figura 1 8 -1 2 ). Se c re e que en la regin en q ue esto s m icro t b u lo s se solap an , a m ed io ca m in o en tre los d os ce n tro so m a s, se fo rm an en la ce s cru zad o s q ue estab ilizarn los e x tre m o s de esto s im pidiend o as su d esen sam b laje, u n ien d o en tre s los dos co n ju n to s de o rie n ta ci n o p u e sta y

microthulos polares

co n stitu y en d o el a rm a z n b sico del h uso b ip olar ca ra cte rstico . Se cre e q ue las p ro ten as que esta b le ce n en la ce s cru zad o s co n los m icro t b u lo s p o lares so n m o lcu las m o to ra s de m icro t b u lo s o rien tad as h a cia el polo positivo, q ue no slo estab ilizan el h u so b ip olar sino que ta m b i n a c t a n em p u jan d o los m icro t b ulos an tip aralelo s en u n a d ire cci n q ue tien d e a se p a ra r e n tre s los dos p o los. As p ues, au n q u e los m icro t b u lo s p olares e st n estab ilizad os fren te a un d esen sam b laje cata str fico , no so n esttico s; v ere m o s m s ta rd e que, in clu so en el h uso m etafsico (Figura 1 8 -1 3 ), que d a la a p a rie n cia de estabilidad, los m ic ro t b ulos p olares ex p e rim e n ta n co n tin u a m e n te la ad ici n n e ta de m o n m e ro s en sus e xtrem o s m s y la p rd id a n e ta en sus e x tre m o s m e n o s en los polos. P ro b ab lem en te los m icro t b u lo s p o lares se p a ra n los ce n tro so m a s m ien tras se fo rm a el h u so d u ran te la p rofase. M s ta rd e dirigirn el alarg am ien to del h uso en la an afase. N o o b sta n te , d u ran te los estad io s in term ed io s del alarg am ien to m it tico del h u so, ste se m a n tie n e co n tro la d o ; m ien tras q ue los m icro t b u lo s p o lares e m p u jan , m a n te n ie n d o los p o lo s del h u so se p a ra d o s, los m icro t b u los cin e to c rico s q ue u n en los p olos del h uso a los cro m o so m a s, estiran c o n tra rrestan d o la fu erza de los m icro t b u lo s p olares, tal co m o v e re m o s a h o ra.

microtbulos astrales

microtbulos centrosoma polares (polo del huso)

Figura 18-13 Huso mittico. Huso

metafsico aislado, visualizado con tres tcnicas de microscopa ptica: (A) microscopa de contraste de fases interferencial, (B) microscopa de contraste de fases, y (C) microscopa de luz polarizada. (Cortesa de E.D. Salmn y R.R. Segall, J.Cell Biol. 86:355-365,1980, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

Mitosis

987

Figura 18-14 El centrmero.

Electronmicrografa de barrido de un cromosoma mittico humano, constituido por dos cromtidas hermanas unidas por su plano horizontal. La regin constreida es el centrmero. (Cortesa de Terry D. Alien.) ^ *

c ro m o s o m a m e ta f s ic o

C S24

; T U *' '

SM
i________ !
1 (jm
c r o m tid a

Los crom osom as replicados se unen a los microtbulos por sus cinetocoros 7
Al inicio de la fase M c a d a c ro m o so m a est replicado y se co m p o n e de dos a tod o lo largo, co n u n a co n stricci n en u n a n ica regin llam ad a el centrmero, d ond e la cro m a tin a p a re ce e sta r esp ecialm en te co n d en sad a (Figu ra 18-14). D u ran te la p rofase tard a en ca d a ce n tr m e ro se en sam b lan com plejos de p roten as esp ecializados co n o cid o s co m o cinetocoros, de form a que los dos ci n eto co ro s de ca d a c ro m o so m a (uno en ca d a cro m tid a h erm an a), se hallan dis p uestos en d ireccio n es op u estas. A travs de sus cin eto co ro s los cro m o so m a s re p licados se u nirn a un subgrupo distinto de m icrot b ulos del huso m ittico (Figura 18-15). E stos microtbulos cinetocricos se utilizarn finalm ente, en la an afase, p ara arrastra r las dos cro m tid as h erm an as h acia los polos op uestos del h uso. P ero an tes de este estadio, m ien tras las cro m tid as h erm an as todava estn unidas, ya existe u n a ten si n g en erad a en los m icrot b ulos cin eto c rico s, sep a ran d o los cro m o so m a s y a ce rca n d o los polos del huso. En la m ayora de organism os el cin etocoro es un gran com plejo m ultiproteico que se puede observar al m icroscop io electrnico co m o u n a estructura multilamin ar en form a de p laca (Figura 18-16). V erem os que no se trata sim plem ente de una localizacin pasiva de anclaje p ara los m icrotbulos, sino que juega un papel central en el con trol del ensam blaje y desensam blaje de los m icrotbulos cinetocricos, ge nerando tensin en ellos y, finalm ente, dirigiendo el m ovim iento crom osom ico.

Figura 18-15 Microtbulos cinetocricos. Dibujo esquemtico de

tidas hermanas

crom

un cromosoma metafsico que muestra sus dos cromtidas hermanas unidas a microtbulos cinetocricos. Cada cinetocoro forma una placa en la superficie del centrmero. Los extremos m s de los microtbulos se unen a los cinetocoros (no se muestra).

cinetocoro

direccin del I % movimiento do -,1a cromtida

microtbulos incluidos

in el
cinetocoro

1 jim
988 Captulo 18 : Los mecanismos de la divisin celular

Figura 18-16 El cinetocoro. (A) Un cromosoma metafsico teido con un fluorocromo de unin al DNA. (B) Un cromosoma metafsico teido con anticuerpos humanos que reaccionan con protenas especficas del cinetocoro, mostrando la presencia de dos cinetocoros, cada uno de ellos asociado a una cromtida. (C) Electronmicrografa de una cromtida en anafase con microtbulos adheridos a su cinetocoro. La mayora de los cinetocoros tienen una estructura trilaminar; el que se muestra (de un alga verde) tiene una estructura extraordinariamente compleja con capas adicionales. (A y B, cortesa de Bill Brinkley; C, de J.D. Pickett-Heaps y L.C. Fowke, 23:71-92, 1970, reproducido con permiso de CSIRO.)

Aust. J. Biol. Sci.

m ic r o t b u lo a la m is m a e s c a la

Figura 18-17 Secuencia de DNA de un centrmero caracterstico de la levadura

Saccharomyces cerevisiae.

e le m e n t o c o n s e r v a d o I

e le m e n to r ic o e n A T II

e le m e n to c o n s e r v a d o III

ATAAGTCACATGAT TATTCAGTGTACTA

88 pares de bases (93% AT)

TGATTTCCGAA ACTAAAGGCTT

La secuencia de DNA mostrada es suficiente para originar una segregacin cromosomica completa; acta ensamblando las protenas del cinetocoro que atraen a un microtbulo (en ) al cinetocoro.

verde

CENTROIV!H:; I n i i i VAI > 1 ;A (CF.N3)

~40 n m

de D N A de fo rm a B

En los cromosom as de la levadura los complejos proteicos cinetocricos se ensam blan siguiendo secuencias especficas de DNA centrom rico 8
La in fo rm aci n que d ete rm in a la co n stru cc i n de un c in e to co ro en u n a lo cali z a ci n esp ecfica de un c ro m o s o m a se halla en la se cu e n c ia de DNA del c e n tr m ero . En las levad u ras de fisin el DNA c e n tro m ric o p u ed e ser id en tificad o m ed ian te su efecto en la p ro p a g a ci n de p lsm id os que lo co n tie n e n : un plsm ido que co n te n g a DNA ce n tro m rico se p u ed e h e re d a r de fo rm a estab le en la m itosis y la m eiosis, c o m o si fu era un cro m o s o m a , m ien tras que un p lsm ido q ue ca re z c a de d ich o DNA (y e st p re se n te en b ajas can tid ad es) se se g reg ar en las clu las hijas d e fo rm a irregu lar y se p e rd e r al ca b o d e u n as c u a n ta s divisio n es celu lares. (En el C aptulo 7 vim os c m o se h a utilizado esta p ro p ied ad de los c e n tr m e ro s en la c o n s tru c ci n de v e cto re s p a ra DNA clo n ad o .) E x p e rim e n to s g en tico s m o lecu la re s m u e stra n que c a d a u no de los 17 c ro m o so m a s de la leva d u ra co n tie n e u n a s e cu e n cia c e n tro m rica d istinta de u n a longitud de u n o s 110 p ares de b ases (Figura 1 8 -1 7 ). A unque c a d a se cu e n c ia es n ica, to d as co n tie n e n regio n es h o m o lo g as su stan ciales y p u ed en ser in vertidas o in te r ca m b ia d a s de cro m o s o m a a c ro m o s o m a sin p erd er su fu n cin . Se h an identificado algunas de las protenas que form an el cin eto co ro de la le vadura p or su cap acid ad de unirse al DNA ce n tro m rico . El elem ento III del c e n trm ero de levadura (vase Figura 18-17), p o r ejem plo, se une a un com p lejo de tres p rotenas. Se cree que este com p lejo p roteico inicia la fo rm aci n de un cin e to co ro sencillo que se u ne al extrem o de un slo m icrotbulo. U n a de las p ro te n as purificadas que u nen ce n tr m e ro s es un m o to r de m icrotbulos dirigida h acia el extrem o m e n o s, lo cual p arece suficiente p ara propulsar el cin eto co ro de la le v ad u ra a lo largo de su m icrot b ulo adherido h acia el polo m ittico. Otras p rote-

Figura 18-18 Tincin inmunofluorescente de cinetocoros en clulas en cultivo. Las clulas de

marsupial (clulas PtK) mostradas en (A) y (B) contienen relativamente pocos cromosomas y se encuentran en fase G, en (A), donde existe un cinetocoro teido por cada cromosoma, y en fase G2 en (B), donde existen dos cinetocoros teidos por cada cromosoma. Los anticuerpos utilizados para marcar los cinetocoros son los mismos que los utilizados en la Figura 18-16B. En (C) se muestra un tipo diferente de clula, que se encuentra en metafase; los cinetocoros se han teido con anticuerpos que reaccionan con una protena del cinetocoro, y el DNA se ha teido con un colorante (Cortesa de B.R. Brinkley y D. He.)

S. cerevisiae

rojo.

(A )

(B)

(C )

10 |jm

Mitosis

989

 as se u n en a otras secu en cias del ce n tro m e ro y estabilizan su in teracci n co n el m icrot b ulo. Los cen tr m ero s de m am fero se co m p o n e n de distintas secu en cias de DNA m u ch o m s largas y form an cin e to co ro s m u ch o m s grandes que llegan a unir 30 o 4 0 m icrot b ulos. Se cre e que la m ay o r p arte de la secu en cia repetitiva (el DNA satlite) de los cen tr m e ro s de m am fero es im prescindible p ara la organizacin esp ecial de cro m atin a en el ce n tr m e ro . Pero p arece ser q j: existen secuc DNA, com p ren d id as en este DNA estructural, que u nen com p lejos proteic eidos a los de los ce n tr m e ro s de las levaduras. El h e ch o de que los en ferm os que p a d e ce n ciertos tipos de e

gris

escleroderma (una

en ferm ed ad de cau sa d e sco n o cid a que se aso cia co n u n a fibrosis progresiva del tejido conjuntivo de la piel y de o tros rganos) p ro d u zcan an ticu erp os que re a c c io n an esp ecficam en te co n los cin eto co ro s, h a facilitado el estudio de las protenas de cin eto co ro de m am fero. Si utilizam os estos an ticu erp os p a ra m a rca r clulas en divisin m ed ian te in m u n oflu orescen cia, se ob serva un p atrn de p un tos fluores cen tes en el que ca d a p u n to in d ica la posicin de un cin eto co ro . S orp ren d en te m en te, si se m a rca n clulas que no estn en divisin se ob tiene un p atr n similar, de form a que el n m ero de p un tos p or clula se co rresp o n d e co n el n m ero de cro m o so m as, lo cu al sugiere que los p recu rso res de cin eto co ro s se u n en a cad a cen tr m ero incluso en el n cleo interfsico (Figura 18-18). Los au to an ticu erp o s de la esclero d erm a tam b in p erm iten el clonaje de los genes que codifican m u ch as de las p roten as aso ciad as co n los cin eto co ro s de m am fero, de m a n e ra que ah o ra estas p rotenas p u ed en fabricarse en grandes can tid ad es m ed ian te las tecnologas del DNA reco m b in an te. As p ues em p iezan a caracterizarse las in teraccio n es de u nas p roten as co n otras, co n el DNA y co n los m icrotbulos.

Figura 18-19 Captura de cinetocoros por los microtbulos. El cinetocoro se une a un costado del microtbulo en crecimiento y se desliza a lo largo del mismo hacia el polo del huso. En las figuras de la izquierda la seala la direccin en que crece el microtbulo, mientras que la seala la direccin de deslizamiento del cromosoma. En la figura de la derecha se presenta una reconstruccin tridimensional por ordenador de un cromosoma de tritn en prometafase, a partir de varias secciones finas. Este cromosoma ( no ha hecho ms que iniciar su desplazamiento hacia el polo del huso tras la unin de su cinetocoro ( ) a un microtbulo (De C.L. Rieder y S.P. Alexander, 110:81-95,1990, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

flecha roja

flecha

azul)

naranja

Biol.

{blanco). J. Cell

Los cinetocoros capturan los microtbulos nucleados en los polos del huso9
D u ran te la profase, m ien tras se form an los m icrot b ulos p olares y se alarga el huso, e n co n tra m o s m u ch o s m icrot b u los tod ava en crecim ien to y que se retraen rp id am en te d esd e el ce n tro s o m a de c a d a polo, c o n sus e x tre m o s m s exp lo ran d o al azar to d a la clu la. L a p ro fase te rm in a y co m ie n z a la prometafase cu a n d o la rp id a fosforilacin de la lm in a n u cle a r d e se n c a d e n a la d e sco m p o si ci n de la e n v o ltu ra n u cle a r y los m icro t b u lo s co n sig u en a c c e d e r a los c ro m o so m as. M ed ian te u n p ro ce d im ie n to que se p u ed e c o m p a ra r al de u n p e sca d o r lan zan d o el sedal, u n m icro t b u lo a la c a z a p a sa a m en u d o lo su ficien tem en te c e rc a de un cin e to c o ro c o m o p a ra ca p tu ra r el cro m o s o m a . En las clu las de tri t n , en las cu ales se p u ed e o b serv ar la ca p tu ra inicial, p rim ero se o b serv a c m o el cin e to co ro se ad h iere al co sta d o del m icro t b u lo y en to n ce s se desliza co n r a pid ez a lo largo del m ism o h a c ia el p olo del h uso (Figura 1 8 -1 9 ). P ro b ab lem en te la ad h esi n lateral al m icro t b u lo y el d eslizam ien to p o sterio r h a cia el polo son d ebidas a la a ctu a c i n de la d in en a (tra ta d a en el C aptulo 16), u n a p ro ten a m o to r de m icro t b u lo s o rie n ta d a h a cia el e x tre m o m e n o s , que se p u ed e lo c a lizar en el cin e to co ro m e d ia n te el m areaje co n a n ticu e rp o s antid in en a.

990

Captulo 18 : Los mecanismos de la divisin celular

Figura 18-20 Experimento que demuestra que los microtbulos cinetocricos metafsicos aaden subunidades por su extremo ms unido al cinetocoro. En este experimento se inyect tubulina marcada con fluorescencia a una clula viva, en la que acab incorporndose a los microtbulos del huso Entonces se introdujo tubulina marcada con rodamina a una clula en metafase, en la que se incorpor a unos microtbulos cinetocricos, concretam ente en el extremo m s ( por el que se unen al cinetocoro. Tambin se observa una cierta incorporacin en el centrosoma. (Cortesa de G. Borisy.)

(verde).

naranja)

C ad a cin e to co ro ca p tu ra ca d a vez m s m icrot b u los, a m ed id a que se desli za h acia el polo del h uso, d o n d e la densid ad de m icro t b u lo s es m s alta. D u ran te este p ro ce so las in te ra ccio n e s iniciales de los m icro t b u lo s q ue se p ro d u can en los co stad o s se co n v ierten en in te ra ccio n e s en los e xtrem o s, c o n el cin e to co ro ad h erid o al polo m s de c a d a m icro t b u lo . Fin alm en te, el c in e to co ro co n trario , situad o en la o tra cro m tid a h e rm a n a , ser c a p tu ra d o p o r el e x trem o libre de un m icro t b u lo p ro ce d e n te del p olo co n tra rio del h uso, c o lo c a n do a las cro m tid a s p ara su seg reg aci n y ten san d o el sistem a de m icro t b u lo s cin e to c rico s. D ichas ten sio n es se d eben a las p ro p ied ad es esp eciales de los aco p lam ien to s en tre m icro t b u lo s y cin e to co ro s, que v erem o s a co n tin u a ci n .

Los extremos ms de los microtbulos cinetocricos pueden aadir y perder subunidades de tubulina mientras estn adheridos al cinetocoro1 0
C om o los m icro t b u lo s p o lares, que d esp u s de e sta b le ce r los co n e x io n e s c ru zad as en el e cu a d o r del h u so co n tin a n a ad ien d o su bu n id ad es a u no de sus extrem o s y p erd in d olas en el o tro , los m icro t b u lo s cin e to c rico s tam b in m a n tie n e n un estad o de flujo d in m ico . Si se in y ecta tu b ulin a m a rc a d a q u m i c a m e n te en clu las m it ticas d u ran te la m etafase, se o b serv a que se in co rp o ra co n tin u a m e n te a d ich os m icro t b u lo s c e rc a de su p u n to de u nin al cin e to co ro (Figura 1 8 -2 0 ). V erem os b rev em en te que d u ran te la an afase o cu rre la re a cci n inversa, y q ue se p ierd en m o lcu las de tu b ulin a de esto s m icro t b u lo s c in e to c rico s a m ed id a que se d esplaza h a cia el polo del huso. E ste h e ch o h a c e n e ce sa rio q ue ta n to la ad ici n c o m o la p rd id a de m o lcu las de tubulina se p ro d u z ca m ien tras el cin e to c o ro co n se rv a u n a u nin m e c n ic a frm e co n los m icro t b u los. D icha u nin co n tin u a r siem p re bajo p resin , tan to si las m o lcu las de tu b ulina se a ad en c o m o si se p ierd en . As p ues, p a re ce que el c in e to co ro a c t a co m o un co llar co rred izo , que m a n tie n e u n a a so ciaci n lateral co n las su b u n i d ad es de tu bulina p o lim erizad a c e rc a del e x tre m o del m icro t b u lo m ien tras p erm ite la ad ici n o la p rd id a de m o lcu las de tu b ulin a en d ich o e x tre m o (v a se Figu ra 1 8 -2 8 , m s ad elan te). C uan d o se a a d e n m o lcu las de tubulina, el c o llar se m an tien e en el ex tre m o del m icro t b u lo d eslizn d ose h a cia atrs; si se pierd en d ich as m o lcu las el collar se m a n tie n e en el e x tre m o d esp lazn d o se h a cia ad elan te.

Los polos del huso repelen los cromosomas11

M ien tras que los m icro t b u lo s cin e to c rico s tien d en a em p u jar a los c ro m o s o m as h acia el polo, o tra fu erza m s m isterio sa a c t a en d ire cci n co n tra ria , re ch azan d o cu alq u ier ob jeto gran d e que se a ce rq u e d em asiad o a los polos. E sto se

Mitosis

991

p u ed e o b serv ar si m ed ia n te m icro ciru g a se liberan los b razo s de u n cro m o so m a del cin e to co ro . M ien tras que el c in e to co ro se dirige al polo m s c e rc a n o , sus b razo s tien d en a sep a ra rse de l (Figura 1 8 -2 1 ). El origen de e sta fu erza de e x clu sin astral, o vien to p o la r, es d e sco n o cid o . P u ed e ser resu ltado de la p re sin de los extrem o s en c re cim ie n to de los m icro t b u lo s libres que se n u clean sin p a ra r en el p olo; p o r o tra p arte, los b razo s liberados del c ro m o so m a p u ed en ad h erirse a m o to re s de m icro t b u lo s o rien tad o s h a c ia el polo m s y m ig rar a lo largo de d ich os m icro t b u lo s; ta m b i n es posible que o tro s c o m p o n e n te s c e lulares p u ed en d esp lazarse de e ste m o d o a rra stra n d o co n sig o los b razo s del c r o m o so m a . Se co n sid e ra que la fu erza de exclu sin astral ju eg a u n p apel im p o r ta n te en la alin eaci n de los cro m o s o m a s en el e c u a d o r del h uso d u ran te la m etafase, h e ch o que tra ta re m o s a co n tin u a ci n .
CORTE CON LASER

Las cromtidas hijas se unen a polos opuestos del huso m ediant sus cinetocoros 12
L ajexp resin ltim a de la in te ra cci n en tre los c in e to co ro s y los m icro t b u lo s es l seg reg aci n p re cisa de las dos cro m tid a s hijas de c a d a p ar de c ro m o so m a s a lad os o p u esto s de la clula. E sto req u iere que los c in e to co ro s h e rm a n o s se a d h ieran a los m icro t b u lo s que p ro c e d a n de p olos o p u esto s; si am b o s c in e to c o ros h e rm a n o s se d esp lazaran h a cia el m ism o polo la divisin celu lar resu ltan te p ro d u cira dos clu las d efectu o sas, a u n a le faltara un c ro m o s o m a y la o tra te n dra u n a co p ia extra. La m a y o r p a rte de la co m p lejid ad de la m itosis rad ica en este req u erim ien to p a ra u n a seg reg aci n ap ro p iad a, y el e rro r m it tico m s c o m n es que am b as cro m tid a s h e rm a n a s te rm in e n en u n a de las dos clulas h i jas. Tal erro r p u ed e p ro d u cirse si un c ro m o s o m a rep licad o n o p u ed e unirse al h u so, si slo se u n e u n a m itad del h uso o si las d os cro m tid a s h e rm a n a s no p u ed en sep ararse d u ra n te la an afase. D ebido a q ue los cin e to c o ro s o cu p a n p o sicio n es o p u estas, su te n d e n c ia n a tu ral ser u nirse a p olos o p u esto s, p ero esto n o o cu rre siem p re. A co m ie n z o s de la p ro m etafase los d os cin e to c o ro s hijos de un c ro m o s o m a p u ed en ad herirse al m ism o p olo del h u so . T an to sta c o m o o tras co n fig u racio n es in co rre cta s, que im p ed iran q ue el c ro m o s o m a se seg reg ara de m a n e ra a d e cu a d a si d ich as co n fi g u racio n es se m an tu v ieran , se co rrig en casi siem p re. P a re ce que el equilibrio m s estab le se p ro d u ce si c a d a cin e to co ro hijo se u n e a un slo polo distinto. El p o rq u de esto lo su giere u n ex p e rim e n to d ise ad o p a ra averiguar c m o se u n en los cro m o so m a s al huso. Se utilizan u n as agujas de cristal e x tre m a d a m e n te finas p a ra in y ectar y d e s p lazar los cro m o so m a s d en tro de u n a clu la viva, en este ca so u n e sp e rm a to cito d e sa lta m o n te s en m eiosis, cu y a m e m b ra n a es so rp re n d e n te m e n te flexible y p erm ite su m an ip u laci n . M ed ian te la m icro m a n ip u la ci n de los c ro m o so m a s d u ran te la p ro m eta fa se , es p osible obligar a los dos c in e to co ro s de un m ism o cro m o s o m a a q ue se u n a n en el m ism o p olo del h uso. E sta situ aci n no es d e m asiad o estab le, p ero si m e d ia n te la agu ja se m a n tie n e n los m icro t b u lo s cin eto c rico s bajo ten si n tiran d o su a v e m e n te del c ro m o so m a en la d irecci n o p u e sta al p olo en que se e n c u e n tra n u nidos sus cin e to co ro s, se estab ilizar y a g u a n ta r h a sta la an afase. P o r lo ta n to los m icro t b u lo s c in e to c rico s se esta b i lizan m ed ian te ten si n y n o rm a lm e n te slo los cro m o s o m a s unidos a po los del h u so se u n irn de fo rm a estab le al h uso.

LOS BRAZOS CORTADOS SE SEPARAN DEL POLO

Figura 18-21 Demostracin de la fuerza de exclusin astral. En este experimento, se cortan por la mitad con un rayo lser unos cromosomas en prometafase que se encuentran unidos temporalmente a un solo polo mediante microtbulos cinetocricos. La mitad que se libera del cinetocoro se ve separada rpidamente del polo, mientras que la mitad que permanece unida al cinetocoro se desplaza hacia el polo, reflejando menos repulsin.

ambos

Fuerzas bipolares equilibradas m antienen a los cromosomas en la placa m etafsica 13

D u ran te la m etafase se p u ed e o b serv ar que los cro m o s o m a s se d esp lazan d e so r d e n a d a m e n te p rim ero en u n a d ire cci n y d esp u s en la o tra, an tes de alinearse a u n a d istan cia eq u id istan te de los dos p olos del h u so fo rm an d o la lo cu al se ala el inicio de la m e ta fa s e . P ero , qu es lo que les co n d u ce a esta p o sici n p recisa? Si se e jerce u n a p resi n co n s ta n te h a cia los dos p olos del

fsica,
992

placa meta-

Captulo 18: Los mecanismos de la divisin celular

(A ) "E S T IR A R "

la fu e r z a d e a tr a c c i n e s p r o p o r c io n a l a la lo n g it u d d e lo s m ic r o t b u lo s c in e to c r ic o s

(B) " E M P U J A R "

la fu e r z a d e e x c lu s i n a s tra l d is m in u y e c o n la d is ta n c ia al p o lo

h u so m ed ian te dos fuerzas iguales so sten id as y o p u estas, los cro m o s o m a s p u e den m a n te n e rse equilibrados en cu alq u ier p o sici n a lo largo del eje del h uso. T iene q ue existir algu n a fo rm a de v ariaci n en la p resin ejercid a p o r las fuerzas seg n las d istan cias a los p olos del h u so , de m a n e ra que si algn c ro m o s o m a se d esp laza fu era del p lan o ecu ato rial sufra u n a fuerza n e ta que lo obligue a volver a d ich o plan o. U n a de las h ip tesis sugiere que la fu erza ejercid a p o r el m icro t b u lo cin e to c rico a u m e n ta a m ed id a q ue el m icro t b u lo se alarga; e n to n ce s la fu erza n eta ejercid a so b re ca d a c ro m o s o m a se dirigir h a cia el polo que est situad o m s le jos, y su fu erza n e ta se r igual a ce ro slo cu a n d o el c ro m o s o m a se m a n te n g a eq u id istan te d e am b o s p olos (Figura 18-22A ). U n p osible m e ca n ism o q ue p u ed a g en erar u n a fu erza p ro p o rcio n al a la longitud del m icro t b u lo sera d isp o n er de m o to re s m icro tu b u lares o rien tad o s h a cia el e x tre m o m s inm ovilizados en u n a m atriz a so cia d a co n el h u so : cu a n to m s largo sea el m icro t b u lo , m s m o to res se ju n tarn , h acien d o re tro ce d e r al m icro t b u lo h a cia su polo del h uso. El co m p o n e n te d ep en d ien te de la p o sici n , de la fu erza ejercid a sob re el c ro m o s o m a sera su p lem en taria a la fuerza d esarrollad a m e d ia n te la activid ad de las p ro ten as m o to ra s del p rop io c in e to co ro . O tra h ip tesis (Figura 1 8-22B ) p ro p o n e que la fu erza astral de exclu si n es la resp o n sab le de m a n te n e r el cro m o so m a ce n tra d o , em p u jn d o lo lejos del polo del h u so c o n u n a fu erza ta n to m a y o r cu a n to m s c e rc a se halle (tal co m o se e s p erara, p o r ejem plo, si la fu erza se d eb iera a m icro t b u lo s libres que c re cie ra n en el exterior del p o lo ). De e sta fo rm a tam b in se a lcan zara u n equilibrio so la m e n te cu an d o el cro m o s o m a estu viera eq u idistan te de am b o s polos. Las d os h i p tesis n o se exclu yen m u tu a m e n te , y es posible que en algunos p olos p u ed an a ctu a r am b o s y /o algn o tro m e ca n ism o . Las fuerzas que llevan a los cro m o so m a s a la p laca m etafsica siguen a ctu a n do d uran te la m etafase, y se pued e observar a los cro m o so m a s oscilando adelante y atrs, ajustando sus posicion es co n tin u am en te. Si m ed ian te un rayo lser co rta m o s las uniones de u n p ar de cin eto co ro s durante la m etafase, tod o el c ro m o so m a se d esplaza in m ed iatam en te h a cia el polo al que se m an tien e unido. Igualm ente, si seccio n am o s la u nin en tre las dos crom tid as, am b as se sep ararn y se despla zarn a polos op uestos del huso, tal co m o h a ce n en la anafase. De este m o d o las fuerzas que em p u jan las crom tid as h acia el polo d urante la an afase no em p iezan a actu a r de form a rep en tin a d urante la transicin de la anfase a la m etafase sino que se h acen p resen tes en cu an to los m icrot b ulos se u nen a los cin eto co ro s.

Figura 18-22 Dos hiptesis sobre cmo se alinean los cromosomas en la placa metafsica. En ambos casos
los cromosomas entran aleatoriamente en el huso durante la prometafase. En (A) los cromosomas se alinean finalmente en el ecuador (la placa metafsica) porque la fuerza de de cada cinetocoro aumenta a medida que cada cinetocoro se aleja del polo. En (B) los cromosomas terminan en el ecuador ya que las fuerzas de exclusin astral los hasta all. En ambos casos los cromosomas se mantienen bajo tensin en el ecuador debido a un equilibrio de fuerzas.

atraccin

empujan

Los microtbulos son dinmicos en el huso m etafsico 14

El h u so m etafsico es un en sam b laje co m p lejo y b on ito, su sp end id o en u n e s ta do de equilibrio d in m ico que ya est d eb id am en te ten sad o p a ra los su ceso s

Mitosis

99 3

hso metafsico formado in vitro a partir de un extracto de huevos de Xenopus, se le incorporan tres marcadores fluorescentes: tubulina marcada con rodamina {roja) para marcar todos los microtbulos, un colorante azul

Figura 18-23 El comportamiento dinmico de los microtbulos en el huso metafsico se estudia mediante la fotoactivacin de la fluorescencia. A un

que se une a DNA y m arca los cromosomas, y una tubulina marcada con fluorescencia empaquetada, que tambin se incorpora a todos los microtbulos pero que permanece invisible (porque no es fluorescente) hasta que se activa con luz ultravioleta. En (A) se observa la distribucin de los cromosomas y de los microtbulos en el huso. En (B) se utiliza un haz de luz ultravioleta para visualizar la tubulina fluorescente empaquetada, localizada principalmente en la banda izquierda de la placa metafsica. Durante los minutos siguientes (tras 1 1/2 minutos en C, y tras 2 1/2 minutos en D) se observa cmo la seal de la tubulina fluorescente desempaquetada se desplaza hacia el polo izquierdo del huso, lo cual indica que la tubulina se desplaza continuamente hacia el polo aunque el huso (visible en gracias a la tubulina marcada con rodamina fluorescente) permanezca inalterado durante largos perodos. La seal de la fluorescencia empaquetada tambin disminuye de intensidad, lo cual indica que los microtbulos individuales se despolimerizan y se substituyen sin parar. (De K.E. Sawin y T.J. Mitchison, /. 12:941-954,1991, permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

(A)

rojo

Cell Biol.l

que em p ezarn en la anafase. T odos los m icrot b ulos del huso, p ese a su ap aren te estabilidad, estn in tercam b ian d o co n tin u a m e n te subunidades c o n el acervo de tubulina soluble libre: un tratam ien to co n colch icina, que bloq uea el en sam b laje de la tu b u lin a en los m icro t b u lo s, p ro v o ca q ue to d o el h u so se d e sco m p o n g a rp id am en te. El co m p o rta m ie n to d in m ico de los m icro t b u lo s p olares y cin eto c ric o s se h a estu d iad o d ire cta m e n te p erm itien d o que los m icro t b u lo s in c o r p o ren tu b u lin a q ue se h a co n ju g ad o co v a le n te m e n te a flu o rescen a e m p a q u e ta d a fotoactivab le (vase pg. 197). Si d ich o s m icro t b u lo s del h uso m etafsico se m a rc a n c o n u n a franja flu o re sce n te (m ed ian te su exp o sici n a rayos lser), se o b serv a que los m icro t b u lo s m a rc a d o s se d esp lazan co n tin u a m e n te h a c ia el p olo (Figura 1 8 -2 3 ). E ste ex p e rim e n to d e m u e stra que ta n to en los m icro t b u lo s p olares co m o en los cin e to c ric o s las su bu n id ad es de tu b ulin a se d esplazan co n tin u a m e n te h a c ia los p olos - u n p ro ce so q ue c o n o ce m o s co m o (Figura 1 8 -2 4 , y v ase pg. 8 8 4 ). Las m a rc a s se h a ce n m s dbiles co n el tiem p o , lo cu al in d ica q ue m u ch o s m icro t b u lo s individuales se d espolim erizan 10 |jm

rotatorio

intercambio

medio

:o

Figura 18-24 Diagrama simplificado del huso mittico en la metafase. El

huso est formado por dos medios husos cada uno de los cuales est compuesto por microtbulos polares, microtbulos cinetocricos y microtbulos astrales. La polaridad de los microtbulos se indica mediante las puntas de las flechas, que sealan hacia el extremo ms. Los microtbulos polares que parten de polos opuestos del huso se solapan en una regin en la que las protenas asociadas a microtbulos pueden entrecruzarse con ellos. Ntese la colocacin antiparalela de los microtbulos en la zona de solapamiento.

{verde y naranja),

gris),

{sombreada en

se d e s e n s a m b la n e n lo s p o lo s

p o lim e r iz a n a q u

e x tre m o " m s " d e l m ic r o t b u lo

e x tre m o " m e n o s " d e l m ic r o t b u lo

994

Captulo 18: Los mecanismos de la divisin celular

METAFASE

ANAFASE

Figura 18-25 Comportamiento de los microtbulos cinetocricos en la metafase y en la anafase. (A) Durante la metafase, se aaden subunidades al extremo m s del microtbulo, en el cinetocoro, y se eliminan del extremo menos, en el polo del huso. As se produce un flujo constante de subunidades de tubulina hacia el polo, al mismo tiempo que los microtbulos mantienen una longitud constante y permanecen bajo tensin. (B) En la anafase la cromtida se libera de la unin de su cromtida hermana en la placa metafsica y el cinetocoro se desplaza rpidamente microtbulo arriba, desplazando en su camino subunidades de su extremo m s. Por lo tanto, la cromtida unida es transportada hacia el polo del huso. Parte del movimiento de la cromtida se debe a la prdida simultnea de subunidades del extremo menos de los microtbulos en el polo.

s u s tr a c c i n e n el p o lo

a d ic i n e n el c in e to c o r o

s u s tr a c c i n le n ta r p id a s u s tr a c c i n e n el p o lo e n el c in e to c o r o s u b u n id a d e s > A O m a rc a d a s

i :tt \
V
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

el m ic r o t b u lo c in e to c r ic o m a n tie n e (A ) u n a lo n g it u d c o n s ta n te (B

el m ic r o t b u lo c in e to c r ic o se a c o r ta d e b id o a la d e s p o lim e r iz a c i n en a m b o s e x tre m o s

p or co m p leto y son reem p lazad o s. D ebido a que los m icro t b u lo s p o lares y cin e to c rico s del h uso m etafsico m a n tie n e n el m ism o ta m a o , tien e que existir un equilibrio p erfecto en tre la ap o rta ci n de su bu n id ad es de tu bulina en los p o los m s en el e cu a d o r del h uso y la p rd id a de su bu n id ad es de tu b ulin a en los extrem o s m e n o s u nidos a los p olos (Figura 18-25A ). El d esp lazam ien to co n tin u o de las su bu n id ad es de tu b ulin a h a cia los polos del h u so m etafsico tien e p rofu n das im p licacio n es en la co n stru cc i n del h uso. Se cree que m u ch o s de los e n laces existen tes en tre los m icro t b u lo s p o lares del h u so, y en tre los m icro t b u lo s y o tras e stru ctu ra s tales c o m o los cin e to co ro s y los ce n tro so m a s, son p ro d u cid o s p o r p ro ten as m o to ra s de m icro t b u lo s. D ebi do a que las p ro ten as m o to ra s se a so cia n y d iso cian del m icro t b u lo c o n tin u a m e n te m ien tras av an zan p o r su ciclo cataltico , su d iseo es ideal p a ra co n tin u a r unidas sob re m icro t b u lo s cu yas su bu n id ad es no d ejan de d esp lazarse. P u ed en m a n te n e r u n a ten si n inclu so si el m icro t b u lo se est alargan d o, m e d ia n te la ad icin de su bu n id ad es, e igu alm en te p u ed en m a n te n e r u n a co m p re si n c u a n do el m icro t b u lo se e n co g e debido a la p rd id a de su bu n id ad es.

Figura 18-26 Separacin de las cromtidas en la anafase. Durante la transicin de la metafase (A) a la anafase (B), los microtbulos del huso separan las cromtidas hermanas -com o se observa en estas clulas de endosperma de (lirio) teidas con anticuerpos contra tubulina marcados con oro. (Cortesa de Andrew Bajer.)

Las cromtidas herm anas se separan repentinam ente en la anafase 15

C o m o vim os en el C aptulo 17, la anafase se d e se n c a d e n a debido a la d e g ra d a cin de la ciclin a y la co n sig u ien te in activ aci n del M PF. Ello co n d u c e b ru s c a m e n te a la divisin sin cr n ica de c a d a c ro m o so m a en sus cro m tid a s h erm an as,

Haemanthus

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A )

2 0 iim

Mitosis

995

ca d a u n a de ellas co n un cin e to c o ro . La se p a ra ci n de las cro m tid a s h e rm a n a s las libera de la fijacin que las m a n tie n e en la p la ca m etafsica, y los cin e to co ro s p u ed en e m p e z a r a d esp lazarse h a cia el polo del h u so al que se ad h erirn m e d ian te su s m icro t b u lo s cin e to c ric o s (Figura 1 8 -2 5 B ). Se cre e que las c ro m ti das se m a n tie n e n u n id as a lo largo de su lon gitud m e d ia n te p ro ten as c ro m o s m icas que se alteran b ru s c a m e n te de algu n a m a n e ra al co m ie n z o de la an afase, p erm itien d o q ue las cro m tid a s se se p a re n e in icien su tra y e cto h a cia los polos (Figura 1 8 -2 6 ).

La anafase se retrasa hasta que los todos los cromosomas se posicionan en la placa m etafsica 16
La m etafase o cu p a u n a p arte im p o rtan te del perod o m ittico (vase Figura 18-7), en p arte p orq u e las clulas se d etien en en ella h asta que tod os sus c ro m o so m a s se alin ean de fo rm a a d e c u a d a en la p la ca m etafsica. Si el h uso m it tico e st d e s en sam b lad o debido a un tra ta m ie n to c o n co lch icin a, las clu las se d etien en en la m etafase d u ran te h o ra s o das. (Este m to d o de d ete n ci n del ciclo celu lar se utiliza n o rm a lm e n te p a ra re co g e r g ran d es can tid ad es de clu las en m itosis, lo cu al p erm ite an alizar sus c ro m o s o m a s co n d e n sa d o s.) M ien tras el h uso se halle d esen sam b lad o debido a este tra ta m ie n to , tam b in se b lo q u ea la in activ aci n del M PF, q ue h ab itu a lm e n te se aliza la tra n sici n de la m etafase a la an afase. P a re ce q ue cu alq u ier cin e to c o ro q ue no e st u nido a los m icro t b u lo s g en era u n a se al difusible q ue de algu n a m a n e ra estab iliza el M PF, lo cu al n o rm a lm e n te g aran tiza q ue to d o s los c ro m o so m a s e st n alin ead o s a n tes de que se au to rice la p ro g resi n a la an afase. P o r lo ta n to se e sp era que al d e sm o n ta r el h uso m e d ian te d ro gas se p ro v o q u e u n a se al fu erte que p ro lo n g u e la m etafase de m a n e ra n otab le.

Dos procesos diferentes separan las cromtidas en la anafase 17

C u an d o ca d a c ro m o s o m a se h a dividido c o m o resp u e sta a la p u e sta en m a rc h a de la an afase, sus d os cro m tid a s se d esp lazan a p olos o p u esto s del h uso, d ond e se en sam b lan d en tro del n cleo de u n a n u ev a clula. Su d esp lazam ien to es c o n se cu e n cia de d os p ro c e so s in d ep en d ien tes re la cio n a d o s co n el h uso. El p rim ero , al que se d e n o m in a anafase A, co n siste en el d esp lazam ien to de las cro m tid a s h a cia el p olo, a c o m p a a d o del a co rta m ie n to de los m icro t b u lo s cin e to c rico s (vase Fig u ra 1 8 -2 5 B ). El seg u n d o , al que se d e n o m in a anafase B, co n siste en la s e p a ra ci n de los p olos, a c o m p a a d o de la e lo n g aci n de los m icro t b u lo s p o la res (Figura 1 8 -2 7 ). A n te rio rm e n te esto s d os p ro ce so s se distinguan m ed ian te sus d istintas sen sib ilidad es a los tra ta m ie n to s c o n drogas, p ero a h o ra e st claro q ue se d eb en a m e c a n ism o s d istintos. L as co n trib u cio n e s relativas de la an afase A y la an afase B a la s e p a ra ci n fi n al de los c ro m o so m a s vara co n sid e ra b le m e n te seg n el o rg an ism o . En las c lulas de m am fero la an afase B co m ie n z a p o co d espu s de que las cro m tid a s h ay an in iciado su viaje h a c ia los p olos y se d etien e cu a n d o el h uso tiene un ta m a o de c e r c a 1 ,5 -2 v e ce s su lon gitud m eta f sica . E n o tras clulas, tales c o m o las levad u ras y algu n os p ro to z o o s, p re d o m in a la an afase B y el h u so se alarga h a sta 15 v eces su lon gitud m etafsica.

El desensam blaje de los microtbulos cinetocricos se produce durante la anafase A18

U n a fu erza so rp re n d e n te m e n te p o te n te a c t a so b re los cro m o s o m a s m ien tras se d esp lazan d esd e la p la ca m e ta f sica h a sta el p olo del h u so . M ed icion es e fe c tu ad as calcu lan d o la d esviacin de u n as agujas de cristal delgad as d an u nas esti m as de 10-5 dinas p o r cro m o so m a , u n a fu erza 10 0 0 0 v eces m a y o r de la que n e cesitan los cro m o s o m a s p a ra d esp lazarse a su velocidad habitu al p o r el cito p lasm a. O b viam ente, se n e ce sita n u n o s m o to re s m u y p o d ero so s p a ra d es-

996

Captulo 18: Los mecanismos de la divisin celular

ANAFASE A

ANAFASE B

a c o r t a m ie n t o d e lo s m ic r o t b u lo s ; d e s p la z a m ie n to d e la s c r o m tid a s h a c ia lo s p o lo s ; fu e r z a s g e n e ra d a s e n lo s c in e to c o r o s

u n a fu e r z a d e s liz a n te (1) se g e n e ra e n tr e lo s m ic r o t b u lo s p o la r e s d e p o lo s o p u e s to s , e m p u j n d o lo s y s e p a r n d o lo s ; u n a fu e r z a d e a tr a c c i n (2) a c t a d ir e c t a m e n t e e n lo s p o lo s , s e p a r n d o lo s

m ic r o t b u lo s p o la r e s

p lazar a los cro m o so m a s, y la velocidad de d esp lazam ien to de los cro m o so m a s d eb e de esta r lim itad a p o r algo m s que p o r la viscosidad . C o m o h e m o s d iscu ti do an terio rm en te, los m ism o s m o to re s p u ed en g en erar la ten si n sob re los c r o m o so m a s en la p la ca m etafsica. M ien tras ca d a c ro m o s o m a se d esp laza h a cia el polo, sus m icro t b u lo s cin eto c rico s se d esp olim erizan , de m o d o que en la telofase casi ya h an d e sa p a re ci do. La p rd id a de su bu n id ad es se p u ed e d e te rm in a r m a rca n d o los m icro t b u lo s c in e to c rico s m ed ia n te su bu n id ad es de tu b ulin a flu o rescen te y rayos lser, c o m o h e m o s d escrita an tes. En e xp erim en to s de este tipo se p u ed e o b serv ar que los m icro t b u lo s cin e to c rico s se d esp olim erizan p o r am b o s e xtrem o s d u ran te la an afase, y que la m a y o r p a rte de la d esp o lim erizaci n se p ro d u ce en los c in e to co ro s, d on d e se h ab an p olim erizad o p rev iam en te. En u n a clu la de trit n en cultivo, p o r ejem plo, el m o v im ien to en la an afase A su ced e a u n a v elo cid ad de 2 m ieras p o r m in u to , lo que equivale a u n a d esp o lim erizaci n de m icro t b u lo s de 5 0 su b u n id ad es p o r segu nd o. El 6 0 -8 0 % de esta d esp o lim erizaci n tien e lugar en los cin e to co ro s, y el resto en los polos, a la m ism a velocidad que o b serv am o s en la an afase (vase Figu ra 1 8 -2 5 ). El h e ch o de que el cin e to co ro es el lugar p rin ci pal de d esp olim erizaci n de m icro t b u lo s sugiere que al m ism o tiem p o es el lu gar p rin cip al d o n d e se g e n e ra la fu erza que d esp laza los cro m o so m a s. Sin em b arg o , el m e ca n ism o p o r el que se d esp laza el c in e to co ro , y p o r lo ta n to el cro m o so m a , h a cia el polo del h u so d u ran te la an fase A, es d e sco n o cid o . E n la Figu ra 1 8 -2 8 se m u e stra n e sq u e m tica m e n te dos m o d elo s posibles. En el p rim ero, u n a p ro te n a m o to r de m icro t b u lo s o rie n ta d a h a cia el e x tre m o m e n o s en el cin e to co ro hidroliza ATP p a ra d esplazarse a lo largo de su m icro t b u lo unido, y a m ed id a que q u ed a al d escu b ierto , el e xtrem o m s del m icro t b u lo se va d esp olim erizan d o. En el segu nd o m o d elo de d esp o lim erizaci n de m icro t b u lo s el cin e to co ro se d esp laza p asiv am en te ya que el c in e to co ro p e r m a n e c e u nido al extrem o del m icro t b u lo m ien tras ste se d espolim eriza. El r e cie n te d escu b rim ien to de p ro ten as m o to ra s o rien tad as h a cia el polo n egativo h a p ro v o ca d a u n a co rrien te de op in in en favor del p rim er m o d elo , au n q u e es m u y p ro b ab le que la d esp o lim erizaci n co n trib u y a al d esp lazam ien to , quiz a c tu an d o c o m o un d ire cto r que lim ita la velocidad de m ig raci n h a cia los polos.

Figura 18-27 Los dos procesos que separan las cromtidas hermanas en la anafase. En la las
cromtidas son hacia polos opuestos por fuerzas asociadas al acortamiento de sus microtbulos cinetocricos. Se cree que la fuerza que conduce este movimiento se genera principalmente en el cinetocoro. En la los dos polos del huso se separan. Parece ser que las fuerzas que conducen la anafase B son similares a las que provocan la divisin y separacin del centrosoma en los dos polos del huso en la profase (vase Figura 18-5). Existen evidencias de que dos fuerzas diferentes son las responsables de la anafase B: por un lado la elongacin y el deslizamiento de los microtbulos polares, uno sobre otro, los dos polos; por otro lado, unas fuerzas exteriores ejercidas por los microtbulos astrales en cada polo del huso los pol.os hacia la superficie celular, alejndolos el uno del otro.

anafase A arrastradas

anafase B

separa

atraen

Mitosis

997

d ir e c c i n d e l d e s p la z a m ie n to d e lo s c r o m o s o m a s

d ir e c c i n d e l d e s p la z a m ie n to d e lo s c r o m o s o m a s

Figura 18-28 Dos modelos alternativos de cmo el cinetocoro puede generar una fuerza hacia los polos sobre su cromosoma, durante la anafase. (A) Las protenas motoras
de microtbulos forman parte del cinetocoro y utilizan la energa de la hidrlisis del ATP para arrastrar el cromosoma a lo largo de los microtbulos a los que dicho cromosoma est unido. (B) El desplazamiento de los cromosomas est dirigido por el desensamblaje de los microtbulos: cuando las subunidades de tubulina se disocian, el cinetocoro ha de deslizarse hacia el polo para mantenerse unido a las paredes del microtbulo.

p r o t e n a m o to r a d e lo s m ic r o t b u lo s d ir ig id a por ATP

p r o t e in a c o n a lta a f in id a d p o r la t u b u lin a p o lim e r iz a d a

m ic r o t b u lo c in e to c r ic o c in e to c o r o c ro m o s o m a

m ic r o t b u lo c in e to c r ic o c in e to c o r o c ro m o s o m a

(A )

el d e s p la z a m ie n to d e lo s c r o m o s o m a s im p u ls a d o p o r e l A T P c o n t r o la el d e s e n s a m b la je d e lo s m ic r o t b u lo s

(B)

e l d e s e n s a m b la je d e lo s m ic r o t b u lo s im p u ls a e l d e s p la z a m ie n to d e lo s c ro m o s o m a s

Dos fuerzas distintas podran contribuir a la anafase B 19

La an afase B a u m e n ta la d ista n cia en tre los d os polos del h uso, a d iferencia de la an afase A, y se a c o m p a a de la de m icro t b u lo s. Se c re e que el m is m o m e ca n ism o que se p a ra los ce n tro s o m a s en la p ro m e ta fa se co n tro la los m o vim ien tos en la an afase B. M ien tras los d os p olos se sep aran , los m icro t b u lo s

elongacin

p olares se alargan , p a re ce que p o r p olim erizaci n en sus ex tre m o s distales o ex tre m o s m s . T an to la m agn itu d de la s e p a ra ci n del polo del h u so en la an afase co m o el grad o de su p erp o sici n de los m icro t b u lo s p o lares en la z o n a m ed ia, varan de fo rm a co n sid erab le de u n as esp ecies a o tras. En m u ch a s d iato m eas, que se c a racterizan p o rq u e en ellas la m itosis o cu rre d en tro de la en v o ltu ra n u clear, las zo n as de su p erp o sici n de m icro t b u lo s so n e sp e cia lm e n te p ro m in e n te s (Figu ra 1 8 -2 9 ). Estu d ios de re c o n s tru c c i n de la arq u ite ctu ra trid im en sion al del h uso co m p le to de u n a d ia to m e a a p artir de c e n te n a re s de se ccio n e s finas seriadas exam in ad as al m icro sco p io e le ctr n ico m u e stra n que los m icro t b u lo s p olares de ca d a m ed io h u so se su p e rp o n e n en u n a regin ce n tra l c e rc a del e c u a d o r del h u so y que los m icro t b u lo s de p olaridad o p u e sta se distribuyen o rd e n a d a m e n te d ejan d o esp acio s e n tre ellos. Segn p a re ce d u ran te la an afase esto s d os gru-

Figura 18-29 Deslizamiento de microtbulos solapados en la anafase. Electronmicrografas que

muestran el alargamiento y la reduccin del grado de solapamiento de los microtbulos polares durante la mitosis en una diatomea. (A) Metafase. (B) Anafase tarda. (Cortesa de Jeremy D. Pickett-Heaps.)

regin central de microtbulos solapados

microtbulos polares del huso

regin reducida de solapamiento 2 pm de los microtbulos ----------1

998

Captulo 18: Los mecanismos de la divisin celular

Figura 18-30 Modelo probable de actuacin de las protenas motoras de microtblos en la anafase. En (A) las protenas motoras dirigidas al extremo m s, de la familia de las quinesinas de entrecruzamiento contiguo, entrecruzan microtbulos polares antiparalelos y hacen deslizar estos microtbulos unos respecto a otros, la separacin de los dos polos del huso. Las indican la direccin de deslizamiento de los microtbulos. (B) Protenas motoras de microtbulos del extremo menos se unen a la corteza celular y a los microtbulos astrales que apuntan al exterior del huso y los polos del huso alejndolos entre s.

empujando

(A) LOS POLOS DEL HUSO SON EMPUJADOS PARA SEPARARSE

corteza celular

flechas negras

atraen

pos de m icro t b u lo s p o lares an tip aralelos se deslizan y se p a ra n u no de o tro en la regin de su p erp o sici n . Los m ovim ien tos de la an afase tam b in se p u ed en estu d iar en clulas Usadas de d iatom ea. En este m od elo el p ro m in en te h uso m it tico es librem en te a cc e s i ble a las m acro m o lcu las, de form a que se p ued en estu d iar los efectos de varias son d as m acro m o le cu la re s (incluyendo an ticu erp o s esp ecficos). El m ovim ien to de la an afase A en las d iato m eas se pued e bloq uear m ed ian te un an ticu erp o que re co n o ce las p roten as m o to ra s de m icrot b u los de la fam ilia quinesina, lo cual sugiere que los m ovim ien tos p u ed en e sta r dirigidos p or u n a p ro ten a m o to r de esta fam ilia. P arece que esta p ro ten a m o to r se localiza en la z o n a de su p erp o si cin , d on d e p u ed e sep arar los m ed ios h usos (Figura 18-30A ). Se cre e que los m icro t b u lo s astrales, que se alargan en to d as d ireccio n es d u ran te la an afase, ju eg an un papel ad icion al en los m ov im ien to s de la an afase B. T an to en los h o n g o s c o m o en los an im ales, co rta n d o el ce n tro del h u so n o se b loq u ea la sep araci n de los p olos del h uso, sino que de h e ch o la a celera. E sto sugiere que los m icro t b u lo s astrales que a p u n ta n h a cia fu era del h uso g en eran u n a fu erza que arra stra los polos p articip an d o en su se p a ra ci n d u ran te la a n afase B, p osib lem en te in te ra ctu a n d o ju n to c o n p ro ten as m o to ra s o rien tad as al extrem o m e n o s q ue se h allan u nidas a la co rte z a celu lar o a otras e stru ctu ra s cito p lasm ticas (Figura 1 8 -3 0 B ). De a cu e rd o co n esta su posicin , la in y ecci n de an ticu erp o s co n tra la dinena, u n a p ro te n a m o to r dirigida h a cia el extrem o m e n o s , p ro v o ca el co lap so del h u so de clulas en cultivo. P a re ce que e sta fu er za de arrastre tam b in a c t a d u ran te el en sam b laje del h uso en la profase, y que u n as fuerzas sim ilares a ella guan la d istrib ucin esp ecfica de los h usos, previa a las escision es celu lares asim tricas, c o m o v erem o s m s ad elan te.

En la telofase se recompone la envoltura nuclear alrededor de los grupos de cromosom as 20

Al final de la an afase los c ro m o so m a s se h an sep arad o en d os grupos iguales, u n o en ca d a polo del h uso. En la te lo fa se , el estad io final de la m itosis, se re c o m

Mitosis

999

p o n e u n a en v oltu ra n u cle a r alred ed o r de c a d a grupo de cro m o so m a s, fo rm an d o los d os n cleo s hijos de la interfase. H ay que con sid erar al m e n o s tres p artes del com p lejo de la envoltura n uclear (d iscutido en el C aptulo 12) d u ra n te su d esap arici n y re co m p o sici n en la m i tosis: (1) las que son co n tin u a s c o n el retcu lo en d o p lasm tico ; (2) la su b y acen te (u n a fina red de fila m e n to s in term ed io s en fo rm a de h o ja fo rm a d a a p artir de lm in as n u cleares), q ue in te ra ct a c o n la m e m b ra n a n u cle a r in terior, la cro m a tin a , y los p o ro s n u cleares; y (3) los fo rm ad o s p o r g ran d es co m p lejo s p ro teico s. En la p rofase la fosforilacin de las lm in as n u cle a re s tien e lugar en varias lo caliza cio n es distintas de c a d a c a d e n a p o lip ep td ica, p ro v o ca n d o su d esen sam b laje, y p o r lo ta n to la ro tu ra de la lm in a n u clear. En co n se cu e n cia , quizs co m o re s p u e sta a u n a se al diferente, las m e m b ra n a s de la en voltu ra n u cle a r se disgregas en p eq u e as v escu las de m e m b ra n a . La rep en tin a tra n sici n d esd e la m e tafase a la an afase in icia la desfosforila ci n de las m u ch a s p ro te n a s que se fosforilaron en la p rofase; au n q u e las fosfatasas p ertin en tes p e rm a n e c e n activ as d u ra n te la m itosis, no p u ed en a c tu a r sin o p o sici n h a sta que se d esactiv a el M PF. P o co d esp u s de esto, en la telofase, las vescu las de la m e m b ra n a n u cle a r se a so cia n c o n la superficie de c ro m o so m a s individualizados y se fu sion an e n tre s, re co m p o n ie n d o las m e m b ra n a s n u cle a res, en volvien d o p a rcia lm e n te gru p os de c ro m o so m a s, an tes de co a le s c e r y re co m p o n e r la en voltu ra n u cle a r co m p le ta (vase Figu ra 1 2 -1 8 ). D u ran te este p ro ceso los p o ro s n u cle a re s se d esen sam b lan y las lm in as desfosforiladas se re a so cia n fo rm an d o la lm in a n u clear; u n a de las p ro ten as de la lm in a (lm ina B) p e rm a n e ce a lo largo de to d a la m itosis co n los frag m en to s de la m e m b ra n a n u clear y es p osible q ue p articip e en la re c o n s tru c c i n del n cleo . T ras la n ueva co n stru cci n del n cleo , los p o ro s b o m b e a n p ro ten as n u cleares h a cia el in te rior del n cleo , los c ro m o s o m a s se d e sco n d e n sa n , y se re a n u d a la sntesis del RNA, to d o lo cu al p ro v o ca la re a p a rici n de los n u clo lo s. Se cre e que la d e s c o n d en saci n de la c ro m a tin a p u ed e ser p ro v o ca d a en p arte, p o r la d esfosforilacin de las m olcu las de la h isto n a H l. En e x tra cto s cru d o s de h uevos de se p ro d u ce ta n to el en sam b laje co m o el d esen sam b laje n u cle a r siem p re y cu a n d o esto s e x tra cto s p ro v en g an de clu las que se e n cu e n tre n en el estad io a p ro p iad o del ciclo celu lar (clulas m it ticas p a ra el d esen sam b laje y clu las in terfsicas p a ra el en sam b laje). En estos e x tra cto s el p ro ce s o co m p le to que im p lica la lm in a, los p olos n u cleares, y las m e m b ra n a s n u clea re s p a re ce p ro g re sa r c o n n o rm alid ad en re sp u e sta a ciclo s de fosforilacin y desfosforilacin . Sistem as de este tipo p ro p o rcio n a n un sistem a de en sayo p a ra la id en tificaci n y la p u rificaci n de p ro ten as que ca ta li zan el en sam b laje y el d esen sam b laje de la en v o ltu ra n u cle a r en la clula, in clu yen d o las p ro ten a s (co m o el M PF) que regu lan d ich o s p ro ce so s. M ien tras que p a ra en sa m b lar u n n cle o h ay que su m in istrar DNA a esto s e x tra cto s, se fo rm a r u n a en v oltu ra n u cle a r co m p le ta alred ed o r de m o lcu las de DNA purificado p ro ce d e n te s de p r c tica m e n te cu alq u ier o rg an ism o , inclu yen d o virus b a c te ria

membranas nucleares exterior e interior, lmina nuclear poros nucleares

Xenopus

in vitro

n os. P o r lo tan to , m ien tras q ue las p ro te n a s que se u n en al DNA h an e sta r im pli ca d a s en este p ro ce s o , es p o c o p ro b ab le que d u ran te el reen sam b laje n u cle a r se p ro d u zca un re co n o c im ie n to de se cu e n cia s esp ecficas de DNA. S o rp ren d en tem e n te , la ro tu ra de la en v o ltu ra n u cle a r no es un re q u e rim ie n to p a ra la m itosis. D e h e ch o , v e re m o s a c o n tin u a ci n que en los eu ca rio ta s infe riores la e n v oltu ra n u cle a r n o se d e se n sa m b la d u ran te la m itosis. Se d ice que el h u so de esto s o rg an ism o s es ab ierto en lu gar de ce rra d o .

Resumen

La mitosis comienza con la profase, que se manifiesta mediante un incremento en la fosforilacin de protenas especficas, y se desencadena por la actividad de una protena quinasa inductora de la mitosis, MPF. Una consecuencia de esta fosforila cin es una estructura microtubular extraordinariamente dinmica, nucleada en
100 0 Captulo 18: Los mecanismos de la divisin celular

los centrosomas duplicados que forman los polos de huso. Un subconjunto de los microtbulos de cada centrosoma se estabiliza, parece ser que estableciendo lazos cruzados con microtbulos del centrosoma contrario, formando los microtbulos polares, los cuales se supone que son responsables de la separacin de los polos. Tras la rotura de la envoltura nuclear en la prometafase, los cinetocoros de cromo somas condensados pueden capturar y estabilizar otras subformaciones de micro tbulos de los muchos que crecen constantemente en cada polo del huso. Los cineto coros de polos opuesto del huso tiran en direcciones contrarias de los dos cinetocoros de cada cromosoma duplicado, creando una tensin que estabiliza la unin de los cinetocoros. Fuerzas equilibradas sobre los cinetocoros tambin llevan a los cromosomas al ecuador del huso, formando la placa metafsica. Las subunidades de tubulina de los microtbulos del huso sufren continuos desplazamientos desde el ecuador hacia los polos del huso. En la anafase, las cromtidas hermanas se separan una de la otra de repente y son atradas hacia polos opuestos (el movi miento de la anafase A). Mientras, los dos polos del huso se separan (el movimiento de la anafase B). En la telofase, el estadio final de la mitosis, se reconstruye la en voltura nuclear en la superficie de cada grupo de cromosomas separados al desfosforilarse las protenas que se fosforilaron al comienzo de la fase M.

Citocinesis2 1
segmentacin. A unque n o rm a lm e n te la divisin n u cle a r y la divisin cito p la sm
tica estn relacio n ad as, so n a co n te cim ie n to s que se p u ed en sep arar; en algunas circu n sta n cia s n o rm ales la divisin celu lar n o va seguida de la cito cin esis. P or ejem plo el em b ri n te m p ra n o de exp e rim e n ta 13 p ro ce so s de divi D u ran te la c ito cin e s is el cito p lasm a se divide m e d ia n te un p ro ce so d en o m in ad o

Drosophila

sin celu lar sin que se p ro d u z ca n in gun a divisin cito p la sm tica , fo rm n d o se u n a sola clu la gran d e que co n tie n e 6 0 0 0 n cleo s d isp u estos c o m o u n a m o n o ca p a c e rc a de la superficie. P o ste rio rm e n te se g en eran clu las m o n o n u cle a d a s p o r seg m en taci n cito p la sm tica alred ed o r de to d o s esto s n cleo s (vase Figura 2 1 -5 1 ). No o b stan te en u n a clu la n o rm al c a d a m itosis viene a c o m p a a d a de u n a citocin esis, que c o m ie n z a en la an afase, co n tin u a en la telofase, y a lca n z a su cu lm in aci n al co m e n z a r la in terfase siguiente.

El huso m ittico determ ina el lugar de la segmentacin del citoplasm a durante la citocinesis 22
N o rm alm en te el h u so m it tico d eterm in a d n d e y cu n d o o cu rre la se g m e n ta ci n . En las clulas an im ales la p rim era m u e stra visible de se g m e n ta ci n es la fo rm aci n de un estran g u lam ien to y un

surco de la m e m b ra n a p la sm tica

du

ran te la an afase (Figura 1 8 -3 1 ). La fo rm aci n del su rco o cu rre in variab lem en te

Figura 18-31 Electronmicrografas de barrido de la segmentacin temprana de un huevo de rana. El

surco de la membrana celular se forma por la actividad de un situado debajo de ella. El surco de segmentacin en esta clula gigante y esfrica es extraordinariamente obvio y bien definido. (A) Imagen a poco aumento de la superficie del huevo. (B) Superficie del surco a mayor aumento. (De H.W. Beams y R.G. Kessel, 64:279-290, 1976. Reproducido con permiso de revista de Sigma Xi.)

anillo contrctil

Am. Sci.

[A>

200 \im

I _____I

(B)

25 |jm

I --------

Scientist,

American
1001

Citocinesis

centrosoma

bolita de vidrio

Figura 18-32 Experimento que muestra la influencia de la posicin de los steres microtubulares en el posicionamiento del plano de segmentacin. Si se empuja el huso
mittico de una clula de forma mecnica hacia un lado de la clula, la membrana del surco resultar incompleta, ya que no se producir en la cara opuesta de la clula. Las segmentaciones siguientes se producirn no slo en la relacin convencional respecto a cada uno de los husos mitticos sino tambin entre los dos steres adyacentes que no estn unidos por un huso mittico (pero que en esta clula anormal comparten el mismo citoplasma) Al parecer, el haz contrctil de filamentos de actina que produce el surco de segmentacin siempre se forma en la regin intermedia entre los dos steres, lo cual implica que los dos steres modifican de alguna manera la regin adyacente a la corteza celular.

clula huevo en divisin

una bolita de vidrio presionada sobre la clula desplaza el huso

el surco se forma slo en un lado de la clula, produciendo un huevo binucleado

{flechas amarillas)

ambos ncleos entran en mitosis

la segmentacin ocurre entre centrosomas unidos por husos mitticos y entre los dos centrosomas que simplemente son adyacentes, formndose cuatro clulas hijas

{flechas rojas).

en el p lan o d e la p la c a m e ta f sica , en n gulo re c to co n el eje m ay o r del h uso m it tico . E sto aseg u ra q u e el s u r c o d e s e g m e n ta c i n p a sa e n tre los d os gru p os de cro m tid a s, y d e e s ta m a n e ra las d o s clu las hijas re cib a n co p ias id n ticas del m aterial g en tico . Si m e d ia n te m icro m a n ip u la ci n se ca m b ia el h u so p re cisa m e n te en la an afa se te m p ra n a , el s u rco in cip ien te d e sa p a re ce y se d esarrolla o tro su rco d e a cu e rd o c o n la n u ev a lo calizaci n del h u so . In gen iosos exp eri m e n to s e fectu ad o s c o n h u ev o s fe cu n d a d o s d e erizo d e m a r d e m u e stra n que el su rco d e se g m e n ta ci n se fo rm a a m ed io ca m in o e n tre los steres que p arten de los d o s ce n tro s o m a s in clu so a u n q u e a m b o s ce n tro s o m a s no estn co n e c ta d o s m e d ia n te el h u so m it tico (Figura 1 8 -3 2 ). As p ues, lo q ue se aliza a la c o rte z a p ara q u e in icie el s u rco d e se g m e n ta ci n n o so n los c ro m o s o m a s sino los steres m icro tu b u lares. M s tard e, cu a n d o el p ro ce so d e fo rm a ci n del su rco ya est bien en carrilad o , se p ro d u ce la se g m e n ta ci n au n q u e el h u so y los steres sean alte rad o s p o r su cci n o se d estru y en c o n co lch icin a . No c o n o c e m o s el m e c a n is m o m e d ia n te el cu al un p a r de m icro t b u lo s indi c a n la lo calizaci n d e la s e g m e n ta ci n en la co rte z a , p ero sin d u d a co n stitu y e un ejem p lo clsico d e c o m u n ic a ci n e n tre los m icro t b u lo s y los sistem as de fila m e n to s de a ctin a del cito e sq u e le to . U n a h ip tesis sera q u e las dos fo rm acio n es d e in icro t b u lo s a strales co n e c ta n c o n la co rte z a celu lar y e sta b le ce n la futura lo calizaci n de la se g m e n ta ci n , p o sib le m e n te m e d ia n te el d esp lazam ien to de filam en to s de a ctin a . T am b in p o d ra o cu rrir q u e la co rte z a p ercib iese un g ra d ien te de C a2+, q u e se e sta b le ce m e d ia n te d e v escu las se cu e stra d o ra s de C a2+ q ue sab em o s q u e existen en los p o lo s d e h u so . C ualqu iera que sea la se al e st claro q u e la c o rte z a e s t p re p a ra d a p a ra d e te cta rla y am p lificarla. T o d a la c o rte za se e n c u e n tra b ajo te n si n (vase F ig u ra 1 6 -8 0 ), y si la te n si n a u m e n ta lo ca l m e n te en la lo caliz a ci n del in icio del su rco o d e c re c e en los polos, los filam en tos de a ctin a se alin earn lo ca lm e n te y a tra e r n n u ev o s filam en tos, ju n to co n m iosin a-II, p ro ce d e n te s d e la c o rte z a circu n d a n te . As p u es, el su rco p u ed e ser un sistem a de a u to a m p lifica ci n , q ue se au to o rg a n iz a so b re la b ase de u n a sutil in d icaci n inicial.

El huso se reposiciona especficam ente creando divisiones celulares asim tricas 23

La m ayo ra de clu las se divide de fo rm a sim trica. El su rco de se g m en taci n se fo rm a alred ed or del e c u a d o r de la clu la m ad re, de m o d o que las dos clulas hijas resu ltan tes so n del m ism o ta m a o y tien en p rop ied ad es sim ilares. Tal sim etra en la seg m en taci n es el resu ltado de u n a co lo ca ci n previa del h uso, el cual tien de a cen trarse en el cito p lasm a, de fo rm a que el eje del huso quede alineado a lo

100 2

Captulo 18: Los mecanismos de la divisin celular

franja roja

de las protenas motoras de microtbulos orientadas al "menos"

Figura 18-33 Rotacin del huso. (A) Diagrama que muestra un mecanismo que posiblemente subyace a la rotacin controlada del huso. La representa una regin especializada de la corteza hacia la que los microtbulos astrales empujan un polo del huso. (B) Micrografas pticas que muestran la rotacin programada exacta del huso mittico de un gusano nemtodo en el estadio de dos clulas, preparndose para la segmentacin que producir cuatro clulas siguiendo un patrn especfico. El huso de la clula de la derecha gira casi 90 en el sentdo de las agujas del reloj. (Cortesa de Tony Hyman y John White.)

C. elegans

largo de un eje d eterm in ad o de la clula. Se cree que d ich a p osicin se estab lece m ed ian te fuerzas de a tra cci n sob re los m icrot b ulos astrales, ejercid as p o r p ro ten as m o to r cito p la sm tica s dirigidas al e x tre m o m e n o s (vase F ig u ra 1 8 -3 0 B ). Sin em b arg o, existen m u ch a s situ acio n es d u ran te el d esarrollo em b rio n ario en las que las clu las se dividen a sim trica m e n te . En esto s ca so s el su rco c re a d os clu las de diferente ta m a o y d estin ad as a d esarrollarse p or ca m in o s diver g en tes. A m en u d o las divisiones de este tipo se definen e sp a cia lm e n te de fo rm a e x a cta . P or ejem plo, p u ed en g u ard ar u n a relaci n p recisa co n la superficie de u n a lm in a epitelial o seg reg ar regiones del cito p lasm a que c o n te n g a n un c o n ju n to de orgn u los distinto. La c o lo ca ci n a sim trica del h uso m it tico an ticip a siem p re la p o sici n a sim trica del su rco . El h uso gira de fo rm a co n tro la d a a d o p tan d o u n a p o sici n a d e cu a d a d en tro de la clu la y o rien tan d o as el p lan o de la divisin. P a re ce p ro b ab le que esto s m ov im ien to s del h uso se dirijan m ed ian te cam b io s p ro g ram a d o s en regiones localizad as de la co rte z a celu lar y que e n to n ces la co rte z a d esp lace los p olos del h uso a travs de sus m icro t b u lo s astrales (Figura 1 8 -3 3 ). P a re ce que en las clulas p olarizadas el ce n tro s o m a se p o sicio n a m ed ian te u n m e ca n ism o sim ilar a ste (vase pg. 8 4 8 ). L a divisin celu lar a sim trica es e sp ecialm en te im p o rta n te en las clu las v e getales, debido a que estas clu las no p u ed en d esplazarse tras la divisin; p o r lo ta n to la m orfologa de los tejidos viene d eterm in ad a p o r los plan os de divisin celular. Las p lan tas utilizan u n m e ca n ism o distinto p a ra e sta b le ce r su p lan o de seg m en taci n , que v e re m o s m s ad elan te.

La actina y la m iosina generan las fuerzas necesarias para la segmentacin 24

La seg m e n ta ci n se con sigu e m ed ian te la c o n tra c c i n de un fino anillo c o m p u esto p rin cip alm en te p o r u n a fo rm a ci n su p erp u esta de filam en tos de a ctin a y

Citocinesis

1003

surco de segmentacin

(A)

anillo contrctil formado por filamentos de actina y miosina

<B) 0,5 |jm

(C )

de filam en tos b ip olares de m iosin a-II. E ste anillo contrctil define el su rco de se g m e n ta ci n . C onsiste en filam en tos o rien tad o s en circu n feren cia, u nidos a la c a ra cito p la sm tica de la m e m b ra n a p la sm tica m e d ia n te p ro ten as de an claje n o ca ra cte riz a d a s (Figura 1 8 -3 4 ). El anillo co n tr ctil se en sa m b la en la an afase te m p ra n a . U n a vez en sam b lad o , d esarro lla u n a fu erza su ficien tem en te gran d e c o m o p ara d ob lar u n a d elgad a agu ja de vidrio in se rta d a en la clula. Existen evi d en cias co n v in ce n te s de q ue lo q ue g e n e ra e sta fu erza es el d eslizam ien to de los filam en tos de a ctin a y de m io sin a del anillo co n trctil, de u n a fo rm a m u y sim ilar a co m o se p ro d u ce en un m scu lo . P o r ejem p lo, en clu las m it tica s Usadas, la se g m e n ta ci n se d etien e cu a n d o se a a d e n su b frag m en to s de m io sin a in activ ad a q ue b lo q u ea los lu gares de a ctin a que n o rm a lm e n te se u n en a la m iosin a. De fo rm a p arecid a, u n a in y e cci n de a n ticu e rp o s an tim io sin a en h uevos de erizo de m a r fecu n d ad o s p ro v o ca la relajaci n del su rco de se g m e n ta ci n sin que ello afecte la divisin n u clear. E n c a d a p u n to de su circu n fe re n cia el anillo co n tr ctil co n tie n e u n h az de u n o s 2 0 filam en tos de a ctin a . D u ran te u n a divisin celu lar n o rm al el anillo no se v a h acie n d o m s gru eso a m e d id a q ue el su rco se invagina, lo cu al sugiere que se p ro d u ce u n a p rd id a co n tin u a de filam en tos, re d u ci n d o se as el v o lu m en del anillo. As p u es, c o m o o tra s e stru ctu ra s cito e sq u e l tica s y a d iferen cia del m scu lo esq u eltico , el su rco es d in m ico . El anillo co n tr ctil se elim ina p o r co m p le to al te rm in a r la se g m e n ta ci n , cu a n d o la m e m b ra n a p la sm tica del su r co de se g m e n ta ci n se e s tre c h a fo rm a n d o el cuerpo medio, que p e rm a n e c e co m o un p u e n te e n tre las d os clu las hijas. El cu e rp o m ed io co n tie n e los restos d e los d os co n ju n to s de m icro t b u lo s p o lares, q ue se h allan fu e rte m e n te e m p a q u etad o s p o r m ate ria l d en so de la m atriz (Figura 1 8 -3 5 ). El p ro ce so de cito cin esis req u iere la reo rg an izaci n co m p le ta de los fila m e n to s de a ctin a y m io sin a en la c o rte z a p a ra co n seg u ir que se p ro d u z ca el e n sam b laje del anillo co n tr ctil. D u ran te la fase M se ven afe cta d a s o tras fu n cion es de la co rte z a , esp e cia lm e n te la ad h esi n celular. P o r ejem plo, clu las cu ltivadas de tejid os q ue d u ra n te la in terfase se m a n tie n e n ad h erid as a un su b strato d eb i do a fu ertes co n ta c to s c o n m o lcu las extracelu lares de la m atriz, al e n tra r en la fase M se red o n d ea n ; m s ad elan te, to d av a en la cito cin esis, las clu las se a p la n an de n uevo. Se c re e q ue d u ra n te la fase M las activid ades de las p ro ten as de ad h esi n tra n sm e m b ra n a , c o m o las in tegrin as (se d iscu te en el Captulo 19), se e n c u e n tra n de algu n a fo rm a so m etid as a retroin h ib icin , o b ien que se m od ifi c a n las p ro ten as de a d h esi n que u n en estas p ro ten as co n los filam en tos de a c tin a de la co rte z a . C o m o o cu rre c o n o tras m a n ifestacio n es de la fase M, es p ro b ab le q ue esto s cam b io s e st n m ed iad o s p o r la fosforilacin de p ro ten as.

Figura 18-34 El anillo contrctil. (A) Esquema de un surco de segmentacin de una clula en divisin. (B) Electronmicrografa del borde que crece hacia el interior de un surco de segmentacin de una clula animal en divisin. (C) Una ameba del moho en la que se ha teido la actina (de y la miosina-II (de La miosina teida en el anillo contrctil enmascara de alguna manera la actina que tambin est presente. (B, de H.W. Beams y R.G. Kessel, 64:279290,1976, reproducida con autorizacin de revista de Sigma Xi; C, cortesa de Yoshio Fukui.)

rojo)

verde).

Am. Sci.

American Scientist,

100 4

Captulo 18: Los mecanismos de la divisin celular

Figura 18-35 Citocinesis. (A) Electronmicrografa de barrido de una clula animal en cultivo durante su proceso de divisin; el cuerpo medio todava une las dos clulas hijas. (B) Electronmicrografa del cuerpo medio de una clula animal en divisin. La segmentacin es casi completa, pero las dos clulas hijas permanecen unidas a esta delgada franja de citoplasma. (A, cortesa de Guenter Albrecht-Buehler; B, cortesa de J.M. Mullins.)

En casos especiales, determinados componentes celulares se pueden segregar a una sola clula hija 25
M ien tras q ue la m ay o ra de divisiones celu lares p ro d u ce n dos clu las hijas p a re cid as, algu n as divisiones p ro d u ce n clu las hijas m an ifiestam en te desiguales. E ste fen m en o se d a p rin cip alm en te en las p rim eras se g m e n ta cio n e s en las que u n h uevo fecu n d ad o gran d e se subdivide en clu las m s p eq u e as d estin ad as a fo rm ar diferentes p artes del cu erp o . Y a h em o s visto que la co lo ca c i n a sim trica del h u so d u ran te la divisin celu lar p u ed e p ro d u cir d os clu las de ta m a o d e s igual, p ero la gnesis de clu las hijas b io q u m icam en te d iferentes es u n p ro b le m a distinto. El c o m p o rta m ie n to de u n a fo rm a ci n ca ra c te rs tica de grn u los en el huevo de u n gu san o n em to d o C. p ro p o rcio n a un extrao rd in ario ejem plo de

elegans

e ste p ro ce so . E sto s g r n u lo s-P se distribuyen de m o d o u niform e p o r to d o el cito p lasm a de un h uevo n o fecu n d ad o , p ero se d esplazan h a cia el e x tre m o p o s terio r de la clu la ju sto a n te s de la p rim e ra se g m e n ta ci n y c o n s e cu e n te m e n te son h ered ad os n ica m e n te p o r u n a de las dos clulas hijas. La m ism a clase de p ro ce so de segregacin se repite en varias divisiones celulares p osteriores, de fo r m a que, al final, los grnulos se e n cu en tran so lam en te en las clulas germ inales p rim ordiales, a p artir de las cu ales se p ro d u cen los huevos y los esp erm ato zo id es (Figura 1 8 -3 6 ). Es posible que los grn u los ju eg u en p a rte im p o rta n te en el c o n trol de los d estin os p articu lares de estas clulas. Los g rn u los-P se d esp lazan al e x tre m o p o sterio r de c a d a clu la in clu so en las clulas m u tan tes en las que el huso m ittico se d e sco lo ca y se le localiza en n gulos re cto s resp e cto a su p o sici n n o rm al. A d em s, la seg reg aci n de grn u los se b lo q u ea m ed ian te la d roga cito ca la sin a D, que inhibe la p olim erizaci n de los filam en tos de actin a, p ero no m ed ian te la co lch icin a, lo cu al sugiere que el d es-

Citocinesis

1005

p laza m ien to o rien ta d o de los g rn u lo s-P d ep en d e de los filam en tos de a ctin a p ero n o d e los m icro t b u lo s. A unque la seg reg aci n desigual de e sto s c o m p o n e n te s p a re ce b asa rse en alg u n a p ro p ied ad a sim trica del cito esq u eleto b asad o en a ctin a , el m e ca n is m o m o le cu la r q ue g e n e ra su d esp lazam ien to o rien tad o to d ava es d e sco n o cid o .

En las clulas de las plantas superiores, la citocinesis ocurre m ediante un m ecanism o especial 26
La m ay o ra d e las clu las d e p lan tas su p erio res e st n e n ce rra d a s en u n a pared celular rgida, y en e sta s clu las el m e c a n is m o d e la cito cin esis es d istinto al de las clu las an im ales q u e a c a b a m o s d e d escrib ir. En vez de p in zar las dos clulas hijas m ed ian te u n anillo c o n tr ctil e n la su perficie celu lar, el cito p la sm a de la c lula vegetal se p a rte p o r la c o n stru cc i n de u n a n u ev a p ared celu lar en el in terior d e la clu la (Figura 1 8 -3 7 ). E sta p a rtici n d e te rm in a de fo rm a p re cisa la u b ica ci n de las d os clu las hijas re sp e cto a las clu las v ecin as. De aq u se d e d u ce que los p lan os de la divisin celu lar, ju n to c o n los de cre cim ie n to celu lar, d e te rm i n an la fo rm a d e la p lan ta. La n u eva p are d tran sv ersal, o p la c a c e lu la r, em p ie z a a e n sam b larse en un p lan o situ ad o e n tre los d o s n cleo s hijos y en a so cia ci n c o n los m icro t b u lo s p o lares del h u so, q ue fo rm an u n a e stru ctu ra cilin d rica llam ad a fra g m o p la s to . El firagm oplasto, q ue c o rre sp o n d e a los m icro t b u lo s del cu e rp o m ed io de las c lu las an im ales, co n tie n e d os co n ju n to s d e m icro t b u lo s que se e n trelazan en sus extre m o s m s en c re cim ie n to (Figura 1 8 -3 8 ). Los m icro t b u lo s tien en sus e x tre m o s m s en g lo b ad o s en un d isco e le ctro n d e n so del p lan o ecu ato rial. Tal co m o se resu m e en la Figu ra 1 8 -3 9 , p a re ce q ue p eq u e as v escu las ro d ead as de m e m b ra n a , p rin cip a lm e n te d eriv ad as del co m p lejo de Golgi y rep letas de p re cu rso re s d e la p ared celu lar, c o n ta c ta n c o n los m icro t b u lo s en ca d a c a ra del fragm o p lasto y se d ejan tra n sp o rta r p o r ellos h a sta a lca n z a r la regin ecu ato rial. All se fu sion an e n tre s fo rm a n d o u n a e s tru c tu ra discoid al ro d e a d a de m e m b ra na, la Las m o lcu las de p o lisacrid o liberadas p o r estas v e scu las se en sam b la n en la p la ca celu lar p re co z fo rm a n d o la m atriz de la p ared celu lar p rim aria. E ste d isco tien e a h o ra q ue exp an d irse la teralm en te h a sta al ca n z a r la p ared celu lar p ro g en ito ra. P a ra q ue esto se a posible, los m icro t b u lo s del frag m o p lasto te m p ra n o se reo rg an izan sin p a ra r en la periferia de la p laca celu lar p reco z, d o n d e a tra e n m s v escu las q ue se fu sion an en el e cu a d o r e x te n d ien d o el b o rd e d e la p la ca . E ste p ro ce so se rep ite h a sta que la p la ca celu lar en cre cim ie n to alca n z a la m e m b ra n a p la sm tica de la clu la p ro g en ito ra. La m e m b ran a p lasm tica y la m e m b ra n a q ue envuelve la p la ca celu lar se fusionan, s e p a ran d o las d os n u ev as clu las hijas p o r co m p le to (vase Figu ra 1 8 -3 7 ). Los fila-

Figura 18-36 Segregacin asim trica. Estas micrografas muestran la segregacin asimtrica controlada de un componente citoplasmtico a una clula hija que ocurre en todas las primeras divisiones de un huevo fecundado del nemtodo En la parte superior de la figura se presentan clulas vistas con microscopa de contraste de fase interferencial y teidas con un fluorocromo especfico para DNA; en la parte inferior de la figura se observan las mismas clulas pero teidas con un anticuerpo contra grnulos-P. Estos grnulos (0,5-1 Jim de dimetro), de accin desconocida, se distribuyen al azar por el citoplasma del huevo no fecundado. (Cortesa de Susan Strome.)

C. elegans.

azul

placa celular precoz.

1006

Captulo 18: Los mecanismos de la divisin celular

5G j fn
m en to s de actin a ta m b i n a b u n d an en el frag m o p lasto , alin ead o s co n los micro t b u lo s, p ero su papel fu n cion al en la fo rm aci n de la p la ca celu lar es p o co claro. Algo m s tard e, las m icrofibrillas de celu lo sa se extien d en d en tro de la p la ca celu lar, co m p le ta n d o la n u ev a p ared celular.

Figura 18-37 Micrografas pticas secuenciales de una clula vegetal en divisin. El tiem po transcurrid o en
m inutos se indica en la esqu ina inferior d erecha de cada fotografa. Las vesculas que se alin ean form ando la placa celu lar pued en observarse tras 42 m inutos. E n to n ces la placa se extiende por sus bord es hasta que alcanza la pared de la clu la m adre y se fusiona co n ella. (C ortesa de P eter Hepler.)

Una red de citoesqueleto determ ina el plano de divisin de las clulas vegetales 27
N o rm alm en te, el h u so m it tico en s m ism o no es su ficiente p ara d e te rm in a r la p o sici n y el ta m a o e x a cto de la p la ca celular. La localizaci n de la fu tu ra p laca de u n in co n la p a re d de la clu la m a d re p a re ce decid irse en algn m o m e n to de G2, an tes del co m ie n z o de la m itosis. As, el p rim er signo visible de que un clula v egetal su p erio r h a in iciad o su divisin en u n p lan o d ete rm in a d o se a p re cia ju s to d esp u s de q ue d e sa p a re z c a la red de m icro t b u lo s in terfsico s de la c o rte z a , d u ran te la p re p a ra c i n de la m ito sis. En este m o m e n to , a p a re ce un franja de m icro t b u lo s en circu n fe re n cia que fo rm a u n a anillo a lre d e d o r de to d a la c lu la, ju sto p o r d eb ajo de la m e m b ra n a p la sm tica . D ebido a que a p a re c e a n te s del co m ie n z o de la p ro fase, e sta fo rm a ci n de m icro t b u lo s recib e el n o m b re de

franja preprofase (vase F ig u ra 1 8 -3 9 ). La franja se e stre c h a a m ed id a que la

clu la p ro g resa h a cia la p rofase, y d e sa p a re ce an tes de a lca n z a r la m etafase, cu a n d o en los alred ed o res ya se h a d e te rm in a d o de algn m o d o el p lan o de di-

Figura 18-38 Micrografa ptica de la citocinesis de una clula vegetal durante la telofase. La placa celu lar tem prana (entre las dos flechas) se est
form ando en un plano perpendicu lar al plano de la pgina del libro. Las dos form acio nes de m icrotbu los que con tribuyen al fragm oplasto se tien utilizando anticu erp os con tra tubulina m arcad os co n oro, m ientras que el DNA de las dos fo rm aciones de crom osom as hijos se tien con un coloran te fluorescente. (Cortesa de Andrew Bajer.)

50 (jm
Citocinesis 1007

c o m p le jo d e G o lg i

p a r e d c e lu la r m a te rn a

En algn punto de G2 los microtbulos corticales se recomponen formando la franja que rodea la clula, justo por debajo de la membrana plasmtica. Esta franja preprofsica de microtbulos se estrecha gradualmente y predice con exactitud dnde se unir la nueva pared celular con la pared celular materna cuando la clula se divida.

te lo fa s e

f r a n ja p r e p r o f s ic a d e m ic r o t b u lo s

En la telofase el fragmoplasto est formado por dos juegos de microtbulos polares. Las vesculas derivadas del Golgi que transportan precursores de pared celular asociadas con microtbulos se acumulan en la regin ecuatorial y se fusionan formando la placa celular temprana.

v e s c u la s d e r iv a d a s d e l G o lg i c it o c in e s is

r e s to s d e m ic r o t b u lo s p o la r e s d e l h u s o

Los microtbulos del fragmoplasto se forman de nuevo en la periferia de la placa celular temprana. En esta regin se reclutan nuevas vesculas derivadas del Golgi, y se fusionan al borde de la placa celular, extendindola hacia el exterior.

p la c a c e lu la r te m p ra n a

m ic r o t b u lo s d e l f r a g m o p la s t o

La membrana de la placa celular en crecimiento se fusiona con la membrana plasmtica de la clula madre, completando la nueva pared celular. En cada una de las dos clulas hijas se restablece la formacin cortical de microtbulos interfsicos.

f o r m a c i n c o r tic a l d e m ic r o t b u lo s in te r f s ic o s

p la s m o d e s m o s

Figura 18-39 Caractersticas principales de la mitosis y de la citocinesis en una clula vegetal superior. (A) Diagramas que muestran clulas vegetales
en G2, telofase, citocinesis, y Gt temprana, resaltando los cambios dinmicos que se producen en la distribucin de los microtbulos a lo largo del ciclo celular. (B) Micrografas de inmunofluorescencia de clulas de la punta de las races de cebolla, mostrando la franja preprofsica de microtbulos en G2 y el fragmoplasto en citocinesis. Los microtbulos se tien de y los cromosomas de (B, cortesa de Kim Findlay.)

azul.

verde,

100 8

Captulo 18: Los mecanismos de la divisin celular

visin: cu a n d o se fo rm e la n u ev a p la ca celular, d u ran te la cito cin esis, c re c e r p o r los b o rd es h a sta fu sion arse co n la p ared de la clu la p ro g en ito ra, p re cisa m e n te en la z o n a que a n te rio rm e n te o cu p a b a la franja p rep ro fase (vase Figu ra 1 8 -3 9 ). A unque tras la d e sa p a rici n de la franja p rep ro fase se d esp lace el c o n te nido celu lar m e d ia n te cen trifu g aci n , la p la ca celu lar en c re cim ie n to te n d e r a e n c o n tra r su ca m in o de vu elta al p lan o definido p o r la a n te rio r franja p re p ro fase. A hora sab em o s que la franja p rep rofase co n tien e n u m ero so s filam en tos de a ctin a ad em s de m icrot b u los. La p re se n cia de filam entos de a ctin a no se lim i ta a la co rteza celular; en clulas vacu olizad as tam b in fo rm an un e stru ctu ra d is coid al radial de filam entos, que cru z a la clula y se c o n e c ta al n cleo cen tral en divisin, su jetn d olo. D espus de la d espolim erizacin de los m icro t b u lo s de la franja p rep rofase, los filam en tos radiales de actin a p e rm a n e ce n , y p ro p o rcio n an u n a m e m o ria ' a la p laca de divisin p red eterm in ad a D u ran te la citocin esis, a m ed id a que el fragm op lasto c re c e h acia el exterior, co m o los anillos circu lares de ag u a en u n estan q u e, los b ord es de la p la ca celu lar en crecim ien to co n e c ta n co n la localizaci n de la franja p rep rofase m ed ian te filam entos de actin a. P or lo ta n to, la actin a p a re ce te n e r u n a fu n cin im p o rtan te en la divisin de las clulas co n p ared au n q u e la co n tra c c i n no ju egu e en ellas un p apel im p o rtan te. La a ctin a tam b in est im plicad a en la fo rm aci n del sep tu m en las clulas de h ongos, lo cu al sugiere que p u ed e co la b o ra r en la co n d u cci n de la citocin esis en to d as las clulas eu cariotas.

La elaborada fase M de los organismos superiores evolucion gradualmente a partir de organismos procariotas de fisin 28
En las clulas p ro ca rio ta s la divisin del DNA y del cito p lasm a estn aco p lad as de m an era m u y d irecta. C uan d o el DNA se replica, las dos co p ias del cro m o s o m a se e n cu en tran u nidas a regiones m u y esp ecializadas de la m e m b ra n a p lasm tica, las cu ales se sep aran grad u alm en te p o r el cre cim ie n to h a cia ad en tro de la m e m b ran a existen te en tre ellas. La fisin se p ro d u ce en tre los dos lugares de unin, de m a n e ra que ca d a clu la hija adquiere un c ro m o so m a (Figura 1 8 -4 0 ). C on la evolu cin de los eu cario tas, el g e n o m a in crem en t su com p lejid ad y los c r o m o so m as a u m e n ta ro n de n m ero y de ta m a o . A p aren tem en te en estos o rg a n is m o s fue n ecesario un m e ca n ism o m s elab orad o p ara rep artir los cro m o so m a s en tre las clulas hijas. E st claro que el a p a ra to m it tico no p ud o h a b e r ev o lu cio n ad o de re p e n te . E n m u ch o s eu ca rio ta s prim itivos, co m o el d inoflagelado la m itosis to d av a d ep en d e de un m e ca n ism o de u n i n a la m e m b ra n a , au n q u e en este ca so la m e m b ra n a n u cle a r a su m e la fu n cin que en los p r o c a

cohnii,

Cryphthecodinium

rio tas d e se m p e a la m e m b ra n a p la sm tica . La situ aci n in te rm e d ia de esta gran alga u n icelu lar tam b in se refleja en la b io q u m ica de sus cro m o s o m a s q ue, c o m o los de los p ro ca rio ta s, tien en u n a ca n tid a d de p ro te n a a s o cia d a re la tiv am en te e sca sa . La m e m b ra n a n u cle a r de C. p e rm a n e c e in ta c ta d u ra n te la m itosis, y los m icro t b u lo s del h u so p e rm a n e ce n c o m p le ta m e n te fu era del

cohnii

n cleo . La en vo ltu ra n u cle a r se fru n ce en u n a serie de ca n a le s p aralelos p o r los lu gares en q ue los m icro t b u lo s del h uso eje rce n p resi n (vase Figu ra 1 8 -4 0 ). Los cro m o so m a s se u n en a la m e m b ra n a in te rn a de la en v o ltu ra n u cle a r, en los lu gares o p u esto s a esto s can ales, y su se p a ra ci n e st to ta lm e n te m e d iad a en el in terio r de esta m e m b ra n a n u cle a r a ca n a la d a . As, el h u s o e x tra n u cle a r se u ti liza m e ra m e n te p a ra o rd e n a r la m e m b ra n a n u cle a r y p o r lo ta n to define el p la n o de divisin. En e sta e sp ecie, p a re ce que los cin e to c o ro s se in teg ran en la m e m b ra n a n u clear, p o r lo que p u ed en h a b e r ev o lu cio n ad o a p artir de algn c o m p o n e n te de la m e m b ra n a . El origen evolutivo de los m icro t b u lo s to d av a co n stitu y e un m isterio. Son im p o rta n te s p a ra la seg reg aci n c ro m o s m ic a in clu so en los e u cario ta s m s prim itivos, p ero tam b in e st n p re se n te s en ax o n e m as flagelares (vase pg. 8 7 5 ). Lo que e st tod ava p o r d escu b rir es si p rim ero fue el flagelo o el h uso.

Citocinesis

1009

BACTERIAS

membrana plasmtica

los cromosomas hijos unidos a la membrana plasmtica se separan mediante el crecimiento hacia el interior de la membrana plasmtica situada entre ellos

Figura 18-40 Distintos mecanismos de divisin de los cromosomas utilizados por diferentes organismos.
Algunos de estos mecanismos podran haber sido estadios intermedios en la evolucin del huso mittico de organismos superiores. En todos los ejemplos slo se muestra la regin nuclear central, salvo en el de bacteria.

D IN O FLAG ELAD O S CARACTERISTICOS

varios haces de microtbulos pasan a travs de tneles de la envoltura nuclear intacta, estableciendo la polaridad de la divisin; los cromosomas se separan en asociacin con la membrana nuclear interna sin unirse a los haces de microtbulos

cromosomas

envoltura nuclear intacta

HIPERMASTIGINOS Y A L G U N O S D INO FLAG ELAD O S POCO C O M U N E S

centrolos microtbulos polares microtubulos cinetocricos

se forma un huso central nico entre los centrolos, en un tnel a travs de la envoltura nuclear intacta; los cromosomas estn unidos a la membrana nuclear por sus cinetocoros e interaccionan indirectamente con el huso a travs de sus microtbulos cinetocricos

LE V A D U R A S Y DIATOM EAS

la envoltura nuclear permanece intacta; en el interior del ncleo se forman microtbulos polares del huso y se asocian con la envoltura nuclear; un nico microtbulo cinetocrico une cada cromosoma a uno de los polos microtbulos cinetocricos centrolos
AN IM ALES

el huso empieza a formarse fuera del ncleo; durante la prometafase la envoltura nuclear se rompe permitiendo a los cromosomas que capturen los microtbulos del huso, que ahora se convertirn en microtbulos cinetocricos fragmentos de envoltura nuclear

E n los

hipermastiginos, en los que la en v o ltu ra n u cle a r p e rm a n e c e tam b in

in ta cta a lo largo de la m itosis, se o b serv a u n a h uso algo m s avan zad o, au n q u e a n e xtran u clear. E sto s g ran d es p ro to z o o s del in testin o de los in secto s p ro p o r cio n a n u n ejem plo p a rticu la rm e n te claro de la in d e p e n d e n cia en tre la elo n g a ci n del h u so y los m o v im ien to s de los cro m o s o m a s que se p a ra n las cro m tid as, ya q ue los cin e to c o ro s h e rm a n o s se se p a ra n p o r el cre cim ie n to de la en voltu ra n u cle a r (a la q ue e st n ad herid os) an tes de ad h erirse al h u so . Slo cu a n d o los ci n e to co ro s est n c e rc a de los p olos del h u so , ad q u ieren la fibras cin e to c rica s n ece sa ria s p a ra u n irse al h u so . P u esto que las fibras del h u so e st n sep arad as de los cro m o so m a s p o r la e n v o ltu ra n u clear, d ich as fibras, que se fo rm an en el e x terio r del n cleo , se h a n de u nir de algu n a m a n e ra a los cro m o so m a s a travs de las m e m b ra n a s n u cleares. T ras p ro d u cirse e sta u nin, los cin e to co ro s se d esp la zan de fo rm a co n v e n cio n a l (vase F ig u ra 1 8 -4 0 ).

101 0

Captulo 18: Los mecanismos de la divisin celular

U n estad io m s av an zad o en la evolu cin de los m e ca n ism o s m it tico s p o dra estar rep resen ta d o p o r los o rg an ism o s que fo rm an el h uso d en tro de un n cleo in tacto . T an to en las levad u ras c o m o en las d iato m eas el h uso se u ne a los cro m o so m a s p or sus c in e to co ro s y los c ro m o so m a s se segregan de m o d o m u y p arecid o al d escrito p a ra las clulas de m am fero -s a lv o que to d o el p ro ce so o cu rre d en tro de los lm ites de la en voltu ra n u clear (vase Figu ra 1 8 -4 0 ). Se cree que la m itosis a b ie rta en org an ism o s su p eriores y la m itosis c e rra d a de leva d u ras y d iato m eas ev o lu cio n aro n de m a n e ra se p a ra d a a p artir de un a n tep asad o co m n p arecid o al h uso del h ip erm astigin o m o d ern o . En este m o m e n to no existe n in gun a exp licaci n co n v in ce n te de p o r qu an im ales y p lan tas su p eriores h an d esarrollad o un a p a ra to m it tico que req u ie re la d isolu cin co n tro la d a y reversible de la en voltu ra n u clear.

Resumen

La divisin celular termina con la divisin del contenido citoplasmtico mediante el proceso denominado citocinesis, y con la descondensacin de los cromosomas, con lo cual se reinicia la sntesis de RNA. Parece ser que la citocinesis est dirigida mediante haces organizados de filamentos de actina en clulas eucariotas tan di versas como las de animales, vegetales y hongos. En las clulas animales el huso mi ttico determina dnde y cundo ocurre la citocinesis; el anillo contrctil de actina y miosina forma un puente a medio camino entre los steres de los polos del huso. Mientras que la mayora de las clulas se dividen simtricamente, en algunos casos el huso se coloca deforma especial generando una divisin celular asimtrica: por ejemplo una clula determinada se puede dividir en una clula pequea y una grande, o un componente citoplasmtico determinado puede desplazarse a un ex tremo de la clula antes de la citocinesis de modo que slo sea heredado por una de las clulas hijas, que de otra forma hubieran sido idnticas. En las clulas vegetales superiores la citocinesis tiene lugar mediante un mecanismo especial: el citoplasma se divide mediante la construccin de una nueva pared celular, la placa celular, en el interior de la clula. La colocacin de la placa celular se determina segn la colo cacin de la franja metafsica de microtbulos y filamentos de actina. En algunos protozoos y hongos la organizacin de la mitosis difiere de la de animales y plan tas, lo cual sugiere la posible y complicada evolucin del proceso de divisin celular de las clulas eucariotas.

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Captulo 18 : Los mecanismos de la divisin celular

Las clulas en su contexto social

20 Clulas germinales y fecundacin 21 Mecanismos celulares del desarrollo | | C j| f l l l i l l l l i f 22 Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos 23 El sistema inmunitario
j

Un embrin de ratn de 15 das de gestacin.

Seccin transversal del tallo de la planta con flores Utilizando sondas fluorescentes para la celulosa ( y para la pectina se pone de manifiesto la distribucin relativa de estos dos polisacridos propios de la pared celular o de la matriz extracelular. (Por cortesa de Paul Linstead.)

azul)

{verde),

Arabidopsis.

Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

i
U niones celulares Adhesin in tercelu lar La m a triz extracelu lar R eceptores de la m atriz e x tracelu lar en clulas an im ales: lasin teg rin as La pared celu lar de los

E n la m ayora de los organ ism os pluricelulares, las clulas se organizan en co n ju n tos coop erativos d en om in ad os que, a su vez, se aso cian form an do grandes u nidades funcionales d en om in ad as Las clulas co n ta cta n , gen eralm ente, co n u n a com p leja red de m acro m o lcu las secretad as, d en om in ad a sta p articip a en el m an ten im ien to de la estru ctu ra tisular y en los anim ales

tejidos, rganos.

lular.

matriz extrace-

p osee u n a organ izacin reticular m ed ian te la cual las clulas p ued en m igrar e interaccio n ar. En m u ch o s caso s las clulas integrantes de un tejido tam b in se m a n tienen en su lugar p or m edio de adhesiones intercelulares.

En v erteb rad o s los tejidos prin cip ales son el nervioso, el muscular, el sangu neo, el linfoide, el epitelial y el conjuntivo. El tejido con ju ntivo y el epitelial re

p resen tan los dos e x tre m o s en los que el papel estru ctu ral que ju ega la m atriz y las ad h esio n es in tercelu lares son ra d ica lm e n te d iferentes (Figura 1 9-1). En el te jido conjuntivo (C aptulo 22) la m atriz extracelu lar es m u y a b u n d an te, m ien tras q ue las clu las estn p o co rep resen tad as. La m atriz es rica en p o lm ero s, p rin ci p alm en te co lg en as, siendo la resp o n sab le prin cip al de la re sp u e sta a las te n sio n es a las que est su jeto el tejido. Las clulas, que se e n cu e n tra n u nidas a dife ren tes co m p o n e n te s de la m atriz, p u ed en e jercer so b re sta diversas fuerzas, m ien tras que la co n trib u ci n de las u n ion es in tercelu lares es e sca sa . P o r el c o n trario, en los tejidos epiteliales las clulas se e n cu e n tra n e stre ch a m e n te u nidas fo rm an d o lm in as (d en o m in ad as

epitelios).

La m atriz extracelu lar es e s ca sa y

LUZ INTESTINAL
l m in a de c lu la s e p ite lia le s

Figura 19-1 Esquema simplificado de un corte transversal de la pared intestinal.

Este rgano alargado, en forma de tubo, est constituido por tejido epitelial tejido conjuntivo y tejido muscular Cada tejido es un conjunto organizado de clulas que se mantienen unidas entre s mediante uniones clula-clula, clula-matriz extracelular o por ambas.

t e jid o c o n ju n t iv o fib r a s c ir c u la r e s f ib r a s lo n g it u d in a le s t e jid o c o n ju n t iv o

m u s c u lo lis o

{rojo), {verde) {amarillo).

l m in a d e c lu la s e p ite lia le s

1017

est co n stitu id a p rin cip alm en te p o r u n a delgada c a p a d en o m in ad a

lmina basal,

que est en la b ase de las clulas, las cu ales o cu p a n la m ay o r p arte del volum en. Es en stas d on d e reside, sob re tod o, la o p o sici n a las ten sion es, m ed ian te fila m en to s in tracelu lares de ca r c te r p ro teico (co m p o n e n te s del citoesqu eleto) que se en trecru zan en el cito p lasm a de la clu la epitelial, tran sm itien d o la ten sin de u n a clula a o tra; los filam en tos se an clan d irecta o in d irectam en te a p roten as tra n sm e m b ra n a de la m e m b ra n a p lasm tica, en regiones dond e se localizan u n ion es esp ecializad as co n otras clulas, o co n la lm in a basal. Las ca p a s de clu las epiteliales tap izan to d as las cavid ad es y superficies li b res del o rg an ism o y, m e d ia n te sus u n io n es esp ecializad as, d o tan a aqullas de p ro p ied ad es de b a rre ra que restrin g en el m o v im ien to del agua, solu tos y clulas en tre los diversos co m p a rtim ie n to s del o rg an ism o . C o m o se ilustra en la Figura 19-1, los epitelios se sitan so b re so p o rtes de tejido con ju ntivo, el cu al p u ed e co n stitu ir u n n exo c o n o tro s tejidos (m u scu lar, p o r ejem plo), los cu ales no p re sen tan , n e ce sa ria m e n te , u n a o rg an izaci n epitelial o con ju ntiva. En este cap tu lo tra ta re m o s in icialm en te de la e stru ctu ra y o rgan izacin de las u n ion es clu la-clu la y clu la-m atriz (en co n ju n to d en o m in ad as A co n tin u a ci n estu d iarem o s c m o las clulas an im ales se re co n o ce n en tre s e inician la fo rm aci n de u n ion es celu lares en los p ro ce so s de re c o n o c i m ien to celu lar form an d o tejidos y rgan os. F in alm en te tra ta re m o s de la e stru ctu ra y o rgan izacin de la m atriz extracelu lar anim al y de la p ared celu lar en plantas.

lulares).

uniones ce

Uniones celulares1
A unque las uniones celulares so n e sp ecialm en te ab u n d an tes e im p o rtan tes en el tejido epitelial, tam b in se localizan en regiones de c o n ta cto clu la-clu la y c lu la-m atriz de to d o s los tejidos. La m ay o ra de estas u n io n es tien en un ta m a o que se e n cu e n tra n p o r debajo de la reso lu ci n que p ro p o rcio n a el m icro sco p io p tico , p o r lo que d eb en ser visualizadas m ed ian te la m icro sco p a electr n ica, bien sea co n v en cio n a l o b ien c o n la t cn ica de la crio fractu ra. A m bas m u estran que las region es de las m e m b ra n a s p lasm ticas que in te ra ccio n a n (y, a m en u d o, el cito p lasm a su b y acen te y el e sp acio in tercelular) son alta m e n te especializadas. Las u n ion es celu lares p u ed en clasificarse en tres grupos fu n cion ales: (1) uniones de oclusin, q ue im p lican un sellado en tre las clulas epiteliales, el cu al im pide el trasiego, incluso de p eq u e as m o lcu las, en tre las dos superficies del epitelio; (2) uniones de anclaje, las cu ales u nen , m e c n ica m e n te , las clulas (y sus cito esq ueletos) a sus vecin as o a la m atriz extracelu lar; y (3) uniones de comunicacin que, m ed ian te el p aso de se ales q u m icas o e lctricas en tre las clulas a d y a c e n tes, p erm iten su in te ra cci n .

Tabla 19-1 Clasificacin funcional de las uniones celulares 1. Uniones de oclusin (uniones estancas) 2. Uniones de anclaje
a. regiones de anclaje de los filamentos de actina (uniones adherentes) i. clula-clula (por ejem plo, bandas de adhesin) ii. clula-m atriz (por ejemplo, co n tactos focales) iii. septadas (slo en invertebrados) b. regiones de anclaje de los filamentos intermedios i. clula-clula (desm osom as) ii. clula-m atriz ( hem idesm osom as) 3. Uniones de comunicacin a. uniones de tipo gap b. sinapsis elctricas c. plasm odesm os (exclusivam ente en vertebrados)

101 8

Captulo 19: Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

E n la T abla 19-1 se re la cio n a n los p rin cip ales tipos de u n io n es in tercelu la res. T ratarem o s ca d a u n a de ellas a e x ce p ci n de las sinapsis q u m icas, las c u a les estn co n stitu id as exclu siv am en te p o r clulas nerviosas, que se r n tra ta d a s e sp ecficam en te en los C aptulos 11 y 15.

Las uniones estancas form an una barrera de permeabilidad selectiva a travs de los epitelios 2
A p esar de las gran d es diferencias e stru ctu rales y b io q u m icas en tre los d iferen tes tipos de epitelios, to d o s tienen , c o m o m n im o, u n a im p o rta n te fu n cin en co m n : co n stitu y en b a rre ra s selectivas de p erm eab ilid ad, sep aran d o fluidos de d iferente co m p o sici n . Las uniones estancas ju eg an un im p o rta n te doble p apel en el m an ten im ien to de e sta fu n ci n de b a rre ra selectiva; un b u en ejem plo ilus trativo es el epitelio intestin al de los m am feros. Las clulas epiteliales que tap izan in te rn a m e n te el in testin o delgado m a n tien en la m ay o r p a rte del co n te n id o in testin al en la cavid ad in te rn a (luz in testi nal). Sin em b arg o , sim u lt n e a m e n te , b o m b e a n n u trien tes de m a n e ra selectiv a a travs del epitelio h a cia el p lasm a del tejido con ju ntivo su b y acen te (vase Figu ra 19 -1 ), el cu al es d ren ad o h a cia los cap ilares san guneos. E ste d ep en d e de dos grupos de p ro ten as tra n sp o rta d o ra s lo calizad as en la m e m b ra n a p lasm tica : u n o en el (la regin m e m b ra n o s a en c o n ta c to co n la luz intestinal) que b o m b e a n u trien tes h a cia el in terio r de la clula

lular

transporte transce-

dominio apical

epitelial; otro , situad o en el (basal y lateral) que tra n sp o rta las m ism as m olcu las m e d ia n te difusin facilitad a h a cia el p la sm a situad o en la o tra c a ra m e m b ra n o sa . El m an te n im ie n to de la u n id ireccio n alid ad de este tra n sp o rte im p lica la im posibilidad de m ig raci n re cp ro ca de los tra n s p o rta d o res en tre u n o y o tro d om in io de la m e m b ra n a . A d em s, los esp acio s in tercelu la res existen tes en tre las clu las h a n de e sta r sellados p a ra im p ed ir la difusin p a siva h a cia la luz in testin al de los n u trien tes (Figura 1 9 -2 ).

dominio basolateral

superficie apical
LUZ INTESTINAL

---------.

\/

g lu c o s a )

simporte de glucosa impulsado

BAJA

por Na+

Figura 19-2 Papel de las uniones estancas en el transporte transcelular. En las clulas epiteliales
del intestino delgado, las protenas transportadoras se hallan confinadas en diferentes regiones de la membrana plasmtica. Esta regionalizacin permite una transferencia vectorial de nutrientes desde la luz intestinal hasta la sangre a travs de la lmina epitelial. La figura muestra el transporte activo de la glucosa hacia el interior de la clula, mediante un mecanismo de simporte de glucosa impulsado por Na+ , situado en la membrana apical, y posterior difusin de la glucosa hacia el espacio extracelular por un mecanismo de difusin facilitada mediado por transportadores de glucosa situados en la membrana basolateral. Se supone que las uniones estancas confinan las protenas de transporte en sus dominios de membrana apropiados, actuando como barreras en el seno de la bicapa lipdica de la membrana plasmtica; estas uniones tambin bloquean la difusin de glucosa desde la cara basal del epitelio hacia la luz intestinal.

membranas plasmticas de las clulas adyacentes

glucosa

alta concentracin de glucosa

transportador pasivo de glucosa superficie basolateral

clula
glucosa

BAJA

SANGRE

Uniones celulares

1019

S I ra l

m o l c u la t ra z a d o r a

Figura 19-3 Las uniones estancas permiten a las lminas celulares actuar como barreras en la difusin de solutos. (A) Dibujo esquemtico
donde se muestra cmo una pequea molcula trazadora extracelular depositada en una de las caras de un epitelio no puede pasar a travs de las uniones estancas, las cuales sellan las clulas adyacentes. (B) Imgenes de microscopa electrnica de clulas epiteliales en las que se ha depositado en el exterior de la clula, ya sea en la cara apical (a la o bien en la cara basolateral (a la una pequea molcula trazadora electrodensa; en ambos casos el trazador se detiene en la unin estanca. (B, cortesa de Daniel Friend.)

(A)

{S)

0,5 pm

0,5 |jm

izquierda) derecha)

Se cree que son las u n ion es e sta n ca s los elem en to s b lo q uean tes de am b o s ti p o s de difusin. E n p rim er lugar, a ct a n co m o b arreras c o n tra la libre difusin de las p roten as de m e m b ra n a en tre los dom in ios ap ical y b asolateral de la m e m b ra n a (vase Figu ra 19 -2 ). Sin em b arg o , se ob serva este tipo de difusin cu an d o las u n ion es esta n ca s se d eso rg an izan al elim inar el C a2+ del m ed io extracelu lar, el cu al es n ecesario p a ra m a n te n e r la integridad de d ich as u niones. En segundo lu gar, co n stitu y en un sistem a de sellado en tre las clulas vecin as, de tal m a n e ra que las m o lcu las h idrosolubles no p u ed en difundir en tre las clulas: cu an d o se in y e cta un m a rca d o r electro d en so de bajo p eso m o lecu lar en el esp acio ad y acen te

Figura 19-4 Estructura de una unin estanca localizada entre clulas epiteliales del intestino delgado. Las uniones
estancas se muestran esquematizadas en (A) y observadas mediante criofractura en (B) o mediante microscopa electrnica convencional en (C). Ntese que las clulas estn orientadas con la regin apical hacia la parte inferior. En (B), el plano de micrografa es paralelo al plano de la membrana, y la unin estanca aparece como una banda de anastomosadas que rodean cada clula en la lmina. Las hebras de sellado se observan como crestas formadas por partculas intramembrana, situadas en la cara citoplasmtica de la fractura (cara P) o sus depresiones complementarias en la cara externa de la fractura (cara E) (vase Figura 19-5). En (C) las uniones se observan como series de conexiones focales entre las hemimembranas externas de las dos membranas plasmticas que interactan, correspondiendo cada conexin a una hebra de sellado, observadas en seccin transversal. [B y C, de N.B. Gilula, en Cell Communication (R.P. Cox, ed), pgs. 1-29. New York: Wiley, 1974. Reimpresin con permiso de John Wiley & Sons, Inc.]

de sellado

hebras

u n io n e s ta n c a

rrpemb.r n a

(B)

(O

1 02 0

Captulo 19: Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

m e m b r a n a s p la s m tic a s in te r a c tu a n te s

Figu ra 1 9-5 Modelo actual de unin estanca. Se postula que las h eb ras de sellado que m an tien en unidas las m em bran as p lasm ticas estn con stituid as por h eb ras con tin u as de p rotenas tran sm em b ran a, las cuales e stab lecen co n tacto a travs de esp acio intercelular, dando lugar a su sellado. En el esqu em a, se ha separado la m itad citop lasm tica de un a de las m em b ranas co n el o b jeto de exponer las hebras p roteicas. Se han caracterizad o dos p rotenas perifricas asociadas a la cara citop lasm tica de las u n ion es estan cas, pero la supuesta proteina tran sm em b ran a no ha sido identificad a todava. En m icro scop ia electr n ica de criofractu ra las protenas de la unin estan ca p erm an eceran co n la m itad cito p lasm tica (cara P) de la bicap a lipidica para dar el patrn de partculas in tram em b ran a observado en la Figura 19-4B, en lugar de p erm an ecer en la otra m itad com o se m u estra aqu.

e s p a c io in te r c e lu la r

0,6 (jm

h e b ra s d e p a r tc u la s d e la s u n io n e s e s ta n c a s

m ita d c it o p la s m tic a d e la b ic a p a lip id ic a c lu la 1 c lu la 2

a u n a de las caras del epitelio, este m a rca d o r no pued e atravesar las u niones e s ta n ca s (Figura 19-3). Aunque tod as las uniones esta n ca s son im p erm eab les al p aso de m acro m o l cu la s, su p erm eabilidad resp ecto a m olcu las de p eq u e o ta m a o vara m u ch o en los diversos epitelios. Por ejem plo, las uniones e sta n ca s que se en cu en tran en el epitelio que tap iza el intestino delgado son 10 0 0 0 v eces m s p erm eab les a iones in orgn icos tales c o m o el N a+ que las que tap izan la veji ga u rinaria. Las clulas epiteliales p ued en m od ificar tran sito riam en te sus u n io nes e stan cas p erm itien d o un a u m en to del flujo de solutos y de agu a a travs de las ab ertu ras de las b arreras de unin. E sta va (d en o m in ad a ) es esp ecialm en te im p o rtan te en la a b so rci n de am in o cid o s y m o n o sa c ri-

lar

transporte paracelu-

dos h acia el lu m en del intestino (donde su co n ce n tra ci n es a v eces su ficiente m e n te alta p ara im pu lsar el tran sp o rte pasivo en la m ism a ad ecu ad a). La estru ctu ra m o lecu lar de las uniones e stan cas no es co n o cid a, au nq u e la criofractu ra revela que estn co m p u estas p o r u na red filiforme y an asto m o sad a que ro d ea en su totalidad la zo n a apical de cad a clula epitelial (Figura 19-4A y B). A nivel de la m icro sco p a electr n ica de transm isin, las uniones se resuelven en u n a serie de con exio n es puntuales en tre las h em im em b ran as externas de las dos clulas ad y acen tes (Figura 19-4C ). La cap acid ad de las uniones p ara restringir el paso de iones a travs de los esp acios intercelulares se in crem en ta logartm ica m en te co n el n m ero de estru ctu ras filiformes de la red, efecto que se esp erara si cad a u n a actu a ra co m o u n a b arrera independiente. Se cree que estos elem entos filiformes estn co m p u esto s p or largas hileras de protenas tran sm em b ran a esp e cficas, situadas en ca d a u n a de las m em b ran as p lasm ticas im plicadas, las cuales se u nen en tre s d irectam en te ocluyendo el esp acio intercelular (Figura 19-5).
f ila m e n t o s d e l c ito e s q u e le t o

Las uniones de anclaje conectan el citoesqueleto entre clulas o entre la clula y la matriz extracelular
Las u n io n e s d e a n c la je estn a m p liam en te distribuidas en los tejidos an im ales. C ap acitan a d eterm in ad o s grupos celu lares, co m o p o r ejem plo los epitelios, p a ra co n stitu irse co m o u n idad es estru ctu rales resisten tes, co n e cta n d o los e le m en to s cito esq u eltico s de u n a clu la a los esq u eletos de sus v ecin as, o a la m a triz extracelu lar (Figura 1 9 -6 ). Son e sp ecialm en te ab u n d an tes en los tejidos que estn som etid os a ten sion es m e c n ica s, co m o son los ca so s del m scu lo card a-

u n io n e s d e a n c la je m a tr iz e x tr a c e lu la r

Figura 19-6 Uniones de anclaje en un tejido epitelial. R ep resen tacin muy

esq u em tica de cm o las un ion es de an claje u n en los filam entos del cito esqu eleto en tre una clu la y otra y entre un a clu la y la m atriz extracelular.

Uniones celulares

1021

Figura 19-7 Organizacin de una unin de anclaje. Representacin muy

esquemtica que muestra las dos clases de protenas que constituyen una unin de anclaje: protenas de adhesin intracelular y glucoprotenas transmembrana de unin.

co y la ep id erm is. Se lo calizan b ajo d os fo rm as e stru ctu ral y fu n cio n alm en te d i feren tes: (1) (2) y (3) Las u n ion es ad h eren te s son reg io n es de co n e x i n e n tre fibras de a ctin a, m ien tras

uniones adherentes,

desmosomas

hemidesmosomas.

q ue los d e sm o so m a s y los h e m id e sm o so m a s lo son e n tre filam en tos in te rm e dios (vase T abla 1 9 -1 , pg. 1 0 18). A ntes de e n tra r en la d iscu si n de los diferentes tipos de u n ion es de an claje, es in teresan te co n sid e ra r b re v e m e n te los p rin cip ios gen erales de su o rg an iza ci n . C o m o q u ed a ilustrad o en la Figu ra 19-7, estas u n ion es estn co m p u e sta s p o r d os clases de p ro ten as: (1) que form an una en la c a ra c ito p la sm tica y c o n e c ta n el co m p lejo de u n in a filam en tos de a ctin a o a filam en tos in term ed io s; y (2)

glucoprotenas transmembrana de unin, cu yo s d om in io s cito p la sm tico s se u n en a u n a o m s p ro ten as de a d h e uniones septadas,

placa

protenas de adhesin intracelular,

sin in tracelu lar, m ie n tra s q ue sus d o m in io s extracelu lares in te ra ccio n a n c o n la m atriz extracelu lar o co n los d o m in io s extracelu lares de glu co p ro ten as tra n s m e m b ra n a de u n i n de o tra clula. M u ch o m e n o s se sab e a c e rc a de las las cu ales son exclu si vas de in verteb rad o s. P ro b a b le m e n te d eb eran clasificarse c o m o u n ion es a d h e ren tes, ya que a ct a n c o m o lugares de co n e x i n de los filam en tos de actin a, p ero h ay indicios de que en algunos ca so s p ued en a ctu a r c o m o b arreras p e rm e a bles.

Las uniones adherentes conectan haces de fibras de actina entre clulas o entre la clula y la matriz extracelular 3
Las u n io n e s a d h e r e n te s in te r c e lu la re s a p a re c e n b ajo d iferentes fo rm as. En la m ay o ra de los tejid os n o ep iteliales, se d e te cta n c o m o red u cid as reg io n es de ad h esi n c o n fo rm as p u n tu ales o zig zag u ean tes, que c o n e c ta n las fibras de a c ti n a situ ad as en los cito p la sm a s a p icales de clu las a d y a ce n te s. En los epitelios fo rm a n u n a b a n d a d e a d h e s i n co n tin u a (o ), situ ad a alred ed o r de c a d a clu la epitelial, c e r c a de la m e m b ra n a lum inal y p o r d ebajo de las u n io n es e sta n ca s. En las clu las ep iteliales a d y a ce n te s, las b a n d a s de ad h esi n se e n cu e n tra n en ap o sici n , p e rm a n e cie n d o u n id as a m b a s m e m b ra n a s p o r m e c a n ism o s d ep en d ien te s de C a2+. P a re c e q ue las g lu co p ro ten as tra n sm e m b ra n a de u n in , q ue m ed ia n d ich a u n i n , p e rte n e c e n a u n a fam ilia de m o l cu la s de ad

zonula adherens

h esi n in tercelu la r d e p en d ien tes de C a2+, d e n o m in a d a s las cu ales tra ta re m o s m s ad elan te. Las b a n d a s de a d h esi n se d en o m in an , en algunas o ca sio n e s, d e sm o s o m a s en b an d a, a u n q u e el t rm in o p u ed e in d u cir a erro res, y a q ue las b a n d a s de a d h e si n so n q u m ica m e n te m u y d iferentes de los v e rd a d ero s d esm o so m a s.

cadherinas,

102 2

Captulo 19 : Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

f ila m e n t o s d e a c tin a e n el in t e r io r d e l m ic r o v illu s

m ic r o v illi q u e se p r o y e c ta n a p a r t ir d e la s u p e r f ic ie a p ic a l

Figura 19-8 Bandas de adhesin entre clulas epiteliales del intestino delgado. Esta banda de adhesin
rodea cada una de las clulas interactuantes. Su caracterstica principal es la de constituir un anillo contrctil de filamentos de actina, situado en la cara citoplasmtica de la regin membranosa implicada en la unin. Los filamentos de actina se unen de clula a clula mediante protenas de unin transmembrana (cadherinas), cuyos dominios extracelulares se unen al dominio extracelular de una molcula de cadherina idntica en la clula adyacente (vase Figura 19-7).

u n i n e s ta n c a

ha z d e f ila m e n to s d e a c tin a

m e m b ra n a s p la s m tic a s la te r a le s d e la s c lu la s e p ite lia le s a d y a c e n te s

s u p e r f ic ie b a s a l

E n ca d a clu la p u ed e o b servarse un haz de fibras de a ctin a, co n trctil, que se e n cu e n tra ad y ace n te a la b a n d a de ad h esin , que co rre paralelo a la m e m b ra n a p lasm tica, a la cu al e st c o n e cta d o m ed ian te un co m p lejo de p ro ten as de u n in que co n tien e n

a-, 0 - y y-catenina (se estu d ia m s ad elan te), vinculina, a-actinina y placoglobina. Los h a ce s de a ctin a se e n cu e n tra n in te rco n e cta d o s a
travs de las cad h erin as y p ro ten as de u nin, fo rm an d o u n a ex te n sa red tra n s-

celu lar (Figura 1 9 -8 ). Se c re e que la co n tra c c i n de e sta red, que d ep en d e de p ro ten as m o to ra s de tipo m iosin a, p u ed e ser la m e d ia d o ra de un p ro ce so fu n d am en tal en la m orfogn esis an im al: el p leg am ien to de los epitelios c o n stitu yen d o tu b os a n a t m ico s y otras e stru ctu ra s co rre la cio n a d a s (Figura 19-9). Las u n io n e s a d h e re n te s c lu la -m a triz c o n e c ta n las clu las y sus h a ce s de a ctin a a la m atriz extracelu lar. As, p o r ejem plo, fibroblastos cu ltivados sob re su b strato s artificiales que co n tie n e n m o lcu las de la m atriz e xtracelu lar se ad-

l m in a d e c lu la s e p ite lia le s

k l*W tl
f ila m e n t o s d e a c tin a a s o c ia d o s a la s b a n d a s d e a d h e s i n

k W fe fe fe iM
INVAGINACION DE LA LAMINA EPITELIAL CAUSADA POR EL ESTRECHAMIENTO, A NIVEL DE LAS BANDAS DE ADHESIN, DE LAS CLULAS SITUADAS EN DETERMINADAS

Figura 19-9 Invaginacin de una lmina epitelial que da lugar a un conducto. Se supone que la
contraccin orientada de filamentos de actina situados a lo largo de las bandas de adhesin provoca el estrechamiento de las zonas apicales de las clulas epiteliales, lo cual es importante para el enrollamiento de la lmina epitelial, formndose un conducto (a pesar de que parece que los reordenamientos celulares tambin juegan un papel importante). Un ejemplo de ello es la formacin del tubo neural en los primeros estadios embrionarios de vertebrados (estudiado en el Captulo 21).

SEPARACION DEL CONDUCTO EPITELIAL DE LA LMINA ORIGINAL

.4

c o n d u c to

Uniones celulares

1023

h ieren e stre ch a m e n te al su b strato m e d ia n te regiones esp ecializad as de la m e m b ran a p la sm tica d e n o m in a d a s c o n ta c to s fo ca le s o c o in c i d ien do co n las zo n a s term in ales de los h a c e s de actin a . En los tejidos las clulas g en eralm en te esta b le ce n co n ta c to s focales c o n la m atriz e xtracelu lar an logos a sto s. Las g lu co p ro ten as tra n s m e m b ra n a de u n i n que m e d ia n e stas a d h esio n es y q ue c o n e c ta n los h a ce s de fibras de a ctin a a la m atriz e xtracelu lar en estas p lacas p e rte n e ce n a u n a g ran fam ilia de re ce p to re s c lu la-m atriz d en o m in ad as las cu ales e stu d ia re m o s m s ad elan te. El d om in io e xtracelu lar de la

placas de adhesin,

integrinas,

in tegrin a se u n e a un c o m p o n e n te p ro te ico de la m atriz extracelu lar, m ien tras que su d om in io in tra ce lu la r se u n e in d ire cta m e n te a h a ce s de filam en tos de a c tin a a trav s de u n a va co m p le ja de p ro te n a s de unin, que in clu yen la la a -a c tin in a y la vin cu lin a (Figura 1 9 -1 0 ).

talina,

Las u n io n e s se p ta d a s se e n cu e n tra n en tejidos de in v erteb rad o s. C o m p a r te n m u ch a s ca ra cte rs tic a s c o n las b a n d a s de ad h esi n , c o n las cu ales a v eces co existen : (1) fo rm an u n a b a n d a co n tin u a alred ed o r de los m rg e n e s de las c lu las ep iteliales, (2) se c re e q ue ay u d an a m a n te n e r ju n tas las clu las y (3) a ct a n co m o lu gares de an claje p a ra los filam en tos de a ctin a . P re se n ta n u n a m orfologa su m a m e n te esp ecfica, ya q ue las m e m b ra n a s p la sm tica s que in te ra ccio n a n e s tn u n id as p o r p ro te n a s de u n i n m al ca ra cte riz a d a s que se d isp o n en en filas p aralelas c o n u n a reg u lar p erio d icid ad (Figura 1 9 -1 1 ).

Los desmosomas conectan filam entos intermedios entre clulas; los hem idesm osom as los unen a la lm ina basal 4
Los y a c t a n c o m o re m a ch e s rep artien d o las fu erzas de ten si n o de cizalla a lo largo del epitelio y del tejido con ju ntivo su b y a ce n te . Los d e s m o s o m a s so n c o n ta c to s in tercelu lares p u n tifo rm es que m a n tie n e n u n id as las clu las (Figura 19-12A ). En el in terio r de las clu las a c t a n co m o lu ga res de an claje p a ra los filam en to s in term ed io s en fo rm a de cu erd a, los cu ales fo rm an u n a red estru ctu ra l en el c ito p la sm a p ro p o rcio n a n d o u n a cie rta rigidez (Figura 1 9 -1 2 B ). M ed ian te estas u n io n es los filam en tos in term ed io s de las c lu las ad y a ce n te s est n in d ire cta m e n te c o n e c ta d o s fo rm an d o u n a red co n tin u a que se extien d e a to d o el tejido. El tipo esp ecfico de filam en tos in term ed io s a n clad o s a los d e sm o so m a s d ep en d e del tipo celular: de en la m ay o ra de las clu las ep iteliales y de en las fibras m u scu la re s ca rd a ca s. La e stru ctu ra gen eral del d e s m o s o m a e st re p re se n ta d a en la Figu ra 19 -1 2 C . C o n sta de u n a p laca cito p la s m tic a d en sa, c o m p u e s ta p o r un co m p lejo p ro te ico de an claje in tracelu la r q ue es el resp o n sab le de la u n i n de los e le m e n to s citoesq u eltico s a las p ro te n a s de u n in tra n s m e m b ra n a , las cu ales in te ra c t a n a trav s de sus d om in io s e x tracelu lares m a n te n ie n d o ju n tas las m e m b ra n a s ad y a ce n te s. C o m o en las b a n d a s de ad h esi n , las p ro ten a s de u n in tra n sm e m b ra n a p e rte n e c e n a la fam ilia de las ca d h e rin a s, m o l cu la s de a d h esi n in te rce lu lar

desmosomas

hemidesmosomas

Figura 19-10 Localizacin de vinculina en un contacto focal. En

estas micrografas de inmunofluorescencia, se observan clulas en cultivo con un doble mareaje con anticuerpos contra actina y contra vinculina Obsrvese que la vinculina se localiza en los contactos focales, donde los grupos de filamentos de actina conectan con la membrana plasmtica. (De B. Geiger, E. Schmid, y W. Franke, 23:189-205, 1983.)

{verde)

(rojo).

desmina

queratina

Dijferentiation

dep en d ien tes de C a2+. La im p o rtan cia de los d esm o so m as en el m an ten im ien to de la u n i n in tercelu lar se d e m u e stra en algu n as fo rm as de en ferm ed ad

pnflgo,

de la piel c a ra cte riz a d a p o r la p ro d u cci n de a u to a n ticu e rp o s c o n tra u n a de sus

Figura 19-11 Unin septada.

Electronmicrografa de una unin septada entre dos clulas epiteliales de un molusco. Las membranas plasmticas que interaccionan, observadas en seccin transversal, estn conectadas por filas paralelas de protenas de unin. Las filas, siguiendo una cierta periodicidad, se observan como barras densas o septos. [De N.B. Gilula, en Cell Communication (R.P. Cox, ed.), pp. 1-29. New York: Wiley, 1974. Reimpresin con el permiso de lohn Wiley & Sons, Inc.]

clula 1

c lu la 2

20Q nm
102 4 Captulo 19 : Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

c a d h e r in a p la c a c it o p la s m tic a c o n s t it u id a p o r p r o te n a s d e u n i n

f ila m e n t o s d e q u e r a t in a a n c la d o s e n la p la c a c it o p la s m tic a m e m b r a n a s p la s m tic a s q u e in te r a c t a n

0,1

[ir

0,1 [jnn

(C)

Figura 19-12 Desmosomas. (A) Electronmicrografa de tres desmosomas entre dos clulas epiteliales en el intestino de rata. (B) Electronmicrografa de un desmosoma entre dos clulas epidrmicas de un tritn en desarrollo, mostrando claramente su unin a filamentos intermedios. (C) Dibujo esquemtico de un desmosoma. Sobre la superficie citoplasmtica de cada membrana plasmtica que interacta se sita una placa densa compuesta por un conjunto de protenas de adhesin intracelular (incluyendo y Cada placa se encuentra asociada con una densa red de filamentos de queratina, que estn unidos a la superficie de la placa. Algunas glucoprotenas transmembrana de unin, que pertenecen la familia de las cadherinas y que actan como molculas de adhesin intercelular, se unen a las placas e interaccionan fuertemente mediante sus dominios extracelulares, manteniendo, unidas las clulas mediante un mecanismo dependiente de Ca2+. [A, de N.B. Gilula, en Cell Communication (R.P. Cox, ed), pp. 1-29, New York: Wiley, 1974. Reimpresin con el permiso de John Wiley & Sons, Inc.; B, de D.E. Kelly, J. Cell Biol. 28:51-59,1966, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.]

placoglobinas desmoplaquinas).

p ro p ias p ro ten as del tipo de las cad h erin as d esm o so m ales; esto s a n ticu e rp o s se u n en a d e sm o so m a s d eso rg an izad o s en tre las clulas epiteliales (q u eratin o cito s) cau san d o la relajaci n de la e stru ctu ra epitelial, lo cu al in d u ce la fo rm a ci n de ab u n d an tes am p ollas debido a la fuga del fluido tisular. La c o n sta ta ci n de la e s pecificid ad de esto s an ticu e rp o s p o r la ep id erm is sugiere que los d e sm o so m a s p resen tes en o tro s tejidos p u ed en ser b io q u m icam en te diferentes. Los hemidesmosomas, sem ejan tes m o rfo l g icam en te a los d e sm o so m a s, difieren de stos ta n to a nivel fu n cion al co m o b ioq um ico. En lugar de unir las m e m b ra n a s de las clu las a d y acen tes, u n en el d om in io basal de las clu las y la - u n tipo esp ecializad o de la m atriz e xtracelu lar que se e n cu e n tra en la in terfase en tre el epitelio y el tejido con ju ntivo su b y acen te. Sin em b arg o ,

f ila m e n t o s d e q u e r a t in a

desm osom a

lmina basal

m ien tras que los filam en tos de q u eratin a a so ciad o s a los d e sm o so m a s esta b le ce n co n ta c to s laterales co n las p lacas d e sm o s m ica s (vase Figu ra 19-1 2 C ), la m ay o ra de los filam en tos relacio n ad o s co n los h e m id e sm o so m a s se an cla n p o r u n a de sus region es term in ales (Figura 1 9 -1 3 ). En los c o n ta c to s focales las p ro te nas de u nin tra n sm e m b ra n a de los h e m id e sm o so m a s n o p e rte n e ce n a la fam i lia de las cad h erin as del grupo de p ro ten as de ad h esi n celu lar u tilizada p ara

Figura 19-13 Distribucin de desmosomas y hemidesmosomas en las clulas epiteliales del intestino delgado. Las redes de filamentos de
queratina de dos clulas adyacentes estn conectadas indirectamente a travs de los desmosomas, mientras que los hemidesmosomas permiten su conexin con la lmina basal.

l m in a b a s a l

h e m id e s m o s o m a

Uniones celulares

1025

Tabla 19-2 Uniones de anclaje

Algunas p rotenas de unin extracelu lar cateninas, vinculina, a-actin in a placoglobina desmoplaquinas, placoglobina talina, vinculina, a-actin in a protena semejante a la desmoplaquina

U nin A dherente (clulaclula) D esm osom a

P ro te n a de u nin tran sm e m b ra n a cadherina (cadherina E)

Ligando ex tra ce lu la r cadherina en clulas adyacentes cadherina en clulas adyacentes protenas de matriz extracelular protenas de m atriz extracelular (lmina basal)

U nin intracelular al citoesqu eleto filamentos de actina

A dherente (clulam atriz) H em idesm osom a

cadherina (desmoglenas y desm ocolinas) integrina

filamentos interm edios filamentos de actina filamentos intermedios

integrina (ot6P4, vase pg. 1069)

los d e sm o so m a s sino a la fam ilia de in tegrin as de re ce p to re s de m atriz e x tra c e lular. Las p ro ten a s de u n i n in tracelu lares en los h e m id e sm o so m a s tam b in son d iferentes a las de los d e sm o so m a s. As, au n q u e la term in o lo g a p a ra las d istintas u n ion es de an claje es con fu sa, los p rin cip ios m o le cu la re s (en v erteb rad o s p o r lo m en o s) es sencilla (Tabla 192). Las in tegrin as en la m e m b ra n a p la sm tica se u n en a m o lcu las de la m atriz extracelu lar; las cad h e rin a s en la m e m b ra n a p la sm tica se u n en a ca d h erin as de la m e m b ra n a de la clu la a d y a ce n te . En am b o s ca so s existe u n aco p la m ie n to de los filam en tos del cito esq u eleto , los cu ales p u ed en ser de a ctin a o filam en tos in term ed io s d ep en d ien d o del tipo de p ro te n a de u n in utilizada. A d em s en to d as estas clases de u n io n es de a n claje la ad h esi n d ep en d e de ca tio n e s divalentes extracelu lares, au n q u e el significado de e sta d e p e n d e n cia se d e sco n o ce .

Las uniones de tipo gap perm iten el paso directo de pequeas m olculas entre clulas 5
Las u n io n e s d e tip o g ap co n stitu y en , quizs, las u n io n es celu lares m s in trig an tes. M u estran u n a am p lia d istrib ucin, sien d o m u y n u m e ro sa s en la m ay o ra de los tejidos de la p r c tic a to talid ad de las esp ecies an im ales. A nivel de e lectro n m icro sco p ia co n v e n cio n a l se ob serv an c o m o regiones en las que las m e m b ra n a s de d os clu las ad y a ce n te s se e n cu e n tra n sep arad as p o r un e sp acio u niform e de u n o s 2 -4 n m de am p litu d. Las u n io n es de tipo gap m ed ian la c o m u n ica ci n in tercelu lar al p erm itir el p aso de ion es in o rg n ico s y o tras p eq u e as m olcu las h id rosolu b les en tre los resp ectiv o s cito p lasm as, aco p lan d o las clu las ta n to e l ctrica co m o m e ta b lica m e n te . E ste tien e im p o rta n te s im p licacio n es fu n cio n ales, la m u ch a s de las cu ales n ica m e n te e m p e z a m o s a co m p re n d e r. E ste tipo de c o m u n ic a c i n in tercelu lar fue d e m o stra d o in icialm en te p or m to d o s fisiolgicos en 1958, au n q u e fu eron n e ce sa rio s diez a o s p a ra d e m o s tra r la co rre la ci n e n tre ese a co p la m ie n to fisiolgico y la p re se n cia de u niones de tipo gap ob serv ad as m e d ia n te el m icro sco p io e le ctr n ico . La ev id en cia inicial so b re el a co p la m ie n to celu lar p rovien e de los estu d ios electrofisiolgicos sob re p ares de clu las n erviosas c o n e c ta d a s y localizad as en el sistem a nervioso del can g rejo . A p lican do un g rad ien te de voltaje a travs de las regiones de u n in e in sertan d o electro d o s de registro en c a d a u n a de las clulas in te ra ctu a n te s, se ob serv un in esp erad o flujo e l ctrico , in d ican d o que los iones in o rg n ico s (p o r

acoplamiento celular

102 6

Captulo 19 : Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

ta d o re s del p o te n cia l e l ctrico en los tejid os vivos) p o d an circu la r lib rem en te e n tre las clu las. E xp e rim e n to s p o ste rio re s d e m o s tra ro n que p e q u e a s m o l c u las de c o lo ra n te s flu o re s c e n te s ta m b i n p o d a n p a s a r de u n a c lu la a o tra a d y a c e n te sin p a s a r p o r el e s p a cio in te rce lu lar, a c o n d ici n de q ue sus p e so s m o le cu la re s n o s o b re p a s a r n los 1 0 0 0 d a lto n s (F ig u ra 1 9 -1 4 ). E sto s re su lta d o s su g ieren q u e e so s t n e le s in te rce lu la re s p re s e n ta n u n d i m e tro fu n cio n al de a lre d e d o r de 1,5 n m , lo cu a l im p lica q ue las clu las a c o p la d a s c o m p a rte n las m o l cu la s p e q u e a s (co m o los io n e s in o rg n ico s, a z c a re s , a m in o c id o s , nucle tid o s y v itam in as) p e ro n o las m a c ro m o l c u la s (p ro te n a s, c id o s n u cle i c o s as co m o p o lisa c rid o s). La ev id en cia de que las u n io n es de tipo gap m e d ia n el a co p la m ie n to e l ctri co y q u m ico e n tre clu las que se h allan en c o n ta c to p u ed e co n s ta ta rse a p artir d e diversas fu en tes. E xiste u n a c o rre la ci n e n tre la p re se n cia de e stru ctu ra s de este tipo de u n in y la d e m o stra ci n de aco p la m ie n to , m e d ia n te criterio s qu m ico s o elctrico s. In v ersam en te, tal a co p la m ie n to no se h a d e m o stra d o e n tre clu las de v erteb ra d o s q ue no p re se n ta n u n io n es de tipo gap. P o r o tra p arte, el a co p la m ie n to el ctrico y el p aso de co lo ra n te s p u ed e ser b lo q u ead o si se in y e c ta n an ticu e rp o s c o n tra la p ro te n a p rin cip al de las u n io n es de tipo gap. M s re cie n te m e n te , la u tilizacin de m to d o s m o le cu la re s h a p ro p o rcio n a d o p ru eb as d irectas: cu a n d o e s ta p ro te n a es reco n stitu id a en b ica p a s lipdicas sin t tica s o cu a n d o el mRNA q ue co d ifica e sta p ro te n a es in y ectad o en o o cito s de ra n a o en u n a ln ea celu lar d eficiente en u n io n es de tipo gap p u ed e d e m o stra rse electrofisio l g icam en te la a p a rici n de ca n a le s c o n p ro p ied ad es tp icas de las u n ion es de tipo gap.

Figura 19 -14 Determinacin del tamao del canal de una unin de tipo gap. Cuando se inyectan
molculas de diversos tamaos en una de las dos clulas unidas entre s mediante una unin de tipo gap, las molculas ms pequeas de unos 1000 daltons pueden pasar a la clula adyacente, pero no las molculas de tamao mayor.

Los conexones de las uniones de tipo gap estn compuestos por seis subunidades 6
L as u n io n es de tipo gap e st n o rg an izad as en b ase a p ro te n a s tra n s m e m b ra n a , q ue fo rm a n e stru c tu ra s d e n o m in a d a s C u an d o los co n e x o n e s de las m e m b ra n a s p la sm tica s de d os clu las a d y a ce n te s e st n alin ead o s, fo rm an un ca n a l a cu o so co n tin u o q ue c o n e c ta a m b o s cito p la sm a s (Figura 1 9 -1 5 ). Los c o n e x o n e s e n tra n en c o n ta c to de tal m a n e ra q ue las m e m b ra n a s p la sm tica s im p licad as se e n c u e n tra n se p a ra d a s p o r u n a h e n d id u ra - d e aq u el n o m b re de u n io n es de tipo gap o de h e n d id u ra - lo cu al a u m e n ta la d iferen cia c o n las u n io n es e sta n ca s, y a q ue e n sta s las m e m b ra n a s e st n u n id as m s e s tre c h a m e n te (co m p re n se F igu ras 1 9 -5 y 1 9 -1 5 ). M ed ian te la t c n ic a de crio fra ctu ra , c a d a c o n e x n es ob serv ad o c o m o u n a p a rtcu la in tra m e m b ra n o sa y c a d a u n i n de tip o gap p u ed e c o n te n e r u n gru p o de m s de v arios ce n te n a re s de c o n e x o n e s (Figu ra 1 9 -1 6 ). U n co n e x n e s t co m p u e sto p o r un anillo de seis su b u n id ad es p ro teicas id n ticas d en o m in a d a s co n exin as, c a d a u n a de las cu ales co n tie n e c u a tro hli c e s a que atrav iesan la m e m b ra n a . Las seis co n e x in a s fo rm an un can al m a y o r y m s p erm eab le que el de cin co su bu n id ad es de las b a rre ra s de n e u ro tra n sm iso res de can ales de io n es o q ue el de c u a tro su bu n id ad es (o dom in ios) de la b a rre ra v o ltaica de los ca n a le s ca ti n ico s, que ya h a n sido tra ta d o s en el C aptulo 11 (vase F igu ra 1 1 -3 3 ). E n los diferentes tejidos las u n io n es de tipo gap p u ed en te n e r algunas p ro p ied ad es d iferentes. La p erm eab ilid ad de sus ca n a le s individuales p u ed e variar; p o r ejem plo se sab e que a ctu a lm e n te existen diferencias ap reciab les en tre las co n exin as que fo rm an las u n ion es. E n ratas, p o r ejem plo, se c o n o c e n p o r lo m e n o s 11 co n exin as diferentes, c a d a u n a co d ificad a p o r u n gen sep arad o y distinto, au n q u e a v eces su d istrib u cin tisular e st solap ad a. Algunos tipos celu lares e x p re san m s de u n tipo de co n exin a, p ero n o e st claro si las d iferentes p ro te n a s de co n e x in a se u n e n algu n a vez d en tro del m ism o co n e x n . A p e sa r de las dife ren cias en tre los diferentes isotip os de co n exin a, su estru ctu ra b sica y fu n cion al se h a co n serv ad o m u y bien a lo largo de la evolu cin . As, al m e n o s en cultivos celu lares, u n a clu la que exp rese un tipo de co n e x in a p ued e a m en u d o fo rm ar
c a n a l e n tr e d o s c lu la s a d y a c e n te s fo rm a d o p o r d o s conexones conexon c o m p u e s to p o r s e is s u b u n id a d e s

conexones.

m e m b r a n a s p la s m tic a s q u e in te r a c t a n v

Figura 19-15 Modelo de unin de tipo gap. El esquema muestra las

membranas plasmticas de dos clulas adyacentes. Las bicapas lipdicas son atravesadas por complejos proteicos, denominados cada uno de los cuales se supone formado por seis subunidades proteicas idnticas (denominadas Dos conexones unidos a travs del espacio intercelular dan lugar a la formacin de un canal acuoso continuo entre ambas clulas.

(rojo)

(verde),

conexones

conexinas).

Uniones celulares

1027

Figura 19-16 Uniones de tipo gap visualizadas por microscopia electrnica. Seccin ultrafna (A) y
unin
d e t ip o

gap
g ra n d e

mbranas

u n i n d e t ip o _ Sap pequea

rplica de criofractura (B) de dos uniones de tipo gap, una grande y otra pequea, localizadas en fibroblastos en cultivo. En (B) cada unin es observada como un agregado de partculas intramembranosas homogneas, asociadas exclusivamente a la cara citoplasmtica de la fractura (cara P). Cada partcula intramembranosa corresponde a un conexn de los esquematizados en la Figura 19-15. [De N.B. Gilula, en Celi Communication (R.P. Cox, ed.) pp. 1-29. New York: Wiley, 1974. Reimpresin con permiso de John Wiley & Sons, Inc.] {B}

(A)

----------------------- 1 I
200 nm

u n a u n in del tipo gap fu n cio n al c o n u n a clu la que exp rese u n a co n e x in a dife ren te, in clu so au n q u e las d os clu las se a n de v erteb rad o s distintos.

La mayor parte de las clulas em brionarias estn acopladas entre s durante las primeras etapas del desarrollo mediante uniones de tipo gap 7
E n tejid os q ue co n tie n e n clu las excitab les e l ctrica m e n te , el a co p la m ie n to c e lular m e d ia n te u n io n e s de tipo gap tien e u n a fu n ci n obvia. P o r ejem plo, el aco p la m ie n to e l ctrico e n tre clu las n erv io sas p e rm ite el d esp lazam ien to r p i do de los p o te n cia le s de a c c i n de u n a clu la a o tra sin el re tra so que re p re se n ta la sin ap sis q u m ica; ello es e sp e cia lm e n te v en tajo so en situ a cio n e s en que la v e locid ad y la fiabilidad so n cru ciales, c o m o en algu n as re sp u e sta s de e sca p e que p re se n ta n p e ce s e in se cto s. De m a n e ra sim ilar, en v e rte b ra d o s su p erio res el aco p la m ie n to e l ctrico sin cro n iz a las c o n tra c c io n e s de las clu las m u scu lares ca rd a ca s, o las de las clu las m u scu lare s lisas re sp o n sab les del m o v im ien to p e ristltico del in testin o . N o resu lta ta n ob via la p re se n cia de u n io n es de tipo gap en tejidos que no p re se n ta n activid ad el ctrica . En p rin cip io en esto s tejidos el co m p a rtir los p e q u e o s ion es y m etab o lito s p ro p o rcio n a u n m e ca n ism o p a ra co o rd in a r las a c ti vid ad es de las clu las y p a ra su avizar las flu ctu acio n es al a zar de u n a clu la a otra. P o r ejem plo, algu n a de las activid ad es de las clu las epiteliales, co m o el m o v im ien to ciliar, p u e d e n e sta r co o rd in a d a s m e d ia n te este tipo de unin. De m a n e ra m s gen eral, p u esto que los m e n sa je ro s in tracelu lares tales c o m o el AM P cclico y el C a2+ p u e d e n p a sa r a travs de las u n ion es de tipo gap, las re s p u estas de las clu las aco p la d a s fren te a las se alizaci n extracelu lar p u ed en p ro p ag arse y co o rd in a rse de e sta m a n e ra . El a co p la m ie n to celu lar m e d ia n te e stas u n io n es d e sem p e a un p apel im p o rta n te e n el tra n scu rso de la em b rio g n esis. A p artir de los estad io s e m b rio n a rios iniciales de los v e rteb rad o s (el estad io de 8 clu las en el ca so de em b rio n es de rat n ), la m a y o r p a rte de las clu las e st n aco p la d a s e lctrica m e n te . Sin e m b argo, g en eralm en te cu a n d o gru p os esp ecfico s de clu las em b rio n arias e m p ie zan a d esarrollan sus ca ra cte rs tic a s esp ecficas y em p iezan a diferenciarse, se d esaco p lan del tejid o circu n d a n te . As, p o r ejem plo, cu a n d o se cie rra el tu b o n eu ral (vase F igu ra 1 9 -9 ) sus clulas se d esaco p lan del e cto d e rm o extern o .

102 8

Captulo 19 : Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

M ien tras tan to , el co n ju n to de clulas de c a d a grupo p e rm a n e ce n aco p lad as y as p resen tan u n co m p o rta m ie n to co o p erativ o y siguen de m a n e ra co o rd in a d a u n a m ism a va de d esarrollo. Es posible que en los em b rio n es el a co p la m ie n to celu lar co n stitu y a u n a va de se alizacin celu lar a larga d istan cia d en tro de un epitelio en d esarrollo. Por ejem plo, u n a p eq u e a m o lcu la p u ed e p asar, a travs de las u n ion es de tipo gap, desde u n a regin tisular d o n d e su co n c e n tra c i n se m a n tie n e alta h a sta o tra regin d on d e su c o n c e n tra c i n es m s baja, c re n d o se as un g rad ien te de c o n c e n tra c i n u niform e. El valor que alca n z a lo ca lm e n te la c o n c e n tra c i n p u e de p ro p o rcio n a r a las clu las u n a in fo rm aci n p o sicio n al p a ra el co n tro l de su d iferen ciacin , en fu n cin de su lo calizaci n en el co n ju n to em b rio n ario (se e s tu d ia en el C aptulo 2 1 ). Sin em b arg o , se d e sco n o ce si las u n ion es de tipo gap p resen tan u n a fu n cin a co rd e co n la hip tesis exp uesta.

La permeabilidad de las uniones de tipo gap est regulada 8

C o m o los can ales i n ico s co n v en cio n ales, los can ales de las u n ion es de tipo gap no p e rm a n e ce n ab ierto s co n tin u a m e n te sino que altern an e n tre e stad o s a b ie r tos y cerrad o s. A d em s, la p erm eab ilid ad de las u n io n es de tipo gap p u ed e ser d ism inu id a de m a n e ra rp id a (en cu esti n de segu nd os) y rev ersib lem en te, m e d ian te m an ip u lacio n es exp erim en tales que im pliquen un d escen so del pH o un in cre m e n to de la c o n c e n tra c i n del C a2+ libre cito p lasm tico s. E stas o b se rv a cio nes in d ican que los can ales de las u n ion es de tipo gap co n stitu y en estru ctu ras d in m icas que, al igual que los ca n a le s i n ico s co n v en cio n ales, son regulables: p u ed en sufrir un ca m b io co n fo rm a cio n a l reversible que cierre el ca n a l en re s p u esta a cam b io s en la clula. U n m o d elo in teresan te de tipo de ca m b io c o n fo r m a cio n al se m u estra en la Figu ra 1 9 -17. Se d e sco n o ce el p apel fisiolgico del efecto del pH sob re la p erm eab ilid ad de las u n io n es de tipo gap. Sin em b arg o existe un ca so en el que p a re ce claro el co n tro l ejercid o p o r el C a2+. C uan d o u n a clu la es d a ad a, su m e m b ra n a p las m tica se h a ce p erm eab le. As, ion es tales c o m o el C a2+ y el N a+ e n tran en la c lula, m ien tras que o tro s m etab o lito s valiosos salen de la clula. Si la clu la a fe c tad a co n tin u a estan d o a co p la d a a otras clu las ad y a ce n te s no d a ad as, stas p u ed en sufrir severos ca m b io s fu n cion ales. Sin em b arg o , la e n tra d a de C a2+ en la clu la d a ad a p ro v o ca in m e d ia ta m e n te el cierre de los ca n a le s de las u n io n es de tipo gap, aisland o e ficazm en te a la clu la y previn ien d o, de este m o d o , la p ro p a g aci n de la an o m ala fu n cion al. En la Figu ra 1 9 -1 8 se re su m e n los diversos tipos de u n io n es celu lares p re sen tes en las clulas epiteliales. E n la z o n a m s ap ical, sus p o sicio n es relativas son las m ism as en casi to d o s los tipos de epitelio: las u n ion es e sta n ca s se sitan en las regiones m s e xtrem as, seguidas de las b an d as de ad h esi n y finalm en te de un grupo de d e sm o so m a s; el co n ju n to as fo rm ad o se d e n o m in a Las u n io n es de tipo gap y o tro s d e sm o so m a s p re se n ta n u n a distrib ucin m en o s regular. Figura 19-17 Modelo explicativo de

unin.

complejo de

cmo los canales de las uniones de tipo gap pueden cerrarse en respuesta a un aumento del Ca2 +o un descenso del pH del citosol. Una
pequea rotacin de cada subunidad cierra el canal. El modelo se basa en un anlisis de micrografas obtenidas con el microscopio electrnico a partir de tejidos congelados rpidamente, en los cuales la estructura de los canales de unin de tipo gap supuestamente en estado abierto eran comparados con su estructura en un estado de cierre inducido por Ca2+. Es factible que un mecanismo similar a ste acte en la apertura y cierre de los canales inicos explicados en el Captulo 11. (Segn P.N.T. Unwin y P.D. Ennis, 307:609-613, 1984.)

CERRADO

alta concentracin de Ca2+ o pH bajo

Uniones celulares

baja concentracin de Ca2+ o pH alto

Nature

1029

Figura 19-18 Resumen de los distintos tipos de uniones celulares hallados en el epitelio de clulas animales. Este esqu em a est basado
u n i n e s ta n c a c o m p le jo d e u n i n b a n d a d e a d h e s i n desm osom a

en las clulas epiteliales del intestino delgado.

f ila m e n t o s d e q u e r a t in a

u n i n d e t ip o g a p

h e m id e s m o s o m a

l m in a b a s a l

En los vegetales, los plasmodesmos realizan muchas de las funciones de las uniones de tipo gap 9
Los tejidos vegetales se o rg an izan bajo p rin cip ios d iferentes que los de los an i m ales. E sto se d eb e a que las clu las vegetales e stn a tra p a d a s d en tro de rgidas, co n stitu id as p o r u n a m atriz e xtracelu lar rica en celu losa, co m o

celulares

paredes

exam in a re m o s m s ad elan te. El siste m a de p ared es celu lares elim in a la n e ce si dad de u n io n es ad h e re n te s p a ra m a n te n e r las clu las en su lugar, p ero persiste la n ece sid ad de u n a co m u n ica c i n in tercelu lar d irecta. As, en c o n tra ste c o n las clu las an im ales, las v eg etales tien en slo u n a clase de u n ion es in tercelu lares, los q ue, c o m o las u n io n es de tipo gap, co n e c ta n d ire cta m e n te el cito p lasm a de las clu las ad y a ce n te s. Sin em b arg o , en los vegetales la p ared celu lar que existe en tre un p ar de c lulas ad y a ce n te s tp icas tien e p o r lo m e n o s 0,1 |im de esp eso r, de m o d o que se req u iere u n a e stru ctu ra m u y d iferente a las u n io n es de tipo gap p a ra m ed iar la c o m u n ica ci n en tre ellas. Los p la sm o d e sm o s so lu cio n an el p ro b lem a. C on p o

plasmodesmos,

c a s ex ce p cio n e s esp ecializad as, ca d a clu la de u n a p lan ta su p erio r e st c o n e c ta da a su v ecin a m ed ia n te p la sm o d e sm o s, los cu ales fo rm an u n o s finos ca n a le s cito p la sm tico s a trav s de las p ared es celu lares. C o m o se m u e stra en la Figura 19-19A , la m e m b ra n a p la sm tica de u n a clu la co n tin a co n la de la v e cin a a

r e t c u lo e n d o p la s m t ic o lis o d e s m o t b u lo a n illo c it o s lic o

Figura 1 9 -1 9 Plasmodesmos. (A) Los canales cito p lasm tico s de los p lasm odesm os atraviesan la pared celular vegetal y co n e cta n en tre s todas las clu las del vegetal. (B) Cada plasm odesm o est recubierto por la m em bran a plasm tica com n a dos clulas con ectad as. N orm alm ente tam bin co n tien e un a fina estructura tubular, el d esm ot bulo, derivado del retculo end op lasm tico liso.

m e m b r a n a p la s m a tic a q u e r e v is te el p la s m o d e s m o , c o n e c ta n d o e n tr e s d o s c lu la s a d y a c e n te s

100 n m

103 0

Captulo 19 : Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

travs de los p lasm o d esm o s, y los cito p lasm as de las dos clu las se co n e c ta n por un can al m s o m e n o s cilindrico de un d im etro de 2 0 a 4 0 n m . As, p u ed e c o n sid erarse que las clu las vegetales fo rm an un sincitio en el cu al m u ch o s n cleo s c o m p a rte n u n m ism o cito p lasm a. El ce n tro del can al es atrav esad o p o r u n a e s tru ctu ra e stre ch a cilin drica, el que co n tin a co n e lem en to s del r e

membrana

retculo

desmotbulo,

tculo en d o p lasm tico liso en c a d a u n a de las co n exio n es celu lares (Figuras 1919B y 1 9 -2 0 ). E n tre el exterio r del d esm o t b u lo y la c a ra in tern a del can al cilin drico con stitu id o p o r m e m b ra n a p la sm tica existe un can al de cito so l a tr a vs del cu al las m o lcu las de p eq u e o ta m a o p u ed en p a sa r de u n a clu la a o tra. Los p lasm o d e sm o s se fo rm an n o rm a lm e n te en las p ared es celu lares n u e vas cu an d o estn u nidas d u ran te la fase de cito cin esis de la divisin celular; se fo rm an alred ed or de e lem en to s del retcu lo en d o p la sm tico liso que q ued an atrap ad o s en la p la ca celu lar en fo rm a ci n (se estu d ia en el C aptulo 18). A p esar de las diferencias rad icales de estru ctu ra en tre los p lasm o d esm o s y las u niones de tipo gap, p a re ce que act a n de u n a m a n e ra su m a m e n te p arecid a. Pru ebas ob ten id as p o r in y ecci n de m olculas trazad oras de diferentes ta m a o s sugieren que los p lasm o d esm o s p erm iten el p aso de m olculas co n un peso m e n o r de u nos 8 0 0 daltons, lo cu al es sem ejan te al lm ite del p eso m o lecu lar de las u niones de tipo gap. Al igual que las u niones de tipo gap, el tran sp o rte a travs de los p lasm od esm os est regulado. As, exp erim en tos realizados m ed ian te la in y e c cin de coloran tes d em u estran que p ued en existir b arreras al d esplazam ien to de m olculas incluso de bajo p eso m olecular, en tre ciertas clulas que estn c o n e c tad as al p a re ce r p o r p lasm o d esm o s n orm ales; se d e sco n o ce n los m ecan ism o s que restrin gen la co m u n ica ci n en estos caso s. P or el con trario, ciertos virus de v eg e tales p u ed en au m e n ta r los p lasm o d esm o s y utilizar esta va p ara p asar de u n a c lula a otra, exten d ien d o as la infeccin. E stos virus sintetizan p rotenas especiales que se u nen a co m p o n e n te s de los p lasm o d esm o s e in crem en tan n o tab lem en te el tam a o efectivo del poro. Pero, no e st claro c m o act a n estas protenas.

25 nm desmotbulo membrana plasmtica

______ l l

Resumen

La mayora de las clulas se unen a otras clulas o a la matriz extracelular mediante unos puntos especializados de contacto denominados uniones celulares. Estas unio nes se organizan en tres clases funcionales: uniones de oclusin, uniones de anclaje y uniones de comunicacin. Las uniones estancas estn constituidas fundamental mente por uniones de oclusin que juegan un papel importante en el mantenimien to de las diferencias de concentracin de pequeas molculas hidrfilos a travs de los epitelios, mediante (1) sellado las membranas plasmticas de las clulas adya centes, creando una barrera continua de impermeabilidad o semipermeabilidad a travs del epitelio y (2) actuando como barreras en la bicapa lipdica, restringiendo la difusin de las protenas transportadoras entre los dominios apical y basolateral de la membrana en cada clula epitelial. Los principales tipos de uniones de anclaje en tejidos de vertebrados son las uniones adherentes, los desmosomasy los hemidesmosomas. Las uniones adherentes conectan haces de filamentos de actina, mientras que los desmosomasy los hemides mosomas unen filamentos intermedios. Las uniones septadas tambin actan como lugares de unin de los filamentos de actina, pero slo en tejidos de invertebrados. Las uniones de tipo gap son uniones de comunicacin compuestas por agrupacio nes de canales proteicos, que permiten el paso del interior de una clula a otra di rectamente, de molculas de un peso molecular inferior a 1000 daltons. Las clulas conectadas por estas uniones comparten muchos iones inorgnicos as como otras molculas pequeas, por lo que estn acopladas qumica y elctricamente. Las uniones de tipo gap son importantes en la coordinacin de las actividades de las clulas elctricamente activas, y se cree que desempean un papel de coordinacin similar en otros grupos celulares. Los plasmodesmos son las nicas uniones inter celulares presentes en los vegetales; actan como las uniones de tipo gap, aunque su estructura es completamente distinta.
Uniones celulares

Figura 19-20 Plasmodesmos vistos al microscopio electrnico. (A) Seccin

longitudinal de un plasmodesmo de un helecho acutico. La membrana plasmtica delimita el poro y es continua con la de la clula adyacente. Tambin puede observarse el retculo endoplasmtico y su asociacin con el desmotbulo central. (B) Un plasmodesmo similar en seccin transversal. (Cortesa de R. Overall.)

1031

Adhesin intercelular1 0
P a ra fo rm ar u n a u nin de an claje, las clu las h an de h ab erse ad herid o u n a a otra. P o sterio rm en te , alred ed o r de las m o lcu las que m ed ian d ire cta m e n te la ad h esi n se h a de fo rm ar un a p a ra to cito esq u eltico . El resu ltado es u n a e stru c tu ra b ien definida - u n d e sm o so m a , un h e m id e sm o so m a o u n a u nin a d h eren te o s e p ta d a - fcilm en te identificable m e d ia n te m icro sco p a ele ctr n ica . E fectiv a m en te, la m icro sco p ia e le ctr n ica p ro p o rcio n a las b ases p a ra la v erd ad era clasi ficaci n de las u n io n es de tipo gap. Sin e m b arg o , en los p rim ero s estad ios del d esarrollo de u n a u n i n de tipo gap, a n te s de que el a p a ra to cito esq u eltico se u n a y e sp ecialm en te en los tejidos em b rio n ario s, a m en u d o las clulas se u n en u n as a o tras sin que estas estru ctu ra s c a ra cte rstica s se p o n g an cla ra m e n te de m an ifiesto: m ed ian te la m icro sco p ia e le ctr n ica slo se p u ed en o b serv ar las dos m e m b ra n a s p lasm tica s se p a ra d a s p o r un p eq u e o h u e co de u n a d eterm in ad a a n ch u ra . Sin em b arg o p ru eb as fu n cio n ales p u ed en d e m o stra r que las dos c lu las est n u nidas u n a a o tra, y anlisis b io q u m ico s p u ed en revelar qu m olcu las so n las resp o n sab les de la ad hesin. De este m o d o , m ien tras que u n io n es in te rce lu la re s y ad h esio n es in te rce lu lares p a re ce que so n d os m a n e ra s diferentes de e xp resar el m ism o fen m en o , en la p r c tic a co rre sp o n d e n a d os a p ro x im a cio n e s exp erim en tales diferentes -u n a a p artir de la d e scrip ci n d ad a p o r la m icro s c o p ia e le ctr n ica y la o tra a travs de p ru eb as fu n cio n ales y a p ro x im a cio n e s b io q u m ica s - y a d os visiones d iferen tes - u n a b a sa d a en la e stru c tu ra m a d u ra y la o tra en su d esarrollo. H asta h a c e p o co s a o s e sta s d os a p ro x im a cio n e s no h an em p e z a d o a co n v e rg e r en u n a op in in u n ificad a d esd e el p u n to de v ista de las b ases m o le cu la re s de las u n io n es y de las ad h e sio n e s celu lares. En el cap tu lo an te rio r estu d iam o s las es tru ctu ra s de las u n io n es celu lares m a d u ra s. En e sta s e cci n tra ta re m o s de los estu d ios fu n cion ales y b io q u m ico s de la ad h esi n in tercelu lar que se h a n de p ro d u cir an tes de q ue p u e d a ser o rg an izad a u n a u nin de an claje in tercelu lar p le n a m e n te fu n cio n al; m s a d elan te en e ste m ism o cap tu lo , tra ta re m o s de los estu d ios b io q u m ico s y fu n cio n ales de los m e ca n ism o s de la ad h esi n clu lam atriz. E m p e z a re m o s c o n u n a p re g u n ta de d esarrollo: Qu m e ca n ism o s a se gu ran q ue u n a clu la e m b rio n a ria se u n a a las clu las v ecin as ap ro p iad as en el m o m e n to o p o rtu n o ?

clula fundadora en la lmina basal

Existen dos vas fundam entales mediante las cuales las clulas animales se unen para form ar tejidos 11
M u ch o s de los tejidos sim ples, in clu yen d o la m a y o r p arte de los epitelios, p ro vien en de clu las p re cu rso ra s cu y a p ro g en ie no p u ed e m igrar in d ep en d ien te m e n te al estar a n cla d a s a la m atriz e xtracelu lar y /o a otras clu las (Figura 1 9 -2 1 ). Sin em b arg o , a m ed id a que las clu las se van a cu m u la n d o no p e rm a n e c e n ju n tas de fo rm a pasiva, a m o n to n a d a s d e so rd e n a d a m e n te , sino que, c o m o verem os, la arq u ite ctu ra del tejido se m a n tie n e de fo rm a a ctiv a p o r ad h esio n es selectivas que p ro d u cen las clu las y que van m o d ifican d o p ro g resiv am en te. De este m o d o , si se m e z cla n artificialm en te clu las de d iferentes tejidos em b rion arios, las clu las se clasificarn e s p o n t n e a m e n te restab lecien d o u n a o rg an izaci n m s n o rm al. E stas ad hesiones selectivas son incluso m s esen ciales p ara el desarrollo de los tejidos que tienen u nos orgenes m s com p lejos en los que particip a la m igra cin celu lar en la que u n a poblacin celular invade a o tra y se u ne a ella y en los que quizs tam b in p articip an o tras clulas m igratorias, form an do finalm ente u n a estru ctu ra ord en ad a. P or ejem plo, en los em b riones de vertebrados algunas clulas de la (epitelial), se sep aran del tbulo epitelial neural co n el
unin intercelular

lmina basal lmina de clulas epiteliales

Figura 19-21 El mecanismo ms simple mediante el cual las clulas se unen entre s formando un tejido. La
progenie de clulas fundadoras es retenida en el tejido epitelial mediante la lmina basal y mecanismos de adhesin intercelular, incluyendo la formacin de uniones intercelulares.

cresta neural

que in icialm en te estab an relacion adas, y m igran a travs de vas especficas h acia otras m u ch as regiones. P o sterio rm en te se u nen a otras clulas organizndose y di feren cin d ose en diversos tejidos, incluyendo el sistem a nervioso perifrico (Figu-

1032

Captulo 19 : Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

Figura 19-22 Ejemplo de un mecanismo ms complejo por el que las clulas se unen entre s formando un tejido. Clulas de la cresta neural se
segregan del epitelio que form a la superficie superior del tubo neural y m igran form ando diversos tipos celulares y tejidos en todo el em brin. Aqu se m u estran u nindose y diferencind ose, form ando dos grupos de clulas nerviosas en el sistem a nervioso perifrico. Tales grupos de clulas nerviosas se d en om inan ganglios. En el ganglio, otras clulas de la cresta neural se d iferencian con stituyend o clulas de soporte (clulas satlite) que rodean la neu rona. A unque no se m uestra, las clulas de la cresta neural proliferan rpid am ente a la vez que m igran.

ra 19-22). Este tipo de p ro ceso requiere, en prim er lugar, de algn m ecan ism o que dirija las clulas h asta su destino final, co m o la secreci n de u n a m olcu la soluble que atraiga a las clulas que m igran (por ) o extendiendo m olculas adhesivas en la m atriz extracelu lar o sobre la superficie de d eterm in adas clulas, guiando las clulas m igradoras a lo largo de vas definidas (m ediante

quimiotaxis

orientacin de va). C uando u n a clula m igratoria alcan za su destino, puede re co n o ce r otros

tipos celulares ap rop iad os y asociarse co n ellos form an do un tejido.

MIGRACION CELULAR SEGUIDA DE AGREGACIN

Las clulas de vertebrados disociadas pueden reagregarse en tejidos organizados mediante mecanismos de adhesin selectiva clula-clula 12
A d iferen cia de los tejidos ad ultos de v erteb rad o s, difciles de d isociar, los tejidos e m b rio n arios son fciles de d iso ciar m ed ian te tra ta m ie n to co n bajas c o n c e n tra cio n es de en zim as p ro teo lticas, tales co m o la tripsina, co m b in a n d o en o c a s io n es este tra ta m ie n to co n el se cu e stro del C a2+ y de Mg2+ extracelu lares m e d ia n te u n q u elan te cati n -d iv alen te (co m o el EDTA). E stos reactiv o s d eso rg an izan las in te ra ccio n e s p ro teicas (m u ch as de las cu ales so n d ep en d ien tes de ca tio n e s divalen tes) que m an tie n e n u nidas las clulas. Es d estacab le que a m en u d o esto s d iso ciad o s celu lares se re a so cia n fo rm an d o e stru ctu ra s que se a sem ejan al tejido original. T ales ca ra cte rstica s sugieren que la e stru ctu ra tisular no es

in vitro

p ro p iam en te un p ro d u cto e st tico sino que se m an tien e activ a m e n te y se esta b i liza p o r un sistem a de afinidades en tre las p rop ias clulas o en tre stas y la m a triz extracelu lar. P or lo tan to , el estudio de la reag reg aci n en cultivo de clulas d iso ciad as p u ed e p ro p o rcio n a r u n a b ase p a ra el estudio del papel que ju ega la ad h esin de las clu las co n o tra s clu las o co n la m atriz en la co n stitu ci n y el m an ten im ien to de la o rg an izaci n de los tejidos en el o rg an ism o . Las exp erien cias realizad as en cultivos celu lares de clu las de la p ro p o rcio n an un ejem plo m uy in structivo al re sp e cto . Las clu las ep id rm icas, co n o cid a s co m o se ad h ieren fu ertem en te u n as a otras fo rm an d o

epidermis

queratinocitos,

u n a c a p a p lu riestratificad a que se ap o y a sob re u n a lm in a basal. Los q u e ra tin o citos del estrato basal de la ep id erm is son relativ am en te ind iferenciados, prolife ran de form a co n tin u a y su p rogen ie a c c e d e a los e strato s su periores, ce sa n d o la divisin celu lar y d iferen cin d o se to ta lm e n te (vase Figura 2 2 -2 1 ). Sobre un su b strato ad ecu ad o , los q u eratin o cito s d isociad os m an ten id o s en cultivo ta m bin proliferan y se diferencian. Si la co n ce n tra ci n de C a2+ en el m edio de cultivo se m an tien e en un nivel bajo, los sistem as de ad hesin celu lar d ep en d ien tes de C a2+ no so n op erativ o s p o r lo que las clu las c re c e n en fo rm a de m o n o c a p a en la que se m ezclan las clulas en proliferacin y las diferenciadas. Si se a u m en ta la c o n ce n tra ci n de C a2+, la o rg an izaci n esp acial de las clulas se tran sfo rm a in m ed iatam en te: la m o n o c a p a se co n v ierte en un epitelio plu riestratificad o en el q ue las clu las en p roliferacin fo rm an u n a ca p a basal que se ad hiere al su b stra to, m ien tras que las clu las en d iferen ciaci n so n segregad as h a cia las c a p a s su p eriores, co m o se ob serva en la piel. E ste resu ltado sugiere que el o rd en am ien to estratificad o n o rm al de los q u eratin o cito s en fu n cin de su estad o de d iferen cia ci n se m an tien e p or m e ca n ism o s de ad hesin in tercelu lar d ep en d ien tes de C a2+. U n o de esto s m eca n ism o s im plica la p a rticip aci n de re ce p to re s de la m a triz extracelu lar del tipo de la integrinas, que e stu d iarem o s m s ad elan te; estos

Adhesin intercelular

1033

Figura 19-23 Adhesin especfica de rgano de clulas disociadas de embriones de vertebrados determinada mediante un ensayo radiactivo de agregacin celular. La
velocidad de adhesin celular puede ser medida determinando el nmero de clulas marcadas radiactivamente que se han unido a los agregados celulares a lo largo del tiempo. La velocidad de adhesin es mayor entre clulas del mismo tipo. En una modificacin habitual de este ensayo, las clulas marcadas con un ligando fluorescente o radiactivo se unen a una monocapa de clulas en cultivo.

c lu la s e m b r io n a r ia s d e r e tin a d is o c ia d a s

c lu la s e m b r io n a r ia s d e h g a d o d is o c ia d a s

# # O Q O o O O t)

\ Oo
0 0
pequeo a g re g a d o de c lu la s d e r e tin a c lu la s h e p tic a s m a rc a d a s r a d ia c tiv a m e n te

/
pequeo a g re g a d o d e c lu la s d e h g a d o

O'
c lu la s d e r e tin a m a rc a d a s r a d ia c tiv a m e n te

MEZCLA DE CLULAS MARCADAS RADIACTIVAMENTE Y AGREGADOS CELULARES

re ce p to re s n o se e n cu e n tra n en las clu las ep id rm icas d iferen ciad as p ero s en las clu las b asales, las cu ales utilizan las in tegrin as p a ra ad h erirse a la lm in a b asal. O tro de los m e ca n ism o s im p lica la p re se n cia de m o lcu las de ad h esin celu lar del tip o de las ca d h e rin a s, que ta m b i n v e re m o s m s ad elan te. U n ejem p lo to d av a m s llam ativo del m ism o fen m en o se o b serv a cu a n d o clu las d iso ciad as de d os rg a n o s em b rio n ario s de v erteb rad o s, tales c o m o el h gad o y la retin a, se m e z cla n fo rm a n d o artificialm en te u n agregad o: los a g re g a d os m ixto s, se seg reg an p a u la tin a m e n te en fu n cin del tejido (rgano) de o ri gen . Del m ism o m o d o , las clu las d iso ciad as se u n e n co n m ay o r facilidad a los agregad o s de sus p ro p io s tejidos q ue a los de o tro origen (Figura 1 9 -2 3 ). N atu ral m e n te h a n de existir sistem as de re co n o cim ie n to in tercelu lar resp o n sab les de que las clu las del m ism o tejido d iferen ciad o se ad h ieran p re fe re n te m e n te en tre ellas; estas p refere n cia s de a d h esi n p ro b a b le m e n te so n im p o rta n te s en la e s ta bilizacin de la arq u ite ctu ra tisular. Cul es la b ase m o le cu la r de e sta ad h esi n in tercelu lar selectiva en los v e r teb rad os? E n la m ay o ra de an im ales p lu ricelulares a ct a n dos tipos distintos de m o l c u la s d e a d h e s i n in te r c e lu la r (CAM, de Cell-Cell A dhesion M olecu les), u n o de ellos d ep en d ien te de C a2+ y o tro in d ep en d ien te de C a2+, que p a re ce n ser los p rin cip ales resp o n sab les de la ad h esi n in tercelu lar esp ecfica de tejido o b serv ad a en estad io s em b rio n ario s te m p ra n o s. A m bas clases de m o lcu las de a d h esi n fu ero n id en tificad as in icialm en te g en eran d o an ticu e rp o s c o n tra m o l cu las de su perficie y luego estu d ian d o la ca p a cid a d de esto s an ticu erp o s p a ra inhibir la ad h esi n celu lar en el tu b o de en sayo. Los an ticu e rp o s p o co co m u n e s q ue in h ib an la ad h esi n celu lar fu eron utilizados luego p a ra c a ra cte riz a r y aislar las m o lcu las de ad h esi n re co n o c id a s p o r los an ticu erp o s.

103 4

Captulo 19 : Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

Las cadherinas median la unin clula-clula dependiente de Ca2+ en los vertebrados 13

Como hem os indicado al tratar de las uniones intercelulares, las cadherinas son las responsables de la adhesin celular dependiente de Ca2+ en los tejidos de ver tebrados. Las tres primeras cadherinas que se descubrieron se denominaron te niendo en cuenta los principales tejidos en los que se encontraron: as la cadhe rina E se halla en muchos tipos de clulas epiteliales, la cadherina N en clulas nerviosas, musculares y del cristalino; y finalmente, la cadherina P se localiza en clulas placentarias y epidrmicas. Todas estas molculas pueden ser detectadas de manera transitoria en otros tejidos durante su desarrollo. Adems, continua mente se estn descubriendo nuevos tipos de cadherinas; actualmente se cono cen por lo menos una docena de ellas. Parece que prcticamente todas las clu las de vertebrados expresan una o ms cadherinas, cada una de las cuales est codificada por un gen distinto, siendo la expresin de cada grupo concreto una caractersticas del tipo celular. Experimentos in vitro e in vivo han demostrado que las cadherinas son las principales molculas de adhesin que mantienen las clulas unidas entre s durante los primeros estadios embrionarios. In vitro la li beracin de Ca2+ extracelular o el tratamiento con anticuerpos anti-cadherina desmontan el tejido, y si la adhesin mediada por la cadherina permanece intac ta, los anticuerpos contra otras molculas de adhesin no tienen efecto; in vivo, las mutaciones que inactivan la funcin de las cadherinas provocan un fracaso en el desarrollo del embrin. La mayor parte de las cadherinas son glucoprotenas con un solo dominio transmembrana, constituidas por unos 700-750 residuos de aminocido. La vo luminosa fraccin extracelular de la cadena polipeptdica est normalmente ple gada en 5 dominios, cada uno de los cuales contiene alrededor de 100 residuos de aminocidos; 4 de estos dominios son homlogos entre s y probablemente contienen lugares de unin al Ca2+ (Figura 19-24). En ausencia de Ca2+ las cadhe rinas sufren un importante cambio conformacional, como resultado del cual son degradadas rpidamente por enzimas proteolticas. El significado biolgico de la notable dependencia de la funcin proteica de la cadherina respecto al Ca2+ se desconoce. La cadherina E (tambin denominada uvomorulina) es la cadherina m ejor caracterizada. Ya la encontram os al estudiar las uniones celulares puesto que habitualmente se concentra en las bandas de adhesin de los tejidos epiteliales maduros donde conecta los filamentos de actina de los citoesqueletos corticales de las clulas adyacentes mantenindolas unidas. Tambin es la primera cadhe rina que se expresa durante el desarrollo de los mamferos, contribuyendo a la compactacin, un importante cambio morfolgico que tiene lugar en el estadio celular de 8 clulas del desarrollo embrionario del ratn. Durante la com pacta cin, las clulas todava unidas de manera muy laxa, denominadas blastmeros, se van agregando de forma muy com pacta unindose mediante uniones interce lulares. Los anticuerpos dirigidos contra la cadherina E bloquean la com pacta cin blastom rica mientras que los anticuerpos contra otras molculas de la su perficie celular no la bloquean. Parece probable que las cadherinas tambin jueguen un importante papel en los ltimos estadios del desarrollo de los vertebrados, ya que su presencia o ausencia estn correlacionadas con los principales procesos morfogenticos im plicados en la segregacin tisular. As por ejemplo, una vez formado el tubo neural e independizado del ectodermo, las clulas del neuroepitelio en desarrollo pierden la cadherina E y expresan por el contrario la cadherina N, mientras que las clulas de la capa ectodrmica continan expresando la cadherina E (Figura 19-25). Adems las clulas de la cresta neural que forman el sistema nervioso pe rifrico, cuando estn asociadas con el tubo neural tienen grandes acmulos de cadherina N en su superficie, dejan de expresarla cuando inician la migracin y despus vuelven a expresarla de nuevo cuando se agregan formando un ganglio nervioso (vase Figura 19-22). As pues, los tres grupos celulares que se originan

NH2

Ca2+

Z1 c
Ca2+

=1 tz
Ca2+

=3 m

m em brana plasm tica

10 nm

Figura 19-24 Dibujo esquem tico de una tpica m olcula de cadherina. La regin extracelular de la protena presenta cinco dominios homlogos, tres de los cuales contienen lugares de unin para el Ca2+ . Se cree que el dominio extracelular ms lejano a la membrana media la adhesin intercelular; la secuencia His-Ala-Val presente en este dominio parece estar implicada en esta unin ya que los pptidos que tienen esta secuencia inhiben la adhesin mediada por la cadherina. La regin citoplasmtica interacta con el citoesqueleto de actina por medio de varias protenas de unin intracelular, que incluyen tres protenas del tipo de las cateninas. La a-catenina est estructuralmente relacionada con la vinculina. X representa las protenas de unin no caracterizadas implicadas en el acoplamiento de las cadherinas a los filamentos de actina.

Adhesin intercelular

1035

de un mismo estrato celular presentan patrones distintos de expresin de cadherinas cuando se separan unos de otros, lo cual sugiere que los cambios en la ex presin de la cadherina estn implicados en los procesos de separacin celulares.

Las cadherinas median la adhesin clula-clula a travs de un mecanism o hom offlico 14

De qu manera las molculas de adhesin intercelular, tales como las cadheri nas, median la unin celular? En la Figura 19-26 se ilustran tres posibilidades: (1) las molculas de una clula pueden unirse a otras molculas del mismo tipo de clulas adyacentes (las uniones en este caso se denominan homo/icas)] (2) las molculas de una clula pueden unirse a molculas de diferente tipo de clulas adyacentes (en este caso las uniones se denominan heteroflicas)', y (3) los recep tores de superficie celular de clulas adyacentes pueden estar unidos entre s a travs de molculas secretadas de enlace multivalente. Estos tres mecanismos se han encontrado en animales. Sin embargo, las cadherinas normalmente utilizan un mecanism o homofflico. Esto se ha demostrado utilizando una lnea celular 100 |jm de fibroblastos denominada clulas L, que no expresan cadherina y que no se unen unas a otras clulas. Cuando las clulas L se transfectan con DNA que co Figura 19-25 Distribucin de las difica cadherina E, se adhieren entre s por mecanismos dependiente de Ca2+ ,y cadherinas E y N durante el esta adhesin se inhibe por anticuerpos contra cadherina E. Como las clulas desarrollo del sistema nervioso. transfectadas no se unen a las clulas L no transfectadas, la cadherina E puede Inmunofluorescencia de una seccin unir dos clulas entre s pero mediante la interaccin de molculas de cadherina transversal de un embrin de pollo E de ambas clulas. mostrando el tubo neural en desarrollo Si se mezclan clulas L que expresan cadherinas distintas, las clulas se semarcado con anticuerpos contra la cadherina E (A) contra la cadherina N paran y se agregan por separado, lo cual indica que las cadherinas se unen pre (B). Obsrvese que las clulas del ferentem ente a las de su mismo tipo. Una segregacin similar a sta ocurre si las ectodermo dorsal slo expresan la clulas L expresan cantidades distintas de la misma cadherina. Por lo tanto, pa cadherina E mientras que las clulas rece probable que las diferencias tanto cualitativas como cuantitativas en la ex del tubo neural la han perdido, y han presin de las cadherinas deben jugar un papel crucial en la formacin de los te adquirido la cadherina N. (Cortesa de jidos; seguramente las diferencias en las cadherinas tambin explican la mayora Kohei Hatta y Masatoshi Takeichi.) de los experimentos clsicos de adhesin especfica tanto en rganos como en tejidos in vitro. Muchas cadherinas, tales como las E, las N, y las P, actan como protenas de unin transm em brana mediando las interacciones entre los filamentos de actina del citoesqueleto de las clulas que estn unidas. Son, como hemos visto, las protenas de adhesin en torno a las cuales se construyen las uniones adherentes intercelulares. Un dominio citoplasmtico altamente conservado de es tas cadherinas interacta con el crtex de actina por medio de tres protenas de unin intracelular denominadas cateninas (vase Figura 19-24). Esta interac cin es necesaria para que se produzca adhesin intercelular: las molculas de cadherina E que carecen de dominio citoplasmtico son incapaces de mantener unidas las clulas. Las cadherinas que se localizan en los desmosomas no interactan con filamentos de actina sino con filamentos intermedios; su dominio citoplasm tico es distinto y se unen a grupos distintos de protenas de unin, las cuales a su vez se unen a filamentos intermedios. Las cadherinas no son las nicas protenas que median la adhesin interce lular dependiente de Ca2+: algunas integrinas tambin pueden unir clulas entre

Figura 19-26 Tres mecanismos mediante los cuales las molculas de superficie celular pueden mediar la adhesin intercelular. Aunque todos

UNION HOMOFILICA

UNION HETEROFILICA

UNION A TRAVES DE UNA MOLCULA DE UNIN EXTRACELULAR

estos mecanism os pueden actuar en animales, el que depende de una molcula de unin extracelular parece ser el menos comn.

10 3 6

Captulo 19: Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

s mediante interacciones heteroflicas con otras protenas de superficie celular, si bien la mayora de las integrinas median la unin de las clulas a la matriz ex tracelular, como estudiaremos ms adelante. Adems, una familia de protenas de unin a carbohidratos de superficie celular (las lectinas) denominadas selectinas actan en un gran nmero de adhesiones intercelulares transitorias en la circulacin sangunea, permitiendo por ejemplo a los glbulos blancos unirse transitoriamente a las clulas endoteliales de vasos sanguneos pequeos y as migrar desde la sangre hacia tejidos y zonas inflamadas. Las selectinas contie nen un gran dominio de la lectina altamente conservado que en presencia de Ca2+ se une a un oligosacrido especfico de otra clula -otro ejemplo de adhe sin intercelular heteroflica (vase Figura 10-42). Como en el Captulo 10 ya se trata de las selectinas, no se considerarn aqu en mayor profundidad. Ms adelante discutiremos cmo las clulas pueden regular la actividad ad hesiva de sus integrinas. De una forma similar parece probable que por lo menos algunas clulas pueden regular la actividad adhesiva de sus cadherinas, aunque se conoce mucho menos acerca de la regulacin de las cadherinas que acerca de la regulacin de las integrinas. Esta regulacin puede ser importante para los re ordenamientos celulares que suceden en los epitelios cuando estas clulas cam bian de forma y se organizan durante el desarrollo animal.

nh2

nh2

nh2

nh2

La adhesin intercelular independiente de Ca2+ est mediada principalm ente por unas protenas pertenecientes a la superfamilia de las inmunoglobulinas 15
Las molculas responsables de la adhesin clula-clula independiente de Ca2 + pertenecen principalmente a la antigua y gran superfamilia de las inmunoglobu linas (Ig), denominadas as porque poseen uno o ms dominios de tipo Ig que son caractersticos de las molculas de anticuerpo (se discute en el Captulo 23). El ejemplo m ejor estudiado es la m olcula de adhesin de las clulas neurales (N-CAM de Neural Cell Adhesin Molecule), la cual se expresa en varios tipos ce lulares incluyendo muchas clulas nerviosas. Es la ms comn de las adhesiones intercelulares independientes de Ca2 +en los vertebrados y, como las cadherinas, parece que une a las clulas entre s mediante una interaccin homoflica (entre molculas N-CAM de clulas adyacentes). Sin embargo algunas protenas de ad hesin intercelular semejantes a las Ig utilizan un mecanismo heteroflico; algu nas de ellas, denominadas molculas de adhesin intercelular (ICAM), se expre san en clulas endoteliales activadas y se unen a las integrinas en la superficie de los glbulos blancos, colaborando as en atrapar a las clulas sanguneas en los lugares de inflamacin. Existen por lo menos 20 formas de N-CAM. A diferencia de las cadherinas, cada una de las cuales est codificada por un gen diferente, los distintos mRNA que codifican las N-CAM provienen de la expresin alternativa de un transcrito de RNA codificado por un solo gen. En todas las formas de N-CAM el gran domi nio extracelular de la cadena polipeptdica est plegada en 5 dominios hom lo gos a los de las inmunoglobulinas. La mayora de las N-CAM son protenas transm em brana de un solo paso, con dominios intracelulares de tamao varia ble que parecen estar implicados en la sealizacin celular o en la unin al citoesqueleto. Existe una forma de N-CAM que no atraviesa la bicapa lipdica y que se une a la m em brana plasm tica m ediante un enlace covalente al glucosilfosfatidilinositol (GPI), m ientras que otras formas son secretadas y pueden ser incorporadas a la matriz extracelular (Figura 19-27). La glucosilacin de las N-CAM proporcionan ms diferencias: algunas formas tienen una gran canti dad de cido silico (en la inusual forma de varias cadenas, cada una de las cuales contiene cientos de residuos repetidos de cido silico) mientras que otras contienen una cantidad mucho menor. En virtud de su carga negativa, las largas cadenas de cido silico impiden la adhesin celular, modificando de ese modo la funcin adhesiva de las N-CAM. En efecto, es posible que en algu nos casos las N-CAM que estn fuertem ente cargadas con cido silico puedan

10 nm

Figura 19-27 Dibujo esquemtico mostrando cuatro formas de N-CAM.

En cada caso, la regin extracelular de cada cadena polipeptdica est plegada en cinco dominios sem ejantes a los de las inmunoglobulinas (y uno o dos ms dominios denominados fibronectina de tipo II se repiten por causas que aclararemos ms adelante). Los enlaces disulfuro (mostrados en rojo) conectan las term inaciones de cada bucle, formando cada uno de los dominios sem ejantes a Ig.

Adhesin intercelular

1037

impedir la adhesin ms que provocarla. Por ejemplo, en algunas neuronas la presencia de estas cadenas de cido polisilico fom entan el crecim iento de unas prolongaciones, probablem ente facilitando que las puntas de estas prolonga ciones se alejen de las clulas que van encontrando y con las que podran entrar en contacto. Existen evidencias substanciales de que las N-CAM y sus respectivos hom logos sem ejantes a Ig juegan un papel importante en el desarrollo de los verte brados. Cuando se utilizan anticuerpos contra cualquiera de las N-CAM o contra otras molculas de adhesin intercelular neural de tipo Ig denominadas LJ, y se inyectan a lo largo de la zona de crecim iento desde la retina hacia el cerebro, se altera el patrn normal de crecim iento de las prolongaciones nerviosas. Cuando se utilizan en cultivos celulares estos anticuerpos inhiben la tendencia de las prolongaciones en desarrollo de las clulas nerviosas a adherirse entre s for mando haces (fascculos). Al igual que las cadherinas N, las N-CAM se expresan en grandes cantidades en las clulas del tubo neural en desarrollo; pero cuando las clulas de la cresta neural se disocian del tubo neural e inician la migracin, pierden las N-CAM reexpresndolas de nuevo cuando se agregan formando un ganglio nervioso (vase Figura 19-22). Como en el caso de las cadherinas, las NCAM se expresan tam bin transitoriamente durante estadios crticos del desa rrollo de muchos tejidos no neuronales. A pesar de que las cadherinas y los miembros de la familia de las Ig st -iesan a menudo en las mismas clulas, las adhesiones mediadas por las cadherinas son mucho ms fuertes y casi con toda seguridad son las principales responsa bles de m antener la unin entre clulas, la segregacin de colectivos celulares en tejidos individuales y m antener la integridad del tejido. Parece que las N-CAM y otros miembros de la familia de las Ig contribuyen ms a la regulacin fina de las interacciones adhesivas durante el desarrollo y la regeneracin. As, la inyeccin de mRNA que codifica cadherina N a huevos de rana fecundado provoca una sobrexpresin de cadherina N en lugares donde normalmente no se expresa y conduce a una enorm e disrupcin de la estructura normal del tejido. Por el con trario, el mismo experimento realizado con mRNA que codifica N-CAM provoca una m enor alteracin en el desarrollo, a pesar de que parece que las N-CAM se sobrexpresan en muchas localizaciones anormales. La prueba ms crtica para conocer el papel de una protena en un proceso biolgico concreto no consiste en sobrexpresarla sino en suprimir su produc cin modificando el gen correspondiente. Aunque actualmente esto puede rea lizarse en algunos vertebrados, es ms fcil hacerlo en invertebrados manipulables genticam ente, tales com o Drosophila o el nemtodo C. elegans. En Drosophila se ha caracterizado un conjunto de protenas semejantes a Ig que median la adhesin intercelular independiente del Ca2+. Una de estas protenas, la fasciclina II, est estrecham ente relacionada con N-CAM: com o N-CAM, tie ne cinco dominios sem ejantes a Ig y acta por unin homoflica. Se expresa principalmente en un subconjunto de prolongaciones celulares nerviosas y en algunas clulas gliales con las que contactan durante el desarrollo. Si las dos co pias del gen de la fasciclina II se inactivan por una mutacin, el grueso de la es tructura del sistem a nervioso sigue siendo normal pero por lo menos dos de las prolongaciones celulares nerviosas que normalmente expresan la fasciclina II y se adhieren entre s, dejan de reconocerse y por lo tanto ya no forman haces. Esta observacin es consistente con la opinin de que las molculas de adhe sin intercelular sem ejantes a Ig juegan papeles sutiles pero importantes en el desarrollo.

Muchos tipos de molculas de superficie celular actan paralelam ente mediando la adhesin selectiva clula-clula y clula-m atriz 16
Todos los estudios realizados nivel de biologa celular, bioqumico y morfolgico indican que cada clula utiliza diversos mecanismos moleculares para adherirse

1 03 8

Captulo 19: Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

unin estanca

Figura 19-28 Resumen de los mecanismos de adhesin, tanto los que implican complejos de unin como los que no, mediante los cuales las clulas se adhieren una a otras y a la matriz extracelular. Los
mecanism os de unin se muestran en clulas epiteliales, mientras que los que no implican unin, se muestran en clulas no epiteliales. Una interaccin adhesiva se define como aquella que mediante microscopa electrnica convencional y/o criofractura puede ser observada como una regin de contacto especializada. Obsrvese que las integrinas y las cadherinas estn implicadas tanto en interacciones de unin com o en interacciones de no-unin clulaclula (cadherinas) y clula-matriz (integrinas). Generalm ente las cadherinas median interacciones de tipo homoflico, mientras que las integrinas median interacciones de tipo heteroflico (vase Figura 19-26). Tanto las cadherinas com o las integrinas actan com o elem entos de unin transm embrana, y su funcin depende de cationes divalentes extracelulares; por esta razn, la mayora de contactos clula-clula y clula-matriz son dependientes de cationes divalentes. Las selectinas e integrinas tambin pueden actuar como molculas de adhesin heteroflica clula-clula: las selectinas se unen a carbohidratos, mientras que las integrinas unidas a clulas se unen a miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Las integrinas y los proteoglucanos integrales de m embrana que median la adhesin mediante com plejos que no son de unin a la matriz extracelular sern explicados ms adelante.

filamentos de actina

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CO O

banda de adhesin (cadherinas)

'L U
_l

x<
<

desm osom a (cadherinas)

filamentos intermedios

unin de tipo

gap

2H -O<
X <
LU

lm ina basal

M E C A N ISM O S DE ADHESIN Q U E IMPLICAN C O M P LE JO S DE UNIN

M E C A N IS M O S DE AD HESIN Q U E NO IMPLICAN C O M P LE JO S DE UNIN

tanto a otras clulas com o a la matriz extracelular. Algunos de estos mecanismos implican uniones celulares bien estructuradas, mientras que otros no (Figura 19-28). As, de la misma manera que cada clula de un animal pluricelular con tiene un conjunto de receptores de superficie que le permiten responder espec ficamente a un conjunto complementario de seales qumicas solubles tales como hormonas y factores de crecim iento, esta misma clula integrada en un tejido tam bin puede disponer de una com binacin (o concentracin) particu lar de receptores de superficie celular (molculas de adhesin celular) que la capacitan para unirse de manera caracterstica a otras clulas y a la matriz extracelular. Asimismo, de la misma forma en que los receptores para seales qumi cas solubles generan seales intracelulares que alteran el comportamiento de las clulas, tam bin pueden alterarse las molculas de adhesin celular, a pesar de que en este caso los mecanism os de sealizacin son menos conocidos. A diferencia de los receptores para seales qumicas solubles, que se unen a sus ligandos especficos con una alta afinidad, los receptores que se unen a las molculas de la superficie celular o a componentes de la matriz extracelular lo hacen generalmente con una baja afinidad. En consecuencia, estos receptores consiguen increm entar enormemente la fuerza de unin mediante la unin si multnea de un gran nmero de receptores a sus ligandos situados en otra clu la o en la matriz adyacente. A este principio se le podra denominar principio del Velero. Hemos visto, sin embargo, que la interaccin de los dominios de unin extracelulares de estas molculas de superficie celular no es suficiente para asegurar la adhesin celular: por lo menos en el caso de las cadherinas, y com o veremos en el de las integrinas, las molculas de adhesin tam bin han de unirse (va acoplamiento proteico) al citoesqueleto cortical del interior de la c lula. Parece que el citoesqueleto facilita y estabiliza la agrupacin lateral de las molculas de adhesin, facilitando la unin de mltiples puntos, lo cual tam-

Adhesin intercelular

1039

Figura 19-29 Importancia del citoesqueleto en la adhesin celular.

SIN UNIN AL CITOESQUELETO

mmm * mmmm

NO AFECTA A LA CELULA

Este dibujo ilustra la razn por la cual las molculas de adhesin celular han de unirse al citoesqueleto para poder mediar una fuerte adhesin clulaclula o clula-matriz. En realidad, muchas de las protenas de adhesin pueden ser expulsadas de la clula junto con fragmentos de membrana adheridos, y los agujeros dejados en la membrana se vuelven a cerrar al instante.

CON UNIN AL CITOESQUELETO

ADHESION CELULAR

bin es necesario para permitir que la clula adherida ejerza traccin sobre la c lula o la matriz adyacentes (o viceversa) (Figura 19-29). As pues, es la suma de los tipos especficos de molculas de adhesin intercelular y de receptores de matriz presentes en las dos clulas, la concentracin de estas molculas, las uniones citoesquelticas y la distribucin sobre la superficie celular, 10 que determina la afi nidad total con la que dos clulas se unirn entre ellas o con la matriz.

Los contactos no adhesivos pueden ser los iniciadores de fenmenos de adhesin intercelular especficos de tejido que posteriormente son orientados y estabilizados por contactos de unin 16
Cul de los diversos tipos de uniones intercelulares que se han discutido en este captulo, si es que puede atribuirse a alguno de ellos, est implicado en la migra cin y el reconocim iento celulares que tienen lugar durante los procesos de for m acin de tejidos y rganos? Una de las estrategias utilizadas para responder a esta pregunta es la observacin mediante el microscopio electrnico de los con tactos establecidos entre clulas adyacentes cuando estn migrando unas sobre otras en em briones en desarrollo o en tejidos adultos en proceso de reparacin despus de una agresin m ecnica. Estos estudios muestran que, a excepcin de la reorganizacin celular dentro de un epitelio, estos contactos generalmente no implican la form acin de uniones intercelulares organizadas. Por el contrario, las mem branas plasmticas que interactan, a menudo se sitan muy prximas y siguen trayectos paralelos dejando un espacio de tan slo 10-20 nm entre ellas. Como varias protenas transm em brana conocidas sobresalen de la membrana plasmtica ms de 10-20 nm, dos protenas de la superficie celular pueden interactuar entre s a travs de este espacio de 10-20 nm mediando la adhesin entre las clulas. Este tipo de contacto no incluido en los tipos de unin celular, puede ser ptimo para la locom ocin celular -suficientem ente fuertes para soportar la traccin pero no lo bastante como para inmovilizar la clula. Entre las clulas embrionarias en migracin generalmente no se observan contactos de unin (uniones adherentes, desmosomas, hemidesmosomas y, en insectos, uniones septadas), por lo que la formacin de tales uniones puede constituir un m ecanism o importante para inmovilizar las clulas en un tejido organizado cuando se ha formado. Adems, se cree que la formacin de uniones intercelulares en el epitelio es necesaria para conseguir fuerza mecnica y para ayudar a polarizar y orientar las clulas constituyentes. Una hiptesis razonable se basa en que las protenas de adhesin no relacionadas con la unin celular iniciaran la agregacin especfica en los tejidos, la cual sera entonces orientada 10 4 0 Captulo 19 : Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

y estabilizada mediante el conjunto de uniones intercelulares. Muchas de las protenas transmembrana implicadas pueden difundir en el plano de la m em brana plasmtica, por lo que pueden acumularse en los lugares de contacto c lula-clula o clula-matriz y por tanto ser utilizadas como adhesiones de unin o no de unin. Se ha demostrado que esto sucede para el caso de algunas integri nas y cadherinas, las cuales pueden intervenir en la adhesin celular inicial, para posteriormente pasar a ser parte integral de las uniones celulares. Se est caracterizando un nmero cada vez mayor de anticuerpos monoclonales y de fragmentos peptdicos, cada uno de los cuales bloquea un solo tipo de molculas de adhesin intercelular o de receptores de matriz -y a medida que los genes que codifican estas protenas de superficie celular empiecen a estar disponibles para la manipulacin en cultivos celulares y en animales de experi m entacin- ser posible inactivar los diversos tipos de protenas de adhesin intercelular y los receptores de matriz, individualmente y en diferentes com bi naciones, para descifrar las bases de reconocimiento y de unin que participan en la morfognesis de tejidos complejos.

Resumen

Las clulas disociadas a partir de diversos tejidos embrionarios de vertebrados se reasocian preferentemente con clulas del mismo origen tisular cuando se cultivan conjuntamente. En los vertebrados estos sistemas de reconocimiento especficos de tejido estn mediados principalmente por una familia de protenas de adhesin in tercelular dependientes de Ca2* denominadas cadherinas, que mantienen las clu las unidas por una interaccin homofilica entre protenas transmembrana de tipo cadherina, de clulas adyacentes. Para mantener las clulas unidas, las cadherinas han de estar unidas al citoesqueleto cortical. La mayora de las clulas animales tambin presentan sistemas de adhesin intercelular independientes de Ca2* que principalmente pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas, incluyendo molculas de adhesin de clulas nerviosas como las N-CAM. Un solo tipo celular puede utilizar mltiples mecanismos moleculares para adherirse a otras clulas (y a la matriz extracelular), por lo que la especificidad de la adhesin intercelular ob servada en el desarrollo embrionario ha de ser el resultado de la integracin de va rios sistemas de adhesin diferentes, algunos de los cuales estn asociados con uniones celulares especializadas, mientras que en otros no lo estn.

La matriz extracelular de los animales 17

Los tejidos no estn formados nicamente por clulas. Una buena parte de su volumen lo constituye el espacio extracelular, el cual est ocupado por una in trincada red macromolecular que constituyen la matriz extracelular (Figura 1930). La matriz est compuesta por polisacridos y protenas muy diversos, secre tados localmente y ensamblados en una red compleja en ntima asociacin con la superficie celular. Si la discusin de las uniones celulares la hemos realizado fundamentalmente en el contexto de los tejidos epiteliales, la correspondiente a la matriz se centrar en el tejido conjuntivo (Figura 19-31). En este tejido, la m a triz es ms abundante que las clulas, rodendolas completamente y determi nando las propiedades fsicas del tejido. Los tejidos conjuntivos constituyen el esqueleto arquitectnico del cuerpo de los vertebrados, pero su cantidad pre sente en los diferentes rganos vara considerablemente: desde la piel y el hue so, en los que son los componentes mayoritarios, hasta el cerebro y la mdula espinal, en los que nicamente son constituyentes minoritarios. Las variaciones en cuanto a la participacin relativa de los diferentes tipos de macromolculas de la matriz as como los patrones de organizacin de estas macromolculas en la matriz extracelular dan lugar a una sorprendente diversi dad de formas, cada una de las cuales est altamente adaptada a los requeri mientos funcionales de cada tejido en particular. La matriz puede calcificarse, La matriz extracelular de los animales

0,1 mm
Figura 19-30 Clulas rodeadas espacios llenos de matriz extracelular. Las clulas particu
mostradas en esta electronmicn a bajo aumento pertenecen al es de una extremidad de pollo. Las clulas an no presentan sus caractersticas especializadas. (Cortesa de Cheryll Tickle.)

Figura 19-31 Tejido conjuntivo subyacente a un epitelio celular. Est

constituido en su mayor parte por una matriz extracelular que es secretada por los fibroblastos.

formando estructuras duras com o en el hueso y el diente, ser transparente como en el caso de la crnea o adoptar formas sem ejantes a tensores, las cuales dan a los tendones su enorm e resistencia a la traccin. En la interfase entre un epitelio y un tejido conjuntivo, la matriz forma una lmina basal, estructura extremada mente delgada pero que al parecer juega un importante papel en el control del com portam iento celular. Aunque en esta seccin nos centraremos en la matriz extracelular de los vertebrados, otros organismos fabrican una gran cantidad de materiales relacionados, nicos e interesantes, como las paredes celulares de las bacterias, las cutculas de los gusanos e insectos, las conchas de los moluscos y, como discutiremos ms adelante, las paredes celulares de los vegetales. Hasta hace poco se ha considerado que la matriz extracelular de los verte brados actuaba principalmente como un andamio relativamente inerte que es tabilizaba la estructura fsica de los tejidos. Sin embargo ahora se sabe que la matriz desempea un papel mucho ms activo y complejo en la regulacin del com portam iento de las clulas que entran en contacto con ella -afectando a su desarrollo, su migracin, su proliferacin, su forma y su funcin. La matriz ex tracelular presenta una com pleja com posicin molecular que corresponde a es tas funciones. Aunque nuestro conocim iento de su organizacin todava es frag mentario, recientem ente la caracterizacin de sus com ponentes principales ha progresado rpidamente.

La matriz extracelular est producida y orientada por las clulas que engloba 17
Las macromolculas que constituyen la matriz extracelular proceden, funda mentalmente, de una secrecin celular de carcter local. Como discutiremos ms adelante, estas clulas tam bin contribuyen a modelar la matriz ya que la orientacin de su citoesqueleto influir en la orientacin de la matriz que stas produzcan. En la mayor parte de los diferentes tipos de tejido conjuntivo, estas macromolculas son secretadas fundamentalmente por los fibroblastos (Figura 19-32). Sin embargo en algunos tejidos conjuntivos especializados tales como el cartlago y el hueso, son secretados por clulas relacionadas con los fibroblastos, que reciben denom inaciones especficas, como condroblastos en el caso del car tlago y osteoblastos en el hueso. Las dos clases principales de macromolculas que conforman la matriz son ( 1) cadenas de polisacridos del tipo de los glucosaminoglucanos (GAG), los cuales normalmente se hallan unidos a protenas mediante enlaces covalentes en forma de proteoglucanos, y (2) protenas fibrosas, pertenecientes a dos tipos funcionales: las de caractersticas fundamentalmente estructurales (por ejemplo, colgena y elastina) y las adhesivas (por ejemplo, fibronectina y laminina). Ms adelante veremos (en la Figura 19-57) que los com ponentes de ambas clases presentan una gran diversidad de formas y tamaos. Las molculas de glucosaminoglucanos y de proteoglucanos forman una subs-

10 |jm

Figura 19-32 Electronmicrografa de barrido de fibroblastos en el tejido conjuntivo. El tejido corresponde a

crnea de rata. La matriz extracelular que rodea los fibroblastos se com pone mayoritariamente de fibrillas de colgena (no hay fibras elsticas en la crnea). Las glucoprotenas, glucosaminoglucanos y proteoglucanos, que normalmente forman un gel hidratado que ocupa los intersticios de la red fibrosa, son digeridos mediante tratamientos enzimticos y con cidos. (De T. Nishida et al. Invest. O phthalm ol. Vis. Sci. 29:1887-1890, 1988.)

10 4 2

Captulo 19: Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

disacrido repetido

Figura 19-33 Secuencia repetida de disacridos de la cadena de un glucosaminoglucano (GAG) de tipo dermatn sulfato. Estas cadenas estn constituidas tpicamente por entre 70 y 200 residuos de azcar. Existe una gran densidad de cargas negativas a lo largo de la cadena debido a la presencia de grupos sulfato y carboxilo.

c=o
cido durnico A/-acetilgalactosamina4-sulfato

tancia fundamental, altamente hidratada, que presenta propiedades de gel y en la que estn embebidas las protenas fibrosas. El gel de polisacrido opone resis tencia a las fuerzas de compresin de la matriz, mientras que las fibras de col gena oponen resistencia a la traccin. La fase acuosa del gel de polisacrido per mite la difusin de metabolitos, nutrientes y hormonas entre la sangre y las clulas que conforman los tejidos; las fibras de colgena refuerzan y colaboran en la organizacin de la matriz, mientras que las de elastina le confieren elastici dad. Las protenas adhesivas son intermediarias en el anclaje de las clulas a la matriz: por ejemplo, la fibronectina participa en la adhesin de fibroblastos y de otras clulas relacionadas a la matriz en el tejido conjuntivo, mientras que la laminina favorece la unin de las clulas epiteliales a la lmina basal.

Las cadenas de glucosaminoglucano (GAG) ocupan grandes volmenes, formando geles hidratados1 8
Los glucosam inoglucanos (GAG) estn formados por largas cadenas no ramifi cadas de polisacridos, compuestas a su vez por unidades repetidas de disacri dos. Se denominan GAG debido a que en dichos disacridos, uno de los residuos es siempre un aminoazcar (AT-acetilglucosamina o Af-acetilgalactosamina). En la mayora de los casos este aminoazcar se encuentra sulfatado, siendo el se gundo residuo un cido urnico (glucurnico o idurnico). Debido a la presen cia de grupos sulfato o carboxilo en la mayora de los residuos glucdicos de los glucosaminoglucanos, stos presentan una gran carga negativa (Figura 19-33). En funcin de dichos restos glucdicos, el tipo de enlace entre ellos y el nmero y localizacin de los grupos sulfato, se pueden distinguir cuatro grupos principa les de GAG: (1) cido hialurnico, (2) condroitn sulfato y dermatn sulfato, (3) heparn sulfato y heparina , (4) queratn sulfato. Las cadenas de polisacridos no presentan la flexibilidad suficiente como para plegarse en estructuras globulares y compactas, que, tpicamente, forman las cadenas polipeptdicas. Adems, son altamente hidrofilicas. As pues, los GAG tienden a adoptar conformaciones muy extendidas, ocupando un enorme volumen en relacin a su masa (Figura 19-34) y formando geles incluso a con centraciones muy bajas. Su alta densidad de carga negativa es la causa de la cap tacin de numerosos cationes, tales como el Na+, que debido a su actividad os mtica, conducen a la acumulacin de grandes volmenes de agua en la matriz. Ello da lugar a una presin de hinchamiento o turgencia que capacita a la matriz para oponerse a las fuerzas de compresin (en contraste con las fibras de colge na, que se oponen a las fuerzas de traccin). Por ejemplo, la matriz cartilaginosa que reviste la articulacin de la rodilla puede soportar presiones de cientos de atmsferas gracias a este mecanismo. La cantidad de GAG del tejido conjuntivo no representa, en general, ms del 10% en peso del total de las protenas fibrosas. Sin embargo, debido a que for man geles hidratados y porosos, las cadenas de glucosaminoglucanos ocupan la

protena globular (Pm 50 000)

O
glucgeno (Pm ~ 400 000) espectrina (Pm 460 000) colgena (Pm 290 000)

/&OQQ

cido hialurnico (Pm 8 x 10 )

__________________ | I
300 nm

Figura 19-34 Dimensiones y volmenes relativos ocupados por varias macromolculas. El esquema muestra varias protenas, un grnulo de glucgeno, y una molcula hidratada de cido hialurnico.

La matriz extracelular de los animales

1043

disacrido repetido

Figura 19-35 Secuencia repetida de disacridos en el cido hialurnico, un GAG relativamente simple. Est constituido por una larga cadena de unos 25 000 residuos de azcar. Obsrvese la ausencia de grupos sulfato.

cido glucurnico

/V-acetilglucosamina

prctica totalidad del espacio extracelular, constituyendo un soporte mecnico para los tejidos y facilitando, al mismo tiempo, la difusin de molculas hidrosolubles y la migracin celular. La importancia de los GAG se ilustra en enferme dad gentica humana poco habitual en la cual se produce una severa deficiencia de la sntesis de disacridos del tipo de los dermatn sulfatos mostrados en la Fi gura 19-33. Los individuos afectados son enanos, presentan una apariencia de envejecim iento prematuro y tienen defectos generalizados en la piel, articula ciones, musculatura y huesos. Sin embargo hay que resaltar que en invertebrados y en vegetales a menudo existe otro tipo de polisacridos que son los principales constituyentes de la estruc tura de la matriz extracelular. As, en plantas superiores -com o veremos ms ade lante- existen cadenas de celulosa (poliglucosa) que estn densamente empaque tadas en formaciones cristalinas a modo de cintas, constituyendo el componente microfibrilar de la pared celular. En insectos, crustceos y otros artrpodos, la qui tina (poli-iV-acetilglucosamina) constituye el principal componente del citoesqueleto. La celulosa y la quitina son los biopolmeros ms abundantes de la tierra.

Parece que el cido hialurnico facilita la migracin celular durante la morfognesis y la reparacin de los tejidos1 9
El cido hialurnico (tambin denominado hialuronato o hialuronano ) es el GAG de estructura molecular ms sencilla. Consta de una secuencia repetida de hasta 25 000 unidades de disacridos no sulfatados (Figura 19-35). Se encuentra en proporciones variables en todos los tejidos y fluidos de los animales adultos, siendo especialmente abundante en las fases embrionarias iniciales. Su simplici dad induce a considerarlo como una forma inicial en la evolucin de los GAG, aunque su estructura no es la tpica de la mayora de los GAG. Todos los dems grupos ( 1) contienen azcares sulfatados, (2) tienden a presentar ciertos disac ridos diferentes dispuestos en secuencias ms complejas, (3) presentan numero sas cadenas cortas, de menos de 300 residuos glucdicos, y (4) estn unidos co valentemente a protenas que forman proteoglucanos. Adems, mientras que los otros GAG son sintetizados dentro de la clula y liberados por exocitosis, el cido hialurnico es alargado desde la superficie celular mediante un complejo enzi mtico integrado en la mem brana plasmtica. Se cree que el cido hialurnico acta ofreciendo resistencia a las fuerzas compresivas en los tejidos y articulaciones. Tambin tiene una funcin impor tante durante el desarrollo embrionario como rellenador de espacio, pudiendo ser utilizado para forzar un cambio en la forma de una estructura. De manera se mejante a la espuma de estireno, el cido hialurnico puede ser producido de forma rpida y barata: al hidratarse, una pequea cantidad se expande y ocupa un gran volumen (vase Figura 19-34). Por ejemplo, el cido hialurnico sinteti zado a partir de la cara basai de un epitelio en lmina a menudo se utiliza para crear un espacio libre de clulas dentro del cual las clulas pueden migrar; esto tiene lugar durante la formacin del corazn, la crnea y algunos otros rganos.

1 044

Captulo 19 : Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

Figura 19-36 Unin entre una cadena de GAG y su protena central en una molcula de proteoglucano. En
p rim e r lugar se establece un enlace especfico entre un tetrasacrido y u n residuo de serina. En la m a y o ra de los casos no est claro cm o se selecciona el residuo de serina, pero parece que es ms im p o rta n te la con form acin local de la p ro te n a que una d e te rm in a d a secuencia de am inocidos. El resto de la cadena de

GAG, c on stituid a p rin c ip a lm e n te por

la rep etici n de u n disacrido, se sintetiza a con tin u a c i n , aadindose residuo a residuo. En los condroitn

sulfatos, el disacrido est com puesto

p or cido D-glucurnico y Af-acetil-D-

Cuando finaliza la migracin celular, el exceso de cido hialurnico es degradado mediante la enzima hialuronidasa. El cido hialurnico se sintetiza tambin en grandes cantidades durante la cicatrizacin de las heridas, y tambin es un cons tituyente importante de los fluidos articulares, donde acta como un lubrificante. Muchas de las funciones del cido hialurnico dependen de protenas y proteoglucanos que se unen a l especficamente, algunas de las cuales forman parte de la matriz extracelular mientras que otras son componentes integrales de la superficie celular. Se ha demostrado que algunas de estas molculas (a ve ces relacionadas con las hialadherinas) presentan dominios homlogos de unin al cido hialurnico que contienen un grupo caracterstico de residuos de am i nocidos cargados positivamente.

galactosam ina; en los heparn sulfatos es D -glucosam ina (o cido i.-idurnico) y A f-acetil-D-glucosam ina; en el queratn sulfato es D-galactosa y iV-acetil-D -glucosam ina.

Los proteoglucanos estn compuestos por cadenas de GAG unidas covalentemente a una protena central2 0
Exceptuando el cido hialurnico, los dems GAG se encuentran unidos cova lentem ente a una protena, constituyendo los proteoglucanos, los cuales son sintetizados por la mayora de clulas animales. Como en el caso de casi todas las glucoprotenas, la cadena polipeptdica de los proteoglucanos o protena cen tral (core protein) es sintetizada por ribosomas unidos a membrana, acumuln dose en el interior del retculo endoplasmtico rugoso. La unin de las cadenas de polisacrido a la protena central tiene lugar, fundamentalmente, en el com plejo de Golgi: inicialmente se une un tetrasacrido de unin especfico a un res to de serina de la protena central, el cual acta como un cebador del crecim ien to de la cadena de polisacrido; posteriormente se aade, en un slo paso, un residuo glucdico mediante glucosiltransferasas especficas (Figura 19-36). Mientras permanece en el complejo de Golgi, se modifican covalentemente sus residuos mediante una serie de reacciones de sulfatacin que tienen lugar de manera secuencial y coordinada, as como mediante diversas reacciones de epimerizacin. La epimerizacin altera la configuracin de los substituyentes alre dedor de determinados tomos de carbono de la molcula glucdica; la sulfata cin incrementa mucho la carga negativa de los proteoglucanos. En general, los proteoglucanos se diferencian fcilmente de otras glucopro tenas por la naturaleza, cantidad y organizacin de sus cadenas laterales de glcidos: por definicin, por lo menos una de las cadenas sencillas de azcares de un proteoglucano ha de ser un GAG. Las glucoprotenas contienen entre un 1% y un 60% en peso de carbohidratos, formando numerosas cadenas de oligosacridos relativamente cortas y ramificadas. Normalmente la protena central de los pro teoglucanos es una glucoprotena, pero puede contener hasta un 95% en peso de carbohidratos, generalmente en forma de una larga cadena de GAG no ramificada, de unos 80 residuos glucdicos de media. As pues, los proteoglucanos pueden ser

La matriz extracelular de los animales

1045

DECORINA <Pm ~ 40 000)

AGRECANO (Pm ~ 3 x 106)

RIBONUCLEASA (Pm ~ 15 000) cadena lateral de oligosacrido corta y ramificada

cadena polipeptdica

100 nm

mucho ms largos que las glucoprotenas. Por ejemplo, el agrecano, componente principal del cartlago, tiene una masa de alrededor de 3 x 106 daltons; est com puesto por ms de 100 cadenas de GAG, aproximadamente una por cada 20 resi duos de aminocidos. Sin embargo, muchos proteoglucanos son mucho ms pe queos, teniendo tan slo de 1 a 10 cadenas de GAG; la decorina, por ejemplo, es secretada por los fibroblastos y tiene una sola cadena de GAG (Figura 19-37). En principio, los proteoglucanos tienen una heterogeneidad potencial casi ilimitada. La protena central tiene un peso molecular que oscila entre los 10 000 y ms de 600 000 daltons y tanto el nmero como el tipo de cadenas de GAG que se unen a ella es variable. Adems el patrn repetitivo bsico de los disacridos en cada GAG puede ser modificado por un patrn complejo de grupos sulfato. La heterogeneidad de estos GAG dificulta la identificacin y clasificacin de los proteoglucanos en funcin de sus azcares. Las secuencias de muchas protenas centrales han sido determinadas m ediante tcnicas de DNA recombinante, ob servndose que son extremadamente diversas. Aunque tan slo han sido identi ficadas unas cuantas familias, existe una caracterstica estructural poco comn que distingue claram ente la protena central del proteoglucano de otras prote nas, y muchas de ellas tienen uno o ms dominios que son homlogos a los en contrados en otras protenas de la matriz extracelular o de la membrana plasm tica. As, es m ejor considerar a los proteoglucanos com o un grupo diverso de glucoprotenas altamente glucosiladas cuyas funciones dependen tanto por su protena central com o por sus cadenas de GAG.

Figura 19-37 Ejemplos de proteoglucanos pequeos (decorina) y grandes (agrecano) de la matriz extracelular. Se han comparado con una glucoprotena tpica de secrecin (la ribonucleasa B pancretica). Todos estn dibujados a escala. La protena central del agrecano y de la decorina tiene cadenas de oligosacridos y cadenas de GAG, pero no se representan en la figura. El agrecano est constituido tpicamente por unas 100 cadenas de condrointn sulfato y unas 30 cadenas de queratn sulfato unidas a una protena central rica en serina de aproximadamente 3000 aminocidos. La decorina decora la superficie de las fibrillas de colgena, de ah su nombre.

Las cadenas de proteoglucanos pueden regular las actividades de molculas secretadas de sealizacin2 1
Dada la heterogeneidad estructural de los proteoglucanos, parece improbable que su funcin en la matriz extracelular se vea limitada a generar un espacio hi dratado alrededor y entre las clulas. Por ejemplo, sus cadenas de GAG pueden formar geles de poro y densidad de carga variables, que pueden actuar como cri ba selectiva para regular el trfico de molculas y de clulas en funcin de su ta mao, su carga o ambas cosas a la vez. Existen evidencias de que el proteoglucano del tipo heparn sulfato denominado perlecano tiene esta funcin en la lmina basal del glomrulo del rin, la cual filtra las molculas que pasan a la orina des de la corriente sangunea (se discute ms adelante). Se cree que los proteoglucanos participan fundamentalmente en la sealiza cin qumica entre las clulas. In vitro se unen a diversas molculas seal tales como factores de crecimiento proteicos, lo cual ha permitido suponer que algo pa recido puede ocurrir en los tejidos. Tales uniones pueden aumentar o disminuir la actividad de estos factores. Por ejemplo, el factor de crecimiento fibroblstico (FGF, de Fibroblast Growth Factor), que estimula la proliferacin de varios tipos celula res, se une a las cadenas de heparn sulfato de proteoglucanos tanto in vitro como en los propios tejidos. Para algunas clulas esta unin parece ser un paso obligado para que el FGF active su receptor de superficie celular (una tirosina quinasa transmembrana, estudiada en el Captulo 15). En la mayora de los casos las mol culas seal se unen a las cadenas de los GAG de los proteoglucanos, pero esto no

104 6

Captulo 19: Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

siempre sucede as: la ubicua protena reguladora del crecimiento, el factor de cre cimiento transformante (3 (TGF-(3 de Transforming Growth Factor), se une a la pro tena central de varios proteoglucanos de la matriz, incluyendo la decorina; esta unin a la decorina inhibe la actividad del TGF-(3. Los proteoglucanos tambin se unen y regulan las actividades de otros tipos de protenas de secrecin, tales como enzimas proteolticas (proteasas) e inhibi dores de las proteasas. La unin a un proteoglucano podra controlar la actividad de una protena de alguna de las siguientes maneras: ( 1) podra inmovilizar la protena cerca del lugar donde sta se produce, restringiendo as el alcance de su accin; (2) podra bloquear estricamente la actividad de la protena; (3) podra proporcionar una reserva de protena para su liberacin posterior; (4) podra pro teger a las protenas de degradaciones proteolticas, prolongando de este modo su accin, y (5) podra alterar o concentrar la protena para hacer ms efectiva su exposicin a los receptores de superficie celular. Se cree que los proteoglucanos actan de todas estas maneras colaborando en la regulacin de las actividades de las protenas de secrecin.

Las cadenas de GAG pueden estar altamente organizadas en la matriz extracelular20,22

Los GAG y los proteoglucanos se asocian formando enormes complejos polimricos en la matriz extracelular. Por ejemplo, las molculas de agrecano, el princi pal proteoglucano del cartlago, que se muestra en la Figura 19-37, se unen con el cido hialurnico en el espacio extracelular formando agregados que son tan grandes como una bacteria (Figura 19-38). Adems de asociarse el uno con el otro, los GAG y los proteoglucanos se aso cian con protenas fibrosas de la matriz tales como la colgena, y con redes pro teicas tales como la lmina basal, creando estructuras extremadamente com ple jas. La organizacin de las molculas de proteoglucanos en tejidos vivos es muy difcil de determinar. Debido a que son muy solubles en agua, pueden ser elim i nadas de la matriz extracelular cuando las secciones de los tejidos se exponen a soluciones acuosas durante la fijacin; as mismo, cambios de pH, condiciones

Figura 19-38 Agregado de agrecanos en el cartlago fetal bovino. (A) Electronmicrografa de un agregado de agrecanos sombreado con platino. Pueden observarse tambin muchas molculas libres. (B) Dibujo esquemtico del agregado de agrecanos gigante mostrado en (A). Est constituido por unos 100 monmeros de agrecano (cada uno de los cuales es como el mostrado en la Figura 19-37) unidos de forma no covalente a una cadena sencilla de cido hialurnico a travs de dos protenas de unin, que a su vez se unen tanto a la protena central del proteoglucano como a la cadena de cido hialurnico, estabilizando as el agregado; las protenas de unin son miembros de la familia de las hialadherinas de protenas de unin al hialurnico, explicadas anteriormente. El peso molecular de un complejo como ste es de 108o ms y ocupa un volumen equivalente al de una bacteria, que es aproximadamente 2 x 10 1 2cm3. (A, cortesa de Lawrence Rosenberg.)

1 (jm

agregados de agrecanos

protena central

molcula de acido hialuromco

protenas de unin

queratn sulfato

condroitn sulfato

La matriz extracelular de los animales

1047

fibrilla de colgena
> ^ ,:?*

Figura 19-39 Electronmicrografa en la que se observan proteoglucanos de la matriz extracelular de un cartlago de rata. El tejido fue congelado rpidamente a -196C y fijado y contrastado en estas condiciones (mtodo denominado de con gelacin substitucin), evitando as el colapso de las cadenas de GAG. Las molculas de proteoglucanos pueden observarse como una fina red filamentosa que contiene una fibrilla de colgena. Las regiones ms contrastadas corresponden a las protenas centrales, mientras que las que muestran una menor intensidad corresponden a las cadenas de glucosaminoglucanos. (Reproducido de E.B. Hunziker y R.K. Schenk, /. C ellB iol. 98: 277-282, 1984, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

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0,5 pm

inicas u osmticas, pueden alterar drsticamente su conformacin. As pues, para poderlas visualizar in vivo se han tenido que utilizar mtodos especiales (Figura 19-39).

Los proteoglucanos de superficie celular actan como correceptores

No todos los proteoglucanos son com ponentes secretados de la matriz extrace lular. Algunos de ellos, tales com o la serglicina, son constituyentes de los grnulos de secrecin, donde intervienen en el empaquetamiento y acumulacin de molculas de secrecin. Otros son com ponentes integrales de las membranas plasmticas y tienen su protena central insertada a travs de la bicapa lipdica, o unida a sta mediante un anclaje de glucosilfosfatidilinositol (GPI, de glycosylphosphatidylinositol). Entre los proteoglucanos m ejor caracterizados de membrana plasmtica se encuentran los sindecanos, los cuales poseen una protena central que atraviesa la membrana. El dominio extracelular de este proteoglucano transmembrana tiene un nmero variable de cadenas GAG de condroitn sulfato y heparn sulfa to, mientras que su dominio intracelular se cree que interacta con la actina del citoesqueleto en el crtex celular. Los sindecanos se encuentran en la superficie de muchos tipos celulares, incluyendo los fibroblastos y las clulas epiteliales, donde actan junto con las integrinas como receptores para la colgena, la fibronectina, y otras protenas de la matriz a las cuales se unen. Como ya hemos mencionado anteriormente, los sindecanos tambin se unen al factor de creci miento del fibroblasto (FGF) presentndolo a protenas receptoras de FGF de la misma clula. De un modo parecido, otro proteoglucano de membrana plasm tica, denominado betaglicano, se une al factor de crecimiento transformante (3 (TGF-P) presentndolo a sus receptores especficos. As pues, los proteoglucanos de membrana plasmtica actan como corre ceptores que colaboran con protenas receptoras de superficie celular conven cionales, tanto en la unin celular a la matriz extracelular como iniciando la res puesta de las clulas a algunos factores de crecimiento. Los proteoglucanos descritos en este captulo estn resumidos en la Tabla 19-3.

Las colgenas son las protenas ms abundantes de la matriz extracelular 23

Las colgenas constituyen una gran familia de protenas fibrosas que se encuen tran en todos los animales pluricelulares. Son secretadas por las clulas del teji do conjuntivo y por otros tipos celulares. Son los componentes ms abundantes de la piel y de los huesos, por lo que son las protenas ms abundantes en mam feros, constituyendo el 25% de la masa total de protena en estos animales. El

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Captulo 19: Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

Tabla 19-3 Algunos proteoglucanos comunes Peso molecular aproximado de la protena central Nmero de cadenas GAG Localizacin -130 cartlago superficie celular y matriz amplia distribucin en tejidos conjuntivos lmina basal vesculas de secrecin en glbulos blancos superficie de fibroblastos y de clulas epiteliales

Proteoglucano Agrecano Betaglicano Decorina

Tipo de cadenas GAG condroitn sulfato + keratn sulfato condroitn sulfato/ dermatn sulfato condroitn sulfato/ dermatn sulfato heparn sulfato condroitn sulfato/ dermatn sulfato condroitn sulfato + heparn sulfato

Funciones soporte mecnico; forma grandes agregados con el cido hialurnico se uneaTGF-P se une a fibrillas de colgena de tipo I y aTGF-P estructural y filtrante en la lmina basal ayuda al empaquetamiento y almacenamiento de molculas de secrecin adhesin celular; se une a FGF

210 000
36 000 40 000 600 000

1 1
2-15 10-15

Perlecano Serglicina

20 000
32 000

Sindecano 1

1-3

rasgo ms caracterstico de las molculas de colgena es su longitud, rigidez y estructura helicoidal de tres hebras, en la cual tres cadenas polipeptdicas de co lgena, denominadas cadenas a, se enrollan sobre s mismas formando una superhlice sem ejante a un rodillo. Las colgenas son muy ricas en prolina y glici na, las cuales son importantes en la formacin de la hlice de tres hebras. Debido a su anillo, la prolina estabiliza la conformacin helicoidal en cada una de las cadenas a, mientras que la glicina se encuentra espaciada regularmente, cada tres residuos de aminocido, a lo largo de la regin central de las cadenas a. Al ser el aminocido ms pequeo (slo tiene un tomo de hidrgeno como cadena lateral), la glicina favorece el denso empaquetamiento de las tres cade nas helicoidales a formando la superhlice de colgena (Figura 19-40). Hasta el momento, se han identificado alrededor de unas 25 cadenas a dis tintas de colgena, cada una de las cuales est codificada por un gen diferente. En los diferentes tejidos se expresan diversas combinaciones de estos genes. Aunque, en principio, se pueden formar ms de 10 000 tipos de molculas de co lgena de triple hlice a partir de las aproximadamente 25 cadenas a, slo se han identificado 15 tipos de molculas de colgena. Los principales tipos de colge na encontrados en el tejido conjuntivo son los tipos I, II, III, V y XI, siendo el tipo I el principal de la piel y huesos, y con diferencia el ms abundante. Constituyen las colgenas fibrilares y presentan una estructura fibrosa que hemos descrito

glicina

Figura 19-40 Estructura tpica de una molcula de colgena. (A) Modelo de una regin de una cadena a de colgena en la que cada aminocido est representado por una esfera. La cadena contiene alrededor de 1000 residuos de aminocido, estando estructurada como una hlice levgira de tres residuos de aminocido por vuelta, de los que el tercero es una glicina. Por lo tanto cada cadena a est constituida por secuencias Gly-X-Y, donde X e Y pueden ser cualquier aminocido (aunque habitualmente X es una prolina e Y una hidroxiprolina). (B) Modelo de una zona de la molcula de colgena en la que las tres cadenas a, cada una de ellas representada en un color distinto, estn enrolladas entre s dando lugar a una triple hlice. La glicina es el nico aminocido pequeo que puede ocupar el eje de la triple hlice. Slo se muestra una pequea regin de la molcula; la molcula entera tiene unos 300 nm de longitud. (Esquema realizado a partir del modelo propuesto por B.L. Trus.)

fie.

1,5 nm

La matriz extracelular de los animales

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Figura 19-41 Electronmicrografa de fibroblastos rodeados por fibrillas de colgena en el tejido conjuntivo de la piel de un embrin de pollo. Las
fibrillas, organizadas en haces orientados perpendicularmente, son sintetizadas por los fibroblastos. Estas clulas contienen un retculo endoplasmtico abundante donde se sintetizan protenas de secrecin tales como la colgena. (De C. Ploetz, E.I. Zycband, and D.E. Birk, /. Struct. Biol. 106:73-81,1991.)

com o la molcula tpica de colgena. Una vez secretados al espacio extracelular, estos tipos moleculares se organizan en unos polmeros ordenados denomina dos fibrillas de colgena, delgados (entre 10 y 300 nm de dimetro), de varios cientos de m icrmetros de longitud en tejidos maduros, y bien visibles al m i croscopio electrnico (Figura 19-41 y vase Figura 19-39). Las fibrillas de colge na se agregan habitualm ente formando haces, las cuales pueden observarse al microscopio electrnico com o fibras de colgena de varios micrmetros de di metro. Los tipos IX y XII son las denominadas colgenas asociadas a fibrillas, ya que decoran la superficie de las fibrillas de colgena; se cree que unen a las fibri llas entre s y a otros com ponentes de la matriz extracelular. Los tipos IV y VII son las colgenas form adoras de redes: las molculas de tipo IV se unen en una especie de lmina o red que constituye la mayor parte de la lmina basal madu ra, m ientras que las molculas del tipo VII forman dmeros que se ensamblan formando estructuras especializadas denominadas fibras de anclaje, las cuales ayudan a unir la lmina basal del epitelio pluriestratificado al tejido conjuntivo subyacente y por esta razn son especialmente abundantes en la piel. Los tipos de colgena descritos se sistematizan en la Tabla 19-4.

Tabla 19-4 Algunos tipos de colgena y sus propiedades Tipo FORMADORAS DE FIBRILLAS (FIBRILARES) I Frmula molecular [alfl)] 2 o2(I) Frmula polimerizada fibrilla Distribucin en tejidos hueso, piel, tendn, ligamentos, crnea, rganos internos (supone el 90% de la colgena del cuerpo) cartlago, disco intervertebral, notocorda, humor vitreo del ojo piel, vasos sanguneos, rganos internos como para el tipo I como para el tipo II cartlago tendn, ligamentos, algunos otros tejidos lmina basal epitelio escamoso estratificado inferior

II III V XI ASOCIADAS A FIBRILLAS IX XII FORMADORAS DE REDES IV VII

[<xl(II)]3 [cxl (III)]3 [al(V)] 2 ot2 (V) al(XI)cx2(XI)a3(XI) a 1(IX) a2 (IX) a3 (IX) [al (XII)]3 con algunas fibrillas de tipo I [al(IV)]2 a2(IV) [al(VH)]3

fibrilla fibrilla fibrilla (con tipo I) fibrilla (con tipo II) asociacin lateral asociacin lateral red laminar fibrillas de anclaje

Ntese que los tipos I, IV, V y XI estn compuestos de 2 o 3 tipos de cadenas a, mientras que los tipos II, III, VII y XII estn compuestos nica mente de un solo tipo de cadena a cada uno. Solamente se muestran 9 tipos de colgenas, pero hasta ahora se han definido unos 15 tipos de colgena y unos 25 tipos de cadenas a.

105 0

Captulo 19 : Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

La mayora de las protenas que contienen un patrn repetitivo de am ino cidos han evolucionado por duplicaciones de secuencias de DNA. Las colgenas fibrilares se originan, aparentemente, de esta manera. Los genes que codifican las cadenas a de la mayora de estas colgenas son muy largos (por encim a de las 44 kilobases de longitud) y contienen unos 50 exones. La mayora de los exones tienen 54 nucletidos, o mltiplos de 54, lo cual sugiere que estas colgenas se originan por duplicaciones mltiples de un gen inicial que contena 54 nu cletidos y que codificaba exactamente repeticiones de seis Gly-X-Y (vase Figu ra 19-40).

Los m olculas de colgena son secretadas con unas extensiones no helicoidales en cada una de las regiones term inales 23,24
Cada una de las cadenas polipeptdicas de colgena es sintetizada por los ribosomas unidos a membrana e incorporada a la luz del retculo endoplasmtico (ER) como grandes precursores, denominados procadenas a. Estos precursores no slo poseen en la regin amino terminal el pptido seal necesario para transportar el polipptido naciente a travs de la membrana del ER, sino que tambin presentan otros aminocidos suplementarios, denominados propptidos, situados en las regiones amino y carboxilo terminales. En la luz del ER deter minados residuos de prolina y lisina son hidroxilados para formar hidroxiprolina e hidroxilisina respectivamente, y algunos de los residuos de hidroxilisina son glucosilados. A continuacin cada procadena a se combina con otras dos m e diante enlaces de hidrgeno, formando la molcula helicoidal de triple hebra, denominada procolgena. Las formas secretadas de colgenas fibrilares (pero no los otros tipos de colgena), son convertidas en el espacio extracelular en mol culas de colgena mediante la liberacin de los propptidos (vase Figura 19-43). Los residuos de hidroxilisina e hidroxiprolina (Figura 19-42) raramente se encuentran en otras protenas, aunque la hidroxiprolina es abundante en algu nas protenas que se encuentran en la pared celular de vegetales. Parece que en la colgena los grupos hidroxilo de estos aminocidos forman enlaces de hidr geno entre las cadenas colaborando en la estabilizacin de la hlice de triple he bra. As por ejemplo, las condiciones que inhiben la hidroxilacin de la prolina, tal como una deficiencia de cido ascrbico (vitamina C), tienen graves conse cuencias. En el escorbuto, una enfermedad causada por una deficiencia de vita mina C en la dieta que era frecuente en marineros hasta el siglo pasado, las pro cadenas a defectuosas no pueden formar la triple hlice, siendo degradadas dentro de la clula. En consecuencia, debido a la prdida progresiva del colge na normal preexistente en la matriz, los vasos sanguneos adquieren una extre mada fragilidad y los dientes van perdiendo su fijacin. Ello implica que en estos tejidos la degradacin y renovacin de la colgena son relativamente rpidas. Sin embargo, en muchos otros tejidos adultos, se cree que el recambio de la co lgena (as como el de otras macromolculas de la matriz extracelular) es muy lento: en el tejido seo, por poner un caso extremo, las molculas de colgena pueden persistir hasta 10 aos antes de que sean degradadas y reemplazadas. Por el contrario, la mayora de las protenas celulares tienen vidas medias del or den de horas o das.

I
H CH ch

I I O
C N-

N C C

2 2 2
/
CH

H C OH CH NH

CH

CHn

OH

Despus de su secrecin, las molculas fibrilares de procolgena son degradadas hasta molculas de colgena, las cuales se organizan en fibrillas 23,24,25
Despus de su secrecin, los propptidos de las molculas de procolgena fibrilar son degradados mediante enzimas proteolticas especficas en el exterior ce lular. Ello convierte las molculas de procolgena en molculas de colgena, las cuales se asocian en el espacio extracelular formando fibrillas de colgena mu cho mayores. Los propptidos presentan, como mnimo, dos funciones: (1) diri gen la formacin intracelular de la triple hebra de las molculas de colgena; y

en una protena

h id r o x i s n a

en una protena

h id ro xip ro lin a

Figura 19-42 Residuos de hidroxilisina e hidroxiprolina. Estos

aminocidos modificados son abundantes en la colgena; son sintetizados por enzimas que actan despus de que la lisina y la prolina se hayan incorporado a las molculas de procolgena.

La matriz extracelular de los animales

1051

1. SNTESIS DE LA PROCADENA a
2. HIDROXILACIN DE DETERMINADOS RESIDUOS DE ^ PROLINA Y > LISINA H2N 3. G LUCOS ILACIN DE / DETERMINADOS RESIDUOS / DE HIDROXILISINA ' Q COOH H2N propptido 4. AUTOENSAMBLAJE DE LAS TRES CADENAS PRO a 3 procadenas a 5. FORMACIN DE LA TRIPLE HLICE DE PROCOLGENA 9. AGREGACION DE LAS FIBRILLAS DE COLGENA DANDO LUGAR A UNA FIBRA ..

fibra de colgena 0,5-3 |jm

vescula de secreccion
'OH OH OH 6. SECRECIN m em brana plasm atica

com partim iento ER/Golg

OH ^OHOHOH m olcula de procolgena

10-300 7. ESCISIN DE LOS H ^OHOHOH " 8. AUTOENSAMBLAJE nm PROPPTIDOS m olcula DE LA FIBRILLA J de colgena

fib rilla de colgena

(2) debido a que slo son eliminados despus de su secrecin, previenen la for m acin intracelular de las grandes fibrillas de colgena, lo cual sera catastrfico para la clula. El proceso de formacin de fibrillas est dirigido en parte por la tendencia que presentan las molculas de colgena a autoensamblarse, ya que son ms de 1000 veces m enos solubles que las molculas de procolgena. Las fi brillas empiezan a formarse cerca de la superficie celular, a menudo en invagi naciones de la m em brana plasmtica formadas por la fusin en tndem de ves culas secretoras con la superficie celular. Por lo tanto, el citoesqueleto de las regiones ms externas puede influir en los lugares, velocidades y orientacin del ensam blaje fibrilar. En la Figura 19-43 se resumen los diversos pasos de la sntesis y ensamblaje de las fibrillas de colgena. Dado el gran nmero de pasos enzimticos implica dos en la formacin de la fibrilla de colgena, no es sorprendente que hayan mu chas enfermedades genticas que afecten la formacin de la fibrilla. Mutaciones que afectan a la colgena ele tipo I causan la osteognesis imperfecta, caracteriza da por una debilidad sea que fcilmente conduce a su fractura. Las mutaciones que afectan a la colgena de tipo II causan condrodisplasias , que se caracteriza das por un cartlago anormal que conduce a deformidades en huesos y articula ciones. Las mutaciones que afectan a la colgena de tipo III causan el sndrome de Ehlers-Danlos, que se caracteriza por la fragilidad en la piel y vasos sangune os y por articulaciones hipermviles. Al microscopio electrnico, las fibrillas de colgena presentan estras trans versales caractersticas cada 67 nm, que reflejan el empaquetamiento escalona do y peridico de molculas de colgena individuales en la fibrilla (Figura 1944). Despus de formarse en el espacio extracelular, las fibrillas se refuerzan mediante la formacin de enlaces covalentes cruzados entre residuos de lisina de las molculas de colgena constituyentes (Figura 19-45). Los tipos de enlaces

Figura 19-43 Procesos intra y extracelulares implicados en la formacin de una fibrilla de colgena.
Obsrvese que las fibrillas de colgena se ensamblan en el espacio extracelular contenido en una gran invaginacin de la membrana plasmtica. Se muestra el posterior ensamblaje en grandes fibras de colgena, las cuales son visualizadas en el microscopio ptico, a modo de ejemplo de cmo las fibrillas de colgena pueden formar estructuras ordenadas en el espacio extracelular. No se muestran los puentes cruzados que estabilizan los agregados extracelulares.

105 2

Captulo 19: Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

contrastado dbil de una regin sin espacios

espacio entre m olculas de colgena

m olcula de colgena contrastado por metal pesado entre m olculas

Figura 19-44 El solapamiento de las molculas de colgena da lugar al patrn estriado observado en fibrillas contrastadas negativamente.
(A) Debido a que el agente contrastante slo ocupa los espacios existentes entre las molculas, stos se observarn com o bandas oscuras. En la parte inferior de la figura se muestra una electronmicrografa de una fibrilla contrastada negativamente (B). El solapamiento de las molculas de colgena potencia la fuerza de tensin del agregado. (B, cortesa de Robert Home.)

covalentes implicados slo se han encontrado en el colgena y la elastina. Si las uniones cruzadas se inhiben, la fuerza de tensin de las fibrillas disminuye drs ticamente; los tejidos de colgena se vuelven frgiles, y estructuras tales como la piel, los tendones y los vasos sanguneos tienden a desgarrarse. La extensin y el tipo de uniones cruzadas vara de un tejido a otro: por ejemplo, la colgena tiene muchas uniones cruzadas en el tendn de Aquiles, donde la fuerza tensora es crucial.

Las colgenas asociadas a fibrillas organizan estas fibrillas 26

A diferencia de los GAG, los cuales resisten fuerzas de compresin, las fibrillas de colgena forman estructuras que resisten fuerzas de traccin. Las fibrillas pue den presentar un dimetro muy variable y estn organizadas de distintas m ane ras en los diferentes tejidos. Por ejemplo, en la piel de los mamferos estn orga nizadas espacialmente a modo de un cesto de mimbre, lo que permite la oposicin a las tracciones ejercidas desde mltiples direcciones. En los tendones estn organizadas en haces paralelos alineados a lo largo del eje principal de tensin. Por ltimo, en el tejido seo adulto y en la crnea se disponen en lmi nas delgadas y superpuestas, de forma que las fibrillas de cada lmina discurren paralelamente una a otra, pero forman un ngulo recto con las de las capas ad yacentes. Esta misma organizacin se observa en la piel del renacuajo, la cual sirve como ejemplo de este tipo de disposicin (Figura 19-46).

Figura 19-45 Enlaces covalentes intra

e intermoleculares en las fibrillas de colgena formados entre cadenas laterales de lisina modificadas. Los
enlaces se forman siguiendo una serie de pasos. En primer lugar, algunos residuos de lisina y de hidroxilisina son desaminados por la enzima extracelular lisil oxidasa, que da lugar a grupos aldehido altamente reactivos. Estos grupos reaccionan espontneamente formando enlaces covalentes entre s o con otros residuos de lisina o hidroxilisina. La mayora de los puentes se forman entre los cortos segmentos no helicoidales de los extremos de la molcula de colgena.

enlaces intram oleculares

enlaces interm oleculares

La matriz extracelular de los animales

1053

Las propias clulas del tejido conjuntivo determinan el tamao y la organi zacin de las fibrillas de colgena. Las clulas pueden expresar uno o ms de los genes que codifican los diferentes tipos moleculares de procolgena fibrilar. Pero incluso fibrillas compuestas por una misma mezcla de molculas de col gena fibrilar presentan diferentes organizaciones en tejidos diferentes. Cmo se consigue? Parte de la respuesta radica en que las clulas pueden regular la dis posicin de las molculas de colgena despus de su secrecin mediante la for m acin de fibrillas de colgena directoras que estn en ntima relacin con la m em brana plasm tica (vase Figura 19-43). Adems, como la organizacin es pacial de las fibrillas de colgena refleja, al menos en parte, sus interacciones con otras molculas de la matriz, las clulas pueden influir en esta organizacin secretando, junto con las colgenas fibrilares, diferentes tipos y cantidades de otras m acrom olculas de la matriz. Se cree que las colgenas asociadas a fib ri llas, tales com o las molculas de colgena de los tipos IX y XII, son especial m ente im portantes en este sentido. Difieren de las colgenas fibrilares en varios aspectos. (1) Su estructura helicoidal de triple hebra est interrumpida por uno o dos cortos dominios no helicoidales, los cuales hacen que las molculas sean ms flexibles que las molculas de colgena fibrilares. (2) No son fragmentadas despus de la secrecin, reteniendo as sus propptidos. (3) No se agregan entre s formando fibrillas en el espacio extracelular, sino que se unen de forma pe ridica a la superficie de fibrillas formadas por colgenas fibrilares: las m olcu las del tipo IX se unen a fibrillas de colgena del tipo II en el cartlago, la crnea y el vitreo del ojo (Figura 19-47), mientras que las molculas del tipo XII se unen a fibrillas que contienen colgena del tipo I en tendones y otros tejidos. Se cree que las colgenas asociados a fibrillas median las interacciones de fibrillas de colgena entre s y con otras macromolculas de la matriz. De esta forma inter vienen parcialmente en la organizacin de las fibrillas en la matriz.

5 nm
Figura 19-46 Electronmicrografa correspondiente a una seccin transversal de piel de renacuajo.
Obsrvese el ordenamiento multilaminar de las fibrillas de colgena, en el que las sucesivas capas de fibrillas estn orientadas en ngulos rectos. Dicho ordenamiento se encuentra tambin en el hueso maduro y en la crnea. (Cortesa de Jerome Gross.)

Las clulas participan de la organizacin de las fibras de colgena que secretan ejerciendo tensiones m ecnicas sobre la m atriz 27
Existe otra va m ediante la cual las clulas secretoras de colgena pueden deter minar la organizacin espacial de la matriz que producen. Los fibroblastos act an sobre la colgena que han secretado, ejerciendo tracciones y desplazndose sobre ellas -colaborando en su com pactacin en lminas y en la formacin de fi bras. Este papel m ecnico que asumen los fibroblastos en la conformacin de las matrices de colgena se ha demostrado, de forma patente, en los cultivos ce-

m olcula de colgena de tip o IX (A) fib rilla de colgena de tipo II

(O Figura 19-47 Colgena del tipo IX. (A) Dibujo esquemtico de la unin de molculas de colgena de tipo IX unidas, siguiendo un patrn peridico, a la superficie de una fibrilla conteniendo colgena de tipo II. (B) Electronmicrografa obtenida mediante sombreado por rotacin de una fibrilla que contiene colgena de tipo II recubierta por molculas de colgena de tipo IX obtenidas de cartlago; (C) molcula individual de colgena de tipo IX. (B y C, de L. Vaughan et al.,/. C ellB iol. 106:991-997, 1988, reproducido con permiso de copyright por The Rockefeller University Press.)

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Captulo 19: Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

Figura 19-48 Formacin de la matriz extracelular por las clulas. Micrografa de la regin situada entre dos fragmentos del corazn embrionario de pollo (rico tanto en fibroblastos como en fibras musculares) que han crecido en cultivo sobre un gel de colgena durante cuatro das. Entre los explantes se ha formado una densa lmina de fibras alineadas de colgena, probablemente como resultado de la fuerza de traccin ejercida por los fibroblastos sobre la colgena. (De D. StopackyA.K. Harris, Dev. Biol. 90:383-398,1982.)

hilares. Cuando los fibroblastos son cultivados en una placa en la que existe una matriz gelificada de fibrillas de colgena distribuidas totalmente al azar, las clu las tiran de la matriz, ejerciendo traccin sobre la colgena situado a su alrede dor, lo cual hace que el gel se contraiga hasta alcanzar un volumen que es una pequea fraccin de su volumen inicial; mediante estrategias similares, un gru po de fibroblastos puede rodearse de una cpsula de fibras de colgena, densa mente empaquetadas y orientadas siguiendo una circunferencia. Cuando dos pequeos fragmentos de tejido embrionario que contienen fi broblastos se colocan separados sobre un gel de colgena, la colgena tiende a organizarse formando una estrecha banda de fibras alineadas que conectan am bos explantes (Figura 19-48). Posteriormente, los fibroblastos migran a partir de dichos explantes siguiendo estas fibras de colgena. En consecuencia, los fibro blastos ejercen una influencia sobre la alineacin de las fibras de colgena y, rec procamente, stas afectan la distribucin de los fibroblastos. Probablemente los fibroblastos juegan un papel similar a ste en la generacin de un ordenamiento, de largo alcance, sobre la matriz extracelular del organismo -p or ejemplo, facili tando la formacin de tendones y ligamentos, o tambin las densas y resistentes lminas de tejido conjuntivo que encapsulan y unen la mayora de rganos.

La elastina confiere a los tejidos su elasticidad 28

Muchos tejidos de vertebrados, como la piel, los vasos sanguneos y los pulmo nes, han de ser elsticos y resistentes a la tensin para ser funcionales. Una red de fibras elsticas en la matriz extracelular de estos tejidos les confiere la capa cidad de recobrar su conformacin inicial despus de una deformacin transito ria. Las fibras elsticas son por lo menos cinco veces ms extensibles que una banda de goma con la m isma rea de seccin transversal. Intercaladas con las fi bras elsticas, se encuentran largas fibras de colgena, inelsticas, que limitan la capacidad de extensin, evitando el desgarro tisular. El componente principal de las fibras elsticas es la elastina, una protena muy hidrofbica, de unos 750 residuos de aminocidos de longitud, y que, como la colgena, es extraordinariamente rica en prolina y glicina, pero a diferencia de ella no est glucosilada y presenta un bajo contenido en hidroxiprolina y carece de hidroxilisina. Las molculas de elastina son secretadas al espacio extracelular y se ensam blan formando fibras elsticas prximas a la membrana plasmtica, generalmente en zonas invaginadas de la superficie celular. Despus de la secre cin, las molculas de elastina forman numerosos puentes cruzados, dando lu

La matriz extracelular de los animales

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Figura 19-49 Red de bras elsticas.

Electronmicrografas a bajo aumento que muestran un segmento de la aorta de perro (A), y a mayor aumento, la densa red de fibras elsticas orientadas en otra capa del mismo vaso sanguneo (B). El resto de com ponentes han sido digeridos por medio de enzimas y cido frmico. (De K.S. Haas, S.J. Phillips, A.J. Comerota, y J.W. White, Anat. Rec. 230:86-96, 1991.)

(A)

1 mm

gar a una extensa red de filamentos y lminas (Figura 19-49). Dichos puentes se forman entre residuos de lisina, mediante el mismo mecanismo que por el que se forman en las molculas de colgena. La elastina est constituida en su mayor parte por dos tipos de segmentos cortos que se alternan a lo largo de la cadena polipeptdica -segm entos hidrofbicos que son los responsables de las propiedades elsticas de la molcula, y segmentos de hlice a ricos en alanina y lisina que forman puente cruzados en tre molculas adyacentes. Cada segmento est codificado por un exn diferente. Sin embargo todava se discute la conformacin de las molculas de elastina en las fibras elsticas y cmo la estructura de estas fibras justifica sus propiedades elsticas. Desde un punto de vista, la cadena polipeptdica de elastina, como las cadenas polimricas en una goma corriente, adoptan una conformacin de es piral al azar, y es esta estructura la que permite a la red estirarse y contraerse como una banda elstica (Figura 19-50). Las fibras elsticas no slo estn compuestas por elastina. El ncleo de la elastina est cubierto por una envoltura de microfibrillas, cada una de las cuales tiene un dimetro de unos 10 nm. Las fibras elsticas siempre contienen microfibrillas, pero las microfibrillas tambin pueden encontrarse en matrices extracelulares que no contienen elastina. Las microfibrillas estn constituidas por varias glucoprotenas distintas, incluyendo la glucoprotena fibrilina, que parece jugar un papel esencial en el mantenimiento de la integridad de las fibras elsticas. Al-

fibra elstica

Figura 19-50 Estiramiento de una red de molculas de elastina. Las

molculas de elastina estn unidas entre s mediante enlaces covalentes (indicados en rojo) dando lugar a una red entrecruzada. El modelo muestra cmo cada molcula de elastina puede expandirse y contraerse como una espiral al azar, de modo que el conjunto de la red tambin puede hacerlo, como una goma elstica.

EXTENSION

RELAJACION m olcula de elastina

105 6

Captulo 19 : Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

gunas mutaciones del gen de la fibrilina dan lugar al sndrome de Marfan, una en fermedad gentica humana relativamente comn que afecta a los tejidos conjun tivos ricos en fibras elsticas; en los individuos afectados de forma ms severa, la aorta (cuyas paredes son ricas en elastina -vase Figura 19-49) es propensa al desgarro. Se cree que las microfibrillas juegan un importante papel en el ensam blaje de las fibras elsticas. Aparecen antes que la elastina durante el desarrollo de los tejidos y parece que constituyen un andamio sobre el cual son depositadas las molculas de elastina secretadas. Cuando la elastina es depositada, las microfibrillas empiezan a desplazarse hacia la periferia de la fibra en crecimiento.

La fibronectina es una protena extracelular adhesiva que contribuye a la adhesin de la clula a la matriz 29
La matriz extracelular contiene varias protenas adhesivas diferentes de la col gena que tpicamente presentan varios dominios, cada uno de los cuales tiene lugares de unin especficos para otras macromolculas de la matriz y para re ceptores de la superficie celular. De esta forma estas protenas facilitan tanto la organizacin de la matriz como el anclaje de las clulas a la matriz. La primera de ellas en ser bien caracterizada fue la fibronectina, una voluminosa glucoprotena presente en todos los vertebrados. La fibronectina es un dmero com pues to por dos subunidades muy largas unidas mediante un par de enlaces disulfuro situados cerca del extremo carboxilo terminal. Cada subunidad est plegada en una serie de dominios semejantes a un rodillo, funcionalmente distintos, sepa rados por regiones flexibles de la cadena polipeptdica (Figura 19-51A y B). A su vez, estos dominios estn compuestos por unos mdulos ms pequeos, cada uno de los cuales se repite en serie, y est codificado por un exn independiente, lo que sugiere que el gen de la fibronectina, como los genes de la colgena, se producen por duplicaciones mltiples de exones. El principal tipo de mdulo, denominado repeticin de fibronectina tipo III, tiene unos 90 residuos de ami nocido de longitud y se repite al menos 15 veces en cada subunidad (Figura 1951C). Esto tambin se ha encontrado en otras protenas de matriz, as como en algunas protenas plasmticas y citoplasmticas. Una manera de analizar una protena compleja multifuncional como la fi bronectina es cortar la molcula en sus diferentes dominios y determinar su fun cin. Para ello, la protena fue tratada con bajas concentraciones de una enzima proteoltica, que corta la cadena polipeptdica en las regiones de conexin entre

Figura 19-51 Estructura de un dmero de fibronectina. Como se muestra esquemticamente en (A), las dos cadenas polipeptdicas son similares pero no idnticas (estn sintetizadas por el mismo gen pero son el resultado de una maduracin diferencial de mRNA), y estn unidas por puentes disulfuro cerca del extremo carboxilo. Cada cadena tiene por lo menos 2500 residuos de aminocido y est plegada en cinco o seis dominios en forma de varilla conectados mediante segmentos polipeptdicos flexibles. Cada dominio se especializa en la unin a una molcula determinada o a una clula, como se indica en tres de los dominios. Para simplificar no se muestran todos los lugares de unin (por ejemplo, existen otros lugares de unin a la clula). (B) Electronmicrografa de molculas sombreadas con platino; las flech a s sealan el extremo carboxilo. (C) Estructura tridimensional, determinada por resonancia magntica nuclear, de una secuencia repetida de fibronectina de tipo III. Es el principal tipo de mdulo de repeticin de fibronectina, y tambin ha sido encontrado en muchas otras protenas. La secuencia Arg-GlyAsp (RGD) muestra la regin aislada del mayor lugar de unin a la clula (indicado en a zu l en [A]) que describimos en el texto. (B, de J. Engel et al., /. Mol. Biol. 150:97-120, 1981. Academic Press Inc. [London] Ltd.; C, adaptado de A.L. Main, T.S. Harvey, M. Barn, J. Boyd e I.D. Campbell, Cell 71:671-678,1992. Cell Press.)

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(C )

La matriz extracelular de los animales

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los dominios alargados pero deja estos dominios intactos, de modo que puede estudiarse la capacidad de unin de cada dominio. De esta forma se demostr que un dominio se una a la colgena, otro a receptores especficos de superficie de varios tipos celulares y as sucesivamente (vase Figura 19-51). Cuando se ha aislado un dominio responsable de la unin a clulas, por ejemplo, su secuencia de aminocidos puede ser determinada y pueden prepararse pptidos corres pondientes a diferentes segmentos del dominio. Estos pptidos fueron utilizados para localizar las regiones responsables de la unin celular, y luego identificar una secuencia tripeptdica especfica (Arg-Gly-Asp, o RGD), que fue encontrada en una de las repeticiones de tipo III (vase Figura 19-51C) como una caracters tica bsica del lugar de unin. Incluso pptidos muy cortos que contienen esta secuencia RGD com piten con la fibronectina por el lugar de unin de las clulas, inhibiendo su adhesin a la fibronectina de la matriz. Si estos pptidos se inm o vilizan sobre una superficie slida, las clulas se adhieren a ella. La secuencia RGD no est restringida a la fibronectina. De hecho su presencia es habitual en diversas protenas extracelulares de adhesin, siendo reconocida por varios miembros de receptores de superficie de la familia de las integrinas que unen di chas protenas (se estudia ms adelante). Sin embargo, cada receptor reconoce su propio grupo reducido de molculas de la matriz, lo cual indica que la fuerte unin al receptor requiere algo ms que la secuencia RGD.

Las diversas form as de fibronectina son producto de una maduracin alternativa del RNA29,30
La fibronectina puede presentar diversas formas (isoformas), incluyendo tam bin la denominada fibronectina plasmtica, la cual es soluble y circula por san gre y por otros fluidos del organismo, donde se cree que incrementa la coagula cin de la sangre, la cicatrizacin de las heridas y la fagocitosis. El resto de formas se organizan en la superficie celular depositndose en la matriz extrace lular com o filam entos de fibronectina muy insolubles. En estas formas de la m a triz y de superficie celular, los dmeros de fibronectina se unen a otros mediante enlaces disulfuro complementarios; a diferencia de las molculas de colgena fibrilar, las cuales en solucin se autoensamblan generando fibrillas, las m olcu las de fibronectina se unen en filamentos slo en la superficie de ciertas clulas, lo que sugiere que son protenas complementarias necesarias para la formacin de filamentos. Todas las formas de fibronectina estn codificadas por un solo gen de unos 50 kilobases de longitud y que contiene alrededor de 50 exones de tamao simi lar. La transcripcin produce una nica molcula de RNA, la cual puede recombinarse alternativamente por tres regiones, dependiendo del tipo celular y del estadio de desarrollo de que se trate. En humanos se producen alrededor de 20 RNA m ensajeros distintos, cada uno de los cuales codifica alguna subunidad de fibronectina distinta. Por ejemplo, la fibronectina plasmtica, que es secretada principalmente por las clulas hepticas, carece de dos repeticiones del tipo III que se encuentran en formas de fibronectina asociadas a clulas y matriz. En al gunos casos la maduracin alternativa aade o suprime un lugar de unin celular especfico de un tipo de clula: uno de estos lugares es utilizado por los linfocitos para adherirse a la fibronectina. Probablem ente la maduracin alternativa permite a la clula sintetizar el tipo de fibronectina que sea ms apropiada para las necesidades del tejido. El modelo de recom binacin de RNA para la fibronectina en el estadio em briona rio temprano es diferente del observado despus del desarrollo; pero si la piel del adulto se lesiona, el modelo de recom binacin del RNA para la fibronectina en la base de la herida cam bia de nuevo al modelo observado en las primeras etapas del desarrollo. Estas observaciones indican que las formas de fibronecti na producidas en el estadio embrionario temprano y en heridas cicatrizantes son apropiadas sobre todo para promover las migraciones celulares y la prolife racin requerida para el desarrollo del tejido y su reparacin.

10 5 8

Captulo 19: Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

La importancia crucial de la fibronectina en el desarrollo animal ha sido de mostrada de manera espectacular a partir de experimentos de inactivacin gnica (knockout). Por ejemplo, ratones en los que ambas copias del gen que codifica la fibronectina estn inactivadas por mutacin, mueren en los primeros estadios de la embriognesis. El ratn mutante tiene mltiples defectos morfolgicos, en tre los que se incluyen anomalas en la formacin de la notocorda, somitos, cora zn, vasos sanguneos, tubo neural y membranas extraembrionales.

Las glucoprotenas de la matriz ayudan a determinar las vas de m igracin celular 31

La fibronectina no slo juega un papel importante en la adhesin celular a la matriz, sino que tam bin actan como gua de las migraciones celulares en los embriones de vertebrados. Por ejemplo, se han encontrado grandes acmulos de fibronectina en la va seguida por clulas mesodrmicas en migracin duran te la fase de gstrula en anfibios (estudiada en el Captulo 21). La migracin de estas clulas puede inhibirse, durante el desarrollo embrionario del anfibio, m e diante la inyeccin de diversos ligandos que alteren la capacidad de las clulas a unirse a la fibronectina: tanto anticuerpos contra la fibronectina como pptidos que contengan el tripptido de unin celular RGD pero que carezcan de los do minios de unin a la matriz de la fibronectina y anticuerpos contra las integrinas que actan como receptores para la fibronectina en todas estas clulas, inhiben la migracin. Probablemente la fibronectina estimula la migracin celular facili tando la unin de las clulas a la matriz. El efecto debe de estar finamente equili brado de manera que las clulas en migracin se adhieran a la matriz, pero no permanezcan inmovilizadas sobre ella. Se cree que m uchos tipos de molculas adhesivas de la matriz juegan un pa pel como guas de los desplazamientos celulares morfogenticos, y continua mente se van descubriendo otros nuevos tipos. Por ejemplo, la tenascina es un gran complejo glucoproteico de seis cadenas polipeptdicas similares o idnticas unidas mediante enlaces disulfuro que irradian desde un centro como los radios de una rueda (vase Figura 19-57). Como en la fibronectina, cada una de las ca denas polipeptdicas est compuesta por varios tipos de secuencias de am ino cidos cortas que estn repetidas muchas veces; una repeticin de fibronectina del tipo III, por ejemplo, se repite ocho o ms veces en cada cadena. Cada cadena polipeptdica se pliega en un nmero de dominios funcionales distintos, uno de los cuales se une a proteoglucanos transmembrana del tipo sindecanos, mientras que otro se une a la fibronectina. La tenascina presenta una distribucin mucho ms restrictiva que la fibronectina y es mucho ms abundante en la matriz ex tracelular de tejidos embrionarios. A diferencia de la fibronectina, puede esti mular o inhibir la adhesin celular, dependiendo del tipo celular; se cree que las funciones adhesivas y antiadhesivas estn mediadas por diferentes dominios proteicos. Existen evidencias crecientes de que tambin las interacciones an tiadhesivas, como las adhesivas, juegan un importante papel como guas de las migraciones celulares, como veremos en el Captulo 21 .

Las m olculas de colgena de tipo IV se ensam blan formando una red lam inar que facilita la form acin de la lm ina basal 32
Hasta ahora, nuestro estudio acerca de la matriz extracelular se ha centrado en las estructuras que ocupan el espacio intercelular. Pero en ciertos lugares, espe cialmente en la cercana de los epitelios, la matriz extracelular puede organizar se como una delgada lmina resistente -la lmina basal. La construccin de la lmina basal depende de algunos tipos especializados de molculas de la matriz extracelular, incluyendo una variedad especializada de colgenas, de las que nos ocuparemos ahora. Las molculas de colgena de tipo IV poseen una estructura ms flexible que las colgenas fibrilares: su hlice de tres hebras est interrumpida en 26 re-

La matriz extracelular de los animales

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170 nm dominio globular C-terminal monomeros extremo N-terminal dominios de triple hlice ASOCIACIN RPIDA "CABEZA-CABEZA" A TRAVS DE LOS DOMINIOS GLOBULARES C-TERMINALES dmeros

Figura 19-52 Hiptesis sobre cmo se ensamblan las molculas de colgena de tipo IV formando una red multilaminar. El modelo se basa en las electronmicrografas obtenidas mediante sombreado por rotacin del ensamblaje de estas molculas in vitro. (Basado en P.D. Yurchenco, E.C. Tsilibary, A.S. Charonis y H. Furthmayr, /. Histochem. Cytochem. 34:93-102, 1986.)

ASOCIACIONES LATERALES MEDIANTE LOS DOMINIOS DE TRIPLE HLICE QUE FORMAN REDES LAMINARES

red laminar poligonal

ASOCIACIONES COVALENTES LENTAS A TRAVES DE LAS COLAS N-TERMINALES, QUE FORMAN UN CONJUNTO DE REDES LAMINARES ESTRATIFICADAS red multiestratificada

giones, lo cual permite plegamientos mltiples. De manera semejante a las col genas asociadas a fibrillas, una vez secretadas no se fraccionan sino que conser van las regiones terminales que impiden el empaquetamiento longitudinal de las fibrillas. Por el contrario, interactan a travs de sus dominios terminales no fraccionados unindose fuera de la clula formando una red flexible de tipo la minar y multicapa. Estudios realizados con el microscopio electrnico de prepa raciones de ensam blajes de molculas de colgena de tipo IV, sugieren que estas molculas se asocian por su extremo carboxilo terminal formando dmeros, los cuales luego darn lugar a una extensa trama a travs de asociaciones amino ter minales con otras tres molculas y con asociaciones laterales posteriores que se presentan en la Figura 19-52. Estas asociaciones se estabilizan mediante la for macin de enlaces disulfuro y otras uniones cruzadas covalentes entre las m ol culas de colgena. La red resultante forma un andamio insoluble al cual se unen otros com ponentes de la lmina basal a travs de asociaciones especficas con molculas de colgena de tipo IV.

La lm ina basal est com puesta fundam entalmente por colgena de tipo IV, proteoglucanos de tipo heparn sulfato, lam inina y entactina 33
Las lminas basales estn constituidas por una matriz extracelular especializa da que se organiza en capas delgadas (40-120 nm de grosor) y flexibles que subyacen a las superficies y conductos epiteliales; tam bin rodean las fibras mus culares y las clulas de Schwann (las cuales se sitan alrededor de los axones

1060

Captulo 19 : Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

MUSCULO

LMINA EPITELIAL

GLOMRULO RENAL

lm ina basal
.... '.n r
m. >

tejido conjuntivo
. ................ * *
-

LUZ

1 . J
y

j: i
j# # J

clula endotelial SANGRE / ... ORINA lm ina basal clula epitelial

Figura 19-53 Tres modelos de organizacin de las lminas basales

(ln ea s a m a r illa s ). Rodean ciertas clulas (como las fibras musculares), se hallan en la regin basal de los epitelios, y se interponen entre dos capas epiteliales (tal com o sucede en el glomrulo renal). Obsrvese que en esta ltima estructura histolgica ambas capas epiteliales presentan espacios entre ellas de tal manera que la lmina basal constituye una barrera permeable, la cual es determ inante en el paso de las molculas de la orina a la sangre.

;* 1 j ',

m em brana plasmtica de la fibra m uscular

tejido conjuntivo lm ina basal

perifricos de las neuronas formando la envoltura de mielina). De esta manera las lminas basales constituyen el elemento separador entre estas clulas o entre lminas celulares y el tejido conjuntivo adyacente. En otras localizaciones, tales como el glomrulo renal y los alvolos pulmonares, las lminas basales se sitan entre dos capas celulares diferentes, y actan de filtro altamente selectivo (Figura 19-53). Sin embargo, las lminas basales tienen otras funciones que las simple mente estructurales o filtrantes. Pueden determinar la polaridad celular, in fluenciar el metabolismo celular, organizar las protenas de las membranas plas mticas adyacentes, inducir la diferenciacin celular y actuar como autopistas especficas para la migracin celular. La lmina basal es sintetizada fundamentalmente por las clulas que se apoyan en ella (Figura 19-54). Como se observa al microscopio electrnico des pus de realizar una fijacin y contrastado convencionales, la mayora de las l minas basales constan de dos capas diferentes: una que muestra una baja electrodensidad (lmina lcida o rara), y que se encuentra adyacente al dominio basal de la mem brana plasmtica de las clulas que se apoyan en ella -tp ica mente las clulas epiteliales- y otra que muestra una mayor opacidad electrnica {lmina densa) justo por debajo de aqulla. En algunos casos puede existir una tercera capa, rica en fibrillas de colgena (la lmina fibrorreticular ), que conecta la lmina basal con el tejido conjuntivo subyacente. Algunos bilogos celulares utilizan el trmino membrana basal, para describir la estructura de las tres m em branas, que habitualmente es suficientemente gruesa para ser vista mediante el microscopio ptico; otros bilogos celulares utilizan los trminos lmina basal y mem brana basal, de forma indiferente. En la lmina basal de algunos epitelios pluriestratificados, tales com o el epitelio escamoso pluriestratificado que consti tuye la epidermis de la piel, la lmina densa est adosada al tejido conjuntivo

Figura 19-54 Electronmicrografa de barrido de una lmina basal de la crnea de un embrin de pollo.
Alguna de las clulas epiteliales (E) han sido extradas, dejando al descubierto as la superficie superior de la lmina basal (BL). La red de fibrillas de colgena (C) del tejido conjuntivo subyacente interacta con la superficie inferior de la lmina. (Cortesa de Robert Trelstad.)

im 10 |

La matriz extracelular de los animales

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subyacente mediante unas fibrillas de anclaje constituidas por molculas de co lgena de tipo VII. En un tipo de enfermedad, que es devastadora para la piel, o no existen estas conexiones o estn destruidas, y la epidermis y su lmina basal se separan del tejido conjuntivo subyacente. Aunque su com posicin exacta vara de un tejido a otro e incluso de una re gin a otra en la misma lmina, la mayora de lminas basales maduras contie nen colgena de tipo IV (vase Figura 19-52), muchos proteoglucanos del tipo heparn sulfato denominados perlecanos y glucoprotenas como la laminina y la entactina. La lam inina es una de las primeras protenas de matriz extracelular sintetizadas durante el desarrollo embrionario; y en las primeras etapas del de sarrollo, la lmina basal tiene poca o incluso nada de colgena de tipo IV y cons ta principalmente de una red de laminina. La laminina es un gran complejo fle xible (de unos 850 000 daltons) formado por tres largas cadenas polipeptdicas, dispuestas en forma de cruz y unidas mediante enlaces disulfuro (Figura 19-55). Como muchas otras protenas de la matriz extracelular, tambin presenta varios dominios funcionales: uno de unin a la colgena de tipo IV, otro al heparn sul fato, otro a la entactina, y dos o ms a los receptores de la laminina situados en la superficie celular. Como la colgena de tipo IV, las molculas de laminina pueden autoensamblarse in vitro formando una lmina, en gran parte a travs de interacciones entre los extremos de los brazos de laminina. Cada molcula de entactina, que posee forma de pesa de gimnasia, se une a cada molcula de laminina en el lugar donde los brazos cortos se entrecruzan con los largos. La en tactina tam bin se une a la colgena de tipo IV, por lo que se cree que acta com o un puente adicional entre la colgena de tipo IV y la red de laminina de la lmina basal (Figura 19-56). En la Figura 19-57 se comparan las formas y tamaos de algunas molculas de la matriz extracelular estudiadas en este captulo.

Las lm inas basales realizan diversas y com plejas funciones 34

En el glomrulo renal, una lmina basal extraordinariamente gruesa, acta como un filtro molecular, regulando el paso de macromolculas de la sangre a la orina (vase Figura 19-53). Aparentemente, los proteoglucanos del tipo heparn sulfato

cadena A

dom inios globula

dom inios a-helicoidales superenrollados

i - lll
arv. *.*

20 nm

(B)

1 ________________________ i
100 nm

Figura 19-55 Estructura de la laminina. Dibujo esquemtico de la molcula de laminina representado en (A), y
electronmicrografas de molculas de laminina sombreadas con platino representadas en (B). La glucoprotena multidominio est formada por tres polipptidos (A, B, y B2), que mediante enlaces disulfuro dan lugar a una estructura asim trica en forma de cruz. Cada una de las cadenas polipeptdicas est constituida por ms de 1500 residuos de aminocido. Se han identificado tres tipos de cadenas A, tres tipos de cadenas B p y dos tipos de cadenas B2, las cuales pueden asociarse formando 18 isoformas diferentes de laminina. Algunas de estas isoformas presentan una distribucin tisular caracterstica. Existen tam bin varias isoformas de colgena de tipo IV con distribuciones tisulares especficas. As pues, la lmina basal es qumicamente diversa, lo cual no es sorprendente en vista de su diversidad funcional. [B, de J. Engel et al ., J.M oLBiol. 150:97-120,1981. Academic Press Inc. (London) Ltd.]

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Captulo 19: Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

SMBOLOS entactina

lam im na

colgena de tipo IV perlecano lam im na

colagena de tipo IV
Figura 19-56 Modelo actual de la estructura molecular de una lmina basal. La lmina basal (A) est formada
por interacciones especficas entre las protenas de colgena de tipo IV, la laminina y la entactina y el proteoglucano perlecano (B). En (B) las flechas conectan molculas que pueden unirse directam ente unas con otras. (Basado en P.D. Yurchenco y J.C. Schittny, FASEBJ. 4:1577-1590,1990.)

son fundamentales para llevar a cabo esta funcin, ya que cuando las cadenas de GAG son degradadas mediante enzimas especficas, desaparecen las propie dades filtrantes de la lmina basal. La lmina basal tambin puede actuar como una barrera selectiva para el desplazamiento de las clulas. As, por ejemplo, la lmina sobre la que se apoya un epitelio impide que los fibroblastos del tejido conjuntivo establezcan contacto con las clulas epiteliales. Sin embargo, no es obstculo para el paso de clulas tales como macrfagos, linfocitos o procesos nerviosos. La lm ina basal constituye un elemento importante para la regenera cin de tejidos daados. Cuando ello sucede en tejidos como el muscular, el nervioso o el epitelial, la lmina basal se mantiene, proporcionando un entra mado a travs del cual las clulas regeneradas pueden migrar, lo cual permite una reconstruccin de la arquitectura del tejido original. En algunos casos, como en la piel o la crnea, la lmina basal se altera por ejemplo por la adicin de fibronectina, la cual facilita la migracin celular necesaria para la reparacin de heridas. Un ejemplo de la importancia de la lmina basal en la regeneracin tisular lo proporciona el estudio de la unin neuromuscular, mediante la cual las neu ronas transmiten su estmulo a las fibras musculares esquelticas. En la zona de contacto neuromuscular, las terminaciones nerviosas de la neurona motora for man una sinapsis con la clula muscular. La lmina basal que rodea a la clula muscular separa el nervio de la membrana plasmtica de la clula muscular en la sinapsis. La regin sinptica de la lmina basal es caracterstica desde el punto de vista qumico: por ejemplo, se han encontrado isoformas caractersticas de

La matriz extracelular de los animales

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<

fibronectina cido hialurnico colgena fib rila r " decorina

Figura 19-57 Esquema comparativo de las formas y tamaos de algunas de las principales macromolculas de la matriz extracelular. La protena est representada en verde y el glucosaminoglucano en rojo.

perlecano

Cb*
* tenascina colgena de tipo IV a9recano

100 nm

colgena de tipo IV y de laminina. Esta lmina basal de unin juega un papel central en la reconstruccin de la sinapsis despus de una lesin de un nervio o de un msculo. Evidencias en este sentido provienen principalmente de experi m entos realizados en ranas. Si un msculo de rana y su nervio motor se daan, la lmina basal que rodea cada clula muscular permanece, de forma que pue den reconocerse los lugares de antiguas uniones neuromusculares. Si se perm i te que el nervio m otor se regenere pero el msculo no, los axones nerviosos re conocen los lugares sinpticos originales en los huecos de la lmina basal y se diferencian formando term inales nerviosos de apariencia normal. As, la lmina basal de unin puede por s misma guiar la regeneracin de los nervios motores terminales. Experimentos similares a stos muestran que la lmina basal tambin con trola la localizacin de los receptores de acetilcolina que se agrupan en la unin neuromuscular de la m em brana plasmtica de la clula muscular (se estudia en el Captulo 11). Si el msculo y el nervio son destruidos, y se permite que el ms culo se regenere pero el nervio no, los receptores para acetilcolina sintetizados por el msculo regenerado se localizan predominantemente en la regin de las antiguas uniones, a pesar de que el nervio est ausente (Figura 19-58). As, la lmina basal de unin coordina, aparentemente, la organizacin es pacial local de los com ponentes en cada una de las dos clulas que forman la unin neuromuscular. Extractos de lmina basal de unin contienen una nueva protena de matriz denominada agrina, la cual, cuando se une a clulas muscu lares en cultivo, inicia el ensam blaje de estructuras sinpticas en su membrana plasmtica. Se ha demostrado que las neuronas motoras sintetizan agrina, y se cree que la depositan (al igual que otras macromolculas especializadas) en la lmina basal de la unin neuromuscular en desarrollo y que estas molculas lo calizadas en la matriz ayudan a ensamblar y estabilizar la conexin sinptica. La agrina es tam bin sintetizada por muchos otros tipos de neuronas, de forma que es posible que dirija el ensam blaje de receptores y de otras macromolculas postsinpticas en sinapsis localizadas en cualquier lugar del sistema nervioso. Es probable que la lmina basal tam bin desempee un sofisticado papel com o gua de las migraciones celulares durante el desarrollo embrionario. As, en el gusano nemtodo Caenorhabditis elegans la mutacin de un gen que codi fica una protena sem ejante a la laminina interrumpe el desplazamiento de cier tas clulas mesodrmicas y axones nerviosos que migran hacia la lmina basal

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Captulo 19 : Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

Figura 19-58 Experimentos de regeneracin que indican el carcter especial de la lmina basal de unin en una unin neuromuscular.

estructura residual de la lmina basal nervio cortado clula m uscular1 , cortada para que degenere

FIBRA NERVIOSA REGENERADA

lm ina basal de unin

<

el nervio regenerado vuelve al lugar de unin original

union neurom uscular

MUSCULO Y NERVIO DEGENERADOS

FIBRA MUSCULAR REGENERADA

nuevos receptores de acetilcolina se concentran en el lugar de unin original

Cuando el nervio se regenera y el msculo no lo hace, despus de que ambos han sido daados (parte su p erior de la figura), la lmina de unin dirige el nervio en regeneracin hacia el lugar de la sinapsis original. Cuando se regenera el msculo pero no el nervio (parte in ferior de la figura), la lmina de unin provoca una nueva sntesis de receptores de acetilcolina que se acumulan en el lugar sinptico original (el msculo se regenera a partir de las clulas satlite localizadas entre la lmina basal y la clula muscular original -n o representada, pero vase pg. 1262). Estos experimentos muestran que la lmina basal unida controla la localizacin de otros com ponentes de la sinapsis -e n ambos lados de la lmina.

de la epidermis subyacente. Sorprendentemente, slo estn afectadas las migra ciones a lo largo del eje dorsoventral del embrin; las migraciones a lo largo del eje anteroposterior de la misma lmina basal se producen con normalidad. Es tos hallazgos, as como los referentes a regeneracin de la unin neuromuscular en la rana, sugieren que an nos queda mucho por conocer sobre las especializaciones funcionales de la lmina basal.

La degradacin de los com ponentes de la matriz extracelular est estrecham ente controlada 35
La regulacin del recambio de las macromolculas de la matriz extracelular es importantsima para diversos procesos biolgicos. Por ejemplo, existe una de gradacin rpida cuando el tero involuciona despus de un parto, o cuando la cola del renacuajo se reabsorbe durante la metamorfosis. Una degradacin ms localizada de los com ponentes de la matriz es necesaria cuando las clulas migran a travs de la lmina basal, lo que sucede, por ejemplo, cuando los glbulos blancos migran a travs de la lmina basal vascular en respuesta a una infeccin o a una herida, o cuando las clulas cancerosas migran desde su lugar de origen hacia rganos distantes a travs del torrente sanguneo o de conductos linfti cos, en un proceso conocido como metstasis. Incluso la matriz extracelular de animales adultos, aparentemente esttica, est sometida a un lento recambio continuo debido a la degradacin y a la resntesis. En cada uno de estos casos los com ponentes de la matriz son degradados por enzimas proteolticas extracelulares que son secretadas localmente por las clulas. Muchas de estas proteasas pertenecen a una de las dos clases generales: algunas son metaloproteasas, cuya actividad depende de su unin a Ca2 +o a Zn2+, mientras que otras son serina proteasas, las cuales tienen un residuo serina muy reactivo en su centro activo. Ambas, metaloproteasas y serina proteasas, cooperan en la degradacin de protenas de la matriz tales como colgena, laminina y fibronectina. Algunas de las metaloproteasas, como las colagenasas, son muy especficas, degradando determinadas protenas en lugares especficos, de manera que la integridad estructural de la matriz es destruida por una proteolisis limitada; de esta manera la migracin celular puede estar facilitada por una actividad proteoltica relativamente reducida.

La matriz extracelular de los animales

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Una importante serina proteasa implicada en la degradacin de la matriz es el activador del plasmingeno de tipo uroquinasa (U-PA, de Urokinase-type Plas minogen Activator). Acta como desencadenante especfica en una cascada proteoltica: su diana inmediata es el plasmingeno, un precursor inactivo muy abundante en la sangre y que se acumula en los lugares de reestructuracin del tejido tales como heridas, tumores y lugares inflamados. U-PA degrada un nico enlace del plasmingeno dando lugar a la proteasa activa plasmina. A diferencia de U-PA, la plasmina tiene una amplia especificidad, degradando una gran va riedad de protenas, incluyendo la fibrina (un com ponente de los cogulos san guneos), la fibronectina y la laminina. Existen algunos mecanismos que aseguran que la degradacin de los com ponentes de la matriz est rigurosamente controlada. En primer lugar, igual que el plasmingeno, muchas proteasas son secretadas como precursores inactivos que pueden activarse localmente. En segundo lugar, la accin de las proteasas est restringida a reas especficas mediante la secrecin de diversos inhibidores de proteasas, tales como los inhibidores tisulares de metaloproteasas (TIMP, de Tissue Inhibitors of MetalloProteases) y los inhibidores de serina proteasas, co nocidos como serpins. Estos inhibidores son especficos de determinadas protea sas y se unen fuertemente a la enzima activa bloqueando su actividad. Una idea atractiva es que los inhibidores sean secretados por clulas de la periferia de reas de degradacin activa con el fin de proteger la matriz no implicada; as mismo estos inhibidores tam bin pueden proteger protenas de superficie celular que sean necesarias para la adhesin o la migracin. En tercer lugar, muchas clulas tienen en su superficie receptores que unen proteasas tales como U-PA, confi nando de ese modo a la enzima slo donde es necesaria: esta unin de U-PA a un receptor se ha encontrado por ejemplo en clulas nerviosas en crecimiento y en el borde de avance de los glbulos blancos en migracin, donde puede actuar limpiando el camino que permita la migracin de la clula; esta actividad parece ser un requisito para algunos tipos de clulas cancerosas en procesos de m ets tasis (Figura 19-59).

Resumen

Las clulas del tejido conjuntivo se encuentran incluidas en una compleja matriz extracelular, la cual no solamente une las clulas entre s, sino que tambin influye
(A) clulas con receptores de proteasa funcionales (B) clulas con receptores de proteasa bloqueados

Figura 19-59 Importancia de la proteasa unida a un receptor de superficie celular. (A) Sntesis y
secrecin de U-PA, una serina proteasa que se une a protenas receptoras U-PA de superficie celular en clulas cancerosas de prstata humana. En (B) las mismas clulas han sido transfectadas con DNA que sobrexpresa una forma inactiva de UPA, la cual se une a receptores de U-PA impidiendo que la proteasa activa se una a la superficie celular. Ambos tipos de clulas secretan U-PA activa, crecen rpidamente, y producen tumores cuando son inyectadas en animales experimentales, pero las clulas de (A) provocan una metstasis general, mientras que esto no sucede en (B). Para poder formar metstasis, las clulas tumorales han de migrar a travs de la lmina basal y de otras matrices extracelulares que encuentran a su paso dentro o fuera de la sangre. Este experimento sugiere, por lo tanto, que para poder facilitar la migracin a travs de la matriz, las proteasas deben estar unidas a la superficie celular.

proteasa activa (U-PA) CRECIMIENTO TUMORAL Y METSTASIS

proteasa inactiva (U-PA mutante) CRECIMIENTO TUMORAL SIN METSTASIS

106 6

Captulo 19: Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

en su desarrollo, su polaridad y su comportamiento. La matriz contiene diversas protenas formadoras de fibras intercaladas en el interior de un gel hidratado com puesto por una reddeglucosaminglucanos (GAG). Los GAG constituyen un grupo heterogneo de largas cadenas de polisacridos cargados negativamente, los cuales (exceptuando el cido hialurnico) se unen covalentemente a una protena dando lugar a molculas de proteoglucanos. Estos proteoglucanos ocupan un gran volunten y forman geles hidratados en el espacio extracelular. Tambin se encuentran proteoglucanos en la supeificie celular donde desempean funciones como correceptores facilitando la unin de las clulas a la matriz y respondiendo a factores de crecimiento. Las protenas formadoras de fibras pueden dividirse en dos grandes grupos funcionales: unas fundamentalmente estructurales (colgenas y elastina) y otras fundamentalmente adhesivas (como la fibronectina y la laminina). Las colgenas fibrilares (tipos I, II, III, Vy XI) son alargadas, semejantes a rodillos, y sus molcu las helicoidales de triple hebra se agregan formando largas fibrillas en el espacio extracelular; a su vez estas fibrillas pueden ensamblarse formando estructuras va riadas altamente ordenadas. Las molculas de colgena asociadas a fibras, tales como los tipos IX y XII, decoran la superficie de las fibras de colgena e influyen en las interacciones de las fibras entre s y con otros componentes de la matriz. Las mo lculas de colgena de tipo IV se organizan en una red laminar que es un compo nente crucial de todas las lminas basales maduras, las cuales tambin contienen las protenas laminina y entactina y el proteoglucanos del tipo de los heparn sul fatas, el perlecano. Las molculas de elastina forman una extensa red de fibras y lminas, enlazadas por puentes cruzados, que tienen la capacidad de estiramiento y retraccin, proporcionando elasticidad a la matriz. La fibronectina y la lamini na son buenos ejemplos de grandes glucoprotenas adhesivas de la matriz form a das por mltiples dominios; la primera de ellas est ampliamente distribuida en el tejido conjuntivo, mientras que la segunda se localiza fundamentalmente en la lmina basal. Mediante sus mltiples dominios de unin, estas protenas facilitan la adhesin celular y colaboran eficazmente en la organizacin de la matriz extracelular. Receptores de la matriz extracelular en clulas animales: las integrinas
Para entender cmo interacciona la matriz extracelular con las clulas, es nece sario identificar tanto las molculas de la superficie celular (los receptores de la matriz) que se unen a los diversos componentes de la matriz, como a los propios com ponentes de la matriz extracelular. Debido a las mltiples interacciones que se producen entre las macromolculas de la matriz en el espacio extracelular, el establecim iento de un lmite entre los com ponentes de la membrana plasmtica y la matriz extracelular constituye un ejercicio semntico. Sin embargo, la unin ltima a la clula requiere de una protena transmembrana que una la matriz al citoesqueleto cortical de las clulas. Ya hemos visto que algunos proteoglucanos con protenas centrales transmembrana actan como correceptores para los com ponentes de la matriz, pero los principales receptores en las clulas anim a les para la mayora de protenas de la matriz extracelular, incluyendo la colge na, la fibronectina y la laminina, son las integrinas, una gran familia de prote nas de unin, transmembrana y homologas. Las integrinas difieren de los receptores de hormonas de la superficie celu lar y de otras molculas seal solubles en que se unen a sus ligandos con una re lativamente baja afinidad {Ka = 106 - 10 9litros/mol) y en que habitualm ente se presentan a concentraciones a nivel de la superficie celular entre 10 y 100 veces mayores. Esta situacin tiene sentido ya que la unin simultnea pero dbil a un gran nmero de molculas de la matriz permite a las clulas explorar su me dio sin dejar de unirse a l. Si la unin fuera demasiado fuerte, las clulas proba blem ente podran llegar a pegarse irreversiblemente a la matriz sin poder

Receptores de la matriz extracelular en clulas animales: las integrinas

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desplazarse -u n problema que no se presenta si la unin depende de mltiples adhesiones dbiles. ste es un ejemplo del principio Velero comentado ante riormente.

unin a la matriz

Las integrinas son heterodmeros transm em brana 36

Las integrinas son receptores de crucial importancia debido a que constituyen los mecanism os principales de que disponen las clulas para unirse a la matriz extracelular y responder a ella. Estn constituidas por dos subunidades glucoproteicas transm em brana unidas entre s no covalentemente, denominadas a y (3; ambas contribuyen a la unin de las clulas a las protenas de la matriz (Figu ra 19-60). Parece que algunas integrinas se unen nicamente a un tipo de macromolcula de la matriz, como la fbronectina o la laminina, mientras que otras se unen a ms de una: por ejemplo, una integrina que est presente en fibroblas tos se une a colgena, fbronectina y laminina. Una subfamilia de integrinas re conoce la secuencia RGD presente en stas y en otras protenas de la matriz, mientras que otras reconocen otras secuencias o dominios. Una misma m olcu la de integrina localizada en diferentes tipos celulares puede presentar diferen tes afinidades por el ligando, por lo que puede especularse que determinados factores adicionales pueden interactuar con las integrinas modulando su activi dad. La unin de las integrinas a sus ligandos depende de cationes bivalentes extracelulares (Ca2+ o Mg2+ , dependiendo de la integrina), lo cual refleja la presen cia de tres o cuatro dominios de unin a cationes divalentes en la gran regin ex tracelular de la cadena a. Esta propiedad puede utilizarse para purificar integrinas: las protenas de mem brana plasmtica solubles en detergente se ha cen pasar a travs de una columna de afinidad que contiene una protena de la matriz extracelular o un pptido con la secuencia RGD, y las integrinas que se han unida son luego eluidas de la columna mediante lavado con una solucin li bre de cationes divalentes. El tipo de cationes divalentes puede influir tanto la afinidad como la especificidad de la unin de una integrina a sus ligandos, aun que, como en el caso de las cadherinas, todava no conocem os el significado fi siolgico de la regulacin de este catin. Muchas protenas de la matriz de vertebrados son reconocidas por varias in tegrinas: por ejemplo, por lo menos 8 integrinas se unen a la fbronectina, y un mnimo de 5 a la laminina. Se han definido alrededor de 20 heterodmeros de in tegrina, constituidos por 9 tipos de subunidades P y 14 tipos de subunidades a, y otros se estn caracterizando. Su diversidad se incrementada por la maduracin alternativa de algunos RNA de integrinas. Las cadenas PP que forman dmeros con al menos 9 cadenas a distintas, se han localizado en casi todas las clulas de vertebrados: por ejemplo, a 5P, es un receptor de la fbronectina y oc^ es un re ceptor para la laminina en muchos tipos celulares. En cambio, las cadenas P2, que forman dmeros con 3 tipos de cadenas a, se expresan exclusivamente en la superficie de los leucocitos y juegan un papel esencial permitiendo a estas clu las com batir las infecciones. Una de estas integrinas (32 (aL P2) es la denominada LFA-1 (de Lynfocite Function Associated, asociada a la funcin linfocitaria); otra (aM P2) es la denominado Mac-1 debido a que se encontr fundamentalmente en macrfagos. Las integrinas del tipo (32 median principalmente la unin entre c lulas y no entre las clulas y la matriz, unindose a ligandos especficos de otra clula, como las clulas endoteliales de los vasos sanguneos: los ligandos, a ve ces denominados contrarreceptores, son miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas de molculas de adhesin celular, estudiadas anteriormente. Las integrinas P2, por ejemplo, permiten a los glbulos blancos unirse firmemente y atravesar el revestimiento endotelial de los vasos sanguneos en los lugares de infeccin. Los humanos que padecen la enfermedad gentica denominada defi ciencia de adhesin leucocitaria no pueden sintetizar la subunidad (32; como con secuencia de ello, sus glbulos blancos son deficientes en todos los receptores del grupo P2, y sufren repetidas infecciones bacterianas. Las integrinas del tipo P3

cadena (3 catin divalente cadena a dom inios ricos en cistena

mem brana plasmtica HOOC unin a la a-actinina y a la talina citosol

10 nm

__________ i

Figura 19-60 Estructura en subunidades de un receptor matriz de superficie celular de tipo integrina.
Las electronmicrografas de receptores aislados sugieren que la molcula tiene una morfologa aproximadamente como la mostrada en el esquema, con un extremo globular que se proyecta ms de 20 nm sobre la bicapa lipdica. Al unirse a una protena de la matriz en el exterior celular y al citoesqueleto de actina (mediante las protenas de anclaje talina y a-actinina) en el interior de la clula, la protena acta como un elemento de unin transmembrana. Tanto las cadenas a como las (3 estn glucosiladas (no se muestra en la figura), y se unen entre s mediante enlaces no covalentes. En el receptor de la fbronectina representado, la cadena a es sintetizada inicialmente como una sola cadena polipeptdica de unos 140 000 daltons, la cual es posteriormente escindida en una pequea regin transmembrana y un gran fragmento extracelular, los cuales permanecen unidos entre s mediante un enlace disulfuro; este fragmento extracelular est plegado en cuatro dominios de unin a cationes divalentes. La regin extracelular de la cadena P contiene una regin rica en cistena que se repite, estableciendo puentes disulfuro intracatenarios; la cadena p tiene una masa de unos 100 000 daltons.

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Captulo 19 : Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

han sido localizadas en diversas clulas, entre ellas las plaquetas sanguneas, y se unen a varias protenas de la matriz incluyendo el fibringeno-, las plaquetas interactan con el fibringeno durante la coagulacin de la sangre y los indivi duos que presentan la enfermedad de Glanzmann, deficientes genticamente en integrinas del tipo p3, sangran fcilmente. En Drosophila se han descrito dos integrinas que comparten una subunidad (3 comn. Si ambas copias del gen que codifica esta subunidad P estn mutadas, las moscas mueren en el estado larvario; se desarrollan con normalidad hasta que empiezan las primeras contracciones musculares, momento en que los msculos se desinsertan de sus lugares de unin a la matriz extracelular.

Las integrinas pueden interaccionar con el citoesqueleto para unir las clulas a la matriz extracelular 37
Las integrinas actan como acopladores transmembrana (o "integradores) m e diando las interacciones entre el citoesqueleto y la matriz extracelular que son necesarias para que las clulas se adhieran a la matriz. La mayora de las integri nas se asocian a haces de filamentos de actina. (La integrina localizada en hemidesmosomas -oc6 (34- es una excepcin ya que se asocia a filamentos interm e dios.) Tras la unin de una integrina tpica a su ligando de la matriz, la cola citoplasmtico de la cadena (3 se une a la talina y a la a-actinina, iniciando el en samblaje de un complejo de protenas de unin intracelulares que unen la inte grina a los filamentos de actina en el crtex celular; se cree que as es como se forman los contactos focales entre las clulas y la matriz extracelular, como dis cutimos anteriormente. Si el dominio citoplasmtico de la cadena (3 se suprime mediante la utilizacin de tcnicas de DNA recombinante, las integrinas mutantes permanecen unidas a sus ligandos pero ya no establecen fuertes adhesiones celulares o grupos de contactos focales. As pues, parece que las integrinas interaccionan con el citoesqueleto para que las clulas se unan a la matriz, de la misma forma en que las cadherinas deben interactuar con el citoesqueleto para mantener unidas las clulas entre s. Como discutimos anteriormente, parece que la unin transmembrana con el citoesqueleto es un requisito general impor tante para las uniones clula-matriz y clula-clula: sin tales anclajes internos, el lugar de unin est predispuesto a ser eliminado de la clula (vase Figura 1929). Las uniones al citoesqueleto tambin pueden agrupar las integrinas, dando lugar a una importante agregacin de elementos de unin celular (otra vez el principio Velero). Como estudiaremos a continuacin, las interacciones que median las inte grinas entre la matriz extracelular y el citoesqueleto actan en ambas direccio nes y desempean un importante papel en la orientacin tanto de las clulas como de la matriz en un tejido.

Las integrinas perm iten al citoesqueleto y a la matriz extracelular com unicarse a travs de la m em brana plasm tica 37,38
La matriz puede influir en la organizacin del citoesqueleto celular. Esto puede ser demostrado mediante cultivos de fibroblastos transformados (semejantes a cancerosos) (se estudian en el Captulo 24). A menudo las clulas transformadas sintetizan menos fibronectina que las clulas normales, presentando com porta mientos diferenciales: por ejemplo, se adhieren de forma deficiente al substrato y carecen de la capacidad para aplanarse o desarrollar los haces organizados de filamentos de actina conocidos como fibras de estrs. Ello contribuye a la ten dencia que muestran las clulas cancerosas de separarse del tumor primario y propagarse hacia otras partes del cuerpo. En algunos casos la deficiencia en fi bronectina parece ser, al menos en parte, responsable de esta morfologa anor mal: si las clulas han crecido en una matriz de filamentos organizados de fibro nectina, se aplanan y las fibras de estrs intracelulares se alinean con los filamentos de fibronectina extracelulares.

Receptores de la matriz extracelular en clulas animales: las integrinas

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Figura 19-61 Alineacin de los filamentos de fibronectina extracelular con los haces de filamentos de actina. La fibronectina de dos fibroblastos de rata mantenidos en cultivo se observa mediante la utilizacin de anticuerpos unidos a la rodamina (A), mientras que la actina se visualizada mediante anticuerpos especficos unidos a la fluorescena (B). (De R.O. HynesyA.T. Destree, Cell 15:875-886,1978. Cell Press.)

(A)

(B)

|________________ 50 pm

Esta interaccin entre la matriz extracelular y el citoesqueleto es recproca en tanto que los filamentos de actina pueden influir la orientacin de las molculas de fibronectina secretadas. Por ejemplo, los filamentos de fibronectina extracelulares se organizan sobre o cerca de la superficie de fibroblastos en cultivo ali nendose con las fibras de estrs intracelulares adyacentes (Figura 19-61). Si es tas clulas son tratadas con una droga com o la citocalasina, que desorganiza los filamentos de actina, los filamentos de fibronectina se disocian de la superficie celular (exactamente com o lo hacen durante la mitosis cuando las clulas se re dondean). Estas interacciones recprocas entre la fibronectina extracelular y los filamentos de actina intracelulares a travs de la membrana plasmtica estn mediadas fundamentalmente por las integrinas. El citoesqueleto de las clulas puede ejercer fuerzas que orientan las macromolculas de la matriz y stas, a su vez, pueden organizar el citoesqueleto de las clulas que contactan con ellas, por lo que la matriz puede propagarse, en prin cipio, de una clula a otra (Figura 19-62), creando estructuras orientadas a gran escala, com o vimos anteriormente (vase pg. 1055). Las integrinas actan como adaptadores en estos procesos de ordenamiento, mediando las interacciones entre las clulas y la matriz que las rodea.

la orientacin que presenta el citoesqueleto en la clula (? ) induce la orientacin del conjunto m olecular secretado que constituye la m atriz extracelular de las inm ediaciones

Las clulas pueden regular la actividad de sus integrinas 39

Mientras que las integrinas de muchas clulas estn constantem ente en un esta do competente-adhesivo, las integrinas de las clulas sanguneas tienen que ser activadas antes de que puedan mediar la adhesin celular. Tales adhesiones re guladas permiten probablem ente a las clulas sanguneas circular libremente hasta que son activadas por un estmulo adecuado; debido a que las integrinas no necesitan ser sintetizadas de novo, la respuesta puede ser rpida. Por ejem plo, las plaquetas pueden ser activadas mediante el contacto con un vaso san guneo daado o por alguna de las molculas de sealizacin solubles. El est mulo activa vas de sealizacin intracelular, las cuales a su vez activan de forma rpida y permanente una integrina (33 en la m em brana de la plaqueta, alterando su conform acin de manera que ahora su dominio extracelular puede unirse al Figura 19-62 De qu forma la matriz extracelular puede propagar de una clula a otra un orden dentro de un tejido. Para simplificar, la figura representa un esquema hipottico en el cual una clula influye en la orientacin de las clulas vecinas. Sin embargo, es ms probable que todas las clulas puedan afectar la orientacin de las dems.

la m atriz orientada establece contacto con las clulas @ y induciendo, a su vez, la orientacin de los citoesqueletos

las clulas ( ) y ( 3 ) secretan y orientan los elem entos de la m atriz ms prxim a, propagando as la orientacin a las clulas ( 4 ) y ( 5 )

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Captulo 19: Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

matriz extracelular
/p~~

seal activadora

ligando para la integrina

ACTIVACION CELULAR

ACTIVACION DE
I A IN T F f iR IN A

integrina activada

R E G U LA C I N DEL L U G A R DE U N I N A LA M ATRIZ

integrina inactiva membrana plasmtica

sealizacin intracelular en cascada

matriz extracelular LAS INTEGRINAS SE DISOCIAN DEL CRTEX DE ACTINA

R E G U L A C I N DE LA UN IN A L CITO ESQ UELETO

integrinas agrupadas en un contacto focal

citoesqueleto de actina

fibringeno, protena coagulante de la sangre, con una gran afinidad, estimulan do as la agregacin plaquetaria y la formacin del cogulo sanguneo (Figura 19-63A). De un modo parecido, la dbil unin de los linfocitos T tanto a su antgeno especfico situado en la superficie de una clula presentadora de antgenos com o a una clula infectada por un virus (se explica en el Captulo 23), desenca dena seales intracelulares en las clulas T, las cuales conducen a una rpida ac tivacin transitoria de una integrina C LFA-1) en las clulas T. La integrina activa da permite a los linfocitos T adherirse fuertemente a la clula diana, de modo que permanecen en contacto con ella el tiempo suficiente para ser estimulados; la integrina vuelve luego a su estado inactivo para permitir que los linfocitos T se liberen. La mayora de los mecanismos mediante los cuales algunas seales in tracelulares activan los lugares de unin de una integrina en una clula sangu nea son desconocidos. Otros fenmenos intracelulares pueden inactivar las integrinas. Por ejemplo, la fosforilacin de un residuo de serina en el extremo citoplasmtico de una inte grina del tipo Pj durante la mitosis de clulas en cultivo debilita la capacidad de unin de la integrina a la fibronectina, lo cual puede explicar por qu estas clu las se redondean y se liberan del substrato durante la mitosis. De manera seme jante, en algunas clulas cancerosas la fosforilacin de un residuo de tirosina en el extremo citoplasmtico de una integrina unida a la fibronectina, disminuye la capacidad de la integrina para unirse a la talina, lo cual parece que contribuye a la relativamente baja adhesin de estas clulas a la fibronectina (Figura 19-63B).

Figura 19-63 Las clulas pueden regular la actividad de sus integrinas.

En (A) la activacin celular induce un cambio del lugar de unin extracelular de la integrina, de modo que ahora puede mediar la adhesin celular. En (B) la fosforilacin de la tirosina del extremo citoplasmtico de las integrinas disminuye su capacidad de unin al citoesqueleto de actina. Debido a que las integrinas han de unirse al citoesqueleto para poder mediar una fuerte adhesin de la clula a la matriz, la fosforilacin provoca que las integrinas relajen su unin con la matriz extracelular.

Las integrinas pueden activar cascadas de sealizacin intracelular 40

Las macromolculas de la matriz extracelular presentan notables efectos sobre la conducta de las clulas en cultivo, afectando a su forma, su polaridad, su m o vimiento, su metabolismo, su desarrollo y otras funciones especficas. Muchos de estos efectos implican cambios en la expresin gnica, y casi todos son lleva dos a cabo por las integrinas. Ya explicamos que las integrinas actan como aco-

Receptores de la matriz extracelular en clulas animales: las integrinas

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Tabla 19-5 Familias de molculas de adhesin celular Algunos miembros de la familia ADHESIN CLULA-CLULA Cadherinas cadherinas E, N, P cadherinas desmosomales s s homofflica homofflica filamentos de actina (va cateninas) filamentos intermedios (va desmoplaquinas, placoglobinas y otras protenas) desconocida desconocida bandas de adhesin desmosomas Dependencia de Homofflica o Ca2+o de Mg2 + heterofflica Asociaciones con el citoesqueleto Asociaciones de uniones celulares

Miembros de la familia de las Ig Selectinas (clulas de la sangre + clulas endoteliales exclusivamente) Integrinas de las clulas sanguneas

N-CAM, L1 Selectina P (vase pg. 537)

no s

homofflica o heterofflica heterofflica

no no

LFA-1 (aL b2), Mac-1 (aM b2)

heterofflica

filamentos de actina

no

ADHESIN CLULA-MATRIZ Integrinas muchos tipos s heterofflica filamentos de actina (va talina, vinculina y otras protenas) filamentos intermedios filamentos de actina contactos focales

a6 b4 Proteoglucanos transmembrana sindecanos

s no

heterofflica heterofflica

hemidesmosomas no

piadores transm em brana conectando las molculas de la matriz extracelular a los filamentos de actina del crtex celular y que de este modo regulan la forma, la orientacin y el movimiento celulares. Sin embargo existen evidencias crecientes de que la agrupacin de integrinas en los lugares de contacto con la matriz (o con otras clulas) puede tam bin activar algunas vas de sealizacin intracelular, incluyendo la va de fosfolpidos de inositol; adems, algunas protenas intracelulares, incluyendo una tirosina quinasa localizada en los contactos focales, son fosforiladas en residuos de tirosina. Aunque se desconocen los mecanismos moleculares, es posible que las agrupaciones de integrinas generen seales intracelulares que inicien el ensam blaje de un complejo de sealizacin en la cara citoplasmtica de la m em brana plasmtica, como hacen las tirosina quinasas li gadas a receptores de factores de crecim iento (se explica en el captulo 15). Fre cuentem ente la sealizacin mediante integrinas y receptores de factores de crecim iento es necesaria para una respuesta celular ptima: por ejemplo, mu chas clulas en cultivo no proliferan en respuesta a factores de crecimiento a menos que las clulas se unan a travs de integrinas a las molculas de la matriz extracelular. El reto est en determinar cmo interactan estas cascadas de se alizacin influyendo a conductas celulares complejas tales como la expresin gnica y la proliferacin celular. En la Tabla 19-5 se resumen las molculas de adhesin celular explicadas en este captulo.

Resumen

Las integrinas son los receptores principales que utilizan las clulas animales para unirse a la matriz extracelular. Son heterodmeros que actan como acopladores transmembrana mediando interacciones bidireccionales entre la matriz extracelu107 2 Captulo 19: Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

lar y el citoesqueleto de actina. Tambin actan como transductores de seales, ac tivando varias vas de sealizacin intracelular cuando son activadas mediante la unin a la matriz. Una clula puede regular la actividad adhesiva de sus integrinas mediante la alteracin de sus lugares de unin o su unin a filamentos de actina.

La pared celular de los vegetales

La pared celular es una matriz extracelular compleja que rodea las clulas vege tales. Fue la gruesa pared celular del corcho, visible con un microscopio rudi mentario, la que en 1663 permiti a Robert Hooke distinguir con claridad las c lulas y darles despus dicho nombre. Las paredes de las clulas vegetales colindantes, unidas entre s formando la planta (Figura 19-64), son generalmen te gruesas, fuertes, y, lo ms importante de todo, ms rgidas que la matriz celu lar sintetizada por las clulas animales. Durante la evolucin de estas paredes relativamente rgidas, que pueden tener muchos micrmetros de grosor, las c lulas vegetales primitivas perdieron la capacidad para desplazarse y adoptaron un estilo de vida sedentario que ha persistido en todas las plantas hasta nuestros das.

La com posicin de la pared celular depende del tipo celular 41

En una planta pluricelular, la mayora de clulas se producen en regiones deno minadas meristemos, como se ver en el Captulo 21. Estas nuevas clulas gene ralmente son pequeas en comparacin con su tamao final, y para poder cre cer posteriormente, sus paredes, denominadas paredes celulares primarias,

Figura 19-64 Paredes celulares vegetales. (A) Electronmicrografa de

una punta de raz de un junco, mostrando un modelo organizado de clulas que resulta de una secuencia ordenada de divisiones celulares en clulas con paredes celulares rgidas. (B) Seccin de una pared celular tpica separando dos clulas vegetales adyacentes. Las dos bandas transversales oscuras se corresponden con los plasmodesmos que atraviesan la pared. (A, cortesa de Brian Gunning; B, cortesa de Jeremy Burgess.)

La pared celular de los vegetales

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son delgadas y semirrgidas. Cuando se detiene el crecimiento y la pared ya no se ha de expandir ms, la pared primaria simplemente se conserva o, ms fre cuentem ente, se sintetiza una rgida pared celular secundaria, ya sea por engra samiento de la pared primaria o bien por el depsito de nuevas capas por debajo de las antiguas. Adems de su papel estructural o esqueltico, la pared celular tam bin protege a las clulas subyacentes e interviene en el transporte de los fluidos dentro de la planta. Cuando las clulas vegetales se especializan, produ cen tipos de paredes adaptadas especialmente, en funcin de las cuales pueden reconocerse y clasificarse los distintos tipos celulares. Las paredes celulares primarias de plantas superiores varan enormemente en cuanto a com posicin y organizacin pero todas las matrices extracelulares estn diseadas segn un principio comn: obtienen su fuerza de traccin de las largas fibras y su resistencia a la compresin de la matriz de protenas y polisacridos en la cual se insertan estas fibras. Las fibras de las paredes celulares de las plantas superiores estn constituidas generalmente por polisacridos como la celulosa, la m acromolcula orgnica ms abundante de la tierra. El resto de la matriz est constituido predominantemente por otros dos tipos de polisacri dos, hemicelulosa y pectina, y protenas estructurales. Todas estas molculas se mantienen unidas mediante una com binacin de enlaces covalentes y no covalentes formando una estructura com pleja cuya composicin depende del tipo celular.

Las fuerzas de tensin de las paredes celulares perm iten a las clulas vegetales desarrollar una presin de turgencia 42
El medio acuoso extracelular de una clula vegetal est constituido por el fluido contenido en las paredes que rodean la clula. Aunque el fluido de la pared celu lar de la planta contiene ms solutos que el agua del medio externo de la planta (el suelo, por ejemplo), es hipotnico respecto al interior celular. Este desequili brio osmtico es la causa de que la clula desarrolle una gran presin hidrosttica interna, o presin de turgencia, que empuja hacia la pared celular, exacta mente com o la cmara de una rueda empuja contra la cubierta. La presin de turgencia aumenta justo en el punto donde la clula est en equilibrio osmtico, impidiendo la entrada neta de agua a pesar del desequilibrio salino (vase Panel 11-1, pg. 552). Esta presin es vital para las plantas debido a que es la principal fuerza impulsora de la expansin de la clula durante el crecimiento, y propor ciona la mayor parte de la rigidez mecnica, caracterstica de los tejidos vegeta les vivos. Comprense, por ejemplo, las hojas marchitas de una planta deshidra tada con las hojas turgentes de una planta hidratada correctamente. Es la fuerza m ecnica de la pared celular la que permite a las clulas vegetales mantener esta presin interna.

La pared celular est constituida por microfibrillas de celulosa entretejidas con una red de polisacridos y protenas 43
La fuerza de tensin de la pared celular primaria la proporciona la celulosa. Una molcula de celulosa se com pone de una cadena lineal de por lo menos 500 re siduos de glucosa unidos entre s covalentem ente formando una estructura a modo de cinta, la cual se estabiliza por enlaces de hidrgeno dentro de la cade na. Adems, se forman enlaces de hidrgeno entre molculas adyacentes de ce lulosa que hacen que estas molculas se unan fuertemente unas con otras for mando series paralelas superpuestas, constituyendo un haz de 60 a 70 cadenas de celulosa, de forma que cada una de ellas tiene la misma polaridad. Estos agregados cristalinos sum am ente ordenados, de muchos micrmetros de longi tud, son las denominadas m icrofibrillas de celulosa. Diferentes grupos de mi crofibrillas estn ordenados en capas o lminas, separadas unas de otras por unos 20-40 nm y conectadas por largas molculas de hemicelulosa, que se unen por enlaces de hidrgeno a la superficie de las microfibrillas. La pared celular

107 4

Captulo 19 : Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

Figura 19-65 Modelo a escala de una porcin de pared celular primaria que muestra las dos mayores redes de polisacridos. Las capas de microfibrillas de celulosa ordenadas ortogonalmente [verde) forman una red mediante enlaces de hidrgeno con molculas de hemicelulosa (rojo). Esta red es paralela a la red de polisacridos de tipo pectina (azul). La red de celulosa y de hemicelulosa absorbe fuerzas de traccin, mientras que la red de pectina resiste la compresin. La celulosa, la hemicelulosa y la pectina se presentan a partes iguales en la pared celular primaria. La lmina media es rica en pectina y cem enta las clulas adyacentes.

lmina media

pectina

pared celular prim aria celulosa m em brana plasmtica hemicelulosa

primaria est constituida por varias de dichas lminas dispuestas en una red multilaminar (Figura 19-65). Las hem icelulosas son un grupo heterogneo de polisacridos ramificados que se unen fuertemente entre s y a la superficie de cada microfibrilla de celulo sa, facilitando la unin de las microfibrillas formando una red compleja. Sus funciones son anlogas a las de las colgenas asociadas a fibrillas que hemos es tudiado anteriormente. Existen muchos tipos de hemicelulosas, pero todas ellas presentan una larga estructura lineal central compuesta por un solo tipo de az car, del cual sobresalen cortas cadenas de otros glcidos. La composicin de azcares de ambas estructuras vara en funcin de la especie vegetal y de su es tadio de desarrollo, siendo los glcidos de la estructura central los que forman enlaces de hidrgeno con las microfibrillas de celulosa. Coexistiendo con esta red de microfibrillas de celulosa y hemicelulosas exis te otra red de polisacridos entrelazados constituida por pectinas (vase Figura 19-65). Las pectinas constituyen un grupo heterogneo de polisacridos ramifi cados que contienen numerosos residuos de cido galacturnico, cargados ne gativamente. A causa de su carga negativa, las pectinas estn muy hidratadas y asociadas a cationes, y se asemejan a los glucosaminglucanos de las clulas ani males debido a la gran cantidad de espacio que ocupan. Cuando se aade Ca2 +a una solucin de molculas de pectina, produce enlaces cruzados entre ellas que dan lugar a un gel semirrgido (es lo que sucede cuando se aade pectina a un zumo de fruta para obtener jalea). Ciertas pectinas son especialmente abundan tes en la lmina media, regin central especializada de la pared que une las pa redes de las clulas vecinas; se supone que tales puentes de Ca2 + contribuyen a mantener unidos entre s ios com ponentes de la pared celular. Si son tratados con un agente quelante del Ca2+ , todos los tejidos vegetales se disocian en sus com ponentes celulares. Las uniones covalentes tambin intervienen en la unin de los diferentes componentes de la pared celular vegetal, pero se conoce muy poco acerca de su naturaleza. Adems de las dos redes constituidas por polisacridos, que estn presentes en todas las paredes celulares primarias de las plantas, existe una contribucin variable de protenas estructurales. Una clase de estas protenas contiene gran des cantidades de hidroxiprolina, como la colgena. Se cree que estas protenas refuerzan la pared y que son producidos en grandes cantidades como una res puesta local al ataque de microorganismos. Durante la diferenciacin las clulas

La pared celular de los vegetales

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Figura 19-66 Orientacin de las microfbrillas de celulosa en la pared celular primaria de una clula de zanahoria en crecimiento. Esta
electronmicrografa de una rplica sombreada de una pared celular congelada rpidamente y sublimada extensivamente muestra la disposicin paralela de las microfbrillas de celulosa, orientadas perpendicularmente al eje de elongacin de la clula. Las microfbrillas estn unidas entre s y entrelazadas formando un com plejo andamiaje de molculas de matriz (comprese con Figura 19-65). (Cortesa de Brian Wells y Keith Roberts.)

200

J im

utilizan protenas estructurales para modificar determinadas regiones de sus paredes, generando as la extensa gama de paredes secundarias especializadas funcionalm ente y que son caractersticas de los tipos celulares maduros (vase Panel 1-1, pgs. 18-19). Para que una clula vegetal crezca o cam bie de forma, la pared celular tiene que ensancharse o deformarse, pero debido a su estructura cristalina, las microfibrillas de celulosa individuales no pueden estirarse. Estos estiramientos o de formaciones de las paredes celulares deben implicar deslizamiento de unas microfibrillas sobe otras, la separacin de microfbrillas adyacentes, o ambas cosas a la vez. Como veremos a continuacin, la direccin en la que se alargan las c lulas en crecim iento depende de la orientacin de las microfbrillas de celulosa que se oponen a la deformacin de la pared primaria, la cual depende a su vez de la orientacin de los microtbulos del crtex celular subyacente cuando se deposit la pared.

presin de turgencia

Los microtbulos orientan la deposicin de la pared celular 4 4

La forma final de la clula vegetal en crecimiento, y por lo tanto la forma final de la planta, viene determinada por la expansin celular controlada. La expansin se produce en respuesta a la presin de turgencia en una direccin que depende de la disposicin de las microfbrillas de celulosa en la pared. Por consiguiente, las clulas anticipan su morfologa futura controlando la orientacin de las microfibrillas que se depositan en la pared. A diferencia de muchas otras macromolculas de la matriz, que se sintetizan en el retculo endoplasmtico y en el com plejo de Golgi y son secretadas, la celulosa, como el cido hialurnico, se va prolongando desde la superficie celular mediante un complejo enzimtico inte gral de la m em brana plasmtica (la celulosa sintasa), el cual utiliza precursores de glcidos unidos a nucletidos suministrados por el citosol. A medida que se van sintetizando, las cadenas nacientes de celulosa se ensamblan espontnea mente formando microfbrillas en la superficie extracelular de la membrana plasmtica -lo cual da lugar a una capa o lmina en la que todas las microfibrillas tienen ms o menos la misma alineacin (Figura 19-65). Cada lmina nueva se forma por la parte interior de la ya existente, de manera que la pared est constituida por lminas ordenadas concntricam ente, situndose la ms antiFigura 19-67 La orientacin de las microfbrillas de celulosa de la pared celular influye en la direccin en la que las clulas se alargan. Las clulas
en (A) y (B) parten con una forma idntica (representada aqu como cubos) pero con diferente orientacin de las microfbrillas de celulosa de sus paredes. Aunque la presin de turgencia es uniforme en todas las direcciones, la debilidad de la pared celular provoca que cada clula se elongue en una direccin perpendicular a la orientacin de las microfbrillas, las cuales tienen una gran fuerza de tensin. La forma final de un rgano o de un brote viene determinada por la direccin en la que se expanden las clulas.

1 07 6

Captulo 19: Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

(B)

Figura 19-68 Red cortical de gua en la cara externa. La mayor parte de microfibrillas de las clulas en creci microtbulos en una clida vegetal. miento se disponen de manera perpendicular al eje de elongacin celular (Figu (A) Seccin de una clula de raz de ra 19-66); aunque la orientacin de las microfibrillas de las lminas externas heno mostrando un ordenamiento puede ser diferente, lo que influye de forma predominante en la direccin de la cortical de los microtbulos que se expansin celular es la orientacin de las lminas internas (Figura 19-67). encuentran debajo de la m em brana Una pista importante para comprender cmo se produce esta orientacin plasmtica. Estos microtbulos estn fue el descubrimiento de que la mayora de los microtbulos citoplasmticos del orientados perpendicularmente al eje crtex de la clula vegetal se disponen con la misma orientacin que las microfi longitudinal de la clula. (B) Clula brillas de celulosa que se van depositando en aquella regin. Estos microtbulos aislada de la punta de la raz de una corticales constituyen lo que se denomina la red cortical, situndose muy prxi cebolla. (C) La misma clula teida por inmunofluorescencia que muestra el mos a la cara citoplasmtica de la membrana plasmtica y unidos a ella por pro ordenamiento cortical transversal de tenas mal caracterizadas (Figura 19-68). En muchos tipos y formas de clulas los microtbulos. (A, cortesa de Brian vegetales se observa una orientacin congruente de la red cortical de microt Gunning; B y C, cortesa de Kim bulos (en el interior de la membrana plasmtica) y las microfibrillas de celulosa Goodbody.) (en la cara externa de esta membrana), y se presenta durante la deposicin tanto de la pared celular primaria como de la secundaria. Si la totalidad del sistema de microtbulos corticales se desensambla m e diante el tratamiento de un tejido vegetal con una droga despolimerizadora de microtbulos, las consecuencias en la posterior deposicin de celulosa no son tan claras como podra esperarse. El tratamiento con la droga no afecta la pro duccin de nuevas microfibrillas de celulosa, y en algunos casos las clulas pue den continuar depositando nuevas microfibrillas siguiendo la orientacin preexis tente. Sin embargo, cualquiera de los cambios que normalmente se produciran en el patrn de depsito de microfibrillas entre las lminas consecutivas est blo queado invariablemente. Aparentemente la orientacin de las microfibrillas pre existentes puede propagarse incluso en ausencia de microtbulos, pero cualquier cambio en la deposicin de las microfibrillas de celulosa requiere que existan m i crotbulos intactos para determinar la nueva orientacin. Estas observaciones son coherentes con el siguiente modelo. Se cree que los com plejos que sintetizan la celulosa de la membrana plasmtica generan y van segregando las molculas de celulosa. Probablemente a medida que se sinteti zan las molculas de celulosa y se autoensamblan formando las microfibrillas, el

La pared celular de los vegetales

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extrem os distales de m icrofibrillas de celulosa en la pared preexistente

Figura 19-69 Modelo sobre cmo la orientacin cortical de los microtbulos puede determinar la orientacin de las microfibrillas de celulosa que se depositan. Los

ESPACIO EXTRACELULAR

m em brana plasmtica

CITOSOL m icrotbulo adherido a la m em brana plasmtica

com plejo celulosa sintasa

extremo distai de cada microfibrilla forma enlaces cruzados con la capa anterior del material de la pared. Sin embargo, durante el crecimiento los extremos proximales de los complejos sintetizadores podran tener que desplazarse a lo largo de la membrana en la direccin de sntesis. Puesto que las microfibrillas de celulosa en crecimiento son muy rgidas, cada capa de microfibrillas tendera a desplazarse por la membrana en la misma orientacin que la capa anterior, y el siguiente com plejo de celulosa sintasa lo hara a lo largo de la trayectoria de las microfibrillas preexistentes. Sin embargo, los microtbulos pueden cambiar esta direccin pre determinada en la que se desplazan los complejos sintasa: pueden crear barreras en la membrana plasmtica que acten como las orillas de un canal constriendo el desplazamiento de los complejos sintasa a ejes paralelos (Figura 19-69). Desde este punto de vista la sntesis de celulosa puede tener lugar con independencia de los microtbulos pero est determinada espacialmente cuando los microtbulos corticales estn presentes ya que definen los dominios de membrana dentro de los cuales el complejo enzimtico puede moverse. Las clulas vegetales cambian su direccin de elongacin y, por tanto, su fu turo plano de crecim iento y divisin mediante un repentino cambio en la orien tacin de su red cortical de microtbulos. Puesto que las clulas vegetales no pueden desplazarse (estn aprisionadas por sus paredes), la morfologa de un vegetal pluricelular depende del control de la orientacin de estos microtbulos durante su desarrollo. No se sabe cmo se regula la organizacin de estos m icro tbulos, si bien se ha demostrado que pueden reorientarse rpidamente en res puesta a estmulos extracelulares, incluyendo los factores de crecimiento vege tales de bajo peso molecular tales como el etileno y el cido giberlico.

grandes com plejos celulosa sintasa son protenas integrales de membrana que continuamente sintetizan microfibrillas de celulosa en la cara externa de la membrana plasmtica. Los extremos distales de las rgidas microfibrillas se integran en la textura de la pared, mientras que su elongacin, en los extremos proximales, empuja el complejo sintasa a lo largo del plano de la membrana. Debido a que la red cortical de los microtbulos est prxima a la membrana plasmtica, confinando los com plejos a surcos m embranosos definidos, la orientacin del microtbulo determina el eje a lo largo del cual se depositan las microfibrillas.

Resumen

Las clulas vegetales estn rodeadas por una rgida matriz extracelular, en forma de una pared celular, que es la responsable de la mayora de las caractersticas tpi cas del tipo de vida vegetal. La pared celular est constituida por resistentes microfibrillas de celulosa incluidas en una matriz altamente entrecruzada de polisacridos (principalmente pectinas y hemicelulosa) y glucoprotenas. Una ordenacin cortical de microtbulos puede determinar la orientacin de las microfibrillas de celulosa que se depositan, las cuales, a su vez, determinan la manera en que las c lulas se expanden y por consiguiente la forma final de las clulas, as como sus pa trones de divisin celular.
107 8 Captulo 19 : Adhesin celular, uniones celulares y matriz extracelular

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Clulas germinales y fecundacin

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Las v en tajas del sexo Meiosis O ocitos E sperm atozoides Fecu n d acin

P a ra la re p ro d u cci n n o es im p rescin d ib le el sexo. Los o rg an ism o s u n icelu lares p u ed en rep ro d u cirse m e d ia n te u n a sim ple divisin m it tica . La m ay o ra d e las p lan tas se p ro p ag a n v e g e ta tiv a m e n te m e d ia n te la fo rm a ci n d e ag reg ad o s p luri celu lares q ue, p o ste rio rm e n te , se se p a ra r n de la p lan ta m a d re . D e m a n e ra s e m e ja n te en el reino an im al u n a plu ricelular p u ed e p ro d u cir d e sce n d ie n tes p o r g e m a ci n (Figura 2 0 -1 ). Las a n m o n a s y los g u san o s m a rin o s p u ed en

Hydra

dividirse en d os m itad es, re g e n e ra n d o c a d a u n a de las z o n a s d e la m itad q u e les falta. As m ism o , existen esp ecies de lag arto s re p re se n ta d a s e x clu siv am en te p o r h em b ras, las cu ales se re p ro d u ce n sin a p a re a m ie n to . A unque e s ta re p ro d u c c i n a s e x u a l es sim ple y d irecta, d a lu gar a u n a d e sce n d e n cia q ue es g e n tica m e n te id n tica al o rg an ism o p a te rn o . En ca m b io , la re p ro d u c c i n se x u a l im p lica la m e z cla d e los g en o m a s p ro ce d e n te s de d os individuos d istintos, p a ra p ro d u cir d escen d ien tes q ue su elen d iferen ciarse g e n tica m e n te e n tre s y ta m b i n de sus d os p ro g en ito res. P a re c e p u es q ue la re p ro d u cci n sexu al h a d e p re se n ta r g ra n d es ven tajas, d ad o q ue h a sido a d o p ta d a p o r la gran m ay o ra de las p lan tas y de los an im ales. M u ch o s p ro ca rio ta s y e u ca rio ta s u n icelu lares in clu so, h a n d e s a rro llado la ca p a cid a d de rep ro d u cirse sexu alm en te. E ste cap tu lo e st d ed icad o a la m aq u in aria celu lar de la re p ro d u cci n sexual. A ntes de estu d iar c o n detalle c m o a c t a e s ta m aq u in aria, n o s d e te n d re m o s a co n sid e ra r p o r q u existe y qu b en eficios a p o rta.

Las ventajas del sexo

El ciclo de la re p ro d u cc i n sexu al su p o n e u n a a lte rn a n cia de g e n e ra cio n e s de clu las h a p lo id e s - c a d a u n a d e las cu ales co n tie n e u n a d o ta ci n sen cilla de c r o m o s o m a s - c o n g e n e ra cio n e s de clu las d ip lo id es - c a d a u n a de las cu ales c o n tien e u n a d o ta ci n d oble d e cro m o s o m a s . La m e z cla de los g e n o m a s se co n sig u e p o r m ed io d e la fusin de d o s clu las h aploid es fo rm an d o u n a clu la diploide. P o sterio rm en te, cu a n d o u n d esce n d ie n te d e la clu la diploide se divide p o r m e dio del p ro ce so d e (Figura 2 0 -2 ) se g e n e ra n n u ev as clu las haploid es. D u ran te la m eio sis y a n te s d e q u e los cro m o s o m a s se a n rep artid o s en co n ju n to s h aploid es, los cro m o s o m a s d e la d o ta ci n diploide in te rca m b ia n DNA m e d ia n te

meiosis

Figura20-1 Fotografa de una Hydra en la que se estn formando dos nuevos organismos por gemacin Los descendientes, genticamente idnticos al padre, se separarn de l y vivirn independientemente. (Por cortesa de Amata Hornbruch.)

(flechas).

el p ro ce so d e D e e s ta m a n e ra , c a d a clu la de la n u ev a g e n e ra ci n h ap lo id e recib e u n a d o ta ci n g n ica d iferente, de m a n e ra q ue ca d a cro m o s o m a p re se n ta u n o s g en es q ue p ro v ien en de u n a clu la de la g e n e ra ci n h ap loid e an terio r y o tro s d e o tra . As, a trav s de ciclo s de h aploida, fusin c e lu

recombinacin gnica.

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lar, diploida y meiosis desaparecen las antiguas com binaciones de genes y se crean otras com binaciones nuevas.

En los anim ales pluricelulares, la fase diploide es com pleja y larga m ientras que la haploide es sencilla y corta
Las clulas proliferan mediante divisiones mitticas. En la mayora de los orga nismos que se reproducen sexualmente, la proliferacin tiene lugar durante la fase diploide. Algunos organismos primitivos, como ciertos tipos de levaduras, son excepcionales en el sentido de que son las clulas haploides las que prolife ran m itticam ente mientras que las clulas diploides, una vez formadas, entran directamente en meiosis. En las plantas ocurre un caso menos extremo, ya que presentan divisiones mitticas tanto en la fase haploide como en la diploide. Sin embargo, en las plantas ms primitivas la fase haploide es muy breve y sencilla, mientras que la diploide ocupa un largo perodo de desarrollo y proliferacin. Casi todos los animales pluricelulares, incluidos los vertebrados, se encuentran durante la prctica totalidad del ciclo vital en un estadio diploide: las clulas ha ploides tiene una corta existencia, no se dividen y estn altamente especializa das para realizar la fusin sexual (Figura 20-3). Las clulas haploides que estn especializadas para la fusin sexual reciben el nombre de gametos. Tpicam ente se forman dos tipos de gametos: uno es grande e inmvil y se denomina oocito (o huevo ) y el otro es pequeo y mvil y se denomina espermatozoide (Figura 20-4). Durante la fase diploide que sigue a la fusin de los gametos, las clulas proliferan y se diversifican formando un or ganismo pluricelular complejo. En la mayora de los animales se puede estable cer una distincin til entre las clulas de la lnea germinal, de la que derivar la siguiente generacin de gametos, y las clulas somticas, que forman el resto del organismo y mueren sin dejar progenie. En cierto sentido, las clulas som ti cas nicam ente existen para ayudar a las clulas de la lnea germinal (clulas germinales) a sobrevivir y propagarse.

LAS CLULAS HAPLOIDES SE FUSIONAN FORMANDO UNA CLULA DIPLOIDE

LA CLULA DIPLOIDE SE DIVIDE FORMANDO CLULAS HAPLOIDES

Figura 20-2 Ciclo vital sexual. Implica una alternancia de generaciones de clulas haploides y diploides.

organism os diploides

organism os haploides
< 8>

APAREAMIENTO

esperm atozoide vulo haploide haploide

------- 1 1 -----1
FECUNDACIN

I 0

I
O

zigoto diploide
MEIOSIS

clulas haploides zigoto diploide

MITOSIS

Figura 20-3 Clulas haploides y diploides en el ciclo vital de eucarjotas superiores y algunos eucariotas inferiores. Las clulas de los organismos eucariotas superiores proliferan durante la fase diploide, formando un organismo pluricelular; slo los gametos son haploides. En algunos eucariotas inferiores, en cambio, las clulas haploides proliferan, y la nica clula diploide es el zigoto, que existe transitoriamente despus del apareamiento. Las clulas haploides se han dibujado en rojo y las diploides en azul.

GGGCOGOG
organism os haploides organism os diploides
EUCARIOTAS SUPERIORES CIERTOS EUCARIOTAS INFERIORES

AAA

MITOSIS

1 08 4

Captulo 2 0 : Clulas germinales y fecundacin

Figura 20-4 Electronmicrografa de barrido de un oocito de almeja con numerosos espermatozoides dispuestos en su superficie. A pesar de
que se han unido al vulo muchos espermatozoides, nicam ente uno de ellos lo fecundar, com o discutimos ms adelante. (Por cortesa de David Epel.)

La reproduccin sexual confiere una ventaja competitiva a los organismos que se encuentran en un ambiente que cam bia de form a imprevisible 1
La maquinaria de la reproduccin sexual es elaborada, y los recursos que se de dican a ella son importantes. Por qu apareci y qu beneficios reporta? M e diante la recom binacin gentica los individuos sexuados engendran una des cendencia imprevisiblemente desigual, cuyos genotipos tienen, por razones de azar, tantas probabilidades de representar un cambio para mejorar como para empeorar. Por lo tanto, por qu deberan tener los individuos sexuados una ventaja competitiva frente a los individuos que se reproducen de una manera fiable, a travs de un proceso asexual? Este problema deja an perplejos a los ge netistas, pero la conclusin general parece ser que la redistribucin de los genes a travs de la reproduccin sexual ayuda a la especie a sobrevivir en un am bien te que sufre alteraciones imprevisibles. Si un progenitor produce numerosos descendientes, con una gran variedad de com binaciones gnicas, existen ms probabilidades de que como mnimo uno de sus descendientes tenga el conjun to de caractersticas necesarias para sobrevivir. Se han propuesto otras muchas ideas para explicar las ventajas competitivas de la reproduccin sexual. Una de ellas sugiere cmo pudo suceder una de las primeras etapas en la evolucin del sexo. La evolucin depende en gran manera de la com petencia entre individuos que son portadores de alelos, o variantes, al ternativos producidos por mutacin de determinados genes. Supongamos que dos individuos de una poblacin sufren mutaciones beneficiosas que afectan a diferentes loci genticos y, por consiguiente, a dos funciones distintas. En una es pecie estrictamente asexual, cada uno de estos individuos dar lugar a un clon de descendientes mutantes, y los dos clones competirn hasta que uno triunfe sobre el otro: una de las dos mutaciones beneficiosas se difundir a travs de la poblacin mientras que la otra, a la larga, se perder. Supongamos ahora que uno de los mutantes originales posee una particularidad adicional, determinada genticamente, que lo capacita para incorporar ocasionalmente genes de otras clulas. Durante el perodo competitivo, la adquisicin de genes de una clula del clon competidor implica, probablemente, la produccin de una clula porta dora de ambas mutaciones beneficiosas. Tal clula tendr una probabilidad ma yor de xito que las otras, y dicho xito asegurar la propagacin del rasgo que la

Las ventajas del sexo

1085

capacita para incorporar genes de otras clulas. De esta forma, esta rudimenta ria capacidad sexual puede haber sido favorecida por la seleccin natural. Cualquiera que sean los orgenes del sexo, es notable que la prctica totali dad de los organismos com plejos actuales hayan evolucionado a travs de gene raciones de reproduccin sexual y no de reproduccin asexual. La mayora de los organismos asexuados, aunque son abundantes, han permanecido sencillos y primitivos. Vamos a examinar ahora con detalle los m ecanismos celulares del sexo, em pezando con los procesos de la meiosis, en la que se produce la recom binacin gentica y las clulas diploides de la lnea germinal se dividen produciendo ga metos haploides. Despus consideraremos los gametos en s mismos y, final mente, el proceso de la fecundacin, en el cual los gametos se fusionan forman do un nuevo organismo diploide.

Resumen
La reproduccin sexual implica una alternancia cclica de estados diploide y haploide: las clulas diploides se dividen mediante la meiosis formando clulas ha ploides y las clulas haploides procedentes de dos individuos se fusionan de dos en dos formando nuevas clulas diploides. En el proceso, los genomas se mezclan y recombinan produciendo individuos que poseen nuevas dotaciones de genes. La ma yor parte del ciclo vital de las plantas y de los animales superiores transcurre en la fase diploide, siendo la fase haploide muy corta. La reproduccin sexual se ha visto favorecida por la evolucin debido a que la recombinacin gentica al azar aumen ta la probabilidad de producir, como mnimo, algunos descendientes que puedan sobrevivir en un ambiente cuya variabilidad es imprevisible.

Meiosis2
La com prensin de que las clulas germinales son haploides y, por consiguiente, se tienen que producir mediante un tipo especial de divisin celular, se obtuvo com o resultado de una observacin, la cual tambin fue una de las primeras en sugerir que los crom osom as son los portadores de la informacin gentica. En 1883 se descubri que mientras que el huevo fecundado de un determinado gu sano contiene cuatro cromosomas, los ncleos del oocito y del espermatozoide slo contienen dos cromosomas. La teora crom osm ica podra explicar, por tanto, la vieja paradoja de que a menudo las contribuciones materna y paterna al carcter de la progenie parecen iguales, a pesar de la enorme diferencia de ta mao entre el oocito y el espermatozoide (vase Figura 20-4). El hallazgo im plicaba tam bin que las clulas germinales se han de formar a travs de un tipo especial de divisin nuclear, mediante el cual la dotacin crom osm ica queda dividida exactam ente por la mitad. Este tipo de divisin se denom ina m eiosis, cuya raz griega significa disminucin. (No existe conexin con el trm ino m itosis, el cual proviene del vocablo griego mitos, cuyo signifi cado es hilo, que hace referencia a que cuando los cromosomas se condensan durante la divisin nuclear -proceso que tiene lugar tanto en las divisiones mitticas com o en las m eiticas- se parecen a un hilo.) El comportamiento de los crom osom as durante la m eiosis se present m ucho ms complejo de lo que se esperaba. Por ello no fue hasta el inicio de la dcada de 1930, y como resultado de concienzudos estudios citolgicos y genticos, que pudieron establecerse las principales caractersticas de la meiosis.

La meiosis im plica dos divisiones nucleares en lugar de una sola

Exceptuando los cromosomas que determinan el sexo (cromosomas sexuales), cada ncleo diploide contiene dos versiones muy semejantes de cada uno de los otros cromosomas (los autosomas), una de los cuales proviene del padre y la otra de la 1086 Captulo 2 0 : Clulas germinales y fecundacin

madre. Ambas versiones se denominan homlogas, y en la mayora de las clulas existen de forma completamente separada, como cromosomas independientes. Cuando cada cromosoma se duplica mediante la replicacin del DNA, inicial mente las copias gemelas de los cromosomas completamente replicados perma necen estrechamente asociadas, y se denominan cromtidas hermanas. En una divisin mittica (descrita en el Captulo 18), las cromtidas hermanas se alinean sobre el huso dirigiendo sus fibras cinetocricas hacia polos opuestos. Cuando las cromtidas hermanas se han separado una de la otra, en la anafase, se denomi nan cromosomas. De esta manera las clulas hijas formadas por mitosis heredan una copia de cada cromosoma paterno y otra de cada cromosoma materno. Por el contrario, un gameto haploide, producido por divisiones de una clula diploide durante la meiosis, ha de contener la mitad del nmero original de cro mosomas -u n solo miembro de cada uno de los pares de cromosomas hom lo gos- de forma que el gameto dispone de la copia paterna o de la copia la materna de cada gen, pero no de ambas. Este requerimiento implica una nueva exigencia de la maquinaria de la divisin celular; el m ecanismo que se ha desarrollado para conseguir que se produzca esta distribucin adicional requiere que los crom oso mas homlogos se reconozcan entre s y se apareen fsicamente antes de alinear se sobre el huso. Este apareamiento de las copias de cada cromosoma paterno y materno es especfico de la meiosis. Ms adelante discutiremos de qu forma cada cromosoma reconoce a otro de forma correcta. Dado un mecanism o para el apareamiento de los cromosomas homlogos maternos y paternos y su posterior separacin sobre el huso, las clulas podran, en principio, producir la meiosis mediante la simple modificacin de un solo ci clo mittico celular en el que la duplicacin cromosmica (fase S) se omitiera: si los cromosomas homlogos no duplicados se aparearan antes de la fase M, la di visin celular resultante podra producir directamente dos clulas haploides. Sin embargo, por razones que desconocem os el proceso meitico actual es ms complejo. Antes de que los cromosomas homlogos se apareen, cada uno de ellos se replica produciendo dos cromtidas hermanas, como si se tratara de una divisin mittica. Las caractersticas tpicas de la meiosis slo se hacen eviden tes despus de la replicacin del DNA. En lugar de separarse, las cromtidas her manas se comportan com o una unidad, como si la duplicacin cromosmica no hubiera tenido lugar: cada uno de los cromosomas homlogos duplicados se em pareja con su compaero, formando una estructura denominada bivalente , que contiene cuatro cromtidas. Las estructuras bivalentes se alinean sobre el huso y, en la anafase, los dos homlogos duplicados (cada uno de ellos formado por dos cromtidas hermanas) se separan, desplazndose hacia polos opuestos. A consecuencia de que las cromtidas hermanas se comportan como una uni dad, cuando la clula meitica se divide cada clula hija recibe dos copias de uno de los dos homlogos. Por lo tanto, las dos progenies de esta divisin (divi sin I de la meiosis) contienen una cantidad doble de DNA, pero difieren de las clulas diploides normales en dos aspectos: ( 1) cada una de las dos copias de DNA de cada cromosoma deriva de uno de los dos cromosomas homlogos pre sentes en la clula original (excepto que se haya producido recom binacin gen tica), y (2) estas dos copias se heredan como cromtidas hermanas estrecha mente asociadas, como si fueran un nico cromosoma (vase Figura 20-5). Ahora, se puede producir la formacin de los verdaderos ncleos de los ga metos de manera bastante sencilla, a travs de una segunda divisin celular, la divisin II de la meiosis, sin que se produzca otra replicacin del DNA. Los cro mosomas se alinean sobre un segundo huso y las cromtidas hermanas se sepa ran como en una mitosis normal produciendo clulas con un contenido haploi de de DNA. As pues, la meiosis consta de dos divisiones celulares sucesivas que se producen tras una sola fase de replicacin de DNA, por lo que a partir de cada clula que sufre la meiosis se producen cuatro clulas haploides. En la Figura 206 se comparan la meiosis y la mitosis. A veces el proceso meitico se desarrolla de manera anormal y los hom lo gos no se separan -fenm eno conocido como no-disyuncidn. En este caso, al-

hom logo paterno hom logo m aterno

} REPLICACIN DEL DNA

AREAMIENTO DE CROMOSOMAS HOMLOGOS

LOS PARES HOMLOGOS DE CROMOSOMAS DUPLICADOS SE ALINEAN SOBRE EL HUSO

DIVISIN CELULAR I DE LA MEIOSIS

Figura 20-5 Acontecimientos que se producen durante la primera divisin celular de la meiosis. Para mayor claridad nicamente se muestra un par de cromosomas homlogos. El apareamiento de cromosomas homlogos (simplemente homlogos) es tpico de la meiosis. Cada cromosoma se ha duplicado y se halla unido a su cromtida hermana antes de que se produzca el emparejamiento. Como se muestra mediante la formacin de los cromosomas parte de los cuales son rojos y parte son negros, el apareamiento de los cromosomas durante la meiosis produce entrecruzamiento (recombinacin gnica) entre cromosomas homlogos, como se explica en el texto.

Meiosis

1087

MEIOSIS
hom logo paterno hom logo m aterno REPLICACION DEL DNA

DIVISIN CELULAR NORMAL

'I #
REPLICACION DEL DNA

"APAREAMIENTO DE CROMOSOMAS HOMLOGOS

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LOS CROMOSOMAS DUPLICADOS SE ALINEAN INDIVIDUALMENTE SOBRE EL HUSO

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M s-

DIVISIN CELULAR
11

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A. ill
'i '

V
DIVISION CELULAR

DIVISION CELULAR

gunas de las clulas haploides producidas carecen de algn cromosoma, m ien tras que otras poseen ms de una copia. Tales gametos forman embriones anor males, la mayora de los cuales mueren. Sin embargo, algunos de ellos sobrevi ven: por ejemplo, el sndrome de Down en humanos est causado por una copia extra del crom osom a 21 a causa de la no-disyuncin durante las divisiones meiticas I o II.

Figura 20-6 Comparacin entre las divisiones mittica y meitica. Como

en la figura anterior, nicam ente se muestra un par de cromosomas homlogos. En la meiosis, tras la replicacin del DNA, se requieren dos divisiones nucleares (y celulares) para producir los gametos haploides. Por lo tanto, cada clula diploide que entra en una meiosis da lugar a cuatro clulas haploides mientras que cada clula diploide que se divide por mitosis produce dos clulas diploides.

La redistribucin gnica aum enta debido al entrecruzamiento entre las cromtidas homlogas no herm anas 3
A menos de que se trate de gametos idnticos, los descendientes de los mismos padres nunca son genticam ente iguales. Ello es debido a que, mucho antes de que se fusionen los dos gametos, se producen dos tipos de redistribuciones gnicas durante la meiosis.

108 8

Captulo 2 0 : Clulas germinales y fecundacin

Figura 20-7 Dos contribuciones principales a la redistribucin del material gnico que se producen durante la meiosis. (A) La distribucin independiente de los homlogos paterno y materno durante la primera divisin meitica produce 2 " gametos haploides diferentes para un organismo con n cromosomas. Aqu n - 3, por lo que existen 8 gametos diferentes posibles. (B) El entrecruzamiento durante la profase meitica I intercambia segmentos de cromosomas homlogos, redistribuyendo los genes de los cromosomas. Debido a las muchas diferencias en la secuencia de DNA que siempre existen en cualquier par de homlogos, ambos mecanismos incrementan la variabilidad gentica de los organismos que se reproducen sexualmente.

tres pares de crom osom as hom logos materno paterno

DISTRIBUCION INDEPENDIENTE DE LOS CROMOSOMAS MATERNOS Y PATERNOS HOMLOGOS DURANTE LA DIVISIN MEITICA I

Un tipo de redistribucin es una consecuencia de la distribucin al azar en tre las clulas hijas de los distintos homlogos paternos y maternos, durante la divisin meitica I, a consecuencia de la cual cada gameto adquiere una dota cin diferente de los cromosomas maternos y paternos. Slo debido a este pro ceso, un individuo puede, en principio, producir 2n gametos genticamente di ferentes, donde n es el nmero haploide de cromosomas (Figura 20-7A). As, en los humanos, cada individuo puede producir por lo menos 223= 8,4 x 106gametos genticamente diferentes. Sin embargo, el nmero real de variantes es mucho ms elevado debido a un segundo tipo de distribucin, denominada entrecru zamiento crom osm ico, que tiene lugar durante la meiosis. Se produce durante la larga fase de la divisin meitica I, en el cual se intercambian fragmentos de cromosomas homlogos. En cada par de cromosomas humanos se producen por trmino medio entre dos y tres entrecruzamientos durante esta fase. Este proceso mezcla el contenido gentico de cada uno de los cromosomas de los ga metos, tal como se indica en la Figura 20-7B. El entrecruzamiento cromosmico supone la rotura de la doble hlice de DNA de una cromtida materna y de una cromtida paterna homologa, de for ma que se intercambian fragmentos entre dos cromtidas no hermanas de una forma recproca mediante un proceso conocido como recombinacin gnica general. Los detalles moleculares de este proceso se estudian en el Captulo 6. Las consecuencias de cada proceso de recom binacin pueden ser observadas citolgicamente en las ltimas etapas de la divisin meitica I, cuando los dos cromosomas estn altamente condensados. En esta etapa, las cromtidas her manas estn estrecham ente colocadas una junto a otra a lo largo de toda su lon gitud. Los dos homlogos duplicados (materno y paterno) permanecen conecta dos fsicamente por unos puntos determinados. Cada uno de estos puntos, llamado quiasma, corresponde a un entrecruzamiento entre dos cromtidas no hermanas (Figura 20-8). En esta etapa de la meiosis, cada par de homlogos duplicados, o bivalente, est unido como mnimo por un quiasma. Muchos bivalentes contienen ms de un quiasma, lo cual indica que se pueden producir mltiples entrecruzamientos entre los homlogos.

gam etos posibles (A)

ENTRECRUZAMIENTO DURANTE LA PROFASE DE LA MEIOSIS

El apareamiento m eitico cromosm ico culmina con la form acin del complejo sinaptonm ico 4
Durante la primera profase meitica ocurren complejos cambios morfolgicos en los cromosomas cuando se aparean (sinapsis) y cuando empiezan a separarse

m aterno

paterno

quiasma
Figura 20-8 Cromosomas homlogos apareados durante la transicin hacia la metafase de la divisin meitica I. Con anterioridad, durante la profase, se
ha producido un nico entrecruzamiento que da lugar a un quiasma. Obsrvese que las cuatro cromtidas estn dispuestas en dos pares de cromtidas hermanas y que las dos cromtidas de cada par estn estrechamente alineadas por su eje longitudinal y unidas por los centrmeros. Por ello, la unidad de cuatro cromtidas recibe el nombre de bivalente.

centrom eros

crom tidas herm anas

Meiosis

1089

PAQUITENO
cromtida 1 cromtidas hermanas paternas f\T^nsam blaje def elemento central ~L \ del complejo

cromtida 2

cromtidas hermanas maternas

cromtida 3 cromtida 4

INTERFASE

ZIGOTENO
T IE M P O

DIPLOTENO SEGUIDO DE DIACINESIS

(desinapsis ), durante la primera profase meitica. Tradicionalmente esta profase est dividida en cinco etapas secuenciales -leptoteno, zigoteno, paquiteno, diplo teno y diacinesis- definidas por estos cam bios morfolgicos. El acontecimiento ms notable es el inicio de la sinapsis crom osmica ntima en el zigoteno, cuan do entre los dos grupos de cromtidas hermanas de cada bivalente se empieza a desarrollar una estructura compleja, denominada complejo sinaptonmico. Se dice que el paquiteno empieza en cuanto la sinapsis se completa, y generalmen te persiste durante das, hasta que empieza la desinapsis en la fase de diploteno, m om ento en que se observan por primera vez los quiasmas (Figura 20-9). La recom binacin gnica requiere una estrecha aposicin entre los crom o somas recom binantes. El complejo sinaptonmico, que se forma inmediata mente antes del paquiteno y desaparece inmediatamente despus, mantiene los crom osom as homlogos unidos y estrecham ente alineados formando un biva lente; se ha sugerido que juega un papel importante en el proceso de recom bi nacin. El com plejo sinaptonmico est formado por un largo ncleo proteico, en forma de escalera, en cuyos lados opuestos se hallan los dos homlogos for mando un largo par crom osm ico lineal. Las cromtidas hermanas de cada ho mlogo se m antienen estrecham ente empaquetadas entre s, y su DNA se ex tiende desde el mismo lado de la escalera proteica, formando una serie de bucles (Figura 20-10). No se sabe por qu se alinean las zonas homlogas de los cromosomas. Es poco probable que se produzca una conexin continua a lo largo de los crom o somas que interactan, ya que la crom atina de un homlogo est claramente se parada de la de su compaero en el complejo sinaptonmico. Se ha propuesto que la interaccin inicial entre cromosomas homlogos est mediada por inter acciones de pares de bases complementarias del DNA en regiones discretas a lo largo de cada cromosoma. Este reconocim iento puede ocurrir durante el zigote no o incluso antes, cuando los cromosomas todava no estn muy condensados; tras la condensacin de los cromosomas, la formacin del complejo sinapton mico debe empaquetar entre s las zonas remanentes de los cromosomas.

Figura 20-9 Curso temporal de la sinapsis y de la desinapsis cromosmica durante la profase meitica I. Tan slo se muestra un bivalente. El estadio de paquiteno se define como el perodo durante el que existe un complejo sinaptonmico completamente formado. En los gametos de los animales hembra el posterior estadio de diploteno es un perodo enormemente largo de crecimiento celular, durante el cual los cromosomas se hallan descondensados y transcribiendo muy activamente. Ello acaba con la diacinesis -el estado de transicin a la metafase- en el cual los cromosomas se vuelven a condensar y cesa la transcripcin. En los gametos macho el diploteno y la diacinesis son breves y menos diferenciados.

Se cree que los ndulos de recom binacin median los intercam bios de crom tidas 5
Aunque el complejo sinaptonmico proporciona la trama estructural necesaria para los acontecim ientos de la recom binacin, probablemente no es el m ecanis mo a travs del cual ambos cromosomas se mantienen unidos. Se cree que el proceso activo de recom binacin se halla mediado por unos grandes ndulos de recom binacin, que son grandes ensam blajes que contienen protenas, de un dimetro de unos 90 nm. (Como referencia, una gran molcula proteica globular de un peso molecular de 400 000 daltons tiene un dimetro de aproximadamen te 10 nm.) Los ndulos de recom binacin se hallan situados a intervalos en el complejo sinaptonmico, dispuestos como pelotas de baloncesto sobre una es-

109 0

Captulo 2 0 : Clulas germinales y fecundacin

calera, entre las dos cromtidas hermanas (vase Figura 20-10). Se cree que mar can la localizacin de una gran maquinaria de recom binacin multienzimtica que une entre s regiones del DNA de las cromtidas materna y paterna a travs del complejo sinaptonmico de 100 nm de anchura. La evidencia de que el ndulo de recom binacin presenta esta funcin es indirecta: (1) el nmero total de ndulos es aproximadamente igual al nmero de quiasmas observados posteriormente en la profase. (2) Los ndulos estn dis tribuidos a lo largo del complejo sinaptonmico como lo estn los fenmenos de entrecruzamiento. Por ejemplo, como ocurre con los fenmenos de entrecruzamiento, los ndulos se hallan ausentes de las regiones del complejo sinapton mico que m antienen unida la heterocromatina. Adems, medidas genticas y citolgicas indican que la presencia de un fenmeno de entrecruzamiento impide que ocurra otro fenmeno de entrecruzamiento en cualquier lugar prximo del cromosoma; de forma anloga, generalmente los ndulos no se producen muy prximos unos de otros. (3) Algunas mutaciones de Drosophila causan una dis tribucin anormal de los fenmenos de entrecruzamiento a lo largo de los cro mosomas, as como una intensa disminucin de la frecuencia de recom bina cin. En estos mutantes se encuentran menos ndulos de recombinacin, con una alteracin paralela a la de la distribucin del entrecruzamiento. Esta corre lacin sugiere claramente que la localizacin de cada fenmeno de entrecruza miento viene determinada por un nodulo de recombinacin. (4) Se cree que la recom binacin gnica implica una sntesis de una cantidad limitada de DNA en el punto de cada entrecruzamiento (se discute en el Captulo 6). La autorradiografa mediante el microscopio electrnico muestra cmo los precursores ra diactivos de DNA se incorporan preferentemente en el DNA paquitnico, en los ndulos de recom binacin o cerca de ellos. Aproximadamente existen tantos ndulos como fenmenos de recom bina cin, por lo que parece que los ndulos de recombinacin son extremadamente eficientes en provocar la recom binacin de las cromtidas de homlogos opues tos. Sin embargo an es muy poco lo que se conoce acerca de su estructura o de su mecanism o de accin.

ndulo de recombinacin

ejes proteicos (elementos laterales)

cromatina de las cromtidas hermanas paternas 1 y 2

cromatina de las cromtidas hermanas maternas 3 y 4

Figura 20-10 Complejo sinaptonmico tpico en el que se muestran los elementos laterales y centrales. Tambin se muestra un ndulo de recombinacidn. El esquema slo muestra una pequea seccin del largo complejo en forma de escalera. En organismos tan diversos como las levaduras y el hombre se forma un complejo sinaptonmico similar; todava no sabemos nada respecto a las molculas proteicas que forman este complejo.

Los quiasmas desempean un importante papel en la segregacin crom osm ica durante la meiosis
Adems de mediar la redistribucin gnica, parece que el entrecruzamiento cro mosomico es crucial en la mayora de los organismos para la correcta segregacin de los dos homlogos en los ncleos hijos. Ello es debido a que cada quiasma ge nerado por un entrecruzamiento juega un papel anlogo al del centrmero en una divisin mittica, manteniendo los homlogos materno y paterno unidos al huso hasta la anafase I. En algunos organismos mutantes que presentan una baja frecuencia de entrecruzamientos meiticos, algunos cromosomas no presentan quiasmas. Estos pares no se segregan de manera normal y una alta proporcin de los gametos resultantes contienen un exceso o un defecto de cromosomas -lo cual constituye un ejemplo de no-disyuncin. Existen, como mnimo, dos diferencias fundamentales entre los procesos de separacin de los cromosomas en la divisin meitica I y en la mitosis (vase Fi gura 20-6). (1) A lo largo de la mitosis (y en la divisin meitica II, la cual se pare ce a una mitosis), las cromtidas hermanas se mantienen unidas nicamente en el centrmero: los cinetocoros (complejos proteicos asociados con los centrmeros; se tratan en el Captulo 18) de cada cromtida hermana presentan las fibras cinetocricas dirigidas hacia direcciones opuestas, de forma que durante la anafase las cromtidas son estiradas hacia clulas hijas diferentes. En la metafase I de la meiosis, por el contrario, los cinetocoros de ambas cromtidas hermanas parecen fusionados de manera que sus fibras presentan la misma orientacin y los brazos de las cromtidas hermanas se hallan estrechamente unidos; adems, los cromosomas homlogos paterno y materno se mantienen unidos entre s a travs del quiasma. (2) Durante la mitosis (y la divisin meitica II) el desplaza-

Meiosis

1091

miento de las cromtidas hacia los polos est mediado por un mecanismo que separa entre s los dos cinetocoros hermanos (inicindose la anafase), lo cual permite a las cromtidas hermanas segregarse en clulas hijas diferentes. En la anafase I de la meiosis, sin embargo, este desplazamiento hacia los polos est iniciado por la ruptura de las fuerzas, poco conocidas, que han permitido m an tenerse unidos entre s los brazos de las cromtidas hermanas, as como por la disolucin de los quiasmas que unan los cromosomas homlogos paterno y materno; consecuentem ente, las cromtidas hermanas permanecen em pareja das pero los homlogos paterno y materno se segregan en clulas hijas diferen tes. En la Figura 20-11 se ilustran los diferentes sistemas a travs de los que se separan los cromosomas en las divisiones meiticas I y II.

Figura 20-11 Comparacin de los mecanismos de alineamiento cromosmico (en la metafase) y de separacin cromosmica (en la anafase) en las divisiones meiticas I
y I I . Los mecanismos implicados en la divisin meitica II son los mismos que ocurren en la mitosis (vase Captulo 18).

LOS BRAZOS DE LAS CROMATIDAS HERMANAS SE SEPARAN anafase m eitica I

BREVE INTERFASE A LA QUE SIGUE EL ESTABLECIMIENTO DE CINETOCOROS INDIVIDUALES PARA CADA CROMTIDA HERMANA

109 2

Captulo 20 : Clulas germinales y fecundacin

El apareamiento de los cromosomas sexuales asegura que tam bin ellos se segreguen 6
Hemos explicado de qu forma los cromosomas homlogos se aparean durante la divisin meitica I de forma que luego se segregan cuidadosamente entre las clulas hijas. Pero, qu sucede con los crom osom as sexuales, que no son ho mlogos en los machos de los mamferos? Las hembras tienen dos cromosomas X, que se aparean y se segregan de la misma forma que los otros homlogos, pero los machos tienen un cromosoma X y un cromosoma Y, que han de apa rearse durante la primera metafase de la meiosis para que el espermatozoide contenga un cromosoma Y o un cromosoma X pero no ambos o ninguno de ellos. El apareamiento necesario es posible gracias a una pequea regin de ho mologa entre los cromosomas X e Y, situada en uno de sus extremos. En esta zona ambos cromosomas se aparean y se entrecruzan durante la primera profa se meitica. El quiasma correspondiente a esta pequea recom binacin genti ca es suficiente para mantener apareados los cromosomas X e Y en el huso, de manera que normalmente slo se forman dos tipos de espermatozoides: unos conteniendo un cromosoma Y, que darn lugar a embriones masculinos, y otros con un cromosoma X, que originarn embriones femeninos.
12

RATON LEPTOTENO ZIGOTENO

PAQUITENO

DIPLOTENO DIACINESIS (A) LIRIO

La divisin m eitica II es sem ejante a la mitosis

Cuando la larga profase I (que puede ocupar ms del 90% de la meiosis) ha con cluido, dos divisiones celulares sucesivas, sin que exista ningn perodo de snte sis de DNA, concluyen la meiosis (vase Figura 20-6). Todo el ciclo celular meitico, que concluye con una divisin meitica inicial de la clula, se denomina divisin meitica I, y es con diferencia ms compleja y dura mucho ms tiempo que el segundo ciclo de divisin meitica, denominado divisin meitica II (Figu ra 20-12). Incluso la replicacin preparatoria del DNA durante el primer ciclo ce lular tiende a ser mucho ms larga que una fase S normal, y las clulas tienden a mantenerse durante das, meses o incluso aos en la primera profase meitica, dependiendo de las especies y de cundo se forme el gameto. (Aunque tradicio nalmente se ha denominado profase, esta prolongada fase de la divisin meitica I es semejante a la fase G2 de una divisin celular normal en la que la envoltura nuclear permanece intacta y tan slo desaparece cuando se inicia la formacin de las fibras del huso en la profase I, dando paso a la metafase I.) Despus de finalizada la divisin meitica I, las membranas nucleares se forman de nuevo alrededor de los dos ncleos hijos, inicindose una breve in terfase. Durante este perodo, los cromosomas pueden descondensarse un poco, pero normalmente se condensan de nuevo y empieza la profase II. Durante este intervalo no se produce sntesis de DNA, por lo que en algunos organismos pare ce que los cromosomas pasan casi directamente de una fase de divisin a la si guiente. En todos los organismos la profase II es breve: la envoltura nuclear se rompe cuando se forma el nuevo huso, tras lo cual se suceden rpidamente la metafase II, la anafase II y la telofase II. Como en la mitosis, en cada cromtida hermana se forma un grupo de fibras cinetocricas que se extienden en direc ciones opuestas a partir del centrmero. Adems, las dos cromtidas hermanas se mantienen unidas en la placa metafsica hasta que se liberan por la brusca separacin de sus cinetocoros durante la anafase (vase Figura 20-11). As, y a diferencia de la divisin I, la divisin II se parece mucho a una mitosis. La nica diferencia importante estriba en que en ella existe una sola copia de cada cro mosoma, y no dos. Una vez formadas las envolturas nucleares alrededor de los cuatro ncleos haploides producidos durante la telofase II, la meiosis ha termi nado (vase Figura 20-6). Los principios de la meiosis son los mismos en plantas y en animales, y en machos y en hembras. Sin embargo, la produccin de game tos supone algo ms que la meiosis, y los procesos necesarios para ello s son claram ente diferentes para el oocito y el espermatozoide. Como veremos, al final de la meiosis un oocito de vertebrado ya est completamente maduro (y en algu-

finalizacin de la divisin m eitica I y toda la divisin m eitica II

LEPTOTENO

-o 3

ZIGOTENO

PAQUITENO DIPLOTENO DIACINESIS

(B)

finalizacin de la divisin "meitica I y toda la divisin m eitica II

Figura 20-12 Comparacin de los tiempos necesarios para cada una de las etapas de la meiosis. Se indican los tiempos aproximados para un mamfero macho (ratn) y para el tejido andrognico de una planta (lirio). Los tiempos difieren para los gametos masculino y femenino (espermatozoide y oocito) de una misma especie, as como para los mismos gametos de especies diferentes. Por ejemplo, en un hombre la meiosis dura 24 das, en comparacin con los 12 del ratn. Sin embargo, en todos los casos la profase meitica I es ms larga que el resto de las etapas meiticas juntas.

Meiosis

1093

nos casos incluso fecundado), mientras que al final de la meiosis un espermato zoide no ha hecho m s que empezar su diferenciacin.

Resumen
Los oocitos y los espermatozoides se forman de la misma manera, a travs de la meiosis. En este proceso, dos divisiones celulares sucesivas, posteriores a un ciclo de replicacin de DNA, dan lugar a cuatro clulas haploides a partir de una sola clula diploide. La meiosis est dominada por la profase de la divisin meitica I, que pue de ocupar l 90% o ms del periodo meitico total En cuando empieza esta profase, cada cromosoma estformado por dos cromtidas hermanas estrechamente unidas entre s. Durante esta prolongada profase I, cuando los cromosomas homlogos se alinean cuidadosamente, ocurren fenmenos de entrecruzamiento cromosmico. Se cree que cada fenmeno de entrecruzamiento est mediado por un gran ndulo de recombinacin y da lugar a la formacin de un quiasma, que persiste hasta la anafase I. En la primera divisin celular meitica, un miembro de cada par cromosmi co, compuesto an por cromtidas hermanas unidas, se distribuye a cada clula hija. Luego se produce una segunda divisin celular, sin replicacin del DNA, y cada cromtida hermana se segrega hacia una clula haploide distinta.

Oocitos
En todos los em briones de vertebrados, durante las etapas iniciales del desarro llo, determinadas clulas se diferencian com o progenitoras de los gametos. Estas clulas germinales primordiales migran hacia las gnadas en desarrollo, deno minadas crestas genitales, que forman los ovarios en las hem bras y los testculos en los machos. Tras un perodo de proliferacin mittica, estas clulas sufren una meiosis y se diferencian en gametos maduros -oocitos o espermatozoides. Despus, tras el apareamiento y la fusin de un oocito y de un espermatozoide, se inicia la embriognesis, con la posterior produccin en el em brin de nuevas clulas primordiales, inicindose nuevamente el ciclo.

El oocito es la nica clula de un anim al superior que es capaz de desarrollarse produciendo un nuevo individuo
Los vulos son las clulas animales ms notables, por lo menos en un aspecto: una vez activados, pueden dar lugar a un nuevo individuo completo en tan slo cues tin de das o semanas. Ninguna otra clula de un animal superior posee esta capa cidad. En general, la activacin es una consecuencia de la fecundacin -la fusin de un espermatozoide con un oocito. Sin embargo, estrictamente el espermatozoide no es necesario para ello. Un oocito puede ser activado artificialmente mediante procedimientos qumicos no especficos o mediante tratamientos fsicos; por ejem plo, un oocito de rana puede ser activado pinchndolo con una aguja. Verdadera mente algunos organismos, entre los que se encuentran incluso vertebrados, como algunos lagartos, se reproducen normalmente a travs de oocitos que son activados en ausencia de espermatozoides -lo cual se denomina partenognesis. A pesar de que un huevo da lugar a todos los tipos celulares del organismo adulto (es decir, es totipotente), en s mismo es una clula altamente especializada, equipada nicamente para la sola funcin de generar un nuevo individuo. Vamos a considerar ahora brevemente alguna de sus caractersticas especiales, antes de dis cutir cmo se desarrolla hasta el momento en el que es apto para la fecundacin.

oocito hum ano

oocito de gallina

Un oocito est altam ente especializado para su desarrollo independiente, presentando grandes reservas nutritivas y una com pleja cubierta protectora 7
Los oocitos de la mayora de los animales son clulas gigantes, con una gran cantidad de reservas de todos los materiales necesarios para que el desarrollo

oocito de rana
Figura 20-13 Tamao real de tres vulos. El humano tiene un dimetro de 0,1 mm.

109 4

Captulo 20 : Clulas germinales y fecundacin

inicial del embrin consiga alcanzar el estadio de un nuevo individuo capaz de alimentarse por s mismo. Antes de alcanzar este punto, la clula gigante se divi de en muchsimas clulas menores, sin que se produzca crecimiento neto. Los mamferos son una excepcin de este principio, ya que el embrin puede iniciar antes su crecimiento tomando nutrientes de la madre; por ello, un oocito de m a mfero, a pesar de ser una clula grande, no lo tiene que ser tanto como por ejem plo el de una rana o de un ave. Tpicamente, los oocitos tienen una forma esfrica u ovoide, de un dimetro de unos 100 (im en humanos y en erizos de mar (los cuales com en larvas diminutas), de 1 a 2 mm en anfibios y peces, y de muchos centmetros en aves y reptiles (Figura 20-13). Una clula somtica tpica, por el contrario, tiene un dimetro de slo unos 10-20 |jm (Figura 20-14). El citoplasma del oocito contiene reservas nutritivas en forma de vitelo, que es rico en lpidos, protenas y polisacridos y que habitualmente se halla en es tructuras discretas denominadas plaquetas vitelinas. En algunas especies cada plaqueta vitelina est rodeada por una mem brana mientras que en otras no lo est. En los vulos que darn lugar a grandes animales que se desarrollan fuera de la madre, el vitelo puede representar ms del 95% del volumen celular m ien tras que en los mamferos, cuyos embriones son alimentados por la madre, constituye mucho menos, si es que existe. Las cubiertas oocitarias constituyen otra peculiaridad de los oocitos. Son una especializacin de la matriz extracelular y estn formadas fundamentalmen te por glucoprotenas, algunas de las cuales estn segregadas por el oocito y otras por clulas acompaantes. En muchas especies la cubierta principal es una capa adyacente a la m embrana plasmtica del oocito; en los oocitos de los no mamfe ros, tales como los erizos de mar o los pollos, se denominan cubiertas vitelinas mientras que en los oocitos de los mamferos constituyen la zona pelcida (Figu ra 20-15). Esta capa protege al oocito de agresiones mecnicas, y en algunos casos acta como una barrera especfica de especie para los espermatozoides, admi tiendo nicamente los de la misma especie o de especies estrechamente relacio nadas (se discute ms adelante). A menudo, los oocitos de los no mamferos pre sentan otras capas exteriores que envuelven la cubierta vitelina, segregadas por clulas acompaantes o foliculares. Por ejemplo, cuando los vulos de rana pa san desde el ovario al oviducto (el conducto que los conduce hacia el exterior), se rodean de varias capas adicionales de consistencia gelatinosa segregadas por las clulas epiteliales que revisten el oviducto. Anlogamente, la clara (albmina) y la cscara de los huevos de gallina se aaden (despus de la fecundacin) a medi da que los huevos pasan por el oviducto. La cubierta vitelina de los vulos de los insectos est rodeada de una capa gruesa y resistente denominada corion, segre gada por clulas foliculares que rodean cada vulo en el ovario. Muchos oocitos (incluidos los de mamferos) contienen unos grnulos de secrecin especializados situados inmediatamente por debajo de la membrana plasmtica, en la zona perifrica o crtex del citoplasma del oocito. Cuando el oocito es activado por un espermatozoide, estos grnulos corticales liberan su contenido por exocitosis; el contenido de los grnulos altera la cubierta del ooci to de tal manera que impide que se produzca la fusin de ms de un espermato zoide con el oocito (vase ms adelante).

clula somtica tpica

oocito hum ano o de erizo de m ar

oocito tpico de rana o de pez 1 mm = 1000 nm

Figura 20 -1 4 Tam ao relativo de varios vulos. Se com paran con una clula som tica tpica.

Los oocitos se desarrollan por etapas 8

Un oocito es un vulo en desarrollo; su diferenciacin en un vulo maduro (u ovum ) supone series de cambios que se producen en momentos que estn coor-

Figura 20-15 La zona pelcica. (A) Electronmicrografa de barrido de un vulo de hmster, mostrando la zona pelcica. En (B), la zona (a la que estn unidos muchos espermatozoides) se ha separado para poner de manifiesto la membrana plasmtica subyacente del vulo, que contiene numerosos microvilli. (De D.M. Phillips,/. Ultrastruct. Res. 7 2 :1-12,1980.)

Oocitos

1095

CELULAS GERMINALES PRIMORDIALES

ENTRAN EN LA GNADA

OOGONIA

LAS OOGONIAS, DIPLOIDES, SE DIVIDEN REPETIDAMENTE POR MITOSIS EN EL OVARIO

OOCITO PRIMARIO LA DIVISION MEIOTICA I QUEDA DETENIDA EN LA PROFASE, MIENTRAS CRECE EL OOCITO PRIMARIO

DESARROLLO POSTERIOR DEL OOCITO PRIMARIO grnulos corticales

MADURACION DEL OOCITO PRIMARIO: FINALIZACIN DE LA DIVISIN MEITICA I OOCITO SECUNDARIO DIVISION II DE LA MEIOSIS
Oy c / )h >'Q Qy

Figura 20-16 Etapas de la oognesis. Las oog on ias se desarrollan a partir de las clulas germinales primordiales que al principio de la embriognesis migran hacia la gnada en desarrollo. Tras un cierto nmero de divisiones mitticas, las oogonias empiezan la divisin meitica I recibiendo entonces el nombre de oocitos prim arios. En los mamferos, los oocitos primarios se forman muy temprano (entre los 3 y los 8 meses de gestacin en el embrin humano) y permanecen en la profase de la divisin m eitica I hasta que la hembra es sexualmente madura. En este momento y de forma peridica un pequeo nmero de oocitos madura bajo la influencia hormonal, completando la divisin m eitica I y constituyndose en oocitos secu n d arios los cuales, finalmente, pasan por la divisin m eitica II y se convierten en vulos maduros (ova). El momento en el que el oocito es liberado por el ovario y es fecundado vara de una especie a otra. En la mayora de los vertebrados la maduracin de los oocitos se encuentra detenida en la metafase de la meiosis II, y el oocito secundario slo completa la meiosis II tras la fecundacin. Finalmente, todos los cuerpos polares degeneran. En la mayora de los animales el oocito en desarrollo se halla rodeado por clulas accesorias especializadas que ayudan a aislarlo y a nutrirlo (no se muestran).

segundo cuerpo polar

OOCITO MADURO

dinados con las etapas de la meiosis mediante las que las clulas germinales atraviesan sus dos divisiones finales, altamente especializadas. Los oocitos han desarrollado m ecanism os especiales para detener el proceso de la meiosis: per m anecen suspendidos en la etapa de profase I durante largos perodos de tiem po mientras el oocito aumenta de tamao y, en muchos casos, vuelven a dete nerse en la m etafase II esperando la fecundacin. Los detalles del desarrollo del oocito (oognesis) varan segn la especie, pero las etapas generales son similares, como se muestra en la Figura 20-16. Las clulas germinales primordiales migran hacia la gnada en formacin, convir tindose en oogonias , las cuales proliferan mediante ciclos de divisin celular 1096 Captulo 2 0 : Clulas germinales y fecundacin

ordinaria durante un perodo anterior a su diferenciacin en oocitos primarios. En este estadio se inicia la primera divisin meitica: el DNA se replica de m ane ra que cada cromosoma est compuesto por dos cromtidas, los cromosomas homlogos se emparejan a lo largo de sus ejes longitudinales, y tienen lugar entrecruzamientos entre sus cromtidas. Posteriormente la clula permanece dete nida en la profase de la divisin I de la meiosis (en un estado equivalente al que hemos sealado antes, de la fase G2 del ciclo de divisin ordinaria) durante un perodo de tiempo que vara, desde algunos das hasta varios aos, segn las es pecies. Durante este largo perodo (o, en algunos casos, en el inicio de la madu rez sexual), los oocitos primarios sintetizan la cubierta y los grnulos corticales y en el caso de los grandes oocitos de los no mamferos, acumulan ribosomas, vi telo, glucgeno, lpidos y el mRNA que posteriormente dirigir la sntesis de las protenas necesarias para el crecimiento embrionario inicial y para la puesta en marcha del programa de desarrollo. En muchos oocitos las intensas actividades biosintticas se reflejan en la estructura de los cromosomas, los cuales se des condensan y forman bucles laterales adquiriendo un aspecto plumulado, que indica que estn en activa sntesis de RNA (se discute en el Captulo 8). La fase siguiente del desarrollo de los oocitos se denomina maduracin oocitaria y generalmente no tiene lugar hasta la madurez sexual, cuando es esti mulada por hormonas. Bajo esta influencia hormonal la clula recupera su pro gresin a travs de la divisin I de la meiosis: los cromosomas vuelven a condensarse, la envoltura nuclear se fragmenta (lo cual se toma como punto de inicio de la maduracin) y en la anafase I los cromosomas homlogos replicados se segregan, dando lugar a dos ncleos hijos cada uno de los cuales contiene la mitad del nmero inicial de cromosomas. Al finalizar la divisin I, el citoplasma se divide asimtricamente produciendo dos clulas muy diferentes en tamao: una de ellas es un pequeo corpsculo polar, y la otra es un gran oocito secun dario, el precursor del vulo En esta etapa, cada cromosoma todava est com puesto por dos cromtidas hermanas. Estas cromtidas no se separan hasta la divisin II de la meiosis, cuando se distribuyen en dos clulas mediante un pro ceso que es idntico a la mitosis, tal como hemos descrito anteriormente. Des pus de esta separacin final de los cromosomas, en la anafase II, el citoplasma del gran oocito secundario se divide nuevamente de forma asimtrica produ ciendo un vulo maduro (u ovum) y un segundo pequeo corpsculo polar, cada uno de los cuales contiene una dotacin haploide de cromosomas (vase Figura 20-16). Debido a estas dos divisiones asimtricas del citoplasma, los vu los conservan su gran tamao a pesar de sufrir dos divisiones meiticas. Ambos corpsculos polares son pequeos y generalmente degeneran. En la mayora de los vertebrados la maduracin oocitaria sigue hasta la metafase de la meiosis II, momento en el que se detiene hasta la fecundacin. En la oocitacin el oocito secundario detenido es liberado del ovario y, si tiene lugar la fecundacin, el oocito es estimulado a completar la meiosis y transformarse en vulo.

Los oocitos crecen hasta alcanzar su gran tamao por medio de mecanism os especiales 8,9
Una clula som tica de un dimetro de 10 a 20 |im necesita, en general, 24 ho ras para duplicar su masa como preparacin para su divisin celular. A esta ve locidad de biosntesis esta misma clula necesitara mucho tiempo para alcan zar la masa miles de veces superior de un oocito de mamfero, de un dimetro de 100 |im, o la masa 105 veces superior de un oocito de insecto, de un dime tro de 1000 (im. Sin embargo, algunos insectos slo viven unos cuantos das y consiguen producir vulos de dimetros que superan incluso las 1000 jim. Es evidente, pues, que los oocitos han de disponer de m ecanism os especiales para alcanzar su gran tamao. Una estrategia sencilla para crecer rpidamente consiste en disponer de co pias extra de genes. As, el oocito retrasa el final de su primera divisin meitica

Oocitos

1097

mientras crece, manteniendo un duplicado del conjunto diploide de cromoso mas. De esta forma contiene doble cantidad de DNA para sintetizar RNA en com paracin con una clula somtica en fase del ciclo celular. Algunos oocitos tam bin alcanzan grandes tam aos acumulando DNA extra: producen nu merosas copias extra de algunos genes. En el Captulo 8 hemos sealado que las clulas somticas de la mayora de los organismos necesitan entre 100 y 500 co pias de los genes que codifican los RNA ribosmicos para producir suficiente cantidad de ribosomas para la sntesis proteica. Los oocitos necesitan un nm e ro incluso mayor de ribosomas para atender la sntesis proteica en los m om en tos iniciales de la embriognesis, por lo que en los oocitos de muchos animales los genes que codifican los RNA ribosmicos son amplificados especficamente; algunos oocitos de anfibios, por ejemplo, contienen entre 1 y 2 millones de co pias de dichos genes. Para su crecimiento, los oocitos pueden depender tambin de las activida des sintticas de otras clulas. El vitelo por ejemplo, un constituyente fundamen tal de los grandes oocitos, se sintetiza habitualmente fuera del ovario y el oocito lo importa. En aves, anfibios e insectos, las protenas del vitelo son producidas por las clulas del hgado (o sus equivalentes), que secretan estas protenas a la sangre. En los ovarios los oocitos importan las protenas vitelnicas del medio extracelular mediante un proceso de endocitosis mediada por receptor (vase Fi gura 13-28). El soporte nutritivo puede provenir tambin de clulas foliculares del ovario. Existen dos tipos celulares accesorios que presentan estas caracters ticas. En algunos invertebrados algunas de las clulas progenie de la oogonia no se transforman en oocitos sino en clulas nodriza. Habitualmente estas clulas estn conectadas al oocito mediante puentes citoplasmticos a travs de los cua les las macromolculas pueden pasar directamente al citoplasma del oocito (Fi gura 20-17). Las clulas nodriza de los oocitos de los insectos sintetizan muchos

clula folicular

clula nodriza

oocito

20 (im

puente citoplasm tico

Figura 20-17 Clulas nodriza y clulas foliculares asociadas en un oocito de Drosophila. Las clulas nodriza y el oocito provienen de una oogonia comn, cada una de las cuales genera un oocito y 15 clulas nodriza (de las cuales en esta figura nicamente se observan 7). Estas clulas permanecen unidas a travs de puentes citoplasmticos que se han producido por la divisin celular incompleta. Las clulas foliculares se desarrollan independientemente a partir de clulas del mesodermo.

l m in a .__ basal citoplasm a del oocito

zona pelcida

clulas foliculares
10 [im 50 pm
Figura 20 -1 8 Electronm icrograffa de oocitos prim arios en desarrollo en el ovario de conejo. (A) Estadio inicial del desarrollo del oocito primario. No se han desarrollado todava ni la zona pelcica ni los grnulos corticales, y el oocito se encuentra rodeado por una monocapa de clulas foliculares aplanadas. (B) Un oocito primario ms maduro, mostrado a una ampliacin seis veces m enor porque es mucho mayor que el oocito de (A). Este oocito ha adquirido una fina zona pelcida y est rodeado de diversas capas de clulas foliculares y de una lmina basal, que aslan el oocito de otras clulas del ovario. El oocito primario junto con sus clulas foliculares circundantes recibe el nom bre d e fo lc u lo prim ario. Las clulas foliculares estn conectadas entre s y con el oocito mediante uniones de tipo gap. (Copyright 1979. Urban & Schwarzenberg, Baltimore-Munich. Reproducido con permiso de The Cellular Basis of Mammalian Reproduction, editado por Jonathan Van Blerkom y Pietro Motta. Todos los derechos reservados.)

10 9 8

Captulo 2 0 : Clulas germinales y fecundacin

de los productos -ribosom as, mRNA, protenas y otros com puestos- que los ooci tos de los mamferos han de producir por s mismos. El otro tipo de clulas accesorias del ovario que colaboran en la nutricin de los oocitos en desarrollo son clulas somticas denominadas clulas foliculares, que se encuentran tanto en invertebrados como en vertebrados. Se disponen como si se tratara de una capa epitelial alrededor del oocito (Figura 20-18 y vase la Figura 20-17), al que estn unidas nicamente a travs de uniones de tipo gap, las cuales permiten el intercambio de pequeas molculas, pero no de macromolculas. Estas clulas no pueden proporcionar al oocito macromolculas ya formadas a travs de estas uniones de comunicacin, pero pueden colabo rar en el suministro de precursores, de menor tamao, a partir de los cuales estn formadas las macromolculas. Adems, frecuentemente las clulas foliculares se cretan macromolculas que contribuyen a la formacin de las cubiertas oocitarias, son importadas por el oocito mediante endocitosis o actan como recepto res de superficie celular del oocito controlando el patrn espacial y las simetras axiales del huevo (se discute en el Captulo 21).

Resumen

Los oocitos se desarrollan por etapas a partir de clulas germinales que migran en la gnada en estadios muy tempranos del desarrollo, transformndose en oogonias. Tras la proliferacin mittica, las oogonias se transforman en oocitos primaros que inician la divisin meitica I, y se paran en la profase durante das o aos, dependiendo de las especies. Durante este perodo de paro de la profase I, los ooci tos primarios crecen, sintetizan una cubierta y acumulan ribosomas, mRNA y pro tenas, a menudo utilizando la ayuda de otras clulas, como las clulas accesorias que los rodean. En el proceso de maduracin los oocitos primarios completan la di visin meitica I formando un pequeo corpsculo polar y un gran oocito secunda rio, el cual progresa hasta la metafase de la divisin meitica II. En esta etapa, en muchas especies el oocito se para hasta que es estimulado por la fecundacin, com pletando la meiosis e iniciando el desarrollo embriolgico.

Espermatozoides
En la mayora de especies slo existen dos tipos de gametos, y son radicalmente diferentes entre s. El oocito es una de las clulas mayores del organismo m ien tras que el espermatozoide suele ser la ms pequea. El vulo y el espermato zoide estn optimizados en sentidos diferentes para la propagacin de los genes que transportan. El vulo es una clula inmvil y ayuda a la supervivencia de los genes maternos proporcionando grandes reservas de materiales crudos para el crecim iento y desarrollo, as como proporcionando una cubierta protectora efi caz. El espermatozoide, por el contrario, est optimizado para la propagacin de los genes paternos utilizando las reservas maternas: habitualmente es altamente mvil y aerodinmico para conseguir velocidad y eficiencia en la tarea de la fe cundacin. La com petencia entre los espermatozoides es feroz, y la gran mayo ra de ellos sucumbe en su misin: de los miles de millones de espermatozoides que son liberados durante la vida reproductora de un hombre, muy pocos de ellos conseguirn fecundar un vulo.

Los espermatozoides estn altam ente adaptados para depositar su DNA en un oocito 10
Los espermatozoides tpicos son clulas desguarnecidas, equipadas con un potente flagelo que los propulsa a travs de un medio acuoso, pero carecen de orgnulos citoplasmticos como ribosomas, retculo endoplasmtico o comple jo de Golgi, los cuales son innecesarios para la tarea de ceder el DNA al vulo. Por otro lado, el espermatozoide presenta muchas mitocondrias colocadas es Espermatozoides

1099

tratgicamente en el lugar donde pueden alimentar el flagelo con mayor eficien cia. El espermatozoide suele estar formado por dos regiones morfolgica y fun cionalm ente diferentes, rodeadas por una misma membrana plasmtica: la cola, que impulsa al espermatozoide hacia el oocito y le ayuda a penetrar a travs de la envoltura del oocito, y la cabeza, que contiene un ncleo haploide condensado (Figura 20-19). El DNA del ncleo est densa y extremadamente empaquetado, de modo que su volumen est reducido al mnimo para el transporte. Los cro mosomas de los espermatozoides de muchas especies carecen de las histonas que presentan las clulas somticas y estn empaquetados con protenas de ele vada carga positiva denominadas protaminas. En la cabeza de la mayora de espermatozoides, en estrecha aposicin con el extremo anterior de la envoltura nuclear, se encuentra una vescula secretora es pecializada, denominada vescula acrosmica (Figura 20-19). Esta vescula con tiene enzimas hidrolticas que ayudan al espermatozoide a atravesar la envoltu ra externa del vulo. Cuando un espermatozoide entra en contacto con un oocito, el contenido de la vescula se libera por exocitosis -la denominada reac cin acrosmica; en algunos espermatozoides esta reaccin tambin expone o li bera unas protenas especficas que colaboran en la unin del espermatozoide a la envoltura del oocito. La cola mvil de un espermatozoide es un largo flagelo cuyo axonema cen tral sale de un corpsculo basal situado inmediatamente detrs del ncleo. Como ya hemos descrito en el Captulo 16, el axonema est formado por dos microtbulos centrales simples rodeados por nueve dobletes de microtbulos dis puestos ordenadamente. El flagelo de algunos espermatozoides (incluido el de los mamferos) se diferencia de los otros flagelos en que la ordenacin habitual de 9 + 2 del axonema est rodeada adems por nueve fibras densas externas compuestas principalmente por quitina (Figura 20-20). Estas densas fibras son rgidas y no contrctiles, y no se sabe qu papel desempean en el movimiento activo del flagelo, que est provocado por el deslizamiento de los dobletes adya centes de microtbulos. El movimiento flagelar est impulsado por la protena motora dinena, que utiliza la energa de hidrlisis del ATP para hacer deslizar los microtbulos unos respecto a otros, como se discute en el Captulo 16; el ATP est generado por mitocondrias altamente especializadas, situadas en la parte anterior de la cola del espermatozoide (denominada la porcin media), donde se necesita el ATP (vanse Figuras 20-19 y 20-20).

cabeza

porcin media

m itocondria

m em brana plasmtica cola

flagelo

10 | im
Figura 20-19 Un espermatozoide humano. Se muestra una seccin longitudinal.

En muchas especies de m amferos los espermatozoides se producen de m anera continua 11

En los mamferos existen diferencias importantes en el modo en que se produ cen los oocitos (oognesis) y tambin en el sistema en el que se producen los es permatozoides (espermatognesis). Ya hemos descrito que en la mujer, por ejemplo, la oogonia prolifera nicamente en el feto, entra en meiosis despus del parto y se para en forma de oocitos en la primera profase meitica, que pue de m antenerse durante ms de 50 aos. Los oocitos maduran a partir de esta do tacin estrictam ente limitada y ovulan a intervalos, generalmente uno cada vez, desde el momento de la pubertad. En el hombre, en cambio, la meiosis y la es permatognesis no empieza en los testculos hasta la pubertad y desde entonces se produce de manera continua en la pared epitelial de unos tubos muy largos,
Figura 20-20 Dibujo de la porcin media de un espermatozoide humano visto en una seccin transversal al m icroscopio electrnico. El ncleo del flagelo est formado por un axonema rodeado por nueve fibras densas. El axonema est formado por dos microtbulos sencillos rodeados por nueve microtbulos dobles. La mitocondria (mostrada en verde) est bien situada para proporcionar el ATP necesario para el movimiento flagelar; su estructura espiral, poco habitual (vase Figura 20-19), resulta de la fusin de mitocondrias individuales durante la diferenciacin de la espermtida.

m icrotbulos del axonema m itocondria

fibras densas exteriores

0,5 |am

1100

Captulo 20 : Clulas germinales y fecundacin

CLULA GERMINAL PRIMORDIAL ENTRA EN LA GONADA

ESPERMATOGONIA

LA ESPERMATOGONIA DIPLOIDE SE DIVIDE POR MITOSIS DENTRO DEL TESTCULO

Figura 20-21 Las diversas etapas de la espermatognesis. Las esp erm atog on ias se desarrollan a partir de las clulas germinales primordiales que migran hacia los testculos durante las primeras fases de la embriognesis. Cuando el animal alcanza la madurez sexual, la espermatogonia empieza a proliferar rpidamente, generando alguna progenie que retiene la capacidad de continuar dividindose indefinidamente (como clulas madre de espermatogonias) y otra progenie (espermatogonia en maduracin) que despus de un nmero limitado de ciclos de divisin normal inician la meiosis hacia esp erm atocitos prim arios. stos continan a travs de la divisin meitica I hasta transformarse en esp erm atocitos secu n darios. Despus de com pletar la divisin m eitica II, estos espermatocitos producen esp erm tid a s haploides que se diferencian pasando a esp erm atozoid es maduros. La espermatognesis se diferencia de la oognesis (Figura 20-16) en varios aspectos: ( 1 ) a partir de la pubertad, continuamente existen nuevas clulas que inician la meiosis, (2 ) cada clula que empieza la meiosis da lugar a cuatro gametos maduros, y no a uno slo, y (3) los espermatozoides maduros se forman por un proceso elaborado de diferenciacin celular que empieza despus de que se com plete la meiosis.

z < -o y < / >-

ESPERMATOCITO PRIMARIO DIVISION MEIOTICA I

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ESPERMATOCITO SECUNDARIO

O o

c n i >o Q

ESPERMATIDAS DIFERENCIACION

a s

ESPERMATOZOIDES MADUROS

densamente enrollados, que reciben el nombre de tbulos seminferos. Las clu las germinales inmaduras, denominadas espermatogonias, estn situadas alre dedor del borde externo de estos tubos, junto a la lmina basal, donde proliferan continuam ente por ciclos de divisin celular ordinaria. Algunas de las clulas hi jas dejan de proliferar y se diferencian a espermatocitos primarios. Estas clulas entran en la primera profase meitica, en la que se emparejan con cromosomas homlogos participando en el entrecruzamiento, y despus continan con la di-

Espermatozoides

1101

clula de Sertoli

espermatogonia

lmina basai

X I \I
7t espermatogonia

'" 0

'

SS

espermatocito primario

200 Mm
ni >
espermatocito secundario

I >

m K m

-Wi espermtida

y i I

espermtida en diferenciacin

lmina basal que rodea el tbulo seminfero

clulas de Leydig

espermatozoide en el lumen

(A)

(B)

visin I de la meiosis produciendo dos espermatocitos secundarios, cada uno de los cuales contiene 22 cromosomas autosmicos duplicados y un cromosoma X o Y duplicado. Los dos espermatocitos secundarios progresan a travs de la divi sin meitica II produciendo cuatro espermtidas, cada una de las cuales tiene un nmero haploide de cromosomas simples. A continuacin, estas espermti das haploides sufren la diferenciacin morfolgica a espermatozoides (Figura 20-21), que escapan a la luz del tbulo seminfero (Figura 20-22). Seguidamente los espermatozoides pasan al epididimo, un tubo enrollado situado sobre los testculos, donde son almacenados y sufren la maduracin final. Un rasgo fascinante de la espermatognesis es que las clulas germinales masculinas en desarrollo no completan la divisin citoplasmtica (citocinesis) durante la mitosis y la meiosis. En consecuencia, grandes clones de clulas hijas diferenciadas descendientes de una espermatogonia madura permanecen co nectadas por puentes citoplasmticos, formando un sincitio (Figura 20-23). Es tos puentes citoplasmticos persisten hasta el mismo final de la diferenciacin de los espermatozoides, cuando son liberados al lumen del tbulo. Esto explica la observacin de que los espermatozoides maduros surgen sincrnicamente en cualquier rea de un tbulo seminfero. Pero, cul es la funcin de esta disposi cin sincital? A diferencia de los oocitos, los espermatozoides sufren la mayor parte de su diferenciacin despus de que sus ncleos hayan terminado la meiosis, siendo pues haploides. Sin embargo, la presencia de puentes citoplasmticos significa que cada espermatozoide haploide en desarrollo comparte un citoplasma co mn con sus vecinos, de forma que puede ser abastecido con todos los produc tos de un genoma diploide completo. As pues, el genoma diploide dirige la dife renciacin de los espermatozoides tal como lo hace en la diferenciacin de los vulos.

Figura 20-22 Dibujo muy simplificado de una seccin transversal de un tbulo seminfero de un testculo de mamfero. (A) Todos las fases de la espermatognesis mostradas tienen lugar mientras los gametos en desarrollo estn en ntima asociacin con las clulas de Sertoli, que son grandes clulas que se extienden desde la lmina basal hasta el lumen del tbulo seminfero; son anlogas a las clulas foliculares del ovario. La espermatognesis depende de la testosterona secretada por las clulas de Leydig, localizadas entre los tbulos seminferos. (B) Las espermatogenias en divisin se encuentrar a lo largo de la lmina basal. Algunas de estas clulas dejan de dividirse y entran en meiosis convirtindose en espermatocitos primarios. Posteriormente los espermatozoides son liberados al lumen. En el hombre, para que un espermatocito complete la meiosis y se transforme en espermtida transcurren 24 das y otras 5 semanas para que se desarrolle hasta espermatozoide. Los espermatozoides sufren una maduracin posterior y se vuelven mviles en el epiddimo: slo entonces son espermatozoides completamente maduros.

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Captulo 20 : Clulas germinales y fecundacin

espermatogonia

MITOSIS

espermatogonias

f \ 0 J
DIVISIN MEITICA I

espermatocitos Primarios

espermatocitos secundarios

Figura 20-23 Puentes citoplasmticos entre los espermatozoides en desarrollo y sus precursores. La progenie en maduracin de una misma espermatogonia permanece conectada entre s por medio de puentes citoplasmticos, durante su diferenciacin hasta espermatozoides maduros. Para mayor simplicidad slo se muestran dos espematogonias unidas que inician la meiosis, produciendo ocho espermtidas haploides que se mantienen conectadas. En realidad, el nmero de clulas unidas que pasan por las dos divisiones meiticas y que se diferencian juntas, es mucho mayor del que se muestra aqu.

Resumen

Normalmente, un espermatozoide es una clula pequea, compacta y altamente es pecializada para la tarea de fecundar un vulo. Mientras que en muchos organis mos hembra el conjunto total de oocitos se produce antes del parto, en los machos las nuevas clulas germinales entran en meiosis continuamente a partir del inicio de la madurez sexual, y cada espernatocito primario produce cuatro espermato zoides maduros. La diferenciacin de los espermatozoides ocurre despus de la meiosis, cuando los ncleos son haploides. Sin embargo las espermatogonias y los espermatocitos en maduracin no completan la citocinesis, por lo que la progenie de una espermatogonia se desarrolla en forma de un gran sincitio. Esto permite que la diferenciacin est dirigida por los productos de ambos genes paternos.

Fecundacin1 2
Una vez liberados, tanto el oocito como el espermatozoide estn destinados a morir en'cuestin de horas a menos que se encuentren y se fusionen entre s en el proceso de fecundacin. A travs de la fecundacin, el oocito y el espermato

Fecundacin

1103

zoide se salvan: el oocito se activa iniciando su programa de desarrollo, y los n cleos de los dos gametos se fusionan formando el genoma de un nuevo organis mo. El m ecanism o de la fecundacin ha sido ampliamente estudiado en inverte brados marinos, especialmente en el erizo de mar. En estos organismos la fecundacin ocurre en el agua del mar, donde se liberan grandes cantidades de espermatozoides y de vulos. Esta fecundacin externa es ms fcil de estudiar que la fecundacin interna de los mamferos, la cual ocurre en el conducto re productor de las hembras despus del apareamiento. Sin embargo, a finales de los aos 1950 result posible fecundar vulos de mamfero (ms concretam ente, oocitos secundarios -vase Figura 20-16) in vitro, abriendo la va de anlisis de los procesos celulares y moleculares que se producen en la fecundacin de los mamferos. El progreso en el conocimiento de la fecundacin de los mamferos ha producido beneficios mdicos substan ciales: oocitos de mamferos fecundados in vitro pueden desarrollarse en el inte rior de individuos normales cuando son trasplantados al interior del tero. De esta forma ha sido posible que muchas mujeres que eran estriles gestaran un nio normal. Ahora centrarem os muestra atencin sobre la fecundacin en m a mferos.

El contacto con la cubierta pelcida estim ula al espermatozoide a sufrir la reaccin acrosm ica 13
De los 300 millones de espermatozoides humanos eyaculados durante un coito, nicamente 200 alcanzarn el lugar de la fecundacin en el oviducto. Una vez all, el espermatozoide ha de migrar a travs de la capa de clulas foliculares que rodean el vulo y entonces unirse y atravesar la envoltura del vulo -la zona pe lcida. Finalmente ha de fusionarse con la membrana plasmtica del vulo. Para ser com petentes en el cumplimiento de estas tareas, normalmente los esperm a tozoides eyaculados de mamferos han de ser modificados por secreciones del tracto reproductor de las hembras, un proceso denominado c a p a c ita c i n , que en humanos requiere entre 5 y 6 horas. Parece que la capacitacin supone tanto una alteracin de la composicin de lpidos y glucoprotenas de la membrana plasmtica del espermatozoide como un incremento de su metabolismo y movi lidad; el mecanismo de este proceso todava es poco claro. Cuando un espermatozoide capacitado ha atravesado la capa de clulas foli culares; se une a la z o n a p e l c id a (vase Figura 20-15). Habitualmente la zona pelcida acta com o una barrera de fecundacin entre especies, de forma que a menudo al eliminarla tam bin se elimina la barrera. Por ejemplo, un esperm ato zoide humano fecundar oocitos de hmster si se les ha eliminado previamente la zona pelcida mediante enzimas especficas; no es sorprendente que tales h bridos no lleguen a desarrollarse. Sin embargo, los oocitos de hmster liberados de la zona pelcida se utilizan para estudiar la capacidad de fecundacin de es permatozoides humanos in vitro (Figura 20-24). La zona pelcida de los oocitos de mamfero est compuesta nicamente por tres glucoprotenas. Dos de ellas, ZP2 y ZP3, se ensamblan formando fila mentos, m ientras que la otra, ZP1, entrecruza los filamentos formando una red tridimensional. ZP3 acta com o receptor del espermatozoide: las unin espec fica de especie de los espermatozoides a la zona pelcida est mediada por una molcula (que puede ser la enzima galactosil transferasa) de la superficie de la cabeza del espermatozoide, que se une a O-oligosacridos a ZP3 de la zona pe lcida. Una vez unido, el espermatozoide es inducido a producir la re a c c i n a c r o s m ic a mediante la cual el contenido del acrosoma se libera por exocitosis (Figura 20-25). Al m enos en el ratn, ZP3 es la que dispara esta reaccin acros mica, activando un com plejo m ecanismo sealizador intracelular que induce un influjo de Ca2+ en el citosol del espermatozoide que probablemente es el res ponsable de iniciar la exocitosis. La reaccin acrosm ica libera proteasas y hialuronidasa, que son esenciales para la penetracin del espermatozoide a travs de la zona pelcida, y expone

Figura 20-24 Electronm icrografa de barrido de un espermatozoide humano entrando en contacto con un vulo de hm ster. La zona pelcica

del oocito ha sido eliminada, quedando al descubierto la membrana plasmtica, que contiene numerosos microvilli. La habilidad de un espermatozoide determinado para penetrar en un oocito de hmster se utiliza como ensayo de fertilidad; una penetracin de ms del 10-25% de los oocitos se considera un valor normal. (Por cortesa de David M. Phillips.)

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Captulo 20 : Clulas germinales y fecundacin

Figura 20-25 La reaccin acrosm ica que ocurre cuando un espermatozoide de mamfero fecunda un oocito. Se cree que en el ratn una sola protena de la zona pelcida, la ZP3, es la responsable tanto de la unin del espermatozoide como de la induccin de la reaccin acrosmica. Obsrvese cmo un espermatozoide de mamfero interacciona tangencialmente con la membrana plasmtica del oocito, de modo que la fusin se produce ms en el lado que en la punta de la cabeza del espermatozoide. En los ratones, la zona pelcica es de 7 |j,m de dimetro y el espermatozoide la cruza a una velocidad de aproximadamente 1 nm/min.

otras protenas de la superficie del espermatozoide que se unen a ZP2, lo cual contribuye a mantener el espermatozoide fuertemente unido a la zona mientras la est perforando. Adems, la reaccin acrosmica expone una protena de la mem brana plasmtica del espermatozoide que media la unin y la fusin de esta membrana con la del oocito, como veremos a continuacin.

La reaccin cortical del oocito contribuye a asegurar que sea fecundado por un solo espermatozoide 14
A pesar de que a un mismo oocito se le pueden unir muchos espermatozoides, normalmente slo uno de ellos se fusiona con la membrana plasmtica del vu lo e inocula su ncleo en el citoplasma del oocito. Si se fusiona ms de un esper matozoide -situacin que recibe el nombre de poliespermia- se forman husos mitticos adicionales que producen una segregacin anormal de los crom oso mas durante la segmentacin; se producen clulas no diploides y rpidamente se detiene el desarrollo. Dos mecanismos son los responsables de conseguir que cada oocito sea fecundado por un solo espermatozoide. Parece que una rpida despolarizacin de la membrana del oocito, causada por la fusin del primer es permatozoide, impide que otros espermatozoides se fusionen, actuando as como un rpido bloqueo primario de poliespermia. Sin embargo, el potencial de membrana recupera su valor normal muy poco despus de la fecundacin, de forma que es necesario un segundo mecanismo que asegure un bloqueo secun dario de poliespermia a largo plazo. Este mecanismo est constituido por la re accin cortical del vulo. Cuando el espermatozoide se fusiona con la membrana plasmtica del vulo, activa la va de sealizacin celular de fosfolpidos de inositol (discutido en el Ca ptulo 15) en el vulo. Esta activacin, a su vez, genera un incremento local de la concentracin citoslica de Ca2+ , que como una onda se esparce por toda la clula. Parece que el incremento del Ca2+ citoslico activa el oocito e inicia la reaccin cortical, en la que los grnulos corticales liberan su contenido mediante exocitosis.

Fecundacin

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e s p e r m a t o z o id e u n id o n c le o d e l e s p e r m a t o z o id e

3 2 ZP1
ZP ZP

Figura 20-26 Dibujo esquemtico que ilustra cm o se cree que la reaccin cortical de un vulo de ratn impide que otros espermatozoides entren en el vulo. El contenido de los
z o n a p e l c id a

m e m b r a n a p la s m tic a d e l o o c ito g r n u lo c o r tic a l q u e c o n t ie n e e n z im a s h id r o l tic a s R E A C C I N C O R T IC A L (E X O C IT O S IS )

grnulos corticales, una vez liberado, eliminan los carbohidratos de ZP3 de forma que ya no puede unirse a la membrana plasmtica del espermatozoide, y fracciona parcialmente ZP2 endureciendo la zona pelcida. En conjunto, estos dos cambios proporcionan un bloqueo a la poliespermia.

c o n t e n id o d e l g r n u lo c o r tic a l, y a s e c r e ta d o

B L O Q U E O DE L A P O L IE S P E R M IA

s e g u n d o e s p e r m a t o z o id e

ZP

2 f r a c c io n a d a 3 m o d if ic a d a

ZP

z o n a p e l c id a a lte r a d a

Si se incrementa artificialmente la concentracin citoslica de Ca2+-directamente mediante una inyeccin de Ca2+ o indirectamente utilizando un ionforo de Ca2 + (se discute en el Captulo 11)- los vulos de todos los animales estudiados hasta ahora, incluidos los mamferos, se activan. Por el contrario, impidiendo que los ni veles de Ca2+ se incrementen mediante la inyeccin de un quelante de Ca2+ como el EGTA, se inhibe la activacin del oocito en respuesta a la fecundacin. Las enzi mas liberadas por la reaccin cortical cambian la estructura de la zona pelcida, la cual se endurece, de forma que el espermatozoide ya no puede unirse a ella, constituyendo un bloqueo secundario tardo de poliespermia. Entre los cambios que tienen lugar en la zona, hay que destacar la degradacin proteoltica de ZP2 y la hidrlisis de grupos de azcares sobre ZP3 (Figura 20-26).

Una protena de fusin transm em brana de la m em brana plasm tica del espermatozoide cataliza la fusin esperm atozoide-oocito 15
Cuando el espermatozoide ha penetrado en la cubierta extracelular del oocito, interacta con su m em brana plasmtica entre las puntas de los microvilli de la superficie del oocito (vase Figura 20-24). Entonces, los microvilli vecinos se

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Captulo 2 0 : Clulas germinales y fecundacin

alargan rpidamente y se agrupan alrededor del espermatozoide asegurando que quede unido fuertemente, de forma que pueda fusionarse con el oocito. Tras la fusin, todo el espermatozoide es transferido al oocito, empezando por la cabeza, a medida que los microvilli son reabsorbidos. En hmsteres parece que una sola protena transmembrana denominada PH-30, que queda expuesta so bre la superficie del espermatozoide durante la reaccin acrosmica, media tan to la unin del espermatozoide a la membrana plasmtica del vulo como la fu sin de ambas membranas plasmticas. La protena est compuesta por dos subunidades transmembrana glucosiladas denominadas a y p, que se mantienen unidas entre s mediante uniones no covalentes (Figura 20-27). El dominio extracelular de la subunidad a contiene una regin hidrofbica de unos 20 residuos de aminocidos, que se parece a la regin fusognica de protenas vricas de fusin, que median la fusin de los vi rus revestidos con las clulas con las que interactan (se discute en el Captulo 13). Durante mucho tiempo se ha sospechado que las fusiones inter e intracelulares de mem brana que se producen en las clulas eucariotas estn catalizadas por protenas de fusin parecidas a las que se presentan en las cubiertas de los virus; PH-30 es la primera de estas protenas que se conoce con detalle. El dominio amino terminal extracelular de la subunidad p de PH-30 se pare ce a un dominio de algunas protenas que se unen a las integrinas, los receptores de superficie celular que permiten a las clulas animales adherirse a la matriz extracelular (se discute en el Captulo 19). Estas y otras evidencias indirectas su gieren que la subunidad P de PH-30 se une a una integrina de la membrana plas mtica del vulo, contribuyendo as a que el espermatozoide se adhiera a la su perficie del oocito, preparndose para la fusin. A medida que se va conociendo m ejor la biologa celular de la fecundacin de los mamferos y se van definiendo las molculas que participan en las dife rentes etapas del proceso, va siendo posible disear nuevas estrategias de contracepcin. Por ejemplo, una aproximacin que se est estudiado consiste en inmunizar machos o hembras con molculas necesarias para la reproduccin, esperando que los anticuerpos producidos inhiban las actividades de estas mo lculas. Adems de las diferentes hormonas y receptores hormonales que parti cipan en la reproduccin, ZP3 y PH-30 pueden ser molculas diana adecuadas para esta estrategia. Una aproximacin alternativa podra consistir en adminis trar oligosacridos o pptidos correspondientes a ligandos, como es el caso del dominio de unin a integrinas de PH-30, que acten en la fecundacin. Peque as molculas de este tipo pueden bloquear la fecundacin compitiendo con el ligando normal.

p o s ib le d o m in io de u n i n a in te g rin a

p o s ib le re g i n fu s o g n ic a

re p e tic io n e s s e m e ja n te s a EGF

C IT O S O L

~| membrana J plasmtica del espermatozoide

cadena a

cadena

Figura 20-27 La proteina PH -30 de la m em brana del espermatozoide de hm ster. Las subunidades a y p,

ambas glucosiladas (no se muestra), se hallan asociadas entre s de manera no covalente. La similitud de la secuencia de aminocidos en la misma zona de ambas subunidades, semejante a EGF, sugiere su evolucin a partir de una proteina progenitora

El espermatozoide proporciona un centrolo al zigoto 16

Una vez fecundado, el vulo se denomina zigoto. Sin embargo, la fecundacin no se completa hasta que los dos ncleos haploides (llamados proncleos) se fu sionan y combinan sus cromosomas formando un solo ncleo diploide. En ooci tos fecundados de mamferos ambos proncleos no se fusionan directamente como ocurre en muchas otras especies: se acercan uno a otro pero permanecen independientes hasta que la membrana de cada uno de ellos se rompe en prepa racin para la primera divisin meitica (Figura 20-28). En la mayora de anim a les, incluido el hombre, el espermatozoide contribuye al zigoto con algo ms que con su DNA: tambin aporta un centrolo. El centrolo del espermatozoide entra en el oocito con el ncleo y la cola del espermatozoide, y en algunas especies se replica y colabora en la organizacin del ensamblaje del primer huso mittico en el zigoto (vase Figura 20-28). Ello explica por qu a veces aparecen husos multipolares o extramitticos en casos de poliespermia, en que varios espermatozoi des aportan centrolos al oocito. La fecundacin marca el principio de uno de los fenmenos ms remarca bles de toda la biologa -e l proceso de la embriognesis, en el cual el zigoto se desarrolla formando un nuevo individuo. ste es el tema del prximo captulo. 1107

Fecundacin

ncleo haploide del oocito

CITOSOL

crom osom as

centriolo m aterial pericentriolar

anoxem a de la cola del esperm atozoide ncleo haploide del esperm atozoide LAS ENVOLTURAS NUCLEARES SE INTERDIGITAN, LOS CROMOSOMAS SE HAN DUPLICADO REPLICACION DE LOS CENTROLOS, LA ENVOLTURA NUCLEAR SE ROMPE LOS CROMOSOMAS DEL OOCITO Y DEL ESPERMATOZOIDE SE ALINEAN SOBRE UN SOLO HUSO METAFSICO

Figura 20 -2 8 Unin de los proncleos del espermatozoide y del oocito tras la fecundacin en mamferos. Los

proncleos migran hacia el centro del oocito. Cuando se encuentran, sus envolturas nucleares se interdigitan. Los centrolos se replican, las envolturas nucleares se rompen y los cromosomas de ambos gametos se integran en un huso mittico comn, que media la primera divisin del zigoto. (Adaptado a partir de dibujos sobre electronmicrografas proporcionadas por Daniel Szollsi.)

Resumen

En los mamferos la fecundacin empieza cuando la cabeza de un espermatozoide se une, de una manera especfica de la especie, a la zona pelcida que rodea el vu lo. Esto induce una reaccin acrosmica en el espermatozoide, el cual libera el con tenido de su vescula acrosmica, incluyendo enzimas que ayudan a que el esper matozoide digiera la zona pelcida en su camino hasta la membrana plasmtica del oocito, para poder fusionarse con ella. La fusin est catalizada por una prote na transmembrana localizada en la membrana plasmtica del espermatozoide. Este proceso activa el oocito para que produzca la reaccin cortical, mediante la cual los grnulos corticales liberan su contenido, incluyendo enzimas que alteran la zona pelcida previniendo as la fusin de otros espermatozoides. El desarrollo del zigoto empieza despus de que los proncleos haploides del espermatozoide y del vulo se hayan puesto en contacto, mezclando sus cromosomas hasta form ar un solo ncleo diploide.

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Captulo 2 0 : Clulas germinales y fecundacin

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Bibliografa

1109

I.a mosca D rosophila m elan ogaster. (For cortesa de T.B. Lewis.)

Mecanismos celulares del desarrollo

i
r

> > , Movimientos morfognicos; la forma del mapa corporal Diversificacin celular en el embrin animal temprano Memoria celular, determinacin celular concepto de valores El gusano nemtodo: los genes , i i desarrollo i ii y controladores del las leyes del comportamiento celular

Drosophila y la gentica
Un animal o una planta pluricelulares son un clon ordenado de clulas que con tienen el mismo genoma pero que presentan especializaciones distintas. La es tructura final puede ser enormemente com pleja pero se genera por un limitado repertorio de actividades celulares. Las clulas crecen, se dividen y mueren. For man uniones m ecnicas y generan fuerzas para sus desplazamientos y movi mientos. Se diferencian mediante la expresin o inhibicin de determinados grupos de protenas. Producen seales moleculares que afectan a las clulas ve cinas y a su vez responden a seales que las clulas vecinas les envan. El geno ma, repetido de forma idntica en todas las clulas, define las reglas segn las cuales las diferentes actividades celulares posibles entrarn en juego. Mediante este proceso, en cada clula se establecen las directrices que conducirn el com plicado proceso del desarrollo pluricelular por el que se genera un organismo adulto a partir de un huevo fecundado. En este captulo, en lugar de estudiar un organismo en detalle, ilustraremos los principios generales del desarrollo mediante referencias a las especies que m e jor ilustren cada principio. Primero veremos cmo los movimientos y las divisio nes celulares dan forma al embrin animal y cmo se establecen las diferencias entre clulas segn un patrn espacial. Despus consideraremos cmo acta la memoria celular para perpetuar dicho patrn espacial de diferenciacin y permite el almacenaje de nuevos detalles a medida que crece el animal. En la parte central del captulo examinaremos los mecanismos genticos fundamentales de control, tomando como ejemplo el nemtodo Caenorhabditis elegans y la mosca Drosophi la melanogaster. Veremos cmo la gentica molecular ha revelado similitudes no tables en el desarrollo de las ms diversos grupos de animales. Debido a que las lombrices y las moscas son primos nuestros, lo que aprendamos a partir de ellos nos proporciona una informacin crucial sobre el desarrollo de los mamferos. Las dos ltimas partes de este captulo se pueden leer como mdulos sepa rados: revisamos el desarrollo de plantas con flores y nos preguntamos hasta qu punto siguen los mismos principios que rigen el desarrollo animal, y luego revisamos los mecanismos especiales mediante los cuales el sistema nervioso desarrolla su extraordinaria red.

molecular del patrn de formacin. I. Gnesis del mapa corporal molecular del patrn de formacin. II. Genes selectores hometicos y i J modelaje de las partes del cuerpo El desarrollo vegetal El desarrollo neural

Drosophila y la gentica

Movimientos morfognicos y la forma del mapa corporal1

Empezaremos considerando cmo se forma la estructura geomtrica de un em brin temprano de vertebrado. Nos centraremos en el desplazamiento de las c-

1111

lulas hacia sus posiciones correctas. En los apartados siguientes consideraremos la adopcin por parte de las clulas de los caracteres diferenciados correctos. Tradicionalmente se distinguen tres fases en el desarrollo de un vertebrado -y por supuesto de muchas otras clases de animales. Durante la primera fase el huevo fecundado se segmenta y forma muchas clulas ms pequeas, las cuales se organizan formando un epitelio y realizan una com pleja serie de desplaza mientos, llamados gastrulacin y neurulacin, que determinan el mapa bsico del cuerpo -u n a cavidad intestinal y un tubo neural rudimentarios. Durante la segunda fase se forman los rudimentos de los diversos rganos del cuerpo, tales como las extremidades, los ojos, el corazn, etc.- proceso denominado organo gnesis. En la tercera fase las pequeas estructuras que se han generado de esta forma crecen hasta alcanzar su tamao adulto. Estas fases no estn claramente delimitadas en el tiempo sino que se solapan. La rana Xenopus laevis (Figura 211) nos servir para seguir el desarrollo de un huevo fecundado hasta el inicio de la organognesis. Al igual que en otros anfibios, todo el proceso a partir de la fe cundacin ocurre fuera de la madre, y el embrin en desarrollo es resistente y fcil de manipular para la experimentacin.

La polaridad del em brin de anfibio depende de la polaridad del huevo 2

El huevo de Xenopus es una clula grande, aproximadamente de un milmetro de dimetro, rodeada por una cpsula o cubierta extracelular gelatinosa. La m a yor parte del volumen celular est ocupado por plaquetas vitelinas, que son agregados lipoproteicos rodeados por una membrana. El vitelo est concentrado en el extremo inferior del huevo, denominado polo vegetativo; el extremo supe rior se denomina polo animal. Las regiones animal y vegetativa contienen con juntos distintos de molculas de mRNA, diferentes cantidades de vitelo y de otros com ponentes celulares, y tienen destinos diferentes. En lneas generales, el extremo vegetativo del huevo est destinado a la formacin de tejidos internos (particularmente el tubo digestivo), mientras que el extremo animal dar lugar a los tejidos externos (por ejemplo la piel). La fecundacin inicia una compleja se rie de desplazamientos que finalmente doblarn la regin vegetativa hacia el in terior, formarn el intestino, y a lo largo del proceso establecern los tres ejes del cuerpo: el anteroposterior, desde la cabeza a la cola; el dorsoventral, de la espal da al vientre; y el mediolateral, desde el plano medio a derecha e izquierda. La asimetra animal-vegetativa de un huevo no fecundado define solamente uno de los dos ejes finales del cuerpo -e l anteroposterior- pero la fecundacin desencadena una distorsin del contenido del huevo creando una asimetra adi cional que determina una diferencia dorsoventral: el crtex citoplasmtico del huevo, exterior, rico en actina, gira bruscam ente respecto al centro del huevo, de tal modo que el polo animal del crtex se inclina ligeramente hacia la futura cara ventral (Figura 21-2). La direccin del giro viene determinada por el punto de entrada del espermatozoide -quiz por efecto del centrosoma que el espermato-

huevo fecundado 1/2 hora, 1 clula

1 mm

4 horas, 64 clulas

blstula 6 horas, 10 000 clulas

gstrula
10 horas, 30 000 clulas

nurula

32 horas, 170 000 clulas

Figura 21-1 Sinopsis del desarrollo del huevo de Xenopus laevis desde el huevo recin fecundado hasta el renacuajo autosuficiente. La fotografa superior muestra la rana adulta. Las fases del desarrollo se han dibujado vistas de lado, salvo

en el caso del embrin de 10 horas y del embrin de 19 horas, que se han dibujado desde abajo y desde arriba respectivamente. Salvo los adultos, todos las fases se muestran a la misma escala. (Fotografa por cortesa de Jonathan Slack; dibujos segn P.D. Nieuwkoop y J. Faber, Normal table of Xenopus laevis [Daudin]. Amsterdam: North-Holland, 1956.)

1 11 2

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

POLO AN IM AL

POLO VEGETATIVO

Figura 21-2 Primer desplazamiento morfognico despus de la fecundacin de un huevo de rana. El crtex del huevo (una capa de escasas mieras de profundidad) gira aproximadamente 30 en relacin al centro del huevo, en una direccin determinada por el lugar de entrada del espermatozoide. En las especies que presentan pigmentacin en el polo animal, la rotacin genera una franja gris creciente (media luna gris) opuesta al punto de entrada del espermatozoide. Figura 21-3 Etapas de segmentacin en X enopus. Los dibujos muestran una serie de visiones laterales. Las fotografas estn tomadas desde arriba. Las escisiones subdividen rpidamente el huevo en muchas clulas ms pequeas. La divisin celular es sincronizada durante las 12 primeras escisiones, aunque las divisiones son asimtricas, de forma que el nmero de clulas vegetativas inferiores, cargadas de vitelo, es menor y son ms grandes. Las asimetras del huevo y los patrones de segmentacin varan de unas especies animales a otras. En los mamferos, cuyos vulos pequeos y simtricos contienen poco vitelo, las tres primeras escisiones dividen la clula en ocho blastmeros idnticos. En el otro extremo, tenemos como ejemplo el huevo cargado de vitelo de las aves, cuya segmentacin no se completa en el vitelo, permaneciendo todos los ncleos adheridos al polo animal; entonces el embrin se desarrolla a partir de un grupo de clulas situadas encima del vitelo. (Fotografas cortesa de Jonathan Slack.)

zoide introduce en el vulo. En muchas especies de anfibios aparece una banda de pigmentacin clara, llamada media luna gris, opuesta al punto de entrada del espermatozoide, que es debida a que los grnulos de pigmento se desplazan a causa del giro. En los alrededores de la media luna gris el crtex del hemisferio vegetativo se yuxtapone con la regin central del citoplasma del hemisferio ani mal, creando una regin especial, crucial para la organizacin del eje dorsoventral del cuerpo, tal como veremos ms adelante. El punto de entrada del espermatozoide corresponde, ms o menos, con el futuro vientre; el lado opuesto formar las estructuras de la espalda y el dorso, incluida la mdula espinal. Los tratamientos que bloquean la rotacin permiten que la segmentacin del huevo se produzca con normalidad pero se forma un embrin con un intestino central y sin asimetra dorsoventral.

La segm entacin produce muchas clulas a partir de una clula inicial 3

La rotacin cortical se completa aproximadamente una hora despus de la fe cundacin y dispone la escena para la segmentacin, en la cual una nica y gran clula huevo se subdivide repetidamente por mitosis, dando lugar a muchas c lulas ms pequeas, o blastm eros, sin que se produzca cambio en la masa total (Figura 21-3). Para sobrevivir, el embrin ha de alcanzar rpidamente un estado en el que pueda empezar a alimentarse, nadar y escaparse de los depredadores; estas primeras divisiones celulares son extraordinariamente rpidas, con un ci clo de aproximadamente 30 minutos. Parece que la elevada velocidad de replicacin del DNA y de la mitosis imposibilita que se produzca transcripcin gnica (aunque se produce sntesis de protenas), de forma que la segmentacin del

1 hora, 1 clula

3 horas, 8 clulas

huevo fecundado

fase de 2 clulas

fase de 4 a 8 clulas

fase de 16 clulas

blstula
1113

Movimientos morfognicos y la forma del mapa corporal

embrin depende casi totalmente de la reservas de RNA, de protenas y de otros materiales acumulados en el huevo mientras se desarroll como oocito en el in terior de la madre. La nica biosntesis crucial necesaria es la de DNA, y la extra ordinariamente rpida replicacin de DNA es posible gracias a la presencia de un nmero elevadsimo de orgenes de replicacin, muy cercanos entre s en el DNA cromosmico. Tras aproximadamente 12 ciclos de segmentacin (7 horas), la velocidad de la divisin celular baja bruscam ente y comienza la transcripcin del genoma del embrin. Parece que este cambio, denominado la transicin de la media blstu la, se inicia debido a que se alcanza una proporcin crtica entre DNA y citoplas ma: la transicin puede verse acelerada o retrasada si aumentamos o reducimos artificialmente la cantidad de DNA presente en el huevo.

La blstula es una cavidad rodeada por un epitelio 4

Desde el inicio, las clulas del embrin no se unen entre s slo mecnicamente, sino que tam bin estn acopladas por medio de uniones de tipo gap a travs de las que pueden pasar iones y pequeas molculas, transportando m ensajes que pueden participar en la coordinacin del comportamiento celular. Mientras tan to, en las regiones ms externas del embrin existen uniones estancas entre blastmeros que generan una soldadura que asla el interior del embrin del medio externo. Aproximadamente en la fase de 16 clulas se empieza a bombear Na+ a travs de las m embranas celulares hacia los espacios intercelulares del interior del embrin, y el agua sigue al Na+ como resultado del gradiente de presin os mtica que se produce. Los espacios intercelulares del interior del embrin se agrandan formando una sola cavidad, el b la s to c e le , y ahora el embrin se deno mina b l s tu la (Figura 21-4). Las clulas que forman la superficie exterior de la blstula se organizan en una capa epitelial, que ser decisiva en la coordinacin de su comportamiento posterior.

La gastrulacin transform a una esfera hueca de clulas en una estructura triestratificada con un intestino primitivo 5,6
Cuando las clulas de la blstula han quedado ordenadas formando la capa epi telial, pueden iniciarse los desplazamientos coordinados de la g a s tru la c i n . Este espectacular proceso transforma la simple esfera hueca de clulas en una es tructura pluriestratificada, con un tubo digestivo central y una simetra bilateral: como consecuencia de una complicada invaginacin, muchas de las clulas si tuadas en la periferia del huevo se desplazan al interior del mismo. El desarrollo posterior depende de las interacciones entre las tres capas de clulas, interna, externa, y media que se han generado de esta forma La gastrulacin -form acin de un tubo digestivo mediante la invaginacin de clulas situadas en el exterior, hacia el interior del embrin tem prano- es un paso fundamental en el desarrollo de prcticam ente todos los grupos animales. El embrin transparente de erizo de mar proporciona uno de los ejemplos ms claros e ilustrativos de este proceso. La Figura 21-5 muestra la secuencia de

Figura 21-4 La blstula. En esta fase las clulas forman un epitelio que envuelve una cavidad llena de fluido, el blastocele. Las clulas se asocian elctricamente mediante uniones de tipo gap y las uniones estancas cercanas a la superficie externa crean una soldadura que asla el interior del embrin del medio externo. Obsrvese como en Xenopus la pared del blastocele tiene varias clulas de grosor y que slo las clulas ms externas se encuentran fuertemente unidas formando un epitelio.

11 14

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

clulas m esenquim atosas prim arias en m igracin futura boca L tubo ' digestivo pj| futuro tm esqueleto (A)

100 [jm

(E)

(F)

(G)

Figura 21-5 La gastrulacin en el erizo de mar. El punto de partida de la gastrulacin del erizo de mar es una simple blstula: una capa de cerca de 1000 clulas que envuelve una cavidad esfrica. (A) Una electronmicrografa de barrido muestra el plegamiento interior inicial del epitelio en el polo vegetativo. (B) Un primer grupo de clulas del mesnquima se liberan del epitelio en el polo vegetativo de la blstula. (C) Estas clulas se arrastran por la cara interior de la pared de la blstula. (D) Mientras, en el polo vegetativo, el epitelio contina invaginndose. (E y F) El epitelio contina su invaginacin y se extiende formando un tubo intestinal largo: las clula que se invaginan cambian activamente su empaquetamiento sin alterar demasiado su forma celular normal, convirtiendo as su formacin inicial de cpula aplanada en un tubo digestivo largo y estrecho. Este tipo de movimiento de tejidos, en el que una capa de clulas se alarga en una direccin al mismo tiempo que se acorta en la otra, es una de las causas principales del remodelaje durante el desarrollo animal y se denomina extensin convergente. Al mismo tiempo, algunas clulas de la capa epitelial que se invagina proyectan filopodios hacia el interior de la cavidad del blastocele; dichos filopodios entran en contacto con las paredes de la cavidad, se adhieren a ella, y se contraen, contribuyendo as a dirigir el desplazamiento invaginante. (G) El extremo del tubo digestivo entra en contacto con la pared de la blstula en la localizacin donde aparecer la futura boca. Aqu se fusionar el epitelio formando un agujero. (A, de R.D. Burke, R.L. Myers, T.L. Sexton, y C. Jackson, Dev.Biol. 146:542-557,1991; B-G segn L. Wolpery T. Gustafson, Endeavour 26:85-90, 1967.)

acontecim ientos, comenzando a partir de una sencilla blstula hueca. Esquem ticamente, las clulas situadas en el polo vegetativo se invaginan, formando un tubo que finalmente entrar en contacto con el epitelio cerca del polo opuesto del embrin, formando la boca. Mientras tanto, en determinados puntos salen clulas del epitelio invaginado y se desplazan por el interior de la cavidad del cuerpo formando el tejido conjuntivo embrionario, o mesnquima. En la estructura triestratificada formada por la gastrulacin, la lmina inter na, el tubo digestivo primitivo, es el endodermo ; la lmina externa, es decir el epitelio que ha permanecido externo, es el ectodermo; y entre ambos est el mesodermo, la capa ms laxa de tejido formada por clulas mesenquimatosas. stas son las tres hojas germinales iniciales caractersticas de los animales superiores. La organizacin del embrin en estas tres capas se corresponde, a grandes ras gos, con la organizacin del adulto -intestino en el interior, epidermis en el exte rior, y tejido conjuntivo y msculo entre ambos. Globalmente se puede decir que estas tres capas de tejidos adultos derivan respectivamente del endodermo, del ectodermo y del mesodermo, aunque existen excepciones. El proceso de la gastrulacin es ms complejo en el huevo de Xenopus que en el de erizo de mar. Sin embargo, es importante conocer sus principios bsicos ya que los ejes fundamentales del cuerpo de un vertebrado se generan por los desplazamientos de la gastrulacin. Los detalles de este proceso se describen en la Figura 21-6. El tejido situado junto a la media luna gris, a un lado del polo ve getativo, juega un papel fundamental. Aqu la gastrulacin comienza con una pequea invaginacin que se extiende gradualmente formando el blastoporo -u n a lnea de penetracin que finalmente se curva rodeando el polo vegetativo. El lugar donde comienza la invaginacin define el labio dorsal del blastoporo; este tejido juega un papel importante en las complejas series de movimientos que se producen a continuacin y a partir de l se producirn las estructuras

Movimientos morfognicos y la forma del mapa corporal

1115

POLO ANIM AL

lnea media ventral

lnea media dorsal

labio dorsal del blastoporo POLO VEGETATIVO

tapn vitelino imgenes exteriores ectoderm o neural ectoderm o no-neural

ectoderm o (epidermis) ectoderm o (placa neural)

blastocele tapn vitelino labio dorsal del blastoporo (A) 1 mm secciones transversales

vitelo endoderm o de la cubierta del intestino m esoderm o placa lateral endoderm o (B)

notocorda labio del blastoporo som itos vitelo

Figura 21 -6 La gastrulacin en Xenopus. (A) Las imgenes exteriores (arriba) muestran el embrin como un objeto semitransparente, la visin es lateral; las secciones transversales (abajo) estn extradas del plano medio (el plano en el que se cruzan las lneas dorsales y ventrales). Las direcciones del movimiento celular se indican mediante flechas rojas. La gastrulacin se inicia cuando aparece una corta invaginacin, el primer signo del futuro blastoporo, en el exterior de la blstula. La invaginacin se extiende gradualmente, curvndose alrededor de la blstula hasta que cierra el crculo envolviendo un grupo de clulas con abundante vitelo (que finalmente quedarn encerradas en el intestino y sern digeridas). Mientras esto ocurre, varias capas de clulas se repliegan alrededor del labio del blastoporo y se desplazan hacia el interior del embrin. Al mismo tiempo el epitelio externo de la regin del polo animal se extiende ocupando el lugar de la capas celulares que se han replegado. Finalmente, el epitelio del hemisferio animal se extiende de esta forma cubriendo la superficie externa del embrin en su totalidad, y a medida que se completa la gastrulacin, el crculo del blastoporo se contrae quedando reducido prcticamente a un punto. (B) Mapa del destino de las diferentes zonas del embrin temprano de Xenopus (visto lateralmente) al iniciar la gastrulacin, que muestra los orgenes de las clulas que formarn las tres capas germinales como resultado de los movimientos en la gastrulacin. Las distintas partes del mesodermo (placa lateral, somitas y notocorda) derivan de clulas situadas ms profundamente en la franja rayada, de cuyo epitelio se segregarn posteriormente; las otras clulas, incluidas las ms superficiales de la franja rayada, darn lugar al ectodermo (azul y rojo, en la parte superior) o al endodermo (amarillo, parte inferior). En resumen, las primeras clulas que se pliegan hacia el interior de huevo, es decir que involucionan, efectan movimientos en el interior del embrin formando las estructuras endodrmicas y mesodrmicas ms anteriores, mientras que las ltimas clulas en involucionar forman las estructuras ms posteriores. (Segn R.E. Keller, / . Exp. Zool. 216:81-101,1981.) dorsales del eje principal del cuerpo. Como ocurre en el erizo de mar, el resulta do final del proceso completo es una estructura triestratificada: un capa de ecto dermo externa, un tubo interno de endodermo formando el rudimento del in testino, y entre ellos un capa de mesodermo. De nuevo, la boca se desarrolla como un orificio formado en un punto anterior en el que el endodermo y el ec todermo entran en contacto directo sin intervencin del mesodermo. La transformacin que se ha producido durante la gastrulacin se puede re sumir dibujando sobre la superficie del embrin, al inicio de la gastrulacin, un m apa de destino que indique las regiones destinadas a formar especficamente cada una de las partes del cuerpo del adulto; en la Figura 21-6B se muestra uno de estos mapas.

Los movimientos de gastrulacin se organizan alrededor del labio dorsal del blastoporo 6,7
El labio dorsal del blastoporo desempea una funcin central no slo en el sen tido geomtrico, sino tambin como fuente de control. Si se secciona el labio dorsal de un blastoporo de un embrin normal al comienzo de la gastrulacin y dicho labio se injerta en otro embrin en posicin diferente, el embrin receptor

11 16

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

del dador se injerta en un lugar anorm al en el receptor

invaginacin
el embrin doble se desarrolla con casi la totalidad de tejidos originarios del receptor

inicia la gastrulacin tanto en su propio labio dorsal como en el lugar del injerto (Figura 21-7). Los movimientos de gastrulacin del segundo punto conllevan la formacin de un segundo conjunto completo de estructuras corporales, de for ma que se obtiene un embrin doble (gemelos siameses). Realizando injertos de este tipo entre especies que tengan clulas de pig m entacin diferente, de manera pueda distinguirse el tejido receptor del tejido implantado, se ha podido demostrar que el labio del blastoporo injertado atrae epitelio receptor hacia su propio sistema de endodermo invaginado y de mesodermo. Evidentemente el labio dorsal del blastoporo proporciona alguna seal (o seales) que coordinan los movimientos de la gastrulacin y, directa o indi rectamente, el patrn de especializacin de los tejidos de su alrededor. Debido a este papel crucial en la organizacin de la construccin del eje principal del cuerpo, el labio dorsal del blastoporo es conocido como el Organizador (u Orga nizador de Spemann, su codescubridor). Es el ms antiguo y famoso ejemplo de un centro embrionario de seales -u n a funcin que trataremos ms adelante cuando consideremos cmo se controla la diversifcacin celular.

Figura 21-7 Papel del Organizador. Diagrama de un experimento que muestra cmo el labio dorsal de un blastoporo (Organizador de Spemann) inicia y controla los movimientos de la gastrulacin y cmo, en consecuencia, si se trasplanta organiza la formacin de un segundo conjunto de estructuras corporales. La fotografa muestra un renacuajo de axolote bicfalo y con dos colas resultado de dicho injerto; en X enopus se obtienen resultados muy similares a ste. (Fotografa cortesa de Jonathan Slack.)

Cambios activos del em paquetamiento celular suministran una fuerza conductora para la gastrulacin1,6i 8
La gastrulacin comienza con cambios en la forma de las clulas situadas en el blastoporo. En los anfibios estas clulas reciben el nombre de clulas en botella: tienen cuerpos anchos y cuellos estrechos que les sirven para anclarse a la su perficie del epitelio (Figura 21-8), y pueden contribuir a curvar el epitelio y ple garlo hacia el interior, produciendo la muesca inicial observada desde el exte rior. Cuando se ha formado este primer pliegue, las clulas pueden continuar desplazndose al interior de la capa formando el tubo digestivo y el mesodermo. Como en el erizo de mar, parece que el desplazamiento sea guiado por una com binacin de mecanismos, aunque el principal de ellos es el re-empaquetamiento de clulas, especialmente el de las clulas situadas en la parte dorsal de la zona marginal junto al labio blastoporo (vase Figura 21-8). En este punto se produce la e x te n s i n co n v e rg e n te . Pequeos fragmentos de tejido de la zona marginal

1 epitelio del polo animal en expansin 2 clulas m esodrm icas que m igran sobre la capa de fibronectina 3 clulas en botella que ayudan a curvar el epitelio en invaginacin

4 zona m arginal que experim enta la extensin convergente

Figura 2 1-8 Los movimientos celulares de la gastrulacin. Embrin de X enopus en gastrulacin seccionado en el mismo plano que en la Figura 21-6; se indican los cuatro tipos principales de movimientos implicados en la gastrulacin. El epitelio del polo animal se expande mediante la reorganizacin celular, hacindose ms fino a medida que se ensancha. La migracin de las clulas mesodrmicas por encim a de la matriz de fibronectina revistiendo el techo del blastocele puede contribuir al estiramiento de los tejidos invaginados. Sin embargo, la fuerza principal en la conduccin de la gastrulacin en X enopus es la extensin convergente de la zona marginal. (Segn R.E. Keller, /. Exp. Zoo/. 216:81 -101,1981.)

Movimientos morfognicos y la forma del mapa corporal

1 117

(B)

los lam elipodios intentan situarse sobre las superficies de las clulas vecinas, tirando de ellas hacia el interior tal com o indican las flechas

dorsal aislados en cultivo se estrechan y se alargan espontneamente gracias a una reorganizacin celular, tal como haran en el embrin durante el proceso de convergencia hacia la lnea media dorsal, doblndose hacia dentro alrededor del labio blastoprico, y alargndose hasta formar el eje principal del cuerpo. En la Figura 21-9 se presenta una visin caracterstica de los mecanismos que acom paan la extensin convergente.

Las tres capas germinales formadas por la gastrulacin tienen destinos distintos 9,10,u> 12
El endoderm o forma un tubo, el primordio del tracto digestivo, desde la boca hasta el ano. No slo da lugar a la faringe, al esfago, al estmago y a los intesti nos, sino tam bin a muchas glndulas asociadas. Por ejemplo, las glndulas sa livales, el hgado, el pncreas, la trquea y los pulmones, se desarrollan a partir de las paredes del tracto digestivo inicial y crecen hasta convertirse en sistemas de tubos ramificados que se abren al tubo digestivo o la faringe. El endodermo for ma los componentes epiteliales de estas estructuras -e l revestimiento del intesti no y las clulas secretoras del pncreas, por ejem plo- mientras que los elementos musculares y fibrosos que actan de soporte derivan del mesodermo. La diferenciacin del mesodermo est guiada por el Organizador en el labio dorsal del blastoporo, que parece ser una fuente de molculas seal que regulan las alternativas entre los posibles destinos mesodrmicos. A su vez, las seales procedentes de los distintos grupos de clulas especializadas controlan el patrn bsico de especializaciones del endodermo y del ectodermo e inician la forma cin del sistema nervioso, como veremos ms adelante. Tras la gastrulacin, la capa m esodrmica del embrin queda fragmentada en zonas diferentes situadas a derecha e izquierda del cuerpo. Una especializacin muy precoz del mesoder mo, conocida como notocorda, define el eje central del cuerpo y efecta la sepa racin. Se trata de una delgada varilla de clulas, de aproximadamente 80 (J.m de dimetro, con ectodermo por encim a de ella, endodermo por debajo y mesoder mo a cada lado (vase Figura 21-12). Tam bin deriva de las clulas del Organiza dor. Al pasar alrededor del labio dorsal del blastoporo y desplazarse hacia el in terior del embrin, estas clulas forman una columna de tejido que se alarga espectacularm ente por extensin convergente. Las clulas de la notocorda tam bin se hinchan debido a las vacuolas, de modo que la varilla se alarga todava ms estirando el embrin. En los cordados ms primitivos, que no tienen vrte bras, la notocorda se conserva como substituto primitivo de la columna verte bral. En los vertebrados acta de centro alrededor del cual se agrupan las clulas mesodrmicas formando las vrtebras. As la notocorda es el precursor de la co lumna vertebral, tanto en sentido evolutivo como en el de desarrollo. En general, el mesodermo da lugar a los tejidos conjuntivos del cuerpo -p ri mero a una red tridimensional laxa de clulas conocida como mesnquina (va-

Figura21-9 La extensin convergente y su base celular. (A) Patrn de la extensin convergente en la zona marginal de la gstrula, tal como se aprecia desde la cara dorsal. Las flechas azules indican la convergencia hacia la lnea media dorsal, las flechas rojas indican la extensin del eje anteroposterior. Este esquema es demasiado simple para ilustrar el movimiento de involucin que se produce paralelamente a ste, por el cual las clulas se pliegan hacia el interior del embrin. (B) Esquema del comportamiento celular que sirve de base a la extensin convergente. Las clulas se agrupan y forman lamelipodios, mediante los cuales intentan situarse encima de las clulas vecinas. La alineacin de los movimientos lamelipodiales a lo largo del eje comn causa la extensin convergente. Probablemente, es un proceso cooperativo, debido a que las clulas ya alineadas ejercen fuerzas sobre sus vecinas para que se alineen como ellas. (B, segn J. Shih y R. Keller, Development 116:901-914,1992.)

1 11 8

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

SECCIONES TRANSVERSALES placa neural

ectoderm o tubo neural I

cresta neural

ectoderm o tubo neural so m ito IMGENES EXTERIORES

14Vi horas

187.* horas

207* hras

2YiU horas

24 horas

se Figura 19-30) y finalmente al tejido cartilaginoso, al tejido seo y al tejido fi broso, incluida la dermis (capa interna de la piel). Los tbulos del sistema uroge nital tam bin se forman a partir de l, as como el sistema vascular, incluidos el corazn, los vasos sanguneos y las clulas de la sangre. Estos tejidos mesodrmicos especializados derivan de clulas situadas a diferentes distancias del labio dorsal del blastoporo, de forma que la notocorda tiene el origen ms dorsal y las clulas sanguneas el ms ventral. Al finalizar la gastrulacin, la capa del e c to d e rm o cubre el embrin, dando finalmente lugar a la epidermis (capa externa de la piel). Adems, la totalidad del sistema nervioso tam bin deriva del ectodermo. Mediante un proceso conocido como n e u ru la c i n , una ancha regin central del ectodermo se engrosa, se enro lla formando un tubo y se separa del resto de la capa celular (Figura 21-10). El tubo as formado a partir del ectodermo recibe el nombre de tu b o n e u ra l, y for mar el encfalo y la mdula espinal. Los mecanismos de la neurulacin depen den, como los de la gastrulacin, de cambios en el empaquetamiento celular y en la forma celular; en la Figura 21-11 se muestra cmo puede organizarse el citoesqueleto provocando cambios en la forma celular que pueden hacer que el epitelio se enrolle en forma de tubo. La neurulacin se produce por una interaccin entre la notocorda subya cente y el mesodermo adyacente a la misma. Si.de un embrin de anfibio en gas trulacin se extrae un fragmento de mesodermo dorsal del rea situada justo por debajo del futuro tubo neural y se implanta directamente bajo el ectodermo -e s decir en la regin ventral- de otro embrin en gastrulacin, el ectodermo de esta regin se engrosar y se enrollar formando un fragmento de un tubo neural co locado fuera de sitio. A lo largo de la lnea en la que el tubo neural se separa de la futura epider mis, numerosas de clulas ectodrmicas se liberan de la capa epitelial y emigran individualmente hacia el exterior a travs del mesodermo. Estas clulas pertene cen a la c r e s t a n e u ra l; formarn casi la totalidad del sistema nervioso perifrico (incluidos la mayora de los ganglios sensoriales y todos los ganglios simpticos y las clulas de Schwann que forman las vainas de m ielina de los nervios peri fricos) as com o las clulas pigmentarias de la piel. En la cabeza, las clulas de la cresta neural se diferencian en cartlago, hueso, y otros tejidos conjuntivos, los cuales derivan del mesodermo en las otras zonas del cuerpo. ste es uno de los varios ejemplos que contradicen el patrn general segn el cual las tres capas

Figura 21-10 Form acin del tubo neural en Xenopus. Las imgenes

exteriores son de la cara dorsal. Las secciones transversales estn cortadas por donde indica la lnea discontinua. (Segn T.E. Schroeder, / . Embryol. Exp. Morphol. 23:427462,1970. Company of Biologists Ltd.)

los m icrotbulos se alargan, haciendo

pgggggj

g il ! Jlil

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los haces apicales de filam entos de actina se contraen, estrechando las clulas por sus pices ^ haces apicales de filam entos de actina

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1# \ *

Figura 21-11 Curvatura de un epitelio debida a cambios en la forma celular mediados por microtbulos y filamentos de actina. A partir de observaciones de la

neurulacin de salamandras y tritones, en los que el epitelio tiene slo una capa de clulas de grosor. A medida que los extremos apicales de la clula se estrechan, su superficies membranosas superiores se arrugan.

Movimientos morfognicos y la forma del mapa corporal

1119

cresta neural

tubo neural notocorda cavidad digestiva yema de la cola placa mesodrm ica lateral endoderm o y vitelo ectoderm o (epidermis)

Figura 21-12 Seccin transversal (esquemtica) del tronco de un embrin de anfibio despus de cerrar su tubo neural. (Segn T. Mohun, R. Tilly, R. Mohun y J.M. Slack, Cell 22:9-15,1980. Cell Press.)

germinales producen las clulas de las tres capas concntricas correspondientes del cuerpo adulto. Los rganos sensoriales, por los que la luz, los sonidos, los olores, etc., inciden sobre el sistema nervioso, tambin son de origen ectodrmico: algunos derivan del tubo neural, otros de la cresta neural, y otros de la capa externa del ectodermo (vase Figura 21-102). Por ejemplo, la retina se origina como una expansin del encfalo y por lo tanto deriva de clulas del tubo neural, mientras que las clulas olfativas de la nariz se diferencian directamente a partir del epitelio ectodrmico que reviste la cavidad nasal.

El mesodermo situado a cada lado del eje del cuerpo se fragmenta en somitos, de los que derivan las clulas musculares 13
A cada lado del recin formado tubo neural se encuentra una extensa capa de mesodermo (Figura 21-12). A partir de la regin dorsal de este mesodermo -m s gruesa y m edial- se forman los tejidos musculares y esquelticos del eje central del cuerpo. Inicialm ente consiste en un una lmina gruesa y continua de tejido, situada a cada lado del cuerpo. Pronto esta lmina se rompe en bloques separa dos, o som itos, que forman las series repetitivas de vrtebras y msculos seg mentados (Figura 21-13). Los somitos se forman uno tras otro, sucesivamente, empezando por la cabeza y acabando por la cola (Figura 21-13). La segmenta cin acarrea cambios entre las conexiones de las clulas mesodrmicas. El m e canismo que controla los surcos que separan un somito de su vecino, segn un patrn regular, contina siendo un misterio (aunque se sabe que el proceso fsi co de form acin de somitos viene prefigurado por un patrn de segmentacin de la expresin de ciertos genes). Cada somito se corresponde con una unidad en la secuencia final de ele mentos articulados. La masa de somitos forma los msculos esquelticos del
Figura 21-13 Form acin de somitos en Xenopus. (A) Fotografas de embriones en tres fases consecutivas, tomadas lateralmente y marcadas con anticuerpos especficos anti-clulas musculares mostrando la formacin de somitos. (B) Diagramas explicativos. En el esquem a superior de muestra una visin lateral del embrin; la lnea intermitente seala el plano en el que se ha efectuado la seccin horizontal que se muestra justo debajo. El diagrama inferior es un esquema aumentado de las clulas mesodrmicas en pleno proceso de reagrupacin formando los somitos. En X enopus, inicialmente las futuras clulas de los somitos estn orientadas en ngulo recto respecto a los ejes del cuerpo y entonces rotan en grupos durante la formacin de los somitos. La parte principal de cada somito formar tejido muscular y se llama m io to m o ; la parte interna situada frente a la notocorda es el origen de las vrtebras y costillas y se denomina esclerotom o; la ms exterior, es decir la parte dorsal (en los vertebrados superiores, aunque no en X enopus), contribuir a la formacin de la dermis (el tejido conjuntivo de la piel) y se denomina d erm atom o.

pre-som ito
1 12 0 Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

m aduro

Figura 21-14 (izquierda) Clasificacin. Las clulas procedentes de diferentes partes del embrin temprano de anfibio se clasificarn segn sus orgenes. En este experimento clsico primero se desagregan la clulas mesodrmicas, las clulas de la placa neural y las clulas epidrmicas, y luego se dejan reagrupar en una mezcla aleatoria. Se clasifican dando lugar a una formacin con reminiscencias de un embrin tpico, con un tubo neural interno, una epidermis externa, y un mesodermo entre ambos. (Modificado de P.L. Townes y J. Holtfreter, J. Exp.Zool. 128:53-120,1955.)

ectoderm o (placa neural)

m esoderm o

endoderm o

cresta neural

epiderm is

Figura 21-15 (derecha) Cadherinas en el embrin temprano. Ilustracin de la variacin de los patrones de expresin de tres cadherinas en estadios sucesivos de los embriones tempranos de pollo o ratn, observados mediante secciones transversales efectuadas en el tubo neural y los somitos en desarrollo. Las clulas que expresan el mismo tipo de cadherinas permanecen unidas entre s y tienden a segregarse de las otras clulas. As pues, el patrn de cadherinas contribuye a la regulacin del patrn de desplazamientos morfognicos implicados en la formacin del tubo neural, de la notocorda, de los somitos, de la cresta neural y de los esclerotomos. (Segn M. Takeichi, Trends Genet. 8:213-217,1987.) segmento, mientras que un subconjunto de sus clulas forma los tejidos corres pondientes a las vrtebras y otros tejidos conjuntivos como la dermis. Los somi tos tambin son el origen de casi todas las clulas del msculo esqueltico en el resto del cuerpo: estas clulas derivan de precursores que abandonan los somi tos antes de diferenciarse de forma manifiesta.

tubo neural notocorda

som ito

esclerotom o CLAVE tipo de cadherinas N E+N E+P N+P

Los patrones cam biantes de molculas de adhesin celular regulan los movimientos m orfognicos 14
Los movimientos de los tejidos en el embrin van acompaados de cambios en los caracteres qumicos de las clulas. Por ejemplo, una clula puede alterar su forma o su movimiento mediante la activacin de la produccin de una protena citoesqueltica. Cambiando el conjunto de molculas de adhesin que presenta en su superficie puede romper adherencias anteriores y establecer otras nuevas. Las clulas de una regin determinada pueden desarrollar propiedades en su su perficie que causarn su adhesin entre ellas y su segregacin de un grupo de clulas vecinas cuya superficie es qumicamente distinta. Experimentos clsicos en embriones tempranos de anfibios demuestran que los efectos la adhesin selectiva clula-clula pueden ser tan fuertes que producen una reconstruccin aproximada de la estructura normal incluso des pus de que las clulas hayan sido disociadas artificialmente y mezcladas al azar (Figura 21-14). Como se expone en el Captulo 19, estudios realizados en em briones de pollo y de ratn sugieren que este comportamiento depende, al m e nos en parte, de una familia de glucoprotenas homologas de adhesin clulaclula dependientes de Ca2+-las cadherinas. Estas y otras molculas de adhesin clula-clula independientes de Ca2+ tal como las molculas N-CAM, se expre san de forma distinta en los diferentes tejidos del embrin temprano; anticuer-

Movimientos morfognicos y la forma del mapa corporal

1121

pos dirigidos contra ellas interfieren con la adhesin selectiva normal entre clu las de tipo similar. Los cam bios de los patrones de expresin de la diferentes cadherinas se co rresponden estrecham ente con los cam bios de los patrones de asociacin celu lar que se producen durante la gastrulacin, la neurulacin y la formacin de somitos (Figura 21-15); el patrn de cadherinas puede regular y conducir par cialmente las transformaciones del embrin temprano. Particularmente, parece que las cadherinas juegan un papel central en el control de la formacin y diso lucin de capas epiteliales y agrupaciones de clulas. Las cadherinas no slo unen clulas entre s, sino que tambin proporcionan un anclaje para los fila mentos intracelulares de actina en las localizaciones de adhesin clula-clula (vase Captulo 19): de esta forma ayudan a regular el patrn de fuerzas y des plazamientos que se producen en el tejido en desarrollo de acuerdo con el pa trn de adhesiones. Aparte de unirse unas con otras, las clulas pueden adherirse a componentes de la matriz extracelular como la fibronectina y la laminina. Estas adhesiones se producen gracias a las integrinas las cuales, como las cadherinas, actan de co nectares transmembrana conectando los lugares de adhesin del exterior de la clula con los filamentos de actina del interior. Las interacciones entre la clula y la matriz son importantes para los desplazamientos de ciertas clases de clulas que se sueltan de sus clulas vecinas y migran en el embrin, avanzando lenta mente por los espacios libres entre las clulas. Invasiones como stas, que vere mos a continuacin, hacen que la mayora de los tejidos del cuerpo adulto de un vertebrado estn constituidos por combinaciones de clulas derivadas de zonas del embrin temprano muy distantes entre s.

EMBRIN DE CODORNIZ

Clulas m igratorias invaden los tejidos del em brin de form a estrictam ente controlada 11,15,16
Hasta este mom ento hemos establecido dos clases de clulas migratorias -las de la cresta neural y las que abandonan los somitos formando los msculos esque lticos. Otro grupo importante de clulas migratorias son las precursoras de las clulas de la sangre, de las clulas germinales y de los diferentes grupos de neu ronas pertenecientes al sistema nervioso central. Estas migraciones celulares pueden establecerse marcando las clulas al com ienzo de su trayecto, con colorantes no txicos, o incluso mejor con un marcador heredable genticam ente. La mayor parte de nuestro conocimiento proviene de estudios mediante injerto de clulas de embriones de codorniz en embriones de pollo. Aunque la codorniz es parecida al pollo en muchos aspec tos, sus clulas se pueden distinguir, en cortes histolgicos, gracias a una gran masa de heterocromatina, intensam ente teida, que se encuentra asociada al nuclolo. Mediante este marcador nucleolar podemos identificar las clulas in jertadas que han emigrado abandonando la localizacin donde fueron implan tadas. Por ejemplo, si se substituye un tejido somtico de codorniz antes de que aparezcan las yemas de sus extremidades, por un tejido somtico de un embrin de pollo muy temprano, todas las clulas musculares de las extremidades que se desarrollen sern originarias de codorniz (Figura 21-16). Evidentemente las futu ras clulas musculares migran desde los somitos hacia la regin de la futura ala y permanecen all, mezcladas de forma discreta con las clulas de los tejidos co nectivos de las yemas de las extremidades, hasta el momento oportuno para su diferenciacin.
Figura 21-16 Origen m igratorio de las Abras musculares de las extremidades. Si se substituyen las clulas de los somitos de la extremidad de un embrin de pollo por clulas de somitos de codorniz a los dos das de incubacin y luego se secciona el ala del pollo una semana ms tarde, se puede ver cmo la fibras musculares del ala del pollo derivan de las clulas de somitos de codorniz injertadas.

extraccin de som itos en EMBRIN DE POLLO desarrollo de la regin donde se / J h\ desarrollar la yema i del ala e injerto en el [ / L em brin de pollo

ala en desarrollo

seccin que muestra la distribucin de clulas de codorniz en el antebrazo

m sculo

1 12 2

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

situacin original de la clulas de la cresta neural

tubo neural ganglio sensorial ganglio sim ptico glndula adrenal glndula entrica

ectoderm o som ito notocorda aorta cavidad celmica tubo digestivo

Figura 21-17 Principales vas de m igracin celular de la cresta neural. Ilustracin que muestra un esquema de una seccin transversal de un embrin de pollo en la parte media de su cuerpo. Las clulas que inician su camino justo debajo del ectodermo formarn clulas pigmentarias de la piel; las clulas que tom en el camino profundo va somitas formarn los ganglios sensoriales, los ganglios simpticos y partes de las glndulas adrenales. Las glndulas digestivas, de la pared del intestino, se forman con clulas procedentes de la cresta neural que migrarn a lo largo del cuerpo, y darn origen tanto a la regin del cuello com o a la regin sacra. (Vase tambin Figura 19-22.)

De una forma parecida se puede seguir la dispersin de clulas proceden tes de la cresta neural. Estas clulas migran a travs del embrin por vas espe cficas (Figura 21-17) y se establecen en localizaciones determinadas de forma exacta. Mientras una clula que migra se desplaza a travs del embrin, va re petidamente extendiendo proyecciones que le permiten conocer su entorno in mediato (Figura 21-18) mediante sutiles indicios a los que es especialmente sensible gracias a su especfico surtido de protenas receptoras de superficie. En el interior de la clula, estas protena receptoras estn conectadas con el citoesqueleto, responsable del desplazamiento celular. Algunos com ponentes de la matriz extracelular, como la fibronectina, proporcionan lugares de adhesin que facilitan el avance de la clula; otros, como el proteoglucano condroitn sulfato, inhiben el desplazamiento y repelen la inmigracin. De la misma for ma, las clulas no migratorias situadas a lo largo de los caminos de migracin pueden tener superficies receptoras o repelentes, o incluso pueden extender filopodios que entren en contacto con la clula migratoria, afectando su com por tam iento. El tira y afloja incesante entre las tentativas opuestas de adhesin, conduce a las clulas a desplazarse en la direccin ms favorable hasta que la clula encuentra una localizacin en la que puede establecer una adhesin du radera. Otros factores tam bin pueden jugar un papel importante, com o son la quimiotaxis y las interacciones entre las clulas migratorias. Otro medio para controlar la distribucin de clulas migratorias es la regula cin de su supervivencia y proliferacin. Parece que tanto las clulas germinales como las precursoras de clulas sanguneas y las clulas pigmentarias derivadas de la cresta neural, estn gobernadas en este aspecto por el mismo mecanismo bsico de control. Tal mecanismo implica a un receptor transmembrana perte neciente a la membrana de la clulas migratorias, denominado protena Kit, y a

Figura 2 1-18 Migracin de clulas de la cresta neural. Esta serie de fotografas de un embrin vivo de pez cebra, observadas mediante contraste de fases interferencial, muestran una clula de la cresta neural emitiendo prolongaciones de tanteo en varias direcciones antes de tomar la direccin ventral correcta (parte baja de la cuarta fotografa). Las fotografas se tomaron a intervalos de cinco minutos, aproximadamente. (Cortesa de Suresh Jesuthasan.)

Movimientos morfognicos y la forma del mapa corporal

1123

Figura 21-19 Consecuencias de mutaciones en el gen kit. Tanto la nia como el ratn son heterocigotos debido a una mutacin que conlleva la prdida de funciones que los deja con slo la mitad de la cantidad normal de producto del gen kit. En ambos casos la pigmentacin es deficiente debido a que las clulas pigmentarias dependen del producto de kit como receptor para un factor de supervivencia. (Cortesa de RAFleischman, de Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:1088510889,1991. 1991 Macmillan Magazines Ltd.) un ligando, denominado factor Steel, fabricado por las clulas del tejido a travs del cual las clulas migran y/o en el que llegan a establecerse. Individuos con mutaciones en los genes de cualquiera de estas protenas tienen deficiencias en su pigmentacin, en el suministro de clulas sanguneas y en la produccin de clulas germinales (Figura 21-19). Parece que el factor Steel en una forma ligada a la m em brana es necesario para activar correctam ente la protena Kit y capaci tar todos estos tipos de clulas para sobrevivir y proliferar.

El plano estructural del cuerpo de los vertebrados se forma primero en m iniatura y despus se m antiene a medida que el em brin crece 9
Normalmente, en el mom ento que se forman los somitos el embrin mide unos cuantos milmetros y consta de alrededor de 105 clulas. Aunque hasta ahora nos hemos referido principalmente a Xenopus, su escala y forma generales son muy parecidas a la de un pez, una salamandra, un pollo, o un ser humano (vase Fi gura 1-36). Posteriormente estas especies de embrin crecern y alcanzarn ta maos y formas muy diferentes, pero de momento se puede observar que com parten el mapa estructural bsico del cuerpo de los vertebrados. El sistema nervioso central est representado por el tubo neural, con un engrosamiento en un extremo para el encfalo; un tubo de endodermo representa el tubo digestivo y sus derivados; los somitos representan los segmentos del tronco; el mesodermo ms perifrico no segmentado representa los otros tejidos conjuntivos, incluido el sistema vascular; y el ectodermo, la epidermis de la piel. Durante el crecim ien to posterior todos estos com ponentes aumentarn de tamao, multiplicndose por un factor de cien veces o ms en longitud, y de un milln o ms respecto a su volumen y nmero de clulas. No obstante se conservar la misma organizacin bsica del cuerpo.

Resumen

Los huevos de la mayora de los organismos son clulas grandes, que contienen re servas de nutrientes y otros componentes especificados por el genoma materno. En los anfibios, el primer desplazamiento de importancia tras la fecundacin es una rotacin del crtex del huevo en relacin a su ncleo. La asimetra producida por esta rotacin, junto con la asimetra original debida a la distribucin de conteni dos del huevo antes de la fecundacin, define los futuros ejes anteroposterior y dorsoventral del cuerpo. Durante las posteriores divisiones de segmentacin el huevo se subdivide en clulas mucho ms pequeas, sin que ocurra crecimiento alguno. Pronto se desarrollar una cavidad en el interior del embrin, mientras se or ganizan las clulas de su alrededorformando una capa epitelial. Entonces se invagina parte del epitelio, transformando el embrin en una estructura triestratifica1 12 4 Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

da, formada por un tubo interno epitelial de endodermo, una capa epitelial exter na de ectodermo, y una capa intermedia de clulas mesodrmicas que se han sepa rado de la capa epitelial original. Durante este proceso de gastrulacin las clulas epiteliales cambian activamente su empaquetamiento celular, lo cual parece que proporciona una fuerza mayor que conduce los desplazamientos. El endodermo revestir al intestino y sus derivados, el ectodermo formar la epidermis y el sistema nervioso, y el mesodermo los msculos, los tejidos conjunti vos, el sistema cardiovascular y el tracto urogenital. El desarrollo de todas estas es tructuras depende de las interacciones entre las tres capas germinales y implica desplazamientos celulares posteriores. Por ejemplo, el mesodermo dorsal induce al ectodermo suprayacente a engrosarse, enrollarse y separarse, formando el tubo y la cresta neural. Justo en medio del mesodermo dorsal una varilla de clulas especia lizadas, denominada notocorda, se alargar formando el eje central del embrin. Las anchas lminas de mesodermo que estn a cada lado de la notocorda se seg mentan formando los somitos, de los cuales derivarn las vrtebras y los msculos esquelticos. En varias lugares, algunas clulas migratorias, como las clulas de la cresta neural, se liberan de sus vecinos originales y migran a travs del embrin para colonizar nuevas regiones. Molculas de adhesin clula-clula, como las cadherinas y las integrinas, ayudan a guiar las migraciones y a controlar la cohe sin celular selectiva en el epitelio.

Diversificacin celular en el embrin animal temprano17,1 8

Un huevo fecundado puede convertirse en una margarita o en un roble, en un erizo de mar o en un ser humano. El resultado final est determinado por el genoma: la secuencia lineal de los nucletidos A, G, C y T del DNA del organismo tiene que dirigir la produccin de una variedad de tipos de celulares qumica mente distintos dispuestos segn un patrn espacial muy exacto. La biologa del desarrollo intenta explicar cmo ocurre esto. Cualquier discusin del problema, en este y en siguientes apartados, se basa en un hecho fundamental: todas las clulas del cuerpo heredan el mismo genoma del huevo. No importa lo diferen tes que puedan parecer las clulas -e n msculos, huesos, o nervios, en races, ta llos u h o jas- todas contienen el mismo conjunto de instrucciones genticas. Una de las primeras y ms contundentes demostraciones de este principio proviene de experimentos de trasplante de ncleos utilizando huevos de anfibio (Figura 21-20). Un huevo normal de anfibio es tan grande que utilizando una pi peta fina de cristal se puede inyectar en el interior del huevo un ncleo extrado de otra clula. Antes se ha destruido el ncleo del huevo receptor mediante irra diacin ultravioleta. El desarrollo del huevo se activa con pinchazos producidos por la pipeta fina usada para inyectar el ncleo. De este modo se puede com pro bar si el ncleo de una clula somtica diferenciada contiene un genoma com pleto equivalente al de un huevo fecundado tpico y si es igual de vlido para el desarrollo. La respuesta es afirmativa: se puede producir un renacuajo completo a partir de un huevo al que se le ha substituido el ncleo por el de un queratinocito de la piel o por el de un ncleo de un glbulo rojo de la sangre. Debemos ad mitir que estos experimentos tambin presentan limitaciones. Slo han tenido xito con ncleos de un grupo limitado de tipos de clulas diferenciadas y slo en algunas especies. Pero actualmente existe un conjunto contundente de evi dencias que apuntan a esta misma conclusin. Con slo unas cuantas excepcio nes (vase Figura 23-37), el genoma permanece intacto durante el desarrollo. Los genes se pueden activar o permanecer inactivos, las clulas del cuerpo se di ferencian no porque contengan genes diferentes sino porque expresan genes distintos. En el Captulo 9 examinamos los mecanismos intracelulares que regu lan la expresin gnica. En el presente captulo hemos de considerar cmo se originan las diferencias entre las clulas y cmo se coordinan espacial y tempo-

Diversificacin celular en el embrin animal temprano

1125

Figura 21 -20 Trasplante nuclear.

adulta
' #

huevo no fecundado

destruccin del ncleo con radiacin UV

\/
\
ncleo inyectado en el huevo

clulas de la piel en placa de cultivo

ncleo en una pipeta

Esquema de un experimento que demuestra que el ncleo de una clula diferenciada de la piel de una rana adulta contiene todo el material gentico necesario para controlar la formacin de un renacuajo completo. La flecha discontinua de la parte inferior de la figura indica que para conceder al genoma trasplantado el tiempo suficiente para que se adapte a un entorno embrionario se requiere un paso ms de transferencia en el que se extrae uno de los ncleos del embrin temprano cuando comienza su desarrollo y se repone en un segundo huevo anucleado. (Modificado de J.B. Gurdon, Gene expression During Cell Differentiation. Oxford, UK: Oxford University Press, 1973.)

blstula norm al

renacuajo

ramente dentro de un organismo pluricelular. En este apartado veremos cmo se coordinan los primeros pasos de la diversificacin celular en los embriones tempranos, tomando com o ejemplo ranas y ratones.

Las diferencias iniciales entre los blastmeros de Xenopus surgen a partir de la segregacin espacial de determinantes en el huevo2,17,19
En la mayora de especies de plantas y animales el huevo es en s mismo qumi cam ente asimtrico, concentrando algunos componentes en regiones determi nadas del citoplasma o de la membrana. Como resultado de ello, desde el inicio ya existen diferencias entre las clulas que se forman en la segmentacin porque reciben porciones distintas de material debido a su localizacin asimtrica. La importancia de tales determinantes localizados del huevo vara de unas especies a otras. Tericam ente siempre se ha distinguido entre dos tipos de desarrollo opuestos: en el desarrollo en mosaico, determinantes localizados del huevo dise an por completo el futuro patrn del cuerpo, de forma que las interacciones clula-clula posteriores no tienen ninguna consecuencia; en el desarrollo regu lador, los determinantes localizados del huevo no cuentan para nada, de forma que el patrn corporal se genera totalm ente gracias a las interacciones clulaclula. En realidad, la posicin de la mayora de las plantas y animales est entre ambos extremos. Por lo que se sabe hasta el momento, no existe ninguno desa rrollo que sea com pletamente en mosaico -las interacciones reguladoras siem pre juegan un papel importante; com o veremos ms adelante, los huevos de ma mfero parecen ser com pletamente reguladores. Xenopus representa un caso intermedio caracterstico.

1 12 6

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

entorno experim ental del tejido del polo animal tejido del polo animal

Figura 21-21 Induccin m esodrm ica en Xenopus. Las clulas

tejido del ------polo vegetativo en un em brin norm al cultivado de form a aislada cultivado en com binacin con tejido del polo vegetativo

del polo animal de la blstula, que normalmente slo forman el ectodermo, formarn tejidos mesodrmicos si se cultivan conjuntamente con clulas del polo vegetativo. En un desarrollo normal, probablemente una interaccin inductiva de este tipo sucede durante una fase ms temprana; cuando se cultiva de forma aislada, la regin ecuatorial de la blstula es capaz de formar tejidos mesodrmicos.

tejido ectodrm ico y un poco de tejido m esodrm ico

slo tejido ectodrm ico destino del tejido del polo anim al

principalm ente tejido m esodrm ico

Las asimetras del huevo de Xenopus se manifiestan de varias formas -e n la localizacin excntrica del ncleo, en la distribucin del vitelo y los grnulos de pigmento, en el citoesqueleto y, quizs la ms significativa, en la distribucin de unos mRNA determinados. Las asimetras del huevo dotan a los blastmeros tempranos con caracteres diferentes segn sean animales o vegetativos, dorsales o ventrales. Tanto la alteracin artificial de la disposicin de los blastmeros tempranos como la aplicacin de tratamientos como la centrifugacin o la ra diacin ultravioleta que desplazan los contenidos del huevo antes de su segmen tacin e impiden que ocurra la rotacin cortical que en condiciones normales sigue a la fecundacin provocan drsticas perturbaciones en el mapa embriona rio del cuerpo.

Interacciones inductivas generan nuevos tipos de clulas en un patrn cada vez ms detallado 20
Las diferencias iniciales entre los blastmeros tempranos slo determinan las bases del patrn del embrin. Para generar todos los tipos celulares, los blast meros han de interactuar unos con otros. Si colocamos el embrin temprano de Xenopus en un medio desprovisto de Ca2+ y Mg2+, los blastmeros perdern su cohesin, y podrn separarse y desarrollarse por separado; unos van a desarro llar las caractersticas propias del ectodermo, mientras que otros desarrollarn las caractersticas propias del endodermo; pero ninguno de ellos activar la ex presin de los genes caractersticos del mesodermo, como por ejemplo el gen de actina especfico del msculo. Pero si las clulas del polo animal de la blstula se colocan cerca del las clulas vegetativas, algunas de las clulas del polo animal cam bian su va de desarrollo ectodrmica por la va mesodrmica (Figura 21-21).
Figura 21-22 Modelaje mediante inducciones secuenciales. Series de

1 (!)
C es inducida por B a partir de A

B[cji (!)
D y E son inducidas por C a partir de A y B

C )
(
cj

interacciones inductivas pueden generar muchos tipos de clulas partiendo de unas pocas.

c )

1127

Diversificacin celular en el embrin animal temprano

M oogenesis fecundacin y rotacin cortical VV DV VV induccin del Organizador y del m esoderm o por seales de las clulas vegetativas DV g f dorsalizacin or del m esoderm o debido a una seal procedente del Organizador
Figura 21 -23 Modelo de tres seales para la induccin m esodrm ica en el embrin tem prano de Xenopus.

El cambio de va de las clulas debido a la influencia de un grupo adyacente de clulas se denomina induccin. En el transcurso de un desarrollo normal, las in ducciones interactivas pueden ocurrir entre clulas que eran adyacentes desde el inicio del proceso -p or ejemplo en la induccin m esodrm ica- o entre clulas cuya proximidad se debe a movimientos morfognicos como la gastrulacin. Mediante una serie de inducciones consecutivas se pueden generar muchos ti pos de clulas distintos derivados de interacciones entre unos cuantos tipos ce lulares (Figura 21-22). Tal como hemos destacado, las asimetras del huevo de Xenopus determi nan no slo el eje animal como el vegetativo del cuerpo, y en consecuencia la di visin del embrin en ectodermo, mesodermo y endodermo, sino tambin los ejes dorsoventral y anteroposterior. Parece de nuevo que en la organizacin del eje dorsoventral acta un mecanismo inductivo. Experimentos de injerto indi can que todos los blastmeros vegetativos pueden inducir mesodermo pero que no todos lo hacen de la misma forma: los blastmeros vegetativos dorsales son nicos en tanto que inducen a las clulas situadas encima de ellos a asimilar los caracteres especiales del Organizador de Spemann. Como vimos anteriormente, a su vez el Organizador produce una seal que induce a su alrededor la forma cin de un conjunto de especializaciones del mesodermo. Posteriormente, el pa-

Parece que se necesitan al menos tres seales, actuando de la forma indicada, para explicar los resultados de los experimentos sobre injertos. De hecho cada una de las seales podra ser producto de una compleja combinacin de molculas seal. (Segn J. Slack, From Egg to Embryo, 2nd ed. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1991.)

W nt m RNA inyectado en un blastm ero vegetativo ventral

activina bloqueo de la recepcin de seales

FGF bloqueo de la recepcin de seales

control

noggin hibridacin in situ

I
1

experim ental induccin de un segundo O rganizador, de aqu la existencia de un segundo eje corporal

>

experimental
faltan los tejidos ventral y posterior expresado en la regin del O rganizador; la protena puede dorsalizar el m esoderm o ventral

no hay induccin de m esoderm o, la gastrulacin fracasa

Figura 21-24 Algunas molculas seal implicadas en la induccin m esodrm ica de Xenopus. Se presenta el resultado

de un experimento representativo para cada una de las cuatro clases de factores. Aunque las cuatro clases de factores pueden tener efectos considerables en la induccin del mesodermo, sus papeles exactos respecto al modelo de tres seales ilustrado en la Figura 21-23 todava no se conoce con certeza. Las familias de factores Wnt, activina y FGF (factor de crecimiento de los fibroblastos, de Fibroblast Growth Factor) son muy conocidas en otros contextos como molculas seal clula-clula; la activina (como Vgl -vase Figura 21-25) pertenece a la superfamilia de factores de crecimiento TGF-|3. La recepcin de seales de activina o de FGF se puede bloquear inyectando mRNA que codifica una forma defectuosa del receptor proteico correspondiente, a la que le falta el dominio intracelular e interfiere con la funcin del receptor normal. (Fotografa de S. Sokol y al., Cell 67:741-752,1991. Cell Press; A. Hemmati-Brivanlou y D.A. Melton, Nature 359:609-614,1992. 1992 Macmillan Magazines Ltd.; E. Amaya, T.J. Musci, y M.W. Kirschner, Cell 66:257270,1991. Cell Press; y W.C. Smithy R.M. Harland, Cell 70:829-840,1992. Cell Press.)

1 12 8

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

(A)

(B)

huevo no fecundado recin puesto

huevo fecundado

blstula tem prana

mRNA de Vg1 concentrado en crtex vegetativo

la rotacin cortical activa la protena Vg1 en la regin dorsal vegetativa

la protena Vg1 activada induce al Organizador

Figura 21-25 Localizacin de Vgl y su supuesto papel inductor en el embrin d e Xenopus. (A) Hibridacin in situ,

mostrando su localizacin en la regin vegetativa cortical del oocito (el futuro huevo). (B) Diagramas que ilustran una hiptesis de cmo acta Vgl. El mRNA del Vgl se sintetiza en el oocito y queda localizado, mediante mecanismos desconocidos, en las regiones corticales vegetativas de la clula. Igual que otros miembros de la superfamilia TGF-J3, la forma activa de la protena Vgl es un fragmento segmentado del precursor de longitud completa. El control del paso de activacin de la segmentacin es desconocida. Si se inyecta mRNA que codifica Vgl de tamao normal en un embrin temprano, se produce muy poco del fragmento activo y no se observa efecto alguno en el modelaje del embrin. Pero si se modifica el mRNA para que codifique un precursor que ya est segmentado para producir el fragmento activo de Vgl, las consecuencias son dramticas: se puede inducir un eje corporal completo, de un modo que sugiere que el fragmento de Vgl est imitando la seal que normalmente procede de los blastmeros dorsales vegetativos y que induce el desarrollo del Organizador. Segn otra propuesta, Vgl acta como esta seal durante el desarrollo normal, y la produccin de fragmento activo de Vgl se localiza en los blastmeros dorsales vegetativos mediante un proceso que consta de dos fases. Primero, el mRNA es liberado en el extremo vegetativo del huevo; entonces la rotacin cortical que sigue a la rotacin crea las condiciones especiales en la parte dorsal del crtex vegetativo, de forma que el precursor de protenas se segmenta produciendo el fragmento activo. Entonces ste se libera de los blastmeros dorsales vegetativos induciendo la formacin de un Organizador. (A, cortesa de Douglas Melton.)

trn creado en el mesodermo inducir patrones de especializacin local en el ectodermo y en el endodermo con los que entra en contacto. As pues parece que existen al menos tres seales inductivas que actan en los primeros estadios del desarrollo de Xenopus, cuyos orgenes son: los blast meros vegetativos ventrales, los blastmeros vegetativos dorsales y el Organiza dor (Figura 21-23). Qu son estas seales desde el punto de vista qumico? Pare ce que estn implicados miembros de al menos cuatro familias de protenas seal secretadas. Aunque sus papeles exactos en el desarrollo tpico no estn nada cla ros, se cree que ya estn todas presentes en el embrin temprano de Xenopus, y todas ellas producen efectos inductores dramticos si se suministran artificial mente. Al menos en dos de las cuatro clases, el bloqueo artificial de la funcin produce embriones que carecen de partes importantes del cuerpo (Figura 21-24). Tales observaciones no explican, sin embargo, por qu la localizacin de las seales inductivas que circulan entre los blastmeros del embrin de Xenopus viene determinada por el patrn de asimetras del huevo no segmentado. En el caso de la protena Vgl, que es miembro de la superfamilia TGF-P de factores se al secretados, se puede entrever por qu ocurre. Se ha localizado una reserva de mRNA materno que codifica la protena localizada en la parte vegetativa del huevo antes de su fecundacin. Se cree que la protena se produce en su forma precursora en las regiones vegetativas, y que se puede activar en la regin vege tativa dorsal, liberndose de los blastmeros vegetativos dorsales induciendo al Organizador (Figura 21-25).

Un sencillo gradiente de morfgeno puede organizar un com plejo patrn de respuestas celulares 21
Existen muchas maneras por las cuales las seales que pasan de una parte a otra del embrin pueden controlar el patrn de formacin (Figura 21-26). El Organi-

Diversificacin celular en el embrin animal temprano

1 129

ooooooo##ooooooo

ooooooo##ooooooo

888888888880S8
(B) seales intercelulares de largo alcance (C) seales intercelulares de corto alcance
Figura 21-26 Tres tipos de seales para tres estilos de form acin de patrones. (A) Las seales

ooooooo##ooooooo ooooooo##ooooooo ooooooo##ooooooo ooooooo##ooooooo

(A) seales intracelulares

zador constituye un ejemplo de una estrategia de un inters particular: un pe queo trozo de tejido de una regin determinada adquiere un carcter especial y se convierte en la fuente de una seal que se introduce en los tejidos vecinos y controla su comportamiento. Por ejemplo, la seal podra tomar la forma de una molcula difusible secretada por centro emisor de seales. Supongamos que tal substancia se degrada lentam ente a medida que difunde a travs del tejido cir cundante. La concentracin ser constante y alta cerca de la fuente y disminuir gradualmente al alejarse de ella, establecindose un gradiente de concentracin (Figura 21-27). Las clulas que se encuentren a distancias distintas de la fuente estarn expuestas a distintas concentraciones y por tanto se volvern diferentes. Una sustancia com o sta, cuya concentracin es leda por las clulas para des cubrir su posicin relativa respecto a una cierta seal o baliza, se denomina morfgeno. Se cree que los gradientes de morfgeno constituyen una va comn de suministro de informacin posicional a las clulas o de control de su patrn de diferenciacin, a pesar de que en muy pocos casos se ha identificado el m or fgeno qumicamente. Cmo responden las clulas a un gradiente de morfgeno? La concentra cin del morfgeno difusible debe presentar un gradiente muy suave, y sin em bargo muchas de las especializaciones importantes del desarrollo son discretas: por ejemplo, no existen series graduales de tipos celulares adultas intermedias entre cartlago y msculo, o entre hueso y nervio. Tericamente, en una pobla cin inicialmente uniforme pueden aparecer diferencias marcadas a travs de un umbral de respuesta a una seal cuya variacin de concentracin es muy suave. Si existe una retroalimentacin positiva en cada clula que responde que amplifi ca el efecto de un pequeo incremento de la seal, clulas expuestas a intensida des slo ligeramente distintas de la seal pueden verse abocadas a vas de desa rrollo completamente distintas, en funcin de si la concentracin a la que estn expuestas es superior o inferior a un umbral determinado. Si existen varios um brales de respuesta a una seal, un solo morfgeno puede controlar el patrn de varias opciones celulares diferentes. Por ejemplo, se ha demostrado que cuando las clulas procedentes del polo animal de un embrin temprano de Xenopus son expuestas a la molcula seal activina (vase Figura 21-24), se desarrollan como epidermis si la concentracin es baja, en msculo si es un poco ms elevada y en notocorda si es un poco ms alta. Sin embargo, la funcin normal de la activina

intracelulares pueden organizar los determinantes citoplasmticos dentro del huevo, que heredarn los distintos blastmeros cuando el huevo se divida. (B) Seales difusibles de largo alcance procedentes de un centro seal pueden dirigir el patrn global de especializacin celular en el tejido envolvente. (C) Interacciones de corto alcance, clula-clula, pueden crear un mosaico de clulas minsculas que se encuentran en diferentes estados; a menudo juegan un papel crucial en la toma final de decisiones sobre la diferenciacin en tejidos complejos como la retina y otros epitelios sensoriales.

Figura 21-27 Gradiente de morfgeno. Si una substancia es producida por una fuente puntual y a medida que difunde a partir de esta fuente se va degradando, se produce un gradiente de concentracin cuyo mximo se encontrar en la fuente. La substancia puede actuar como morfgeno, cuya concentracin local controlar el comportamiento de las clulas segn su distancia respecto a la fuente.

distancia de la fu e n te --------- X

11 30

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

en el embrin de Xenopus intacto es incierta, y la naturaleza de las seales produ cidas por el Organizador de Spemann todava no es conocida.

Las clulas pueden reaccionar de forma distinta a una seal segn el momento en que la reciban: funcin de un reloj intracelular 22
Generalmente, a medida que se produce el desarrollo, las clulas embrionarias cam bian su carcter a pesar de que su entorno permanezca inalterado. Si extrae mos clula del polo animal de una blstula de Xenopus y las m antenemos aisla das in vitro, se diferenciarn espontneam ente en epidermis aproximadamente al mismo tiempo en que lo haran en condiciones normales. En este sentido, las clulas actan como si estuvieran controladas por una especie de reloj intrace lular. Las clulas cam bian espontneam ente su estado interno, por lo que pue den responder de forma diferente a una seal inductora en funcin del m om en to en que la reciban. Si por ejemplo extraemos un fragmento del epitelio del polo animal de una gstrula temprana y lo insertamos en el rudimento del ojo de un embrin ms desarrollado, este fragmento ser inducido (de forma inade cuada) a convertirse en un trozo de tejido parecido al tubo neural; en cambio, si le permitimos que madure unas horas in vitro antes de injertarlo en el mismo entorno, se convertir (de forma adecuada) en un cristalino; si se cultiva in vitro un perodo todava ms largo, pierde la capacidad para responder a la influencia inductora del ojo rudimentario en ambos sentidos. De estos hechos se puede concluir una cuestin general importante: la di versidad celular y los patrones espaciales pueden aparecer a partir de una sim ple seal inductora invariable que acte en una sucesin de clula idnticas, en distintos m omentos (Figura 21-28). Ya hemos visto por ejemplo que las partes del eje central del cuerpo se forman secuencialmente durante la gastrulacin, involucionando primero las zonas anteriores alrededor del labio del blastoporo y las zonas posteriores despus. De acuerdo con una teora, las diferencias en la edad a la cual las clulas sobrepasan el labio dorsal y reciben la influencia del Organizador de Spemann son la causa de las diferencias de carcter celular en tre las zonas anterior y posterior del mesodermo y el endodermo y anlogamen te en todo el cuerpo. As pues la estrategia general de formacin de patrones puede resumirse as; ( 1) los patrones son resultado de simples asimetras, (2) los detalles se generan secuencialm ente mediante interacciones clula-clula, y el patrn de diversifi cacin celular resultante depende tanto de (3) las seales posicionales entre las clulas, como de (4) programas intracelulares que cambian con el tiempo la res puesta celular a estas seales. Las diferentes especies com binan de forma distinta estos cuatro elementos bsicos. Ahora consideraremos el caso especial de un embrin temprano de m a mfero, que tiene algunas propiedades reguladoras notables.

Figura 21 -28 La influencia temporal. Una seal invariable acta sobre clulas similares pero de edades diferentes, lo cual puede evocar respuestas diferentes. Los patrones espaciales pueden producirse de esta forma, permitiendo que una seal invariable acte en momentos distintos sobre diferentes miembros de una formacin de clulas inicialmente similares.

En los mamferos, el protegido entorno uterino permite un tipo extraordinario de desarrollo temprano 9,23
El em brin de mamfero acta de forma distinta del de otros animales en mu chos aspectos. Al desarrollarse en el entorno protegido del tero, no tiene la m is ma necesidad que los embriones de la mayora de las dems especies de com pletar rpidamente los estadios iniciales del desarrollo. Adems, el desarrollo de una placenta proporciona pronto alimento procedente de la madre, por lo que el huevo no necesita tener grandes reservas de alimentos bsicos como el vitelo. El huevo de ratn tiene un dimetro aproximado de tan slo 80 |im, por lo que su volumen es 2000 veces menor que el de un huevo de un anfibio comn. Sus divisiones de segmentacin no se producen ms rpidamente que las divisiones de muchas clulas somticas ordinarias, y la transcripcin gentica ya se inicia en el estadio de 2 clulas. Adems, mientras que las etapas ms avanzadas del desarrollo de los mamferos son fundamentalmente similares a los de otros ver-

Diversificacin celular en el embrin animal temprano

1131

huevo fecundado de ratn cuerpo polar

2 clulas de 1 1/2 das

m rula , de , ------------------ 8 clulas de 01, ,, . ., 2 1/ 2 dias compactacion

. 16 , clulas _ das ,, de 3

seccin del blastocisto de 4 das

pelcida

proncleos materno y paterno

celular interna

trofoectoderm o

5G |jm
tebrados com o Xenopus, los mamferos empiezan por dar un gran rodeo en su desarrollo, formando un conjunto de complicadas estructuras -principalm ente el saco amnitico y la placenta- que envuelven y protegen al embrin y que pro porcionan las condiciones idneas para intercambiar metabolitos con la madre. Estas estructuras, com o el resto del cuerpo, derivan del huevo fecundado pero se denominan extraembrionarias debido a que se eliminan en el parto y no forman parte del animal adulto. En la Figura 21-29 se resumen los estadios tempranos del desarrollo del ra tn. Inicialm ente el huevo est rodeado por una cubierta celular transparente, la zona pelcida. Tras la fecundacin, el huevo se segmenta dentro de la cubierta formando un grupo celular con forma de mora denominado mrula. En algn momento entre los estadios de 8 clulas y de 16 clulas, la superficie de la mru la se alisa y adquiere una apariencia casi esfrica a medida que las clulas modi fican sus uniones y el grupo se vuelve ms compacto (Figura 21-30), y las clulas situadas en el exterior de la esfera se unen entre s mediante uniones herm ti cas, aislando el interior de la mrula del medio externo. Poco despus, los espa cios intercelulares internos se ensanchan dando lugar a una cavidad central que se llenar de fluido -e l blastocele. En este estadio la mrula ya se ha convertido en un blastocisto. Las clulas del blastocisto forman una lmina esfrica que en vuelve el blastocele, en la que se destaca un polo debido a una mayor acumula cin de clulas. Como se observa en la Figura 21-29, la capa celular externa es el
Figura 2 1 -29 Las prim eras etapas del desarrollo del ratn. (Fotografas por cortesa de Patricia Calarco, de G. Martin, Science 209:768-776, 1980. Copyright 1980 the AAAS.)

Figura 2 1-30 Electronm icrografa de barrido de un embrin tem prano de ratn. Se ha extrado la zona pelcida. (A) Fase de dos clulas. (B) Fase de cuatro clulas (adems de los cuatro blastmeros se observa un cuerpo polar). (C) Mrula de ocho a diecisis clulas -s e produce la com pactacion. (Cortesa de Patricia Calarco y C.J. Epstein, Dev. Biol. 32:208-213, 1973.)

<D)

I________

10 pm

1 13 2

Capitulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

trofoectodermo ; el grupo de clulas situadas en el interior del trofoectodermo, en el polo ms grueso, se denomina masa celular interna. De la masa celular interna deriva todo el embrin. El trofoectodermo es el precursor de la placenta y es el primer componente que aparece del futuro siste ma de estructuras extraembrionarias. Cuando la zona pelcida se ha formado, las clulas del trofoectodermo entran en contacto con la pared del tero, de for ma que el embrin queda implantado. Mientras tanto, la masa celular interna crece y empieza a diferenciarse. Parte de ella da lugar a estructuras extraembrio narias, como el saco vitelino, y el resto participa en la formacin del embrin mediante procesos de gastrulacin, neurulacin, etc., que son muy parecidos a los de otros vertebrados, a pesar de que notables distorsiones geomtricas difi culten nuestra percepcin de ellas.

em brin de ratn en la em brin de ratn en la fase de 8 clulas, cuyos fase de 8 clulas, cuyos padres son blancos padres son negros

la zona pelcida de cada huevo se elim ina m ediante un tratam iento con proteasas

Todas las clulas del em brin animal temprano tienen el mismo potencial de desarrollo 24
Hasta que llegan al estadio de 8 clulas, las clulas del embrin temprano de mamfero conservan su capacidad de desarrollarse en cualquier parte del em brin adulto. Si el embrin temprano se partiera en dos, se produciran un par de gemelos idnticos -u n a nica clula producira dos individuos totalmente normales. De forma parecida, si una de las dos clulas de un embrin de ratn bicelular se destruyen mediante pinchazos con una aguja, y se coloca el medio em brin resultante en un tero de una madre adoptiva para que se desarrolle, en muchos casos nacer un ratn completamente normal. Inversamente, dos embriones de ratn de ocho clulas cada uno se pueden com binar formando una mrula gigante, la cual se desarrollara formando un ratn de tamao normal (Figura 21-31). Tales criaturas, producto de agregados de clulas genticam ente diferentes, se denominan quim eras. Las quimeras tambin pueden generarse inyectando clulas de un embrin temprano de un genotipo en el interior de un blastocisto de otro genotipo. Las clulas inyectadas se incorporan a la masa celular interna del blastocisto receptor desarrollndose un animal quimrico. Es incluso posible conseguir una quimera inyectando de esta forma una sola clula; de esta forma se puede estudiar la capacidad de desa rrollo de una clula aislada. Una de las conclusiones ms importantes derivadas de estos estudios es que inicialmente las clulas de un embrin temprano de mamfero (hasta que alcanzan el estadio de 8 clulas) son idnticas y no tienen restringida ninguna de sus capacidades: todas ellas son totipotentes. Aparente mente los determinantes localizados no juegan ningn papel en el huevo de m a mfero, y el patrn de diversificacin celular del embrin se genera posterior mente, y de forma completa, mediante las interacciones de unas clulas con otras y con su entorno.

los em briones se colocan juntos y se fusionan incubndolos a 37

el desarrollo de los em briones fusionados contina in vitro hasta la fase de blastocisto

el blastocisto se transfiere a un ratn pseudofecundado que acta com o nodriza

la cra de ratn tiene cuatro padres (adems de la nodriza)

Figura 21-31 Procedim iento para generar un ratn quimrico. Se

combinan dos tipos de mrulas de genotipo diferente.

Las clulas madre em brionarias de los mamferos m uestran cmo seales procedentes del entorno pueden controlar el ritmo y la va de desarrollo 25
El desarrollo temprano de los mamferos est altamente regulado. El futuro de cada clula se determina a travs de interacciones con sus vecinas. Los experi mentos con ratones que acabamos de describir lo ilustran perfectamente. Las clulas de un medio-embrin o de un embrin quimrico doble tienen que ajus tar su comportamiento para poder generar un animal completamente normal en cuanto a su patrn y a su tamao. Sin embargo, cuando las circunstancias de desarrollo son mucho ms anormales, las clulas embrionarias pueden quedar totalm ente fuera de control. De este fenmeno hemos de aprender varias leccio nes importantes. Si se inyecta un embrin temprano normal de ratn en el rin o en el test culo de un adulto, el embrin queda rpidamente desorganizado y desaparecen los controles normales de la proliferacin celular. El resultado de ello es un gro-

Diversificacin celular en el embrin animal temprano

1133

testo crecim iento denominado teratoma, cuya composicin es una masa desor ganizada de clulas que contienen muchas variedades de tejidos diferenciados -piel, hueso, epitelio glandular, e tc m e z c la d o s con clulas madre indiferenciadas que continan dividindose y generan todava ms tejidos diferenciados. Teratomas de propiedades parecidas a stas tambin pueden aparecer espont neam ente en las gnadas a partir de clulas germinales como resultado de va rios accidentes del desarrollo. Es posible derivar cnceres transplantables a partir de los teratomas. Tales teratocarcinomas crecern ilimitadamente hasta que maten a su husped. Se pueden conservar indefinidamente implantando de forma seriada muestras de las clulas tumorales de un husped a otro y se observa que los teratocarcino mas siempre contienen algunas clulas madres indiferenciadas, junto con una gran variedad de tipos de clulas diferenciadas producto de las clulas madre. Las clulas madre de los teratocarcinom as tam bin pueden m antenerse en cul tivo com o lneas celulares permanentes. Podra pensarse que las clulas madre de los teratocarcinomas, como otros ti pos de cncer, se originan por mutaciones de genes responsables de los controles normales del comportamiento celular (Captulo 24). Sin embargo, las observacio nes siguientes sugieren que no es se el caso. Se pueden obtener clulas madre con propiedades muy parecidas a stas colocando la masa celular interna normal en un cultivo y dispersando las clulas al inicio de su proliferacin. Una vez dispersa das, si las mantenemos en condiciones idneas en el cultivo, algunas de estas c lulas continuarn dividindose indefinidamente sin alterar su caractersticas. Las lneas de clulas madre embrionarias (ES, de Embrionic Stem) son similares a las l neas celulares derivadas de teratocarcinoma, pero se pueden generar a partir de embriones normales con una frecuencia tan alta que es poco probable que sean producto de mutaciones. Por el contrario, parece que al separar las clulas de sus vecinas normales y colocarlas en un medio de cultivo adecuado, el curso normal de su programa de cambios temporales de caracteres celulares se detiene, lo cual permite que las clulas continen dividindose indefinidamente sin diferenciarse. Parece que la presencia en el medio de un factor de crecimiento proteico denomi nado factor inhibidor de leucemia (LIF, de Leukemia Inhibitory Factor), es crucial para la detencin del programa de desarrollo. Con un coctel un poco ms comple jo de factores de crecimiento podramos inducir el mismo tipo de comportamiento en clulas germinales embrionarias en cultivo. El estadio en el que se detienen las ES, los teratocarcinomas, o las clulas madre derivadas de clulas germinales parece ser equivalente al de las clulas de la masa celular interna normal. Ello puede ponerse de manifiesto tomando las clulas de una placa de cultivo e inyectndolas dentro de la cavidad del blasto cele de un blastocito normal (Figura 21-32). Las clulas inyectadas quedan in corporadas a la masa celular interna del blastocisto y pueden contribuir en la formacin de un ratn quimrico aparentem ente normal. Los descendientes de las clulas madre inyectadas estn presentes en prcticamente todos los tejidos del ratn, donde se diferenciarn ordenadamente y de forma apropiada para su localizacin y pueden incluso formar clulas germinales viables. Esta capacidad de las clulas ES constituye la base de una tcnica muy utilizada gracias a la cual se generan ratones con una mutacin diseada por ingeniera gentica en cual quier gen escogido cuyo DNA se haya clonado. Para producir tales ratones de genes fuera de com bate (gene-knockout), se construyen clulas ES mutantes seleccionando para una insercin de DNA que substituya el gen escogido por una versin modificada artificialmente; la clula ES mutante se utiliza entonces para producir un ratn quimrico que contenga la mutacin en sus clulas ger minales (vase pg. 353). El comportamiento sorprendentemente adaptable de las clulas ES demues tra que las seales del entorno no slo determinan qu opciones seguir entre di ferentes vas de diferenciacin, sino que en algunos casos tambin ponen en marcha o detienen el reloj del desarrollo celular -e s decir los procesos que con ducen el progreso de la clula desde que es un embrin hasta su estado adulto.

clulas ES derivadas de una cepa pigm entada de ratn

blastocisto receptor de una cepa albina de ratn

se mantiene una pipeta de succion

grupo de clulas ES en una m icropipeta

clulas ES inyectadas en el interior de la cavidad del blastocisto

las clulas inyectadas se incorporan a la masa celular interna del blastocisto husped el blastocisto se desarrolla en una nodriza, form ando un ratn quim rico sano
Figura 21-32 Produccin de un ratn quimrico con clulas ES o clulas madre de teratocarcinom a. El

experimento demuestra que las clulas madre pueden combinarse con las clulas de un blastocisto normal formando un ratn quimrico sano.

1 1 34

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

Resumen

En el transcurso del desarrollo embrionario a partir de un huevo fecundado se ge neran muchos tipos de clulas. Los genomas de la clulas diferenciadas son idnti cos; lo que las distingue es el patrn de expresin de sus genes. Generalmente, algu nas de las diferencias entre las clulas del embrin temprano tienen su origen en una distribucin desigual de los determinantes localizados citoplasmticos del huevo antes de su segmentacin, pero la mayora de ellas surgen ms tarde a partir de diferencias localizadas en el entorno de las clulas del embrin. Por ejemplo, en el embrin temprano de Xenopus, las clulas animales y vegetativas heredan deter minantes citoplasmticos distintos del huevo, y luego algunas de las clulas anima les reciben una influencia de las clulas vegetativas que las induce a desarrollarse como mesodermo en vez de ectodermo. Esta induccin mesodrmica parece estar mediada por familias de factores proteicos de crecimiento que tambin contribuyen a regular el crecimiento y la diferenciacin del organismo adulto. Los huevos de mamfero son excepcionales dado que son esencialmente sim tricos. As, inicialmente todas las clulas de un embrin temprano de mamfero son iguales y solamente se diferencian a travs de la interaccin de unas con otras. Me diante interacciones clula-clula, las clulas de dos embriones tempranos de ratn ajustan su futuro y colaboran formando un nico ratn quimrico. Clulas de un embrin temprano de ratn, alejadas de las influencias tpicas de sus vecinas, pue den proliferar deforma inadecuada dando lugar a teratocarcinomas, de los cuales se pueden obtener clulas madre embrionarias. Sin embargo, estas clulas recupe ran un comportamiento normal cuando se implantan en un embrin temprano normal, y sus descendientes se diferencian segn su entorno y pueden contribuir a la formacin de un animal quimrico normal.

Memoria celular, determinacin celular y el concepto de valores posicionales

Las clulas no slo han de ser diferentes, sino que han de permanecer diferencia das tras la desaparicin de las influencias originales responsables de la diversifi cacin celular. A pesar del continuo recambio y resntesis de prcticamente to dos los com ponentes celulares, en el adulto muchos tipos de clulas tienen caractersticas distintivas que se mantienen estables y heredables, incluso cuan do el entorno cambia. As, cuando una clula pigmentaria se divide, sus hijas continan siendo clulas pigmentarias; cuando un queratinocito de la piel se di vide, sus hijas continan siendo queratinocitos; y, aunque un fibroblasto puede convertirse en otro tipo de clula perteneciente a un tejido conjuntivo, como una clula cartilaginosa, nunca se convertira en una neurona o en una clula del hgado; y as sucesivamente. Las diferencias entre tipos celulares se deben, en ltimo trmino, a las distintas influencias a que han sido sometidas las clu las en el embrin, pero dichas diferencias se mantienen debido a que las clulas recuerdan de alguna manera los efectos de pasadas influencias y los transmiten a sus descendientes. Como veremos en este apartado, la memoria celular -y los tipos de informacin celular, especialmente la posicional, que las clulas con servan como consecuencia- son elementos centrales de los mecanismos de modelaje que hacen posible un organismo pluricelular complejo.

A menudo las clulas quedan determinadas para su futuro papel especializado mucho antes de que se diferencien m anifiestam ente 15,26
La existencia de una memoria celular se hace patente en la persistencia y estabi lidad de los estados diferenciados de las clulas del cuerpo adulto (vase Captu lo 22). Pero habitualmente, el carcter final de una clula ha sido decidido a tra vs de una secuencia com pleja de influencias que afectaron a sus progenitoras

Memoria celular, determinacin celular y el concepto de valores posicionales

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durante el desarrollo y este carcter puede haber sido establecido y fijado mu cho antes de que se manifieste la diferenciacin. Por ejemplo, a travs de varias series de decisiones tomadas antes, durante y justo despus de la gastrulacin, algunas clulas de los somitos de un vertebrado se especializan, en un estadio muy temprano, como precursoras de las clulas del msculo esqueltico; enton ces migran desde los somitos a otras regiones, entre ellas a las regiones donde se formarn las extremidades (vase Figura 21-16). Estos precursores de clulas musculares carecen de las grandes cantidades de protenas contrctiles especia lizadas que se encuentran en las clulas musculares maduras; de hecho, superfi cialm ente se parecen mucho a las otras clulas del rudimento de las extremida des. Pero despus de varios das empiezan a fabricar grandes cantidades de las protenas tpicas del msculo, mientras que las otras clulas de las extremida des, con las que estn mezcladas, se diferencian en varios tipos de clulas de te jido conjuntivo. Por lo tanto, la decisin de desarrollarse en clula muscular o en clula del tejido conjuntivo se haba tomado mucho antes de que tal diferencia cin se manifestase abiertamente, y se registra en cada clula como un cambio molecular que no tiene ninguna consecuencia apreciable en la apariencia exter na de la clula. Se dice que una clula que ha tomado una decisin sobre su desarrollo est determinada. Dado que dicho concepto es parte fundamental del lenguaje de la biologa del desarrollo, nos ser til contar con una definicin formal: una clula est d e te rm in a d a si ha sufrido un cambio autoperpetuante de carcter interno que la diferencia, a ella y a su progenie, de las otras clulas del embrin, y que las obliga a tomar una va de desarrollo especializada. Normalmente, el trmino d ife re n c ia c i n se reserva para designar la especializacin celular manifiesta, es decir, referida a la especializacin de un carcter celular muy evidente. General mente una clula ya est determinada antes de su diferenciacin, aunque en al gunos casos ambos procesos ocurren simultneamente. De hecho, la diferencia cin puede ocurrir sin determinacin, siempre que la especializacin del carcter celular sea reversible.

El mom ento de la determ inacin celular puede ponerse de m anifiesto por medio de experimentos de trasplante 27
Para comprobar si una clula o un grupo de clulas est determinado, se ha de demostrar que estas clulas tienen un carcter distintivo que se mantiene incluso aunque las circunstancias se alteren experimentalmente. La tcnica ms comn consiste en trasplantar las clulas a un entorno experimental (Figura 21-33). Un ejemplo sencillo de este tipo de experimento nos lo proporcionan los es tudios con embriones de anfibios. Como apuntbamos anteriormente, es posible trazar el mapa futuro de la blstula o de una gstrula temprana, indicando qu partes de la misma se desarrollarn, segn su proceso normal, y en qu se con-

dador

Figura 21-33 Prueba estndar de determinacin.

antes de m anifestar la diferenciacin husped

tras la manifestacin de la diferenciacin FUTURO NORMAL NO DETERMINADO DETERMINADO

1 13 6

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

vertirn. Por ejemplo, las clulas de una regin estn destinadas a convertirse en epidermis si su desarrollo sigue el curso normal, mientras que el destino de las de otras regiones ser convertirse en cerebro. Para establecer cundo estos dos gru pos de clulas quedan determinados para seguir sus vas de diferenciacin parti culares, se secciona un bloque de clulas de la futura regin epidrmica y se las sita en la futura regin enceflica, y viceversa. Si la clulas se trasplantan en el estadio de gstrula temprana, no muestran memoria alguna de sus orgenes y se diferencian de la forma ms apropiada para sus nuevas localizaciones. No obs tante, si el mismo experimento se realiza un poco ms tarde, en la gstrula tarda, las futuras clulas del cerebro trasplantadas a una localizacin epidrmica se di ferenciarn como tejido neuronal desplazado y las futuras clulas epidrmicas trasplantadas a una localizacin cerebral se diferenciarn como epidermis des plazada. Esto demuestra que ambos grupos de clulas han quedado determina dos en algn momento entre el estadio de gstrula temprana y tarda.

La determ inacin y la diferenciacin celulares reflejan la expresin de genes reguladores 28

Del fenmeno de determinacin celular surgen tres cuestiones moleculares: Qu molcula o molculas definen el estado de determinacin de una clula; qu mecanismo de memoria mantiene este estado; y cmo se acoplan determi nacin y diferenciacin? En general, el carcter de una clula est dirigido por la com binacin de las protenas reguladoras de genes que contiene. Estas prote nas controlan su patrn de expresin gnica. En el caso ampliamente estudiado del msculo, visto en el Captulo 9, las protenas de la fam ilia MyoD estrecha mente relacionadas con las protenas miognicas (MyoD, Myf5, MRF4 y miogenina) desempean un papel crucial en dicha regulacin. En circunstancias apro piadas estas protenas pueden activar la expresin de genes especficos del msculo, como la actina y la miosina musculares; la introduccin de un m iem bro de la familia MyoD dentro de los fibroblastos y de otros tipos celulares dis tintos puede convertirlos en clulas precursoras del msculo. En un desarrollo normal, los genes que codifican las protenas de la familia MyoD inician su ex presin muy pronto en las clulas precursoras del msculo a medida que stas dejan los somitos, lo cual sugiere que la presencia de estas protenas define el estadio de determinacin celular. Si por ejemplo se elimina el gen miogenina mediante recom binacin gnica dirigida, las clulas musculares no consiguen desarrollarse. El conjunto de genes sujetos a activacin por la actuacin de los miembros de la familia MyoD incluye al menos algunos de los genes de esta misma familia. Por esta razn, normalmente la expresin de un miembro de la familia conlleva tambin la expresin de otros miembros. Adems, algunas de estas protenas re guladoras actan directamente en su propio gen manteniendo la expresin del gen una vez ha sido activada. La retroalimentacin positiva resultante de una ac tivacin mutua y de una auto-activacin proporciona un mecanismo posible de memoria celular, tal como se vio en el Captulo 9. Aun as todava existe un problema: las clulas precursoras de msculo no empiezan a fabricar grandes cantidades de protenas especficas del msculo hasta das, semanas o quiz aos despus de haber abandonado los somitos. Cmo pueden continuar sin diferenciarse durante tanto tiempo una vez que han quedado determinadas? El mecanismo podra depender de otras protenas que interactan con miembros de la familia MyoD regulando su accin. Como se vio en el Captulo 9, MyoD y sus parientes pertenecen a la superfamilia hlice-buclehlice, cuyos miembros dimerizan unos con otros, se unen al DNA y activan la expresin gnica. La eficiencia de la activacin gnica depende de la correcta eleccin del compaero para efectuar la dimerizacin. Aparentemente, la regula cin de la disponibilidad de compaeros apropiados para la dimerizacin de una protena de la familia MyoD bastar para que la clula pueda cambiar de un esta do determinado, en el cual la protena slo es capaz mantener la produccin de

Memoria celular, determinacin celular y el concepto de valores posicionales

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Figura 21-34 Circuito del control gnico para la determ inacin de una bra muscular. En este diagrama simplificado slo se muestran dos

miembros representativos de la familia de genes MyoD -el propio myoD y el gen miogenina. La activacin mutua y la auto-activacin de estos genes por parte de sus propios productos crea una retroalimentacin positiva que conlleva la expresin autoperpetuante de los genes. Id es una protena hlicebucle-hlice codificada por el gen inhibidor de la unin a DNA; gracias a su dimerizacin con otras protenas hlice-bucle-hlice, y particularmente debido a su competicin con miembros de la familia MyoD para obtener compaeros de dimerizacin adecuados, se cree que dificulta la expresin tarda de genes musculares especficos. Sin embargo el sistema de control completo es mucho ms complicado de lo que sugiere este diagrama.

miembros de la familia MyoD, a un estado ya diferenciado, en el cual la protena activa toda la variedad de genes musculares especficos (Figura 21-34).

El estado de determ inacin puede estar controlado por el citoplasm a o puede ser intrnseco a los crom osom as 29
La memoria celular, tal como se manifiesta en el fenmeno de la determinacin, es uno de los principales problemas que desafan a la biologa molecular. En el Captulo 9 vimos algunos de los mecanismos moleculares a travs de los cuales al gunos patrones de expresin gnica pueden convertirse en autoperpetuantes. En el contexto de la determinacin celular pueden distinguirse tres grandes categor as de memoria celular, que podran denominarse respectivamente: memoria cito plasmtica, autocrina y nuclear. El mecanismo que acabamos de apuntar sobre las protenas miognicas es un ejemplo de memoria citoplasmtica. En este caso los componentes codificados por el conjunto de genes activos estn presentes en el citoplasma, y actan directa o indirectamente sobre el genoma manteniendo la expresin selectiva de este conjunto determinado de genes. Una consecuencia de este mecanismo es que si un ncleo tomado de un tipo de clula diferenciada se inyecta en el citoplasma de otro tipo celular, debera de modificar su patrn de expresin gnica para encajar con el carcter del citoplasma husped. Los experi mentos de trasplante nuclear efectuados en huevos de anfibio que estudiamos anteriormente proporcionan un ejemplo de esta clase de comportamiento. El m ecanism o de memoria autocrina es una variante del mecanismo cito plasmtico. Tam bin depende de la sntesis de productos que estimulan su pro pia produccin, pero con la caracterstica especial de que estos productos se se gregan al medio extracelular y actan sobre el exterior de la clula para que la clula permanezca en el estado ptimo para su produccin. Este mecanismo tie ne un efecto secundario importante: debido a que las clulas vecinas comparten el mismo entorno extracelular, tendern a actuar colectivamente, adoptando el mismo estado porque estn expuestas a las substancias que ellas mismas produ cen, y por lo tanto una clula individual trasplantada a un medio nuevo tender a cam biar su carcter para ajustarse al de las clulas que la rodean por todos la dos. As pues, un grupo celular puede actuar como determinado aunque una c lula de este grupo aislada no lo est. Parece que estos efectos comunitarios de la determ inacin celular son bastante corrientes y se han estudiado con profun didad en el embrin temprano de Xenopus. A diferencia de las memorias citoplasmtica y autocrina, la memoria nuclear depende de cam bios autoperpetuantes que son intrnsecos de los cromosomas -cam bios que definen la seleccin de genes que se expresan, sin alterar la se cuencia de DNA. La inactivacin del cromosoma X (vase pg. 476) y la actividad heredable (vase pg. 481) son ejemplos claros de ello. La base de la memoria nuclear son las modificaciones heredadas en la cromatina o en el DNA; la m e moria citoplasmtica, por el contrario, permite que dos genes idnticos coexis tan con diferentes estados en una nica clula, uno expresado y el otro inhibido, aunque ambos estn expuestos al mismo entorno intracelular.

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Captulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo

En los temas concernientes a la memoria celular nuestra ignorancia es pro funda, todava, y en la mayora de los casos an no podemos discernir si la m e moria es citoplasmtica o nuclear.

Las clulas de los tejidos en desarrollo recuerdan sus valores posicionales 30

En el embrin animal las seales posicionales y las interacciones actan a dis tancias cortas, aproximadamente a un milmetro o incluso menos, y estas in fluencias dejan su huella en el carcter celular a travs de la memoria celular. A medida que el cuerpo se va desarrollando, otras influencias ms avanzadas ac tan sobre cada una de sus regiones, creando nuevas diferencias dentro de cada clase de clulas y trazando niveles de detalle cada vez ms finos sobre el mapa corporal bsico original. As pues cuando las clulas quedan sometidas a un modo de diferenciacin particular, normalmente quedan especificadas regionalmente: adquieren marcas bioqumicas distintas de direccin, o valores posicionales, que reflejan su loca lizacin en el cuerpo. El valor posicional de una clula guiar su com portam ien to en fases consecutivas del patrn de formacin -la manera en que responder a seales posicionales posteriores, las vas de interaccin con sus vecinas, y toda la variedad de modos de diferenciacin abiertos a ella misma y a su progenie. Se dice que las influencias que controlan la eleccin del valor posicional proporcio nan a la clula la informacin posicional. La existencia y la naturaleza de valores posicionales almacenados en la m e moria se demuestra mediante experimentos sobre injertos llevados a cabo entre un muslo y un ala de pollo, ambos en desarrollo. Tanto el muslo como el ala adultos tienen msculo, hueso, piel, etc., y prcticamente la misma proporcin de tejidos diferenciados. La diferencia entre ambas extremidades no radica en la clase de tejidos, sino en su distribucin espacial. Cmo se produce esta diferen cia? A simple vista podra parecer ms simple explicar la diferencia en trminos de la presencia de una distribucin espacial de seales distinta para las extremi dades anterior y posterior, ambas en desarrollo, que ordenara directamente a las clulas qu estado diferenciado deben adoptar. Un simple experimento utilizan do injertos demuestra que esta visin es profundamente errnea. En el embrin de pollo, el ala y el muslo se originan casi simultneamente en forma de pequeas yemas con forma de lengua que se proyectan desde el costado (Figura 21-35). Al principio las clulas de los dos pares de yemas de las

Figura 21-35 D esarrollo de un em brin de pollo. (A) Un embrin de pollo despus de tres das de incubacin, ilustrando las localizaciones iniciales de las yemas tempranas de las extremidades. (B) Electronmicrografa de barrido que muestra una vista dorsal de la yema del ala y los somitos adyacentes, un da despus; la yema ha crecido convirtindose en una proyeccin con forma de lengua de aproximadamente lm m de largo, 1 mm de ancho, y 0,5 mm de grosor. (A, segn W.H. Freeman y B. Bracergirdle; An Atlas of Embriology. London: Heinemann, 1967; B, cortesa de Paul Martin.)

vescula auditiva cerebro posterior notocorda cerebro m edio cerebro anterior yema del i Iei tubo neural som ilos yema de la pata

(Bl

500 |_im

Memoria celular, determinacin celular y el concepto de valores posicionales

1 139

Figura 2 1 -3 6 Futuro tejido del muslo injertado en el extrem o de la yema de un ala form a dedos del pie. (Segn J.W. Saunders et al., Dev. Biol. 1:281301,1959.)

extremidades aparecen similar y uniformemente indiferenciadas (vase Figura 19-30). Entonces se puede seccionar una pequea cantidad de tejido no diferen ciado de la base de la yema del muslo, procedente de la regin que normalmente dara lugar a parte de la cadera, e injertarse en la punta del extremo de la yema del ala. El injerto no formar la parte del ala correspondiente ni tampoco una pieza desplazada de tejido de la cadera, sino un dedo del pie (Figura 21-36). Este experi mento demuestra que las clulas de las yemas del muslo temprano ya estn deter minadas como muslo, aunque su determinacin slo implica que formarn parte de la extremidad posterior sin concretar la parte del muslo que formarn: todava pueden reaccionar ante influencias de la yema del ala, formando as estructuras adecuadas para el extremo de la extremidad ms que para la base. Al parecer, el sistema de seales que controla las diferencias entre las partes de las extremida des es el mismo para el muslo y para el ala. La diferencia entre las dos extremida des deriva de una diferenciacin presente en los estados internos de sus clulas en el inicio del desarrollo de las extremidades. Aunque las clulas parecen iguales y estn destinadas a dar lugar a la misma variedad de tipos celulares diferencia dos, son no equivalentes, y presentan valores posicionales distintos. As pues la especializacin del comportamiento de las clulas de las extremidades se desarrolla de forma combinada: primero, y segn la informacin que reciban, formarn par te del ala o del muslo; luego seales presentes en el interior de la yema de la extre midad especifican componentes ms detallados de valor posicional, indicando la colocacin exacta en la extremidad. Una de las revelaciones ms notables de la gentica molecular moderna ha sido que casi todos los animales parecen utilizar los mismos mecanismos m ole culares altamente conservados para retener los valores posicionales situados a lo largo del todo el eje corporal (de la cabeza a la cola), y algunos de estos mismos productos genticos tambin pueden actuar especificando valores posicionales en la extremidades de los vertebrados. Tendremos que aplazar nuestras teoras sobre estos importantes controladores del patrn corporal hasta que hayamos estudiado la mosca del vinagre, Drosophila, cuyos mecanismos fueron los prime ros en ser descubiertos y caracterizados.

yema de la pata

masa de tejido m esodrm ico que habra form ado las estructuras del m uslo

yema del ala

presunto tejido del m usculo injertado en el extrem o de la yema del ala

dedos del pie acabados parte superior en garra del ala y antebrazo ala resultante

El patrn de valores posicionales controla la proliferacin celular y se regula a travs de intercalacin 31

Un aspecto crucial del patrn de formacin es la regulacin de la proliferacin celular, a travs de la cual las diferentes partes del patrn alcanzan sus tamaos adecuados. Muy a menudo, tanto el crecim iento como el patrn de valores posi cionales dependen de un estrecho acoplamiento de interacciones clula-clula continuas. Partiendo de estudios realizados sobre la regeneracin que ocurre en varios organismos cuando se yuxtaponen fragmentos de tejido con valores posi cionales distintos y se concede el tiempo necesario para que crezcan y se adap ten, se ha deducido una ley sencilla, cuyos principios al parecer son bastante co rrientes. Quizs su ejemplo ms claro sean los estudios realizados sobre la pata de la cucaracha (Figura 21-37).

fm ur

tibia
Figura 2 1 -37 La pata de la cucaracha. Mediante mudas sucesivas la cucaracha se hace cada vez ms grande (por proliferacin celular), pero no cam bia su estructura bsica. La pata se reviste de una cutcula segregada por una capa epidrmica y que es reemplazada en cada muda. El patrn de la cutcula refleja el patrn de valores posicionales que subyacen a la capa epidrmica.

trocnter trocnter
tarso

garras

114 0

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

(B)

Figura 21 -38 Regeneracin intercalada. Si se injertan regiones de la tibia de la cucaracha que no se corresponden, se intercalar (mediante proliferacin celular) un tejido nuevo [verde), para rellenar los vacos en el patrn de valores posicionales (numerados de 1 a 10). En el caso de (A) la intercalacin restablece la parte ausente. En (B) la intercalacin genera una tercera parte central de la tibia entre las dos partes centrales ya presentes. Las quetas indican la polaridad del tejido intercalado. En ambos casos la continuidad se restablece en el patrn final de los valores posicionales.

Las cucarachas pertenecen a la clases de insectos que no presentan una m e tamorfosis radical de la larva al adulto, sino una progresin gradual a travs de una serie de formas juveniles separadas por mudas, en las cuales se elimina la capa de cutcula vieja y se genera una nueva capa mayor. La cucaracha juvenil tiene extremidades bien diferenciadas, pero sus clulas diferenciadas - a diferen cia de las extremidades hum anas- todava son capaces de responder a las in fluencias que controlan el desarrollo del patrn de la extremidad y pueden rege nerar dicha extremidad si sta se ve perturbada. As pues, los mecanismos del sistema de patrn de formacin se pueden poner a prueba mediante operacio nes realizadas bastante despus del perodo de desarrollo embrionario. Si a una cucaracha le amputamos dos patas por uno de sus segmentos m e dios -e s decir por la tib ia- pero por distintos niveles, el fragmento distal de una pata puede ser injertado en el mun proximal del otro, de modo que la pata com puesta sane aun careciendo de la parte central de la tibia. A pesar de ello, la pata que aparece tras la muda parece normal: la parte media del patrn ha re generado la parte que echaba en falta (Figura 21-38A). Ms sorprendente es el resultado de una variante de esta operacin. Se corta la tibia de una de las cuca rachas cerca del extremo proximal y otra tibia de otra cucaracha cerca del extre mo distal. Antes injertam os las dos partes seccionadas ms pequeas de ambas patas, pero en esta variacin injertaremos el fragmento y el mun ms gran des. El resultado de este injerto ser una pata excesivamente grande cuyo frag m ento central es el doble de lo normal (Figura 21-38B). Dejamos que el animal efecte la muda. La pata resultante, en lugar de tener un tamao ms o menos normal, todava es ms larga porque se ha desarrollado una tercera parte cen tral entre las dos que ya existan. Tal como se ilustra en la Figura 21-38B, las quetas de esta nueva regin apuntan en direccin contraria a las de las del resto de la tibia. Se pueden realizar muchas operaciones de este tipo, y todas ellas apuntan hacia la existencia en la epidermis del insecto de un sistema de valores posicionales que convierten en no equivalentes a las clulas situadas en posiciones dis tintas a lo largo del eje de la extremidad, hecho que va parejo al control de la proliferacin celular. Es til describir el valor posicional mediante una escala

Memoria celular, determinacin celular y el concepto de valores posicionales

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numrica cuyo mximo se halla en un extremo del segmento de la extremidad y el mnimo en el otro extremo. En las operaciones descritas anteriormente, se unen clulas con valores posicionales muy diferentes. Como resultado de ello obtendremos clulas nuevas producto de la proliferacin celular de las clulas vecinas al punto de injerto. Estas clulas nuevas adquieren valores posicionales interpolados entre los de los dos conjuntos cuya confrontacin provocamos (Fi gura 21-38). Este comportamiento se define como principio de intercalacin: la

proliferacin celular local est provocada por discontinuidades en los valores p o sicionales, y las clulas recin form adas adoptan valores posicionales intermedios para restablecer la continuidad del patrn. La proliferacin celular terminar
slo cuando se hayan intercalado clulas que hayan recuperado todos los valo res posicionales perdidos inicialm ente y hayan quedado situadas segn el pa trn de separacin intercelular que les corresponde. Todo este proceso se deno mina regeneracin por intercalacin. La ley de intercalacin, con el corolario de que la proliferacin celular conti na hasta que se consigue un cierto espaciamiento de los valores posicionales, es un principio organizador muy potente en los sistemas en que acta. A partir de un patrn ms o menos especificado y en miniatura -u n gradiente de morfgeno, por ejem plo- puede causar la construccin de un patrn completo y muy preciso de valores posicionales que regular el crecimiento de todas las partes del patrn hasta que adquieran su tamao normal: todo lo que se necesi ta es que el patrn inicial sea cualitativamente -e s decir, topolgicam ente- co rrecto. Parece ser que el mismo principio dirige muchos procesos de organog nesis y regeneracin celular en insectos y tambin en crustceos y anfibios. Incluso en criaturas como los mamferos, cuyas estructuras perdidas no acos tumbran a regenerarse en el adulto, el principio de la ley de intercalacin puede contribuir a la regulacin del crecim iento y del patrn de formacin durante el desarrollo embrionario. Desgraciadamente no se conocen los mecanismos m o leculares que originan esta forma crucial de control de crecimiento.

Resumen

Las clulas embrionarias no slo han de diferenciarse sino que dicha diferencia cin debe mantenerse tras la desaparicin de las seales que iniciaron la diversifi cacin celular. Para que ello ocurra es necesaria la memoria celular, ya que permi te que las clulas queden determinadas particularmente para desempear un papel especializado mucho antes de que se diferencien abiertamente. Los mecanis mos de la memoria celular pueden ser citoplasmticos, implicando molculas del citoplasma que actuarn retroactivamente en su ncleo para mantener su propia sntesis; autocrinos, implicando molculas segregadas que actan retroactivamen te en la clula; o nucleares, implicando procesos de modificacin de cromatina o DNA. En algunos casos el estado de determinacin se ha relacionado con la expre sin de genes reguladores especficos, como los genes miognicos para las clulas musculares. Los diferentes tipos de clulas de un embrin se producen segn un patrn re gular espacial. Normalmente, el origen de la formacin de este patrn son las asi metras en el huevo y contina mediante interacciones clula-clula en el embrin. Las seales espaciales que coordinan el patrn deformacin suministran informa cin posicional a las clulas, y el almacenaje de una de estas informaciones por parte de las clulas se denomina valor posicional. Por ejemplo, las clulas de un ru dimento temprano de la extremidad posterior o anterior de un embrin de verte brado adquieren valores posicionales diferentes, convirtiendo a las clulas de las extremidades anterior y posterior no equivalentes en su carcter intrnseco, mucho antes de que el patrn de diferenciacin celular se haya determinado. En muchos animales el patrn de valores posicionales se acopla estrechamente al control de proliferacin celular segn un principio de intercalacin muy simple. Segn este principio, la discontinuidad de valores posicionales provoca una proli feracin celular local, y las clulas recin formadas adoptan valores posicionales
1 14 2 Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

intermedios para restablecer la continuidad del patrn. Es muy probable que este mecanismo acte en el desarrollo embrionario tpico corrigiendo inadecuaciones en la especificacin inicial de informacin posicionaL

El gusano nemtodo: los genes controladores del desarrollo y las leyes del comportamiento celular32
En el caso de las clulas, como en el de los ordenadores, la memoria hace que com plejos programas de comportamiento celular sean posibles; muchas clulas a la vez, todas ellas avanzando gracias a su complejo programa de desarrollo, pueden generar un cuerpo adulto muy complejo. Algunos de los pasos que la c lula da en el transcurso de su desarrollo son autnomos, mientras que otros se ven afectados por seales de otras clulas. As pues, las clulas del embrin pue den compararse a un conjunto de pequeos ordenadores, o autmatas, actuan do en paralelo e intercambiando informacin unos con otros. Las leyes que de terminan el comportamiento celular estn codificadas en los genes celulares. Cada clula contiene el mismo genoma y, por lo tanto, su comportamiento sigue las mismas reglas, pero existe una gran variedad de estados celulares; las leyes dirigen el desarrollo a lo largo de vas alternativas segn una com binacin de la informacin que la clula ha conseguido retener en su memoria y las seales del entorno que recibe. Los modelos por ordenador muestran que incluso un pro grama muy sencillo puede conducir a los individuos autmatas (clulas) de un sistema como ste a producir patrones sorprendentemente complejos; la simple observacin del desarrollo normal del patrn no basta para deducir las leyes que rigen el programa. El reto, por lo tanto, consiste en descifrar experimentalmente las leyes subyacentes al desarrollo celular y esclarecer cmo los genes especifi can estas leyes. El gusano nemtodo Caenorhabditis elegans ofrece condiciones excepciona les para este estudio, y se ha convertido en uno de los principales modelos de la gentica del desarrollo. Aqu, lo utilizamos para ilustrar varios principios genera les, pero reservamos el estudio ms detallado de la gentica del desarrollo del patrn de formacin para el prximo apartado, sobre Drosophila, de la cual se ha conseguido una visin ms completa gracias a ms aos de investigacin y muchos ms medios.

C aen o rh ab d itis eleg an s es anatm ica y genticam ente sencillo 33

Como animal adulto, C. elegans tiene una longitud aproximada de 1 mm y slo consta de alrededor de 1000 clulas somticas y de entre 1000 y 2000 clulas ger minales (exactamente 959 ncleos de clulas somticas ms aproximadamente 2000 clulas germinales en un sexo; y exactamente 1031 ncleos de clulas so mticas ms aproximadamente 1000 clulas germinales en el otro sexo) (Figura 21-39). Se ha reconstruido, clula a clula, la anatoma del nemtodo, mediante Figura 21-39 Caenorhabditis elegans. Visin lateral de un ejemplar hermafrodita adulto. Ntese que el tejido llamado hipodermis del nemtodo corresponde a la epidermis de otros animales. (De J.E. Sulston y H.R. Horvitz, Dev. Biol. 56:110-156, 1977.)

--------------------------------------------------------------------- 1,2 m m -----------------------------------------------------------------------------H DORSAL ANTERIOR intestino huevos gnada POSTERIOR

El gusano nemtodo: los genes controladores del desarrollo y las leyes del comportamiento celular

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el estudio al microscopio electrnico de secciones seriadas. El mapa corporal de este nemtodo sencillo es bsicam ente el mismo que el de la mayora de los ani males superiores dado que consta de un cuerpo alargado con una simetra bila teral rudimentaria, compuesto por los mismos tejidos bsicos (nervio, msculo, intestino y piel) organizados segn el mismo patrn bsico (boca y encfalo en el extremo anterior, y ano en el posterior). La pared externa del cuerpo est com puesta de dos capas: la epidermis protectora, o piel, y la capa muscular subya cente. Un sencillo tubo de clulas endodrmicas forma el intestino. Un segundo tubo, situado entre el intestino y la pared del cuerpo, constituye la gnada; la com posicin de su pared es a base de clulas somticas, con las clulas germi nales en el interior de la misma. C. elegans tiene dos sexos -u n o hermafrodita y otro masculino. El hermafrodita podra describirse como una hembra que pro duce un nmero reducido de espermatozoides: puede reproducirse tanto por autofecundacin, sirvindose de sus propios espermatozoides, como por fecun dacin cruzada tras la transferencia de espermatozoides de un macho a travs de la cpula. La autofecundacin tiende a producir una progenie homozigtica, que facilita la utilizacin de C. elegans como un organismo excepcionalmente adecuado para los estudios genticos. La relativa sencillez de la anatom a de C. elegans queda reflejada de la mis ma m anera en la sencillez de su genoma. Se calcula que el animal tiene en sus pares homlogos de cromosomas un total de 3000 genes esenciales, (es decir, genes en los que las mutaciones son letales o de consecuencias fcilmente detectables en el fenotipo) y cuatro o cinco veces este mismo nmero de genes no esenciales. El genoma haploide consta de aproximadamente 108 pares de nucletidos de DNA, lo que representa cerca de 20 veces ms que E. coli, aproxima damente igual que Drosophila, y 30 veces menos que los seres humanos. Actual mente, mediante mutaciones se han identificado ms de 900 genes esenciales. Entre ellos existen genes que influyen en caractersticas visibles como el tamao y el com portam iento del gusano, genes que codifican protenas conocidas como la miosina y genes que controlan el curso del desarrollo. Se han realizado mapas de casi todo el genoma mostrndolo cmo una gran serie de segmentos solapa dos de DNA, representados por una biblioteca de clones genmicos ordenados (vase pg. 339), y se han iniciado esfuerzos sistemticos para determinar la se cuencia com pleta de DNA del organismo.

El desarrollo del nem todo es prcticam ente invariable 34

C. elegans comienza a vivir como una sola clula. El huevo fecundado da lugar, por medio de divisiones celulares repetidas, a 558 clulas que forman un peque o gusano en el interior de la cscara del huevo. Una vez fuera del huevo, se pro ducen ms divisiones que provocarn el crecimiento y la maduracin sexual del gusano a medida que pasa por los cuatro estadios larvarios sucesivos separados por las correspondientes mudas. Tras la ltima muda se alcanza el estado adul to, y el gusano hermafrodita inicia la produccin de sus propios huevos. Todo el proceso de desarrollo, de huevo a huevo, dura solamente tres das. Puesto que el C. elegans es pequeo y transparente, se puede observar cmo sus clulas se dividen, migran, se diferencian y mueren en el embrin, y se pue de seguir el linaje desde el huevo hasta el organismo adulto. Esta sencilla tcnica de observacin directa ha servido para describir el comportamiento y el linaje de todas las clulas desde el huevo hasta el animal adulto. Esto ha hecho posible un anlisis de lin aje pormenorizado, que es mucho ms difcil de realizar en ani males de mayor tamao, en los cuales cada una de las clulas ha de ser marcada en estadios tempranos para poder identificarla a ella y a su progenie. Adems, en animales mayores los pormenores del linaje celular presentan muchas varia ciones aleatorias, incluso entre especm enes genticamente idnticos. Por el contrario, en el nemtodo las estructuras somticas se desarrollan segn un li naje celular invariable y predecible, y cada una de las muchas divisiones celula res se produce en el momento preciso. Esto significa que los precursores celula-

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Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

HUEVO

10

eclosin II II II II

I I I I I I I I

I I

I I

! I

I I

I I I I l i l i

I I I I

I I I I

intestino ANTERIOR POSTERIOR

res siguen el mismo patrn de divisiones celulares en cada individuo, y salvo contadas excepciones, se puede predecir el futuro de cada clula hija a partir de su posicin en el rbol genealgico (Figura 21-40). La descripcin com pleta del linaje celular del C. elegans nos proporciona una respuesta inmediata a una pregunta fundamental. El nemtodo, igual que muchos animales, se forma a partir de un nmero relativamente elevado de c lulas que se pueden clasificar en un nmero mucho menor de tipos celulares diferenciados. Dada la importancia de los antecedentes celulares, cabe la tenta cin de suponer que todas las clulas de un mismo tipo celular son descendien tes de una nica clula fundadora que ha seguido una sola va de desarrollo. Sin embargo, el anlisis del linaje demuestra que generalmente esto no es cier to, ni para nemtodos ni para otros animales. As, en C. elegans (salvo pocas ex cepciones como las clulas intestinales y las clulas de la lnea germinal) cada clase de clulas diferenciadas -hipodrm icas, neuronas, musculares, de la gnad a- derivan de varias clulas fundadoras que se originan en ramas separadas del rbol genealgico (vase Figura 21-40). De este modo, clulas de carcter parecido no tienen por qu ser parientes cercanos. Por el contrario (aunque ra ramente), clulas de carcter distinto pueden tener un parentesco muy prximo en cuanto a linaje; por ejemplo, algunas de las neuronas de C. elegans son her manas de las musculares. Entonces, el problema consiste en comprender las leyes que actan en cada rama del rbol genealgico generando un conjunto determinado de tipos celula res, cada uno de ellos en un nmero adecuado.

Figura 21 -40 rbol genealgico de las clulas que form an el intestino de C. eleg a n s. El huevo (a rr ib a ) se ha dibujado a la misma escala que el adulto (abajo). Obsrvese que mientras que las clulas intestinales se forman a partir de un nico clon (como hacen las clulas germinales), las clulas de la mayora de los dems tejidos no lo hacen.

Los genes de control del desarrollo definen las leyes del com portam iento celular que generan el mapa corporal 35
Para explicar cmo el genoma define las leyes del desarrollo, necesitamos poder identificar los genes que controlan las opciones de desarrollo de las clulas. Las

El gusano nemtodo: los genes controladores del desarrollo y las leyes del comportamiento celular

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mutaciones en estos genes dificultarn el desarrollo, aunque las mutaciones no son las nicas que lo hacen. Por ejemplo, algunas mutaciones interrumpen to dos los linajes celulares y causan la muerte prematura del embrin simplemente porque destruyen los genes constitutivos que toda clula necesita para sobre vivir y proliferar. Otras mutaciones afectan genes que codifican protenas que determinados tipos de clulas diferenciadas necesitan para poder realizar su funcin especializada; el mapa corporal ser bsicam ente normal, pero algunos tipos celulares, aunque inidentificables, funcionarn mal. Por el contrario, mu taciones en genes especficam ente implicados en el control de opciones de de sarrollo trastornan el mapa corporal: normalmente dan lugar a tipos diferencia dos de clulas normales dispuestas anormalmente o en cantidades anormales como resultado de alteraciones especficas en el rbol genealgico. Identificados de esta manera, los genes de control del desarrollo, se pueden clasificar segn las partes del rbol genealgico afectadas y, por lo tanto, si conocem os las leyes del com portam iento celular que generan esta parte del rbol, los genes se pue den clasificar segn las leyes de las que son responsables. Para ilustrar los principios del anlisis gentico de un mecanismo de desa rrollo, veremos un ejemplo de interaccin clula-clula en el nemtodo -la in duccin de la vulva.

La induccin de la vulva depende de un amplio conjunto de genes controladores del desarrollo 36

La vulva -e l orificio por el que el gusano hermafrodita pone sus huevos- es una obertura ventral en la hipodermis (piel) formada por 22 clulas producto de lina jes especiales de tres clulas precursoras de la hipodermis. Una nica clula de la gnada, que no se divide, denominada clula de anclaje, adhiere, o ancla, la

D ESA RRO LL O NORM AL DE LA VULVA

CELULA DE AN CLA JE MU ER TA

ELIMINACION DE TO D AS LAS CLULAS DE LA GNADA, EXC E PT O LA CLULA DE ANC LA JE

gnada clula de anclaje hipoderm is

restos de clulas muertas de la gnada clula de anclaje

. vulva en desarrollo
(A)

Figura 21-41 Induccin de la vulva. (A) Experimentos que demuestran que para que se desarrolle la vulva es necesaria una influencia inductiva procedente de la clula de anclaje. (B) Visin amplificada de las clulas de la hipodermis ventral adyacente a la gnada, en los alrededores de la clula de anclaje, con un esbozo de los diagramas del rbol genealgico tpico de su progenie en la parte inferior. Las seis clulas (y ninguna otra) son capaces de responder a la influencia inductora de la vulva, pero normalmente slo tres de estas clulas estn expuestas a ella.

la vulva no se desarrolla clula de anclaje

vulva
1 146 Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

vulva en desarrollo a la gnada subyacente (el tero) originando un pasaje que los huevos atravesarn para alcanzar el mundo exterior. Experimentos en los que se utilizan tcnicas de microciruga demuestran que la clula de anclaje es responsable de la induccin de las tres clulas hipodrmicas ms cercanas para formar la vulva (Figura 21-41). Si destruimos la clula de anclaje con un rayo l ser, estas clulas no dan lugar a la vulva sino que producen clulas hipodrmicas tpicas. Si se altera la posicin de la clula de anclaje en relacin a las clulas hi podrmicas, se vara la futura localizacin de la vulva: las tres clulas que nor malmente originan la vulva se encuentran flanqueadas por otras tres clulas que tam bin son capaces de hacerlo si se exponen a las seales de la clula de ancla je. As pues, la clula de anclaje induce la diferenciacin celular en C. elegans del mismo modo que los blastmeros del polo vegetativo inducen la diferenciacin mesodrmica en el embrin temprano de Xenopus. La nica clula necesaria para la induccin es la de anclaje: si destruimos todas las clulas de la gnada salvo la clula anclaje, la vulva se desarrollar con normalidad. Para identificar los genes implicados en un momento determinado del desa rrollo, tenem os que buscar mutaciones que interrumpan el proceso, mediante el estudio de la progenie de una gran poblacin de animales que han sido expues tos a agentes mutantes. De este modo se encuentran mutantes que tienen un fe notipo sin vulva, en los que las clulas hipodrmicas se comportan como si no hubieran recibido la seal de la clula de anclaje. Otro gran grupo de mutantes tienen un fenotipo multivulva, en el que las seis clulas hipodrmicas capaces de responder a la seal de la clula de anclaje se comportan como si todas ellas hubieran recibido la seal, de modo que el gusano forma varias estructuras en forma de vulva en vez de una sola. Entonces se estudian las mutaciones indivi duales que dan lugar a fenotipos similares para ver si los genes afectados son los mismos o si son distintos, tal como se explica en el Panel 21-1, pgs. 1148-1149. Una vez se ha identificado de esta forma, un conjunto relevante de genes, por regla general todava podremos descubrir ms componentes del sistema bus cando mutaciones en otros genes que supriman los efectos nocivos de m utacio nes en algn gen ya identificado. Dichas mutaciones supresoras extragnicas pueden ser raras y slo son favorables a nivel gentico en organismos como C. elegans en los que son fciles de encontrar; si se encuentran, sin embargo, a menudo identifican genes cuyo productos proteicos interactan directamente con los productos del gen identificado previamente (por ejemplo, se puede com pensar la modificacin de la forma de una molcula proteica mediante una modificacin com plem entaria de la forma de su protena compaera). Se han identificado ms de 30 genes implicados en el control del desarrollo de la vulva.

Pruebas genticas microquirrgicas revelan la lgica del control del desarrollo; el clonaje y la secuenciacin de genes nos ayudan a descubrir su bioqum ica 37
Nuestro estudio se centrar ahora en tan slo cinco de los genes controladores de la vulva, llamados lin-3, let-23, sem-5, let-60 y lin-45. El deterioro de la fun cin de cualquiera de ellos a causa de mutaciones conlleva la misma consecuen cia -u n fenotipo sin vulva. Por el contrario, un cambio gentico que provoque un exceso de cualquiera de estos productos gnicos o una actividad excesiva o no regulada -e n otras palabras, un incremento de funciones- puede producir lo contrario: un efecto multivulva. Por lo tanto, los cinco genes son imprescindi bles para que se produzca la induccin de la vulva, lo cual sugiere que fcilm en te todos ellos podran ser eslabones de una misma cadena de causas y efectos; es decir, que los cinco genes podran pertenecer a una nica secuencia gnica. Ya se vio en el Captulo 15 cmo se defina mediante anlisis gentico el proceso de sealizacin que controla la especializacin de un tipo celular particular del ojo de Drosophila. Para determinar el orden en que actan los genes controladores de la vulva, se ha utilizado un tipo de anlisis parecido, como se explica en la Fi gura 21-42. De hecho, parece que los cinco genes estn situados en una nica

El gusano nemtodo: los genes controladores del desarrollo y las leyes del comportamiento celular

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GENES Y FENOTIPOS
G en: u n id a d f u n c io n a l d e h e r e n c ia , n o r m a lm e n t e c o r r e s p o n d e al s e g m e n to d e D N A q u e c o d ific a u n a s o la p r o t e n a . G e n o m a : c o n ju n to d e g e n e s d e u n o r g a n is m o . lo c u s : lo c a liz a c i n d e l g e n e n un g e n o m a

telos: formas alternativas del gen

h o m o z ig o t o A /A G E N O T IP O : c o n ju n t o e s p e c fic o d e a le lo s q u e f o r m a n e l g e n o m a d e u n in d iv id u o

T ip o s a lv a je : el tip o m s h a b itu a l

M u t a n t e : s e d if e r e n c ia d e l t ip o s a lv a je e n u n c a m b io g e n t ic o (u n a m u t a c i n )

h e t e r o z ig o t o a /A

h o m o z ig o t o a /a

F E N O T IP O : c a r a c te r e s v is ib le s d e u n in d iv id u o

el a le lo A es d o m in a n t e ( r e s p e c to a a ); el a le lo a e s r e c e s iv o ( r e s p e c to a A ) En el e je m p lo ilu s tr a d o (p a r te s u p e r io r ), el fe n o t ip o d e un h e te r o z ig o to e s el m is m o q u e el d e u n o d e lo s h o m o z ig o to s ; e n lo s c a s o s e n q u e e s d if e r e n t e d e lo s d o s , s e d ic e q u e lo s d o s a le lo s s o n c o - d o m in a n t e s .

CROMOSOMAS
centrm ero
brazo "p" corto
------ 1 ---------------' I

u n c r o m o s o m a e n el in ic io d e l c ic lo c e lu la r , e n la fa s e G v la b a r ra r e p r e s e n ta u n a d o b le h lic e la r g a d e D N A

EL CICLO HAPLOIDE-DIPLOIDE DE REPRODUCCIN SEXUAL

brazo "q" largo

u n c r o m o s o m a al fin a l d e l c ic lo c e lu la r , e n m e t a f a s e , f o r m a d o p o r d o s c r o m t id a s h e r m a n a s id n tic a s (c a d a u n id a s al c e n t r m e r o . U n c o n ju n t o t p ic o d e c r o m o s o m a s d ip lo id e s , ta l c o m o s e v e e n u n a a p o s ic i n e n m e t a f a s e p r e p a r a d a r o m p ie n d o la c lu la e n m e t a f a s e y Cu) )rv \ (A v ) paterno m aterno \ \ \ t i e n d o lo s c r o m o s o m a s d is p e r s o s . e ' e j e m P l lu s tr a d o e s q u e m t ic a m e n t e , a p a r e c e n tr e s \

madre
DIPLOIDE

r------ __________________ u n a d e las c u a le s c o n tie n e u n a d o b le h lic e d e D N A )

brazo
"p" corto ^

brazo/
"q" largo .^ ^ a u to s o m a s ^

MEIOSIS
HAPLOIDE

z' / / //O

' fra te rn o 1

oocito

esperm atozoide

(y / / / y / ' paterno .i

f) n

p a re s d e a u to s o m a s (c ro m o s o m a s h e r e d a d o s s im t r ic a m e n t e d e a m b o s p r o g e n ito r e s , e x c e p t o lo s a s e x u a le s )

FUSIN SEXUAL (FECUNDACIN) DIPLOIDE r crom osom a materno i i y ------------crom osom a paterno

y
Pa terno 2

\ /m i \
\U (y \ \

fl n
{ / / ( j) ) U

CT
materno 2
\ \ Y

/
/

/
/

y dos cromosomas sexualesuno X

de la m adre y otro Y del padre. La
/ c a n t id a d y lo s tip o s d e c r o m o s o m a s s e x u a le s v a r a n d e u n o s o r g a n is m o s a o tr o s , al ig u a l q u e la c a n tid a d d e p a re s d e a u to s o m a s .

OH W
y /

P a ra s im p lific a r, el c ic lo se r e p re s e n ta s o la m e n te p a ra un c r o m o s o m a /p a r d e c ro m o s o m a s .

cromosomas sexuales

MEIOSIS Y RECOMBINACION GENICA

crom osom a m aterno crom osom a paterno MEIOSIS Y RECOMBINACION

genotipo Ab

C u a n to m a y o r s e a la d is ta n c ia e n tr e lo s d o s lo c i, m a y o r s e r la p o s ib ilid a d d e r e c o m b in a c i n p o r e n t r e c r u z a m ie n t o e n u n

lugar de entrecruzam iento genotipo aB

p u n t o e n tr e a m b o s lo c i. S i se r e c o m b in a n u n a p r o p o r c i n x % d e g a m e t o s , e s ta r n s e p a r a d o s p o r u n a d is ta n c ia e n el m a p a g e n t ic o d e x u n id a d e s d e m a p a (o x c e n t im o r g a n s ) .

g e n o tip o

gametos haploides (oocitos o espermatozoides)

1148

Panel 21-1 Revisin de gentica clsica.

TIPOS DE MUTACIONES
I o

~~

L................... i ).... z ........ : ... J . u ......i

d e le c i n : s u p r im e u n s e g m e n t o d e u n c r o m o s o m a

m u ta c i n p u n tu a l: c a m b io d e u n n ic o lu g a r d e l g e n o m a c o r r e s p o n d ie n t e a u n p a r d e n u c le tid o s o u n a p a r te m u y p e q u e a d e u n g e n

in v e r s i n : in v ie r te u n s e g m e n to d e un c r o m o s o m a

tr a n s lo c a c i n : s e c c io n a u n s e g m e n t o d e u n c r o m o s o m a y lo u n e a o tr o c r o m o s o m a

m u ta c i n le ta l: p r o v o c a la m u e r t e p r e m a t u r a d e un o r g a n is m o e n d e s a r r o llo . m u ta c i n c o n d ic io n a l: p r o d u c e u n e fe c to fe n o t p ic o s lo b a jo c ie r ta s c o n d ic io n e s , d e n o m in a d a s c o n d ic io n e s re s tric tiv a s ; e n o tr a s c o n d ic io n e s las c o n d ic io n e s p e rm is iv a s e s te e fe c to n o s e o b s e r v a . P a ra u n a m u t a c i n s e n s ib le a la te m p e ra tu ra , la c o n d ic i n r e s tr ic tiv a m s c o m n e s la t e m p e r a t u r a a lta m ie n t r a s q u e la c o n d ic i n p e r m is iv a e s la te m p e r a t u r a b a ja , m u ta c i n d e p r d id a d e fu n c i n : r e d u c e o e lim in a la a c tiv id a d d e l g e n . S o n la s m u t a c io n e s m s tp ic a s . N o r m a lm e n t e la s m u ta c io n e s d e p r d id a d e fu n c i n s o n re c e s iv a s g e n e r a lm e n t e lo s o r g a n is m o s p u e d e n fu n c io n a r c o n n o r m a lid a d m ie n tr a s r e te n g a n a l m e n o s u n a c o p ia n o r m a l d e l g e n a fe c ta d o . m u ta c i n n u la : e lim in a p o r c o m p le t o la a c tiv id a d d e l g e n .

m u t a c i n d e in c r e m e n t o d e f u n c i n : a u m e n t o d e la a c t iv id a d d e l g e n o e x p r e s i n d e l g e n e n c o n d ic io n e s in a d e c u a d a s ; n o r m a lm e n t e e s ta s m u t a c io n e s r e c ib e n e l n o m b r e d e

d o m in a n te s .
m u t a c i n d o m in a n t e n e g a tiv a : m u t a c i n a c tiv a d o m in a n t e q u e b lo q u e a la a c t iv id a d g n ic a , p r o v o c a n d o u n f e n o t i p o d e p r d id a d e f u n c i n in c lu s o e n p r e s e n c ia d e u n a c o p ia n o r m a l d e l g e n . El f e n m e n o o c u r r e c u a n d o el p r o d u c t o d e l g e n m u t a n t e in t e r f ie r e c o n e l p r o d u c t o d e l g e n n o r m a l, m u t a c i n s u p r e s o r a : e lim in a el e fe c to f e n o t p ic o d e o tr a m u t a c i n , y el in d iv id u o c o n a m b a s m u t a c io n e s p a r e c e n o r m a l. El g e n a f e c t a d o p o r la p r im e r a m u t a c i n p r e s e n ta e n su in t e r io r u n a m u t a c i n s u p r e s o r a in tra g n ic a ; un s e g u n d o g e n p r e s e n ta u n a m u t a c i n s u p r e s o r a e x tra g n ic a ; a m e n u d o el p r o d u c t o d e e s te s e g u n d o g e n in te r a c t a d ir e c t a m e n t e c o n el p r o d u c to d e l p r im e r g e n .

DOS GENES O UNO SOLO?

S i d o s m u t a c io n e s d e te r m in a d a s p r o d u c e n el m is m o f e n o t ip o , c m o p o d e m o s d is c e r n ir si s o n m u ta c io n e s d e l m is m o g e n ? S i las m u t a c io n e s s o n re c e s iv a s (y la m a y o r a lo s o n ), p o d r e m o s e n c o n t r a r la r e s p u e s ta m e r c e d a u n a p r u e b a d e c o m p le m e n t a c i n . C O M P L E M E N T A C I N : M U T A C I O N E S E N D O S G E N E S D IS T IN T O S E n el t ip o m s s im p le d e p r u e b a d e c o m p le m e n t a c i n , u n in d iv id u o h o m o z ig o t o p a ra u n a m u t a c i n s e c ru z a c o n u n in d iv id u o q u e e s h o m o z ig o t o p a ra la o tr a m u t a c i n . El f e n o t ip o d e su d e s c e n d ie n t e r e s p o n d e la p r e g u n t a . N O C O M P L E M E N T A C I N : D O S M U T A C I O N E S IN D E P E N D IE N T E S E N E L M I S M O G E N

madre hom ozigoto m utante

padre hom ozigoto mutante

m adre hom ozigoto m utante

padre ho

m utante

el d e s c e n d ie n t e h b r id o p r e s e n ta un f e n o t ip o n o r m a l: c o n t ie n e u n a c o p ia n o r m a l d e c a d a g e n

el d e s c e n d ie n t e h b r id o p r e s e n ta u n f e n o t ip o m u t a n t e : n o p r e s e n ta c o p ia s n o r m a le s d e l g e n m u t a d o

1149

ACTIVIDADES DE LOS GENES la actividad de cada gen depende de la actividad del gen precedente m utacin de prdida de funcin en A y m utacin de increm ento de funcin en B m utacin de increm ento de funcin en A y m utacin de prdida de funcin en C

FENOTIPO tipo salvaje

A
hshhhhhshsot

increm ento de funcin prdida de funcin

secuencia gentica: lin-3 ocupando la primera posicin, seguido de let-23, y en este orden sem-5, let-60 y finalmente lin-45. As pues, por ejemplo una mutacin de increm ento de funcin de lin-3 no tiene ningn efecto sobre el fenotipo de un animal que tam bin contenga una mutacin que conlleve la prdida de fun cin de let-23; la doble m utante carece de vulva debido a que el componente que abre la secuencia no puede hacer nada si el componente siguiente sobre el que debera actuar ha desaparecido. El problema siguiente consiste en relacionar las actuaciones de los genes con clulas determinadas del embrin. Por ejemplo, es necesario lin-3 en las clulas de anclaje que producen la seal de induccin o en las clulas hipodrmicas que responden a ella? La gentica molecular nos proporciona una fcil respuesta para el caso de lin-3 : el gen se ha clonado y se ha demostrado su ex presin en la clula de anclaje y en ninguna otra parte de la zona circundante (Figura 21-43). Parece que los otros cuatro genes, por el contrario, actan de un modo distinto en las clulas hipodrmicas, y una mutacin de incremento de funcin en uno de ellos puede causar un fenotipo multivulva incluso si se ha destruido la clula de anclaje. Para com pletar el panorama vamos a relatar el camino definido gentica mente para molculas proteicas y su bioqumica. Se han clonado y secuenciado los cinco genes lin-3, let-23, sem-5, let-60 y lin-45, y en cada caso la secuencia in dica una posible funcin: lin-3 codifica una protena similar a una molcula se al segregada muy conocida en los vertebrados -e l factor de crecimiento epidr mico (EGF); let-23 codifica un receptor de tirosina quinasa homloga a los miembros de la familia de receptores de EGF de vertebrados; como vimos en el Captulo 15, sem-5 codifica la protena que contiene los dominios SH2 y SH3, presente en muchas protenas que se unen directamente a dichos receptores y que actan sobre otros com ponentes intracelulares; y let-60 y lin-45 son hom logos respectivamente a los genes de vertebrados ras y raf, cuyos productos transmiten seales de estos receptores al interior de la clula, como se vio en el Captulo 15. Por lo tanto, es posible que la protena Lin-3 sea la molcula seal segregada por la clula de anclaje, que la protena Let-23 sea el receptor trans mem brana de las clulas hipodrmicas a las que se adhiere, y que las protenas Sem-5, Let-60 y Lin-45 sean conectores de la va de seales intracelulares, a tra-

Figura 21 -42 Los genes se pueden ordenar en una secuencia gnica mediante pruebas efectuadas con imitantes dobles. Se dice que un gen A se sita p o r en cim a de un gen B si su producto normalm ente regula la actividad de B (o el producto de B) y p o r d e b a jo si la regulacin es al revs. Si al gen superior le basta con regular la actividad del gen inferior para afectar el fenotipo del gen inferior, diremos que ambos genes estn ligados en una misma secu en cia gnica. En este caso, m utaciones de cualquier gen tendrn consecuencias similares en los fenotipos. Para descubrir el orden de los genes en una secuencia, utilizamos mutantes dobles para determinar cul de los dos genes determina de forma ms directa al fenotipo. El estudio depender de que encontrem os m utaciones especficas de A y de B que tengan consecuencias opuesta sobre el fenotipo cuando se presentan por separado. En el ejemplo ilustrado se com bina una mutacin (dominante) de increm ento de funcin en el gen B, que lo activa independientemente de toda regulacin procedente de los genes superiores, con una mutacin (recesiva) de prdida de funcin en A o C: la doble mutante (A,B) tiene un fenotipo de increm ento de funcin, que implica que A se sita antes de B, mientras que la mutante (B,C) tiene un fenotipo de prdida de funcin, que implica que C se sita detrs de B.

Figura 21 -43 Expresin de lin-3 en la clula de anclaje. Un embrin de C. elegan s ha sido transfectado con un gen informador artificial que consiste en la regin de control de lin-3 acoplada al gen que codifica la enzima P-galactosidasa, cuya presencia es fcilmente detectable mediante una reaccin histoqumica que da una coloracin azul. Slo se tie de azul la clula de anclaje, lo cual implica que el gen lin-3 slo se activa en la clula de anclaje. (Cortesa de Russell Hill.)

1 15 0

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

CLULA HIPODRMICA

Lin-3 (EGF)

<
Let-23 (receptor EGF)

C Z b/\
Let-60 (Ras)

G e>
Lin-45 (Raf)

Figura 21 -44 Camino que sigue la induccin de la vulva en C. elegans. Los diagramas muestran las funciones de los productos gnicos que se han identificado. Los nom bres de las protenas homologas en los vertebrados se indican entre parntesis.

vs de la cual la unin del ligando con el receptor ejerce sus efectos finales sobre la expresin gnica y la determinacin celular (Figura 21-44). De hecho, el anli sis gentico de este sistema del gusano nemtodo en desarrollo proporciona una de las visones ms claras que tenem os sobre la organizacin de la va de seales que parece que se ha conservado en la mayora del reino animal. Como vimos en el Captulo 15, un camino muy similar a ste aparece del anlisis de sevenless mutantes de Drosophila (vase pg. 817).

Mutaciones heterocrnicas identifican los genes que especifican cam bios en las leyes del comportamiento celular a medida que transcurre el tiem po 38
Tal como saben los programadores de ordenadores, pequeos cambios en el programa pueden tener consecuencias drsticas en el resultado que se obtiene al ejecutar dicho programa. De forma parecida, una mutacin sobre un gen de control que altere una sola ley del comportamiento celular puede provocar un rbol genealgico totalmente anormal. Las mutaciones heterocrnicas en C. ele gans constituyen un buen ejemplo de este fenmeno, ya que provocan un com portamiento en ciertos conjuntos de clulas que sera normal en otros estadios del desarrollo. Por ejemplo, una clula hija puede comportarse igual que una c lula madre o abuela mientras que la clula descendiente de la hija puede com portarse de nuevo de la misma manera, etc., lo cual hace que una parte del pa trn genealgico se repita indefinidamente. La Figura 21-45 muestra los diagramas de linaje para una serie de m utacio nes de un gen llamado lin-14, que ilustran este fenmeno: en lugar de progresar

tipo salvaje

m utante lin-14 de prdida de funcin T

m utante lin-14 de increm ento de funcin T

prim er estado larvario

rfti

segundo estado larvario tercer estado larvario cuarto estado larvario

Figura 21-45 Mutaciones heterocrnicas del gen lin-14 de C. elegans. Slo se muestran las consecuencias en uno de los muchos linajes afectados. La mutacin (recesiva) de prdida de funcin de lin-14 provoca la aparicin prematura del patrn de divisin y diferenciacin celular caracterstico de la larva madura; la mutacin (dominante) de incremento de funcin provoca el efecto contrario. La X indica una muerte celular programada. Las lneas verdes representan las clulas que contienen pro tena Lin-14, las lneas rojas las que no. En un desarrollo tpico el inicio de la nutricin larvaria marca el inicio de la desaparicin de Lin-14. (Segn V. Ambros y H.R. Horvitz, Science 226:409-416, 1984. the AAAS; y P. Arasu, B. W ightm an y G. Ruvkun, G row th Dev. Aging. 5:1825-1833,1991.)

El gusano nemtodo: los genes controladores del desarrollo y las leyes del comportamiento celular

1151

mediante series normales de divisiones celulares caractersticas del primero, se gundo, tercero y cuarto estados larvarios para detenerse tras el cuarto, muchas de las clulas que presentan una mutacin de incremento de funcin de lin-14 repiten los patrones caractersticos del primer estado larvario, hasta un mximo de cinco ciclos - o m udas- y persisten en la formacin de un tipo de cutcula in madura. Las mutaciones que implican prdida de funcin del gen lin-14 tienen un efecto inverso: hacen que las clulas adopten precozmente estados adultos, saltndose los estados intermedios, de forma que el animal alcanza su estado fi nal prematuramente con un nmero anormalmente reducido de clulas. El gen lin-14 ha sido clonado, y tambin se ha descubierto que la pro tena que codifica se concentra en el ncleo celular. En un ejemplar normal, la prote na est presente en la mayora de las clulas somticas del embrin tardo y en el primer estadio larval temprano, pero en el segundo estadio larval su concen tracin disminuye hasta casi cero. Las mutantes lin-14 que entran precozmente en el estado adulto presentan un nivel de protena Lin-14 reducido, mientras que las mutantes que continan repitiendo los primeros ciclos del primer esta dio larvario presentan una expresin de la protena Lin-14 durante un perodo extraordinariamente largo (debido a una mutacin en la porcin reguladora del gen). As el efecto de la protena Lin-14 consiste en mantener las clulas en un estado inmaduro, y su maduracin normal depende de su desaparicin. Pode mos suponer que este producto gnico es solamente uno de los muchos cuyas concentraciones en las clulas provocan cambios en las reglas del comporta miento celular a lo largo del desarrollo.

El tem po del desarrollo no est controlado mediante el ciclo de divisin celular 39

El ejemplo que acabam os de ver nos conduce a un problema fundamental del desarrollo. El genoma tiene que definir un conjunto de reglas que dirijan tanto la divisin com o la especializacin de la clula, y ambos procesos han de estar co ordinados. Cmo se coordina la divisin celular durante el desarrollo, y cmo se coordina a su vez con la especializacin celular? Una sugerencia es que existan cambios de su estado interno que esperen el paso de la clula a travs del ciclo de divisin: por decirlo de algn modo, la c lula pasara a la fase siguiente como lo hizo a travs de la mitosis. Esta idea pare ce tentadora, especialmente cuando se describe el desarrollo en trminos de diagramas de linaje, pero las pruebas van en contra de esta hiptesis. A menudo las clulas de embriones en desarrollo continan diferencindose de forma casi normal incluso cuando se impide artificialmente la divisin celular. Obviamen te, tiene que haber anomalas, aunque slo sea porque una sola clula no dividi da no pueda diferenciarse de dos formas a la vez. Pero parece que en la mayora de los casos que hemos estudiado las divisiones celulares no son las manecillas del reloj que establecen el tem po del desarrollo, sino que la clula cambia su estado qumico con el tiempo independientemente de la divisin celular, y este estado cam biante controla tanto la decisin de dividirse como la decisin sobre cmo y cundo especializarse.

Las clulas mueren ordenadamente como parte del programa de desarrollo 4 0

Un C. elegans hermafrodita genera 1030 ncleos de clulas somticas en el trans curso de su desarrollo, pero 131 de las clulas mueren. Estas m u e rte s c e lu la re s p ro g ra m a d a s ocurren segn un patrn absolutamente predecible, y sin causar problemas. Mientras que las clulas que mueren a causa de heridas o envenena mientos normalmente se hinchan y explotan, vertiendo su contenido sobre sus vecinas, estas muertes de clulas normales ocurren mediante un proceso cono cido como a p o p to s is , en el que el ncleo celular se condensa, la clula se seca y el cuerpo m archito es engullido y digerido rpidamente por sus clulas vecinas

1 15 2

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

(Figura 21-46). La muerte celular programada es una caracterstica tpica del de sarrollo animal y probablemente el destino de un porcntaje substancial de las clulas producidas por la mayora de los animales. Debido a que la apoptosis ocurre rpidamente y sin dejar rastro, es fcil que las muertes pasen desapercibidas. La muerte celular puede ser tan importante como la divisin celular para generar un individuo con los tipos celulares nece sarios y en las cantidades y localizaciones correctas. Por ejemplo, en los verte brados regula la cantidad de neuronas (como veremos ms adelante), elimina los tipos de linfocitos no deseables (Captulo 23), elimina las clulas que han ter minado su funcin (como cuando el renacuajo pierde su cola durante la m eta morfosis) y ayuda a esculpir la forma de los rganos en desarrollo (por ejemplo, creando vacos entre los dgitos eliminando las clulas situadas entre los rudi mentos de los dgitos de la yema de la extremidad). Se cree que la muerte de las clulas normales son suicidios en los que la clu la activa un programa de defuncin y se autoinmola. La mayor evidencia de que las clulas animales tienen un programa intrnseco de muerte procede de estu dios genticos sobre C. elegans, en el que dos genes, denominados ced-3 y ced-4 (iced, de cell death abnormal, muerte celular anormal), que han verificado la n e cesidad de que ocurran 131 muertes de clulas normales. Si uno de estos genes es inactivado mediante una mutacin, las clulas cuyo destino inicial era la muerte sobrevivirn, diferencindose en tipos celulares fcilmente reconocibles como las neuronas. Por el contrario, la sobreexpresin o la expresin desplazada de ced-3 y ced-4 (como resultado de mutaciones de prdida de funcin que inactivan otro gen, ced-9, que normalmente reprime el programa de muertes) hace que mueran muchas clulas que en condiciones normales sobreviviran. Se conocen las secuencias de aminocido de estas tres protenas Ced. La protena Ced-4 es nueva y podra actuar antes que Ced-3, que es una proteasa. La secuencia de aminocidos de Ced-9 es idntica en un 23% a la de una prote na de mamfero Bcl-2 (el producto del proto-oncogn bcl-2) que, como Ced-9, reprime la muerte celular programada en muchos tipos de clulas de mamfero. Al transferir el gen humano bcl-2 a C. elegans, acta como inhibidor de la muerte celular normal en el gusano e incluso es capaz de rescatar mutantes ced-9 que de otra manera moriran en etapas tempranas del desarrollo. Estos importantes descubrimientos indican que tanto el mecanismo de la muerte celular progra mada como su regulacin se han conservado a lo largo de la evolucin, desde los gusanos hasta los humanos, lo cual confirma que la capacidad de suicidarse de este modo es una propiedad fundamental de las clulas animales.

fti
V _________ )

la clula se suicida

V.

la clula m uerta es engullida por una clula vecina

el cadver es digerido y no queda rastro de l -

v_________y
Figura 21 -46 Muerte celular por apoptosis en La muerte depende de la expresin de los genes ced-3 y ced-4 en la clula que va a morir, mientras que la expresin de otros genes en las clulas vecinas controlan la absorcin y la eliminacin de sus restos.

C. elegans.

Resumen
C aenorhab d itis elegans tiene dos caractersticas que hacen de l un organismo atractivo para investigar la base gentica del desarrollo: primera, su anlisis gen tico es sencillo porque su tiempo de generacin es corto y su genoma pequeo; se gunda, el curso normal de su desarrollo es extraordinariamente reproducible y se ha estudiado detalladamente, de manera que una clula de una posicin determi nada del cuerpo tiene el mismo linaje en todos los individuos, y este linaje se conoce a la perfeccin. Al igual que en otros organismos, el desarrollo depende de interac ciones clula-clula y de procesos autnomos de clulas. Por ejemplo, experimentos de destruccin celular demuestran que el desarrollo de la vulva depende de una se al de induccin, y los genes necesarios para esta induccin se pueden identificar a travs de mutaciones que interrumpen el desarrollo de la vulva. El anlisis molecu lar gentico revelan las junciones individuales de estos genes y muestran que algu nos de ellos codifican componentes de la va de sealizacin que tambin acta en los vertebrados. El anlisis de linaje de mutantes conduce al descubrimiento de muchos otras clases importantes de genes, incluyendo genes cuyos productos esta blecen deforma temporal los cambios de las reglas del comportamiento celular du rante el desarrollo y genes que sern responsables de la muerte celular programada -una caracterstica invariable en el desarrollo de todos los animales.

El gusano nemtodo: los genes controladores del desarrollo y las leyes del comportamiento celular

1153

Drosophila y la gentica molecular del patrn de formacin. I. Gnesis del mapa corporal4 1
La afirmacin bsica de la gentica clsica es que la estructura de un organismo est controlada por sus genes. Los mecanismos del control gentico de la estruc tura del cuerpo continuaron siendo un misterio durante casi un siglo, y mucho tiempo despus de que se descubriera el papel del DNA en los procesos de la he rencia. Desde hace pocos aos se est llenando este vaco de nuestro conoci miento. En el apartado anterior utilizamos el gusano nemtodo para describir algunos de los principios ms importantes segn los cuales los genes de control del desarrollo organizan los procesos del desarrollo. Pero la mosca Drosophila melanogaster (Figura 21-47) es el organismo que ms ha contribuido a la trans formacin de nuestro conocim iento sobre el control que los genes ejercen sobre la formacin del mapa corporal. Tras dcadas de estudios genticos, culminados con investigaciones sistemticas a gran escala, se ha conseguido un amplio cat logo de genes de control del desarrollo de la mosca cuya funcin especfica es definir el patrn espacial de los tipos celulares y de las partes del cuerpo. Ahora es posible no slo identificar los genes bsicos, sino tambin observar cmo tra bajan: mediante una hibridacin in situ utilizando sondas de DNA o de RNA se puede observar directamente cmo se definen los estados internos de las clulas del embrin m ediante la expresin de conjuntos de genes reguladores. Gracias al anlisis de mutantes, animales transgnicos y animales que constituyen una masa confusa de clulas mutantes y no mutantes, se puede avanzar ms y des cubrir cmo acta cada gen como una parte de un sistema que define la organi zacin del cuerpo. Adems, la m osca ha abierto una puerta fundamental para conocer nuestro propio desarrollo, ya que los genes que controlan el patrn del cuerpo de Drosophila tienen equivalentes muy cercanos en los animales supe riores, incluidos nosotros mismos Nuestro tratado sobre la gentica del desarrollo de Drosophila est dividido en dos apartados. El primero trata los procesos del embrin temprano y describe la creacin del mapa bsico del cuerpo, con un rudimento de la cabeza en un ex tremo, y un rudimento posterior en el otro extremo y entre ambos una serie or denada de segmentos -la s unidades modulares bsicas a partir de las cuales es tn construidos todos los insectos. El segundo apartado trata de procesos ms avanzados y habla del aparato gentico que dota a las clulas de valores posicionales que diferencian las clulas de un segmento de las del siguiente; estos pro cesos aseguran que, por ejemplo, la cabeza desarrollar antenas y el trax desa rrollar patas -y no al contrario, como veremos que ocurre en algunas mutantes.

Figura 21-47 D r o so p h ila m e la n o g a ster. Vista dorsal de una m osca adulta normal. (A) Fotografa. (B) Dibujo. (Fotografa cortesa de E.B. Lewis.)

1154

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

El cuerpo del insecto se construye mediante la modulacin de un patrn fundamental de unidades de repeticin41,42
El programa del desarrollo de Drosophila, desde el huevo hasta el adulto, est re sumido en la Figura 21-48. El perodo de desarrollo embrionario comienza en la fe cundacin y dura aproximadamente un da, al final del cual el embrin abandona la cscara del huevo y se convierte en larva. Entonces la larva pasa por tres esta dios, o crislidas, separados por mudas en las cuales se deshace de su cutcula vie ja y se reviste de una nueva. Al final de la tercera crislida se convierte en pupa. Dentro de la pupa se produce una remodelacin radical del cuerpo, y finalmente, unos nueve das despus de la fecundacin, emerge una mosca adulta, o imago. La mosca est formada por una cabeza, tres segmentos torcicos (numerados de T I a T3), y ocho o nueve segmentos abdominales (numerados de Al a A9). Aun que cada segmento es diferente de los dems, todos se construyen de acuerdo con un mapa parecido. Por ejemplo, del segmento T I salen un par de patas, de T2 un par de patas y un par de alas, y de T3 un par de patas y un par de balancines -p e queas protuberancias de gran importancia para el vuelo que han evolucionado a partir del segundo par de alas que posean los insectos ms primitivos. La segmen tacin casi repetitiva se desarrolla durante las primeras horas tras la fecundacin, aunque es ms obvia en la larva, en la que los segmentos se parecen ms a los del adulto. En el embrin se puede observar que los rudimentos de la cabeza, o al m e nos las partes de la futura boca en el adulto, tambin estn segmentados (Figura 21-49). No obstante en los dos extremos del animal encontramos estructuras ter minales muy especializadas que no estn derivadas de segmentos.

F E C U N D A C IO N

0 das

C 3 huevo

D ESAR R O LLO E M B R IO N A R IO

1 da

E C L O S IO N

TU TTTU y

larva

tres estadios larvarios separados por mudas

5 das

P U P A C IO N

M E T A M O R F O S IS

partes de . . , , la cabeza torax abdom e"

2 horas

_____________

5-8 horas

Figura 21 -48 Sinopsis del desarrollo de D r o so p h ila desde el huevo hasta la mosca adulta.

/
(B)

10 horas

0,5 mm
Figura 21-49 Los orgenes de los segmentos corporales de D r o so p h ila durante el desarrollo embrionario. Los embriones se presentan en vista lateral en los dibujos (A-C) y corresponden a las electronmicrografas de barrido (D-F). (A y D) A las 2 horas, el embrin se encuentra en el estadio de bla sto d erm o sin citial (vase Figura 21-51) y no se aprecia segm entacin alguna, aunque se puede trazar el mapa de destino mostrando las futuras regiones segmentadas (icoloread a s en A). (B y E) A las 5-8 horas, el embrin se encuentra en el estadio de b a n d a g erm in a l ex ten d id a : la gastrulacin ya ha tenido lugar, la segmentacin ha comenzado a ser visible, y el eje segmentado del cuerpo ha aumentado de longitud, curvndose sobre s mismo por el extremo de la cola de forma que encaja dentro de la cscara del huevo. (C y F) A las 10 horas, el eje del cuerpo se ha contrado y se ha erguido de nuevo, y todos los segmentos estn definidos claramente. Las estructuras de la cabeza, externamente visibles en este estadio, se pliegan posteriormente en el interior de la larva, para emerger de nuevo cuando la larva experimente la pupacin transformndose en adulta. (D y E, cortesa de Rudi Turner y Anthony Mahowald; F, cortesa de Jane Petschek.)

Drosophila I. Gnesis del mapa corporal

1155

Figura 21-50 Segmentos de

em brin

Drosophila y sus correspondencias

con las regiones del blastodermo.
Tngase en cuenta que los extremos del blastodermo se corresponden con estructuras no segmentadas que forman grandes zonas internas de la larva como, por ejemplo, los rudimentos segmentales de las zonas bucales del adulto. En D rosophila, la segmentacin puede describirse en trminos de segmentos o parasegmentos: la relacin se muestra en la parte inferior de la figura. Los parasegmentos normalmente corresponden a patrones ms sencillos de expresin gnica. El nmero exacto de segmentos abdominales es discutible: ocho estn bien definidos, y es probable que exista un noveno.

A l 1A 21A3| A4| A 5 1A 6 1A71A 81A9/10 PARTES

ABDOMEN

segmentos parasegmentos

internalizados en la larva larva recin puesta

El lugar donde se traza el lmite entre un segmento y el siguiente es en parte convencional. Cuando tratemos los patrones de la expresin gnica veremos que es apropiado hablar en trminos de un total de 14 parasegmentos (numera dos desde P1 a P14) que son mitades de segmento fuera de registro con los seg mentos tradicionales (Figura 21-50).

Drosophila inicia su desarrollo como un sincitio4143

El huevo de Drosophila tiene aproximadamente 400 |im de largo y 160 |im de di metro, y presenta una polaridad muy definida. Al igual que los huevos de otros insectos, empieza su desarrollo de una forma poco usual: varias series de divisio nes nucleares sin que se produzca divisin celular, dan lugar a un sincitio. Las divisiones nucleares tempranas son sincrnicas y extremadamente rpidas, pro ducindose aproximadamente cada 8 minutos. Las nueve primeras divisiones generan un conjunto de ncleos, la mayora de los cuales migran desde el centro del huevo hacia la superficie, donde forman una m onocapa denominada blasto dermo sincitial. Despus de cuatro rondas ms de divisiones nucleares, la m em brana plasmtica crece hacia el interior, desde la superficie del huevo, envol viendo cada ncleo, y por lo tanto el blastodermo sincitial se convierte en un blastodermo celular compuesto por unas 6000 clulas separadas (Figura 21-51). Un pequeo subgrupo de ncleos situados en el extremo posterior del huevo es segregado a clulas unos cuantos ciclos antes; estas clulas polares son las clu las germinales primordiales que darn lugar a oocitos o espermatozoides. Como en el huevo de un anfibio en segmentacin, parece que los rpidos ci clos de replicacin de DNA dificultan la transcripcin, de tal modo que hasta la fase de blastodermo celular el desarrollo depende mayoritariamente -aunque no exclusivam ente- de las reservas maternas del mRNA y de las protenas que se han acumulado en el huevo antes de la fecundacin. Tras la celularizacin, la di visin celular contina, siguiendo una va ms convencional, asincrnicamente y a una velocidad ms baja, y la velocidad de transcripcin aumenta espectacu larmente. El blastodermo celular equivale a la blstula hueca de un anfibio o de un eri zo de mar, incluso aunque su interior est lleno de vitelo en lugar de ser una cavi dad llena de fluido. La gastrulacin se produce cuando finaliza la celularizacin, y aunque la geometra de este proceso es muy diferente de la del insecto, el resulta do general es sumamente parecido. Las clulas endodrmicas se desplazan hacia el interior mediante movimientos celulares coordinados, formando el intestino que se extiende a lo largo del eje del embrin. El mesodermo que envuelve el ru-

115 6

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

clulas somticas

huevo fecundado
(A )

muchos ncleos en un sincitio

los ncleos m igran hacia la periferia y se empiezan a form ar los lm ites celulares

clulas polares (clulas germ inales prim ordiales)

Figura 21-51 Desarrollo del huevo de D r o so p h ila desde la fecundacin hasta el estadio de blastodermo. (A) Diagramas esquemticos. (B) Vista de
superficie y (C) fotografas al microscopio ptico de secciones del ncleo blastodrmico durante la mitosis en la transicin desde el estadio sincitial al blastodrmico. La actina est teida de verde, la tubulina de n aran ja. (A, segn H.A.Schneiderman, en Insect Development [P.A. Lawrence, ed.], pp. 3-34. Oxford, UK: Blackwell, 1976; B y C, cortesa de W. Therkauf.)

dimento del intestino ocupa el espacio entre ste y la capa exterior envolvente de ectodermo. Si marcamos las clulas y las seguimos durante sus complejos movimientos de gastrulacin, podremos dibujar un mapa futuro de la monocapa de clulas si tuada en la superficie del blastodermo (Figura 21-52). El futuro mapa es espe cialmente sencillo en una seccin transversal a travs de la mitad del embrin, con el futuro mesodermo situado ventralmente y el ectodermo a cada lado por encim a de l. Como en un vertebrado, los cordones de las clulas nerviosas que corren a lo largo del cuerpo derivan de parte del ectodermo: un subgrupo de c lulas se separarn en este ectodermo neurognico de sus vecinas, escaparn de la capa epitelial, y se desplazarn hacia el interior del embrin convirtindose en precursores de neuronas. Para el mesodermo, el ectodermo y el cordn nervio so, se mantiene aproximadamente la posicin de las clulas a lo largo del eje an teroposterior durante la gastrulacin debido a que sus desplazamientos se pro ducen en el plano transversal. Sin embargo, el intestino se forma mediante la invaginacin de dos grupos de clulas situados en extremos opuestos del em brin; ambas invaginaciones se encuentran en la mitad del embrin y finalm en te forman un tubo intestinal continuo. A medida que la gastrulacin se completa, en la superficie del embrin apa recen una serie de muescas y protuberancias que definirn la subdivisin del cuerpo en parasegmentos a lo largo de su eje anteroposterior (vase Figura 2149). Pruebas ms sutiles demuestran que las caractersticas principales de este patrn de segmentos ya estaban establecidas en el estado de blastodermo celu lar, antes del inicio de la gastrulacin.

(B)

(C)

Figura 21-52 Mapa de destino de un embrin de D r o so p h ila en la fase de blastodermo celular. Vista lateral y en
seccin transversal del embrin, ilustrando la relacin entre la subdivisin dorsoventral en los principales tejidos futuros y el patrn anteroposterior de los futuros segmentos. Una lnea gruesa limita la regin que formar estructuras segmentales. Durante la gastrulacin las clulas situadas a lo largo de la lnea media ventral se invaginan formando el mesodermo, mientras que las clulas destinadas a formar el intestino se invaginan cerca de los dos extremos del embrin. As pues, aunque los dos extremos del embrin se encuentran situados en puntos opuestos y lejanos, comparten funciones y destino. (Segn V. Hartenstein, G.M. Technau y J.A. Campos-Ortega, W ilhem R ou xArch. Dev. Biol. 194:213-216,1985.)

A N T E R IO R

P O S T E R IO R

DORSAL

VENTRAL

V IS T A L A T E R A L

m em brana extraem brionari epiderm is dorsal sistema nervioso y epidermis ventral parte posterior del conducto digestivo mesoderm o parte anterior S E C C IO N T R A N S V E R S A L del conducto CENTRAL digestivo

Drosophila I. Gnesis del mapa corporal

1157

Dos sistemas ortogonales definen el mapa geomtrico del embrin4 4

Se necesitan dos coordenadas para definir cada una de las posiciones en el blastodermo y, de forma correspondiente, se pueden distinguir dos conjuntos de ge nes de polaridad del huevo que actan independientemente en el inicio del de sarrollo definiendo los dos ejes principales del embrin -e l dorsoventral y el anteroposterior. Estos genes definen las coordinadas espaciales del embrin es tableciendo gradientes de morfgenos en el huevo. Los genes de polaridad del huevo se descubrieron tras investigaciones ex haustivas en busca de mutantes que transtornasen la polaridad del huevo. De esta forma se descubrieron 12 genes polares dorsoventrales del huevo. Salvo uno de ellos, todos los dems tienen el mismo fenotipo mutante de prdida de fun cin en el que el embrin se dorsaliza -e s decir, todas sus clulas toman un ca rcter dorsal, de modo que las estructuras ventrales no se forman. El gen restan te tiene el fenotipo de prdida de funcin contrario: el embrin se ventraliza. Veremos que tales genes son com ponentes de un sistema nico que establece el gradiente morfognico en el embrin temprano. Por el contrario, el conjunto de genes anteroposteriores puede subdividirse segn sus fenotipos mutantes en tres subsistemas , responsables de la definicin de partes diferentes del eje anteroposterior (Figura 21-53). El grupo anterior (4

Figura 21-53 Dominios de los sistemas de genes de polaridad del huevo: anteriores, posteriores y terminales. Los diagramas muestran los destinos de diferentes regiones del huevo/embrin temprano, y las regiones que no pueden desarrollarse si los sistemas anterior, posterior o terminal son deficientes, se indican en blan co. Los diagramas centrales muestran esquem ticam ente la apariencia de la larva normal y de las larvas mutantes que carecen de un gen del sistema anterior (el bicoid, por ejemplo), del sistema posterior (el nanos, por ejemplo), o del sistema terminal (el torso, por ejemplo). Los diagramas inferiores muestran la apariencia de las larvas en que no funciona ninguno de los tres sistemas de genes o slo uno de ellos. Las letras que aparecen debajo de cada larva especifican qu sistemas permanecen intactos (A P T para una larva normal, -P T para una larva que tiene deficiencias en su sistema anterior pero que conserva los sistemas posterior y terminal intactos, etc.). La inactivacin de un gen determinado provoca la prdida del conjunto correspondiente de estructuras corporales; las partes del cuerpo que se forman son producto de los sistemas de genes que permanecen funcionales. Obsrvese que las larvas con un defecto en el sistema anterior todava pueden formar estructuras terminales en su extremo anterior, pero son del tipo que normalmente encontramos en el extremo posterior del cuerpo ms que de la parte frontal la cabeza. (Ligeramente modificado a partir de D. St. Johnson y C. NssleinVolhard, Cell 68:201-219,1992. Cell Press.)

A N T E R IO R

P O S T E R IO R

T E R M IN A L

bicoid

torso

1158

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

genes) controla la parte anterior del eje. El grupo posterior (11 genes) controla la parte posterior del eje. Por ltimo, el grupo terminal (6 genes conocidos) contro la los dos extremos del embrin, que comprenden las estructuras terminales es pecializadas no segmentadas y particularmente el par de regiones -u n a anterior y otra posterior- de las que se deriva el intestino. Al igual que el sistema dorsoventral, cada uno de estos tres subsistemas establece un gradiente morfognico -u n o en la mitad anterior del embrin, otro en la mitad posterior (aunque es dis cutible) y otro que acta simtricamente en ambos extremos del embrin. Las mutaciones de prdida de funcin que inactivan uno de estos subsistemas cau san la prdida de la estructura anterior, posterior o terminal correspondiente. Las cuatro seales espaciales primarias -anterior, posterior, terminal y ven tral- organizan el modelaje del embrin gracias al control que ejercen sobre la expresin de otro grupo de genes, que interpretan, pulen y almacenan la infor m acin que suministran las seales primarias.

Influencias procedentes de las clulas que envuelven el huevo marcan el inicio del modelaje del embrin44,4 5
Los genes de polaridad del huevo son transcritos desde el genoma materno du rante la oognesis, y sus productos actan poco despus de la fecundacin, y en algunos casos incluso antes de ella. As pues, el fenotipo del embrin se determi na a travs de los alelos presentes en la madre (y en sus oocitos) ms que por la com binacin de genes maternos y paternos que posee el propio embrin. Los genes que actan de este modo se denominan genes de efecto m aterno. Fueron descubiertos al buscar los fenotipos mutantes adecuados de embriones produci dos a partir de huevos puestos por madres que parecan normales pero que con tenan mutaciones genticas que convertan a sus huevos en anormales (Figura 21-54). Normalmente, la mutacin de efecto materno es recesiva, y las madres que producen huevos defectivos son homozigotas para el gen mutante. Figura 21-54 Herencia de una mutacin recesiva de efecto materno.
El patrn de herencia se inicia con unos abuelos heterozigotos (m/+) para la mutacin (m) que es recesiva al gen normal (+). A la izquierda de cada animal se muestra su genotipo. El color rojo denota la presencia de un producto gnico normal (+). El producto gnico acta slo al iniciarse el desarrollo, y la apariencia de una animal maduro refleja el conjunto de com ponentes especificados maternos presentes en el huevo. Ntese que el espermatozoide no contribuye significativamente con estos productos gnicos en el huevo. El patrn de herencia de una mutacin de efecto materno dominante es distinto pero podra generar unos efectos muy parecidos.

esperm atozoide el citoplasm a todava proc contiene productos m/m maternos

DESARRO LLO NORMAL

zigoto

el citoplasm a ya no contiene ningn producto

m/+

zigoto

DESARRO LLO A N O R M A L

Drosophila I. Gnesis del mapa corporal

1159

clula folicular

oocito

clula acompaante

Figura 21-55 Oocito de Drosophila en su folculo. El oocito deriva de una

clula germinal que se divide cuatro veces dando lugar a una familia de 16 clulas que permanecen en com unicacin unas con otras a travs de puentes citoplasmticos. Un miembro de la familia se convierte en oocito, mientras que los otros se convierten en clulas nodriza, que generan muchos de los com ponentes necesarios para el oocito, y se los transfieren a travs de los puentes citoplasmticos. Las clulas foliculares que envuelven parcialmente el huevo tienen un origen diferente; son la fuente de las seales ventrales y terminales que polarizan al huevo.

las clulas foliculares proporcionan seales ventrales

las clulas foliculares proporcionan seales term inales

Cuando se ha identificado un gen, ya se puede investigar su campo de ac cin a travs de la creacin y el anlisis de mosaicos genticos -m oscas que con tienen porciones clonadas y marcadas de clulas en las que el gen que interesa est ausente o mutado. (Ms adelante explicaremos cmo se efecta este sor prendente truco de microciruga gentica.) Utilizando este mtodo se puede de mostrar que la mayora de los genes de polaridad del huevo son imprescindibles para el linaje del oocito, mientras que en las clulas foliculares que envuelven al oocito en el ovario son suficientes unos cuantos. Los genes requeridos en las c lulas foliculares proporcionan influencias que actan en el exterior del huevo lo calizando las fuentes de los gradientes morfognicos terminales y ventrales que se desarrollarn en el interior de las clulas (Figura 21-55). Adems, los produc tos localizados suministrados al oocito en crecimiento, por medio de las clulas nodriza gigantes a las que est conectado por un extremo, definen la polaridad anteroposterior del huevo. Para observar cm o se establecen los patrones en el interior del huevo, pri mero nos centraremos en el sistem a dorsoventral.

El eje dorsoventral se define en el interior del embrin mediante una protena reguladora de genes con un gradiente de concentracin intranuclear44,45,4 6
La funcin de las clulas foliculares en el establecimiento del gradiente dorsoventral del huevo de Drosophila consiste en suministrar una molcula seal lo calizada que se une a un receptor en el exterior del huevo y de este modo con trola la distribucin de una protena reguladora de genes en el interior del huevo. Este sistema puede analizarse genticamente a mediante un mtodo muy parecido al utilizado anteriormente para analizar el sistema que induce la vulva en el gusano nemtodo. Siete de los genes del sistema dorsoventral parti cipan en la produccin de la seal extracelular localizada; uno de ellos, denomi nado Toll, codifica el receptor transm em brana de la molcula seal, y los pro ductos de los otros tres actan en el interior del embrin, siempre despus de Toll. El ltimo gen del efecto materno de la va seal codifica una protena regu ladora de genes y se denomina dorsal. La molcula seal extracelular fabricada por las clulas foliculares slo se genera de forma activa en la superficie ventral del huevo y forma un gradiente que se refleja en una activacin selectiva de la protena Toll y finalmente en un gradiente de concentracin de la protena Dor sal en el ncleo del embrin. La protena dorsal pertenece a la misma familia que la protena reguladora de genes de vertebrados NF-kB (vase Figura 15-32) y podra actuar de modo si milar a ella. En el huevo recin puesto tanto el mRNA dorsal (detectado median te la hibridacin in situ) como la protena que codifica (detectada con anticuer pos), se distribuyen uniformemente en el citoplasma. No obstante, tras la migracin del ncleo a la superficie del embrin para formar el blastodermo,

1160

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

Figura 21 - 56 El gradiente de la protena Dorsal y su interpretacin.

(A) Gradiente de concentracin de la protena Dorsal en el ncleo del blastodermo, puesto de manifiesto mediante un anticuerpo. (B) Interpretacin del gradiente Dorsal por genes que demarcan los distintos territorios dorsoventrales; para simplificar slo se muestran dos genes representativos. Los procesos posteriores efectuarn subdivisiones ms com plejas de estos territorios. Particularmente, el gen d ecap en tap lg ico (dpp) codifica un factor segregado que acta como morfgeno local controlando el modelaje detallado del ectodermo. (A, segn S. Roth, D. Stein y C. NssleinVolhard, Cell 59:1189-1202, 1989. Cell Press.)

< A>

-----^ --------1 -100 nm

(B)

cubierta vitelina (cubierta del huevo)

dpp transcrito

proteina Dpp

m em brana extraem brionaria epiderm is dorsal

ectoderm o neurognico 1 gradiente de protena Dorsal intranuclear 2 genes zigoto regulados por la protena Dorsal 3 la proteina Dpp segregada form a un gradiente dorsal inductivo 4 territorios dorsoventrales especificados m esoderm o

tiene lugar una notable redistribucin de la protena Dorsal: dorsalmente la pro teina permanece en el citoplasma pero ventralmente se concentra en el ncleo, y entre estos dos extremos existe un gradiente uniforme de localizacin nuclear (Figura 21-56). Parece ser que la distribucin de la protena Dorsal entre el n cleo y el citoplasma est controlada, al menos en parte, por el producto de un gen llamado cactus. La protena Cactus es homologa a la protena I-kB que inhi be NF-kB en las clulas de los vertebrados impidiendo que migre al interior del ncleo (vase Figura 15-32). Anlogamente, se cree que la protena Cactus se une a la protena Dorsal, atrapndola en el citoplasma; tambin se supone que la protena Toll transmite la seal que pone en marcha la fosforilacin de la pro teina Dorsal, provocando su disociacin de la protena Cactus de forma que sta pueda entrar en el ncleo. Ya en el interior del ncleo la protena Dorsal activa o desactiva, en funcin de su concentracin, la expresin de diferentes grupos de genes. De esta forma el gradiente de localizacin nuclear de la proteina crea una serie de territorios dorsoventrales -franjas distintivas de clulas que aparecen a todo lo largo del embrin. Por ejemplo, donde la concentracin de la protena Dorsal es ms alta, un gen especfico del mesodermo, denominado twist, activa su expresin princi palmente en la zona ventral. En cambio, donde la concentracin de protena Dorsal es ms baja, un gen decapentaplgico (dpp), puede activarse, especifican do estructuras dorsales. En la regin intermedia, donde la concentracin de la protena Dorsal es lo bastante alta para reprimir a dpp pero demasiado baja para activar twist, las clulas se especializan convirtindose en ectodermo neurognico (vase Figura 21-56). Los productos de los genes regulados directamente por la protena Dorsal generan, a su vez, seales ms locales que definen subdivisiones ms delicadas del eje dorsoventral. Particularmente, dpp codifica una protena segregada de la superfamilia TGF-(3, que podra formar un gradiente morfognico local en la re gin dorsal del embrin. La accin de esta protena tiene reminiscencias de la accin de la activina, miembro tambin de la familia TGF-(3, en el desarrollo

Drosophila I. Gnesis del mapa corporal

1161

SISTEMA DORSOVENTRAL

SISTEMA TERMINAL

SISTEMA ANTERIOR

SISTEMA POSTERIOR

determ inan ectodermic vs. m >dermo vs, endoderm o; estructuras term inales

determ inan . clulas germ inales vs. clulas somticas; cabeze vs cola; segmentos coiporales

temprano de Xenopus. A partir de experimentos inyectando mRNA de dpp, se cree que las concentraciones ms altas de protena Dpp causan el desarrollo del tejido ms dorsal -la mem brana extraembrionaria-, las concentraciones intermedias causan el desarrollo del ectodermo dorsal, y concentraciones muy bajas permiten el desarrollo del ectodermo neurognico. Como el sistema dorsoventral, el sistem a term inal depende de un receptor transm em brana que detecta las seales localizadas transmitidas por las clulas foliculares para generar gradientes de protenas reguladoras de genes en el inte rior del embrin (Figura 21-57). Estos gradientes definen el endodermo del in testino y algunas estructuras terminales, por lo que pueden clasificarse, junto con el sistema dorsoventral, com o parte del aparato que define las tres capas germinales del insecto. Por lo tanto, los sistemas dorsoventral y terminal de la mosca que utilizan molculas segregadas que actan como seales inductivas, son comparables a los m ecanism os inductivos que determinan las capas germi nales en el embrin temprano de Xenopus. Por el contrario, los sistemas anterior y posterior de los genes de polaridad del huevo establecen gradientes que dependen de acumulaciones localizadas de mRNA especficos en el interior del huevo (vase Figura 21-57). Estos gradientes controlan las diferencias entre la cabeza y la cola, y definen las series de segmen tos corporales a lo largo del eje cabeza-cola, como veremos de forma detallada en el sistema anterior. Primero nos detendremos brevemente en discutir la funcin especfica del sistem a posterior: la especializacin de las clulas germinales.

Figura 21-57 Organizacin de los cuatro sistemas de gradiente de polaridad del huevo,

El sistema posterior define las clulas germinales y tambin los segmentos corporales posteriores47
En prcticam ente todos los animales estudiados, las clulas germinales primor diales -lo s precursores de la prxima generacin de gam etos- se distinguen de las clulas somticas -q u e formarn el resto de los tejidos del cuerpo- en un es tadio muy temprano del desarrollo (vase Figura 21-51). En muchas especies el huevo contiene com ponentes citoplasmticos localizados -visibles como grnulos polares en C. elegans y Drosophila, o plasma germinal en Xenopus- segrega dos al interior de las clulas primordiales germinales durante la segmentacin del huevo y que probablem ente incluyen o se asocian con determinantes del ca rcter de las clulas germinales. Generalmente estos com ponentes se concen tran en el extremo posterior o vegetativo del huevo, y las clulas que los heredan migran de este punto para colonizar las gnadas. Los genes de efecto materno de Drosophila necesarios para la formacin de las clulas germinales pueden ser identificados mediante el descubrimiento de los mutantes que producen hijos que carecen de clulas germinales. Esta descenden cia anmala tambin carece de segmentos corporales posteriores, lo que indica que estos genes pertenecen al sistema posterior de genes de polaridad del huevo. Los productos de muchos de estos genes se localizan en el polo posterior -en tre ellos, probablem ente, los determinantes del carcter de clula germinal. El gra diente morfognico que organiza los segmentos corporales posteriores depende

1 16 2

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

de los m ecanism os que crean y localizan los determ inantes celulares germina les. Un gen fundamental de este sistem a es oskar. Generalmente, la protena y el mRNA de oskar se localizan en el polo posterior del huevo. En su ausencia no se desarrolla ninguna clula germinal, y si artificialmente se desplaza el mRNA de oskar hacia el extremo anterior del huevo, las clulas germinales se forma rn en aquella localizacin. Adems, se puede demostrar que el mRNA locali zado de oskar controla la localizacin de otros com ponentes -productos de otros genes del grupo posterior implicados en el desarrollo de los segmentos corporales posteriores y de las clulas germinales. Mediante su localizacin en el polo posterior del huevo, estos productos pueden quedar incorporados de forma especfica a las clulas que all se formen, determinando su futuro como clulas germinales.

El mRNA localizado en el polo anterior codifica una protena reguladora de genes que constituye el gradiente morfognico anterior44,48
Si se pincha cuidadosamente el huevo de Drosophila por su extremo anterior, permitiendo que salga de una pequea cantidad del citoplasma ms anterior, el embrin no podr desarrollar los segmentos de la cabeza. Si se inyecta citoplas ma perteneciente al extremo posterior de otro huevo en la localizacin donde se ha perdido el citoplasma anterior, se desarrolla un segundo conjunto de seg mentos abdominales, con la polaridad invertida, en la mitad anterior del huevo receptor (Figura 21-58). Este experimento demuestra que el control del modelaje de los segmentos del eje anteroposterior se efecta por medio de substancias lo calizadas en los extremos del huevo. Estas substancias se han identificado gra cias a investigaciones genticas, comenzando con la bsqueda de mutaciones que imiten las consecuencias de la prdida de citoplasma anterior o posterior. De forma ms destacada, las madres que son homozigotos para una mutacin en el gen de la polaridad del huevo bicoid, producen embriones que carecen de las estructuras de la cabeza y el trax, y cuyas estructuras abdominales se extien den sobre una fraccin anormalmente larga del cuerpo. Sin embargo, tales em briones mutantes pueden salvarse de un desarrollo anmalo si en su extremo anterior se inyecta citoplasma procedente del extremo anterior de un huevo normal. As pues el gen bicoid normal es imprescindible para fabricar cierto pro ducto en el extremo anterior del huevo que puede actuar como fuente emisora de influencias de largo alcance que controlan el patrn del desarrollo de las zo nas anteriores.

Figura 21-58 Determinantes localizados en los extremos del huevo de Drosophila controlan su polaridad anteroposterior. Se extrae una
pequea cantidad de citoplasma anterior del huevo y se reemplaza inyectando citoplasma posterior. La larva doble-posterior resultante (fotog rafa d e la d er ech a ) se compara con un control normal (fotografa d e la izqu ierda); la substitucin del citoplasma en un extremo del huevo tiene consecuencias a largo plazo, ya que convierte a todos los segmentos ms anteriores en un duplicado especular de los tres ltimos segmentos abdominales. Las larvas se muestran con iluminacin de campo oscuro. (De H.G. Frohnhfer, R. Lehmann y C. Nsslein-Volhard, /. Embryol. Exp. M orphol. 97 [Suppl]:169-179,1986. con autorizacin de Company of Biologists Ltd.)

anterior

posterior

huevo fecundado norm al

pinchazo para facilitar la salida de parte del citoplasm a

inyeccin, en el extrem o anterior del huevo husped, del citoplasma posterior de un huevo dador

el em brin se desarrolla hasta el estadio larvario

Drosophila I. Gnesis del mapa corporal

1163

GRADIENTE DE LA PROTENA BICOID

100

P A T R O N DE S E G M E N T A C I N R E S U L T A N T E

0 copias gnicas

100

1 copia gnica

50

100

distancia desde el extrem o anterior (% de la longitud del huevo)

Figura 21 -59 El gradiente de la protena Bicoid en el huevo de Drosophila y sus consecuencias en el patrn de segmentos. El gradiente se manifiesta por tincin con un anticuerpo contra la protena Bicoid; el patrn segmentado se
manifiesta con un anticuerpo contra el producto de un gen de regla par, ev en -skip p ed (que veremos ms adelante). Se com paran em briones que contienen cero, una y cuatro copias respectivamente del gen b ico id normal. Con la dosis cero de bicoid , no se forman segmentos con carcter anterior; al aumentar la dosis gnica se forman segmentos cada vez ms alejados del extremo anterior del huevo, como sera de esperar si su posicin se determinara por medio de la concentracin local de la protena Bicoid. En las grficas se presentan las medidas de esta concentracin, indicadas por la intensidad de tincin. A pesar de las diferencias de posicin y de espaciamiento de los rudimentos segmentales en los em briones con una o cuatro dosis del gen, ambos embriones se convertirn en larvas adultas de proporciones normales. Los m ecanism os que probablemente son responsables de esta regulacin se explican en la pgina 1140. (Ligeramente adaptado de W. Driever y C. Nsslein-Volhard, Cell 54:83-104,1988 . Cell Press.)

La hibridacin in situ demuestra que el mRNA de bicoid se sintetiza origi nalm ente en el ovario por las clulas nodriza conectadas al oocito (vase Figura 21-55). A medida que el mRNA bicoid atraviesa los distintos puentes citoplasmticos en el interior del oocito, queda anclado por su cola 3 no transcrita a un com ponente del citoplasma -probablem ente una parte del citoesqueleto- en el extremo anterior del oocito. La transcripcin del mRNA empieza cuando el hue vo es puesto, dando lugar a un gradiente de concentracin de la protena Bi coid, con el punto ms alto del gradiente en el extremo anterior del embrin. La concentracin del gradiente puede alterarse genticamente mediante la cons truccin de m utantes que contengan copias mltiples del gen bicoid normal: al aumentar la dosis gnica en la madre, tam bin lo hace la concentracin de la protena en el huevo. Los segmentos del embrin resultante se desplazan de forma correspondiente hacia el polo posterior, como haran si la determinacin

1164

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

G EN G AP

(Krppel)

G E N DE R E G L A PA R

(even-skipped)

G E N DE P O L A R ID A D DE SEGM ENTO

(gooseberry)

Figura 21 -60 Ejemplos de los fenotipos de mutaciones que afectan a tres tipos de genes de segmentacin.
En cada caso las reas sombreadas en verde sobre la larva normal (izqu ierda ) estn suprimidas en el mutante o estn substituidas por duplicados especulares de regiones no afectadas. Convencionalmente, las mutaciones dominantes se escriben con letras en mayscula y las m utaciones recesivas en minscula. Varias de la mutaciones de modelaje de D rosop h ila se clasifican com o dominantes debido a que tienen un efecto apreciable en el fenotipo del heterozigoto, a pesar de que su caracterstica ms importante, las consecuencias letales, son recesivas, es decir, slo son apreciables en el homozigoto. (Modificado de C. Nsslein-Volhard y E. Wieschaus, N ature 287:795-801, 1980. 1980 Macmillan Magazines Ltd.)

de sus localizaciones fuera debida a las informaciones posicionales derivadas de la concentracin local de protena Bicoid (Figura 21-59). Por lo tanto, esta pro tena encaja perfectamente con la definicin de un morfgeno. Como la prote na Dorsal, la protena Bicoid se une al DNA y su funcin es regular la expresin de otros genes.

Tres clases de genes de segmentacin subdividen el embrin4 9

Los productos de los genes de polaridad del huevo proporcionan, pues, gradien tes globales de seales. Las influencias que actan sobre el sistema anterior deri van del mRNA bicoid localizado en el extremo anterior del huevo antes de la fe cundacin, y toman la forma de un gradiente anteroposterior de la protena reguladora de genes Bicoid. El gradiente dirige la creacin de una serie de seg mentos corporales discretos. Este proceso depende de la acumulacin de genes de segm entacin, de los cuales han sido caracterizados cerca de 25. Cualquier mutacin en uno de estos genes altera el nmero de segmentos o la organiza cin interna bsica del huevo sin que la polaridad global del huevo quede afec tada. Los genes de segmentacin actan en estadios ms avanzados que los ge nes de polaridad del huevo, cuando el embrin transcribe su propio genoma en vez de depender del mRNA materno almacenado. Debido a que son los transcri tos de los genes embrionarios, y no los transcritos de los genes maternos, los que determinan el fenotipo, estos genes se clasifican como genes de efecto zigoto en vez de genes de efecto materno. Los genes de segmentacin se clasifican habitualmente en tres grupos se gn sus fenotipos mutantes y los estadios en los cuales actan (Figura 21-60). Primero encontram os un grupo de al menos seis genes gap, cuyos productos marcan las subdivisiones ms bsicas del embrin. Las mutaciones en un gen gap eliminan un grupo o ms de segmentos adyacentes, y las mutaciones de ge nes gap diferentes provocan varios defectos de solapamiento parcial. Por ejem plo, en el gen mutante Krppel, la larva carece de seis segmentos, desde T I a A5, ambos inclusive. Los siguientes genes de segmentacin en actuar son un conjunto de ocho genes de regla par. Las mutaciones de estos genes provocan una serie de supre siones que afectan segmentos alternos, dejando al embrin con slo la mitad de sus segmentos habituales. Mientras que todos los genes mutantes de regla par presentan esta periodicidad de dos segmentos, difieren en la posicin exacta de las supresiones relativas a los lmites segmentales o parasegmentales. Por ejem plo el mutante de regla par even-skipped, que se estudia en el Captulo 9, carece de todos sus segmentos pares, mientras que el mutante de regla par fushi tarazu

Drosophila I. Gnesis del mapa corporal

1165

(ftz) carece de todos sus parasegmentos impares, y el muante de regla par hairy carece de una serie de regiones de amplitud similar pero con registro distinto a las unidades parasegmentales. Por ltimo, existen al m enos 10 genes de polaridad de segmento. Las m uta ciones en estos genes producen larvas con un nmero normal de segmentos pero una parte de cada segmento est suprimida y reemplazada por una imagen especular duplicada de todos o slo parte del resto de los segmentos. Por ejem plo, en el caso de los mutantes gooseberry, se reemplaza la mitad posterior de cada segmento (es decir, la mitad anterior de cada parasegmento) con una ima gen especular aproximada de la mitad anterior del segmento adyacente (vase Figura 21-60). Luego estudiaremos, paralelamente al proceso de segmentacin, un grupo de genes ms evolucionados, los genes selectores hometicos, que definen y pre servan las diferencias entre un parasegmento y el siguiente. Los fenotipos de varios mutantes de segmentacin sugieren que los genes de segmentacin forman un sistema coordinado que subdivide progresivamente el embrin en dominios cada vez ms pequeos a lo largo del eje anteroposte rior, que se diferencian segn diferentes patrones de expresin gnica. As, otra vez la gentica molecular proporciona las herramientas necesarias para investi gar el funcionamiento de este sistema.

La expresin localizada de los genes de segmentacin est regulada por una jerarqua de seales de posicin50,5 1
Se han clonado la mayora de los genes de segmentacin, y la secuenciacin de los cDNA revela que cerca de las tres cuartas partes de ellos, incluyendo todos los genes gap, codifican protenas reguladoras de genes. Por lo tanto, sus accio nes sobre otro u otros genes pueden estudiarse comparando la expresin gnica en em briones normales y en embriones mutantes. En efecto, se puede fotogra fiar la activacin y desactivacin de genes en patrones cambiantes utilizando las

regiones en las que se transcriben los genes en el em brin tem prano

hunchback

Krppel

| Int | Mn | M x | La | T I | T2 | T3 I A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 | A9/10 PARTES DE LA CABEZA 1 TORAX 1 ABDOMEN 10 11 12 13 14 regiones deficientes hunchback cuando los genes estn m utados

hunchback

Krppel
(A)
Figura 21-61 Dominios espaciales de los genes gap hunchback y Krppel.
Ambos genes codifican protenas reguladoras de genes de la clase de dedos de zinc. (A) Diagrama de los principales dominios anteriores de hunchback y Krppel que ilustra el modo en que los defectos provocados por una ausencia de producto funcional de hunchback o Krppel se extienden por los alrededores de la regin en la que normalmente se hallan los transcritos gnicos. (B) Distribucin normal de los transcritos de hunchback y Krppel observada tras una hibridacin in situ en el estadio blastodrmico. (C) Distribucin tpica de la protena Krppel {en rojo) y de la protena Hunchback {en verde) tal como se manifiestan con anticuerpos fluorescentes. La regin de solapamiento, en la que estn presentes ambas protenas, aparece en amarillo', una tincin ms sensible revelara un solapamiento ms extenso. Las protenas se distribuyen fuera de sus dominios respectivos de transcripcin gnica y es posible que acten como morfgenos locales participando en la regulacin de la expresin de otros genes (genes gap y genes de regla par incluidos). (A, adaptado de M. Hlskamp y D. Tautz, Bioessays 13:261-268,1991; B, cortesa de Diethard Tautz; C, cortesa de Jim Williams, Steve Paddock, Sean Carroll, y Howard Hugues Medical Institute.)

Krppel

(C )

116 6

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

Figura 21 -62 Patrn de expresin de

f t z en el blastodermo de Drosophila. La hibridacin in situ muestra que el gen se transcribe siguiendo un patrn de siete bandas que se corresponden al patrn de defectos en los mutantes ftz. Las bandas de expresin de ftz aparecen com o manchas negras debido a los granos autorradiogrficos de plata presentes en esta seccin longitudinal. (Cortesa de Philip Ingham.)

sondas adecuadas para detectar los transcritos.gnicos. Analizando por este m todo mutantes que carecen de un gen de segmentacin determinado, se puede empezar a deducir la lgica del sistema de control gnico. Ya hemos visto como la hibridacin in situ de embriones normales ha ayu dado a demostrar que los transcritos de gen bicoid son la fuente de una seal posicional: los transcritos se localizan en un extremo del huevo, a pesar de que los efectos de una mutacin en el gen se extienden sobre gran parte del em brin. De forma similar puede demostrarse que los genes gap generan a su vez (directa o indirectamente) seales posicionales que ayudan a controlar el patrn del desarrollo en zonas vecinas que se extienden ms all de sus propios domi nios de expresin. Por ejemplo, los mutantes defectuosos en los genes gap Krppel o hunchback presentan anomalas en la regin en que se detectan los trans critos gnicos de un embrin normal y tambin en varios segmentos ms alejados (Figura 21-61). Se cree que, al igual que la protena Bicoid, las protenas reguladoras de genes codificadas por genes gap como Krppel y hunchback, se distribuyen com o morfgenos difusibles a partir de los lugares en que estos ge nes se transcriben. El nivel siguiente de modelaje espacial, ms delicado, lo marcan los genes de regla par. Algunos de estos genes tam bin pueden codificar protenas que se distribuyen por difusin ejerciendo efectos sobre clulas vecinas al lugar en que

fuente de seales

Figura 21 -63 Dos estrategias para utilizar los gradientes de concentracin de seales para especificar un patrn detallado de clulas en diferentes estadios. En (A) existe un
solo gradiente de seal, y las clulas seleccionan sus estados respondiendo adecuadamente a pequeos cambios producidos en la concentracin de la seal. En (B) el gradiente inicial de la seal controla el establecimiento de un pequeo nmero de seales ms locales, las cuales controlarn el establecimiento de otras seales todava ms locales, y as sucesivamente. Debido a la multiplicidad de seales locales, las clulas no tienen que responder de forma muy precisa a una nica seal para generar una disposicin espacial correcta de estados celulares. El caso B se corresponde de forma mucho ms estrecha con la estrategia del embrin real.

A (A)

estados celulares

fr
H I

fuente de seales

gradiente de seales

(B) Drosophila I. Gnesis del mapa corporal

estados celulares 1167

se transcriben estos genes; en cambio, otros parecen afectar slo el desarrollo de las regiones en las que son transcritos. Por ejemplo, los transcritos del gen ftz normal ocurren en siete "bandas cebra en forma de circunferencia, en el esta dio de blastodermo (Figura 21-62), de aproximadamente cuatro clulas de an cho cada una, parecindose en amplitud y localizacin a la de los rudimentos de los parasegmentos pares perdidos en un mutante ftz. En conjunto, todas estas informaciones implican que los productos de los genes de polaridad del huevo proporcionan seales posicionales globales que activan la expresin de genes gap concretos en regiones determinadas, y enton ces los productos de los genes gap proporcionan un segundo nivel de seales posicionales que actan localmente regulando detalles ms sutiles del modelaje afectando la expresin de otros genes, incluidos los genes de regla par. De este modo los gradientes globales producidos por los genes de polaridad del huevo organizan la creacin de un patrn detallado a travs de un proceso de subdivi siones secuenciales por medio de una jerarqua de controles posicionales. sta es una estrategia de confianza: debido a que las seales posicionales globales no tienen que definir detalles sutiles, los ncleos individuales que responden a di chas seales no tienen por qu reaccionar con una precisin absoluta a peque as diferencias de concentracin de seal (Figura 21-63).

El producto de un gen de segmentacin controla la expresin de otro gen generando un patrn detallado41,50,51*5 2
La jerarqua de relaciones de control existentes entre los niveles consecutivos de genes de segmentacin puede ponerse de manifiesto mediante la observacin del patrn de expresin de un gen determinado cuando otro gen queda desacti vado debido a una mutacin. Por ejemplo, en un embrin mutante que carezca del producto normal Krppel, las bandas ftz no puede desarrollarse justamente en la regin del blastodermo que corresponde al defecto en el mutante Krppel. As pues, el producto de Krppel regula, directa o indirectamente, la expresin del gen ftz. En cambio en un mutante ftz, la distribucin del producto del Krp pel normal no se ve alterada, lo que indica que el producto de ftz no regula la ex presin del gen Krppel. Tam bin existen interacciones entre genes del mismo nivel de la jerarqua reguladora. Por ejemplo, los genes gap Krppel y hunchback se expresan en re giones adyacentes del blastodermo, existiendo un lmite muy marcado entre el territorio anterior de hunchback y el territorio posterior de Krppel (vase Figura 21-61). La represin del gen de expresin Krppel por la protena reguladora de genes Hunchback ayuda a establecer este lmite, asegurando una correlacin adecuada entre los dominios de expresin de ambos genes. Interacciones de este tipo contribuyen a dirigir el patrn de expresin peridica de los genes de regla par, estableciendo un acuerdo de reproduccin exacta de exclusiones y solapamientos mutuos que se repite de forma fidedigna en cada unidad de segmento doble del blastodermo de todos los embriones normales (Figuras 21-64 y 21-65).

Figura 21 -6 4 Cmo definen los genes de regla par los segmentos del blastodermo de . El

Drosophila

segmentos parasegm entos hairy even-skipped pairea fushi-tarazu engrailed

_j

A5

A6

A7

A8

A9/10

P1

P2

P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14

|_____ [

genes de regla par

] | |
I I I I I
gen de polaridad del segmento

diagrama muestra el patrn de transcripcin de cuatro de los ocho genes de regla par conocidos, y de uno de los genes de polaridad del segmento, engrailed. Aunque individualmente cada gen de regla par slo define una alteracin con una distancia de repeticin de dos segmentos, el conjunto completo de genes de regla par combinados, por medio de su patrn de adyacencia y solapamiento, define potencialmente una subdivisin mucho ms compleja del blastodermo en bandas de slo una clula de amplitud, al igual que las que expresa el gen engrailed. (Segn M. Akam, Development 101:1-22, 1987, con autorizacin de Company of Biologists Ltd.)

116 8

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

Figura 21 -65 Form acin de las bandas ftz y eve en el blastoderm o de

Drosophila. Tanto el gen ftz como el gen eve son de regla par. Sus patrones de expresin (coloreados en marrn para ftz y gris para eve) primero se
3 horas despus de la fecundacin
372

horas despus de la fecundacin

encuentran difusos pero se definen rpidamente en bandas. (Segn P.A. Lawrence, The Making of a Fly. Oxford, UK: Blackwell, 1992.)

De este modo se distinguen, hasta el ms mnimo detalle, bandas de clulas di ferentes alrededor del blastodermo por medio de diferentes combinaciones de expresiones de genes de regla par -la anchura de una sola clula, que correspon de aproximadamente a una cuarta parte de la anchura de un futuro segmento o un parasegmento. La totalidad de este detallado proceso de modelaje depende de las largas ex tensiones de secuencias de DNA que controlan la expresin de cada uno de los genes de segmentacin. Estas regiones reguladoras unen muchas copias de pro tenas reguladoras de genes producidas por un subgrupo de otros genes de seg mentacin, y el gen se activa o desactiva segn la combinacin de protenas que se consigue. En el Captulo 9 (vase pg. 456) nos centramos en un gen de seg mentacin determinado y vimos cmo la decisin de la transcripcin o no trans cripcin de un gen se efecta en base a todas estas seales de entrada.

Los genes de polaridad del huevo gap y de regla par generan un patrn transitorio que es recordado por otros genes41,50,5 2
Durante las primeras horas siguientes a la fecundacin, los genes gap y los genes de regla par se activan uno tras otro. Sus productos mRNA aparecen primero en patrones que slo se aproximan a la imagen final; luego, al cabo de poco tiempo -y mediante una serie de ajustes interactivos- la confusa distribucin inicial se resuelve por s misma dando lugar a un sistema regular bien definido de bandas (vase Figura 21-65). Pero este sistema es de por s inestable y transitorio. A m e dida que el embrin progresa a travs de la gastrulacin y las etapas posteriores, el patrn regular de segmentos de los productos de los genes gap y de regla par se desintegra. Sin embargo, sus acciones han dejado un sello permanente en for ma de conjunto de mareajes (valores posicionales) sobre las clulas del blasto dermo. Estos mareajes posicionales se graban en la activacin continuada de al gunos genes de polaridad de segmentos y de genes selectores hometicos que mantienen la organizacin segmentada de la larva y el adulto.

Los genes de la polaridad de segmento marcan las subdivisiones bsicas de cada parasegmento5 3
Los genes de polaridad de segmento se expresan segn un patrn que se repite de un parasegmento al siguiente. El gen engrailed proporciona un buen ejemplo de ello (Figura 21-66). Sus transcritos de RNA estn dispuestos en el blastodermo en una serie de 14 bandas, del tamao de una clula, y que corresponden a las porciones ms anteriores de los futuros parasegmentos. Las bandas aparecen en una relacin establecida con las bandas de expresin de los genes de regla par (vase Figura 21-64). Nuevamente el patrn est controlado de un modo com bi natorio por los productos del conjunto de genes que le antecede en la jerarqua y se ve mejorado y detallado por medio de interacciones entre los propios genes de polaridad de segmento. A travs de la expresin de distintos segmentos de ge nes de polaridad en varias bandas de clulas, cada futuro parasegmento queda subdividido en el estadio del blastodermo celular en al menos tres regiones dis tintas. Las diferencias qumicas persistirn, mantenidas por la transcripcin continuada de al menos algunos de los genes de polaridad del segmento, des-

Drosophila I. Gnesis del mapa corporal

1169

engrailed, un gen de polaridad de

Figura 21 -66 Patrn de expresin de

em brin de 10 horas

100-----|jm

pus de la desaparicin de la mayor parte de los productos de los genes de regla par (vase Figura 21-66). Algunos de los genes de polaridad del segmento que se expresan de este modo -incluyendo, especialmente uno llamado wingless- codi fican protenas secretadas que tam bin actan durante el desarrollo posterior como seales espaciales dentro del parasegmento regulando los detalles de su crecim iento y modelaje interno. Adems de regular los genes de polaridad del segmento, los productos de los genes de regla par colaboran con los productos de los genes gap (y quizs con los genes de polaridad del huevo) provocando la activacin localizada y pre cisa de un conjunto de mareajes espaciales ms desarrollado -e s decir, los genes selectores hometicos, que distinguirn un parasegmento de otro de forma per manente. En el prximo apartado examinaremos en detalle estos genes selecto res y consideraremos su funcin en la m emoria celular.

segmento. Las fotografas ilustran el patrn de engrailed en un embrin de 5 horas (en el estadio de banda germinal extendida), un embrin de 10 horas y un adulto (al que se le han extrado las alas para este experimento). El patrn se hace visible gracias a un anticuerpo (marrn) contra la protena Engrailed (para embriones de 5 a 10 horas) o (para el adulto) mediante la construccin de un linaje de Drosophila que contiene secuencias de control del gen engrailed acopladas a la secuencia que codifica la enzima p-galactosidasa, cuya presencia es fcilmente detectable por medio de mtodos histoqumicos a travs del producto azul de la reaccin que cataliza. Ntese que una vez establecido, el patrn de engrailed se preserva durante todo el transcurso de la vida del animal. (Cortesa de Tom Kornberg y Cory Hama.)

Resumen

Igual que otros insectos D rosoph ila se construye a partir de una serie de unidades modulares repetidas denominadas segmentos, con estructuras no segmentles es pecializadas en cada extremo del cuerpo. Cada subdivisin importante de cada seg mento se distingue por medio de la expresin de una seleccin de genes de control particular que define su udireccin p o sta lE l origen del patrn est en la simetra del huevo: la informacin posicional la proporcionan cuatro gradientes estableci dos por los productos de cuatro grupos de genes de efecto materno llamados genes de polaridad del huevo. Los cuatro grupos de genes controlan cuatro diferenciacio nes bsicas del mapa corporal de los animales: dorsal versu s ventral, endodermo versu s mesodermo y ectodermo, clulas germinales versu s clulas somticas, y ca beza versu s cola. Los genes de polaridad del huevo actan estableciendo distribu ciones escalonadas de protenas reguladores de genes en el huevo y el embrin tem prano, pero los gradientes los establecen de modo distinto los diferentes ejes del huevo. La polaridad dorsoventral se define mediante una seal localizada proceden te de las clulas foliculares que rodean el huevo. La molcula seal se une a los re ceptores transmembrana presentes en la superficie ventral del huevo, lo que con ducir finalmente a una concentracin intranuclear escalonada de la protena Dorsal reguladora de genes, a lo largo del eje dorsoventral del embrin temprano. La protena Dorsal regula la expresin de otros genes, incluido dpp, cuyo producto acta a su vez como gradiente morfognico definiendo subdivisiones ms sutiles del eje dorsoventral, como hacen las seales inductoras tempranas que actan en
X enop u s.

En el caso del grupo anterior de genes de polaridad del huevo, el gradiente sur ge a partir de un depsito de mRNA producto del gen bicoid, localizado en el extre mo anterior del huevo. Debido a que el huevo del insecto se desarrolla inicialmente
117 0 Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

como un sincitio, la protena Bicoid transcrita a partir de este mRNA es capaz de di fundir el citosol a lo largo de la longitud del embrin, dirigiendo la organizacin global de su mitad anterior. La concentracin del gradiente Bicoid pone en marcha la expresin ordenada de los genes gap, genes de regla par, genes de polaridad del segmento y genes selectores hometicos. Estos genes, a travs de un jerarqua de in teracciones, quedan expresados en algunas regiones del embrin y en otras no, subdividiendo el cuerpo deform a progresiva en una serie regular de unidades segmentales y subsegmentales.

D r o s o p h ila

y la gentica molecular del patrn de formacin. II. Genes selectores hometicos y modelaje de las partes del cuerpo41,50
Las primeras observaciones sobre el sistema de genes del patrn de formacin se efectuaron hace ms de 70 aos, con el descubrimiento del primer grupo de mu taciones en Drosophila que provocaban perturbaciones extraas en la organiza cin de la m osca adulta. Por ejemplo, en la mutacin Antennapedia de la cabeza surgen patas en vez de antenas (Figura 21-67), mientras que en la mutacin bithorax, aparecen porciones de un par extra de alas donde normalmente deberan surgir unos apndices mucho ms pequeos denominados balancines. Estas mutaciones, llamadas hometicos, transforman unas partes del cuerpo en estruc turas adecuadas para otras posiciones. Un grupo completo de genes selectores hometicos determina el carcter anteroposterior de los segmentos de la mosca. En este apartado seguimos el desarrollo de Drosophila a travs de las ltimas eta pas en la formacin de la mosca adulta. Al final de este apartado veremos que es tos mismos genes tienen un papel crucial en el modelaje del cuerpo de otros ani males, incluso los seres humanos.

Los genes selectores hometicos del complejo bithorax y del complejo Antennapedia definen las diferencias entre parasegmentos54,5 5
Los genes selectores hometicos que aqu nos interesan se encuentran todos ellos concentrados en una de las dos estrechas agrupaciones de genes, conoci das como complejo bithorax y complejo Antennapedia. Cada complejo contie ne varios genes con funciones anlogas: los del complejo bithorax controlan las diferencias entre los segmentos torcicos y abdominales del cuerpo, mientras que los del complejo Antennapedia controlan las diferencias entre los segmen tos torcicos y los de la cabeza. En otros insectos los grupos de genes correspon dientes se encuentran en un nico complejo, denominado complejo HOM; por lo tanto se piensa que los complejos Antennapedia y bithorax son las dos m ita des de un nico complejo HOM que se dividi en el curso de la evolucin de la mosca. Cada gen hometico selector tiene un dominio de actuacin propio, de finido por la regin del cuerpo que queda afectada si se produce una mutacin en este gen. Generalmente, el dominio tiene unos lmites bien marcados despla zados de los lmites de los segmentos convencionales aproximadamente medio segmento, lo que indica que el dominio es un parasegmento o un bloque de pa rasegmentos (vase Figura 21-50). Muchas de las mutaciones de los genes selectores hometicos tienen un fe notipo letal recesivo y slo permiten que el embrin sobreviva poco tiempo a su nacimiento. En consecuencia son las observaciones efectuadas en embriones y larvas muy tempranas las que nos proporcionan la visin ms clara y en algunos aspectos ms completa de la funcin de los genes selectores hometicos. Las larvas que son deficientes en todos los genes del complejo bithorax tie nen una estructura especialmente simple: la cabeza y el trax son normales has ta el parasegmento P4, pero los 10 parasegmentos restantes se convierten en el

Figura 21 -67 Mutacin hometica.

La mosca que aqu se presenta es una mutante Antennapedia. Sus antenas se convierten en estructuras de pata debido a una mutacin del gen Antennapedia que provoca su expresin en la cabeza. Comprese con la mosca normal que aparece en la Figura 21-47. (Cortesa de Matthew Scott.)

Drosophila II. Genes selectores homedticos y modelaje de las partes del cuerpo

1171

Figura 21 -6 8 Consecuencias de la supresin de la m ayora de los genes del complejo bithorax. (A) Una larva normal de Drosophila observada con

iluminacin de campo oscuro; (B) la larva mutante en la que se ha suprimido la mayora del complejo bithorax. En el mutante todos los parasegmentos posteriores a P5 tienen el aspecto de P5. (Cortesa de Gary Struhl; A, de Nature 293:36-41. 1981 Macmillan Journals Ltd.)

carcter P4. Las supresiones parciales del complejo bithorax provocan transfor maciones que son menos generales (Figura 21-68). Estas observaciones, y descu brimientos anlogos en el complejo Antennapedia, ilustran la funcin funda mental de los genes selectores hom eticos respecto a la definicin de las diferencias entre los parasegmentos: cuando se pierden estos genes, los paraseg mentos no se diferencian unos de otros.

Los genes selectores hometicos codifican un sistema de marcadores moleculares de direccin50,5 6

Como los genes de segmentacin, los genes selectores hometicos se activan primero en el blastodermo. Desde que se clon el DNA completo de los comple jos Antennapedia y bithorax, disponemos de sondas de DNA que permiten esta blecer el mapa del patrn espacial de transcripcin de cada uno de los genes se lectores hom eticos, mediante hibridacin in situ. Las conclusiones obtenidas de estos estudios son sorprendentes: segn una primera aproximacin, habi tualmente cada gen hom etico selector se expresa en las regiones que se desa rrollan con anomalas, por ejemplo debido a una mala colocacin, si el gen est ausente o mutado. De esta forma se puede considerar a los productos de los genes selectores como marcadores moleculares de direccin de las clulas de cada parasegmen to. Si se cam bian los marcadores de direccin, el parasegmento se comporta como si estuviera colocado en otro lugar. Debido a que los genes de segmenta cin contribuyen al control de la activacin de los genes selectores hometicos, el patrn de expresin del gen hom etico selector se sita en el mismo registro que los lmites de los parasegmentos definidos por medio de los productos de genes de regla par y de polaridad del segmento. De esta forma la combinacin del producto de un gen hom etico selector (o una suma de tales productos) con un conjunto de productos de genes de segmentacin definir con precisin una sola direccin, que nicamente tomarn las clulas de una subdivisin de un segmento. Aunque el patrn de expresin de los genes selectores hometicos sufre ajustes com plejos a medida que avanza el desarrollo, estos genes continan ju gando un papel crucial en el transcurso del desarrollo posterior de la mosca. De algn modo equipan a las clulas con una m emoria de su valor posicional.

100 [jm

Las regiones de control de los genes selectores hometicos actan como chips de memoria de informacin posicional54,57,58,5 9
Como se vio en el Captulo 9, los productos de los genes selectores hometicos son protenas reguladoras de genes, todos son homlogos entre s y todos con tienen una secuencia homeobox muy conservada que codifica un homeodominio de unin a DNA (de una longitud de 60 aminocidos) en las protenas corres pondientes. Aunque muchos otros genes tam bin contienen un homeobox, el tipo de secuencia hom eobox encontrada en los genes selectores hometicos es caracterstica. En los com plejos de genes Antennapedia y bithorax existen ocho genes se lectores hom eticos (a los que, por convenio, nos referiremos colectivamente com o com plejo HOM). Sus secuencias codificantes estn repartidas en medio de una cantidad mucho mayor de DNA regulador -cerca de un total de 650 000

1 17 2

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

Cromosom a 3 parasegm entos ' 0 ' 1 I 2 I 3 I 4 I 5 I 6 I 7 I 8 I 9 , 10I 11' 12I 13I 14I labial proboscipedia Deform ed Sex combs reduced Antennapedia P2 U ltrabithorax abdom inal A ----------1 A bdom inal B com plejo Antennapedia

Figura 21 -69 Comparacin de los patrones de expresin y las localizaciones crom osm icas de los genes del complejo HOM. La secuencia de los genes en cada una de las dos subdivisiones del complejo cromosmico se corresponde con la secuencia espacial en que se expresan los genes. Obsrvese que la mayora de los genes se expresan a un elevado nivel a travs de uno de los parasegmentos (color oscuro) y a nivel menor en alguno de los parasegmentos adyacentes (color intermedio, cuando la presencia de los transcritos es necesaria en un fenotipo normal, color claro donde dicha presencia no lo es). En las regiones donde se solapan los dominios de expresin, normalmente el gen que determina el fenotipo local es el gen localmente activo ms posterior. Los diagramas en la parte baja de la figura representan los patrones de expresin gnica de embriones en la fase de banda germinal extendida, aproximadamente 5 horas despus de la fecundacin.

i m

com plejo bithorax

labial

Antennapedia

U ltrabithorax

D eform ed

pares de nucletidos. Este DNA incluye localizaciones para la fusin de los pro ductos de genes de polaridad del huevo y de genes de segmentacin -com o bicoid, hunchback y even-skipped. El DNA regulador del complejo HOM acta como un intrprete de las muchas unidades de informacin posicional que le proporcionan todos estos factores, y, como respuesta ante ellos, decidir si se transcribe un grupo determinado de genes selectores hometicos o no. Sin em bargo, todava existen grandes incgnitas acerca del cmo se organiza el sistema de control HOM y cmo acta. Una caracterstica notable es que la secuencia en la que los genes se ordenan a lo largo del cromosoma tanto en el complejo Antennapedia como en el bithorax, se corresponde casi exactamente con el orden en que los genes se expresan a lo largo del eje corporal (Figura 21-69). Es como si los genes fueran activados en serie por un proceso que se extiende cada vez ms lejos a lo largo del cromosoma en proporcin directa a un indicador intracelular de distancia, presente a lo largo del eje corporal. No est claro si estas rdenes son tan solo un accidente evolutivo o si realmente reflejan la implicacin de algn mecanismo que se propaga a lo largo del cromosoma, aunque luego veremos que sta es una caracterstica del complejo HOM altamente conservado en el curso de la evolucin.

Drosophila II. Genes selectores homedticos y modelaje de las partes del cuerpo

1173

Existe un rom pecabezas todava ms complejo. El complejo HOM sirve para diferenciar cada parasegmento del siguiente, pero el nmero de genes selectores hom eticos es ms pequeo que el nmero de parasegmentos. Por ejemplo, el complejo bithorax contiene slo tres genes, pero de l dependen las diferencias entre 10 parasegmentos (vase Figura 21-69). Adems, existen muchas m utacio nes, que afectan a diferentes localizaciones del complejo, y que alteran el carc ter anteroposterior de nicamente un solo parasegmento o incluso de parte de un parasegmento. La mayora de estas mutaciones se encuentran en regiones de control no codificantes y que tambin estn ordenadas a lo largo del cromosoma en una secuencia que imita hasta el ms mnimo detalle el orden anatmico de las regiones que afectan. Esto sugiere que las diferencias entre las regiones del cuerpo no se definen nicamente por la presencia de productos de varios genes selectores hometicos, sino ms sutilmente por alguna clase de diferencia per sistente en los estados de las regiones de control asociadas con los genes. Desde este punto de vista, una regin de control no debe describirse como un simple interruptor sino como algo ms parecido a un microchip de ordenador: recibe entradas de informacin (en forma de factores reguladores y otras molculas que se unen a l), produce una respuesta de salida (en forma de rdenes de transcribir o no el gen hom etico selector), y puede almacenar un rastro de m e moria (una unidad de informacin posicional) que afecta el modo en que las en tradas de informacin calculan las salidas de informacin. De este modo el valor posicional de una clula no se reflejar necesariamente en un nivel fijo de expre sin de los genes selectores hom eticos sino en un modo de control particular de este gen en respuesta a las condiciones cambiantes. De mom ento todo esto son especulaciones, cuya confirmacin pasa por te ner respuesta a una tercera pregunta, tal vez la ms importante: Qu m ecanis mo m antiene el rastro de memoria? Como vimos anteriormente (vase pg. 1137) una posibilidad es que el m ecanismo implique una retroalimentacin po sitiva, en la que el producto de un gen, una vez producido, estimule su propia transcripcin. Parece que al menos algunos genes selectores hometicos tienen esta propiedad. Por ejemplo, el gen Deformed (perteneciente al complejo Antennapedia) tiene muchas localizaciones de unin para la protena Deformed en su regin de control superior, y en algunas clulas estas localizaciones son suficien tes para m antener la actividad de la protena una vez sta se ha desencadenado. No obstante, estos efectos autoestimuladores no son suficientes para mantener el rastro de memoria en la mayora de las clulas. Se ha descubierto que es nece sario un conjunto adicional completo de genes, llamado grupo Polycomb, para m antener inactivos a los genes selectores hom eticos no expresados: si se inac tiva cualquiera de los genes del grupo Polycomb mediante mutaciones, los ge nes selectores hom eticos se activan primero siguiendo un patrn normal, pero luego se activa de forma indiscriminada por todo el embrin (Figura 21-70A). La protena Polycomb est unida a la crom atina de los genes que ella controla (Figura 21-70B). Adems, parece ser que genes relacionados estn implicados en otras regiones en el control de la estructura de cromatina, lo cual sugiere que alguna modificacin persistente de la crom atina del com plejo de genes HOM podra ser la transmisora de la memoria de valor posicional.

La mosca adulta se desarrolla a partir de un conjunto de discos imagnales que contienen informacin posicional6 0
En Drosophila, el patrn bsico de expresin de los genes selectores hometicos ya se establece en el embrin y no slo determina la estructura de la larva, sino que todava es capaz de determinar las estructuras de la mosca adulta. Para apreciar la funcin completa de estos genes como portadores de memoria posi cional, es necesario tener una idea aproximada de la curiosa va a travs de la que se desarrolla la m osca adulta, o imago. La m osca adulta se forma mayoritariamente a partir de grupos de clulas, denominadas clulas imagnales, que permanecen en un rincn de cada seg-

117 4

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

Figura 21-70 Actuacin de genes del grupo Polycomb. (A) Fotografa de un * embrin mutante que carece de un gen extra sex combs (esc) y que desciende de una madre que tambin careca de este gen. El gen pertenece al grupo Polycomb. Prcticamente todos los segmentos se han transformado parecindose al ms posterior de los segmentos abdominales (comprese con Figura 21-68). En el mutante, el patrn de expresin de los genes selectores hometicos, que inicialmente era casi normal, es inestable de una forma tal que pronto todos los genes situados a lo largo del eje corporal intercambiarn posiciones. (B) Visualizacin del patrn que normalmente rige la unin de la protena Polycomb a los cromosomas gigantes de Drosophila por medio de un anticuerpo contra Polycomb. La protena se une al complejo Antennapedia (ANT-C) y al complejo bithorax (BX-C) as como a 60 localizaciones ms. (A, segn G. Struhl, Nature 293:36-41,1981. 1981 Macmillan Journals Ltd; B, cortesa de B. Zink y R. Paro, de R. Paro, Trends Genet. 6:416-421,1990.)

n *

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BX-C
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ANT-C^

(A}

100 pm

(B)

ment de la larva, y que aparentemente no estn diferenciadas. El origen de la mayora de las clulas imagnales del cuerpo adulto se encuentra en la epider mis embrionaria -e l epitelio que envuelve al cuerpo. Permanecen conectadas a la epidermis de la larva, y su destino ser formar las estructuras epidrmicas de la m osca adulta. Las clulas imagnales de la cabeza, el trax, y los genitales se organizan en discos im agnales; otros grupos de clulas imagnales constituirn el abdomen. Tam bin existen grupos de clulas imagnales en las visceras de la larva que darn lugar a los rganos internos de la mosca. Los discos imagnales han sido el principal objetivo de los estudios detallados en este mbito. Hay 19 discos imagnales, dispuestos en nueve pares situados en sendos lados de la lar va, ms otro disco en la lnea media (Figura 21-71). Los discos son bolsas de epi telio, con forma de globos deshinchados y apretujados, que se evaginan (se des pliegan desde el interior hacia el exterior), se extienden y se diferencian durante

Figura 21-71 Los discos imagnales de la larva de y las estructuras adultas a que dan lugar.

Drosophila

(Segn J.W. Fristrom et al., en Problems in Biology: RNA in Development [E.W. Hanley,ed.], p. 382. Salt Lake City: University of Utah Press, 1969.)

labial

clipeo

dorsal

balancn

Drosophila II. Genes selectores homedticos y modelaje de las partes del cuerpo

1175

la-metamorfosis. A partir de un par de discos se desarrollan las antenas y los ojos, de otro las alas y parte del trax, de otro el primer par de patas, y as sucesi vamente. Las clulas de un disco imaginal se parecen a las de otro disco, y cuando se diferencian, dan lugar a conjuntos de tipos celulares especializados generalmen te bastante similares. Pero experimentos con injertos demuestran que de hecho las clulas ya estn determinadas regionalmente y que son no equivalentes. Si se substituye un disco imaginal por otro en la larva y permitimos que sta atraviese la metamorfosis, veremos que el disco trasplantado se diferenciar de forma au tnoma, y dar lugar a la estructura que le corresponde segn su origen, inde pendientem ente de su nueva localizacin. Esto implica que los discos imagna les estn controlados por algn tipo de memoria de su posicin original. Mediante un ingenioso procedimiento de injertos que permite que los discos imagnales proliferen durante un largo perodo antes de su diferenciacin, se puede demostrar que esta memoria celular se hereda de forma estable (con es casos errores) a travs de un nmero indefinido de generaciones celulares (Figu ra 21-72). Los genes selectores hometicos son componentes fundamentales de este mecanismo de memoria. Si se eliminan estos genes de cualquier disco imaginal en cualquier estadio del largo perodo que conduce hasta la diferenciacin en la me tamorfosis, las clulas se diferenciarn dando lugar a estructuras incorrectas, tal como haran si pertenecieran a un segmento distinto del cuerpo. Esto se puede demostrar gracias a la poderossima tcnica de recombinacin mittica inducida por rayos X -d e hecho, una especie de ciruga gentica para clulas individuales que posibilita la generacin de clones mutantes de un genotipo determinado en cualquier momento del desarrollo, tal como veremos a continuacin.

Los genes selectores hometicos son esenciales para la memoria de la informacin posicional de las clulas de los discos imagnales6 1
Una breve exposicin a la radiacin con rayos X puede provocar, como efecto se cundario al dao causado en el DNA, un entrecruzamiento entre cromosomas ho mlogos de una clula en divisin -norm alm ente, dicho entrecruzamiento slo se producira en la meiosis. Como ilustra la Figura 21-73, si la clula es heterozigota por un gen de la regin del entrecruzamiento cromosmico, es posible que el re-

Figura 21 -72 Experimentos que permiten comprobar el estado de determinacin de las clulas de los discos imagnales. El mtodo de
ensayo consiste en implantar clulas en la larva que est a punto de sufrir metamorfosis; las clulas se diferenciarn formando estructuras adultas reconocibles que, sin embargo, se encuentran en el interior de la mosca tras la metamorfosis sin integrarse en ella. Las clulas del disco se pueden examinar de inmediato o pueden implantarse en el abdomen de las moscas adultas, que servirn como cmara de cultivo natural. Las condiciones hormonales de la mosca adulta permiten que los discos imagnales que hayan traspasado la metamorfosis continen su proliferacin durante un tiempo indefinido, sin diferenciarse, antes de que se efecte el ensayo de la determinacin celular. En ambos casos, las clulas se suelen diferenciar formando las estructuras propias del disco del que derivan originalmente.

larva

m etam orfosis

parte del disco injertada en la cavidad abdom ina

parte del disco injertada en otra larva las estructuras adultas se diferencian a partir de clulas de discos imagnales

las clulas de disco im aginal proliferan en la mosca adulta y se pueden trasplantar de form a seriada de un adulto a otro se tom a una muestra y se im planta en una larva para com probar la determ inacin de las clulas de los discos imagnales se form an las mismas estructuras adultas que en las clulas originales del disco

117 6

Captulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo

(A) MITOSIS NORMAL

(B) RECOMBINACION MITOTICA

materno paterno los crom osom as se replican los crom osom as se i replican y se recom binanl

A
i1 M ----------- ----------- .1

la clu la se divide
' B

r -~ i

& r O O

sultado del proceso sea un par de clulas hijas homozigotas: una recibir dos co pias del alelo materno del gen y la otra recibir dos copias del alelo paterno .1La coincidencia del entrecruzamiento se puede detectar si el animal escogido tam bin es heterozigoto para una mutacin en un gen de mareaje -por ejemplo, un gen de pigmentacin- que se encuentre cerca del gen que nos interesa, de forma que ambos sufran juntos el entrecruzamientos. De esta manera, se pueden gene rar a medida clones de clulas mutantes homozigotas marcadas (Figura 21-74). Las consecuencias ms importantes de las mutaciones en los genes selecto res hom eticos acostumbran a ser recesivas: slo en el organismo homozigoto

los rayos X provocan la recom binacin m ittica en una clula en proliferacin de epitelio del disco maginal
-O -o -o

Figura 21-73 Comparacin de la recombinacin mittica (B) con la mitosis normal (A). Los diagramas siguen el destino de un solo par de cromosomas homlogos, uno procedente del padre (sombreado ) y otro procedente de la madre (no sombreado). Estos cromosomas contienen un locus para un gen de pigmentacin (u otro gen de mareaje) con un alelo A de tipo salvaje (un pequeo cuadrado blanco en el cromosoma paterno) y un alelo a con mutacin recesiva (un pequeo cuadrado rojo en el cromosoma materno) de modo que una clula homozigota A/A o heterozigota Ala tiene un aspecto normal (ilustrado en blanco) y una clula homozigota a/a presenta un aspecto alterado (ilustrado en naranja). La recombinacin por intercambio de DNA entre cromosomas maternos y paternos puede dar lugar a un par de clulas hijas, una homozigota A/A y consecuentemente de aspecto normal y la otra a/a y por lo tanto visiblemente diferente. La recombinacin mittica es un accidente raro que ocurre sin la intervencin del aparato especializado que facilita la recombinacin durante la meiosis. Una breve exposicin a rayos X provoca una mayor frecuencia de recombinaciones.

Figura 21 -74 La utilizacin de la recombinacin mittica para generar un clon de clulas mutantes marcadas genticamente en el ala de Drosophila. Cuanto ms temprano sea el estadio en que ocurra la recombinacin, mayor ser el clon resultante.

Drosophila II. Genes selectores homedticos y modelaje de las partes del cuerpo

1177

mutante es visible la transformacin hometica. Si utilizamos la recombinacin mittica podremos generar un clon de clulas mutantes hometicas homozigotas marcadas en un disco imaginal y estudiar su comportamiento en un medio heterozigoto, con un fenotipo normal. El descubrimiento es que las clulas m ar cadas, y slo las marcadas, presentan la transformacin hom etica (siempre que estn situadas en el dominio de accin del gen hom etico selector); este hecho se produce tanto si la recom binacin se provoc en una fase temprana del desa rrollo como en una fase tarda. Por ejemplo, una larva de 2 das heterozigota para una m utacin que elimina la funcin del gen Ultrabithorax (Ubx) (del com plejo bithorax), puede ser tratada con radiacin por rayos X para producir los clones aislados de clulas homozigotos en sus discos imaginales que contienen gen Ubx no funcional. Estos clones, si estn situados en el disco del balancn, darn lugar a parches de tejido del ala en el balancn. Estas y otras observaciones indican que la memoria de informacin posicional de la clula depende de la ac tividad continuada de un gen hom etico selector comn. Adems, esta memoria se expresa de forma independiente en cada clula -cad a clula mantiene su es tado de forma independiente de las dems, dependiendo slo de su propia his toria y de su genoma, sin tener en cuenta a sus vecinas.

Los genes selectores hometicos y los genes de polaridad del segmento definen los compartimientos del cuerpo53,62
Las diferencias recordadas definidas por los genes selectores hometicos son dis cretas: existe una gran diferencia en la expresin gnica en clulas situadas en parasegmentos adyacentes. Lo mismo ocurre con algunos de los genes de polari dad, como engrailed (vase Figura 21-66), cuyas diferencias en la expresin se corresponden con la gran diferencia existente entre clulas situadas en la parte posterior del parasegmento y las situadas en la parte anterior. As pues, por m e dio de la expresin diferente de estos dos tipos de genes, el cuerpo se subdivide en una serie de regiones discretas que constan de clulas en diferentes estados de determinacin. En la frontera entre una regin y la siguiente parece que las clu las no pueden mezclarse, como si existiera una cohesin selectiva entre las clu las que contienen el mismo mareaje de direccin molecular, que las mantuviera segregadas de las clulas con un mareaje diferente (Figura 21-75). De este modo,

vena central del ala

lm ite del com partim iento clon en el ala com partim iento posterior ala que presenta los com partim ientos posterior y anterior un clon de crecim iento rpido respeta el lm ite entre los com partim ientos posterior y anterior

Figura 21-75 Compartimientos. (A) Las formas de los clones marcados del ala de Drosophila revelan la existencia de lmites de compartimiento. El borde de cada clon marcado, donde entra en contacto con el lmite, es recto. Incluso si un clon marcado ha sido alterado genticamente de forma que crezca ms rpidamente que el resto del ala y por lo tanto sea ms grande, este clon respetar dicho lmite (ltimo dibujo). Obsrvese que el lmite del compartimiento no coincide con la vena que discurre por el centro del ala. (B) Patrn de expresin del gen engrailed en el ala, puesto de manifiesto por la misma tcnica que en la Figura 21-66. Los lmites del compartimiento coinciden con los lmites de expresin del gen engrailed. (A, segn F.H.C. Cricky P.A. Lawrence, Science 189:340-347,1975. 1975 the AAAS; B, cortesa de Cory Hama y Tom Kornberg.)

500 |jm

117 8

Captulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo

por ejemplo, si mediante recombinacin mittica se genera en el ala un clon de clulas marcadas genticamente, aunque normales por todo lo dems, se observa que el clon est estrictamente restringido a uno u otro lado de un lmite marcado de forma muy precisa en la frontera entre los dos parasegmentos en los que se construyen las alas. Una subdivisin del cuerpo definida de esta manera en el ala o en otro rgano se denomina compartimiento (Figura 21-75). Por definicin, el lmite de un compartimiento es la frontera existente entre dos poblaciones de clulas que, debido a presentar diferentes estados de diferen ciacin, no pueden mezclarse. Como el estado de determinacin normalmente no es reversible, cada compartimiento tiene que ser una unidad autosuficiente. No puede reclutar clulas de los compartimientos adyacentes ni transferirles ex cedentes celulares. Sin embargo, puede regular su organizacin interna y su ta mao segn el principio de intercalacin, visto anteriormente, mediante reajus tes que no violan esta limitacin. As pues, en relacin a la regulacin del patrn y del crecimiento, cada compartimiento parece comportarse como un mdulo ms o menos independiente durante el desarrollo normal (aunque durante la re generacin que sigue a un trastorno importante algunas veces alteran su carc ter y sus alianzas de compartimiento). Algunas de las seales morfognicas que actan en el disco imaginal contro lando estos procesos, han sido identificadas. Parece ser que incluyen productos de los genes dpp y wingless, que, como sabemos, son activos en el modelaje del embrin temprano (vase Figura 21-56). Pero todava no sabemos en trminos de gentica molecular cmo se organizan estos sistemas de seales o cmo cola boran con los genes selectores hom eticos proporcionando a cada comparti miento su patrn interno caracterstico y haciendo que detenga su crecimiento una vez haya alcanzado el tamao adecuado. De este modo, si seguimos las vas genticas de formacin de patrones hasta estadios cada vez ms avanzados y detallados, llegaremos a un punto donde la cadena de causa-efecto se desvanece. No obstante, en el ltimo estadio del pro ceso, mientras las clulas se preparan para la diferenciacin final, se puede reto mar la pista, y podemos establecer los mecanismos genticos que controlan al gunos de los detalles ms minsculos del modelaje de la superficie del cuerpo de la mosca, tal como muestra la distribucin de sus quetas sensitivas.

La expresin localizada de protenas especficas reguladoras de genes antecede la produccin de quetas sensitivas63
Las moscas tienen muchas quetas repartidas por todo su cuerpo -unas grandes y otras pequeas. Las mayores actan de baliza en la superficie de la mosca: son relativamente escasas, muy espaciadas entre s y ocupan unas posiciones prede cibles con exactitud. Las pequeas estn mucho ms cerca unas de otras y estn dispuestas en regiones de la superficie corporal bien definidas. Estas quetas son rganos sensitivos en miniatura -com ponentes del sistema nervioso perifrico. Unas responden a estmulos qumicos, otras a estmulos mecnicos, pero todas ellas han sido construidas de forma parecida. Su estructura puede verse en su forma ms simple y estereotipada, la queta mecanosensorial. Cada una de ellas, no importa si es grande o pequea, consta de cuatro clulas: una clula lanza, una clula alveolar, una clula de la vaina glial y una neurona (Figura 21-76). El movimiento de la clula alveolar de la queta excita la neurona, que enviar una seal al sistema nervioso central. El origen de las clulas de la queta de la mosca adulta se encuentra en el dis co imaginal epitelial, siendo las cuatro nietas de una nica clula sensorial m a dre. Estas clulas se diferencian de las futuras clulas epidrmicas que la rodean durante la ltima fase larvaria (Figura 21-77). Antes de referirnos al patrn de di ferenciacin de las quetas, hemos de explicar cmo se controla la gnesis de las clulas sensoriales madre, y luego cmo se diferencian entre ellas las cuatro nie tas de esta clula madre.

Figura 21 -76 Estructura bsica de una queta m ecanosensorial.

Diagrama que representa las cuatro clulas de la queta.

Drosophila II. Genes selectores homedticos y modelaje de las partes del cuerpo

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Figura 21-77 Clulas madre sensoriales del ala del disco imaginal. Las clulas madre sensoriales (aqu azuladas) se ponen de manifiesto con facilidad en esta muestra especial de Drosophila, que contiene un gen marcador artificial lacZ que, por casualidad, se ha insertado en el cromosoma colindante a una regin de control, lo cual provoca su expresin selectiva en los genes sensoriales madre. Animales como ste nos proporcionan una va de deteccin y de estudio de regiones de control especficas del genoma -la llamada tcnica enhancer-trap, activacin-caza. La tincin prpura nos muestra el patrn de expresin del gen scute; ello antecede la produccin de las clulas sensoriales madre y desaparece progresivamente a medida que las clulas se desarrollan. (Segn P. Cubas, J.-F. de Celis, S. Campuzano y J. Modolell, Genes Dev. 5:996-1008, 1991.)

Hay dos genes, denominados achaete y scute, cruciales en el inicio de la for m acin de quetas en el disco imaginal epitelial. Estos genes tienen funciones si milares que a menudo se solapan, y codifican protenas reguladoras de genes de la clase hlice-bucle-hlice estrecham ente emparentadas entre s (estudiadas en el Captulo 9). Ambos genes pertenecen a un grupo de genes homlogos muy re lacionados, todos del complejo achaete-scute. La hibridacin in situ demuestra que la expresin de achaete y scute se produce exactamente en las regiones en las que se formarn las quetas. Las mutaciones que eliminan la expresin de es tos genes en algunas de sus localizaciones habituales bloquean el desarrollo de quetas precisam ente en estas mismas zonas. Las mutaciones que provocan la expresin en localizaciones adicionales y extraas causan la aparicin de quetas en estas regiones no habituales. Pero la expresin de los genes achaete y scute es transitoria, y slo una minora de las clulas que inicialmente los expresan se convertirn en clulas sensoriales madre; las dems se convertirn en clulas epidrmicas tpicas. El estado que se define mediante la expresin de achaete y scute se denomina proneural. Las clulas proneurales estn preparadas para to mar la va de diferenciacin neurosensorial, pero esto depende de interacciones competitivas entre ellas, por lo que no todas lo consiguen.

La inhibicin lateral regula el patrn detallado de tipos celulares diferenciados63,6 4

Las clulas proneurales, que expresan achaete, scute o ambos, estn situadas en grupos en el disco imaginal epitelial -u n pequeo grupo de menos de 30 clulas si se trata de una queta grande, o un grupo amplio y uniforme de centenares o miles de clulas si se trata de una regin con quetas pequeas. En el primer caso slo un miembro del grupo de clulas se convierte en una clula madre sensorial; en el segundo lo hacen muchas de las clulas distribuidas por la re gin proneural. Las clulas sensoriales madre casi siempre estn separadas unas de otras por una cantidad mnima de clulas epidrmicas. Experimentos con m osaicos genticos demuestran que todas las clulas que toman la va de diferenciacin celular de las clulas sensoriales madre envan una seal a sus vecinas para evitar que ellas hagan lo mismo; esto se denomina inhibicin la te ral (Figura 21-78). Si m ediante procedim ientos genticos impedimos a una cFigura 21 -78 Inhibicin lateral. Inicialmente todas las clulas de la . muestra son equivalentes; todas tienden a desarrollarse como clulas sensoriales madre, y cada una enva una seal inhibidora a sus vecinas para que no sigan esta va de diferenciacin. Ello genera una situacin altamente competitiva. En cuanto una clula toma ventaja en la competencia, esta ventaja se magnifica. Cuanto ms cerca est la clula vencedora de diferenciarse como madre sensorial, mayor ser la inhibicin que padecen sus vecinas, y stas, por el contrario, a medida que pierden su capacidad para convertirse en una clula sensorial tambin perdern su capacidad de inhibir a otras clulas. As pues, la inhibicin lateral conduce a las clulas adyacentes a destinos diferentes; es decir todo lo contrario del efecto comunitario tratado en la pg. 1138.

1180

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

Figura 21 -79 Consecuencias de la inactivacin de la inhibicin lateral. La fotografa muestra parte del trax de una mosca que contiene una porcin mutante (generada por una recombinacin mittica inducida por rayos X) en la que el gen neurognico Delta ha sido parcialmente inactivado. La reduccin de la inhibicin lateral ha provocado que casi todas las clulas de la porcin mutante (en el centro de la fotografa) se desarrollen como clulas sensoriales madre, lo que produce un gran exceso de quetas sensoriales en esta zona. Las zonas constituidas por clulas mutantes que contengan mutaciones ms extremas, con prdida completa de la inhibicin lateral, aparentemente no forman quetas, debido a que toda la progenie de clulas sensoriales madre se desarrollar como neuronas en lugar de diversificarse formando tanto las neuronas como las partes externas de la estructura de la queta. (Cortesa de Patricia Simpson.)

lula que se convierta en una clula sensorial madre, una de las clulas proneurales circundantes, liberada de la inhibicin lateral, se convertir en clula madre en su lugar. Fue en estudios de embriones mutantes donde se identificaron por primera vez los genes responsables de la inhibicin lateral. Ya en el embrin, tanto el complejo achaete-scute como los genes de la inhibicin lateral, controlan el de sarrollo del sistema nervioso central y perifrico, justo del mismo modo en que luego controlarn el desarrollo de los rganos sensoriales del sistema nervioso perifrico en los discos imaginales. En ambos casos, las mutaciones que elimi nan la inhibicin lateral causan un efecto simple y sorprendente: se producen grandes cantidades de clulas neuronales a expensas de clulas epidrmicas (Fi gura 21-79). Generalmente se denomina a los genes segn su fenotipo mutante; he aqu por qu los genes responsables de la inhibicin lateral reciben la confusa denominacin de genes neurognicos. Forman un sistema gentico de al m e nos siete miembros. El gen neurognico ms conocido se llama Notch. Codifica una protena transm em brana cuya posible funcin es la de actuar como receptora de la seal de inhibicin lateral. Experimentos con mosaicos genticos demuestran que las clulas que carecen de Notch no responden a la seal y prosiguen la va de dife renciacin neuronal. Parece ser que otra protena transmembrana relacionada codificada por el gen neurognico Delta es una protena ligando que se une a Notch y lo activa; al parecer, la inhibicin lateral se transmite por medio de con tactos clula-clula. Por debajo de Notch, actan intracelularmente los produc tos de otros genes neurognicos que interpretan la seal y suprimen la diferen ciacin neural. Puede demostrarse que este mismo mecanismo de inhibicin lateral de pendiente de Notch acta por duplicado en la formacin de las quetas -prim e ro, obligando a las vecinas de las clulas sensoriales madre a seguir una va de diferenciacin distinta, convirtindose as en clulas epidrmicas, y segundo, haciendo que las cuatro nietas de la clula madre sigan vas de diferenciacin distintas dando lugar a los cuatro com ponentes de la queta. En ambos casos la va por defecto es la neural y la inhibicin lateral proporciona una interaccin competitiva que obliga a que las clulas adyacentes se diferencien de maneras distintas. Este mismo conjunto de genes neurognicos no slo media en la inhibicin lateral tantas veces como sea necesario durante el desarrollo del sistema nervio so, sino que tam bin es imprescindible durante el modelaje detallado de mu chos otros tejidos de la mosca. De hecho, la inhibicin lateral es una estrategia crucial para el control de los patrones de diferenciacin pluricelulares de todo el mundo animal, y seguramente tam bin del mundo vegetal; los tipos de patrones de diferenciacin que puede generar son mltiples, desde el estoma de una hoja a los fotorreceptores oculares. En los vertebrados se han encontrado genes ho mlogos de los genes neurognicos, por lo que es probable que conserven los mismos mecanismos moleculares, y que stos acten al menos en algunos de

Drosophila II. Genes selectores hometicos y modelaje de las partes del cuerpo

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estos casos. En la parte final de este apartado consideramos hasta qu punto

Drosophila es un modelo universal para la gentica molecular del patrn de for

macin.

Los genes de control de desarrollo de Drosophila tienen homlogos en los vertebrados6 5

La teora de la evolucin nos dice que todos los animales son primos nuestros. Es bastante fcil apreciar parecidos familiares del ser humano con un ratn, o incluso con un pez, y establecer homologas entre partes de su cuerpo y del nuestro. Pero si nos comparamos con moscas o gusanos, de los cuales nos sepa ramos hace aproximadamente 600 millones de aos, las correspondencias no estn tan claras. Es cierto que podemos reconocer algunos tipos celulares fami liares -com o neuronas, clulas musculares estriadas o espermatozoides. Con un grado de coincidencia menor se pueden apreciar similitudes en el plano corpo ral, con el intestino en el centro y la cabeza en un extremo. Pero hasta dnde llegan estas similitudes? Aunque los fsiles no han proporcionado ninguna res puesta clara al respecto, la gentica molecular ha comenzado a hacerlo. Las com paraciones de secuencias gnicas ponen de manifiesto que una proporcin sorprendentemente amplia de los genes de un animal como la mos ca tienen, de modo inconfundible, homlogos en vertebrados, y viceversa. Tales analogas han sido comprobadas para la mayora de los genes de control de de sarrollo que hem os mencionado en el transcurso de este captulo. Pero se usan estos genes de control con las mismas com binaciones y para propsitos hom logos, de forma que se conserva el mismo sistema gentico de control del desa rrollo? Al comparar un ser humano con una mosca, las diferencias que aprecia remos de entrada parecen fundamentales, tanto en el desarrollo como en la estructura final. Por ejemplo, los huevos de los vertebrados no atraviesan un es tadio sincitial como hacen los insectos, y por lo tanto su modelaje pluricelular inicial no puede controlarse por medio de gradientes morfognicos como Bicoid de Drosophila, establecido mediante la difusin intracelular de una protena a travs del citoplasma compartido por muchos ncleos. Y todava ms, cuando nos fijamos en estadios un poco ms avanzados, encontramos un patrn consi derable de correspondencias anatmicas. Sin la ayuda de la gentica molecular nunca habramos podido discernir esta cuestin. La gentica molecular nos re vela en animales muy diferentes la presencia de marcas posicionales seal pare cidas que se expresadas en partes del cuerpo que de otra manera nunca podra mos haber considerado que tuvieran nada en comn. El complejo gnico HOM ha sido fundamental en la elaboracin de esta nueva visin sobre nuestra rela cin con moscas y gusanos.

anterior

posterior

- (j b y p b ^ j------------ (jM y ^ y - ^ f^ U b xy^ b d -^ ^ b d -^ -------------------------------------------

i
HoxB (Hox 2)

t ;= i = ^

< h o > m )^ IM lK IK Z K Z K fK I) CEKEKZ) C i >

<IKXD<Z)-QIH5KI
<ZKi>QD <Z)-GEKZKZ)-GEi-

HoxC , (Hox 3)

(Hox 4)

H o x D ,- G l XD -------------CIXZ)-GD^ID-GE>Captulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo

Figura 21 -80 Comparacin entre el complejo HOM de un insecto y los complejos Hox de un mamfero. La lnea superior ilustra la distribucin de los genes de los complejos Antennapedia y bithorax de Drosophila; a continuacin se muestran los genes correspondientes a los cuatro complejos Hox de un mamfero (ratn o humano), tambin en su distribucin cromosmica. Los genes que presentan un predominio anterior en los dominios de expresin estn dispuestos en la parte izquierda, y los que presentan un predominio posterior en los dominios de expresin estn dispuestos en la parte derecha. Los cinco complejos estn alineados de modo que los genes con secuencias ms parecidas estn en la misma columna. Se cree que los complejos han sufrido la siguiente evolucin: primero, en algn ancestro comn a gusanos, moscas y vertebrados, un nico gen selector hometico primordial sufri una duplicacin repetida formando una serie de tndems de estos genes -un complejo HOM. En el sublinaje de Drosophila este complejo nico se dividi en dos complejos separados, Antennapedia y bithorax, mientras que en el linaje que conduce a los mamferos se replic repetidamente dando lugar a los cuatro complejos Hox. As pues, el gen labial (lab) de Drosophila es identifiable por medio de su subsecuencia como equivalente de Hoxa-1, Hoxb-1 yHoxd-1; el gen proboscipedia (pb) es el equivalente de Hoxa-2 y Hoxb-2; y as sucesivamente. Aparentemente, el paralelismo no es perfecto debido a algunos genes individuales se han duplicado y otros se han perdido tras la divergencia de los cromosomas. (Basado en M.P. Scott, Cell 71:551-553,1992. Cell Press.)

1182

Los mamferos tienen cuatro complejos HOM homlogos59,66

Debido a que el homeodominio de los genes selectores hometicos ha sido muy conservado durante la evolucin, ha sido relativamente fcil descubrir hom lo gos de los genes de Drosophila en otras clases de animales. stos se han encon trado en prcticamente todos los tipos de criaturas -e n Hydra, en nemtodos y gusanos de tierra, en escarabajos, moluscos y erizos de mar, en peces, en ranas, en pjaros y en mamferos. Cabe destacar que en los casos en que se ha investiga do adecuadamente, resulta que estos genes se agrupan en complejos parecidos al complejo HOM de los insectos. En el ratn encontramos cuatro complejos de este tipo -denom inados complejos HoxA, HoxB, HoxC y HoxD- cada uno de los cuales se halla en un cromosoma distinto. Los genes individuales de cada com plejo pueden reconocerse por sus secuencias homeobox, como homlogos de miembros especficos del conjunto de genes de Drosophila. Al parecer cada uno de los cuatro complejos Hox en los mamferos es, sin entrar en detalles, el equiva lente de un complejo HOM completo de insecto (es decir, un complejo Antennapedia ms un complejo bithorax) (Figura 21-80). La distribucin de los genes en el interior de cada secuencia Hox es bsicamente la misma que en el complejo HOM en los insectos, lo cual sugiere que el origen de los cuatro complejos verte brados radica en las duplicaciones de un nico complejo primordial y que su dis tribucin bsica se ha conservado. Cuando se examinan los patrones de expre sin de genes Hox de los embriones de los vertebrados mediante hibridacin in situ, resulta que los miembros de cada complejo se expresan en series de la cabe za a la cola al lo largo del eje corporal, como en el caso de Drosophila (Figura 2181). El patrn es ms fcil de observar en el tubo neural. Salvo escasas excepcio nes, este orden anatmico encaja con la distribucin cromosmica de genes en cada complejo, y los genes correspondientes en los cuatro complejos Hox tienen los dominios de expresin anteroposteriores prcticamente idnticos. Los dominios de expresin gnica definen un sistema detallado de corres pondencias entre las regiones del cuerpo de los insectos y las regiones del cuer po de los vertebrados. Como muestra la Figura 21-82, los parasegmentos de la mosca se corresponden a series de segmentos de la parte anterior del embrin de vertebrados marcados de forma parecida. En el cerebro posterior esta serie de segmentos se denominan rombmeros. Los tejidos colaterales al cerebro posterior presentan la segmentacin en series de arcos branquiales, prominentes en todos los embriones de vertebrados -lo s precursores del sistema de branquias de los pe ces y de las mandbulas y las estructuras del cuello en los mamferos; cada par de rombmeros del cerebro posterior corresponde a un arco branquial (vase Figura 21-82). En el cerebro posterior, igual que en Drosophila, los lmites de los domi nios de expresin de los genes Hox se alinean con los lmites de los segmentos anatmicos. Y al igual que en los compartimientos de Drosophila, las clulas de un rombmero no se mezclan con las del rombmero siguiente. Sin embargo, todava no est claro hasta qu punto se parecen los detalles de los mecanismos que establecen la segmentacin del cerebro posterior y del arco branquial de un vertebrado y los que generan los parasegmentos de un in-

Figura 21-81 Dominios de expresin de los genes Hox en un ratn. Las fotografas muestran en embriones enteros los dominios de expresin de genes del complejo HoxB (mancha azul). Los dominios de expresin se visualizan gracias a la hibridacin in situ o, como en estos ejemplos, generando un ratn transgnico que contiene la secuencia de control del gen Hox acoplada a la secuencia de la (3-galactosidasa, cuya presencia se detecta por mareaje histoqumico. Cada gen se expresa en una larga extensin de tejido con un lmite anterior bien definido. Cuanto ms anterior sea la posicin del gen en su complejo cromosmico, ms anterior ser el lmite anatmico de su expresin. De este modo, salvo pequeas excepciones, los dominios anatmicos de genes sucesivos forman un conjunto ordenado, distribuido segn el orden de los genes en el complejo cromosmico. (Cortesa de Robb Krumlauf.)

Hoxb-2

Hoxb-4

vista dorsal

vista lateral

vista dorsal

vista lateral 1183

Drosophila II. Genes selectores homedticos y modelaje de las partes del cuerpo

Figura 21-82 Correspondencias entre las regiones del cuerpo de un insecto y las de un vertebrado, como definen los genes de expresin HOM y Hox. Representacin de un embrin de Drosophila en el estadio de banda germinal, con sus parasegmentos coloreados de acuerdo con los genes HOM que expresan. El cdigo de colores es el mismo que en la Figura 21-80, y tambin es el mismo para el patrn de expresin del gen HoxB del tubo neural de un embrin de vertebrado. Para simplificar, no se ilustra la expresin de los otros tejidos del vertebrado. En las regiones en que los dominios de expresin de dos o ms genes HOM/Hox se solapan, la coloracin de los genes corresponde al ms posterior de los genes expresados, tanto en la mosca como en el vertebrado. Los puntos que presenten la coincidencia de varios lmites de expresin de genes distintos aparecern rayados. Obsrvese que de igual forma que los dominios de expresin de la mosca estn relacionados con los parasegmentos, los dominios de expresin de los vertebrados estn relacionados con los rombmeros (segmentos del cerebro posterior). Cada par de rombmeros se asocia con un arco branquial (un rudimento branquial modificado), al que transmite inervacin. El patrn de expresin de los genes Hox en los arcos branquiales (no est ilustrado) encaja con los rombmeros asociados.

secto. Aunque, por ejemplo, los vertebrados presentan homlogos de los genes engrailed y wingless, estos genes no se expresan de una forma segmental repeti tiva en el cerebro an terio r..

Los genes Hox definen los valores posicionales en los vertebrados tal como ocurre en los insectos67
A pesar de las incertidumbres que se plantean en los mecanismos de segmenta cin, pocas dudas pueden existir sobre la condicin homologa de nuestro eje de cabeza a la cola respecto al de un insecto y respecto a que esencialmente el mis mo conjunto de genes marca los valores posicionales anteroposteriores de nues tras clulas. Al parecer, los genes Hox no tienen tan slo patrones de expresin similares a los genes del complejo del insecto, sino que tambin presentan fun ciones reguladoras parecidas. Los vertebrados tienen cuatro clases de complejos de genes Hox que actan ms o menos en paralelo a lo largo del eje corporal, donde en el insecto acta un solo complejo HOM. Por lo tanto, no basta con eli minar o provocar la expresin deficiente de un gen Hox para conseguir que una regin experimente una transformacin hom etica de consideracin y adopte el carcter de otra. De todas formas, gracias a la ingeniera gentica se ha conse guido que un ratn con alteraciones en un solo complejo de genes Hox presente anomalas localizadas que se podran interpretar como transformaciones horneticas incompletas. Este hecho ilustra una de las dificultades principales que presenta el anlisis de la gentica de los sistemas de control del desarrollo de los vertebrados. El genoma vertebrado es muy grande, y debe su gran tamao fundamentalmente a las duplicaciones gnicas que se han ido produciendo en el curso de la evolu cin. As, contiene muchas copias diferentes de genes que en moscas o nemtodos estn representados en solitario: los cuatro complejos Hox son un ejemplo tpico de ello. Las mltiples versiones de un gen tienen funciones solapadas y parcialmente intercambiables, y esta redundancia parcial hace muy difcil iden tificar la funcin bsica de un gen en solitario, de la misma forma que resulta di fcil, poniendo o quitando un solo tornillo, demostrar la funcin de uno de los muchos tornillos que tiene una puerta en sus bisagras. He aqu por qu los datos aportados por modelos de organismos ms simples como Drosophila y Caenorhabditis elegans son tan importantes. Sin embargo ello no quiere decir que la importancia de un gen individual sea superflua en el conjunto de genes de un vertebrado; a medida que avanza la evolucin, los genes duplicados divergen y comienzan a adoptar funciones nue-

118 4

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

vas y cada vez ms especializadas que los distinguen unos de otros. Los viejos com ponentes pueden adaptarse organizando el desarrollo de los nuevos tipos de estructuras que se aadirn a las ya existentes. Las extremidades de los verte brados superiores nos proporcionan un ejemplo muy interesante de todo ello.

Subconjuntos de los genes Hox se expresan distribuidos a lo largo de los dos ejes ortogonales de las yemas de las extremidades de los vertebrados6 8
En este mismo captulo ya hemos utilizado las yemas de las extremidades del embrin de pollo para demostrar que las clulas de regiones distintas se distin guen unas de otras mediante una propiedad que denominamos valor posicional. Esta caracterstica de la memoria celular decide si las estructuras que se forma rn sern de la pata o del ala, del omplato o del antebrazo, del pulgar o del m e ique. La gentica molecular ha revelado lo que significa valor posicional en trminos moleculares de la yema de la extremidad. Ya sabemos que a lo largo del eje corporal, en moscas y vertebrados, los va lores posicionales se definen mediante el estado de expresin de los genes Hox/HOM. La hibridacin in situ demuestra que esto es cierto para las yemas de las extremidades de un embrin de ratn y tambin de pollo -aunque existe una pequea diferencia. En lugar de encontrar que los cuatro complejos Hox se ex presan de forma similar, mediante patrones solapantes, igual que en el cerebro posterior, se observa que un subconjunto de miembros del complejo HoxD se expresa en una serie de dominios distribuidos a lo largo de un eje de la extremi dad (probablemente el anteroposterior) y que un subconjunto de miembros del complejo HoxA se expresan en serie a lo largo de un eje distinto (probablemente el proximodistal) (Figura 21-83). Para comprobar si estos genes realmente con trolan el modelaje de la extremidad, se ha utilizado un retrovirus como vector de expresin en el embrin de pollo para introducir un gen Hox particular dentro de las clulas de la yema de la extremidad, forzando la expresin del gen en una

ANTERIOR 3' cerebro anterior

mdula espinal

yema de la extrem idad anterior som itos

Figura 21 -83 Patrones de expresin de los genes Hox de las yemas de las extremidades de los vertebrados. (A) Diagrama esquemtico del patrn de expresin de los miembros expresados en la parte posterior del complejo Hox de un embrin de 12 das. (B) Comparacin entre los patrones de expresin de los genes de pollo HoxD (ChoxD) y HoxA (ChoxA) en la yema de la extremidad anterior de un embrin de pollo de 4 das. En el pollo y en el ratn, los genes HoxD definen el patrn de los dominios antero-posteriores; los genes HoxA definen el patrn proximodistal. (A, segn D. Duboule, BioEssays 14:375384, 1992. ICSU Press; B, segn Y. Yokouchi, H. Sasaki, y A. Kuroiwa, Nature 353:443-445, 1991. 1991 Macmillan Magazines Ltd.)

Dxa-10 Hoxa-11

yema de la extrem idad posterior

proxim al distal (A) 5' POSTERIOR (B)

anterior posterior

Drosophila II. Genes selectores homedticos y modelaje de las partes del cuerpo

1185

localizacin inadecuada. Si se fuerza a las clulas pertenecientes a la regin en la que se desarrollar el primer dedo del pie a que expresen el gen Hox caractersti co del segundo dedo ( ), su comportamiento se ver alterado, y en la lo calizacin del primer dedo se desarrolla un duplicado del segundo dedo. Evi dentemente, cuando el vertebrado desarrolla las extremidades, combina los diferentes conjuntos de genes Hox de formas distintas para controlar el modelaje del em brin y tam bin del principal eje corporal. Ahora, el problema central de la embriologa de los vertebrados es descubrir cm o se regulan los genes Hox. Varios estudios sealan que el cido retinoico puede controlar la expresin de los genes Hox en las yemas de las extremidades y a lo largo del eje principal del cuerpo, pero la forma en que se ejerce tal control y el papel que juega en el desarrollo normal son, an, preguntas sin respuesta. En este mom ento los genes HOM/Hox constituyen el ejemplo ms especta cular de conservacin de mecanism os de control del desarrollo. Pero el camino iniciado con las homologas genticas descubiertas mediante las secuencias ge ntica durante los ltimos aos nos concede esperanzas para pensar que pronto podremos constatar muchas coincidencias ms, y no menos importantes, en el desarrollo de vertebrados e invertebrados. Los estudios genticos tradicionales y moleculares de organismos pequeos com o moscas y gusanos, ms accesibles, nos dan las pautas para aclarar los mis terios del desarrollo de todo el mundo animal. Pero, y si vamos un poco ms le jos y afirmamos que tam bin nos abren las puertas del desarrollo vegetal?, o, es que el desarrollo de las plantas acta segn un conjunto de principios y m eca nismos com pletam ente distintos? Con esta pregunta abordamos el siguiente apartado.

Hoxd-11

Resumen

Los genes selectores hometicos definen las diferencias entre los segmentos del cuer po desde la cabeza hasta la cola: proporcionan a las clulas una memoria de su va lor posicional. Mutaciones en estos genes pueden convertir un segmento corporal al carcter de otro, y la supresin en masa de estos genes causa larvas que tienen todos los segmentos corporales iguales. Se observan transformaciones parecidas en las es tructuras externas del cuerpo de la mosca adulta, derivadas de los discos imagna les de la larva. Experimentos con trasplantes demuestran que las clulas de los dis cos tienen memoria a largo plazo de sus valores posicionales, y esta memoria depende de la presencia continuada de genes selectores hometicos. Todos los genes selectores hometicos codifican protenas que unen DNA, y to das contienen secuencias homeobox muy bien conservadas. En el genoma se agru pan en dos conjuntos que podran ser partes separadas de un nico conjunto de ge nes ancestral denominado complejo HOM. La distribucin cromosmica de estos genes en cada parte del complejo encaja con la distribucin espacial de sus domi nios de expresin en el cuerpo. El mecanismo molecular del fenmeno de la memo ria es desconocido, pero se cree que depende de cambios autoperpetuantes en el es tado de las regiones de control del complejo HOM. La expresin conjunta de los patrones de los genes HOM y de los genes de pola ridad del segmento, subdivide el cuerpo en compartimientos, cuyas clulas no se mezclan. Los procesos posteriores generan un patrn de diferenciacin celular de tallado en el interior de cada compartimiento. La inhibicin lateral, mediada por los llamados genes neurognicos, juega un papel central en el estadio final de di versificacin celular. Determina que clulas que se hallan en contacto unas con otras se diferencien deformas distintas, lo cual ayuda a organizar la creacin de conjuntos de clulas con especializaciones minsculas que contribuirn a la for macin de quetas sensoriales. Gran parte de los genes de control del desarrollo identificados en moscas y gu sanos tienen homlogos en otras clases de animales, incluidos los vertebrados. En algunos casos se ha demostrado que los genes correspondientes tienen funciones en el desarrollo, lo cual implica que los mecanismos fundamentales del desarrollo
1186 Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

animal se han conservado incluso cuando el aspecto externo del cuerpo ha evolu cionado hasta ser completamente diferente. Al parecer, prcticamente todos los animales contienen complejos de genes HOM, de organizacin parecida a los de los insectos: los mamferos presentan cuatro complejos, denominados complejos Hox, y se cree que sus productos definen los valores posicionales que controlan el patrn anteroposterior de zonas de la regin del cerebro anterior y del tronco. Los complejos Hox tambin han adquirido nuevas junciones como especificadores de informacin posicional en partes del cuerpo de los vertebrados evolucionadas ms recientemente, como son las extremidades.
El desarrollo vegetal69
Las plantas y los animales estn separados aproximadamente por mil millones de aos de historia evolutiva. Ambos han desarrollado su organizacin plurice lular de forma independiente pero a partir del mismo conjunto de herramientas -e l conjunto de genes heredados de su antepasado eucariota unicelular comn. La mayora de diferencias entre sus estrategias de desarrollo provienen de dos particularidades bsicas de las plantas. La primera es que las plantas consiguen su energa de la luz solar, no ingiriendo otros organismos. Esta caracterstica de fine un plan corporal distinto. Y la segunda, que sus clulas estn encerradas en paredes celulares semirrgidas que las mantienen en grupos compactos, evitando que se desplacen como hacen las clulas animales. Esta segunda caracterstica determina un conjunto distinto de movimientos que definen la forma del cuer po, y unos mecanismos de desarrollo distintos que puedan hacer frente a un en torno variable. El desarrollo animal est muy protegido frente a los cambios del entorno, y el embrin genera la misma estructura corporal definida genticamente sin que sta se vea afectada por condicionantes externos. El desarrollo de la mayora de las plantas, en cambio, est influido dramticamente por el entorno: debido a que no pueden desplazarse a su entorno adecuado, las plantas se adaptan al m e dio que les corresponde alterando el curso de su desarrollo. Su estrategia es oportunista. Un rgano determinado -e s decir una hoja, una flor o una razpuede ser generado a partir de un huevo fecundado mediante diferentes vas, segn las informaciones del entorno. Una hoja de begonia plantada en el suelo puede desarrollar una raz; la raz puede dar un brote; el brote, si recibe la luz su ficiente, puede desarrollar hojas y flores. Normalmente, la planta adulta est compuesta por muchas copias de un pequeo conjunto de mdulos estndar, tal como se ilustra en la Figura 21-84. Las posiciones y momentos en que se generan estos mdulos estn muy influi dos por el entorno, provocando variaciones en la estructura de toda la planta. Las opciones entre los mdulos alternativos y su organizacin en toda la planta depende de informaciones del entorno y de seales hormonales de largo alcan ce, que en el control del desarrollo animal juegan un papel mucho menos im portante. Aunque el desarrollo global de una planta -la forma de sus races y ramas, el nmero de sus hojas o flores- puede ser altamente variable, su organizacin de tallada a pequea escala no lo es. Una hoja, una flor o incluso un embrin vege tal temprano, tienen una estructura tan precisa como cualquier rgano de un animal. La organizacin interna del mdulo vegetal presenta esencialmente los

Figura 21 -84 Ejemplo simple de la construccin modular de las plantas. Cada mdulo (coloreados en diferentes tonos de verde) consta de un tallo, una hoja y una yema que contiene un centro de crecimiento potencial, o meristemo. La yema se forma en el nudo, punto de nacimiento de la rama, donde la hoja diverge del tallo. Los mdulos derivan secuencialmente de la actividad continua de los meristemos apicales.

El desarrollo vegetal

mismos problemas en el control gentico de su patrn de formacin que los del desarrollo animal, y se solucionan de formas anlogas. En este apartado nos centraremos en los mecanism os celulares de desarrollo de la plantas con flores. Examinaremos tantos sus diferencias como sus similitudes con los animales.

El desarrollo embrionario empieza con el establecimiento del eje raz-brote y se detiene en el interior de la semilla7 0
A pesar de la asombrosa variedad de las plantas con flores, su origen es relativa mente reciente. Los ejemplares fsiles ms tempranos son de hace 125 millones de aos, frente a los 350 millones de aos de fsiles de animales vertebrados. Este hecho contribuye a explicar por qu algunos aspectos de su forma y desa rrollo son extraordinariamente constantes. La estrategia bsica de su reproduc cin sexual est resumida esquem ticam ente en el Panel 21-2, pgina 1189. El huevo fecundado, o zigoto, de una planta superior empieza dividindose asim tricamente, estableciendo la polaridad del futuro embrin. Un producto de esta divisin es una clula pequea con un citoplasma denso, que se transformar en el embrin propiamente dicho. El otro producto es una clula grande y vacuolada, que se divide de nuevo y forma una estructura llamada el suspensor, que en algunos aspectos es comparable al cordn umbilical de los mamferos. El sus pensor mantiene unido el embrin al tejido nutritivo adyacente y proporciona una va para el flujo de nutrientes. Durante el siguiente estadio del desarrollo, la clula embrionaria diploide prolifera formando una bola de clulas que adquiere rpidamente una estructu ra polarizada. Comprende dos grupos clave de clulas proliferativas -u n o en el extremo del suspensor del embrin que generar una raz en un extremo y otro en el polo opuesto que generar un brote (Figura 21-85). El eje principal razbrote establecido de este modo es anlogo al eje cabeza-cola de un animal. Al mismo tiempo empieza a ser posible distinguir las futuras clulas epidrmicas, que forman la capa ms externa del embrin, las futuras clulas de tejido bsico, que ocupan la mayora del interior del embrin, y las futuras clulas de tejido vascular, que forman el ncleo central del embrin. Estos tres conjuntos de c lulas pueden comparase a las tres capas germinales de un embrin animal. Un poco ms tarde durante el desarrollo, el rudimento del brote empieza a producir las hojas embrionarias de la semilla, o cotildones -u n o en el caso de los monocotiledneas y dos en el caso de las dicotiledneas. Normalmente, el desarrollo

embrin

globular

cotiledon

Figura 21-85 Dos estadios de la embriognesis de la planta Arabidopsis thaliana. (Segn G. Jrgens, U. Mayer, R.A. Torres-Ruiz, T. Berleth, y S. Misra, Development [SuppLJ 1:27-38, 1991.)

suspensor

prim ordio de a raz

118 8

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

LA FLOR
Las f lo r e s , q u e c o n tie n e n la s c lu la s r e p r o d u c to r a s d e las p la n ta s s u p e r io r e s , s u r g e n a p a r t ir d e lo s m e r is te m o s a p ic a le s d e b r o te s v e g e ta le s (v a n s e F ig u r a s 2 1 - 8 4 y 2 1 - 8 8 ). C u lm in a n su c r e c im ie n t o a p a r t ir d e -e s te m e r is t e m o . F a c to r e s m e d io a m b ie n t a le s , c o m o el r it m o c ir c a d ia n o o la t e m p e r a t u r a , a c tiv a n el c a m b io d e d e s a r r o llo v e g e ta l f lo r a l. A s p u e s la s c lu la s estigma g e r m in a le s a p a r e c e n e n el t r a n s c u r s o d e l d e s a r r o llo d e la p la n ta , y lo h a c e n a p a r tir d e la s c lu la s s o m t ic a s , y n o a p a r t ir d e u n a ln e a c e lu la r g e r m in a l c o m o los a n im a le s . . \ ! es P ta lo : d is tin ta s e s tr u c tu r a s e n f o r m a d e h o ja , g e n e r a lm e n t e c o lo r e a d a s c o n t o n o s b r illa n t e s , q u e a c t a n d e s is t e m a p o lin iz a d o r , p o r e je m p lo a t r a y e n d o in s e c to s . / / ' / / / E s ta m b r e : r g a n o q u e c o n t ie n e c lu la s q u e s u fr e n m e io s is y f o r m a n g r a n o s h a p lo id e s

w '-c o -

X t!

'

d e p o le n , c a d a u n o d e lo s c u a le s c o n t ie n e / d o s c lu la s e s p e r m t ic a s m a s c u lin a s . ~ C u a n d o t r a n s f e r im o s el p o le n a un e s t ig m a , g e r m in a , y el t u b o p o ln ic o de polen

J
/

0,5 mm spalo ptalo estam bre yema tem prana de flor

La e s tr u c tu r a d e la f lo r e s v a r ia d a y c a r a c te r s tic a d e c a d a e s p e c ie ; c o m p r e n d e c u a tr o f o r m a c io n e s d e e s tr u c tu r a s c o n c n tr ic a s q u e p o d r a n c o n s id e r a r s e h o ja s m o d ific a d a s ,

] //

vulos en el ovario

j I c o n d u c e lo s d o s e s p e r m a t o z o id e s clulas 4 / in m v ile s al o v a rio . esperm tcas\ / m P is tilo : r g a n o q u e c o n t ie n e u n o o ncleo m s o v a r io s , c a d a u n o d e lo s c u a le s del tubo \ \ c o n t ie n e v u lo s . C a d a v u lo e s polnico
h u s p e d d e c lu la s q u e a t r a v ie s a n la Lv

grano/^A

fr

m e io s is , f o r m a n d o u n s a c o e m b r io n a r io q u e c o n t ie n e la c lu la h u e v o f e m e n in a (o o s f e r a ) . E n la f e c u n d a c i n , u n a c lu la e s p e r m t ic a se f u s io n a c o n la c lu la h u e v o c o n s t r u y e n d o el f u t u r o e m b r i n d ip lo id e , m ie n t r a s q u e la o tr a s e f u s io n a c o n d o s n c le o s d e l s a c o e m b r io n a r io c o n s t it u y e n d o el t e jid o t r ip lo id e e n d o s p r m ic o . S p a lo s : e s tr u c tu r a s e n f o r m a d e h o ja q u e f o r m a n u n r e v e s t im ie n t o p r o t e c t o r d u r a n t e el d e s a r r o llo flo r a l t e m p r a n o .

LA SEMILLA
U n a s e m illa c o n s ta d e un e m b ri n q u ie s c e n te , res e rva s n u tritiv a s y la e n v o ltu ra . A l fin a l d e su d e s a rro llo el c o n te n id o d e a g u a p u e d e h a b e r d e s c e n d id o d e s d e un 9 0 a un 5 % . Est p ro te g id a p o r un fru to c u y o s te jid o s s o n d e o rig e n m a te rn o .

EL EMBRION m eristem o apical del brote huevo fecundado

La o o s fe r a f e c u n d a d a d e l in t e r io r d e l s a c o e m b r io n a r io c re c e f o r m a n d o u n e m b r i n , s ir v i n d o s e d e lo s n u tr ie n te s t r a n s p o r t a d o s d e s d e el e n d o s p e r m o p o r m e d io d e l s u s p e n s o r . U n a s e r ie c o m p le ja d e d iv is io n e s c e lu la r e s , ilu s tr a d a a q u p o r u n a h ie r b a p e q u e a lla m a d a z u r r n d e p a s to r , o r ig in a u n e m b r i n c o n u n m e r is t e m o a p ic a l d e la ra z , u n m e r is t e m o a p ic a l d e l b r o te , y u n a ( m o n o c o t ile d n e a s ) o d o s (d ic o t ile d n e a s ) h o ja s o c o til d o n e s . El d e s a r r o llo se d e t ie n e e n e s te e s t a d io , y el s a c o e m b r io n a r io , q u e c o n t ie n e el e m b r i n , s e c o n v ie r t e a h o r a e n u n a s e m illa p r e p a r a d a p a r a su d is p e r s i n y c a p a z d e s o b r e v iv ir e n c ir c u n s ta n c ia s a d v e rs a s .

m eristem o \ apical^-de la raz suspensor dos hojas o cotildones

envoltura de la sem illa I "

'cotildones (reservas nutritivas)

GERMINACION
P a ra q u e u n e m b r i n c o n tin e su d e s a r r o llo e s n e c e s a r io q u e su s e m illa g e r m in e , u n p r o c e s o q u e d e p e n d e d e fa c to r e s in te r n o s (e s ta d o q u ie s c e n te ) y d e fa c to r e s m e d io a m b ie n t a le s , c o m o el a g u a , la t e m p e r a t u r a y el o x g e n o . L as r e s e r v a s n u t r it iv a s p a r a la fa s e t e m p r a n a d e la g e r m in a c i n p u e d e n s e r t a n t o el e n d o s p e r m o (m a z ) c o m o lo s c o til d o n e s ( g u is a n t e s y ju d a s ). H a b it u a lm e n t e , p r im e r o e m e r g e la ra z p r im a r ia d e la s e m illa , p a r a a s e g u r a r el s u m in is t r o d e a g u a n e c e s a r io p a ra la p l n tu la d e s d e el c o m ie n z o . El c o tile d o n (e s ) p u e d e (n ) a p a r e c e r p o r e n c im a d e l s u e lo , c o m o e n la ju d a d e ja r d n m o s t r a d a a q u , o c o n t in u a r d e b a jo d e l s u e lo , c o m o e n lo s g u is a n te s . En a m b o s c a s o s lo s c o til d o n e s a c a b a r n p o r e x t in g u ir s e . A h o r a el m e r is t e m o a p ic a l p u e d e m o s tr a r su c a p a c id a d p a r a el c r e c im ie n to c o n tin u o , p r o d u c ie n d o el p a tr n tp ic o d e n u d o s , in t e r n u d o s y y e m a s (v a s e F ig u r a 2 1 -8 4 ).

germ inacin de una juda de jardn prim eras hojas foliares sem illa todava no germ inada cotiledon m archito

cotildones

raz prim aria

'races laterales

Panel 21-2 Caractersticas generales del desarrollo temprano de las plantas con flores.

1189

se detiene poco despus de este estadio, y el embrin queda empaquetado en una semilla, especializada para la dispersin y para la supervivencia en condicio nes adversas. El em brin en la semilla se estabiliza por deshidratacin, y puede permanecer latente durante un perodo de tiempo muy largo -incluso centena res de aos. Cuando se rehidratan, las semillas germinan y contina el desarrollo embrionario.

Los mdulos repetitivos de una planta son generados secuencialmente por los meristemos7 1
Sin entrar en detalles, el em brin de un insecto o de una animal vertebrado es un modelo rudimentario a pequea escala del organismo maduro, y los detalles de la estructura del cuerpo se completan progresivamente a medida que ste aumenta de tamao. El embrin de la planta crece hasta convertirse en adulto de manera bastante diferente: las partes de la planta adulta se generan secuen cialmente por medio de grupos de clulas que proliferan estableciendo las es tructuras perifricas de la planta. Estos grupos de clulas, todos importantes, se denominan m eristem os apicales (vase Figura 21-84). Cada meristemo est for mado por una poblacin de clulas madre autorrenovables. A medida que estas clulas se van dividiendo, producen una progenie que emerger desde la regin meristemtica, crecer, y finalmente se diferenciar. Aunque los meristemos apicales del tallo y de la raz generan todas las variedades bsicas de clulas n e cesarias para formar las hojas, las races y los tallos, muchas clulas situadas fue ra de los meristemos apicales conservan la capacidad de proliferar posterior mente. De esta forma los rboles y otras plantas perennes, por ejemplo, son capaces de aumentar el grosor de sus tallos y races a medida que pasan los aos. Los rudimentos de los meristemos apicales de la raz y del tallo ya estn de terminados en el embrin. En cuanto el revestimiento de la semilla se rompe du rante la germinacin, se produce un extraordinario aumento de tamao de las clulas no meristemticas, emergiendo primero una raz que establece inmedia tam ente un anclaje en el suelo, y luego un tallo (Figura 21-86). A continuacin, en los meristemos apicales tienen lugar divisiones celulares rpidas y continuas: en el meristemo apical de una raz de maz, por ejemplo, las clulas se dividen cada 12 horas, produciendo 5 x 105 clulas cada da. Las races y los tallos, que crecen rpidamente, escudrian el entorno circundante -las races increm en tando su capacidad de captacin de agua y sales minerales del suelo, y los brotes aumentando su capacidad de fotosntesis (vase Panel 21-2, pg. 1189).

brote de m eristem o apical (escondido) cotMedon (hoja de la semilla)

La forma de cada nueva estructura depende de la orientacin de la divisin celular y de la expansin7 2

Las clulas vegetales, encerradas en el interior de sus paredes celulares, no pue den arrastrarse y tampoco pueden cambiar su posicin a medida que crece la planta, pero pueden dividirse, y pueden hincharse, estirarse y curvarse. Por lo tan to, la morfognesis de una planta en desarrollo depende de una serie ordenada de divisiones seguidas de una expansin celular orientada de forma muy precisa. La mayora de las clulas producidas en el extremo del meristemo de la raz, por ejemplo, pasan por tres fases distintas de desarrollo -la divisin, el crecimiento (elongacin) y la diferenciacin. Estas tres fases, que se solapan en el espacio y en el tiempo, dan lugar a la arquitectura caracterstica del extremo de la raz. Aunque a menudo el proceso de diferenciacin celular empieza mientras la c lula todava est creciendo, es relativamente fcil distinguir en el extremo de una raz una zona de divisin celular, una zona de elongacin celular orientada (que afecta el crecim iento longitudinal de la raz) y una zona de diferenciacin celular (Figura 21-87). El plano exacto en el que las clulas se dividen es crucial para la morfogne sis de la planta, debido a que afecta la direccin de la elongacin de la planta, y los cambios en el plano de divisin estn a menudo asociados con procesos

m eristem o apical de la raz

Figura 21 -86 Una plntula de
A ra b id o p sis. Los objetos marrones situados a la derecha de la joven plntula son las dos mitades de la envoltura de la semilla desechada. (Cortesa de Catherine Duckett.)

119 0

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

cilindro vascular que contiene xilem a y el floem a en desarrollo ZONA DE DIFERENCIACIN DE LA CLULA

pelos radiculares corteza epiderm is

ZONA DE ELONGACIN DE LA CLULA

Figura 21-87 Extremo de una raz en crecimiento. (A) Organizacin de los 2 mm finales del extremo de una raz. Se indican las zonas aproximadas en las que es posible encontrar clulas que se dividen, se alargan y se diferencian. (B) Meristemo apical y la cofia radicular del extremo o de una raz de maz, presentando las series ordenadas de las clulas producidas. (B, segn P.H. Raven, R.F. Everty S.E. Eichhorn, Biology of Plants, 4th ed. New York: Worth, 1986.)

ZONA DE DIVISIN DE LA CLULA

m eristem o apical cofia radicular

(A)

{B!

100 jm

morfognicos, como la produccin de primordios foliares o de ptalos (Figura 21-88). Los mecanismos intracelulares especiales que controlan el plano de la divisin celular se tratan en el Captulo 18. En la fase de expansin controlada que generalmente sigue a la divisin ce lular, las clulas hijas pueden a menudo aumentar su volumen cincuenta veces o ms. Esta expansin est conducida por una turgencia de base osmtica que presiona las paredes celulares de la planta hacia el exterior, y su direccin est determinada por la orientacin de los fibrillas de celulosa de la pared celular que conducen la expansin a lo largo de un nico eje (vase Figura 19-68). A su vez, la orientacin de la celulosa est aparentemente controlada por la orientacin de formaciones de microtbulos situados justo por debajo de la membrana plas mtica, los cuales parecen guiar la deposicin de celulosa (visto en el Captulo 19). Estas orientaciones pueden ser modificadas con rapidez mediante regula dores del crecimiento de la planta, como el etileno y el cido giberlico (Figura 21-89), pero los mecanismos moleculares subyacentes a estas dramticas redis tribuciones del citoesqueleto son desconocidos.

divisin divisin periclinal anticlinal (aumentos en dimetro y rea superficial)

estambre

divisin transversal (aum ento en longitud) (A)

El desarrollo vegetal

Figura 21-88 Relacin entre el plano de divisin, la expansin celular y la morfognesis. (A) Los tres planos de divisin celular que presenta un rgano vegetal tpico. Las variaciones en la proporcin de cada uno de ellos, combinadas con una expansin celular orientada, pueden ser las responsables de los patrones morfognicos que actan en las plantas. (B) Seccin longitudinal de un yema floral joven de una vincapervinca (hierba doncella). Las pequeas cpulas de clulas destinadas a convertirse en las diferentes partes de la flor son producto de una combinacin de los nuevos planos de divisiones celulares y de expansin celular orientada determinadas por refuerzos anulares de celulosa en la pared celular. (Segn N.H. Boke, Am. J. Bot. 36:535-547, 1949.)

1191

Cada mdulo de la planta crece a partir de un conjunto microscpico de primordios de un meristemo7 3

Los meristemos apicales son autoperpetuantes: continan sus funciones indefi nidamente mientras la planta sobreviva, y son responsables del continuo creci miento y desarrollo de la planta. Pero los meristemos apicales tambin dan lugar a un segundo tipo de crecimiento, cuyo desarrollo est altamente limitado y cul mina con la formacin de estructuras como una hoja o una flor, de tamao y for ma determinada y con una esperanza de vida corta. As pues, a medida que el brote se va alargando, su meristemo apical deja detrs de l una secuencia orde nada de nudos donde han crecido hojas, e internudos (segmentos del brote). De esta forma la actividad continua del meristemo produce una cantidad de m du los similares, cuyo nmero no para de aumentar; cada uno de estos mdulos est formado por un brote, una hoja y una yema (vase Figura 21-84). Los mdu los se conectan unos con otros mediante tejido de soporte y de transporte, y los sucesivos mdulos estn situados unos respecto a otros, de forma precisa, dan do lugar a una estructura de formas repetidas. Este modo de desarrollo interacti vo es caracterstico de las plantas y se observa en muchas otras estructuras a parte del sistema tallo-hoja (Figura 21-90). Aunque el mdulo final es grande, su organizacin, como la de un embrin animal, est mapada primero a escala microscpica. En el pice del brote, en un espacio de un milmetro o incluso menor, se encuentra una cpula central, pe quea y baja, rodeada por un conjunto de protuberancias de distintos tamaos (Figura 21-91). La cpula central es el meristemo apical; cada una de las protu berancias que la rodean es un primordio foliar. Esta pequea regin, por lo tan to, contiene los rudimentos ya diferenciados de varios mdulos completos. M e diante un programa muy preciso de proliferacin celular y expansin celular, cada primordio foliar y sus clulas adyacentes crecen formando una hoja, un nudo y un entrenudo. Mientras, el meristemo apical da lugar a un nuevo pri mordio foliar, generando cada vez ms mdulos, en una sucesin potencial mente infinita. La organizacin en serie de los mdulos de la planta est contro lada, de este modo, por procesos del pice del brote. Las seales locales dentro de una pequea regin determinan el patrn del primordio -la posicin de un rudimento foliar en relacin con el siguiente, el espacio existente entre ambos rudimentos y su localizacin en relacin al meristemo apical.

de dos reguladores del crecimiento vegetal, el gas etileno y el cido giberlico. Estos reguladores ejercen efectos rpidos y de consecuencias opuestas sobre la orientacin de los microtbulos corticales de las clulas de brotes jvenes de guisantes. (B) Clula tpica de una planta tratada con etileno, sus microtbulos presentan una orientacin longitudinal. (C) Clula tpica de una planta tratada con cido giberlico, sus microtbulos presentan una orientacin transversal. Se depositan microfibrillas de celulosa paralelas a los microtbulos. Debido a su influencia sobre la orientacin de la expansin celular, el cido giberlico y el etileno favorecen el crecimiento en direcciones contrarias: las plntulas tratadas con etileno desarrollan brotes bajos y gruesos (A), mientras que las plntulas que reciben tratamiento con cido giberlico desarrollan brotes altos y delgados (D).

Figura 21-90 El modelaje repetitivo de las plantas. Una colocacin correcta de los mdulos sucesivos de un nico meristemo apical produce estas complicadas aunque regulares formas en las hojas (A), flores (B) y frutos (C). (A, segn John Sibthorp, Flora Graeca. London: R.Taylor, 18061840; B, segn Pierre Joseph Redout, Les Lliliaces. Pars: chez lAuteur, 1807; C, segn Christopher Jacob Trew, Uitgezochte planten. Amsterdam: Jan Christiaan Sepp, 1771-cortesa todos ellos de John Innes Foundation.)

119 2

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

100 gm

100 pm

No se conoce prcticam ente nada sobre los mecanismos que median los procesos centrales del modelaje en el reino vegetal. Todas las estrategias que he mos tratado sobre el modelaje de la formacin de los animales -com o las basa das en morfgenos locales, los mecanismos del reloj celular y la inhibicin late ral- tambin podran darse en el reino vegetal. No obstante, estudios detallados del destino y el linaje de las clulas en el pice del brote y en el pice de la raz estn empezando a aportar parte de esta informacin bsica esencial, y empie zan a ser identificados algunos de los genes fundamentales del control del desa rrollo. La protena reguladora de genes codificada por el gen Knotted, por ejem plo, se expresa en la parte central del meristemo; una sobreexpresin de esta protena en una planta de tabaco provoca que las clulas foliares acten como meristemo, generando nuevos rganos a partir de la propia hoja.

Figura 21-91 pice del brote de una planta joven de tabaco. (A) Electronmicrografa de barrido que muestra el pice del brote con dos primordios foliares emergiendo secuencialmente, visibles aqu como dos protuberancias laterales a cada lado de la cpula del meristemo apical. (B) Seccin fina de un pice similar mostrando que el primordio foliar ms joven surge de un grupo reducido de clulas (aproximadamente 100) de las cuatro o cinco capas ms exteriores. (C) Diagrama muy esquemtico que muestra que la apariencia secuencial del primordio foliar tiene lugar sobre una distancia reducida y en una fase muy temprana del desarrollo del brote. Finalmente el crecimiento del pice formar internudos que distribuirn ordenadamente las hojas a lo largo del tallo (vase Figura 21-84). (A y B, segn R.S. Poethig e I.M. Sussex, Planta 165:158-169, 1985.)

Seales hormonales de largo alcance coordinan los procesos del desarrollo en partes distantes de la planta7 4
Para que un tallo se ramifique, han de generarse nuevos meristemos, y es m e diante el control de estos procesos que el entorno ejerce una parte importante de su influencia sobre la forma de la planta. En cada nudo, en su ngulo agudo, o axila, entre la rama foliar y el tallo, se forma una yema. Esta yema contiene un nido de clulas, derivado del meristemo apical, que ha conservado un carcter meristemtico (y que expresa Knotted). Dichas clulas han conservado su capa cidad para transformarse en el meristemo apical de una nueva rama, pero tam bin tienen la alternativa de permanecer en estado latente. El modelaje de la ra mificacin de la planta est regulado por esta opcin, en cuya eleccin participa el entorno. Partes distantes de la planta que reciben influencias de entornos dis tintos reaccionan frente a ellos individualmente mediante cambios en su desa rrollo. Sin embargo, la planta debe de continuar actuando al unsono. Esto exige que las opciones del desarrollo y los procesos de una parte de la planta afecten a las opciones del desarrollo del resto del organismo. Es preciso que existan sea les de largo alcance que den lugar a tal coordinacin. Como saben los jardineros, por ejemplo, cortando el extremo de una rama se puede estimular su crecimiento lateral: extrayendo el meristemo apical des aparece tambin una inhibicin que afecta a los meristemos axilares en estado latente, permitindoles que formen nuevos pices. En este caso la seal de largo alcance procedente del meristemo apical, o al menos un componente funda mental del sistema de seal, ha sido identificada. Es una auxina, un miembro de

El desarrollo vegetal

1193

uno de las cinco clases conocidas de reguladores del crecimiento vegetal (de nominados algunas veces hormonas vegetales), los cuales ejercen poderosas in fluencias sobre el desarrollo vegetal. Las otras cuatro clases conocidas son las giberelinas, las citoquininas, el cido abscdico y el gas etileno. Tal como se muestra en la Figura 21-92, todas ellas son pequeas molculas que atraviesan fcilmente las paredes celulares. Todas estn sintetizadas por la mayora de las clulas vegetales y pueden tanto actuar localmente como ser transportadas in fluyendo a distancia en otras clulas diana. La auxina, por ejemplo, se transporta de una clula a otra a la velocidad aproximada de un centmetro por hora desde el extremo de un brote hacia su base. Cada factor regulador de crecimiento tiene mltiples efectos, que estn modulados por otros reguladores del crecimiento y por seales procedentes del entorno y del estatus nutritivo. As pues, la auxina sola puede estimular la formacin de la raz, pero conjuntamente con la giberelina puede estimular la prolongacin del tallo, con la citoquinina puede suprimir el crecimiento lateral del brote, y con el etileno puede estimular el crecimiento la teral de la raz. Los receptores que reconocen estos reguladores del crecimiento empiezan a ser caracterizados, y los mecanismos de sus actuaciones continan siendo un misterio.

C= C

/ \

etileno

o^

ch3

cooh

cido abscsico (ABA, de "abscisic acid")

-CH2COOH

cido ndol-3-actico (IAA, "indole-3-acetic acid") [una auxina]

CH2OH

Arabidopsis se utiliza como organismo modelo para la gentica molecular de las plantas75
La investigacin sistem tica en busca de mutaciones que afecten el modelaje del embrin vegetal ha facilitado que se empiecen a identificar los genes que dirigen el desarrollo vegetal y que se empiece a dilucidar su funcionamiento. Este enfo que precisa de una planta que sea, como Drosophila o Caenorhabditis elegans, pequea, de reproduccin rpida, y apropiada para los estudios genticos. El papel de planta modelo recay en un pequeo vegetal, el berro comn de pa red A rabidopsis thalian a (Figura 21-93), ya que se pueden hacer crecer un gran nmero de individuos en el interior de un tubo de ensayo y producir millares de brotes por planta al cabo de 8 a 10 semanas. Arabidopsis tambin presenta la ventaja para el anlisis molecular de tener el genoma vegetal ms pequeo co nocido (7 x 107 pares de nucletidos), comparable al de la levadura (2 x 107 pares de nucletidos), C. elegans (10 8 pares de nucletidos) y Drosophila (10 8 pares de nucletidos). Se han llevado a cabo cultivos celulares y se han establecido m to dos de transformacin gnica, se ha aislado un gran nmero de mutantes de in ters y ahora disponemos de una notable coleccin de clones de DNA genmico. Arabidopsis presenta, al igual que C. elegans, una ventaja importante sobre Dro sophila para los estudios genticos: como muchas otras plantas con flor, se pue de reproducir como hermafrodita debido a que una sola flor produce tanto las clulas huevo como el polen que las puede fecundar. Por lo tanto, cuando una flor que es heterozigota debido a una mutacin letal recesiva se autofecunda, una cuarta parte de sus semillas presentar el fenotipo embrionario homozigoto (Figura 21-94). Mediante la utilizacin de mutgenos para generar decenas de millares de plantas mutantes, e inspeccionando de este modo su progenie, se ha identificado hasta el momento un total de 50 genes distintos que controlan la formacin de los patrones embrionarios de Arabidopsis. Como en Drosophila, los genes del mode laje pueden agruparse segn sus fenotipos mutantes homozigotos (Figura 21-95). Unos son necesarios para la formacin de la raz de la semilla, otros para el tallo de la semilla y otros para el pice de la semilla con sus cotildones. Otro tipo de genes es necesario para la formacin de los tres tejidos bsicos -la epidermis, el tejido fundamental y el tejido vascular- y todava otra clase de genes es necesaria para los cambios programados de la forma celular que dan al embrin de la semi lla su forma alargada. Ahora que poseemos este catlogo de genes fundamentales, pronto debera de ser posible dar otro paso y descubrir su funcionamiento. Pero a partir de la gran cantidad de fenotipos mutantes, ya parece probable que el m o delaje del embrin se pueda explicar conceptualmente de la misma forma que

zeatina [una citoquinina]

COOH

cido giberlico (GA3, "gibberellic acid") [una giberelina]

Figura 21-92 Reguladores del crecimiento vegetal. Frmula de una
molcula representativa de cada uno de los cinco grupos de molculas reguladoras naturales del crecimiento vegetal.

1194

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

Figura 21-93 Arabidopsis thaliana. Esta pequea planta pertenece a la familia de la mostaza (o crucifera). Es una hierba que carece de valor econmico pero de gran valor para estudios genticos del desarrollo vegetal. (Cortesa de Chris Sommerville).

para los animales. Tal como veremos ahora, lo mismo puede decirse de los pro cesos posteriores del desarrollo por los que se genera una flor.

Los genes selectores homedticos definen las partes de una flor76

Los meristemos tienen que elegir entre otras opciones de desarrollo adems de elegir entre permanecer en estado latente o iniciar el crecimiento; dichas opcio nes tambin se ven influidas frecuentemente por el entorno. La decisin ms importante es la de formar una flor (Figura 21-96). El cambio que se produce a partir del desarrollo meristemtico hacia la for macin de la flor est desencadenado, normalmente, por la luz. Mediante unos mecanismos poco conocidos basados en la absorcin de la luz por medio de unas protenas especficas denominadas fitocromos, las clulas del meristemo son capaces de modificar su patrn de expresin gnica en respuesta a un cam bio en la longitud del da, y de esta forma, de experimentar el cambio de estado que marca el inicio el desarrollo de la flor. A travs de este cambio de su estado, el meristemo apical abandona sus opciones de continuar el crecimiento vegeta tivo y apuesta su futuro en la produccin de gametos. Sus clulas se embarcan en un estricto programa de crecimiento y diferenciacin finito: por medio de

sem illa mutada

plntula

sector de clulas m utantes del m eristem o

vainas de sem illas procedentes de:

Figura 21 -94 Produccin de imitantes de Arabidopsis. Una semilla, que contiene un embrin pluricelular, se trata con un mutgeno qumico y se deja que se convierta en una planta. En condiciones normales, esta planta ser un mosaico de clones de clulas portadoras de varias mutaciones inducidas. Normalmente, cada flor producida por esta planta estar compuesta por clulas que pertenezcan al mismo clon, todas ellas portadoras de la misma mutacin, m, en forma heterozigota (m/+). La autofecundacin de flores individuales a travs de su propio polen generar vainas de semillas, cada una de las cuales contendr una familia de embriones la mitad de los cuales, por trmino medio, sern heterozigotos (m/+), una cuarta parte sern homozigotos mutantes im/m), y una cuarta parte sern homozigotos de tipo salvaje (+/+).

25% m/m

50% m/+

25% +/+

100% + / +

generacin F2

El desarrollo vegetal

1195

Figura 21 -95 Plntulas mutantes de

A ra b id o p sis. Comparacin entre una plntula normal (A) y cuatro tipos de mutantes (B-E) que carecen de alguna parte distinta del patrn apicobasal: (B) presenta estructuras que carecen de su apndice, (C) presenta apndice y raz pero carece del tallo que las une, (D) carece de raz, y (E) forma los tejidos del tallo pero presenta carencias en ambos extremos. Las plntulas han sido transparentadas para mostrar los tejidos vasculares de su interior (puntos claros). (Segn U. Mayer et al., Nature 353:402-407, 1991. 1991 Macmillan Magazines Ltd.)

una modificacin de los mecanismos ordinarios que generan las hojas, se forman siguiendo un orden muy preciso una serie de pices especializados o verticilos -habitualm ente primero los spalos, luego los ptalos, ms adelante los estam bres portadores de las anteras que contienen el polen, y finalmente los pistilos que contienen las dos clulas huevo (vase Panel 21-2, pg. 1189). Al final de este proceso ha desaparecido el meristemo, pero entre su progenie ha producido c lulas germinales. Las series de hojas modificadas que forman una flor pueden comparase con las series de segmentos corporales que forman una mosca. En las plantas, igual que en las moscas, se pueden encontrar mutaciones hometicas que convierten una parte del patrn al carcter de otra parte. Los fenotipos mutantes pueden agruparse en tres clases (Figura 21-97) en las que se modifican conjuntos de r ganos diferentes pero solapados. Esta primera clase, ilustrada por la mutante apetala2 de Arabidopsis, tienen los dos verticilos externos transformados: los s palos estn transformados en pistilos y los ptalos en estambres. El segundo tipo, ilustrado por apetala3, tiene los dos verticilos medio transformados: los p talos estn convertidos en spalos y los estambres en pistilos. El tercer tipo, ilus trado por agamous, tiene sus dos verticilos centrales transformados, con una

Figura 21-96 Estructura de la flor

d e A ra b id o p sis. (A) Fotografa. (B) Dibujos. (C) Imagen esquemtica de una seccin transversal. El plano bsico, ilustrado en (C), es comn a la mayora de las plantas dicotiledneas con flores.

pistilo

estniurc peiao
ulamur

pistilo

ptalo

A)
119 6 Captulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo

Figura 2 1-97 Flores de Arabidopsis que presentan mutaciones hometicas. (A) En agamous, los estambres se convierten en ptalos y los pistilos en el meristemo floral; (B) en apetala3, los ptalos se convierten en spalos y los estambres en pistilos; (C) en apetala2, los spalos se convierten en pistilos y los ptalos en estambres. Otro gen, pistillata, presenta un fenotipo mutante parecido a la apetala3\ de este modo es posible identificar las tres clases funcionales de genes selectores hometicos. (D) En una mutante triple que carezca de las tres funciones, todos los rganos de la flor se convierten en hojas. (A-C, cortesa de Leslie Sieburth; D, cortesa de Mark Running.)

< 0/

consecuencia ms drstica: los estambres estn convertidos en ptalos, la flor carece de pistilos y en su lugar las clulas centrales se comportan como un m e ristemo floral, el cual empieza de nuevo todo el proceso del desarrollo, generan do otro conjunto anmalo de spalos y ptalos que anida dentro del primer m e ristemo y, potencialmente, otro conjunto anidado dentro del segundo meristemo, y as indefinidamente. Estos fenotipos identifican tres clases de ge nes selectores hometicos, los cuales, al igual que los genes selectores hom eti cos de Drosophila, codifican protenas reguladoras de genes. Estas protenas de finen las diferencias del estado celular que otorgan a las diferentes partes de una flor normal sus distintos caracteres. La hibridacin in situ confirma que los ge nes se expresan segn los patrones previstos de acuerdo con esta interpretacin (Figura 21-98). En una mutante triple en la cual las tres funciones gnicas estn ausentes, se obtiene en lugar de una flor una sucesin infinita de hojas anidadas de forma compacta. Por lo tanto las hojas representan un estado bsico en el cual no se expresa ninguno de estos genes selectores hometicos, mientras que los otros tipos de rganos son el resultado de la expresin de genes en com bina ciones diferentes. Con la boca de dragn Antirrhinum majus se han llevado a cabo estudios si milares a ste y se ha identificado un conjunto parecido de fenotipos y genes. La secuenciacin de genes revela que, a pesar de la larga distancia en la evolucin existente entre Antirrhinum y Arabidopsis, los fenotipos hometicos correspon dientes surgen a partir de mutaciones en genes homlogos: las plantas, como los animales, han conservado sus sistemas de genes selectores hometicos. Otra vez, el conjunto de estos genes parece haber surgido por duplicacin gnica: va rios de ellos, necesarios en los diferentes rganos de la flor, tienen secuencias claramente homlogas. No son de la clase homeobox pero estn relacionados con otra familia de protenas reguladoras de genes (la denominada familia MADS) presente en levaduras y vertebrados.

El desarrollo vegetal

1197

verticilo 2 ptalo (ab) verticilo 1 spalo (a)

verticilo 3 estam bre (be) verticilo 4 pistilo (c) = gen a (apetala2) expresado en el m eristem o = gen b ( apetala3) expresado en el m eristem o = gen c (agam ous ) expresado en el m eristem o

flo r norm al

Arabidopsis.
verticilo 2 spalo (a) verticilo 1 spalo (a) verticilo 3 pistilo (c) verticilo 4 pistilo (c)

Las investigaciones sobre la gentica molecular del desarrollo vegetal aca ban de comenzar. Por el m omento, no se conoce casi nada, por ejemplo acerca de los sistemas genticos responsables de la com unicacin local clula-clula ni sobre la sealizacin posicional en la formacin del patrn vegetal. Sin em bar go, ya est claro que plantas y animales, a pesar de sus diferencias, han encon trado de forma independiente soluciones muy similares a muchos de los proble mas fundamentales del desarrollo pluricelular.

Resumen

El desarrollo de una planta con flores, igual que el de un animal, empieza con la di visin de un huevo fecundado formando un embrin con una organizacin polari zada: la parte apical del embrin forma primero el brote, la parte basal (la raz) y la parte media (el tallo). Primero la divisin celular se da a lo largo de todo el cuer po del embrin. No obstante, a medida que el embrin crece, la adicin de nuevas clulas queda restringida a regiones pequeas denominadas meristemos. Los meristemos apicales, situados en el extremo del brote y en el de la raz, persisten du rante toda la vida de la planta, concedindole la capacidad de crecer secuencialmente aadiendo nuevas partes del cuerpo a su periferia. Habitualmente, el brote genera series repetitivas de mdulos, cada uno de los cuales consta de un segmento de tallo, una hoja y una yema axilar. Una yema axilar es un nuevo meristemo en potencia, capaz de dar lugar a un rama lateral; el entorno puede controlar el desa rrollo de la planta regulando la activacin de sus yemas. Las seales del entorno
119 8 Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

Figura 21 -98 Expresin de los genes selectores hometicos en la flor de (A) Diagrama de los patrones normales de expresin de los tres genes cuyos fenotipos mutantes se ilustran en la Figura 21-97. Los tres genes codifican protenas reguladoras de genes. El sombreado de color en la flor nos indica los rganos que desarrolla cada verticilo del meristemo, lo cual no implica que los genes selectores hometicos estn an activos en este estadio. (B) Patrones de una mutante en la que el gen apetala3 es defectuoso. Debido a que el carcter de los rganos de cada verticilo se define por el conjunto de genes selectores hometicos que expresan, los estambres y los ptalos se convierten en spalos y pistilos. Las consecuencias de carencias de un gen de clase a, como apetala2, son un poco ms complejas: la ausencia de un producto gnico de clase a permite que el gen de clase c se exprese tanto en el exterior como en el interior de ambos verticilos, haciendo que estos verticilos exteriores se desarrollen como pistilos y estambres, respectivamente. La deficiencia de genes de clase c impide que la regin central sufra la diferenciacin terminal como pistilo, de forma que contina su crecimiento como meristemo generando cada vez ms spalos y ptalos.

axn (desde menos de 1 mm a ms de 1mm de longitud)

Jas dendritas reciben las seales de entrada de las sinapsis soma celular las ramas terminales de los axones establecen sinapsis sobre las clulas diana

25 [jm

Figura 21 -99 Neurona tpica de un vertebrado. Las flechas sealan las direcciones en que se transmiten las seales. La neurona representada pertenece a la retina de un mono. Las neuronas ms largas y grandes de un humano tiene una extensin de cerca de 1 milln de |im y su axn un dimetro de 15 |im. (Ilustracin de la neurona de B.B. Boycott en Essays on the Nervous System [R. Bellairs y E.G. Gray, eds.]. Oxford, UK: Clarendon Press, 1974.)

tambin pueden provocar que el meristemo apical pase deformar hojas a formar flores. Seales de largo alcance mediadas por hormonas vegetales coordinan los procesos de este desarrollo que tienen lugar en partes distantes de la planta. Sin embargo, la organizacin interna de cada mdulo de la planta est contro lada por mecanismos deformacin de patrones muy estrictos, anlogos a los que controlan el desarrollo animal. Estos mecanismos actan en las proximidades del meristemo apical, donde las posiciones relativas de los rudimentos foliares y otros rganos estn inicialmente mapados a escala microscpica. El patrn de hojas mo dificadas -spalos, ptalos, estambres y pistilos- de una flor se establecen deforma similar. La base gentica del patrn deformacin de las plantas puede analizarse del mismo modo que el de Jos animales. La pequea hierba A rabidopsis th alian a es muy utilizada como "planta modelo en tales estudios. Los genes que controlan la organizacin del embrin, anlogos a los genes de polaridad del huevo y los genes de segmentacin de D rosophila, pueden ser identificados. La secuencia de las par tes en una flor est controlada por genes selectores hometicos estrechamente an logos (aunque no homlogos) a los de los animales.
El desarrollo neural 77
Las clulas nerviosas, o neuronas, son unas de las ms antiguas de todos los ti pos de clulas animales especializadas, y son tan importantes para las medusas y anmonas marinas como para los gusanos, las moscas o los humanos. Su es tructura es distinta a la de cualquier otro tipo de clula; los problemas que plan tea el desarrollo del sistema nervioso no estn presentes en otros tejidos. Por en cim a de todo, lo que sorprende ms de una neurona es su forma enormemente extendida, formada por un largo axn y dendritas que conectan con otras clu las por medio de las sinapsis (Figura 21-99). El principal desafo del desarrollo neural consiste en explicar cmo crecen los axones y las dendritas, cmo en cuentran sus compaeros adecuados, y cmo establecen sinapsis selectivas con ellos generando una red funcional (Figura 21-100). Muchos de los com ponentes caractersticos del sistema nervioso -lo s diver sos tipos de neuronas, clulas sensoriales y m usculares- se originan en lugares del embrin muy diferentes e inicialmente estn desconectados entre s. As

Figura 21 - 100 La compleja organizacin de las conexiones de las clulas nerviosas. Este dibujo semiesquemtico ilustra una seccin transversal de una pequea parte del cerebro de mamfero -el bulbo olfativo de un perro, impregnado con la tcnica de Golgi. Las manchas negras son neuronas; las lneas delgadas son axones y dendritas, mediante las cuales se interconectan varios conjuntos de neuronas siguiendo reglas muy precisas. (Segn C. Golgi, Riv. sper. freniat. Reggio-Emilia 1:405-425,1875; reproducido por M. Jacobson, Developmental Neurobiology, 3rd ed. New York: Plenum, 1992.)

El desarrollo neural

1199

gnesis de las neuronas

crecimiento de axones y dentritas

refinamiento de las conexiones sinpticas

fe

pues, durante la primera fase del desarrollo neural (Figura 21-101), se desarro llan las diferentes partes del sistema neural, segn sus programas locales, que actan de acuerdo a los principios de diversificacin celular comunes a otros te jidos del cuerpo que ya hemos visto. La fase siguiente implica un tipo de morfo gnesis exclusiva del sistema nervioso: se establece, a lo largo de rutas especfi cas, un conjunto provisional pero ordenado de conexiones entre las diferentes partes del sistema nervioso, mediante el crecimiento de axones y dendritas, gra cias al cual pueden empezar a interactuar. En la tercera y ltima fase, que se prolongar en la vida adulta, las conexiones se ajustan y perfeccionan a travs interacciones entre los diferentes componentes, mediante un mecanismo que depende de las seales elctricas que transmiten y reciben.

Figura 21-101 Las tres fases del desarrollo neural.

Las reservas de neuronas generadas en el inicio del desarrollo neural no se reemplazarn posteriormente7 8
En todos los animales, el sistema nervioso se desarrolla a partir del ectodermo. Como hemos visto en este captulo, en los vertebrados, en los cuales nos centra remos, el sistema nervioso deriva principalmente de dos grupos de clulas -las clulas del tubo neural (una invaginacin del ectodermo) y las clulas de la cres ta neural (una poblacin de clulas que se liberan del ectodermo neuronal y migran hacia otras regiones del embrin). El tubo neural forma el sistema nervioso central (la mdula espinal y el cerebro, incluyendo la retina del ojo), mientras que la cresta neural da lugar a la mayora de las neuronas y a las clulas de sos tn del sistema nervioso perifrico (Figura 21-102).

tubo neural placodo/ vescula auditiva cresta neural ojo placodo nasal corazn

de los ganglios sensoriales craneales som ito vaso sanguneo

Figura 21-102 Diagrama de un embrin temprano de pollo (2 l/2 das), que muestra los orgenes del sistema nervioso. El tubo neural (en verde claro) ya
est cerrado, salvo en el extremo de su cola, y yace internamente bajo el ectodermo, al que perteneca originalmente (vase Figura 21-10). La cresta neural (en rojo ) yace dorsalmente bajo el ectodermo, dentro o encim a del tubo neural. Adems, los p la c o d o s (en verde oscuro), engrosamientos de la superficie del ectodermo de la cabeza, dan lugar a algunas clulas transductoras sensoriales y neuronas de esta regin, incluyendo las de la nariz y del odo. Las clulas de la retina del ojo, por el contrario, tienen su origen en el tubo neural.

pliegues neurales (el tubo neural an no se ha cerrado)

120 0

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

Figura 21 -103 Formacin del tubo neural. Electronmicrografa de barrido que muestra una seccin transversal del tronco de un embrin de pollo de dos das de edad. El tubo neural est a punto de cerrarse y separarse del ectodermo; en este estadio consta (en el pollo) de un epitelio de un grosor de una sola clula. (Cortesa de lean Paul Revel).

to r n

cresta neural ectoderm o

tubo neural

notocorda

El tubo neural, que trataremos ms profundamente, consta inicialmente de un epitelio de una sola capa (Figura 21-103) que genera tanto las neuronas como las clulas de sostn, denominadas gliales, es decir las clulas del sistema ner vioso central. Durante el proceso se transforman formando una estructura ms gruesa y com pleja con muchas capas de clulas de distintos tipos. Debido a que las neuronas ya diferenciadas no se dividen, se puede asignar un nacim iento a cada una de ellas, definido como el momento en que ocurre la mitosis final que generar la neurona a partir de una clula precursora de neuronas en divisin. Tanto en los vertebrados superiores como en los inverte brados, todos los nacimientos de las neuronas de un tipo determinado general mente ocurren en el transcurso de un perodo estrictamente limitado, tras el cual no se producirn ms neuronas de este tipo. Cada regin del tubo neural en desarrollo tiene su propio programa de divisiones celulares, y las neuronas con momentos distintos de nacimientos normalmente tendrn funciones distintas. Las clulas neurales madre no acostumbran a persistir una vez completada la produccin de clulas nerviosas, por lo que las poblaciones de clulas nerviosas solamente se podrn regular disminuyendo de nmero, mediante la muerte ce lular, como veremos ms adelante.

El momento y el lugar de nacimiento de una neurona determinarn sus conexiones7 9

Antes de emitir al exterior su axn y sus dendritas, la neurona inmadura o su precursora acostumbran a migrar desde su lugar de nacimiento y se establecen en alguna otra localizacin. Las clulas gliales muy a menudo proporcionan una va para la migracin en el sistema nervioso central. Por ejemplo, el tubo neural de un embrin de un vertebrado contiene un armazn de clulas gliales radia les. Cada una de estas clulas se extiende desde el interior del tubo hacia su superficie exterior, una distancia que en la corteza cerebral del cerebro en desa rrollo de un primate puede llegar a representar hasta 2 cm. Las futuras neuronas atraviesan sus ltimas divisiones celulares cerca del lumen del tubo neural y entonces se trasladan hacia el exterior arrastrndose sobre las clulas gliales (Figura 21-104).

El desarrollo neural

1201

superficie externa del tubo neural en desarrollo y t ' t m ti i"

prolongacin - d e las clulas gliales radiales

neurona en m igracin

ncleo ' t t > 1 i

Figura 21-104 Migracin de neuronas inmaduras a lo largo de las clulas gliales radiales. Los diagramas se basan en reconstrucciones efectuadas a partir de la corteza cerebral de un mono (parte del tubo neural). Las neuronas nacen cerca de la superficie luminal interna del tubo neural y migran hacia el exterior. Las clulas gliales radiales pueden considerarse como las clulas supervivientes del epitelio columnar original del tubo neural, sorprendentemente estiradas como el grosor de la pared del tubo. (Segn P. Rakic,/. Comp. Neurol. 145:61-84, 1972.)

1 1 i superficie interna de un tubo neural en desarrollo

soma celular de una clula glial radial 10 pm

Sucesivas cohortes de clulas migrantes, nacidas en momentos distintos, se establecen en posiciones distintas. Por ejemplo, en la corteza cerebral, las neuro nas estn dispuestas en capas segn su momento de nacimiento, como resulta do de una migracin en la que las clulas nacidas ms tarde adelantan a las que nacieron antes. Gracias al trasplante de clulas entre embriones jvenes y em briones maduros se puede demostrar que las diferentes opciones de futuro ya es taban tomadas antes de iniciar la migracin; reflejan diferencias entre los carac teres intrnsecos de las clulas producidas en momentos distintos -diferencias que influirn tam bin en las conexiones sinpticas que se formarn posterior mente. De este modo, en la corteza cerebral las clulas nacidas primero (capas internas) enviarn sus axones hacia el exterior de la corteza, mientras que las c lulas nacidas ms tarde (capas externas) enviarn sus axones hacia las regiones del interior de la corteza. La relacin entre el momento del nacimiento y las co nexiones de los axones se mantiene incluso en ratones mutantes cuyas migracio nes son anormales e invierten las posiciones finales de las clulas nacidas prime ro con las que lo hacen posteriormente, lo que confirma que las conexiones reflejan el carcter intrnseco de las neuronas, ms que su localizacin final (Figura 21-105). No menos importante que el mom ento de nacimiento de una neurona es el lugar en que lo hace. Las clulas de diferentes regiones del tubo neural tienen valores posicionales distintos que controlan las conexiones que formarn. Estas diferencias dependientes de la posicin son apreciables tanto en el patrn de ex presin de los genes Hox, que ya hemos visto, com o en un gran grupo de otros genes que codifican protenas reguladoras de genes y otras molculas regulado ras. Se conocen muy pocos de los mecanism os que generan las diferencias m o leculares entre la futuras neuronas, pero los que se conocen parecen ser muy parecidos a los m ecanism os del patrn de formacin que vimos anteriormente. Sin embargo, la cuestin que hemos de afrontar ahora es otra: Cmo actan las

1 20 2

Captulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo

CORTEZA D E RATN NORMAL

CORTEZA DE RATON REELER

aunque estn mal emplazadas, las clulas piram idales pequeas, de nacim iento posterior, envan axones a otras regiones de la corteza
.f c

Ai ! !

aunque estn mal situadas, las clulas piram idales grandes y de form a irregular, de nacim iento tem prano, envan axones a regiones situadas fuera de la corteza

p p
kTkm

Figura 21 -105 Comparacin entre la disposicin de capas de neuronas de la corteza de ratones normales y reeler. En el mutante reeler una anomala en la migracin celular provoca una inversin aproximada de la relacin habitual entre el momento del nacimiento neuronal y la posicin de las neuronas. Sin embargo las neuronas emplazadas de forma incorrecta se diferencian y realizan las conexiones adecuadas segn el momento de su nacimiento.

clulas nerviosas recin nacidas, equipadas con sus marcadores especficos, para establecer un patrn de conexiones bien ordenado?

Cada axn o dendrita se extiende gracias a un cono de crecimiento situado en su extremo77,80

Por regla general, los axones y las dendritas.empiezan a desarrollarse a partir del cuerpo de la clula nerviosa poco despus de que el soma celular haya alcanzado su localizacin final. La secuencia de los procesos que se producen se observ originalmente sobre tejido embrionario intacto mediante el mtodo de impreg nacin de Golgi (vase Figura 21-106). Esta tcnica, y otros mtodos que se desa rrollaron posteriormente, han revelado un engrosamiento irregular y erizado en el extremo de cada prolongacin en desarrollo de la clula nerviosa. Parece ser que esta estructura, que se denomina cono de crecimiento, se arrastra a travs del tejido de su alrededor. Esto incluye la maquinaria que produce el movimiento y el mecanismo que dirige el extremo de cada prolongacin por el camino ade cuado. La mayor parte de los conocim ientos de que disponemos sobre las propie dades de los conos de crecimiento procede de estudios realizados en cultivos tisulares y celulares. Es posible observar cmo una neurona empieza a extender sus prolongaciones: primero son todas iguales, hasta que uno de los conos de crecimiento acelera su prolongacin bruscamente, identificndose esta prolon gacin con el axn y presentando el conjunto de protenas especficas del axn

cono de crecim iento de una neurona sensorial entrando en la mdula espinal soma celular de una neurona sensorial

I }J

soma celular de una interneurona cono de crecim iento de una interneurona que permanece dentro de la mdula espinal cono de crecim iento de una m otoneurona abandonando la mdula espinal

soma celular de una m otoneurona

El desarrollo neural

Figura 21-106 Los conos de crecimiento de la mdula espinal en desarrollo de un embrin de pollo de 3 das. El dibujo muestra una seccin transversal impregnada con la tcnica Golgi. Aparentemente la mayora de las neuronas tiene inicialmente una nica prolongacin alargada: el futuro axn. Los conos de crecimiento de las interneuronas permanecen dentro de la mdula espinal, los de las motoneuronas salen de ella (emprendiendo su camino hacia los msculos) y los de las neuronas sensoriales crecen hacia interior de la mdula espinal desde el exterior (donde se hallan sus cuerpos celulares). Muchas de las clulas de las regiones ms centrales de la mdula espinal embrionaria an estn proliferando y no han empezado a diferenciarse como neuronas o clulas gliales. (De S. Ramn y Cajal, Histologa del sistema nervioso del hombre y los vertebrados. Pars: Maloine, 1909-1911; reeditado, Madrid: C.S.I.C., 1972.)

1203

Figura 21 -107 Formacin de axones y dendritas en cultivo. Se ha aislado

una neurona joven del cerebro de un mamfero y se ha colocado en un cultivo para su desarrollo, donde emitir prolongaciones. Una de estas prolongaciones, el futuro axn, ha empezado a crecer ms rpidamente que las otras (las futuras dendritas) y se ha bifurcado. (A) Fotografa en contraste de fases; (B) patrn de impregnacin con faloidina fluorescente, que se une a los filamentos de actina. La actina se concentra en los extremos de las prolongaciones de los conos de crecimiento, que son muy activos extendindose y en otras actividades de los lamelipodios. (Cortesa de Kimberly Goslin, segn Z.W. Hall, An Introduction to Molecular Neurobiology. Sunderland, MA: Sinauer, 1992.)

(Figura 21-107). El contraste entre el axn y las dendritas, establecido en este es tadio, provocar que ambos tipos de prolongaciones crezcan hacia direcciones distintas, siguiendo caminos diferentes, y as desempeando funciones distintas en la formacin de las sinapsis. La distincin entre el axn y la dendrita no es a menudo fcil de observar en una neurona aislada en un cultivo, y es conveniente referirse a ambos tipos de prolongaciones como: neuritas. El cono de crecimiento situado en el extremo de una neurita de crecim iento rpido tpico, avanza a una velocidad de 1 mm por da. La neurita consta de una extensin ancha y aplanada como la palma de una mano, con numerosas y largas microespinas o filopodios que se extienden como dedos a partir de ella (Figura 21-108). Estos filopodios permanecen en continua actividad: unos se retraen hacia el cono de crecimiento mientras que otros se alargan, ondulndose y adhirindose al substrato. Las membranas o velos existentes entre los filopodios forman lamelipodios, con una membrana fruncida. Todas estas caractersticas, al igual que la configuracin interna del citoesqueleto, sugieren que el cono de crecimiento avanza arrastrndose de un modo muy parecido al del borde anterir de una clula como un neutrfilo o un fibro blasto, como vimos en el Captulo 16. El cono de crecim iento explora con sus filopodios y lamelipodios las regio nes del medio situadas en posiciones ms avanzadas, en todas direcciones. Si estas protuberancias entran en contacto con una superficie poco favorable, se retraen; si entran en contacto con una superficie ms favorable, se mantienen estiradas, orientando la extensin de todo el cono en esa direccin. De esta for ma el cono de crecim iento se puede guiar mediante sutiles variaciones de las propiedades de superficie del substrato sobre el que se desplaza.

Figura 21 -108 Conos de crecimiento neural. (A) Electronmicrografa de

barrido de los conos de crecim iento presentes en el extremo de una neurita emitida por una neurona simptica en cultivo. En este caso, un cono de crecim iento se ha divido en dos. Observnse los numerosos filopodios y el aspecto tenso de la neurita, debido a la tensin generada por el movimiento hacia adelante de los conos de crecimiento, que a menudo son los nicos puntos de adhesin firme al substrato. (B) Electronmicrografa de barrido del cono de crecim iento de una neurona sensorial in vivo, arrastrndose por la superficie interna de la epidermis de un renacuajo de X enopus. (A, de D. Bray, en Cell Behaviour [R. Bellairs, A. Curts, y G. Dunn, eds.]. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1982; B, de A. Roberts, B rain Res. 118:526-530, 1976.)

1G |jm

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Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

El cono de crecimiento conduce in vivo a la neurita en desarrollo a travs de una va definida con precisin8184
En general en los animales vivos los conos de crecimiento se desplazan hacia sus destinos a lo largo de rutas establecidas, sirvindose de mltiples seales para encontrar su camino. Muy a menudo toman rutas que ya han sido utilizadas an teriormente por otras neuritas, siguindolas mediante guas de contacto. Como consecuencia de ello, las fibras nerviosas de un animal adulto suelen estar agru padas formando haces compactos y paralelos (denominados fascculos o tractos fibrosos ). Es probable que el avance de los conos de crecimiento a lo largo de los axones est mediado por molculas de adhesin clula-clula homoflicas -glucoprotenas de membrana que capacitan a las clulas que las expresan para ad herirse a otras clulas que tambin las expresen. Como vimos en el Captulo 19, dos de las clases ms importantes de estas molculas son las que pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas, como N-CAM, y a la familia de las cadherinas dependientes de Ca2+, como la cadherina N. Generalmente existen m iem bros de ambas familias en las superficies de los conos de crecimiento, de los axones y de muchos otros tipos celulares sobre los que se arrastran los conos de crecimiento, incluyendo la& clulas gliales del sistema nervioso central y las c lulas musculares de la periferia del cuerpo. Los conos de crecimiento tambin migran sobre com ponentes de la matriz extracelular, especialmente la laminina, a la cual se adhieren mediante receptores de la matriz de la superficie celular de la familia de las integrinas (tratados en el Captulo 19). En algunos casos se puede demostrar la importancia de una molcula de adhesin clula-clula o clula-matriz simplemente bloqueando su funcin con un anticuerpo y observando los trastornos causados sobre el crecimiento del axn. Sin embargo, por regla general un cono de crecimiento utiliza varios siste mas de adhesin en sus migraciones, y si utilizamos anticuerpos contra uno solo de ellos, los efectos sern mnimos; slo cuando se aplican mltiples anticuer pos, de modo que se bloqueen todos a la vez, se retrasa seriamente el viaje del cono de crecimiento. En principio, diferentes combinaciones de molculas de ad hesin proporcionan una gran variedad de propiedades de superficie de los conos de crecimiento y una sutil y compleja seleccin de vas de acuerdo con las com bi naciones de molculas presentes en las superficies de las clulas que se encuen tran a lo largo de la ruta. Todava desconocem os hasta qu punto son suficientes las diferentes com binaciones de protenas de adhesin como N-CAM, cadherina N e integrinas en la membrana del cono de crecimiento para explicar por qu algunos conos de crecimiento escogen una ruta mientras otros escogen otra, o por qu un conjun to de axones, cuando han llegado a su regin diana, son capaces de generar for maciones ordenadas de sinapsis. Seguramente las molculas de adhesin no son las nicas influencias que participan en estos procesos. Los contactos que un cono de crecim iento establece con las superficies celulares y con la matriz pue den dar lugar a seales intracelulares que, por ejemplo, pueden inhibir activa mente cualquier avance. Substancias difundidas a travs del medio extracelular tambin pueden dar lugar a gradientes que proporcionen un gua. Por ejemplo, en la mdula espinal en desarrollo existe un grupo de neuronas cuyos axones se desplazan ventralmente, hacia la placa bsica del tubo neural, cruzando, por esta ruta, hacia el otro lado del tubo. Si colocamos estas neuronas en cultivo cer ca de un explante de la placa bsica, sus axones orientarn de nuevo su creci miento hacia l, lo cual implica que las clulas especializadas de la placa bsica secretan molculas que tienen un efecto de gua quimiotctica.

Los tejidos diana liberan factores neurotrficos que controlan el crecimiento y la supervivencia de las clulas nerviosas82,85
La mayora de los tipos de neuronas del sistema nervioso central y perifrico de los vertebrados se producen en cantidades excesivas: un 50% o incluso ms de es-

E1 desarrollo neural

1205

tas neuronas morirn poco despus de alcanzar su destino, aunque su aspecto sea perfectam ente normal y saludable hasta el momento de su muerte. Por ejemplo, aproximadamente la mitad de todas las motoneuronas que envan axones hacia el msculo esqueltico mueren pocos das despus de entrar en con tacto con sus clulas musculares diana. La muerte a gran escala de neuronas po dra reflejar el resultado de una competencia. Cada tipo de clula diana libera una cantidad limitada de factor neurotrfico especfico, que necesitan para so brevivir las neuronas que inervarn esta diana: aparentemente las neuronas compiten para conseguir este factor, y las que no consiguen una cantidad sufi ciente mueren por muerte celular programada. Este proceso aparentemente inti, proporciona una medio simple y elegante para ajustar el nmero de neu ronas de cada tipo al nmero de clulas diana que inervan. El primer factor neurotrfico que se identific, y con diferencia el m ejor ca racterizado, se conoce simplemente como factor de crecimiento nervioso, o NGF (de Nerve Growth Factor). Fue descubierto accidentalmente en el transcur so de unos experimentos en los que se trasplantaron tejidos extraos y tumores a embriones de pollo. Los trasplantes de un tumor concreto quedaron excepcio nal y densamente inervados y provocaron un engrosamiento sorprendente en algunos grupos de las neuronas perifricas en las proximidades del injerto. Slo se vieron afectadas dos clases de neuronas: las neuronas sensoriales y las neuro nas simpticas (una subtipo de neuronas perifricas que controlan la contrac cin del msculo liso y la secrecin de las glndulas exocrinas). La bsqueda de una causa para este fenm eno condujo hasta una protena especfica, NGF, y demostr que si se administran anticuerpos anti-NGF a un ratn mientras su sistema nervioso est en desarrollo, la mayora de las neuronas simpticas y al gunas neuronas sensoriales mueren. Esto mismo ocurre en un cultivo: las neu ronas simpticas y algunas de las neuronas sensoriales mueren en ausencia de NGF; en presencia de NGF, sobreviven y emiten neuritas (Figura 21-109). De for ma similar, algunas clases de neuronas del sistema nervioso central dependen de NGF. El NGF est producido por tejidos inervados por neuronas dependientes de NGF. Manipulaciones experimentales confirman que a mayor cantidad de tejido diana, mayor ser el nmero de neuronas que sobrevivan, y se puede demostrar que este efecto es consecuencia del NGF porque puede ser simulado mediante la manipulacin directa de las concentraciones de NGF. Despus de que haya terminado la fase de muerte celular, el NGF contina manteniendo una funcin reguladora de la densidad de inervacin controlando la cantidad de procesos que emitir el axn. Este m ecanismo es esencial para la restitucin de la inerva cin, por ejemplo en tejidos daados de la piel o del msculo liso. El NGF acta sobre un tejido intacto de la misma forma que lo hace sobre una placa de cultivo (vase Figura 21-109), preservando la supervivencia de clulas y estimulando lo calm ente la actividad de los conos de crecimiento y as ajustando el suministro de inervacin a las necesidades de la diana. El NGF es slo uno de los miembros de la familia de factores neurotrficos homlogos (denominados neurotrofinas) que son responsables de este tipo de

Figura 21-109 Efectos del NGF sobre la gnesis de neuritas. Micrografas de campo oscuro de un ganglio cultivado durante 48 horas en presencia (arriba) o ausencia [abajo) de NGF. Las neuritas se desarrollan y crecen en y desde las neuronas simpticas slo en presencia de NGF en el medio. Cada cultivo tambin contiene clulas de Schwann (gliales) que han migrado del ganglio; tales clulas no se ven afectadas por el NGF. El efecto que ejerce sobre los conos de crecimiento es local, directo, rpido e independiente de cualquier comunicacin con el soma celular; al eliminar el NGF del medio, los conos de crecimiento deprivados, detienen su desplazamiento durante uno o dos minutos. El efecto de NGF sobre la supervivencia celular es menos inmediato y se asocia con la asimilacin de NGF por endocitosis y su transporte intracelular de retorno al soma celular. (Cortesa de Naomi Kleitman.)

control

120 6

Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

Figura 21-110 Conexiones entre el ojo y el cerebro de un renacuajo de

Xenopus. En este espcimen se ha inyectado una molcula trazadora en el interior de un ojo (objeto oscuro situado en la izquierda), ha sido asimilada
por las neuronas presentes, y transportada a lo largo de sus axones, lo cual pone de manifiesto las rutas que toman hacia el tectum ptico en el cerebro. (Cortesa de Jeremy Taylor.) regulacin de las diferentes partes del sistema nervioso de los vertebrados. Se unen a una familia complementaria de protenas receptoras transmembrana (denominadas as debido a un proto-oncogn llamado trk que codifica una de ellas); estas protenas pertenecen a la clase de receptores tirosina quinasa vistos en el Captulo 15. Se espera que los factores neurotrficos sean tiles en el trata miento de las enfermedades neurolgicas, como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de las motoneuronas (la enfermedad de Lou Gehrig), en las que las neuronas degeneran y mueren inadecuadamente. Ahora volvamos al problema del modelaje espacial de las conexiones ner viosas.

tectum

Los valores posicionales de las neuronas guan la formacin de mapas neuronales ordenados: doctrina de la especificidad neuronal8 6
Normalmente las aportaciones de informacin procedentes de rganos senso riales trazan mapas o se proyectan de forma ordenada sobre las regiones senso riales del sistema nervioso central, y las salidas de informacin de las regiones motoras del sistema nervioso central se trazan de manera ordenada sobre los msculos. As pues, clulas nerviosas similares pertenecientes a regiones distin tas de la retina de un vertebrado emiten sus axones estableciendo sinapsis con neuronas de regiones correspondientes distintas del tectum ptico del cerebro intermedio (Figura 21-110); de la misma forma, motoneuronas similares entre s de distintas localizaciones de la mdula espinal emiten sus axones hacia diferen tes msculos. En principio, los conos de crecimiento se podran canalizar hacia sus varios destinos simplemente como consecuencia directa de los puntos de partida, como los conductores de una autopista multiva en la que estuviera prohibido cam biar de carril. Esta posibilidad fue comprobada en el sistema visual median te un famoso experimento en los aos cuarenta. Si seccionam os el nervio ptico de una rana, ste se regenera. Los axones de la retina crecen hacia el interior del tectum ptico, restituyendo la visin normal. Si, adems, en el mismo momento en que se secciona el nervio se hace girar el ojo, de forma que las clulas origi nalm ente ventrales de la retina queden en la posicin de clulas dorsales de la retina, todava se restituira la visin, pero con una carencia notable: el animal se comporta como si percibiera el mundo al revs. Las clulas retnales mal em pla zadas establecen conexiones apropiadas de acuerdo con su posicin original, no con sus posicin reales (Figura 21-111). Evidentemente las clulas estn dotadas de valores posicionales que contienen una memoria de su posicin original, de modo que las clulas de localizaciones opuestas en la retina son intrnsecam en te diferentes. Igual que ocurre en la corteza de un ratn reeler (vase Figura 21105), es el carcter intrnseco, y no la posicin, el que elige la localizacin diana. Tal no equivalencia entre neuronas se denomina especificidad neuronal.

Los axones de lados opuestos de la retina responden de forma distinta al gradiente de las molculas repelentes del tectum87
Una vez han alcanzado el tectum, los axones retnales tienen que escoger, segn su carcter individual, qu regin del tectum inervarn. Por ejemplo, los axones de la retina nasal se proyectan hacia el tectum posterior, y los de la retina tem poral (el lado ms alejado de la nariz) se proyectan hacia el tectum anterior. Esta opcin se controla mediante diferencias del carcter intrnseco de las clulas de

El desarrollo neural

1207

tectum derecho

tectum izquierdo

tem poral ventral retina derecha ventral

tem poral

retina izquierda se secciona el nervio ptico derecho y se hace girar el ojo derecho; los extrem os seccionados de los axones de la retina degeneran las neuronas de cada parte de la retina, a pesar de estar desplazadas, regeneran sus conexiones con la m ism a parte del tectum a la que estaban conectadas antes
Figura 21-111 Regeneracin de las conexiones entre el ojo y el cerebro de un anfibio despus de la rotacin de un ojo. Los axones de cada parte de la
retina girada se regeneran y vuelven a conectar con la parte del tectum adecuada a sus posiciones origin ales en los cuerpos retnales. De este modo, por ejemplo, la luz que cae sobre la parte ventral de la retina girada es percibida como si cayera sobre la parte dorsal, y el animal percibe el mundo al revs; si colocamos alimento por encim a de l, el animal se agachar, etc.

las neuronas de cada retina em iten sus axones hacia el tectum opuesto, estableciendo un mapa ordenado (A-a, V-v, etc.)

diferentes partes del tectum. As pues, el mapa neuronal depende de la corres pondencia entre los dos sistemas de marcadores posicionales, uno situado en la retina y el otro en el tectum. Experimentos in vitro con tejidos de embrin de pollo aportan alguna luz sobre la naturaleza de los marcadores del tectum y la forma en que los axones retnales responden ante ellos. Se colocan fragmentos de retina en un cultivo, permitindoles que emitan axones sobre el substrato que est revestido de ves culas de mem brana preparadas a partir de clulas tectales (Figura 21-112). El re vestimiento est dispuesto en bandas, de forma que se alternan bandas de m em brana del tectum anterior con bandas de membrana del tectum posterior. En funcin de los detalles de la preparacin, los axones de la retina nasal pueden no presentar preferencia alguna y crecer indiscriminadamente o presentar una preferencia, la adecuada, por la membrana del tectum posterior. Los axones procedentes de la retina temporal crecen de forma consistente slo a lo largo de bandas de la mem brana del tectum anterior, en concordancia con su destino habitual. Sorprendentemente, esto no ocurre porque la membrana del tectum anterior sea particularmente adhesiva o atractiva, sino porque la membrana del tectum posterior es especialmente repelente: los filopodios que la tocan se colapsan y se retraen. De hecho, si se hace gotear sobre ellos una suspensin de mem brana del tectum posterior, los conos de crecimiento de los axones tempo rales (pero no los nasales) se colapsan y retroceden. En el caso de una prepara cin de m embranas del tectum anterior, no se produce colapso alguno. Los efectos peculiares de la membrana del tectum posterior sobre la clulas de la retina temporal se deben a una glucoprotena inhibidora especfica que est distribuida en gradiente desde la parte posterior hasta la parte anterior del tectum. En otras partes del sistema nervioso se puede demostrar que otras mo-

Figura21-112 La selectividad de los axones de la retina en crecimiento sobre las membranas del tectum. El
substrato del cultivo ha sido revestido con bandas alternas de membrana preparadas tanto a partir del tectum posterior (P) com o del tectum anterior (A); las bandas del tectum anterior son visibles gracias a la impregnacin con marcadores fluorescentes en las bandas verticales de ambos lados de la pelcula. Los axones de la neuronas procedentes de la mitad temporal de la retina (en crecim iento desde la izquierda) siguen las bandas de membrana del tectum anterior pero evitan las membranas del tectum posterior, mientras que los axones de la mitad nasal de la retina (en crecim iento desde la derecha) hacen lo contrario. As pues el tectum anterior difiere del tectum posterior y la retina nasal de la temporal, y las diferencias guan el crecim iento selectivo de los axones. Estos experimentos se han efectuado con clulas procedentes de un embrin de pollo. (De Y. von Boxberg, S. Diess y U. Scharwz, N euron

p A P A P A P A P tem poral nasal

10:345-357, 1993.)

1208

Captulo 21 : Mecanismos celulares del desarrollo

lculas de superficie tienen funciones anlogas a las de los repelentes de los co nos de crecimiento. Estos sistemas bsicos de marcadores son adecuados para definir la orientacin anteroposterior en el mapa del tectum ptico de la rana. Sin embargo, para trazar el mapa completo con precisin son necesarios otros mecanism os completamente distintos.

Los patrones difusos de las conexiones sinpticas se definen mediante la eliminacin de la sinapsis dependiente de actividad88,89
En un animal normal el mapa retinotectal es inicialmente confuso e impreciso. Estudios en ranas y peces demuestran que el axn primero se prolonga de forma profusa en el tectum estableciendo multitud de sinapsis distribuidas a todo lo largo de una ancha rea del tectum que se solapa con los territorios inervados por otros axones. Estos territorios se ordenan posteriormente a travs de la eli m inacin de sinapsis y los retrocesos de las prolongaciones de los axones. Este perfeccionamiento del mapa mediante la eliminacin de sinapsis est regido por dos reglas de com peticin que, actuando juntas, crean un orden espacial: ( 1) los axones procedentes de regiones distantes de la retina, que tienden a excitar se en mom entos alternos, compiten por dominar el territorio tectal disponible, pero (2) los axones de localizaciones vecinas a la retina, que tienden a excitarse al mismo tiempo, inervan territorios vecinos del tectum porque colaboran para mantener sus sinapsis con clulas tectales compartidas (Figura 21-113). El m e canismo subyacente a ambas reglas depende de la actividad elctrica y de la se alizacin procedentes de sinapsis ya establecidas. Si se bloquean todas las ac ciones potenciales por medio de una toxina que se une los canales Na+regulados por voltaje, la eliminacin de sinapsis se inhibe y el mapa contina confuso. El fenmeno de la eliminacin de sinapsis dependiente de actividad se produce en prcticam ente todas las partes en desarrollo del sistema nervioso de un vertebrado. Primero, se establecen muchas sinapsis y se distribuyen sobre una regin diana muy amplia; luego el sistema de conexiones se reduce a travs de procesos competitivos que dependen de la actividad elctrica y las seales si npticas. El proceso de eliminacin de sinapsis no tiene nada que ver con la eli minacin del exceso de neuronas a travs de la muerte celular, ya que tiene lu gar despus de que el perodo la muerte neuronal normal haya finalizado. Los m ecanismos celulares de la eliminacin de sinapsis comienzan a ser comprendidos gracias a experimentos efectuados sobre la inervacin del ms-

Figura 21-113 El mapa retinotectal se acaba de perfilar mediante la eliminacin de sinapsis. Inicialmente
el mapa es confuso porque cada axn de la retina se ramifica inervando amplias zonas de una ancha regin de tectum, solapando las regiones inervadas por otros axones retinales. El mapa se acaba de perfilar mediante la eliminacin de sinapsis. En los lugares en que los axones de partes distantes de la retina establecen sinapsis en la misma clula tectal, se produce una com petencia, y las conexiones establecidas por uno de los axones desaparecen. Pero los axones procedentes de clulas que sean vecinas a la retina cooperan, manteniendo sus sinapsis sobre clulas del tectum compartidas. As pues, cada axn retinal termina inervando un territorio tectal reducido, adyacente y en parte superpuesto al territorio inervado por axones procedentes de localizaciones vecinas a la retina.

neuronas tectales

MAPA INICIAL CONFUSO: CONEXIONES DIFUSAS

MAPA FINAL PERFILADO: CONEXIONES DIFUSAS ELIMINADAS

El desarrollo neuronal

1209

FIBRA MUSCULAR ESTIMULADA REPETIDAMENTE MIENTRAS LA NEURONA PERMANECE EN REPOSO smapsis fibra muscula

ESTIMULACIN REPETIDA Y SIMULTNEA DE LA FIBRA MUSCULAR Y DE LA NEURONA

LA SINAPSIS SE DEBILITA

LA SINAPSIS PERMANECE FUERTE

culo esqueltico en embriones de vertebrados, donde habitualmente cada clula muscular recibe sinapsis de varias neuronas distintas, aunque al final slo sea una la que inervar. Para el anlisis in vitro de este mecanismo se utilizan cocultivos de motoneuronas y clulas musculares. Se puede identificar una clula muscular inervada por una nica neurona y entonces excitar directamente la c lula muscular m ediante un goteo constante de acetilcolina mediante una microaguja cercana de su superficie. As, la sinapsis establecida por la neurona sobre la fibra muscular estar perm anentem ente debilitada, a menos que se estimule elctricam ente a la neurona de modo que se active en sincrona con el goteo de acetilcolina sobre la fibra muscular; en este caso la sinapsis permanece en bue nas condiciones (Figura 21-114). El debilitamiento, o represin, de la sinapsis re fleja un cam bio en la zona presinptica, que provoca que el extremo del axn li bere m enos neurotransmisor cuando la neurona se activa. Es fcil de demostrar que la represin sinptica depende de la entrada de Ca2+ en el msculo a travs de los canales catinicos asociados con los receptores de acetilcolina. De algn modo, un increm ento brusco de la concentracin intracelular de Ca2 + hace que las clula postsinptica rechacen los terminales axnicos que establecen sinap sis sobre su superficie en las inmediaciones, pero los terminales axnicos que acaban de ser activados son inmunes a este rechazo. Estos y otros resultados sugieren una interpretacin sencilla de las reglas de com petencia que rigen la eliminacin sinptica en el sistema retinotectal. Los axones de regiones distantes de la retina no se activan al mismo tiempo y por tanto com piten entre s. Cuando un axn se activa, la(s) sinapsis establecida(s) por otro axn sobre una clula diana tectal compartida se debilita(n) hasta el punto en que uno solo de los axones quedar al mando de la clula. Por el con trario, los axones de clulas vecinas de la retina tienden a activarse sincrnica mente, y por lo tanto no com piten entre s sino que mantienen las sinapsis de las clulas tectales compartidas, creando un mapa preciso y ordenado en que las clulas de la vecindad de la retina se proyectan hacia localizaciones cercanas del tectum (vase Figura 21-113).

Figura 21-114 Eliminacin de las sinapsis y su dependencia del patrn de excitacin. En el experimento que aqu ilustramos esquemticamente, se ha permitido que una neurona y una fibra muscular procedentes de un embrin de pollo establezcan una sinapsis in vitro. Entonces se procede a la estimulacin de la fibra muscular mediante la aplicacin de gotas de acetilcolina (imitando la estimulacin neural); esta tcnica se aplica tanto sola como en sincrona con la excitacin elctrica de la neurona. Los resultados ilustran un principio general: cada excitacin de una clula diana tiende a causar el rechazo de las sinapsis cuyo axn terminal presinptico ha permanecido inactivo, y a mantener las sinapsis cuyo axn ha estado activo en este momento.

La experiencia moldea el patrn de conexiones sinpticas del cerebro89,90

Este mismo principio de activacin que se aplica a las sinapsis y la actividad neuronal contribuye a organizar nuestro desarrollo cerebral en funcin de la ex periencia. En el cerebro de un mamfero, los axones que transmiten las entradas de informacin procedentes de ambos ojos se juntan en la regin de la corteza cerebral, donde constituyen dos mapas superpuestos del campo visual externo, un mapa percibido por el ojo derecho y el otro por el izquierdo. La organizacin y el desarrollo de las proyecciones corticales procedentes de ambos ojos han

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Captulo 2 1 : Mecanismos celulares del desarrollo

sido estudiadas en profundidad, tanto mediante investigaciones anatmicas com o mediante pruebas fisiolgicas en las que se estudia qu tipos de estmulos visuales excitan clulas determinadas corticales. Estos estudios revelan una sen sibilidad extraordinaria respecto a la experiencia en edades tempranas: si, du rante un se cubre un ojo privndole de estmulos visuales, el ojo tapado pierde sus conexiones sinpticas con la corteza y queda prctica e irre versiblemente ciego. De acuerdo con el principio de activacin, ha tenido lugar una com petencia en la que las sinapsis de la corteza visual establecidas por axo nes inactivos se eliminan, mientras que las sinapsis establecidas por axones acti vos se consolidan. De este modo el territorio cortical se asigna a axones portado res de informacin y no se desperdicia con los axones que carecen de ella. Pero el principio de activacin tambin acta de formas mucho ms sutiles estableciendo las conexiones nerviosas que permiten ver. Por ejemplo, la capaci dad de ver en profundidad -visin en estreo- depende de la presencia en la cor teza visual de clulas receptoras de entradas de informacin procedentes de am bos ojos, transmitiendo informacin acerca de la misma regin del campo visual, pero desde ngulos ligeramente distintos. Las clulas de conduccin binocular nos permiten comparar la visin que obtenemos a travs del ojo derecho con la que obtenemos del izquierdo, de modo que seamos capaces de derivar informa cin sobre las distancias en relacin a objetos situados a nuestro alrededor. Sin embargo, si se impide que ambos ojos observen la misma escena al mismo tiem po durante un perodo crtico -p or ejemplo, cubriendo primero un ojo y luego el otro en das alternos o simplemente como consecuencia de un estrabismo infan til- prcticamente no se conservarn clulas de conveccin binocular en la corte za y la capacidad de ver en estreo ser casi irrecuperable. Evidentemente, segn el principio de activacin, las entradas de informacin procedentes de cada ojo recibidas por una neurona de conduccin binocular slo se mantienen si las dos entradas de informacin se activan sincrnicamente con frecuencia, como ocu rre cuando los dos ojos observan juntos una misma escena. Ya vimos en el Captulo 15 que los cambios sinpticos que subyacen a la memoria en muchas partes de cerebro giran en torno al comportamiento de un tipo particular de receptor para el neurotransmisor glutamato -e l receptor NMDA. El flujo de Ca2+ hacia el interior de la clula postsinptica, a travs de ca nales abiertos por este receptor, desencadena cambios duraderos en la fuerza de las sinapsis de esta clula, tal como ocurre con la entrada de Ca2+ en una clula muscular va los canales de receptores de acetilcolina, que durante el desarrollo afecta las sinapsis establecidas por las motoneuronas. Los cambios inducidos por el mecanismo dependiente de NMDA en el cerebro adulto obedecen a principios muy prximos al principio de activacin del desarrollo. De hecho, el perfecciona miento y el remodelaje de las conexiones sinpticas que acabamos de describir en los sistemas visuales en desarrollo de mamferos y anfibios puede bloquearse gracias a un inhibidor del receptor NMDA. En consecuencia, tanto la memoria como los ajustes en el desarrollo pueden depender de los mismos mecanismos fundamentales. La base molecular del mecanismo gracias al cual la experiencia moldea nuestros cerebros es uno de los mayores desafos que el sistema nervio so presenta a la biologa celular.

perodo crtico,

Resumen

El desarrollo del sistema nervioso consta de tres fases: primero, se generan las clu las nerviosas por medio de divisiones celulares; luego, cuando han dejado de divi dirse, las clulas emiten axones y dendritas estableciendo sinapsis con clulas ale jadas, entablando as comunicaciones; por ltimo, el sistema de comunicaciones sinpticas se perfecciona y remodela segn el patrn de actividad elctrica de la red neuronal. Los axones y las dendritas crecen mediante conos de crecimiento que existen en sus extremos, siguiendo vas especficas trazadas por otras clulas y por la matriz extracelular situadas a lo largo del trayecto. Los conos de crecimiento estn guiados
El desarrollo neural

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por diversas clases de molculas de adhesin as como por seales intracelulares y factores que inhiben y repelen el crecimiento de los conos. Conos de crecimiento pro cedentes de neuronas distintas, no equivalentes, responden de modo desigual a estas seales, y de esta forma se establece el mapa neuronal -proyecciones ordenadas de formaciones de neuronas, una encima de otra. Cuando los conos de crecimiento han alcanzado sus dianas, se producen dos tipos de ajustes bsicos. Primero, muchas de las neuronas que inervan mueren como consecuencia de una competencia por fac tores de supervivencia como el NGF (factor de crecimiento nervioso) secretados por el tejido diana. La muerte celular ajusta la cantidad de inervacin al tamao de la diana. Segundo, las sinapsis individuales retroceden de algunas localizaciones y se refuerzan en otras, generando un patrn de conexiones ordenado con mayor precisin. Este proceso depende de la actividad elctrica: las sinapsis ms activas se refuerzan, y neuronas distintas que contactan con la misma clula diana acos tumbran a mantener sus sinapsis en la diana compartida slo si ambas se activan sincrnicamente con frecuencia. De este modo la estructura del cerebro puede ajustarse reflejando las conexiones entre sucesos del mundo exterior. Los mecanis mos moleculares que subyacen a estos mecanismos pueden ser similares a los res ponsables de la formacin de recuerdos en la vida adulta.
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Consecuencias del recambio tisular, vistas en una seccin histolgica de un hueso compacto. Los pequeos segmentos negros alargados son los espacios ocupados por clulas maduras del hueso (osteocitos) incluidas en la matriz del hueso. Las bandas alternantes brillantes y oscuras son capas de la matriz que contienen colgena orientada (visibles con la ayuda de luz polarizada). El patrn proviene del proceso de continua erosin y reconstruccin, segn el cual el hueso antiguo es destruido por los osteoclastos (clulas semejantes a macrfagos) y se deposita hueso nuevo, en capas, por los osteoblastos (precursores de los osteocitos).

Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

En el transcurso de unos cuantos das o semanas, un nico vulo fecundado da lugar a un complejo organismo pluricelular formado por clulas diferenciadas dispuestas segn un patrn preciso. Por regla general, el patrn del cuerpo de un animal se establece a pequea escala y luego crece. Durante el desarrollo em brionario, los diferentes tipos celulares quedan determinados cada uno en su lu gar apropiado. En el perodo posterior de crecimiento, las clulas proliferan, pero salvo algunas excepciones, sus caractersticas especficas permanecen ms o menos fijas. El organismo puede continuar creciendo durante toda la vida, como sucede en la mayora de crustceos y de peces, o puede dejar de crecer al alcanzar un cierto tamao, com o sucede en las aves y en los mamferos. Pero in cluso cuando se detiene el crecimiento, en muchas especies la proliferacin ce lular contina. As, el organismo adulto de un vertebrado puede equipararse a un ecosistem a estable en el que una generacin de individuos (clulas en este caso) sucede a la anterior sin que se altere la organizacin del sistema en su con junto. Todava se desconoce de qu forma se alcanza el equilibrio exacto entre proliferacin y muerte celular. En este captulo se discute cmo nacen, viven y mueren las clulas en los te jidos y de qu forma se mantiene la organizacin de dichos tejidos. Nos centra remos en los vertebrados superiores y al considerar el problema del m anteni miento y de la renovacin de los tejidos, vamos a intentar ilustrar un poco la notable variedad de estructuras, funciones e historias vitales que se encuentran entre sus tipos celulares especializados.

Mantenimiento del estado diferenciado 1

Los tejidos del cuerpo se diferencian notablemente en muchos aspectos, pero to dos ellos tienen ciertas necesidades bsicas, satisfechas por lo general, por distin tos tipos celulares, tal como se ilustra para la piel en la Figura 22- 1. Todos ellos necesitan una fuerza mecnica, que en muchas ocasiones est proporcionada por un trama de sostn formada por la matriz extracelular, segregada principal mente por los fibroblastos. Por otro lado, todos los tejidos necesitan un aporte sanguneo para recibir nutrientes y eliminar productos residuales, y por ello es tn surcados por vasos sanguneos limitados por clulas endoteliales. De forma anloga, la mayora de los tejidos estn inervados y poseen axones de clulas ner viosas, junto con las clulas de Schwann que los rodean. Con frecuencia tambin existen macrfagos que eliminan las clulas muertas y la matriz superflua, as

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(A)

epidermis tejido conjuntivo laxo de la dermis

nervios sensoriales

tejido conjuntivo denso de la dermis

tejido conjuntivo adiposo de la hipoderm is

vaso sanguneo

epidermis

tejido conjuntivo laxo de la dermis

tejido conjuntivo denso de la dermis

0,5 mm
Figura 22-1 Piel de mamfero. (A) Esquemas que muestran la arquitectura celular de la piel gruesa. (B) Fotografa de una seccin transversal de la planta del pie humano, teida con hematoxilinaeosina. La piel puede considerarse como un gran rgano constituido por dos tipos principales de tejidos: tejido epitelial (la ep id erm is ) en la parte externa y tejido conjuntivo, que constituye la capa de la dermis (a partir de la cual se fabrica la piel) y la capa ms profunda de tejido adiposo: la h ipod erm is. Cada tejido se halla constituido por varios tipos celulares. La dermis y la hipodermis se hallan altamente irrigadas por vasos sanguneos y nervios. Algunas fibras nerviosas penetran incluso en la epidermis.

queratinocitos clula pigm entaria (m elanocito) clula con funcin m acrofgica (clula de Langerhans)

fibroblasto linfocito m acrfago clula endotelial de un capilar fibra elstica

fibra de colgena

como linfocitos y otros leucocitos que combaten las infecciones. Pueden existir melanocitos que proporcionan una pigmentacin protectora o decorativa. La ma yora de estos tipos celulares, auxiliares de la funcin especfica del tejido, se ori ginan fuera de l e invaden el tejido en el transcurso del desarrollo (clulas endoteliales, axones de clulas nerviosas, clulas de Schwann y melanocitos ) o de forma continua durante toda la vida (macrfagos y otros glbulos blancos). Este complejo sistema de sostn es necesario para mantener las principales clulas es pecializadas del tejido: las clulas contrctiles del msculo, las clulas secretoras de las glndulas o las clulas hematopoyticas de la mdula sea, por ejemplo. Por ello, casi todos los tejidos son una com pleja com binacin de muchos ti pos celulares que deben continuar siendo diferentes unos de otros y al mismo tiempo coexistir en un mismo ambiente. Por otro lado, la organizacin del con junto debe preservarse a pesar de que en la mayora de tejidos las clulas mue ren continuam ente y tienen que ser reemplazadas. El mantenimiento o conser vacin de la forma y de la funcin del tejido es en gran parte posible gracias a dos propiedades fundamentales de las clulas. Gracias a la memoria celular (va se el Captulo 21) las clulas diferenciadas mantienen de forma autnoma su ca rcter distinto y lo transmiten a su progenie. Al mismo tiempo cada tipo de clula especializada detecta continuam ente las caractersticas de su entorno y regula su proliferacin y sus propiedades en funcin de las circunstancias; de hecho, la elevada supervivencia de la mayor parte de clulas depende de las seales de otras clulas. Los mecanismos celulares responsables de la memoria celular se han discutido en el Captulo 9, mientras que las formas de respuesta de las clu las a las seales ambientales se consideran en el Captulo 15. En esta seccin pre liminar sobre el comportamiento de las clulas en los tejidos hacemos una breve revisin de ciertas evidencias sobre la estabilidad y la heredabilidad del estado diferenciado y consideramos hasta qu punto este estado puede ser modificado mediante influencias ambientales.

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Captulo 2 2 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

Figura 22-2 Desarrollo del ojo de los vertebrados. La retina se desarrolla a partir de la vescula ptica, una evaginacin epitelial de la regin del cerebro anterior del tubo neural. (A) El epitelio neural entra en contacto con el ectodermo que recubre el exterior de la cabeza. (B) Este contacto induce la invaginacin del ectodermo para formar una lente. Al mismo tiempo, la porcin externa de la vescula ptica se invagina, reducindose la luz vesicular a una interfase o entre dos capas que constituyen una estructura en forma de copa. (C) La capa de la copa ptica adosada al cristalino se diferencia en la retina neural, que contiene las clulas fotorreceptoras y las neuronas que transmiten los estmulos visuales al cerebro (vase Figura 22-6). La otra capa se diferencia en el ep itelio p ig m en tario de la retina. Sus clulas se hallan provistas de numerosos grnulos de melanina y el conjunto forma una cmara oscura para el sistema fotorreceptor (que sirve para reducir la cantidad de luz reflejada, de forma similar a una cubierta de pintura negra en el interior de una cmara fotogrfica).

tejido conjuntivo prosencfalo (epitelio del tubo neural) luz de la vescula ptica ectoderm o de la cabeza

copa ptica

La mayora de las clulas diferenciadas recuerdan su carcter esencial incluso en un nuevo entorno2
Diversos experimentos sobre cultivos celulares demuestran que a pesar de que las clulas se separen de su entorno habitual, tanto las propias clulas como su progenie mantienen intacta su programacin original. Consideremos, por ejem plo, las clulas epiteliales que forman la capa pigmentada de la retina (Figura 22-2). Debido a que dichas clulas manifiestan su carcter especializado produ ciendo unos grnulos de melanina de color pardo oscuro, resulta fcil estudiar su grado de diferenciacin. Cuando estas clulas de la retina de embrin de po llo se aslan y se mantienen en cultivo, proliferan formando clones. Clulas aisla das tomadas de estos clones dan lugar a subclones de clulas epiteliales pigmen tadas similares. De esta forma se puede m antener el estado diferenciado a lo largo de ms de 50 generaciones celulares. Sin embargo, el comportamiento de las clulas no es independiente de su entorno. En ciertos medios de cultivo o en condiciones de hacinamiento extre mo las clulas quizs puedan sobrevivir, pero no sintetizan pigmento, o muy poco. Pero incluso si no pueden expresar su carcter diferenciado, las clulas permanecen determinadas como clulas pigmentarias: cuando se las expone a condiciones de cultivo ms favorables, empiezan nuevamente a sintetizar pig mento. Existe una o dos excepciones conocidas a esta regla. En algunas especies de vertebrados, bajo determinadas condiciones, las clulas pigmentarias de la retina se transdiferencian en clulas del cristalino o en clulas de la retina neu ral, pero no se ha encontrado ninguna manipulacin de dichas condiciones que pueda ser la causa de este tipo de diferenciacin, en lugar de diferenciarse por ejemplo en clulas sanguneas, clulas hepticas o en clulas cardacas. De for ma parecida, la mayora de los tipos celulares especializados, incluyendo las c lulas sanguneas, las clulas hepticas y las clulas cardacas, mantienen en cul tivo su carcter esencial. En el organismo, al igual que en los cultivos, la mayor parte de las clulas di ferenciadas se comportan como si su carcter bsico estuviera determinado de forma irreversible por su proceso de desarrollo. Las clulas epidrmicas, por ejemplo, permanecen como tales en la mayor parte de ambientes distintos. Si se prepara una suspensin de clulas epidrmicas a partir de la piel de la cola de rata y se inyecta bajo la cpsula del rin, las clulas crecen formando quistes constituidos por una autntica epidermis, similar a la de la superficie corporal.

(C)

epitelio pigm entario de la retina epitelio neural de la retina

cornea en desarrollo

vescula del cristalino

El estado diferenciado se puede modular por el entorno celular1,3

Aunque no se producen transformaciones radicales, las caractersticas de mu chas clulas diferenciadas pueden estar fuertemente influidas por el entorno. Los posibles reajustes pueden clasificarse en su mayora como modulaciones del

Mantenimiento del estado diferenciado

1221

estado diferenciado, es decir, cambios reversibles entre fenotipos celulares estre chamente relacionados. Las clulas hepticas, por ejemplo, ajustan su sntesis de enzimas especficas (mediante cambios en los niveles de mRNA) en funcin de las concentraciones ambientales de la hormona esteroidea hidrocortisona, y la produccin de protenas de la leche por las clulas de la glndula mamaria puede ponerse en marcha o detenerse en funcin de los cambios de la matriz extracelular. Los fibroblastos y otras clulas afines -la familia de son un caso especial. Estas clulas son extraordinariamente adaptables y pueden presentar varias interconversiones: los fibroblastos, por ejemplo, pue den transformarse, aparentem ente de forma reversible, en condrocitos. Estas transformaciones tienen su importancia en la reparacin de heridas y fracturas seas as como en otros procesos patolgicos. Se discutirn ms adelante, en este captulo. Sin embargo, estas conversiones de un tipo celular diferenciado en otro suelen darse de forma muy restringida: la clula transformada contina perteneciendo a la familia de clulas del tejido conjuntivo. En muchos tejidos adultos normales tienen lugar importantes, aunque restringidos, cambios del es tado diferenciado, en los que las clulas recin diferenciadas se generan a partir de -precursoras que no manifiestan el carcter maduro diferen ciado pero se especializan en dividirse y producir una progenie que s lo m ani festar. Distintos tipos de clulas madre quedan determinadas para la produc cin de distintos tipos de clulas diferenciadas y no son intercambiables. Sin embargo, la mayora de los tejidos adultos estn formados por un nm e ro diferente de lneas celulares determinadas de forma irreversible. El nmero y las relaciones espaciales de estos com ponentes deben mantenerse funcional mente por mecanism os que no requieran que un tipo de clula diferenciada se transforme en otro, sino que dependan de complejas interacciones entre distin tos tipos celulares.

tivo-

clulas del tejido conjun

clulas madre

Resumen

La mayora de las clulas diferenciadas de los tejidos adultos mantienen su especializacin, incluso cuando se trasladan a un ambiente nuevo. Generalmente los estados de diferenciacin son estables y no intercambiables, pero algunas clulas especializadas, incluso, pueden alterar algunas de sus propiedades en respuesta a determinados requerimientos ambientales. Adems, en muchos tejidos adultos se generan deforma continua nuevas clulas diferenciadas a partir de clulas madre que se muestran indiferenciadas. Las transformaciones celulares ms relevantes tienen lugar en la familia de clulas del tejido conjuntivo que incluye a los fibro blastos y los condrocitos.
Tejidos con clulas permanentes 4
No todas las poblaciones celulares del cuerpo estn sujetas a renovacin. Algu nos tipos celulares se han generado en cantidad suficiente en el embrin y se conservan durante toda la vida adulta; parece que nunca se dividen y, si son des truidos, no se pueden reemplazar. Casi todas las clulas nerviosas son perma nentes en este sentido. Tam bin lo son otros tipos de clulas, como -e n los ma m feros- las fibras musculares del corazn, las clulas ciliadas del conducto auditivo externo (Figura 22-3) y las clulas del cristalino del ojo. Aunque todas estas clulas tienen una vida extremadamente larga y viven necesariam ente en medios protegidos, son diferentes en otros aspectos y resulta difcil encontrar una razn general para que tengan que ser permanentes e irremplazables. Para las clulas del msculo cardaco y las clulas ciliadas del conducto auditivo resulta absolutamente difcil encontrar una razn. En el caso de las clulas nerviosas parece probable que un recambio celular masivo en el adulto resultase desventajoso en lneas generales, ya que en el adulto sera difcil restablecer el com plejo y preciso patrn de conexiones nerviosas que se ha

122 2

Captulo 2 2 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

clulas de sostn

clulas ciliadas externas

mem brana tectorial

estereocilios clulas ciliadas internas

m em brana basal

fibras nerviosas

< B ) constituido durante el desarrollo en condiciones muy diversas. Adems, proba blem ente cualquier memoria registrada en forma de ligeras modificaciones de la estructura o de las interconexiones de las distintas clulas nerviosas se perdera. La permanencia de las clulas del cristalino parece ser simplemente una conse cuencia inevitable del mecanismos a travs del que se ha formado el tejido.

5 [im
Figura 22-3 Clulas ciliadas del odo.
(A) Esquema de la seccin transversal del aparato auditivo (rgano de Corti) en el odo interno de un mamfero, donde se observan las clulas ciliadas auditivas situadas en una com pleja estructura de clulas de sostn y rodeadas por una masa de matriz extracelular (denominada m embrana tectorial). (B) Electronmicrografa de barrido en la que se observa la superficie apical de algunas clula ciliadas del odo, con su caracterstica ordenacin en hileras de los microvilli gigantes (denominados estereocilios). Las clulas ciliadas auditivas actan como transmisores, generando una seal elctrica com o respuesta a las vibraciones sonoras que llegan al rgano de Corti y provocan la inclinacin de los estereocilios. En los mamferos, las clulas ciliadas auditivas que se producen en el embrin poseen un nico ciclo vital: si se destruyen por una enfermedad o por ruido excesivamente fuerte, no se regeneran y se produce sordera permanente. (B, de R.G. Kessel y R.H. Kardon, Tissues and Organs: A Text-Atas of Scanning Electron Microscopy. San Francisco: Freeman, 1979. Copyright 1979 W.H. Freeman and Company.)

Las clulas del centro del cristalino del ojo de un adulto son residuos del embrin5
Muy pocas estructuras del cuerpo de un adulto estn formadas por las mismas molculas que fueron producidas en el embrin. El cristalino del ojo es una de las pocas estructuras cuyas clulas no slo se han conservado, sino que m antie nen su contenido. El cristalino se forma a partir del ectodermo, en el lugar en que las vesculas pticas en desarrollo entran en contacto con l: en este punto el ectodermo se engruesa, se invagina y, finalmente se estrangula y separa en forma de la vescu la del cristalino (Figura 22-2). El cristalino se origina por lo tanto como una capa de clulas, formada a partir de un epitelio, de un grosor de una sola clula y que se dispone rodeando una cavidad central. Pronto, las clulas de la parte poste rior de la vescula del cristalino (orientadas hacia la retina), sufren una notable transformacin. Dichas clulas sintetizan y se llenan de cristalinas, las protenas caractersticas del cristalino. Durante el proceso se alargan enormemente dife rencindose a fibras del cristalino (Figura 22-4). Con el tiempo, sus ncleos se desintegran y cesa la sntesis proteica. De esta manera, la parte del epitelio de la vescula del cristalino dirigida hacia la retina se expande formando un grueso cuerpo refractario, constituido por largas y numerosas clulas sin vida, ntima mente unidas entre s (Figura 22-5). La cavidad central de la vescula se oblitera y en la regin frontal del epitelio de la vescula del cristalino -la parte dirigida hacia el exterior- permanece formada por una fina capa de clulas cuboidales. El crecimiento del cristalino depende de la proliferacin de las clulas frontales, que empuja a algunas de las clulas de esta regin alrededor del borde del crista lino, hacia la parte posterior (vanse Figuras 22-4 y 22-5A). A medida que las c lulas se desplazan hacia atrs, dejan de dividirse, aumentan su velocidad de sn tesis de cristalinas y se diferencian en fibras cristalinas. Las fibras adicionales del cristalino continan formndose de esta manera durante toda la vida, aunque a una velocidad decreciente. Los tipos de cristalinas de las primeras generaciones de fibras del cristalino son diferentes de los de las generaciones posteriores, del mismo modo que las

Tejidos con clulas permanentes

1223

hemoglobinas de los eritrocitos fetales son distintas de las de los eritrocitos adultos. Sin embargo, los eritrocitos se renuevan pero las fibras envejecidas del cristalino no lo hacen. Por ello, en el centro del cristalino adulto se encuentran fibras que fueron producidas en la fase embrionaria y que todava presentan los tipos de cristalinas caractersticas de este perodo temprano. Las diferencias de ndice de refraccin, entre los tipos embrionarios precoces de cristalinas y las producidas ms tarde ayudan a evitar al cristalino del ojo las aberraciones pti cas que existen en las lentes simples construidas con un medio homogneo como es el vidrio.

vescula em brionaria del cristalino

clulas del epitelio anterior del cristali fibra prim aria del cristalino

La mayora de las clulas permanentes renuevan sus componentes: las clulas fotorreceptoras de la retina6
Existen pocas clulas tan inmutables como las fibras del cristalino. Por regla ge neral, incluso aquellas clulas que persisten durante toda la vida sin dividirse su fren una renovacin de sus constituyentes. As, las clulas del msculo cardaco y las clulas nerviosas, aunque no se dividen, son metablicamente activas y capa ces no slo de sintetizar RNA y protenas, sino tambin de alterar su tamao y su estructura durante la vida adulta. Las clulas del msculo cardaco, por ejemplo, renuevan cada una o dos semanas su contenido de molculas proteicas y tienden a ajustar el equilibrio entre sntesis y degradacin de protenas as como a aumen tar de tamao a medida que la carga del corazn aumenta -por ejemplo debido a un incremento sostenido de la presin sangunea. Las clulas nerviosas tambin renuevan su contenido proteico de forma continua; adems, muchas clulas ner viosas pueden regenerar axones y dendritas que hayan perdido. El proceso de renovacin de los constituyentes celulares queda ilustrado de manera particularmente clara en las clulas nerviosas altamente especializadas que forman los fotorreceptores de la retina. La retina neural (vase Figura 22-2) consta de varias capas de clulas organizadas de una forma aparentemente complicada. Las neuronas que transmiten las seales visuales al cerebro (deno minadas clu las g an glion ares d e la retina) estn situadas ms cerca del mundo exterior, de modo que la luz, focalizada por el cristalino, debe pasar a travs de

crista lin o adulto (no a escala)

fibra del cristali recin form ada centro del cristalino adulto, form ado por las fibras prim arias del cristalino originadas en el em brin; los ncleos ya no son visibles lm ina basal
Figura 22-4 D esarrollo del cristalino del ojo hum ano. La proliferacin slo

se presenta en las clulas del epitelio anterior del cristalino, que se desplazan hacia la regin posterior y se diferencian en fibras del cristalino.

(B)

l________ I

20 um

Figura 22-5 Estructura del cristalino maduro. (A) Micrografa ptica de una

l m in a b a s a l ( d e s p r e n d id a )

100 p m

parte del cristalino donde se observa la unin entre la fina capa del epitelio anterior que cubre la parte frontal del cristalino y las fibras diferenciadas de la parte posterior. (B) Electronmicrografa de barrido de una regin del cristalino. Las fibras del cristalino se hallan densamente apiladas, como tablones en un almacn de madera. Cada fibra es una nica clula muerta y alargada que puede alcanzar hasta 12 mm de longitud. (A, por cortesa de Peter Gould; B, de R.G. Kessel y R.H. Kardon, Tissues and Organs: A Text-Atlas of Scanning Electron Microscopy. San Francisco: Freeman, 1979. Copyright 1979 W.H. Freeman and Company.)

1224

Captulo 2 2 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

ellas para alcanzar las clulas fotorreceptoras. Los fotorreceptores, que se clasifi can en conos o bastones segn su forma, se disponen con sus extremos fotorre ceptores, o segmentos externos, parcialmente hundidos en el epitelio pigmenta rio (Figura 22-6). Los conos y bastones presentan diferentes complejos proteicos fotosensibles con pigmento visual: los bastones son especialmente sensibles a niveles bajos de luz, mientras que los conos (de los que existen tres tipos distin tos, cada uno con respuestas espectrales diferentes) detectan el color y los deta lles ms finos. Parece que el segmento externo de un fotorreceptor es un cilio modificado con una ordenacin caracterstica de microtbulos similar a la de los cilios en la zona donde dicho segmento externo se une al resto de la clula (Figura 22-7). El resto del segmento externo est casi completamente ocupado por un denso apilamiento de membranas en el que se hallan los complejos foto sensibles; la luz absorbida en dicha zona produce una respuesta elctrica, tal como se discuti en el Captulo 15. En el extremo opuesto las clulas fotorrecep toras forman sinapsis con las interneuronas retinianas, que propagan la seal hasta las clulas ganglionares de la retina (vase Figura 22-6). Los fotorreceptores son clulas permanentes incapaces de dividirse. Pero las molculas proteicas fotosensibles no son permanentes. Existe una renova cin continua, que se puede poner de manifiesto mediante la inyeccin de ami-

clulas -------epiteliales pigm entadas cono fotorreceptor bastn fotorreceptor

- i '

Figura 22-6 Esquema de la estructura de la retina. La estimulacin de los

fotorreceptores por la luz se transmite por las interneuronas hacia las clulas ganglionares, que envan la seal al cerebro. Los espacios entre las neuronas y los fotorreceptores en la retina neuronal se hallan ocupados por una poblacin de clulas especializadas de sostn, que no aparecen en la figura. (Modificado de J.E. Dowling y B.B. Boycott, Proc. R. Soc. Lond. [B io l] 166:80-111,1966.)

fitt h

* \*

******

>

/
interneuronas

clula ganglionar (neurona)

t
i

#
t t

#
i

axones nerviosos hacia el cerebro

luz incidente

Tejidos con clulas permanentes

1225

Figura 22-7 Esquema de un bastn fotorreceptor. (A) Esquema.

Realmente existen unos 1000 discos fotorreceptores en el segmento externo. (B) Electronmicrografa de parte de un fotorreceptor de tipo cono, mostrando la base del segmento externo y el cilio modificado que lo conecta al segmento interno. (A, de T.L. Lentz, Cell Fine Structure. Philadelphia: Saunders, 1971; B, de M.J. Hogan, J.A. Alvarado, y J.E. Weddell, Histology of the Human Eye: An Atlas and Textbook. Philadelphia: Saunders, 1971.)

segm ento externo

discos de m em brana fotorreceptora m em brana plasmtica cilio de conexin

segm ento
interno

tleo

nocidos radiactivos, los cuales se incorporan a dichas molculas. En los basto nes, (aunque curiosamente no los conos) esta renovacin se organiza en una se cuencia ordenada de produccin, que puede ser analizada siguiendo el trayecto en el interior de la clulas de una serie de molculas proteicas marcadas radiac tivamente despus de un breve pulso de aminocido radiactivo (Figura 22-8). Las protenas marcadas radiactivamente pueden detectarse gradualmente en su desplazamiento desde el com plejo de Golgi en el segmento interno de la clula hasta la base de la pila de m embranas que ocupa el segmento externo. Desde all se desplazan gradualmente hacia el extremo opuesto a medida que se incorpora material nuevo en la base de la pila. Finalmente (en la rata, despus de unos 10 das) una vez alcanzado el extremo del segmento externo, las protenas m arca das y las m embranas a las que se han incorporado, son fagocitadas (absorbidas y digeridas) por las clulas del epitelio pigmentario.

Resumen

Algunas clulas de los mamferos -incluyendo las clulas nerviosas, las clulas del msculo cardaco, las clulas receptoras sensoriales de luz y sonido y las fibras del cristalino- persisten a lo largo de toda la vida sin dividirse y sin ser substitui1226 Captulo 2 2 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

clula epitelial pigmentada

Figura 22 -8 Renovacin de la

protena de membrana en un bastn.

Se administra un pulso de leucina 3H y mediante autorradiografa se sigue su paso a travs de la clula. Los pu n tos rojos indican zonas de radiactividad. El mtodo revela nicam ente la leucina que se ha incorporado a las protenas; el resto se elimina mediante lavado durante la preparacin del tejido. La leucina incorporada se observa primero concentrada cerca del com plejo de Golgi (1), y desde all pasa a la base del segmento externo a un disco recin sintetizado de membrana fotorreceptora (2). Los nuevos discos se forman a una velocidad de tres o cuatro por hora (en un mamfero), desplazando a los discos viejos hacia el epitelio pigmentado (3-5).

fXD

das. En las fibras maduras del cristalino, los ncleos celulares han degenerado y la sntesis proteica se ha detenido de modo que la parte central del cristalino adulto est formada por protenas cristalinas producidas durante la vida embrionaria. En la mayor parte del resto de clulas permanentes, la actividad de biosntesis con tina y existe una renovacin constante de componentes celulares. En los bastones retinianos, por ejemplo, se sintetizan nuevas capas de membrana fotorreceptora cerca del ncleo, que se desplazan constantemente hacia el exterior, hasta que son absorbidas y digeridas por las clulas del epitelio pigmentario.
Renovacin por biparticin simple7
La mayora de poblaciones celulares diferenciadas de un vertebrado no son per manentes: las clulas mueren continuam ente y son reemplazadas. En el adulto, las nuevas clulas diferenciadas pueden generarse de dos maneras distintas: ( 1) pueden formarse mediante la biparticin simple de las clulas diferenciadas existentes, que se dividen dando pares de clulas hijas del mismo tipo, o (2) pue den formarse, tal como se explicar con detalle ms tarde en este captulo, a par tir de clulas madre relativamente indiferenciadas, mediante un proceso que im plica un cam bio en el fenotipo celular. Las velocidades de renovacin celular varan de un tejido a otro. El tiempo de renovacin puede ser de menos de una semana, como sucede en el revesti miento epitelial del intestino delgado (que se renueva mediante clulas madre) hasta ms de un ao, tal como sucede en el pncreas (que se renueva por bipar ticin simple). Muchos tejidos, cuyas velocidades normales de renovacin son muy bajas, se pueden estimular para que produzcan nuevas clulas a mayor ve locidad cuando existe necesidad de ello. En esta seccin trataremos dos ejemplos de poblaciones celulares que se re nuevan por biparticin simple -las clulas hepticas y las clulas endoteliales.

Las funciones del hgado como interfase entre el tracto digestivo y la sangre7,8
La digestin es un proceso complejo. Las clulas que revisten el tracto digestivo segregan a la luz intestinal diversas substancias, como cido clorhdrico y enzi

Renovacin por biparticin simple

1227

Figura 22-9 Algunas de las clulas especializadas que se encuentran en el revestimiento epitelial del intestino. A menudo las posiciones
vecinas en la capa epitelial estn ocupadas por clulas de tipos distintos (vase Figura 22-16B). (Segn T.L. Lenz, Cell Fine Structure. Philadelphia: Saunders, 1971.)

la clula oxntica del estm ago segrega HCI

la clula con ribete en cepillo del intestino delgado (enterocito) absorbe nutrientes

mas digestivas, para hidrolizar las molculas de los alimentos hasta nutrientes sencillos. Las clulas absorben estos nutrientes desde la luz intestinal y luego los liberan a la sangre para que puedan ser utilizados por las restantes clulas del cuerpo. Todas estas actividades estn reguladas de acuerdo con la composicin del alimento digerido y con los niveles circulantes de metabolitos. El complejo conjunto de funciones se realiza mediante una distribucin del trabajo: algunas de las clulas estn especializadas en la secrecin de cido clorhdrico, otras en la secrecin de enzimas, otras en la absorcin de nutrientes, otras en la produc cin de hormonas peptdicas que, como la gastrina, regulan las actividades di gestivas y m etablicas, etc. (Figura 22-9). Algunos de estos tipos celulares se ha llan situados en la pared intestinal; otros se hallan agrupados en grandes glndulas que se com unican en el intestino y que en el embrin se forman a par tir del epitelio intestinal.

1228

Captulo 2 2 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

bilis hacia el intestino conducto biliar fibroblasto canalculo biliar hepatocito clula de Kupffer sinusoide

clula endotelial

(A)

1 ___________I 100

50 nm

Figura 22-10 La estructura del hgado. (A) Electronmicrografa de barrido de un fragmento de hgado mostrando capas irregulares de hepatocitos y numerosos pequeos capilares, o sinusoides, por donde circula la sangre. Los conductos mayores son vasos que distribuyen y recogen la sangre que fluye a travs de los sinusoides. (B) Estructura microscpica del hgado (muy esquematizada). Los hepatocitos estn separados de la corriente sangunea por una nica capa de clulas endoteliales con clulas intercaladas de carcter macrofgico, las clu las d e Kupffer. Pequeos poros en la capa endotelial permiten el intercambio de molculas y de pequeas partculas entre los hepatocitos y la corriente sangunea protegiendo a los hepatocitos de los embates que les ocasionara el contacto directo con las clulas sanguneas en circulacin. Adems de intercambiar materiales con la sangre, los hepatocitos forman un sistema de diminutos canalculos biliares en los que segregan la bilis, que pasa finalmente al intestino a travs de los conductos biliares. La estructura real es menos regular que la que sugiere este esquema. (A, de R.G. Kessel y R.H. Kardon, Tissues and Organs: A Text-Atlas of Scanning Electron Microscopy. San Francisco: Freeman, 1979. Copyright 1979 W.H. Freeman and Company.)

El hgado es la mayor de estas glndulas. En el embrin, se desarrolla como una regin en la que discurre una vena principal junto a la pared del tubo intes tinal primitivo, de forma que en el rgano adulto mantiene una relacin extraor dinariamente interrelacionada con la sangre. Las clulas del hgado que derivan del primitivo epitelio intestinal -lo s hepatocitos- estn dispuestos en hileras ra diales orientadas hacia unos espacios llenos de sangre denominados sinusoides (Figura 22-10A). La sangre est separada de la superficie de los hepatocitos por una nica capa de clulas endoteliales aplanadas que reviste los lados de cada hilera de hepatocitos (Figura 22-10B). Esta estructura facilita la funcin principal del hgado, que se basa en el intercambio de metabolitos entre los hepatocitos y la sangre. El hgado es el lugar principal en el que los nutrientes que se han absorbido del intestino y luego se han transferido a la sangre son procesados para su utili zacin por las otras clulas del cuerpo; la mayor parte del aporte sanguneo que recibe proviene directamente del tracto intestinal (por la va de la vena porta). Los hepatocitos son responsables de la sntesis, degradacin y almacenamiento de un gran nmero de substancias que juegan un papel fundamental en el m eta bolismo de todos los carbohidratos y lpidos del cuerpo; a su vez segregan la m a yora de las protenas que se encuentran en el plasma sanguneo. Al mismo tiempo, los hepatocitos permanecen conectados a la luz intestinal mediante un sistema de conductos diminutos (o canalculos) y conductos mayores (vase Fi-

Renovacin por biparticin simple

1229

gura 22-10B) a travs de los cuales el hgado segrega hacia el intestino un agente emulsionante, la bilis, que interviene en la absorcin de las grasas. A diferencia de lo que sucede con el resto del tracto digestivo, parece que en la poblacin de hepatocitos existe muy poca distribucin de funciones: cada hepatocito parece capaz de realizar la m isma amplia gama de funciones metablicas y secretoras. Los hepatocitos tienen un estilo de vida diferente del de las clulas que re visten la luz del intestino. Estas ltimas, expuestas al contenido abrasivo y corro sivo del intestino, no pueden vivir largo tiempo por lo que han de ser rpida mente reemplazadas mediante una aportacin continua de nuevas clulas. Los hepatocitos, alejados del contacto directo del contenido intestinal, viven mucho ms tiempo y se renuevan a una velocidad baja, pero controlada exactamente.

La prdida de clulas hepticas estimula la proliferacin de clulas hepticas9

Incluso en los tejidos que presentan una renovacin lenta de las clulas, un pe queo pero persistente desequilibrio entre la velocidad de produccin y la velo cidad de prdida de clulas conducira al desastre. Si cada semana se dividieran un 2 % de las clulas hepticas de un ser humano y slo se perdieran un 1% de ellas el hgado crecera hasta sobrepasar, en 8 aos, el peso de todo el re< <o del cuerpo. As pues, ha de existir algn mecanismo homeosttico que acople la ve locidad de proliferacin celular y/o la velocidad de muerte celular para m ante ner el tamao fijado para cada rgano. La prueba directa de la existencia de un control hom eosttico de la prolife racin de las clulas hepticas surge de experimentos en los que se extirpan quirrgicamente importantes cantidades de hepatocitos o se destruyen inten cionadam ente por medio de tetracloruro de carbono. Al cabo de un da, aproxi madamente, de efectuar cualquiera de estas lesiones, se observa un aumento brusco de la divisin celular entre los hepatocitos supervivientes, de forma que rpidamente se substituye el tejido perdido. Por ejemplo, si se extirpan los dos tercios del hgado de una rata, a partir del tercio restante se puede regenerar en unas dos semanas un hgado de tamao casi normal. En casos de este tipo se puede demostrar la existencia de una seal en la circulacin para la regenera cin heptica: si se conectan quirrgicamente las circulaciones de dos ratas y se extirpan dos tercios del hgado de una de ellas, en el hgado no mutilado de la otra rata, se induce la mitosis. Una de las seales responsables del incremento de la proliferacin celular se ha identificado como una protena denominada factor de crecimiento de hepatocitos. Estimula la divisin de los hepatocitos en cultivo y su concentracin en la circulacin sangunea aumenta bruscamente (por mecanism os poco conocidos) como respuesta a la lesin del hgado. El mis mo factor afecta a diversos tipos celulares en forma distinta y se conoce tambin como factor de dispersin, debido a que transforma algunos tipos de clulas epi teliales en clulas mviles que llegan a disgregarse unas de otras y se desplazan. Se desconoce por qu estimula el crecim iento del hgado de forma especfica despus de una lesin heptica. El equilibrio entre proliferacin y destruccin celular en el hgado adulto (como en otros rganos) no depende nicamente de la regulacin de la prolife racin celular: parece ser que intervienen controles de supervivencia celular. Por ejemplo, si se trata una rata adulta con la droga fenobarbital, se estimula a los hepatocitos a dividirse, provocando un ensancham iento del hgado. Cuando se interrumpe el tratamiento con fenobarbital aumenta considerablemente la muerte celular de los hepatocitos hasta que el hgado recupera su tamao origi nal, generalmente al cabo de una semana poco ms o menos. Se desconoce cul es el mecanism o de este tipo de control de supervivencia celular, aunque se ha sugerido que los hepatocitos, al igual que la mayora de clulas de los vertebra dos, dependen para su supervivencia de seales emitidas por otras clulas y que el nivel normal de dichas seales puede m antener solamente un numero deter minado de hepatocitos. Si el nmero de hepatocitos supera esta cantidad (como

123 0

Captulo 2 2 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

resultado de un tratamiento con fenobarbital, por ejemplo) la muerte celular se incrementar automticamente para volver a rebajar el numero de clulas. To dava se desconoce de qu forma se mantienen los niveles de los factores de su pervivencia.

La regeneracin requiere el crecimiento coordinado de los constituyentes de los tejidos1 0

Como ocurre en los dems rganos, el hgado es una com binacin de tipos celu lares. Adems de los hepatocitos y de las clulas endoteliales que revisten sus si nusoides, en el hgado existen macrfagos especializados (clulas de Kupffer), que engloban a las partculas que circulan por la corriente sangunea y fagocitan los eritrocitos viejos, y un reducido nmero de fibroblastos, que proporcionan una tenue trama de sostn de tejido conjuntivo (vase Figura 22-10B). Todos es tos tipos celulares son capaces de dividirse. Para que se produzca una regenera cin ptima, su proliferacin ha de estar coordinada de forma adecuada. La importancia de la regeneracin equilibrada de los diferentes tipos celula res se demuestra precisamente cuando se presenta una situacin de desequili brio. Si los hepatocitos, por ejemplo, se intoxican repetidamente con tetracloruro de carbono o con alcohol, a intervalos tan frecuentes que no puedan recuperarse por completo entre los ataques, los fibroblastos aprovechan la situa cin y el hgado queda obstruido de forma irreversible por tejido conjuntivo, de jando poco espacio para que los hepatocitos crezcan incluso despus de la des aparicin de los agentes txicos. Esta afeccin denominada cirrosis es frecuente en los alcohlicos crnicos. De forma similar, a menudo la regeneracin del msculo esqueltico altamente lesionado se ve seriamente obstaculizada por un crecim iento demasiado rpido de su tejido conjuntivo, de modo que el tejido ci catricial substituye a las fibras musculares contrctiles. Sin embargo, para que se lleguen a producir estos desequilibrios es necesario que se produzca una altera cin importante del tejido; en circunstancias normales de renovacin, actan unos mecanismos todava muy poco conocidos que regulan la proliferacin y la supervivencia celular a la vez que aseguran la permanencia de una proporcin adecuada de los distintos tipos celulares.

Figura 22-11 Corte transversal de una arteria de pequeo calibre.

(A) Esquema de un fragmento de la pared. Las clulas endoteliales, aunque poco conspicuas, son el com ponente fundamental de la pared. Comprese con el capilar de la Figura 22-12. (B) Electronmicrografa de barrido de una seccin transversal de una arteriola (arteria muy pequea), mostrando el revestimiento interno de clulas endoteliales y la capa circundante de msculo liso y de tejido conjuntivo colgeno. Una ligera contraccin del msculo liso ha hecho que el revestimiento endotelial del vaso quedara plegado. A causa de la fijacin, el revestimiento endotelial se ha arrugado separndose de la pared muscular y dejando un pequeo espacio entre ambos. (B, de R.G. Kessel y R.H. Kardon, Tissues and Organs: A Text-Atlas of Scanning Electron Microscopy. San Francisco: Freeman, 1979. Copyright 1979 W.H. Freem an and Company.)

Las clulas endoteliales revisten todos los vasos sanguneos1 1

En contraposicin con los ejemplos anteriores de comportamiento mal coordi nado de los fibroblastos, las clulas endoteliales que constituyen el revestimien to de los vasos sanguneos tienen una notable capacidad para adaptar su nme-

revestimiento endotelial

msculo liso

colgena

tejido conjuntivo laxo m sculo liso lmina elstica (fibras de elastina) revestimiento endotelial

lmina basal

(A)

I _____ I

100 |am

Renovacin por biparticin simple

1231

Figura 22-12 Electronmicrografa de un fino capilar, en seccin transversal. La pared est formada por
ncleo de la clula endotelial

lm ina basal

luz del capilar

una nica clula endotelial, rodeada por una lmina basal. Obsrvense las pequeas vesculas transcitsicas que segn una teora posibilitan el transporte hacia dentro y hacia fuera en estos tipos de capilares: los materiales solubles son absorbidos por las vesculas mediante endocitosis en la superficie luminal de la clula y expulsados por exocitosis en la superficie externa, o viceversa. (De R.P. Bolender,/. Cell Biol. 61:269-287, 1974. Reproducido con permiso de copyright de the Rockefeller University Press.)

vesculas transcitsicas

2 pm

ro y su disposicin a las exigencias locales. Casi todos los tejidos dependen del suministro de sangre, y el aporte sanguneo depende de las clulas endoteliales. Estas clulas crean un sistema de sostn vital adaptable, propagndose hasta las ms recnditas regiones del cuerpo. Si las clulas endoteliales no se extendieran y remodelaran la red de los vasos sanguneos, el crecimiento y la reparacin de los tejidos resultara imposible. Los vasos sanguneos de mayor calibre son las arterias y las venas, que poseen una gruesa y resistente pared de tejido conjuntivo y de musculatura lisa (Figura 22-11 A). La pared interna est revestida por una nica capa, extraordinariamen te fina, de clulas endoteliales separadas de las capas externas por una lmina basal. La cantidad de tejido conjuntivo y de musculatura lisa de la pared del vaso vara segn su dimetro y funcin, aunque el revestimiento epitelial siempre se halla presente (Figura 22-1 IB). En las ramas ms finas del rbol vascular -lo s ca pilares y los sinusoides- las paredes estn formadas exclusivamente por una sola capa de clulas endoteliales y por una lmina basal (Figura 22-12). De esta for ma, las clulas endoteliales revisten todo el sistema vascular, desde el corazn hasta los ms finos capilares, y controlan el paso de materiales -a s como el trnsito de glbulos blancos- hacia el interior y el exterior de la corriente sangu nea. El estudio embrionario revela adems que las arterias y las venas se desa rrollan a partir de pequeos vasos sencillos formados nicamente por clulas endoteliales y por una lmina basal: el tejido conjuntivo y la musculatura lisa se forman ms adelante, cuando se necesitan, bajo la influencia de seales produ cidas por las clulas endoteliales.

Las nuevas clulas endoteliales se generan por biparticin simple de clulas endoteliales ya existentes1 2
En todo el sistema vascular del adulto, las clulas endoteliales conservan la ca pacidad de divisin celular y de movimiento. Si, por ejemplo, se destruye una re gin de la pared de la aorta y se disgregan las clulas endoteliales, las clulas en doteliales ms prximas proliferan y migran haca dicha zona recubriendo la

123 2

Captulo 2 2 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

superficie expuesta. Las clulas endoteliales recin formadas consiguen recubrir incluso la superficie interna de los tubos de plstico que se utilizan en ciruga para reemplazar las zonas destruidas de los vasos sanguneos. La proliferacin de las clulas endoteliales se puede demostrar utilizando timidina 3H para m arcar las clulas que estn sintetizando DNA. En los vasos normales la proporcin de clulas endoteliales que queda marcada es especial mente elevada en las zonas de ramificacin de las arterias, donde la turbulencia y el desgaste consiguiente de las clulas endoteliales parece estimular la prolifera cin celular. Sin embargo, las clulas endoteliales se regeneran generalmente con bastante lentitud, con unas vidas medias de meses o incluso aos. Las clulas endoteliales no slo reparan el revestimiento de los vasos san guneos existentes sino que tam bin generan nuevos vasos sanguneos. Deben hacerlo en los tejidos embrionarios para adaptarse al crecimiento, en los tejidos adultos para resistir los ciclos recurrentes de remodelacin y reconstruccin y en los tejidos adultos lesionados para soportar el proceso de reparacin.

Los capilares se forman mediante proliferacin13,1 4

Los vasos siempre se originan como capilares que surgen de pequeos vasos ya existentes. Este proceso de angiognesis se produce como respuesta a seales especficas. Se puede observar claramente en los conejos, practicando un pe queo agujero en la oreja y fijando fragmentos de cubreobjetos de vidrio a am bos lados, generando una fina cmara de paredes transparentes hacia la que pueden crecer las clulas que rodean la herida. La angiognesis tambin se pue de observar en estructuras de por s transparentes, como la crnea del ojo. Los productos irritantes aplicados a la crnea inducen el crecimiento de nuevos va sos sanguneos, a partir del borde de tejido que rodea la crnea, el cual se halla muy vascularizado, alcanzando el centro de la crnea que normalmente no pre senta vascularizacin. As, la crnea queda vascularizada a travs de una inva sin de clulas endoteliales en el grueso tejido colgeno de la crnea. Observaciones de este tipo revelan que las clulas endoteliales que forma rn un nuevo capilar crecen desde la pared de un capilar o pequea vnula em i tiendo largas expansiones o pseudpodos (Figura 22-13). Inicialmente, las clu las forman un brote macizo que luego se vaca hasta formar un tubo. Este proceso contina hasta que el brote encuentra otro capilar, con el que se conec ta, permitiendo as la circulacin de la sangre. Experimentos sobre cultivos de muestran que clulas endoteliales colocadas en un medio que contenga los fac tores de crecimiento adecuados forman espontneamente tubos capilares incluso si se hallan aisladas de otros tipos de clulas. El primer signo de la for macin del capilar en cultivo es la aparicin en una clula de una vacuola alar gada que al principio est rodeada por el citoplasma (Figura 22-14A). Las clulas contiguas desarrollan vacuolas similares y, al final, distribuyen sus vacuolas de tal modo que las vacuolas quedan ordenadas de forma continua de una clula a

Figura 22-13 Angiognesis. Un nuevo capilar sanguneo se forma como un brote a partir de una clula endotelial de la pared de un pequeo vaso ya existente. Este esquema se basa en las observaciones realizadas en las clulas de la cola transparente de un renacuajo vivo. (Segn C.C. Speidel, A m .J. Anat. 52:1 -7 9 , 1933.)

glbulo rojo

clula endotelial

luz del capilar

esta clula endotelial generar una nueva rama capilar

una prolongacin de tipo pseudpodo gua el desarrollo del nuevo capilar a medida que crece hacia el tejido conjuntivo circundante

la clula endotelial se divide

se form an vacuolas en las clulas las vacuolas se unen contiguas generando la luz del capilar en crecim iento el proceso se repite a medida que el nuevo capilar se alarga

Renovacin por biparticin simple

1233

Figura 22-14 Formacin in vitro de un capilar. Las clulas endoteliales en

cultivo desarrollan vacuolas internas que se unen entre s dando lugar a una red de tubos capilares. Las fotografas (A) y (B) muestran los estadios sucesivos del proceso; la flecha en (A) indica la formacin de una vacuola en una clula endotelial. Los cultivos se han realizado a partir de pequeos agregados de dos a cuatro clulas procedentes de reducidos segmentos del capilar. Estas clulas se establecen en una placa de cultivo recubierta de colgena y forman una pequea colonia aplanada que aumenta de tamao a medida que las clulas proliferan. La colonia se extiende por toda la placa y, al cabo de unos 20 das, en las regiones centrales se forman tubos capilares. Una vez iniciada la formacin de los tubos, las ramificaciones no tardan en aparecer y a los 5-10 das ya resulta visible una extensa red de tubos, tal como se observa en la Figura (B). (De J. Folkman y C. Haudenschild, N ature 288:551-556,1980. Macmillan Journals Ltd.)

100 kJtn

otra, formando un capilar (Figura 22-14B). El proceso est estrechamente rela cionado con la naturaleza de la matriz extracelular en el entorno de las clulas: la formacin de los capilares es activada por los componentes de la lmina basal, com o la laminina, que puede ser segregada por las clulas endoteliales. Los capilares que se desarrollan en un cultivo puro de clulas endoteliales no contie nen sangre y no circula nada por su interior, lo cual indica que no son necesarios ni el flujo ni la presin sanguneos para la formacin de una red capilar.

La angiognesis est controlada por factores de crecimiento liberados por los tejidos prximos1 4
En los animales vivos las clulas endoteliales forman nuevos capilares en donde son necesarios. Es bien conocido que cuando las clulas, en los tejidos, quedan privadas de oxgeno, liberan factores angiognicos que inducen el crecimiento capilar. Probablem ente por este motivo, casi todas las clulas de los vertebrados se sitan a m enos de 50 pm de un capilar. De forma similar, despus de produ cirse una herida, en la proximidad del tejido lesionado se estimula un desenca denamiento del crecim iento de nuevos capilares (Figura 22-15). Substancias irri tantes locales o infecciones tam bin pueden producir una proliferacin de nuevos capilares, la mayora de los cuales entran en regresin y desaparecen cuando remite la inflamacin. La angiognesis tam bin es importante en el crecimiento tumoral. El creci miento de un tumor slido se halla limitado por el flujo sanguneo: si no fuera invadido por capilares, un tumor dependera de la difusin de nutrientes proce dentes de la periferia y no podra alcanzar ms que un dimetro de unos cuantos milmetros. Para que se pueda producir un crecimiento mayor, el tumor ha de inducir la formacin de una red capilar que invada la masa tumoral. Un peque-

Figura 22-15 Formacin de nuevos capilares como respuesta a una lesin. Electronmicrografa de barrido
de moldes del sistema de vasos sanguneos en el borde de la crnea, donde se observa la reaccin a una lesin. Los moldes se realizan mediante una inyeccin de resina en el interior de los vasos, dejando que dicha resina polimerice; con ello se pone de manifiesto la forma de la luz del capilar com plementaria al contorno de las clulas. Sesenta horas despus de la lesin, numeroso capilares empiezan a brotar de nuevo hacia el rea lesionada, que se halla junto a la parte superior de la figura. El crecim iento orientado de los vasos refleja una respuesta quimiotctica de las clulas endoteliales a un factor angiognico liberado en la zona de la herida. (Cortesa de Peter C. Burger.)

control

I---------------1

100 |jm

60 horas despus de la lesin

lOOgm

1234

Captulo 2 2 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

o fragmento de un tumor de este tipo implantado en la crnea provoca un r pido crecimiento de vasos sanguneos desde el borde vascularizado de la crnea hasta la zona del implante, y la velocidad de crecimiento del tumor aumentar bruscam ente en el momento en que los vasos lleguen a l. En todos estos casos las clulas endoteliales invasoras han de responder a una seal producida por el tejido que necesita aporte sanguneo. La respuesta de las clulas endoteliales consta por lo menos de cuatro elementos. Primero, las clulas han abrirse paso a travs de la lmina basal que rodea a los vasos ya exis tentes; durante la angiognesis las clulas endoteliales segregan proteasas, que les permiten la digestin de distintos materiales a su paso por la lmina basal del capilar o vnula originaria. Segundo, las clulas endoteliales han de desplazarse hacia el origen de la seal. Tercero, tienen que proliferar. Cuarto, tienen que for mar conductos. En algunos casos, algunos de los componentes de esta respuesta com pleja pueden conseguirse en ausencia de los restantes. Sin embargo, tam bin se han identificado factores de crecimiento que pueden manifestar conjun tamente los cuatro com ponentes de la respuesta angiognica. El ms importan te de estos factores es una protena conocida como factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, de Vascular Endothelial Growth Factor -relacionado en parte con el factor de crecimiento derivado de las plaquetas [PDGF, de Platelet-Derived Growth Factor]). Este factor acta de forma selectiva en las clulas endoteliales estimulando la angiognesis en circunstancias muy diferentes, y parece ser el agente responsable de la elevada irrigacin sangunea que presen tan algunos tumores. Otros factores de crecimiento, incluyendo algunos m iem bros de la familia del factor de crecimiento de los fibroblastos, tambin estimulan la angiognesis pero al mismo tiempo influyen en otros tipos celulares prximos a las clulas endoteliales. Estos tipos de factores angiognicos se liberan durante la reparacin , inflamacin y crecimiento de los tejidos; son fabricados por dis tintos tipos celulares, incluidos los macrfagos, los mastocitos y los adipocitos. Tambin se ha identificado un cierto nmero de inhibidores normales que pue den bloquear la formacin de nuevos vasos sanguneos. As la angiognesis, al igual que el control de la proliferacin celular en general, parece que es regulada por complejas com binaciones de seales, ms que por un solo tipo de seal.

Resumen

La mayora de poblaciones de clulas diferenciadas de los vertebrados estn sujetas a recambio por medio de la muerte y la divisin celular. En algunos casos como el de los hepatocitos del hgado, las clulas completamente diferenciadas simplemen te se dividen, produciendo clulas hijas del mismo tipo. Tanto la velocidad de proli feracin como la supervivencia de los hepatocitos estn controladas para mantener el nmero total de clulas apropiado. Si se destruye una gran parte del hgado, los hepatocitos restantes incrementan su velocidad de divisin restaurando dicha pr dida; si se incrementa transitoriamente la proliferacin de los hepatocitos median te tratamiento con drogas, el aumento del nmero de clulas es inmediatamente compensado por un aumento de la muerte celular, recuperndose el nmero nor mal de clulas. Estos mecanismos de control en un tejido, normalmente mantienen el nmero de clulas de cada tipo en un equilibrio apropiado. Sin embargo, como respuesta a una lesin ocasional, la reparacin puede darse de forma desequilibra da, como ocurre en lesiones repetidas del hgado en las que los fibroblastos crecen demasiado rpidamente en relacin al crecimiento de los hepatocitos, de forma que los hepatocitos quedan substituidos por tejido conjuntivo. Las clulas endoteliales forman una monocapa celular que reviste todos los va sos sanguneos y regula los intercambios entre la corriente sangunea y los tejidos subyacentes. Los nuevos vasos sanguneos se desarrollan a partir de las paredes de pequeos vasos ya existentes, a travs del crecimiento de clulas endoteliales que tienen la capacidad de formar capilares cuando crecen aisladas en cultivo. En el organismo, los tejidos anxicos, lesionados o en crecimiento, estimulan la angiog nesis mediante la liberacin de factores de crecimiento angiognicos. Dichos factoRenovacin por biparticin simple 1235

res atraen clulas endoteliales y las estimulan para que segreguen proteasas, proliferen y formen nuevos capilares.
Renovacin por medio de clulas madre: la epidermis 7,15
Ahora pasamos de las poblaciones celulares que se renuevan por duplicacin simple a las que se renuevan mediante la intervencin de clulas m adre (stem cells). Estas poblaciones varan ampliamente, no slo en cuanto al carcter celu lar y a la velocidad de renovacin, sino tam bin en cuanto a la geometra de la substitucin celular. En el revestimiento del intestino delgado, por ejemplo, las clulas estn dispuestas en forma de epitelio monoestratifcado. Este epitelio re cubre la superficie de las vellosidades que se proyectan hacia la luz intestinal y reviste las criptas que descienden hasta el tejido conjuntivo subyacente (Figura 22-16). Las clulas madre se encuentran en una posicin resguardada, en el fon do de las criptas. Las clulas diferenciadas que se generan a partir de ellas se transportan hacia arriba por un movimiento de deslizamiento en el plano de la capa epitelial, hasta que llegan a las superficies libres de las vellosidades; en el extremo de las vellosidades las clulas mueren y son expulsadas a la luz intesti nal. Otro ejemplo lo encontram os en el epitelio que forma la cubierta externa de la piel, denominada epidermis. La epidermis es un epitelio pluriestratificado y las clulas en diferenciacin se desplazan hacia el exterior desde su lugar de ori gen, en direccin perpendicular al plano de la capa celular. En el caso de las c lulas sanguneas, el patrn espacial de produccin resulta catico. Sin embargo antes de entrar en ms detalles hem os de detenernos a considerar qu es una clula madre.

Figura 22-16 Renovacin del revestimiento del intestino. (A) Esquema que muestra el modelo de renovacin y proliferacin celular de las clulas madre en el epitelio que forma el revestimiento del intestino delgado. Las clulas diferenciadas que no se dividen en la base de las criptas poseen un ciclo vital definido, que finaliza con la muerte celular programada y son reemplazadas continuamente por el linaje de clulas madre. (B) Micrografa de una seccin de una regin del revestimiento del intestino delgado, mostrando las vellosidades y las criptas. Obsrvese como las clulas caliciformes, que segregan mucus (teidas de rojo), estn entremezcladas con las clulas absorbentes con ribete en cepillo (enterocitos) del epitelio de las vellosidades. Vase en la Figura 22-9 la ultraestructura de dichas clulas.

m igracin de las clulas epiteliales desde su "nacim iento" en el fondo de la cripta hasta su desprendim iento en el extrem o de la vellosidad (el tiem po de trnsito es de 3 a 5 das) clulas epiteliales cripta tejido conjuntivo laxo

LUZ INTESTINAL vellosidad (sin divisin celular) seccin transversal de una vellosidad

vellosidadclulas absorbentes con ribete en cepillo clulas caliciform es^ que segregan mucus

clulas que se dividen rpidam ente (tiem po del ciclo = 11 horas)

cripta -

(A)

clulas diferenciadas que no se dividen

clulas madre que se dividen lentam ente (tiem po del ciclo > 24 horas)

(B)

I---------

100 p

1 23 6

Captulo 2 2 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

Las clulas madre pueden dividirse sin lmite y dar lugar a una progenie diferenciada1 6
Las propiedades que definen a una clula madre son las siguientes: 1. No est totalmente diferenciada (es decir, no se encuentra al final del pro ceso de diferenciacin).

clula madre

2. Se puede dividir sin lmites, por lo menos durante el ciclo vital del animal.
3. Cuando se divide, cada clula hija puede permanecer como clula madre, o puede iniciar una va que conduce irreversiblemente hacia la diferencia cin terminal (Figura 22-17). Las clulas madre son necesarias siempre que se presenta la exigencia recu rrente de reemplazar clulas diferenciadas, las cuales no pueden dividirse por s mismas. En diversos tejidos el estado terminal de diferenciacin celular es in compatible, por cuestiones obvias, con la divisin celular. El ncleo celular, por ejemplo, puede destruirse, como sucede en las capas ms externas de la piel, o puede ser expulsado como ocurre en los eritrocitos de los mamferos. Tambin es posible que el citoplasma est sobrecargado de estructuras, como por ejem plo de miofibrillas en las fibras musculares estriadas, que dificulten la mitosis y la citocinesis. En otras clulas diferenciadas de forma terminal, las propiedades qumicas de la diferenciacin han de ser incompatibles con la divisin celular de algn modo ms sutil. En cualquiera de estos casos, la renovacin ha de depen der de las clulas madre. La misin de la clula madre no consiste en llegar a diferenciarse sino en producir clulas que se diferencien. A consecuencia de ello las clulas madre tienen a menudo un aspecto poco conspicuo, por lo que resultan difciles de identificar. Pero esto no quiere decir que todas las clulas madre sean iguales. No estn diferenciadas de forma terminal pero s estn determinadas (vase pg. 1136): la clula satlite muscular, que origina el msculo esqueltico; la c lula madre epidrmica, que origina las clulas epidrmicas queratinizadas; la espermatogonia, que origina el espermatozoide; la clula basal del epitelio olfati vo, que origina las neuronas olfativas (Figura 22-18), etc. Las clulas madre que dan lugar a un nico tipo de clula diferenciada reciben el nombre de unipotencialesy las que dan lugar a muchos tipos celulares reciben el nombre de pluripoV.

clula diferenciada de form a term inal

Figura 22-17 Definicin de una clula madre. Cada una de las clulas hijas procedentes de la divisin de una clula madre puede permanecer como clula madre o iniciar el proceso hacia la diferenciacin terminal.

Figura 22 -1 8 Esquema de una seccin transversal del epitelio olfativo. En este epitelio, especializado

tenciales.
Los tejidos que se forman a partir de clulas madre plantean importantes cuestiones. Hemos de considerar qu tipo de factores determinan el que una c lula madre se divida o permanezca quiescente, qu es lo que condiciona que una clula hija, una vez formada, permanezca como clula madre o se diferencie y de qu forma se regula el proceso una vez ha entrado en la va de la diferencia cin. Por otro lado, cabe considerar cuntas clulas mueren y cmo se controla la supervivencia. Empezaremos nuestro estudio con la epidermis, que por su

cilios m odificados

clula basal (clula m adrw

neurona olfativa clula de sostn

axn (hacia el cerebro)

en la percepcin de olores, se pueden distinguir tres tipos celulares: clulas de sostn, clulas basales y neuronas olfativas. Por autorradiografa se demuestra que las clulas basales son las clulas madre de la produccin de neuronas olfativas, las cuales, pues, constituyen una de las pocas excepciones a la regla general de que las neuronas son clulas permanentes. Cada neurona olfativa sobrevive aproximadamente un mes (en los mamferos) antes de ser substituida. De la cabeza globular de la neurona olfativa se proyectan entre seis y ocho cilios modificados, los cuales, segn parece, contienen los receptores olfativos. El axn que se extiende desde el otro extremo de la neurona, transmite el mensaje hasta el cerebro. Cada vez que una clula basal se diferencia y se convierte en una neurona olfatoria se ha de desarrollar un nuevo axn, que tendr que establecer las conexiones apropiadas.

Renovacin por medio de clulas madre: la epidermis

1237

capa de escamas m uertas queratinizadas capa de clulas granulares capa de clulas espinosas capa de clulas basales lm ina basal tejido conjuntivo de la derm is

(A)

|-100 |jnn-H

sencilla organizacin espacial facilita el estudio de la historia natural de sus c lulas madre y del destino de su progenie.

Las clulas madre epidrmicas se encuentran en la capa basal17,1 8

La capa epidrmica de la piel y el revestimiento epitelial del tracto digestivo son los dos tejidos que sufren el contacto ms directo y perjudicial con el ambiente externo. En ambos casos, las clulas diferenciadas maduras desaparecen rpida mente en los lugares ms expuestos y son substituidas gracias a la proliferacin de clulas m enos diferenciadas en nichos ms resguardados.

100 |jm
Figura 22-19 Seccin transversal de la epidermis de mamfero. (A) Esquema.
(B) Microfotografa de una seccin transversal de la planta del pie (tincin de hematoxilina y Van Gieson). Las clulas granulares entre las clulas espinosas y las escamas aplanadas se hallan en la penltima fase de queratinizacin; aparecen granuladas debido a que contienen unos agregados que se tien de oscuro, formados por un material denominado qu eratoh ialin a, que al parecer participa en la com pactacin intracelular y en el ensamblaje de la queratina. La queratohialina est formada bsicamente por una protena conocida como filag rin a. Adems de las clulas destinadas a la queratinizacin, las capas profundas de la epidermis contienen un nmero reducido de clulas de carcter bastante diferente (no se observan aqu) -com o las clulas d e Langerhans de carcter macrofgico, derivadas de la mdula sea; los m elanocitos, derivados de la cresta neural y las clu las d e M erkel, que estn asociadas con terminaciones nerviosas de la epidermis. Vase tambin Figura 22-1.

filam entos de queratina desmosom a que conecta dos clulas entre s

H------- 5 p m -------- (
Figura 22 -2 0 Una clula espinosa. Esquema de una electronmicrografa de una seccin de la epidermis, mostrando los haces de filamentos de queratina que atraviesan el citoplasma y se insertan en los desmosomas puntuales que unen la clulas contiguas. Obsrvese que entre las clulas adyacentes quedan unas aberturas en canal que permiten la libre difusin de nutrientes a travs de las capas m etablicam ente activas de la epidermis. Ms externamente, a nivel de las clulas granulares, hay una barrera impermeable formada a partir de un material cem entante que segregan las clulas granulares a partir de las vesculas denominadas g rn u los d e m em b ra n a d e revestim iento. (De R.V. Krstic, Ultrastructure of the Mammalian Cell: An Atlas. Berln: Springer,1979.)

1238

Captulo 2 2 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

La epiderm is es un epitelio pluriestratificado constituido mayoritariamente por queratinocitos (denominados as debido a que su actividad caracterstica di ferenciada es la sntesis de protenas denominadas queratinas que forman los fi lamentos intermedios) (Figura 22-19). Estas clulas varan de aspecto de una capa a otra. Las que se hallan en la capa ms interna, adheridas a una lmina basal subyacente, se denominan clulas basales y normalmente son stas las que presentan mayor nmero de mitosis. Por encim a de las clulas basales se hallan unas cuantas capas de grandes clulas espinosas (Figura 22-20), cuyos num ero sos desmosomas -zonas de anclaje de gruesos haces de filamentos de queratin a - se visualizan al microscopio ptico como finas espinas alrededor de la su perficie celular (de ah su nombre). Por encim a del estrato espinoso se extiende la capa granular (vase Figura 22-19). Esta capa marca la frontera entre la zona profunda m etablicam ente activa y la zona externa de la epidermis, constituida por clulas muertas cuyos orgnulos intracelulares han desaparecido. Estas c lulas ms externas se reducen a escamas repletas de queratina densamente em paquetada. La mem brana plasmtica de las escamas y de las clulas granulares ms externas se halla reforzada por su cara citoplasmtica por una capa fina (12 nm), resistente y entramada que contiene una protena intracelular denominada involucrina. Normalmente las propias escamas se hallan tan comprimidas y son tan delgadas que sus lmites se visualizan con dificultad al microscopio ptico, aunque tratndolas con hidrxido sdico se hinchan ligeramente y con una tin cin adecuada se puede observar en las regiones ms finas de la piel una dispo sicin ordenada de forma geomtrica. Las escamas estn apiladas en ordenadas columnas hexagonales que se entrelazan en los bordes (Figura 22-21), de forma que una columna presenta una altura de 10-20 clulas y se apoya sobre una base de unas 10 clulas basales.

Las clulas epidrmicas en diferenciacin sintetizan una secuencia de queratinas diferentes a medida que maduran1 8
Una vez descrita la imagen esttica, pasemos ahora a la imagen funcional. Mien tras algunas clulas basales se dividen, incorporndose a la poblacin celular de la capa basal, otras (sus hermanas o primas) salen de la capa celular basal y en-

escama desprendindose de la superficie escamas queratinizadas capa de clulas granulares capa de clulas espinosas capa de clulas basales lmina basal tejido conjuntivo de la derm is H----------30 |am clula basal perifrica pasando hacia la capa de clulas espinosas clula basal en divisin

Figura 22-21 Organizacin en columnas de las escamas de la capa epidrmica de la piel. La

estructura se visualiza hinchando las escam as queratinizadas con una solucin de hidrxido sdico. Este tipo de organizacin en columnas slo se presenta en los lugares en los que la epidermis es ms fina. Algunos estudios sugieren que cada una de dichas columnas es una unidad proliferativa, que corresponde a una nica clula madre de las 10-12 clulas basales en las que se apoya la columna.

Renovacin por medio de clulas madre: la epidermis

1239

tran en la capa de clulas espinosas, siendo ste el primer paso de su movimien to ascendente. Cuando llegan a la capa granular, las clulas empiezan a perder sus ncleos y orgnulos citoplasmticos y se transforman en las clulas escam o sas queratinizadas de la capa crnea. Finalmente, las clulas escamosas queratinizadas se descaman en la superficie de la piel y son arrastradas, en forma de polvo, por el aire. El perodo que transcurre desde el momento en que se forma una clula en la capa basal de la piel humana hasta el momento en que se des prende de su superficie, oscila entre dos y cuatro semanas segn la regin del cuerpo de que se trate. Las transformaciones moleculares que acompaan este proceso se pueden estudiar analizando cortes finos de epidermis paralelos a la superficie o capas sucesivas de clulas obtenidas por sucesivas aplicaciones y desprendimientos de cinta adhesiva. Por ejemplo, las molculas de queratina, que se hallan en gran cantidad en todas las capas de la epidermis, se pueden extraer e identificar. Exis ten varios tipos de queratinas (estudiados en el Captulo 16), codificadas por una amplia familia de genes homlogos, cuya diversidad se ve incrementada progre sivamente mediante la maduracin alternativa de los transcritos gnicos. A m e dida que el nuevo queratinocito en la base de la columna se transforma en la es cam a de la parte superior (vase Figura 22-21) expresa una sucesin de distintas selecciones del conjunto de genes que codifican queratina. Durante este proceso otras protenas caractersticas, como la involucrina, tambin se sintetizan en funcin de un programa coordinado de diferenciacin celular terminal.

clula madre inm ortal

/, k #C
4

Las clulas madre epidrmicas son un subconjunto de las clulas basales1 9

Si cada fragmento de epidermis se mantiene indefinidamente mediante la proli feracin de sus clulas basales, entre dichas clulas basales debe existir por lo menos una clula cuya lnea de descendientes no muera durante el ciclo vital del animal. A esta clula se le denomina clula madre inmortal (Figura 22-22). En principio, la divisin de una clula madre inmortal podra generar dos clulas hijas inicialmente similares, cuyos diferentes destinos pueden estar generados por diversas circunstancias. En el caso opuesto, la divisin de la clula madre puede ser siempre asimtrica: podra ocurrir que una, y slo una, de las clulas hijas heredara una caracterstica especial indispensable para ser inmortal, m ien tras que la otra podra presentar algn tipo de alteracin desde el momento de su formacin, de tal modo que se vera forzada a diferenciarse y, finalmente, a morir. En este ltimo caso no podra haber nunca ningn incremento del nm e ro de clulas madre inmortales existentes, lo cual se contradice con los hechos. Si se destruye un fragmento de epidermis, la lesin se repara gracias a las clulas epidrmicas sanas cercanas que migran y proliferan hasta cubrir el rea afecta da. En este proceso se establece un nuevo fragmento de epidermis renovado, lo que implica que las clulas madre inmortales adicionales se han generado para compensar la prdida. De este modo, el destino de las clulas hijas debe estar regulado al menos parcialmente por las circunstancias externas. Un posible factor determinante de este destino puede ser el contacto de las clulas con la lmina basal o con el teji do conjuntivo expuesto en una lesin, con una prdida de dicho contacto se des encadena el proceso de la diferenciacin terminal y el mantenimiento del con tacto tiende a preservar el potencial de la clula madre. Sin embargo, estudios in vitro han demostrado que ste no es el nico determinante del destino de la c lula basal. Los queratinocitos basales pueden disociarse de la epidermis intacta y proliferar en una placa de cultivo, dando lugar a nuevas clulas basales y a clulas di ferenciadas terminales. Incluso en una poblacin de queratinocitos basales cul tivados en que todos aparecen indiferenciados, existe una gran variabilidad en la capacidad de proliferacin. Cuando se aslan las clulas y se comprueba su ca pacidad para formar nuevas colonias, algunas carecen totalmente de la capaci-

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Figura 22-22 Clula madre inmortal.
Cada zona de epidermis con capacidad de renovacin debe contener en cada generacin celular por lo menos una clula madre inmortal, cuyos descendientes todava se encontrarn presentes en aquella zona en un futuro lejano. Las flechas indican las lneas de descendencia. En el dibujo se muestra una clula madre inmortal que ocupa la misma posicin en cada generacin celular. Se pueden formar otras clulas basales qumicamente distintas, de tal forma que se vean obligadas a abandonar la capa basal y a diferenciarse; tambin pueden ser clulas madre, equivalentes a la clula madre inmortal en cuanto a su carcter y slo mortales en el sentido de que su descendencia ser desplazada posteriormente desde la capa basal y desprendida en la superficie de la piel.

124 0

Captulo 2 2 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

dad de dividirse, otras desarrollan nicamente unos cuantos ciclos de divisin y ms tarde se detienen, y otras todava pueden dividirse lo suficiente para formar nuevas colonias. Las clulas basales difieren tambin en la expresin de los re ceptores de la matriz extracelular de la familia de las integrinas (estudiados en el Captulo 19): las clulas que poseen mayor nmero de dichos receptores y m a yor capacidad de unin a los componentes de la lmina basal son las que pre sentan un mayor potencial de proliferacin. Esto sugiere que no todas las clulas basales son similares in vivo y que el mero contacto de dichas clulas con la l mina basal no es suficiente para mantenerlas como clulas madre. Mejor dicho, al parecer las clulas madre constituyen un pequeo subconjunto -alrededor de un 10% - de la poblacin de clulas basales que estn programadas para generar una cierta proporcin del linaje destinada a la diferenciacin terminal, incluso antes de haber abandonado la capa basal. De hecho, si se cultivan queratinocitos en un medio deficiente en Ca2+ , que permite mantenerlos en monocapa y por tanto en una posicin basal, algunos emprenden una diferenciacin terminal a pesar de su localizacin, como indica la sntesis de involucrina; dichas clulas diferenciadas emergen de la capa basal en el momento en que se aumenta la concentracin de Ca2+ . No obstante, el contacto con la matriz extracelular ejerce una influencia cr tica en la seleccin del destino de la clula, que evidentemente no est progra mada de forma rgida. Si se mantienen las clulas en suspensin, en lugar de po der dispersarse y adherirse al fondo de la placa de cultivo, todas ellas cesan de dividirse y se diferencian. No obstante, algunas clulas no se diferenciarn ni en suspensin, si el medio incluye fibronectina (un componente minoritario de la lmina basal y un com ponente mayoritario de la matriz extracelular que provo ca la migracin de los queratinocitos durante la curacin de las heridas). Las c lulas que manifiestan dicha respuesta a la fibronectina son las que poseen las in tegrinas adecuadas. En condiciones normales, posiblemente la existencia de dichos receptores mantiene las clulas unidas a la lmina basal, conservando la posibilidad de permanecer como clulas madre; la prdida o inactivacin de los receptores provoca la expulsin desde la capa basal, confirmando con ello la opcin de la diferenciacin; la expulsin de la capa basal por otras causas que provocan la prdida de receptores obliga a la clula a diferenciarse de forma pre matura.

La proliferacin de las clulas basales se regula en funcin del grosor de la epidermis2 0

Sea cual sea la influencia de la lmina basal, deben intervenir controles adicio nales para regular el ndice de produccin y el ndice de mantenimiento de las clulas epidrmicas. Por ejemplo, si se extirpan las capas externas de la epider mis, la velocidad de divisin de las clulas basales aumenta. Despus de una hi pertrofia transitoria, se restablece el grosor normal y la velocidad de divisin de la capa basal disminuye hasta los valores normales. Es como si la extirpacin de las capas diferenciadas liberara a las clulas de la capa basal proliferativa de una influencia inhibidora y fueran sometidas de nuevo a esta inhibicin en cuanto las capas externas recuperan su grosor habitual. Es bien conocido que los queratinocitos en cultivo responden a una gran va riedad de hormonas y factores de crecimiento, incluyendo el factor de creci miento epidrmico (EGF, de Epidermal Growth Factor), pero los mecanismos moleculares que regulan su proliferacin en el organismo continan siendo un problema todava sin resolver, de gran importancia clnica. Las consecuencias de un control defectuoso de la proliferacin celular basal se observan en la pso riasis. En este trastorno cutneo tan frecuente, la velocidad de proliferacin de las clulas basales est muy aumentada -la epidermis se vuelve ms gruesa y las clulas se expulsan de la superficie de la piel al cabo de una semana de haber surgido de la capa basal, antes de haber tenido tiempo de queratinizarse por completo.

Renovacin por medio de clulas madre: la epidermis

1241

hembra virgen

leche expulsada en el conducto

grnulo secretor de proteina de la leche

gotitas de grasa de la leche

*> 4

hem bra embarazada

ns

com plejo de Golgi hembra lactante

ite o 1*

clula m ioepitelial

conducto

alvolos dilatados por la leche

'< clula alveolar lm ina basal -

______________I 10 pm

expansin de una clula m ioepitelial

Figura 22-23 La glndula mamaria. (A) Esquema del crecimiento de los alvolos a partir de los conductos de la glndula mamaria durante el embarazo y la lactancia. nicamente se muestra una pequea parte de la glndula. La glndula en reposo presenta una reducida cantidad de tejido glandular inactivo, englobado en una gran masa de tejido conjuntivo de tipo adiposo. Durante el embarazo tiene lugar una intensa proliferacin de tejido glandular a expensas del tejido adiposo; las porciones secretoras de la glndula desarrollan preferentemente alvolos. (B) Uno de los alvolos de la glndula mamaria secretores de leche, con una red de clulas mioepiteliales {verde) a su alrededor. Las clulas mioepiteliales se contraen y provocan la expulsin de la leche del alvolo como respuesta a la hormona oxitocina, la cual, a su vez, se libera como respuesta refleja ante el estmulo de succin. (C) El mismo tipo de clula alveolar secretora produce las protenas y las grasas de la leche. Las protenas se segregan de manera normal por exocitosis mientras que la grasa se libera en forma de gotitas rodeadas por membrana plasmtica que se desprenden de la clula (B, segn R. Krstic; Die Gewebe des Menschen und der Sugetiere. Berlin: Springer-Verlag, 1978; C, de D.W. Fawcett, A Textbook of Histology, 1Ith ed. Philadelphia: Saunders, 1986.)

Las clulas secretoras de la piel estn agrupadas en glndulas que tienen su propia cintica de poblacin2 1
En ciertas regiones especializadas de la superficie del cuerpo, a partir de la epi dermis embrionaria se desarrollan, adems de las clulas queratinizadas antes descritas, otros tipos de clulas. En particular, secreciones tales como el sudor, las lgrimas, la saliva y la leche se producen en clulas situadas en glndulas profundas, que se originan com o invaginaciones de la epidermis pero que tie nen patrones de renovacin distintos a los de las regiones queratinizadas. La glndula m amaria presenta un inters especial a causa del control hor monal de sus procesos de divisin y diferenciacin celular. La produccin de le che debe empezar cuando ha nacido un beb y debe terminar cuando ste es destetado. Una glndula m amaria en reposo est formada por un sistema ra mificado de conductos excretores rodeados de tejido conjuntivo; estos conduc tos estn revestidos en sus porciones secretoras por una nica capa de clulas epiteliales relativamente inactivas, que actan como clulas madre. Como pri mer paso hacia la produccin de leche a gran escala, las hormonas que circulan

124 2

Captulo 2 2 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

por la sangre durante el embarazo hacen que las clulas de los conductos proliferen y que las porciones terminales de los conductos crezcan y se ramifiquen, formando pequeas bolsas dilatadas o alvolos, que contienen clulas secreto ras (Figura 22-23). La secrecin de leche se inicia slo cuando, tras el nacimiento del beb, estas clulas son estimuladas por distintas combinaciones de horm o nas circulantes en la madre. Ms tarde, cuando el lactante es destetado, las clu las secretoras mueren y la mayor parte de los alvolos desaparecen; los macrfagos eliminan las clulas muertas y la glndula revierte a su estado de reposo. La degradacin de la lmina basal parece que desempea un papel crtico en dicho proceso de involucin. En la glndula mamaria la divisin celular viene regulada no slo por hor monas sino tam bin por seales locales que se transmiten entre las clulas del epitelio y entre las clulas epiteliales y el tejido conjuntivo o estroma, donde las clulas epiteliales se hallan inmersas. Mutaciones en los genes implicados en es tos controles locales provocan el desarrollo del cncer, tal como se ver en el Ca ptulo 24, y es mediante estudios sobre el cncer de mama que se han dilucidado algunos de estos mecanismos de control.

Resumen

Muchos tejidos, especialmente los que tienen un desgaste y una proliferacin rpi dos -tales como el revestimiento intestinal, la capa epidrmica de la piel y los teji dos hematopoyticos- se renuevan mediante clulas madre. Las clulas madre, por definicin, no estn totalmente diferenciadas y poseen la capacidad de dividirse durante el ciclo vital del organismo produciendo unos linajes celulares que se dife rencian y otros que continan como clulas madre. En la piel, las clulas madre de la epidermis se encuentran en la capa basal, adheridas a la lmina basal El linaje celular procedente de las clulas madre se diferencia al abandonar dicha capa y, a medida que se desplaza hacia el exterior, sintetiza una serie de tipos de queratina diferentes hasta que, finalmente, sus ncleos degeneran produciendo una capa ex terna de clulas queratinizadas muertas que continuamente se van desprendiendo de la superficie de la pieL nicamente una mnima parte de clulas basales son c lulas madre. El destino de las clulas originadas a partir de una clula madre est controlado parcialmente por interacciones con la lmina basal y en parte por otros factores muy poco conocidos. Estos factores posibilitan que durante las procesos de reparacin se formen dos clulas madre a partir de una de ellas, y regulan la veloci dad de proliferacin de las clulas basales segn el grosor de la epidermis. Las glndulas conectadas a la epidermis, como las glndulas mamarias, poseen sus propias clulas madre y sus patrones de renovacin celular caractersticos.
Renovacin por medio de clulas madre pluripotenciales: formacin de las clulas sanguneas22,23
La sangre presenta muchos tipos celulares con funciones muy diversas, que abarcan desde el transporte de oxgeno hasta la produccin de anticuerpos. Al gunas de estas funciones celulares tienen lugar enteramente en el sistema vas cular, mientras otras utilizan dicho sistema vascular slo como medio de trans porte y llevan a cabo su funcin en otro lugar. Sin embargo, todas las clulas sanguneas presentan similitudes en su ciclo vital. Todas ellas tienen una vida de duracin limitada y todas se reproducen de forma continua a lo largo de toda la vida del animal. La caracterstica ms notable, sin embargo, es que todas ellas se generan en ltimo trmino a partir de una clula madre comn de la mdula sea. Esta clula madre hematopoytica (o formadora de sangre) es, por lo tanto, pluripotencial, ya que da lugar a los distintos tipos de clulas sanguneas dife renciadas.

Renovacin por medio de clulas madre pluripotenciales: formacin de las clulas sanguneas

1 243

I________
10 |jm

Figura 22 -2 4 Electronm icrografa de barrido de clulas sanguneas de mamfero en un vaso sanguneo de pequeo calibre. Las clulas mayores, ms esfricas y con una superficie rugosa, son leucocitos; las clulas menores, lisas y aplanadas, son eritrocitos. (De R.G. Kessel y R.H. Kardon, Tissues and Organs: A Text-Atlas of Scanning Electron Microscopy. San Francisco: Freeman,1979. Copyright 1979 W.H. Freeman and Company.)

Las clulas sanguneas se pueden clasificar en rojas y blancas (Figura 22-24). Los glbulos rojos, o eritrocitos, permanecen en el interior de los vasos sangu neos y transportan 0 2 y C 0 2 unidos a la hemoglobina. Los glbulos blancos, o leucocitos, com baten las infecciones y, en algunos casos, fagocitan y digieren substancias residuales. Para llevar a cabo sus funciones, los leucocitos, a dife rencia de los eritrocitos, se han de abrir paso a travs de las paredes de los vasos sanguneos de pequeo calibre y han de migrar hacia los tejidos. Adems la san gre presenta una gran nmero de plaquetas, que no son clulas completas sino pequeos fragmentos celulares disgregados o miniclulas derivadas del cito plasma cortical de grandes clulas denominadas megacariocitos. Las plaquetas se adhieren de forma especfica a las clulas endoteliales que revisten los vasos sanguneos lesionados, donde intervienen en la reparacin de las roturas y bre chas as como en el proceso de la coagulacin sangunea.

Existen tres tipos principales de glbulos blancos: los granulocitos, los monocitos y los linfocitos2223
Todos los glbulos rojos son similares entre s, com o tambin los son las plaque tas; sin embargo existen varios tipos distintos de glbulos blancos. Tradicional mente se agrupan en tres grandes categoras, denominadas granulocitos, m ono citos y linfocitos, en base a su aspecto al microscopio ptico. Todos los granulocitos contienen numerosos lisosomas y vesculas secreto ras (o grnulos) y se subdividen en tres clases en funcin de la morfologa y de las propiedades tintoriales de estos orgnulos (Figura 22-25). Las caractersticas tintoriales reflejan diferencias importantes en cuanto a sus propiedades qumi cas y a su funcin: los neutrfilos (tambin denominados leucocitos polimorfonucleares debido a su ncleo multilobulado) constituyen el tipo de granulocitos ms numeroso; fagocitan y destruyen pequeos organismos -especialm ente bacterias. Los basfilos segregan histamina (y en algunas especies, serotonina) que acta en las reacciones inflamatorias, estn estrechamente relacionados con la funcin de los mastocitos, que se encuentran en los tejidos conjuntivos pero que tambin se originan a partir de las clulas madre hematopoyticas. Los eosinfilos intervienen en la destruccin de parsitos y modulan las respuestas inflamatorias de tipo alrgico. Una vez han abandonado la circulacin sangunea, los monocitos (vase Fi gura 22-25D) se transforman en macrfagos, que junto con los neutrfilos son los principales fagocitos profesionales del organismo. Tal como se vio en el Captulo 13, los distintos tipos de clulas fagocticas contienen lisosomas que se fusionan con las vesculas fagocticas recin formadas (fagosomas), exponiendo los microorganismos fagocitados a la accin de complejos enzimticos, a mol culas altamente reactivas de superxido ( 0 2 ) y a hipoclorito (HOC1, el ingre diente activo de la leja), as como a una mezcla concentrada de hidrolasas liso-

124 4

Captulo 2 2 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

(A)

neutrfilo linfocito eosinfilo m onocito glbulo rojo 20 |jm

Figura 22-25 Los glbulos blancos de la sangre. (A-D) Electronmicrografas

en que se muestran respectivamente, un neutrflo, un basfilo, un eosinfilo y un m onocito. En la Figura 23-4 se han presentado electronmicrografas de linfocitos. Cada uno de los tipos celulares representados aqu tiene una funcin distinta, que se refleja en los diferentes tipos de grnulos de secrecin y de lisosomas que contiene. Cada clula presenta un solo ncleo, aunque presenta una forma lobulada irregular, y en (B), (C) y (D) las conexiones entre los lbulos se hallan fuera del plano de la seccin. (E) Micrografa de un frotis sanguneo teido con la tcnica de Romanowsky, que tie intensam ente los glbulos blancos. (A-D, cortesa de Dorothy Bainton; E, cortesa de David Masn.)

2 ti m

somales. Los macrfagos, sin embargo, son mucho ms grandes y presentan una vida ms larga que los neutrfilos. Son responsables de eliminar las clulas alte radas, envejecidas y muertas de muchos tejidos y son los nicos capaces de in gerir grandes microorganismos, como los protozoos. Existen dos tipos principales de linfocitos, ambos implicados en respuestas inmunes: los linfocitos B fabrican anticuerpos, mientras que los linfocitos T m a tan clulas infectadas por virus y regulan la actividad de otros glbulos blancos. Adems existen clulas de carcter linfocitario denominadas clulas asesinas (c lulas NKde Natural Killer Cells) que destruyen ciertos tipos de clulas tumorales y de clulas infectadas por virus. La produccin de linfocitos es un tema especia lizado que ser discutido con detalle en el Captulo 23. Ahora vamos a centrar nos principalmente en el proceso de formacin de los otros glbulos blancos, tam bin denominados, en conjunto, clulas mieloides. En la Tabla 22-1 se resumen los distintos tipos de clulas sanguneas y sus funciones.

Renovacin por medio de clulas madre pluripotenciales: formacin de las clulas sanguneas

1245

Tabla 22-1 Clulas sanguneas Concentraciones caractersticas en sangre humana (clulas/litro)

5 x 10 12

Tipo celular Glbulos rojos (eritrocitos) Glbulos blancos (leucocitos)

Funciones principales transportan 0 2y C 0 2

Granulocitos
Neutrfilos (leucocitos fagocitan y destruyen bacterias invasoras polimorfonucleares) Eosinfilos destruyen parsitos y modulan respuestas inflamatorias de tipo alrgico Basfilos liberan histamina y serotonina en ciertas reacciones inmunitarias Monocitos se convierten en macrfagos en los tejidos, mediante fagocitosis y digestin de microorganismos invasores, cuerpos extraos y clulas envejecidas
5x

109 108 107 108

4x 4x

Linfocitos
Clulas B Clulas T fabrican anticuerpos matan clulas infectadas por virus y regulan la actividad de otros leucocitos matan clulas infectadas por virus y algunas clulas tumorales inician el proceso de coagulacin

2 x 109 1 x 109 1 x 108

3x

Clulas asesinas (clulas NK)

Plaquetas (fragmentos celulares procedentes de megacariocitos de la mdula sea)

1 0 11

El cuerpo humano contiene alrededor de 5 litros de sangre, que supone un 7% del peso del cuerpo. Los glbulos rojos constituyen alrededor de un 45% de este volumen y los glbulos blancos alrededor de un 1 %, el resto es el plasm a sanguneo lquido.

La produccin de los distintos tipos de clulas sanguneas en la mdula sea se halla controlada individualmente22,24
La mayora de los glbulos blancos no actan en la sangre sino en otros tejidos. La sangre nicam ente los transporta a los lugares donde se necesitan. Una infec cin local o una herida en algn tejido rpidamente atrae a los glbulos blancos hacia la regin afectada, como parte de una respuesta inflamatoria que acta contra la infeccin o reparando la herida. La respuesta inflamatoria es compleja y est provocada por distintas molculas seal producidas localmente por mastocitos, por term inaciones nerviosas, por plaquetas y por glbulos blancos, as como por la activacin del com plem ento (discutido en el Captulo 23). Algunas de estas molculas seal actan cerca de los capilares, provocando una dismi nucin de la adhesin entre las clulas endoteliales pero incrementando la ad herencia de la superficie de estas clulas al paso de los glbulos blancos. As, los glbulos blancos quedan atrapados en la superficie interna del vaso como mari posas en un cazamariposas, de donde pueden escapar deslizndose entre las c lulas endoteliales y atravesando la lmina basal con la ayuda de las enzimas di gestivas; la unin inicial a las clulas endoteliales se realiza mediante selectinas (estudiadas en el Captulo 10) y la unin ms fuerte que necesitan las clulas sanguneas para atravesar la pared de los vasos sanguneos se realiza mediante integrinas (estudiadas en el Captulo 19). Otras molculas actan com o agentes quim iotcticos para distintos tipos de glbulos blancos, provocando una polari-

12 4 6

Captulo 22 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

Figura 22-26 Migracin de los glbulos blancos desde la circulacin sangunea durante la respuesta inflamatoria. La respuesta se inicia a travs
de distintas molculas seal producidas localm ente por diversas clulas (principalmente del tejido conjuntivo) o por activacin del complemento. Algunos de estos agentes intermediarios actan a nivel de las clulas capilares endoteliales, provocando la prdida de su adhesin a las clulas prximas de forma que los capilares se vuelven ms permeables; la estimulacin de las clulas endoteliales provoca la expresin de selectin as -m olculas de la superficie celular que reconocen carbohidratos especficos localizados en la superficie de los leucocitos de la sangre y provocan su adhesin al endotelio. Otros agentes intermediarios actan com o factores quimiotcticos dirigiendo el avance de los lecucocitos que penetran entre las clulas endoteliales de los capilares hacia el tejido circundante.

clula endotelial

glbulo blanco en el interior del capilar

Z 7T

EXP OSI CION A LOS AG EN TE S INTERMEDIARIOS DE LA INFLAMACIN LIBERADOS POR EL T E J ID O LESIONADO

zacin en dichas clulas la cual las hace avanzar hacia el lugar de origen de la sustancia quimiotctica. El resultado de todo ello es que en el tejido afectado pe netran un gran nmero de glbulos blancos (Figura 22-26). Otras molculas seal, producidas en el transcurso de la respuesta inflama toria, pasan a la sangre y estimulan a la mdula sea para que produzca ms leu cocitos, liberndolos hacia la circulacin sangunea. La mdula sea constituye el objetivo principal de esta regulacin ya que, con excepcin de los linfocitos y de algunos macrfagos, la mayora de los tipos de glbulos blancos en los m am feros adultos se generan nicamente en la mdula sea. La regulacin tiende a ser especfica para cada tipo celular: algunas infecciones bacterianas, por ejem plo, provocan un aumento selectivo de neutrfilos, mientras que las infecciones por protozoos y por otros parsitos provocan un incremento selectivo de eosinflos. (Por este motivo se realizan rutinariamente recuentos diferenciales de glbulos blancos para emitir el diagnstico de infecciones y de otras enfermeda des inflamatorias.) En otras circunstancias, se incrementa selectivamente la produccin de eri trocitos -p o r ejemplo, en individuos que viven en altitudes elevadas, donde el oxgeno es ms escaso. Esta formacin de clulas sanguneas (hematopoyesis) implica necesariam ente la existencia de complejos controles, bajo los cuales la produccin de cada tipo de clulas sanguneas se regula individualmente, de forma que pueden variar de acuerdo con las necesidades. El comprender cmo actan dichos controles constituye un problema de gran importancia mdica, y se han conseguido grandes progresos en este campo en los ltimos aos. En animales intactos, la hematopoyesis es ms difcil de analizar que la re novacin celular de un tejido como la capa epidrmica de la piel. En la epider mis existe una organizacin espacial regular que facilita el seguimiento del pro ceso de renovacin y la localizacin de las clulas madre; sin embargo, en el caso de los tejidos hematopoyticos esto no es as. En cambio, las clulas hematopoyticas presentan un tipo de vida nmada que las hace ms accesibles a otros tipos de estudios experimentales. Las clulas hematopoyticas dispersas pueden transferirse fcilmente, sin alteraciones, de un animal a otro; adems, en estas clulas mantenidas en cultivo se puede observar y analizar la proliferacin y la diferenciacin de clulas individuales y de su progenie. Por este motivo, se dispone de ms datos sobre las molculas que controlan la produccin de clu las sanguneas que sobre los mecanismos de control de produccin celular a ni vel de otros tejidos de mamferos.

QU IM IOT AXI S HACIA LOS A G E N T E S R E S P O N S A B L E S DE LA ATRACCIN LI BER AD OS POR EL T E J ID O LESIONADO

glbulos blancos en el tejido conjuntivo

La mdula sea contiene las clulas madre hematopoyticas22,25

En la mdula sea se pueden distinguir los diferentes tipos de clulas sanguneas y sus precursores inmediatos por su aspecto caracterstico (Figura 22-27). Todas ellas se hallan entremezcladas unas con otras, as como con los adipocitos y con otras clulas del estroma (clulas conjuntivas) que forman una delicada red estruc tural de fibras de colgena y de otros componentes de la matriz extracelular. Ade-

Renovacin por medio de clulas madre pluripotenciales: formacin de las clulas sanguneas

1247

leutrfilo s n m aduros

precursores de los eritrocitos

(A)

50 |jm

eosi notilo inm aduro

m onocito inm aduro

eritrocito

linfocito inm aduro

10 |jm

Figura 22-27 La mdula sea. (A) Micrografa de una seccin teida. Los amplios espacios vacos corresponden a adipocitos, cuyo contenido en lpidos se ha disuelto en el transcurso del procesado de la muestra. La clula gigante con ncleo lobulado es un megacariocito. (B) Electronmicrografa a bajos aumentos. Este tejido constituye la fuente principal de nuevas clulas sanguneas (exceptuando los linfocitos T, que se producen en el timo). Obsrvese que las clulas sanguneas inmaduras de un tipo determinado tienden a agruparse en grupos familiares. (A, cortesa de David Masn; B, de J.A.G. Rhodin, Histology: A Text and Atlas. New York: Oxford University Press, 1974.)

Figura 22 -2 8 Los megacariocitos. (A) Esquema de un megacariocito situado entre distintas clulas de la mdula sea. Su enorme tamao es el resultado de la elevada poliploida de su ncleo. Un megacariocito produce alrededor de 10 000 plaquetas, las cuales se extienden mediante largas expansiones que se introducen a travs de los poros de las paredes de los sinusoides adyacentes. (B) Electronmicrografa de barrido del interior de un sinusoide en la mdula sea, en la que se observan las expansiones de los megacariocitos. (B, de R.G. Kessel y R.H. Kardon, Tissues and Organs: A TextAtlas of Scanning Electron Microscopy. San Francisco: Freeman, 1979. Copyright 1979, W.H. Freeman and Company.)

prolongacin del m egacariocito em itiendo plaquetas

clula endotelial de la pared del sinusoide glbulo rojo

clulas sanguneas en form acin

m egacariocito

20 nm

plaquetas

expansiones m egacariocito

glbulo rojo

1 24 8

Captulo 2 2 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

ms, todo el tejido conjuntivo est altamente irrigado por vasos sanguneos de pa redes muy finas (denominados sinusoides sanguneos) al interior de los cuales van a parar las nuevas clulas. Tambin se hallan presentes los megacariocitos; estas clulas, a diferencia de otras clulas sanguneas, permanecen en la mdula sea despus de haber madurado, lo cual constituye una de sus caractersticas ms re marcables; adems son extraordinariamente grandes (con un dimetro de ms de 60 ^m) y presentan un ncleo con elevada poliploida. Normalmente se hallan adosados junto a los sinusoides y extienden sus expansiones a travs de los poros del revestimiento endotelial de estos vasos; las plaquetas se fragmentan a nivel de sus expansiones y son arrastradas por la sangre (Figura 22-28). Debido a la compleja ordenacin celular de la mdula sea, resulta difcil la identificacin de las precursores inmediatos de las clulas maduras. Las clulas que se hallan en estadios tempranos del desarrollo, antes de que inicien ningn tipo de diferenciacin, son muy similares en su aspecto y no existe ninguna caracterstica visible que permita reconocer las ltimas clulas madre constituidas. Para su iden tificacin y caracterizacin, se necesita una prueba funcional, que consiste en el mareaje de la progenie de cada clula. Como veremos, esto puede realizarse in vitro simplemente examinando las colonias que producen las clulas previamente aisla das. El sistema hematopoytico, sin embargo, puede ser manipulado de forma que los clones celulares puedan reconocerse in vivo en el animal intacto. Si se expone un animal a una dosis elevada de rayos X, las clulas hem ato poyticas se destruyen y el animal muere a los pocos das como consecuencia de su incapacidad de producir nuevas clulas sanguneas. El animal irradiado pue de salvarse, sin embargo, mediante una transfusin de clulas extradas de la mdula sea de un donante sano inmunolgicamente compatible. Evidente mente, entre estas clulas existen algunas (alrededor de 1 clula de cada 10 000) que pueden colonizar el husped irradiado y proporcionarle un nuevo tejido h e matopoytico de forma permanente. Uno de los tejidos en el que se desarrollan las colonias es el bazo, que en ratones normales constituye un rea adicional muy importante de hematopoyesis. Cuando se examina el bazo de un ratn irra diado al cabo de una o dos semanas despus de la transfusin de clulas proce dentes del donante sano, se observa un cierto nmero de ndulos diferenciados en cada uno de los cuales se puede localizar una colonia de clulas mieloides (Figura 22-29); algunas de las colonias que se presentan al cabo de dos semanas pueden contener ms de un milln de clulas. El carcter discreto de los ndu los sugiere que cada uno de ellos puede corresponder a un clon de clulas des cendientes de una nica clula inicial, de forma similar a como crece una colo nia bacteriana en una placa de cultivo; mediante marcadores genticos puede demostrarse que esto es lo que sucede realmente. La clula fundadora de este tipo de colonia se denomina clula form adora de colonias, o CFC (de Colony-Forming Cell), tambin conocida como unidad formadora de colonias, CFU. Las clulas formadoras de colonias son heterog neas. Ciertas colonias se hallan constituidas por un slo tipo de clula mieloide, mientras que otras se hallan constituidas por diversos tipos. Algunas clulas for man grandes colonias mediante varios ciclos de divisin, mientras que otras se dividen con menor frecuencia y forman colonias ms reducidas. La mayora de las colonias mueren despus de generar un nmero restringido de clulas san guneas diferenciadas. Sin embargo, un reducido nmero de colonias son capa ces de autorrenovarse produciendo, adems de clulas sanguneas diferencia das, ms clulas formadoras de colonias. Se asume que las clulas fundadoras de tales colonias capaces de autorrenovarse son las clulas madre hematopoyticas que se presentan en la mdula sea trasplantada.

la irradiacin con rayos X detiene la produccin de clulas sanguneas; el ratn m orira si no recibiera ningn tratam iento posterior

INYECCION DE CELULAS DE MDULA SEA PROCEDENTES DE UN DONANTE SANO

el ratn sobrevive; 2 semanas despus de la inoculacin, en la circulacin se pueden detectar numerosas clulas sanguneas sanas

EL EXAMEN DEL BAZO REVELA LA PRESENCIA DE NDULOS NO HABITUALES EN SU SUPERFICIE cada nodulo del bazo contiene un clon de clulas hem atopoyticas, descendiente de una de las clulas de la mdula sea
Figura 22-29 El experimento de formacin de colonias en el bazo. El bazo de un animal intensamente irradiado queda sembrado con clulas de la mdula sea procedentes de la transfusin de un donante sano. Este experimento, desarrollado en 1961, revolucion los estudios sobre la hematopoyesis, al permitir por primera vez que clulas mieloides precursoras pudieran ser analizadas.

Las clulas madre pluripotenciales dan lugar a todos los tipos de clulas sanguneas2 6
Con frecuencia en una colonia del bazo originada a partir de una sola clula madre se pueden encontrar juntos todos los tipos de clulas mieloides. As pues, la clula

Renovacin por medio de clulas madre pluripotenciales: formacin de las clulas sanguneas

1249

madre hematopoytica es pluripotencial: puede dar lugar a muchos tipos celulares. Las colonias del bazo no parecen contener linfocitos, pero otros estudios demues tran que estas clulas se forman a partir de la misma clula madre que origina to das las dems clulas mieloides. En la demostracin de esta teora se han utilizado marcadores genticos que permiten identificar los componentes de una colonia in cluso despus de que se hayan liberado a la circulacin sangunea. Para ello se han utilizado algunos tipos de marcadores clnales, pero la utilizacin de un retrovirus (un vector retrovrico que contiene un gen marcador) diseado para este fin ha per mitido alcanzar plenamente este objetivo. Este virus marcador, al igual que otros retrovirus, puede insertar su genoma en los cromosomas de la clula que infecta, aunque se hayan eliminado los genes que posibilitan la generacin de nuevas in fecciones por partculas vricas. As pues, el marcador queda confinado en la proge nie de las clulas infectadas inicialmente, de forma que la progenie de una de estas clulas se puede distinguir de la progenie de otras clulas ya que las zonas de inser cin del virus en el cromosoma son distintas. Para analizar los linajes hematopoyticos, las clulas de la mdula sea se infectan in vitro con el vector retrovrico e inmediatamente se transfieren a un receptor irradiado letalmente; entonces se pueden utilizar sondas de DNA para marcar la descendencia de clulas individua les infectadas en los diferentes tejidos hematopoyticos y linfoides del husped. Estos experimentos no slo confirman que todas las clases de clulas san guneas -tan to mieloides como linfoides- derivan de una clula madre comn (Figura 22-30) sino que tam bin permiten seguir el pedigree de las clulas san guneas durante largos intervalos de tiempo. Meses ms tarde, cuando el siste ma hematopoytico ha tenido tiempo de estabilizarse totalmente despus de la transfusin, prcticam ente todas las clulas sanguneas del ratn husped irra diado son descendientes de un nmero muy reducido -e n algunos casos sola mente de u n a- de las clulas transfectadas iniciales. Una nica clula madre pluripotencial posee evidentemente la capacidad de generar un clon indefinida mente grande de progenie de clulas, entre las cuales, presumiblemente, se ori ginan nuevas clulas madre con una capacidad similar, as como clulas dife renciadas definitivamente.

El nmero de clulas sanguneas especializadas se amplifica por divisiones de clulas progenitoras determinadas22,27
En cuanto una clula se ha diferenciado en eritrocito o granulocito o en algn otro tipo de clula sangunea, parece que no existe marcha atrs: el estado de di ferenciacin es irreversible. As pues, en alguna etapa de su desarrollo, alguna descendencia de una clula madre pluripotencial ha de ser determinada de for ma irreversible hacia una lnea particular de diferenciacin. Esto se observa cla ramente a partir de una simple observacin microscpica de mdula sea en la que esta determinacin se produce mucho antes de la divisin final que da lugar a la clula madura diferenciada: se pueden reconocer clulas precursoras espe cializadas que todava siguen proliferando pero que ya muestran seales de ha ber iniciado la diferenciacin. En este sentido parece que la determinacin hacia una lnea particular de diferenciacin va seguida de una serie de divisiones celu lares que amplifican el nmero de clulas de un tipo especializado. As pues, el sistema hematopoytico puede considerarse como una jerar qua de clulas. Clulas m adre pluripotenciales dan lugar a clulas progenito ras determinadas, que estn destinadas irreversiblemente a ser las clulas an cestrales de uno solo o de unos cuantos tipos de clulas sanguneas. Las clulas progenitoras determinadas se dividen rpidamente, pero nicamente un nme ro limitado de veces. Al final de esta serie de divisiones amplificadas evolucionan a clulas diferenciadas terminales, que generalmente ya no vuelven a dividirse y mueren al cabo de unos cuantos das o semanas. Las clulas pueden morir tam bin en alguna de las etapas iniciales del proceso. Estudios de clulas en cul tivo constituyen una va adecuada para determinar cmo se regulan estos m eca nismos celulares -proliferacin, diferenciacin y muerte.

1250

Captulo 2 2 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

TIMO

clula madre linfoide?

(# )

CFC-T

clula T

O O

CFC-B

clula B

clula madre pluripotencial CFC-Bas

C(?

CFC-Eosina

eosinfilo

basfilo

clula madre m ieloide?

CFC-mix

CFC-GM

O
plaquetas m egacariocito

CFC-MEG

( )
BFC-E CFC-E eritrocito
Figura 22-30 Esquema tentativo de la hematopoyesis. Normalmente la clula madre pluripotencial se divide de tarde
en tarde generando nuevas clulas madre pluripotenciales (autorregeneradoras) o clu las p rog en itoras d eterm in ad as (tambin denominadas CFC, de Colony Forming Cells), que se hallan determinadas de forma irreversible para producir slo unos cuantos tipos celulares de la sangre. Las clulas progenitoras son estimuladas a dividirse por factores especficos de crecim iento, pero estas clulas van perdiendo progresivamente su capacidad de divisin y acaban evolucionando a clulas sanguneas diferenciadas, que generalmente slo viven durante unos cuantos das o semanas. En mamferos adultos todas estas clulas se desarrollan principalmente en la mdula sea -excepto los linfocitos T, que se originan en el timo, y los macrfagos y los osteoclastos, que se forman a partir de los m onocitos en la mayora de los tejidos. La parte ms conflictiva del esquema reside en el lugar que corresponde a los precursores de los linfocitos T y B. Asimismo, las clulas madre pluripotenciales pueden dar lugar a varios tipos de clulas de otros tejidos no representadas en este esquema, como las clulas NK, los mastocitos y una gran variedad de tipos de clulas que presentan los antgenos (se estudiarn en el Captulo 23); sin embargo, las vas a travs de las cuales estas clulas se desarrollan son desconocidas.

Los factores que regulan la hematopoyesis pueden analizarse en cultivo28

Las clulas hematopoyticas pueden sobrevivir, proliferar y diferenciarse en cul tivo si y slo si se hallan provistas de factores de crecimiento o acompaadas de clulas que produzcan estos factores; si se ven privadas de dichos factores, las clulas mueren. Por ejemplo, se puede conseguir que clulas madre pluripoten ciales proliferen durante largo tiempo cultivando clulas hematopoyticas aisla das de la mdula sea encim a de una capa de clulas del estroma de la mdula sea, lo cual posiblemente mimetiza las condiciones de la propia mdula sea; este tipo de cultivos puede generar todos los tipos de clulas mieloides. Por otro lado, clulas hematopoyticas aisladas de la mdula sea se pueden cultivar en una matriz semislida de agar diluido o de metilcelulosa, aadiendo artificial mente al medio factores derivados de otras clulas. Debido a que las clulas no pueden migrar en la matriz semislida, las clulas descendientes de cada clula precursora aislada permanecen juntas en forma de colonias fciles de recono-

Renovacin por medio de clulas madre pluripotenciales: formacin de las clulas sanguneas

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cer. Por ejemplo, se puede observar cmo un progenitor neutrfilo determinado llega a formar una colonia de cientos de neutrfilos. Este tipo de sistema de cul tivo, desarrollado a mitad de la dcada de 1960, constituye un sistema de anlisis de los factores que regulan la hematopoyesis y, por lo tanto, permite purificarlos y estudiar su actividad. Estas substancias se encuentran en forma de glucoprotenas y generalmente se denominan citopoyetinas o factores estimuladores de colonias, o CSF (de Colony-Stimulating Factors). Del creciente nmero de CSF que se han definido y purificado, algunos circulan por la sangre y actan como hormonas, mientras que otros actan en la mdula sea tanto como mediadores segregados locales com o seales ligadas a la membrana que actan mediante el contacto clula a clula. El ms conocido de los CSF que actan como una hor m ona es la glucoprotena eritropoyetina, que se fabrica en el rin y regula la eritropoyesis (la formacin de los glbulos rojos).

eritroblasto

La eritropoyesis depende de la hormona eritropoyetina29

El eritrocito constituye, con diferencia, el tipo de clula ms numeroso de la san gre (vase Tabla 22-1). Cuando est maduro es como un paquete lleno de hem o globina que prcticam ente no contiene ninguno de los orgnulos celulares habi tuales. El eritrocito de un mamfero adulto carece incluso de ncleo, de retculo endoplasmtico, de mitocondrias y de ribosomas; todos estos componentes han sido expulsado de la clula durante el curso de su desarrollo (Figura 22-31). Por lo tanto, el eritrocito no puede crecer ni dividirse; la nica va posible de fabricar ms eritrocitos es a partir de las clulas madre. Adems, los eritrocitos tienen un ciclo vital limitado -d e unos 120 das en la especie humana o de 55 das en los ratones. Los eritrocitos envejecidos son fagocitados y digeridos por los macrfagos del hgado y del bazo, que eliminan hasta 1011 eritrocitos envejecidos en cada uno de nosotros cada da. La falta de oxgeno o una disminucin del nmero de eritrocitos estimula a las clulas del rin a sintetizar y segregar mayores cantidades de eritropoyeti na hacia la circulacin sangunea. La eritropoyetina, a su vez, estimula la pro duccin de ms eritrocitos. El cambio producido en la velocidad de liberacin de nuevos eritrocitos a la circulacin sangunea se detecta al cabo de 1 o 2 das despus de increm entarse los niveles de eritropoyetina en la sangre circulante por lo que probablem ente la horm ona acta sobre las clulas que constituyen los precursores ms directos de los eritrocitos maduros. Se pueden identificar las clulas que son sensibles a la eritropoyetina culti vando clulas de la mdula sea sobre una matriz semislida en presencia de esta hormona. Al cabo de unos cuantos das aparecen colonias de unos 60 eri trocitos, cada una de las cuales se forma a partir de una nica clula progenitora eritroide determinada. Esta clula se conoce como clula form adora de colo nias de eritrocitos o CFC-E (de Erythrocyte Colony-Forming Cell), la cual da lu gar a eritrocitos maduros al cabo de seis ciclos de divisin o menos. Las CFC-E todava no contienen hemoglobina y derivan de un tipo de progenitor inicial cuya proliferacin no depende de la eritropoyetina. Las mismas CFC-E depen den de la eritropoyetina tanto para su supervivencia como para su proliferacin: si se elimina la eritropoyetina de los cultivos, rpidamente las clulas experi mentan la muerte celular programada. Un segundo CSF, llamado interleuquina 3 (IL-3), activa la supervivencia y la proliferacin de las clulas progenitoras eritroides tempranas. En su presencia se forman colonias eritroides ms grandes, de ms de 5000 eritrocitos cada una, las cuales se desarrollan a partir de cultivos de clulas de la mdula sea durante un proceso que requiere una semana o 10 das. Estas colonias derivan de las c lulas progenitoras eritroides denominadas clulas formadoras rpidas de eri trocitos, o BFC-E (de Erythrocyte Burst-Forming Cells). Las BFC-E se distinguen de la clula madre pluripotencial en que tienen una capacidad limitada de proli feracin y dan lugar a colonias que slo contienen eritrocitos, incluso bajo con diciones de cultivo que permiten a otras clulas progenitoras originar otras cla-

Figura 22-31 Esquema del desarrollo un glbulo rojo (eritroblasto). Se

muestra cmo la clula expulsa el ncleo y se convierte en un eritrocito inmaduro (reticu locito ), que ms tarde abandona la mdula sea roja y pasa a la corriente sangunea. El reticulocito elimina sus mitocondrias y ribosomas un da o dos antes de convertirse en un eritrocito maduro. Los clones de eritrocitos se forman en la mdula sea, en la superfcie de un macrfago, que fagocita y digiere los ncleos desprendidos por los eritroblastos.

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Captulo 22 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

ses de clulas sanguneas diferenciadas. Se diferencian de las CFC-E en su insen sibilidad a la eritropoyetina, y en que su descendencia ha de llevar a cabo 12 di visiones antes de convertirse en eritrocitos maduros (para lo cual ha de estar presente la eritropoyetina). Estas clulas tam bin difieren de las CFC-E en su ta mao, de forma que ambas pueden separarse por sedimentacin. As pues, se cree que las BFC-E son un tipo de clulas progenitoras determinadas en la dife renciacin de los eritrocitos y que constituyen un antepasado temprano de las CFC-E (Figura 22-32).

clula madre

En la produccin de los neutrfilos y de los macrfagos influyen mltiples CSF28 3 0

Los dos tipos de clulas fagocticas especializadas, los neutrfilos y los macrfa gos, se forman a partir de una clula progenitora comn denominada clula progenitora de granulocitos y m acrfagos o GM (de Granulocyte/Macrophage Progenitor Cell). Al igual que otros granulocitos (eosinfilos y basfilos), los neu trfilos circulan por la sangre nicamente durante unas horas antes de migrar desde los capilares hacia los tejidos conjuntivos u otras reas especficas, donde sobreviven durante unos cuantos das y luego mueren y son fagocitados por los macrfagos. Los macrfagos, por el contrario, pueden sobrevivir durante meses o quiz incluso aos fuera de la corriente sangunea, donde pueden ser activa dos por seales locales reiniciando su proliferacin. Hasta ahora se han definido hasta siete tipos distintos de CSF que estimulan la formacin de colonias de neutrfilos y de macrfagos y se sabe que algunos o todos ellos actan, en distintas combinaciones, regulando la produccin selecti va de estas clulas in vivo. Estos CSF son sintetizados por varios tipos celulares -incluyendo las clulas endoteliales, fibroblastos, macrfagos y linfocitos- y su concentracin en sangre aumenta rpidamente de forma caracterstica como respuesta a la infeccin bacteriana de un tejido, aumentando as el nmero de clulas fagocticas liberadas desde la mdula sea hacia la sangre circulante. IL-3 es uno de los factores menos especfico y acta tanto sobre clulas madre pluripotenciales com o sobre la mayor parte de las clulas progenitoras determ ina das, incluyendo las clulas progenitoras GM. Los otros factores actan de forma ms selectiva sobre las clulas progenitoras determinadas GM y su descenden cia diferenciada (Tabla 22-2), aunque en muchos casos afectan tambin a otros linajes de la familia hematopoytica.

2 eritrocitos m aduros
Figura 22-32 El desarrollo de los glbulos rojos. Interrelaciones entre las clulas BFC-E, las clulas CFC-E y el eritrocito maduro. Las clulas BFC-E y CFC-E son clulas progenitoras eritroides determinadas. Las BFC-E son sensibles al factor IL-3 pero no a la eritropoyetina, mientras que las CFC-E responden a la eritropoyetina. Las series de divisiones celulares que tienen lugar en este linaje bajo la influencia de la eritropoyetina dan un potente sistema de control de la produccin de eritrocitos sin interferir en la produccin de otros tipos celulares.

Tabla 22-2 Algunos factores estimulantes de colonias (CSF) que influyen en la formacin de clulas sanguneas Factor Eritropoyetina Interleuquina 3 (IL-3) Tamao (en ratones) 51 000 daltons 25 000 daltons Clulas diana CFC-E Clulas productoras clulas del rin Receptores familia de las citoquinas familia de las citoquinas

Granulocito/ macrfago CSF (GM-CSF) Granulocito CSF (G-CSF) Macrfago CSF (M-CSF) Factor Steel (factor de clulas madre)

23 000 daltons

clula madre pluripotencial, la linfocitos T, clulas mayor parte de clulas epidrmicas progenitoras, muchas clulas diferenciadas de forma terminal clulas progenitoras GM y linfocitos T, clulas neutrfilos endoteliales, fibroblastos macrfagos, fibroblastos fibroblastos, macrfagos, clulas endoteliales clulas de estroma en mdula sea y en muchas otras clulas

familia de las citoquinas familia de las citoquinas familia de receptores tirosina quinasa familia de receptores tirosina quinasa

25 000 daltons

clulas progenitoras GM y neutrfilos 70 000 daltons clulas progenitoras GM y (dimero) macrfagos 40-50 000 daltons clula madre hematopoytica (dimero)

Renovacin por medio de clulas madre pluripotenciales: formacin de las clulas sanguneas

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IL-3 subunidad a del receptor IL-3

subunidad comn 3

GM-CSF___ subunidad re del receptor CM-CSF

subunidad com n (3

seal

Figura 22-33 Reparto de subunidades entre los receptores CSF. Los receptores IL-3 humanos y los receptores GM-CSF poseen subunidades a distintas y subunidades (3 comunes. Sus ligandos se unen a las subunidades a con una baja afinidad, lo cual desencadena el ensamblaje de los heterodmeros que se unen al ligando con alta afinidad.

seal receptores de baja afinidad receptores de alta afinidad

Todos estos CSF, al igual que la eritropoyetina, son glucoprotenas que ac tan a bajas concentraciones (~ 1 0 12M) mediante su unin a receptores espec ficos de superficie, como estudiamos en el Captulo 15. Algunos de dichos recep tores son tirosina quinasas transmembrana. Los restantes pertenecen a otra gran familia de receptores (denominada a veces la familia de receptores citoquinas), cuyos miembros se com ponen generalmente de dos o ms subunidades, una de las cuales se encuentra con frecuencia entre algunos tipos de receptores (Figura 22-33) Los CSF no slo actan sobre las clulas precursoras provocando la formacin de un linaje de clulas diferenciadas, sino que tambin activan fun ciones especializadas (tales como la fagocitosis y la destruccin de clulas diana) de clulas diferenciadas de forma terminal. Las protenas producidas artificial mente a partir de los genes clonados para estos factores (en ocasiones conside rados como factores recombinantes debido a que se han formado utilizando tec nologa del DNA recombinante) son fuertes estimuladores de la hematopoyesis en animales experimentales. Actualmente se utilizan en pacientes humanos para estimular la regeneracin del tejido hematopoytico y aumentar la resis tencia a las infecciones -u n a impresionante demostracin de cmo la investiga cin biolgica bsica de la clula y los experimentos con animales pueden con tribuir a la m ejora de un tratamiento mdico. Tambin se han descrito factores que estimulan el desarrollo de los restantes tipos de clulas mieloides, tales como los megacariocitos y los eosinfilos. Una vez ms, existe una gran cantidad de dichos factores, y presentan una actividad solapada tal como se comprueba en los ensayos de laboratorio. No es fcil descu brir de forma precisa cules son sus funciones particulares en condiciones natu rales. Quiz la prueba ms directa para conocer la funcin normal de un CSF es inactivar dicho CSF o su receptor en un organismo vivo y estudiar las consecuen cias. Esto se ha aplicado a algunos CSF. Anticuerpos anti-G-CSF, que neutralizan la actividad del G-CSF -u n CSF que estimula la produccin de neutrfilos in vitro- se ha demostrado que producen un marcado descenso del nmero de neu trfilos cuando se inyectan a perros sanos, establecindose que el G-CSF es nece sario para la produccin normal de neutrfilos. Los estudios genticos pueden ser todava mas demostrativos. Por ejemplo, ratones con una mutacin en el gen que codifica el M-CSF son deficientes en macrfagos, as como en osteoclastos, que tambin se desarrollan a partir de los monocitos. Dado que los osteoclastos son necesarios para la resorcin sea (tal como estudiaremos ms adelante) di chos ratones producen cantidades excesivas de hueso que invade la mdula sea y produce huesos anormalmente engrosados, disminuyendo as la formacin de clulas sanguneas -u n a alteracin denominada osteopetrosis.

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Captulo 2 2 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

Las clulas madre hematopoyticas dependen del contacto con clulas que expresan el factor Steel3 1
Los CSF que actan en clulas madre pluripotenciales son los menos conocidos. Tal como hemos visto, IL-3 correspondera a este grupo. Otro factor parecido de im portancia fundamental se ha esclarecido a partir de anlisis de ratones mutantes que presentan una curiosa com binacin de defectos: una reduccin del nmero de glbulos rojos (anemia), de clulas germinales (esterilidad) y de clu las pigmentarias (manchas blancas en la piel). Tal como vimos en el Captulo 21, este sndrome se origina a partir de mutaciones en algunos de estos dos genes: uno, denominado c-kit, codifica un receptor tirosina quinasa; el otro, denomi nado Steel, codifica su ligando. Todos los tipos celulares afectados por las muta ciones derivan de clulas precursoras mviles, y al parecer para que estos tipos celulares se produzcan en cantidades normales, dichas clulas precursoras de ben expresar en cada caso el receptor (Kit) y proveerse del ligando (Steel) a partir de su entorno. Al igual que IL-3, el factor Steel acta en algunos de los linajes de clulas sanguneas determinadas, incluyendo el linaje eritroide, as como en las clulas madre pluripotenciales, pero tiene un efecto reducido sobre s mismo. Bsica mente potencia los efectos de otros CSF incrementando notablemente el nm e ro y tamao de todos los tipos de colonias de clones de clulas sanguneas en cultivo. Tam bin constituye un CSF poco corriente en otro aspecto. Se encuen tra tanto en la forma vesicular como en la forma segregada, generadas por m a duracin alternativa del mRNA, y parece que la forma vesicular es la ms impor tante: los ratones mutantes que fabrican la forma segregada del factor Steel pero no la forma vesicular presentan deficiencias acusadas. Ello implica que la hem a topoyesis normal requiera el contacto directo clula-clula entre la clula madre hematopoytica y la clula del estroma que expresa el Steel y que nicamente mediante este contacto el factor Steel logra la activacin de la protena receptora Kit de forma eficiente. Debemos considerar dicho factor Kit como un correcep tor (como veremos en el Captulo 23) que tiene que activarse simultneamente con los receptores para los factores tales como IL-3 para la estimulacin de la hematopoyesis. Esto podra ayudar a explicar por qu la hematopoyesis tiene lu gar nicamente en ciertos entornos especiales, como los que se hallan entre las clulas del estroma de la mdula sea, mientras que otros tejidos no manifiestan la invasin y la colonizacin aunque siempre se encuentren algunas clulas he matopoyticas en la circulacin sangunea.

El comportamiento de una clula hematopoytica depende parcialmente del azar28,3 2

Llegados a este punto vamos a considerar una cuestin fundamental. Los CSF se han definido como factores que estimulan la produccin de colonias de clulas sanguneas diferenciadas. Pero, qu efecto preciso ejerce un CSF sobre una clula hematopoytica individual? Un factor de este tipo podra controlar la velocidad de divisin celular o el nmero de ciclos de divisin que la clula progenitora presen ta en el transcurso de la diferenciacin, o podra actuar tempranamente influyen do en su determinacin; o podra actuar simplemente incrementando la probabi lidad de supervivencia celular (Figura 22-34). Mediante el seguimiento de un cultivo de clulas hematopoyticas ha sido posible demostrar que un solo CSF, el GM-CSF, puede ejercer todos estos efectos distintos. Sin embargo, todava no que da claro cules son las actividades que in vivo son ms importantes. El comporta miento de las clulas madre pluripotenciales contina siendo especialmente dif cil de determinar: estas clulas esenciales son escasas y se hallan muy dispersas -m enos de 1 de cada 1000 clulas de la mdula sea- y son extremadamente dif ciles de identificar claramente. Adems, estudios in vitro indican que existe una elevado componente de azar en la forma de comportarse de la clula hematopoytica. El CSF no dicta di

Renovacin por medio de clulas madre pluripotenciales: formacin de las clulas sanguneas

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PARAMETROS CONTROLABLES clula madre 1. Frecuencia de divisin de la clula madre 2. Probabilidad de m uerte de la clula madre 3. Probabilidad de que la clula madre descendiente se convierta en una clula progenitora responsable de la form acin de un tipo celular determ inado

Figura 22-34 Algunos de los parmetros que pueden regular la produccin de un tipo determinado de clulas sanguneas. Estudios in vitro sugieren que los factores estimuladores de colonias (CSF) pueden afectar todos estos aspectos de la hematopoyesis.

4. Duracin del ciclo de divisin de la clula progenitora determ inada 5. Probabilidad de m uerte de la clula progenitora

/A A y
clula sangunea diferenciada term inal

6. Nm ero de divisiones de las clulas progenitoras determ inadas que se producen antes de la diferenciacin term inal 7. Ciclo vital de las clulas diferenciadas

rectam ente lo que debe hacer cada clula sino que acta regulando probabilida des. En cultivos de clulas hematopoyticas, incluso cuando las clulas seleccio nadas constituyen una poblacin lo ms homognea posible, se produce una marcada variabilidad en cuanto a tamaos y a menudo en cuanto a caractersti cas de las colonias a que dan lugar. Dos clulas hermanas que se separen inm e diatamente despus de una divisin y que se cultiven aparte bajo condiciones idnticas, frecuentem ente darn lugar a colonias que contengan distintos tipos de clulas sanguneas, o los mismos tipos pero en cantidades distintas. As pues parece que tanto en la programacin de la divisin celular como en el proceso de la determinacin de una clula en una va particular de diferenciacin parti cipan una serie de acontecim ientos aleatorios a nivel individual, aunque el com portamiento de un sistema multicelular en su conjunto se regula de forma ms precisa.

La regulacin de la supervivencia celular es tan importante como la regulacin de la proliferacin celular33

Aunque estas observaciones muestran que los CSF no son estrictamente necesa rios para ordenar a las clulas hematopoyticas cmo deben diferenciarse o cuntas veces tienen que dividirse, los CSF son necesarios para el m antenim ien to de las clulas vivas: el comportamiento defectuoso de las clulas en ausencia de los CSF es suicida. En principio, los CSF deberan regular el nmero de los distintos tipos de clulas sanguneas de forma completa mediante el control se lectivo de la supervivencia celular y existen evidencias de que el control selectivo de la supervivencia celular juega un papel fundamental en la regulacin normal del nmero de clulas sanguneas y, tal como vimos anteriormente para los hepatocitos, tam bin de muchos otros tipos celulares. Al parecer, en muchos teji dos las clulas estn programadas para destruirse a s mismas si no reciben se ales especficas para su supervivencia. Ya hemos visto la importancia y el mecanismo de la muerte celular programada durante el desarrollo (vase pg. 1152); es un factor igualmente importante para el recambio y la renovacin de las poblaciones celulares en el individuo adulto (Figura 22-35). Los genes que la

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Captulo 2 2 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

Figura 22-35 Muerte celular por apoptosis. La electronmicrografa muestra una clula apopttica de la glndula mamaria. La muerte celular apopttica es un hecho normal en dicha glndula, estabilizando la proliferacin de las clulas epiteliales mamarias que se da en cada ciclo menstrual. Obsrvese la desintegracin de la envoltura nuclear y las zonas oscuras de la cromatina condensada. Puede compararse con una zona de una clula normal, visible a un lado de la figura. (Cortesa de David Ferguson.)

regulan se han conservado durante la evolucin hasta el punto que al menos uno de dichos genes, denominado bcl-2, que codifica un inhibidor intracelular de la muerte celular programada en clulas de mamferos, puede llevar a cabo la misma funcin en clulas de un gusano nemtodo. Una frecuencia de muerte celular demasiado baja puede ser tan peligrosa para la salud de un organismo pluricelular como un exceso de proliferacin, y las mutaciones que inhiben la muerte celular debido a una sobreexpresin del bcl-2 se hallan implicadas en el desarrollo del cncer, tal como se ver en el Captulo 24. El cantidad de muerte celular programada en el sistema hematopoytico de los vertebrados es enorme; por ejemplo, miles de millones de neutrfilos m ue ren de esta forma cada da en el hombre adulto. Aunque el m ecanismo de la muerte celular programada contina siendo un misterio, generalmente las clu las que mueren experimentan una serie de cambios morfolgicos caractersticos denominados apoptosis, durante los cuales la clula, incluido el ncleo, se con traen condensndose y con frecuencia se fragmentan. Por el contrario, las clu las que mueren accidentalmente, como resultado de una lesin aguda, general mente se hinchan y estallan -u n proceso denominado necrosis celular. Mientras las clulas que mueren por necrosis liberan su contenido citoslico al espacio extracelular y provocan una respuesta inflamatoria, las clulas que mueren por apoptosis desaparecen de una forma ms eficiente para el organismo: rpida mente son fagocitadas por los macrfagos (u otras clulas vecinas) lo cual no provoca la liberacin de com ponentes citoslicos ni respuesta inflamatoria. Una vez en el interior del macrfago, la clula apopttica rpidamente se fragmenta y sus com ponentes bsicos son reutilizados. Para activar este dispositivo, las clulas apoptticas cambian la com posi cin qumica de su superficie de forma que puedan ser reconocidas por los m a crfagos. El m ecanismo de reconocim iento depende del tejido y del tipo de clu la sangunea. En algunos casos una lectina de la superficie del macrfago parece que reconoce los grupos de azcares alterados de la superficie de la clula apop ttica. En otros casos una integrina (como hemos visto en el Captulo 19) de la superficie del macrfago reconoce una protena de la matriz extracelular deno minada trombospondina, que es segregada por el macrfago y parece que acta como puente entre ste y la clula apopttica; se desconoce el m ecanismo por el cual la trombospondina se une a la clula apopttica. En algn otro caso el m a crfago es capaz de reconocer la fosfatidilserina, un fosfolpido cargado negati-

Renovacin por medio de clulas madre pluripotenciales: formacin de las clulas sanguneas

1257

vamente que norm alm ente se localiza en la subcapa citoslica de la bicapa lipdica de la m em brana plasmtica (vase Figura 10-11) pero aparentemente se resita en la subcapa extracelular de las clulas sanguneas apoptticas. Inde pendientem ente del sistema de reconocim iento utilizado, los macrfagos reac cionan frente a las clulas apoptticas de forma especfica: las engloban y las di gieren, pero no segregan seales inductoras de inflamacin como ocurre cuando fagocitan y digieren clulas necrticas. sta es la segunda razn por la que la necrosis celular se asocia con la inflamacin y la apoptosis no. Si bien los bilogos han centrado mucho ms la atencin en el control de la proliferacin celular que en el control de la supervivencia, se observa claramente que ambos tipos de controles pueden servir para regular el nmero de clulas. Am bos tipos de controles dependen de seales especficas producidas por otras clu las, que aseguran que una clula se divida nicamente cuando se necesitan ms c lulas y que una clula sobreviva slo cundo y dnde se la necesita. El desafo reside en poder definir todas las seales que regulan la supervivencia y la prolifera cin de cada tipo celular, para determinar cmo se controlan sus niveles para equi librar la proliferacin y la muerte celular de acuerdo con las distintas necesidades del organismo, y comprender cmo una nica clula integra todas estas seales extracelulares y decide si vivir o morir y si dividirse o permanecer quiescente.

Resumen

Los principales tipos de clulas sanguneas proceden de una clula madre pluripotencial comn. En el individuo adulto las clulas madre se localizan principalmente en la mdula sea, donde normalmente se dividen, de tarde en tarde, produciendo ms clulas madre (autorregenerantes) y varias clulas progenitoras determinadas que pueden dar lugar a uno o varios tipos de clulas sanguneas. Las clulas progeni toras determinadas se dividen profusamente bajo la influencia de varias molculas proteicas seal (denominadas factores estimuladores de colonias o CSF) y posterior mente se diferencian en clulas sanguneas adultas, que generalmente mueren al cabo de unos cuantos das o semanas. Los estudios sobre la hematopoyesis han pro gresado enormemente gracias a experimentos in vitro, en los cuales las clulas madre o las clulas progenitoras implicadas forman colonias de tipo clnico cuando se culti van en una matriz semislida. El linaje de clulas madre parece ejercer su seleccin entre vas de desarrollo alternativas de una forma parcialmente casual. La muerte celular, controlada por la disponibilidad de los CSF, tambin juega un papel funda mental en la regulacin del nmero de clulas sanguneas diferenciadas; depende de la activacin de un suicidio intracelular programado y es capaz de contribuir a la re gulacin del nmero de clulas en muchos otros tejidos y en otros grupos de animales.
Gnesis, modulacin y regeneracin del msculo esqueltico34
El trmino m sculo se aplica a un gran nmero de tipos celulares, todos ellos especializados en la contraccin, pero distintos en otros aspectos. Como se dijo en el Captulo 16, el sistema contrctil compuesto por actina y miosina es una caracterstica bsica de las clulas animales en general, aunque las clulas de tipo muscular han desarrollado este sistema hasta un grado elevado: los mam feros poseen cuatro categoras principales de clulas especializadas en la con traccin: clulas del msculo esqueltico, clulas musculares del corazn (o car dacas), fibras musculares lisas y clulas mioepiteliales (Figura 22-36). Estos tipos de clulas se diferencian en cuanto a funcin, estructura y desarrollo. Aunque todas ellas generan fuerzas de contraccin mediante sistemas organizados de fi lam entos de actina y de miosina, las molculas de actina y de miosina utilizadas son algo distintas en cuanto a su secuencia de aminocidos, tienen una distribu cin espacial distinta y el control de la contraccin se produce a travs de su asociacin con distintos conjuntos de protenas.

125 8

Captulo 2 2 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

Las clulas del msculo esqueltico, cuyo aparato contrctil se discute en detalle en el Captulo 16, son las responsables de prcticam ente todos los movi m ientos que estn bajo control voluntario. Estas clulas pueden ser muy largas (2 o 3 cm de largo y 100 jxm de dimetro en un humano adulto) por lo que a m e nudo se les denomina fibras musculares. Cada una de ellas es un sincitio que contiene varios ncleos en un citoplasma comn. Los otros tipos de clulas musculares son ms convencionales, y tienen un solo ncleo. Las clulas m us culares cardacas se parecen a las clulas musculares esquelticas en que sus filamentos de actina y miosina estn alineados de una forma muy ordenada, formando series de unidades contrctiles denominadas sarcmeros, de forma que las clulas tienen una apariencia estriada. Las clulas del msculo liso re ciben este nombre porque, contrariamente, no tienen aspecto estriado. Las funciones del msculo liso son muy variadas y abarcan desde la propulsin del alimento a lo largo del tracto digestivo hasta la ereccin de los pelos como res puesta al fro o al miedo. Las clulas mioepiteliales tam bin carecen de estras pero, a diferencia de los dems tipos de fibras musculares, se hallan en los epi telios y derivan del ectodermo. Forman el msculo dilatador del iris y tambin actan expulsando la saliva, el sudor y la leche de las glndulas correspondien tes (vase Figura 22-36E). Las cuatro categoras principales de fibras m uscula res se pueden dividir en varios subtipos, cada uno de los cuales tiene sus rasgos caractersticos.

Figura 22-36 Las cuatro clases de clulas musculares de un mamfero.

(A) Esquemas (a escala). (B-E) Electronmicrografas de barrido, en las que aparecen (B) msculo esqueltico del cuello de hmster, (C) msculo cardaco de rata, (D) msculo liso de la vejiga urinaria de cobaya y (E) clulas mioepiteliales en un alvolo secretor de una glndula mamaria de rata lactante. Las flechas en (C) sealan los discos intercalares -u niones entre los extremos de las clulas musculares del corazn; las clulas de la musculatura esqueltica de los grandes msculos unen un extremo con otro de forma similar. Obsrvese que el msculo liso se ha presentado en esta figura a menos aumentos que los restantes. (B, por cortesa de Junzo Desaki; C, de T. Fujiwara, en Cardiac Muscle en Handbook of Microscopic Anatomy [E.D. Canal ed.]. Berln: Springer Verlag, 1986; D, por cortesa de Satoshi Nakasiro; E, de T. Nagato, Y. Yoshida, A. Yoshida, e Y. Uehara, Cell a n d Tissue Res. 209:1-10,1980.)

(A)

clula de m sculo cardaco

clula de m sculo liso

clula m ioepitelial

..
clula de m sculo esqueltico
I

11

I ______ I

50 |im

c lu la s d e

m sculo cardaca

fibras clula m ioepitelial clula secretora de lechc

haz de clulas de m sculo liso 50 um

10 [jm

Gnesis, modulacin y regeneracin del msculo esqueltico

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A)
100 | jm

35 |jm
Figura 22-37 Fusin de m ioblastos en cultivo. Micrografas de contraste de fases de mioblastos en cultivo, en las que se observa cmo las clulas van proliferando, se alinean y luego se fusionan formando clulas musculares plurinucleadas. A mayores aumentos (C) se observan las estriaciones transversales que empiezan a visualizarse al desarrollarse el aparato contrctil {flech a roja), as como las acumulaciones de numerosos ncleos dentro de una misma clula {flechas verdes). (Cortesa de Rosalind Zalin.)

Los mecanism os de la contraccin muscular se han visto en el Captulo 16; en este captulo vamos a considerar cmo se genera y se mantiene el tejido mus cular. Nos centraremos en la clula del msculo esqueltico, que presenta un modelo especial de desarrollo y tam bin una notable capacidad para modular su carcter diferenciado, as como una estrategia especial de regeneracin.

Las nuevas clulas del msculo esqueltico se forman por fusin de los mioblastos2,3 5
En el captulo anterior describamos cmo ciertas clulas, originadas a partir de los somitos de un embrin de vertebrado en un estadio muy temprano, quedan determi nadas como mioblastos (es decir, precursoras de las clulas del msculo esqueltico) y migran hacia el tejido conjuntivo embrionario adyacente o mesnquima. Tal como se trat en el Captulo 9, parece que la determinacin de constituir un mioblasto (y tambin la de constituir un fibroblasto) depende de la activacin de uno o ms genes miognicos, que codifican protenas reguladoras de genes, de la familia hlice-buclehlice. Despus de un perodo de proliferacin, los mioblastos se fusionan entre s formando clulas del msculo esqueltico plurinucleadas (Figura 22-37). Al fusionar se sufren un marcado cambio de fenotipo que depende de la activacin coordinada de un conjunto de genes especficos de la clula muscular. Una vez se ha producido la fusin, los ncleos ya no replican ms su DNA. La fusin implica molculas de ad hesin clula-clula que intervienen en el reconocimiento entre los mioblastos. Mioblastos que se han mantenido en proliferacin en un cultivo celular du rante dos aos todava conservan la capacidad de diferenciarse y de fusionarse formando fibras musculares en respuesta a un cambio adecuado de las condi ciones de cultivo. Parece que la presencia en el medio del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF, de Fibroblast Growth Factor) es esencial para mantener la proliferacin de los mioblastos e impedir su diferenciacin: si se elimina el FGF, las clulas detienen rpidamente sus procesos de divisin, se fusionan y se dife rencian. Sin embargo, el sistema de controles es complejo. Por ejemplo, para di ferenciarse los mioblastos deben adherirse a la matriz extracelular. Por otro lado, el proceso de fusin es cooperativo: los mioblastos que se fusionan segre gan factores que incitan a otros mioblastos a fusionarse. En el animal intacto los mioblastos y las fibras musculares se sostienen en las mallas de una red de tejido conjuntivo formada por los fibroblastos. Esta red coordina el desarrollo muscu lar y controla la ordenacin y la orientacin de las fibras musculares.

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Captulo 22 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

(B)

I-------------------1
100
|_j m

Las fibras musculares pueden modular sus propiedades mediante cambios de las protenas isoformas que poseen3 6
Generalmente cuando una clula de msculo esqueltico se ha formado, se mantiene durante todo el ciclo vital del animal. Durante este perodo, crece, m a dura y modula sus caractersticas segn los requerimientos funcionales. El genoma contiene mltiples copias variantes de los genes que codifican la mayora de las protenas caractersticas de la clula muscular esqueltica, y adems los transcritos de RNA de estos genes pueden madurar de distintas formas. Como resultado de ello, para los com ponentes del aparato contrctil se pueden produ cir numerosas variantes proteicas (isoformas). A medida que la clula va madu rando, se van produciendo distintas selecciones de isoformas proteicas, adapta das a las sucesivas demandas de velocidad, fuerza y resistencia en el feto, en el recin nacido y en el adulto. En el msculo de un individuo adulto, se pueden encontrar adosados distintos tipos de fibras musculares esquelticas, cada uno de ellos con un conjunto distintos de protenas isoformas y con distintas propie dades funcionales (Figura 22-38).

Figura 22-38 Fibras musculares rpidas y lentas. Dos cortes consecutivos de un mismo fragmento de msculo de pollo se han teido con dos anticuerpos fluorescentes, cada uno especfico para una isoforma distinta de la miosina II. En (A) clulas especializadas en la produccin de contracciones rpidas se tien con anticuerpos contra miosina rpida; en (B) las clulas especializadas en la produccin de contracciones lentas y sostenidas se tien con anticuerpos contra miosina lenta. Las clulas de contraccin rpida se conocen como fibras musculares blancas, debido a su contenido relativamente bajo en una protena de color rojo que une oxgeno, la mioglobina; las clulas musculares lentas se denominan fibras musculares rojas debido a su mayor contenido en dicha protena. Las clulas pueden ajustar su carcter lento o rpido mediante cambios de la expresin gnica segn el tipo de estmulo nervioso que reciben. (De G. Gauthier et al., / . Cell Biol. 92:471-484, 1982, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

En el adulto persisten algunos mioblastos como clulas madre quiescentes3 7

Un msculo puede crecer de tres maneras: sus fibras musculares diferenciadas pueden aumentar en nmero, en longitud o en grosor. Debido a que las fibras musculares esquelticas no pueden dividirse, la mayor parte de ellas se forman por fusin de mioblastos. El nmero fibras musculares esquelticas plurinuclea das que tiene un adulto se alcanza en una etapa temprana -e n la especie hum a na antes del nacimiento. El enorme incremento posterior del volumen muscular se produce por aumento del volumen de las clulas. El crecimiento en longitud depende de la incorporacin de ms mioblastos a una clula plurinucleada ya formada, principalmente por fusin a nivel de los extremos, con lo cual se incre menta el nmero fie ncleos de cada clula. En contraposicin, el crecimiento en grosor, tal como ocurre en los msculos de los levantadores de pesas, depen de de un increm ento del volumen muscular y del nmero de las miofibrillas contrctiles que contiene cada fibra muscular ms que de variaciones del nm e ro de las fibras musculares o de sus ncleos. En el adulto, sin embargo, persiste un pequeo nmero de mioblastos en forma de clulas inactivas, pequeas y aplanadas, en estrecho contacto con la

Figura 22-39 Autorradiografa de una sola clula muscular plurinucleada con clulas satlite asociadas. La fibra se ha aislado a partir de una rata adulta y se ha transferido a un medio de cultivo que contena timidina 3H y un extracto de un msculo lesionado, que estimula la divisin de las clulas satlite. Las clulas satlite en divisin (flechas) aparecen marcadas radiactivamente (los granos de plata se visualizan como puntos negros); los ncleos de la clula muscular no tienen posibilidad de proliferar y permanecen sin marcar. (De R. Bischoff, Dev. Biol. 115:140-147,1986.)

20 |jm

Gnesis, modulacin y regeneracin del msculo esqueltico

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clula muscular madura y localizados a nivel de la lmina basal. Si se lesiona el msculo o se trata artificialmente con FGF, estas denominadas clulas satlite se activan y proliferan (Figura 22-39) y su descendencia puede fusionarse forman do nuevas fibras musculares. Las clulas satlite constituyen las clulas madre de la musculatura esqueltica de un adulto, que normalmente se mantienen en reserva en un estado quiescente pero que son utilizables cuando se requiere una autorrenovacin de clulas diferenciadas de forma terminal. Aunque este m ecanism o de reparacin muscular funciona bien en animales pequeos com o el ratn, es m enos eficiente en el hombre. Por ejemplo, en la distrofia muscular, las fibras musculares esquelticas diferenciadas mueren de bido a un defecto gentico en la protena del citoesqueleto distrofina (vase pg. 917). Como resultado de ello, las clulas satlite proliferan formando nuevas fi bras musculares; pero dicha respuesta regenerativa no consigue ajustarse a la le sin y las fibras musculares quedan finalmente reemplazadas por tejido conjun tivo, bloqueando cualquier posibilidad posterior de regeneracin.

Resumen

Las clulas del msculo esqueltico constituyen una de las principales categoras celulares de los vertebrados especializadas en la contraccin; son responsables del movimiento voluntario. Cada clula del msculo esqueltico es un sincitioyse de sarrolla por la fusin de mioblastos. Los mioblastos son estimulados para proli/erar por factores de crecimiento, como el FGF, pero una vez se han fusionado, ya no pueden volver a dividirse. Generalmente la fusin de los mioblastos se halla aco plada con el programa de la diferenciacin de la fibra muscular, en la cual varios genes que codifican las protenas especficas del msculo actan deforma coordi nada. En el msculo del individuo adulto persisten algunos mioblastos (en estado quiescente) como clulas satlite; cuando se lesiona un msculo, estas clulas se reactivan, proliferando y fusionndose, y reemplazando las fibras musculares perdidas.
Los fibroblastos y sus transformaciones: la familia de las clulas del tejido conjuntivo38
En el individuo adulto, la mayor parte de las clulas diferenciadas pueden agru parse en familias cuyos miembros se hallan estrechamente relacionados entre s en funcin de su origen y de sus caractersticas. Un ejemplo importante lo cons tituye la familia de las clulas del tejido conjuntivo, cuyos componentes no slo estn relacionados sino que tam bin son interconvertibles en un alto grado. Esta familia incluye fibroblastos, condrocitos y osteocitos, clulas todas ellas especiali-

clula sea (osteoblasto/osteocito)

clula cartilaginosa ginosa Figura 22-40 La familia de clulas del (condrocito) :ito) ... _ , _ .
||f ||||\

clula del m sculo liso clula adiposa (adipocito)

tejido conjuntivo. Las flechas senalan las interconversiones que posiblemente tienen lugar entre las clulas de la familia del tejido conjuntivo. Para mayor simplicidad, el fibroblasto aparece como un tipo celular nico, aunque de hecho se desconoce cuntos tipos de fibroblastos existen y si la diferenciacin potencial de los distintos tipos puede restringirse de formas distintas.

12 6 2

Captulo 2 2 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

Figura 22-41 El fibroblasto. (A) Micrografia en contraste de fases de un fibroblasto en cultivo. (B) Esquemas de una clula viva similar a un fibroblasto, de la cola transparente de un renacuajo, en el que aparecen los cambios de forma y de posicin en das sucesivos. Obsrvese que los fibroblastos en cultivo se aplanan pero que en los tejidos pueden presentar morfologas ms complejas, formando diferentes expansiones. (A, por cortesa de Daniel Zicha; B, dibujado a partir de E. Clark, Am. J. Anat. 13:351379,1912.)

zadas en la secrecin de la colgena de la matriz extracelular y que en conjunto son las responsables del soporte arquitectnico del cuerpo, as como los adipocitos y las fibras musculares lisas, que parecen tener un origen comn con las an teriores. En la Figura- 22-40 se ilustran estos tipos celulares y las interconversiones que tienen lugar entre ellos. Las clulas del tejido conjuntivo juegan un papel fundamental en el sostn y en la reparacin de la mayor parte de los teji dos y rganos; la adaptabilidad de su carcter diferenciado constituye uno de los aspectos ms importantes de las respuestas frente a distintos tipos de lesiones.

< a >

Los fibroblastos cambian sus caractersticas en respuesta a seales de la matriz extracelular38,3 9

Los fibroblastos son las clulas menos especializadas de la familia del tejido con juntivo. Se hallan dispersas en el tejido conjuntivo de todo el cuerpo, donde se gregan una matriz extracelular blanda rica en colgena de tipo I o de tipo III, tal com o vimos en el Captulo 19. Cuando se lesiona un tejido, los fibroblastos migran hacia la herida, proliferan y producen grandes cantidades de colgena, la cual contribuye al aislamiento y reparacin de los tejidos daados. Su capacidad para desplazarse en el momento de una lesin, junto con el sistema de vida soli tario que presentan, podra explicar por qu los fibroblastos son las clulas que crecen ms fcilmente en cultivo -u n a caracterstica que las ha hecho el elem en to fundamental en los estudios de biologa celular (Figura 22-41). Tal como se indica en la Figura 22-40, parece que los fibroblastos son las c lulas ms verstiles del tejido conjuntivo, ya que poseen una notable capacidad para diferenciarse en otros miembros de la misma familia. Sin embargo, existen algunos puntos oscuros acerca de dichas interconversiones. Existe una eviden cia clara de que los fibroblastos de distintas partes del cuerpo son intrnseca mente distintos y est totalmente comprobado que todos los fibroblastos de una regin determinada son equivalentes. Ante la falta de evidencias que prueben lo contrario, lo ms sencillo es suponer que efectivamente son equivalentes, aun que es igualmente posible que el tejido conjuntivo pueda contener una mezcla de linajes procedentes de fibroblastos distintos, algunos de ellos capaces de transformarse en condrocitos, otros en adipocitos, etc., en lugar de que un solo tipo de fibroblasto posea mltiples capacidades de desarrollo. Es posible tam bin que puedan coexistir los fibroblastos maduros incapaces de transformar se junto con fibroblastos "inmaduros (frecuentemente denominados clulas mesenquimticas), los cuales pueden dar lugar a una gran variedad de tipos ce lulares maduros. A pesar de estas indeterminaciones, a partir de estudios realizados tanto in vivo como in vitro, existe una evidencia clara de que las clulas del tejido con juntivo pueden sufrir cam bios radicales de sus caractersticas. En este sentido, si se obtiene una preparacin de matriz sea mediante raspado del hueso hasta obtener un polvo fino, se elimina por disolucin el com ponente mineral duro y se implanta en la capa drmica de la piel, algunas de las clulas (posiblemente fibroblastos de la dermis) se transforman en clulas cartilaginosas y, algo ms tarde, otras lo hacen en clulas seas, de tal forma que constituyen una pequea protuberancia de hueso que se completa con una cavidad medular. Este tipo de experimentos sugiere que los com ponentes de la matriz extracelular pueden in-

da 2

(B)

da 4

Los fibroblastos y sus transformaciones: la familia de las clulas del tejido conjuntivo

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fluir notablem ente en la diferenciacin celular del tejido conjuntivo. Veremos ms adelante que transformaciones celulares muy similares a stas son impor tantes en la reparacin espontnea de fracturas seas. De hecho, se ha detecta do que la matriz sea contiene en su interior concentraciones elevadas de algu nos factores de crecim iento que pueden afectar el comportamiento de las clulas del tejido conjuntivo, incluyendo, en particular, el factor (3 de transfor m acin del crecim iento TGF-(3 (de Transforming Growth Factor (3), y un conjun to de diversas protenas morfogenticas del hueso (BMP, de Bone Morphogenetic Proteins) que pertenecen a la superfamilia TGF-p. Estos factores constituyen po tentes reguladores del crecimiento, diferenciacin y sntesis de la matriz por c lulas del tejido conjuntivo, ejerciendo distintas acciones que dependen del tipo de clula diana y de la com binacin con otros factores y componentes de la m a triz que se hallan presentes. Cuando se inyectan en un organismo vivo, pueden inducir formacin de cartlago, de hueso o de matriz fibrosa, segn la zona y las circunstancias de la inyeccin.

La matriz extracelular puede influir en la diferenciacin de las clulas del tejido conjuntivo, afectando a su adhesin y a su forma40
La matriz extracelular puede influir en el estado de diferenciacin de las clulas del tejido conjuntivo, mediante efectos fsicos o qumicos. Esto se ha demostra do en estudios realizados sobre cultivos de clulas cartilaginosas o condrocitos. Bajo condiciones de cultivo apropiadas, estas clulas proliferan y mantienen su carcter diferenciado, manteniendo durante muchas generaciones la sntesis de grandes cantidades de una matriz cartilaginosa notablemente caracterstica, que las rodea por completo. Sin embargo, bajo condiciones en las que las clulas se mantienen a una densidad relativamente baja y permanecen en forma de monocapa en la placa de cultivo, tiene lugar una transformacin. Las clulas pierden la forma redondeada tpica de los condrocitos, se aplanan contra el substrato y dejan de fabricar matriz cartilaginosa. Concretamente dejan de producir colge na de tipo II -la caracterstica del cartlago- y en su lugar empiezan a producir colgena de tipo I -la caracterstica de los fibroblastos. Al cabo de un mes de cul tivo, casi todas las clulas han modificado la expresin gnica de la colgena y presentan aspecto de fibroblastos. Probablemente los cambios bioqumicos de ben de producirse de forma brusca, ya que slo unas cuantas clulas fabrican si multneamente ambos tipos de colgena. Algunas lneas de evidencia sugieren que los cambios bioqumicos estn in ducidos, al menos en parte, por cambios producidos en la forma y en la adhe sin celular. Por ejemplo, las clulas del cartlago que han realizado la transicin al carcter fibroblstico pueden irse separando poco a poco de la placa de culti vo y transferirse a una placa de agar. Al formar el depsito de gel a su alrededor, el agar m antiene las clulas en suspensin sin ningn tipo de adhesin al subs trato, vindose obligadas a adoptar una forma redondeada. En estas condicio nes, las clulas revierten inmediatamente al carcter de condrocitos y empiezan a fabricar de nuevo colgena de tipo II. La forma y la adhesin de la clula puede controlar la expresin gnica mediante seales intracelulares generadas en for ma de contactos focales, tal como vimos en el Captulo 16. Para la mayora de tipos celulares y especialmente para las clulas del teji do conjuntivo, las posibilidades de anclaje y adhesin dependen de la matriz circundante, que generalmente est elaborada por las propias clulas. De este modo una clula puede crear un entorno que posteriormente acta sobre s misma reforzando el estado diferenciado. Adems, la matriz extracelular que segrega una clula forma parte tanto de su propio entorno como del de las clu las vecinas, lo cual provoca un mismo tipo de diferenciacin en estas clulas prximas. Por ejemplo, se puede observar que un grupo de condrocitos que constituyen un ndulo de cartlago se expande, tanto en el organismo en desa rrollo com o en una placa de cultivo, debido a la conversin en condrocitos de los fibroblastos vecinos.

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Captulo 2 2 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

ncleo

gotas lipdicas clula precursora sim ilar a un fibroblasto adipocito

Figura 22-42 Desarrollo de un adipocito. Una clula precursora similar a un fibroblasto se convierte en una clula adiposa madura mediante acumulacin y coalescencia de gotas lipdicas. El proceso es, por lo menos parcialmente, reversible, tal como indican las flechas. Las clulas en los estadios temprano e intermedio pueden dividirse, pero la clula adiposa madura ya no puede hacerlo.

Distintas molculas seal actan de forma secuencial regulando la produccin de adipocitos4 1

Se cree que las clulas adiposas o adipocitos tambin se originan a partir de c lulas similares a los fibroblastos, tanto en condiciones normales de desarrollo de los mamferos com o en circunstancias patolgicas -p or ejemplo, en la distrofia muscular, en la que las fibras musculares mueren y gradualmente son reempla zadas por tejido adiposo. La diferenciacin de la clula adiposa se inicia con la produccin de enzimas especficas, seguida de una acumulacin de gotas lipdicas que posteriormente se fusionan y ensanchan hasta que toda la clula queda enorm em ente dilatada, de forma que tan slo queda un fino cordn de citoplas ma alrededor de la masa lipdica (Figura 22-42). El proceso puede estudiarse en cultivo (utilizando lneas celulares de fibro blastos como las clulas 3T3 de ratn), de forma que se pueden analizar los fac tores que influyen en ellos. En un principio se observ que el desarrollo de clu las adiposas en cultivo requera la presencia de suero bovino fetal, un aditivo corriente para los medios de cultivo. El factor crucial del suero que desencadena la diferenciacin celular fue posteriormente identificado como hormona del cre cimiento -u n a protena que normalmente segrega a la circulacin sangunea la hipfisis. Se ha demostrado que la hormona del crecimiento estimula la diferen ciacin tanto del condrocito como de la clula adiposa, y que acta de esta for ma tanto in vivo como in vitro. Sin embargo la hormona de crecimiento no es la nica molcula seal segregada que regula el desarrollo de la clula adiposa. Los precursores celulares de los adipocitos que se han estimulado mediante la hor mona de crecim iento se vuelven sensibles a IGF -1 (de Insulinlike Growth Factor1), el cual estimula la proliferacin de los adipocitos en diferenciacin. La diferenciacin de las clulas adiposas, al igual que la de los condrocitos, tam bin est influida por factores que afectan a la forma y al anclaje celulares. La diferenciacin de las clulas 3T3 a clulas adiposas, por ejemplo, queda inhi bida si las clulas se dejan expandir sobre una placa de cultivo recubierta con fibronectina, a la que se adhieren fuertemente. Sin embargo, esta inhibicin re vierte mediante el tratamiento con el frmaco citocalasina, que disgrega los filamentos de actina y provoca que las clulas se dispongan en la periferia. Todos estos experimentos con clulas del tejido conjuntivo ilustran un con cepto recurrente: la diferenciacin viene regulada por una com binacin de se ales solubles y de contactos con la matriz extracelular. Los efectos de cada uno de estos factores dependen de las caractersticas de la clula afectada lo cual, a su vez, depende de la historia del desarrollo de la clula.

El hueso se remodela continuamente por medio de las clulas que lo constituyen4 2

El hueso constituye una modalidad muy densa y especializada del tejido con juntivo. Como el hormign armado, la matriz sea est formada principalmente por una m ezcla de fibras resistentes (fibrillas de colgena de tipo I), que resisten las fuerzas de presin, y de partculas slidas (fosfato clcico y cristales de hidro-

Los fibroblastos y sus transformaciones: la familia de las clulas del tejido conjuntivo

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xiapatita), que resisten la compresin. El volumen ocupado por la colgena es prcticam ente igual que el que ocupa el fosfato clcico. En el hueso adulto las fi brillas de colgena se ordenan en capas regulares en forma estratificada, de tal manera que las fibrillas de cada capa se disponen paralelas entre s, pero per pendiculares respecto a las fibrillas de las capas contiguas. A pesar de proporcionar esta gran rigidez el hueso no es, aunque parezca lo contrario, un tejido inmutable y permanente. Atravesando su dura matriz extracelular se hallan conductos y cavidades ocupados por clulas vivas, que alcan zan alrededor de un 15% del peso del hueso compacto. Estas clulas se hallan implicadas en un incesante proceso de remodelaje: un tipo de clulas destruye la matriz sea envejecida mientras que otras clulas depositan matriz sea nue va. Este m ecanismo posibilita una continua renovacin y substitucin de la m a triz en el interior del hueso. El hueso nicamente puede crecer por aposicin, es decir, mediante el de psito de matriz adicional y de clulas sobre las superficies libres del tejido duro. En el embrin, este proceso debe producirse de forma coordinada con el creci miento de los dems tejidos, de modo que el patrn corporal pueda aumentar de escala sin que se alteren radicalmente sus proporciones. Para la mayor parte del esqueleto y en particular para los huesos largos de las extremidades y del tronco, el crecim iento coordinado se consigue mediante una com pleja estrate gia. En el embrin se forma primero un conjunto de diminutos modelos a esca la de los huesos, a base de cartlago. Cada modelo a escala crece, y a medida que se forma ms cartlago, el cartlago viejo se substituye por hueso. El creci miento y la erosin del cartlago y el depsito de hueso durante el desarrollo es tn coordinados de una forma tan ingeniosa que el hueso adulto, aunque pueda tener medio metro de largo, tiene casi la misma forma que el modelo cartilagi noso inicial, que nicamente meda unos cuantos milmetros.

Los osteoblastos segregan matriz sea, mientras que los osteoclastos la erosionan40,42,43
El cartlago es un tejido sencillo, constituido por un nico tipo de clulas -lo s condrocitos- inmersos en una matriz ms o menos uniforme. Esta matriz carti laginosa es deformable, y el tejido crece por expansin a medida que los condro citos se dividen y segregan nueva matriz (Figura 22-43). El hueso es un tejido ms complejo. La matriz sea est segregada por los osteoblastos, que se hallan en la periferia de la matriz existente y depositan nuevas capas de hueso sobre ellas. Algunos osteoblastos permanecen libres en la periferia, mientras que otros quedan gradualmente englobados en su propia secrecin. Este material recin fabricado (formado principalmente por colgena de tipo I) recibe el nombre de osteoide. Se transforma rpidamente en matriz sea dura, mediante el depsito de cristales de fosfato clcico en su interior. Una vez aprisionada en la matriz dura, la clula original formadora de hueso, llamada ahora osteocito, ya no tiene oportunidad de dividirse, aunque contina segregando a su alrededor, en pe queas cantidades, ms cantidad de matriz. El osteocito, al igual que el condrocito, ocupa una pequea cavidad o laguna en la matriz, pero a diferencia del condrocito no est aislado de los otros osteocitos. Desde cada laguna parten unos diminutos conductos o canalculos, que albergan las prolongaciones celuFigura 22-43 Crecimiento del cartlago. El tejido se expande a medida que los condrocitos se dividen y producen ms cantidad de matriz. La matriz recin sintetizada, con la que se rodea cada clula, est sombreada en verde oscuro. El cartlago tambin puede crecer incorporando fibroblastos del tejido perifrico y convirtindolos en condrocitos.

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Captulo 2 2 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

clula osteognica (precursora del osteoblasto) osteoblasto osteoide (m atriz sea no calcificada) m atriz sea calcificada prolongacin celular en el conducto calcforo osteocito 10 |jm
lares del osteocito que reside en ellas, permitindole formar uniones de com uni cantes con los osteocitos adyacentes (Figura 22-44). Aunque los osteocitos no segregan ni erosionan cantidades apreciables de matriz por s mismos, es proba ble que desempeen un papel importante en el control de las actividades de las clulas que s lo hacen. La matriz sea es generada por los osteoblastos, y se erosiona por los osteoclastos (Figura 22-45). Estas grandes clulas plurinucleadas se originan, al igual que los macrfagos, a partir de clulas madre hematopoyticas de la mdula sea. Las clulas precursoras se liberan como monocitos hacia la corriente san. guinea y se agrupan en las reas de resorcin sea, donde se fusionan dando lu gar a osteoclastos plurinucleados que se fijan a las superficies de la matriz sea y la destruyen. Los osteoclastos son capaces de abrir profundos tneles en la subs tancia intercelular del hueso compacto, formando cavidades que posteriormen te son invadidas por otras clulas. Un capilar sanguneo crece hacia el centro de cada tnel y las paredes del tnel quedan tapizadas por una capa de osteoblas tos (Figura 22-46). Para producir la estructura estratificada del hueso compacto,

Figura 22-44 Depsito de matriz sea por los osteoblastos. Los osteoblastos
que revisten la superficie del hueso segregan la matriz orgnica del hueso (osteoide) y se transforman en osteocitos al quedar englobados por esta matriz. La matriz se calcifica poco despus de haber sido depositada. Parece que los propios osteoblastos derivan de las clulas madre osteognicas que se hallan estrecham ente relacionadas con los fibroblastos.

lisosomas

Figura 22-45 Seccin transversal de un osteoclasto. Esta clula gigante

multinucleada erosiona la matriz sea. El ribete estriado es una zona de secrecin de cidos (que disuelven los minerales del hueso) y de hidrolasas (que digieren los com ponentes orgnicos de la matriz). Los osteoclastos varan en cuanto a forma, son mviles, y a menudo forman prolongaciones que reabsorben el hueso en distintas zonas. Se originan a partir de los m onocitos y se pueden considerar macrfagos especializados. (De R.V. Krstic: Ultrastructure of the Mammalian Cell: An Atlas. Berlin: Springer, 1979.)

varios ncleos

cierre herm tico

m atriz sea

ribete estriado del osteoclasto

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Los fibroblastos y sus transformaciones: la familia de las clulas del tejido conjuntivo

Figura 22-46 El remodelado del hueso compacto. Los osteoclastos, osteoblasto que actan juntos como un pequeo quiescente (clul grupo, excavan un tnel a travs del sea lim itante) hueso viejo, avanzando a una vaso sanguineo < velocidad de aproximadamente 50 |im pequeo calibre al da. Los osteoblastos penetran tras clula endotelial ellos en el tnel, revisten sus paredes y hueso nuevo empiezan a formar hueso nuevo m atriz sea nueva depositando matriz a una velocidad de todava no calcificada fibroblasto 1-2 nm al da. Al mismo tiempo, un hueso viejo capilar crece a lo largo del centro del osteocito tnel. Finalmente, el tnel quedar tejido conjuntivo laxo lleno de capas concntricas de hueso formado de nuevo, nicamente con un estrecho conducto central. Cada uno capilar creciendo osteoblasto a pu de estos conductos, adems de dentro del tnel de depositar hue constituir una va de acceso para los form ado de nue\ osteoclasto excavando osteoclastos y los osteoblastos, que llenar el tr un tnel a travs del excavado contiene uno o ms vasos sanguneos hueso viejo que transportan los nutrientes que las clulas seas necesitan para sobrevivir. 100 pm De esta manera cada ao se substituye un 5-10% del hueso de un mamfero adulto sano. (Segn Z.F.G. Jaworski, B. estos osteoblastos depositan capas concntricas de hueso recin formado, que Duck y G. Sekaly, J. Anat. 133.397-405, gradualmente llena la cavidad, dejando nicamente un estrecho canal que ro 1981.) dea al nuevo vaso sanguneo. Muchos de los osteoblastos quedan atrapados en la matriz sea y sobreviven en los anillos concntricos que forman los osteocitos. Al mismo tiempo que algunos de los tneles se llenan de hueso, otros que dan perforados por los osteoclastos, que de este modo se abren paso a travs de sistemas concntricos ms antiguos. Las consecuencias de este remodelaje constante se ponen claram ente de manifiesto en los bonitos patrones estratifi Figura 22-47 Seccin transversal de cados de la matriz que se observan en el hueso compacto (Figura 22-47). una regin compacta externa de un Todava existen muchos problemas no resueltos en cuanto a estos procesos. hueso largo. La micrografa muestra Por ejemplo, los huesos presentan una marcada capacidad de adaptacin frente los lmites de los tneles formados por a la carga que deben soportar, debido al remodelaje de su estructura, lo cual im los osteoclastos y posteriormente rellenados por los osteoblastos plica que el depsito y la erosin de la matriz estn de alguna forma controlados durante perodos sucesivos de por un desgaste m ecnico local. No se conocen los mecanismos que determinan remodelaje del hueso. La seccin se ha preparado mediante la tcnica de desgaste. La matriz dura ha quedado conservada, pero no as las clulas. Sin embargo, las lagunas y los conductos calcforos que haban estado ocupados por los osteocitos son claramente visibles. Los anillos concntricos claros y oscuros en alternancia corresponden a una conducto antiguo orientacin alternante de las fibras de colgena en las sucesivas capas de la conducto nuevo matriz sea depositada por los osteoblastos que en vida revestan la laguna sea pared del conducto. (Este modelo se revela aqu observando la muestra entre filtros polaroid parcialmente cerrados.) Obsrvese cmo el sistema ms viejo de capas concntricas de hueso de la parte inferior derecha se ha cortado parcialmente y se ha reemplazado por sistemas ms 100 pm nuevos.

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Captulo 22 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

que la matriz sea depositada por los osteoblastos o bien sea erosionada por los osteoclastos localizados en una determinada superficie sea, aunque probable mente jueguen un papel importante los factores de crecimiento sintetizados por las clulas seas, aprisionados en la matriz y liberados, posiblemente, cuando la matriz se degrada o se desgasta de una forma adecuada.

Durante el desarrollo, los osteoclastos erosionan el cartlago y se abren paso en el hueso44

La substitucin del cartlago por hueso en el transcurso del desarrollo parece que depende tam bin de las actividades de los osteoclastos. A medida que el cartlago madura, en algunas regiones sus clulas se ensanchan enormem ente a expensas de la matriz que las rodea, y la propia matriz se va mineralizando, al igual que el hueso, por depsito de cristales de fosfato clcico. Los condrocitos hinchados mueren, dejando grandes cavidades vacas. Los osteoclastos y los va sos sanguneos invaden las cavidades y erosionan la matriz cartilaginosa resi dual, mientras que los osteoblastos siguen su recorrido empezando a depositar matriz sea. El nico residuo de cartlago que permanece en el hueso adulto es una fina capa que forma una cubierta lisa en la superficie de los huesos a nivel de las articulaciones seas (Figura 22-48). Sin embargo, en el tejido conjuntivo que rodea el hueso persisten algunas clulas capaces de formar ms cartlago. Si el hueso se rompe, las clulas prxi mas a la fractura llevan a cabo la reparacin mediante una rudimentaria pero efectiva recapitulacin del proceso embrionario original, depositando primero cartlago para llenar la rotura y substituyendo luego ese cartlago por hueso.

Figura 22-48 Desarrollo de un hueso largo. Los huesos largos, como el fmur o el hmero, se desarrollan a partir de un modelo cartilaginoso en miniatura. El cartlago no calcificado se ha dibujado en verde, el cartlago calcificado en negro, el hueso en marrn y los vasos sanguneos en rojo. El cartlago no se transforma en hueso, sino que gradualmente se substituye por ste debido a la accin de los condroclastos y de los osteoblastos, que invaden el cartlago en asociacin con los vasos sanguneos. Los osteoclastos erosionan el cartlago y la matriz sea, mientras que los osteoblastos segregan matriz sea. El proceso de osificacin empieza en el embrin y no termina hasta el final de la pubertad. El hueso resultante consiste en un cilindro vaco de paredes gruesas constituidas por hueso compacto que limitan una cavidad central ocupada por la mdula sea. Tngase en cuenta que no todos los huesos se desarrollan de esta manera. Los huesos membranosos del crneo, por ejemplo, no se forman a partir de un modelo cartilaginoso sino directamente como placas seas. (Adaptado de D.W. Fawcett, A Textbookof Histology, llth ed. Philadelphia: Saunders, 1986.)

La estructura del cuerpo est estabilizada mediante su armazn de tejido conjuntivo y mediante la cohesin selectiva de las clulas45
Un hueso, al igual que un organismo completo, es un sistema dinmico que mantiene su estructura mediante un equilibrio entre actividades opuestas de numerosas clulas especializadas. Cualquier sistema dinmico plantea un pro blem a de estabilidad, lo cual hace que nos planteemos una cuestin de tipo ge neral sobre el mantenimiento de la estructura del cuerpo. Hemos visto que las clulasfde tejidos distintos mantienen su estado diferenciado, se producen nue vas clulas de forma controlada reemplazado a las que se han perdido y se re nueva y remodela la matriz extracelular. Pero, por qu los diferentes tipos de

Los fibroblastos y sus transformaciones: la familia de las clulas del tejido conjuntivo

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la com presin en esta zona favorece el depsito de hueso

la prdida de compresin en esta zona favorece la erosin del hueso

EL HUESO SE

EL HUESO SE DESPLAZA DE SU POSICIN CORRECTA

HUESO REMODELADO

Figura 22-49 Remodelado de un hueso largo de la pierna despus de una fractura, reparada fuera de su posicin correcta. La deformacin que se origina en el hueso recientemente reparado lo somete a tensiones anmalas. Donde las fuerzas de compresin se han incrementado, el nivel de depsito de hueso aumenta respecto al nivel de erosin; en la zona donde las fuerzas disminuyen, el nivel de depsito disminuye en relacin al nivel de erosin. De esta manera el hueso se remodela gradualmente hasta recuperar su forma normal.

clulas no van quedando paulatinamente desordenados y desplazados? Por qu toda la estructura no cede, se deforma o cam bia sus proporciones cuando las zo nas viejas son substituidas por zonas nuevas? Hasta cierto punto, evidentemente, el cuerpo cede y se deforma con el paso del tiempo -esto forma parte del envejecimiento. Pero tiene lugar de forma muy lenta. El esqueleto, a pesar de su constante remodelacin, proporciona un arma zn rgido cuyas dimensiones cam bian muy poco. Ello se debe en parte a que las regiones de un hueso se renuevan no todas a la vez sino poco a poco, al igual que un edificio cuyos ladrillos se substituyeran uno a uno. Junto a un tipo de re novacin tan conservador actan mecanism os hom eostticos activos. Por ello pequeas desviaciones de un hueso respecto a su forma normal constituyen pa trones de desgaste alterados que regulan la remodelacin del hueso de tal forma que el hueso llega a recuperar su forma normal (Figura 22-49). El crecim iento y renovacin de muchas de las partes blandas del cuerpo es tn controlados tam bin hom eostticam ente, de modo que cada componente se adapta a su nicho. La epidermis se extiende manteniendo cubierta la superfi cie corporal, y si se lesiona, las clulas crecen cubriendo la lesin y detienen su migracin cuando han cumplido esta misin; el tejido conjuntivo crece justo lo necesario para llenar el vaco creado por una herida; etc. Sin embargo se necesi ta algo ms. Los diversos tipos de clulas diferenciadas se deben mantener no slo en las cantidades relativas correctas. La renovacin tisular implica necesa riamente movimientos celulares. Estos movimientos han de estar limitados de alguna manera; las clulas han de estar sometidas a restricciones territoriales. Estas restricciones son de diversos tipos. Por ejemplo, a menudo las glndu las y otros grupos celulares especializados se hallan contenidos dentro de cpsu las resistentes de tejido conjuntivo. Muchos tipos de clulas mueren si se en cuentran fuera de su entorno normal, privadas de unos factores de crecimiento especficos de los que depende su supervivencia. Posiblemente la estrategia ms importante para m antener las diferentes clulas en su lugar sea la estrategia de la adhesin intercelular selectiva: clulas del mismo tipo tienden a unirse unas con otras, ya sea en masas slidas, com o el msculo liso, o en capas epiteliales, tales com o el revestimiento del intestino. Tal como se describi en Captulo 19, este m ecanism o posibilita, por ejemplo, que clulas epidrmicas disociadas se reagrupen espontneam ente formando un epitelio correctamente ordenado. En un sentido ms amplio, las capas de clulas epiteliales sirven para dividir el or ganismo en diferentes compartimientos, manteniendo as las distintas clulas debidamente separadas y confinadas a sus territorios correspondientes. Los controles y equilibrios que preservan la estructura del cuerpo y la orga nizacin celular frente a continuos procesos de recambio y de renovacin son sumamente intrincados y sutiles. La im portancia de dichos controles queda cla ramente en evidencia cuando fallan, tal como veremos al tratar el tema del cn cer en el ltimo captulo de este libro.

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Captulo 2 2 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

Resumen

La familia de clulas del tejido conjuntivo incluye los fibroblastos, los condrocitos, las clulas del tejido seo, los adipocitos y las fibras de la musculatura lisa. Al pare cer, los fibroblastos pueden llegar a transformarse en cualquier otro de los miem bros de dicha familia -en algunos casos deforma reversible- aunque no queda cla ro si es una caracterstica de un nico tipo de fibroblasto pluripotencial o de una mezcla de distintos tipos de fibroblastos con potencial ms restrictivo. Dichas transformaciones de los tipos celulares del tejido conjuntivo estn reguladas por la propia composicin de la matriz extracelular circundante, por la forma celular y por las hormonas y los factores de crecimiento. Tanto el cartlago como el hueso estn constituidos por clulas inmersas en una matriz slida. El cartlago presenta una matriz deformable y puede crecer por hinchamiento, mientras que el hueso es rgido y slo puede crecer por aposicin en sus superficies. No obstante, el hueso est sometido a una constante remodelacin a travs de la accin combinada de los osteoclastos, que erosionan la matriz, y los osteoblastos, que la segregan. Algunos osteoblastos quedan atrapados en la matriz en forma de osteocitos y desempean una cierta funcin en la regulacin de la re novacin de la matriz sea. La mayora de huesos largos se desarrollan a partir de modelos cartilaginosos en miniatura que, al crecer, actan como moldes para el depsito de hueso mediante la accin combinada de los osteoblastos y los condroclastos. Anlogamente, en la reparacin de una fractura sea en el adulto, la fisura se llena primero con cartlago, que ms tarde es substituido por hueso. Aunque el hueso, al igual que otros tejidos, est sometido a una continua renovacin, este proceso dinmico se regula de tal forma que la estructura global queda preservada. De este modo, y mediante otro tipo de mecanismos como la adherencia intercelular selectiva, la organizacin del cuerpo se mantiene de forma estable a pesar de que la mayor parte de sus componentes se reemplazan continuamente.
Apndice
Catlogo de las clulas del cuerpo humano adulto
Cuntos tipos celulares distintos existen en un ser humano adulto? En otras pa labras, cuntas vas de expresin del genoma humano existen en un adulto nor mal? Un voluminoso tratado de histologa citar unos 200 tipos, con sus deno minaciones especficas. Estos nombres tradicionales no son, como los nombres de los colores, unas etiquetas para las distintas partes de un sistema continuo que se ha subdividido arbitrariamente. En su mayor parte representan categoras discretas claramente distintas. Dentro de una determinada categora celular a menudo existe una cierta variacin -las fibras de msculo esqueltico que m ue ven el globo ocular son pequeas, mientras que las que mueven la pierna son grandes; las clulas auditivas ciliadas de diferentes partes del odo pueden estar adaptadas a distintas frecuencias de sonido; y as sucesivamente. Pero no existe ningn sistema continuo de tipos celulares adultos, intermedios en cuanto a ca rcter, entre, por ejemplo, la fibra muscular y la clula auditiva ciliada. La clasificacin histolgica tradicional se basa en la forma (morfologa) y en la estructura de la clula observada al microscopio y en su naturaleza qumica, determinada por su afinidad a diversos colorantes. Mtodos ms tiles revelan nuevas subdivisiones dentro de la clasificacin tradicional. As, la inmunologa moderna ha demostrado que la vieja categora de linfocitos incluye ms de 10 tipos celulares bastante diferentes. Anlogamente los exmenes farmacolgicos y fisiolgicos revelan que existen muchas variedades distintas de fibras muscula res lisas -las de la pared del tero, por ejemplo, son altamente sensibles a los estrgenos, y en las ltimas fases del embarazo, a la oxitocina, mientras que las de la pared intestinal no muestran esta sensibilidad. Otro tipo importante de diver sidad se ha revelado mediante experimentos embriolgicos como los discutidos

Apndice

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en el Captulo 21. Dichos experimentos demuestran que, en muchos casos, clu las aparentem ente similares de regiones distintas del cuerpo no son equivalen tes, es decir, son intrnsecam ente diferentes en cuanto a sus capacidades de de sarrollo y a sus influencias sobre otras clulas. As, dentro de categoras como la de fibroblasto probablemente existen muchos tipos celulares distintos, dife rentes qum icam ente en aspectos que an no podemos apreciar directamente. Por estas razones, cualquier clasificacin de los tipos celulares del cuerpo ha de ser algo arbitraria con respecto a la exactitud de las subdivisiones. En la rela cin que ofrecemos a continuacin slo constan los tipos celulares del hombre adulto que un tratado moderno de histologa reconocera como diferentes, agru pados ms o menos en familias segn su funcin. No hemos intentado subdividir la clase de neuronas del sistema nervioso central. Asimismo, en el caso de un nico tipo celular, como el queratinocito que recibe convencionalmente una su cesin de nombres diferentes a medida que madura, hemos indicado slo dos entradas -u n a para la clula diferenciada y una para la clula madre. Con estas importantes salvedades, las 210 variedades de clulas del catlogo representan una lista ms o menos exhaustiva de las diferentes maneras en que un genoma determinado de mamfero se puede expresar en el fenotipo de una clula nor mal del cuerpo adulto.

Clulas epiteliales queratinizadas

queratinocito de la epidermis (= clula epidrmica diferenciada clula basal de la epidermis (clula madre) queratinocito de las uas de manos y pies clula basal de lecho ungueal (clula madre) clula de la vaina pilosa medulares corticales cuticulares clula de la vaina de la raz pilosa cuticulares de la capa de Huxley de la capa de Henle externas clula de la matriz pilosa (clula madre)
Clulas de los epitelios de barrera estratificados hmedos

clula epitelial superficial del epitelio escamoso pluriestratificado de la crnea, de la lengua, cavidad oral, esfago, ano, uretra distal, vagina clula basal de estos epitelios (clula madre) clula del epitelio urinario (reviste la vejiga y los conductos urinarios)
Clulas epiteliales especializadas en la secrecin exocrina

clulas de la glndula salival clula mucosa (secrecin rica en polisacridos) clula serosa (secrecin rica en enzimas glucoproteicas) clula de glndula lingual de von Ebner (secrecin para lavar los botones gustativos)

clula de glndula mamaria, segrega leche clula de glndula lacrimal, segrega lgrimas clula de glndula ceruminosa del odo, segrega cera clula de glndula sudorpara ecrina, segrega pequeas molculas (clula oscura) clula de glndula sudorpara ecrina, segrega pequeas molculas (clula clara) clula de glndula sudorpara apocrina (secrecin odorfera, sensible a las hormonas sexuales) clula de glndula de Mol del prpado (glndula sudorpara especializada) clula de glndula sebcea, segrega sebo rico en lpidos clula de glndula de Bowman de la nariz (secrecin para lavar el epitelio olfativo) clula de glndula de Brnner del duodeno, segrega una solucin alcalina de mucus y enzimas clulas de la vescula seminal, segrega componentes del lquido seminal, junto con fructosa (como combustible para los movimientos del espermatozoide) clula de glndula prosttica, segrega otros componentes del lquido seminal clula de glndula bulbouretral, segrega mucus clula de glndula de Bartholin, segrega lubricante vaginal clula de glndula de Littr, segrega mucus clula del endometrio del tero, sobre todo segrega carbohidratos clula calciforme aislada de los tractos

respiratorio y digestivo, segrega mucus clula mucosa del revestimiento del estmago clula zimgena de glndula gstrica, segrega pepsingeno clula oxntica de glndula gstrica, segrega HC1 clula acinar del pncreas, segrega enzimas digestivas y bicarbonato clula de Paneth del intestino delgado, segrega lisozima pneumocito de tipo II del pulmn, segrega surfactante clula de Clara del pulmn (funcin desconocida)
Clulas especializadas en la secrecin de hormonas

clulas de la hipfisis anterior, segregan hormona del crecimiento hormona folculo estimulante hormona luteinizante prolactina hormona adrenocorticotrpica hormona estimulante de la tiroides clula de la hipfisis intermedia, segrega hormona estimuladora de los melanocitos clulas de la hipfisis posterior, segregan oxitocina vasopresina clulas del tracto intestinal y respiratorio, segregan serotonina endomorfina somatostatina gastrina secretina colecistoquinina insulina glucagn bombesina

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Captulo 22 : Clulas diferenciadas y conservacin de los tejidos

clulas de la glndula tiroides, segregan hormonas tiroideas calcitonina clulas de la glndula paratiroides, segregan hormona paratiroidea clula oxfila (funcin desconocida) clulas de la glndula suprarrenal, segregan epinefrina norepinefrina hormonas esteroides mineralocorticoides glucocorticoides clulas de las gnadas, segregan testosterona (clula de Leydig del testculo) estrgeno (clula de la teca interna del folculo ovrico) progesterona (clula del cuerpo lteo del folculo ovrico eclosionado) clula del aparato yuxtaglomerular del rin clula yuxtaglomerular (segrega renina f (inciertas, pero probablemente relacionadas clula de la mcula densa < funcionalmente; posiblemente clula peripolar implicadas en clula mesangial la secrecin de eritropoyetina)

podocito de glomrulo renal clula del segmento delgado del asa de Henle (en el rin) (= tbulo descendente) clula del conducto colector (en el rin) clula del conducto de la vescula seminal, la glndula prosttica, etc. (varias)

Clulas epiteliales que revisten cavidades internas cerradas del cuerpo

clulas endoteliales vasculares de vasos sanguneos y linfticos fenestradas continuas esplnicas clula sinovial (reviste cavidades articulares, segrega en gran parte cido hialurnico) clula serosa (reviste las cavidades peritoneal, pleural y pericrdica) clula escam osa que reviste el espacio endolinftico del odo clula escamosa clulas columnares del saco endolinftico con microvilli sin microvilli clula oscura clula de la membrana vestibular (parecida a la clula del plexo coroideo) clula basal de la stria vascularis clula marginal de la stria vascularis clula de Claudius clula de Boettcher clula del plexo coroideo (segrega lquido cefalorraqudeo) clula escam osa de la pa-aracnoides clulas del epitelio ciliar del ojo pigmentadas no pigmentadas clula endotelial de la crnea

tendn, del tejido reticular de la mdula sea, roja y amarilla, etc.) pericito del capilar sanguneo clula del ncleo pulposo del disco intervertebral cem entoblasto/cem entocito (segrega un cem ento parecido a hueso en la raz de los dientes odontoblasto/odontocito (segrega la dentina de los dientes) condroblasto/condrocito del cartlago hialino del fibrocartlago del cartlago elstico osteoblasto/osteocito clula osteoprogenitora (clula madre de los osteoblastos) hialocito del cuerpo vitreo del ojo clula estrellada del espacio perilinftico del odo

Clulas contrctiles
clulas del msculo esqueltico rojas (lentas) blancas (rpidas) intermedias haz muscular -sa co nuclear haz muscular -cad en a nuclear clula satlite (clula madre) clulas del msculo cardaco ordinarias nodales fibra de Purkinje clulas del msculo liso (varias) clulas mioepiteliales del iris de las glndulas exocrinas

Clulas epiteliales de absorcin intestinal, glndulas exocrinas y tracto urogenital

clula con ribete en cepillo del intestino (con microvilli) (= enterocito) clula del conducto estriado de las glndulas exocrinas clula epitelial de la vescula biliar clula con ribete en cepillo del tbulo proximal del rin clula del tbulo distal del rin clula no ciliada del conducto eferente clula principal del epiddimo clula basal del epiddimo

Clulas de la sangre y del sistema inmunitario

glbulo rojo (eritrocito) megacariocito macrfagos monocito macrfago del tejido conjuntivo (varios) clula de Langerhans (en la epidermis) osteoclasto (en el hueso) condroclasto (en el cartlago) clula dendrtica (en los tejidos linfoides) clula microglial (en el sistema nervioso central) neutrfilo eosinfilo basfilo clula cebada linfocito T clula T auxiliar clula T supresora clula T asesina linfocito B IgM IgG IgA IgE clula asesina clulas madre para la sangre y para el sistema inmunitario (varias)

Clulas ciliadas con funcin de propulsin

del tracto respiratorio del oviducto y del endometrio uterino (en la mujer) del rete testis y del conducto eferente (en el hombre) del sistema nervioso central (clula ependimaria que reviste las cavidades cerebrales)

Clulas especializadas en el metabolismo y en el almacenamiento

hepatocito (clula heptica) clulas adiposas (adipocitos) grasa blanca grasa parda lipocito del hgado

Clulas especializadas en la secrecin de matriz extracelular

epiteliales: ameloblasto (segrega el esmalte dentario) clula del planum semilunatum del aparato vestibular del odo (segrega proteoglucanos) clula interdental del rgano de Corti (segrega la m em brana tectorial que cubre las clulas ciliadas del rgano de Corti) no epiteliales (tejido conjuntivo): fibroblastos (varios -d el tejido conjuntivo laxo, de la crnea, del

Clulas epiteliales que actan primariamente como barrera y revisten el pulmn, el intestino, las glndulas exocrinas y el tracto urogenital
pneumocito de tipo I (reviste el espacio areo del pulmn) clula de conducto pancretico (clula centroacinar) clula de conducto no estriado de glndula sudorpara, glndula salival, glndula mamaria, etctera (varias) clula parietal de glomrulo renal

Apndice

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Transductores sensoriales fotorreceptores bastones conos sensible al azul sensible al verde sensible al rojo auditivos clula ciliada interna del rgano de Corti clula ciliada externa del rgano de Corti aceleracin y gravedad clula ciliada de tipo I del aparato vestibular del odo clula ciliada de tipo II del aparato vestibular del odo gusto clula del botn gustativo de tipo II olor neurona olfatoria clula basal del epitelio olfatorio (clula madre para las neuronas olfatorias) pH sanguneo clula del cuerpo carotdeo tipo I tipo II tacto clula de Merkel de la epidermis neuronas sensoriales primarias especializadas en el tacto (varias) temperatura

neuronas sensoriales primarias especializadas en la temperatura sensibles al fro sensibles al calor dolor neuronas sensoriales primarias especializadas en el dolor (varias) configuraciones y fuerzas en el sistema musculoesqueltico neuronas sensoriales primarias propioceptivas (varias) Neuronas autnomas colinrgicas (varias) adrenrgicas (varias) peptidrgicas (varias) Clulas de sostn de los rganos de los sentidos y neuronas perifricas clulas de sostn del rgano de Corti clula del pilar interno clula del pilar externo clula falngica interna clula falngica externa clula marginal clula de Hensen clula de sostn del aparato vestibular clula de sostn del botn gustativo (clula del botn gustativo de tipo I) clula de sostn del epitelio olfativo clula de Schwann

clula satlite (rodea a los cuerpos celulares de los nervios perifricos) clula glial entrica Neuronas y clulas gliales del sistema nervioso central neuronas (inmensa variedad de tipos -an mal clasificados) clulas gliales astrocito (varios) oligodendrocito Clulas del cristalino clula del epitelio anterior del cristalino fibra del cristalino (clula que contiene cristalina) Clulas pigmentarias melanocito clula del epitelio pigmentario de la retina Clulas germinales oogonia/oocito espermatocito espermatogonia (clula madre para el espermatocito) Clulas nodrizas clula folicular ovrica clula de Sertoli (en el testculo) clula epitelial del timo

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Nuestro sistema inmunitario nos salva de una muerte segura por infeccin. Un vertebrado que nazca con un sistema inmunitario gravemente defectuoso mori r pronto, a menos que se adopten medidas extraordinarias para aislarlo de un ejrcito de agentes infecciosos -bacterias, virus, hongos y otros parsitos. Todos los vertebrados tienen un sistema inmunitario, mientras que los invertebrados presentan sistemas de defensa ms primitivos, que a menudo se basan princi palmente en clulas fagocticas. Estas clulas (principalmente macrfagos y neutrflos) desempean tambin un papel importante en la defensa de los ver tebrados contra la infeccin, aunque slo constituyen una parte de una estrate gia de defensa mucho ms compleja y sofisticada. La inmunologa, el estudio del sistema inmunitario, naci a partir de la ob servacin habitual de que las personas que se recuperan de ciertas infecciones son inmunes a la enfermedad a partir de entonces; es decir, rara vez sufren de nuevo la misma enfermedad. La inmunidad es altamente especfica: un individuo que se recupera del sarampin queda protegido contra el virus del sarampin, pero no contra otros virus comunes como el de las paperas o el de la varicela. Esta especificidad es una caracterstica fundamental de la respuesta inmunitaria. Muchas de las respuestas del sistema inmunitario inician la destruccin y eliminacin de los organismos invasores y de todas las molculas txicas produ cidas por ellos. Estas reacciones inmunitarias son destructivas, por lo que es im portante que nicamente se produzcan contra molculas que son extraas al or ganismo husped y no frente a molculas del propio husped. Esta capacidad de distinguir entre molculas extraas y molculas propias es otro rasgo fundamen tal del sistema inmunitario. En ocasiones el sistema inmunitario no distingue de una forma adecuada y reacciona de forma destructiva contra las propias mol culas del husped; estas enfermedades autoinmunitarias pueden ser fatales. El sistema inmunitario evolucion en el sentido de proteger a los vertebra dos contra la infeccin por parte de microorganismos y parsitos mayores, pero la mayor parte de lo que sabemos sobre la inmunidad procede de estudios sobre las respuestas inmunitarias en los animales de laboratorio ante inyecciones de substancias no infecciosas, tales como protenas y polisacridos extraos. Casi cualquier macromolcula, siempre que sea extraa al receptor, puede inducir una respuesta inmunitaria; las substancias capaces de desencadenar una res puesta inmunitaria reciben el nombre de antgeno (generador de anticuerpo). Es importante subrayar que el sistema inmunitario puede distinguir antgenos muy similares entre s -p or ejemplo, dos protenas que se diferencien en un solo aminocido, o dos ismeros pticos de la misma molcula.

Las clulas T cito txicas Clulas T colaboradoras y activacin de las clulas Seleccin del repertorio de clulas T

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Existen dos clases principales de respuestas inmunitarias:(l) respuestas por anticuerpos y (2) respuestas inmunitarias mediadas por clulas. Las respuestas por anticuerpos implican la produccin de anticuerpos, que son protenas que reciben el nombre de inmunoglobulinas. Los anticuerpos circulan por la sangre y penetran en otros fluidos corporales donde se unen especficamente al antgeno extrao que los ha inducido. La unin del anticuerpo inactiva a virus y toxi nas bacterianas (como la del ttanos o la botulnica) bloqueando su capacidad de unirse a los receptores de las clulas del husped. La unin de los anticuerpos tam bin marca a los microorganismos invasores para su destruccin, facilitando su ingestin por una clula fagoctica o mediante la activacin de un sistema de protenas sanguneas, denominadas colectivamente complemento, que destruir a los invasores. La respuesta m ediada por clulas, la segunda clase de respuestas inmunita rias, implica la produccin de clulas especializadas que reaccionan con los antgenos extraos situados sobre la superficie de otras clulas del husped. La c lula reactiva, por ejemplo, puede matar a las clulas del husped infectadas por virus, que presenten antgenos vricos en su superficie, eliminando as la clula infectada antes de que el virus se haya replicado. En otros casos, la clula reacti va segrega seales qumicas que activan a los macrfagos para que destruyan a los microorganismos invasores. El principal reto de la inmunologa ha sido entender cmo el sistema inmunitario reconoce especficam ente y reacciona de forma agresiva frente a un n mero casi ilimitado de macromolculas extraas distintas, evitando al mismo tiempo reaccionar con las decenas de miles de macromolculas propias diferen tes producidas por las clulas del husped. Empezaremos nuestra discusin so bre el sistema inmunitario considerando las clulas que son las responsables principales de los dos tipos de inmunidad. A continuacin consideraremos las caractersticas estructurales y funcionales de los anticuerpos que posibilitan a las clulas reconocer y destruir los antgenos extracelulares. Despus de discutir cmo se genera la diversidad de los anticuerpos, consideraremos las caracters ticas especiales de las respuestas inmunitarias mediadas por clulas, que son cruciales en la defensa contra los microorganismos intracelulares.

Base celular de la inmunidad

El sistem a inm unitario humano est compuesto por billones de linfocitos 1
Las clulas responsables de la especificidad inmunitaria pertenecen a una clase de glbulos blancos conocido como linfocitos. Se encuentran en grandes canti dades en la sangre, en la linfa (el lquido incoloro de los vasos linfticos que co nectan los ndulos linfticos del cuerpo) y en rganos linfoides especializados como el timo, los ndulos linfticos, el bazo y el apndice (Figura 23-1). En el cuerpo humano existen ~2 x 10 1 2 linfocitos, lo cual hace que el sistema inmunitario sea comparable, en masa celular, al hgado o al cerebro. Aunque los linfocitos fueron reconocidos hace tiempo como uno de los principales com po nentes de la sangre, su papel central en la inmunidad no fue demostrado hasta finales de los aos 1950. La prueba se obtuvo a partir de experimentos en los que se irradiaba intensam ente a ratas o ratones para matar la mayor parte de sus gl bulos blancos, incluidos los linfocitos. En estas condiciones estos animales son incapaces de producir respuestas inmunitarias, por lo que es posible transferir les varios tipos de clulas y determinar cules son las que corrigen la deficiencia. nicam ente los linfocitos restauraron la respuesta inmunitaria de los animales irradiados (Figura 23-2). Como se recuperaban tanto las respuestas con anti cuerpos como las respuestas mediadas por clulas, estos experimentos estable cieron que los linfocitos son los responsables de ambos tipos de respuestas in munitarias. En el momento en que fueron realizados estos experimentos, los

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Captulo 23 : El sistema inmunitario

Figura 23-1 Los rganos linfoides humanos. Los linfocitos se desarrollan

en el timo y en la mdula sea (en amarillo), los cuales se denominan por este motivo rganos linfoides primarios (o centrales). Los linfocitos recin formados migran desde estos rganos primarios hacia los rganos linfoides secundarios (o perifricos) (en azul], donde pueden reaccionar con el antgeno. En el dibujo slo se muestran algunos de los rganos linfoides secundarios; por ejemplo, muchos linfocitos se encuentran en la piel y en los pulmones.

linfocitos se encontraban entre las clulas de los vertebrados menos conocidas; ahora se encuentran entre las clulas que conocem os mejor.

Los linfocitos B producen las respuestas humorales con anticuerpos; los linfocitos T producen las respuestas mediadas por clulas2
Durante los aos 1960 se descubri que los dos tipos principales de respuestas inmunitarias estn mediadas por dos clases diferentes de linfocitos: las clulas T que se originan en el timo y son responsables de la inmunidad mediada por c lulas, y las clulas B, que en los adultos se originan en la mdula sea y en el feto en el hgado, que producen los anticuerpos. Esta dicotoma del sistema linfoide fue demostrada inicialmente en animales con inmunodeficiencias inducidas ex perimentalmente. Se encontr que la extirpacin del timo a un animal recin nacido perjudica de forma pronunciada las respuestas mediadas por clulas pero ejerce mucho menos efecto sobre las respuestas con anticuerpos. En las aves tam bin fue posible demostrar el efecto contrario debido a que las clulas B se desarrollan en un rgano linfoide discreto asociado al intestino, la bolsa de Fabricio, que es exclusivo de las aves. La extirpacin de la bolsa de Fabricio en el

Figura 23-2 El experimento clsico que demuestra que los linfocitos son los responsables del reconocimiento y de la respuesta ante los antgenos extraos. Una caracterstica
importante de todos estos experimentos de transferencia de clulas es que las clulas se transfieren entre animales de la misma cepa consangunea. Los miembros de una cepa consangunea son genticamente idnticos. Si se transfieren los linfocitos a un animal genticam ente diferente que ha sido irradiado, estos linfocitos reaccionan contra los antgenos extraos del husped y pueden matar al animal.

antgeno antgeno anim al norm al antgeno

NO SE PRODUCE RESPUESTA INMUNITARIA RESPUESTA INMUNITARIA NORMAL RESPUESTA INMUNITARIA RECUPERADA

el anim al irradiado recibe linfocitos de un anim al norm al antgeno

el animal irradiado recibe otras clulas de un animal norm al

EXPERIMENTO

NO SE PRODUCE RESPUESTA INMUNITARIA

CONTROL

Base celular de la inmunidad

1281

momento de la eclosin disminuye la capacidad del ave para producir anticuer pos pero ejerce muy poco efecto sobre la inmunidad mediada por clulas. Por otra parte, estudios realizados con nios recin nacidos con una inmunidad de ficiente demostraron que algunos de estos nios no podan producir anticuer pos pero tenan una inmunidad mediada por clulas normal, mientras que otros presentaban la deficiencia opuesta; adems, los que tenan una deficiencia se lectiva en el tipo de respuestas mediadas por clulas, casi siempre presentaban anomalas en el timo. Uno de los rasgos ms sorprendentes de estos estudios sobre animales inmunodeficientes estribaba en que los individuos deficientes en clulas T (porque su timo haba sido extirpado o era anormal) no slo eran incapaces de producir respuestas inmunitarias mediadas por clulas sino que adems presentaban unas respuestas de anticuerpos algo deficientes. Ahora sabemos cul es la expli cacin. Existen dos tipos principales de clulas T -clulas T colaboradoras y clu las T citotxicas. Las clulas T colaboradoras intensifican las respuestas de otros glbulos blancos, y algunas de dichas clulas T colaboran con las clulas B en la produccin de las respuestas por anticuerpos. Las clulas T citotxicas, por el contrario, destruyen las clulas infectadas; debido a que se hallan directamente implicadas en la defensa contra la infeccin, a diferencia de las clulas T colabo radoras, las clulas T citotxicas (junto con las clulas B) en ocasiones se deno minan clulas efectoras.

Los linfocitos se desarrollan en los rganos linfoides primarios y reaccionan con los antgenos extraos en los rganos linfoides secundarios 3
Los linfocitos se desarrollan a partir de clulas madre hematopoyticas pluripotenciales, que dan lugar a todas las clulas sanguneas, incluidos los eritrocitos, los leucocitos y las plaquetas. Estas clulas madre, que han sido estudiadas en el Ca ptulo 22, estn localizadas primariamente en los tejidos hematopoyticos -e l h gado en fetos y la mdula sea en adultos. Las clulas T se desarrollan en el timo a partir de clulas precursoras procedentes de los tejidos hematopoyticos, por va sangunea. En los mamferos las clulas B se desarrollan a partir de clulas madre en los propios tejidos hematopoyticos; sin embargo, en las aves las clulas B se desarrollan en la bolsa de Fabricio a partir de clulas precursoras que han migra do hasta all a partir de los tejidos hematopoyticos, a travs de la sangre. El timo, los tejidos hematopoyticos y la bolsa de Fabricio se conocen como rganos lin-

tejido hem atopoytico

tim o

rganos linfoides

Figura 23-3 El desarrollo de las clulas T y B. Los rganos

linfoides primarios, donde se desarrollan los linfocitos a partir de clulas precursoras, estn reseados en los recu adros am arillos.

RESPUESTA INMUNITARIA MEDIADA POR CLULAS RESPUESTA DE ANTICUERPOS

bolsa de Fabricio (nicam ente aves)

128 2 Captulo 23 : El sistema inmunitario

foides (centrales) prim arios, debido a que son centros donde se desarrollan los linfocitos a partir de las clulas precursoras (Figura 23-1). Tal como veremos ms adelante, la mayora de los linfocitos mueren poco despus de haberse formado en un rgano linfoide primario. Otros, sin embargo, maduran y migran va sangunea hacia los rganos linfoides (perifricos) secun darios -principalmente, los nodulos linfticos, el bazo y los nodulos linfticos asociados al epitelio del tracto gastrointestinal, tracto respiratorio y la piel (vase Figura 23-1). En estos rganos linfoides secundarios es principalmente donde las clulas T y las clulas B reaccionan con los antgenos extraos (Figura 23-3). El grueso de la migracin de los linfocitos desde el timo y la bolsa de Fabricio se produce en las primeras etapas del desarrollo, por lo que la extirpacin de estos rganos en los animales adultos tiene relativamente poco efecto sobre las respuestas inmunitarias; sta es la razn de que su papel en la inmunidad tarda ra tanto tiempo en ser descubierto. Por el contrario, la mdula sea de los m am feros contina generando grandes cantidades de nuevas clulas B (~5 x 107/da en un ratn) durante toda la vida.

Los marcadores de superficie celular permiten distinguir y separar las clulas T de las clulas B 2,4
Las clulas T y las clulas B slo son morfolgicamente diferenciables despus de haber sido estimuladas por un antgeno. Las clulas T y B no estimuladas (en re poso) tienen un aspecto muy similar, incluso al microscopio electrnico: ambas son pequeas, slo algo mayores que los eritrocitos, y tienen un ncleo volumi noso (Figura 23-4A). Ambas se activan por antgenos, pasando entonces a proliferar y a diferenciarse. Las clulas B activadas se convierten en clulas secretoras de anticuerpos, las ms maduras de las cuales son las clulas plasmticas, que pre sentan un retculo endoplasmtico rugoso bien desarrollado (Figura 23-4B). En cambio, las clulas T activadas presentan muy poco retculo endoplasmtico y no segregan anticuerpos, aunque segregan una gran variedad de mediadores deno minados linfoquinas, interleuquinas o citoquinas (Figura 23-4C). Ambos tipos de linfocitos, T y B, se presentan en todos los rganos linfoides secundarios, por lo que ha sido necesario encontrar sistemas para distinguir y separar ambos tipos celulares y sus numerosos subtipos, con el fin de estudiar sus propiedades individuales. Afortunadamente, existen numerosas diferencias en las glucoprotenas de la membrana plasmtica de los diferentes tipos de lin focitos que se pueden utilizar como marcadores distintivos. Por ejemplo, los an-

Figura 23-4 Electronmicrografas de linfocitos en reposo y activados. El

linfocito en reposo en (A) puede ser una clula T o una clula B pues resulta difcil distinguirlas morfolgicamente hasta que hayan sido activadas. La clula B activada (una clula plasmtica) en (B) est repleta de un extenso retculo endoplasmtico (ER) rugoso, que se halla distendido, con molculas de anticuerpo. La clula T activada en (C) presenta relativamente poco ER rugoso pero est llena de ribosomas libres. Obsrvese que las tres clulas se muestran al mismo aumento. (A, por cortesa de Dorothy Zucker-Franklin; B, por cortesa de Cario Grossi; A y B, de D. Zucker-Franklin et al., Atlas of Blood Cells: Function and Pathology, 2nd ed. Miln, Italia: Edi. Ermes, 1988; C, por cortesa de Stefanello de Petris.)

(C) clula T activa

pm

(B) clula B activa (clula plasm tica)

jjrn

Base celular de la inmunidad

1283

clula precursora
PROLIFERACIN Y DIVERSIFICACION DEL LINAJE CELULAR distintos clones de clulas B en reposo (vrgenes)
B1 B2 B3

Figura 23-5 La teora de la seleccin clonal. Un antgeno activa nicamente

aquellos clones de linfocitos que ya estn destinados a responder ante l. Una clula destinada a responder ante un antgeno concreto expresa receptores de superficie celular que reconocen especficam ente al antgeno y todas las clulas del clon expresan el mismo receptor. Se cree que el sistema inmunitario consta de millones de clones diferentes de linfocitos, cientos de los cuales pueden ser activados por un antgeno particular (vase ms adelante). Aunque slo se muestran las clulas B, las clulas T actan de forma similar.

B2

UNION DEL ANTIGENO A UN CLON ESPECFICO

PROLIFERACIN {EXPANSIN CLONAL) Y MADURACIN

I I I !
clulas B secretoras de anticuerpos de un solo clan B2 82

ticuerpos que reaccionan con la protena Thy-1, la cual se encuentra en las clu las T del ratn pero no en las B, son ampliamente utilizados para eliminar o pu rificar clulas T de una poblacin mixta de linfocitos. As mismo, los anticuerpos contra las protenas CD4 y CD8, que veremos ms adelante, se utilizan muy a menudo para distinguir y separar clulas T colaboradoras de clulas T citotxicas, respectivamente, tanto en el ratn como en el hombre.

El sistem a inm unitario acta m ediante la seleccin clonal 5

El rasgo ms notable del sistema inmunitario estriba en que puede responder a millones de antgenos extraos diferentes de una manera altamente especfica -p o r ejemplo, mediante la produccin de anticuerpos que reaccionan especfi cam ente con el antgeno que ha inducido su formacin. Cmo puede el sistema inmunitario producir sem ejante diversidad de anticuerpos especficos? La res puesta empez a dilucidarse en los aos 1950 con la teora de la seleccin clo nal. Segn dicha teora cada animal genera primero aleatoriamente una gran va riedad de linfocitos y posteriormente se seleccionan especficamente las clulas que reaccionan contra los antgenos extraos que el animal ha ido encontrando. La teora de la seleccin clonal se basa en la idea de que durante el desarrollo, cada linfocito queda destinado a reaccionar con un antgeno concreto, antes de haber sido expuesto a este antgeno. Una clula expresa este destino en forma de unas protenas receptoras de la superficie celular que se adaptan especficam en te al antgeno. La unin del antgeno a los receptores activa la clula haciendo que prolifere y madure. Por consiguiente, un antgeno extrao estimula selecti vamente a aquellas clulas que expresan unos receptores complementarios y es pecficos del antgeno y que por consiguiente ya estn destinadas a responder ante el antgeno. Esto es lo que hace que las respuestas inmunitarias sean espe cficas del antgeno. El trmino clonal de la seleccin clonal deriva del postulado de que el sistema inmunitario est compuesto por millones de familias diferentes, o clones de clulas, cada uno de los cuales consta de clulas T o B descendientes de un an cestro comn. Cada clula ancestral ya est destinada a producir un tipo de pro tena receptora determinada, especfica del antgeno, y todas las clulas de cada clon tienen la misma especificidad antignica (Figura 23-5). As, segn la teora de la seleccin clonal, el sistema inmunitario acta segn el principio de lo ya confeccionado y no de lo hecho a medida.

128 4

Captulo 23 : El sistema inmunitario

Figura 23-6 Dos tipos de experimentos que apoyan la teora de seleccin clonal. Para una mayor
simplicidad, los receptores de la superficie celular se han dibujado nicamente en los linfocitos que estn destinados a responder al antgeno A; de hecho, sin embargo, todos las clulas T y B tienen receptores especficos para el antgeno en su superficie. Los experimentos se han realizado principalmente con clulas B, puesto que las clulas T reconocen un antgeno slo cuando ste se ha unido a la superficie de una clula husped, como veremos mas adelante.

EXPERIMENTO 1

EXPERIMENTO 2

antgeno A altam ente radiactivo

las clulas con receptores para el antgeno A se adhieren a las esferas recubiertas con antgeno A y son elim inadas las clulas con receptores para el antgeno A resultan * irradiadas letalm ente

-m

los ratones no responden al antgeno A, pero s a otros antgenos

Existen muchas pruebas que apoyan los principios de la teora de seleccin clonal. Por ejemplo, cuando los linfocitos de un animal que no ha sido inmuniza do se incuban en un tubo de ensayo con un antgeno cualquiera de una serie de antgenos marcados radiactivamente -p or ejemplo A, B, C y D - slo una propor cin muy reducida de los linfocitos (<0,01%) se unen a cada uno de los antge nos, lo cual sugiere que slo unas cuantas clulas pueden responder a A, B, C o D. Ello se confirma haciendo que el antgeno A sea tan altamente radiactivo que cualquier clula que se una a l quede irradiada letalmente; la poblacin restante de linfocitos ya no es capaz de producir respuesta inmunitaria ante A, aunque todava puede responder a los antgenos B, C o D. El mismo efecto se puede con seguir con una columna de afinidad de cuentas de vidrio recubiertas con el ant geno A y haciendo pasar luego los linfocitos a travs de la columna. Las clulas con receptores para A quedan retenidas en la columna mientras que las otras c lulas la atraviesan; por ello, las clulas que salen de la columna ya no pueden responder ante A, pero responden normalmente a otros antgenos (Figura 23-6). Estos dos experimentos indican primero que los linfocitos estn destinados a responder a un antgeno determinado antes de haber estado expuestos a l, y segundo, que los linfocitos tienen receptores en su superficie que unen especfi cam ente el antgeno. Por consiguiente quedan confirmadas dos de las prediccio nes principales de la teora de la seleccin clonal. Aunque la mayora de experi mentos de este tipo se han realizado en clulas B y en respuestas de anticuerpos, otros experimentos indican que las respuestas mediadas por clulas T tambin se desarrollan por la seleccin clonal. En la actualidad sabemos que los receptores especficos de antgenos tanto para las clulas T como para las clulas B se hallan codificados por genes que se ensamblan a partir de series de segmentos gnicos mediante una nica forma de

Base celular de la inmunidad

1 285

recom binacin gentica que tiene lugar en una etapa temprana del desarrollo celular, antes de encontrarse con el antgeno. Veremos ms adelante cmo el proceso de ensam blaje genera la enorme diversidad de receptores que capacita al sistema inmunitario para responder prcticamente a una diversidad ilimitada de antgenos.

| 0=C

residuo de lisina
no2
g r u p o d im t r o f e n il

H -C -C H 2-C H 2-C H 2-C H 2-N H -

La mayora de antgenos estim ulan muchos clones diferentes de linfocitos 6

La mayora de macromolculas, incluidas prcticam ente todas las protenas y gran parte de los polisacridos, pueden actuar como antgenos. Las zonas de un antgeno que se com binan con el lugar de unin para los antgenos de una m o lcula de anticuerpo o con el receptor de un linfocito, reciben el nombre de de term inantes antignicos (o eptopos). La mayora de antgenos tienen varios de term inantes antignicos diferentes que estimulan la produccin de anticuerpos o la respuesta de clulas T. Algunos determinantes son ms antignicos que otros, de modo que la reaccin que provocan puede dominar la respuesta gene ral; se dice que tales determinantes son inmunodominantes. Como cabra esperar de un sistema que acte por seleccin clonal, general mente cada determinante antignico activar muchos clones, cada uno de los cuales produce un lugar de unin al antgeno con una afinidad caracterstica para el determinante. Por ejemplo, incluso una estructura relativamente simple como el grupo dinitrofenol (DNP), que se muestra en la Figura 23-7, puede ser mirada de muchas maneras distintas. As, cuando est acoplado a una prote na, suele estimular la produccin de cientos de especies diferentes de anticuer pos anti-DNP, cada una de ellas producida por un clon de clulas B diferente. Tales respuestas se denominan policlonales. Cuando slo responden unos cuan tos clones, se dice que la respuesta es oligoclonal, y cuando toda la respuesta est producida por un solo clon de clulas B o T, se habla de respuesta monoclonal. Las respuestas a la mayora de antgenos son policlonales. Incluso los antgenos que activan muchos clones slo estimulan una frac cin muy reducida de la poblacin linfocitaria total. Para asegurar que estos po cos linfocitos sean expuestos al antgeno, los antgenos son recogidos por clulas presentadoras de antgeno especializadas en los rganos linfoides secundarios, a travs de los cuales circulan continuam ente linfocitos T y B. Los antgenos que entran a travs del intestino son atrapados por los tejidos linfoides asociados al intestino; los que penetran a travs de la piel o el tracto respiratorio son reteni dos localm ente y/o transportados va linftica hasta los nodulos linfticos loca les; y los que entran en la sangre son filtrados en el bazo.

(DNP)

esqueleto del polipptido

Figura 23-7 El grupo dinitrofenol (DNP). Aunque es demasiado reducido
para inducir una respuesta inmunitaria por s mismo, cuando se acopla en forma covalente a una lisina de la cadena lateral de una protena, tal como se ilustra aqu, el DNP estimula la produccin de muchas especies diferentes de anticuerpos, que se unen especficam ente a dicho grupo.

La mayora de los linfocitos recirculan continuam ente 7

La mayora de las clulas T y B recirculan continuamente entre la sangre y los r ganos linfoides secundarios. En un nodulo linftico, por ejemplo, los linfocitos abandonan la circulacin pasando con dificultad entre clulas endoteliales espe cializadas; tras filtrarse a travs del nodulo se acumulan en pequeos vasos linf ticos que abandonan el nodulo y conectan con otros vasos linfticos, que a su vez atraviesan otros nodulos linfticos situados ms lejos. Circulando a travs de va sos cada vez mayores, los linfocitos entran finalmente en el vaso linftico princi pal (el conducto torcico ), que los devuelve a la circulacin sangunea. Esta recir culacin continua no slo asegura que los linfocitos apropiados entren en contacto con el antgeno sino que tambin asegura que los linfocitos apropiados se encuentren entre s: veremos que las interacciones entre linfocitos determina dos constituyen una parte crucial de la mayora de las respuestas inmunitarias. La recirculacin de linfocitos depende de interacciones especficas entre la superficie celular del linfocito y la superficie de clulas endoteliales especializa das que recubren el interior de pequeas venas en los rganos linfoides secun darios; debido al extraordinario tamao de sus clulas endoteliales, dichas venas

1 28 6

Captulo 2 3 : El sistema inmunitario

Figura 23-8 Dibujo muy simplificado de un ndulo linftico humano. Las

cortex (principalm ente clulas B) paracrtex (principalm ente clulas T) m dula folculo linfoide vnula postcapilar de endotelio alto seno m arginal senos m edulares vaso linftico eferente arteria 3 mm
se denominan vnulas postcapilares de endotelio grande (Figura 23-8). Muchos tipos celulares de la sangre entran en contacto con dichas clulas endoteliales grandes, pero slo los linfocitos se adhieren y migran entonces fuera de la co rriente sangunea. Distintas subpoblaciones de linfocitos migran a travs de dis tintos tejidos linfoides: por ejemplo, mientras que la mayora de linfocitos migran hacia los nodulos linfticos, algunos migran preferentemente hacia las placas de Peyer en el intestino delgado y constituyen, efectivamente, un subsis tem a intestinal especfico de linfocitos especializados en la respuesta frente a antgenos que penetran en el cuerpo desde el intestino. Dichas migraciones estn dirigidas por los diferentes receptores buscado res en los linfocitos y por los ligandos de dichos receptores (en muchos casos denominados localizadores de receptores, counterreceptors) en las clulas en doteliales. Ambos tipos de receptores y de localizadores de receptores se han identificado mediante anticuerpos monoclonales que se unen bien a la superfi cie de distintos linfocitos o bien a la de clulas endoteliales altas especializadas e inhiben la capacidad de los linfocitos para unirse a las clulas endoteliales en cortes de tejido de rganos linfoides secundarios as como para recircular in vivo. Por ejemplo, la migracin de los linfocitos hacia los nodulos linfticos de pende de una protena de adhesin celular denominada selectina E, que perte nece a la familia de selectinas de las lectinas de superficie celular, como se vio en el Captulo 10. Este receptor buscador, que se encuentra en la mayora de linfo citos, se une de forma especfica a los grupos azcar de un detector de recepto res altamente glucosilado, similar a la mucina que se expresa nicamente en la superficie de las clulas del endotelio alto que revisten las vnulas postcapilares de los nodulos linfticos (vase Figura 23-8). La unin de la selectina E induce a los linfocitos a adherirse dbilmente a las clulas endoteliales y a deslizarse len.tam ente por su superficie. El deslizamiento prosigue hasta que se activa otro sis tem a ms fuerte de adhesin. Dicha adhesin fuerte, que est facilitada por un miembro de la familia de las molculas de adhesin celular integrinas de la su perficie de los linfocitos (como vimos en el Captulo 19), permite a los linfocitos detener su deslizamiento y desplazarse al exterior del vaso sanguneo hacia el nodulo linftico (Figura 23-9). Se cree que otros receptores buscadores de linfocitos son los responsables de la segregacin de las clulas T y B en reas diferentes en el ndulo linftico (vase Figura 23-8). Una vez han sido activados por el antgeno, la mayora de los linfocitos pierden muchos de sus receptores buscadores iniciales y adquieren otros nuevos: en lugar de migrar a travs de los rganos linfoides migran a travs de tejidos no linfoides hacia los centros de inflamacin. La migracin de los lin focitos activados y de otros glbulos blancos de la sangre hacia los centros de in flamacin est facilitada ampliamente por diversas combinaciones de selectinas e integrinas (tal como hemos visto en el Captulo 10).

clulas B estn localizados primariamente en el crtex, donde estn agrupadas en estructuras llamadas folculos linfoides. Las clulas T se encuentran mayoritariamente en el paracrtex. Ambos tipos de linfocitos penetran en el ndulo linftico procedentes de la sangre, pasando por unas pequeas venas denominadas vnulas postcapilares de endotelio grande y migran despus hacia sus reas respectivas. Finalmente tanto las clulas T como las B migran a los senos medulares y abandonan el ndulo pasando por el vaso linftico eferente. Este vaso desem boca en la corriente sangunea, permitiendo que los linfocitos empiecen otro ciclo de circulacin a travs de un rgano linfoide secundario. Los antgenos extraos que entran en el ndulo linftico son expuestos en la superficie de clulas

presentadoras de antgeno
especializadas: un tipo de estas clulas

(clulas dendrticas con interdigitaciones) presenta los

antgenos a las clulas T en el rea paracortical; se cree que otro tipo de clulas (clulas dendrticas foliculares) estn implicadas en la activacin de las clulas B de memoria (se discutir ms adelante) en el centro activado (denominado un centro germinativo) de los folculos linfoides.

Base celular de la inmunidad

1287

lm ina basal

# [# ]#

1 I ; .

i I

Figura 23-9 Migracin de un linfocito desde la corriente sangunea hacia un ndulo linftico. Un linfocito

ADHESIN DBIL Y ADHESIN FUERTE Y DESPLAZAMIENTO MIGRACIN (selectina-dependiente) (integrina-dependiente)

linfocito clula de endotelio alto de la vnula postcapilar

f* *

vnula postcapilar

*T

Ii

r* 1
J a

1 * 1 * i

circulante se adhiere dbilmente a la superficie de las clulas especializadas de endotelio alto. Dicha adhesin inicial, mediada por la selectina E de la superficie del linfocito, es tan dbil que provoca que el linfocito se desplace a lo largo de la superficie de las clulas endoteliales. El linfocito activa rpidamente un sistema de adhesin ms fuerte, mediado por una integrina, que permite a la clula detenerse en su desplazamiento y migrar hacia fuera de la vnula entre las clulas endoteliales.

La memoria inmunolgica se debe a la expansin clonal y a la maduracin de los linfocitos8

Como el sistema nervioso, el sistema inmunitario tiene la capacidad de recordar. Por ello, tras estar expuestos a determinados virus desarrollamos una inmuni dad para toda la vida frente a muchas enfermedades vricas comunes, lo cual constituye la inmunizacin. Este mismo fenmeno se puede poner fcilmente de manifiesto en animales experimentales. Si a un animal se le inocula el antgeno A, su respuesta inmunitaria (ya sea por anticuerpos o mediada por clulas) aparecer al cabo de un perodo de retraso de varios das, aumentando de ma nera rpida y exponencial para luego volver a disminuir, aunque de forma ms gradual. ste es el curso caracterstico de una respuesta inmunitaria primaria, que se produce en la primera exposicin de un animal a un antgeno. Si se dejan transcurrir algunas semanas o meses, o incluso aos, y de nuevo se inyecta al animal el antgeno A, se producir una respuesta inmunitaria secundaria, muy distinta de la respuesta primaria: el perodo de retraso es ms breve y la respues ta es mayor y su duracin ms prolongada. Estas diferencias indican que el ani mal ha recordado su primera exposicin al antgeno A. Si al animal se le admi nistra un antgeno distinto (por ejemplo el antgeno B), en lugar de una segunda inyeccin de antgeno A, tpicam ente la respuesta ser de tipo primario y no se cundario; por consiguiente, la respuesta secundaria refleja una m em oria inmu nolgica especfica del antgeno A (Figura 23-10). La teora de la seleccin clonal proporciona una trama conceptual til para comprender la base celular de la memoria inmunolgica. En un animal adulto, las clulas T y B de los rganos linfoides secundarios son una mezcla de clulas

c oo
Q _

100

Figura 23-10 Respuestas prim aria y secundaria de anticuerpos. La

< D < D
_ 5 CD

respuesta primaria al antgeno A

respuesta secundaria al antgeno B

respuesta primaria al antgeno B

Q-

10 prim era inyeccin del antgeno A

20

60 tiempo (das) tt segunda inyecc n del antgeno A y prim era inyec :in del antgeno B

30

40

50

respuesta secundaria es ms rpida e intensa que la respuesta primaria y es especfica para A, lo cual indica que el sistema inmunitario ha recordado especficamente el haberse encontrado anteriormente con el antgeno A. Si se miden las respuestas mediadas por clulas T y no las respuestas de anticuerpos de clulas B, se obtienen pruebas de memoria inmunolgica del mismo tipo.

1288

Captulo 23 : El sistema inmunitario

Figura 23-11 Modelo de los fundamentos celulares de la memoria inmunitaria. Cuando las clulas T o B vrgenes son estimuladas por su
antgeno especfico, proliferan y maduran; algunas se activan dando lugar a una respuesta, mientras que otras se transforman en clulas de memoria. Durante una exposicin posterior al mismo antgeno, las clulas de memoria responden ms rpidamente que las clulas vrgenes: proliferan y se desarrollan dando lugar a clulas activadas y a ms clulas de memoria. En el modelo que se presenta aqu, cada clula virgen individual puede desarrollarse ya sea en clula de memoria o en clula activada, dependiendo de las condiciones. En un modelo alternativo (que no se muestra en la figura) las clulas vrgenes que maduran a clulas de memoria son diferentes de las que maduran en clulas activadas. Se desconoce cul de estos modelos es el correcto.

clulas de m em oria segunda exposicin al antgeno

I

clulas activadas

que se hallan por lo menos en tres fases discretas de maduracin, que se pueden denominar clulas vrgenes (o nave cells ), clulas con memoria y clulas activa das. Cuando las clulas vrgenes se encuentran con un antgeno por primera vez, algunas de ellas se estimulan para multiplicarse y se transforman en clulas activadas -e s decir, en clulas dedicadas activamente a producir una respuesta (las clulas activadas T realizan respuestas mediadas por clulas, mientras que las clulas activadas B secretan anticuerpo). Otras clulas vrgenes se estimulan para multiplicarse y diferenciarse en clulas de m em oria -e s decir, en clulas que no producen respuesta pero que fcilmente se inducen a transformarse en clulas activadas, ante un encuentro posterior con el mismo antgeno (Figura 23-11). Mientras que las clulas vrgenes y las clulas de memoria pueden vivir durante meses o incluso aos, las clulas efectoras mueren por muerte celular programada en unos cuantos das. Las clulas de memoria responden mucho ms rpidamente al antgeno que las clulas vrgenes. Veremos ms adelante que una de las razones que explica esta capacidad de respuesta incrementada de las clulas B de memoria es que sus receptores presentan una mayor afinidad por el antgeno. Por el contrario, las c lulas de memoria T parecen responder al antgeno ms rpidamente que las clu las vrgenes T no debido a la presencia de receptores de alta afinidad para el ant geno, sino porque que se adhieren de forma ms fuerte a otras clulas y traducen las seales extracelulares de forma ms eficiente. Segn este esquema, la memo ria inmunolgica se genera durante la respuesta primaria, en parte porque la pro liferacin de la clula virgen, desencadenada por el antgeno, genera muchas c lulas de memoria -proceso conocido como expansin clonal- y en parte porque las clulas vrgenes se diferencian en clulas de memoria que son capaces de res ponder ms fcilmente al antgeno que una clula virgen. Los antgenos pueden persistir en los tejidos linfoides durante largo tiempo constituyendo una respues ta primaria y se cree que una estimulacin continua mediante un antgeno con tribuye al mantenimiento de dicha memoria a largo plazo.

r .... .

clulas de m em oria

clulas activadas

La falta de respuesta ante los antgenos propios es debida a una tolerancia inmunolgica adquirida9
Por qu es capaz en sistema inmunitario de diferenciar entre las molculas extra as y las molculas propias? Una posibilidad estriba en que el animal hereda unos genes que codifican los receptores para los antgenos extraos pero no para los antgenos propios, de modo que su sistema inmunolgico est constituido genti camente para responder nicamente a los antgenos extraos. Tambin es posible que el sistema inmunitario sea, de forma inherente, capaz de responder tanto a los antgenos extraos como a los propios, pero que durante el desarrollo aprenda a no responder a los antgenos propios. Se ha demostrado que esta segunda explica cin es la correcta. La primera prueba de ello fue una observacin realizada en 1945. Normalmente, cuando se trasplantan tejidos de un individuo a otro, se reco nocen como extraos por el sistema inmunitario y son destruidos. Pero se observ

Base celular de la inmunidad

1289

que los mellizos dizigticos de bvidos, que se desarrollan a partir de dos vulos fe cundados y que por lo tanto no son idnticos, intercambiaban clulas sanguneas in tero como resultado de la fusin espontnea de sus placentas; se demostr que estos mellizos aceptaban mutuamente los injertos cutneos. Ms tarde, estos hechos se reprodujeron experimentalmente en pollos, permitiendo la fusin de los vasos sanguneos de dos embriones distintos; tambin se realizaron en rato nes, introduciendo en un neonato de ratn clulas del bazo de una cepa distinta, donde sobrevivan durante la mayor parte de la vida del receptor. En ambos ca sos, cuando los animales maduraron, los injertos procedentes del animal unido o del animal donante fueron aceptados (Figura 23-12), mientras que los injertos de un tercero fueron rechazados. As, la presencia continua de antgenos no pro pios iniciada antes de que el sistema inmunitario haya madurado, conduce a una ausencia permanente de respuesta ante los antgenos no propios determinados. El estado resultante de la ausencia inducida de respuesta inmunolgica a determina dos antgenos recibe el nombre de tolerancia inmunolgica adquirida. Existen claras evidencias de que la ausencia de respuesta del sistema inmu nitario de un animal frente a sus propias macromolculas (tolerancia inmunol gica natural) se adquiere de la misma forma y, por lo tanto, no es innata. Por ejemplo, los ratones normales no pueden producir una respuesta inmunitaria contra su propia protena del com plem ento C5, pero un ratn muante que ca rezca del gen que codifica C5 (siendo por otro lado genticamente idntico en todo lo dems a un ratn normal) puede producir respuesta inmunitaria frente a esta protena. El m antenim iento de la autotolerancia requiere la presencia cons tante de autoantgenos. Si un animal elimina un antgeno como el C5 recupera la capacidad de respuesta a dicho antgeno en unos cuantos das o semanas. As, es evidente que el sistema inmunitario es genticamente capaz de responder a lo propio pero aprende a no hacerlo. El proceso de aprendizaje que posibilita la autotolerancia puede implicar tanto la elim inacin de linfocitos autorreactivos (delecin clonat) como la inacti vacin funcional de las clulas pero mantenindolas vivas (anergia clonat). Como veremos ms adelante, muchos linfocitos autorreactivos se eliminan o inactivan cuando encuentran por primera vez un antgeno en los rganos linfoides primarios. Al parecer, los linfocitos formados nuevamente en dichos rga nos no se activan por unin al antgeno aunque son eliminados o inactivados por dicho antgeno. Alguna vez la tolerancia ante los antgenos propios desaparece, haciendo que las clulas T o B (o ambas) reaccionen contra los antgenos de sus propios tejidos. La miastenia gravis es un ejemplo de estas enferm edades autoinm unitarias. Los individuos afectados producen anticuerpos contra los receptores de acetilcolina de sus propias clulas del msculo esqueltico; los anticuerpos in terfieren en el funcionamiento normal de los receptores, de modo que estos pa cientes se debilitan y pueden morir por incapacidad para respirar.

Figura 23-12 Tolerancia inmunolgica. El injerto cutneo que muestra esta fotografa, trasplantado de un ratn pardo adulto a un ratn blanco adulto, ha sobrevivido durante muchas semanas nicamente porque el segundo animal fue convertido en inmunolgicamente tolerante gracias a la inyeccin de clulas del ratn pardo desde el momento del nacimiento. (Por cortesa de Leslie Brent, de I. Roitt, Essential Immunology, 6th ed. Oxford, U.K.: Blackwell Scientific, 1988.)

1 29 0

Captulo 23 : El sistema inmunitario

Resumen
El sistema inmunitario evolucion en el sentido de defender a los vertebrados de la infeccin. Est compuesto por millones de clones de linfocitos. Los linfocitos de cada clon comparten un receptor determinado de la superficie celular que les per mite unirse a un determinante antignico concreto, consistente en una disposi cin especfica de tomos de una zona de la molcula. Existen dos clases de linfoci tos: las clulas B, que se forman en la mdula sea y producen anticuerpos, y las clulas T, que se forman en el timo y desarrollan respuestas inmunitarias mediadas por clulas. Durante las primeras fases del desarrollo de los linfocitos, muchos linfocitos que reaccionaran contra determinantes antignicos de macromolculas propias son eliminados o inactivados; a consecuencia de ello, normalmente el sistema in munitario reacciona slo contra antgenos extraos. La unin de un antgeno ex trao a un linfocito inicia una respuesta por parte de la clula que ayuda a elimi nar el antgeno. Como parte de esta respuesta, algunos linfocitos proliferan y maduran a clulas de memoria, que son capaces de responder ms rpidamente que las clulas vrgenes frente al antgeno. As, la prxima vez que aparezca el mis mo antgeno la respuesta inmunitaria ser ms rpida e intensa.

Propiedades funcionales de los anticuerpos1 0

Los vertebrados mueren rpidamente a causa de una infeccin si no son capa ces de producir anticuerpos. Los anticuerpos nos defienden de la infeccin m e diante la inactivacin de los virus y de las toxinas bacterianas, as como median te el reclutamiento del sistema del complemento y de varios tipos de glbulos blancos de la sangre que matan a los microorganismos extracelulares y a parsi tos ms grandes. Los anticuerpos, sintetizados exclusivamente por las clulas B, son producidos en millones de formas, cada una de las cuales tiene una secuen cia de aminocidos y un lugar de unin al antgeno diferentes. Conocidos colec tivamente como inm unoglobulinas (abreviado, Ig), se encuentran entre los com ponentes proteicos ms abundantes de la sangre, constituyendo aproxima damente un 20% en peso del total de protenas plasmticas. En esta seccin des cribiremos las cinco clases de anticuerpos que se encuentran en los vertebrados superiores, cada una de las cuales media una respuesta biolgica caracterstica tras su unin al antgeno.

Los receptores de las clulas B especficos para los antgenos son molculas de anticuerpo 11
Como predice la teora de la seleccin clonal, todas las molculas de anticuerpo producidas por cada clula B tienen el mismo lugar de unin para el antgeno. Los primeros anticuerpos producidos por una clula B recin formada no se se cretan, sino que quedan insertados en la membrana plasmtica, donde actan como receptores para el antgeno. Cada clula B tiene aproximadamente 105 molculas de anticuerpo en su membrana plasmtica. Cada una de dichas m ol culas de anticuerpo se halla asociada de forma no covalente con una serie cons tante de cadenas polipeptdicas transmembrana implicadas en transmitir sea les al interior de la clula cuando el lugar de unin extracelular para el antgeno se halla ocupado por un antgeno. Dichos polipptidos constantes tienen la fina lidad de acoplar los receptores de los antgenos de las clulas B a uno o ms miembros de la familia Src de protenas tirosina quinasas (incluyendo la Lyn quinasa), de forma que cuando se une un antgeno se activa una cascada de fos forilaciones (vase Figura 23-54B). Cada clula B produce una sola clase de anticuerpo, con un nico lugar de unin al antgeno. Cuando una clula virgen o una clula B con memoria es acti vada por un antgeno (con la ayuda de las clulas T colaboradoras), prolifera y

Propiedades funcionales de los anticuerpos

1291

madura convirtindose en una clula secretora de anticuerpos. Las clulas acti vadas producen y segregan grandes cantidades de anticuerpos solubles (en vez de unidos a membrana), con un lugar de unin para el antgeno igual al de los anticuerpos de la superficie celular que inicialmente haban servido de recepto res para el antgeno (Figura 23-13). Las clulas B activadas pueden empezar a se cretar anticuerpos mientras todava son linfocitos pequeos, pero la fase final de su proceso de maduracin es una gran clula plasmtica (vase Figura 23-4B) que secreta anticuerpos a gran velocidad, del orden de unas 2000 molculas por segundo. Parece que las clulas plasmticas han dedicado una parte tan grande de su maquinaria de sntesis de protenas a la produccin de anticuerpos que son incapaces de crecer y dividirse, muriendo la mayora de ellas al cabo de va rios das.

antgeno

clula B en reposo

receptor ^ - / del antgeno { g ^

PROLIFERACION Y MADURACIN

/ B A

B S

VA

v y A r

Las clulas B pueden ser estimuladas a segregar anticuerpos en una placa de cultivo 12
Dos adelantos realizados en los aos 1960 revolucionaron la investigacin sobre las clulas B. El primero fue el desarrollo de la prueba de la placa hemoltica, que hizo posible identificar y contar clulas B activadas secretoras de anticuerpos contra un antgeno especfico. En la forma ms sencilla de esta prueba, se toman linfocitos (generalmente del bazo) de animales que se haban inmunizado contra eritrocitos de oveja (SRBC, de Sheep Red Blood Cells). Luego, estos linfocitos se incluyeron en agar, junto con un exceso de SRBC, de modo que la placa contena un csped de SRBC inmovilizados y algunos linfocitos. En estas condiciones las clulas son incapaces de moverse, pero cualquier anticuerpo anti-SRBC que sea secretado por una clula B difundir hacia el exterior y recubrir los SRBC de las proximidades de la clula secretora. Una vez recubiertos de anticuerpo, los SRBC se pueden matar aadiendo complemento. De esta manera, la presencia de cada clula secretora de anticuerpo viene indicada por la presencia de un punto claro, o placa, en la capa opaca de SRBC. Esta misma prueba se puede utilizar para con tar las clulas que producen anticuerpos contra otros antgenos, tales como pro tenas y polisacridos, acoplando qumicamente estos antgenos a la superficie de los SRBC. El segundo avance importante fue la demostracin de que las clulas B pue den ser inducidas a segregar anticuerpos exponindolas al antgeno en un ensa yo en tubo o en la placa de cultivo, donde las interacciones celulares se pueden manipular y el entorno se puede controlar. Esto condujo al descubrimiento de que la mayora de antgenos necesitan, para estimular a las clulas B vrgenes a secretar anticuerpos, tanto los clulas T colaboradoras como las clulas presen tadoras de antgeno especializadas , tal como veremos ms adelante.

y y
y

-<

y
-<

A
u

anticuerpos segregados
Figura 23-13 Activacin de una clula B. Cuando se activan clulas B
en reposo mediante un antgeno para que proliferen y maduren a clulas secretoras de anticuerpos, producen y segregan anticuerpos con un nico tipo de lugar de unin, que es el mismo que en los anticuerpos unidos a membrana actuaba como receptor del antgeno.

Los anticuerpos tienen dos lugares idnticos de unin al antgeno 13

Las molculas ms sencillas de anticuerpo tienen forma de Y con dos lugares idnticos de unin al antgeno, uno en cada punta de los dos brazos de la Y (Fi gura 23-14). Como tienen dos lugares de unin al antgeno, se dice que son bi valentes. Cuando las molculas de antgeno tienen tres o ms determinantes antignicos, las molculas de anticuerpo bivalentes pueden establecer enlaces cruzados entre molculas de antgeno, formando amplias redes (Figura 23-15), que pueden ser fagocitadas y degradadas rpidamente por los macrfagos. La eficiencia de la unin del antgeno y la formacin de enlaces cruzados se ve al tam ente increm entada por la presencia en los anticuerpos de una regin bisa gra flexible, que permite variar la distancia entre los dos lugares de unin al an tgeno (Figura 23-16). El efecto protector de los anticuerpos no se debe simplemente a su capaci dad para unir el antgeno. Tam bin participan en diversas actividades mediadas por el pie de la molcula en forma de Y. Esta parte de la molcula determina lo que le suceder al antgeno despus de unirse al anticuerpo. Veremos qe anti-

Figura 23-14 Representacin sencilla de una molcula de anticuerpo.

Obsrvese que los dos lugares de unin al antgeno son idnticos.

129 2

Captulo 2 3 : El sistema inmunitario

o
rT

un determ inante antignico

tres o ms determ inantes antignicos

Figura 23-15 Interacciones antgenoanticuerpo. Debido que los

anticuerpos tienen dos lugares idnticos de unin al antgeno, pueden formar enlaces cruzados entre antgenos. El tipo de com plejo antgeno-anticuerpo que forman depende del nmero de determinantes antignicos del antgeno. Aqu se muestra la unin de una sola especie de anticuerpo (un anticuerpo monoclonal) a un antgeno que presenta una, dos o tres copias de un mismo tipo de determinante antignico. Los antgenos con dos determinantes antignicos pueden formar pequeos complejos cclicos o cadenas lineales con el anticuerpo, mientras que los antgenos con tres o ms determinantes antignicos pueden formar grandes redes tridimensionales que precipitan rpidamente en la solucin. La mayora de antgenos poseen muchos determinantes antignicos distintos (vase Figura 2325A) y los distintos anticuerpos que reconocen estos determinantes diferentes pueden cooperar formando enlaces cruzados con el antgeno (no se muestra en la figura).

dos determ inantes antignicos

> ^ y<
'J lL .

< # >
J L -

A
J L

cuerpos con lugares de unin al antgeno iguales pueden tener uno cualquiera de los diferentes tipos de pie, cada uno de los cuales confiere al anticuerpo pro piedades funcionales distintas, como por ejemplo la capacidad de activar el complemento o de unirse a clulas fagocticas.

Una molcula de anticuerpo est compuesta por dos cadenas ligeras idnticas y dos cadenas pesadas idnticas 13
La unidad estructural bsica de una m olcula de anticuerpo consta de cuatro ca denas polipeptdicas, dos cadenas ligeras (L) idnticas (cada una de ellas de unos 220 aminocidos) y dos cadenas pesadas (H) (de heavy) idnticas (gene ralmente de unos 440 aminocidos). Las cuatro cadenas se mantienen unidas entre s gracias a una com binacin de uniones no covalentes y covalentes (enla ces disulfuro). La molcula est compuesta por dos mitades idnticas, con el lu gar de unin al antgeno igual, y normalmente tanto la cadena ligera como la ca dena pesada cooperan entre s formando la superficie de unin al antgeno (Figura 23-17). Las enzimas proteolticas papana y pepsina rompen las molculas de anti cuerpo en diferentes fragmentos caractersticos. La papana produce dos frag mentos Fab (de Fragment Antigen Binding) idnticos, cada uno de los cuales presenta un lugar de unin al antgeno, y un fragmento Fe (llamado as porque cristaliza con facilidad). En cambio, la pepsina produce un fragmento F(ab)2 llamado as porque consta de dos fragmentos F(ab) unidos covalentemente (cada uno de ellos algo mayor que un fragmento Fab); el resto de la molcula se degrada en fragmentos menores (Figura 23-18). Los fragmentos F(ab )2 son biva lentes, por lo que todava pueden, a diferencia de los fragmentos Fab monova lentes, formar enlaces cruzados con los antgenos, y precipitar. Ninguno de estos fragmentos conserva las otras propiedades biolgicas de las molculas de anti cuerpo intactas debido a que carecen de la regin del pie (Fe) en la que se basan estas propiedades.

regin bisagra de la m olcula de anticuerpo

Existen cinco clases diferentes de cadenas pesadas, cada una de las cuales tiene propiedades biolgicas distintas 10,14
En los vertebrados superiores existen cinco clases diferentes de anticuerpos, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, cada una de las cuales tiene su propia clase de cadena pesa da a, 8, e, y y |i, respectivamente; las molculas de IgA tienen cadenas a, las m o lculas de IgG tienen cadenas y, etc. Adems, existen varias subclases de inmunoglobulinas IgG e IgA; por ejemplo: en humanos existen cuatro subclases de IgG (IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4) constituidas respectivamente por las cadenas peFigura 23-16 La regin bisagra de una molcula de anticuerpo. Debido a
su flexibilidad, la regin bisagra aumenta la eficiencia de la unin del antgeno y de la formacin de enlaces cruzados.

Propiedades funcionales de los anticuerpos

1 293

lugar de unin al antgeno

lugar de unin al antgeno

H2N

NH2

cadena ligera

Figura 23-17 Ilustracin esquemtica de una molcula tpica de anticuerpo. Est compuesta por dos cadenas pesadas idnticas y dos cadenas ligeras idnticas. Obsrvese que los centros de unin al antgeno estn formados por un complejo de las regiones amino terminales de ambas cadenas ligeras y pesadas, pero que la regin de la cola y las regiones en bisagra estn formadas nicamente por cadenas pesadas.

HOOC

COOH

sadas y,, y2, y3 y y4. Las diferentes cadenas pesadas imparten una conformacin distintiva a las regiones de bisagra y de pie de los anticuerpos y confieren a cada clase y subclase unas propiedades caractersticas. La IgM, cuya cadena pesada es siempre |i, es la primera clase de anticuerpo que producen las clulas B en desarrollo, aunque posteriormente muchas clu las B pasan a producir otras clases de anticuerpo (como veremos ms adelante). Inicialm ente el precursor inmediato de una clula B, denominado clula pre-B, slo fabrica cadenas |j., las cuales se asocian con cadenas de polipptidos no li-

ROTURA POR LA PAPANA

ROTURA POR LA PEPSINA

Figura 23-18 Fragmentos de anticuerpo Fab y F(ab)2. Estos fragmentos se producen cuando las molculas de anticuerpo son degradadas con las enzimas proteolticas papana y pepsina, respectivamente.

pepsina

pepsina

lugares de unin al antgeno ?-S-SJ

-S-S^

lugares de unin al antgeno

un fragm ento Fe
129 4 Captulo 23 : El sistema inmunitario

de Fe

lugares de unin

Figura 23-19 Una molcula pentamrica de IgM. Las cinco subunidades estn unidas entre s por enlaces disulfuro. Una nica cadena J, que presenta una estructura similar a la de un nico dominio de Ig (se estudia ms adelante), est unida por enlaces disulfuro entre dos cadenas pesadas | i. La cadena J es necesaria para el proceso de polimerizacin. La adicin de cada una de las cuatro subunidades sucesivas de la cadena IgM requiere una cadena J, que se desprende, excepto la ltima, que queda retenida.

bacteria recubierta de anticuerpos IgG

geras (con frecuencia denominadas substituyentes de las cadenas ligeras) y si tuadas en la membrana plasmtica. En cuanto incrementa la sntesis de las ca denas ligeras, stas se combinan con las cadenas 1 1, desplazando las cadenas li geras substituyentes, formando una molcula de IgM de cuatro cadenas (con dos cadenas \ i y dos cadenas ligeras), que se insertan en la membrana plasmti ca. Ahora la clula tiene receptores en su superficie a los que puede unirse el antgeno; en este momento la clula recibe el nombre de clula B virgen. Muchas clulas B vrgenes empiezan tambin a producir molculas IgD de superficie ce lular, con el mismo lugar de unin a antgeno que las molculas IgM. La IgM no es slo la primera clase de anticuerpo en aparecer en la superficie celular de las clulas B en desarrollo, sino que tambin es la clase principal de Ig secretada a la sangre en las primeras fases de una respuesta primaria de anti cuerpos. La forma de IgM de secrecin se compone de cinco unidades de cuatro cadenas, teniendo as un total de diez lugares de unin para el antgeno. Cada pentmero contiene una copia de otra cadena polipeptdica denominada cade na J (de joining). Las clulas secretoras de IgM producen la cadena I y la inser tan covalentemente entre dos regiones adyacentes del pie (Fe) (Figura 23-19). La unin del antgeno a las regiones Fab de la IgM pentamrica secretada induce a las regiones Fe a unirse, y por tanto a activar al primer com ponente del sistema del complemento. Tal como veremos ms adelante, cuando el antgeno se encuentra en la superficie de un microorganismo invasor, la activacin resul tante del sistema del complemento inicia un ataque bioqumico que mata al m i croorganismo. A diferencia de las IgM, las molculas de IgD raramente son se cretadas por una clula B activa; sus funciones -adem s de las que presentan como receptores para el antgeno- son desconocidas. La clase principal de inmunoglobulinas que se hallan en la sangre es la de las IgG, que se producen en grandes cantidades durante las respuestas inmunitarias secundarias. Adems de activar el sistema del complemento, la regin Fe de una molcula de IgG se une a receptores especficos de macrfagos y de neutrfilos. Estas clulas fagocticas, en gran parte mediante estos receptores Fe, se unen, ingieren y destruyen a los microorganismos infectantes que han sido re cubiertos por anticuerpos IgG producidos en respuesta a la infeccin (Figura 2320). Algunos tipos de glbulos blancos que expresan receptores Fe pueden tam bin matar clulas eucariotas extraas recubiertas de IgG, sin fagocitarlas.

regin Fe de un anticuerpo IgG _ receptor Fe

m acrfago o neutrfilo

Figura 23-20 Fagocitosis activada por anticuerpo. Una bacteria cubierta por anticuerpos IgG es fagocitada eficazmente por un macrfago o un neutrfilo, los cuales tienen receptores de superficie capaces de unirse a la regin Fe de las molculas de IgG. La unin de esta bacteria recubierta de anticuerpos a estos receptores Fe del macrfago activa el proceso de fagocitosis.

Propiedades funcionales de los anticuerpos

1295

Las molculas de IgG son los nicos anticuerpos que pueden pasar de la madre al feto a travs de la placenta. Las clulas de la placenta que se hallan en contacto con la sangre materna tienen receptores Fe que unen molculas de IgG y median su paso hacia el feto. En primer lugar, los anticuerpos son captados de la sangre materna mediante una endocitosis mediada por receptor, y luego son transportados a travs de la clula en el interior de vesculas y son liberados por exocitosis a la sangre fetal (proceso denominado transcitosis, tal como se descri be en el Captulo 13). Otras clases de anticuerpos no se unen a estos receptores por lo que no pueden atravesar la placenta. La IgG tambin se segrega en la le che m aterna y es captada por el recin nacido desde el intestino hacia la sangre. La IgA es la principal clase de anticuerpos que se hallan presentes en las se creciones (saliva, lgrimas, leche y secreciones respiratorias e intestinales) (Figu ra 23-21). Se transporta a travs de las clulas de un epitelio de secrecin desde el medio extracelular hasta el material de secrecin por otro tipo de receptor Fe que es el nico de los epitelios de secrecin (Figura 23-22). La regin Fe de las molculas de IgE se une con una elevada afinidad (Ka = 10 1 0 litros/m ol) a otra clase de receptores Fe. Estos receptores se localizan en la superficie de los mastocitos de los tejidos y de los basfilos de la sangre; a su vez, las molculas de IgE unidas a ellos actan como receptores para el antgeno. La unin del antgeno desencadena la secrecin por parte de las clulas de una serie de aminas biolgicamente activas, particularmente histamina (Figura 23-23). Es tas aminas causan una dilatacin y un aumento de la permeabilidad de los vasos sanguneos siendo en gran parte las responsables de las manifestaciones clnicas de reacciones alrgicas como la fiebre del heno, el asma y la urticaria. En circuns tancias normales, los cambios que sufren los vasos sanguneos estn pensados para ayudar a las glbulos blancos de la sangre, a los anticuerpos y a los compo nentes del complemento a penetrar en los lugares de inflamacin. Los mastocitos tambin segregan factores que atraen y activan a una clase especial de glbulos blancos denominados eosinfilos, los cuales pueden matar varios tipos de parsi tos, especialmente si los parsitos se hallan recubiertos de anticuerpos IgE o IgA. En la Tabla 23-1 se resumen las propiedades de los distintos tipos de anti cuerpos en el hombre.

cadenas

cadena ligera com ponente secretor

cadena J

Figura 23-21 Diagrama altamente esquemtico de una molcula dimrica de IgA, la cual se presenta en las secreciones. Adems de los dos
monmeros de IgA, existe una nica cadena J y una cadena polipeptdica adicional denominada com p on en te secretor, el cual parece que protege las molcula de IgA de la digestin por las enzimas proteolticas de las secreciones.

Los anticuerpos pueden tener cadenas ligeras pero no de ambos tipos

oA .,

Adems de las cinco clases de cadenas pesadas, los vertebrados superiores tie nen dos tipos de cadenas ligeras, k y A ,, que pueden estar asociadas con cualFigura 23-22 Mecanismo de transporte de una molcula dimrica de IgA a travs de una clula epitelial.

FLUIDO EXTRACELULAR

fC
CLULA EPITELIAL

LUMEN

dm ero IgA

....

<

:
:/

com ponente secretor

...:
receptor Fe unido a m em brana

TRANSCITOSIS

i?
129 6 Captulo 23 : El sistema inmunitario

La molcula de IgA, as como la cadena J que contiene el dmero, se une a un receptor Fe transm embrana especializado de la superficie no luminal de la clula epitelial secretora. Los com plejos receptor-IgA son ingeridos por endocitosis mediada por receptor, transportados a travs del citoplasma de la clula epitelial en vesculas, y secretados en el lumen del lado opuesto de la clula por exocitosis. Cuando queda expuesto en el lumen, la parte del receptor Fe, que est unido al dmero de IgA (el co m p o n en te secretor), se escinde de su cola transm embrana, liberando as el anticuerpo, tal como se muestra en la Figura 23-21.

vescula secretora que contiene histamina

IgE

receptor Fe especfico de IgE

EL ANTGENO MULTIVALENTE FORMA ^ <~ ENLACES CRUZADOS ENTRE MOLCULAS DE IgE ADYACENTES

LIBERACIN DE HISTAMINA POR EXOCITOSIS

quiera de las cadenas pesadas. Una determinada molcula de anticuerpo contie ne siempre cadenas ligeras idnticas y cadenas pesadas idnticas; por consi guiente, sus dos lugares de unin al antgeno siempre son idnticos. Esta sim e tra es crucial para la funcin de formacin de enlaces cruzados que tienen los anticuerpos secretados. Por consiguiente, una molcula de IgG puede tener ca denas ligeras k o X pero no ambas a la vez. Por el momento no se han identifica do diferencias en la funcin biolgica de estos dos tipos de cadenas ligeras.

Figura 23-23 Funcin de las IgE en la secrecin de histamina por los mastocitos. Un mastocito (o un basfilo)
se une a las molculas de IgE despus de que hayan sido segregadas por las clulas B activadas; los anticuerpos IgE solubles se unen a las protenas receptoras Fe de la superficie celular del mastocito que reconoce especficamente la regin Fe de estos anticuerpos. Las molculas IgE adquiridas pasivamente por el mastocito sirven como receptores de superficie celular para el antgeno. As, a diferencia de las clulas B, cada mastocito (y basfilo) presenta un conjunto de anticuerpos de superficie celular con una gran variedad de centros de unin al antgeno. Cuando una molcula de antgeno se une a estos anticuerpos IgE unidos a membrana formando enlaces cruzados con los de las clulas cercanas, activa al mastocito a que libere histamina por exocitosis.

La intensidad de una interaccin antgeno-anticuerpo depende tanto del nmero de lugares de unin ocupados como de la afinidad de cada lugar de unin 10,15
La unin de un antgeno a un anticuerpo, al igual que la unin de un substrato a una enzima, es reversible. Est mediada por la suma de numerosas fuerzas nocovalentes, cada una de las cuales es relativamente dbil: enlaces hidrofbicos, fuerzas de van der Waals, interacciones inicas, etc. Estas fuerzas dbiles slo son eficaces cuando la molcula de antgeno est lo bastante cerca para permitir que alguno de sus tomos puedan encajar en los huecos complementarios exis tentes en la superficie del anticuerpo. Las regiones complementarias de una uni dad de anticuerpo de cuatro cadenas son sus dos lugares idnticos de unin al antgeno, mientras que la regin correspondiente del antgeno es un determi nante antignico (Figura 23-24). La mayora de las macromolculas antignicas presentan muchos determinantes antignicos diferentes; si dos o ms de ellos son idnticos (como sucede en un polmero con estructura repetitiva), se dice que el antgeno es multivalente (Figura 23-25).

UNION DE ALTA UNION DE BAJA AFINIDAD AFINIDAD determ inante antignico

Tabla 23-1 Propiedades de las clases principales de anticuerpos humanos Clase de anticuerpo Propiedades Cadenas pesadas Cadenas ligeras Nmero de unidades de cuatro cadenas Porcentaje respecto al total de Ig en sangre Activa el complemento Atraviesa la placenta Se une a macrfagos y neutrfilos Se une a mastocitos y basfilos IgM IgD
8 K O, K O ,

lugar de unin al antgeno de la molcula de anticuerpo

IgE e
KO X

cadena ligera

cadena pesada

IgG Y
KO X

IgA a
KO X

Figura23-24 Unin del antgeno al anticuerpo. Un determinante antignico

de una macromolcula interacciona con el lugar de unin del antgeno de dos molculas distintas de anticuerpo, una de alta afinidad y otra de baja afinidad. El determinante antignico se mantiene en el lugar de unin gracias a la accin de varias fuerzas dbiles, no covalentes y en el lugar de mayor adaptacin al antgeno posee una gran afinidad. Obsrvese que normalmente tanto las cadenas pesadas como las ligeras de la molcula de anticuerpo contribuyen al lugar de unin al antgeno.

1 <1
-

1
75
++ + + -

1o2
15
-

1 <1
+

10
++++

Propiedades funcionales de los anticuerpos

1297

La reaccin reversible de unin entre un antgeno con un nico determi nante antignico (indicado por Ag) y un anticuerpo con un nico lugar de unin al antgeno (indicado por Ab) se puede expresar de la siguiente manera: Ag + Ab ^ AgAb El punto de equilibrio depende de las concentraciones de Ag y de Ab y de la intensidad de su interaccin. Evidentemente, a medida que aumente la concen tracin de Ag mayor ser la fraccin de Ab que se asociar con l. Generalmente, la fuerza de la interaccin se expresa como la constante de afinidad (K J (vase Figura 3-9), donde * _ [AgAb] [Ag] [Ab]

m ltiples determ inantes antignicos diferentes (A)

(los corchetes indican la concentracin de cada com ponente en el equilibrio). La constante de afinidad, denominada a veces constante de asociacin, se puede determinar midiendo la concentracin de Ag libre necesaria para ocupar la mitad de los lugares de unin al antgeno del anticuerpo. Cuando estn ocu pados la mitad de estos lugares, [AgAb] = [Ab] y Ka - II [Ag]. Por lo tanto el valor inverso de esta concentracin de antgeno que produce la mitad de la unin m xima es igual a la constante de afinidad del anticuerpo por el antgeno. Los valo res habituales oscilan desde cifras tan bajas como 5 x 104 hasta cifras tan altas como 10 1 1 litros/mol. La constante de afinidad para la cual una molcula de inmunoglobulina deja de ser considerada como anticuerpo para un determinado antgeno, es algo arbitraria, pero es poco probable que un anticuerpo con una Ka inferior a 104 sea biolgicamente eficaz; adems, es poco probable que las clu las B que posean receptores de baja afinidad por un antgeno sean activadas por dicho antgeno. La afinidad de un anticuerpo para un antgeno determinante refleja la fuer za de la unin de una sola copia de un determinante antignico a un solo lugar de unin del antgeno, y es independiente del nmero de lugares de unin. Sin embargo, cuando un antgeno que transporta mltiples copias de un mismo de term inante antignico se com bina con un anticuerpo multivalente, la fuerza de dicha unin se increm enta notablem ente debido a que para que el antgeno y el anticuerpo puedan disociarse, se han de romper simultneamente todas las uniones antgeno-anticuerpo. As, una molcula caracterstica de IgG puede unirse a un antgeno multivalente con una fuerza de por lo menos 50-100 veces mayor si en lugar de participar un slo lugar de unin participan todos los luga res de unin al antgeno. La fuerza total de la unin de un anticuerpo multiva lente a un antgeno multivalente se designa como la avidez de la interaccin. Si la afinidad de los lugares de unin de una molcula de IgG y de IgM es la misma, la molcula de IgM (con 10 lugares de unin) tendr una avidez muy su perior por un antgeno multivalente que una molcula de IgG (que tiene dos lu gares). Esta diferencia de avidez, a menudo de 104 veces o ms, es importante debido a que generalmente los anticuerpos producidos en las primeras fases de una respuesta inmunitaria tienen afinidades muy inferiores a las que muestran los producidos ms tarde. (El aumento de la afinidad media de los anticuerpos producidos despus de un tiempo de la inmunizacin, denominado madura cin de la afinidad, se estudiar ms adelante.) Debido a su elevada avidez total, las IgM -la principal clase de Ig producida en las primeras fases de las respuestas inm unitarias- pueden actuar de forma eficaz a pesar de que cada uno de sus lu gares de unin presente una afinidad baja.

m ltiples determ inantes antignicos idnticos (un antgeno m ultivalente) (B)

Figura 23-25 Molculas con mltiples determinantes antignicos.
(A) Una protena globular con varios determinantes antignicos diferentes. Generalmente distintas regiones de una cadena polipeptdica pueden quedar juntas en la estructura plegada, formando cada uno de los determinantes antignicos de la superficie de la proteina. (B) Una estructura polimrica con muchos determiantes antignicos idn ticos ; una molcula de este tipo recibe el nombre de an tg en o m ultivalente.

La utilizacin del com plem ento por los anticuerpos contribuye a la lucha contra las infecciones bacterianas 16
El com plem ento, denominado as porque complementa y amplifica la accin de los anticuerpos, es una de las formas principales a travs de la cual los anticuer pos defienden a los vertebrados contra la mayora de las infecciones bacterianas.

1298

Captulo 23 : El sistema inmunitario

Los individuos que presentan alguna deficiencia en uno de los componentes centrales del complemento (denominado C3) estn sujetos a repetidas infeccio nes bacterianas, como si fueran individuos deficientes en anticuerpos. . El sistema de complemento consta aproximadamente de 20 protenas solu bles que principalmente se producen en el hgado y circulan por la sangre y por el fluido extracelular. La mayora de ellas son inactivas a menos que se activen a travs de una respuesta inmunitaria, o de forma ms directa por un microorga nismo invasor. La ltima consecuencia de la activacin del complemento es el ensam blaje de los denominados componentes tardos del complemento que for man grandes complejos proteicos, denominados complejos de ataque de m em brana, que producen perforaciones en la membrana de un microorganismo y pueden llegar a destruirlo. Una de las funciones principales del complemento es atacar la membrana de las clulas microbianas, por lo que su activacin se concentra sobre la m em brana celular microbiana, activada por los anticuerpos que estn unidos al m i croorganismo o por los polisacridos de la cubierta microbiana; ambos activan los componentes tempranos del complemento. Existen dos grupos de com ponen tes tempranos, que pertenecen a dos vas diferentes de activacin del com ple mento, la va clsica y la va alternativa. Los componentes tempranos de ambas vas actan localmente activando C3, el componente ms importante del com plemento, cuya fragmentacin provoca no slo el ensamblaje de los complejos de ataque de membrana sino tambin la seleccin de distintos tipos de glbulos blancos (Figura 23-26). Los com ponentes tempranos y C3 son proenzimas que se activan secuencialmente por escisin proteoltica limitada: la escisin de cada proenzima de la secuencia, activa el componente que genera una serina proteasa que escinde la siguiente proenzima de la secuencia, y as sucesivamente. Como que cada enzi ma activada escinde varias molculas de la siguiente proenzima de la cadena, la activacin de los com ponentes tempranos constituye una cascada proteoltica amplificada. As cada molcula activada al inicio de la secuencia provoca la pro duccin de varios com ponentes activos, incluyendo muchos complejos de ata que de membrana. Muchas de estas escisiones liberan un pequeo fragmento peptdico, y de este modo se expone en el fragmento mayor un lugar de unin a membrana, el cual se une estrecham ente a la membrana de la clula diana y ayuda a llevar a cabo la siguiente reaccin de la secuencia, provocando temporalmente la for macin de complejos de ataque de membrana. Esta forma de activacin del

unin del anticuerpo

polisacrido m icrobiano

Figura 23-26 Fases principales de la activacin del complemento por las vas clsica y alternativa. En ambas
vas, normalmente las reacciones de la activacin del com plem ento tienen lugar sobre la superficie del microorganismo invasor, com o por ejemplo una bacteria. C1-C9 y los factores B y D son los com ponentes reactivos del sistema de complemento; otros tipos de com ponentes (no se muestran en la figura) regulan el sistema. Los com p on en tes tem pran os estn sealados dentro de las fle c h a s grises, mientras que los com pon en tes tardos se hallan dentro de la fle c h a m arrn.

C1 C2

VIA CLSICA

C4

VA ALTERNATIVA

ESCISION DE C3

JB R I M I E N T O DE LOS O O R G A N IS M O S IN JC CI N DE LA OCI TO SIS

C5 C6 C7 C8 C9

SELECCIN DE LAS CLULAS INFLAMATORIAS

I /
\

T / iu

^ LISIS ^

' i '
1299

Propiedades funcionales de los anticuerpos

Figura 23-27 La compleja estructura de Cl. La unin de dos o mas

com plejo C1

m olcula de IgG

antgeno de unin de m em brana

com plem ento est confinada principalmente a la zona de la superficie celular donde ha comenzado. El fragmento mayor de C3 se denomina C3b. ste se une de forma covalente a la superficie de una clula diana. Una vez all no slo acta como una proteasa que cataliza las etapas siguientes de la cascada del comple mento sino que tam bin es reconocido por protenas receptoras especficas de los macrfagos y de los neutrfilos que increm entan la capacidad de dichas c lulas para fagocitar la clula diana. El fragmento ms pequeo de C3 (denomi nado C3a) acta independientemente como una seal difusible que provoca una respuesta inflamatoria, estimulando a los glbulos blancos de la sangre a migrar hacia el foco de la infeccin. Generalmente la va clsica se activa por agregados de anticuerpos IgG o IgM unidos a los antgenos de la superficie de un microorganismo. La primera etapa de esta va queda ilustrada en la Figura 23-27. Por el contrario, la va alter nativa se activa mediante los polisacridos de la cubierta celular de los microor ganismos, incluso en ausencia de anticuerpos, aunque la activacin de la va cl sica tam bin activa la va alternativa mediante una retroalimentacin positiva. Por consiguiente, la va alternativa proporciona una primera lnea de defensa contra la infeccin, antes de que la respuesta inmunitaria pueda ponerse en marcha, y una vez la respuesta inmunolgica ha empezado tambin amplifica los efectos de la va clsica. Las molculas de mem brana C3b inmovilizadas, producidas tanto por la va clsica como por la alternativa desencadenan una cascada posterior de reaccio nes que provocan el ensam blaje de los com plejos de ataque de m em brana a partir de los ltimos com ponentes (Figura 23-28). Dichos complejos se forman en la m em brana cerca del lugar de activacin de C3; en las electronmicrografas teidas negativamente tienen un aspecto caracterstico. En estas micrografas se

molculas de IgG (o una molcula pentamrica de IgM; no se muestra) a la superficie de un microorganismo capacita a sus regiones Fe para unirse al primer com ponente de la va clsica, C l, que es un gran com plejo integrado por tres subcom ponentes -C lq , C lr y C ls. Cuando C lq se une a los complejos antgeno-anticuerpo, activa a Clr, que adquiere actividad proteoltica, rompiendo C ls e iniciando as la cascada proteoltica. Obsrvese que C lq est integrado por seis subunidades idnticas, cada una de ellas con una cabeza globular (que lo une al anticuerpo) y una cola similar a la colgena.

Figura 23-28 Ensamblaje de los componentes tardos del complemento, formando el complejo de ataque de membrana. Cuando se
produce C3b tanto por la va clsica como por la va alternativa, queda inmovilizado sobre la membrana, donde provoca la escisin de una protena del com plemento denominada C5 produciendo C5a (no se muestra en la figura) y C5b. C5b permanece unido de forma laxa a C3b (no se muestra en la figura) y se ensambla rpidamente con C 6 y C7 formando C567, que se une entonces firmemente a la membrana va C7, tal como se ilustra en la figura. Este complejo aade una molcula de C8 formando C5678. La unin de una molcula de C9 a C5678 induce un cambio conform acional en C9 que expone una regin hidrofbica, insertndose en la bicapa lipdica de la clula diana, prxima a C8 . Esto inicia una reaccin en cadena en la que C9 alterado se une a una segunda molcula de C9, la cual sufre un cambio de conform acin y se inserta en la bicapa; a su vez, esta molcula puede unir otra molcula de C9, etc. De esta manera por cada molcula de C9 se forma un gran canal transmembrana.

m em brana plasmtica

1300

Captulo 23 : El sistema inmunitario

puede observar cmo forman poros acuosos a travs de la membrana (Figura 2329). Por esta razn, y debido a que perturban la estructura de la bicapa lipdica en sus proximidades, hacen agujeros en la membrana. Las molculas pequeas salen o entran de la clula a travs de estos complejos mientras que las macromolculas permanecen en el interior, de forma que se interrumpe el mecanismo normal de la clula para controlar el balance de agua. Por consiguiente, el agua penetra en el interior de las clulas por smosis, causando su hinchamiento y ex plosin. El proceso es tan eficiente que un pequeo nmero de complejos de ataque de membrana (quizs uno slo) puede matar un glbulo rojo. Incluso un virus con cubierta, que no presenta un gradiente de presin osmtica grande a travs de su membrana y no es susceptible por tanto a esta lisis osmtica, puede ser destruido por estos complejos, posiblemente debido a que estos complejos de ataque desorganizan la membrana vrica. Las propiedades destructoras autoamplificantes de la cascada del comple mento hacen necesario que los componentes clave activados sean rpidamente inactivados despus de haber sido generados, para evitar que el ataque se extien da a las clulas del husped que se hallen en las proximidades. La desactivacin se consigue por lo menos de dos maneras. En primer lugar, en la sangre existen unas protenas inhibidoras especficas que finalizan la cascada, bien fijando o bien escindiendo ciertos componentes cuando se han activado por escisin pro teoltica. En segundo lugar, muchos de los componentes activados de la cascada son inestables; a menos que se unan inmediatamente a un componente apropia do de la cadena o a una membrana prxima, son inactivados rpidamente.

Figura 23 -29 Electronmicrografas

de lesiones de la membrana plasmtica de un glbulo rojo, obtenidas con tincin negativa. La

lesin en (A) est vista d e fren te mientras que en (B) est vista de lado, como si fuera un canal transmembrana. El colorante negativo llena el canal, por lo que aparece de color negro. (De R. Dourmashkin, Im m u n olog y 35:205-212, 1978.)

Resumen
Una molcula de anticuerpo tpica es una protena en form a de Y con dos lugares idnticos de unin al antgeno en los extremos de los brazos de la Y (las regiones Fab) y diversos lugares de unin para los componentes del complemento y/o para varios receptores de superficie celular, en el pie de la Y (regin Fe). Los anticuerpos defienden a los vertebrados de la infeccin, inactivando virus y toxinas bacterianas y reclutando complemento y diversas clulas para matar e ingerir a los microorga nismos invasores. Cada clon de clulas B produce molculas de anticuerpo con un nico tipo de lugar de unin al antgeno. Inicialmente, las molculas se insertan en la membra na plasmtica, donde actan como receptores para el antgeno. La unin del ant geno a dichos receptores activa determinadas clulas B (habitualmente con la ayu da de las clulas T colaboradoras) para multiplicarse y madurar, convirtindose en clulas con memoria o en clulas secretoras de anticuerpo, las cuales secretan anti cuerpos cuyo lugar de unin al antgeno es igual al que tenan los anticuerpos uni dos a la membrana de las clulas B. Cada molcula de anticuerpo consta de dos cadenas pesadas idnticas y dos cadenas ligeras idnticas. Tpicamente, los lugares de unin al antgeno estn fo r mados por parte de ambos tipos de cadenas, pesadas y ligeras. Existen cinco clases de anticuerpos (IgA, IgD, IgE, IgG e IgM), cada uno de los cuales tiene una cadena pesada caracterstica (a, 8, X., y y jjl, respectivamente). Las cadenas pesadas tam bin form an la regin Fe del anticuerpo, la cual determina a qu protenas se unir el anticuerpo y, por consiguiente, cules sern as propiedades biolgicas de cada clase de anticuerpo. Cualquiera de los dos tipos de cadena ligera (k o k) puede aso ciarse con cualquier clase de cadena pesada. Sin embargo, parece que el tipo de ca dena ligera no tiene influencia sobre las propiedades del anticuerpo. El sistema del complemento coopera con los anticuerpos defendiendo a los ver tebrados de las infecciones. Los componentes tempranos son proenzimas que circu lan por la sangre y se activan secuencialmente en una serie amplificada ele reaccio nes proteolticas limitadas. El componente ms importante del complemento es la protena C3 que se activa por escisin proteoltica y se une a la membrana de una clula microbiana, donde colabora en la iniciacin del ensamblaje local de los componentes tardos del complemento y en la induccin de la fagocitosis de la clu
Propiedades funcionales de los anticuerpos 1301

la microbiana. Los componentes tardos constituyen grandes complejos de ataque de membrana en la membrana de la clula microbiana y de este modo destruyen el microorganismo invasor.

La estructura fina de los anticuerpos

Existen tantas formas diferentes de anticuerpos, que cada uno de ellos constitu ye una mnima fraccin de las molculas de Ig de la sangre de un individuo no inmunizado. Este hecho coloc a los bioqumicos frente a un difcil problema, nico en qumica de protenas: cmo obtener suficiente cantidad de cada una de las molculas de anticuerpo para determinar su secuencia de aminocidos y su estructura tridimensional. El problema se resolvi gracias al descubrimiento de que las clulas de un tipo de cncer, conocido como mielom a mltiple (dado que se desarrollan ml tiples tumores en la mdula sea, o tejidos mieloides), secretan a la sangre del paciente grandes cantidades de una nica especie de anticuerpo. El anticuerpo es homogneo, o monoclonal, ya que el cncer suele empezar con el crecim ien to incontrolado de una sola clula , y en el mieloma mltiple esta clula es una clula plasmtica secretora de anticuerpos. El anticuerpo, que se acumula en la sangre, recibe el nom bre de protena del mieloma. La estructura detallada de los anticuerpos fue establecida inicialmente con el estudio de las protenas de mieloma presentes en la orina y en la sangre de es tos pacientes, o de ratones a los que se les haba inducido experimentalmente un tumor similar al del mieloma mltiple. Posteriormente ha sido posible conse guir clulas B secretoras de anticuerpo inmortales, al fusionarlas con clulas de mieloma no secretoras de anticuerpo. Los hibridomas resultantes proporcionan una fuente rpida de anticuerpos monoclonales, que pueden ser producidos en cantidades ilimitadas contra cualquier antgeno deseado, tal como se vio en el Captulo 4. En la actualidad pueden producirse cantidades ilimitadas de anti cuerpos homogneos mediante la tecnologa del DNA recombinante.

Las cadenas ligeras y las cadenas pesadas presentan regiones constantes y regiones variables 10,13
La comparacin de las secuencias de aminocidos de distintas protenas de m ie loma revel un rasgo notable de importantes implicaciones genticas. Tanto las cadenas pesadas como las cadenas ligeras tienen una secuencia variable en su ex tremo amino terminal y una secuencia constante en su extremo carboxilo termi nal. Por ejemplo, al comparar las secuencias de aminocidos de muchas cadenas k diferentes de mieloma se observa que las mitades carboxilo terminales o son iguales o slo muestran pequeas diferencias, mientras que las mitades amino terminales son com pletam ente diferentes. Por consiguiente, las cadenas ligeras tienen una regin constante de aproximadamente 110 aminocidos de longitud y una regin variable del mismo tamao. La regin variable de las cadenas pe sadas (en su extremo amino terminal) tambin tiene unos 110 aminocidos de longitud, mientras que la regin constante tiene unos 330 o 440 aminocidos, dependiendo de la clase de inmunoglobulina de que se trate (Figura 23-30).

CADENA LIGERA
regin variable regin constante (tipo k o tip o
X)

H tN I

I ----------------I I

Figura 23-30 Zonas variables y constantes de las cadenas de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras
y las cadenas pesadas de una molcula de Ig tienen distintas regiones constantes y variables.

1 COOH I .........

CADENA PESADA H oN -l
regin variable

i __________ i[ ________________________________i
regin constante (tipos a ,5 ,e , y o

130 2

Captulo 23 : El sistema inmunitario

regin variable de la cadena pesada

regiones hipervariables de la cadena pesada

regin variable cadena ligera

Figura 23-31 Regiones hipervariables del anticuerpo. Dibujo altamente esquemtico que ilustra cmo las tres regiones hipervariables de cada cadena ligera y pesada forman, en conjunto, el lugar de unin al antgeno de una molcula de anticuerpo. A veces a las regiones hipervariables se les denomina regiones determinantes de la complementariedad. La estructura tridimensional real de un lugar de unin al antgeno se muestra en la Figura 23-35.

Los extremos amino terminales de las cadenas ligeras y de las cadenas pesa das son los que se unen entre s formando el lugar de unin al antgeno (vase Figura 23-17), y la variabilidad de sus secuencias de aminocidos constituye la base estructural de la diversidad de estos lugares de unin. La existencia de las regiones variable y constante en las molculas de anticuerpo plantea importan tes cuestiones genticas que consideraremos ms adelante. Antes de que fuera posible investigar directamente estas cuestiones genticas, los estudios estruc turales de las protenas de mieloma revelaron otros rasgos importantes de la es tructura de los anticuerpos.

Las cadenas ligeras y las cadenas pesadas contienen tres regiones hipervariables cada una, que en conjunto forman el lugar de unin al antgeno 17
El estudio detallado de las secuencias de aminocidos de una gran diversidad de cadenas Ig muestra que la variabilidad de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas est restringida en su mayor parte a tres pequeas regiones h i pervariables de cada cadena. Las restantes zonas de la regin variable, conoci das como regiones de armazn , son relativamente constantes. Estos hallazgos condujeron a la prediccin de que el lugar de unin al antgeno est formado por tan slo los 5 a 10 aminocidos de cada regin hipervariable (Figura 23-31). Dicha prediccin se confirm ms tarde gracias a estudios mediante difraccin de rayos X de las molculas de anticuerpo (vase ms adelante). En relacin con el tamao del lugar de unin al antgeno de una molcula de anticuerpo, gene ralmente el determinante antignico que es reconocido de forma especfica por un anticuerpo es comparativamente ms pequeo: por ejemplo puede ser de menos de unos 25 residuos de aminocido de una protena globular de superfi cie (vase Figura 23-35) y puede llegar a ser tan pequeo como un grupo dinitrofenol (vase Figura 23-7).

Las cadenas ligeras y las cadenas pesadas estn plegadas en dominios repetitivos similares 10,18
Tanto las cadenas ligeras como las cadenas pesadas estn formadas por seg mentos repetitivos -cad a uno de ellos de una longitud de unos 110 aminocidos y con enlaces disulfuro entre cistenas de la misma cadena- que se pliegan inde pendientemente formando unidades funcionales compactas, o dominios. Como muestra la Figura 23-32, una cadena ligera consta de un dominio variable (VL )y otro constante (CL ), en cambio la mayora de las cadenas pesadas constan de un dominio variable (VH ) y tres dominios constantes (Cl, C 2 y C,,3). (Tanto las ca denas n como las cadenas e tienen un dominio variable y cuatro constantes.) Los dominios variables son los responsables de la unin al antgeno, mientras que

La estructura fina de los anticuerpos

1303

los dominios constantes de las cadenas pesadas (excepto el CH 1) forman la re gin Fe, la cual determina las dems propiedades biolgicas del anticuerpo. La similitud existente entre los diferentes dominios sugiere que probable mente las cadenas de Ig surgieron durante la evolucin gracias a una serie de duplicaciones gnicas, empezando con un gen primordial que codificaba un do minio de 110 aminocidos de funcin desconocida. Esta hiptesis se ve confir mada por el descubrimiento de que cada dominio de la regin constante de una cadena pesada est codificado por una secuencia codificadora aislada (exn) (Figura 23-33).

Figura 23-32 Dominios de la inmunoglobulina. Las cadenas ligeras y las cadenas pesadas de una molcula de Ig estn plegadas en dominios repetitivos, que son parecidos entre s. Las zonas variables (en azul) de las cadenas ligeras y de las cadenas pesadas (VLy VH ) forman los lugares de unin al antgeno, mientras que los dominos constantes de las cadenas pesadas (principalmente CH 2 y CH 3) determinan las otras propiedades biolgicas de la molcula. Las cadenas pesadas de los anticuerpos IgM e IgE tienel un domino constante adicional (Ch4). Las interacciones hidrofbicas entre los dominios de cadenas Ig adyacentes juegan un papel importante en mantener juntas las cadenas en la molcula de Ig: por ejemplo, CLse une a CH 1 y los dominios CH 3 se unen entre s.

Estudios por difraccin de rayos X han revelado la estructura tridim ensional de los dominios de las Ig y de sus lugares de unin al antgeno 19
Aunque se conozca la secuencia completa de aminocidos de una gran protena, no es posible todava deducir su estructura tridimensional; generalmente hay que realizar estudios por difraccin de rayos X sobre protenas cristalizadas. Se han cristalizado varios fragmentos tanto de protena de mieloma como de anti cuerpos, as como de una molcula intacta de IgG, y los estudios sobre su estruc tura por rayos X han confirmado las predicciones de los inmunoqumicos. Lo

secuencias codificantes Ch3 intrn intrn TRANSCRIPCIN RNA MADURACION DEL RNA POR CORTE Y EMPALME ChI bisagra C2 CH3 TRADUCCIN Ch I bisagra Ch 2 Ch 3 H2N regin constante de la cadena pesada
130 4 Captulo 23 : El sistema inmunitario

DNA

mRNA

COOH

Figura 23-33 Organizacin de las secuencias de DNA que codifican la regin constante de una cadena pesada de Ig. Las secuencias codificantes (exones) de cada dominio y de la regin bisagra estn separadas por secuencias no codificantes (intrones). Las secuencias intrnicas se eliminan mediante la maduracin de los transcritos primarios de RNA, que da lugar al mRNA. Se cree que la presencia de intrones en la secuencia de DNA puede haber facilitado las duplicaciones accidentales de segmentos de DNA que, en el transcurso de la evolucin, han dado lugar a los genes de los anticuerpos (se discute en el Captulo 8). Las secuencias de DNA y de RNA que codifican la regin variable de la cadena pesada no se muestran en la figura.

dom inio VL

dom inio VH

dom inio C L

(A)

\ cadenas ligeras

2 nm

Figura 23-34 La estructura plegada de una molcula de anticuerpo IgG, basada en estudios de cristalografa por rayos X. (A) Cada residuo de aminocido de la protena se ha dibujado como una pequea esfera. Una de las cadenas pesadas se ha dibujado en azul claro y la otra en azul oscuro, con los dominios de las cadenas ligeras en amarillo. Todas las molculas de anticuerpo estn glucosiladas: la cadena de oligosacridos unida a la regin C(I2 est representada en rojo. (B) Configuracin de la cadena polipeptdica de una cadena ligera. Las regiones varible y constante estn formadas por dos lminas (3-una con tres hebras (verde) y otra con cuatro (amarillo). Las lminas estn unidas por un enlace disulfuro (negro). Todas las regiones hipervariables (rojo) forman bucles en el extremo distal del dominio variable, donde forman el lugar de unin al antgeno. (A, segn E.W. Silverton, M.A. Navia y D.R. Davies, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:5140, 1977; B, segn M. Schiffer, R.L. Girling, K.R. ElyyA.B. Edmundson, Biochemistry 12:4620,1973. Copyright 1973 American Chemical Society.)

d o m in io va riable (VL)

d o m in io constante (CL)

que todava es ms importante, estos estudios han revelado la forma en que es tn construidos millones de lugares diferentes de unin al antgeno, siguiendo un patrn estructural comn. Tal como se ilustra en la Figura 23-34, cada dominio de las Ig tienen estruc turas tridimensionales muy similares, basadas en lo que ahora se denomina el plegamiento de las inmunoglobulinas. A grandes rasgos, cada dominio es un cilindro (de 4 x 2,5 x 2,5 nm) compuesto por un bocadillo de dos capas protei cas extendidas: una capa contiene tres hebras de cadena polipeptdica mientras que la otra contiene cuatro hebras. En cada capa las hebras adyacentes son anti paralelas y forman una lmina (3. Las dos capas son ms o menos paralelas y es tn conectadas entre s por un nico enlace disulfuro intracatenario. Veremos ms adelante que muchas otras protenas de la superficie de los linfocitos y de otras clulas, muchas de las cuales actan como molculas de adhesin clulaclula (estudiadas en el Captulo 19) contienen dominios similares y por tanto son miembros de un amplio nmero de protenas de la superfamilia de las in

munoglobulinas.
Los dominios variables de las molculas de Ig presentan la caracterstica propia de tener su conjunto particular de tres regiones hipervariables, que se disponen en tres bucles hipervariables (vase Figura 23-34B). Tal como se haba predicho, los bucles hipervariables de los dominios variables ligero y pesado es tn agrupados formando un lugar de unin al antgeno. Un principio importan te que se deduce de estos estudios es que la regin variable de una molcula de anticuerpo consta de una estructura rgida altamente conservada, con unos bu cles hipervariables unidos entre s en uno de los extremos. Por consiguiente, es posible generar una enorme diversidad de lugares de unin al antgeno cam-

La estructura fina de los anticuerpos

1305

Figura 23-35 Estructura tridimensional de un complejo antgeno-anticuerpo, determ inada por anlisis de difraccin de rayos X. El antgeno proteico, que es la enzima lisozima, se muestra en verde. El lugar de unin al antgeno del fragmento Fab del anticuerpo est formado por la cadena ligera (en a m a r illo ) y la cadena pesada (en azul). Unos 20 residuos de aminocido del lugar de unin estn en contacto con un nmero similar de residuos de la superficie de la lisozima. En (B) se han separado el antgeno y el anticuerpo para mostrar sus superficies de contacto complementarias. La porcin de antgeno protuberante de la superficie com plementaria (en rojo) es un residuo de glutamina. En (C) las molculas separadas han sufrido una rotacin de unos 90 grados alrededor del eje vertical (A) para mostrar las superficies que interactan; las cadenas laterales de aminocidos que interactan se muestran en rojo, con la glutamina protuberante en rosa. En otras molculas de anticuerpo que han sido estudiadas de esta forma, el lugar de unin al antgeno (para un determinante antignico pequeo) est formado por una hendidura mucho ms profunda. (De A. Amit, R. Mariuzza, S. Phillips, y R. Poljak, Science 233:747-753, 1986. Copyright 1986 por AAAS.)

biando slo la longitud y la secuencia de aminocidos de los bucles hipervariables, sin alterar la estructura tridimensional global necesaria para la funcin del anticuerpo. El anlisis por rayos X de cristales de fragmentos de anticuerpo unidos a un antgeno o a un determinante antignico ha revelado con exactitud de qu for ma cooperan, en determinados casos, los bucles hipervariables de los dominios variables ligero y pesado entre s formando la superficie de unin al antgeno (Figura 23-35). Las dimensiones y la forma de cada lugar diferente varan segn la conform acin de la cadena polipeptdica de los bucles hipervariables la cual, a su vez, viene determinada por la secuencia de aminocidos de las cadenas la-

1306

Captulo 23 : El sistema inmunitario

terales de los bucles. La forma de los lugares de unin varan mucho dependiendo del anticuerpo -desde hendiduras, hasta surcos que se adaptan a las superficies ondulantes, e incluso protuberancias. Los ligandos ms pequeos tienden a unir se a depresiones poco profundas, mientras que los ms grandes tienden a unirse a superficies ms accidentadas. Adems, los lugares de unin pueden alterar su for ma para que la unin con el antgeno pueda encontrar mejor al ligando. As pues, en la actualidad los principios generales de la estructura de los anticuerpos estn claros.

Resumen
Cada inmunoglobulina ligera y pesada consta de una regin variable de unos 110 residuos de aminocidos en su extremo amino terminal y de una regin constante, que en la cadena ligera es del mismo tamao que la regin variable y en la cadena pesada es tres o cuatro veces mayor. Cada cadena estformada por dominios repeti tivos, plegados deforma similar: una cadena ligera tienen una regin variable (VL )y una regin constante (CL ), mientras que las cadenas pesadas tienen una regin va riable (VH ) y tres o cuatro regiones constantes (CH ). La variacin de la secuencia de aminocidos en las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas est restringi da fundamentalmente a varias pequeas regiones hipervariables; forman bucles que sobresalen de la superficie y se juntan formando el lugar de unin al antgeno.

La generacin de la diversidad de los anticuerpos

Se estima que el hombre puede producir por lo menos 10 15 molculas de anti cuerpo diferentes -su repertorio preinmunitario de anticuerpos incluso en ausen cia de estimulacin por antgenos. Los lugares de unin al antgeno de muchos anticuerpos pueden presentar reaccin cruzada con varios determinantes antignicos relacionados entre s pero diferentes, y por lo que parece el repertorio preinmunitario es lo suficientemente amplio como para asegurar que siempre haya un lugar de unin a antgeno que encaje con un determinante antignico potencial cualquiera, aunque esta unin sea de baja afinidad. Los anticuerpos son protenas, y las protenas estn codificadas por genes. Por consiguiente, la diversidad de los anticuerpos plantea un problema gentico particular: cmo puede un animal producir ms anticuerpos que genes hay en su genoma? (Se cree que el genoma humano, por ejemplo, contiene menos de 105 genes.) Este problema no es tan formidable como podra parecer a primera vista. Debido a que las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas contri buyen al lugar de unin al antgeno, un animal con 1000 genes que codifiquen cadenas ligeras y 1000 genes que codifiquen cadenas pesadas podran combinar sus productos de 1000 x 1000 maneras diferentes formando 106lugares de unin distintos (asumiendo que cualquier cadena ligera puede combinarse con cual quier cadena pesada formando un lugar de unin al antgeno). Sin embargo, el sistema inmunitario de los mamferos ha desarrollado mecanismos genticos nicos que lo capacitan para generar un nmero casi ilimitado de cadenas lige ras y de cadenas pesadas diferentes de una forma altamente econmica, fusio nando segmentos gnicos separados antes de que sean transcritos. Las aves y los peces utilizan estrategias muy diferentes para diversificar los anticuerpos, pero centraremos nuestra discusin en los mecanismos que utilizan los mamferos.

Durante el desarrollo de las clulas B, los genes de los anticuerpos se ensamblan a partir de segmentos gnicos aislados20
La primera evidencia directa de que el DNA se reordena durante el desarrollo de las clulas B procede de experimentos realizados en 1976, en los cuales se compa r el DNA de embriones tempranos de ratn que no producen anticuerpos, con el DNA de una lnea celular de mieloma de ratn que s los produce. Los experimenLa generacin de la diversidad de los anticuerpos

1307

clula de m ielom a de ratn que produce cadenas ligeras especficas

clula de em brin de ratn no productora de Ig

Figura 23-36 Experimento que demostr directamente la reordenacin del DNA durante el desarrollo de la clula B. Las dos sondas radiactivas utilizadas eran especficas de las secuencias de DNA codificantes de la regin C y de la regin V de la cadena ligera del mieloma.

secuencias codificantes de las regiones V y C en un m ism o fragm ento

V :

secuencia codificante de la regin C las secuencias codificantes de las regiones V y C estn en fragm entos secuencia diferentes codificante de la regin V

tos mostraron que las secuencias codificantes especficas de la regin variable (V) y de la regin constante (C) utilizadas por las clulas del mieloma estaban presen tes en el mismo fragmento de restriccin de DNA en las clulas de mieloma pero no en dos fragmentos de restriccin distintos de los embriones, lo cual demostraba que las secuencias de DNA que codifican una molcula de anticuerpo se reordenan en alguna fase de la diferenciacin de las clulas B (Figura 23-36). Actualmente se sabe que existe un acervo diferente de segmentos gnicos para cada uno de los tipos de cadenas de Ig -cad enas ligeras k , cadenas ligeras X y cadenas pesadas - a partir del cual se sintetiza una nica cadena polipeptdica. Cada acervo se halla en un crom osom a diferente y norm almente contiene un gran nmero de segmentos gnicos codificantes de la regin V de una cadena de Ig y un m enor nmero de segmentos gnicos codificantes de la regin C. Du rante el desarrollo de la clula B, para cada una de las dos cadenas de Ig a sinte tizar se ensam bla una secuencia codificante com pleta por recom binacin espe cfica de lugar (se estudia en el Captulo 6), juntando la secuencia codificante de la regin V con la secuencia codificante de la regin C. Adems de reunir los segmentos gnicos individuales del gen que codifica un anticuerpo, estas reor denaciones tam bin activan la transcripcin a partir del gen promotor mediante cambios en las posiciones relativas de las secuencias activadoras y silenciadoras que actan sobre el promotor. As, una cadena completa de Ig slo puede sinte tizarse despus de que haya ocurrido una reordenacin gnica. Como veremos, el proceso de reunin de los segmentos gnicos contribuye a la diversidad de los lugares de unin al antgeno de varias maneras.

Cada regin V est codificada por ms de un segmento gnico 21

Cuando se analizaron las secuencias de DNA genmico que codifican las regio nes V y C, se encontr que la regin C est codificada por un solo segmento g-

130 8

Captulo 23 : El sistema inmunitario

regiones del DNA que se van a unir

&

DNA de la lnea germ inal

............ .. .......... i

VI

V2

V3

J1 J2 J3 J4
REORDENACION DEL DNA DURANTE LA DIFERENCIACIN DE LA CLULA B

DNA de la clula B ..

VI

V2

V3

J3 J4

TRANSCRIPCION 5' transcrito de RNA

V 3 \\ J3 J4

MADURACION DEL RNA 5' 3'

mRNA

V3 J3 C
TRADUCCION

NH2 cadena ligera I

V3 J3 C

COOH 1

Figura 23-37 Proceso de unin V-J que participa en la produccin de una cadena ligera k en el ratn. En el DNA de la lnea germinal (en la que los genes de las inmunoglobulinas no se expresan y por consiguiente no se reordenan), el grupo de los cuatro segmentos gnicos /est separado del segmento gnico C por un corto intrn, y separado de los aproximadamente 300 segmentos gnicos V , por varios pares de nucletidos. Durante el desarrollo de la clula B, el segmento gnico Velegido {V3 en este caso) se desplaza quedando exactamente junto a uno de los segmentos gnicos J (J3 en este caso). El gen/extra (J4) y la secuencia intrnica se transcriben (junto con los segmentos gnicos unidos V 3, J3yQy luego son eliminados durante la maduracin del RNA, generando molculas de mRNA en 3, J3yC son las cuales las secuencias V contiguas. Luego, estos mRNA se traducen a cadenas ligeras k . Un segmento gnico /codifica unos 15 aminocidos del extremo carboxilo terminal de la regin V , y la unin de los segmentos V-J coincide con la tercera regin hipervariable de la cadena ligera. Figura 23-38 El conjunto de segmentos gnicos de la cadena pesada en el ratn. Se cree que el ratn contiene entre 100 y 1000 segmentos V , al menos 12 segmentos D, 4 segmentos /y un grupo ordenado de segmentos C, cada uno de de los cuales codifica una clase diferente de cadenas pesadas. El segmento D codifica los aminocidos de la tercera regin hipervariable de la regin V, que forma parte del segmento /. La figura no ha sido dibujada a escala. Por ejemplo, los segmentos gnicos J1 y Ca se hallan separados por unos 200 000 pares de nucletidos. Adems se han omitido muchos detalles: por ejemplo, existen 2 a, cuatro segmentos gnicos Cy (Cy / , Cy C y2by Cy 3 ); cada segmento gnico C est compuesto por mltiples exones (vese Figura 23-33); y los segmentos gnicos V H estn agrupados en el cromosoma en conjuntos de familias homlogas. Los mecanismos genticos implicados en la produccin de una cadena pesada son los mismos que los que se muestran en la Figura 23-37 para las cadenas ligeras, con la excepcin de que en este caso se necesitan dos etapas en la reordenacin del DNA en lugar de una: primero, un segmento D se une a un segmento /, y luego un segmento Vse une a los segmentos D/reordenados.

nico C de una cadena Ig, mientras que cada una de las regiones V estn codifica das por uno o dos segmentos gnicos. Cada una de las regiones V de una cadena ligera est codificada por una secuencia de DNA ensamblada a partir de dos fragmentos gnicos -u n segmento gnico V largo y un segmento de unin corto, o segmento gnico / (no confundir con la protena cadena J, vase Figura 23-19), codificado en otro lugar del genoma. La Figura 23-37 ilustra los mecanismos ge nticos que participan en la produccin de un polipptido de una cadena ligera intacta a partir de segmentos gnicos V,JyC separados. Cada regin V de una cadena pesada est codificada por una secuencia de DNA ensamblada a partir de tres segmentos gnicos -u n segmento V , un seg mento / y un segmento de diversidad o segmento gnico D. La Figura 23-38 muestra la organizacin de los segmentos gnicos implicados en la produccin de cadenas pesadas. El elevado nmero de segmentos gnicos V, J y D heredados que son disponi bles para la codificacin de las cadenas de Ig contribuye substancialmente por s mismo a la diversidad de los anticuerpos, pero la unin combinatoria de estos segmentos (denominada diversificacin combinatoria) aumenta ampliamente esta contribucin. Por ejemplo, cualquiera de los aproximadamente 300 segmen tos V del acervo de segmentos gnicos de la cadena ligera k que existen en el ra tn, puede unirse a cualquiera de los 4 segmentos / (vase Figura 23-37), de for ma que a partir de este acervo se pueden formar al menos 1200 (300 x 4) regiones V diferentes de cadena k. De forma similar, cualquiera de los aproximadamente

VI

V2

Vn

DNA de la lnea germ inal

D1D2 Dn '^ t V

J 1 J4

Cji

Cy

Cg

Co

La generacin de la diversidad de los anticuerpos

1309

500 segmentos V del acervo de la cadena pesada que existen en el ratn puede unirse a cualquiera de los 4 segmentos / y a cualquiera de los, al menos, 12 seg mentos D, para codificar como mnimo 24 000 (500 x 4 x 12) regiones V diferentes de cadena pesada. stas son slo estimaciones aproximadas ya que no se conoce el nmero exacto de segmentos gnicos Vque existen en estos acervos. La diversificacin com binatoria resultante del ensam blaje, en diferentes com binaciones, de los segm entos gnicos V, J y D heredados, que acabamos de ver, constituye un importante m ecanism o de diversificacin de los lugares de unin al antgeno de los anticuerpos. Se estima que nicamente mediante este mecanismo, un ratn podra producir al menos 1000 regiones VL diferentes y del orden de 25 000 regiones VHdiferentes. Estas regiones podran luego com binarse entre s produciendo 25 x 106 lugares diferentes de unin al antgeno. Adems, como veremos ahora, el propio mecanismo de unin tambin aumenta ampliamente este nmero de posibilidades (probablemente en ms de 108 ve ces), hacindolo mayor que el nmero total de clulas B de un ratn (alrededor d e 5 x 108).

La unin im precisa de los segmentos gnicos aumenta la diversidad de las regiones V 21,22
Todava no se conoce con detalle el mecanismo por el cual segmentos gnicos que pueden estar alejados entre s cientos de miles de bases de nucletidos, se unen formando una secuencia codificante funcional de la regin VL o VH . Cada segmento gnico est flanqueado por secuencias de DNA conservadas, que su puestamente actan com o centros de reconocim iento para un sistema de re com binacin especfica de lugar, de forma que se asegura que slo se recombinen los segmentos gnicos adecuados. As, por ejemplo, un segmento V siempre se unir a un segmento / o D y no a otro segmento V. Parece que dos genes estre cham ente ligados, denominados rag-1 y rag-2 (de Recombination Activating Ge nes, genes activadores de recombinacin) codifican las protenas especficas de los linfocitos del sistema de recombinacin V(D)J. As, si se transfecta un fibro blasto con ambos tipos de genes, se puede conseguir experimentalmente una reordenacin de segmentos gnicos Ig introducidos, lo suficiente para que la c lula B se desarrolle normalmente. Adems, los ratones transgnicos que son de ficientes en ambos genes son incapaces de iniciar reordenaciones V(D)J y en consecuencia no poseen ni clulas B ni clulas T funcionales. (Las clulas T utili zan una reordenacin similar para ensamblar los genes que codifican sus recep tores especficos de antgenos.) En la mayora de los casos de recom binacin especfica de lugar, la unin del DNA es precisa, pero durante la unin de los segmentos gnicos del anti cuerpo (y del receptor de la clula T), a menudo se pierde un nmero variable de nucletidos de los extremos de los segmentos de recom binacin y, en el caso de la cadena pesada, se pueden insertar uno o ms nucletidos, elegidos de for ma aleatoria. Esta prdida y ganancia de nucletidos en los sitios de unin [de nominada diversificacin de em palm e (junctional diversification)] aumenta enorm em ente la diversidad de las secuencias codificantes de la regin V creadas por recom binacin, especficam ente en la tercera regin hipervariable. En este caso, el increm ento de la diversificacin cuesta un precio ya que, en muchas ocasiones, producir un corrimiento de la pauta de lectura de forma que se pro ducir un gen no funcional; habitualmente, en el desarrollo de las clulas B se producen uniones improductivas de este tipo.

La hiperm utacin som tica dirigida por el antgeno acaba de afinar las respuestas de anticuerpos 23
Tal como vimos anteriormente, a medida que va transcurriendo el tiempo tras la inmunizacin se produce un aumento progresivo de la afinidad de los anticuer pos producidos contra el antgeno inmunizante. Este fenmeno, que se conoce

1310

Captulo 23 : El sistema inmunitario

como m aduracin de la afinidad, es nico para los anticuerpos (no ocurre en los receptores de las clulas T) y se debe a la acumulacin de mutaciones puntuales especficas en las secuencias codificantes de la regin V, tanto de las cadenas pe sadas como de las ligeras. Dichas mutaciones tienen lugar despus de ensam blarse las regiones codificantes, una vez que las clulas B han sido estimuladas por el antgeno y por las clulas T colaboradoras para generar clulas con m e moria en el centro activado (tambin denominado centro germinal) de un folcu lo linfoide, en un rgano linfoide secundario (vase Figura 23-8). Las mutaciones puntuales tienen lugar a una velocidad de alrededor de una mutacin por se cuencia de regin V codificante en cada generacin celular, que es aproximada mente un milln de veces mayor que la velocidad de mutacin espontnea en otros genes; por eso, el proceso se denomina hipermutacin somtica. No se conoce el mecanismo que posibilita que los cambios de nucletidos puedan di rigirse al DNA de una parte especificada de forma precisa del genoma. nicamente una pequea parte de estas mutaciones puntuales se reflejarn en los receptores de antgeno, los cuales presentarn un incremento de la afini dad para el antgeno. Sin embargo, el bajo nmero de clulas B que expresen es tos receptores de alta afinidad sern estimuladas preferentemente por el antge no para sobrevivir y proliferar, mientras que las restantes clulas B sufrirn muerte celular programada. As, como resultado de ciclos repetidos de hipermu tacin somtica y seleccin de antgenos dirigidos, en el transcurso de una res puesta inmunitaria se producen anticuerpos de elevada y creciente afinidad, lo cual proporciona una proteccin progresivamente mejor contra los antgenos agresores.

CELULA PRO-B
aterna p at er na

1 i

K yitmmmMMiml X m m m m sm m

La unin de los segmentos gnicos de los anticuerpos est regulada asegurando que las clulas B sean m onoespecficas 24
Tal como predice la teora de la seleccin clonal, las clulas B son monoespecfi cas. O sea, todos los anticuerpos que produce una clula B poseen lugares de unin al antgeno iguales. Esto garantiza que los lugares de unin al antgeno de algunas molculas de anticuerpo sean idnticos y, por tanto, que los anti cuerpos segregados puedan formar grandes redes de antgenos entrecruzados, que de este modo provocan la eliminacin del antgeno (vase Figura 23-15). Esto tambin asegura que una clula activada segregue anticuerpos con una es pecificidad similar a la de los anticuerpos unidos a la membrana de las clulas B que se haban estimulado inicialmente. La necesidad de monoespecificidad significa que debe existir algn m eca nismo que asegure que, cuando los genes de las Ig se activan durante el desarro llo de una clula B, cada una de dichas clulas B produzca un slo tipo de regin VL y un slo tipo de regin VH . Las clulas B, como otras clulas somticas, son diploides, por lo que cada clula tiene seis acervos de segmentos gnicos codifi cantes de anticuerpos: dos acervos de genes de cadena pesada (uno de cada pro genitor) y cuatro acervos de cadena ligera (uno k y otro X de cada progenitor). Si las reordenaciones del DNA ocurren independientemente en cada uno de los acervos de cadena pesada y de cadena ligera; una sola clula podra producir hasta ocho anticuerpos diferentes, cada uno de los cuales tendra un lugar dis tinto de unin al antgeno. Sin embargo, cada clula B slo utiliza dos de los seis acervos de segmentos gnicos: uno de los cuatro acervos de genes de cadena li gera y uno de los dos acervos de genes de cadena pesada. As, cada clula B debe escoger, no slo entre los acervos de cadena ligera, k y X, sino tambin entre sus acervos materno y paterno de genes de cadena ligera y de cadena pesada (Figura 23-39). Este tipo de eleccin, se denomina exclusin allica y parece que nica mente ocurre en los genes codificantes de anticuerpos (y los de receptores de c lulas T). Para otras protenas codificadas por genes autosmicos [excepto para las que son codificadas por genes sujetos a actividad heredable (genomic imprinting) estudiados en el Captulo 9], parece que tanto los genes maternos como los paternos de una clula se expresan casi por igual.

CELULA PRE-B terna paterna

%H conjunto gnico conjunto gnico de cadena pesada de cadena ligera seleccionado CELULA B seleccionado

Figura 23-39 Desarrollo de una clula B. Este esquema muestra las selecciones secuenciales de la activacin de los genes de Ig que deben realizar las clulas B para producir anticuerpos con un solo tipo de lugar de unin al antgeno. Se cree que la seleccin entre los conjuntos de segmentos gnicos materno y paterno ha de ser al azar.

La generacin de la diversidad de los anticuerpos

1311

Todava no conocem os el mecanismo de exclusin allica y la eleccin del tipo de cadena ligera, k o ^ , que se produce durante el desarrollo de las clula B. Una posibilidad reside en que las clulas B son monoespecficas, simplemente debido a que la probabilidad de que una serie de reordenaciones se den en ms de un conjunto de genes para cada cadena Ig es muy baja. Sin embargo, ste no constituye el nico m ecanismo, como resulta evidente de algunos tipos de regu lacin por retroalimentacin negativa del sistema de recombinacin V(D)I, por el que una reordenacin funcional en un conjunto de segmentos gnicos supri me las reordenaciones en los conjuntos restantes que codifican el mismo tipo de cadena polipeptdica. Por ejemplo, en los clones de clulas B aislados a partir de ratones transgnicos que expresan una reordenacin del gen de la cadena \ i, la reordenacin de los genes endgenos de la cadena pesada generalmente que da suprimida nicamente si la cadena | i codificada por el transgn se inserta en la m em brana plasmtica. Se han obtenido resultados similares a stos para las cadenas ligeras. Por consiguiente parece que para que acte la retroalimenta cin negativa, el producto de un ensam blaje de genes de cadena pesada o ligera debe expresarse en la superficie celular, lo cual indica que en la regulacin del proceso participan seales extracelulares. El ensamblaje de las secuencias codificantes de la regin V de una clula B en desarrollo tiene lugar en una secuencia ordenada, con un solo segmento cada vez, generalmente empezando con el acervo de la cadena pesada. En este con junto, los segmentos D se unen primero a los segmentos en ambos cromoso mas paternos. Despus se realiza la unin de VHa D/Hen uno de estos cromoso mas. Si esta reordenacin produce un gen funcional, la produccin resultante de cadenas \ i completas (que siempre son las primeras cadenas pesadas que se pro ducen) conduce a su expresin en la superficie celular asociada a una cadena li gera substituyente. Estos receptores de la superficie celular posibilitan que la c lula B reciba seales de las clulas cercanas (denominadas clulas del estroma) y dichas seales suprimen otras reordenaciones de los segmentos gnicos codifi cantes de la regin VH , de forma que puede incrementar la velocidad de las reor denaciones de V L. En ratones, por lo menos, la reordenacin de V L generalmente ocurre primero en un acervo de segmentos gnicos k , y slo si falla esta reordena cin, se reordena el otro acervo k o los acervos X . Si en algn momento la unin en fase VL a JL conduce a la produccin de cadenas ligeras, stas se combinan con las cadenas |li preexistentes formando molculas de anticuerpo IgM, las cua les se insertan en la membrana plasmtica. Los receptores IgM de la superficie celular permiten a las clulas B recin formadas recibir seales extracelulares que suprimen posteriores recombinaciones V(D)J por inactivacin de la expresin de los genes rag-1 y rag-2. Si una clula B en desarrollo no consigue ensamblar la se cuencia codificante funcional, tanto de la regin funcional VHcomo de la regin funcional VL , es incapaz de producir molculas de anticuerpo, y muere. No se han encontrado diferencias biolgicas entre las cadenas ligeras k y X , pero el hecho de tener dos acervos distintos de segmentos gnicos codificantes de cadenas ligeras supone una ventaja obvia: aumenta las probabilidades de que una clula pre-B que ha ensamblado con xito una secuencia codificante de la regin V contine con xito con el ensam blaje de una secuencia codificante de la regin VL , convirtindose en una clula B.

Cuando las clulas B son estimuladas por un antgeno, pasan de la produccin de anticuerpo ligado a la m em brana a la produccin de la form a segregada del mismo anticuerpo 25
De los mecanism os genticos que determinan el lugar de unin al antgeno de un anticuerpo, pasemos ahora a los mecanism os que determinan sus propieda des biolgicas -lo s responsables de la forma de la regin constante de la cadena pesada que ser sintetizada. La eleccin de los segmentos gnicos particulares que codifican el lugar de unin al antgeno es irreversible durante toda la vida de una clula B y de su progenie, pero el tipo de regin CHproducida cambia du

1312

Captulo 2 3 : El sistema inmunitario

rante el desarrollo de una clula B. Los cambios son de dos tipos: cambio de una forma ligada a mem brana a una forma secretada de la misma regin CH , y cam bios en la clase de regin CHproducida. Todas las clases de anticuerpos pueden producirse tanto en forma ligada a m em brana como en forma soluble y secretada. La forma ligada a mem brana ac ta como un receptor para el antgeno en la superficie de la clula B, mientras que la forma soluble se produce slo despus de que la clula haya sido estimu lada por un antgeno para convertirse en clula secretora de anticuerpos. La nica diferencia entre ambas formas reside en el extremo carboxilo terminal de la cadena pesada: las cadenas pesadas de las molculas de anticuerpo Ig ligadas a membrana, por ejemplo, tienen un extremo carboxilo hidrofbico que las an cla en la bicapa lipdica de la m em brana plasmtica de la clula B mientras que las molculas de Ig secretadas tienen un extremo carboxilo hidroflico que les permite escapar de la clula. El paso al carcter de produccin de molculas de Ig tiene lugar debido a que la activacin de las clulas B por el antgeno (y por las clulas T colaboradoras) induce un cambio en la forma en que se procesan los transcritos de RNA de Ig en el ncleo (vase Figura 9-78).

Las clulas B pueden cambiar la clase de anticuerpo que producen 26

Durante el desarrollo, muchas de las clulas B pasan de producir una determi nada clase de anticuerpo a producir otra -proceso denominado cam bio de clase. Todas las clulas B empiezan su vida de sntesis de anticuerpos produ ciendo molculas de IgM, que insertan en la membrana plasmtica donde ac tuarn de receptores para el antgeno. Antes de interaccionar con el antgeno, muchas clulas B cambian y producen molculas tanto de IgM como de IgD, las cuales actuarn como receptores de antgeno ligados a membrana. Tras la esti mulacin por el antgeno, algunas de estas clulas se activan y secretan anti cuerpos IgM, que son los dominantes en la respuesta primaria de anticuerpos. Otras clulas estimuladas por el antgeno cambian y producen anticuerpos IgG, IgE o IgA; las clulas con memoria expresan una de estas tres clases de m olcu las en su superficie, mientras que las clulas B activadas, las segregan. Las m ol culas de IgG, IgE e IgA reciben colectivamente el nombre de clases secundarias de anticuerpo debido a que se cree que nicamente se producen despus de la estimulacin por el antgeno y porque dominan en las respuestas secundarias de anticuerpos. Como hemos visto, cada una de estas diferentes clases de anticuer pos se especializan en el ataque contra microorganismos mediante diferentes procesos y en lugares distintos. Como la clase de un anticuerpo viene determinada por la regin constante de su cadena pesada, el hecho de que las clulas B puedan cambiar la clase de anticuerpo que producen sin alterar el lugar de unin al antgeno implica que una misma secuencia codificante de la regin VH(que especifica la zona de la ca dena pesada que se une al antgeno) puede asociarse secuencialmente con dife rentes segmentos gnicos CH . Ello supone importantes implicaciones funciona les. Significa que en un animal un lugar de unin al antgeno particular, seleccionado por antgenos ambientales, puede distribuirse entre las diferentes clases de inmunoglobulinas, adquiriendo de esta manera las propiedades biol gicas propias de cada clase. El cambio de clase sucede mediante dos mecanismos moleculares diferen tes. Parece que cuando las clulas B vrgenes pasan de producir nicamente IgM ligada a mem brana a producir simultneamente IgM e IgD ligadas a membrana, el cambio es debido a un cambio en el procesamiento del RNA. Las clulas pro ducen grandes transcritos primarios de RNA que contienen la secuencia codifi cante ensamblada de la regin VHjunto con las secuencias C^ y C8; entonces se producen molculas de IgM e IgD por maduracin diferencial de estos transcri tos de RNA (Figura 23-40). Por el contrario, la maduracin final a clula B activada que segrega una de las clases secundarias de anticuerpos est acompaada por un cambio irreversi-

unin V-J 5' V3 J4 Cu C Cy Cg C 3' DNA

TRANSCRIPCION V3 J4 Cj^ D4 DOS TIPOS DE MADURACION DEL RNA V3 ^ V3 Cg C transcrito

D4 J4 D4 J4 TRADUCCINj cadena (i V3 C, D4 J4 IgM V3 Cg D4 J4 IgD cadena

mRNA

Figura 23 -4 0 Sntesis sim ultnea de IgM y IgD. Las clulas B que producen simultneamente molculas de IgM y de IgD ligadas a la membrana plasmtica, las cuales tienen los mismos lugares de unin al antgeno, producen transcritos largos que contienen las dos secuencias y C5. Estos transcritos maduran de dos maneras diferentes produciendo molculas de mRNA que tienen la misma secuencia codificante de la regin V ( V3D4J4) unida a una secuencia C o a una secuencia Cs.

La generacin de la diversidad de los anticuerpos

1313

VDJ ensam blado Cn DNA

C 5

VDJ Cu IgM

C 6

Ce

DELECION DE DNA POR MADURACION POR CORTE Y EMPALME DEL DNA CERCA DE LAS SECUENCIAS DE CAMBIO VDJ

TRANSCRIPCION, PROCESAMIENTO DEL RNA Y TRADUCCIN VDJ Ca I 1

DNA

igA

ble a nivel de DNA -u n proceso denominado recombinacin del cambio de clase (class switch recombination). Ello supone la deleccin de todos los segmentos gnicos Cu que se hallan en direccin 5 (si se considera la direccin sobre la hebra codificante) del segmento gnico CHparticular que la clula est destinada a ex presar (Figura 23-41). La evidencia de que esta etapa del cambio de clase implica la deleccin del DNA procede de experimentos realizados en clulas de mieloma: clulas de mieloma secretoras de IgG carecen del DNA codificante de las regiones CM y C8, mientras que las que secretan IgA carecen del DNA codificante de todas las dems clases de regiones C de la cadena pesada.

Figura 23-41 Un ejemplo de la reordenacidn del DNA que sucede en la recombinacin de cambio de clase.
Cuando una clula B que produce anticuerpos IgM a partir de una secuencia de DNA ensamblada VDJ es estimulada por el antgeno para madurar a una clula secretora de anticuerpos IgA, suprime el DNA entre la secuencia VDJ y el segmento gnico Ca. Las secuencias de DNA especficas (.secu en cias d e cam bio, que en la figura aparecen como esferas negras) se localizan en direccin 5 de cada segemento gnico CH(excepto C6), se recombinan entre s suprimiendo el DNA intermedio. Se cree que el tipo de recombinacin de cambio de clase est mediado por una recom b in asa d e cam b io, que se dirige a las secuencias apropiadas de cambio cuando stas se vuelven accesibles bajo la influencia de seales extracelulares (linfoquinas) segregadas por las clulas T colaboradoras, como veremos ms adelante.

Resumen
Los anticuerpos se producen a partir de tres acervos de segmentos gnicos diferen tes que codifican respectivamente las cadenas ligeras k, las cadenas ligeras k y las cadenas pesadas. En cada acervo, los segmentos que codifican las distintas zonas de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas se unen mediante recom binacin especfica de lugar durante la diferenciacin de la clula B. Los acervos de la cadena ligera contienen uno o ms segmentos gnicos constantes (C) y grupos de segmentos variables (V) y de segmentos de unin (J). El acervo gnico de las cadenas pesadas contiene un grupo de segmentos gnicos C y grupos de segmentos V, de di versidad (D) y J. Para producir una molcula de anticuerpo, un segmento gnico VL se recombina con un segmento gnico JLproduciendo una secuencia de DNA codifi cante de la regin Vde la cadena ligera; un segmento gnico VHse recombina con un segmento D y uno JHproduciendo un secuencia de DNA codificante de la regin Vde la cadena pesada. Cada uno de los segmentos gnicos ensamblados se cotranscribe con la secuencia apropiada de la regin C, dando lugar a una molcula de mRNA que codifica la cadena polipeptdica completa. Combinando de diversas maneras los segmentos gnicos heredados que codifican las regiones VLy Vlp los vertebrados puede producir miles de cadenas ligeras diferentes y miles de cadenas pesadas dife rentes. Debido a que el lugar de unin al antgeno se forma donde se juntan V y VH en el anticuerpo final, las cadenas ligeras y pesadas pueden asociarse formando anticuerpos con millones de lugares diferentes de unin al antgeno. Esta cifra se ve enormemente incrementada por la prdida y la ganancia de nucletidos en el lugar de unin de los segmentos gnicos, as como por las mutaciones somticas, que ocu rren con una frecuencia muy elevada en el ensamblaje de secuencias codificantes de regiones Vdespus de la estimulacin por el antgeno. Todas las clulas B producen inicialmente anticuerpos IgM. Algo ms tarde pa san a producir anticuerpos de otras clases pero con el mismo lugar de unin al an tgeno que tenan los anticuerpos IgM originales. Este cambio de clase permite que los mismos lugares de unin al antgeno se distribuyan entre anticuerpos con pro piedades biolgicas diferentes.
1 31 4 Captulo 23 : El sistema inmunitario

Los receptores de las clulas T y sus subclases

Las diversas respuestas de las clulas T reciben el nombre colectivo de reaccio nes inmunitarias mediadas por clulas. Al igual que las respuestas por anticuer pos, son altamente especficas para el antgeno y son importantes para la defen sa de los vertebrados contra la infeccin. Sin embargo, las clulas T se diferencian de las clulas B en varios aspectos importantes. Primero, actan nicamente en un radio limitado, interactuando directamente con otras clulas del cuerpo, a las que destruyen o sealan de al gn modo (nos referiremos a dichas clulas como clulas diana)] las clulas B, por el contrario segregan anticuerpos que pueden actuar a distancia. Segundo, las clulas T se especializan en el reconocimiento de un antgeno extrao nica mente cuando ste se localiza en la superficie de una clula diana. Por este m oti vo la forma de un antgeno reconocido por las clulas T es distinta del que reco nocen las clulas B: mientras que las clulas B reconocen un antgeno intacto, las clulas T reconocen fragmentos peptdicos de protenas antignicas que han sido parcialmente degradadas en el interior de la clula diana y luego transpor tadas y expuestas sobre la superficie celular. De este modo las clulas T son ca paces de detectar la presencia de microorganismos que proliferan en el interior de las clulas, as como de detectar antgenos extracelulares que han sido ingeri dos por las clulas. Existen dos clases principales de clulas T -clulas T citotxicas y clulas T colaboradoras. Las clulas T citotxicas destruyen directamente las clulas que han sido infectadas por un virus o algn otro microorganismo intracelular. Las clulas T colaboradoras, por el contrario, contribuyen a estimular las respuestas de otras clulas: por ejemplo, colaboran activando macrfagos y clulas B.

cadena a H2N

cadena p
nh2

C1TOSOL
Figura 23-42 Un receptor heterodmero de una clula T. El
receptor est compuesto por una cadena polipeptdica a y una (3. Cada cadena tiene aproximadamente 280 residuos de aminocido de longitud y posee una porcin extracelular que est plegada en dos dominios con aspecto de Ig -u n o variable (V) y el otro constante (C). Se cree que el sitio de unin al antgeno formado por un dominio Vuy otro Vp (sombreados en azul) es similar en dimensiones y geometra globales al lugar de unin al antgeno de una molcula de anticuerpo. Sin embargo, a diferencia de los anticuerpos, que presentan dos lugares de unin al antgeno, los receptores de la clula T presentan uno slo lugar de unin. El heterodmero a l (3 mostrado est asociado de forma no covalente con un gran conjunto de protenas invariables (no se muestran) que colaboran con la clula T activada cuando los receptores de la clula T se unen al antgeno. Una clula T tpica tiene alrededor de 20 000 complejos receptores de este tipo en su superficie.

Los receptores de la clula T son heterodmeros similares a los anticuerpos 27

Debido a que las respuestas de las clulas T dependen del contacto directo con un clula diana, los receptores del antgeno producidos por las clulas T, a dife rencia de los anticuerpos producidos por las clulas B, existen nicamente en la forma ligada a membrana y no son segregados. Por este motivo, result difcil aislar los receptores de las clulas T, y no fue hasta 1983 que se identificaron bio qumicamente por primera vez. Tanto en clulas T colaboradoras como en clu las T citotxicas los receptores estn compuestos por dos cadenas polipeptdicas (denominadas a y (3) unidas entre s por un enlace disulfuro, cada una de las cuales contiene dos dominios similares a Ig y comparte con los anticuerpos la propiedad caracterstica de presentar una regin amino terminal variable y una regin carboxilo terminal constante (Figura 23-42). Los conjuntos de genes codificantes de las cadenas a y (3 se localizan en cro mosomas diferentes y contienen, como los conjuntos gnicos de los anticuerpos, segmentos gnicos V , D, J y C separados, los cuales se juntan por recombinacin especfica de lugar durante el desarrollo de las clulas T en el timo. Con una sola ex cepcin, todos los mecanismos utilizados por las clulas B para generar diversidad en los anticuerpos, tambin se utilizan por las clulas T para generar diversidad en sus receptores; en particular utilizan el mismo sistema de recombinacin V(D)J, requirindose las protenas codificadas por los genes rag-1 y rag-2 estudiados ante riormente. El mecanismo que al parecer no acta en la gnesis de diversidad de los receptores de la clula T es la hipermutacin somtica estimulada por el antgeno por lo que la afinidad de los receptores permanece baja {Ka ~ 104 litros/mol) in cluso en una respuesta inmunitaria avanzada. Ms adelante estudiaremos cmo los mecanismos de adhesin intercelular no especficos del antgeno estrechan fuertemente la unin de una clula T a su clula diana, contribuyendo a com pen sar la baja afinidad de los receptores de la clula T. Un nmero reducido de clulas T, en lugar de producir cadenas a y (3, pro ducen un tipo de receptor heterodmero distinto, compuesto por cadenas y y 8.

Los receptores de las clulas T y sus subclases

1 31 5

Dichas clulas surgen temprano en el desarrollo y se localizan principalmente en los epitelios (por ejemplo, en la piel y en el intestino), donde proporcionan una primera lnea de defensa contra los microorganismos que intentan penetrar en dichas capas celulares. Como ocurre en el caso de los receptores de antgeno en las clulas B, los re ceptores de las clulas T se halla estrecham ente asociados a la membrana plas mtica por un nmero invariable de protenas, que se hallan implicadas en la transmisin de la seal desde un receptor activado por el antgeno al interior de la clula. Ms tarde estudiaremos con ms detalle estas protenas.

Las diferentes respuestas de las clulas T estn mediadas por distintas clases de clulas T 28
Las dos clases principales de clulas T poseen funciones muy diferentes. Las c lulas T citotxicas destruyen clulas que hospedan microorganismos nocivos, mientras que las clulas T colaboradoras contribuyen a activar las respuestas de otros glbulos blancos, principalmente por la secrecin de diversos mediadores locales, denominados en conjunto linfoquinas, interleuquinas o citoquinas. As las clulas T citotxicas proporcionan proteccin contra microorganismos pat genos, com o virus y algunas bacterias intracelulares, que se multiplican en el ci toplasma de la clula husped, donde quedan resguardadas del ataque de los anticuerpos. La forma ms eficiente de prevenir que tales microorganismos in vadan dichas clulas es destruyendo las clulas infectadas antes de que puedan proliferar los microorganismos. Por el contrario, las clulas T colaboradoras son cruciales en la estimulacin de respuestas frente a los microorganismos extracelulares y a sus productos txicos. Existen dos tipos de clulas T colaboradoras: las clulas TH 1, que activan a los macrfagos para que destruyan los microorga nismos que han ingerido, y las clulas TH 2, que estimulan la proliferacin y la se crecin de anticuerpos de las clulas B. Tanto las clulas T citotxicas como las clulas T colaboradoras reconocen al antgeno en forma de fragmentos peptdicos que se generan a partir de la de gradacin de protenas antignicas extraas en el interior de la clula diana, y ambos tipos, por tanto, dependen de la presencia de protenas especiales de la clula diana que se unan a dichos fragmentos, transportndolos hasta la superfi cie celular, donde los presentan a las clulas T. Estas protenas especiales se de nominan molculas MHC debido a que estn codificadas por un complejo de ge nes denominado el complejo principal de histocompatibilidad (MHC, de Major Histocompatibility ComplexJ. Existen dos clases distintas de molculas MHC que son estructural y funcionalmente distintas: las molculas MHC de clase I, que presentan pptidos extraos a las clulas citotxicas y las molculas MHC de clase II que presentan pptidos extraos a las clulas colaboradoras. Antes de examinar los diferentes mecanism os con que se procesan las protenas antigni cas para exhibirlas a los dos tipos de clulas T, debemos estudiar de forma ms precisa las propias molculas MHC, que juegan un papel muy importante en la inmunidad por clulas T.

Resumen
Existen por lo menos dos subclases funcionalmente distintas de clulas T: clulas T citotxicas, que destruyen clulas infectadas, especialmente las que son infectadas por un virus, y clulas T colaboradoras, que contribuyen a activar tanto a las clu las B productoras de anticuerpos como a los macrfagos que ingieren y destruyen los microorganismos invasores. Ambos tipos de clulas T expresan receptores simi lares a los anticuerpos en su superficie celular, que estn codificados por genes en samblados a partir de segmentos gnicos mltiples durante el desarrollo de la clu la Ten el timo. Estos receptores reconocen fragmentos de protenas extraas que se exhiben en la superficie de las clulas husped asociadas con las molculas MHC.
1316 Captulo 23 : El sistema inmunitario

Las molculas MHC y la presentacin del antgeno a las clulas T29

Las molculas MHC se reconocieron mucho antes de que se entendiese cul era su funcin normal. Inicialmente se crey que eran los antgenos diana principa les en las reacciones de trasplante. Generalmente cuando se intercambian in jertos de rganos entre individuos adultos de la misma especie (aloinjertos ) o de especies diferentes (.xenoinjertos), estos injertos son rechazados. En los aos 1950, experimentos realizados con injertos de piel entre diferentes cepas de ra tn demostraron que el rechazo del injerto es una respuesta inmunitaria frente a antgenos extraos de la superficie de las clulas injertadas. Ms tarde se demos tr que estas reacciones estn mediadas principalmente por clulas T y que es tn dirigidas contra versiones genticamente extraas de las glucoprotenas de la superficie celular denominadas molculas de histocompatibilidad (histo sig nifica tejido). Con diferencia, las ms importantes de estas molculas son las de la familia de protenas codificadas por el grupo de genes del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Las molculas MHC se expresan en todas las c lulas de los vertebrados superiores. Su existencia se demostr por primera vez en ratones, recibiendo el nombre de antgenos H-2 (antgenos de histocompatibilidad-2). En humanos, estas molculas se denominan antgenos HLA (de Human-Leucocyte-Associated antigens) debido a que se describieron por primera vez en leucocitos. Tres propiedades notables de las molculas MHC confundieron a los inmunlogos durante mucho tiempo. En primer lugar, las molculas MHC son, con mucha diferencia, los antgenos diana preferidos de las reacciones de transplante mediadas por clulas T. En segundo lugar, una fraccin extraordinariamente grande de clulas T son capaces de reconocer las molculas MHC extraas: mien tras que, por ejemplo, menos de un 0,001% de las clulas T de un individuo res ponden frente a un antgeno vrico tpico, ms del 0, 1% de ellas responden frente a un antgeno MHC extrao. En tercer lugar, muchos de los loci que codifican las molculas MHC son los ms polimrficos que se conocen en vertebrados supe riores; es decir, en una especie existe un nmero extraordinariamente grande de alelos (formas alternativas de un mismo gen) en cada locus (a menudo ms de 100), cada uno de los cuales se presenta en una frecuencia relativamente alta en la poblacin. Por esta razn, y debido a que cada individuo tiene cinco o ms loci codificadores de molculas MHC (vase ms adelante), es raro que dos indivi duos posean conjuntos idnticos de protenas MHC, lo cual hace muy difcil el emparejamiento de un donante y un receptor para el trasplante de rganos en humanos (excepto en el caso de gemelos genticamente idnticos). Un vertebrado no necesita protegerse de la invasin de clulas extraas de vertebrados; por lo tanto, esta aparente obsesin de sus clulas T por las molcu las MHC extraas y el acusado polimorfismo de estas molculas constitua un gran rompecabezas para los inmunlogos. Este rompecabezas slo se resolvi tras el descubrimiento de que las molculas MHC actan concentrando las clulas T so bre las clulas del husped que presentan antgenos extraos en su superficie y que las clulas T responden a las molculas MHC extraas de la misma forma que a las molculas MHC propias que poseen antgenos extraos unidos a ellas.

Existen dos clases principales de molculas MHC 29

Las protenas MHC de clase I y de clase II presentan estructuras muy similares. Ambas son heterodmeros transmembrana cuyos dominios extracelulares amino terminales se unen al antgeno para la presentacin a las clulas T. Cada gen MHC de clase I codifica una cadena polipeptdica transmembrana (denominada a), la mayor parte de la cual se pliega en tres dominios extracelula res globulares (a p oc2 y ctg). Todas las cadenas a estn asociadas de forma no covalente a una pequea protena extracelular no glucosilada denominada $2-mi-

Las molculas MHC y la presentacin del antgeno a las clulas T

1317

cadena a

cadena (5

Figura 23-43 Protenas MHC de clase

I y de clase II. (A) La cadena a de la molcula de clase I presenta tres dominios extracelulares a ,, a 2 y a 3, codificados por exones diferentes. Est asociada de forma no covalente con una cadena polipeptdica menor, p2-microglobulina, que no est codificada por el MHC. El dominio a 3 y la p2-microglobulina son similares a los de una inmunoglobulina. Mientras que la P2-microglobulina es invariable, la cadena a es extremadamente polimrfica, principalmente en sus dominios a , y a 2. (B) En las molculas MHC de clase II, ambas cadenas son polimrficas (la (3 ms que la a), principlamente en los dominios a t y P,; los dominios a 2 y P2 son similares a los de una inmunoglobulina. As, existen notables similitudes entre las protenas MHC de clase I y las de clase II. En ambas, los dos dominios ms externos (sombreados en azul) interaccionan entre s formando un surco que une el antgeno extrao y lo presenta a las clulas T. Todas las cadenas estn glucosiladas con excepcin de la P2-microglobulina (no se muestra en el esquema).

m icroglobulina HOOC ESPACIO EXTRACELULAR m em brana plasmtica

P2-

CITOSOL COOH (A) PROTENA MHC DE CLASE I

COOH

(B) PROTENA MHC DE CLASE II

croglobulina, que no atraviesa la membrana y est codificada por un gen que no pertenece al grupo de genes MHC (Figura 23-43A). La P2-microglobulina y el do minio oc3, que son los ms prximos a la membrana, son homlogos a un domi nio de inmunoglobulina Ig. Los dos dominios amino terminales de la cadena a, que son los ms alejados de la membrana, se unen al antgeno y contienen los aminocidos polimrficos (variables) que son reconocidos por las clulas T en las reacciones de trasplante. Al igual que las molculas MHC de clase I, las m olculas MHC de clase II son heterodmeros con dos dominios conservados, similares a Ig, que se hallan prximos a la membrana. Sin embargo, en estas molculas ambas cadenas (a y (3) estn codificadas por MHC, y ambas atraviesan la membrana (Figura 23-43B). La presencia de dominios parecidos a las Ig en las protenas de clase I y de clase II sugiere que las molculas MHC y los anticuerpos poseen una historia evoluti va comn. En la Figura 23-44 se muestran las localizaciones de los genes que co difican las protenas MHC de clase I y de clase II en ratones y en el hombre.

Figura 23-44 Los complejos gnicos

H-2 y HLA. Este dibujo esquemtico com plejo H-2 crom osom a 17 de ratn H-2K H-2A
a

H-2E
[i a

H-2D H-2L

centrom er HLADP crom osom a 6 hum ano

P a

HLADQ
p a

HLADR
p a

HLA-B HLA-C

HLA-A

com plejo HLA

muestra la localizacin de los loci que codifican las subunidades transmembrana de las protenas MHC de clase I {en verde claro) y de clase II {en verde oscuro). Existen tres tipos de protenas de clase I (H-2K, H-2D y H-2L en el ratn y HLA-A, HLA-B y HLA-C en humanos). En el ratn existen dos tipos de loci MHC de clase II {H-2A y H-2E) y ms de tres tipos en humanos de los que slo se muestran tres {HLA-DP, HLA-DQ y HLA-DR). Cada locus de clase II codifica al menos una cadena a y al menos una cadena p, pero algunos codifican ms de una cadena a o p (no se muestra en la figura).

131 8

Captulo 23 : El sistema inmunitario

surco de unin al antgeno

pptido en el surco de unin al antgeno

enlace S-S

p2-m icroglobulm a ESPACIO EXTRACELULAR

COOH (B) VISTA SUPERIOR

Figura 23-45 (A) Estructura de una protena MHC de clase I humana determinada por anlisis de difraccin de rayos X de cristales de la parte extracelular de la molcula. La parte extracelular

m em brana plasmtica

CITOSOL

HOOC (A) VISTA DE PERFIL

de la protena se escindi del segmento transm em brana con la enzima proteoltica papana antes de la cristalizacin. Los dos dominios ms prximos a la membrana plasmtica (a 3 y P2-microglobulina) son similares a un dominio de inmunoglobulina tpico (vase Figura 23-34B), mientras que los dos dominios ms alejados de la membrana (a, y a 2) son muy similares entre s, y juntos forman un surco de unin al pptido en la parte superior de la molcula. Se cree que las molculas MHC de clase II tienen una estructura muy similar. (B) Visto desde arriba, el surco de unin al antgeno contiene los pequeos pptidos que copurificaban con la protena MHC. sta es la parte de la molcula MHC que interacciona con el receptor de la clula T. (De P.J. Bjorkman, M.A. Saper, B. Samraoui, W.S. Bennett, J.L. Strominger y D.C. Wiley, N ature 329:506512, 1987.)

Estudios por difraccin de rayos X revelan el lugar de unin al antgeno de las protenas MHC as como el pptido de unin 30
Cualquier individuo posee nicamente un reducido nmero de tipos de m olcu las MHC, que han de ser capaces conjuntam ente de presentar a las clulas T fragmentos de pptidos de prcticamente cualquier protena extraa. As cada molcula MHC tiene la capacidad de unirse a un gran nmero de pptidos dife rentes. La base estructural de dicha versatilidad surge de los anlisis por cristalo grafa de rayos X de molculas MHC. Como se muestra en la Figura 23-45A, una protena MHC de clase I presenta un nico lugar de unin al pptido, localizado en un extremo de la molcula. Este lugar consiste en un profundo surco entre dos largas hlices a derivadas de los dominios a , y a 2, casi idnticos entre s; la base del surco est formada por ocho hebras (3 derivadas de los mismos dominios. El surco es suficientemente grande como para alojar un pptido de unos 10 residuos de aminocidos. En rea lidad, cuando se analiz una protena MHC de clase I mediante cristalografa por rayos X, se encontr que este surco contena una zona de baja densidad, que Las molculas MHC y la presentacin del antgeno a las clulas T

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Figura 23-46 Ilustracin muy esquemtica de un pptido en el surco de unin de una molcula MHC de clase I. Desde esta perspectiva el esqueleto peptdico se muestra como una serie de bolas rojas, cada una de las cuales representa uno de los nueve residuos de aminocido. Los esqueletos de los residuos de anclaje en los extremos del pptido se unen a los pliegues conservados de los bordes del surco.

posiblemente corresponda al pptido de unin que haba cocristalizado con la protena MHC (Figura 23-45B). Este descubrimiento implicaba que este surco era el lugar de unin al antgeno y sugera que una vez que el pptido se une a este lugar, se disocia muy lentamente. Esta conclusin se apoya en la observa cin de que clulas expuestas durante un corto perodo de tiempo a fragmentos de una protena vrica pueden conservar durante algunos das su propiedad de ser dianas para las clulas T citotxicas especficas. Sin embargo, en soluciones acidificadas, los pptidos de unin pueden ser eluidos a partir de molculas MHC de clase I aisladas, y efectivamente se ha encontrado que poseen una longi tud de 8 a 10 residuos de aminocidos. Casi todos los aminocidos polimrficos de la protena MHC (los que varan entre formas allicas de este tipo de m olcu la) se localizan en el interior del surco, donde se supone que unen el antgeno, o en los bordes del surco, donde seran accesibles para el reconocimiento por el re ceptor de la clula T. Se han encontrado distintos pptidos que se unen al surco de una protena MHC de clase I m ediante una com binacin de contactos variables e invaria bles. En cada caso se considera el pptido com o una cadena extendida de 8 a 10 aminocidos, con el eje peptdico invariable de aminocidos terminales en cada extremo del surco (Figura 23-46). Otras regiones del pptido se unen a bolsas especficas formadas por porciones polimrficas de la protena MHC, mientras que las cadenas laterales de algunos residuos se dirigen al exterior, en una posicin que sea reconocida por los receptores de las clulas T citotxicas. Debido a que las bolsas conservadas en los extremos del surco de unin reco nocen caractersticas del esqueleto peptdico que son comunes a muchos pp tidos pero no a las cadenas laterales de los aminocidos, que varan, una nica protena MHC de clase I puede unirse a una amplia variedad de pptidos de se cuencias diferentes. A su vez la distinta especificidad de las bolsas a lo largo del surco asegura que cada forma allica de molcula MHC se una y presente su propio y caracterstico conjunto de pptidos. As, los numerosos tipos de m ol culas MHC de clase I de un individuo pueden presentar un amplio rango de protenas extraas a las clulas T citotxicas, pero en cada individuo lo hacen de maneras muy parecidas. Las molculas MHC de clase II poseen una estructura tridimensional muy parecida a la de las molculas de clase I, pero su surco de unin al antgeno aloja pptidos m ucho ms largos y heterogneos, alcanzando un tamao de 15 a 24 residuos de aminocidos. As, aunque un individuo produce probablemente me-

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Captulo 23 : El sistema inmunitario

CLULA TCITOTXICA

CELULA T COLABORADORA

Figura 23-47 Las clulas T citotxicas y colaboradoras reconocen distintas molculas MHC. Las clulas T
citotxicas reconocen los antgenos vricos extraos en asociacin con las protenas MHC de clase I en la superficie de cualquier clula del husped, mientras que las clulas T colaboradoras reconocen a los antgenos extraos en asociacin con las protenas de clase II en la superficie de una clula presentadora de antgeno, com o un macrfago o una clula B. El antgeno extrao unido a una molcula MHC de clase I se sintetiza en la clula diana, mientras que el antgeno extrao unido a una molcula MHC de clase II se ha captado por endocitosis y se ha procesado antes de ser presentado en la superficie celular (no se muestra en la figura). En las reacciones de trasplante, las clulas colaboradoras tambin reaccionan contra las glucoprotenas de clase II extraas, y las clulas citotxicas reaccionan contra las glucoprotenas de clase I extraas.

receptor de la clula T fragm ento de la protena extraa

fragm ento de la protena extraa

clula diana infectada

clula presentadora de antgeno

nos de 20 tipos de molculas de clase II, cada una de las cuales presenta un ni co lugar de unin al antgeno, parece que en conjunto estas molculas consi guen unir y presentar una variedad aparentemente ilimitada de pptidos extra os a las clulas T colaboradoras, que juegan un papel crucial en casi todas las respuestas inmunitarias.

Las m olculas MHC de clase I y de clase II tienen funciones distintas 29

Las molculas MHC de clase I se expresan prcticamente en todas las clulas nucleadas, posiblemente debido a que las clulas T citotxicas deben ser capa ces de concentrarse en cualquier clula del cuerpo que haya sido infectada por un microorganismo intracelular, como un virus. Por el contrario, las molculas MHC de clase II se hallan normalmente restringidas a clulas especializadas, como las clulas B, macrfagos y otras clulas presentadoras de antgenos, que extraen los antgenos del lquido extracelular e interactan con las clulas T co laboradoras (Figura 23-47). En la Tabla 23-2 se resumen las caractersticas prin cipales de las dos clases de protenas MHC.

Tabla 23-2 Propiedades de las molculas MHC de clase I y II Clase I Loci genticos Clase II

H-2K, H-2D, H-2L en el ratn; agrupaciones H-2A y H-2E en el HLA-A, HLA-B, HLA-C ratn; DP, DQ, DR y algunas
en el hombre otras en el hombre cadena a + P2-microglobulina cadena a + cadena p la mayora de clulas nucleadas clulas presentadoras de antgeno (incluyendo clulas B), clulas epiteliales del timo y algunas otras clulas T colaboradoras

Estructura de la cadena Distribucin celular

Intervienen en la presentacin del antgeno a Origen de los fragmentos peptdicos Dominios polimrcos

clulas T citotxicas

protenas producidas en el citosol

protenas extracelulares y de membrana plasmtica, endocitadas i + pi

a + a2

Las molculas MHC y la presentacin del antgeno a las clulas T

1321

Un aspecto im portante es que las clulas T citotxicas concentran su ataque en las clulas que producen antgenos extraos, mientras que las clulas T cola boradoras concentran su colaboracin en clulas que extraen los antgenos ex traos del lquido extracelular. El primer tipo de clula diana constituye una amenaza, pero el segundo tipo es esencial para la defensa inmunitaria del orga nismo. El sistema inmunitario debe ser capaz de deshacerse de los antgenos ex traos extracelulares, de numerosas bacterias que se multiplican fuera de las c lulas, y de algunas toxinas proteicas segregadas, como la toxina tetnica y la toxina botulnica, que pueden ser letales. Las clulas T colaboradoras contribu yen a eliminar estos patgenos ya sea colaborando con las clulas T para la pro duccin de anticuerpos contra los microorganismos o bien contra sus toxinas, activando a los macrfagos para que destruyan los microorganismos ingeridos. Para garantizar la direccin correcta de las funciones citotxica y colabora dora, cada uno de los dos tipos principales de clulas T, adems del receptor del antgeno que reconoce un complejo peptdico-MHC, tambin expresa un corre ceptor que reconoce una parte no polimrfica de la clase apropiada de molcula MHC, tal como veremos a continuacin.

Las protenas CD4 y CD8 actan como correceptores de unin a MHC en las clulas T colaboradoras y citotxicas, respectivamente 31
Generalmente la afinidad de los receptores de la clula T para los complejos peptdicos MHC de la clula diana es demasiado baja para inducir una interac cin funcional entre las dos clulas. Son necesarios los receptores accesorios para contribuir a estabilizar dicha interaccin aumentando la fuerza total de la adhe sin intercelular; cuando estos receptores tam bin ejercen un papel directo en la activacin de la clula T generando sus propias seales intracelulares, se de nominan correceptores. A diferencia de los receptores de la clula T o de las m o lculas MHC, los receptores accesorios no se unen al antgeno y son invariables y no polimrficos. Los ms importantes y mejor conocidos de los correceptores de las clulas T son las protenas CD4 y CD8, que son protenas transmembrana de paso nico con dominios extracelulares similares a las Ig. Al igual que los receptores de la clula T, reconocen a las protenas MHC, pero, a diferencia de los receptores de clulas T, se unen a las zonas no variables de la protena, lejos del surco de unin al pptido. CD4 se expresa en las clulas T colaboradoras y se une a las molculas MHC de clase II, mientras que CD8 se expresa en las clulas T citotxicas y se une a las molculas MHC de clase I (Figura 23-48). As CD4 y CD8 contribuyen al reconocim iento de la clula T, contribuyendo a que la clula se concentre en un tipo concreto de molculas MHC, y en un tipo concreto de clulas diana. La cola citoplasmtica de estas protenas transmembrana se halla asociada con un miembro de la familia de protenas quinasa Src especficas de tirosina, denom i nada protena Lck, la cual fosforila varias protenas celulares en los residuos de tirosina y de este modo participa en la activacin de la clula T. Las protenas CD4 y CD 8 no slo se requieren para aumentar la fuerza de adhesin intercelular y para contribuir a activar la clula T, sino que tambin son necesarias para el desarrollo de la clula T: si se inactivan los genes que co difican CD4 o CD 8 en ratn mediante recom binacin gentica vectorial, no se desarrollan ni las clulas T colaboradoras ni las clulas T citotxicas. Irnica mente, CD4 tam bin funciona como receptor para el virus del SIDA (HIV), per mitiendo que el virus infecte a las clulas T colaboradoras.

proteina CD8

protena MHC de clase I

clula infectada zona no polim rfica

proteina CD4

clula presentadora de antgeno

protena MHC de clase

Figura 23-48 Los correceptores CD4 y CD8 de la superficie de las clulas T.
Obsrvese que estas protenas se unen a la regin invariable de la molcula MHC que ha unido la clula T receptora, de forma que se m antienen adosados a los receptores de la clula T durante el proceso de activacin celular. Los anticuerpos contra CD4 y CD 8 son ampliamente utilizados para distinguir entre clulas T colaboradoras y clulas T citotxicas.

Resumen
Las molculas MHC de clase Iy de clase II son las protenas ms polimrficos que se conocen -es decir, muestran una gran variabilidad gentica de un individuo a otro- y juegan un papel crucial en la presentacin de protenas antignicas extra as a las clulas T citotxicas y a las clulas T colaboradoras, respectivamente.
1 32 2 Captulo 23 : El sistema inmunitario

Mientras que las molculas de la clase I se expresan en casi todas las clulas de los vertebrados, las molculas de la clase II quedan restringidas a unos cuantos tipos celulares que interactan con las clulas T colaboradoras, como son los linfocitos B y los macrfagos. Ambas clases de molculas MHC poseen dominios similares a Ig y un nico surco de unin al pptido, que une pequeos fragmentos de pptidos deri vados de protenas extraas. Cada molcula MHC puede unir una caracterstica y gran cantidad de conjuntos de pptidos, que se producen intracelularmente por de gradacin proteica. Despus de su formacin en el interior de la clula diana, los complejos pptidos-MHC son transportados a la superficie celular donde son reco nocidos por los receptores de la clula T. Adems de sus receptores especficos de antgeno que reconocen los complejos MHC-pptido de la superficie de las clulas dia na, las clulas T expresan los correceptores CD4 o CD8, que reconocen regiones no polimrficas de las molculas MHC en las clulas diana: las clulas colaboradoras expresan CD4, que reconoce las molculas MHC clase II, mientras las clulas T citotxicas expresan CD8 que reconoce las molculas MHC de clase I.

Las clulas T citotxicas

Como estudiamos anteriormente, las clulas T citotxicas nos defienden contra microorganismos como los virus que crecen en el interior de las clulas, lejos del alcance de los anticuerpos. Las clulas T citotxicas, a diferencia de los anticuer pos, pueden reconocer estas clulas infectadas debido a que las molculas MHC de clase I envan continuam ente fragmentos de las protenas microbianas a la superficie celular, donde pueden ser detectadas por las clulas T. En esta seccin estudiaremos cmo se generan dichos fragmentos y se reparten entre las m ol culas MHC de clase I, y consideraremos cmo las clulas T citotxicas destruyen las clulas diana infectadas. Figura 23-49 El experimento clsico que demuestra que las clulas T citotxicas reconocen el antgeno vrico y algn aspecto de la superficie de la clula diana husped. Ratones
de la cepa X se infectan con el virus A. Al cabo de siete das, los bazos de estos ratones contienen clulas T citotxicas capaces de destruir fibroblastos en cultivo de la cepa X infectados por el virus. Tal com o se esperaba, estas clulas T citotxicas nicam ente destruyen los fibroblastos infectados por el virus A, pero no por otro virus B; as pues, las clulas T citotxicas son especficas del virus. Sin embargo estas mismas clulas son incapaces de destruir fibroblastos de ratones de la cepa Y infectados con el mismo virus A, lo cual indica que las clulas T citotxicas no solamente reconocen los virus sino tambin alguna diferencia gentica entre ambos tipos de fibroblastos. Gracias a la utilizacin de cepas especiales de ratones (conocidas como cep as congnitas) que o bien son genticamente idnticas excepto para los alelos de sus loci MHC de clase I o son genticamente diferentes excepto para dichos alelos se encontr que la destruccin de clulas diana infectadas requiere que dichas clulas expresen al menos uno de los alelos MHC de la misma clase expresados por el ratn infectado inicialmente. Esto indicaba que las protenas MHC de clase I son necesarias para presentar los antgenos vricos unidos a superficie a las clulas T citotxicas.

Las clulas T citotxicas reconocen fragmentos de protenas vricas en la superficie de clulas infectadas por virus 32
La primera prueba clara de que las molculas MHC presentan los antgenos ex traos a las clulas T surgi de un experimento con clulas T citotxicas realiza do en 1974, que demostr que las clulas T citotxicas de ratn infectadas por un virus podran destruir clulas cultivadas infectadas con el mismo virus, slo si dichas clulas expresaban alguna de las molculas MHC de la misma clase I de ratn infectado (Figura 23-49). Este experimento demostr que las clulas T de cualquier individuo slo reconocer un antgeno determinado cuando dicho antgeno se halle asociado a las formas allicas de molculas MHC expresadas por ese mismo individuo, un fenmeno conocido como restriccin MHC. Sin em bar go, no fue hasta 10 aos despus, que se descubri la naturaleza qumica de los antgenos vricos reconocidos por las clulas T citotxicas. En los experimentos

las clulas T matan a las clulas diana virus A fibroblastos 5 de ratn de la ( ^ ( f ^ cepa X infectados con el virus B fibroblastos del ratn de la cepa X infectados con el virus A fibroblastos del ratn de la cepa Y infectados con el virus A
Las clulas T citotxicas

NO

C~a " c '>

(/ fc O

SI

NO

1 323

con clulas infectadas por el virus de la gripe se encontr de forma inesperada que algunas clulas T citotxicas reconocan especficamente protenas internas del virus que en la partcula del virus intacta no deban ser accesibles. La prueba siguiente sugera que las clulas T estaban reconociendo fragmentos degradados de las protenas internas del virus. Debido a que la clula T puede reconocer mi nsculas cantidades de antgeno (slo unos cuantos centenares de molculas), nicamente una pequea fraccin de los fragmentos generados a partir de las protenas vricas llegan a alcanzar la superficie celular, donde atraen y son ataca das por las clula T citotxicas. Sin embargo, el misterio no ha sido desvelado to dava. Se sabe que casi todas las protenas de una clula se degradan continua mente (Captulo 5), por lo que no resulta difcil comprender que en una clula infectada se producen fragmentos peptdicos de protenas vricas internas. Al igual que otras protenas celulares, las protenas vricas son sintetizadas por los ribosomas citoslicos y, como se explic en el Captulo 12, se requieren m eca nismos especiales para que estas protenas dejen el citosol, atravesando una membrana, hacia el interior de algn otro compartimiento. Generalmente las protenas destinadas a la superficie celular empiezan su trayecto pasando desde el citosol hacia la luz del retculo endoplasmtico (ER) (Figura 23-50). El rom pe cabezas de cm o los fragmentos de las protenas vricas alcanzan la superficie celular se solucion con el descubrimiento de un sistema de transporte remar cable que poseen las clulas de los vertebrados para transportar dichos pptidos desde el citosol hasta la luz del ER. Una vez en el interior del retculo, los ppti dos pueden unirse a las molculas MHC que se encuentran all y de este modo pueden ser transportados con ellas hacia la superficie celular.

fragm ento peptdico

retculo endoplasm tico

cadena polipeptdica MHC de clase I

Figura 23-50 El problema del pptido transportador. Cmo pasan los fragmentos peptdicos fabricados en el citosol hacia la luz del ER, donde se fabrican las molculas MHC de clase I? Se requiere un proceso especial de transporte.

Los transportadores ABC codificados por MHC transfieren fragmentos peptdicos desde el citosol hasta la luz del ER 33
Como se seal en el Captulo 5, en el citosol la degradacin proteoltica se lleva a cabo principalmente por un mecanismo dependiente de ATP y de ubiquitina que acta en los proteosomas, los cuales constituyen grandes complejos de enzi mas proteolticas construidas a partir de subunidades proteicas muy distintas. Aunque probablem ente todos los proteosomas se encuentran capacitados para generar fragmentos peptdicos que se unirn a las molculas MHC de clase I, se cree que algunos de ellos estn especializados en este objetivo debido a que contienen dos subunidades que estn codificadas por genes localizados en la re gin crom osm ica MHC. El m ecanismo mediante el cual los pptidos se transportan desde el citosol hasta la luz del ER se descubri a travs de observaciones en clulas mutantes en las que las molculas MHC de clase I no se expresan en la superficie celular sino que se degradan en el interior del ER. Los genes mutantes de dichas clulas pro porcionaron las subunidades para codificar una protena perteneciente a la fa milia de los transportadores ABC, que estudiamos en el Captulo 11. Esta prote na transportadora se localiza en la membrana del ER y utiliza la energa de hidrlisis del ATP para bom bear pptidos desde el citosol hacia la luz del ER. Los genes que codifican estas dos subunidades estn en la regin cromosmica MHC, y si algunos de estos genes es inactivado por una mutacin, las clulas son incapaces de suministrar pptidos a las molculas MHC de clase I. El hecho de que en estas clulas mutantes las molculas MHC de clase I sean degradadas en el ER sugiere que normalmente para que las molculas MHC se plieguen y/o en samblen de forma apropiada, han de unirse a pptidos. En clulas no infectadas por virus los fragmentos peptdicos provienen de las protenas citoslicas y nu cleares normales que son degradadas en el proceso de reciclaje normal de prote nas; dichos pptidos se transportan a la superficie celular por molculas MHC pero no son antignicos debido a que las clulas T citotxicas que deberan re conocerlos han sido eliminadas o inactivadas durante el desarrollo de la clula T, tal como veremos ms adelante. En la Figura 23-51 se muestra un esquema

132 4

Captulo 23 : El sistema inmunitario

clula T citotxica clula diana

RNA vrico cubierta del virus ENDOCITOSIS Y ENTRADA ALENDO SOM A endosoma endosoma protena vrica interna

RECONOCIMIENTO POR UNA CLULA T CITOTXICA TRANSPORTE DE UNA MOLCULA MHC DE CLASE I CON EL PPTIDO DE UNIN A TRAVS DEL GOLGI HASTA LA SUPERFICIE CELULAR

ensam blaje de una m olcula MHC de clase I con un pptido de unin

FUSIN DEL VIRUS CON LA MEMBRANA DEL ENDOSOMA Y SALIDA DEL RNA VRICO HACIA EL CITOSOL cadena a de la MHC de clase 1 \ P2 -m icroglobulina

REPLICACIN Y TRADUCCIN DEL RNA VRICO protena vrica interna

LA UNIN DEL PPTIDO A LA CADENA a ESTABILIZA EL ENSAMBLAJE DE LA CADENA a CON LA fc-MICROGLOBULINA; EL COMPLEJO ES TRANSPORTADO HASTA EL GOLGI

transportador ABC

PROTEOLIS1S DE ALGUNAS MOLCULAS DE PROTENA VRICA POR LOS PROTEOSOMAS

<r>
proteosoma

TRANSPORTE DEL PPTIDO HACIA LA LUZ DEL ER

general de cmo se procesan las protenas vricas para su presentacin a las c lulas T citotxicas. Cuando se activan las clulas T por un antgeno, segregan varias molculas sealizadoras, incluido el interfern- 7 , que intensifica notablemente las res puestas antivricas. El interfern-y induce la expresin de muchos genes de la re gin crom osm ica MHC, incluyendo los que codifican las protenas MHC de clase I (y de clase II), las dos subunidades de los proteosomas, y las dos subunidades de la bom ba peptdica localizada en el ER. As, toda la maquinaria que se requiere para la presentacin del antgeno vrico a las clulas T citotxicas entra en accin de forma coordinada mediante el interfern-y, creando una retroalimentacin positiva que amplifica la respuesta inmunitaria y culmina con la muerte de la clula infectada.

Figura 23-51 Procesamiento de una protena vrica para presentarla a las clulas T citotxicas. Una clula T
citotxica destruir a una clula infectada por un virus cuando reconozca fragmentos de una protena extraa unida a molculas MHC de clase I en la superficie de la clula infectada. Aunque no todos los virus entran en la clula por la va que utiliza este virus de RNA recubierto, los fragmentos de las protenas vricas internas siempre siguen la va representada en la figura. nicam ente se degrada una pequea proporcin de protenas vricas sintetizadas en el citosol, pero es una cantidad suficiente para atraer y sufrir el ataque de una clula T citotxica.

Las clulas T citotxicas inducen a las clulas diana infectadas a destruirse a s m ism as 34
Cuando una clula citotxica ha reconocido un pptido vrico unido a una m ol cula MHC de clase I en la superficie de una clula diana, su trabajo consiste en destruir a la clula antes de que el virus que da lugar al pptido pueda producir nuevas partculas vricas que puedan salir de la clula infectada. Si se marca una clula T citotxica con anticuerpos anti-tubulina, en el momento de destruir su clula diana, se observa que su centrosoma se orienta hacia el punto de contacto con la clula diana (Figura 23-52). Por otro lado, el mareaje con anticuerpos muestra que en el crtex de la clula T en el lugar de contacto se concentra talina, una protena que contribuye a unir los receptores de la superficie celular con los filamentos corticales de actina. Se cree que la agregacin de receptores de la clula en el lugar de contacto conduce a una alteracin local, dependiente de talina, de los filamentos de actina del crtex celular; entonces, un mecanismo de pendiente de microtbulos desplaza el centrosoma y el complejo de Golgi aso ciado hacia el lugar de contacto, enfocando la maquinaria de destruccin sobre la clula diana. Se ha observado una polarizacin similar del citoesqueleto cuan do una clula T colaboradora interacta funcionalmente con una clula diana. El mecanismo por el cual las clulas T citotxicas destruyen sus clulas dia na no se conoce con certeza. Al parecer, utilizan como mnimo dos estrategias,

Las clulas T citotxicas

1 325

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que al parecer actan induciendo a la clula diana a llevar a cabo la muerte celu lar programada (tambin denominada apoptosis, vase pg. 1257). En una de es tas estrategias, la unin a una clula diana estimula en dichas clulas T citotxicas la liberacin de una protena formadora de poros denominada perforina que es homologa al com ponente C9 del complemento y polimeriza en la clula diana de la mem brana plasmtica formando cadenas transmembrana. La perfo rina se alm acena en vesculas secretoras y se libera por exocitosis en el punto de contacto con la clula diana. Las vesculas secretoras tambin contienen serina proteasas y otras protenas, que se cree que juegan algn papel en la destruccin de la clula diana, quizs entrando a la clula diana por los canales de perforina y induciendo la muerte celular programada. Por el contrario, la segunda estrate gia implica la activacin de un receptor de la clula T citotxica en la superficie de la clula diana, lo cual sealiza la clula diana para llevar a cabo la muerte ce lular programada.

Figura 23-52 Clulas T citotxicas durante el proceso de destruccin de clulas diana en cultivo. Las clulas se
observan por microscopa electrnica en (A) y (B) y por microscopa de inmunofluorescencia tras la tincin con anticuerpos anti-tubulina en (C). Las clulas T citotxicas se obtuvieron de ratones inmunizados con las clulas diana, que son clulas tumorales extraas. En (A) y (C) se muestran clulas T unindose a la clula diana y en (B) despus de haber destruido la clula diana. Al contrario de lo que ocurre en una placa de cultivo, en un animal la clula diana destruida debera ser fagocitada por las clulas vecinas en lugar de desintegrarse de la forma que aqu se indica. Obsrvese que en la clula T, el centrosom a y los microtbulos que irradian de l estn orientados hacia el punto de contacto con la clula diana (C). (A y B, de D. Zagury, J. Bernard, N. Thierness, M. Feldman y G. Berke, Eur. J. Im m unol. 5:818-822, 1975; C, reproducido de B. Geiger, D. Rosen y G. Berke,/. Cell. Biol. 95:137-143, 1982, con permiso de copyright de The Rockefeller University Press.)

Resumen
Las clulas T citotxicas destruyen directamente las clulas diana infectadas que exponen fragmentos de protenas microbianas en su superficie. Algunas de las pro tenas microbianas que se sintetizan en el citosol de la clula diana son degradadas por los proteosomas, y algunos de losfragmentos peptdicos resultantes son bombea dos por un transportador ABC hacia el lumen del ER, donde se unen a las molculas MHC de clase I. A continuacin, los complejos peptdicos-MHC son transportados a la superficie de la clula diana, donde son reconocidos por clulas T citotxicas. Se cree que dichas clulas destruyen las clulas diana infectadas inducindolas a lle var a cabo la muerte celular programada.

Clulas T colaboradoras y activacin de las clulas T3 5

A diferencia de las clulas T citotxicas, las clulas T colaboradoras no actan directamente destruyendo clulas infectadas o eliminando microorganismos, sino estimulando a los macrfagos para que resulten ms efectivos en la des truccin de los patgenos, y colaborando con otros tipos de linfocitos en su res puesta frente al antgeno. La importancia decisiva de las clulas T colaboradoras Captulo 2 3 : El sistema inmunitario

132 6

en la inmunidad se ha puesto claramente de manifiesto de una forma dramtica por la devastadora epidemia del sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). La enfermedad est causada por un retrovirus (virus de la inmunodeficiencia humana, HIV, de Human Immunodeficiency Virus) que reduce el nme ro de clulas T colaboradoras por un mecanismo desconocido, daando as el sistema inmunitario y haciendo al paciente susceptible de contraer una infec cin por microorganismos que normalmente no son peligrosos. Como resultado de ello, la mayora de los pacientes de SIDA mueren a causa de una infeccin al cabo de varios aos del inicio de los sntomas. En esta seccin estudiamos cmo las molculas MHC de clase II de las clu las presentadoras de antgeno adquieren fragmentos peptdicos de las protenas captadas por endocitosis y los presentan a las clulas T colaboradoras. Ms tarde discutimos la multiplicidad de seales que se requiere para activar las clulas T colaboradoras y cmo dichas clulas, una vez activadas, contribuyen a activar a las clulas B y a los macrfagos.

Las clulas T colaboradoras reconocen fragmentos de protenas antignicas extraas endocitadas, asociadas con protenas MHC de clase II 36
Antes de que las clulas T colaboradoras puedan ayudar a otros linfocitos en la respuesta contra el antgeno, primero han de activarse a s mismas. Esta activa cin tiene lugar cuando las clulas T colaboradoras reconocen un antgeno uni do a protenas MHC de clase II en la superficie de clulas presentadoras de ant geno especializadas, que se encuentran en muchos tejidos. Estudiaremos estas clulas con detalle ms adelante. Como en el caso de los antgenos vricos presentados a las clulas T citotxi cas, los antgenos presentados a las clulas T colaboradoras por las clulas pre sentadoras de antgeno son fragmentos de degradacin de la protena extraa, que se unen a las molculas MHC de clase II exactamente de la misma manera que los pptidos derivados de virus se unen a las molculas MHC de clase I. Pero tanto el origen de los fragmentos peptdicos presentados como la va que siguen para encontrar las molculas MHC, son diferentes de lo que sucede con los frag mentos peptdicos presentados por las molculas MHC de clase I a las clulas T citotxicas. En lugar de obtenerse a partir de protenas extraas sintetizadas en el interior de la clula diana, los pptidos presentados a las clulas T colaboradoras se obtienen a partir de microorganismos extracelulares o de sus productos, que han sido ingeridos por las clulas presentadoras de antgeno y degradados en el entorno acdico de los endosomas. Estos pptidos no tienen que ser bombeados a travs de la membrana porque no se originan en el citosol; se han generado en un compartimiento que es topolgicamente equivalente al espacio extracelular. Nunca penetran en la luz del ER, donde se sintetizan y ensamblan las molculas MHC de clase II, sino que se unen a los heterodmeros de clase II pre-ensamblados en un compartimiento endosmico tardo. Una vez se ha unido el pptido, la molcula MHC de clase II altera su conformacin atrapando al pptido en el sur co de unin para su presentacin a la superficie de las clulas T colaboradoras. Para que la presentacin de pptidos derivados de las protenas extraas ex tracelulares sea efectiva, las molculas MHC de clase II recin sintetizadas no han de unirse prematuramente con pptidos derivados de protenas sintetizadas de forma endgena en el lumen del ER. Para que no se produzca esta unin pre matura, un polipptido no polimrfico, denominado la cadena invariable, acta por lo menos de dos formas. Primero se asocia con heterodmeros MHC de clase II recin sintetizados en el ER de tal forma que impide que se unan a otros ppti dos en la luz del ER. Segundo, dirige a las molculas MHC de clase II desde la red trans del Golgi al compartimiento endosomal, donde la cadena invariable se li bera por proteolisis, permitiendo a las molculas MHC de clase II unirse a los fragmentos peptdicos derivados de las protenas captadas por endocitosis (Fi gura 23-53). De este modo las diferencias funcionales entre las molculas MHC

Clulas T colaboradoras y activacin de las clulas T

1327

clula T colaboradora
clula presentadora de antgeno antgeno proteico plegado ENDOCITOSIS Y ENTRADA EN ELENDOSOMA RECONOCIMIENTO POR UNA CLULA T COLABORADORA LIBERACIN DEL COMPLEJO PPTIDO-MHC DE CLASE II A LA MEMBRANA PLASMTICA PARA SU RECONOCIMIENTO POR UNA CLULA T \ COLABORADORA

Figura 23-53 Procesamiento de un antgeno proteico extracelular para su presentacin a una clula T colaboradora. Una visin actual
de cmo se forman los complejos pptido-MHC de clase II en los endosomas y se liberan a la superficie de una clula presentadora de antgeno.

PROTEOLISIS LIM ITADA DEL ANTGENO PROTEICO + PROTEOLISIS DE LA CADENA INVARIABLE + UNIN DEL PPTIDO DERIVADO DEL ANTGENO A LA PROTENA MHC LA CADENA INVARIABLE DIRIGE LA PROTENA LIBERACION DE LOS PEPTIDOS MHC DE CLASE II HACIA DE CADENA INVARIABLE Y DE " ELENDOSOMA TARDO ALGUNOS PPTIDOS DERIVADOS com plejo DEL ANTGENO AL LISOSOMA de Golgi PARA SU POSTERIOR /, DEGRADACIN cadena invariable red trans del Golgi lisosoma

de clase I y de clase II se mantienen: las primeras presentan molculas que pro ceden del citosol, las segundas presentan molculas que proceden del espacio extracelular. Muchas de las molculas MHC de clase I y de clase II de la superficie celular de una clula diana poseen pptidos derivados de las propias protenas en el sur co de unin -para las molculas de clase I, fragmentos de protenas citoslicas y nucleares degradadas y para las molculas de clase II, fragmentos degradados de membrana y protenas sricas que pasan a travs del sistema endosoma-lisosoma. Slo una pequea fraccin de las molculas MHC de clase II de la superficie de una clula presentadora de antgeno estarn unidas a pptidos. Sin embargo, esto es suficiente para iniciar una respuesta inmunitaria, debido a que slo unos cuantos centenares de dichas molculas son suficientes para activar una clula T colaboradora, como unos cuantos centenares de complejos peptdicos MHC de clase I de una clula diana son suficientes para activar de una clula T citotxica.

Las clulas T colaboradoras se activan por las clulas presentadoras de antgeno 37

Al igual que para que una clula B pueda proliferar y diferenciarse en una clula secretora de anticuerpo y pueda funcionar, primero ha de ser activada, una clu la T ha de ser activada para proliferar y diferenciarse antes de que pueda destruir a una clula diana infectada o colaborar con un macrfago o con una clula B. Generalmente la activacin inicial de una clula T tiene lugar cuando reconoce a un pptido extrao unido a una molcula MHC de la superficie celular de una clula diana apropiada. Para una clula T colaboradora la diana adecuada es una clula presentadora de antgeno. Las clulas presentadoras de antgeno derivan de la mdula sea y com prenden un grupo heterogneo de clulas, en el que se incluyen clulas dendrticas con interdigitaciones en los rganos linfoides, clulas de Langerhans en la piel, as como las clulas B y los macrfagos que a continuacin sern las diana de la colaboracin de las clulas T. lunto con las clulas epiteliales del timo, que tienen un papel especial en el desarrollo de la clula T (se estudiar ms adelan te), y las clulas activadas de algunos mamferos, estas clulas presentadoras de antgeno especializadas son los nicos tipos celulares que normalmente expresan las molculas MHC de clase II (vase Tabla 23-2). Adems de las molculas MHC

132 8

Captulo 23 : El sistema inmunitario

de clase II, las clulas presentadoras de antgeno tambin expresan una segunda molcula de superficie celular, llamada B7, que juega un papel crucial participan do en la activacin de las clulas T, tal como veremos ms adelante.

El receptor de una clula T form a parte de un gran com plejo de sealizacin en la m em brana plasm tica 38
La activacin de una clula T citotxica o colaboradora constituye un com plica do proceso que todava no se comprende del todo. El heterodmero receptor de la clula T reconoce pptidos extraos unidos a molculas MHC de la superficie de la clula diana. Como en el caso de las clulas B, el receptor se encuentra aso ciado a un conjunto de cadenas polipeptdicas transmembrana invariables (de nominado el com plejo CD3) que transduce el proceso de unin extracelular a seales de activacin intracelular. Se cree que el complejo CD3 activa uno o ms miembros de la familia Src tirosina quinasas, incluyendo la protena Fyn, que fosforilan varias protenas celulares, incluidos los componentes del propio CD3 y la enzima fosfolipasa C-y, la cual activa la va de sealizacin de fosfolpidos de inositol descrita en el Captulo 15. En la Figura 23-54 se comparan los receptores de las clulas T y B y sus cadenas polipeptdicas asociadas. La activacin de las clulas T no se produce nicamente por la accin de los receptores de la clulas T y el complejo CD3. Tambin juegan papeles importan tes una diversidad de correceptores. Ya hemos visto los correceptores CD4 y CD 8 y tambin se han definido sus asociados Lck quinasa y algunos otros. En el proceso de activacin de la clula T parece que dichos receptores y correcepto res, as como sus asociados, las tirosina quinasas similares a Src, se ensamblan formando un gran complejo de sealizacin en la membrana plasmtica de la clula T. Sin embargo, incluso este gran complejo de sealizacin es insuficiente para activar por s mismo a la clula T colaboradora: se requiere otra va de sea lizacin independiente.

Para activar la clula T colaboradora se requieren dos seales simultneas 39

Para activar la clula T colaboradora, una clula presentadora de antgeno ha de proporcionar como mnimo dos seales. Ya hemos visto la seal 1: la suministra un pptido extrao unido a una molcula MHC de clase II de la superficie de la c lula presentadora, que activa el complejo receptor de la clula T ilustrado en la Fi gura 23-54A. Dependiendo del tipo de clula T colaboradora (como veremos ms adelante), la seal 2 la suministra tanto una seal qumica segregada, como la interleuquina-1 (IL-1), o bien la molcula sealizadora B7 unida a l