Texto Ilustrado de Biologia Molecular e Ingenieria Genetica2

TEXTO
flUSTRlBO
DI
Biologa Molecular e Ingeniera Gentica

Concenos. Tcnicas y Aplicacion(:S en Cienci.1s de la Salud
TEXTO
ILUSTRAD O DE
Biologa Molecular e Ingeniera Gentica

Conceptos, Tcnicas y Aplicaciones en Ciencias de la Salud
Jos Luque Cabrera

Catedrti('tl de Universidad
Angel Herrez Snchez

Proflsor TiiUiar dC' UniveNidad
Ocpanamcntv tk Bic.J.qumka y Biologa Molecular Universidad de Alcal.i AlcJij de llenares. Miidl'it.l
GLSE.VIER
\ 111\lnd 8fi1\JCIVna Atlb4fnlam l~tllll Fila.leiiM I..Qml:l:" C)rl.lndO 1~ Rwm Sydne} T)).:i< Tcorun1n
ELSEVIER
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A nuestros alumnos, Inspiradores de <Hite estucrz.o.
A nuestros compaeros profesores, Montse, Cristina. Jos Carlos,

Pilar y Ana, por su confianza y apoyo continuos.
A nuestras familias y amigos, por su comprensin
y por el tJempo que han cedido.
Prlogo
En la Preseotaclon de e<ste libro. QUe tengo el honor e prO!oJar, bs au~res c1rman que prelenden reunw los~ cep!os actuales de ta Blo4ogla Molecular y las modemas metodologias de la lngenleria Gentica con \1Sta& a su apkactn
a la Pa10109la MQiecu\a.r, human<1 y li'W"al, en 514 divettOos ou;peciQI'; eti()IQg:it', fisiopa!Qiogi.-. (l!agn$lti;Q PI'Qt'f;boo, \Ora?utiea y preVGnO!On do 1~$ toltl'f'l'IO&k<Je$, y pr()IYIQCi()(l cte: ltl salVO Y pretenaen ~riQ (fe$(Se una petSpe<:ei~ pl1.1ridi$Cipli~r e inl~<Jom dif9a, tuncsatncnlalmerue. a lOS estudiatltes qve cursan las llecnOifi.IUtas de Faunacla,
Modieinl), ~OIOQII.l y Veletlnarla, y 18$ orlen1aoooes blosanll.atfas de Biologa. Bloquimtca '1 Oumca. Se Itala, sin dv(1() , dO IJt1t\ e<npresa l.at\ opon~ \' ambkx:l6a, como ~ y dHicit Peto, a la VIsta del resutUI aleanZaao, puede
ofitmt'rGO que: .. ew:ito M Sido tolat
La elaboracin 00 un texto de lascara~enS1icas m9nciol'adas 9$ oportuna '1 nece<saria. En los Uhimos deGenio&, la Blolog1a ha experimen~ado t.n pt000$0 de progresrva 'moleculanlacn' qoo ha oonauc;~do a un nuevo p.mu;ltgma blolgioo QVa trato t ontond41'r k.> qvo $0 1\3 <lonomin&oo '1.3 ~ dv WYMI~ (F J.oeob. 1970) <>IN motoMI IOQie 01 <he IIVU'IQ state (A. l. LEM!nger. "Biochemistry", 1970) ~ las bases moleculares sul1yacentes a los procesos biolgfoos El ~ee~ente de$ci1ramento c;lel gen<>m3 00 diV91$0$ OIQar.$niQ$, y mvy O$I)OQ;;t!rnon1c da! gonorn.'\ humano_constituye una ct~ tur,(larr~enw que M <le halar w oonunuldBd en el no n"'e((OSirnportante estudio de aos proteomas. Sigutel'ldO los pasos de la Slologla. la Medclna y fa Ve1erlnana estn experimentando un proceso de ''tnolecu!arlzacln creciente que ha ttecho emerger la que se ha flam&do Patologia Molecular. Hoy en dia. el rwvel molewlat no es soto un rwel de in vesttgadon biomdica. sino t8ITiblOO un nivel de acumcin diagnsuca, pronstlca y teraputiCa. Por ello. es !mptesdn dlble preparar adecuadamente a bs hJturos proJe&IOflales de la salud, ya que. slo s disponemos de profesiOnaleS oompetootes podremos ha<:er treme oon l01o a los retos deoJ futuro. 8 ejerCICIO prof~al de los anos venideros exglr oompeleflCm para abordar a niVE!I moCecular los prob'ema& de la salud. Por elo. harn falla protesiona!es que poseen lOs ooncoptos y los o~ontO$ do l(ltlgu;,Je molcc!Aar neoee~ p."'ra oompronder la& ba$$5 moleculares de la salud y la en termeclad. Protes1ona1es ~es <le a<lqu,rir con$tantemetttC ta in!Ofm&en biOQuim<;t~ necmn<.'l p0ro mat~~of'IC:r :;u com petencla, y ca~oes de aplleat diCha lr'lf.Orm3Cf(ll'l a lll $01uein de 108 problemas QUIO les <::onoeman_prolesront~!es con ~ida<::! do aviOC'IptCI'ICiiUI!* o.a.r<l ~Cior StAti1uir IO$<::OI'ICOI)IOS caducO$ >Of 10$ nuevos. hacieodo uso de todas las posi bilidades Que tas m()defflas toetlQiogfas oc ta il'lfQn'na(in ~n t1 su ale31'1e0 P<ua ktiQrmaQf'l bilseca t tale& protesiooales l!enel'l gran vatOt tos tex!Oe que: resumetl toa nuevos elemenl<lS eot~eepluale$ de tas di>lff$~ flnt3$ de la Slologia un1o a las oonesporeflleS tfCr.cas y metOOOiogas; ya que t:)efmuen que estudian1e eaquier3 ufl..'l base $(11idn a pa111r de la cual podr ampliar bs conocirTH~lOS acudtendo, luego. a las monograllas especa!ilada$, a las fevsiQr\0$ o. lf'ICiuso. a 106 a.nicutos orignWes. Por lodo eto. y pot abarcar un campo hasta ahOra insunclentemen.te cub1e11o. con S.dMIMO$ QVO la obra~ JQ:s l.oot.lo y ngel Hlvrilez tespcnOO a una neoet;ldact urgente e wnponante.
NIOta bien. como hemos indicado, ia emptesa no era naoa lli'leil. Y no 10 a po( su catactet de ()brll 1)6&.ea, dirigi da a e5tudiantes de "'anal> lioenc~aturas y. por taniO, con fotmacio dtvefsa, y por su pt~ensln oe seguir un ~rat~m.en1o do los ternas integral y moftidt~r. los autores pte<~endlan Integrar lo conceptual, lo teci'IOk>gloo y lO aPliCado, abor dando to esoocial y rechazando. en roos de la daridad. Jo complejo y no bfen es.tab\eoeiCio. Es e~o ~ 0$10S obie INOS reQI..M.Itian, PQI parte de los atllores, lanto un oonocrn!entoprotundo yaciJJa!lzado ~k>$ c;liWtt$(1$ tomM tr;.tados co m1ca y B10tog1a Motea.Mr. y un conoci"*"o do mo ~ conocirr.eo amplio y completo de tos contet>os de la e.oq..,1 lOS contenidO$ rormaliVO$ de las diversas hcenaatu1as: a la VE"Z que e>~g!an una gran capaclao Oldclica. Sin Ol.l:ftl. la prolol'lg!WiA e inten$a d&dieaort do lo.$ autQft$ oa tea dioooncia urwer&ltana ha Sido un factor dOOSI'/0 para CUif'tW'Ial con JCAo la efl'~Clre$8 BCOmectda. El ~locto oe ttt\bbjo 5e9Jid para 1a elaboracin del teXIo. e<sde la recogida de la inb macln lno.aJ a la (eviSlOf'l: l'inal de Cllda cap(!ulo, c~iMdO ftl cuonr ll'l; obt;orv<aciof'IK y sugerencias de toe ptOfesore$. especli&lista.&, dOCiorando& e a"tCiuso estudiantes de llcenclatwa que lo Nlt anRIIUIOO, tl;'l oonlriblf!OO, !amblen s.n <M~a. a 11'.1 4'm;:Gfencm ele la labol roo'il:ada, Excelencta acrecen4aa por el&::et1adO trata~to vi$ool quo se ha hecho de la in f0fm3<:in prosonlod<t
El'l re$Url'len. el "Tcucto lfuSirado d& Biologfa Molecular e lngenlerfa GeMtle:a~ de lOs ProtHOrC$ JO$!) 1.~ y n gell'ietrleZ C$ una Obr'& ai'I'Qciosa. muy bien reallza.da y Que ha de sef de gran utlrdad pata la fOt'l"naeil'llonto oe ta omplia gama eJe et!udian!e$ 3 Quifne$ va 6rigi<lt~ como de los prole6Kirulles de la salUd que oesee-n aetu31iZtlf $U$ conoe#n1en1os en li'\Ode los campos mas lrni)Or!MtO$ dt ta octvt~l biomecicina. Es por- lodo elb. que ha SI paf6 mi IM'I hOncx y una satlsfacon nx:Sacltll 0$13$ lineas oomo Prologo.
PAOF. JOSE CAAREAA$ ~
U!i!VERSIOAO OE BAf\CELOtl4
OtctEUGAE 2000
Presentacin
OBJETIVO
LOS 3v3JIICC$ y ili)IICo'(:iOI'Ie$ de 13 inves1lgac::Ic'l bloquiiTIICa y genbca ocupan hoy dia una poSicin pnvleglada en el e:u'l"fX> <:le las CienciaS de fa salud en general y en la Farmaaa y &ome6cina en parbcular. Se vi&tumbra en loo albores del SJgiO XXI una tendencia hacia el erlfoque molerulat de la enfermedad, oomo referen10 ll1mo en la in!etpre13CI6n d9
lOS pr"OCeSOspat<liOgtOOS y como non:z~e de nlH.Mls estra~ di;t,gn3tJc$$ y lcr\'tpuhc:b$ b\l$lldo:'l$ en dichO$ &v81'100$
Pota d<lr r~pue~ a t:Sta Slluacin se requiere U!\8. adecuada preparaCiOC'I uf\1\'erSitana, k) que ,._.suflca el desano-. lo de1 presente pro19CIO un libro de etO que f.a(llile .la &dqul!liCitl oe una forrnaciOn oS(Ca en et area de Sl~ogfa Mol~u tat, f.l'l. enfOQUe est1\IC1ural y lndlm.enslonal del matenal gE!(ltico y de los prod~os gniros, asi oomo en la In gen.ierla Ge-n-Uea. et1 un s:emldo amp10 18 mocifiCae)n de dicno material en beneficio dE't la 6atOO o oe la tecnoe:: P01 su glllll slgnl!lcado y su potencial futuro. esw cbclplina.& ya se (tl'l5ef\an, CQtl mavor o menor pra!undidad, en las liovnclatutaa con responsabilidad dfrea o mdi~a en la sanidad {Farmacaa, Med,ON. Odofl~ia y Vo~nnan-ca BIOiogia, ~mtca y Ou1mlca) y en detemunadas d!plomatt.ras (Enfermeria y Fi~r~J Con el fin de contribuir a esta forma~ <:i(ln, $e oropone ul'l enfOQue adaptado a la realidad, aseQUible a todo e&t alumnacb. QU8' pueda fecilnar el proc.eso de e:nseflanza y aprendtzaje de tan in"CX~rt.an1es y noveclosa.s malefas en un tea de conoctmento en wntinua elQ)aflSIn.
P LA N T EA~ li ENTO
Para oat cumpllmiento a este objell'o'O, el libro se plantea bapo una lnple verJ!ente. Conceptos
~ la Vilnrcdad y p&ft!Cularidao&s del elum~<b al eve (llrigl(j& la Obr~. ~ ~ J)~l() 1,11'1 e~ltl$i$ OSPectal Oti lO$ tundarTMJntos. COmut'lO$ ()(Ira !OCios S. ~ten con ~ill~. avnQtJe con 01 ngor CIOI'I(jliC:O eJCigidO hoy di<t. lns bolsos torlc:as irnproscil'll1b.\O$ para OC)mpr~ la matOO!I y ~a CIC$MOIIar y ~ Ocn1tllt:l o pro!C$tOf\)ltnOn!e lll toonologlt' dcriv.a(ffl <t~tc:st.os eoneeptos. se Pcu~ode un llbi'Ovalido para cooOO&f' de IOJma adecuada y SV!u::ien'e la &olog~.t.
MoiOOI.I.af e lngonieria Gon-tict~ $in toncr Q1.0 a~ a l)l'ltl. o-coSi'va, y a veQH ~nt~ewsaria, Aspectos tcnicos
~C~oci6lilaein
La metOCJOtogia deftllada O& ra BIOIOgia MOieetMr. y eo espeCia! ae 1a tngenierla Gen&-11ca (iniCialmente !itM&CJa a la tecnologfa del ONA teoomblnaote). se ha ex.lendie-Jldo con etlle~ a !lnes IT'AI)' d.\ersos (als&amienco_e1on~in, hiDhGtacion, secuenaadon, ele.}. para dar lugar a. una 8iotecn010gls ~~ . tm'l!no que eo Cierto 1'1"1000 pootia ub !Izarse como aJiemaliva a lngt/e(fa GeMtielt et1 el Ululo~ lib10. De ah1 Que, bajo un P\.IMO oe '1418 IOdnt\lwo. n00$1.10 segundo objetiVO consista en esWOiar tos principios de Jos m&lodos y ccr11ca:s mas comunes. aqullos de 1'1\a.yor ttnl)a(tO y U!!l+dad en la -'YeStt9'1-Cin bsca y en ellaboratOOo d(Nco. La de9Crlpd00 y aplicacin concrew ae las vartan~ tec-no)glcas. metodolgicas o nstrumenta!es. cada vez m-s dNerc..as y en rnodiicadon constante, debe soer relegada tos periodos oo doclorado o de especaallzac!n profesional en reas dellaboralorlo dinlco. entte ottas, prloclplOO'Ienc eM
w-a
Aoisis C,inicos o en Bicquimica ctinica y Pa!ologia Motecula!. Aplicaciones biosnnitarias La a.ok>g;la Molecula e lngeoieoria Getkl!ciea h8 OOMribuiO a lf':SOivet prOl*!tntt$ de cout~c!ttr lnv$\IJ<:II (Ohm!naQf\ de x.enobihcos o tesldoos), agricola y ganadero (meJOC'a gentiCa y aimeniO$ lrMsgnico;). tias ~:tplic;aCfOiloQ$ en Far maoa. Modiooa y Vetennalia, que se centran en la lucha oonua ta f!fllermeded runaoo y anlmal ((l'liOIQgf:l, 1)3!QgOI'Ii&, d~;~.gn6boo, tratamranto y prevenon) y en la &lnte&t& <S& mo6oculas con l!nes terapvlloos. ya han rendlclo sus pNmeros lMOG. e~ extraordinariO avance ha d!lOO 1uga1 a una ser;e ce lfm.oos QtJe, en Qe!tCJ'81 ncluyon tf proJio tJ(Q. o el ad,otivo mofOCVIat. Como 1Presefl4al!vo e 40dos ellos se aoep4a hOy el ttm!no Blomecllclna o MeOcna MOl~' c;Oc'l>siderado de una torma amplia como una 'ViSin molecular' de \Odas tos aspeS relacionadOS eoo la enU.l!medad
CARACTERSTICAS
Trotaml(mto Integral
vmultidi&eipllnar
Se na. btJ9C8do integrar las tenieas y~~,_ con 10$ (:O(Icq>!Ot. abofdando lo esenoal y fechazat~OO, salvo excei)CtCW'IEis, lo cof'I'IJ)Iejo o no bien estabteciOo, relaCionandO cacta nuevA iNormae-n <:Qn lo d$c::vlido en ()(ros temas y con bs mbitos bioqulm.oo. genelioo. quimtoo. fslologlco. anatrtlco, e1e. Asi 10 sugiere kt insuhciente o de&pfopotaena
xu
da preparacu)n re<:lb!da el'/ ocasiones por el alufl'WIO en matet'laa bralcas preVas, la InClusin de la Blologfa ~ular e lngernetra Genetica dentro de una disciplina de Bioqulnvca Genera!. w lmpart:cln en programas vat1ado6. en cursos dis.tinto6, con un numero llmilado do crdhos doc:ren:95. eet: Se ha lnten&ado propoccionar al libro un derto carc! outnomo. ~<1ble al ri!Jno, nivel y s!tvecill de cada estudio patticolar. Ello no ob6ta. muy al oonuano, para que deba seguir ffeOmMddndoS4 lo oonstlla di) la bibiografia espttcifk:a y. sobre todo. do lO$ excelentes llbtos de texto clls~ hQy dia, oon un abaNeo y tr:Uai'IW:1o de tos tema; difetente$ n1.1ostro,
Di seo v isual
Como aspecto ms elgnlllcawo. y para facl!tat la caracterlstica aotenor, el !lbro &e apoya en un tratamiento lli8ual, original, oon proluan e esquemas y figura& Pftldoi'IW\al'ldo &Obfe un te.xto lo ms dato y sencillo po&bkt. Como con &ee~.~encta. las ilustraciones deben considerarse parte lfltegrame del lelOO por ro qU&, en contraste oon lo habl~uat. no son aladas en ste n tlen$n \oW1 pie o tiUo de$<:rip1ivo, E16eclor debe aCOG1umbrNW a. eJO'amkw la figura cuando llegue a ella, pus~ la PO:sioiOn de $Ct\ etn la P6gin~ Qf oO:Jcl1rnente .1<rJll~ qvo re OORe$pOf\<le on lo lectura (salvo contada& ex oe()CIO~ debid3$ 31 t3mat\O de la figura. Pi)r ocra pane, se hace un oso extensiw> del COIOf, no $010 p::trO! aumontat el :wacuw dO las i!u!ltraeiones. sino para tra~!r ~ inrOMCin: por eje~. el Ollf!MO <lb.llaCJo y et te,xto fel~tiYo a l companen color. Los <fibufO$ ton Otiglrude$ en su conoepcln y pretenden la lntetpreta('j()n ~ea de ~l'le'S que pore-set~to reaul!an a veces complicadas o tedoaas. o de lOs dibujos 'f esquemas de ottoe autofes. Se pef9i9ue un cataclerln:Uitlvo. que t.clllfe te comprensin y mowe al alumno al estudio detenido oe la matena. al tiempo que enriquece la exposac:ln. Serta dese&Die qt~e as.1e esfuetzo ptdefa servir para vencer la resistencia actual del alumnado a la con tk.lfta y corwaste de las fuentes tibllograflcas. peta ocwwe.ncerlo de iO anti!KWers!lsrto del uso Indiscriminado e 1os apunle$, propios o ajenos. oomo I'llca fuenle de Wormacin. Como es;imtAo adicional a esta enfoque. ta Editooal tam bln ha ttatado de lograr m precio universitario. Termtnologla
Se hanlirMado la& palabras i~ y .sus trfi~otionGl oxot$ivatnen!O ilor<'ltS, ompleandO 10$ trmlnos Ga$10113 nos wds.tentes. A. pesar de ello. la dOfOcin d ta~nos M ~ <1t 13 equrvarenOia 1ng1osa, CUIU'I($I) 6sta O$ de uso muy extendido en las fuentes bibliogr;Jflcas y, especiBnen!e, ci.IM<b petmite c:o~ndcr 10$ acrnimO$, A eS4o respecto, hemos. dooidido utiiz.ar o.x.ttu:swAmOI'IIW lo$ a.crnimos ingle$9$, .VJO $U u$10 ~tonsivO en toda labibliOgr.tlia y en el Sertguaje cientlfioo hablado; nos parooe. I)Or titmP'O. ~~ betle escasa utlllda que .. alumno conozca la RCP', cuan do en todos los. :)'lornos ~iO"** en que te pueoa movef en et tuwro se enconttar ooo la 'PCA'. Como oonse cuencaa ms llrunatrva o. G$'10 criterio. lo$ 6cldo$ nuelcieo$ 1'10 se llaman ADN y AAN, SinO ONA. y ANA.
E.nfoque a organismos eucarlotas Nuestro tratamiento de la ma1eraa uende a reooge:r et mximo de inlormacin posible, aun dispersa y t$CC'!Sil en ottas !uentee. relatfYa a mamlfel06 en~ y a humanos en particutar. S9 ~iondo . pOc' qetnplo, quo dobo p(:lntt$0 ms. OOfaSIS en el cromosoma l"oumano y sus a!l0t8Ci00et: Que en el m~mo de accin de tas ONA po~merasas de Esdlerichia <OH. Obvlam(ll'ltO, no $4 rCI'\Uf'lda a 18 QfBn riqueza oe COIM)Cimlentos aleaMada en procariotas '1 Vln..s. sobre lodo Qlando Nl.al n~m'laQIOtl os e~ndal para comf)(ender ptocesos &eocos o de inters analitlco en eucaotas. Orlentacl n El oon~enlcto se deSanola pensando en las orientacion&S bi0$31'1il6tia$ que J)OSiblement.e mas reqW!(en del conOC*'niO'IO de los concepcos y tecnlcas de la BfotogM: Molecular e logenie<~ GentiCa~. avnquo, dados au amplitud y su turufo, en el presente lillt'o 90io pueden ap.ntarse las bases mlnlma$ necC$;arias para $u OOI~'C)fcn$in. Por vn l&QO, el diCtgnstico m01ecul6.r, ya de U90 casi ru!lnano en los modemos laboratorios dinicOf par<&. pof ejemplo, la preven eir1 prenatal. 1tt idenbllcadr't de Individuos ooo fines lorenses, etc. Oobo. no ob~10, Mllal~rW que no se !tata de un libro de Pal06ogla Molecular, sino un uooo bsico sobre lO$ OOtiiT'Iitneos neoeosarlos pata abotdar prooeeos palotglcos. Por otra parte. la ter apla moltec:\IIOir. o tralmionlo cte fulufo de ta en!ermedad basado en los avances. sobre moditicac:in gene!lca de la'!l clula$ (ku~ 96ftea}. el ooox:lmlentodelgenoma humano (genmlca) y, tMu 'o1go pi~. $u relaCIOI'I oon la lunctOClalidad do tu P")4tfnas (pro~).
Desarrollo del libro
EJ mtodo de trabafo :se ha ba$ado ~ una tola! COeSi))f''88bSdad y ooottlnaan ele ambo& autotes a lo largr> ero 511 oonsm..eein (en su ms esuiero ~iOo), en varias etapas dutan~oeoloG ;ati wt~~ro tuWs det su ge$taei00. se ha pet !Ido< tOCit\ 1a lntonnacln recogida prevlameme. oon fines dootontos. etc innumerableS ruentes (telrtos. libros especial ~. teviSiooes. artfcuoe origloo\ls, notas por50nal05. o!JC.). Cada tema, t...a vez tedaccada su primera versin. en oca siof'oeos a f)."lt1!1 \10 tr~ en grupo con estuciantes. se tadai)I lnOOtJ)O(ando las figuras originales elaboradas para 13 OC3$in e Incluyendo en ellas ~ ta informacin po$bhJ a eqei'ISA$ del teklO. En una segunda dicho lr.lbt.,io IIG h{lvls.o enrtq~.Jeeido. pedaggica y caentific<lrnet\'lo. potta lt\tlOt de rev19fn, observactonee nftlciosas y criticas rig\lrO$a$ ;~ttll~s por andguos alumnos, oclMI!IdO$. ~ pt~esores. irYVe&~:igadotes y prole510fl.'llo$. Por oJo, OQtl nuesuo profundo agraoocmlonto fos n()ITI()ros do estas personas aparecen ciUKkJ6 en la otlta
pa.
Revisin y asesoramiento
Revisores
Nos es grato hacer mencion oe1 esfuerzo generoso reatlzado pot' las pec"90na9 que han remado temas concre-;os (~e-~ libro, en algt.nO de tos motnentos de su elaboracin. A pesar de eMa OO!.abcM'aelon.la responsabilidad de los P<>Sbles etrO.<l$ e$ SOlO nue91ta.
Miguel Aguil01r Urbano
Protesoc Asoaado. Opto. Sxlquimic.1 v Biologiil MQioc:~r Univtrsid:ad Cle Crctob3
fTflfflM 12 )' r$)

Franc::iseo Javlet lvar ez Pachn Doe'!Or trt Farm3Ci~, 11\Cbstr'la latr'MCtJiica AJc:)! ~~ates (TemtJ 15)
Isabel Fabtegat ROn'ICfO Pro&e$0r>a Tlt~. Opto. BtoQui mlca y &ologfa MOieO!Aat u Universtdad Comp!uoonse de Madrid (T ema.s 20 21 y 26) Mu g;,ti'll Fornbndez: do C3stro Prolesor.'l Titc.A:l r, Opto. ~mica y &Oiogt~ MOitcvltu 11 Unlvtt"Sid310 ComplvlcnM de MoCiritl
(TcMW 20. 21
y 26}
Eduardo Arma Forreiro Cate<*'tiCO, I)pto, Bioquimica y BiolOgill Molecular Universidad de Aical
(Tema 1)
M Oolon:ts FcrnndQ Moreno PtoiOSOf'<) Titvtru, Opto BiOQumica v 8iologia Moleculal UniV91$idad <14 Alc:t~l rrem 4)
Esther FfHret Cebt lln
M Oolores de Arri;J.ga G!n4tr
Protewil Tcu\ar, Opto e.o<wimic:<t y BOIOgitl MOIOO!Mt

UnivetSidad de Ltn
/T>m~JS 2.
Profesora nUJiar. Opto. &oiog~ Ceh.W y Genbett

Universidad de Aleal
3 y 16/
(Temas 17 y lB}
At acell F'o mlnaya vage ProfaSOf8 Titular, Opto &otogla Celvlar y Genel.iCa UnivetSidad de Alc:a! (Tqn!iJ$ 17 y 18} Luis Franco Vera Catedrtico. Dplo. SIOQu!rTIICS y B10logfa Molecular Univer5tdad de Vale.ncl&
(Tema t9)
Mflogros e.,nostcrot Gont-'Jet

Pro!e50'a TittAa.r. Opto. Oui~ Aflnti1ica o lngcnioria Olllmic. UniV9ftidlrd d Alea!:\
(Tetn H )
M" Cat men Boyano Adnez. Profesora TtAat fmerlna, Op!o. BJoqulmica V 8i01ogia M<l'ac:ulaf Univer&rdad de A\calli (Tftm8.5 12 y r6)
Xot6 R. 8utt91 o
Ciontifi.;.o Ti!~rltu, (Afuro do tnvest~g<tcin del CnOOf UnivetsidOO do Sflit.nmca - CSIC (T""" 30)
Fom;~ndo Cllmcnt RoJTKO Cated't<O, Op4o, CienciQ:& Fi&dgtca$ 1 Univet$1dad do Baroelona (iema r3J
X..Wicr Fuentes Ar dc:criv Strvieio CIQ; e.oq.limi~ Ctinic~ Ciudad Sanitaria y OnivCr$1l3rl8 de Bollvi Hospitalel oe U01.'1Jega1 (Temas 28 y29)
J-uan Pedro Gard a Ballesta Ptoiesor Cle Jnve61lgacin. Cen11o de ~ Moleeulat "Se...ero Qoho.aK Uni~ Autnoma de Madnd- CS!C (Tema23J
u Dolores Delgado Vinar

Profesora TiMar, Oplo. 81ologia MOfecdar UnfYemdad de Canrabria
(iemas8 y9J
Jos Cark>s Diez Ballesteros Profesor Titular, Opio. Boqu(mlca yetologia Molecular Urwer&tdad d& Alcaia
{Tema 7)
Ana 1 . Garcia Prez Pfo4esora Tltutat. OpiO. S!oqulmlea y Biologfa Mott:eut.ar Universldad de Akala (Tema31
l.&arina Garin Ferrelr a Investigadora po6doctotal. Opt Haetnatotogy, tmpqrial Co!!ege Schod of Meoctrcne
Ham~mith Hospital, l.Ondre&
(Tema 221
XIV
Lu is A.. GonzJez Guijarro Jess Mendleta Gmez In~~ QOtltrJtat'JO. CfntrO <kl Bio!OQia Molecular sevctO OChOa: y Opto Fartna~ CStC y Uf'ri.vorsidad do AIC316 (Temas 6 y J4)
Jul io Mon1oya Villa.roya Pro1e90f Tllular. Opto. B~mlca y Biologa Motecutar y CelWt Unlvett>lclad de Zaragoza (Tema t9)
Pt-oCew Tit!A31, Opto. ~miel vS!OI(lga Mofular

Univet$idad de Abl
(T.,., 5)
Jos6 M. Gonui~ de Bultrago

Cateorlluc:o. ~. BloqulmiCa y Blolog!a Molecular y JefQ de Seccin de Sloquim~ca, Hosp~,al Un!vei'SICallo UolveNcW! de Satarnat)tG (Tnas28y29)
Pilar lnielta CAno
Profesora TIIular.
Opio, BOQulmica y B1olog!a Molecular 11 Untverstdad C~ense de Madnd (Temas 20. 2t y 26)
Antonio Jlmnez Ru Profesor Tllular. Opto 8ioquim1Ca Urwer&ldad de Alcala.
(TM?a6)
.SOrge Mooknol Sanz Ldo. en Slologia y Tcnico de Cltomstria.

Opto. Medicina Univenlad de Abl
(Tl1fflil , )
y Biologl<\ MOIOQ,jar
Fel1pe Moreno Herrero Jefe de la Unidad de Gentica Molerular Ho$f)ital Aamn y Cajal, M01drid
(Tt;trlt 10)
U" c,rmen Lastra Gonz,le% ProfNOra Trlular,
Op$0 Oufrrnca Analitica e lngerrieri;; Qvifni~ lfflersidad de Alca& (Te!T/8 11)
Javlet Len Serrano QliOdrUOO. Opto. BiOIOQia MOleCular Ut'IYersidad dt C&nlabria (TOI1M$ 8 y 9)
Juan Lpez Bar ea ca!edruoo. Opto. Boqojmica y Btologfa Molecuta.r ~..~rntNetsidad de Crdoba
rr- tt
, . TClf'Ma: Muio Blanco Prole&Ofa TttiAar. Opto, Bioqu.imiea y Biologi;.1 Molac:utar y c.kllar Univor~d do za,il9Qla
Rat~l Oliva VlrgiU SotviC:iO <te Gcn61iea Hospital C11nlco, Saroelona
(Temas 17y tB)

FIMI Or1e0ft Orti!. de Apod&ea
(1emas5y6)
Jos M '" Uacarulla Greole$

Caledruoo. Opto. &oqutmica y &elogia Mdecula.r Utlivorsidad def Pal's vasco
ProfesO( TittAat, Opto. Ouimlca Anallttca e k'lgenteria OuJmica Urnversdad de AJca\ (femtl , 1)
ACI.SCIO ~rez: llblttos PtoleS(lr Tltc.N~t. OpiO 81oqu!'1mca y BioiOgfa Molecular y Ceb.Jiar UniverstOO<J ele Zta~a (Tf!ffl41$ 1, JO y t8)
(Tem.,
121
lt41fcodes M;utln t.t.'lrqufMZ
Prole$0r& nu,llar, OpiO. Blologfa Veoetal Uni\'Ot&ldad dl:t Alc:aili

( TMm21)
ttonortn;~ M~r1 rno:z Blnnco
lu1 s del Peso Ovale Investigador det ServiCIO de lnmloll"'ddg::a Hospital Univer&i\ai'IO de la Princ:est~, ~A:Idnd
(TOfiV 13)
Profesora TTiutar. OtAo Sioqvlmiea y BloiOgla Molecular lkwer&~dad O. ln fTem<~s 2, 3 y t6)
W Begoi'la Martfnez Jatrela
Profesora Trtular. labotatooo do GetlcltiC~ Forense, Opto. Aflatomla Patolgl~ . Metlldn3 l.t98l y Forense
yToxi~ U!WYerSK!ad do l;)r~t~t (Tema B)
Al~to UMtfnez serrano Prof~ TII\llat.
Pedro Pi&clril& Montilt. Investigador Conltatado de Aein(:IOfJ)Ot<1c>tl. Opto Bioquimic.. y 8ioiOQiiil MOIOC\Aft.r Universidad de Crdoba (Tems.s J2 y 15)
Manuel Pineda Prie90 Proie&Of Titular, Opto. ~mi(:(l y BiioiOOa Mok!euiAI llniYef&idad de CfdOb (TfJfflll.$ 12 y 15} MontserrtJI Pinin 84rr1 1u Proteson'l Tllular. Opto. B>qu/m1ca y Bdogia Motecular
Univets~ ~AlCal
(T~4)
Cenlro de 81ologfa MOlecular "SevetO Ocht

Uni~W,'ld AulnOtna de Madnd - CSIC
(Tems51
Miguel n~ Medl na Tortes Protesor Titular. Opto. ~ MoiOCvlar y &oqulmlea Univers.:lad de Ml<tQ(l (Temot 3())
(Tema"'
Atfredo Prieto Martin ProleSOf Asociado. Opto. Medicina Umotersldacl de Alcal
XV
UI ~n Puebla J1 mnez Ptolesom Tltu\;u tnterlna. Opto. S!OqU"l mlca y 8101ogfa Moeecutar Unwetsidad de AlCal
Bar1olom Sabater Garcia Cate<*tUico. Opto. 81ol0g!tl Vegetal Un1vc-1$idad do Alcl\!j

{T6ma21)
{Tema 16)
Carmen P\IQ:yo d" '"' Cucttlt Catodr,fl1~ . OPio. 8ioqufm~ y BiOIOOIB Molecular Uni~ad de COfC!Oba
(Tema 25)
Franc:i.s<:a Snchez J iminez Prolescxa Tl&:ular. Opto. &ologia Motecutar y Universidad de Mlaga
(Tema 30)
~lmlca
Juan A.. PulidO MOfa Doctor en CJeocias Biolgica& y Supe.rviSOt de lns.talaclones. Aadiacuvas (T(IIn;l$ 16 y 24) ngel Regleto Chilln ProleG Tilultu, ~. BIOQuimtC<I: y Siologite Uniwmidad do Len (Tqmas 2. 3 y J6) Eduardo Reye& Mar1i n Profew- ASQCiado. Opto Medicln<'l Univertidad de Ate<~l
{T4mil 11)
MOl~
Jos s.inc:hezPriet() Borj;~ Prolesor T1 tulaf, Opio. BloQulmica y 91ologt'a Molecuat rv Universidad Complutense do Mad1id
(Temas 20. 2J
y 26)
Pilar Sanc:ho lpez ProleSa Tllt.llaf, Opto. Stoqutmica y Siologt'a Motecular

Uf!IWM'Sh:Sad Cle Aleala ( Tema2)
Juan Saus M.s ltlvesf19adof Jefe del Opto. Pa!oiOgla Mote<:Uat Fvndai>On vatoneiana <ICi nvest~iotM:t$ Biomdica$. lnsllhllo de lfi'Ve~igac10nes Cifdgrcas. Valenaa
(Tema 13)
Nieve-s Rodt~ue z Henche ProleSO(S Tttular lntoona.

Opto.
BloQu!rr~C& y
Bdogia Moiecula.r
Joaquin Soler ,..ed1na

ProfeSO! Tllular, Opco. UM.ersdad de len
(T~$ 2. ~mica y BIOloga
Ut'IIV&f'$idad d& Alcaf

(TQm:t 16)
Moleculal
Jos Cario& Rodri.guez Rey

Profesor ntulaf, Op1o. Biokgia Molecular, l.lnidad ASOCiada al Centro de lnvesllgacte:nts Biolgicas UmW~Jrsidad diJ Cllnt8,bri.1 - CS~
(TQtn;J 15}
3 y 16)
a.t" Cristin.a Tejedor G martfn Prolesora Trtular, ep.o. Bicxwlmu~a y Blologa ~utar Un1Y81'$idad de Alcafa
( Temas 5
y ZZ)
l. OOIOfU Romn C:ur10 Profesora Tttular, Opio. Bioquirr.ca y Bologt'a Molecular Universidad de Alcal
MJguel ngel Trueba Conde Profe901 T'llular. O,Xo. BIOQUl m.ca y &ologt.a Moleculac
Un.verSi(l~d OCf
P3is v~sco
(Tema 3)
( T9ma 12 )
Alumnos de licenciatura y de doctorado

Varios len'la$ se .-.i~tQn como !rulo dof tr.Jb<'lio ~ gr14 ton h.1mnos. a l)altn del evrto t99719a AJgonOJ de ellos
han r\risado
I)O&IA!'~e con
especial dediCIICi(ln 1 em3s <I'ICretos.
Gema Alonso Poves LlcenCia<la Paloma calleja Lampatero

Llcon~ ~$tri~
Ctolla Garcta UOteno Lioencit't.<: ~tria l:)rm:~c-;tutic:ca C.at los David Gea Mnctez Licencl3<):) ffanel seo J avier Gondlez Cappa LicenCiado
( TemtJ:t 8 y 9)
8~011rlz Gonz.iiln Oiu Liccn01.8d:l
tnrmatuliea
Susana Cantero Blanco LicenelOOa. residente hOsp!lalana Diana de Crdoba del Campo LicenCiada. n1JW1a larmacevbca
(Tqm;~
1J)
Mon1 ea farto Pareoes Bec:ana ptedoctoral Raquel Fuen tes lrlgoyen ucenctaca. tesieloote llOSplla!arla
l nmact.~lada Fuentes
Ttre&.a GoozaJo L<izar o
Eltalumna
Marta Herrtuu 8etr6n Llcencaada
Rus
ucenCiada
Maria P;~z Jlmnez Hetnhdez

O;ivila l teendada
Raquel
Ga~ia.
bcanci&dt'l' industria tarmaoullc:a

(Tettl8 t4)
Jos AntonJo Jotdn Hernndel
Ooe1or. profesor de enseflan:za !100\M<Iatla
XVI
Cfrl'nt'n Lltano Vaquero OOCiora; industria l~11mt~o6uliCC'I
Lu is AHredo LOIOt'O r.ta.rtln
Helena Rodero Torres

UOMCiada: indl,.l$lria l{rmoo::v!ic&
cenaado; IOdUSITia farmacutica:

Luisa L~.s Panas
IOveEifl9iO'Ml posdoctorBI
fitima Rodrig!Jel: Barrios 8ccana prOOociiOrat

(TO(rl{ls H y 18)
An tonio Jos M.attf~z Osorlo

Uccnoado; ll'ldustri& fttrm:u:6u!ic.a
Paul ~
Alicia Rodrigt.N!"tBobada Jlmnez Ex-afunma
Joa A.lbOrto Rojo Lpoz Llc:onclado

(T~ma25)
l.tat.eiU NUM:t
Secaria prodoctoral
(Tema
"1
Sara <MI AO$al MonecltWo
Uoenciada
Ana Maria Snchez: de Abajo
Elena Mollino Centeno

~;,x,afumna
Ex-alumna
Berta s.'inc-he:r. d$ Juan
E JClhJrM<I
Juan CaiiOS Murciano Fcm&nctez
lnvesligador ~oral M lnmacut.a<:ta Navarro PGrot liCenciada

Gemma Olmos Centenera
Barla l)fe<IOCIOr31
Rosa Snehez Sinchez

Ucen01ada: 1'\duS!ria farmaootlca
Sitvit S3nz Mortltilla
Ooelora; farmacutica eitvlor
Stlt a Otti.z Gatrudo

l,jcneiada: !l'l(lustria ttumaoeutica
Omar Sharal Ordez Eatumno

tt1" ng.Mes Vlllar N~z Becarla predoct0011l (Temas 6. r r y J2)
IU~I Z~rdan Rocfr(gucz Ellti!Umtta
M Terua Pfte.z Mafoto

D~o; loobort~tono ~linic;o
Francisco Javi.flf RIVeto Vilches Becaoo predOCioral (Temu 6. n y 121
Otros agradecimientos
tnerl!atios.. M!lcas, sugeu.mclaa af 1emarlo y al planleamlento gkal. p0r b
gmtitvd:
~&Us vU.a de Grado (Maarlcl), Jos A. Cabeus Femindctl del Campo (Sal<ti'NIIlC3), JoM C;arreras Bar~ t~. Antonio casas Mote'.M (Madr\d), Jos A. Cebrln PWez (Zaragou), Cristina OIJ!gado MontN (Looctres),
TM;<> al lfllefo como dutante el deSM'ollodM libro, drversas per&Oflas han mostrado su apoyo V I)Olrticipado QQI'I c:oQue talrtli6n Querell\00 eK pre$lrlo$ f'IIA$lf0
Eduilrdo Grela Peregrin Gtanada), ngel GJmnez Sofves (Madrid), Niocolils Jo1.1v deo lo! 8e~rrwdt\ (Aie31 <1t HOI'IatO$), Manuel J . Lpez Prez (ZaragozaJ. Jos Manu.l L uque Pin illill {Madl'id), lg.nM:io NUI\u: de Cll.ttto (MAJa g;o), Manuel Ortega MalA (Madrid). Jacinto Pinilla Barrau {Zaragoza), Pedro Rondlt4S Rabinal (Zaragoza), VIcente Rublo Zamora (Valenaa) y Enrique Viflar !Adnml (S&tamMC$). Agradecemos lgua!rnot~te a E~r Espaa, S.A.. en la persona de su droctor.'l edl\oriJI, MariJ JOS Hom6nd~ Gme:t. so con!IMU en este proy~ y su empeo en que el libro haya salido adolan4e: con Joda; sus ~<:10$
te<:nicas.
lndice
I' REI.I<\11'1.-\ HES
PrJQgo IX
'
Pre&enlac:in XI
Revisin y
a~sorarnkmto
xm
Tem<J 1:
Introduccin y aspe~ctO$ gencrf'OS en euc:ariotat t Trans"*Sin de ta .mormacln genlica 1
Tema 8 :
El ONA como ma~erw genllco: AMecedentee 2 Caractetistical5 g9norotcs del ()etloma S

Teme 2 :
ConctensaclOn del OHA y cromosomas 83 Cof'!Ciensacln d$.1 ONA M euca.no4a& &3 Esrudio del cromosoma metarasico 88 Do1ac10o genuca en eucanot:as 93
Terna 9: C iclo c:etul a:r 97 II'IU(>(IUOCIM 97
Componentes
fundamenta~& de los
cidos
nuc:lckos 9
Componenle Cido Fosta1os 9 Componente neulto; AzUcares \ 1 COmpol'lel'lte bSieo: Bases nluogenadas 2
t.a CIOO'Ifttitla en 13 interfase 98

OIVISil'l <k OMtJI8S $(W'l'u11!leas pot mUOSI!S 99 D!YiiSin oe ce!Uias germ1na1 es primarias 1>01 meiQs;i$ 99 Unin 00 10$ g~metos ~s wmnw. ta tecundacaot~ 106 Resumen inl.eQiado 106
Tom~
Tema 3:
Nucle &ldos y n uc:letidos 19 Esttuctura ele ntldesielos 1g E$truc:turo de nuc:lelidos 2.3
To~4:
Estructura prima.ria de <1c:idos nuc::leic:O& 31 Asp&elos geoorales 31 E$11\1C~vr\l primaria 32 Formas de representacin lineal 32 Dos tiPOS de cidos noclelcos segun
SU (X)mPQSICiOn 33
10: Orgt'ni z<'ciOn del genom<J c:uc.:<triOtico 107 Complejidad del genoma eucaribco 1 01 ONA do copia Urw:.a. si"'Pie o no repetrlivo 108 ONA repeb1ivo 109 Estudio eliP8fl!Tief'Cal de la complejidad en el gef'IO!fla de eucanotas 11S
Propeda.dea #!slooqufmicas efe los odo6

nucleicos
34
Tcmll 5: Estructura secundaria del 8-0NA 37 Proporeln ae bases nitrogenadas: R<lgl_,$ <le CMrg;.'IN 38 Modelo de Wa1son y Cric;lt' forma B del ONA 39
Tcm;a6:
Variaciones en 1 01
" trwft.lr.;~
Tema 11: Pre-parac&n de mues1ras.. extracciOn y anlisis de ticidos n ucleicos 117 ObtenOOn y preparacin ptelimnar de !as muestras 119 Disociacin 00 la muestra tiSUlar 122 Separac10n de clulas 122 Carac1enzacWn ootutar y medidas de viabilla<:l 129
Lt$i$ de 1M clula& 132 Prep.voa,c:i" do l~c<:i~ l\Uboefvl<lJO$ 133
Tr'atatni~\10$ atlidOna!as o col'll)lementanos Extl'~eci6fl ~ ti,eiOO$ n.~clcicos por
del ONA 51
Vanan~es en dobfe
hebra: formas A y Z 52 Vartantes lOCales de ta esttUctura secund$rla dol 8-0NA 5& Motl\'OS o:slruc;tvfale$ resPOnst'b1 9$ 00 la urnn 001 ONA con proteina.s 60
133
solubilidad
o" faS<t511'lmi$Qble& 134
Tema 7: EstiVC'tura.s de oren ~perlor de DNA y ANA 65 ~renrollamiento del ONA 66 E-struci!Jra de loe RNA.s 69 Los f'l:lOSOmas 79
Puf'lilcadOn de cidOs nueleioos poc pfeo()l,l\dn salina dr!ereooal 1 35 Aecogoa y oonseNadn de las mues1ras 135
Procedimientos ahema:ivoe: diroc~:<n det ONA 135
extmcoon o anaJas1s
Fr;)CCionamienlo da cicbs nucleicos 1 36
XVIII
11. TRAK.S:'\IIS IN DE I.A IN"FORMACIN GEN"tTICA Y1'EC!\'0~0CAS RLAC10NADAS

Tema 12: RepUcacln del ONA 141 Caracteuslieas generaf,es d& la teQ!ieacln 141
EnllmologM. de la repfie&ein t45 Etapas en el prooe$0 de teplleaein 150 AepUcacJon m!IOOOitd'lal 160 Tema 13: t-ll bfldacln de cido& n ~telco&: fuodamenlo y
Tema t 6: Cfon<tcin celular: Tecnotog:ta del ONA

recornbln.a:nte 197
En:bf'l"'as de teslcci6f\ 197 ~ein oel.f#r <tt mot6evlas c1o DNA 203 G9notoca& 215
Tema 17
mitodo dCI ensayo t63

lntroduoeln: OesnaWr'aliz.acin y renaturaizacln
detONA 163
Anlisis moiEIC\Uf de
Gtomlca. Obtoneln de los map.;t.& gentico y fiai co del ganoma 217 ltUroducdn 217
Mapas genelloos 218
ta hibridacin de CJdos
nucleiCO$ 16'1 Metodos de ensa)'OS de hlbtldacln 169

T~m~a1 4 Prepo~r-acln
Mt'IP.,"'$ fisiO:O$ 221
y miltct~ie de sonda& pa111
hfbridad o 175
Proparaon de $01'1dt\& genticas 175
Marcaje de las soncia.s 180

Temn 15 Ck>n.aei6n acelut.ar: Reocci6 n en cadena de la. pOilimet asa ( PCR) 187 tniJO(h,tCX:Il'l 9CI(I<Itl'l1. fa eb'ISOI()rl 187 A~i~Ci6n in wro <Jel ONA: Reaeein trt c:ad&f'la
Tema 18 Sclcuem.iacin ct.f gcmoma v Proyectos Genoma 231 lnttOOJoeiOn 231 MiOOO c;uimico <fit seeliOneaOI'l del DNA 23t Mtodo enzlmlito dCJ secveroacin del ONA 235 Secuenclaan del RNA 238
Proyocto GCI'IomA Humoano (PGHt <:aractOfl&ticas
l)$tntllll0$ 239
Otros proyectos de &ec:uenooc:in del genoma humano 240 Geomlca comparauva 241
<M 13 poin'lerasa o PCA 188
Ul. E."~WRES I ~ (;t,."'ti <.:A

T~a
19:
Tema 22:
T ranscd pcl n 243
lntrOCIIJC:I>6n: COtl(ltl)40$ genetales 243 Enzimologla de !a lr.lnscPQOn Mec<ln!Smo do l:t

reaccin ANA pollmerasa 246 T~IX*Sn en euearlotas: d!lerenclas oon
El cdigo genttico 287 Atuecedentss V propiedacles geootalee del

cdigo 287 Asignacin de eo<~ones a aminoAciCioe
(;(lntrtiQ$
289
Pf0C41101U 2SO Etapas en el prOCG$0 CIO lrt'll'l&e~ln 252 transcripdn del genoma mii<XlCWc;tr,looll ?57 t~es de la lranseupclon 258
Tema 20 ~ Contro l de l.a e..:pre:si n g6nlea: precranserfpd onaJ y lt en&eripcklnal 261 tntroduccin general a la ogulacin eJe la 4txpr0$i6n
Modele)$ de ~t'&$t'lnUlt':l61'1 293 car;~~tteri~ielt$ eSJ)OC:Ificas 294

Tema 23: Sfn tesls de proternaa: Traducdn 299 Caraccerf5$1cas de M troouedn 300 Fase ptO\ila: ae!lvaeiOn de lOs aminoCidos en fOffl'IS
(Se 8/'I'W'liOaCiHRNAs 302
Fa$8 1: in~cietl 307
gnica 261
C<lr\410II)I'tlrans,c~IOnal
Faso 2: olonga.cin o ala1gamiOn!o do ea ~

263
peptdca 311
Aegd.aelon gentica de la transcripcin 264 ~ 69igenti1Ca 271

Tema 21: Mad(.ltacln del RHA o pt'oc;~samien1 o
potr an&cr lpdooal 27$ illlrodUCCIn 275
Fase 3: tem'llnacin 3 14 Enetg6e8 <tt 1a .$if')!e$is de proterna& 315 Inhibido/es de la traducaon 316 Rogulaeln de la a/MeS18 ptote:a:
Niveles de ooouot 318
Caracterl!Wcas Clfereocales de 1a maduraeion 276
Prooesamlento del FI.NA rmmsnj6to 2n

Prooesamtenlo de lo& ANA& tlbo&mlco y
dO ttansletooc:ia. 282
Mad~M4Cin <te~ ANA miiOOO~I'Ial ~cin POOtr.ln&erlpQOni"tl
Tema24: MOdilleaelonH pos.lt &ducdonales 32-1 lnllduotln 322 Tniffco o destino de \a& protenas 322 Madvracin o procesamien~ dol SJO!i9Ptido
284 y pr(tlrBCII,ICdonai de
naciente 326
Piegamlenlo de protelnas 337 Oegf'&dacin de las pro!ei.NS 340
la expresin gnlea 284
XIX
IV. t\.SPt"rHS A I'I .IC',\ 00~

Tema 25: Ba.s.e$ moleeul ares de la I' I'UJt&eln ~lONA 343
Tem;:a 28:
y l a repar&ein
Enfttmod<tdes
monogtni~OIS
moacc ut;~ r~s: enfcntJC'd:,d~
300
Conoepo de mu~acln 344 Clasl!icacon oe las mutaciones 344 npo de clula que sufre a mutacin 344 Mutaciones. a pequea escala o p~uales 346 Causas y mecanrsf'l\06 bSICOS ele
Conoopto y claSifiCata<ln 389 Enlormodt'ltiC$ exogenas 390 Enlon'l'ltd~tlc~ gonliCM 390

En!Orn'l<~dcs polign~Ca$,
mullitactMales.
mixtas o co~as 399

Tema 29: Entefmedades cromosmi ca& o cl1og4mticas 401 lntroooelon 401 Clas.Jiicacin y nomenclahn A()2 CrOmQ$0n'IOpa!i3t nvl'l\nC<I.$ 403 CromosoMopatis~ esHuclutates .t06
las !'Nl1adooes 352

FlepataCiOn del ONA 356 EnfeoneaOOs humana& a&OCt~dt~& ;:a
la repatacin 363
Tema 26:
Diver sidad del genoma: pollmotfl$mO& 365 ltttroduccen 3&5 Otversldad genica dentro de
una especre 366

Mecansmos tmpl~doS on 41 V\U'I<'II)illdatl
gentJca 366
Consec\lenC~M luncaonalos d&l $)(llimor1i$1'M 368
Tema 27:
An.llsis M genes. De:tecd n y aplicaciones de lO& polimorfi smos 379
Tema 30: Bases molecvklres del cncer 41 1 lntrodUOQn 412 El cf'lcer COt'f'IO enf.etmodad gonli<;oll 412 Etapas caractensticaG- en el <l<t&atTOIIO del cntet 413 MecaniSIOO$ dt tr.lrl$1()01"1<1CI" <lo <:(l:lvll) norM<\1 en lumoral 414 Cootrol de la Ofoliferacin 001 :14ili!IO$
lntr()(luc>eln 379
An\\li$1$ 00 901'1(!$ 3Wl Deteccin Gel pollmOffismo de secuenaa
deONA361
exlfacelolares 420 Flegulaoon del ciclo oeUar 422

ApoptOfiiS. moorte celular progr~matla O liUiCOo oclul;1r 43l
~cnci.- drctl
Aplicaciones de los pol!morlsmos de ONA 384
c.;'mcor 434
Mat<:aCJOte-9 IIJmot'ilfe.S 434
Rolert ncl:t$ hl$t rka$ ..:141

Blbliogrefia 4-47
lndice analitico 449
Tema 1
Introduccin y aspectos generales en eucariotas

1.1 1.2
Tran &mi-s.io dct ., i nform.ac~n genbtiea - -" .. - - ...................~......_ El ONA como m:ttafi~l genhtico! p.11sado, pr.sen te y futu,o ..............................- .......................................
Ca~ctcui-5ticas ~-neraJcs
1.3
del ge.netna..................................................................... ,,,,,,,,,,,, ....................... .
1 3 .1 1 3.2
~de PfocaM&a:s y eucanocss.........................
2 5 5
1.3.3
Magnllud del genoma nuclear de eucariotas, , Magnii!Jd y catacteristicas del gcnoma mitooo~l
A modo ~ inltO<Iuoei6n gener31 a1 presente le)(fQ (y. e-n defln!ttva. a nuesuo enfoque de la a.otogla MOieculaf e Gel'lellea), es ootwenlente deset1bW suanlamente tos tre<s aspecto& que mejor ponen de mcwfioslo ol papel de )OS ilcic'Jos nuc~s en la cUa y en especial del DNA como ponador de la nformaon Qllfl4tica Por un l<ldo. 1;, <le$Crlpa0n giO~ ele l&s rulOs e lt<lf"'$lfli$ic)(l ~ la inr0tm$CI(ln gentiea: en segvnoo lugar, lOS 8fl(ece<lentes e)(penment.ales que dem061raron el import.N'l:o popcl do lO$ ;kidO!I nutiOICO$~ ~le, l:tS earacterlstieas QMf!fales 001 gonoma de c~.Jet~riot4\$ . como punlo 00 pMid3 pata el eshldio posleOI' M prorundldaa de tos conceptos teorlcos. tas
lngo~ia tocnologl~ y
lt'l$ flplieil~ de esta Matea en las cienCias de ta salud.
1.1
TRANSMISIN DE LA INFORMACIN GENTICA
liffM & 'Rl"A <k"'""' & 1 .,..,.,.....,-n,..m,.,
~,.lo)n(U"-"" tfl
rn,_; ...mrnuomJo4;oo
.,. ri O"-" T IV.Ol!CC'IO N

);i.................... om""""odo". ~~!:o.l,..
~llll(""9f V~ ,o)6,!'l,:o6) ~ ri llokN""o
--
f""'Or... ....
lNTRODUCCtN Y ASPECTOS GENERAUS EH EUCA RIOTAS
Fr;)nci$ Crick. intn.xkljo "' 1rmino "Dogma oontral de Ja gen!Jea molewla,. pera desak, lnek.19o a"'es de CQO()(:OflO su import.tv~cia rNI en lo& &$$ vivos, el flujo de la Informacin gendca y la utlllza016n oeU.v de diChO' infQm'IOOn En ooncro10.1a lransmisin de ia informacin conteflida en la secuencia del ONA alas o&Jias y organismos (lesoetdie"'es tnedi&llto 1...., tepfic~cin, y s' o_xpre$in en blomolruras fvndoflales medlarue 10s proce909 de ttat~SCIIpeiOn y tradl..eOien. COI'I'IQ(endo, Pl.l"$ ti ()()l"'j..ttto ~ rel3eion05 gene...- exiS1on!M entre el ONA. el RNA y las
prolei'MS
()et)e resaltar.5e Que l.;i tf)C)(e$01\ttlei6tl ~vi;llda DNA ~ RNA - Protoln<~ no indica la baniiormae>n de una mOie&U en 0178. 1~1 oorno te indica norm~lmonte on t.$ wtM metablicas. sino que cada elemento en la &ee:uerecia aporta le~ lnf0rmaei61'1 l'leoe'lll!lrin para 13 t i nleliS ~ siguionto En este &Onlido, a importante el ooncepiO de planll'lta o
molde molecular: aunque cad8 paso est catallzado por una f!f'l21ma. los sustratos. (nuetetido$, J~mlnokidot) no .&on seleccionados pot ela. smo que ....enen especlbdos por ia lntetvenclon del rnotcle. en concreto pct su $COJetc:, de
nuclel:ldo&. El progreo en 4lf conocimiesllo de 106 prooe&Os de lr.tn&mlsin de la infotmadn genbea oblig a la afYIJ*aCI6n diJ n!e esQVema bsieo origf\811 para acomodar otfOS proce506 ~ tcwnbiM oo.::urren. al mell05 en algunO& orgarusmos l)&t1iOOI.are$, ~mo N d c::MO dt3 <'lgutiO$ virus :
SiMn" .Jo uruo ~~~t~l\'t'W.l de
Jc'A ~Mfll(l'i)t!JOC.,\_ Clllalif.u1i

po.'f" R'\ f(plo~~,;l), ~J;;o fl!
rtMt~duphc.clnd~Wl
11l;um"Jo nnll'. (l'ltK> c-1 ckt mo:&lli< dtl lallacll _.,/
Visin aclual de la tmnsmisin de la inronn.'ICln gcnCsi<:3 ("dogm:J ~1\lrnJ d.: la geotica m:olecu lar"')
replicacin
n ~n RNA
DNA
repNcacfn
de;RNA
traduccin
---lransc.n]>cin~inVrsa
..
Protena
~~,,..,_.,~ & U'-\ ; punir d~l R'-iA "'"'n" ""~' <-MahNJII
""-"'tow~nr'*- hi\ITWjl_ !H.' di tn IOudro~ru..
1.2
El DNA COMO MATERIAL GENTICO: PASADO, PRESENTE Y FUTURO

EJ conOCI"'''ieMO de bl estructura de 108 cidos ooclelcos se Qcla en el siglo XIX oon .. aislamlonto on el
n~
oeuat de una nuel.eina foonada por una pane clcla {hoy. ONA) y u~ par(e bsica (Prolofna).. Clllf <Xln'IO ~n 01e&tvdi:> parO;N. de las prope<lades da la mclalna y de sv JllltiOiOn <:On 101 ~ celul&r. Sin Ornbrargo,. la oaructura sll'liO se
OOC'IOCi a mediados 001 ligio XX, .-1 m()61rarse Qu!: ONA 81'8 el oompooente cromo$6rnloo dei)06flarlo de la inklfmedn gel'l1k:ac. C..C. deslacar.., t$t0 sentiOO. ~ anlecedentes Clave. lOs expe'nentos de Oswald T. Avery, Coln Mac:Leod y Maelyn McCt~ny. et'l 1944, y de Alfred D. Hetshey y Martha Chase. en 195:2, q.,e tor~stituyeo un hito en ol <.:OilOClmi&nlo dol m:.:tenzu genliOO lS escala molecular. Trt~~s estaS- lrC)OitaOOtlet Iniciales. el verdadero inicio de la BloiOgia MoloC\Mr tl'locter!\11 k> tos:lilvy6 aa ~~a de e&tructvra eo <kltlkt tll108 pa;r el DNA. formvl,da, en 1953, po.- Jamea D. W"tson y FntnciS- cr.ek. A p&rtil' ck!l l~ momento, casi lodo o1 cs.ivorto r~ $e Ol!fllr& en el es1udlo del ONA genmloo, desde et puntodEt wsta estructtnl y funr.lon&l, ~n procartotas y e!..leariOias. con una 811encln espedal a mamlf.etos en Qenerat y humanos en particular, Los avances togrados. U'll'lto let!OOS eomo tcfliiCOS y aplicados. han sido enormes. A ello Na contrilMJiclo ltt {)1)3riein de la ingeniarla genOC... ~mo prino!potl ~rea ~8da de la bioaogla rnolectAar. Queda pendianto para vn rvturo i)f.ICimo 13 oorw.:luSIOO del PtQyOC;to Geno~ Humaoo (gen6mlca 1\n::lorml). el an!hws de la. funciones de c9d<ll gn (OO~ica funcional) y la discoci6n de 13 t$1tvdut'a y f..n:ln de In ptotelnas (p'ocOOmica). Como expresiOn <J6 t$10$ ~os oonodniiCiflto~J.. htl su'l)idO ma gran variedad de campos de actrvldad eo las CicnciM de '" $M.I<:I (M!i<'ta, FarmaCia y Veto\rial). '"~ como anbCuerpos monoelonale&. mtodos in'"'JflOQuimiCOs, biOChipS- p~ra el dlag.\$UOO, Clonacin ~lar y elon~ibn aMnal, fafmacogenes.. ingerueria de proteina&. procelnos tt<mbinantes de tn~er!l dlagostlco y teraoullto. 90fldB!I de hbtdaoo. terapia oo:kA<w y g6nic:a, 11'8nllferencla oe genes. vecsoree. Wus. etc. Nuestro objeUYo no es Oeecriblr lo6 aspeelos conCt'9tos c1o $$10$ ~ml)(lt. $ltlO sOlo poner de manlfies1o las bases moAeculares que les sirven de soporte. como p.mo de patUda para un estudio detellklo de cada campo 9n $1J con-o~n~t; jrtA do co~nto. COI'I este lttl se presel'ltan en este primer lema las caracteris.ticas gencrale:s del gonoma de eve8~.
.a
te,...
EL ONA COMO MATERIAL GENTtCO: ~ A~ N.c TE :! C :! E '.': O :!'E~ N.c TE=:S ,___ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _--". 3
F;xpt-rhnenro de Avery. MacLcod y McCar1y (1944)
f.~ICI'i I.'C'I!ll ~
de I'IIC'\UJ>IIC~> (Srrl'Jtfdt_o.r.:'t 'li\
jUh~>ll.llltJo') wdeJdM
~,...:ando)' b'ten~.o;
h<ID; > '"'\- tdcl inglb \f'RI<Qlh) A1 Ul)'l:~lM~ {lmdu.:cn n.:I.Hllc..'l!lJ >
.X'aSI(tl!ll!l llll'llu\C 1""" fi61(lt!CS.
JI"' 11110\ c.ip,.11b
de
:~'i;M'.
B,...f'tllll.fiO\'ml!cma<.mc~
_"'"""...)--1
~-
(.llrn~ C'CJ'~ dt ncu!~'<l(o. Pl'' fa\!~ \k 11111 Clt/.111U., 00 ~"n l,t d~"b) "'''f:l IOO fCMI\ al'. OOpliiO_I!.~IIob~ bI(ICruiJ ntg~oua>" "R" (n,li,~:'JJ ca in~J 5b l
Dl>ctenlll -...- ..ukn111
t\1 Wtno.~l.'l o;CJ)\b II'JI"C-<\ 1~ ~.. .t.J.;I.,lr.

Cul<~r
fokl.:O;t; li\UO."''CII )
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de-Jan. dt '><:f lflfl' !l'>ql~
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l.llo; CC(lO"' nn l(lfccuo)'<a R" I'Uo(l.icn tntnsftlmlllt"" !ICm'l~ll('fll<'mC'f'1C il11 m f,"O;~~ l"~" 1 l'f\f ' (>lll;loCll ~on ,r;p..s S" o .. '<!n un ('\IJ,.;I(),\,:clul do: .t-.b be c-..trt~~.:to,...: lr.lO.'cWII 1\blil ctK'<tl'l'lr un wnronmr cm b.~U\ 1o.bd mmd{ln name. el c 11ul
!V~oa 11-. OOfYII)(I;Io:il'ln ~lnt~o:..t '>~'"'*a 1;. del
ONA y f"J((pei.!Jd..~
hS.,.'\1-q.t~lfllh.~ fll~cltC~
(\~(\U~ll.., llr-J\ Cll\111~11~)1\11 (Jihl<.k'n. cl<x.:'ln'fo.)l t~... ). Adtnh. tlo) le Cl<'ldt~ lu \IW\
,.s,w
1rlf''lll>l ,, IJolliflhiCti:'l)lfl lp!'(ll~,.)u .:lit nho..nuo:k11.:. (o.fllC ~,..,el RNr\ ), l)l:fl' ~se p..tdm !,1a.:u 1111d tr.w)iOrnl!liuf:l tr.u d lr..,tam!Cfllo '-~l
dcwxtrnboatu\ku~
Jtf .tlfllk~! ll)('ll'<JI;;, dc CO\IJ'l'l~~l(ol) d~ f'!OfC'olla$ o) llpOOS.. '" \< \'i:la Jfc~wb lXI' el lr\ll~lllk:nf<}Nfl
fa reodiCMon d arim tDi' IOIOOnmi!!Joc U 0 1\A
Ci.,toelusin: El J>N:\ es el n. 'SJXIflS.<tblc de la sintcsis de ln cnltnU ftL'i.'I!S~ri t'l par'allt f(N'lnacin di." ls c.\1pst.lltl y. por tanto. <'S el portado de la infomtacin ;!CUtlca
INTRODUCCIN Y ASPECTOS GENERALES E.N EUCARIOTAS
Expt'rimento de Rersbey )' Chue

(1952)
r~li~u6o mcdinmc pt(llifcrtw:in de I(IS 1'i M
\l i.!Nat' tfKluCh\ t' rcua dlfl:r.:l)(-iar l:Sp<."Ci(K*II<(IIt' 1.'wllt\' DNA y prlkina>. o:n 1111 mcdcon )f. o con 1 - :S
1 A
--=-.
Vin.s fl. d~; l.tpo IMn !I!.J:I) <.:s'*':.. cipwlu n cilp;io.b prutcia.
\"mkrt'll ONA1 Stl lntn1 .,_.
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(\IIU\:;) ll!l)\t-l.'liJI
"'fl .-;~~i?p/
':%'~_....,. "/! ~...,-./~<E;-,:;,,::,:-~ :.::,= ,.", :---.

skl en In.:opdn
(protdna.~. Uu ~a~5
.:oo fslim}
rnol&ulA~ con a7ufh:l
~e - )
~.......JI!X!..,.,..l.~ 'uus inrn.'WI 11111~ Nc1 enas ~. . . . . . ..,,IU:t::l,..,....
(t~W'I<!W sOlo MI DNA}
(R. th"ft'iol. 19' 1)
Al lwlmosen<'fflW"" l\'li11JICh l.u umun~m~ \'tN$ )' ~riu. Po>l CCI)Ln'o~ ~ pul{dcJt $C:PIIr'.l(l(l~ ~truiUo!m:ttildatlt~) \le biSN,;terins(~lfimciUAI.. p('OC'11ldistil\'l() tumaflo
n'"'icbb \lO.. -as

rlldi~th'll.\
(.r.S)
(.
)~
111
" a (, )
11
U"O<ri" 0 0 n dlKOiti
k-!t.U.: r:HI.IMd 'l'lU (JSP)
~ l l4;.
1fBI:Ob&cifl 1
la.'>lxl>:tni:IJ han Sido u'I(C"CWdltt 'IC!r ct \tru.) unt i~harbol pr~n u~a ftllC'\'1 emeraciM .k"'"'~
'----
~t}..~
Conclusin: El ONt\ intmductdo en la btte(eria contiene la ,,ronuacin tlectS>lria paro

generar nuevos virus: es decir, el UNA t.'S el pOrtiido..- d~ 1~ informacin ge:ntii(a,
CAAACTERISTICAS GENERALES DEL GENOMA
1.3
1.3.1
CARACTERISTICAS GENERALES DEL GENOMA

Genoma de procarlotas y oucariotas
Con:ptuattnen:te, el geooma (ce la ralz grieg<1 gen, Oll!;IUn) ~ $Ct oon11idenwo corno et ~patrtmooa:l gen6l.IOO' de un otgal'll8tTIO, es declf, el GOnjunlo t~ de ma1erit1l ~-tiCo I'Mffedit*riO ~nte en una cluls. tanto nuclear como e11.1ranuclear. codlficante o no. La mayoria; do orgoni$t'llOS tM.JseM ut1 get~On'ul eot~s.tlluido por ONA: excepcionalmente. algunos wvs tienen un 90norno de RNA, t.a p:wte <:od;~came <lef genoma. aunque en euc:anotas as m!noritaoa., especifica en bma de 98fl.S _, nbm&cin neeesal1a para dar lugar a prod!JGtos gnico&. t06 RNA& y las proteinas $IO$ $0n r0$pon$3ble$ ae toda t.a acsMdad ceiUtaf. de sus caracterf'stlca& morfolgica$ y 00 muctlas dt i3$ ~I;)YO't tlel oomport<'lmiet\40 de un Qtgantsmo, des6e ta embnognesrs a su crecmento. mac:luratin fl~ e inteloet1.131. 9$\Mo adulto. teP(OductiOn, y 10d~s SU$1u'le::i00eS metabOtlcas y saNidades fisiolgicas. Con respecco al es-tudio del genoma. aeben tesallarl>6 primertamonte la$ <::.trati$!iCM diletend.IIIIH; de ~l)$ y eucariotas:
ll(Ak t(lf\~
IAinmalcJ.. plunu;. k\'Wuru.lt:nt:ll'S)
l'kOt-ARIOT.\!;
1bi!t'l\' .tlll-!
DNA nuck'3r
(cromatma/
crot\'lo~)no'l~
N.ou. ~~~~~... 1"" , bthltol. ~ 11 l~lllll ....., ~ lop 11:1~ d 1 . - o dt tu dhllu NO.;mt!U,....,. ~ ~'QI. N)l!lflW ltltnpK!If'lltrl!'nlt .:1!Cill> ,o.~ lo Qlllodad 0.0 ~A <lllt b anno'I'Om.b t ...r..anc~ a - ) Wf'<tK>I" 1 l>1 ~o'IJHp>lld!nti<! >~ll'floll~ f"'>(~ot tg.oallfll.'n!t. h C11lfll0o<.'ICII!I> <k~ 'll>!l MI)'OI'e> 11;' J,r,. rtuni!IM
proa,.,...,,_
l(,n"'
'"11)"'
R~(!ldese
que los Otganlsmos procat lota.s ('o procarlontes) 501'1 olllas (ecJbacterias y
arq~lenas)
de
IM'\&1'10 pe<)Jetlo (0.2 a 5 .~m diameiTO) c.on membrat\al pla&mbca y generalmen\G oon una ~
odvWr Ogldtl. y
diversas eeuuca:uras s"I.C)Mlciales (1)6. tlagelos. etc.). pero carecen dtl membrana nodGar. d9 ~lo$ y de cua!Quirlf intern3. B g~nom.a d4l pto<:t~ota $ 01. OC>mP&r;,ll'll)tner\\C. ele ~ t.a~i"C> y relativamentil sencillo. Se n:~duoe a un nJCO CIOmQ$QI'OO formt~do por una mol&wl~ c:.'Cult\1 ~ ONA, loea!iUldQ et\ $U$ponsin en el (:ill)$0!. 01'11~ llt'mado\ zona Jk.\Cft:M<> ttUCiltOidtJ. Sin meml)tan& que la delimite. E!llree~le enoon!far. ;,c;lcm.b. una pequet\a cantidad de material gentico extra. no esenCial. en forma de pequMas molOJias dtartares de DNA, 1:3macas pfl)smidos. Los plsmldos poseen la propiedad dG replicacin autnof'l'lrlll.. ea decr. sin ooohnaclbn alguna: eon M di'hSIOn celular. JU(!9an un papel lmpottanie, al eod!!'tcal p-or.elnas que confieren res.slet'laa a tos MllbiOtieos. u otros m~uerlale11 t6Jucos. y ofrecen l.tn8 imponaMe ~ como herramlenlas en la teCt\Ofogfa del DNA reeomblt\an:le. conctetamente como vectores para la lllOOtPCit'8clOo de ONA a clulas.. t.as ot!I\Jias de eoeartot.as (o eueartontes}. &anlo mllloetulares (animales y planta&) COO'IO vnloeOJiares y multitlulares $imptos (Pto1o:oos. hongos y ~lg<'!s}. oon mil$ v~d:(l$ y ~0~1'\V~GI<'S Son do rn.ayor tt~mtlo (1().50 p.m). POse<.-n mcml;lr.Jn~ ~mlltico-'1. pueden po*r PIW'< 0/!M.'tf (platltat}, t.et~en titOe'Squei!!'lo ~nterno, y mue$tt;)n unttgr8ft ecmpMi~taein dloplasn'l'ltlea. con dlfefentes IIPO$ de otgnulos SUI>Celulare!l (mJIOCt>tldriat et1 t'lf'lm'lales y pltl1'113!1 cJofoplastos 81'1 plantas. li.SOSOtM$ IN\ a~~~ . e1e.) y ceras esti\JICb.ll'as (ret/ct4o endop(cisnuco. COfTII)I8jC de Golgf. etc.) El nctoo oone oomo caracterislica esenoal la pf'@WIC13 de una doble mamOrarm nucle<Jr En el QE11'10tna de eucancxa& debe distingurse entre ef genom<J. ~le.-r y el dt orgnulo& El ge_noma n~,~cte<~ r apareoo bajo dos formas eSfructur'*"eAte <Neu~ntes durante e1 cicto oeb.!lef te eromatina (en ~ interla$e enttt divi'$1Qne$), como m<ttonal r.aamen10so disperso p<>t la Mayor patte del nocteo, y los cromosomas (duranle la dlvi!I!On), tacilrnente <lb$ttvttble$ eomo entidades ~as o eotpUscuiOs ltldependlenles Ambas lormas estn COf'ISlitukl.as por &as misml)s moteoulas lineales muy largas de ONA de dob6e hebra. ewechamente asoclikfas a proeeln&s.. El geooma de orgnulot (doroptas.tos y mltoooodrias) est etganiz:aao en cromosomas crculares. al ,gual que eJ de pocarlolas
ovo ll'PO de oompMimuo\acin
lNTRODUCCIN Y ASPECTOS GENERALES EN EUCARJOTAS
caractertstlcas dlfer.nclatH
humano
1.3.2
Magnitud del genoma nuclear de e ueari otas
El material gentiCO conwnldo en el ncleo supot1e generalmeota ms def 90% del total de ONA celular. Por 1an10, el ptlmar aspecto a des&acar es &u magnitud con re&peeto al genoma rMocondrial y el de procariotas. A ditereocla de sto&, el genoma nudear est repaltido en varios cromoeomas. en nmero variable segon la espec:i&, 9(!tlen<lltnet\1C muy grandes y oon el ONA miJY condensado al estar estrechamente asociado a hlswnas y otras proteinas. La magn!tutt det gQI'lom<ll v1eno determlr~t~Ci<l por la <:entidad 101al de ONA en el ooojun~ de cromosomas de una 06Uo E$1.<) $C I)UO(IO e.xprc${tr do vtlml$ tonn:as;
En nmero de e~OI't'l#$,
c:acsa c:tOti'IOSOf'M.
d~ig!\OI:) po..
n en org$ni$1'0$ "-~ y 2n en dlploio$, donde hay 2 ~s do
En masa de ONA (pg pleogramos). Como v aJor consiste en expresar la candcioo de ONA tolal en el genoma de una clula ooo respec10 a la PfOMtl\$ Qn l.lf\a otlul01 hclploido <kt la mtSma ot;pQo;::tO. ComQ so~. qn ol1,1las ciploldes ol v;a!Qr p~ &Gf de 2C o 4C, dependiendo tSol estadio del Qc:lo ctlul<tr lo ms habltwf O$ expre:sarlo en fongitvct pb = PMQ de b<t$(1;; on hcbr.a dotllt, o nt = nuciatio$ en hebra
Mn<:ill~. Pttro molCulas ltttgt'S $0 emplean ki100a$es (kb o kpb = 103 pi)) o mcgttbt'ISM (Mb o Mpb =- 1rt pf)),
c mn!Oicionrj . (!Uf reyzaiiJ!!! la III!W!!ilyd dt l UiSA gt:kar ~a c ut acigtall: Pn rro~io. bl ~n(dud IQt:;tl de 0).)A ('Jll.mh :dula 4ipl(lldc c~~ t:~ C'fllfC' ti)' lOO \'CIX."!! ~twpmor quoc-In d< un:.. ttlulo, p~riota. unQ'Jc la diletenci: puede lkpr h11~1:t 100.00(1 \~
por C)C'!UplO Cl,nl'!id~'fliDdn 105. ~ ~~~!k 11l~utw Qlul~ de: pbi!U$ )' 11nfitli~ IT~ 111
rnX'JI~ de m~-.~or amnl)(). el mi<pl~
En fonn:a
li~t.
la toogrlud totaJ dd D'M de: uoo "'"' ll1.1m111
110milti~ flfiplodc~ JI\
C1lll<l!iUUla...) sct ok uflo.lS l m -ttrM.
Al rtfcnt <'Mil cifrn uJ nim~C;:tO de tiluliiS del C\ICI'f" humnDI () billon .. ~ J()!! cilub$). In lutgitud loltl ''-suhante. -1 bltlottes M m l!frM (4 10u ml, cqlli\'a lc u 100,(100 \"clms 11 la 'noerrn (drwnf~rcnc:in de In TW:m~ 40.000 tm;. 7.000 viajes de ida )' vuciUI 3 la Luna (dJ'ItuKb T!~TDI..una - ) 00.1)(10 km) y 1) \'iljd dt 1J:1 y ~utlta 111 S\ld ldl'!a.ntQ .crraSol 150 millollt;'; dC' \m). l'rt C$Cribtr b St'l.'vtncia oompkta del g\~O~ lOOII de: una cifuln hum11~ $e ncccsitAom I .J!O
~OIUihCI)(:S de Ufl:l ubfl'l !cotlSidtrun00 1,(11)() Jljinllli pt'f Vt~lumt'll y 5.01)0 Jctra~ p(lt Jlflinll). que fonnarn ul'lll "'ptla.. de 2(.0 m de allliJ'll La.~ 0:1I1:~ se h3oen <:as.i JQCOChptttiSibks si !:t qQi(.te COBS!odcnu ~ l(IO-l!JI\Id U>WI dd ONA ""'
h>da l:t lnurumi&d (lll:malmet~l<' b lO" tndividloll$)
Procode, por otro pt'r1e. ~~ ta magN!u(i Del genorna de rOna eomparatflla tan!O enue il'ldivKtoos de una mismtl ~ oomo eo1te e-speCies di,etente.s..: a) Toe!,;. las clula& de 10$ ht:ividuo!l d~ una tnisma especie poseen la misma CMtldad Cotal de ONA y nUmero do r;:rom()SOf'RIS De esta geneull:z.aelon deben exoeptlJarse las olotas 09"TT!inales, dedicada& a la repoduocin del lndivdUO, que poseen la mitad. En lodo& bs cat;O&, e&Ca; cifras M fefieron a o6lul3$ en un miSmo ~t.OOO t:1t diviSin ceU9f (normalmento l;la'ltorfaM). puos, cmo ::;e vr.'l post~ntt: (terna 9). b eancided total de DNA. aunque no el nUmero de Of<Jm050mit$, varia en unill Clvl~ a ~ latgo del Ciclo oeJUiat.
INTRODUCCIN Y ASPECTOS GENERALES EN EUCARIOTAS
~bargo, se ~llmil hoy en dil qoo ~ <:On~e IKI08 100.000. de modo que la Pf'090'CI6!i
eodir-.cantc &61o ~nz<~
a1redl!!d0f <Sel3% (~ DNA. lotl)l, Aunque l8 tunden de los ge* e~!i bl6tl M:l<)bleocl~ par~ una pequoa fraccin e4 total presente en el genonta lMnano, la ~xistencla de una correlaciOn entre cantidad ao1a1 de ONA el'l el geno~ y gr.ldo <~& compfejidad del organismo superior puso oe ma.rvflesto la necesidad di;! e~ruci:Sr OQtl ~yor pccisin 1o11 cwganiZJJcl6n esltuctural. a nivel molecular. tanto del genoma (tema 10) CQmQ de b$ gene. (tem{' t9) 1..0$ hechos ms caracterislioos eo relactn oon la complejidad del genoma nudear 900 la presen01a de gandtt regiotlcs qvc: no GOdifican Pf'Odi.IC1o gnfco allguno (DNA no COC'IIf}c8J)Ie) y fa ex..si.P,tlca de .S~Itl$ de OA ~ $8 repilen un nUmero ms o menos elevado de veces (DNA repetJ!IYo). Como se estudiar (0(1 de1enrmie'IO po~~. My QI}O unir a ello la ex1~encw de una enorme drversldacl de secueocras (polimorfismo, tema 26) M diStinll)$ r&gi~ dol ONA, tanto sencilla& como repetitlvas,
oodificantes o no.
1.3.3
Magnitud y caracteri sticas del genoma m itocondrlal
8 gero:na de o~ (mltocondrlas en animales.. mitoconctria&: y cloropla$106 en ptantas) cs., pos.jblamenee, un vestigio del cromosoma de bac:tenas .cwcaicas que oc.cedief011 al ci!Opla&ma de euc&cM; primitivos. par. dtu ~ tr..s ta evoluci6n a dichos orgnulos.- So ace Q\10 1<t millocondritt (orgnv.lo qve apott3 ei90'Yo de ltl enorgi<'l que n~Mn clulas} surgi al acumularse et OJtigono.., 18 alm6$ftlfCI terrstrc Po~o. lo milCondritt y ll mjQoo df;! lt~ c61ul<' eucariota se crearon a la Vel". ill lncorportarno por 4lfldocilo&is tlulas p~riol<ls uorObiea$ <11 interior <fo lct clula wcaribtiCOJ ~ y tusiOnar~et aneJa$. Con el 11empa. la mayot(a de tos genes procariO!icos (gene!! protomitocondri:"'lf!':!l} st1 integtan)(l en el genom11 nuclear, eon 10 ~ et eucanota primiUYo 31\af!tbiOO ya podfa vMr en Of'l:t {ttm6dera aetbic:a.. rica en oxigeno: slO ooa pequera froocin del genoma procaoni1co primigenio $)8f1Tiilneci en la mltooOfldrla. la&c:\.ia:s anlmale; po&eetl un nUfllllttO ""'Y vt~riObiO <'t milO<~. df!pen(liendO el kl;do. Ca(l{t rnllooondl1~ PQ$00 vanas copias do un (lnioo t;rC)m(ISQma, $11uad:)S en la matriZ Milloeot~dr1:tl y aont:lada$ a 1~ cnembtana iti'Orna. En con~i;). el nUmero de eopl3s de ONA rMOOOfldrial {mtONA) en una olula oscila entre 200 y 1()0.000. El ~rom0$(lllna miklOOndlial es blcatet\alb y CirCUlar. como el de j)(OC8tlota9, aunque de tamal\o muy Inferior. 16.569 pb en hc.lrru:aA~n, Q)n ua long~I.Jd de 5 ~m y una masa moleQAar de tO MOa~ e.s1o supone. unas 3.000 veces menos que la longitud del ~romosoma ooelear ms pequeno. Tenlendo en cuenl8 el nmero de OCJPas totale& (2 del genoma nucil:tat y m1,1lhple$, y muy vari3!11e$, del miiOOOfldnal}, se puede calcular que el ONA mitooorw:lnal total supone. dopendiando dol lejidO. enlt$ un 0,05 y un 20% del OHA total de la clula. Finalmente. el cromosoma de cloroplas1os O$ igv,almenlc bc&!enariO y cireulat, pero de m8)'or tamallo (JJ8 el mitooondrial. A dderencla <JetONA nUClear, de gron cOITC)kl;d.,d. oon rcgiOncn oodilicam~ y no codif.e.,nc es, ~ miDNA ts f!n su ca&t total~ ooditcanto y no rqpotllivo En C(lncreio, ~ Ct0c'M$0nl<ll milcX:ondrlal null\&t\0 c:::oouene un 101 a1 de 37 genes: 2 par" rRNA, 22 .,-t~tRNA y 13 para pt01elnas que forman parte de los oomplep:S enzimticouespiralorios 1 , 111, IV y V. $t.'s $Up(Wiet'l slo el S% de tas pro~Jnas mltocondfiMes, mlenltas q~.~e el resto Mtn codifiCadas por Ot4A nudltar.
**'
Tema 2
Componentes fundamentales de los cidos nucleicos

2. 1
C.omponen.t.e 6eido: Foslalos ................................... " ...................................................................................
2 .1.1
Monof06fatos ............................... --
9
10 10 11
2.1.2
2 1.3
Oifosfatos ..... . , .... . .

Ttifoofalo$ .. , , ....
2.2
2.3
2.1.4 Tiposdeenlaoes6osrt~w.... .. ..... - ... Componente neutro: AzU c:"*''"' '''' '"""'' ' ''- - .... .. 11
Componente b.lsk:o: Ba.' " nitrogen<ldiL$.............., .................................................................................,.... 2 3. 1 ~C$ niii'OgcnoO;)$ tnl\!$ lreeuen~ - 2 tipos.......... ....... . ...... . ..... , .. .,_ ,_ ,., ....... .......... ... 2 32 Ollt\$ blt$0$ dO itltetS biOIOgir.O y CllniOo ............. , , _ ,,, ... .... 2 33 ~3<10$ r ~~Sieoquittneas. dO~$ bases pul1r'liea$ y J)ltlmidinh:as , , 2.3.3 1 Exls!eneia de dipolOs .... _ ,_ ,,, ........................................... _ ,_ ,_ ,. _.,----.. ---........ ... 2.3 .3 .2 Hidi'OfObieleac:l... ....... . . .......... ............ ............. ..... ........ ......... .... ....... ...... .
2 .3.3.3
12 12 13
2.3.3.4 2.3.3 .5 2.3.36
14 t4 14 OsposiCIOn coplanar ae kls enlace$ de caaa an1 110 (C N y C .C) ....................................... 1 4 Tautomerla o iSOITierla <lnilmica ....................... ... ..... . . . .............. .......................... 1<1 CarCier bSIOO............................. .................. .,,__, .,,_ ,.,, .............. ....... .......... 16 Absore.Onoo lt'l lu% ullr.'lvio~tt , \7
"".a
Los actdo& nucleicos (DNA y RN A~ e&tan con&til\lldos por la unlon da numerosos nuclelldo&. de .; bpo&. Como &u estudio. se oon&ideran algunos aspe~o& de lntets !)Mil cada uno de los componemes estf1Jaurales de diChas unidades, los nuclebdos
r~troducci6n a
Fosfao(s) Nuclelido + { { Nuclcsido
Azcar + B<1se ni1 rogcnada
2.1 2.1.1
COMPONENTE CIDO: FOSFATOS Monofosfatos
El fosfato 11'\Qrgnk o (P). mezc:lil de 1 35 especies qulm&Gas result.81Mes de &a dlsoclacton oe la molct.il3 de Aeld(l fosJOiico, aparece como anin a pH c.:!o, como dlatliiOO a pH tlsOigico y como ttiani6n t~ vH alCalino En la ~. el losfa!o &e encuentra en fOIITia libte (P1) o fOt'l'Mndo pane de numerosos compuestos gniOO$ (R.P) I)C)r ejemplO. los
nucle!idos.
10
COMPONEKTES fUNDAMENTALES DE LOS CIDOS NUCLEJCOS
~i(h.'t fo;l!<ftiOJ: lliddo onof06!Jrico)
1 -K>-P-o ~
1-i,PO(
.w -"" ' .,
.9, _"'-",.\l _ uo-P-o ~ CY-P~)
,-
.\-
f, .. ruw tnut~au,.._ , 1 P 1 e- mt"l.d:. dt Lu J "'-lillleu dc:l 1.: t.-lhnM

m oltf_.tlf(opo,:lbn~ el f'm
2.1.2
Oifosfatos
El d.ifosfato o plrofosfato (PP.t &e presef'lt8 a pH re~ como trianin (una de las -1 formas inicas del cido pirofosfrico}. Es ~ble n diso!~~tiOn a pH nevlto o ole81ino; 1in ombtlrgo, dOntro dO 13 olt.lf~ es 1110$taCIIO por ~ctiOn de la& PI'Oioff;t10ws. lormttr~<~o 2 P1 Al*ece oombinaec> fund111ment811'1'1en1 e t1t1 nuei&6sicl0s-dib$1a1o (por ~jt.~mpfo.
AOP).
l....,_.<"!Uihhi.,...w~ ~ f~~t~o;.004d poli
ictdo pirofosrtiro:
llic-u .lt) dt f~fi\rx:v)
1 10--- >--<>H -.a: _..
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-rmrMtatt f'lfl!lnlt' tRf>l')1t vrnpuc lo v1 ,:atlt pttlfr...l:.hao.kll
2.1.3
Trifosfatos
El crifosf;~to (PPP1 ) e preseda a pH I!Skllgloo oomo t-etraanin. No aparece en forma libre, M10 foonaodo parte. o&cn(::iefr'nen1e, ese nuclecldos-trifoslato (por ejemplo. ATP).
ki(lo tn(oc-l~o
JI4P~Otll
COMPONENTE N.EUTRO: AZCARES
11
2.1.4
Tipos de enlacas fosfato
Pueden distinguirse canco tipos <k enl~c:es fosfto que van a formar pttrt <10 los nucJ(IOtdO$ 0b$6(vst ta estructura y nombre de 10d06 ellos. asl oomo la diferen.:::G enlre enlace esw y anhl~ on tos nuclobdos (llfoofat~ y trif061atados.
r~-. .- P-o
fc,.f.X~h;r
( li:~follli'IIIOI.-':>1cr,
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R -o-r -o--R '
ftl;,l~ iS,I('{.
f,.(ul<t.monoiOsfatot un ~;,,:r f:flliM ~H.:Kin ik 1., mol(culu
un -stC'J dobk coo

do6 ~1.'ulas di!l!rtm~
ln[coslilo
2.2
COMPONENTE NEUTRO: AZCARES
El azOcar (ftclalmente llamado OSd) siempre es una pentosa {5 lomos de carbono), biM la 0-ribosa o fa 0 -desox.rribosa. La rtbos.a (nombre derivado ae osa de' Rockefelet' ln511Me of B~hemisuy 1908) interviene en ooclesldos y nuclebdos bajo su forma ms estable. PO.ribofuranosa.
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m~r$9
OtoqulmiOo:
12
COMPONENTES FUNDAMENTALES DE LOS CJOOS HUCLEICOS
2.3
COMPONENTE BSICO: BASES NITROGENADAS
Son moleculas OO!erodcllcss, con ms deo Uf'l tomo de nitrgeno.. lormadas por un anillo llnloo (pltlmdine) o por dos atlllkle condensados (porina),. Obs.tVense en 5os ejemplos de bases qoe lfltervlenen en lOe cldos nuclekos f.a numtf8Ci0n de lOS tomos del helefocldo y la posi016fl de los wshtuyentes eltlemos.
2.3.1
Bases nitrogenadas ms frecuentes: 2 tipos

P{lm~uln:s )' nomencl:uum d~ BASES PIRIMIDiNICAS
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wollo,)nn+~..-.....hl.,.ml
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A modo do: resut~)CO. la posu:jn de los

b:l> niuo~.:;~ es:
~i1U)'<'Illl.'"' ~~:..; ~.'n Olida u011 de lal
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2 )'4
'
6
2)4
COMPONENTE BSICO: BASE'S NITR.OGEHADAS
13
2.3.2
Otras bases de inters b iolgico y clinico
Ei$t9tt QCt <a$ bt~MS pKinu;~s y piwrudtn.cas., en Q(:t"'ernl poto fr&rue!\le'i, (l~e SutQ!m por modficoOn de laS bases pnn~ A. G. C y U o de alguno de ws anlog06 (hlpoxantna. HJ. Son de origen natura1 o sntuoo. lnterv~ en procesos como la melilac6n del ONA en la olJfa y mue&tran dtsbn4as propledaf:)es (anllbiOtleas. antl\llrlca:s. anlltumorales. ele.}.
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14
COMPONENTES f UNDAMENTALES OEJ.O~_ CIOO ~ CLEJCOS
2.3.3
Propiedades fisicoqumicas de las bases purnicas y pirimid nicas
2.3.3.1
Existencia de dipol os
Toda ~s bl'ltell PQSeen lomOS: eleclronegativos de O (e~toeplo a<lerdna), en poslciOn exoclelica o ell'lranudeer, y <le N, IMI<> t.~toc.ielicS oomo ef'l el anillo, nucleares. Como consecuoocla. son aboodSftleS los enlaces po&ares, lo que ' " l)rmitt inltr.lloeionEu entte si mediante pueNes de hidrgeno, que poseea una ImportanCia capital en la estructura ~n(l~ri~ <te IQS AcidO$ nudeioos. en eSQeclal del ONA.
2.3.3.2
Hidrofobicidad
1.01 n.,,~rt'IN:.ttt arcmttue~ de ~ a~ Nlee que las bases ~~gan u.-. mateado car6ctar apolar, aean hldrolblcas y pooo $QiubiC$ en agua t~~l pH celular, cef'Cano a la neulralidad. A pH cido o alcalino edQulefen carga y se haoen ms $01 ubles en agua. Como ya se esrudiar, tas Interacciones hdrofblc:n d a.pllam1 ctnt et. qve tktneon lugar eniJe ba&O$ diSI)ue9t8:S patatelatne<nle (a mooo oe t'nOI'W!dJJs apiladas). son esenciales para e&labiiz&r la estructura tridimensional e
b$ a<:iOos ~W~Cielcos .
2.3.3.3
Disposicin coplanar de los enlaces de cada anillo (C-N y C-C)
Se debe al carctsr arom:tioo. y" pu6de Ob$01'\'ar en mOdelOS e$paclales:

(' itosirm
Adcnn,
2.3.3.4
Tautomera o isomera dinmica
Es una l$01'1'1$tla de ~ f\Jncjoo,aes, Consiste. con carkter geoer.:ll. en lt' rnigfb(ibn del $:1<lm0 de hklrogeno uniOO;) un &tomo de C, O o N hacia 0110 atomo adyaoenle. El tipo m$ ftcuet\IO" lb Un.Jiometie; oetOenllea.
f l)Uli'IIIC'It:l ~C'IO:tt(!>ho.'
41l'ma amina
prin~ria
SQn muchO$ 10$ eompue$1 0S orgtrioos que emten como mctc:li\$ de 2 o mJ de estas formas tautomttcas, lntcreon~rti'*'* y en ~ Entte 1 06 oompue&tOS he'leroclcliOO$ son do espeeial llmportanc:aa las tautomeria& en la&
basn P'Jnic8$ y pirimid[niCas, en las cuales la migracin del H llene lugar dE!$dle un 10m0 de N nuclear haaa 0110 tttomo exltanuae.at. y vleeY8t'Sa:
Tlii.IWIIli'liU Dos bpos
.,.
la.:.I:UOOIaclilll.'l
rn11 r~~-;21U1 n:t
fnu(''"lC'rW rruna.rl.a
l 3UI001 (ri ta:s
en las bases
nnrog.t:Mds
11~~
lactam3
( (('ut\11 N.'l"-
1 laeuma
Jtl!~
fonJIOl imiM
~NH~Q
Nl-1
/" rnmu cnut

Nn~k'lllt
forrna amjna primaria

CN t'IUCh.: l )
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rn o:ue~lUo>. ri 1rupv o:o:1 o f.;ttJ~~ pa~dt un cnlu!X' ...-.Jn ~i~l~. o;./.rt;ra-. Al cai~P~~r el )l(oulo) .Y J 1dNk d N nudo:;n al O li:t ll'VJ'!I t'(kl. K OIIIIV~\IC' ~ d la tU<.\ ml ' l i(w'""'' F.~'" IU"""IIll.'ti llfua C. Unte., punlli;li OW"!!Il)ltbml. ~ f;t!' J tltttutdlu..~ {", l, y '1 '
.0"1 ~c.wtldwo~.,.ur~~~ l'l!mlf.

~:~uc:ai
m bin:l iltlf'IW'I lk 11 ob,lc

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ti N IIUdtl!t
Clln\i(1\C' c. vn
JI'II'IO "'""" IOS!a '"il"'' mcria lll 11!11 UatQ.

p!rillltdiniiPnunl)>w;shtiltdA. ('. )11 t..ll 1 j'lut!~ o\ ) (;
f:t""
COMPONENT E BSK:O : BASES NI TROGENADAS
15
En oon&eQJencaa.las tao~omerias de la& bases nitrogenadas 90n las sgu.entes;
tina OOsc (A) rrcsenta u~ sola tsulomcra:
La ltlul (lmC.ria de A es
im1ns-amina primari:l.
t~ l:tuWn~m' mrnt ~~ nnmbnm pcmeo.SC \ 111 .11~t<n~co wbn.- 111 k lr.a ~k
~NJ_N
'
aminn
J.:_)
"
o
IIN!.y~) (J_N
~
imina
A NH
llbiii'C"
"
('U3tro bascs(T,
U. G , C) p~ncada
una dos tautomcras independientes:
T y U mucs1ran tautomcris doble. lactamn-laelima
~~~:rCII T
0~1
JI
........
........
lnc.1ima doble
laetanut doble
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H
u
l.tlc1ima doble
loctamu doble
(j )' (." lll U(!$lr:lll 13UIOnl<:tf<'l$
imina-rumna pn mana y lac1 amalactim.a.

t w; ln~t~mcr'.)fi imiru. ~ n;)mbr..Jn IX'nrcndo un ll<"l~~ $<litre- b
II:N
I'~N G ""~~-'> NAJ.) A.JlN . . -.'= ...- H

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JI
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ktr&dr laNse.
lactama y
amin.:~
l:telim;.l e
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N
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NB
I)Ctamay
lac.-c i ma e
lnllll:l
amina
eS"I:Ibles.
amna. con lo que eJ equilibriO se ei\Cuenlr.'l de:5PiazMo hacia la rzquletda
Oe$de el punto Oe Vl9ta qulmlco. en las bases lib(e$ 1a11 form..'1$ lWIOmricas laCllma (enol) e .nina son mei'IOS y pOr ello son unas 10.000 veces menos abundarttes que M OQftOSQ()ndiente& ~meros lactama (OlMO) y
16
COMPONENTES FUNDAMENTALES DE LOS CIDOS NUCLEtCOS
2.3.3.5
Carcter bsico
Todas las bases nitrogenada5 &OO ba&~n d~blle$. J)Ve$ M lrtQITIC)$ do N, tanto nuelot~~ros eotnO extraMJelerot.." pueden protonar. oon valore& de Pl<a a~mprendidos. on110 9 y 10 Como ejemplo reclort:SOI'tl8tiYO, Ob&rve$e la iOf'li~ll't de la adenina;
t~lguno-s su:sliluyentes.
Sin embargo, es1e carCier bs*::o. propio de los onillo$ p.ritli't y l)irimidiM, se ve disminuido por la presencia de En c:oocreto, el grupo -OH de b5 enoiO& ()' \;lc;lima..) e. ligeramente &Ciclo y puede disodarse:
OH
N ~C
'
Como oorn;ecuetlCia. la& b95e5 nllt008fl.;das QVC I)Q$00n grui)OS. ladama (ceto) pveden actuar como cidos. a tmtd!s de sus t.au!.meroiS lac:tima (enol), c;:()n b tv31-M 'tt (eduCido el C8f8cter bsico propio de tos anillo&. en mayor medida cuooto mayor sea el nUmero dt grupo$ ~OH . V6anse lOS ejemplos ~tes: a) A es la Onlca base que no tieno QI\ICIO cotorenol y. por 1 an1 o. no ITlUeStra ningUn can\cter icido y e& ta ms bisk;;t de todas
o) En e y G. el Unloo grupo OH apol1a"" c;~rlldor jeida nvJY d&bil, 90f lo que siguen oomportndose a~mo basfn;
NH,
(\lido 1ambi.n
para G )
{_] u~o ~~
N
1 <0 N
NIJ
(forma l~amal
"
(for,n:l Lactima)
tfonn;1lactima
ionilada)
(\lido 1.ambin
.,.... U)
2 JJ~
tfom1a laclin).'i doble)

d) Como e,emplo e.xnniQ, jt:ido f'lco (base nitrogenada con ITO$ grupo$ OH) ya muestra vn marcado carilcklr ddo
{at~nque
oo e& un cil: futtte)
((orma l;1 c1urna ttipk ioniil'.a{b)
COMPOHENTE BSICO: BASES NITROGENADAS
17
E&.la di&OGiacin. oomo cido$. de 10$ grupos enol oompensa en parte el det;equi!ibtiO tautomric.o antenonnente con&tderado, a..mentando la presenCJa de las formas lactim;~ (enof). No e<:Utltit un fllfecr.o &imi<w oon las f.otmas iJmrn;t, pot 10 que e.-~ 1a (ltilcUca es oomOn que en las bases nlltogenadas $610 se oesetlba 1a tau!Ometia laetam31aeti~. de rYU:'Iyct llascendef'ICia biolgica.
2.3.3.6
Absorcin de la luz en el ultravioleta
E& una pn:piodad car(l(;tefiRictl de laS ba$0$ punicas y pirimidini~ . debida i'l ~ carlleiat aromitiw. En bs e&pectrO& do absorcin,;) pH=7, se obSoe:Na \11'\& rutw\c al>$orci6n de la Jl.lz en el ullr.IWO(e43 (UV), ton un rrW.imo cerea de 260 nm para kM:ia& ellas.
~~ ll!llok
U>() 1111\
b nu:;eda o.k ~
14
u;knion
21ro nm rflltctl'iertt ron b medida de prod~
Q,:=>"'-r-',
7
'
\
1 1
guanma
'
longitud de ond.'l (nm)
1 1
''
,,,_
El mantcnimiemo .-esta propiedad en noclosidos. nt.ltlebdos y ados nucleico5. de los que las bases forman Pilr'W. POrmito &u vti!iJQ6n C~nalftie<t en e&tot; oompve&tos: por ejemplo. par<~~ la cuantdicacin do cidos nuclelcos (pOg 36).
Tema 3
Nuclesidos y nucletidos
3.1
E&l ruc-tura de nu<:6e&ido& _, _ , _,,_,,_, _,,_,,_ , ,_ ,,_,,_ ,,_.......- .- ............._,_,~--"-~- ..~ - 19
3.1. 1 Calacterls1lcas genera6es -- ...- - - - ... - - - "'""- -- -.. - "_..,_ ,,,_..,_ ..,_.., ,,,,_ ,,_,,_,.,. _ _ ,_ 20
3.1.2
T ipOS de nudesidos ,,_, _,,_,,,,_,,_,,_...... ........... ..,_ ... , ....... ..,_ ,,., ... __..,_ ,,, ..... 3. 12 .1 3. 1 .2..2
3. 1.2 3
Nude&Jdos que f<:ltmaon pana de ~c:icb$ nucte.oo& Otros nucle6sido& de inters biolgico y clinioo _. ..
20 20
21 23
... - .... ... - Anlogo& de nu~idos . inhib1dores de la tran&CtlpiS$CII inversa .. _,,,_ ,,,_ ... _ ,,,_ ,,,_,,_,,,
3.2
Estruetura de nuek!Udos - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 23 3.2 . 1 CaraCieri&tlcas generMes .... - ....... - ... - ...... _.................... _.... - .......... ................ - ...... - ....... - ...... ~... . 23 24 3.2 .2 Nucletidos sencillOs ... -....... -.... -...- .. -.. -- ---... -... _ ..,_, ,.,_ .,., 3.2 .2.1 NOmenclatura . .,,,_,. __,, .. .,,.,., .., ........ ,, , .... .. .... ... ... .. 25 3.2 2 2 E$1ructura de los nucle6sidC~Hnonofosfato que forman pane de los cido& nucleloos 27 3.2 3 Prop~ f~&iooquimica:s de nudesidos y nudebdos _, ............... ~ ........ ....... _ .. ,,._........ . 27 3 .2 .3.1 Propiedades iOonieas ,._ ,.,_,,.,_ ,.,_,.,_ ,.,_,,. ..., .......,.. - , ..,, .,, __,._ ..... _ 27 3 ,2 3.2 Forrn<'Cin<lccomplej()$ , .... , ..... ,, .... . . .......... - ...... - .... ~.. - ... 27 3.2.3 .3 Absorcin de la tuz en el ultravtofel a ,_, _..,_,.. _, __.. .,. __.,._.. _ ., ... ... ... ... , . 28 3.2.3.4 Noeletidos como motec:ut~$ do n~&uf\'a onergtiea ... ... ........ _..... - .......... 28 3 .2 3-5 HC:Irll&i$ _,., ...,_ '_,., ..... ,.,_.,., 28 3 .2 .4 Nucte<ltil:$ cidicos .....,,.,_, _,.. ~... 29
3.2.5
Nuo!e(idos OO<Piejos. , _.,,
29
3.1
ESTRUCTURA DE NUCLESIDOS Con-esponce at esquen'la gel'lerat: nuclesido
= base nitfogenada
+ azcar
Tatnbtn Pvoe<lefl con&i<ferarse como el producto de la hidrlisis de lOs l'luCietlctos, 001'1 liber<'Cil'l do fo st3to .-.otgntto. Equivale, por tanto . a un nuclelldo carente de 1 0$1 0'110$
20
3.1.1
NUCLESfOOS Y NUCUTIOOS
Caracteristicas generales
La \P6o oovalente (~..ce N-gJico$ldico) onV. ao bMe y ol O'llli~~~ ~tibost'l o oesoxirrbQ$8} toe ~s:lablece enlte el C-1' {carbono ancmrico) del azUcen y el N-1 del anillo pirimidinico o ~1 N-9 ~Millo purlruc::o, oot1 prdida de un~t
mol6eult'l ele~
oildwdo
llll<t ba,~
nu.;koHk'
IUIII biSo;<
pitiGlldiiiKII
purlnlo;
,.
Ofl (0~1
3.1.2
Tipos de nuclesldos
Debe disl!ngulrse entro nuelt0$1do$ oonslltuyentes de addos nuclelc:os y otros nuct.sidO$ do In~ biolgiOo y d inteo. Su descnpdn sie~ se hace en f1.11o:;;i6n do la na.turaleza QO!IWC& de la base y del azOcar.
3.1.2.1
Nuclesidos quolorman parte de cidos nuclelcos

Nudcdorii.los pu.rrrucos
N'~~eil~idoo;: pirimidiokos
ttl~h;c.\~l!li}
'
,...
e , :; ,
~
~
nl>tlllw-k\1-i<Jull (.-..; ~\IC!Mr.ll t"tl d 1" <\ ) )' (.:n RNit.l y dr;o~>m"l>o."'iil. ll:t ';.t\l""t..,. r'floueflll'illl &'11 d U 'lA lle-IITibon~KWsicli (t n. DNA)
delitlXInlbOMitlo:oddo>
lf'!IU~Al
n\o!ollt~c-~.111~
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II<X'Ib .n.
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T.u 1..
~ ------ - - - -
,_ ..,. E ------- -------------------------------2' -dCSOAiocitidi.Jlll l '~1itnidiM 2 di.'SO,iad.,..no!lina l'dcsox " -----------" ...... nllu{o;o,....... "~" - ;'c\,
~
su liJO -K1111a ............... ~ ---- ----~~iJo .!"!~ ... -- ~ - -- ----------- ....

:.d~ln.a 1 1' l!--O.tcloo.oflor:onuolli
guano$uli:l
~lfu
11 1!11!1..
tiJidltl!l
'J...4 1'-04!Htlu1n1Mil)
1<ti'-fl-O.rii>C.fllnont,.il)
IL'\Qfpo: ...,,_.
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lll' dC'!IIctl!I'-IHl
lldlmiiM
"~""';_!) .........
nhc>r 111_.._l~
1-(l' -lbol.l l' ,_.,_ ni'Ciflllll-1) t unin
la Cfi$1Anclon antf9 nbonCJCieSidos y

de$0inib<>s:~ en la molwta
desoxlrrlbonllde$~
esllit'la, obviamente. en la presencia do
rl>o$<t
ESTRUCTURA DE NUCLESIOOS
21
3.1.2.2
Otros nuclesidos de interCs biolgico y clinico
Adems de los oompotle:l'\1es de 1\uCieObcfOS y ic:ICIO!I nucteleo!l. eiste' en lf'l Mtu1111ez:a 0110$ nu<:le0$1d<)$ en IOrm& libf'e o oombinM;a Algt.mo$ do ello& $0n $igr'iiri'C<'Ibvos l)(lr ~;u lo~tJCIQn o ~CCin b.ioQuin~n . o induoo por sos apllcactOfles elinicas Deben citafSe louigu!entes
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11-( ~IMlolllluul"'"'""'t 1 :Kinmu
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1\l '..i-l).~fior.uU~I
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22
NUCLESJOOS Y NUCLETIOOS
Cmfl!lll..
"'''llo._"'f''"'k.o.' A. B. C, D
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\11: ..('U,
h!Kto.lo.>)
A ti lo:<O\;fl;
,,..,.,.,...,.hito v ltl,\'hl.omW.tl 1' ..(_JI..('II,.CO.Ntl,
'~~~o"''"""""''-'".,'
' 1'
t ,,~ua~
5' -dcsoliadenusilcoballunima (unlll (1(' las ffl rllln,( t(Jeu.dm:1d~as dt l.a 'it:tmlnu o_;, 1~ en~ """ii' R1ll Yfi:rrm.:ii6n ~
-.-c.c,
ESTRUCTURA DE NUCI.Enoos
23
3.1.2.3
Anlogos de nuclesldos, lnhlbldores de la transcrlptasa Inversa

lnrnunodellclencra tunana (V1H1 y VIK-2). causan~es da! SIDA. En tos eotwierte en lOs eoespor.tte.ntes desoxitludeOsiCIOS
Se~*' para combatir tos rettovlrus de la
retWK:S~ aeWM como l)f'Of;';rrrtaOO$ ya que ta celu!a an.flVIOtla 5' trifo~fato. que son los verdadeltos firmaoos. pues eompiti!fl
oon los de$0J~irribonuelettc>$ normales. 1mpicliendo ~
ea ttansetiCltasa lnYBtsa. ptopla del v.f\ls, sintetice el OHA COI"'lPlementanoal RNA vinco
" 1!IUtUkO\ lk.'\t 1'\
Uased: la
..uc d~n\<Jn E$trtl(tu r;
fmliru
Cit'l!\in:.
Hi(k"3ntin;l
~
NQml)~
C:<lfflpl~10
" '
~~"
1d "d " "d "'d

2' .3. ~ll idQhi(lr~-... 2'.J'dideSOXI
timi dina
2',).'-c.Me~.-.~i
<>
~"
N
)~,
.0 "":.X> 1.., '

1' ,J'd ldC~O.\i
mosina
'11
"
. r .;~.t;i.Jo.
timidina
1' -c.1~o"$0Xi
)'.til.Jc:ltldma
1'.3' -<JideSOM
,\/T 1 idm 11J m;a
c:nidin.:t
NQntbfl;:
oomcrdal
d-IT 1,,nudin;l
dd( l..tl~ltahin<~
l l( 1~m\ 1Mfiu.<1
ddl
1) i,J,U\1,.,. ifl;
3.2
ESTRUCTURA DE NUCLETIDOS
Corresponde al esquema genet"al:
nucletido = nuclesodo fosfato(s) = base nilrogenada azcar+ fosfato(s)

Tamfln se puede cons.toerat cOtnO:
nudetido = azcar-fosfato base nitrogenada

Nuclctido
3.2.1
Caractersticas genoralos
se e:sl.ablece entre uno o varios grupos fosfato y sel\006 grupos
La ~ . de carcter eo~te (tosromono&$ter),
OH ~~ t~ZIX:t'lt del nllde$i(lo
La ImportanCia de tos f'k.M:Ieotldos es eKoepcional, ptir'IC:ip3!mente porQvO $()fl k)s mon6meros constltvyentes de tos c\0005 nucleic;.o$ y. POr tanto. los productos normales de &u l'ltdr611sls. Al mismo tiempo, porque apateeen et~ lorm& lif>fe en disbnCas localrz8CIOOes subcelulares, forman<lo parte de molculas Cle gran l(ltetes DiOquimieo (e$C)eeatmentoo coenzmas) Para estudrar lOs nucle6tld06 se emplean diSI.irllos crfte-rlos de Clasiticaein, acendiert<JO., Carae1erlstlcas esttucl\.l"8tes, ctitetlo U1111z.aoo I'M)frrta!mente: El n(lmero y poslclbn en et azOCa de tos grupos IOSiaiO. nuctes.icto$ mol'l()fo$i310, -bi$1o$1ttto y .tn.sfot;f.ato EJ tipo de azea,.. rlbonuctelldos y 2' -dC$01(irribonuelttiOo$ El tipo <le baSe nitrogenacsa. nudeOtidO$ purin1eos y pirifTII(.!iniOO$ Ct~~r3~e line31o cictioo (dmermnado POt ' fO;Sfato).
24
Otras carac!Kr~leas . atas que slo se alude ocasiOnalmente: Proeo<Jtneia o es~ en 1<'1 o&kll8 Funcin. etc.
NUCLEOSIDOS Y HUCLEOTIOOS
....
3.2.2
Nucletidos sencillos
Se oonslderan nucletidos senc:ilocs lo$ q.e presentan tosf;.rto(s) on 1)1\CJ $da po$iocin def a;ilct'r: os1o inch.Jy~t tanto fO$ oue tienen un Unioo I0$.1810 ~onolosratos) como lOs que Uenen dos o tres fosfatos que estn unidos entra si {dtfo6fatos y lrifosfatos) Se muestr<10 como ejcmQIOS tos eoespo~lentes 8 adenlna:
Nuclesidos-Monofost:no: 1N M P)
(P n(lrmalmcntt en 3'
1)
Nu<"le$idos-Di fosfato: ( NDP 1

(P CORSUii\'0$. DOrmalmente ~ S')
5'. rarantei\Ce en 2')
N ti~
S(r)
()- -Q('H,_A.
,.,.,,
d AM P AMP
r.~tu
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' '
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o-1!~-~-o~j
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" J...,._l l:):N

1
NH,
N N<J
f 6
.1
H
dA I)I' AOI)
H
Nll1
En forma hbr~ y .;Qmo JI'ICNl(~'"ten)$ ~'<Mbt1tu)'CTitcs de los C"idoo nudcico~
Slo en fo.'lmla libre: tienen funcin
~m"rgtk,.
Nuclesidos-Trifosfuco: 1NTP 1
(P c>n...."'CuLhi)$.
nom~alm~'tltc en S')
Sl<tcn l(lt'Yl\ll libtc.
Son lo$ 101.S i mpoelnant~'S por

stl
funci-6 cncrtica yJo
o-IL-o-l!-o- ~-o
p o
" o
't~).
N
.,;QCntmd tiCll. Adnu.b. SOtl

pt\.'<:Ur:)te$ ~'1'1 la biOS.iiMcs.iS
bt b t
"' ..o. ......
dATP
t\TP
1k ddo nuclciros
, .,
s.
.1
lO$ nuciOOikiOS que torman pane de los CIOO& nucloico$ sen siempre NMPs oon un fOsfato en posicin Su es-IT\Jctura y nomenetatt.wa se estJJdlan de forma detallada a continu:tein. Lo& nudeeldos con 2 3 fosfa1os consecutivos en (dloslt'IOS o NDPs y trlosf.a1os o NTPs-, respectNamet~to). dllda su imponanta funcin bloquimica. son objeto de esrudlo en QJI'SO& de SioQui~& Generat ~afmenlil . otros nudetidos. oon m ra1os on mlliQies poslcbles del azOcar. se est\dan pc)$t.eri0fmel'lle oomo nucteo!Jdros clclicoso compleps (pg. 29)
ESTRUCTURA DE NUCLETIOOS
25
3.2.2.1
Nomenclatura
lO$ A~~Cietidos s.c nombran se-gn dOS Criterios:
a) Como steres fosfato del n1.1closido. P(l( ei~: adenosina-monofosfato, guanosina-difosfalo. unchtl~rlfosfato, etc.- (llble'Vi8CIOS.. respeC1ivamen!e, como AMP. GOP. UlP),
b) Como icldos. sustitttyendo la terminaeiOn del nombre de ta base por el sufijo -iNco. Este criterio slo se ul:litll norrnaiMMte para tos nudet5idosmonQfO$fMo. Por q .: 6Cido adef'tllco, ciOO guan!lroo, cido undilico. etc.. (respectivameole. ~1'3 AMP. GMP y UMP). En el caso de nuclebsidos.-<litosf31o y .tfifOSf310. se emp6ear'lanl0s nombres diadenilico. tritu::!eniieo, diguar\lllco. etc.. (para ADP. ATP y GDP). Si se quiere tontr en cuel'lta que IO!l restos tosfato eslirn ioniUK:IOS a pH rtslolgloo. se ut!llz.a el wfijo ~ato: adenilato. gol'nit;)to. ~dilftto, etc.
C<ltr~
.rvandeoci3 <'nu .. l ~ nomh
',s,. h:t,.e~.
IIUCicb~1.Jo~ \' I'IUd\'iidM:
llbtc-nturllc(lmU:u.
u
Ul'aCiiO
,.
e
citosn:.
citidirn~
bm:
nuclesido: nucktido:
(tlu\'1(6si<lo monofo.sf1110. NMP)
ndcnin3 adcno$ina
guanina guanosina
lim.ioo
timidin.'l
uridina
timidilato, citidilato. gu3nil;no. uridikuo. adenilato. c. adt"nlico de. guanilico 3c. undlico irc. timidlioo c. citidilio oTMP oCMP oAMP oMP oUMP
Sajo amboe critenos. pata, indic{lr de forma 11\1\s delallada la es.lruaura. &e espeCifica et nUmero y toa POSicin do lostotfatos.. Por ej.: 5' -N/IP adenosina-5'-monofoJfato ~CiOo 5'-Menillco y......,p adenosina-3'-monofosfato cido 3'-a<Senilico 8cldo 5 '-dladeni tico 5'-AOP 01Ciei'IO$il'ltl5 '-<li'IOsla10 acldo S'ltladennlco ~f-ATP aelonosinn5 lri'Osfato Cuando 110 se especifica el nmero. impflc:ilamente se asumct que., rostmo ocupa &a poSiCin!'). En este senttdo. tos dos UltiiTIO$ cjomi)IOS se IIO<tHan !limptemenlil comoAOP y ATP. Esm si:stemoas ele nomet~ctatuta se S(liean tanto a desoxlrribonucletielos como a rtxnJctetidos. L.gie<~mente. para tos prlmetos debe anteponerse el prefo d0$01 o su forma tlbreviada, la letta d . P(l( ejemplO: desoXJtlmldiM
rnotw)t'OS.fato. dTMP. de$Oxltlmldllato. ~ -c!TMP.
Una forma aun ms abre\llada ele reptesentar 106 oot~esidos monotosfato es mediante In inici.,l de su l:>i'l$0. anteponienOo '" lctr<t p si et los.fato se ul'le el'l5' o posponiendo la -p st la unin es en 3. Pat ej: pA. pG . pU, Ap. Gp . Vp. Este criterio es de intets para el e,.UCiiO 6e la nicltkls. qulmlca o enzlm3tlca de los. cidO& nuclet<:Os (pgs. 35 y 198).
US l3l;llaS siguielltes resumen todos tos nucletid06 sencillos (NMPs. NOPs y NTP$) emteo:es on la ctlul,
IIICh.r~dO SU$ clh;linll!$ d0:1'10mi'I8CiOI'Ie!l.
26
NUCLESIDOS V NUCLETIDOS
llMf'KLATURA DE NUCLE!niOOS SENCILLOS Pt.RINICOS
Ribonuclc6tidos
2' --adeni lato adcnosina2' IOsf:uo
5'-udeniLuo ndo:nosina-S'fosf<Jlo
dcsoxi-ctc.
desoxi-ctc.
(la dt:soxirribosa no ienc .OH en C2)
NOMENCLATlJRA DE NUCL
IDOS SE.'IICIU..OS PIRIMIDI NICOS
De:tO:\itribonuclelidos
RibonucloEidos
---()
<k:soxi-
"'
(In dcsoxirribosa no ticn~ .01-1 en C2)
ESTRUCT\JR.A DE NUCU 0 TIOOS
27
3.2.2.2
Estructura de los nuclesidosmonofosfat o que forman parte de los cidos nucleicos

f\udco.\~idc-mc~noti~f:,to :omponcnlt's dd
RNA ( - ribont.K:Icilcidos)
PimidinJCos
Putiniooe
oi-u-Ltf:
, 8 "8
o=l'-0(:,..
~fe,
000 000
A.
o ,.l~)
.
Utl Oll
=I~"~
1 11 "'
001-fu
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lllil.:nltliO,
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uridilato.
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j ' IOO-fMO
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.,,...,...s.r ,nr~t"
Nuckh~ mooof~fa1o compo1~1MCS del

PurCI.OOS
DNA ( = dcso,ilribonuclccidos)
Pirimidlnicos
1
lf:.."'
o=
"8
t-()<'11:
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ooo
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dcS(). \icnidilato.
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!.\MI', S'..J ,"SI", oJA,
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okoovllm<don ..~ .fo~a"
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dtw~!jliJ....,.~.-~ (..,..C.~
c 1" " ~~~~"'~~" .n.
<k~i~lltd...... ~ -(.,.f.Jh)
3.2.3
Propiedades fisicoqumicas de nuclesidos y nucleti dos
3.2.3.1
Propiedades 16nlcas
fOOS
como oonseewia <le 1a disoeiaciOn en disolUCin ecuosa de tos grupos P, PP y PPP.
109 nuclewoe
(NMPs. NOP$ y NTPs) muos!nln un m;n(Ndo <;<1r&ctcr o\<:ido. con 2 , 3 y 4 valtOS de p~<. . rcspec!Namemc. En genert~l , al sor SU$ valOres e pK01 irrferiore$ 7. w encuen11an ~rg-3dos negntivnmonto (O)IJ$!etl como Mioncs) a pM fi$io10gioo Gracias a este <;areler aniniCO. los nudetidos forman salln <;on metales. son <;rist;~l iu bles y s011 ms solu bles en ag153 que los l'lutlesidos o sus bases ntCrogel'l&das.
3.2.3.2
Formacin da complej os
Los grui?O$ PP de NOPs y PPP de NTPs muestran gran afinidad (IIITP 10 \'ete& ms que NDP) por callones citvalentes. como Mg2. Mn2 y Ca2. Al estar slos presentes a alta ~noentra.x,n en la clula. los NOPs y NTPs no existen como aniones liDI'es. sino lormanclo eompte-jos q~lato 1:t. S)t!ncc:>al<ertle eon Mg2*. Sajo estas "formas activas' (MgAOP' y (\\1ATp2 ) ambos nudeotldos parocipan en reacaones enzlmllcas de 1ransferenda de foe.fa!o.
28
3.2.3.3
Absorcin de la luz en el ultravioleta
NUC LESIDOS Y N UCLETIOOS
y lO$ nvCIOOii<IO$ mvostran el earactcristioo mllimo de absorcin de la luz en el UV a 260 nm. debido a la OOM nitrogenada oorrespondierrte Por ejemplo. los va~es de absontvldad mOlar (, en M t em' ) de algunos nucle6sido9 -monolos.latoson los siguientes;
Los nuCieSicJo$
AMr>
GMP
UMP
Th9
CMP
15 400
11.700
9.900
9.200
7.!00
/ Veamos un ~j('mkl d(' SJIIiradn prirC.ir de~~~ propiedad; ~ 5in~o-'fl p;lr:'l e:.kul:n lla C(!nccn\Jtlcin. n p;u1iJ de l;a fnnul~ R..-nJcsc que c'$1()1; \'3IC1n.
A~~
t;t+ b (~ -(' '"' A ~ 1 ~~6t b)
absonhidad rnolar (an1~'S llurnada coefw:.enl~ dt ~uncin molar)
e "" coocen1,.;in
h "" p11W plico
molar
ONA k a cquitlll)l;u 0'1 1~ CWIITC) desxamlxlflutk'Lidi)s. alwlar la C(lfu,:cnrmdn m1hmQI;ar de nut:lettdtu <n 111 mcn::l:a :mah:tJad:a. Allfat&r.oc tk un:a rnl"'t.tla o:quin1ol:ar. el C(Jo.'f1C'i~ll1~ de ~.xtu)('if'l s.:ft 111 "~-dia.
Una mcl(la de nucle1idos.. ob1cnida por hidrlisis <k una mucst.ta de DNA. po$1N' una absorlxtJ)('ia ~ 260 nm <k 0.547 (mo."di\1., <n un11 cubel:;~ de 1 cm de: pillO ptico). S..poniclldo que 111 <:omposkin de ese
E ( 15.400
~ucgo:
11.700 + 9.200 + 7.500 ) / 4 10.950 M 1 ~arr
e ..{ 0.547 1 10.950) M = 0.05 mM
3.2.3.4
Nuclelidos como molculas de reserva energtica
Muchos nuOetidos {fundament.M'nente. NOPs y NTPs) actan en todo lipo de clulas y en rrdtitud de procesos metablicos oomo eompuest<>!l rleos en energla. Entre elos, los nuelesldos Wo&fato in!Mvlenen como pteanores de la sntesis de ONA y RNA. con libefacln de plrofosfato.
32.3.5
Hidrlisis
l.Ot nueleo!liclo$ y nueleOtidos J)Uedef'l sef llldtoizados en sus ~es. en medio ddo o alcalino. Esta hidu!l!isis quimiea PoS.OO eieoo interS en el esbJdic:tde lOs tcldos nucleloos.
Nuclelido
RascAzi~e3tP
ludroil~l) 111: 1da "ll.IH' N-glieosl~ __.....---\..

CflliiCC
1"(14.\lta
del
-----
--......_
hldf'hu'i ak.uln~a
rotur:'l del ..i.':II IIIICc J ------~

----..._
~ , Ba..<\1! Adtcar-P
Nuclesido ,
Bal>e-AzU.car
A7(tcar
1'
Sasc
A.Wcar
ESTRUCTURA D E NUCL E TIOOS
29
3.2.4
Nucletidos cclicos
Son nuclesidO&mono'o$f.ttlo en bs que un miStnO lostato &e une a do~ poaeclone~ del a:cVcilr (do& OH diferentes), generalmenle 3' y 5' Actcln oomo $8900(10$ men~~. ttaMI'I'Iillendo sellales desde el enlomo (POr 9J$mplo. hQnnoMs o prime>S mensajeros) 1nterior celular.
.:o~.:r
"""'k .. ,. ""'""' f...r.v...

~
lflll.~~o>:
'~'""'' "~
,~o,;h,'l))
3'.5 -fosiUto cidko de adc:n<JS.ino r

(
\\IP~o:tdil,
.s.ti)sfall) d clk l) de gu:u)t'cSina

( (o\1J>ddK\), (."(;\11')
e\\IP)
3.2.5
a~os
Nucletidos complejos
F~almente. se engloban en este apa!'Wc.lo ~ n~,~CiefidO$. no componen1 es de los a~ nuci&Jcos y con 1\Jnciones dilferstlS. Que etlruC!ura!mMte Cli1leren de tos nucleoudos senoiiOG en uno o varios de los s~o&
Va.o$ grupos fos.ftel O estetifieacJOS en poSiciOnes mttlplesde' azucar (bis y tnsfosfatos. CoA. N AOP"J. Presencia de dos nuclesidos, t.ndo6 entre si por un 'puente" de gi'\JPQS lost.Mo {FAO, NAO. ~A) , estos e<~uan cJentto de ta calegorfa de dlnucleddos.. Presencia de otras b&Ses nitrog&Mdas (FMN , FAD, NAO. NAOP') Presencia de azUcaro$ di~ini0$<'0 1 3 ribOfi.Jranos:a {FMN. FAD}. Grupos funcionales a.c::ionale& (CoA)
IJI'St iiS t .I\ICl\
Adenusma3'.5' .blst'os1 1llo
. . ,,,.. ~,
_,l'~.l
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f.:od'umonosw:r irld.:p. -ndi.:llk$
<'n J"'"'Cioncs
d:itliUtl6 &,- tlll
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30
NUCLESIOOS Y NUCLEn DOS
' OP'Cll\1 \ (i RII)O>,
Mononudeudo <k tl:mna. FM~ :
Dimtelt,,d() de ll:l\ u l:l '} udttum. FAO:
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nbmam(onna lmol.)' m(l(li tk:ada

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or.n ba~ ndlup:nada

fdimclil uo;a.kr.ucma.
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11- -<)11
-<>11
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alliebidl>cntouoll
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fibosll CIJ 1\lfTilil lineal > ' roochOOidll

ukkhilo 1 nofl
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naclc(lo;idl.w
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dllillililllt
n'hlllauru
\ 'untmna R
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&,
'11
fl"'CIIIMta de r\1, \ F \hj
Dmudc1ido de mcounamtda y adenina.

NAO+:
lllrt buM>
Fosf ato del dmudttido .k nicotinamlda y {ldcninn..

NA OP+:
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l.d$-t'nilda
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~tuf'l' l~idJO !k)
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Tema 4
Estructura primaria de cidos nucleicos

4.1
Aspecto&
gener;~.les ,,,,,,,,,,,.,, ........................................................................................ _,,, ..............,_,.,,,~......
31
4.2 4.3
4A
1 1 Niv<ele$ estt\ICt\lrales ---- --- .,.,_ .... , ......,_ ..,.,.,._,_ ,.,._,_,.,.,. .. _ ,_ ,,,.,._,_ ,_,.,, .. ,._,_ ,.,.,._ Estructu r:.. pcirnaria .......................................................................................................................................... Formas de repces.entacln lineal ~....... " .."'""'""' ''""'""''"'' '' '''' '''' '' ' '' '' '' -..- .............. 4.3.1 Ftrtwlacompleta... ... .............. , ------- ... ,,._,_ ,_ ,_,,, ................................. 4.3.2 Representaciones G<SQUemticas .,., .........,......................... .................... .................. 4.3.3 Representaciones abre-nadas .... ,., ..... ,,., ..................................................................... Dos tlpos de tic:idos nud eic:os s.gUn su c:on'lposi-cin .......................... - .................... - ......................... - .. Propiedad$& fisi c:oquimic:.:..s de los ic:.ldOS nuc:~ic:os ......................................................................... ~....... 4 S 1 Pro~ades en disoruOIOI'I............ ................ ........ ................... ... 4.5.2 Reac:llvldad .................................................... ....................... ,_, 4.5.3 Hidrlisis qulmlca de ec:idosnucleicos........................ , , 4.S.3.1 HidrliSIS Cida ,_,_,_,_, ,................. ........... .... . . . 4.S.3.2 H"ldrli$15alcalina .. , .., .........., ... ,.................... .............. .............
4 .5.4
32 32
32
32 33 33 3J 34
3<11
34 3S 3S 35
Abso..-on e-.1'1 el ultrtwiolela ............. ................................. ........... ..
36
4.1
ASPECTOS GENERALES
Tr~io~mcnte se OOiltide' & que los ~idos ~"K~Cieicos !Oti'IWl pane Cle lOs t~ueleop(Ot~ldos. el grupo mils impo~Utrte de hell:roproteidos o "pfa.elnas conjugadas~. entte lOs que tambin se nc:tJyen gllooptO(eKbs y ltpoproteeoos
y, en ocasiOnes. tan'l>itl losfopt()(eks y cromo- o meta!oproteldos. Efectivamente. bs nudeoptoteedo$ resultan de la lntetaoclon. mediante enlaces elec:lrostllliC06 fuenes. de los residuos b&ioos (cabni006) de oenas proteinas (histonas. pro~anwws) y b5 QNOOS fosf.ttto {aniniOO$) del t\CJdo nvctcioo El cs.ludio del~o de osttts 3#ocitl(:o()t'Wt$ nU(;leop,oteic:.as se htlr ut~.a vez OOI'loeida la esttuduta ele los cldos nueteioos a todos sus l'liveles.
POt su eomposJeiOI'I qulml<:a eleme-ntal (C. H, O. N y P), denvada de la pre5en<:.a excluS'va de nucleotidos en su esuuci\Ka. bs cidos nucleicos se dif8f$11Citm de las protelnas. esenoalmenle. en su m<JYOr conten.do de fsbo (10%) y en la ausencia \Otal de azufre.
en
(v<W'IO$ crcmosomct:5).
en m;Jtriz mitoconctri<ll y en estroma da
en 1<'1 zona del cilo$01 (un <:romooomt\ y
..
en
c&pslda (en ottos tipos
~W'U$)
vanos plsmiclos)
la lnfom\ttCin de50e el ONA haSta lOS prOOu<;I.O$ gniCO$
en
(temporMnente), en cilo$01. en motlrit mieocondfil'll y en estroma de
ESTRUCTURA PRIMARtA DE CIDOS NUCLEICOS Exl$1en 00$ 111)0$ O& &eido$ nut~eiC:OS, <lenor!WI8dos ribonucleko o RHA y desoxlrrtbonud elco o ONA, que difieren en 109 nuci&Qiidos COn-()Otlenlet;. Atlte$ de <IKcribir so estrucl\lra. recordemos brevemente que ambos cidos nucleiC:Os se encuenttl'll en k><JO ti>O oe oeu&s. t31'1tO procariotas como eucariotas: oomo excepcin, los virus ~lenen slO ONA o ~ RNA. En lodos los eot$0S, sus <ivor&as funciones en la transmisin y expresin de la hformacl6n gen6tietl vienon determi~ por su localizacin ~boelular y su estruaura de Otden superiot {oonformacl6n
tr~imens.onal).
4.1.1
Niveles estruct urales
Desde t.n punto de vista estnJctural. en los cidos ru::lelcos se pueden considerar vatios ni veles, $imU;aros en cieno modo a loe descril06 tradicionc*nente para protefnas: Es-tructur a ptim,;ari,;a, de&erita POf la tri6n de runerosos nuclesid06 mecian.a enlaces fosSodlst. dando lugar a un polimero lineal. El oroen de bs nuele$1!3o$ (o sus bases) en In cadena define 1(1 sc:ue~ia dol ic:iclo nudeioo. Estructuro sec:undaria, oon la Que se il'*.::ia el N!lisis t$Pt'lci31 dt 13 l'l'l()lt(ulal. comu;pondient a la c:onformac:i6n lOcal. es cJeelr, la disposiCin relalft'a de nuclelldos (lue esW! ()(6Jtlmos en 13 sec:uenc:ia P3ra" ONA este nivel estruc:l\.lrat viene dellnldo por la asociacin de dos cadel\89 ~ucteolfdlcas a tra~ de laS ba.Se:!l nilfogM&daS que &Obre&alen del e&<~ueleto azccw-losfa1o. En el RNA slo se presenta en detennnadas reglones de la f'f"dcula. Estrvc:turas de orden suP4tflor: Se engloban bajo este trmino gentloo IOdas aquellas estruauras tridimensionales que surgen a partir de bs niveles primario y sec:undario. En eucarioLas son c:ompleJ&s. variables y en ocasiones escasamente conocidas. En el caso del DNA pueden ln~e aqul las estruCilJras te!IUilantes del superenronamlento y de 1a asociac:in c:on pt"Oiefnas bsleas para totmar la cromaN. Sin embargo, y a dderenda de 10 que ocurre en protelnas. eo ganeta! la estruCil.lra adoplada a este nivel no vler\e delermit'lada por las de los niveles Inferiores. En el caso de algunos RNAs (especialmente lOs lANAs) se obse~Va un plegamiento trldlmensblal bien <!efndo. equiparable a la estru<:Wra terciaria de las potelnas. lwn en este caso. no se observa una estrucWra cuaternaria, ya que dicho pl998f"ienlo slo afecta a una rncMtwla y no a varias asociadas entre si, c:omo en las proteklas.
4.2
ESTRUCTURA PRIMARIA
la e&tructwa ~na. c:omn Pt'lf<'l ~ y RNA$. consi$1c en la J)tencit'l Cio C3<Sor\M, gonert~lmento larga$, de cattlcler 1'1'181CroMOieo.Aar, kitmedas por la tr.iOrl de nuctebsldos mediante enlaces cova..ntes 3'5'fosfodlster. Por tatiSO. la uniOM ~a es el nudetldo, o nuele661dc>11'10f'10fosfato (generalmente c:ontemplado como 5'-NMP). Los ~idO$ nudeioos son. por tanto, pottmeros de nuc:letldos o potlnuc:letldos, con t.Wl esqueleto ll.neal 1~ oor u~ allemas de foslato y pentosa (parte oons&ante de la secuencia), del c:ual sobtesalen lateralmente las bt'lses (pat1e varia!*!>, que define la secuenc:U), unidas al azcar respectlYO por enlaces n.glc:osktic:os.
Por convenio, ta secuencia siempre se Indica en direccin 5' ... 3', es dec:lr, con el extremos terminal (5'P) a la Izquierda y el exlremo 3' terminal {3' OH) a la derecha.
j
5".. -P-ok
-P-oJa-P-oJ..-P-ola-... 3
Dentro de oste ni~ o&truct\.1111 110 esWdior6n a c:on~uadM tas 6istintas formas de repteSentaeiOft. fas ditel'~las on c:omposiei6n quimlea de los dos tipos de ddos nuc:telooe y~& propiedades 1\~lmicas ms represenlativas.
4.3
FORMAS DE REPRESENTACIN LINEAL
P\ledon emplttaf'&O M~ 6 niveles. de SiMJ)IitleaeiOr'l creciente. En general. se haoe uso de la letra Inicial de las bases, en may~, JNirtl representat a Sias o a sus nuc:tesldos. El c:ldo nudeioo propuesto oomo ejemplo es~ RNA (~Cic<'ir: rib0$:1 y baSes: A. G. U y C). pero las representaciones son Igualmente valdas para un ONA (azcar: dosoxirrib0$3 y bases: A. G. T y C).
4.3.1
Frmula completa
P<lt r<U:one$ do O$~io y fundamentalmente dldccas. es aoottSejabie comenzar con una representac:ln vertical del esqueleto del cido nuelco (notac:ln 1 en la f9,wa). que permite apreciar c:on de1alle tos .-cos fosfodit,.er ftllre nucteOsldos oonsewclvo6 (uniones azc:ar-lo$fa1o) y 1o'l situllc:IOo perpeodirc::Ww 1111 esqueleto de lOs enlaces ~sklicos (uniones azOCW~&e). ~n'l mM!Mier 13 orlenb'ICIOn S' .... 3', se slllla el extremo S' P ~la parte superior y el exnmo 3'.QH en la infeot.
DOS TIPOS DE ACIDOS N UCUICOS SEGN SU COMPOSICtON
33
6~-
,.
~
G
,.
l...L)
:\\
\ \
...r;;;;;
l...L)
,~ucle~n CO\IIII'n!c
1 ~
("
V
<Q
l ,.NNo
f'o' ~ ~ f s s
~ ~
Q)AGUC
liftefll de fllld~
tsq11cleso
!p.>ll(
-~"
"'''*'!
h
4
pA,CjlUpC
oAGUC
.~
t\GU<"
4.3.2
Representaciones esquemticas
V$rti~l. cuyo
Como peculiaridad ese ~111 representaocl6n. el arillO furanbsico del az~r IIC $1mplillelll tnediante un SOlO 1razo exttemo superior corresponde al C-t' y el infiof al e-s (notacin 2 en la figura) . En una lorma aun mas SlmP'e se omiten lo$ tosfalos intermediC y la mo~meraeiOt\ de 1os a.We&re$ {notacin 3).
4.3.3
Representaciones abreviadas
La $impli~in n ovede aumentar il'ldlcando cada nucle6sido mediante la tslra niciall de su base nitrogenodl'l {11) nioo variable en la &e<:IJO;nti~) El polinudetido queda~~ reducido a una SuCle$in de letras mayso.ia& fllercaladas con )elras p minU$Culas (notacion 4 ). El ext111mo 5 'P (a la IZquierda) vieone represcnlado por un3 IC!nl p ~.udil por lb ~ra del pmor nucte6Si. El U tl'iltnO 3'.01-i. a la derecha. v.ene dado DOt l<l le!ro del Ultimo nucle$ido Los ~IGOsidos intermediOs tevan lapa Izquierda y derecha, correspondientes a las poSiciOnes s y 3', re$P&Ctfvl'lmtn~ . En la oesctipcin ooddiana de 5eeuencia$ de <icidos nucleicos se supritnen las leltils p intetme<Ras, OOI'liO que 1& reptesentaan se reduoe a una $CQJetlCi3 de letras preoedlda por una letra p para el fosfato en el eJCtretno 5' tnolacln 5), o so il$umo &tJ pre$enc:ia del tosr-ato en 5' y se omlte incluso esa pf'lrners p {notacin 6).
4.4
DOS TIPOS DE CIDOS NUCLEICOS SEGN SU COMPOSICIN
'.''1"0 u,.: -'cdo oocloow

Monmefl)!;;
ddo rlbonudeico (Rt " 'A) Ribonuehlidos
cido d l'SOx:irritffln ud(('O (l)NA) Otso ~ 1rrlbonu det idos
F'osf~to
enl,nm.:lu los mon6mero~ (C'tl!:.cc ftJ:IfoxliO:stcrl
l!
Azcar
Hibosa
l'uri.llll$
r .l)es,odrrfbos:a 1 Adenina, A (6-aminopurin.1) Guuin:a. G (2amioo(H>xopurina)

'l'imina, T (Sm<tlurudlo)
Citosina. C (2-uxo-4--aminop~rimidin.,)
IJradlo. U (1.4dioxopnimidjna)
f'irhuld l:u
34
ESTRUCTURA PRIMARIA DE CIDOS NUCLEICOS
Segn la fl04aeion de fi'ITI.lla completa. la tepttscnl<tcin dlt ambos cidO& nucleiC06 es la slguieole:
RNA
n
ONA
A
n
=._,~'")
u
H,, ..,~ji' " '

o= 1
~ f
u
~np
e
T
11: l
'
"T~~
Pxtn:mo)'
o~'} h.
4.5
los cidO& nue681cos presentan propiedades imi)Of1arrtes en transmisin (replicacin) y ellp9SI6n (transcripcin y trOOUccin) tweYemente algunas de ellas. relacionadas con la estruct\n, y ~ aplicacin al propo e6Wdlo de estas molCUlas (pcw efemplo, la analizar como fundamento de la hibridacin).
b1>'oJ ~
PROPIEDADES FISICOQUMICAS DE LOS CIDOS NUCLEICOS

relacin con &uS funciones de atmacenamlento, de la infonnacl6n gentica. Se comentan aqu resto se irn estudiando a medida que surja $u renaturallzacin de un DNA ctesnatura!lzado te
4.5.1
Propiedades en disolucin
Las ~dena& polinucleotkticas de ONA y RNA son hldroflltca&. debido a la PQ6iblida<l de lormaeiOn de enlaces de hidrgono con el agua por parte de los numero5o& 0~'\~~Xl$ lo$f<Uo y OH libres del azcar a lo largo del esqueleto. P<:w otro lado, a pH fisiOI6Qieo lOS grupos IOsfato f1>K. ptli'I'IO a 6) e iOrntal"' eesi por completo, haciendo que las molculas de OHA y RNA se comporten como icldo& y tengan rwmerosa& cargas negativas. Debido a este carctet polianinieo. tos c::idos nuc::ktiooa: se oncuenlr8n casi siei'I'IJ)f"C floOVtrali;a<So$ por interacci6n i6nica oon las cargas pos.~ivas de OtrM rnotoeutas.. C<lnore4~mente. el DNA del genoma nuc~CM euc:~rilioo so ~vont'<' unido 01 histons, protelnas ricas en Alg y Lys. carg&!la'S posltwamente a pH tislolgleo, dando lugat a nueieoprOt.eidO$; la importancia de esta asociacin se considerar posteriotmente (pg. S.). En klos espermatozokles, el papel de las hiS1onas es desempel\ado por pe!JJE!tlas pmtelnas ricas en Arg, llamadas protamlnas y tambin con ruerte carga positiva. En otras ocasiones. eJ DNA se u~ a poBamil'\aS (pt!neip8Jr'rle!nte espe~ y espermlctina, asi llan'4Cias I)Of Nlrler s1cto detectadas otlglna!mente en el semen). distribuidas ampliamente pero de forma especial en algunos virus y baderlas en estado de rpida prollferaciOn.. As.1, por eje~. en el fa9o T. las poliamlna& neutralizan un 40% de la carga negaUva total del ONA. estabilizando su conf<:ln'Mcin. Por Ultimo. oomo resultado e)q)8nental de esta propiedad. la Qn$t<IIJ:tacin de t\cidos nveleioos te facilito si su ca.ga negati'ltl $0 <Mpensa por ltt unin de iones mcltllioos. Debido <' 1<'1 tetatNa rigidez de la molcula (en doble htioe) y a su lnmetl$& IOngilvd en telaeiOn a1 dlmetfO, las de ONA son Mtl'f viScos.a:s.. Esta propiedad llene inter-s en relacin oon el estudio del proceso de desoaturaiiZaeiOn (pag. 165}.
~iones
4.5.2
Reactivldad
En general, los cidos nucleicos son quirrjcamente muy estables. especia!ment& en el caso del ONA. Ello se debe
a que la desoxWrllosa careoe de grupo$ reactivos; ol 4'-0H ost c;on'Clf'Of'l'ltido on el ciorre del anillo, y lo& 3'-0H y 5'
OH ft'ln f()fTn;lnOO en1aoes fOSfodiStef". EJ RNA es algo mas reactivo, gracias a 1os grupos 2' OH, 10 que te re-fleja en $ \15 ()n)Oied~deS.. por e,empiO, su ntdrllsls en medio alCalino, como se ver a c:ontlnuaciOn.
PROPIEDADES FISICOQUiMIC AS D E LOS CIDOS HUCLEICOS
35
4.5.3 4.5.3.1
Hidrlisis qumica de cidos nucleicos Hidrlisis cida
Los k idos fuertes escinden tanto lo& enla085 fosfodi&ter entre nueseoSidos como tos f!I'Wioes Ni!!loosldlocos de cada nuetetldo. P tanto. sirven P<ll'et ana!iU~r t;:a co~iein de cases de un aCldo nueleloo, pero no para determinar
su secuencia. Enlaces Entaoes Enl(tteS ErUce& tos!odis.ter N-g!icosldioos fosfodi6stef N gtiCOSidiCoS (entre nuetesklos) (en cada nuc6esido) (entre ooc!obsidos) (en c&ea nucteSidO) si $i S
se hdrollzan7
Medio cido tuene .. HCi lM
.,
Medio ~iCIO dbil
no
sJ
(todO& o purmas)
no
s<
(IOdOS O purii'II)S)
LO& ;'ic.ido& dGb i'-.& rc$Pellltn tos ~s toslodl&stet. pero tienden a tQI'T'IP8' la unin N glieo6idlt;a. E$tc entaoe es
ms lbil con PJMO$ Que (01'1 pirimldlnas. por lo que se puede conseguir {J)Or ejemplo, <'1 pH zJ) ts.(:il'l(lil seleCtiVamente
I<'IS bNcs purif'llCM, dai'ICIO lugar a kl6 denominadO& ilcidos <Jt:1(Jrini(:os Es-ta hidr(llisis es e <:ietto inlet'l!s psra estudiar ~rel3lk'l'lente la secuencia del ONA. Con el mismo fm. 1<\ml:lin se Ml'l preparado Oidos nu~s spJrim1dlnicos. po1 dil'l'liraacion selectiva de tas pirirr.dJnas bajo OQrldiciooe$ quimiCllt$ diferentes.
e:
e:
0:
...P-dRi bP-d Rib-P-dkib-P-(JR1b--P-d Rib 1"-dkib--PdR ib ...
... PdRib-P-dRJb-P-dRib-P-<3ktb-P-dkib-PdRib41dl~ib-...
...
...
4.5.3.2
ONA;
Hidrlisis alcalina
r.lt'Oii~o
El medio bsico afecta de distinta manem a te enliiOO$ fos-fodi6ster. tos enlaoes H-gkosktico& son resistente5.
lOS del RNA pero t10 lOS del
DNA
Enl;tCO$
EI'IISOCS
se hidrohzan?
Ef'ltac:es N-gtieosldlcos IOSSOOistet N~sidicos (enve nt.JCieOSidost (en cada nudeS*lo) (entre nucle6slos) (en cada nuctesldo)
(0$1od i6~er
.,.....
"
RNA
no
no
no
El RHA se '*Wellz.a rllpidamente. liberando sus nudetldos. en d"~oluciones <tiuldas de NaOH (pH 11), Sin afectar a los enlaces N 1J1ICO&.Jdico5 l <'l tudrli$1$ de tos .-...ces azcar.rosroto se debe oto omplic&cif'l directa de los grupos 2'-0H de hl ribost1 en la c<~taisis quimi~ Se torm<'n a-si NMPs 2'.3'Cidioos oorno l')l'(lduetos k\!ermediOs. que son hldrollzados rilpldamente en el medio ak;alino, al azar a uno u oliO lado det cnlalcc 2',3'f0$fexli~lr. parra dar una mezda de lo&. 2'-NMP& y 3'NMP$
36
ESTRUCTURA PRIMARIA DE CIDOS N UCL EICOS
....
f'Jro nplo hidro)t;t~j sleliln ck
ao RNA lnll(lrC riQO ~do) por

( llMIO _.rcOu.:ktl
(un to:trwribunudc6ti<k>)
-'
l
110
o
-()11
\-<''o(2'.. '011')
m..:~:! 'lllonofoSt.f.>
""
,.
011
+
l.loast ......:~; ...101~~
(l '. NMI')
lf IIIOl~ 'OIIM(OOII dl,;tlfii.U haola.) dt
nuo:!mnl(>-1' J mo~t'Jto d d .:o

(l',J'...:NM I")
011
110
El DNA , al conlrario que el RNA. es re-siste-nte a la hi d rlisis en medio alCalino. EIO se debe a
te. ausencia <10
grupos Z'-OH en las unidades de desoxlrrilosa, k> que Impide ef ~mo expuesto anteriormente.
4.5.4
Absorcin en el ultravioleta
la wnlllll.ld en el vsJot maxlmo de absol'banda de las dlstimas bases (pg.. 17) puede utiliZarse no s:6b para detectar y cuantlftcar aas bases. lOs nueleskl06 y lOs nudelidoe, Sil'\0 e64)E!Cialrnente para determir'lar la coooer\llradn de lOs acldos nudeioos. De hecho, es et ptocedlmlento eomCinmente tAilluldo, a pe581 de M ser el ms exado. Basla con medir el valor de A:.o e.n una dlsolocln diluida, &ufldentemenle transparente. de ONA o A.NA para poder calcular su con~in . Sin embargo. es con~te la realizaciOn de algunos contm~H. leniendo en cuellla especialment~ la poSible contamlnaeiOn con protelna&. cuya ptesencia contribuye a ta eb&OI'dn y, por tanto, lnterl'.ete en eeta determnac:in. EMctivamente. aunque bs mlOO'Ios de absorci6n son caracteristicos de cad<l uno de e5105 oompuestos (260 nm partt c\cidos nucleicos y 2ao nm para protein;~~S) , ambos absoft>en en ciorW modi<l& a las do& longitudos de onda. Por ejemplo, 13 ab5ofb<lncia de tlt'O'einas a 260 nm e.. par3 igual C(!t'~Cen!l'l.'l(:i:!ln. unas 20 30 vttees inferior 3 lt1 de lOS
cidO$ nucleiOO$. En la l)(tletlea. ler'liet~do e;~ cuen~a esta slruacit\, se deben emplear ambOs valores abSorbaneia (A260 y Aao) ~ra podel c:orregir la lnt.enererw::la murua y asl de~ OOf1'eCtamet~te las oor.eenttaclofleS de Cido nueleloo yoe l)rotetna.
oe
Tema 5
Estructura secundaria del B-DNA

.5. 1
511
Prop<:~rcin de b.:lsea nitsogn adas : R~Uis de Ch8tgaff ....................................................................... -.... 38 Algu!\M te~aeiot'oes en1 re bases son Iguales en todas las especies 38
5 .1.1.1 S.1 1.2 5 1 .1.3
Retaclbn emrebases..........,.,_..... RelaciOn entre punnas y Pft'l'lidiNJ:S .... ... .... RetaeiOn eoue a!TllnObases y oxobases.........
38 38 39
S 1.2
S..2
o~r.~s (eladooes SM dtferemes segn la especie .....
. . .... .
39
Modelo de watson y Cr lek: forma 8 del ONA ................,_...........- ..................................~...........~...........,_ 39 5.2 l Complemenlaried~d de l<'l$ b3$(l$ nilt()genadll$ ... .... . .. - . .. ......... ....... 39 5 2 1. 1 COI\Secueoeias de la complementar\edad . . .... .. .. . . .... . . . .. . . . . . a 1
5 2:.1.2
Efeetode.l pH sobte el apareamemo de bases .........

.... .... ...... -- ......"...
42
5.2.2
5.2.3 5.2 4
Geometrla ae 10s pares de bases.... ... ........ ...

Anbpera!elismo de tas dos hebqas . 0 1ferenci<as. en la 5ecuenci<a de ;mblls hebrol'i
tioicid~
43
44 .u
5.2 5
5.2 6 5.2 1
v ct~rtlc!Or dotr6glto
.... ... . .
.... .......... ..... ..... .... - .......... _...
S 47
Perftmctros cuant1 t:JtivO$ <le la <.IOble Mlioe....... - .................... -- .......... - .......... _ .. -- .a& C3nictcr l)miplcl!oo y t:t:~bilidad de la doble ht:hce . . . ...... ... ........ ... ........... ...... . ..... .s1
5 2 7, t
S 2..8 52 9
Sit1)31C~t)n ele 10$ (0$1 StQS y cart\clet hi<.lrotmco........................
5 2.7 2 Co~l)!,S, :r~amief\10 de &as bases y catilcter hdrott!co ..... .......-...... .... 48 Superf l (ie de 13 molca.l la SIA'lXIS ~ e-1 ONA ................................................... ............ ............... - 48 SignitlcMo blok'.lgk::O. JCb'leldad para la re~n ........ . .. ....... ........ .... .... .. . . . .... . .... 4 9
El
Ql\3li$h~ t)()f 4ll18et;l6n
di)
r~yO$
h:~ ~t~nwcSo r'IO!t~blemenl.e
' sus IniCios se observaron, lncllso en muestras Impuras de ONA d!auetlo, sel\arJes que oorre:spol'ldlan a un espaciado regular de 0.34 nm a lo targo de las fibras ele ONA. En los aos 50 se obtvvleron datos mis preci&OS, con muestras de ONA mM P'KQ y h<tolondo uso do lo:;. mtcx.Jos dO difr<~cdbn de ruyos X, qu~ ytt S(! habian desam>llitOO para el estudio vstrudor<~l de prOleinas, A I)Mir de los oorrespo~cll p!l:tc.>n<l$ dcJ difr;:tC;Qn. QQncle l~s m3neh;,s -~ f!>~trl'llc:s en tQtma ~ aspa indican ur\3 ~lttretura e;~ hellr.e y laS; band:lt in1en$tt~ en la parte superior e lnfetlor indican la repetian peridica de eslttrCiuras. &e condu)'O que: la molcUa de ONA eslaba formada por dos cadena. <:on una disposlCiOn tlelieot<lal y oon una doble periodiCidad a lo iaf9o del ete de la nllce, Cilda 0.3-C nm y e<~d;: 3A nm Por otra parte, la qulmlca de nucle61idos perm1tla conocer la exrslef\Cia de Interacciones hldtofbiC86 por ap4amlenlo. as$ como la SSOClaCIn mediante pvenles de nidrgeno rapareamien!O~). Todos estoG daiOS eJrperimenta\es, tOnto con ef ana!iSd de k1 PlPPfQQ6n de las bMc:s GOn&ll11.l~ntcs de la moiCCUiil <:uyas c:onclvsiono:s. so elq)Q(Icn 01 conbnUao.n, y la c:.ooslroccin de model~ moleculares. sirvieron de base para la prop!.IG$ta por Watso'l y Cnc:k de ta efJtructura de doble M liOO. cuy;:~ de$CripQ(Jn ~ t:t objelo jlnnp<ll dt C\UO tl)mtt.
sobtt el C()(H)Cimien!O de \3 S.ruUf<'l $0CUnd<lri3 del ONA DeSde
-u
--
....
38
ESTRUCTURA SECUNDARIA DEl. 8 -0NA
5.1
~e
PROPORCIN DE BASES NITROGENADAS: REGLAS DE CHARGAFF
A pesar de que la COf'lllOSicin de bases puede perecer un aspecto ligado a la eslructura primaria, su estudio se en este temtt por eMar diroctamonte relacioflada oon la esttucwra secundarla del ONA. En un ptlndplo se ~&yO Q~ et ONA ost<~b;t formado por C<'nti<l<~dos iguales de 106 cuatro nuclecidos A, G. C y T, y que la unidad f\lndament&l ..a el (ftr~IIK!Iido, MS!tt Qvt El\00 CNrg3tl. et'ICre otros, obset'o'6 dirintas propcwciones de los 4 nuclecldos en <ivorsos or~nismos. Ccncrclametlte. lO$ ONA$ aislados a partis de clulas o tejidos dlferontes de distlntoe indMduos. dentro de ooa misma espeCie, presentan idntica composicin de bases. que adems no cambia con la edad, estado 001rici011al o variaC*:ltles del et'ICOmo l..cll oompoS:in del ONA e&. pot anto. caracterl&tice de e:ada especie. A partir de e$0& dorios se formultuon un<t& rogtu o goner;~~lizaciones cu.-ntit~tiV<~$ $ObrO 101 ~mpO&Icln de baM$ del ONA,
que rueron 1:1 tl l'l~ para deduCir su estrud:ura en dOble ~
Anima~
.._
"""'
Galine
""""' ....
T011uga
-A
Composicin de bases f% moles1
Relacin entre bases
nrnna
29,4
G
1 0~
Guanina ~r'l 19.8 21,0
Purinasl Pirwniclr'ltls
Rclat:IOn de
aslmcrlrla
A
T
.li.
.t.!ll.
TC
.6:1.
GC
30
29,3
1,06
u .
ErilO ele mar E&CI'Iel'ietlia COl
23,8 29, 7 29, 7 32,8

2<4.7
28.3 23,<4 20,2 27,9 29,1 32.1 29,2 :>0,3
2 1.4 2M
20~
20.4
21,5 21,3
22,0 2<),8 17.7
o...
1,06
1 "" 1,01 02
1,0 2
1.0 $ 1,0 5 .02 1.00 10&
1.01 1,02
1,00 0,96 1,03
1,03
1l l> M2
0~7
U>
1.36 1,30 1,33
1,<43 1.8.
Sacton..s
Staphylc:ICCocus aurei.IS Ctll~l#l\ porlnn99nc
safdne 1u~~ea VM
"""""'Fago ~ 114 (monol\lllf) Faooo174 lonna tEI()IIcltllli.l (l)lliar
,., .
30.8
21.0 13.4 24.3 ...3
23.6
...o
21,0 1<4,0 29.0 37,1
24,1 22.3
,...
11.3
19,0 t2,t 37.1
'""
2U
18.$
.02
1.02
m 1,0 2
1,0 3 1.07 1,. . 1,0 0
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~
1~
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....
1,11
1.0 2
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1,00 1.0 0
0.73
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32.7
014
1,00
.30
1,00
22.>
o.
.oo
1,34
1,1$
5.1.1
A lgunas relaciones entro bases son iguales en todas las especies
A pesar de~ la COfTClOSicin varia eniJe e$()ft(:ie:s, en todas ell&$ se c:ump~et~ ciertas relaCiones entre 13$ ba$4'$, kwmutai:SM oomo las tres l)tWneras rog!M do Cl'\;lrga1f, que $C CJq)c)t'letl a OOI'Itinuadbl\.
5.1.1.1
Relacin entre basas

y e1 cntonido de G a1 de e :
A$
En pracbcamente toda$ las espocios,., QQI'Iteni!;So ese A se aproxima a1 de T
"
~
Razn Aff
TI A
Razn GIC " CIG "
Esta observC~Cin fue Her<;i;'lll ~rtl oue W&tSOtl y Crlct: postJJiaaert los pares AT y GC. que detlnen la oomplementariedad de bases en el ONA de doble hebra. Hay que destacar~ es.la regla no se cumple para las poca& e$Peeles cvyo maUJJr, ~ieo esta IOn'roaclo pot RNA o DNA de hebra sencilla (oomprense en la tabla 106 ejemplos del virus 174, en 51.15 rormas de hebta sendlla y de doble t.ebra).
5.1.1.2
Relacin entre purinas y pirimidlnas
Como consecuencia de lo anc.riot'. el oon!enido ~ Cl'I'MS putinicat {A G) se aproxima al de bases plrlmklnlcas (T + C}, es decir, hay un 50% do I)Jrint'l$ y un 50% de piM'Ik1J\&.s:
A+C
T +C
Razn (A+G) 1 (T+C) "' 1 Razn purlna.s / plrimidlnas ~ 1
MOOEL.O DE WATSON Y CR.CK! FORMA B DEL DNA
39
5.1.1.3
Relacin entre ami nobases y oxobases
N observarse QI.Nt A/T-= CtG-= 1 ltlmbib'l se h.tl d~e c:un~ir (por razones ~ltlclaf'IWite matem&~lcas) QUe lA~Cl t (T+G) = ' Por tanto. puede conduir$&. c::omo tttaOIOn ~ICional ($1rt un signdkado especial). que:
8--aminoplnl(l$ (Al+ .!.;;ffiinopnimitlinas(C) 6-oxopurlnas fG) ~ 4-oxopwmid!nas {T)
5.1.2
Otras relaciones son diferentes segn fa especie
r~On de .:tslmehla.
A- T
Ci +- C'
que. adems de tener oo vator d-'orente paro eaa ospocit, no -10 t~proKitn.'l a la unidad como !.MI mmoes anlerlorea (..-er labia). Por ejemplo, "" ;:~nimo:~lc:$ la ro~OO de: as.melri& !!':S s.etnpte supet~or a uoo; lo rr;-smo oourre en planeas superiore$ y hongos Por contrsto. en baClerlas y virus 10!1 valores son mucho mas variados &Uperiores o nf9:1'\10te$ a l<l unid<Jd Ltt r<~zQn ~ ~$imc:tfin p.tode ~ambUm caleufarse directamente a pttt~t OOt conton.!o 9n G~c p<trbmcl! h<~bitual en otros t.IIX'$ de! C$1\1<110 como la desnai!Jrallzaan de1 ONA:
Oe acuetdo con ello, los .,,,mates. p1an1as sopenores y nangO$ muestran un exceso de Al (50-65,.) soDTe G+C (so.3S%}, tmi,WI.Ir;as <l\IC: en bt'ldl)rias y vrus se apreda la gran variablldad en. G-..C (ts-25%)
U.!~
" =-~-==--==--==--==~~~~ ~
ou
"'
.,
ZH
A+T ,_
Virus
B11.<:1<:rla.i
'"
'"
"'
~ '\. G+C
G+C
Protw:oos
1loogos
En ~umen, con e!IIOs estudios se ha obServado que los ONA9 de especes 8\folub.vamente r~as llenen ~ou\3 r~On de as.n'let"'- s,m,lar mien1ft'IS que tas especies l'l1lfY ~as tleoden a tener \~~'la raz:On d!ff!fente. A pesar de sw ~3 1~ mel'll)$ (:OI'IQCI(Ia <".e laS- r~ ~ Ch:trgaff, el hecho de que pennl~a dstlngulr entre espeCieS haoe que pueda ut-.t:~rst como Ctitefl() en las relar.ones evolullvas y las clasificaciones laxonrr.:as de los organiSmos.
5.2
MODELO DE WATSON Y CRICK: FORMA B DEL DNA
B modelo tridiroonsion011, como ostructvra de refet"Cnoo par<~ \ls pn:~piedad9& detONA., rue posl.\llado iXlf James Wau;oo y Ftaoci& Cnck $n 1953 Com:l$ponde a&.., ~ente donomWI.ilda form; 8 dof ONA. lit mils tomUn en las ofiulas la mas establo de ~odas lCII5 que puedo adoptar vn ONA balo <:OII(f~<:iones li&lolgie<~s !:$te modelo se bas taPio en tns obseN<'tCi(lnt$ por ;wos X <::omo (lfl las r~s do Chl:lrgt'il! y, I)Of tanto, os!J: de <tc!.*W c:on oJios, O'lsi como o:::.n Otro!; estudios reabzado!l medi:ll'l~ un gr-an n(lmero y variedad de 1~ Simlllt.neament~ !Sb ptopuso 1:. adecuacin del f1'IOCtek) a la fooc10oalldad de la molcUla de ONA para lB conservacton y transmls16o de la inletmaein genebCa (pttg 49). ~a las s.guentes caraete<lsticas bSIC8s
5.2.1
Complementariedad de las bases nitrogenadas
Ut e~rudura quimica de tas bases peonlte la formaeiOn de enlate!~' por )Uetl~ de l'litlr!)e'no (dQ$ <'J!Qmo::;_ electrooegatlvos, oomo N yo. comparten un 1omo de r.:frgeno). En concreto, dos nuclelldos pueden lnteraeO()f'W de forma esped rlca rned!ante dichos enlaoes y se habta de "base-s COI'IIplettW!nUlria:s~ ..paru de bas~s .. o " ~p;Jr~.;~mie nto do b;J$1!-.S''
40
ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL BDHA
P.,.& un;) mop comprensi6n de 1<t c:omplemontariedad, es conveniente establecer unos Ctlterios prevbs en cuat\10 a 13 ewiMa de lO$ nt.ICietkiOS on <:ada pareja e basM.. Se trata con elo. &impemente. de faa.tar la esct'CX:In de unas estructura$ relattvamenco oomplejn
f'rmui~HOn
la bii'C in.dll I!W'
3-lrnkdor okl enbl:o: N-shcG~id:""'i' cut~ ellll'l ..._ , dt!!it:J~IIf el cankk-1 OOnador o IIC('fllor para 1& fonnllt'Jil <k p,M'I'llcj de ludr6gcoo:
f (lnnula.sprnilltt lllO sobre ... lll~I!U$:
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\'V"'IVfflTI~i<\fl
bu d~:>fllhi~i~"fl. t~.'llla base lejii,J, 111:1 ~- ..e ~mona .:o)Cit;:.rmn.:ill 111ml
SIJUC si~n~
<o.ll ft~lll ~1#1
MODELO DE WATSON Y CRICK: FORMA 8 DEL ONA
41
(:7\ Al re'lre,cow uo par debo~ )C tu'lpk--J la f.1n'lula de upo : parot<l M~Cictidol ''nundo ._ 1~ i;(qui~nla. y b de IJP<J J \.2) p.r:l el ~ltuado.l a la o.kfet:ha (ambas cooronn. wM)n .rntl)
Ado:n.:ina )" Tmilll (0 U~llo) ~n IOI'n'IM' 2 cnbo:o,; por pucnk dt bidrgo:n..r. 0 del crupo <"-Ocn ('-t dcT 001.1 H def ~ XllzmC-6dc A llcnNJdo:T ~l N l ckA
H, _.11
(11
' N:x~,
"'' N
TfU
()
Gwain:. y Ci~~:Hinll puNto iurmaf 3 C~~lattj por bo~ ll dclppoNUz cnC-'IdtC oon 0o).i~C- cnC-6dcG :-..; de(' CJOD llo:n ~\.J do: G O do:l srupo ('..0 C1l Cldt C oon H del s.ruJ10 omina en C 2 ole G
'*""" o):
11.._ _.11
ftmui;J $oCJin
Cnltriu (2)
tx
N
la& interacciones ptimas &e forman errtre G y C (lrC$ ei1MCCS dt hidt~) y e-Mre A y T. O biM A y U (dos eriaces de t1idr6geno). El par G C 9$1ableoe asi una inter;ac.ci(ln 11\bs fueoe (tue ef par A T (en et ONA) o el par AU (M el RNA} OOOrve&e e siempre se fonnil un c~o do hidtgeno el'ltte tos oos atomos de N nucleares. mientras qve lO S rMtar'ltes se torman entre un grupo amlno exoc:lcAico y un grupo carbonio. Son taMDin 1)0611lole1i otros apatOOmlenlos entre bases. denominado& de tPO Hoo9st99ft". Que <aparoocon mono& frecuentemente y no forman parte del 8-0NA. Por eje!T!Qio. B;n el RNA (Wg 73) , en i<'l$ ln(liiJ$ hliCC$ de ONA o RNA (_pag.. 60) y en la interaccin cod6n-anticodn (pt\g, 296).
5.2.1.1
Consecuencias de la complementariedad
Gradas a 1<'1 comp;enw~larieOad descrita. dos cadenas polinudeotldicas &e pueden asocaar siempre y cuando todas sus bases sean oornplementarlas. Este apareamiento oompleto de las dos cadenas da lugar a un cido nucleioo de doble he-bra o doble cadena. e'SiflJctura habual dal ONA. Esto quiere decir que siempre que en oo. ONA eJOSta A. G. CoTen una cadena. se encontrarn T. C. G y A. respec:6tamente, en la otra, Es l.,..,ortaf\.le destacar QUB; la oomplementariedad entre las dos hebr<ls del ONA. El$ fund<wnental ptr~ su P3J)I)t romQ portador de la informacin gcn6ti~ Por- un ttldo. POI'QuO se reduce 1~ posil)iliQtld de~ t~s ~ses se rnOdif iQUef'\ qvin.e&mentct Por otro, porQu& ~ 1-aOiila ta eorreeciOn de mutaCiones y de errores prOduciO()g ~rante la replicacin del ONA. Fil'l8k'rlente. porque la lntorrnaCIOn est en cierto modo duplicada, aooQUe las secuencias de ambas hebras san <iferentes enve si (p;ig, 44), Adems. la exiSiencla de la complementane<lad elq)llca las r~ de Cl\arQ8ff (pg 38), y jusbflca dos carac:terls1icas estructurales 1mportantes.la helicidad y el antiparale!ismo. que se es.~ucian ms adelante.
42
ESTRUCTURA SECUNDARlA DEL B.ONA
lluscrdOO. mediante ut1 ejt1npt.o lup(llil.co bl"~ ~ 1 :1 ~s:ic)(Jn del ONA humano. de cc'lrl1o0 1:. dobk hcl:m del DNA pcnni1e c::(plicnr las reglas de Oargaff:
C:ornp<t~iicoill'l de~
......
A
% motes en
,.... "'" ""'"""" 1

32
%~sen
hqbra
% tnOies en
la<klblehet:lr.t
COCIEII'II&S
COCiel'ltes
...
30 30
Regla oe Ch8fgel1
cooespond~et~te
T
G
23
2S
"'
32 25
43
15
15
20 20
50 50
RelaciOn entre ba$e$ !ndi'o'ldualt$ A:T,C--G

Retac!On enve pumas
AG =punnas
C+ T :pi!Wiidin'"'
.,
51
1,33
puriNI$ 1pmmdin&ll
A+C
57 0,15
53
1,0
50 50
y pitlmlcJirlas A G/C+T 1
amnobases
yO><OOa&es
= amintlba&e$
47
1,08
Relaci6tl enb'c
GT oxocases amino / OXOC:IIKM
"'
47
0,92
1.0
El llpl'n!llmjciJio iqllica que el conacniclo de 001.1 b.,llC en una hcbrn lv de liCr igual al \k su baso: complerncntan:. en 111 otra btbr.t.. POt" o!'llb. 111.~ reg.J11s de Cb:lfi11ff 111e cumplen n :mdo tiC ounsidtrn In composklfl lo4111 dtl ON1 \ d~ dobk brbNI. pero no pata ead11 beb.-. pM" separado. ya quo: c.- cMc Ca$0, .'\ s T y C ~ (i. T:Unp(K'O $e Cumpll 'll ~ relll$ en kJtl ~ llUCkiOOtl de cnh.."NI K DCillU (p.~ j.. RM y ONA v/rico), doode A wt U. A T y C -. G.
5.2.1.2
Efecto del pH sobre el apareamiento de bases
Los cambios de pH, al afectar a la Ionizacin de b9 grupos funcionales de las bases nlttogenadas y al equilit:>tlo de &autmeros. modifican las posibiliclades de forman de enlaces de hidrgeno y, por tanto, eA apareamiento de bases.
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H _ )-N
1
'\,
\o
Como oon$0CI.Ieneia .., valOreS de pH in~s o superiores al fiSioiOgiOO el menOI' nmero de enlaces de hidrgeno posibiC$ I)I'()Yoca la tepat~~Cin de las hebras componentes del ONA, fenmeno denominado dO$na1uralizeCI6tl (p&g. 164). No debe conl\lndlrse es1e efe con la hidrlisis cida o alcalina, ba;o condiciones m.ils extremas. de las caclen<~& 00 <.\<:ido ~loico (pAg. 35).
MODELO DE WATSON V CRICK : FORMA 8 DEL ONA
43
5.2.2
Geometr1a de los pares de bases
A pesar de la dlfM:ullad de vi&ualizar !al geometdn <Je un ~"l r de bases el'l 8ttSer'ICia de un CfiOOeo)() cercano a la rNOOad (modelO trJdlmenslonal, sea material o informiltico), M OO$crlbe a COtttii'W.JaCiOn de 1a forMa mas l'tel posible. La fort'r.aclbn de un enlaoe de hidrgeno roqvie:re q~,~c 10$ lrC$ $tomos implicados (dos electronegallvos y U'l H) se siten sobre ooa linea recta E&1a condicin $61o So9 p~,~eoo evmplir Ol.lal'ldO lOs <lO& el'llac:es Ni;IICOsidicos de lOS nuclesldos co,.,.emenlarios forman ~,~n ;ingviO, it~ftnor a oon 13 linea i~aria que une los C-1 de ambas pe.n1osas. E$1a geomelria del par de base$ detetmin3 13 <li$PO$iCi(l(l espacial relallv'a de las dos hebras en el ClNA (hellcidad) y es la causa a nivel molecular de 13 l)re$e(~Ci3 de SUI'CO$ menor y mayor en su estruci!Jra lfldlmenstJnal. ambos a&Q:tos so...-.ali:z:tn en detalle ms adelante {pgs. 45 y48).
oct.
rcprcscntac:in bidnnc.'1lsional del par de ba~s
modelos tridimcn!:laQnales del par de nuc:kudos

1no ~e m11n.1liltll...: 11)
J~x111"1bo!t:t ca~
x.-..pcc.Jicular a la base (d O anuJar queda btlcis atrs y el PS' h3cia dcl.amc reSJ)C(IO al plano del papel)
dcsoxittibosa Caloi ptrpendic~,~lar a la base (el O anular queda haci11 delante y el PS h11cia 111rs.. rcspce1o al pl11no del papcl)
II J-<;.,.~ -~
\ & +
e,
,-_.,. .--!'\; ... -. e, 1 ...... ___

~
\,
n :t.. ~~ 11 -~ ..... ~ ?\G

, ,.. "1\ -
N - t-1 O
'ifi~...l} ,-
r" "
.....
...
Gn conclusin: Todos los p:Lrcs de bases prescn1an una g.comctria s1mlar, definida por. longitud de lo.,c; enlaces de hidrgeno s.c..-p.:m~i n entre las pcn1osas de mnbs n U(: ICti~ ngulo entre los cnlnccs glicosdicos )'la line.n C t '-CI
Una ~z ostable<:idos lo5 enlaces Oe hidrgeno mttiple:s, &as di,...ncias entre m tomos q~,~e los kwman son pr(lcticamenle iguales p."lra ~Odos los CII$OS lg~,~t'!mcntc, ill ~l'$<1fW & iompro ......., PIJrina con una pirimid1rta, la separacl6.n en11e las pentosas de ambas hebras taf'I'Cifn se manuene constante Solo de e~a Mal\era (dlsta1 '1Cia oonstante entre las hebras. hdependlentemente de su secuencia) es posible ta a sociacin tol'lbl'lua de tas dOS cacJenM para formar una molcula de OHA doble.
44
ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL BDHA
5.2.3
Antlparalellsmo de las dos hebras
Ya se ha ncicado que el apareamiento oompleto eotre &es dos hebras exiQe que sus secuonCJN sot\n compklmentaas. Debe al'ladir&e ah01'8 que estructuralrnen1e e!Uo slo se puede conseguit Si ambas l'lcbms $0 di$900Cn en senticlos ()JNfliO$; a una avanza de 5' a 3', la otra debe t\acerlo de 3 a S'. Se dloe que las hebnls llenen p;~rilleias, El concep(O de an~lellsmo va, pues, esuec::hamente lig3d0 t~l c:se polarictad opue!Aa, o que son anti complementariedad
' o 'e"!
n
~l')(qutla ~.k la~ !lo.

~(,w.:mpu
j .;o ~ '!.
<.li:ninUt. ._ , IC'!Ido <ll
d ml5nll) ,mi., L'<mlo)
cewn~or~:
S'!TCCC't'CAC,.J. 1n !~'I TACTGACCGA IJ')

yt(,lo)~
~nto:n~-M
ko;on.,.,.inlo>
>llo.:lltlldC'J' a~'(tn
Co)mn. tkl :.C)Ih'C'M)
C$hMt~OO p~~r, d WO:UC'J>n.l dC'-
JOellboW un:. dl! ~ 11 ) '
.:lll&:oa)
5.2.4
Diferencias en la secuencia de ambas hebras
Yf:t
Debe desta<:arM que lns dos hebras de un DNA. complementarias y antJperalelas.. poseen secuenaas t.o&almente
<:trererrtos. oomo &e J)Ue(le
~rcntement.e
en el i.CI:Imo eje~ mostrado. Es d~. son hebr as no ldntk-.as. Este nacho.
si""C))e pero que a menudo pasa lraacM!rtldo, es de gran trasoendencla; en concreto. en el proceso de lr<\nscripein, lt~ molcula de RNA que se sintetiza es completamente diferente segn cuAl de las dos hebras del ONA se transcriba. En ocaSIOnes &e utaza el ttmino MINaS eo~NNO((td&$ refirindose a aquellas reglones del ONA en l9S q.se una< las llebfae contiene 9Jat proporCin <fe purinas y pirimldlnas. Como consecuencia, la hetlra oompiemeoteria es tambin
~ada:
- C- A-A- G-G- A- T-Gtle"bra 2

tm.J,.. -C-T-A-C -G-A-~-c-
__.A
- G-T- T- C-c- T- A-chctwus ''no cquilibrndas":

% ( A (j~ctnl > %(1'--C"-'""''
r.wt ,-"-
hcbr3S "t!quilibrndas-:
o/II(A {j\...t.n.l .. % (T (_')hfbml ..

%( '\+{j ~""'-2
so-;.
= o/o(T ~ (')ht11t111 = 50' ~
%(A G).,.tul o!%( r C\.,.,,..,z

corno consecuencia:
%(A~{i ~""'' > %(A+G~ctrct.!
como otmsecue:nc:i<l:
%(A(i ~tnl =,-..(A+G ~
o/ o('r C)t~ 1
.. %(T
<'>...:tnl
%( 1-.-l').,tnl < %( f ( ~,r,]
MODELO OE WATSONY CRtCK : FORMA 8 DEL ONA
45
En prinQpio, la existenCia do hebrt'S equilibradas o no w refiere a rogiOn$5 lot<~!iz.:Ja$ de una rnOiC\Aal de ONA, Existe. sn e.margo. un ejemplo singular en el ONA mitooondrial humano: considerado en su conjunto {16,5 kb). sus dos hebras son de~ibt'adas. ~'" ul\ill " m;is nctt en wrina& qua ltl Qllrt\ (56 y 44%, rG;speelivamenle) A 1<' primet<J se la lama habitualmente 'hebra pesada (o hebra W. del~nglslleavy: rowrde&e el mayot tamao del 3nill0 pUrinico} y a la otra, 'hebra ligera <o N L dt tigh()..
5.2.5
Hellcidad y caracter dextrgiro
las~"eSITiociones esticas irnC)I.Ioslas POr 13 geome4ria CStl<l$ ~res <le Mses (Que indu~ loS en13oes ~re bar:se, pent0$3 y tosltuo, P$9 43) ~cen que et apareamento comp1e1 ooe las doS nebtas s6fo se pooo.a. est&l:lle<ier S lOS pares oo bil$0$ suOHivos wn gir;)nOO unos con respectO a o 1 ros (OOtlete-tal'flente. 34.SO et\ e1 S.DNA). Como oonsewem:ia <le 13 liCI.In'lu!t\OC)r'l de eSioS giros. tas hebras de DNA adoptar\ una disposicin helieoicJal (es OeOt CBC!a hebra aescriDe utta helice) y 18 caCie1'13 Cle 0001e hef)f1l es I.Wia "doble hl ice.
Georntricamenle, l.l"'a hliCe (genrica. no de ONA), sea sencilta o doble. puede ser de d06 IJPOS:
h('Jiccs 0.:.\"lt&ifti.
dcM~s..
b:l~tt:>
~~~)$1r.l.~,
a dcn:cha:..
(1 ~'1'1 ~"'l'llido
:. i:T.quic~. 0<'11 ~mido
h4-mrio:
llntibornRO:
,..,-ncmu
hHic.:
hlice
dublc
~cnerlla
h 'ti~
En el caso de ta fOrl"n& B del DNA <tl'l'lf>al hebras se Cl'lrOial'l alre<l(!(lor de oo t,e <:otnUn, longrtudinnt, format~do uM dob le hel ice dextrgifa. La <setva(:IOtl de mCMSeiOS MOleculares tri(fitnension&le$ perMite un mejOr (;Ompron$i(ln de este car&cteoJ hellcoldal.
Modo tw.l:mu:llunJI do: b
:.,..,..;oa~~~ckd!l> ~~dpo(.k#')dt
.,..,... " ' ' ,jt ..~~ t>;'OI
dRito-- T
p
,. ,.
d ll!...:kh00.,.((orrrlo;lt'o(11htt().. T(' )' GA (dt.l:c prndC' ~ u~io:oJ;etn 1~ ~~oet'ICU!I
"f!CCO> .. Ql!lttl(lf
~"'
...~
,.
c.llht-C
011
(.,..r T ' A o;!i el plll'l(l rt'lfo;llo)f, pr C 'fG ~" cl pl ~no ~
,.
5'
,
,.
.~.
46
ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL B OHA.
5.2.6
Parmet ros cuantitatjvos de la doble hlice
..
liiAmetro de la hliceo 2.)1 tiM (23.7 }
..
Dobl-e: pc:riodicidad a k> largo del e-je longiludinal:
..2.~ nm
(22 J
,...,.,. ""'"
de" h i~otk bpm'sdc ~)
t j C dt
b hlice (.-conttc' l.:e pucnlb
Ejrn;.do: A pan ir dd dllto de $C:'p.1nu.:. 16n enll't c:ub <ls p:ucs de ba..":"s (0.34 run). se puede cakulnt el mlmcro lotal de p.m.-:s dt: bnso:s de UOil molcula de ADNA dc cualquier longitud (por ejemplo. un otelro): 1 m 0.34 nmlpb -= 109 nm i 0.34 nm.pb .. 2,94 109 pb ., 3.000 millones de pb (Mb)
Vke\ersa.. 3 panit dd nmero de pres de b~ de un I)NA (p.ej., $.880 Mb), ft~."(:tu:-ntciCiliC llal\300 su " longi1 ud en~ de ~sc.::s-, .!iC Micdc c:alcul3r la lon;:itud (di n)(:tiSOI'I:'!i) de la mol~cJia:
S.880 Mb S.Slill 10" pb l.88 10' pb 5.88 IO " pb O .J4 nmlpb .. l IO" nm 2 l~ .un = 2 Jo-\ n1m ~ 2 m
l ooa: 106 pb .. 1 milln dc pb = 1 Mpb. pero se suele usnt Mb y no Mpb)
MODELO DE WATSON 'f CRIC K: FORMA 8 DEl ONA
47
Lu ~":SCakrn Fnmdsco 1del c.-.sullo d<.

Chanlhm.J (\ aJk del Luua., haJM:m),
tuyo dJ~io ~ utrl00)'<' 11 LeonurOO da

Vmci. ba sido con!>idcradn como u.OOdv tk lalubk hlicr dd 1>1\A, <;tm la :ml\cd:~:l d.; que~~.~ g.rv es
lc~giro.
Se l l':!.l:t de un.t C'ii!ah.To:~ h.;h('Oid.11 (de 1'fl'-, <;:lr<~<:nll, Cl)n 111 C:r.J'l)\'tcnS1ic.a
adpic:~
de ,,,,.,..rer dos ram:Al$
mdC'!)l'tldJ<."IllCS. l<ldU UOU ~"On S"IJ
..:1\lllli:b (t"tl
deu-:1~
la fmo, un:~ ul fr~cuc- y ou-a Pm \;)nlo, !> p('rsomts p~.KdcQ utd i1.:.rla al m1S1ll0 ncrnpl) sin
En c:l C<l50 dciiJOI\A. d NIIICiclo de 1;.~ d..!ll he~.. cnnesromleri:l o b~ banut<hll;ts t:\tl-rn; ~ de 1~" c.Jo;.. nmtxa~.
5.2.7
5.2 .7 .1
Car~cter
antiptico y estabilidad de la doble hlice
Situaci n de los fosfatos y c ar3eter hldroffllco
Debido :'1 la lnlaracci6n e-mu~ fas ba:$0~ de 1~$ do$ hcbr;)tO, 10$ ~qvclclos a...Ucar-fo$1al0 do ambas d&bon dlspooerse hacia el eJ(tenor de la doble hlice po1 lo que Ef ONA duple.K tnl)(l:$tt.\ un m;'.lrc;ado ~r(tCVJI hidrofilico La &Uperllcie de la molo.Aa establece as! 1nlefacc10nes lattOrables oon e1 mediO ar.uose> etlcvnctanle. At tni$MO !iCn!pl> l(t dl&eribucin relatiVa de ios fosfatos es !al que .mlnlmiu la repulsin ~!tca entre P.IOs
en CSt(: IMdCI<l -.( ~~Jlf'l'CU biL"ff la u~ehn:u:nn de 1~ txbc...
n.-sr~"1.'1"\J al CJe
\ k
1!
Ullln.ll
(ji);U\1!1.1
Cllll'I-IR;I
48
ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL B..ONA
5.2.7.2
Coplanariedad, apilamient o de las bases y carcter hidrofbico

Las f)ages ~inlcas y piM'IIdlniC89 de ambas cadenas se encuentran dirigidas hacia el interior de la doble hlioe. superpues&as.
de
bmanOO un apilamiento similar it un ITI()I'ltn monedas Como consoooenci;t de !al

y paralelismo de los < millO$
proldmidad
aromflcos. se origint~tn entre euos IVel'lt'IS oe

01tracciI'l, de lipa van ~ WAals, 1131'nad3S
klteracclooea 011 s,olfamfMto (fuerzas hidrofbicas). De esta ~ el interior de 13

r~-~~e"" y~l(llbl't"< ~~de 11 w....,
wtllkll me ..:"
""'~
doble h61iee. &ltamente nidtolbloo, quedB aiSlado del medio acuoso (hldroflllco). contribuyendo a la establ!lzaciOn de 1a molcula
y a te (liOteCCiOr\ de la lnkw'tnacln genlica (pues sta la constituye 'a secuencia de bases).
Estas in!eracclones son mayoritariamente

'lespeclfiC8s (es decir, son r.dependientes del tipo de base implicada). a dit.fencia de tos
enlaces de hidrgeno entre bases complementarias. muy especffiOO$, Aui"'Q~ loa atracci6n ontre @ ~res oe bases
i'ldiWcJualmeole no earNJy tuene. al axhodr t0,4 ba5eS por vveltCII de ~. la ~ribucin ~<:~~al <al;, o51<tbil~ do,., molcula~ Muy ekNada.
Resumen de ftlcrtas que
fl"'"'"tllt<\ iNK'tabilizan la
doble hlice del !)NA:
I~IQI'I('\
/L~ ':~ ::.:: '~ " :::: "':......J
~
5.2.8
Superficie de la molcula:
__
"""
1\tdn)f~
<k arilowrooenw de
surcos en el DNA
COMO $e M observaoo. la geometrla de lo& )i'lrcs de bases (pg. <$2} y el antlparalelismo de la$ hebras (p~. 43). Mee&atios para la formacin de lOs puentes de hidrgeno, hacen que los C-1' de tos a.roeares de los dOS nudetiOO:s compementariOs no se di&pengan simtrieetl'lente oon re&pee~o a las bases y, pOr oliO, que lOS esqueletos de$0lllrribo9a--losfalo de las dO$ ~s no se siten en pu'\10& diametralmenle OWMI*S de la OOble hlice. Como consecuencia, a todo lo largo de la estructura en doble tllioe se fofman OOS sureot, ~ may (o hendidura profunda) y otro menor (o hendidur3 pequ&fl&), que van girando de fol'nlOI Nllieoidal, al igual que loe dos esqueleto&. Los svreo6. especialmente el mayor, dejan espacio suficienle para Que moleculas externas puedan oootactar con las 03$$$; ste es el rundamet'lk> de la lnteracan del ONA con nuMerosas protefna:s eepace& de r.conOQ&f socueneias de base& (pito. 60), con fur.clones tan importantes <:omo 13 tegulac:IOn de la e.xpresin gnica (1'(:1' ejemplo, factDteS de ~n~nscrlpon}. En cierto modo, es como si IM ptOielnas "leyetan la secuencia a traii'Q do lO$ grupos funCionales de laa bases que "asoman doniJ'O del S\.WCO mayor del ONA.
MODELO DE WATSON Y CRJCK: FORMA B DEL DNA
49
,\~ddo
c~uhu.!IICi:l tk l.lu~unclrl3 de 11,..,. (lllt<'i M 11ll~ lcl,d!'>S,
Sll!lph ftdlit) JXII".I :q~l:lf b l(MTI\III;;()n 4 1.: los SlPt'O'S. Co11l11)
'
.........,...._ .... ............. ..,...

---~
'"=~ \~" .... ...... .... ..,.-.... .......... .....,,.._

~
.......
._
5.2.9
Significado biolgico: idoneidad para la replicacin
El mooeJo de doble hliCe de WM$0n y Oick oonnilc olqlic;v que se mant&PQ& una eslt\lclura ~ular a ~~ de 1<'1 vi)riaci()n oo secuef'lda y que se produzea tn&C:Iiante un meeanismo muy $imple lo duplicacion del matenal gentooo. En resumen la wpllcaciOn PlotcdO de una rnmern II)Qica. con dos procesos ~ (a) la separaci6n de las dQ$ hebm$, y (b) ro sin~is. a l)arbr do ollas como mOlde. de ottas dos C8det\a9 complementa."" (tQ$ de~ <:fe e$te PIOGe$0 5C esaudlarn OOSteilormetlle, lema 12) Tambin l)effl'll!e la repatae& de mulaciones y daos en una hebra, al disponerse de la otra 'COITM) reroronoo do ta sec:uencQ c::otT'Eicta
'
' ,,
Tema 6
Variaciones en la estructura del DNA

6.1
Varlant~s
en dob&e hebra: fonna s A y Z ........................................,_,,, .. ,... _,,,,........................... _................. 52
6.1 1
6.2
forma A del ONA. en compc~racin ron la forma 8 .. ,
.. , , . , . . . , , , . .
52
6. 1.2 F()tma z del ONA. en comparaciOn 001'1 las formas By A.. - . . ...... . . . ... . . . . .... . . . . --- . SS Variantes toeales de la esti'Uetu ta s&eundarta del BONA ............................- .............................. 56
6.2 1
6.2.2
Cl.IVatl.lra de la doble hlice.................................... ,.... _ ,_ ,,, .......... ,,_ ,,,.............. ............. .... . . ...... 57 Palfndrornos .... -,_ ........ -....... .,_, ........... _ ,_ ........ _ ,_ .... _ ,.,_ .....,_ ...... _ ,.,_ ...... _ ,.,_ ..... --- ..... _ ,_ ...... ,,_ ,_ ,,... 57
6.2.2.1 6.2.2 .2 Conceptoycartteterlslleas , , , ... , , , - . ,, , ........ ,_ , ........ 57
Jtpeticionesde~i<t
,.,.,_,.,..,,_,_
--- -------- -----..
58
6 2.2 .3
6 2 2.4
6.3
Z2 $ 6.2-3 K.DNA.. trfple hiee ...... ,_,_, ........... ....... ,_,_,_.,,._,_,_,_., ....,_, __,_,_,, ..... Motivos e-sttuccu.ra!es responsables de la unJn del DNA co n protei nas ............................~..................... 6.3. t Oescnpa6n de los motrvos estruelurales ms frecuentes ... . ...... .. .. .. . ...... . ... .... .... .... . . .. . . . . . . . . . 6.3.1.1 Motivo hke~iro-hlioe o hlice-vuefla-hllce .... - .........................................,_,_ ---- 6.3.1.2 t.totivo hice-bucleMioe .............. ..................................................................
6 3 13
6 .3 .1.4 6 .3 1.5
, , , , , , , ........... , . . .. . . . .... . . . . . 59 Co!t$eC~JenC~C~s e$1Mlur31e$ de 10$ palfndtOI'IlO$ ...,.,_, ....... ---- . ,,._,_, ...... -59 ti) En iJCidos rM:IeicoS de hebra MfiCilla.. ,. , , ... , . , , .. . . . . . . . . . .. .... . . . .... 59 b} En ONA.de doble h9bra ,_,_,.,.,.,_,_,_,_, . 59 Fvncion.-1~ ele los l)<'llindrcmo5 . 59
Pttlfndromos ef'l moleu181$ 00 h0br81 sen<:illa,
61
63 64
60
f.'04ivo horn~ir.o .
Moociii'O<IedO<'O llt!C. MociVO cremancrt' de tevci~ .
,_,_,_,. ,., .... _ ,_,.,._,_ ----
----
61 62 ,,_,_ ,_,.,.,,_ ,_ ,_,. .... 62
,.,_,_, ...... . . ........ .... . . . . . . . ...... . .... . .
la molcula de ONA no es una estrucl\lra estttce, sino fleJUble y dinamica. Gracia!! a la eapaciclad ese: r~in ;JIIre<Je<:l()r de los enlt~~ces de 10$ nvclelidos. el ONA puede ad~r m \01vo diversas fonnas, dlsbrolas de la lorma S de Watson y Click. Se e$ll.ldian en este l$'n:t: Aqullas que, manteniendo la estructura hei!OOidal de doble flebrtl presentom una oonJormaOOn diferenoo formas A
yZ.
las vanacooes oonformaCIOf\ales de carcter lOCal en lomo a la eSiruetvta B La itl(er~ oe regione:s e:spocffic.a.s del ONA con estrueluras ceractetlstlcas de algunas proleif\a$. En g.et~ert'll, e$105 tros tiiX)$ 00 variaOOfles es1ruaurale:s tienen relaCin con funCIOc'les Importantes en et <MI ONA. interw'liendo, por ejemplo. en el inicio y la regulacin de 10s ptOOeSOS de ~~in, teeomblnaein. ttanseripdr'l ele. De ani el intet6$ de $u .,ludio conjunto, como tema rldependlente, para a!l'l(llia{ l8 estructura secundarla y sertt{tr las b3!Ses de dieflas funcio!'IG$, que s.ern ot,elo de estudio en temas postetiores
mett~b01i$m0
52
VARiACIONES EH LA ESTRUCTURA DEL ONA
6.1
VARIANTES EN DOBLE HEBRA: FORMAS A Y Z
El ant\li$1$ POt ditraccin de rayos X a reSOiuciOn aiiOmiea revel la emteneia de dos nuevas lormas esttucrurates o QQrr!ormaciones diferentes a la BONA ttacJicional. en 199 que se mantienen las caracteRsucas bsicas de ste (compemenlarledad, amlpara~mo. helic:idad, etc.), JM.If'O ll"'Will<m Qtr<ll$ dife:r~nci~$.
Comparacin entre los t res tipos estructurales bsi~os del ONA en doble hebra:
TIPO OE HWCE
A (deshidratada)
Sentado o. giro do _, h6tiee Fma y tt~mt'o DeX1r6giro
B (Watson.C<ICI<)
DeX1rgiro ll'ltermedia
Z (Ric,..Oicke<son)
Levgiro
La n'I&S ancha y
coo
11
la ms e&tred'la y larga
OliJme1ro de '" fllioe 1 Otstanc:ict en~ bases (d)

Pare& de ba&eS )(Ir vventt (n)
2,55 nm (25,5 A)
0,23 nm (2.3A)
1
2.37 nm (23,7 Al 0,34 nm (3.4 A)
1,84 nm ( 18.4 A) 0.38 nm (3.8 A)

12
Ro'l<'lcin pot cada base (360" in) Longit\ld vvelta de hliCe (Mi)' lncliMcin del plano de lOS pares de bases " Suroo mayor o gtande Suroo met~Ot o pequet.o Enl<'lot N-glioosklloo
Nor..
3.2:,7
2.53 nm (2S,3 A)
19' <gran inelinaein)
Esuecho, ~u~ Amplio, no profvndo
10.4 .. 3-4.6" 3.54 nm (35.4 A)

1,2 (casi perpend'ICular al eje de la hlice)
Estrecho. profundidad
- 30'
4.56 nm (45,6 A)
9'
(ligera inctnacin) Estrectlo, proiundo
AtlehO. cwo'urdiclad media Plano. sin profoodidad
Ant;
...... ..,.
Sin {C. T) y Anti (G)
Os.~- o'*" ~tde beMt. MtCHt ak:l llrgoc:leldl:l h6a. : Rouc.on por cada pat de beSes. o giro re&P$CIO .111 Jlill' _,1-not ( delllrgro. - II!'Y(Iif'O). 3 L.Onglluoda M vueb IW!Iice, medMia e lo l&f'(IOclel eje. eoloQoJI&Ime'*' )IMO doa rosea* o po~sode htlioe'.
" lne~CIOn ~ iM ~~~no pe!J)endioJI81 al ee de la hlee
6.1.1
Forma A dol DNA, en comparacin con la forma B
Lill re<luc:ein de la hUrTied80 relativa por Oeb<lto del 75% (por ejern(llo. eon Clieoludones t1'U)' conoenlrada&. es deor. deShidratadas) hace que el 8--DNA tienda a translotmatse, QQmo ejemplo de la llexibiittad do la m016ClJia.. a otra conformacin. denominOO. A.oONA. Aunque esta forma no se ha encontrado bajo COndiCiones 6$iOIOgk:as, su esl\Jdlo es de tnter& por ser la que adOc>t3 e1 RNA cuando posee regiones de doble hetx"a. MI como lt' <le tos hfbrldos ONARNA.
Estruct~.r<*nente, el A--DNA es similar a la forma 8 : es 9v<'lmonte una Clotlle htliee deXttOglra. oon hebra& oomplctnent<'lrias y an~ralelas untda& por e~o& de hi!Wigeno. Sin embargo, dltlere en sus dmen&lones: ltt hiico A es mtts anchll (mayor dimetro), mi s cort~ ~m un triSmo ntJmero de nucletidos {menor diSianc:ia enlrO pares de cases} y llene mayOf nmer o do bU I!S p01 vuetta. Como QQn&eOJencia. son monorell 1<" rotac:i6n POt cada base y el paso de hlice. A.demas. la& MSM 110 se disponen casi perpendicularmente a1 eje de la hlloe, sino daramente h:llnadas. y se Jit(mn mbs separadas del eje de la hlice La suporfi<:ie de la MOlcula es tambin d1feren1e e' suroo mayor es mas estrechO que ., la forma B y muy profu~. mien11'3$ que el su-co menor casi no se aprecia por ser ancho y poco profunOO Mien1~S Que la forma B puede aCXlfi'IOd)r en sv surco menor IJl8 columna de molcula& de agua, el 5urco ~lcit'l de la IOtm& A no olrece e&paOO wficionte. ~ta dlfetenc:ia expliCa, al meno& en par1o, POI' Qu6 li!l desh4<11t'cin laveoe la lorma A.
VARIANTES EN DOBL~ RA: FORMAS A Y Z
53
Pra tn{hlnr- ln,'> diferenci:t!i c....,ln~elurn lc!. .!>C put.'<l!! emplear un modelo de .. ci nta,s'~. donde d I."Squtlcto se rcpr~u:t por 1ma cinta, de la cu:1l se dcSl~c;;)n los ~ullfo s JH'n l :~~gon: l es de dt~><irrih~:. qN :'llc:unos dt oxigE":no (c.:rc~q >lll:-t gru iHh fos fal o
h:tnlla~ que o;obrc."$tlk"11}. Cada nucleOtido c.,o;t:i representado
Lll.!>c."CU!!Ill"iil t'.n ambrn. Cibl"'- .sla 1 msmn:
15', GGGTATACGC ( n
en un CQIM dil' crcme
{3) CCCATATGCG (S'l
E~1c mismo nw<k:lo vi.!>lOdesde su plltc :.uperior) 1 )cnn1h: tluslrot que f:t hChcc .\ c<> m.1s :thu:na. <;Qn lll::t)'(lr di;'Lmcuo y un diliJ)I)l!liC ill lk' lits bases ms :lc.:J:uLa dcl l.'jc de la hi'ilce;
2.55 nm
..
!.~ \7 nm
...
54
VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL DMA
Un:l '*j , complcmcnwria !1 la anterior. all.l: \'Cl que ms Cit"n::ana n la r.,'"'lidad,
es la dd modelo espaciaJ compacto.

la-: t~sc~~ C'ltn colorc:ldM en roo;a y el C$qudcto de pcni0'\3'> y fosfatos etl \'Cfdc.
los Mll'l!OS
en i111Ch~P:t:
hf~fl)
ptu
<;QnrtW
u .to,.
put>d4'
~
1S3nnt 11 pb-.
...
o.:J nrn
Las dtferonCia$, roCI6n eomentacJas, en la esttuetura de las dobles Nl'ioe& A y 8 vlen(tf'l ~~ on Ulbm<t ins.tancle por la diferonlo dispoSICiOn dO lOS pares de bases. debida ooncretarnen1e a ooa distinta ((lnform.-c:in do la dft-&Ol(irribos~ En ot A~DNA, el C3 <Sobresale del plano formado por los otro& CIViltro C'oatbOI\0$ de la tllQCuranosa (oonformaciOn Cl'tfldO), mienlnls que en eiBONA es el el que no es c:oplanar (coflfmmacin C2'ettdO).
cr
p
, , . , . . . , . . , . _
\
~~~-
~ L./
,.
'o
H
11
"
r
cl)nfonm lC:tn Cl'cffl'h lADNM
_..o
11
.'
11
-N ~ =
(T,(.T t: )'()~,
confonnann CZ"('m4l
(BDl'A)
Esta d1s!lnta con~in del anillo de t\boe.a hace que en el A..ONA tos dos gruiJ IO$f310 oonseCU'IIvos esten ms prXftlos enlrn si. 10 que explica que los pares de bases suoosiVOI so acerqven. aool'lando la cadena..
Smilarmenie, o1 c:nmbiO en ~ geometrla c:onoooe a tos difer'"'~ par~elrO$ geo~t(i(!QS ya comenl.ados.
VARIANTES EN DOBLE HEBRA: FORMAS A Y Z
SS
6.1.2
Forma Z dol ONA, en comparacin con las formas By A
La oxiswn<;ia de 18 ~* Z surge por jlrimera vez cM la ObsetVBCIOn, me<liante dlkaociOn oe rayos X . Cle una doble
hlice del hexanudetido CGCGCG. oon c;u-.c:toristieas diit!ntu a lM f<:wm<t$ B y A. entre ellas, oomo ~Y sQmficativa, so giro .. iZQUien:las o levgir'O P<l$!erlormen,e. $e M ~ncon~rodo esa* e$11\JC!ura en Otros oligonucleU<IO$ sintticos oon S9Cuen3s de pun;t:S y pirimidiM$ 311en'l<1$. hinque in vivO predOMiM el BONA, se ha pooiOQ Ql)Set\tar 1a presel'leia Cle algUnas reglones Z en el genome de clulas eucaritJCes. ompieando anticuetPQ6 oontra esta ltJme oonformadon. Su f\JnciOn. an pot conflm'ler, parece estar relaaonada a~n et control de la expresin goruca y oon la reoombineetn
En c~nto a $liS Cll'nllYI$iO~, Ob~aocJ&$ af'lora eomparativamel'lte con las ollas oonJormadOnes, se ob!lei'VB que ltt hofice es 1& mb estrecr"l.a (1,84 r'tm de dlametro), la m's larsra (mayor <IIStar'tcla entre beses: 0,38 nm) y la que tier\e mayor nUmero de pares de bases por v~~elta {t2). 1o cual supone une menor rotacin por base 30~) y un mayor ~so o longitW de un$ vuena de helee (4,56 nm). Es, en resumen, una hlice rooy esbl'ada. En su superfioe forma un solo SuJCO. profundo (oorrespondienle a la poSICin dol surco menot en A y ~NA)
Modelos t spaciai('S compactos:
1 fl.ONA 1
,,..~~.~k,
Wlin \~
4,Unm
""'""' f l-
., pt..
fl, )l; '""
ttu""'~ cu ~oklf ro'a o:~dtt" 1\CIII<o)f.lll\l\C..., 1:11 ~~~ \Cfde)
de es~ estn.ICti,II'O t1 niV(II mQiec~ muoslra Que su& diferencie*& respecto a las klrmas A y 8 se cfisti nt:l eonfonnac.in, en este C<'l$0 <tlrededor del enlaoce N-gliC06idioo En la& fonnes A y B t<XIM laS bases f'litr~aCias se Orief'ltan alejadas del anao de pel'llos.~~. en l<t ll;,m<tdl) confcwm9tin Ofnti , mlentr<l* Q\16 en el Z-ONA s61o lo hacen las plrirmcinas: las purlnas denden a s!Warse sobre la pen60$a (OOfi'On'naciM .sin), Por ello. en las secuencias de purlnM y plrln*inas a!ten'lal'lt&S (pot eje~. CGCGCGCG} tipicas del ZDNA, $C f<rvorece la &ueesln de ambas eonformaoclones, .s;n (G) y anrl (C), obligando al esqueleto azUcar-fosfato a plegMS<t en zigz~g part~ I)O(Ier t$1t'tblecer lOs ~<le$ de IU:;Ifgtno
La oonsiCiett'Cin
Ul'l(l
deben tamOi(ttl a
56
VARiACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL DNA
cooformucin ~in
(punru:c en 7-D\lA}
cvufum~ tmti
C:tdn t"u
po:Oh.'ISll
Ouaoos.ina et1 confOI'I'Ilac_,n ~In:

~e wrha SlOb
laprn~
bas<' llkja.b de b
modelo
LridtmcnsionnJ del par de
nuclc(ilidos CEG
en un Z-ONA
rcll.lh\'113 muy <hfercntc~ la..-, del n. I)NA
ee eo
lo" f(l(. fAtO!I quedn eo J'I&.'eiotws
e N
p
Ln drspo:ucin en nta"' del esquel-eto de la fom\a Z del ONA ~ aprecia de fom.a plitru~ en este rnoddo de varillas. doode 1~ @.nlp(IS fos-iitl se hall mido con una linea \'CtdC' hipocttica. Se mucsrra, a cf':t(ll$ oomparutwO$. cmo el 8-0NA no prcscnt~ esta orderl3cin, sino quC' $U esquct~o describe; uoo hlice continuu. Obsnesc que el Z.OhA es el oH.: oon Mlict <n sentido levt'iro.
li.l!} ;rupo;.e; Rost'.aoo

..:n tllt'-.(fl' (de hi d numbn:
Z.O'i\)
"'lfUC" ~~n&lhwa
l'IICII<IOIII trW1 pr0.\.m!l(l8, (111 h' M (tu~ M A y (I.,,J )!.,A, poli"

ti:Q~ . . . dt\<..J.'I
1.o:1 sru.- r~~~~t~ ~
kl e~ in n'rP&e
M nCC!IIIIn.cJn !Ollina pan l'fduci1 lai

tq~ulsi~ C!l'CirOiol:iliC'M ttl!fi'
ellos y a fll)lkr
~C'Itel'~
co.lllf~arinZ
6.2
VARIANTES LOCALES DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL B-DNA
Los estt41C4 de difttteeiOr\ de rayos X lambln rGYelaton 18 eldstanC~Ct de v<lriclociorw 0t1 la c:Qf'llormO'IeiOO el\ detemWtadas s.cucnc:ia$ del B-ONA. Aunque dentro de es1e apartado lantin podria incluirse ti ~rolla"*"'to del ONA, so M preteridO describir es!il aspecto como una eMructrsa de orden~ ese 10$ ~ nucleloos, dada su Implicacin en la org~I'Klaeitl oet c:t()tl'I()SOma.
VAR IANTES LOCALES DE LA ESTRU CTURA SECU NDA RIA DEL BDNA
57
6.2.1
Curvatura do la doblo hlice
A pesar de ta regularidad del mooeto ele Wa1$on y Cnck. e.1usten P$QI.Ie!'IM diferenOO$ IOcilh~s en la ~!1\IChJr.t de tos ONAs depe.ncllendo de 106 nuclelido& integrantes. Por ejemplo, on detQrmn(l(!'a$ $OC\IenciM: los p;)rt$ <st bi'I$C:S no
son e)(aCiamente coplanares. to Qve puede OC<IISionar una Oc:sviaciOn Clel eje <te l:t OOblt Mliot En otros Cli$OS. frecuenle&. '" cvrvt~tur<t no se origiM por uM secuenda parteutar ese I'MJCteOtioos. Sino que es forzada por la union de u!\31 prot&i!\31 a 13 cadent' de ONA (como. por ejernpiO,ta mos.trada en pg. 61)
6.2.2
6.2.2.1
Pallndromos
Concept o y caractersticas
Se denomina &e<:vencia& ~!inctr6mic., o $imptcmerttt palinOtOf'I"'IS, a aqueuas regietles de un ONA cuya seeu&ncit' os 1;) mismt' en ambt"'$ hel:lta$. Son f)3$1ante comunes, y llenen un stgnltlcado especial por varia& razones: ($)ser IIJ93re:t-di&M ele las etUimas de re&trlccl6n (herramientas elq)Eirimentales para escindir cido& nucte.cos en la tccnolog.ia del DNA rec:otnbir\Mte): (b) actuar oomo centros reguladorer. de la expresin ~: (e} ditr lugar a estruc:tul'as secundarlas pect.*ales en ONA y RNA, ele. Orama(!carmente. un pallndromo (del goego p.:~Nn = de nuevo. dlomos = urrera) C$ tod<t patarbra o frase QVO $0 dele-trea Igual de Izquierda a derecha y de deorecha a izquierda, Por ejemplo: RAOAR, ANILINA OABALE ARROZ A I.A ZORRA EL ABAD. En los palindromos hay un centro de $imotri<l (a 1(11 vez e,e y piMO ele sillWHfil}. que es ltl letr<'l central o la posion $~\'~te las dos leb(ls Ql:ltltrUIC$. Sin embargo, la eldensin ~este t6rmino a1 ea~moo de 13 Siologil'l Molecular no es directa. se diCe que u!\8 regln de ONA O$ p;JIIindrmicn eo3n00 ll' secue~i* de un3 hebr a, lei08 Ge iZJ::Iulercsa a derec:lla. es igual que la de la o tra hebra, leida de cere(fla a iz-quierda Por tanto, tos pallndromos se observan en lar. dos cadena& conjuntamente. y no en on., $018. P04' ejemplo, 1a secuer~eia liAGCACCACGAn set'la un pal1ndtomo gramatJCal. peto no es una secuencia pa!incsr6mica. Tenetldo en cuenta que, segn el convenio de escritura de lOs ONA&. ambas hebras se deben leer de 5' a 3', se concluye que las dos hebtu de un >al fndromo denen la misma secuencia; sl8 puede eon&!derar&$ una definicin de p;dhlromo.
Hebr.1 1. le\!b de izquierda a deroclldll (S' ~3 ): lkbra 2. ldda de d~'fe\"'ha t1 iUJuicrda (5'-n:
TTAGCACGTGCTAA TAGCAr.:GTGCTM
1 :
~ ~ ~ ~ ~ ~ ! ~ ~ ! ~
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
A 1 T
1 '
5'
Como una extensin del conceplo de pallndromo. se llaman pal fndr omos Interrumpidos aqulos en tos cualeS una pequeha secuencia separa las dos mitades del pallndromo y actOa, por tanto, oomo centto de simetti<'l no puntual (en lugar del espaoo enlte dos nucletido& de un pallndromo esl1icto). En cualquier caso. lOOO pallf'ltll'o;no est3 IOrmado por dos n.~ade&. de seOJencia idntica. separadas por un centro de s.nelria, puntual o no ~ual .
.,.l!(!nm(l intc:rrumrud(l
unll-110)!~1~~~
'\'!"'""'~"""'""..... '""\''"",.
~: 1
T T A 1 A 1
~ ~
1
e
1 G
ar~ liTa e
G
1
~ ~
1
1 T 1 T 1;:
Al CUmplits!) lar\10 la $iwne~ Pf'OQit'l <SOIPl'lindromo QQmO la oomplltmenlariedad de las do& hebras resulta que les secueneia!l oe ul\8 misma nebra que <\'ledM a ambos l:ldos del centra <:le simetrlt' son oomp!Gomentanas en!Te s!: se dice por ello que las secuencia& pabndrmicas son aulocomplementat ias.
58
VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA OEL ONA
~ q t lf JIJG le 1 J c c;: 1 f Id JC 1 t Ji 11 p- hctnl q x 11 1t 1e 1e 1f 1exe 1x 1e 1a t x 1t 1+)f hcbD 2 ( 'I T!TiliCICP.Jel ~ ~-- " x 11 1t 1e 1a 1t 1G 1
~h
. ......
( - ~ ITITiliGICii i CI '< J i lll lf i C IG !f IG 1
1,
t " l lll"' nmrkm-:ontiiOI
6.2.2.2
de
Repeticiones de secuencia
En OCIIIIonH H ubl~ZJ como Sinnimo CllifnclrOI'IO ti ~ ~
~. ~que en~ opMtol . . do. ftllllade6 Mnen la

~
leen
..,....... """*"'o no)

()lro temwlo ~ 95 .. dt ~IOirc:lnN dnc:tn, ~ M emplea Cl.lai'IO .,. "" ONA M)' repeCICibn O. una ~~
~ llumtllll j()G l~t$ ~ ~ 1 m!Ud ( );
lo('
.mbol lados del
c.ervo
'*'-
ca.
kt'll C1t lotfltiI. ~O.;

, 'T1AGtAC l '
~TCGT~
~umnll tn.1tad ~~ ~:
(\DCIId t rapet.cln), "ida $itmpre en ti mismo tonbdo No son I)CIIIindr011'10$ J)Otqut no cumple el criteriO de igu<'lldad de ttc:utnCial leidas ttllef'lticlo ~esto, ni !\ay ctntto de tlmocrla. por 10 que no se habla de ~mlt6c*" EttM l'fll)e.::lones llenen ..,_.. potQUt tpereoefl con enonne freoJenoe en
' ' nAGCAC 3 '
AA1CG1C
con.-
fi> 109). taniO en ~ o adyacentes (repefiC:IcW* ..,

&19 MI;;Js pot un
~
.....,.., OOJI'O
~ de
, '*" e
do
bneS ~
- ~~ La.~"*",...~ w lea ncianmo-.dbdo
................
cr.
se tlaflla de tepeflaofNN ~~ cuando la seouenc1a ae ft!PIII,

F.,...tllffllf
\a....,.. l,.uc ( t !>- r..ttOCAO:: 3'

MT..G!G
~- :- ~ 1
t:
'M'A
Mfe';TC
A.C 1'
tortn. lnvenlda, dentro de la ,..,. hiCira De nuevo no son pallndromol pun
no l\ly centro de simetria rotaCIOtlel. tino pq,no d& tlmottli! .specular.
ltlat
Ultimas
poslblldadet,
11'-t<k "'- l l l lllllj[W'IIIoolll
......
.urqut apateoen con frecuencia en k>l ONAI. ocupando W\8 parte impoa~nle dt w
141C:!UeftCia
cuanto
no
a ti
tienen ~ tn M!N(11Jtl seaJI'ICiaria de lol
k)l'l
ili(~"""
6ddot ~ por 10 que Plfbt de ..,.

i'ft01rIIOI6to M
r""*" tos~
~ll
11 RpttiC'IOn f- t
' TfAQ.;AC 3' ut .a
"ia.Mua l ~ - l. Ml'eCTG .!' T'T>.GCAO

Suloo 1~ V
. . ~ W' ~CII
~ WMr.t...t. ckras
5 ' TTAOCS..C 3'
1'
MTCGTG
!TAGCAC M":'CGTG
VARIANTES LOCALES DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL BONA
59
6.2.2.3
Palindromos en molculas do hebra sencilla
el C3$0 de bCdO$ MJCieieos de hebra ser.cma, la deJinieln de pal~omo no se puede aplle:al esttiCial'l'lef'lte. Sin embargo, dada ta relacin de oomplementane<lad enb'e la secueno-a de un ANA y ta de una de la$ hebras del ONA que So codifica, tas secuencaas de RNA de heb101 ~ codifi~o PQf vn ONA Pttlindrmico $Qn t<smbin autooomplementanas y se oonsii:Se:tan oocno pa!ihdromos Bajo este crilerio, C&de'l vna de 13!$ oos heM:I$ de un ONA paltfOmico larnbln es una secuencaa pi!ilinc)'mica de hebra sen~
p.,,_,
6.2.2.4
Consecuencias estructurales de los palndromos
a) En cidos nucleicos de hebra sencilla

La e:d9tencia de pallndromos.. por ser 9E!cuenclas au\OCOmplemenUirias, puede afectar de forma wnponante a la estrocl\Jra secuOOana. A&l, tas nebtas sene1llas de ONA o RNA PA!den plegarse OCCI$io~lmente SOI:lre si mitomt1to pw-01 formor un~ estrueb.lr'l!l 4IVt notquiU8. SI el cen110 de 9imetrla no es punllJal (paUndromoe ln~etrumpidos), su &eevencia forma un bucle en et extremo de ta hotqi.!a. La formacin de hOrquillas posee gran rele'vancaa en la estructura tridunen&ional de algunos RNAs El ejef'flllo mas significa1ivo to constitiJyen los btazos de tos tR.NAs, regiones. con c:litrucl\Q de lfIO y bt.IC1e {pilg. 74), torm3!00S por secuencias patitldl'6tnic3s Pat otto lado, este tipo de pleglamie.nto en el RNA (:()(lttibttye, en algunos casos, a la termlnaein de la transcnpcl6n: ooncretamen:e, en el mecarnsmo de termif\Sdn lndependletlte de p de procariotas y los mecai"'ISmos equwatentes de eucanocas
p.ol io~:o,~mfll(l a\<.1(1;
~ ole ;,emcnlll j\lll'!lul l
,. ..'lWl"'.'i'IWi'l'~" ,.
~~ta.cin
J
'.
de """ llcbn ~e
,.
'
H<~rq<.nl!.l ~on budc
En el caso de hebras sencillas de ONA tambin PJeden enconlr.lrw horqvillas. POt ejemplo en e ONA de$natur'81i~. Qve CMtot de Ul\8 estructwa secul'ldatia ~flnida. TaM~ se propone su formacin E!f'l sMuaclones particulares, por ejemplo durante la slntesls en el labotatono del cONA (ONA oomplementafiO) a pattlr de un mRNA, donde el extremo 3' del ONA de hebra $91'1Cilla se repl~ &Obn:l si mi$mo y sirve <l$i ~ ocbOOQf para la polimerasa (p&g. 2(}f)).
b) En ONA de doble hebra

En el caso de vn ONA doble, las hebras dol ~lindromo P\IOdon .OP<Wew&e y '"sociarse de otta IOtf'l"'&, generanoo estructtMas de <fOOie hOrqua& o CtiJCilormes (en &orma de c:ruz). Similarmen:e al caso antefiat, tos pelinci'omos intcrru~T~CJ~dO$ form<111 crucifQrmes oon do& buefe$.
ln11: !ou ,;
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''
tru..:ofonnt wn b~Kk
o e
6.2.2.5
~01'9s,
Funcionalidad de los palndromos
Los pallndromos en ONA dt'Jplex aetUan 00tr10 seflales Ot feoot'I()Cimiento a las qve se unen nvmeroGaS protenas que poseen estruccuras d!mrlcas que 1es permiten Uf'lil'$0 <~>e bm<'i simtrica <t ambas n.~ades del pat!ndromo (pi)g. 61).
60
VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL DHA
6.2.3
H-ONA: triple hlice
Se trata de IA'WI estructvr3 poco h<lbit\,.1;11, k:nnada por 3 hebras: una triple hlice. tambin llamada trfplex o trlpb Se de5Cubri0 por "rimera Y8l. <en \lO RNA, aunque O$ en ol ONA donde &e encuentra con m:s frecuencia Se fQfTMn en fogioncs riCil$ en J)'nnas (secuencio {CT., t en unt' l'lebr;ll y rica5 on p,rini's (M<:vencia (AG)n ) on la hobr<' eoml)lement3tia, En condiCiones normales. diChas secuencias se encuet~tran IO!almoet~~ a!X'readas $irt el~iOn atgvna en 18 dOble hliCe. Sin e~Jargo. puede OCUYir que parte oe aa doble hlice se 8bta y la hebra riCa en e y T se ropliegt~t y se a~rtte con 13 ocra nebra <AG). m&<Jiante urta nueva <:Jase de~* oe hldr(lgeno (COnocidos ()()mO
enlaCQ de Hoogsteen), er'l una Zot\8 cf()(lde Sta aun Jotma doble 1\liee. Apateoe asl ~ triple hlice (CT}n 1 (AG)n 1 (C T)n en dihO segmento del DNA. La ocra hebta sendlta {riCa en A y G), desapareada, fOtma una especie de bUCle.
Org;.lnit:;ICin de las cadenas en el pl.anB:

hdo.:c
bqutrIMI:bI)Ml~. 111) l .n~ d(K he~ e1 y 21 ro~ 111\l do'blr hhee' 111) Una .;k llll hcbr.u g \'lllvttndo h;l.;..a alr.h ~ 1
y se aperea oon los doe: betlr.s 8Mcriorn, fomum..to tl.lemcnw de tnplc hhoe. 3"~ L11 otra hdm(:!:) qultda dc~arc-ada. basca qw 'iC R\.WIC' de nue~o con la bcbrn 1 para {Qm~nr "" SCI\Indc.l tumo de doble h8 ier.
()rsanizaciOn cllpadal de las tadcnas:
" .-6 ....} ..... ...,.a.

f'(ll"~ ktn 1
EJ.:::mpk) de #p3re:tmlcn!C) tSc 3 bases que da' lugar a la lriple hlice en el H-ONA (TAT). El <Jtro ap.<treamientCt ~$ cntrt dtosina, u;nrn:~ y citosina protonada: c<;e+. l5n el caso de !{~M . l:tmttt:~~In 1'A1' '-.. vcDdriu S\IStit\litb por UAU.
~11111(011 ~r-kP
'
/
1
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Ol
1.
"
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tunllik nrrux un.adu' .k 1~ heho ...:: '

H
'
\ \
enlKC'S de 1
'
dioi<o (de W.won..Crid:.)
E$t4.t tipo de eslt'IJclura ha despertado gran ner& POr &~.~ t~Pii(:(l(;i6n en tcrapiM de inhibicin de la expresin gnlca. meclante la unin de un oligonucleOtido U\t&liOO a 13 cSoble hlice del ONA en la regln promotora de un gen. IQt'mando una triple nlioe que lm~e la expresin Cktl gen.
6.3
MOTIVOS ESTRUCTURALES RESPONSABLES DE LA UNIN DEL ONA CON PROTEINAS
Son numerosos los procesos biolgicos on 10& que la funcin del DNA depende de su interaocln especifica 000 pn>eeinas: de!Ueca entre ellos el oontrol dCJ la expr.si(ln gnlea, e;etcldo pot protelnas denomi'ladas genricamen~ /tJctores de t!Mscripcln (cuyo papel $0 ~bJdia mas 8delan!e. pg. 264). El estudio de e&4a& proteina' tiune in!c r6s dentro del contsm de la5 variclntet estruet\nles del ONA, preclsaments por su capacidad de roconocer e Interaccionar ~n secuencias concretas del DNA. Este reconocimiento lient lug3r gr~C.$ la posibilidad de variaciones tocoles en aa estru~ura ttidlnensional del ONA, asi como a lil intoreoei6n directa de 1 8 protelna oon las ba$0S.. nin neoe-sidiKI de qu& se separen ~ hebra& do In doble ""'liee. En la mayor parti! de los CtJSOS, 106 runerosos contactos eMablecldos (de bllO i6nioo. hid~ y enlaces de flidtgeno), aunque Individualmente dbiles, se oombinan para 0.... un ineetaif'' especlnc:a y muy 1\Jerte enlte ONA y protefna.
MOTIVOS ESTRUCTURALES RESPONSABLES DE LA UNIN DEL DNA CON PROTEINAS
61
El ft<:Ont>Cii'I'Mie(lto se etetce a ltavs de regiones o elementos 9$tt\IChJr<lles, que $01'1 SOlO una parle de t.a torcuula co~a de la protei na, y QUe se pueden enoontr3f. con vna es.~rucn..a espacial muy simiar. en pt()telnas dl~ln18s, r.lervinlendo en una mistna funcin en !Odas ellas SI se cumplen es1os rOQIJISito$, rocibon f.o~ <foec'lominaclon generica de motivos estructurtllet. l)l'l)leiOOS (ett ing~ . mob/s), en esli! caso moiJ'Yos de unin a ONA~
esiTUCiurt~
La Interaccin tiene lugar oon el e11.1eri0r de 18 ~ htlce, espeC*almenle sobre el suroo mayor, Como caraeteristlca Imponente, un nw:smo moiJvO MK!e oon.taeaar simultneamente con lf8rios puntos diferentes del ONA., torzat\do asJ en ste una modifie<~Ot'l conf<:wYrlaeional que ttaoe que seasenc.as lejanas puedan aproJ~imarw Oict10 camoio confmacional puede inducir ii'ICiuSO 18 ~raeiOtll)ardat de las hebras tdHnaturaliz:aCJn 1~1). oon lo Qv& se verla faii'OteOOo el aceeso de <Wt'$ ptOlefnas. Tal es el caso. por ejemplo. de la RNA-pallrnotr<l$8 et1 el l)rooeso de trnnKripein
6.3.1
Descripcin de los motivos estructurales ms frecuentes

IW ~t\1' C1l foljl)
h.lflflliHI ~....
~
1 ... ..,, pi,_
t:~~IC!f'lo.,. a tll
6.3.1.1
Se n.-
Motivo hlice-giro, hlice o hticevuelta hlice
Se abrevia oomo HTH. del ingtt:s ~K..Jum..t>eNx. Fue el primer molivo ptOieco de unin al ONA bien esludiado.
enQ~:;~~Mr;)(SO en l)tOieir'laS regt.RaOOtas de \a expreSIOn gntea, tan.a en viru tomo en l)f~t\S y eucariolat. Est tormndo pot oos tegmeniOS pepUdloos en f.thlioe, de e&trvctura rigidl. ~rt'dO$ por una secuel'leia de aminokidos. nexll)te, que permite QUe las dos hlices se t~proximco entre si. una. <1~ las aheliOH (llamada hlice de reoonocimtento) se encaja en el surco map del ONA, de f()l'l"na que los residuos aminocidos de un lado de la hlice lnteratQOflan mediante puenles de hidi'9"f''O con laS Dases tlilrogenadas e~eslas en ese suroo. El dl&metro de la uhllce liene la dimensin aderuada (1.2 nm) por<' Mtnlt en el SUlCO. Algunos aminocidos. situados en la cara opuesla de la miSma hlioe, e;tatl&e08f'l inlettiOCiones 001'1 otros oe la segunda hHoe, fijando la posldn relallva de ambas en un ngulo Ciltii pcfl)Cfl(liQJtar {ver esquema ir'liCial). La segunda n-hlloe queda asl cruzada &Otwe la de rec.onocin-.et~.o y ~uada er'l el &llterior 001 ONA.
[)o:.; tn.>~kllll> tok-cula.rei dttn..k se Ji~r~Xia la intCf'aC'(in del DNA con un 10011\'0 it(liccgm>hCiicc <bm(..-,c(J. En c:;l.:: c:t-so, 111 protdnu ootnl)lrtil cuui~-.u: 2 tnoli\'OS BTII. Se n\UC$11"J[l slo 6tos }' nl,g\tMS hCiic~ n:an;t:S.. np.:n.l~> ;,J roouvo; el fe'l!l<t de 1:. noul&ula 1 ..0 so: tnueslta. pues oo se rdadon:l ~on la uniUI) al DNA.
ronfoOffiliiC':I()IIIII en el [))I.A, en ~k' <!liJO una all'~r&. re~nsubk dt la Nnci6n dt b prou:i~
1.11 urrilln fk " do.l!l mothm HTH pucc furr.~r ,_ niOd:!lk' .tCtn
(p_q .. &t.:n;:r l.tlrtll&op:lim).
62
VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL DHA
Es frocuente que uNt protelna p-eserne dos moUYos HTH o bien q~,~e $C <JSOC!en do& molculas de protelna q.atet: (es dOcir. un <llmetQ), ~una oon un moll\10 HTH. en ambos cesoe, las dos h611oes de roc;:anocimienlo (f.l'l<l de cada moclvo) se s111.i~n ;) vna di~i<' mutua o unos 3,4 nm, b cpt coincide con el paso de neuce <1:et B-ONA (3,54
nm) y, P lamo, OQI'I dos posiCiones consewliVil$ de &u &Uroo ma)'OI' Es cledr, ambos motivos inlemociOMn .simultr;ean'lente con el ONA. conttli>UyendO l:l est<Jbili~ lt' unin <lo tct prolefna.
Los ejernpl06 rnejof conocidos de protelnas oon l'nOiiv<l$ HTH 3C1V<ln rC9Jiando la transa1lci0n en baClerlas y virus respect;vamenu~. El primero, la protefna receptora de AMP cJcNoo (CRP. t<Jmbin llamada CAP) es un dfmero, por tanto, coo 2 motNos HTH que cuando une cAMP aumenla su a-nnidad pOr $~ias especificas. del ONA. de&Oncadenando la expres1n de los genes del opetOn lacsosa {esle fue ell)rimor ojetnplo oonocido de control de la trans~iOn) . El segundo e,empio {en la figura) es Sa 9f01elna Cfo dei lago l8mbdl'l, CQdifie3da por un gen del Wus y 01($)f8$ada en toa bacteria anfll1!0na, que lnterncclona por su moi1YO HTH 001'\ et gen de lo) PI"QQeln., vinca llarNMSa tepffJW delltlg<) 4, ~~ndo eotno COI'I&ec:uet~cia su expresin (transcripcin del gen y slntesi$ de 1~ pro4elna)
6.3.1.2
Motivo hlice-bucle-hlioe
Se abtEMa como HLH. det Ingls heJIXfoop-h6Nx. No aeDe OOf'llundltSe con tll anlorior Cc>n$ta tMnbit'n de dos UMiioe. pero en e&;e caso el ppbdo que los une es ms largo,> que 10 dola de mayor nex'tilftd~d y,.., c:<wl.socUonoa. Nty m.tl$ pooibliado$ de orleraacin mnua de las dos hlices Gener<*nente. 86 igual qve en HTH, dO$
~nonios on
motivos HlH se asocian, rormlln<l~ poteinas dimlric::ts, aunquo no lj,iompro 1nto~ en posiciones con&oeCUtwae
del surco mayor. Un ejemplo de molivo HlH bien oonocido es el de la proteina Ahx 41: rt:tln (tn la fgura),
MOIWO hfhce--bude-Mbc.: t.lun6K. 'H y ~~~ mlcrn<."CK>-1 1:(10 d ONI\
(fl ~$1() \le b1 proto:irJII oo $C mu~r;a)
motho 2
lllll hficc:t de
fl'l:lmoc'11ni~
doftl;,.,,-do$
m~,..1'108<t6tl
doln111i~ lflfl ~tll.'f!Jatl Cll 1 11
dcf O~A. ~o"' al dnble~Ji~
ckl SurtO IN\'01'
6.3.1.3
Motivo homeodo minio
Se puede OO(tSiderar como IN\a ampliacin del molwo hice'9iro-hlioe (HTH), pero adqUlell'e errlldad propa por aparecer repetidamente, con icMnbca estructura. <tn distkl\tls protGinas Ade""*s de la dispoWcin de d06 hlioe:s
~wda$ tipicli del HTH, cKIS!e un tu':.:r tramO en uMIIee, del que s.<tle un:t rogi6n sin et~truchn socundari;, definid:. tuYQ$ aminOOck:fOs inleraoeiOnoJn Clirect3m&nte ((ln ef ONA. e:t1 e motiVo (en InglS, h~} $$ lmPOrt41nte POr' apn-.cer n las ptot&lnas que reg!Jan el des.aon'OIIO embtlonano, estudiadas especialmente en Drosophlt8.
MOTIVOS ESTRUCTURALES RESPONSABLES DE LA UNIN DEL DNA CON PROTEfNAS
63
M(liWO bc~t~t.:odo:mln)l) d 11n61CO )' S.U

in1\~in ooo c:l O~A
~ qu< ,,_...,..~'ffllu
r.'JOI<>
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' 11'
. >1\1.; ...1\1111
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ZI\C'II(>J
_..,;.,..,,o (,a, ~ lw!K..,. ( , _ ,. . e;.~-.. III>IUt ti dtrninlo;l ll1 11
h(lw."
6.3.1 .4
Motivo dedo de zinc
Se ha onoontra<SO eSle tipO de motii.'O estructural (en .-.gres. zmc fngef) en mol!itvd ele prot.einM eo~ritie<IS cve se unen ;)1 ONA.. et~tte el!as el tae1or oe IJanecripOO'I TFUIA y el reoeolor de e5tr~ Al igut'll Qve ert tas eflructullltS anteriotes, es ttecuenta que una misma proteintt DO$Cll mM de un motrvo; en este easo. se observan n~ente
mt:a11ples dedos de zinc oonseeutiV06 t.sle es un elemento es.tructiM'al 6otmado por unos 30 aminocidos. de loe cuales 2 astefnas y 2 histidinas tt!);)recen (lfl POsiCiOnes conSAantes. coordinando tetraQdncamente un Ion Zn ' 2. Esu. l.nn obliga a un pleg.amiMio de la carsena J)t()Cidi~. de t.orma que el motivo se caraCieriza por una OOfllormaon tridimen&tOnal alargada. en forma de 'dc"cr, Qllt 1e da f'l()r'r'lbfe. La vaname ms frecuente muestra dos hojas ~ antiP<J(alelas. C<ldt'l una oon un re$idVO Cys, seguidas ae un 9ifO y oe una estrucl\lra a-heliOOidal. <;en las do,; HtS Este motivo $C <klnQtnir\8 C 2H2 ($brevi:Uuras de uM letra pera los aminoCidos qua unen el Zn.. 2) y $U $$CU9nCJ<J oonsen50
...
~irn
1(' !CC (),
donde lOs sublncliees reprosentM e1 n(lmetQ de residUO$ (amlno&cldos variable\ X} que separa kliS aminocidos consenso <cons~nte$). e~3:$ U>eueneias ~ieten es;pontl'll!l8f'l'lente graoas al Zn la confonnaclon apropl8da para cue el segmento Miicoid<'l int~ocione OOt\ tre$ b3:ses expuestas en el surco mayor del ONA. tos res.tos vanabtes permiten que se teo::onozean distintas secuenCI'as del DNA.
b 1ruo:tura d(.,"+:~ ok "n okdo ~(' l:IIW" C)'S;Ht$:. '') ]' II()JM fl, 1 htlt~ -e o. ) l l( ln 7,n:
lnlt... \!1(01
t'nd (,.~I.,..Oc:t~Wk~"' 1H I I A.~l mCIIV.f>~' 6: 1W l'OAI'.:tlli:J\'m (J.: muennon ll "lgll\'ft t"l -.:o 1111)'(11 dd ONA
....
~tnfl
~.,
--
..._,....,
Clhf:lkl:
lll' .WS heb!b<kl O NI\..: lflll~1rnn OOITI<Htrlll ' 11rol~ Los motios m dt o;in.: de !01 (lffll~Ctna1 1 111A.a:~ f(lj,ll~i OIW't.IC6. c. nllltllt.J'I lw; h~ !}.ca~ el ft'I!J6: b o,;lidcna ''" ~ur.t 'o~;>;..,.._
L~.!!>IIJn.:,/#'
;:n.:nJr
En ocros ca909 se ObServa una variante de oedo de zinc llamada c., donde el ion m&~lico se OO()(dina con cuatto
Cys en la secue.I"'Cia consenso
CysX,.C'f'X1,-C'f'X,.C'f'
que no forma hojas ~. sino dos segmentos en hlioe E.s\01 ostJoctora hofmonas 41$\eroides
~reoe. pot
ejemplo, en lo$ receptores de
64
VARIACIONES EN LA ESTRUCTURA DEL OHA
6.3.1.5
Motivo cremallera de leuclna
t.., confQrm;Jcin u.-beiiooiCSal &e ooooentran en un lado k>9 aml1'108cido, hldrOIObioos, d& tal tnlln(!rn que leu 110 repne en
la msma cata cada <IQ$ vvettas dt h6'1eo (2 vueltas de 3 4 resdUO$ 7 amlnoac:idos) Dos cade-nas peptld1C8s de este tipo pueden asoclatSe hidro(aicamenfe, lnl~do SU$ ros!Os CIO le1.1 oomo $1 se tratara de los dlen~ de Ul\8 cremallera (en Ingls, leucine z~l). En el o1ro extl'emo dol mottvo 10'1$ dos <Ah6iicos encajan en el Sl.ltco mayor del ONA y presen1.an en fa cata ~:xU!rior ab~,~l'ld(Wes ;:ami~CJdll)$ Wsico5 Ql.lo inunaccionan favoral*menle con tos k>sfalos. De algOOa manera, este modelO ~ asetne~ a un..1 "Y' en lt'l q~,~., ot talb <:Orresponderia a la cremallera ele feuclna y los brazos a 106 tramos de In hliCes que 001\laetan con el ONA. E.stru.:hJms. de e$te opo AP<'f"C~Cen, POr ojc~o. en las proteinas regjdorasde la transcnpci6n llamadas OZIP.
So trata ele una regn de la ptolelna CIJYS secvene~a llene un te-9;10uo d& ~eir'lil ~ 7 aminobcidotl N ~
1'-~),1-,
las lb ll'hilii.:C'II
~ldu::;~ IIIICJ">otllh"'
brlicW<k. ~ :q
d 000 CIICajllll al el mrco _.)'Uf ddO~A.
filfi!III'IW
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...
'"a.:talldo l la
~hrli~
Tema 7
Estructuras de orden superior de DNAy RNA

7.1 SupcHtH'Ironamlento del ONA ................,.,_, ........~........................................... _,,,.......................................... 7.1 1 Superenrollamiento del ONA en procariol.a$ (y mi'looon<lrit\$ y cloroplasiOS de eucat!Oias) ........... . . 7. 1.1.1 Conforrnaan relajada ............ , .... ,,,,,, -- ........................ ........ ....... - 71.1..2 Conformaooneswperenrollaclit$,.,.,_,_, . . . .... . . . 7 .1.1.3 Demostracin e)Cpelimental del superQfVOII3~to - .,,,_ ,_ ,_ ,_ ,,, .... _ ,_ ,_ ,,,......... 7.1 .2 Aspecto& tencos del supercnrQII(Inwer'IIIO .,. .,_, _ ,_ ,_ ,,,,_ , . ...... . . ...... . .... ........ . ...... . . ........ .. . .... . . Estruetura de los RNAs .........................................- ......... -....... -................................................." " '"""'''"' " 7 2 1 CompoS!CiM ae Mses y estrucl1.1'as primaria y secundaria del RNA . , , , , . , 7 2 2 E.slnlctura triOitnenslonal ae los RNAs en 9M8fal -- ---. ............ 7.2.3 Tipos de RNA: propiectaOes y e&eruct\.W"as partJcu~r8$ ........ ............ 1.2.3.1 RNA mensajero (mRNA) .... ............ ....... .. . .... . . . .. . . ...... . . ....... . .... . 1.2.3.2 RNA de tran$1ereo<;il' (tRNA) .......................... .................................................................... a) E.specifici(S;I(I de IO$lRNA$ por lOS 3Mii'IOeidOS ...... .... .. ...... . ........ ............ .......... b) PrHCnei<t de l'luleOsiOos il'llrecuel'ltes ........................... -............................................. e} A4>01re~miei'IIO oe bases il'lttae&-lenarlo .... . ............... .. ~... ........ ............ ........ . . ..... d) E.$1t\1Ciur3 se<;ut'ldaria en ttOol................................................................................. e) Estti.Jctura ~etCiarla en ' L ....... ........ . ........ . ........ . . .... . . .... ... .. . ... .... .. 7.2.3.3 RNA rlbosmico (rRNAJ........ . ......... .,.,_,_,_, .,_, 7..2.4 Rlbozlmas: funan catali1ica de algui""IO$ RNAs 7.2.4.1 Accl6n ~t;tHtica on lt'l ~cio de RNA ................ . . . . . . . ..... ---"".... 7.2.4.2 Aca6n au1oca!illi6~ &n 101 elimi~iOn <le inlrol'les. ... - -- .. ,.,....... 7.2.4.3 Acc:l6n UIUIIi liect y vloe.talitiw en virOide$ ribOZitn$$ <f.e I>O$ibiC tiPiiC::t'lcin ten~peut.ea . 7 2 4 4 Acci6n c<~taliliea lffll'lspepticlasa el'l \a sin1eSis de procelnas................. ........... ................. 66 66 66 67 67
68
7.2
69 69 70 70 11 1t 11
12
73 7 4 75 76 76
17
11
78 78
7 .3 Los ribosom.'ls.................................................................................................................................................. 79
7 .3.1 7 3.2
7 33
Loe:tlizaea6tl telular ................... ..................... .................................................................................... 79 Caraaerlsllc:as dlfe.-eneiales de los ribosomas procaritiCOs y eucaritiC06 .. . . . ........ . .......... . . . 80 7.3.2.1 Origen ..................................................... .,.,_, .. .,.,_.,,_,_,_,_,_,_, _,_.,_,_ ,_,_,_.,_,_,_,_, .................... 80 1.3.2.2 Cornpo6icln ... ,,, .. ,,,, , , , , .. , , , , , , , , ... . . . . . 80 7.3 2 3 EstrvctiJ,., ................. ....................... ....... . ................. .............. .,......... ..... . ............... 81 ~r.aciOn de los ribQ5omas. St.ibutlidades ytol'r(>Otlentes ......... -- --- ---- .............. --- 81
I.Os llcil.'o$ nudeiOOS no ~ etlouet~lran en tas ~las el'l las Jonnas e:xtel'ldidas OOtrespor\C!ietl.es a su estruerura prnar'ia y seeul'ldarta, sino r'nOieculatr'nenle ms oompactadro$, k> que hemos oenominado (p. 32) nivel esttucrural '"de orden superior". En el caso del ONA. parte O. esta oompact<~cin o COtldons-<!c.-n viene representada por el enomnado sup~~renrolkmwmto, o nteorcinwmo de la caden<J sobro si n-.sma micnb'n qvc !)<Ira el RNA M plalsma en eslructuras tridimen&IOI'lales variadil<&. En ambos casos. la oondenS<tein se completa por Ja asociacin 8$\JGcl'l<l con proteinas (J.Io8 tnducen el plegamiento de la doble hlioe del ONA o de IV tadentt lineal de <~lgunos RNA$ (p,ej . el RNA ribosn.co, pg 79). La ton~in de esta aSOCiacin con prot.ct-inas POSOO un<t re\c'YMcia .spcK;ial on ol CMO del ONA nuc:tear eucanbtico (lcm;a 8).
66
ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERIOR DE DNA Y RNA
7.1
SUPERENROLLAMIENTO DEL ONA
El supere.nr~lento. como parte de la eondensac:iOr'l ae1 DNA et~ goner'CII, PQ$08 esoecial significado para enlender ta organlzaclOn del cr01T10601Tla. En concreto. conttb.lye a e~icar como un DNA do !.<In grt'n magnitvd puede ~en el imerior de la olula (~)o del ndeo (eucariotas), de dtr'leMio~ muy inferiore$ longitvd IOiiC8 del ONA en doble ll6ice. PQr ejemplo:
a,.,
ONA
E. co1i
Gada cromosoma humano Genome humano dplolde
tamano ! longiWd en k:ln'na de S.ONA dWnonsione& en la& Que &e oompacc.a 10 ~ pb 1,6nvn=1.600~ 2.rn (Clula) 50 - 250 1O" pb 17 85nvn 4-6 ~{nCleo) 6 ,6 10 2.2rn
4.7
Se entiende pot superenroll smlento {enrollar algo que ya e&t enrolacb} del ONA el retorcmlenlo o giro sobre al misma de la doble hlice (Que ya lleva impltcito el. enrol lamiento mullJo de dos~$), de fQrma Qvc el do 'a doble hlice no &q.~e una 1~ rocta. sino otr.- h6!lce (...,.., sue>Ortl66cen. Su ceuw. oomo s.t ~ 3 <:ontinut'Cin. t$ 1~ intr~ <1t una tensin eltruaur31 en '" ~ moi6<:\A:I Ap..,rooe do algl)o modo en 10<)0$ 10$ DNAs eelu181ret {y3 enrolt'ldO$) y $t et~eventra es.1reenamente regulado in vfvo POr la ~(iOn de tM 10p0i$0t/lo&fflS8$ (Pag. 151 ). En MSur'nM, tas dos Metas del ONA surren un enrollatnienlo, rnientrtts que ,., doblo hlico sufre un superenrolamiento.
Un ejemplo inl\litivo del concepto de superefVOIIamiento es el oordn del telfooo, Que de poc si presenta un enrollamiento heliOI:lltSal y. oon el uso <:Olidiano, termina por adoptar un enrollamienlo adicional (oordn retorcido). Esta simil &e utiliz para elllllicar mUChas propiedades del ONA vioo {circular y peQuel\o). Un modelo m& prximo a le e&tructl.M'<t del ONA es una cuerda fo~da por do$ cabo$ OOQIIados entre si. Aunque la cuen:la Dende a mafltener e&e t\nOI'-mionto. puode w ~ manualmente a un m3"y'Or o mcncw nUmero de vueltas en~ svs C<lbo$ (IQf'sin), c:on lo que se genera ul'la 1ensi61'1 que se liDera ~e ta tormaciM de supe~et~rollamien!OS.
7.1 .1
Superenrollamlento del ONA en proc.arlotas (y mltocondrlas y ctoroplastos de cucariotas)
Aunque a!ecta tanto a procarlotas como a eucarlotas. el superenrollamlento es M5 conocido y de oomprensln mas sencilla en tos pnmeros, por Jo que asl &e abordar a contnuaCIOn. Estas consideraciones son Igualmente vllcias para el ONA de pl&mid06 procaritioo& y el de cromosomas milooondriales y doropl&ticos de eucariotas. En todos esto$ c:OIIO&, a;. mol6c:u1., do DNA mutsln'l una eStructura ~irtular o oerrada (una doble Mliee 00t1 sus extreiTIO$ un~ entre si). et~ la que es fbeit aptec:iar tos tel'lbmenos de superenrorramlento.
7.1.1.1
Conformacin relajada
1.<' confONn~n ~esa por el DNA M su rotma B (aprox. 10,5 pblvuelta eotre!I)Ot'ldC a l.WI e$1aCSO estable, de mi!Wna enorgia, QVC 10 oonsicsera no supereonrollado o rehl}tuJo, cuando el eje de la doble hlloe 1e puede dlsooner ~monte 500r'o ~ prano.
ES'I AOO RlI.AJAOO o NO SUPERFf\kOI LADO

(eonfom1:1dn de cnfnima cBCrgia., mh.im:~ estabili dad)
1 '1>1' "'Jo;mp\0, 011 una r.:p'ln dt 6) pb h~~y t. ~-.,.:!u.. dt Wl..:o: ron 10.5 pb v~tciUr: .:loCI:\I.:IWll D.f>NA. pur- luCUIIO rn.,ad3
SUPERENROLLAMIENTO DEL DNA
67
7.1.1.2
Conformae1ones superenrolladas
En tas cluiM el ONA generalmenle no se onQ1911tr<a en k! QOI\torm:)OIOn relajada sino en un ~lado no relajado. su~tenrollado y mas COfT9<1CIO. Este es produado por lopQISOmcrttm (1\le ~nte el c.one ttansltono de una o ~lb$!1 hebras, introducen un aumeneo o una dtsminuCI6n en el n:Umei'O de vutfl<lS de hlice {P89 151 ). En a:mtx:>S-ca!los. :se produce IJna tensin estructura'. debid;, a un plcg<'lmien10 IOC(Il ~ la!l IW!tlfas y a una pos,ei6n re!awa de loe nucle6tJdos ~eref'!les de &u goom11.1tria ener~~menle mlt$ ct;~~. la del S..DNA Esta tenSin se contrarres.ta en la moleculcl mediante la ~i6n de un supcrcnrQII3miento ta C<ldena O(llera del ONA g.ta SOOte si misma de forma que lss base& puedan cfl&ponorliC cw. nu~No del modo mas proxlmo a 1.a COf'l'otmaot! S..ONA En pnnt~~,~t I!Jg~t ~;i ~ "'duce el numero de vuel1.8s de hlice. la tensin se libera formando un<t $UPCf~icc it ltl que s.e le ~$~ un vlk:lt negativo de superemollamionto
1S TAOO NO ~~LNM>O o TENSQ (&: <n<rgia superior) origmudu por dc:&enrolllnuk l\w de 13 dobk l~hct (pnJllb de ' 'uclw)
COnformaCJ6n :: mtnhn3 L"fltq;.m. obcmtdn medi.Aolc un
SUPFRENROLV\MIENTO NEC:J\1'1VO
1 , ,, '" \ 1 lo 1cnfhil oJ, 1111 1 1cromu... >ma & 1 10 f!~ ~ luni)('IW ~IIIUM 1~ \ ..MI<lt hth.-t. con 11. 1 pt..\'OC'lta
1 lftl'lljop "
1Pll' j 1' "'

t
.. ,,,-.
~hdt<:
W'I'IIIIO..Vi.:ro.'a ~ 1.1 tnok\:uhllk-O"'tA ~i~~:ubt

l"v ' " ' fooiM-n;lll\o ll.u-.tftl!l
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llf l::tfi
l l\:to>tl\lo<oilol ...,"'o'I'I!O OII..!ot.Ho~
':if ~ co:n!itdem 'f'l< In !l('rd!ob de una vuclllf( htiiiX kl U.:urtlllocnlu ''S'"'* <k 1--1 flto, /:<.111 llo'fl<lr~' '~ dt hbh> (l(tfl ll,fl pb vud1a: 11),5 ph wciM. t111~'"' - nua
St,
!l \ ut11:u m loS rb l WII.I

.,,..,,,)f,$t~jl 'o!\ no1 '~"u
por el oonlrario.
super~ de
&e aomen1111 el nUmero ~ V\l!lt3$ de hke, senbdo opuesl(). oon un ~;&.~p(ltOnrQII;mionco ~iti vo.
ESTADO NO RELAJADO .o TENSO (de cnlorgil'

SU'ICf'iot') \)rigmado pot liUpueorollumknto eh: 1:.~ dtlt)1e l)lt(;e tatu~tlltl de vuchas)
1'
Conform:actQn di: mlrunJ: tnt.'ftti~

~blcnida medJante un
SUPERENROLlAMlENTO POSI'rl\' 0
'
"''
111..
..........
U ~l!fl'A .lo: ~ lO rb lll-lfl.:n..: .OOm l l '~ 11;; lotll., ._..
10.rh-\\dla
!4o.Jroill o.lc UD
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n t,j >l'>!lllfloOIIIII.I llf"':l llflf.ollu11i1 u.'lk' ~1) l l'(_. . . (\'111 '11,_; '~t~:hJ
t-o)IIflrtlwt.o(nf . ,. I HI\li
'i ""C '"'''-1Ckr.l rcu.: t:l lllllr""'' '"" -.o~wlu\k !WI...., h.t .x11rnd;, r.n la rtp6n de nl pt.. nu. ~ 1 'udt...< de bHkc,.,,. ~JI pll \\fdlll ~ 111.~ pt\ ~~~l;ltb . (1111 hmlo) lcii,S
'*'
7.1.1.3
Demostracin experimental del superenrollamiento De e$I8S dos po!l!bl!ldades, ~ ONA se encoonre normalmente en las clula& oo un e&UKto de upe~enrollamlento negativo. la primera evodeflcia experimenta~~ que a.r--6 e Pf'OPOI"IOf ta twptMI5 del
superenrollamiento de la& otadenM se obuvo gracias a la aplicaciOo de lit !tnica do IJ!jraOIN'ftflfugacin i.scpicnica (basada en el equlli'btbde &4:1dimt'n1 3Cin en un gr;'Jdlcntc <'&defcSidOO do ;lon.oro dC ~io. pbg, 1'37) Se obsetv que ol DNA dtt potiontJJ, un p~~,~quco vinn <ue ( <.'IU'$il cn(ltf ~ rn!One$, se l:if.'P<Jft\bi:'t en 1 111$ bandits en o:1 grad"~t(J. 1.3!1 tr~ fmociof'lt!t, sio emb31l)O, tetlian ta misma masa tl\Oieo!Aar. por 10 que la dtlereoea debia estllr en su forma o es-t1uC1ura. Se pudo co~obar que las molctllas menos densas etan lineales, mientras que las dems eran el~. S6b ttas la h1pleStS del supereorolamiento se pudo explic-ar la difwenaa enlre eses dos fraooones mas densas
68
ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERIOR DE DNA Y RNA
b&n.U. 111. l-IS

tmeno;w \'ekK:i\l.o\1 oJe dnM:I'*Innr.
ONA de &lbk bcbn linul

\'-''"-'t'llfil. melll)l; C(IIJllpiOC!Ia
1\'C:IoK:i~ de -""'unern~ rnc .:nnedia)'

DNA. do: dobk b.:bnl (lrrcular, rcobjad!l
banda l. 20S
{ trll)'ilt w~idad o): kdlllllent~o:i6n): DNA de doble he,. C'lro.ot. jUI)C(~:nrotla:ko tiiltuth.lf:i mM CO!tlpltlll
bond;r 11. lt.S
7.1.2
Aspectos tericos del superenrol lamiento
El ~de la Topologia (rama de las Matemticas que e:srudia las propiedades de posicin r&latlva de tas partes de \.1'\ objeto, propiedades que no cambian al ser somecldo a delormadn} ha permitido aClarar la eS4ructura def ONA 5\4)Etrenrollado. El signo y rnagnil\ld del &upetenrolfamiento se asignan oon base en dicho estudio topolgico. del e~ llo &e comenl.<ln i'Qvl iQ$ i1$PQC,:IO$ ~ element<~le&
I'Q>iiblt.i du(lflf1ici.,.,..,. trona... & do.lcc htllnll t(l<lt t"jcmpio, do$ (llbQs de cum,l) ron drfe~ pdo.l dt eto~llaoi)ICilll) cnlto.: ~ (o.blho:ntc 1.ui.IT"no ik 1'JJI.teli\ L - nimwrv do.t ('111~ n de '<1.'<X'l'tuo: la ho:brlu t< cner-. (1=1 mookloo do:lll llcl'~lla, oon L lO, .:~pondffi;l al (),~\ tt!aj~M~i) ,Je '!lO tlb((llu;ldt~ _,,erklnno;!llel
e ) e )
Se define el ;ndice o nUmero de enlace topolgico (L o Uc., de linkinp numbef) como el nUmero de veces que las dos hebras se QUz;an entre &S: mils especiflcamente, ol nUmero de \'OOOS que....,.,. hebra cruza el plano domido pot la olra (como anillO o corva cerradet). Se 1t t~sigrla valor I)C)$i!ivo Q.IMOO las h6br~$ $0 c:n.a.an n.-.~ 1~ dort<:NI
se Jlabta de enlace topoiOgoo potque cuando t.$(1 las dos hebfas estn l lslc&mente ligadas (es deot', no se pueden separar). a pesar de que no hay enlaces 00\'alentes enb'e ellca&, Slo se POdrfan separar (L =O) rompiendo alg(ln enlace CO'Ialente {es decir, cortando una hebra). lo mismo es aplicable para cua~cJ~ier cambio del valor L. Por &a misma razn. la dofofmac::in. llle9amiemo. eec., dt ta1 hebras. sin cortarlas. no al&er<~n el nmero de onlaoe ni el nmero de superenrollamiento
de hliCe, sil!l\"'pre (X)Sitivo puesto que la doble hlice del ONA es deXb'glra. Como ya se ha estudiado. las situaciones de superentOIIamlefl(o surgen de cambios en el nmero de vueltas de hi<:e, es declr, en el nmero de enlace L Para discernir y c:uandflear 106 estados superenrolados se refiere su valor de L al del estado relajado, defriendo un I'IUeYO valor numrioo de superenroNamiMto como la difetencia (U ) entre el nmero de enlace de una confonnacin concreta del ONA y el nUmero de enlace de w foona relajada, Este valor <le supereooamien1o p.ede. lgicamente, &ef posi:ivo o negativo
P'.W.1ue I)NA 400k~1a!I Br do: ZIO pbde IOfllitud,la t:SUUO:natll 1 tiene 2lll pb / l(),j pl)\ u(lu " 2() \'Ud~. Por lllne(l, b 001tfo>t'1~n ro:l;tp4a de C\1: O,NA ~ 1 ~ Oc I,.,.ZO P'..lr C'1K'ni'Ja y P')r debaj~de L ..20ll( hab!n dt un liilll)('f<rlroiW:Jii(MO oostti\'O o ~i\'(l, respet'IJ\'afll('n~
Parn ot etl!IO del DNA. a. oonfOttr'lac:itl relaj&<la posee, por lanto, un nUrnetO de etllaoe ~al al nUMf:f'O de vuellas
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-l
ESTRUCTURA DE LOS RNAS
69
7.2
ESTRUCTURA DE LOS RNAs
Como y<~ $C M iO(Iict'ICio (p&g. 33}. JOS RNAs soo polirtiDOnucleOtldor. {POIInuctetiOOs con rlboe.a, y U en tugat ae T) fom'laOot; por ~ linet\les de hebra serteila, ae varias decenas o milates de unidades, pero de longltud muy lnlenot a las de ONA No lKt pre:senl(ln como <:ttdenM <klOies de nebras complemtlf\larias.
7.2.1
Composicin de bases y estructuras primaria y secundarla del RNA
L& estrueh.lta ptlmar&a de ios RNA& ha sido e&tudlilda ant9n0m'lento (temt~ 4J En <:ut~nto ., ltt M(:un(fl!nl! es <:ar&eleti$1iea la ausencia de ~ esiTUctlJra repetitiva y blen definida, a 6fenmcia del ONA; r$()1mante $010 OIIJS\e es1 ructura secundarla en parte de ta molcula de lRNAs y rRNAs. Al no extSlY un apareamento sisto~tico ~ dos netwn, la oomPOsic:o6t\ 6e bases en lOS RNAs es mucno ms que el el ONA y no se cufll)len las reglas de Ct\argatf (pg. 38). Por otro ~. en .-~ RNA$ h<Jy <:ictt.;~ atlundsnCia oe nuc:Je(ido9 dlstJnlo& de lo& cuatro prinooales (A, G, C y U}. aunauc en ~ bajl) <:on respe.clo ~fa
vt'lri~
ae estos.
Com~it:i n d~ b:ast~ de O n.::a i~ mo
, uric'IS RI"A" (~j_
R:J:. <hlg:.do)
1'1po dt RN A t1ude:u
u
24.6 20.9
20.~
nlitoooodriaJ nbosm"-"1> de lrlln~i4:-n.-nc-i:

mcn:.aicro
20.2 17.8
25.7
J 1.8
~0.$
29.5
28.4
zo.o
~\,,dum
nOOsmx:o
~ tran~r..-r~'flc-ia
mcns:.icro
E colr
rtxll>I~OUM de u:.nsr..-r~'1lt:ia
mcnS~JK'ro
20.1',1 23.8 !4.Q 18.5 17.5 .. 25 19.) 24.1
)o.9
2~ .J
31.6 28.5
17.4
19.4
10.4
20.5
26.? 20,0
27. 1 21 16.0 2:!.5
27.7 29.2
~5 .1
JI
18 4 20) .. 22
:!~
)1.0
27.7
2~.7
ObsCncse cmo. a diferencia de lo qu~ Ql.:\111'1: con~~ ONA. la composicin de bases \'aria dt:11tro de u11a 1nisma espec-ie (scgiln el RNA cots.idc-mdo
n(lul$!C una cqui~slcncia
entro: bases tA-U, G-.C. purinas.-pitimidinas)
Algunos RNAs aooptan estruefi.Wa secunana en pequeflas r~s de su molcula, graoas al p~e9<Jfniento de s.u nica hebra sobre si misma. s;empre que sta permita el apareamiento intraGatfH!ano de dos zonas a.tyas secuencias sean complemen\arias, a pesar de e"ar separadas en la estructura primar.;~: se 6orma asi W'!a doble hlice klc.al. de carcter antlparaleb. De manera similar se forman tambin dobles hlices entre una moloola de RNA y una hebra senclla de ONA (hbridos RNAClNA) En estos casos. si el grupo 2'-0H de la ribo&a adopta la 00t1lormaon C2"6ffll'o presenta mpe<Miento& esteriC06 con otros !OmOS de la <:adMa de RNA. Jo ave mpide que se forme la doble hlice (que seria de tipo 9). En concreto. el 2'-0H 9$taJi<t mil)' <:orca de los fltom()$ del grupO k)$f3IO eoMiguo y del C8 ~ 1!1 ba$C ady(l(.onte En cambio, en 13 confOrmaClI'I C3'~ et 91'\4X> 7 .OH se proye<:la nacla ruara, te{os ae ottos tomos Clel eSQueletO y no ll()al'eoe impedlmet~to e$trlco alguno. potiO que es POSible la fotmacln de la dotlie nelloe. en este caso oe tiPO A. En te$umen la Unlc.a doble nlce en la que puede panacipar un RNA es fa de tipo A (el ONA. al careoet del OH en 2', puede adoptar lanto la A como la 8 , oomo ya se ha estodlldo en el lema 6).
1111
'o
CQI'Ifonnacin CJ' <'ndo (10rma A. nica pos.ibk

p:ir:lel RNA)
'
<"
e _( ,o......._..
,.
conf(lnn:.on C2'Nidu
(cst:. c.mfomucM'ln es ,~ltds p:1r.1l:a fomu R
endONA. ('11:1'(1 es
mJ!Q~ibk p:r.l ~1
RNAI
70
ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERIOR OE ONA Y RHA
7.2.2
Estructura tridimensional de los RNAs en general
Existe una gran diversidad en la esttuc:rura trtdmenslonal de las t'l'l()j(!oCulas oe RNA. ~tia es oompteja. \mica pera cada tipo de RNA, y resulta de la 00fl"'bit'I&CI6n de eSirueturat se(:l.lt'ldariM l~!es, estabilizadas por erce& de hidrO!)enO y por lntetaoclones l*!roleicas oe apil8mlento oe b*Ses. Sv e:sb.ldiO ooncrolO &e har mas adelante. para cada tipo de RNA.
tallo
A pcs:ar oo && tne.~~iMenci3 CIC una e~rucbKcl secvndarii'l propiamente diel\3 PN'<'I IOda ta moi6Cu13, 1<'1 eactona senCilla oe cualquier RNA ~ IOC:almenle vartadas estructuras: hOrqiAas, Ct\.lclmes.. buCleS, lazos. e4e. Algunas de .-as se <JeC)er'l a1 8C)att.'lmienlo de b.-ses ~tetMrlO formando cortos tramos de doCte hlioe de upo A. c:otnO $e acaD& de Indicar. La proporcin de z.onas nellcoldales varia ampliamente entre di9bni:Os RNAs. pero puede alcaf\Zar hasta un 50% de la estructl.l'8 total.
7.2.3
Tipos de RNA: propiedades y estructuras particulares
Tamo en proc.anola& oomo en eucariotM existen ll'Gs tipos princiP&IOs do RNA m,.n$<18f0 (mRNA), de trans.forei'ICia (lANA) y ri)o:$0mic:o (rRNA) , Adom~s oe eiO$, en evcaotas exl$1 en RNA nue~r l'leler~neo {fwi!RNA}. I'IIICIOtlt ~ ($nRNA) y ti!Qc)lsmie:o I)&QI.ICI\0 {seRNA), y RNAs de Otg&OOIO$ {MiiOOOI'Id&$ y ~8$10$). TodO$ elll>$ tienen en oomun ooa fl.lndn relacionada. dlrecu o Indirectamente, con la eJ:presln grica (madllacln postranecrlpciOnal y tradvcci6n). AGiclonalmente. en a9Jn06 virus el RNA iV09<1 el papel de P011t~dor de 1t1 inform;Jocln genelca, qve en el resto de atgani&mO& corresponde al DNA. La& <frferoncias ~meotale:s tt~cre lO$ CJiStiniOS lipes eJe RNA se te$1Jtnen en la labia.
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oectoee- ok Md!noen~ao:~o::. (u~ll~cu S\'td~ pis. 1211
ESTRUCTURA DE LOS RHAS
71
7.2.3.1
RNA mensajero (mRNA)
La propuesl8 de la eJCi&)ncia de ~ molOI.Il<l QVO transllere: el mensaje gM&tioo des<Se el n.Jcleo al Citoplasma se debe a Frant;:oi& Jacob y Jaocqves Mono<~ (premios NObel et1 1965).. DiCha tnOiocula es el RNA mensajero que. al ser una ooora de ta infom'3(:i(ln contenida en la secuencia del ONA. acca po61eriormente en el ribosoma oomo molde o p~lla pnral3 sinleSis proteica. w cat'tiCiertsucas principales del mA.NA son las siguientes:
Se en~tta en e1 ciiOplas.ma de todas las cUas. en baja propo:i6n t$Specto "' RNA totaol y <:.on vt~o vido medio
COI'ta dt\08 su rpida slntesls y degradacin. Aparece a$0(.iado transitoriam811te al ribosomtt Sus mo~tM:ulas son de tamano muy diverso (en relaan (.(In el tai'J'I<IIIO <:le 13$ prOieinns QVO OO<Iifl(:;)n} Es el tcx> de RNA de estructtKa ms sencilla, con uf\3 cadena lineal, IC)tl"'\$d8 exCJUs!vamenle poc tos rit>OnuciOOSidos A. U, C y G '-"' <.:omPQ$1Cin de b&Se$ S un reflejO de ta del ONA r'l'oO((Ie oet que proceoen. La mola.l.a careoe de u!\<1 oootorm;)cin oeflnida: la eadena se mantleo.ne elltentida. sin adop4ar e&lruefuras secundarias ni terciarias signifi(:ftivM:, graciM a la participaCin oe pro1efnas que se asocian a ella.
7.2.3.2
RNA de transferencia (tRNA)
Fue Frands Crict; QUIE!n sUQR) que lo& aminocidos se unj$n a una mOiO!h inlem'18<18. o "accaptBOO(' aMes de rnteracaonar con el mRNA Efoctiv~mtlfl(l}, los IRNAs actUan como l'l'deulas aaaptadoras en la slntesrs de ptOielnas. Esta funOOn doQende <:le una dOble interaccin: Por un eltren'IO de la mole!Cula une.n el amlno&cldo para dar aminoacil-tRNA (P<ig 302). fa forma acbva ne<:esaria r:wt~ta reacdl'l <'e fonnocln del enlace peptidiCO. Por ~ otro extremo se aparean oon el mR.NA. en presencra del rbxioma, IJansfirienOo el &mino<'erdo (ljl ppbdO <:.rocient.e ~ etlit manera. los amlnocklos se ordenan correctamente en la prolaina, de acuerdo con la secuencia letoa por el tRNA 90b'e el mRNA (pg. 311).
EIIR>lA es d mcdt.lldur cntrt el ll\CINJC rkl mR.NA y la llct'UC:ntia de arnu-oocidos dd polipptido quc se cstil smtet11.1111do:
rm~
.. nrnn~K'l ur ;o !lii!<O;~o.;l\l<t
1111<'. II;Uo>!1 ,-,,.,.,
, tul(\\
A pesar de ser tos RNA.s de menot tama!\o, lOs tRNA& pteiSenlan ooa gran oomp~d escruct!Xat Se han a1stado y e:Sl\Kiiado mUChos. de dlstinlos organismos. mostrando una estructura comn a pes.lr de S41S dlslintas secuenclas. que
tettejan 1a r.eeesidad de BC&J)Iaern a su especitlcldad.
a) Especiftcidad de los tRNAs por los aminocidos Los IRNAs oonstotuyen ooa fraCCiOn imponante del RNA total. y se encuentran dlsuel1os en eJ cl\O&ol. Una olula
puede contener hasta 60 IRNAs dlferentes. es decir, en OOme~o supetior al de amlno&cldos (20), puesto que cada tRNA irlleracclona e&peclflcamenle (.(In un solo aminocido, pero algunos amrnoci<:idos son reconoe<os pot ms de un tRNA (se habla en este caso de tRNAs ~sinnimos~. pg 296).
La especifiCICSad se indica <.:on el nombro del 3minoCido on supe.rindice {001' ej . tRNAAia); los tRNAs sin6nmo& llevan subinditfl numCrieos (por ej . tRNATrp1 y tRNA Trp2), Cu<'tndo vt~t.RNA es~ un~~: oon ot aminocido se dice QW &Stil "activ&<)C)~ o <:.arQ3<10~. se aenomina aminoe~tRNA y se lnCiica con et amino9CiCJo c::o10 prelijo (por ejemplo, AJI'l.4RNAAI$, TrpIRNA l rpl. TrpIRNATrp2, etc.).
_c 7!; 2 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _- E "S e: T e: R ,UC> CcT..,UR. A S DE ORDEN SUPERIOR DE ONA Y RNA
b) Presencia de nuclesidos infrecuentes

Una de tas caracteristtcas de 106 IRNAs es que en su composicin presentan, adems de tos eua!ro princ:ic>i'IIO$,
otros nucle6sidos no comentes o infrecuentes, que pueden suponer hasta un 10% del total. Generatmert!e $t tr313 do derivttdo$ do 101$ <;uetro princip<'!l~. A. G. C. U. it$1 oomo de la hipoXM~,in;t, a meMo con grupos metilO en la base o la de$0llitrirl0!1a. AOerl'l!l. es ~Niderisliea ~ PI'Csoncitt <Jo ribotimidin,,,, LJ l)f\l$0nc;ia de todos estos nuctesidos est relacionada con 18 estructura tetclalfa y tiene por e1o una dara influettela sobre la tuneiOn.
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ESTRUCTURAOELOSRNA~ S ------------------------------------------------~ 7~ 3
e) Apareamiento de bases intracatsnario

A pesar de la abundancia de nuctetidos no usuales. los IRN.As muc&tr3n 1..1'1 Ciet\0 9fac:JO <le oomplemontariedad. es decir, de re~lones con es-tructu101 socundri , on doble ht.l ice bas&<la en ~tl)llre.emienlos (Se b3$C$
ln ttacatenarios. Con freooencia M observan ;Jp;JH );;,amie:ntos (5:s6ntos CIC !()$ OC W<"Jt$On y Crick. nmMos genricamente de HoOfSt/ien: PQf ejemplo. G puOCSO ap,ttre3r$e oon V mediaonte un ~13CO fflCI'IO$ fvet'le Qvt el enlt'tot G..C En otros etl$0$.. eo el cnlt"tce de l'lidtgel'lo participa el 20H oe ta l'lllOSa. Tanon pueaen e.otlstir baSes tl'l!rentaaas pero 1'10 cof1l)leme.ntarias, asl como una o mas bases a lo largo de la e:adena separadas mediante I.WI bucle ).{~~ laeililal el aooptamlento de ottas bases.
1 \:wcunierno \ - l , pero en pastont~~lllip.:aJ";
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74
ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERtOR DE ONA Y RNA
d) Estrvct(Jra secundari8 en trbol

Al coml)3rar l;t estJ\lchJrtt dt distiniO$ tRNAs M obMN.- oot~ notable Mmejarlu. El Ple9amiento rns probable e& 1:1 cstruetvt"a M<:unOW denomin&03 f'n ttfbol {POI' su M310gia con tres h0j3S y un ._110, o ~m OITO$ con cuatro hojM).
dOf'lde t1 aparebtnlento ef\tre Dases es mttxmo. En ella se dls.iingt.lel\: Tres brazos o asas princi pales: una central, 11. y dos perifricas, 1y t11 (cada una con tallo y bucle) Un brt~zo o tl$01 menor (IV), de dimensin variable entre 10$ difefGnte& tRNAs Un brazo abierto o brazo ~tceptor
Est ru('tur M'tund aria g:trM' ral ( ..hoja d(' t~bol"') dt lo!ltR.. 'IA.s
- ! J id<:l lu..,ntt l"'rl blot)
Brazo T. T!V(; 9 asa 1 conlo:rw ell!

~n(ill oon d~ n'bonuel~ido!;
l!lf rt<:Ul'!l!l.'' (ribo.lli~t~idiiQ. )' ~~~~~~11111). IUIII,YC>MWh'aOOJ.
Brug n. P lll' o
an 111:
Uofllbcbl lllllllll<lo> bulo
dihXJ ru.rid il.. IJO)C'qllllt \}OnllfCIIC

l:o ~ tnftC'I.'UI'fi!C' lliilti.!rour'IIC'IIO
(UII,t f'"rtx''P' M 1 ~ UJ6n 11.-1 ~mf ~IJ.41U~,, al n~
niNmoo r .. ,c.... lupr<kl ... ,,.,...,m p(l
l'l'll.!lilt('(I~C~d
Ejemplo:
Detalles. !le ls cstruc~ura
primaria y sceundarin
del tRNA f>< de kvadu!'ll
1.11$ p unliu U.: Occh1 sd lal n
b lll.ll:k$JdOS mrUI:!IkS
O dllll.aoun.hnll (wnbt&l DIIU <1 Ull1)

(}" ll'llC'~UIII()Wia UM'I'IWII m G1
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nbo'JtJMoJmll
001 110 In I<Kin:~~
l:tl vtro!~ IRNiu a~IX'tl ~

r~utlusodot.
UlliC<lda.
ESTRUCTURA DE LOS RNAS
75
e) Estructura tsrciada en LMediante anii!IStS por difraocin de rW)'OS X <le cris~ Cle lRNAs se pueoe obse1V8r una estructura teroana oompecta, en forma <le L E:sla se ongin<t 1)01 '-"" retc)(Cimier'ltO et\ et espacio de ta estruc:t\Ka secundarla en trebol. Impuesto por las dobles hfiCc& IOC<IIC$ y 1)01 l)uenle$ de hiargef'lo que aoetcan los brazos O y T Es10s puentes son de tipos infrecuentes, incluyendo en alQUilO$ ~S()S tr'(lletes de bases (pag. 73). La esttuaura en trbol es. por tanto, slo una representaan b..-nensionat $imptillcttda oe ta verdadera esb'uctura tridmensronat
Pl~~amient<t d..-1 esqu~ll!'lt.l en b cstnctura ltl"\:liUU , Se nan.nenc pns~ Ap:u\"J.mi~"fltO <k base~ ~'<lrlljlkn'lentarias; se dcUIIIan ls 7.JIM~ o,:n doble h.hc t
11 rucu~~ de htdn'~gen.:. ~'flll'~ blls.:".$ de
bruz.:...; di~t intO\'i,
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El oonoetmieniO delallado de esta es1nJC1urs perm~e comprender una pecutiartctad de lOS tRNAs. u:xsos $0n dis.tinto6 (pof' tener discinta seruencll e interaocionar oon un codn de mRNA y un amlno&Cido especil'\cos), pero <ti I.J8mpO son do atg.Un modo simil<trcs (pOr ~~ ooa estruauret leroana oomn. unirse a I'IXlSOmas y ser reconOCIOOS por 10$ f~I.Or$$ qua .,tervienen en &a tr3dvcci6n).
76
ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERtOR DE ONA Y RNA
7.2.3.3
RNA ribosmlco (rRNA)
Es Ef soporte estructural y componente principal de los rfbosomas. Eld:s:ten dislintOS tipOS de rRNA en cada otula pto:arlota y eucarlota. oon masas moleculares dlvet$8$, constituyendO la mayor patte del RNA 10181 {7$%). Al Igual que el tAHA. preseo~an un altO 0001enldo de nuclesldos Infrecuentes ('t'. T y aqullos con bases me~as, furlclafi"'E!!Olllmente).
tos RNAs mosmlcos adop4an ooa oonformacl6n compleja. Estn formados por una SOla hebra con regiones heUcolda1e& oorta& resultantes del apareamiento incraca:tenario de base&. Son molet.a oon mucflos repliegues sotlfe $i mi&m;ll5. muy 1'\eJcible& y~Orm3blc&. QuO so toi1'C)()r1an hidr<xfinilmic<~mente oomo espir<lle& al az-ar, especialmente a baj;a
~ ioic;) o <111<'1 IOI'I'I()el1lb.lr<~ Parece Que w c~rvel\lr'n con$1itV)'o un armatn o l'nl)kte SOOro ol Que so cn$<tmt)WI v<'!ri<'l$ prote{nf$ Pi'!NI <Jar IUI)al 311 tlboSOr'l\a.
Pr.:ditXio)JI de: Mnm ;cnt pnrn los rRNh
SS )' lf!S de
fi:('()/J. bljo una
c r.mt(lrrnocim ooo el mi~1mo nUmero do.'

apo~ ...micmos de baSC$:
\to.Jdos tndui'ICII.'li(luakll \Id rRNA SS. olm:nidQ .,k-1 ooeiJ de 111 nana J:cnqpu,) btU. Ob!ICn~ ~u >im1htud co. e:\ de t.. ('t)/1
En eoearlotas. l.a mayor parte de6 RNA p~nlc en ot nUc:leo son lOS rranSCiifot prlmai1os, molculas oblenldas dir&Ctamenre de la transoipan del ONA y <P.Je s. CIOfW<irn en RNA ~ tras sutrlr el proceso de maduraciOn postran&OIIpcloMI. Et tam~ai\Q dtl mayor IT'anscrito prirnano ptltQ.M'Sor cJel rRNA vatia entre 6 y 14 kb. segn la especie (c:Qn un ~(llet'lte oe sedimentacin de 3S a 475). Poco despus de $911' sint.eti.tado. eM pr rRNA e$C:Iin(lid0 para dar tres rRNAs maduros. de 28S, 18$ y 5.8S: stos, junto al IRNA 5S (l)roduC*> de un gen il'ldepencliente y. por ello. de un pre.-RNA dfeteNe) son los RHM que constituyen 13 m;J')'Of P<'rt.lt de lOS riboSOf'I"'8S euea~leos (p&g. 80).
En procar lotas. un Unioo pre-rRNA da lupa~. l8ml>i6n IXW' prooesamlento postranscr\XIonal, a rRNAs maduros de 16S, 28S y 55, que fonnan el riborsoma procantico (Pag 80). El misrn() precur$01' produce adamas algunos tRNAs.
7.2.4
Ribozimas: funcin cataltica de algunos RNAs
~as molculas de RNA $0n <:<IP<'OH 00 acruar OOfTIO biocataiZE.tCJOres, <le ani que el concepto clsloo de enzfma haya sido ampliado ms all de las ptQC9inls A os60s RNAs con actividad catalltlea, es decW. con capacidad de disminuir la anergia Oe activacin de cJe!ern*ladas reaoclones bkxufmlcas, se les llama ribozimas, para distinguil10s de tas enzimas proteioa:s. U c;apati!Sad catalitiea esll'lla Igualmente en la gran oomplejiclad y dW.I'$itlad de ostrue1urt\ tridimen5ional QvC l)ueden aCIO)tar lOs ANAs, lo que les pemwte edaplarse a& sustrato. <~~&i COme) en su r~lividaCI gr.'lcias a los grupO$ tunciOnaleS e bases y esquelelo. De hecho. se han pociOO realizar est\do$ cinticos ten ~$ tlbOzimas. verlt~eanoo ~ cumplen ta cintica de MichaeisMentoo. tlpictl de enzima$ proteiCas. se piet\S8 que &as tlboZiM3S ~ los primeros Dkleat811z.adores que apai'EIQEifOI'l on a;. o'IOivciOn. sienCIO <Je:splal:ados po$1eri0tmente por 1a4 ~imos )rott~Cas, mas vetSMiles. l06 RNAs serian asi las molcU3:s ~ de la \lida, antes de que t'YOitJCionasen 10s ONA.s oorno portadores do inbmacin gentJea y l&sprotefnas como catallzadotes.
Se c:Qnooen nbozimas que actU3n en divet'SOS !!pos de reacciones de inters en Biologla Molecular e lngenierla
Gencica
ESTRUCTURA DE LO S RNAS
77
7.2.4.1
Accin catalitJca en la maduracin de RNA
El pnmet ejemplo conocido de molcula de RNA con acbvl(j(Jd calaH1ica fue la RNasa P (se ha e&Cudrado en Proeiln04l.t$ pero pa~ existir vn(l t~elivi~ $imii<"Jr en eVC<~ riot<t.s) . Est3 enzim~ .,-1 (1 (Ofm;'l(f.) PO' molcvlt~$ do prot~tintt y de RNA, J)8I'O s. h3 comptObodo qve la actividad C<"~t.<llitioca roside on ol OOO'lll(lnen(O R.NA. Reconoce oc:mo wstn~o ~~ e~reOUtSor rnociO oe rRNA.s y lRNAs en pri)C:.;l'lrioi.M y cat*lilt' utl:l de 1M re~ociones ~ s-,1 m_,<:Jvracin posuanscripciOf\81 (para dar 109 rRNAs y IRNAs h.wtcionaleo9), en ooncre10 .a generecln de lOS e"ltemO!I S' Cle lOS tRNAs
(pag.2&3).
sustrato:
RNA rn.'(:~ miMO de rftt\As
enzrma:
~ RNasaP
prOdu<:IO:
p;tn:N.Imcnlc pwcc,..fu,c (e.;ln:mo S' (ldmni'"'
y~ . lllf'll(ldllt\'1)
plt"-I.RNA:>
y tlt\A!t
~'
..
pn:~UDI!f de
fRNA>
7.2.4.2
Accin autocataltica en la eliminacin de i ntrones

4
<Jet prec u rsor de r'RNA en el protozoo Torr<lhymGna (evcariot.J unic.lvltu) A dlferencii'l det ~o anicrior, este ribolimtl i'lciV<t ~forma 3Vk>Ct'llalibea, es decir. el su1Sirato es
sv prop~ molel).ll:l ~e un me<;Mi$ti'IO $a'l'lil3t ac:tUM oomo rlbOZWI'I3!$ otros pre-RNA$ prOQirlota:s y eoc;ancx.s. aqv6110$ Qvc 1)(1~ i ntrono$ de tipo 1 y 11 1.0$ in!rones (~ 245} $()(1 s.c~ del RNA precursor QIJ$ no se
l.3 $iguien!e 3'et1vid('t(t fCx)zim&!iea- ei'IOOI'lii&O& f~ 13
lraduoen 3 ptOtei n:'l o 110 fOrMM parte del RNA rnadutO pve:s $e elimiMn dur:'ltl-1e I:J m{l(lul(lcQn; el prcRNA compret~C~e. pues, el RNA madvro y 1 os it\uor.es. LOS bpc)S de intron y lOS f)rOOitSOS de madur<lQif'l <.lel RNA preC\11'$01' por OOtte y ~lme se estudian en el ptooosamleniO postr8fi6CtlpCiOtlal <M' RNA (p&g.
zso,.
En este c;a,o no se puede esltiC'Iamente hablar de cal&!lsls. pues uno de les requiSitos es que Cl ealaliudor 1\0 $e ~nsuma en el proceso. Sin embargo, el produclo final de una sene de r8aCCIOftes de autOhidrliSJS del 1nttn de Tetlah}"f1)6mm es una molcula (derivada del propio Wltrn y denominada l19 IVS que es capaz de ccuatlzar r&ac:dones <Se l.:;ln)b$i& y "tcrif-'C~cin do ollg~clotidos extornos il el!it Por Wn40. &1 bien no lo son el preRNA o el intrn or'igwlales, l I91VS si es vn V(lfdadero biocat<lllilodor.
rRNA nudum
.. ut .., , ."
~rnrlrn~
! .t~I\S
~
~
..
CpCpCpC" +
mtrn hhcmdO".
~ kll!C'ft!kl lo:ll\ odJdnl~IIIIQIIO.' <drf~ ,J f1h..,.,...)'"'ltm: ~ fi'I;A
- !.-. .-
------~ -~--~ ~~
CpCpCpC><
'1" '
78
ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERK>R DE DNA Y RNA
7.2.4.3
Accin catalitlca y autocatalltlca en viroides: ribozimas de posible aplicacin teraputica
Los vkoides son molculas droulatee de RNA monohebra oon capacidad pera Infectar plantas. en at(p..W'Ios de ellos &e han encontrac tambin ribozimas capaces de actuar. de f<:lnn3 i'~a al caso antenot, &Obre su propia rnoikul~ o sobf"e socvencit'$ de RNA de molculas diferentes. Estas 11boz:ir'l'las oontienetl dos c:ornponentes esenci~IM.' CIOf un toldo. 1M S&Cuenei:ls de rl!ltonoeimiento Clet RNA sustrato (por apereanje;)IO <'e b$Ses co~emenlarias) y. por otro, w centto catatft!co. que adopta t.na estruccura tridrmensional peculial, denomlnacla cabe%a de martillo (hammerllead). y produce la esci&~n del RNA &ustr.lto, inaCCivndolo.
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IIK\)liO) .jc. (uilo.,.
Modtlo tr"tdlM~:~tOn:al de 111 nb<lt.ltllll UIUdll ''00 d $USitdt(l,

~o'ni~ la; ..:gioou de ;aplltClllllil'llUI de hl$t:l, (011 dcoblt belio:o: $u(al. do: la hrlora
Q411hti>COI Cl()!lSigo mi$ma y oun b hebr.o ~U."!n110 fl3 trayC(:IOrill 6tl CtlQU clclo) So: ha d~ uni<'tlikllo~ QI'nos
de t oon una barra 11'\'C'SIIl
Se 1\an ensayado anlogos sin~icot de atguoo de estos ti:!OZimas (obtooldos por l~la gentica) para la destruccin &elediva de molculas <SeRNA con secuenc&as caractetlsclca&. Este es un planleamlento de terapia gnica. dentro de ta estrategia de ... ~ dirlg!Ga de la expresin genlca". Se trata de preparar riboZimas artific:iafft eon secuencias de rooonocimiento que tes perml!&n trrse "anttsentido' a un mANA. de forma que el centro ctrl3!ilieo lo oscincla, suprimiendo la sltttes!s de la pro~lna <:Orr9&pondiertte (El concepto do cadona mt.i5ftf!tido se inii'Od'ueira flt'l el tem;t de transc:ri()(:i6n, pr.g. 2:43.) Otro tipo de plantearrento de larapia, denl:ro delll estr.-tegi<' de eotrec:ciOf\ dirigida de mutaciones. conSISte en el corte meciante ribozimas de vn lr<~n5<:riiQ prteut'f.Or de: RNA cuya ~ estuViese mu&ada (poc proceder de oo gen mui.CidO}, de fOI'I"n& que ta esciSin ocurra alrooeoot de la mutaciOn y reS\.IIe un transcrito corregido.
7.2.4.4
Accin catalit ica transpeptidasa en la sntesis de prote1nas
El cuano e,emplo to oonsliluyo lO\ riboZima que ejerce la accividad tran&f)e9Cidasa o peptldi ttr.ansf orasa, responsable de lt\ fO<'\CCIeiOn 001 ~~~ee peptldlco en la tlioe.lntesls proteca. entre los 1'9$id00$ amino(:I()Ot & ituadOf M los sitios A y P del fibOSoma (Pg. 313). En este caso. la *accin riboantic;~ G~die<t en el t RNA 235, uno de los (lOtl"'ponerues de la subunidad mayor {50S) del ribosoma procari61ioo. y t)OSif>lemense taiYIOin en el tRNA hOmlogo da eucatiotas (rANA 28S de la wbunld90 60S).
LOS RIBOSOMAS
79
tKNA llS
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UlNA
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A nivel fi$10k)g1oo. la RN.asa P y la peptdltransff!fU& nbosomlca son posiblemente 109 que me1 or r(:flejan P.l paree-do de las ribolimas con las erqima$ Orot~J~~Ca&., a 5aber: actan sobre un sustrato esl)e()Rc:o.. aceleran ta reaceln v~rba r~ de mttgnitud 00 ~1) dt$~ durtlnto C;t c~ttilisis y at PilfiJOOf se comportan de ac:uetdo con la ontiCS
m~Ch<teliaf\3
7.3
LOS RIBOSOMAS
los nbo&om<~s son partietkos ~elulares, u orgnulos. de llflportanoa eruc.al pata ta transmiSin a. 111 ln!M'nati(ln gen&lica, ~~ ooosbtulr ol fugar fi$1C0 donde $0 rvahza la .sfnteSI& de protelnas Se pueOetl c:on&~detar oomo eslnJ~uras qulm.oo-meenocas f!Uo!!S, 1)0( un la<fo. $& de$p~,an $Obcc el mRNA Otdon~nc:to la Interaccin de sus oodones oon 105 oon-esponcl!entes antlcodones del t~NA y, pot olfO., Pf'OP<UOOO(tn 4JI ontorno nCJCC$nrio pai(J que los anwnoodos formen los entace6 pepbdlcos del pollpeptldo en c:recimiel\10.
EsiTUctura!mente. los ribosomas son conluntos plurimoleculares de prot~nu y rRJtAs (35 y 55" crn poso. resoectivClfl1ante}. oon un 1amano de 20 a 23 nm. Es deot, son nucJeoop(Oledos. E.l e$1udi0 d(l otros nutltoprol~os c:cwa<:test~eos.los WU$. Y<l $El aborOO Qene~ente en una ma!ena propia, ia VltoiOgla.
7.3.1
Localizacin celular
En cada eMula existen varios miles de nboSOtnaS (por e;.. mtt!l de 15.000 ~.,un 1: coA). que IIC!]<'n ili>llPOner un cuarto del P8$0 seeo de la etllula Se encuentran en el cltosol 8!11 como en la m.:.tsiz. mtiOOOndnal v en et estroma de cfQtoplas.los Puoden estar en forma libre, como panlculas discretas, Pfl'I'O a menudo se Ob$<trvan en f.orm<~ de lWera. at;rv~ $Obro vn mRNA; en e$1e caso se les llama poUsomas o potlrtibosonlu $u gmc,lo do 3grvp..cin o pollmerlzaciOn depencse de la acllvldad flletabllca oelult11 los nt!O&oma& del cltosol de eucanotas son ms complejOs en eompo$iQf1 y ~ho mayores en tamal'oO que tos ul$0~$ WcttJn~nos. Los tixlt$omas de mi!Ooondnas y ctotopla!ltos eueariObc$ S on som<:~ntos <' tos l:><K;tet~anos (C1tot.lico$), EvohJIIV;)Ifu":n!e Pi'l'il l<ldos. los. bpos se ha consetVado una misma e. stfvetura ~und<llia. pero no la seOJeOOia que la crea.
I'UC ARillTA~
l ~num1lcs.
pbuta).. k ' adura:>. huu~

PltoC"AR(OTA'
-----ll 'IJI.:1t:fl.
80
ESTRUCTURAS DE ORDEN SUPERtOR DE DNA Y RNA
7 .3.2
Caractersticas diferenciales de los ribosomas procarltlcos y eucaritlcos
7 .3.2.1
Origen
Los ptee~~Sores del rRNA muestran una gran 4rver&idad en su secvenci<t, <W9 se rn;tMiosta en la ac:>al'fci6n (durante el proceso de maduracin postranscripaonal) dt di$1intos til$ <te iRNAs, carae~eri%ados e~ente por su d.terenle coefic~enle de &edimentac:in. .s.
7.3.2.2
Composici n
LO!I (ibOSOmas es.u~n lormado:s por dos subvnfd;tdtn dt tam;to diferen1o y forma fte9,113r, cada ur'l8 oonstitu!Oa J)Of uno o mas rRNAs y varia& proteinas de divoru mIJ$;) mo&ocul'r (entre 6 y 75 kDa). Tanto el ribo6oma compteco como sus subunldades y los rANA& oompanon1C$ M don~ segUn su ooef.cienle de sedimentacin. Las proteJnas. por su parte. se de&q~an por nUmeres consecutlm precedidos por l (Aav'gre) o S (sma.ll), s.egOO penene.zcan a la subunldad grande o pequea, respectivamonto,
Otfcn'nClll:l t:n ongen, c<wnput~M:in y estructura de los bosoma.~ ptocari61kos y cucari6ticos
ribosoma procarilico
JWur'Of ok rRJ\A .;k p-l)l:ariulll r-onA.NA t1ltl>o AIIJOSJ
ribosoma eucaritico
"'IIM~dM~,nsm~~
rftNA 1 ~ f'kN4 US
'\':tl 1 ~ 11 1 1 "' 1 1 (mao.1u"'d'*\ltii!IW:tt~ ' ' \h

lithAiliS
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1'\fl\'tin\:S \IC IR~A Oc ~&rtl)llll>
e""~" Jllli~ <"Js,
rRNA 55
rill\" .S..IIS
rRNA 1SS
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M, ., l .SOO.OOO
/ ~iactcill ..... A~
80S
M, .. 4.100.000
~una de li:Js Y'3lores S de aiTIW~
n."i:urdC5C que la
subunidades oo es
ivuaJ al valor S del ribos<wna nnph. '1o
lOS 1\IBOSOMAS
81
7.3.2.3
L:t
Estructura
de 10$ iibo!ll)l'l\3$, igual en KldM las 06fllla$, es muy earaae,istlea se 1'1& <fllJeiCS&(Sc)
em)t(:~
~truccum
dlfraceibn de rayo!l X, dttracan de neutronet. miCroscopia electfnlca en oombnac!on con mtodoslnmmolg009 el<: Debido a su enorme lamal'!o (MOa) y 1;~ oomplajid<ld 00 6U .a~i6n inl(lma. al es1udio da la estructura dinmica y funcin oe los nbosomas COflS"Iltll)'o un lmponanle te1o lrwest~or las dQs s~ades n ~&O;i<Jn po1 ~n'cr'CQQI'(l$ no C:OVt'leniO$, ele utl~ lo1m~ ~ QmO s l<1 su!.>unK:fild pequoa ~~~ el t'lvoco do 13 gr<"1n6e. <f.eWn<IO Vf\il htntlidura o 1 \lnel .wre .amba$ PQI' l;t QOO :)~W Cl mRNA 41 motdldJ qve et rlb0$()(M se desplaza duran~e el proceso de traducc.on y ti!! la que emerge la (:lldena ~ldlc,a
( ~INCCIIrB 1:11 do~ 1>\lbullidJ\ks ~C k)s n~f&<; )'
$1tllb(i6tirr~inWI.
(0'1111)111..
'"" l.'efl'""' s.ai,,~
Ot:{lrflh-, If!; ~!M: .:1 t!IIO<tclll'lll del m k N \ y 4k lu o.:11!.1o:n.1 M)lir .oermh~.. n.)\!i~ 'Gic
,. ,..Uv~tiiN~
,............... . .
"""" --M!i:Yilo.l~l ~lfl\11.

m.tlllll (1 h~'n11'
lplnNJII
l~~~~~~ill;
7.3.3
Separacin de los ribosomas, subuni dades y componentes
tanto tos tbosomas .OOI'Iktales oomo sus subunidades y sus COfll'X'll"'enle$ ( RNAs y direrl!lni.C$ protoinas) so pueden separar med!ame cet~trtlugacln en gmdiemes de sacatOSa o de doruro de ~iO. en Pfe$Cncitt do ooncenlraciotleS defndas: de Mg ' 1 las subunldsdes aiSladas no sao activas. Por ouo 1800, a. se mezclan lOS componentes {rRNI\5 y protenas) a pH y tuena trica correaos. se Mooan espontrMJatnen1e en undade9 funcionales
1
Se\;l rllllll
d.: I\IIS
f.I)\J'I)IlCilh.-.. d~
1~ rlx,somas
. _ . g :-::
..
_...,
procnnlkos
_, .....
,...............r
n.:o:lt.-.,~~.
....
'
1:.k.'" ..,.... PI'E ]
~=
'"'
fi'"''=l "
~l:u~
Tema 8
Condensacin del DNA y cromos omas

8.1 Condensaci n del DNA en eu<:aflotas -.......................................................................... 83
8. 1 1
Proteinas ~mponen!es de la aomatlna... . .. . .......... ......... . . ....... . . . . . .. .... . . ......... . . .. .. . 81. 1. 1 Hi~.... ,_,_,_,. ----.................................... ..................................... .................
8 1 12
~inl's no hi$tc:lf'l3$ ,,,,, . , ...... , ...... . ...
84 84
84
.... . . ..
. . . . . .. . . . . .
8.2
NivelO$ de condenSC~ciOn del ONA nuc:l8ar eucaritioo.. --- ------........................................... 8 1 2 t Oi190$'Cin en nt,~cl00$0ml's y fibras de 10 nm , , . . . . , , . . . ...... . . . ...... . . . ... .. . . . . 8 1.2 2 Formaon do !al fitlt<l de 30 nm,_,_,._,_,_ ,._,_,_,_,_ ---- _ ,_ ,_ ,_ ,.,._,_ ,_ , .....,.,_ ,,,., ... _ ,_ ,_,.,.,,_ ,.,,,,_ , 8 1.2 ~ Crom.,t:.'l.t' o Q'OI'I"W;l$0m<t if"1crf(ISICO . . .. .. . . . .. . . . . . 8.1.2.4 Cromosoma metat&Sioo ........................,.. ,_ ,,, ............. ----- Estud.lo del cromosoma m.etal .steo ...................... -................................................................... -..... ~... ..... .. 8.2. 1 Aspecl06 Cllogenticos........ ............ -............... ............ ........ ................. . . .... . . . . .... . . ... 8.2.1 1 Morfologia de lo$ cromosomas ,_.,,._ ,_ ,,.,,._ ,_.,,_ ,.,,_ ,_ ,_ ,.,.,_,.,_ .,,._ ,_,.,,... _ ,_.,,_ ,,,._ ,_ ,_ ,,. ---- 8.2. 1 .2 Cariotipo y &u anttisis ...... ............... ......... ........... ................ ......... ........ ....... ........ 8.2. 1 ~ Bandeado ,.,_, .,.,_ ,_,_.,.,,._ ,_ ,_ ,_ , --------- .... _ ,.,._ ,_,,,,_ ,_ ,_ ,_ ,.,.,_,_ ,.,,. .. 81 2
Rcgl()nf:$ oon signi~ rvnCIQf1t~l . . . . ... .. . . . . . .. .. . . . ...... . ... .. . .. . . . . & 2.2 . 1 Ccnlrmer-o. _,_, _, .... ., _ , _--- ------- --- --- &222 TeiOmCrO$ ,,,,,, . ......... .... .... ........ ...... ......... .................. ........ D<1t11eJ6n gen6tiea en eucatiota'$ .......................................... ~........................................................ ~..... ~....... 8 .3 1 NW'tlero de eroi'I'IOS()tl'laS (n) c;)r~tOt h3J)IOido y diploidtt .... . . ... . 8.3.2 Con!enldo de ONA. V'illor C ........ ........................ ............. -- ., 8.3 3 LOQJs y alelo -- _ ,_ ,_ ,_ ,_ ,,,..,_ ,_ ,,,. .. _ ,_ ,.,,._ ,,.,._ ,_ ,_ ,,..,_,_ ,,.,..,_ ,_ ,_ ,_ ,, _ , ----- - 8.3 4 GenoliPO, rcnobCX>ydOtflinancia ...... ........................... ............ - .......... ...... . . . .... . . . . . . 82 2
85 85 87 87 68 88 88
88
89
90
92 92
92
8.3
93 93
94 94
9~
8.1
CONDENSACIN DEL DNA EN EUCARIOTAS
Para eotn:lle181 13 descripeQ-1 do l<t osll'\llct\lltl dol ONA oomo mater&al genuco y como requt.siiO f)fCVIC) al cs.tu<::lio del ciClo eeii.Mt (tema 9), es C()(l~nte analizar el complejo problema de la condensaCIn del DNA nucte3t. que ocune a 10 largo ~ &a .-.tetfase <se <iChO cielo este &&PeCio. un~ al prooeso enaT~&tioo de la repllcaclon cse1DNA (Iom<~~ 12) durante M fase S. es oe la mayor ifl')c)r\$nti<' dewe el pyntodlt VtSta basico y de sus apticaoones. Como ya se ha Indicado. la co,tdensaci6n del DNA oornpref'()e dos .-speaos lencamente noepEtnd1entes pero funcaonalmente relaaonados y &ubotdlnaoos entre sJ:
Su~f\."l!rull,uow;nh P"'~n:unc:ne r: dicho de l a molcul a de [1..0'\!A ldobk hC hCI.' ,k;,.trgm). b an logo 21 su1>tn::nmll :arm~'fl10 nt#.ll\0 ~ dcscnto l)ilta ptoC:ItiQt::~ (p:'g.. 66); SI.' ~OflO' poot en cu.:ariolti pot w m3)'0r <,;Qmpkjidlld, d~'bida co panca la g.rntllll\\gnitud dl.'l g-cno ) lllo.ll.
(-!Tln<\QIII.'t.amt.:nt<. rle$:unu :nto o <:ompa(Utcin de l 11 mokcul a de ONA debi do u l:a a)oC.)Cwc-in wn pi'O(c-inu.s. parn dar l ugar 11 niM'koprotdn:~ .._
Se ctudw en <:stt terna.

E~te a~pce1o apc:n:ts
1)0 h :.y
do;mdc
t)l:is1e e n pro,-atious y org;inulos do: cuc:m t.:L" hiS*CRill> y la oondcnsacn'!t) se ltSII ;.4'1 IU en d s~,~pcn:nl\'lllamicnto de la doble h~hcl!'.
84
C OND ENSACIN D EL ONA Y CROMOSOMAS
La condensacin del DNA desde cromatina a cromosoma owrre de forma gr.~dual durante la tase G. del ciclo cerular (le(na 9 ). mienttas que el proceso Inverso. la descondensac:ln del ONA, oomienz:a despus de la divisin oetular ( !ase M) y contina duran!& la fase G 1 hasta alcanzar de nuevo la oondiciOn 6fusa, que pemwte la fel)licacin (lase S). No se conocen con prec1&1n 106 aspectos moleculttre5 00 <lfl1bc Pf'QC~tt$0$ , ~o se (1$1,1'110 una gmn anaiOgla y se oonsidera. pot tanto. que .,.,bo$ tr(ln$().11Tcn PQI' 10~ mismos mee~nismos. en sentido irwerso..
8.1 .1
8.1.1.1
Protel nas componentes de la cromatina

Histonas
Son las poeipale$ PI'Oielna$ CQI"l''pooenteS del ma!eriaf gentioo de eucariota& (~alenlas en masa al ONA). Su 1\lneiOn fvndt~mtl'ltal ~ eslabi!Uar la estructura del ONA. contrbJyenOO a oompactarta. ~ra fatilit<w su
emCW)quetatniento. EstrucbJralmente, las ~onas ron~ituyen ooa familia de prolei!\31$ wnojanros. de I<'IMai'IO retallvamente pequetlo y con elevado oontenido (casi 113 del ""al) do t~minr:)Aeic:Jo$ WsiCOs (PI de 9 a 10). Gracias a euo, 1Y11Jes1ran naturaleza policaiJ6nica a pH li5iol6gioo {nuiTief(l$3$ e3rgas I)O$itivt'S en cada molCJJia) y se asocian 1\lertemente. met\ante lnteraociones eleclt0$t<'~&. oon lOs 9'WO$ kl$fa.o del esQueleto I)OIIaniOnkO del DNA.
% L1sinn % Argimna
o/ (I(.Ll~+Ar)
111
H2A 1128 113
24.829.5 10.9 16.0 9.6 10.8
1.32.6 9,3
6,4
27,430.8 20.2
22.4
22,9
24,5
N" de aminocido.~ 215-244 129 125
l\ laSil molecular
11<
13.3 13.7
I3S 102
21.1-23.0k0a 1 4.0 kDa 13,8 kDa 15.3 kDa 11.2 kDa
E.lci&ten c:inc:o tipos l)tineipales de J'listonas bien caractenzadas, que $9 <frfer.x:ian en su ((l~ieion y. como se veto\ des!lVh, en su papel e-9ttucb.ltal e.n ta organizacin del ntldeo&Om<l y c:rom0$01'1'\a. La Mlona H1 se pteSenta oon
tn3)'0r vMiabiliOae de secuencia y u.mat\o en distinta$ especies o lojiS, ~eras que las otros cuatro estn al\amente OOI'SCMidO'IS. En algunos casos, H 1 es &ufitituida por un<' V<trittnte. denominada HS, con especial afinidad por le cron'lalina, lo que refuerza el errc>aQuetamienlo y 1a inaditAclad ttanscrlpclonal.
El grado de condenS<'IeiOo <f.el ONA se regula en parte mediante 1a acetilacin y fo:sfotilaCI6n de ~;: hislon<'IS (pg. 326). afectarw:to Mi a la $Coe$ibllclad del ONA para la transetipci6n~ de es&e modo le~s li$tonas intei'Vietoen en et control de 13 el({ltt$iOn genlca
8.1.1.2
Protenas no histonas
rnenQ$ abundantes,
En Sil c:romatinn se pueden encontrar ottas protei na&. eo general peor caractetlzacJas:
mAs variables enlte tejidos y especies y
8) Con functn esuu.ctural

F'w'Q4eln<t$ bS.:::l!IS Prc>t:aml nas: Oesempefian la funci6n EtQVivt~lonte a las hislonas en tipos celUlares conete~. PttrticVItmnente el e-spermatozoide. Son ~in<ts pequcr'las ( 50 anww:lcldos, en alg(in caso} oon elevad<~ propOtCi6n ~ Arg, AJa y Sel. y eslruellJra pedoi1Wiantemenle (lhellcoidal. Su menor tamaiio pennlle la eotn~>&et&CI6n del ONA en el espaao minimo di&ponbloe en et espennatOzdde. Protemc.& ilc:IO<tlv HMG; HMk:l ur'l S% de las prolelna& nucleare:s Ql)rrC$()Qt\den al grupo lamado HMG (high mobiNfy group), protei nas oet grupo de alta moWidad ete<;tn)l(wetiea. I)Or su catcler cido, relativamenle pequcflas Algvnl11$ se asocian al nudeosoma {al menos in Vllro).. m~e<Mras que ottas interaccionan oon el ONA espaciador (pbg, 86). E.ste grupo lnduye algunos faelores de 1n1nseripc:i61'1 Protelnas del esqueleto o matriz nuc:ter. ESla estructl.n. que sirve de &OPOrt o gvit' en el empaquetamlen!O de la crom;'Wiin(l (pg. 87), esta formada por diversas proteif!i1$, inci.lyei'IOO algunas HMG y otra& proteinas de
~ler&eidO.
b) Con otras funciorles

Asociadas ata aomatlna, au~ en minima ~idacS, se pueden encontrar numerows ~intts. rnuy difetentes. que inleMenen en la fl:!Oiic:<tc;:i(ln y ltMtcrll)c:iOn (lema& 12 y 19} y en la propi<'J ~i6n del gtado de oonclensacin ~la cromatina: ONA y RNA-polimetaMii, sus Pf()4einc:~s avldlares, factores de replicacin, factores do trAnscripcin, receptotes hOrmonale&, t<lPOisomemos. ~t .
COHOENSACIN DEL ONA EN EUCARIOTAS
85
8.1.2
Niveles de condensacin del ONA nuclear eucaritico
Se puecle resallar el graoo <Je oonaen&8cl0n alC&ru:ado recor<Jai'IOO (lue 18 IOJ'I9ilud del ONA e$ variOs tdeMs de magnitud supenor a las dimenSiones de las estrucllJrM celulares que 10 a\bet9M (pg. 66). Se denonW\8 gtsdo eh condensacin o de empaquetamiento al cociente entre 1a lOngitud del SDNA en doble hebta y el 1amano del mismo una vez oondeo.nsado: este parmelro se ucl!lzara para comparar lOS dlsllniOS nlvetes de oompaet3Ci0n
La condenseciOn del ONA puede estUOiar&e en cuatro t\iY&IeS, aunque esta divisiOI\ es tel81ivt'l, ya que IOdavia l'lo se ;emotende ;en detalle oOmo aoon1ece este fenmeno a n1ve1moleci.Aaf. Es i~nte ncficar que la condensaciOn y de$CQrldcns,ci()o a trtrffls de CSO$ ,.,.ele$ cstb, cslrec:hilmerrte 50(;1Jd<l a la pcogre&l6n por las distinlas fases del aclo ee1u1:u {Pllgs. 100.101)
=
~
e c.
c.
o
~
= " = ,.
2
~
~ ~ /) Bucles de eromacma \ 1
Helcroctomatin41
UU
/
,.
(I~)(OMU
/
I:.U~.:ronuuma
"
\

~,, '11~11
\ \
\
Cromosoma mt~-rl':s.ioo , /
IJr""..S.Jl.'( ''"'l:'l"''"'n
.~
.. =
E
2 " +
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.u' <nbrn .lO nm1-+ c~.~m~ ..r - t

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Fibf:l de JO nm
(soknotdc),"'
di:
"!11
., n!kn"a:"on
< z Q
Fi bra de 10 nm
''
(nudcosomns)
''
''
' '
.., "
v
= o
'"""t~; nn.l*c!
......... "'" ,.._.,.,.,.
~ - I,.. 'X0U\5)_
Cadena de ONA ldoble fllice)
8.1.2.1
Disposicin en nucleosomas y fibras do 10 nm
EJ nuct~ es la unidad bilsica o elemental de la eromaUI\& y 10$ cn)m()$Omas, Conl;CibJye un pa1r0n tegular de il'ltet3eeifl tntt ONA e hi&'Ona.s, responsable de la organlz&eiOI'I e$1n.-:;bJ~I del material gentico en tooos los organiStn(:IS euCilrlotas (en cv<*luier tipo celular y etapa del ciclo). TMIO fll ni'CIOOIOmil como sus componentes y las fb'as en las que se blegra. 1'13n SidO Ob1oni0os y analizados por dlgest!Otl COI'I DNtl~$, t6a'!re3S de entrecruzamlen10 (CtOSsNtl*.ng). hl>tldadn, dift&eer'l de cyyos X, microscop(a electrnica. dlflaecitl de noe\ltrOrJO$, dieroi&mo clf'tulat, u!l~c:entril\rgacie.l anaH bca. eic.. la PfopueS1a de ta t.xiSienei~ del nueleosoma surg1 del estudiO oe 1a aoeiOn de 0Na&a5: &Obte un ONA naU'YO, el tamau\o de lOs frorgn-.ntos producrd06 es siempre mU!titliO de 200 pb, l'fll<:ntra que sr
86
CONOENSACIN DEL ONA Y CROMOSOMAS
ac:KIM sobre Ul'l ONA pre-viamente lberado de historias, los fragment06 son de cualquier tamao. Esto sugiri que la t.n0n de lar. histonas protege regiol"'8$ de ONA de unos 200 pb.
Cada n ueJeosoma e~ klnnado POt 9 molculas de histonas y un cr...-no de ONA, Bajo CllfUI& <:Onclic;ionet experimentale<s ouede libet4ll'$e lit hi&ton<t H1, k>ealizada vtem<'m(lfl't, 10 QUO 1\fCe ~otesibte ~ 18 ON8S3 una parte <MJicionl del ONA. El nucleOSOI'I'Ia 4Ueda 8$1 r&ducldo a la llamada partieuta ncleo {col'&), formada pot un octmero de
h1$t<lnaS fO(Ieado por ONA. El arronamleniO le'f'6glro del ONA sobre las hls10nar. StJpone un wperenrollamiento negativo de la cadena de ONA (en procariola& el superenrotlatniento se consigue por simple relorQmiento del ()NA dn::vi<N'. sin iml)!ieaciOn de protelnas., y no existen nueleosomas).
ON,\ de l.klbk htli.:.: ("<200 pbj
Nuckl\\Wnlil comrtc;o:
200 pb ONA fii'!A.JI:m.H~.H.a)1

111
ONA na1ivo
CCI\lln31m.a)
p. ~
111U
u4
~- MO...r\
ll(lb~el
L11 ort'*"""
'lAmen) .le
hi)tom lo
"'ihb: plllll
..,.._uon.w""lll (lll'd~ pt\llCIIIas
fTI8f\06 in !litro. con e&da
Finalmente, <>lri\$ protein.M no hls!ona& tambin pou1icipan oen la estruetu<a. HMG14 'f HM(;.17 se a.soclan, ill nudeosoma. mtetas we HMG-1 y HMG-2 h !eraoclonan con el ONA e~iaOOJ,
UM misma motecuta de ONA envvetvt tuceSivamente a distirrtos nucleosomas y los oooec~a entte si. La porcin preHf'!to entre do9 nudeosomas suonivos se denOITW\8 espaciador, ligador o ONA incemucleo~ (Ntl{Wi); &u longil\ld P'*'t variar entre 20 y ms de 100 pb, <tependiendo del cwg.anlsmo o incluso del tejido dentro de un mismo org<1nismo. Esaa estrucwra de nucSeo$()tnas espaCia<I08 a lo largo de la molcula <10 ONA se denO<ina fibta b'slca de eromadna o fibra de 10 nm, pues su grosor corresponde al dit\nwwo dCI I'IucleOSOma. El grado de empaquetarniEIO\O aleat\Zado es unas 6 \'ecef supe!tof al de la doble hlioe ~ ONA ex!endlda. la fibra de 10 nm tambin se lam3 eetructura en cuen~ de rosano. por su aspecto tc~r.'lcterlslloo al miCtOScopio electrnico. generalmcole SOlo
006e~do cuMdO se prepera In vifJO a baja fucna i6tliea (Pot ejemplo. 1 mM), mientr<t<& Q~ote d&ntro ~ la clula la cromatina se et~euentra mayor1tariamente en formas ms condensadas. y &u disposicin en t$te est:8do te~atlvamente e:xt.et~dldo se limita. en todo c;a$0, a pequellas zonas.
CONOENSACtON DEL ONA EN EUCARJOTAS
87
8.1.2.2
Formaci n do la fibra de 30 nm
En &as preparaciones de cromatina obtenidas in wrro a may fuerza inca (por ejemplo, Msta 100 mM), la fibra de tO nm se arrolla en sentido levgiro para dar lugar a una iorma ms oondens.ada. denoi'IWiada &cNenolde o flbla de 30 nm. que supone un grado de empaquet<tmiento 40 veces $UDCiriot al de ltt doble hiice original E$1<1 fllt<'l oontiene algo ms de 6 rucleo&omas por ~da vuelta de solenode. Av~ se de&(l()I'I(IC$ &u e&(rvc:tUtil ex01cca n vNo. &e cree que 13 hi$eotl3 H1 queda situacta en el .,_teriOr del solerw:lkle. aoetcanoo los nuc1eoSOt'l\aS entre si ~ heCfiO. expet'lme-l'ltalmente la formacin de la fibra oe 30 nm. a dlfeten(G de la de tO nm, requiere ra preS~Cia de H1. E-sta es probablemente ra forma fl&iOI:glca ms descondensada de la cromatina, adopt.acia por la mayorla del ONA durante la lnteriase.
8.1.2.3
Cromatina o cromosoma interfsi co
Este niVel de condensaciOn supone 1a presencia oe 1azos y supetenronanventos oe 18 estructura anU;lrlor t.os bucles o as.as radiales. formados por tn:lS 50 100 kb de fibra de 30 nm. emer9f!'l\ de un armazM oe pt(l(einas no h!Sk>nas denominado ncleo o andamiaje central, matriz nudear o proen, o esqueleto nuclear. ESolo& buCleS sufren superenronamlento. regulado pot topOisomerasa& asociadas al esquete4o. Parece que, adems de contribuir al empaqueta!TIM!flto del ONA.Ios budes oonstitt.ryen unidades tran&eripcionales, al haben;e observado la presencia dentro de un $0lo buctt de un 9'" oomplcto o b<qn do ~,.~~n grupo do genes rogul<'dos do form~ ~ Es tipi~ Ita ob&ervou;in do i'll$<1$ mdi3Tos on 13 interftl$0 <Je c:tQtn0$0~$ I)OiteniCO$ gigMtet <S& ~N~$ de ins~ y en CTQm0$0fl'\(ll$ I*Jt'n0$0$ meit.cos dt ooei~s <Je anncios.
A P<Ntir do e$(;) ~lniCh.lf(l se t<wman cnroll;tmiontos $U{ltriorcs, <;ve h<leon QUO 1<'1 crom<'J til\3 en la nterfas.e presente en el nUcteo un grado <le condensaCin variable: se calcula que se mtmlpiiCa el gracJO de coMeMaein del ONA por 1.000 O 2.000. Este diversidad local en la denSKiad de oondensaclon se obsetVa en forma de ta presencia slml.llnea de &ucromatlna y heteroeromatlna en una clula en werfa~.
EoCJ'Om3tifl3 (cromabna verdaOerra)

Aspeao al miCroscopio bajo
Se bl'le .mensamen:e oon el oolorante

M3yGrtinwt~ld Gicm$il
Se ur.e debl!mente y con

aspecto cifu&O
F()n'l'\3 met'IO$
tincin (c:feliniein Qrigin<'l)

Otado de condensacin del ONA Conltlbuein at 104811 de &a cromatina
M&xlma condensaciOn de la erornatil\8 (prOxima <runque menos, a la del cromosoma me-tafsiCO) Mli"'Itilaria, SlO algunas porciones del m(ltCODI gentiCO se encuentran en eSia aorma. HetorOomatina con&titutiva: reg.ones del genoma qua se encuentran permanentemente en formta de heterocromt~tina (durante toda ta l'llerl&&e l y en !oda& las clulas Se d8$c.ondensa el t~empo mnimo neoesario para replicar-se durante la ras-e S det <:ic:to cetul<n inCluye et DNA ~st6Nte (lema 10), concentrado e6.pE!Cialmente en regio~ 1e10rnt:rieas y centromrlca de los cromosomas (p&g, 92) Heter ocromatlna facuttaUva: se et'l~ra corno hetCf'OC)"'matina t;lo en alguna& clulas de un mi$mo Otg~ni$mo o on t~lguno& ndivd.los de una especie; puede P3$l'' a euerom;)tin.,, en reSilUEI&Ia a determn&Cias sel\ales Uno de tos ejemplOs es la ii\8Ciiv&ci6n de IIAQ eSe lo$ 2 cromosomas X en la m~, puesto que se puede in;tetivnr \anlo el X ITI<Ileri"'I como el paterno. Uno perm~noco condens<ado oomo heteroc:romatma, mientras el otro est en forma oe euetOm&tina Al final <S& 1<) lt'$<: G2. previa a l;t diVISin pot ITdOSI& o meiosis, toda la aQII"'&IiM de 1<11 OOiu!a adW 1& forma de hetef'OC:toma!ina (ante:s de condon&ilt&e an ms para dar ef cromosoma)
condensada
Mttyont;;nia durante la
interfase
Aeoeslbilidad oo la mo~&eultl de ONA para su inleraeciOn OQt\ pt'O(elnas (DNA polimerasas, RNA pokne(asas. tact01es de transor,.x:ln...: pg. 250)
No es 9oce&ible. debido a su elevada condensacin. Es ~iblo cromatina Se h&b!a de cromatina lranscnpclonalmente ff&n$~l9 mxtiv;J SG rplica allinal de la fase S. Los genes 8Clivfl Se t))ica ttl <1ue <:Ontiene no st expnl&an principio de 13 fMO S Sus genes se CKJ)rC$CH'I
88 8.1.2.4 Cromosoma metafsico
CONDENSACIN DEL ONA Y CROMOSOMAS
Avnove "' fiMI de la protase ead8 (tOI'n()$(!11\8 ya esta OOr'ldel'lsado corno heterOCI'Ot'Mt!na, dur&f'lte 1a I'IW!'Iatase se COndon$0 an mA$, aoq~o el aspecto tipieo Cle lOS cromosOMas metaflisieos, corpseul09 observaflleS al miCtOSCOplo (lptlco que muesiTan. en general. aspecto de baslonclllos oon dos cromtidas ms o men06 separadas entre si.
la$ f1bras de heterocromatlna se arrollan en una primera espWaiz.acin para formar una espiral menOf de paso
muy pequeno. que se arrola a su vez &Obre si rrama (en unas 1().30 'Neltas} ~radar la espirill somiltk 01 Con GQ doble espralizacin se acorta la c:romtida a \A'\il v~im~ P<tr1G, sin <M.ImOI'YI&r $1..1 dimetro E$10 f3 Mo. m6l5 vi$ibl0 31 mlcro&copio Ot:>tico A~s te(,)iones de la crom'lida &e arrollan slo en .spir.-1 menot, como. POr ojemplo. las ~
eenb'meto
8.2 8.2.1
ESTUDIO DEL CROMOSOMA METAFSICO Aspectos citogenticos
8.2.1.1
a la regiOn ml$ estrecha del etOf'I"'Isom&. por la que permanecen tnefas las d06 ero~ herm~n.-s El oentrmoro ~ita 10$ brazos eromosm.leos (cuatro antes de la mitosis, dos tras ella). Los btazos cortos &e de&ignan oon la letra p {de p etif) y k>$ latgos 00t1 q (de QUE'Ue). Cada btllzo se nombta.. poes, por el nUmero del cromosoma al que perteneot. S&Qt.1i00 ele 18 letra p o Q. Por ejemplo, 6p es el Otazo COf10 del cromosoma 6, 8q el brazo larvt> del cromosom~ 8, ele;, l O$ CtQtnOSOmas se elasltlcan atendiendo a la posicin del eenttmero y. POf lan. $09Un el tam3flo relatwo de lOS bralOS:
Morfologla de los cromosomas Se llama centrmero, ~nstriccin primilriil o contr;~t
CroI'IUiiOna,
lllt'l:actrkOJ: br.:(o>s de 1nmni\o
100 blll,.ladoltko~
h n!WII de llliJA.fil) dl f etei'IIC:
eroo\05011'4S
Crom~lfll:lti 11Cfl)('ffl lric9S"
un br.la'l muy
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la IUI~IS dnblc, O.S;\ ,lu,,, -..:, .'(: ! .:romibda...." ~
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en 10$ ttazos 00t1os de los crom060ma& acroc6nlri00$ {exoe~o el Y) existen, adems, otros estrecnarr.emos do la eromtitJa, denominados eonstrtecioon sec;t.~ndaas, :OI"'M en las que la espiral 901T1lica presenta un <iiwnG1ro ms ...clu(;i(:k) Oelimlan ooa seccin temwt.al en ., cromo$011\&, a modo de una pequella esfera, a la que &e llama s;~tCiito cromosmi co.
ESTUDIO DEL CROMOSOMA METAfAStCO
89
(~if teaein clo.:
kxo; C.:IQm~ll' hunmnQJ.. ~CJI.IIl' lrpoll\lo:'i iKi'nm~'(> \ut...no:~ln "n \~ft'o;~"f'>tnu! III!TilU;..,I(.;r.of)lk, \kdiWI(o, ruq\IICilv)
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8.2.1.2
Cariotipo y su anlisis
C1riotipu
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~fUI!Io)(li4'1T!IIOO dt \1(1 111oln iiiiCI Uo\ o MJI <~ltrkl>o;B .,k ~ .lilA
~unlu-ok~'OJ,
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Son valioe tos motodos dessrrolaaos para et sn.tolisis <Sel eafiotipo. Nomalmet~te, esto es-tudio 5e rc<lliz-<t 11obro cromosomas en el estado de prometafase o meta~ase. Las preparaciones de cromosomas tnelatMieos $0 omi)I(!M aaemas para anatizat anoMali;as er010$0I'I'Iie&s. Cle~.ermi~r 13 pro&encial o ausencia de cromo50n'las extra. A este fin, e-J MiOOO ~naJ y mas seneilo de obler'ICi(ln ae CtomoSOI'I"oo)$ p~trto de ICtuoocitos, como OOkias nuele>adas del organismo mas aseqt.Dies.
90 f'repuucin de el ul:~s pam csruditsr el c.-vi<Jiipo
CONDEHSAC.oH DEl. ONA Y CROMOSOMAS
Anlisis del ca.rio1ipo
de"" '-'.-.:00 ... ~ ,_._ ....

~n-..lllio:a.
l. St Ji,;od(' lllllllhaboolx
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~urp.:.;ulo:< ~~ -rl.lllfl(tiXnl~
Aetualml!:l'lte. se parte ya no slo de cuttivos de leuoocito6. con la 00$'1801aja de su vida~ oorta. de 3 a 4 d.i~$. $ino dt t uliNO$ a largo plazo de ot!Uas de dfversos tipos de tejidos (fibroblastos. m60ul3 $0.31, ll~idO amniOiico, biOPsias, etc:.). Las ms usadas 901\ las de ma)'Ot pot.enclal de divisin o mav folc::ifid.OO de cultivo A$imismo. exisAe una variOd*Ct de lratar'l"'lenlos de desnaturalizacan yto degradacin enzimMiCCI de &a cromalina. y <le lineiones con COlorantes espec1 ftcos para el ONA. Por ltimo. " hM 40:$arron~ sistemas de carlobCJiflcaciOn que pueden ser Informatizados de forma que seteocionen aueom~ment.e las clulas a analizar, el tillO de trleln y el anlisis de los cromolS(lf1lCIIS,
8.2.1 .3
Bandeado
Aplicando distintas tcnicas de tinOOn. u~ de l<lt'm3 ru!lnarla en labor31orlos de c!togenelca, se puede 06 cromosomas ~$ l)bllictas y oscuras atlemativtlmet'lte. que defll*'t gtandes reglones crofTI066mlcas observar en 1 llamadas i&--ros E~e bandeo o bandeado de et0n"10901Tlas no es consecuencia de agrupamientos foftuilo&. sino qve et;t;i r~ion.-~ con ta Qtganlz.acl6n eslruCIIJral del genoma, reflejando variaciones mtos como _, CQti'IC)OSiCI(In de basct. ~o <~e condensacin cromosm1ca, conformacin de la cromatil'l;ll, soo.~encias ropotiCi~s y no trt'lnsaltas, etc. lOS pattones de bandas de cada cromosoma &On prc;ticamenie idl'ltieOS en clulas d ltetet'IU!S.. y en casi tOCios lOs tejidos, pero pueden diferir entre individuos; I)Of' ejemplo, al menos 12 cromosomas muestran variaciones en la longil\ld de cienos segmen!OIS en discintas pet$0l'llill$. Se we<~en llegar a apreciar 11asta 500 bandas en un cromosoma; en tuncl6n de 18 resducln microscpica alcanzada, las bandn :::.Meipales se subdi'ofden sucesivamente en subbandas y subsubbartdas. A todas ellas se tes asigna un noml)ro, Q~ incluye el cromosoma, el brazo y t.W\ nCimero OO!'felatlvo desde el oentrmero hacia los extremos
ESTUDIO DEl CROMOSOMA METAfAStCO
91
RESOLUCION CRECIENTE
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~-~tlb;li)ll)
nucnroropil l M'~n ~
-~1-) ~okwrn&
Qda~..r:r&'...tt
PNa el bandea<lo de c:tomosomas se emplean diversos metodos de tlncln oet ONA con colOrantes especflioos;
a) Bandeo G
Es la l&cnitt'l mils. vmi~ se b~'"" th una deStlabJ1'3tit.&CiOn OOtltfOiaCJ8 <1t las proteinas ct0n10$0mieas (generntmente tJOt Oige!Shr'l con tr;psil\8). segLCSa de lltleiO!I con Qiemsa (Cie donde ~e et nombre Cle bandeo G) y obsef"acin al miCrOs.eopio (el rettc:tlvo <le Giemsa es uM mezeta oornpte,a de (:()lortu'ltes;). Cada p{tt de Ct(lr'l'IOSOMM rTKJeSifil ast pa~rones c:aracterisucos de tlnclon. con bandas oscuras {0-posahras o bandas O) y bandas aras (Gnegt'IIN<'$).
~~ Bandeo O
LOS etOm0$0f'l'I3S se Utlen con t.r1 oompuesiO tltiOl'eseente. como mostaza de g uinacrlna {N<IrOCIOt\lro de quinaet'la). 4',6-dia"**ino-2fenll-lndol (OAPI) o Hoechr.t 33258, que se lntetcalan en el ON A. doble Se r equiere. por tanto, un examen mediante mlcrosoopfa de nuore&eencla. Aparece un patrn especilico de bandas bnllanter. (bandas O o 0-poGibvas), que &e corrcsoonclen CCII$i ex,ctamerrte con la$ ba~ G (G-posibvas, ~curas).
Las bandas G y O cont!Mefl ONA que, en gener<tl. es algo ms rico en pares Al {~60%) . pues la q~cnna se in&ef1a preferentemente enlte e:stos P<WEI$. Corrosi)Onden a (7Qf'I'\(W(ina altamente condensada, oon ONA de replicacin tiVdiil dentro do lt~ f<'&e S del CiClo cct~. telt'ltlvt'mente in;)CIJYO trilntencx:iol\illmcnte
e) 8andooR
Se bas8 en oo tratamier'lto de kloS crom0$0ma$ 00t1 ea1or (para dtsl\&1uu)!i!~r ti ONA rico en Al). antes de la tii'M:In con Glemsa. Re-sutl8n ssl o.anda& oscuras (bandas A ) que ooW::Iden 00t1 m t:landa!l G o O clor;)S (el nombre deriva de patron rever!IO). Tambi&n se oonsigue el mismo paltn de Daildas emp!eaf'ICJO Olivomic:ina, un COlOrante con atndad pos lOs Plf'8$ GC.
L.3$ b;lnd".:l$ R contienen ONA rloo et1 GC (50-60%), Cle b<JP condcnst'on cromatinica, que se replica en etapas tempranas ce la rase S y es retat?Yamente activo transetlpciO'Ia!Mente.
d) Bandeo T
ldcnlifctt un $u~n10 de band\1$ R C$C10CialmCntc conoentrOO<at; en los telmeros. las de tnclon ms .nlensa. y se "i$~4'1'1 eml)leando un tr3'ta~nto ln'niCO 1)3rbeularmonte severo antes de teir los cromosomas oon Giemsa o una oomoinacin de !in()()r'les y ~OtOCI'OrnOS.
e} Mtodos especiales
Otros m4odos de oullivo cromosmlco y de unclon se utilizan para Slluaeiones paniculares: bandeo e p;ara l i ncin NOR, Pt'lr;) lt' ~ ~ZiJdoriJ dfN ni)Cieo(o, que oonUene los genes de rRNA 18S y 28S: ba ...O~o de ptofase y prome-tt~fasc . o de alta resolucin sobrel)"()fn0$0I1\il$ detenidO$ en una e~pa tempral\8 de la mitosis. oon un estado relativamente descondensado ( Su mayor tong\tucJ permite apreciar ms Cle~lleJ.Iogndose aO bseNar ha~ 850 bandas en un solO cromosoma). ete. F".-..lmeme. 18 ci togen6tic01 molecular emplea &ondas de DNA ciOnaoo (preparaaas por U;Cnicas oe ONA rc.eombinttnbl:t. p\g. t76) wa ext~min;)r crol'l1060mt~s. de forma similar a los en&ayos de hibridaCin moleCular pero sobre ~rnCiOr'les <le CI'Qm0$0mas completos. sta es la tcnica denomnada h[bt1dacln In sltu CM ftufesc~nci:l (FISH, /fUMtscence Jn slru llyMt:Nzauon, pag. 172), se dispone oe $0n<Ul$ e$()oe(!ifieN para cromosomas ndividua6es y para reglones cromosmieas, que petmilen OQr' ejomi)IO, idenlif~Cnr rocwc:ktn<amiento$ cromosfTtloos particulares u ob(enet un diagnstico r&pjck) ese la el(i!ltet~eia de ~ nUmero anormal de cromQ$0mtts
reg~ MtJei"'Cromalieas.
92
CONOENSACION DEL ONA Y CROMOSOMAS
8.2.2
Regiones con significado funcional
Los CIQfi'IO&omas eucarilioos muestran tres elemoniO$ f:t$G;ntialos para uM funcin OOfi'9Cia del ciclo celular y la divisin. imllt9$cindibles ~~ l;a 9XP'e$in, dvpUct~cin, y sogrog<'Cin 00 Q QOmO&Of'I'CI&' el ~ntrmero (lugar de
uniOI'l del Cf01"1'10$0Ma a les flbrBs del fluso acrom.tlco). los t~.ln'letos (reglones SII!Jadas en lOS extrtm~os los cromosomas) y k:lS o"9el'les de replleaeln {puntos numetosos en cada cromoec::wna donde se Inicia la oopt.a de la!i dos
oe
neoras de ONA). Se tratan a Cl0t'dlnuacl6n lOs aspeciOS mool6gicos reladooados con los dos primeros; el anlisis de los ogenes de !PPicacin M po$00ne haS1a que se ntudie el proceso 00 repl~can {pig 1 50).
8.2.2.1
Centrmero
Se puede conslderar el centro emtico del aomosoma. poes sobfe l se Sitan las estrud uras llamadas ei netoeoros. a las cuales se uoo.n las fibras que constituyen el ~ acromatloo o huso mlttlco. Es18s fb'as, filamentos oonttcclles o mlcrotbulos, de nawrsleza proteica. eferoen la traccin neOKariel para &eparar las do& cromWtida& durante la dimin ceUiN' Ce e$t<ll f(lfmJ M prcxkJce; 1 0' sogroga.cin orden~ do los tn)(n()$()mi'IS y C3d<" t6!ul3 hijn recibo unil crom(l~ de~ (:t()tnOSI)ma, es decir, ldntiea dotaclon gentk8. La ausenCia de oenttrnero (cromosoma ac::tntrico) in"C)ide ~ el orotnosoma se una al huso mlttlco y. por tant.o, que se lnt:*lya en~ neleo de las clulas nias. La:S secuencias esenciales para la Nnci6n de los oentrmeros son muy ricas en pares AT. tienen unos 170 pb en humanos y se repiten entre 2.000 y 30.000 veces en cada centrmero. Fonnan, p.es. parte dellilm..OO ONA repelilivo (pg. 113) y ademils suponen una parte mportante de la fr.-ceiOn de netetocromatin3 constiluti'v~ . <'lqu&113 quo sOlOlleg3 a desconden&af'&e un tiempo min im o en el cido celular, el Ploei$0 1)3r* so roplieaciOn.
8.2.2.2
Telmeros
Tolmo O$ una pal8bta de etiMOioga gtlega: l&los, extremo, y meros. parte o regln, que Mee referenc:sa e t99iono$ $itultd.'lS en los e)(lrei'!10S de k:lo9 cromoecrnas eucatlolioos, oonstkuid8s por secuencia& especlaizada& de ONA asociado a ptOielnas y con caracteristicas estruct\lrales y fvncion31'" PtWins <auc 1 <'1$ dif..-etlcian <te ouas reglones cromo&mlcas. Los tclmeros de la m~y()(ia de eucariOtas estn fonnadoe por doe tipos de secuencias de ONA. Una de alas, denomini!d<'l secuenci a telom6riea. l'ei)etleln te60m6t1e8 o repeticin tennl nal. constibJye el extremo de la cadena de DNA del cromosoma. mediante la repclk:iOn en ~ndcm de un Oligonudetkb oorto (vat'iatlle segUr'~ especies. en huMatiOS es nAGGG).. Generalmente esta Meuencia telom6tica .s m(lsl"iC3 en Gen uno de las neoras., la que forma el extremo 3 ', que sobresale 000$ 1216 nucletks S<ll:lte tal 1lebt1l que aporta el exsremo 5'. Ese extremo salente es reconocido por proteln<~.s lig;~ntes del tctlmero (TBP. leiOmef'e birldir1g prot&IM). que acblan a modo de "caperuza protectota de <icho ONA terminal E.xisten taml:li6n unM secuencias mas compleJas adyacentes a las an1eriores (er. dec*. mr. lntema& en el ~rom()$o()tn;ll), que se denomll'\8n as.ocl adas a tetm~ros o secuencias eubteiOmrtcn.
tlb llllCII('Jt('taJ. y \' tfnsJ ~"JJ(lnoJel'l a hiiC'IlA111. ' 4) te"-ncr(l tdomtf\1
'>t'~-ucnoll~ ~k>rntna-.
fll :' i;b (1'1 l"ll'l'IIJ
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f.ATCC(I\ATCCC Wl
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fq1<1Kl!!11.:11 CI51).2-(J00)
11-lt tiC)
Se han asooado .., los tciOmeros distintas 1\Jnc::iof\es: Participar en la M1<'1bil~8t:i6c'l y tnantenlrrVento de la Wttegridad estructural del crom()S()m: en ausencia de teli'JMII'Q$, .- extremo del aomosoma tiende a t~W&e a otros y aumtnan 1 <'1$ PQSibilidacs de que sufra reeomt:linaeiOn y degradan. Pot otra paM. 10$ te!Otneto$ permiten a las et1Zlmas encargedas de la repatacln 0e1 ONA <ttereooar emre el o..~etrcmo natu'81 del cromosoma y uno que resulte de la fntgmen1acn ~~ d ltt cadena do OHA: en eS'Ie <l!lmo caso se detiene el ciclo oeUar. evitando la replicacin 1\Mta que se haya reparado lales.n. La funcin mt'l$ importante oooslste en asegurar la replicacin ~" ~ tos eXIrtrnos 0e1 cromosoma. Es!e a&QCCIO $0 estudiara una vez considerado oon detalle el ptoceso dlt 1 <'1 ~~ del D NA (J)g. 15 7). se espe.c:ula tambin con ta implicacin del toliTI(JnJ en In arqui(&etutS lri<limenslonal del neleo yJo del apareamiemo ~romQS6mieo.
DOTAC+H GENTICA EH EUCARIOTAS
93
8.3
DOTACIN GENTICA EN EUCARIOTAS
<se este material pre!lef'lte en
Es conveneente oompletar el oonOOO'Iiento de la ~i6n del material gen&tieo cons."dert~ndo 01 oorneniOO \01 31 las clulas eucarl6tlcas y &u relacin oon el bpo de: otlu!<t y 01 o~io en el Qt.te se encventm Para etlo, es pteclso describir el s.gnifiCtldo de a.gunos !Orminos y ;;nooptos gcn61icos bc\&iCO$, noce$tuios lamcin para te comprensin del cielo celulaor y Oe 106 do& hPO$ de divisiQn, mi!OSi$ y rnewoshl flt:l'l\ll 9).
8.3.1
El
Nmero de cromosomas (n): earacter haploide y diploide
n6mero de cromo50mtt$ n~~" O$ cart~cterislieo de eacla esc>ecie, y varia muctto de unas a o11as. Se haCia de clulas haploide& (y de 01gani5mo5 ha~oidos. &i ._1 <\n tonn.,do!l slo 1)0( ellas} cuando cada c:tomosoma se presen1a en forma individual. de modo que ena& OiUia contiene un juego de cromosomas. lodos dlslln>s entre s. El nnero de cromosoma$ se identifica con ol nUmero n,
e..<;pcnnatllzid~: u vulo (clulas
Clula haploide huma na: sexuales o gametos).
TiC"nc 23 cromo..c;nmas (n=23); cada uno d~: cUos ~L ron:nado pOr unJ molcula lineal de ONA de doble h<..-bru.
.
1
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3 . 1
1
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2
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1; . ; 1 ; 1
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1
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1
1 1 1
" 1
1 :
1 0
19
OIUICXWI'I\IIs (l'Tl t<Xb~
' 1 cr<wnO!il)m21
......
Por ej conltario, ~>e <ktnomin.a clulas diploid.s (y organi$tn0$ (liploide$) .;~ ct(IV(illt'l$ en 1 <':1 ~ 110 ob$C1V<ln pareja5 o par9$ de cromosomils morfolgicamente gu81 es entJo si, tos esos miembro$ <H: 13 porej<l se oenominan cromosomas homlogos. Por lant(). c:8dCI 061ul<'l Clil)loiCie f.iiene CIO$ ici090'S <te cromo&()(nM, y es.to e3r.'tcW ~ipiQidot so idenbf~ ~n el nlimoro 2n (n l).llrojas de cromo~) En C8dl par, un O'()(I'IO!IOma se na 1\efedaciOcJel padre y otto ae
1~
mDdre
C lula diploide human : clulas somtica.<> (hcpatocito. neurona...}. <..-lula.s ge:rmmaks pnxursorus )' cigoto. Tiene 46 cromosomas (ln ): 46 moiCculas lineales de ONA de doble hebra. 1-'omum 2 conjuntos de 23 cromosomas distmtos. u 23 pan:s de erumosomas (a \COCS denominados 23 "cromosonms diploidcs'"). De ellos. 22 p.1res. que son homlogos)' adems similares en ambos sexo,., se Jlaman aotosomas: los 2 <:romOSOJnl.l; reslan!..:S dilicn.n dc~ndicndo del sexo y slo son honllogos en la muj er.
.-.. .w + X
lXY
.. Y
~ e< \ 'llrt'n.
""
01
!!
22 pares de: autosomas {en todas las cCiutas e: individuos)
,,
1'
XV un par de
.sexuaJ~
eromo~>~.,,n:~.;
94
OONOEHSACtN DEL DNA Y CROMOSOMAS
cromosomas
SCXU<tiCS
l~omol(l~in
-

JI
muj er:
t.l pUl n"' 23 l"!!li formado ptM'
var6n:
..
X X. """"""""
d% cromosomAS bornlogos.
ig-ua.l qu,:. los 11ut0s6mic<lil l.res nllll n 1:)
J; = i
X Y. muy dut1nW111 m _!Ww r(l2) esU formado 110'

dOS CIOC'IIO!OOOI'li M boolhlo~
S61 o una po:qlk'iia n!gi6n

~1 V y el X on hOI'OIOgl$ (~"CJI.NI pscuikJ.,riiOSITli.:'lJ)
Pfoduc~:
Gtum. 't""'
Se d1 ce q~ 13. mujtt u lwmt)g.MJt:tk: lodos ws 0\ulos I ~VWI un mismo tipo de :t(IIIIOJ(tll lll, X
un X lk la mlu,lre. el ocro X tlc'l pt~dre
Pr(JOC'(ktw;ia lk l 115 cromosomn11:
Tran5mmn de
loo crflm(owlf'lla.'l:
cromoroma X alas hijas y a los hijos..

mdU.in1umenec (por fenili:taein con-... CliJ)I:nl'IIIIO.coiOO X o )'. mpt-t:liVIII'llltuc J
$e dlCC qiK t J \111iJn ~ Mlcr~iU'I1&1CfT 18 mnnd de sus ~ 'lii'J\'1"thaiOl.OIkswn jl(lrtlldortJ de X . loa otrn miuul tk Y d X ~iCtllf!rt de la n~f\~. el Y Acmpre del rxdn: el X Sl6kt a la.~ tuj11S. 1."1 Y l\OJo 11 1~ tuji)S tal fendjonr ~ln.k\Jicr \11\o.
que s~-nlpl\' ser X)
Eo oi@'IJUIS esJ!CCM:t. o dfmncin de los b~J~R~oos. ooexisle cromo.soma V, .sino qut los nac~ u~-ncn 1111 -olo \'f(lmQSQt'll: ~WII X.un pnte"jn, mianr~s las bembr~s tienm dos \"fomo!<lmos X homlog<~~~.
En 8'1 <:;<\$0 de ctlu!M (1.1 orgWliSITIO$) <::On ms de 2n cromo50fi'\CI& (4n. 8n. ele.) se habla de carcter poliploide. Hay OUM que son polipiOI(fleS oe torma nahM'8t. porq~ Mtn Jottnacto eot:~i<'ls ~diCIOn:lles dt sv jvOQO Ot cromosomas itlicieJ mediante tMlo8 repleaclon sin dMsiOII eelvlar (endomltosls). Por ejemplo, las olvlas del hlgado et1 ~er<~Ci!ltl son tetteploldes (4tt). lOS megaa~riooiOs gigantes de mdula sea contienen usualmente 11),) o 32n. ttey tat'l"titt sltuamne& patolgicas caractOOzaclas po1 poiploldle: la& ms frecuentes son la ttlploldla (Jtt) y ta teltapiOIOia (4rt). Estas anomallas cromoemlcas se estudian en el lema 29.
an.
8.3.2
Contenido de ONA: valor C
Durante el ck:IO cel~. la formacin de gat001os y la fertlllulciOn lier'len ligar variaciones en el n(jmero oe cromoS()t'n&S de la clula, Indicadas mediante los l'l'l{jljlpiOs de n. En hurnanoe y animales, es&as variaciones lransOIM'I'en entre 1) (flapiOide) y 2tt (dlpiOide). No debe confundirse esa variacin con la del contenido en ONA de ceda clula, aunque s1e lambln varia durante bs l)f'OOe<SO& cltaOOs. Para Indicar e&le oon4eni00 &e emplea una nolaci6n basada en deno~r Ca la cantidad de ONA (de dob&e hebra) corre&pendierrte a un jlJ890 hapiOi!Je de cromosomas (85 decW. tt) antes de su replicacin. Se pueden enconttcw clula&, tanto haploide& como diploicle6, cuyo contendo C 85 diterente:
n,C n ,2C
gameto maduro (6\<uiO y espermatozoide)
2n.2C
Ol'!lula somtica cuando no esd en <ivisin, antes de sufrir la repr1C8dn de su ONA

Clula somiltiCa l ra!l sufrir la repllcaciOfl, a poo&o de dlvtdlrse por mitosis gametoc:ito I)JYnario. ames de dividirse por meio6i& dando 2 gametoc:itos &eeundarios
Clula diploide
2n,4C
8.3.3
Locus y alelo
locus tM:
p<I~M:IOI1 delindlL.
oc upadu por un
~cu~~nci.a de ONA 1en t~moo-.
loc k varias
poiciotliti pata
~11('$ cliftmll~
b>t'n 1o \1011
en un milimo pat
de eromO$lti.U
cromose>m.as
hornlof!OS
Jt-1 1.1
~\lerlC181 de:
I>'J.'\ '"uJ(Iu, en
un IOC\I'>
cada par de aleloo; (K:tlf)ll el mi~mo l1x:u~ (un alelo h~:rcdaKlo del padre y d ocro de la m~~drt")
OOTACIH GEN ~TICA EN EUCARJOl A$
95
En eu31Qulf!r clula de \RI mcsma espeae, ~ gen ocupe s1empre el mismo lugar en un cromo~ detlWI'IiM(fc),
'1 la posiCIOO equivatnte en su h(m(:IIOg<> (P.ot 3h<lt:il. basta eon que se enuenria por gen una secuenc1a de ONA que
OO!Jrflco un p.(lduttO tunonal. bien protelna o bien RNA.) Pata referirse de (Qnna gell6nc<t a eS<~ pcn.~i(Jn $C1 utillll:l ~~ tbnnn'IO loeus. Por tamo, genes distintos ocuparan diferenles ftXi (pyr<ll ele loW$), on &1 miStno .ac de cmmosomas o en "O!ro. E"os trminos tamben se 111ilizan P<J(a \3 posicicirn de rtl!)iOne$ dlt: ONA quo no f;ean genes.., A cooa &eOOenea concreto~ de ONA .l!!lic:a o no) s.,uiK\8 en un toeus se la llama a.ielo. Piles1o que cada cromosoma se prosenl{l OOti"'O 1,11'1 ()<V, en cada ltld!VIdtJO hay dos alelos en el mismo tocus que ~en sendnbcos o
diferonles
los oos alelos que .ptesenta un lndl..-lduo en 1,1n locus delemunado $01"1 dif~Jronte5 de los d' otro la m:sma especie (d...ersldad geneoca o pol(morfismo, p:Jg. 365) ComQ consec~i11 en el CX>n;un1o de 1:1 pobl{leiQn e~ti$101'1 mAS de dO!I alelO$ dllerentes pan~ un locus. El e&tudio de IWstornos dlf!ICOIS ht.l ponnitido lclcnt.1il;$r numerosos alelo& ~IIQ$ mnno,; fracur:ntes. en la pobl&ciOn, que SII'Yen tlO)' como mate&Ootes para .OOrMi~ dic;l'l~s pa!Ologias
gec~
En
ndi~ de
8.3.4
Genotipo. fenotipo y domi nancia

E.'>lodk) l'e~ringrOO : un soJo lot:U!>. ~'t1 CU<Jtl\l ith.li.,.idoos de la mi:vn:
csp~~c
(prCSI.'t!ICS en prvpcirdoo~
Aldos posi bk~ en la poblacin: A 1. A ~ )' A, diiCrente:s)
,,
' :o
'
S1 ;~mb;.. 1ldo' dtl pnr ~n

'!l"llk <~., el u1Jo"d"ll e~
S 11m~ ;~klo."' dt'I IW ....

diftwlllo:J, ~ ndl~ll...,.. e~
bnnlo iC'i)!, liw

UIIU C~~< dada).
twlcro lrilt'itico
Se lkline {ttn!Uipo cumo 1 11 ~conJtl1utJ6a g-eu(:ut".a de w1O ls;wl.-..mo" (CS dtl.:ir. de! un iMnkloo de
I.W.IOI'IIcJcJ (k IIXI~ }1)!1 Crumf.lmll \ dcl c nd.nJdub. San c:rntlllrgo, 11 d~ ...-..,., :riel~,: K sudc: cun~i~t el cno1tf'll qta uo llll:llll par1.cu1at. ttJII 1 1) que el ;tOOCI <k 1.111 iudiidt10 vi~e dcfmido J10f II)S do!; pf('!~ pnst:V~I6 en ew IQC:!tl~ en ~ rmll'l()!l,)mJ' hum~. de .eultt lol 'tlli.hJpks aldot.Jt1M7Jksl"',. el locu,. en l11 fX~di1n de eSA ~ic.
t i thmlou pi!Cdr 9et conSJ!krado ca sctllido ~cml 1.'01110 cl COOJUnr.o de tos nklm pmo.'tlt ,:n
fil'""''"''
(
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oo, m,,Jd.ol~: lllll'l>luc;(ll
1'1111\'llld-
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11~ 4otllfll1t((.... CIWC lclt,.
l.tlllltlpo M! ""'fii\:!.lo) p:ll d
96
CONOEHSACIOH DEL DNA Y CROMOSOMAS
Rtllleiil nure d ni m~ dt ltt~K ni~Tftn t la pobtacW. par llitlll.I IOCIIS ~ 1~ J:l'IIOti~ diflltlllllltt 1 le $ 1("1'- (ltltdt11 dtr lg.tt
Rdkitldc
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rri'CIM'IICiO
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C'll Ut~ m,;mo~ ~IIOOpo> bt!(IVC'I.. 'IK'IH'HI n>'ulldo dt 00, nunbiiUI.~ df' cadulu~ 11Mm. {p CJI'Illpk. AtAJ "'!\~ 1 b .:'*'mn;, .h Como .:<lll~ {~~lumna .!). la troNI:qlld:id de cxi!o1m:..a de ad;, 1100 de 1M gcn"'il"l" k~o:mcg&iMt .,.!1 l.! p.>bii'C'tlm t."S lloblt (111$" l l \k ctd.ip;lo(ipO liuuli:i~IW
En la& ~uaclonet> en las que 8XI&ten dos o mh alabs en Ja poblacin se dice que hay poUmorllsmo. otwlamente refcncJo al loeu& oonsidert1do los polimorfismos del 98floma huiT!ano son objeto de alenao especial en el teros 26.
Tema 9
Ciclo celular
9. 1
9.2
La ctom.;~ ti n.tl en
92 1
lntfod ...ce~n ................... , ,.......... ,............ ., - ................................................................. 91

1~ V~cioncs et1 Divisin~ clulas
interflls.t..................................... -.....................................................~ ..........,................... 98 tonde-Maei:)n y contenido en ONA de la aomatll'lill , , , , - . ...... 98
9.3
9.4
somatleas por mitosis ............. -.............................................................. .,.,.,,.............. 99

99
Divisin dt cilul.-s genninales pl'imarfas por m.elosls ......................~~- ........................ .. ........................ 99

9.4.1 GametogneS4 . .. ...,.,_,_,_,,,............................................. .. ...........,., _ ,.,_.,, _ -- 9.4 1 1 Espennatognesi9 ..................... . . ....... ........... . . . .. 9.4 1.2 Oognesls ...........,.,_,_ ,_ ,,,..................... ....... ----... .... 9.4.2 Reparto del ma1ena1 gentiooen la meio&i$ ........... _ ,_ ,_ ,_ ,_ ,,.,,_ ,_ ,_ , ,_ .,.,., ....................., _.,.,,_,_,_., 9.4.2 .-1 Car<icwr reduelor de l3100i0$i& .......... , ---- . . . . .. ...................... -... . 9.4 2 2 CQnlp;:aracin entte meioSiS y mdoSis ......................................................... ------- 9.4.2 .3 Segr~iOn de croM0$0m~$ y 6YetSidad geneliCa ............................................... 94 2.4 Reeon'ICinaeionmeiOtlca......................................... _ ,_ ,_ ,_ , ............ _,.,_, _ , _,.,_ ... Unin d~ los ga.n'l~tos h & plo lde's d urante la feeundacln ......................................................................~ R esuMenlntegr aoo .......................................................................................................................................
t02
t03 t04
104 104
105 106
9 .5 9.6
106 106
9.1
INTRODUCCIN
E.s importante resaltar que lOs aspectos estructurales hasta ahora oonsiderado6 p;.ra la moloola de ON A dobon estudiarse bato la s!bJacln fisiolgica en la que r~nte se encU91\'Ira el material gen8tioo en el nUcleo e\IIC&ritico. e$ decit. durante tas etapa'S de teposo y drvi&ln que se altnan en la Y10a de 1<' c41ult~ Con frocuoncia. 0$1<'1$ dQs cuestiones se relacionan pooo entre si. o se analizan bajo planteamientos &in unn sur!Cieme M~ mOle~
~ctuter ~ getlen'ln 1an10 tos getroetos {diviSin meiO!ica) como, a psttlr del cigoto. todas laS para QUC ~o~n Ot!)&fli$mo cr~ca y $e de$8ti'Oile <Jutante los petlodos embrionario, fetal y de crecil1lMitl\O ht1111t<t el fllt~do adulto, y p~ra la teflOV&eiOn oontlnua de tas OOA!Ias que IYI.lefen <1\Jfante dlCIIOS perlooos (divisin miltiea). Medit~nto 1:.
divi$itl
oUa<s
neoHar~
()ivi$il'l por !WIIoSis llene lugar notmalmente <U'aflte toda la existencia del organismo. desde la divisin IniCial del cigoto ha$1tl ta muerte ae1 rnaMduo. Se calcula que duran:e la vida tunen& se producen unas 10" diviSIOftes. la uansidOn entre oos diVISiones &uoeslvas oo.nstttuye. junto a la prop~a di'J'5in. el c:ld o de d ivi sin cel ~o~lar o smplemen1e elc:lo c:eh.ll4!r, Su <lvtl'ftin v.vl01 01mplit~mente de ~euordo COI'I ol bpo od.ll:ar ~, o:~mo en fui'ICin ele determinados e~i muiO$ AlgunO'$ ctlv!M evoru~n POf una $uoesi6n continu3 de (:i(:IO$ (le div.si6n (pot CJel'ri)IO, oetutas epiteliales oe1 ilrltesbno y procursores hematopOyllcos en la mdula 66ea), otras poseen cielos ms espaciados (una vez al mes en clulas hepucas. una vez cada 3 al'los en ol!lulas endotetca\es de vasos saf'9Jineos. etc.) y. como caso exb'emo. algunas c:l~ detienen $V progf'OIIin en ol c:ielo, rc.;JnudndOIO !ttl$ un pcrio<to pr<*ltlgado (quie&Genaa) o inclu100 no divd.indO&e m.fl$ (nouronM) AJg\.lna$ clulas se espeeializan en ta produccin de oametos o Qitutas $0XU~IO~~ q~Mt l)9l'tl'litir<in la formaCIn de un nuevo individoo Tales celulas gttrmin~ lcs (ti diferencit~ del re~. ~luh'l$ somiti~as) so dividen mediante un mecanismo dlferen\$. denominado moiosi s. Qut lt1rnt:>i6o V<\ precedidO de un cic;Jo c;.el~ 11imil8f lll de !;)$: Mh $0mlicn11 u na viSin glObal del ciClo oeiiAat permlte ObServar oomo la clula ltanscurre de maneta Of<ler'lada y $ar'l dlsconlftlliaad por dos grande$ etaPes bl$n diferenciadas: la d ivi$i n c:olu l; u propiamen\G dictla lpot mrtosl9 paro oluta& somllticas y pot meio6i& para clula& germinales) la i nterfase (oomUn a ani:J.as). Durante e&tl1 idlim<~ la c9fula s.e !)repara para ta siguienle diviSin duplicando su msterial ~tico { ON A) y tociO $u contenidO (OfQt.ein;:t$ RNA. Of'gnulos. membranas). oe modO Que se duplietJi $U 1 arnarno 3tlte$ oe dMCiirw en 0<>$ clulas tllpiS Cl$1C3t11onto . el
u.
98
CICLO CELULAR
ciclo &e plantea en torno el proceso de replicacin, o 4UC!Iie$Cin del ONA nvelei'll. oon lo que se definen dentro de ia interfase tres elapes: ta fase S (durante la cual tie~ lug~r la repliCC~oeiOn). la fase G. (previa) y la fase G, (pos1erior), Mientras ~ algunas clulas entran en divisin tras COtJ1)Ie4ar caaa lntettase, otrM ~$31'1 a ~ estadio mcxilicado de
Gt .lam~ f.;:uc Go o QUIH(:$nt. en -que pennaneeen das o inc:Liso &"ca hasta cmpronder \lr1 nvevo
clcio. o del que
nunco Sillon {C61utas ~no se dividen. como es el caso de las neuronas).
Fa~ PQ$1 "inl~b d~ ON\
o..n.:u... ....,;,... ...,,.... ~ topo~

.:clubr, ok un~..,.._.~.,..,~-.. o i111.'lu110 Jm ll:$1\'IKI M~cckl.
Siigtliendo el pt8flteamiento genetal de este texto. interesa relacionar iOs aspectOS 9f:lll!tieo$ Cl$$101>$ 001 Cielo oon aquellos cxros de 11\doie ms bloqulnw:a y molecular. Para ello, se aborcsatlln en Totma oe1a11Bd3 13 interf.-se y lOS dos tlpos de dlvi&iOO celular. con un,_.,~ objetivo.
Poner de manifiesto la enorme variacin estruaural que supone, durante !a lnteffase, la condensac:aOn de: la molcula de ONA desde cromatina a cromosoma y su desoonclensacin en senlido irrverso. Re:salltlr ell)n)08$0 de la rc~n . ~ tambin liene ll.lgar durante la Interfase, pero en !Al momento diferente del 8r'lte(IOr. Su car~et l"r''IOeCCA8t y enzim:iltieo se estudiar6 oot1 Cletane en el toma. 12. EstableCer &as ar'lalogias y aireter'IOias er'ltre la disin por mitosis de las Qlulas so~icas y la divisin tXJt meiOfi$ de las oii.Aas gei'ITII'lales primaria& pata dar lugar a clulas getmif'l8le:s ITI8dl.nls o game4o&.
9.2
LA CROMATINA EN LA INTERFASE
la l r'ltetfase, o lapso Que transcurre entre dos tivisiones celulares, es nonnalmente el periodo mas prolongado del ciclo celular, con sus tres fases G~. S y <3?. Esta etapa ternWI.a cuando una oUa somtica entra en dt'Yisin por mitosis (par.- formar oi~Uas &omilticas tijas), y QRifldo una ;lu!<t germiMI l)tWn31ia $C <iviOe IXlf' moiosi$ (par<~ formar lcJ$
~utos germinoiC$ modurtt$). Se .a a estucli&t emo d!.w"~ ltt irltt:tfase vt~M el gr~ de Ol)n()etls,acin dol m11tcrinl gef'l&tioo y taml:llen oomo varia el OOfllenldo de DNA (2C en G ~. 4C en (h) sin modtlc&rse el t'M.lmero de croiTlOEIOfl'las (la clula se mantiene diPIOide. 2n).
9.2.1
Variaciones on condensacin y contenido on DNA de la cromat ina
Ot.wante 18 ma)'Ol parte de la v\da celular {bien Interfase o bien qulescencla. segUn lo& casos), la molcula de ONA no e~ presente en la torma extendida de doble hMico ni tampoco en 13 fOfma ~cla <Jtt Q'OI110$0mas. $IAO en el e;t<ldo p;a~i;:~!mente oondcn$l)(So COI'Iooicb eomo crom.:..tin:. (Pilgs. 85 y 87). Al pr0QI0$3r on el Qeie> oetu&ar. la cromatna se desc:ondensa gradualmente durante ra tase G, hasta adoptar una confOtmacin localto!atmetue eldleilaida (correspondiente a le doble 1\otlce), necesaria para le separacin de las dos hObr3$ <1\.11'11rl'O la roplieaeiOf\ (fase S). Para eiG, ta euetoma1!na ha de pasar pteviarmente por los esUidos de fibra de 30 y 10r'lm(p&g. 101). OU'oote la tase o,. las clula&. tanto &OmticaG oomo germinales. son diploldes (2n) y &u contenido en ONA e& 2C. En 1a fa:H S o de &intetl$ se pt'(lduc;le ~ r~On CIOI OHA de I()S :ltt cromosomas IMMC1ua1es. cacta nebra ae este ONA sifve de ITICllc)e p<~;rtt 1<~; sinttl'$i$ CIO otra nueova, quo permanece asoc:iacl8 por apa.reamiento de baSfl:S. Las dos motecuas de ONA resu!tar'ltes permanecen u"''Os IXlf' el centtmero, dando asllugar a crom060f'l'la& oon ~ hebras de ONA: ceda doble hebra constituye una c.romatJCia. O. este modo. el nmero de cromo&Omas permaneoe oon&tanle (~a. 2tt). I*O Mt Cluplic<t., oontenir;to de ONA. dotde 2C <t 4C. Un3 ve: flMii~:8CI<' 18 191)1ict~~Cin . la ctula entra en
OfVISIH DE CL ULAS SOMTICAS POR MITOSIS
99
ta tase G2 dQncfe se ir'liela ta condensaclon gradual de la cromabnl <Pag 100. M seeue~a 11\\'(!IS& a i8 descondenseci6n ocurnd'.a du;r3nlO l<t f.t~s.e G ,, pg. 101). que se completa en las primerss. oi&P9&- ele IQ mllo&i$ dandO lugar a Cl'Ofl'lO$Omas viSibleS al mierosOOJ*). con su aspecto t!pico do 2 cromiltda$ y 4 ~zos. La clula s~e siendo
2n. 4C
A~..Jnque se puede conSiderar q.e cada molcula d1t OHA C$ ~,~n cromoSQma en cualqUiet momento del octo. et termino ctomosom.a oottespoi'ICJe e$trlctamenli! e esta forma oonc.5ens~ i!ll mllximo. A \>eoes se usM lOS trminos CJOm0$0tl)ft ~afa$.ICO y c.romosom<t intfHf.sioo par<~ l<tS f()fmas condensada y desoondeonsada (cromatl'ta ). resoeclivamente.
9.3
DIVISIN DE CLULAS SOMTICAS POR MITOSIS
La mitosis o fue M , es el periodo ms corto 001 CiClO celular. d1.1rante et que t~&.ne lugar ta civisin de la ck.'a, que ya ha duplicado su material gentico y Ci~m~tiCO, en dOS clulas hijas ldenticas.. Clasicamente se eonsidera divicfid.a en Cinco etapas: (1) Profas. lcl cromatina se~~ nas.1a formar tos etomosomas, dejan de ob54.1N<W'Se b$ nucaeoAOS y apatece el huso m!bco. (2) Prorml:lfue comienza a romperse la ~na nuclear. se \>en por primern vez las 2 cromiltldas de cada cromosoma y lOS 2n erOtnOSomas migran haaa el plano ecua10rial de la clula. (3) Metafase: tos 2n CtOmOSomas, ~a!mente oorw)eosados al)3tCQet'l atine&dOs en e p&ano ecual0r181, independtentes unos ele OliO$. (4 ) Analau: los cromosomas se rviden POf ~$ <:enttmet<>$, separndose en dos cromtldas, que son desplaZadas haw polos opuestOG de la ollla Ct~Cit'l cn:>m3'1ida es ya un cromosoma hilO Independiente. (5} Teklfan comienzan a desoonden&ar5G tos crom0'$0(1'13$ y se t(ltr'n80 membranas nucleares para delimrtar dos nUc:leo$ Patalelam9MG. ta membf"lln;:t celul.-.r seport~ et eiiOf)laStl'la en oos partes, cada une con un n(l(;loo y 1~ mitad clq tos cwg.;'lnutos, formando las dOS clulas hija9 , en el proceso lamado citoclne$i S (O citoQvine5i$)
' " ~~ ..... '-"I"L tn~o!rco
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Como consecuenCia de la mitosis. cada clula hijt' rocibo lllf\81 cromittida <le eada Ct()t'l'IOSOI'n3 de ta Clula madte, es decu. la mitad de DHA. pero constilvyerdo un conjun!O Ct()l'nOSOI'I'kO completo (23 pares de cromoeomas} con toda la infOtmaein gon61ica dota oi!Aa tn~. Po eno, se dice que la mitosis es un proceso de dMsiOn no reductora (pg. 104). La Unic<l <itan~ncia es Que fa clula ~s1o an1es ese dMdlrse tiene 2n cromosomas de 4 hebfas y 2 cromtldas cada uno (4C) y Iros aa diVY$i(lon Cada ~18 hija tiene 2n Cf'Of'I'IOSOI'I\89 de 2 hebras y ooa croml.lda cada uno (2C) (pgs 100, 101)
9.4
DIVISIN DE CLULAS GERMINALES PRIMARIAS POR MEIOSIS
L& divi$r6tl moitico forma ~ Clet ptOOe$O get~eral de lormaclon de gam-etos o cetulas se)(U8les hapiOides, a partir de clult'ls germint~tes prit'l"()((liales (que son ClipiOICies, atogual que tas clulas somUcas), en ef proceso conocido OOMO gametogfnHIS.
9.4.1
Gametognesis
La oogenesls y .la espennatognesls se Wclan a partir de clulas germinales ptlmordlales, olulas especializadas del 6\lulo o testiwlo, mediQ n~ una serie de divisione$ mittic<l5 que, con et consguiente proceso de crecimJIWI4o y dif9rcnci.On celul.\r, POduOCn sucesas get'letaCiOnes de clulas llaMadas oogonios '/ espe.rmatogon iO$ (Wmbien oogonia y espermatogot~~a. l)gs. 102,103). A oontinuaciOn stas. tan'()in por m!I0$1S, dan tvg<~r t'l oocitos y espermatocitos prin'latlos. TOOI\'!I estas clulas son dlplolcles. F.,almenle, a partir de cada oocl!o o esperma!OCIIO pr1 mano y medlan1e dos dlmlones suce&Nas Cliferentes (melosls 1 y metOSis 11) se produce ta reduocin del esta<tO dii)IOie)e at llaploide. Por euo, el conj~Jnto oe esa& dos CIM&iones recibe e4 norntw'e de Meiosi s o dlv1sln celular reductora.
100
CICLO CELULAR
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DIVlSIN DE CELULAS GERMINALES PRIMARIAS POR MEIOSIS
101
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li~M<fluit d,(I]()OoJc :n. ""'< ~a diploidco; 2n.
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DeseondCn$acin
gradual del DNA:
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(des<xlllden,..&K,. C"l\"IIIQUIUij
cua!qu.._,. ctllpa dd d.:5armlli>
{o,!lul;c, ~CI!I"Ion;ald; dllt:ll!~ lodud tl~-,.,m.llo
h."tllhft~ - pulx'ft.IJ 1
<-"W m::orls..so.,: .:"" una Jobk

kt'IQ,<k O"JA
102
CIC LO C ELULAR
9.4.1.1
Espennatognesis
t1
En et caso del vaon. el proceso, que tiene lugar tel)t!Jdamentc

prOOUIX:iCor\ de es;pennatol.Oides o gametos maseullnos
10 '"'90 de toda w Y1da.
~ina
oon la
mtoi!I(IIIH
"""''"
Pv1 tJ., k>!> ~(lUII1iii...,Mi~ dt
ho.'mbre <k .40._ qw- a.k.trnrO b pobcn.-d u ko~ IS V' 1S) pi'OC'fdtJI dt JO o-1:0 r41) l ~i"' ~ ( 1 0{11\ o ~~
~:el~
Wo:CShti.
uno de
klS
es~errnatozoldes Iguales.
espermaaoci!O& primarios ha dado lugar <' un reparlo ""'6\liOO del cltol)lasma en cuatro El nmero total de divisionN <~lc<\nl(l .,lores $01'1)'endentes, vari8tlles 9eg(ln ta edad, ya que
dependen de los afio& traon&c:urridO$ <le$do to j)ubettad. El nUMet"o total de eepenna1oZOkles reatnente prodocidos es obVIamente varillble': bM:te indieer QW un varn sano puede formar unos 200 millones dao& durante toda ~ W::l<l fftil y que un ey~cvt<'ldo, (;(In unos 2 mt, eontiet'le \.W'I09 60 millOnes de espermatozoides.
DIVISIN DE CLULAS GERMINALES PRIMARIAS POR MEIOSIS
103
9.4.1.2
Oognesis
Pot o:"l oorrlfafio. en 18 mutet la oogn$&1s ocurre en su mayor 1)9Me dtK<WUe la Vldil ''""" il l)<'r1ir dt la "lul gemw'!al pnrncwdial originada en el enckxfermo del saoo vitOiinQ del cmbriOn. El m.-yor nmem de oodlos primariOs se alcanza haoo el Ql.llf'lo me$ Cle vitlt'l lel31 (oomprese con la puberlad para el vatn} y es muy Inferior al de espennatocilos primarios A J)a(lir tiO C$C I'I'W)tnColo, el tUY~ero oe OO<:itos se te<luoe oonllnuamet~le hasta la t)uClertaa, se mantiene durante l3 vide frtil oe 1 rl1l..l}tt y o.saparece C<l$i IOI31menle -"' llega( 1;) mel'lopauSia
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0118 peculiaridad que diferencia espermatognea.ts y oognesls es que en las dos
dMs.tot~eS
Mei61ieas de esta
ltima el reparto del citoplasma es asimtnco: en la meiosis 1 se &orma una oft.lla pequel\a llam:ldo CJ.Jetf pofl)t y ~ oc.x:ito Mtunc.iano grande l~ diVt&in do &4G en la me~os~& 11 ongna un segt.tndo CUINPQ potar y un vv!o maduro. Ambos c:uetPOS polar-e& degeneran go&teriormoote Pc:w U.Mo. un oocilo primario slo QGMra un vulo. rTIIE!t'ltras que un
.sPOrmatocito primt~rio produco CUtltfO 9$1)0rma~oi00s
1 04
CICLO CELULAR
9.4.2
9.4.2.1
Reparto del malerial gentico en la meiosis

Carcter reductor de la meiosis
En la 1neioSiS 1, e' gamtl'!Oc:rt<) (oocilo o petmaiOcilo) pnmatio ~lll SU$ l3 P<lJ<tS dq Q'OmQ$0~$ homlogO$ (2n . .ce, ooo dos crQMI\ttdlt!l c:ad3 uno), de totTI'\I.l que pHan 23 crom0$0Mft$ dit~ontet (Uf'IO d., Qld~ l)~r. n 2C. con 2 crotl"'bd.1s) a cada gameotodto secundao (t Ley de Mendel). Se dcoe q~ .te prOdutc:~ 1:) &togtcgarcin de los cromosoma"- o que ceda Pftf ha suf.OOO di'sytmein; se teduce asl a la m!lad el nUmero de c:romosoU)$. Por ello, so dioe que &8 me.os.s os una dMsin tedl.lctGv8. debido a la meiOs:is 1. La meiOsls 11 es no ~ y et1 ~ al reparto de ma~l ge.n&11co se asemeja a !a rt~~tosis, eomo se dscute a oon.tlnuadn.
l.-.pcn~~~Wo;oln loo<C>&nll"" O.~ldi>lll!b~l jlnll:t....
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f<'lltlku )~ thopllt!ll
J't'l'"'""''f''""ll>fu!
~j~J u ~eJuJ!Jr
=" .&('~
9.4.2.2
~ (nt. De este moro. cada c61ul<t hij~ 1~b copias id-6-ntlea.s de ONA (doble!! hebras la repllcaciOn). En oontraste. en la mebsu; 1 uparn lo miernb10.t de c:.&da pa.re}a de cromosomas. oon lo que so reduoen a la vez la canbdad de ONA (4C...2C) y el nl.lrne;o de cromosomas (2n-.n). y las clulas hijas d ifO(nte material Qfl'tlco (pues cada CtOmo6QITia de un pa1 ~e<le cootetler alelo!! diferentes en C9CS& looos .... 94)
Comparacin entre melosls y mitosis u, dlf&~oncia eseoclal entre la mitosis y las dos etapas de lit ~is rad~ .-. 1<'1 distribuCOn del material gen11co entrolo'ls. o&lul~$ hijas (!IQI'llBiicas dlploldes en mnom; 9"fllOlO$ haploido$ on mei0$1$) El m~ni51T1o de la meiO!IiS 11 es e<t.~ivaiente al ese la mitosis, pueslo que "' s.eparan In dos eromb.1ida$ y se reduce la cantidad e ONA (2C-.-C) Slf'l
e~biar el
eatact
dt.~Phca<las M
*bon
DIVISIN OE CELULAS GERMINALES PRIMARIAS POR M.E10SIS
105
9.4.2.3
Segregacin de cromosomas y diversidad gontlca
En ambas melosls. el teparto ele lo& cromosomas hofn6loOos de cada par (meio&~& 1 } y de las aomlida& de cada etomosom.a (meiosb 11) se hace el azar, de forma lOCalmente indepenciente para cada cromo:sorna (2 tev de Mendel) En delinltlva.. se a&egura ron creoes Que cOOi! g.-meto .-.c:ibc difer<Jn~ m;.Jteri<'!l genlitieo; ost<'l varittbilk:litd t t Of fundamew uo del pollmotfismo gentioo, CIJYO& detalles y con&eeuencia& se estvdian m<& adeli'lnte (tem<~ 26)
Se&rt88C in indC'(lerwlicnte dt!' los c:romO!>Omas en la mciosis

llalie~u.-.un~fiiii!Ook -~llllilrl<.'l.'ll
J porwdf\'JO- ~(<k 1. 1J 1\'!fltn..!lw~J
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1 gome1ocllo ~:.~o ~ X
f~luloitll) ~k~ ud:pm.ljc'ol.<' ole lo lemlrs

P'l"" d: ~rna (c-W> fw p prop~ Jl(lr \lo:.,.lel c. ~u ~,.e)" ok la~liln)
meiOSIS 1
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+ + + + ~ ~~ ~\lfl.,J~\IU J l\llij 1~\lil 1 1 \1 11 1~\lft ~~\Ir Q

f~ 8 ~~n ~dCDdc b kfblir.tcin por mi~rnupmelll. Si q, ronilkr~ clr.x.d J.c JI'KWodidH., J.- ""'~ -sMi ~y llUI!rt 11.'1) 8 ~p111o:1010 - -"""'") t p:o:o;iblt:o & - " " ' f - . lol ;uNb, . ~.k t..s ~ ~onlllilllto...II(IM'f,cn el ~ 1 ~blo ~~ feiiiC'IIino. olu. 'JQoll;<ollt)nf.l dt ~iblc t~JM(K. Pct tJnt~ .;u loulllfiii(Jo, 2 1 :~m.,.;~ y 11-
f!jptnnMO~. a. J1 ! c igotos poaibiiiO:a<l~1 oe ea<1a ~ oe gameto) +

QO..Y "" 1111$1110
"
<:"
1 1 1 Fertilizacin (con u mismo gameto}
d' "" mi)ll)() 6\'0do, ,; d MMril.lf
ti tlllnlc>M('JJ b un 6-. ulor;

t~I'IIIMOl~
I'O,.bf,.,
106
CtCLO CELULAR
9.4.2.4
Recombinacin meitica
Durante la profase e la melosis 1 (Profase 1) llene ligar un prooeeo de gran ITascenoeocla en cuanto a aa. ttereneio y a la generacin de la diversaclad gentka de cada lndllftduo: se trata de la reeombltutcl6n mel6tiea, o simotem&nle reeombinaeln. Los detalles de este prooeso no se tratan aqul, pero bscamente consiste en 61 ~atll'1t.levWO. o ir.tetearnbio de regiones de OHA entre cromtidas de los dos cromosomas homlogos (es decir, nunca 1\ay recombinacin entre cromA1idas de distinto par). De ahl que se llame tambin reeomblnaciOn homOloga.
~
-...
9.5
UNIN DE LOS GAMETOS HAPLOIDES DURANTE LA FECUNDACIN
Cuando los Oot; 9<"met0$ {n , C) w ~.~nen en la focu ndttc:in, el pronUeteo ~(tic) del etl)enn<'l~~ te fu~ oon efpronUdeO hembra del vulO, mbinatiCJO sus doS gef"'l'nas hapiOides pata dar un geootns 2n, 2C en ta clula hueYO o ~. lttta, M i 13 prim+en'l e611A3 ~iea l)fOI)IarTifH'te diCha. Como 1.81, ootra en la fase G1 y poS1erlores de la intOrfMe A )l)rbf <Jet Cig()IO se letman en dellr.tlve IOda9 las cUas somticas. Et mecanismo que rige la tranSiormac:::tOn de una simple CUa. el cigoto, en un h:Vvlduo coostitll)'e un tema de groo Inters biolgico. casi totalmente desoonocldo desde el punco de vista molecular. Tras mltiples divisiones oelulates, se origina~ amasijo gtlbular de d!lutas ett~bOOf\allas, 1M cuales se auiOOfglanlzan y especializan hasta tormar un fant&tioo oonjun1o de clulas (220.000 ~es). subdivididas en ca<si 250 familias dif9ren1es. ~da una oon untt h.lneiQn y di:;po$icin concnKa&. en las di&bnt; QlructvrM (081l)JO, ops, 1'\arit, razn, ele.) del orga.Mmo oompleto. la Biologf.a del Oo$011't011o os un QlmpO dO "div~ invesligac:O'I y en tos llllimos alios s.e Nn aiSlado genes <Jte oontrolan, por ejemplo. la diSQO&ieln d~tral o defed'laflzqulerda de algunos f'9CW'I06: sin etl'lbcw'go. an estarl\06 lejos de oonocer loe mecanismos moleculare3 que gooornan la Qtganognesls.
9.6
RESUMEN INTEGRADO
Para tenninar, el &~guiente esquoma re&v"'- fO$ di$1inl0$ poeosos $$1udi~. roeogionelo de una forma unilie:KI3 los cambios en la camidad de m{ltOti811 ~iO> q.e sutte le clula durante m procesos de tecundadn. divisin
meitice y mhbca y ciclo celular.
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INTFRFASI
_ _,...
G0 rG,
o,
MitOSIS
Tema 10
Organizacin del genoma eucaritico

10.1 Complejidad d el genoma euc.-riOtic:o ........................................... ~............................................................. 10.2 ONA de copia nica, &imple o no repetitivo ................................. - ............................................................. 10.3 Ot.IA repetitivo ....................., ,, ,, ,, ,, ,,,,_,,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,,~.- ....................................~.. ,.,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,.,,.. ,,,,,,,, ...... 10.3 .1 OtilA repetivo CO(I!fic.an1c ,_,., .....,.,_,.,.,_,., ....... , ., .,.,.,_,_,_,_,., --, ... .,_,_,_,_,_,_,_, 10.3.1.1 ONAtepetltivocodificanleagrupado ..................................................... .... a) Familia& 9fuc.as clsicas ............... -------...,_,_,_ .,,_ .....,,._,_,_,_ ,_ ,_,_,_,_,_,.,.,._,_,_ , _,_, b) Familias molbgnic;as de get~91> agrupados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . 10. 1 1.2 ONA ~tilivo <:Odirleat'l(e diS()et'SO: famT131$ molligrw:a;$ ~ gene <ii$PCr$0$ , 10.1.2 OHA repebliVO no eoc:lincante - ---.. ------- ........ ,..,_,_,_, ... ----.. -......... ------------------ 10.1 2.1 ONAaltamente epetl!lvoyagrupacJO. ONAsatlitt!. .......................... ------ 10. 1 1.2 ONA mooeractameMe epelltlvo y <Rsper'o ,.,_,_,_,_. ----- ... -----------.. ---a) Bloques dispersos oe repetiCIOnes et1 lndem. ONA 11*\Sa!dlite y DNA ~rosatlile. b} Re;>eelt~ones dispersas: SIN Es y UNEs ,._,_ ,_ , ,.,.,_,_,_,,........................,.,_,.,.,._,.,_ ,_ ,_ ,_,_, 10.4 Estudio ex.pe l'llental de la complejidad en el genoma de e~ riotas ...,,,__,,, ,~...................................... 107 108 109 110 110 110
1 11
112 113 113 114 114 114
115
En pr oeal"iotas. prc:Uc&IYIE!f'lte tooo el OHA eJCiSte en torma <le copla tlnica y codifica ptO(Iuetos gentCO$ (protena$ y RNAs). Sin en'Cargo. esto no se cumple en et get~oma nuclear de eu<:at iotas. pot ejemplo, se Cillcolet 01.-e slo 100 Mb del 1ota1 de 3.300 Mb del genoma humano haploide son codificantes. Adems. el genoma eucarll.lco se caracteriza por la repetian 00 secuencias. El objetivo de e&te lema es. por lento, plantear esla distincin entre DNA <1e oopta Utl.iCa y ONA repetitivo y est\ldiar con detalle es.le UltJmo en e1 genom.a humano. El carcter codifiCSnte. aunque se InCluye Wmbin aqul, se c:ompr~ mop en temas po:s\etior-es. al esl\ldiar la expresin g6r.ca (lnlnscripc~n, madl.wacln y
~<lu~Xin) . LOS aspe.ctO$ CKpem'IOnlalos que Mn permii:IOO la demostracin de la ~ncia de OHA repe1itivo et1 el genom<'l euearit<o st OOscrixtn al fin;al del capitulo, Ba$ndose en ~a esta a1JormaC16n. &e pocfnl abordar mas eelan.te so apllcaciOn. a ptO()Iem&$l:liOW!<inol()giOOs e.\ general y Clinieos en pMictA<w
10.1 COMPLEJIDAD DEL GENOMA EUCARITICO

la presen~ de ONA repebtivo da lugar al concepto de "~mptetida d" del genoma. E-ste trm~r'IO se delil'le c:orno 1& S\M'I"l& <le tMWIOS (Pb) de tOdas sus secv&nei'$ <!iierorttes (e$ decir, l<ts socuenaas repe:bdas se 001'\Jabilzan s6b una vez). Ett consecue.ncla, para un tamar.o <le ge_noma dedO, a mayor gr&CIO <le ropcticin, menor oomplejidOO".
l::!9.Jj: L8 Interpretacin de eele trmno se puede prestar a COI'IfusiOI'I, pues frocuentemc;nte so U$<1 con la acepCIn oomn de la palabra complejidad, que puede parecer <:OI'Ittarla a; la defiOI'I Mteri(n A$i, un 900oma <:On gran nUmero de seooencias repetidas es eparentemen1e ms complejO, ~o por oeftl'lic::.)fl su ~oomptej~ ~menor. P...,-a e<viler confvsione:s, se usar entreoomiltado cuando se rellera ata OO!lnldn especiftca dac:la.
Para et estUGIIo oe ta ~complejidad del ge~a; numano, 6ste PJIIKIC diOOirse en <tis004as categorias de ONA en funCiOn de su rel)f!(IIW!dao y su <:arder ooei'licante.
108
ORGANiZACIN DEl GENOMA EUCARITICO
I)NA do
Rcguladot (c:oturola la c-:<pttsin del gen)

No orxhlk<~nlc
copia nica
Hlmcin ckS<:onoctdll)
lntroocs. o 0:-..IA inlrsgtnico Hmcn:slado dentro de los gcnl':S)

I>NA imcrgCmto (~pura los geDt:lll
gr
u dol Gt:ncs rt-~ido,: en uindcm pll F1umli~s mvhtgnt.:~~ 11gru~as
Otspc.'f.so: Familius multigbu~s <hs~rw.s

Agrupado (en regiones. bct~-tocromlitKil~)~ Repctl~lODoC:S C'U lAndcm )' AJtamcmc rcp<"tilh'{) toN/\ ~lhtt~)
DNA
n:pl!lit\'t)
l;l)di(KllnlO:
'"
Rll'lqiK'!I dispi:t'l!M d'l! K f"':llttOnocll o."fl li nckm
Minisau~lncs
Oispcr.so (pof todo d tcoom=l) y \tod.-.dllmentc n:-pctiti\O

LJNI!: ~~'U~11eiils KptJ y c~nu,
Ocnoma ll~X1rar hutnano
G"'oont;a rmll'l.:tlndr"' fmmaoo

165 kb \.'tlunu molinla c;trCnlar.
JJOO.OOO kb t'f'l 2J moJCcul.as hnealcs. 2 C\lpta." por clula diploidc.

11Jlf1)'1.
100.000 gdiC'.S
milt): do: oopiJ;S pOr <.:.Mu.. J7 g-.omlt
,.,.,... lriK t>if~- rco" m"t...

y dir..,-.,. ~ '"" """"'")
A dlterencaa del nuclear. et genoma de lCl milooonda, de tatnar.o muy pequel\o ( 16.569 pb en huma,no&. 200,000
'VE!Oe!llftleru al genoma nuclear tlaploic:lt), esti 1~ pot DMA oodJ'tcanle casi en su totalidad.
10.2 DNA DE COPIA NICA, SIMPLE O NO REPETITIVO

COttsiJcuye la mayot pene oel genoma. <~t~nquo en un., prOpc>rei(ln V\lri~da depet'ldiendo del tlpo de Otganls.mo (100% en procanotas, 80% en eue&nOia$ inl'&iores, 50-70%. en animales ~rlores). Parte de esle DMA (-6%) COOS!Jtvye tas secuentla$ de gonoa. ~ O()dilicaalos A:NAs '1 protefnas celulares: o tra parte (--5%) es rc~~PQM~ dot OOfltrol de la oxprMiOn de es:!S secuenaas, mentras que eJ reslo. mayoritario (-60%), .S DNA no (;Odfleante. cuya
funcin, si existe.~$ se c:oooce.

El OHA de OOilM sencilla fue <:On$iderado 4ut'Btl"' mucho uempo oomo responsable nlco del conceptO cl5100 de 90n; hoy" $ilbct que tlllmbi6n una pequena pana del ONA tepetJI!vo fOtTI\8 algunos genes. eucanck:o6, <:Omo se-~
ONA REPElrTNO
109
a Q)n!Jnuacin EJ ootlc.GPIO dO gen avnQvt M $Ufri(S() unn grt~n OVOiuciQn en ~riotO\s, ()3la M08f'5e ms corl'lQicado y con mUI!Jt)los COI'l'lponetltos. s. ~ue definiet\do bajO un cM&rio es1ridamente funaonal. sJempre en relacin con la transmis-n de l<l tnJormtaoin dosdo ONA a RNA y ck.rsdo mRNA a pro~int's Convet:l~o. un gen~ itQ~.~ttlh: rogi6n 00 ONA <)1)8 oompron<'e. POr un &ld<l. ' - $eCI.It~f e$1r~.s. que se lr&n$Cri~:>tn eltCIU$1-V;)mente ~ RNA (rogi6n estructvraf do genes de IRNA y rRNA) o ()(en se ttM$Crlben en ~,.~n mRNA QIJC 3 $u vn d~ t~,.~gar a 1,1n<t Potoino. y I)Or el otro 1<'1$ te(:t*J)(f;')f ~gutadQ.r3.s, que actUM en aMbOS casos controlando la transetlpeiOt'l de aas regiOnes ett:r\Jetumle$ El estucio detallado de las caractetisbe89 de tos genes eucar10Ucos se <feia pera temas postertOfes, cuanoo se analiCe
su expresaOn.
Genes pnm
RNA:
RNA
Genes p..1rn protcina.

~ lnlnSoeben 11
cxdus1~1nnC'nlc ~ li'UJtSnibt:tt ;a
mRNA y s~lrOOtn
rc!!in
ro.g.tn
regin
1\ltUI~ - -
ro.-gin
n!guladortl
"".e_"' -''"-"'-'- -
--""~ - -"'"e" -' '' --
I.II'<A~
........... lt"-'
rRN ,\
10.3 DNA REPETITIVO

Las secuencias de ONA. que aparecen en copias mOftiples, o ONA repetitrvo, cons.tlwyen entre un 20 y un 50% d&l 10ta1 del genoma humano, segn a1.110res. Esta abundancla es la e<ncterisbC8 de4eJmlnante oe la enorme oomple)lci8d"' del ONA eucanblico. Las secuencia& repebdas, llamadas u nidades de repetldn o ~ple.mente repeUeloneos, tler.en lamai'lo$ diYIJfSos y cada una se encuentra 00 torma idntica o casi dntiC8 muchas veces en el genoma. Esta di;t~in puodo Mt on form;a d:isporn POr todo .t genoma. entremezcladas Q)n las secuencias de copra Uruca, o l)if!,n en form11 3grupad:a,b:(l!i:cadtl en rOQIIOne$ QO~~tretas del eromosomt'l En ambo$ ca&O$, el nmero de c:op~as de la unicJad de repetJCIOn varia desde unos c.entos o miles (ONA moderadamente re~titivo } h:lsto e-tif'I'O$ (le rnilc:l$ (ONA :altamente repetitivo). es.~o ooineiOe en ""'-'ChO$ C<'l$0$ con un~ dislrib1.1ei6n en rormo. di:;POI1S<t y agrupada.
respecclvamente.
"umd;t.j !k l'q)C1t~ >n 'fC'J'<'h~CilYt. de <1 .. ll\ "'
l:I!Nf'l<,... pc:-j
{j
rt'
'\"''' landtlf'
"blv;.x.. dt to:p.-t.~vnt~ ~r11pu.d.b. UM.l)a~cntc-.. n'l'l:w..,); tllmaflo<kl bl(\111~' : ' f!b
una parte d(ll ONA repetitivO tiene ~tor eodifi-C<1ntt. e:s decir. contiene la ink>nnacin para e)Q)tesar un I)(OduC1o funcional (RNA o prote-ina). Para el resto <st DNA reQetiliYO no $C tonoce una funcin clara: alguno posiblemente ooncrlbuya a manteoe~la estructura de los cromoSOtnas mienlfas Que st t\3 llegado ., propontf que una parte sea DNA ctlatana o DNA basuf8, 1.1'1 ves1Jglo fWQIIJI!vo .sin tuncion iletual. Finalment . debe de<staca~Se que algvnas de las secuenCia& repetidas no eodlficentes (COt'lcretamente, 1M denonW\.adas ITWli$8161ltes y micro$0l~litc$). aun con f\.I'ICI6n desconocida, tienen gran relevancia aplicada en pruebas ot klentffit<"lan y esl\ldios f.amilitarM . debido a su variabilidad entre r~dwiduos.
La repe!itividad del DNA tiene probnblemenle: un ongen 9\'olubvo Por vn lado. las repetiCiones agrupadas :~ueden
surgw por errores en ta tepllcaclon o en la recon'laCIOn genEtuca. Po otro, ta s.e()o3r<lCin enlt9 repebcione5 dit;persas puede proceder de van&Joeaeiones o tt&r\SposiCIOfl~ CIO<ISOmieas.
110
ORGANIZACtN DEL GENOMA EUCARITICO
10.3.1 DNA repetitivo codificante

Se le llama tambif'l OHA repetitivo funcklnaJ , pues klrma genes que .se elq)f'eSan (aunque no todos, como se Su 1amano se esllma entre el 1 0 y el15% del genoma.Apweoe en forma de "familiBS de genes. CU)'OS miembros se caractenzan pcw su homologla, al haber&e origlln.ldo medfante dup(icac:ione& (pllg~ 367) y vari<tclones de un gen
ver ~
ance51ral
Tipos de DNA repttilivo codilic:mlc
y ejemplos camclcriSiicos:
lli.stt~
l. Aj;lupodo: a) F~nul ias gCnicus dsic<.as o oonsc" 'lldas. con ~l-nts n:pc:d do!i en t:indon
\4UI."'IPIII \111 $lio) jp~\11) lk ~111 di: $t'i!10dlfU, 4 dti. 'W. ~~ O:llfldll
J!lllt1,.,'11m(nk -.1&1~ ki que
$t ~,.,_ oJo . . 1\'f'l'UC'!Illll'l b) Fwrubas mulugC:niCDs ~n gencs. llgrup<~d(l<(l

~itUIIIIIIU11 loaJil!XIOIIr\U'S JIf1Cl!Sdd [i.'IIIIIIUip:nl Wl nb:II ron l;tt "tu<t~ OOIImlnm:~t~ ~ lotiomtncao) Sus "lld~IQIICS s:ro.-s.....man ll:)('ll(r -"oi!K>IO!IJI' \ 1rilfll~ p;tudo.~. s~:nt!l tl\l~f )' f,..llk'IIIO,~ dt JC'fttll
..,..a,
tRNAs:
ti{N,\lli
Ej. 1 Ej. l
1111 rdk'M't11 IIYillllll\ll ,.
Jifn(.,.~gl
snR.NAs
Globinas: IILA-1 Ej. 3
SMc. v UfllftMI al~ !le a. rep:uelunu
tY ouu rnuthlil
t\ldolast~
2.
Oispc:~:
Fom11ias muJti.!..CnkaHoo g01cs dJspt.'rtm
'-<lf1'nlll~. ~.u '111111 l. e:il f<:lnlllkla fll,ll" 11" 11111111m1 peucllo de tt(ltiK'I'IIl~:t rf'JWiida por-l(lllo el lc:'OOIIUI (indwtl) e11 ~ dl'i1~1. lJIIC (11M J..:~ 111111 t(ld.li liai<.ullle.
1\<:lina
FcrnLina CWPDfl
10.3.1.1 ONA repetitivo codificant o agrupado

a) Fam#tas
gtmicas clsicas
(;~ncs de hiSil>ns.~
1h
~~~ -C1ooo<.,C,ttp!l>l:l~ ai. WRdml (ll)..tll at. tt~.lonl l!tu wri~
ll!lldao.t 6:: Npt:ll~llio! 1 - ),lllh), '01'11\W..tltlf 5 lllllobdts& ~n. -~~odi~
rllll)f,
~lu.~:~~cotr,n~~)
........ ,, ""!."'"
1ibo:lwnl01
t ubunillt.l Jnnck
~
1
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~llt'nh-~1-ltennu ...-
.:n
11
lciMI'" oJt"-Afo....le
~<;'!11-JII<
1.1 1:1W111 u!"~ d.! 11l~ o\. d01 ~S. ~~"''hf~ ta P'" Mep.:l'l:llrnto: )' lotl u-anKnk 1 -pn:-,ltNA ~IHM~ i ~-.. ljuc.S. hl!lll' a Ufllllllro k.'A -~~~~~~(CJIC ......... iumu
j\ltll' de t.. oulnonldad pllllndc okl ,,~""11\.l)
;
(..,_,r._..,c,.
o.. ...
r ...,..IUIIQai ..~ """' lo~tpell~i$lb.

f.xm.- pnc dd predUilA. J1C1m IW dc:'ll KNA CIUillltlti_L
oqio)A_,~n ~tl'll'l{7.7 ~1);
Al WIIJIIOI~ tiC.w)Cd(t(IO.::H l Mb)te k rOS.\ i p!lf ...,,.. !\ rboJWcnwn
no 1m1toeri1 11.
DNA . , <difiAIIIf)
u.n.
ri)'<A " n~A ~-~
~
sl}(q{\~t l(pctiO;Jtonoo e11 1 W:m... ~
a ~rl(lo o.ornwe..,
4fllWl cos!"iw: ~ "'-'"'''' .:ou rq>urti~ ~ lw' ,.~ ll}.l-&,.l f)l,l2'1 n s.'C'II oktR.,.A ~S 1:~1cn ~~ trlll-.rlll 1, uunlllcn n'ltetldo (Q lalodt. ( IIM\..l(ilo JI '-''1'".,, q 111 llil'l'"-"' 1
\""-'*'"'..
..
ONA REPETITIVO
111
Contienen $rt!COOilCit:l$ r e pclidV$ que codirgn un mismo RNA o proloin<'. que puede asl Sllltetu:arse con rapdez y
en gran candad. Son efetnPIOs caJactlisticos los gonot> do histonas y los de RNA OOosmioo. productos ambos que la t':lula necesita en gran cantidad {feoulese cue tas hi!ltooas debtin sintetW.r~ r*ptdMtente en &a f~sc S (!el Clc:lo celular, para asooiane at nuevo ONA prooe<letlte de la replicaciOn, y~ rANA ~e ei 75% del lolnl de RNA QOi.ll.<~r}
b) Famtlfas mulltgl)/cas de genes agrupados

A (lf~naoa dct \3$ Mtcnofo$, los m1cmbto$ ~ C41<.1<1 f.lm11ia son genc:s con m<~yor dwaW<:~ad e $0CUE!n~. $$ pueden loclulf en esle grupo ~tes tipos de familias:
Aqullas 00/'1 flOmOIOgla slo en parte de la setue(ICI:l <!e ONA, que dt\ lugar a prote-il'ia!l OOf\ gntn(lc:s rogionos 6o secuencia y estructura comunes {dominios). Familias OOfl homologia escasa en &as secuenOI.'lS del ONA, lo que genera prote'lnas con peqt.Je"<>S rnot1vo.s comunes. cada uno de pooo9 amtoo.1el00s Gttll'ld(!s "superfamitlas"", COt'l muy (Sflil homQiogl.;t tn la ~io de' ONA y pQt" t.'mlo, crn li! de las protan<~~S. a pesar oe lo cual OSias mantlenoo una ~~mlldud esuuct>JNII (en parte de su molCula, doltln'IU)S O()rnu~) y utli) relac.On- funcional. los genes que fomlan cada ~amma parecen estar relaciOnados e\/Oiut!Varne-:Me W<> mfl$ diSiantes entte si que los membros 0001pof"entes de las famaas anteriores
Familia.; de gcnC$ humanO$ dc la.o; csdena!l: a y fl de td\lbirw :
- - - - -- -
f11miliu ~ka d~: lu (-glubitu~ en i:l cwm1~11llll 1(i
~ D
fnmi\ia ~1<;;1 \lt il lhtltobul:l

t.:t.ot-mu ~ p, 8 , Y\ "tr; y r. > ' ('>cudogfu th
y f'W'Udog_~:ne~ u . )' ( 1)
(1\ot;ti.-
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112
ORGANIZACIN DEL GENOMA EUCARITtCO
Corno consecuencia de lOs ptocesos eVOIIJ,ivos que dan lugar a familias multlgnlcas, aparooen oon frecuencia en enas miembros coo caraaerlstlcas d1feronclale6: Coplas de gene-s ( Yarlantes) con ~as diferencias de secuencia. que codifican prodt.JCtos Qrioos funcionales pero de caracteristicasligoramente distintas (pOr ojollll)lo, difefenciM en ~;...~ on.vmMie&. p,ttl"tllntlros cin6tieOS .specifiCid~d por ~Vslr..'lto, ;~f~nidnd por su ligandq, ~c.) , Es comUn que se &eliYe de forma alterna1iva la expresin
<J. un;a u otr<' v;J~anle en funo&'l <te1 estadio de desanollo, de dlfefetlclacln celular. t(!Ode tejido ... Puudogenes. se aplica es.te ttmlno (abre~Aado como 'fl) a coplas lnacdvas de un gen, es decir, que nunca se e.,Jcpresan, o que aun expresndose no son 1\lncionales. Generalmente, la lnaaivacl6n &e ha producido por
aeurnulaeiOf\ de mutaCiones durante la evolucin en b QUe
iniCialmente era un duplicado del pse!J098ne&. en fmociQn de

e'YOh.JIM>,
Existen tipos diversos (t so CJCPro~n. si suftet~ procesamiento PO$lrancripeion81, 3$1 0011"10 do su origen
oen
s.
Gonos ttunclldtJS: se ltata de oopla9 inoompielas del gen, por l)eficJa de una regln sii!Jada en LriO de tos ex.1remos (5' o 3'}. Fntgm~rrtos M ~l!'s: en este caso se conserva slo ~ porc:iOn del interiot de la secuencia del gen (&e 1\an perci:lo ambos edremos). Obviamente, slo las oopias idnticas (famJi&s dil$ieas) y la$ varlantb$ Or)tlduC*' a ptOOuCIOS gnioos flJneiOf\aleos, mlenttes que 106 pseudogenes. genes truncado& y fr<9"'I'IIO$ (le; gonn paroo.n 110r vestigiOs 9\'0iutivos
sin l'unan ectuaL l06 genes de la globin~ constillJyon \1110 de lOS cjel"r(llos Ms representallvos de familias ndlgnlcas con geoos agrupados, implicada en uno fundn lttn imi)OI'Iante corno es el transpone de oxigeno en la corriente sangulnea. Su
estvdiQ i~ oonsiclentciol'les e'YOiu!ivas, de Cle98ti'OIIo y dltereneiacln. r~in de la exprein gnice ....
[ n ~~~~~~~ t111pa del dcoa~m11.., hW~oanu n , . bf '<r~l'<
l~ '"t\'f.l~ d\: ('(WIIfl)l del
1 '~' 1..:~ ~prc-d'.'l dr uno u (llrB
-........ !O( ~~~~,._
o;:l ioo o '<XpkSIII(I<C ;,ene do: klhtN.. Adtm.io. en ~ltda ilr;anu
<ort:aM
k>cu f'a1111l us mu
..... ami:\J
c.cta <UJU dtl dC':ioarroll.., ~ Olra>kri;o:a. po.lf t n_,, Pl'f la p l\'lio. "no.:l'l
.k d t(<n.'nl.:5
hetn~bi-.
VCfleS d1 rer(l'llcs
,..
1111 se-- dtpe'Ddiendu <k- 1 1 e111p=; de dtsamlll> y <tri * '
P.<t .. Ubf l(~)
::::,.
HbA4ildullll)
..:;:: .
Ecar a de' dr~rrollo>
y 6fw.!nl ~ndc
~ .IUltcU TMio
las t lob.lnas
l~mbri( rn
Genes que se c~prc:sun c:n la famclia gC'tt.icocde 1 ;~ 0 $1t)bim (en el cromosooaa 16)
<nQ que se ..:xpresan en la f.amili3 g~nica de la 3-g.lobtna (en el Cf'OIOOSOO'I3 11)
l~emogk>bii!OI(S)
sintccimdll(s)
(saco \'itdioo)
" ~ t.::2 Un1 11 n ..

v - O
\b_)'(Jritlroa "t.'lhu""' ~(;.'ell)
_ JI
"" '""
~ l!Jl -M~f.,._lll'll.: :kl!ina
Ji
{J,
r.hooriuri.1: &lobina y
f eto (hgado)' OOw)
1~ '
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'
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,,
M I-
M")'(of'fi.Orl: P:,bina M inori~ lubina
- ~ll:Jl-l
r
Y .. ? t~
,"/. . .
Ac.hll10
(mdula sea )
\b)''lllna: ~hillil a
~-~-
\b)'<lnlam: ttklbi 'll~ ~"' M ill(lnlaria: ~hillil ( 2'>)
li:S!- -
&
fl
\Cay<~rot:otla; .;Jr.J \111Utocarl : ~l'fl
1!'
M lfiOrilarin tt:IS1
Mayuri~. ~Y!
/> rT'
Jj, Zl
MliJUOII!nt:
M onQriutu.. u
1t
J
10.3.1.2 ONA repetitivo codificante disperso: familias multlgnlcas de genos dispersos

Mienlr.l$ qvet en las familias Mltlgenlcas ameriore las ro~ic:iQnO$ 110 disponen agrupadas. prxlmas en te secuencia linet~l del genorna. en otras 106 genes <PJ6 forman la f~milia ((:(l()iaS iOnbCas, variantes. pseudogenes ...) se locafll:an <fiO fQtma dispersa por el genoma. a mrtnudO incluso en cromosomas dlsllntos.. Entre e518s familia$ w el'louerl(t8n genes que oodifl~n proteinas de i'IJI'Ic::iOf'oeS divetaa&: enzi'nticas. reguladortt$. <Jc Mml."loenarnieMo. estructurales .-e PQf l)jef'nC)Io. ta lamlia de alekllasa comprend 3 gono$ fur.:ioni!MS y 2 pseooogenes. repartidO& en 5 cromo$0m;a$; los genes de ectlna fonnan otra femili<'l con 4 genes y l."ll menos 16 pseudogeneS.
ONA REPETITIVO
113
10.3.2
ONA repetitivo no codificante
Esca es la fracctn del genoma a la que el trmino DNA ropetJtivo se teflere ele lonna mas MbiMtl Su lam31\0 se esW'I'Ia entre Uf'l 20 y un 40% del DNA gMOmico total. Como ya se ha indicado, se subdavlde en dos cacegorlas: e1 rnodcrOO;:trnon!c repetitivo, que ~ ubic-.t~ en fQmlt' disper&a, y el alumente repeiJitYO, que adamas es agrupaoo Su <'islfobuCi6n gener31 en 01 genoma I)Vt(kt ropresent.<ne gr.ificamente oomo w muestra en la figura, para dos cromosomas reptesenl.atlvos.
!ln)(l\'rnohm~o:nt.: rcp."11tno
y di~f10 l)(lr uldocl i C:II(IIl'lll , .;1llfC'JIX'X'bdc<m i'l L>NA de copu Utua)
ONA n:~uno d~ptr""
1),.~ 1pnr- w.:ll
\lod('t'\loJin"' "'* ~IJ\"hhOJ
~.cn~~~m)
i5
<
Rc110:Uttl"nc.<
o.lb{lf.'"'b
10.3.2.1 DNA altamente
rep<~titivo
y agrupado: DNA satlite
Supone entre un 1 0 y un 30%~ ge:nom<"!, y se le llama tambin ONA repetitivo en 18ndem. No~ confuf'lC.htSe
con el ONA mk~satiJfite y m..cros.,-,'6.Lil~:~ (ambOs COfr(l$W'lden al ONA moderadamente repeotitiYo y disperso, ~9 114) ni
con lOs sar.Nlfes CtOmo.smiOO$, l&s peq~as mti$M do croma:bna que forman el extremo oe lOS ~zos OMO$ de ~tn CtOMOSoma acrocntrleo (Pg. 88).
Este bpo de ONA est tonnaoo por u'*"BC!es oe pequel\o 13m<'lo (250 pb} repelidas en tndem entre miles y utl milln de \'eteS. con lo qoe el bloque de repedcin abarca cientos <Je k:b o induso \'ar\3s Mb. Tambin es caracterisllca su toealiz.aein agruptd" en 1~ espocffiOO& de \'arios cromosoma!!, c::orrespo~10$ (1 lo~ regi ones heteroeromauea-s. prineiparmet~te et1 torno al oet"ltr6mcro y en los ~ros Se oonooe el papel de es1e ONA S<Jill!4 on 1 35 regiomn telomricas (pgs. 92 y 157), peto an no su f1Jt~Ci6n eaclo en el 01Mtr6mero. El ~bre de DNA f.t~t6Jil~:~ tiene oo origen metodolgico: debido a su ana tasa de repebci6n, las reglones de este tipo <fe ONA poseet~ una 00MP0$1Ci0n de ba:se& diferente ata del res1o del genoma. que es rn611 promediada. Cuando el ONA total se fragmenta (por ejcmolo. por fuerzas de ciz.ala) y se analiZa en gradiente$ ese c!Ot'lsi!Sad de CsCI (pg. 137), los fragmentos prooeet\le:$ de ..., tegiones de ONA satlite. que poseen menor cl~$1d3d debido a &u menor contenido en GC. se separan oe la b811'1d3 l)rinQCN'II de ONA li:lrmando 'bandas satlites. Ca!ta Uf'l-3 d~C: elas c:on'tls.ponde a una subfa~ de DNA $Mlitt (l<tles como 1, 2. 3. y P). con disllnta secuencia <le re!*iCin y/o nmero de repeticiones.
114
ORGANIZACIN DEL GENOMA EUCARtn CO
Allitilt 1
ti~; 2 y ) ~~tKiiltt u " lfu,k
2S-4X pb
171 pt.
~o:~U:btc fS
.ek'l~m
(hUIDIIIO.
,,. ,,. "'"'
10.3.2.2 ONA moderadamente repetitivo y disperso

repet!done$ no muy elevi'OO (ontrc tat y 1<f). se S\Jix!Mde en doe ca1egorlas. en funcin de la forma corno &e dlstrbvyen las repeticiorm en ptfmet lugar, algunas secuencias se repiten en tndem fofmando bloQues, los cuaN$ aparecen de fofma dispe:sa por el genoma. El segundo tipo consiste en repeticiones igualmente disponlliiS por IOdo ct
Cotno su nombre indica. e54e tipo de ONA M <lisb'f)uye a lo targo de KldOS lOs cromosomas. con oo nCI'nero de
genomo, pero que t10 se agrupan en blci<Jes.
a) Bloques dispersos de repeticiones en tndem: ONA minisatlte y ONA microsatlte

Se distinguen estos dos IWbgrvpos on funcin del tamafto de la ur.clad de repeticin. Constituyen conjuntamente entte el S y el 15% det genoma Obvia~6. a pesar de la slnilllud de nombre, no deben confuncJir&e con el DNA satlite (pilg.. 113). del <PJe &e difercnci.-n POt estat lOCalizados de lorma <ispersa por et genoma. aunQUCJ se asemcj&n a l en la proM~t~cia clo fOPCtkiones et\ lndem.
t.a impoi'UW'\Cia ptetlca del ONA minisatlite y micro&al.ta8 G'ldiea en su gtan varlabildad entre h:lrviduoa. que permitO utiliZarlo como nwcador molecdaf en medicine forense. pruebas de pa1errldad y dlagostico de enferrnedade& motularet. estas ftl*9clones se describen,. il<lclontJO t'l nablar de polir'nolflsmo gentico (pg. 3M).
a/J DNA mri:mtt!/il(: E.stil formado por repeliciontl$ de 10 a 65 po, tices en G+<C, agrupadas en tnOem formMdO t)loques relativamente grandes. do cioniO$ o miles de repetiCiOfles: esos bloques &e encucnlr..'ln re(*tiOos por lodo el genoma. Algunas do 0$1tts repetiCiones, denominadas "ONA mini$;J~6Iife hip0rvttriltbr6~. se CIWa<:littlz.an por su elevado po!imoffismo (diferencias en secuenaa y nmero de; ~iones). no slo enl!e lndrviduos de una especie. sino inclu&O entre !os dO$ en:m<:J$0(1\81$ hOmiogo& de un indiW:Iuo Sus repe:lieiol"et, de 10 a 24 pb, preserrtan la &eeuen('.ia; cnSenso GGGCAGCANG {donde N represen~ e~ nuelecldo). Este ONA es impottante por !as t~pli~iOnes derivadas de su polimorfismo. principalmente la Ob!endn de nuellas de ONA, donc:le untl sonda para te secuencie oonsen&O puede hibridar P'nulli'lneamenlit oon mOl~ toci ministttCiitos difetenlbs distrb\jck)$ por IOdos ros c:romo$0t'mtll, d:mdo lugar a un esquema o patrn de: hibrid;M;in diferente para <:&ea il'ldllvlduo. a ] J DNA ml('r()Sm i-lite: Se aplica nlc "'rmino OUIII\do la unidad de repelic:in es in'-ior 7 pb. Se presentan ~das en tndem en bloques de ha~0 50 ~ticlones. tambin dist:rbJidos de fofma Oi$petS3 por el genoma. Su polimorsmo &e apliect lgUalmenle paro la obtenciQt\ de huellas genticas. para pruebas de idcntictad y esrudiOs larnlates. Aunque 18$ seclJC'nelas telomrleas se han dasif~eado .-meriOrmente oomo ONA repetitiVO ag"4>00o (ONA satli(e), por su ul)iC:.Ci(ln et1 puntos concretos del cro11'10601'na, algvnos aotores las eonslderan ONA microsatite p<Jr er heeho de rompattir con este eataeterlsticas de tsmalk>, nUmero y disPOsiCin en tOOem de &as repetJCiones.
b) Repeticiones diS(J&rsas: SINEs y UNEs

De nuevo. la klngitt.ld de la 11nidad ~ repeotiein sirve de orilerlo para subdtvidirtas;
~lene un sitio clan<'! P<Wt~ 13 &Mima de restricdn Afu.l Se tr<tiOI et1 reaidacl oe una familia de secuenc:icl$, con oo 85% de hOmologla. que supone I)Or si sola alrededor de un 5% del genoma, de modo que, en promedio, existe una secuencia AlU cada 4 o S kl) Se cree qUI8 bs elementos AJu pueden haberse originaOO ~oh.tlivaomen!e por la ln~rselbn en el de mJI!Jples eopias (f&troposot~~)$) IOmwi8:9 pof transcripci6n inVSa 001 gen de RNA 7SL. un RNA citoplsmico pequel\o (!~CANA) oomponon1o de la pMic.ul8 de recot,OC.tnll'9nto d#l soll$1 (p~. 324). A pesar de la homolog:la (~1001) de Heuencta. las secuencias AIIJ no ejeroet~ '- tuncl6n de este seRNA.
h/) &rm!Jid .as SIN/l': Las siglas proceden e Sllort lnJerspersOO NI.ICIHr E~. elementos nucie.ares di spersos oortos. St Mbl3 oomt:.nmente de unid900-s de 100 a 500 1)1). repelidas ha!lla 20 veces. Sin embargo. el ejemplO ms caraeserl stloo, el oremenco A/u, de 300 pb, aparece en el oenoma humano ~re 500.000 y un milln de \'I)C(I$. Su nol'flbre se debe a que
oenoma
ESTUDIO EXPERIMENTAl DE LA COMPLEJIDAD EN EL GENOMA DE EUCARJOTAS
115
hl) SI!CI~tmcias UNE: En es.le ~&O. se trata de elementO$ nuclear& dispersO$ la.rgos (Long ~ed NucJe8l Elet&&WS}. <:on unid~$ Ckt m3yor l<{lma/10, 9Cf'let<Jimcnte v300$ miles de pb. QVI(t se repiten ha&(a 50.000 veoes en forma dispersa. La princip."tl rn~ LINEen fu'nanos ta constill.lytm 13$ sec:ucncitl$ Kpn , t.ambin llamtldas. L 1 o U N E-1 Se encuentran en
el genoma de 50.000 a 100.000 repeticiones dispersas, oe tatnal\os oomprendi<Sos entr~ 1.4 y 6 ,1 ttb COOa un;.~, dcb.fQ ;.~
$U
divers.iclad.
10.4 ESTUDIO EXPERIMENTAL DE LA COMPLEJIDAD EN EL GENOMA DE EUCARIOTAS

El descubrimienlo y anliSis del ONA tel)t'tibYO Que. como se 1\011 indicado. determina la ~complejidad " del genoma tunaamenta!met~te et1 13!S tk-nicas de reetS<Iciacin del ONA desnaluralizado. np3s Esquematican'leMe. este estuOiO im(llica IJS siguientes c1
eueafltiCO, se ha basado
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Para obtef\et conduSIOI\6:$ 81 oompa:,ar la renaluUIIiU~~Ci6n de dis.tinlo$ tJPo$ de ONA es convernente que ras. molwlas que se reasocian seM de klilgitucJ tegutar Esto se oonSiguo (ei~P<'I 2) f.ragment~no el ONA genm1 oo mediante sonlcaCIOn de la diSOlUcin (ullr~onldos de a!t.a inteosldac:l) o Jta<:it!>nctola pa~r a pre$1rl ~ tr;crV\)5 o. ~ ofloo pequMo. lo <PJe ejeroe fuenas de cizalla ~ fragmentan las largas molc.-as de DNA. tguatmett~e, convienct pcvlir de la misma con08fl(racin de ONA, o en caso conlrario debe oompensarse su vaiOt h::luynCioiQ en 1<~ v<Ui&b4tt Cot, lhrmirw:> dcfini()o 0.1 contiruac;i6n. Lit fiNI$0Ci3cin w analiza (etapa 5) midiendo la f1aco6n numrica de tragmei'IIOs we se Mn rM$0Ci31):), en funcin del tie~ de templado. La proPQtein de DNA de doble hebra se de!(tfm~ espectrolotoo'lttlcamente. o pot otrt'l$ tec:nic<ts <aue <Jircrencien el OHA de hebra sencilla y doble. Como fliemplO de este tipo de esllJdio, se muestnl la escisin de !fes genom~s hiPOtticos. MOCillos (A. By C). de lamal'lodlferente (1, 2 y 4 kb), en fragmen!OS de Igual b'lgltiiCI (1 kb).
t:,:cupodcfd !Aio, p.r.l ti senllflll H;\ ": El poo.>II'KII\~Uhll <k un pa1 <k ll!l~>t'HJ ~~~ pwmf<lil dt' toi O, p!lf kl que 1 copo Ade*"nlldiQ de llb
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F.n h ~!llllur.ll r.le.. :...ca..t. f ~ lt~nc> m)l)f prub.!lbohol:l+l +le> llltcl~),""'"'
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116
ORGANIZACIN DEL GENOMA EUCARITICO
Pata oompensar e1 electo que ltndr14 1;) d:i$11M3 eonoenttacibn 1t11eiM de ONI\ en las llluoe$1f8!1, se IJ98 el proctuciO en lugar del oompo de r~ci6n. r. E$t l)fOdveto se ~noce noona!rnet~te (()niO ..,_.lltfttble Col. la 1epresemadn gr.fica de la clntica do reosoc:;i;Jitin $CJ h;:~co por t$nlo, con ftaoclOn o pot()Onl:.jo te.II$0Ci""do en on:lenada.& y loQaritmo d& Coten ilbsci&M. y te ~:t cotoq(Ji3tmente de las -curvas Cot"
~ xt
Ut ob$oNl)CJIf'l do un:. coneladn inversa entte la pos.cln de la curva de reesoclacin '/la mago.tud del genom<t de partida permllc et empiOO de &o:s curvas. COt para obteflef ttformaan sobre ellamal'lo de un genoma:
~f(ln'K''""~ O:~'>nuntll ck IMi~lll'\'"1>&! l~oatM.I
6; lrn.-.lml"""' ~k <:'II'(':'C) llfo!l\"nle:~~ t""limnllln......,l. All& h'.l.Jro"" ttld!\ 111....-..rC'
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'llllllll!J.:IOQ llllllll ilc I)NA, (_' "'kl <~Me"""' de p(litnl.a

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de: uli pw de ~: 11111)
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flllllccu._ _.dlit
Adems, las cuM$ C4t tiOOen espec:ial lnl!!fea porque eponan tnformac:n caoe~ del c::onlefll()o en DNA ~lvo de un genoma. Esto ts deQ!do a que, para una misma conoemracin de ONA wcal (o. en $1,1 de :feeto. corregida usando la vanable Col), 10$ fr(l!)l'l"leliOS de secuenc.as repetida& em:ten en mayor conoontrOOn OQf 10 que se teasoclan m:s rpidamente. Se .,slr.J primeto e!lta dependencia con un ejemplo simplil'irc<ao, QtMJ parle 00 los Mt~:
Si ~ mc:ulnn lil$]
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... (Tiomoo)
O. torma ~~mil&r. cuando se analizan gcnoml:l$ (e.eles las curvas COl reflejan la pre&enc~et do $CCUttn~s oon distJmO nme> de tepetlciOOE!S. Por ejemplO. P~~'<' dO$ genomas l1p1C0$ de un procariota {E COi) y un ~rlota {humano) M oh$el'va, de acuecdo coo los cn;erte)S de intetJ)reL&cOO expfiCados, que en el primero pr~K:an~e tOCio et ONA O$ de copla (Mfca. mlenlras que ~ tmomO'I ttumano posee un marcado componont0 rcpe1illvo, que se agrupa baJO 10s t&rm.nos 'ONA altamenle 1'9P41lilivo~ y ~oNA nodetedamenle repeblivo..
LII>N1\ J'lllo:.:m\'IU -;r ro:u<.o'll;ill l!'tiCoS\IIX' el de I.XIfllll
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Tema 11
Preparacin de muestras, extraccin y anlisis de cidos nucleicos

11 .1 Obtenc:in y p rep.a r<K.in prel imin.<~r de l;a& mu9$.l101& .............................,.~,............................................. 119 11.1.1 Muestrasdete,dosslidos .................................................. ............... .................. ...... 119 t 1.1.2 Muestras de suspensiones celulares...................................... . . ........ . ..... ................ . . ... . . . .. . . 119
11.1..2. 1 Clulas embrionanas (diagnstico pre-implantaan),_ ,,,..... . . ................ .. . . .. .. . . . . 119

11.1.2.2 Liquldoo lluldoamni6UOO ................ ....................... .......... .................................. 120
121 122 11 .2 Di:tociacin de la mue:tlfa ti sular .......................................................................... H H"""' """""""'""" ' """' 122 11 .3 Separacin de clul as ...... -...........................................................................................................~.... 122 11 .3. 1 So!*aci6n de ~lul3s por m61 0dO$ do $Gidi~T~G;nta00n y centnf~in ... ,.,_ ,_ ,_ ,.... -- - . . 122 11.3.1.1 Centrilugacl6n diletetlcied ..............................,........... .. . .. ...,.,_,.,_,_ ... ,_ ,_ .. --- t 2'2 11.3.1.2 Centnrugaclon en gradiente de den!liclad . .......... . -- .... , , . 124 a) Mtodos de barrera. tef'lt(llugaciOn a tra~ de vo medkl de densidad oonslante ,_ ,_,. 124
H ..... . ..
11. 1 .2.3 Clulas de te,dos o sangre felales .......................... ................................ . ............ 11.1.2.4 Clulas de sangre o mdula sea adultas...... ..... . . . ... . .. ... ...... . ... ... . . . . ........ . . . . 11. 1 2 5 Muer.1ras bucales....................... . ................................................ . ................... 11. 1 2.6 Semen ................ ............................. .............. ............ .......... .......... 11.1 'l.7 Clulas en Ol.llivo , ...................... ............ . . ............ ................... ... ........... t 1.1.3 Muestra& celulares de llquidor. biol6glcor. axtravs~es . . . ... ...... ... ...... ... . . . . . ... ....... . . . . 11.1 3,1 Liquido ccfalorr,qvideo , , , , , , , , , , ...... , . , , ........ ................. ... .......... 11. 1 3 2 Licuidor. o dorr<Jmes 1S4:It'O$O$ .. , , , , ... .. .. .. .. ... ... 11. 1 3.3 Liquido Mieulttr o sinovial .......................... ------- ...... , 11.1 3.4 Mues1f8S bJOIOga:as menos 1\81lituale!l ............... --- .......... . .. .. , ---- - ..
120 120 120 120 121 121 121 121
11 3.3 Separaciones dwecta& de bpoS ~lares .... ............... . . .... n.3.3 .1 Sepa~aciones por afinidad oon partlculas magnlieas... . . ... 11.4 Caraetertueln eefu.lar y medidas de villbi.tldad ............................................ 11 4 1 Ensam de exelu96n,_,_, ,_,_, .......................................................................,.,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_ . . .. . . 11 4.2 Recu~to de c61ulas viaelle$ por R:;orporacin de un marcador .................... .................................. 11.4.3 Et'lsayos por modida de 1~ ful'ltin mgl;;~blic;.;~ ------ ........................ 11 .5 L i si:S de las c.41ul ar. ........................................................................................................................................ 11.8 Prcpa101cfn de fracciones subcetl ul<lrH ..................................................................................................... 11.7 Tnttamientos adicional~ o complementarios .................. , . ~~""""' ""'"' "" '"'"""'"'''"""""'"""""' """'.. 11.8 Extraeetn de $leidos n uelcicos por sofubilidi!d en f;:a59r. i nmi seibles ..................................................... 11.8 .1 EJCIJ'30Ci0n <!el ONA ........ ,, ..........., ...... , , .... , , , ... ......................................................... .,, _ , _, . . 11 8 2 Exlti!otin del RNA , , ........ ,,,,,,,, ....... .................. .................................... ------ 11.9 PurlflcaeJn de eldos nucteleos f)Ot precipitacin salina d ifercnci01l ..................................................... 11.10 Recogida y con:&eNaeln de 1 41& muet&trs .................................................................................................. 11.11 Procedimientos alter natlv&S: ex:trac:c:IOn o anAlisis d i rtc:-tos de-l ONA ...................................................... 11.12 Fraccionamiento d& cidos nuc&eleos ...................................................................... 11.12.1 Ullraoentrl!ugaein ......... . ----, ................... ............ .. ............................. _ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_ , --- 11. 12.1. 1 CentrlfugaeiOt'l zonal .................... .. ,..,_ ,_ ,_,.,_,.,... . ........,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_,.,.,............. 11 12.1.2 CemrifugaOOn l&oplcnlca..................... . . . . ........ . -------.................... 11. 122 Eloctrofores.s , ... ..................................................... ......... _,_, -----.............. -- 11 t2 2. 1Soporte para la electrofore&e&....... ........... . ............ -- _ ,_ ,_ ,_ ,_,., 11.12.2.2 Detcoci6n dol ONA tras su separacin ('revetado1 ............ - , --- , -- -- 11. 12 2.3 Cclltrac:in de la e&ecb'oloresi& para el clculO CleltaMat'IO de 10$ fr<tQmeniO$ de ONA ..... 11. 12 2.4 e toctroforesis de campo l)l.ftante ......... .......................... ,_ ,_ ,_,_,_,_ 11.12.3 M~ CrOm(ltogrilfiCOS ............................................................. ,_ ,_ ,_,. ---
H .................... . . . . . . . .. . .. . . . . .. . . . . .
b) Centrilugacin zor\811 o de velocidad de sedimef'lta<:iO n 124 e) Centrifugacin isoplcttiC& o de equllbtlo <le $#XIlmentaci6n ... -------........... --- 124 11.3.1.3 Elt.rlrlacin cenlrifuga ............................ -----" ---------. 12.$ 11 .3.2 CaracterlzaOOn y seP9facl6n de e&lula!l pot citolluc ,imeltit\ de flt~jo . - . ,_, . . 126
127
128 129 129
130 131
13'2
133 133 13-4
134
134
135 13$ 135 136
< n H. . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
136 136
13 7 13 7
138 138
138
138 139
11 8
PREPARACIN DE MUESTRAS, EXTRACCIN Y AHU S IS DE CIDOS NUCLEICOS
Las teenlet'ls <flerivac)8$ <'e la BiOiogia Molecular e 1~ GentiCa se u!lllzan de IOrma ~e tanto oon fines b!lieos como ~. lundemeM&Imente el dlagnslklo Cllnloo, penlendo de muestra& biolgica& muy dlvei'M8. Elo requiere &a e.~W<~ocin y analisis de RNA y ONA y,.., su easo. ~lnas u otras m&eromol&evlas. TO<IO$ es10$ ..spot'O:~, oomo en tOdo pnx;:e$0 iltltllitico, M desarrollan en tres fases:
Prc.anotiti ca. deSde la obtenciOO y prepat8CIM preliminar de la muestra inlciall\asta su transporte &llabotatorio. A nlitic;a o c1e aplieae'l ese prooec:!imietlaos para la extraccin de lOs cidos nudeicos.. sobte los que se realiza
IVOOO Cl aMiiSiS t*'>qui mlc:o-geoeiiOO prO(liat'l"'ef\le dicho: 1oma y tratamienlO de datos, y recogida de resultados en
un infonne.
Postana11tica o de valld&dn tcnica del lnfotme anarrdco. Al conjunlo de esta fase y la preanalftica se le llama
"fase ecraanalltice~.
Estas fases. hoy dla ooncicionadas por los continuo& avance& lec:nolgi~. in$1rumontaltts. dtt <Mom<ltizaein e lnlormtlcos. han lle9000 a tal estado de dHarrolo que puoden a veon enmNCarnr ti ear6etor CieotiflC:O que SWyaoe a lodo el prooeoso ana!ltico. Dentro del planteamiento dlt e;te libro, corre;ponOit considor&r $01<1monlc y de fOrma l:>feve bs aspeCios esenciales de las fa&es pn:~anatitic<t y (ll'ltllilie.. Lo$ detallO$ con~. descritos en librOS especaall:aos, P*>CCIOS de laboratorio. etc.. SOf1 objeto 00 estvdio ~ico duranlc lOs pooclos de formac:in y de etjereic:io prolesional o c;ientlfiCO en di~sas tweas de labotatorlo. Aw'lque de dificil delimitacin y COI'Menldo (por e;etnplo. a Yeees 50 IMna proceSIJ<IO de 18 M116$tf8 a la pteperadn preliminar, pero otras &e inc:toye en e51e tmWio a la faM anatrtica), ~bt'S tases se nan Integrado aqul, para su descripcin, bajo un GSQIJ8fl'la unificado donde w imcnl<'l revnir todM ltts
Mues1ras tk: ~1Spei1SiOOC$

ttlulan.'S
I'('R
CCIIO'tfu;-.:in ronaJ
clc.-:ll'llftlw.iJ.. Jino$t!
C!l!it'(l~
OBTENCIN Y PREPARAC.C.N PRELIMINAR DE LAS MUESTRAS
119
posibliclades, a\.I"'QUe stas puedan no darse ~ultilneamente on la realidad Se cs.lttbleec ~s.i ~,.~na, $0tic de e~s m&s o menos consecutivas, coneaedas entre si, en las o.aales &e aplican tcnicas nYJY diversas. en ocasiones sencillas y oomunes. a veoos muy complejas y especificas.
11.1 OBTENCIN Y PREPARACIN PRELIMINAR DE LAS MUESTRAS

celular &e obtiene y prepare~ a partir de e'ganos. w,de o fluido& blolgiCXl$. en toocin del obecivo o de ionti~n de .,dividvo$), tipo ~ cCiu!t\ (somtioc<l o 9(1tnwli!l}. tw 00 gcnoma (r-..clo,r o mitooondrial), lipo do c~udiO a re.alizar (secuenCia <!el gMOI'l\8.. genes pr~ctos gr'liOO$), ~e En cu:~tquier caso. clet>en e~rse condiCiOnes que g818flt)Cen ra C<JN<tad de la mue&tra trente a la& <liversas variables q.e ale~an a la fase pre.ooaltica (recogida, arrtiooagulante empleado -en su ca~. rnanipulaaone& para la oonservacin, ttanspof\6, 94(:..) , En ~~. t<t ptept1rttcin prdWnir.. se hbce rlll:lid.,menlc tms 1, obteocoOn (dentro de 1 hOfOI (:OITlO ~imo 24 h). o ,., moostrtl se mnnlienc oonQiel:ldn ~1:1 ~ llog<t al ~torio
La
I'I'JJie$lnl
~o (clflWCO
11.1.1
Clu!M
Muestras de tejidos slidos
NornW~I~nte
se obtienen meocsiante biops.ia (metooo inva.srvo <te teOOgk:Sa. wo condieiOf'les ~rgcas . ele o porCiones de tejiOO de vn or~ismo vivo. oon fine$ diagnOstiCO$). se libeffln oe restos oe ~AQr't. 9r3$3 o
~ji<Sos aoomp<ti\;ao1C$ ClQf lovOOQs con disotvcin $<'!!in;;~ r1$ioJe9C3 fri;J y te envi<en <'11 l<'!borttlorio. segUn los ct'IIOS. rofrigcf"'tldos o oonc:Jelodt't$. pr()(ogi(t(l$ con hielo, niev-t ~rtOniC3 o nitrgeno liQviOO ~ clectin del tejido y ~ de extraocion clepe.~ae de muelles tadores. entte o tros, oonteniao en ONA. tinalidac:t del esbJdio, o neoe-sid&CI de amplillcacl6n por PCR de pequM&s muestras. En ocaSiones se palie de tejidos fijados o de ONA ant.guo
C-aracteristicas generales de 1 3S principales muestras de tejidos y r!)anoS de 3diJitOS

Tejktos tumorales Para analizar marcadores de membrana (glicoprotenas, receptores, etc.), de citosol (receptores hormonales. etc.) y de ncleo (oncogenes)
Rico en ONA (15 ,..grrng); par;;~ cnfermedodCII mct.abliCll& Pobre en DNA (3 f.lgtmg); pata enzlmopatlas
Tctjido hopiltico Tejkjo muscuJar Tej ido i ntostin.al Extensione-s de p~l

R.3i:r: d e pelO Huesos
Tejidos tij:ldos Tejidos Incl uidos en pa.raflna
DNA antiguo (rt$tO$ humanos y onimnlcs) ONA atrap.ado
Pobre en ONA (3 1.19 /mg). Se obtietle de zonas no W!losas CsntiOad mi nma de ONA (0,5 Jl (>l'r<'ti Z); <:on fin$$ foren$CS. dificil do e~~tudia1 Pulpa de los dionl$$ o mdula de ocros hue&OS. El tejido seo &e tntura por mtcxSo$ fisicos
Se debe ellmirw la para,_,a e-mplear.oc> d!solll$'ltes, por ejeml)lo deno o tOiueno lntore& <wquoo16gico y antropolgioo. Debe eV1tarse la contamnaclon por DNA e!Wgeno e inllitliQOf(ls de Tacwo!imerMa (que altGran el anllsls por PCR)
Oesoe h&ee miiiOI'Ie$ <ft ai\Os, L3 rC$IJ'IO vegeWI pertec1o 0$10do
(~baor) m.anti9ne el ONA en
11.1.2
Muestras de suspensiones celulsres
11.1.2.1 Clulas embrionar ias (diagnstico pre-lmplantacln)

El 'I\IIO fertilizado Of%lll'ltt en el Utero l)()r $Vcesfvas mto&is estruauras de 2. y 8 clulas tollpotl!f'ltes (6
OfaSIOmetOS. que forman la mrula) y luego de 16. 32 y 64 olulas plutiPOtente&: esta (l!ima esttucwra se Jama 0/aS"locisto o blastodermo, y a partir de ella se IniCia el desarrollo. Para ObWVt'r Si el embrin es poaOOt de un
ttastomo gentico se puede obteoer DHA ex!tayendo 1 6 2 DlaSt6meros (10 Que clulas ele la mrula).
ta~ vl'Nro J)t'Nntiw)),
no af:ta al desarrollo de las ottas
El bli!$1 odermo P<l$iJ ~ formar una capa extema de c&tulas (lfO/oOfaSlO) y utla mMa oel.llar nterntJ (Of01.stocefe o A \lJ\0$ 5 dias de la fewndaetOn se produce la Wnplal'lladn, cuando e trorOOI:I$10 invade 1iJ pared del endometno (~ re-viste interMmente el Ulero), d<anOO I1.9C1' a la ma<fullllcln de las~ OOrinkas. que penetran en la placenla para permitir la c:a<culatiOn f~l.'ll. Las ~$ de un POlo del blaMocele Gngll'lan bs sacos embrionario y vitelino, rrventras que el res.lO del bla:stocete fortn<'t el embrin, Do 1(1 maS<l oelular que oonst:Jiuye este Ultimo se pueden obtener oUas madre plurlpotentM, de elevadO ttller~ POtencial pewa trasplantes. pues pueden dar lugat en cunJvo a Cf!>llaS especialiZadas O& cti~~tiniOs bpos,
120
PREPARACIH DE M UESTRAS. EXTRACCIN Y ANUSJS DE CIDOS NUCLEI COS
11.1.2.2 Liquido o fluido amni1ico

A partir de la 11 semana de gestacin, el embrin queda protegido al e~r inmerso en el liqu)do amnitico, contenido deniTO de \lna membrana llamada $C11C0 amnitioo o amnio.s. la compoSICin del liquido amn161lco, cuyo
~en llega hasta 1.100 mi a trmrlO, deponde de un equilibrio dinmico de intercambios oon el ie1o y la madre, y oontlene clulas epdeliale<s que apot1an unO& 65 rg ONAIM. la obtencin de una muestra. medlan'e punciOn abdominal a travs de la pared del tero. &e denomina cvnnioceflfe.sis t:&~a se usa a partir de las 14 semanas de ges&acin pata el diagnstico (ln)flatat de anomaliM cromosmicas.. enfemte<l8dc& meUilicas congnilas. defeelos de' desarrollo (in~re;,r: l)u!ITIOtlar oet fetO), estuclk) Clel sexo, ele. LaS muestras del Jt! lfimes1re sirven par~ vt'IIOrttr 1& grtt~tld 00 ltt eril:f'OC)I&$1 0$$ felal y C)fededr etslndrome oe dlllc.Aad resphtofla del neonato.
11.1.2.3 Clulas de tejidos o sangre fetales Como alternativa at lf<pdo amnitico &e vtilizan f1'IIJ8:Siras de ''Ctll0$idadon corin~s . tojiOO fetal procedente del conon (membrana mM o.x\er!\(11 del embrin. Quo corrlal;t<t con la J)l.t'.;;e.n1<t). ;_slils constituyon a, mojor f\Jeolo de ONA
felat
Se obtienen por biopsia a las S..12 sttl'l\!'lnas do gestacin y tlan <'t w tu!IW~ se pueden obtener <ambin muestras de sangre letal, dentto del seno materno, e~eando do9 prooedimlenlos.:
Ltt 1$to$copi8 (m&IOdo similar a la endoseopla, vlido &aMO pera expiOraeiOn como pata lOma de muestras) se utjfza entte las 16 y 21 seManas de gestaclon, pata detetmlnar ~tlas. coagulopatlas. anbsl9 de ceriotipo. etc. Una tcnica alternativa mk sencAa, la ~ocvnfO$iS o f~os4. permite oblcncr $i'lngrc fetal ~lamente del OQfdr'l umbilical a13 ltimestte de e~tazo: sus er~s {ntJcleados) y llnfoci!OS se uUizan para dlagns.lico prenMal Sin interterencias con el lelO.
11.1.2.4 Cl ulas de sangre o mdula sea adultas

las muestras da ungre perifri-ca 60fl las ms empleadas, oomUnmente do $;)ngre ~ (unos 40 J9 ONAJml) recogida sobfe antlcoa!)!Aenle. Se utiliza la fraccin celUlar total o W5 dis(in1os tiPO$, untt &epttr3(k)$ pOr alguno de los mtodos disponibles. en especial la oentrifugacin segUn W5 di'oreneiots <'t t.&m81\o o dcnsi(Uid
""l
Se utilizan tanOn manchas de sangre, QUO se obOenen de $31\gffl fiSiOlgica (l<liM. dedO ... ) secada sobre un papel o canon. o bien <le origen aoc:ien1al (prei'ICiM, 'IOhicPo$. utensilios... ) , La mancha M! raspa y extrae por twvado oon diSOlucin salla Se utilizan par.~ metaboiOP<~ti".. idcntir1C3cin., r.nes JoreMes. etc. Se pueden destacat las Utl}etag G~. P301 diagnbstiOO l'leonatal. y las l8rjelas ele papel FTA. malerial especialmente tratado en el Que se seca la ~. $e lisan .las clulas y se extraen sus componentes. quedando fijado e.xdvsivai'Tl(lnl$ el ONA, Etlllt tllrjetM poseen la ventaja de &u fcil tran;porte y con$tf\';)Ci(ln,
u.& mun1r de mdula 6s.ea rOja (&CIIva en hematopOyesls) se obtienen. bajo ane<5les.ia local. po1 aspiracin mec:i;ln4e 1>4.rndtt rne<Jtd~t. generalmente M el estemr'l o en la cadera, v&llndose para ob&ef'Vaciones citolgica& al micros.eopiO y estudiOs get'lbc:Os e hlslolglcos.
11.1.2.5 Muestras bucales

Los raspados y enjuagU4$ bucales., Obtenidos por m&odo!l no lnvas.Nos. con oepllo suave o algodn y disolucin salina, contionon c::61 ui8S epiteliales de descamaCin oon suflc:lern(e ONA genmico pata &u dMeccln. previa ampliflc:.&oeiOn por PCR La saliva es de uso creciente POI su hu::iidi!d de obWicin (lOMa directa o pre!W!f\Cia sobre la piel. sellos. colilla de clgarrilo. etc.). La& <:lula& eoiteiclles que incorpora. prooedences de descemaciOn. pueden apot1ar cantidad su6clente de ONA (89 ~51" vn<'l 'Cm~ de muescra oon hisopo) peta su anli&is oon mes kwenses o estlldo de la patemiOOd
11.1.2.6 Semen
Contiene millones de eSQerme1ozoides (S..7% del \'Obnen rotal. oon 1.3 pg DMA. POI cltJial) forrn.;u:IO$ on 10& te&ticviO&, n suS()enSiOn en t.W\8 rraoc:l6n liquida de secreciones de la& veskulas semin<~los (50"4 en wtumen), la pslllta (20% en vOlumen). las gtilndvlas bulborrectales y el epididi'no. Se recoge <'t v3M maneras, PQf ejemplo. {il) en prcsetValivo, para estudios de f\lnclonamiento del tracto genital mas~. m3~ de tcrtilidad, etc., (b) por ..spiraein directa de la vagina, para investigadn c:ninal por agresin soxu;'llt. o {e) POr lavado salino de manchas scc&:S en ropa. p.e~. pelO. etc. Las muesttss fte5C85 &e deOOn ana!iarr CIIICCS de 1 h de su recogida. mantenindOlas a te"'*"atura corporal dvranto $U tr3nSI)Ort.e Los espermatoZOiOes se pueden separar del reAO de olvl<rs {QV!tJ incatyon 1a5 <le la vielim;t. en c&sOS de asarlO sexual) me<11ante ISi& d#erencial de sta& oon SOS (doCiocilsull'ato sOdico) y proteinas<~ K
OBTENCIN Y PREPARACIN PREUMINAR OE LAS MUESTRAS
121
11.1.2.7 Clulas en cultivo

las ~lula6 al&ladas o pro08<1enlttS de ~dc.xs u rganos di~<tdO$ M I)UOden ~u!bv'r en medios ~peci:tles El oons:b~uye ver .s~ un <'r~ de o'*OOio i~diente. Ol:'lrt requerimientos espeda!il:aoos en cuanto a equiPO, procedim.etl$0$ sutttatos. niJitlenleS y tactotes <fe eteclrnlenlo, etc. Pueden CLtarse como ejemplos llneas ceUares CiOtloeas (gentica y met.aDlicamente uniformes con la clt.N Inicial) y euliWOs oe clulas de tejidos, oon un pote;lal <fe ap!lcac:iOrl como a!tematwa al ltasplan~ de rganos y tejidos o para la reparacin de lesiones 6$1Aiwes; por ejer'l'lpl'o. llbroblastos y quetatlnodl06 para pteperar par~hes ele p.el ttrtificittl (<f(ll'nlf$ y epdenni&.. I'G$POCI.Nttmente). hepatoclto6 para patoklg1as neptlticas termnales. y~ de miocardio OiltO IO$ionos cardiaca$
QJttivo lular
11,1.3 Muestras t elulares de llquldos biolgicos extravasculares
se ii"'CCuyet~ en eS2e apartado algunas muestras con lntefes dlagOOsiJCO por si mismas o complemenleriO de t.as
t'lnteriotes.
11.1.3.1 Liquido cefalorraqudeo

E$ un fluil: resu!tatlte de lt' ul!raf4tracl6n del plasma (de ahl su analogla en OOITipoS!CIOn) y que reooge bs !)I'Oduetos Cle de'SeCIIo del mel&t:>Oiismo oetebtal. Se encuentra en dos compa~Unen~os que recubren el oentbro y la mt!!OIAa espr\81, tonU\ICado9 entre si: el sistema vemnctlfar (30 mi) y el &S.Qacio sutlaraCYloio'eo. delimitado por las membranas piamadre y aracnoides (120m)_ Se produce y reabSOfbe conbnJ<Imen1C {oon un recambio de -500 mlfdia) en lOs venrriculos de los dos netnislenos 08febr.lles. Sirve oomo 50()0rte protector del sisMma nervioso ~enltal , para Que "ffote el oerebi'O evitando su apoyo direao sOOfe la superfic.t sea. Se puede oblenet una muestra por puncin lulnb<v. Aunque su aspectO normal es transparente. en condiaones pa~s aumenla su turbidln por la present~a ele cUars (esencialmente leucoa\Os, eri!J'Ocrtos, microorganismos. etc.). en funan del tipo y gravedad de la enfermedad. Se utiliza paro d&leaar enfetmedades del sistema nef\1'10150 oem~ral, asl como pera deteclar marcadores tuf'I'IOt'Sie&.
11.1.3.2 Uquidos o derramos serosos

Se ~li:M en ...., QJw:;l<idOs del cue1po <PJe rodean toos lg8tlOS, delimitadas por dos
metnbr~.
lt'l p{)rlt'IIJf
{t:xterna) y 1a visce18J (interna. supel1leie deltgano). Estas membranas estn fotmooas pot ~ ~nt!vo y una rica
te<1 de capilare-s sangulneos y llnlilbcos. a tra'lls de Cll)'8 pated se Ntra el plasma cuando se anere el batanee twdr061 ill:aco u osmtico: de ah! la analog' a de oomposlcin entre pla&ma y llq.Jdo& sero&06. En la prctica d lNca, se tis6nguon do5 tipos de ultr3filtrado tr.Jns!Jd.b<to$. de ongcn no dlamatorio, ~on S)OCaS elulas (menos de 300/ml), y fJJCI)d<K/o$. ~os a demmcs .,namatorios y con m1.1ch<Js <:etutas {mAs de 1 ()())'mi) . Lar:5 m.~~Htra s. normalmente transparentes. slo IIC ~n en sitvocioncl$ Mor~t$. pre5cn~o entonoe:s !XI grttCJo de turbidez: vanable en f1.1ncrn de su contenido en leveo<:s y eritrocitos. fl.lndarnentalmenle.
volumen no<mel Liq uido peritoneal

on~iti~o
100 m!
toraCOCMtesis o ~esis (punCIOn en la bil&e do IQs ~lmol'l$&) ele la pared tor~ o del espa pleural) Conhene cUas de muchos bpos y e& ele intets ollnlco en enfermedades innatnatoria$ inlecclosas. maf'C&dotes I\.WI'IOreleS, ele.
Liq uido pl eural
1030 m e<Mded pleural {M acunula
liquido peri~rdl~o
2050 rn1
espaciO petidrdico
~nte$1$
Se usa con met~or lreeuen~. y3 QI.IO preseM3 mM ~omp!icaaone$ que 10$ antenore&
11,1.3.3 Lquido articular o sinovial

Es uo uttrafllltado del plasma, vi!ICOSO. 00t1 un alto contenido etl pro!eb\35 y ~iOO hi<t!urOnico, locaizado en la C8\tldad articular para conJe.nr un carc&er futlncanre trente a la tfietin Qt'OI)i<' etc 13$ artJC\.Ocionos di.Jrante el movlnvento. Con un volumen normal oe t a 4 mt, su contenidO cetulat llene .n1er~ tonto on PfOC0$0$ mecn1100s oomo en P'008SO& inflamat()OO$ pa101gi006 arucutetes. Se obciene por 81'tfOCMte-sJS, es decw. O'ISflitaCiOon lt'aS puf'l(:in en ol eswcio articular.
122
PREPARACIH OE MUESTRAS, EXTRACCtN Y ANUSiS DE CIDOS NUCLEICOS
11.1.3.4 Muestras biolgicas menos habituales

Pueden contener clulas y. por tan40, ONA, tRI. serie de muestras de lntets en casos OO!'W!ret.c>S: nuMOt acuoso (cmara anterior del ojo). tunor vftreo (detrs del iris), lgrimas. endolinfa (1\Jbo espiral dej oldo interno) y perlllnfa (caoiiiEI$ del ecP!ibrio), mooo OOO'ical. liquidO$ l'oliQAcw, oviductal y vaginal. het:;e& , Meteciones nasales, utlas. etc.. Y orina, q~ nor~TW~I~e no oon!ieno ~h.Jiitt. $4t uliliu ptnt' ~ ~ metabolitos on enfermedades hereditarias relacionadas con el ~mo 00 los aminoc:idOf (~tonuri. *"plonuria, Qtt<n.ria de amnokidos
ft'mifi(;;Cidos. cistiruicl. cte.). CIClas b&Ses purinie3s (gota) y pirimi(llnieas (aO(ftJta orOt;ea), del gtl.l!XI
r,omo (po~s).
etc.
11.2 DISOCIACIN DE LA MUESTRA TISULAR

En lo&
~.
las ol\llas M oncuentriln
atr~;oas
en
un;:~ Qtgani~in
tritlmensional,
CQn
in!Cf11ociom: u; o
<'dhNiono$ lt~neo (l(ltre o!!t~S como ton la ~riz. oxltaeelullll' (1)1!11 flicltatado rom-.ac~o por 1\btas proleleas, como~. y eacset~as ~ldicas completaS). El mejor tetldlmiefl&o en c:uant.o a dlsoci9Cin de clulas vla~ se alcanza a partir de tojidot ~tilos o neonatales. Pueden SOI'I31latse: w s estrategi as:
aiTIOf't~ <'O pM, ~rl.l c>o.e~ Oi$greg~cin
Frag,men taeiOn mecini ca: Mediante corte. troceado o triturado de 13 mooS1ra origint~~l en disolucin c61ul3$ il'dlvidu31eS o ftagrt~en~os llS\JI&IeS pequei'los que tacllllef\ su OblendtL
quimie.a: La rotura de 13 m&.1tiZ. ettocelull.lt y de l&s uniOnes ln~ero&llat'es se suele te4'11i2at pof (elq)OSicln a lArasonldos.. ondas sonoras o acsticas no percibidas por el oldo humano por po&eer una frecuenCia superiOr a 20kHZ). generalmente et1 l)(esenc:ta de detetgentes (inlcos. O(W'I'IO el doecilsulfalo &dioo o SOS. o no iOonicos. ((liTIO Tween.20 y Ttilon X-tOO). La elimirlaeiOf\ de catiOneS divalentes, en e~ el C;t2' (CQt'l ~1es qudo1ntes como EDTA).. taMbin deseslabllll.a la adhesin de clulas entte si y ooo la
homogoneia~ciOon i:tOiniC:. O por &Onieac:iOtl m<~trit. CJC~tt~Celul&r.
Dlg.sti6n enzlmt tlea: Las protelnas de ta matriz se digieren CQt'l protNSa$ oorno colagonasa. protalnasa K. pepsina o trlpstla. Dependiendo del dpo de rr~JeWa , esta digesti6n Jl'lllll(le requerir largos tiempos de inOLA;:tao::in (por ejemplo, cllJias en cultivo o ralees de pelo).
11.3 SEPARACIN DE CLULAS

La obtencin de muestras celu:laru adeOJadas par.~ la a.so tr~nalitiet'l r~ v~ procedimientoS de seperaci6n. fTaoclonafTef'IIO y caracterizacin. basados ~ente en I;)S ptopi~ de cadtt tipo ceiiAaf exiMente en la muestra. Su elecc:in en 6$tint<l$ o~ do 1M foues. preanalitiea y analltJC& depende de mUChos laciOfes: mue5tta de ~*'!ida. grOOC. de: separadtl oeseBOO, conservacin de la viabilidad, operaciones y lcnicas a ap1icar post-el'iOtmente, a.c. Aclems <le b& mtod06 m$ comunos. quo so uponen a conlinuaci6n. existen otros procedlnW!n4os especlficos, pero que no han ablnl<l<lo un uso general {POI ejemplo, ~rto en sistemas blfsloos aCUO$OS, electroforem de llujo ibte, etc.).
11.3.1
Separacin de clulas por mtodos de sedimentacin y centrifugacin
la se~l6n celular puede hacer&G por sedimentacin 1 gntvedl)d ~d. bajo la f\lena de la gravedad ten"es:tre, pero 10 1\a~ual es acek!rar el Pf008$0 aumenlando muchaS veces esta tuerza mediante la centrlfugac:l6n. Al rearll.:arse sta en el seno de un medio l iquiOO. 18 separt'ldn no sb depende de la fuerza centrifuga, &no de otro& taciOffiS que modifican la sedimenCc~ocin y que d!penden de las eatactetls.t!cas de la clula (o partkula en generlll) y del medio. El conjunto define. voloeid~d de s.edimen tacln de le clula (pg. 123)
11.3.1.1
Centrifugacin diferencial
Nonl'I<Jimonlo, el planteamief'lto ms senlto es la M~PCWa<:in por ccntrifugt'cin, comenz.anoo con valotes bajos de g (pro~ugaeitt). En la pdldica. slo se pueden $0Pf311' ~" oUM que rwestren grandes diferenaas de tamallo, al menos de tO veces {por ejempo, plaqtlttt'l$.. muchO ms pequei\as que 189 restantes olias wnguinN:s). P')f ejemplo. en el caso de sangre oon an~te. a 2009 bs eriltocltos sedimentan en la zona inferior. los IGuoocitOS IIC)8teoen en la Werfase y queda como sobren<tdanle un plasma riCO en plaquEMas lf>RP'J. Se puede preparar ~sma potlfe en plaqueras (PPP'j empleando m3yor ~idao (alredecklt de 3.000g).
SEPARACIN DE CLULAS
123
Recordc~
la. -....'J'I:II'llo.'ICl ' ''C'IJlflfl.lVA ''"\ --~ fk l1 fl\,bl d'llllat f l. tkf !'tJMI do; Jlf\1 dd twbu. t rad1 -'.:1 d..ft.'l..- ""' ~ ~,;o,&.,,...t a. rn;co.IQ Ir 1 >ik 11 \ ('i,. 1~ ka~~t..-t. J"-ofll U'OU1har;a 1<'9 o\')
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bl:mpl)ik'lo."dJm.."'IC.&Io'CI~.-lliiCC'ftCII.U,.(1Ifl)
.lflrC..kt M.lllif't'kJa m d IIID'\tiiiiC'Mol\ ck ftMaoo.llt 1,..... ~a,o IJCIO IQIAf a r t;; to <: r 1
puncl~,,.....,,"'*n.c...,.~~lfwt
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124
PREPARACIH OE MUESTRAS, EXTRACCtN Y ANLISIS DE CIDOS HUClEICOS
11.3.1.2 Centrifugacin en gradiente de densidad

e) Mtodos de baf'1'9ra: cemrlfugacn a 1rovs de un m&dio de dens1dad c<.msta,te
conlegur sepat&Cione.s ms ertcaces (pof e;efll)b, la de tos tewocito6 respecto al re$10 de las elult~s sa oenltlfl98 la muesln'l sotw un lecllo de densidad llllermedta entte la de 10s ~pos celulares que se quieren separar. se emplean pat'8 ello medl05 comercl*s como F1COIIPaque, lympi'Jop(ep y otros mueflos, tctmados gcnernlmente- por me.:et.,s de FiCOII {un pob!\Saitldo slntciea) y mMrlzamida (un oom;>ue:sto Sinttico )<ndo). S. dispone de v31ios me<!los con densidades adeciJadas pata la separacin de llpos oeUate$ concre!O!I: poc eJ.. Hy~ 1.0n P.,"W'''' e:IIJIM mot~onuoeares, Hyc:cprep-1.068 p.am mooocdos., PotymorhOp(ep r.ara elultts
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mc:\ho d..: tc:mm.1ud

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b) Centrifugacin zonal o de velocidad de sedimentacin

P~ $0fimai tipo$ celulares euyo coe&lente de sedlmen1adn Olflere poco (p.e , llnloatos y monoo&os} es proQ$Q ;~Q,Jdir 111 uso die Medios ~ forman oo gratliente de denAc~ad lo que ti'Yorece la concentracin de cada tipo oeuat en Uf'la banda o :zona estrecha por ello. a esla tawca so 1a: denomiM centrif~i,., UIOI)t El g1'8dicnt.e <lo denSidad se genera. antes de all.adlr la muestra (gradionlo prqfonmtdo),. modiatl~ v~ria.s ditoluCIIOfl(!S de dlstlnla OI)I'ICenrtacaon de un compues10 adecuado (ficoll. sacaro$8;, <c1lbUfllfl~ SYefO lelttl boW\0 .. ). le~ p-epanKiOfl pue(le h~ese de tonna !l'laflU8I (dando lugar a un g;radierne disoonlinuo) o crn()leando t.m ;))&f&IO (()rJMdot de g,..Cfiemes (gradiente conllnuo}.
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Uo pequeno ~n d9 mu~;~:~U. $e deposita soOce ee gradiente y se oenlnfuga a alttt vekx;idt'd dumnl(l un Clt!mpo corto. HabibJ;,I~C se ~ un gradiente cuya den&lditd miKirna os lnforior ~ '- de la$ Ululas. oon 10 que stas podriar~ .-lcan:tar el kJI)(b de{ tubo si se c::eftrtfugase duranl9 1iempo wr~tient~. empe:&n ~lempre dempos menores, por lo que el re~r\l'd<> e$ depe~te del iiempo de centritOQacin: dicho de otro no 84 ~nza el equilibrio de sedmeMacln. Con esta tcnica se consiguo. por ejemplO, separar todos 10s tipos celulares sangulneos. ~!Ctlr ospermllozoi(lt!$ vi.<rbles., sepatiW clulas viableS y no viat.l6n do tejidOS de'S~ados y muestras con oU8s en $U$1)en~i6n, etc.
se
mooo.
e) Cor>t.rifugacin isopicnica o de eq1.1ilibrio d& s(Kfitnetttacln
se pueden '!leparat celulas en funci6n oxch.$iv~rnente de Sll den'll1ad empJeando otra variante de cenlriftJg<~Cin. llamaaa ~b (p~labr<t ~ origen gr~o que significa de Igual oem~. Se realiza tamblf)n sobre ~n gr~te do denSidad. pero en este caSQ el liompo de cenlrifgael6n e'!l lo aufiC~er~temente largo como parn Clte w alcnc d equilibrio d9 &edimerrlaon {-"tr4 la rueall oentrlfuga, el empuJe hidrosttico de la oUa y su difusin), ~ro
SEPARACtN DE CEJ.ULAS
125
coo~. se u$81'1 gradientes continuos~ CUbren toOO etlntef\'alo de densidades ele las oilult'l$. en eJ t(ltl(lo oel tubo la densid~d del medio na de ser mayor que la de tas Olulas ms densas. De esta forma. Wldependientemente oet t;;e;npo de oentrlfugaclbn, las clulas oonC3 sediMef'olaran en el fondo. s-'\0 que ale<~nzan unt~ po$ieiOn estable int.en6dia en el gradlenle. con una variante peculiar 08 0$1l."' lheniea se OCW\Sigue purifur linfocitos 00 $U rne~lo can monocltos, aprovechando la capacidad de ~!M lllmos para fagocitar micro8$f<:r.'ls de oro eoiOiclar 00tt 10 que su den&tdad se haoo artificiatmenrc muy $U!)etior y sedi11"'1eNan milos abajo dellubo.
CcrnrifugaciOO
dil~rw~ iol
C.:nrrifugae-in J:IOO:tl <J de

q~loe-iditd deo s.edimcnt.aci6n
l~n to:ldimlt rlfd...--JI'l.
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('('ntnfug;.nm ..:!JIICnic:a &: t..'IJIUiihno di! !dim.:nUto:-i6n
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&!l!.!i ......, vc-:IA- .11<'
')~m 1'-:in prino;ip-'mnto:
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( UO.:Iin:l!ll: de joo:oliMI:o!IMO.'otl.o, q~~C" dtp.:n<Jc. <k la m- {llomailo & ..,,,ICI.ul 1~ dt b l'or!N.. (n1.:didu \'& ''ocll>rfv.t. 1~ 1uIJ ~ Apli!Ctlto : K fl.-.c..... -': ~ <.:lu1:u'c:~ fl oo....Unlknll) lolllxtluhf ~Jlltl" ~lfl4c ~ "Pt-llo~). ~u..O:ifll
.8J!1.,a " -ulanu; :isl~o.ll!; '"' "'-:w. do.!l c...Wridc: w..r''*"'~ -"<i"" <k~ dt m~ ) furm.. El pltdien~C ctal~ mt:~da pos oon\'C'o.'6cin di fusin hl!IUH bk" <q'UO'W:I1. :.C olC'Iit~ \lo
dt ai;!M;o' el f>Pilibrio. l>-idlld mlllll'l'l.l "~'
~lit < & n..oi:ld dt ko wmx.m~o.k 1 &muCiU11 ~~-..:~& lllri fu~!)n iollcS
f!.kwNm~I-
S..Wttei(n (111 ru"~'''" <k O..:ll wokll

U pad~ \'\ illo la mc't d a p;.!f _.611\UC!M ohu~bien
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ck i.:-*'-.;l~ioo. I'U"f..;-.0011\k
.kulo. nw.'lt~We~. ~u:.
11.3.1.3 El utriacln centrifuga

La erutri aein coMiste en la separacin de ~h;l01s (o pa.rtieui3S en gMetal) de acuerdo eon su velocidad de S!XIimentaciOn. El proceso orignal. coo&istente en la realizacin de ddos sucesiV06 de secfmentacibn y decantaei6n. tue tadl1tado por la incorporaCIn al aslem<J de U'! nuo cJel propio mettlo l ~ido de wspensin. en senlido contrario a la & grtwYed&O). ESte lue tlnatnente combinado oon el efecto de la fuetU cenlrifugl."'. dMCIO IU!)l)l' a sedimentacin (c.onlro 1 la modalidad de -.,tr~in de mt"tyor uso actual. la elutrtae&ft eenttlfuga. ~i. las olvtas se vttn 5ometid" dos fuerzas ql08SiaS: PO "'~ oa~. 1a tuerza oetttrlfuga y. por otra, la tuerza de arrastre ClOf el !lujo OOfltinuo del me<fiO en soniJdo conlt'ariO.
{ 'nda uu~~o:~OOIiuhll ~t 111111 propiNIII!It:t ck' "f'drncwlaoim ,J,f~mn 1;.,. d 'lulb mil~ I:Jlln~ ~ S<ni'IC'MI<f'l '"ii~ r.l)t(b. 1~' ~ pcqudlll' tiMan mil"
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El resultado es un mtodo versAd!. rpido. eficaz y rel&livamenle suave para sepafllr subpoblacioner. oellfares segUn su tamao a paftir de una mexcla en suspensin Admile nUmoroo 9fi'lndO$ de eh,.1l<tt; e. in<;lu$0. pennilo Qblonor
126
PREPARACIN DE MUESTRAS. EXTRACCtH Y ANLISIS DE CIDOS NUCLEICOS
una mayor ptOJIOfCI6n de clula!! vlaCies respec~o a la mUMtra origfl.al (al separarse las clulas d8118das, <fe 4ism1a densidad). Se aplico para oblonor gran diversidad de subpoblaclones efVtquedcfas, a p~rtir do PQblacione$ celulares
hepticas, clulas en proli~raciOn (sine::~ en la fa&es M, G,, S o~). clulas sarqu:ineas y otros lipos celulares.
11.3.2 Caracterizacin y separacin de clulas por citofluorimetra da fl ujo

Es hOy dla un mtodo de sop~u~n import.ai'Q en Wl...es~cin biomdica y en el labon.t!Orio d inico, espec:il*nenta por su capacidad para ed ~isis au!omlico de suspensiones oelulares. El WIS!tl.lmet\tO emple80Q N basa en el tran&p01'1e de una suspensin celular (<:61ult'l$ t(lnguifl(las. aspirado medular. 4ejl00s disociados, ele.). impul&<l<la por oo ,._., de disolucin ISOtnica, al pun10 de medi~ o tilmarn de rqc,, En su aplicacin habitual, la <:itQmotria de flujo analiza y separa clulas prfMamettle t'l'\8teac:las eon un fluorocromo,
Cic~U~s molculas ~en la propiedad dt ser !luclr'eJttnltll, t!l decir, cupncilbd de absorber CflttgI de Ul'l! radiadll dcronag..tl:a (ha v1sibl~ o ultrnviolle~). que las hace pasar a un cslado.l dccttiliCO eJ~dlaOO desde d Ct~<~J V\IC'h~n Juego aJ MaiJo fundamcnUJ. )iba'andO CtU:tgI tanw.n l.'fl forma d~ lur. Como lu cnergia de In radiacia dcctromagnC1ica emitida 1.. 'll si...,nn inf1..nor a b
nb~.
In lolljilud dC' onda & la luz entitida es suxri(lc' al& 111 de lalut- :lbwrbida:
El .:uploo de llul)rfro~ y 11 ~ ~omu IUC)Icul~ ma.n:,dof'a5 ~ dC' unn grn 1.11ilidad. la Jl(ibi l ~ d..: l.ktec:IUI dislinla molCc::ulas )' c,Ciulas ~:n muy pequdla c.antidtd )' sin lo.ls riQ);U$ IISQCilldo, ll) m.1n:IIJC oon il>IOJX>ll radinclivos. En QOOCre40, en a;ologia Molular 9C utiJiza) priO(ipo.lmemc dos lipos d\ lluorocr~ agcn1cs in.1crcalantcs que se uIC':Il al cido mclctt:o y s.il'\'tll asl pun detcct:uitl en gek!l de cltrul1lfl."::d o gr.ubcnt...'lllk dc1U1.J:kl (ules como bromuro de ctltli(l, ~rnQjt~ de ll!Cndm:t y col(lf'.a.ntes llocdtst), y Roonxmmos unidoiS de fum\11 cxwulcntc a SoOCidas do.: hibridacin y a Ndom;; de PCR (rluoresccina. rojo Tc.xas. rodaminas. etc.).
puc:~ o(m:~
L:1 dd1..'C'Cin liC p~ ~;,Ji~r Jne(linnte: C!lpecltOiluorimeltO y lcctm' de miCTOpiX.:lS: mic!...'fl 1:! !lu~nc:ia pnm~hu de b mult';Slrn dcnt~I.mt'UO de fluore,ounda: ~~~ gotk'll de C"k"<'lrofon:~i~. blt~l (1 c:rtlfn.'dogr:.fQ.; en pi:Ja mi~copio de RuortSCcncil: pcnnitc obsoer'''ar secciones de lcjido o cflullls indhiduak:s. dcfonM scm icuanti1ativa CIIm\"'~ de ll' I JO: rtmt.ite medir dlu!Jr:" individuales, de liJrrrnl C\llllllitltiva
El PfQCodimionto de citome'lritl t1o nujo oons~ de dos otopas caracl.eritacin y separacin. De hedlo. alguno& inslrumentos (t'Mii2:t~dOeS} slo ~li2;81'1 18 primeo~. mientras que oltOS (dn:sirlcaole$) $IOf\ ~~oet& OOem:& 00 llcvilr a cabO la $0gul'ld3. a) Caracterizacin de t9 I)Ob69Cin celular:- analizador, cltmtto d fluJo o cltonuorh tto El si~ma conSigue Que la suspensin celular Uegue en (:(W'Idlc:iones de ftuiO IIWI'IIn&r. formtlf'ldO un ChOtr'O muy fino que. wmo oonseeueneia de la dluoiM. con~:~et~e las ~las ~lduales M suceSin. t:t~as IX'ISM as! de una en uM a travs de un haz k.w'nlnoso lS, cuya IOngilud de onda permite la exd!adn de los martadOfE!S fluorescentes hxlrporados prevlamet"Me a la clula. En la luz emergente de cada clula se analiza la disper&ln y la kltensldad de la fluorescencia (emisin). Oisper&in frontal de lt~ lu (reftaccitll o ;se Dispersin pefpGfldiQlar Arquitocttn inlcrnt~ (gmdo de cstrvcturoci()n subcelular, de la luz (reflcxjn} o SSC <:Ontonido dO orp!nuiOs, pularidad, rugos~ ...) lntMSiclaCI de ftUorescenc::ia Cantidad de nuorocromoos marcadores prevtamenta hcorporados a ta oUa. ComOnmente se usM anticuerpos, marcadOS oon (a ooa o varia$ /.,) fluorOCtOITI06. <:Ontre antlgenoe da la superficie celular o bien colorardes o sondas que &e lijan al ONA
SEPARACIN DE CfLUI..AS
127
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hll-""
b} ~ibn de Clulas Claslilcador de cehJias actwado por fluore&c.enelit (FACS) La c:omense de flquldo, tras p,ascw por el ~ do de1oc.cin, $0 t!1m$f()fl1'1(l on \.mn $UCe$16n de go~ muy pequenaa {Oooetai~T~e~Ke, oomo oonoec;ooPCitl de unt~ vibr<JQ6n apf~ IXl' \MrMOni<io$ <'1 1;'1 ~mar;;t d., ""o). 13$ cuales conDenen como rOOximo ~ $01~ ~~~...la AJ m.smo ue~. en 1\Jnoon de los resultad()g 6el anll!ils anteflor de la clula, el $sibdor aplica t~uiOm.J\~oc;;:~mcnle a (';;!Id:. gola un pul~ de vollaje (erllfe ~y .t150 v que le propon:~Of'la
yn."' e<"~rg::t efi!Cir1C." Elu$Utlo(() dellne ~lamenle el ptAso que se ha de aplicar a cada QOI8 (y, por &anto, el Signo y cuanua de la carga que adquirira), en tunciOn de criterios &Obre 106 parmetros del antos,IS en el Citmetro. El sistema infOI"l'nitioo que controla analiZador y daslficador permite ta$ decisin en el breve lnteNalo transa.mdo emre el paso de cada clUla por 8 detector y la ormaCIOn de la gota que &a O)(ltl!!fle. Al mismo bempo, todos los datos de cada clula se almaoen.an
pata su estUdiO IXI$Wfior.

A OC>Ittin~,~;;td(l(l la~ !)01:.'1$ ~das pasan porWl campo elCtrico. donde se desl/lan de acuefdo oon su carga para caer en <hSiintoS tubos dP. recolecclbn de ITJ.lesua; de esta maneta se conSigue la separac1on da .subpo0lac10oes oelulareli di> acuerdo con IQ~ O'ltetiOs definidos (combonacin de 1amano, esttucbJrac:KIA y tluoresoencla) Como meros e,emplos de las lll'lf\Umetabl1$ aplicaciot!es de esta tcnica !Se pueden Wr: aJ El estudio de la superficie celular oon antiCOOt'J)Of> monoclonales. siendo posible ~donar una c"'a con un an(lgeno especifico do superficie. de elllre 1.000 que r.o b tengan y cl<t$ifi<;.;,\1 mile& do o6ful~s J)Of $()9'JtldO b) li11 wlomdn del tonteniOO en DNA. y RNA de 1.1no ~lul<t (p ej .. en (l$11)1';1iQS del cieto celular). e) Ltt de!fl(l"I*'I3Ctbn de su fMna: y lilrmai\0, po1 ej(m'lplo,
~ n.,opl~sl~~
11 .3.3
Soparacionos diroctas de tipos celulares A~,.~n $1!ln0""' caso oortltl.llar. es de uso 1\ab(uat y oo puede df!18t de menoonas. ta PO~iblidad de ai$fo)t f.llltt10S tipo& ~aros g"<'QN _. &u WJndencaa a oonerirw floiQflomento a te $1)pernQi8 de un &OPOft& de vldno o plsdco
(adhe$in cel.ul<lr ). ~eralmentel~ propia plaCt Oc cultivo Con \a llegada de los antlcuetpos monoctonales este prin~ se pudO ampliar a prac~Jeamen~ cualquier tipo de celula. La posibilidad oe disponer de esl<lS anueuerpos M cootr'buido OO'Iablemenle a la .separaciOl de clulas. en el tabotstono ctlnlco y de nvesbgaan. Su exquisita selectl'ndad en la un.n e eptopos M(lgnicos de la wperf.cle tia pe(milido di~ar m1odos diven;os para atslar y caracteriz.at de fOOTia directa 106 tiPOS oetulares. swesenter. oo una mezcla heterognea. ES1os ~odos pueden aplicarse, por ejemplo, para definir la& olutas a trasplantar en caso <le enfermedades graw& {celulas preOJrSOtas de mcU.a sei'l e~anOO clula& T madurar. inmunocompetentes), para
128
PREPARACIN DE MUESTRAS, EXTRACCJN Y ANLl$.1$ DE CIDOS NUCLEtCOS
detecmlnar el fenotipo de tejidos pwa trasplantes, ~r lOS IIPQ$ ~$ rt$p()n$t'lbkl5 do procesos en la respue61a wnurte. euaoblk:&r~ubi)Oblac.ones oetutafes, eie..
8 uso ele ant!c:tJetpOS ha dado lugar a una gran dt>.-ersldad oe mtodo$ inmunO<Inilllilit;O$ y do separacin. QUe
considerar parte de lOs mtodos de afinklad. Por ejemplO, las clUlas de un b:J() puOden ul'lirs.. 3 trtrV5 de aua anligef'IOS, a at~tiwerpos moooclonales prevametue fijados en supetfleies d! plSlio:> {tubos. plae\\s <.Se t;~,~hiv<>, varillt'ls. micloe$fcms . ) o malnees de; cdgeno, polisacando. ecc., io que pennte w separa~ de ese dpo eeluiBr, CM'IO eje~ Slngul:u, de (lntr ,, multitud dfJ v~es <sanolladsr:s, se comentan e continuaCin 108 mtodo!~ basados en el uso de mlcroesfems magntiCas
&oe pueden
11.3.3.1 Separaciones por afinidad con particulas magnticas
1. Marcaje:
ftuo.1ih)' Mo;:r..,.~a
-1:~1111.... .-
fo.YIIll llP'lliC111.t ,,
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J!!hCIIt;I'J"' '"l'(('lfll,)<'l
l'f~l.-~<llan ,OIIIWntnmlc lol()ooc\o. loMiall
IOIIII""nliml" uq I'~<J ~~ le .,!lula 'J""' ~ ........ VJII'I" ""

~'"' ~ 101. ...~pi.! m.l.'loiliOO ("f':irw.,,
\'~11.1p1; ..._.liN)
rJ,:ulu, pliH lbk> ttq&Ut1t
Vmtld
2. SelecciOn:
lntolflW'III-
~ mort t\-o. -pcli~ ,.,., .-nmunn (*:a kloJ,. ' '"' !la:eWflio v.pu cu1-
..,.,.!ti'
~~ .-a.__,____.__~----------0.~
tnspmlluwl., _,....~ltliiCt.."" !l:h o , - .,.. d """' " <k a.-ih l 1"1' ......,..,jllo4 fll.ljjf~ ~.
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CARACTERIZACIN CELULAR Y MEOIOAS DE VIABILIDAD
129
Esto$ proetdiiTIIIef'lto$, oe gran sencile-z y por ello en eJ~pansi6o tlet1.1811men!e ~en uso de microesferas disponilles oomercialmento en variOS tamanos (entre 0.5 y 10 pm. es decw. rt'190015 que las o6ful3$) y con <li$lint3$ posibil~ <.le tl)litaCiM. Esliln formadas por un ma1erial $U~l'Gf~Xlqlmo'lgntico (WcidO drtt l'lieno) reeubiel1o oe una capa fina de 1m t><)limero pl&stlco que permite la edsoran o la 1.1ni6n oovalente de <'if!int.M molculas. Frec:uentetnente se les une un anllooeq>o, P<-'3 IOMlar &'lll'c uetpOS magnrkos o tTNCrotl$(&r.rs inm(.II'IOmt1QI'Itlt.iC<;I$. o bien avldina o esllept8Vldina, protelnas ilrnbaS oon gran artt~idad por la blobf'la (mlcroes/6J<l$ magnlic,,s do <linld<td) Ms <'li;lel31\le se e~tponen aplicacaones Similares de estas microe:S'eras M$9netieas pata la e~ttfaca6n dlreCla de
~idO$ n~~tleh~os.
11 .4 CARACTERIZACIN CELULAR Y MEDIDAS DE VIABILIDAD

Es ..,PQttM!e prooe<~er en esta fase preanalibca a ta caraetetiU~~Cin < lt$ dl1.11as po1 alguno Cle los procodimiento$ diS()Otlibles en la blologla moderna: micr0$~pia ptica, come> putttO Cle ~rtiCJ3 ms obvio; microscopia de cootraste de fase, en paralelo al anterior. para QOSetvar con ms detalle ia supe-rlloe cetular. microscopia electrnica de batrtdo (SEM. de scanninu ~t/Otl nM:;tosoopy). pata <leflnir ia superfiCie celular y la naturaleza de las lnteracoones ellA<K:61ul3. o microscopia eleettnlca de transmisin (TEM, de tmnsmis.$101? elewon rmcroscopy). P<lrtl otnervtu 0011es celulares y exaRW~ar ~ orgnu1o& o nc:k.a5iOI'I$$ Tambi6n sc:t C(raeterizan las clulas par c:itomctria de flujo o el uso de mJcro&$fetas mag.Wdc:011s. lc;niCM Y<' oomenl:.di"'S.
E$ igualmente impot1ante confirmar el estado ~al de lit$ ~Iros ceii.IIIHes duraflte ui'IS u otta e1apa de la fase preMatitiC.a. El COI'IOf!P40 oe vtabllldad ai...OO a la c:apac:iOOd do vna GthAa para realZar sus procesos fisiolgicos y biOQulmiCOs. especialmente en lo que respecta a su mol8boli$m0 y su capacidad de dhl'lslon. Sin embargo, en la prctlca et tarmino es relativo. pue:s 5e vtiil<'l COf'l diversos crilerios. por ejemplo, e CClf'OOn que se l'lable de "labilidad re~d0$9 $implcm(ln\C <J 1<1 intPd~td oe l8 061uta, o Dlen a su acuvleao melablic:a o. tlnt*nenle. a Sl.l taPi:JCidi1d de
diwsin (prolifGraCI6n) Ptr<'IIOCIOS elos eJUSten runerosos ensayos de vlabilk:lad: los ms empleados 50fl
11.4.1
Ensayos de exclusin
Corresponde al recuettto de eJL.Us Que no incorporan un oolor..mo. ,..... Slplicnble 11
<Ciul11~
cooocido es el azul do: trip:ml'l, Ul\ colorante grupos ct~rgndos ammo > ' wlfal) le impidcrl
El ~j..:mplo n:s
lndi,iduaks
(niJ(~Illl)
!oOiubk en :.~u:t CU)'~
atravesar las cCiula 1nt:teta nw:ml>r:tttti.'O celulares IIII.U(;I.ll$; ~Of 131ll), tie slo las cdulas mUI.'fWS
L.a~
clula no tci\ida
o dal\3dls . c.:llll.ll$ 'hu.s no se
titn. pero dcb~ tt'S3hnrsc que el ensayo cl31uls dMn.da s(ll(l ul(lra l.a intclt{rid:d de su .n..'1nbr:tn:l, 1)1) ls
cCi ult~ tci\ids
''o:rd;,do:r.a 'iab1hdad
~ .,clu lar.
130
PREPARACIN DE MUESTRAS, EXTRACCIN Y ANLISIS OE CIDOS NUCLEK:OS
11.4.2
Recuento de clulas viables por i ncorporacin de un marcador

MtoOo a!tema\A<o, bM&OO en fa entrada de~ COITII)YC$10 a
Ir.!* de la membrana de clulas ln18ctas.

aplic11bk a t:lul:u: indh:ldualol (mu:ro!IOOpa.) y a
l)(lblk:()r)N ;:c"lan"ll
(tns.t.you~n
colonont< (ej.: , . ncuuo)
cluls int3C1~
- 8
plac11 muttiponiLo)
~'\._) ~' \._ )

clula dnada
~.8
clulilleida
" -~
\._) ~'
clulll oo lttlid3
t
ctl~o~IIIS m11) 115
1:~mo la~
H<'''(Q=(~
En algunos casos. el eolorantil (geoeralmeo~e un nuorocrorro) se une a tos ileiOOS nuCieiCOS., en cspcc:;~ ol
ONA.
\"
Eilliflnulja d.: aeridina entr .l librttncnte en t()<):ls l.:~s :lul.:~s. El yoduro de propid1 0 c.'$ excluido de las clulas intactas.
erutando slo en las dal\:t<b$. Ambos se unen al ONA.
c-lula dsi\ada
.g.2
.!
~-elula oon
corno las
r: ' '- )
m~
(ll'l'Seflli:lll f\U~io
lnii.'RS.1 en
~~~
' "" '"''

n(Jcko
11uoresc:cnci;, roja
cluiii"OOo
umdo al ONA t.'1lltl.1SCilltl la nrde del narnnja de acridina

;\mbo!r; compuc~ Ylll ~ltillolliM:IIbtll\.>j! Sil \'l>lfi.IIM:UOI
la intensa nuorl':S(:ecnci.a roja del )'(tdli.n,, de pc-opidio
nromoitk11 plallll 1~;\'~cc In!
entre ICB P'J'."ll. ~ bllse!!
opi13(b; dd ON.A. PQSo..""Cn propiabdQ; lloo~cnt.c'$: al ,;u

~~dl:ldos oon 1 u:t UV C"mit(fl k11. ~isibk
El __,Ja dC' ncridi&.~ C"n-tite uoa lluores~ dC' di.scimo color qn IC tncutt~w uUdo 11 k idos llll(lcio(l5dC" bebrll dob1C" o sencilla: 'v:rdc C4)n I)NA de dobk hebn~ ~<~nos ifUC';fl'DCdioos(dC" amarillo n Ullojn) coo ONA pon:iai A)tiliC' deS1'18turt.1ilado ro>jll coo ONA di: bttlra SCt~Cil13 (desoawrnliudo
compkta!na'lll.'} o tUl RNA
CARACTERIZACIN CEL ULAR Y MEDIDAS DE VIABILIDAD
131
11.4.3
Ensayos por medida de la funcin metablica
A etivld.ad n enzlmtk.a-s la llf9Mntio en los ch.ll{lls <)e actividades ei\Zimtieas gen&rlces.. 1&6es como es.1erasas. y deshldrogono~s. petmite ptartte:u e;~sayos oe vlablidad basados Eln la generacin de produelos oon grupos vomlorO$ o lluotloros. procedentes de la ruptura enzimiltic<l de &uttr;alos $in1beos l.Jtt.a anemaliva. per8 llf)O$ celulares concrecos. es la detemw~acin de ooa aclivitlad tfltim;tliea os~>eeil'ie&. en cuyo caso es especialmente 1mpot1.at~te eW!ar que las oondcionn e:q)(lf'imcrltttles afeeter"' 1t diCha ertZirna.
El diaoc.1ato de carboxiOooresocina. poco i()niladO. <ttm,test. l:. membrana por difusin: las tSitru <~:as ci10plsmica.s lo hidmlizan <t cortx>xiOuOc'CSeI.a que, :'11 tener mayor csrga dCccrica. ya no puede 3 1f3\'CS3f la membrana y qu'--da aliUp0da dentro de l., cCiula,
cCiul-n dai\udtl
/"": ' ') ~.J()
..
i '8 ~
~e
tluM~cnda \ct'd
clula coo
~,_e
lart>lt) la:tfl ui~~>'"J~ C<lfll<:l la~>

H)UCfl..t!o fii'O:'<fll:l/) f\uo~n~M
lfll(fl~
/"":'
cCtui'ii'Con fluort.'SCCf\C IIl roj01
1 El yoduro d..: pn:tpidi() SC emplea C()Jn() Cl)ntr.tl>IC, p~JCS (2ir'l<: la.s clulas dal\ndas. A<>i 1odas tienen IIUOI'('S'nda.
.., \
..
("~itl oon:s..-c;no
11 olii(C(.lll.' (k
' 111).( ~ ..~.
~. \
"
!)U(;Cin:IIO
r..nT
(una sal <k lt.'Crazoho). <k colo' amadl~
dtshldroeyna$n mitocondrial y
otras 1\:dut.lls.\S
cclul:trcs
v Mo. ~ un form: de color azul -
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NAJ)II
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132
PREPARACION DE MUESTRAS, EXTRACCIN Y ANLISIS DE CIDOS NUCLEICOS
pre&eneia de aminocidos marcados (generMnente. oon "~-~c. 3H o ~JMel ). Sintesis de ONA: ineotpOracln de ooclesldos marcados. Reftea la IA&OIIldao en lerminos <M cal>lCidad de
ereeilrieniO o, m6s O$lrict;)monle, profrforadn celular.
BrdU \~un anil\11;(>
('$lfUCiutlll de dl'. pu..-:; d
uun~ simila:r allk-1 grupc.
Sintesls proteica: Wloorpotadn de radlactMdad a las protelfW~t aormadas dUrant ot evllivo de ~;~os oll,jas en
S1lile al'lalk'
Jc:'lobxtutudwa m3tC*Iu OOfl 't 1 (limkrma trilitrda) al m<io dc cuhnn, bll t~<
i~aiONA
'"N
'l:r J '
Jl...,,
ilomo de Or 1.cne m
melilo. Por ello K i...-otp0111 al 0NA nut:\'0
dura.-e 111 replicacin. en

lu;at de Jf. Se dttta
medi:nle amic-..c:I'Jl(l;
marcad~ CXJfl un
dunmtc 111
n,.-pl.ico;. ~in. rndi~rvild d<:
.S-broo\1).2' -lksQxjuridina 11\JOrol.'romo, ~'ti mtodos lai ttlulas.lkbtd:l (~IOifiiDim::n~ : limtdiN~) (bromodcsoxi...;dina. BrdU) dt intnutllll.li)ttiCOCa o de citomeuU de ll~o a su ONA (~1rdc~ que lia trminn a S-rndilumcilo)
2'dcwllilim idinn
S< tkh."'.':t::l:i
C$1)C'CI.Iicos.. g<"ncralrncnlt
11.5 LISIS DE LAS CLULAS

Esta et<~P<t svpone el P~Jnto de enlace entre la preparacin do la muestra cekjw y la de m\le&tras dt genoma o i c:id o nucleico ; oomionla. pOr tontQ, la faso ant!lli1i(;a. Qut ~e (11 frt!leonami!Jnto ~~. la extJacci6n dlrecaa o el fraoclonamlento de !leidos nueielioos y la fragmentacin del ONA. En general, la isis oeiUlaf se realiza con un me<fiO hlpotnloo; en algunos casos esta etapa es sln'IIAinea con .. preparacin de la muestra (p.ef .. homogeneizacin). La lisis se puEide aplicar tanto a clulas en suspensAn oorno a las 'ladas por achlosin a placa& da oAivo. En la preparacin de cillula& sangulneas e& fteouente &a aplicacin de react)w)s de lisis diferencial (&Oto de detemWISdos tipos OGUares). Asl, pera el recuento y estudio de Mucocitos se lsan los erib'ocilos con un medio cido (por ejemllb. lbliOO de T~k}o una disolucin de doruro amnico.
PREPA RACIN
DE FRACCIONES $U.~ 8,_ C, EL ,U, LA = R=: E ::. S _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _.:_ 13 ::;3 0
11.6 PREPARACIN DE FRACCIONES SUBCELULARES

El prooeocfir'niento general, empleado clsicamente, parte el $0btont~dMtc que te$ulla de 1& <I1$0Ciao6tl mee&niCa de un tf!llldO por homogeneizacin en un merfu 15otnioo y postorlOr liSi$ celular Mediante tef'ltrrlugac;n dlfetenclat se &&pa~an SU08$1VCinl$nto n.,Jc;loQ$, org~UIO$ y Olras estructuras celtAateS.
Disoci.aci6n del tejido

"~""'W<l.:Qtl 01'1
d ~n 1'"lCIn r~ ~
i,.:e.:a~U.Il
1)~ 1\ nutllo:undnal <k I!!W'I\~ o;n l'lC'd~"l;) lolft:" ~ ;~t:.c~"') JJI l)l>o A. OIU~hrill 1 fl OOI~io de ~11>> ~~ (C CP'fiiU par-~ odenulicu md.-odu.;u. oktnmllllll rn;~ohdlld ,nn mal . r ~J.tro:o tk 111 n t:....:Wn ~Y;.mana. e!~
0.25 t-h o
~.; ""~ cl rq ido>. ""J'_..~n6oK kJ,_ ~1\ol~s,. \ ~ l tuonl:l>, c<lu.b-1

m RNt\ cllvp4S.m{IIJ<: ~ 11Uiv ,1 Pllr~ ~"MII\1131
ron u llnlwotJ\10'.> fwnte'll~~"'->
1J
Fraocionamiento subcelular por
centrifugacin
diferencial
do.'to:nn.,nadll proto:- . S< oJct.c- ~ .~r de OJCIV) lfli"'dc R" \. IM('I"Jinlo;!l~ ~- 111l\~dc 11fin idad f101 b cob P"hiMfp.<-.J .. d mo;~;'IOO JNf1lf'lrcnqut !'t CO.llld1a rn!l~ alkbtnt).
O:~jllo:...Ofl ;Id JC!oO.'trO:'IiJI(\Ild!C!l\to: 11 11011
-......f'C'I"""' ,_,.....,
11 .7
TRATAMIENTOS ADICIONALES O COMPLEMENTARIOS
~ntario&
Es esenaal combinar tas operaciOnes preoeoentes y postertO<$ oon W~.a sane de tratamienl06 adicionales o Ellisado <:elult~l M pvecS!t someter ~ troU.mion\o$ Qvo PGYG~ &u dOSlTUocin o 'l:liminen molcula&
ttOn prown1es. etc:; Pt\rt' montener 1~ integrid~ de tas muestr<'S, espeoalmente de blguno$ ~ (POr ojcmplo, p6ncreM y b~o) . se 1\& ese evitar ta aoeil'l ae .-.eleasas. el'ldOget'las (ONasas y RNtt$M), oe ahi la OOII'Yel'lienci:l de
u$ar nvestta$ frescas. mantenidas congeladas o afiadlr lnhOC!Otes de nuC~eesas Para su st*blttacin se acuOe a 13 rotura celular pot homogenelz.aciOn o resuspenSIOn en pteser.cla oe detetgentes, ya menoonados.. y/o al empleo oe disoluoones de Ma luena 61'1iea. Estos ltatatniei'IIOS son espeeial~te i~a..tes pata e.dtaet el RNA. lo <ue 18mbin requiere de fonna especifica ta presencia de agen:es disoaan:es (como ellloclanato de gu.anldlna, lnhlbldor oe RN.-.sas) o rcduC1oes ~ejemplo, 2mercaploetoool}. Para la pteparecln de RNA todas las diSOluCiones empJeaoes oeoen ttatarse ptevia<ente oon dielllpirocarbon:.to (OEPC). que lnacdva oovalentemenie las RNasas; igualmente, se ndll)'en durante la proparaclon de ca muestra y Pl.lnfic-.aein del RNA (:llrQ$ inhi)ldore$ <Se RN<l$<1$. Debe ~nbin ponerse 0$1)0C!al atei'ICion a la ehmnaciOn de cuakpef resto de ONA. gener<*n0n1e <N'Iadiendo una ONasa.
lgw~lrnente, IMIO en la Ob!enein oe RNA oomo de DNA, Cl m.t'lterial de vidrio y ~boo dobe 9$1ar ;;mpleu.mente lb-e de aciaos t~ueleieos y nueteasas. y debe evic:lenten'lef'lte e<vittwse la conu.minaci6n par el at\lllisltl ~e ol uw de guantes y precauaones como el maneto separado de l&S muesttas de dsllnto Otigef'l
134
PREPARACIN DE MUESTRAS, EXTRACCt,. Y ANUSIS DE CIDOS NUCL EICOS
11.8 EXTRACCIN DE CIDOS NUCLEICOS POR SOLUBILIDAD EN FASES INMISCIBLES

En ~ill, dttda &u complejidad mc~teromolecular. lOs cidos nuctetcos son dlf tCIIe$ de &epatar de sos oomPOnonlcs de membrana. proteina tNidual o afladida ( l81es oomo la& enzi'nas de restrlcclOn) y ollas molcUlas ~tlles (por ejemQio. poli$3~) . 1.0$ ~ drstioos alteran sus estrucwras y sus caraaerlsticas. De ahl que sean muCh06 lOs mtodos suaves ecacoracl06 para eliminar la imp.reza de tas preparaciones. !Odot ciiQs tNI$<1100$ on la& propedades fisiccK!ulmicas deil cido nuelelco. Para la ellminac:::lc:ltl de prose!nas asoeilldM se uliliu.n cntift'IM
proteolf1icas, como la prole*\asa K
11 .8.1
ambos),
Extraccin del ONA
El protoooiO !>Mico oonsi&t& en el lra'tamiento del homoQenOOo oon <isol\lentas orgnicos (fenal, Clofo6ormo o
Proeodimi&ntos alternativos
aiOOilot iS.IOmilp;Q
1.\k/ffm-mo>
l:lllll'3lnl (atuoeo;J)
t!l('".l.da por agc.a.;Kin

~utrif~a.OOn
meb po1 ~i1ad6n

tl'nlnfupeiOn
'
tnla fa..: ~ (SIIj')\'fklr. lftl.'tl(IS

IIIS flr'(>l toll~
-a)q~ d~'utll~
en la
(~r.lll~ "llOS
di~~
.......,_..
D}I.A y R..'A
~llof~
f~UC
IIClUMII
dr:ooniOIUtllll/.lldM r"' ll~
DNA y tu.A
d.....,rl)l'tl'a(l
~. <OC SolaN) M la illlf~~K
'""' r,.,
a. la f.ue
o>r@llruca (inft'J'I(If.
Q~ll
l~~e~ pf'1111d~. ~r.dil'~
nW &o,;:,. \os llpldof
doror <ormo. ~e
~iui'IM III
"""'
dt mcmlnmo
inb.'IIIe
(orllAnic. (mlb'1or. miu dtn)ll) quc411n ~ IJpido.'Of

dt< mcmhana
(2)
Plrilcad6n por precipitacin
atiNe l'lltct~:bltd.. ti al~ ..lbo:>l
~ullilllll el
1 \'01, de dllnol ~luto o de lS(Iprop:u)C)I (con as,itacin sua\'C)
DNA.quCHI
q11M..tn~:n
funna <k
fibnl~
.::ue se crnoll1m
\'n la >'liriO.
m'""'""'""
al~leiONA
C'll illllltlubl('
11.8.2 Extraccin del RNA

La eXIracci6n del RNA \ambin se realiza a partir del hQmogcnaoo, en prn enci& do iOoeianaiQ de guanldlniO. por adicin de fenol. clorofOITOO y acetato sdico de pHaS, seguiOo de agitacin vigoto&a y eenlritugacln: el#tNA aparece en la rase acuO&a superiOr. A partir de ella &e otJCiene RNA POt proe"Piacan oon etanol. Existon 01ras 16cnicas mM simpleS que O() r~ dicha e.xlf80cin. como 4 empleo de solucionot. 00 t.~r-... y cloruro de litio. <JJO h.'lmC>i6n int'ctivan RNasas y solublizan el RNA.
N=C-S
guanidil\8;
liOd31l310
d..: ttuanidinio:
PURIFtCACIN DE CIDOS NUCUICOS POR PRECIPITACIN SAUNA DIFERENCIA L
135
11.9 PURIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS POR PRECIPITACIN SALINA DIFERENCIAL

Se 1ril!<t de ""'prOCO(Ilmoet~to al!erl'l81iv0 al al'lteriOr, baSaOO en las diferencias de SOlUbilidad de ONA y RNA en funCIn do la c::cncen!r3Ci0t\ (le $MeS: TaniO ONA como RHA !101'1 solubles en disolucin saliBa conoentrada. mientras que a baja roncentr..ci6n de $<'tle$ $010 0$ $(llOie ti RNA,
,...--,
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~ ~.....: -~ ~
... t""'-'1
...
Pata es18 preopcacin &aitinit &e SUG!c util~~~ ~~ . PCtO puede 1nmbin e,..,.enrse aee1ato Sdio::> sarurado. en oombinacin ron ilfooholc$ org.Anics, OOtlducieldo a resu!lados ind.Jso MejOres que COtl fenol y Clorofotmo. sobre lodo para cantidades pe.cueilas de ONA.
11.10 RECOGIDA Y CONSERVACIN DE LAS MUESTRAS

Uno '19l 5Cp;)r000S y eJtll81d09.. k:$ &ciClos nuctetcos deben ser conaetY8009 adecuacamenle. El preopitado seco de tu;idO$ nvc:leico$ o el "&vilO de fibras de ONA obtenido oon la varilla pueden disolverse en disolUCin amortiguadora (O!II~Iif\3, en e1 caso oet ONA} y conservarse a 4 OC. o diSOlverse en agua y mantenerse oongelad06 para posteriores mlni~ioi'IO$ ~~imlttieas. El ONA geoOmlco en diSOlucin no se debe congelet, para ev!lar la rol\Jra de las molctJas pot 1as IUetZas de cizalla provocadas al solidificarse el l'llet) y al descongelarse. Por el oontrano. el RNA si puede conservarse OOflgelado a -70 OC en di&Oiucin acuosa, cuidando de atladir un ii\ID:Ior de Rl'fa<sa&
11 .11 PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS: EXTRACCIN O ANLISIS DIRECTOS DEL ONA

A voQ8':S. no M pO$lble vmiur 1os procedimiet'lk>s deserllos. Ol()) el bajO eonlet~iCIO et~ ONA oe atguno$ I'I'IVe$1111$.
pem, $il'l emW.tgo, pt.l&de ~Wdiarse el ONA de la mueslta Sin l'leCeSiCiaCI de mMipui$CiOn alguna, salvo lt'l liSis de las Clulas. Este es el caso de la amplificacin y detecCtiOn del ONA mediante la lcnlca de PCR (vet tema pos~arlot). Por ocro lado, cada vez es ms frecuef'(e y etlcaz: la exrraocln dilecta del ONA con mtoctos mas espec1rw:lOS. lclles. rpid06 de realizar y fl8bles. No se requiere la manipAa.cin previa de la muestra. oon lo que el ONA y RNA se pueden exlraer de fonna directa a panir de mt.teSITas l'letetognea& y de ~o volumen Exh;ten varios procedimlel'l!os. Para muestra& forenses se na descrito. con resoltaclo6 prometedores. el empleo de un intercamblador inico {Chelex) y una suspens<n de partfc~Aat; de slliott como m;Jteri;lle& de dsorcln adecuados para la extraoc16n <111ecta de ONA, en especial mitooondnal Tambin se utiende el IJ&O para pruebas de idel'llidad de la& t81jefas FTA. papel e:spec;ia!I'I"'IJe; tratado que PQfmite ab&o~ uno mvo&tr~ (gota d8 $ilogJG). i&ar sus clulas y diJenr sus JlfO(elna&.
quedando., ONA int.,eto fijado en et p&()el y asi se
~ conservar indellnidamCf'IW: '" 111UHir3
Tambin se e~n cada vez m&s mioesferas magl'ltieas. analogas a las de separacin eetu!81, SOI:lfe cuyo superficie se adsorben dlreCiamente lOs cidos nuclelcoe o se unen de forma oova1en1e otras mol&culas oon allrtldad pc)r f!Bos, So consiguen :tsi m6kX!os ~ de f!.Klfbedn que se pueden ttplic<w a untt ampi.;t vttr~ de mve&tras (1ejldos at*n&'e!l o vegetaleS, clulas culbVaas. suspensiones ooUIWes, etc.).
136
PREPARACtN DE MUESTRAS, EXTRACCIN Y ANUSIS DE CIDOS HUCLEJ COS
EMr:.tc.:-in
du-.:.c;Lu
I"..X1ra~;c(lll du~l~
dcmRI\A
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cuca61ioo
umn llll; mkn:o.:J" ,..,.
:qfll la ~t6t1 lk b
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ICJ!IPI'' 11
11.12 FRACCIONAMIENTO DE CIDOS NUCL EICOS 11.12.1 Ultracentrlfu gacin

E.s1e mtodo se basa en ef aumento do Ji voloc:id;td de $edim~tadM COt campos centrifugos lo s.uflcaentemenl& anos (5UI*l0' a 100 ()()()g) ~Qmo per.~ supetar las ruenas de ditusiOn. Se emplea en espeaal para el ONA, tAAtc> con fine$ pu)p"r~ivos (gran CMidad de material) como analftloos (peque!\& canddad de material)
11.12.1.1 Centrifugacin zonal

Oe forma sm1l<1r il b c5tuclado para la .separaein de tipos celulares se p(lede emr:le8r e6&8 modalklt~d de contrirug.&O!On sobre grad.antes de densideo 9<lfS separar molcula$ de cido nuclciw, en fi.IN:in do su velOcidad de sedlmentaao (definida por w coeficiente de sedimonlilc:iOn. en uni<*Se$ SVOdbetg. s._ Se tons~ que las mc::tculas de atldo nuc:tetoo sedmenlen e velocidad con~nle. coo lo que M .-ut'n en Wttdit$.. eu)'tl PO$idtl depeMe dell.amaf'IO y forma de le molo.lta slil' M P~Jctdon fO<l09et separadas en !r&eelones {pot ejemplo, por ponocif'l del fondo del tubo) y cucm11brs midienOO su absorcl6n a 260 nm.
FRACCfONAMJENTO DE CIDOS NUCLEJCOS
137
11.12.1.2 Centrifugacin isopicnica

El mfOdo isopeenioo o ~ equillf\o de sediol'l'lenlaCJOO es qull& el mas ulitl:ado 1)81'8 la sepernOIOn de disbntoS aodo nueleleo, en espee181 ONA. Rec:uef'dese que en este caso. las m9Cf()(l'olG\.Gas se .separa!\ en funcJM de su densidad gE!'(IE!ftllmente usando un gradiente qua se va formando dutanoe la ultracenlnfugaci6n a la 'VQl que se sepsrnn lOs eomponentes de la muestra (gradiente autol'otm.OOO). El mediO habitual para preparar el grad1en1e es una di!IOfucibn de doruro de ceSIO que. gracicts a su alta &OIUbilidad y baja vi$0051dad. permit formar gradientes de un amptio margen de densidad. la mt.Mt51ra w men:la con d1cl-a d"t$Oiuc;in do C$CI V se prCIQICio <1 la ultrKOntrilvga.cin durante largo 11empo (tloms o diast. hasta alcanzarse el equilibrio de sodimel'!taciOn Cad~t (ipo do cido 111JCI81co se SJ!a. formando una banda. en aquela posicin del gradiente donde la de!IGidad del fl"<1o ~ a la de la mofc:ula
~<f-e
Eidnplo M urlie~~dn dt la t~'(l\n(ugadiln lsop;mo;;,, Al~unus rcgi(lfl~ "S dd gC'n~lfllll es4iln (ormSIXlf l.oa repcti~i(ln <k !fuencu'" c(lf"'n .. n ..hlltl, n ciJo. s:u ~omJ'(lSI~iOO de b."i<;c,; nrlrt"go."fl~ es <hr~TCnt.;- !k lu c::l ~ti~ del tc:cnoma, <t\1<' c.: mi1s promc.:b:l(b.. C'cMI11) M'IM'tU~'fll'lll. cuanJlt....: lragmenlil d UNA l<lt al y .w :u'l:~lv-: ..:11 ~l adKtltc~< .J.:
di!'IISwbd !k t:.CI. l.!ll fnttn~,~~~ piOCt-drittc:. <kll4' ONA .ahanlctlh.: t<:j)CtitiHt se ""P:tl'*n de la batida pnncipL fomlondo ~J,.,,,~,, sar.Wrt. , : de uhi \ ino el nombre d~ /).\' 1 wtll/tr, (di.':!CfiiO en ~1 1 c-m11 <k 1\~unt:-adn dd ;cnon\11 > DNA rqo.-snhtll ;nldlr.:ll!C d~ (OIK'CI'IIt<IC Iil
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11.12.2 Electroforesis
Como es bien sabido. esta tcnica .se basa en la capacidad de las macromoleculas catgadas paca desplazarse en un campo elctrico. con V91ocltf.ad proporciona1 a su ca~ e inVGI'$iiiiTiente proporcionat a su tamal'lo Las moieulai de ONA p()$con, 011 pH ttlc.:<~llno hilbil\JIII 1.1nt~ (;;:tfg<l neg;)lwa uniformct por UNCIOO de m<JSa, ro que hace que su movlliciad
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138
PREPARACtN DE M UESTRAS, EXTRACCfN Y ANLISIS DE CIDOS N UCL EICOS
Mci3 e1 nodo () slo verva Ck!lerminada por e1 taMafiO e kl f'I"'IO&&Jia (I"Uneto de pares ele baSeS, Si es lil"'f!ffl). o.!lle destac819e que 109 CtOmOsomas eucarlo&as son demasiado grandes pera ser idet6lcados por este ~ de anlisis. por b
que cocn'lnmenre se aplica sobre ONA hgmentado oon ru::teasas.
11.12.2.1 Soporte para la electroforesis

La s.eparaoin 00 los fr<lgmeflk>J de ONA doblo M realizo ClOf elecl70b't$is on geles de aQalr0$8 (gonora!menee en horizontal) o poliacriclmitt<l (oomUnmentct en vertical). En al'!'lbo$ Ca$0$. el 9e1 te prep3t'O c:on distintas concentr.cioncs en funcin del tam"o de tos fragmertiOS de ONA que se QUieren tepatat. Los fragmentos tnlls pequeos
(npron~enlb hM!a 1.000 (lb) se pueden separar adecuadamente en gMes de pollacrilan*la. para lamal\os algo "'*YOres (li8Sh.l 20 I<.SlO) se usan geles de agarosa. Modil'btldo la oo~entrac& de acrilamlda o 898'098 se oonslgue vatiaf el intervalO de tamanos que es posible separar (rNOIIJcin),
11.12.2.2 Deteccin del ONA tras su separacin ('(revelado" )

Ul\3 voz. seoor~s.. IM mol6culas de ONA se visualizan normalmente por aa fluoresoenda de distintos oompues105 que se unen a ella'-. Aunque el mas t.dllado e6 el br'OO'U'O de elidlo, va &lencto suslituido por otros flOOt'OCI"'mm& oon mayor I)OOef de deteociOn otnenOr toddad. Bron111ro d(' f<tldJo: AgCfltc inten.:<~bote. k mtroc:l...ot ~tre l t~:~ t:K~ aJMI~Ias d~I I>.NA, .sbrt un
poco la doble ~licc. provoca un dc:s<ru'oii;J~mielllu ~1 .
dcii)NA. ei~i.slmcP!c usado ct1
oon UV): mtOOo de tu~ein o r\"\'dadct
Su ftUOC\_'SI.'dleia aumcnla mucho cuaado se une al ONA (ookw ""rnqja bl ilumin.illr

c:ltroforc:sis y en tt.nlrifug~Cin,
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u ~lflllllt> <k idio ~

mollii:JVI< ~un Pll."ffll(1(lft IJO.I'QlO.'
pe>~ Ulr~CIC'I "111111~\'ntCO
11.12.2.3 Calibracin de la electroforesis para el clculo del tamao de los fragmentos de ONA
Las molctjag liooales de ONA doble migr&n on 13 eJoctrorOfeSis a una velOcidad lnversamenle proporcional a su tamar.o (dentro del inaervalo de resoluci!ln del gol tmP*'<IO). ESIO petmlle estimar la klng!tud de los fragmentos estudiados.
Se: Af!loN ~n ..-o llc 105 pocilkK del Id una

ltlo.'u:lackt ~~ ~ O.~A \k: ~IJIIII(I
ili)IJtCCo,
dt~ ll)fl'linod>Jt~, ~~.
..rnoll:'ildon'l; ok pco.o mulctul;ar" u "eltllkta

DNA" (L)SA kMMr) .r~ ~~~ ~~~~
~ la ckxtroi~u<. se tr~o'dm )'le klf~IA j)QU. Uld.ts lo hilld.u rl kl~lm.'l dd bmll1o Ounl!"llo! tn pb) le al !opri~a~e~ d.: l;~ ..,vil idad
'"" l!!l
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(diSQno:lil. i!VllbC'tJ, Subrt~ la tC'tUI ~llllth w ifdtii'OIM!Ias .is1 ancias de a~ancc .X la$ mueoltlls p-obltma. ~~landu lui u lan~o;~il(lo at )'lb. fe "'," (IC:mplo. 105 JUCmfiCI .:rn~d010 l(Ofl f~1010 bit:t~ CClllt)(oJoo!l.. aqu~nos ~~~ 1 wtlr del ON A do:l '\'irus ). pur la accia dt tao <neklnudo:a:\ de reolrio:d.S. I:.co.>RI '1 HulldUI.
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20
$0
SO fO ?O 80 100
Movihtad (mrn) (etealaiOQIIWII.II'-ce)
11 .12.2.4 Eleetroforesis de campo pulsante

Las rnolc4Aas o fr<'g~os Cl6 ONA de longlt\KI superior a 20-40 lq)b no se PVO<Icn reSOlver (sepatat) etnpleaOOO 19 91ectrolorosis c;onW!nc:iot\al et1 gel de agarosa. EfiO se debe:. en prirTM~J ligar, a la dHIOJIIad de manejo de los geles preparados con las bajas ooncenb'aciones de ~ <J,Je requeririan (Inferior al 0,4%). Adems, &as molootM de ONA. que adoptan una conform3Cin mb o menos giOtlulat, poGeen un lamatlo exoesivamon1c gf<'lnde p:,ra a!n~vesar los PQfO$ del gel y no sa sepatan en funcin de su tamallo, Para $01YOnltlr este l)fOblema se NI Ideado una modificacin de 1a teeniea. eonoaa oomo e6&cttoforesis de campo pulsante (o Plft&CIO, puiSedJiefd ger ereCU'Ophol9sJ$, PFGE.).
FRACCIONAMIENTO DE CIDOS NUCLEICOS
139
Se emplean gele& de agal'()l;a al 1%. P8fO se a!teta
peridicamcot~ 1(1 orionlon del ta~ o!ctrioo aplicado. activando allernativamente dos pares de electroOOs. El frecuente cambiO de direcei6n del campo elctnco con5igue Que la5 molcula& &e de&pJieguen y avancen a travft de lo& poros en oontormt~c:-6tl CKtentida A mayor tamallo, &e rconP.fllan con rnils difiCultad lXlf lO q~ avaruan ms despaciO. ASi se conSigue !W!9&rar fragn'W!fltoS de DNA de hast:t varias nw!gabases, lo que S41pone 1M'! a"~Snoe sQntlcatlvo pero an no sirve pera e&tudlar tos cromosomas humsnos enteros (de 50 a 250 ,..Cb cada W'\0}
,\ \'~< DC'W 1.'11 ;un~ ColliCl>.

1.'11 fUDCIU dtll.lll'UifiCI
'lllllJ.I'-' ~l+.ttM;.;
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C) C) C) C)
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l.<l$ muestras nan de cont(lr'ler et DNA sin tr&gmeMM, por 1 0 que 1'10 sirven las de ONA purif!C&CIO. que geoeqlmerrlc ya se NI ftagtnenlado ~ debajo de 100 k:b como consecuenci;) de 1M fueq:as de oalla durrmt e lO$ m610dos Mbiluales de aislamiento. Para oate.w preparaoeioMs con lOS cromo$()m3$ itltac!OS se mezeiat\ las c61utl'ls con agarosa c:aMinte (37 11C) y se vierte en pequetlo& mOldes de tn:lS m&lmetros, <le forma ~ ai SOIId!l'icarse la ~a (.4 -t) forma blOQue& ('iniettO$) QI.Je incluyen la$ olula& int<aoctas, En s:t06 se rea!ila la i&i& celular y diOG<Sbn de 1M proleinM (p,e. oon EDTA. SOS y Pf'O~& K, que difunden tt lr~\'6$ do lO$ ()Oros <Jel ~)$in ..rtornr las gratlcles mol6<;ulns OC DNA. Tras una <'iMisi$ para elimir\af' lO$ re$tos <Je 1 <'1 <'igo$tin, sct consig..~~& un f:liOQve <5c f!gl'lrosa con el DNA intacto fl su inlerior, que se cfeS)O$ita et1 un pocillo del gel de electro~ .
campo&. est06 mtodo& slo son apropiados para separar cidos I)IJCieiC06 en algoo.as aplie<teione& Por e,emplo. en ooKwnna& relena:s de hidroXNJP<JIJlO se te(lene por ad&oran el ONA d9 doble hebra. y con menor trllnidad el de net:wa senc:ila La crom.'Nogr(I/"IJ.J d6 irlfooreambio inif;Q, utili~ clt\&icamente pat<t sep<trar protelna&. se ha convet't*:to en un m610do a!terntii1Yo pan~ preparar DNA de alta J)urcu. ~ torrnl\ rns r.\pida que la GKtr<I(.CJn orgn~ o la cenlnfugacin en gradiente de CsCI. Las columnas con resinas de w ercan'tiQ aniOt'lioo (C8f'93$ po$it1v3$) tt!ienon el DNA (cargado negativamente) de{ando pasa~ olfa& molcas (ftNA. prO!einas. ele.). Tambin M omc*itala ~itl <*1 pt'ra fraccionat o separar RNAs de distinto& amai'los. estrucrura y TunoOtl. Por ejefi'C)b, P3tal)l.rillear mRNA a partir del RNAcelular 601 81, $e utiliz;)n t;OIUITirlil$ de oligo<rf-celulo&Ol o de poiiU-Septlarosa. que rellenen el mR:NA a ltavs de la cota de poi(A} de este ;)(:ido nuc:lelco, de lorma &imiar a lo vi&to en el ejemplo oe exlfacC!n directa con rrkroesleras msgr.Mlcas.
11.1 2.3 Mtodos cromatogrficos AunQue ampf.amerrte utili:z:iiOOs en \oda$ lo&
.,rmkJ,,d
Tema 12
Replicacin del DNA

12.1 CaraetfHfsUeas generale-s de la repUcacin ................... - ............................................................- ....... - ...... 12.1.1 Can~ccet semlconservador .................................................... ,.... _,_,_,,,_,,,._..., .... _ ,_ ,_ ,_.,,, ..............,_ ,_,_ ,,,. 12.1.1 _1 Oemo61radn expe:nmental de la replicaCIn semconservadora..... . . . .......... . ....... . ... 12.1 2 SintesJ&simu!tnea . sewet~c~lybidire<:QOnal ... .,,,_,_,_,_, .,.,_,_, ,_, ---- ---- ........ _,_, -- 141 142
12.1.3 Inicio monofocal o ,._.!tifocal ,,, .. , , , ........ .......... . ......... ........
142 l44 . .......................... .,_ ,_, .. 145
12.2 Enzlmo1011Jia de la repllcaciOn .................................................................................. _......... _.,, ............... 145 12.2.1 Requennientos de la reaocin de slntesis de ONA .......................... ................................... ,.,._, ... 145 146 1222 Moc;tni$ti"'IdCI~r~On. ....... 12. 1.3 Olreocc:iOtl oe la slntesls ..........................................................----.. --. ---- 146 12. 1.4 Tipos de ONA pollmerasa~................. ................... ............ ...... . ........ ......... ............. ... . l.t7 12.1.4.1 ONA pollmerasa~ procarl6tlcas: acttvldede-9 pollmetasa y exonudeasas ......................... 147 .. .. 148 12 1.1.2 ONA polmeJasa~ eucarl6ticas: actividades pollmetasa y e~Conudeasa ...... . . . . 12.1.5 Vetoacla<l de replicacin _,..,_,_,_,_, ...................................................................................................... 149 12.3 Etapoa5 ~n ~1 pr~so d9 r~pli~;:a~;:in ..............................................................~....................... M~""""""'""" 150 12 3 1 lnicit'QI'I , , ,_, . ---- -- .. 150 12 3.1 t Q.-tgor-.s de replicacio ................... ......................... ............... 150 12 3.1 2 ~il'lt\$ inieiaCi()(l .......................... .. ........ - ..... . ...,_,_,_ ........................... 151 12 3.1.3 COnexi6n entrt la inioaeibn y lA elo~i6n : pr(Jicin~s nete$<tn(t$ .............. 151 a) Helieasas.. .... . .......... ...... . .. . . . .... . .............. . .. -- 151 b) Protelnas de unin a hebra sencilla ............................................ ----. _,_,_,_,_,_, .. , ... , 151 e) Topo~Someras&s , , , , .................................. .............. 151 d) Prirnasa,.,_,_,_,.,_,_,. --- ,_,_,_,_,_,_,_,,,_,_,_,.,,.......... ,.,_,_,_,_,., ................................ -- 152 .................................................... 152 12. 1.2 Elong&eiOn., ..........,.,_ ,., .................,................... 12 1.1. 1 A$imctri3 de IV rOCJiiect(iOn en MnbM hebras .................................................................... 152 . ,_, .. . . . ................. 153 12. 1.1.2 Meocanis(n()oe 1a elong&eion. ...... ... 12. 1.1.3 MdJNiciOn oe los rragn'le(ltOS de C*tunki.. ....... . --- --- 156 12.1.2 Tenninaci6n ............,._,, _ ,,., .............................................,., ..... -- . , .. , .. 157 12.1 2.1 FNI de la elongacin ............................. .......... ...... . . . . . .... . . . 157 12.1 2.2 Repicacln de los te10tne-Jos ............................................ - ------. 157 12. 1.2.3 Telomerasa: componentes y caracterl~t!c:as ............. -- ..... -- . , . 158 1 2. 1.2.4 Mecanismo de acciOn de la lelomerasa ...................,.,_,_, ...... --159 12 1 2.5 FI.R';ionaidad de la ae1iVId<td lelomerasa en las celulas . .... .. .... ... . . ... .. .. ... . . .. .. .. ..... . 160 12..2 Repl icacin m itocond ri.aJ ................................................................................................. ~............................. 160
oe
12.1 CARACTERISTICAS GENERALES DE LA REPLICACIN

La repliCaCin es el proceso. eoneeplu:l!rnet~le sencillO I)Cro molocularmente oomple}o. mediante el cual a pattir de
una molcula de ONA progettltOttt o P8fe(lt8i s;e sinlotiz<'l un ~a. originndose asl dos moleculas de ONA ~111$.. O& secuencia Idntica a la deJ DNA original E$$0 permite ot 1)3!$0 de la n formaCI6n get~tlce a la deSOOf'ldenc:ia (131'110 <M
una clula oomo del incivlduo).
Au~ la repl~on oonsbtuye el aspecto ese~ial oe1 metaboli~<mo dol DNA, la~ w deben con&detar oomo patre del mismo (!(ros prOQ!I$0$ directa o indirectamente re-.lacionado9. la re-eombinaciOn o r~(.'n<imiento de la lntormacot~ ~tiea . la mutacin o llllert'Cin de ~secuencia y la reparac-In de las altetaciOnes o daf'tog et\ et DNA.
142
REPUCACfOH DEL ONA
C(!HJUnlodc
n'I(IUbo.)l~
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ddDNA
La repllcac:i6n &e produoe de fonna ~da con la diwsl6n oelular (tcwn;~ 9), ooncrolclmentc en la f<"SO S. dlsante las inteases preVICI$ t<tnlo ~ 13 milolli:s oomo 4 1<' mciosis 1 , do Jorma Qut, en et caso de la mi&osls, las dOs clulas hijas reo"bc:ln la mi$11\;t d0t3Ci6n gentiet' que WW'loia la 06Ua madre. En cuanto a la meiosiS. puesto que da lugar a cuatro <:lulas hijas. Ja roplic:t~CIOn previtt permite que tostas tec:iban ta mitad de dicha dotaclon gentica. y no una <:ui!'r\<1 p;~rto (pAg 104). La fel&eiOn eftlfe el est.BOO de repllcaciOo y ta progresin por el ck:IO oeuat se puede resumir en k)S: siguientes principios genet"aleS: EJ lni()O e la teplicaclon del DNA oblga a la clula a emprender t.rta divisin. una vez .-.ciBda &a replicacin. no puede tener lugar la oonsiguierrte divisin hasta Q~ se 1\;ry<' ~ado dicha replc&cln. En teelldad, el final de la replicacin oonstituye PO$iblomonte t.II'WI $01'\~1 ~rtlla dMsiOn. EJ proceso de replicaci6n se lleva a cabo sin ne<:esidt'd ese ur\8. sepatael6n oompleta de ta C8den8 pt0gtet1itora: ta
doble hlioet sc desenrolla gnduarmente y sus oos hebras se van separando a la pat que &e prodUce su replicacin Antts de esrudlar bs detalles moleculares de la sintesis de un nuevo DNA.. procodo ()nt'!iZ;ttf ~$ ec~mdorl$liCM l)rinclpales del I)I'OOOSO, atendiendo a un criterio eminelll.emente didt\c:tiCO $1&$ $0n: eariiCier umlconsorvador, ro;tlil:<'lc:in simultnea en ambas hetlfas, de forma secuencial y oon carcter bidireccional, y ogen moooiOC81 (proeariolas) o mutl.lfocat (euc:erlotas). Otra cera~eri&tica de&&acada. el a-r;ictel' scmidiscontinuo. se e:xpliec'lril una ve! que se conozca el mec:aN:Smo de la reaocln.
12.1.1
Carcter semiconservador
Aunque tericamente SQn I)Oslbles tres mecanismos para la rep!icaci6n. oos oe 410$ $0n hiPOitieOs y pronto se domostro que iOio el tetoero tief'le iJgar en las clulas
R~lk:.cln semiconservadont
Un complep enzim1ico reoorrerla .. ONA. 1'9C0nociondo

lA socu~&neia en ambaS nel'.lras
EJ ONA l)rogenllor se tOfi'C)ef1a

varias veces antes de que &e *'leltz.aran lo& nuwvo& fn'lgmeti40S de DHA. !:.9:105 se uniri.(ltl al DNA progenitor para 43r lugar a 10& dos ONAs hlf06,
31TCX>S 001\ tragrnen1os tanto
para oollilf1as simultneamente.

de forma que el ONA pr.nilor de doble hebra &e conservarl a intaelo mientras que el ONA hijo CCIO'Iendria dos hebras totalmente nt.oevas.
nuevos como de las dos hebras del ONA progenitor.
Es el mecanismo real. Las d06 hebra& del ONA progenifol" &i,....n de triQik:Je pt\r;J 10 & n osis ese sus resp&etivas hebras oomplementanas. Cada ONA hijo est lormado por una hebra proge.nilof'a' y olla hi,j;J {recin Wl4elizada}. El mecanismo se ropite en sucesivas generaciones de clula& Et nombre alude, precl&amente, a que siempre &e conserva ti mil3d de 1;\ rnoleda or!gl!\81.
1.11 ttpli.:aci(m
m~.:ub
u-n~>C>."ln'Ct\'li&'lll*
1lt UNA
pmtll'flll(lfi>
dd DNA e~
rohtn:~~C~e .:.-d
fl'l(llklo de <k>bl.:
~
..
,. .....
......
...
.....
lujll
CARACTERISTICAS GENERALES DE LA REPLICACIN
143
12.1.1.1 Demostracin experimental de la replicacin semiconservadora

El
mecat~~Smo real de la
repllcaclon liJe
emo~redo pot primera
ve2 txW M&!l'leN
Me~n y
Frar,khn W St:Jhl en
1958. mediante experimemos m.ay eg<~nles. &ll'tCillos y representa1ivos de muchos otTOS reafiz9dos en dWersas ateas ~ ln BiQiogt Molceul<~r, .Au'rqu" IQ!I a~b:l$ molo0Jiar8$ de la n:tpllcacin rueron G&tabteciOos po~eriotmente con e:1 f:SbJdro <$~; 1~ ONA p(llil~~. el e,:l)eM'lenlo Mesolson y SWN lione ~nters. IIP<If1t~o de oor w orop~o diseo. por habor sido 13 prifOOr<J vol. qvo $0 ~plicaron tanlo la tcnica de sedimet\1aon et1 gradiente de densidad oomo 18 IntrodUCCin de 1$0101)0$ en 1;)& mo1 6tul{!$ 01: ONA ( 1~, inrrocoon~. y 1'N, Istopo habl,ual) Para comprender lll novedad y troscendel'll;:i& ~ t:$10$ ex~oa en $1.1 momeniQ y cont(lldO, lS4t v.-n a; considerar loa ant~e$ y el plat\leamlento antes de descublr el reSNfladO, So vproY$Ch3 <tSI este eJ~W~plo para lll.lst.rar el mtt!odo <:lenl jf\oo, en es,pecaat oomo un dlsel'\o adecuado del ex>Mrnento, que XI~ sirnplc, permite Obtener una informacion notable
a) Antecedemes
El pnmer lugar $e eJiamlr'la la po6lbAidad de aptcar la l&ctllca de equlldlrno de sedrmentaoCIM en gratlierrt~ de densodiKS, o 0$1\'!tlfvgacjOn JSoplcniC<t (~ 124 al anll&ls de mue&.~m de ONA cuya densidad es dlle!ef\te por eslar rn.-rc..tlo o no oon el is61opo 1~ .
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m !lt' lll$ hu u!u,j
b) Planteamiento y diseo del expedmenlo

5N y su al\ltli$1s- pot cenlnfugaC'IOn tsoplcnka, se dr:$efl0 el AQ!Icando eiUI l6et11<:tl de m.)t~l~ del ONA oon 1 ellperimento de torm...'i QUot lo$ ft;Sv!l.o."'CCO$ u111on~ permitieran difenciar oul de las hiptesi~ era la .correas
(!) Di~o dd experimento:

S.: cuJII"\'oMI ~In!;~,; de F
<YIIII!aofm~
, ..'11 J( 1COOI'I'IO) mi.:.. flu,:1110: de tUI~'fNW
ll11ll:l!w.!1CII<'I.ICXIIM:~ ~ 1111 rntoJift 'f!l
'\~: 11nah.1<J 1""'
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Rl:PU CAC.ON DEL DNA
&JO 1~ bipOI:csl> de: rtpl~kln \."\lft.'lft'\ adora:) ~JCOOStf\adora.. ~ n:--.u~ fW"C'\ ~>.tbao scrun. compantt\ -arn.!TIC'"
,.,...._ _
\\ll'loflk nu 'loe 'ln."l>"--ntJin. loi rnultadt~. lill REPLICAC.oN DISPERSA.~TE babri.a (lfl'lb: ~ n11~ua.. de 0' o\ +;:01'1 ltteidaa fcjIIOfia de lllk;l<'illll~l<> l"h'!"flllllfU) IWUo. ...S. tsdlx"it, ftl IOJ 1 Jf~ntoi.Min UN 'lt\1.1 Nnda m
11\lenn..,:hn \"fltR' l;a :~nlem1r )' l.a lkl hVCI\1)
el #l*fimtc ((lcnsKI:Jd ll'll(fme,b.t ('n(f\' "'"Jdu )' lttt<'fO) )' en ht ~CiliO""'" Ultr.a ~o~1l.1 Nndt llklbldad
e) Rosullodos obtenidos y conclusi6n

El rtkiii.IW ob64111'Vi!l6o lA ,.tllllt"r illll)lriml!lf'IIO tue de una banda de DNA 00 ~lOM Wltetmedla en la primera on ._ stgunclt OI'*8CIOn Oe deo:5idadet: baljt, 1 IMtrmedll /IJ oolncidir los da&o& ~1M c:on lOS re.aaOM PRW~tltllft dt l*1f otl'1(;hal de ltllgura, se eondU)IIO QUt t1 h iptn ls ~es Ll ~..,....adora es deCir en a ~~del ONA tilda una oe tas l'l'lOtec:aAas t\ttll conMrvl ~,_.del DNA Pf'OOl"'*W ., en hetn de ~"MM~ Sif'lleiM:
gtntfliiCI(.)n de Cllula& y dtls ~n~
'*"
12.1.2 S ntesis s imultnea, seeuencll y bidireccional

O. ate la ~ ~ "**"'omo 0t
OONtviOal por primera ~ en E 1#11*0 igueli'Ntlet . . . pera eucariotall (,..,..1 11 MCIOn 111 medto de cultiYo CS. lin'tdnO lribldrit ~~ ~r el ONA dlt ~~ til'le.it 'f lllegO ~riO pot IMIOdOa ~tOgrMiooe)
a.
~ ~ ~
carac:tesocas
U tln41fif no c:orn.enza al azar, alno tl'l punlot conc:rft)S de ta molcula. denOmll\ldot ~$ di ~adn En ~ uno de ellos se produce la apenuro loet,l dO 1 doble hlice y COf'Ntf'IZI 11 'Nfltl/f .J'flM't61W de las dos ~ hbras (no~ oonlwdrse a~n.neo oon el t#ltCier cotttlnuo cte la sn1e14 dt Utl{l to'll: dG 1~$ hebras,
QIA M
Como
U
~ de las nebra& progei'IIICWM. QUe ~ en 'Cada ~ ~ tn ~ dlf'tiC:dones.. por lo QUI M d11 QI.Mila ~~!K~ A lot p!,ll"'tcc& de Ir~_., dOtlle hebra 'f l'llltns ~-M
--
..W<,IJ.IIfil ms adelaNe). conHCVenC~a aas dos hebr-.1
f!IWw'M .. van alargando progreslvanwMe, por
~IOn teeuendar
de
,.-.....,..._no debe pa
tcllllllmt IOQuiiN dt~A'CII(Jft. ., ......."ldoM ~Si

M por
.,........o, con
en ....W05
Ncno
de..,.
~data I'IOI"quult ~en ...-.eso~
dedo..,
In 001 ,..,_del OHA ton . _ . .,,su c1t l '*- 5 y para la on
___.. 3' f 11 ~en
on h0nluel1
para_.,_..
E.NZIMOLOGA DE LA REPUCACIN
145
FORMACIN Y AVANCE OE LAS HORQUILLAS OE REPLICACI
en procariotas (ONA circular}

~llflllllr.l
en eucariotas (ONA lineal)
"';::lll ' ~::::o~;:;sr;..~n
II!Jt:"' ok onkov 11
'
K1 Jto K, ~*" Vfl)lt'l'l d! lutJf ~ 1-o inll;wo ,t.; un q:t\ln J;J 0 ' \ unidad run~ic>nal <k l'tf'l ic'<Koi>n t> n'f'h,-
>MilC">" '(I.;IIC!IC>.il.
. . .. .11!'>
btillrt\.-.;M!I! ~
.A ~~;;;::;;;;~"-~
~--
1(
12.1.3 Inicio monofocal o m ultifocal

En e1 cromo~ (;i~ titlic:o e or~as '" re(llicacin comienza &~ampre en oo ~o det.etmlt\a(fo. dei'IQr't'linaoo origen (y mareaoo corno o e); se <liot Qve la ~icacin es monofocaL En consecuencia. PfOQffl$8 fOtmando dOS hOtQuiii:'IS de repic;aci6n. PQf ol oontmrio, on 4:1u~s la replicaCIOn es multlfoeal. ptJes en cada uno ese lOS cromosomas e.xiSien mU111ple$ Otigenes de t~n (centenares o mieos), QUe dan lugar a oo nmero ooa~e oe h()rqullas. GraCias a euo se 1\&Ce l$ible ~t'r en un OOmpo razonable la reprk.acin de los cromosomas. muehO mas largos que en procatlotas.
12.2 ENZIMOLOGiA DE LA REPLICACIN 12.2.1 Requerimientos de la reaccin de sntesis de ONA
Cebador: La s.JntesiS <'e una l'luev:~ hebril de ONA no puede oomenzarw a partW de dos nucleOildos.. sino que requiere un fragmento de hebra iniCiador, <fterl()l'nit'ladO JbtJdor. Que aPOtt un gf\ClO 3'-0H ltbre. Se trata de ul'l ofgonuc:lecido. pot lo comn RNA. que <1e0e estar apareaoo a la hebrJ progcnrtora de ONA. de forma oomplementana y anttparalela. Por 1anto. se p\IE!de decir Que ~ rcplicaciOn no e:s aotoiniciadora (a difefencia de la traM~IOn. pg. 248), Sino que slo f!Jonga o 818rga mol&w!tl$ prooxis1entes. Su~;tr;tos 54 ut601 <.emo &uWatO& el oon,luMo de loe cuauo dN'TPs . <IATP. dGTP. dCTP y dTTP O. C<W.la uno
de ellos quecsa tncori)Ot8dO en et ONA nvevo la ~rte NMP de la moJcula. A estos eJectos lOS oNMPs y dNOPs 6011 Inactivos.. Cofctor9&: Pa~ ~.m accMdad pliT\8 se requiere un klt'l mel.Mieo div31Mtc como cofilctor, i.JSOCI9o a 'OS <INTPs. AunQue in vitJo oste pCJPOf pueden de$emper'latlo tanto Mn~ como Mg2. es eSie Ultwno et <I'U ~ in VIVO Mo lde o plantilla ;;Sta es. QUiU, lo principal caractetl$tca de la reaccl6n. El or~ correcto <f.O -'CQrpOr<c'Cin de tos dNMPs viene detetmlnado pot su comprementeriedad de baMtS ron la sewenoa de cada hebra ae ONA, Qve
aaa asl como molde o pkmli~J~t.
146
REPLICACIN DEL DNA
12.2.2 Mecanismo de la reaccin

Se iric;ialtl r~i6n Q:)l'l ol apare8H'I'Iientode un dNTP oomplemenuwto alnueletldo de fa hebra molde (DNA) en la po$icin ~iMI <'!1 exltemO 3' de la nebra ett ttee*nlento {Wclalmente. el RNA cebador: h.1990. la hebra que se est $intotiUni:JO), La t~ocin propiamente dlcN oonslsle en la unin del dNTP seleccionado. bajo la 6orma de dNMP, con llber9Cin de PPr Ello implica la tormacin de un puen1e fo5fodi6sttf ttre el f0$1<'11 0 a C:SCI <SNTP ~e se lrw:orpora y el 3'-0H libre de ta cadena en c:recimlento (ini~lmeole. dol ~Ot) La I'LJC)Iura dei~Waee JosfOI'Inhldrldo (u-~) del dNTP proporciona la enesgia necesaria ~1<1 impuls.'lr 13 re~(:(:i(W\. ayudttda por la wbsigulente hidrlisis del PP1 a 2 P1 catahzada porta pirofosfv\:;11$0\. Tms muChas reaoeiones similares sucesivas. eJ producto es la nueva hebra de ONA:
n1 dA'rP - n1 d(iTP +- n, dCTP + ~~ diTP
ld~''-1~ --~O~N~':.,::m~o: RN A ccldo>t,

Ml*. DNA rolim~rol$a
,.
...
+~
hebr.J <k ONA t:o t'"'mu:r-of < l'
o,:;:"> l...::.J
\t f('-'l><ISMO OE I.A lli:AtL'1"'l:
cntk.. dc
'ln""kt~
lhoebh d.. I>NA ua.:iOilCl
~ .><~""'\,"
lllllC!aUI
l...!~~~.J B11~
C'.alkl3 de DNA con
""'
oucloot;dos
o-t-o-~ -o
(}
0 ""'
12.2.3 Direccin de la sl ntesis
Puesto que la ad icin de nucletldos se realiza &lempre a partir de S*trif.:)Sft\11:)$ y SOOte un eJitremo 3 '.QH lble.
la hebra crece per $U exlren'IO 3'. y se dice que la slntesi& lran$CI.Iri'O en d i.reeci6 n 5' ...3. Esto es vlido pera toda& !;o~$ ONA polimerasas. tardO <le procariotas como de eucarioeas (y ~mbin cwa~as RNA pollmerasas).
ENZIMOLOGIA DE LA A..EPliCACtON
14 7
12.2.4
Tipos de DNA polimerasas
Aunque la reaet61'1 de Sintes.s ese ONA es vrwversal. es deeir. bene lugar de tnlita fonna en lodos lOs organiSmos y ublcaelol\eS subCelulares $u CM<\Ii$t$ .s efe.;;luada tt1 cada taso por dis1inla& enZIITias. bajo la ei"'mlnaeit'l (()f'nOO de DNA pol!'rner.t$$ (&brevi<M:SM: romo ONApol). ES1rie4amente su nombre es ms oompleto politnefflUt$ de DNA dl;fgi(Jit$ DNA (o dcl>(tndiontO$ d9 DNA) , para i~r tanto la molca que sintetizan oomo la que emplean oomo molde. Mas adelante se C$1udi;)rn otrt\s PQiimera:s<a$ do ONA o de RNA que ublr.tan d1stii\I06 moldes.: pera ofreoet una vlsiOn unlllcooa se resumen a tot~ti'luaei6tt.
molcula sintecizada
DNA RNA ONA RNA
molcula
molde DNA ONA RNA RNA
nombre oomplelo f)OiimetaS& de DNA dir;2da PO! DNA po!imerasa de RNA dingtda por ONA
)OI!metasa de DNA <Jil'igld3 i)Ot RNA
ejem)IOS (nombre oomUn) ONA po!i,....-asas RNA pollmetilsas o transcriplasas
uansCtiptasas invers~s teiOlerasas

RNA repllcasas
......
polimerasa de RNA <!1Q1da por RNA
12.2 .4.1
ONA polimerasas procariticas: actividades pollmerasa y exonucleasas
La p(IIYieta DNA pollmerasa des~ (Mhvr K:omberg, 1958) y la mept es1udiada hasta la fectla es ra ONApoH de schencrua cotl' . la oomprol:laclon Cle que su actividaCI no es $1JfiQ(ttlt$ par<~ JU$1ilicar la veloadad de <(lhcacin del cromosoma bacteriano JI) v.'vo condujo al de9eubrimiento de o~tas entimtts 16$ OHApoiJJ y ONA.po!-111. l as tres. ooeJ~isten en E. coN. con funciones especializadas: pollll realZa la mayor ~ne de la t3fe3 diJ ntPiiCCIICin, mienlr(ls <IUCI pol1 y polll se encargan de funciones aux:Wares (sus earaaeri$1Jcas pat1iWit~re$ se mvestran en la tabla de ~ 148. p.nto oon l&s de 1a:s potimerasas eucari!icas). L3$ tres ONA I)OitnerM<'l$ ~ntan. adems de su accividad enZlmtlca como pollmerasa una o oos :.cti vid3dn nonvcle:~s.;. l~ actividad 3' xon veleasa (taml:lin llamada eonueteasa 3'-t5') )ermrte hidrolitnr el nucleOlido Sl(vMO en el eJttremo 3' oe 13 ~ de ONA, $IQ un nucfleciOO cada vez. Ea.a ehmlnaclon uene lugar cuanOo el t"RJCietido noorporado por la activiOad pollmerasa a la caaena en erOOmien1o os errneo. e:5 decir. no aparea corroct<wnonle oon el pn~Mnte en la netlra molde de ONA.la pollmerasa es a$i capaz eJe r;ofl()I';Cr el error. detener la <tdicin de ms. nlJCiebdos y liberar ese Ultimo dN\IIP mal ln00t'J)01'8do. Los te(ltiOS acti'IQ$ pohmera$<'1 y exonudeasa $0n dif.er~les. En resumen, las. ONA PQiimw~as conigen sus propjos MOtes, en sentidO (3'_.S') contrano al de la polirnerizt'Cin (5'_.3'); por eiO. 3 esta actividild 3' -e)(()t'IIJ(:Ieasa se la llama tambin aetividad correc:to~ d9 prveba& (o de galetaaas. por Malogia a1 prooe$0 en .mprcnt8), o correctora de errores proptOS. De este 1'1'10<10 mejora la ldelidad de la replicacin, en un factor de entre 10t y 10l sotlte h'l que <'POrta la inoorporacl6n de nucleotiCios oomplemel'ltafl<>$ por &a pobmerasa (que \lene una lasa de error de un nucleollCJo por ead<l 10' o 10~)
CARACTERISTICAS DE LA DNA POLIMERASA 1DE E coli

ONApoll (unida al DNA)
uN. ~1>4 ~':'lllcnilp(>ll$'lt'Pit<h~ll.
f ntgrnc:nlo ..gmndc''
103 ~
o de Klerow
"" ~n:r. i)S
polin~<r ...a)
Pfe'etllil ..,, IIQI \ >ll\1~'>

~fftlroll<.t>'('>
u:.-..
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o>nud
,; ...-\on....:k.c>l M uy l.lcl>~'Uu\lr.ldo. X nnpko;J frocno:"' (lllf~ ..nle<i< in ufm;k DNA
"'*
111
Frn_gm~"nlo ..pl-quc:o..
CICmli~nl. lS k i)J, ~(' >!~ltll lllliCI1\id.d
'\locl\'(llo<Jo nx.... ''fflll'lldoV'I. ~

p.nl" 1k unii'O( la h:bllJ en
~tC,...,..O(Ol...
ll n~lt>.~idc ~ ltnnnul.
f<'ftQmei!U: ,~ r~lk ...., o:timo,....ol< ~><T la
~.c<~nu.:k\1"* Ellnli:U.v~ xoro ~~o.X'ld:.
So~ Cl'll.!ftu.\, """~ dDUOO. . . po><l:>

1>.11\~~
J ..:..~ ..._.
:o.;o.....tod ~..,..._~
._. ONAQQII <le procanas es nica entte tes POiimeraS<~s por poseer adems una segunoa actrvidad eK.OtluCI~Ms~. on esto caso 5' -exonvcleasa (O exonueleasa 5'- 3'). qve le porr'""e hidrolczar secuencialf'Y'le(lte DNA o A.NA a partir (fel elltr~o 5' o la hqbra De nuevo, el centro aalvo es ~ef){!nCiienle ~ los .-nteriores en este caso esta srtuado en el fragmento pequeno Esta activi!Sad juega un papel fundamental et'l la rel)litaCiOn del ONA. procanbtioo al elimnar el A.NA cebador y sustitulr\0 por DNA, dur<Wt4e la stntesis disoonllnua de la hel:lra retatcl&d~ (p."'g 156J Tamblen
143
REPUCACION DEl ONA
oompleiTl@nta la actwrdM 3'~)1.0fMJ(;Iens3i Ol)n'igiendo ei'I'OI'O$ de <Jt$bnt() llpo, y se la lama en ocastOneS aetMdad ele ropo u <K:in; pc>r eompk), inlervene en la escisibn de 109 dlmeros de ptrlmi!W\8 que se forman por expo61Cin del ONA a i.lz W Ell~ritnent;.llmenle, se aprcwha la aCIMdad S'-exonudeasa, por ejemplo. para. la prepar.~ci6n de &anda5 mare<~d0S (1)60 t82,
Algunas caracteristicas de lu ONA polimerasas desde el punto do vis t3 bloqu1mico
'1 tu n cfon~ l
PROCARIOTAS
Pollmeraoa:
Ublc.<JCIO" !Wbcolwtt Actlvida~11 enzim8Uces : Pnmass .-.:io PoWnerMa s 3' 'elo~clbn) a~Exooooleasa (o 3' S'} lcorrecctbD de orueba!l1
5 (ot()nocleat.oil (O 5'
a
nuc:leo
8
no
si
EUC~IOTAS
6
no
nucleo
mitoooodria
nO~
nudoo
no
Si
no
.,
,,
no
e;.mnacon de cebadores Fu nci n an la dluta:
3"
..
no
,,
si
,,
,,
no no
no
no
,,
lti
"
no
~
no
no
no
..
"
"
elevada con PCNA
~s.ooo
..
al
,,
si
no
ReplicaciOn (&inle$!$ conlinui)(Sa de t'!ebras 11Cit\'AS. (OO(IUCIOta y re1atdadf) Empalme 6e kagmentos & Okaur;l
VolocJd.ad <k lteadn: Velocidad de polmeriucin (nucleddosl
P1ot(I$1VIrllld
no
..
,,
no
2S().J000
mvy ;)lit\
slo 1nl c atrnente
no
si
no
no
oon nutleiJSM
"
, ..20
baJa
3-200
2-7
media
10000
(nui'JetJ()S allachdos antes de SU d1SOCIBC10n 1
'
,.
..,.
"" 200
1
*vada oon/$n PCNA
""'
elevada
12.2.4.2 ONA polimerasas euearttlcas: actividades polimerasa y exonucleasa

En eueariOtas, las ONA poijmer~as $0n 4ilcremt:s ~ las de ptocarlot.as.. auf)QO& pre~n cierta 6imililW de seeu&ndSI y 8$-lrUc:tura. Se hao descrito mAs de cJn~o ent:lmas. t.a ONApo4 a se encarga, graCiaS a su aetivtdad prlmasa, e IniCiar la sintests mediante la fofmacin40 un RNA oeb.'kiOf '/. poi' su acllYidad polimerasa. de la olongon lni(l(ll de ese oooadOf'. Es.m tarea se cede Mgo a las OHApol ~y" tespoosables de la mayor parte de la olo~On & an~ hebras, ~hecho. aiiT!bas ttenen ac:li'Jid;,d~s. sin'lii:!IM. pero aUn no est dato si desempel\an incS&tin4tlm(lnl& la mtSma runon o estn HpeocialiMdM. L.a DNApof p no lnlervtene en la JepliCC~oCin, sino q.-t e:sltl .mplieada en ta reparaon de crro,.cs o~ en el DNA (procesos en lo. que wmt:-tn pnrtJc';ipan otras polhoontsas, lnWyendo a '/10). Mientras os.t~s C\l<ltrO en%1mti:S son tesponsables de la ceplicacibn, r~ci6n y teoomblnaciOn del DNA nuclear el DNA mill)()()l'dnai es sintetiZrto por una ~rasa diferente. la ONApol y P UltimO, se han descUbierto recier~Wmt:nt.e 0\!89 poimef'8S8S nUCINt$5, <t~'.-t poca OMOoeidM ( 'J:tetal. 'l leta l. l [~) ). QUe estn 1mpbd<J$ $0bl'fJ todo en rvparact6n y etombii\{ICiOn En cuMt.O t~ la aclNidad exonudeasa de las ONA polimcr~tes eucaOCicas, sto las 3 que se encargan do ~;a ~il)n {\$,y y r., ...er tablal poseen actlvid<td 3' .. 11onuc:leasa, aqu&lla tesponsable de la capaclaad de (lOffCI(lQ6n Oo Motes eome41dos al lnoorporar los nueletdes .a la hebra Que se est &fNetlz.ando Ninguna de. 1 3$ polin1tWaS;IIS eueanOtJcas patece tener acll~ S'...~tonucleasa la b\cibn de elimirtaoibn de oebadOJes 13: desempel\an do9 nucleasas independientos, aunque t.as pollmerasas. $ y e si s.e enccwg.an do rellenar ol huooo eon ONA; los dela!!es se
8UUCiian ms adelt1nlo U*.l 156).
la fl.lnCIOn espoeifiea de eada pollmetasa &to se puede ~<ler ~ el ~nlexto de los mecaniSmos de !nlaacl6n y elongaQn 6ft ll'l$ cadenas de DNA. que so utudi<tn con dc~38e. donltQ del mecanismo de la elongacin
(pg 154)
B.;JtO el alcance de este libro no I)IIII'Oet!t t~doeuado describir In ~es estructu~t~les do 1 (:1$ dis!Jntas En la 1 ab18 &igYien~ o resumen \os dal06 ref:elf\1'05 a t<JmafiO y Ol)mpo$1c::ic':ln on sub~. pero debe teoorse en cuentn q~ l()davla es muy 8\'ada la v;~ria!biiidod ~ citl'8$, en especial pan; las enzimas eucariticas. o !tlcluso la *"ter'PI'01t'ldn dt los mrsmos en los distnlos orQ;)fli$1Y!os e!l.tudlados. oomo para w generariUIOOn a IOdos los
poli~sss
e\lctllfit)l(t$
ENZIMOLOGIA DE LA R EPLICACION
149
Carae-toristic;as ostrueturates do 101s DNA polimernu

PROCARIOTAS EUCARIOTAS ''1
Polimerasa:
M, total (kDa) 171
N11 ~Wbvnidadell M, subunld&9s
1
103 1
11
90
;,:4
111
c900 22
o.
356
4
B
39
5
173 263 125 48
"
'"
160 2 125
35
313
2
258 55
Pt Mt\$.1 molecular rc~t~tivtl <N: la no!Oetlzim~ o tlt"'ZiM:J ful'leic)(ISI oon todas sus St.b.d\idades. ;,. la ONApol-111 de E. r;()Ne$16 torm;"ldl' t>0r 22 $Uti!Jnid<'CICS de 10 tliX>$, con un~ <:Ornoosicin glob<'ll ((J.,c,(l),trty,,Q,-y.lbl\4. De enas. 1a &gt\4)8ci0n ((1,~;,0) se conoce oorno "rlUCieo~ <te 1a PQiirnert~sa. La suDunidad { 130 kDa) llene el centro acuvo pol!metasa, la : el 3 -exorucleasa o correC$0ra de pruebas. ... La ONApol u humana H1a 'ormada por 4 subunldades diferentes: 180 kOa. oon el centro actiVO pohmerasa
\.0$ d3tc couesPOnoen a numanos.
48 kOa oon el oen4:ro activo prm;:~sa; 58 kOa, col~ ele la pnm;:~s;:~; 70 kO;:~, r"'J')I.;~doq~ de 1;:~ POiim~w
12.2.5 Velocidad de replicacin

0..00 ol gran tamaflo ~ 9CAO~ de ..,na c61v!a, <1ue sv ' cplieaor'l COMPiela te lleve il C<'lbo en vn tt&mPO rnzon3ble ell)root$0 de $inte$i$ det>e ser tnvy r&I)I<IO. El'l proeariotas. 13 vetocidao llega 111.000 n~.~CieOIX:I0'5 oor minuto En ...coriolt~s. el m;tyOr l<'tmoti\o dolgenoMa 1\bee pettSt'l e;~ la ne-ceSidad <te vM gtan veiOQ<Iad t1e r~n ~. sin ernt:N~rgo , no POCista se tt\n etevooa grtleias 11 1a exi$teneia de v~\liO$ oigel'le$ de reQiiet'cin on cada crom(l$()tfl;:~, que rodiJCe 18 IOI'Igilud de ONA Qve debe Sinlelizar cada mo1ecu1.a <te polimeras.a t..a consecucin oe una alta velocidad de slntesl& s06o es posible gracias a vn mecanismo peculiar segun el cva1 la molcula de ONA polimerasa se man1iene unida a la cadena de ONA molde, a la vez que asociada POr su oo.ntro activo al extremo 3'-0H de ta flebnl creC181\1e. Oe esta forma puede incorporar numerosos nucleOtidos suceStvamente, oon vntt rOOvoein dol bempo necesario para la ;:~dicin de cada vno: por ejemplo_la 1Xllimerasa puede tardar vn mn-..to en darse y votven;e a urw al ONI\ (por mera difusin de las molculas}. mientras que para aadr vn nucletJdo sin SOII3rse lo OOslan ullO$ milisegundO$ E$11!! capacidttd de I<'IS polimctrt'IW$. vt~ri(lb!e ente e!!tts. se rec;:oge bajo el trmino ~svidtld, que se (Selil'le como el numero de ru:leo!idos que son ineoPOrOOO$ .1 18 1~ 3n1es do ave ta (lnz-n;) so separe del molde (coloqviatmente se dirfa alladiclos 'de vn lirn~). Un valor elevado de prooesMdad en una Cl()lirnerasa es mucno mil$ imPOf1ante para la repbcaetn <P,~e una velociclad alta de calhsir..
las P01Wnera11as de mayor procesivi&ld son fas que intervienen en la elongaCIn de las hebras de ONA (I.Snla en pg. 148), mtetltras Que las de baja procesivicJad se encargan de lareas Qve podrian llamarse auxiliares, la!es OOMO la sintG$i& y eliminltein do ceMdocs. su sv$tituc;i6n oor ONA o la reparacin. Generalmente, la alta proceswldao se QOn$igve gt3Ci3!$ a uno f'n016cvlal que ~<'lbrt'lza o rodCt\ lt\ cadena de ONA, evitando asl Que la enuna se separe: este mecanismo se aenomin.a de 13inza deSlizante. pves l)ermite el doSiizttmiento oonbr'-.~Mo de la polimeras.a a to largo de la cadena de ONA, sin separarse de eb.
wa
(!}NAN~ 111])
2 mot.C,:ulas de la ~ubum1.S:d 13 d.: !:1 0NApo-lllll1 1. c11l1 ~c. : ~t.xa:n r()<lo::m(lo al UNA, y :asi C\'ll~n q\.11! c.l n(~;f~-o de la polnnc:r<~Sll (coo ll41 liUbuntdad t<lllalitl'(a a) se separe del
molde. uumcnta.ndo su proecsividad.
V1SL:I
l ;al c:rnl
J mole.;;ulas de ul\ll pro1eioa indcpendknlc. d "llnligeno nudcar de ~lul:t.:S Cfl prolirci'SCin'" !PeNAl lle llS(K'ian IOnnsndo un anillo que Rltlk::. ::.J ONA y se une a la.i ONApo\ 5 y r. de <:I.IC$-UOI.:I~o, aurnC'Iuand<) su prQCC$i' id:lol.l
(en e~1c <:a$(1, :;.: mut~lf; la post-ctn del 0\JA).
150
REPLICACIN DEL OHA
12.3 ETAPAS EN EL PROCESO DE REPLICACIN

12.3.1 Inic iacin
Mienlras que et1 procaOOtas es proball6e que la re(lleaocl6n tenga lugar en conexin con ta membtana celular, pues
el ~o cromoSOO'Ia esta Mclaoo a ena en ta ZOt'la nucleolde. en eucarlotas el proceso ocum~ . toglcamente. en ta matriz nu(:fet!r El DNA se tf!l)llca una vez por cldo oelutar. durante la fase S.
Inicio de la repllcadn: apertura de la dOOie hlioe en et Ofigen de replicacin, creacin cte dos horquillas de replicacin y sintesis de cebadores
L:a um&n <k prtlh.tIIJI) tk i 11k i&li la k"tllenCia \Id urigm lk rcpficf!d6n f31:. 1hla lu !lt"KirJc.6n do: las hebra<~
A panir de abom (co <:SU! figun. y Las $'ilnmlct~). .Wio k rt:pn.'llc. mad una horquilla: en la ou:a ocurre lo 1r1i:.too. aunque oon 1~ p.1pele5 c.k hd:lfa cqfli.IICir:. y retardada in~erc~unhi:dM :
,.
,.
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s
12.3.1.1 Origenes de replicacin

La reoicacin sie"'l)fe oomienza en I)Ullos de la molcula de ONA con &eeuenclas caracteri&tica& En et caso de procariotas. el CJOm()$()1!n('t tiene un (rigen de tepllcacln Clnico, Jamado oric: por e;empo, en E. coN et:l<\ constituido po1 \1'\il secuenci<t do 24S pb. En eocariotas, como ya se ha comentado. la enorme longaud de lo5 c:romosomas rei91"9 101 9.Jii~ncin de numerosos origenes de repllcac:in; aunque peor <:Onoc::id06, sto$ ~ tambi6n secuenCias cttr&eaerl sliee.s. El proceso de replicacin :se rea!i.ta en la un~&!S fiJndonal del genoma denominada replk:n. e'finidtt oomo ~la regln de ONA <IVO I)O(KIC ser teplieada a par$' de un mismo origen (pg. 145), Cada replicn oontiono, pues., un orven do ~~~iOn y se replica medlan!e d06 horquillas. MientrM en prcx;Miolas el croiTlOS(lma eotnpleto eons.IIWye un $010 repic(ln, en euear\0&89 son runerosos &IJfren la rtple.(in <$0 IOn'na easi Sinwl'll\ea, k> que supone la existencia oe un complejo mecaNSmo de control QIJ!8 c::oot'dii'le el inidO, elongaclbn y tetminadn en todos los AIC)Iioones do cada CtOI'I'IOSOm&. Estos aspectos estn pendientes <te resoluCin, al Igual que muchos ottoe relacionados, por ejompk). con 111 replicacin de 109 cen1rmeros otra& rogione$ hetorocrotl"'tiee.s alilamente OOf\densadas.
Centtndonos en el Wlicio y progreso de la tepllcael6n en cada replloOn, surgen igualmente grandes coe&tionos relativas a o6mo son las interaociolle$ osoeeifieas entre ONA y proteln&s que desencadenan la inic:iaocin, a la consiguiente aetuocln do e&t<l$ PfQCoint~s y :11 contf<ll del ptOOeSO. Por delante de la nor~ de Nil()lic;M;in, OIP91'1i1S se oonoce omo tienen lug~r la Meesarla deseondensadn de lo& cromosomas. la disi$cin de lOS rucleosornas y la separacin do lit$ pr01e1nas hl540nas y no histonas (lemas 8 y 9). Por de:tr<\s de fa hOrQuaa, debe lambln aclararse omo $0 reuliltan las tw.110nas y no his.tonas P8r8 a. r~ac:io de lO& nudeosomas. o6mo tiene IUI)CW la lenta orgttnizaeiOn COfi'4*1C8 de la cromatina {C~UJ no par~ ~tableoerse hasta que fa horquilla do replicacin se on(:U(Itltra
mucha& kb m~& <1delanto),
etc..
ETAPAS EN EL PROCESO DE REPUCACIN
151
12.3.1 .2 Protenas de iniciacin

Tanto en procariola$ oomo en ov~riOt<l$. 91 orlgon < ropl~cu)n n r9oonoodo 9Qt v<tri<~s molwlt~$ protoi~ . que provocan el piqgue do 1. ~<:lon;t do ONA y c;rf,Wn vntt ton$1n II.IPerhelicoidl 11eg<'!!Wa que racilil<'! sepoW(I(i6n <fe 1~$ ncbr<l $. OtOer.t!met~e ay~a por la aOundanoa de ~res ATen esa regiOn. Po' ejemplo, en ta secutmela 011~ esl3 accin se deoe a la unin especfica oe un Ollgmero oe la proteina denominada OnaA. que atrae a otras protetnas, ptlncipMnente Onae (una heobcasa} y OnaC Tamblen e)dsten proteinas de nlcladn que se unen es.pedflcame.Me a las secuendas de .-.clo eucaribllcas. formando un eompl~jo de reconocimiento del Otlgen.
12.3.1 .3 Conexin entre la iniciacin y la elongacin : protenas necesarias

Unt~ ~ 'ormt~do el oc;wnplejo de iniCiacin. replicaon precisa el desec'lr'OII8mier~IO de 18 OObJe Mliee, 8 M <!e ha<;er 3C08$ible$ 1<'1$ ~se$ oomo tnOIOe ~ Jormar las nuevas hebtaS. El desenrollamlef'lto irlieal en et tramo couespondiente al ori!)e'.n de repllcaciOn. por e.leC$0 de las prote!nas oe lnlclaCIOn. debe oonclnuar avanzaooo por delante de 1& pollmetasa, encabezando la hOrquilla de replicacin. Adems.. a medida que &e van sintetllando las hebras t'KII9Va& se debe r reo,perando el enrollarniento en la& nuevas dotlles h6ices En eS1as opera.eioncs de dcsonrollamiento o relaamlef\4o y ervolamiento o compCtCta.ein in4orvicnen diYorsiS Clf"Q~intts C$00C(IIiUidC'Is, El <::orn()l'-.o mJQiprotoico formado por stas y por IG$ ONA I)Oimor;lr$9$. que viaj& 0\$0Ci&do ;l C<ldi'l hOtQvill<'l y r~t'll.tl rcllie3cirl se COf'loot como repli$omit
a) Heficasas
E$t;ts protein(IS m1.1llim6ric:M (g~er;)!ment~ hC~rnc>rO$) se unen al ONA en el ongen y acWan separando su~ dos en un proceso que ruiere la hiOrOisiS $itn1.1Mne3 de ATP S. crean asl dos horq~ de repticaetn, ~ comienzan a awnz.ar en sentidos opuestos, cada una liderada por uM nelieasa. M ~V3n.u CIOf la ~ segu.da ' l horqvilct inmediatamente por el resto de oocnponentes del replisoma o oompe;o de etol'lg&ein aSO<::iado <'! l..
~$.
b) Pt01.elnas de unkin a hebra sencilla

Una vez separadas las hebras por la hellcasa. lnteMenen las ~rote.inas de ul'liOc'l al ONA de 1-.etlf"a scncina. que eviiM el ftaOOrelm.en&o de las hebr..s. Oe e51a forma. las bases nitrogenadas pueden acoger a los nucleotidos que se inoorPOt.,_ en l;l rec>li~i(ln , Se 1M~ oocnVnmont.e protei n<ls SSB (singfe J>trand bJnding PfOt~). en especial et1 prcx~riOio:l$ E.n oucariotas desempe;la esta func:iOn la proteina de repl icacin A (RPA).
e) Topoisomerasas La: separacin de hebras oca&lOnada por la progresin de la helicasa a 10 largo de la cadeM de ONA eonlleva I.J apariCin de supe.retYOIIa~os pos!livog (X)( oelame ere la hc)fqull!a. Si se tr31 3$0 d$ un ONA lineal y corto. e1
superenrollamM!f\lO se podrfa ellmlr'lar pot Sir'np6e rotacin de la Mtioe en sentido con(r.)rio Sin embargo. s.ta no es posi)le en los ONAs 01cutares (ptocatlotas) ni en lOS lineales de grM lal'nSW\o (eue&nota&). que res.tltan k>rzado& tocxgicamente, detledo a su nal\l'aleza circular y a su unin a ptotelnas. respeeti~mem.e. P;)r;it olivittr e;a tensin de totsiOn te requiere <tlgVn 1iPO de moct1nismo giratorio; e lo conlrario, el superetWotlamlento acumtJ\800 por de!Mt.e cto 10 horquilla llegaria a iml)edir el avance de lo replic;aciOn. Este problema se resuelve gracias a la 8Cdn <re 1M topeisomerasas. et~zimas ~ afleran e1 est...-.to de supecnrolltlmiento del ONA &In modifica~ en ovos aspectos su escructura. E& de~. inlel'(:()tlvierten lODOiSmetO$ modificaOOo el nmero de Mlace del ONA (ni de vuettas que de" un~ hebra respecto a la otra, p8g. 68). Las top<)isomer&sas UWI'Ibi6n intC~Vicncn on b$ procesos de recomblnaeiOn y. PO&~'blemente. troanspo&iciOn. constltuyenoo un meeaAi9mo baioo gret~erat de modifica<:in topol6g~ de ltt motoola de DNA.
152
Alerdendo a su modo de aOCIOn. se distinguen dos gr\C)O$ de topol&omercu;as:
REPLICACIN DEL DNA
l as topoisornera&a& de tl'po 19$Cinden 'ransitoamen1e una hOOfa del DNA (un enlace fo6fodi&Wr), dejan pasar la olr.l por 1<11 brect\it abierta y vuelven a soldar o ig;ar la primera hobrct Comt) C(l(lsecoencia, el nUrnoro de enlaoe aumenta~ o <isminuY$ en una unidild la rooccin lran$Curr a lrtt"" de 1,.1n intetmedi<trio <:ovalentt: entre uno <:kt lo& ex.trcmo5 el ootte y tJtl re$~ de lirCI$in~ <Se 13 et~zim~ . Al Qtrmaneoet 13 enzim~ unk:ta asi al ONA ~bierto Clur8nte 1.1 aociOn eeta!ltiea. se eot~lfo&a en tcXt> momet~tO et grado oe tet'ISiM llberaoa.
AccUm de lns topoisom~'fllS.'IS
dl upo 1:
de tipo 11:
las topois.omor;~us de tipo IL cuyo ej:etr'lf*) dilsleo es ta g.rrua procsr161!ca. oonan transltoriamerrte la& Clo& hebras del ONA, I)Ormitet~ ti t~aso de otra doble hebra, con~. por la brecha abierta y finalizan resellando los cortes.
Por eonsiguien~. er nmero de enlace aumenta o dlsi'IW"'U)'8 en dos ur.dade5. La misin de estas enzima& oonera~monte inducir superenronamlenlos negatfllo& que facilitan el posterior desaparoamiento 10c81 El c:onsumo enetgiiCO cJCI prooe90 eslmportaMe: se hldroliza una molt::~Ait de ATP POr ~ wn ~ 1<' ~.
d) Pdmasa
Como ya se ha Indicado. las ONA polimera$&& no $C)(I ~C:e$ de iniciar la sfnlesis de una molcula de ONA. es deCir unir 10$ dos primerof> niJCietldos. sino slo de alongar untt 1\ebr.t p-eexiStente: ~ ello, e.4 lnloo de las hebras nuevas requiere un cebador. Este es sirrtetizado por ~ polimeta$a de RNA dirigida ~ DNA (pg. 14 '1). denorrineda pr lmasa (oe pn'mef. cebador en ~r~gls). que pr~ ~ cortas de RNA, complementattas de ceda una de las hebras des-emparejadas en el ()rigen de replcadOn. En procarblas. la pRnasa es t.r~a protelna irdependienw que forma parte de un COMplejO proteico oenomlnado prlrno$om;) , ~ado ., 1<! horquilla. Ero eucariotas, ta aetiviad ~asa reside ~ una de las sub\ndades de la ONA polimeras& o:, distinla oe la $Ubunld80 CXlf\ el cenb'O acdvo pollmerasa (taOia en p&g. t419}; por ello, se habla de DNApol <a/prim,
12.3.2
Elongacin
la teplic:acin depene no 5610 do 1<' ONA ptllmerasa. sino de numerosas e~Uimas y fa~ores Pf0'81cos (ms Oe 20 e.n E. cotr). Esle conjunto de Pf(lleiM& que, como $e ha ii"'CJieacto. recibe el nombre de reptisoma o comprejo de reptiC<ICJ6n, se asoci<'t tri torno a 18 hOtQI&l de tepllcaciOn, pal8 pettlper de fonna directa o ~~ eo 1<'1 slntctis
S~multilnea <toe ambas nebras.
12.3.2.1 Asimetra de la replicacin en ambas hebras

Conceptualmonlc, el principal problema de la replicacin surgo 31 ton$1<'ttatSe que ambas hebras son ~s $1thulliu'leamente, a medida <P.19 wvanza ta norquina, mediante enzimas (ONA polirner.'I$C11$) que SoOto &On capace5 ~ &~ntctiz;ar en direccin S' ~3. N abrirse la ~ ~ de la$ IWtf.lras progenitoras se va exponendo en el sentido correcto para actuar de molde. 3'-.,5'. pOf 10 Qut 13 s.tntests de su hebra complementaria puede cranscurrir por simple av<anec 4e la poliMetasa a lo tcwgo 091 molde ltt p3r ouo a:vanu. la hotQuill~ A o5t3 hebra nueva se la llama conductor. lfder o pul y~ sl.nHtd); ero ocasiones, su '*bta molde rcciloe el mismo nomt>te, pero pera evar confuSIOnes la lai'I'ICitemo5 " molde det l<t hCJbra conductora"'. P(l( el conttaliO, la ob'a hebra progeni_,ra se expone en sentiOO 5'_,3', por 10 Que no pue<~e a~uar como mOlde a medida QUe avanza 18
ETAPAS EN El PROCESO DE REPU CACIH
153
norqullla. COrno se -..eta en segukla, ra sJnte$$ de su compSetnentaria A~Quiere oo meC<~~Wsmo P<lt'lioolar que, entre otra&. OOS 3S, SU(Xll'le un desfase con la slntesis de la hebra conductora, por lo~ se la llama hebra retardada o retrasada (lagglng sttand}. La solucin al problema de sintesis de la hebra mardada se re'v"tiO 1111 Of>Sei\' Qve <JurMte ea l'tl)licttoeiOI'I ero pos1bje aislar molculas de pequeo tamao de ONA recin sinM'Ii~do (menor' ert t\.le&tiOtas ~ en procariotas), conocidar. como fngmerutn dfl Okazaki (por Reiji y Tuneko Ok<Jz:aki. que 10$ doSQbierot~) S. l)fopuso <WOI"'Ces utl mecani&mO que e~Ullicase la sinte&i$ de la llOOf<l retan:l8da en J>artllelo 1111 des;pl&lamiento de 18 liOtQu!lla oe tE!C)Iieocln, consistente en la sintesis disoontinua da la hOOra retardada <:ada rragmento de 0k3ntki (OuoSQOI'I<Ie ~ ur\3 l)(lteiOn <M dlct\a hebra, wya sinlasis slO comieru<J (de <Jhi el nombro) cuan():) el 3\'SI'IOe de la I'IOtquiDa ha llletado sufiCiente tongitud 00 hcbr<~~ &enc:iltl eomo ~"'que la polimora~ ta utilice oomo molde, en senlido a- .s. Se propone paca ello ~ la hebra sencill<l f()(m3 un buCle, arrolla sobre &a propia enzima. paca permlbr la sJntem en ef sentido s~ pr(l()io oe la poiWnerasa. La slntesls oonjunta de arreas hebras (la conduclora, de f<lrma continua. y la ~rd<Kia. e forl'l\3 diSOOf\lnua), por dos molculas de ONA polimerasa. se dice que es semidiscontinu;,
I.Qgleamet'l(e, la s.lntesas de cada fragmento de Okazaki requiere un RNA cebador. W\4ezado por una actiVIdad pftnasa (parte del pnmosoma en procanotas. ONApol (l)'prim en ~ettriQIO\$) Qvt vraja eon 1& horquilla y que t.amb~ slnte1lz en el origen de replicacin el iDeo <:.e:bador r~erido POI' 13 hebrt'l OOl\(fuctora.
12.3.2.2 Mec anismo de la elongacin

Avanoe de un.a de las horquillas de reptic:acin; la sfntesis continua de la hebra conductora es simultnea a la sintosis disoontinua de la hebra retardada. n fragmfltos d Okazaki
hl.l'RJuill~ de rcpl~ ,;e lbpl11111
Vl:'1:
co)nlnMrari'ICrlole. y a lil )C ' ':ur Mntc'lu.andu nml).l hc:ba-;
L& hcbrJ. cor~h.tO:'I..wa ,;e\~ clonp ndc de
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154
A.EPLICACtON DEL ONA
Para que la slntes.ls de cada fragmento de Obz.aki se realice en el enlOMO de 18 norquilla, el l>uC:Ie do hebra molde en tomo al rep(soma debe sufrir algn tipo de eVOiudOn en cuaMo a su tatnal'iO y diSC!O$iC16n, deSde Que $0 comienza la sinle&IS del fragmento hasta que, una vez terminado. se libeta el bude. ya de doble hebra. Este mecanismo refuoru el ooncopiOdt dis<:ontinlidad on la sinlosis de la hebra retardada:
1 Progreso de la slntesis de un fragmento de Okazakl

(slnte&is del fragmen~ n 2. durante el periodo de la figura anterior. &e incluyen en es&e ceso las
1
e
y
ta dtferenle dls)OSicitl y variaCin do

Una r~la llc DNApol &o c. 3.!10Ciad:! a la
hc~!lla.. donga ~onLilliUamcnc b h.:bra ~"*'uctora
-t
,.
,.
1) 2) -
un
un
1:1 iDNAun.cloa b h~o-b111 molde c:s reconocido JIOt' In ij J)fOictnn I'*CIOf" de rc-pl~cl C (RJ-'C). que hace que pOI o. k" iepare dtii)NA y $C ut1a el tis:tM n ( lnr d'
prolif tnein ccl ul r (I'CNA), <lita ptOt.eiiP q~Jt 1 u
ve~ w.e
pol6 os. qm COf11 in6an 111 eloopcitl.
Crecimiano del
ftagii'ICIIW> de Okao:llld
-t
A co:uliMJaCin se coiDC'lzani la sin~cw dt:l
,.
ET A.PA S EN EL PROCESO DE REPLICACIOH
155
lkpn:.')(l.'nl<lCti.n glob<l apro.~w:imada de 1 ~ -.>rgani:wdn de l<ls llrl''llCIOas re;X>ns~bl c& d(' 1:~ replicacin (compon~llle" dcl l\.--plisom:l.) en nrno a bt horquilla de replicacin. 1a ~1rUldbn 1 110Sir.td3 oom:spondc- o un llll'llK'nto mtcnncdJO de la <:kmg.m:JOn, t.:oJfl un JhgnX'IltC do.'Ok:uaki sinlcb:tado a nll:dllls tp.C:J.. el n" 2 colas figur. ~ ;~nt~:rio~. c~p:t U).
I'Q c:bridad, M s.e n'IUC'Stt.ll\ orros liK'tii'CS procdCIO.". oomo l'l PCNA que \'3 a~tnd<il hS- ONApc>l ~.el .~oi~L'fn de lll.tdcas.."'S FEI\'1 I~Nasa H 1 que ltlaiflml l05 (r.\g.mcntOS <k Ok;.;ald. J: u~,, ~~~~~ l. )'I;S tomisonlcti'S:IS q~JC n:gul:m cl.upcrcnn.JIIonnicnlt.> en li.l.; t.luhlcs lu.::bw"' l>fQstfll<\ta e hi1:
(A hd.r, C01\l.f11Cilli':J n~>(le~l:,t
un ecOOOOr lilo IJI ~:ocntnnlr,

hdfi!
t.,l(l,jUdl1101
.;imcti<!<kk> por la w;undud prim.1sa de In ONApol"
Lll>'-1 \pi!
l) hila (;l \;tll
Uil
..m,_.,!~ ti< 11la.-t.r.e nmdu./(1'/J d.:
molde de 1:1 hcbrn cut'ldu<:tora

l.:. ON:\(IUI o micia la
cltl,g:tci(,n.l.'(lfllll ONA.
d-.:1 Rt-. A cch;s.:k> do: l:i

hdw.t. ;,)nthu::lot:l
molde de 101 hcbm .:onductom

m~.>lde di: IJ hdlr.l rctrn!;.'lda
Ml't\ , proi.C'il)l de
UI'IIOn a ho. ....lll ~ACIIL
1,..-n111f 5'~y ndkaOO ('r In~ llt.cl\ ;)7\ll~l .., -
L~hadorpara 1.-ad:e fmgnt.:lliO do: Ok:v.ttkt, ~iiill'111.:11ti!) 'lolf' In fs.::li\ id.1d J'f'lrll.f,;.:j d..: la IP~API)I IX
Ln hcbm n1an.tada ncsltlt un
IL'rl Ir ~ u:ntl'-. de o:...s/.11..11 .1 / '-:;:;:;::-;:-::;:-::--.
1.1 h:lnhl:u.!;~
doble hebn: hija n~
156
REPLICACIN DEL DHA
12.3.2.3 Maduracin de los fragment os de Okauki

Para oompletar la sl ntesis de la hebra retardada. deben U"'lrse 10!1 ffagrnet'llos de Ot<a.zakl. Esae proee$0, denominaQo ~lmetMe maduracin, requiere lit eliminacin de loe cebadote6, la elongacJOn del fragmento adyacente para r~r con DNA 01hueco dej<'do pOr ~d<' RHA cebador y la unin o empalme de lo& eldrem06 resultan~ pera dar una hebra conurua. Tooo tAO llene 1ug1u potiOiemet~Ce en 1~s pt'())timi(I~Cie$ de 13 pt(IC)it t hOIQuilla, o bien posteonne.nte. tejos oe etta.
1Maduracin dO uno de los fragmentos de Okazaki

(se represen&~ y~ $010 tal hebra r etardada y su I'I'IOICit)
La Ultima
e:l~~
on 0$1a
mt~dvr<a<;in
de 1<' hebra re1ard&oa, la unin <te los
ff'&gmet~&os .
es eatatiUda por DNA
ftgasas (o sin'()lerneote tlgat.n). El m&eanlsmo qulmlco <te la reaccin es el siguiente:

c-~~-&1-uli~
(OI)IIM,) I CK"Mede e~!CI'JIII)
NAO""
tiV~wcs
dt h.
y do' uunsl:ul1t'mll)
,w,
A1' P:Mil'"
(li~J."II' de! b..:~~efl6lilgu 1'4
ydt-euttn0118)
~m~" d<l'l hcboto< ..pamola~ ec.mpktimnw: pero C'!ll llllll de- o'lbo ra!Q
Ulltllll:tee~(~
..C ..G 1 11 111 -'1'-'1'-A-A G-C A A ~T T
- A..A- T-T-c-G1 1 1 1 1 1
T - T A AG-G
-o
...
Reaccin total ; D'IIA''I' ,._ H03'-l.l"A + NAU IAlP
0:0.''I>.1'.UNA + A \tP + '')1:0. PI'
a I>N" s -AOf' C'll t r -
t l .u.tllt' nudrolillt(l del J'..QII (llnl-.n-.:rw o:lo'Rille r ~r oldit$11:1
IIC'Ii \11&! dtl ll'l'ntU , p dd DNA
"~ pm~~i1o:
V
~
Adem~s do OS! papel nsdgloo. las llgasas &on en.n-nas de gran utilidad en 01 &ilbora'Orio, jonio nocl8asas ~ ro~ricc:;iOt\. especialmente para la preparacin <kt molQ.IIas de ONA reoombinantc (1 Cri\8J 16).
las
ETAPAS EN EL PROCESO DE R.EPLICACIN
157
12.3.3
Terminacin
Ul'la vez descrlt06 lO& detalles p<trtiC!kf del nocio y etongabl'l oe ta fe9licaci0n (l()(t'e<sponoe e&.tudlar 10& mecanismo~ de la terminacin. Debe i~rso Ql.'t e$1e I>>CCSC> no se conoce tan bfen como lo&. antenore&, entre otra& razones pot ta propia amplrtvd y oomplcjid:ild del CQr"~CCpto de 1.em~ci6n. Se trotat aquJ de exponer lo&. problemas que piJn4ea la tormin3ciQn Cle$de oo. puMO de vl~tatgloo y asu~do su lnsufit~ent. C()t'lfirm~n t:llll)eM'ICnlt~l
12.3.3.1 Final de la elongacin

Se puede oonsiOtrar, OOtl<iePM!Itmenle que lB tem*'laciOn comprende varios aspoc!O$ E1 primero ~ ellO$ es 13 finalizacin proci~~1c dieh3 de ta f!!Mgadn por te ONA polmerasa, que so vcrrfic.tt en 13$ dos horquillaS c:se replicaCI6n de ~ r(l(:6c;On. prcviSitllelente cuando en w avance alcanoen a IO'Is horQui!l" r0$1>e(ti'V3$ de repliOOt'les adyaoontos ste t$ un proceso prctlcarnente desconoado. pero cuya resotvciOn no CIIM~ Clilicunaa conceptual. pues al reler'IO oe nueoos y la unlon de tos dos tram06 da nueva h8tlr<l pve<Je re$0111'etSe de 18 misma fOtlTia que la 1'1\tldur<'CIOI\ y uniOn de los fragmentos de Okazaki en lit hcbr<~~ rcWrdl'ldl"
Pot otra parte. como segundo problema. lalt'l POI' bCI;)rar cul es el nt:.nero de replicones implicados s-'l"'u11Meamente en ta replicacin de cada CJOm0$0~. Mi como tos me<:anismos de oontrot que coordinan E\1 proceso en todos elos. A diferencia del caso anterior no existe t'Un una hiptesis previsible
1Repfesentacin esquemtica de la replicacin de un cromosoma eucaritico 1

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Ml)l tlui~ fll(\~hliMe In e~on.un~in del (fllmento de Ol:~i adynccn~e. 1,..,~ cdllldor~ dr lo-s f)jll(-11\(IS ~ .k 111~ hebrns tille\'~ ~itn ~"len >oel diminnd~ rem "" SU)Ilh"',Jo,., po~ tllo.. lns ll~"bras tiiiC\oiiS qm:~n ms con~1 en 5 ( f\lle ~~~ ""''ldc:
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12.3.3. 2 Replicacin de los telmeros

La replleaciOn de tos exttemos del cromoSOil'la eucarl6tloo supone el tetcer problema de la tem'linaciOn. pues. como &e vera en seguida. no pUede llevarse a cabo mediante la elongaon IXl" la ONA polirnersw. Este proce&O e&. por ahora, ef mejor conocido da la terminacin. posiblemente por su ma)'Of traS<::endencia fisiolgica y pa1ol6gica.
158
Como ya &e ha estudtado,. bs tel6meros son reglones s.tuadas en 10$ e~etremQs dt
ml'l~ de evc::uiola&
REPUCACt0N DEL DNA
(pag. 92,, a las que se unen ciertas protelnas. Estn constituidos por~ ele 1ar:s faiTilias de ONA
m oom06011'1a& lineales de la
repetitivO no eodHiCOU\1e (~ 113~ formando b5oqiJes de 1 a 12 k.b de long!lud, con unidados de 6 ;:~ 8 pb tt~peti!Jas en tanoem O!'!t'ltenMM o mit"s die V9Ce$ Para entender la impllcacl6n de los teiOmerO!I en ta roplla.ciOn debon rooord;<ii$G sus dos a~racte:rlslie3s princi(X'IIcs 101 l'bund.imcia de repetiCJOfle& en tndem y e1 car&cter COiteSvo de 10$ el(trOIT\0$ {Q\le rea.Jef'da aunque $In ret~ 1\Jnc:iOnal alguna, a los elltremo& resthames de la acdn de delttl$ enzimM de reslrlocin sobre un DNA,. pag. 2011 El carcter oot\oe5iYI),. en fOI'l"'''::l de ~tientes 3' en uno de lo& exflemOS de los cromosomas, lat'I!O palflll'IOf. como filiaM&, &e expllca por el mecan.smo de te-plie&ein diSOQn!inutt do loa hebt<J relatdada (figura anterior) Como OOo$0CIJCnci3 tldiCIOflal do dichos saliente& 3'. se I)I'Oduc:e un aoonar't'U!f'lt.O ptogrtSivQ do la$ hellrol$ 00 ONA en sueestvas f'Ondo1s de r~"CiOn
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f 11 .:.111 rond11 IIX'e~iv.t de f~licaci/lrt lul lidltnS fllle\"1111 "-'11 tn.ie\ CIIIM:lti Cl'l 5' q.;,e MI (ll(ll;,ie, (.l)ln.) coaSueocJa, b klll!:itod del tron'IOSOOla w: ,n a.:onando progmi\1llfiCI\1C. M !>115dos ~\U't:tiiiCI~ o 1tk'lm~~
--== ============= = ='
Este acortamiento de las regiones telomricas (calculado entre 50 y 200 pb por cada di'l!sibn celular) 5UP008 la disminucKln ptQgfesiva de 1<'1 Jortgi~(l 6et ( rOnl0$0m{' <'1 IQ 1W:gO <.5t $UOHN':l$ divisiones oolularos. oon ~~ eonsiguien$e probl(lmo ' l p~r..'l la perp~:luaOin del met'$aje gentiCO. Este pr>r.ema se j:XJ(I(Ie rQ!v(!r on ,., cith.Mt I)I..Ci<'I'S 'l ~ aelvt<~c.;)n, lt'lmblft dtlrantla ~ase S del ciclo de di'IIISin celular (tema 9), de un nuevo lipO ~ enzima, ta telometa.s.a. que a&atg:a 10!1 tetomeros. c:ompen!l<lndo asl aa prdida an~rior.
12.3.3.3 Telomerasa: componentes y caractersticas

So M pmpue!ltO qoe la !elomerasa tn un re!lto tWOiuii'IO de una nbozima (p&g. 76) que pudo servir antiifme!\te pam anauuu la slme!lls de ONA; ta~ que pudo suponer un if'llarmeo.ario en la tran:slo6n eVOIUwa desde las RNA repllcasas a las transcriplasas inveJ;Sas proteica&. Se trota d4t una cnvrna d& 1ipo ONA polimafa:sa. ooncret.amente un, pollmerasa de DNA cflri9ida por RNA (p,g 147) y, pc)f taniO, ~una trttns~a!>a in~<t (p~s 196 y 206), pero oon caracterlsticas especiale5. Efecllvamem,, $0 trota do uM ribOnuclcop,otel~ $lo et (<'l)ttt de sinlotiwr una 69CUencra OOte~<~d!J DHA. y qJe nlil for~d., pc)f dos compon4lnt~:
1. Componente ribonucteotldieo o "RNA de la W!fOmefasa {TR o TER, ~ l~ler'lt$e RNA.}, de tainaflo vori;)blc 6e(P(Jil espec~es (desde 146 nudeb<los hasta 1.544), que forma pane integral de ta enzima. tnc:tuye ooa secuencia.
ETAPAS EN EL PROCESO DE REPLICACION
159
caracterlsbca para cada especie, de 9 a 28 m y tomt'!ementari3 a 1a secuenca telomtlca respeal.a Por ejempio, el RNA ooml)(lnenl e de la leloiTIE!fasa humana ( hl'R) tiene 450 nt f)tltre 10$ Que My una se()l,l(!!t'l(:la f"'C3 en C. (5')CCCU~3'), oomplemenu.ria y an~ra!ela a la hebra nca en G de 13 repetlctOn retomrlc:a (S')TTAGGG(3). Graaas a ona, oomo $t ~ h.Jt90. el hTR s1tve de molde para la sintesis de nuovns. soc~iM: etomMCM.
2 Componente proteico, que contJene la actividad nzimtica, o tr-attSCrlptasa inrersa oe la l~etasa ( TRT o TERT. de telomera.se lflve.t'S6 trooscnpt,se} SI<'I es 13 0\C.tivid~ te.lotnera-sa prop~atnente diCha A dlfetencla de la IT.(InSCriptasa inversa vlnca y 0e1 te610 de ONA pollmerasa&.. sintetczt~ ot ONA te1Qm6nco de (N)VO. sin ne<:e$idttd de c:ebadOI' alguno.. Generalmente suele Ir acompel'lado de otri.l& sub~n~ no cnlalilicas. t~mf)il!n pt01eieas.
12.3.3.4
Mecanismo de ac.cln de la telomerasa
Primera fase (A): La telomerasa alarga el saliente 3'

tdmcro hunUtno
\(
-1'TAQGG'M'A.Q(;C'M' AATOCCAATCCC
tclomc:ru~
humana
pnth m.1
( A 1) """"""';;,., <lo O> 1 C10mo,._O )
~~~~~==~~~~
( A2J """""' .1o......ssn~
apar<'ilmie~n de b11~Hn1n: J)I.~A
tciOOtrico y RNA de l:a tt<h!lllell!l'l
Fl ((l!l~te (ltO!dcndc la k'lorncr~:t au.lix:t la ~ dcl:~ah,'ftlc J' <'fnpii:Jll\lo) onl(l 1!\\lklc t!l bd)l:to de k NA
i.k 1 Pfl)JII!o tdc)mer..-
( A3J ..ns1ocacln )
ni.X'''""' nudrot"""" 1~()1. por b li;IOI'It~ "f*Sa
lil 1\'IOmC!'til ,.; d<->h~ sobr~ (i ~h;.'I'IIC }' f"I'C\'Iilmtnl.(' ~'i(). .IIJ.,,
(>.'otiS..,...undl) 111 ;.'m!lkt'!lCMan.:\lild

p-..,;Q.:< 3 l, tqX\i~III
de> !H,.~'U<,'II~;e.
fiiU,:'~~ ~ lllll~l~'l)ciJ..'~
,.,.
-MTCCCAATCCC
-TTI'.OOG1TAGGQTTAGGG'rt'l't.fi,QI;Tt'AQ;(;t'TAQOO'l'TA<;GC"M'AC<;QM'ACC;C;TTA(;
160
REPUCACtON DEL DNA
Segunda tase (8): la DNA polimerasa rellena la ooa hebra
12.3.3.5 Funcionalidad de la actividad telomerasa en las clulas

prcscn~ en c61u!M de la linea germinal,
En 1(11$ o61ula$ tomfrtiet'IS de 1<'1 m~yOI'it'l de tejidC)$ adultOS no est.e aetMdao ~ICWnert~~so mientn'ls qvc si 0$1;!1 en tejidO$ fetales y en ciertas ClulaS maore (p~ipalmente, hemaiOI)O~ic.$),
todas eliiiS clulas (lOO() diferenci~ y en r;\pi(lal C)n)li~iQn , E~ so oe,. a la r~iQn de la ell'tlfesin g6nica, al igval qve ()l3t3 CU&Iquier otral)ro~ (tema 20), petO aqul no se neoetlta erwar en toiS meeani$(1"1()$ IXlf lOS que $e evila 1 <'1 expresin de 1<t ~rasa , Sino que iMeres~t deStacar sus oonsecuenaas. En ausencia de telometau. a medida que las c&lulas se van dMdlendo -y envefeclendo- sufren un proceso constante- de aoortaiTII8fllO de sus telmero6 (pg. 158). OaOO el ~rc&er repetitivo y oo codificante de $106, inieia!~e esa p6r(j(Ja, de lOs extre!TX)S de cac:.la trOI'T'I()$()rtTI3J no tiene consecuencias. pero noga un pyn~. ~ai:Sas
todas l<ts rcpolic:iono$ IOIOm6rit:a$, en que afecm a regiOnes eoctilleante$.. y entOnces 13 fun~ ~ul3r se ve pcrjudic.dn y IJ ol\.fa; tetmil'\;l par morir, S. M 0Qn$i(Sct&<JO es~ tl~miento oorno p:.rte ese un 1e/()j OiQrgicO o cciufN Que mide el procesc> de envejecl~. contando' el nmero de dhrislooes hasta <JJe la clt.'a debe morir, para oootrolar asl su proli!eraein corretea en los tejidos. Puesto que en la may pane de las clulas de un organismo no 1\ay actividad telom8f"ii$CI, este a00f1amiento es fisloK>glco y se produce oontinuamente durant-e~ la ...~ de oo individuo En ef~:ttto, M ha dem0$1r..OO Que la prdida de repetiaones telomncas aumenta proporcionalmente al nUmero de divisione$ mit4:ie8s e~~:perimel'l~ o a la odad del individuo al que pertenecen las cUM. En consonancia con e&le hocl'lo. se ha ob&ef"o'atlo QI.Mt la inlroduocin af'bllclal de telomerasa en clulas somticas normales repono .., pn:lida de telmero&. Se ooncluye. par tanto, que el acortlwnicnlo tclom6rieo e-sltl telacionado invet'Samcnle con Cl gr&OO de i!"'mort.etid&O O&lular y. en defi!"'itiva, que Cl cnvejotclmleruo es un.a consecuencia de la prdida de telmer os con la edad. Ello e64 tantin de acuerdo con la prdicl<t acelerada de teliTIQfQ$ oblservad<'l en pacientt:s de vttrios si~ <Jo envejocJI'IiieniiO prem~uuro.
La tcJomer-;au est i prc.s.ente. por el eon1rario, en easi todas las oeuas en prOileraeiOn, en espeCial en las clula$ tuMOmles, corrttlbuyendo junto a otros &actofes a la proliferacin lnOOflnlda de tos n.mores. A&l. el aumenlo de accividad telomera&a obMr'iado en fa&e$ tardi<t4 del progreso t~o~morat pUOO. $Or noc....-.r> ~ el crecimieo!O del 1\lmor. 011 impedir Ja, muerte oetult~r
Por con$9Jionte. se NI propt.teStQ 1 3 i'll'lil:lieiOt\ de la accMdad telomerasa eotr'IO un prinCipio de terapia antitumoral y la telot'l'l&tMtl se conSidel't'l una <tana ten~Putlca . Se buscen actualmente lnhlbldores especltlcos del COr'nl)<)t\ef'lte tat8illtieo eJe la telometasa runana. ttwmacos y fac:~es que ac:Wen modulando la telomerasa o cualquier olro companertle asocit'do <' lO$ ~os . Estos aspec:~os tienen lM\ problem*S <Jo envt;eeimiento y Ct'ICer.
gran itllef's aplicado en reladn oon los
12.4 REPLICACIN MITOCONORIAL

la repllcaclon del cromosoma mitooondrial humano se realiza POt oo mecanismo peculiar. di:ferente al $$b./diado para los c;a$0$ de procariotas y genol'l'llll nUClear oe eucano&as.. PreW&mente, se deben ntroduclr alglM\09 conceptOS relativos a esta molCula Cle ONA.
En el cromoeoma ~ocondrlal, circular, una de las hebras PG6M un ma)'Of' contenido en b<J$$6 purinicas. par lo ! ~ora o L (lighl), Por otra patte, ooa zona particular de la molcula recibe el nombre do na de ct..&doblamionto o ckt dotplaumicnto, o bucle O (O-loop): se trata de la riC<tregin oo c:odif~eante del ONA ~Cirial, <11.* desempci\;t el papel de rcgiOn do control. oves OOfltiene el Ongen <le r~n ~ 1& hebra H y lO$ origen~s <Se ltt'lntcrii)Cin <Jo ambM hebrM
que se conoce oomo hebra pe.uda o H (de MJvy. en inga6$). miontms que ea 04ra es l<t hebra
REPLICAC1 0N MJTOCOHDRIAL
161
ONA mi~~C~C<~ndriJ
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6: hl:bolx:~ul.o !111 Clllplt'il~ NR1II ~
1, hdlf, li~'C'Q
la cl\lfiPOI,'fl W la~~U<;w ~o;.,,

1 - " ' 111' 1 " "'Jllano J !.<o
ll l'f\)J~
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... ;.,.,.. ok tqll...--.'!n'" 1 ~ lill(Q
La !)limeta caracteri$~ singl)l(lr de l3 replitacibf\ del ONA mdocondrlal es que no tiene llgar especlhcamente en la fa5e S, sn:> a fo largO de 1000 el cielo celular. E1lo e!U de acuerdo oon la dviSin de las mitooondrras durante la lllterrtt~SC', en de~Jfase oon la oM&liOn de ocros orgftI06 y e la c.lul<'l Adem.ias, no tOO;t$ la$ molCl.lltiS de DNA se replie&l\ una ...e.z por clcio, sino que lo hacen al azat,
La segunda peculiaridad que diferenCia esta replicacin de la del genoma r-.,deaf es $V avnnoe: unid ircccton.;~ l, meoiante doS hOrquillas que parten <le origenes distin1015 y avanz-an en sen6do OI):J0$1o sint.ti:ando 1.1n<' SOI<t het>ro caaa una. Cano consecuencia de este mecanismo, la replicacin lamllin s. diferencia de la do! ONA n~.~CIM PO $el' no simultnea, bHocal y conti'nua (no M klrmaln l'ragmen4os de Olt<'Jtaki, !Ois dos llOOr<ls s. sin~i.tan ~mo conductotas).
Rep!icaCIOn del genoma nucM-.-r de eucaliolas Rep -caon cel ge,oma mitoconclrial 00 cuct~riolas Replicacin del flCOOma ptOC&ritiCO
Carcter
semiconservadora
Simultnea en ambas hebras

seeuef'ICiaf Bidireccional Origen
si si si si
si
si si si
no
si
para 1.1nobrfocat
no
miA!If~ll
mlllples
~~~da hebra
NOO
monofocan
SemldiscontnJa
no (C()fltl!\,l'l etl <~~t> hcbl<tSJ
"
Tema 13
Hibridacin de cidos nucleicos: fundamento y mtodos de ensayo

13.1 Introd ucci n : De-snatural izacin y renatvraliz:.ac:in del ONA. .............. ~..................................................... 163 13.1.1 Aglen4e& detsnalur;;a,lizOJntG$ .... , ., ........,........... ., ......... -- .. ................ . . ...... .. ..... .. ........ . 164 13.1 1.1 DesMturali2&ein y renawra!lzacln por electo de la temperaiUra ......................... ---- 1&4 13. 1.1 .2 0-esMtura~lon por cu:tos y bases. .. .. . . .. .. .. . . . . 164 13. 1.1.3 Oesnatura~acin por agentes c:p.Jimioos ------"""'' , ... . .............,. 1~ 13.1.2 tnlluencia de fa desnaiUratizaciOn &Obre tas propi~ del ONA 165 13. 1.2. 1 In fluencia 60bte lot vi$C0$1dad ... .. .... , .. ......... ..... ------ . . .. ........ . ........ . . .... 165
13. 1 2 2 lnflvenci<'l $()()re ~ 3bSOre.)tl u11ravi01eta
' " ' ' ' " ' ' ' ' H - < H < > < > H < H H -< <><><< < H H H < < < HHO<-<-HHHH
16S
13.1.2.3 Signmcaco l)f'CiiOO de las OJt'tas de <Se:snawrallzaciOt\ .................................................. 166 13.2 Anallsis moJe~;.utar de la hibridi!lcin do .c:idos nucleicos - ............... -............................. -............. 167 13.2. 1 Principio bsico del en~o <le hit>ridaCIOn ....... _,_,.,... ,._,_,..,, ............................................................ 168 13.2.2 lnfluenci<'l <le U~gvnos f<"Jc:tore$ sobre la Nt:ld::te.!)(l ............. _ . ,_ ............. -............ -..................... -......... 16B 13.2.2. 1 R4got de la h!brldacion..... . ................................ ........ ........ ..... . . ....... . ...... . . ... 166 13.3 Mtodos de en e.ayos de hi brid.-cin ............................................................................. -............................... 169 13.3. 1 H:ibndaci6n en f(l$e liquid3. ,._,_,_., .. ,..,_,_., .,,._,_,_.. .,,. .. _,_,_,,,. .. _,_.,,.,,_,_,_, .. ,,,_,. .... _,_,_,,,._,_,_,_,,_,_,,,. .... _ ,_,.,_,_. 169 13.3 2 Hllrid<~ciOn en $OS)C)t!e slidO ...................... -....................................................................................... 170 1 3 3 2.1 Hil;riclaCIOr'l ~~biOI" y '"StolbiOf ........................................ -................... _ ,_ ,_.,,.,,_,_,............. 170 13 3 2.2 HibfldaCIOn oe Soulhern ......................................................................... ....... -............... 171 13 3.2.3 Hibt'ldaeiOt'l NoMern ........................................................ _,., __.,.,,.,._,_ , ............. -..... 171 13.3.3 Hlbrioaci6nlns1tu ............................................................................................... 172 13.3.3.1 Hibridacin in S/.tutisolar _,.,.,._,_,_.,,.,._,_...... ,._,_,_.,,_ .. --- .. ----.... -----.... _ ,_., --- 172 13.3.3.2 HibriclacininSIJucromoSO'IICa ....... ................. ....... . ................... ..................... 172 13.3.4 Tcnicas relacionadas........................,.,_, ....,.,_,_,.,....,_,_,. .. ,..,_,_, ....,_,_,_,_,_, ...,.,_,_ ,._,_,_, .. ----- ... 173 13.3.4.1 Transferencia Western ......... ...... .. ......... ...... . . . .... . . ............................. 173
l a hibttdacin es oo fenmeno de import.Mte aplicc.cin prctiCCt on IOdas l<tS ilf@iiS do 13 8iologla MoleOJiar e lngenierf.a Gentica. y en especial en la Patologia Molecular Ptatill c.omlltender esta& ~ones es pteCI&O estudiar prevt8me:nte 18 ~se ITI()IeOO.W we 1vn(S31menla este Pf'O(le$(l y los meiOdos ensayo etaDOrados Ntfl su ttOiieaeln (M este ten\8.). asi como la91&enieM de pteparaCin oe sondas (tema 14).
oe
La hlbrldaclon est basada en el pt008$0 de renaturaizacin de dOs cadenas sencillas de un ONA.. que se observa. por ejemplo. al enfriar lenl8mente una &Oiucin del ONA dplex previamente desnaturaizado por calOr. La set~slbllldad del aparearr*!luo por puentes de hidrgeno entre bases complemental'lils (AT. A .U o C-G}. presentes en cadenas sencillas contiguas, da luoat a estructvras de dOble hebra. de gran establiclad Estas QUeden ser l'l.ibtidos ONA..ONA, hibdO$ RNA-RNA (ambos horncxfUI)Ie~~o) o hib ridO$ ONARNA {l'le~plex)
13.1 INTRODUCCIN: DESNATURALIZACIN Y RENATURALIZACIN DEL DNA

Pl.le$1o Que la hi~ci6n surge de la observaciOn del proceso de tet~atur~liU.C:iOn <Jt un ONA prcviamerne desnan.ratzaoo. se estudian oomo ll'lttoduocln tos procesos de desnatura!lz.aclon y renatvrallzaCiOo..
Al .gua! que lcJ.s proteinas. los e~doe nueleloos s dtsnaturallun por e'ecto de ag.enteS qui mloos o ti8iC08. $u OOtl'c>rmaCiOt'l tri(Jimensional. et1 t$1)e(:i<'ll la f0tm3 Ou~i~ <let ONA, La <lt$naturalizacin se debe ltln.a 8 la rotura. de los puente:$ de l'idrgeno ontrc p;are$ do 00$0$ como de lt~' intoraociones hidrofbicas entre baS%
peroie~
164
HIBRfDACIOH DE CIDOS N UCLEICOS: FUNDAM.EHTO Y M T ODOS DE EN SAYO
apiladas AJ <Msnalum!i.uww, I<'IS dos ~s del ONA s. .opar.~n y p;~san a \1'18 oon6ormacln al auw {o de o-.-o aleatono}. sin que se ~ere la esttucnn ptlmat1a. pues oo nay rupttn de ent~cs c<walenlos En el ~o de los RNAs, oon muy distinta con#ormadn tricllmenslonat a pesa' de su analogla en eswcbJ1'3 primaria, 13 Clesnaturaizacin afecta fl.ndamemalmente a los tANAs y rANAs, ya que son lOs que pteSMtan regic:ltles en CIOtllt h61ioe. Al no dar lugar a
apllcac~ experimentales. la de:$nah .r{tlitaC:i()rl dl RNA no se considera de
fOfi'Tla particular en este tema.
13.1.1
Agentes desnaturalizantes
Aunque pueden considerarse desnaturallz:anteS bs miSMOS l&ctotes que aetU&I'I tobre las proloin.M, $IO :;o ci"'rn aquf, brevemente. los cidos y bases y cierto6 agentes qul micos, para oeotrar la atet'lcl6n en el e1& <Je 13 temPatura, oomo faoctot representativo AUJ"qJe cada uno de ellos llene un mecanismo paruculaf de actuaciOn. tocJOS debifllan las intetaociones por poontos 00 t.drgeno ykJ de apila,...,!() de bases. conduciendo a un mismo PfooeSO de OC&n<tl:l.ln'lli~i(ln y dO $ep3:r.Ci(ln de la$ Fleblt\$.
13.1.1.1 Desnat uralizacin y renaturalizacin por efecto de la temperatura

La letnperal\lfa, e1 agoet~&e de$n81llfl'llizanle mM tec)(esenta!ivo. acla <St lt\ torma s~'t::
El r ..knllll1lJC'IIIU :;;nu, u:d del O."rolA okhtlilll "'" rucrt.~~~ <:)lllbiliuo;ko.-~~ O: b doblt.: ~l.:o:, le (Qrma que las U htbfi!J .sc- o,k,;:.:nrnr:tm
hml:.~ ,. ~~~ ~QUI
Si <:1 \n(n,mi('Dit! l't ~ ltlltll-1(' y sinlle~ a N.jalr lt:rnpcm~Ut~~~ (lwm 21).)1) <('). hay pG\tiblli,L"Id
1 molcula de DNA de dobk hebra
"\'flC!UI'Nh.''fl
desnatu ra lb.acln
l>('pk"flll'lllll
fn<:~-WP"X~dc
Cllntl'I1U11 M' CUflllllll& )'
do: ~uc .... ~ (t~mpltmcnlllriao M: !f ~ fOtmen d: 1\UI'V~ kas IIUI:III.:l oJr: hidtg.tno cntn: l;u llebn~ ("ltmplaotl'q. 1..11->W pul<: de lao ude~~~U :ttQCill lommt~ el miSil)(! ONA okoblc aripn.al: s..: pt'l)IJJJ.:e la
del ONA.Hl-JI eli.'l'it.la
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""""""' calcmamicmo
--::,~~~:::::::::~rcl,J :a tu ra
ci n
desn lurA.I i:u.~in
rt'\'cn ib li'.
cnf1iamicmo lento
2 mol(ulull de ONA de: hebra M':nellla
En general. se e~ el proceso de de$nallJra!iz:aci6n para el estudio de la e&ttuclur8 del ONA. micntrn Q1.10 &3 renaturaHz.acln 86 til oomo bas& de la& t6cnic8s d hibridacin, de enorme tr.IISCC~it' en BiOiogla MoleeuiiU e lngeneria Gentica. La do&nliM<~Iit:aciO<I\I'renatur~liUtCiOn e$ e~n1e ctltiea en la tCnica de PCR (tema 15).
13.1.1.2 Oesnaturall:tacln por acldos y bases

Como ya se ha e~udlado (pg. 42). el apareamiento de las bases disminuye o se debiliu. po1 valore& do pH alejados de la netStralidad. con la oon61guiente des~uralizaci6n del ONA Sin ..,bclroo. oo mediO ;)Qdo p~ QOnducir t;~mbi:n <' 1;) rvpturn de 1:- e$truelllra primaria de 109 eidoe nuelelcoe (recuerdese que el medio eido luerte rompe 106 enlaces rostOdiS4er y N-gliCOsktloos. mlenb'as que en oondiciono5 ms &uaY86 -f)Or ejemplo, a pH alrededof de ~ $8 sepet8f\ las purir\as: pg. 35}. Por ello. para la desnaturalizacin del ONA es ms habitual emplear rondiciones alcalinas (a las cuales el ONA. a diferencia del RNA. 86 estarl*t}. l a I'IOIAJ<'Ii:ri~cio dol mOdio puoctc permitir la rocuporllci()n ele la estructura de partida, 85 decir. ltt ronatur:lliuci n 001 OHA (oon OOr'ISicJetaCIO~ similares a las de la deSnallJrallzacln pOr<;<tiOr) ,
INTROOUCCIH: OESHA TURALIZACIN Y REHATURALlZACIN DEL OHA
165
el ONA S(W'I motecutas &enellas atlamente polares. con grupos amino y W~rt)Onilo . stO$ le$ '*milel'l competr en la fotmaOIOn de enlaces de hidrgeno con Sos grupoo amino y carbonio prOP<I$ <le las bases, raciti!ando asl la ruptl.l'a de sus apweamKm1os y la consqnente separacin de las hebra$.
13.1.1.3 Desnaturalizacin por agentes qumicos Algunos de tos tot'l'lpUHIO$ tt"'l:lletldos con ftetuel'leia para d&Snarurauz.ar
Agentes qumicos dcsnntumli..:ntcs. <k uso ms frocu~"tc :
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fonnaldchdo
9$13 ~e &e cli,..,,
Oopc~o del tipo de &cei6fl del agente desnatwallz.ante y de la fOf'l'l\i oomo rC$ oonsoguir la tet'latl.lt'alkzBCin del ONA. de modo anlo)o a lO$ Cii$0S an1oriO
se puede
13.1.2
Influencia de la desnaturalizacin sobre las propiedade-s del DNA
En l<l {)filcUca. ta desnatutaiJZaci6n del ONA. se puede seguir fcilmente miditttm &c:~uel!l)$ propl&OadeS llsicas que permite' dlletenclar eJ ONA de doble hebra y ol de hebra scncil!n V~rins de ~ exJ)eM'IeMan profundos cambios (lurttl'lte e1proceso~ aumento de la ab&eroi6n ptica. cambio en ta rot:aciOn ptJca, avmemo de 1a oeMic:Sao de flotaclon y descenso de la visoosidad. Las ms utilizadas $01"1 la tlb$01'Ci6n en ttl ullt<l'l~;) U 260 r'lm) y 18 viSCOSidad. A pa.u Cle estos cambios tambin se puede oblerMW .,formacin de tiPO .structvrat acer~ del prOPQ CidO t'IIJCieico (au~ este aspecto no se oonsidera aqvi)
13.1.2.1 Influencia sobre la viscosidad

La rel81iva11gtdez de la doble hlloe y &u inmen$<1 aoogitud en ~tlefOn (11 di(l~tro Meen que las diSoh.JCiOI'Ies de ONA de doble hebra sean muy VtSOOI$a5. Por el conlf<)rio, en forma do htt>t<l $enona et p~iei'IIO al azar de la C$(Jf!tl8 hace que la 'IISOO$idad Mli'l menor. Dt ac~o COI'I ~. a1 aumentar la .ernperawra. el pH o la concentraCin del agente QUimtOO y produtirw 1~ df!sf\Munlllit3ci01'1, se obSeMilM\8 Oisminueln en la viscosidad de ta diSOluCIn de ONA. Cambio& en tn vi$00$id00 y 8b$0rtl0tl optiea del ONA por electo de la temperatura (resvllada$ similares se obl.lef'lel'l con c~~ otro &gente desnaru!llllzante)A mayor temperatura, ma r arado de desnaturalizaciln
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IJe &O~ dM~81il:$(111!)
AI.IM(!I't\0 de la abSorCin
Descenso de 13 VISCOSidad
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13.1.2.2 Influencia sobre la absorcin ultravioleta

Recurdese que ltt& base& n.trogenadiils, los nv<:lo$idos y los nocletlos poseen valores milxmor. de ab&Otci6n de la luz cercanos a la longitud de onda e 260 nm. dobidio a ta P1'9$$ncia en &u molo.Aa de sistemas conJugados de dobles enlace&. E!M propiedad se mantiene en los cidos oocleiC06, pero la tna9fW!IJd de la absoran no er.la ITIISma. pU$6 el apilamtento y los puentes de t.:kgeno la reducen (a eSio se Wt llama efecto hlpocrmlco). Pot ello, el ONA. de hebra sen~ atorbe en m;~gnitud simtvr a los rn.~c\ctitto& R:>r.s. mientras ooe el ONA de dotll8 nebra absorbe mel'los. CO<I eonseeuer'M':ia, la <lesnatulaliZaCil'l del ONA va a001pal\acla de ul'l aumento en la A.-x,o (al que se Lvna efecto hipercrmico).
166
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HIBRIDACIN DE CIDOS NUCI..EICOS: FUNDAMENTO V M~OOOS DE EHSAYO
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Ob$f\oese Ol)(llPara1V1!t'rlMie la relaclon exiStente entre dtSmlnudn de la Vt:SCO$da(l y aumen10 de A26Q ntn con el Pfooe90 de desnabJrahzaaon del ONA. El RNA, al presentar en 51.1 ~ un graoo vanable de doble netJra. Pfesen1ara tM'Ia absoran Intermedia entre la de un ONA dple.x de t.amal\o equrvalente v uno de hebrn simple (de&naturaizado), la magnitud depeOOe de la: c:omp&e;dad de &u eslructura &eOUnana y por tanto. lambin del tiPO de RNA (mensajero, ribostnlc:o a de tmnsforencial
13.1.2.3 Significado prctico de las curvas de desnaturalizacin

La 'eposen1 acM g~tic~ de la vatiBCIOn de viscosidad o e ~ lrente a la tempera!IJra (o concenttacion de obtener las cutv.n de desnatutallucln. que &oon caracterlstlcas. para cada ONA en d!soluan. El cerctet slgnodal de es.las curvas Indica qu. la de&noaturMaon se produce brustamtWIO. on un mafVCO muy esttectlo de lemperalura. de pH o de concentr..cln de agente $$n<1Malil.arl\1e Esto oontra&t<J 'n NI tr<~n$ici6n ms gradual observada en la dMnatwallzacin IBrmlc8 d$ proteina$. y~ que las inl.erl)(;ciOI'IC$ QU& tn$ntlenon 13 doble hlioe {aptamlemo y puentes de hdrgeno) &On OOCJI)erativa&, e& docir, lt~ ~ ,r<~Qft de l;t$ ~' on Ul'\ ~ fa'iCM'eCe que se &gan separando en el resto de la molcula. Al ser la trarnslon ~ bru&Cil. I<J d<I$Nttura!i~ci0n t6,mc;a dol ONA es ~lrf'lt.(lr tn cieno mOdo "' la fliSiOn de un $iido, por 10 que s. Mbla lll~ de e utvu de fusi6n, y a la tempen'ltura cenlral del ~ervalo de uanslcibn (50% de deSnallJral!zac:ln) se le lama tempefatura de fu sin (T o T..,, del: Ingls meffing) Bajo condiciones definida&-. cad3 ONA muestra \nl CUNa de fu oon valore& Cilaeleristicot do T..,. y de m<lgnituc:f dcri o!~ hiper'CfiniCO (di~ emte A:;oao !:luma y mlfim;a, o <:0\mbio dO viSQO$idad) ~~os ~tos $0n una medida de U. ~labilidad esaructuNII de la moiOOJia d& Cido nvtlok;o. Sv v;tlol d~ adems. del pH y ta tuenalnic.a del medo, y de f3 composicin en bases dol 6cldo nucleieo Es imporiNI!e resa!r.tw la relacin entre T.., y el GOnleniclo en pares de be$$$ C:oG o A=T del ONA: Cuan\o ~s al)und(ttltes son CxG. ms desplazada hecla la derecha apareoo la curva es decir. se neceW mayo1 temi)Oratvra para l(ll deSnaDJta!lz.aclon, T,.. e9 mayor. V 'lkevtw'&a. cuamo r$ pares A= T, mryor despit.zamktnto a ta izqvierdt' y mcno1 T111 E$10 .$8 debe a ~. al se~ ms fiJene la lntetaocin el'lllll pares C..G (3 puenCes de hidlgeno). necvl5itan ma.yo1 enetgia para dtsodarse
aget~Ce desnarutal!zante) pemlle
ANLISIS MOLECUlAR DE LA HIBRIDACIN DE CIDOS NUCLEICOS
167
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En decco. al <lete.rmlnar la tetJl)ef'atura de fus-.n para varios DNA$ d4J origenes di~sos, se N Moontrado ur'l8 00fl'ei3Ci0n lineal oon su contenidO de G-+-C (que, de acuerdo oon un<t de I<Js regi<\S oe Chargart, ya esrudladas (p&g. 39), v8tia en1re especies y puede e~arse oomo indiot en cstvelio$ evolut:rYOS}. EIO permite ullaar la T.., de una muestra de DNA para es1lmat su oomposiCI6n en bases Por e,empiQ, MI p~ utiizat J)."'ffl determinar la presencia de reglones r1cas en G+C o de 'islotes CpG', asociados rrewet~temente en el gE!f'loma eucanOtico a regiones promotoras. reguladorM de la ttiW'I$cripein y ~nmefllc metiladas. Finalmente. la rQprc~n grllfiC;ll de 1as cutvas de desnal\.l'allz.aclon y re.naturalizatin de un ONA permite oomo se indiCO a1 prindpio, que la Smllllud entte ambos proceS06 <kJc)ende de la$ condiQIOf'let en 13$ que se intente la tet~a!Ufa&zaCfn . Obviamente. ambas OJrvas di:$wrren en $O:nlidos OPYHIOS. peto slo si el oolrlamrento es ler'lto uene lugar una ren.a!Ufahzaetn, mentret$ cuc vn enfn<tmieMo rliCii<IO tt'l'lpiCJe 13 teasociadn corree1a de las hebras:
observt~r.
Enfriamiento rpido:
No hay renalurallL.adn
( ;\ :.e pc-r manf' casi ("on)t ilnH:)
Enfria miento hmto: Rcnalur ali1..ci6n

(dhrni nud n d r \ ~)
.. ..
.Joble
hcbrn
13.2 ANLISIS MOLECULAR DE LA HIBRIDACIN DE CIDOS NUCLEICOS

Cebe tcncr11o en went3 que 1:1 tet~attnlizactn aepenoe Sk) de ta completnet'ltatiedad de seeUMCia de 1as hei.Q$. P()f eno. aunque to mtls ptOtlable es que estas se reasocien fonnancJO tas mismas pareja'S o dplex originales. pueden darse otras reasoclaclones. En partiCular. si se parte de una mezCla desnaturalizada de ITI06culas dlstln18s oe ONA, pero con secuencias parecidas en p&rto {OOf e,emplo. de OHA que ocxlifica la misma proteina en espeetes dl6tntas). ;,~1 ronttl\lra!iuw 110 Pvedc pr~it la asociacin p{treiat de dOS hebras proee<~entes de mo61!oeula11 dU(lleK dilltn1a11 Se f()fman asi DNAs hibridos de doble hellta, eon regiones de apareamiento y de no aJ)."'re::t~IO. Esta formacin de molOJias dplex. de ONA cuyas hebras tienen distinto origen (distinta especie o. en general, <i&ttnto ilcldo nucleico) reobe el nombre de h ibr idolcin Es a~r;;~ctcfis1ico el carjctcr ilrtifiet<~l de 11v C.On$qQ)Cin, ~ i!tM QUe tcwnbin se CX)(I$i00te hibridO()(I 1<'1 fonna.ci6n <:Jt: hitndOS et~tte DNA y RNA, o entte un t\CidO nt~eteico y un Oligonuctetl(.tO nctturat o sinttico. si(w'lpro en !uncin de 13 eltisten~ oe s.ecvenei<'tS 1~1 o ~(Cialmen4e oomplcmentanas .
iMIC:a que tos organiSmos oe donoe proceden comparten un cierto grado de netencla eVOlutiVa comUn. y que 541$ RNAs y proteinas llenen esb'lJcturas y fvnclones similares. Se dioe que los cidos nucleicos que codifican estas protefnas y RNA$ benen s..c.vencias si,.tS. homlogas. A mwyor grado de hibridaocin. m<ryor oone.xin evolutiva entre .,pecies, y vioovcrU~ . por tjemp~. t i ONA hvmnno hibtid3 en mayor l)r()C)()f(:iOI'I oon ..- ONA de ((}tn qve: con et d8 1.0 e~bil~ <MI l'librtOO fiS ~ttnto meyor OJanto mas elevada sea 18 ~Cin de b$Ses como~emeM3ti(lS y mfj}'(lt lt~IOngilud ese las Sec:uetlCi&S &p.ateadas. EJ heChO de que cacsenas ~iferenles ae aeido nucteico hibriden et\lre $i
168
HIBRIOACION DE CIDOS HUCLEICOS: FUNDAMENTO Y METODOS DE ENSAYO
levadura. Sin emb3rgo. no e:t 6$1f 11 (;ni<:<\ mucha$ et~tre ellas en e diagnOs.tiOr>Ciin.:;o,
vblidt~d
de I<J hibridacin, WIO que da lugar a runerosas
~ones,
13.2.1
Principio bsico del ensayo de hibridacin
Todo$ los ens&yos de ~daoin se basan en la gran especlflcictad de la iruerac::CIOt'l et~tre b3$e$ CCitfltllemen!(lri<'Js P<!rt~ Que 1;11 hibrid..cin permita kfentfficar en un genoma. u otra muestra cualquiera ae &ciClo oocleleo. una seeuerM:Ia partiCular s.e rec:ui&ren CIOS elementos bilsicos:
La presenaa de .la secuenda d.lana en uno de lOs fragmeniOS, genera!Mentte Obtenido$ con <tn~tl& de tSbiocin. de la muestr.~ de cido nudeeco. Un fragmento corto de cick> nucleioo. llamacb sonda, de secuencia oonoclda y oomplemenl.at1a a la s&euel'leia diana, maleado de bma que pem~ila t;u deteca6n (radiactivo. oob'eado. 1\Jotescente...: lema t 4).
rne:'.dll de (r,;nu:n~
o.kUNA
(de dllblc hchru)
I'IIC:t(b de: flll~ 1k ON A !k hcbn1 ,.,Oo. , ILII (ON A _~llatuntht.-kiJ
,. ':; -~ -
,._ ,_..;;;;r
r
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betcrodliplex, hlbrido~ de
la. :IUQd, """' 1,1111) de 1~ 1'1'28110'1101 de 13 tlll.>blr.l lit< DN1 \
llOfW de I)NA
('fl
n*''U~ COI'I I$ ~~Ca~encU (di11na) q,.e .e bu;o;-,
b muw ra
!J'M.J. .o:n W ia ~,lllbona.qw tllpo.>nt<

W'1 0.0000~"'4 ..1tt111t'0Da ..,...,
.1. T
homodl,lfll de: b
tu~anmJi:tado)
s..m.S.(ONA
13.2.2 Influencia de algunos factores sobre la hibridacin

Adems de la rompo9ein de beses de las cadena$. eKi$1c una $Crie de P<W~ ~ ttfectoln a la po$ibilidad de renaturalizac:in de dos hebras scntiua, y. por tan10. <:Onc:ieio!'l<lln e:~~pe'nontalmente la realil8Cin de un ensayo de hibridacin. Esto6 faacfM, cvya OOsc:Qx;in ~aii..OO <:Orre:$poni:Se a. ~ trM.-do e$f)ec:lfico de mo1odologl<t en 8iol0gi<t MOIO<:VI<w. Ht~n O$CIIC~Imenle relaCiOnadOS OOf\ 13 OOtloer'ltt&CIOn Cle ONA O RNA diana {00 SOlO la ooneentraciOn Cle CXIO t-..cleieo en la muestra. sioo el nmero de oopla!l de la secuencia diana que conuene esa muestra). la OOI'ICenttaCIOn y 18matlo de la sonda. la temperatura y tiempo de hibridacin, y las carae1errs:6c:a& del medio de reacd6n. tales oomo toona inic:a. pH. ooncenlrac:in de agente$ de$nt'Wfi!liZ<W"!tt$. <tdic:in de tiOrto$ pOiimcros, etc:. A ooncin\.la!Cin $0 comento~ $IO un il$pc<;IQ, de inters genere~ en eualquier ensayo ese hibricl&eiOn, determinado por algunos de dichos factore&
13.2.2.1 Rigor de la hibridacin

Se define el rigor (en ingiO$, &tringoncy) oomo ol grado de espocir.eid3d on ~ 3parea.mieMo conseguiOO el'l b$ hlbtidos: es decir. supone !A'la medida de la capacidad de reconocimieneo mutuo de dO$ N ~~~~~ 111 hibridacin. normalmente " bl4c:a ~ ~ro<'!mien'O CQI'MC)Ieto t!te sonda y dial\&, pero en ocaSiOneS lntete~ tolerar un cierto gr~ de csesapateamient.:l. 001\ ellln <M dei6Ct&r reglones del ONA cuya secuencia no es exac:tame.Me igull a la diana. pero pre&enta elevada homologia. Por otro lado. ol ~ontrol del gor on ~ l)licac::in y C$0 conc::re1o et esencial: ni debe Mr tan allo Ql.'8 il'l'lpid3 ltt unin 11t$1 ;ti)IC e la $()1'1(18 a su diana, lli tan bajO que petmfla la hibridacin inc~ifica de 1<'1 sondo oon $f)(Ueneias poco relac::iol'ladas, dBno lugar a una senal de tondo elevada o a falsos po$itivos El rigOr d~l'lde de diversos faclores experlmenlalea: temperaiUta y liempo de renaturalizacin (o templado), longii!Jd y oonc:entrac.n de la& cactena:s, oompos,iQItl de baH& y t~mbicntc Quinico (Pflt$CilCia do c::.lioncs, for~mi!Jil. urea. pH. tC)O de disoluc:in. et.c.). Cuttnto mi11 olovt~d<'l os 1.1 temi)On"!bJrtl dumnte 1. 1 f;)~K~ de ...,p~. m."''s e$00Cib
owen*
M T ODOS DE ENSAYOS DE H IB I\IDACIOH
169
debe ser te lntetacdn entre las hebfas para Q1.Mt M m;Jil4C:"'!);ln vnidas los cationes rnonovatentes { Na) estat:>ilizan el duplex. pues aparua!lan la rept.Asin electrosttica entre los grupo$ I0$1310, facilitando la a.ptoxlrnaOIOn de ambaS het.H'l$, Por !tn~o. la formamid<l y la ~Ji'~ vfoct;t.n a 10$ en1aoes de hidrOQeo!IO {pilg. 165) y son por ello agentes que desesttlbillzan la doble hlice.
En consecuencia. 10$ pm<;ipaie$ faC1ores que se suelen manejar en la prcoca para malOITIIzar el ngor de la hibridacin, y permitir siQ lO$ flibtidO$ que estn apareados oomplelamente. son la eievaan de la temperatura de tnpi..OO, lt~ di$mif'I~~Cin de ta ooncentraCIOc'l de Na y et aumeMo de le de fmamlda. Vl08'Yersa. para reducr et ngor de la hit)rid:.eibn, es decir, para perrn!llr la formacin de hlbrido6 paraalmente desapantados. se emplean ten'IP8fcrt\m.ls de templado relativamente bajas.. oonoontraciones altas de Na y bajas dt r~ida
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13.3 MTODOS DE ENSAYOS DE HIBRIDACIN

TodO$ los en$<JYOS de hibrldt'lcin se WIS$n en 13 Me:CIIl de hebrM set'leillllS de 6cidO nucteoc:o olutiS.Irtl o <liMa, m;uC<'do, <;on 1.1n& sono. de seeueneia (::()(lOCiCJa.. Mai'C&Cia. bajo condiciones e.perimertales que l)e(MiUW\ e~ a~:.miento enve baSes eornplementanas. SI ta sonda o el ONA dlana sen oe OOble neora. 1\an de w prteviamente Ot$natu~lita4QS, ~mente por caiOf o por tratamiento alcellno. Una vez mezclacas, se petmlte la ren aturaliz.aein e-.n ta ct.lllf. 001"1'10 ya se ha comentado. se pueden tormar hlbrldos sonda:dlana. Se 1\a de diSpor'W!f, Me-mas. de Ul\ MiOdo pata deteclar tos hlbrictos toonados. que viene determinado por elllpo marcaje empteaoo en la sonda.
no
oe
los ensayos de r.i:lndaci6n se oueden clttsifictlr en tres gruPOS:
Hibridacin en filS lquida

''Oot+blot'' \' "'SI\ltblol"
Hibridacin en soporte slido Htbridacin ia sim
1-Jibridaci~ de Sou!Mm o ..Soothcrn bt.o1.. 11ibridadn 1\'orthcm o M'Jorth~~m blot''
13.3.1
Hibridacin en fase lquida
~$~ tv& el mlM<IO iniCJ<~ImrriO empleado. Vliliza,ntto un& muestra de ONA o RNA. en disolucin, se realiza w hlbrldaOIOn con 1a sones: a1 estar ambaS diSUeltas. 1a cintiCa es ms rapiea. Adems, t<X18$ tas rnot6Q.IIa$ CliMa son guatmente accesibles, por 'lo que la tecnlca es ms cuanMaliva que la hlbrldaein en sq:l()tte SOiiclo. ~ ernt>argo e. (JI m61odo ~ menO$ se utiliza acl\la1mente. t\atlienclo sido desplazado por otros ms 0011\'enlentes. Se aplica. por ejem'llo, tf'l el estudio de ~ c~I'\ICI\IJ(I4f los mRNAs emPI&.3ndo lli.'Cioaso S 1
170
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HIBRIOACION DE CIDOS NUCLEICOS: FUNDAMENTO Y M ~ TODOS DE ENSAYO
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13.3.2
Hibridacin en soporte slido
se ttata de un tipo oe ensayo mas Si'nple, que permite procesar varias muestras slmt*aneamente y tacll!ta el OQMrOI de la hibriOaein. Aunque 1& ~lea de la hlbl1dadn es ms ien&a y el proceso menos ellclente. se utiliza mUCho MM que .la hlbrlcsacln en <bolucl6n, por ser ms sen~ de realizar y ms verstil.
E.s!OS metodoe han adquirido hoy dla un inters parbculat como herramientas muy vrldas para el an.Msis de ddos nucleicos y el6agnstioo de enlermadade& moleculares con base 98fl6ca. C<lmo antecodenles. PJIO(Ien citarse la lnmc:wlllzaciOn del ONA en nittooeluiOGa, &u det9CQn por primera vez por lllldacin y el OO&OI.Itlrmienlo de un mModo para &a lisis in situ de colonias bacterianas en filtros <'e oetut~ .
El esquema
genero:~~!
de este b1J0 de on~K'YQ$
M puocte ilustrar oon et mModO oomUnmente empleado
~rll
identif~ear. de entr9 voriM QO!Ionia$ b;ac;lcrianas on ptaeas eJe cullivo oon agar, tl'agtr~ento de ONA de lntetos bajo 1a fonne de plsmido recombinante (tema 16),
aqullas que contienen un get1 o
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$t llltljo()lli .. d@
l)&llal 01' ag~r ~u,_ diJ
<tlda ('.0101\ia M PlQIWI I)Cipel.
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S. ~ ., dhoo da PtiP'I con 1.t 101*'- 1)e " ' cx*n... Ot ~
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13.3.2.1
Se~-~Pd
_.... ~ bOQI'M'Ica
t~<le~X)
dtclr.- ,~ '1~ (Oillc..... fl
. . . .................... - -l)f<C . .. - ..
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'fMIO.-.Ia-.111
Hibridacin " dot-blot" y stot..fllot"
Es ef mlodo m:5 ;imple y eomUn. 91~eias a su J)OI$ibificlad oe empleo con muestras de cldo nucleico sin purificat (por ejemplo, sengH ) , hoots o esr;~utos). la ~ se aplica. bien gota a gota (dot~) o en manchas alargadas (.SSOrbfOf). sobre un "11!110. de n)ton o M rocelulo&a, Oll)'a& prQPO<Iados do 00$01'c;in fijan las molCulas oe eillo nuctelco y prote!na.
ME"TOOOS DE EIISAYOS DE HIBRIOACI:! N- - - - - - - - - - - - - - - - - - - ' 1 "7-'1
13.3.2.2
Hibridacin de Southem
0c$(WIQIItdl! pOI t;,M SOU!hem, al que deb~ SU 1'10\bi'O (Southein ~ . Es &1'13 tCnica Simple yfol de reallz.at 9 d4Jioct~ rr;'lgmenl~ ~ DNA, sepatados por tamatlo mediante electro!oreSis en gel (pg 137) Combina la $CPar~n etoecttOforllca del ONA oon su trans.lerencla a ~ sopotte slido o 'filtro (rrylon o nrtrooetulosa) para su hbrid<t~ Ta1110 s1a como ta posll:lriOf detecclbn se realizan de lorma mas: eficaz 8fl el !'VIro de Jo quo 58 han.a en el gel ES'Ia tcnica ha eonMbuido de forma notab1e a aumentaf la poleru:::aallclad de fa hiboaci6n oomo herra~ruenta enalitica. coostltll)'endo hoy dia en bloQulrnica d imca ct mloOO he~biluol dt.' (ln<\li$is del DNA exlri;I.OO tJe mueSfmS <M
sangre, ~pl.dOS.. reji(SO y Clulas (llnfOOIIOS, 3fMiOCI!O$ .J

Mcx:So~Ogleatne!nle
lmpliea cnco ecapas bien d!rerenc.adas: separacon elecuofortaca, desnatur-alizac:fon,
tr;)n$1ert'hei3, h01daci6n y deteoclon
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13.3.2.3 Hibridacin Northem

A diferencia del caso an.tenor, su Mm~ (notthem .t:tot) t10 COf(espont ~ de ning(ln IIW(I;ligMor, ~a un unple Juego de palabras (southem = del sur, tWJttttem = del none). El procedlmento es.ICIMtJCO, p6fO el CidO nucleier> ;~n::~lir.:ldo n5 RNA Por 5U tn9I'IOC tamilo, nQ 95 no~nc- w ft<loJil'l$nlaca6n IXln e~l$aosat>. pero debe 1enerse es.pee.al CullladO para eW:atla 4t<iei0n ~ RN3Stt'&. l<'lniO en<:lgni!l$ C(lmO OXSJCn<'l$ (contaminacin muy comOO.InCiuso por las manos del anali!lta, y muy dlrkiles de IMetivat. ES uso co agentes dtt$t\o'I!UI';:Ifa;.\ntos $9J'O $tl..'ndo necesano para evitar apareamfefltos .ntmcatanatlos. que a!lemrlan et patrn de !leparaein pot tamaM la tcnca 6e hibridaclon Nortnem se emp1e.a pnnclpalmente para obten&f' lnfOI'maeiOn SObfe el tamano do!! RN.Ali y liObte el modelo do e"presin de 991"" especrfioos. Es10$. une. 'V9l c:lonadot>, pueden & UllltZados. como sondas pam hibrid3r m!Mir<l$ O. RNA t'i~ de vna v~ de lojidos dilerenle&. y oll&i oonooet los tpos. celulares en los que se expresa e! gen. la .abutl<!Jn03 te131lva y tamal\0 de lOS ln:11'1$CNIO$. y dl'lf$0$ de'lalle& de &U procesarmenlo poslerlor.
172
KIBRIDACIN DE CIDOS NUCLEICOS: FUNDAMENTO Y M~TODOS DE ENSAYO
f.jcmplo de m1crpre1sctn
de un experimento de Southcm.
Las srnaks <Jblc:rudas cD la :.Uion-...Jiogr .. fRI d.:pmdcn del mupa de ~tril:c;in del ONA (dutribo(in de kll5 puMOS de t.'.Jonc J l i.k lb rondas n nplndas.
~=~ ...........
A 0
IIII!Wi'k> jlb)
- ... . -. .-.. _,
~()No\
N$Ullado de b tubnda~ t(to Southern trn~ la aUion.dl()gtal'ia
- .... .. _ .... ...........

......-o~l)
df P>i-'
13.3.3 Hibridacin in situ

E& un tipo espe<:i;lr~t.-do dt hibrid<'Cin en sopol'le Slido, et1 la que la SCl'lda se aplica 90bfe muesttas en su t.bcacin na:l\lrt~l. genoraln'lente aQuellas preparadaS para mlcrosOO!l'a. Supone, por taolo. e6 empleo de la hibrlljacin Np un al)c)((laje eilolgico e hiStolgico. y metodolgicamente e& anloga a la& tc:nlcas innuwx:itoqufmicas e iiM'IunotustoquimiCM. Oe forma muy global, cabe distingt.W entre su& aplicaciones tiQAcw y cromo&Omic...
13.3.3.1
Hibridacin in stu tisular
Se realiZa sobre oones de tejido. clulas In~. ,.j,cleos aisla<io$. , En muc;ho$ ~$0& s. il:rv;) a C<\bO dlltectamenle sobfe tejidos fijados oon f~ incbd06 en pam&\a. oo~dos. eec. es unITIQ<J:IIidad d& hibMaein pattladarmente Importante para detectar virus ~~1'10$, par<' diagn0$~r C61 uiM tanoetOSas 0010 consecuencia de cambios genelcos o para estl.dar canbios en la exnsiOn Q6niea. deteett~ndo secuencias en el RNA oelulat. En es.1e caso. ttas \.W\1'1 r~acln suave de la preparacin. se afladen sondas de ONA <:Omplement<lrio {CONA), de hcbr3 sen~. La delecx:IOn se realiza por euiOtrildiogr<~fi;t y ex.;wne;n de &.1. peltcull'l fologrMlca bajo el mierosoopio, o por l"'''ierosoopia de lloofe&cenciil. s;i se emple ce m;)rC<'Iie PN"ala sonda (lema 14).
13.3.3.2 Hibridacin in situ cromo.smica

Se reaiza &Obra preparaocione$ 4Ml ()Ort.& de ~mas meta1slcos o prometafsk:os (pg. 90), tratadas con fijadores para onnerv<~r l<'s tan'Cicri$tic:as m0r101glces <Jet ctomosoma. Para haoer accesible la secuenQCI de ONA. se lr.lta 13 mucstr;:a ~n enlimas prOieolltlc:as y se desnat!Jrallza el ONA por ealor, lcal o Jonnan.da pera permitir su hibrltt.-.ci6n con 1 3 S<:c~a. l nieialme.Me se emp6earon sondas raciaoctfvas. pero ll'QOiemas tcnco& (1(1 la det:ec<:in de la set'lal lil'l'litan su utilicS&<J. Se ha~ aumentar ~ sens~d y ~lucin <;On ol empleO de sondas tnareadas eot1 nuorescencla. En es1a tcnica. llamada hibridacin in situ POt" fluorosuneia o FISH (/'ttlof'e$'CM~Ce In situ hybrlCNza!ton), la deteocln se haoe bajo lricrosoopio de tluoresc::encia, bien de tormt' directa o IJCI un l'l'ltoOO ~ecto
(pg.
1M>
En cuanto a svs a()(I(;;)Cioncs dada la gtan deteetabllldad de los ftuotoc:romos aecuales se puede empl&ar la FISH
con fines mvy diver$0$ y se ha OClfWertldo en una lcniea con elevado potencial diagnstico en (;J"OI'I'l()$()OP31it'$ (tem3 29), gene.~ tumOtalet.. vlroiOg&a, trasplantes, etc. Vno oe 10$ me-1 000$ surgidos de la hllridaciOn in &itu cromo&mica es el denominado pintado de cromosoi1'1M (cJwomoso~ p.t,imir'l!)). donde se usa como sonda una mezcla d4t fragmentos de ONA PfOCO(fenlcs e un MiSmo CtQmOsoma. con to cual se observa fluoresoencia en el crotn0$0m<l como~eeo. se * ilita ul la ldenuflcadOn visual de eacta CI'Ot'I'IOSOma (o vanos sirrv.ll~~e. si M emplct\n $(lf'l()as con distintos nuorocromos). en lo que se ha llamado un eanocpo moleaiar" E&kl es (ltil ~r<t estOOi<lr gr~tldes reotganizac::lones de lOs eromosomas. que denen h.9lf por ejemplo en proce&O& canceroSO$.
M ~TODOS DE ENSAYOS OE HIBRIDACIN
173
13.3.4 Tcnicas relacionadas

Se eomenta tinM-n~nlf! una llt(:ftca clt! anMshl que, aun no et~l'ldo baSbC.tn en !Qlf. prlnetplo$ de hlbrt;t<Jctn, POSee una swnilltud en tos planteamientos que hace Interesante 'Su eA'posieio ~ este lugar Hil' s~ongid<> l<lmbin Oti'O$ numerosos miOdos de anliSIS de acidos nudetoos, vanantes de tos 8iQU 1expuestos, que oombh\:tn fl!l .cOI"'f)Cil11ief'lto de ros addos noclelcos por sondas con la tnteracciOn espectflca entre aqullos y prnceinas, Ulle$ con'IO tos ensttvos da nHardo en gel o tos mf:lodos SoulhweSJem y FtJfWesrem Su t!escri)Cin excede el l\lieancc ~ eS!o libro
13.3.4. 1 Transferenc ia Western

A pesar de que en esl8 caso no exl~e h!brldacion entre aodot nuCiiiC:OS, se CleSCtibe aqui ~t(t ~ por su slmiltucl tcNCa y macanisbca con las hblda0100es Southern '/ Northern. El ensayo We$tern (we$rcm del C)Kie} so emplea Pll'fCt aetectar ~s prQ tefna& pres~wnes en una mues.tre. Para &110, son ~tidas a eteetrofou~StS en gel ~
proia<:rilamida (separndo$G en funct:)n de tamao y carga. salvo en el CB!IO frewente de electroforess en presencia de SOS, que S~P<If~l S6b en funcin dO ~milfk>) y tfltl$f<tridas a una membraNJ (wesrem brot). La delecan de las-bandas I)J()tiQ1$ en ta memb!'al\8 o muo se reah:a gr;t<:ias a la uni6n O$f.IOCificl.l de un Qn~ c;onlra fa; pro~elna o regl6o proteiCa que se qwete estudiar. Oe ~'arma similar ~~ tMrcaje y dC:teIOn de so~ <k <'tOICk> nuCfoeioo, so puede marCCN' ~IM'Itnle et \lllbeuetJX> o Qetecurto tnedi~nlelauniOn do una proleina liganle marcada a su vez, lanto empleando JS6!opM oomo t~nieas no t.'ldiacsivat El p~r;'llcA$mo (y t.os diklnJnc;ias) entre los 3 mitodos $1) roS\lme en 1.a figura
Southem
Northem
WeSi t'tm
tru'U
L:. ekrofo~i~ de> icld.~
r.udnw!i !le llllek hueer rn &de!!~ tk apow. )'en horit.untlll; b de
clcctroforcsi!i
elccnofot~i-..
proleinu., en F-le~ dr rnfiuenllunida y t(l \CI'I:ICIII
$(1ftd
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Olllllkbc. l p r~~t CJC!Uplp::
nl:J('(II)C q~ w bubl<::ul ltiOOrpmltOO en 111 liUI.dll

m~~m~OO tO;
1 ll l((nica de ~.0., llo.-ptndt dcl b:_po do:

\k'lq,~{m t(n
iWiJ)I.! IMI...tti'o o~Uicm~diosnsf~<~" d.:llo.:'Wr de naoJiucin

OuM~Cmmo
dr:sCC:IOf de lluOrtiCCib:ll
11\'idlllll O C"'tti'IIUI\IICbtllt dn!l diJ'C)Jtir:niiU QIUDii) lile d,l J)II~IJCI.a !WtcadQ, lbtc~IC ct q~nm.il'>lumin~Jli.C
tnOI!nll
dl;<l:u:o.~
eorin
De forrna 81 \8\o9a, lal'nt!l~n ~ re<~Az.an ensa)'os "dolblol" y "siO(bbl' pcwa prolelnas, con un plan~.<~tnief\1o 31miar al cxpoe~o para cidos nuclelcos, salvo poc etlipo ele m~tta y vn ~iento de unio y deteocin completamef't!e anlo90 al del W&stem (en esw caso, otwtameme al no rewar e!l(!~rOf<lreS~S no es p-edsa la 1ransferenc1a).
Tema 14
Preparacin y marcaje de sondas para hibridacin

14,1 Preparacin <te sondas genUcas .................................................................................................................. 14.1.1 Clasificacin de las sonda&. en funCin del mtooode preparaciOn - ---- ---- 14 : 1.2 Sondasconvencronales ................................................... ----.... -. , .. ... --- 14.1.2 .1 Sondas de ONA obtenidas 1)0( dOt'laeiOt\ ct!u!ar (\&Cnologin del ONA re<:ombin<ente) 14.1 .2.2 Sondas de ONA obtendas por donaCIOn acelular (amplifiC&eiOn oor PCR}.. 4.1 .2.3 Sondas convencionales oe RNA (tibosondas) ---. .. . 1 1 4.1.3 Sondassintbeas ... ........................................................ . ............................ .. ----" .. 14, 1 3 1 Sin~si5 quimica de oligonuclei.KI06 ................................................................ ,.,._ ,_ ,_ ,_ .. - 14 1 3.2 Oi$eflo de on3 $()fl(l(l sinttica . ...... ....... ................................... ................... .......
14.2 14.2.1
17$ 176 176 176 176 177 177 173 179

181 182
Ma~aje de l.:ts sonda'S ...... - ... - ..................................................................... ~.~............................................ 180
MarcajedlreciOe.nlamolctAa de$0t'lda ............... ,_,_ ,_, .. . ... ..... ....................... 14.2. 1.1 Marc:.afe con ONA pollrnef'asa.......,_ ,_ ,_,.. ....... . ............. _ ,_ ,_ ,_ ,,........... _ ,_ ,_ ,_ ,_ ,, ......... <t) M~de ITS&Ia<loe la~ ................................................................ ,,,,,_ ,_ ,_,,,._,_ , b) M~todode iniciacin o oebado al azar ............................... ................. ...... ,_ ,_,, 14.2.1.2 Mareaje lermin;tl... , ,,._,_,. ,.,_,_,_, ...................................................... a) Marcaje oon potinucleolido quinas-.3 - ,_ ...... . ........ .......... ................. b) Marcaje terminal por relleno ........... ........ ......... _,_,_,_ ,,,.,._ ,_ ,_ ,,, .... _ ,_ ,.,,. .. _ ,_ ,
Marcaje externo a la sonda................................. ....
1$2 183
183
184 t84
14 2.2 142.3
14.2 4
Marcaje .-.c!1redo ....................... ......... _ ,_ ,_ ,,,_,_,_, ....,.. . ..., _ ,_ ,_ ,_ ................................. Tipos de grupog marcadotes e h:licadot~ y sudeleoeion ....... -- .......... . .................... 1 4 .2 .~ 1 Marcadoresradiaaivo& ................................. .......... ,_ ,_ ,_ ,_........ . 14 2.4 2 MarcadorN no radiacti\IQ6 .................................................... ---. ,. 14.2.4 3 Gt\IIXI$1~ , , , .. . . ......... .......... .......... ....... ........ .....
,_,, . ......................................... 166 18S
185 185 186 186
Como y: se h;t indicado. la deteccin de cidos nucle.lcos mediante en~m de hibridaocin depende de la presencia <le la seCO(!lcia <lian~ ;) <le~ltlr en la! mt~G:Stra y de la disponibilidad de ul\8 so n& o oligonuclelldo de secuencia oomplementt\lt.t'l a la <.iana P()r tanto. la utilidad de la hibridacin. el puMo Clave. ((ldica en la sonda: de su nawralez.a depende que el ens8yO $C81ructifen> El p;~pet de fa &OI'Ida ~ale al del anllouet'PO en un inmunoensayo y. al eS-lar marcada, es posible localizar y QIM!lflcar cualouiet seruenc!a diana con la cual se pue<Ja hibrittar Gracias al empleo de sonctas. la sensibjj(Ja<l oe 1'8 hlltl<lac:tOn ~ muy elevada. ha&ea un n-.on de veces superior a 13 <JetoociOn diroct.;ll per OITO$ mlodos.. POt ejemplo oe tinciOn Iras elecuoloreSoS. L3 sonc:li $G ;onvietle as.l en un elemenlO esencial para cualquier' estudio moiOcv!ar. en especial para analizar la variabilicl&d o pOii:'norfismo del genom.a. De ahl la converwnela oe eS1udiar lOS ~de ~r<lQII'l y marcaje de sondas. COI'I'o() asloeelos flOilCialqs p.:~ril su empleo en ens<~)'OS de hibricSacin.
14.1 PREPARACIN DE SONDAS GENTICAS

Se vtili:a una gran vanedad de mtoOOS para occener $01'1d3S. ltlnto de ONA (en hebta doble y hel)ra sene:ilfa) oomo de RNA Obviamen~. para su empleo en e1 ensayo oe hi0rid;'ICI6n la &OOda &~ef11Xe ha de enconvarse ~ forma de hebl1t sencilla. para b cual se acude a la simple desn&luralil~Of'l dl8 las sondas de dob6e hebta.
176
PREPARACIN Y MARCAJE DE SONDAS PARA HIBRIDACIN
14.1.1
Clasificacin de las sondas, en funcin del mtodo de preparacin
La& $Onda$ se pi.IC<ten clasificar segOO varios Ctltenos: loogltud o rama/lo de la secuencia diana. mtodo de marc<~io y <)c(CK:Ci6n, tarna!k> de la sonda, mtodo de preparacin, ele. Este iltimo criterio e& el mis utift~~do. di$tinguindose enlte sondas preparadas por mtodo& oonYeOCionale$ (POf clon<locin coh..ll&r O t'oelular, lemas 15 y 16) y por mtodos de sfntesls quln-.ca.
obtendn:
celular ctkic:a
acelular
(PCR)
trat\$Cril)t3S3' ill'wer!.a {RT PCR)
sonda formada:
(of'!IJIO(kJ$Q. KinibOnucle6tldo)
14.1.2 Sondas convencionales

Tambin llam'd3!$ soncsu genOmlcas. Clonadas o
especialmente al progrt$0 de la Blologla Molecular.
blolgl~$ .
fueron la$1ri'nOras utiiz&CSas y nan OOt'ltribtMo
14.1.2.1 Sondas de DNA obtenidas por clonacin celular (tecnologla del DNA recomblnanto)
Son e tamai'lo (tongiluG) varl8flle. entre t OO bases y cienl06 de kb A4a'lque lOS delt'llles eK4)ef1me-ntales de la clonaci6n celular se estudian m:s adelante (tema 16). se adelantan <~qui brevemente las etapas principales del prooeso.
C rlB!fl...." ck
O ~A de interec
plid1n.odo>
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El_"'._.,pi._.., .....:-... --Mc.. ""'""'* hloi*MI ........ ..... D.'.A

l'!(~. . . .rh'Wo, El ti>S.\w~"f~-
VCCIQt d e d onaci6ft 1romo ejemplo,
un pa,crnidu)
..a.~~ 'llff:t F..,...,..; f:su "" -""" ...
...,..,.w.. ti ,1)1\l,\
!---
~d~Ayblll:w oq,m.,.()NA~-
OII ........... d ............
lllk'M ..........
l<:plltlldn o.k-1 irnt~ (p<>r 0(111~ eon

1r.in-s d~ ~n)
~ -~
~iblc: u~ rm.ucnc~)
UiO COC'tiO)
(()N,o. ~11tilk1)
"""''
=..
14.1.2.2 Sondas de ONA obtenidas por clonacin acelular (amplificacin por PCR)
Eslas sonda:s $Otl de menor tama"o quo 'M Obtenidas por clonacin llular, entre 0.1 y 20 k:b. El mtodo de preparacin (PCR. lema 15) tambin conMa de un monor numero de fases. por to que la& 5()(1(13!$ se obtienen de forma ms rapid.t y senCilla. En general. paftiendo de OHA de dob6e hebra se preparan &OOtlas de la misma 1\81uraleza. salvo en la PCR it$1m~ea . que conduce a ONA de het:lr<l sendlla. y en la RT.PCR. que pormite Ol*ner sondas de ONA de doble~ lltlrliendo de un RNA (pago. 1 96)
PREPARAC.ON DE SONDAS GENTICAS
177
1 1111 ---f>NA & f'lll'!o.:b
U '(> lil,lt1'\<.
iDNA
""~~"'' nowrarv
'""''I'Ca...,n
(rnpTl~lliO d~ tm.:rb ,,....,li('t< ""!"""")
"""''
~cncillo)
14.1.2.3 Sondas convencionales de RNA (rlbosondas)

la clonecln celular se puede emplear tambin para pre~at S()(ld<l$ de RNI\ de 1.11'10$ milo$ <Se nudetidos El proceso. relativamente complep). se basa en la ~rans~l6n de un DNA pre...lamente dOOttCIO $e v$3 un pliJsmido espeQCII (generalmente el pSP64). que &e caracteriza por lnelur et promotot de una RNA pollrnetasa de tago (PtomOior SP6). El tONA resultante, vna \<eZ purificado y linea!izaao. se utiliza oomo molde para ta transafpclon pot RNA polimentSil SP6. QUI8 transc;ri)e el insetto especlficamente a panir de la seooenaa promotora S/'6. slntetiZaf'ICSO numerosas COI)ias (de heOr'a senc;:i!l~) de RNA. Si alguno de los NTPs. 5u&tralos de la RNA polimeras.a. esl& marcado (~ . 181}. el RNA $e puooe vtwlat diteCh'lrnoetltt como sonda: si no. deber man;arse el RNA pootariormenle a su obtenCIOt'l.
1
('*tm~""' o.k .-r~rec iON A<k<Uk ld>ta)
plh11Udo) eQI'!Illo)
...............,
PNA""""' I"*'I
pl,~nttdo>CS~al
U)N \ <1<-"'*"~ ld><l
rSJ~
plll~OO
fC'llllbinaMC
Ventajas de las r lbosondas Al no I)O<Icrw rormar el homod(lple..K $00da:soOOa. se tavoree& la efie)ci3 <Je la inleraocin de la sonda con la secuenCia diana. Las SOOCJas no unidas espe.cifiearnc:mto pveotSen ser elinmadas por (jges1in oon RNasa. que degrada hebr~s MOCi!tas, pero r@Spela los hlbndos RNA sonda: ONA diana. ~ puede emplear comQ control negativo la !IOtlda oompaementt~rla (socuenciil en dirOCOI6n antl9enddo. pg. 24&, oonsegukla al ii\COC'porar ., in~o jurrto al promot<lt' en orientacin contraria t.
Desventajas de las r lbosondas Es necesario usar un ~lor dlt donaCIOo panicular, con un OfOtllO'Or de transcripcin. Se aanenla ta oomplejid&CI 31 preCISarse l.1 etapa de reacciOn RNA polimern~ P\les-to que el RNA es mUCho mas lbil <Jue el ONA. y la RNasa es una oontamlnaciM muy trecu&I'IIC, M rec)Jiere un manejo cuidadoso de las soncsas de RNA P<'r<t cvitc~or su degradadn y el uso de tecnica9 y rna1erl;\ll O$t6rii~H y ospocificamente bes de RNasa.
14. 1.3 Sondas sintticas

L8 <i3P~id(l(l do &Jntescs qulmca es esencial en lnget'lieria ~6tie<t no slo para preparar 6011das. sii'IO tamf)in para mottlllcat parCial O gr;u~mente un producto gnloo o para sintetizar getlt$ QOn'l~os En general, se oblieflen sondas de ONA mas o::wtas Que vor Cloni!lcin El mtodo mas popular esta sin~esis de $Ond<'S COf't.ls de ONA (de tS a 45 nuclttidos). monocatsnarlas. llamadas otigonucletido' o simplemente otlgos. l!stos pte<len $ertttmbin de RNA, <tunQ~ M Sll'l;ebz.an oon mayor dlflctlltad.
178
PREPARACIN Y MARCAJE DE SONDAS PARA HIB RIDACION
14.1.3.1 Sntesis qumica de ollgonucletldos

El aspecto bskx> de 1a sfn!e&ls e& la tonnacin repe'litiva de un enlaCe ~or on!re el grupo 3'fotfato oe oo tWCieOtido y el grupo ~'-OH <le otro, para dar un enlaoe ~fo<li~er. Es do(:ir, se parle de 3'NMPs y se a ...anza en sentldo 3' ~5', a diferencia de la sintesis do ~c:ictO$ l'ludeioos en las clulas (lanto repllcadtl como b'8fiSCripci6n emplean 5'-NTPs y avanzan <l4t <' 3'). l.O$ NMPs se aftaden ui'IO a uno partiendo del primer nuclesido, que est Indo por su posian 3' a Wl soporto slido y OQt'ISiitui'a el elCiremo 3' del cido nuclelco W~S vez shezado.
base
base
f\ZUC3
base
base
1
' 1 zuca
' 1
3"
...
la: '1 zuca

2'
(l
zca " >
..
l" n~o.l) ll,.,loe~~un 1<>fii>IIC
,j'lt~t-
q U il'!ll~.
,.nirdc 3'-dNMPs.
El J)rincil)tll proble<a es la gran reecclvidad de 106 dNMPs. <:On grvPO$ ..()H primario y secundario, un NH:: , un grvPO f0$13"1 0 y gt\.11)08 amino ylo carboiWo en la base nitrogen.ct3. I)Or 10 QUe se feqJreten mtodos de bloqueo y (fe$biOQueo que oo afec!en Wreversiblemente a ninguno de 10$ componentes de la molcula de nucletido. Por otro lado. e1 gn.ri)O toslato (en 3') ha de actrvarse p.3r.1 q,e ro~ con el -OH (en 5' del nudetido anterior). \1Ciodo d~m,llado ,
!1)!. ;tilo!.
70
por H. Gobind Kbonanu p;.~.nr 1 ~imc.~s <,rirntea de t)ligmuliCkcKio!>.

he hllll <''~~'~"'"" loJ dcr:llk~ quimiro' pu111
(nfJIIill!r ... <'l~Cnil>l.1t'lf dtl IW~kJ
1(IS'Ii)rl.; olldo
(p1111k11l.u !k Phct)
'
'
PREPARACION DE SONDAS GEN ~nCAS
179
j ' 0 1 :
'"'
1\udOO..odo> s-.crnllllll
<lt;~l)l'l)'Ct:IOo
.."$!1bulin lf.Wt!illn
...
1'.
Estos procesos estn ya noy dla automatiZ:adO$.. son cflciontes y de baJO C06t0. Debido a la que la IOI'Igilud <Jo OSlO$ oligos so v. imitada por el rendimiento de las reacciOneS de Sil'll~is 1;) $etl$ibilidad alcanzacta con euos es, e.n ~~1. ~ Qvo oon las sondas otxentdas por clonaclon. Sin e~r'{IO. la eonlil'lu3 f'TlOioql en los mtod06 de slnteSI$ qui~ permke la (()lcf'ICin <.te ol9n cacta vezl'l'la)'Ofes.
Respeocto a ta quim.ca de sint.eosis de oligonuclelid06 de RNA, es.& mS attas303 dcbicto il la dificultad de Pfote98'r elgruoo OH 2' $11'1 at~ al 3'
14.1.3.2 Diseo de una sonda sinttica

Las sondas sintclcas se dlsen&l'l oe lon'Y'la que COtlte1'9<'n lit M<;uencia CICM'J1llementarla a Ul\8 ZOI'I& del DNA diana, por ejem:lk>. de u~ Pttr1e del gen que intetesa analizar. El oejeeiVo es P"ePt'l31 un Oligonuc:lecido que pueda nlbridarse con dicho ONA. ~!mente. se ~ntenOe localizar el gen que OOCilf.ca ltl sin~is de ._,., Pf'Q(eina detecminada. Para dlsenar a SOI'Ida, t$1'1Coesario: 1 Conocer la secuencia oomple!.a ae la protei~. o ll menos de un fr<19""en10 de ella, M que eorre$()0ndor~ la secuencia diana de ONA. 2 A P<lrtw de esa secuencia anWioacldlca, se es1ableoe {61'1 Nsc al cdigo gentico) la secuenaa tUCieol.,iC:a que habr de tenef' el ONA. Sin embargo, debiOO 3 13 degeneraan del cdigo genelloo (d iSlil'ltos lrinuCiotiOOs ooc1iftean un mismo aminoCido, pg. 295), hay l.-l i'IUmcro cle'v.-cto de secuencia<s de ONA que pueM ooeifi~r el
"1 .:: 8.:: 0 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __:. P ::; R .;: EP :.; A :::;:;:: AAC ::;I ::; N ::..!. Y.:: M ::: A ::; R .:: CA :::J ::; E ;.! OE SONDAS PARA HIBRIDACIN
11'1lsmo polppcldo y. obYiamente. no &e puec.le C00009f' <1 priori f;u~l" 1;'1 qve lo l'l;)<;e en ol gcnom;t rot\1 00 ltt
clula. por lo que es preciso sintetizar sondas que cubran toOOs las posibilidades. 3. Para redu~ su nmero. se &e)ecciona el seg~o de $0CUCnci:~ Q110 poseo a;. menor dogonerac:iOn J)C)$ible. 4. Una vez ~ell:z.aclas todas a..s sondas. &e en&<ayl.l sv hi~ciOn (;(In el ONA de pnrtida; IJI\3 de ellas sern la
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.;A..~ ~A.,..xnr .
'
-Ca!la s~-.;u~1a -.k ONA s-i~ dC' ~~!la pata la (llfJ bcbna. X puecL.n, pues. dbcilat d06 gt\lpQJ
lk 16 sondu -~o~~nltt.ca'l fJc: O!"A.
En este lipo de experimentos, los m~ de &i nlo&is y secueneiadtl de proteil'la!l y de ONA convergen y &e conl&)lemeM&n. Como se acabe de ver, la $4JICVOnti<' ese una pro1erna aaslada puede usarse pera aisla~ el 98" cotrespondiente; de uno:t forma Similar. aunque if'IYerSa, oo gen ctonado (y, sxx t<~nto, &oc:venc:iado} pu&de usatSe para aiSlar la protointt prQducto. la secuencia del gen pennile <beflac" y $into6zotr quil'l'oie3imente un pptldo oono que ropre:s&nla una parte del prodocto proteico del gon En.onees.. una de W posibilidades es. pclf' e;etnplo, utilizar 3nliOUI'!ti)OS contra este pptiOO &lnttioo l)all'<t idenlir.e&r y l)uri!'ieaw lal)f'Oielnal)era su estudio potHetior.
14.2 MARCAJE DE LAS SONDAS

El empleo Clt $()(1d3$ de DNA o RNA como herrarrentas anatif~eas 1*'3 k>e3!i:ar secuenCias diana por ensayos de hibrid$CiOn requiere llgamriatnente un proo8$0 O. m<trcaje de la toooc~a. que permita su deteccin. la molcula o grupo m~rcMIOf puede tener diY9t'&a nattxaiUt. siempre y tu8t'ldo se pueda detectar su presencia de focm;t diroc:U o Indirecta: los marcadOfeS mM uliliUdOS son istopos radiactivo&. flvorocromos y enzimas, En gerw!tal. dan lugar am~ &encill06 do r1Zt11. que deteCtan conoenlracione& muy ~ja& do lit soi'I(SI. El mareaje debe ser e&$8ble bejo diVSas rondiciOtle$ oe tempeta.lura. detergentes. disoi..,.,\M, etc . y no afectar a la reacci6n de hibridacin. Lo& mhtoCios r~iaetwos son 106 emplead06 c:l$~menCo. micn!ras que lOS ottoe mareadores surgen prlnQPaln-.nle parn eYIIar klos riesgos denvados de la radittc:i6t\. pata aptovechar la mayor VIda media de &uS re~c:tiVO$ de msrca;e y. et1 algunos ta$0$. p<u<a ~omr et liMite de O&teocln.
De formt~ge,~. jltleden plantearse dO&~ de prooe$0 de marcaje: In viVO (mt\s OONectarnente, en cultivo): S. hace SVITWii$1rando nuclelldos radlactNos a clulas en cultivo, QI.M:t lo$ tnoorpor.an en sus eiclos nuc:Jeloos de nue'Ya slnte:&i& Su uso os muy limitacto, por ejemplo, pars preoarar ONA vir~l mareado en cUas Infectadas por virus.
MARCAJE DE LAS SONDAS
181
In vitrtT
Es mas
de$~
~<ltil Puede haGef'$e e~eando i&61opos radiactivos o por 01ros mtodor. a!lematNos Se "oootinu..ci6n illgunta5 ~ l<a5 divOf5i'l> vt~riantEI$ mel0dol6gic<a$
En muchas ocasiones, en espedal con tlbosoodss y SMdas sinlliCas. la so~a se marcn al mismo t~mpo que
s.e prepara ncluyendo, oon bs NTPs que My que sui'IWits:ITar a la reacciOn de slntesls. 8'gur'W) oe ellO$ rnare&<Jo ceon
un Istopo redlactivo, un f'loOI'OCI'OfTIO o cualquier tipo de grupo kldieadot) mietluas que er~ ()Ir;)$ 01 mt~rti'J(t se re*a tru haber completado la slntesls de la sonda. Puesto que la preparaciOn de $OM8$ ya se M O$t~O. tlO$ <:entTar$0'10$ t~hot<t en eS"te ltimo <:a$0, aunque las consideraciOnes r~1vas a la deleocln Slt'Ye.n ~~gualn'lf!onle para
sondas marcadas durante su obtencin. El pnncipio bsico del marcaje es la umn qutmica o conugaCIOO del marcador a la son<la (en e1 caso radi&c:tiVO. t90IOPO forma parte oe la moi~KUia de so.noa, no se u~ a ella). Como se acaba ele indicar. esk> pu!Se hacerse uniendo el marcador a la sonda y.- preparada o a un nudetldo que se Incorporar durante la J)te$llataei0n <:se allt'l Por Olr.t Pill"l<t, lt~ sondt~ puedo lev<tr unido el marcador detectable (m$todos <JJ.recros de mar~. a conlinuaeiOnt o bien otra mcecula no detedable o orupo i ndicado.- (en ingles. reportllti). con ta cap...-.ci(IOO <.f4:t $Cl reconocido PO$leriormente por una-protei na detectora. que esta que va marcada (tnelodos lllnileCtos, l)bg. 185}
en reaidad el
n-ccto: d marcu.du. que se pucdedl.1cctar , vn unido a la SQnda. Dos ulrcmativas, des us de la slr1tesi.s <k 1 ;, sonda o durante dlla:
N""uckc1Cios _ _ _.,_
pn:pan1tii1U de 1 11 lf<lC1da (p!lf loil!t.:~i
o> m~'<litka~-..)
WliO. O.l~lll~oc.e
tJIIII>;ilft
Nucle!ido M
unt.ln nr~<ablc lllalt" ..Jf
o~ -d.,,
(J
Q ..
ok"
,.;mda .,._,. iillfe'i~

mllf~~oan~'lll
1\'farcaje u1d.1recto: cl"man:ador unido a la sonda no es dccoclabl din.-ct.1m~'1llc: :se le llama indicador. Para lu de1eccin, el il\dkOOor se une uno' proe.:n.1 dt."toctora. que lleva el rnurcajc. Dos alternativas. despus de la sntesis de la sonda o duramc ella:
N\(;lcfiilos
(1
j'lfq~a~:o.;ti:on o.lc 1., lo(lllr
.. "
14.2.1
Marcaje directo en la molcula da sonda
El gruPO m<are<ldor &e puede unir C0\1'8!ent.eMe.nte a grupos funoon;~lo5 C$Pecllloo& o fonnar enlaces oova!en~t:S de forma inespeciflct~ I.O$ cidos nudeieo& muestran menos g~ fui'ICionale$ OOecvOOos para este fin que las pt<l(einas, b&tCamente. algunos tomos de las ba$-C$ ntJ'09Cflada$ (especialmente, aqullos no l~acl()$ en el <'P<H~tamiento oon la ba&e compjementarla) y los grupos lermin<'!IO$ Y.QH y 5'-P,
182
tlarcaje cov lent de la
NTPU)ol)uda
-t
PREPARACIN Y MAR CAJE DE SONDAS PARA HISRIOACION
'""'
lluo)t(J('t(liDO t~o ~m
~~.,-u~r-a fC';O<XO\IIW- ba.,;~)
"'"'
teleciOn "' OOI)Ugecten
(enl~
N1'f' o klltiiJ" mn~

(fl\llf\')CCnk:>)
GeleWOn POI'
nuornnettia
C:OWII$rlal)
( ofltrPJ
+>-~-.:
r~esentattvos.
"
:k e-;~~ 101 "1 ~

(6...-:t~ll.,. ~
"~.-'"-'"1""""'"'-'"~~~ ~
'"'
Ejemplo de' nudtillidu

nuo~h. -:
un deri\'lldcl do. ' dUTP y

cll!bcolljflU(IR':ICdna. lll bnlaH!~f"CoadOI' ~ lll!p(IRif!IC J"'r.:l ~o!oiQI' 111
onl~ ,Jcll~lo<\0
- ~'
'ft el .'i11l-.:lri:l'> U'<"'~" hllcrl-laron la f . - n & !a Jo)blc hlkl
En esta categorfa de m'todos puodcn <nsiderarse tanto la lncluSiOn de nucletidos marcOOos drxante la slnte&is de la sonda como el marcaje de la so~ y3 ~rminaa. De estos ~ltlmo6 m4odos, se ocwnerrtan a oontinuacinlos ms
14.2.1.1 Marcaje con ONA polimerasa

Se de meiOdos de slntesls enzlm;itk:.a. los ms comunes. LOs cuatro tipos Cle nueletido (al menos uno de &os m:trcado) se il'leotperan <b"ante le r~ de t;fntttsis do una ~ de DNA. Exl!lt&l'l dos variantes: lra&lado de la mela (ruck 1/an.sfatiot'l) e ir.ei<'eil'l o cetlado al azar (AMO'om pnming).
Ira'*
a) Mtodo de traslado de la mella

Es un mtodo facll y rpido, coosictot11dO ft ejemplO c:taslco de Incorporacin enzlmtica de oo 1Tli1~. sin neceslaad de desnaturalizacin dt ltt $0ni3A de DNA doble. Aeqtjefe dos enzimas distil'llao unt~ ~)ljrril)onuCieasa (ONasa 1pancretica) y I.JI\3 ONA )(llimet"asa ([)t(Apc.l de E. colf). El resultado del marca+o es l8l SUSbludn de una gran pane (30-60%) ~ 10$ nucletieloe Oflglnale& de cada hebra de ONA por otrO$ mare&OOS tfldiactlvamenta en su
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La DN,\ polinull 1 do t: rol!. l'lo tn~ ''"r~ll de DNA ptlomcr.u:u., p(ISII:'t ll'tll 11eliido~ e!Uimit~ (pis. 141): pohmcnts:t. J'CXOII\k'lefl~ y 5'-<'~OOucl.e-UA, de b$ cw.lt"'!ll' llpN\'C~hu'l f!Q,Ui dO!>. a) La actividad c\OfiU(k-~ S'-4)' u~lila sobr~ el g:rupo Y .Jt de Cllila mella m d iroinac:i6n ~~u~nc:ial
de IL...-t-11~.
r.
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b) Simullinl.'ament(':, la aeli~ 1iJad pOimKft.Sa ~ue,a Si111 nI0.'6ti~. U'l('orpot:t,.ll) (llf(l~ n~~~o,"''<IS sobr< el 81>11)(1 .l'.011 do.' 1 :. mella. a IJQJ11t d._, dN'I'IOo; mnn;ndo~o. 1.'!1 la din:eclim l1 abnual de la Siflttl>is ~oh; DNA (5'-..J'), El pmo.'eW el id&JbCO en IO!Ia.'l las lk'~Cilas y, otniamen.e. OClltT\' tD lCfll.do 11pues.10 ""' cf!iJ:l h~bt'u.
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(que k'l"\ 1(:\o ((111'10 SM\bs), Su 1nmuilo puedo.'
~rlrolf!rso: 3 lt:n de la J'lroporcin ele t!Wmas en la mndll d~ t\'ll~ci6n. U11a ' 'l'T.I)lltlii.U 1:a
.........
rucci6n C(lll clllc~t )' EDTA. )(' !l~pQnltlla<> s<tndllj 6e ICIS rmdocitidos 1!1) illCOtpo)T'oldo!\. por (11.'1111'1(1, pM etoll!rol.'UStafiu de fiJtr-:od6n ~'ti @('l.
P\JeSIO que el ooeie61iclo rn.arc.OOo se inOOfPC)I'tt a ta sor'ltia, en lugar del marcaje radiaciYo (en lt~ rtg1.1ra) pueden
emplearse nuctetlclos ~ (On fluorocromos o oon grupos indicadore6 (pg&, 181, 185).
183
b} Mtodo de inc,acin o cebado al azar

E$1~ <lftorniiltiv.-, 011 dif4:n11c101 de 101 ;,r~tcrior. rOQ~ ltt dC$ntt!Ur;JiiZ<J~ inittl dc:l ONA doble, parl' que hbnOO un a reoti~iOn POI ONAPOII de E cotl A,_,., bion. en este caso slo se oligonoclo61ido qve aCIV<'t como Qtl:)<'ldOr de 1 roo~,.~ief"e ~~ t'C:Civid3d l)()limer*sa. !)(Ir 10 que se prescif'l()e del frbgt~O l>t<JU(h'lO y $C svele ulkar et fragmento de KJonow (pt,g 147), Eslt'l 16cnicoa Qlroce \lnt~ $Cric de ventt'ljt'$ ~ ct~r(l~cr t6<;:n.co lli$P8'CIO a la antenor. cuya conSideracin escal)3 ~ t~Jtslros obf8.1ivos Clc C<'ri\Ctet esenCialmente conccpt.ual
~tl ok'<n.wlunaliJC:uJ,;, por ~lor t i DNt\ dobk. !lt' h1bnc:b knf.llmmt.: wn unll m~l:o ok
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<rh,;o.:mudtllduo:. Wllt(otf(l.);l ( I:OOIUI\ItiCIIk' btXIIntA"koi!tob: ni b f4tU~ l~'tiOIIfluek<ol>d&.~)

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Al Igual que e4 m40do anterior, aotnlle la~ nucleolidOS- marcadO$ oon nuorocron"IO$ o con grupos indicadores.
14.2.1.2 Marcaje term inal

E" osto ~$0 se aplica, en IU9'1' de IA\a sfntesls, una modlfie&eln en.zimtic3 de las hcbtM do t!CIOO rNC!eu:o exiSt~te$. modiante la ncorporaocin de uno o unos poros nuclelidos marcados a uno o ~mi)Os ex:tromos de la 50flda ae DNA o RNA. A~e se utilixan rnetiQ$ que 10$ onteriores. son mlodos .:rUles en Ciertos casos, ~ ejemplo ~r(l matear ollgos de hetlta sencilla. Se IJilllztll'l dos S)latltC.&micniO$: el mafCC11!8 oon polinuclebdo qu!nasa y e-1 marcaje
t.minal por ~leno (fi-in endfabebng}.
184
a) Mar caje con polinucJOOll do quinasa
PREPARA CIN Y MARCAJE DE SOHDAS PARA HIBRIDACIN
rxw et k>5tato (marcado) en posicin y de un dNTP. con la uel\>endn de pciA'wclelldo q!Mnasa y. opcionalmente. rosratasa atc:ain3
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Este mttOdo Moepetlde de la eltbtet'leia de una IM!Cta molde y. pot tanto, puede emplearse para cualqUief tipo de sond'~~ ONA senCillOo dOble, o de RNA. Consiste, en esencia, en un intercambio del S'P terminal de cualqulet hebra
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r~n1tdli (pc\11,. 199)
En este caso SOlO pueden utilizarse matea}es ra6activos. PUM lo Unioo que se i\cOrPQI"& <' la S(W'o(la es el foS!ato y
def ATP
b} Marcsje terminal por relleno E&te mtOOO &e ~rtl1.ta por ser el Onlco que utiliza una enzima de re&triccln especifica para
e11trernos eohe!liYos.. (ltJeluego son reuenaoos POI' t;t ONA;Jol.t
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S' Ktiutn c-omo molde paraquo; ti KlviHI"' tll b ON" pll+ti m~uul l' o:r lfltoll)do de ccblldo 21 anrlafllld11 I!Udcliodllll JNn:lldll!l a l.:t~ cx~mu, . l '. L-. sabcntc~ rra;,m~t\1 tlf
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con fiUOtocromos o con grupo& Incitadores,
E&M mtoOO de nue-Yo permite el uso canto de nudetido$ radiactiVO$ (en la figurtl} como de aqullos marcadoe
185
14.2.2
Marcaje externo a la sonda
En lklgar ae matear sus ptoplos nucleOildos. la sonda se puede unv 1n otra mOiC\Aa que a su vez lleva el mcwcadof. Una posibllldaa e& la unin de Pf'O(elnas mediante reactivos oniTOc::rvuan10S (CtO.sstinll:6f.s: ~. glutaraldehldo. etc.). Tambin puede uNrse el marcador por inter..ccin Oloctr0$1ilt~ ton el ONA o e~l'$9 agentes intetea~ntes, cuo se in$Cr1<'!n entre lO$ l>(lfflS do wscs dO 1~ doble l'l!ioe (hibriao 9C)(Ida : DNA) de forma no oovalente Unin de una enlima a la &ondil oon tfhlctivos enlt9cnrr.~ntes
li(>lliJ,~ ::; !'1:'0~Minw. (P())
\lt'lin eiOCITO$lt.l~ ~ 1(1 $0fldlll de un 'lOiic;ntin oonugado oon etlllr'I\SI

p:ro~idit:Q. ( r Ot .. p<~httk-ninum
Marca,e ese 10s hibridos oon llgen!e$ 11'11en:d, , nt6

ltlbnOOWpk'\ .tondat--I)'IA diana
IIJ!Cil~
+ eh.aarald~:IUdi)
phcn:wqu!CIIIfla
t eei<<n <le QOti)V!l~ (8f'lla0t covaletr~e)

~1'0 4100da1811n.'lilal
IMC!tlll:afUC
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~l~rkmtt\11\aI'O
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~I)!Qteii>J,)
o 11.111\!ni,:OX~(K
14.2.3
Marcaje indirecto
Como se ha indic<~do (.Pg 180), PI*Je ~nvm Qve n 18 $Onda so un~ 1M\ gn.sw no detectable o ino'ic.1dot. ol cual en una segunda etapa es reoonoado por otra rnoliJ.cula, generalmente una proteina. que ln(;OrPOfa el marcador dot:table Para la unin del indic<'ICSOr son ap~gb16$ laS oonsil:5erclciono:s ytt ~~~ rC$PCCIO a 13 t.~nin dol marct'dor en aos ~odOs <lil'eciO$. se lkl$lftl l,lf\ ejemplo oorre:spondiente a 13 rnodif!C3Cin <le 10$ NTPs:
'udecuJ() (d.'(fl'J
gt\lpcl h'l!htlllktr
ti &tapa un1 n covalente de nudecldo y gf\100 ind~r
1 lhgandol
rncori)Ot<lcin a la sonda per

enzimiltMXI& (Ir~ de mella,
miii'Cl!IJii W!rfi'Witl )
oualq..-era de ~ rn1odos
2c~pa
:oppN
;=======!-~'==:., ~
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l- etaP& rec:onoca1'iento del indicador pot su proteina detecao<' .,.._C<lda
!ol)nda lll/IIC,Ja
14.2.4 14.2.4.1
Tipos de grupos marcadores e indicadores y su deteccin Marcadores radiactivos
El marcaje r&IJiacl.i-..o o iSotpico es el que se !\a el'f!Clle..do con m~s froooenCJa. auncue va &18000 de$pazado ptogresM'Imente por lOs mtodos no rac:rraCilvos, Aur.que no e.JCi$tt 00"101'1$0 ..cerc:a <lef marcaje ideal, en 18 mayoria de b& casos se hace oon 32p. Pueslo que ltl ootta vida media de eS1e iStopO (14.2 dias) crea dificultades en la pntparaci6n, oomeraallzacln y uso Mlnarlo de tos ensayos.. se ullllzan tambietl: O lros ~ern3'1iVOS (35S, lt.t. t251 o 14C).
Ls <tetocciOn y reg.slto de 18 hibriclacin se haoe por autorradiogra/la; el sopotte oon el ma1erial nibridaao se pc)nll;t oonl<'tcto con una pelici.Aia folOgr.ifica (del tipo empleacb ~ralas radlograflas). 1e ouat queda if'I'C)(eslor\3o::ta oon"""' mageo_n que muestra 1~ ptO$CI'ICia de In r<'d~tivid<td {ver, por e,empJo, el mtodo de Soulhem, pg. 171). la lntef'lsidaod de la~ depende de l<t iwllcnsid~d de fa racf~C~Cin erMicia por el i&iOPO y del. tiempo de eX'posiCin.
e;~
1 86
PREPARACIN Y MARCAJE DE SONDAS PARA HIBRIDACION
14.2.4.2 Marcadores no radiactivos

En funcin del marcador empleado. la deteccin &e haoe por lluorimetrla o atladiendo oo sustra.1o especifico cuya transformacin enzlonllCe por la enzima marcadora pueda detectarse por alguno de bs siguiente& principios: Espectrololometria medida de la absorcin de la luz por lo& productos de la reacci6rl. bien &olubiN o in501uble&, et1 et u!tta'fi:>leta o el ISible (*>rim ettfa). FluoM'Ielria: mediOs de la luZ emitida por pro<ludo& e la teaociOn que po&ean un ttuorok>ro (pg. 126). OuimiolunWII&eenaa medida de kiZ emltlcia como con&ecuencla de reaccione& con esta caracterl$tace (por ejemplo. la transklnnacin de fas luciferina&, cata!iz:ada porlucifwasa. o la oxidacin dellumno&l OobG Mi\t~lttrse Qve f$1 0$ y OCIO$ prooec~imifmlo$ no 501'1 C:lt.l$i'l()$ Oet m~r(;;3je de $01'1(13!$,. $i1'10 qve M al)lie<tn igva!menw en lt~ do1occi0n do ~in~&. antigenos, POQt.te/I0$ 1ig;:tnciO$ ole.
Re$1111. , , de rnsreadorc:s, ,)('licsdOC'cs y n\codl)s para su dcL eccin 1
Gn1p11~dur
(bgtan.Jo)
Prolcb..-. ft'fflii';J o l~lrlk( Jhidin11,

O YllrillllleC l 0 0 1
Man:.!or
.0.
~ltli!O
Ol:t.t>:o:i&! del mlin:.dur

" lllo)fi'IIJiosnJb
de la rr o~.:o:i61! t'n~timil~ ..
d.:~~t6n
B oan
lli&topo rodillo.'ll\0
f
l~~o. --.roemmo
l~1r~'idin11,
nuoriO)eUill
M.t. a:t1611 t
Dir;u:u.;cni~~a
MI~ :UIUOI(.i
l'l:midlJj:j
l~l.ofolt(-
rObtlgCnxa.
ABTS
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u l'"'"ti.,.u......... ..nm.lAIJ:,!! #IJI"l ~....

v._n<k.-.... otw~,.~~;u<.o ~ t.J.,..~llltdlolo ---
I'IC)
1'()11,1UU(l. IIKI"J
Derivn.!.u ,J.: ca~llol RewcibQ F'luorostni.:a: Qui.-.i<ltlumillisccocia:

Derin~ oJo: diu~e~anu
.....~"" .. """' 111 dt.wt...
~Nnt .. tktcot."-.pN
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11 dt hul'linol
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Fo:sbuun Ab.liM
Rcaa:in Cn>~~~~~g~.'lriu:
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14.2.4.3 Grupos i ndicadores

lO& grupOS mM OOI'T'IUnmente usados 900 la bk>tlna (vitamina natural) y la digoxlgen if\lt (este~Qide do && pl;tf'll<'l Dig.ifatls ). Ambos son l~ente oonjugable& a lo& nuclelido& y se unen con gr~n afinic:Ja!!, respedi11'81'1'1enle. a te9 proteinas avldlna o e&treptavldlna y a antJcuerpo$ antkligoxiglenint~ Al igut~~l que l)tlra t>$ detivtldOS lluorescentes. se
dl81)006 comercli*nerrta de dNTP& ya unldOf lanto t~l>iotina oomo a digo)dgenlna.

La detoocln de las &Onda&~ llevan biotint~~ o <Jigr)xigenna se realZa mediante ensayos de unin. similares a bs emplead06 para el inmunoensayo. A es~ fin. 13 l)rotelna oetectora. oon allnlded por el grupo Wldicador. se marca prelf'l;lfi'IOnlo Q)n un ISOIOPO tadiaetivo. un grupo nuoresoente o una enna.
SOt'lda biounilad3
sonda mn~-<~dll
('On dgoxig.o:ni""
Tema 15
Clonacin acelular: Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

15.1 Introd uccin general a la clon,acin ................ "........................ - ................................................................... 187 15.2 Amplificacin /rt vJYO del OHA: Re-acdn en cadena de la poUmerasa o PCR ,_................................. ~ 188 15.2.1 Pnnc!plodeltnlodo ............................................................................. _ ..,,.................................. 188
15.2.2 Etapas del proceso.....................................................................................................,_ ,_ ,_ ,,, ............... 189

15.2.3 Algunas caracterfstJCaS del proceso......................................................... , ... ,.,_,... 15.2.4 AU'Iomatizaan de lit PCR
15 2.5 V(lll"f3ttte;$ ~ m61(l<k).,_.. ,_ ...... -------.. ------ ...... -------------...... ---------- 15.2.5.1 PCR 'larga....................................................................... . ................. ... ......... 15.2.5.2 PCR anlclada ...................................... -...................... -.......... ,_,.,. ............. ,_.................... 15.2.5.3 PCR lnV'E!rsa ........................................................................-........................................... 15.2.5.4 PCR con adaptadOtes .................................................-.............................,_ , .................... 15.2.5.5 PCR asimtrica ........................................................... ......... ............................................ 15.2.5 6 RT-PCR <'mpli~n <:fif RNA
192
19J
1 93 193 193 194 195 195 195
15.1 INTRODUCCIN GENERAL A LA CLONACIN

Conceptualmente. el proceso de Clonac-In (cton.edo o Clona)~) con!ll9te f!f'l la obtM<:iOn de un don, entet~dido oomo un conjunto de 'elemenlos gentiCamente Idnticos entre si y a su precursor. Estos etetr~enlos pueden ser molculas. clulas. te,.:le&, rgano& u orgarusfT\06 pluncelulares oompl&los. Cada componene lndMdual de un don oontiene lt~ misma informaCI6n 98f10:1 iocl, ol mi5mo 91J001ipo. que el elemenlo de partida: por ele. &e puede con&klerar
mol&ula de ONA prccun;cw.t.
~ precursora
ch,dt1
188
CLONACIH ACELULAA:: REACCIN EN CAOENA DE LA POUMERASA (PCR)
qve ,., Clon<'iOn SIA)OnC un3 amp lificacin gen6f~ . Ah0t3 bien, ~ t'>e$lU do la dofinici6n Mteriof". cmtre 10$ de un ~1011 ambi6n se dioe que C60a uno es un dOr'l de tos ceros (pof oj . einoo oYe~ gcn(tti~me:ntc iCSMtiCM lormM un don, y 31a vez <:ada O<vejal es un C*>tl e cualquiera ele 13$ dems. o toda$ son ~ tnl:re si). Debe ,ndlcatSe que la Clonacin es un proceso flsiol6gloo normaL son Clonlcas las OJUI.8.s embriorwla.s tolipotetlte.s IOM\9Ca'9 por mitosis a panlr del Cigoto: cada una de estas clulas da lugar (medlanle ~ procesos de diferenciacin y desarrollo) a individuo& adultos fotmad06 IXIf clulas &Ofl'lticas Clnicas. genticamente ~ errtre si y ala clula embrionaria de partida (ex.cepto en lo que aktct, a su cliwH$idad o polimotfismo gentk:o. resultante
CQmpOI'IC)flte;$
ele mutacin. recombinacin, transposicin. etc.). En el ni~ do <Xg<anismo& compielo&, son clnicos los gemebs monocig(ic;O$ o univitelinos. procedentes <lo un mi$mo vulO recunc:!OOo.
El intor$ de la ~iOn r<'Ciiw C$0t1Ci811monto en su a'lr~Cier biot.ec:noiOgie:O tc)mO proceso de mulliPiic:tei6n de m016cdas de ONA o RNA. Clulas. tejicbS u Otg81'11Sti'I09 oomp1E!It>6, med!WI~e mecaniSmos de manipulac:i6t'l 9f!Wl'lic:a. La Blologla en general. y lB lrwes.ligBcln biomdica oo particular, estn avanzando enonnemente y lo harn an ms en el futuro. oon la val'iada ~a de (;()pia& de Mnl$l'llf)$ ~.icos ya omplc;~clo& e>era mudi,r y tftOivcr problemas tanto de carctel bsico como ;~plicado
Globalmente. intesa de&eribir la clonacin dosdt el punto~ vis~~ su
lln~!id<'d.
os de<:ir:
Cton.a.;in dt Ofgnismos Plt'nlas o ~imalts cmple-IO$. Cfon.aci n de clulas, aisladaa o klrmanoo t.eidos u rgaoos. Cfon.ac.i6n de molk ul.as. sean Sias genes o fragmentos de ONA o ~NA. Ore acuerdo con et proceso e~tperlmentaf. esla Clonacin puede <Widlrse a su vez en dos tipos: Clonacin &cel ular, es decir, clonacin de molculas sin tntervencin de clula alguna. Es sintWno de a~caciOO In vi1to de molculas de ONA o RNA mediante la reaccin en cadena de la OHA pollmerasa (PCR. potymerase ch8in reaction). Se de&cribe en este tema. Clonacin cetul ar (con oUM, no de~) . Es l<a ampli!lcacin do moiOOJias de ~c:itlo nveloioo modionte su !nb'Oduccl6n. a&i&bct<t par ~~-$ , en ~$ omfifriorltl$ en culliYo. Em~ la tecnologia del DNA recombin~ml e Se esi!Jdia et1 etl teMa 16.
15.2 AMPLIFICACIN IN VITRO DEL DNA: REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA O PCR

conSidefaela f10V ola como una herranventa ~ndlble en el labor.IIOrio de Biofogla Mokx:ular ., lngeniorla Gen6!iQIII, et ()tljelivO de- esta tecrica es la amplkaciOo dtecta de un gen o un fragmemo de DHA. o irdrocta de un RNA (en es1 e caso. a travs de su ONA complemereario, o cONA), Pf9&Gnle& en mezd;;l& do nJJV divo!1<'5 f\.lentes, sin nocesid~ de ~ por'llcaciOn previa de la muestra Integra original. Se puede pa~tir de hOn"'ooenaoot, e~ Ctu<IOS ele lejir;lc>. sarqe eornple4a. mezclas de fragmeniO& de ONA obten~ con onimt':s ~ resttioci(ln. mues11as resultantes oe- la extntc:c:i6r'l y at51amento de OHA. etJ; Sin omb<WgO. debe resbltar.W:! que. por raz:ones (Jle se oomptendetn msadelanfe, es un requisito imprMCindibleQU$ se conoz.ea b s.ecueneia de una parte de la regln de ONAo RNAcue &e CJ,iere ampiicar (&atvo en el caso do algvnns v8rianles del meoclo dsloo. eomo la PCR l'lven;e, pag. 1 94). Por estas caracteristl::as, en ewecial la te~paei(13(1 e ampl~ 19 PCR es un m!Odo muy adecuado pan~ ptep.arar clc.to$ ~en una C8r'lliclad muy superior a la de la m.~estra origrlal, Ctlt*) como mtModo de c:tonacl6n aoelolar
comoper<~lll~n .
AMPUFICACIN ptop&ameonte dicha
ObJCll\'0 biiSJOO de la 1
amplific11r ONA
. .
. .
'CR
:
{
Para disponer de cantidad suficiente oomo para utili.:wlo. eoo fines diversos
DETECCIN
Para podcflo dcu:ctar en mucslras oun !X(Iu1.:.;~s c;an1id.1d~ dd DNA di11n:1
us aplicaciones de la PCR eon rmy 111.1'1'11Jt'0&a& y ~ . Como ejetnpiO&, pueden CifatSe: dOnaCiOrl aoelulal' oe tragmenlos oe- ONA. deteccin de secuencias &in pVribc;in previa, s.ecueneiad6n de cidos ru:::telcos. eatableclmienlo de ~ de seaJE~ncia. mtJoo de; mul3ciones. fPaCb oe- ONA P8ffl tf8S4llan1es. diagnOstico de enfermedcldes genticas. prenatllc$ o no. dclen"'''inadn de secuencies especfficas de ONA relacionadas con situaclone$ ~icM cklflnida;.. ~de p(()()lemas totenses o atqueolgioos. esn.iOS eYOivtivo&, dcloccin ele microorgt'nisrnot ir'lfeOCic:leOS, dclocc:i6n de c:61ui&S rumora~&&. ampllflcaci6n de DNA para $U ~ ~ <;:Cl.ll<tr, eh;.
15.2.1
Principio del mtodo
trC$ conceptOS. ya oescrli.OS
y PCR nQ es una lt)cr'lica analltlca per se. Mno ms bien una metodologia. '9$\.lltan.. do lit tll)lica.ci6n P'kliea de (pgs. 163, 16? y 11. re&peetjvCim9l'flo):
1. 2.
O.Snaturatlucln del ONA par;~ dt~r hebr;)S sendlas. Hi bridltc-iOn e$p0Cifie& de la nebra sencilla con un oligonvelebdo. Tambin se denomina etapa de t~JmPI<~do (enlcndldo oomo diStnii'IUCin de temperai!Jra que pern'Mte la reasodacin de hebras senolas tras lo
AMPLIFICACIN IN VITRO DEL OHA: REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA O PCR
189
do$Miur.'l!i.taeion termica; en i'lgls. annealing). !:sta es la elap;) q~ e:xpliea pot qu se debe c::x>nocer parle ae ta
3.
seooencia. Replicaci6n de la heOta senCilla por una ONA poknetasa a p,&(lil del lt'mbil'l. elongaeit\ o extensin del cebaclot, o pol imri~acin.
Qligon~leOti<IO
at\teriOt OOti"'O oeba<IOf.
~e ta apllcaciOtl en forma cfclica de es1os tres llfOCC&O$ $& OQI'ISiguetl mUIUI)IeS copias 001 lragmei'IIO de Cido oocleiCO et1 un OOtlo espacio de tiempo. como ;e ~r 3 contirM~CiOf\.
A pesar de esta aparente c.omplejidad. en teori(l e. un f'l'l)( sencillo. !ien!llbte y relativamente rpido para t'lmplitlcar secuencias. En la praica. se raquicre un conlr()l preciso de 1M variables que condiciOnan este triple prooeso (secuer.ela dlal\8, cebador. enanas y resto de oompol'llt\1es). ~M~ iMI.nJMI'!f'l(()9 Bdecuados (tefi'POrCJCiadores de DNA) pata estable<:er las condilciont$ cte cada e-tapa y repetlrta9 cldic:amente (tiempo, temperatura. nmero de ciclos. etc.) Se oon$igve tt&i arr()li!lau ~neias ele Lamai'IOs diversos. oomprendldoe entre 50 pb y 2.5 kb. Patt~la rct'lii.:Cic~ pr&ctiea se preel$;81'1 en la mezCla de reaccin 106 59Jioentt1:6 'rot~ctivos:
a} Los cualtO d NTPs, en exceso. oomo
&u$lr.lto$ par.~ la si.nlc&i$ de li\$ i!V'IUI'n!'!t1ltlles COI)ias de ONA. Pata ser reconoad06 por la I)CIImerasa, delxln ir ooom~ de Mgt<. b} Oos ol~onuctetidO$ do ce4entt sencilla (COIOQuiatmel'lte. ougos'}. generalmenle sinttiCO$. de 18 a 30 nt Sus secuenc::ia,s 1\an ~ser complementarlas. te'Spe.ttfvamel'lte, a loe dos ex11emos 3' de I;J regin diitnt~. vno en ~da hebra. de modo que &o$ ()ligos Pued3n eieroet de cebadores para la replicacin da las dos hebr.ls ef'l la regin diana. POf esta f8zo no te oueoe M'C)ilicar vi\SI regln de DNA si no se conoce la secuencia de sus do$ oK'Ircmos. De hacflo. t t &3 poe<i()n dOildO hlbf'idan tos cebadores la que defne la lo"91'ud del fragmento quo so amotif~Ct~ (secuencitl di:lna)
REGtON OE ONA OE LONGITUD VARIABLE

,)' .......,. .. 1
~
,.
--Como ya se 1\a fldicado. se ~viere

utl~
r ,.
e;) Un<t ONA polimerosa tefl>est.Bbfe, es decir, enzlmdcamerue actwa a tempetMura& relativwnente altas (al! menos 75 c. y estable oon ltecuencta 1\a'SUI 95 e). Esta caracterlstlca permite su actuaCIn en suoe&iY06 CIClos sin n<~Ciival'$0; adems. 1& tef.llicaciOn a tempetaturas eleVadas Impide la formoon de hi bndos pan::ialmente desapareac~os y contr'l!Uye a la especificidad y rendimienlo d8il proceso. La enzuna ms en'C)Ieada $(1 llama ,xJ~Ntleta$8 Taq, pot proceder de la bactena fhemw.s CJq!Jatiws. QI.Mt Yl\e on mt~I\CIItltitllc& ~ t~gva c:aietltc E&t<t oozlma tiene el inoonvenienta ele carec.er de lt~ ~ctividad oom:~Ctort~ de prvcblls (eonude<ts.<t 3')., por 10 que 13 frecuencaa de errcwes e& supeor a &3 do la r~Cin (atrecteoor ese un e~ pot eada 5 .000 l'lueteotiCios n::orporadOIS); de ahi que en ocasiones se wsbtuya por otras ONA polimera&as wmoestables.
15.2.2 Etapas del proceso

Sv<:e$i0t'l de ciclos (gel'leratmente etltre 20 y 40, oe 1 5 a 5 minutos oe
y replieaelc'lfl. para conseguir \M\8 e~ ampilicacion del numero de molculas que conlienen ict secveoc:ia de inters o diana. La duraciOfl total es de l!lltededor oe 2 hOras. dependiendo oe tas condic:iooes elq)E!rimeontates concretas.
dl.lt<~~ein ~uno) de dcsnttl\lrllliVteibn. hil:lrldaei61'1
Cada Cdo de una PCA. 001'1618 . pue&, dt
'*
G~P<t:&
1. Oe&naturaliuc;in: Catont<Nnicnto parn la ~ttciOon oe las dos hebrlt$ del ONA. mCCiionte unt'l intutk"'CI6n bl'e~
2.
(:J0.-120 &) a vl'l<l tempeft1\\lrQ ontrQ; 68 y 97 e , que debe ser 5UPCriOr 3 13 <le tusiOn (T.,, p<\g. 166) do la regin de ONAQI.Itt &OQI.I._. 3mplll\c31, lemp&<ldo (O hibr~in) : enfnttmiemo tlll)i<IO )Or deWP de T..,, Cle form3 que SC permite 13 hibridt'lon (pg 167) de 13S ~s senCillas oet ONA oe ~e(es OOt\ 1os Oli!gOS cebadores. Gef'leratmente se usan tempetaturas c:te 37 a S e Qve &a mantienen entt910 y 120 & Elongacin (o n.~ptic..cin) : El<tP3 do ;,wnplifle3Ci0n propi3mente ditn<'l {7275 'C, t-3 mtn}. en la que la ONA poliMet&Sa lermoestabte e1onga tos ceb&OOtes, empleando como motc:te ambas heOtas originales. La replicacin traMwtre (p&g. 14-6) en dlrecciOn 5' .-,3' a partir del exttemo 3' -OH de cada cebadot. empleando oomo sustrato tos cuatro dNTPs, haSta tetmlnar la lectura del molde o hasta que se comience una nueva ecapa oe desnalurallzaciOn {s~te ciclo).
190
CLOHACIN ACELULAR: REACCIN EN CADENA DE lA POUMERASA (PCR.)
fta& lefi'98180Jrat v. eapeciellnellle 108a.e~ aon. on&ni::IIIYos. ~n pera 11ecuaf'!e ceda 11"1111!6n COI'Icret.~
Esquema temporaJde una reaoc16n cte PCR pn' l

1a. ddo
1 :
f=:::;:;;=~~:--r.---1' o
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JCII .:,~111 ".!~pa
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10
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1 .
30
o
.c;ic~Q$. clc:vad<~
150
160
tiempo (mint
Ade!Tis de &as 3 Olapas de Cilda cidr:J, comUnllMiflte M'l ai\OO!e una etapa previa y una final al conjunto de IOdO& los
La provia .,
ICITIJ.l(lr.Jt\.lr.l (illth..l$0 $Upcrior <' IP do ict$ e~ do de$na1Uralizaan), ~e b&icamente
!*'* INI<;hv3f S)(OIO!l$<1$ y nuele;)&aS ot tt1 mliHiro asl eomo par~ 0$0QW.W ~ <l~$00.turt\htaein c:<>mplcrta dol ONA de pMida, es;peclalmente si este es de gran wnano o posee regloneg nwy compactadas (c:O dt un DNA gon6mioo coi'Of'l(e!O). La etaps final. por su pana .conSdle en una prOioc'lgaCIOfl de la Ulbtna ~ae~ para pefmihr quiO so completen todos los fragnl!Wos. Esquem!lcamene, el OOOJU'Ikl de reacciones y los resuhados correspondientes a los PM'\6109 daos son los siguientes:
1*' ciclo
la d UIIII {IIIC ~ llft h,1'1dC Mlrl ll'lclr ~ l;
~"11Cn(o.o ~llmjl.--1"1'' r tllft l():llllldu~
tu~~ ~ c
1 '11111
lle rickl:
una pa!W dt 111111 1110lhuk ~ 0)\A
m;~yllf'
&1 f11 mcn10 <li11111

~ .
~ ~-
~
- .,..,...lo !> ll:lltiJ..
IJ":\ d.' O.:~t lltbt.l. &:vl r.:. '-lfi . Qtbto.i>='- m -'111dll!lCl11N
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~ cr
.,~
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NNIIIIUIII~I\\n lcii)J.,I dulkll f(!f'll(!l.ldio, (1 !ol~ll(lll l!!l IU5 ~~ ~
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c.:OO~-.
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1 rase de diiJIIIIIO.
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111no'l'lellli'l M ""' h:i
.,a11r1:Wll u dtt 1'11\'"h:otln! 1 .....,l,d !'

.:11...., 1111,....~1~.
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2 copbl,
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AMPU F ICACtN IN VITRO DE.L DNA: REACCIN EH CADENA DE lA POLIMERAS A O PCR
191
2" cic-lo
(o:omicnxa dl!lldc' termIS:a ~ 1 ptiiDC'tUI
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4 copias. de doble nebfe
8 c:opiN. de he~<~ s.ncltl

l~ olc bll. l.n ~llli
8 toplu, <j,e dobkl M-t>ra
t:a"""' ; ~r ~.._-.:.ap:ul'.~" P'f' ,.,._,. \1/J ~"""*''

)ojuco.WI\'~knaii.'I~IA
.m.'""'oo. bll>~ :llllo vvdll(on:n copo.. 1mslb(a.
Debe hacerse notar que si la muestra de particla.. romo OQJrl'9 en el ejemplo dncrito, est bmada por1 mol<.:ulas de ONA de mayor lamao que la regin diana &lo a paftir del tetcer CIClo apa1 ocen ~i<J$ eactas de la dian&. Si la
mvcstr<t de p;)rtidtt twbicse ~ el ptOpio fr<~gmeoto ditm;,, lodl!s l;,s OOI)QS llparecid;,$ desde el primer ciclo ~eri.,n
igu~IO$ t'l#:l
192
4R ciclo
CLONACtl'f ACELULAR! REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA {PCR 1
'. -~~~
.
16 eopiu, de
d~
'
8 eopia.s, de dOI* hebra
16 coplas, de Mbi1
~neilla
hebr.
[
Ademils de fa amplificaQ()n globQI, por ac.~memo del nUmero de mol6culaa de ONA, debe not<ne cmo el numero
de c:<lP3$ do la ~D aumenta ~ho ms ttp00;nen1e quo el de (){rM ()()J:li3S mM largas. Todo ello Mee Que en la
nJ$zCII.'I
fin~l.
el teoninM 1& PCR, Jos lragmanlos diana $14)efen abrumaooromente en
n~ a
cualquier otro tipO de
ffflgmnnto, inclu~o obviameMe la~ molc:utas de DNA otigu\l'lles de la m1.1e111111 (q..e no tlan sido ampfllicadas).
billn en 40 clcloe.
Observese en 18 labia siguiente el eoorme gredo de ampllflcaceon conseguido, de un milln de veces en 20 eld06 y un Esto es lo que permite aplicar la PCR a muestras poco purificadas y analizar los rewltados directcwnenle on los que $61o M podr dolec::lar el fr.lgm&neo arnplif~Wdo.
n~ de celos
realiZados 1 2 3
n~ total de coplas 2
n'i de coplas
'18!]8S
n2 0e cqias
dot~na
dlanasllotal
5
10 20 40
X
8 16
8
10
o o
2
o o
25%
32 \ .024
8 :22
1 004
69%
..1(Ji
., 10 11
20
40
80
2x
. ,Cj'
10'1
99,996% 100%
50%
2:~C
15.2.3 Algunas caracteristicas del proceso

Rendimiento: Pues1o que los prcx!Uctlo6 de cad& cido sirven do moldo par3 ef siQvi<lnte. ltl ao.m.l<lein de copios vez do &noal- Sin Qmb8tgO, en 13 prielic::3 flt rtndirnic!1to de~~ no os complelo, por lo que las cil'ms MI ven algo reducidas. A pe$<11' do olio, $k;ucn lSiorldO muy~;)$. El nUmero de.'! Wl)i3$ el !iNf de m <:ido$ ret~~$ $& puede ealcl.llar como:
(tanto~ como dianas) a& axponencial en
AMPLIFICACIN IN VrrRO DEL DHA: REACCIN EN CADENA DE LA POLLMERASA 0 PCR
193
Siendo
N =nUmero oe <:OP'8$ <lClflenidas ~ = nUmero de molclAas ink:i81e$

R =!'$~lo de c..-.d:. c:.c:lt)(ge~lt't'leMe. de 70a
85%). Cl(ptM8do en tanto por uno (0,70.0.&5)

X n(xnero de ciclos
hatl aesarr<*ldo modlflcacionft del mtodo dec;ritt>. cncanw'laCias a aumen\ar la eftclenc1a. sobre IOdo en lo relaiNO a la conoen1racin de Mg1 ' (normalmerl1C ele 1 a 4 mM) y al tiempo y temperSiura de lemplado
se
Dur acin: La dur..ci6n <.!e Clld3 ul\8. ele las 1res etapas de cada ciclo y el nmero de e:octos Qebcn optimiZarse. ese la secuencaa oonc:reta ave se q.liera 3r'l'()lillcar. En m.~coos C890S. la eleoci6n de e&tas oondicionos def.>e hacerse de forma o~irie<t EtipeclfiddOKJ E$ mvy elevada ESI& oetetmlneda especiameMe pot la &eCOOnci<t de 10$ >s ceb:ldores util:zados y por las oondicione6 de templ3d0 $e pueo& determinar la especificidad anaiz:.ando pot OIOctfOfOrC$i$ lO$ pn)(I~O$ generados: la aparion do uno bi'lnoo Uniea ll'ldiea que la l<:niea es especlllca. P e,amplo. $11il to~tura de tert1lladO se reduce excesiv.,en!c se pr~ falsos pos!wos debidos fundamentalmenle a ~eamtef\\OS impettectos del cebador c;on sec:oetlcias disbtlta!l oe i8 diana. aunque similares. ~ resuiWn <~&1 ~.<~I'I'Clin amplificadas.
dependiendo
C111paeldad de delecdn (oomUn. aunque intlQfT'OCt.amon~ c:tenominl!da sensibilidad): Es muy alta (bajo llmM de e*'Ci6n). tanto que la PCR puede permitw de1ectar una (il'li(:;) f'I"'IOeula oe OHA en ces cualqUier tipo de muestra clinica, lorense o arqueolgiCa (~ll. pelO,~. eet.). Sin en'()atQO. esta C818C*fsllca supone ....,bln un e~;)()) IIC$90 de coMaml~ por mole\A<Is de (!rigen ~no a la muestra. Fidelidad' E$ doeir. 18 eapaciclad de ooplar secuencias con precisin. $11'1 W!ti'OI).IOJ mulaeior.es (carOOios en la secuencia de nucletldos). Esta caraaerhl!ca depende sobre IOdo do qve 1<' enocima emp~e~a tooga o no acuWded correcsora de pruebes (3"-exonuc:leesa. pg. 1117), Asi, 1 <' ~encia de en osola en!re 2 10_. de una polimerasa Taq coNYer.clotlal y 10 de la poimerasa Pfu, que $i tiene ~ividad 3'~XOr'ludeasa. En 1000 ceso. la eleccin de la enzima depenclef del objetivo de '<t PCR NO es muy impMance 1a ftclel(led s solO se prelerde ob1ener u03 sond<!l, oero .s fundamenlal si el objotivo tn la ictentir.:tldn de mutaciones pooo frecueM&S.
15.2.4 Automatizacin de la PCR

La au10matlzacl6n es sencill;l y 00 bajo eos4e. dadO e1car&c:ter eieleo <1e1 prooeso. el empMo de componente$ eSiable& a1 c;aao, y el delK!rrollo de lermocielaootes pata ptogramar los camtos de temperarura. Al mismo tiempo " lmptesclndible, pues slO mo4i<ln~ lf <'lu!Om31i.taei0n se hace faC11ble la realizacin de un rnero elevado dlt ciclos y se aumenta la P~Ci&in del proceso Ello lacilll.a un empleo cada vez ms e<spec.ffico y senSible en ellabonctlorio climoo.
15.2.5 Variantes del mtodo

Han surgido numerosas modiflCCIICioAC:$ dcrivttdtt$ <lel miO<IO ~ioo IniCial,. con el prop:'l$110 de mefotar el rendlnW!nw o la espeCificidad, adaopUtrse il muestrO$ Ntticu!tm:)$, ampi!lcar molculas de RNA en lugar de DHA. pro(!uc- c.-dona!! de hebr~ set'ICila ... 1>ot ejemplO. una !TIOdlflcacln muy comUn en la aocrua!lda<:l (denoiTIIflada ~c:om.ienzo en caliente. hOt stan PCR) cons.s:le en privar & la mezclo de reocc~ de algt.:> de ws COn'CX)c'lentes (frecuentemente la polimera&a} haJt.ll Q~ w Mv<t aleMJ:&dO un.a letnpe!&tura supetlor a la de templado. De e&le modo. &e e~a la elongoOOn de ceMdor~ asoc1aoos inlcil*nente con poco rigor (a secuenaas de homoiOgla parcaal con la diana) y, como re5Uitado. se aumenta muChO la eS(leelllcldad de la amplificacin.
A oontinvalcin. 110 (Ometll;)n bre-Yemente alguMS de 18!1 variantes ms &~gnltlcatrvas.
15.2.5.1 PCR "larga"

Oenonw~ada l.PCR (long PCRJ o LAPCR (LOI'IgC'I' -'ncl' ACCu!Mt PCR. 'PCR m:\slargtl y tJttl~), su Ollj!livo es superar lOs 11mltes de la PCR convencional para amQiifiCal con fidelidad region&ll <fi<'IM do gr.'ln t&mao (entre 5 y 40 kb). EJ principal fat*)r limitante es lil OMJ$Cn<:ia de aelrviOM ~IOI'a de pruews en la potimerasa TaQ {pl\g. 189), por lo que se aade una cantii:Sad menor O. otrt1 cnzirn3 con etlpaeidlld de OOtr'eOCiOn <le pruebaS (por eje~o. la Pfu) pata con!rarre!l'ar la carencia ae esta aC1MCiad y. mismo !lempo. seguir apovechando la efiCSeta de e10ngac10n de lj, polimetasa C)tlnciPQI (T80 o &~mltar).
15.2.5.2 PCR "anidada"

La espec:if'IC~'Itd OUOCSt aun-.enwse re..'Vi.lanOO IM\8 ~unca rescc.on de PCR. con dos cebaoores nuevos que hltw\dan <.len!ro del tragmer~IO diana Ml)liritado p:~t el primer pat. dando BSI lugat a prodllc:IOS de PCA mas 00tt06. pe~o mas esleO!Icos. Las coplas oonect.as de la prWneta diana contendrn arrtlas seruencias complementarias a lo6 l'l.levos ~dOres.~ diferenCia 00 10$ ()r(ldue10$ t10 especilleos generaoos en la primera PCR (que se obsel'\fan en la electrotore!lls 0010 varias bandas o uM bai'ICJ3 fusa}. que pot eiO no resunarn amplllk:ados en i8 segtM'Ida. Este miOdo tarmlen StW !XIt8 at#lef'ltar el !actor de amplificaciOrl <Xlr\Seguldo. al suponer dos rondas de af1l)llflcacln.
194
CLOHACtN ACELULAR: REACCIN EN CADENA DE LA POI.IMERASA (PCR)
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, . ,dHo.lilll!
3'
'1~
________
y
J'
~ .. 1
S'
__..
15.2.5.3 PCR Inversa

Esta varitlfUe &e empl9a para Clonal r~ desconocklas de oo ONA, Situadas en P<>$iC:in vccin<tl a M<:VG;ncit~s oonoc:idM E$ decir. en lugar de a~if ~ear la regin interna, ltanqueada pot 109 dos c::ebadole$ (PCR <XInvencionat). " ampliflctt la reg.On axterna. que flanquea a los cebadores. Para etlo es neces.arkl eottat el DNA a 811'1"1bOS lados ele la regin diar\3 con un<~ tna:iiTlil do r9$lriocin (pg, 1 97). de tal forma que los extremos eoheatvos tesultantes pue<~an hib~ entre si, tOI'l"'\\WWo Ut\8 mol6o.Aal c:irt1.1lar. EJt;t O li oorrnda DOf una ligasa y &e realiza la PCR
~:1
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S' AGCTT
.
OesnaiUralzacin 1 + Templlldo 1
,.
. ftCGA S'
ONA \,K'Uiar de
&>hk hclxtl
c.'lllretnU:~ c~i\'(>1;
A l q;_l.ll:ll quo: en 111 PCR nurrn11l. 111 d 0Jigad6n .,..001! progr('.Uir lfl,! u 1rl(fi()L pero l6kl jo,' a n plif!C'IIdl el
l"lJIIII.'MO Si sobt\-p~~S~ Ia IM'k&l o.k la otta d~au
hibricbdus y tip:~dus
AMPLIFICACIN IN VITRO DEL DNA: REACCION E:N CAOE.NA DE LA POLIM "'"' ER"' A ._S,_ A ,_,O~PC"R ~----~ 1~95
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~o.:
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twa unphrt<'"""' ;nnlxb
"""'~ ~~ llrtm~ut-JNn
1;,~ !o('(UC!!d:o ~I)Nio,:o,U.
oon ceb<adof~ Qve htitlri<IM oon 106 extre-mos 5' de la secuencia oon(l(;iO;II. po1 k> que la eiOo \gaeiOn se exlef'lder a!redfx:lo' del ci ret.AO. Se generan copias de un ONA. Iif'IOOI delimitOOQ, como en la DNA normal, por la po9lel0n de ambos
oebadoros.
1 5 .2 . 5 .4
PCR con adaptadores
$0CUCn~ <le:SOOI'lOCida ligando a ws fragmentos de rq$1riocin I,M1()S tJdaptadof'fJS, ollgonucle6lido& sinttico& (.Qn extremo$ (.QhC;$iYO$ oompatlble9 ooo k>9 generados en la mve:slta. A connnuaCin. ooa vez desM!uralizadO$. se <'!&oe:n ce~es especlfloos para las secuencias 3' de los t~d:tptactores. Se amplifica asl el eonjunto de adaptadores y sec;uc~~Ci<'l ~1'18 pero deOe senalarse que se amplifiCan pot igual tOCIO$ lOS lragmentos de resltJCCin presentes. no ~o :slo
Tomt)i4fl puede amplfficarse una regn de OHA de
~In que se ~uere nmpli li~11r, do! 'l'.:~.~Cm:-11 de.roll(l(td~o
'\' AGCTT
l" , A. -adaptaOOr 1 S' GT'CCACTCC
adq'ludiJf =
TTCTTACTCAC l' 'l'CAGTG 5'
J" C>GG"!GACG::'TT0:::C'5:
AAGCTTCTTAGTCAC )'
IX'.t!ildut 2
[TTG] S.
~
TTCGAAGAATCAGTQ
1Ei y l'e$to do QciQ, de PCR 1

S' G'l'CCACTGCAAGCTT , , 3' CAGGTGACGTTCGAA .. , AAGCTTCT'l'AGTCAC ) ' . TTCGAAGAATCAGTG ~
15.2.5.5 PCR asi mtrica

Er'l f;$!e coso, ~ !rata oe geht!ftlr copla-s de hebra sencilla de un ONA. En la vanante ms &~mple. se al'laden c:ar'ltiOiaoe-s muy doteret~-les de ambos cebadores, de modo que tras los pimetO$ cic:fo& de PCR uno de 911os se aQOia y, disponibles ya sufiCientes cooi11s 081 ONA ditma, $(AQ vn.11 de sus hqbrns sigoo ampifidil'ldose grncias 011 ocb:ldOI' rnts abundan1e.
15.2.5 .6
amplif~taCI6n
RT-PCR: amplific.acln de RNA
El nombte. MPCR oon transcn~a inven;.( (inicitlle$ do /V'I'Cilo tr<Jn$Crlj)r.;;$<t). mdieo ~ so lr<tla de un<'! de RNA (cspecicllmonte mRNA) <'1 tro~ ae 1a sln.leSis pre-v1a ese su cONA (DNA complefl'lentario al RNA), que despuh se amplillea por PCR. Es de<::it, no se OfJCienen Clelt)ias del ANA de pattlda, sino de ONA. aunque se OOI'lsei'Va ocvlamente la secuencia de aqut.
Es el m&iodo con mayor capacidad de detoecin de los disponibles pt~ra lb medida de la eJCpresin ~ni(::. in vit10. Se utiliza greierenlement. para an'Cllific<u mRNA$ do ekA&S asequiflle$, PQ1' t'je<pb sal'lguir'let~S, COI'I utl:'l e;,cpresiOI'l
196
CLON:ACIN ACELULAR: REACCIN EH CADENA DE LA POLIUE.RASA (PCR)
eltrvada de caeno& gel'i&$ (pot ejemplo. globlna). Tambin se ha alle~ "' a~li$1$ de lran&eritos da genes expresados tn gr..OO minimo La mezcla inicial conltene IOdos lo8 eompot~entes neoe:s3rios muostr<11 de RNA, tran5Criptasa lm.eraa. ONA J)OiimetM3. <:eb<ldores y dNTPs.. El proceso comienza (por ejemplo, 45 mln a 48 e} eon la si ntesi$ do una hebra de cONA pot la aoein de la trotn.SCriPtM<' irrvor$a. una polimerasa de ONA dirigida por RHA ~- 14 7}, ~icnOO et cONA unido al moldO <mo ~ RNA: cONA. En una segunda etapa (por ejemplO, 2 mln a 94 "C) se CIOSMturaliu el dllplex y ~~~ la a~~tacibn $09Un el mec:ani$ITIO de una PCR nonnal: la nee de cONA liberada acwa eomo ple.x se a~~ea en woeslvos ciclos.. molde para una segunda hetlta eso cONA y 11.11g0 el dU
R""A. de' hc'br11 tn~oll~
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1E2 y ddos suoesiYos T+E D1

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J' !'rCAGC'TU('CCGQtATAGQCT'I'
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Te6ric<l~t. Mst3 con \IN! rnolk~o~l3 do ANA Ql}e este i'1tact3 entre ~ do$ &itios de unin al cebadof pera conseguir 1& amp!ir-caciOn. BajO et mismo Pf!~. ~ se pueoe ~irlear RNA usanoo 1 8 potimctau Tth (1811'1bi6fl ller'mOes&able. aisiada de 1a bader'ia leM'IOfll& Thennus ~). que ~lene 111 mismo tienl>o aclivid~ ONA po~tnetasa y IJ'ansctiPiasa ii'YVef'SS.
Tema 16
Clonacin celular: Tecnologa del DNA recombinante

16. 1 Et\Zimas de r estrfec.in,_,_,_,_,_,_,,_.. _ .._,_,_,_,_,_,,,_,,_,_,_,_,_,,_..._.,,_............_.,,..._,,,..._,,,_ 19 7 16.1 1 lnlt0duccl6n a las nudeasas .,.,_... _ ,,_,,,_,,,...,_,,,_,,,,,,,_ ,.,_,,_,,, ..,,._ ,.,._,, ,........ . .... 198
16 1 2 Entim.<l$ de re.lroeOIOf'l .. ,,_..,_... _,,, __,,_... _,,,_ ..,_,, __..,_,,,_,,,_,,, ------........ ........_, 199 16 1 2 1 C<n ;)Cteri5lic:.a$ gcner31e!S ..... - .... .......................................... .......... ......... ... ..... 199 16 1 2 2 P <IC)OI bdgico del sisl.em" rne4ill.'ICJI6o.4'esl.ncc01. 200 t61 23 Aeci6ndol&$9n.vm&500to$1riccindebell. ........... ................. ............. 201 16.2 Clonacin cel ular de motkulil& de OHA , _ , _, _ , _ , _, _ , _,_ _ _ ,_,_,_,_,,_,_, _____ _ ,__ ,,.,,._,,,.,,._,,,_.... 203 16.2.1 PreparacindeiONApara~c::lonoon .. , , , , 205 16 2. 1. t Insertos de ONA .- ... - ....... - ... - ....... - ....... _,,_... _,,_.... ,.. _... _....... - ... - ... - ... - ....... -........ ..._. 205 16,2 . 12 l n$Cr1QS de ONA compler~~entaotiO proee<~ene de un mRNA .. ,_,,_,...... _,,,_ .,,_.,,_ .,., ,.,_, 205 206 16.2.2 Preparacin del vec4or de clonacin ,,_.,. ,,_.,, .,, ,, .., 16.2.3 Fof'l'n8Cion de la moic::ula de ONA reoatnbinante .... - ............ - ... - ... - .,._ ., ,_.,_....... _.,.,_, 207 16 2.4 TiPO$ de ve<:!Otes ._.. , ... - ... - ........... - ...... - ... - ....... - ... - ... - ...-... - ... - ...... - .... - ... - ..... - ... - ... -........ ..._. 208 16.2 .4 1 PliiSmiOos ,.,_ .,,_,, _,,_, _,,_... ...-... - ........ ,,_,.,,_,,_... ,.,_.,,_,.,_,,_.,., ... _. 209 16.2.4.2 S..Ctorifa~ , .... 2 10 , 210 16.2.4.3 Csmdos .... """" .,, 16.2.4.4 Cromosomas attifi~ .. ... .... .... .. ... ........... .. 211 16 2 .5 Incorporacin del ONA reoor~~blnante ala cUa anfltrlona .. _,, _,, ... _,.,,_,,_... .,,_,.,_,., ...... 21 1 16.2 .$1 Tipos de cth.JI<' <1nfiri0na .., .., .., ..,, 211 16.2.S.2 Mtoo& de introdoocin del tONA ,_,, ,, .., ,,.,, ..., __.,, _,, __.,_, __., __ ,,__ _,,, __,,,_.,,_.,, __.,, __.,,_., 211 16.2.6 Propagac::l6n en coltrvo .. _ ., __,.,_,.,_,.,_ ,,_,,,_,., __,.,_,, _,,_, _,,_,.,_,.,,_,., _,., __.,_,_,, _.. , ... -....... _...,_,., __.,,_. 213 16.2.7 DetecciOn y selecan de tos c:Sones reeotnbinanJes ... - ... - ....... - ................... ,.,_,.......... - ....... - ............... 213 16.2.8 E11ptesl0n genlca ,_.,,_,, _,,_.,,_,.,_ .,,_, _....... -... -... -... -... -... -....... -... - ........ ,_.,.,_,.,_ ,.,_.,., .. ,_.,,.,, .. .,..,_ ., 2 15
16..3 Gcno tcca s ...._,,_,,,_,.,_,.,_,,_,,.,_ , _,,,_.,_,.,_, _,, _,.,_,,_,,,_.. ,_.._ .._,,_,.,_.,_.. ,_..._,,,_, _.,_,,_.,,_,_,,_.,,.,.,_,,_.,._, 21S
16.3.-1 Genotecas9@nmicas ,,_.,, __,, __,, __, ___, __,., __,_ ,, __,., __, __.,, __, __, __, ,_.,,_.,,_,, . 216 16 .3.2 Genotecas de ONA OCHTlplen'lentano , _............ -... -....... -... -....... -.............. .,..._ .,, ... -...... -....... -... -......... 216
E1 mtodo clkioo de donacin de Ac:idos nu~os os el Que ~ocll<~ la c::apaCJdOid do l<at; clulas par01 replic.at ef ONA. Sorge gracias a la aparicin de una: &ene de tcncas que oenniten elal&lamento del OHA y al descubrimiento en los al\os 70 de las enzimas de teslnCCin. qoe hace postie en el labofatorlo cortar el ONA e ineotpe)tar tos lragmenlos a w~ctoteJt, que a su vez se inlroduce.n en oMullls anf,'ff10ttas, dOI"'de tiene lugat su replicacin . Aunque . etl ~ipio e111a teenologi a SOlo se planteaba pata c:toi\$Cin oe1 DNA . eJ~is.ten ~tu/lln'lente vri3ntes. Que ol'lllltion su eliaenc::ia y exbenden su aplicaci.n al RNA.
16.1 ENZIMAS DE RESTRICCIN

Arttes de Clesc:tit>ir el proc:eso de ClonaCin del ONA, es I'W!oees.ario Moer ~ inCJ$0 Pilq~ et;tutiill con CJet10 detenimiento laa propiedades y earaetetis.ticas de las endonucte~LS.:Js ~ restriccin AvllQ~ cst<l<$ enZimas Cleser~~pel'lan un.a funeiOn propia t~~ l as C61 u!as proct~rio!M en l~s q1.10 w doscvbr..,ron, $0n P<'rt<vl;ument ImPOnentes POr ~ er11)100 O!';J)Orimentaf en vt~rios rea~ de la Biologia MolecWII. de intets tanto bsiCO como aplicado al di<~gnsbco d inioo En espeCial. se utilizan en el proceso de la cionacln mo6ecular del ONA. de ah la oportuf"'icSad de su esludiO en e$te ~r. AOems., bei'Wsn aplica<.:in en otra& t6cniet$. oomo la seeuenciacin del genome y el estudio de
198
CLONACIN CELULAR: TECNOLOGi.A DEL ONA RECOMBINANTE
tos po.limorllsmos (temas 18 y 27}. Se IniCia eJ estJJdlo oe estas er'IZimas OOf'l un ~e re.cordat.orio do&&:$ ooclea$01$ en gel\er&l.
16.1 .1 Introduccin a las nucleasas

Se denomina de fonna genrica nudeesa a cualquier enzima con eapadctad de escindir los et~laoes tosfOdlifJ:$tor de le cadena polinuCieotidiCa de los ~i(J()s nuleico$: $0n, POt tal'llo, fo5fodiestera&a&. Su espec:jicid-00 puede
""*ar$0 CC)tl ~pecto" tros cmerios:

1. hci$in on posk;iOOC".s intomi'ls o respectivamente):
tot~
en la estructura primaria (endonuc:IN&as
y exonudea&as.
fo"l$to en lU8
L:i.l f)oouch::!'S;:s hulmlatlln

rx<-IIUl~uu,,.te cnla('(';i
qt.te pwbcip& d nuo:lcUolidu t~-nn.itul
(bi<-.n 5' o bicl'l i . dcpu~dicDdo de la nonudeao). (knan, por ~nto. Utlll C11okn11 pohnuct.wtfdK:aliCOrtadll y un nucic+&ido(N)..
ut ruaclt~&t-nwoofo~fato tPN o 1\' p)

o un n1.aCiefidobi;(osfnto (p.-.:p). vbc"
p~p
1)
"u;:n
<; bocn
..
t\pNp~'pNp_.
.. .fl~'pNpNp .. NpNpNp_.
..pNp}\pNpNp N
Las tndoouch'llw k'llo l'lldroliat~ .:~~bien internen M 1~ cadena. r~ decir. ~in af~ar a lO!> nudHido; !~itul~. Qcncr.m do1 ftamcntu8
polinuckochl:ici.
2 ActunciOn $Obre uno de 10!1 dOS tipos M enl ace IOstoE!stet:
... pNpNpNpNpNpNp...
J;C'
Alunu lliOICieliSDlium::a:) nct'-'n apcciticammtc: bidrol ~o los '-'fllll\4 fosf.aao

(Cimllldoo tUII d 011 3', mi<"l1!nu: que UCtaJ OuM j!] bi.Jrol rnu'll~ f..-.rn~ oon OH S'. Oc CStt mudo, lu de: liJ:Q.::L d11n l up 1 C.XIr\:II'IO!l J' OH y$'P. lllknll'llS QUC l:!S 0.. LiJiu..:ll:: produo:cn C"X!n:mc~ J',p y S' .OI I.
)'
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o~dc~01 lk IJW
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ooxle;u.;. dt IJilO ~b
lftllllll" t 1 . ~~ \-.011 ) ' PI
trompe j ' .f'. tntk $ OU ) 1

,p}.'pNpNp _._ NpNpNp...
fjnttshtiJCC3itl 1 (k rrn!.1'11\ tk srmimtU b una 3' cM"udcasa de tipo a... por nmo libc:rn el nuc~ido ,}". t..-noio.;a! <n forma de: nuc~i<b-S'P. Su amOO <"Xhau5u~a ( hk!rlii-1io t(!hal) pf'\Jduce lll ln(>.lCII d-. ni.ICIC\.\stdos,.j ' .p
pNI)Np. ...~ ...,~ .
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c:0010 rnontnoch:(o,:uSc~oJ' ,S' .JM.:J(I,fato. S1 la eSC'Isln C$1\"J''(:lili\ a. 114'1111\'CCU kw PJeesi,os monon~leOsiOOr~ .p y('! n~K:ks.i!J ~ 4ef11'1inal
p'pNpNpNp.. 1\'Plto'pNpN ~ )o..;pNpNp ......NpNpNpN
p.~p.r E Np+N
c-.,nP ,. N., >-l' NMh)
P''
Np
Np
3 Reeonodr'!"'ienlo de nucle6sld06, bien por la pento&a o bien por la b&M nitrogonad<' ($(:110 en t'lgu~ nueleasas): desox.irribonuclus.as o ON asas. que actan slo sobre ONA; ribonucloaus o RN<'I$M,. Que hielr01i%an RNA;
r..,alrnente, algunas nucleasas distinguen encre nuclesidos purlniCO$ ypnnidlnk:os
ENZIMAS DE RESTRICCION
199
R)1n1 1 (.k nirn;a hmmp) . EfldrrJbnucl~.tSU <k ltP..' "b" .u.: ~tW s<oto iQI!te cnlllc~' en t.o~ que el rtbottu.:lcMidl) dd lado S' r$ puimidinieo !C.L:t Se IUmt;m, po;-.r 141110. uU~ud\'OCk!Os <un <:'-l~tO !i'..QII } .:\ltc'lll(t 3'P pirimidlnico !m~~. en $1.1 caso, d s ..nboruu:ll'~tdl) pmt!ll'llttuco> Ytenuintll) d niiOnud~'S.td.:l
l'l<munall: fiA.I'{;fll. p <'ipl p( !l<ip( fiA~
p.>\ ....
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Gp< P
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tlU.Cih~ClS purft'li.:O
GIS 1, Enchs!csu:\imhon+Xka.~~ de tipu ...,_.. que h.ll<li:o:a pn:fcn:I'II~'J'It~ w t-1 t-Illa' o:nll\" y pirirnidlnico; con ll1C'ftlll fn:~urnna. entre plnm!dinoro ) punn.w u cotn: pun11oro ) purintOO. 10..-s. uaig~u~'lcudos oon cxrr~n~ (' .fil! y )'.p:
pltp(;pl plopl pCp C.o( p.\pl pi\ pAp(.p l p(op
t
imo
l r('p{..p
( " '"
-t
l l'\11.
16.1 .2
Enzimas de restriccin
16.1.2.1
oe&SQ'Ie$.
Caracteristicas generales
las enzimas de rc$1Tlitl se llamM tambil'l nuc:teaus de restl'lc:cln, endonucleasas de rHtrlcdn y. en enzimu r0$trictivn o rcsb'ic:luas. Pettenecen a este grupo una gran di'Yer&IClad de endodesouribonucSN$~&. dOKI,Ibiort~s <:amo enzJrnas ~s !Se diStinJas tlactetlas y caracterizadas en lOs anos 70. Se dispone hoy comercia!mente de un gran r.Cmero de oll&& ton elcv~ e$pecifiOdad esaabii~&<J y pureza.
Se nombran con tres Jetras tomad~$ del 96nero y es!)eeae de le l)acaeria de la que se aislaron orlglnatmen!e, !eguldas a \teces por una lelta ms, que dentifica el scrotipo (VC~ri~nte ;tntig6ni~ de llltlaeteria}. y fin...,el'lte P<W un nVmero romar.o ~ las idenb'llea en et caso de que en una misma vaname se hayan encontr<KJo varia& enzimas oon di&tint<l esl)ec;ificid~d :
bn~'1<:riu
de rig.:tL
flw:mlJJit{//J~ twg1ptl115
---
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8(l(i/lm own/oliqvd';~
Cl.--p3
Hum 11 1
fl
la lf'f'lportancia datas enz;imt~& do re&trioci6n r:.clie3 en su granespecifieidadde reconoc:lmien1o de una seeuenela 00f1a de ONA dl:cllex y 1 Q()n$iguiente hicltOii:$iS de un enlace los.loellester en ca<la heb'a, jusUimoo.le en secuenelas concretas del OHA llamadas sitloti de reconocimionto o de rastricc:i 6n , Los rmgrnoet~tos de DNA originadO$ $01'1 Ulles !)ara iniCiar la ctonac:ln celular o aoelular, para el aniisis de ONA. ONa elaborar mapas fi.sioos de re:stricOOn (pg 22tH. !)ara 18 eteoein de pownortrsmos (pg 381), etc.
l.~s di~t'$ enzimas de restriccin se agrupan I'IOrma!menle en
!res tamilias. oe acuerdo oon s.us propledaoes.
Endonuc:-leasas de restriccin
Tipo 1 Endonucleasa y medtasa en una mi&ms ptQ4einil ~en distintas subundades) ATP, Mg~ . SAM (") 3 Sutlul'lklade:S. S recono(:imienl o, R re$.1ricc.n. M motilaciOn No pellndtmlco. dos partes sepatadas (ej.: TGA(N)$TGCT) Corl8 les 2 hebras et1 ~I'ICO$ cerceonos entre si. poco espocirt(;Qs. 8 unO$ 1 000 pb dol Sitio de rOCQnQ<;imiento Dentro de la secUMCi& de reconoamien1o. En ambas flebras
Tipo 11 Endonucieasa (mctUMtt Cf'l \11'14'1 OfO'&inO'I independienle)
Ti.po 111 Endonudeasa y meblasa n 1.10<\ t'nl$ma, protoi M (en distintas subumdade&) ATP. ~'9'"'. SAM{) 2 Sutluntd8Cies. MS rooonocimiento y
m~~ttJI.&ein,
ActiviCI&C!
emimie\Jclt Coel'lzimas o
00$U!If(MO$
Mg ?"
1 subunidaa. aunque actua oorno h0!1'\0drnero Pallndrmlco (48 pb) (pOg. 57)
C,O.,~ las 21\ebrM en puntos oouwalenle&. muye&pec.-ft<::os. denlto de la SEIQJenCi& de re<:onocimienlo
Estruccura pro!elca
R re&1riecin
No pa!lndrmtoo C01'11;1 tas dos llebl't~s en punl06 diM&nlesentre sl2 3 nL srtuados a 2426 Pb del sflio de roCQnQ<;imt(ltl\0 Aden1na det'tlro de ta secuencaa de re<;onota'l'lie:nlo en una $013 hebra
SitJOde rec::onocim.eniO Pvnlo <le eorte
PunJo de metilacin
Aden1na ocitosina rooy especificas den!Jode la $e~neia e1e reeonocim.et~lo. En t~moos hel:lrss
Inters en trg.erueria i!nlica !mplos (") SAM
No
EooK.EooB ..
S
Numerosos (pg . 202)
No
Eco PI, Eco P15, Hin/111 ..
=S-adenosilmetionina (pg. 201)
200
CLONACIN CELULAR: TECNOLOGIA DEL OHA RECOMBINANTE
Nos oonoentraremos en el estucliO de las ei\ZiMaS oe tiX> 11, pue$. 1/A ~rtnr on soc:vencica:s muy definida&, son las utmadas como herramientas en lngenlerla gentiCa.
16.1.2.2 Papel biolgico del sistema metilacln-restrlccin

la e~tis1encit~ f\lltural do '-1$ nu~$3$ de rost.ricdn en mucba$ beelerias ofrece a &tas un mecanismo Cle
Cletensa COt'ltra la entrada cM M(ttf!l"ial ~iCO do 0110 orgt'nismc>, ooncrelamente de virus beelerifagoe (cuya reproducan depende de la ~atta gentica de la baeleria): se trata de lOS sistemas Clo ras.tric;c;:in.modfficacin o metllK.In-restriccln. Para cada enz:Wna de restriocln, una metllasa reconoce la miSm8 seeuenei<'t que con$1il\lye ol sitio de 1$1tiocln y une COYalentemente grupos metilo a determinadas bases del ONA en dicha Seouet\Cia. En el C3$0 de et~timas de lipo 11, la metaa&a es una proteina ndependiente. mientras que las de tipo 1y 111 poseen las acliv!CadeS
y mcti3$a en su ~ulal oliQOmrica. oomo subunidades qt.Je actan coordinadamente (ver tabla anteriot). El rnoeeanismo de defensa es el $iguiente 01 ONA propio de ~ bacteria es metilado de una lonna especl11ca. earacterl$1lea <le <:ad3 esl)eeie baC1eti~n3 (on 1M secvoncits reooncx;idas tamo por la restrictasa como por la metilasa
nVCIM~
oe esa e~le). La l'rle'lllaeitl oe las bases itnp~ la uniOn Clo la enzima do rostricc:in, oon lo~ el ONA propio no es
loti:ZBdo. Pot ef conttarlo. al enttar et1 la clula ONA de otro organiSmo, no metlll'OO o oon un p~rn de melilacibn diferente. este ONA puede set oegtadado por la enzima de teS~tlociOn, ya que eareco de los grvl$ metilo en la secuencia diana (por razones I)IM'amente alee1orias, en cualquier genoma habr~ CiertO nUmero <le secuencias de 4, 6 u 8 pb iguales a &it roconoada por l<l enzima, "-'ego 1\abr secuencias diana disponibles). A partir de este mecanismo <le oocin combinada S!A11i pteCisamente el nOI'fll:n de enzimas de restriccin: la accin Cle la nuclea!18 te8trltrge ta J)C)Sibili<2ad de inft<;On POf virus. D.\ .\ no
I~Jteibdo
0\A l!lf'libdv en v.v adenma ~cifiQ del s1tiu
con sir"> di!" te$tti~in pan EooRI

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de rtStriin pan lia.JJU ((1'1 arni!Gs hbras)

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En resumen:
1 1) restrictas.-' :.etc'&~~ sobre s11ios no mecilados. y

la mctilasa 31.1\ia sobre sitios no oonados.. ~(Mr(K:itndb ambas la misnL'l ~C\1encia.
& est metilada una sola h9bra del ONA.. el sitio no es reconocido 001 la enzima de restricoin. pero si OOf' la metilasa. <PJe allade el grupo melilo a la otra hebf<t Esto es 10 oue OQ..ne, POI ejemplO.,. fi~ de ta reQiicacin, donde ol ~ cst;\ k:wm3do por u!\11 hebn!l molde. pree.xi!denle y. en eonseeuetW:ia, metii&Oa, y olnl ~ red61'1 sftletizac:Ja, Qve aon carece <le grupos met*>. E.'lta aocln de las metllasas asegura que todo el DHA de tas dos clulas hijas quede n-.e(ii&OO lo antes poslbte. la metlacin del ONA afec:Ca prin~lmente a Qtosi~ y adeninas de la sec:uenciit reconodda En a.. reaccibn. las nwtil3:;os~o~an oomo don&OOr del grupo memo el (:01'11)ueS.IO S.adenoSilmeotloniM (pg. 22).
ENZIMAS OE R ESTRICCIN
201
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Oebe adelant3r&c que ~ m.etiltlc.!ltl (lol ONA in.tetvieM en eucariotas oomo un mecan1smo de regulaCIn de la e)(presln gnica. aunque este proOHO no cienc nOO;a QVO ver eon. ol rne.canismo ese proteociOn que Clesempel'ian 106 sistemas me~a-restrlctasa en procartOtas. Esencialmente. en eucariotas 106 oenM tiot1den <' est'*r desmetil~$ on tos cejldos donde &e elq)I'9S(In y metilados donde no se e~~ProS<~n. o.pe~ente en las regiones ese ONA llamadas 'iSIOl&$ cpG-. pot tener es.ta secuencia dinucteotldica en la que C &ufre la meliaGin.
16.1.2.3 Accin de las enzimas de restriccin de tipo ii

SOfl estas las restnct.asas estructuralmente ~ ~PIO& y IN me;o.- fltudt~d.tl$ por su utilidad et\ tngenieria Get'ltlca, a mOdo de t,eras para el corte del ONA. El s.itio de restriccin es a la vez toga de roconocimionto y do r'lidrlisit.. S hidroriz.an oe IOtma muy especifica etMce& f06foster del ONA. uno en cada hebta, getMWtlnd06e d06
fragJmMtos. de nntriccKm El enl tloe hlc7tOiiZado es siempre el 3 'P (es decir, son E!f'ldonuc6easas del tipo a. pg 198). POr lo Que el fOSfato queda uniOo as. deja~o en ambos fragmen1os exttemos 3'0H y ~.P. La reaccin no necesrta A TP. k:> qvo la diftreneia de te cataliz.ada J)Oitas enzimas de Upo 1y 111.
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l'llll'\'molll llenen b;ec ob:ifl'U\'a.b; ~ iJ~'Ik!mll'lati\' ~ I ...IW~ et~beooho.,. ot

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202
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CLONACIN CELULAR: TECNOLOGiA DEL DNA RECOMBINAHTE
Algunas enzill\CII& de restriccin de tipo n empleadas en ingeniea gentica
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ObsfVe&e que en lodos tos casos tos extremos de tos dos fragmentos gonor<tOo$ &Of'l idntiCos. tienen '- mismt' secuenei3 (se puede ver girando tao uno de ellos). E.sto es oon&ecuenda de la simetria del palindromo y de la posicin srmtrica de los punto~ de COfto en c&cltt llet>fj. TOOO ello se deoe aqueta enzima actUa en !onna de dlmero, por tanto reconociendo una misma &eeuenCiill y cortando oo mismo tiPO do ontnoe e11tas dOS hebras: por e_emplo, Eco Rl eot\8 el entace (5') G-AA1TC (3') en ambas hebtas. y fOrmacin de e ..~ttn'I09 OOfleSivos es de gran Inters aplicado en ingenierla gentica (pg. 207), pun fr.-gmonto$ ~nor.OOS oon una MiSma restttctasa a partir ele dos ONAs ddtos pueden interaccionar rne<fJ.a(lto ol apareamienlo de 1M ~$eS sut e1t1re.oos COhesivos {tal intetaccn no es posible entre eldremQS romos). Igualmente se pueden asociar los fragmentos producido PQf enz:im<J$ distintt~s que prOCiuoetl exltemos compatibles.
oe
Oebe resa!tarse que ef produao ~la I"O?I$0Ci<'lci6n de lOs dos ttagmentos en ninguno de lOs casos es Idntico al ONA de partida, pues e~ formt~do 11' dos molkulas.. La falta de enlace oovalente entre los extremos de los lragmet~tos reasoclados se indica con el nombre de ~mella o 'nMt:$c<l~ t*k. pg. 156) . stas se pu&&n <*lt&t o sellar" w 1<'1 t'CX::in <Se aas erulmas l ~asas (o DNA lig.a.sas). dando una molcda .:mica de doble he:tlra. Como M visto (l)llg 156), 1M ~as catallzan la lormacl6n en ceda hebra del erce fo&b&tef que tallaba. oon consumo de energja, Pueden, Incluso. unir o '1ig.ar" do& fragmontos 00 ONA<:on ex~s tOn'IOS. aunque oon nu::ha metlOf eficacia, pues no hay aparea~o entre elos. la acci6n de l<as ligt~W$ pues, contr3ria a la de las nocleasas (IOrmacln de enlace fosfostor fref'lte a su hidrOiisiS). pero et mecaniSmo de la reaccin no es exactamente opuesto. por ef
CLONACIN CELULAR DE MOL.fCULAS DE ONA
203
r~~ un grupo S'.P
requerirnien1o ei'M!'rgllcode la primera. Debe teSaltatse c;ve la liga$<' $iO:ml)tc propiedad que posee utilidad e)(pe(IIT'Iental (pg. 208).
para S.u ndui)Qf\,
ACCTC-G -A-~T
1),, ,
-~~AG-TAG-C~
U\\!
1111 1 111 111 111 11111 1 TCOAG < -'11-A-A- CC'fCA'fCG-C
TT A CACC'fACCCCG AAT-T-C-GC'f 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 AATGTCCATCGCCwC t ~ A A G~C CA
ACCTC 1 1 1 1 1 1 ' .- ' ' 'l'CCAG 'f-1'-A-A
CCACTACCG ' 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ~ -CCTCATCGC
r-<:-G-G-t 1 1 1 1
TTACACC1 A~~C~C.C~G
c -e-c-A
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 AATCTCCA TCC CG-c-T-tAA
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16.2 CLONACIN CELULAR DE MOLCULAS DE DNA

El objetivo cenlnll de etla ctonaon es la ptoeluocln de un gran n~mero de cop&as de una regln de ONA (fragmentos o genes) o de cONA (f()fm<'ldo e: P<Jrtir de \10 mRNA), $4) lr318, POI ~lo, de un l)tQ(eiiO 00 don<oci{)n de liPO cel u.lar {pues se consigue gracaa5 atmpleo ele ~ur~. ~g 188) QI.Mt. pOr <:ontr800$ici6r'l <'1 la clonacin .o~cetul;:r POI PCA:. m vkro. se puede conSiderar qve se realiza in vivo (e:stclamente I\OO&ilndo, en cultivo) Se Da.sa esla donacin. al ig~l qve ''-' PCR. et~ ra realizacin de ,_,pres rondas de replicacin, peto en este caso catanzadas pot ta ONA peolimerasa propia de 18 eerura en raque se lleva a cabo el proceso. clula <mtttrtona. Para eJIO. el 1ragmen10 de ONA o cONA a clona1 (llamitdo in serlo. POf razone$ mprenderan dCSf>JS) &t vno et otro ONA ( vector dt cloMcin). y la ITIOievla de ONA recombinante formada se incorpOra a la clula anfitriona donde tiene lugar la amplifiCacin por repllcaciOn. Una vez detea&da la presenoo del ONA de inters y &eletcioMcto& tos clones que lo han amplificado. se alsca el gen o fragmento de ONA o cONA. que se emplea oon disdntos fln&S , esencialmente el e$ludi0 de caraaerlstlcas
S'--eucndadn
. .. Amphh<:oc10n Obje-t i\ ,-s d~: la doni11n F.:audio de l:l CSLrucrura d::: cidos: nucle-ict-.;. _ . . EstudiO de homolog1a entre csp."eii!'S {
l delllili~'tldn d.c
multldoncs; (1M ejemplo, :lSoX:ia<bs :l enlt:tml."(bd
&.tudio del proc.::so de tmnS~:rix;in y tmduC4;ifl F ~11M.iio de ~u regulacin: $'--cucnci a.~ de conLml ((\(!( cjo:mpl(l, pt~)f'll(~O'tS) Prdoccin de la ptotcina o RNA (formas nom1alcs < :o ltcr.td~)
1ura su Kkntilicactn Para su estudio (pruptl'<ladcs. iUnctOn ... ) f,M uplicarn, (producdn <:om~naal); diagn-M1oo. tcrupu11ca. nu1r1<:1fl. mdustna ... lng<:nicria de pr01cinas coo altcl':)('i(J(l di." sus. J'lf'()pic~dc~o (par:l l."~ltdto o :lph'-O'Icin)
204
CLONACIN CELULAR: TE,CNOLOGiA DEL OHA RECOMBlNAHTE
fiSICo<t$, sec~~i<' . 0$11\ldurtt, prQS)iod.adO$ 1\!n~. tP(pre:sin gnica a proleinas. eK.. (muchos de 96106 objetiYOS
pueoen set apliCables tamtlit'l a la PCR o Clooac:i)tl
~!utar) .
Pot razones peclagoglcas. a la vez que de enfoq.se experimental. pveoe <le$Cribil'$e lll clonacin en siete etapas: do& de preparacin de muestras. cuatro sucesivas de Clonacin proplameo~e dicha y. segUn los casos, una de e11pre&i0n. En oca&tOfle&, &e aliada la amplificecin por PCR del ONA donado (en esle caso. et p100e90 oompre~a dos donaaon8$ sucesivas, oeUar la primera y acelular la seguncta). Hoy die, todas las etapas se realizan de forma rutinaria. a veces induso automatizada, al disponer&e de fama oomercial de las enzimas. suslta.tos, vectotes, etc., e instMneniOs adecuados para &u reaizadn.
Esquema ~tntra l del proc('().imienlu d(' clunnci n:
*<<r de ckl!l:.cll'trl:
phb~:~~iOO
('omo vce~or
.:k clonacio6n 9C' pu..odc utili.tier un p~iOO, un ~rt'lldl). "''
\'i ru& . ..
So propiedad
i.":$fr~r1d
es que
!IC'Jin au~
n."Piichlivos
lillbrcl'ldo.~ c~>nado el DNA y d V<lQior con un. rnl1>11 0 tnd\'Onuc:1~'3:!111 de ft'illncc!Cin, ~
~en unino: rncias !IDa bgasa, Al C01 1JiliKI. \ 't:CI(Ir t iSfnO, il' k
0000
l ~tnil D ...A
l"f'lnrbhra lt
( ~ )
F J ONA rcootnl!iflamc se intmducecn
boc:ri.s.
('ll'tpol'lll)d(l
rnlllcllllli\~
El ~'''or ~ rephora 111 doVlduu la bm:w:n a y tatnbM de ronna III.IIIIO:lln/1. C<tll tUI>,IIIllntnta d nmero de copill$. C.-da bllctcria. bryB i~o no UD \'t'ft(lr y un I>Ni\ reombomlltlt~ ,_. mull1phca ~ lbf lup a un ~f'lon". pOOI~~eirl de bacenas coo idmico
IIU:I\'tlll] ~'ilt"Lil.lO (ll'll:hudo el fC'(lOl'lll!iflll~l<.:)
~y 6 ta'l:lS (silnulr:\tlcas): p~1c:i6n etMar y t~tletc-in
No lodo~ lq. baclcrin& h311

int.t:t$ rCinn/ltiiJO ps~ del
\'lar 1'\'CUmb:matll.('. Se
UICOr110r*J0 d 0NA !k
(de las clulas que: han incorporado el ONA eJe in.:r!l)
&ciQI).fllln l t$ que a{ lo
han h\~bo,. nonnatmc:n~ot
cull\frndola~ 1:11 Ull nr,'\'1;(1
con antibi6tao. :r;:i \'JI d \' lor ~ indu}'C:I #Cn ck m!l.'ltCI'Ida a cst atlllbitir.
7'napa (opdooal): expresiOO del DNA clonado
CLONACtON CElULAR OE MOlCULAS DE ONA
205
16.2.1
Preparacin del ONA para su clonacin

pre~r<~~ein
Esu. prim~ el<'IP<l de lal cton<Jcin, &;1 esencial del proceso
inicral del iiCido nvcleico que $9 quere
ctonat, es una parte
16.2.1.1 Insertos de DNA

Se p3rle Ot olul:l$ nueleadas I'IOrma!I'IWI~ ~guir.eas, JiSadas pot SC)(Iicao:;in o f>Ot llu$0en&i6o en un medio nipotf*::o. una vez elln-.nadas las molculas ecompanantes, tanto RNA (con RNas,a$ o llidrOii$i$ <'IIC311i!'WII) oomo ptOteina$ (OOtl proteasas) y enzimas o fragmentos ptOteolili009 (en SiSieM3$ M.&tieos tenov~gu$), $e pretip.ta y ooncontrd el ONA {con etftOOI y sales). ~ste posteriormente se fragmen ltt <;on onzim<l$ ciG restnoc.:in, P<JI't Mlat$e, o sep$rat'$e Clel l't$1 0. mediMte <'llguno t~ntca aaecuaaa, por f!tertl)tO etectroloreSls en gel de SQ&rosa, ceniiWugaeton en grB!fiM!e <!e ae.nsidad, CJ'O(nalogralia 1~ de alta presin (HPlC), etc. Cuando$$ desee expresar el fragmento clonado (etapa 7). es neces:ano preparara adems un int;erto ao11liar que: oon40ilQ<l elementO$ ~guiadores de la epre&IOn gNca,
OC'talles del p rocedimiento de t lonllcin: prtpar acln d el O~A (erup a 1)

3 posibilidades de gcDtrac.n dd fragmC'nlo de ONA que se qui~-n: clonar
""'"'" Ls
lip.l.k
muesllll
dt; (roq:m~mudll, putitiuda..

~utofr~o;cll.lla.da. dt
f"''
---c.a.UOOCAAUCC--- U u u uA IJ"
1 ~intouddl).\.f~ ' tdJNAo ;,.,...,,_...~ ,;...-~;
pn:pnmcin de un inserto IIWtili.1r pn01 c:l caso de: donacin con c:tp~in: t
....c::JC'Iapa 3
16.2.1 .2 Insertos de DNA complementario procedente de un mRNA

En muChOS casos interesa ctoflar la
Secuet~Ci$ Codific.n'O dt un
gon ~cariola , para lo cual se parte de mues.tras
~ f'I'IANA que debe ser convertiOO en et cONA (:(ltrCSpotl(l~lct (pti9, 195) par.;t ~ M!f donado.
En es:te caso no es Indiferente la eteocin oe laa oell.fM de partida, pues c:o<!:. tipo cetulo C)(ptCSt1 tMt oon1unto de prOIGin<IS diferente y, por <;on&~guiente. no <;onbene los mismO& mRNAs. Una vez lsadas las oiul&$ del Otgano, lcji<:So.
206
CL.ONACtH CELULAR; TECNOL.OG(A DEL ONA RECOMBINANTE
tipo celular, estadio oe oesarrono. etc .. elegidos. se purifica ef mRNA, generalmente aptOYeehando te presenola en su mol&eula de la OOl8 <Je poM(A) (pg. 280). Se emplea para ello crornetografla de afinidad en eolumr.e o 11'kroe6feras magnlbs de afinidad (pg. 136); en ambos casos. la matriz cromatogrfica o microesfera magotlca llevan unido un olgo(dT), Cuando el mRNA ca donar no e5 ~te , se puede amplific:cM' mediante PCR. filCilitanOO a&l su clonado postenot en clulas. Pata ptepatat el cONA se em:Ma la transcrlpta&a inver&a. de forma anloQ& a lo estudiado en la PCR (pg. 196):
Oolil)('ldG): en (1~ uJOS. Wtapl'\)'l.\~ha una ((1'1,..'0C'UI nol>;u'allkl c~o )' n formar uN bbtqtuJI11 que hace el pt~pcl de eebeOOr sin M$i&d de inlrodtK"ir In c:oln .1' p)lj(d(),
El cONA w:lusii'Vo:" <k JOOI.:k JQI'I la slnle11S do: unn ~ullda hcbn. mcdianu- In ucc6n .k 111 ONAp:,ll !k E.. roiL El salict11.: poll(dC) sirve: de molde a un c:c:blldor
16.2.2
Preparacin del vector de clonacin
En general, un vector es un;a motecutt\ do ONA de tamaliO pequer.o, lc:t de aislar y C81'acterlzar, oon secuenca y mapa de restrlocln (pg. 226) conocidos. de fcil inlroducdn en la c$h,.1la anfitriona y un.- voz cali oon ~od dll Atp.licaocM autnoma. es decir, independiente de la replicacin del oenoma de la o6IIA;II arrlltriona. E$ QOI'I\OOnienlo que el vector po$68 el mayor n6mero posible de s!bOs de restriccon. P.,.llll"'<5$rtM el fragmcJn1o~ ONA q.,.e so q.iore clonar. y qutt incluy3 al monos un ge11 marc.&dol (pof eempb, un gen de reSIStencia a un antibitico) que permita identificar yfo seloocion<ar las~ que lle\1111'1 el DNA recombinante {pag. 213). Lo com6n es qoe 106 veetore& naturales no posean todas este~$ carac;teristic:a4, p0r 10 Que Mbitua!met~te se etl'lplean vectotes modltlcedos (a su vez. obtenidos pot tcnicas oe DNA recombinante. pero ya di~ oomorcialn-.n1 COfl todas an prestaeiol'les deseadas).
La rntsin del veelor es unirse con el fragmento de ONA Que se Quiere clonar (llamado entooces Inserto) para facilitar su entrada en la clula anfitriona y su replicacifl Par.t ~r unir con fa<:Jir;18(1 ambOS, se debe cortat el vector con 1<1$ mi$mas onzimas de restrlocln que se utJtzaron pata escindW ej DHA de la muestra o con enzirT~M que proporcionen xltefnOS CQmpatictes: de ese modo, sus secuencias complementarias pueden asociarse y ser unidO$ !Xlf la ligasa. dando tu9ar a una sola ~ul<' do ONAdebte hebra, llamada DNA ncomblnante (rClNA). En funcin de tos oo,etivos de la clonacifl (ampiflcacin y xposin). so suese Mbtar <te dos graneles grupos de Por un lado, los vectores de donacin, que &e emplet~n ~nicamtn1o P''" ;lml)lifiebt ef DNA de inters; lr.mbi6n ~ los llal'l\8 a veces vectOtes de Insercin o vectOte:& de pro~gacln Tericamente. $lo inooparsi&n el in~o do inc1S (p&g. 205). Por otto lado, lOs vectores de expresin. que poseen adem$ car~eri sliccas ~e f'o~cilit&n la e.prosiOn por lt'l eetuta anfitriona del ONA de lntefs. En este caso deber incorporarse. adems de 51e, et ya mencionado in&ef1o au~~;ili<t con una tegOA oe ootltrol de la exptesln {pg.. 205). En ia prctica, bs vectores de exp~esiOn comerCiales suelen lnck.w Yil un<a regin <:s. <:QntrQI, comUnmentc ~ promotot potente que se indulea fcllmente bajo condclone& experimentale& oontrolables. viiliclo PVt'l o~a' <:u~ inser10 <Se in.ter6s que se SitUe tras l en el rONA.
veciOte'S.
Aunque exi&ten dlvet$os IJil06 d molcula pequet\Cl de ONA c:wcutar
vec::tore:s
(~ .
208), pc)f
la descripcin
se
har con un plsmdo, una
CLONACIN CEl ULAR DE MOLECULAS DE DNA
207
Oetalle:; del procedimiento de clonacin: preparacin del \'tor (etapa 2)

(<.-ortc del vroor para ~oenmr <:xtrcmu5 compl~"ftldltlnos a 5os dd 0"11/\ l
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f"-Jfl!~llt(ldt; O"" A
-e::,...
CUlpG
16.2.3
Formacin de la molcula de ONA recombinante
Coosls.te et1 la unin eovatet'lte, kt vtto. del inSerto ~ DNA a1 vector fragmem~~M:So. mC(Ji3nlo "'"' lig;.a, La especificidad de la unin depende del tipo de e11trem0$ q11e hayan resultado al prepatat el nserto y el vector:- SI son cohesivo6. w ~uencii'l es 1& especlfiC8 de la enzima de rutriocln etnpleada y slo se asoCian los eJttret'riO$ compatibles (pg 202): una vez asociados POf ~areamrento de bases. la ltgasa estabJece la uniOn covalef\te s.euartOO las dos mellas. Si se ttata de e)(lte<IS romos, no pueden asoeiarse ~ ta lig;)UI lo$ pvccJo unir, illunQve con rnenot el'icaeia y ('M) suporte nmguna diferencia 18 6f'IJ:ima dt teStfie:ti(ln cn 1<'1 que te tlfCPtUC'ron (se ClOeda decir que todos bs c,xtromos romot $On QOtl'lpaijble$),
Detalles del prf)(. e <Hmi('nto de clonacin: pre-paracin del rONA (Na pa 3) {untn <kl Ol"oA que: so: quKTC c.:lonat al \'t."Ctor)
lhip:!'lC!flfO dt r.>NA ~lllt ~~ p (1 quc ~ 'lil lfl'C <:lllfl:)f fins.cnodt in1crb1
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208
Er~
CLONACIN CEL ULAR: TECNOLOGIA DEL OHA RECOMBINANTE
lt\ prtlcticao, pu&den OCUtrif dNersos t4)0S de asociacin et~Ue ftagmentos oe restriec:iOn eot1 exttemos
eo.,.,....iblos. IO<Ias etla4 ettt311ilodas IX>' la ligasa. En primer U)at. sien"())'e puede darse la asociacin i ntram olecular. es decir, enb'e los do& extremos de una misma molkula (vuctor o inMrlo); lli se trate~ de un vector c:Wcular, da lugou a &U reclrcu181tzacln. Esta Interaccin e!M favoreetda wando la ooncentr..cin de ONA es~ (pue$ la probal)iidad de que dos mOlcula& se enOJentren es menor). En segundo 1~. puec:M t9rter lugar una i1$0CSOCin ln termotecular . tanto la ~ oonduce al tONA (vector+inser1o) como otras q.ae oonc).Jcen a produaos no deseados \'9Qor+vectof, irtSeno+inumo. unin de ms de 009 mOlculas. etc.: !Odas eb9 pueden ser clrcdates o lineales. E!Uas Interacciones
son m#l5 probnblos p,ttrtt ooneenltaelones elevadas de DHA.
~~'C'IUU<llloC'~ Jtl Jll'li'f KI
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o- o o-en
o)U11S \' CCI Of'
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:J)IM.'1&i.'i( oll\ 'll' d.,~t \ffii)J'
ri)NA
b~cado
ll!~ICiOlOl'lnC's
Para evtear la formacin de e5to& prodl.~Cto$ $0CVndnrios. que disminuye el rendl~o de la elonadt'l. se acude a eostra!egias expennenlales. previ.,s n 13 mezCla oe veet!lf e inserto. taleS como la esdsiOrn oon dos enzimas de re:tttieeiOn Cllferen!es (pg. 207), que e~a ta recWcularizacin del ~tof o. oomo t;e di8$Cri00 ;) con~i6n , l;t oet!Qslol&cin del vedor oon fosfala&a alcalina.
~ ~ .l pum(K de !N.I'>blc ufUOn, ... ~ : p\ledcn unm e eon 1 lit:~.._
vcctOf al:licno
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La lilt& de grui)06
impode l.a rccucu1Util3Ct6n par 1~ ligua
( ' .f~fnto
16.2.4
Tipos de vectores
Los ~ores empleados para la donacin de inseftos de 0NA$0n mvy variado$, Pue<fien ClaSif~tatSe segUn varios cnterios. t&lt$ oomo
Su procedencia proc<~ritiett o e~~C&riOtiea . Ell4)0 de ITIOikula a partir de'- Qvt $0 preparan:

Plllsmldos: bacterianos. de Mdur<'l o
oe pcan1as..
Virus: que Infectan bacterias (bacunlfagO$ o $implementefegos). planl.as, ii'WerteC!tados o venebrados. Cromosomas artificiales: denvados de elemento$ eromosmiOO$ de lagos (PACs). de bacterias (8A.Cs) o de
ICYI!M).Was (YACs).
$$ deot, MOlculas fQtmadas combinando partes de otras cuyo origen es difofente Normalmente, Quimeras OC pi&SMI y lago: esmls. fagmiOos. fllsmld06, El pO de oUa anfitona en la que el DNA rec;omDinante resultante se puede luego lnoorpctar (etapa El gen de teslslencla (Jie conbene er1 V9Ctor para $U poslerior detee(j()f\o seleedn (e!apa 6). El tamano Ge' OHA que admiten como ln:sCf1o,
Quimeras.
>.
CLONACIN CELULAR DE MOL~CULAS DE DNA
209
MC1odo de prop3gaci0 n
Tipo d9 v9ctor Pfasmidos normales Bac:tenbfagor.. pot insercin (fagoi.)

~let'Wa!)Os.
Tamao del inserto u~ atdmitc 0-IO kb
Replicacin prora del fago 923 )(b 30-44 kb Replicacin ptopla det fago Replicacin a modo de plsmido
por sustl!ucl6n (fago A)
C6smidos
Bactenolago P1
PACs {cromosomas artifiCiales de P I )
70-100 kb
130150 kr> H.Mt8300kb
0,21 Mb
BACs {croi'I\OI$omas ertifieialesoe bacteria)

YACs (cromosomas artifiCiales ae levaoura)
Debe, adems. setlalarse que continuamente surgen f'K.Ie\'0& bpos de vectores oomo consecuencia el avance en las tctlCas de lngenlerla gentiCa y las necesadades 1~188 por el de68rrolo acelerado de bs Proyec:IOS Cenoma.
16.2.4.1 Plsmidos
Son molculas de ONA de doble hebra, de peQuefio lamao (25 t:b) y forma cvcular. presentes en terma libre en el eilo$(:11 de mucnas baeaerias (de 1 a 3.000 p&ttsmkiO&foellAB) y de algunos eucariotas UW\Ieelulares {1)01' ejemplo. el pljsmicto J de ~duta.s o ~eireuiO de 1Jtn1 son ladtes de puritlC81 a partir ae1 cultivo cacteriano Pen1'111en ~ incorpot;)C*)n clo inl;cr\0$ ~ ONA do un tamt'o m~ imo de un~s 10 t~b. Los f)ltlsmidos nnturtlle$ conl~et'l 1)0(:104 genes propios, ninguno esencial para la viabilidad de la olula. po1 10 que pueden ser modificados sin afectarla Para su repllcaciOn autnoma (inOependlen!e de la Clel cromosoma bectenano. aunque UllliZanclo las mismas enzimas), se requiere una s.ecuencia origen de replicacin. En cada divisin tlular. el cromosoma ong.'\<1 una sola oopa por otuta hija. n.e:nlras que el jll!I'I'IICfO (en su caso. el tONA IOf'mado a partir de l, etapa 3) sufre replieaoooes mUitiples y origina varias oopias por <:elula {oe 20 a 50). Los plasmldos son asJ tepliCOnes (unidades de repliCaeiOn, p&g. 150) que se trnnsmi!en y ma.n.lienen de l'l\8f"oee'8 e,stallle cornoeiteulos e.~ttt&erom0&6mioos El empleo d9 un pt$mido oomo -..ector de cton.ocin se favoreoe cuanOo ncluye genes marcadotecs. euya presencia pueda ser delectada o OJya expresin confiera a la olula anfitriona portadora del rONA una sene oe propiedades especiales (pg. 21<1). Por ello, se U!lllzan eomntr~ente plsm.ld os artiflei ales o sint(ioos, obtenidos a $U voz por tcniCM do ONA re<:ombinante ydi$poniblos comerei;'t!mtniO. Saosle tomo ejemplo el ll&:smdo pUC19
1GAATI,GAGC TC!G_GT')CSCG5GATCTCTAG~GTCGA.9C TGCA.,GCATG ~ AAGC1

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<i<n de (i.-gabc1~11i~ (g~n

tna::diK). l n!~"mltnptdo jX't
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que- Nn<W~ en un uru.. -o pune()
210
CLONACIN CELULAR; TECNOLOGIA DEL OHA RECOMBlNANTE
16.2.4.2 Bacterifagos
{ll'llecc:i6n). E~a propiedad re&UIIa til pera
Los virus en general se replican modiante l<a QrOOJ<:cln de su genoma en clulas procarlotas o eucariotas oon&egl!M una alta efiCiencia de clonacin, empleendo como vectores virus modificado&. Cada tipo de virus infecta a oUas espeeffica.s y, dependiendo del tamal\o del genorna vfrico, dnlle ll"lserto6 m9 o meno& grandes. pero en general mayores que 106 que se pueden in&er\ar en plsmldos. Asl, para clonar en baoctenas w vson b3(;.t ctri f;tg0$, baculovirus Pf!r<'l ~ltts de inseclO. y vY\.1$ SV40 o retroviru& para oUas de mamiforo L;a l)f"Oiif~ de lO$ virus recombir\hntes $e oonsigue en un cu!liYO do &M~ anr.rio~ AJ$pectiva5. en tas <ue el virus se reprOduce. El uso de virus es especialmente adecuado para la clon~ein en Q&lui<'IS do mttmiforo, I)Of su elevada elieacia de ntr~ oet rDNA. pero dada su compleleiad y pot razones de eldef\o!liOn no se tratar et1 este tema. Los vWs mas ~nte empleados oomo \'&ClOI'ee son lOs parslt06 bacterianos fagos M13 y A(l.ambda) . El tamai\o def vector recombinante se ve rmilado pot la necG$idad de su em~amiento dentro de la cpsida. El Wlserto M puede introducir do 1<'1 mi$111<1 form<t q~ por<'! lO$ v~or" ~mi<ioos, " dO<:ir. corWndo inJOrlo y ONA dol folgo con las !Mm.as enz-onas de r8$lriocln y ligando para ObWottr un rONA. ei!Ao M denomina lkni~ d4.t in$on;i6n, y estoo voc&oiO$ osPOcifloos p&ra eno. CUando et tamallo <tet DNA de interes que se ~iere donar es may, se puede II"IOOrporcw etlminMdo previameo1e la Nt'e del oenom3 viricO Que no se reQuiere l)at8 13 infeQCin y repUeci6n: se lltll)le entonce$ de tknic:l de JusfittJCIOn o '"m~ramienlo . V'-x tor<.'$ de donacin basados en
el fago lambda
ONA de intl'tS
(..o)Oo \ 'NU)(q d t
i-d.S. lOdltUicn
~~IIKM(IS
peq~. p.tc'~ i 110
.o se pu~-d('o
;jplid ~w ...
e.tl'!l\i( !UCIAf C.
1 \ l d iminarw 1, ~~i.)Q no
,.;o lll , l(l.
"''dtwilio ...Jroi~n Wl~.t'r\(ll de ma~Qr Ut!Nikl si -.Pt'r"~r d Um~e

JW'II que pu.:dM tmpauo:lllnt
,. K!..,.,., tk
Sl>lcnut do;
eltl~liuftitrnl) del \ 'U'IlJo.. ~pcn~<k
lnun:utnc:i-s ""'~
16.2.4.3 C6smldos
Son vec-tores s.lntllcot.. quirnerM que COI'I'IM earacwisaieas de plstnldo!l y legos para eomblnar las ventajas ele ambos dpos de V9Ciores El fragmo.nto plasmidic:o propOrciOna las caractetistlcas de tamallo pequei'IO (5-7 kb}. ~ oo origen de repticaCI6n. un nUmero oe siliOs de reslriOcin <lOMe se va a Insertar el DNA. uno o ms marcaOOfes &eleecienable$ y 13 prop~iOn en t:laC'erias oomo SI f\Jesen plsmldos. Del fago >. se toman las secuencias oos (del inglk IXlho~ Sres). que propordonan al COSmldo &a capacidad, propia del ONA del fa9o. de &er em~QuotlldO en dps!Oas vi ricas In VltfO. l.06 csmldos son ties para donar 11"1$01'10$ de gr311 tam~r'lo (!'lasta 45 kb), especialmente en &a preparacl6n de librarlas genrri:as de organi$11l0$ supori()res, ya Que dlsmlruyen en gran medda el nmero ele clones necesariO$ para que todo el genom<'l 0516 rcpro&ontlldo en la genoteca (p&g.. 216). Los ml!odo!l de k\troooecin del f{)NA C06mkico (e~ 4 ) dependen det tamallo del In~. SI sle es pequeflo. se puede introd\lcir por tran3bmacin (ltts dlul~ts se nnocn compotefl1tts p:wa inoorpotMO en forma de pl!lmdo rec:omtwlan~. pjg, 2 1 1) Si el tolmailo " r.WMmeote grande. la transfotmacln se complica y debe acudirs.e al ~quetamionto CJteviO en torma de tagos, Bprovechando las secuencias oos.
CLONACIN CELULAR DE MOLCUlAS DE ONA
211
16.2.4.4
Cromosomas artificiales
Este bpO 4e veelOte-s se h&l'l disellado f!f\ especial para adapt81'8e al gmn tamano de insertos requericJOs f!f\ el casooelgenoma humano y de otros mamfferos. y para la clonaan en <;lulas eucariotas.
a) Cromosomas artificiales bacteriatlOS

$1} lOS 11.3tn<'l oomUnmettte BACs ~ttwkW att.fiCiat cltromosomes). Se ttata de vectores Sil'lt&ti(X)S derh<aoos del ptsmldo F o o1 ftlgo Pl. Se c;.o.ra.cteri~3n, en primet lugar, por aoepl.at gtan<~es nsettos Cle DNA, er~tre 100 y 300 k:b. En comparacin con otros tipos de vectores. los BACs oontienen genes que reducen $U capac:dckJ de copia. es decir. de teQIC&Cl)n oo la clula anfitriona del rONA fonnado (elapa }. Como rewl\ado. se con&tgue mayor estatl6d.ad de lOs ii\SOrtos <)t ONA <fe origen eucariOtloo. qoo en cosmldos wfren con frecuencia reordenamlentos Internos. Gracias a estas dos c.aracteristica$. tos BAC$ $01'1 voctorO$ a4ecuados 03re~ '" elabor<tein do gonotecas ~.-,riOtie<'ts (p&g 215)
b) Cromosomas artmciafes de fevedora

Los YAC& (yeasr 6ftiftCJaJ Chromo.s~s) $0n vectores &intboos que oont!enon tas1ros regiones rolt'ClOfladas con
aa lunciOI\&IIdad de U1\ cromosoma (pg. 92): secuencras constituyentes de un oentrmero, de dor. telmeros y de un oQen de re(lf~taeiM. A<JemAs. inCorporan ef'l general genes rnatcadores sete<:Cion.ables (etapa 6) y un s.tlo oe ctooaoo mU!tlPIO (t(apa 2) en el q\Je admi!en ul'l inseoo de gt&n tamallo. que puede alcanzar t Mb, to que constitUye una ~~acristiCa fundan\IGI'It&l. En OC:biones. e-ste llpo < veoclOt~ se del'lomir\81\ A~SfCENfTEL. pot lOs 3 tipos oe
secuencias que conbooen. La &ec:UMCia oentromnca permite la $egregacin oorr.ct& de l<ts;;~ QOS:llit$ hij;;~:s del cromosoma durante la divlein de la oluta (pg. 92). rr.entras que los telrnetOO elitabililan. como ye~ se ha estlldiitdo. 1()$ (;r'()<0$018S a to tatgo de sucesivas dMsooos (p&g. t S7). Et origen de repiM:acln o secuencia de rel)tiC8CIOn autnoma (ARS, autonomo~~Sfy ropflc<.tbng ~e) permiW l<1 form~C*)n de oopiil$ del croll10$0mll Mifici311 dt form;~~ Jndependtente a la del genorn.a propo de la ci!Aa anfitrioM. los YAC$ se utilizan en part!Wit'r ~q p-ep,JtCJt genoteCM de genomas MIJY grande$. o para manterter un gen oompleto en un Unioo dOfl
16.2.5
lncorX>racln del ONA recomblnante a la clula anfitriona
La repllcaclon de las molculas de rONA (donacin) requiere que stas se r~uoctuzcan en una dlu la anfitriona (receptora u hospedadofa. inocwrectamente llamada CliMa husped). Para que esta noetp0r8c1n. que en general tiene IIJ08r por mecanismos POOO conOQC.IO$. setl ef~z: 95 preciso empl$lar telul;n espeetaiiZ<ldil& (oon un genoW seteoclonado} . adecuadas al vectol de donacin ubiiZado y con c::apaetdad de diVisin.
16.2.5.1
Tipos de clula anfitriona
COI'I ttecuenct8. laS clulas anfttrlonas son procarttlcas. pnnclpalmente cepas de E. ccN. O<l' w f&Cilt$ <fe obtener. maniP',IIar. JOOI!iplicar. ytonooerso M~ geo(ttic& Al proceso de .,troduoci6n del rONA plasmid1<:0 se mdenomna vansl ol'mselrl (pg. 212)-. L&(s) molaAao(s) de rONA plasmidlco lnOOfPOfadSs se replican luego V81'13$ veoes del'lltO oe la clula. de acue((lo COI'I las propedades de 10!1 ptasm!OOS. El inSerto de ONA p!JeOe per~t~ecer un.O<> t'll ~"*'<> (10 m$ frecven4e) o rec::ombi~rso con el ONA del c::rol1l(l$oma Si se integra en el vector ms de un 1Jp0 de ONA, pot eemplo, dos genes o un gen y un regulador de la transcnpcln, eJ proceso de lncorporacklon a la clula anfllf\ona <lel rONA se llamacormnsf0rml8ciotl. Las cl ulas a nfitrionas eucartUcas son ms dtllclle& 00 obtener y m&tltenet, pot roque Slo se utili%M oon rWteS especil'ieos, rur.oamen111ftnen!e pata el anill:iSis oe la regulaeifl gflle&, la ex!)(e$i0n de unt't prote-ina eucaonbtica. etc De enlre el&s, lt'IS m$ ~en c::ul!ivo $01\ 13S ievaduras quoe, a,mqve manbeOen .-nas caracterlsucas Similares a llf(lC;)riotas (~ indiY'Id\lales. c::recimien40 rpido y ec::on6mioo. manipulables, etc.). tienen una organizacin oetulat Plll"<t de eucanot&s y $0n de- intet's bio!oc::nolgico por su caopacidad de expre~ y madurilciOn de protelnas. Enlre la$ clula& animales que pueden eslablecerse en ct.mlvo, se puede>n cltat las c:lu&as Het..a oe careir-.oma Aumano. Jos fibroblastos N!H de ratn y BHK de rll'ln de hmstet. los OYOCitos de tatOI'I, ele. En~. pueden divdrse multrtud de veces conservando los mtSmos caracwes. pot lo que su r~iei'IIO de Clonacin elevado.
eo~tmioo
e.
16.2.5.2 Mtodos de introduccin del rDNA

Pt.le-sto que I'IOrrnalmenle la !1'4mbr;)n;) P'Mmtlllic:a moostre~ ~ pen'I'IOilbiliciad selectrva y no admite gcat~des rragmMtos ~ tONA, se act.H.St tt diV9rsos mtoOO$ para facilitar su captacl6n por alterac::lon uansllorla de ta per~ad celular (m!Odos paSNO&) o lnttO<Iuclr et rONA directamente (mtodOs activos). En muchos e-.tl$011. 10$ mecanismos son pcx:o oonocldos y bs mtodos resultan ms o menos eficaces del)el'l<liel'ldo del lipo do voaor y de cluta. EJ proceso suele denominatSe ti!Wt.sforl'n.9c.ln o tllh'ls/eocc.Qt, aunque es.trictnrnet~to ., prifTI8;r trmino OOtte-!pol'lde a 13 intrOOUCQt'l on btt~eric-s <mfitnonas y et segundo al empleo de Vlf'US como "eaores. tos trlbtodos utDiZados Pueden dividir11e lai'Yll:llln en fi>sioos y qulmiOO$,
Eltralamienlo m$ freo.Jente 9$ de tipo fi&~co-qulmico y se dtce que la clula se hace eompetMte. Se ~:.ca con una incubacin en presencia de CaCh a o seguida de un C'3mbl0 t)(u$CO a 37-43 que induce a las
c.
c.
212
ba<;ttri;~s 3
CLONACIN CELULAR: TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINAHTE
<'OOf)lar mol6culas do ONA.. Se dispone de eop3$ eoslnblocidns espqc:i81mctn1o $1.15C(1ptllle$
es-le
proceso
La lncorporadn pasws de OHA se favorece cuando sus rnolciAa9 se 1\811\ agregado o oopreelpitaCio por
lnteraoc:ln con cationes. tpicamente rosra~ clcioo o OEAE~no (dlelilamlnoecil~tteno . un pollmero poiicab:)nic:o) Otros agentes ouimoos. en O$P8Cilll41 porictileng!iCOI (PEG). avrnen~n 13 permeabilidad de ta membrana oolular. a.n 10 que se incorpora mM teoeirmente e1 rDNA, lamllitl de tona p$SiV8.
EJ ONA se OUOCIO i!'Corpor3r en liposomas, Que luego COf'l raciliciad se tuslonan oon la rnetnbrtt~~ celular y lii)Orttn su contenido al inttrior (inCluyendO 01ONA we. en rc~1~. ~ l~Si~f'$0 "'"superficie txtorior hitfrofilic<~ del
JipOsom:a).
Un tnt!Odo oon gran efiCaCia es el empleo de vectotes de tipo vi rko, ~ por su Vla natutal de lnfeocln ln(rodueen e.n &a o&ltAa anfJtrlona su ONA. en es\e caso reoombinanle. Para este tipo de ncorporacln se ha ecutlado el
1efl'l*to rtansleccin.
Oet alle~
del proct.d imienlu de clonado: intOrJU')racin del
rD~ A
(elapn 4)
e )\ +J!~~~~
~lilno,M;t ~~~,.
~'=I.ICOI6rl<lel rONA (l'l'le!OC* .,Y&ftOf)

''o:attwl!.'l((lml~..
eada t clllil.
......... jl},.
run~.-0
frn:ucnl<'mcnl<'l
~;orilU
'"'o:tl(
t: fl'l(llce..la4
cttWifl
o -.olk.,.
de ON!\
1\''ll!'-"k. '$Uab (1 d,.;,olltMI;
disllrnas de rDNA .,.tluJ)
,.,_
dcONA
t>r.ccria 1111ntf0ro11111Ja
o .:th..S. tr:ut,;(cclllda
Aplicando ~rgas etic.tric;il$ on Jon'ntt de pulsos breves ele atto vonaje se consp la apeftora de poro$ ttansiiOflos en la meombranca. POf IQ$ que puede pa~ el tONA. Este metodo de el~ N 00$\ante habirual para c;lulas eucari61i<:M, ttui'II)Je de resultados muy variables. Un mtodo wrio&O y de ;)pl~cin creciente. la -blollsrJca~. consiste en el bombardeo de lt's c6lulta5 ~nfitonas oon microeS'eras (Cie turgsteno u oro) recubiertas con el rONA. So omplec:~n Clisx>$1tivos &Ciecuados ("ppstolas de gel'le!l1 que impulsan NOS ml~ile$ meditmte un g3!1 a presin. pt.dieil<lo Bf*&rse sobre auspenslones
CLOHACIN CEL ULAR DE MOLCULAS DE ONA
213
celulares. clulas en cultl-.o o lnduso kl VIVO (sobre la piel, hOjas ...). A9lnos de 10$ ptoyt'es impa<:tat'l y l)efV!(ran f!n ras~. cuya mef1'1btl9n8 se re~la rlllliclamer\te, quedatldo et DNA illCOrporltdQ qn su mt9riot En casos doMe ta etlclenaa de Stlmlnlstro del rONA debe ser maxlma se acucie a ra i n yeccin <lirccu ~ ONA en la clula o en su nUcleo, empleando rrucrornanipuladotes y agujas de ondrlo (n-.:rojerl~ o micropipei3S. de ~a eKtnwnitalmenle fiAC~;}, bajo Ob&$rv..cin ill microtK:Opio. Obviamen~. el iloonvenlente es el escaso nUmeto dlt dlult\$ quo so pi.'Odon tr<tl3r I)Or C$tO mlO<Io m<~M.Ial., por lo QI.Mt 98f!er.tlmente se utiliza slo sobre oocltos y cigoros. Dado su car~lef directo, se p~ incluSO presei~ del YeCIOf y sumini$tr;;n el rragmemo de ONA deseado &11'1 modlbr. A gente promotor dec la inco r por :.c.io N ombre cspocffico dol mitodo
Caricter
Quim.eo
OEAE -de)(lrano
PEG (polielllengticol) lii)Osomas descargas elctricas inyecon dil"ecta c.on ITIICropipetas electropotacl6n ITIICro!nyeocl6n
qul"""'
Ql,lim(;O
leo
fi$iOO
...... ...... ......

P~~o
ns.oo
li$ioo ti.sioo
activo activo activo activo
16.2.6
Propagacin en cultivo
La divi.$io de 1M c61~ (Jnfitriol'l;ti$ en cultNo pnxluc:d. junto con la rel)kac:tn de su propiO genoma, la torm<lCIOn de COQi;;~s dol rONA ~e hay<~ podi(Jo inOOfP(l(ar y, po1 tanto. la clot'N'Win propiamente dic:na. En la ptctlca, se $Uel(l; h.t~<:er uf\3 primer<' $111mbr(J colultlr sobro una placa de agar para que c:tezcan la& colonias (cada cOlonia proviene de una clula, $01'1 crones) y una resie~ I)OSierior de t.s colonitt$ on medio liquido, que fotma poblaciOneS con mnlples c::op;as de cada oluta Originar (clone$ oelol:trcs) Dcpe;n(fiendo de &as propiedades del YeaOf'. ef rONA puede replicarse de forma rpkta e lndepetdetlte del genoma de la ce-rula anrttriOM
Detalles del proedimicnlo di.' clonado : pre~pagacic)n telular (et:tpa 5)
0
dct~"'-ion n i~ll-c.:o&n ICUJU bl
Slm.JII.neament.e con esta et~ <le M)f)09<'cin wele tener luJat eKpreSIn opcional del gen donado.
ta
selec:c:i6n ae CIOfles reeoml;llt!Mtos y l(l
16.2.7 Deteccin y seleccin da los clonas recombi nantes

Oado el gran nUI'I'Ief"o de 06Uo'ls eml)leMO\s en la donac:~n , y la dlversld9d de prOOUCIOS que pueden origii\(M'$e en
el proceso de eteacl6n del ONA reoombWiilfe, es csenc:~ POder diferenciar~ oetulas (o colonias a 1M que hM OOOQ '-'90r en w!trYo) 1\owl incx.wporado roo!men~ el ONA recoml:>inante dese~do Esttt do~in se POO<Ie oomblf\81 oon una
.setecc:u)n, es dec:lt, c:on&eQt* que $OJO las ~1t.11M lldCc:t.~ildil$ &ebrovtYan en el ooltNo. Esto laeilita muehO 11' Ulrt3 <10 ~gacln celular. reduciendo el nmero de done$ que $C deben $Q\1uir cu!6vando. Dependiendo del mel!l<lo utilitlldC, ..s posible distingWr clulas que 1\an hcorporaclo Cl vettOf {nxx>tnl)inttnto o no), que 1\an ncorporack> tONA o il'lCiuSO que han inCQtPOr-8do el rONA con el ftserto dispuesto OOt'l'ectamet~te.
Se pu&~Jen oonsicSerar 11ft tiPOS de mtodos de detec:cln.

Mtod os de hibfid ;u;JOn: deteccin de una sec:uenaa del ONA clonadO. o cre1 mRNA transcnro a partir de l. por nlbriC!aCit'l c.on ~ $Qn(l<\ mt~rcatS<t Mtodos inmunoquim.iCO$' <lete<:cin de la protelna c:o<ldicada pot el gen CIOn<\Cio, mediante un anticuerpo especilloo.
214
CLONACIt4 CELULAR: l'ECNOLOGlA DEL OHA RECOMBINANTE
Mi todos genticos o de sel~dn fenotlplea: en cienos casos. la expresiOon del ptopilo Inserto ptOduoe CIWI'Iblos
apreciables en 1& 04!1ula ar'!fitr'iOt'la. que tif\oen pata rellejat su c:tonacin con xito. Sin embargO. la eslltltegla ms conUl es la detein y s.ti&CeiOn baS&d.s en~ presencia oe genes mareadores en el Yee~or: Gens qu codi~n una protoint~ dotoct<lblo, cornnmonlc uM enz:i!TOOI po~ 1(1 quo so dispono diJ un ensayo. Por ejempJo, laP-ialacto&Qasa (gen lacZ de E. coll) transfoonil el 54Jstr.lto sinttioo X-gal {5-tlfomo.
4cl0ro-3-lnd0111-J\-O-gatactopiran6sido) en un producto de color azul. GoOC!'.s de resi stencia a un anti.bl.lleo, que codifican una protelna que permite el crecimiento de &e clula anfllrione en pr0$0nCi' de un <tetermn&cb atltibiOtloo. Por ejelfiC)IO. el gen amp' COdifiCa una 1}-lactamasa capaz de degradar la ampiCI T111oa. una peniQlil $0misint.,i~. El gen do rosistencia a tolrot;il;iil\3 fotA) ooalrtea una protelna de membfana que act6a como una bomba. Glltrayendoeste antibitico de la \lula. GeM.s que compt~mentan defectos nutrlelonales. En e-ste caso. se emplean cepas mutantes de la clula anfilriooa. QUt nc> ~t<lon crecer en aus.et~cla 6e un nutriente. Por ejemplo, clonandO en ~&duras con un de~ metaCOtico en la ruta de bbsfnteStS de ~fano. se emplea un ~ que oontiene el gen TRPt oorree1o. con lo que slo las clulas trensforrn.ada& crecen M Trp en et medio Los planleamientos e.xperlmenlale& son ITK.IY diversos y gener<*nerrte combinan varios de; o$10$ mare<~don:l$, Por razones <Ji::l.kticO$. $C ~en ui'IO$ ejemplOs que ilustran &1 uso de varios genes mareadores. aunque no se ajusten a la prilebca del llbor.ltorio. Un oo~epto il'f'IC)(M1ante a este respectO es el de lnecti'llseln lnurclonaJ. la lnetu&ln de un polloonector o &iOO de clont~do ~Pke {p41g$ 207, 209} fft et interiOr de un gen nwcador hace que la accin de ste se ejerza slo en las clula& que han incorporado ~tOf sin W1$9rtO
Octallts del procedimiento de clonacin: deteccin y selecc:1n de clonei recombinantes (etap 6)

EJemplo de un $('l()r JX.\I'll dO'I:cin: oontenc; d insc:no de I)NA (gen de: inters). uoo n-gin de conlrol )' un ~~ nu ~ ili31 ' (tJtn m3rc3dor o gen de
rt-sis1e.~ia 3 31 \libilioos)
)'
\f(lpf~....... ~llfli~Wl~n
Jo~oliM(A.
Dctt'l:d<in de- d''"Cl: el gen A seria un &ocn narcador. codifica una pt(l(C'Ina que se pu~-dc d~1octar
Seleccin de dones:
(t~mt..!lt ~~~
romu okt~'iiO)
4:lgcn A scris un gen de

1\.'Si'\l.Ct"'ia a antibitico
lktoccin de cloocs oor in.'lcti\acin insert'iooal: el &~n A scrfs un gen JMn:ador, coditia. tma
1)1$Cdtla qul.' se puede detectar.
t..(L m(mlmrock>.
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4c ll/Ut dCIIIW 1110.'
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- ---- -(in.:...."-"" 1,'011 ti
.,,.,,_ X .pl l
"- ""'"P'........ ~
w-
GENOTECAS
215
16.2.8
Expresin gnica
Eh a~ casoe se :we-tende no 60io 1& aml)l.tlcaclon del ONA clOnado. sino &u e:.pre&iOn. l:llef'l para esl\l<lf.CII este
ptoceso o para investigar el produC10 (RNA o ptOielna).lg!camente. el ONA clonado ser en eMos casos un gen. y pot etto COfl r,.cveneia $C trtttara de un cONA. Para con~uif esta elq)fe-sl61'1 se e~n \lfetores dtJ ex~sln
especializado$. dislirrlO$ de tos vocaoros de cl011aci6n por present;u Wr.'lciOri$tic&$ ~ fn vorecen la trM&eripeir'l del gen una vez inoetpOtado ala olula anfitriona. n picamente, un veclOf de expresin incluye (o se debe nsertar en l a la ve:t que e1 get'l, pa,g. 205) ul'l promotor. l'egiOI'I reguladora de la ttansa'()eln (pag. 264). Es lfeeuente emplear promotores induciblos. ajenos ~~ organi$mo dt' que ~ et gel'l CiOf\800 wo que ~ &el:tvan DajO COI'ICii~XltteS e,.;penment;(lles control;sblcs, como la lldicin de ~ nuti'R!flte u otro tipo de compuellto, disparan etllOneell la transcripcin d9.l gen clonado.
16.3 GENOTECAS
Se llttma genric:ornente gcnote.e.a o &it>!ioteea de Ot.IA a ooa OOie<:OIOn de Clones IOrmados a pal'tM" de todos tos fr,.gmomos <.le ONA obtenidOS previarnet~.te por esCiSIOn del genoma de una espece o de un tejido. En el caso de ta CIOMcifl celula1, cada uno ce e$tos l ragtnentos se presenta integra<fo. bajo la forma de rONA. en un vecaor lncorporaCio en uno de bs dones oelutares que componen la genoteca. En la clont~CJn i:teeh,lln se Pt9Sentan oomo fr(9'"entos Individuales independientes.
Dependiendo de si tas muestras de parbda para la donacin son fragmentos d9.l ONA gef'lmlco o molculas de mRKA (~ 205), se destingve el'llle gMOt~s genmleas y genotecas de eDNA. Es imoottame indicar que 18 lnklrmaci6n proporc::eonac:ta por ambas genotecas no $$ idntica. pues slo las primeras incluyen tanto las teg!Oni&$ oodlflcantes oomo tas no oodificantes. ademM:. las genocecas de cONA son dferentes segOO el tejido pattlcular del que $0 han pteptlflldO, p.~ Slo contienen &as regiones. cdiroea.ntes que $0 e:~epresan en ese tepdo, tic celut;:.r. elbpa del de~r f(:A:) o ditefef'ICiaeiOO, ei'IIO\\ bioquimiCO... De aouetdO con tAo,~ utiliZan an.e~atM!U'I'I(!\te dis.tintas gei\Oiecas oomo pul'ltOde partida para la c tonaeion, seweneiaeiOn. ete. Clel ONA.
GE~OTECAS CE~.\11 CAS
ONA .:rom0o16mi.:o
C~t~a tompl<ru. un.o lln<ll> o.'ln~:ISI f;n h ~o~nuno~o l3 l O" pi)
mRNA Ull<~l d~ l11 c~:tul;,

1!i:ll\'fli;t.l> qu<', ~'fl ~'OflJIII'II(l. ll'ldU)t'll lod.v> loto fell\'S QIIC ~l.;in ~iCfl00 C\pt<'SIJ~J
trt.~&en p~.asa
------..:o.'Pkin de fl~m\'tiiOS
(Un~)$
1(,5,()0( tll I(IIJol ,
----.:uk.:dn dt tnutoknlll)' de ONA o.'Onpki'IICIIIiil'lo> !CONA)
8 !<ib>
20 tpb elld~ u ll(l pot trmioo m<.Pt
o
senltc.:a de doncll gc'llmi('(JS ( unos 76(1,000 dones e" tOllll)
Una Yltl plep.-rada una genoM<:a. sta se convierte en el punto de partida para 18 f)Usqueo;a de Cu<t!QuWll regi6n de.l ONA o de genes y so estudio mediante clOnacin adlc:IOI'Iat (que recibe et t'!Ombf de wbcron;~c.'n). secuencaadn.
10$ e$1udiO$, el poblema genrico que se expreStbn, etc. Con respecto atuso de las Qei\Oteeas oomo luen~ pa.ra 01 ~tea es ta tocaiiZaCIOn en la genoteoca del don quo <:Ontiett~c ot ONA b\.1$~. Para ello se acude a lo& dlsl!ntos mtodos de detecciOn yseteoclOn. pteviamente OQmentados ''describir la <:lonaetn de un solo fragmento (p&g. 213).
216
CLONACIN CELULAR: TECNOLOGlA DEL ONA RECOMBINANTE
16.3.1
Gonotecas gonmicas
El conoeplo Cf.slco de genoteca oorresponde en realdad estrlaamente al de genoteca genmca, representativa oel genoma oompleto. El nmero de Clones componentes debe !lef, en la prActica, suficiente para abareat .000 el 9tnoma. inch.lyen<IO tat~o el ONA CO<Iifieante tomo el no todil'ie<\ntt. U. prcf)MI(;i(>n del ONA de pt\1 se~~ pOr 9Kisi n del geooma oon ef'IZimil<$ de re$1riocin bajo colldiciones de rotura pan;:ial. es d~ir. que no permilan la actuacin exhaustiva de la en.nma &Otn \odos 106 sitios de restriccin presentes en el ONA. la rotura se produce en cada molcula alealOrlamente sobre el conjunto de &Jtloe <le reS1J'lccin, de fonna que aparecen un nCimero menor de fr.<~gmentos, y ttos soo de mayot tamet.o. teSP&ctO a lo t&ricamente posible, y diSerentes de una a otra mOlCula.
Gcnmn: oompk1o
mu.:h <J- <,lt t"lfono~f1
Mot.:c11bos d.:
D~A ill.,nlic-. io;Qn~t>(l""''l!"
X X
X X
A]UJtMKIO \.1$ wndoc-i'*" 1C o:un""'f:"'IJU!I. d11 111!> ~ili,.do 'suicci dosp.niNt:s en d Dt-A.
MilO~ tll(ipda IIUll 1111111~
.,nriJfv;...Jo.
~~~~~,..
.,_.,d......,
~
unA enli~t~.t. de n:uricriOO

l e(f11d(>nl lnl)ta~CMr)
4lci!c<!lol" lliUialtM
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cloooi. <k r.odll frapnt:niO P<'f

~uudo <n C<'l~ nr.ln(oau
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q.,c, "" tWf~Julllo.l. cubt~:n 11.l0Jb la; rtsiillws del

tcn(lfnll
D"" m.:I.IO'Ibo.,...,;
A partir d$1 tamalio delg4tnom<!l completo y e11amai'IO Medio de los Insertos &e puede calCular el mlnimo nmero de Clones necesano para que la genoteca ~nto al genoma tomP'eto. Sin embargo. el carcter aleatorio de la pteparacl6n de fragmentos y del prooeso de donaCIn ~n QI.IO , l)&ra l.etler certeza de que ooa genoteca cootlene cualquier regln del genoma. se requiera en la prctica un nUmctro <le <:lonM muy superiOr al terico. Este nUMero de clones nea1es dividido por el nunero de Clones lerioos define el parmetro conocido como cq uivalcmte gcn6 mieo ~GE) , Qut C$ de 3 a 1O ()3r;t COnSeguir un 99% de probabilidad de clonacin.
Retacln entre tamaos de genom~ e i ns.crto y n .tm-HO de d ones ter icos y prcticos Organcsmo eeccenar.
Le'VBOOOIS
Tamano del
genoma (Mb)
-4 -1 4
~3.300
T;~""'I\Q de in$CrtO (kb)
N" de Clone!!. independlertl&S (lel!lrlcos)

4 .000/20 210 14000120=700 3.300.000120
W de Clotles
en la prcdca
-900 - 3.500 ...7<1Q,OOO
Equhtalente genmtCO (EG) 900/210 4 3.5001700 5 760.000 1 165.000 4.6
20 20 20
tl.m311'10!1
= 165.000
16.3.2
Genotecas de DNA complementario
A di'lerenc:ia del caso anterior. las geooteus de (:()NA representan elCCiusivamente a la parte oocliflcante del genoma. Son e$peocitllmen1e Uliles en eucarlotas. donde una celula &Ok> expreu un;~~ pequefl fr.Cci6n de su genoma (menos del3% en humanos), lo que reduCe el t:amar.o del material gentioo disponille para oonstruir la genoto<:3 y. pOr n~nto. e1 nmero de dones. El m~JtElrl81 de paftda. el mRNA de la olula, contiene mencxs de 20.000 mol<:ulas diferente$.. con un tamano mediO de 2 a 3 k.b. Por oiJO lado. puesto que ti rU'Yiero de OO(lias de lOs dlsb\los tipo& de mRNA es rooy Vl'laf>le en eucarlotas. su representacin eo la gonotec<'l no $en'! unif()tme, PueSio que los eCHAs carecen de seAiiiG$ de cu:;presiOn. cuando se pretenda la expresi6n del gen ciol\ildo G$ imprcscilldiblt inctuW en el \'8Ct0r oe expresin un potente promotor ~uado parata oUa anfitriona. de modo que sta ex:prG$& kl Pf010IN OOOir-caCia por el cONA.
Tema 17
Genmica. Obtencin de los mapas gentico y fsico del genoma

t7.1 lntrod uccibn ...................- ..... -.................. -........,_......................................................................~.................. 217 17.2 Map.as genticos .................................................,_,,__,.,,,,,_,.,,.,_~, .................... ~ ...................................... 218 17.2.1 Fraccin de recombnaan romo medida de d1stancra en un mapa gencico 218 17.2.2 Obtenci6ndelrnapa98fltiCO... ...... ...... .... .. 220 17.3 M01pas; fis;kos .................. ~- -- -- -- - - - ..................................................... 221 17,3 1 Obl.eflciQn do~~$ tiSioos a baja reSOiudOr'l .......... ,.... _ ,_,_.,,, .....,_,_.,.,_.,,.,_,_ ,_,,,................................. 221 17 3 1 1 MC'IOdos b3SMOS ~empleo de line:tt ce1U1ates SOMticas ntbticlas ........... ............... 221 17 3.1.2 OOtet\CiOn de mapas tne<Ji8tlte ensayos de hbttlaciOn oon sondas fluorescentes ............ 224 a) Mapas por hibtidaeiI'I iln Situ (FISH) cromos<iCa ............................................ 224 Ol Mtlll)a$ oorcilometria oe nuo .... ............. , -----... ,_,_, --- 225 17.3 2 M.-PM fisiCOS dt <'llltl resQIUCiOn ........................................................................... 225 17 3 2 1 Mapa f!stoo por hibridacin in s-Jiu (FISH) de afta teSOJoCIOn .... ,_,_,_,_,.,._, _ ,_.,, .......,_ ,_,,_,_ ,_ ,., 225 226 173.2.2 Mapaf!&looconenzmasoerestncon ....................... , ,_ 17.3.2.3 Mapaos, fiSICO& de STS y EST,_,_,_,_,._,_,_.,,._,_,_, --- ,._,_,_,_ -- -----... 228 17 3.2.4 Mapasdeentigos ., .. . 229
17.1 INTRODUCCIN
Se conooe hoy dia como genmiC<J al oo~o de es:lrategaas y t.cnologias empleadas para la caraclerizacion mole<:ula 001 gonorna. en su mbs <tmplio sentido. pero con vn etlfttsis tspec.ial en el Q8f'IOffl<l humcano. Conceplut~!mente, 1:. gen6mica QOt'l"eSponocle a la Obtetleitl del mapa de un genom:a, que <t sv ~ puedt ser consideradO oomo la estNC:1unt fina del matenal. gentloo de cuakpet espeae. Pot !.afilO, constiruye: 1a O*Se ~ una Blotogla MOlecular e lngef'llerla GentiCa modernas aplicadas a la s..dad
De acuerdo con esl06 oo,etrvos. se pueden di&tif'9J.r d06 oireas dentto de la Genomica, oonsecuttvas, aparentemente independieole& pero totalmente relacionadas entre si:
En primer ._,g.,r 1~ genmica fltruclurlll, Qt~e corretpO~ al estudio de las tcnicas y estrategias necesanas para obtener aolo 1 os mapas lisieos. del ger'IIO<&. posibles a diSllr'llos ni~et <.loe teS<llt~on .-;omo lt~ secuencicllotal dol DNA gen6mieo. o mapa flsieo a la reSOiudt'l maxima. el l'luCietdO r.div~. Los m..'lo>a$ fi$1CO$ IMto d6&1Q05 oomo modem06, se descnben en el presente tema. mientras (J.le la secuenciaCOn prop~Stnen-te diCha. o Ot$<;ift300 e1e1 conunto de "1ecra!l que oonslltiJYen la informaciOn bblca ele OIJ8lquier orgat~isrno (3 300 Millones de pb en humMO$}. se descdlen E!f'l et rema 18. La mayoria de IO!l ptOyectos genoma ~ (;t~r$0 $0 cncuentr.ttn denlro de alguno de estos ot;t01dio11 de la gcn~ G:~~truclurt~l En el ~so del Proy~Peto Ot'nom1 Hmnano (PGH) , &e est llegando a lO largo del ttbn, De ahi la etl<)lm$ tra$CCndcnci~ de lodos lO$ proyeew& mpicados en este gran objetrvo. no 2000 ~ Ullin-:> e$1
En segundo IU98f. la genOmiea funcional, c:otl"espotlCiiel'lte a la caracteti!aei61'1 del prolcomOJ, C$ doeer. el conjunto de todas las proliltna& Ollglnadas pot el genoma, bajo los diversos petrooes poSibles de expresin gniQI 3 proteinas. modificacin y degradaon ptOielca y desarrollo de su 1\inc:IOn. IOdo euo dentro de cada tipo de oful3, momen1o oelul<lt, condiCI()l)l)$ partlc~Aares in VJVO. etc. C<ltresponde. en deflruuva, al estudio tt.w.c:lonaf del ONA toclir.eante. Por anaiOgia se l, 1 ma prol,pmic-<J conjunto de tcn1cas y e&trtttegias utilizadas para el estiJCIIo del proteoma. En COt'llraste con la genmi~ estructuf'i'!l, la protcl)mic:. so oncventr;:. en &1.1& ncios. y slo se tienen datos para alguf'i06 organismos mooelo Traosct~rfiriw\ ~!\OS ante$ de COI'Iooet' al COOl)fleto la t\lnci6n dG tod06 los genes humanos y sob'e todo para dar Vlllidad ClfflCiiC3. en sv caso, a 1M l)tl::)(eil't3$. IMto c:n ~ W.SiCOG como aplieados en fa'IOI' de ta rn.nanldaO (por eje~ a la tliome<f!Cil\8).
'*'
218
GENOMI CA. OBTENCION DE LOS MAPAS GENTICO Y F iSICO DEL GEHOMA
El PGH es un proyecto de tal ewwergdn que sus ~lvos oo se puedlet'l alcanzar con el Simll"t (ll&tltcamiento de buscar mlodor. para la etapa de secuendaci6n. a pesar de su creciente eficiencia. De hechO, el progteso logrado ha &Ypue~o la lmpcacin de numerosas Hciatlvas y mecodOiogfas que superan con cteoe9 dicha etapa. Ante te lmpostlilldad material de recoger toda esta informacin (por otro lado. ya disponible de forma espec.allzada dra a dla en lntomet), M prO$Ctlt;tn en O$le tem<' y el sig~ tM lineM *i~s ~ra un enfoQue 'lgico" del oonocirn.ento del geooo>a. la elaboracin del mapa. o -mapeo". de un genoma, tanto el tunano como lOs de ottos organlstnOS, se ha abordado a lo largo del dempo en varia& e4apas consecutivas, a niveles credentes de resolucin. E'5109 se
corre&pOnden. a orandes rasgos. con tres grandes estrategias metodolgicas. oomplemenlaria& entre st mapeo goniltico, mapcro fis ico y sccuonciaci n Adcmlls M sidO neot'$t'rio el dc:st~ rrollo do l6<ric&ll informMi~$ para re190r. aimae4)nttr, distritluir y analiU~~r et cr&Ciente VOlumen de oa~os Oblenictos.
Fases del PGH Mapoo Caracterl&licas
Mapa gJentico Prol)(lrCion3 1;~ mellC' roSOiuc;iOn. Sit<'l ~ IQITI'III <'!proxi~a en k erom0$0mt'S o de ~l'~Wf!to dlvtrsos IOCi (de genes y de oi!O!l marcadOteS o secuenCias Identificables)- El cl~ de la <iStanCia y. por ~nto. la ubicacin relativa de genes o marcadote-s, se basa en la frecuencia oon la que los pares de loci se tr.lnsmiten oorlootamente a la
de&Oendenciil.
Mapa IISiCO ASigna IOcalizactones a loe marcadOtes, definidas por dlslandas en pares de bases. Oestacan entre sus variantes los mapas de reatrlccin (ordenaci6n en el cromosoma de las danas para enzimas de restnccin). Eql.livt'le a l;t obtencin del mapa genmico en su nivel mas delai;ldo. Su Ol)jecivo es estaOieoet la secul!tncia nuc:le<:ltldica c:otnple4a del getiO(N!I humano. e.xploraf'ICJO lO$ 3,300 ~.,de pb (te la Oklla 1'18pi01de {6.600 en la clula d!plolde). Se lleva a ~ en paraii!IIO y oon ef apoyo de 18 ln!Otn'\8CIM proporelonaca por los rnapeos gel'l1loo y trsloo. Hace u90 de planteanW!n~ y mtodos sumameole especlflcoe, ceda \'Bt mas automcnizados e informatizados. S. describe en o' toemtt 18
17.2 MAPAS GENTICOS

lnicialmome, los map{'$ ge'*!i(:(IS oonsistlan en una representacin grfica de la ordenacin y ubicacin de los genes en e&da cromosotY~a. Sin e~rgo . acbJalmeole se InCluyen en est06 mapas no &lo genes. sino otra.s regiones del ONA, de MOCIO que pata e"'JJIbar a arOOos se emplea el til"'*"o lt\lllrcador gen4tlw: est. papel p..ede desempenarto cualQUier caradertsdca flsice o molecular del ONA que dffiera eotre D:lividuos y sea OOtoctSible en el laDOtatotb. para poder seguir su patrn de herencia. Como marcadores gen&ticos, por laniO. " inc::lt)<cn tan10 rogiones que fOrmM parte de un gen (m&.rcador g'nko) oomo &egm$nl05 no coctilic:aneos (marcadcwoA no gO nicos). La gran mayora de man:aCiores ~iCOs en 1 0$ mapas actua'eS son marcadofes no gnloos.
de~.e~:.:.c'm de
la bm:od11:
rnarc1nlurb senCdi.l!l
se OOI\5IJ\I)'e0 irNI.irt;.Jrwmc,a pnrtir dt la

hercno.-.a do:: los maretKIOte& (enl.:vlnOOo fr"uccx:i~de ttCombiNICi6n)
Mapas C~ctld<"&..
.o
Mapu Hdeos
~.: Cl)lll>11VyCil rfin"('Uin'JT/t',
loeahunOO b
poJ.ciCl dt
luo:
milll:lUklrn m ~i crilnl~
17.2.1 Fraccin de recombi nacin como medida de d istancia en un mapa gentico

0\w-ante la miJIQI5i$ tiene lugat el $0rbt'eC~l~Zsmie!'lto, o lntetcambio reciproco de fragmentos de ONA entre cromosomas homlogos (tOQOmO.ir)8CiOtl hOm.loga o meln'ca. pg. 106). Debe destacarse que la r~eiOn nunca tieno tugt~r enlre cromosomas diferentes, sino Unicamen1e entre los dos miembro$ de t.l"' l)t'r de Ct'OI"''W)SSmas hOmOIOQOS. Los mecanismos moleculares de ia rec:on'lbin.aci6n no se dtseribcn on q te libro, IXlt ootres:poMer a un tratado oe Gentlce. Aqui interos.,n esoncial~o. las eonseouet\Cias del pt'CICIMO. Por un lado, qJ$ toe crornoeomas ff#COmbimmtt~s Que t~!><'reeon en gameto ya no son ldntl009 a los originales (paterno y materno) y, IXlt olro, que la vatiBCion gentiCa te-sutt&nte depende. obviamente, de la po&~eln del &ebrecruzamiemo en cada par de aomQI$0m<ts.
e.cs.
MAPAS GEH~TI COS
219
Como 1;)$C ~3 a &a Obltl'lol'l de mapas getleleos, debel'l recoroarse algunos l&rmlnos btlsiOQS;
"~'Vl 1ti"'ci6on"
de \'t\)liiO.Xtll'llll.-.
ho,_nklll>~l)'i
(}' ffi>!l'l;ih..iM; 1
Wfl:.l r.cl6 n de lo)' .:1\'lH loOM'In\M<
h~tnl~ en 111 n-.ei~i~ l (jlliUI fnmm pal'le de I~U gal!-.-.cll:l11l!' ,...1'\lfld:tn~l do: be! ('1\111lllbdil;, (1l 1:. tll>. -,tl,.l~ 11 IX'll':'lu il p.lf:lt a g:Jl'lll'"lo.'S d i fl ~llfleS) , ('adll ~ $1' ~I'!PTIP de fnm l lk-IM"lldk-ntC' di' 1 \"'lS ;jen,'i,; ( ~Xi'- 105 ). L<tc rmce-~u e~ md.:prnlbc'nto: dr q~ r \l.ilil o no,) r'(mtu~.
>
"St-:reww-iOn" di' ald.;.'l!l "' ~;~....ci n lk o.kiJ 11!d<J!, ok kN:i dlf<"l\"tt!CS oJe un ffibii'IO cromOISOOlll du rante 1 11 m~:05S 18 ) l-- Skl pu~Jo: dlli'$C si ha t.~.ttillc> rn'llCllhi~tudoc'm entn- o o)!; b:i. y ~.. 1 1'1AnirteSfll <t'l el mo)men\1> de la ""gfl:lt:tcin de llH o:nm!OSOOI:tli y bl l'RIIl'liltdll.. ti tkrn'tu'l(l ..l'IW'I:rt'!:IICiUD" ok alfiOS (A } U) J'IW& p!J(I'Cff CMU'lldiclo.'rio. P'IC'S indi(ll o.]lll' Csi\'\S ~n1...,1'11 JUIIWS.. ("S ..1-ir, !K~~~ $1'JP'.-p6c}n l'llltl:' !d.
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(lllllll'\111-Hk 11 ~ 1-:.<~Mt~-k..; U y(
La c:arac:ISI"isuca que daMe el mapeo genooo es el anilli$1$ dtr le~ f~c;cin o fro<:u1tnci<~ d ntcombinaci n. deh !a oomo la probabildad de que los a!elos preMfl(os en dO$ 'oei direren!a (corre11ponclientes a la pc)Sicin de lOs mcweaOOre:s <:on$iderMO$) $C $eparet~ o segreg~ como OOI'ISeCueneia oe la tecomblnacin meiOilca. Olcno de otro modo. es la llocuenc:ia oon la qvt dO$ alelO$ deterrt*lados apatecen recomblnado9 en la descendencia. Como se diteute 3 oontinu&eiOn. e~a tracciOn depende de la distancia entre los dos lool en el cromosoma. iO que permite e~rta pata estableeer el mapa.
I:J~mplo. 11);;. 3 l"ci >On htti'I\'ICr!.-.'lt.Co.'l.s.. (Qb\ iamo:ntc. b rccombinxi'm rwltt!\r
llar.cclldn'l.:-ia en Joci 1'100\IX'i~Jii~~ ~
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A ) (.se h11n sc n. -gndo
220
GEHOMICA. OBTENCtON DE LOS MAPAS GEN ~TICO V FISICO DEL GENOMA
Conclusiones de mtcr-.s. r..:tocionndas con la construccin de m.npas gc:ntlcos:

a) S d<r..~ IQCI
~1lln
muy pr:um~ en d cromosoma (fKK ej .. A)' U:
E$ dilicil que: se prodUZ(11 r'-""Wmbinacin en una posicin intci'ITiCdla entre a.mbo.h: pt>r tanw, hay baja /frt,"'lJCmtiJ de rct'OI11binJ('iOO t2 de un total de- 12 game1os = 16. 74}~). Con a ha probab11id3d, IOO dos aldM quc:dtln en un rnu:m<1 ci'Of'l\05\)l'lla y l'(lfllilltda t>C roiN.-n.:vJ;nL L~ aldos q11e se t.obcrt:dllo con frcoucoa ntil;llima (es decir. que c~si nunca se SICgregall) se dice que
esuln ll~ados. L!,ic:amc:ntc:, kls )ocj de cromosomas difercmcs nui\IC"a estilo lig:ados. o tienen un
li$.1hl1t'111<' ;Cnk-., nulo A l C:OOJWliO de 11l<los klotnhM,)s en UN! rc:gJ6n ~-qu.::a dd cromosoma se l e denomina baploti>o Se
Cfll'aCI~ "f'iza pootquc sus aletos !lC ttan:.~nite11 eO!lJUI,amcnle {S<"' :ddos lig.ados). b) A mll) or ..CJ""na.:l(>n O:nln! lot~I!Xt ~n d trortl<I'Mm'~ ( pqr ~j ., 0 y C o, ~~~aUn. A )' C); EMstc mayor probabilidad de rccombinacin en posiciones intem,cdlos: por Lanto. hay mi}'Or ftiXucrt.,;il d.: recontbiuein (para 8 )' C: 4 <k 12 .-. 33.4'-. paro A y C: 6 de 12 - 50%,. J\l sufrir la rttOtbina.::iI'. l<l d<Jo$ ale los queotbm en distmto eromo~m~, por lo qul! h11y m('nor problbllidiJd de q.x ~ hcrroen JIU11(K. Nta: la tennin<llogla es an m.ir ' 'atiadil de la QU: ~ha nnpkll.IOO ilquf: pt ejctn)IO. una illt.a frocuct~eia
de I'OCO!nbitlll.CJII ~ rjntUmO di.' htl't:IICtfl tl'lnjUtltll infn.><:u:l'ltl.', OOhCI\":!I<:i:l infrt~CII!C, SC$n.-saein de 11lc:l<n~ (roc:u..:nle y CQ$('JI:r\.-"l.IICIn infru~nt~ . ~10 puede dificultat, n vcc~ la cornpren. "jtn dd stgmiic:do de -rn:cu1!71cla do: ret(lfllbl1lxt6n".
17.2.2
Obtencin del mapa gentico
Una \'8Z oonocicias las po&iCIOfMI$ relativas de un n(lrnero elev<ldo do m~~ores gen61ico$, so I>UO(kt 0$1udit~r 13 frecuencia de reoom~acin oon respecto a ellos 00 c~ier IMtYO gen o $4.1(;Uoncia y asi sit...., su IOC:US en el ~mt'P3' definido por aqullO$ Do OSt'l fonn3. se c.1ico Qt.Je $e N mape&CSQ' su POSicin en el (n)c'n()$0ma. Ur'l8 vez localizadO, el nuevo 98'1 o secuenci~ ~w <' ..-.grQ$11' 01~ do mrc~dore:s que forman el map{t
l a escaltt en losma~s gentiCos $e rricle en uniclacles c:entimorgan (cM). 1 cM oortesponde. pot' defflcln, a la diMancla Que separa o:>s to<::i que e.xperimentan reoombii"'&Cibn en el 1% de las meloSis. Empineamente, en el genoma humano e$la distanCia corres~nde aproximadamente a 10' pb (1 Mb).. A parW de la frecuencia de reoomblnacin se d~ucen las <ftStaneias relativas entte varios k>CI y se puede estableoet su ordenacion en el Cf01UC)$0ma, comenzando asl un mapa gentiCo:
Como <:J<:rnpk> rn11y simpl<:. ul estl.idi.ar 1n:s,loci c:ualesquicra, X, Y)'
Fn....:u~rtdil de t<:tOOlbi nacin observada para cada pareJ3 de loei:
Z:
Distanci-a c:ntre los lod:

X
y
.....
~
y
201}.
z
10" ~
,,
JO%
'
">
~
X
y
,,
20cM
IOeM
30cM
"
10
z
inlcrprt'tlldn (mal)<l geo~1oo):
"
\11 ~\t
Se ooncluye que ellocus

X debe: c:stn.r entre ios
---l!I]i--
. -1[8]
~~ ----~ w ~--~~ ~1----
loci Y y Z. o lo < 1ue es lo

mi~mo. 'os
ltX:i ~n en
i.'lordenZ-XY (O YtC:I!"V<r.lll, y . X Z)
E:w.perirnentalmentG, 10s mapa& Qentico6 reQuiefen Nb.ldiO$ f.atniliares con tu'f)O ies geneaiOgioos. en kl>S que se examina. para alguno de los mt'lrc:ldoros, In combii"'&Cin de aleiOs que va siendo heredada. Estos se analizan en bs distirrto6 individuos <' lo &argo <Je v-arias, gerwaciones: en humanos nonnatrnente se pana de ~T~~JE~Gt:ras de clulas sanguineas nudeac!M. La p~esenela de una u otra fonnill altica M de1G.;I<' POt lo$ proooc;!i~to$ vt~riados, que permitan distinguirlas. bien a travs de su Influencia sotwe el fenotipo (~:artlcleros ob$eMII)IQ, acx"~ric:i6n de Mf~f:dOO, etc.) o bien mediante tcncas. moleculares de de4ecC:iOn Ot secuencias (hibricJ&CIOn In Situ por tiUOl'escencla, metodo Soulhem o amplifi<;<'QIn POt PCR). A partit' de la Normacln de ta herencia de alebs se caiQ.II'an las frecuencias de
MAPAS FiSICOS
221
reoomblnacin entre $10$, Con .stc pi(II'YIC<'mienl<> se !\al\ poclido detemw~ar. entre otros. los mapas genbCOs de lk'l'ltM, levadura, Dlo&ophiJ8 y ratn En humanos es dific:i <Sttermil'l3r mediante tsl\.ldlos farMiares las frecuencias de reoombinaan de kx:i gniCO$, Es10 se debe, por un lado. a &a e&e&&Ol: de C3$0$ MIOS qve se traMmlten s.nuttneaments dos aleiOs representa tiVO&, por ejemplo aquiiO& t;r~u$alltes de dM ertfetmeaaoes. Por otra parte. la bafi1 ~.a:&;:a de reprodvcc.On del &oOt hurn.t~no <lticult.3 el elllcviO fiatlle de <Jicha frecuencia. Para supwcw esta limitacin, 01'1 1(1 ~etica se ac~ 3 marcadortt$ polimrfir:os, es decir. aqullOs que presenan en la poblacin vn ele'vaOO ""mero de nteiOS (f<)tmtt$ t'!tetnativas), OOC'I 10 e~ son mw tteeoontes los lndlvtduos heteroc.g(iCOG y la reoombinacion se ~)()()'a Cletec:lar en ul'ltt!to poroerua;e de 1a de$CC~ia (recufdese que 13 recombinaan de loci homocigQ!icos no .se puede aprecia!'). Los marcadores poirnOrficos son en general no ~. no relacionados con enf~ o oon ge~ncs . sino Si!T'I{lletrlei'Yie see~ias dlt DNA deteetaeleS en una posidn fija del cromosoma. Entre e1os desu.ean 10$ oasaCIO$ e.n e1 ONA mini y miO'OSa!ellte que ptesenlan pohmorli&mO en el I'M.imc:> de re~icq~e$ (VNTR. pg. 383). EJ nUmetO de marcadorer. poJimOrfl009, especialmente lo$ microM~ti0to5. ho <:roc:ido do iorm:. e-xpor~eiaf a iO largo de 106 anos. de modo o..e ~nte se di$1l<l0t de un mapa pata cada cromosoma oon la ublc:acln de t.W~ eiev..OO nmero de rn(lreldOffl$ La utilidad del m;:apa gcnbeo se ilusata, por eje~o. oon la posibilidad de focaizar el gen rtt$lXlfl$&ble do Uf'\l enfermedad hef00it9fi;), <'Un $11'1 oonocer la kJentldad oe dlc:no gen nlla base mo6ecl/ar de la eniermedM Pttrn ellO, $t busca, enlrt todO$ 10$ que componen et mapa, un alelO de oo marcador que estO pr~ente en los ndiviOs atec;~aaos pero no en tos sanos. lo que lnlca que ef locus ele 1011 m<arc,dot e$1il lig01do al del gen t:>us.eadO. Por O()tl$iguiente. el get\ debe estar muy prximo a la posicin OOflOCid(l Otd rno'll'ea<IOt en el mapa. Esta posib6dad de ubicacin de genes se potsnoa s se elabort'., ~ oon mar<:adOt'e$ dispuestos a lo tatgo de todo el genoma: se ar.egura ttsi . por puro 3Uit qve siempre tue1$1t' a~go\~1'1 1'1\811'e8CJOr S:Ofieientetnente prOxlmo al gen oomo para qve ambo$ e$\n 1~ De esltt rorma ,.. ha POdido ti'I<Xlfltrar, ()01 eemi)IO. la loca!lz:acln CI'OI'no66mica de lo& genes rMpon~ ae 1~ filltos1s qt.ristiea 13 nnemi~ f;)ledorme, la enfmedad de TaySachs. el slndrome Xfr.igil y la d"~&trolill ~.
17.3 MAPAS FSICOS

Como $e M .ndiea<, estos mapas rr.den direccamente dlstanaas fisicas (es decir. en pares do bases) entre genes u otta.s re.g.ot~es del ONA en el genoma. Las estrategias me~1ca& son muy diver&as y ooncb:en tt dislintas variantes de ~ y l'livde$ (le resQllcln. Dependiendo de la escala o nivel de resolucin. oonocida oomo unidad e<~r1ogrfic;) o de mapa-. se distil'lguert tres estrategias. ~ resducln {varia& Mb). alla resoluQn (hasta 1ct bases) y m&~tima teSOIUCIOn (secuet~cla nucleocldlca). En este capitulO se de&crilen Unicamen48 lo& dos pnme105 niveles. dejando la secueoclacln del ONA para el tema 69Jente,
17.3.1
Se utilizan distintos plantoomlento& que ademils mpl~ n rnuostrtas dif8f91'ltes, $t9IVn se doKrib$ il oootinv~l'l. En general, el marcador se detecta empleando $0nd<l$ o ccb<'dores de PCR. ambos esPOc1fic.os ~f<'l sv secuencial; en el caso de vn marcador gnico. puede acudirse 1 9rntlli6tl &la detocx:ln de sv prodvciO l\ln(i(ln(ll ~ci nn o RNA)
Obtencin de mapas fislcos a baja resolucin Este l'livel de mapeo oomtsponde a la a&lgnaCIOn de caOO marcador a un cromosoma o regin cromosme<t
17.3.1.1 Mtodos basados en empleo de lineas celulares somticas hibridas ConSiSten en la bsqueda elel marcaoot (9nfoo o no) en lineas celUlares hlbfielas, preparactas ele tal forma que
oontlenen material gentloo de do& origenes diferentes: el genoma completo de 111 roedor (aunque oon vl'lil m,'acin Util. explicada ms adelante} y una parte del ~ humano. ~ POOde $01 v<~rios <:rorn0$0mas, vno solo o vn fragmento da aomosoma. Disponiendo de una OOieccin (o JWttJ{} de toles Clone$ cekllvres hfbri!Jos, cad3 uno <:0n partes distintas del g.enoma humano, se puede ensay.-r la pre$1(1:flcia on toc:lo5 ottos <lel marcadOf y asi W.ct~r en qu crom0$0tTitl o PCW'O del mi$11'10 w cncucntm Repitiet'ldo ef proceso para dlst1nl0$ ma~ se llegtl a con$truir vn mal><l fisioo
1
MAPAS FiSICOS
223
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224
GENMI CA. OBTENCtON DE LOS MAPAS GENTICO Y
FISICO D EL GENOMA
Conset'ur.ndas del (ultho de las cHulas f:n mtdio 11AT l"ar~ qt.: el moclu,) li1\1 :u::~ ctic~U tw: req11.im L1 fusK!n de clulas humanas se: rcolioc: ~"00 lii)CaS d~
~"!ilru:ial
roedor n)utantcs. ddl cltniH cD la a<thidad f'IUhnA tlt>a HCIR.1'.
xlnl l:a v.:.
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rocupcmcin,
Lasc cO.:Iub:- de n)C,Iqr '~pe:~ p.ct~. de la viu de /IOlO. que no es usado habitualmcmc por las clula<> nom'lllks. Oc <:a forma. C l) d bbrid(l se oomplcmeuala caracidad de prolifentdn propi:a d.: 1~ oCiulll de rUo..'dr c\ln la c:ap:cd:ld tSc crccmcnto en m1."CCt0 IIAT l.lp<ll111dll por la Pf('$('ACia ck material gcnCtko humaoo (que si posoc d gen de la cnrima HGPRT U(lfmill).
Utililt~K'ilicl de
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El n~dio rto~,mn;J no J'ICml ii C la 'iCo.'CCit)n
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La p-eparnOOl de hibl'iOO$ <t pertW de cttrur.-s somMic<~s h.l~ slo l)(tfmite iOOntib el crotn0$0IT'I<I en el que esr sittA<ldo ol ONA de inrcr6s Se p~ a!Q1n.QW mayor re$01ucin dO mbQeO omplcandQ hl~idO$ similares ~.,n"ldO$ OOt'l unO' por()iOn met~OI" del genoma humano: flibrldos mooocromosOmicos, oontenier\00 un tolo crom0$01'1'131. e hiM<k>$ WOC10m0$0mi00$, con ~o~n lragmento de (tQtr'IOSOma Con e~s t.ilbmO$ se consr.n.rye ro Qve .se denomina m;)pa dO asig!'\81CiOn re.giOr\at'. e.s decir, la loealizaclon oe cada mateedOI et1 Ul'la tegiOn aete"'*'ada de un
cromo$()fn;t
17.3.1.2 Obtencin de mapas mediante ensayos de hibridacin con sondas fl uorescentes

La ublcaclon de marcadores para formar un mapa flsloo de baja resducl6n puede taiOOin conseguin;.e realizando ensayos de hlbridacan con &Ondas que contengan la propio! secuencia del marcador. E&ta lcnica ha adquirido gran aplicabilidad en el mapeo grac~ a ltl$ $o(Jntlas fiVQrO:SQenCO$ {hi bridacin i n silu por fluorescencia o FISH, p(lg. 172), la SQnda so ~a con un lluotooromo, bien de totma directa o a travs de un grupo "lndleadot" (repot1V.f, por ejemplO, tliotir\a o digolllgenlna, pag. 185). Para ldenbllcar el cromoeoma o la regin del mismo donde hlbrlda la &Onda &e puede acudir a la observacin bajo el microscopio de Doorescenc:ia o a la citometria de flujo.
a) Mapas por hibn'docin in situ (FISH) cromosmica

La hibridacin se realiza sobre PfflP<Ir&QOfles pera el microscopio de cromosomas meflicos, previamente desnaturalizados. La identidad de los cromo&Omas se revela pollas * nie<is habi~ d e~imionto dol tttrioti"po (forma. tama"o y banc:las ba;o 6nci6n), El ONA dianlt (m~e<tdOr) so m<'nillt$10' bajO el mierQS(:(IpiO do fiUII)reSCencin
oomo ~~~ lumlnoSQS dobles. debido a la Plit>ridl'tdn oe la sorda oon las dOS ctol'l\il!idas. Se alcanza COI'I ests teenlea
un nivel de reseluon O'OI'l'IOS6mioo o si.CX:romosmlco,
y es posible IOeallz:ar o
~r
Sil'l'll.llneamente val'bs
marcadores empJeanclo varias sondas con tloorocromos distintos
MAPAS FIStCOS
225
Q(ltTIO:ICII)II..ntO:t:IJ~; Or~n .:rnpuqu~rtn!l) tPk1;111'1'1!tflli)J
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J-:1'11111'$ flu~Jn.~ '"n~ wmJU)

cl (lf&ft
la~
~ ~lfl;'nll)
b) Mapas por dtomettla de flujo

i(Jetltillcaci6n del c:tOt'l"'ISoma en el que se encuentra cada marc:OOor ove<lo wmben realiZarse si ta S()tt(la se hibrida 00t1 mue:stras que contienen cada ooa 1.1'1 solo 1.1p0 <le cromosoma. stas l)ueden consegutse aplicando la c~ifle3Citl de otulas activada pot tJUOtescencaa (FACS. 1>ft9 126), <'!dt'Pii~dt'l al mapeo oet mocJO SigUiente: Los cromo$()(1\3$ se tratan con fluOfOCiomoG Que &e intercalan entre ll'& bl'ses nitrogenadas apiadas del ONA; los de mayor longitud puedet'l Incorporar mayor cantidad de ese ~4e int8fC\IIaonte, PO lo q~ aoquwen ms ftuotescencla. E5to POnnilc diferei'ICiar los cromoeoma5 en la e4apa de anillisi& o caraeleriueii;ln, CH'(Ipotdonando lo que .se ha llamado un ca~a de IJup, a&l como MPC~rarlos en la el<'lp~ de dtt$1f!C3Wl y O()(ener mues118s, cada una con un solo bpo de cromoSOO"'a. Fii\CIImorrto, o&tos cromo$0tnM ~dos puedet'l emplearse, pot e,emplo, en t11bridt~on dol-btor <;on 1<'1 sonda esoecil'ic& para el mareac101 DLtScado.
u.
17.3.2
Mapas fisicos de alta resolucin
Estos ~. oomptemen\MIO$ a 10$ ..nteriOres, permiten atcaf\Zar una resolueiOn Wenor a l Mb. induso hasta legar a unos ~ nvclebdos, 10 <ue ya supone et nivel molecu lar de resoluCin; de ahi que $O<W'I &o$ de mapeo fi&ico m~s i~l'ltes. Sirven de e-'*loe entre lor. mapas fisioos arrteriores y tos de seQ.Ient:~ion o mapas de resoluCin tcl<'ll ~ O$Cala de ul'l nudetdo (tema 18). Se plantean pmcipalmente do$ tipos de ;)bc)r hitrid<lCO'\ y enzimas de reslriocin.
me.ooo.:
17.3.2.1 Mapa fsico por hibridacin in situ (FISH) de alta resolucin La baJa resoluCIn asoquible ~ Ct<)(nOSOmas metalilsiCos se puede aumentar medrante ta h1bnaOOn sOOfe
cromosomas menos C()f'n~tados.
~wniiJntcrl:IK'cr. 'l cnO.Wl'fflJlfl!l~
Ottoidl.' 111 l!k\!ll!ll!f;l\11) \11

lll'.lf dt III<Udclll ;k f)'I:A. cl
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226
GENMlCA. 08TENCI0N DE LOS MAPAS GEN~TICO Y FiSICO DEL GENOMA
17.3.2.2 Mapa fsico con enzimas de restriccin

Antes de que se descubrieran las endonucteasas de restr!ociOn y se eli$C~ su uso en el laboratorio de itwestigacin, se utiiuwon otras nucleasas para secuenciat RNAs, siguiendo et mismo ~ vtilizado l)t'CWiwnente PMa M<:vencittr I)Oii)pt:ido$. es decir. &a fragmentacin de la molOLfa por puntOs de caracteristie3s OCli\Of:id3!& y 1~
reconst~ del OOI'Ijuntc) mediM~ sol:.p:.mionto de los fmgmcntoo. E&&c me.odo no diO 108 re&l.llados esperados COt'l ONAs, debido a su mayot tong!tud y. SOOte IOCb, a la menot espe.eifi(i<UM:f ~ li!& ONasa;, PO' lo que &lo &e consigui secuenaar algLJ"'I!S Oligodesoribonudetldos. F'r~cnto de RNA
o DNA problema
l~ vent<'lj~ de cscos 1)1Mte811'1iet14os inic:i31o$ es que Sitvieron oe ~ para 1<1 confe<:dn de los acl\Jales mapas i'isioos oetgenoma a panir ere ttagmeMos de DNA otigi!\&dos por enzimas dct rostric.cin. Un map.- dCJ ' "triocin ~a
una regi(lr\ <le(erminMa <Sel genoma estA ~nstiluido I)Or ul'\3 ref3ei0n Ot'Oct'li8dt'l de silios ~ puedon w cortados PQf eN:Imas de resttiedOn conetew, COt'l II'ICJicaeiOt'l oe las diSIMCIBs enlte ellO$ (en PI>). A ~cceneia <Jo los maoos genlic:os, pata su elaboracin no afecta le funcionalidad de la regin de ONA (su car8C1er gnlco) ni ia pre-senCia en ella de m.~taciones (salvo Q~.MJ sw alteren precisamente el sitio de reostriocln). Pof el ~rao. si m ponan algunas t~lter.-c:iones que ()Vede svfrir el ONA, oomo lran;IOQ<!cionft. detecioncl$ o inserdone& La reSOiuciOr\ o escala de los mapas de restriccin depende de la separacin entte los snlos de oorte o, dichO de otro modo, de la lreOJeneia 0011 que le secuencia diana reconockia por la enzima aparece en el geootna (/tectJevlrda de f9COtlocJm.i&nlo del genoma pot ta en'na). Por ejemplo, asumiendo~ en un ONA de gran longltud las cuatro bases queden di5lribuidas aleatoriamente. cuanto m;is corta sea la &ecuencia del sitio de tM!riocln, ms probabilidad habt de enconttCMia. por PISO azar. e& decir, mayor ser la frecoonciil de reconocimiento; tamatlo de la Meuencitt ditln~ <Se reSteor'l
.st;J<Hs~mon~. ~~
.,.
.,.,
6pb
una diM~ ~da :
lamatlo terico medio de IQS
n9 terico de dianas
enttgenom.humano naptOide
'
2$pb
4 ,096 pb 65.536 pb
rragMel'ltos 256pb 4 096pb 66.535po
13 . 1ft 6 . lo'
5 . 1cf
La lrecuenei& suele ser Inferior a 10 tericamente cab..Udo. debido a vanas causas. Pot un lado, la distribucin de baSes en et genoma no es IOlalmente aleatoria, lo que conduce a fragmentos de longii!Jd muy variable (frente a las cifras promedio lndlcedas). Como ejemplo, bs fragmentos ele DNA humano generados por distnas enUnas de reostnocl6n varian entre lOs 300 pb en promedio obtenidos oon Alu 1 (diana de 4 pb) y las 9 ,7 Mb para Not 1 (diana de 8 pi)). Otra causa que re<llce e4 nUmero de slclos de corte en el genoma es la presencia de regiones ncas en secuencias CpG, que al eslar notmamente metlladas no son aensties a las enzimas de restnccin. la construccin de un mapa 00 rHiriocin se Mnplifica si el nOOloro dct $11io$ ~ r0=$lricci6n os te<J.,u::ido. E~ os .specia!mente neoost~o ~m "'-P'0' molbeui<1S gr~ndes <M DNA.. en lBS que las sec:uetlda'S espee!r.eas pata laS enzimos de reS1rhx:i6n hatliluales se hacen muy runerosas. Para e&tos fragmentos graneles el mapeo slo se puede abotdar e~ndo enzimas COI'\adoras ir'lfrewentes y electroforeSIS en c:empo pUiwnte, En c:::uilkluier.J de lO$ Cil$0$, et roYeltt<to <10 tc~S geles y te hrlridac:iOt\ SOUthen'l con diversas soncas permllen Of!<!Uclr 1a diSttiDuCiOn oe lOS SitiOs de rtstrioein, o car~ogrBfi~" del mt'll)a. Para tacllltar la comprensin del mlodo de obtencin de m.apes fl&icos de restriocln, se proponen a oontinuad6n unos ejemptos prclk:los. En el primer caso. &e emplean dos enzamet& {A y 8). ~ <tisletdamenle o ., forma conjunta (experimento de doble diges66n) En el segundo ejcml)lo, ltl$ dos ~ima$ ad(lttn de lorma suoesllia. En el tercero, &a digestin enz:imatie~ es iCSMiiea. at primero, pero se emptea la ~aciOn para enriquecer la W ormaaon O()(eniCa,
1
MAPAS FISICOS
227
J'(lt'ICKMl ck
l:Jcmplo de aphac100 dr las enzimas de resmcck\n J"''U'8 IR\C\tlp b dclmranada$ $CCUmt"lllS de DNA (nJ&pro fl~k'O), dentro de Ud ff"'pDee\10 ck ~ de in1erC:s (por ejemplo. por la J)Rj('ft(\6 ck un gen)
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MAPAS FIStCOS
229
17.3.2.4 Mapas do cnUgos

Se denQmin;. <tsl t~ 10$ ITiiiPi'$ q"" $C obtienen medil.'lnle el solspamiento de fragmet'l~S de DNA. Estos fragmen1os proooQon go~e <.le 13 dqeS:Iin parcial eon enzimas de restrkdn de otros fragmenos mayoreg, C3d<'l vno de 10$ evaleS se NI ooce.nido a su vez por fragme.ntadn de los 24 tlpo.s diferen1es de cromosomas (en hvManos) de 18 ~Y~JeSifa. El planteamiento del mapeo es Idntico en ambos nrYeles, y similar al desc:n"' para las nve~e~ SM. Para la deduccin del orden o solapamiento de los diferentes fragmentos se acude a la co~raci6n de los mare8d0tes preserues en cada W'IO. qve oonslihryen generalmente mapes de restriccin o mapas de STSs o ESTs.
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u d4' I:.S T Cll d ~~~)O ll" par1U ll" un~ 1)\,i,\
mnpnlkl fragmento 7:
ddx <:ompl~mcellaf'Sc con Jo.., mup:I.S

-~nCiicQ!o;
ubi(IICin de genes y eJe mnrc3dc>rcs de d1\crsos 11pos
Tema 18
Secuenciacin del genoma y Proyectos Genoma

18,1 Introduccin-- 231
18.2 Ml!todo quimieo de seeuenel acln del ONA ................................................................_............................... 231 18.2.1 Marcaje de~ hebta dGI ONA ................., .... _ ,_ ,_ ,.,,_ ,_,_,_,_,.,._,_,_,, _ , _,_,_,_,_ --- --- ,_,_,.,._ ,_ ,_,_, 232
18.2 2 Modificacin de las bases y fragmentacin del ONA 232 182 3 S4Jvaraon dl:t lo:s froyrneniQ$ y ;;tnai$i:s -- -- - - -.. , . - - , - - - - -- 234 18.3 Mtodo enz;imjtiw de $Ccuenciaei6n det DNA - 235 18 3 1 Sinte$l$ <.lt ~.~n DNA eofTC)Iert'lef\tatiO Cle tongill.Jd vatial)le ........ . .. . ............... -- 235
1 8.3 2 ~rOQn ~ lO$ frtlgmen!O$ y t'nttli$i$, ......,.,_,_,, .. ,_,_,_ .. ,._,_,_,_ , --- .....,_,_,, , ,_,_,_.,,_ ,_,_,_, --- 237 ,_ , -- ........... --- 237 18.3 3 A.u40mt'tiz.cin ......, ...., ........, ....... ,............................................... ---- ...,_ ,_ ,_,,_.,,_ ,_,, ..................................................... _,_,_,_ -----..-.................... ---- 238 18.3 4 Vtlri(lntt$ del tl'lf!'!odO ,_ SeeueneiaeiOn del RNA ................................................................................................................................... 238 Proyecto Genoma Humano (PGH): Caraeteri&tleas e&enc::i ale& .................................................................. 2U Otros p royGC::IO& dG $G'C.IJCnc::iOtc::in dol genoma humano ............................................................................ 2-1 GonOmie comparativa ................................................................................................................................... 241
18.4 18.5 18.6 18.7
18.1
INTRODUCCIN
Los esfuerzos inlelates pata secuendar cldos nudeloos dieron poCO$ rewltados. Hasta k)S anos 70 era di(teil y costoso secuenCial' induso fragmentos de s6b 5 a 10 nuctelldos. Fueron los m&loaos quimloo de Ma..am y Gitflert (1977) y enun-lioo de Sangm (1980) \os Que abrieron el camino a dicho gran objetivo. Se consiguieron molculas mayores de ONA y &e defu.eron algunas secoencias concretas como la& del fago ~174 (5,4 kb). mtocondria hl.mana (16,5 kb). ~ lttmbdo (48.5 kb) y virus ~t~l de EP$1cinBcm (170 kb) Estos dos M(OdO!I piotletOS ese ta seeueno.acion tiet'\oen en OOtnn atgu1"1011 aspe.ciQS, como lt\ vtilit<~on d4J fragmentos del DNA Orignal escindidos oon enzimas de res-ttlocln. el marcaje del DNA de lorm:'l rac:lioctiVil o ~im~ (oompuestos tluoteseentes). el empteO de mtodos etecvolortieos para sepatar lOS rregmeniOS genetac~os. ete.. La m!.$$tTtl de ONA de partida para lt~ &ec::uenciacin procede generalmente de clonacin oetular. de amprlflcaelon por PCR o de ll' digeSlin conlroladtt con unO' enZJm3 de nnlriocin de 1.1n genoma. un cromo&OIT1a u otro fragmento ele ONA. Con frocuoncia ~s muostriiiS $0 ampllfietn por P CR oora disponer <le $UiiQente cantidad Igualmente. es converuente la puri!'ieaci(l(l para eliminar ONA oonwnir.aMe en 1 a muestra (por ej ONA ~ctcrittno) y reactivos procedente5 de 1a purifieacion o ele ottos lf'()Cesos previOs (como ceb~t$ y nueleOlldos res.tnnles ele 1(11 PCR). Se !X*fe aoodir tambin 1'1 recuper&~ del gel et ONA oonUJniOO en una banda oe electroiOteSI&
18.2 MTODO QUMICO DE SECUENCIACIN DEL DNA

b te procedimiento. \lflO de lO$ m~$ u&ad06 pero acruatmente de&p6a.zado por et mtodo ef'\Zimtieo. se ba!Uio en la hidr61isis quimic& y en u!'l disel'lo ONJinal opli(;(lble $9CIJenQOI$ de ONA d4J menos de 250 nudebd06. Se conoce hablbJalmente oomo mtodo de Max.am y Gi l bert. Puede oeseritlirst en tros .,<'IP<I$' marca1e del ONA. hidr*si5 qulmlca selectiva del DNA y anMsls de tos ptOduetos.
234
SECUENCIACIH DEL GENOMA Y PROYECTOS GENOMA
18.2.3 Separacin de los fragmentos y anlisis

Para analizar la& 4 mezclas de fragmento& obtenidas, t;e separan lodos ellos de acuetdo oon t;u lamafto, emp6eando elec:l1oforesi&. El lamal'lo de cada fragmento marcado indica directamente &a posioin en la secuencia del nucMcldo oonespondente al oorte.
2
l.a -ldll ~llllntC' dt Coldll
un11 dt la~ Wl:IIIO ~' M'
Si la bnOO:illp.;lfCCc en 1~$alk~o O o C. b ~t~~~IICitl es obvia Si to Mc>t 1 l;.ls c111Jes ~A (l C 1'. hll~ {IIIC 11:1"-"t" a'l cuo.:nu ~~ tN'Il.bie.t
lllllli\:CC bonda en laG o C. f('$P':WV'.lm<:u.lc:
p:l ) '< dct.;>.'t.o pl - ..e..w :Wco:uar al riiRfl.'

1nrruoJ~ ll'l~l-mc
~ p.-w tln'lrt~lmc c.-
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T A
~ M~ ~~ T== OO= O~ E ~ N~Z~ IM ~T ~ IC =O ~ O~ E~S ~ E ~ C ~ U ~ E~ N~C~ IA ~C ~ ! ~ N~ O~ El ~ O ~ N = A ~---------------------------------"' 235
18.3 MTODO ENZIMTICO DE SECUENCIACIN DEL DNA

El mttO<Io et~timbeo o de SangtH es 13 base de 13$ VllriMl OS ms utiliZadas aetUllllmente l);')rt' I.D!iocoonci<tcin a gJ"iln O$C\!II3 del ONA en ., no so dmdtt ti ONA oomo en el m61odo QuimieO. $d:) auo so aci.Jd6 a lcl intetrupcin conlrOiada de ta sin(e!li$ de ur\8 hebra eomptementatfa durante ur\8 replicadn mVlfO. Esta SiMeSis, t<'IUIIi~ POr vM ONA I)Oiimer3!S<t <Jel\ne., c;~rlteter enzimt\lioo del ~odo .
Puesto que 18 acllvidOO s el(()(lucleasa oe las ONA po~merasas natuq:tes no es COt'l~te aq.ri, se ~ u$311' v\\risntes, tates como et ~in~ '"fragmento de IQetlow~ o tr&gmento granot de In ONAPQiimerM<l 1 do E. eoli
{pg 147), o
form&$ &!t~(I;')S orbficit~lmcn'le del& ONA PQ!irnoras& del
d4J $t!CuOMSOI. Soquenase~ Tamtli6n ~ emplean en ocaSiono$ trtan$criptaSall in~ o la ONA p0timcrt1;a TtJQ {X)Iime~asa termoestable de la arqueobacterla TbMnus &qu$l'leu$, conO<XIa pot' su aplicaCin e.n PCR, pag. 189). ES1tl$ atterl\8llvas ntootan, adems de evil.ar la acuvidad 5'-exonu~sa. oonsegt~r mayores procestvldad, actl'IIOa<l enzimtJCa y eficaoa sobre tegl008$ lw:lmopo(mricas y regiones oon lenctencia a ad~r estrucl\lra &eCundana. Todo
ello conduce ;) 1(1 CIO'Siti'dt~d df: $eC~iar eMtl vex fragmentO$ mlls l(lrgO$ y oon met~or m~r~ de error
fago T7 (tttgvn&li co~i.-!itadt~li con ot nombie
lguatME!t\te, nen kJO SI.W!}lletldo distintas var.ianles del mtoOO irlieial et'l 10 rel811vo al upo y &.~gar de marcaje ae lOS nucleOliCios. espedalmenle el aparecer 106 fluorocromoe como atternallva a tos ls04opos radiactivos. Para slmpljllcar. y puesto que eJ fund.amento no varia, se expone a contii'K.tacl6n una de ellas. que emplea cuatro fluorocromos distintos y odrece la posibilidad de automatizacin. El mtodo puede descnbirse en tres secciones: slnte:sis enzmtic:a, anlisis de lOS tragmeniOS y auomatlzaeiOn.. Al final se Indicaran tos matices que supone el empleo de varianles allernalivas del melodo.
18.3.1
Sintesis de un ONA complementario de longitud variable
Dado que se emplct' ~~~ ONA polimc:tf3~ P<'f<" $in:tiUN' lleOrn comptomontanas a aa que se qu,ere secuenciar. una prirnora <:t'lr(ll(;terisOea del melOdo es 1a tW~id&a df: ut'l <:eb&OOt, un oligOnueleQticto di$Cflt'I(SQ PlV3 que se hibtido con et e tremo 3' <le la regiOn que se quiere see~iar. La seogutlda. y pri~lpal, caracterlstica Ge este ~'~'~Modo Cle sewer~daci6n es el uso de dideso inuc;letidos , anlogos estrl.lcturales de 106 desox!nudeddos que provocan la Clelencl6n de la reacCiI"' de stMeSIS de DNA. Por ellO, se oonoce 1ambin oomo sotCUencICi n diMoxi o de terminacin de cadernt
lljcmpkJdc o;htl>4\ltTII>:Inu('l00lldo (ddN fl>);

.bii~'"SOxiiC',tidinln(lbfat<l.
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Ej~i>;Jdc:
(k$(1~11 11boo1JiCkIO\k!
Ejcmplodt
(dNTP,
nbomud.:lllko (~l'H I .;-ohdU\a ln(c)!<;(lll<o,
ddC r P
tl:S<tJUCIIMitnatn(<l~ltrto.
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1',]'.ddcscolliCihlbn;a..S '.fi(ll<'lflltco
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La razn para utiiiUit dldesoxlnuelelklos es q~ compiten c;on los desoxinucleOtidos en ~ reaoelon de sinles.:s. La DNA poli~$~ vtilit<l ct ddN TP oomo suMrato. pot su ana!ogla estructural con el dNTP. y queda iroeorporacto a lallet:lra en crecimiento oomo ddNMP, poro a partir de l la caclena no se pueoe etongar det:liCIO .,,. rt~lt;t de 9'\410 -OH en 3', que Impide que ronne IO$tJi6$l cr oon el siguienle nuclebdo. Los ddNTPs, pot tanto . de1fenen la slntesls.
.,._,ate
!2~3~6~----------------------------~ S~EC ~U ~E~ N ~C~ IA~C ~ ~ ~~O= EL ~G~E~ NOMA YPROVECTOSGENOMA
C.ondi~o~n~
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MTODO ENZIMA.neo DE SECUENClACION DEL DNA
237
18.3.2
Separacin de los fragmentos y anlisis
se slgtue un prooe<llmleiUO oom~amente i.lnlOifQ <tl<~ n<lliosi$ ol mtodo ql.limco
18.3.3 Automatizaci n
l a posibilidad de usar un fluorocromo distinto en cada una de las 4 reaocionos de siMesis 1*11'1ile automabzar et mKIOO. de torma que se ~ean" si!Tll!tneamente las nebras marcadas oomponenW$ de las 4 mezClas, Adems, esta lectura de la ftuorescencla se puede hacer en continuo. oon b que la elettrofore&is s.gue trCI05turriendo, las moloolas de Menor tarnai"'I, ya detectadas, se salen POI el extremo tnfentlf del gel. y se sigue COI"'S~ la separacin de mOictAas mayores en el gel. de modo que &e amplia el nUmero de nucleotidos que N ClCJeden SGoCuonci<'!r en un &OIO
experimMlO.
GnK'III) 1 crnp!cl) d
.:.:'>liminar "'"'""'dtnOO
d., ~~) .. n:(W(Io,:!ltt~ ) '
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Se gcncrn un ll'l!;i~ru infonn~uzado de loe. .t
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mttl'p~lln ~mo
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Fl roi<or !k c.lu band.-.
coor,:;pond.: ,.,
di~~'irwdendo ) ' -ttnrmllll d4: ~-se fr.liii'ICIII~'
' o '
e
!>l:par:k'!6u d('l('lfl.lll:lrt-110.. .~f'll>quc md11>11 :~tg.Un ''Z u-.,..;utricndl ~~a d

dciCCIOr ptll<diO'
Ullll
Mltdir ll.
oc V o A
e
f
V
~ud;a de la.~ bando!.~ qut \llll uunOO p<~r ti hllll ~u
)'""' c>ltlf.
G
G
238
SECUEHClACIN DEL GEHOMA Y PROYECTOS GENOMA
A lltuiO ~Sitatl\<0, Cle lOS f'kll'l'letOSO$ lltl()(()(t()f'l'IQ$ cftSponible$. se indican lo& 4 usado& ms oomnmente para Sf>CUCnciaci()n en 18 <act~ (tOOQs tomo N-hidroxisuocinimidil&teres, forma acttva que petrnl;e su unin a un grupo a~ del nueielicto). Nombre
comUn
(5 (5 JOE TAMRA (5 (5 ROX
FAM
nombre OOI'I'Ipleto 6)<arboxifiUClf8'SCtl'Jna 6)<arboxi-4',5 -di~2',7'~1metoxlftuoresoeln& 6)<arboxitetrametilrrodamlna 6katboxi-X-rodamina
prpoledade$ de nuornoencla A,. (nm) 11m (nm) color emi1idO

494 522 555
590
518
550 590
rojo anaranjaoo
t<*>-OUf'i)ura
prpura azul Y&f'd090
605
18.3.4 Variantes del mtodo

Adems da mediante el mtodo iluSirado, el marcaje de la hebra de nueva slntesls se puede conseguir de ottas maneras. iiQii~nOOH a ocro& compOf'lentes de lit reacc:iOn en la que M sin1ebl.an dictlas hebras:
u~ de ~<Se
le hebra nUIW$
tl~ do:
._..,.,, '""~
..............,
~cob;Kior
En el dicteS<dnuccelido
<-31
wn la iillsma .-cuencia en
10& 4 IL.Jbo&.
( ltaCCIOI'IOii4lfi(!IA M
'"""""""'
san man:ar
...,... .....
-~ ~
dliMnlo.
.,...,,
..... ""' """"' - ... ....... , _ """

--~
-~
En el ceclldOr texlremo ~)
p.,..,,
4<INTP$, 0en ceoa 11.100 tos 4
dl"''llil 1& '"'""
.sin m8!Cll!
4 GCINTP&,
et1 tada IUbO
.....,..__
4G:Iklil~n. .
-_,
~o&lo
-""""'~
diiWIIQt;
............ """""' ......

~'"
"""""""' .,
.
... .....
~'" ~
tin I'I\81C8r
.... ,
~~
En los de!IQJOI'ludoOclos (a lo 18r~ ele 18 hebra)
;an '~o 1 ..o1111114
3sn...-ear, t~n~~reado
,.._
., .,
.
,,_2'
,n......ow
., .,
. .
. . .
l(llhrwll'IC O:Qomllarflbok 1eJCII'I~ olu~ruOO,
1[
y IOCiur.llr WM'II>IIt
.,
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illeclroiOtiiM illl 1 tille )' ~ IHT'<JIIii!!O* (poill:lllldld ~ 1Uiotne$11CIOtl)

<~l(ln()c
.,
111
C"JI:'ITtpl<J IIUSlradV
en
._, r'S-ura~
sal\<l que la divi~ de lo mi)C..sm en 4 debe b.>er.IC U~t~:c de :i'unbr o:l b:.dctr
IJ\~w.,So
origiaal de
lii'CU.."'ll:i~
NOla 1: Emplllldo nu~'khokts II'IQ~OJ durntue .w sJMCt&s qulntien o bien POJ modi ~io)n <111i(ru\i;ll del ;,x tllu,f.. lr
.:Otupl('tl), ncl!lante IQJ ntbOO~ de n~rc..tje ~,tnnlnal ( vCMc el mure:.: de :IOt'll.baJ. Nl)lll 2: lb.~t:a <:cltlllDII de kt)C dNll'$ II'Uirt:adO Ca b!OpO rlldiiCtl\'( (J. P. ~P. <l)JSo C(m llUOfOCI'\)tllb, que le lnC"'l"!r.lri <'ti \"ari~ pui'IIO! S 111 hcbnl tri Cl'l:Ct1D.Itii.O /'<t>!'$e (lile. ti <hfCtc'JtCO l.ld m~t(M.\10 Quln:JI<Ie 9"11~'0Cil1Ctft. C ft ~ CIISO el i$t(IJXI debe c:ct;ven d fil'%fllt(l a (oo om ti y ). IJIII' 1'11 el itnicl) que ,.,e ~ttucn11. in:orporlldo l'll el I>NA.
~ Mf'l aesarrolle adems de estas modiflceclones, otras que aktctan al planteemien~ y alcenoe del mlModo quimleo y, especiatnen\e, del enzlmcico, y que 9$1n siendo a~ en los distinto& proyecl06 ~oma bajo e$1udio en el momento accual Sin embargo, c:ntetnO$ que &u d9$crip(:in ttk.Code la<6 pot;ibilicl;lde$ de es~ te.Kto, 8<1$le c:il<'r entre ellas la secoonciacln cicftta, 1<' se<:uOnci<'c:iOn mU!IipiO, 1* QuirniQiutnirl$ctnc. y 1<' teeuttnti;)<;in en f3$e $()liCM ,
18.4 SECUENCIACIN DEL RNA

La secuenciaOOn del RNA e$, en gonerttl, ~$ difiCI que la Gel ONA. cnlre olla$ Cf!USa$ POt su menot est3bili030. E posible deducirla a partir de la secuencia del ONA del que se traneeribe, o ambln *&tlZ81 un CONA a pattlr del RNA de Inters y seruenclar aqul. Sil embargo, a veces M nace&ario seruenc:iat directamente et RNA, &Obre lodo cuando &e desea delenninar la5 poaciol'l$5 48 nud~ moc:ificado5. caract01i&ti006 de lo$ tAHAs y rRNA&. Para
PROYECTO GENOMA HUMANO (PGH): CARACTERISTICAS ESENCIALES
239
ello, se 1'\a desarroAado un procedmlenlo que empleoa dislintas RNasas que cortan en el lado 3" de nuclecidos espe.ciflOC>$, oon lo quo $C puQCfe ()t)I.Me( una serie de fragmentos que re4lejan las ~lclones de cada ba~ Squ.et'ldo un planteamiento anlOgO al de 1a seooenclacin qulmica del ONA &e puede entonces deducir ta &eeuenca del RNA.
5' . . pNpNpA:pNpN .. . J'
E> ,. .
RNii S:I T I
pNpNpA'
+ NpNpN .. . J'
, .pNpNpG NpNpt-1 ... 1
, ... . pNpNpG' , .... pNpNpA

~,
X
5'., . pNpNpA... NpNpN ...
~
NpNpN ,
. 1
, , pNpNpU:X NpNpN.,. r
RNa.ia Phy M
R"<~l>ti de
. pNpNpU:
+ NpNpN .. . r + NpNpN , , 1
J' .. pNpNpOf- NpNpN .. . J'

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~ ... pNpNpU; ~ ... pNpNpC,
-NpNpN .. . )'
B:trillus et'ft'fl.f
X
~gar
NpNpN. .. l' NpNpN.. . J'
ASimiSmo. at menos en teoria. es poSil:lte aplicat el metodo de secuenciac>n di<leso)(i a RHAs Log~eanente, en de la ONA pollmerasa usada pata secuenc.ar el ONA, se precl&:a t.na tran~a inversa, capaz de emplear el RNA de mters como molde para sintetll8r una hebra de ONA oomplementano (pEig. 196), partiendo de la nvsma mezCla de dNTPs y de un ddNTP dt:&liniO en cada tubo.
18.5 PROYECTO GENOMA HUMANO (PGH): CARACTERISTICAS ESENCIALES

la conseooc16n del mapa completo def genoma humano es un suel'lo del siglO XIX. que tom fonna en la segunda mitad del siglo XX oon la inb'oduccin de los mapas gentioos y fisioos, y que se comple! oon el iniao a partir de t990 de la sewene1ac16n. graClaS a la puesta a punto y ta au!Omatiz.acin del mlodo enZJmlloo de Sanget.
ln~llv\O$
Se trata de un enorme estuetlo de IIWe&bgacin, bajo la duecctn lnietal de J. Watson, financiado por 109 Nlleio<nales de $~100 de EE UU y ta F ~aciO<n Wcleomc Trusl del Rwlo Unido. con un ambici060 objeb'Yo, la
secuel'lec&ein et1 15 ll<i'w>S de 1os 3..300 ml!lones de pwe$ de MM$ del genomo hvm.-no, inclu~o. por tanto, la pane eodi!lcante (3% ae1 IOtal tormancJO unos 100.000 genes, au\que reeienlemente se dttn cifr.:ls aUn m(ls dl$Gordi.lntes, entre 30.000 y 200.000 genes) y la no cod!flc:ante (el 97'% restante). Han partiel1)3<10 16 ectntn::l$ pl)blicos y ptNados de lrWestlgaclon de 6 pa1ses (Alemania. Cenada, EE.UU.. Franela, Japn y Reii'IO Unic):))_ Enlt"e ;)q\.ICIQ$ C<'lbc cilar. POr ser respoMables del 85% de la secuenclaclon, el Centro Sanger (Can'()ridge Reii'IO Uni(J()), 13 Univers~ de Wa.shington (San l._. Mi$50vn. EE UU.). el Joinl Genome ln&.tiMe (Callf.oma. EE.UU.), el lnsMuto Whlteneao (Cambridge, Mas.wchu$$Cit$ EE UV.) y 1<~ fac;ul!;~d <s. modttin.- &.ylor (Hou&40n. Texa&. EE UU). El director acruat ael proyeeco es Franeis Collins y. ert Espatla (que no M .n!eNenidO en C$1C prOyecto), Santiago Gn&olia preside el corrut para el PGH de la UNESCO. EJ Proyec10 ha sido OOtnparac, pot su i~ar.cia, al O&Scubrinw:nto do ,.. T.-bltt Peridica de los Elemen1os Ouim.cos (MendeleJev) y. por su co"" y oompleJia<l. a la faMcacln de la bOMba 310mice (Proyeczo Mar\ha'IIM} o l:.le9ad:t do(!! hOmbre lot L.vna (Proyocto Apelo)
E~tperlmentalmenle . el PGH consta de tu sig~~~~
gr:mdos ot<1pa&
1.
2
3
4. 5
Se parte de muestra!~ de ONA h~Mt~ano, de voluntarios, e~tlt~Jdas de sangre y mantenidas para su oonservaCIOn en nitrgeno liquido (196 e). El ONA. se $'ilca"'lde en fragmeMOs. por puntos conctetoS, mediMte en11~ de rC$tnc00n E51o se hace en dos fases. una para originar ft'agmetUOs relativamente gra~ d(l ~0$ 150 kb y, a partlr de stos. una segunda escisin para dal fragmen1os ms pequenos. Se clonan los fragmeMos. mechante la11'16erdn oe cada uno en un vec:IOC' (ptMmido, BAC YAC ) e 'ncorporaclon a una clula anfilriona (bactena o levadura). En junio oe 2000 se hablan donado vnos 24 000 fragmenlos, &qulvalent&S a~ 97% deiiiOI:tl del gefloma. Separacin del ONA a partir de cada clon y en SIJ ea:so ~tnplilicacin (l()f PCR. para oblener mi!es de COJl'IIS iQntiCCJ<S de ~da fragmento. Sccucn~;~a<:iOn <::ompleta y rePMida de caa fragmen10 de ONA {lM'IaS 7 ve~ en lron~<ho). pOt' ~ mtodo de Sanget. En jUI'IlO de 2000 se Mbio MCvcnci.-Oo ""37% del genoma, oon una preclslbn <lel 99%. Esltl lrewsu. su finalizacin para el al'lo 2003. Ordenac;iOn de 106 fragmentos secuenclaooe para es-tal:lleoet su j'Xl$iein Original en et gonomtt
P~r3 todas eS1as etapas. e$pEICJalmante para la secuenci&Cion y el OtdenamienlO oe lOS frl)gr1'14;1'1lOS ha sido n&ee$3nl) un gr<tn pntSupuesto (450.000 ~es da pesetas), un gran nmero de pet$.01\M (t:n torno a 1.000 en todo el mundo). y el doWJTQ!Io de vntt gran \eenoiOg!a y una elevaci& capaeklad de aviOI'N'ItiZ&cin ~ inf()f'r'Nltiz;,1c;i0n
240
SECUENCIACtON DEL GEHOMA Y PROYECTOS GENOMA
18.6 OTROS PROYECTOS DE SECUENCIACIN DEL GENOMA HUMANO

Como a!tematiY"a$ M PGH p(.CliCO, OfiCial, h8 $urgkl> etilOS illi1110$ ~ una serie tle proyeao&.. en cierto modo oon un carbelel mareadatnetote oomereial. pero que har'l COt'lll'lluido a adelantar ra obleneiOn de la s&euenOia del
genoma humano, obviando en 9ran parte las etapas previas de mapeos gentico y f'f:slc:o. Estos planteamlet'\los han dado lugar a acaiOtada polmiCa tlco-denUtka, ante ef Intento de apoderarse delluet8M campo de \a bloleenok>gla, a medio camino en11e lo cienUflco y b indu&trial, a modo de una batalla para hacerw con ol dominio de la mediooa y la bioto<:nQiogi<t detl fub.WO El hec:he> de que indu$0 algunos ttWesr.gac~ores est&n tood&r'ldo sus J)lq)ias empresas, p8rtl eq)l&r sus ~s ~ntC$ dC que lo haga.'\ otros, t\8. ereacb una Inquietud en la ~idad Cientlfica lntetf'la~ y ha dt'cto lvgt'lr 11 '' int<ef\'onciOn de aos gOCiernos llnaneiadores en apoyo del acc:eso pUblico y \.W'~et'S&I a lodos lOS OMos del oenoma I)Of parte oe lnve,.lgadOtes delseCIOt acadnb o '\dustrial farmacutico. como eje-mplo feptesenlatlvo. cabe citar la ptesencle de la empresa privada c.ta Genomlcs (ROCI<\IIIte, EE.UU.) que. con oontreiOS nw.itlmlllonarlos sin precedentes en la historia de la biologia y la eplicacln de un nuevo planteamten4o de seooenaa<:in, ha oon&egi!Ado en slo 3 ellos &eei.H!Oeiar el ~ hurn.ano, tras haber verillcaOO previamente la viabiklad del ~odo oon la $0CU9ncioloi6n del getl()f'l'\1 de ()rQ$q,M;, mtl~;,s.~or. t.a 16c:nica empleada se puede re&Umir en 3 elapas: Secuenc& acJo $hot-gun f en 9$001)0101zo~ o en Wdi~na.ct~n. ES1<l teenoiOgia et: muy direrence ~ ta emple$0<'1 PGH. Se ba$il oo &a es<:i&In <tlc<ttori<' do IOdO el genoma en p.e,quel'iOs rragmMtos (unos so 6 70 mittot~es) , q~ se c:tonan por:. kltmar g&r\OI&eas. Po~eriOrmente, se procede a secuenciar tos dos e.xttemos de C9d8 lragmet~to (en el mayor nUmero posible de nudelbo6 perm'ldo por las lc:nlca& de secuenciacin disponibles). Esta Wlgente tarea. realizada de fonna robolizada (se han requerido 300 sOOJenCiildores ilutom<'bcos funciont~nOO dla y noche). ha permitido seooenQill varias veces cada rragmento (4,6 de media, lo que supono Vl'li'l prt>Ci$i0n Inferior a la del PGH). ha~a completa~ en slo 3 ~ (abril de 2000) 1<' & oc:uenci3 del 99% de lOs fragtneniO$ procedentes de un genoma de varn. El anuncio de estos resu!I01dos se hizo fJfl un ttml)iento vn W O$PeCtaCu'-. 2. Ensamblado de los fTagmontos. ConsiS1iO en un ttabajO metarnet~te infmllco, &t.C'Ique de gran magnii!Jd. ent<'mint~do tt rocomponor correctamente lOS fragmertiOS anteriOfes, a modo de punte gigante. hasta lograr en un $010 met, et mapa completo. Se ha conseguido asl. por pnera vaz en la MIOria (mayo de 2000), la secuencia de un gertoma humano. Sin embaf90. este rewii.IIOO h<t "eniOO t'oomp.-1\;ado do fuorte$ ori~s. por Mf menos ordenado (CM~Que ms rpdo} QI.MJ ol rnt1odo del PGH. 3. Anotacin (o i<*lti~cin) , E.$13 ~ neoes~ria P3ra oomplelar la secuencia de todos lOe 1ragmentos y tratar de localizar la posiciOn t 10$ genes en et genoma IOISL Es, precisamente. la ms compleja (prevista su consecucin pata e1 al\0 2001 ) y a 18 "ez la mas lmpottante. Equivale, en realidad. a le. fetso protorrka PO$torior ta lf! gen6m.::a (pg 217), Estos dOS ptO~. eJ pUblico (PGH) y el pnvado (Celera), de$9U& do vario& onfrent;w~ientos V'Oft>i'llot y criticas mutuas, l*:tNOn fiMmente un aCI.Iel'do. sin vencedores ni venc:iOOs. acerca de lo$ datos aleanza<s por C3C.Ia gt\l)O COmo oonsewet~eia. se NI elaborado un "'botrador' comn de la soooenc:i<t del ~ humano aiCanz::ada bajO pl;lnle~tnlttllOS distirrtos. Presentado ef 26 de P,mio de 2000 (fectla ya hiMric<l). a nivol intorn~ional y con inlerveneiOn de clentlficos y poU tlcos. &e pretendo que ftle borraoot sirva de l)artida para fututos estudios. ptesumlblemence reallz.ed06 en adelante Y<l ct. l'orm;a conjunt
1.
PQl el
Pot otro lado, ebe Indicarse que ~ grupos, incluso antes de eonoterM lOs res:IA!aCIO$ O& la en'C)r'esa I)Ubliea y privada. nan emprendido proyecten centr<tdo& _, la sewenc:i&o:iOn de lOS genes, el(<:luSivamente. presc::lnd!e.nOO de las reglones no codificanlos dol gonOma. Con'IO eemp10 reptesent&!illo, debe citarse la ernp~esa tb'nan Genorr.c Sciei!C$& ~. desde t992, he conseguicll) sewenolat (hasta junio de 2000) ms del95% de los oenes que .se expr(!,S&n. Ll!lleniea ulii!Z.ade &e be&a en la lranscripe;in in'w'CfS<' del mRNA de oelul:.s e!lf)eeifietliS. para oblener su cqli8 de cONA. que 1~ os ~ido il fUCntiacin. Su Objetivo, lrttetmedio entre 10 elenUflco (sewenciar slo lo que os til para la mG<icintl) y 10 oomeorcial (latltfear medicamentos a partl' de dichos genes), Ml adQuiriendo una trayeaoria dominada marcadamente por el ~$~C'O econmico, Y\ publie.v los resultaclocs de cara a la elaboracin de patenles. En e~ ea50, los avanOI:I$ conseguidO$ M&ta ahora han supueslo, sin lugar a dudas. t.na reV'OiuciOn de gran Impacto en la socledild Oo hocl'lo la apariCin de lOS tn8fl88 y la secuenclacin del ~ se han convortido on ol centro de ateneiOn Cle lO$ mediO$ de oomunlcaein. Peto na de recordarse que la genmlc3 ~no es el rll'\flil de un ca~. $in() el oomienzo de todo. Urta ..-e.z supetad06 estos objetiVO$, so en~n~rn en la tase )f'Otetr*:a o de deduccin de la l1.1nci6n de cada 961\. su expresin y la aplitaCIOn de 13$ proleinM lctm&OaS. Slo asl se podrn con0081' la& a1:erac1ones prOielcas re&pon&able$ do much<'!s p;)lo!oglas y empez:ar a obtener benellclos del PGH. airados en ccwnpos 1an dlvers.os como la idontificacio, dingnOstieo. lerapla y pteYeneln de muchas enfermedades. el conocimiento de Ir. diversidad gentle<' {POiirnc)(fiSMOS del DNA). la elaboracin de tratamlenlos il'llivid~JC~Iizillclo&. ole. Qveo&i igualmer'lle pendien4e 1.1n aspado muy mportante del genoma humano. Debe quedar Claro que en rwgUn caso existir una secuenaa nica P8fil el gonomt~ do IOdoS los ii"'CCMCiuos de la especie 1\tlmana. pues e& bien oonocida, deSde naoe muchos anos. la existencaa do ooa ma~ divtt'$i<Jad o polimorfismo gentico entre ntivlduos de una misma especie. Este""'**' QI.IO terb ana!iz.ado mils adelante (tema 26), nos indica que los proyectos gonom<'l, $Obre lodo en 1.-s reglonos de DNA M c:odifiC8r'lte. debern ser considerados bait> e&*e nvovo prisma. 9o e)((lliea que lOS PfO)'OCIOS aetualmenll!l en o.no ya estn lr.ltcw:fo de illbordat este aspecto oon la secuenc:ladn oomparativa del ONA <Je ii"'CCMduos-fepresentatwos de distinta& razas. como un l)'l(ipiO de diS1inc:IOt'l en1re genomas pollrnrllcos.
====::::..:.::=::.:.._____ --------- GENMICACOMPARATIVA
241
18.7 GENMICA COMPARATIVA

la Wtterpretaan del genoma humano se facilila por comparacin de su secuenoo y sus genes con 10$ de otn organismos. En el momen~ actual$$ s.guen de$arrolclndo y se ~'~can iniciado o e&tliln plaoneadO$ m~.~tho& oi.TO$ pro)'e(:I.OG genoma. En la lista &e incluyen b$ de la ievitdur<~~ S<1e<:hM>mY"S corovi$1H. 01 gus.t~no C<10norll~ ofQ9<VIS o I;J ni0$Ctl del vmagre Dro$0(JIIif8 meutl'lfJ9'3SUtl'. Entre lOS mamlleros, oestaca el J)tO)'eoCto genoma Clel raton. de g1an intetS aplic:ldo en i~YYestig&ein y por la eJ&vM& flomoiOgja con 10& gene& humanos. El genoma de Oro.sophiJB mel800{}8ster. rooentemente secuenciado con la intervenCIOn (eKCepc:ional) de irrvcst~ G:SP<Iiof(l$. o& uno do los ~ ms ubllzado& para estudiar el oontrol genlioo dol OOs;motlo del: orgttni$m()$ complejo$, osi como l)<irt'l el .Siudio do tTii$1QfnO$ Qvo ofo<:111n a humanos. Un 61% de los genes de Dro~b se nal'l vincul&cJO a er~termedades hl.'laMs tale$ como ti ~ncer, el ~rk""On. el Al%heimef y la <li3l;)etes. Igualmente, es im1)0r't81Me el ger.oma de otras espeCies como modelO$ ptu<' 01 estu<liO troS;tornos ~iCOs y SQbre tos tjrmacos s empleaf De ahi Que lOS ptimet'O$ genomas ostOOiOOos fvtrol!O lOS mi(J'00(9Mi$(n()$ t>a~ caU$antes de ertfetmedacles humanas.
oe oe
MvthOS mils get~es oe lo que se pensa00 se encuen1ran et1 diversas espeocles anmaleS. Con el tiempo su es:uaio,
o gcnmie<t CQtn!*Miva. permitirA avai'\Zar en f!l COI'IodMienlo de I)I"'OeSOS biolgicos baSioos. CliviSion celUlar, fertilt<*J, diletertdaein sexuaL. desarrollO oet cuerpo y rganos. melttbollsmo del envejecimlenlo. aprendizaje,
wscepbbih<lad a frmaC06, evolucin, etc. Adem&. 69 aportar informacin &Obfe el mec::ansmo de la e\/OfUcl6n: en este sentido, mereoe de&UK&r&e el de&elb'mienlo 6e lo que pockia Hr el *genoma mirwno~ ne00$;1rio para mantener la VIda de fQJm3 <'V~ (300 dellotat <.le 470 genes de 13 bat'eria Mytq)i8sm8 get~ita~um)
Genomas que se han secuenciado (mayo 2000) (ordei\CidO$ por lamao)

Organtsmo
VIHI (\'lfi.IS. de ini"''U\\det.lciei\Cia nuMatta}
Caracterl$bcas virus mitoeondti;a procariola procar1o1a prOC<"Jriotv

prQW~riota
P.P esurnaoeso Tamao ae1 de get~es gei'IOI'nll (Mb) 0,0097
ONA mitocondr~l Horno~$ Cromosoma 1 de Leishmania maor

hf)ocoptasma getl.iraNum hfycopfi"1$m.'t pnOoumonii"IC Crom0$0m812 de Pf(j$m0dii,Nfl f;JicipMI.Nn
37 470
677
Chtamydig tr.Jehomatis RickGttsia prowa.zeWi Trepon9flla paiNdum
BotteNabulgdOffen
Aqul/eK 80NCU$ MetMn()C;OCC<J$ Nmfl6$C/W
HGiicobacu~r P)'lon
procariota procariota procariola procariola procariota &rQueobacteria procariola

procariol~
0.0165 0.27 0,58 0.82 1.0 1.05

1.1
1.234
863
1,14
1.3
1.508 1.692
1.590 1 855
1.5 1,66
1,67
Hatobactenum h8f0blum MethttftObactelfum lheJmOtJutott~ieum Ttle.mtOtoga marit~~t~a Hae-mophi(l)$ inlfi.Jonl~O
Pyrococcus tvri0$1.1$ Ate.ha6oglobus ftilgidus

Pyrob8Ctltum 8efOPhNum D&JnOCOCCU$1'9dJot:Ju(8t1S
S)'nechocystJs sp.
Ck>$t1idium 8CINObu~rn &ciNus svbtitts Eschencma coN

$(jcch,romyce;$ corevisjoo
arQueob."'leril.'l proctttiOI<' procariola procariota arqueobacterla procariOia ptOCariQia pr0<:;3riol<\ pro:;.ariola ptoc:ariola
pt()CariQ!t'
1.740
2.471
3. 168 4.100 288 6 03<1 225

545
17.000
euca1iota
eVC<~riot<'l
.2 4.67 12,1 33.8

34.5
..,
1.7 1.8 1.8 1,83 2.1 2,2 2.2 3 3.57
(lev<llduril de l<l cerveza y del pan) Brazo q Clel cromosoma 21. Homo sapieM Brazo q del cromosomA 22, Horno $o!!pion$
C8enomabdt1Js eregat~s (gusano nematodo)
euca(IO!a (1tf cromosoma humano seouenQado, 1999) C-VC<'lfiOIO (1 getl()(n\ onim;:\1 $&Cuet~Ciacto. 1998)
e~~eariOta
100 180
(secuenciados
120, r~
Oros.ophJia melanogaster (mc:l$Ci;l de la fruta o del Yr~agre)
13.600
(el mayor gettOtl"'& secueneaa<lo)
ovcromiltica)
Tema 19
Transcripcin
19.1. 1 Transcripon y transcnpcn lf'lv ersa.. _.. ,_....,.. _,,,_........... -- ,., _ _ .,,_... ,_... ,,.,_ ,.,_,,,_ ,.,,_ ..,_,,,
.... 243
. 244 . 244 ,. _ .... 244
19 1 2 Cooceptode gen,_
19. 1.2.1 Oefinrc16n d.llsica. no mOlecular .... 19. 12.2 Oefr~lon mo!eC\IIar - ... -.. 19. 1.2.3 Situaciones paniculares ......--...
19 .1 2.4 Nomei'ICialul'a .. .,... _ ... _... _ ,,,, .,... _ ... __... _ ... __... __,,,__,,,
>46
246
249 249 250 250 250 250 250
2~1
19.2 Enzimologi.:J de l a tr3n seripc:;i n: Me<:anismo de la reacci n RNA. polimeran ..... ,_, _ , ....- ..........._ ,_ , _ 246 19.2 1 Torminok>gi<l... ... _,, _ .,,_,.,_ , 248
19.2.2 Orlentacin delasecuencla._,,,_ ..,_,,,_,,,_ ,.,_... _ ,.,,_ ,.,_..,_... _ , _ ... , . 19.2.3 Carcter aSir'rlbltloo._ ... _,,,_,,, ,.,._ ,.,_,,, ,,,_ ... __... __... _ ,., __,,, __,,,__,,_ ........ 19.3 Tr:.nscripcin en eucl!lriotas: diferenci as con procariotas ...........,...,,_ , ,.,,.., _, ,.,,.., _ ..........._,.., _ .......19,3. 1 Relacin con la condensacin del ON A_,,_,, _,, ....... - ... - ........ ...- ... - ........ .,,_ ,.,_ ,,_,,__ 19.3.2 Solo &e tran&eribe una peQU81\a parte del geooma ... _,.,_,,_ 19 3.3 El prooeso e~ mudlo m&~ oomp!ejo que en procerlolas ..... -... ,.,_..... -... .... 19.3.4 EJUS!M \13tias RNA polimetasas di'tr~IC$ ,.,_,,..... .... ... 19.3 4 1 ES(le(:ffi eidad l'fll>e~O ~l lipO (le gen trt~n:scrilo y RNA formado. 19.3 4 2 Loellil0QI6n y c.n6d8d .. ,................... ,_ ..... _ , _ .,,_ 19.3.4.3 Susceptibilidad a lr.Nbidores.. _ _ ,, __,,_..,_... .... , 19.3.5 Las ~NA pollmeras as estn formadas pot"ul'l gtal'l t~Urnero<Se subunidt~Cics
25 1 251 251
19.4 Etapas en el proee-so M tran scripciOn ...- ...- ...................., ... _,...,_.,_.,...., .......................- ......- ...~................. 252 19 4 1 l n11Ci8e.n , .,, ..... .......... _ , ,_.,,_ ,,_,, .... ,., _ , ,_,,_,, ,,_,,_,, ... 2$3 ,.,, .. _.. ,_,,_ ,.,_,,_ ,.,_,,_.. _ 253 19.4. 1 1 Formoon de' ro~ de ini acion,_.. ,_ 19.4. 1 2 Oesnaturaliz.acion del ptomotor .. -.. -.. -.. - ......... -... .. ....... _ , 253 19.4. 1 3 Form;)Cif'l de k>$ priiTMiilfO$ enla08$ fosfodistet , _ ,,_.. , _,,_ ,,_,,_,, ... _ ,, __, 254 19 4 1 4 Liberacin del prom040r: tran~JCin de lnic>acl6n a elongaCi61'l.. .. . .. . .. .. . . 254 194 2 Elo~n o ~iento del RNA .. ,_........ ,,_..,_,,_ ,., _ ,,, __,,, __,, _ ..,__ 254 19 4 3 Termii\(I>Qn,_.,, __, __, _ ,,, __,,, __,,,_ ,,.,_ ,,_,,_,,_ ,., ,,_ .,,_ ,.,_ ,,._,,_..,_ ,, 255 19 4.3 t Temwlaan en procarrotas ........... - .......... -... ... .... . 255 19 4,3 2 Termnaan en eucanotas , _ ,.,_,, ,, _.. ,_,, _,,_ ,,_,.,_,, , 256 19.5 TranSCflpcln del genoma mitocondrial. ............... ,_, _,, .... ,........ ,,.,,,..,,_.,_.,_, .., .......... _, ..,............................. 257 19.6 lnhlbldores de la tra nscrlpeln ......................................... ,_.........................._ .. _ .. _, _, ...,_ .................................. 2S8 19.6.1 Antibiticos ele upo L _,,_ , , __..,_,.. .. , .. .. ... 258 19 6 2 Aotibiticos de lipo 11. .. ... -... .,._ ,.,_,,_,, ,,_,,,...._ ,,_,,_... . 258 19.6 3 AmibitiCO~ de tipo 111 ,.,_ ,.,_ ,.,_,, _,,_ ,, _,,_.. ,_ ,.,_..,_,,,_ .. 259
19.1 INTRODUCCIN: CONCEPTOS GENERALES
19.1.1
Transcripcin y transcripcin inversa
Lt'l b'<'!\$c;pein os el proc::.e&O encargado de la sl ntests de una l'l\()(ll)(u!;) de RNA <' p<1rt11 de la informaan gentica contentda en la regln CO<flflcante oe un ONA. Es d~. dlt de~r !~r a una ~cop1a' de ANA (con secuenc.a no i06;ntic.a. sino oomplementana y anttp8fateta) a partir de ul'la sewenci;) "moldo" en una de las hetltas det ONA. E-Ste proceso conslltuye el segundo paso del esquema c:tMieoO. lTOin$mi$i6n de la nformaOIOn gene-lica (p&g. 1).
244
TRANSCRIPCIN
Se tnll8 ~ vn l)rooeto etUi!'tiOI) catallzado et1 lodos lOs Otganismos por una enzima RNA polimerasa (potimerasa de RNA de:peOO~errte de ONA. o transcrip~atf, p(lg 14 7), Como ecepciOt'l. n.Jehos vin.IS con RNA cornc> material genetieo (por eje~. tos retrovlrus} utilizan su ptOClio RNA oomo molde para la sintesis de un ONA complementario (cONA). mo<.liclnte \1M polimeraost~ de ONA <pet\\::iel'lte de RNA (ttan&Ctlptasa invetSa, pgs. 147 y 195). Pot esta razn. el e&QliMia general del flujo de infQnnacin gcn6ticn $0 oonsidem actu~tmonte quo es bldlreoclonal en su ptJmera pane (pg 2). U. l)reMI'ICi<tdel OH 2' en la ribosa. qu.t Nioto ;al RNA mjs ronctivo (pig, 35), pvee elq)llcar que el papel del RNAcomo material gentioo (probable en todos tos organismos al inicio de la G\'otucin) se haya desptaz.aoo al ONA. una molcula mil$ e5tabte.
citosol
1>~ , c~11n0- tr~~~:~~~~t(cr ..,)
mitocondri
.Onu.:rip~:tc.,n
milllipiC'J. ptt:Jt1o..M (<llfoo:moec prii!W'JO$}
\
"' ~~
--
o "'
DNA (un nomowm:.)
'1''"' '"
lj'lre-lt'.\ ~
(O lf\t""'lloot pnmariN)
n~llf'll{"... Vf". >-trlln~nr-.:
..........,.
,_,.___ I'I'Iitipkos ~
rn;uillro
19.1 .2
Concepto de gen
19.1.2.1 Definicin clsica, no molecular

En trminos gentioo& c;l$&i00$, et gen se deh oomo la unidad ele,....,.t~l de lt~ horoncia, 13 regiOn t!sk& y tunclonal Que c::ontrol<l vl\3 (;lltl'lctet1:Sik::a hereditaria ooncreta. la port.mr<~ do 1<1 informaeic:W\ gentica de una generac:iOn a la $9JI$f'ltO, 1<11 que gobierna, en deflni!Na, las c::aracterlstictls do un rHgO partiCular.
19.1.2.2 Defi nicin molecular

En tb'tninos moleculares, puede <istinguirw entre 13 visiOI'I Of'Vtlal y el conoep1o actual. En una tase (lf'eYia, la definiOOn de gen ;e b8I&O en l)l&r'lt.Nmlenlos muy sln1)6es, relacioMdos oon los (JV8r'IQH
ptOOudoos c::on el tiefT4lQ

Hip(:rteSIS un gen -\Jna ~nl1ma . Basecla en el ~del gen como resxll'ls&bte de la slnlesis de enzimas. primeras molculas con funciones ~talitiea!l ettlas clulas. HClQ!ollis un gen- .na p(Ot~lna. Basada en la nocin (W'iginal oe que eod&s las enzimas son pro4elnas (hOy se~ que algunaS molc:utas no pro1oials, como ~as, &ambln tienen fun<::ioi'IG$ ccrta!itic:M). Hip(osis u.n gen- un poll>tptldo. Basada en Que mucttns pro!A!inas estiln formadas por varios pol.pptidos, cada uno ccxiflc:ado pOf' un gen c:r.-erenle.
INTRODUCCH'.Hf ~ CONCEPTOS GENERALES
245
Como consecuencla.la deflnion basica. la conSiderada nOI'n'lalmenle como villida y aoeptarJa. esUn gen e-.s aqulla ttogtn del ~noma Que contiene- la (nfonnae!6n necesaria pata slnt&tlr.ar u ne molilcula de polipepdo. En el momonto actu31, ftitt eonQtP~o debe ser m~th~y atnpliMo para dl'lt (!(ltfada a dos nuevas carac~erlsl!cas do un gen cvttlquiertt. (:KiMenCia (le dos llpOS de ~eCJJet~eias con ruociones oderMtes. una estructural o realmente co<liticOOora y olril ~il do 1& e~in, y pte~ia en la reg.On esuuctutal de 1egi0nes cocllf;cantes y no codificarno$
FJem)!> de 1~ CCIOl!)(KlC111~ dr un gen cu.::anl ico Lipico (<Ji: tipo 1 1 , p3.1<1 Ull3. p!XlolCE \Ol)
3'
d<lUlh:~ 'olli"
..., ~~~~~~~~ \1\l1l

c -tolllut lol>
J'f (>(C',.Of
5'
iiC
l.mnscnlo prmu.lfM.l (pn... IJIRNA () hnRNAJ

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tiiUo~
re:tC>n tr""'"-110 rnu
ellmm11da
ptodr..n cmlll'ltt'flder (lltiiiJIImnltlllk '"" dt-
~c6.ol d. ~
tr.n,n!p;Km,
mlldun~io.ift ~
fl'lttiulcmllot u\11
mRNA maduro: 3 hrr t+!o\t '-c'c'""~~~';'"";;~"'~~ y 1 lfil!!n ~ rmdudl~ _.. 1 jlx-1!/\fl.~ nu t.WU.-.Il G"""'"' """ .,'WJ ~e:;,,.,,.,,,,,.,,~,,;:
...(I<"'W.. ,
t>ll
N
111
tXII ip:pttdt:~ :
l
l
'"
L.:t regin cstrvduraJ ~crmina l:lexpr~i6n rf}.al del ~ COmprende dQs tipos de ~cur.ncus en 1\lnon do 51J capacidad de expresin: intlonH. o reglooos oo coddlcames presentero en ellnte(a del gen (Pag. 276). y e.xones. cue Incluyen tanto las secuencias oo<lfficantes como las no codlficantes de ambos extremos del gen El conjunto de exones e intrones de la r~ e&truct\ral se ltanSt.:rib& para dar I~J9ar a un RHA llamado pt9CUr$Ot o transc-rfto pt lmario. ~le ro<uicrc un pr<>ccs<> 01diei0flt'll po$\Crien ~ !) b3nrscnrx;r0n, P<lf'OI d\\1 lms mo1kolas foncaonales de RNA (tema 21) la mayor p._'lrt de 1 (1$ ttanscri!os fOr'nl&dO$ en pt~as y euC(IrricX~s $vire iel'<> proceso. ll<tl'n<Jc> mt~durac:in postnt.nscripcional, s.endo excepd6n los mRNA.s proctuiO!iQOS;, que! so .:;inlet;it:;;.n dne<:tolmcntc 9n $U tonTI3 Nnr;ionet Como pane de ese pcoce!IO se p~Hden b9; tnuones, y los e:Kones se unen lit'IC31 t'l'lle(lt1)., t\.11$1 3 Ct)n$1.itvw .,1 RNA maduro o funcional {pg. 280). La re-gln reguladora. sin tUf'lcrbn oocMcante. esl ~!luada notmalmente COftiente art'ba (es ~ir, h!i<.i<~ S '. pg 249) de la regin estrue1ural Conoone dhuinlas regiones pcomotoras, encatgadas de intetaocionar eoh Jos ~s de llt'n&~in protetoo& para 19g1.11er PQ61hva o negatiV.-menle el lnloo de la traMCflpCtOO (p&g. 264) t..o I"'4JOI't<NIIO P<W'# 1~ dcJfinicin moloc:ul<tr dol gen e& 1& tormaCIOn a panlr del ONA de do& upos de proouclos gnioos: RNA.s o prole;nas tunCIOC\8ies Prtra 18 fOimaliOtl de 10$ primer~ s~ r~ll) 1 ;:1 !rt'lnSQII)cir;)n y. en su caso. la rnadufacion poslransOfl:>Cional. Slo uno de los tipos de ~NA el metl$3,ie(O, Sii"Wt como punto dtJ p3rtlcl3 p;.1ret sin1otr.c:ar el segundO produCio gnioo, la ptoli!'lna funei0n81 Ello ha requer;oo, ~d<::~ de 1;:~ tr;)ol:q;c:npci()n y mitdlJfi>Ci6n postran~. la lf8duccln o slntesls del pollpoptido y. en la mayoria d& los easos, et pleg<'miertto prQ!aiCQ. nooosttnc> p3r3 tu tnifrc;o tiA lvgf)r do OtXi6n y P\1' <' ol ~ie;io <~q su luncin COI'IlO eonseeuenelrt, la definiCin ~ult11 3Ciutll $0 M Dmpliodo: v n gen H el conjunto d& secuenc.ias de OHA de todo tipo. estructurales llntrone-s )' C)(O~} y regulado!'as. necerias para codificar un produt-to gilnlco, s.a Hte un RNA maduro de cualquier tipo o una I)(Ot&ina funcional.
S<lt CKtof'ldi<:J;::t$, ~nquo no so<r
Ob&MtSe cue ambas deflfliciooes moleculares estan basadas en la ~is un gen rnt p(J/ip>tldo, pt~OOcn fri)WCnto 1\ilcerlo. a:
Hlpc)tesls un ge.n-u.n RNA, tXII'nO pnmP.t )rexb:log&.nloo
1
H.potesls un gen un ptodueto g4oic:o
funcit)f~l
246
TRANSCRIPCIN
19.1.2.3
Situaciones particulare.s
~ gene& po$tllttn ~rae1eri$lica5 que requieren forzar las definiciones establecida~ en esos caso. se deOe acudir a le lnterpretecl6n ms funcional del concepto moderno de gen. ms que a Jos detalles de la definicin So il'ldiean algunO$ eemp6QS.
005 gent:SOVO<Itl'l ser ~w.s, es decir, co~rtir untt misma regin de ONA(pag. 249). bien
po~ cada uno e&t<i CO<Iific.~do en \.lOa! hebr.'l di&tinta (y, por l<tnto. &u& secuencias son completamente dlfetenles. pg. 44) o bien lnc:tuso ef'l ta misma hebra (lo cual no Implica que 189 ptoeinas CO<II'Ilca4e:!l compart3n secuenci<' amino<'lcidir;a, debido a la e)(lstenda de tresmarcos de lectura, pg. 288). Algunos genes dan lugar a varios productoe (pg. 276_). Un ejemplO es el gen oe Jos rRNAs. que se 118t1Sctibe en un RNA preeursOt que~ maduradOr\ se tragmet~ta t:Jaf\00 V3nO$ rRNA$ funcio"-105 (p,'Jg 283). Otro C<l$0 est en el ONA mi!OOOnc:fnat. cuyos 3 transctitos pramarios ~ pam dar ~' uno vt~O$ RNA.$ (~. 284). F~naknente. mvct~os genes proe3ritiCO$ s. ltt~~n$CI'iben a un mRNA \neo que sin embargo da lugar P<lf trsduca6n a varias pt01efnas (mRNAs pollclstrnlcos, pilg. 301} En otros casos. una misma seeoeocla de DNA puooe aar lugttr alterMiiv!men"' a dOS productos gCnicos, trorv6t ~ >ll'lrWltes oe su eliPfesiOn Qenlea. por ejemclo. POt un 41fetente proeeJ3miento P0$1.t'a0$CtiPcioMI o postraduocional (tema& 21 y 24}. Igualmente. en NJmero806 casos la protelna es& formada por varias &ubunidades: en e~ caso. no existe en gen para la prote!na. Sino para cada uno de esos poUppticJos (JXlf eje~. no se habla oe1 gen de hemoglObina, sino de len gen" de ICII .globina y la ~-globina) . En casos excepcionales. oomo Sar$ inmu~a$. un 98'1'1 nico sutr. roorvanilacaonn intemc~& en 11u secueocia ante& de &ef b'ans.crito. de forma que da ~ar ~lamente a una vanedad de polipiptidos (los diRiniO$ anliet.lf!>rpos oon f!SpeeillciCad para anti9f!'.nc>s di~os).
19.1.2.4
Nomenclatura
l.O$ QOI'I$5 se nombQII'I gcnera!mMie con ttes letras minseulas y en cutslva (por ejemplo. get~ ras}. la ptOteina codile.da por l r~ a v~ el mi$mo l'lombre pero comenzando eott 0118 retra mayoscula, y sin curS& (protelna Ra:s). En ocaskln9s se emplean* tres tatr&& en may&eula (por ejemplo.~ APC),
19.2 ENZIMOLOGA DE LA TRANSCRIPCIN: MECANISMO DE LA REACCIN RNA POLIMERASA

Como y3 se ha i'u::fi+e&CIO. !OCIOS lOS organismos, procarlotas y eucariotes. slntecizal'l el RNA de acuerdo 00t1 una reaocin cataizada fXX la RNA pOiimert~" .
Previamente. po1 &u significado hl$1rioo t n relttcin <::On 1<' siniOSIS <le RNA. debe eilarse la et'IZim& pol.inucletldo fosforilasa bacter~~ma (descrita por Marianne Grunberg-Manago y Sevvro OehOa on 19$5, y lltt~ asi por su arWOgla oon la tos.lorllasa heptlca). Esta enzima requiere un cebador y Mg" 1, pero t'l no utilitat un ONA mo10e conduce a una pollmerlzacl6n IW!eal al azar. no predeterminable:. La pOiimeriUJoCin se produce por uniOn de miiCI'Ios S'NDPs mediante enlaces 3'-5'-fosfodi&ter con la 00tl'e$pondierrte liberacin de P., para formar una molioJta semejMto al RNA n3Wrat (un poliffli)OnuCiel!do):
u inOOfpcf'&eiOn ae cada nucleo!Jdro depende de su concentracin relativa {respecto a bs otros tre$) en &ai mo:es.t de tO<Icn Mem6s, la posiciOn de ~io de ta reaccin favorece ms la fosiorolisi:s que la polimeriz.aci6n. No se conoce c;ue lt\S o&lui3S Ulihoen ~ta enzima; se cree que puede servir ms bien como mecanismo de degrildaciOn que d.a slnteslsde RNA. El mecanismo de la reaccibn fisiolgica, ca'-lil<'ldi! por 10'1 l:r3nscri0tau. es bMi~en~ idntiCo al de la ONA polil'nerasa (pg. 146' La reacci n g lobal es la siguM!nle:
EJ deseonsooe eoorgla Jl)re de 1a reacdn. para ceda nueletldo alladido. es.40.. = -2.6 kcalfmol = -9 1tJimQI Es decir. es t~Qeremente e~tergnlca y espontnea. AJ igual que en lit ONA po!imetM<t, !t' tC<'IOCin 0$111 asislidtl IOimo<linllmieamenle por 1a rup1Ura def enlace fosfoeMJdriclo del NTP y la hidrlisis del PP por ,... pirof.osf3"1<'s. Se asegura a&l que la! reaccin lran$CUn'il irrevor~ent~ en ta direccl6n de sintesis.
La adicin de nucietido& a &; hebra de RNA nuevtl y tas eaoraocteris!icas de la reaocln se exponen compata11vamente con las de la reoicaCI6n:
ENZIMOLOGIA OE 1.A TRANSCRIPC*N: MECANISMO DE lA REACCIN RNA POLIMERASA
247
RcaL-<in
d( la
ONA
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1
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polimt'raSII
(M.OJ4o!O)r.l>
Nfflp.nlb'\"001
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"
248
TRANSCRIPCtN
oomo
oe
SMI'Iuttneamerue.
conserva una de la& hebras
actuar como molde pero no almultneamente. Tras realiZarse

la copq de Ul'\8 SOla tlebta {l8 molde), se oonsetva
Iniciar la slntesls como c.ebadOf. que se aparea por de bases y anliparalelamente
La M2ma asociada al DNA mOlde flaee 3 OH lilm' 31:tque IIVCIOOfilic;)mente ''<~ prtmeroNTP ya apareado. Se forma el1~
l la:e fostodltt&ter. se rompe el fostoanhidndoa-tl PP. Su hldrOilSIS favorece ia reaccin de
apareado. La ei\Zma asociada al DNA mo~cse Moe que este 3'OH l'll.aqoe nucloofili~nte al <1 P del 2' NTP ya apareado. Se forma ~ 1~ enlaoe f06fodster se rompe el fosfoanhfdri00- 1} y se libera PP. cuya hidrOiisas favorece la reaccin de
'
nucloofili()(.)$ del 3 OH del
sobre el o~P-5 de cada dNTP tpar$CtOQ.
s,ntesls es en dttecCI6n 5-3 de la t"KJeYa

DNA es OOC.r en dtre<:C!tl Y 5 det
19.2.1 Termlnologia
Para una descripcin dldccica de la transcripcin es CltCOn&oef,tble trazar "" hori~ntal ot ONA ~ dot>lo l'lebrt' Q\.10
se va a ltans~: se oonsidera a la hebta superior(extwno 5' .pala izquicn:lo1} oomo Mbro1 no-molde y <'1 1<'1 interior, at\(iparalela (exttemo s ~Pala derecha}. oomo hebra molO.. Vofviendo Osta. PHa il sor lil suporior en su aparot~mieoto eon el RNA Mntetlzado, que &e &lla. arrtiparalelilmente (e.xttemo 5'-PPP Q la ilQI,Iien;ta y 3'.0H o t& dO:IOc:ha), det>a;:> de esa hebra molde. La sfnt.sl& ele' RNA, que &e marca a menudo con lno;:t (inicio) y flt.l;ha (scnliOO), ocurre on sentido 5'-.3' del RNA naclen~. E $lo e<!'lrvale a decir qve lil hcbm moklo de ONA se tran$Cribe (se 1ee') en direoeiOtl Y - s .
~Tt eCTTA~~
; 11111111111111111111111 3
hebra no--molde - - - - - -
DNA )' l l l l il i llf f ""iT ""TGt i l l i i 11 111J' lt "J;.\ -~ 1 !1 11 t 1111 ... ~ l< OtCGOUl<C lo
RM
'"""' "'""'' ~
hcbrn molde 1rnnta"ilil ~o infomuui\a"110 codi f "~Cam~.. "anti!iefltido"'
bellm no-molde
1 1 1
~"''' inllo"u''
M unmtnl:a "mfatmali,..-C!Odifi.:antc. ''
"con 5(111ido"
- +"
. .-
La secuencia del RNA nue'IO es. PQt tan~. i(:J6nlic;) a la de la he-tl'a de DNA n~lde , satvo por la ptesencla de U en lugar de T. Por elo, esta hebra se llamacodificantc o i nfonnativa (~ponde a la secuencia de bases del RNA y opinart\. l)()r ~.18 secuencia de amlnocicbs de la protel na). Tant.n se c.onooe como hebra no transcrita, hebra (~n) sentido y hc:t.lftl positivao (+). La secuencia de esta hebra e& la que normalmente se documenta al d...- &;t &ec:uenC'a de un oen En eonson.-.ncia oon lo ante(IOr, la hebra de ONA mOlde &e llama hebra nocodffi~nte , no JnfOtmatlva, lransc:rita. anti sen tido o negativa (-),
250
TRANSCRIPCIN
19.3 TRANSCRIPCIN EN EUCARIOTAS: DIFERENCIAS CON PROCARIOTAS
19.3.1
Relacin con la condensacin dal ONA
Al gual que en la repllcaan eucanotlca (pg. 151). un problema especialmente .tni)OI1;3n-" el nNel de eonden $&Cin ~1 DNA ar ini(;iO del orocoso Clt tranc;ripc:in, En los CtQI'l'l060mas metaf&icos. donde la oondensacl6n &S m&xima, est tOtatmenre impedida ltl tran~in . .;$t;ot tiene lugar dvrme la interfa.se. PJG$ &lo ocurre &OOte la eonf()rmociOn de fibr35 de 10 nm, $minina condensa<:in (pg. 85) y, por tanto, ma)'OI acce&ibilldad a las RNA polimera&a& y otras prolelnaos necesanas para el proceso. La mayor descondensacln nunca se da slmurt.neamenle a lodo lo \argo del Cf'OITIOaom&, k> que e.IQ)I.:& la oorrelacln obsew'v&da e)l.l)etlmeoralmet~te entre actividad ttanscripeional y posicin de las regiones descondenaadas (euaomatlna. pg. 87).
19.3.2
Slo se transcribe una pequea parte del genoma
Como ya se il'ldic, \.W\8 g~n mayorla del DNA genmico de: eoeario~s f'ltlnea se ttanseril>e (DNA no oo<lificante:, en l:lueOb ().llf1e ropell(iVO. pilg 106) . Asoci~ a t$1e e~~r~r no hmcional o simf)lememe no tr8nseribible (pg. 107) aparecen oopias deieuo&as de genes (pseudogenes y fragmenios de 98f18$, pg.. 112). 8$ltuctlJras CtOmOISmcas ~ oo se 1renscriben, etc. Slo se transcdle ellS% restanle, correspondiente a los exonesde las reglor.es estructurales de tos genes. sean de secuencla nica o repelda, y a aua Wl trones (aunque stos, eslrlctamente. son DNA no eoclifical'lte). Adems. denrro del ONA que se puede ttanscribir, ofulas diferentes transetllen dlsdnlas regiones de DHA. segUn sus t'W!e6Sicl&des y gracia!l al OO<plejo proceso que ccnsli1uye el oonrrol de la ex,presin gnlca (rema 20).
En este CXJtltexto parece 9decuado Insistir en que no e!l vlida acrua!met~~e 18 deflnldon de gen oomo '!leeueneia de ONA que se trensctlbe. porque eJt<:luye ta r&giOn Clel genoma que oontrota la tt&MCf'1X:IOn (pg. 244).
19.3.3
El proceso es mucho ms complejo que en procariotas
En pfocatiotas. la mOlcula de mRNA resunante de le transcripcin (transcrito primario) es ya funcional. no y M utiliza inrnec:iatamen1e como mok:St P81'8 13 lnldvc~n. en el mismo oompartimenro subcelular (puesto que no hay membrana nucle-ar) . Existe por ello una a.sacMcin temponJI y e~ i nlitn.f ~tre tt81'1:S~I6n y traduccin: de hecho, un mRNA puede empezar a traduche antes de haberse <:OmpeltidO su sln tesiS por transcrlpcit'L Por ef contrario, la meyorfa oe los lANAs y rRNAa deben sufrir maduraliOn, a.noga a 101 de outalrie>tas. En euec~rlotas, el tT<Wl$c;:riiOprim;lriQ, o RNA resul!anto de ltt tr3nscripci6n, experimtoto en el r.Uci&O la mtJ<I.ur'$cin o J)IOCe!J.&I'rliooto postral'l$crlc<:ionll. Los RNM mt'lduros te l r(ln$PQI13n luego al cilosol ~ p<'lrticipar en la 1 111dueci6n. E:lli&te. por tanto. una sep<~~<~c.in ~"'y htmpomJ ontr tr;)n$cripei6n y lntduoein, que SUPOne uno"! rogul~ mM oo~ de la expresin gnica, contrb.ryendo ata ~a en variedad y funcin propia de las clulas eucariotas, Ellle <:ontrol se 1evt1 a eabO ef'l gran medida por regulacin de la acrMdad de la RNApolll. El hectlo de qua esta enzima no se una QI)OCirJC.<tmetl-10 oor si misma a ros promototes euceriticoe ea otro signo de le complefidad respeao a
pteCi&a sufnr el proat$0 de maduracin postranscripcional
procatiO(;)$
PROCA RI OTA~
EVCioRJOT/oS.
. ~
f ! N -Dio.>
..
o.M R.NA
p<lrBotrlfiOOIIAI
19.3.4 Existen varias RNA pollmarasas diferentes

En pr~Xtariotas y orgn ulos $ubcei!Jare:t (mltoeondrlas y cloropla~os de euearlotas) se utl lza ul\8 sola RNA polimerasa para llinleb:Zar los 11ft tii>O$ de RNA oeUar (mRNA, IRNA y rRHA). En el ncleo de eu~riota existen tres RNA pollme.-asas diterentes (1, 11 y 111), que slnt.etiUin C8d8 una dr&btllos tipos de RNA . Sus catacleristlcas diferenciales les confieren un mayor grado de especiatizacin en cuanlo a su laboJ de si mesis do RNA. Adomlls, empleat'l distit'IIO$ 1 -ac!OteS de ttansetlpcl6n QUe se unen a ptomotofeS auados en dlstln18
posicin ( tema20).
TRANSCRIPCIN EN EUCARIOTAS: CHFERENCIAS CON PROCAAJOTAS
251
Transctlto
RN:A polimen~us eucaritk:u Producto Localludn
Acti vidad
Efecto de ta
RNApol ~l RNApol ~ll
RNApol
MRNAS (pre.mRNAs) ' ) y mayoria de snRNAs pretRNAs IRNAs pre-rRNA pequel\o tRNA <le SS ('J y vatios RNAs pequeo& (') rRNA$, mRNA$ y tRNA.$ miiOOOndriales o clof'qllilsliOO$
Nu<:leoplasma 11\h:ibiein Nueleoplasma
- 10%
Ninguno
Mi,OCOf'ldrit~S y
CIOtoplastos
19.3.4.1
Especificidad respecto al tipo de gen transcrito y RNA formado
poatr.-nseripciQfl~l disbnlos tipos 6 RNA mt~duros . Por tlhOI'tl
caoa RNApol ltanscrlbe un Upo de gen y da lugar a 118n&erltos pr!manos que onglnarn por mac:ful"acion se eotnenl.a SOlO el prlm&IO ~ eS~os .c~spettos
l a RNApoll trtlnKriOO et ~ del pre-rRNA -grande' (4$$), Clf.Cursor \ir.::.o do 3 de b$ 4 1.'100$ de rRHAs oomponente6 del ribo&Oma ClloptasmAtico (pilgs. 70y 80}. La RN~tt transcribe IOdos tos genes de protelnas. $1tLIE:ttzando lOs RNAs nucteates hetetogtleos (hnRttA$). que son los precursores de 'o$ mANA$ (PO ello, el h.nRNA estil COI'Il!ituido pOr m016cul;)$ ~ tamao& muy variados, de foque procede !lu no~). L:. misma RNApolll transcribe tambi6n la mayori.a de genes do lo$ RNAs nuCIIHUOII de lt'll'l\8JI'Io pequet'lo (snRNA) . Pu0$10 Qvt RNAPOIII transcribe 1 (1 grt'ln mttyori ele gene\S. los que codi~n proteint~s. C$10' onzma se ~n$def'CI repre:sent.ativa Oe ~ PQiimor..st~s e\let~ri~s l a RNAPOIIII. POr su parte. tranlKribe los 9tf'ne& dlt toOoo los tRNAs, sintiJ!iUM1do sus pre-tRNAs re&90Ctivos, asl como el gen del pre-tRNA pecJJe~~o. que madurar para dar lugar at cuaf'lo ~de rANA (SS), y los oe ouos RNA$ pcquet'IOs.
19.3.4.2 Localizacin y cantidad

especifiCidad. lar$ R.NA.pol se localizan en el nvcleoplar>ma (RN.A.Dol-1 1y 111) o en el nucleolo reglon densa del ncleo. de lincln mas lntet'lsa, rica en RNA y proteinas, no rodeMtt t)Ot :1 ()f()C)I~ trt~ns.erii)C:in <e k>$ gCt'le$ de rRNA, proceso muy memtlf'8t\8 alguna ni 00$0tvtlble dutante 13 milos-s- Svrge de 1 actwo ~ra ()fO()OfCiOn<ar lt~ clevOO. t:Mti(;!;)d de ribo$0ITitll QVc:t 114J(O,..t' l tt cilul3 La cantidad de cada tJpO de A:NApol (medida oomo freccl6n de ta acclvtdad enz1mtlca tocal) fefleja la 6ell'landa de sus procklctO$ gniCO& respeccivos: es mxima para RNA.poll. 1ntermed18l& de A:NApolll y casa reSk!IJal en RNApollll.
De t~coordo eon {R~I ). Este es una
19.3.4.3
Susceptibilidad a inhibidorcs
Es la drferencia m& &igniflca!Na, al periTII!Ir la distincin expetmental de las 3 polimeras;)S nu~rcs por su respuesta a la l).amanltina (101til'l8 de Am$1'1if8 p/Ut~$), un oct;lo6pti():) biciclico con vanos aminocidos infrecuentes (p;\g 2S8). En c:!ultts anima!e$ e$\e compuEI$10 no afec(S a la RNApoH tntube fuertemente 1a baja OOI'IcenltaciOn, 1o M) <' la RNADc-11. y dbilmen., a la RNApol-111 (a mayor ~noenuaCIOn, entre 10 ~ y tQ' M aunque 6e torm.a variable segUn la especie). E.n CJ.IMIO a ta RNApol rnitOOOldl'lftl, no se ve ofott<)dt' pOr 1~ <N'Im;)nilJna, pero si por la rifampieina, que no aJecaa a las polimetMas nuclesues El'l l:t rc~es-1.-. n nn-tos inhibidores 1~ pelimeras.a mitocondrlal se comporta !Igual que la RNAJ)Ol de ~uiN pro~icn (rocun:lese el probable origen endo&mbitlco de las mltoconar'ias, pag.8).
19.3.5
Las RNA polimerasas estn formadas por u n g ra n nmero de subunldades
E&la es una ear8ct61isbea comitn, 4\lnq...e con Cte-J'I:ts direrenci:ts Clfltto PI'O(;ariol$t )' eue<atl018$
l8 RNApol de proe8fiota:s (E eoiiJ, la mejOt estudiada. eS1 fonnt~dtt PO' 4 (posiblemente S) ~Ido&, asoeioCIOS en ta 13mt'ld<'l cn.timn ~minima~ o nvctoo~ Pnra inici&r l;a transct'lpcin. la enzwna mlnlma requlele la unie'l de ocro PQiip6plic;!c> lfldeoondiente. t.;a subumdad o f-actor o . que partJcipa reconoaendo las. secuenCiaS promotot.s en et ONA. o sitio de ncio de la lran$Cripan. Una V$Z iniCiilda l.a transcripcin. la subunldao (J se vueiYC ., di!SO~r de la el'lzima mil'lll'l\8, que eortlinVa etong8<lc>et RNA.
252
TRAJ4SCRiPCIN
Es1ruc1ura de una RNA rnilifi\Crasa procuritica lE. to/i)

t.l (35
kOa
P\151 k0u)
ltl (
p (1SS kOaJ
11 k0:1)
o (70 klla)
la& RNApol de euc~ rlo~.s son muctlo mil$ co~. Aparecen como \}fandM agregadO$ de m<l$<1 cercaBa a 600 kOa. fOOTiados por entre 1 Oy 14 subunidades la &Utlurtidad mayot <M la RNAI)OIII contiene un don-.nio Cterminal (llamado CTD, de C-termlnal domaln) ooo mllipleg fepeticiones (50 en mamiferos) de la secuencia TytSerPto-Thr
Scr-P~e>Thr E$te dOminio~~ $$ rosrOI"itadO et'l ser y Tht, ~!OfldO una elevada carga n&g&liva, lO cual esl& relaeionlldo ton su funcin en lit tr.ln$il;ln .,tro lt~$ fa$CS do inicittcl6n y otong<JOi()n (pAg. 254)
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IUCARIOTA'i
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I'ROCARIOTAS
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200! p.:l-1
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cxCIU~II\4Ill'-"'lll! de 11nmlo ~on o:l
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~ p.:l-111
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la llllnln.ldad IIV)'IIr de elida R.\'A~X-1 p;btc h1~ de .k'Cuo.'OCJI coo. la lk llli (lita!! p:ollrro~ A lf'.t\-d ('~;,
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1amano de la
mnl;.'tub).
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19.4 ETAPAS EN EL PROCESO DE TRANSCRIPCIN

Para que tenga . r lit transcripcin es necesaria la preseocia en la hebra molde de la llamada unidad de tra.nscrlpcin. QUe incluye la secoonCUI del ONA que $8 tia de ttanscribir ms las dos seooencas consenso que la flanquean {llamadas promotor y termjnador). E$ impropia l:,t de'riniei6n de unidad <.le ttansalpclOn com:o regin del DNA que se exlleftde entre el promotor y el te~ Es igu;)ln~ie l~re<:l& oonslderar al promotor como la ~reg~ del ONA qu& se transcribe'. Se reserva el trrNnQ Qpctn pow~ '"unidad de transcripei6n en procatiotas
-~~~
ONA de doble hebru Al Igual que la replicacin, la transcripcin en eucariOW tr;)l'ltcurre en laS 11es tases cls.cas de lniciaaOO. efoogacl6n y tenmnoon, oon notables diferellCia& rospoo a prc>cario~ trt CV<'!tlt() al te(;(lnoclmlenlo de las secuencias promotora y terminadora,
ETAPAS EN EL PROCESO DE TRANSCRIPCtN
253
19.4.1
Iniciacin
E&. eon mucho, lit etiliP<' md$ co~ d@ la llan&etipcie'l (y, por ello. en la que tJene lugar la mayor parte de 1.ao regulacin, tema 20). Requiere la separacin ele ' " ~M del ONA ef'l un pequeno tramo ootcano a la &ecuenda promotora, para petmlt.r que la RNA pollmefasa sint.e:tioe un fragmento oor1o de RNA (ele unos 10 nuclelidO$) )01' apareamiento con la hebra molde la regin ()e ONA que sulre este desenrollan-.ento pardal se llama burbuja de tr.~n.sc,i pein: sta se fonna en el 1nicio y po~riormento. durM!e ta ~iOn, se desplaza a b largo del ONA junto eon la RNApol. PiWa 1ct inici3ciOn tambin se requiere la unlOn al ONA de prote-ina& llamada& fackRS ele inicio ele la ltilnscripci6n o. comUnmente. factores de transcr ipcin (TF). Tanto &tos como los promotores se estud1arn en detalle~.; adclattte (tema 20). En procarlota& y 9n ~~ mito~ndas es frecuente que un mismo promotor Inicie la corranscnpcin dtt vario$ genes contiguos Por el contrt~rio, ~n el gcnorn.a r~ucl ea r de eueario tas, a part.r de cada promotor sto se transcntKI un gen. Olstlnto6 genes, en especi.-1 en funcin del& RNApol , utiiiZM distintos tipos de secuenCiaS promotoras. a las~ se ~o~r.en f)istintos faCIOfes de transcnpci6n. El proc;cso de iniciacin Qvt se deserll:le COMO tipiCO de eucariOUI& uWiza promotores Qvc tienen ta s.e<:uenela TATA, pet'O no la lrw (lamados por ello de tix> TATAIm- ) , cuyM Cl)n'ICICf'itlleas se descfiben po5leriormente (pttg.265). La secuoocla TATA es reconocida por la RNApol inditoctamen\0. pro~ intet".CCIOtl <:an lOS TFs. Es imponente resa!tat que tanto en ptQC&tioiO$ como en eueattotas, la ink:laCOn tequiele la presencia de la RNA)c)l oomplela u hOioenlima (es decir. RNApot bacteriana COflla sub,miCIM o. p&g 2~. y RNApol eucanO!icas oon todas ws ~.,y con tos f&etor&S de transcripcin}. La IMCiaciOn puede $Ub0rvi<.IW'5e en 1 re' $Ubct;.;pld. que slo se des~ para lO& genes transcritos por l<l RNApolll (gEWles d6 ciase 11) lo$ gonos de cl osc 1y 111 se l tanseriben por mecanismos slmllates, salVo por lit iden~ y pecul&andades de su& RN~. promolores y TFs .
19.4.1.1
Formacin del complejo de iniciacin
Este cof'I'IClklp plurimolcM;ul;n o& impre-scindi ble p.ara que l a RNAp~ pueda aeuar. ~e la OM6n de vario& TFs a las reglones Pf(ln"'Itoras del ONA y 1~ intc)t'J)O(tlciOn de la et~zlma. que parudpa en la forma oon dom1nio CTO no 'osl~ (pg. 2~ ). Se han propuesto dos modelos pMa 1.3 fOtmadn ese es-te co~p. oon el miSmo resutl.ado. sus ~anes se desCI'Ilefl posteflonnente . una Y$Z estudiado$losxomotore$ y lOs TFs (p~g . 267). et modCl:fO d"J I'IOJOefllim8, en el que la RNApolll se une pte-\'iamente
El modeloescalomtdo. en el Que los TFs se v3,n <"tS<>Ciando a 18 reg1on Pf'OtTIOIOta uno a oontlnuaciOn del un cierto orden. Es el modelo actualmente ms acept.aoo,
a lO$
TF$ y 1~ ti oonjvnto ~une 01

0110 y en
19.4.1.2
dos hebras del OHA (desnaturalizacin local}. esenCial par.t '" e.J~posicit>n de las b8$C:S a 1& RNApol es~ zor\3 de hebtas separadas. butbuj.a de tran scripcin o complejo abierto, es el lugar donde v<t <' tcne1 tvgar la sin1escs de lil C<ll<letl~ oe RNA, Esta etapa requiere, al Igual que el ncio de la replicacin (pg. 151), una actividad ONA.ftel kasa. presente ahora on dos de los rnctorcs de lt'Oflstrlpci6n, TFIIF y TFIIH, con un gasto C>JWg11co (l'liCirOiisis oe1 ATP). 0110 faCior. el TFn E. estabiliza la rGgl6n desnaturatiZild<'l del prom04o' (paQel ten Ciet1o mooo sa'l"liltlt .111 ejettl<l<> I)OIIil RPA en larepucaCIOn,pag. 1~1 )
Desnaturalizacin del promotor El complejo de ini~ciOn prOduce en 1a regiO(! ese iniciO de la transcrlpCOn el de&en~OIIamlento y separaOOn de las
w , ,, poli_...,..
........ .'i' . le war~u.c.,'oA ( ll1h'~ ~~~>:n la rco(.,, 1'"~ m el UNA ) al --.; a cf~ l)l;tWitW.!fil': latni)I~SC' unl la 11.1'-A P"'~ A ll11. ,e onl(!l(ld: llliDII!oCo>n. El ~~do: 11\!CIIl 1\'wlll(ln ~1\1 hl l~do/1 O NA( rt1incl(l ,. bJrbut !lctlilllf(JKS!\,1
V,u illo ,
1 N 1
1 A
e
1
254
TRAHSCRIPCIN
19.4.1.3 Formacin da los primeros enlaces fosfodlster

El entaoe fQskcfi6stor iniiCit'l $e forma entre dos ribonudetlctos. a partir oe sus NTPs et1 ronn.- libfe Uno de ellos, 9(1110flllmtnle oon !);ase purinica (concretamente ATP). se aparea con el nudeticJo 1 et1 11 hebra mole de ONA. El otro M enc:ventr~ igualmente aoatado con el nucletido +2 de la misma hebra.
pppA
! IOlnudeltd(l ( A TP}.
U(:! (la
pppN
Rtbl.,nuc:I~TdO
..
pppApN
RNA dedos nUt:h.,iol1d011, oon tri~P en su
pp.
' '
como ~ "'t'bndor,
Se ~pilreil cvn T ~n -11 !k l:a hebru m(l lde ~}el
tril06fa10 (NTP) emnpk ml!'ntllrio ni
\.. 21'
DNA
nudelido de 111 po~ici-ll +"2 de la h(hr. molde
c.\C~mo 1' .
unido
;1 l a hd>nl mold~:
E$1e primer enl<'o. oonesponde, pot tanto. al extremo S' P del f\NA naciente. La reaceion se reQilo $Obro ol extremo 3' del dinucte6tido te$Uitante, y asl sucesivamente hasta Jormar un OligoMb<lnu~ido de unt'$ 10 bases, que permanece temporalmente unido a la hebra molde de ONA como l'llt:ltldo RNA*DNA. En O$Wt momento. 1& RNApolll se separa de lOs Tfs unidos a lOS promolores l)ibfHltdn <Jf/1 PI'QmOIO() y comienu a desplaz.ar&e por el ONA (en sentido 3'- s de .ta I'IObr3 moiCJO), Este momenlo se oonsidern el final de la etapa de inici9Cin y el co~o de la de elongaci6n,
19.4.1.4
Liberacin del promotor: transicin de Iniciacin a elongacin
En p roc.otrio tn . e$1a tr;:.nsici6n se desencaOena pot" la di&OCiacin de la subunidad o de la holoenzlma R NApof, quedando aqurlla disponible pera su interaccin oon una nueva RNApol ndeo e Helar la tra~~in en un nue't() promotor. El 1'9$10 de la pollmetasa { RNApol ~nCideo. desprO\IIsta de la subunldad o) conlinU& aetuat'I(JO en la'l el0ngaei6n.
(-~ . """"'' -~
~ot'tlpll'lll
I>NA
d e C ,,.,
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''nld\11~ df la lt"A (>(ll m!~t,..,..
1'
\ .,
u o ...........-,
t:&
En eucar1ot,;uo. la traMicln entre las fa&eoS de inicaacin y elongacin vtene marcada por la iosiOrleciOn del dominio CTO de la RN.A.pol-11 (en la fase de Iniciacin parti~ la forma no fosfOtlaoa). Eslil foe-forllacl6n la le\ta a eaao et faelor de transctipcic'ln TFII H .
19.4.2
Elongacin o alargamiento del RNA
\.a RNA polim...,s;) oootin\1;) t'lt'rgttndo 13 ~na de RNA mientras avanza por el ONA.. de&pla:zando junto con ella la burbuja de transcnpcln. El complefo de elongacin ya e~ &61o formado por el ONA abierto. la RNApol y el RNA naciente. Durante "te avance continuo ocurre lo siguiente: Por detente de la pollmerasa se aeparan las dos hebf'M del ONA por rupcura de los puentes de l'lic1rOQei"'I (avar.ce de la burbuja). La tensin cseada por el efecto de S\4)el'erwolamlento debe set compensada por lopolsomerasas (pg:s 66 y 1S1}. La pollmeta.sa alarga el RNA M<"tdiendo nuc:JeOtido$ al e:xlremo 3' CSOI RNA n~ent. El Ultimo trttmo permaneoe dcnltO & la bu~. \\Pt'tot~clo b'ansiloriaiTI!ffl como hibrido RNA.QNA. Por oetr~t de IJ POiimertt$&. lJ ~na de RNA nuevo se va separ<11>1l00 de la hebro molde de ONA. saliendo de la burbvi~ y <1\*iai'IOO oomo ANA de hebta wncilla. En el ONA se vuelven a apa.r$il{ la& dos hebras y &e produce el reenrollamien~ o rebobinado de la doble hlice, de nueYO aSIStido por topoi:somerssa&.
ETAPAS EN EL PROCESO D E TRANSCRIPCIN
255
r r.\\ bat.. '1' lliXIJ)lo~Uil<l' 10 11u~~. la ii.M pt."blfiC'flt!OJ 1< .iep(llil dt lo:l Tr } f."'m'llnlllokiplttr.~IW. llf'I* '><Jo> U llutkilnOOud 1!).1!T,._,J' dt b c.dcn.tl ,,,. RNA Lll bu.t.p. d.,. tr;,IIK'1'"'lQn ~~~-113 l 3fW.
1 avance de l:t. E L
b~bus:>
o
N
e
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N
Cnu- . d&,;pli1Mfllmw) d ~ttt:II!Mt'IIICO t kJrls.-:on dl'la c.ok111o lk II.N.\
__ ,_=>_
P11ra que la e1 oogac1on sea efiCiente se requiere. adem<is. ta ayuda de los llamado$ htctorH de tran5c:ripcfn g-enerales de la elongacin ( PTE) Se del(:onoot $u mecanismo CKSCIO oe &elu&Citl. Son p.-otel nas que se agrupan en vanos tipos: PTEFb y SU oviton l<t lenin.CiM premetura oe la CIOI'IgaeiOon, mief\tras (Jie FIJF, Slll (o etonguna) y ELL aumentan la velocicSad de la elongacin altwl)rimi los Pil1.1$8$lratl$i\Ori:l$.
19.4 .3 Terminacin
El complejo dG tnns.cript.in re'$p0tlde a sef\at~ especillcas para rlf'UIIizal el proceso. separnctose el RNA. formado.
T M 1 N
~
A
e ~
19.4.3.1
Terminacin en procariotas
E$ impart;)nle ~$Cribi 10$ ~ mee&n!Smos Wsieos de termi1'18Ci(:ln <le l;"t tron $tripei6n, bien <ffforoneioldO$ en ptocarlotas, '/Que han servick>de 80PQI'te para compreN:ter los mecantSmo9 rn:s complejos en eucsnotas. El prmero, denonwlado terminacin i ndependi ente de p . se caractenza por la presencia en el RNA. eon &ormacin, en una posicin cercana a su extremo 3', de un punto de terminacin" definido por una secuenoa pal il'ldl'miea. intrf-nseca 811 RNA, Obvi81mente esta secuenei8 e Clebe a unt\ 1&g:i01'1 P31in(lf0mi3 on ol ONA de doble hebra. sitvado en eMt momomo en l a~ de I:T'~cr1pcin C<:mo c:onsecuenc:ia, el RNA fOI'lTia una h01ullla ,lo que por alguna razn, nodaramenle de&Grita. haoe que ste se separe del ON A molde y &e intetrumpala slnle:sls def RNA. El m<te;)nismo donomn..OO t.onnln;~dn dopqndlef'lto do p $9 bas! en lil pro$$nc;:r.;a on el RNA de otra secuenCiO espec:.illca. rica en C y pobre en G. de 5090 nt 00 longitucl. Cuando e&ta secuencia e&t situada en el RNA ya formado y fuera de la bwtluj.;a .,teracc:iona con una proteina llamada p { ro). heltaiY'Ica ( 275 llOa en total), con ac:twkledes ONA!RNA.flebcasa '/ ATPasa dependiente <fe RNA. Al parecer, ul'la vez uniOa ft etYIPiez.a a de!Pit'UU$C ~e el R N A. en settlido 3', fl&81a alctw\l&r el OOtrlplejO de el0tlgaei6n. En este eomacto, p provoca la oesnatt.mlllil:tteo6tl del hbnOO, liberando el RNA~ inl$'1'\lmpicndo l a tronscrix;:in
256
Tcrmioodn indc!'!C'ndieme de p ero) o intrin:>t.'Ca Actila como SUC'nc:ia dC' ll'111linadn una n:-gKm patindrm ~~:a ~ n d RNA t4UC lbnna unu borquill.1) SC.1,'Uida de
TRA NSCRIPCIN
\'lirios residuos de: uridina.
S ' OOCACA:GC'CCC'CAqi''I'CCOj:'!'CCCGCOT!'UAAC'M'TAATCA j.
3'
GOCTOr; ~rcu.t;(;t~.V..U.'I"''Go\MTTACT ~
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19.4.3.2 Terminacin en eueariotas Al ..,nu.r dol,ermill.WM $0CUMeias del DNA eucariOtJeo, an poco carat(erizadas.
se produce la tenninaci6n.
oomo conse<:uenc:iit de IJ combin~ciOn de dOS raetores o m&CMiSmos: ladffilnctn o pausa de te ftNA pollmerasa y la dHestabUitaeln del hlbrtdo RNAJONA El resultado final e& la separacin <kt k>$ (X)mponontos del complejo de
uanseripeion y. en el caso de la ftNApolll. su desfosforilacin pera que pueda enwmblar&e <1 un nvevo comptejo ~ inici&CiOt'l y oomenz.ar otto cielo de transcnpc:i6n.
La in~ia de lO$ dOs mecarismos Merw::lol'laCSOS es Ollerente para ceda una de la& tres pollrneras.as eucarl!(;il&-. A difereflcia de proe:triotas. parece ser \.-'\ fleChO eo~ &a ausence de teg.iones pallndrmlcas del RNA Que partiooen en la terminaciOfl de 131f3nser'iC)Ci6n, I.M earactetls.llcas para ceda RNApol son:
Tcrmon.xin de BN t\ vcd-1 <n <U~ariut~:
rnt~-"3-muna 1m11 l~r a
111 t~"mli...Citl tntrnS<'U de
Pf<~CIIriOCn,,
Utw pr(ltcin~ JI; PRUS3 '" o '"l'f(ltdnn c:rmil\adorn'" se un.e :o

~la'ICIIIli tfpcdfic!lf del ON;\ )'lk'licM d ll\'III)(:C fk la
RNApol.
lJtt:l \ 'I'J. tl~cnda l a poluru:ras.. la ~ftl:ia Oc Wlll r~pn rica <:fl ..:t~lallcbrn I'IOmolde fci fit:o l ~:onKin d<l RN;\.
tcn'llir.&OOn:
N(l h~y ~..S.~ p:olindr6tmn.
Rc:bl p en )c:\~rn.
rfF.t e n r~~thn. simitar .-..huma~
T RANSC Rl PCIN DEL GENOMA MITOCOHDRlAL
257
l'i'lltl1lla{'III
ds: 8: NA ooH 1 Cl'l C\ICIIri()lll~'
n'": O:atltlmO St.milur ,d dcpcodtentc d~: J) en proc~rMltlllo'. tn II'U J i tJtk'S Slli(l~ \knl ro> lk unu~~.rn!'li;~. regin de h:rminl!c)n" lu RN1 \pol u- dctwe.,:. lo'!uC putil.: tk bcl":: a "e~:uennas ~.Jf!e~:i(e<'b eu el O~A (la ~prottfnas de pauso..
qU(' ~ 1.u K'n &1 ON.-\. Una petlllci~. :;tm i lllr a p (d bccho. la pt'(lpu p 1;\act~'t'intU produ<"< el ll'II:U'II(l ;:f(!('tO m~,/,(>), SI: une al RNA indt~o::i~o.ndoo
w !<e~r.:in .
Ntl
pro)lcfll3
~md~e ;~p
ha) resiiln palindr6mka.
Tnnma.:"(m <!(. KNt\ooHU .m cnril)ca.~ tn~'l."<U'lrwtO smilar a 1~ emniiWICin inuen~oa de protarnllas. 1 u RN\poi se detien..- en U"Cuee~~'a"' np:dfi~,:; t.lcl ONA (M $.,. lmn en~onw ..do pm!einil:; tt rzt11tlildotas. Una \C( duudlll $)0hu~rns.J. In rrc!lencia de unn ret~.il)n ri<--l en T 1111 hcbrn tll)mulde f:clila la .~cp.r..cin d.:l RNI\.
I<NApot.-111
,.
No bll) rc8in palindrrnic11

Finalmente. e independientemente de 9$10$ mec<'lnismos. es impon.ante acelantar que el eXIremo 3 del R:NA tunC()f\81 1'10 OOttesponde al punto donde ler1'T111"1a la tr~c;rip<;in , debitSo a que durante la maduraan OO$lrH1<$c:tlXIonal se cona la molcula de R:NA recin transcrita (pg. 279) Por t$1 :t t.320n es menos wrtpol'lante pteciS311a terminacin 9n eu~<'$ que en pe~riotas. y t.aMbi&n se e.xpllca la dlflcu!tsd del estudio de las secuenoos y mecanismos de termii\CIICin euC<If"IticoS (pves C$ difiCil aiSlar los ltansctltos ptlmarioe.. de corta vida).
19.5 TRANSCRIPCIN DEL GENOMA MITOCONDRIAL

Como ya se na i~ic<'I(IO. et cromosoma Cltcular ml!ocondrlal humano. y de maml'eros en 99neral. es transcrito por una sola RNA.pot que est tormt~dt'l poeun SOlO polippliciO y que. para la "'telaOIOn. requiere la pte&eooa de un factOf' de ltl'lnSCriJ)eiOn mtTFA. El mtONA se lranscribe a panir de 3 ll)9ilres de inici~ci6n, dO$ pafll lt'l hebra !)&SaCia (H 1 y H2) y uno pt~r<t ltt lig~ (t), produCindose asl tres transcnlos primarios diferente& (dos de ellos comptomenl;;~rlo$ y COI'fespondient9$ a tOOO la k)ngdud <let CtOmOsoma. t6.5 kb}.los 3 promotores se EI"\ICuentran &lluados en la regin no codlficante de control o bucl~ O (p~gs 160 y 378). AUI'l se desOOttoee si el inicio en H t y H2 depende de un mismo promotor o de dos indepenc:!lontes ('princip{'ll" y se.eundttrio'), ui'IO de ettos tocta>~la <les.conoCiCio. A partir de~er IU!Jil'r de iflleioci(>n de 13' hoef;lt& pe~ (Ht) se ttans.cribe et ONA que eodrflca los tRNA~. rRNA 12$, tRNA y rRN A 16$; ta transcripan se debene Ira& este lbmo. mediante la partit.~pacin de un f;l<';tOr de tetmin~n (mTERF), Cuatldo la ttanscrlpc::IOO comienza en el segundo punto de inicio H2. localizado inmedalamente tras el tRNA"-. el transcrito prim<.'ltiO (L2) conlit~Ua ms all del punto de terminacin anterior. comP'e'tando el resto del
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258
TRANSCRIPCIN
cromosoma. POt taniO, el lugar de lniclaCi(>(l oenne Qu&til)() de RNAs. ribosmiCO$ o mensajeros. deben sintetlzarse: 1a stol&a::iOn del punto oe inicio ostb a su YOt r~<t POf &ilos hormtlf'ICI<S tiroidNs. Gracias a es&a doble unidad de
trtm:;cripcin la mitoo:~ndria 1111teliza mud'la mayor cancidad de RNAs ribosmioos que del .-eslo de proouctos g6niCO$ (unas 60 veces ms). (Co~e con ta Sluaei6tl aru'tiOga en el genoma nuele~r. conseguida grilCias a la abundancia de la RNApoH especializada en transcribir rRHA, l)g 251 )
A l)fr1ir del promc>1or do l;t hebr<t ligera se sintetiza una soia moacula (que e9 una hebta pesada, H) que sOto
oocific:a 3 tRNAs y un !TitNA.

los 3 transcrito6 prlmanos wfren luego maduracion para dar ligar cada uno a varios rRNAs, lRNA.s y mRNA$ maduros (pg. 284); def vanscrilo H se Oflglna tambin el ANA oeb800t para la replie&eitl <M la hebra H.
19.6 INHIBIDORES DE LA TRANSCRIPCIN

EXIste uf\8 sene de oompuestos que inl'liben la transcripcin al actuar sobre la RNA poiiMerasa a travS de distintos .necaniSI'I"'IS. Sol"' de il'lt~s deSde el punto de Wsta e.~eperimoet\t('ll y PQr su <iplie<tein oomo antibitioos. por n'IO$!n'lr ~ Cli$1in~ ~tividad SObrei3!S c6h,llas pn,x;ariQticas y evcari6ticas.
19.6.1
Antibiticos de ti po 1
unen a la RNA pollmeJasa, ln&Ctl~ndola de mocso dire~o .
Es.1e grupo eaui formado por los compuestos que se Perleneeen a este grupo:
Rit.lmid nas (prOOucidas POI Streptomyoe$ msd.iterrane:u:s) y sus derivados semi&lnttioos (oomo la rifamplcina}. que se unen e'Spectflcemente a la ~bunkla<l 13, de la RNApol bacteriana, l~o el InlOO de la ttansetlpcl6n. La petmanencla de la enrlma inac:Mtada 90bre el promotor impide la unin de otras molculas oe R NApol 1\0 modific('ld3!5 Sin cmb&rgo, tiC) tienen ofoeto $Obre ltts C>C)Imer&:SO'l$ nuc:te.3rC$ oocttri(JiiCM, por lo qve &e vtiliUin como agenle$ bactericida& fren:e e~ divenoos tiDO$ de ink.tcciof'ICI<&. la RNApol mitooondrial tambin es inhibida. aunque con menot potencia que la procaritica. E$treptolidig ina (prOducida pot SVeptomyces lydkus). que tambil'l se tija a la sub~ fl,, 1*0 inhibe 13!
el~in
L3 ((o~tm:..nitin:t es un inhibicJor e-specil'ieo oe la etapa de elOngacin de &a slntesls efe RNA en eucarlotas y no en procariotas. Su efecto inhibidor se ha emple-ado oomo -..n Ct$P9C*Q (liforenc:i<ldor ontre JH 1105 RNAol euc:;ari6tic:N (pg. 251). ES!e agente tl6co es un mecanismo de deklnsa de la 5t1a venef'Oia A~;; ~s. par<'l nit3r su ~OOn. La h lox6cacln no provoca sln40mas nnediatos. sino el deterioro de la funcin heptica en lo& dfao& siguientes, debido a la taita de produccin de nueVO& mRNA.s para la sintesis oootinua de proteinas.
19.6.2
Antibiticos de tipo 11 En eMe caso, la tran&eripcin se inactiva indirectamente. PU8<& el anlitli64:ico &oe une at ONA impidiendo la uniOn do
1.8. potirnetesa o bien su 8\lanoe. Por ello, se Inhiben por Igual todas las ANApol. asl como las ONApol (es decir. la rePicacin), ste es fl easo de la aetlnomlc:ina D. Sintetizada por vallas especies de Slteptomyoes, tonnada por dos
e>ont<'lp6Piid0$ Qclioos unidos a ul'l sistema anular plano oe lenollzona. t:ste se inlercala et1 la doble hlice del ONA. entre dos Pt're& de b35ot:5 G;.C svcosiYos. OCfonnando el DNA. Al mismo tiempo, tas dos estrucl\.W'aS pentapeptldlcas clcli~ abt<lzan ola doble llCiicc. silu&ndose en et ~co menot. ES!a alteraei6n lmpi(le e1 mcwimlento de la DNApola 10 taf9o 094 molde. la actinomicina O e& mvy tOica, pues impiQo ta f~On do los (:(1~ 3biertOS, tliOqueMciO el paso de c:ualqUlei llpo de pollmerasa. Al Inhibir la elongacin en clulas nlactas y en extractos Qllulares, es ~ til pata kflf!ntlftcar prCIOO$O'il oelulares que dependen de la slnte&l& de ANA
INHIBIOORES DE LA TRANSCA:IPCtN
259
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Otros compue$to.s mtercatantes son la a"idi na y $1.1$ derivadO$, Qvt itll'li~ la $intes.s de RNA oe una letm3 similar. y lo d<~t.momic:i.no y sus derivados. que se emplean oomo qulmloterapeuiiCos en dt\'ersos bpos de canear, ya que actan preferentemente sobre c:lul<l&con cu.,cimiento r~ Por Ultimo , el bromuro de etld.lo, de uso comUn en el laDOtalorlo para la tlncl6n de ONA en efft(;troforcm (pg 138), ~ lt~~ un agente .,_,en:at8tlfe {aunque 1 '10 emple3CSO como MlibiOtieo}, IO que justifica su toxicidad, que debe tenerse en cuema durante su rnat\lPUiaein
dox<MTUbtclna o ndriamtetna
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19.6.3
Antibiticos de tipo 11 1
Los anlibitlco$ de tipo 111 son l<lmWn inhibidoros indirectos. Qvt "c:IUM on este C3$0 im()::ttldO lt~ <'C(i()n <!e l<t DNA gl rasa procaritica. la enzima que inl!Oduce superenrollamientoo nega6YOs en el ONA (pg 152). Se comprueba asi que e~os son necesarios para la separaun de las t.ebr89 de ONA. lo que penn!ts la repkacl6n y la ttanscnpclon lO$ (lfQ;iP<'IIO$ M~i(l()$ ef'l e:$te grupo son 13 cumemtici na. 1a novobioeina y e1cido nal tdixico
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Tema 20
Control de la expresin gnica: pretranscripcional y transcripcional

20.1 lntroduccJo gc.neral a la rtgulaeiM de la expres&tt gnlca ~-" --..- ...- ...........- ...........- ..................... 2$1 20.2 Control Pf"GI~I\5't'ri pcio nal ..,.._ ,,...........................,_ ,,_,,,..,,_ ,,_,,,....................... ,_ ,,,............................................... 2&3 20.3 Regulacin gentica de la transcripc;in ........_ ,_,_,,_,_,..,, ........................ ,_.................................................. 264
20.3 1 ElomeniO$ Que actan encfsy transcomo reguladores de la transcripcin.
20.3 2 PromolOft$ de lOS gene-s de Clase 11-...... - .............................................. - ........ 20.3.2.1 Secuencias o elementos OO~Ie; del promoi<W . -... --... - .
.... 264
. .. 2M . ........ 265
20.3.2.2 Secuenciesoelemen\Ospro-..nales ... ... .. 265 20.3.2.3 Secuencias oelemenlosci:stales , _ .,.,_ .., __..,__ ,, _ .., __.,. __,, 266 20.3-.3 Factores de transcrr.>c;i6n de Chl$0 11 , ,, ..... ,.,_ ... ,,_.., __..,_. _ , __.., __.., __, 266 267 20.3.3.1 FaC$0resclettan$Cripangenera!es ...... "" , a) Ensamblaje oonsewtivo de bs factores gener;:~les {modelo es~OM) 267 D) Modelo de la nOioenzlma_... _.. _,,_,.. "'" ... -... -.......... -... - ... -... - ... 267 20.3.3.2 Factores de trans.cripctn proJOmale& 269 20.3.3.3 Faaoreg de transcnpciOn inctu.cibles ...... ..... ,,. .,. .. ... 269 20 3,3 4 lntet~iOn de los taetores de IIM.Sc:t1pcln oon la pollmerasa.... 270 270 20 3 35 lniQ0Ci6n e l&~tanseri)C(I a 1)*1ir Cle Cliferen~es protnOlores .... ... - ...... - ... ~ ... 271 20 3 4 Rog~o~I<'Cin de la lr;)nscriO(in c:se genes de ela ~sl y 111.. - ...... - ... - ... - ... _ 20.4 Regu1acln eplgentic.l~., -.,_,,_.,,.., _, _ .._ , ..... _ .._ ,_, _ , _, ...._ .._ , _, _ , _ , .., _ .. ,........_ , _,,...._ ...., _ .." 271 20.4.1 Metlacitl d~ ONA y control de la exptesin ... _, _,,_.. ,_... _... "'" ... -... - ... -........ ... -... ~... - 272 20 4 2 P.11r6n de metii3()fl Clurartte el <teSarroiO ... -... -......._ .,,_... _.....,_,,_,,_ ,_ ,,_... 272 20.4.3 MeblacinycnOE!'I' .... -... -... -...... -... -... -....... -... ~...... -... -... -...... _.. .... ... .... .. ... -...... 273
20.1 INTRODUCCIN GENERAL A LA REGULACIN DE LA EXPRESIN GNICA

U v.;in global del control de ~ e)(presin 9$f'MC<l 95 especialmente difiQI e:n evct'riolil$ en general. y en organ1smo$ plurie4Jiul.;~rG$ on Pilrticult~r Por &jtmplo _t~vnqve tc.xl<t:$ l<t$ ~ul;t~$ hvmMM eontiol'tt'n ol mi$mo go;noma (salvo mutaCIOnes somlicas). emten daras 6ferencaas frente a las oUa<s procaritica&. Es ca&t un mlsteno el hecho de que ta<s ~lulas de organismos complejos. procedentes 001 desarrollO de una misma oUa. (el cigoto) y conten'Eindo un ONA ldnbCO. sean capaces de expresar funciones tan diferente& y \mica& en cada rgano o tejido parucular. Es18 enonne lleKiDili<SBCS et1 el control oe sus genes vie-1\e Cleternw~acla por los ~tes tipos ae e~preSJM grtH:ll diloronciiJJ:
a) O.Sbr\tos tipos <Se clulas en ea.:~a especie y. Cle;~tro de 6S-taJ, en e~a rgano o teii<lo En humMO$, $0 eillcutt~n unos 200 tipo$ cetuhlrC$, agrupCII(JQ$ en tamilit~s- segUn su funCJ6n Hpocifica: ~ epiteliales. contrctiles. sanguinea&. del sistema nnunitario. sensonales, neuronales, etc b) Variedad en eJ nmero de genes en cada e&pecie. En humanos. el tol81 de genes pareoe ser del etden de 75.000 a 100.000. aunque recientemente se dan dfras an msolsoordantes. entre 30.000 y 200.000 get~es. <:) Proporc:t6fl de gel\es expresados en e&da tipo celular. En humanos. una eerula SOlO eJCpreSJt. en eo'ldl'l momenlo un 1020% del total de g6f'les: es ceeir (aSUtnienGO SO.QOO.HX>.OOO genes). solo $e e"'";)n entr 500 y 2 000 gones en cada clula. d) lnftuena:a &Obte la expre&tbn de cada gen de los esta<ltOS del ceclo de dlonslon celular y del desanotto del Mrviduo necesidades metablicas o de otro bpo. respuesta a agentes externos, etc..
262
CONTROL DE 1.A EXPRESIN Gf.HICA; PRETRANSCRIPCtONAl Y TAANSCRIPCtONAL
Oentto ele 9$195 posibilidades. es de destacar la vanaciOn de la W~pcesl6n genlca Clurame el pri)Ct$0 do d!fetencaCIOO oolular, es decir, la a<lquisiCiOn de propiedades esp&efficas por parte 00 las ditvers.as ~ do un organismo, que tiene ~ durante la embrlt>oene:si$. Ello tl,ece que exi$1/Jn Qell:et ~JV't no responden a cambio
li$iolt\giQQ
~o o ~
pOr Ql oontr.. n io, ftln sometiO& a "*1e oon1rol como Q)(l&eCUencla del desarrollo animal o
d4:l! tejidO$ en orgni$ti'IO$ oompletO$, La n\M'Jifesutein pmcipal cte et;'* !le~ .,, ta $1Cpro$!n g6nic;a " la ap~nCII'I en ceda ~ celular de proleinas en P'OPQ:iones diV91'Sa&. de$de muy elevadas en unos c.asos a mliY bafa1: en otros. D&do que &8!1 proteina$ condicionan las pro>ledades celulares 1 arqulwct\.U celular, aCIIvtdades enzimatiCas, propi~d~ fi$iol0g~ ntetaC(Ic)nl))t'l el 3mbeen~. etc ), IOdO to N~teriOr ~e deeif que es varia~* 1<'1 proporcin de genes implicados en la rorm~in do prolei~ pum un<J <'"AAOt"*Wd<l 1tsroa o ft.~I'Cin
ve<~tll dtt 13 OIQM!Utein dG c61vl:t& oo tqjidos y
r......lrl., f!t\"tiii!H C()j!Jii..llll

CICUd);ICo' htib bun
Jl!lf ,.,.,_ " " -
lA exp.esion de los. genes de un Ofganlsmo superiOr puede set regufada a <tiStinlos niveles. Desde et punto de patolgtco. os. wnportarne re:saltaf que la a!tefilci6n O. cu<'IIQvior;, diJ 10$ J)MO& impliC~dO$ on la Ol1Jlf0$i6n 96nic<l pueden causar enfermedades.
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NIVELES DE REGlAACIN DE LA EXPRESIN GN>CA EN EUCARIOTAS

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CONTROL PAETRANSCAJPCtONAl
263
El e$1Udio en prol\lndid<l<l de ~ e:$10$ niveles de QOntrol <tebe Moetse et1 lr.lt&c)()$ ospe~{:ldos En e~e lelltO slo trawemos de desglosar de forma paulatina lo esenCiaL cada uno de elos en &u eotrespondiente proceso de expreson genu (temas 21. 23 y 24)
20.2 CONTROL PRETRANSCRIPCIONAL

EJ nJclo de la transer!pcn requiere que la maqulnana mo6ecular responsable (RNA po!imerasa y factOf'es de 1ran&eripci6n. pg 264) pueda ,a,coeder lisic.ment o le bNes de 1., flff)f1 <le ONA que se ha de uanseribit. E.IO supone la desoon<lensaa6n previa del cromosoma durante la interfase del ciclO de diwsin oelul<lr (E)ilg 98). tn001-81\1c mec:anhmos moleculares an no oonoclttos exaaamente.
La uatkSC'/ipein oo puede tener lugar sobre DNA en estados de condensaocion supenores a la fibra de 10 nm {r0$:uio Cle nuC:IeOSomas, pag. 35). En ocaslone5. el ONA se puede 1ranscnb11 wando M encuentra bajo la forma de co~ con las hls.&onas {nucleosomas}. pero tarrOM puede ser necesario que ~os se desensamblen para permitu el acceso al ONA. En 98""''"" 1o11 ~ibilidt'ld del ONA 1 3trMScripein o actividad ttanscripeiOn.al de 111 cromatin:a, est relacionada estrecflamento c.on .. 9'34<> de c.oncsensaei6n (&)hg. 87) y puede valOrarse experimentalMente por la sensibilidad a la acCibn de ONa&aS. Se pueoe 001\Siderar que el acceso al ONA neoesario para la transcripon es una combnact6n de tres moc.nismos a) Posicin precisa de los nucleoso m.a.s.. El reoonoeln'lief'lto de las secuenciss ptOn'IOtOf8S del ONA por lOS factores de ltan9Cr'lpcl6n (pg. 264) puede tener lugar. al menos en alg\ln caso. graaas a una poSICin muy especfica de los nvciC0$0t'l'laS Cle !Offl'la (1\le t8I&S secuE!f'lcias queden en la regln lntetr'KICieosmiea (ONA espaciador o Ntlk.er. pg 86)0. si fortnM pMe ~ nuoeleOSOO'I<'t Qv&Oen orienlaCitl$ ~~su $4Jpet'lic.e ~~~ma
(J{ii rc!llooe'o<k' ll A i<;~..,d Pb.!r lll ll(>;vce;;:la lmc.JI of,lo.IJn l'lht/0111 Cft
d~ (lq .ucb pcnMC'. fiOJI
cjtmf!l.,. nll.c'~ t l)ll un m~t~oo pr.x..-.u. f"a<" dtiOI!!Knp:ionl
b) Reti.rada de lOS n uc1eosomas. Tanto el teconoeimle.nto de 1aa secuenCias ptomototas por lOS tac10tes ae ltan$CflC!Ci6n oomo l.;l unin y 8\ranott de 18 RNAlx'lf pueden requerir 18 liber&On d~ las Mtone:s o .;ll menos ul oesplazatniento de los nucleosomas. para hacer el ONA aocestie. Se hM et~conlf&():) >rOieinas ca)~es Cle erectv<'lr esle ~remoc.kllado de la croMatina-. gtaiM 3 _, hidrlisis do ATP.
AOP P,
e) Ava r.ee cOMpatible con l,a presencla de n ooleosomas. La IUinsct'lpCIOn pueoe tel'ter lugar E!f'l regl()tles oe DNA con nucteosomas Integras: posiblemente, && A:NA pollrnetasa se desplaza a 10 largo de la nflta ese 10 Nn . lransetlblendo una Meta gr&eias a un desensamblado parcial y revei'Sible de lO& I')OCieosoml'ls
fi 1A>II11J
Al ltecf~c .. RNApc,l. ti n~J~.,'SI)l'l!a ,e dcs."lt'l:lmb&a pm:iodnletll~ ('~nliC'tU;: , ~ ~

lill.~nd11 qw ... _ dc'flllll'll b
Una \ <!'/. q11~ la n~o;ma N

lF.llboC'ritO \'Se' lrw'IIO .k UNA l>< fOt'lloU\ 11)'<' d nu<:lobOma.
mi1;W ik lns hi~1on:1~
ok la ptrtk\Jb
nuclo(~ ll.ir~ 112AIi211).
REGULACIN GENE'rtCA DE LA TRANSCRIPCtN
265
ptopa RNApol en el reconocimiento de la secuencia del promotOt y se encargan de la tegt~aeln de 18 trans~ion . Su <iversidad Et5 aUn mayOr que la ese promo4ores.IO Que l)em'lite la gran llx:ibiliMCI eldstente en el conlrol de la expresin de los gene:&. Los TF$ wdenominoan tombllo "f-Ktorn que <11<:1\.lan en tr.;~n.s o fc;tonts Vc1ns~. pue5 sus gene5 e&tan en po$1CiOn a1eaaa y no relecionade oon aquella regl6n genca cuya e.xpreSIOn r~. & eapaei0$0 ae unin 3 1(1 moi6CIM ~ ONA. easi Siempre reC(l(IOCiei'IOO Cie.ta$ secuencio de ba~. e-:stb 9~et'Sime:nle mediada porQut l<t PJ$$enc:aa en la$ molculas de TF de motivo5 estrvctvrale5 de \lfl...;n al ONA.. oomo do<IO$ de z-'1<:. homeodomniO&. etc
(pag 60).
La especializacin de las RNApol eucatitlcas pata ~tansetil)ir slo detemW\adOS gel\e!l (p&g. 251 ) ~iel'le <Setermnada por la regulacin de estos genes por secuencias promotoras y fae1ores de ltansetlpciOn <Jo.leremes. Antes de describir 10$ pormeneteS del CC)(IItOf <M la transcripCII'I de lO$ g.et~eS de dase 11 eonvieo:r'oe reotll)ilar 13 terminoic>gia empleada para 1M mo16oo~N que inte~ Se <'istingi'O <'!Si cntrepromO'ores pa.~a ge.~ <.1!&13 c:l(l$C 1 , de la Cl!'$0 11 y de la clase 111. Los factOtes de transcrip(;iOn respectivos se nombran oon las inic~ TF ~del tipo de RNAPOI t(l(l l<'t que pueden actuar (1, 11 o 111) y una letra que lOs ldentlflca (por ejemplo. TFIIA. TFIIB, TFIIO son 31ac:tores de trt~l'lsetipciOn para la RNApol-11). genes que ttanscrlbe (ONA) declase f ~de ctase u de clase ur fil!<:tores de transcripcin (protetnas) TF! TFII TFIU
pollmerau (enr.lma)
ANA~!-!
producto g9nic:o !ANA o ptotelna) rRNAs de 285. 185 :z: 5,8S protelnas y snRNAs tRNAs. rRNA-5S y RNAs pequenos
promotor" (ONA) de clase 1" de a.ase 11' de C185e n
RNApo!ll
RNApoiIU
20.3.2
Promotores de los genes d e clase 11
La regulacin de tos 9900:5 de cla&e 11 (transcri!Os por la ANApolll) es del mXJmO Inters por ser responsable de la sfnlesas de los mRNA y. por tanto, de la sintesls de todas las prot.elnas. Sus promotofes se localizan tfplcamente en diteceiOn S' (ton"iettte an'()a) del eriget'l de transcripCin y MUe<!V&n uM M8yOI variacin de s:ucncia que IQ:s promotores para RN.Apol-1y 111. Los promotores en genetal. pero de forma caracterislica los de ase 11. se pueden dl'ldr en 3 tipos. oe acuerdo con su aoein y su ubieael6n. Su funcin se comprender mejor al estudiar lOS faeiOres Cle ~.rt~nscrlpciOn (\le se unen a
enos
20.3.2.1 Secuencias o elementos basales del promotor
El promotcw btlt.al CQf'npren~ 1~$ sect.enci3s Que dfJiimm el punto de NNCio de la tmnscnpcln y son NnPfflf(;indiQH.$ Pilrtl ql.'9 4sttt oo.rruenc. E$ una regin sulda en POSieiOn adyacente al ortgen de ltan&etipciOn. oorrwnente coniente arriba hasta la posian -30. Dentro de esta reg161\ puede distinguirse como m6 Mbit1.1011 la secuencia TATA, caja TATA o caja de Hog.ness. sll1.1ada Uplcamente atre<le<IOI' posiciones -15 a 25 (no debe conruMirse oon la taja TATA de proc::arloW o caja de Pril)now. oon secvonci<1 consen&O TATAAT y &lluada en -1 0t. 011<' $OC\14t0Cia b~sal fre<:oent est;asecuenc iniciadora lnr. situada sobre el ptopb origen, entre 3 y 5
de'"'
promotor b.'lsal
En ousionos. ol promolor de tm gen se califiCa. de acuerdo con las 9ecuef)Cias flat:ales que proscnta. como de llj)() TATAII'Ir. TATAfnr-. TATA-tnr o TATA- Inr-
20.3.2.2
Secuencias o elementos proximales
Genera!Met'lte. el l)r'OmOIO r ~31 no es suficiente por si mismo para pt'CWOC8t el !nido de la tr31'1$Ctii)OOn. sino que se reQuiere la il'ltet\'eneitl a4icion t~l ele otra regin conocida como promocor )fOJ(Imal. ~ste esta oereano al promotor basal. pero mas alejaCio <:orrienle arriba del ongen. oomOnmente entre las pos;ciones 30 y 200. POr tanto. esta rogin
266
CONTROL DE LA EXPRESIN G:NICA: PRETRAN SCRIPCIONA L Y TRANSCRI.PCIONAL
de ONA suele $91 de m&yor u.molio ~ ta * promQior basal. Los eternet~tos proitl"'ates no ~peeiflean la posieiM de Inicio, '!o que del~ la frecuMCiit con fa <N/19 .se {)(0(/IJ~ eJ rrn*<H lit fnM$criiJt;in. Ello os posible gr<'Ch~s e qve sobre ellOs se \.W'Ielft daver&OS factores de transcripcin que faYOrecen la interaccin de la RNApol-11 con el ONA en el punto de inicio y su .CIJvidad etttim~lica. Aunque el\ general las secuencias son mas valladas que las basales. &as dos ms caracterisbcas. son 13 e<~jill o s ocuenc:it'l C AAT, cn~te 60 y -$0, y la caja GC, Qull) ~1)-reee en eoj)i3$ mUUii)IO$ y oon cualquier orientacin a ambo$ lados de la caja CMT
scc ncm
(o(
.. .ten..:1a .'\:\1
1-120
l -90
20.3.2.3 Secuencias o elementos distales

t<t epro$10on ~ nlgunos genes sufre una regulaelon aun ms compleja. que depefld& de &eeuencia& sitvatdcts a gran distan~ del p.uno de inicio, ineluso de varios miles de pb, eotrienle 8ITba o corriente abajo. Esto ocurre especiaiiTJ91\te para los gones i nducib!fl. aqullOs que no se expresan continuamente en la clula. sino cuya xprotit sufre una regulacin amph'a y pr&Gisa como r&5puesla a di11'61'$.9$ .w~.s (POI' ejemplO, las llonnont~S et!eroides y tiroideas). A~ no se suelen contemplar COme) tales. o,..s .socvenc:i*S promo.oras det:lef'l tamtlif'l oonsiderarse parte del gen, atendiendo M conc:epco funcional de ste (pg 244), En gener.~t s-e 1M l!t\m.& secuenci as promotoras d ls~ales , por enoontr.trw 310j~das del otlgen, o tarTlblen, de acuetdo con su funcin. e-lementos espeelficos de regul<~cin, mOdul O$ do control o e tomentos de respuesta.
Estas secuencias prornoCoras son rroy variacJas: y especif!C<'IS para cada gen Otta pattlculatfdad es que actilan tanto activando la transcriPQ6n c:omo re.Qucindola. De acuerdo con ellO, se c:lasifican en dos tipos:
Potencladon~s . aaivack>res, intto$ibdoros. amplificadores o estlmutadOteS fltlhancers}. Pueden aumenlal rru::ho la veloac&ad de inicio de la trnnsc:ripcin (y, pot" oottSigulente, 18 del proceso completo) conseguida a partir de promotores ba9ates y proxlrnaleuitu<Kbs en la misma mol6c:uta de ONA snenci.ctores o ~es (sl~Mcel'$) el ofr.cto opuesto, generalmt!t\le porque toe laetores de tr3n$<:tipc:it'l q~ se unen a ellOs c:ompjten con la accin de lo$ espeeific:OS de los promotores poterw:ladOteS y proxim.ale$
Ti'*'
Los dtmcnt~ distaks pUt:dcn ~11.1.r ~P'lrfl~ del promotor por ''11ri~ mili!:' di." pb
~=::1f~Jt:1J~)~CO~J~.. ~Q(~O~l~jm~o~h;~>~;=~
dispcl"o.I)S. p...-ro pr.mO$ ni orien, d~emunan la l'rccu~neialk inici: se di~uibuycn aprox.. cncn: SO y 200
rrxin'h)i al origen. determinan el

punto d.: inic.io; e di~Lribuycn
~km~m~ d.: ll('cucnda muy
<;r:NDO!'~ql:
lus12 30 o 40.
<~=:>
Ekntl'"")'l d15J;tlr5 <ft01rada.;loro y sjkocydoo:s1 prximos 0010: si p::ro II.IC-jlld(ltl dd (ln$Cn: reaula.r1 1 2 dioc.: del inic i de latral'lSCt'ipcin. se distribu)'CD \'TI un mati?('D d.: unol! 100 pb
20.3.3
Factores de transcripcin de clase 11
La RN~II iMeracclona con gran variedad 00 t;teto1es de lfanseripcl6n (TFU) dependierxto <191 gen. habitu.-rmente de forma s;muttnea con !Al nmero con:~id(1111Die de ellos. E.stos tactores se pueden cla<sificar en generales. proxi""*" e indueible$, de acuerdo oon su unin a unoe k>$ 3 tii)O$ oe tecueoclas o eleomentos promotOfOS recin e&eudiados So cstudittr$n a oont!nuac:iOft con cierno detalle los que actan sobre el PfO<IIOt TATA. mept
COOOdOOS
REGULACION GENTICA DE LA l RANSCRIPCtN
267
20.3.3.1
Factores de transcripcin generales
R~iben e~e nombn:t k.lo$ TFs que AK:Onocen IOG elementos basales de un promolor. Son prot~iMs muy conservadas evoliJiivamente. que promueo.oen la lormaCIOO alrededor del punto de IniCio de un complejo '*"rmolecutar. Wt tu~ et t)t()ti'IOI.Ot WMI. 10$ proPQS lF 94)ntr&l$$ y 1<1 RNApol+ll Se puede decir que al reoonocer el promotot basal ach.ian de mediadores para que se fiJe la potimerasa. de-finiendo asl el punto de inic;.o de la ttt~t~$t;ni)Cin y actrvando a la enzima para que oomience a sintedzar el: RNA.
Se conocen las funciones de algunos de los factores de ttanscr1pcl0n generales asoci:tdos "lt'l RNAPOIII
TFltO. $1 ms significativo de lodos ellos, es el: nteo con especdiCIOBCS pot u11a secuenci3 dO DN.A. lil de lt~ ~ TATA. A pesar de eJIO, parece actuar tamblen sobre prom~ores que no ~Jef'len c:a,;a TATA. Este factor determina CI~IC lt'l RNAJ)OIII t'ctOc a Vl\;l cioi'Ul dist<lneta del promotor. dei'Witendo eJ punto oe lnleiG de la ttanscripci6t'l (nuelelido 1). Tiene un grM ta~ (mt~$3 mOiecvtar cercana a 800 k.Oa). al estar formado por dos tipos de QOmponontc:; Una molcula de T&P. o "proteJna de unin a TATA. (rATA 8Jtt<NI'I{J Ptotein). que conl'iefe a TFIIO te eapacidacf de recono00119nto de la secuencia pomotOf'a. Su uniOn a Mta es e-.1 priMe-/ paso en ltl fOtmt'ICI6n deJ complejo de Inicio. oon la pamcutarldad de unirse 8f surco Me-.r\Of Clet ONA (CI diferenc:ial de ta mayotia de protoinM. Qve se \Kief\ al ONAen el surco mayor) y provoca la Rexion de la mo6ocula de ONA.. Varias motcutasde TAfs o "factotes asociados a TBP" (T8P-assoclate<t fact()($), chfeten1C$ ontr& si y~ pueden variar para le unin a promo(ores C11ferentes. Son subuniCisCies Cle 30 a 250 k03 QuO lorm(ln Pttrte oeHFIID en oomero <)e 9 a 12. tipicamen.111. TFIIH es partiCUlarmente Importante por su dOble activlc:Sad eruimatiea. oomo heliei'$<'1 y como proteint~ quinasa. resiOentes en distintas sul)unidl)des U hetic;lsa esto\ .-nplicad<l on lt~ separt~on de las hebras del ONA en el sitto do inicio. necesaria para el aoceso de la polimerasa a fas bases. rr.entras que como quin.asa 10$10t\la e1 dOnw.c> C.termI'ISI de la subunldacl mayot de la ANApot-11 (CTO, ptog. 252), provoca~ en 6s!a un cambio ~nfonnttQOnal que~nduce ei comienzo de su desplazamiento a k> largo oet ONA. la separacion de algunos TF$ y en <linitiv'it. la llansiei6n enlre et iniCio y l<t etongt'e-On de 1<'1 tr<mscnx;in. Este factor de lranscripCin es tambin singular pot intef\tenir en 1<t reP&ri!lcin del ONA por esasin de nuclebd06 (pg. 359). P.ara la fonnoon det compleJO de inicro se han propuesiO dos mecanismos. cuyo resultado fin,.l es et mismo
a) Ensamblaje consecutivo de los fact0f9s generales (modelo ~esc~kmadO'J

SegUn esu. hii)te&l&. 10& TFs y la ANApol-ll se van asocianao a la reg.on t)tOf'l'IOtON'I en un Q~ orden uno tras otro (pig. 268); se oon&ldeta que cada 'actor va establecietldO un complejO oon lit estructurt~ adecuada para que se una et $igc.Jiente Le~ fQrmnoOn delcorrdeiode intciaan corr.enza ooo la unin de TFIID al DNA en la .eeuenoo TATA y .a oontinuttcr6n. so vcm a:sociando tos factores TFtiA y TFIIB, que permo.ten la unin de 1a poli"'*'M<' junto <:On el faaor TFIIF, y fi~lmente 110 mcorporan TFIIE y TFIIH:
b) Modelo de la holoenzima
En C:$t;) t...x>tc&is attemativa. tambin apoyada por estudios In !litro. la RNApoMt se a$0Cit'1 p1evramente a vano$ factofes de transcripCIOn. formando una enzwna actn.oa u h oloMzim:r quo luego 11o9 une al ONA. en la secuencia prom04ola defma polla unin del TF 1 1 D.
EJ re$UIIado es el mismo comi)ICjO ~ inici..On que en el modelo esc:a!Of'lado. que )Ormito ti comienzo de la transcrlpei6n. y la polimer3osa fuogo~ abandonaria y avanza1ta IgUal que se na it'I(:Sie;XJo on nqoel modelo.
REGULACIN GENICA DE LA TRANSCRIPCIN
269
20.3.3.2 Factores de transcripcin proximales

Tambin llamados faaore& de unin oomente arriba, &On protelna& que reconocen especfficamente los elementos prolOITiales del proi'I'IOtor, oontribuyendo a aumen1 ar la ellciencla de formacin del oomplejo de -.:lo o favoreciendo su activicSM sobre la pol!metasa. Caca ptOfTIOIOf en particular requiere un COt'ljunto preciso de estos lactOteos para su elq)Ie&in plena. Como eje~. et faaor de ITan&eripcin CTF (o t-E1 ) intera.cCJOOa con la c;aja CAAT. siendo aparentemente el mximo responsable de la ef.lcienoo del promotor. mieniTas que el factor de transcripcin SP1 se une alas cajas GC.
Los promotores que slo oonlienen elementos reconocidos por TFs generales y proximales oonlrolan los llamados
~.s t:OriStituliVos , aqutlos que se eJ~P~esan de una fOtma eonst.ante, a la misma velockS&d ~ 1000 momento de 1~ vida~. S. &StM1e oen.Mmente que ftle oon<::eplo es sinflimo de ~nEJS d~sticos o c<~s.ros (houseA:eeping
genes), aqullos que &e expresan en todas las clulas del organismo; el nombre se debe a que codifican lOs ptoduclos que aseguran las funciones indispensables para la vida de la clula. Ambos conceptos Incluyen t.anto genes que se transetlben oon elleret~cla, porque sus ptodl.lctos gnieOs se pt'edsan en IOtma acundante, como genes que se ttansetlbetl a baja veiOcklaCI porque sus productos se neoe:silan en pequel'la canticS&4, pero $iompr~t de form;l conlinua en ambOs cosos
expresin rcguladll
(gel)($ indi)Cibll:ll)
~.xptcsin
bssal
(ge:ne.s ci'IUJtutl\'S y ~l)ts mcluc!Mc~l
- . . . . - + - . .regin . - rc~uladora + --- + --dd b"Cn ..____

1 1 ol 1 1
20.3.3.3
Factores de transcripcin inducibles
tct ten:;er grupo de f<tctore; de transcripcin lo conscituyen aqullos que reconocen los etemenlos OiS~ del
ptQmOtOf Alli t~c!Vt~n de forma similar 01 10$ f...ctOte:& proximales, es decir, fat*lando ta formacion y actlviC&CI del complejo de ~n.cio de la transcripcin o, por el contrario, d!tlcu!tndOias, regutan, por tanto . la lfai'ISeriPCi6n t;)nlo de
forma posittva oomo negativa {08 acuerdo oon sus promotores. sean potenCiadateS o sue~iadores, l)(lg 266). A difetencia de los generales y proximales. estos factOtes oe transet1pcl0n no esta.n prese.ntes en la ottAl de forma contn.aa, sino que se sintetizan o se aclivan en momentos eS()f!(;lflOOS o et'l tejidos P<tr1icut;nes Como consecue~la, ta expreSin oe los genes cuya ltatlseripciOn cor'rolan eslil igtl31men~ rogut~ en ti(lmpo y espacio, es decir, se exp~esan activamente en ocasiones y no 10 naoen et1 abSOluto l'! OIT3S; oon fr.cuMcial. en mvchos tiPO& oelutares~.~n gen concreto no $t: elfeSa nunca. Se lOs llama por do genes inducibles {poi oonlraposecin a 109 genes
OOAJtltvWos). rogui~IHN o d9 xpr$$16n diferncl<~l
270
CONTROL DE LA EXPRESIN GENtCA: PRETRANSCRIPCIONAL Y TRANSCRIPC:IONAL
Como efemplo caracterlstlco se pueden ctlar loa receptes nudeates para hofTI'IOI't3S asteroides o tlrotdeas. La umn de In hOffllQ(l<l .;:t~fl'lbi{l lt' IXlnJOrl'l13ei0n <fol r~p~. qvc &etV~ ((lm() l<'ctOr do tfelnS(ripei6n ~ 00tn(lt<\f su
afinidad por ciertos promocores dist.Ms, denomin<Jd$ el emntos de rnpuesta ;t hormonas (HRE). Como oonseeuet~eia. se acttva o se blOquea, segun los casos. la lnlnscrfpd6n de genes esp&cltk:os, los ptOdiiC&OS Pf"''6COS de C$10$ gene$ ropre-sen~:&n J>*f!!il<' t.:Ua 61 mt.e('lnismo de respuesta aJa hOrmona
20.3.3.4 Interaccin de los factores de transcripcin con la pollmerasa

Cabe pregunt.arM cmo lo& f<.~ctores q~ M t.WlCIIlet promoloeftlcjnnoll <JIIoriQon de t:roos~;npci6n puQdon pariiCIJ.)af en el oompleje>de iniCio (mecanismos de regt.Cacln a dlstanae). Pata ell~rlo se debe considerar la .,x!bllldad de la ca&AII de DNA, que ~ p&tm1ll1 la aproJUMadOn fl.Sita de lOs tres tipos de seeuendas promotoras a pesar de su tejnnl~ ~ la *IX!ncia lineal de DNA
s
FIU."t(lt(';j; d~ lr.lt&'tlpo. i indudblrs. unido5 o k>~ ckuu.tto,. d.stuks., Jc
tll)II.\1 111CIC'm
O. c~<'l t0m13 lO$ 13CIOre$ de lt'41n$CI'\pei6n unldO!I a las reglones basal, proximales y t!itale9 pueden oonlactar
entre $1 y eoo la RNApolll, por lo que partk:pan a& unisooo en el oootrol del W'IICIO de~ ttan9Ctlpc.6ft.
AJgunoG TI=$ no intoriiQCionon d~~el11rl'llltnle con la polimerasa, sino QUt hacen de~ emre ()(tos lFs. Se han lden!Jficado PtOielnas o OQmplojos dCJ JWO'qino$ qut: Q)Operan oon k:$ fACIO(e5 adlvadOfeS, oooeet.Mdofos COf) la maqujn:ana basal paret f~ lit trt~n&cnpci6n P()f 0$1 tt f<'ltOn. ~~e oonoeen eotno coactt\fadot~s o cofacc<>res g~nerales; entre ellos se incluyen tos TAFs (pg. 267). qu. we<:on d$EimpeMr un ~>el O. mediOO<ltet en 18 inlef..c;d6n onlre b5 t;,ct()fes gef'!er:&les por un lado y los faCiores prox!ma1es y d!Slales por 0110.
20.3.3.5 Iniciacin de la transcripcin a partir de d iferentes promotores

La inic:tacin de li) tr;;.nl;r;ux;in en promotOre!'l no bailados excluSiYamE!ffle en la ceje TATA (Pg.. 265) tiene lugar oon CMaeteristlcas. ;~Un~ conoc:di!$, 6rlocntes a lo1S estudiadas. En los promotote:s basados en ~a secuencia lnr p<~ro $in <:ttia l'ATA (I"ATJWn r+), la rormaciOn dei oo~jo de OCiac66n uene lugar cuando &e unen ar1 elomen1o lnr t~ro5 de transeripc:in 4J$~1fle0$ .;mP, p101 einas de unin a IN). Enlre stos se eDCuenltan TAF150, TFU ~I, VY1 y t propi<'l RN~Il POr Jo dertlil$, 61 prOOMO y tO!I ~rime,niO$ dt unin de f&eiOteS de transcnpcl6n para el inido son smilares a los promolores TATA+ lrv- Y<l
e$tudhdos..
En lOs (>fl>'t'IOI.(>r~ que poseen ambas secuenc~as (TATA~Inr+) , entran en fU890 tanto la TBP como las IBP. dando ~~ t~la tormaci6n do oomplf:!Jo$ '''rll)' es!ables. E.i$ICJn lncltJ$() PJmQIO!$ qu& no lienen ninguna de 1M dos seeu&.nelas {TATA-Int- ), en ellOs no se &.abe cmo tiene lugar el inioo de IC'IIJ();I)$CriX:in
REGULACIOH EPtGEN~TICA
271
20.3..4 Regulacin de la transcripcin de genes de clases 1 y 111

Como ya se ha !nd!cacto.las &eeuenca~> promotoras y el oof'l.lunlo de lae4ores de 1 ranscrlpei0n empleados por eaoa una de las RNApolimerasas eucariticas son diferentes (pg. 265). La diversidad de promoiOtes y TFs para el inicio por RNApoll y 111 es muy inferi01 a la oorrespondienle a la RNApolll. Eslo puede rellejar Wnplemente el metW:lt nUmet<> de get~e. Que $()n tn:mscrilO$ oor ~cuell~$ dos enzima$: lo RNA.tl<lf.l sinlotiUJ un solO transcn4o primano {el precursor grondo de ANA ribo$6mioo). mientrM Quo la RNAI)Ol.lll lrl.'n$<;ribe IJI'IO$ POCOS 98fle& (el pt&1'ANA SS, IOf> cerca oe 410 IRNAs y algunO$ RNA P!Uei\0$. pg 251), Ello contrasta oon las deoenas de miles ele genes pro4eico6 de cuya transcnpcin es responsable la RNApoJ-11, por b que necesita una maqUI'narla MM cof'l'C)Ieja para su regulaCiOI\ individual. como se acaba de ea.udiar.
los promotores de genes de la clase 1(para RNApof-1} se kX:allzan, al igual que lOS~ la clase 11 estudiados hast3
ahor~ . en direoein
s (eorrleme anib3) del !)untO de inicio.

I) U l .o~l..- .!o: ltiiii iO:n p.;oc'oll lJlW ,.,.,.,MlNimrihrtfC}<I t<Vt..: 11* al.u
pr(lniOIQt b!lsal.dt Ha 20:

, m wcutn(ill TAr A
S~ l
'-C1:UI:!O\;~ !lllllllo~IM IHIU~I j otlojll'~illdlble , l Li l~~t-<o; 'll\1 ) po,.i.uof(ft'ICJIIIll l ~ o:liCXICI I 1)U8f :urnc- al (l!tn fiiA!II , ~LI
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(J('ko:t/V: }Qr1(>f"). (omuodo

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mo .mo quo; "-'"m n'IID. ~.nqw ltqu i 1!1) "-'t~ ~~ J'f('I"!O o.lt(JI . 111.1-~ o;&Jil TATA)~ (o<r- r A ~ ~ (olof .:r~ .,,..,,
p..,...,.,.. prom mal . tk 1~ ll 1(17 ( l A: 1:. Nf~''"''._ OWJiml.-f~"lt""/),

!!,~. do: ~i:. C\"G oti!Nos:.l .ntbc!t "'"'
o.Jo: kt o.kt ITIIDt Jt:)LI h:ocot Q1A' :>< o;.onnt'll('\'
II M<Ii.,l'""' )
C~N"iiln
'! C 2
Entre tos genes transcri!OS por la RNApo!-111 se et'IC:uenttan el de rRNA SS. Ios Cle tRNA$ y el <le uno~ lO$ ANA$ nucleares pecuel'los que in4eMenen en la eliminacin de inlrones (&nRNAU6: pg. 281): todos ellos tieoeo promotores y TFs di'erentes. l06 promolores de rANA 5S y tRNA apareoen en dWecctOO 3 ' del inioo (oorr~nte abajo), $itv;)nc):)$(1 dentro de la regin estructural Cef gen: por ello se llamM regiones intetnu de c:onttol (ICR) L3 PO:sici6n e i0en1 1dad de la<& $G!OOenc:i<~ s prom040rt':s y b$ oorre:;pendientes TFs son diferentet para los genes de rRNA SS. tRNAs y snRNAs; ~ muC$1 r3 $IO c:omo ejemi)IOel primero
1)
r Mtlna cot~ dl-dll< .lo: ?u!\', ,;e ~a 1.1::<

~uo:~~~ ~
u ra.:....-.r ,,_nr-.:,...,. ., ~m ,, '"' ~

pr<>l'llo)(;.'J(il,;.
f'rt~tiiOIIII'dO: rR.~ ,\ ~:
!) TfiiiA m...-:.1 ..-ero~~. n mc. J) TfiUC ~,;u ~c;o :tinte llb.:l<or 'rt"HI R,
fo.lrtG:IOJOpctl l61' (~ tni$1TU) IJII<' l\lffill
'11"110) Sl l .a~alfl-i".. '"'"'''".:a.:o: cl
--o@
TAF'l (dlfo:lt'Dir.s de 1 1)10 de Tnt O) !'>l. l l
~no bay Qji1 TATAt)<olt>~o:l."d
4 ) Tfln(' ~ ..... y ,..;.. b puli..-.,. ) .asl o.'OIII>oCIU1ll:l tr """'"I'('I'
Cabe resallar que en la iniaacl6n por las 3 RNA pollf"l'loOO"Isas il'ltCMetlC un f(I(;IOf de tran$<;ripc:tn de varias subunidactes (SL1. TFIIO y TFIIIB. una de tasc:ua1es es la prote.ina de TATA, TBP. Las otras subunida<Jes son TAFs especlloos pata cada tipo de )rOrno40r. Mientras Que en lOs ge.nes de tipo 11 TBP es el factor Inicial que reconoce la caja TATA (pag. 267). esta ~ecvei\Cio n0 eJCistc en tos otros casos (genes de tipo 1 y 111). En enos, TBP no se ut~e diRJc:tamente al ONA reconociendo la secuencia promotora. sino que requie(e otros r-..c:tonn de transcnpcl6n para a$0clarse. Parece qJe TBP desempel'la una funCI6n comn a los 3 tipos prom040ie$ la interacc:in oon la pollmerasa respectiva para Situarla en el pun1o de inicio.
..,.,.on
oe
20.4
REGULACI N EPIGENTICA
Este seguooo tipo oe regul&ci6n <fe lo expresi6n o{tnica, Que oootribuye a expltcar la diver9i0ad l'l'IOtfOiglco y funcional <Se clulas oon un mi$mo gcnoma, depende del llamado componente eplgef\.tico ce ta eslf\JC:Iurtl (1(11 ONA. es <S&dr. no consiStente ecn $4.1 :sec:t.l8flc:ia. Concretamen1e. se ejerce a llaves ~ la rne(itaciM espec;ifi(".il do algunas ba&e:s del ONA. AunQue;., efecto reguladOI. se ooocx:e el ~ de ta metlaein del ONA propio en &as bac:tenas. oomo prolecCIOn frente a las enliinas oe rettrio:;i6n de lit mi$rn;a o6tuta (pg. 200) Corresponde ahOra esll.ldiaf el p~pel do lo'l metilaCI6n del DNA en oiU'*$ de vertebrados. para ~silenc:iar~ la trans~in de sus genes.
272
CONTROL DE LA EXPRESIN GI!NICA: PRETRANSCRIPCIONAL Y TRANSCRJPCIONAl
20.4.1 Metllacln del DNA y control de la expresin

En el ONA de vertebrados una p.o~rte de los r.sidoos <: ~ito&in8 (en huM3nQ$, el 3%) se eneuet~ltan tne'lllados, prindpalment.e et1 posicin 5. Esta metiacln aparece casi exdu&NamEM'11e 60bf9 la &eWencla: <inucleotidica CG. Qoo adems es especialmenlt t'bu~o ~la$ reglones promotoras de los genes, dando lugar a los denonwtados lslote.s CpG. Los ge11es Que se transcbefl etetiv<~mont.e en ~10$ teji(,SO$ poseen i$10ieS CpG sin metdat (o IStot&S hpomtHilac/os). mlerrtras Que en \o&1ojidos dondf) ol9tft no so l!xpre~ st t'!SIM meliadOS. Por tanto, la meiA&ciOn de la DIOsM!a par~ dese~ un papel en la fegutacin de ta e)(presin Q6nic& La detenCi6n de la transcripciOo de un gen como consecuoncia de ta prc~itJ d 9l\lsS metilO o.n l<'t ~ula de ONA se puede ellpkar mediante dos n-..cttnl&mos, no ttxduycntos:
b '""' l!Cno:~ o:~ itlutn CpG nu "tiln mt'li'laltM.I fllMt'flpccOn ~ lllida libnmcm~ m flltw'OC'l de tus
I:.Cki'I'U de c 111nKrlpc16n a,lecw.in
la IIIO:hl~~~- di bk ~t('llnKj. . pmn!OOitM lmp..le 1 un:!lm dt 1~ f...:c orn dt uunu:npuc m. d ;en no 'l' c.rnn,;cnliC'
t. nwtiWcll6n o:n 1 pr.,vmJdlld

dd (lflllt:ll 11< (1\111t'otlrrl'(:!f>n. ro.
M.'llHII)(:Id& 111'1 l'fO'tinlt~ (C:;.JI'roh MI:CPI y MtCf'l l ~\c .,_. III I)NA ~r~nibdu impid.K'.Ildu 1
\' "''' M ~>
111111Ktixl(on (po.llf Qnnplg,

bl~uo:AndOtl&vm'l~;C: d~
puii!Mf1lW (o IJ!J!pollll'fldo b \IRIO. dt kJC f~n~~te' ok
ttanwr!.,cl(.n l
20.4.2
Patrn de metilaein durante el desarrollo
Como ~CS1aetbn de es1a tegtAacin por mediacin. c.a<Ja, leiido prtsenta un SX~trOn earacterlslloo de meli&cin del ONA en sos clulas (cocn~nlo opigen&eO). t!ste se c:of\Sigue y conserva durante el desarrollo embrionario, mediante tres p roceso s sucesivO& d di$tribur)t) de lOs grupos mecilo:
ONA CllD p!llfn
-o
* JI!C:ltlfiCII':cl
o
de: kot. t*)l'tl>
e~
l:tl una muy fllttOl de' t. <m~t):, I:Wl'ldo 111) Cl!lula. ~ notslllMln difcrt:neiaOO:s. $C'
d imclllil ('(Hf.,kt3.fll(.>o lle del I)NA d p:cttn de
ril$
mt:tilaciii brtrtdado de ~ J!it~ PnJi'.'"'W,:

c;c::J
Cl
~ad6. o met1l:,W~
Ui'JMC""
Cl
d ;::k-
r::J.-C:I
Coi~~Cidcndo c:on l:c
lilrmxi6n lk b dt~'** 1ipos telulnreJ (que $e Q!SII!lu:m en llrjidw.., difcrelll:itc~ pm ejemplo c.on un cmbnn.
&i tu)bf
t.c~ de 8 ~mllllll)) W' iiK'l~llll AII>NA un
pultm e!;p('dr.oo dt ~dus ncu
DN,.\ con pamln d<' mcltl~~eOn pn.,.i.:o d~o:ll;l'll!:ri611

~
u .,
O'l.!'Nflio t11
jXTO dlf(fJit en cadn qulo
l('d)dOO d~ RIIIJitfllmknla
........
Cl
rr.u~ a..1.- ronda ck rqlltoo:a.:(n. "" ~~~'<'
;c7
o=
t':'lqumm dtl n1Ct1~ pt(:'Jnl!O cr1 111$ hdns rt'(lj;O:IUIIXl!S. {!\.Ole *~!lU.I lk tn;;~l~. 0e l':W fottfll. ~ (l:tlf'I) se OCJI\$t7\~ en ~t~~l11s m cdui~U~ hP.. de Pll tipo d~>~crmiNdo.
rw:lmmlc: ~'f\ llli "'-~ 11~115 de- filA d
REGULACIN EPIGEN'TICA
273
De los Pf'OCEI&OS de metilacin se encarga una ONA meti ttrans fentsa (o metilasa) , aunque an no se sabe oon certeza si la meliacin de novo y la de mantenimiento dependen de una rrusma enzJma o de dos diferentes. Se ha podido aislar esta enZMna oe I'I'MJIChO& or9Qnismo&, indt.ryendo 10$ humanos, e inCluso &e han donado sus genes. ACAa similarmente a las metlasas cue t()tl'nan parte de lOS $zSletn3s <Se metl3<:i6nrestrioei6n en proe&.rioi<'IS (p;)g, 200} y de 1;;~
mttclurt~c:iOn do mRNA on oucoariotas (pg 278), emP'etlndo Sadeno$lmetionin;;~ como coenzima donador de gl\lpos metilo (l)g 22} y. en eS!e ~so. ton fnpcQficidad PQf citidina adyaoente a ~ina
( 11 -' ;H
La reaccin opuesta, responsflble el prooetO de dt$:mctilacin global. la cala!iza una desmelilasa, que reconoce
las $0Cllet!Cit'IS mctiiOOtts "'CpG elimnaodo el grupo metilo de ta tosina. Esta enZima se na podidO I)Wificetr <1 partir de
ctul<'s tvmor.-165, en las que es especialmente abundante.
20.4.3
Metilacin y cncer
Estos prooesos de metioclon4esmetii&CIOn 0e1 DNA se ~ pOdi(:So in ve:stisJw gracias a la observaciOn en oe-uas cancero&as de alteraciones en la rne-tllaCIOO del DNA. posiblcrncnto responsables de la modificacin en el l)f'o gtatl'la <Se expresin gl!niea earttc:leri Stiet'l del pr008$0 l\lmoral, aunque no su causa nlea. El\ esas ctuiM ~ ONA Mt gtOba!meote hipomctil01do. pero al mismo bempo aAgunos genes e91tu'l hipet"metilldos (concretamente. los genes su~!Ot'l'$ ~ lumot"Ct$, temt~ 30} Esta aparente oontradlocln es el reS\.flacto, por mec:anismos complejos, de una eleva& el!J)t'esiOn de ambt'$ enim;li$, la me:tilaw y la desmetiasa. La h!pom&liladOtl ptOYOCNit\ t~ eKpro&in de genes que 1\M)i!u&lm.etlte esllin silenc:iadc>$ (inc:l!,liOo el de la desmelil&aa). condueief'ldo j)<)Sibtemente ., t~lgvl\0$ de los cteS4jus,te:s eausM\.0$ del cnoer. mientras que la hiperme1llac0n de tos ge~ S>JOC"O$Qros de tumores bloquea su expf9Sin, elif'IW'Indose su funcin natural. el lreno de lt'l' PfQiifcracin celular. y oonduclendo a la mul~t\~ anrquica de las clUlas que genera el tumor ue~ 30}.
Tema 21
Maduracin del RNA o procesamiento postranscripcional

21,1 tntroducciOn - -- ...................,.,_,,,,, .- ............ 275 21 1 1 Mab'Zaclones a conoep40 de gen ........................................................ _ ,_ , .... _ ,_ ,_ ,_ . . 276 21.2 Ca.rac-tc.ris ticou, difOoronc.ialo& de 1 011 maduracin ~...........................................- ................ -....................... 276
21.3 ProeCS.3mionto del RNA mensajero ................_............ ~............................................................................... 277 21.3.1 Modi!leaciOn del e.:tremo 5' ....... ....... .. .......... .............. .............. ................... 211 21.3.1 .1 FormadOt'l de la ~U OC$$(1u~e 5' ,.,_,,. ,.,_,_,_,, ,_ ,_ ,_ ,_,_ ,_ ,,,. ...... ............ 278 21.3. 1.2 MellladOn la capenaa s .......,.,._ ,_ ,_ ,,,.,._ ,_ ,_ , _ ,_, . . . . . .. ........ 278 21.3.2 Modificacin del extremo 3'......................................... .............. ,,_ ,_ ,_,, .,., . --- 279 21.3.2. 1 Formacin del extremo 3 ' y su relaCin con el final Clt 1<11 lr(ln$Cripc::in , ... .......... 279 21.3.2.2 Polladenllacln del eXlremo 3'. ......... ,..,_,_,_,, _,_,_,_, ................... ,_ , 280 21.3 3 Eliminacin de inttone6 y empalme de axones..... .. .. ...... 280 -- 280 21 3.3. 1 Magf'duddelosinltOt'le& ........................................... -- - - 21 .3.3.2 Seeoef'leia:S que delirniton el fl1r6n , ,_,_,_ , _ ,_ ,_ ,_ ,_ .............................. ,_ ,_ ,_,,.,,,._ ,_ ,_ ,_ 260 21 3.3.3 FOIITI&eln de cuerpos o complejos de emparrne ,_ , _, , , ... 290 2 1 334 Moec.ant&rnodelareaocln....................................................... ., ., _ , . ,_ , _281 2 1 3 3.5 01.10$ tiPO$ de n roneos ................................................................ _ ,_ ,_ ,_, 282 21.4 PrOCHaMiento de los RNAs ribosOmico y do tr;ansforen-cla ............................................. - .................... _, 2*2 21.5 Madurac:&On det RH:A m.itoco ndr i al ................................. ~....... ~..................................................................... 284 21.6 Regulac:&6n posttansc:ripc:ioml y pretn,duccJon;al de 1<1 expr$$.ln Qnlc:a................................................ 284 21.6 . 1 Regu180t'l de 1 3 t'l'\&dUr.'ICJOn <Sol RAA ...,_,_,_ .,_, ,,,..,_ ,_,,.,_ ,_ ,_ ,,.,_ ,_ ,_ ,,,,,_ ,_ ,_ ,_,_ ,_ ,_.. 285 21.6.2 Vida media y degradacin del mRNA ......... .... , , , , .. ................................... - . 286
oe
21 .1 INTRODUCCIN
La ttaMCripc:i6n del ONA os ~ proceso qJe no d1ftere. en esencia, erttre prl)(;<lriotols y eucanotas: las RNA. polmerasas se unen a see~i3!$ promoi.Or.ls especif iCa&, y se realiZa ta slntesis en dircociOn 5'- 3' a lo laroo del gen. $In embargo. surgen Importantes dl!erendas en1 rc (lrnbo$ tJpos de clula& cuando se consiCier la fQon3Cin del RNA
func;ion<~l
Se ll;)mt'l trans.crito pr imario o prec-ursor del RNA ~ 1('1 f1"1Q16.cula de RNA que resulta directamente c1e1 l)fott$0 de tr~pein Todos. los transcnlos primarios tienen 13 misfn3 socuenoa que el fragmem o correspondiente de 1~ hebra r.>rnO~ (no trai'I!IC'Iila) <f<: ONA, s<tlvo por la preS~Cia de U en lugar oe T. Eis.ten lrttnsc:n,os pnmarlos para 10s tl'9$ 6po6 de RNAs en eucatlotas y para lOS IRNAs y rRNAs en procarlo!as. En OOMraste, el mRHA <le procariotas es el Unico RNA que ~t$Ce de \M'I I)fetur&Of',lo que permite su empiOQ inM!IKiia!.O p;ua la traduociOn (que oeue incluso M IOS de finalizar su sin~is POf !Kin&eripc:in, pues no existe eompartil'l"'en1~Cin subcelular. pg. 250).
los ptec:ursores de lOS tre$ 111)05 de RN A fotmacbs en el ncleo eucariolioo no pui)(S&n dGMmpel\al d lreC1amente su hncin (en el caso del mRNA, utili%ar~ oomo molde para la tradi.ICdOn). sino que nan ese convorwse antes en ANA m<Jd<lfO, tuncional, en un proceso laMSOO mOdificaciOn o procesamiento posttanscripcio n al o sunplemente maduraci n dol ANA. Esta tiene lugar en el OOcleO. y S(liO Cu<'ndo se ha co,.,.eUKto pueden las ~1,113!$ do RNA lfflf'l$Cl(ltl3t$e Jll Q4op!Mma, donde ejercen su fooelon. Este tr,f'\$portc tiene lugar por paso de las molei.IM de RNA maduro arra~ de 10$ p0r05 do la membrana nuctear (o poros n ucleer c$}
276
MADURACt0N DEL RN A O PROCESAMIENTO POSTRANSCRIPCIONAL
(~ase
El procesamiento postran5CfiPCionaf consiste, dt modo tambin pg.. 28J): Modlflcecln oovalente de nuclesid06 Ktremos Adicin de RJcletidos a lo$ e.
g~:meral,
on una o varias oe las
slgu~tes
reacc:iotles
E&CJ$i6n de nudctidos ~lOS e.xtretnos Oi~iQn de ta molecllla en varios fragmentos Proce:$0 de 8y\1Ste, ellmlnadOn de lntrone&. o corte de introne& y empalme O. CKonc$
Como se \<era ms adelante. la maduracin coofiefe ost3l>ili<l3d al RNA. btSieamet'lte por una mayor reSistencia
lrente alas nucteasas y pot un plegamiento triclirnet'l$ional OOITIPaeto (el'l el easo de tRNAs y rRNAs).lgualmente, faclll~
su teoonocinVento por otros COI'T1PQI'Ierrtcs oetulttres. que mejora la funcionalidad para la tradocdn.
21 .1.1 Matizaciones al concepto do gen

La maduracin po6transcripcionat es uno de k:4 pr<>ce$0$ Ql.le 4t'ln lugar a SituA~clones en las que la detlnicln de gon debe m&~iz.arse o forzarse ligeramente (pg. 246). Concret&mente, pueden Cllarse dos !li!Uadones: Un gen se ttanscribe dando un prRNA. ~ es J)n)CeS3dO por esdsiOrn generando varias molo..Aas de RNA. En e9le caso. el ron~ O. gen se puede apliCar al gen gk:lbar de panda, pue5to que e& una unidt~d de lran$Cripcin, con sus region&S esttucbJral y reguladora. Sin embargo. tambin C$ aplicable a cada una eJe las regiOnes M patCiales de DNA qua oodifican uno dlt loo RNA$ flnale::$, I)Ues son ~os los pnxluC1os gnicos 1\Jnt:iOnales. Ejemplos de esta situacin los tonet'I'IO$ en lOS precuf!es de RNA rlbosmico, tan1o pnx:aribticos como eucaritlco& (pg. 283) <:uyo gen globar da -.gar a vaos rANAs maduren, y tambin en el ONA mltoCOndrial. cada lA\0 de CU)'O$ ttanec:r110S primarios se procesa dando una oombinacin de rRNAs. IRNAs y mRNAs (pg. 234). El transcnlo primario obtenido de uf\3 regln de DNA puede sufrir su maduracin IXIJ dos rula$ o vai1"Mt.eS
distintas, dando lt.9iJI por euo a dOS productos genicos difefen(e&. E.ste o& et a~so del ayuste arternativo (p&g. 2$5), donde se pueden emploaf dOS seeuenc:ia'!l de corte y empalme pera la elimin;,(in t intrones (pg. 280) dependiendo. pc;w ejemplo, del tejido en el que se exprese el gen o de la llegadtt <'lla e611Aa de dlvetSaS &et'\ales.
21.2 CARACTERSTICAS DIFERENCIALES DE LA MADURACIN

Las ~ecencias en11e procanotas y eucariolas relaliv.s a la maduracin del RNA se centran en el RNA mensajero; los tRNAs y rRNAs suffen una maduracin similar en ambOs lipos de Of9Mismos. Pue&lo que, adems. <JJot;ta a In sin*is de protelnas. nos centraremos. por IMitO. en el an!ISaS de ia maduracin del mRHA.
En un gen proteioo procariti<:o IOdo el DNA es ocxtdlcan~e (exdu')'endo la regin regulodora. que en este lema no nos lntetesa considerar). de moOo qve al traMCI'Iblrse origina un tran&aito primario qut es yt1 el mRNA lunclooal , cuya seeuenc::la corre5()0nde eK~~monle & la del ONA. E-s decir. el mRNA de proc;eariot:l$ .-s 01 Ul'liOO RNA que oo requiere ~c;ibn . POr el oontrarlo. la transcripc:in de un gen prQieico eucariOUeo 9f!'\CI'8 un pte-mRNA QU1J debe sufrir mnduraaon para ttans.forman;e en ...,..., mollk:vlal luncional oe mRNA. El ~nto de lo& dihwentol pro-mRNAs se latr'la RNA nuclear heterog9noo (hnRNA) , debiclo a que oonsb.tuye \.1"101 ~c:i6n de molc13!1 de tarnat'IO muy variado. Oencro de lt'$ diferenCias en1re pre-mRNA y mRNA mo'lduro, l:t rns llamativa es que ia &ec:uencia del mRNA no corre&pOnde c;om'Jie1l'!mente a la del pre-mRNA. ni a la del ONA d&l t:JJe se ha trat~scrho (se dice que ~se ha: pc...rdido 13 coline~liCS&CI ~1re ONA y RNA '), Eslo M debe o que granctes segmen~ lnlemo& del gen do~reoen ~ la mt~dura.Ci6n . Estas r991'ones del DNA quo .se~ del pr&-mRNA en Stl maduracin se <lenOmif'\31'\ i ntrones . Aunque son ONA no c:xxiflcante (pg. 108). deben oon~emolarse como parte del gen (pg. 245).
Se pueden definir tarrtlin los intrones como reg!One.s no codificantes situadas Qn tt1 .vMoriof de un gen, lo que da lugar al slnonlmo secuencias inWrealilldM (lVS, lntetYening sequ&nees}. No &On in~es aquellas secuencias que !Otman 106 ex11emos 5' y 3' del mRNA maduro. 8Uf'Q.Ie se trale ~nte eJe ONA no OOCJIIIcante; por ello. una tercera definicin de intrQn CQ1'r10 regin que se tntnscribe PIHO no Sot tradiJ~ no es estrietamente oorrecta. ~nque 10!1 .-r~rones son carac::lerilticos ese los genes eucariticos que <:Odffican proteinas, tar'Yibln fl6tn l)re$el'ltes en a6gl.n)6 Q8f'l9$ de tRNA '1 tRHA, en especial eucaritioo&. En &'os el intr6n se: puede definil!lnlcamente oomo la r9(JIOn de ONA {O de su pi'OCIIJCIO transcnpclonat. el prO>RNA) Qu& se elimina durante la maduracin Fina!mentG. la$ regiones que nanquean a tos intronos y~ se consetVan en el RHA maduro so dcnomint~n a su voz uones.. En ger'lefaf. son la I)Mie <:Odifican.1e del gen. pero el ptWner exn y etl tlimo tambin lnctuyen, rQpcctivamente.las regiones S y :r no tr-..cidas. que no son oodificantes.
PROCESAMIENTO D EL R NA MENSAJERO
277
1 Gen para un3 ptOteloa procarltiea

w
rcgi&l estructuml dl'l gen

ll (..,.ll(ll.l t lii!I,II O,:io,
tia u11 e~~ ~nu;o
ONA (slo 1-a hebra cmhficaot<l
_j
5'
1
lru"nldu,
U'allSI.'rito
-n~np.;
pmurio a mRNt\ 3
no t.n .ntlklww.ll'ln ~=~~~~ ,.....,r .. ..lllll
1Gen pare una protelna eucarltica

regin CSUUl'1urnl dd
vrtnM llllmnes:
AA'Ut1\Ct~
~c:tl
inte1ulltdu no cllhr 'K'll'*"')

~thr K:u!lcJ qtll' " m prl..: !k
'M-o C\tllll.., ' ( k'cucncta<;

"'' '') . nt
J'
S" tr.mscntn pnm:trit) (pn:~mKNA o hnlt~;\,
#-
mRNA 1 3"
po~mtnsclil)(!iQn:tl.
m: ~~
Gnuone. )
mOO~a~cune~ ~ ~rt~Kh llr.:ad~~~~ t'

cltmllli)O:tt"- de onll'OIIDt
Por tanto, el DNA de ~ genes procat ltlei)S de ptOielnas se puede Ct>n$~f fOrmado por un exOn Unlco, sin lntrones. que alttanSCflblrse octgina un tran.&erlto :ri'nano tat'l'lbn sin intrones.. Sin embMgo, C{tsi ooo ol ONA ~ de &ucari04as contiene vanos intronefi y exones. y se tra.'lscrlbe a ptecursotes de RNA con lo$ mi&mo$ intr(lnC$ y exone&. Como parte del prooeso de modificacin postransc::rbdonal se ~befen los tnuooos y se unen tos e~~.o-~$ l o lormac::iOrl dol mRNA eucarilieo maduro a partir efe su correspondiente pre-RNA consdruye un fYICI(JI!b ideal pattt ol ~ludio del procesamienlo postransaipoional pues sufre todos los lipos de ttst~sfonnaclon implicado$ ~ di(hc) pr0<;c50: O;'ldicin O. noclotkbs al extremo S'. metllactn posten:lf, alargamenco de la cadena en el e~<tretn 3' y minatln 4Ct lntronos OQn vniOn dO ~ll()llO'S f"Wrl4J y empalme1 Una vez comple1ada esta maduradl6n., tamb1n se ptoJCe el paso del mRNA maduro 3 ltavS de 10!\ porO$ de t<'l mombr.-na nuclear Mda el cilol)laSm.a lugar <!Ondt:t se emplear para la &ln.tesis proteica. Se esWdarn con detenmien1o cada uno de ~kl& pll$0$
21 .3 PROCESAMIENTO DEL RNA MENSAJERO

L.& m~de.mx:in del mRNA puede describlt$EI mediante tres ~ de modificacione-s, que pueden tmn1K:urnr ()e lofma SUC$$iYA o $imullnea. todas oJias reali~ en el ncleo.
21.3.1
Modificacin del edremo 5'
~he 5'-PPP OOJmRNA oo~ioo comf81'1UI a moolftCenoe muy prOMo, poco despue!l ese ihit:l3d:,l &.1 Se tmta de una rnoetffi(:."'<;in cov<ti~~Jnt4 qu. globtt!mente, implica tres bpos de e~UJmas (loelawa, guanilillransferasa '1 me61asas) y que oonduoe <' ta lrlO()t'J)(lt<'CIOtl $ingutar do un nucletido protect sobre el NTP en poscin .$' hliTI'IInat del RNA (no,..,..lmente purlnoo, ATP, el mi$MO <IUII'I ac;t.u como cebador en la vanscrlpan) transa~~X:IOn.
EJ el'.1remo
278
MADURACIN DEL RHA 0 PROCESAMIEHTO POSTRAHSCRIPCIONAL
21.3.1.1
Formacin de la caperuza o casquete S'
S. INiiz<'! tn <So$ etai)M. una M.sfosfotl1.acin previa y una g uanl11tac&6n a costa de GTP.
'
t etup:
CK.,ibqdri
r~tllt<)
extremo ~ del
pre-mkNA
desf~fori tm:liin
7 lkt
gwnilatoo GMrtlkl GTI' al e,;~~erwo ~ -4 IQtOt.u.;.

dtl . mJI.NA
lr'l'Uijf e~ \1c: un p\IJ)Q ~tllUo (rndl..lll del
2' Clllp!l:
guatlthlaeuSn
.,
mOlcula radical:
nu
'
9"""""
guanllo
gu<~no&lnt~
'
u
guanililo
9"ttnill'II:Q (GMP)
'
guanoollo
Auroque en ta segunda reacci6o s. lr(ln$1lere un residuo guanllilo, el resultado conjunto de las dos 1oacciontts es 1<1 ltloorporacin al mRNA do tan slO un teS~ de guano&ina. e& decir, una gu01nosilaeiOn; "'diec qu6 el mRNA ha sio ~antado en 5 ' l<'! estructt.tra teminat resultante se oonooe COITIO caporuu de g uani n a. caperuza 5 ' o casquete 5' {tn inglt$ C8,0). Se trata de una estruaura si~. que no so encuentta en t*lguna otra parte de nucletidO& ni cidO& nocleieos, oon respecto a lo& &lguiemes critorios: Unin de dos nude6idos a Ir<'"" de oo enlace trlf06fsto. Un nuclesido {g.lano&inl) ur'lidO en setllldo opuesto al del resto de la cadena polinuc:leotidieit (erMoee lti!Oslato entre dO& po$11Cionet 5'). ES1a caporuua ejeroe un etecto protector de la molcula frente a 1M eonucto.MI.'Is (l)uef $1as tolo act6an sobre e~c$ 3'.S'..1osl0cfister), marca e( pnHI'IRNA PMtl $U OMI)Ieo po$1erlor corno wstrato eo otras reacciones de procesamlenlo en el neleo y sirve wmo ~o de \rit'l del mRNA a bs rlboeomas al Inicial la sl1'!18tli5 PfOkloicCII.
21 .3.1.2 Metllacln do la caperuza 5'

los tres primeros nuclelidos de la estri.ICti..Wa 5'-guan06ha.,.rif06fa!l>mRNA son entot'loc$$ modiflc&QS por metlltransferasas {metil<~sas). qvt ~pie*\ S-adenosiiLmet:kri'la (pg. 22) oomo ooenzim<'l doo<ldom del gt\4)0 meo!llo (reacdOn similar ata de mttei~in <le (:i!QSII\89 que rE9Ae la b'anscripcin, pg. 272). la meliaociOn pueoe tenet lugat sobre varias posiciones El N7 de la guanoslna terminal. para dat la ~pecNU de tipo O, o eapetUZ& de 7-met~noY't.tHrifo&fato (c.'JP 0), La teaocin &a catallza la mRNA(guarina-N7)melitlran&'erasa. EC 2. 1.1.56. Adem~s del anterior. eJ 2' 0H de la ribosa atfyt'etn!IO (1 nucleotldo orlghal del pre-mRNA: 2' de la secuencia actual), dando la caperuza de tipo 1 (CltP 1). E-sta reacan la cataiza un& mct~Ma dilf!f'lte, la mRNA(nuctesic:So-2'O)meli!transferasa, EC 2. 1. 1.5 7. Ade~s de las dos antetlores. puede metilarw li~mtliOn d 2'..0H de la tlbOsa Siguiente (2" nuctetido original; ~<t. la secuencia actual), para dar la ~peNn do tipo 2 (C8P 2}.
PROCESAMIEHTO OEL ANA MENSAJERO" ----------
279
.. '...
'- ./
"-*'""
"'""e_:;:;
metiltransferasas
"' ' ' ',"
, >lo
..
...,...
\"
~ \"
....
..
'ou ou
: OCil,
Se Ei3b& que las mmila&ils y las guanililtron5totMas $41 asocian al dormnio CTD loslt.~till.'o d(t l;t RNApolll y l!evtltl o cnbQ 13 rta<:c:ifl dO prCXe$01miOOio Oef RNA \'lnle$ de qve ellrtln$CMO hay~t Olean~ yn tamJ(Io <:le unos. 30 nudlttidos. Parece, por 1an10, posible qoe la IOffl'lec:IOn de la caperuza pN'Iiope en el ca!TbO de enieira<iiOn de la ttanscrlpaOO a elongaaon
(~g 252)
21 .3.2
Modificacin del extremo 3'
21.3.2.1 Formacin del extremo 3' y su relacin con el final de l a transcripcin Olra pec~Jiaricfad ef mRNA eucaritico es que el exltemo 3' del mRNA no corresponde a la poSK:ton donde s:e
termina la lranscripcin (qi.IO' se produce graaas a la tnteracon de las RNAPol oon protefnas de pausa o lefl'I'WW:Ioras pg 256), Sino quo denva de la esmif'l de lit moteculca de prmRNA en una poslclon comente emba de su exltemo 3' Como OO~Cii( el mRNA 0$ mb$ ()OrlO en $U ~:xtromo 3' Q\IEI l;U l~nscrilo pnm;trio
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280
MADURACIN DEL RHA O PROCESAMIENTO POSTRANSCRJPCtONAl
21 .3.2.2 Polladenllacln del extremo 3'

Sobre el extremo 3' -OH resdlante del corte por la endonudeasa 8Cbla una RNA pollmerssa especial, que no usa
molde y sOlo aoep!a como sus.lrato al ATP,Iamada poli(A) pol!merasa (EC 2.7.7.19). COmo ~ia. $0 ~ ;,1 RNA un gran nmero de residuos de adenllato (AMP), formando una "cola" de polladen.llato o cola do poli(A), de longitud Upica emre 40 y 250 nt (como excepan. los mRNA$ de M:tonas carecen de esta 0018). Es&& estructura, que
permanece intacta 1\a&ta la formaCIn mar del mRNA. wedo patticipar en procesos de 1an gran significado oomo el lran5D(lf1e del mR.NA al citoplasma y la determinacin, en PilrOO, de'<! Nt.atlilidad y vida rnetia del mRNA (pg. 286).
La presenci3 CIC la 0(:113 de I)Oii(A) VniCNI'IeOte en 10$ rnRNA$ eu~ico$ .e ~a eon fines experimentales. para &a putlr.eaCiOn Clel conjunto de mANAs de una clula. ~do tcnicas oe atlnkiad oon sopotles que ()()M!enen cadenas oligonuc:leotkk:as de poll(dT), poli(T) o poli(U), complemencariss a la cda de poii(A) (pg. 136).
21 .3.3 Eliminacin de intrones y empalme de exones

1.01 f:lt<aPit 0$4:lflt;:~ tiO lo ma<JuraeiOn po$tr;.\nscpeional del transcrito primi.'lrio t\Mto 4ar el mRNA eucoritiQo tonSoSt.e et~ &a etiminaeiOn oe 10!1 introneS y te Ul'liOtl o empalme oe lOS el(()(les. ESie proceso se OOI'IOOe ctll"nn corte y pegado, corte y empalme o ayuste {en ~. spiicing).
e~nte en lOS Yet~ebraoot , se encuentran casi Sie<pre intenumQidO$ ()c)f intr ones. que separan 1M regiOnes eoditicantes o ex ones (pg. 276). Como exoepcln, las hisiOnas son uno de lOS escasos ejemplos de genes que carecen completan'lente de introne:s. lo ms frecuente es que la ~ud total de tos -.ror"'e$ supere ampliamente a la suma de los e)(()l')66, por lo que el uwnal\o del gen depende fuertemente del nUmero y longitud de sus intrones, Aunqutt la; c:ifras $0n variobtcs.. se h<lt>lo de hl.'lstt'l 40 intr'()nOS por gen y de una longitud de nasta 20 kb por intrn. lo6 exone:s son de tamal\o roochO mas PIQUiel'lo. lipiC3mcnlb inferiOr a kb.
21.3.3.1 Magnitud de los intrones Debe n:tOOfdar&e <liJ4J lo6 oenn dO; eut<\rio~s.
21 .3.3.2 Secuencias que delimitan ellntr6n

La ellmlnaci6n de un intrn est determinada por w secuencia, y no par su li'lmat\o. Slo interVienen dOs secuencias especificas,. quo Oclincn 10$ OKt:temos del intr(Wl. y Olra oe su inWrielt, conOCidas en su conjuniO OOfi'IO sitios o t;:ntros d o corto y empalme o de ayuste {eenlfo 5'. centro 3' y cenb'O de ranWlcacln). Todos lOs dios de corte y omp<'t!me ~~ ser equivalentes, mientras que fa secuencia del re51o del intrn no tiene trascendencia sobr ol proceso.
Tm S'UCDCias conns. nh11meo1e OODS<O'ada!l, detioen 11>5 cwtro' ck tllrl t y t!mp~ln.r. Parn k~ ccniM~ S' >'' 3. slo 008 Ml~k>6ddotl o:m t-~ti:lll!t.. .,..,.. el de twniC ~in. ~lo vn ao.kPiiiiiO. El u~1" dt nllctc6tl~ \k la$ 3 ~nd.u ()OOje(lliO pueden v11rur 1 lc:rvnnne. Pe~r t~.n"' lo:o on1rone;~ $1CIJ'Ip OOfiiKI1.dltl p(lr GU y ltnninllll por AG (ti cl kNA (GT y AG en la hebra no ua:n:rita lid DN\).
Un eambiO en el Sitio de oorte (por ejemplo, por mutacin de uno de los ~lelidO$ CQn$01'11() esenCiales) darla tugl.'ll t1 un ayuste ertOOeo: se utillzarfa pera el corte y empalme ta $iguiertlo secuencia oonsenso, si la nublera, con lo que el lntrn o parle de l q~ia induido en el tr'IRNA. ESIO eonaudtia a la srntesls de un pollpptldo alterado. con una inserc:iOn g,_ndc en su secuenCia de amlnoddos, o Incluso con cambio de toda la secuen<:iit a Pilrtir del pun!Q de atter...ein debidO a un desplaz.amlenlo del marco de leaura (pg. 350}
21 .3.3.3 Formacin de cuerpos o complejos de empalme

El CXlf1c de intrones y etl'lpatme <te axones est mediado por t.na asociacin ma<:romolec:ulor den~ C:UCI'1)0 o complejo oe empalme, o ayustosOfl'la (.sp.Vceosome). E51e se forma por ~tlc;:i(w'l del preomRNA (alrededor oe tos centros Cle ayu~e) con vartas rlbonucleopr otlnat nuclearu pequiJ.,s (snRNP, dt!nOtnin&das U1, U2. U4, US y U6}. constituidas a 541 vez POr protelnas y ANA nuclearH p q..,.os (snRHA. del miSmo nombte). El 1amat10 def
PROCESAMIENTO DEL RNA MENSAJERO
281
ayu~osoma es de unos 3.000 kOa, con un ooetlcienle de seownentadon de 60S, &~mllar a la subunldad ma)'Of del nbosoma eocari61ioo: en total, esl formado por alrededor de 4 5 poli!>otidos y 5 000 nt de RNA. E&.\e complejo de CO(te y empalms es necesano tanto para el rQCOnootn1811\lo de los pun1os de e:sas16n oomo para la ca181i&ls.
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de oone y ~mpal me
21.3.3.4 Mecanismo de la reaccin

La reacci6n. de Cl011o y emoaltne! $U p()OC. ttPi*ten1omcnt.e. 1 ;, ruptura de dos oni<K:e:> 'osi'OOiGstcr (lo$ que &el}<tlan fa b'maciOI'I de un nue-vo enlace fOSfO<Ii<)ster entre lO$ dO$ e..Mones Sin ernbargo, el mce<~ni$JTIO ~~l.tllitOOo 1)01" el ayuS10$()1'1'13 no ttanscutte de e$3 toona, ft() My acCin de nur.te:,sas y ligat..1 $ir dO$ reacoones de ttansesterifleaciOn.
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1
PROCESAMIENTO DE LOS RHAS A.IBOSMJCO Y DE TRANSFERENCtA
283
En eueatlo tas. et proceso es similar. oon un transeri1o primario que genera 3 de lOS 4 rRNAs y con trar't$CriiOS l){im3rios SOI*'adors ~1(1 ti OlfO rRNA y ~ro~ C3CI3 ti~NA. T31bin on alounO$ ta$0$ hay elimina~ d intrones. En el caso de IA:NAs se prOO.Joe. adems de ~r~ recorte de los extremos 3 y $ , la adicin. a las mola.las de 1RNA que n o la po&ean. de la &eeuencl8 .CCA en el extremo 3"-0H. Lo& tRNAs, especialmente. sufren numetosas ntaOOone& de motflfl~in Quin.c<~ QI.M:t deierminan que en a;.$ molC\II<J$ maduras abunden lo& nuc*Jsidos
lflfocuent.- (p~g 13, 21, 72 y 74). dlf~~ a
10$ CU<tlro que Oilrtlcipan en 1t1 $intosis dol RNA < A. G. u. C) E$1<ls mocJirle&eiO"teS C(l(ltfl)uyen a naoet mas resiStentes lOS tRNAs a toe l)r'ooesos <.le deyrttdaei6n eelulal, ttuntntancJo, pQt tonto, $11 e~ael mcti!Oliea y su vid3 me<lia
1 Resumen de las n)()(iilicaciooes postranS~:ripc tonaks espcrinwntadas por los dislinto.'IS u pos. de RNA 1
Jlf''li'SCW
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1 I"J"'!nm,.,np.:iuml o.:(Xlf'IICII)Il J'W'If t\"OAC .,....duno~Joo oJo: nltl:IIIC"'
284
MADURACIN DEL RHA O PROCESAMIENTO POSTRANSCRIPCIONAL
l'fi>I~'A
E.jt:~tlplo: n\al,tu~in <)eltRNA 1> ' de kvadurn.:
se escinde la s.xo..:ncia 3u;~ en 5'
se escinde UU dd cx1rcmo 3' y se aade CCA
lila~
' parlmiKtip;ioul;
n'oii<Jura<'>On dr e~.,.,,_
ocluMnaotton ~ IMI(l~ mOOiti(rin cqyalt:n~ ok nr,do:,ib
se mdilicom co..,.,ltntementc \arias bases se elimina un mlfnde 14rluc:ktdos
' +
21.5 MADURACIN DEL RNA MITOCONDRIAL

gran
La transcripCiOn <Se~ molCUla de ONA mitocondrial humano (pg. 257) produoe 3 RNAs transcos pri!Nriot <Se l<~~llo, Cli)'O prooesamleniO da klgar a todos lo& mRNA.s, IRNAs y rRNA$. Es.1a ~i6n llene lugsw prin~ente por escisin del pre-RNA y. en el caso de los mRNA$, ta~ p01 DQiit~Cienilt~CiOn (pero no hay 10rmacaon de caperuza 5').
1ranscritn Ll
(YCr PIII, U7)
~ tRNAf'tw
tranSCrito L2 - . . ''RNA 4 (no funcional) + 12 tRNAs + SI~~~~~~

lr.tO $Cl'ito H _ . . S tRNAs- 1 -+ RNA oo (uudonal + cebador pll'll la rcplie<Jci6n de 11
21 .6 REGULACIN POSTRANSCRIPCIONAL Y PRETRADUCCIONAL DE LA EXPRESIN GNICA

A pesar de que la mayor l)all1e del oontrol de la elq)(esi6n giri::a &e oe anto la e~ oe lnieio de la transcripcin. a trav$$ de 106 f3C10IC$ de lrtii'I$Ctlpcln (pg. 264), 8J'is.ten mecani&l1106 de regul<'lc:iOn on IQdas las etapas. de lil exwHiOn (p6g, 262). En 10 que respecta a 106 proc8$0$ posteriores 1~ trt'ln&ei)Cin pero previos a la IJCidvociOn, ex.iSten ejemplOs de conltOI tanto en la madurCtCin dol RNA C(lf'I'IO et'l su transp:tte al citoplasma y cambln a travs de la regulac!On de la vidtt rnc<ill del mRNA el'l el Ciloptasma (velocidad de &v degra<lacln), Pot faZQOt$ drt s.indicidad. 50 dNt~rrolla Uni~met'lte este Ultimo aspecco.
REGULACIN POSTRANSCRIPCIONAL Y PRETRAOUCCIONAL DE LA EXPREStON C~NICA
285
NIVELES DE REGULACIN DE LA I;XPRESIN GNICA EN EUCARIOTAS

{'\IIWt"l
m:
11'\11 \<ol;np:IIONI
D'A a )11 lr.'l'*f'ICI'-"n l:CndcnSlltll}ll de: '- .:wmama j ,\l ctllack'lll&t I)~A
il!ll.' loHk 1 1 11o1~11 V~;C.,.;Q,L4.~'klh8-'tC ilon old ltN A 1 po<.. N,...I [ fKtwi <k ~ rtnlnvtlf'l<le '- IW!oO(rlf'"''"
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c,..k')' ~jl\c
Moditie.Ku.~
6r! kNA
Jobdur..:oo allcrnlllh"il
Sd.:I.'Cfl'n l; qvt JC NA~ ror~ ltan$porbll"f -'ttM,PC~11t lli:U\'11 a tn~b 11.: lw IJIIttlf.
RNA
Coouol <k
d.:~W. dd
R"<A
21.6.1
Regulacin do la maduracin del RNA
Las dls.!lnlaS etapas de procesamk!Oto de bs pre-RNAs. prn~le eslvd~ada&. son lgicamenle $V$GOP!iblc$ do
(eguta.clon, lo Que &lactar a la tasa de eJ(pre:S~n <.1e: m~ wu cspondiel\le~ Esa regukl<:i61\ JIQ slo tiene lugar el\ cuanto a la vetoc::idad o efiCiloeiil d~J ~ r(lt'IQCioMS de r'Md\Jrac:l6n, SitiO que en algunos casos uo mtsmo pre-RNA
m.advro .segUn pt00e'$05 disbntos de)el'ldie!'IOO de la clula considerada, formando mRNAs edap1ados alas necesidades proteicas particulao'Mo de Ufl teiict<> o de Ur\(1 s!I\Ja()C)n tl!llologlca cooOI'ela. La lmpllcac:ln d8 este t4X> de vanablhdad en el contrd del prodveto final., enotr'l'le y, por ahOfa, poco conoada: a este nivel. tero-a mucho que aportar en al Muro la prote(mlica (p&g. 2t7).. Vn e,empiO camc.terl6tico de esra torma de regulic1CIIn O$ (11\1Y\I$1CI ;~ltam;~tivo, qve COm(omt:ntQ de:$m:lt'!M t~n papel (ll'lla dlterenc:aa.cln cAaryen el control del des.atrollo {por ejomplo, on lic1 detot~in dol sO.x(l tn ~)
Ejemplos
de ayuste
altetnativo
Je:t\.lflii!IH '"\ug"6:IIXI!i~
J lrJda..--..:in L
\'KIMk "cutU" dd l"!ht*rciclo
----..-
Tema 22
El cdigo gentico
22. 1
Antecedent~s y prop~dades gener ales del cdir~Jo ..................................................................................... 237 7.2 1 1 LO!!. codones del cdigo son IJ'Ipletes ........................... , ... _ ,_,_,,,,.,_, ... . .................. 288
22.1.2 Lot> tripletes no se solapan ..... , ., . .. ,,,, .. ,,. .. ........................................................................... 288 22.1.3 ElOsten tnn. marco6 o pauta<& do Scl<;lu~<~ , ........ --- ....... . ................................................ ............... 288
22:1.4 Papel ildOPI.ador d.e!IRNA ....................................................................................... ---- - ,_ .... - 289
2:2:.2 AsignOJcin de oodones a ami noicidos c:oneretos - .....-~.....................,_,,,,, 289 22.21 Tr~ondepo&lt!CietlosslnlllOOs ...................................... _,.,,_,_,.,_,_,_,.,. ...... - .... 289 22 2.1. 1 Enswyo 001"1 h()mopollmeros ........................................................ ,.,_,. ...... , 289 2'2 2.1.2 Ensayo con secuencias repetidas de dos nudetidos ....,_,_,_ - .....,_,_,., ... , .,_,_,_, ....... 291 22 .2. 1.3 Ensayo con secuettelas repetidas de tres nucletidos 291 22.2.1.41 EIISayos con secuencia; repetidas de OJatro nucletidos ... -.. ............ 292 22.2.2 Evidencia Jn vhoo del c:d1go genllOO , .... ,_,_,,,,_,_,_,_,_, .............................. 292 22.3 Mo de&os de representacin ....... ,,,,,_,.,,., ............................................................................ _......................... 293 22.31 Form~toonUI!btil ...................... _,_,_,,.,.......................................................................................... 293 22.3.2 r.o,m&to tin::u&ar ............................................................. , ....... , , , 294 22.4 Catacterfs-dcas especificas ...... ~,........ ~................................................................................................... 294 22.4.1 Cod6n de ~ioo.......................... ,, .... , , , ........................, ............................................................. 29 22.4 2 Codones de tCJITIWI-t~Cin ............................................................ .............. ......................................... 29-4 22.4 3 Degeneracin ..... , .. ,, , , , ...................... _,_,_,,,_,_,_,_.,,,.... _ , _,., ..................................... 29S 22.4.31 Hiple$isdelbcllanoeo ... ... .................................. .............. ............ ............................. 296 22.4.3.2 Consideraciones priloctica<S .., ... ,.,_,_,_.,,_, ----- ----- ,_,_,_,_,_.,.,.,_,., 297 22.4.4 Universaidad........ , ..... ............................................. ,_,_,_,_,_,,, . ........... .... 298
El COdigo gentico es el conjunto de pavtas que rigen la transrcrenoil de lit .nform&on oontonil:i<l en ol mRNA (y en delinitrva en el DNA} para la sln~is de 1<1$ PI'Qteinas. oes~. tanlo Cl"' procariQUI.$ como el"' eueanotas, ta corre~in en~ dos 1eng1,1#1jes infOtm.lltivos: 1;~~ ~ia <M 1'\uelelidos en el mRNA (elle(!(Ju8frJ COit cl.l&fro lettiU de lOS I'CidO!II"'ucieioOOS} y la sect.tenela de amlnocldos en el polpptio (leflguaie con VE~inte fetms de las ptO(einas). Ms concretamente. el ccllgo gentiCO establece la (ll)l'ttt:$pon00ncitt entre lO$ 64 Pl)$i~ triP'etes de b-1$1!$ df;l mRNA y lO$ 20 aminoeid06 de las protelnas. (Noto~ E$ frot:;veole. O$Peeialmetttc en el ecligo gcn61i0o y la t1&0UCon, ucili%3r la palabro "ba$e' oomo sinnmo de ~nueicticJO~. er"JIO lf~lalivo a la seeut!i\Cia del mRNA}.
22.1 ANTECEDENTES Y PROPIEDADES GENERALES DEL CDIGO

Hoy dJa es relattvamente fa oonocer la corre&OQndencia entre amino<:idO$ de un.- ~int~ y triplotH d nu<:;I&O!ldos del mRNA que lOS oocMican, me<Jiante simple comperadOn de la secuencia de ambos. Sin embargo. fueron muChas laS aproximaciones experimenU~Ies realizadas.. a partir de los ellos 50, que contnbuyeron a descifrar el obcigo gentico. a la vez que a entender la transa.,cin y la tradocan Globalmente considerados. estos estudios han supuesto uno de 10$ m;Jyorcs retos et'l la historia de 13 Bioqui.....:a y la Gef'l6ti(:a.
t..<'l inforrt"'lttCiOI'l pt"evia et~ la que se aas.a el OOf'IOCimleniO del edigo gentico es ae dOS Upos. Por un laao . k> rtfcrenre al tRNA que. a pesar de no ser un elemento propiamente dichO del cdigo genetloo. su Intervencin es. esenCial para entender la OCMTespondena:a entre mRNA y protelna. Por otro 1800, el rtbosoma (pags.19-at,, orgfnlo cltoplasmuco donde &e reaiza la sntesis protGICS, segUn se demostr empleando aminOOcidos marcadOG oon isOtopos tadiactlYOS.
288
EL CDIGO GENtnCO
Se OO&criben a oonlinuacin las caractari&cas generales y particulares del OOdigo gen61 ic, basadas on ~ de lOS e~r'rlenlos mtls tepresetlt&liVOS QUe Mn conlribuiOO 01 ISo&eifrar el o6cigo geneico y su retadn con la slnteSis
pro<elca
22.1, 1 Los codones del cdigo son tri pieles

Lct 'hiptesi& de los codones se demosiJ' al obsetVar que cambios en ta secuel'lda de un mRNA CQn(ho,~citm a a!ter...cionell en la secoencia <kt aminoacidos de la prot.eina skltetiz:ada (eo el bacteri6fego T4). EII'UT'Iero mrnlmo oe nudeticSos otteewno para 'cxxflf~Car un aminocido (tamatlo de las unidades de codificacin o relacin de oodifleaei6tl) $t deduce PQf' un simple cloolo malemflco:
unidad de
inSufl~e para oocMlt:2'1r
4' = 16 3 nudetldoa 4, 64
20 aminocidos
mas que suf.lc~te
La unidad do codificacin es el trip leto do nucletidos
poJ
Por lanto, para poder codificar lo& 20 amnocido& naturales se necesita que cada aminocido venga especificado una secuencia de 3 nucletidos. llamada trlplete o codn. El ~te es i8 caracterlst!ca que ttenne la naturaleZa general del o6diQo. Obviamente. kas 64 posib)e:s cofTtlinaciooes exceden las necesld.ades para 20 an*loctoos; mas
adelante se analizar cmo se acomoda ese exoeso de lofOI'In&CIOn (pg. 295).
22.1.2 Los triplotes no se solapan

Una de las propuestaS .W:iates para la dl!ltr'b.lei6n de lOS (:()(J()nes en el MRNA fue que tr'iplttes C()(ltiguc>s compartieran nueletldos.
lA
Hipcesis de
tripl<"ln :solap;mte,.,
wxrpu(3t05
~
8 C DE F G H 1 J K L M N . ..
1
elida nudCi)cido> (por cj , J;J
e u1m
n Jdl,o.
~~
1,,. ni
'
CD!, D!F, ! FG, FGB , GBI, HIJ, I JK ... CD!, ! FG, GHI, I JK, KLM
.l
litptc;:ls di: tripktt$ no t~C>Inp:ml ~
--------~
--...:;"':;;"<:.o = k 'c: -==-_)
cW nudM udo ibmla
"1
'---"'-""""'--="---'
l)(t CX!fl)~rli4os
OOOliSutl!l.
ABC , D!F, GHI , JKL , MN0 .. .

b ood..-s tiC) cUIIIpanm n~.M:k1leido.lel
...--
En la hlpte&IS &daipante. la 68CUencia del primer triplete re$1ringe la& po6ible$ &ecuencia& del $Ggun0o, &ta& a
$U ~ las del teroero. y asf suOKivament-e. por to Que la socvcnc:itl (Jet <tmino<ICKs de f3s proteinM es:tn~ condicionada. no podria Mf cualquiera. Sajo esta llip(lt.Mis la aneraeiOn dt una base ~ftcta a vaO$ OO<Iones, ti> QUt pnxlueirit'l ttllemc:iotles en mM de 1-W" altft:)lleio. Pli&!lto que estas previsiMes no se cumplen en te realidad, se pucto
<klm0$tnw
q~
la hipO!eSis sorapante I!IS
~rreeta.
los ltlpletes nunca compartan r.ucleOtldos. no se sdapan. Esto es
asl para el coct90 gen'tioo de todo& 106 seres ..tvo&
22.1.3
Existen tres marcos o pautas de lectura
El hecho de que bs oodone& contiguos no &e &elapen no impliect q..e exista setlal de separacin entre ellos {es decir, no e)(lsten 'ooma&~. 'pui'TI06"' o int.emJpc:iones; tal 5eP<W8CiOo slo se Mee notar sobre el papel, par f.aci!itcw !a lectura e intcr~<tcin <l<t 10'1 SOQ..Iencia). Como consecuencia, en p.1nc:ipi0 1a tec:tun~ <too ~ mRHA en la ~On se S)O(Iria iniciar on euatquier ru::I&Oildo, 10 que detin~la a ste como el prtmer l'klc:leeldo del codn de lrklo de la tr~t.~tciOtl. E~ signil'ka la em!encia potenCial de tres men~s en cualquier mRNA. dependiendo de en qu nueloOiido se inicie la l&et\n de lOS <:OdOnes: se habla de ltes marc~ o pautas de le<:tUJ'a. la traduccin def mRNA siguiencJO cada tn:t de enos formaria ttes pollpptldos dl!l'.lntos.
ASIGNACIN OE COOON ES A AMINOCIDOS CONCRETOS
289
J fomna.. d.: lttr" l :M.'l.'\ll.'tlClJI Jd mRNA

J m:m:~ d.: l\'leltlftl
(A 8 C D E F G H I J K L M N
1":
~:
J"
ABC , OEF, GRI , JKL , BCD , EFG , HIJ, KLM , CDE . FGB , I JK, t.MN ,
Id J' )':1 c111~1d1.' CCIIII \"1 (WUlll"M. lln~"'''!lajC ~S d 1111MI'IO lluUqfJ(: C'Ot'llliYI llnliMicidO m('tiOS)
Sin embargo. en 1:. ll'ad!edn (tanto in ViVO como in \!lito) no se manifie&t<l e&Ut t'parcnl(l amb~gOOd<I<J (por ttl ltlltluct et mRNA eorre~>pondlenle a un gen). Una 'Y8Z lniCill(la la tr..OO.CQn $gl.in vn m.'k'CO de lettura, ~ puede docir ~ lO$ ouos dO$ carecen de infOI'IT&aein. Sin embatgo. uno de 10$ otrOIS mt\rtos puedo ~esen1ar on mensl!jo vtllli$0 pata otro gen dlstlniO, caso de bs genes solapantes (pg. 249) El marco de Jeclllrn puede cembl&l debido a! det;plazarTilGOio im 1 O 2 PQ$iCiOM$ del !)ul\10 de eOtCiO o. OI#'!We lB traoucdr\, por salto eccicfefltal de vn nuclelido mientras et mANA ~ roCOtrido por el rlbOsoma. la oonsecuei'ICia del cambio de maroo es que a parlir diJ e:so ~io 1;:~ :;oQ.I~C:!a de t:1 pi'Oieina nueva es dl&tlnta a la ori9nat. E:s!a es el mecanismo utilizado a \'eCOS p<tra fotnl(U do$ O~ protelnas relaCIOnadas a pMir de un mismo transQ"'to. Tambin es el resultado de atgun<!s mtii.Ociotl$ pvl'lt\rol~$, 3q.ll!llas en lr.i que se insertan o eftmlnan nudetidos l nmoro no
eje~.
m6!tlpto de 3 (pg 350)
22.1.4 Papel adaptador del IRNA

l)(tbe tOCotdll se ~ la '1!!CWrn .00 la secuenca de c;odones esta protagonizada por los IRNAs (pg$ 71-75J. que ~n el p;))Ol (!~ daptttdores de la IC'Itormadn gentica a ia sec.uencia de~ proteinas lntervllm8f1 para elo oom~:~ estroC:IUr..'t$ Oetivas e$f)eei:;t!lzaclas (lormando los amlnoacll-tRNAs), que dlrtgen los anlWIOcidos ha<:ia el mRNA slluado en el nbo$0ma E.n e$te gtlnulo UMe lugar la lnteraccl6n det tripJete de bases del amlnoaQI-tRNA ~ anlicodOn) COtl el tripltltt de bas.e-s del mRNA (codn) determinando, dolante la tradocci6n. l:a incorporacin ~ ;;~minotloido especifico
Irente a cada postc:n del mRNA. Pof tanto, ;eioqu~en\IJ , ctno oc:u11e do aqui en adelante, se dtoe slmpl~men~ <ue "un codn determina o oodifica un amino;!K;ido
Et tR.I'o"A e' d modi<tl.lor ~ntf(! el mco~:jl' .X1 mRNA y l;a SCC"uc:nc-ia d\' nmino:il,do' del puli'lfpti.do quo: Jo.C c.s.t $.intcaiz:tndo
intL"T'.teti~
un aminoeidQ
nho..oma
22.2 ASIGNACIN DE CODONES A AMINOCIDOS CONCRETOS 22.2.1 Traduccin de pollnucletldos sintticos

22.2.1.1 Ensayo con homopolmeros
La necesidad de un ttdete para codibr un anwlOc:ldo .se demosiJ' lniCISlrneniO Jn lllt!o c;on el emp&eo de dos lipos de componente$: un eXff8ClO libte de cJIJJ83 (lntcialmente de E. coN o de tiHIC:liiOCdo& de oonejo. hmado ~extracto S-30'), que apof1a 106 oomponentes neCEIS<lC'IOS para qve .se de$iiii'J'Oife la sinlfJ$Is pnxeka. a excepon del ~NA
P wh
c::ga
homo~cnci>'.;K i ~
D"A """""'
mltNA
ri~"
~"'ll.tln&s.
ONit~a mRNA
. . d(~A
ribo:>on,Ot.~
1.-'UI .Unll!>
ccnLrifugacin
1RNA
37"C. .. l5 mm
l it NA
nbQ..;oo~as
cntUilD
"tnratto S:.lo
290
Un hOmopolin10MucJelfdo sfrltelico, por ejeil"'piO poi-U, ~ IXlf (pg. 246) a panlr de UOP y un cebedot, sin necesidad de mol6e.
~~lis.5
El CDIGO GENTICO
con polinucteeldo fosforilasa
~-..
RN A C'cb.,dor +
...
Molcula de llpo RNA

(poli-U)
+X 1>
Al afladlr este pollrrilonucle6tldo al exttaciO acerurar (S-30) se eonsr!ruye un siS1el'ntl do lr&Civec:iOn in vilro. produciendo un homopollppciOO. Empleando amlnocldos marcados oon lslopos radlactrvos. se pve>e 3'Yt:tigut'r cvl es el polipptido oblenldo.
pllnien<l<> ok (ldiL
~
!3\IG'ICII\~~~ad ~d 1\ltru
partinaOO de poll<C
~
I''C,.._.
1
~
r ""''"e"e"'""e::"'c"'"' 'c.Ce__, e/
~
l'"t'l"-
I'"':iti
'~'"""' '' ,.,..,,
I"CII.li
~ ~= :;: =: : ;:'~ ..~~ 1 t:..,==;'==;:'~=# ~ t:..==;'=;:'~ =#"'=. J l~:...;==e==;:!'!: ~ ~

r '-flo !k ino:ubec'ocin
lil!ltlN ~i(ift
... =..J
tiempo> <k; ~i{ln
1..:~ <k:~~"~"
..
A penor .k ~U. d no.-.. -.b!> oll'>t>k ~~ lllolia:d'iltlld prlplublf IJIIIf*ln.l) co el (\IR ~o<ibl INif!Ca .. ft11ll,_., S:~Ufll:lll)~.:,.t I'IOC""' d .moI<Ik> -li~P"' l'lwlpkk UUU )'~H'Iul ""'-bd ~ Jl')ll-l'h:. l!llo'l K~1l_,..., IIJI,u!>lll\)tlt.~ de ld.._'li'i.lii._I"CJJ'W Iu , _ . l i t f'OI.C.poli.(;;>poii<A
Los
eXDefltnen~or.
an&eriote& slo permiten
de$ciffa~
algun05 <:odonc$ muy
pwiicul~ros;
p:!irn do5velar ..,
oorresponencia entre lo$ dom:; todonos y 10$ 1'1mii"'I6Cil:los se ~ polirrlbonuetetdos oon secuencias rooetl!JN de dOS. tres o eu&tro baSeS. que conducen a 1& slntesls de polipptidos con uno o unos pocos afWI'\Ocidos eo pattOI"eS tepelltlvos.
ASIGNACIN DE CODONES A AMINOCIOOS C ONCRETOS
291
22.2.1.2 Ensayo con secuencias repetidas de dos nucletJdos

rql ~ de un.:a hebr: de OXA
lile tQrmaiJII
siMtlioo. de liuencia
)l(lto;, llpo .k pollpq,udo.:o. cnr dos nnunoQ.:ldof; aflcmam~:,
"~; ~'~,,~,~~~=--~~~~ ~ =o'---uh;oauo:klllkl ;

Mltltii!OO
(a.mermmdo pw"IIO o pot t~lm)
dA
dG dA dG dA dG
ONApol
dN'rl's
..
dA- dT
dG-dC
dA- dT
dG- dC
RNApol
dA- dT dG- dC dA- dT dG- dC d.A- dT
l TI' (!P
..
mR."'
u
u
si.slcma de
in u'tro
o e
o
lraduedn
..
dG-dC
dA- dT dG- dC dA- dT dG- dC
e u e
o e o e
l
cod!tlca Leu
rsitiiiL'!Oi~ de
PNA
IT,m,tnpc6n del 0!\'A
Se conellye que 105 tripletes UCU y CUC oodif~ean Leu y Ser, o vioe"o'ersa; oon es.te ensayo oo se puede definir la correspondenda de cada uno. Fueron expenmeniOG posteriores lO$ e dCn'IO$lr.lfon que UCV wdiflcil Ser y CUC
22.2.1.3 Ensayo con secuencias repetidas de tres nucletidos

Para slmpl!flcar. se represen~ dlreaamenle el mRNA. en este caso con una secuenCia trinucleolidica
tM~Ii:'de

IIUnl
lodo~
, ,.)'T
II)C
1nplcsn 9011
iguale!>
IThr
, ,.)'T
e e
e e
1 L
Se estae6ece. pues, 18 OOespof\Oetlcia eotte Tyr, Thr y Leu oon UAC, ACU y CUA, <le nuevo Sil'l )(l(ler <:telinlr cvltl de los oodones OOCI.tica Gada uno de 105 3 amlnoacldos.
292
EL CODtGO GENU ICO
22.2.1.4 Ensayos con secuencias repetidas de cuatro nucle6tidos
u
A
e
A
o o
C'fl Ud>~ lln(l .k los. J m31\!0S de
..
e
A
o o o o o
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lei!Wf11 CliiUCfl.i ~r:~1m\ -s. ~e !OC
un altcn'lando
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sistc-mn de
Haducctn ,;, ilro
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CIJA
1lle ser lleu 1~ ITrr l ile 1 Ser lleu 1 S.r ITyr l ile !Ser IL<u 1 ITyr 1 1 'yr l ile 1 Ser lleu luu IT y r Ser !ser ILeu 111 1
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w ubticnc una
c~la ck4
pnlipfptidot.. q~ tt'almcntc ci~nm b

rnumn ti'UCI'ICP y lo di f~ e" ~1.16 lllttiMflt1 do es
d p:nmcro
~ r,, ---.... '~
~ s" ...-/
l,cu
l ile
...
l ile 1S.r 1Leu ITyr
ITyr
El mismo planteamiento exi)Erinental puede &el extendido a otras secuencias repelitivs& (de S. 6. etc.. nuclelid06). observilndcne siompre 1;1 oorrespenc)en(;ia entr un ~y un amioob<;ido, Esttldiando a&i la sfnte&is O. vn gr.an nUmoro do mANAs $inttti00$ se pu(IO d0$Ciftaf 13' asignacin concreta <Se ocros lriplcle$ (c:od(:l'\0$), 31a ~que se ~OriO te ~ltdn del 00c1g0 (pag. 295).
22.2.2
Evidencia in vivo del cdigo gentico
Son vatios los expetJnentos in vJvo ~e confirman las concbsiones alcanzada& in Y.itro; en especial. aqullos~ a"*an el efecto de las mutaaones sobre la HCUencia peptjdica (tanto ii'IIJucidas como e$p(lf\ti'INI, pg. 344). Como ejemplos *.lsb'ati'Yos se pueden adelanta aqui algunos ;errcspondien1os a los geno& do la subunidad o: de &a llemoglobina, En ambo6 ~$0$, la sv&titucin de una sola ~M ..., .a OtO nom\i'll m<XIiflc:t~ U'\ cod()n, 1;011duc:iendo a la <~l*'icin de ~ ilfT!ino~do di$!into en ltl seeuencNI peptldiea .
...,..
\ AA ( LYJ)
~ c:in
A-> G
\... (.;
WI:I!lD!Il C A1\ (Giu)

GG A (Giy)
AAA (LY!') CAA (Gin)
Sustituc:iOrl!e$ de nU(;Ietidos en el g-en, GM (Giu) que C3uSM C31nbi~ m W\ aminocido GAA ((ilu) dd polippcido, cooontt:ldas en la c:.otdc'-" a de hcn.oIOOinas hUin.'lnas GAA (Gtu) ll.nQrmales.: GGU (CiyJ
CAU (llis)
G_, .\
G~ C
(; ... A
C-> 1
U~ t\
G ' U (Asp) liAU (T')r)

AAA (Lys)
AAU(Asn)
MODELOS DE REPRESENTACtN
29 3
22.3 MODELOS DE REPRESENTACIN

Se han elaborado diversos modelO$ (tal>!~$. esquemas. ~) para representar de bma dara y sencdla la correlacin exls.tente entre codone& cSel mRNA y a~ciOOS ()el 0Qiil)6plldo lfaducido. En todos ellos, la seCJJencla del triplele se refJete al codn del mRNA (de ahi '<! pre:sonci8 de u y no de T), tltlnca se lrldica (X)tr'l() ~ete del ONA ni como ~e antloodOn del tRNA {aunque se PIJOdon y deben Moer referencias c:ruz~ entre las secuencias correspondiente&). Las btl&e& de c;do eodOn se numeran. 0010 siempre, en la dl'eocln S-. 3', la misma en la que &e sintetizo el mRNA: asi. 13 1"' x:.sidOn es el extremos del codn y la 3 1po&lcln e& &u eldremo 3',
22.3.1 Formato en tabla

L<' 11JPreset'll3CiM mas c:omrvnef\4e usada uliiza filas y columnas. a modo de tabla de doblo entr;)(f3. P~
$CnlarSe dos variafues;
En b \'Crsi6n trndiciotul , l~ liblt 1udican d 1 nuclclido y las Ol)lumnn.~ el 2". ~ oht1~1cn 16 cuadrrcubs. Al 11!\ldir d ~ m.w.:lo.-tido panx:en 4 tripldcs en
.:ada cu11drlrula. id6n1ioos Cfl sus

Finaln'IC'II1c .se india. el amii'IC)dcido codlli~CI por cad:1
lkl11 pnmeros nucll:hdbl.
codn.
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294
EL C0DtGO GEN ~TICO
22.3.2
Formato circular
Un modelo ms re~e. posblemente ms sencillO y fcil de ulli:Zar, emplea eirtuiOS oooe6nlri005 on 10$ que se Indican. del cen11o hacia fuem,los 3 nuclelldos 6ef OOdn y el amlno&cido Que eo<Jili(;fl, NutiWddv!l:
1~ blse del
codn
Aminoi ddos: (:abn.. -vl;nuM> d~ 1 y 3 d~ (Asp, lu) b.~iOO!l (lys, AJ'8)

11~
1 c~"'''DI& o.\o:! ~~~~pi~ .,._o ri prv,::tama
Z' OO.sc: d~l cod6n Y b.'tSC: del COli6n

l~ras)
C(ln :t?lll'rc
(("ys.. M~)
llh.. -<JIolcs(Scr. 'l'hr) amidns (Asn. Glnt nromtix> (Pflc. TyrJ T'P
ntiftJCOS (Leu. Val. 11<:)

Pro
Al Gly
fl>m'W;o:;) ,Jc \'islUJ'IlJ01~ !k III,)IIdoS
1!11111'>.'11111"" RII'M!II: tole~~ tm!lllllll'oipUII ~ ~ o:uluti'J u.o.;urwpm

-hl\lkliJUt. hi<II'CI~)
22.4 CARACTERSTICAS ESPECFICAS

Se pueden analizar etnpleando las represeoladones an1eriores. Son las siguientes:
22.4.1
Codn de i nicio
El codn AUG. el unlco que codifica metionlna, es responsable como cuaiQuer otro oodn de la lnoorporacl6n del aminocido correspondiente al polipplido. p4:1ro al mismo lien'C)O PQM8 1~ ~r1icularii:SOO de ac:Cuar de forma O$Peelf~ea como codn de inicio en lt' rn~i.e de bs (;11$0$ (!Xln mvc:ha!l menos ttecuencia se uS81n oomo iniCio ouos eoctones.. en G$~ttl ACG, CUG y GUG) Es docir, 1<'1 s.intosis mayOri a de laS protein eomier'lu el'l ul'l cod6n AUG: ellO explicn que M~ Siempr-e ocupe la CX)Sici6n 1 (IniCial o N-terminal) de o.salquler pollpptldo recin sintetizado. Como se \'OrA h.lt)OO (p~ . 306). las (lf'OteiMS eoeariOiicas poseen una me11onlna Ntennlnal. mlentfSS que en procarlotaa se ~rpora oomo fotmll-metlonina. Para que AUG acWe oomo codn de lnioo en eucariotas se requiere <PJe tonne parte de una secuencia especifiCa (seooenaa de Kozak. pg. 306).
(Se'*'
22.4.2
Codones de terminacin
Se puede ob6el'var en las representaciones del cdigo gentico que los oodones UAA, UAG y UGA no ooc:Mlcan aminocido alguno. sino que causan la finaliza<cin de la sfmesis proteica (p,ig 314) Se les donomintt codones de
termlnadn, de paro, codones $top... o Wmbi6n c:odoncs si n s.enlido. La PteSenciCI de 3 eodones (je tormil'l<'lcin en un total de 64 ir'ldieatia que, estadistieamet'lte, la alntesla no se ill:lrgttri.& mas all de unos 20 aminocidos (3.'64 a 1/21 = 4.7'%). SJn embargo, la regln estructlJral de los genes pata j)n)teinas conuene una frecuencia muCho menor de oodones de terminacin. La regJ6n del ONA ~dlda entre un coOn ae Inicio y t.I"'I de terminacin se lama ~marco abiec1o de lectura (o,oon nMdinp trame, ORF). Por ojomplo. l);l<r.l una proteina de masa 60 kOa se reqV$riri;J ~ m;wQQ abierto de locbs<a OQf1 unos 545 codones (masa media de un residoo aminoc:ic:lo = 110 Da: 60.000 ~/ 11 0 ~"' 545).
CARACTERISTICAS ESPECIFICAS
297
los de\alles mo!erulares de las interacciones e Wa1son y Crlek (p&g 41} y 13!$ menos f.3"o'Ort\l)lcs (enlaces de Hoogsteen, pags. 60 y 73) son 106 &j~Qulente$;
ri~OoiCn
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J" nuciOOI.OO (3 ') en

d (:odn ( mR.NA):
1\"'>tllt.lh.:lt':
C r'C\JI)(IC;.' Ull ;.l
\ r~ccm<K~ \In
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A
l.1
G t\\'aiS(tfiCnclc:)
U (Wa1$011Cnck)
A I WaiS(II'ICnclc:)
wl(l t'OIJn
-"!
~
~
G
E
G (mis ISCbd) C t WaiSOnCrick)
t 1 r~COI!(IC~ d11._ \:l)IJn!W'
(ms dbil)
( ms ..SCbd)
rc~'<WIOo."'C o.l1l;. "'01101~~
.e
=
A
u e mas dCbil)
(ms dtbil)
l rccont'I.'C ln:s ~.._..dt.,ncs
22.4.3.2 Consideraciones prcticas

Todo 'o antttt detetmina que el ;,ntioodn de un tRNA ouede leer uno, dos o ves codones de un mRNA, en tos cwtes la$ 2 primefas bases son idntic-.3s. v eamos ahorl cmo puede calcularw el f'nero de antacodones, el rnero de m()lei.JIM direren~ de I.RNA nece$811as 1)81'8 10$ 61 eodones OOdiliC<'Idores de loG 20 aminocidos. Aunque en tas otvlas s&a es una cifra impi'Eicisa, desde un pfanteamiento te6rico, basado en ef aptovecha"*!nkl al mlM'IO del balt\nceo, p~ orlm'\(11'$0 <1ue so fMICID$il.<tn .W mtttOS 31lRNAs para 'leer" todo el cdigo.
298
EL COOIGO GEN~TICO
tft).<\to. , } I.M~.\h
)ia~;o;"l"
)tJU..""'
p.w hat,p'"""' m ) to>ol.~ lo..'~< 1m>11.0M "" L', r '1 A ~ nqt~m' ~10 l llfJClldoJft P'~ e l ,.. ;:odbn ik' la
fii!O<!ric..tl tul.lllilro.
n Je ~;,lek~n.,."\
n" dr an.llcu..lo.IL"'\
~ Wtllllo:C idCI
Kir .llnurwOcidu
aenino5~ idos
n" IV1al de
n toto) d rl' to.al de antioodQncs cod<>n<o
1
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2 3
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22.4.4 Universalidad
5 J
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9
18
,,1
Lo; pnme.os e!Uudlos Indicaron que la oom~spoodencla Gl'ltre todones y amenQ<\ckkl$ ltl'3 ltt mi$M3 lndependientemeo1e del Of9il'll$mo e$bJdiadO. eondueiendo a la atlrmadn de qLM~ et cdigo gentico es unlvenat',
Actualmente se sabo ~ o~ no es oomple4amente derto; se han encontrado ex.oepciones, auf'IQIR escasa&. en tas
mltooondncws hvmt'IM<'I$ y de otrOJ mamifmos y en ciertas bactenas. Debemos, cui u nive-rsal
PUf!$,
decir que el ~digo gen9tico G $
AGA. AGO
paro
AUA UGA
M<t
poro
T'J'
Por taBio. compt\rtet~ el mlsn'C> ~igo goodco los procariotas. los ncioos do todos lo6 eu~$ y ltl$ Pal'eOe probatlfe que IIOdas las forma& de vida h~n toniOO un ;~ntopas.'ldo eVQtut1vo oomn, con un SQt) C'.(dlgO gentiCO, que se ha conservado rooy bien <J lodo lo livgo de l;a ovqb':in ~ Las diterenclas. pueden hab surgido durame fa eYOiix:in por lr.lnsfc:renc:k'l de4 getl(lma J)tOC&roUoo Of'i9inal, oon cdigo genlioo universal al get~oma rTIIIocondri;,l
mi~ondriillll (1(1 pl~nl.\$
Tema 23
Sntesis de protenas: Traduccin

23.1 Caract&ri&lica& de &il tradt,~ccin .......................................................................................... _,,, ................. 300 23 1.1 Sei'Tiido de <JV&nce de 1& sinle$i5 l)feie<tl ......................,.... ,...,., ... --------- -------.......... ,.,_,_ , 300 Z3 1.2 ~rtleter monoeistrOrioo o xlicistrnioo del mRNA .......................................................................... 301 23.1.3 Fases de la traduccin ......................................................................................................................... 302 23.2 Fas~! previa: &etivaeln de kls amlnoddos en forma de amlnoaell--tftNAs ............................................. 302 23.2.1 Reacciones de amlnoacllad6n ............................................................................................................. 302 23.2.2 Amlnoadi4RNA slnteeasa~... .. .. .. ..... .. ..................... . ......... . .... . . . . .. .......... ....... ........... 304 23.2.2.1 TIP06 da sintetasas _,_,_,,..,_,_, ... ,..,_,_, .., .,.,_.,, ....... .,.,_,_ -- .. -- ,_,_,_,. -- 304 23.2 2 2 E$QCCifiQid~d ~ lt'$ 3min~eiM.RNA $iniCUISt'$ ---.. ,_,_,_,,_,_, _ ,_,_, , ... , , ,,._,_,_, , .... 304 23.2 2.3 ~~~~ntSrt"W> ese reeonOOI'l'liento de lOS amii'IOAeiS ()Ot las sinletasas .................. -- 304 23.2.2.4 Mecarusrt"W> oe reconOOI'l'lle.Mo de 109 1RNAs ()Ot aas sinletasas ......................................... 304 23.2.3 Coeoclon de etrores eotn~Mldos por las slntetasas ............................................................................ 305 23.2.4 Balance energ&lloo de la activacin ..................................................................................................... 307 23.3 Fase 1: ln lclacln .............................................................................................................................................. 307 233. 1 E;peafiCJdaddel pl.IO!odeinicio..... - ,._,_,_,,.,,_,_, 307 23 3.2 Formc~Cin dol metionil-tRNA inioodor , . , 308 2333 Pt'$OStvcetiVO$enta lt'lseeleinicio........... ........ ............. .. 309 23.3 3 1 Oi&oci8cin del ribo$Om3 ~$0 1) . , ......... 309 23.3 3 .2 ~ ~ nmino<'lci-tR~ y Cfol mRNA 8 1 <'1 S1.1b1.1n.:.IC1d menor dol ti:lo$oma oomplep do proinicit~cin <Paso 2) ... 31 O 23.3 3.3 uni(l(l oe 1a $l.C)ur'lidad mayor: ~ooe iniCiaOIOI'l (paso 3) ..... -- .... --- 310 23.3.3.4 ReutiliZaCin de IOslactotes de iniei&Cin ............................................................................ 310 23.3.3.5 Balance energboo de la I"'ICiacin .................................................................................. 310 23.4 Fase 2 : elongacin o aJarvamJento de la cadena pepddlca ........................................................................ 311 23 4. 1 Ubicacin del amll'IOOcil-tR.NA en el t;ibo A (pa&O 4) ........................................................... 311 23 4.2 ll'<'nlll<tf)titlaci6n: formaQiOn del cnl;x:c pepCidlc:o (PMO 5 )... ---- 313 23 4.3 Transtoeaeln: deSplaza(l'j(!r'lo del tii)C)S(lt'l'la en un codon (paso 6) , _ , _,, 313 23."1.4 Repelk:IOn del ciClo <le eklngaCiOI"' (paso~ 4, 5 y 6) ............................................. ............. ............. 314 23.5 Fase 3 : terminacin ......................................................................................................................................... 314 23 5.1 Unin del faaor de iberaan paso 7) ............ ................................................................................. 314 23.5.2 Hidrlisis del peptldlltRNA (paso 8) .................................................................................................... 315 2353 Oisoci<tein (peso9) ,, ,,,, ,,,, ,,,,, .............................................. ................. 315 23.6 Eneorgl!Uea de l a sintesis de protei nas......................................................- ....... ~.......................................... 31$ 23.7 l nhlbldores de l8 traduccin ........................................................................................................................... 3 16 23.8 Regulacin de l8 sfnte-sls proteica: Hlveles de control ................................................................................ 3 18 23.8.1 ConiTOI delb'ansporte de mRNA ......................................................................................, ......,.,_,_,_ 318 23.8.2 ConiTOI de la capacidad y frecuencia de tr8duccl6n de lOs mRNAs .......... ..................... -- .... 319 23.8.2 1 E',etnPIO 1 Cc)(ll.r()l de 1<'1 $in''"' de terrilin& CIQr bloqueo del mRAA ................................ 319 23.8.2.2 EjemplO 2 . Regulae.otlcse la sinlesis de nemoglobint'l por fo$fo~in de un factor de Iniciacin .................................................... -- .,_ 32'0
300
SIHTESIS DE PROTEiNAS: TRADUCCIN
23.1
CARACTERSTICAS DE LA TRADUCCIN
La traduccin consiste en la slntesis de las protelnas mediante la unin de aminodd06 segUn el ord&n por la secuencia de oocle6tldos del mRNA y el cdigo gentoo. Se completa asf el 'dogma centrar de transmi516n de la nformadn gentica a parti' del ONA genmioo original (~. 1 y 244).
e~ablecldo
Puesto que este prooeso es esencat*nente Igual en ~ tipo de organismos {salvo pequel'las diferencias en 106 mecaniSmos y componentn mpf~tados). nuestro e:stvdio se centra en oucao4as. aludiendo a procariotas cuando to requietan sus aspecto6 particulares en faVQr de una mejor comprensin del prcx:e10 en IGrminos moloc:\lfaru, Se plantea en escrec:ha rela<:in oon el cdigo gcnlioo <tema 22) y :so oomplol<lrll con ~ modificaciones POStracb:cionales (lema, 24), n~arias para el e;etclclo de su tuneiOn: nnalmente, se analizarn lOs m~mos de degradaeiOII, de f()f'l"l'\8 ai'IMOga a 10 ya tradicional para olnls blomolc:utas (gfl}cldos y lfpklos. prlndpalmente). Con todo elo se ci&rran los dos grandes niveles. bioslnlesls y degradacin, de' met.aboismo proteico, Este enfoque es impfe$clndible hoy dfapara oonoc:er el funcionamiento normal y patolgico de las protefnas (bctse de la:s entwm~ molec:ulivw, ~a 28) y para abordar en ef futuro los rvanoes en 1;11 naciente ProtEKimica (pg. 217) con vist3S itl di~t;oo y 1~ len:tp6vliea. Desde vn pvnto de vista biocluimloo, la traduc:ci6n se catac:terizill por la gran V<1ricd;)d Cfo protoinas 6ormt'dtt$. su elevado co&te energlicO (consvmt un 81).90'"4 de t~ enwgi3 de blosinteSb) y ta necesdad de una regulaCin muy estroc:M en roSC)uesla a las n~idacJ&s celulares y al Mmo de degradac:IOn prolelc:a. Es. posiblemente. el ms c:Qmpiep de lOS j)t()Oe'SOS de slntesls, en el que participa ._... mayor nmero de ma~las diferentes. Las principales son: un IRHA especial para 1:a lnldac:On (lANA!~M~ en proc::ario&as, I.RNA.,. en eucariotas; pg. 308).. 3t tipos de lANAs pot\8deltes de amlnoac:ldos. en t.onna de aminoac:II-IRNAs. En realidad, ste es el nmero minimo t~eoesario terieaMet'\te (pgs. 298 y 304-305). en las clvlas suele h8bef vn nUmero superiot de tRNAs d!leret~t.es: pot ejemplo, 40 es una cifra frecuente y en la cepa K12 de E. coli se 1\arn cncontr3do34 tRNA$, Albosomas, fOfiTiaOos per numqtQSO$ rANA$ y protolmn (p.\g.. 80). Un mRNA, de $fK:veACi3 di$1inte. p~ra cada ~Ido sintetizado. Faelores proteiCO$ de RciO, ~eibn y ~In de la slntesls. En vn;~~ ~la e.xls.en rrAwes de estoe partk:ipante~ unos 20.000 riboSOI"'''aS, 100.000 molku!as de enzimas y tactotes proteloos, 200.000 de tRNA&, e4c. Se reqviere, ademlls. ~ ..corvo {pool) 00 mtnos 20 aminoac::idos, ATP, enzimas amlnoaeil-sintelasas para ac:frvar 105 aminocidO$. GTP ll0m v~ri<'s ~. grupo$ r&doctotes, ones (Mg., y K\ enzimas avxlllares, etc. Intervienen, dhc;l<'l o indirec&amenLo, eati todas las esttucwms SIAX:elulares (nc:leo, 0o1optasrna. atgnutos y mef'l'll)f'anas), A PNar de elo. et p~so es muy rApido: en ~eteri3S, I:t veloddad de ttacfuodn es de LI"'IS 20 anW!oeiOOs por t.egundo. mlellCf*S Qt.te en eucariotas es ms reducida, se incorporan de 2 a 4 amlnoddos por segundo,
23.1.1
Sentido de avance de la sntesis proteica
El primet aspecto b900. el sentiOO en el Qve se teali:Zf!lla slntesls. puede seJ oonslderado desde \.1'\ doble punto de ':Sta: 1a secuencia nocleo61Jica del mRNA se l&e de s a 3'. m1enb'8s <JJ8 ta secuencia an*\oac:ldlca del polipptido se inCorpora deSGa f.ll e.xttf!ff'IO amlno hac:ia el c:cwt>oxJo, Esto \ilt1mo $oC (!lom()Stt por primera vez modiat\te lneubae:iM de t~lc:uiOOios (prec:ursote& de eritroci!o$ quo $inlecQ:~n hemoglObina) con amlnoddos mateados. !'~tiendo i8 radlacdvidad en la globina aislal:t3 In!$ distinlO$ tiempos de marcaje.
Ull ailll~ n\fll(':llljo, f;II) ~~~1118 ~Je bo J'IIIMC \k )fl)ICIM que 111t1 sin~cti udoc:k$de q~ &e alllldi elominolc!do m111'1:';ld(l:
Al61udllf 1 11 ptoM:ina i::OII'Iflk'a a < hSii111 o!JS IJC:fllp(.'S lfal> haber aAIIdido
se
~ .... Ut4o f'IU6.o ....., 11411fl ~~
m11eillr.l 1:
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Ul'llllllitcido tnan..OO ~,.------!;,;
inc\lbldn eon uft
mu;S m;mde
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r..to.1111011'\'ll.lad
r.:rio1daal n iR'ruo Nrboxllo de lll proltbw.
"' .
,:.
'
ron el 1ic:mpo. la
r~dlact" klod $e
~11 I:IICOO!rtllldo ~has.,.
e el rts~<~ de b.
tubru 111 pro&C"inll romrlct:l.
..dl!O-
--= = ..-
Loul lll!Ci\'111 6d INfl."ffJC en 111 proldl!ll complclilll diMi~ litmM.!II:
Cooc:tus.iOO, la toin~l~dCI IWlh(!t(llid.:> roll\ienu

PQt ~~~ c:uremo t.'"'ermm11l, )' l.:n umincQ.:-.1.,...:
Yllnllillldiendu G.lexb'l:mu Cltnninal dd prinn anunOOei40 '1 dtl pohl't:ri.OO OIICKI'Ifc . Es deo:ir, Clllb :u11ill0ioeido> ~e incorporn unicndclou pupu 1>mi110 al earboJ~:ilo d~l..,inu3~ido ~mltrior
CARACTERISTICAS DE LA TRADUCCIN
301
23.1.2
Carcter monocistrnico o policistrnico del mRNA
Un ~poct.O i~te en retaeiOI'I con 13 traouedOtl es que Ul\ mRNA pueae <181 1ug111 a la sinresis de un polippti<IO o de ~riO$ , E.$blpropled9d se define mediante el conoeplo de cistrn. que 001'1\'iene distinguir del de gen , sunque etl<'tn ~~tech3tnente rtH8eiot'l8dO$ y ambos pueoen considerarse una unidad" de fur.eionaliead ger.etiea. Los mRNAs tnonoc::l:sttl'lleos. pteSentes en procarlotas y dpicos ele eucariotas. ooddlcan UJI soro polp6pl'do. Ello i~ica que 1a ttaducx:ln se IniCia en un solo s!lfo del mRNA. el cod6n de ncio, para f.nalzar en otro sitio. un cocln de termina001. Los mRNAs poUelstrl'l.lcos. que slo apare<:en en proocano~as y virus. codifican vtmos polipptldos. por lo que la traduccin se inicia (Simu!lilnM"*'lO o no) en v.-ri()$ SitiO$, en variO$ (:O():>'It$ de inioo. l)(lr;) fil'lo'lfiz,r en tefl!))$ oodones de lerminacin
mRNA procaritico )
~ >=======:cuna endona pol1pcp1idics
~iim l' no tn.cluc:iW
~
, ,...- - -.,.,
(!>.
varias <adenas polipc.-,tidicas
1mRNA eu~ritico
~-;pcnllWY
~!n
5' tli> 1r.Jducid11l
.,.
-
N
3'
. . . _ ..IJM
'lll f'l.l'li( ,, )
~
'
e un.1 c~cna I)Oiipeplldica
El OOf\Ce'I)IO de gen (pag. 244) eorr&Sponcse 3 una regitl wdil'c:<mte dc:ll ONA gen6mico, re&QOn&<lble de un produCio gtco. sea s!e ANA (por transcnpcln y madiXacln) o proteina (por ~tans.cripciOI'I , madUrtleiO. lrMuctiOn y modificacin postraduooonal). En el caso de mRNAs monoclstrnicos. et oonoopto ele eiSttn es praetieatnente indi5tinguible del de gen la diferencia importante surge oo los genes que se transaiben dando un mRNA policisttrieo (y, IXl' tan&o. slo il'oct.;t ~tos o~r.smos procariotas), B eotloepto de elstrn. en &~ forma get~tlea, se dilerer.eia. a) pot ser 1'1'1&$ amplie)~ 01 de 94'0. al considerar oomo reorp oodif~eante tanto a! DNA oomo al RNA (ambos dan lugar a un ptodUCIO gntee)). y D) ()()f w al mismo tiempo ms estncto. pUes se define como la regin del genoma (ONA) o del mRNA que eoclll'iea un Clf(lduCIO Qt1<0 (11'1100. Norma!met~~e se emc>~ea $()lo par<~ os1o Ultimo caso. POt lo que I.Ml eistrn es la seo,ene~a de mRNA que eocllfica una moi6M de polil)t!pti(SO, Recvrde$e we la def'inic:ibn mk amplia de gen obl~ a induir casos lfmlte oomo ()()I'ISecuenc:ia de 13 maaur&ein posttanseripciol'lal (p&g, 276); de fQfm3 $imitar ocurro on el Cii50 ~ nos ocupa, el mRNA pollcl~trnleo, oon uM ul'lid&<S de lraf'l~iOI'I que ooeiliea v3rios prOduciOs (OQnOCid~ uwnbin ho;~biiV.11mente oomo opern) Por k) lallto. en este caso se trata ele un gen poNcistrnico.
302 23.1.3
()ufldetl
S iNTESIS DE PROTEiNAS: TRADUCCIN
Fases de la traduccin
~e
1Resumen de la traduccin
Dentro del proceso de ttaduoeion

previa o de actlvaeiOn de lOS
distinguir vMas e~s o tases: uM

a~ciOOs
(El aa
pteeursores y tres tlien

lnJelae&n, elo ngacin
lA'I
diferenciadas.
y terml nadn, bajo
~ ~ aa- tRNA -=:::::::._
actJvacin
replicacin
cnlerio anlogo al &eguido para la y la ltanscripcin (tema& 12 y 19) la maduracin ~duo:;iol\ill, con&idert'd<' ~ voc:fl como s rns.e. $0 tr&1<' hOy di& ae modo lndepencrrenle (tema 24).
\111 p.!llpl'piiiJ.-1 dt },;
llmi~Klicll.b IIC'n'SIIll
m~Q~
complejo de iniciaci n
N le:nl.c"
iditos
terminacin
po lipf plido = (aa)\.
23.2
FASE PREVIA: ACTIVACIN DE LOS AMINOCIDOS EN FORMA DE AMINOACIL-tRNAs
La unlon a ceda tRNA de1 aminocido rorrecto (el que, ~el odigo gentioo, e&Ui <:Odificaclo por el oodn tRNA) es posibloment., J>SO mts critico de 1<1 ~;pre:sin g6nic<t Si no se haoe de fOf'fl'\3 QOtrect<'. C<\r~ de $Onlido tO<JO 01 c:;Qdigo gentiCO. Esa uniOn OClJtfe en Cil0$01 oe~. oomo e1 retiO del ptOOf!'SO de trtlduociOn, y supone la ectlvacin de los amlnocldos (en fonna de amlnoaciHRNAs) para podef tormar enlaces pel)ldoos. De este forma. la fase de accivadn defne el papel coneelor del tRNA con los aminocidos en la traoucon.
comple~ario del anueodn que P06G8 G$G
ee
~
'-=''=! \.
" )
._ aa
1) atlfvacln
~ MJ>
2) unin
23.2.1
MZi~
Reacciones de aminoacilacin
ominoociltRNA
u. lnQn <:kll <'l~CiOo <:on el tRNA se vetlb mediante dOS reatC:IClOf!S. ambas catallzadas por W'!a misma (en un oetmo acll'\10 ~ o en dos centros prximos). Esta enzima es una de las aminoacil-tRNA sinteta&a&
aaRSs).
(<~brevi&CS~mente, sintebl9M o
1Resumen de las reacciones

Prin1~:N1
F.IITUN '" ~mmoociMkNA J'illktluOl
amloollc::ido-tRNA lill)lil
eH: 6.1
l.x)
rta(d00: acth11d6n dtlmlBDi<'id(l
R.CII(Nil:).COOII tttu~o.-...:..iH
~ AMPPt .- l:Mil"lll
IAT'Pl
2.....
M~
i;.ti1JII-1\MP.('Q.('"II(}o:H#k + PP1
t.:n~it AMVflllri..,l
..\V"' .. )2,1 Ulmo!
Cl 8fliPOH"'>:IIo> M III~IOO w iiiM'~ el ~ ll&:nIM<> Jd A '1'?. iJIC :~or hid"*-'
mo:rtiiNAno <f11<1 ~--nco.;c~
IK!idu ... llC'IIIro ..cti'O
:ocnbao> reatcklfltJ ~
C'l<Dttloo\11$1.'
rv,
FASE PREVIA: ACTIVACIN DE LOS AMINOCIDOS EH FORMA OE AMINOACIL-TRHAS
303
'W:und:~
rf1to:('l(ln: unl(ln (Oft ti IR'\

l kN \.(111
l n.~;c ma A \tP<O-< II(NH.!)K t
llt i\A ..) .("Q.(,_<II (N1-1 )--It 1

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\1
;,milll*:ol-lk.~A t~
una futwU a.:u ~ai;i
tk ;aiGJ ~!pol. <kl;.mo ._oOO
El ptoduCio final de 1a doble reecaOO es un aml noaciltRHA. oon un enlace ster en!re et grupo OH 3' terminal 0e1 tRNA y el grupo cafboxiiO del amnoilciOO (v+ase pg. 71 pera la fonna de nombral10). En el caso de las amlnoadl-tRNA slntetasas de Clase 1 (pg. 304). el cstet se fonna inic!M'nente sobre el grupo OH 2', pero luego se convief'te at
I&metO 3',
1Detalle de l$5 reaociones J

amirwltdcto
..,,....,,
~,;;,;,::: ... ,.,,,\.
~l
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. . t ....
+
C"\lr~mo .\'
d"11R'\
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arnitl(;u:-il \ \11 ou11L6 hminoJcil adtBilatoJ ~"" r.:~c

4
aa.1:;J'~-AMi' ~
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z
ai..""C"hu:.-cml"\> OOJ:I_HWho*..... aminoadl)'.r{' \

- aroirw:.diIH' \
R~.:~il)l)
tnGJI:
.jb_t, U'mctl
.l.(j....
J1.1.l!.4*"2'il
3G4
SINTESJS DE PROTENAS: TRADUCCION
23.2.2 Aminoacil-tRNA slntetasas

23.2.2.1 Tipos de sintotasas
So Mn ais~ n"'l..lib.Jcl de 811'1"11noaotlltRNA slnteutsas de bact.etlas, plat'IW y animates. cuya rRa$3 O$Cila entte 86 y 181 k~ en alg!,II'IO$ ~$0$ se nan podido secuene:iet y CriS131iuw para e$1udiar su ttlt\Jctur), T<os las sinlctarsas catalizan de km\a similar'' r~in <Se 3Ctlv&el6n del aminOCido oon AMP, oero presen~ difen<:i3$ tw\ 1<1 ~ rNCOn. 1& <le ul'lin al tRNA. COOO'etamen~e. unas unen el amlnoddo al grupo l'licJtOJtiiO 2' y Otras 31 3', siel"nf))'6 del t:<imo AI'Ciolido del tRHA (p&g. 303). oe acueroo con ~10. y tamblo ton diferencias eslruCWn'lles,. se dasmean tas sinteta!la!l en dos grupos <JenOm11\8doe, respecttvamente, claN 1 y clase lL
dpode
....
grupo OH del tRNA
tran ses-ter iflc.acin postoOOr es neceaarla
estructura
aml noddos que r econocen
<J.& dase 1
de clase 11
2'
da la omim<~ ta mayotfa
Atg Cys Gln G!u Ue leu Met Trp TyrVtiA

(10, 10!1 mas grandes y polares}
:r
no &e roqoiefe
"'""""'""''" lamsyoria
dimric:as
Ala Asn Asp Gty His L'f$ Pne Pro S. Tnr

( lO. los mlls poquoi\Os e h~bos)
23.2.2.2
Especificidad de las aminoacil-tRNA sintetasas
Ya &e ha explicado (l)9. 296} cmo la hipto$1$ del ~noeo permito que \ll'l minimo (te 31 tRNA$ reoot\OZCifln b$ 61 ooOone$ que (X)(ific;an bs 20 nn*'OcidO$. se forman , pues, l2 atl'llooaciHRNAs diferentes (debe al\adlrse un tRNA e&POci5c:o l);)r3\3ltiQOr)(lta(:iOn de la metlonlna de lnk:ladn). Cada ooo de stos h1eracdonar, a travs de &u ~icod. ((In el oooon del mRNA que codlftca el aml1oacldo correspondiente. En muc:ho& casos. un mi&mo tRNA puede it'lt&tacdonar con vaooe codones 'II'IIITI06, gracWI& al balanoeo. Pot otr<~ pal'\8, el grupo de ooc:fion9& (4 6 6) de a~ aminocidos requiere m& de un tRNA; stos se lclfna,n tRNAs si nnimos e> isoacepte>res (p&g. 71),
Este papel adaplador de bs tRNA$ en!Tc &a inforr'rin genliC:a ctel 1'1\RNA (twele61ldos) y la secuencia del pollppeldo (aminoCidos) slo puede de&empef\arse gracias a ll' t$1)e(:il'icil:lad de las $1n1etas~ts POt ambos sustratos., el tRNA y el amnoQOO. Cada aminoaciltRNA sintel.3$tt reootlOOe un UniCO a~ciOo (del que ttma el nomble) y 18~ lodo& 106 tRNA& WYQS ;~ntcodonCI$ codificara ese mismo ami~idO (OO<Iones sinnimos e.n el o6diQO gen'lico). Ot c:uet<~o ((In *existen en la clula 20 aaRSs distintas. 8 papel de las sinleta&as es. por tanto. esencial p;ar011 ltl fidelid8CS de la SinteSis ptOtelea '/constituye la esencia del cdigo gentioo, el problema cel'flml de ltt 1 !1'1duocin; pOI' eno. se suele considerar que las aaRSs representan un s.gundo cdigo gonitic:o.
23.2.2.3
Mecanismo de reconocimiento de los aminocidos por las sintetasas
La m eraCCIOt'l eSQOC:itiea de ~ SOlo aminocido oon cada sintetasa es anloga al reoonocirento de cualqoies oliO :~rninoilddo encaj a et1 un de(ermlnadO lugar del ceniJ'O acovo de le slntetasa, gracias a interaocionn por pueMOs de Plidtgeno. electrostticas e hldrofblcas. Slo se ri'n aquell06 aminoCido$ oon un nUmero sufiCiente de lnteracdones twvorables.
wsttato por la enz.ma OOtr9$pondionlo. C;)(ta
23.2.2.4
Mecanismo de reconocimiento de los tRNAs por las si ntetasas
La capacidad de una sintetasa, espocific<'l 1*11 un niCO am!noAcldo, para reconocer varios tRNAs, '/al mismo tiempo rechazar otros, depende del tnOdO como s!M inlerecclonan con el centro acclvo de la aaRS. Este reoonocimien!Q ti$ cx:tnPiej() y tS!erente para cada pareja tRNAsinteeasa. implicando no slo las variacione$ cS1ructuraleS pattlculares de cada enzima (M especial, segUn que settn do el3se 1 o 11), sino tatrlbin la Interaccin con divtf'StlS zonas de la molcula de tRNA.
L11 p.u1i.::ulllridad de ea.b ltl!Ui.XUIII !k tKNA. quo: dcpcJNio: de"" tlmlfltep ~rucht111 tndil~Jtnslooal. se pue<lc C$Quemaci1:1U' dd <"lgUJC!Ille modo:
I'CpiiJC!' rrt '()OI)ttda~
1M principalt;f punUl" de
ronooim~o e.c.Uin en el bf1170
por la nnRS
Algun:..~ rtpoQN lk la muiCcula c-.)tjn tnU>y W~UCn-a.ia1 cmn.: )M di(ercnte~ tRNM '!
.oepc (lr de ttl\iMkido (c;tremo l'i y cu d brazo o.kl a.wkodtl (a'~
rC!iiiOOCl> df~IC!i
en C'ada tRNA
amll'loaCiltR!'o"X
tint~ 'CIIIIII
rqume~ ~ -omu.-
11
poi cllu DI) Jlt\'CII Pllfl
di.criminarlni
!(Id)' tcxl tR'"'"'
....
illcluyo:..t& al propl& atlt~). Mudlu de b, <"intctuaJ de la d&w: 1

~COJIOO.'tl el bliilel)dCI UIIX>OIJ611.
mucha< de la c:IIIS.. ' 11 rttOnOCUI s.lo d bW'.l'l accpllw. alguna~~ r('O()n(I(;Cn

~~y* hay ~e rcq-..lcrcn adcmir. <11111$ s.co:uend.u y lid~
11D ticud6o
C$INCiuralcs dd tRNA.
FASE 1: INICIAC+ON
307
Ejemplo 2. Con e.l mismo caso anterior, si se ha legado a tormar errneamente Vai~AMP-E en el SibO &eiNO de lleRS. se percibe el enot y se hidroliza el anhidrido entre Val y AMP. Es probable que estt~ OOOOCiOn ele prueba5tong~ lug<~r ~~ ol $ilio hldrottico 00 lt~ f:lflzimil Oldmile et VaiAMP (ncorrecto' pero e11.c1uye o reCflaza. pot lmpedirnettto ~ll!ric:o, lleAMP {correcto, ele mayor tamai'lo). Ejemplo 3. La enZima vabl-tRNA Sintetasa (Va!RS) Sil'tle P<lf1l oetnostrar lt1 cop.a.ci(IOO de coueg.r orrores entre d06 am1noitcidos cuyo tamaf\o es casi IdntiCO por tener cadenas l<'ttetates. muy s.mill\res eoncretamente. v., y Thr VaiRS reChaZa a Thr por una comblnaclon de dos mecanismos. El een1ro actiVo oe ttanstetet~Ci3 t$ hidrofbiCO e inloraoeionil ms favorablemente oon Val. de cadena tatetal ms hldrofblca Por el conllatio, et oe-nMo activo oe hiCI!Oiis$ es hidrofilico e interaccaona mejor oon Thr, ms potar. Como resultado. la Thr uruda por error a tRNAw~ se hief(Qiizara preferentemente. mientras Que Val unida correctamente a IRNA'41 se conserva.
do.' 1 \r c.. ;nul;u 111 d:l t "ltt:U 1 <k V~l, b ~lfln&l pr-..ro. pcolar,eomd bolwo h1 dmiD.oo ~ mk fu t11t.le
-o~~e ti
*-d.!I.,U!"('II(III
Mh
..
(ll't_ n_,.
u /
'('u~ ,0
A pesar de todos es.os meeau'III!I'I'IOS de OOtteoeion. 18 tasa de OHOr de lil sintoJis prote.cil es mucho mayor qJe la de, pot ejemplo, la replicacltl (respecclvamence. ooo por cads 10 atnit'l()6(:i00$ y uno POf ctldt~ 1cf.10~ nvclebdos). E6t0 es permisible puesto que el error en una protelna desapatece al oegtadarse esta y no l)a$<'1 ~ Murl's gei'IG;ra+ciones y supone un gr-ado de fidelidt~d suficien1c en 1& pr6ctieo, :;in mptioor oo gas~ eMf96tico ex00$IVO
23.1.1
Balance energtico de la activacin
El prim(11' p.Jstet energ6tico Que se debe oonsiderar en la ttaduoclon es el neeesario l);)t& la formacin de cwninoaciHRNAs I)<W"a todos los anwtOOCidros que componen la protefna. Como se l'lll (!~rilO (Pig 302), en cada ~n d8 aminoaci.<l<:in se hidrollzan d06 enlaces fosfato de arta el'lergia (ATP ~ AMP -+- PP y PP, - 2 P,) para formar el enl<tce ftter e:nlre aminoilcido y tRNA. No se tei'IOIA en eue.\(8 p~ra et ~oo globlll, <M.Ifl<lue evidentemente es SJgnlbli\'0 en ta situacin real ert ltt clula, et gasto energ!lc:o desperdiCiado cada vez que un <'JminOOOIOO se rncorpora incorreaamente (p&g. 306); cao:a error supone dos enlaces fosfato. al haberse slnteliZaoo oo aatRNA intitil. Qo.Mt es I'Mdro!izado durante la OOeocion por la sintetasa
23.2 FASE 1: INICIACIN

Esta etapa, preVIa a la formaciOn del j'lrimer enl~ot PCPtidico. detemw1a normalmente la velocidad gkal (le 1(1 s1nt%i&. Tran&OJITe de forma semejante en proeariQias y eucariOt;:s, s<'Jivo por la Identidad de las proteloas lmplicadss, por lo Que lil el(plicacin se oentrar en e<s!OS (dllmoe. Tanto en esta la~ como en 1<'15 do olong<'on y tefmlniiCin es caradefi!lbC8 18 ir'ltel\leneitl ele comptojos f0tf1\iltd06 por l<l& 3 molQ.Ms prinCipales - IRNAs. riDOSOtr\3$ (completo$ o una sola subunldad) y mANAs-. adem~s <le Olft)S f;)t*)ro:; proteiCO$, coonzimas.. rones. ele. Para laolilar 1:1 de$Cripcrn did#lcbetl ~ " " " fttscs. t~vnwe $In exlsur c:onsenso al rMpecco, se nace refet"fH'!Ci8 (1 dicho$ comploJOS en tunc10n del n(lmcro de moloolas principales Q\.19 condenen: comptefos binarios (dOS molculils) y tq,me~ rio& (tres mol+Culas).
23.2.1
8
mRNA ($l(lf cito, se ha venido repre:senl8ndo sle~ u\a ~i6n lider 5' no tradvcida'. por ejemplo en pg. 301) Slo un <:odOn AUG (pag.. 294). sltvado intemamei\te en I;J mo~ul3. a+et.Ua como punto de ncio. para lo cual neceSI+1a ser ~nocido como tal por el nbosoma y el IRNA~ inieiacSot'.
Especificidad del punto de inicio 1.;) trOOvcan nunca <:Of'11161'1z.a por et el!.1remo s del
308
SINTE$ 1 $ DE PROTEiNAS: TRADUCCtON
En pr ocariotas. cada cis.trn de un mRNA (pg 301) posee ul\3 secvenei~ ll3mada ctt Shlne-Da)garno (SO), que interaociona o~lf!C3monte con la su~CI pequetla del tibosoma, de!Wendo la eleccin como codn de Hcio de
un AUG Sllu<'OO unO$ 10 nt CQ<ente abajo.

proe<Jr iolas
Shn+~l1&111'110..
euc-.arloCa&
-~ta:~IC'
.k
s., 12 n.;:uo pulll'l

~rP
l'
'"'""" <"a >mpltl...,.niM'ill '1

IMiwakl'll( ri(a tilo
SO ri!IM~tCI<)n:l -
,.-.dinl!>l ddrlt.'i f\ 16S
En eucarlotas. mRNA es casi $iempre monoclsb'nlco (pg. 301), por lo que tiene un &Oio codn de inicio. No existe un.- &Ofllll eS()edal que una el mANA a la sublridad mayor del ribo&oma. sino quo _, o$C)O(ii!Cidad se estaOAece a traY'(:$ <le un tRNA especial, iniciador. la unin do 6:ste fll mRNA. et1 el entorno proporcionado por la 9Alunidad menor dol rit>Q$0ma. req~Aefe que el codn AUG forme parte <:te 1{1 secuencia de K otak, y da lugar a un com~ejo lemaOO" mANA : (i)O$Qma : IRNAilllll (como se ver de&pus. el tRNA porticipl' rtalrnente oomo meUonll-tANA asociado al
faaor eiF-2 y a GTP).
23.3.2
reconodO$ pot ot1 tRNA lnlc:ador. llameclo tRNA'-' (en pr~riOt&$ te le SIJele llamar tRNAr-. pero usaremos el primer nombre de tonna gentica). los codonos AUG que eorresponden ~alciones .-Merna& en la cadena pelipeltidiea lr'lteracdonan con un tAHA disnto. we se llama !limpletnente IRNA . En ambos casos el tRNA participa como meclonil-tRNAw.:. (etapa pt'e'lia de aC1ivadon del anWiod<lo. pg. 302). La Incorporacin de metionin;.~ internA OOI'I'esponde a la etapa de elongacin, y lieno 1t1gv <Sct la misma Sorma que otros aminoacidos: la de meti<lt*\tl Ntetmlnal ocurre, &in embargo, dlnnt. la i'licl~(ln, y oe torma llgemmente diferente en proc.anot8& y eucao1as En proc;:itrio~ (y en m.itocondt las y eloroplastO& eucaritioosl se rorm& M e4-IRNA""'. que llego e& modificado con un 9"Uill lorn'MO en el a-emlno de la mctioninf. Es deCir, hay amlhOaell.eln y fonnllaeln. para irn;orpomr N4ormll-meclonina (fMet) al inicio de 111 ttaduocln. Como oon&eOJEineia, todas lcls PmteinM teei6n Sinleliladas oomlenzan DQf formilmeiJQflina. Debe resa!tarse que no M 1.11!!1ua fMcl como sustrato, ni wnpoco un IMeHRNA,,..., Esta etapa ~e un '*"'e"o to.-e et~etgtlco adicional pera la tnlduoci6n (que no se oon1e~ar al haoer el batanee general. ~g 315}: oonque ta reaccin no consume eoergla <froC1amente, si lo haoe te. tegeneracin del ooenzi!T'I<I bmi!!.o'rahillrofota!O.
Formacin del metionil-tRNA Iniciador lo5 cooone:s AUG en lOs que se Inicia ta traduccin (residuo Met del extteMO N-tennlnal del pollpp6do) &en
procariotas mitocondas y cloroplastos eucarlticos
eucariotas
~'"' +
:.
J. ;
~ r. ~ -U+
~.
0R" " " M91RS
FA SE 1: INICIACION
309
En ra tradtiCQOn citoolasm31ie3 de eucariotas no llc:ly p$rti~Ci(w\ Ot fOrmilmetionin;a, $010 st re<)vltre 1<1 ami noacilacin oora incorporar metionina <'! inicio de 1.1 sin1osis. Por l;lnto, los pOiijl)c)tido& formados eontienen m~:tionin;a en su extremo Ntetmin(!ll,
23.3.3
Pasos sucesivos en la tas de Inicio
En pr~ment9\odo$ e&tot; P<I&O&. Mi oomo on la& ft\114}$ de ctong..cin y IOtmif'I(J(';in, intONicnen unil Mtle de S)t(lteinM lam8CS3s gen6riearnenre factor~! pr oteico! de inielaeiOI'l, e1009f1Ci01\ o tetmii'I&Cin. LOS faCt()(~S d~ i nieiaciOn se nombran con la rafz IF en procarlotas, eiF en eucatiotas y en gernetal (e)IF. A pa11ir de este momen1o. sOlo se describe la tradUccin en euc:ano4as: para faciilar su segUimiento, &e e51ablecer l.Wia div;sin en 9 pasos sucesivos: 3 en la ir'liclaocln, 3 en la elongacin y 3 en la terminacin. Resumlencto, el ~lo de la traduccin requiere la unin del tRNA al ood6n de inldo AUG en el mRNA. en el entomo del siUo Po pepddllo del nbosoma. No Intervienen en e&ta fase el codn anejo (corrienle abajo) at AUG ni los sitios A o aminoacikl y E o d e safid.;~ (6)(it) del ribo&Om<t (pjg, 311).
23.3.3.1
Disociacin del ribosoma (paso 1)
Debe Indicarse que las dos sub\ndade5 del ribosoma {40$ y 60S en 6utariotas). ""eb:zacla<s en el rcleo y exponedas a travs de los poros nudeares al citosol. se ensamblan en sto formando ol rix>$oma 80S (vase pg 80 para detales de e51ructura y composicin). Para su inteMtnCI6n en la ltaduccin. el ribosoma dobo disooiarse en sus
dos &Ubunldade& para permitll'. en la& subelapa5 siguientes. a;. unin de tRNA y mANA y el lnioo de 101 sfnle&~s.
la unocin d.: .:IFJ.
cJt>.4(; y dt>.(; Pf'"'l>:ll
. . (".uribil) ,..,..r(lll'lmtO(Jnal
e1t 1~ wlbun..ksdd
ritwtwm1. lilA' h.:l- qut
...,;v
'-
K Kpllr~Jll
>11l11 ~ruz1 S' dtl mRNA ) fll~ibusn. oon consumo <k ,HP. ~~~ to~i.lci.:.o.'lfl lA lollbunu,l i,J pc.oquda dd ri~1Dril
t.os t.:"'rc.; c-~r..& ~~~nn
H llmoon~.-l IANA lliC"Ud..lr,iMI,:NitNA1 M"'

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FASE 2: ELONGACIOH 0 ALARGAMIENTO DE t..A CADENA PEPTiOICA
311
23.4 FASE 2: ELONGACIQN O ALARGAMIENTO DE LA CADENA PEPTDICA

Esta tase InCluye oesoe la adan del segundo <~mino6cido M$1.3 et UlliMO. Se 1181& oe oo proceso ciCIIOo que se 3 oe 3 pasos. l.Cllcadn 001 nuevo aatRNA en el repite t.anas veces como amnOO<:ido$ se ncorwcn C<'ldtl ~ic:IO 001'1$1 Sitio A ael ribosoma. f()t11\l(;i(ln del e~ peocidiOO y translocaclon <!el peptld!HRNA al slllo P. En ellOs intervtenen tres factores proteiooo& <:itOQiasmt\IX:o& o f:lctores de e&ongaeln: eEF-1a. eEF1ftr y eEF-2 (los faccores pnx.anlioos oorresponcienl.e&. EF-Tu, EF T$ y EFG $Oin Similares y &eb.ian de la misma terma: EFTu es la proteina ms abunclanle en la clula d8 E. coft) Debe rt$8111arse que la etapa de elongaoOn no posee la capacidad de diferenoar el aminokido we se if'I(;Ori)Ofa, s1no <Mt es C$DOCifi(;;) Uniea~te eon respecto al anlloodn del aa-tRNA; la ll"'CCrporacl6n de ~ amii'IO<:ido correcto v.ene dctcrminC~dtl J)Or 13 actuaei61'1 previa ele la &!Yiinoeci-IRHA &ln~&&a dlran4e la etapa de activa<:iOn. Esto &e demostr al Mcer reaccionar Cys-tRNAc.. con Ndruro de nlquel para -.,;n;w ej grupo tiol de Cys y obtonor Ah.'llRNAo.... s.1e. tklnque sgue recoooclencJO lOs antiCodones oorrespondien4e5 a Cys seg(in ol oc>digo. OQndu~,. 1;, inOOfJX)f'8ci6n de Ala oo la& posiC1one& donde el po!ip6ptido dcbori(l tener CV$.
23.4.1
Ubicacin del aminoacil-tRNA en el sitio A (paso 4)
Tm$ in0()r'p(')11:1rse el Met-tRNA al sluo P del rlbosoma en el compleJO de inttiaon 80S. QVedil ;,1(in v0:1tio-' 5'1io A en el se prOCJuelr& te lnOOI'PC)t'SoiOn de ~d.. nuevo ilf"!ii'IO<:ido (en la primora vUI'!III'I dl'!l <.:ido de e~Mg.a<:i6n, el arnnoiK:ido n 2). ll'Of apt~re;wnienlo del antie<6n de su aatRNA 001'1 el oodn <.:orrespondleole del mRNA.
En d nbosoma hay
3 lugar:;!> donde puede unirse un tRN.'-\ ~ n. g.l:r .nn~lllcni<:: I;PA. k-idQ de 5' :1 3'
~lclmRNM
sitJO E uxu. salida) Silill P (p...'jl(idilll)
ri bllSOma
s..itio A
lllllli.Jl(XtCdO)
S' '''''''''''''''''' 3'

mRNA
La entraca de lodos los &ueeslvos aatRNA en el &lo A requiere que estn unicbs al factor de ~aetn eEF-1a que, s..nllarmente a lo ya e51udlado para el factor oe inie1aci0n eiF-2. une GTP y llene activdad GTPasa latente (la eslrUctvr<J de los ,,.~,~ ciF2, eEF l(l y (!F2 es simil3r en1 re si y a 13 de olms prQteinos G, 10 qu~ sugiere su ()n)Ced(lnei3 do vn<l J)tO(eiM anees-t31 OOti'IUI'I.} De hect'IO, la f{)(m8 habiWal in vivo de casi todos lOS aaIRNA$ e$ oomo oomplejo lerMriO aatRNA : eEF Ia: GTP. 5Qf\ es&os ((U'I~ejos los que difu'*" al Sitio A vaeio del ritlOeoma y teoonocen en~ sllios <se unin aooeuaoos. SI el apareamlenlo entte anliCOdOn y ccxton es eoeCio. et a~ciiIRNA se ul)iea Cle fOrma estable en el ribosoma. lo que provoca cambiOs confonnaclona~e-S que estmulan 1a aeUvid&O GTPasa de eEF Ia. La lorma GOP de eEF1cl no posee aflnldacs pot el rlbosoma, liberndose y quecanc~o asi el &atRNA unido al sitio A, dispuesto para las eU~pas SJgUJentes. De forma anloga a lo que ocurre ron el faaor e inic:ia(;in eiF-2 (pg. 310), se reg.enera la forma eEF-1u : GTP
pot intercambio de nocletidos me6ado POI' un nuevo factor de elongaon. eEF-1f'r. 69 produce. pues, el cuarro gasto (tncrgtieo de ta ttac).CCiOt'l (uf'lll molO!Aa de ATP {)01' cada aminoacado il'corporlld(>). ~EFlo Qu&d3 ~$ disooniblc
oora ii'Corporar vn nvcvo t'mino.iodo DeDe ii'IOiearse Que eEF1u interacciona con euatquier a.MRNA ~xcepto O()l'l e1 iniCiador, MtltRNA/'..', Que $C distingue de lOs restantbs IRNAs en la esltiJCiuta sec:IM'K!atia del tallo aoepor. De este moclo, dlntl.U~ la ei0r'lg:.ei6n. el tRNA nciador no Werviene en la 1noorporaci6n de Met Internas. Esla espeafld<lad, junto con la ya deS(;rlta en la fase de rocio. mantaenen la dva!idOO de IRNAs para Mel.
312
SlNTESI$ De PROTEiNAS: TRADUCCIN
UBICACIN
8
TRANS pfiPTI ..
t~ drR XA
llWIYOf; (ft ciiCIIfiQillli
que h ei 1RNA 28S)
DACIN
+----8
ntAN$LOCA-
CIN
1
1
1
'
lANAs libres
~ FAS ==E~2~ .E ~L~ O ~ H ~ G ~ A ~ C ~ I0 ~ N~ O ~A ~LA == R ~ G ~ A ~ M ~I: EHT ~O ~D: E~ LA ~ C ~ A ~ D ~E ~ .N ~ A ~P ~E ~ P ~ T ~ i~~ C= Ac_______________________~ 313
23.4.2
Tronspeptidacin: formacin del enlace peptidico (paso 5)
Ul'la vez siruadaa taa l'l"'IOeulas ele ~uHRNA y MettRNA,- (el'l CielOS sucesivos. ~l)tidiiIRNA) efl loa silios A y P del rlbOsoma, respectNamente, se fOtma et enlace peplldco entre ambos. Esta reac:drn la catatiza IJI\8 actividad
enzlmtlca pepcldlllransferasa {o 118n&pepcieiasa), localizada probablemente en el rf\NA 28$, 001ponente oe la subunid<a<t g~nd<t 60S; ~ tr3t3, puc$, de uM ~im., (~ 78) . iM,Jnqvq Ita$ proteina ribo$rnca:; CXlfl.lribvycn
)OSiblemente a que sea ectlva.
Oetalle de la reaccin de transpepliclacin (paso 5)

con d 1" ciclo de elongacin (unin ddsaminodos 1 y 2)
,, 11111+
en cl 212 dclo de dungactn
,11,
" l l () - <
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(1,1nin de 1 0'! ;'lmino:toCidos 2 )' 3)

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ila 1 t11.NA ..
J\Uiqlll' nudCDffiitn lid par de- C'lc.:mllle &1 tnlp.l.atnino:o del lllltRM C'lflltanle IC'lfl d Wlio> A) ioDb(( ti -.., urboxilu q\K Q!ll' d ppc:odo> ao ~~imicnto iliiJlNA (~ <f "tiD r 1. Se: ((llfllll un cnl...:c pcpc:il.h.;o>J~rc d tarb<iko d(l pfpcido>~(n"1;11D1(111o> y cl;onmudc-1 amn<odD llfM'\'(1. 11~ lranJ-r\tc..:A en b!o>ql>t' del ppc:ido> desde el xitiu P al Alio ,<\ , probllb!tmcl\lc pot ~cmomoel!h) del bm.w ammuiiC'llo>dtiiRNA en J \. ......... S.: to:nnin;o ~-.on U111 tJlNA librc, no>('.or;llllo>.. tn d xitiu P y U111 pptidodl!ngil.W<D t i N ilo A. ,.,....
--
!npo;ph,liiI.K~,\-.
23.4.3
Tl'ansloeaein: desplazamiento del ribosoma en un codn (paso 6)
El rlbosoma completo se desplaza en sel'llldo S' ~3' del mRNA (corriente *io}, c;;.(l(l<~ vez un solo codn, desde su Ubicacin Inicial sobre AUG. El responsable de e~e desptaza....-et~lO e$ el tercer 1~ proteico de elongaoin. eEF2. oonociclo como tran slocasa . ES!e factor interaeciOt'la prii\Cif.II*Yiente con la t ubtridad rn.a)'(lf. onginando cambios oontorm:.cion;tle$ en Gl ribo&Of'l\tl oompiGio q;e justifican el desplazamiento. Al mismo tiempo, impide la uniOn de un nuevo aa.lRNA fn el sitio A, cvitolOdo oue se pase al siguiente dcfo anles de tiempo.
Detalle de la translocacin (paso 6)

11\'Jonru la wbonidud rnnfk; e i 1R:\.\ qt.-t esub11 e el !.ilkt t' pasa aJ ;Wt. ! .
tn.tnlf\IS el pcpu,lll-tRNA do:l dtkl A pll):l al f>
..
<11)1' 11'11114o1:11U
tU'Z
314
SiNTESIS DE PROTEiNAS: TRADUCClN
En esl.a ~epa llene lugar el quinto ~sto ertef96tko, pues la energla requel"'da para cada uansloeaein se obllene de la hidrlisis de GTP graCiaS a una actiVIdad GTI>asa que fflSide en el propio factot eEf'!-2 o en el fibOsorna. Tamo en es.~e caso como en los anteriores. la hidrlisis de GTP est acoplada a cambios oonlormaC~CMies en la maqunarla de tra<luociOn, que c:ooducen a e se retire ~ complejO el factor que une et nueleol!do y posee 18 ecdvldad GTPa53
23.4.4 Repeticin del ciclo de elongacin (pasos 4, 5 y 6) Al tsnninar ta primera tran:slocacio M ha oompletado ia pnmera wolt3 o ciclo de elongaci6n. ller;ando a una
MetIRNA del smo P ha sido stJStJtuido por un dipeptdii-tRNA.
&ltuacin idnbca a la 8.1CI&tents al C01'11181"1ZO: lllio A libre y 9!lo P ocupado POr vn lANA, Y, diferencio es~ en quo ol L<~ elongr.ciOn Qf'llinUet de kmn~ ci~ (f!Qt.Jr<t en pg. 3t2) hasta que se aflade el ltimo aminocido La Pegild" al sitio A (tav.-do SOOto \o$~ 2. 3. 4, ot.<:,) de olrOG aa.-IR.NAs permito la unl6n de ios siguicntos <tminocido:s on $1.1CO$lYO$ CielOS de elong2tel0n AJ :,~ ~di.l uno de ello&. el ppb<lo en CN:~ClmieniO sio"'P(c QI.IO(I<~ IP'iOO - IRNA 601 .;.mmo ~nlinoQ<Io it\cXII'l)QI'ado l.O$ er'li;)QtS pe:ptldico& 54t ~n IMC~ $0bi'CI grupo NH, det Ullimo. amino,cjcido W'IOOc porado y, por tanto, la cadena polipeptidiea
~deSde $U ~JCVnr::> am.no-tetminal haaa
el CNboX*>-termlnsl.
23.5 FASE 3; TERMINACIN

Comprondo 10$ jl3:IOS n~ paca fibemr et ~Ido ya ~de su unin al tRnA en el sitiO P y, al mesmo bemi)O, di!IOCiat el fihosoma del mRNA. Esw slo puede ocurrir en respuesta a la oresencla _. el sillo A de uno de 10$ 3 oodones de termlnacion IUAA. UAG o UGA en el caso de mRHA coc:liftcedo por ONA nucfaltilr. y UAA.. UAG, AGA oAGO en el caso de mRNA codlficet~Jo por ONA mllt.leot!drial), En eucanotas lrv.erviene en el procaso un Unioo f.actor proleico do lerminac:i6n o c1e libor*CiOn, cRF ( R<dC$.$itlg F8Ctot._ en eontnu.te ooo procariow dortde ex1sten Iras (RF1 1 RF2 y Rf3)
23.5.1
Unin del factor de liberacin (paso 7)

ribos~ u tron~ $0bf$ uno
No tJtiS(e nmgun tRNA que reconozca los oodones de paro. P<H' lo que cuando el
de ellos no puede progfnar t.a e~ln En au lugiN, 4111 f;)ctor c:RF 114 une t~l ribcQmtt en al ~moA. lnanl.e al oodOn de
termln!WO..
....,"'
,,.,..,..~s.,, ~111le1l\
E-- ., -.)
" E~ N~ E~ R~ G~En~ C~ A ~O ~E ~ LA ~ S~I O ~~ TES~I S ~O ~E~ PR ~O ~T ~E~i~ N~ AS----------------------------------------' 31 5
23.5.2 Hidrlisis del peptldil-tRNA (paso 8)

La un.on de eRF al ribo&ome altera la acbviOOO peJ)I!dllttan&ferasa de 1&1 fonna <PJ1G como agente nucreofll!co se emPkta el agua {en ~ c:klol gruPO ('lmino do vn &minOOciOO, pg 313). Como consecuencia. se hlcfrotiza el enlace ster del POPiidil-lRNI\ libert'ndo 1& ~n~ pO~idie& En et!e proceso adom41s se: tudro!iza una moloola de GTP asoci<'dl) (11 f<telor eRF, 10 que Su~)(:~~le et sexto gasto energtico de l<"tlr;)dveoin
23.5.3 Disociacin (paso 9)

EJ IRNA no earg&do sale del ribOSoma La f()ntla eRF : GDP
YfJ no posee afinidaG por e1 rib0$01'1'\8
y lt\rnl:ll.., se
libera. F ~nalmen.1c, se seo<"trt~n 13s dO$ SVf>l,u'lidades ribl>$0mie&S (el\ euC<'IriotM, 80S , 40S 60S). Iitoet'ando el mRNA Todos IOG oomponsmes Ql..lfXfan t'si di$00niblos parta inioor l<t sint$$i& 00 un<' rweva proteina (oxoep1o el oRF. QOO debe roe;ambi3r W GOP W GTP. probablemet~te I)Or 1,11'\ ciClO $1mll&l a bs estudiaOOS 1)3ra ~F 2 . eEF Irl y eEF2).
23.6 ENERGTICA DE LA SNTESIS DE PROTENAS

U! simosis prQioic:t~ ~ un Pf'QQO$O ene~icameme ""'Y 00$1 0$0, Quo utkill ul'lill grt~n proPQN.:in ele ~ el eQuivalenW en ATP cliSI)Onible en la ~~~ R~l.l13rW lodo lo clot;lll.-.clo :rcVI(Imente en ead~ ett'Pt'l y lcnicndo en Wet~ta 18 repetiCin e4clica <le la elor'93CiOn se l)ueo& <:alcular el reQuerimiento enetgtiCO minimo (I)OSibiememo la fQtma<:iOI'I o diS()(:i&oCiOI\ Cle 10$ numerOSO$ complejOs mv!tmoleeutares te<uier.; 3fgUn apor~ ener~iCO adicional, as.i eotr10 la oorreec:IOO de pruebas y. en el caso de procarlolas y orgnuiOS, la torMila661'1).
wn ("llo~oj,) <k N
~om.n."oktob<
na:.,.Ju
tenia~,:
N1 CiClO$ de
po::td~
elongacin
termnacin
n11 de!' en.laus
nll total d~ enl ;~~u fosfato por
E.sta hidrli&tS de cuatro enlaces fosfoanhkfrldo por cada aminoaeiCIO represen!<! un gran ettmbio en energla libre. -30.5 x 4 = 122 kJ/mol d amlnoicldo, muy superior a &a etlef'Qa <let et~laoe peptl(.fi(.O (encrgit~libro C$1MCI3r de hidrlisis de unos 21 kJfmol). AuncpJe pueda parecerlo. esto no es un de$Cll'l3tro enerQC'Iic:o, sino que la m;ayor I)Met de la energia extret (101 k.J imol) sirve pata compensar la pfdida de et~tropi{l Que tiene lvgor durante la sint.esis pr'Oteiea. Este <lesc;enso de onlrol)fa &e debe principalmente al Ot'denamlento de bs amino()(J()$ en ol pollpplldo. Tafltif'l se pierde entfOI)ia cuando vn aminokido se une a un 1RNA panlwlar y cuarooo un ttttIRNA se asocia a un OOOOn especlftco. Asl, el aparente exceso energe1lc:o se ofi'IO!e<'l en CXlflSeSJUl' la c::aSt perfeCia fidelidad en la IJadvocin biOlgica del mensaj& gen1ico del mRNA a la secuencia de amino6ciclos et 1.-s protel na<s.
C<:n:;rctt~mcnlo,
316
SiNTESIS DE PROTEiHAS: TRADUCCtN
23.7 INHIBIDORES DE LA TRADUCCIN

Numerosos y divetSOS con'ClUe$10$ aetC&an l~lenelo o dl1'icul!ttndO la traduccin. Su estudio es de hlers por
v~moti~ :
a) Desde el punto de -vista prctico, porque muChos de ello& &e pueden emplear oomo antibitico&, especlatmente cuando ejetcen su efecto selectivamente sobte clulas procariotas (bacterias}. afectando pooo o nada a las eucatllieas. Preclsamer.te el estudio de sus mec:at*smos de accin ha c:ontritnclo a lo largo de muchos aflos al esdateclmlento de lOs detale:s moJeculares del proceso de traduccin. A e51e re&peeto, debe mencionarw que ol uso Indiscriminado (tin control mdloo) de k>$ <~ntibliJoo$ ht~ creado uM ro$is:tonao~ b<lctoriana CS. gran IJascendencla tanto con t9$P9C*> tt IJ 11om ~na intestinal ootr10 a la tetapia de las Infecciones: estos aspectOS deben set llb:ltdados de torma especializada, en tratados de Mic:robiologla. b) Desde un putlto de vista terico. pot el pepel central de la traduccin en lit Wtta oelular. Son mucos 10$ MttiOCiCOf y &oxlnas que blOquean o Interfieren en cienos pasos de &ct slnt0$is protci~. de fom\31 ~ o flMIOOS es~iflca. on proearlotas y eucano1as. Esta especif.icidOO es la mejor prueba de ltt diferoncitl entre la ~~ ()e tt8dUoeif'l en ambos tip:)6 de Otganlsmos.
El efecto tnhibidor puede ejerect.rse en di,tintu
Etapa af~da
~.tUpas del proceso de traouoCIOn.
Efecto Ejemplos
sob<e
procaotas
Oet.-llo' de 1 ., acc:iOn
Inhibe competi!Namente la lle-tRNA mtetasa, evitando la incorporacin de lle y deefriendo la s&nte&i:& roteica Se tif8 de modo .-reYerSible a la &Ubunidad n"'660f 305, por irneraocci6n con varia& de &u$ protena1 y con el rRNA 16$ Ois!Qr'Siona lb entrMa de rMet tRNA inic;iador y tambin produce errotes de leCt\ft cJel mA.NA durante al
o eucariota'
Activacin de 10$
<~11Wl10ci00$
Mupirocinn (O Cido pseudomOnlco) E.$tte()40miCil\8 (un amir'IOglic:slo)
lrWciac:in
(P<'SO 2. complejo de pteinielaclon)
SI'IOwdomlelna lnterfern
E
E
subunldad menor 40$ Impide la formacin del comQ~ejo Met--tRAA : e1 F2: GTP l nduoe la elQ)I'tlsiOn de una protelna quinasa que fosforila a e1F2, inOtc:tlv<'nOOio (de form01 similar al
HCI
.320
rniclac::b\
(paso3.~
Eritromlc:lna
00 inkiac:i61'1)
Elongaan (paoo
~aCIOn)
Tetr~(:linM
Ki"omi~
P>E
p
ElonQec:ln (paso 5. tn'lnspeptidaeln)
Rieinb (gliC()(IIO&elna de Oligen Yege(al; con 2 cadenas. A y B: la primera %la toxina, 66 kOa CIOranfenioOI
se une a oo sllio espeelrJco en el rRHA 23S de le subunlad mayor SOS. Impide la asoclac:in con la &uOOnld~d menor. otra boeiOn poSirlle e$ interfiec'ldo la lt8nsl0eadn Se unen a la subunidad rnenof. intortlricnc;to c:on la fijacin del a..JMRNA al sitio A Bloquea la disociacin de GOP del faaor EFTu (equivalente al eEF1o. euc:aritico). b que ema $U salida del rllosoma Se t.r~e a protefnas do la $1.1bunidad mayor 605, bloqueando la unin de aa-tRNA: eEF-1a : GTP, y I)OSiDiemente tambin de eEF2 (tt'anspeptldttciOn)
CldOhelfl'llda
P\.lromic:in3
Py Se \Kie selec:frvamen~~t a una J)tO!eina de la mitooondrial su~od m3yor SOS. lntetflrierdo en la irueraeciOn del ,...ANA con el centro aaivo de la E!!E!~ansferasa oomo inhibidor comeglitivO 1 Si~e <ti cloranfenlc:ot. inhibe la actividad E peoti(IIINWI$ferasa pero slo en el rl:Josoma eueariOtiCo {subunklad ma~ sos~ PyE Anlogo estruaural del ail-tRNA.. form' enlace con el pptiOO prQY'OC:<VI(Io su 1ermlnacln 1ura
INHIBIOORES OE LA TRADUCCIN
p La mayoria in!crt'CCIOt'lan con el rRNA 165 de ta SlbJnidad mayor 50S. lmpldleno la fijaan del f.;a<;IQr eSe elonga<:ion G ( EF-G, equlva\enle ill eEF 2 eati6tieo}. Los mecanismos de aocin $0n
dl~s
317
ElongaC*ln
(paSO 6,
AnwloglioQsi<S
distintos de 101
ettrtpl()r'nieina
tran&IOCCM.:in)
(ejs .. gen18mlclna, kanamldna. neomicina) EsparsomiC*la
Acido fusidieo
E PyE
lnnbe la translocacin
S4:l ~ de form3 tr~.~y eS1able al complejo

EF-G: GDP : rlbosoma, m pldlendo la liberaCin de EFG. Toun()if'l Inhibe a eEF-2 (faaor euca~ico eqtj'valet'lte) ue int~aiv<:l eEF2 de Ca18Uza una reaccin Q forma ~ersiblo (AOPrlbOSitaclbn a oosta de NAO, SOI,)r(: un reSicluo HIS modlftcao de eEF-2)
Toldna <iftriCCI
(proenzim<'!Qroteica de
Terminacin
62 k.Oa: la tol( lf\l es un fragmento ele 2 1 kD<~) No se OOI'IOOe ninguno
A"-"""'~"'~.;._~ou
- --1\11_.....
T-lo:..
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Ol>;k (,....,. ~--<~ o.;,,;.c..... ..

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clohcx1mida o
Cloranf cniL 'OI
ON--15'--\'II~It ~(m /:H!-on
s u -co-CI IC'~
Puronucin:t
!
U poromiciM reuiooa ! dC' tll...._'fll ~ldlila1 a .:omo 1 1) 11.-.rlo el uninOIOC'iiIRNA.
fl)n~W~iJo) 1110
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!11 put'OII'ieina C':l un 11n.:ih.'$0 ~Jiruo;lural o.kl ~r,r,;n\0 )' dd IUIUOOI!cilolkJ'oA
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ln!A!rrum~ ptcnlllwt~nlll.'ncc
.....,.
q.
La selectiwct.ad de la m.ayoria de antbticos y lO~$ S()()fe Otganismos (ltOCI'IriO(as o eucaflotas es poSIDie gracias a las dlfere~t1$ en u ribo$0mils, as.i oomo, et1 algui'IOS casos (pOt ejemplo tettaclclinas), 1& itte&pacldad de la molkuta d ~r<l~r la m embrana celular de organism06 St~PE~rietes.
REGU LACIN DE LA SINTESt$ PROTEICA: N[\IELES DE CONTROL
319
Desde un punto de vist& bMico. Slo deDemos relerlrnos a una Sttuacin genercll. la do li~ oCulii de ~,n ndividvo adulto Entre las proteJnas esoecilic8S Que se unen al mRNA rean Mltebzado y ayudan a su transPOrte fuera <Sel nUOto ~~e e'ICIJenva un tectot proteloo m.llimrioo, q.,e incluye ;)1 ciF-4E o proteoina ese u nin a la ea p~ruza (CBP) . ya es1udiad<t por su papel en et Inicio de la traduocin (pg 310),
23.8.2
Control de la capacidad y frecuencia de traduccin de los mRNAs
Una vez que el ~NA ha ttlcanttldO et Cit~>ptasma. el oontrol de su traduoclon se ejerce esencic*nente en la lnlclacion, haCiefldo ele HW 1;) ~CIP8 limitante. Prlnclpalmentte se regula la formac.on del compleJo de pte-'ll(;i.-cin 80S, la ecttvlclad de tos fact<7es do inicio e1F2 y etF..:IE. o bleon a travs de la Influencia de 9$b\lellJtas seOJndnrit'l5 en et mRNA, por e,emplo n:tgionc$ en OOb46 nebra lntramolealal', que pueden etma&Clfar lO$ sibos de uni61'1 d-el rlboSQm3 y el codn de inicio Se estut1ian a ooMinuaciOn con cieno detalle dos e,emptos cvyo m~>C<tnismo es bien OOtlOCiOO.
23.8.2.1
Ejemplo 1: Control de la slntesls de ferritina por bloqueo del mRNA La ferriti na os una proteill\8 cvya flWlcln es almacenar hieflO, como re&eNa para l<lf>ioSifl"te$1$ de nemogloblna,
mioglobin<~. citocromO$ y ~ras mucnas protelnas. y al mismo tiempo pr01egi9ndo <"1 1<"1 <;tuta oontrala IOJdeicS&cS del Neo libre Sv &in10$iS se (:OI'IItola a travs de 18:s pt(l(elnas IRP. o...e M unen<~ 1<"1 ~irllider S 1'10 tra<Jucida Gel mRNA impidienOO el WliCIO de ta traducaOn.
Las IRP o protenas reguladoras del hiCJrro (Otll'egloii&Jory ptOI&Ins) poseen la capaCidad de unirse a1 mRNA, con d lsdnta afiniead en funcin de ta OOtiCCnlr<tc:itl inlrbCei'IUW oe ese metal. Por ejemplo, una de ella&. li! l RP1, cuando el hierro es abundanle lo incorPOra en forma oe nudeo tW!tr.;arufre (cJusttw Fe.S..) y no inter..coont~ <;on el mRNA POf' el contrano. <;~o el hien'O es esc:aso en la cENuta la IRPI no presenta el nvcloo FeS y ;)de>ta u1\8 confotmaoOn que 1t permite unirse con elevada afinidad a una hotquilla de RNA oon bvcte (p~g . 59). ilSia se C()c'I()OO oomo motivo IRE o etemento de resp uesta a hierro (i~spoi'I$Q f/on7(tflf), por 10 que las IRP se laman tambin protoi nas ligante:s de IRE (IRE-8P, IRE~ ptOteins) Exi$te un mowo IRE en 18 regin S' no ltadueia (pag. 245) dCI mRNA de ferrillna, al que se IKIEII'l las IRP lmpitfl80do el inicio de ~ lf3Ciuoei0n y reduclencJO asl la ooncenttacl6n intr.ee:!ular ae ten'ltu\a. La oluta se adapla as a la escasez de r.em:>. evitandO 18 sinteSis de I.Rl PfOielna que no es l'leoes,aria. Pot el contrario, eo condioones de exceso do hierro, $C: $inlebcZa libremente la ierrlllna, para poder l'ija11o
- """
U G
< < CG
uG G C
GU
en att-..l~nci.'l
llorquill de RNA ~n el
de Fe
ttll)d\';) 1RE
de ftrrilina
[(,1< ~ ~
01, mu.ill~tdil
mRN,\ ,.
-~~ ~ , ..,,(In s
l "lodcr''l
tJ ,.
IC~JIIf'l _\-
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,.
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la pro!(tllll 1R f' no ~ une ~1 R."A. nO~I:ta a la J'
IRP
tf*lue<:n
mRNA S' de
r.,rrili n~
,..._.....J
.:ttOn j '
OOtt..dt.o~:IIt
('1id~)
J'
IC\!IO)f'l _l'
'""' u.Wu.; i&
EXISte un ejemplo muy smilar oe r~iOn. coordin<'tlct con ltt an!Qnof, ()CtO on C$te (.;)$0 <;oniTQiando 1& v48 media del mANA, lo que cort$SPQn00 a Uf\CI; rogvlcllcin p rctraduccio n al (p6g. 286). Se trata del rece ptor de tran5fcrrina. uM proteina de Me~nbraf\8 neoesar~& para <l'Je la9 clulas capten el Nerro. En condiciones de escasez de hierro la prolb\8 IR'P se une tambin a este mANA, que posee ~ motivos IRE, pero al 9$t.1t sto& en su regin 3' no traducida el efecto es de pro!eocin deJ mR.NA frente a ta degradacin, En conseOJenC$3, M simotrz&n ml!s. mot6cvi<'IS. del reoeptor O. tr.-nsfenina .- partJJ de ~ n11$mo mRNA, W'IP<"Iei,anOO a lit ctttA& para captar hietm (:()1\ mas efltada. EA la sitl,)(tCin contr,..... (atluncti\lnci<"l de hierro) IRP no es activa para unirse al ~NA. que se oegada mas rapdamenle. 1edueienao 1a $inte$i$ del reoeoeor. ya no tao necesariO. AtriJos mecanismos de regulaCIOn (tradUCCIOn del mRNA de fetrltina y degradaCin del mRNA del reoep(Of oe tranaferrina) aCian al unisono con un rn1smo obJGtiYO. la adaptacin de la clula a la disponibilidad de hierro.
3 20
prot<ctM IIU C"'(;)bth:i-..t C'l n1RNA: ~te ltllduee nluC:hil!< '' d
S iHTESIS DE PROTElNA.$; TRADUCC IN
en :.u.1senc a de Fe
a.
IIU'
IKP
nkNA S" lk rttt llltlr dt

l l'l"" ' e. ( 11,11
en prn.enti.a
3 pnll\.'\113 IRJ0tioiu '-lne 111 M.I'A: e l ni.RNA k

dcg~a rpidamrn~.e. ~1nu.luce !'(ICII' ~~es
IRP
de Fe
lk U
nlltNA S'
IR '
de: n~t'f' 1nr lil"

lru n~ftrTi llll
23.8.2.2
Ejemplo 2: Regulacin de la sntesis de hemoglobina por fosforilacln

do un factor do iniciacin
La .slnteSis ti~ ~a .reQuiere C3nlido~s .stequiomtticas de hamo y de ~s. La s2ntes.i9 de .las glob1M9 llene lugar en pt"eCUMKires erUrOideos y en (e.lieulolos (ptecur$Orcs lnmodittlos de loo eriltocitos), cbtde se expresan actwamente Jos genes conespoodlentes. La velOcidad de ltllduocion del mRNA <le gk>bin<'! GSi l'(l!jiUiada en funetOn de la concentracin de hemo en la clula. de modo que si sta de6Ciende, dlsn'!lrklye as slnt.etis U ~ ~vilo asf lB ~ ln1P ele la protefna para la que no hay gt\4)0 oroelitt.oo (hemo) dispot~ble. La ~i6n lic'!ne rug;~r POt lnhibieiOn ot iniCio de ltt tradoin. inl0tf.Jn8fldo en la reutilizacin del faaor elf 2 (pg. 310).
4
Debe httCf:lrse notar que resul\a inllfblda 1oda nveva incorporacin de una M4:lc iniaal: pl*Se <:Ontnrar la &intesis de I<J$ ~$ )'<! inic:itKf<J5, pero no puede iniCJarH...,... nooV<J. Por otr3 parto, a difercnda de los t;emplos anteriores (fetril!ns y retefliCW de traoslattina), el oontto1 no afeela esp~eitiearnente almRNA de una proteina, Sino a la lt.:'lduOCiOn do lodos los mANAs de 1& o1Ufa4 ste aparente perju!oo polendal pare la clula esl jusWlcado porque se trAia de OiUIM t$pecitl!iza<l3$. que $irlte1itan C<'ISi cxdmivameme globina.
mw
Tem a 24
Modificaciones postraduccionales: maduracin, plegamiento, trfico y degradacin de protenas

24.1 lntrodocciOn .......................................................- ...................................... _...................~............................, .. 322 24.2 Trfico o destino do las p roteinas.....................................,_,,, ........................................~ .............. 322
24.2 1 Compatlitl"'et\40911Tlplic:ados......................................... .......... ... .... . . .. . .. 24.2 2 Tranc:o ese proleinas en el citosol y enb'e giinulo& ........................ ..... ........
- 322 .... ............... 323
24,2 3 Trtflor> de proi.IN!'IM de secrecin ......................................................... ,,,_,............ .. . 324 24 2.31 cara<:teti!ltieaSdel pp!ldosetlal .................................................,_,_,_, ,_,_, .... 324 24.2.3.2 Mecanismo de entrada de la proteina al rumen del R.E ........... - ...--- 324 24.3 Maduraelln o procesamiento del pollp6ptido n~c;iente............................................................................... JM 24.3.1 Maduracin por rnodificadn de ttmino&cidO$ ..................................................................................... 326 24.3. 1_1 Unin do $V$\itvyent0$ <'1 10$ arnW~otu::icse& ........................................................................... 326 a) Acetilecin ..................................................................................................................... 326 b ) CarbOxii&CiOn............................................... ........... .......... ... . . .... ,,_, ..... , , , , , 327 <:) Fosk)raeiOn ............................................................................. ,,._,_,_,_.,,, ...........,_ ,_ ,_ ,._, 327 d) Hldroxitacln ...................................................... ,_, ............................ , , ....... 328 e) Meladn .............................................................,_,_,_.,.,_,._,_,_,_, .,.,_,_,_,. ,_,. ..... 328 24.1.1.2 lnocwporacinde ~idos: gticosiaci6n , .... ................. ,.............,.,_,_,., .................. 328 a) Caracceristlcasdelasg1icoprotefnas...................... ,_,_.,_,_,,..,_,_,_,, .. 328 b) TiposdegfiCOsitaan ... .. ........................................................................................ 329 e) BiQsineesis de las glliOOptOielna!l .................................................................................... 332 24.1, 1 3 MOdlllcaclon con Upldos ....................................................................................................... 334 a) Acilaein (Cidos grasoe) ...................................................... ......... ............................. 334 b) Prenlacin (lerpenos)..........................................................,_,_,..,,._,_,_.,,.,._,_,_.,,.,..,_,_,_,_,_ 335 24.1.1 .4 Formaclnde puentesdesulfuro 335 24.3. 1 5 Olr&& mo(lille&eiOI'IIt$ ......................, .................................................................................. 336 24 3.2 Madur3dn S)Ot e-sdsiOt'l de l&!l pr01e1naa: Procesamiento proteolltlco ............................................... 336 24.3.2.1 Activacin de ptoenzirnss ptoteolltJCas ................................................................................ 336 24.3.2.2 Acttvacln de P"~Cursores de hormonas peotldiCCII$ 337 24.4 P&egamtento de protei nas --- ..............................................................~.................................,_, .. ,...... 337 24.4.1 Mecanismo del plegamiento ele las protelnas ...................................................................................... 337 24.-1.2 Pfotefnas implicadas en el plegan-.ento: carabinas fi'I01eculares .. , .. ..... . ... .. .. ............ ...... 338 24.4.2. 1 Tipos de carabinas .. _,_,..,.,.,_,_,.,,.,.,_,...................... ....... ............. 339 a) Car.Jbin.as dol tipo Hsp70 ... .... .. ... ........ . .... ... .... .. 339 b) Carabinas del tipo Hsp60 ..................................................... ....................................... 339 24.4.2.2 Funcin de las carabinas ...............................,_,_ ,_.,.,.,_,_,_,,.,_,,.,,._,_, .,_ .. ,_,_ .,.,_,_,_,..,.,_,_,_,.,. 3-40 24.$ 09grad~ci0n de las pt'Oteintl$ ............... _,., ....................................................,_.............................................. 340 24 5.1 Ocgr&CSaein liSOSOMita .............................................................. . ................................................... 341 24.5.2 Degr9dadon cnosllca ......................................................................................................................... 341 24.5.2. 1 Ublqu!tina ........................................................................ .................................................... 3..t 1 24.5.2.2 Seales desencadenantes de la Lbquitinacin ................................................................... 342 a) ReSiduo amhc>termlnal.. ................................................................................................ 3-42 b) Secuencias PEST ........................................................................................................... 342 24.5.2.3 Proteasas responsables d$1a degrad;tcin , . . , , , , ....... , ......... . , .. , . . . . . 342
322
MOOIFICACK>NES POSTRADUCCIONALES:
24.1 INTRODUCCIN
la slntesls proteica no termina con la libet8Ci0n del polil)t!ptido 4e' l;Omplejo ele lraduocibn. sino que en IOdos bs orgarnsmos se requiere una serie de procesos para que el mettsajt11lneat o unidimen$ional dol pelipptido {secuencia de aminoados determinada pot la secuencia de rucle6tldos del mRNA) 9e ttansforme en un mensaje tl:knenslonal, la estructura nabva de la protelna responsable de su funciOn. ES!os procesos, recogidO$ do forma conjunta bajo el Mtmino ~ maduracin o modi'ficac,ln po;straducc'onaJ, OOtl$111.\lyen el colofn de ta slntesis pfOieiea, que 3 v~ $8 con~ lb 5 1 f:.se de ltt b'ilduoei6n, dO$ClVI$ do lit activ..cin del aminocido. lnlci9clon. elongacin y termir'laciOn. Por diversa$ ralX:lneS. espeOalf~te por oo e$t!J(Ji:) e~o o P<Wtial ha51a haoe poco& al'ios. e~os procesoe no han reclblclo la consterac:iOn que metecen en cuanto a su impottanci3 pam 1#1 ~util Los avan08$ logrados ya pennlten tener una Vt&i6n global, aunque aproximada. del reconldo que eq>erimet'lt<\ 13 prot.ein;t d05do w 5i nleSIS hasla su funan La maduracin postradiJCCIOnal es esef'leiaf en IOdo momento y ~vnstanc:ia do la o6Ua evcaritite. Cada comparta'neniO M.tlcelt.lar requiere protelnas dlierentes.. que no se sncli;at~ en 61, pat\'1 $U$ v3riad;a; 1\lnc:ione<$: ac:tlviclad ca1alilica <le reacciones en todas las vlas metablicas, papel estrucb.Jral en la mematana celular, tran$P()rt0 o almacn de molcula$ e ione<$, 1\lnc:in motora muscular, transmisin de sellales intra e IMercelular, regAacln de ta expr95i6n ~. etc. IOCIU$0 las tmocoodrias y doropla:sto&, que poseen un genoma pro!)*), oeceSl&an mullltud de PIO(eina$ codifie<'d3s et1 el genoma tM:tear, q~.Mt lueQO deben llegar hasu. es1os oroflnulos. La vatlablliCI~ en cuanto a Ot'ltldic:iorles y drwnstanci:.s p. ..rtic:ut<~m5 en ~::~da tiPf) cotult'r y ~ ;:\mplitvd y complejidad de tos procesos Implicados e.n la moddlceclbn postraduoeional n&oe~~ difcil su de!lerip<:iOn. A es1e fin, so 5egUI' un eSQuema relativamente comn y adaptado a la realidad celular. aparentememe toglco. dividiendo el prooesamiento postradUCCO'Ial en lOs siguientes apettado6. Debe senalarse, sin ernbalgo. que lOs 3 I)M'Ieros procesos tienen IU9llf gonera!menle de forma Mnullnea.
1 T rafiCO o d81Sbno c5e las proteinas hacia diferenteslocaizaciones. subeelulares o extraoeUares. para el ejerciOO de
~
fvncin.
2 Madutacil)n o pt()C!e$81mlenl0def potlpeptldo, Es el a$09(:10 ~iat de 1& rnodif!C3c:in postr~ducc:iOI'Iall . ComMtnde modifiC8c::iQI'IeS qulmieas de tos amlnoo:dos y ellmlnacln de lragmen&os oe1 I)Oiij)()ti(JO. 3 Plegamiento OOtl'eC1o deJ pollpptkto has1a aleanz.ar su oonk>rmaeiOn bloiOgle& activa. Req.iere, M muehos casos. una macb'acin previa por modificacin qulrnlca. oon lo que pleganVento y maduradn estan lntlmamente ligados. 4 . Es entonces. una vez que la protelna ha legado a su descino y eomplido su misin, cuando se debe describir tambin su eatabolismo. su degradacin l'\a.$ta aminocidos Con este CltOCC$0 se c:ien'1 <te11nllfvltmente el'et::IO bioiOgiCO de 13 proteine~. e$ dOClt'
trfico
_ _ _ . - maduracin - - - - - - ~ plcg.amicmo ---.., biosintc:sis fUJ)CI) .....______ nminofu,':!dos
dcgr..lda<:in
24.2 TRFICO O DESTINO DE LAS PROTEiNAS

Se eot100e C(Jt'n() lttdico, descino, topogn&sls e lncklso 'aslfrcacln. de protei nas ta M& que Siguen estas en &a clula eucatitlca nasl8 alcanzar su 10calizaci6o (intracelular o extracelutar) donde pueden ejercer su IIJnciOn, y loe mecaMmoe motecuia<s responsables de que sigan esa ruta. El trfico se desal'f'Oii de forma estrechamente oooectada oon la madLW'acin y el plegamiento del polipptido.
molci.U:$
24.2.1
Compartimentos Implicados
El lrMico de protelnas tiene tugar oon n:tferencia al c:ilosol, <t la membrantt pl~$tniliC<J y <t 106 compertimon\o$ cerrados presontH en aqul, lo5 Qtgnulos detimitados pOr membr.VI.'"IS, ton$1i!uyel\4cs del llam~do 'sistema orM:Somombl"i'lnoso: ReUeuto endoplstrli co (RE). Es un sistema intraoek.tlar muy ramificado, plegaOO e interoonectado. de estruellJra 11'8tlada (canales. esferas. rubos. cls!ernas apjanadas). con IA'l espaocio Interior (lul o lumen) ait;lado de' ci!Q601, En su mayor parte, el RE posee nbosomas asociado$ a so 5uperfic:ie caot;lica {fonnando el RE rug040). donde se realiza la tinte&*!! de las protelnas .-..egrales de membrana {celular, del RE. del Golgi y de li50601Tlas. do las desthadas allumen de RE. Golgi o li5060tl'las y de las destinadas a secrecin. Las proleinas con destino y fvncln clto&llcos, nucte>ares o de 01106 Otgnulos {milooondri8$.. cloro~IO$, peroxi$()111<\$.. ) $0 $intetia:t~n en ribo$(1(1\<'$ no asociado& al RE Las prot..rl0*5 M intofl)Or.\n al lumen <MI RE de forma OOin'lduCOI'\&I (a la ve1 que se $intetix.an). P\'lr.'l ttlli SUfrir los primeros pasos de la rnaC~utaCIOn. La salida del RE se hace bajo la lorma de pequet\as VE>skutss. que se dirigen al aparaiO de Golgi. a lisosoma& o a la membfana externa.
TRFICO O DESTINO DE l-AS PROTENAS
323
midro
rt1iculo -cndopl:bntica
uparuto de Golgi
,__ o
CompkiJo o aparato de Go4gi. Se !r;Jta, de un oc:wnpitrtimonto siti.S<I4o en11e el f(E y la merrilr'tll'la ptasmauca en una dl&poslcin (caro "ci$.. frcnto ;;~1 RE y e;:.ro ~l,:'ll'ls-lrM!e a la membf'Ma) que factllla"' llegada de las veslcutas del RE cargadas de Pf04&1M&. E~ formado oor un apil&mleniO de &8009 o bolsas aplanadas, con fonna de disco (dlctlosom<f$), no intorconoct~$ cnttc si. l$ polips:ltldO!I sufren aqui f\LJIWO& ptOOOS&mientos haMa dar t.a prot.ena m3du~. y3 dOI.l(l:t de 1a, senales mofecutares necesarias para definir w de&fino ffnall: lils prot.eirlil!i &an r(lcr!VI."ld3S 81 cltosOI en nuevas veslculas que se d+ngen al orga~ ~Uildo o b.it<;it' 1;) lll(lml)(~ e.x1 emn (durante Ste ttanspotte tambin se procesan ITlUeha& prot.e-inas PQf escnsin P'Qledibea) En el CMO dt las prote.nas que la clula seaet<l 0o1l 0.111~ $e Mbta de vesie~,~ras de ~rl, que fin-a!nente se fllnden con &a membrana cilopl~sm;itica llbcri\nOO W cntenidO .81 e11.teri0t celtAat por e~toclfosls. Adems de esta funcin el aparato de Golgl ~mbin d:t lt,~g;;tr a tos i!loson\85 cargados de- el\limas hldrolltlcas. que no slo degradan moUK:u!as n~J<~~Cel~, sino tanlbiM pMICJJfas exttaoeuates incorporadas por endocitosls (mediante ta fuSl de eod<l\Somas con i&oSOrn.'IS) Mitocond~. $ itl0$ donde tlefte fugar eapecifkamente la k>sfonlacin ollldatn.+a. coola ptOOOcon de ATP P\>lr<'l tod~$ \M neoes~ energe11cas de 18 oluta. Solo una& pocas de las prota#las neC!$$3riil$ e:s!An oodrfie3das on ol gcnc)ma m.!ocondrlal y ae suuewan en ribosoow mriooondriales por lo que se nqu,ere ta efllrada a tra~.>s de su dobie membfana de gtan CBnlidad de proteinos sintetila<l<'l$ en el QIQ$()&. Pero:ldsomas. Soo organubs de ~.;o peqvollo do.lmitdO$ por l.lntt tne!niJr<\M tin1t:a, fiCO!I en et\Zif'l\ll$ ~ lnt~lenen en reacciones .())!id;.tliva. de moloola$ tKieli'S Otro& wmp.,rtimtntos Quita ~n meoor trascend&l"'Cia en b que respecta al lrt.eo y la mao..wac:IOn, peto ctwiamcnle con iniJX)rt3tiCI8 l\lnc!Of\8f y que lambin son de!iOOO especfic:o de su& prolad\SS respect!v~. deben cil.<lr$4:> los doropi;)&IQ$, li!IO!k'l<B!I etc
son
24.2.2
Trfico de proteinas en el citosol y entre orgnulos
Tod<l$ l~s prOICin.t~t CQmie'n:Z&n su Sl!ll$($ et1 el C1IOsol (e.xcepto las codlr.cadas en tos genotna!l mltocondrlal y clorop!M:IX:o), lt'l clave 6f)t ~o por el que las protelnas se dll'9f!ft a su toceliz.aclbn son s.el\ates de claslficaciOn o $OCuqnci.;~$ s~al ~ forman parte de la prctelna naQente y <klgen el trfico de la molecula haca distiniOs ompilrbmC!'!IO$ de 1$ ~ul;) . Lt'l$ pro1e1 nas ~ no ptegentan secuenaas sel\al permaneooo en el cuosol. Eslas setlales sve~ se1 {09*'1e$ <.:Onlint,~;)S de ltt s~enela. de aminoCidos, de 15 a 60 residuos, frecLtM!emente suuadas cerca de IQS eKtremos <Ji@ ta cadena y casi Sierren entniMdas por esci:siOn proteohllca pg. 336) una vez han cumplido su fundon. En ottos casos. s.n embargo, la set'ial e& una regin $Ctal' una disposiCin lndimenS~XLal e$PE!CiftCa dependienkl de; plegarnief'l'to la protein;"J, formt~dfJ i * ;.lmu't&cld$ nO COntiguO$ n l<t 8$11\lCivra prfm<Jn<J
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MSp:rfi~IC crluhn
_)
324
MODifiCACIONES POSTRADUCCIOHALES:
Et aspec~o mas des&ac&ble del ttiltieo tntteoeuat y 1'1\b oomUfW'I'Ief"te es.uct~ os el que (Xlf'r9$pon00 a las protelnas de secrecin. ~ste ocooe. de fonna f1'U)' ~ y versa\111, a trovoS de 13 me~no del RE y ;emplejo de GolgL E-ste sisaema de transporte fmpllca ta lnttoduocl6n de la eaena poUI)e;l)li!Jiea ($inteli~a en ta superficie del RE rugoso) en el fumen, a travs de la membrana, la salida de la protena completada en ves.ieutas l'l~tt et oomplojo de Golgi y, finalmente, &U tran&pOtte en vesloJas de secrecin hasta la membrana plasmtica y su secteeiOn at exeriOr. tste ser el nico e,emplo que se estudia en detalle, a oontlnueclo: no se abordaran otros aspeoetOS ()C)II"CrelO$, de gmn inter$ pero Qllt O$C<IP<I" al carruw general del pni$Mte libro. Entre s;os. pueden cilarse la lntegradn de pro~tnas on ~ mombr;)fl;l d e~ QtVnulo. el trilfiCO a orgnl.lbs especiale$ como nwlocondria, cloroMs:IO o perolSOmas. el uansporte bajO ta IQnna de vesrcutas de $&Ctec:iOn deSde et RE at c:omplojo <te Gdgi y <1 ta membrana plasmtica, ta
liberaeiOn final de su (l()l'denlo por eJtocMosls al exli!rlor eelul.ar o la mecian;e endocilosis facilitada por receptor.
in~ciQn ~
~iOI'I
de protei nas c:Jel rrwlio
circu~o
Como ejemplo de olro tipo de destino. cabe mencionar et trllfiCO de protaCnas del loSOI a nUCieo para su 1~ ~matin<~ o w intetv9nci6n en 10$ Pf00$506 de replicacin, tr81'18cripcln y maduracin postransetipciOI'Ial. Estas proleinas deben pasat a U.V6S de ros potO$nu~"ros (eS1ruCiuras mvy complejas. fonnacJa<s por 1\aS~ 100 proteinas diferenteS, que t~traviesnn la doble onvQ~rur;, ~ A lrilv6& de 106 poros tiene lugar Igualmente er ttAJieo, en senrldo inYel"$0, de las molculas oe RHA y M $Ubunic:laCics ribo&omt~lts. $intotizadas o ensamblada$ en er ncleo, respectivamente. A\n:lue el paso puede ret'lilar..e 1r>te CliflniOn, ~rcoe existir una difusin se6ectNa. sin de1ij)iegue de la estructuta trldlrnet'lslor\af (a dlfetenei8 de ros olfOS ~ de tr61lOO). So ha propuesto la presencia en ras protelnas que se han de transportar al neleo de una secuend8 setial (seeueneit'l oe locaii:Zacln nudeer) a traYs de la cual se unen a otras "protelnas reoepeores de nportadr\ nUClear", que ditlget\ la entrada a travs de lo& ll'OfOI5, con &al ell8f91a liberada por la t.drli&i& del GTP.
'*'
24.2.3
Trfico de protenas de secrecin
24.2.3.1 Caractersticas del pptido seal

La secuerw:la se~~ar para 18:!1 proternas ere secrecin es f'10f'm81menle ul\8 secuenCia pei)Udiea 00118 en el e.xlfemO N-terminal del ~Ido recit'l slntellzado, que se denomina se-eue.neia sel'lal o de etiquetado, etiqueta, p6ptido sel'lal o secu encia Uder (pot su poSiCIOn N--rermlnal). Pre~a \.WIO o ms residuos oon carga positiva (Lys o Atg). seguidos de 5 a 15 amii'IOeldOs flkii'OMilklos y de unos pocos residuos rela!Nament.e I)OiateS y de cadena oo11a, e~nte Gry y Ala.
Ejemplo de pptido seal en la prcproinsulina humana
Como &e ver a conlinuaQQn. es frecuente QVO ol 1>6171ido sellar M (llimint. por r_. t'c;c;iOn ~ t,r~r~ prote.t~:t<~ d e l.t~ casos, las prote!nas redn sintetizadas. euya seeuMC::Ia senat an no se ha &~minadO, se <lef\Oinlnan foonas pre-protefna, para dierenclarlas de la molcula que ya ha sufrido la proteolisb del ppeldo seftal, en algunos ca!I06 sta a su vez es una fotma lnactrva que precisa un proeesamleluo adicional por ptOieollsls. por lo que se la lama pro-protefn;~ , y su precur$0f ricial es. pues. una pr-..pro-proteina (pig. 336),.
seal (o prote3:sa sel'lal). En est!l&
24.2.3.2 Mecanismo de entrada de la protena allumen del RE

Como se ha Indicado, roela& las proretlas royo de&dno e& la ment>rana celuf.af. la membrana de RE o Golgi, el interior de %tos Of9{lnuloo; o la MCroI'l al exterior " sintotiz;.n oo II)O$()m<'l$ a$OI;iild0$ ;)1 RE. Adcmils, reci6n comenzada su !Wntesis la cadena poipeptidica M introduce al inlerior 0e1 Re , se tr..n$locll o111.men. U (:()tl(liCiOn Vnie3 e lmptt1<5andible para 95t<l tral'l$~ci0n e:; 101 prc$Cneit en 1# cadena PQtipeptidial tSo 13 sewet~eia seN~. A ~tnr.aciQn M cstvdi:. con detalle eue ptOC:eSO, ooncre-tllndoto pata el easo de protelnas de secrecin. 1. Ptitner ptOOeSO de Uf'litl. La secuencia sel\al se sintetiza pronto tra& el comienzo de la ttaduociOn, por 95tat situada en el ex.tremo amino del polipp(ldo naciente. y emerge del ribosomct cuan:lo el poipptido alcanza unos 70 aminoacidos de lof\lgitlld. l.a MCVOnti~ Ml\al .- cn!OOc:CS rooonoc:ict4 t;\C:lidamenre por un OOf'l'lplejO proleloo cl10$61ico dlt gran tam311'1o (325 kDa), lamaoo partleula de reeonoeimlel"'to de la sel'lal ( SRP). Estructuralmente, la SRP es una ribonucleoprotel'na formada por 6 polipptid06 y un RNA (del grupo de loo; RNAs cltoplasmloos pequeflo6 o seRNA&. llamado en concreto RNA 7SL. con una &ocuencia rel<~ciooclda oon la famiia Alu de ONA repatitrJo. Jlg 114), er RNA 7SL es el ~$POt'l$~ble; dir.eto del re<:onoeimiento de la
SEICUI.IflOO Mtf'i<'JI
TRfiCO O DESTINO OE LAS PA.OTEJNAS
325
cito sol
2. SegvndO pr-oceso de un!bn: la unin de la SRP provoca vna detencin temporal dlt ~~ etongacQn del ~00 en el ti.IO$(:tma, hasta que el complejo anteoor {mRNA : nbosoma ; aat.RNA : polipCplido mJCII:mlO : SRP) ooncacta con la superl\cle C*Sllca del RE. doncSe tea SRP es RJOOf\QCiOO y w uno ;: uno p;oleiM ntegrM M: la membrana dei RE. Iilm<Jda pt"otelna rcc:Gptor:. dG SRP {SRPR) o protei na d! anc:la;~. Como tesu!lado todo el ootnplciO queda fljaCIO fuertemente al RE. El .-eeeptot de Sru> es una protema neteroomerlca ooo la capacldaet ce unir GTP y de 4A't31il:or w hidrliSIS (octiwlfld GTP*'a) La fOf'll\8 con GTP unido es la que l'lterac010na con la SRP. mtel'lttas que al ~ano a GDP pierde aMidad y se !Ibera la SRP 3 Tetcet proceso de unin. 8 corf4llejo ba quedado dispuosto sobre el RE de tal forma que H !avooec su interacci6n oon ooa prolelna integral de i;t mombran, dol RE. $ilut~d<'l en YM IXI$'Cin VQcn<JI a l<l SRPR E$13 nueva prollna se llama pro1eina re<:eptora del ribo$om.t~ O n'bofori na pon~ve 50 misin o:s.. preQs3lmcnt~. h,t de reconocer ta &Ubunid<~d mtl)'Or d"l nbQ$<:am3 que formA par!~! del gr'M complep y medi<~r .m la f!tl!fada del polipplido l)(ll(;iont,H.t intcrOt del RE, e:leeruancso un p.'lpel como )l<lf'O. : la membtl'ltla
a Como <.:o!'l:secvencia de e$te "anel8ie:" ocure 10 slguierue. La i!lutlidad u de SRPR hldrollza
ef GTP unido,
dando GOP y P1 (g."'roet~ergti.Co de w GlP 1)0( ~Ido). b Se drsoaa la SRP. quedando disponible en el cltosol para volverM a emPlear r clclo oe la SRP"~
e) Al i!ber81'$EI la SRP se etlmil'\ll &a lnhibion de t.. trOOtJCCin ft decir, 50 rcl'nc~ lo tointeshs pro~oica. Yll qn (11 lumCIIl d<lt RE d) En ,, riboforina se llbte un car.at de ttansklcacln' que permite la enrrada en el lllrnerl de la cadena Sl(lfipepli(tica etec:eerne. De ahl los nombres altematrvos de translocua para la ribofoma y de compleJo de ttanskleaciOn para el comptrefo que se form 4 En la cara lumlnal del RE. asoclaaa a la porcin lnteno( da las riboforlnas def poro, se enQ.Ientra una nueva protelna Integral de membrana lamaa peptida&a e l a seal. pues esc:inde el ppi.Jdo &ei\al, sepcw.lndolo del tesiO del poUpbptldo en eredn'J,ento. Una vez liberado, aquf se degrada Msta aminocidos. 5 La l'irla!l;wein do lit sinlc:lsi1: <ffl m lumen del RE. con libec-&ein de la pr()letna, ocurr~ c:uatldo "' c:x1rcmo ea;bOxiO del polip.(leido 1\a pa!l.ll<IO a uaves de la mentltana del RE.. El f'lbosoma se disocia entonoes df'!l RE y se de$01t98f1i28 todo el compleJO de tfa<luoc:ion pera volver a rac1c:Sar&e ('aclo del ribo6oma).
326
MODIFICACIONES POSTRAOUCCtONALES:
24.3 MADURACIN O PROCESAMIENTO DEL POLIPPTIDO NACIENTE

ConoeC)tu&lmcnte es el co~ent.e mlls Mncillo de 1;~ modifiCC~oCi6n po6traducdonal Puede l ener lugat tras haber finaliZado 18 slntesis, uraa vez: liberaoo el poliptoptido <1et ribo$0n\ll o, ~ CQI'l"'nnel'lle, de klrma simul"nea con 18 traduccin. es declr. la regin de la molcula que se ha slnteliledo antes (/16-lerminal) va Sietlc:IO m(l(li~ ~ras an se est elongando el polipptido por una regin ms prxima al e.xttemo Ctetmil\8l Esta seguncJ& po$ib~ llK:i~ el nombre de modlfteadn cotraducd onat, aunque 106 procesos sufridos son lOs mismos en ambOS ca&Ot. Se VlilitM ena:imlllll y cofaciOfOs espoc;ificos p.va uM muetitvd de rO<tedonos de rnoc:illcac:in
'' ~ -S'
~ \
~ ~::;;;~~
las modifJCac:iooes "pos:traducciooales.. pueden tcn..-r lugar de fomla colraductlol'll
:..::::::::..:.::::.:::::;:::;::::;..-'
Ji
La maduradOn ""Plica dos grandes tipos de moditlcedones def poltpptlOO: la transformacin de tes eaoenas la1erale9 de alguoos amlnoclctos y la escisin proled1tlca.
e:
1 e l
24.3.1
Maduracin por modificacin de aminocidos
Diversos aminokidos del p01ip6c)Ci00. $iempfe en Pl)$ieionet .-peci1ll;l$, $UI1 0n I.....Ccionos <kt nWflc:iCin quimice, aunque a~t.ali:utda enzim;\'licameoto, Se describen a QOf'ltint.181Cin otgunas <kt lil5 m;\$ freci.'Mtos.
24.3.1.1 Unin de sustituyentes a los aminocidos

lateral de amlnocld06 o a los extremo& a~ o carboxi-temW!ale&. Se han aminocidos modilicado5: veamo5 algunO& de 106 ejemplos ms COI'I'U'Ie$,
Es fr&Wente 13 adiCIOw\ ~ dete~dos grupos (oomo acetilO, carboxllo, fosfato. hidroxilo o metilO) a la cadena des~ ms de ..n centenar de re&Qj06
a) Acetilacin
La adicin de
Of',C)06
aoelilo tiel'l$ tvg.,r en un 50'4 do lt~s protoii'IM euc;ariOticas. Un:, posioin frllcuonlo es al
modificacin es un aunon1o de
a. resiStenci& tila deo~. JI proc.ege~ el grupo amlno. Ta~ se acetlla el grupo 31$ his~a$, de fOfma re~ible; esta rnodifieadr'l es en parte amino en lCII c:atna lateral do midW$ do li$int't en 1 tSpo1'15abto do 1<t rogut.ciOn de tal oon<~onsaciOn de la <:romah (pg. 264).
EJcmllo: el atn:illO lcm'lit~~l de l:a
bl:.tOC'II H~ SC'COCUCIWI't s1mlprt acccllldo
grvoo <amino tenninal, ~ia eUminaeOn del re$1duo de mellonlna N-terminal (pg, 336). Uno de 109 eteccos de esta
ace-tii-Ser
n t ,t'OS<M
(liCCtil.("oA)
C'MSH
MADURACIN 0 PROCESAMIENTO DEL POLol P.-: Eo::. PT !.' I DO "~ N~A!::CI~ E!! N.!C TE =-.__ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ___: 3~2 :.!. 7
b) CEJrboxifacin
En algunas pnxeina& se atlade un gt~JPO e<~tboxilo n 13 endOna ta.terat de un ai'IWlOcido, pot ejemplO al ..Ctir de Asp (dando (k.arboxiaSPiiMio) y Gl\.1 ('f'(i3iri)OJCigh.JI3m&IO, et\ lOS taoctores de coagulaCIOn y en proteina& estructurales del hvCJ$0) ,
r,;emplo: Ln l)r'CI'tncil de un aran nilrnnv de n.'l'ilklue~rarbo:dgiUIUiu:li!O ct1 la r<:in Nlttrmnnl (le la ttornbnn ~ C!iCI'ICial raro su ao:ci,ili;l.;l cllrno fnclot t1e J:.gulacau. 1::1 r-carbo.'lxtglllllU'IlatO acra como queloMe 6cl C11' 1 , net.::c:linrio JUf.l 111 uci\idad deo la ttombina. Un defi~ de l<llamlf'la K '){0"1.'0(11 la Cllfb. , ull~~e6n
iruuticienlt' dllr.ll'llc la biu!.i.otc~i. daod l ~.~gar IIIM'I si!XIromc: hcmorrigJOO.
e) Fosfon'lacin
Es qu~ la modif~eac:i6n freci.J8flte. actuan~ e3$i Siempre <1~ l(lrma reversible (fosforflaclndestostortlac&n) oomo oo mecanismo reyul8dor de 13 ~Ciivi<Jad de la proteina (reguladn pot mocliflcacln covatente). Afeeln al gfVI)C) OH <le ser. Thr y Tyr, estanoo catallz.aaa pot protefna qulnasas. oon hidrlisis del ATP. Produce un o::remento n()l<'tble en 1~ carga neg&1iva de 18 protelna. La reaccin opuesta. de desfoslorilacin, la c;ualizan pro4eina fosfamw$. En 01mbOS casos, se ltttta de una modtflcacl6n estrlctamenle postraduocional. ~ tiene 1uga1 en et c;.o:oo~ O$!Jpue:s de qt.ie se ha oompte-lado la slntesis y el plegamento de la prole/na
E.Fmti()IS; La gltl~ fqs(qrilnll b ((l)l'm;l. lltaCti\.o)e.s (~f..,.,l:.da ~~~ el l'tl1dUCI s~'f"l.f p.ll la ftf(lril~a quii'I:HII datldo la cl u.-~Ml (I)SfiN'il:tJ:t 111 (uti\'a). ql;l( lilxrn IIJC(Is:l l l del ,glucilgocm.l.la 1(\rma 111 lic ltamfOit'llla
mas
de nuevo en b ~ por la o.:ciln dc la re~~foribu r~fu t~~:a. La fosforilaoi6n de ,~rio:s resif).K)o tle S m b nwJ pcnnitt' la fijacan del Ca1, ae1 uauOO 1M la lecho: ()Offll) nutrimlt' de r )' c. p.1rn el lact:arll~.
fosfo-Ser
protelna QUWtasa del tipo sennallreonina quinasa
~
ATr ADP
C ll,i
O= P-O
~ prQielna fos.fatasa
del tipo fosfo.sennatfosfo1J'eor11na foslatasa
()
Tyr
-n1,~11
protelna qulnasa oet llpo tlroa~na ~asa -------.. ( ATP
~ AOI
fosfo-Tyr
~""""
H,--fi--A
1)
~,: ()
328
d) HidroxiladtJ
M OOIFICACtONES POSTRADUCCIONA LES:
Varias hidrolC!Iasas, presentes en et rt'lfcuiO endopiMn*. C.t81it;Jn la inCQI'POfacin de grupos -OH a algunas protein<l$; por ojemc>lo. en Pro y Lys del colgeno.
Ejemplo: t i pr~~Colt:I'.U ltt mtxhlk.ll {nlmU part~ de MI 1r.monn:u:in en colflmo) por hidroKila.:in de alrtdo."'llr di: un 500. de< ,w, n:~iduw rro. en la t.~.-cumc:in X.Pro-Giy. 1..11 cllliml rcspoos~~blc es 111 tn~l il hidrfl ita~. tmn tlioxir:na!'l q-..e uliliu oxl8ft!O mok eu.lar )' 2-o.-:osiUiansto oonu) ~!itfliiDS, y nscorbmo )' F~ eomo eofaciOf'C:S. El ~1110. en.fmncdad drn ~w do: una illSII(ICict~te hidro.Xilncin del COipO, ts produt u,1() ptUII dfio:rl de v'Jiamuui C (ilcrdc~'otbil'O).
lW' m~Je'IT.a 4hidroxiprolitu: rambieu :ce (orm;a J.hidtl),;ipr()liN
e) Metitacin
Consiste en te Incorporacin de mediO al grupo e-amo de ta cadena lateral de Lys, o bien al grupo y-<:arbollito de
Glu.
E)CU lJllo,:: La ac:bvtdaiJ de ils h1 MOCiaS puo:dc rnodlka.1e por: mou;)+ () dm~lllacnln dd n-;;1 1kf L)'120 dc la hislu u. 11-4. r :wnt,.En apart'tt' nu.mumt.:til y d!nlchlliinacn al.pm11) wolei n muw-uJurn y m el ('it(KTO..I) C: (.a nl nWJdiJi ilt~ (le 1:1 ml}'<l!VIe (WJ;!.IIJS1110\S COOitenC un ~iduo trimcliJ.Ii$ina en 11 m pot~kii>n~pcdlica.
metii Lys, dimctii-Lys, trimctil-Lys

-(CII:),- NIIT-cu 3 - (CII,J,-NII!?cl i 3
metlttran&lerasar. (EC 2.1 1.x)
tH
-(CH,).-N"CH,
tH;
r~'
24.3.1.2 Incorporacin de glcidos: glicosilacln
'*"
Se lama gioo&ilacin a &a unin OOV81ente do tadCI"'3$ dtt oligondriclos. {o gti~ nos.) et la cadona la1oral dt <llgunO$ t~minot\c:idO$ on ~<a$ prolt'in;:a$ UtctuO'IImente se prefiere el pror.,o ~ 011Mt9JQ gJuco-, que quedl.'l res.erv...OO 10 tsi)6Cilloo de gllloosa). Esta modificacin es muy frecuente en pr01ernas de membrana y en aqullas que la chJI& secreta al exterior (etltre las que se "cluyen las protefnas plasmA1!cas). y menos comn en ptOtelnas lnCrecelulares. Por otra parte. es caracterfstica de eucarir:Qs y Yirus, peto inex.istente en procaricKas,
a) CaracterSlicas de las glicoprOielttas

Las gliooproteiNs en su COI'1Utl40 no tienen una !uncin c:ornOO definida por la glloosilaeiOI'l. Sln embargo, 18 OOICin de ~~res c ieno un l)ai)et esenCial en la eslructura y en la funeiOn de cada una de ellas. Pot ejemplo,
13gl~i0n :
Cof'!lnbuye a et$1~bteocer l.a Q)nfQfmacin de &a prolein&. A.umenlt~ $U ftt<1bilid00 (POI o;utnP'Q fl"onto 111 Ct'llenlalrieniiO) y SU reSistenCia oonsecuenc!a. 8U'I"'ee'lt81a vida media en plasma (disminuye el aclaramiento).
<.'1
13 digestin por P'Qt00!$0$, COmo
MADURACIN 0 PROCESAMIENTO OEL POLIP~PTI OO NACIENTE
329
Hace la~ protefnas ms hidrofllcas, atlmenlando su sotubiklad y por 1anto. fadbtanoo 541 Interaccin con las celulas def enlOmo /l.p<ll1a e:slt\Jcturas indMduatizadas que median Ja lnteracc:i6n con receplOfes especifiCO$ y &On import<Jmes !Mermnante:s ant~s Son innumerableshn proto\f\3S que osU.n g!i00$il~s (ms que ltl$ no gliOQSilttdilS). ~&i como &U':S funcione& y no &o 6$cutir3n on e$l<.1 ICldo. Como merO$ ejemplo$, Q\le no repruscntan e! eot~junto de fui\Ciones.. c..,bc ci1l>' $U P\'Jpcl corro base de loe distintos tipos oe grupos aangufneos. entre enos el grupo ASO I,_Pg 369), ooyos aniJgMOS A. a y O son Ollgosacriclos oonstrtuyentes de glicoprotelnas y gliOOilpidos presentes en la wperficie de bs er~roOIIos y de ouas clulas. y en gllcoprote!nas de secrean Por otro 1900. un mtodo Mlnano de vi~;~ilancia 6e la dlabems es la medida de hem09lobina tk: o&l ~a. <:uya conccnlt<t<;i6n ~e <lo 1<'1 dr: gii,00$3 en $angn~ (la henl(lgt()binl) une covalaf\1(tf)1Einte la {illuco&a qult a-tri"Vit:s;, libremente ll'1 membGfn;'l critrQC:kana). lgualment&, ClCiS.tcn abund:tntt)S ejemplos de patologlas proYOCadas lXX la a!tetaei6n del patrn de gliC10$ilacin la urvn de los oligosacfldos, qe llene log<Jr tanto de formo colr.lduocion;d erxno po~r\\dvc.:IX!fwl d<1 1~ ;, una gran vanedad de g!iooproteina& e.n la& quo lt1 S)ar\e gltcidic<~ fcpfOSG'nltl un<- ~~ lami;H6tt VilriO'Ible ~ 1;) rn;'J$t'l total. la ;it'l$1li~;i~Ci6n 00 10$ compue$ll)$ que poseen -glcidos y ~llefo$ con'IO parte de su t'l'IOhkula no es sencilla, debido a 1;, gr~n divCr$il;l~d elCi$1ente. En ~er caso, eJt~Sien dl!ereru::.as 1.3010 en cuant-o a la propordn de la$ parlo$ 9lueldl~ y oei)Udie& oomo M tipo 00 azucares que pattlcipan '/la forma oomo ~e unen entre sf. A patt1r de aqul, l:e dtl$<:ripci0n se Umllar& a 10 relall'fO atas gliooproteinas ptop.lamente diChas.
OlioopJoceinas
lirk~
* rmri~nence dkhu
GIK'106 Uc 1 11mallo 1 nedlo (obgos&CirhJos._ .wmfi.;aOOse lmp~ l.a 11(1~ a,tucidk. ~~ dd 2 1 85% de N. rt~ l(lmJ
Protc:ugltcanos
la f!:uk J:IUCidita wnglir~Wii1111glktu1~. pol ~&t:ilri&l, lmltOf. lroCIIIdl y ~gul.u.:s (R"pctit(n de ... diiOidodo>),. Conumcon 111111 pmxm:iUn 1fi1U!t:lltivll de 111nmmu:U.:;uq, >liMnuycnk!l !'1111;, )' ilddU~~ urnko,.
(mono:GIIeilridot; coa MI grupo CI-I,OII tmni1111l o:o.ilbdoa COOII).
b prtt Jl~~t<htiee .upvne un 8.SQO% d~ llMSII t<ltal.
IIu :olu t1 po de: ;lieano. l..a pent ~Cid1t;;l thlpoot IQdll)ol dd l"" tk 1,1 t!Ul~ lo,)liiL
rn:.amm propicd111lcs ~k;u (cbast~llb!, ~llili01enc~&, 'itcoMdad.
lullt'iad6a en ankulacio.l~ etc )L*fao.'ttriSII((J~ de la 1 10tCd ctlullll bctoetllttt. No hay pr!Citll proptltllefll~ dld. l.ll U:IIW'lll (1 'l(lr m l ncc tunidiU:II lupt de tboosi~l
b) Tipos de gllcosilacin las cadeflas g!ocidicas de las glicoproteinas. se dasllican en dos gr81'1des grupos., M luooM de cul sea et enL~e
cntr<:~ el olig~OO y el polil)bPiido. E$1i1 da$il1cCKin puee apican;e en oena medida a las propia& ghooproqelnas. pero talguf\3:5 PfC$Ct'l\<ln &inwoil'l6amf3"1 o azUcares unidos mediante ambos tlp06 de enlace, en punlos d!StlJ\!os <Nt su
moiOcU'il
0 Thr
(#Pe;J
H-0
H.1
330
MODIFICACIONES POSTRAOUCC IOHALES:
Otigosac.dos unidos pOf o x.fgeno (0-gicoprotefnas): el a:ruear se une al tomo de ox~ de cadenas laterales de Ser o Thr. En general. lOs 0-gl&canos, ollgosacridos O-unidos o unid~ por O son estructuras sei'ICillas, aunque varledas. L06 ms frecuentes llenen como bese un residuo de N-eootllgalactosamlna unido a serina o treonlna, pero existen uniones ~erina, galaC'osa-hidroxlli&lna. arabinosa-hidroxiprolina,
N-aceligluoosamlna-&etinattreonina e ~nclu&O galaelosa-cist.eina (con oo enlace $.gli00$ldioo),
monosaericlo.
abre'IICUura:
u~uoosa
N--eootil-~glu::osamlna
<to-Manosa
(O~) Man
Cl-t.Fucosa
(~ollk-Gal)
Glc
GloCHAc
11
Fue
k?. h
1 1
H
t
NH-<:0-('11,
11
~
1 1
monos.-.drido abreViatura:
f!::O:GataC'osa
N-.acelll-o.:!):9!.8CIOsamN
GaiNAc
Addo SUIIIOO (Neceblneuramlnlco)

Si;a (Neu NAc:)
Gal
11~11 S'"
"
~"
!13 H lo-~"
0011 11
NU-CO-CIIl
n.:present.u<:in ;abreviada:
Sat flu
ca:t'IICit'JisLicos
'"~"'
().hcan~
"j:-._ o = ~\L..;/1
Oligosac:!rdos u l'tldo s por nitrgeno {N-glicoprotelnas); el azVcar se vnc at 3-!otnO de l'lkrOgeno amicJico de la cadena late.ral de Asn. E~ debe fom\ilf parte dS.. ~ia A$n.X-5er'Y. donde la poSICJOn de Set puede estar ocupada tambin por Thr oC)'$. y X e Y son cu<tlquiet an*'ooeiOO e~CCepto Pro. Las estfuC!!Jra~ de los N-glicano&, ()19osacrldos N-unidos o unidos por N &en m.~hc> m:.s (:Qt'l"'plefaS y diversas. El ~ de l'llOflOSaCridos consaltl.lyen~e~ es generalmente diferente dol de bs Oogticanos..
Esuuctuta cetural de todos los N-glicanos
GkNAe
Asn
Alrededor de una estructlsa cerrlr.tl oomUn $e ul'len monosacridos muy diversos (cido &iillioo, galadow. N-aoetilgii.IC06amina ...). rorman<~o cadenas con distintas dispo&*:ione&. De acuerdo oon stas. tos N-gticanos se daslfican en 3 tJ'UPQ&: riooll.,.. manosa. complejos e hlbrldos.
MADURACION O PROCESAMIENTO DEL POLIPPTIDO NACIENTE
331
N"'i,,icano del tipo

'"f~"(t en '"RIMW;II~
(por ejemplo. oola

ti1'011 00ullna)
Slo *""du~ & m1111~ ~bn- lll "'\ el!fllCWifl:l tn'l!r-.1. fJ I!ftiCI'(I Jc J>:~u..-... y de r-.mli<-"~'OCIN l'' d~,
N~g.liQno dd cipo
-QOmpleJ(>(~ ej~nplo, en la
inmunoJotn,iluv 0)
~~~;::~~~~~~;;;:.r~U~ ~"~;:nxru
Gk~Ac y
Ull lltJII!\'1'(1\')IIIIIbk de l'llllllfil'IIO<IIIC,_
oh\'l'I"!IU &
cad~na. con
11 ]XItllr dci nri~k11 \!l;nll(ll

1_... "miRa~~ f;ICIIIJif<: ~OI'!I<:IICII
mcn\1 Gl. s;.. o FtK
Nglieano del tipo ''hlbkkl'' (por cjemp'o. en

la o\'().11bWttl1111)
.....,
na~
en lti.WKI~a 1'{>0
"'mil..... lid tipo o,)mplejll
r.unal> <kllfll) o:Ol'lplqu
l)cl C'fflltp H- (Qf'IIIQII
' t\knb'\ de: SN"~n)n
y dt tnmspunt
El pOOpfplidll,;,:
n~ll "<>>llhl~ al MJ: roWtl<l, ~oJIIIIOO l'ft la 1 ..-: o llf_..lkl Rt l~,;p:.~~ IMffi<lf), D bien 111..:n.&' o;n ' u ,...,t'Jlor;ma ~ ..III'!<*C
!IJ.*:oprol.:IIWI>
e d<~vtro,
_,m,.. en
com!*'llmtntGIIi
subo.:duhnn
l)o;l k l ,.. "'"". .
Yl'.!io:llln (!lit lr.IIIJJ!OI'Ill!l el jll)l~phl.k:l
E...:l~~~~~~o.~ oM
COJOIIJQMmllWIll('llrid..:ll
"".Uiln!fel,,
332
e) Biosintesis de las glk;oproleinas
MODIFICACIONES POSTRADUCCIOHA LES:
La incorporaat'ln de las cadenas oligosacaridicas al polipptido es uno de ~ prin~IM prooe:sos metab6icos que tienen lugar en et lumen del retiC\Ao endopfsmico (RE) y del aparato de Qo9. las protelnas. por tanto. se mantienen aisladas del citoplasma dur&nle su glicosif<'lci()n, <~Yt tiene k.ll)tlt mientr&s 1<'1 l)t()4elna vtt v!ajtlncJO a 10 18rgo die
la ruta reticulo enclool.smioo _,. ve&kulas de lranslerencia ~ ap<tr;,tlo CS. Golgi ~ vni<:UlM do scc;rocin o dMtino llnal de ta glicoproteina (pg. 331), los OiJicanos y N-glicanos &e sintetizan IXlf Mas mctOOlicM cfclr3mente (fofcrcnlos. pero., ~ lOs e.sos ~
unin de 106 mono&aerido$ ft$1<\ ee1<'11in~da p0r glicosi ltn.nsferasas, espeemeas no SOlo J)ara reooi"'IC:ef' e1 ~rido Que se incorpora y la C&<JMa olifiOsaearidiea que acta de aoeptOr, sino tan'bin pata fotmar el eorMee en l)(l$icionet muy de&lidas del anillO de cada uno de toe azcares. Estas enzknas se encuentran en el inlerior det retlcdo endoplas.....::o y del apatato de Golgi. asociadas a su membrana. Para poder&e emplear como sustrato6, los
mooos&earldos deben estar accivados por LR6n a nuclelklos: conetelamen~. como UOP.Qc, UDPGicNAc, VDPGal, UDPGaiNAc. GDPMan. GDPFuc y CMPS&a. En otros ca606, el precur&ar es el azcar unido a una molQM: de dolleol (un lfpdo terpenolde),
HO
La adiCin de los 0-glicanos al reSiduo de Ser o Thr N 1031itl direelllltl"'&l'tle , por unin SIJoeslva de los mooosaairidos, calafizada por lasrHpectNas g!iCO$illtMS'erasa$. Todas las etaPaS tienen lugar en el aparato de GOigl, de torma po61t9ducclonal (la slntesil t 13 ~a poipeptidiea se termina pre\ltame.nte, en el RE).
EJemplo do bi0$fn!esis de Q-glic;anos (........ dt ll'lll(lNl .... lill ~1>!11!1 tubmullll.,_ paMS)
5>11u
MA.OUAAC tN 0 PROCESAMIE,NTO DEl. POliPt Pn OO NACIENTE
333
La slnles.tS de H-gllcoprolefnas es un proceso ms CQmplejo, que comienza por la Simescs M un Oli!)t:l!l::teando Pf'OO\K$Of un.oo a1 dohOQI, !!eguida de ta u.-.nswenot3 tn blOque ~ ese Obe~tno 31 tesidl.lc> 49 <IISP~~~~ del: pohpeplido y finalmente de nueY\ls react~ones. de adlaotl de monosac'rldos y !amblen de et.minaciOO de alguno!! de bs prev4amente I'ICOtporados. El oroceso se desatroila secuenCialmente enlre ~ recuto endoplstnioo
(OOlradCCIOnatmente) y el aparato o oompleJO de Golgi (postraduocionatme.nle)
c:ltosol
1 ).)1 -f'l' DviP
ldllttwlpiro/u.-fiiiOI "1
!
:
del RE
lumon
Ad..:III - u l de mDII0)1;.KilrMh1~ lllJbellp""' Q) N:Ut.:*(eU<~o\ adw uni~ Hiohcol f~f.uc>.

pt)f
l:.a ho nn ollkma de 1 mtonbr.ml dd R[
Mmhn~-::~~.,oo
dd
oi1 10$11Ciiri00 hu.,1:1 w
fooua definiti\'11
~
pohpo:~adoiAtn.tGkN,\J~\bn..Gkt
trcl'fli'PI!OO).I\:.n1Glct. hcl:llfo,l,ml ,
citosol
!{lllf("Cf''hJal~\"fl~(' ~~ ... '( l;f'hl
lum&n del RE
_L.
JO
~"
~~
~"
334
MODIFICACIONES POSm.ADUCCIONAt.ES:
.ie~ co~loo de Golgl
lumen
Qok
fo l!>fi!h}
Q Ok'lAc Q
fuc
1(<!} AliKtiln '1 eli:m11ucio'm M~:u.:ncinlct 11.: monc~t~~ciridr;l9 1 En tllumm dd )(llut-le$) o 1 l11 t:.trll
G~ruldnn
Q nal
Q taN-\e
Q M~n
mll.-mt dO 1& ti'ICI!l
,. (flrolelna. de mell!hr-.a~w)
O S
24.3.1.3 Modificacin con lipldos

a) Aclfacin (cidos grasos)
Aunque menos conooda que e t>ico&ilacin. la aciliK:i6n C$ \.lt\a modlnestcion Igualmente importante en algunas protelnas. Puede afectar a las ~ l:l'etaleS o a 10!1 exlfemos terminales del pollppt}do et1 general aumenta la hldrolobtcidad do la proleina. y ttn ooneretQ ellipio StJPOOe a menudo un pon10 de anctate a la l"f''Qtnbrana (oomnmontc en la cara lntemcl} Gonomhncm~ C!$1:1 reaeo.on ttene lugar en protelnas diiOS!lcas $Oiubte:&, *"e~ on t\bo$om9$ Aeiladn Cle cadenas ta1era1es de Ser y Ttv (enlaot %1cr con 01 grupo OH) o de cys-(enlaee tlo@ster con el SH).. wn -'oe~ gt<:t$Q$ c 14C (mirh1t.ato), 16C (Ptdmil8l0} y 18C (ea.teerato y Oleato)
......
Q-olelln:rina
()
(:111~)
/V' . /\/\/\/\
1 utOtllr. 11 1
fllelmltdill.nldl!Cat do.i kldo palmhll
MADURACIN 0 PROCESAMIENTO DEL POLIP~PTI DO N ACIENTE
335
Aclttein de m .:xlleln:)S El grupo 3/l'lln() tbtrl'linal ~eCie formar enl:w:e arnida eon 1Tnri$1(JIO (1.tC) o p;,lmitalo 1' 6C), lo <1\10 t1et1e luO<W cotfttdv<:~lmente ~ant&s & COO'IPielar 13 sintOSI$ &f polippbdOJ La reacaOo pane de mirlstlkOen:oma A catMzada por\#\<'! mlristiiCoA : protelna Nmlrlstll cranslet<t$8.
\". mir i$1i 1~1 k i1111
1-1
,._.~
11.1, .
1
nlln UI:Q
~~ . .lu.l~Jt,tto)lfii)S...(f'W l(llio~l, 1 ~'<~OIIU.... .....,.._, (l f 1011'lJi. . .lt'<

Otl ..,~ de
._.. ..,,liu..ol
l,.....,.l)
M.aw. p~ llllflhc..SW 01 1
lt\ln ilfi(J. t:1di.::1l del klll(l
"'"""'""'-.e ooaoopn<,.,.,.., .......rn.-.x.x.x. ~~, -~.\ .
""'*''"" ~ ~ttlno
. . . .,....
...
"
b} Prenrlacill (terpenos)
kclll< ~ ""' -illi'O;o~ Woiwo
Principt'llmtn~ te "nen lr(IS. tipo$ de Qlc.IK:i.'ilc$ l~noi6eos (~ f'Ot" unid;)dcs do esoprG'OQ. de alll nombre "'J,lrenilooorn g~rMIIO (10C). aarne:siiO ( I.SC) y gcrnnilgoranlo f20C), los dos pnmeros ;;on mulabolitos 1ntermedianos de la rut.'l t'li0$1ntlHie& clel OOieS!erol. Al tgtlbl qu~ 1~ 3tii~Q6 . $vfron esta mcX:Mc;:<)(;i6n Vf'O'I)intiS $inlet!UdM en ~mas ei10&6k:o~.
e:
w:ramlp ml~rmo
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10
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Emre 1W9 proteioos modllicacas con lamesdo se eocuen:ran la pt'Ot:f)ina R:.$ ~int'ls G y l)ro4einas de la ma<nz nudear La oncoprotelna Ras utiliza et fameSib para andatse a la superfkiB lnt~ dtt loa mc~ana l)l<tsmtica y poder ~Ciivar las sel\ala$ nlraoelulares que desel"f!bx:.an ef1 el fenotpo ear-ceroso eJ b(oqueo de 13 iSOPOI" 'l(:il';ln .coniiOV(I lt~ pl)r<Jk'3 de lt' a<:l.iviC:SOO tr<Wl$f~C' {et~rc:inognit.aJ. por lo que !>e han desaf'f'()(.ado Mrmacos antJCaneetOSO$ b.<lsaoS en ltt rHlieibn de lll lnmt!!dltrar~f(lt:ts.:t
24.3.1.4 Formacin de puentes dlsulfuro

Muchas proteinas forman entrecruzarrlentos cova}e(ues mediante puente-:s dlsulf\lt c:nlrt re"os Cys de la mtStna o de distlnla cadena (nlra- o lntercateoaoos. respectlvamente) EstO$ enl3!.'<!$ qve ~ dt~n ~n menor trewena.a en pJ'otoin.;J$ inlr.:~oofulares que en las que la clula &eae~. panclpan et1 et plegamiento cor(t;.~;to (pg 338) y protegen la eonrormac;i(ln .'ttivo de 1{1 protol~ frente ., la dosnawrahzaCItl en oo ambiente exzracelull~f que I)I)OO(t $el' m$ agteslvO La ~acn ele Mll'IOtS diwtlvro (uN) rot~oon rOOox) wene 8)'~ por la enZitna pr~in3 di!l;utfu ro lsomer as.a y por ~ peq\Jef\a~ oon grupa~ SH (tiOI). 13 pnnoipat de ~<N; cuales es el glulabOI\ (f" gM:ImiiCi'$letnilgliCI!)I)
lj l;;,miO.t
GSSCi
2GSII
pu>~e<n.t d!!U..I!t.n)
"--
_.1
I!IOmr.t;t!,;a
tEC53 4 1)
336
MODif iCACIONES POSTRADUCCIOHALES:
24.3.1.5 Otras modlflcaclones

Para ejercer su actividad muchas proteinas procaribs y wcariOCic<ts emp~ grupos p rost.Cticos, algunos <So& M:ls unidos covalentemenle una ve:z que el POiipptido ha mdont'OO ol riboiiOfl'al, En!Te e$1Qs grupos Ptle'den citarse la blotina en la <N::elil-CoA C'rboJI<'IS. o el grupo 1\emo en Miog~ MMOglobina y elocromo c. La actividttd de alguMS enzimas se regula mediante la adiclOn de monon uetetldos. Por efempiO, la glutan sin~stt (do! s.stema fijador de nl!tgeno en procariotas) en su fonna inoctiva se enruentra aclenilada en ~ rt$ic:IOO Tyr. EtgrOOO de adenlladOn es controlado por una Pf'O(elna reguladora. Ul A DP.,.ibosilaein es Olt& reecdo de modlflcaciOn que acta de fama te'Yetslble con carilcter regulador de &t funcin~ protei1'18S dtopi&:Smicas ~nuCleares. Transferas:as especificas actan sobre His,Jvg. A&n. tys o Glu, etnPieaf\CJO oomo oosuS(rato el NAO . la misma actividad es ejercida, perturbanOo la rogutaciOn fl$iol6gie<~, ()Ot 1<'1$ tolllnas diftrica. COlrica y pertsica. En algunas pt04einas se pr~e la sulfaQc:i6n de Tyr C()(l 3'fostoodenoslnaS'fosfosulfato: tiene lugar en el wml)lojo de GolgJ..
24.3.2
Maduraci n por escisin de las protenas: Procesamiento proteoltico
Este segundo tfpo de maduracin P)(eic<' wnsi$to ett la ruptura ~peocflea del polipplido (ptoteol ~ls) en pollppt:IOOs mas pequel'los. cada uno con distinta activ!d3CJ, o en la etmlnaciOn de una pordOn sin lJndOn (generalmente pequel\a} ~,._ dt'lr un Sc)lc) polipl)tido activo. En cualquier caso. se trata de un proceso de ac-ti vaciOn, de preCU'&Ore& inacM~; a ""*'int'ls t~etivas. No debe OOOiuncl!ii"Se eosta rowra con la respon&able de la degradacin proteica (pg. 341)Adems de lo5 prooe$0$ de &CIIvacln por proteollsis, que &e describen a oontinuacin. se deben oons~ dentro de este apartado 1<"1 ..iminaoeln de residuos amlno y carboxiterminales, esencialmente la !ibelacin en~411ic. do meliOniM Ntermlnal (previa desb'mlladOn en protelnas procaritiCCI$), y ta *"in..-;iOn de aa: lam&Oa secu eneia s.eal (responsable de la direccin o destino de la&; pro&elna~; mach.ma5,. p~ . 324).
a.
24.3.2.1 Activacin de proenzimas proteoliticas

1.as P'Oieasas <Jiges1lvas trlpsl na y qulmottipt,i na se sintcWan en forma ir'ladiva. como ptecursores o denominadas z:lmOgenos (en realidad, rec::in sinteiled3$ son Pf'ept'o-prOieinas. pues poseen un p6ptido ~181 que 1&9 maree como ptQteln$& de MerociOn y 1uogo es elir'IW\Ildo).. De ese modo se Pftl4eoen las oUas dOrde se sintetizan y se reserva la actuaciQn par<' ellubO digestivo,
pr~einas.
la trlpsl na. produCidoa en el pancret's. se $CIIva por elmlnacln de su octappcioo N-t.erm~nal . PQf lcl aociOn ele la enter oqulnasa producida f)O( la$ cl~ de 13 pareo del il'ltestino ~do:
~idu(l$ aminocidos
1...
prc-pro-prot.:lrn prctnJinS.c'C> proprotdna protdna actiHI ti'IJSint:eu)
cripsinu
15--16.. 2324...
147
La trip$in.a ~ctUa a su vez activando otras p..-oenzimas o z:imgenos. ol'llro ellO$ el quimottlpsl~geno , pteeursor de otra enzima digotlivtl pancrellea.la qulmotrfpslna: esta aclivacin os algo rnh OOMI)Ieja:
residuos amino8c1dos
1819_.
33~34...
164 ..
263
pro'flfotdna
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PLEGAMIENTO DE PROTEiNAS
337
24.3.2.2 Activacin de precursores de hormonas peptdicas

Como ejemplo caraaerls1Joo, veamos la a.lntesiS de la Insulina Ademas oe demot.trar la maouraciO' )()( escis.tl proteol11ca, constkuye un eje~ tipeoo de modificacin qufmlca por formacin de enlaces dlsulturo (~9 335). 1. La Insulina se sintettta en l cu; clulas B (o fH de los Islotes de l angemans del pa~reas bajO la b'Mil de preprolnsu1ina. un preoorsor pofpep(ldioo inactrvo. Se evita asf la posibilidad de que la Insulina activa P\Jdieta actuat sobre dichas cHulas. La presencia en su extremo amm de una secue.ncla sel\91 detef'tl'lina, OOtM en !Oda protelna desbnada a la secrecin. el transporte de es1a motcula rnedianle veslculas hada el eX1er1or oerular
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2. En el rctic:uiO tndoplt\smico MI
cliMW~a
~cuvo E:ste M pliega en u~ eonfor~in
la secuencia &ella! dando la proinsu11na, el verdadero precursor an lridimensio!\31 C$pOcifie<t. e$1able. que ~lita la formacin de tres
effl\ct$ <liSulfuro. 3. La pf(lirlsulina se ttat\Sporta haSta en e1 t'IPl)rllto dt: Golgi, dQndC oomion;o;;e~ w con~in PO' proteoli&~r; en IMulina activa. Las mol<:IABS se acumulan en vesiet.~as denomint~tdll$ !)r'6nv/o$ dfJ .$e<:f"(.iCitf, donde se completa su ptoteollsls y se almacenan ha"a que la clula reCIDe las sel\aleS que detetmii\M la secre66n de 1;) msulina al medio extracelular.
24.4 PLEGAMIENTO DE PROTENAS

Uno de les probletnas lmponantes en biOiogfa molecular es oomprencser cmo 18 ir'lfOrrnt'lc:itl oontcntd<t en la secuencia de aminocidos de una protena da lugar a &u estruCiura lrldlmenSional <IStlnli\la, regponsable de su lunein o ;:tCtividt'ld biolgico~. Er;to plcg;,m~to Oe \<1 e<tef'l(ll PQI'ipeptidica. QJa tiene lUgar en unos segundos, se realiza sifT'II.II<\neamenW tll tr'fioo y a unt'l ~>&rlc do la mildur.~ci6n cel polipptido, PQr lo qua maduradon y ptegamief'lto es&l\n intimamet~te ligMOs.
A:edentemet'lte se ha descubilerto que los defeCIOS en 1M MaS (Jc Plc9itmiel'llo y trfico da las protelnas son la causa molecular de varias enfetmedades.
La flbtosls qutstlea se Otlgina
por ooa miJ!aei6fl er'l el gen oe ~ l):)(eint~ trCin$PQf1adora de cloruro, que suprime uno de sus af1W'IOclos (pg. 3.51 ). Este cambio i~e la seoorociM <Jet complejo proteina<arabina (pg 338). 10 que a su vez mplde que la protena !lalga del RE y oontinUe $V mMort~Cin y trfico hacia la membrana
eitOOia$mlica. 1.4 enfer~ad de Alzheimor, ~ ttfe.ct:t t'll 10% de l<1s personas mayores de 65 anos. se orlgiM en 1)3f1e por 18 acumulaCin de agrag&ckl$ !Se un ppbclo derivado de la protcina P<llribde. e&OS agregadOS poSiblemente estn causados por un defecto en el pleganVento. Una forma herdaria de enflum.a (enfennedad pulmonar degenert~tiV3) se proOOce por mutacaones en el gen de la u.,-antilripM"~a (pg. 376) qua conducen a la agregaein de la ptOteiM, impidiendo su seorecin: la deficiencia de la protoina en plasma prodUCE! susoeptlb)iad al desarrollo de la enfetmed8CI. Por U!brn(), la <:onocid<t onfermedad de &cls vacas tocas, ~cmp/e en ovejas y ~~~med3d de Crcutzfoki-Jacob en nurnanos son <:aus&CI8$ por \lf'ltl protefOCI con plegamiento anmalo, la protefna prinica PrP. AvncNC 1(1 descripcin de este problem~ supera IO'lS PO$ibilidades da este libro, baste deat que una molcula Cle l)f()4cina plegada anormalmente lnCiuoe et mtSmo p~egamiMto tn ()(rttt~ rnol6culas de la misma proteina, conducienoo asi lro$ individuos por " ' lacio al desarrollo de la enfermedad y por otro a su lf81'1Stni$i00 a O
24.4.1
Mecanismo del plegamiento de las protenas
Algunos polipptidos. espeaalmen:e los ms peqoonos, pueden adoptat su oort~orm8on tndimenstonal naliva de IOti"M espontane,a, pero en la mayor parte de los casos et plegai'Nen40 correctc:> reqviere la ay~Kta de protenas espeaates (<1rSiinlas de 1as ~ se tsl~n plcgt~ndo): la lr.lduccin del trmino ingls Ch8perotles na llevadO a 11an~ chaperonas, chaperoni nas, <:el&doras o earabins; etnPIC0rcmos eMe ltimo nombte. ms fiel al significado Otiginat (1*$ont~ de edad acompattsnte de una JOven, que evita intetaocione:s nt:orroctas') Al p;;1rec;er no slo estn Implicadas en el plegam19RIO, 61110 18nan en la lranslocaein 8 travs de tnembr&nas suboelularos y en la degfildaOIOn de las prolelnas.
338
MOOlFlCACIONES POSTRA DUCCIONA LES:
Adems <Jo l<i$ <::<U<tbinM, en tas ~las eon!tlbuyet'l al plegamiento dos ~de lsomerasas que, al catalzar ruptur.~ y ~nsbVCcin de enl~ee$ o::wa~ente~ aoeletan e-1 plegamiento sin afectar a su tesultado final. Entre elas cabe
cital 1& protai na-disulfuro isomerasa, Que lnlefeambla enlaces dlsllfuro entre dos molculas (pg. 335) y otras enzimct$ Q1J8 C<JI<'!IiUJn 1(1 inter00tlv'$i6n <le tas ootiormaCiOf'les Cl's y IJ'8nS de ta ~ foonando enlace peptldioo, cont:OOv)'onoo <\mMs a que ta eMet~a pollpepUdloe adOpte distintas confonnaclones en la bsqueda de la de m' mma cnergi<t Et conoc-nlento e bs mecanl&mOS e interacciones que 9$l:abiliz:.;~n ltt 9$11'\lf;iurt\ tridim~~ surge de e.xpenmen*OS pioneros de de51lat\lraliuac;in y ron3turrllizaei0n ptOieiCa (OOf' ta enZima ttiXlr\ucteasa, de pequetlo tai'NI"''o y un &olo dominio) y CI0$1orM;.mcnte de la .,plic:aeiM de l'r'ltodos biofTslcos de anlisis y tecnoiOgla del ONA para pr~ir PQ!ipepliclos alterad~. Dada la variedad de protelnas y la 00f'11)1ejjdad de b6 mecanismos implicado$. no se conooen aUn a.., regl(l<S que rigen el plegamiento in vivo: an no somos capaces de predecw la estructura tridimen&ional O& una ~il'la a partir oe su secuel'laa. Sil'l embatgO. est daro que e& la prop;~ &ec:.uenCJil de ...-ninokidos ., que detenniM por sj n'isma 1a estructura trldlmenslonal activa. la estruct\lra prm31ri;l o sec~itt lineN re~ll3nle cte la a$()()ia(:l6n por enlaces pepfdfcos de 10s aminocidos {delerminada a su ~z POt l<t $0(:U0t'l(:i31it'.e411 de bases del ONA a 1raves del mANA) define la di&pOSicln de la cadena polipeptidica para formar puentes Ot hldr(lgeno, la capacidad de sus residuos hldrofbicoe pera acomooarse en el lnlenOt de la molcula y los ,.qucrimien~ eSitiCO$ que definen las posiciones ms 'd6neas de la conformacin na1iva. Este pvnlo linct i~ioncs de incklle pr&etka, blotac:no!Oglca. porque cualQuier mocbllcacin de la secuenCia aeler.~la stn.-clum final de ta prOielna. Lls tl<'Ps del proceso de plegamiento pueden analizarse, de klrma aDrO:UnOO<', siguiendo lOs niveleS de organilataOn oe las protefnas globulateli. En gener<lf. .,a pleg&mieniO viene oetern'inado pot considefaclones energelleas oorvespordentes a las estruellJra& seca.mdaria y terei3ria. &Quelas Que petm!ten el mximo nmero de puentes de hidrgeno e interaociones de v0111 dcr w...ls, inie&S e nidrotbicas, es decir, fa oonfonnacin de menor energla (termodint\rn.c<~mcnte, la mAs e-:staf:)le). Mucha& protei~$ st !)legan a tr8'Ys de eslados globtAares interrnecios. conociesos oomo de ~gl6bulo fundido" (moNM ~) . estru~uras COf'I'ClGCias aunque mas abienas y ftexibles que la col'lformciQn ntttivt~ , c:on una esuucrura se<:un<i<lrial ocmsidert'ble, mas o menos slmllaf a la de aqulla, pero que carooen t~tn do su estructuta tetclarla oel!nlda. las cadenas lat.-aln de los at'l\l"'ocidos en el glbulo fundido no 1\an e:stablocido aUn sus il'lletllociones muruas, pro$0r'lU.n libertad oe mo~m1en10 e h eracc:in oon el disolvcnto, osmalmente 1&s hidrotOblc:as. Este primer asl oorno un plogamiel'lto seria oomo el ~esque191o &Obre $1 que $0 c:tl<"bon~ria la estructura ltldlmen&iOn&l deflnltlYa, pliegue en panes~ e la 4:1$b'Uelurit firwl El pmcipio b&sioo del p&egarriento, en su conjunto. es la presencia de resldOO$ hidrofbi(X)$ de l<l c:&el'l<'l en ul\ ambeenle acuoso altamfntt pelar: el efecto hidrofbico. el mi&mO que Oeterminit &a t'SOCialciOI'I oe los l!pido$ el\ las membranas celulares, O$ lt' prinopetluente de estabilidad de la oonformaci6n Pie93d<'l de una proleil'l&.
24.4.2
Protei nas implicadas en el plegamiento: carabinas molecular es
los oollpptidos en es~dO de glf)ulo fundido. 106 plegados oarciaf o inoorrectamente y e:sl)f)~lmenle aqullos que ~Un ~tl\ saletldo del tilosoma {cadena$ NJoCionlot) exponer\ en su superllcte residu06 hidro'bicos que en la ()f'()telna nallva estar&n siempre dispuestos en el norior de la molcula ("escondidos' o enterrados por la 91\YOitura do residuos hkrofilloos que torma la 11uporficie de la proceina). Estas regiol\es hidrofbicas. !*it evil;;ar 1<1 in~oein con et medio acuoso DOlar. tienden a a&Ociars.e entre si, conduciendo a &a fotlnacin de agregados dtt V'ari3s m()lCIAM {().le en
fontll>IC~:l
inrom:C1am~1uc
lu c11rabin.u ptUtcgco 1 pui1~pttlo). dfludole ll('rnp<l p(lra 'I\M: 9C pl~e
(plepmknt correcto.
ronnanativa
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ronklnnacan nalwa
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eoerglK<'mC:IIIC ms c:st<lbl(:)
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f<tMn
PLEGAMIENTO DE PROTEINAS
339
algunos casos consdwyen tos llamados cuerpos de nctu&ln"). El plegamiento corre~o. por tanto, requiere uM ptOiecclbn frente a es:la posibilidad, hasta que la l)t'Oteln~ teng~ la ocasin de encontrar su confotm~(:itl MbV3, 1~ ms. estable; este e& uno de 10& papeles de las carabinas molecu lares.
24.4.2.1 Tipos de carabinas

Las ptWneras ptotelnas ldentiflcact.as oomo aocesorias. auxllares o catalizadoras oet plegamiento se oam&ton protelna-s d e choque trmico (Hsp, por he8l. ShOCk prorein), porque su slntesls se e~lmula al SOf'l'le>ter o11.11as en cu!6vo a una elevacin temporal de la temperan.a. Esto es asl porque en esas condiciones aumenta la canl!dad <Je molculas parcialmente desplegada$, Ql.Mt es 1'1ee$$ario replegar. Actualmerue. el grupo de Cilrabinas Incluye otras muchas proteinas. no relacionadas enlre si. imoortames para la viabiliclad celular a todas las temperaturas y bajo !Odas &a:s Ortunst&nc::ias De .-cuen:So con su modo do 3Ciu<lci6n, se pueden disllngw dos grande$ grupos de carabinas
molecui<UO!S
a) Carabinas do/tipo Hsp70

Esta lamma (CU)'O nombre procede de su masa molecular de 70 t~Da) oomprenae protetnas que se asoc..&f\ a s&gmel'ltos peptldlcos oonos.. en conformacin eJttel'ldda o desllegada y riCOs M amino&cldos hidrol6bieo&. Pot ello, ceoonocen las cadenas polipeptidicas naaentes segn estn saliendo del rilosoma. Su aocl6n ptinc:c>al es ev.tar que se agceguen por r.teracaones l'lktofblca& lntetmotecutares (reoordando la metalora oe la senorlta). Existen carabinas de esta familia en procariotas. eucanocas. mitooondnas. ckltoplastos y en el intenor del retfculo endoplsmioo. Su unin y separacin, reversibles. con la prolelna desplegada dependen de la hidrlisis de ATP pot parle de una ae1iVtdad ATPasa propia de la H $070 Es1os prooe&O$ estn a menudo roodulado& pot otro tipo de proteinas. la familia Hsp40, con e<tP<I!CidM de activttttore:s 00 13 H$p70 (oo-C<Wabinas) y tambin de carabinas molecares por 5i mismas
d H ~!"~:""~;o,, ..,. ~~. II'UIII I~~
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Jllo:..ll)rj,p
las carallirlas HSp70 estabilital'l, por t31'1to , tas c:eden<'ls potipcptidicas naetenles. proteglnoofas aeta agregaCin, S<~Pr<icin proporaonan un entorno seguro para que ta proteint'l pued3 plegarSe ac:secuadamMte. Sin embargo. no contribuyen a deflrw el plegamrento. que soto depende de la secuencia oet pollpptido.
y mediaMe tos CiC*:>$ oontr(ll;l(:k)$ dtt l.n6n y
b) carabinas del tipo Hsp6Q

Estas prol.ei~$ rom\30 un<'l tt&trvclura multJmrica muy caracterlstlca, en fonna de caja CilMrlle31. en cvyo mtcrior se a~o;an tos potipeptidOS y <'Ondt experimentan !SU ples)amiento, aislados del entorno y de nuevo evlla~ 13 ~er3CCI6n con ovas molculas de>sptegacia'S o parci3!mente J)legnd3$ El ejomplo mejor oonoado esta ptotelna GroEL ne E. C()li, cuya estnJctura se ha determhaoo por criStaiOgtafla de ta)'()S X a 811<'1 reSOlucin Con la colaboracin de GroES. Jl'O(elna de la familia Hsp10, dfige el (lfe93Mietl'O del poliptl)tidO. Si &$~no &e pliega completamente en un CiClO, puede volver a entrar en la callidad para contil'lu::tr p~eganoose. hasta tlle:tnUM' 13 e$lructura naliva.
34,,-: 0__
MOOIF ICACtONES POSTRAOUCCIONALES:
GroESUbpiO)
1~ubu~
de IIH:Oo
1 \DI'
GtoEL (Hsp60)
! ~~~il lo.W. l cad.l lolll) .:. . "' Mllounl~ de 6() lJ.);,
1
" 1 '
7 \ rP -~A~ L_ _ _ _ _ __: 1_:P_

U vni6116c: An ~&1 eJ~mboqe
((IU(QfRUCiolllllften h .mtll llf'ir.M, doo& oc unen OroES 1 ~1 p~lbpiJIIW Su.tfiiJj) ryt;S
mtdtnlll<-t~ 6t u.uion o; ho o.b'Ololg dt 1\11' Jlllt p!lf11! ck hu: lut..id~ dt
Fl flltpl'nMio tmnl"une
...,.,., a!lll.14od:' ~" tW la.:ujil, otma~ldu 11M u n rompll!rtllllnllu hidro.llilbi<o
(fto ll,
Se han
GflQOn~ h(lm()(o:)gOS del sistema CtoeL-GtoES en I'Tftocoodrias
y CIOf'Oplastos, y proteinas mono&
estrechamente ref<lcion,'ld{IS on et l'!i!OSOI eucaAOCico.
24,4,2,2 Funci n de las carabinas

Uts cart'bnt"tS mole<:ulares deosempenan un papel esencial et1 vari;)& tirounsiMQ.1S: En ol ci~l ~t!lulf, dao& la gran den6idad de orl)lnlos y macromolc:\la$, Ita W!ricd<ad y eilwOOa eoneent.racl6n de ptdeinas 9111 I)(O$$t\1e$ t1\ tase de plegamiento au~a la probabilidad de inten'lociOOO$ ~bicas '/ de agregaciOn dl~s protei.n.ns, ~. oomo se ha comentado. es avit<Kia por las car<~binas en '"" mil(l((lndria y el c:loropi;tsto lntvlenen en el ~tlrOC'I'O ne;ee$ario para el ttatioo de pro~efnas de origen cilOS611Co a travs de las membtan;:~s oldorna <! nl~rna aet otg&ntAo, M oomo en el pSegamiento en 5111nWtof, par.J adQulnr ~u fu!'lcionalidad En ol lumen d.,& RE ifltracoonan eon las protenas p~ inc;arn;,ct;,rnr.nte (o l:.s proteiM!. dimflcas o mulbn'l6rk0s no ertSambladas de forma aOOcuada), con 10 que ~tas quedan retenidas en et RE hasta que tiene IUQtW t!l plegamlemo eotroc~o. Slo enlonces (al lg~ que 1$$ proteltlaS ~ pleg9das desele el pnncipio) se tra,,sponan en \'eslculas hacia el (;(lmpltlo ~ Go9. En c:aso conltarlo, las proternas no plegadas tioon degrod.,d<'!&-.
24,5 DEGRADACIN DE LAS PROTENAS

En l)arNIIetO con el desernpeno de &u funon, l;.as proi.Cinas se degradan cons.tante~e en la clula E&te pr001it$0 continuo. \lNOO a'<! bic)llm"'!ds, ~n!lliluye ell8tflado recambio PfOteloco (fltl ingSk. twn(W41") . que tiene lugat a b largo de toda fa W:la cdull)t y t!S necesario para mantener eo lodo momento un nlv<ll adl!euado de pt"Oteinas (estado ost<1CJOnOriO). nfJSpeo!\'SaDie para la acwidad celular, il(lrtt i~ir kl acumulacin de protelnas anormales o no n~ y pam Jacll!lar ei recidado de los amii'IO&cidO$ oe foima genc'lca, se puede door Q~Mt en una ~ una prole-in;, ' sobrevive- en promediO uoos dos dlas anlCis de sei Ol!gradada, lo que da idea de la groo aelividad do IC)I prQQO$Qs dt biosJnle~ y de degradacin E.ltlsten protelnas que l!IJ sarneti;fM y degradan (se recambian) de forma muy rilpidtt rt:Spe<:IO a aa vida media de la oU a donde se enC\ICnlr.ln Entte ellas se encoen1mn las protefnas do~~. por ejemplo poc haber inootpOtado amfiOcldos incorrOQos en la sil'llest!l, las que no desempet\an <;Orr~enl.e !N !Uncin, a \'eces un simple cambio quimioo COI'v,erto l) una prolelna en b!anco de una accin prot.eolitica. Por el conttario, otras protelnas. la& nooos:.ri3S en todo momen1.0. $Otl muy es.!ables y pcx ello no requieren una sintesis continua a elevada veloc:icJcld Asi ocuue. por c:jelm~. con la ~na. qua puedo <lt.~mr lodO el tiempo de vida media del eritrocito (120 ditt$ on hunw\0&). En eucariotas axisron <Sos !listerMs prinCipales de degradaQOO de las P'Q4CiM$. uno me<~iante los IISosomas y et OltO en el CMO&OI
OEGRADACION DE LAS PROTEfNAS
341
24.5.1 Degradacin lisosmica

EJ pl'imet SiSiel'l\8 de degradeeiOt! GeSCtl~ se realiza eo !os lisosoma& l!bemOo9 lnleialmeflte poi' ge~OO'On a paru1 del complejo de Golgl (lisosome& prlmano&} y que despus reciben enzimas hiclro!lt1C8S mediante YeS!culas procedentes tamblen del GoiQI. Estos etgnulos delimlta<bs por una membrana &efl(;illcl aet.mulal'l mas tie 50 enzimas htdrol bcas de tooo ttpo, capate$ de atWll $Ol)(e p10tei~, iu::idoo nvcl$ieos lfpido$, en~~ gtic;O!Iticas. etc , oon una gran acbvldad al pH ~ido c:aracto:sb<:o del ~o$()(n3 fa!rcdedor de 5) 1..3$ om:imti:S li3C)$0tni'lle!l Q\lt l'ndrohun protcinas ~orotoasas)
SEt denomMn c.-te~psi n.n
las envmas hidroli6c&li ~ntreU.S P'.WI'IIos en IO$Ii$0$0111liS ~n de Wldt~ Upo d9 Ulula. como ejemplo las of!lutas pan!l'fMtlcas coobenen l~&osomas con en.rimas capaces de ~nteNenir en las .sigulfmte& rulas e degradaCin Para la WCOCdOSIS, o lranlijlOfte de su oonteni.do ennmllc:o al ex!enor de la c:etula isecreclbn} P<~ra ta fagOQ((Isi$ o tormacin de liSO$Orna$ ftlgiCO:S Oilri'l igoorir ~r,IIO$ Pi.tr;J dStruir v~euoltu fZtgoetbC3$ con nu~t~entes $upet1icit ctlul<"tr En oca~. pal'a (()rllper inttacelu!arme;~te k>S li~~$ y libel(lr $1JS tol'l11M3S, cooduoendo 8 la :'MhSIS ~ .. Olula (una de l:ts tonnas ce muerte celular programada. que lnteNiene por eempto en el desartolo embrionafiO)
<le'"
24.5.2 Degradacin citoslica

U. m;1yo,-la 00 las prolelnas presentes en to1ma b!}te en el dtosol se pueden degradar por esta ruta El proceso es rruv selectivo, est bafo un e&triao centro' y es la ruta de degradacin que requ1ere mayor Qi~Sto de ATP Al gua! Ql>e
en et ttftCO da protenas. inlervtenen como mediadores en la degradaon seales ()O('ICtetamente af'I'W)Ocidos Nlemw!ales y la protelna ublqultll\8...
molecult~res
esoeciales
24.5.2.1 Ubiquitina
1..'1 \lbQ!Jitintt es un.'\ protem~ PJueM -<!e 76 ~minoll~idO$ ltolffl;)c,t asl por ~ontr,tl~ ef'l ~ 1~$ ~~lul<l$ {e:s ubicua) Es poslblemenle una de bl$ proteinas m~s consef'ladas entte ~pec,es fl8:s de te-vfjuf'3 y humanos 96k> se diferencian en lfes anwlOc.ctos). De carcw globuW, tigida y muy estable, lnteMene eo'OO marcadOr ~wo de la degradacin de otras {)roteinas, at unirse ccwalentememe a euas. de forma qoo las protelnas ubiq(l{tJn.<KJas quedafl di~:puescas oora ser digeridas por los !i4temas. proteoilboos. La ubiqulti nacln. ubiquitlllilacl6n o uflol6n tt fa ubiQU!IH1a a c~r protelna de~Mda e la deslruocon se realiza en un ptoceso ckt tre$ reacciCwtEI$. catalizada:s por 3 enzimas diferentes
eu~as
r:3 \lne laubiquiri n11

rruh."!IU q~K M:
debe degrlbl
protcina diana. a.~n\C~dc

un ~tdaml.~ dci101 11
Ci!lbda p)ll' 1:211 Ju
ubiquilinll
f\1~ ~m r:nboc Ul)\>1~oor <Qirr ,; Gly C~I.. 'TIIlUI.U
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la himaubiquitina unida 111 proc.::inu ii<.ld..:n ' '"' cudcn11 de
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El enl8c:e amida de la ubiquilit~a con l:t ptotqif'l<\ (113m<~tf0 i&opeplfdico porque no llene lugar con el am.no " su'll) oon el e <le la cadena '<ltal de lyt constituye L<t set~at fJIIIffl 1~ <.fe11t~ociQn, el marcaje parCJ la .woteol!sltf (se te ha ll~mao el ber:so de la muerte"). e&.peeialmente coando My mu!llublquitiMOiOn (ha$13 20 lflQiOI.A. 1Sdo ubiqurtina untdas en cadena a un~t ~ de prolei~)
342
MOOIFICACI<mES POSTRAOUCCIONALES;
24.5.2.2 Seales desencadenantes de la ubiquitinacln

a) Residuo amino-tetmfttal
U lc:Sentidad del amno&c:IOO Nlerminal pareoe delemnar que una protelna reSIJite 11\iWCa!Sa con Ublqultlna con map o menor tacllldad. Rewrdese que en eucano1as est& resdoo resulla de la eli"*""cl6n de Me! y de cualquier otro proceso de mao.w-ado de dlctlo exuemo; las setlales aOW'IotecmirWes parecen 1\aberse conservado durante miles de mtllone$ de anos en la evolocln.
amino..\r.ido en !)O!.io<lf N tecm~V~I grupo 1: basicos Arg, L):$ Hi:s gruPO 11 hidrol6bioos v~Jn'llntll$0$.. l..bo,lle, Trp, Phe, Tyr grupo lll: netJ:roS: Gly, Ala, Val, Ser, Thr. Cys1 Mcl. Pro
Wla media de la protelna

Prolongada
Prolof!g.ada
eo""
b) Secuencias PEST
Por O(rt~ parte. ltlmbi6n ~ 3S()(.IB una vida media OMa con ta presencia en la protelna de regiones de 12 a 60 amnocidO$, rlc<'ls en Pro, Gl1.1, ser y Thr {P, E, S, T, eon aa abrevlann de una lerta._ E.sw teglones acwarian a modo de esqo.ema de rec::onoc.:imiento par:. lot Sistemas en211'n:\llc:os que degradan las proteM\as de vida cona.
24.5.2.3 Proteasas responsables de la degradacin

La proteoliS~S de l{t$. ptQI#J nas marcadas con ubiqulbna puede ser responsabilidad da disbnlos mle~"na& da prOtM$.3$ se h&n de!ICri'lo ealparnas, proteasaa. QIJe reQUieren calcio para su aauacin, pero d sisWm<a mt'l$ import,ow)to es probl)blemenlcl et del proteasoma Se "~ denominado ptoteasoma a un gran complejo proteic:o (2000 ~O;aJ quo ttp<troec en tnuehM Clulas eueat!Oueas, lonnado por dlstlmas wbu.nldade& PfQieollb$ El oon)unto, prot..1$oma 265 o cOMplejO ptotelnasa mutueatalUco, eonbene d06 comPQC'8fltes a&OdadOIS entre $ i Un compooente central o protea&om<J lOS. fofmOOo por 28 $t.buni<J;t~det en uM d$posb6n clllnclrica, que es el ndeo catalltiCO responsable de la proteoli&is MC~a1. oon r.tleraOIOtl de fragmen1os peptldloos y de ta9 unidades de ubicplina int<tCI3$ J)flffl su fetltllizaCIII- (En cierto modo, recuerda a ia estructtKa de las caraobi!\a$
Hsp60 ) Uno o do&- CQml)C)netnt.es latetaleS, eompt&jo 195, oon acciVIdad ATPasa y capaciOad de re()QI)Q(;Or o*PO(:if<:4ltnente los conjugados protelna-pollubilquilina.
1~ l'tiOOMCC b
ru:ina ~
.,,..._ <
coo llbtqUnna. 1 ~ne illdtvidad.
rrotdna
Wl:t!fii.:J'O :grllu.k u 1% 17-Zfl iiAIIPIIdlldo.:!l p.Ji rpo.:phc btb dtl'c't<nt.. 'S, ( de ~lh' oon CAp.xldad
o !I(INJ'llllbo,a )' do.'>iruamralba b
Jl(llmbiqu .unada
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j'lf(ll taW!I\& :!OS
1 ~tnil)r~~t fumud~ l"f 7

~li!UIIid:ub fl!'lifli.'Jlllthclh (:$(111 \ II)ICI
~ '\1 J:..,
...
~ \ 7dol1f' 1~
Tema 25
Bases moleculares de la mutacin y la reparacin del DNA

25.1 Conc41pto de mvtad n .....
N . . . .. . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
l44
344
25.2 Clitslfic:aciOn de l as mu1aeiones ................................................................................................................... 25 ..3 Tipo de c:6tula que s utte la mutaeiOn .........................................................................- ................................ 25 3.1 MulbeiOn en o&ll.lla9 de la linea genn~ ........................................................................... 25.3.2 Mutacin en clUlas somtlcas ...... _, _ ,_ ,_,_,_,_, .... ------- -
344
344
34~
25.4 Mutaciones a pequet'la escala o puntuales...................................~~ ............................~............................ 346 25.4.1 Camblos en la secuenCia del ONA ................................................................................,., _ ,_ ,_,_, ...... 347
25.4 .1.1 SustituCIn ............................................... .. . . . . . . . . . . . ......... 347 a) T ran9CIOtM!'S ............... _,.,_ ................... _,.-- ........ ------ -----.. .. . . ..... _ , --------.. . 34 7 .. . . . . . . . .... 347 b) Transversiones ............. ....... . . . . . . . . . 254.1.2 Oelean. ptda o olinw~aci6n 348 25.4 t .3 lnsereiOn ----.,_ ,_, ...... ,.,_,_ ,_ ,_ ,_ ,_ .................,_ ,_ ........... -----, _ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ........... -------... . . . 348 25.4.2 E1eclo sobre la secuencia de la proteina &lntellz.ada . ........................................... . . ............. 348 25.4 .2. 1 Mutaciones silencio&as ......................... -- ...--........ _, ------ -----. . .. _, _, _ , -------.. . .. 348 25.4 .2 .2 Mutaciones no silenoosas. . . .... .. .. .. .. .. . . . . . .. . . .. . . . . . . . . . ... .. . . .. . . . . . . . . . . . 349 01) Mut.-cio""" Que tlll~:rttn el $Cnlido --- . . . . -- -- 349 b) Mut:W:Iol'le$ que caml)isn el maroo de lectura ......... --- ------ . --------- 350 e) MutaciOnes que no canUarl el mateo... ........................ . ................................... 351 d) Mutaciones oon tennlnacion prem!Wura de la ptOielna _, ........................... ,_,_,,, .. 351 e) Mutaciones oon tenninacin retrasada . . .... . . .. ..... . . . . . . . . . . . ..... . . . . . . . .. .. . .. 352 25 ..5 Causas y mecanismos baslcos de las mutaciones .................................................................................... 352 25.5.1 Mutaciones endgenas .................. . ........................ ................ . . . . .. . . . ... . ............ . . . . . . . . . 352 25.5. 1.1 IncorporaCin de nudetldos errneosdlltanle la tepflcecion ...................... _ ,_,_ ,_,_,_,,, ... 352 25.5.1.2 Otras rrMJtaciones espontneas ................................................................ 353 ~) Sustituciones POt desanw1aci6n oliJdativil _,. , , , , -------- ~ b) PerCikJa oe bases por inestaDIIICiad quimk:a del f!fllaoe Ng!icosidioo ....., _ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_,_,, 364 e) ModifiCaCin de 189 base-9 pot mutilgenos enoogenos................................... 354 25.5.2 Mutaciones induCidas o axgenas.. mutagrnesis .................................. - ..................... , _ ,_ ,_ , _,,, ... 354 25.5 2 1 Lesiones o mutacioAC$ nduciOM S)Qt ~e~~ QV;irruoo11 , ... ,_, . , . . 364 25.5,2 2 Lesiones y mutnDOnes inducidns por <tgenles fi$100$ ,_, --- ... 356 25.6 Reparacin del DNA ......... - .........................................................................................- ................................ 3S6 25.6 .1 Elimin:w:ln de aget'ltes ml.llgenos ........................... ---- -- . . 357 25.6 .2 RevetSin dlrecia de ta tesl(ln -----............................ . . 357 25.6.2. 1 Reparacin de lotocli meros .................. . .... .............. . ... -- 3 57 25.6 ,2 2 Re~iOn de btliSCS mcxlif~dtls con~ i!IQuilo _, 357 25.6 .3 Repat:w:in pot ~d&iOn .................................., _ ,_ ,_ , _,, .... _,_,_,_,,, 358 25.6.3.1 Mecanismo gene1s1 ae reparaeiOfl por escision de nucleolidos . 359 25 6.3 2 Mecani$ITIOS especffioos de reparocl6n por eSGI~ oe basas ... ,.. ,._,_, , _ ,_,_,_,, ,_, 360 25 6 4 Reparacin de ,p,~~eaf'T11l8tltot; 1r1oorrectos ........................................................... 362 25.7 Enfermodade$ h um.11n35 ;~s-oci<lda& a la reparacin ..............~............... ~................................................... 3-63
344
BASES MOLECULARES DE LA MUTACtH Y LA REPA.RACIN DEL ONA
25.1
CONCEPTO OE MUTACIN
Clsicamente. se dMlnc 1<1 mutacin oomo una atleracin en &a secuencia del ONA de un indi'l1duo ~ se tr<'l!'l$11Mc par hete:n<;ia "' $1.1$ dO$COndiontos. Loa formO' inalto~t' del ONA.. ll<'!m..OO tipo S<Jfvaj$ o~ (en logls.. wird IYJ)t).. se c:::otWierte asi en 01ra fOrma. pc:lt\M()ra Cle tal n~u*i6n o tiPO mutlltlM. t.as mutac:iQno$" prodvcon POf Off'QrO$ en la tepllcacl6n. por la aiteracl6n esporWiea de ru::te6tido9 o debido ata aocl6n e agenleo9 fl9ioos o <J.!iMieos (mut.tgenos), pero r~Jnea oomo eonsecuencaa de la reoombinaeln mei61iea entre cromosomas hom01og08 (pg. 106).
El carcter l)efaditiwio inclt.so en la OOfirjcin $\4lQne que la rrMaein debe presentar&e do modo estable en las
bien. OliO no 011 cstriettwnontc <t$1 AI.Jnquo <:On frocuonc:ia &e a"'me que ta rrMacin &lo c;:()n'e$I>Oflde a socuenciM oodifleat~.e~ {gctles), siendO las ~!lert~cioncts en los producto$ ~ (genefillmollle protelnas} 1M '"l)(ln5able:5 de 1M et~tern~e<:~acses Mre<liUJM$, el eonoep1o de muloci6n es llOY df.ai ms arrPo Us mul8ci00e$ ticnon ligar en 10<10 el ~om&. inth Jyendo las seouencias COdifie<tntos o no. del gonoma nvcloilr o mil~. en chJIM getmii'\8Ae$ (llercd3ble) o ~icos (no horodt~ble:). Por t(lnto, 1{1 mut4'lci0on cs. ;unto oon la
Q{:tui<JS gonn~ . Ah0r<1
raoombir\;lein mcilica (p.ig 106), ta prin~l fuen$0 de v<Niabilidod 9CIW)tica en lodo liPO de organismos. y sv os:tudio tiene inter6s btiSieo y aptieado 1)01 su rei9Cin con I)'OC(ISOS ~rontcmenee tan alejadas eorno la CYOIUCiOn Cle las espoeieS, la idel'lllead g&ntlca de un i'ldlvlct..IO. Ias aheracaones pa1016gic:as de su g&nOma tesponsallles e enlermedaoes, el dlagn6slk:o prenaW o el trMamieniO de enfetmedades somllcas (por ~. el ci'lnoer) o de ctulas germinales. Aunque rruchas mutaCIOfl% se generan al azar, y existe la mbma su&oeptibiicJOO dlt mutacin en toOa& t.as regiones del genomt'l, las QL.e ocun cn &Obro el ONA coctlfle<~nte (3% <101 eotttl) tienon peores eonsecuenetas. DenltO Cle esttt mutaciOn gitnica se ei)O distinguir ontrc la de la regin del gen diroettwnenle responsable Cle la in!on'nacin (fe910.1) estfiJCtul'al), qua altera al RNA o la protelna sintetizados, y la que ocure en las &eeueneias no oodilicantesdel gen lmpllC8Cias en el oonttol de la expresin (regW:in lllgUf8dolcJ). que no a!tefa la prololna $lno "' slrl4e&i$ (aumenk:l o descenso en <:Onoentracln).
25.2 CLASIFICACIN DE LAS MUTACIONES

OOOa la variedM de tae1ores implicados. e:~tislen ~ plal'lteam1enl08 para c:tasifical las mutaciones. Se estOOI<N'c\n bajo tres Criterios: lipa de clula (germinal o 90mUca), magnlbJd de la ITIIJ&acln (pequel\a, mediana o granoe) y Mee&f'ldn'C)S causante!'. de la mutaOn..
' , 1 1 { S G.:mlinal 1" lp()v..tU .. omau<:a
Grandes mutaciones o anomalias c:r..'lf'llMmicss

Mut:l(:iones mcdia.n3s': ett r.ecueflcia.'l re>CCidas
Lo
....
.,
,._kcanismo
Mutaciones poqudlas o punluoles
Oesami.l\i'ICR OXid:.lli\'0'1 de base$ (cspontancas o fortu1 1a:s) ) l n~abi l id:xl qufmic:t NvlicosdH;(l
\ Mutg_enos clldgmos
Acein dir.."Cta Agcnlcs qumicos
\1ut~iones c.xso.onss
MUIII<.'~OC$ ....OOg<t!,O\S
rron.'$ m lo ~pli(;II(Jn
Alquilantcs
lntc:rcalantc:s bi runcionales
(indoc1das por mutot,oenos)
A3tntcs fit<kos
Radi~~~:in UV { R.ttd i;t~;.iOnes ionit.:mtcs
25.3 TIPO DE CLULA QUE SUFRE LA MUTACIN 25.3.1 Mutacin en clulas de la lnea germinal
Se origina en algur\a <kt las <ivisiOnes tnil~ie8s o meitlces de la gal'n9$0Qnesi& {pgs. 102103), a p(lrtir de o6fulil$ progcnitor..s cf!ploidos Clo laS got\aelas. La mutacin puede no ~fluir en el fonoliPO do ti! clul;, o indi'I..O quo 18 $1.lfro. ni M 1 :. cop:.c:ctaCI r~uetora de ele, pero, puesto que el genomiJ se tr.1nsmile "lil do$()1Jf1(1oncict, la mutnoi6n se hereda, IJansmlclndOM a todas In dluln del orgarus:n~o hijO y generando. en su caso, la alleracln o enfetmedad
TIPO DE CLULA QUE SUFRE LA MUTACIN
345
hereditaria. Obviamenle, esa tran&rri$in Clopet'l(lc etc Que en U IOCUno::JaOI'I participe un game!O pottadof de la mJtaan. A su ~z. las clulas germinales del hijo tambi9n la oosoorn (al igual que lodas sos Clulas som~liCM). por lO que se volver a transmitir a la &iguiente98f!Cr<'ICJn en ~nseoue-nti~. la rnui&Cin se ~mp011a como una variaCin heredable, que estaril sujeta <tia &el9cl;i6n nttlur<'!l; se l)uecle deeir que son la mareri8 prima para los cambios evolt.tlivos.
La irl'l!X)ft)nci<'l dct C$I<'IS mu~iOne-:s df!S:let'lde olrectarn&nle ae cul sea la lunclon a!eccada: si esta es esenCial, se originan orgni$m()S .wit'ble$ ('f>Ortos tempranos, a veces no deleelados), mientras que SI la funcin no es esencial, pero si mi)Of'lt'nte, se ongitltl una enletmeci9CI oongnlta o herdarla, o una sobnormalidad. Sin embargo, no debe otviCI.-1'$0 q~,~e 3tgun01s mutaCiones resunan bef'lelleio6811 y son la base ele la evolucin. Las mutaciones en la linea germinal son habltuatmente acontecimientos espordicos. minoritariO$ y rolativamen1e inlrecuentes en la poblacin humana. Su laS<l" de W\01& 10.o muto:~cione$ 1'01' IOOUS y cliv.sin Celulll!. A este re-specto, se puede calcular el nmero de mu\ilciQI'I(lS que !i~ncn IU!Pf dun:tnte tas Olvis.ones milticas y rr.eiOIIcas de la espermatogones.s. En la tormaan <le 1.m csperl'l'l<UOtoidc humNIO tp&teOen a!1eoedor e 100 mutaoones detlilctas a errcwes en la replicaQ6n, lo que. lenicndo en cuenta ti t3m<'ll\o de su ger'loma haplolde. supor'le una mutaclfl por cada 33 Mb. La mayorla de ellas 11011 reoesfvas o por el txlf'ltr3o U.n -.t'tes Que no son fenotipieat'l'lef\le evidentes. pues no alcanzan la conoepcibn o el naci~TNt~nto Oc t~hi que lt' 1~$<1 de mutaCiones de la linea germinal oon conseeuet~cias Pil~l9C<'S set~ muy poQI.M!i\~
25.3.2
Mutacin en clulas somticas
A <iferencia de las antGOOf"O$. 1M mul3c:i0nos $0tl'~Mie~s (el'! ~lulas no r~uecort'S) slo se transmllen a l8S G61ult's tlijM (en 1;<t meosis), y t10 a un etgarwno COI'Ilple!O. Pueden alectar a CualQuiera ae tos 46 cromosomas de cualquier tlula ~i~. (lipiOi<Jt, en cualquier rgano. tepc~o o Ch.Ra a.stada, durante el desartQIIo ptecoz o f.nal del org;ani$mo. o en su t~e <'1Ciu!l3 Estas mutaciones determinan laS e&raclet'sucas normales o patOlgicas del Individuo. pelO los tarntloOs nunca SO r'l her~ab6H. ~as $0n mut~iones mayOtltaas potque las ce-lulas somMicas son las que mas se davlden 4LW!as 1013 OlviSiotles et~ nu~nos cle'ScJe el 0190to hasta el lr'dvlduo adulto). La wa de muteCIOn. Ge' orden de 10 por pb y di'Vi&IOn oekllar, es infer101 a la de olulas geri'IW\illes. Sin embargo, se iru:;:remonta OOt'I'IO oonsecuencial de la exposiOOn a agen~es mutgenos (algunos de ellos CilflCerigenos). de 1<1 edad y de la ~~~racin de 10$ ni(IC;)rli$1l10$ de rfX><Wt~Ci6n del ONA, llegando a p!O\'otar miles cl8 nuevM mulaciooe$ durante la vid<~ de vn adulto pr;\diC<~mome et'l ca<'l 15ioin y en CI.ICIIQuier PMC del orgonismo en el
oenoma
El rndividuo portador de una mutaCin somitica QUe se h3 pr~l( <Se:Spus del ~ pero vntes de <'IIC3nzar su dcs.anollo ~. puede ~nsidert'rSe un 1110$"ico, t6rmino gel'ltieo que defitle la prosenoa de dos o m~s !inens cetul3rCs gerlol:tic:tmetlle diStinla$ Cletivadas oe un miSmo cigoto. A lf&vs de la n~itos.s. las Clulas somtiCas oe1 incJNICiuo ao..eo Qertel\eCf!r&n a dos lineas o clones. ta prop;a o norma~ y 1a anm8l8 def'lvaca de la clula que SU1rio 1a mutaciOn. Los iM~Viduos oon una rplica fiel y ~a oe ambos bpOS de clulas. muesttan lt'IOS8lC'ismo somhco. Este fenomeno se puede observar. por eje~. en clertM trasaornos citogendcos oon alteracin en el rnero oe cromosomas (pag 406), como la !Momia 21. Loglcamente, Cl.18nto ms temprano llene lugar la mutacin en el <tesarrollo del organismo, mayot sera la abundancia de cltAas de la linea anOtnala sobre las de l8 llr'lea notmal.
mut~;w)n
St.mliltela l:a rdi:o

el o~anis.rl'h) OOI'Irpkt() ti~.: una gran pr~>pordn de \'Ciula~
por.;..lllf'U' <k l.;a ntu\11~1.-ln
.:-1 fg;l.ll ismu cvmplt-11) 11\"nt"
p~Xas
\dul;lo pnn...s. r;b do. rm.l.l 1\ln
346
BASES MOLECULARES DE LA MUTACtN Y LA REPARACIH OE1. ONA
Las mul8cl0~ que seat\ compali:lles eot1 a vicia de ea ~lt.Ca t)Ueelen, sin e~rgo, afectar <'t tu cocirnietlto. Et efecto de ta mutacin soete la dtlula somttca depenoe en pet1e de su COf'J'C)81lbllldacJ con el dCIG oe dMSiOn celular, pues la clula afectada se dlv\de aCiivamente y conducir a la ptOiiteracln de la ITWJiecin, pudiendo ocaSblar probiema& cllnioos. At;l ocurre, por ejefll,llo, en proce&06 dtt etwejecimiento celular y transtormadn neoplsica. El cncer &e inicia por la mAacin de genes qa.e <:Ontrolan la divi5in celular ( tema 30).
25.4 MUTACIONES A PEQUEA ESCALA O PUNTUALES

El est\dO de las mJ.tadones en f\.tnciOO de su magnllud, lOngitud o grado de ta lelliOn per!TM(e cla~lcarlas en pequetla y gran escala {y. a veces. f'I"'ICCiana)- Las anomallas a gran escala ocurren por duplicaciones, prdidas o reagrupemletdos que alteran una regln de millones de pares de be&e& y &e rel\eran en la estructura del Ct'Ofi'IOSOma. Se laman tamb1n muuu;lones cromosmic," o volvmino&,a;&, Sv e$1\KfiO $C re&ei'Va pare el tema 29. como anomalias
crom0$0mic:N En 6s.tc nos timit<trcmos as mutaciones a pequel\a escala.

L$ m uto~.ciOM.s a ~uef\a escala, uncillas, pun tuales, mini rnas o mieromodificadones, implican nQfl'n31monto <' vn $010 tiUCielidO ( y, Ct.111" consecuer.cla, a su ()()tl'lplementario en la otra nebra del DNA). Sin embargo, t<tmf>l6n $0 in~en aqul ~las otras leSiones a pequel\8 o mediana escala que a~ a vatios pb. Nuestro estlldlo ptetei'IOe cubrir. esenCialmente. los tipos de l'h..llaein punlual en cuan&o a ta modificacin en ta secuencia del ONA. como punlo ce pankla para su hfluencla soble ta 8$ltUaura y func:l6n proteicas, Clases y tipos de mutaciones puntuales y medianas, y su grado de tnddencla
Clase
Sostituci6ro
Tipo
- ...
lncidenda
npo de ml.lltteln oompnllvament.e OOfi'l en ONA codd\canle y no

Ms oomunes ltls lrt'M:iciotles que las trans~, SOilr'e lr::XIo en DNA
mitOct.II'IOiial Las slntirna6 son muCho ms oomunes que las no snnimas en ONA ~: las oonservadoras son ms OOfl1l6le$ q,e l<t& no
1nr~
"""""'-.. exceptO en dertDs IOd tepetldos en tt.ooem o repelldones

9U1*18S Muy comn en ONA no codific;ne pero infrecueMe en ONA oodificante
Expall&itlnc$
repetid<'!$ <)e tr(IIOICS
lnfreeuenet. !)erO puo(le c:ontriluir a vatiOs ttaSICW'I"'I$,. especcalmen~

neuroiOgicO$ lni'TecueoMe: pn:x).toe OC<II$ional~ ~~en lil~ e i1"1Ser016n oe Etlet'l'letoiCS transponlble8 Muy OClfi'1 en ONA no cocliflcante pero infrecuente en ONA coclit'ic:<lnW
......
e,~eistenle .
EJmn3CiOn o De \.W'IO o unos pocos
~~~~~~~c----c~---c-----------c----~~~~~~~~~~~~Gr<:WKIOS dQioeiones lnfr6cuetlle, ocurre a merudo en reglones que contienen repeticiones en

18ndem o entre repeticiones di:sper$a$
Las muteclones puni!Jales son tan representatrvas que a veoe:s se a~en como ill Unico !iPO oe mu1t'ldn Es itl'f)Oflante resaltar que es la estabilidad del cambio b ~ h~oo q~.te ~ mutilociro &e pcrpot.Ue en la J)t09enie celular. al pasar por repllcaOOn a ceda nueva copia y permanecer en las secuencias oe ONA de (:3(18 ~lduo. Estas variaciones genticas heredadas conlribvyen a &M: diferencias eMre indivickJO$ den110 de una potllaciOn. EB algunos casos. cuando la modificac;iro " produce ero uM ~ g6tlie8 (estrucaural o teg.A000f8} puede set sunciente para al~rar &u mefl$;Jij4J, <tfodandO a la funelonalkiad de su ptOCiuC1o gnlco y ooncruciendo a~ enfermedad herdaria, Al dopqndor do la 81tetacl6n de t.r1 nico gen, estas enfennedades se llaman monognica.s, y se caraacritan por tfMSMilirse a la desoendenaa segn las leyes de Mlmdel Como excepc:in. las n.Ai:\Ciotles en 01 90notna tnilOCOndrlal se ltansmlten por hetencla materna e..x~ivamen1e. debido a QVO ol ro~mero do miiOOOt'dias que apona el espetmalowde en 1;:~ fQtm;:~cin del cigoto os muy inferior al procedente del OVulo.
!M~ U~ T~ A~ C~ ~N~E~ S~ A~ P~E~ Q~ U~ EA ~A ~ ES ~C ~A ~LA~O~PU~N ~ T ~U~AL~ ES ~--------------------------------~ 3-4 7

25..4.1 Cambios en la secuencia del DNA
La de&a'lpcin <le lo$ disliniO$ tipOS de mul8do'IC5 IIC Nwtl Mencliei'IOO a su causa a n!Yel l'l"'IteeJiaf en el ONA: mt.llacione& por s~b.u;in, r:>o insetetl ypot deleci6n.
I)NA orgml
~
ABCDEE'l;HlJKU(NOPQR .. l'
Este estvdio se aOOf'IWI\3, etl C8da ~,~t~O 00 $\1$ ill)artt'tOO$, oe e;emtiOS especllloos Indicativos de las oonsecuenaas patolgicas do lt' mul3c;in,
P!L ra la dcscnpce<'u'l de la~ nmtSICM)JtC':I pt.u\lua\('~ ~ MI:> ...rectos SObk la pc'(lttl.na '-"1\hi.:'IIIIa :;e hari u~ ...u:m~ qu..- ,;es f!Oi!bl ~. de la .... -xu~uo!'i:l do: 30 lb de ONA que ('(xhii..:-11 los (l(itnt."fOS 10 31llitlt.'11Cidos
k In pi\1C clnlli}gl;.,hinn humnnn iCQn m tOIJil de 1J7 >lmmC>flci~l
25.4 .1.1 Sus titucin

Como su nombre inQiea, la mutaciOn COMiste en ta ap3rlc.6n de un nuc:tetldo (OOIO<Iularmettte, una b89e) en t.W\8 posiCIOn de la secuencia ocupada orig~nte por otro: dicf1o de otro modo, un cambio de \.1\a &da base (O
nutlebdo}. Es retetivamerrte oomW'I en el ONA. tanto codfficanle oomo no codib1te En ca&Os raros. pueden ~ilzarse swn.llt.Aneamerwe WNI$ btlW$ <19!\IPCiidO$.
5eO(n 13 nat.uraltll w rinie<'l o l)irfrri:liniea de 1 .-s dO$ f>\l$e$ lr'll'llie~tdM. $$0$111'l!)Je entre transicin y tran$vet$1(ln,
a) Transiciones Son sustl!uclooos de una plfW'I'Ikllna por oua (C ~ T;

o de una puma por oiTa (A-G o G A). e,ci$ton, PIJH, 4 PO$ibilid<k!C$. l.l"tl P<r.! ~ bMO Origit'llll
b) Tronsversiones
Son susliruoones de t.na ptA'Ina por una piM'Ii:!ina (A o G - T oC), o viceversa (T o C ~ A o ElUSien 8 posi:lild;Jdo&, dos w (:il(lt~ bt1$0 origln;;11
lnln~'l.'r~in
r ...... C)
o,.
-..,...,.,--...,.,...,...,..-----::-...,t rans ici611 ~r inicial 2"t fin01l A-+G A:T Grc GIC AT G"""'A
T-+C'
T IA
par mic1al
A_,T
A-(
,,.
par final
nA
An
G:C'
GC
TIA
(1 ..-\
C'G
T:A C.'G
C:'G
T:A
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G >(
T-+A
('_,T
C:'G
NT
T.-.G (-+A
("
C:C
Ci
,_,,.-r
C'G
G'C
348
BASES MOLECULARE S DE LA MUTACIN Y LA REPARACIN DEL OHA
Tericamenle, a. la SI.JS1itucin de las bases fuera aleatoria, la fl'ecuencla de una ttansversin en el genoma deberla ser m<t)'or quo lo! 00 un<\ tr.~nsicin, PUO$ h&y doble PO$ibilidad de q.,e <Xli..WI'8. Sin embargo, &e ob9etV'8 en diferentes pt'00&&06 mulagenieos q.e las tr;)r'lSi<JOne$ $On ti'IM oomunos que las O<'lf"'SVCf$iofiO$, cspoeialmente en el ONA no foo::ional.
Como ejemplO especU'\co pueOe citarse la transin de una base (G7A) en la regin~ no traducida del gen del factor IX ele la coeg..Aaean (regk'ln que conllene ISioles CpG, pgs.. 167 y 201). El cambio de secuenola en esa regln regtAadora
Impide la uniOn de ~ factor de transcripcin dave que, en oondiclones normales, activa el promotor del gen. Como conMQ.Ienc:ia. dismir.JY8 la exnsin del gen y se sintotiza O'l8flO$ factor OC.. lo que prodvce hemofilia, de tipo 8. tras1omo 00 la c:oagulaciOn oon I.A'1a accWidad (li);)Q!.ItlnOO disnW!uitla en do& tvrclo$,
25.1.1 .1 Oelecin, prdida o eliminacin

Conslsoo en la prcida de \KIO o ms nuctatidos de 1.1'1& &eOJencia. Es muy oom~ en el ONA no~. pero fnfrecuen1e en el ONA codfficante. Notm;llmarrte &On ~ pewaMs. y slo en raras OCit$lone:s afectan a zonas b $Ul~Cioneemonlle gr.;~n<tft como ()01"3 ser viSible$ a niYel d!Ogen!lieo (en regiOnes con rel)eticiono& en tbtldem o et'llte repetieiones ~S). Puedenorigll'l&f un cambio en al marco de leclura (pg. 350).
25.1 .1.2 Insercin

Se trata de la "uaan contraria a la an&erior. la ap.aric:i6n de uno o vario; ~ ~ates en un<~ $GCI,IOf'l(ia, Es muy oomn en al ONA no codfficante, pero rara en el ONA codifiCMIO. Un e)en'CliO es 13 "r~ oe UinUCieolldos~ o ~9ltl)ai'ISin do ~olos', un liiUITIO~ Clf1 el nUmero de copiM de un ~le ~ NJdeC!Iidos ObMrV&dO en un~ o en sus
proxim~
25.1.2
Efecto sobre l a secuencia de la proteina si ntetizada
El eernbiO de secuet~cia del ONA que supone la mu1adn puede cenar dlsthlos efec40& &Obre la secuenc*a i'!minl)8(:1diea oodiflcada y. en consecuencia. &Obre ia secuencia de la protelna que se sintatlce y su funci6n. Se dit!ingue pot e1o enlte mutaciones sitMoosas y no s.IJ&ndosas. Tipo de mutaciOn SustituCin
Causa posible
OeleciOr\ ll'tSerciOt'l ; Mutac:iones sner.closas ; ; ; Mutaciones no silenciosas ; oe senticb allerado Conservaooras No oonservadOtas ; ; Desetauu..-..et~to del Mareo ; {!ripl!) ; (triP'ol Sin des.p!e:zamlento del marco ; ; ; Tertnirwion prematura ; ; ; Te.rminacln retrasada (wando no se Indica lo oootrario. el cambio afecta a una sola base)
25.1.2.1 Mutaciones silenciosas

Se 1M llamt' tomtli6n si nnimas , n~utral~s. ssii'Womb'cas o con sentido (dellngl$ Stlm$6 nwtations). y &On muy Se caracterizan PQI'Que. \ll pQ&r do Mber un (:3mbio en 1$ SewetlCia del ONA. no se allefa la secuencia de su prodl!cto proteico Esto es po$il)le ClebiOo a la cJeogeneraciOn del o6d9o genlloo (Vilf106 tripkfto& o c;odonts codifiCan un mismo aminocido, pg. 295). Normal~e. la mutacin es s!lenQCl~Sa po~ afocta ., la 3 baSe de un COCIOn de tal totma que el ooevo trlp!ete es annlmo del original . .s de~. <dil'ic9 ol mi$1n0 anwobcxlo
l'tl,liTIOro~s (2325% de todas las ITI.JIIaclones en DNA codiflcan1e).
MUTACIONES A PEQUEA ESCALA O PUNTUALES
349
1Ej.(-n1pl.:~ hii)O(lio)
Lu mVI;M;in ro :-U:Jilltuct~'>n de f l)()f G en d cudiln 4 Tlu d lil he-lita 1)() u::.n~oen t:1 ( ACT). o d.: A l)(lf C en 1 :~ hebr$ trJt~:.cna. ('(l(ldu~'<' 3 1111 oodll ACG en la 1.-brn no-molde) en <:1 mRIM, qu~ t:o>ehtic: gu:.lm~'flte Thr (wr c&lg-1)). f'( lf lanto. 13 procd'*> l<flteti7ada e$ la ~Jnbhm nornlll l
Igual ocurro $i la $USiitucion de la base OCU'I'e en la t posian de det~rmin~ lripleles. conc:teeamente. CUA ~ UUA y CUG <b UUG. Que C:OOtlcan l eu (ver odlgo). y A GA (:) CGA y AGG <b CGG. paro Atg. Obviamente. l3IS mvlac:iotles silenciosas pasan inadverbdas, pue:s no se dlt1o~n <l riYet lenoupco ni conlleren ventaja o oesvenlaja alguna al or~l$mO en cvyo ge:I'IQmtt surgen. En eonsecuec'lcl&, no escn sometida& a la P..SIOn de soletei6n eVOlutiva ,.; Influyen en la susceptibilidad fnwlte a enformed006S Sin erOOargo. pueden originar una enOI'ITie divetSidad genebC& en una poblacin. conoOOa como polimol'fis.mo gecn6Uc:o, ett esle caso no gnioo (tema 26)
Cdigo
,,
genlico
(se incluye ;)Qui una COI)Ia del o6digo 90~icx> para f~i!itat
el &n61i$i$ de tos eiel1'4ib$)
'
25.4.2.2 Mutaciones no silenciosas
En este caso. la alteracin en la secvonci& de nvtloOiiciO$ afecta a la secuer~eia Pf'Ote-ca, pues OO<Iiliea uno o vanos aminocidos diferentes do lt\ soc:vet'!Ci' Original . Depencier'ldo del electo que tenga M 81ter&ei0n de la secuenCia proteie3 sobro su hJnc:ibrl. se pueoe d!Silngulr entre mutaciones con efecto beneliCIO&o y con efecto petjudlcaat AUf'IQUe unas pocas mutaO\Of'leS (menos del 1%) pueden tener un efecto beneficioso o posi tivo , por ejemplo favoreCIIOdo la 1\.w\ciOn de &a proteil\8 COdifiCada o le lntersocln entrtJ gen$$, son l<ln POOO fJ:UOI'lltJ& Qu4. on l<t prActica. os oornn quo no se consldetet~ En cualquier caso. bs mecanismos que l<l& oener.an son los mismos quo si el oreeto os perjuttici;)l Por et contrario. intetesa ti$Wdior eon IOdO dtla!le la$ mutaciOneS oo silew'lciosas que se manlfles!M con efecto 049<~1iv o, de19t8rlt0 o C:411at1r6fico.
A ()(.)fl(inu~On , se eot~"~eMan los efec(t)S mas frecuentes de las mutaciones no silenciosas sobte los c:odones y, en OQI'lsecvoncicl. sobre l<t seeuenCitl del prOducto proteloo.
a) Mutaciones que alteran el sentido

Contrariamente a las mvtaciones silei'ICiosas. donde la sustilucin de
\,Jf'l<t
OO<sc origint un nuevo triplotc que
O()(jfioa o1 misnw:> e~mi~iclo. O$ mas oomUn que diCho tambiO ptOduzca un c:ooon nuevo que COdifiCa un atTlinoaOIC)O dife<nM. S. lt\$ llt'm<t C>Or ~ mutaCiones r10 sinnima$, ~ sMtldo oquivoc11do, f!tso o 111t~rad0 (~ ingle$. lrJ,I,$Un$C mutfllj()n) , La mayoria de las mutaciones en teg!Ot'les ooddleatl!es son de e1te tiPO (73%). por 10 que soo
causa de muchos trastornos. Adems. la lormacin de ms da una vetSIOn proteica supone que el poUmorflsmo gtnic:o generado por estas mutaciones da lugar tambien a un polimorlismo proteico (tema 26). Lgicamente, estas ~e& son ~;:~rmonto ~<tnl$$ cuando uonen lvg;ar en J9g1onN gjnic.-s estructuraR P<lr ejemplo. son de este tipo la mayoria de las mvtaciones que PtOdooen hernoQJoblnopatias.
350
BASES MOLECULARES DE LA MUTACIH Y LA REPARACIN DEL ONA
)'
Y... ~pu~pAGMGJ1C'OJ?CC~ J ' u ,.Vnl ilis lA-u Thr Pro \'al Glu L~'S Ser Ala... 1 2 1 4 S 6 7 ~ 9 10 o-"\
$"S~i1-lol.nnl1
111t~I'M
..
1.& J'U~rlucln de A po~ Ten el \'Odn (,..(;tu de !11 hdx-.1 no tr.wkn~ (0A(i). o de T pot A ~n la bcbrn tt:lu!ltrtt:a. cunducc un t:01ln (JU(i en el mR.NA. qu\~ codifk11 Valen lugar do: Glu. f-<lll t~ob mu~in
(b~bit-. S. a$:) e~> b
causa
de la :urernlll fatd fornu (ps.J82y396).

~-----------
Dentro delli<S mUiaCtOnes de MOticlo altetado se dsllnguen dos sub~:
Sustitucin cons.,-vadora , El aminoilc:ido es sustituido por otro con una cadena lateral qufmiC8t'l'lente si~Mat. POI lo que el efecco sotwe la e:slructura y funan de ta prolefna puede ser mlnimo. Esta Situacin se aotelM'Ia, t11.1e$. taos mA.aciones silenciosa&. En ciel1o modo. parece que et cdigo gentico se ha adaptado para reducir el efecto e las mutaciones. pues. ademk de la degeneracin, los codone<s <J,~e espeallcan amino&clelos simiiBtes son a su \'el pateeicJI'>s. Por ejemp6Q, lOS COCIOne.! paut Asp (GAC, GAU) y Glu (GAA, GAG) $Qn muy parecidos, de modo que el cambio de la 3 base en un codn GAN (donde N es cualquier nucletido) o bien 0$ 11ilcnc:iQso o lief14J tXI efoclo mlnirno, el cambio de un anwx>c:IOO cido pot el otto. Tambin pueden ser CX'lf'\!lei'Y&dores Mgunoe eatl'lbios en la primera posicin dd cod6n, por oj, CUN {lou) t:$ GUN (Vt'l), >nc:t. N rCIP'8$Gnta cu~ nueleodo s~stitud6n no cons~N8dorB . El amlnoddo es sustituiciQ pOt otro no similt'r. <:iferen4e en ce~~. polaridad, tamar.o de la ~a lalef'af. etc. Son no conservadoras casi~ las sustituciones on l;a t o 21l06icin de un oodn; por ejemplO, CGN (Atg) ~ GGN {Gty), CCN (Pro), CUN (llltU) o CAN (Gin/HI$), ..e,
b) Mvtaciones que cambian el marco de lectura

Este es un conoep40 Importante, por la frecuencia con la que afecta a la secuenCia del produCIO proleloo. El dKplaumlento. desfase o cambio del marco de lectura (/ramefJI'Nft muta.!l'on) oonsiS~e en que la lnsetcln o delecln de nuc:lGOiidos. ~ &In <afectar en gran medid<t <a la socuencia de ba$8$, cambia la forma como se teen los b'ipletes (pg. 288). PQl' lo Qve PfQduoe un;t <~IWI'&Cin i~ on 1~ llec:\leflcial de la ~in<~
se produce un e8Mbi0 de marco c:uar~do hay inseteiOtles o deAeciOnes de tM'IO o rnM pares de basO$, on nUmero no mU!tiplo de 3 (es dec;lr. un n6mero no .-Mero de codol'le$), El c:amblo en la s.cuencla de aminocido& se produce a parbf de la primera l'lsetein o delacin, hallla el extremo carboxilo-tenninal de la proteina. Por ello, en general la prot.oi~ resulta fT'IIIY Mef'8(18 en"" eStNCWra
1Ejemplt.'l hrpotllt(l)
TC
bcb111 trntlifi:Oia de DNA. o ~tJOidt-
La prdida() dekti..'ln de tn el Co.ldbn 4Thr de 1~ hoeln no ttansetita fACT), (.1 d..- (i en la hcbro~ tru.n:~trilll,
c:~nlllla ~ 'lote uiplctc y todos los
~iguitt~t es tse di
q...c ~hu
dc,.-p.tana.:lo d man:o de lcctj,lr.t).

aparc~ >icnda una S~"\'Utncaa
)):.!mcrlU:: ;dtcr.adn en li\ :lobinn
Como oj(lmpiQ CIIPOc:ifioo e>uode c:ilt~rw lt\ mutac:i6tl mil$ comn encontrad.& en ~ellos Mhktntlzi (es doeir. con .-ntepa$ildols de EufQP\\ del Etr} ~ p~on 18 enfennedad de Tay.Sachs. un trastorne> auiOsmieO reeeSO con acUm~ de gangliOS.CO$ 41" k>$ li$0$(lti'U:t$ neuronales. El gen afectado es el que OOdiflca la subunldad t~ oe la enzim& liSOS()miea tlexosaminklasa A. (ISoenzima A eJe la ~N-acelllflel(()Samlnldasa) La de&clencla enzimtlca total es responsable oet ret~otipo grave 008ei'Yado etaslc:atnenle en i8 forma lnfantl de la enlermeclad.
Alel<l norm:d
<' ... ~CU)lACf.. J'

... Arg lk Ser T)'' Ala Pro Asp ...
'...FGtiJWA)!Cl)!l<fUAJGC:cc:uey .q '
,_, At! lk Ser lit ltu C)'J Pro 1At1 ..
la "'s~:i(,n d 4 uuck.Stidi)S TATC ttlla hebra no tran~rita.. o.l de A 'I'AG eo la bebru 1n1111~rit11. cn.rnbio el m3100 6e kcrwa, Adcmli$ de cnrnbillr todo$ los llminocido:f de 1~ bcJH)thlm.nidn~m a p:nr del pustU> de n.~n.,6n. en d nue"\'0 ma reo b:y un co)(!6n .Je tcmunactn mAs adda"e pot lo q\le la protdna t s ns co.lna > ' DO funciol.
MUTAClONES A PEQUEA ESCALA 0 PUNTUALES
351
e) MCitaaones qve no cambian el marco

la lrl$CfCi6n o deteoQn de 3 pb en el DNA (O ml~os de tres), aunque a..O. o clillWla algUn amir'C)Acido a la protelf\CIJ. no e<~mbit'l el tnareo ~lectura, por 10 que el testo ele ta se<:uencia <amino<~~Cidiet' es f'OII"nal. Et e1ecto de estas mutaciones es. por anto. muCho menor y puede no <tfectar a la fvnc.<Jn de la proteina.
se
..-
Como ejemplo e&pecil'loo. 4141 el 70% de tOdoS 10$ (!lelOS asoeiaaos oon la mucovtsddosls, o fibrosh; qui&tic<a. observa una deleci6n triple. ~ et tr0rn()SOM3 7r La mutacin afecta al gen de una p!Oieina de mombrttnt\, ttansponadora de aniones c:lot\lro U prot.tiM tn1,1~d<l se pliega II'IOOrrectamente. por lo q...a durarrte su proo8$amicnto posuaducaonal queda retenida on ctlurnen <fd reficuiO en:)f)lilstl'lico, uniOa a protelnas carabina (l)O& 337338): M l~e ssr su Uegacla a 'a membt<IM pi(I$M<\tiea, CQf1 eonsec:uetlCiM que ateaan a verlos tejldor. y glandular. endocnnas (lnwtlclencaa pancretica y aktccione$ re:.pitt\'!Otitl$). Lt't entermedad se diagnostiCa por un exceso de cloruro en el
Alelo norm:,l
A leSo O:llu~:nte de iibro;, (Ju~.cil
/""'
La pCtd1d:, de 3 n~rch:tid.;os (Tr) en, hehn oo U 1U,Srilil. de t . \ \ .:-n 111 llcbnl tmnscn1a. prod~ "n t~anu,;;:lliQ e n Ita cadl.."nll p.!plldtca.. pero al ~~ lil delcdtl un mUhiplo de ~ nud... '{tdo~>, ~e n:~.-'Uptr:a d u~a .:-o de IC'('Illi".L El c\liJ6n 507 se ha \ isto afl;lodo> ror la u1uiAI.'M'nl. ~ro. CIIMJ3I n~~Cnle, d~'bido a 111 d~"g~'flcracin d4:1 OOdi~o. no~ ulh;ru clnrnu"~do 4AL C :llc - t \ U l ':lle), f.t t~id~ Phe-SOK dc:sapltece, PI"' 1<> qu..- lo\ protch~ lll~'tde 1111 ami n(l(j;:id~'; 1~ mlll,liClOn ;e dcnomllt;t Af'~ hkkti(tu di.' la f ~ 't'ILI:J.I~ IIUI 503) _..,
d) MCitaciones con terminacin prematura 00/a protelna Algun.-; mv1acione5 no i!ftX:l<ltl a lt1 secuetteia de amii"'Ibeidos ooelllcados. Sino que 1& suS(IIlJc.On. la lnserciOn o
la delecin de uno o vario$ nvclelii:IOS U e11e oomo e!eCio 18 apark:ln de un codn de 1ermlnact.n o de paro (UAA UAG o VGA en el mRNA <:il())tilsmieo de eucariolas SYperlores, pg. 294). Como conse<:uencta. se provoca el cese prematuro oe la tradoceiOl'l oet mRNA y se obtiene una protelna aoortada (en su feQin Ctornwtal) Er.te tipo de mulaciones. tambin la~ mut;:tciOOH sin sentido (nonsen$e mtrltitiOrJ$. (lue no del>e confundne oon m/ssoos-e ITNJfations. mutaciones de sentitk> eQtliYoc:ildo pOr $1.1Situcin de un l!lmino~ido x>t otro) son
poco trocuentes: POr ejemplo, s~.~ponen terca del 4 % de 18S sustituCIOnes oo el ONA oodlfican.te. El aoottamlento oe 1a proteina C$ <' ITI9r...:fo eonsid9f3blo. pot lo que se ven atecLadas damt:~eamente su esttuc1ura trldlmenSioftaL su e;t<lbiidi!d y ~~~J fvncin Con fnJcvtl"lcitt C$1.3 at!e~iOn aoetera la degradaeiOn intracetulsr Cle la protei.na oo funCional. ocasiQr\atldo genetalmet~!e un electo lenotiJ)Ieo.
Ln
iEj~-nlpl tupo11ic) ~u~1lhtcin tk ,\ J!Ql Ten d
OO<In )l..l ys d.: la hdlD oo r,.n"lcnl;a

( '1AG) ( d<!" J' piK :\ ~'fila h~'br.a JranscniA) ;:(Induce a un ~'Od&n UGA e n d mRNA, qu~ c!i un C)ll;'tn de par. di.'" l('lll'IUt:l(tf'l < dn """ sen1wlo La ~fmc~is de 1~~> prot4:in:, !<>e
dchcne a lllepr a Cl, x..- lo que b

l'r(IICna rc~ou llll :a.."<:ad::. V lr\11\l.'ildl
352
BASES MOLECULARES DE LA M UTA CIflt Y LA REPARACIN DEL ONA
COrno ejemplo ewoc;if'ICO, la mutacin ~te de la neutoflbromatosls tipo 1 (NF1) o crcnfcmliOd<ld de Reeklingh:tus e:n, un lrttS'Omo tuftoOOmico dominante (pg. 395)1ocalizaclo M el Cf()fl'l()6lOfl 17q.
A Id~ caus&nt.e
deo .wurulibrl!lmllJM'Ii upo 1
'':fi;}~-
l,.a t~U51i1uctbn de ( porTen la hebra no li'$RSiUI (o <k G pof A ca la hl>brJ.tnlll!:lttiua) pwoclllllparidn lk un cQCJn de tC'tJT1inacin UVA. Por tanto. d ald muUIOO chftoea una prottfn11 aconada..
1nltibc la
futltt~' )n do! l;a
oncoptut~rnil p 211'a'
~
no mhibe la foocin de 1
OO!JJtOttina p2 1ra~
frena la prolif~iOO .xhllar la onoopro>tdna pllr.u :u:ta lbftomcntt: Pu(';Slo ~uc c:1 ten nofmal frc~~:.t lt f<lf'fhal:iOO prolifct~CiOO lular incorttrolada
dt un turt'lr. Jlc d.tce que e$ un fl<'.'1 supru<>r tk '''"''('"~ <t umiifflr:t1gcln (km:t 30}.
~
~
(,mn:.crn di: un tumQr
l.<'lllliJlacin PVe<Jo PR)(Ivcir dirtt~<tiTI(In~ la ~iOn ol ooOn delerminacan. oomo en los ejemplos f'I'IOSb'ad06, !)ero tambi6n pve4e 1\aoei'IO incJWeclameole, 11"160i<llnle un e-t~mbi:> en .. m(lrto <te lec;tura (~ase. oomo ejemplo, el polimorfismo de grupo s.engul neo ABO, ~ 369}.
e) Mutaciones con terminacin retrasada

Oo 1<1 mi:stl"'<t lollTI3 QUe t.r~a mul~iOn p..m11.1a1 puede~~ 13 t'll*ic;in de 1.1n codn de tormio<lcin, !;)mbin puede olmfl."'r l.lnQ <tislon1o, $U$Iil:ll)'l:ndOIO por OlrO que OOdific:a un 3mirw)eido, En~ (;3$0, lt~ ~ dol mA.NI\ oontM ms al del eldremo 3' codiflcaMe Ollginal. hasta <rJEt se ak:8noe t.r~l'l.le'IO ooe10n de temW~adn. Por tllt'lto. se sintetiZa una PI'O(ellna de mayor longitud. cuya MCUeflCJia do aminocidos en la regin c..eminal no tiene significado estrua~Xal ni funcionill. lar$ con&OOJen:;ia.s fcnotipic;ts $01'1. en gonci'CII, imlclros a &as de &a temW!adn premall.ra.
25.5 CAUSAS Y MECANISMOS BSICOS DE LAS MUTACIONES

El ONA es~ sometido a daos. IG:sionos y mocliftcclcionos do dMII'$0$ bpo$, provocados por distrt@s causas Estas pt~eden ser fortuitas o endgenas y provocadas. inducidas o e.xgenas.
25.5.1
Mutaciones endgenas
Son mu~onos QI.IO se 90ncr&n por SituaciOnes o agenteS !)rOPO$ del a~ intr~telul<)r, bajo condicaotlet
normt'IICs, ilslos son la fue,ttc mayoritaria ele I'Y'IU!aeiotles. Pueclen Originarse por eores en aa r~acin. o bier\ por reacciOneS ~ OCIJrren de tonna espon!nea como oonsec1J9ncla ele la Ns18billdad Ql.lln-.ca <:le la molclM ae ONA o de la accin da &utlptodiJCk)S del metabolismo C91lkt (mutgenos ef'ldbgleno$) ,
25.5.1.1 Incorporacin de nucletidos errneos durante la replicacin

La repllcac:i6n I)Of la ONA polimetasa, rncwinclose a lo largo det ONA. co..-ntWla la inOOtPOfSan de n~.~detiOOs a la hebta n1.1eva con la correccin de pruebas. de forma q1.19 ~ la doble hlice con una gran tideldad. Ms del 99,9% de los eti'OfEI& <le replicacin son rtipic:iamerrlo oorregidos por enzimas reparadoras q1.1e reconooen e& n~.~clebtido irM.:Orteclo en la hebra q1.19 so G<Stit sintoliundo y lo reompl~~n por uno wroc:to. oomplomont.&rio 011 de la hebt<~ mokle. 11 LOf orrof9s do rcplic;:aciOn ob$4.1f'VOOo$ Q<:U~n oon uM frecuencit'l m1.1y boajil. ~ 104 <' 10' m.rlt'lcionos PQf nuciOO'Iido i~rporaoo en cada dcto <!e <JWISin c::etJiar. Esta baja tasa glObal de mulacln slgnlftca que slO se lntrOCJuee un ru::leobdo k\oorrecto pot cada 10.000 Mb. Puesto que el genoma dlploide humano tiene 6 .600 Mb, elfo se traduce en monos do un.. nueva mv~<~~in POf Cilda divisin ~uSa r, A po$;111 do ello, ol gran nmero do divisionos oolul<ltn 6solt1to In vida de un irdviduo ho:~oe quo ol nUmero de rrutociones se:. signillc::Mivo.
CAUSAS Y MECANISMOS BSICOS DE LAS MUTACIONES
353
Una de las causas de incocpor;M;in err~ <te M.~Cic!iCios. ~lil en la tBtllomerfa de la-s bases nllrogen~ {p,fJg 14): \M rormas lautomf!.ncas menos estable<s (mina y lacbma) ts1<:~bloctn puet~CeS; de hidrgeno ciferentes, lo (Jle petml!e et aparearnlenlo de un nucletiOO incorreceo en ~ hebra Cle nueva slnlesls. Adem<s de los em:~tt~s on l;t~ ic!et'ltldao oeii'M.!Cielido inoocpor.~do. durMIC l<'t rcplitaci11 IMll:li&rl se ir\Uoducen mutaciOnes debido a dNiizamieniO$ oe la ONApol sobte la hebra molde. que PfO(!uoen cte~Ccione$ o insetelones por repeticin de una PPJeiia sec:venci;a
25.5.1.2 Otras mutaciones espontineas

Las baSH en el ONA pueden experrnentat esi)CW'IUneameme tet'CO'-$ ($lr'l inter"VenciOn Cle enZima algUna) que transforman su klencldad. <le modo Qut si no son corrogir;ltts por lOS ~~as Cle r~raciOn se COI'l'Yienen en una motaon
a) Sustituciones por desaminacin oxidativa

CoriSiSien en la prdida de 1.11 gtUpo amino exociclico. con apaof'l de un grupo catbonilo anUlar. Ello da IIJ9ilf a que
se altere la formacin de puenle& de hidrgeno (tf'II!O I;)S b;;'t$e:$.
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O N 1
la adenlna se con~iene en
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A~H y
Las uansbmaoones e-u v >me~I.C.-T se pn:dloen lentamente. ~ro unas 100 Yeoes ms rpdamenle que las G-X. Por ejerrc)lo, 1.11a desaminacin de citO&ina al dia POI' cacla 10 C en el ONA ele una clula tip.ca ele marn1fero (bq.,e oaviv<Q <~~O$ 100 mu~OQI'Ie$ pot dia).
CAUSAS Y M ECANISMOS BSICOS DE LAS M UTACIONES
355
AgentH q uim itos at.qu.llante-s Transfteren grupes, g&nef""'lmonlo mctiO o eblo, a un !OmO nucleofllioo (O o N) de las bases nitr()!)!\3(13$ env. 106 mep estOOICidos e$1<'n:
OimemSUIIaiO ~ (CHlpso,
Oll'nellrnittosamlna: (Cii:)hN:!O Metllnltrosourea N~trosoguanil:ina$ Et*netanosul'ono1o
\'m~'ti ~ \'"-nitro- \ .fliun"'lf"llnidlnll
IMNNG)
-
d !mtl:ll'M~SIIilbn:l!U lt:\.ISr
b nlrti lfu ~ll!INI 1'10 ~ a()Qrh! 111: t.).,ll<l <:~le oon 1.1 ~-~~~~~
11-N
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mut-.:in poc <li.J\'1'11.: alqubmt"
h:ji.-rtl)IO: MN'IG)
N>:0 or'\
ll~ \ "'"udu oo uft) htbtll _
t:n i.lguK'nll.'$ replicaciones purdc t"RIIill

cimu101 en b1pr de nr..Mna:
la I!'IC'Iilguanu:sa pul'dt
'-'~~OC! hflll " l
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1' n~rh<"l(>o>n ~ b nuol.,.ltl
" C__ , __
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,.,., '6.
).
~n~r!o~ J. .... 1.1 1<'.11 ,.,., " '
,,,...
--U9
.... ....,..,.., b ,,.,,...,.....
AgerHM l.ntercalantes
Allnsenarse entre 106 pare& de OOM5 aoilild05 del ON A, distOrsionan su es.tructt.tla helicaidal. Algunos ptcwocan et desplazam.ento del maroo de loctvr.-. miontras (lt.Je otros (~tes blf1Jnc10r\81'es) eslableoen enleces cruzados entre bases de la mt$m;ll hebr& o de ~s opuesaas.
Naranja de 91Cridin&, ()n)flavna. ere. Benzo(<~JPircrao, ooode lOs prOOUCIOS que se enwentran en el tuno. Ntr()geraQ mostaza
COmpuestos Cle ci!IC)Iaboo
...,_,
,-.. .,...... nco:.~-)
Otros agentes qu lmlcos 5-bromouraCIIo: se V'ICQrpora en lugar de T Olxanie lt.J replicacin, gq~~ a
w tm;)IOgia c$1tuelurt'l
(pg. 132). f:#jo nitroso (HN0t): acelera la d%aminaetn <~idativa e-u
Cotnpuestos que pueden metabolilaf"&e a cido nilro$0, como nitritO$ o nitr<JIO$ Hldtocarbui'O$ arornticos polieicliOO$' bonz:o(&Jpireno, 2 iloet<tmidonuoreno, N rne1il-4-.&ntrt'CCno Anwoas aromticas N-met~mi~obenceno (MAS),
V<triM drogas: cidotosfamida, <:JietilestilbeSttOI. CotnpuestoS naturales: dacbnomlclna, aflatoxlna. Compvesto$ norgtiniCO$: <*t56niw, i~sbe$'10$, berilio, e;~dn"OQ, cromo
356
BASES MOLECULARES DE LA MUTACIN Y LA REPARACtN DEL ONA
25.5.2.2 lesiones y mutaciones inducidas por agentes flslcos

Son var'i!0$10$ .,gontO$ qve originan lesione$ por exposicin. oon efectos mu&agnloos o canoerlgonos La radiaci n u ltravioJc!,t.:a, componente de 1<'1 11.1z: &Oiill. Pf'O\'OCa la reaccin en11e d06 residuos de limidina adyacentes en 1& misma hellta, rorl'!l<'ndo .- pMir do $U$ dOOI8$ enlace& anulares un sistema trlcklloo con un an~ de cidobutano. que se conoce OOtnO dfmero tH Umin . Esta a.ociacin oovalel'fle de d06 T mpide que puedan apatearst
oon sus A ~ntarlas y or~ una e!llructura lriclirnensio!\31 bc31mont.e ~oomp~tible oon el 9iro de 18 dob6e hllo.. ~ fotmtt un QX!o' en la mo((;ule de ONA. Adems, se patallza la reple&Cin, pues 1& ONA POfWner<~sa no
puede recon~r tos dimorOJ y M deliene. la irraciaci6n IN tambin o.a otra reacdOn entre T adyaetnl.e$, con fOtmaCIt'l oe dmeros difer'ef'ltes la!TI&CIO$ fotoproch.lelo$.. en lo$ <Mt el eriaoe aparece entre el C-6 de una T y et C-4 de
ta ooyaeente.
Las rad.laclones k)niz.antes trayos X y rayos '() pueden PfO\'OCSf apeftl.l'a de lOs anillos. fragnentaci6n de las bases. asi oomo rotufa dM esquele4o oovalerrte del ONA. Tambin generon (por fotolisas del agua) radicales hidro& . que producen 8-hidroxlguanina. entre otro6. Debido a su mayor poder ele penetracin. e!Ma& radiacklnes afeaan a lodo tipo do tejidos. a <flferoncia de 131uz uv, quo provoe. losionot S(ltovncntc en la piel.
25.6 REPARACIN DEL ONA

y N)O(lrt1r dati\oo$ en el ONA os CM!flcial para et mantenimiento do la e~e OlljetO dlYetSOS sistemas enzlmticos In vivo, que pueden llegar a ser tan oomplejo& como el propio apar81o de repllcacOn, lo que pone de manifiesto su gran imi)OI't8nCia para la supel"'livencia cehJiar. Ce hecho. la Yeb::ldOO de mutacin es el refteio del balanoe entre el nYmero de errores OQ.Irridos y c.orrogi!JO$: una btlj<'l IO'tS<II de n11Aaci6n indica una gran efiCiencitl de los sis~mas ele repar&citl. l'l-.etltti!IS que un fallo d<S MIOS ooncJuOe a un auMento del nMero de MutaeiOr..es.
La capacidad de una <:!ula Ptlr<t
dd~r
k'lteglicled estrudural de su genoma en general y de sus genes en pattlcular. Exlstel'l 0011
En general, no pueoe ee.tabWteerse una e&.trategla nica de distintas vias.
~eperac.on
por perte de la clula, 9ir'IO que exie:teft
Tipo do rcrp~racin
ElinWcin de mutilgenos
Ejemplo Superi>:ido dismutasa
Se evita la formacin de la lesin oxidatNa
REPARACIN DEL DNA
357
25.6.1
Eliminacin de agentes m utgenos
El primer meCCifiiSmo pata reducw el dal'lo .al ONA no Cl$ PfOQit'lmttnte una via de repar&dtl, sioo que oonsiste ef'l evltat las te<siones antes de que se produzCIWl. mcdit~ntc lt1 nevtn.'l!:ac:O'I de (:()t'l"C'lU~Ios mu!genos. Uno de tale9 meCW'IISmos de des:t().)(ificaci6n lo ejerce la $\II)O(ICdo dismvi<'S<!I. Que eviU. l(t aeumulaCfl de radicales supet'C!ido, &gefl.les causantes de lesiones 01ndatfvas en el ONA..
rJdkallibr'l:'. JlfMhlre dafu ,. mr

Q~t~.l:~dn dd ON,\
25.6.2 Reversin directa de la losin

Es ta forma ms Inmediata de reparcw una mutacibn. l<l
trat~slonadn :~gonert~cin de: liJ MM daiiilldal revrtiondo 1tt qulmlca que na sufrido. Este mecanismo no es facti.lle en la mayorit'l do 10$ ~&Os. a OK.CePcin de lO&
ejemplos &~tes .
25.6.2.1 Reparacin de fotodimoros

Ya &e ha explicado que la luz \llr<Molottl proi!OC<) la 1Qnnaei6n <le MillO$ de cidOOutano entre dO$ piflm.Of'M adyacontes (pg 356), 10 Que S!)I)Otlt una <liSIOttiOtl estructutal que lmpiOe tlsicamente la replicacin y la ttanscripciOn. El m81C<'ni:;mo de rcpM~CiOn , . r:>asa et1 et reoooocimiento del fot<XJimero por la el\Zima fotolla-s.a. que 10 esCitlde, mcdi<lfl~ untt re:.cc:.tl de ttansferenc:at~ erecttOOiCa IniCiada pot absorc:On de luz visible, regenerando sus dos bases originales La tolollasa llene como ooet~zlmas FAOHt y oo cromOforo que absorbe la luz e iniCia la rranr.ferencia de electrones Este requeniT*!n&o de luz (arul o violeta) hace que se ta lame tarmin aNima fotorreactivado r a En oo~.ciones efe osc:uidad se requieoref'l ottos sistemas para reparat estas lesooes. Esta si64ema se ha encontrado en algunas especies. pero no en orras: asi. existe en bacterias, hongos. &iJ lcvaduro ~~s CG:I'$vi.s.o.H. peces, reptile$. l'll'lflbios y m;Mnif.ero& mtu:supit'llc$.. pero no aparece en Sd,;zosaC'C.Itatt:lmyoes pot,_ ni et1 rnatniteros l)la<fltOriO$.. inclu~do a lO$ hurn&t\0$. En argui'IOS organismos. inta.~yenoo OtoropluYa, se ha <!eMCtadO oua lotollas& que reparn ros IO!OptO<Iuctos 6-4, auset~te a su vez en E. c:oN, levaduras y humanos.
''~
25.6.2.2 Reversin de bases modificadas con grupos alquilo

El caso m.ils conocido. muy bien estucflildo en E. coJi e igualmente presetUe en eucanocas (levaduras y humanos) y en todas ros t!$pec;ie$ estud~, esta repar&cin de d'-met~nintl y cf-clilguanif\111. prodvcm XX .,_ modilie<M;in <!el DNA por agel'ltes f'rll.C&gef\C)S alcuilantes. oomo nllrosoguandr'las, mellrnitrOQiourca y etilrneit'lnQ$U!I'oni~IO (pt\g 355) El grupo alquilo de la base es eliminado por l.I'IS a~ltran6ferasa. que to ttansliere a un r~iCiuo eisteina de su PfOQio oentro actiVo. EM no puede regenerarw. por lo que la cathsir: inactiva la propia enzima (oon ro que estrictamente no es ero:ima ni C<'lltllliza(Sor, pues no se Cuf'I'ICIIe la condioin de Que no se <\!tete como consecuencia da la reaocin que aoelera). O&c:la esta inacltllscion. 18 clula Clebe sin~etiZar nuev:~S nl016c:ul.as do t'IIQviltron:s'cr~<=~ p'lra mantener el proceso reparador, por ro cual en preset~eia de un nivel excesivo Cle rnutaeioi'ICS ~c:s POO(Ie tener lUgar tona saturacin" del sistema enz:mtioo de reparacin.
358
BASES MOLECULARES DE LA M UTA CIN Y LA REPARA CIN DEL ONA
Ot'aiQuilguanina akuiltransf~
t .ntl llQ
r '
1'
l--{c;J:-"
)'-H
" o ()---'(
Q,.,sl 1
"
25.6.3 Reparacin por escisin

Se ooooce bejo este nombre genrico a la reparacin cM lesiones basada en la eliminacin ~ la ba:se Ntrogenada. nucle!X!O o segmento de ONA defeauo&06 y su ree~azo pot otro ruevo. de secuencia correet;&. A dillererM:ia de la reparaein por reversin, sle es un proceso complejo. que !lene lugar ett varias tases. que uliliza variM: PfO'elnas (slo algunas especlficamenle reparadoras) y que conlleva siempre la slntesls de oo fragmento de OHA (denoml!\iltda sintesi$ f1NmJ dt~ progvame), El prooo50 se inicia a traY& del reconociiTII8flto molecular de la 6esln (base
altcracta o cambio er'lla estrvctura llfdirnensiot\81 del ONA).
De forma gk:lOaJ. en el mecat\llsmo de reparacin se pueoen di$ti1'9.1J 3 rneeanlsmos '"get'lef'al* y especif'loo. y las dOs res~antes comunet;:
o~s.
13. primor<'l <:li$tint3 Pt'rtt lo.
Mec:.msmo
gclll!ml:
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HH HHIIII- .. S'
o
,.
,.
\tecani.smo
~===2 rl'le... -anismo:l l.k rtparnctn >Or esesio===;~
especlic.o:
nucklidos ..,-,--'"'-.,-,
Escisin de
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Escisin de bases
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REPARACIN DEL ONA
359
25.6.3.1 Mecanismo general de reparacin por escisin de nuclctidos

En e$!e meeatliSn'IO (HER. llueleotJde 6XC~Sioo f&PBN') lnleMenon PfQteiM$ qvc re~ di$liniOS ~ de causan dis~etslon en ta doble hlice. como 106 dimef06 d& timina o untt bl'&e con un susbtuyente volunw'IOSO (Psoraleoo. clspiadno. aOOiamidol\.loreno ... ). En humanos. es ef 5i$40m<'l de <SIJI"en~ I'S impottal'l.e contta et dano al ONA cau$CKk> por el dellobttCQ. ~o ro$pons<'lble de mas Clel 30% de las muertes 1)0( Cilnoer en el mundo .
altorQcior'IC$
we
numo
El ~o comietlza 001\ el reeonoelmlento de 101 ~si6n por unin de prote1nas componentes del oornptejO de reparacin, con gasto de ATP. En la fase O. escisk)n un CQr'I"Clfejo proteico que incluye (lfldonvcle<'l* hiOtOiiUI sendos enlaces fot;fodi$10r de 1;) hebra leSiOtlada a ambos &ados <le! punto de mu1 ac16n (pero no jvnto a l: ooner~nment. a 21 y 6 en humanos). La pec:uliaridecl de cortar &61o vna de las nootas y en dos ~'011 $$PCWOOO$ lt' distingve de Oltil$ .....:;IOt'$(1$, pOr lO QVC $t 13 dcnOIJWl{l escinucteasa. e.n hu'I'Ulii'I09 e~ ION'Mada por 16 pollppbd06. A cononuaan. una heUca-sa favorece S.. separacin del Ollgonueletido liberado (de 12 6 t3 nt en PfO(;al'l()(t'$ y unos 28 nt en eu~riolas). AIQI.IIVI.S de tas suDuniCades de la esooueleasa pet'l"'''ttlrw!een unidas al tramo de he.tlta sencilla Nsla que sean des4l'aZ&das por la maquinaria reptieaCIOtl.
J\
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2 1110~
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-J"',
(m~lln)
(j
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.}J
A continuaCIn. en la fase de " slnte&i & de rep.ataci n", una OHA poli meras.a relena el hve<:o dojaoo POt la C$<;invclct'$.3.. rtledian~ 1a ~~iOn del ox!remo 3 .()H r.otmaoo en el corte anteriOr, Et v$0 ~ 13 01ra hebra coMO molde asegura que se lnltoduee la secuencia correcta. En eucanotas, realizan esta slntesi& las pollmerasas S y r, juniO con s.us rae1ores
(j
''"
acoe:sorios PCNA y RFC {pg 154).
-J
Fina!met'lte, una vez que la polimems:a ha relk!nado todo el hueco y slo queda una mella, una ONA ligua \jne el extremo 3'.0H reCin $int$1iz-,;~do a~n ol oxttomo 5'.p 'orm3do on ctl corte Cle la hebta orgii'ISl. cerrStldo la ~ (fa-se de sel lado o ligamiento).
. .J
,,
ES!e mecanismo de reparacin posee la particularidad de esu.r relaetOnado con la transcr1pc&, gtaclas a que partiopan protelnas comunes (pm<:ipalmente. el rootor de transetipcin TFIIH, pg. 267). La RNApolll detenida en el punto de tesin guede actuar de &ella! ~roa <ti ~de repi'lr3ci6n. y adems w observa una reparacin preferente de 19& regioneq; de ONA QU8 ~ tron~~Cri~ y, dentn:) de Cllt\s. dO 101 hel.lr<t molclc
360
BASES MOL ECULARES DE lA MUTACIN Y LA REPARACIN DEL ONA
1.3 e$Cii'II.Jde:l$lll'lu~ C$ un 9'<Nl oomplejo proteioo (oe:a de 1.000 kOa en totBI) que se pue<Je c:::onsidcrar Jo1mt'dO por 6 S\bA!idade& runcionales ~se.,.., asociando y separando a 10 latgo dell)f()(;:e$0, ton$1il\lidas por un
tolal de 16 cadenas polipeplfdicas. Se conooen ya prcticamente ts sus QOnes, las proteinas y su h.rlcin. Si se
suman las prolelnas nn.ponsable& de la repllcaciOn y sellacJO, et1 total partiop.an en el prQQ0$0 do ~racin por
oseilll:)n 00 nuctetiOO& 0006 30 polipptidos diieren~es.

Svbunid~d
~ de
cadenas poliMptidiu&
XPA RPA TFIIH
Funcin
Reconoce la lesin en el ONA y se une a l.

Pose un dedo de zinc
c. (pg. 63).
3
7
Re<:onoce la! lesin en el ONA y se une a l. Es la misma protefna de unin a '*"a sencilla~ interViene en la replicacin. Es el miSrnl) ltlc:IOr de tr<Jns~in genor<lll de loo genes de cta.se 11. Ae!Ua por su adividnd helicttst~. IIOWtandO lt.'IS hobr;,as def ONA en la regln a reparar. Su aecividad j)tOteino quinas;a. no es ni)C(t~.
H411icallt~
XPB XPO
PrQtoin<~ Quin;)$a:
...
.,..
Helicasa 3' -+5' HCiie3$a 5' -o3'
p62
p41 p33
Ouina<sa dependiente de cictin<ts COK7

Cictin;t H
XPC+HHR238
Funcl6n de&oonocida, poe;lblemente ayuda a estabilizar el complejo
XPG
XPF-+-ERCC t
e&einucleasa Endon.lciN&a que corta el extremo 3' de la regin escindida. Presenta hornologia de secuencia oon la endonocleasa FEN 1 (pg.. t56) E~a que corta el extremo 5' <te la regin escindida.
Not.t'I' IOS no~ XPAXPG proceden de A'IfO<Icrmicl pigmento;a {~g 363)
DNA
la! protdn11~ nomponciUc:<
del ~inude.tSIIIrumano ;.e \111'1 soeiando pi)t
ill1e.-.oc:i(WICS murWi (- ) lOI!t\' la rcpn del ONA

qucluy que rl:IJ!Itllf
d o:Otnph:J(l
001 1lpie4l) (!lllt
lllit& la.
akalll.la 1 015
I.OOOkOa
"''"""
(XrF) ~
<:orte S'
oont.: J'
25.6.3.2 Mecanismos especlflcos de reparacin por escisin de bases

Este sistoma (BER, OOS41 6.tci~iotli'OP<J) $C encarga de r~ bases OSpe.cifiC3$; pOr lt'nlo, ~y actW en sitio$ conou:t:IO$, reP<trando k>$ione:s quo $On demasiado sullles pata diS10rSionar gra~nle el DNA, es C!Odr. no $On ~nocid<'t$ por el saslema ~etal de e!\ebln de nudetldos. Pot eje~o. puede OOegir danos pot hldriiSs (<JeS~minaCJOn o perOIOa oe base). oaacln por radicales fb'es de O)(lgeno. alqUiaciOn. y derivados no \'Oiumlnosos como la timina gliOOI, N Mf!(l190e0ha. 8-hldroxlguanlna, etc.
REPARACIN DEL ONA
361
~M~Cra
(se represerrta solo la
que se repara}
A
La fase de esciSin se diferencia de 18 reperaclOn
geoetlll porque, en ptmer lugar, se eWnina la base

alterada o lnoooecta, y no w nudetido c:omp1eto. Una N-gJicosllas.a de ONA reconoce un $Oio tipo de ba<se. anOmala o apar$<1da W'ICOHGoet.;wncntc, $ l'li(Jro!W) w erce N1Jficosdico con la <Se:&oxirriboS<J. donelo lugor ~ un $iliO apiriridilbCO o apurinfOO, segUn sea el caso. En lO<Ias tas oUas existen varias N-gftOOSilasas.
l-m .
,\ G l '
especllicas pwa bases distintas y ~e. POt tanto. f9P<Jfiln

~iono5 diferentes.
Una vel genortldO Cl $iliO 8MS<O. et\ ul\8 $eg und.:~ su~t~pa dct la fa M de esei5.i6n se pr~uee el COftt' de 13 hCbrl'l de DNA jurtto a esa desoxlrrlbosa q~ no esta undll a ul'l3 base n!ttogenada. Entran eo juego para eiO las endonucleasas AP {de apurlnloo y apirirrlldi nico). que hidrolizan oo enlaoe rosfodister. onginando una mella; en evc<~riotos (kJvadurtt5 y mamifetO$) eorwn lli~rrc:we 01 ~ 5' del :;itio ab<\$100, generan< un extcemo nucleo!iCI03'0H y otro ; .-osfc'ldlesolUrrlbosa.
A partir de este momento, la reparacin contiOOa dlt form.a similar al mecanismo ~~1 .
gr~ias .- 13 intorvtnciOn do ONA pollmeri!Ju que elongo svstilv~do et nuclolido ;){)Mico y, en OCMiOI'Ie$. variOS 1'1\b {e it'llrOCiuoe 13 secuencia oorrecta pcw c.orTPemenlarieditd oon let otra hcbr<~) En OOC<lriolt~$ $41 h&n cncOntr3do ~ mocMismo$
una
a) RePQfa<:in dct un solo nudetiOO, medinnt.e ta ONA.p)IIJ. qve posee oos actiVIdades enZim&!lcas: deso irtiboloslodlfltetas.a. que elimina e\1 nueletlcto absico. y polimerua. Qve lo 5u&lil\lye por uno co~. Fmlmeote. una l ~asa completit la reparacin oetrando la mella
bl Reparacin de oo tr.1mo mil& largo. realiz.etda POf

la9 pol lmerasu 8 o c. junio oon w& factore& a<:ott$0rlo$ PCNA y RFC. y ltl endonuel us.a FENt (pgs. 154 y 156). Finaliza igva!mente oon el sellado de la mella por una llgasa
362
BASES MOLECULARES DE LA MUTACIN Y LA REPARACIN DEL ONA
Como ej9mplo de N-glicosiasa, la urtteiloOHA g lico&lta.w es una enzjma muy e&()GCifice, que no acta &Obte resdm U del RNA. pero q~.~e reoorre el ONA reoonociondo oomo etrallo eJ uracio (que &lo se diferencia de la timlna en a. ~renc;ia ~grupo motilo). en l<ts ~lul<'l$ so rodi.IQO lt~ PO$ibHid.&d dlt Q~.~~t U se in()()I'JlQn) en &a si nte&IS del ONA
grac:iM l ~,~na d UTP piro fosfata..,_, que elimit\& el nyelelido preeur~ (UTP - UMP + PP), Sin ornt>.wgo. on el ONA ya sinteliZaO se Jorma u oon gran fl'ecuencla pot 18 desam1n9eln espot~tt\ea de C (pBg. 353). Si td ONA estuvie$0 IOtmado pot u (en lugar de T) serf.a irnpc)Sible <lllerenclar 10s residuos u JormadOs a partir ele c. y 18 n"'lttadn v-e no podrla ser repaN!da. Gradas a que ~ componente del ONA es T, y no u. es posible la teparaeln de la mutacin frecuente U...C y el man1enimlen10 del par NT. Esta mecanismo se con&<era una de las ventajas por las que el ONA (oon A. G. T, C) 1\a podido eYOlloclonat oomo un mejor depo&itario de la informacin ~ica. Sin embargo, no ocure lo mismo oon las Cl4o&inas metilacia&. relativamente cornoooEt$ en el ONA eucari6tioo. cuya desanWiacin oXJdativa prodiiCEI T. <PJo8 no puede ser disting~Ado de los T Pf'C.lPIO$ del ONA
Otras glicosilasas de ONA repc~~an de forma anlo9a div9r$CII$ OOses fl'l()ljffic:adas:
Eru:lma
utaeic>ONA griOOSIIasa
t.sln q ue repa ra
u
3-Me-A. 3-Jilo-G. 7-Mo-G.
o1-~C.d-MoT,
hipox~ntiflt
desamlnacln de
3-metiladelllrlVONA gioosilaSoil$
mtl'lilacin dtt A. G. C o T.
d0$&111inotcin do A ox.icJacin do G
o:dclacl6n de plrlmkllnas
8-hidroxigl,.anina, klfmami(Sopil'i'nidinM hidr<Jto de pirimiclinaONA glioosllasa
l:ltnlna gllcol, plrimldinas

ollidadas o ftagmenledas
{")Me= mebl
Finalmente, debe mencionttrso ~ ol ~imion10 M los siriOs AP es vitM no $610 para oomplelar la aoei6n previa do ~ NOiic:silttsas. sino para corregir la desputlnacln espontnea. que es un hecho relalivamenle frecuen~ (pg. 354).
25.6.4 Reparacin de apareamientos incorrectos

NOtmtl!met~te. los mecanismos de tepataCI6n an1eriotes actan al poco tiempo de cp.e se 1\a prodllcido la mu&CiOn, anteS de q.e ~a se perpe(e debido a 18 replicac:ln. Sin embargo. exis.ten ademk otros PflXl8SOS, denominados oe repataeln posteprJcacln, que corrigen errores comelidos en la replicacin o errotS ~ la impiden (~aUt~~n. por lt~nto, una vez po1 cada divisin celular). Entre elos se encuentran la reparicin por recombin.ac:i n y la reparacin de apareamientos Incorrectos. Comenu.remos solamente esta ltima. Los aparea~ incorreao& 54 prodi.Jcen PQf errores de la repliettc::i:M'I o COA' OClW'\!$6Cl!fl"I'ICia oe teoomDinaeiOt'l. el nw;mo sistema es tambin c:t~Ptt.t dtt eorregk pequofl;as insetdol'lf!S de 1 a 4 nudeUOOs en uM de ias hebras. NOtmalmente, la mayorla de los errores oomelidos ~lcii*nente porta ONA polimorasa M roctffi<;an gr.'lCiM <' su propi, aaiviclad oorrectota oe pruebas. o exonuc:leasa 3'. perro Uf'IO$ poco$ pueden ~r sin ~ e, en4onccs cuando entra en JU091> este mec;tni$1Tl0, ~ por proleiMS que reconocen la presenda de un pat de Dases lneotJectamen.le apareada& y eliminan ~ 00$0 f:lfTI'ICtt oDien un tramo de 18 hebra de DNA que la contiene. t!.stss son luego repVHt<l$ por los mocaniSmos de repar9cln ya estudiados. con fntervencin de las ONA poknerasas 6 y t. y &us OOfadores RFC y PCNA. En tunanos se han podido idemibr $ gones QUe c:odific<tn PfQ40in31s de es1 e SiSlerna de reparacin, ll&ma<I0$11MSH2. hMl.H1. hPM$1, hPMS2 y GT8PihMSH6. La cuestin mponante que ~ge es: cmo dctermirwll<'l ti\8()Jinaria de reparacin cul de las dos bases de un par InCOrrecto es la en'nea. la que llay que eliminar? P~rtcen eld$fir varios mecanesmos para esto. pero uno de ellos se basa en la metlacin del ONA {l)g 272). l-3!$ entirnas encargadas de la metilacln de bases &ardan un tiempo en aduar. por lo que en el ONA d(.lpleJ( roci(ln roplictldO 13 hebra ooeva an no est metllada. mientras que la hebra
progenitora $i lo o~ . ESio permih! a las protefl\85 reparOOOtas dlferenolat 18 hebra nueva. qJe ha de la que oontiene lt\ mut;)ci(ln, y eottegir sta. Este mecanismo se oonooe bien en E. cob . y posiblemente act\IG bajo principio$ similares en eucat10t89.
'*
ENFERMEDADES HUMANAS ASOCIADAS A LA REPARACIN
363
Com-edn 1k nuc:let:id().) mal apart'3d~:
n~ alsut~~:~
Consc<.'Uetlcas s-i no SC' corngc d nuck~tido mal apa.r~ado:
~lll'nXtilmC'IIk dt.o~lt ~ G ,~--~ _ ,_

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25.7 ENFERMEDADES HUMANAS ASOCIADAS A LA REPARACIN

Se a~nooe ooa sena dlt enfermedades atribuiGas a defee1os en genes Que todilc.n Poteinas de reparacin del ONA. Estos defedos oonducen con frecooncia a una mayor inc.idenca<~ del cincel. pue:s se PfO(Iuoe una aGumulaan de mutaQOtleS no corregidas.
EJ ~nc;cr (fe, piel denominado xerodcrmi.:. pigmenl os.a, o pigmen tari a (XP;
tne'-nQ$i$
tal'l"()ifl xefO<Ien'ni3 d<t K<li)0$1 o
lenti~ prog.esi-4), C$ un<\ et~termed&O neredittuia causada ~ ul\& defieiei"'Cia et1 algtM'IQ res~abtes e la reparaciOo por esoslbn de ru::le6tldos, cor.duclendo principalmente a la acumulaclon
oe dlmeros oe
de 10$ geno$
limina. La piel de es&os enfermos es extremadamente sensible a fa exPOSicin a tos rayoe. UV de la 11.12 SOlar. ocaslonndoles: cnoetes de piel con U'l8 frecuencia 1.000 2.000 vooes superior ala de petSOnas nonnales. Tambin sufren una Incidencia de 10 a 20 veces mayor de cin08f9S en rganos internos. y slntomas '*IOigloos como retraso menlal, <tt<txi.t~ Pf'Qgrc$iva y $0fdcra Se h.t~n idcnti(IC<)dO defct;1o3 C.IJ$t'lnlcs de XP en 7 genes del sistem<' de ~mc:iOn. que COdifican CQnl)OnenteS de la e$Cinuele3$a XPA, XPB, XPC, XPD, XPF, ERCC1 y XPG (~ 3e()). El si ndrome de Coekayne (CS) , CMacterizado por enaniSmo. retraso mental y sfn!omas neurolbglcos progresi\IOS causados por des~lzacin, tamtn oon una senM* Idad moderada a la raciacin ultravioleta, se oog."~a por mutaciOIM!S en los genes CSA o CS8, relacionados ambin con la reparacin pero ms bien oon su conexlon con la transcnpcin. AtJ;p.nas nYJtaciones de XPS, XPD y XPG dan lugar a sfndi'Of'I'IG<S solapan tes XP/CS. Otra enfermedad gentica relacionada oon la reparacin del ONA es la ttlcotiodlsltofla (TTO), OO*:Ia a mutaCIOfles en los genes TTD-A. XP9 o XPD. Se trata mas bien de un defecto de la trans~ln , que se puede eoeglr in vilro ()Or microinyeccin de TFIIH a las cUa$, Sus sintotn.<Js (en los dos Oltwnos C<l$0$ . sotapantes con XP) .,cluyen e.et dental. telio$is, onomali<t$ c$WI:IICtict\$ y retrt\$0 menlal pn;grcSO por dcsmiotinil:aan
El cilnc~r colcwrectol her~ditario si n pofipo$i$ (H NPCC, hcrodil"ry n()tijXll'yt.JOsi$ ooiOffJCUJI cancell, uno de los ci"'CE!res heredilatiOs mas comunes, ~~~~ ~u~do J)Of ctefeC10S tn 10$ ~ h1ASH2 o hMt.H 1, .arri.lQs rnponsables de la reparaclon de apareamientos incorrectOS. Se pueoen detec:~ar mediante VNTR, pues el 3istei'NI de ep,racin defectuoso no ellrrlr\8 pequenos bucles de hebra desapareada de ONA, 10 que conduce l) ....,.,_ mt'Y'Qf lc)ngitvd do algunos microsatlites de ONA (pg. 383}.
Otras enfermedadG& asociadas a defecl06 en los sistemas de reperaan son la ataxla-telan.glect.as\.a, uoclaaa oon unt~ mayor $$A$ibilidcld al dao del ONA por r.I)'O$ X, y la anemia de falconl . que parece deberse a un defecto en la repa~clbn del dalio por ef\treeruzal'l'liel\40 qoimieo OC b~ses.
Tema 26
Diversidad del genoma: polimorfismos

26.2 Diversidad ge~Uea derltro de ul'\8 especie- 3&6
M . . . .. . . . . . . .. . . . .. . . . . . . .. . . . .. . . . . .. . . . . . .. .
26.1 Introduccin ~-- 365
26.3 Mecanismos Implicados en la vari.a.bil idad g e.n91i<:41 ..................................... 366 26.3. 1 Doplicaein del mttterit~l senCbOo ......................., ......,., ......, ..., ....... --- ., .............., ..........,., ..... ---- 367
26 3 2 Transposicin..
... ........ ........
. ......................................................,_,_,_, ---------- 367
26.4 Consocu-onci<ts funcion.tJ.ICS del polimorfismo................~............................................................................. 368 26 4 1 Polimotfismo en ~ionM eo<till~cs o t>Oiimotfismo Qei\ICO. -- ... -- . --- - ., .. 368 26.4.1. t Sir\ electo iet'toUploo ............................................................................................................. 368 26.4. 1.2 Con alteoraciOn det fenot1po..................................... ......... ...... .... - ............... 369 26.4.2 ~plos represenl.all\1'06 de polimorfismo gn1 oo ------ . -- -- 369 26.4.2 t P<*norfi$1n0 ele gtVPO ~incoo ABO .... .. 369 3) ldenlidad de tos grupos sanguineos y aspeetOS Clir'lioos ....... ----- .. --. 369 b) GentiCa y bloquirr:a del sls.lema ABO ........................................................................ 370 26.4.2.2 P<*norflstnO en ellocus de la ga!actosemla ....................... _. .......................................... 373 a) Oe&eripc::i6n y bioqu:!miC<t de la 9-<~laCiosem~a.........,_,_,. ,._,_, .. ,_,_,_, ........,_,_,_,,, ............. 373 b) Gentica de fa gala<:toGetnia . .... . ........ .......... ...... ....... ........ ............ .................. 374 26.4.2.3 Poirnorfi6JT'IO de la u,..an~itrips-ta .......................................... -............................................. 376 26.4.3 Polirnotfi&n'IO en regiones gnicas nocodlficantes .............................................................................. 376 26.4 4 Polimotfi&n'IO en reglones no~ ..... _ ,_ ,_,.,._,_,_,,_,_,_,_,.,,,... _,_,_.,_,,._,_,---..------- ............ 376 26.4.5 Polirnc:w1i&tnO en eiQGnoma mitoconctraal ....... .......... ........... ......... - ..................................... 311
26.1
INTRODUCCIN
EJ OH.\ geOOmloo fltCiear es una et'ltiCJaocl e.xtte~ftOSme_nte variaele. no slo etttre individuo~ de espe~ diferentes (vMCJcin mxima, interespec~e). &~no tambin entre intividuos de una misma especie (vanacln mlnlma. intracspecie}. Es13 6versidtld es resport5ttblc do fenI'neOQ$ biolgloos de tc~n~ 1rCtsottndonCJa oomo la evohJCIOn dola<s especies y. oeruro <M ~ especie, <te a ptesenoa de ca~istie<"'$ dilerenci31e$ en c<'d3 ndividuo. t.leas e lrrepeoores. La dl\lersl dad o vsrtsbJtldttd geMtlee se debe a vaf1aei0ne$ en la $&evCnci~ 0e1 genoma. pOI' tanto, en un sentido ampliO el OOtloel)lo <'e dNet$l dlld se naoe $)tlimo de polimorlitmo (en sv S~gnif!C8do r11orat mvcholS formas) o. mas eoncretamenle. polmorrismo ~ieo etOMOSOMiOO. ae 5eWP.t'ICia o de ONA. 1.0$ provIOS do soouQnOICIICin del geooma ya tienen e_n cuenta es.la dlvetSidBd; notma!mente se seeuer.cia et geno;n* de individuos conen:ttos. representativos de distintas razas o etnias (pg. 20J.
El PQiimorlismo a-fee&<~ lanto a regiones codif~eantes del genoma (pollmorlismo (/nko) COMO no eocllficantes (pOlimorfismo gen6tieo en get~eral). En ambOS casos puec:~e eonMiir en 1<' v3n<~cin de ~.n SOlo par o. ba:se:s del ONA o, meoos frecuentetnente. de n'A:lnes de pb ( m&erOMutaein). El ptWner caso se o::lf'IOQC: hoy diil como polimorfismo de un SOlo nueie4:1do o SNP (aetnlmo Ingles de SU'IgJe-1'/UCieOllde polyr'IW(Jhism; t::Oioquio!mertte. "$WP~) Cut~IQuier varnacin pvede lene lugar en clulas germinales o reproductoras. oon 10 que se transmite a la desoenooncia (pOiim()rfl$mo her~nrio, por eifmpiO en 1M orrfcrmedades oongnita<s), o bien en clulas &Omticas, no reproeluCioras, en cuyo es, so n0 se lrttnsmlte (pOiimorlismo no het"cdit.tlnO. por Qjcmplo on lt1 mryorfa de los cnoete$).
ii'W:ial~nte. la oefit'lidn de ~ se n:lklritl a la$ prote:if\315, y luego tt sus oan95. Hoy dia, se debe defrllr como la ~e~ slmunanee en una poblacin de genomas oon <Jiistlnk:l9: alelO& P8ffl un h:X'us deleu1'Wlado", sct<t ste gnico o no. Los.,..~ son variac-:ln95 de la secuencia de ONA pre:serM en 1.1'1 Joeus o po6IC:iOn dellnla et1: 1.1'1 er001osorna (pg. 94): eonsec:uet~temente. en una ~11.13 dii)IOiCSe ~ IOOJ$ ~v10$0mioo eS1 ocupado por dos alebs. uno de origen patemo y 0110 materno. situados efl ~ cn)r'nOS(Imat homlOgo$ El grado do polimorfil.mo de una pobtaclon es
MECANISMOS IMPUCADOS EN LA VARIABILIDAD GEN TICA
367
26.3.1
Duplicacin del matorialgcntico
Se habla de ~n a g ran e-scala cuando aJecta a grandes porciones oe un cromoSOI'I'Ia. S11'1 er\lt'flr a describir los aspectos con~s del proceso (propios de una Gentica Molecular), OObe indicarse que ha actuado progre&tVamente durante fa evohJon. mediante una vanedad de ~mos c:omp6efos.
Lct d~ic:acin a 1)9que.- H cala es de inlars cuando tiene lugar en rGgiOMS codrficantes del genoma. afectando a gene:s e~. por k) Que t.amtlin &e lama dul)icacl6n gnics, selectiva de genes es.peclfiC06. La aparicin de mUlliples cq:~i:u del get~, itlici..,.lmente id6tltit*s, 5ucle ~ionC~r PO$&erionner~to "<J(;i.- l.a fOfTI'Iatin de copas ligeramente drferentes. De esla !ena, t.ll\8 c::q:lia ar.ceS(ral de ul'l ~ pueoe origit'lar IOdOs lOs miemt.lr"O$ de uf\3 f;~m ilia mulligr~lea (genes que codifican pollpeplldos oon sec:oenclas relaciOnadas, pg 110). Estas lamilii'IS CO<Iif~n diversn&protelnas 1 px:as de eucario1as: por ejempb. globlnas {POXelnas de ltanS(IOI'te y Mnacr~ de oxigeno et1 sangre y tn$CIAO). ac~s (par'le del aparato contrctil en oeuas musculare-s y del citoesquf!le.lo el\ ChJiaS no rrlu$Cultlre$} , opslna:s (Que detectan la tuz a drfetenles IOngltuOOs de onda en oll.fas de la rettna} . eolgeno (en difef'Mtes tipos oe tejido CXlt'ljuntrvo). t'lbmintts e inmunoglobulil\3$ (en (llclsma sanguineo), ele.
EJ pli'lc)pal mecMismo respot\Sable de la dl4lli*i61'1 oe genes oompiC:tos a 10 f3t90 de 13 ro<oh.-cin y, en definitiva. de la generaeiOn de tan gran varled&O y canl!daa oe DHA repetilivo en las regiOI'Ies no coomc.ntes y ooalfie&Mes del genoma eucar16tlco, es la l'ec.OMbin.!le~ no homlOga o desjgua /. tsta ocurre dur.tt~et la meiO$i$. ttntro homolOgO$ no OOeetamente alineadoS de un oor de ~s.. en 10$ QtJ& POr tantO. 1'10 coinck:Jen las regiot'l8$ equlvl!llet'ltes (como si ocurre en la reoon'lllnaciOn ~a), pero si se enrter~l~n tegiQI'le$ 001'1 similill.4 de $0C';UOf'IOO Cot'no consecuencia del sobrec::tuzarr.ento ae c::rotr~Miaas (pilg. 106), un ~o puecse recllir tMyOt canliaaa ~ m;'tteri;)l gentico que el ocro (lo que supone en ambos, ~amentl8. una rrserdn o duplicaCin y ooa deiOOIOn).
cambhr la
SCCU~"I'IC~II
de
codo cromo;oma. p:ro n(l su
canudad de DNA
~~~~de ~mr~'"'"'~S
hom~
(141 de CI(IPI(OSOC'I'IIIS
re.-:umbinnnu:s
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ca.nbia la
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ONA ~cada cronnoma
':-
Col t_!c:n \ Cf'dc ~
,.-<:1 g<'n ~<'nk se ha

pcnJrdo (ddc.;:in, n. duo:c:um, :svpre~in
g~"'tloca
h;r duplicado
(HtSo.-"f'tinJ
T8mbin han surgido por duplicacin gnica los genes que codillcan, en tejidos dllerer~les, las J$0{0.1-mM (formtts anemativas de una j)I'Oteina) o . en su e&$0, IM i$()(tfllimtts o if;ozirrws (fOf'lTiaS alternativas de ooa enziMa). Por ejemplO, la tostatasa aJeal ina, OOdilieada por at mer.os 4 gene$ dif~cn~. Que se exresan de forma diferencial en ca<1a .ejiOO. Tres de ellos estn agrupados cef'C8 del lelmero del crornoSOI'n8 20' ALPI de in.1ostino, ALPP de placenta (con un 87% de tmililvd entro si) y ALPPI.., smiar a la de placenta. El gen de la cuarta lsoZima, Al.Pt., de higndo. ~. riiln y otros ~0$. os~ localizado cen:;.a del ~ero de 1p y muestra una similitud de secuer.cia de 57% 00n ALPI y SQ% con ALPP. Tan eleVada homologi.n inc:ic<t quo estol$ fonnas especificas de la miSma ~elna enz.n&!ica se Originarol'l por una dupllcaclon gnle3 8flee$ttal.
26.3.2
Transposicin
011<1 fuorrte i~nle de vanabilided geneice es el ptoceso de tral'lspotjcin, tl.etl conocido en btrc:teritl& pero 06-1~$ eu~tr:; Consi51e en el desplazarruento. de un SitiO t1 otro del aomosoma, de fragmentos oe ONA oamaoos ~>JO$ mdY.iles, etefl)(fflt0$lr.1tl$ponible.s o transposones: su IO~uo es vnrit"ld<'. de:>dc UI'IO$ cuanm cientos de ruclelidos a decenas oe- mileS. La lrttn$()01$iein es responsable en eucariOtas de ul'la gtan ~i(lo dol ONA repetitivo no codificante, destacando las se.cuencia$ Atv y LINE-1 {pgs. 1t4-115}. que pot si SOlas supol'len el 10% delgenoma r..wn..no.
tarOOin presente en el genoma de la$
Existen dos mecan1smos de lranspoSiciOn er~ WC8ri013$ En el mecani smo de cortr y pe~r. que tambin se da en proc:ariOtas, e1 lr'$rl$P(l$tt $0 o~h'lde del ONA donador pata il'lsertaf'$e en el DNA diana. de modo Que ta moletla donadofa queaa itllerf'I.Jfl1Pidtt. ~. y el transpo&n cambia de molcula. LO$ COt!es y uniones e&tbn ca1alizados por enzimas especificas. transposasas, Que
368
OIVERSJDAO OE1. GEHOMA: POLIMORFISM OS
reconooen Cief1as &e<:uen<:itt& de 10$ ex:llomot del !J111'1$C)(!Sr'l. Er'l algOOO$ casos. 18 ttansposasa est oodlllc:ada por parto de la pr~itl sooucnea3 c:tel tta$1)Q$n,
1 OESPl.AZAt.IIENTO GEL TAANSPSON POR CORT'E Y PEGADO 1

Rcgi(H) 1 de DNA dUpkx
(o.Jun,;oo.J(II'J)
.,..,.._,.._,,
1'\\!(UI<o;,.Ja . NI"
1~SPU\Z.A.MeNTO PCR RETROTRANSPOSiX) 1
r:= LI ~-
Rqio! de O.'llA
en o:l mHifiC) Crot'lll)fOITlll o cr~ om"> di:JInw
...
4~0111 Q
diu),
---------------
Modit~~nt e ft m~nlsmo de retrotransposlc5n.. exclusivo de e~o~t<niola$, 1.1 regitl <Jet DNA dOt'lador que 96 tr<tntPOndnt se transcribe pftne/0 a RNA (1>01 RNA pollmert~5<'5 OOh,.JI<We$). A partir ele t una tr&nscrlptaaa Inversa
Of'igtna el OOfl'espondlerue cONA (pgs 195 y 206), que tve.go se inserta en el ONA diana. Este mecanismo e<s sinU al de la repli~cin en retrovrus.. cte CIO'* r&CIDe el nornbte. Debe OOStciC<tl'$0 ~ a diforoncit~ dl:lf ~t~eC~~~nismo de OOI'tar y pegar anterior. en etto caso el transposOn no cambia meramerrte de lugar. sino Q\10 adel'l'ltls se dupliCa. Pot (Jtllmo, llgvnO$ rottQiransposones oodlfiCSn en &u propia &eeuencia la! tran$Cril)tMa .,versa necesaria pera su propagacin (Por
ej~.
L!NEf).
26.4 CONSECUENCIAS FUNCIONALES DEL POLIMORFISMO

El pOiimorfi$mo puede 1ener dlslinta trasoendenc:ia <1esde et x,no eso YiSia ti.eional. dependiendo de si afecta a regi0t1es. oo codlncanles. regt.Mdoras o rodificantos del gonoma y 18mllit'l del MOdo como afeC1e al men&af& gentico <te euas llimas.
26.4.1
Polimorfismo en regiones codlflcantes, o polimorfismo gnico O. t;t parle ooelftCante del genoma humano (alrec5edOt do 100.000 genes), se aee que unas 1res cuart8s penes
son monomorlos, genes nicos compartido& Al variacin CIOf ICXSO$ 'O$ indMdu~. stos constituyen la parta del geooma com(ln o "de referenclat. q1.10 demtla es~ y detetmiM sus caraC1erl&llC88 (1>0' eJ., en hum;lf104, presencio oe cabeza, tronco, extremiclade$, etc.}. T<lln genes son easi idnticos a kl6 correspondiente en la Mpecie ms~ (en nuestro caso. el gorila}. El resiO. un~ wart& patte del total {WIOS 25.000 genes}. son polimorfO$, &U$ vari3Ci0nes, en nu::hOs CSS06 minimas, detorminl\n el pQirnOrflsrno gnlco. Dentro del polimorfismo gnico, $0 l)u&Oen di9~ulr dos sitlJaciones de acuerdo con es decir, &Y efeelo &Obn:t el f.ootipo,
w traSOII:OCJenCiJ funeiotlal,
26.4.1.1
Sin efecto fenotpico
Aun %1MdO la vatlaDIIIdad lOcalizada en una soc:vencia QX:Iilicante. et polimorfismo puede no tenor ClOn$$CVOnOM tobce el &ei'IO!lpo (es decir, &Obre el produc:Oo g6ni(:O}, prineipa!rnet~te por dos motivos: que no &e altere la SbCuei'ICia proteica ~cada (oomo conMc:utnCia de la degef\eracin del o6dlgo gentico, caso de la$ mtlf.ftre(QM.S sJ,IencioS&s, pg. 348) o que la variac;.Otl oo..rra en una rf4n de la prot.eina ~ no e& Menci<'!l par<' SIJ t~,~ncin (e-nlfe ottas, las mutacion6s 1t!~8.$, p6g. 350). Podrfan nclulr&e tambin en 0$10 Uftimo caso lOs polimort19.moe que afec.an a tos lntrones, reglonH gnita$ poro no OOdifiCa~t~.es (que, pot tanto, puedan oonsidorarse tambin polimorfismos no getliOOS, p&g. 3?6}.
CONSECU ENCIAS F UN CIONA LES DEL POLIMORFISM O
369
Este llpo 00 pobmodismo es el ms comn respoosable de una dNerSidaa genbca f!tlletamen!e normal Las Of'Q!elnas fOOTIIM'las por tos cs:lu'ltos aletos de un kX:us ae es!e tipo !IOn vammes tel<tiNAm(tflte comunes. con secuencias y estructuras idnriCC~~S o s.imilarG<S y manteniendo una runaona!idad similar Aparece por e,empiO, en QtOtelnas pta$m.illlcas totTIO ~nmunog'otlulinas <~anttlripA'Ia. hapeog1oina. transrem.,a y cenloplasmna. y en olras pt<>~eln~s t:mto inCr#l CXImO ~ll<'led~Al,~,es, ~e aos. estas formos- ro~ o ~oo.!JnlCis de ~inaos fueron ~ p(leipal produ.:co fVJftJt:iltbfe del paimortlsmo, gra.:;itt$ a tu ~r;;~Cf princip'J!m(!n!~:t m!i(lnle; eiCWOfQrC:Si$
26.4.1.2 Con alteracin del fenotipo
En <>trO$ lo variacin en l;:t seo.,Otleia del gen modlfi;) la ~Cih de pro~int'l ~ ltlt f~ que aroct<1 a $U luncionalidad. Aooque esta modlf~CaciOn puede ser booeficiosa (base de 1;, evoJuc::i6n), )o mas comn es encontrar oo polimorfismo patoiOgioo o delet.fec> (petjvditi<tl) l{l al.1cr&ein pvrxie: mod!ll(;(ll lo$ <;;;u~istic<IS t*xuimie<~S, fi$iolgic:M o nduso morfOI(IgiQII$ de la eMula, pudiMdO leg:tr tt Ofi9nac pf'OOeS()S pttlot'lg~ en klr'IOI6n de la gffl~ de diCho eJecto h!nOtlplco. Se puede distinguir enlfe ~ Vanaciooes fenoliPIC8S Que no Influyen en la susceptbib<lad a enfermedades caso de ios ~smos lll$poosables de ICJ estatura. el color do pelo. el grupo sangvineo, Ole: . Vtrri<'ICiOOO$ renolipil;tl$ qve innuy(!n a~ iOtm:t I~IIW) o trtit'lima en 13 sus;oeptlbih(S.1(f ~ <:eer!QS prOOHO$ ptltoiQvioos.
VMaCtQnitS
1rtiC$ (QfllQ I(:JS poliMorliSti'IQ!i teSpohS8bl~ de} taSgO$ motf())Ogi((loS COrt'lpljOS t~no rp;ca!i que ~mpei\oo un papel ii'OJXl'1~nle en la BparieiOn <k uM l)l)loiQ!Jitr Esto ~ 10 t' ocurre, lOf ce~, oon 1$$ hemogtObinas atloona\es, q~,~~e se man:lle$tan en l()(n'l3 de ertf~dO$ gecltlleb!S PreeiS:WI'~tenl&, el t:OnOP.ClfO de Mfern1 N11d tlf!l'lticiJ cor\Slih,l~ lot m<'lllf~lCiOn mAs obv;~ y n vooos mM cnrlremt~
"'@.
'*
ele un cam!).c) genfiOQ.
26.4.2
Ejemplos representat ivos de polimoismo gnico
A oonllnuacin so Y<ln a de$tlrrollaJ on detalltJ tres ejemplos de polimorfismo proteiCO ben ooooc!OOG. algunos too
impliellOC)t'les p:<!IOIOgiCM, or~os por st:r\dO$ polil'l\()ffi$fn()IS gcnb<:O$ en regi<ln(l$ cxxJificantC$
26.4.2.1 Polimorfismo de grupo sanguineo ABO

a} JdemKJad de Jos grupos sanguneos y aspectos c/lnlcos
La existencia de los grupos. sangulneos humanos del sl5tema ABO rue el l)(lmet caso <~eterlll) 1990) <le diversidad protetca cretermenada genticamente la elUStenola de 1tes a!eiOS determina cuauo l~ipo:s en ~ SCI!Jl9rc humana denomenados grupos sangulneos O, A, By AB. .:stos se deben a la pte$ene.a d!let"el'leial de do& anf.i9ei'OS. A y B, en la superlic.e de 10s ern~os E.stos antlgenos son o19Qsaerldos difetente$ et\lre $1 q1.tt rorman pome de e~tructuras glucldicas mayores en glleoprolilffla~ y glleollp.dos, situados tal'llO en la cata extorntt do lt~ mombr.lna del erllrocrto como Ce la ma~orfa de las ciiJ!as del orQSnsmo (especla!!Tie(lte epiteliales y endotet:t!es). r111i como en se<:~ones sott~~es (j)()f ejflmplo. en 1~$ mucna:s: ''" tipo de g!icop)telnas pre&ente en $W/a, jugo gastrt.co y seereeu)li tntestJMI) Una paruculatid.ad del SlStema ABO es que en el plasma de ~ I>Or&Onfl so cncuentron hab!ua!mctnte anbcuetPOs contra tos antlgenos de ios que carecen su!! ollu&as. Se trata de lo qe;e $C con~ como "i~nbcvorpos que e~tsten naluralmeote~ (ooluraJiy occumng amtbocbes. NAO). es deek, q~ 110 son et re$1A1ado ~ ~ rc<~ocin inmune. Son de bpo lj)M {a d!ff!fenaa de los anlicuetpOS ""unes, tg(;) y enlC)iel*t a pr()(:l(.l(;irsc "partir de los 3 6 meses de vida. En consecuenCia. en cada lndiv10u0 exl~le una fetael~ redp~ trttJe tos <Jr~IIQenos l)fU5er40:5 en 1ots eriltoclto6 y los lt!'IICucrpo& en el plasma.
Grupo O
Al)li;.t"IIOS
ptt'StCit~
Gr11po \B
(Jwpo ( 1
<:n
,.m; ..ntfO.:li<JS
\lliJ~VC~
n~~luraks cu
llla:.ma
yy
:umA y llllllU
370
OrvERSIDAO DEL GENOMA: POUMORflSMOS
Lit trascendeocia de e!IO$ anticuerpos nacurales tadlea en que detennlnan la COf'll)atlbllidad de transfusiones ooinclden antiQ81106 de lo& erilr0Cito6 del donaMe con anticuerpo6 del plasma del1ecepklr, En ~cia. el grupo O e:s don8nto \ll"'li~l y et A8 .s
sa~ulneas y de trasplante de te{lelos. Una comtndn competit:te es ~lla en la q.e no
receptor universal
L.-"" ~'fltl'l<:hos dd dona::ru~ no de"'-'"' cnoo~tl'.ll anucuerl)(ls .:oura SU!l anllgtOO!> cn ln sa~ del rt-ccpt()f (s.i ~ fw:sc-. .se produ<'irb In at;~ncin de los cnlroc:ios doondl).\)
rc:sultados
Compatibilidad en lransfusioocs
f~ayo
scrolglco para detem1inar el grupo sanguineo ABO
Ala;J(hr pi~Rt o. mfls comii:nmenu:, ~~~ero de un gr\11'1(1 san;uinoo oooocido a los cnlrocil~ de un11 m"c~1.ra de ~anp, btm (imnlu, agrcpkl~ si el suero coBticoc ami~~ ()Ofltr, I~X anri.cno~ prt5CnJc!l en la .Mipcrfw;ic de: IQII~o.TiLn,.::iun.
Reactivo
resultados ( ..- - ~g.acln )
grnpoA
Suero de yupc) o grupoAO

IIOI.lA
jy\lj)O
f\1 ueslra
:t:ruooA
EtllrQ~.:ItO; de
~
A
:a.null
"'t""'
llnli A '! IUmU
1/ 1\
iU'IIICtlcrpo$
COOti('t!Cfl
que
grupo a ~f\lpo.l AO @.rupo O
B
1\)
+ +
+ +
-+ + +
ru"llunq
IX ~.. 'C'll
l:.J'IUl;CI~
b) Genticb y bloqulmlca del sislema ABO

DeS<te el punto e vista de la biologl01 moiOQI.IUJ, es de sumo il'llris considerar &M mplleaoiones en arrtles iiN:~as
ae un Sistema pollmiCO tan repro$()flt{Wiivo como e-1 de JOS grupos sangufneos ABO.
Et sls~ma ABO consis:te. corno se 1'18 Indicado, en oo polknorfismo de oUgo&.adridos (ectrb0h~1os}, que es el t$$Uitado de un polimorfismo protleo en tas glco&llttansferasas responsables O. lcli simosis 00 e:sos OllgOSaCrldos. tste se origina, tt sv "ez.. en un polimorfismo gnico. '<! existencia de 3 alelO$ p~lltl el getl del sistema A80 que codillca lt\ g!lOO$illranS'erasa. P otra parta. la ell:pre&i6n do lo$ <'n1igenc)$ A y 8 O$tb condiCionada adems por la de otro gen poirnorfloo. et gen H, cuyo prodiJCtO ptOttieO e$ otra g!lcoslltrans1erasa que sintetiza el cart:lohidrato ptecul'$01' {;wltigeno H) SOflte el ~ ae1an tas transferCIISO):s coelif~ pot el gen ABO. Los aspec109 pattla,dare& de todo el si$1e11'18 se muestran oomparativamenle a contn.~aeiOn.
COHSECUENCIAS FUNCIONALES DEL POLIMORF1SMO
371
9
que detcnnm11n lo\ grupos <;angumeos A. By O:

c,m H codi~ luafa.'(ljlltrsn~f.emu que ttencn "l ull~o
pm:unnr 1J IIMIJC!ll.' 11.

''~ AUO c-xh li~ la ltCOIIiihnlll!ikfaolO ~. n f"Mtlt J.:-1
19
.,.. I!C'IP lf. .,oc.-.loot .,,, ltCOO~ A. u B

IAeut ,\UO: en fu bimda cmrn,"lfi>nticu 1).141 U ;en 1\ UO cubre en 1 01111 1'1',i kb, w n 1 do~ ) ( mtn"~
I.M q ionC) CUiblk,lniC) (n~! Jllmllll 1.06:! rb.. f..t lll..~t. , /J ) lJi ""'dl(.:or., "!l~lllft (11'OIJI!I)IIIW\'k .,tiJI1' o,k ~~ ~liVIIO:!< ()) "1 L~ pn,.\ol~"* ~,t,'nlc~ !k lo.lS ~II)S 1) R ~III)OIIt""'rt kk~ de,}~ <li)I!I'IOOO:Kius. O:Utt un; m.J,.;a u-.liUI:il'dr .t 1 l:l)ll) a;m idJ,~ t 1...a.:;o l1llll"f t1-MI.l d ~u nu, , rt r1udui.'lo;l dclufrio () .am ,(,In - Amtooflridn,._ 11(' llene ilal\iiLfd t'll7l11Wica
1.11\'tl, 11: e,, d bw(t nr'lt~llte.\1 I'J'-1 1 1~n U pr.:"'""", \11)$ 11k~l>( 111 ) M [1 rnlductl) l!.c.'r'lit< del ;~~ldu domlrn~n~ 11 e~ un pt)li~hdo) C llll 110:1i'tld, o,t """"' hl\11\~krfl a 1-1~'f(kl.U,.h) ll\q .l,-11 /o nv ~..,
(QIIIrio )!llll 1"-.:0 ~<'illul utllllJitl ~~~ dfl:rC Jh.'ta; CINIC JI y b.l
>
tr:m""~~"~ ~~1--"lf"'n_"" _ ~ _''_'_'_ "'_''__ ~_"__ '_'_"'_____=='-~ '==,....'==D'="'t.JILI)-:! 'i 1~-'1

..uam'
"''
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8
4'
56
J.
s.._ i
-':-'1 1~ 1 :-'1 -~ ~ ;-~1 ~.J... I - ---:;---___.J' -'1 1 1 3 -1 5 6 7

miDf!l;li mullil;:l~"'''f.!-~
l:.n l'lo!l~ ~ ~-~~
>Ct!
cl"lducclliln
l'l!'f'llfl\llblc.. 1 f'.' lml< rti.. -u~ot~f.ko ~ '""'!!lineo;;; Al}.( 1, qur w

d~tlll lllll 11 <'<ol\Uflllll\11'111
ptOfdna:
protcin:1 O
Pilfa una mep- cornprenslon de las dif.erencias causan!e'9 del pobmorflsmo, se detallan lOS pVnl.o$ pohmrficos (on los e ~ 6 '1 7) de la11 :;ocuoncias <le mANA y proteina sin1etaaos PCIC' ca<la aieb, oonsideranoo el A como t(lfeteftei!."t y el B y o como mc.sltl(liO(leS de a<u" l
mRNA y J)I'QCCntl forn~<tdos 1 >0r d alelo A:
CONSECU EN CIAS FUNCIONAL ES DEL POLIMORFI SMO
373
Los aspecto!> considerados se pueden resumir moslrando las re!aciones entte lo6 dos tocus gf'llcos. sus aletos los productos gnlcos de s!os y los 81\(lgenos resultantes de la aocln de Has enzimas
Anl.igcno (oligos<~etn:fo}
(o tocvs)
Hh 2a~:
"""
Alelo Ptodudo gnlc:o (proleina. g!loosltltans.lerasa)

H
-f~ indicen vsriOs nomores" su t~mero de dll:&irlcac;on eq
generacso por a
*oslttransferosa
H
Fucoslltransfetasa
GalllctSoO 2L.fuoo6illrar'ltrl!fa!:a
H domtnranUt, h f0ott$1VO
A80
EC2.U.69
h
No tur.clonaf
GalaCIO&.anWliltral'l$fGra$CI
nintuno
A
uN&eellgellletOS8,........1rlr'rSMt8S8
3 alelo$;
AyS
Ttll"'$fera:aa oet l1lJOO n~ngulneo A
coclonw1antes,
ec 2.4 t40
8
<:iiiCOOfOieii'I841JC06ilg~O
fOCEISI'YO
Giii<'Ciosittran$iet<IIKI
Tr&Miet<l$01 tl gtVPO h~llQUintO 6
GfieQPIOI$1no~..tui;O$ilg<"~c:t051oo v.gat~:&ilr.Jn&l~
EC 2.4 1.37 No funcional
nin uno
El geo ABO oonstJiuye un e,emplo dslco de mtlalellsmo: bs alelos A y 8 son ood011Wlances, mlflt\Uas que O es ,.;eSIYO. POt 'o Q~ lOs 6 gonotipos PQ$ibf(t$ dot.ermnan 4 fenotiDO$. En :uani.O al gen H, 1Xl'$ee Kilo 005 atelos. uno domintsnte (H) y et otro rec:esivo (h) . qve prOOuccn 3 geootipos y 2 fenot()O$
1po, feno tipo antfgenos y a ntlcuerpos pr esen tes Gr u po& sangu1neos: geno t'
Genolipo
AA
AO HHOHh
F~OtCX>
~$11tt8n$1et<l$3$
An~
Anlie~en et
sintetiUtd<'ls
~.n1es
nlasma
grupo A
HyA Hy 8
H. AyB H
A
H(pocotyA H(poco)y B
H (poco), A y 8 slo H (mucho)
andB
aMIA
ninguno anti-A y antiB anllH, 8tltio.A y &nliB antiH, MtiA y ~nb-8 antiH, uotiA y ;ni).B
se
80
AB 00
AA
AO
9""0 8
grupo AS
grupo O
grupo O grupo O
grupo O
ninguno
ni~ ni~
hhC)
B8
80
A8 00
AyB
grupO O ningu~ anti-H, antiA y anUB nif'9J'lO ( ) En el caso de genobpo hh no &e S1ntec1za el antgeno H poc toque no se {lW<Ien Stnlettt:or '0$ antigenos A ni B. au~ exi"an glioosittransferasa~ de tipo A y/o B. Por tt'nto. et {.JrVCIO wngulneo e6 &patentemente 0 : &e le llama fenotipo O.., Bombay
26.4.2.2 Potimoismo en el locus de la galactosemia a) Desetfpcin y biOqumica de la galaclosemia

La gatac~en!ia es ul'\3 cnrermed<'ld *"'osmica rece&iva causada por la impos.Mdaa oe metaboli.t3r ta galactosa. oue como consecuenCia se aoutr~uta M sangre. sintom:t qve dctorrninta _, nombre e l;l. enfenneooo. En teoria (vase ta ruta metabOiica). ta 9<'1t'ct()semi<l uede deben;e a mucaaones en <lis1intas enzimas, oe hf!CI'IO, <'l$i M ha de1T106trado, aunque con escasa ine~iOr . El'l 1& prbclict\, 1<t ~uWJ miu; rt.cuente &OO mulaconea en el goo que codifica la enzima ga!actosa 1f06fato urldltl!ttans.ferasa (GALT). En Situ&eiOn normt~rt. est3 enz;iml', de 379 aminoadoe y ur\8 masa de 43 kDa, tormt~....,. dimero que calaliza la reaccin
Gl!rlhP UTP UOP-G&I .. PP,
El norrtlre corredo de la e.nzlma es uridilitlr<'II'ISfetMa, I)Of(lue se transfiere a la ga&actosa-1fosla10 oo res10 urdt<IIO (UMP); s-" embargo. se suele usar utid'i!1r(ln$fet11S3. Ob$6M:IM que sta es &Oio una de las l enzimas Qt.Je tr.Jnsf~eren un grupo \n:ltlalo.
374
DfVERSIDAO DEL GENOMA : POUMORfiSMOS
1RESUMEN DEt METABOLISMO DE LA GALACTOSA ]

m1a 10031 de utilincin de la galactosa
fE!\Illac;l""'\
ATP --.... 1
enzima 2
galactoquinasa
ADP _.,- .
\ITP\(e,.., . \
enzima 1
O
_ . / "'--) '-._PP, 1' -<P
PP,
~\....
(ll)PGw p
a~ d 0
UDPQio; p
o~ "d 0'
0 1 -.. . d./ .__:; ; ;--
.............. glucogcn()!,oCncsis
UOP .galactosa Opimerasa UOP.gtu<Xl6a eo1merasa
enzima 1 : EC 2.7. 7. 10. UTP-tlc:xos., l fosfaiO ul'idilih111n <;;fet:l..~, o gaUlctOs3lfos-rato undahhr.tnsfcrasa. o GALT 1f:.s~s ~ la cnr.ims cuyo polimortismo Sl" dcsl-:ribe aqui) enzima 2 : EC 2.7. 7. 12 UOP-gluc()S:lhex:osa-1-fosfato unddtllransfcrnSIL. o uridil uun.s-t'l'TilSil en21ma 3 : EC 2.7.7.9. UTP-glucosa l fOSf3tO uridilihrans tCrasa, o g.Jucosa l-fosfato uridihltransfc:rosa. o UDP-ghtC(l($.1 pirofosforilasa
La deJicamc.:ia de .:uodquicro de CSt.'IS cn7inl3s dificulta la uliliznctn de la gaJoctosa y.
por t:uuo. e, <. causa potencial de galaclosemia:
GALT (enzima 1)
epimc,_"'f'.ua
enzima 2 ~lncwqui n.asa la ni~,a <le in1cr:s cllntco es 1 3 dcflcicnciu en la cnzama 1
Los recin naCidos con 9 *losemia comienzan, en las semanas trM el Qcio de 13 ~1.3tleia, a desarrollar ptOblemas gastrointestinales.. c:in'o$i$ llti)Atiea y ca\ar818~ ms adelanta la enfennedad pro~ rOita$0 mental y con rrecueoaa rewl\a fatal. Se puec:~e evi* 1a mayQt parte de es!os efectos ad'l8t$0$ climioanoo ele ea alimen&aclo 105 productos laaeo& y todia 1\len'- do lactosa o gataCIOSa.
b) Gentica de lB gafactosemia
Los niflo& afectado$ son hOf'l'loeigtieos en el IOcu& GALT para un aloto mut~~t~te . Se llal'l eocol'lttado al menos 150 aMios diferenes tl'l este tocus (&Muado en la barda uomosmiea 9pt 3), con loftuenca variable 50bfe la aoctividad enzimilt~ y. consecuentemente, sobte la PQ$ibilidad de dosarronar la eotermedad. Las frecuencias de eSio5 alelO$ vorien muc:r.o dependiendo de la PObl~ein coosidCI'ada, como suele ocurrir con todos lo& poli'norfl$11'10$ Los aleles ms frecuenle&. N {nom'ICIII). G ("9'~to$emia ClsiCin, O ("Ouane o "Owrt9-Z') y I..A ("1.11)$ ngeles o ouar1e-1") dan lugar a las ~nte$ $ib,lnci0c'll!$.
CONSECUENCIAS FUNCIONALES DEL POU MOR.FISMO
375
G~Otipo
ACti'WidaCI entimtlea
FenoUpo b loqu im ieo normal galaetosemla dsca normal. Quane" (accividad reduod~ . lWI tra&Gendencia) normal Los A~oes: (<'letividad exceSiva. sintra~ia) p normal (actrvidacl redtJcida, sin tra&Oendencaa)
NN
100'4
<5%
GG DO
tALA
50%
140%
NG NO
NLA
50%
75% 120%
GO
GlA
OlA
25% 70%
95%
normal (aclividacl redtJcida. &in tra&eer.dencaa} norl'f"'al (&etrvidllrd excesiva. sin tu~seendMc:ia) srtuaon llmte normal (aclrvidad redtiCida, sm tr\\scenclone.a) normal
1") El l eflotipo bioquimieo "Ouarte se ientil'tea porque la eru:ima GALT se ptesenla M \lf\3 tsOIOt'l'l\8 m&s aclda {coherente con la mui.8Cin oe asparragtna a asprtiCOque se explica despus). oe punto ~bic metiOf. que avMZa 1'1\M tapidarnente en electroiOr'esis y en ISOOiercttooef'lt.oque se Si!W. cor~ oet <\1'1000. La$ V31'1Mte:S Ovarte t y 2 $& diferenoan en~ &etivid8(1 enzlrn3ti~
"'*
TOCios lOs lenotlpos resumidos antenormente son a su vez polimOrllcos. \..a reduocion de ta aciJ'YidacJ enzlm&tlca varia en distinto grado segn la rombinacin de alelo& <JJe presente el indiVIdUo
Detalle de las mutaciones causantes del polimorfismo en el kX:us GALT

Se lllolle'lrn f; ~a do: l.r. fll(lleiiU! VAL! ll()fiiNI il(lo.:o.t$ p:-o~l((l~;ll b t1M11b o,:rv,.,...o \rn"" 'Jrl J
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121 SAAGVCKVMC FHPWSO'JTLP LHSVPElRA'J VOA1'1ASV'iE:E LGAQYPWVQl FEta<GAHMGr" l!ll SNPHPHCO\"W ASSE'LPDIAQ REER:SOOAY:< SQHGEPLLI>!E: YSPQELLRYJ::. RLVL7SEH~il. lH \ILVPF'WATWP YQTLLLPRRH VRRLPEL7PA ERDDLASI~Y. KLLTK YDNL.F' ETSFPYSMGti JN :iCAPTGSEAG AN WNH~LHA HYYPPLLRSA T'.tRI<F!.fVC'fE t-1-LAQAQRDL, PEQAAERLf-'.A J~l LPEVHYHLGO KORETA71A
Ln Jo~"'U "e i""icn modian.:- r.< nllt\-~i.r.tu~ oJO: UIIA lo:lr.t!XII'II !OS noIIIOO(idM (p.IS. :!~1
C"~~o."'b biO..lll<' ~0001iene li> III'IOO~,.,I(o,
1nurii\'IliO:In okl primero 11 liil iliJIIIoi.ll 111'11 (l l wPr<..tli") ,...., ;)tl'loo~CoOO~ dc;l Mu) ach..> l''!rilld:i'' o::.'*'('l'r)t'l'a; kb do:~ ro:Hd~~ ;,k hutidma p.wticip;m rn
la ~.-it,,;~~. So: b:a ido:nci fio:nd..> oom O llillla..:oiln. 11 IIWQ (lhJ-;.Gin, nu ~In nqui l. qut :..focta d.n"Ciamemc ni ~m nctt\(1.
1~ muucin Q tiS R (Coln At.. dcbilb 11 UN tmnsici6n (\ -~>(C .{,) ei IJ ~ IOW<'tl!~ o:n uod>~ldu% ('(Oro
al rt~,.'IQo,o:no o:l ~l ro~ ;:~loro.."Me ~,. ~~~
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CUIVP,:II y
nV~WankTO(-.
('lUJO~~ nut. . 4Gin IS11o:J un aminu.kido a!lilrllento: ~'lmi~"IO). (lllt 111111"
CondulY ~ ._... prol~llla ~'WI a:lildlld cwno:ul p.11~ 111 1\oncio.ion. pr<obobktlll;niC rcoo
o:o:rQnia al centro ttni'\l) y 1101'1 ~UJIO p&..:~rnieu.
lA lllutu:tun K-2115'
I L)'l'-.A.~. ddltd11 a un!! ln lnS\cl"'iM Ai\Ci ->A\ 11 e b ~o~~~~ 01\i<. (~oh;:,. l;j f'(lblao:o~oto
o!IM(J'Ie._ Tic1~ tllnlbi~n o:f~cto-; ((11(llpic.,... eravcs i~I;)~(01;~oftoa)_
l.-11 rnuuon S IJS I. t~r-, t..cu. dcbtda 11 1111a tJ;J111!Cj;in TCG-.Tr Cil ~" ~(lei:olll ~t;: ll....lld;lntC 1 ~~~ O.:lh~~e< \le JIIIICIOIOffl:l a un; la po\>IIICo o)tl aconca'l"leiii,'Anll oJc: r:a:l f'ICf:111 1( (110(111"' ~Nr.;u.l") Y &Ctl\'idad <nromil!icn no<>< rc"(luddo. en di!>1in111 mo:lbdt )l;ll'"' ti tt')ldu nm.-:>deraOO. Se (lUC'dr dl'll'CIIll e~t~ n!o:ka tncSJi~m.:- Rflf'tpis .}.t( t 1 . n(lro\~() ~ 111 no \lh('On lq,;-o: ~~e1 una d iuna pm-a la enl':ima de le'lrio.i, ' m r;,q 1
b m...ncin ~.ll.& l) (Ao;n->A~r. dcllo.:b " oon:. 1ran...c1M ,\ AC .. to A(,') ~ ('a(l'll'll;oi otica olo: IOh -Ou.tc-,.,., ''tJw.t.nc.l-1 y "lo)S n~~- 10 "Owtto:I-J, ti pntncro -.e C11r.lo.'lm-!ll p u11n ..rll~idld cnntnal ie.l te((uo:ida o r~~~ <k;l '\(l"o), n1 tom!111~ ('J !i<'liUI~ tou,....,I,..IICt""'ad ~..,.-a In de ondnid~M> I)(Jmla~ (IW;;,I, [1 knlll opo ''I.Q< .n~- wc:ll; fW:i('lllar. ;~dtmil) do: In ant<nC~r. o n11 m~~tllcicin ~leno: Mln U: un tlcool....,.. u"'"*~lo)n ( ' lA n A. quo: pm"\'\:1.' )l;f ll'"P'Uh"'bJr dt u na traduo:d~ 1'1111> rl(lio.b ). J)(ll d.to. oJc: uru !N)~r C(lnC('IIIr.ICo~ dt; <lllna o.tUf <"\PI""'""- o:1 ;u,ment.;. en netni&d Clllim~IICII.. Al 0 5"AI qooo: el<&~ I!Meoii)f, w pueden ~ llfl!lxl ..~l~~e< moxll\rllt.C kfLP. J'IOC->!0> q11r 111 m ..l.o uoo A_,(j ~C(' artnre>:o:r u~ <lana f\II"J 1:. :n;oo~ ok n:l!tri., '<:'o .:. AJ 11.
f''""''I'W
CONSECUENCIAS FUNCIONALES DEL POU MORF'ISMO
377
mjs not<'!bles ~ genom<'! ~ un ~dividuo e$ la exC:IUSiw:l""d ~ su petfll get~OCO (satvo (lata lOS hefmanos gemelo$ univilelinos, individuO$ dnioos que lerd'lln lOS Mi!I.MOS a!elos el\ cada uno de sus IOc::l, aunque induso M este caso pueden exls.llr diferencia& debida& a mulaC*:Wte$ somtica&}. Se pueOO, por tan>. ubhzar el anli&~& de e&IO& polimorti&tnos para ta ldenlfficacin de una per&Ona, con una fiabi!idOO 1 gual o $Up(ttior a 1<1 de leas huellas daccilaores, b que ha dado lugar al trmino h uella genioca o h~Ua dactilar geniti~;~ (p\g, 385} Con este objeto se e~n pnnciP'*nentelos polimo.rsi'T'IOO en IM regiones de ONA mint- y mi0'0$316!i!e (p3gs 114 y 221), Por otra parte. ~to que la& secuencias no codrficantes no proporcionan informaciOn sobre C<'lr<'!taeri:s.ticas .spociales de 1M P8f"&&nas (posibles enfennectacfes, cualidades fisica$ o psiQ~:s.. -..). .- ttn~lisis b<'iwdo en polimOrfi$m()$ de no codificanles po$&8 la ventaja de evil.ar cualquier oonfli~ 8tic0.
'190'1'"
26.4.5
Polimorfismo en el genoma mitocondrial
En el 9l!'t'IOM8 mitoeoi'IOriaf p~ darse lgualmet~te MU1aeionea que generen un pollmotfiamo. Su ONA e:.perlmenta mayor proporcin de mo\aciones (pJe el nuclear, debido a la exposicin a especies reactivas de o~~:igeno, resultantes del metaboltsmo oxdativo nvlocondrial, a enconiTar&e ms desprOiegido DOt carecer de tuslonas y a la menor ellcaC*a de lo& &lStem~s de n:tPat;JQn mitooondriales De esas mtJiaQOncs, ~a$ ~ .;~J~n <1 rogioncs codificanles (ms del 93% de la molku13 de m10HA) svolen tenor oonsecoenci<~s oerjUOiCiates part' 1& tt.~ncio~ de las ptO(elnas Qlllt oodif~ean y P<Wil 1<' v~ de lct o6fula l.<ls mut;tcionos en lil r(:916n no CO<IifiCante ~ OOtlsetvan oon I'MS facilidad , al no !XCcr eio~ ~1'041Dioo A<)Jcllt'l$ ~<'!ciOnes que no son l)efjudidales dan ~r a 1)0timotfi$ti'IOS genticos: c&Oa "et parece ms C:IIII'O que ~lOS 1 8n-cx>OO son oompleltlme.nte ii'IOC'I.JOS para las dferentes funciones celulares Por ejemplo, vn3 oombin3(i0n ~icut~r de ;)lelO$ en variOs loca DQiimorfiCOS del aomosoma mltoOOI'Idtlal IM.lmano (poco lreeuent.e y denomin~ "MI)t091\1PO T"J da lugat 3 eSC)ef'l"l\8tOtOi<les con motJildad teduciGa.
Como COtlse<:ueneia. tos polimorfismos mils comunes son aqullos que afectan a la nica regln no CIXVflcante del DNA tnitooor'ldtlal, conocida como buele O (pg. 1&0). En este corto tramo de ONA (1.112 pb en hl.l'nanos. menos del 1'% del meONA total) se acumulan mu1ac:aones con untt frecuenCia cinco veces superior a la del res.1o <ktf ONA mitooondriclf En p;llflitlllar. la lt'l$3 <le polimotfismoos es maxima en dO$ pequeiias poreiot\es deo.! bUCle O, Clet\Of'l"'inacsas OQf ello r~ione$ hipc.rv#lrillbkt.$
asa de des-plazamicnlt), bucle D o

nu..nM:'I'utiln
O-loop ~ 1 112 rbl
!oif::---;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;-''f "'C'"'''~;;;:-;;:----l
1 .,.,,
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11
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n."til'm n.-~:ubdom dd CfUt!l\XoJfll.l llorig_.:ne' de

r('flhc~K;iM t0)) JIO'n~"<>rt~ h~i'lr*" I)('SJIL.I Hll }' hi[Cfll (1
t' ll ""'11\1""' anhfll)lanu U

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\k Tfllll ....fljXIOO 1P1 ,1(' IJ"
Ml\1:1 {Cn:il Jd ~Cit!r' ,-t~l ll~lt
dos regiones. pankulamllle ricas en polimotfl5nlOS, .a;.e utili, ,.an habi1ualm.:nl.:

.:n pnteb:l~ d.: Mknti<.bd
El aniiSis oe polimorfismos en las reglones h!pervatlables mitoeonl';lriales eSt) ~Ntr<'lr\c:to Qran <tplicac:a6n en esb.ldlos fartaares. aotropo!OgieOs e...otutlvos y tambin de ldentifitaC:il)n, A &:Ste 6xil0 OO'*ibvye lambi6n lO oonvenienoa de obtencin y maoop de mi*StTas mitooondnales. gracas a ta emtencla de un mayor nUmeto de ooplaS (cien1os de mitoooncfnas par olula, cada u~ con decenas de copias de mtONA}, 10 que diSminuye la probabilidad de que IOdaS estn de$1ruil';l3!1 o dal\als, ttad!Ciet'I(I()S.e en ~inlliva.,. un<~ mwyor estabilidad del ONA Por 0110 lado. al ser las tegfOfle& hlpetVarlabtes mucho ms cortas en el mtONA es imptObable su degn'ld<'lcin en 10<1<'15 !;as (X)Clr.CI$ do ONA de la muestra.
Tema 27
Anlisis de genes. Deteccin y aplicaciones de los polimorfismos

27.1 ll'ltrO<Iueeln -"'-.. ~"'''''''''"'''''''''''"''''' 37$ 27.2 Anlisis de genes ..,,,__,.,.,....,.,_,.,, ., ~................................................,_,,,,_.,,.............................................. 380
21 2 1 81jsqvedtl de gtt~e$ )()r ;)n(lli$i$ oe ligar t liento,_,,,,_,_,_,
.. --- ...... ........... ... .... .. . ....... . 380
V .2.2 Empleo de mtooos l lsic::os parara iOentlficacln de get1es ............................. ,,.,_,_,.,., .,.,_,_ ,_.,.,., ...... 380
27.2.3 ldentlflc:acl6n de genes por secuenC18CI6n ................ ................... ..... ......... ... .. .. . .. .. . ........ 380 27.2.4 ClonaCIn funoonal ,,.,_,_,_.,.,_,_,_,_ ,_,_,_,_, ...,_,_, ..,.,.,_,_.,, _,_,_,_,_,_,_,_, ,_,.,_ ,_,_,_,_. 380 27.2 . ~ kjontiflc:<~ci6n de gene$ y bioinfQnn6.tic;n .................. - -- ... -- -. --- ---- ,_,_, -- 3SO 27.3 Dotoc:ciOn de,l po limorfismo de s.ecue,nc:i:a de DNA .... -..................- ............- ............................. -............... 381 27 3 1 PolimorfiSmos en 1810tlgitud oe lOS frttgmer'ltos de resbiecin { RFLP) ---- --- ,_,_,_,_,,.,_,_, 361 27.31.1 Ejemplo Polimorfismo en 131\...giObir\3. ~nnte do lf oncmi<' ktlcif(lm"'I 382 27.3.2 Polimorfismo en e1 nomero <le reoetieiones el\ tM<Iem (VN TR) . 3&3
21,4 Aptlc:ac:iones do J os po !imC)tfi$m OS do DNA .............................................................~.............................~.... 384
~<'e poliiYIOrl'i$t'I"'IS SNP .......... ........................... ,_,_,_,,,,_,_,_,,,_,_,_ ,_,_,,_ ,_,_,_,_, ,,_,_,_,,_,_,_,,, --- 3&4 27.4.2 AA.llsis del ONA oon fines familiares...................................... ........ .... ........... ........ ........ .......... . 385 27.4.3 Huella dactilar de ONA ................................................................................................... ,_, _ ,_ ,_ ,,_ ,_ ,_ , 38S 27.4.4 Anlisis de polimorlismos con fines ciagn&tiC06 .. . .................. .................................. .. ......... .. 386 27 4 4, 1 Oi;igns.tico dCJ ~ oongni!Q$ del mel~boli11mo 337 a) Vt\IOr<ICioncl$ prclimin&IOS ,,,, ,,,, , , , , , , ,_ , ........... ... ..... , ,_, ..... 387 b) Ensayosgenelioos.................................. . ................. . .. . ................................... 3&7 e) locld&ncla de las enfermedades congnitas .................................. ,_,_,_,_,,,.. 3$7 27 .4.5 810Chlps o e~ de ONA .... ............................................................... ........................... -- 3$7
27.4. 1
27.1 INTRODUCCIN
Son mue~ lOS aspe.ciQS de intets en et e$t:vdio del ONA gnico, t<Jnto desde el punto de vista bilsico (WormaciM sobre el )(()plo gen) como. espeCialmente, pata su al)lielli6n t11l ostv6o de 13 enfermedad t1"1CAecular con fines diagnsticos y teraputicos. Aunque et eonoclnVento del factor gen&lic:<> (1() t:>il$1<1 l)<'r& resotvet' definitivamente la enfermedad. si que es obligado conocer el aspecto molecular del get1 o 9f!i1eS cisrtJneiOI'ISies re$1)0tlsable$ (mut<lci6n o mutacione-s) para poderla Identificar. El rnero de enfennedades pata las que ya se tliSI)On& de inforrn;:tCin 96nic<;l Cll muy amplio; se pueden a.ar, por ejemplO, anemia talcif<ltl'l'le, cnoet oe mama y de ooiQn h(!IC(filttrios, eore<~ de Hunbngton. distrofias musculares. enfennedad de AIZhetmer, enferme<latl de TaySachs, fibroSoS quf.sbcl1, neuroti!)r(ltl'll'IIO$i$, po!iQI'i$10$i$ renal, $ii'!Orome de Marfan. 5indrome del X l'rgil, &Ofdera hereditana. etc. El objetivO de la get~miea estruetural (p~ . 217) .s identific<~r 1<1 &CQ)I(ttlCIOt del genoma oomplelo y, sobre lodo, klcallzar tos genes responsables de ef\terMedaeos. Aul'lque el I'IUrne;o de gel'les I~<"IOOs ht1 ereodo exponencialmente dl$$de bs ao& 70 hasta la ae1ualidacl, lo& ya ientlflcaoos suponen menos del 10% deltolal de gei'ICS presen1es en el genotn;J n~,.~mt~no (.sl'nitOO como media en unos 100.000 genes, pilg 239). que a su vez sOlo equivale a ul'l 3-5% deiQei'IOn'l~ !Otal (Pllg 108). Entre 106 aspectOs estl.da<IOS cabe eltar 18 locatllaeir'l tiC ger~es en tos cromosom&s. la identrficacin de la funcin de sus productos gnloos en la clula, la bsqueda y tleteocion de genes ;)l'l()m(IIOS rospon~~ables de cnfennod*& wnocidas o t'IUeVa&. la identiflcaciOtl de mutaCiOnes respons.ab6es de m tii'IOr'l\allias., el esttldio del polirnorfi$tn0 dt &ec:vencia. el anliSis de las prolelnas sintedzadas en forma alterada, las pruebas geneueas en el
380
ANLiSIS DE GEN ES. DETECCtON Y APUCACIOHES DE LOS POLIMORFISMOS
<iagf!O&tioo <:llnioo de enlermedades monognlcas y
"'uraaorlales, etc. El conocl~to de estos y otr09 aspectOs se ihcrementan'l en los prximos atl06 con los recientes avances en el conoc:wnienlo del genoma humano.
27.2 ANLISIS DE GENES

Bajo un tOmw'IQ t.1n g~::n6n::;o como el do an l isis de genes se estudian en esl.c lcm.."t tllguno$ dO k>$ pqtlteamientos y hemltl'llentas bSICBS sobre las que se asienta la nueva medicina molecular. medicina geoOmlea o medicina del futuro y en lOs Que w ba&a la Industria fannacutlce en un ~n&enlo de de&errollar frmaCO$ ~ accen t;Obre gei'IEI$ anmalos. oon $$tralttg~ P<'ftl ~lit~ o wroglr u funcin. N1.1011tro orrfoquo, inc:witt~blomonto r"lringido, no se dirige al esllJdio de enfermedades cor.cretas, mb propio de 1ra1ados especializados (clfr:os, metod016giCXl$, etc.). Y\0 a la desctlpdOn de algunos aspeciOS aplicados en ei diagnstico y la teraputica. partiendo de la INormaciOn apottada en los temas precedentes y siguiendo como objetivo los punto& incluidos en los temas
siguientes.
27.2.1 Bsqueda de genes por anlisis de ligamiento

Un primer paso en la b6squeda de genes es ta decennintaeln aproximada de &u presencia en tos <:rOITIO$Omas. El anlisis de llgarrento clsico. ya 9$Wdiado pera el mapeo <181 genomtt (g 218). pormitc tt,..gu~r la proximid<'d entro do6 genes a paftlf de la fT'Qwenci;J oon Q~.~~t 6.-os ~ recomtlinados en la descendencia. Ef'l nurnat~os se (:()~\Sigue ~ loca!iucin m;b prOCi$a Sl el 311illisis del gen llust&cJO se Mee no tespeeto a otro gen. sino a marcadOtes genfiCOS. tspe(:it'lmetlt$ lOS I)OiimOrfiC:OS (pag 221).
27.2.2
Empleo de mtodos fsicos para la identificacin de genes
EMOs propon::iOnan uf'la IOC&IIZ.ac:IC'lr\ ms pteds& de los genes, ya que se describen en dislanclas ab&olulas de pb {J).tg 221), So l'laoe uso de m'lodos basados en algunas caracteristkes de 106 genes. ausentes en regiones no eodillc.ntcs Is lotes CpG. Se ecnoce la ~la de ISlotes CpG hlpomedlados (Pi'i9. 272) en la regin promotora de genes de lo'ertebtados que se transcri:len activamente: ms del 50% de los genes humanos ~nt(ln tale$ i$101 0$. es posible udizar las genote~ (pg 215) P<tr& butcr eS1e tipo de seeuei"'Cias y aSi idenlir.ear get~es potenciales.
OOn no caracteriuados Marcos abiertos de lectura.. PIJesto que 18 regln codlflcante de todo gen ha de empezat por un oodn de inicio y finllll~<'lr .,.., ~ oe tem'lirw::ln, 18 bsqueda en las genotecas de segmentos de ONA co~dido& emn, $$\os tripiC:!O$, $0gmentos denominados marcos able.rtO& de lectura (ORF, de optM ffliading frame: POig.. 2941 es otro me!Odo pata encontrar geneos potenCiales. Genotecas de CONA . EoMentemente, \ft gen que se Gxpre$8 en un tipo <:etul8f oetennina(IO M de estar reotesentado porta presencia del mRNA IT8nscrito a paftir d8 l El en!i&is do gonot.ecM de <:ONA (P89.. 216) es. POf tanto. otr.~ fuomc para la bUsquf:da de 9f!toeS nueV06.
27 .2.3 Identificacin de ganes por secuenciacin

La soouenciacin serta la Jofflla mas diMCI& '/ sendle de analizar un 90" de de~ un po!imorlilimo o una mutaciOn. Sin emb.ttgO, en la pdtcllca. este objeth-o no es f.ic:il dado el tamal'lo y oomplejldltd dOI ge:nom tunano y tos prwemas talicos espealiZ.SOOS e incluso econmicos <PJit ~ te &OC:UenC~iOn a gran escala. Es pteterble seleccionar o cribar", pcw alguno de lo& mkdo$ antefiores.I()Sftagmontos candidatos antes de secuenc::iartos.
27.2.4 Clonacin funcional

se plantea cuando ant.es de conooet la alteracin del gen se ~n'ldor~~ su prooueco g&r.co. por ejemplO ta proteina respoMabte de una enfermedad (como la tf.globina en la anemia fatCilorme). El obje:tl\10 es entonces iOentifiear la secuenCiB deJ gen alterado a partir de la sewenc:;ia do 1~ l)'()(elna anMala, proceso conocido oomo clonaeln 1\melonat A partir de la secuencia de ;,minocidos se <teduoe la seeue~la de oocle6tldo& del gen y se disefla ~a sond<' {pllg 180) que permita kleallzar por hbtdacin el alelO mAarrte a&Ociado a la enformodi!IIJ,
27 .2.5 Identificacin de genes y bioinformtlca

t.a Br\lotmtka o conjunto de tecnologlas de la informacin ~ 411 esaucJiO de lOS &en6menos b~s estA atcanzanc~o su oerw oon ocasin del Pro~ Genomt~ Hvmt\no. Ha sido ~peetaeular la teenotog!a desatrollada para <Jilucldar el ordenamiento de lo& !ramos~ HCUoncie Que se van deScifrardo. Eh esta momenlo se habla ya de la biolnfonnAtica (o bioQuimioinfom\Mica) como \W'WI ciencia que teOOge infonnac:in de reas de oonoc:imlento antes tan separadas enlre sf como 1<'1 t;lioquimiea, la biologla rnoteetMr. ta estad:lsclca. la rarmaooeogta, la ti&ica, la Jisiologfa. &~~
DETECCIN DEL POUMORFISMO DE SECUENCIA OE OHA
381
oe las nuevas 9f!t\81'8Ci0nes de ordenadores, Internet.
gentiee, la qufmlca fi5JC8, etc., en oolabot<Jcin
con~~ dCf,(t'n)llo
la r(l()6(1ca. etc. A m de idenblicar las secuenoos que definen a los genes, $e 1'130 ell\bOfOOo lOs llaiTIS(I()S programas ptedletores de genH: exlsien ya unos 20 de ellos. basados ~n distinlas al)f"OK:im&eiones y C'X)I'l'\tlndo et empleo de Slsternes de
reglas. tecles neuronales, Inteligencia artificaal. rn00e1o$ eS1adi$1iCX>$ y, mAs recien~mente, meto<loelingislioos.
27.3 DETECCIN DEL POLIMORFISMO DE SECUENCIA DE DNA

Para detectar las variaciones (I)Oimol'llsmo, tema 26) en 18 secuenda diM genoma de dlstinlos 1ndivtduos se awde a <:isbnl.a; c:tll-tr<.ttogios con enfoques earaetetlsllcos, o W\8 oomblnaCin de ellas. En principio. lil fotmil m;fls 6nx;l~ ~ detectar ut'l polil'l"o()rliStnO es la secuenclacln del ONA. pero pot su laboriosidt!ld so $1.1CIO t'QJdir ll QC:rll:$ ~niC('I$, en~ 13$ que deStac:atiiO!I ar\81isls RFLP y VNTR.
27.3.1 Polimorfismos en la longitud do los fragmentos de restriccin (RFLP)

Quiztt el m!Odo ms empleado. se denomina simplemente PLFR o RFLP (R~srtfCl,OI'I Fragment Length un cambio tenolfpeco, un cambio identificable 00 l<t epresiOI'I ~ catt~cteres morfok'>QICOs o tunc1ona1es. 51no en la detocciOn de ~las variaciones Cle ta secuencia e1e1 ONA {codlncama o not que llenen como ronsecuencia ~,~n <:.ttmbio en un<'! diat\a di~! tesltiocln. Por Lanto, los. fregmentoe de re&lriocin que &e obtienen son <frforcntO$ dC:pencier'ICio Gel alelO ptesente. cada t'~Weslra de ONA generara mOl~ fragmentos. de longirud di~e en fUI~iOn oe lOS Sitios de resuiCCiM presentes. Pues10 que muchos de elos no OOtJ$$pcn:len a, la regin que se pretenCIC: C$bJdiat. generalmente se utiliza una sonda que hlbrida en pot;idn oercal'lil al &i6o polim6rfi(:O y se M~liZM 10!1 lr.:~gmentcs por el m4odo de Southem (pg. 171). Se puede por ello <'!firm;af QvC: el RFLP es un ar\&!isiS de polimorfismos basado en ta hibridacin.
Polym<Np11/'$m). No se basa en
X X
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1Caso 1: una secuencia de restriccin est presente en un ale*o pero ausente en otro )
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OETECCt0N DEL POLIMORFlSMO DE SECUENCIA DE ONA
383
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27.3.2
Polimorfismo en el nmero de repeticiones en tndem (VNTR)
Este tt><> (le polimorfismo surge de la ptesencla de ONA repeti~ no oodfiCSnte en eucanolas.. concre\amente de repetiCiones en l8ondem (0 NA satlite. minisatile y mietO&atlite. pgs.. 113-114). EJ poliffiOf'(tSmo, ent10 ndivicM>s y emre lOS dos ateiOS de un ml&tno t'ldlvdvo. surge porque el OOtn$1'0 de un~ <kt ropeliciOn que f(l(rT\lllf\ C*l3 bloque no es slelTipre el mismo: de ahf el nombre. POiimorli$mo de n(lmero varit'ble de repetieiol'les ef'l lilnCiem, o sln\C)Ieme.nte NVR T o VNTR (V<Jn<'te M.mlbtJr o1 T~n Repe&rs). La ta:zon de que v&rle eon ~anta facilidad el: nUmero de rw<~ticione11 011tit en ltl X>Sibilidad de recoti'"'aCIOn entre etas oon sobreetuZ&mienlos. desigu&le& I,Pilg 367)
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f'~n'l(nt(J~
X X
de n:>1n.:.;,(nl. Sil(o )oc.' de1~.:b
<1que hibndn conl;1. wncln
leaso 1: deteccin def fr&gmnlo de restriccin que contiene l bloque de repeticiones: 1

C':td.'l alelo conlicnc l)l oqucs con un nmero di ferente de unidades de repct1d6n.
Pur tanto. nUmero V<~ri <bl c d~ sc.~:utfu:iliS nptlidus dcrliil del por una .....,n,b q ue hibrid focrtl de la!: I'CI)Ciicio-r~.
Aldu lt
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p<o)llblo paro~ un flh:10:
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384
ANLISIS DE GENES. OETECCfH Y APUCACIOHES DE LOS POUMOR.FlSMOS
1 caso 2: deteccin del propio bloque de repeticiones: 1

En CSIC caso. la ~lf1di1 hibrida con la secuenCi."11't'p!lida. EJ resultado es similar al del caso l.
Ah;IO t\
Alelo;'! O:
..---1!!!1!- -
LOS l)(llil'l'o()l'fiSITIO$ VNTR ave $C e:mplean en la prctica corresponden a bloques moderaclamente grandes de unidt'dOS de S<' 64 OO. OOrrO$pon<'icn1C$ t'llos mini&<~tlitn hipefVariabiN. Otro& tipos no suMen recit* ese nombre, como eii)Oiimodismo& repeti(iOilt$ Soelleii13!S en tilndem (uniclac::l de repeliciOO de 1 a 4 pb, es decir. ONA microsa1lita) y el polimorfiSmo de repelielor.es en tancJem asocia oon grttn<Ses bloquet do ONA s.atlite. los Joci h ipervarie~ble& se llaman asi pot teoet de Jorma caracterlltlea MuChOS alelos. Los mareadores 11\M in.tormtt!Nos l)enen decenM (le; afeiO$, por lo que es poco probable que dos individuos no emparentados compartan los miSmos. E!IIO!I mate:MOres VNTR proporcionan mucha mbmacin para el af'lflsis de li9Jimiento genelco (mapas genticos. pg. 218) y para la idenlific:cu;i6n de individuos (prveb<.s forOI'I$C& y dtt patemiditd. pg 385), Tonto 104 RA.P oomo ~ VNTR h&n incroment&do tvor10mon10 el nUITIGfQ do marcadofes POimrfioos de que &e di$(l(lfl4J ~m elt:Cimin;~r la diver&i'*' ~iQI entre indi'li;IVo$ y P't;J soguir 1;11 segregacin de (tierentes porciones del genoma a lo &algo de las familias. Se han descrito mUes de es:IOS pollmorllsmos, IOca!lzadot en tOdOSiot ctQ<IS()(N:S , Como atternatlva al metodo de Southem. para detect&r el pollmorllsmo VNTR puede apliCarse \.1'\8 8rY1plllie&el01'1 por PCR (pg. 188). En lugar de una sonda. se precisan entonces dos cebadores que hlbriden a sel"'dos ledos del bloque de repeclcione&. PueAo que asl slo &e amplifiCa ta regin qoe contiene eiiOOJS polimiCO, no es necesario purificar el ONA. ni digEriio oon enzimas de restricci6n. y en la electroforesis slo se observarn (sin hibridacin, basta la ti'lcln normal de OHA, pg. 138) las bandas de los fragmenlos que lnc:il.t)'en el b~ de repetiCiones. de 1811'18009 dis1into6 segn el alelo presente.
27.4 APLICACIONES DE LOS POLIMORFISMOS DE DNA

El anlis:s del polimorfismo gencico da pie a RJfl'l8t'06a5 aplicaCIOfles, tankl en rl\'8stigaci6n bsica oomo en dinic.a quo u b;~wn on los tipos do polimorfismos antos descritos. Los polimotfismos <Sef DNA que no tienen efeeto fenocipko se utAzan pata 18 comprobacin de la ldeolldad (huella daailar gentica). Se emplean para e!lo ptin~!mente los RFLP y VNTR. Por ejemplo: Olagnst!co de la paternidad biolgica y seguimiento de rbokl<s genea16glco6. Identificacin de 606P9ChosoS en procedimierrto6 penale$, por comparaQn con el ONA procedente de diversos restos biolgicos (sangre, semen, salva, raices de cabello. te;itSoo corporales diversos. piezas derrlales. *te.) ldontffic:;l(;i6n PO$tmOnem de indi'lhiOs, en easos judiCiales o caltlstroles. Otras aplicaciones Oe Inters diver&O. Por ejemplo, M ~ aplicar e&tM ln6'todologlas a muesltas cJ(tjcas con el fin de oomprobar lldenidad de las biopsias. posibilidades de t:ran$Cllall~. ine$13bil~ genotica caraaeri&1ica de c:ief\os tui'TlOflls, c. El estudio de los polimorli&mO$ QIIJ9 tienen una <:onlribucin minirnl o tovo o la susceptibilidlld frente a eiertos procesos pe~ioos ()O$flt interft mi<liOo...peci;~~lmen~ en la ~iOn de etotermedaoes oomplejas. Lo$ polimorfiSmos que de!le~an un papel directo en la aparicin de un lenoc!po pa1olglco son, e'llidentf!<ente, aplicables pata el dlagn6stko, asl como para el estudio de los mecanismos rnolec:dares de la enfermedad (Pa1o6ogla Mo6ecular).
27 .4.1
Mapa de polimorfismos SNP
Los polimorfismos SNP o de un solo RJcJe6tlcto (pg. 365) son responsables de una gran parte de la diver&IOad del geooma runano. Aunque la mayorfa de ellO& no origi\an directamente enfermedades. en ocasbnes pueden kx:a!izarw muy otlfC8 de mutatcionn o PQimorflsmos involucrados en procesos pa10Qet'IOS, lo que lOS haCe UtileS oomo marcedOtes gon61iCO$ (pig, 221 ). /loJ it'te earacaerttancto cada vez ~nUmero mayor de esiOS polimorfismos, se hace poslbkt la construeciOn de Ul'l mapa dt SNPs. lo que se une a la utilidad propia de algunos como determinantes de enfermedades. Se 1\a iniCiado un gran ptoye pera Identificar 106 SNPs del genoma humano y lograr~ mapa de tt!tct re$01vCiOn con la posleiOo de unos 170.000 de ellO&. En l participan, desde abril de 1999, ttN centros <Se inYMtiQaeiOn, aW~IC'IdO$ por 10 grandes empresas farmacuticas. el Weloome Trust britnico y Motorola. En abril d4J 2000. con ul\3 in.-sin Que supera tos 5.000 millones de pesetas, se habfan identfficado y cai10!Tafiado mts do 41,000 SNPs. l' PMir CIOI material gentiCo de 24 Individuos de distintas a.nias. En este proyecto H ha aoon:li!ldo no pa.tentar las socueneiM deSOl.Clieftas.
APLtCACIOHES DE LOS POLIMORFISMOS DE ONA
385
27.4.2
Anlisis del DNA con fines familiares
El arWiels. geners!ment9 POf RFl.P y VNTR, de ur.os cuantos pollmol'flsmos permtte reaizn oo ~p..umiemo do tn befenda de lo6 aielos respectivos y ~~ ot:ltenet conclusiones sobre las relaciones familiar-e& ef'ltre vnri~$ oe~s . AnlogarMI'Ite, se pueden rM!izar esluOiOs ev<lii.J(Ivos y an~ropo16glcos . tale& como el soguimien!O oe ta:$ migrlK:iones numenes desde tiempos pret-stoos y las. relaCiones entre los antecesores de la rsz.a l'luman.-
~l enu~ tO \ u n Q IIIJIIJO:I l
~iO. dd IO.~mnl~lar"'" 1'\' .JUl lflllt<: del aMo> ij
~ifl Idcl hUII'll.; ....f"'""tot'('nu.. (S!II o.kf Jllclo\
---------
''-
AnirJis1s: 1 no es hija de 3 (le falla el alelo O paterno).
' ' ' ' :] -- ---
S1 U ~ -:.1<\ asl)(;i~td :l tuUI er'lfetrncdad sutosmictt m:cSf\'a (simbolos cokJrcud~) :
3 la pOO~"('t (ho-moctguoo), miaura.~ que 1, 4 y 6 cttlf'l portadores (hctcrocigtioos). 5 hered de su padl(' ( 1) ~1 utdo 1\. con lo que se extin3ut la lk'tt.'tlcia de la enfcmu~ad pt esa ruma. El ~en po11ador de la cnfcnncdad de 6 fUe hlm.'d.1do de su PGdrc (3). oo d la m;ttdre (4). IX la (tJtunr g~-nertrdn . S. 10 y 11 SQn portadores, micnlrns que 9, 11 y 13 c:stin Sttn06.
Una de la$ pnnci~le$ ap&:aoeiones de es!OS es1udlos familiares t\a sido relacionar la presencia de una geotk:a. causada pot un defeao en un gen an de&COnocido. c:on lt'l de un polimorfiSmo det.em'liMd<>. Mediante un estudio amplio del rbol familiar. basado on 1.;1 IT.trn$mis-Otl met~delial\8 del gen ()atOIOgleo y de bs marcadores polim6rlloos. se puede legar a enoontrt\r un ntelo potimOrfiOo que est ligado a aa enlermeded (por la proximidad de sus b:i respecti\106 en el genoma, ~ 218) Esto oermrte. en primer lugar. ldentlllctlf de iorma aproximada ta posietn del gen patolgico y iSi fnc:ili~r sv bU$Ciueoa y. (lO( otro lado. et diagnostiCo pteYentlvo de ta enfermedad modian1e la deteoci6n del llcto JX)Iim(rilCO *$0C.iedO Este ~ief\10 se 1'18 apicado oon algunas enfermedades h~P~<t~& QOtnO l;<~ fibrosis quis.tiea y la oorea oe H un~\On.
et~$ermeda!1
27.4.3
Huella dactilar de DNA
Como &e h<l visto M$tt' 3hOra. 10$ potimodismos. RFLP y \INTR se b::atlzan con una sonde parucular. para exftminttr ~ tocus Unico. Sin embargo. ta msyotia de secuencias repebtlvas que &e estudian en tos pollmorfi$mos VNTR ~n en mUitiples zonas del genoma (recurdese que los rrw-. y rr.crosatti.tes son ONA moderadamenttt repetitivo y aispeno. Otganlzaoo en tooques dtsperso& de repetietone& en tndem. pg. 114} Las unidoele& de r4WetiCin ptesentes en pyntos diSDntos del genoma pueden ser dnticas o bien lo sufiCientemente $WI"'il&re:& como Plf<l permitw su deleoci6n &iiOOitnea en lodos e$0$ kx:i. Si w utiliza oomo sondo ul\3 $C~ q.,e pueda hil:lric:W con IOdOS '0$ tOCi de una ,..mili.- do ONA mini o miao~t61i!e se pvede observar sil'nl..ll3l'leatl'lente el pa!rOI"' polimOtfieo de todos e11os ~. oaoa 1a OQmbif\&Ci61"1 oe gral"' nmero de variaclcnes lnctwlduMes. es ptctlcameme UrVoo para cada IndiVIduo. Por * al pab'n resunante se te llama ' tluetla dacllJar de OHA' (DNA f~t. SQlo tos gemelos dndCOG presentan huellas lndlstlngui~.
la l'luella gentica puede utilizan;e en es-ludios famili;ves. pruo~ de potomid3d. iOOnti~cin de recien I"'OIXIO$.
crir~W~otogf<~~. ~s forCI\$C$, etc Otra de $US al)lie&o:iooes. es la deCeceiOO rapiaa cte ea~ somatieos. del I)Of ejemplo, al eompatar ONA ae tejidos normal y neoplaslco. En una aae proporclon de 1 umores malignos.
gMOma. la huella
gen(lca sufre cambloe:, que consiSten en la aparicin o prdicSa de bandas
386
ANLISIS DE GENES. OETECCt0H Y APLICACIONES OE LOS POUMORFISMOS
J p.1rc:jas de
~emelos
Se 4~t...cha ~u ONA po.lr
h1 bnda.:an SCJutlu. 'Til, llOII
b 60 O
una ,;onda que dctta pubn1 otfi<ma$ VNTR en muchO$ lncf d..-1 moma,
handll.~ di(crcn.e (huell<l dnctilar de DN,\). C'lttepcD l11 prii!X'n pa~ja de acmc:lo:s, que 1ieocn d mismo. Por cUo. han de SCt#Cftlftclj idnticlb. UJi h-tclin u~ o id;.tirll!l. U8 otms dO!! pct.l\'}aJ j()ft ~\'111ft"' IIU idt:lic:o}, bhilcliuo o dkitltkcto. (En d km.:f" cuu. okl cm de C'..if'llr, Jlljj,'~ dos gemelos Mlntk~M M puo:dc.on !K'r vutn y mujer.) PQr Olfll panc. puede ~CflioC o6mo la hocUa e5
Cada pc.'tllllllOl rnut'51l11 un p.1ttn de
ll'la~ ptlt:li.b ft'lltl: ratlltl!at\.'S que Cilltl: tnd.- 1 .,..08 no empan;:nCIIdo.'l$.
Cc.m eht$i6n :
unicigti<:O$ diciglC06 dicigtic05
(~""'-"~;00
- - -- - ----- - - - -60 O
-- ---
--
27 .4.4
~
Anlisis de polimoismos con fines diagnsticos
El anltisis de porllflorflsmos es un ml6todl) p&no par;~ el <fiagnO&tico. en especial por la posibilir:lad de detectar la
prccisposiciOn gcn6tico't tt ciott;:a$ ~crmod<'ltfcs cuytt tt~usoa no QS nic:<~. E$ ononne imcr6$. eje<piO, et diagt'IOSbCO ptenatal de enletn"'edades oong$\itas, O$ docir <te toda at'O'T'I~t!la del oesarrOIIO morfOlgico, estrucWral , funcional o molecular presente al nacer (aunque pueda manifestarse ms larde),
onfonnodt~d Olfi40$ 00 que se do~l'l'OIIo , o lt~
'*
eJCtema o Interna. familiar o esporcica. heteditlria o no. Unice o mUitiple-" (definicin de la OMS).
Esquema gencrnJ de ltt sccucncin de acontecimientos de la cnfcnncdad genlica.

1 >cw ejemplo, p...n un:1 cnrennl ' tbd morwgnu:n (ra.t.n"m de h<. 'TC!nc-1:1 mendcli:um por nltern.;;Qn en un pWllO ll'oo del gen, que afec~a una sola prOicina).
goo nonnal
ftl ll lltd611J'-+{ \.
lt\.'71
muliUlle~ ~ :=:.:! Qpro.lrinu un-(unll Q

Cl'l1.1Ma
J\'CqJI(JI'
fun ~in
incorrcd
sub.:'elulat.
ll)l~~illde ~'l>lruCiuta.
c:1 pl'lcicbd de unin,

loCii:ah.-.~~cl(~n
118nspo!1ador
"""'""" nnw~ulinoa
col~mo
Clilllbil ict.J,.
dtpbei6n.
CIC.
conoenuo~.:.n.
(ac10I de trll~ipciln fnetor de conu lnciJI
'"'
~,---.
tnftnntdad
11in1omas clinicos Una vez realizada la EU(pkw'acln rnlOca del paciente, e& decir do(~JMtado el fenotipo dfM:o, la <:onlribuci6n del l;abota!Qrio tal di;lgn$1ioo Pvode ~er&G a lre& niveles: e~esi6n y f'leteneia de lOS gce$ (nlvcl genieo o gcnorna). ~ SObft e l prooucto g6nic:o anormal resultante (lo que hoy se llama proteoma), y Vla metebllca o desequilibrio qui mloo afectedo (nlvet bloqulmlco). CUalquiera de estas situaciones oonstitvye un objetivo y debe ser estudiado en Patdog1a Uolecular, una materia hoy dla multldlsclplincw.
1.0$
errores <:ol'l9nllo& se putM:Sen con&ldor.tr como .,.r.'ldig!M de 10$ tm$1ornos bioquimiCO$
det~
gon~mon,. t)fl
l<t ost~'-'01 y fun(:in do molc:ultls protei::~$ La t;~n'ermcd3d ~ $implemento ltt il1.1str..ci6n fni\s
elliOer\le de 008 vatiaeiOn gentiea q..,e alecta a la salud.
APLICACIONES DE LOS POLIMORFI SMOS DE DNA
387
27 .4.4.1 Diagnstico de errores congnitos del metabolismo

A <iterencia de adul'o&. donde se &uelen utiliuw mve&tril5 de 5<109f u OIJOS tejii:Sos. et1 et di&g1'10SbCO prMatat se u'l!lzan dos tipOS de tocnicas: no inva:s.Nas. aoe inc*Jyen ultr..soniOO$ y radiogr3fi.a. e ltlvasivas, corno amniooenteSis, biopsia de "ello&ldades oon6nicas, oon:looent4Sis o biopsias de hig..OO f~al {Pllgs, \ \9120). Si el oonteniOO en DNA de ra muestra no es suliclente, puede amplilicart;e lar~ de intetes per PCR {teMa 15).
a) Valoraciones prefimjnares
Emro 10$ p~r;)meiiOS de careaer bttsico o preliminar para 18 monltonz.acin fetcd y el Qragn~>tioo Pffltli!U.I M 1& gonadotroclna corlnlea chCG), una glicoproteina Plducitla. pOr el embriOn en eS&rr<*:>, que se detecta como Indicador de embiltuo d%00 tos primc:ros d~ de 1<'1 OOI'Ioepcion, el laetOQe-no pl&eentarlo (hPL) sintetiZado por la placenta. aue aumen~ h;.&~ el trr'I'WlO del etnbarazo el'l sar.gre matema. y el estrlol, un e&4erode sintetizado POI' feto y placenta Hoy dia, 0$10$ el'ltayOS Mn sido ~dos por la Jn\'estlgacin oltra&n1ca y cardiotocogrlica P(ll(l est.abkK:et riesgO$ de matfo,mac;.Ott tett~l $e miOe la a fetoprote(na (AFP), slntebzada en saoo melino e h.igaOO fetal. que debido a so pequeo ta!Tiiii'IO p;)IS~ del plasma a ta orina Cetat y. por tan40, at fluido anncico y sangre materna. Un aumento po1 encwna del v<~lor ~~ C$ indioe de anotr\BIIas oongnlw, especr.almente defe<:I06 del cierre del tUbo neurat (espina blfllja. anencefatia. ele), Adern&$ Cle C$to$ parmetros, p.eden tantwn metirse, con distintos fines OiagnOsllOO&, tos nrveles Oc bilirrvbll'la y ooncenlftleibn de k>!lkltipiOos et1 nuldo anv~!otx:o , el pH. oases sangulneos y conoentracin do l~taio el'l sangre letal, e1c..
~p~ean
b} Ensayos genticos
Et en$ayO gen&lloo detectar la pa!Oiogfa buscando, como ya se ha descrito. el aleto n$0Ci(l(k) .,,., .-~lermed~d.
$l
$e QOtlooe su gen, o mediante otro poirnorfismo cuyo lows muestre ligamiento con cri IOOV$ P3tol()gieo (StSC(l(I()CdO. Se aplican 109 metodos ya descritos, ba$OOos en elligamienlo de genes, polimorfismO$ RFLP y VNTR. reaccin de la PCR.
etc. Como ejemplos cabe citar Medida de un si6o de ICStnccin aneracto pot ta ~tacin , oomo en et pollmorllsmo AFLP con Mst 11 en la aoemlil
faleif~ (p~g
382).
EndeO de 0190$ Sir'l.tetioos oorno sondas. para la secuencia alterada. cuando el trastorno genboo se debe a un ca.mbio ~ ul'l l'ludetiCk> especltlco. Un ejemplo es la defiCiencia en tJ.-antitrip&lf'la. <:Ne oonduce: a un<~ molyor probabilictad de desarrollar enfisema pl.llmonar, debido a tn canDo en una 50ia base (pilg 376) Un M~li$i$ Soutnem con una sond;a $1n1bc;.J 1>9nnit9 dctorminar $i el ONA contiene la secuencia norm:tl o la Mutada. Ensayos por PCR. Puesto que esta lcniea petmite amptlftcar la secuenaa de ONA pocencialmente defeetuosa, P~Jede emp1Mr$e p~ra el dlagn6stlco prenatal de enfermedades donde se encuentra en westin eJ sWo e11.acto de MVI<"Jc;.Otl
e) Incidencia de las enfermedades congtMftas

Se han descrito cerca de 4 000 fenotipos n\OI'lognieoe, <te lOS cuales 1& mitact <Xll'$litttyen uastotr'IOS genuoos En centenares de estas erdermed~. IMtO tas oomune$ OOtnO las mas tarll!$ se M teco1'10Cido el ctetecto bloqulmiCo W&ico y, en m~.X:hos ~$0$, ~ 1'\a aislado y c:IOt\ado el gM tesponsabte. Esto quiere Cleeir que eJ$te hOy inlormac::iOn de algunos o v.'lrios de los: tres nivt~es antes cteserltos, para unoe 500 ttas:tornos con heter'ICi& mer'KJeliana Su lncldencra a t~ivel mvn<:lial ~<re, aprolli'n~ente, uoo de caoa 500-800 nlr.os. Es precisamente esta elevada ncidencia de errores cor~Qrwlos del metaboli$li'IO b QI.Mt 1\<t motrvado la <'P<aricin de: pcograma$ de cri bado ( $crceninpt ~n.atal en IOdOS lOS paises ~!'larronaoos. En Espar'\a se realiUII'I ya en tO<JaS 1as comuniOS<SeS Autno:nas.. Su et;e!J\Io es diagnostiCar lo ms precozmente posible la altetacln melabllca, antes de que se manifieste en Aesones irreverSibles. Esta detecon ~e inioar on tratilmieolo precoz y ms efiCaz, lrt'lando de fa\toreoet el desatrOIIo de una vida nonnal. lncloso en casos. po1 ejemplo la fibrosis qui:sbca, en que la enfermedad no se puede evi\ar, no slo se puede oonooef precozmente sino que se pueden ))f9Y9'W las wfec;ciooe$ o tratnr l<a wtSulic~encia panae<'ltica
27.4.5
Biochips o chips de ONA
El COI'Ioei~o de ta caus.a e las el'lfenne<l.ades geniJCas en familias se ha aoel&rado gracias al anlis;s de marcadores genticos. En el Mvro se podr Cli$CX)ner de mnr(;;)(IC)(e$ n'I<\S li3ble$ y $01l$1iCi)(IO$ pt~ra dagnosticar qoozmen4o ta a!terac:l6n motcC\Itar, <' rwet cetvtar. anteS de que cteje de 1\JneiOoot ef orgai'IO. Et di(lgnOstico evotoQon~ hacia et O!II'IOCimiento de ~ catalogo de variaciones genetlcas mectlante una apllcaciOn tecnifie&Oa, ll\lto de estoS y otro& avances en oor;uncin con la bX:wlform;}!Jc<t Se trida de b~.~&e<~r un POrR gentJco que nos permta identificar las enfermedado& a tns Que poc:temo5 .S.I<H pre4$pVCS;tos (por ejtet'npiO, bJ<Ir m;lligllQ, P0)1otogia C(IR.Iiov<eul<lr, 1\CI)O)tib$, ~ern'1Cd$d neurocse.gerwatNa), oesoe el punto de vls&a de las mutaciones. En de!lnitiva, va a sui)OfW un 913n 1)3!10 hacia 1& medieil'la predi etlva, Qve permllil'll lOmar medidas terap+UIIcas pJeooces peta el!nwtar el riesgo de enfermedad.
\.0$ llt'ITitldO$ Wochips , gcnrxhips o g9nosC!:nscm:s, fruto de 13 fusin de lt\ biotogla. moteeul..,r <;On la automatizacin y la inklfm'lica, estn destinados a reV'OllcioncM el diagn$tico molecular del rutlKO. al discriminar de una manera mt~y sencilla. rpida y at.rtoma(lzada la presencia de la enf9f'ITIOdad.
388
ANLISIS DE GENES. OETECCtON Y APLICACIONES DE LOS POLIMORFISMOS
.:on t.ll'mt>i'IJ;).
\'k UNA ..
~Dlt'Qdoo:oo
llibtida~i(ln
lluo~
a11la poskia del. biodlip

h~:nc
uni.,..n
ol~nucle6tid,) difctmlr
!:161(1 ....... '(~: ~iial nutlft':lnte (hibtiobeJAn ~l\1a)C.It ptUI...IOIJ oom.1pondknu: 111 olq.'V ~11ya ~.u:nria e~ ok lll mueum
Se IT818 de placas de silicio. vtdrb u otro material, de unos cent1mettos de talT\811\o. a cuya superficie se han adherido segr\ ur.a di~i6n oroei\8Cia, eooociea, llien <versas rnolo.Jias de eDNA o bien oligonutloticiOs de MCIJtnciOI$ iget"<'"'*"O ~orontcs. et;pe<:ifiC..$ ~r<t vn detetmin~ gen O un3 rogitl de ONA de inlor&. La tecnologia ernpleaoda permlle unir en cada biocl'lip entre cien!O$ y deoeol$ de mile& do mol6o.ltas diferente$, por lo que &e puede haoet un ~ro de ensayos 11'11.1)' elevado de b'ma slmu!tn&a a partir de t.l"il muestra mLIY pequetla (pe!( ejemplo. una gota de sangte o Met'IOS de un mictogramo de mRNA total pur1flcado de oo llpo Of!'IIAaf eontte40). E.seneiaiMMte, se
~rata
de un en~o de hillftcfaclon (tema 13), M el que el papel de sonda 10 desen'IC)el'lan las MOlculas t.WllcSaS al biOehip
y et1 este caso se matea el ONA o RHA de la muestta. La mueslta. desl'l&turaiiZada, se vierte sobre el biOCIIIp para que hibride c;on 1<'1$ MC~i3S de este. ' e lava y se <IMecta en qu posiciones aparece el mart<'lje. Una \'el Sl4M!fado el afn por el esllJdio e.Kcllsivo de la secuencia del genome htii'Tiano y atmitido que sta no es la pMelpai c:uestin, &e ha encrado ya en la necesidad de aplieat lo& I'IUeYOS conocinVentos a la klentlflcacln de los genes conteNdos en dicha seruenc.a y sus alteraciones, es decir. las muUICiones y su detecci6n con fines diagnstico&. Posteriormente, !\abril de daf$e explie<~ciOn a 13 funcin de 10$ ge~. lo ave algunos ll;)m{'ln dal1e sentido 31 ~. analizando la e.xpresiOn de lO$ mRNAs QI.M:t Vn3 Clttu13 ~M un momet'l.c.> d*'O ("lr3nseril)tom3), En es.1os dos <'trC3$ (~ones y e:xpresion geniea) se base el progreso del diagnsaleo del ttJiuro, y es ptecisamente en ambOS c:ampos donde adquiere inters ta aplicaCin de 10$ biOehips.. inlc:iatmei\le desafi'OIIacJOS para idenliflc:ar s&euenc:ias de ONA. So h.:~ conMtgUidO ya pr~rar bioc:hips de tamai\o muy c:>equel'io (la,......s de vidriO del tarn.ailo <Se una ul'ia), donde se deposita una fina a~pa de 10$ cONA& obtenidos a ~rtir dlt los mRNA.s de un tipo de c61ula, e~ aderuadamente. Uoit Yet a..Oiea l<t mueSir<' ton ol mRHA J)n)Oiem&. se ObSeiV& (:()ti ~ <H: 10$ CONA$ del bioehip hibrida. Con es!OS biOdlips se pretenoe identifiCar milels de mRNAs humanos reMCIOOados con enferme<laoes.
Tema 28
Enfermedades moleculares: enfermedades monognicas

28. t Conocepto y clasifte::~cin ...................................................................... -...............- ...................................... 389 28.2 Enfecrme-d&d~s exogel'l.a.s................................................................................. -.................... 390 28 ..3 Enferl'l\edades ge-ntic as .................................................................................................... ~-..................... 390 28.3.1 ExtensiOn y frecuenoa de las enfetn'IOOades genticas .................................................... _ ,_ .,,_ ,_ ,_ ,,,.. 391 28.3.2 Cla&ifiC&Cin de las enfermedades gencicas...................................... . , . , .............. 391 26.3.2. 1 Tipo de clula que sufre la alteraOOn .............................................. --- .......................... 391 28.3.2.2 PfOducto gnloo defectuoso que da lugar altrastorno.......... ....................................... 392 26.3.2.3 Extensin de la alleracin ..................................................------ --.... ---------- 392 28.3.2.4 Tipo de cromosoma afectado , ,,, , 392 28 3 3 Enformedodes monogi!omeas nucleares ........... ...................................... ...................... 393 28.3.3.1 EJecnpiOs de enfermedades mon~s .......................................................................... 393 28.3.3.2 Tran&~n~&in en familias.,,,,, .... ,,,,, .... ,,,,,, . ,,.,_,_,_, .. .. , , , , , , , , , , 393 394 28.3 3.3 CI<J&if~an de tos trostornos moi'IQ96ni00$,, a) Etllermedades autos~as dOI'nir\&tltes ....----- .... ----- ................. ------- 395 1)) Eltlermedaes &uK!S~as reoeslvas ......... ...................... ... ....................... -- 395 <:) El\lermedades oom!nantes ligadas al cromo$()f'l'la X ........., .... ,... .. ...... , 396 d) Entermedades recesivas ligadas al cromosoma X ...... ---- .... , 397 El\termedildeSII\)3dasat cromo$0tl'laY....................... , 397 28 3.4 Enforll\IOdadcs mit()O(lon(f~tes . ..................... ......... ........... ,, ,, .,_ ........,_,_,_,_,_,_ ,_ ............... ...,_,_,_,_,_ , 398 28.4 Enfcrmcdac!H potignicas, muJtifactOI'i a~s. mixtu o compJej;as ............................................................ 399
>
28.1
CONCEPTO Y CLASIFICACIN
se admite hoy <li3 que pr;ktieament.e todas 1M enfermedades lienon un<' c~us.o~ molecular Cualquier f!flfermedaCI, tf'ICiuyenCio las eonoeidas tr&Ciieionatmente, cursa en m.ti)'OI o tnel'll)l mcdit!a ()()1\ .n~crttcionus en lt' estru<:rura. propiedades, metabolismo o funcin de las btomoleulas. Enlfe las causas que Inducen la enfermedad se encuentran agentes flsicos. ambientales o no; agentes biolgicos como wus. bacterias, parsi!O!I, ecc., y lrastotnos gentlcoe, hormonales. hmunolgtOOS, nutrlclonates, etc. Todos euos se traducen en di$1\Jnck:lf'oes tisulares y oelvlnre$, lemporales o permanenle&, cambJos en el medio interno. vaBaciones en la fu'lci6n de rganos y S6temas y se tetlejatt. en !tmo lmuno, en fom1a ele enfermedad. ln~$0 aqullas clebiclas a agentes externos (118umatlsmos por ac.ekJel'ltes. cat<h-trof91. o-te), Q~.~Ct obvitamente son oonsidof-01d~s COmQ de ~U$~ no molewlt~r. 5a OOtWierten una Y$Ziniciada's en enfermedades mOleCUlares.. Oe ahl que un estudio moderno de la enfermedad requiera la 00f1Si0et"l)Ci6n <10 105 a.spectos moleculares qua aco~flan a las observaclone& cllnlcas y &e consideren v88d06, oomplemett&att>s y no e~tetvyent.)$ 10$ dos bPO$ de claOOcaon d&la enfenneciacl:
l.i'l$ c.lasifJCt~c:ion~ cli nieas &e btt&M en el dittgnOstioo tt partir <le la observacin mdica (exploracin) OOfl el
apoyO de tos datos <fe lt'b()ra-torio (fn89'lit""'" l>iOI(lgic.')&. istopo$. ratiologa. ele.). Desde el punto de vista genbOO, se basan f!il un <:rilerio renotipiCO. Ia manifesltlci6fl bajo la forma de slndrome ctinico. Este tipo de estudio es exclusivo de los proteSjQt'!ales Ci!nleos. La& clasificaciones molecul ares. o estudio de la enleMledad &ajo un enfoque ~utl)r, $C bi*san CKct..tsivamenta en critenos genot!picos. Dependie.nOO de las causas que attefan &a OOt'ISlituciOn del Qenotl"'l) se distinguen trO$ tipos oll.6gonas. 9Mticas o miiC.\a& Al no conocerse todava oon preci&tOn la cavsa molecular de mucl\89 en.termedade$,
390
EN FERMEDADES MOL ECU LARES: ENFERMEDADES M ONOGENIC AS
es.tas c:la$ilicacione& son ~n imperfGcta$, Este tipo 00 e&ttldio lo Jl'leden rttali:zar hoy dfa diver&O$ pro6esionale& 0$1)11(;it~liZ<'!dos on et broa ~ lt\ biomedieif\11.
El Of)jetillo Ot la pat olo gia molecul ar es I)(IIXIS~mente el conoe-nieniO Ot l3 enf~ d(l$t et ponto de vista de su 811eraei6tl molecular, para contribUir al diagnostico y la terapia. Empieza a ob9ervetSe a comienzos del siglO XX, al esttlbleoerse el ltri'IWIO crrtJ~s congni tos del meteboh'smo para describir aquellas alteradotles heredllari:.s. perennes durante tOda la vida del paelenle, que afectan a Mas espectl'kas del metBbol!lmo por ebetse a 1a auset~cla o klactlvacln de ennas especificas (entre ocres. albinismo, aleaptonur1a, clstlnuria y galaciOEDetr'lla). El Inicio leal y slstemleo de la patoiogla molectAat. que tiene rugar en los a'\os 40-SO. &e desarrolla con las tCIIIcas de es.tudlo de 109 cromosomas humanos y su papel en el desarrollo selWal y en las anomatraG cromosmicas relacionadas: en Espatla, la patdog1a mol~ se introduce en la dinica en los aitos 60. El rastreo de determinadas enftii1Tiedade$ en recin nacidos y la ayuda de nue'Vas tcncas de manipulacin y anisis del DNA, a partir de los 70, transform la gentica mdica. Al tlnal de bs anos 80 se hablan recopilado ya varios miles de alteraciones genflcas heredkarias tistinw. casi siempre con amento o disminocin de la actWidad de ooa enzima especifica. Bajo el ttmino genmi~ se inollf)'e OOy dia no &lo e.l e~udio del genoma. ino t<wnbin ltt ()plic;-aciQn tJc, OK{im(lnc$ go~icw p<trtt iOonlific::t'r 1()$ t'llcq~cionc$ I'$$POI"IS<'bles dlt uM enfcrmed8d. detectar en una poalaeiOI'I las petSOnas con rie$00 y aSi oonltibuit al lratam~o <M la enfermedad. De forma anloga. en el futuro la protemk a reafirmar el papel que desen..,etlaron las pt01elnas. en sotllano. en el riciO de la pMologla molecular.
Clas-ificac.iln mnlecula de In~ enfermcdadc~ h u manas

t;.xt\t.cna~:
irtt(l:..tcadoncs, infcccioo\$.. (latasiu~is. debidas a >rioncs. nulricionalcs...
s~-gUn d tipo de (:luln { S<l.nucas G~-mt!'111c::s (camxr)

Mutlld(ltl... ~ pwrtual~:
{ 1:-..!1 1\."S.il)ncs (:!>ltiJCfUtlll cs del gen
f_nfCTII'll."<b&l>
Cnicas
\..cnh.tca.~
mono)lin~oCII~
{
En rq!.ionl.'ll n:gulador<J.Sikl <n:

ahcru(:in de: la
c:,p~in
. lll.'t.UO ('1
(en f;CI)Ctal)
IIPQ de ahcrnc-in {
Mutac-in m~..-diana
,. {NvmCric'" (miJiacione!l ~nimucll.:ll) e'n,'Ul l(l(I'IUCIIS Cll(l$.enc11Cl'IS EsllUCtumiC$ (crornosomopatiil$)
28 .2 ENFERMEDADES EXGENAS
Se denomin;tO Mi 1<'$ enf~ cau~as poc agentes de lodo tipo. externos al individuo: intoxicaciones por pnxlue1os qvimico$, drogas o medicamentos, persi!Oe unicelulares o pluricelulares. toxinas b~&. agonle$ ~s como b3c::teriaS y viM, ete. Tal'l'lbln se "'uyen las enfem'l9dad% por alteraciones rM:riliv<as (genort'lmemo carenciales) y las causadas por priones (prolelnas de plegamienlo anmalo C<IP<'CO$ do in<lucir el mismo en ollas molculas de protel:na notma1 y por ello consido,..d3!S -pro~nas il'l&eoec:i0sas1. Ninguna de ellas se tta1a de forma especifica en este lllro
28.3 ENFERMEDADES GENETICAS

Son el grupo de enfetmeda<IO$ moiOculares pot excelencia. Para su Inclusin en este grupo, la enfermedad hit do cumplir ias siguientes cttr;;u;tori$1iCM:
Debe ettar ~orminada geneamente, es deor. deberse a mulaciones que alteran la HeuOnci3 <> 1a (W'98f'lizacln del gtmom<'J COCiilleMte. DebO 3foctar a motecutas en cantidad. estruaura. actWidad o fvn~ En cspoC13J. $& altetan las protelnas. en cantidad o en acll\Iad La alteraclOo bloqufmlca cau&aMe de la nfermed.-d debe w el reSUilMO oe las altdraclones en tas molCIAas, que afeccan a estrucl\ltil$ cotult~ros o vios metalllieas en las que se encuentran 1"1)1icaoas (en espe<:ial. la$ pf01einas de caracter enzlmtlco).
ENFERMEDADES GENTICAS
391
28.3.1
Extensin y frecuencia de las enf ermedades genticas
en cuanto a la eten$in dt l<t onfetmte.too, debe di~~ci:s.rsc entre inrvidt.IO!I portlKiorcs de def.eciOS gen61icos tnuy :lbundante$, pero et1 lOs que oo se hace evldenle la enfermedecl pot la exisJenoa de un alelo sano que SU(lle la lun(:iO(l del get~ allefSdo, y enfermos o afeaados por el trastorno oeneico E&te itlimo caso correspondo &la$ enrene<:Saoes gentiCas pr()C)Iamenr.e dichas. de gran mportanCJC~ olob;;llrnenle ~ P<twr diJ l<t b&i<' fr.:;uencin <.le cndn una. los datos suelen ser ineJCactos. tntre otrO$ moli'l()$ por ert'OieS dl&gn6$1loos y por 18 cofYIC)Ieildad del estudio, especialmente en las enf~dC$ mu!tift'cto~.
/\lgunas cifras n:lotivus n las enfc:tmedad:$llentic-<S er gen~.....-.tl

l:sJm iniluH.la~ pr ,;,~n.:s m 30"'.{. d~ IOO:s;.l:ls enfctmod-:~d~-s humlll'lll$..
S< c:lculln unas 7.000 cl'.:nncd3dcs Cll ba.~o: g.:nkica. J:n nuo:ho:. do: los 4.500 lod desctiws se coooo:c al menos una forma de mu~aei' 3$0C-iada a uo U'.ulorno clinioo Si,t!.nilicaii\O,
Hay dclh 'tOS de ~-<;O~'S aislados en un 68% de lil' cn(cnn.. "(bfk,. mflunes. Un S% de 1.11:; pi.T.sQn:as nlt!Otm.~ de 2.S ao$ pnstnu. Ufl Lra;.tu'l0 go:nti~-o. Son 111mbiCn 101 cau$ll de muchtLS en iem~d:u:I.:"S en' mi~-a,; di.' ad uhos. $1 :;e mc:luy<11 1 &:> rasgos C(nll'll.cjos d~ aparicin ~ardia. un 60'-~ de personas
ptcstnla .cnfctrncdadcs oon innucr)l:io ~'tnli~:o en l.in1 m<JfOcnl o de !'11 \'1~.

La frecuencia oon la que aparece ooa enfermedad se expresa mc<lianto dos magnitOOe:s epidomiolgit:<J$: iACidei'ICia y prevalenaa. La lnckSenda es la fraccin del nmero de casos respecto al nUmero de individuos n&eidos vivo.; e>vede reSUQ:at dil'lcil de es.tlmar si la enfermedad oo se observa flsicamenle o no se dragnosdca en el momonlO del nacimiento. La prevalencia, o frecuenCia de casos en una poblacin d4t llldivOJos viVO$, 9$ a(m mt\s dific;il do estinar, sobre \Oda cuando la poblacin es grande y la enfttm"ledad tata.
28.3.2 Clasificacin de las enfermedades genticas

Se pueden seguu V<IOO$ cnterlo$ ~t<1lclcw
28.3.2.1 Tipo de clula que sufre la alteracin

I.<'IS enfermedades que se transmiten de generacin en generacin son de carcter hereditario debdo a que se origiMn por una al!eradn en las clul as germinales (pg. 3.44). La alleracln de las clulas somticas oo es herettllarla nt afecta a todo &1 organismo. y da lugar a pocas enfermedades Enb'e &Uis debe cilan;e el eilneet (tema 30), Que se estudiar como ejemplo de enfennedad sombca, a la Y9'l que de carcter IOOfiO o 1001tifaeloriat
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la t'I~dad
~e uan~mh:
1~
dc.,..cnd.:ncin
392
ENFERMEDADES MOLECULARES: ENFERMEDADES MONOGfHICAS
28.3.2.2 Producto gnlco defectuoso que da lugar al trastorno

E!ite criterio ha pef'l"Cido estl.dtar mUChas enk!rmeclade!l ge;~tieas y estat6eeer la$ clasibcionC$ Clfq)ia& t1e 1<~; patolog1a moleoLAat tradiCIOtl81. oon muchas variantes segn f!ltlpo de protelM al~ la enfermedad &e denomina dis.enmla cuando se altera una enzima. Consbtuye el caso ms !recuente de e&tudio de una '\Ita metablica allerada. Se mo lf' IC8n sus caracterfstlcas oinclcas o su tegulaCiOn (sensibllldacs a activad~& inhibiOOores). S. 4i$11W'!vye 13 actiOOad, puede desapateoer el producto de la reoocin catalizada y, cmo ~~~~ia. et J)I'Odudo llnat <le 18 via mc~b!ie<~ o 1 ;) que ptr1enece la enzima. y lambin puede t'I(:UI'nvlt'fle ct suitr3"1 0 corre$pondiente: o 1,.1n procur$0f t.o ..,om31i a puode oft:tr 3 1.1n3 prolei llal implic-'a en pro<:e$0$ de trilln$por1e dlt moloulas por el organismo (cilosol. $<1ngre o medio extnloelll<lr) O a travs de membranas (plasmatica o intracelulafes). Alt...CICione$ do 1 (1 biotintosi5 o 13 degriKiaci n de otra& llfQ4Ginas. a tr~ de mecani$1'1'10& Ktruc::turale& o
mo<llflcean POSII8duoconal. agrupedn oe &41bunidades, ltlico, fotmaciOn de complejos mu!bPfOtetoos, etc. Alteracin de proteinas ntructurales. po1 ejemplo, CQIT1X)08flte& de las membranas. AllontCiortot ~ pr()1oiml$ imp!ietlde~s en J)fO(leSOS de transmisin y transducc:i n de sealtts {hormonas, factores de crodmionlo. nour~rt'nsn-..or.s y nour(W'I'IO(t~. ~os de mombr<'lnJ o inlr8~'" etc.), en la hOn'leostasi s o en la defensa (Inmunidad).
procesos rnetabOioos
tates COMO W"OnteripciOn. proeesamietlto
J)c)SirtlnSCripeion~l,
tr;)(Su(:Qn ,
~mienlo,
28.3.2.3 Extensin de la alteracin

Aunque el tamao de la alteracin no condooe a una dasfllcaci6n estricta, este criterio. ya utilizado para clesc:d:li' las m.~\aeiones (pg. 344). es una simplffic:acibn ad~ a efect06 pedaggiCO$, Se disti'9*1 treos ca1egorlas de iJIIt<trttCJOnot gcn6tic3S, y denuo de ~d<'l una se I)Oedel'l eot~Sic!etat otros tactof'es. COmQ origen de la e~t~r.ein. eonsecueneias fu(I('M)t'l81 es. tr~&Canismo patognico. productO gnleo anetadO y re.giOt'l g&niea atectada La alleraein puntual, debfda 8 la mutacin de un SOlo nucle6tido. da lugar 8 las enfermedades monognleas,
<J.te &e de9criben a eontn.raci6n.

Una altef'ad n mediana tiene lugar normalmenle en &eO.JenCias repetidas. pero no &e disovtlrn por ser poeo conocidas. la$ altetac:Jones a gran es.ea.la, erom0$mlc:u o eitogon9C~-5 ~ a c;:rQITIQ$Om:ts c:ompllm!s o a grandes fragment06 cromo$6micoo, Su inc:i~Jen<:i;t M M estimadO en un 0,65%.. se CliS.ingue enlre MOI'I'\llli.&.s nurn6rict~s, os 1!1 e6tul:t, debicMs a segreg&ein eromosomiea errOIW!.a (m.Jt3Cin decir, en el n(.mero de c;:rotn0$01Tli:1S existentes en 1 genmAca). '/ anomal .es estrucll.lrales o eromosomopatlas, debid as a reordenamienios c:rorrmmioos. Se
c10$Ctibir6:n on ~ ler'n3 29.
28.3.2.4 Tipo de cromosoma afectado

Las enletmecJaoes moleo.Aates puecten afectar al genoma nuclear. caso ms frecuente por su mayor tamai'IO, o al genoma mhoeondtlal. Dentro de las nuc$eare$, el defecto gentico puede estcw klc:alizado en lo$ c:romosomn
uuaiGs (1 par) o en 105 cromosom.as autosmicos (22 p.;tres). Esta dislindbn, comllin:.d~ con et c:~~rllcter dominante o rooesivo con el Que se expres. 1 3 ef\lermedad, es la elasltlcadn ms sencilla, la ms conwnenle empleada en gef\flca. y se ll!lll.tatpara desc&lr la ttarumisn pot herencia de las enfennedade:s monogNcas (pg. 394).
MuUM:in en ui)Odt 1 06
rl'II(J50f1111S A11,08:rltiC~;
t:nf('f'MJi dC$ li ii i(I~!Jfii.S

M ulllcn en un crumoi:lflmll
S0.":\"1101.1:
EnferruJ.d~!l ligada.s
11 Jt-Xo
ENFERMEDADES GENTICAS
393
28.3.3 Enfermedades monognicas nucleares

Se pueo:!oetl considerar OOrt'lO modelO de etlem'edad~ gel'llle:es. al ser la~ que se 1\811 e$1udiedo meto~ y oon mayor rigor a escala molecular. Se deben a una mutacin pun1ual que afecta a un unico gen. ong~~~ando un alelo ~normal. t.a discusl6o se cenuara en las aneracbles tocakzadas en el genoma nudeat. dejarulo el C890 de las rnllocondf'lales pata un apaftado especifico. St el e10 anormal aparece en los dos cromosomas homlogos.. el lndrYidiJO es OOmoQ96tico pata dicho gen: ~ apaceoe 6b en uno. con et alelo normal en el otro. el mwldoo es heteroOgtico.
28.3.3.1 Ejemplos de enfermedades monognicas

las alleraoonos. monogn.c;)tl gcnert'ln muct\S enf<:tniO<IildeS. A tituro men~rlenlt~ wWmutM> p1,1~ eiWf'5& aeondropl~&ifl, a!bil'llsmo, Me~ia talcifo~ (o dtepaoOCAemia). da!lonlsmo (eegueta para algunos <:Oiore~ defcieooas
ef\Zlmllcas de adenoslna*saminasa u,-anblnpslna (pg. 376). glucosa-6-fosfa1o-deshidrogenasa, ~oqulnasa. galactosa-1-foslato unoutranst'et&$8 (o \JTP-hexosa-Hoslalo-uridlll!transferasa. causante de la galaaoseOII<I, pg. 373) y fenilalanina-4moooxf96nasa (o fenilhidtoltilasa, rHPOO$able de lct feniloocoi1Unt:~J , distrofit~ rllltltnicliJ, l51101iil muswlar de Oucttenne oorea de Hurotington. enfeiTI'IGdades do Chau;ot-Mari&-Tooth de Toy-Sactts. de von Gicfil(l y do Wll$01\, muc;oW$Qd(:l$is (o fibrosi. qui!Jtial, pflg 351), hcmorllkts, hipe.~!lli!tQien\i.:'l ramilia1. nwotlbron'I&IOS!S ~ tipo 1 (~gs 352 y 395). OSIOOgnesis .nperleela, r~1inobfaSIQma (pg <~30), stndromes M Hunrer y Hurler (muoopoliS\'Ietuid0$1$ 11 y 1), $indrome del X lrgl. tumot de \VIIm, ete. La dormaclOn actualiZada y ms completa sobre t;:~fl)d(!res. mcndliano11 humanos (ftsiOtOglCO!I y par.o~s) se enOJentra en el catalogo de Mc:KuslCk lMenc:lettan lnherltance 11'1 Man), pucleado cada 2 aros, y se cenlrallza en la base de da!Os en Interne' OMIM (Onlloo Mendelian ll'lheritance 11"1 Mt\1'1); en amtlOS se le a519na a cada 9M un nl.lmero de 6 d~os..
28.3.3.2 Transmisin en familias

Pueslo que los trastornos mon.-1100$ ~en del genotipo 4lf\ un solo loOJs. SO$ p~ttones. de hefenaa familia1 son mvy OOnc:i~Qis: so fiimt~n potfOnlil$ nlend~linot I)OIQ~.Mt st ~lM tt lo e$cn.o P<lf ltt 1' ley do Montlof l"Y de 13 $eg!'egaf::i0f1 los dOS~~ c:a<~a par de CtOmOSomas del gttnie!O<:ito pnmariO (2n. AC) se sepan.,n o :~egregan en la rne!I0$1!1 1(pg. 104), de forma que cada cromosoma hOmologo aparece en un ga(rleto secundat!O (n. 2C). En la met0$1!1 u se separan al azar las dos cromtldas pera formar los gametos (n. CJ. Globalmente na ocun1do una dl!utlbuclon Independiente. aleatoria (pg. 10S), de bs cromosomas pateroos y male.mos y de sus cromatldas. oon 10 que cualquie-r Wld'f'lduo hereda ele C8a progeni10r (y transrn:te llego a cada descefldlenle) un cromosoma de .cada par autos6mico y un cromosoma &exuaf Por tamo, IOio s;e tr.-n&mte uno d& los dos alelos Oel gen presente en ceda looos Para e&tablecer lo~; pa1rones de he,erecia de e&lo~> uastom010 se aoue a: la nform&e~n facilitada POf los ""~~es fam6tlres del ~lente, qvo se resumen en br1t1 rt de irbol g~elllgico En th.!c so en'llllean una nomcnd.'ll1tna y s.tmb<llo-. partiaA;. .;
394
ENFERMEDA..DES MOt.ECULARES: ENFERMEDADES MOHOGNICAS
28.3.3.3 Clasiflcacin de los trastornos monognlcos

Como se ha c:omefl\aOO (pg 392), es oomVn dasif~ear las enfennedades monognicas de awerdo con el tipo de n!oct.;Jdo (sexual o ~vtos6mi00) y el t 3r*' dominttnW o rocosNo (P\ i g. 95) do ; u expresin. Si el kx;us P<l'OI09ico esl<'t silu~CIO en un Ct0r'n0$0mtl sexual, se llabltl de enfOi"mcdad ligada al sexo; en e.MO oontr<"triO. o. enfermedad aulosmica .
~rom0$01'11tt
LOII c.r~tefes ;)UIO$(lmie0$ y lOs ligados al cromosoma X se puedet'l manlest3r de f(lml<t d<>n*\anee o receSiva, mlenlros QUit bs lig~ ttl (:R)r'nQS(Ima Y no tienen esa d~ posibllkJad. pues s6b existe un ateto et1 cada individuo, Q1.11e: hll de m~Jnlfcs.t<trse $1 11'1dMO. Sir\ interaoeiOn oon un I'IOmlogo.
RC:o.'Ortll.ll('f"K'' <.k chminanda dt' a lt'~ (\ase p:\. 9$): Vn aldo t!l d..cnllllllll(' ~ (lUOIS cuando su prc:!lmcill se m~ifi~u ~i<mpre c:n el fc:OOtiJH). wdcpt:udienlc-c"colc de cuil s-.'3 c:l cero aklo.l (uno potc:roo y el ouo mntc:mo), El f<11olipo <3 iB'c aJ pnru los udi wduoo hootOOigti\'\'l!i del donunan1c- (akl~ idmK-015 <'" mbos bomiOfCS) que: p.1rn b bc:lc:rucircicos pckl<,o!! difer>."'''lb en C:ida ucltl}. En ~tili!K' a.cc ula. ptJd. l11 IUntklnaHo.lad dd otroaklo, d rrtnh'O. f'lo!lllkiootl ;on l'OdQmin...fC'lii O :w:m idom inallfH) cuandO el f~'fl{)lftl(l ho,'ti'f'OCCg_61Jt0 rl:fkjala PfC'-Setll:'ll de amOOel. s.ii:Ddo inu:nno:di.o c:ntrc los dos fc:ooci poe; hC)Jt)(J(lig(lcirot~ . Oiocho de oii'U ml)do.. tiC ckt.. "CC:c la expn:i t('" ~k cada alckl en pn.-scnda dd 01ro. Aphl~dn a In da ~ific-Dci n de las t'nfc-rm t'dndn gl-ni:lc(<.l!> mun~me~t;-.: Se d.ce tIJ( una tofetult d:ad tf tkm'licuuut o :~~lg~r 11t1 pauOO de htrt'cldfl domhullll c Ctllfldo c:loklo p.lt.;lgi.:o:o <!' dumcn:inte .Mtbre d nOrr..aL La cnkrncd:.d {fcOUC1pU dminac~e} se lt'lllllificsaa igual \'ti hclm(l(tll-0~ que e n hdtroctgctoit; 00..'112 un alelo pttulgu:(l p:il'a que !OC pr;lC'III(' 111 Cl'lf l'fl"tlo:dad. C-()(1)() ejemplo de cnferm.. 'Ciad nut%C)mica do:~mm:cnte, igualmente 8J".l'''-' t:n el g.et~Oitpo hiJtc nueig.(llc< }'el bctl't<M: ' ;!!alico. pucdoc- cuarsc 1 3 OOI'<'.t de l-luntiopoo. LM t"nl(:rc"co.illd<:s de ('llri;."c:r scmi-domillantc: o cOO.Ominalltc tlC' rn;Jntfiest:m d~ formn mi$ lc\<c en lc:d lltl"tcroetg(tL kus que e11 los hocnocigtiooos. l.a C"nfennedadeJ nht~ o COII 1 ..-l'ellcla rccnha CS1ll cau~ por un lelo n..'Cet~\0 f(\'flte al nonnnl, Slo lll' rnamlk 'llt.a b cnfcmt.-dlld cuandolo8 dos alckl61000 atlormnks.. es dlxir. co bomoti.g(ltOS,
1-n. "Cut:ncia de las l!nli:nnedad~ ncmogni-cas

La indd.:cK'ia es de 1 caso por cada 100 nacimientos vi\'OS El 70% $00 domiBanlc:s. d 2.5% recuivu, ().4% h~du al cron<,.MI.tl X )' !tlU)' CSoellllit.S las ligadas al Y
A oontinuacin &e pn:~&enlan lo$ 5 tipos pOSibleS de en.termedad monognlca, de acuerdo oon su patrn de transmisin hefOOit.aricl Se ilvl>tnrn nlrtdiM~ 6tbOieS genealglco6. en los cuales se han utilizado los siguientes crilerios ~ifiC<'ldorcs. Wjo un ptameamiento ped8g6giee: Se con&idetan 3 gener<~~Cion4 (l, n y IH) y $610 esos parejas (en les generaciones 1 y 11: el 5 rbol es tna excepcin obligada!) Ello supone, Obviamente, una IIJiacln et1 cuanto a posibilidades de emparejamiento y ron&~guient$ aparicin de indiViduos sanos o enlennos, homoci(Odcoe o heterodgticos. varones o mujer$$. Enlendem06 que la exhaus!WiOad de p(esentttcln de posibiidades de transnWsin, al igual que el uso de datOS fa~ reales. v<a on dctli'nento de lB Clatidad concepbJal que se per&lgu$. La geM1'8CiOn 1 est fonnaa por una ~ wyo$ dO$ l.'IICios (siempre teterido1 t1 un UtliOo toeus gnleo) se muestran et1 COlor azul para la prifrl(ll(<a PEir&an<' y n rojO para la segunda. La asignacin de aletos a ceda pet"88M varia en los 5 rtloles. pom ~f'$e a 10 que se quiete ilusttat en cada caso. La gGtlOr.lc:Ifl 11 ost.6 klrm&ea por 4 descendlentos. aqullos resuttant95 de la combint~c:in de bs 4 alelas prQ90nilorcs. 10$ 4 nljOS. 2 son varones y 2 mujefes. La gener<I'Ci6n m eslil Jormadll por lOs 4 deseendien(es re~omtc. de "' ~aei6n de tllelos de lB pare;a fofmooa por ui'IOde lOs indlvkl.los de la genetacin ll y ~ nl.IO'Ytll)ef~ Para fflelllar el seguimiento de la herencia, el genotl>o de eacla indlriduo se expresa 00t1 los siguientes rotores y letras: Alelos del prmer rt'DE!d'lbro de &a 1)3r.,_ 1 Aletos det segundo m.embro de le ~ 1 AleiOs del nuevo mtembro de la oorei<~ n (OIOICn(IJ la l.atnilla !nidal) LC!n'l N (O n) J)8ta el alelO normal y P (o p) para el pato!09ico. Leila A para alel06 presetllett en ..\1106(lft'l<t$ Leb'as X e V para alelo& en cromosomM $0liU~Ies Leila may$CI.lla (superindice) J)at1181e10S dominantes. leiJa minsQAclt (~;~.,~porindioe) p~tra alelO$ reeeslvos.
oe
DO DO DO
EN FERM EDADES GENTICAS
395
a) Enfermedades autosmicas dominantes

El gen n1WQn$i.l~. k>cn!ia:ado en uno de los au!O$Oil'l3~, posee un alelo pa!Oigieo (P) que e~ dominante ~ el normnl {n}
AulOSfnl(a
dominante
11
111
t.os dos SC)tl)$ portMIOS 3leiOS normal (n) y patologieo (P) del gen. La et~term&dad se ttal'lsmite por igual a varones y a mujere~. La et~lerm&dad se manifiesta en homoclgolos (PP, 1113) y hetetocigo4os (Pn =nP). Todor. 10$ Wldrvldoos no afeaados son homocigtioos (no). Cada indiViduo afectado tiene un progenitot afectado. Los hijo& (U1 a 11-4) de pateja mixta enlle afectado hateroo:;iglico y no at'eclado lienen un 50% de probabirdold 00 har~ el taSS)Q O lo que os iguill. I.Mt individuo afect9do hatenx;iglico (11.4) ticf'llt un 50% do prob<Jbilid0d de tr<'ln$111ilir el rttsgo pMoiOgiCO a COda ~oer'ldiente.
Pof &ef dominanle
E"o& trastornos con$1itvyen OOrc<IJ del 45% da 1~$ .,_fcrmod<t<ics monogniCCJ$, Aunque .,._,c;:hos 10n poco y en ocaSIOf'les espoCiillrnenlc _.,3 en Mefls googntllc&s espe.eific:~s.
COITU!e$ indiY1doa!men\e, son \an numero$0$ que su incidencia en oonpJnto es apreciable,
Ejemplos de
cnf~rm~d~<M-5 auto.Omicas
oofelmed&CJ
tf!p!!p?le&terolemia familiar de tipo llA Corea de Huntlngton Net.wollbroma!OSI9 de !!po 1 SirdOr'no do M~rfrtn
protefna sfectsda
domi nantes IOCuS del W

19p 13. 2 4p16 3
~CiOr
Receptor de li!)!?!l!O!einas LOL ' Huntirgt!na
Neurotibtomlna
FOilint~ 1
t7g11. 2 15q21 1
pi!9 352
b) Enfermedades aurosmicas recesivas En es~ caso el 9et1 teS()Or'IS&Ille. loca!iUI<IO en uno oe 11>$ 3'VI0$0m9s,
receslvo con respeao al nonnal (N).
flO$Oit ...,
alelo patolgioo (p) quo es
Auosmica
1
tCICCSiva
11
'
111
396
EN FERM EDADES MOLECULARES: EN FERMEDADES MONOGNICAS
1.0$ oos u.xos poi'Uin IQS aletos normal (N) y paiOIOglor:> (P) del gen. La en~ se ltan9tl'lite por Igual a varones y a mujeres. La enfetmedad se manifJesl.a slo en homoclgoiOS (pp, JJJ-3}. Hay lndllftduoe no afectados hOmoagdcos (NN) y hetetoagticos (Np = pN}. Estos C.ttimos son portadores. se dlc:e qUI'!' et'len ef rasgo. no la f!f'lle.rmedad ..
Los padrG$ de pet'$01\M a~ $0n gonor<*nontc fletorcx;igliOO$, portadoros it&intomiliOO$, cSin~menlle normales. Cada ti'ICiiviOuo areetado tier.e dos proget'IIOres aledados o J)Ofl8c)Ofes. Cada portador tiel\! at tnei'IO!I Uf'! proqet~ltor pottsdOt o afededo.
Por se~ autos6mic;a
Por set dominante
Ltt ;~nGmi.. ,_ falciforme es un .;en-.~ tlpioo oe traSkl'r'll:) autos6rnioo reet:Sffl>, que fue 8detr'IM la primeta prueM $1CPOrimentat do \lf'ltl enfermec:la'u1 causada por mutacin {en 109 81\os 50). El slndrome dinleo es consecuei'M::Ia de la alleracin de un tluCieOtldo en el gen de 18 fl-gtoblna (pg_350). oondl.lclenOO a una pt04elna j.l5 Los hOmocigotos para el gen fl5 man!l'iesl.an ef ttastomo (a.nem la faJclforme). mientras que los hetefoclgo4os se dice que mueslran el rasgo falciform~. producen taMo hemoglobina normal (A) como anmala (S). una parte de sus etitrockos son falcormes y padecen una anemia ie\oe. Por &anlo. la dominancia e:s incompleta. EJ diagnstico es sen~ meciante RFl.P (pg. 332).
!t'tl'
Ottas enfermedades autosOmleas reeeslvas eflfennedad
(XO!olna altada
Adenosina.clesamhasa et,Antiripslna
o.tiaenci3 dO ADA
En1bema hete<Matio Mooovfscidos.s (tibro$is guistiea) Enlf!ffl'leCaC3 de Tay-Saehs
R..,.dorde la oonduet<'!ncio transmemb'ar'la (CFTR) Subunicled et de ia isoenzima A de

la 1}-N-acetlh&xosaminldasa
locu del goo 20q13.11 t4g32. 1 7q31.2

15q23-q24
d<>~
Fenileetonutia Feniaf.anlna-4-monoxigenasa t2s24 1 etTalasemia a.-GIObina tpte!=ptl.3 (!:Taf.<Jsomic f!:Gioblna 11pt5.5 En conjunto. 8$ie tipo de traMomQ$ ~n t~lrededOI del25% de las enlennedades monognk:as.
e) Enfetrtl6d:HJfJs dominantes ligadas sf cromosoma X

Las Mujeres pueden set hOmoc~Odcas o heterocigticaos para IKI gen que 9$IG si~ en un kx:us del cromo60ma X, pues tienen dos ropias Oo eJ!.tt cromo&e~ma &elt\lal. No ocurre asl en los vatQf'IE!S, que, al poseer un solo X. no pueden ser homocigtil:lo$ ,.. Mterocigtieos pa~ eso get'l o rasgo: se diCe que el vatOO es hemleJg tleo . SI el alelo patolgico (P) es dominante sobre ol l'l()n'l\\ll (n), fa$ ~ padeeern la entermedad tanto cuando PO$e01n vno como los dos :.lelO$ P, mienlfas que 106 V8II'Of'les la padecetn 81 u Onlco 8ielo es P .
lnUJ(f SAl
.:.....,.--(lXBX" 2
ligada a X
domi nante
11
'
III
alc:tiO$ norm.,l (n} y patoiOgiCO (P) del gen.. pero ies mo..fetes portan 2 copi;)$ y 11)5 varof'le!l solO una. U. entehf!dad se 1ransmlte a varones y mujeres. pero afecta ron ~or frecuenCia a esaas. Por a ligada al X Las mujeres afec&adas { U4) transmiten la enfmo<<a4 I)(M' igual a flijos e flijas (11M a lll~). con una probabilidad del 50% s-son tMH&rocigOtk:as (Pn) y del 100'it si fueran homoclQ6ticas (PP).. POf .t co*fiO. tos vai"CW!S afectados (11) slO la transi'Men a sus hias ( H3 y 11-4), u. enfenned&d se manll'ieeta en mujeres hOmodgdcas (PP) y he:lorociglic<t$ (Pn), y en varones hemleigelco6 (P). Los rldivickKI& no afec:Udos $Ofl mujeros hQmOCigOticas (M) Los dos sexos portan y varones hemicigtico$ (n-), Cada lndlwctuo afectado tiene un progenitor afectado.
Por ser doi'!Wlante
ENFERMEDADES GEN nCAS
397
Para compen&a~ la presenaa de do$ copias del Qen on las n-u,.JjorO$ ("doble tol'l'l()letneni01, $ut o61u!as slo el(pl'esan bs a1e1os de un cromosoma X (el ob'o est inactivaclo COITIO cromali'la fa<:IJialiva, pg. 87), En consecuencia. las mujeres h!MerocigtJcas 1l08den 0$1ar o no akloct;ltd;cl$, dcpendienOo de Que se e~tpre$e e1 alelo patOIOgioo o el normal: generalrnen1e. ma maniffitacin en ~11.1so difet"ente en un{ts o61u!as y otras. p.es la seleCcin de c:ul de los cromosomas X resull.a inactivado 1iene lugar duftlnl$ uM ~-~ oml)riontllit' len'lpr~M pero mul!loeuat y es a~ea~oria ef'l cacSa Y1oil do SU$ ~lulot: un3 ve:t e$1tti:II&Cida la IMclivaCitl. lodas las OOIIAa9 descendientes posleriotes manuenen la
&eleccin
d) Enfermedades recesivas ligadas al cromosoma X

CU(IInck> SOf\ hOm()CligOtlcas,
AJ Mr on "le ~$0 domirwlte el *lo normal (N) sobre el palologieo (p), las Mujeres l)aoCieeen fa enlene<JaCI slo y por taniO oon frecuencia muy baja. Los varones la padecetn de forma simiar al caso amer10f, cuando posean el ale6o paiOiogiCO.
Ligada a X
1
reccsi va
ID
LO$ dos sexm portan lOs 8ltllc>$ norm('ll {N) y potolgico (p) del gen, !)erO 1:1$ ~es 1)()1'1<10 dO$ OO()r<l,5 y los vtHones Slo una. l.<t enlermed<W:t se lf'M,mite a varor.es y m.Jjeres. petO afecta oon mayot lteeuMC:ia a aqullos. Las nwjoles portadoras (12) traMmiter\ la el'lfetmeOacJ por igual a r,.os e ( 11~1 .2,4 y 5). oon ul'l3 probabiliOad del SO%. Las mujetes Mfermas (pp) t.an'bitl. pero oon ul'l tOO%. Por el coottatlo, los varones enfermos ( 112) slo &a 1ransm1ten a sus hijas (1113 y (ln~). La eruermedad se manifiesta en mujeres hOmoolgOtlc&s (pp) y varones hemlc::igOCieoe (P). Los Individuos no afectados son mujerM homocigbcas (NN) o hetstOCiglOCic:as (Np) y varones hemcigtioos CN), Los vatOI'Ies afeelados llenen ptogenllores sanos: &a madre es generalmente portadota asiMomuca.
Por ser hgada 81 x
Por ser don'Wlante
Corno eempk> caracterlslloo. la hemofili a A se debe a un defeelo en el factor V III oe la ooagulaCIOn. El gel'l de esta pro1efoa est srluado en el cromosoma X (banda Xq28). por 10 que la transmlsiOn sigue et palt6n llgaOo al sexo. Se han k!entlfleado varias alteraciOnes dls.linlas del gen Que causan la enfermedad. Sus alelas se exptesoo oe forma reoeslva oon respeelo al alelo normal del factor VIII, por lo Que tas mujeres sufren hemofilia con muCha mel'lor frecuencsa que lO$ varones (se suele decn que ta hemo A slo la padecen los varones y no las mureres. pero es10 no 0$ .xt~cto. c;omo s. di$Cu~ a contiooo:~ein). L<J frco:;uoncia 00 lelos ptofgioos en l;t~ PObi<llcin es O. alrededor de uno por eeda 10.000 alelO& nonnale:s. por b ~la Incidencia en varones (hemlcg6tleoe pwa el gen) es oo 1110.000. LaS mujetes 6fo padecen la entermedad cuando son homoclg6!1eas pera alelo$ patolgicos, por lo que la nodel'leia seria de 1110': con t.l'\a poblaCIn mundial de 6.000 millones. esto equivale a 30 casos viVO& de muJeres aiecl8das en IOdo el mundo, frente a 300.000 varones: da ahl ~ se asl.ITia que las mu;etes no padecen sa enfennedad. En cualquier easo. $1 o; rolovnte l;t~ fn:lcvoncia 00 mujcwe$ ~01$. hoteroo96Cicas para a198f! del faC*>r VIII. que ~edan tran&mibl' la enf.,.,.,<Kiad a sus hijo& vttrOfloe$ (1110,000), Slo la OOsoendenc:il de una mojar portadora (X x') con un varn l'lernofllieo (X"v} pue<;te dar lugar a mujeres enfermas (xf'x11). Otros ejemplos de enlermedaoes reeeSivas 1~ al cromosoma X son la Jisttolia Museutat ele DucllMI'IC (Xp21.2) y eJ daltonismo (Xq28).
e) Enfermedades ligadas al cfomosoma Y

Se expone es.le caso por razones pedagogleas. a pesar <le que no se COI'Iooe l'lii'IQUI\& Mfermed3d lir:fadll <'1 Y L<'l primef"a razn es el pequef\o tamao del cromo&ama Y (en realidad. aUn menor, pues parte del'( ttene regln l'lom61oga on e' X y El$0$ loci &e compoft<W'I COt'I'IO lO$ autosmioos): por ello. $$ conocen 8$C:8&0S ejemplOs de earactetes asociaoos a Y. y f'lirlgui'IO es p,at<:IIOgioo. la segond& mtn 0$ que ~ qoo OJ$1~ una ~ologia debe haber un gen cuya funca6n sea lmportanle y. lenlec'ldo en cuen1 a que &as Mujeres careoet~ de 1a1es IOCUSiigaclc>s ~~ Y, no pOO/itln desarrollar esa funcin.
ENFERMEDADES POUGENICAS, M ULTIFACTORIALES, MI XTAS O COM PL EJ AS
399
Entre las enfermedades asociadas a mutaciones del ONA mitooonthal &e pueden citar taos sigl.llef'lote&: Neuropatla ptica tletedltarla de leber (NOHL). Fue la prlmeta enfermedad donde se demostr la tleteneia por yla matorl\8 de un delee&o el'l el gei'IOf'l'la MiOeondrial. Ol'lalmoplejla extema prO'!)I'eshra crnica (CPEO}. Slndrome de Keams-Sa)'l'e (KSS). una oltall'fiOPiejla ellterna oon complicaciones varla9. Epilepsia mioclnica con fibras rojas de aspecto raido {IIERRF). ErM;efalomio~i<t mitocondrial oon <tCidosisl~ct~ y episOOio$ simil;nC$ a <'I>OP'eti<t (l.El.AS) Adiciono*nonte 0$ PfOb{tble '- imolie$Cin ~ f'nl.llociones mitooondriale$ somMe-.3$ o <'ldquiridl'$ como uno de k>$ f.aclores que conlfil)u~ al proceso de et~veje.cimiemo y a Mtermedades neurOCI&generalivas, incluyendo la entenneoacl' de AIZhelrner.
28.4 ENFERMEDADES POLIGNICAS, MULTIFACTORIALES, MIXTAS O COMPLEJAS

Muetlas enfem'IE!dades genlicas no estn causeoas trieamente por el deieceo de un ge.n, oanao lugar a I..Wl grupo de traston'IOS oonocidos bajo nombr&S di!erentes, de difiCil delinwaein o caracteraados de fonna .ncompleta. A dlfE!C'encla de las enfermedades monognlcas, la manrfe~acln dlnica es un retlejo del efecto combinado o interaocin acumulativa de alteraCIOnes productdas por factores genticos (mlliples mutaciOAe$, a veoes &~mullneas en un nmero l~eci9o de genes} y ambientales o exge.nos (de todo tipo: nutnc10na1. agentes txiC06, eslts, etc.). En cualquier caso. la complejidad d9J origen explica el conjunto de efe& diven;os produadOG y los disdiTlOG nombres recibidos, Estas on!crme<lades mo!tiact<lnales no doben oonfunditt;e ooo lot; trastornos croi'T10$6mi()C)$ (en~ genticas., gran escala. tcm& 29), S~Jnque en ambas IJIVI8d<l tMcr lugar una anoracin oomptoj3 del oenoma.
AJ no $Or lr.'I$10ri'IO$ de \1'1 gen Unic:o, la neren~ de estM afterOOone$ no $iguc la goteti(;3. CiMie3 mendeliann A pesar de ello. $i ~~e obsetva una mayor trat~smisitl ~ estas enterrnedtlde$ dentro <!'e un:t fatl'lilia que entre il'ldiwluos no tmparentados P(lr<'l que., $indrome M ITMStniW 3 otro mictmC:lto de 1(1 millfl'l3 f.amli;t os ne.ce""no qve, 119 r.Of\1 un<' COI'I'Ibineci61'1 de cal"''li06 gnlcos.
Entre estas enfennec:tades pueden Cllarse vanas maliormaclones cong,._as, como el labio leporino, las y los defectos dell\ltlo neural {anenoefalia. espina blflda y olras). y ciertas enfermedades de la edt'ld OOt.lln, como (llgunos ~de enoer y las enf~ de ta.s arterins ooron;uin$, do~ se 1\8 ob$Crvndo un3 preolsposiCIOn gentiCa. Oe todas ellas slo se conwerat et car.cer, 1a mas esrucuaaa oesoe e1 punto oe vista molecUlar adems de por su trascendencia clfnlca (tema 30).
can:IK~PE~tlas oongfllas
Tema 29
Enfermedades cromosmicas o citogenticas

29.1 lntrod ucc-.in ............................................................................................................ ,., ..., ................................ 401 29.2 Cl;asi ~c:in y nOf'Tienelatura .................................., .................................................................................... 402 29.3 C rQfnosomopalias n u meas ....................................................................................................................... 40 3
29.3. 1 Eup!OiCiia ......................................, ., ... -----................. ,.. 403
29.3.1 .1 TrlpJoidla .................................................. ............. .. .. -- ......................... .. .... -- 403 2'9.3.1 2 Tetraploidla.............................................................................................. --- 404 29.3 2 Ancuptoidia ........ ,,,,,,,, ........................................................................................... 404 29.3,2 1 M~ni$mO de generaciOon do 1~ ttnevploielia , , .. .,.,_,_,_,_,_,_ , ..... ..... _,_, -------- 404 29.3 ,2.2 MOI"'ISOmia ..........,.., .. ,..,_,_,_,_,_,_,_,_,,,., ...... ... , , ,. , , , ,., , , ... _,, . ... 404 406 29.3.2.3 Trlsomla ................................ ..................... ........,.,_,_,_, 29.3.3 Mlxoploidla ...................................................................................,.,_ ,_ ,_ , ..............., ....... ,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_,_, 406 29.4 Ctomosomopatias estrueturaJes .................................................................................................................. 406 29.4.1 Un punco de ruptura en un cromosoma: delecaOtl tetmr\al .........,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ,, .... ---- .... -----.... 405 29.4.2 Dos puntos de ruptura en un O'Ofi'IOSOma ............................... . -- ............ .,.,_,_,_,_ , ---- 407 29.4.2. 1 lnver&an ............................................................................. ----- .. .... .,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_,,_, 407 ----- 407 a) lnver&in paracnt:nc.a ....................................... ... ..................... .... -- b} rrwerS:iOtl perie6nlfiea........... .......... ... . ................,.,_ ,_ , 407 29.4.2.2 DeleCinlntetsi.ICiar................................ ... , , , , , , , , , .. , ............ ................... ..... 408 29.4.2.3 Cromosomas anurares..................................,.,_,_,_,_,_,, -- ------ 406 29.4.3 Dos puntos de ruptura en cromosomas diferentes. transroeaeiOn , , , , , . .. . .. , . , . . 409 ... _,_,_,_, .,_,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_,_,_,_, 409 29.4.3.' TranslocaCIOn recfptoca .....................................,.,_,_,_ ,_ ,_ ,_,,. 409 29.4.3..2 TranslocaCIOn de Robettson o fu'Sion Of'lttiea. ,_ 29.4 4 1$0<:fQfi10$0mas ,, , , , , , , ... ............................................................ ...........,_ ,_ ,_,_,_,_, .. 4t0
29.1 INTRODUCCIN
En este rema se t;aUitlln tns entermiXI&Cie:$ CfQf'nOSmu~a:s. uno ele los tpos de enfermedad molecular (pg. 392). Como au nomDte Indica, &e original'\ po... la artetaeiOn del rUnero o ta C$1ruc:lurt' 00 lO$ CI'QITIO&Omas: de ah que se lletmcn l<~mbin atleraciones UOn10$micas a gran escala, aberraclones.traston'los o Momalias CtOI'n0$6micc.s Al poder Obscrv3t'SC tos (:3mb/o$ oon el micro&<:epio plioo. son \ambien consideradas oomo enfermedades eiiOgentic<'l$ Son artetaeiOne-s espot6dicu y de baja frecuCtlci;:l, quo r;;art~mente so perpei\Jan al ser ea$1 ii'ICOmpatibles con ltt supervwencia y la reproduccin. Sin embargo, cuando 10 l\aO&I'I, muo$tran manifestaaones cllnieas, flslcas o psiquiea$, muy gr8\tes. a vec:es dtam.illlcas. POI' 10 que pue<:Jen 00f'l$ii:Jerarse la$ principales enfermedades gE!f\6tlca$. oe hechO. son responsables de una gfan propordr'l de ab0t1os eSC)On~. malformaaones congnitas, retrasos mel'llille$ y tufTIOfes. Como ~rte de las consecueooas de esta'!l enlermedaoes. apareoet~ l<'lmbi6n alt8f'at;ione& en el metaboksmo y en M s inletis o iliCIiOad do lltQ4elnas. Talos vanaciones bioqulmlcas pueden conS~demrw $4J(;Unl:iana$ a la enfermedad, a d1terencla de ras que apweoen et1 lt'IS enfermedades monognieas, pero son tguarmente Obiec<> de 0$1velio de la pet<*lgla molecular actual.
402
ENFERMEDADES CROMOSOMICAS O CITOGEN~TICAS
:\lgunas cifra-s .significati\'$, re1a:ti\'aS las anomalas crmJ.usmicas

Se p'wnl.nn en d 4.; de IM na~Jos tnuctl\IS
Apa.rca:n en d 2% dt." los cmbfii'UO$; d~ mujt"tCS mayO"s ck 35 alkl6 Jr;:So."'ri.:S en d 50% d~ Jos ahorlos cspoolAnoos du:rantc <1 primer tnmescrc l a fn:cue.uci;3 h atitl rna)Of e itnpr('(isa en la etapa embrionaria (aMes de lll.~ it ;.cu\tl!lt$ de: ~estadll). del oolcn dr 15 por coda. l.OOO <"mbsioocs Se han Mknti licod~' unos 60 sindromc:s
Las atteracaot~es son mucho m& ax.tensas QtMt las produCida& on 1 ()$ lti!JSIQrnos monog6nieo$, ~ractenzttncto!le (lOf granaes camDIOS en el nmero de nuclelidos (mile:s o miltonO$), en l;t esuuctut-a O& 109 ct'O<I9omas o en la ~c60o de gone5 por sn$0f1;i0n o ddecibn, ~plica.eiOn, ttanslocacl6n, ~ersin, etc.
Pueden a!~r ~mo 3 lOS t.lutosornas como a los cromosomas sexuales: en ambos ~~ poeden ser constlwtivas o adqwidDs Son <~berrcionn c;o n$titutiv:ul Jtqu611as que afeclan a IOdas las clulas del organismo, por aparecer durante la rvisKwt mei61ica. de la5 cUas germinaleS (g:tmetogneSiS), o bien durnnte la primera dimi6n mltcica del cigoto. Como COti$$COOnc;ioa, son 1,~ do mayo g r1M!dad. Las aberro1<::io01ts adquiridas o somfie89 slo octlll'en durante las mllosis po6cigt:icas.. Se ncian. por lar\4o, C n Clula~ soml\l!e&S, sin afect.at a todas las clulils dol orgttni$1'00; de ~ l{t mOI'Ic)C' giltvedad (a vecea mlnlma) di! sus oonsecuencla9.
29.2 CLA SIFICACIN Y NOMENCLATURA

AnoltliU 1 IIIS
1\iumlrlea~: .,~altera el nmero de: c..-omosam:as
cromosmicas { Ulrucumlt'1: se modilic:.l:r es1n 1CIIU!l (k :algn cromosom:.

Entro Jos abotWs por ane)matias cromosmlcaa dufante el primer trWnestre do ~mb;lra;c. 01 96% $e deaen a ~ITIGMe, on madre:s mt~YQt"O$ de 35 :u'los, el 85"' de tos abonos debido$ a CR)ti'I()SOrr.:lp8tiM oot'J"eSponckln a las anomtllllas numric;.M y el \S% a las esttue~utales. En la desctlpdOn ele las anomallas I;IQ01Qs0mfeas, la nomenclatura ullizada se basa en la de la dol?~t;in CfOC'l'IO!IO\ICa oormal, es decif, 4f,.)(Y en o6U&S di)bdes del vatn y 46,X'X en~ mujer. Se a"ttden ilblevi;lVNJ$ ~r:t exp~esar aspectos re&MIVQS il la morfologa del cromoeoma o para n:licar las cwsas dO 11 anormalidad. Los. detalles de t'PiietrCi61'1 de la nomendatura &e descrtxtn en eild01 onO(l'ulfia,
altGf'<IQCIIr14J$ numl;riCliS y el <l% a e!.ttuctutales.
46,XY 47,XXY p
olula masculina Mm\8!1, (ipl(lidO. 46 crom~s. induyerdo un X y un Y un Cf'Ot'l)I)90ma X adicional
46,XX
39.X:X:X
clula femenina nonT~al, dliploide

46 QQmOSC)maS, IncluyendO 009 X
con lo<
dol
..... cono
brazo largo
poi
mol
die d
1
olul\) lemet'llna trlpiOide origen patemo oripen ma&erno

crQm0$0m& d ie6nlrieo
een!JmciO o.xtretno (setmlnttl. telmero)

de!eciOn
cnwnosoma dedllado
dup
...
'"' 1
rob
'"' ,,.,_
1mercon duolicadn
mar
' ,,.
"""""""" ..,..,_ fr;jgil

$illo
ISOCromoeoma cromosoma anular
oanancW
prdida
(O(Uf8
ln1tl~ teclproca ~dOn de Robertson
msaieismo
..
tOCura k: unin
CROMOSOM OPATiA S N UM i:R.ICA.S
403
29.3 CROMOSOMOPATiAS NUMERICAS

rembin lamedes slmplern(!(l1e afteteelones genOO'Iieu. implican 1.11) cambiO en el
numero~ ct()(l"'()90n\&S,
bien
prdida o ganancia, pero nunca se a!lera la organtzac.n def cromosoma. Son les anomaiJes mM trecuentllS y se originan en gran parte dwanse la <ivisin meitica (pg. 104), con lo que se lmnsmhen 11as la feoondac16(1 a todas la$ clula& del hilO o hta En general 501'\ ltflale&.. impdiendo que se SClb(epase el de&ar'l'OIIo embriOI\IWlO, coo abonos espon!M@os de~ de ta 00t1oep<:i6n.
l tt5> nnomal~ cromosm~$ num6ritv$ se dt'1$diean as:

Nombfe de l;:t ~nomall3 c;rom()$Omle.,
NJ do
Crott'lOSOrNS
EIC!fi'IPIO$ fhumanQ$)
Eup6oidia
( xn)
._., ._., ~ T_rlpiOidia

N
d1a
o
n
...,<>Cllo6
a uews
2J X
<16.XY
Pol!ploklla
Te
...
la
zn 3n 4n 2<>2 2<>1 zn
69)00'
92.XXYY
44.XY,2k21
NIAosomla
'"
MoAO$o!T1ill 45,)( 45.)()(-18 -oila Olsom1 a lnotmBI, no es (tt xn) aooutlioidfa) Trlsomia 47 ,X:XY 2<1 4.S.XX.t21 PCIIiSOtnio 49 )()()00( Mhcoploldf.a Mezcla da dos poblaCiones celulares con 46.,XXI47,XX.8 d.stlnta dotac::jOO cromosmu:e Se habla de heteroploldla en todas m s!luaCiOOeS (OOk'lfeadas) et1 1M que ti nUmero de Ct'Of"llOSomas es d!fere.ne el normal
,..,
29.3.1
Euploidia
Recit>e e&le nombre (del griego eu, bien. W!teladero; piOidfa eone<;la o ~~dee;a) to1 $IIUtiCIfl on la que e.xlste w. !Qnero entero de docooones cromosnlcas haploides complel89, es decir. el tlllrnero de cromosor'f!Ol$ C:$ vn m(ltlplo do n Para los C3$011 ton ms cromoGOmas de lo normal f2n) se habla ele poUpfoldta.. En el extremo Of)ues.~o se eneuentrl'l\ aQUG~as o6Mas di~en<:iadas como plaquetas y enltOOflos. que carecen de nil(:leo y se Olee que son nuliplo-idts.
29.3.1.1 Triploidia
Ea;. la ~nomal 'a en l3 que las clulas conoenen 3 juegos eromos6mlcos (Jn, en huma!W)" Jx23:oo69), que 111~lwon 3 crom()SQmtt$ ttJu ,<'llot Es ~ poliploit!ia ms oomn, llegando a ooosbtu1r N 2,. de tod8's las oonoepcionet$ s-'1 embttrgo, s1as S suelen ~der tlbor\o cspon\3neo. por b que la .,cidencia es muy baja.
'*
11M lfl'~to~~& lalllflfll)i<!IIW'

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~~~ 11 11 '""tlo;ouo
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m,.,, ...... .....

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lllltc"l'l:ld<le li> lfllol""""'' ""'~ o i.l knobuo.li)ll de 111 1 ' ' ' 'dk
lll'<mll l)"f IIII ...Spcl"!ll)oi(J.Wo!lc.'
.tlfiAodt,,., ........... .
l M iblll!li!lk, lJ,.X .!.l.X ;U,.X '".B.) l!,Y ~ ll,'l'
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~ ~J... '>.:
2l , X
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M,XXX
ftJ_XX V
404
ENFERMEDADES CROMOSMICAS O CITOGEN81CAS
29.3.1.2 Tetraploldla
En este ~so (4n. 4a3=92) la ~ultt oontiene do$ doi.Cieioncs C:rQITIOt~s extras.: $0(1 siempre 92)(XXX o 92.XXVV $q origint~ u&~J<~Imen1C por un'*' en 1& primera mitos.s del cigOto: tras. W!a ~ieaeiOn normal del DNA no
oc;~,~m~ 13 division cetul81 sub9.1g~Uiente,l& que deberla
formar las dos primeras clulas embrionaas.
((fi\\ 2n. 2C
~
pnmcras <kl6
mfwsb
ciluJasdel
C@)~::~c
r...,
S
@ID
!'
2n,4C.......__
d~
@; ... 'Jr '- \U)

2n.2C
29.3.2 Aneuplolda
Este nombre se apf~ta a las anomeli.N ~se J)letde el carcter euploide. es decir, el rnero de cromosomas oo es mltipJo del t't'l9tO Aaploido n, Ello M ~ a '& variacin del rnero de copias de un &do crom060ma, no de
JU890$ <:e~$ de cromQ$0mas. En general. se presen~ una copia de ms o de mono& ($e vn $010 crom()$0ma,
especifioo en Qldlt ar~r;'l(:iOn. ptOducilk'ldoee. respectiva~. una trisom i;~ (3 c:n)mOSOMa$ hOmlogos) o una monosomta (una SOla ClOP'Q.. no hay homlogo}. En COOMOI.Iet!C:i3. la dotacin cromosmlca IOtal es de 2n-+1 {4&t 1 = 47 cromosomas en la trisomla humana) o 2n1 (4$&.1 = 4.$ c:rQI'I"'Isomas, monosomla tunana). El cromosoma extra &e l'dea oon un signo ~. y el ausente oon un signo-.
Son las anomarlas numricas ms trecuentes y elinicllmente sq'liflc8Was.. aparecen en el 3-4% de lo6 embarazo&. asOCinOo&e oon un <:14n3rrc:*> fi$iOO o mental anotnalos. En las clulas cancerosas tambin apareOI:Ifl 8 menudo aneupiOidias exlrci1\M, (;(In mur~ 81'1()(tf1811dades eromosmiCil$, Cuando falta un par do homlogos., ra anom81ia es letttl, y $e ~a~ma n utisomta: pot ejemplO, 44,XY.21.21 (varn) o 44)(X.21.21 {m.,.;et).
29.3.2.1 Mecanismo de generacin dala aneuploida

Lll aneupiOiclia se genera por una falla de dis.,.-.cin dur3n1 e la meiosis., es decir, un talO en &a seperad6n normal do un par de cromosomas o ele crom1idas. Las 00115eeutneias cJel proceso son dlfetetlr.es dependiendo de la <ivi$in melclea (1o l l}en la que se ptOdu%(;<) el ta!1o. La ausencia de dit;~cin eromosmiea duranre la me.osis 1 hace Que los do& homlogos dol CIOm(ll$(lrtl~ afectado pasen juntos a uno de 10$ g~metocltos seoundarlos. y el otro gametocito Quede sin oso c;rQtl'l()$0m6. Los 2(n-1) cromo50n'lill5 restaniO$ 1\af\ sufrido la disyuncin normal y, por tanto, han ~ratiO $U$ hOmlOgOS y cada gametOCIIo M<:unC<ri:> ~nlief'le n-1. En 1a subsq..11ente meio&is 11. con O'ISY~.~ACiOn nonna1. se separan roelas 18& parejas de eromiltic:IM:. Lo& gametos madi.Wos lienen una cromti!Jda (;)llera ya cromosoma hijo) de ms. o bien una oe menos. siempre oon lOs otrO$ nl (:n)f'l'IOtOmas ootrec40&. La no disyuncin de la$ c;:rom*'idtts ~ cromosoma afecrado <M-ante la meiosi& 11 (tr..s un; moio$is II\OM\SI) haoe <PJe ambas pesen *un mi$11'10 gameto, que queda a&i oon dO$ c:QI)i.<ls del (:n)n'II)SOma a1eetaOO. mientras el otro no eon6eno ninguna. se fotman rambin otros dO$ g<~moeot normales.. El resto de CfOtl'tOSOMas (n- 1 ) separan sus erol'f'\:tiC89 (;Ottectarnente.
29.3.2.2 Monosoma
Como se ha n:licoldo, C$ la siruaciOO en la que hay prdida de tn solo homlogo <le un par de Ct01'1"10$0ma:5 (en lotal. 2n-1, 45 en humai'IO&), El ojem)IO m6S frecuente es el s jndrome de Turnen, una rnQI'IO$Omia et1 Ct0fi"'090mas
sexuales. oon carioeipo 45,X y. pot tan\0, feno~ femenWlo Se origina pOr 18 no ClisyunciOn de loa Ct'Ofi'IO&OmitS $CXU31e'S (casos ~ 4 o ~ 1 en la figura: el Q'OI'!'IQ$(lf'l"'8 de COlor rosa rayado seria el X. prooedente del gttm* normal). Su incldenCiia es de 1 PO' (;Otd" 5.000 niflas naeicias v1vas (la mayorla de l<ts OOI'IC$~ set pior<Sen prenatarmente). Otros ca<&OS 1n et mismo fer.o1ipo ~ mosslcos 45.X/46.XX o 4S.X/46)(Y (~nidos a oontinulk:in, pg. 406).
CROMOSOMOPATiAS NUMRICAS
405
AnomaliiLS croiD05illJtaS nurnericiLS originadas por n:prto anmalo ~'fl L1 m<:tOsi.s

llrMI:r,d& mN- 111 ~o.'O (Ofl J
'*"'
d~ n o - u k~
ldf b :J tnlmo:n~ ~tfniOol
gametocito primario
,......... ..-.......... . Mciosls . ....... ..........

~
'-"' ~~"'lia ~ pllt!IC'~ roj(> '""""' .; m k>,.;I~-JIIwm-1
-m.
flOTflt11
mciosis 1
lon.llo<~,...""" dt Hlf('IIOI;I(OI
~
.,,..11 ... ('11 " " '
.... ..
-
meiosis 1
n<lmlal
- ,.. dls,-.ndtln prlm~rtaH: ~ \t 1itPf11'1rn
gametcx:hos sceundarlos
'"' cr... (,,...,_ ... . ~tnill.,...
0J)@
.. 2c
ffi~0J) @
., ... ,.K ..l
ll.l{'
nI.K2
mcKllsis 11
mciosislll oonnal
1 n.K oori~~::::::::::::~ 11
110,.,. Mf'l tln la d.,. (rn' lct
a.~r
@) (@),:metos Cfill) ~l.(l @) @,.,,., L t'@) QlD o I('IC@D Cli) ~( (@) Cli)
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406
29.3.2.3 Tr isoma
En eslle caso existe ul'l
~1090
ENFERMEDADES CROMOSMICAS O CITOGEN~nCAS
BCJiCIOMI de un CI'Of'I"'ISOmB.. es decir. 3 coplas de diCho cromosoma (en &olal,
2tt+ 1. 4 7 .,. humanos). Puede a1eetat a e.~a~q~llet'a de lOs 23 pares. ExiS!en varb9 eje~ modetadamente comunes.
EJ sindrome de Down o mongolismo ~a (en el 95% de los casos) una copla eJrtra del cromoSCtY~a 21 (trisomia 21), por k> que existen tres homlogos de este cromosoma. la nomenc:la!lJra es 47,XY;t-21 para los varones y 47.~21 para tM mujeres. Se origina por la no disyuncin del cromosoma 21 (casos n9 3 o nt 6 en la figura; 106 etomosomas de COlor rosa y rojo serian lo$ h~06 21). E el tipo de lri$0mla ms c;omUn, oon un<! int;iOOnci., 00 vno por cada 800 naCidos vivo$. El rio$90 (tambi6n de las ollas ttisomias en general) se: telaeiona ooo la 6C8d avanzada de 1<'1 rn'e. pr(lbl'blemente pot ur'l atM'I'Iento de &a no disyuncin en las mujeres mayores. de fotma que la frecuenda de lntOmia 21 es de 1/400 a lOS 35 al'iOs y 1/ 100 a 10!140 allos. Presenta. &~We otros slntomas, retraso mental moderado: 1a supervivencia es de unos 40 Silos. No existe anormalidad alguna a nivel gnico. El sndrome de Edwerd es 1& trlsom1a 18, repesenu.da 47)0(,+18 (varn) y 47,XY,+18 (nqe,). con una lnCJC!encla de uno por cada 6.000 nacidos vivos.
El sfndrome de Patau o ltlsomla 13 liene una W'ICidencia de uno de cada 10.000 nac:ido6 vivos. P\leden sobrevivir a trmino. pero muestran malfolmaciones congnitas mU!Iiples y gr.-ves. 1.<'1 nomencla:tul'8 05 47,XY,+13 (vitrOn) y 47,XX.13 {mujer). El sil'ldrome de Kllnefeltet, con una incidencia de uno por cada 1.000 naciOos vivos, es tM1.il trisoma eo cromoSOtl\89 sexuales que produce varones 47)0(Y. Con una ii'ICidt.mCi3 pareiela se enC\.Iefltr(ln !itMCitl tti$0MitlS 47.XX.X (mujer) y 47,XYV (varn),
29.3.3 Mixoploldia
Recibe e$W) nombro 1<"1 sitt4ei01'1 et1 la que el l)l'lf'lls.mo contiene clulas con dlstlnlo n(,nero de cromosomas. Aqu!l<'s con&til\lyen dos (O mils) lineas celulares. cada uM dertvada de una clula madre. Se puede distinguir entre mOSllico. cuanoo las CIOSiilneas derivan de un SOlo clgolo. gef*almente pot mutacin en una elapa Rcial del errtlrin, y quimora, c~nde> el otigetl son dos elutas msdre Independientes que se han unido en un solo embrin. Como eje~. 46.)0<147.XX, +3 in(lie<'l ul'la mujel con dos poblaciones celulares. una con cariotipo normal y otra oon trisomia 8
29.4 CROMOSOMOPATiAS ESTRUCTURALES

Este .segur'KiO tipo de anomaflas cromosmicas. menos frec::uonlos quo
lt~s numOric:f$,
corresponde a eal'l'tiOs en
1<"1 estructura de uno o varios eromoeomas. &In que &e altete su nUmcwo (46 on ol $Or humano). El cambiO se debe a la rotura del cromosoma. col00nrrw:m1e ~ 00 un (O(:!Qn$titucln de ta molcula en una disposicin tiferente, anormaL Son P<ll'tiwl<~rmente frocuenttis en la anen'li& de Falconi. la alallla ~siD y el &lndrome de Bloom
1.3 descripei6n de )Os dderentes tipos de anormalidadn estruc:tur.-1N tiene en wenta ol nUmer o de puntos de totura del cromosoma y el cariK:ter eq uilibr~do (no h3')' Qrdiela de material cromosmloo) o desequ.U 1 btado (&e pierde parte del cromosoma).
29.4.1
Un punto de ruptura en un cromosoma : delecin terminal N~n~ . tras 18 ruptu'a ele la cadena de ONA lo& oX1remos ro"*"ntos se suelen
unir rpidamente por la
aco6n de enzimas de reparacin. S. &il rotvr<~ OCUltO on un SdO punto y no se repara, el fragmento~ no oontiene el
cenltmeto se perder en 1~ siguiolllo divisin oeiiJiat. se OOgina asl un CtOtTIOSOma con delecin termiNIII.
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CROMOSOMOPATiAS ESTRUCTURALES
407
lO$ erectos fenolfpico$ svelen se' grttves. pve$ My p61ida de l'l"'e!etit~l gcrll1ico (a~ia d-Hequilibrada). Adems. MJ'IQue el cromosoma fragmet'l~ remanente CXlfltlene un cenlrJOOtO. I<I auser.cie d& tele'rlero en ti extremo able y te pveoa aegt\'telat Meitmente resultante del corte hace Ql.lt et Ct0tn0$0ma $ea ll'le$1
En cu<'n1o a IV nomcnela-tura. $e utiliZa l a ~rminotogi a C$1<\bleeida intetr'laciOnalmert~e (pg 90). OeDe if'ICiiea~. en este CMO. los nUmen>$ <::e Ct()il'IO$Oma ~fectado _ ~~. banda. subbar'.da y Sl.C).Sub-bMda donde se pt0<1uo ta robJra. Por ejefnpiO, 46,XY.del(41(p16.3}-plef indica una delee;oo en et !)tazo 4p de9de i8 benda 16.3 hasta el extremo (re o. 10 que es igual. una ruptura en la bal'lda 1 , sul>banda 6, sub-$~nd<J 3 del brtto:> wrt<.> del vrQill0$0(1\8 4 de un
varon
29.4.2 Dos puntos de ruptura en un cromosoma

Cv9n<IO se M ptO(Iu(lrdO mas de un oorte, las enzimas de teparaaon tienen drfiaAiades para dlsbnguir enlte bs extremO$ ~antes y pueaen unw extremos <l'!e no se ootresponcllan en et ctomosoma ong1na1. Como oonsecuenaa. svrgen ltt~n abef'raCiO~ eslrudutales.
29.4.2.1 Inversin
Tiene~ vuanOo el fragmento intermedio formado p01 tas dos IO(uras se we1 ve a unil' en su !)O$icion otigit\81, peto inverticlo. La secuenCia del CI'OI'I'IOSoma reWRa. por tanto, a!tetada. Son reoroenamlenlos ~aos . pues el material perdido se vuelve a incorporar y no 1\ay prolda neta de material uom0$mico Pueden dis'-!gunse dos ca:t;O$. con distinto resdlado:
a) Inversin parac6111rica
....
de t\lptUf'3 CSie
,~
Los dos puncos
m d nismo bta:lO
di:! Q'OII\iO(IIil )'.
1:0 tlCJI&'i:U\.'Odll.
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con1:1cm~:
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~:t'ntrmcro
...
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1
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Se nombran, pot 9J9mp1o, como 46.XY..,v(11)(p12p14) para una inversan entre las bandas 12 y 14 del btaz:o eot1o del crom0$01110 11 de un vt~rn; 1'\19$10 que OmtNI$ ()OSiCIOtles on del btillO p, lill in'Yersin es paracn1rica. aunquf! no se itleliea eJtpllcitame.nte este ear6Ctet.
b} Inversin pericnfriciJ
loS f'W'IIOSde
lbstinll) bral;l) y d
!'l:gn~iiO lll' .. -rtOO
oon~ <:Sitl e"
111Cluye el
(letll f\'ol""f~
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7
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l a nomencia1ura er. anloga al caso anterior: por eje~o. 46,XY inv(3)(p21q 13) ir'l(!ie&OCIO inver$in on et cromosoma 3 de un varn, desde la banda 21 del balzo oono a la 13 del bfa.ZO largo (y, IXW 1;11tll0, >eoc6nltica por ,ncluor et centr6mero).
408
ENFERMEDADES CROMOSMICAS O CITOGENETICAS
29.4.2.2 Oelecin intersticial

El ffill!lmo tfagmef'\10 <:romosOt"lco intermediO~ 10!1 ejemplOS antetloru puede p(ttCier$<: en lugac O V()(Yofle ' menar. por uniOn de lOs fragmenros reslantes. En este caso, el teordenamiento es desequilibrado, f)t.les hay pRIIda 00$& de maten.al cromosmico Slo es estable el fragmento (lnler5ticlel o urnn de 106 laterales) que contiene el cenlrmero; ef otro (fragmonlO acntrico, pg. 92) se perdetil en la &lguiente diVISin celular. Un e,emplo de
I'IQI'nereclal\r.l &orloa 46,XY,d111(1)(q31)-{q33}.
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1
t\mho:J (lllDI.X lk ruplura ~~~ 11"1 rnllln)( bi&I:O del
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29.4.2.3 Cromosomas anulares

Aparecen af unirse los dos exlteiTIO!I del tragmenlo 11\1erl11$dio de cromo&Qm;t lt!hrl\ll\ildo en la <.1411~ Slo si coni!Onen el centlfn&ro puodon lf(ll\$mi..._ en 18 dMSIOtl celular.
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CROMOSOMOPATiAS ESTRUCTURALES
409
29.4.3 Dos puntos de ruptura en cromosomas diforontos: translocacln

La escisin de dos cromosomas no nomlogos, en un punto cada uno. puede conduar a la unin 1"100t1'e cta de fragmentos entre anO)s. genetando cromosomas anorrna68s 'hltlndoo o derivadO$
29.4.3.1 Translocacin recproca

Er.la tran&locacin wnpJIC8 el intercambio de material Gntre los dO$ cromo&Of'l'loCI&: al no haber prdida de ma\etlal QMcico en su conjunto. se tra1t~ de un;;~ anom;c~li ecsuil ibr<td<t Son anOITI<Itlit~s relaliv.-ment.e fr9e0entes. aui'IQU~J ~~meme no tienen efecto fef'lotlpleo. pues 109 get'les Simplemente camelan oe CtOmosoma.
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IIUO):',.U Sn ~lh.b..:n'-1:' l!lf'd (".Jdi!U\11~111 ( :<IA'I )' !!I~ttH)
29.4.3.2 Translocacln de Robertson o fusin cntrica

Es un reordEmamiento particular. entre dos cromosomas actOCntricos no homologos. que se escinden muy oetea del oen1rmero y cuyos fragmento6 grandes se unen por los oentrmeros. Los dos fragmen&os cortos. aOntl'ieOs. $e pieoroen en la pnmera nwosls.
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410
ENFERMEDADES CROMOSMICAS O CITOGEHETICAS
29.4.4 lsocromosomas
Como ejemplo ilustrativo oe b exist.eneia de otros ~ tte tw'IOmllllias eromosmi:::3s Hlru~oral$5.. &e mencionan los itoer"OntOtCm8S. que res:t.~~an de una dMSil'l afleante de etemOSOmas por t i e;o perpeocicolar al eje nonnal de diviSin: 1M eromtlcias del ooeYO CI'Oml)g(lfn8 estn fonnadas por los bra%0$ ~so los largos del eromosomtt original
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Tema 30
Bases moleculares del cncer

30.1 lntroducc:in .............................................,_................................................................................................... 4t2 30.2 El c:.ilnc:gr com o cnfcnnod:td g~n6tiea .....- .....................................................................- ............................ 412 30.3 Et.1P-'S caractc.fistieas en et dcu.rrollo del elneet ........................ -...................................................,_,,,.. 413
30.3. 1 Tumor Pf!0\81'10 bef'ligno ..................................................................................................................... 413
30.31 CrM:er In sltu ..................................................................................................................................... 414 30.3l Tumor tnalignoo c8ncer propiamente dicho ................................................ ................. .... .......... 414
30.3.3.1 Escape ~ro lnvaslvldad .................................................................. - .......................... 414
30.l.3.2 VascularlzaC16n o angiognesle ................................................... - .................... 414 30.l.3.3 Fonnacln del tumcw &eC\Ild.ano o metstass ....................................... - .......................... 414
30.4 Mecnlsmos de tr<~nsfomuu;:in de cil uloa nQf'mal en tumoroa1....................................... ~.......................... 30.4 1 EquilibriO en1 re prOf l fcrt'cin y muene celull)r...... , .,. ....................... -------...... ---- , ---30.4.2 Gene-s responsables del ea.neer..................................,..,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ,,., .......,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_,,.,__,.,,._,_ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_,,_, .. 30.4.2 .1 MtllaCIOt'l de protoonoogenes: oooogenes .......................... ........ ...... .... . . ............... a} Cor.eepto......................................................................................... ...------............ 414 414 416 416 416 416 417 4 18 4 18 4 18 419 420
D} Tipos de I)!Oiooncogene&....................................... ....... ... ............. ....................
30.5
30.6
30.7
30.8 30.9
e) Caracteristica& de la expresin de los onoorJEifles. .. -------- .. _ ,_ ,_ , _,.,.,............... Mu10I)ndegene$~$upre$C)fC$ .... .............. ............. . ........ o) Conceplo ..... -----.......... b) TipO$ <.10 genes On00$upre$0res .. .... ............... ... ... ... ... ..... . . e) ~rael<lStieas oe la expre$iOn de 10$ genos oncoSAJJ)f"C$0f. S _,_, -------- Conttol de la proli.feraei6n pot sel\ales extraeetularcs .............................................................................. 30.5. t Tipos de ~el'lal .. ................... . ........................... . ...... -- .... 420 30.5.2 Transdued6t'l de la sel\al eXIrt'loelular N in!eriOr ......, _ ,_ ,_ ,_ ,_ ,_ , _,..... . ------..--.. ---- , , 4 :2 1 Reg-ulacin del cielo eel ular.......................................................................................................................... 422 30.6. 1 Puntos de control en el ciclo de drvism celular ................................................................................ 42:2 30.6 2 ProteJn~ ~controlan el etelo ~ , , , , , , , , , ... , , , ......... ......... 424 306.2 .1 Cielinas........ .... ......... ............. ,_,_,.,_, ...... 424 a) CielinasoelafaseG ~ ocieiit\as deinieiO ........ .... 424 .. .... 424 b) Celinas Mit61ieas o de la &ase G, ....,.,_,_, _,_,.,........... 30.6 .2 .2 Prote4na qu!nasas dependientes de eiC:IiMS (Cdk) ...... ,.,_ ,_ ,_,_,_ ,,.,... . 4 24 30.6 .2 .3 ACCivdad de 10$ COmplejOS Cdk.Cidina ...., ...,.... ------- ....... 426 30.6.3 RegulaoOn del eaclo eelulaf por los eomplefos Cdke.cllna y al!eraeiOtle$ en Cl Cflnc:er , 427 30.6 .3.1 Es.!fmuiOs de progreslon por el clcb celular y onoogetteS Que lOS a!tettll'l ... , 428 30 $ 3 2 Es.~lmv\o:& de delencin del Ciclo oelluler ............................................................................. 429 30.6 .3.3 El gen supresor del retinoblnliiOmil ( Rt;l) ... . . .. .. ........ 430 30.6 .3.4 El gen oncosuptesor pSJ.............. -....... . ................... ----- ...... .. .. . 431 Apoptosls, muerte cel ular ptogramada o suicidio celul ar ......................................................................... 431 J0.7.1 E1.8P8s y contrOl del ~o <.le ~Si$ ............................ , .... ............... ............................ 432 30.7.1. 1 lf'lc:luocin ............. ........ ... ... ,.. .,.,.,_,_,_, _ , _,.,.,.......................................... 432 30.7.1.2 EjeeueiOn .....................................,.,_,_,_,_,......... . .... , , , , , , ..... , , , ............................ 432 a) Protea~ . easpasas y su papel et1 el eortrol de 13 <'I>OI'I0$1$ _ ,_.,,_ ...,.,_,_, 432 b) Nueleasas ............................................................................. ... --- ... .... . 433 30.7 1.3 Fase final de la apoptOsls .............................................................. -- .......... . 433 30 7,2 Relacin entre ciclo celular y apopto&is: p53 como punto de enlace ......................................... .,.,_,_, 434 Herencia del cincer ....................................................................................................................................... 434 Marcadores tumora.les ................................................................................................................................... 434 30.9. 1 Allera010nes IOC81 es y genettlliza<Sas .......... , , .............................................................................. 435 30.9.2 Al!erneiones lurnorafes y tisul01e11 .,.,_,.,..... ................................................................................. 435
30.4.22
41 2
BASES MOLECULARES DEL CNCER
3Q9.2l M;'IIC<'Idores turnotl'llos............. .. ..., .. , ..,.,, .... ................ .. ...... , , , , , , , a) Marcadores WIYIOI't'lles dO tecroeiOn o ~s 'dtlsieCisM .. .. .. .. .. .. ............. .. ....... b) Citocil"'a!l o medlftdotes SOluble$ de Of9etl celula' .......................................,, .............. 30.9.22 Marcadores tiSOiefea ............. - ........................................................................................... 30.9.3 Marcadores genotlploos o moleculares, _, ..................- ....- ......... - ................... - ...............- ...............
436 436
437 437
437
30.1 INTRODUCCIN
EJ cnoer. neopla&~ o tumor pUede wnsiderarse una enfermedad gentica (YN&e ta dasifl~in moleOIAaf de la& enfmediiOI en ()llg 390), que se oesauol& ~ Otgnnismos superiore~ en la mayoria de los teji!l y en todo Upo de oU;as 5011'\1ic::as (como ~oepcon. tambitn en lr.s e61ul3s geti'!Wlales en er.eeres hereditariO$, pg. 434). Bajo el nomore get~rOO <te eancet se engklC& IJl oo~ de enfermedades que tienen en comn un crecimiento celular de$0f'Cienado (lllmot) y ut~& colonlz.ac:On tisular (met'Stasls), IOdo elo detetmlnedo por una mutacin ncial seguida de 1<'1 t~teumtMC:iOt~ de otras ml.llaeiooes sucesivas. Cada c:ttnOf!ol' es una slruaciOn dls.tlnta con pecullaricfades dependientes del tlpo de o&lt.Aa donde se origina. sus causas (etiologla) y &u mecanismo. el grado de malignidad y otros factore:&. Por oonsiguleme. &e diterencia ciarCIII'I(I;nte de otras enfermedades oentlc<t$. o~ntc Nls monognictls (14m<~ 28) y las anomalia5 O'Ofi'I05~$ (letM 29} y $0 distingue de: JoJs enfermedades multifacaotiales (Pbg.. 399) por la ~sidad en &*as do uroct oorrfluenci<"' de ICJCIOtes gen61i00s y ambien4ales para ~idtW a enletmedlld. AJ igual que !Odas. las enkwmoi:Sade:s molttcvlare:., et et\ncer se m~~nir.esta en artetaelones tliOqulmkas de IOdo llpo a nivel oeluiBr, UStAat y. paJ1Jcult~rmonte pOr 1.'1 apariciOn de marcadores tumotales y tl&\Aates (pg. 434).
Es. PO$ib~c::tnente , la entermedad es.tucJiacla mas lnter'lsBmente y desde ms puMos de vls&a diferentes, habiendo P<ts.OOO en lOs Ullimos ai'IO!l de un oonoc:i'l'llen1o casi nulo a uo gran avance en muc:hos aspectos molec:tMtes, desde aquellOs que explican l9 proliferacin exoesrva y la prdida de <:lulas pOr apo()IO&is (muerte c.Ual), hasta lo$ mecanismos pot los que el cnoor genera la5 rne4sta<&i$. Nueslro objetivo os presenlt~r vl\3 visiOn ~~ inW~gra43 de todos esos <t$pec;IO$, Quo ya h<Jn bcno!lci<wJo a la Biotogia MolecLCar MSica y son nece&anos para oomprender 1M aplicao:;iol'le$, pre~oenles y Murtts. on especial para conflgl.wN una nueva capacidad cllnica en cuan10 a pron661ioo. diagnstico y lr8~mieniQ L3 di$ponil)ilidad acbJal de frmaoos para el tratamiento del cncer por ~erapla se ver &UPerada <tlg(ln dia por t'IQ\'CO()$OS tipos de abordaje basados en Ea terapia gnica, asl oomo en la inhibicin especifJca de la af'lg~ls . la melstaas y la apop409is.
30.2 EL CNCER COMO ENFERMEDAD GENTICA

La par1iCIC)aciOn ae tos genes en la carclnognesls puede seguir do$ tipo6 do mecanil;mo.
Por un lado. algunos cilnoeres se deben a '"'mbiO$ epignticos. ~ no Oien <;on(l(i(l()$, QUe afectan a la ell)fOSibn de algunos~ y puec:en permanecer en estado latente duraMe toda lit vicia de la clutil, Por ejempto. &On Olbvndantes lO$ agentes n..~lgenos que modlfk:an la expresin gnlce alterando la metilacin del ONA (pag. 273). Sin eunb3rgo, la Maycria de 106 cnceres se deben a cambio5 genlioos i~iOOs por mulacionQS. L<t c61vll.'l inicial afectada oreoe con mayor rapidez de b normal y, si no existe vn conltOI ae eso crecimiento, lega a formar un tumor ptlmao on el tofM:to cireuncl8ilte (neoplasia) o t.l'l tvmor secundario (metstasis) en tejido& lejanos.
Las mut:ac::ionos dol genoma responsables de la en!ennedad son producidas por agente$ cancerigonos. do mvy variadas naturaleza y car~istictls (pag. 354), asf como po1 errotes espontneo6 o inducidos en la replicac:in y reparaci6o del ONA. pOr ellO. et 81\6lisls de la catclnogenia se haoe a la llz del ef:to mutagnico, Hoy 5on bien <noeld<t$ (:010 cat~sa de cncer i8s mutaoones que afectan esenciolmentt 1.'1 genes de <lOS t4X>S: 109 protooneogenes y tos gene$ oneosupresor" (o genes supresor" de tumores) , Esto juslifica uM de tM <:ar~iS1icas del cncet, el ser utl8 enfermedad pollgnlc. lo QUO no debe confU"'occitSe oon su car&ctet monodonal ij)g. 413). Como re~ado de la mutacin. lo6 genes e.xprosan I)(OWtJnas attetadas, sobreexpresan las notmales o no expresan stas, $09I)n lOS caSO$; ooalquict<J 68 oMo11 efoc:10S modiflea funciones de ia oUa tan bsicas oomo el oomrol de w divisi(Jn (pg. 422), lo que so m;anl'~tl.al en una proiller&cln excesiva y contirtuill o en una reduocin de la m~.~Me c;ci!Mf progratl'lada o ttpoptOSIS (pg. 431).
pro 1 l'tiiCI 1(1 anonnal
ETAPAS CARACTERiSTICAS EN El DESARROLLO DEL CNCER
413
30.3 ETAPAS CARACTERiSTICAS EN EL DESARROLLO DEL CNCER

El cnoet. una voz: ongini!do, se manilles.a de torma v8fjlbla &egUn la& cif'Q.In&t<Jooc;i;;.$.. el tipo de cnoet. la ed8cl 01'!1 individuo. etc. A grande& ra$9Q$. su de$arr(ll() suele agruparse en tres fase&, oon llO$ibiCII st.Jbetapas de dltldl del'n!l.aciOn: la formacin del tumor pcim<trio bcnig;IO. su ptOgreSIOn In &ru y la ~vasi6n y apariCIn etc mel$1~Sis o tumot maligno.
30.3.1
Tumor primario benigno
Esto (lritnera etapa del deS81Tollo del tumo~, Jamada tvmorogOnfliS, carcinogfnKis tumora.l o tran&formacin neoptiltic, es ta mas esrudlada y me,or ooncx:ida. Se inicia con 13 t~acta ~clula ptogenltora del cncer, que surge en un deter~inaclo tejido por una mutacin en n gen (J)ilg 412). Su prOfileracin da lugar a un clon (pg. 187) de clulas mutactas, un cton ncopl bico. Este comienzo m0t1octona1 es la pnmers C<Jr~i&eic. , dol cilnoet, ~e lo direrenCJa do li!S enfermedades muklfactoriales (pg. 399): a po&ar do Oll<l origen comlin las OMJias del don inicial se Meen gen&lieamente distintas por el aomulo de nuevM mutaciot~es.. Asi, ta mutacl6n _,ielaoota oonflere a la clula ta susceptibilidad tumoral. una predisposicin &etoctiv~ para la prollfetaclbn desmedida. la acumulaan en las olutas hijas de sucasrva& mutacione:s on genes il'llj)licadOS en el ootttrol del cicio celular o de la apoptoSI5, <PJC foVOfez<:an ta protlferacln o le nmorl<'!lidt'd, <::Onduce ptegreSivamente atas propiedades genbcas anorrn;IIEI$ del cncor
lb\'I'DII$ ~p.'>df
llllii>OCl' ~n:
l'liklla y
11'111(1~
mulmllll t' adhdl(on ) tc'CI'ptOI'C:I tll"Uillll) de IDI."l''lbffinil. ~01'11\J biS

;,.,ee,.i~!IOfln
c.\ltncclular
I'C:I~ab!clo'dl' 1:.~
ll'll(f111(1At~
1 11111 AM;Illtelo)HIIIl' llfi.'C'Ic 11 1111 ten que rq-ul11 cl ciduo:o:lul~
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{.111\'1\'111)
~QQ t i titnlfll una nuo:~01 mu.......Un rut'dc-
af1111 a un:. <k_, d lulat!; yll mu....,.ho. tas o:tlullls oX!n las ...,S mmao:i(lno..~
fl~lllll ) " .1. UhlliTiflf(CII\)$i~ ll!le'fildi:l
CIIIIO:I'I'Oo/lj. J'll~~fll
lll.'l(ltr "' <&dtlc~U~C.a mro:rcelulil o oon ..

IIUUi1 C\U'IIl~luJat,
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ll l l!lll,lll'h
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Cuamit.ati1amcntc. se ti'(!C qu< son n~'(:Csarias ~ de 6 mutacioo~ p;r~ < ttc Ullll t:lul I'Ortm~l :~..: oonvrr:r~a en c.anccrosa lda l~a baja 1 41Sl4e mu1.,1dn (del (IC'I,kn de 10~ por ~n y clula). t'~uha pr.knc:un..:ltte rmposrbloe q1.1c dich.'l <:l)n~t~i6n tcngu lu~r CM l'nut.aC'ines indepcndi(>ntcs. La probG.bihd:.d d que u M de las ec-ea d<: 10 14 clulas dd cu~~rpo humano sufra& mutuc:ioooe.s e$ minim~ ( 10H 1ctl\ (> 1oH JOlf>,.. J(ltl), Es prociso. J'MIC$. q11C cxisla un manismo de multplicacrn :decln~ 01111 t.::d~ nu._..,_. mul:;,d(ln .
414
BASES M OLECULARES
DEL CNCER
30.3.2
Cncer in situ
Correspot~de a la siluac:iOn en que las oitulas del t~or primario no han escapado del tejido dOnOe so of'iOin.;lron Puesto que el rumor carece de eapacidad inV#Si-4. ef pron&tioo cllnioo es "' general benigno y con tteeuei\Cia puede oorr~e por simple exttpacln quirrgica. Slo re:suna grave si por su locaizacin afeas a vasos sat'9Jineos. msC\.b o neMeos crrtlcos, en cuyo caso, ;)un sin $0r 'ormalmente un <:nc:.er, podrra consiOOtatSe como una IM!OI)faSia maligna.
30.3.3
Tumor maligno o encer propiamente dicho

COflooen en parte sus aspectos ndeo.lafes. Puede
~ldlrse et1
la etapa que define ycarectiza el cncer. resplt'lsable de la conversitl de la o6lut3 ~ica en cancerosa. es tv progresin O pro~i6n t\.lmor.lll. A pesar de 6U trascendencia, ha sido la menos estudiada: SOlO en klS Ullimos a"'s
se le esaa prestai'ICJO mayOr ~tenCliOn y " subetapas . de dficll St.tlotdlnac:On. vartu
30.3.3.1 Escape celular o invasividad

Las clula!! constitttyentes de tejlc!OS tiOI'I'Mies se mantienen doblemente adhorida& errtre si gracias a uniones lntetCleUtlffiS y a uniones de las clulas con el espacio o matriz tr;:te9.1 ular. t.m es una eslruct:Ura fcwmada por lil)cillns de protoit\3$ ~as {001~ y elasti~). secreloldas por las propias clulas, que act6an a modo de soporte para empaque~at o separar las clulas o 1*3 pl'()()(:ll'eiOnar elasticidad o fuerza de sostn. En estas interacciones ln!etvietoetl proleil\89 ttanSI'I'IemCfal'l&, llamadas integrinas, de varios tillos, siendo la mejol descrita la lbonectina. Por su dcll'ninlo Intracelular. las W!(99riMS se unen a lOe fllament&S de aelina ~ ei!OeSQueteto de cacta oUa.. mi(mtrtts que a ltavs de su dominio extraoelular tienen afinidad por prote"'as teeep~oras de las clulas veCW'Ias (adhe:Sin c61 ul3-dlul8) y poJ protainas fibrosas de la matnz eldracelular {adhes& clula-matriz).
Amlxl$ tipo$ de i!dho$in se ven atlerados en el cnoet y, oomo consecuencia, la c(ula puede desprenderse del tejido. convirtindose en una clula invasora de otros tePc~os. la liberacin de las clulas es consecuencia tambin de la ae~ de cnzim;as proteolltica$ o pr otcan&. O$p0Qibs. QU9 destruyen la matriz extraoeiJiar, pem'litiendo que sea atr~YM3(Sa DOr la clula Of4I)Oga(la de $U$ vecinas Entre (lll<'ls. son destacables las llamadas metaloproteasas de m.atriz ox.tractl ul<~ r (MMP). Que oegradan cesi lodos !Os componentes de la matriz exlraoelltar, pol )O que _,tervienen oo pt00$50$ fisiolgiCO$ 00 rorncx.Sc::lttc:in ti&ulin. ~.<~fes como deWfi'OIIo embrionario. crec*nlen!o seo y cicatnzadn de hefklas. La adlv'i<laiJ t))(easa aumenta especialmenle en las ~las malignas, posiblemen~ COMO oooseeuencia do oo aumen10 de la bloslntesls de estas enzimas. En consecuencia. la lnl'lticiOn de las ptoteas.as ~ Importancia <::On fi'*l torttp(IUiiOO$, p;tr3 el tratamiento del e6ncor. A91n0$ de C$10$ inhi~s adan sobfe la activac:i6n de las ptote.asas a partir de sus precu90tes inadivos (proenzimas o zimgenos. p&g. 33e}. mionlr~ts quo OliO$ bloquean dtectamP.onle la BCCI6n de la protena activa.
30.3.3.2 Vascularizacin o angiognesis

ConsiSte este proceso en la c.apacidad de un tejido para 'armar una red vascular propia mediante el desarrollo de
RJGYOS va$0$ sangufneos. por mec&ni$ITIOS CUYQ$ dcrialles se oonocen an de fotma i~. Las ol.llas tuf'f\01'81es
produoen agenl$5 artg~C~gnioos ~e actUan sobfe oUas endoteiales vecinas para dar lugar a la formacl6n de una ~eva red de vonas. <W'Iorias y caplal'o$. Ello pormie!J que el tumot' crezca muctlo y rn.ry ritpidamenta. al asegurar la legada de oxigeno y nutrien1es: la vascularizacin puede asimismo favorecer la migracin de algunas clulas C<\ncqro$oiiiS t~l torreote Qrculatorio p;,rt~ dii\Jndire a otros tejidos. donc:Je generci una meliastasi&. la ~nesis es ulO de los ob;e-tiVOcS 00 lOs trnl.3mientOS Mtic3noerosos aeb.lales.l'lacieno:;tO uso dO la cxi$1Cnc:i& de prolttinas 01..o inhiben el proceso. como etKk'lStatll'l& y af'l!106tallna.
30.3.3.3 formacin del tumor secundario o metstasis

Mediante la invasin o disemi1ac:i6n colultn. la$ <;61ul;;a$ dol twnor primtlrio Pl*!en fljt1rse en t~ nOfn\CIIe$, para mul!iplie&t'$0 y difttef!Cii'U:SC en ellOs, 4;W)(te) lugar al 118m8d0 tumOf secundario o melistasis . Est& etapa es de enorme gr<~vedad dinica y <:OnstibJye la nota distil'llivt' letal, irreversible. dol tumc:w mO'lligno, pOrque supone la destruccin del tejiCSO sano Que rOdea :1 1M ct-lul<\!$ tumor~les y ta conSiget'ltoe dflieullad de ellminaCIOn PQI' in1e~c:ic>l\ quirrgica.
30.4 MECANISMOS DE TRANSFORMACIN DE CLULA NORMAL EN TUMORAL

30.4. 1
Equilibrio entre proliferacin y muerte celular
La vid.it media de la clula, o periodo de tiempo tran&Ciolnido de$00 SIJ formacin hasta su destruccin. es m.ry variatlM (hor:.s., dlas. meses, etc.). Las ~s m~ntienen controlad:. esta ctlpacidad ntrlnsec:. de crocimienl.o tanto en la embriognesls y el desanolo como a lo largo de la vicia del individuo ~lto. Atgu\8$. oomo las precursotas hOm<'ltopQylioc<as o la$ epiteliales. con vida media muy eot1a. eXP8fW'I'Ienlan una prollfef8ci6n constante para dar lugar a
M ECAN ISMOS OE TRANSFORMACIN DE CE LULA NORMAL EN TUMORAL
415
otra&IOO(;h<ts clula$; otrt'$. c:;omo IM ~as, dt$1n de dlvldl'se una vez difetenclildas. Salvo stas. todaSICI$ c6h,.113$ se renuevan contnl.amen1e en un ~o ele ~~blo celular'. En condiciones fiSIOlgicas. se requiere una eslricta r~iOn getttiea para mantener esta homeosla&IS o equilibrio ooh.Jittr ~ 'orm<' ~u&Oa a las neoesidaoes de cada tejido. mediante la oontraposk:l6n de dos proce&OS:
La IOtmacin por mltosi& de nuevas OOiul<a$ (en el ciclo de <JiviSi6t'l celular, tema 9) determina la 1858 de
proliferacin. Se asocia a un pr008$0 simultneo etc <iferel'l(:iaelon celular, partJCular para cada tsjtdo o estado del deSarrollo (aspecto que no se considera en et pteSei'IIC libro). El eontrol de la prollferncl6n comprende dos grandes MPectos. relacionados pero generalmente no COI'ISider<ldo& de lt' f<ltma glObal neoesarla para fac61ar su comotet~si6r\.tas sel\afles extracelulares (pg. -120} y lit regu~in del ciclo celular (pag. 422). LB a.poptosls, muerte oeltAal programad<' o $Uici:Jic> ect~Aat, es un mecat~iSmo frSioiOgico de elmnacln de clula& al r~t de su >Ada aci.JVa. como parlo del re<;0mbio celul~r neoeuril:> para OOt'ltrarrestar la fonnacln continua por drviSI6n oelular. Igualmente. ~"""'iene et1 la formaciOn oe leJidos (por ejemplo, oe.,tas del cnsla!ino y de la piel), eo la 1'11Qtiog6oosis (por ejeinpiO, tormaCiOn oe 109 dedoe) y en la elif'IW'IaCIOn d4J otult~~;. oon d.Yio ~ico Los do1<'111C$ <fe la apoptOSis se analizan po&teriormente (pag. 431}.
ltl a!lefaeiOn del equilibrio en OOfldjc,ioiW$ patolgiens (nooptasitiS) Cla lugar a un eteelmlento lnOOt'ltrOiado, (f.le puede deberse a una G)(cesrva proliferaociOn o i!l Ul"'a reduCida muerte oetJiar Parece que normalmente el cn001 &e origina por una conjuncin de ambas a~u~$ .
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t'J('tl!)IO; rn\llacin Ji:...,, ~l:n ndue~ de aj)(lllt~~
41 6
BASES MOLECULARES OEt. CNCER.
30.4.2 Genes responsables del cncer

Las mUI8cb'les, presentes en las clulas eaneeroaas. que provocan la ~ptariein do lt't ~~s tuiT'IOf'ales afeccan a genes cuyor. ptOdus proteloo!i regulan ra prollferaeiOn oeh.llat. ra apoptOSis o ra senescencia~ cerva.t (etrYejecinw.lflto). La prolit.acin y la apoptOSis se estudiarAn progreslvamenre en esle tema. deSCI'IDienao tanto lOS rtlea'lnismos 'IOrmares de 1egul&cin como sus ttllcrt~dones conduoente& al cnoet. Primeramente. debemos C!eflrw la e:<i9tet'lc:ia de dos tipos ele gr tu'les. cuya al!ort~CiOn se reraoona con 01 pr()(;Ct$0 cancero&O: onoogenes y genes oncosup~eeores (y sus pt<lctos respectivos. onoopro~inas y prote.iMS oncosupresoras).
30.4.2.1 Mutacin de protooncogenes: oncogenes

f\Ofl"NNII o ptotooncogn que eausa canee como consecuencia de uf\8 ganancia de runeln" de la protelna e~ por el gen. El ptOCOOnOOgtl eodll'ica una proteina normal, generalmenle relacionada con la proliferacin ce....., o la apopto6is, ~ acti.a slo cuando recioe senales na) reguladoras especificas. Por el conlrario, la forma molada u oncovin expre<sa una protelna anormal (oncoprote1 Que :se mM!icne ttt:aivt'l ittldel)end;enlemet~ce de las sel'lales regutadoras. I)C)r 10 Qut el r0$1.11<'00 es un<l 98f'l(ltiCi& do tuneiOn ese le proteina. Se pueoe dec:.. en conseeuet'ICifll, que ros oocogenes son el resullt'tdo de una multtein actlvadOt'a de la tunciOn I'IOrmal de 109 protoonoogenes.. ~s&a conduce. segUn lOS e&!IOS. a ul\8 pfOilerac:in desconltOiada o a una apoptOSi& rel)ti'nida y. en definitwa. a la aparicin del cnoer.
a) Concepto Se aa er tiOmbre de oneogen a ra torma mutada de un gen
fundOO 1 \oi'Jiflllal:
onln)l pcilim de prolifl:fflcin
o C(lfllrul nceuh '' di! llpopiQli s
b) r;pos e piOiooncogenes Se llan iderrtif~eado Pf'Ot<:IOrooo98fl85 Que codifle.n prOioin~s nwy di''Of$~$.
Factores estimul lldorcs del c111cimiento celul.at. La mutaciOn onoognlca otlglna I.W\8 prodUCCIOtl e~:eSiva <fel factor jl)Ceieo o una mayor acti~ de s&e. Ejemplo: el ptotoonoogt'l sis oodiflca la cadena 8 del faelor de crec:Wnienlo aenvado de plaquetas (POGF).
418
BASES M OLECULARES DEL CN CER
30.4 .2.2 Mutacin de genes oncosupresores

a) Concepto
Al igual que lOs
l)f"OIOQn(;Qgot'IO$,
w tnltct de 98flEIS que causan cncer como oon~la
de una mutacin
experimentada por la fom'la normal, llt'mt'd;) gen ooeosuprnor. gcm su.prnor de tumores o anUoncogen (porque su aedtl es OOI'Itrari& a la dtt los ona)genes, -..IQUo lt\ .;c,.ron por un ~nismo distinto). la forma nom\81 del gen (ge.n
onc:osupresot) codlfic& una protl!lna normal (proteina onc:o$UPf~nl o antionc:0f116ni ca) que aell.ia detMiendo ta ptollleracln o bien InduCiendo la apol)lo$1$, CuanCIO una mut3Ci0on dol gen (gen onco&A.4lf9$0r n-..~ado) oonduce a la slntesis de una pr01erna no f'l..w\dooal o l~e esa slntesis ("prdtda de funcin"), ~ prolikwacin deja de estar oomrolada o la ~ls I'U'1C8 liene lugal. por b que aparece una prOI!Iereein e:xoeslva, a menuoo eon <'QJrrU;IIein de d~i'los gc:tflticos en &a$ clulas, Dicho de ocro modo, la versin m utada de un gen or.cowpteSOr pjefe su 1\.inein normal. regulndor<t do 13 prolifor..c;.On, y da lugar al cnoet.
cr1 lll)m1al
gen oncosuprcsor, ge:o supresor de tumores o 31llionc o
flltt!aoOn
gtn oncosupresor
pro>tcna anmala
(thJ Ol~iOta )
~
~
mutado
""""''( l ' """

no hay C$Cimulo
funcin I'M)mlal: nuol O(l;;lth o tk prolifcrncin o> oontrol posh h o de apoptosis
h::.
a protcina
1~ proedna
b} Tipos de genes oncosupresores

Al Igual <JI'8 los ~tlG$, los genes on00$upre:&Ores codifican prolelnas que actan en distirrto6 p..Oo& de las rvtas de ~n , del oontrot del cielo ee1u1a1 y ele lo ac>OI)tOsis:
o
Factores Inhi bido'" det crecimiento celular Ul tnulaein del gen oncosupreSOr Or)fTeSp()tldiente -.In ,., fvneic:naidad ~ la ClfQteina Sin4&1ll8da. Ejemplo: el gen OI'I00$1Jpre:&Ot dcc oodffica una protefna de adhesin oeUat. ausen>e en el carcinoma de
colon.
o
Receptores de esos factores in hibidorn o de hormonas que frenan ol crecimionto celutar. la forma mvtada
del gen onoosupresor codifiea un reoepeor in:&cnsiblo a su liQandc:) o que no translrite la $8!\al al interior de la
clula
Ejemplo: el gen onoosupresor ~ oodlflca el receptot de membrana para el tactot
!l de
crecimiento
ltansfonnante (TGFI}).
Protein.11s c:itopln m itic;.11s q ue i ntervienen en los sistemas de tt11nSduc:c:i n do sel\:l.los a~os a bs recoptont$ M~ . U'! sicu&ci(ln varia segUn sea ta hJnOOII cooetela de &A ptOteifla.. EjemplO: el gen onCOSU(ltesor n/1 codillca 18 neurotbromlna. proletna que estimula 18 ac:twldad GTPasa de R;)s. on c;onst!Cuenci~ h3(;1l'latodO Wt (~ 422). En la enren'l"'edad de Reelellf\9hk$&n. el gen nlf es mutado (pg. 362). pot 10 que la neurofibromlna es defecbJosa. la ptOtelna Ras no libera el GTP y queda en fonna acciva mas tieri'IP) del normal. ~mando &a proliferacin. Fact0fe5 de tf01nKtipei n que dirijan la exPresin de genes cuyos l)f"Oduotos proeeieOs frenan el Cielo ~lul'l o producen apopt05i& t..a fonne mVIada del gen onc:osuprosor exprese un' proteina no lunciOnal.
EjemplOs lO$ genes onCSul)rcsores Rb y 1>53: se estudian en deudle mas adelante (pags. 430 y 431 ). Protcin.u q ue frenan el ciclo cel ular o produeen apoptosls . El gen mutsdo no expre-sa ta ptotelna o da lugar a Uf\;1 f<lrmtt no funcionnl.
M ECANLSMOS DE TRANSF ORMACION OE CL ULA NORMAL EH TUMORAL
419
Ejcmp&o de: gen oocosuprcsor
que frt:na el ciclo

cd ulllt
Gc.-n inhibidor: gc11 C\lya (lr04Crt~a eo~ ni\U)'c (de di~wu.,_.; munC'tll.<;) 11
(rcn:at ~:"l:t\'afiCC okl o:ICI~
----~ e
mnla d ci rt lnaclh'ldQ
en mul:uk. 111 p!l:ll('il!a f\'l>ullli wbt\:t\J'Irtsll\kl <l hil)('tlCti'<~: se (n;na <wtSuml'ICnU: el ~i(IQ
gen rnoutldu.l:a pn.Jil1lll

~~~
SC SIIIICUllJ (l ('S I!'IIICII\ ll
11\'1 :;< l'lt'rm d ~~d~. llatltA W. C\C)l\"1 l'.torlh\l:td
~
1..- cEiulll ~.. di\ id..- u_,..l'S de 1~ nottu:d u fiQ 111
1111>!1.' dcfl(:icnc cr..-.:imienUl) rorolir~"f''u:li"', ptl<'lbk n~rr1 0: lullu fbosw oon \lUC clmdi1id110
~Cll he!l'nx-ig>tlliCI. parll d bCI1 lllUIAd)
Pr~hiCr\l~;(lo ~lular c~~iu e JfiCQIIU\ll .u:b, quo: SCJi gt:i\ (' SI(J SI CIIIXhHdOO CS IICOIIMXifIIi~l Jl:\111 d s en roo1ndu.
GI:N ONC.:OSUPRtSOit O SU I'IU~Wk l>t 1UWORtS
En ('ji C<*SO, al ~en n(lrm l se k
llnmn
e) Caracterislicas ele la e xpresin de los genes otteosupresores

A difer$1'1Ci& de los oncogenes doncse un soto alelo mutante alecta at fenotipO de la celula, la prdida de la funan de un onoosupret;or lo $0 Pf'Qduoe OrAndo han rntJiado tos dOS alelos (individuos homoclgOtloos. genotipo OtlCO$upreSOt rntJiado-oncosvptesor mutado. o pp). Es decir, la fonna mutada de un gen onrosupresor se expre:sa 00t1 caracter r~ivo (pgs. 96 y 395). Es10 es a&l pue&to q~.Je la mut<w;i6n pnx!voe l)r<!idi! Oo l'vn.;i6n C..'fl l<t protoin.t~ . ~o i8s motcul89 de ptO(eina sintelllada:s a partw del <~~lelo normst pu~n $Uplir C$& ~reneio, lA 111enos parcitl!rt'lente. Al IgUal que en el alliO de los onoogenes. la heroncio de tos gene. on00$upre:sores tnutl'tOOs es ta eoesi)Ondiier'lte a su .;arec~er reoesivo. pero &6to bef'le Jugar .;uanOO 1 <'1 ml.ltn()6n 1\3 ~rectado a e61 utas gertnir\81es (ptg. 434).
oen
La probarblldad de muta.;i6n omiltic<'l on los 00$ <'liCIO$ de l,ll\:l misma clula es baja, por 10 que la hO YlOCip()SiS generada dfJ novo et; mvy infrocucn!c ; sit'l embargo, lOS .nc!tiOuos heteroclg()liOCl$ en un gen oncosupresor (que han hetdado ~.o~n (!lelo mul<'!dO) tienen predispoSieiOn a la apariCin oe Cilnoer, ya que slo necesitan una rnutadn somM!ca ~ el otro nielO p{Jffl perder totatr'l'lf!f\1e la lui'ICiOn <le la protefna onC08upte&Of8.
420
COI'I'Eisponde estudiar a oontlnuacln con detalle las tres rutas que regulan
conduce a cilncer:
a. prolif~cin celular y cuya altetacin
1. La transduocin de sel\ales extraoelllares al interlot celular Ms.la ooneew (;(In fl CielO celular. 2. La rogulaan del ciclo oetJJar (proceso esi!Jdiado pte'<iar'l"'MMe en el teme 9), 3. la apoptosi& o muerte oelllar programada.
30.5 CONTROL DE LA PROLIFERACIN POR SEALES EXTRACELULARES

L8 seMiiz:30i0n .-tic;iOOtt PQf mol6<;v13$ Oldernas a la clula oons~uye. en general, el mecanismo de control de la pro!lletaeiOn celular, oeseneadet~ante de la r~iOn del ciclo celular JXlf otras molculas intracelulares. Los mecanismos PClf tos que las sel\tltes ex!raeeuares dan lug;(lr una re&puost3 en interiof de la clula se conocen
gMerlcamet\4e oomo transd'ueel6n de la ael\al, constituyen un ilret~ ~ gnm $ig;ni(IClldo en biologi<'l celular e lnterwenen
no slo en el coniiOI de la proiferacin celular, sino tambin en la respuesta tisiOIOgiea a unt' gr3n ~nlii:Sad de sustancias, como parte eseoclal de la fl.lnciOr\ de tos dl$tin40$ tipos celulares Se ostudian aqui, de forma sucinta. 1M sel\ates procedentes del elderiOr que vat~ a de~ 1<1$ rc$0Vo$1as irflracelularos <Mt r~an en (ltimo e.xtremo el ckiO oei\Mf y. con ello, la tasa de proll!etaciM. Autlcue se conocen l.l'"'biM 001'1'10 Sef\A 1cs mitgenas. OOberia reservarse 8$18 lmWlo para 188 sustancias cue accan estrictamente sobre la m!toe.ls.
30.5.1 Tipos de seal

las sel\ales que fWYoreeen la actividad del cic:to oea.llar se t:Oilooen como posi ti..,u o cstimulador u . E.xislon tambin seflale& eWac:elulares negatt>las o in hibid or as, que acttJan frenando la actividad del dc:to. En ambos C890S.. 60fl muy variados bs tipo& y ceracter!s.tica& de tas molculas cue al incidir sobfe su oi!Je diana actCtan como &eftai, a 11<1'16$ ($e ~ ii'I1(11Qtei(ln CQn IOCOPIOit'S O:sPO<lifieo$ Tipos ~ sealizaci n Por molkulat secretaela.s Setlallzacln a utocrl na Senallzacln paraet1.na Senallza.cln en4oc.rlna (u honnont"l) Sel'ia!iz.aciOn i ntraet'lna Sefla!izacl6n shptica
La diana es la propia oUa seaetora la clula &eeretof8 y la clula diana son adyacentes La clul;~ socrot.Qf"a y la c:Oiult1 d*tlna 9$1jn ~.as; l.a molo.Jia &OI'Il"l (hormona) se transpone por la sangre La moleufa senallntemoclona oon un moep~or /r'lltaoeuat en la ptopla
oUa
Lit moloofa seal (neurotran511'1i&or) e:s secretada por \KICt neurona e ntcraccioo.a con el receptor en ob'a neuona o en una cUa muso..dar ~ e&tn en estrecha proximidad (&ir\apsis)
P~ mo!4eula& unida$ a la membrana lnt.ornocin dirg,~a do mo!Ocult'& de membrill\il eon 1'906'Piorc& do ($eoliUC:iOn y uxt:.p uesta o yuxtaerl na) membraM de la oUa diana P~ unlOnes comunicantes Conexiones <*ectas entre el ceoplasma de las dos olulas
Moteulllf. se.at Factoru de crecimiento Hormona. Pptidos y proteil\ill$

e~croi<le:s
E l........
Faaot de crecimiento epidrmico (EGF) y factor de c:rocimion1o dori..,OOo do plaquetas (POGF) HormOM$ pancreMicas in$Uiir\3 y gluCng6n Hormonas 8drenales y seX\.Iafes Hormonas tiroideas Slo son relevantes en las neuronas NvcletiOOs, rGtinoide$, derivados de c:iclos grn&06, :llido niltioo. montuc:ido de carbono , ..
Derivados de amlnoacldos Neurotransmisores
Ot<05
Tipos de receptor lnt,..cetularas De superflc&e cel ular Con actividad enlimtica intrlnseca Asociados a canales inicos
Asoci~ ~ on~
y nUctoo, que unen molecuiM seal hielrOfObieas Protelna& lntegraies de menCwana. qua unen molculas setlalhidrofUicas
E,emplo ti10$il'l<l quinttSils. como el r~ de POGF y ol de in&ulin<J
~in<'s sit~r.tdas en ciiOSOI
Asi*' proloinas G tril'l'l6ric:M Asoclaoos a culnasas Intracelulares
L.M; prolelnas G estal acopladas. a su vez.. a canales iOt'lioos o a
.......
CONTROL DE LA PROLIFERA CIN POR SEA LES EXTRACELULARES
4 21
30.5.2 Transduccin de la seal extracelular al interior

Au~. como se ns Indicado. ex1sten m~.Jehl& pe$ibilid01des do lrons.miSI(I de la se<'l, POr llrr(llic;:i(S.'t(;S lil (lescripc:On se centrar en el mecar.smo de activacin en el que intorvieno lo ~eina R3.s. et~usat~te de numer0$0$ ptOOeSOS cancerosos. Su activacin es un paso esencial en &ti transOOccif'l de $C;!'We$ p!'O(Iuc;:~ 1 muchos ftlctores
<le eteelmlento
wimu.lacio de fa woduin
..,._..:.;--CITOSOL
ESPACtO EXTRACELULAR Y SISTEMA CIRCULATORIO
mduccj'M'l (1 lnfubll.'tG'
de fac-101\'S de
cnximicnto,
hKil\(lntl!l;, e'!.:..
< h: lu ~poplosi.;
ctLULA VECINA
1. la molcula sel\al actUa como l igando al interltCcionar con gr.~n afinidad y de modo reverSible ton el domi nio utracelular de una prote-ina rti'C4ptor<~ especifica, wyo d omi nio tra ns.mflnbr<~na hidrofbtoo est insertado en la bicapa lipkka de la membr.ma. EJ nl)mcro de rQ~rO$ de ~ tipo concreto en e3d& olvla e& mvy vanabl&. oetde cientos a mi!IO!\es. Ell e1 caso de la ruta que activa a Ras. 18 sena ptocede de dlvet'SOS reoeocore$ ~ni el factor de crecimi!J,nlo dcriv~ de pi&Q~<'l$ (POGF), el f~r de c::rocim.cnto cpi~ioo (EGF), la in$1Aina. etc 2. Al unirse el ligando al receptor, ste se estmuta. En et caso del receptor oe POGF. torma ull dlmeto '/ se activa una ectMded protefna Qlktasa lntrlnseca, c::onetetamente del tipo IW061f\8 ~sa (p&gs. 327 y 425), &oslotilanelo, con gasto de A1P. el domin io i ntr~~lular prooio o bien otr<~S proteinas easeaoa de ltallStnisi(ln oe ra sei\al~ oue<~e rO<Ji;(<'lriiC por v<'lri<'l$ YiM en la$ 3. El paso s~r.e. que lltunaretr'IO$ que, en general. se prOCJueen r'I'IOC21eaeiones et1 la oontorrnaeiOn de ua prot.eina que "' su ve~ permi!.(tn 1<'1 ll'lteracc:IOn COil otraa protel.rm ' adaptadoras o su fosfOtllacln. 4. la propagacin de la &etial contina medtante la activacin de ta protelna Ras. ~ protelna G r1'lOf\OfTirica (tambin lamada p21Ra:s, por su masa de 21 ltOa} . las ptotei nas G actall en nu!T'IE!fosos procesos oomo "interruptores moleculares. al poder pasar de su lorma inacdva, untda a GOP, at estado activo. uniCia a GTP (\lanse como ejemplo algunos faccores de ttaduocln: etF2, p&g. 310; eEFh:t y eEF-2, pg. 312, eRF, pg. 314). En este caso. el complejo activo Ras:GTP transmite la sena! medtante su lnwaccl6n con ollas proteitta quina~$ cltoplasmiiC&s (protelnas ~efectoras"). activndolas, con b que oornlenz.a uM i' cascada de b'&nS<I!!iOn <le la sol'\tal' Lcl oonsiguiomo hidrc)is.~& del GTP per Ras devvel~ a sta al 9$18do r~acuvo. Interrumpiendo a&l ta transmi9i6n de sel'\al has18 <PJe Baya un nuevo estimulo. Debe atladlrse que aunque Ras fue la pritnera CleSCI..Ibel'la y es la ms .nporlante. 8Xisten otras proteinas relacionadas que forman la familia Ras e Intervienen en vatlOS prOC::0$05 celutaros (CQmO Ri'Jb. Rho y Arf)
~ 4~2~2------------------------------------------' BASESMOLECULARES DEL CNCER
00 IJCI~ .U lr*"M:fll'tlllll .,._.ndicnee & \a ..:ltll e:<~ullir
cuudc'm bluquiM
Um~ alteraci6n lre.t:uMI.e en unl propotein elev3<1<'1 ~ tum(Ue:ll {esCit~lmento de colon y l)(lncre<'I<S) ft &a ftwtscln deJ gen ras.. dando lugar a U"'8 protena Ras que e$ Incapaz. de hldr~ar el GTP. por le) quo perm{ll'll)(;$ continuamente en su fMN ~i\11 Ras GTP, desencaenandO ut'l3 .senal de proliftf<leiOn eonlinu(l y no rogut<'tda, responsable de dichos c&ooeres
5.
~~~
protetna efectora activada por Ras produce a oontinu9Cin carrdoe de oonformaan o f06fonlaaones en
do lo "? aascnda de !!el'lnlcs.", entro los que c~:~bo cil:~r R1d, MEK y MA.P qulnasas. 6. FW!almente, 81gU'Ia& de estas proteJna quina&a& de la i!' CMC<~da ac:tVan $0\lnt 1m factor de transcqK:in, ., que f0$forilan Como c.onr;.e.cvcndoa. (ls.tc ~mbia su oordorml310i6n 10 que- le pel'l"nite utlirse al ONA y aetivl!r o te<)t'itflir b.'l ITanscripc:iOn de goi'IO$ ospOciflOOS qvc; eodllieao las protelnas. .que regulan el cielo Cf!lular y la apoptosls..
3VOEt&l'lit$ pt040lnat eotnpQnentos
30.6 REGULACIN DEL CICLO CELULAR

Ante!\ de descflbit 109 detales de la regutaclon. debe indicarse <l'Je la repet!do Oleffada y contr'Of.ada del ciclo celul&r def.ne s;v (luracin caraaerlstlca, es decir, determina el grado de proliferacl6n normal de fas clUlas en cada 1eji00, Cuando 1 a ptQiiJerac:iOn celular es conhnua. exceSNa y OOSoontroiBCia se origina el cncer. Como se ha indicado, t$l0 p~ set OOI"'Setuei\Cia del acunulo suce~ (a ..-eoes CiJmnte anos) e alteraciones o muladooes en ~de klS genes anterloonente descrttos {por e_empto, ras). Analizaremos previai'FIGflte lo& asPI)Ctos mol~ dol prooow
""'"""
30.6.1 Puntos de control en el ciclo do divisin celular
la regulaCin del OCIO oo ~ en ttO$ J)IM\105 bien derlll'lldos, que dependen en SY co,...n~ de las condlclooes itfnbionl<liO!'i mh fttvon<~bles (nutnentes. 1emperarura, sales) y la presencia de los f~ores de creciiTIIGf\40 celular n:es.'Jrios, t.ot: dOS C)t.ll'llos <1t OOtlttOI ptlnCJC)ales se s11Uan en ia inleffase. ooncretamente en las lrans..ciones de Gt a S y de Gz a M. El ter~ punto se iOcaliza en plena miiOSis. Gradas a este tpte OONrot las ohJias &lo inician una, nuev<t fase de dNisl6n cuando se han currpdo las condiciones necesarias en cada punto y se ha finaliZado la rase anteriOr UWz:afldo un sknll. ceo.a puflto oe control aCIUa a modo de "freno de l;t 9lap.- previa Cut'lquitf ~lrc;un$1t'lni;<l an(ltmtlf en uno de (!lo$ hace ccw ltt diYC$iO v lt' consiguiente ptQhfetaei6n oelllar.
REGULACIN DEL CICt..O CELULAR
423
Pregunta
(vcrifi~l6n)
interfase
Elpnmero $e denOmina ponto de control en GtiS. Ocurre cerca deii'J'Ial de G, (211, 2C). antes e entrar el\ le&e S, y una vez superado se dispara la repliwctOn del ONA. Este ~o $0 llama 'oicio on ICva<f\lros dCi gcm<'lon (oomo Sacchammyces eerevis.ICle} y pumo Ro detttstriocin en mamfferO&. donde es el to11tf'OI pnnc1pat del cx;lo. Al & la tase G1 la ms prolongada <S$1 ddo (6-12 h). es en ella donde ms Jn.tervronon l<1s con<.icioncs eldracelularos (por .ornpiO. del mc<fiO do <:l.l!liYO), el Ur1IOO punto d<lnde ~ eielo (egpo~ a sellales e:o:lerna$ y progresa 6111 dependlmcia de estlmukl$ mitticos B P<IW por est.o pvnto lo rtgult'll'l 13$ prC)I(!in.olS ntr;)etlulnre$ llamaoas dclfnas de G, (pag 424),
2. El sagvndo, o punto Ot oontrol en G2fM, 'OCUlte ;Jifin~l <le G2 {2n. 4C). MtS <1(1111'11(:ic) de 13 niii()!U$ M. S. la ckAa no sopera %te pomo, pcrm<tnocc (;(In ese conpiOmcn(() doble) de dl)l1101fl ctOn'()Sc)miea Su (Se(\uegular .ln puede f;8r mport<lnlc on l.:t 1r:.n,f(lr~l6n MOpl$ic:~ El paso pot es~ puMO lo tegu\an las protelnas lftlracelulares 1131'1\BCaS ciellnu dt G: o mittlcas (pg. 42-4) 3. El tercel conuoJ. pun to M, se ejeroe du1ante ta mitosis (2n, 4C -+ 2n, 2C). enll9 lit mot<dt~&o (crofl1()$()01a& oonc:k!Mado& dispveslo& (:n el p&tno oev<~tolicll d<t ltJ o(ll ul.;.) y t;J ~n<Jfaa ($t:p11ro~ei6n ~ kt$ c,:u,)n~oLt~ htlmi;JO;)$ vrlid(IS (ti hu$() miiOt.eo hacia cada pob cellell Asegura que &e okU no se diVIda &:1 hay erfOfeS en te tormaCIOO del hu!IO aaoom!Uoo o en la alineaciOn de lOs CtOmosomas et'l la placa acuatotlat Es ef punto de control cuyo mecanismo es menos conocido y oo se detallar en este laMO. pero postl(emeote depende 1amb1n de las aclinas mlltcas.
(,1 fi-. .\RIO pnnkvtar 1 ur b n~tIKiQa dtl cide rt'lul:u,.,J. 1 l.tl< ~lllt("!; <.: ftOI)Ihrnll c.on .;~;~"",. y min~h.:uiBs.; ,.,..,, t'!dc'. u tud.J cu !ll;l}lhO:t.~la'lo(<kj~~;u..tkW .Se la "-1 '1'(' < on CIC.IIl<le dn1~1nn ccll.lrl, l__t,~ p1'11(till.l.-" ~ numOOul. m CUI'N'IoU, eon b pnmcra lclr'.t en lllll) !btul;;a,; l'dc2 ( 'dk .. ndJ-.it-(1f1.4vlf Ail~. qUIII;!q dctll.'lldkflllc: de- ctehlll. Se ltllld de UN r~uh de l!fiiiCII"!'- Cf!IIA:U\Idad P"l'kiiW'QIIUI/Illl wM r:-.!IJW'I-dc :>\'tll~ lf>."tl!llllll d.; dc1''11111n<Foh1 l)nfiCI~ MI ~J. So>f> ...10-.;CI\~ Co.'IJilll quin.llQtl cuando uum ~Jo.-Ucla.-1 C4lrl 111. Cldt.UII. C"lrlins rnio;mlxn do; un11 lllliludc f!MICI~ que \1! unen u l1\ f!llc;;tlll< (_'dk IICIWillld''""'- -.u U1'11nh1~ llfC.:*dc: la!> ~llllliCio.!!!CH.'kl~...,: que t':\lll.'tltllC!IU W. {'(II!O:C!I(r~K)n ni la dJ11k. t'll pwakltt t:UII el C.ll) d.; di\ ftl\.111 "i.; ela..olio:;m en ckiJ1111~ d-t" G 1O d~ MIIOCI )" ciclitt ..\ d~ C: ot 1itli~lll'
& '*'" (/;
424
BASES MOLECULARES DEL C_NCER
30.6.2
Protcinas que controlan ol ciclo celular
En lo:~- puniQS dt QQ!t1rol G11M y G2IS moMOncn ~ llpO$ C<llilctcrtstoos < proteiN$, las clclinas y 18'9 protelt\8. quinasas , qu& se :'ISOCian l<)n'n~n60 oompio;o. Cdk.Qelinc~~ por<1 c<.mtrol(u la OJCtMdad dGI cido celular. Se ea..udl&rn sucesivamente los oos lipos e pta(elnas yta .,cnvaciOn del COYI()Iejo rotmac~o por atnblt$. p,ara podef abordar despus la reg~.~.a<:ln del ciclo celular por fos opmplejos Cdk-dclina.
30.6.2.1 Clcllnas
El nombre de e~ 91upo de proll:tlnas se debo.-. qVIt 111.1 wnOOfl~racin.,. 1 o6Ua Aucb.iot de acuerdo oon la etapa del ciclo celular. de modo~ estlln presen~ en \N etapa oonero._. y ds$31)3rteen dur.Jn'- l resto dol ciclo.
Exstan numerosas elcllttas; tas prlncipale!l en htlmatlO$ $OC'l ~$ ~s A, e, o y E. AJ9un<~t de olla& %tiln relaCionadas entre si; pcw ejemplo, las Oicllnas B1 )' 82. o IB!I 0 1, 02:, 03 y 04. La lui'ICICn e:xacta de 0!18!1 (ic;linC~~5 {C. F, G. He f)se cooooe peor. ta cicllna F parece esrarlmpllcada en ef contrOl de la transld6n entre ras tases S y Gz.
a) Ciclinas de la fase G, o ciclinas de inicio

SM aqui!llas qu& inlei'Vienetl reg~ el punto <1& oonlrOI G tiS En hul'l\llnO$ pOrl(lnooon a o&le grupo cicllnas def llpo O (01, 02, 03 '1 D4) '/la oclina E. Ambas se SinlebZan duranle la fase G1 {por eempiO, al &n~ la clula en el ocio desde Gol y 6ll conoencr9Cin celular se regula por lranscripcln. Debido a &tl rpida degradaan. tieflen UM onda media oorta (unos 25 min para lar. El balance enlte sntesis y degradacin llaoe que aparezcan en la olula .-t ~~de G1 y de-sapar4tlc:ill'l dur.tr!Co la fase S o t!l iliCtlbar d51o.
o.
Cic-bnas de G 1 o de inic-io
fJ $f\UM del anillo
"'"'cn>!t 1 amanllo)
lndu b Cllllli4W dtali:lprukW pn...cmc C'n la "tula a. ad.l mmncmo lkl n.:.lct n:Niar
dlulll ,ufe v~~ _.,..tn:coo la~ del cido.. dtbido" dntt:d~t y dcgtW::IdO. a di:..IJDI\If pmloJl dd niiQII Eml~" millllpt.."' t1dirwl. que k' lgtllpan l'll dof upo.~
Gml.tii;H; d~hn"" .\ .... l..tllctcfmas- proldmu ~up ~d:.~ en 111
Ciclinas mi1tkas () dc- 0 2
oJ
b) Cic#nas mitlicos o ele la lose G2 Es.te grupo, fotmado por las cicftnas A. Bl y 82. regula el pooro de conlrol Gl/M. En esle caso se mtetzan duran1e la& tases Pftt\'189 a la mlto61s. (S o G2) y se degradan rpida '1 especifie:amenle durante la mltools. La dcllna A
patli en el control de la replicac:.in del ONA y en la entrada en miCosis. La ciclina B. que KAo parti~ en la mitoGi&. &e con~a la cicfina por antonOmtl$iol, ll'U'O' 0$ L.. hQm61og;a ~ mt'lmik:rof <1~ 13 primN<'! c;i~ dC!Icub~<'l ill comenzar el "tudb del oontrot df;l ciclo ~M en los OOCdO!I de la mna XIJMJpu$ 1M111S'. la QU& fOrm:. pa~ <!et ltJCJOr' pro.motor de la madUracin o de la fase M (MFP en .,gls).
30.6.2.2 Protoina quinasas dependientes de ciclinas (Cdk)

COMIItuyen una eamma de protetll8S oon una gran hOmoiOgla de secuencia (supenor al 60%), que foslotilan residuos set'l'ta '1 treoi'IWI de ptotelnas sustra.to especificas. Se trata. PQf t.anto, de &EWV'Iahreonina quinaS8S {pg 327}. Sin embargO. slo pueden GflWC8' eN <1CIIV1dOO ontlmMietl cuandO osln 0$0Ciitdas con UR<~ Q(;lin<': por ello, ~ las llama quii\8S8s dependienteS de~$.. Cd~ o COK (do cydin-d4>~ kin~$0$), Do <'CUerdO con elo, so eorttldtl'3 que en el complejo acbvo (~dN) le; C<!k n 1;, tiUOOnidad <'.Utalilica y la ciclinil &a aubunidal110gul~
Lll u11tc'ln. d~: b n d 1 n.t

pe:rnul~ qu~
b 'I(Uin.;bll
1Cllk) ~J a'hH >" ltJ~Sfl.,l\!"

proldn~ ~fl:l.llll..l ( 1, 2. ]
~lfkas
1 nam~mnqlll.nll ...l'dk )~ ruc4e Ullif 11 dilllmU:c (!(}j!Q$ ( 111 :! eu lupr !k la 1 ). telllltllik! CllolllfiCe!; :..:th id::Jd p:1ra f~Cnnl:~r d!!oollnla. 'O
prntclll;l$ j;lff . .rnlu eol. S. O)
426
Cd<1 Cd<2
Oclina.s dG ~ A B G,ll.1 G,IM S
Ciclinas de Gt
Otros CieliMS menos conocidas
o
( G,IS)
GIS
]j
~ e
Cd<J Cd<4 Cd<5
G,IS G,IS
-.ciacwlll.$
do: cic!ICI$
ricto ,.n d
pumo) lfl<lkllll() 00"
""'
(
(.f~lill.te d~
rootrPI:~n el cid'-" C. d p11m10ind~
Uo(Qa(~~ Ci1 qut
~ot ..
( G,IS)
G11 S
Cd<6
Cd<7
tocio~., t ll)\'l pun~o> de: oomrol no te ron~'i'
lltO.:iltciOiu.:s ..S.: Qlllli
./
Cd<B
~nuol por una
dk d~nudo.b
./
SIG,
30.6.2.3 Actividad de los complejos Cdk-ciclina

L3 3Cfut;)Citl de las Cdk como proteil'l& QL6\8$a9 no consiste simplemenloe en su unin con una cidlna. M\0 que
sv n:~gult~ciOn deo)etlde <Je o1 ros mecanismos:

ll} La poSibilidad de cue se 1otme el oomplejo Cdk-dclina depende de la disponibilidad de ambas proteina&; PV8$Io que las Cdk etiln pr8$0n10$ de Jc>nntt oon!inua etl la clula. soo laS clelinas las 4Je regAan. a1 ) Tasill de sintcsis de las decli nas: oorno se ha lndJc:ado (pg. 42A), ia s.intes.fs est controlada en funcin de &;t e~ ~~ Cic:Jo, aumentando en Ciertos puntos del mismo, diferentes para las ciclinas A y 8 que para la& Oy E a2) Tasa de degradacin de las ciclinas determina, junio con la sinl0$i$, 1<1 CQncenltl!oCi61'1 disponible para SIJ ~In a las Cdk.
b ) Ur\8 vez fOtmado el complejo Cdk-ciclina. sv activid~ protelnas.

DI}
QOti'IO
Quinas& est SOI'I'Ielida a regulacin
pot
01raa
Modlficac~n d& 1 Cdk pOt' fosfOt'il;acin y desfosfotilaein: la actividad 0e1 complejo Cdk~ctna P~Ci&a la tos~i6n <te c:ieftOs reSiduos atnk'loacld lcos de la Cdk y no de ot:roe, lo cual fttil regulado por
dislint;a; QUin<)sas '/ toslal8Saa, que a su vez estn reguladas po1 la propia Cdk activO' (v6ns. r.gur3 _. Ptlg. 427).
1>2} l l'l.tetaeelt\ de &a-s qulna!N:ti con prot9:inn
inhibidoru~ el Ul!imo me<:31'1iSmo reg.AadOf de la actlvklad de k>S COI'I"'I))ejos Cdk-dclina se ba&e en la e.xi&kncia de mvcl'l3$ C)I'OteiM$ que se unen a laS Cdk. Inhibiendo direc;Wff'ICO'lte su &Ctiviciacr. se tes llama JnhibidOtN el$ los compi6Jo:s C(Nc-cfcNml, o CKI Sv eto;to es, por 181'110, bloquear el ciclo de divisin. P k) que blciQ~ QOti'IO o~rti {Pilg. 418).
Los CKI se agrupan en dO$ f<Wnilitts. on 1\JnciOtl de su estrucruta (exlsle sln.dud de sus secuencias), modo de aocin y especffic.l<'d ~ $Ystrato:
I'IOn'ilre de la proceina .,t~ibidora
familia
otros non09s
aocin inl'libiOota Preferentemente sobre lo& complejo$ Cdk-eielina d6 G, y S. En menor modidJ. $Obre CDT~plejOS Cdkl<idil'la de e,
EspeclflGil~C $Obre l()s eomp!ejos
KIP
p21 p27 p57 p16 p15

p18
CIP1
KIP1 KIP2 INK4a INK4b INK4; INK4d
WAF1
INK4
MTS1 MTS2
p19
ARF
do <:ielinas de G, con Cdk4 o Cdk6, pues compilen oon las cic:Mas O
REGULACIN DEL CICLO CELULAR
427
Q 11hUu
(Cdl)
i~tin1
(lloa:o:!'<II'J(I
Cllllllpkj<> Cdkd d ina p:rn b .ll:ti-idad qu illllSI.. po:ro Qn IIIK'Innt
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La prt'kll(ll \!(; fe.fOT)T 11!1p!lk; IIIIW:'ll~ldld q~:~in;."' 1.1~ -t (l(llt'IPI~ (\ll...:ic:liN!

dottocnd.u.
,b,,(l'.o~ .li'IC"\Cil
La Pf\~oa & tos/l)'l'ht c::ll IICi.'IO* P/II.IIIIICII\Idi(J q...inr..q del Wmt~lt:J(' C.dk~i<:h n.
m
~IT>< A"l~d.;(d.o
(.'(ln'lpi~'J('I (.\lk"'("tc:llfll &im m:.o:uo (I(II!WI ~ 1'1:,1.':;1
EA !pUlliCO:
La 111.'11'~ quiua,; df lb l'dk
ll'!ll.l11'11;':
~ ((ll;fyn1~116n de un ~\klo c.pcdlicl)de T)'T (o:cncro lfllltlidorl y otru de Tltr (ccnull C$timubdoltl manlll'nc al n.~lo:J(I Cdk~Kiiru
1 Nctico, ~b que IK1Ua la fof.,.iro-~ina f ~fiiiiiQ C&-2.5
()\le !copn I.Wli;la tmn cidioo Qur t'l ~taduo do: Th t,ti fo>61'Unlao.ll) Out t'l f\'Ndoo de Ty1 ct" cloli
i~tbribodl)
1 '(.1 lo tlln46. &th odaoJ~utn8S$ .uN s~ulldl por: 1.11 dilipMibd...ud do: 6chna.c (q.x lluo:tio l'<lll la. ctapu dtl ddou o:ch...lr), balaiX'o: cmrc w
,:intt"$i:c y:cu&~
com1 1kj!) c.n<ttlon

a<1h (1 o;tllOJ '-IUJI!a)ll
laac i~Jdad&di~'C't'aS lunn*" y f,,s!a.t!ost~qu.: a~not.fl
...;tbrc ('dl.
la ..-lt,"f"ol~d6n n on pnttrifla
inluh iduu" (no 11)(1~,..._)
30.6.3 Regulacin del ciclo celular por los complej os Cdk..ciclina y alteraciones en el cncer
El descubrimiento de la relacin entte dl$tln10$ prooesos ~<\SICO$ y las alteraciones en algun06 genes, especialmente aqulos oon un papel clave en el oon!fol <let dCIO celular, 1\8 pen,itiOo c:cmpre~ 13 tr<l4oendenoo y tos mect~nismos de Mtcionamiento de este ooncrol. Olstinlas alleraclones en la$ pr01eif'\8S que ' C9t.lan - ( ic*) de <:ivi&t6n celular pu~n teno (;OmO COI1$0Cuencia la <ivi&in oelular exoesiva o IncontrOlada. <1anao lugtw a ul'l3 prOiifert"cin celular deSmedida con awmui8CiOn <le 8f\OI'I'IIIItitts genetie.s y fi$iol6gica$ en la$ otula$, que pasan a eonsallulr el rumor.
428
BASES MOLECULARES DEL CHCEII
30.6.3.1 Estlmulos de progresin por el ci clo celular y oncogenes que los alteran
Como ya se ha descnto. el avance por el OOo oelltar se impol~ 01 grande:$ rasgos on dos puntO&: fa sfn1em y degradaeibtl de clctlnas de G., seguida de ta ectNaciOn de sus oomplejos Cdk<ic:Cina. y la etapa equivalente en~ . La aclivacln de estos complejos conduce a reS4)00Sias vanadas, mediadas por fas protelna diana que resultan fosfooladas pt)t la actillldad QU~flasa. Se mueSlra a oontlnuaac'l una v\:s;K)n global de es1os dos puntos e actiYaarl ~ciclo.
~:oadc!I8..Ct00 de
lnrrnm11una
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Tr.l): la m1klsu alu~ pmdudllt' d. b qut~~~

fa~uwm la dc:ti'JdM'IOC'I ck 111 .:i.:lillll, CUQ lo ~ ~
~ll.'no:
la lk11~ idad quc111iii:l
KlfVIICI/;ln de l:dk
L-fll'-J <"dtUJ ~
W lllio."n' oi(D) llo
l nm dt lodo el attliialubr. rcm mc.lnclap;:a51.'

~~~iain)ron ibsun~ cidinb.
CjuinSII
111~11 \'fl
tCcl li)
Trn< U rql~iiln, l11 propia

Cdlllt'li\11 flsVOf(\.f "'
bola~ dei.W tk llliltllt lit: ,l'llc;l t/Miikii*IIC l. fJ<oe (o~ y 11'11&:<; de la f~je $ ya uW! fl~n~a c:n c;u11iibd w lic1ctar p;t~ lllll~tvadellk Cllk
okgr.adxOn d<' b ckhl'llo.

la!ll hH JIIC !<' dcl..:riC 19
a~1wldlld
lfll''*"'
101!\'il"<n"-'nl~:s, biclnn;u;, enrimlll
rqtiJC~~.-.lln (d 1~ 41 :.\lllb <k CMat DNAp(llu*f<l'*' lo~S.
S< mdutt la lrJn. .,:rip<t!Hic pratdnl!l ~~~ n~il"as Jrutw la
fkla d nlfiii' de IIUCIL-illido.">C,

f nc1~~n:,; de
Wllcu..'lim)
St-IICIJ\"1111
tq!Ulli:kl' de lu wphcncilil1
Se ~or~duoo la lrnn$Cripc~
de mk ~liMS Ci1
REGULACIN DEL CICLO CELULAR
429
Esta estmutacin normal de la ptQSJre$1n pOr 01 <;iciQ puede alterarse. tot'lduCendo a un cancer. La mu18cl0n de
crotooncoocnes Ql.lt co<lii'~Can estas proteiMS es1imJiadoras del cielo lOs pueden ttttnsformar en onoogenes. Esto <>eune cuando tas oncoprote*nas respeaiva& actan sin obeOOccr a la ~u!ncin, pnwoct~ndo una es.tintutaei6n
conbrluaaa oet dciO que oonttu.ce a la proiferacin GXCEI$l'Vil CCIV$Mie ~ cilnoet".
Ejflf'Tiplo de ptotel na regu ladora del ciclo
eetulat, codificada por un protooneogn

Ciclina
Efe<-to oneoginiw re&uft.11ttc de 1~
mut~tci6n
Slntesls. excesiva Slntesis no regulada de acuerdo con el eido

Sinl$$is c xotsiva Actividad quina!UI e ..u::eslva o lndepet~dlente de la LR6n de la ddma
Pro~int'l QvinttS<' o protetna tosfatMa
acliv<'ldoras del eotr~ptejG Cdk<:ldlna

Protelna qunaw o proteint1losfolltlt$<'1
Slntesls o actiVIdad excesiva&
inh:bdoras del complejo C<!khna
Proteif\8 no ru~lonat
30.6.3.2 Estlmulos de detencin del ciclo celular

La regtAaeln normal del ciclo depende del balance entffllo$ e;timvlo$ PQ~iVQ$ que le) impu!~n y lOS negstrYos o frenos que deolienen el ciclo en 10$ In!$ punto$ de OOfltrol. G.IS. G;IM y M (~*. 423), paa a~ la correcta preparacin de la oluf.a par<~ 1<1 fa:se igvientc {1* ejemplo, que se haya con'C)Ietaclo la repllcacl6n ante9 de que se OOfldense el genoma y se divida 1.a c6h,.lal). Por ClhOfl'l, lO$ me(;3nismos de ~uaoeiOn oe e$$0s estimulos negativos se conocen peor a escala molecular que aqullo& lXX' lO$ que 6cnc 1193' el eonln)l pO$ibYO: $in embargo, ooneeplualmettte 541$ impicaoone& en la r~~cl6n norm;ll y &!tetada et~ el eaneer 90n Similares en ambOS casos.
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llfU'.-in:o p5J ~~~
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la aparicin da ccincer ClOf a!tet<ICIfl del OOfltrol negativo ton'O$(l(lflde a gelll oncosu(!Clt$0r'8$, o $\lllfescttes de
t\W'nores , wya lui'ICiOn noti"'''BI es ttet~ar el CiClO y, al vetSe rr.rtaoos. Clejan de !\&CeriO (p&g. 416). Como consec::uei'ICi&, la
ol!lul:. replica su DNA y se CllviCie pot MitOSis sin aleflcler a lOS puntos de 001'\tiOf y, Cl'l 00ti'S6Cuenc.a. prolifera
430
elleesivamente y acumula <*feaos oenG~icos (por eje~. por una mitosis premall.lra ames de que se haya ootl'iplel:ldo
feplicac::n~n). Er\ln! IO!l mUitijlleS genes svpe$Qles de t\1~ de"'ilot, lo$ mejor "Miiados &On Rb y p$3. CU)'O!I productos ptOI.OtOO$ actUan SObre 13 teQt.~laei6n 001 cido. A wt~tinu{tciOn :&e dclall<m $V funcin normal y su impkadn en el cnO(!(
la
30.6.3.3 El gen supresor del retinoblastoma (Rb)

El ~c:Wnmicnlo <ht un~ pt\XIi$9C)Sicin herocM;,nia para sulir retJnobJutoma, un tipo i'lftecuenle de cncer que aleda a Jos Ojos, petmil:iO idenlir.e~r un gen (denominado R(J) do trascelndcn~ .,_ 9:1 0011trof del ciclo oelufar. Su ptOOIJCIQgnleo 1<'1 ~ina del rehn0bla$t0ma (Rb. pRb o p10S.Rb. pot su m<t~ de 105 kOa). &e enouenua preseote y a:;tU. on el control de .000 14)0 ~ ~lul~$ nQrmt'IO$-i de <1hi su impol1ana g.oneral. en contraste con el carcter r0$ttingi<IO ~ aetvt~cin qve :u:-~ ~irse dt $u AOmbr6
La proleJna Rb se car8Cledla por experlmentat cambios de fOSIQrii3Ci0c' a 10 largo del cielO oetutw, quo modul;,n su acwldad como freno en el punto de control G1iS. Es!a actividad 'e dt<!be a la asociaCin de Rb no ros.lorii;\3 QQO vM gran cantidad de otras proleln.as neoesarias para la proliferacin celUlar, en e$f)GCICII factoffls de trans~6n lndueties (piQ 269) c.:omo Myc y E2F
f:ri~!,h,-~1 .' , )
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~rO!ir~ Rtt (1 r......-~urorIIribii1J flllll'llll o.'ll \'.
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prokiN' k b "Vflill,l,l l 1t t 0 1\
l..a An11a 011 fnt.fcwilndu dC' Rb M'Cil,.~tn l011 footOI't~ de 11'811So.~i0tl
e nl*k lJ\IC" ao:lfttl
('tdi~a~~
A , l),l;
""
En una clula notmal, ia protelna Rb est siempre presel\le, pero su estado de foskriaciOn (y, por consiguiente. -tu &Ctlvldad) v$tla a lo Wgo de 189 etapas del acto. Los factores estlrralfadores del aeclmlerrto actao oomo setlal que favorece 18 acti\laeiOO de bis protelnas Odlt. oon lo que a.n puedefl f05fotllar Rb y ardan a~ su ef:to lnhibldor sobre
la progresin del octo en G1IS .
l.<t prdid;, o mut<tCIOn do l~ s (JO$ copi~$ {atelos) deJ gen Rb anula ta turw:i6n de la procelna Rb, supfinW!ndo et eonii'OI por Cdk y pr~ un ~ premi'INto a tase S. Aunque &a iR8Cilvacln del gen Rb es responsabk! de cnceces en dWer$0$ 1ejid0$. ateaa en espeoat a las olula9 de la telina inmadura, ~o a la protifacacl6n Clutar exc.e$iva ~ ct~uta et relinobtastoma. Los nil\os CJ!e heredan una copia defectuosa del gen Rb poseen un llnioo alelo normal. pot toque es ms proballte que una mu~i6n anule oomptetamen;e t.a fvnc~ad de Rb y t.,.. mayor &usoeptibilidad al desarrollo de tvmore5 el'lls Attina
APOPTOS&S, MUERTE CELULAR PROGRAMADA 0 SUICIDIO CELULAR
431
Fi~ente. ta aocl6n de la ptotelna Rb normal se puede vet tambin i~lda como oonsecuencla de aertos virv$, ~ bonct rx>t oliO :'ICCi6n promo&ora del cncer lndependletl.le de la mutacin del genoma humano
protc-nas \ lttCiiS ao:luiltl sc~ ~uCS.INII'Ido Rb e impidiendo su $Cdn. Ejemplos: :unl"tno T del \iru~ hlm<wal SV41) p r 111cinu 1 :7 dd p:plorn~\'ttuS proh:i n a t; IA d-el OOI.:nonrus
~ 'f"S::;.
-ol\
..
No se r~-qukt'C' la quin.a:.il para

hl)cro~r E2f': r~ ~ditb. del contrt)l G 1
30.6.3.4 El gen oncosuprcsor p53

AproQmOOmente el 50%~ lO$ l\ltn(lre$ '-,m;)OO$ pr~ntttn mu!:tciOoo$ en vn gen rel<~ciona(.lo con ot 0001ro1 del ciclO cek.l<lr, denomiAaiOO p53 PO' o:x:lillct~r vn& proteinc. cvytt m;)$<'1 moiOCUil!r 05 ~53 kD<t e$t0 no Qvicr9 dOQJ Qve l;a protoil\3 p53 MOri'Tlill $Oil Ja UnicJ (;(IV~ <.!el 50% de lO$ tvmore$. PI.H lot ~umviM mcJt<'Cione$ en otrO$ gene$ cuyo cf<K:Io oombinodo C$ 13 enfermod;)d. 511'1 ern~roo, las leSiones del gen pS3 I:Cr'len un efecto claro $obre la progrcSI6n neopc&slca. El catcter oncosupresor del gen p~ &e debe a las funcaone& de la protelna normal Wt4etiz.ada. que oonsls.len en i nducir Ja apoptoe.is y actuar como freno n 9'1 punto do c;.ontrol G1IS. L<t ooncentraC1fl de la l)ro(eina pS3 en clula& normales 95 baja. por 10 Que $IQ adQuiere relevancia en 5IU<~tCionos OlKMtCialle$ A$1, $G !'la comprobado oo imPQrlante 3umcnto do p53 <:uttndo oxis~ d:t"O en el ONA (JX)f ejem()IO , tr~$ 1~ t:XpO$iCin tt r<'(Ji;M;ionC$), cv&nOO se altera Ja COiOCn!r:tOiOtl de ~letldos en ta OhAa, en ~u&eiones de hipoxia, bajO estil'l'dO$ oneog~nicos, el(. En 0$<'1$ OOtldiCiOr.es, aumettUil la COloentraCin de la protena p5J y se proiOI)!)B su vlea mE!<Ii8 (pasanao de 5-10 minuiO$ 1\3$1 3 150 m!nutos). La presenaa de dallos en el ONA es detectOOa por vanas pro<elna&, entre ellas una ptotelna Q~JW~asa que fosfonla a pSl. La forma fosfonlada de p53 es un faCior de traoscripciOfl (pg. 264) que lnduoe la ex:tesiOn de alguno$ gene& y reprwne la de 01.106. Entre las protelna& wya exp~&In aumenta destaca en prm er lUgar p21, que Inhibe la actlvfdad qulnasa del COf'llllep Cdk2-clclina E. necesana para superar Gti S. En ~o kJ98r. GADD (g(Owfh tf((tt.$1 on DNA damage. detencin del aecmiento por dal'ios en el ONA), una ptO(elna que, al igual que p21, secuestra el PCNA. faCior de proce&tvidad dele~ ONApo~ 6 (pg. t-49). mpKIendo de este modo la replicacin. En consecuenCia. y ce form3 $imilw 3 Rb, la fun<:i6n normal eJe p53 es r~ar 18 progresin del cic:iQ, o~;)/\00 QVot fl <*uta rQPiiQue ese DNA daflado. Ms an, e9 po6lble que la propia ptotelna p53 pattlclpe o estimule la reparaCIOO del ONA.
los defeCio& homocigtioos en p53 conducen. por tanto. a ooa falta de oontrol en el pooto GtiS y una re<JtK;CIfl de la entrada en apoptosls, re&ut1an00 lXIS prollfetacin <:elul&r descontrOlada que ocaslol\a tumores. En individuO$ heteroc:IQiic.os produoen el sindrome de U-Fraumeru, ~racteozado por ooa predi9po&icln al oesarro110 de lumotes. Por !6mo. de m<~f'e8f"et anlog;, ;, lo que OCJ.Jm:l sobre Rb. diver5as proteina& vlnca& generan rumores a travs oet bloQveo de p53 (nt~ T de SV40. l)f'OlttinfJ ~ dtt P&Pilom<JVirvs y proteimt E 18 de adenowvs. por eJ91Tlplo).
30.7 APOPTOSIS, MUERTE CELULAR PROGRAMADA O SUICIDIO CELULAR

La 8POI)tO&I5 e& un proceso fisiolgiCO. controlado geon(lcan'lf!f'tte, que se da en lOdO ~ 6C ~l.as de org;lni$11\0$ multicctvlt~ICS y P<l' tanto en todo$ lOs rganos y sistemas, med1811.te el cual la& olulas danadas o no oeseada$ (que 11an cumplidO su Ci(jO vital. p&g. 415) t~e;liv(ln moc<~ni$mQ$ <;uo conduOllfl a su Pl9ia de511Uoon; de ahl el nombre alternativo de sulckJio celular". No oebe confundirse oon la noe<:rosis, dob~ ;)1 efoQo nocivo ~10 de "9Cnte:s e:lde:rnos. de Mh,rt'llcz~ mcobn~ (rotvrca). biol6gca (wus, bac.ten&S), qulmlooffslca (drogas. toxinas, ~os), e1c. que oonctx;en a ptdlda oe ta capaelelacl de regulaaOtl o$1'1'16tiCill, hincM~to. rotura do 1tt mombrana, sa6da del conter*lo lnttac:8Jiar y. llna!met'lte, tagoeiloSis de tos resic)u()s oet.MirC$. Se observa reduocln de la apoptoSis f!t'l OOt\diCiOnes ll$101gic:M C<ltt'Ciori.tt~d&s por una gran proiferoon celular (desarrollO eiTt:ltlonarlo y posnatal temprano, metamol'fos.s, "'''IC3ni$ti'IO de <'IQCi6n do hormona$ y factotes paracnnos, etc.). asl oomo en Situaciones patolgicas tan diW!t$3$ oomo el cncer (lit ms rept$8ntaliva de ooa exce&flla prOileraCi6n). enletrnealk!es aut<W'lu~ o infecciones viricas Ce ahi la i~;,ncitt del .sl\1Cf10 del proceso apopttlco y su oonlrol y fallO& en procesos petoi6gicos. El estudio do 1:. ~poptosis ht~ <.!e h~C91'5e en oone.:xin con el de la Dtoflieraclon celular Como ya se 1\8 if'ldicado (pag. 415), 1& Clvl3 tanoet<>$3 so consier'a hoy d ia como una clula con una prollferaan incontrotaoa Cet:liaa pt'Obablemente a la suma de una activacin de la prolifet'flec);l y un bloqueo do lt'l ttPOPIOSis De hecfto. la propia
43 2
BASES MOLECULAR ES D EL C N CER
quinliiO&erapia del crnoor estil iri'O.M:Ia de esta dea el .npacto mi\$ bien ti'IOOe:$10 de los tratamientos antiproliferativos, ~ntc C<)usttdo por una ba;& tapaddad de proliferacion de muthos lutnOr"'S. ~ ~on1)tomcnt<'r$CJ con tratanjentos ~ indt.acan &al apol)losis.
30.7.1 Etapas y control del proceso de apoptosls

Oe&<le un punto O& vi&la ~lar y moleQkf, los cownbios en relatiYamente definidas. denominadas indllccin, ojowci6n y faw final
l.o~ aPQPIO$is ~ tran&<:urrif en
11'9&
et;)p~s
30.7.1.1
Induccin
se da este notnbfe a la reacciOnan~ un estimulo o sel\al. Al igual que en la prollfetacOn celular, es lmportanle indicar que la induca6n de la a~osls requiere estmulos adecuados (:sefla'es po:sitivas), tanto extracelulares oomo procedentes de la propa o..lla Existen tambiin Mi\clkl$ nogotiY<'I$ qvo <~oeb.ian on $0rrlido conlmrio, frentllldo la apopt06is.
30.7.1.2 Ejecucin
Tras la nducciOn com~GnZa el verdadero prOCflO dt apoptOSi$. que cns~ <So aKetaCioll$$ diversas que oonducirn a la mucnc de f<'l th.llb: ~ml)ios ~ y de la membrana ()()fl diSnw'ltlCIOr\ de la adheSit'l a otras ~las y a la matriz el(1racelular, contraccin del c:iloplasf'T'Ia.. oon00n$<'Cin <18 '" crom~h. fr~en~ci6n del ONA.
disminucin del 'Volumen noc:INI seguid Cle $0 CJeSinWil'teiOn. rotura oe mieO<:OnCiri~s con '<'eftldo Cle su conteniOO ~~ Qloplltsm;~~, ap._"'ric:i6n de protu~ias et1 la MemOtana oetJiar {lenotneno COt'IOCIOo como :reiOst.s). etc. Estas t~!tetaeiOnes se deben a la ac~acln de 'Varias protea5as y nucleasas, que se oon'Vierten a$1 en las prin~ molculas responsables de la apoptosis.
a) Proteasas: caspasas y su pap! en el contml oo la apoptosis

Lil$ eH pans son u!\$ lt~Milia de proteasas ei109611eas (CienlfO de te clase EC 3.422, dste'na endopeptidasas). En numanos se 1\an ldentttkado 10, daUlcadas en treos grupos, de awerdo con su especificidad de su5tralo. Proctucen la proteoli5is de protei\M dlana o susuato. entre las cueles cabe citar una protelna nudear con acci!/Jdad de reparacin del ONA (PARP o poli(AOPrlbosa)polimerasa) y un facb de tran;Qp(:iOn ($R8P). Las ~PII58$ no slo ~ dc.lgntdomdo proteinas $USI18to. sino ~ tamtlin actt~;an a otras caspasas. ~diendo de su posiCin ett la cascada de accivac:i6n. se dls.llngue asl entre ca&PMa& 'iniciadoras. y ~ejewtor;;as
son dsttinprutcasas. C'$ decir. tiC1lcn un residuo Cys implicado en d <:C"Jllro acti\'0
caspasas
c:;c-ind~-n
la c-.adcna polipl.-ptidica de la protc[na sustrato ~;:n po.s-icionC;S posteriores a un residuo Asp
nltlCUfll
pMl-"\11! E la
cotts pillidos:
f(lnnllllJnatll,llll
tjCit!pl(l!l ~
Rcsuhado:
La et~dl>nucl,..~a act& hbkmo:l\tl.', (rastJK'I)I31Cin dd DNA ProEcoli ~b: de 1 2 :u:l11lli. prd1da dC' 111 IOOna do: la \~lula
ProlciDa q...c "oc: llflll enclonuclea~.

bl"<!ueando su llt'tlvidad
.:<llore int\nsos:
f(lnn:lli liCIJ\'ll"
Pto..~n:r.ima que oorta l11 ne~ina
Ro1ura d... (IC'pinull)os f'ramen~cin dda cilula
APOPTOSIS, MUERTE CELULAR PROGRAMADA 0 SUtCIOIO CELULAR
433
La 8PO(l4osis se cx;:nt1 01 t' rnedianl.e pt'Oceinas implicadas en varios niveles de sel\alaaon oelutar, oodjicadas pot de la apoptosis puede alterarse. generando &ituacione5 P<J"'IOgicM ont1 C 1M que se induye el etu'IOH. Se COt'looetl ya algunos genes que oodlflcan proteint)$ rogu~ol$ de la apoptosiS y su altetaeiOn por mll!aCiOnes. El eontr ol positivo consiste en et ll'liclo de la c:Mcada de caspasas: tona de las prinopales sei'iale& induaora& es la libemciOn eii()C)Iasma Cle los componentes de las rndocondrias rotas., en especaal el citoc:romo e (integrante de la c::<tdeNll IC~toria) . ~te se uhe a &a protefna Apaf (factOt acdvador de las ptotea&a& apoptticas) formando un complejo que 3ctiva 13 proeasp89a llkladora. Algunas prote.lnas. oomo Bax, estimulan estas etapas de inioo: en cier1o& ellneeres BaJt est 1nae11va. anulando su eCecto de control positrvo. Este conlrOI po&llivo de la apoptoSIS es al'llogo al ejerciOO en la prolferacln celular por la inducan en ca.scada de la actiVIdad pr01eina QVinct.:sa de k>S complejos Cdkclcllna (pg. 426).
protooocogenes y ~ oooosupresores. AJ IQtaal qve el ciClo oetJiar, el control
El control ncgo11ivo de ta aporp4oSis, por treno de la activacin de la& caspasas. YTene determinado por protelnas como Bel2 y lk:lx., que aseguran que el proceso apopttico permanezca bloqueado bajo c::oncliciones normales, En algvnos clw\ceres se sobreexptesa Bd-2. reduciendo 1\ ~rh.ndo de 111 <kctr<>IOr.:sr; aun mas 1a apoptosiS. en otros, se sobreex.presan ptOtelnae que bktquoean las caspasa&. oomo la& I>NA de o:~l~ ~ ok lula I>NA denomlnildas S4Jrvlvinoas . En general. est$ CXlfltrol es "- .-nr~l II]IO.'oill<'!~ fr;,gmoent~u.lo similar al e;ercicto soOte el ciclo ~l<~r par l<1 r<ot.lk.. .se: ~ activacin de ptOieinas que inhiben 1 3 ~livi034 l'f,._,. _. ~'11~ mrdc-osomas ptoteina ~ilsa de los oomplcjo5 Cdk..ciclin<'l
b) Nucleasas
se ef'lcat9ftt! de la rotura del ONA cromosn'rloo. genera!menle en sus po&teiones ms acceslb6es. el ONA espaciado~ o n1emucleo&mico, de forma qua se origiM n fl t9f1Cnlos cu)'O tam8flo es tnUIIil)lo de 200 pb (10nga1ud aprox.lmada del DNA oe cada nueJeoOSoma. pg. 86). Por ello, uno de los slntomas oe apoptO&Is es la observacin, al estudiar ef DNA por ele<:ttokrresls. de un patrn de bandas e-n ~escalera (ONA Jaddel).
30.7.1.3 fase final de la apoptosis
l>NA ml:lct(h
n1 ol 6o:ul as do! gran 1amailo.
ii V\U\tiU1
muy
poco por d
tzd
- -
- ~ : Ollll b
l llllll ph
1 600 pb
1.-IOOpb
llllU ph
c:; C'.akra de ONA]

Las proturlelanC:ia'S exsernas de la clula, tormadas durante aa etapa oe ejecucin, terminan por separa1se tormando 109 llamados cuerpos apoptlueos: s10s son caraaerlstloos y oonstiCuyen una de &as diferenCiaS respeeto a la necros.is celular. Loe cuerpos apoptticos son reconocidos y faQOCitados por ocras clulas. tanto vecinales o del propb tejido como especializadas (macrfagos), de forma que toda la clula ~ica se dEI$Iru)'e sin que &e llegue a liberar material oeUal al medio y. en consecuencia, sin la aparicin de una reacan inllamatoria (a diferencia de la necroSIS, d0t1de 111 clula rC"Yienla. liberandO su CJ:)(Iteniclo y prOYQClll'ldO ~a rC$pues ta). Obvi:'lrneo1o, IOdo ~~ procc$0 va ti(;Ompondo do QIIOS ~tnbQs l)io<uimiOQS,
Clhda
llpl)piI j;-;
d~ ':'lttuida
434
30.7 .2 Relac in entre ciclo celular y apoptosis: p53 como punto de enlace
como se M tnaieadc> prevfan"'ef\4&, el gen OncotuJ)rCS(It p53 CC)(Iirte;) la oroteinQ ~le..r p53. reguladora de la ttarlseripciOf\ de t::lettOS genes retaclonaooos con la progreSitl del ciClo celular (pag, 431). Por otrt~ pafW, p53 proyoc;a la apoptosis, cuando las le9b'les del DMA son l~lble9 de reparar, bien sea por su e~t.~nsi()l"' o por detOCIO& on lo$ SiStetruts de reparaOn. Se elimiM asf ta posibilidad de que se uansmittl el DNA gravemonte <'lterc~~do (oon gran llmoro de mutacaones. con teOrganlzaciones etotn096rrkas o oon aneuploldla. por ejemplO), l,O$ 11'of(;81"1ism0$ por 10$ c::u;tkt$ p53 I)I'C)OOCe e!S;) activaCin de: la apopt0$is soo I'IWitiple!l 'f ie oonooen aUn de fotm<t inoomplot<J, paro incluyen tarrto la ac:tivaciOn de la tran~IOn de genes como ae!illiclades no transc~lonales proteina p63. L<t ..ncracin de e:slaos fooclones de p53, debido a la mutacin de su gen. Impide la entrada de la clula en 8Cl(li)CO!Iis, 10 que, unido a la
de..,
desapericiOn de la funan de freno del ciclo celular, tiene oomo consecuencia que las clulas contlnUen prolerando aunque posean dat'fos en el ONA o defeCio& genliooe. ~M.mentando asf la probabilidad de que stos se acumulen y f<Jvoroeiondo t<J 3p;~ei6n do un cn<*
30.8 HERENCIA DEL CNCER

las alteraciones inducidas en el cncer se transrrillen en la milo&IS de unas clulas a otras (oUas somticas}. pero no sa transmiten por hefencia da padfes a hlfo$. Para ello habria de elOStir una predispoSICin o susceptibilidad a la mutacin en la l inea germinal, una susceptibi lidad hereditaria EJ!isten, &oi"l embar9(). taSO$ de cncer hereditario. ttbi<So& a 1<:~ mVI<'Ici6n do ~llCOgenM o geno (ln(;Q$Uprosorot en el volo o 01 o~do do 10$ ~rot . La c;eu$3 y mocnni$mo rn<l'ecol<'lr del dOtarTOIIO del c:aneer heredMtio son lti miSmas que para el t::t~oer $0(1"1tico, SOlO difieren en el t~ de clula OOr'Kie se inieaa (germil'lal o som!iea, respecllvamente). Por 0118 pane. una vez heredado el et.noer. el individuo atectado se OOtlvlerte en portadot y lo transm!l!r a sus desoetldlentes de acuerdo con las reglas de herei'M':Ia mendeliana y depetldlendo del carcter dominanta o rece&No del gen alterado causante del cncer (por iO c:omt'.rn, dominante si ee un 01"1009n y recesJvo si se trata de un gen oncosupreeor mutado. pgs. 417 y 419). Uno de lo& cnceres hetedilarios mejor conocidos y con espocial trascenctoncitt 0$ 01 <te m<~m3. que 1icl'le 6$10 carCier en un S-tO% de lo& (.8$0$, Sv CCMJ prin~l n la mut;lcin do k.l$ gono on~"'Pf'O$(Uet$ SRCAt dol cromosomot 17 o 6RCA2 del t3 (de tNeMt g Met', cncet de mama). El I)M'Iero se expcesa eo mama y ovano. oodif~ndo un f<tclQr ~ trttnsc:ripein 001'\ un motiYo d&do de Zinc (pg. 63) f!f\ su tegln N-terminaL Al tiMarse de un gen oncosopresor. la tr&n$Misi0n hereQilarla se debe geflef'almente a oo a~ mutado, que sao se manifestar en la hija d(l$arre'llanclo un tumor si !an'bl'l sutre I"'"'U!aei6n I)OSI.eriotr'l'lef\e el otro alelo, heredado eomo fonna notmal (pg, 419). La presel'lcia de BRCA 1 anonnat se asoaa en nwjores a ~ 50-80% de probabilidad de padecer citl'loer de mama y a ul'la pre<JiSposieiOf\ al c:tll~r de ovario. Existen otros defeaos gentiooe AenK!dario&. donde se trcansmile lea prodi$()0$icin d~lor un tipO e:sPOOiflco de ~oor: ~ia {lllgmOnlota {pllg 363). enfertnedad ese LiFraumel'll. c~r oetebtal, sarcoma. laucerrM. ataJtla tetatlgioCialilil.IWliomt' oo hO(Igkini<'tno. teuee~ llnfoclliea aguda, etc. Gei'M'!UI!rnente, la aparldn del c:ncer se demora b<"t~nto, pues es r.eeesario que se acumulen mutaciooes somtlc:as adk:lonale6.
30.9 MARCADORES TUMORALES

la$ altomc-oocs de las c6tutas ~rales pueden c::oraslderarse a distinta escala. Lo tradic:lol'lal y ms udlizado en d inic:a son ~~18$ que, &ul'l sin estar dlrec&amente l~lcadas o ser responsables del proceso neoptsico, son OOf'\Secuenda de la exls.tei"'CC& del tumor o Incluso de su G"Y''Ouc:Ifl o respuo&1~ a un.a OG1o~ ~ Con frecuencia. sfee1an a componenl$$ esoeclfic.:os do lit propia ~lol;'l o de c61ulall Y()Cinas.. Estas alton'lc:iones cons1ituyen la base de 10511ari'ICIICSo$ m.;~rc3doro:s tumOf"a.les y tisulares. esaablec:ldos 001\ fines di nk:os y tela()(')fWjos, en geoorel c:x>o o1 grt\00 de rnaigl'lidad <Seltomet. Se obsetVan tanto in vluo (pot eje~ en oll.llas en clltivo ln6ectadas con Wus onoogl'liOOS en el QtOOeSO llamado tf8tl'S!ormacin maligna) oomo in vivo. en runerosos CSISO& cllniOO$, EJ uso dt 10s marcadores tumorales slo es valido si para su determlnaan se cumplen ciertos reQUisito& analllic:oe. En cual'lto a sus posibilidades de vtiliza,ciOn cli.nicct, deben ~rse algoi'\M CQI'ISidetaclones bsicas. Por un lado, raramente $8 emplean los ooos do maret'dOro$ ~ es13bl6eef un diagnO~!co, Sino que ste ha de besarse en datos cllnloos, radio~&. biopM. 01c:.; on goncrt'll, lOs marcadores SOlo sirven pata confirmar le evidencia de' cnoer. Tampoco dotxtn utJiZ~fSe matcaoores para buscar cl'loet en una poblacin (salvo excepciones, como en poblaciones de alto riesgo). En cutmio <11 pronostico oe una .....,ermeded, se exige U'l8 COffelacl6n entre la concentracin del marcador y la mt~w del tumor. SOn acteocuMO!I para el segulrTiiel'l&o del cnoer, on cuyo caso debe confirmarse la of~Qia dellfatamien!O Sigulel'ldO la ooncenttacl6n del marcador a lo largo del liefi'IPO, para averiguar, por 9jcmpl0, si 01 aumetdo de un marcador es irdcio de recurrencla de lea eoformodad y o roquiere una. 'eralia mas enrgiea o un cambio de estrategia.
Las a!!Ot<!Cione$ oe 1&$ c6turas C&l'loerosas son tan var\adas ~ pueden estuciarse e$de <i&tintos puntO$ de vista,;; aoc310s y gcncrali~. bJf1'101'111eS y tiSulares y. Gl'\almel'lte, genocfplces o mole~.
MARCADORES TUMORALES
435
30.9.1
Alteraciones locales y generalizadas
El Pf00$$0 eo~ncqroso eje una innuer~eia directa &Obre la Pf'QI)ia o$11Aa y su vocind;)d (e!eeiO toc&l) o sobre la lotaida<l del organismo (electo get~era!lzado o s.s:Wmico).
E(~IOS l oc..u l ~ Muy nn:.d,~ :>buruccin de 'asos sanguincos. comp~in d~ ICJ~~
Alteraciones CiluSd3S por d

t :11 1(;:f
dc:suvcdn t:dul:lt, <bi\1)5 .::n el sistema nl'r\ ioso, mfoccn. nccro~s y. t:\'i'tllu:llntlll. 1'1\U('ItC: dd paocicnu:
t.ff'dC~ ~n eraliud M
t-utldron~"'ltalmcntc: ocasionados por W ~-.n:tcOO de ha :o~-.::reci'm de
m()l~o.:.Cul:a!> reguladl'li"JS.. obsCfVada
en n1uc:hos (::inccrcs tun1o d.: ICJtdiX, c:ndocrinos dpicos como no cru.tx;rtni)S
30.9.2
Alteraciones t umorales y tisulares
Pr.xlutlll!'i ~o..d(Jl; { P:uimclnos s;nc.'<~ alttrldoos por el't.) dd tW'l'lo)l' a!&,. tumo'S Emimll$ ti.wle.~ q\le ;alt:" ..nlan 1!'1 c.ttctdi~"Mltn a caus:a dd IUl'llOf
f;e!Opica
~ p11odu~ut. P"' un tqtd_. que" tll)! !!131f'lll' !!l 11o) Sll*"l. ~ hon~t~YU ~a i p l<l~t~~ln., en m:.plt ~l!flli<bd u d~ an~....-.nt.i) ~d I"IIPV t.q!doldumk:;.: :.m!KUI.i.l -onnahnm1t ti-' IM)ro ll(tll-'
fo.lt""
30.9.2.1 Marcadores tumorales

Se d<t este nombre a cu&lqdet sus1aneaa relacionada oon la e.:~Stenci<J o <ll.l$0:ncitl ~ un tumor trt liqui<los biolgicos. en ctt>eeit'll el t)lasms o el suero. Su naturaleza molecular es rooy hetei'Oglnea: ln m$ comvncs ~en fvnci6n I'KltmOnal o en2imllca. o presentan ceraaeristiC<IIS antignicas 54.1 aooriQf'l PviXSen deberse 8 al!erttCIOtleS oe 18 tnorfologia celular. de' ~queleto (microct:dos, mic:rofiq,mcntos y filamet'~O$ intermediOS). oe ra supetfieie oe l& Mf!t'I"'IH&n& (anUgenor. a&Oeiado$. prdidOt 00 inhibicin del crecii'!Wr'lto SlOr OOI'It&eto, reeeptores), oe tooo llpo oe par&metros bloQuimiOO$ o de l;:t dOI<'ICQn crOf'I"'ISSmiea (carlobpO anotm&l, tema 29). Son lOs marcadores ~ ms se analizan desdo vn punto oe vista general. Se pueden dlstlnp dos grupos de m.arcaOOfes tumorales los de secrGCin y l<'!s cilocint~s (O cilocuinas).
a) Marcad<>res tvmoraJ.es de S&Crecill o marcadores "clsicos

Pueden chnificarMt on tvncin de lOS 1 -actOtes (liSUiates, mea.abllcos, flsaolgloos. metodolgioos... J que
determinan su wnoentr~iOn en liQuick>s biolgicos. ptlnc~trnerue la sangre. La bS18 de marcadores de secrecin es enorme y. a etectoo ptctiCO$, 1t~mbi6n pueden ClbSiAearse en funcin del material blolg!oo en el que se pueden mudiow m;;.n;adofos Hricos. urinariOs, de liquick> cef.alotraquldeO y oe metastasi& Osea&
A oondnuacin se describen algunos de los matC"adores de ~~rocin mojen t;3r~cleri:QI(!OS
J Cnctr de hJtadn ]
f.il~olrOO;hu oJc ~.;na ;cncillat$~1 arninoieido~). con e!11na:turn Ji.m.il;w la (A1 gl<lbuhnl. aldilicmJ:a pur- un sen dd ~~~~~~~II:Till 4 S.: deu:;;~ :,. 311!1 eOJeentraciM en )u~-to y hqwOO ll!llll'lliOCO del ftIO nom~JI d.: 1 < J ti(1li:IJ~ l\l(omk )1' )ln!Clll.& tn SliOO \itellllo e 111:1,:1100, con Ulnl! f~oW~Cin ~imilar ll b de la Jlbi1mina en ll>.1ilhll<': IIWII.:nt'l b ~i6n (ln.:iic.Jo
y !l'llmp.ll'lllr ~U'Itwd ~JO. Tambim pvu al ~uero m11temo. a 1.1\l\'h \le 1$ pla<o.-nlil. b
c)f'lil\<a IXII".l
diaguslieo fl\-oot. del diX'ICt' llcpcko) dr 1\J~ t!Cf~J~inal.:sqt~t alun ~ wmpo)ncnlesdcl <lll.'<) \itdmo>
436
BASES MOL ECULARES DEL CNCER
~ulmnidad ri de In gonudotropina corinicn (~~bCG))
l Cintem de la lnea germinal J
Ghoopr(\ldnn o:~pr3(1l c:n In piDCtn~ d.-attl(: d cnbur':t>. (oma:ada P"' un11 cadt'n;. a (92 a.minoic:idoG). oodi~ en el crc>~nc,;,ma 6. )' oc:r11 ~ 1145 nmml.'kidos), Q.prcsadll por 1 pes dtl er<lii'IO&ll'lll 19. S:u mi11iOO e11 t'ifimulnr d CIIC1'J'I '1100. uDI ''Cltmpbrnad() el vllk> k-cundada. l:a ,;ul:o.tn.dnd P libre se dctectn en $1u:rl) y. (:fl ocusiorH.s.. \"n li~1id., o:cl~lorrqukk\, Sirve ~ diD~t<'81 tll'll'otlul) num:d. gntm:IClnd p:n.cMgicas y o.:tpieaJ. eA~ I<';Stt~uta~ de ..Vt~ gtn~uv.l >ror.oearctnOII.U! lllll'llCM& t:lmb..:W. .._..,el .Andtomt ck ~n. Se mide por n~ muy ,'llriad~ pri t'l(i~lmo:ntt imuuooq~tlmk-o.'S.. lal~tO cual hath'<l!! l."nli) Qlalllh:atnflll.
P:mi4.:rO"~Iobulinn Hl("'-~ 0
l l.infomas ~ leumia(j (
f'o.li{lptido.' PJocfi{)C94 aniDOdclo!i) lt.u1iza00ftl C"o~..~i todlli$ Jt.- ~ji(b. fo;nna pn11e de"" ndgmo de su~riicit" do:- t.xlu la ce!uW nuck-.adll,. Pu~:de l\(lSIIt o;o fonna soJubk a 111 CIN\IIaein y ~ 111tra en los tilbuko rcn;do. Se d~tt:o ~~~ ~~ )'en orin;J.. Se de'~ con Jndrome$ prolif<11.11h~ ~'n~' utkiOflllill!l. Unl'omu y t.eucemill,.. y C'll en !;~'1'1C'Jal do: utilidad tU tOOO ~m d~fun.eitl rcn;d IUbular,
J\nt:l~no c.:~rcinotmbrionario (C'J:A))
1(':inctr de colon 1
f:unili:l de tlr(Oprolctnas e-.\l)fl:sadas p(lr geue!l del cn)m(osonu 19<. f,Jm:tn llmcac,ncs en a~n edul.-. 1'\'COOOC:i.m~rmo <h: lxlcleri~. inkiactn t\ 'm~ll del tumoc-, ea[cid:ld dt- meli.~t:ti:ut y R'!llbC'in del ef~:Cto inmunciMS"'11. S~ pre.~lltll en l'ario:c ~inom.s y $115 ~~as. :~SI COOIO ('ti '' 'JI~ (fllbrioollrloij; (;k ahl d .,.,ufla ~ suero. OOtto tnarcador heterogneo. poX<I t:ct~ilku (uociaOO a mudl cvcinomas); iC' tll1tnbrd. Se det\ 11$:1 mA$ <n dinic.a [XItu lurnoru deri''lldoG del c:ndonno foolorrc:endc:s. ($[~ pu.III'II'I y n11111na).
1 \ntgrno etuhohid rafo 1 2~ ~CA
12S))
1Cnctr de manu 1
liOOJ!o Vtdna lk do!'\'111.10 U:n~allo>. t\'<MOC.da por un :rn&ic~.~tq~t> ltltlllCI(Ional. pi'\'So'fltc en V\U'tllll f!rt>L'a(lt; no t\lfl\(11111~-s) 1umonles (11X'rem.t.o cm c.:tula& epidi&IC$ del o~ario).)' as.x~a m~-spcct.rteatbMte a twoi(Jrcs de narna. puiii'II'I. !*ciTas y colurm:ul. Es r:~"<'i!ica p;ua r:1 carciDUII'Ill DU n1t~<:iDOw uvAricu. y,.. factor dr pmn&ct.icu p:orn el COoctr !k pulmn oo nticnxJrJOO. Se ~oCilil!il OOMO n~dot dt dtttl&t r:ll t\llnotl:~ r:prt~>tia~ <k ovano (r:MqltO ltl!l m~Krn~i.
( C'alc:ltonlna)
1C'ardnoma~ medularh dt llrok1t5
Uornl(ln3 pcptldice de t3m300 poq1K110C3'2 arninCiieidos)&cgtcgllda pot las \'tildas C ddllroidu {U parafobeulam). Fl umcn"' de $11 ~in produoe un de5o:ftlio.'1 de In eonccnmM:iII de c.l~io libtc c.n pllbna o.kbido a la inhibic.c)n d~ ~u rqotcifl sc.'a y su ~ tubular, Es litil p:or11 el d~nSiieo [lf'CC(ot y el sqrtitni<fiiO ckl cltleer ll'ltdulf!r ok tM<C!i.
( Fa~fniJI'a :ic:ldn pr~rilflu (P \ P)
( Citnctr dt prslaUt J
En1imn. ~~"CIIiCII de~o. ~~~ b i~ima !, implicMin m e l rnctd.lofi&MO de fOoSfollpldos y pmK-1\I.C en t i ~-pitf'ho aco~ pr()li't&tic~>. !)('. dr:tta tn tqutdo s..rrun11l. Sf' udli.w p;;wa detUor )'('(lll(n>f:.r 11 ~"'""""" coo dn< dt pn.\$1 0111n.
\nrfgtntt ~~~O\' indo al c:nrclnoma de tlul:a~ Hrnmo~as (SCC0

~l iooprou:fna a.rs!ad11 de e~~n:ioom11 del eudlo u~erioo. p~c <ti suero
1 CJnctr dt ttro 1
y {!Ccffte.t~ 1.'0010 ll'lllrc.lor tpidtnMiJo:.
( Tlro::lobulina (TGB))
l Cncer dt- liroid~~ 1
Pro-ina t'K'II l'JI t\'l!o duo)S .k ltnAIIa, muy abt111darote m el to.roodeJ ;:o:omo ~cursona de .dn""lll )' al~ dr hom)()IWIS riroi~. U irneliza el IU(I(MQ o " lul11 tiroedcn. en ,..,.i(IIS :rwdos de yodocin. Se lk-c.c:mlilla tn S*'lgtc. ~ndl1 ltutnr:malb .:11 el boo:lll c.:<~ku. la tirlduu illl:'loguda y b C'll(l!rmc'dad de fti!J<'dc,... . E$ cospedlic:. pMa c.Jonec~ di f\'t\-n.;:inlko~ OOil'W> el clDC'Cf PIIPIIIIr y del foUeulo liroidoo&.
( Qut'ratina!l C \ .. RA
()ucrtdJII:i
2 1.1)
1Carcinoma cscamol'o de pulmcn
del 11p) 19.
~~~~
~n)t'lle~~. lll!>\ln~n~ 't:IIS
en t'l c11~uekto cdulat. Su l'alorx.c'ln en ~~~~'N es sc""ihtr: ~ hc~X~UJratias t\'ftll\:5 y (WI.'UI()('nag ~m~ de pul!nn, I:J tat~b.M un mdlcador itt~ ~lf.oo <k
pmhfcrnri&. cdutOif'_
Apndices
Referencias histricas
Aportaciones a la biologa molecular e ingeniera gentica, especialmente en relacin con la patologa molecular
E$1.<1 relacin no j)(eter.oe ser- una ISla exhaustiva de !odas las aportaciOnes CIEifttif~eas que, a tirulo ntividoal o ooleciJ'Yo. &e han !lOChO ha$1~ C(l(lf9Jrar la materia l)(esen1ada en este lbto. sino que si~e se desea rel!ejar b& origenes de las pnnopafes aporwcionos, eon una mencin O$>eetle8 para las pet$0na:S e hilos mas slgr.llcatlvos en l'luestro peJs. En SU mayoria, los daiOS &eleccionado6 han surgido <t ~ir de l;tt irrlormac>n <:onMada, Onglr'l:tl O de fuentes indlreaa&. l06 datos se ordenan CfO(Iolgicnmenle agrupodos baio sieu~ apartados
1.
1?39 Pnmera edicin de la
l<tri'NI~
N01 tura~a
de la materia viva
1 6605 Ft Hooke observa las cektilas miCrosOOp.c.as (c6/W.s} del ~rd'lo

cspai'lota (Farmacopea Matritense}
1838 J, Btr:elitJS sugiere el tl'l'l'lii"'I ptOlelrta pera dertas suS!anclas nitrogenadas de clulas animales y vegetales 1840$ COmienza la te-orfa celul ar de los seres vivos con T. Schwann y M.J. Schleiclen R. Brown OOSeMI una regln densa circular dentro de las ofulas vegetales
(n~
e. Purkinje OO$erva l)(lr primera ~ et citoplasma (Pf01oplUm8) en el interior oe la clula
1650$ R. VirCI'IQw domueS1ra Que IOO'a ceruta oenva oe otta: surge el concepto de di\-.1Sfdn cerutar 1866 G. MenOOI describe 106 mecanismos de herencia de 106 caraclet$$ (plttsm;,do$ tln svs la.m<>$;'15 Leyq$) F, HoppeSG'yler oeup;J &.1 primer<'! Cte<:Jr'a de 6iOQulmiea (OttimiC.1 FISiOM)giea), Unlv. Ttb'lga (Alemania)
1869
t876
1881
J,F Micsc:hor deSCubre la ncJCJfil'llt. ut\a sustanCia eicia tita en lstoro (el ONA) O. y A. HettWig. la sustalld8 genetlca ele loa progen!tOtes se trasmrte en l.a fect.W'ICiaclon
E. Zocharlas demuestra que los aomooomas oontienen la TNJCiefna descubiena pot J.F. Miescheor
1882
W. Flerrming: fusl6n de gamet06 en la lecundaan y posterior separacin del cigoto en doG clulas Se Introduce la Ot.im1ca BiolgiCa en Espaa. en el doctorado de la Facutrad de Fannacia de la UniYer&ldad ~ral 0t MadtiO (Laut'e&IIO Caldern Atana) 2. Surge 1:1 Gen~Uc.a como ciencia
1886
1$69
R. Al!m3M purifica un ONA libre oe prote4nas y aeutla para la nucleinB el trmino .icJdo n~
Alfre<~ NoCel dona su tonuna pata aear lOs premios que llevan su nombre (se eft'll)tezan a concede! en 1901} C.E. C<ltrens, H. de Vries y E.T.E. Seysseneg reoescubfen las leyes de Mendei, al cabo de 35 an06 A. Garroel analiza \a a/captOilUII8 como alletacln del metaoollsmo: surge el concepto de dlllerSidad gentica o polimotfismo W. Sunon concluye que 106 genes 601'1 unidades lisica5 blen definidas y localiz.adas en los cromo&OI'TiaS Primor libro dct Bioquirrca tn ~a Tratado de Ovimiea Bio~. dt Jo:5t Roddguoz Carrael(tO W. Bateson observa el signi!icado gentioo de la consanguinidad y aeul\a el trmino Genetica F. Ganon y A. GariOCS IniCian la gentiC8 mediCa, oon el concep~o oe errore&congnitos <Jel me&a~X~~Smo Sanbago Rvmon y C;ijaJ. pnrrec premo Nobel e&paol (con C Golgi), por su trabafo SOOte la estnJCtl.Wa del
1896 1900
1902
1903
1906 1906
$1$!em3 (ICf"''iQ$0
1909
se tunda en ES()a{W) 1~ Juttla pariJ 1.1 A~ de Esludic$. ta0 la prcsi<:SMeia de S R.nmn y Cajat T.H. Morgan estudia las mutaciones genticas, lOs rasgos ligados al sexo y la tuncin de los cromo!IOt'l'\aS W. Astbury utiliza por pnmesa vez el 1nnino Biologia Molectliar. aunque sin su significado aC1ual P. Joi\Msen n rodt.Jee el t6rmino {1(Nl para las unid~ do la herencia con carctet transmr:sible
1 9 10 1919
A. Kossel. premio Nobel pOr sus estudios sobre la ouimica de las clula& (proteina.s y cidos nucleiCo&) Eke.y acua el tfmino Biolocnologfa para descrbr la -.ueracei6n de la blologia y la tecnologia"
442
REFERENCIAS HISTRICAS
Ptemlo Nobel para T. Sved:letg por e~r la tllr&eenlli'lugaciOn 8/l&lillea para oe-tennin<'lr maS<~:s moleeularc$
A. t.tuller (ptemb Nobet en 1946) demuestra en
1926
1928 1929
moseat Que 10$ rayO$ X cauSt<~n mutae:iono$
F. Gnftl!h demueS~ra el proceso de tf1M$/()ti'1'J8ddn b8Cftrlana (tran$1croncia <JO tteiOo nucleico} A. Levine determina <pe la 2-<te&oJ~irribosa es el azcar presente en loe nuc:teocldo$ Clel ONA
1< I.Md$1.einer, premio Nobel por desctbnr y tipfficaJ los grupos &angu(neoG humanos OH WarW9. premio Nobel por 01 e$1vdio <)el proceso de respiracin celular T.H . Morgan, premio NOOtl POr de$Cvbrir 1a funcin de 10$ ero~ como PQrt.adofes de la hewncia A. Fomng <:Se$CIIW la lel'lilcetOnLmft.. ul'la di!IMzirnia eongerita
J.O. Bemal y O. CIOWioot pM'Ier estudio de una protefna mediante <Jilraccln de rayO$ X (pepsina Cri~li!ada)
1930
193l 1933
1934
1937
19.3$
J. WaldestrOm describe la
macr~ullnemla y
la jXImera vaAemd de porlirla. ia porfW1a cu\nea tatda libras del ONA
W, A&lbwy y Bell encuentran un 059aciado regUlar do 0,34 nm a lo~ do -
A. Huxley: la biocecnologia llegar a ser ms impottanle ~ la Wtgenieria mecnlca y la QUimica
1939
Se crea en Espafla el Cmsep ~not de lnVesDgadones Clemilicas (Jos Maria Albareda y

Manuel LoraTamayo)
1941
1943
1944
La bioquimica t~~lcanza su m41durctz B. MeCitliOCk (l)(e....-o NoCel en 1983) muestra que lO$ trati$1)0S0nes cal'l'oOi&ll 3.
G .W. Be&dle y E.L. Ta!um
e~en la
do ~ en el gonoma
h1p6teM un gen- una eozlma
G. de Hevesy, premio Nobel por la aplicacin de los i&copos raclaCiivoe a las reacciones metablicas
H. Hlnselmann publica una monografa sotwe el d agnstico de cncer de tero medan!e trotls v~l O.T. Avety, C. Macleod y M. McCatty: et ONA es el mcuerial portador de ta lnfotmaeln geootlca Se lnltOtluee la BioqumiCa en los estucflo6 ae llcencialura: comienza la prornoe'l de btoqulmlooe espal\oie9 (I'Igel Satllos Rllizt 1946 S. Takahara tOOniflca la primera <S&enzimia &ilenclo$a, la acaltllaMtnia o carencia de cataJasa 1947 Se mta On Algenl:lnt'l Ol lnStiliJIO do lnVOfbg.'ICior'!Of BOQuimiaf.Fundaci6n C#mpomar Ben'oaf(k) A. HOUS$ay (prerr.o NoOel en 194n y Lvis F . Letoir (directot dol ln$rltJ.AO dvrante 40 MO$ y OttmiO HoCe~ en 1 9 70) OOI'l$triii)'On un~ <te la ii'We$~C;it\ bioqumiCa en HISpanoamriCa. 1949 M ,l.,.. ~rr y E.G. Bortratn ~bton la O'Omath't ~xual en clulas Ge animales nei"MM'a 1950 o. Bevis deseriDe &a avnnloetmteS~Spera deteecar en el teto la hoompalbllldad de tact Ah 1950s Se conoce ya gran parte de la ~lcln ~mica del ONA (anicar, ~es fosfodister y base&) R . Franklln y M.H.F. Wllldns: primeros da106 ptedsos por rayos X &Obte la estrucbJra del ONA J.C. K~ y M.F. Per111z dilucidan mediante d!fraocln de rayos X la estrucllJra de mk9001na y nemog~obln.- (premiO Nobol .., 1 9e2) L Pauting dttCubre 13 base mo10ev1ar de 1a anetnia laiCi!Ofr'ne: surge el OOI"'Ceplo de entmedsd mOI~r H.G. Hets esiUda las enfermedades lisosomales. disenzimla& asociadas a orgnubs celulares E. Chargatf es1ablece la relacin eqvimoleoJiar exiS1ente en!Je puMas y pirimidina& en el ()NA. M, Chase y A.D Horshey oonfirman ~ '111\1$ que ol ONA C$ 01 ~de la inlormaciOn gonttica Se eq,an la~ Esp31i01.1 de BIOp.a&oiOg/a Cttnk8 (AE9C) y la. Scoedad Espat'fola de Clendat
1951
1~
F " _ .(SCF)
4. Se iniclalla Biolog(a Molecular con et estucno de la e.$truetura del DNA F.H.C. CriC* y JO. Wa1 son propof'ICW\ la e-strueb.lta en dOble hliCe para el DNA (premio Nobel en 1962) A. Levan y J.H. 1)io flljan en 46 el niinero de cromosomas homan06 Se descubren la ANA polimer.~sa y el mANA; el mcn$tljO gcntic rOQuiere $0Coeneia$ de pai t!$ do ~>eses F. Jacob y J . Monod de~ran la o)ljs lcnc:ia dO genes esiNCiurale$ y genes regt.ilaOOfes ll'lleaa !lOS acllvtaaOOS <:ientl"Cas el Cent10 de Jnvesri,gaciotles 81o10gicas (ClB): proyeca6n de la Sloqufmlca haCia la MeciiCiOa (Aibe110 Sois y Caf10e A&enslo): se propone el trmno MEdctna Moi9CI.Ifar G..w. Beadle, J . Ledetbefg y E.L Tarum, premio Nobel por e~udio6 de rec:ombinw;in gnica y OJg"lniuacin del mcuenal gnic:o de bacterias M. Mesel&on y F W Qahl Clem~.~Kiran ll(lf' o!IJ<tconlrifugacin ol carO'or $9MiO()n$0MldOt' do lt~ r!)l)liC:<'Ic.tl A. Komberg 95tablece el m.cani$mr> etc la rol)lieacan ea,la!iz.aor> I)Ot la DNA I)OiirnetaSa M Ga~Jiier, J . l.ojovno y R. Turpil'l! el mongolismo est causadO 1)01 un ctOMOSOma supemut'l\C!t'atlo A . KomDerg y S. OChoa. ptetniO Nobeii)Or sitlletaar in Vo'ttopolnudecldos de ANA y DNA
1953 1956
1957 1958
1959
443
19SI).I9ro ExpanSIn de la 8ioqulrNCa en lu Facul!ades de Farmacia y Cen01as de Barcelona (Fernando Calvet y Jorge Bozal; V!c:enle Vll!ar Patas/ y Manuel Aosel). SantiagO de CompoSlela (Jos AntoniO Caoezas}. G.tatl8aa
(Fodorieo Mayor). S.Villa (~ L0$0\d<'l) y Madrid (Ango! Mart n Mur.::io)
1960
Con..nra <:1 osti.6Q del mecanis mo do eaocin de to:~ gonos

P. 6crg clOna 1)01 p'nera, v.o: o1 ONA
SO intrOOuee ta hibriC&cin <te lOS O<IOS nu~os

1961 F. Jacob y J . MMOd (premio Nobel en 1965): la intormaeiOO ger.e11ca ftUye <1e1 ONA a travs de u" ~NA
H. OintzJS der'ni.Je$113 que la ttadJocln <beue en sentidos 5'_,3' del mANA y amino ..e&rtx:>iiO oe ta protena
1962 1963
1961 1965
1966 1967 1968 1969
M. Lyen muestta eii)I'OOeSO oe NM.::tivseiM X en e embrin oe matnl!etoe r.emt>ra M. Nlrembeg moestta las primeras eoe$C)Or\(fleneias er'\lre CO(t()nt$ y aminocidos. sirueW:al'ldO j)f'Oteinas a partir \18 un ONA 3r1ifiei31 s. BreMCr y F.H.C . C fiek.. la secuencia oe OOCJOr'le$1ija ta de a.tl"'inoAeidos. et C<figo no se solapa ni se punta M. Meselson y J . Welgle: la reoomblnacin geneclca se proouce pot ruptura y nueva Ul"'IIf'' del ONA F.H.C. Cnck. J.O. Watr;on y M,H,F, Wilkns, premo Nobel pot ws e<sltldios de estructura molerular del ONA S. Benzer: el ammoacil-lRNA se incorpora en la sin \eSis protetca segn la especdicidad de so antJcodn J . Calm9 demuestra la sin:esis simultnea de ambas hebtas cbante la rep6c.acin del ()NA Comienza a uul!zarse el oosayo de Gutnne para el d agnstico de la f*:etonuria Se ftJ'Ida la Sociedad Espaola de &oquitmca (actualmente de Sioqulmfca y Biologia Mofewtar) R. HoAday propone l.l'l modelo para la reconUlacicin homloga M. Aoget oonsigue por prmera vez implantar un 9M en una clula anlitnona R. Holley determina la primera secuencia po11nucleotfdica natural (lANA-) S. Benzer elabora el primet mapa detallado de un gen W. Atber:: bese bioqu1mica de los proce&06 de restriCCIn y motllicacl6n InduCidas por el anfitrin F. Jacob. A.lwoff y J. Monod, premio Nobel pot 5U5 estudios del c:onb'ol gentico de enzmas y de Vlf\IS F H C . Cnc:k prOIX)nC) el~ de la IXI$0 5' (101 Mbeodn dVfMI G: l<'!lf<'ldl.lccin se Ol:>$trva; et paso de matetlales a travs del poro nucteat (po1 eempo, liSSMt'l$) Se 1nlaa. en Espaa la Bojogia Molecular (An1on10 GardaBeaoo. OaVld Vazquez y etadiO V!l'luela), germen del Centro de &oiogla Moleculat (CBM. Inaugurado en 1975 y actuatmenle C. S.M. SewYo Ocnoo) N . Nomura y P. Traub consiguen ensamblari'IX!Somas 1tt W/10 a psnir de StJS compol'lel'ltes
R.W.
~.
Grart lf110UISO dcS<tt et extranjero de ta BJOquirniea y Biotogfa O::hoa, Sallliago Grisotill y F(3f'ICiSCO J Aya.ta. ntrc OllrO$
M Oebiick. A.D
d$VIr\,.IS
H.G. K.hOi\lna y M.W. NiremDerg, premiO Nobel por la it'lterprtt~l'l <k:l C6go gen6tlco Moreo.~ar en E.sp,i\a, por porte de S.Voro
Hclf'sheY y $ ,E l.uri<'l, l)rcmio N()I:)OI PQr el mecanismo d& replicacin y la estructura geniiCa
se il'lioatl en ~ tos prog1amas de Pa1otogia Molecular con la crO{I(in (Foelonco Mayor) del Centro de
lrtV(J$t~ 6t Atrer.-.ciof~C$ M~MJIIrres y CrOI110$6rru:Cas (CIAMVC)
1970
5. Com~nr:~ l t~ l ngen i~(a Ge~tica , como tccnotogi.1 del ONA recomblnante R. Johl\son y P. Rao sugieren los dos puntos de con1101 (G,tS y GJM) ert e1 cido de <'visin Colutar Se obsetVan en mletograflas electiNCaS los procesoe oe lta.nscr1pd6t\ y tradu0ei61'1 R.J. Brlne.n y D.E. Kohne disean las ccnlcas de reasoc:aacin del ONA euea.tico rcl)(l>1ibYO H.O. Smllh y K.W. Wllcox oescubren la primera enzima de restriCCin
O, Ba!bmole y M. Ten11n: be: virus ANA pasan infonnacln gentiCa a su al'ltrtril'l

1971
G Blobcl (premio Nobcl on 1999) y O. SUbalini proponen Aa secuenc;a s.ena1 para el trfico oe prote\Il:S E w Sut'*'<ln<l. premio Not:lel por sus eSt.doe 001 meeatll6mo ele aoeion ~ h()rmOr'las lncia sus act1\ltdades ellnsmuto de 8fologl8 Fl.lf'NJdmen181 de 8arC:e'Ona (Juan Oro. Jaime Palav y JoM Antonro Sub1rana)
1972
Se crna la Sociedad Espaola de~
1973 1 974
1 Reunin diJ Asifomar. surge la preocupacin Mica por la manipulacin mediante ONA reooabif'lante R Kornbefg; el ~oma es la 5!.unldad bsica de e~etamlento del ONA
A. Claucie, C. de Duve y G "E. Pafade: pren'WIO Nobel por la estruci\Jta y organiZaOOc'llutleiOnat do la chAa N K Jeme. G.J F. KOhler y C. Mllsteln (premio Nobet en 1984} describen la lM'llca deii'Nbridom8 para produar M t:w:ueri>O$ monoctonatos
444
1975
E;truc;bJrtt do lANAs; anticoeln {triplcto en el asa modia) es complementario al eOdn (lriplete et\ el mRNA)
E.M. SOUI'Iern <SP.SarrOia su lcnlea de hibridacin de cidos rucleieo!l. Con e1a. A.M. Dozy, M.O. Golbus. Y,W, Kan y S Mllc:hOI Moen 01 prWner <lit'lgnSiiCO prenatal e una tf'lltnnoctacl genliea (a. t'H813somia)
8.
Se lnlc:i.a et d iagn6sUco moleeular
1975
O. &llt~rr~Ore. A. Dulbeeeo y H.M. Temln, ptem Nobel por mecanismos de produccin de tur'I'IOW'es pof Vrus
So crc1u" lt'l S~ EspaiiOia ae Outfl'liCS Ctlnlcs (SEOC ~ desoe 1994 es la SOCJedad Espar'lots de
{Ji()Ou/MIC(j Ct~ y PaJOIO{JftJ Molecul8f) y 18 A.soclaCkftt Espaltola de Fattr'lltCdutkXJs Ana.IIStas (AEFA)
1977
w Gilt>on y A.M. Ma.xam desefber\ el Qffmer mlodo oe secuenclaciOn del ONA

A Roboft$ y P. Sl'larl) (IC)Servan Que el ANA se transcribe a patt:lr de lragmen!OS drsootltlnuos oe DNA
1978
1979
1980
1982
198a
1964
R. FIWWCII y A. Jenreys oesctlben lOs tNrones (secuencias lnlercaladas) en genes de eucanotas La ~ Genentech pa1enta el proceso de donacin del ONA desarrollado por H.W. 8oyer y S. Cohen.. pr~ hormona del creclmaento en bacterias modificadas por hJenleria gentica Se crean en E$paa bs tftulos oficlale6 de E~IJ en An/i$i$ Clinico$ y 8/oqvfmico Clin.'Q W. Atber, O. Nalhans y H.O Smith, premio Nobel por descubrirlas onzimM dO rottrioein y at)lieartas a problemas de gentJca molecular Se produce insulina ht.mana pof donacin de su on baCterias A. Rlch observa el Z-ONA por dfraocin de rayos X do criSialos ele heX3:n~.~CiotidO$ riCO$ en GC S.M. T!lghman visuaiza io6 R rones en el gen de la globina G. Cooper, R. Weinberg y M, Wigler dHcubren tos ~1'10$ R. Whne y A ~man identifican el polimorfismo en 1~ IQngilud <le lragmen.os de testrioein (PLFR) O. Lane y A. Lavine de&CIA:wen la proteina ~lOar 1)63, $inl(lliza0a por t.W\ gon supresor de tumores w Gilber1 y F, $;)~, p-emiO Nobel por sus mtodos de secuencladn de ONA P. Ber9- promio NObel pot' sus estudios bloqur~ de cidos nucle.lcos (en especial. ONA recombinante) Woism:tnl'l lOgra )I'O(IuCII' inteern humano en b6C1eria& se transfiet'e ONA a animales modelo mediante retroWus Pnmor <~V~0$1ic do una onletmed&CI l'leredilarla, la anemia laiCnonne ~hLilly oomorcialira la ns~ humana (l!urnruNna). primer t&rmaoo recombinanle A t.askoy- primera $01"1&1 de IQea!lrac:ton oek!lar que pennfte la entrada de proteina& al ncleo A. Klug. premio Nobel por la aQIC&eln oe la mlaoecopra eleccrnica a los complejos pr01efna-8cido nucteloo M Sart:laCid. V NotariO y E. SantO$ ident)tloan el prtmer onoogn ht.mano. lnduciOf de mucho6tumore& K. MulliS:. tc:::rka de la reaccin en cadena de la ONA pc*nerasa (PCA) P<~ottt producir DMA on canticlad F G~ : m;srCio'ldot go~ieo parata enfttftMISNJ tJe ~y di&eflo oe un ensayo gentico B. McCiintQCk. p.emiO Nobef por el desct.btlmlento de k16 transpo&Oilfi, ~ &e trasladan de ~JR silio a otro_, olgenoma A. HigUChi y A. Wllson: primera replicacin de genes de una especie cxt~
oen
c.
'1.
1985
ComitnUI ~ Gonmica
El Depattamento de Energia de EE.UU. (OOE) plante6 ITit6toOos OMI SOCI*leiar genes, de Inters ctfnlco Comerclal!zaCI6n de proten.as reoombinanles; hOfn'IQn3 de ~o (Ptoroprirl). ir\letletn (A'olern). ele.
A, Jeff<y$ <So$~mona la rweNa genlics para ldentlbr pefSOt\aS a partir de su matefial bio~
Se ausomati%a la secuendacin del ONA se iniCian ras acdvidades de la Soclsdad Espailolg del Biof~' (con$tiluid& 1966 se aloriZa una vacuna para la hepatitis 8 proOOcida Jl(lf ingonieria oenotiea Se crea en los tnsritLNOS Nacionalln de lit Sit/tld {NIH) de EE.UU. el Comit Constll'tJvo del DNA Recombinan:e H, Aoderick acua el ttminO ~ciencia y mtodos para IOca!iz.ar gene& y hallar su &et\loncia
V.A, Mct<usick rooolila unas 4.000 atleraclones gentica& hereclic.ar&aS di&tin\a&
tormatmen~e en
1985)
1987
Se do&cvbfo Que ta me(l!&cln del ONA en eucariotas silencia su transcripcin
Se prooono ol riCio <1e1 Pt~ Genoms Humano (PGH}. coordinado por la Organfz3Cin 6'11 Gonoma
Ht.~rm.tno (HUGO),
ooo ~en Londres, Belhe&da y Tokio, En EE UU, &e cnJa la Qfi(;Jnlt dtllnw:stig.<tci6n del
lnvesogaci6n del GMOma Ht.amano). presidida pot J.Q Wal$10n M$1a 1992. Se desarrollan 10$ cromOS()mM ar1ifieiales oe tevadl.Wa (veclores YAC)
~ (h..OOO. ~ro NBdotlat de
445
1988
1989
1990
1991 1992
tm
J.W. Black. G B. Etion y G .H. Hitchings. premio Nobel 1)0( el tr(ltamonco con t;trm~C()$ Ot van:.s enfern'led&OeS S Anman y T A cecn. prem.o NObOI oor demoSirar DtOQied&des cawlucas en atgunos RNAs J.M. Bi&hOp y H. E. Vannu&. pnm110 Nobel pot el desctbrirr.ento de tos oncogene$ rc11ow~ C. Venter \1t.SIIIrrotla vnn O$trategi& pau) III)C3titar 1M EST (etiqoelas de sect.Jet~CISS expresaaas) M .C. King asocia un gen <e~ Cl'()tn()$oma 11 con ta apart::ln oe cncet de mama familiar E.H. Fiscner y E.G. Kteoe. premio Nobef por lOs mecaniSmos de losfori adn reverstble de las proteJnas Se ob!lenen mapas fisioos del cromosoma 21 (0. Cohen) y del cromosoma Y (0. Page) H. Noller demuestra que la aCiiw:lad peptidiltranslerasa &e localiza en oo rA:NA del ribosoma P.A. Shatp y A .J. Aobens. premio Nobel por observar genes disocntinoos (I'IHOI'I$$elf(ln4)$) en eucariotas
w. Akey elabora fl primer modoto llidimenSionat <Sel tom(JieJO motecu#ttt ~potO nude8r
A. Rosses ~lableoe ta c:oneJCJn entre ef gen ApoE y la enlermedad de Alltlelmer
K.B. Mullis.. premio Nobel por

t 994
et rOOIOOO do reacciOn en cadena <le la ONA !X*no,asa (PCR}
M, Smith., QtetniO Nobeii)Or la tnV!ageoesls dlrlglda mediante Oligonudetdoe A.G. Gilman y M. Roobell, pre~ Nobel por descubrir las procefnas G y su papet en la transducOO'l de
seales
t996
Se *vetleian lOS genomas oe 1a l)acteria mas pequel'la, Myccp'asma genltaum. y de la levadura oe O!'!f\'eza. saccn..<tn::m,yc:"e$ cetevi$H Afflrootryx oomercializ-.a un biochip parn anaizar las mutacione<s del VlflJS del SIDA
1997
Se hace posible la detennlnacin de cromosomopatlas en clulas sanguineas fetales

ConcluSin de' mapa lisco de alta resoluetn de to6 cromo60ll'las X y 7 Secuenciacin comf)lol<l dOI oenoma del OIA;~mo CHnomatx/itl$ tl.,DM$ El gen oe bleomlclnahldroxllasa est ligado a la enfennedad de AIZheollTier.
1008
indeper~memente
del gen ApeE
C. Venter crea Celera oon &ondos prrvado:s para secuenciar el genoma humano en 3 aros. y descifra el genoma de microorganismos patgenos y de inters cornefCial y farmacutico
1999
R. Weinbc1g '' ans1orma in vit1o una clula hi.M'I'Iana sana en cat~oerOS& Median1e mu!ac~ genw:as SecuehCia completa y mapa genlloo del complejo mayor de Nistooompallbllldad en el cromoeoma 6
Un consorcio pl)blico (Europa. EE UU , J<~pn)
SCQI.IItlfl(;ia el
9'7% del prmc1 cromo$Qma ~m<Jnt), el 22
Pl\lcbt'S ~ngviheas c>ara el <liagnstic:o del eAnee1colon oct.\1 a lraW:S oe guanilileictua
2000
SiO<Ivimieos, bilogos molocuiBIO$ y ~leos OCUPtW'~I)UCstos de (O~d on la& R~ A~ia.s dd Ciencias (ngel Martfn Munlclo y Ennque Snchez-Monge y Parellada) y de FamttJcJ.a {Julio Rodrigue:~: Vl!lanueva) y ellnstitUlo de Espaa (Ua:rganta Sala& falgUE!'tas)
Mh.Pa oomplelo oe a mQSICa CROS()f)/"'ikt ~~l'l(lgoUlcr

Los polillcos oe EE.UU. y Reino Unic pi(Sen el libre acceso a lOS oatos del ~01'1\&
Se deSCifra el M8)fl genlloo Cle lOS cromoeomas humanos S. 16 y 19 Se secuencia el cromosoma 21q, que SOfP<nde por 106 pooos genes que conttene So Mee 1<1 prosontatin delgcnoma humnno (95% $0CVCOCi<t00. conjvrnnmonte por PGH y Celara)
Bibliografa
Se rocogo un!l rol:lcil'\ de librO$ CIC texto
recitt~teS , e;~
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ndice analtico
Notu reiiOvM ala onsenac10n a.tabebc:e de bs tmwl06
Se han gnorldo lttnls ~~. numeros v ottos if'ICIIC:a(IQI~H oe poeiCIOn <1e1 IVIII!UVf"llt '-'" como N y 0.)_
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. . . . . . 127 MlfiiC:IOI en~- 432

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dll cldol: nur:t.lcce. 1645
geomtttlll Ot to. p.Jres de modele rnoltc:ulare$, 53. 54 NJP-nbollriiQO_ 336 act'lemcrn. 259
attnldad,
dll baa. niiJ'Ogll-... de ~ICIOI y nuclelldol:. 28, 166 varlaatl en la d<lf'!Dturallzacin detONA, 165 ABTS. 1&6
_,..
139
o:!
&olubrhdad. 134
bpo&,
33
aoen1r1co V611e cromoeoma 2aotl&modolluortno, 355 359 N-aeo~lt'lctOiollmlr\A, 330

~otiglrucolftmrna, 330
'MCOSICiad. 34 aeilaein ot anww)tlcido$ on prOICit\3$, 334 acorlarr.ento de los O)ttremos del
128 para f.(l r&C:CIOn <te mRNA, 280 1>01 lll ~ de pOir(A). 280
mf~.
No.acelineufarn!nleo (fleldo). 330

fl-N;olilht*IMn'llnk:tiiN
V;.N ht'-OIImnciiN A
8oe111aotl
......
ON,6,, 157, 158 acridlna.. 259. 355. Ve.ase naranja
ll"'o*""-. m
ig~r.
deacrldN
AFP. 435 170
dta~.32t dt~ . . .
y e. pton glnca 28'

. . _ _ 2&1
t!!ICISin pot caspasas, -432
.a.ICIITICli!"\11 o. 2S8
lati'Aa ~. 112
de grupos~. 118, 179 tX> atl'liV*"...... 302 303. 307
-..
J9110U, 131
'<IIUbnaclo, 370 JlOOhOf .oatn-=o
en 11 tx~ 0.1 ONA. 1~

..,.,..~_112
. . . . 8S.96
acil~.266
N'~3:2$
<rw:tad
80CIOtW. 13
N:M ViNS9atr.,...
adilptadot
6cldo \lfiCO 1J ktdol tleciO liOtn .. delnltutlhLaeln, 16A6elelo nudll<:o. 1 abson:tn en tf ultn\'!Oittl, 36.
adernna. 12
adenrna fo6fonixl&lltra1'11Sierasa
VeaseAPRT $-adenosllhomocrsteina, 201,273 5-adei'IOSilmtMionina, 22, 199, 200.
~ 91
263
196
-2:20 ,_365
CIOhlrtedldoa. 218
~~-211
~.114
liauIICIOn _3:$6
,..,.,acin. 360
~uguaniM
c:artiCIr hdrol!llco. 34 c:ar<tCier poi!Minlco 34

c:omponon!JM, e
M(IUOIOIO, 32
'"
273, 278
aoenoSina. 20 como oet~ho <M ramirtcacfn, 281
VHN 0-melltguanlna fllqullttiMitraaa. 357 mtc.~~nlf.mo dt CllliN. 358 flltort~Ciontt genmtc-1$, 403
Alu 1'" 32A
450
AI2Fieime-t (en!Mned&O de) 8fltti0tleo
O&~l . llylll. 259
iNOICE ANATICO
apopiQSis seale<& 1'"11J9'Liivas. 432 sei\Aie$ PQ$11Wat.. 432 APAT, 223 apurfr'liCO, 35. 232.354.361 AraA o arablnoslladenlna, 2t AraC o arablnoYcltoeina, 21 rbol genealgico. 385 nomenclatura y simbolos. 39:::} Ar1 (Otn y ~ina), 421, 426 AAS. V&se s:ecvenc;:ie; <Je
relaCin oon et p!eQamionto, 337
t-tamanmna, 251
etlructur* ~imica, 258
aminas atomatieas. 355 amnoCirloS
abfewaturas de 1 y 3 leltas, 294
que Inhibe 1a t.raOJoein, 316

resistencia, 206 Vase tamDin (tamani~ 8fi'Cllcllloa, puromlclna. rifarnpicfna. anboodn, 74,289 aporeamiento oon el codn, 296
aoetllacin. 326 aclacin, 334 activacin. 302

0$1QAACin de QXIO(It$, 290
b~os.. &4
tu.imero nOOK;'tliQ, 297 tetaeiet\ oon e1 n(ltnero de

ocdone$, 298
replicacin autnoma
AASICENJTEL. 211 ~f$I'Iic0, 356 lt$\'1 df dc$00C)Iamion.IO O de desplaza~. vease bucle o asbesto. 355
a&OOftla\o,
carboxilacin. 327 fosfailacin. 327 hidroxilacin. 328 metilaein, 328 mooticaWn en las prOlefnas, 326 prenilacln, 335
anticuerpos
anlioQ9oxigeoi'NI. 186
capliCoillein tr'l ons.tyO WO$!on'l,
173
unin pot enlace pep!kico. 313

amlnolkido-tRNA ligasa. Vase artW'IOaCIHRNA sinle~ amlnoacilaOOn deltRNA, 302
aminoacii-AMP. 300. 300 vecificaCI6n. 3C6 aminoacil-tANA. 2$9 2'y 3', 303
ubicacin en el sitio A, 311
monociOnales. 121 que exls1en ncuuralmente. 3G9 anti'lieo, 223 anllgeno A.372 asociado al can::inoma dlt clulas esca~T106as.. 436
328
8, 372
ea!Wiielrt!JIO 125 (CA125), 436 c;a.n:iooembriOnaliO. 436 oeuar Cle clulaS en prolileffldOt'l. Vase PCNA H, 372
aspartato aminotranstera.sa oomo marcador tull\Ofi'll, 437 iii<'X<'I'Oial'lgi:l<'tsia. 363. 406 ATP como COSUSU1!10 (lit la ligasa. 156 ATPm dOpenc:JieMe Ot RNA, 255
AttoPhos, 186
'NificaCIOn. ~
aminoacil tANA $it'ltetas;a, 302
ca;aeterstieas.. 304
oenuos aetrvoa. 304

eotreocln de errore&.. 305
onootetal. 435 T del virus SV40, 431 amionoogn. Vlrso OI'IC0$1.Clf'0$()1

antiparalellsmo. 441 antlsentldo. 78, 248
do cta~ 1, 303, 304

do cts. 11, 303, 304
e~ilXtad. 304 m0<11010 mOIOCUf8I. 300
auiOinlcladora, 248 au10matizacln de la PCR, 193 de la secuenciaCI6n enZJmtica CkJ ONA, 237 de la sint.esis de oliQooocletidos, 119 9U'Iorraciografia. 170, 1M. 186
v..,antitf1lsina, 376
herenoa, 396 1901orma Z. 376 mUiaclones causantes. 376 u ,AT. Vease Cl, anlilripsina andvif8l21. 23 Apal (l)rOieifla). 433 aparearnleMo de cases oodn-anticodn, 296 entre 3 bases. 73 inOOtl"eCio. 362
intracatcnMio, 70, 73
au1osorna. 93
A.very, Macleod y Mc:Carty. 2 8'Yidina, 129. 186 ayus:e. 290
nl)mero r.eocesa11o. 305

ti)C'O(IO(*'nien10 dOI amii'IOciCIO,
304, 305
rco:onot:in".ef\\0 Gt!1 tRNA. 304,
alternativo. 2'16, 285 08flff05 de. 290

mecanismo. 281 reconocimiento, 281 sec::uencias. 280
a)/1,1$1050ffia.
305 a.minoglic$1100. 316. 317

aminopterina en medio HAT. 223
atl"'l'liOS. 120
290
AMP delito, 29 amplcllina. gen ele reel~ncia, 209, 214 amplilicacln geontica.
AZT, V;U6 tidOII\Idin&

azl.ieates
activados oon ntJcletldo, 332
Vhse ciONiciOn amplilieactor, 266 amp', 209. 214 anatase. 99

anclaje de proteinas ., mornOfflnas il traves ele Hplelos. 334
al'lda:tl'liaje tM::Iear.
\emporal, 248 Vkse tambMn oomplementatiedad apilamiento, 14, 48. 166 aplrlmldrnioo. 35, 232. 3$4, 361 apoptos.s concepto. 4131
oomponen1es de cidos nucteioos, 11 ooniiguraein 8/IO<tiea, 20 azul de tripano. 129
B
SAC, 209, 211 bacteria
cpsula, 3
corrtrol f'IEI9'llivo, 416, 433 comrol po;silivo. 418, 433

CVOfl)O$ apc:lC)tIIOOS, 433
Va&e esque6elo nuclear anemia. Vase falcif()fl1't9 y vt?ase Falooni

aneup~a.t~ia,
403, 404 mocttnismo, 404, 405
:snlltriOM. Vesse clula MgiOgnesls. 414 aoomalla cromosrmca. VElase crom0$Qmop."'1ia anolo:u::in. 240
e;eeucin, 432 ~ilibrlo con J)fOI&eradn, 414 e1apas. 432. 433 tagocilosis, 433 lase final, 433 n:Juocin. 432 nci$Cin pot c.1ocromo e, 433 papel ele p63, 431 telacn oon proliferaCIn. 431
colOnia. 170, 214 i:sis .n silu. 110 Mc:tOfilago, 210 >~ 210 M13, 210 Pt, 211
baQJfcwirus. 210
T2.
iNDICE ANALITIOO
ballnolo, 296, M. 30ol
451
.. _ 2 9 7
dl~.297
de Ut'ae.b. 206 blltldU CftiiMOIOii iiCai
GOAyTtl
de . . . ~. . . , de Cn:II'I"'CCIIO'. iO de prolaM
.._,.,
bude
.................. ...... o,., 3n

257.
BACA (genes), 434 BtdU o btOmOdesOXIUndiNI 13:2

~ct.-.cio 12e
--maiOJV ...__
~lalpertaJo,
32'7
38
_,_327
C:.Qipo
dt~327
eeonogr_.,. VNH Wf'CIIIIPO

....... 22$ mc.c:uler. 112 QttCIIIrton 89
de promera..... Sil barret1 . tnllOdot oe 12 basa! VHu promotot.t bases. et~o tobft ltl
de!P\ii;IUtttlolto()n I CIA
de DaoiSC~ 253 de la ISO~ ctesc*ta"- 11>, 25o4 bZJP (protetnas). 64
e
C,H. veasede> de zinc C,. Vase dedo de Zlne
CA1 25 (anlfgeno), 4136 CMT (&eeuef'ICia o caja), 268, 269
CO'I-.;llda
o. lf(laltl. 421
Oo c.;I&Ol$l'$. 432
~fonlael6n. 327
wttlml.
bases nltfogtt'ladll flbtc)t'Q()n en ti uaavlolel. 17, 16&

C.tUll(let CidCJ.bllfl 16
cuero (gon) 269

CUI)6Ja. 432
oomptamenw.nod8d, 3G oomponontet do leidos nuctllcol 12 deriv.OO. n'IOI,IItOOt. 13, 72,
ealeina, 13
cabeza de mar8c>, 73 c:&dmiO. 355

de~
llCIIvacln en cascada, 432 tjOOUior. 432
MlbiOIOn. 33
II'IIOifOore 32
CUQue1t VHH ~un CIIOpflnl. 3.t 1 C8P 30SI 310 319 Cdc:5. 427 C(f( 424 ..,..,..... '26-4.2e I(WIIJidQYnaN 425-&27 COl,.,.., 001'1 CIC:Will. 424 426. <27
412
CAK. Vase quinasa ac.lvaoom
201 272
OIIAII'IInaon. 3$3
~ N~ec:tNe.
cab'lonlna, 436
-328
232
c:aipJ.onas. ~2
M1n.lelure 12
l"'ff~.
cAMP. VNSe AMP CICIIOO

canee< ~ws.. c:olofrectat tiIIII10 IIR
13
12
rntll-.oon. 3S5
...,._~_,.
~dlttoeMomof.
VIU 01 ,.,.... m eax pro~>eln~~J. 33
...........,.,,
P'~~,..
..-. ....
e1 apas
~363
(:lOmO et'llelmec2ad ~
CIOI"'CCC*>. 412
8d- J (91f1). 417

8c:f.2 (~tn '( p10itiftl) 417. <133 Bcl11 (PIOIOlna}. 433
de l'llgadO. 435, 376 de la linea gennlnal, 43-4, 436 de mama. 434, 436
-n
~""26
Me.... 425 lut~ra!Qe, 428
1
~de&uWal0.424
t~IOn del OCle oeUat
421
8-0NA 39
benl()(l~ftf'IO, 355
de cwano, 434 ele prslata. 36
ltpol,
42t
benzolftdOniM 170
ben~ltotlna. ber~lio.
179
SER. Vtl"s.Ndtl6ndt b~ttl

355
l)iblloteu d8 ONA
de pulmn. 36 de c~re::e$, 436 de Utro. 436

41 3 getmlnal y somtiCo, 434 hetenc!a, 434 lnslfJJ. 413,414
Cdk l. 417 Cdk2. inhibicin por p21. 431

eDNA, 106, 244
como r)Mr1Q, 205

gtnOIOC~& de. 216 oropareciOn, 206 y EST. 228
V6H OI"''C*CII
l)i(lltOOCIOI'\II VMH ~In !)fk)eal VMH 1~
lnYBSIYO, 413
ongen monocb oaL. 413

ongen por mutaCICW'I. 413 vasculafllaCIOI'I, 414 y IT'oeriaco. dEil ~ 273 y tetomera6a, 1t0 CAP VHwPQleit'll AltiCIIC*W"""'""'a <M AJAP Ciellr:o capetUUI S'. 278
papllltn .. nc:toct.ll
'**~-278
CEA. 436 otbldo 11 azar_ 183 o.blot. 14$

..l!nlnaQ!On 1$6_ 157
~IHOtnPCR.189
v.._~pnmasa
bdunoionalel 355
blochp. 387. ...,.
~tlCI.liO
tlialiaea 212
~111 ~
~112t
~119
,.331
<*adora v._.~ ClfiUI enblona 203 211

dUI~9799
......
OtM1odtrmo 1 19 CIWOmtto t 19 Slootn (tlt'ldrome Clet. 40& bloque de ntpetiCIOn. VBeM ONA ttptbtfVO bo~>afd&O 212
Odo c:M.fW. 100 ptWI'IortNI' 102 103

~~VHHOIUa.
IJaCIUCC:tn. 309 310 000$0.1y2 278 dpsiCia '!I'k::a, .. cpsula bactenana, 3 carab*\e.. :517339 acttvidad ATPasa, 339
lr!lithON.
cIUII madre
l)ll.lnpOien~
1 19
Bombay flenollpo), 3'73 en la eslructurfl OOt tRNA.. 74
fu'ICI6n. 340 11006. 339

caractetes. 95
1M c"ula aombcl!. 97 ciClo oe-IIAIII, 100 hlbrlda. 221

tot'I)Oitnte
h!brlda. mueelros pera pref)fltar.
ll22
452
clula oompeten14t,
iNDICE ANALiTICO
ctgolo. 100. 103 CI'MMOCOf'O, 92 CIP1 (pt'Oteina), 426 CWTQSi$, 376
c:digo genfilico
represet~&aclones en
2t t
!aDia, 293,
en cutt1Vo, CQf'nO muestra, t2t

hbiclo l'n()(IOCrOtnOSmieO, 224 hlbtlclo subcromosmlco, 224
295
~cdgo, 304
uniVWS<J~Iidad, 298 eodominant. 95. 394 codOn, 288, 289 apareamiento oon el antlcoan, 296 asignac:ln de amlnoCICIO, 290 AUG o de Inicio, 294, 306 de patO o letn'linaein, 294.314 nmero nec::eS811o, 288 nmero por amhocldo, 295 &In sentido. VOMcodn de paro &inniiT106, 295 $01apantes, 288 superpuett()S, 288 ooetlctente oe ex.11nc10n. vease absortMdad oootioen~ de &edimen1acin, 80 ooenzima A. 30 ooenzlmas nucleosktlcas. 22 r~Jeleotidicas. 30
mtodos de separacin, 122 recambio, 411 S Vld.1 me<:lia. V~<Jse l\popt0$is cenlimorgan, 220
cenlrifUQacin
de equilibrio de sedinentacin, 124
diferenoal, 122. 133
fundamento. 122
isopfcnic<l, 67, 113. 124. 137. 143 para elutaei6n, 125

IJIIraoet~tlitugaeiOtl,
etemento, 1ac1or o soeueneia, 26<1 Wase tambien Golgl cisplatino, 355, 359 cisteina. en oef'l(ro aclivo de la alquiltranslera&a. 358 de las caspasas. 432 dsleina endopeplidasa, 432 clstrn, 301 cititllakl. 27 <:itid"t~a. 20
"'
136
<:itocina. 437
citoeinesis.. 99 cllocromo e, 328 como senaJ de activacin de apoJI4o&ls. 43l citofiUOiimetro. 126 caogenlica. 88, 91 cametro de fll.t:>. 126. 225 citoquine&ls. V6.;asecitoclneosis cil06ina. 12 moli3da, 272 CKI. Vhse Cdk, inhN:tctes cla:slfieaeiOn de proteJnas. vease trfico
CIOn
~de.215
zonal, 124, 136 cenoro

de ayuste. 280
de ranVIicaCI6n. 290 oenlrmero. 87, 88. 9'2, 98 en vecl<lte& de donacin.
211
y ONA scullle. 113 CFTR. Vdse reg!Mdof de la ~ lransmombrana
cGMP. V~HGMPc;((liCQ
ChamOOrd (castillO tle). 47
~a.
vease catablna
c::NipetOnlna. Vase carabina CN.tgatl (reglas de). 38, 42 ctvp do ONA. Vase bi~ choque trmioo. vease carabina ocllna. 424 A..424
ootac:tor ~eral . 270 oota CIC POI(A.), 139, 206. 280 IMeetO prorectot, 286 OOI!i.geno, 328, 329, 414 oolchlclna, 90
B. 424
oomplojo con Cdk. 424, 426, 427
concepto, 187 neoplsico. 413 clonacin ~rodliCCI6n geooraf. 181 *'i\10$, 203 c::tot~aci6n aoeuat Vse PeA
colonias. vease bacteria y vase cton azules, mlodo d&, 214
oompactacin, V9ase oondensacin

oompMimotntO$ Sl.lteUaros. 322 oornpaliblfl!$. 202 competente. 211 oom~deloenoma. 101.109 tsbJOIO de. V68se COt oomplef> atliertO. 253 tlinarlo en la traouocln, 307 de empalme. Vase aytJStosoma de iniciacin SOS, 309, 310 de inicio de la tran&cripc;in, 267 de inicio de la transcripcin , n"'IOeei$, 287 oe preinieiac:in 405. 309 de reconocimiento del origen. 151 do reparacin, 360 de tro!IO$~ein. 325 ptotelnasa mulliCallllillco. 342 terna(JO en la traducclOO.. 307 oomplementarteaad. 39 imperlecta, 169 perfecta, t69 condensacin del ONA, 65, 83, 91,
c:tonacl6n ceiLUI, 188. 197

eequema ganeta!. 2()t
~apas, 204
o. 417,4.:24
de G,. 423. 424
de Gt- 423. 424 de inicio V4as4 ciclina ~ G,

degradacin, 426, 428 E. 424 F. 424
ml!tca. Vsseclcioa. de G, sntesis, 424, 426. 428
dciO
-""
176 del ii"'ser1o, 205 c:tot'18cl6n lunclon81, 380 ctotant&n6col, 316

~rac:.ot~
~ obtet~C*!ln e1e $01'1(Sa$,
de elongacin en la traducr:i6n. 314 del ftii;!Of eciF2. 310, 320

deii8CIOfeEF1(1.312 ciclO celular. 97 eS1fmulos de detencin. 429. 431 estmulos de progresin. 428 tases. 98. 100 freno por p53. 431 onoogenes rtlac:iofl<!ldO$, 429 puntos de oontrol. 422 rvgulnc:iOn, 422, 427
y COndet'daein, 100
en la extraocin de ONA, 134 c:SoroplaS1os. S. 323 cioruro clcico. 211 ctoruro c.to cosio. V4a-.kt conlrlfuoat:in i$0pietliea cM. Vase centlmorgan CMPslllco. 332 ooactivadot. 270 oobalanW\a. 22 Ckayi'IO ($inCirome oe). 363
eo<ffic<1co
N)ta<:iO dO, 288

t.ridaCI de, 288
clciOtoslamlda. 355 cicloht.ximida, 316
OO<ifleante. Vase ONA codlftc:ante o6clgo gen&lloo. 287 degeneracin. 295 <*lerenclas, 298 mitoooncfrial humano, 298
tepresen~aeln
96
en la OPiosis, 432
gttldO Cle, 85 niYeles. 85, 100
circular, 294
NDICE AHAL.inCO
~lndeiOHA
- -- - - - - -
453
rWoOn CO'Itl . . .~ 250

'f~tde~S,26rl yCICIO~r. 100 y r~cln de la tranaa!pCin,
.....,...,.., v.._
al0f71ttt
o
4T. Vsa-st O&tavuelna
dact.nomlclno. 355
~ 'hebra). 152 15A

anri y fN' O. lof nl,l(jlfi(IOS ~
....oonat~
...
Qort'IOIOftl(lpoita
.anulr. 408 anlliolaJ. 211
-!19
asas 86.. 87
moi'IOIOQ~.&.
daslfcaon. es
~. 172 P'~93
da!lonlsmo. 397 OAPI, Sit ->!e
~. 259
.. Of'/A, 55 C2' C3'
oonservadofa. VHU motaeln
-66
23
fttdo., enao. S4 69
S'*
oet1vld0. 409 dlomrloo. 409
dcc(gen) 418 ddC. Vease zalcltabwla
ddt veas.~ 4dHTP v.... (ldest>~""~

DEAE-de:~. 212
eo~A 'f~
ll'l"'Ctl'lCO. 8$. 99 IMel'ltiiOO, mapeo F1SH 225
dadO de U'C. 83, 265
SU!)Oftf'lt011&411 67
110'""""'"'""' (gen). 2$8
)'..,..,...,.m
aeeooa.arll' 88
isocromosomas, 4 10 me~ric:o. e8 mt~a!MCIO 8$. ea. tt

88 numtHO, &, 7, 93
(letectoe nu11Cionale9, para la MIOCX:In de cton..
mN~. mapeo ASH. 22S
....,.,., ....--.
~
cnllgo. 229
eonlrOIM G}S. GJM y M 4:2'2.
~.120
-~ JWMdO drl. 172

leooltil;lonotnles,
_ del180
,~21-'
ai<Jsello oe tondas..
oorea dt HuntinqtOn.
v~ase Hunbn9'on
218 tGI)Il110 "' la divis!Oft celular
llrC*IO cte as tiW&ICiOf'*... 295 <J'elecO. )t7. 3A8

VHM~mY~
gen<oco. m
eotiOf'l. 120 Ctlff8CICIO( de enorel ~. tfldiiCOO"'. 305 eotreocln de pruebll. 147
-406
corrleniO abajo. 249 corrlenr. arriba. 249

220
~~ . 216.226
---- -88
10$
~1a.105
cromosmb irlterthclal. 408

tn)(I"'IOIYIIU terminal, 406 dln$lcl.cl VU.gr...,_ . . . . . . . drl~. 2&& desam~nKICtl . 353
sexual. 03, 94
repaacin. 360. 362

~In. 84
submfllo6t\ltiCO 88
desarrollo lfl'll)nOnrio, 286
C011e y ttrll)a.knt VHH .-yusae

~rto
X.93 X l'lldl\laC:IIOn. fP, 2eA

392
y pegado. VA'IIf ayu$1e
Y, 93
~opatia.
~ 11tular. hibrit*ln 172
desenrollamlenlo. 151. 2.t8 en la lr.,..;pcln, zs.3..25-t

deseqlltW>f~.
COl. 210
~ . 210
adquoriCII 402
~ . 401
V-406
eo. te
Col. 111 cotranteripCIOn, 2$3 cotranslcn'nacin

VNN1r--~
OQf15tJMiva.. 402
f!SitUCIUtal, 406
te :os~ '3Z1 el extr.mo S del mANA, 27'8 esmetilaN 273

~~. 16t cuva de. 1&6
CPAG 1M
CI'Sf. 2711
crtmaiiiM'8 Cle ~. 64
cwttltl~. ~ oon
437
nomtfl<llalura, 402 oomttiCII. 403 wr '1 -"02 CRP V. .N proce1nt rocep~~n dt AMP cic:liCO CIUCi!Oimt . 59
en r~ln de la expresin, 272 desnaturallucln. 1$3

del prcmOIOf, 253
r.,;ermedad
el jitlli9fll't~ 337
CtO {prol..,. dellllgO lambda}. 62 cromallda, 85, 88, 98 soparacin ilf!n\lltll. 4 1o

yc!Oo~r
ese
cs.\.~ ~-
100
croti'IIW!il S, 8'
~
ua.w,....,..,. __.. ., ., 87.
2113
oonOen&ttcin, 98 OHc:Of'ldens:tleiiOn M t'X~ mapeo pot
363 252. 253, 279 a$0CII!Cin con ~~ c"petvta S ', 278 en IniCIO y eiOtlgleln 0t la .,. . . ~. 2$'* 256 fol:foo'lllaoll, 2$4. 2&1 CTF. 208
-361
zss.
....po
FISH.
remodN6o 263
C;tOmO, 355
........
pol8r. 103
-v--.354
"""""' deteocln
en la PCR 188. 189

lOcal pot .. Uflirl de protelnas. 61
renIUt(rl!iuein
y oon!onldo en G-+C. 166

y proplf(lades del DNA 165
VMseDNaM
apopt<CC. 433
tOIOI't\boN, 11 ~at..,. .o de 13 mell ttlliaOo de .. mtlla
vuso
VHU ayustO!Otl'\t de lnc:lua.n. 33Q
de p!OI&tnas. 322
""""*'ma. S
acentnco. 92. 408 409 ....oc:alll........ . .
.......-.258
CYFRA 21 1, 43$
dt caon. nJQOm~- - 213
~ --~110
454
dextrgiro, 45
NDICE ANALiTICO
DNA densidad, 137 disperso, 100 , 109
diagnsdco prenatal, 120. 386
diana, 168 de restriccin, 199 diootrico. Vase cromosoma dictiosoma. 323

didtmosina, 23
235 355 dl!et"enc&acln, 285
diaesol(i~lolido ,
CliCtili&$1i!bC~rOI,
escaleta. 137. 138, 433 espaciador. 85. 86. 263, 433 esqueleto. 84 fetal 120 torm<'t A. V4aH AONA torma B. Vttase B-DNA
10'"'1<"1 n'IUC{U\10, 344
dtt061ato, 10
difraccin de rayos X pera la estructura del ONA, 37

para la estructura del tRNA. 75
torma salvaje, 344 lonna sllveslle, 344 lonna Z.. Vase ZDNA fragmentacin en la apoptOSIS,
ONA me'*ransfetasa. V6iu6 meliasa DNA polmerasa, 84, 14'1 acliviCSA<SG$ enzimticas. 14$ cambio de a 6 o e. 154 cenii'O$ aeliVO$, 147 oellagc> T7, 236 empleo pera el marcaje de sondas, 182 tn la reparaein, 359. 361 ovcariticas. 14$ traomonto CIC KJonow. 147
tnll$8 n'IOI&Cult:lr, 149
Ot<l V9ased90xigenina digeolfn

doble, 227
432. 433
fragmentacin, anisls electrofOI'bCo, 433 hij o. 141 inici;tdof, 1S4 intorfl(.l(;in con prolelt~t~s, 60 inrergnico. pr()CX)(Cin en Ol QOOOma. 108 inttn'lueiOOsmico. V6JJ~ ONA espaci&dOr ligero, 143 mapeo por FISH, 22-5 m.a.rc<\ie. 143
Pfu, 193 procarl6tlc8$. 147148 propledaes, 148

Sl.bllldades, 147. 149
enzimtica. 122
(tel ONA gonmico. 216 ~iQeni\8., 166 ON:Jtoot!Ciina, 72 <2irnoeto do timina, 356 reparacin, 359
Oiti'IOiilnitrosamina. 355
pa~rci;:'ll
nn. 100 ubicac:i6n 9A)celular, 148

~14$
Taq, 169. 235 tetrnoe&table. 189 tipos, 148
l. 147148
dmetllsuHato. 355 para sacuenoiacin, 232 dmetoxitritlo, 119 dir'M;Ie$ido PQitos&ato, 29 60Jcetano. 166
~iget'IMa , ~dia.
1. aphcacn para la preparaciOn

de soncias, 182
""'stA .., ta cOhJia. 6

metabOlismo, 141
1 , en la sintesis de cONA. 206

l. fra.gmento dt Klenow, 183, 1$4,23$ 11, 147148 111, 147148 111, mOdelo moleCular, 149 (J., 14$. 152154 J.. eo la sintesls de tefme.ros, 100
~. 14$
328
<isonz:imia, m disgregacin
6. 93. 100. 403
medlaociOn, 273 ITiiCrosatllte, tt4, 383 mierosatlise. 8Jplieati6tl a te huela gentica, 385
mlnlsatllte. 114, 383
de tejidos. 133
qulmca, 122 dsomia, 403
<hplasia, 413 6sta1 W..=tso promocor (i$110fia m~A&QU~ar do OVCI'IoMe, 397 d $Y\Inoi0n. 104 defeclo de. 404. 400
dversidad 9J80eica
V&.!H pOiimorfi$mo
diviSin eelutar Meilka. VI'Mse meiOSd
minlsallite. aplicacin a la huela gentica, 3M mini$0lllito hipqrvariablo. 3&4 mieocondrial, 108, 257 mitocondrlaJ, tllllldad, 3n mitocondrlal, mue!Mras. 3n moderadamonle repetitivo, 113 coctilican&e, 108, 245, 250 pesado, 143 progeni\Or, 141 propoteln de bases. 38
s, actividad to~tOI'<'w.. 361

~ 148, 153154 f , 148, 153-154 y. 148 r , 148
no
e.
148
( , 148 Dn&A. 151
DnaB. 15t
m!t<>lica. Vase miiOSiS reduel0r'8. VU.se 1"1'\f!ok)SiS

OMT, 179 ONA, 1
reasodacln. Vase
renaiUtalzacin recombinante. Vtiase tONA
DnaC. 151
ONApol. Vase ONA polimeMSa ONasa. 85. 199 1 pancrelieoi, 18:2 11, 199
d:!Oie hebra, 4 t doble hlice, 45
7S. 160
a~do, 108, 109 aftamonto fW(ttitivo..
rccar11cin. V6Mo rOCMWcin e1 DNA

113
analisls de tamallo por
tepe!IIIYO, 8, 108, 109 repeIIIYO agrupado, 109 repetiliYO codrflcan1e, 110
electtofotesis.. 137. 138 basura, 109
repetiti'YO codilicanlie disperso,
ll2
repotilh<o <l$perso, 109 ropeliiWo flO c:ocllieante, 113.383 rol)f1li!O, an61isis., 116 sallile, 87, 113, 137, 383 li)06 en el genoma.. 1 variantes t$1ruchJraiOI, 51 ~oc:i:lod ele slntesls. 149 ONA gliCQsilasa. Vase N-iJ!ioosllasas de DNA DNA llgasa. VOOse ligasa
aplamierrto, 48 car.ieler hitfrofilico, 47 ~r..Cior tlidlo'bieo. 48
chatatra. 109
ciroolar, 145 codificante, 8, 100, 243, 245, 248. 250 comparadn entre las formas A,
curvatura, 57 de tipo A en el ONA.

Vd4HA-DNA de tipo A en el ANA, 69 eriaces de ~o. 48 fl)fm3(in <1t ti1)tt hlieo, 60 hJems e:stat:lilil:8dotas, 48 parmettoe. 46 posicin de tos IO&Iatos, 4 7 rCin con la replicacin, 49
oe
ByZ.52
complemen1ario, V4aH cONA compo$icin, GC dao y pro~Je,ina p53, 431 de copia Unlca.. 8
VI.'"'
iNOICE ANALTICO
dogma contra! dO~ genliea motocutar, 2. 300 oomparado en ci"'$01 y milooondr<t, 243 dolicol. 332 333 I0$1310, 333 elongacin de la 1raducan esquema general, 312 translocaeiOn. 313 transpeptldactn. 313 \.C)icacin, 311 elongacin de la lranscripc;in complejo de. 25-4 en\aco fosfodister alip.co (5'2'~ 281 fo&fof;ter, 9
N~o&Mfco. 20, 329
455
l)irof0$r,:uo, 333
Clom$1iOO (gen), 269 domin<ant. 95. 394 dolblot, 170 Down (slnorome de). 406 dOXOtNbiC*'\a. 259
Nglcosidico, hdrlisis. 354. 361 O.gtioosidioo. 329

S.gtioosf<ioo. 330 csol)9plidc:o. 341
pe~ptidioo,
laclores. 255
elongacin en la PCR. t 89 elutriaCI6n oerurlfuga. 12$ embriognosis m~lilac:'l Clel DNA. 272 ef'I'C)aquetamlen!o, 83 endocllosls. 323 endomhosis, 94
lorm.,cin. 313
dRPasa. VOOH
<Sc$OxStrii)OnUCJeasa galaciOSeomla O~.J:henne (diS'!ro!la muscular de). 397
0~110:. V6.'Jst
endonucleasa. 196
AP, 3&1
de restriccin. Vasq enzimas de restricetn
1i06$1er oon ubiqu!tioa. 341 1opol6gl:o. 68 trifoo1ato (5'51. 278 enrollamiento en la ~raoscripein , 254 en$lll"'blacJO, 240
en~uinasa. 336
Clupllcacln, 367 CIUTP PrOiostatasa. 362
E
E lA (protelna). 431 El S (proteina). 431 E2F (ptOU~in~) . 430 E6 (prOietl'l8}, 431 E7 (prottin,), 431 ed80 1'1\IUerna y nesgo de trisomia. 406 EOward (slnCitome de). 406 eEF. Vase factor de elongacin de la traduccin
de tiPOS 'a' y 'b'. 198 en la reparacin, 361 FEN 1. VMse FEN 1 genetacin del 8Jifi91TlO 3' del mFINA, 279 ~-. 323 e.nlermedad. VOOse tambuin bajo el nombre especfico a90dada a 18 repamc:iOn del ONA. 363 aul0$00lica. concepto. 39'2. 394 &ul0$6mictl Clominttnte. 395 ~vt0$(Jmica rote$1vt', 395 bUSQuC(It't oet gen responsable,
enve,ecimiento y tclmetQS, 160 enna aclrvadora de obiQUitina. 341 <:omo m<~~r dC sondas. 180
IQIOJrttaC1iva<Wa. 35 7 nidtotilica en IIS060r'l'las.. 341 polladora de ubiQIJ'Iina. 34 1 enz1ma de restriccin. 184. 197
aplicaOOn al mapeo. 226. '221

Cilmeloristic;u gcllOtt!IO$. 199
CQn"oO mecani$t'I'IO <le
oetensa en hU MCtt-rias, 200 OOC'\&OOta infrecuente.
vease cortaOOta
de t!po 1, t99 de 1ipo 11, 199, 201 (lO 1ipo 11, ba(lefla <te Origen, 202 de tipo 11, ej001pl0s conetetos.
eleclo hdrolbico. 338 EGF. Vase factor de crecimiento

epidrmico eiF, VEiaH laelor de inici<'IC>fl CIO la lr.lduocin e!MtMa inhibiei(l por antitripSina. 376 etastN.. 376. 414 electrotore61s. 171. 113 calhacin, 138 en tatTClO pu!sant. 136, 226 fundamemo. 137 prepar<'Cin de getC$. t37 dpos de gel y l<'lrn;u\o do ONA. 137 e!Oetropotacin. 212 electrosttica (Interaccin}. 185 elemento de respues1a. vease promotores distales de respuesla a hierro. 319 de respues1a a hormonas. 270 especfico do tgOJit'lciOn Vhso pr omotOr distal mvil. Vase tran&p06n nuc:SNI dispen;o oooo. Vase SINE nuciNr di6JXIf&O largo. V<JSGUNE tranSponible:. V6.Ue 1ranspos6n ELL. 255 elongacin de la repicacin. 152 etapas, 153 mecanismo. 153, 1$4
22t. 385
c:i!ogon61~
V6ase (;IOI'Tlt0$0mOPlllia
mo1ecv1ar. 390 oomplei8.399

c~asmeacin
oong.enlta, oiagneuoo. 386. 387 cromosoma afectado. 392
vease cromosomopatia genlica. 369. 379. 390 l''lefO(:IIIt'lria, 221, 345 lig~da aJ s.tlCO. 392, 394 ligada a X dOminante, 396 ligt'l(l3 ~ X rOCeSiva, 397 ~:gada a Y, 397 tnl1ooondrial, concepto. 392 ml1ooondrial, 398
mo<ia.399
cromosrNCa.
202 de tipo 11. nornendallKa. 202 de tipo 11. seOoJenCiaS dlaM. 202 do tipO 111, 199 en 1a l)reparnQIOn CIC gonotoet\s,
216
CSClilcicSOO. 199 e$lruetura, 199 frocuonci<t (lo r.con<>eimionto,
226
nomenc1a1ura. 199 pera hnooizar ..., plsmdo. 177 pera snteSIS de sondas. 184 sitios de recon0Qml8f\1o, 199 epigerntico. 271 . 412 equrlbradas hebrt'IS del ONA, 44 equilibrado. 406
molecular. 389 mc;n:gnica. 392. 393 n'll.llifae1orial, 399

PQiign~. 399
prOCiuctos g6nicos. 392
enhsetna, 376, 396

relaCIn oon el pletJamieolo. 337 enlace ds hidrQeno de 1ipo Hoogsteen. 60. 73. 296. 297 <te hiCirget\0 Clc tipo Walson y CJtck. 296. 297 dsrA!uro. 335
equtvalente genmioo. 216

erbA.417
erbB. 417
EFICCl, 360. 363 oFIF. VOOse laelor de ten-ninacin de 1~ !tOducan eriltOI'IW:':il'la, 316 error oongR!o del metabo'smo. 390 escalonado (elltremo). 201
escin~.J:Ioaso. 359. 360
tosfoan-'driOo. 10
10$f<Xfit6$!er, 11, 146, 247
456
esci616n de bases I'IICrogenadaS, 358,
el<ltemO
iNOICE ANALfTICO
lactotes de transcripcin
~ibi0$, 269
360 de nucletldos, 358, 359
3'. modltlcadn, 279 s. moclifkadn, 2n eohesNo, 201
inleracc:iOn oon la ANA PQ!imerasa, 270
escorbuto. 328
espatSOmldna. 317
eol'lesNo, aSOCiacin. 203

eoheSi\oo, en 1elrnero, 158
CO~!ble,
mitooonc:ttial. 257
motivo5 estrucb.rafes. 265
especie te&CI!va ae oxigeno, 35ol, 377 roparaoin. 360

o&pGCITofOiometria, 186
O~lida,
202
Myc. 430
proximales. 269 p53, 431 SAEBP, 432 TF"I. 266. 271 TFII, 265, 266 TF"IIA. 268 TFIIB, 268 TFliO, 267, 2$8 TFJIE, 253, 268
romo. Vase romo
F
FACS. 127, 225 facto.acuvaooc de las pro.easas apopttlcas, 433 asociado a TBP. 267, 270, 211 de coagulacin VIII, 397 de coagulacin.. carboxllacln, 327 de aeclmlento, 416 de cteclmlento e~ado de plaquela&, 416.421 de eteemierrto epidnnlco, 41 '1, 421 P 00 crocirni!JOO> tr&nsfom'\MIO, 416 de rel)ieaein e , 154 de t~ln mtlocondtlal, 257 estlmulaoor de la J)Oiadenila(:Ifl por escisin, 279 lnh!bldor del erecimlenlo, 4 18 promok)r oe la madotacln o de &el tase M, 424 foelorcs do tlongociOn do la ln!duc:cin. 311 oEFh;c. 311.312 eEF l (iy, 311.312 eEF2, 312, 313 1ae1ores de IniCiacin oe la traduccin, 309 o1F2, 309, 310 oiF2B. 310 OIF3, 309 eiF-4A, 309. 310 (!IF-48, 309, 310 eiF-4C, 309 e1F-4E, 309, 310,319 eiFS, 309, 310 eiF-6, 309 1aC1ores de 1ermlnadn de aa traduOCin eFIF, 314 laCiores de transc~ln. 60, 84, 253 asociacin en el complejo de inicio. 270 ooaclivadolee, 270 oolares genetales. Z'TO como onooprolena.s. 417 como (lf\()()$UPf0$0f 9$. 418 de comente at(lba.. 269 de la elongadn, 255 defWcln. 264 E2F.430 ~in, 264 generales, 267
102
c$f)efmaloeito. 102
0$00f'm31ogne$i&, 102 e&permalogot*). 102
esperm;uozoide, 84, 102 esperl'Ndna, 34 espemWta. 34
esqueleto nuclear, 84, 8'1 EST, mapa fl&loo, 228 estabiklad del RNA. 286 estavudina, 23
TFUF.253, 268 TFUH, 253, 268, 363

TFIIH, como helle3$J. 267 TFIIH, como protein$ quinaU~.
esteara1o. 334
esteoran y viabirldad. 131
267 TFIIH. ett la repatacin. 359. 360

TFIIH. subunidades. 360
esli'nulador. 266
CSkecQvidinll, 129. 186
0$1N)0401i(Jiglioa, 258
TFIH. 270 TFIII. 265, 271 TFIIlA, 63, 271

TFIIIB. 271 TFUIC, 271 FAO/ FAOH,, 30 ooet~z:ima de 1a foeoliasa, 357 tago. V6..1$D b~tiOI<'OO faleillorme deteocin por RFLP, 382 herencia, 396 mu&acin causano. 349 polimorfiSmo, 382 Fai(::Oni (anemia <Je), 363. 406 FAM, 238 familia multiget'liea, 110, 367 ramesllo, 335 fameilttansferasa y lef'opi<'l arrtitumoral, 335
f!o$tf'ept(!Micina. 316
estrucruta
trir:Jirnenslon,l oe protefnas, predleoOtl. 338 !4lf'claria, relacin con la secuencia, 338 et;trvcPJral VasG gen, $VE!Incia esMJo famhr. 38!t otidio. veas. bretnuro O& elic:JiO
.,i!l'l'loOtanoivllon~tO.
355
etiqueta Vhse ppli<JO S$'181

e:tiQvC:tt"l do $0CuC:nciil e~
veaseEST
euc:arlonte. Vase eucatlota eucariola. 1 diferenciils con procariola. 5 eucromatna. 87 y actividad tran&eripcional. 250 evploidt.a. 403 qxclusin ensayos de, 129 exocitosis. 323 exn. 277
as.
....
anatitlca, 119
de rec>c)$0. 98
G., G,. G.,. S y M, 98

pos&anatflic:a, 118 preanatftica, 118 Fa&' Red TR. 186 FOR. Vase 1\Jen.a oenttituga (etaliYa fOCU'IdaOn, 100. 106 FENI . 156 en ia reparacin, 361 en ia sfntesis de lelmeros. 160 fenllalanha-4-monoxlgenasa. 396
renilceton~..na. 396
con~o.
109, 245, 276
en Ol QC. 245 proporcin en el genoma, 108 exonucleasa. 1 98 3'y5' ,147 s en mateaje de sondas. 182 expresin dterenclal, 269 expresin gnlca, 2
di$PO~i6n
basal, 269
Clitoron~l , 261
niveles de regljacin, 262 regulacin, 261. 269 regulacin po&,t.ran&erlpctonal.
284
ex1tae1o $30. 289
,....
fenol on lit OJCtr<'CCin do ONA., 134 tenollpo, 95 fenoxa~. 258 ferritlna. 319
DNA. 120
sangre, 120
NDICE ANALfTICO
u-teloprote<na,
~
457
OOslonlaaon de e1F+2. 320 cte1 dominio CTD. 252. 2S4, 2SS teooersllle. 327, 42'S IOSkdB:Sa tostetasa, 327 toskWUsa qunasa. 327
f~120
90"
fibra
bbCI dt CIOfN""t
........
Ve.JM Mn de 10""'
de
tO rwn. IS 86 f7
de 10,.., y COf*<ll
ptW~-:ze3
de 10,..., y "'*'CICIOn. 2$0 30 MI . ee. 11 lil:lrOIIS qutllet
Fcoll, 124 FI$H,91,172
--
fosfarasa. 3Z7 42$ ........... -3V.4<!S

k*>d mero. eplltaOio. 367 totoliasa. 357 kJtoprodi.Qo, 358 fracc::'l de rooombinatsn
--250
IYIM:IIdof. 214
v...,~~ ~-de 112
--,
~-de. y~ ...................... "'
mononofto. 368 tll()f1'llf'IC. .Uli. 246
oncDIUPieiOf oncosupre&Of
v,..
mutaCIn cautanlt, 3e 1
p14tg1m~10. 337
retac::IOI'I con ti
cromoeomlea, 224
de atta roiOflu<:IOn, 226 f~ohomaglutlfW\11 , 00 tluctwcln. VHN balanceo
111#~1\1.
131, 1&2, 238
tiUO!'melria, , &e
V6aU' trecuef'ICi8 lt&CCIOtles scAX:elularea,. 133 "agmonlo de tes!rlocln, 20 t ''ecoei'IOI8 de rec:orooinadn, 219,220 tucosa. 330 luC06iillransferasa. 372 luerza centrifuga relativa , 122 luniculoceni&. 120 lu&idco (ckto). 317
0f08nluc:ln. 217 poilmor1o, 368

~
no ''llduc:ida ~ y 3', 245.
276
rt<grn no TradUCida ~erna. VWo lntrn
r"(J!!n ttaduOicla. 245 ftQiiOn ttan.crita, 24.S
r~
tranecnta elim~nada ames

109, 24S
Ot la lnlducc:ln, 24S
tunamtnto. 12t
tiV()rOCI'OMO 126 172. 188. 225. 232 en marc:a,e de IOf'IGN, 110, 182
en~oet
lu&l6n ceh,lla, 222 lu&l6n 001 ONA VU$e

FJIF, 255
....,.......,...,
G
'19.,... 2G9
MOUtneil e5lruclurat.
MOUir'ICil f9gl~Hc:tora. 109, 245 ~ 1etmlr'ltle>ra. 245

~
~ - '2t., fMel V..,_ H-IOIIU*'t .. FMN:!O Iom~. 1M IOrmlwnldl 185. , .

gfiCOtll,.. fon'Mziii'IO, 131
~
___ ,. O..,.
DNA 231
G.C fC:iONMdOl. 39, 137. 166 en~ lefftnildofas"'

GAOO. 431
o-~374
-,()NA
-2S6
....,..... 112 369 ge. ... ~ 38S OMOC"'P VreH blochtP

gtnomii.
~''2
_ .. _ v-. 246. 249
lomwato, pra aecuenoaciOn, 232

lom-a~tetr~IO
l!gl;lll,
30e
lmw::o t6cldo), para
secueno~iteln,
galactosa, 330 vias metabollcas. 314 galactosa 1fo6fato uridlliltranstenua., 373
1S cod!IIC:Ir'" 250
CJIOOII. fl
div~ldMt V~H p0imor1ismo
tX1r8nUC:IOar 5
232
NoformilmGtiOfW\11, 308
IOtmilloiJahlcJrolo&&to, 308
lot(Qet'l) . .. , ,
gatactosaminlltransfet'asa, 372 galacl09emia. 373375 1}-galacloslda:sa. 186. Vase rarnt:Nn W:Z

galactosillranslera&a, 372 GAI.T V hu gJI~O~ g\'mt!Og6tle$i$, 99
0*~. 94, 97. 99 O*I'IOC:bvif. , 3
trecoon tranecnta. 250

m!IOQOtl<bll humano. 8 nuc::6cNu', S numen> de <:romo&oma., 6 tl\imero dt OMtt 8. 241 taml'lo. 6 . 7 111)01 O ONA. 1 08
OOnmlea. 211.390
oomparallva. 241
IOSiataaa aclda l)t061 8tie. 438
f061awa atcallna, 184. 1&$, Z08 tsOenZimu po~ dUOIICeCIOn

genlcl_ )67
lo$1a\MIIno~. 30:l ~'O c:Aicloo, 212
GC (secuencia o Clfl}, 266 269

GO~.fuoosa. 332 GOP~332
MIN(:Iural, 379
QGnOMnaor Veew~ QOIAOietl 215 Cll cONA 216
WCONA.enla~de
IOt'IIIO 1"101'Q11'11C0 (P t ~a10 c. eft NTP

V-'"""~~
........... .....
~
Y ....., tNialfll4t HTP lo6la:Jo y en NTP v..,.,...o.. OtHTP

1, de~ OIMroeenlf. 108 ll,detlf!ZO~. 118 bitog1Uoomuta11, 37<4
....,. . . .,,~
gel ......... - ............... _ ...
__ _.
"""' ...... 388 90"
....,...:090:-~ -
-2<$27$
eonstlll.lfNO,
o-nonraca.. 216
~ dlit dotllle.
busqiJeda.. Vease gen. an.if-
~conCI&ll'On,
301
-. 115
216
~1\8 317
Qt0m~Ctll!
oon vanos proc:tucGol ~
Josfioptotelna lotlato~~u 425

kllforamldllt'l 178
269
dt .,. .,.,... do ba$o$ COt'I'IPIIICS. en A y B-DNA 54 oeran!tgeranlo. 33S

Dtran!lo. 335 01f}m8ajl!nci0n). 87 91 giriiO' 1$2 inl'lllbtc!n PQf anllbilloos, 259
IOstoniiiCIOn
como mecanismo r&gulador. 327

do amlnOCidot en lat
ptOtolnat. 321
de c:tases 1. 11 y 111, 265 de expteston difetenclal, 269 definicin. 244246, 276 ~o o casero, 269 eucaritico, estructura, 245
gllcat10 V6d&-o Ollgoe.acndo
458
N-gllcano, 330
estrucl\lfl:l cet'ltrat 330 rOOCCtOnes <fe biosintesls. 333
iNDICE ANALITICO
GTBP, 362 GTPM<\ prote'M RA$, 421 gu&l'lidina, 134
~nlna,12
herenaa
~cncer,
tipos oomplejo. hlbrido y rico en
manosa. 33t
Qoglic:ano. 330 reacciOf'les de biosinteSI$, 332 gtioolipiOo, en la biosJI'!IeSIS de N. glieano&, 333
gr~teina~.
434 matema.398 patrn menetlano. en tnfermedades

mo~393
g..tanilato. Z7 g..tanililacin del extremo 5' del mANA. 278

guano&~lacin
patrn I'IC) mondeliano, 398

HetShey '/ OIMe.
V64$<t glioosil&cin
glico6aminogllcano. 329 gllco6tladn, 328

en Golgl. 332, 334 en N. 330 en 0, 330 en retfculo enclopl.&mico. 333 IOCAiiucin $Uboeklar. 332 propiod;)(k)$ QVO indvcq en la proreina. 328
del oK.1romo 5' 001 mANA, 278 guanoslna, 20 gufa (hebra}. Vase conctuct.ora Gultlrle (tarjeta), 120
netetoealior'lte, 222 heterocigoels y polimorfismo. 366

hete~ico. 95
H
H. V9ase hebra H H (gen), 370 1\ai)!Ogrupo, 3n 1'18,1)10itlia, 6, 93, 100, 403 I\8C)IO!ipo, 220 HAT (medio de cu!UVQ), 223
hetGI'OQ"Omalina, 85, 87, 88, 113 oonstitutiva. 87, 92 f.aco!tativa. 87

l'leiCrOdUple,x, 163, 168
t:C>os. 329
Nglleo611asa ~ DNA. 361, 362 glicoSiltransfetasa, 332 A y B de grupo sangurneo ASO.
neterogamtieo, 94 heleroplasnva, 396 OO!eroploidia, 403 lleJ(oquina.sa. 374 ,.x~ fo6fato i&emera&a CQn"'I mareador tumoral, 437
fl,OX0$3minid&sa A
370,371 gk>Oina axpres.n en el desarrollo anmal, 112

tnmili;l mutrignica, 111
heret~C:ia,
hCG, 436 HCI. 320
-. arrtisentido. 248
c:oditicante, 248 con sentido. 243
H. V6it$o ONA mit<>CondriN lnl()f'M:Itiva, 248 L. vease ONA MII(IC()(Ielrlal
llgeta, 45, 160
HONA, 60
396
Origen ei!OMiYO, 111
polimorlismo. 382
lipo$. 112 velocidad de traduccln, 320
l'l:rencia, 396 mutacin, 350 HGPRT. 223 deflc:ietlcla, 224 HHR239,360 hlbridaan. 163 anisi& molect..Cat. 167 <JtONA, 171 OtRNA, 171
y talasemia, 396 !>'. 349. 382 glbulo tundiOo. 338

ghJoo-. V6a$etglioo gfuc:geno f0$1orllas;a. 327
molde. 248.
oe Sout11e1. V68se Soulhoern en dotblot. 110

en fase liquida, 169 en la PCR. 189 en stotblot. 170 en &apMe slido, 110. vease tambin sobre blochlp& lat$0re& que afectan. 166 fundamento. 168 in siru. 172 .n siru PQf ftuofescenQCI.. VHsoFISH
f'n>!OCIO$, l9
V6ase tamttin molde !lf9111ivtl. 248 no O()(it~c.. 248 no infQrmaliva. 243
gruoosa. 330
)"'ivlamiltr3n$POPii<'<'l$a como marcadot tumoral, 437 glutaraldehic:b, 186 grutatin, 335
no mokte. 248
pesada. 4S, u;o posi!Na, 248 lranserila, 248 hcJiic:Ma, 150. 151 (te hitlrido RNADNA. 255 &n la reparacin, 359 en la teiTIWlacln de la ltan&c:rJPCin, 2-SS en la lranscripcin, 253
notr~. 248
GMP cicico. 29
Gotgi (complejo <Se). 323 gonadottoplna corlnlca. 436 Gppp, 278
gradlen1e de densidad. t2. t37, 143 grnulos de sacte016n. 337
Grisolia, 239
GroEL. 339 GroES. 339
GrunbergManago y OchOS. 246 grupo sangulneo ABO anticuerpos.. 369 aruigenos. 369 btoqui mlca, m ensayo &erolgico, 370 lenolipos. 369. 373
en TFIIH, 267
hlioe de reconocimiento, 61 1'161ioe-buc:te.-r161ioe, 62 hUoe--giro-l'lllee, 61 hlle&-vuellahllc:e. 61 helleiclad del ONA, 45 hemo. 336 oomo regliadof de la~ 320 hemofilia! ~ 397
hemoglObina
Northem. Vase NOfthem para la detecdn de dones reoombinantes. 213 rigor. 168 &Obrtl)ioc:hlpS, 388 sobre oortes. ti&ulares. 172 $Obre prcparacionO$ cromosmicas... 1n ONAONA, 163, 167 ONARNA, 69, 163, 249, 254 ONARNA, de&eSiabilizacin en la
~ciOn oe tran$C:rii)OOI'I,
256
90fl6Cie 370
getiOCil)()$, 373 kX:allzaeiOn etomosrrka. 371 punl09 polimrl100S, 371 resumen, 373 gruoo pmstiJCo. 336
laldtorme o S. 349, 382

giCOsllada, 329
nemogiOblnopalfa. 349 herencia. 2. Vase rambMn rbol

~algico
RNACONA. 196, 206 ANARNA, 163 hidrato de p&imldlna ONA glico611a.sa, 362 hldraz:lna para secuendacin, 2~
hidrocatburo& aromtico&
poficicllc:o&. 35S
de &as mulaeiones, 344
NDICE ANALfTICD
=------hOmX:igCICO. 95 horrvxll.lplel. 163. 168
459
rnoo Ot 11 ll~n I)Or ti tX'Iremo N, 3CO lf'OIOIO dt le b'~ como W*:t di OCJt*ol. 2&'
~2$3_2$7
hldiOioblold ,. lf'lluerlcil .,. el CMOitniiO 338

flodll~l
aloliiiiN C11t A~
,.......,,10
315
~-~ ~133
hOnldOgl8. de sec:uetOa
36
qlllfNCII ct. 6cJOol Ndeocol
167 hOitlq)Oilu::leoboo. 289

h0i~2'90
e h..tw'daaon.
dlll
~dll.,...,de
--267
mollla 2$3 ft'IOOIIIo dlt ~ 267 modelO ..calonedo. 267. 268 ll'lli'IIICIOn a la f!IOI'I!g9CIn. 254.
354
hidro. . ...,. 138 1H N<lrOdo (IOn). 3$4 8-tllelt011QtJ.Jt'11tll. 3$4, 35e
lldrO~
toogsiJH(l.. V$1 . , . _ . dt taOYIO de tpo

Hoogol-
ct. atnon06c"ldol. 321!1

hldfOlllasl, 321!1
hidrOXIO (tadlctiJ. 364. 3S6 tlldro~na 328 hldruro de ntQutt. 31 1
hon'noni'l$ estclfOi<let. receptores de 270 hormonas lirOideas

re-;ep~s 00
267
1NK4 426
lnti'II.I"'IOInlllol!l. 128
~llnaM
270
I'IQrQuilla, 59, 70
de tepliC3(in, 145, 150, 1St, 15.5
inOIII\Il,
hierro, metabollamo. 310
V6ase r(Hat(l&{t
hiperooeesterolemll lllmlll81, 395

hlporQfOtniQo. 165
hlpttpi&N. 41 13 hlptt'vfk'..,.. VWt rtglono
VMN mlniNt.._.
,,._""'"""""miCO, 165
un Ofll'HM' poiiPif*IO, 2" un 9Ift-U' proc1uc1o gOnco 2'45 w. Olf'"U" ANA 24S
un~ tftM'\1
t ...
H1li
un V"'~ P'*""'- 2" -21

COMO rtkAido Ot 1t
hTR. Veeseii:!IOmefasa.
COI'IIpOI~
- -
de RNA, 3 19
Qon Y tyul&e altematfYO. 296 21. 72 on tt snboodn. 296 on ti blllllnteo. 297
y lefYI'Iii\81Cir'l de 18 1Tanscnpcio, 2SS

VNH<*ul nfrtnona
lnr, 2(i3, 20ti, 270
N&do, ?10
QOrQn 3t 7 _3'8 mMoOo de pr~acin oe wu~
~~.210
hPMS, 362 HRE VS4t .... l101 cJt

~hOriiiOIIIIt
H$p VNN:~dO ~
VM:se~
-363 en medo HAT, 223

htpoltan~gUIIWIII
hl.teAi: dacCitat geoecca 3n. 38S huella Ot ()NA
......... :m
OMO!IO 20<l 20< 1J0 c::ONA 205
Wllllgn&. 4 t)_ 414
~-*
dt tR"-A ClOI'I cwor.w :JOS
91. 18$ 225.258 355
lnfiWtaM 97
y ONA nwi!Niflitlt
114
lo6lonib0111118nterw
Veas.HGPRT hAOna, 34, 84, acehlaCIOn. 2Go4 ~ IAITIIHtl mu!UQ't!lc:G, 1 10 H1, 84, 86, 87 H2A, 84,86 H2B, 84,86 H3, 84.86
humo. ptOduc:lo$ ~- 355. 3511

HU1'111ngton (entermedad del. 395
ee
f'M.Iso emlico. 99
H<l 84 86
Hll, tCMIIIIQn 326
H4 fNIIII.oQn 328
IBP. Vtiaseproteina& de un.On alm ICA, 271 Klentdad. pruebas de, 385 ograma 89 IF VHU lacloret (le U~iC:iaCJ()n oe 1a lf8CiuC:dn
mlna-errwa
y ltl'*l'~Itl. 250 ln*'tron. 316 lnttf9tnleo. 109 lnttagfniOO. 109 lnt~- 277 concepto. 7?. 109.245.276 <ispoiiCIOn en 1M gen. 245 tWnniiCIOn p0r outoc.alli$1$, '77 en fOrma dt ltuo. 281 tn l)ftIANA 2&4 magnrlud. 280
niJI'I'ItiO, 280
politn0111tmO, 368 ptOpOrCIOn tM1 el genoma.. 108
-362
NALH1 3$2
----20"
.......
HS &.4 8e
reduoc:l6n 01 .. cerge
vaase ~Lilorne.-11
21<4
366
po~~tt.oa,
26'
~ ll'lSE!roloMl. ~-
181. 185
~ geneo..ca
hiiiOnl dltr Qtll 'Nt 2&1
ft1Citlle {gen). 269

~~1.243
HI.HVMSe~~
HMG"' 00
J03
............. 248
1lpot 111 )' 1\
llpot 1 y 11' 77. 2:82 282
..,.
CII'OI'fiOIOUCA.
~......
11 -"07
C*dUIIU 4()1
NASH6 362 HNPOC, :163 HNPP. 186 MANA 10 2ti 1 Hoechsl, 91, 126 HoQnas(c-.a dO) Vi<"'HTATA holoenZJma Vias rnocltiO home<ImlniO. 82, 2e6 homoc;Brionte 222
363
n."Jbdoi eoe <liadO pcw heft'IO 320 hbdol (ptomo(oe. etemento o seo.JMCia). 266
ntlaCIOI'I
al aul. 183
.-;10 (punto dre
c;ontrot del cido ceMar). 23
IAE 310 IRE8P 310 IRP 310 . . . Cc>O 1$1. 201 tn 13 bu~Ql*la drt ge119$, 380
mt~~~~eiOn.
272
..:iO do la replieaocin, 150 pr01ein~$de 150 151 ..:iOdO 13 Ir~ 307

enetgICa. 3 1O elapas. 309
mu\ICIOn CIUI;.ti'IM de
htmOhM B. 348
IIIObullrllguan"'* 17'9
40COf"O. 90
leocron101oma, 4 1 o
460 S.OOnzi"" 367

i90eSQui~men:>.
fNDICE ANA TICO liquido 31Mirico, 120

articular, 121 a&eitico. 121
mapa fi$ico
de te$1r1QCi(ln. 228 deSTS, 228 empleo cte Soutner'l'l, 227 h terpretac:in. 223, 227 resolucin, 226 mapa gentloo. 218 CIP'icacin para locali:zat un gen. 221 Of>teneiOn, 220
~eaoor.
202
i901orma.. 367
i~iHRNA Sil'lfet3Stl
correceiOt\ <lo OHOros. 306

iaopep~ldasa,
342
ls!opos t&diacliYos.. 4., 180. 185.
esludio del odigo genl!oo, 200 esludio de la b'aduccin, 300 isontna. 367 IVS. Vase intrn
J
JOE. 238 jun (gen). 417
celalorracutdeo. 121 petie6tdlco, 121 poiitonoal, 12t pletnl. 121 serosos, 121 sinovial. 121 lius celular. 132 lisosoma. 323 degradacin de proternas. 341
primano, 341 Lk. V6ase nrMro de edaoe
180.
Vase tambin mapa

EST. Vdi1HEST gentiCo, 218 gnloo. 218.228 no gnico, 2-18, 228 no raciacll\'0, 186 polimrlico. 221
IObi.IQ!vir, 13
IO(:i.
P1untl ~ 'Oou$
K
kanamlcina. 317 Kaposi, V6ase xerodermla Khorana. 1'78 KIP, 426
kinomic:ina., 316 Kfet~ow (fragmonlo Clo). V6a:te ONA polifYiet'&$8. 1 Kllnelefter {sfndrome de), 406 Kozak (secuenCia de), 306 Kpn, IIS
ICXUS, 95
diSlancia entte IOci, 219 IOCUS PI. Vase (t18nlitrtl$1na Los ngeleS. Vasegalactosemla LPCA. 193 luclfeta$8. 186 luciferina. 186 k.men. V6.1H rG'Ifculo enctop!Mmioo y v68S~t GOigi ~rnol, 186 Ju:l, V4$$C radiaCin Lympnoprep, 124
STS V6ase STS

~.
185
t11~ is610po$
b.ll'nOtat, 434. 435

VNTR, 384
mareaje. V6.?sc
y vease lluoroeromos
con cuatro tluorocromos.. 237 con OHA polimerasa. 182 con un in<fcador. 185 con polinuclelido quin.asa, 184 do NTP en los&ato o:. 182, 183,
184
L
L Vase nUmero de edace
M
maduracin de proteinas. 326 de mANA. m derRNA. 282
~ rRNA y
<te NTP on fosf.alo t. 18-4, 232

oetoccin. 186
drec:to. 181 en CLI!ivo. 180 in vitro, 181 rdtecto. 185
no nudeoddloo de sondas, 185 para la proleoli&ls, 341
pOf oobado al azar. 183 pot trasladO de la mena.
L Vase hebra l
ll. Vase UNE l19 IV$, 77
l<~c:ta~ l~im<~ V.t$~ l3ulon"'eti3
lftNA, 77
oetRNA.. 282
posttaiii!ICt1pc:io(l81. 244. 245.
1aeta10 tleshiCirogenasa. 437
lacZ. 209. 214

lanwvudina. 23 LAPCA, l93 lazo. VBaso inlrn on fotma do LCR. V~ rogin do contrOl del IOCU$
250.275
postrari$Cripcional en la mi!OOOndria. 28A po$trJ/ISCripcional. diftrtf'lcia:s ontr procariOtM y eucario!as. 276 I)(:ISIJ'tlnscripcional, regulaCin,
~leo.
louoomia, 436
lcul)n:l
vuse etemanera
e\/gi(O. 45 ZDNA. SS
LiFraumenl (&oindrome). 431
...
vease mlcroesteras
ligamiento en 1a bV:5Qve48 de gent$. 380 ligamientO gniCO. 220 llgasa. 202
....,.
y vase afinidad manosa, 330

d91igamien~.
MAP quina$as, 42'2
182 1erminal. 183. 232 leminal por relleno. 184 marca de &eeuencia expresada. V6<1se EST t'I\AtCO al:lief\o <1t loctura, 294 en la btlsqueda <1e genes, 380 ma.reo <1e lectura, 288, 291, 292. 350 desplaZa"*"o oet, 289 Martan (sfndrome ae), 395 material gentico e.xlr.lnuc:tear. S nvc!oar. 5 rnalriZ Cldraeelult'll. 122. 413,414
mt~lri.t nuct~r ,
V6Me mapa genlloo de restriccin. 226

de SNP. Vase polimorlismo SNP ditoroncili.S cnb'e gon61ico y li$ic0, 218
en la reparacin. 359. 361

en la &{n'et;i& do leif'I'ICcl'()$,
Vase esqueleto nuclear MaX (pt04efna). 62 Maxam y Gilbert. 231

Mtl,yGri:nwald.Oiem$4 (tinei6n
160 mecanismo de reaccin. 156

pam fOfmat el rONA. 207. 206
de).87
P,ne.~
QCW16mico, 218
mapa li$ioo, 218
UNE, 115. 368

linfQmb, 436
oe antt resohJoln. 225
lipo!eocin, 212
llposoma, 212
cte baja resolucin. 221 . . onllgos. 229 de EST. 228
MCS. Vt.'JH SitiO Ot C*:ln~dO mU!tcl'e mcJm2 (gen) ., 17 MeCP. 272 medcina prodie1iva.. 387
NOICE ANALTICO
rncn.lla sea
ti'U..10$lf3$, 120
461
mini$3!tllite.
MTS (pro4eina$), 426
Vtfa.se ONA minisatllte

MifktiiiO, 334
puncin, 120
meto06iS.. 97.
mtTFA, 257 mucoviSoeid0$1$.

V~
100. 104, 105
com~(t'IOIOf\ 0()(1 ITIIIOSIS, 104
........
noodsyvnQOtt. 404, 405 MEK.422 melil. 156, 202. vease rarrtl:Nen

lta$1800 de &a mella
mlrslllaetn de pr01elnas. 335 mi!ooondria. S. 8, 323 divisin, 161 expresin ~a. 244 generacin de mulQenOS. 354
I(IIUI;J en lt\ apo()10$iS, 432
libroSis qufstlca
mUMe celular ptogramada.
vease apoptosis
muesca. Vease mella
primera aey, 104
mitgonos. 420 milO$$, 97. 98, 100

~ci<lt\
$Ogundatey, 105
Me$CI$01\ V $t~W, 143
oon meiosls.. 104
tne!abollsmo oxlclativo. 3!-4. 377

me1a1ase, 99
melaloproteasa de matnz
ex.tracelolar. 414
melslaSIS, 412,413,414
mebi<ICIn
como sel\a:l parata reparacin, 362
reg!Mcin. 423 $0tit'IC$ de iniCio, 428 $lln CitOCineSis, 404 mii(()CliOida.. 400. 406 MMP. Vase metaloproteasas de matriz eJttracelutar modelO del holoenzima p;:n;) ti inioo do 13 trai"'$CCIpei0n,
moosttas bucales, 120 dsooacn. 122 tipos, 119 MUIUfocal, 145 mup11ocina, 316 mutac:an, 142, 344
a gran escala. 346
a pequcM O$t;.AJ.\, 346

t\$in1(lmbea. V6asesl1encio88. CfaSillcacin, 344 como Otlgen del car.oer, 346
oon cambio, de$fase o

de&plazamien1o de
253. 267
mo<IOIO ~IOMCIO para el 1.-.clo
de 13 uansc~ln. 253,
de amlno9cldos.. 328 de DaSes. nitrogenadas. ~5 de la caperuzas. 278

CIC MMtetiimler\40, 272
de~272
267, 268
mofic<'Cin
co~aducc~.326
maroo, 350 oon &en~iclo. V6au stcnci0$il oon terminacin prematura.

Vase mu\aein sin sentido oon terminaetn relnlsada. 352
oonservadora. 368 de sentdo a!t8flldo, EIQuiYOCaclo o falso. 349 <leleein, 347, 348 ~ec&o beneficioso o pectudlaal,
349 en ONA mitooondnal. 377 endgena. 352 esPOntnea. 353 exgcna. 354 troc:vencia. 346
del o~. 211.212

eo el desarrolo embrionario, 272 tegulaOOn de la e~in gniCIJ, 272
00 amino6CidOS ef'l protenas, 326, 336

pottradueci0!\81, 322 mOoiO$ ae contrOl Vase pomo1ores distale$ ~ . 145, 243, 247, 248
y cncer. 273
I'I'W'Mil&eirHesulcdn. 200
molcula! soi\;:1.1. 420

monQOiismo, 406 monocistrtlico. 301 mor'doeal. 145 monomorlo. 368 monosom&a. 403, 404 mecat~lsmo, 405 mn..&a. 119 mosaico. 345. 406 ct011'106mlco, 404 mo~a.za, 355 mob\'o estruaural en proteinas que se
ONA, $ 1, 266 mANA, 70,71 bloqueo. 319
metlladentna+ONA glicosilasa, 362 N-metil4ai'IW'IOalobef'lceno. 356
Nmetil-4-antrooeno. 3SS
me1ilatk"''$, 278 asociMtl$ tt as entil'l\8$ oe
roolriocin, 200
0"-metilguanina
gnoca. 344
germinal, 344 heredable. 344 incidencra. 34& indvcida. V.':I$C mutaCin C:Jegel\8 ii'ICIUCidt' l)<)t agentes lS<:os., 356 ii'ISOf'C;iOr\, 347. 34& magnitucJ. 346 materia prima para cambios evolubVOs. 345 neUITal. Vase &iencaoosa no hetedab!e, 345 no silencrosa, 349 no sinnim<'t Vf.'tse cte $Cn!iao 811Cn'ICIO por oesamlnaein de bases, 353 por raacin, 356 puntual, 346 sienciOSa, 348. 368 $In c:.a.mbio dq m;itOQ, 351 s-'1 seMidO, 351 ~ima. Vase silenciosa S(W'I'I!iea, 345 $14~ueion . 347
sustihJtin O)nS!f"VIIdOta.
reparacin do, 358 meliloli&in<l, 328 me1i!niltQ$0urea, lS5

l'l"'ellltrans!erasas, 328
mellonlltJ=INA Iniciador, 308 melloniHANA lomllransferasa,
I,.I'W)(I
211
308
metionina. inOOtPOracin intern<'l y
N-terminal, 308
mlodos de inltO<Ivccin del rDN.A, 211. 213 metotreKato. 223 meltlzam!Cia, 124 MFP. 424 mien:)C)S1Cr3$ m.agn6tie3$, 128, 135 ~,-microg600ullna, 436 mietoinyecCJOtl. 212 mletomatrlz de ONA.
corno mueslta para ciOnaocln,

205
aegmoacln. 286 esUlbAI:tad. 286. 319 e)(lracc-n par atinictOO. 139

m3Ciura~e.on. 2n
Vase blochlp mlctosatlite. Vase ClNA microsoU61i!c miCI06COpia, 129. 186 de lluoresooncia, 91, 112 migracin de cll,jas 1VI'T10t<'lc$, 413, 414
pollmerasa que k> transctlbe. 251 precursotes de. 2'$1 proteccin trente a la degradacin, 319 transPOrte, regulacin. 318
mRNA{gvat~ina N7)
"'*illrans.tera$8, 278 mRNA{I'IIJCI&siCI02'.0)
mctillft'U'Is.terasa, 278
meONA. Vlase ONA MiiOOOn(lritll
mTERF. 257
350
462
ml.llaCIOn Su$tlruc::in no conservadora, 350
NDICE ANALiTICO
ncleo hlerr03.tufre, 319 nuc~~. 146,156.247,313 oligonudetldo. 183 empleo como sonda, 177
nucleotde. !)
nucleolo. 251
nu~.31.
empleo en PCR. 189

79
SinltiS quimiCl, 17$ Ollgosaer>. 328 estruc:lura qufmlca, 330 Pf9(;ursor de N-gllcanos, 333 precursor del grupo ABO. 372 unido por N, 330 unido pot O. 330 olivonjcina, 91 oncogn QC(I'Iparacin con onco&41preSoOt.
tranSiCin, 347
trans.versln, 347
y degeneracin del cdigo, 295
y metabolismo, 354 y JX*norlismo. 366 y su~anclas antien&ales. 354 mulgeno
eliiTW'IaCin, 357
endgeno. 354
eiCOglttno. 364 Myc: (gen y prolefna), 417, 430
nuete$i(SO, 19 abSOrCin I.AI1'3viOIC!a. 28. 166 at1CirrelrOvital, 23 COmi)OOCOIO$, 19 -<!ltosfa1o, 24 hidrlisis <Pmlca, 2$ lntreeuenle, 21, 72, 76, 283
-~sfa1o,24
N
NA()o, 30 eo&u&trato de ta ligas&, 156
NAOP-, 30
I'Wlftol. 18&
Mlid-xic (60100), ~
NAO. 369 I'IMtl'lja do oerittion.. 126, 130

NBT, 188 neetOSiS. 431 neotrW::ina, 317 neoplasia. Vhse eMcer NER. Vase escisin de
propiedades flsicoqufmie:as. 27 que forma doe nucle6oos. 20 tipo$, 20 tliiO$lAIO, 24 nuci00$0m&. &4. 85. 86 desensatnbl&, 263 liberacin, 263 posicin y oomro1 de la expresin, 263 b'nucteolida&a como marcado~ tumoral, 437 nuclelido
a~orcin uhra~.
419
OOIICep!O, 416417
exprestn aon'inante. 417 que estimiAa el ciClo oeUat. 429 Qf'IOOprOiefna. 4 1 6 onc$uprell0f ~cln oon onoogln. 4 1 9
~.418,419
28. 166
ru:::letidoe
neurollbromcuosls de tipo 1, 418
hefenoa.m
mvloc:iOn cav:sante. 362 neuro!\bromin~ 39S. 41 e mvt~d81, 352 neurOI\3$, 97
n11 (gen). 269, 352
<:fclico, 29 COrnoteiO, 29 complejo con Mg~. 21 componentes, 23 dlclesoxl-. Vase cldesoxinueletiOOe t.:lrlisi& quinka, 28
como oncosuptesor, 352. 418

nitrato, 35S
nitrito. m
nlftooeLIIoea, 170
nitrgeno, Istopos " N y "~N. 143 nhrgeno mos.1aza. 365

nllt06amlna, 355
nittoeo (c:do). 3M
n~ldlna,
355
no-disyoocio. 404. 40S NOR. VBase rejn organizadora

del nucleolo
NQfthem, 171
nQIT'IGinclaMa. 2S posicin del enlace fosfato. 23 tlfl)piedade$ lisicoquimicas. V PfOI)i0(13CIO$ inict\S., 27 sencillo, 24 tipos, 23 unido a az.:.cer, 332 nulipiOicJia, 403 nulisomfa, 403, 404 numeraCit'l de lOs nudeMOS en genes yen ANA, 249 nmero de enlace. 68 mocificacin por lopoi601'00fasa&.
expreSin receSiYa, 419 tlpos. 416 oocllo, 103 oogonlo, 103 opern. 252, 301 ORf. Vase marco abierto de ledura orgnulo, 5, 322 orr, 151 origen eompiOjO oc reoonocimiento. 151 de repllcactn. Vase replicacin, ofipen origen de ltanscripcin oomo referencia de t'l.l'l'leracln.
249
corno mU8$1Ta. 122 oro, 186, 212
\1\110, 103
orino~,
2-o)CogluiM'Ito. 328
p
p105-Ab {ptotefna). Vase Rb p21 {protefna). 431 p21 Ras. Vase Ras (protefna) p53 (gen y proteW.). 431 actuacin en el CIClo celular, 429 factOf de lranscripcin, 431 in.,aivt\~ par prOiofOils vfrlcaa. 431 incxtencia en el cncer, 431 papel dval en ciclo celular y aiPPosis. 434 PAC, 209 paclamicina, 316 palfndromo, 57 oomo dana de rKIJ'Icx:ln. 201 en hebta sencilla, 59 en ANA. 2$ y ermlnadn de ta transcripan, 2'56
pak'nita~.
152
nmero n, 93. V9anse tambien ~ia. dU;foidia.. poiploidia vari&:i6n et1 la lecund;)c;in, 1 06
compAradO oon Soul:her'r'l y

Westem, 173
y ciclo celular,
Nycoprep, 124 nylon. 170
1DO
novobiocina. 259
NPP. 186
Ntem'lil\31. V6.1$e l)rQIOI'Ia. OXIJOMC)
nucteasa
apllcacln al mapeo, 226 aspectos generalet.. 198
o
octlnero de hiSkN\aS, 86 oetappcldo, 251 Oka:tald {tragrnen!OS de). 148, 153 Madlr'&Cirt. 156 progreso de la &lme&IS, 154 unin, 156
~10,334
de restriodn. Vase enzima

de restriocln
en la apoptosis.. 432
$1, 169
n~Jeleina. 2
nC.Cieo celular, 2. 5
334
ncleo de la ONApollll, 149
olgo(dT). 139. 206. 280
PAP, 436
NDICE ANALfnCO
paptlom~.
~
463
4.31
paremetOO. grado~ di.

dt . . . .
v.... ....,..,
~lldld
gecwn... ., 43 I\"'IIOdd6o ~ 43
~A-l
-329
prart~Cda
peptm setial, 323. 324, 336 -32S

de f:::nCCCift'. . . . 32
PQI!I'IOffot.mO coneep10,36$
nw'll-
r tnetOU~. 385
01~.370
Ot un tolo nudecJII(I) Vease
ena~defOHA Pld~.232
37
AUyCG 41
~potts!M
~381
-SN'
lllndtl"r''
VMslr~
PAAP 432 pattiCUIIl dt reconoc~ dlt lliiMNI 324

pattJCI.Aa nUdlo. 86 PalaU jalnc!fOtN de),
en~ct.~en
.........,...323
PEST, 342
J*Oit:48:S8, 185. 186

PFGE. V~etec~essen
en 9fl'lorN l'l'lllooondtlat. 3n
"'Wltf'OMI :168
tn 10 IOI"'g11\1d dt to$ lr~IOS
40e
ptuen-.dad
pruebas de, 38S
pa~loglt'l
eatr'II>O ptlsame PGH. Vease Proyecto GGnoma
dt rttlnOCtn
Vf.IHAF'LP
mOiteul!lr
cone.p~o, 390 paula d8 lectura. VfiN mon P(:NA 149 1$.4 Vns9 l~mbi'ln
"
.....,.no
oftelo SOI)fe el ap.areamerno de
NIOIOQIC:o y palolglco. 366 geniiOo. 36! QOniiOo no proleioo. 349
bases. 42
efoeto SObl'e aa deSM'llnbaciOn, 164
pinlado oe Ct()tflosomas, 172 pinza desllzame. 149 plperdna para sec:::uenc:aac:In, 232 plrimldlna, 12 plrofosjatasa. 146, 247 plrotosiato. 146. 247 pi~ ele genes. 212 p&~n~~a. ve.s. molde
gn<o.366 366.369
gnioo y prot9IQO, 349 gnloo no co<;l!fie8,nlo, 376 gr&dO e. 36$
"*11'1111'1'10$
ONA polmtras~t 6
y,.
secuestro por GAOO. 4131

PCR. 183 anidada, 1
es
188 tOS
t ~rie*'l 366
aplaciOnN
a~.
no~.37S
~.
3A9. 369. 370
-100 oon ltpt;lcbtt. tts OOft COftloOI'U'O en cehtfllt 193 con~.,.,..._ 115
RFLP VNH RF-LP
......... 193 -193

-110 tidei!Oad
l\lnd;l~.
-5.2011 -2011 ..........._.2011

~19'2018
(:()triO
SNP. 36$_ 38" VNTR W..VHTR

y ln!MQOn_ 36&
'"'-.ceo~. 368
-..368
~ lollofltasa.. 246. 290 ~ 0\llfliiN.. 1&1 232 ~ ...
1"'
,.
veeeor de CIDti800n. 204 F >11

hl'leSIIZaCIOn.
gr.ado de l!mC)I!\CiciOn. 192. 193
.nvtrta lt4 LA-PCA 19G
ongen de repllcaoort. 209

pSP64. 177 pUCt9. 209 plegameneo de pro~etnas, 244, 337, VH$6 tambn
et~ral)in~$
'n
estu:lat el
c6<11go
~ICO
289
_...67
~Pt.dO nl(ltf'lat.
31
"'9> 193
lirn.te <to CIIQto<:clon. 1 93 LPCR, lo:! numero de Cielos 1 g.2 numero de oopon consoguldi\S 192, 103
objOIIYOI, 188 I)Jia f3 (IOitoc:IOn C1t
pO'in"'Off4mol. 334 1)1111 Ol'>t6nein diiOf'ICIIS.
pOIIp!Oid!ll 94. 403
POMbonUCittdo. 246 pcflmbototl'la;, 79 poMomo VHse pollrhbo&oma

~mla.-103
n-.eearismo. 337
dei!Cleilela en la llbroets
qulstica. 351 enfermedades, 337 pcAI(A). Vease oola de pc6(A.l
pc*ll\) pohmerasa. 280
178 ~>'' ooeonor ONA dt hQbra

....... 1. .
-110 retldlf'floeNI) 192
RT-PCA 1915
POOF
V..,. '-ICw dt
CI~IIIO Ol\"~
--)q
~dow,13
dt ClfiiQuetM
...... _....,..
PEG VMNpcM... ~
.. --
IX*{A0P-dxl6.a!poli'nera.sa, 432 poi(T). 139. 200. 280
P<llymorh0p1ep. 12o1 poro nuc:IG<tr 275. 288. 318. 324 postlnterlf)CIOI'Ial OOf"'tiOI Olla t_.,P,Min g6nlca. 28< ~no.dof 266 pRb ~~~~1) VHH Rb
PIPIIKI!On
pt~-~
poli( U 139,256. 280 pc:Macriam!Cia 138, 173
vease c:ow. de ~J
Verase cola de polo AJ
PtC*._,.de"""'*-. 118
-337
pt~-.,.... pt~ii'WI.
c:dieabtln. 18S
__
~
....... dd..-ltOIII. 135
.., P'Qieol,._ ~
,..
ese .. ~ena~ v.._ptOtMrH

del peplldO ..,...
212 poliOslrnleO,. :101 poiiOOfleCICW, 207, 209
324 336
336
32
prequmolrlpe~~
pohelllenglleol. 212. 222

pohelllerwrnna. 185
pre ANA
24$. 250. 27S
con v1r10t ~ genl006, 276

do nntloroi1Cia. 281l
madurACIn Vi.lse maduracin
pep~ld!lttant!trtl13
78 312. 3 13
centro acrwo. 81
pep!ldiiIRNA
hldrlllll, 3 t 5 ppddo C, 337
polimorfismo. 95. 96. 365 Vease tarntltet! man:aoores pol!mtfico6 aplicaciones. 384, 386 con efecto feno4fpioo, 369
pot.lrln&ei1JICionM
m!looondnal 25 7 284 mol o PM\ IRNA y 1ANA, 283
464
prAHA
proposaiUS. ~
fNOICE ANALITICO
~ 18c:ltnefasa,
335,
...-*'oeco,2SI
~
78. 10. 251. 283

284
toboeOmc:o di r..,..,." n
~. conerddt
Pl'tll .IJk:fCICIOI .... c:onti"CCI ct. .. t.:PMIICitl gjMa 283

Pltll~. 336
~ibtlow 4Cifl Gt)
ptl'l'laNI.
......,e.,....
pollmertN
(t
~ 32A.""" ptOtar1Wia. 34. 8o' pnxeasa. 122. 3ot2.. del pipcldo sena&. 324
338
ptOtlto.,. ~oUatasa.. PIOle,. ~ :rrl. C25
Cti5Cel pe
--336
oepttld*... dlt cdne
:arn 432
-
TFUH 287
-c.
. 338
enla~<&32
~321
V.._ TATA 147, 148 152

152
libiot. 318 ,.
IISCSOmal. 3t 1
Ot" OHA.poj 1, , ..,

0t pmleiNII rna:&&al eon
\l!Nf~ONA
"""-
ptOIN&(Ima, 342
pnn, 337
.,_....,.
probendo, 393 f,)r()CArl()ntt, VHH procarlol~
de gt\()OS luncioi"'MM. 178. 179 pro1ema. 2 accivacon proteotltlca. veese pr04ec:Mis
~In., 341-342 VHNiambHin proteasa proMOma, 217
~a . 2 1 1
como produceo gnlco
-6n
COI'Ioop40, 41 6, 417 llpot, 416
dt!oror'ICI.. oon euca11041, 5 gencma, 5

proottamlonto pot1ran1Cf'C)Cional W.M maduracin polttJnKI'Ipoonel ptOCI!tllm.ef'IIO ptOt<l 110o de
V.... ~. JlfCICU"Vlllld. 148 149
.....,...
Oe adhesin. 413. 437 de anclaje, 325 de choqtJe trmico, 339 de membrana, 324 de pausa. 2S& Clt~A. VNNRPA
vease ptO<IUc(o 9rioo
ptex;m"l VM$6: promoe Proyecto Genoma Humano, 217 eeraeter(aeleaa, 218 ~pa 239 ptOytCI08 pnvados. 240
PJP, 337
seoeo.,... 324, 338 de ur'IIOtl: a hetn senci....

de
150.
IS1
de \ftin a
J)loeolligefiO. 328
~9tf'b . 24.$
..,._
.. --3S$
...
~
w . 270
y ....,.~ _ 2SO -(-)316

~21 , 72
PM'l~ - 112
det.nn a la~
dt I.R6n a TATA, 2$7 271
~3<4. 341
~U.24.8
-ceP
_..... ....
p6l'&4 _
................ ..
PTE.20S
p!'OtlOtfnOM. 0011ifei1Mtl
PC2 y PC3, 337
$t11Cbl, 181 , 185 ~-c:ia& enltt tiPO$ . . . . . . ..
pUCtt-....... .. "'l'ldl"'gol"*.. .,
cidUIO
pr'ONuiiM, 337 prollletKIf'l. 213 oonlrol pcw ~IH

ex:~raeelulatol <420 oonlrOI t14t0t#YO, 418 control potlllvo,
262
Vase enlace VNH enlace 23
elCtfemos amino o N!Mml!\111

y caltlOxilo o
C-~rmlnal,
pul'llo di tM1rioei6n, punto A 423
:lOO
funcional, 322 G. 421 gliOOSil&dn. 328 inaeracdn con ONA., 60 ltgante. 181 6gente de IRE. 3 19 lgante del telmero, ~ n~. 300,314.338 no ~'listonas. 84
1e
purlne. 12 puromldne 2 1, 3 16,317
equ!llbllo con rnvol'le c:thJI$r,
.,.,.,.
w
tT'IOOOf;lonal. 4 13
prolil tlidrodlua. 328
tlldi'OIU&&c:IOn. 32'8 prometat.... t9 promoeor_ 24 ~ m 2&1 -:M&
--2$3
diiJ ......_lll
bat.~~- 287 lllOIOdn. . . . por T8P
- --331
.....
256
Vase plegM1iento de procenu

325
1~de:ANP~.62
y IU. 26S
?1S
,.....,....a del rtlOiom&. 325
t~deSRP
,..grl Qdr;n dll
-200
.-.~dttl!P...O. "
~-2$4 mMIIIIC:IIn. 272

IMOCCM'IOillll, 257
......._cte. V. . .....OC'O!C"t\ _..

lliPfesG~as de ~
r.no. 318
setmll'\adotas de la trantCf1)Cin,
transpOrtadora de doruto,
prounat. 26S
351
Vt1se regulador de la
oondJC:'Incie 1T811$mtrnbtan& ubiqui!ir'ladas. 3"' 1 tAcJa media. 340
~IMkW. 2M prc;n..~CIOO,
q_. . _ ... _ quorat!nas. 436
qultiOinCia, 98 qulmer~~. 406
qulmlolum.nlecenoa.. 186
lr'ltllbbon por iWICI1J'lpSille 376 ~'10.33&
-~1 v,_..,De,
~
d'r
adeec.,...n
IIOICiofa ca Cdlr;. q7
Rab (prolelnl). 421

IOnlzat\14, 356 rayo~
oamma. 3M
106
pr~91Ci0ft cotulflr 2 1 3
tlyot X, 35& utu-avioltlt, 356 .,..lbiO y IO~r-.cin t1e1 ONA,
PfOP!do VH H yOO.lt'O de propl(llo
357
NDICE ANALTICO
radic31es libres. Vase especies reguladof de Sa ooocllclan(:l{l
transmembrana. 396
465
repliCaCin reaccin glObal. 146 rei&Ci()l'l ooo et <::icto celUlar. 100 secuencial. 144 semloonseMdora, 142, 144 semidlsoonunua, 153 sel\ale-9 <te iniciO. 428 simultnea. 144 $USll810$, 145 tcrminaCJOt\. ~!nacion ooidao de. V68se replicn t.W'lidlreocional, 161 velocidad, 149 replicn. 145. 1 5? roplisoma. 151, 152 moooto, 155 teMtencia a anbbltlcos. 206, 209. 214, 316 resttioein. V6ase enzimas de rt$1rloci6n tesltlccinm()(lifiC&CiQn, 200 r8$1Tictaws. ve..~ cntimt~s de r.SIIIociOn lel(Udlw:ta (hebra), 152 154 retculO endoplstniCO, 322 lumen. 324 retlculocrtos. para estudlaf la traQJ'ocln, 300
reactivas de oloeno
A<tf (pro~ina), 422 ramiftet'cin. centro oe. 280 Atl$ <gen y protelna). 417 en ne~JrOllbromaJOSis t.)() 1, 352 f811ne5ilaCiOn de, 335 fvnein, 421 mvlodtl, 422 rasgo faJciiOfm&. 396 rasgos. 95 ra:t:on de aslmecrfa. 39 Flb (gen y protena), 430 actuacin sobre el <:ic:tQ *"a'.
reguladota
(s~ncia gnca). Vaso gen, se<;uenCJ<'I$
relacin de ooc:ificacin. 288 relleno. 184 renal\lralizacin, 163, 167 rendimiento Cle la PCR, 192 reparacin, 142, 356 y acbvidad 5' eXOf'KICieasa, 147 de apareamientoo tnOQrrOCIO$,
ve.a.se
362
de bases meuaaas.. 357 del uracllo en ef ONA, 362 por escisin, esquema globel,
429
COmo SUSIUO de Cdl<, 430
tos.torilacln, 430 .nachvacin por protetnas v(rk:SS. 431 inactJVaein y cnoo1, 430 rONA, 200, 204 IOfl1\bCi6n, 201 inlfoduccln en la clula anl1tnona, 211.213 subproduC1os. 208 reasociac:an del ONA.. V.'f.SC Col y !~fiase renaturaizacin recambio prcteioo. 340 receptOf do lt'letoro& de croci~. 417 dC laetorcs inl'libiOOtes oe1 etecimiento, 418 de hOrmonas toroldeas. 4 17 de ltansterrlna, 319 recestYo, 95, 394 Aeddlnghau&en (entermedad de) VOOse neuroflbromatosis reco~cin, 106, 142 fracQOn. V64$C fre.evcneia troeucncta Vh$e frecuencia l'lom66og\, 106. 218 meillca, 218 no homloga o deSigual, 367 reJaciOn oon el mapeo, 218 y segregacin oe ateiOs. 218 rocuento de clulas ~bies. 129 recuperaOiOI"' de bases, va metablica 223 rccmplanvnleniO. m!IOdO cM p~.,mCIOn do virvs re<:Oml)inant.es, 210 regln <e oontrol oe1 locus. 111
eeiJ'uCiuraL
3S8 por reoombinacin. 362 posreplicaCin, 362 SIStemas enzimtcos. 366

IJPO$,
356
V6.1sot.ambi9n escisin repetiCin. Vase OHA repetrtivo

directa. 56
e&pOQJta/. 56
invtttiO.'I, V68$e palii'IOromo le!'lhii\IIIJ. Vase lelmero replic:3Ci6n, 2 , 98, 1 41 autQnoma, 206 bidireccional. 144 blkX:al, 161 bloqueo porGADO o p21, 431 caracteri&tJCa& oomparad<l$ oon transcripcin. 248 <:lelo celular, 142 cofactores, 145 comparacin errtro pr()C{Iriolt\$, euQMiotM y riloeondrlas. 161 eomplejo oe. vea.se tepllsoma eonserva~. 142, 144 oel ANA, 2. 147 demosb"acin del mecansmo, 143 dUeccin, 146 dlspersarrte. 142 elongaCIn. Vase elongacin de la tepllcadn en la PCA. 189 en:timologfa. 145 ert()(es.. 352, 362 llnat Vase ternir'lacin h~ls, 142. 14-4 I'IQrqul!la, 145, 150, 151 iniCio, 150 mecanismo de la reaoon, 146
mi~l60
retinoblasl<lma. V6aso Ab
relra&ada (heobra). Vitso rot:aroMa retrott;i11SI>O$icrn. 368 reiTOtratl$p()$n, 368 re~YWU$, 2, 210, 244 r6'191ado del ONA tras et:Jr()fQft$i$, 138 rever$110t'l di(ecl& de la mlllaeiOt'l. 357 AF-C. 154. vesse 1amoten ONA polimeJasas 3 y e A:F-LP, 381 flho (proteW.). 421 riboforina. 325 ribonucleasa como marcadof ll.mOfal. 437 oomo proteina modelo de plegamiento. 338 V.,sc t<tmbidtt AN(I$t!
ribOnucleopro!einas t'KICJeare-s pequetlas. Vase snRNP rlbosa. 11 rlbosoma. 79
V.'fse gen. $$CUCncia& reguladora. vnsc gen, secvencias Otganizadoro dol nuetooto. 91 reglones hiptrv<tri3.!:lle$ trt et miDNA. 377 reglones Internas de cont101. 271 regulacin pot fosfOtilacin n:rver&i:lte, 42S petrOO~o~ec:.on<tl, 319 tradvct~l. 318
monoloca.l, 145 mvllik.locat. 145 no aT~ullnoa. 161 ()r9tl'l, 92, 145, 150, 211
o~tgen
cen1ros aCIIvce, 81 compoSICin, 80, 81 ~liz<1n-.en110 en ol mc10 Oe la 1rad\.1Ccn~n. 309. 310 Otslizt'~to en 13 elongaCIOn.
313
6soci<tcl0n durante la 1ri'Oueor\. 309, 315 en milocondrtas y eiO(Oplastos.. 79 neracOiOI"' oon mANA. 81 separacin y roosodacen de svbu~de$, 309. 310 $1tiO$A, PyE, 311
miroeondrial, 160 otlgen plasmldlco, 209
orlgenes, m!llple& en un <:romo$01'na, 157 roaocin <:omp._"trndn eon lr~I'I$CriO(:in, 247
466
ribosome
subuni~. lame~'<>.
[N DICE ANAnCO
ANA polimert~sa procatltiea, I'IOIOet\Zima, 254 procarltica, subiJnldad o. 251. 254 sangre manchas, 120 ftKal, 120 perifrica. 120 sarcoW~a. 259 sa1!ile. Vtiase ONA SUlite satlite oromosrNco.
80, 81. 308. 309
79. 80
f<)Ooondo$ ,
VdtlH $01'1(1<\$ do ANA

tibotlmldlna, 72
SP6,1n
subunldades, 251 tii)O$, 250
b'3fi$1Ctil0$ prl'l\itli()$
fiboz:Jma , 76
at.lloa}N&Ie. 282
ANA autocatalitico. 282 tran~lda~. 313

RichOickerson. 52 riCW'Ia. 3 Hl rifamicinas. 258
ril&tnpieina, 251, 258 rigor, 168
slnteelzaCIO$.. 2S1 ' 251,271 11.251.268 u, dominio Cterrnnal. VaseCTO

111. 251. 271
vease Cf01"1'1060ma scc. 436

teRNA, 70
soc...onm, 236
secuencia Cit.. V6&$9 Ci$ cos. 210 lnr, 253 TATA, 253 de etiquetado. Vase pptielo seal ele rep11C8Ci6n a ...tnoma. 211 estruC1ural. Vase gen, secuencia gnica. Vas6 gen. sec...encia in*talacta. V6ase intrn l i<et. Vdakt 06Pti seal promotOr&. VdttU pr(lm(:IIOr reguladora. V6se gen. secuencias
ANA,2
7SI.. 114, 324 aounctancia, 70

cala!itieo. V6Mo rii)Qz:wnas cl!opl9fl\1Co pequei'lo. Vase seRNA
RNA repica&as,l, 147 RNApol. Vtfase ANA polimera&as

RN$$a, 199
como contaminacin. 111
o. 283
oomo producto gi'IICo.

V6au prexlueto gnic:o
oomposlei6o de bases, 69
00 BaciiJus cortus. 238 Clegradacin del mANA. 286

Hl, 156 Hl. ~ntesiS oe tel<lmerot, 160
cromosmloo, 2
de b'ansferencia. Vase tRNA di'IQf'$iOO<f de ostn..cl\r.'ls. 70 en org.nulos, 70
es1abllldad. 280, 286
P. n . 283
PhyM, 238
Tt, 238 U2, 238 1, 199. 283

111, 283
estructl6a, 69
seal. Vase pptJOO seal subt.eiOmrica. 92
e&ttoctlla secundaria, 70, 73 f~.r~CionaL Vtiase ANA maduro

genmieo. s
ro (protefna), 255 anlogos eucaritioos, 25 7 Roben&on. V6asetran&locacln
tetomrice. Vease ~o
ttans. Vase 11ans secuenelacln, 218, 231
CIC QenOmaS, 241 de RNA.. 238
maduracin Vhse madlxacin

posttanscr1pcaot~al
rOCJamlna, 238
rodopslna, 334 rojo neutro. 130 romo. Vase ex.1remo romo ROS. especie reactiva de oxigeno ROX, 238 APA, 151, 360 rANA. 70. 76 5$, 70, 76, 80 5 ,8 $, 70, 76, 80 16$, 70, 76, 80 18S. 70, 76. so. 91 23$, 70, 76, 78, 80 28$,70, 76,78,90,91 285, como tra111$1)0Pliei3N.. 313 gonora.cin pot maCiurac:it:M\. 283 genes ele, 1 t 1
n\aduro. 245, 251, 275

mensajero. Vase mANA
didesolO. Vt:iase secuenclacln.

mtodo enzintlco en la bUsq.teda ele genes. 380 enzlmtica. varian1es. 238 mtodo en.nmtioo. 23S mkldo q\lmioo. 231
rMocondrial, 257
tmocondri$1, madur<'CIIOn. 284 nuClear OOterogooo. V6.1H hnFINA
node3r ~o Vso $nANA naCiet'lte, 247, 254 polladenilado. veasecola de poli(A) precul'$0f W.:t.so l)f'ORNA
ribOSOrrioo.
vease
por 1orminaeio CIC C3Ciona.

Vdase seeoet'ICiaein, mtOOO en.M'Itioo S/)()fgur'l, 240 secuenCial Vdase replicacin sedimentacin, 122 segregacin
vease rANA
secuenclacln. 238
tamao. 70 lif>O$, 69. 70 vanspone. 244, 290

ubicacin en 18 Q6Ua, 70
mec;li., 280 ANA polimerasa. 84. 24A &~lvaclf'l por et complejo de Inicio, 267 Cloroplscica. 2S 1 on 101 tratl$p()Sici(ln. 36& eSC)eeialzacion. 251, 265 inhibicin, 251 localizacin $\lbCtlutar, 251 milocondrlal, 251. 257 pausas. 256 prooorilk.l. 250 procatllk:a, enzima mrn!ma o
~
CIC: -.1010$. 218

ese eromoSootna$ y erQmtiCI~S.. 104. lOS. 218 segunOO cdigo gentk:o, 304 selecon Cle cl.,.las hibrielas.. 223 ele clones recorrbnantes, 213
f~pica, 214 negativa., t29
MEldltadn. 282
pollmerasas (J.Ie lo transcooen. 251

RT~PCR.
precui"SSIfeS de. 2S 1 195
S
saoo
~mniei(:O,
positiva. 129 semen. 120
$0rNConsef\tadOta.
120
V&se repllcaeiOn
<A~ellno, 119
sa!lentas 5 ' y 3' en los extremos Cle restriccin. 201
nl)cleo. 251. 254
saliva. m\lestra.s. 120 S&'lgor, 235
semklsconthJa. Vase replicacin sealizacin, tipo&, 4.20 separacin de clula$. 122 &ematlreonina ~nm. 327. 424, 425
iNDICE ANALfTICO
SSB
~311
467
V~ protetf\U <Je ut'lln a
1elrrloro
WlCO t.ado. 330

SlgliN
V.._ ANA "--~-.., ...

v..,.,...to<~n
-*
~
,....,..,..,.
hebra sencilla STS en mapa trSICO, 228 subdonaaon. 215 SI.,...._~ de a. ONApol t 147
suodiO oeucw.
~66,.83.87 demo611lCliOIJe~,.,... ,
y tf'rl.~~awc~.,"~'on!O . 160
~.,.,..
dlllu..on dtl DHA.
V.._ T,.,
enPCA 119
y~Waocln. l~
&NE n.c
,,,...,. "',..,..., drl fQ;IfoOCide_
...,..,.. """"""negaDYo. 67, 152

po$111JVO. 67
vease II(:'OC!17
GIIdO U18 .., .. PCR 188
Tt:R V. . . !tbnrt~Ma
""~ lf'ltwmofal
$ii'ICIHIS lt.~tta dll I)IOQfatfll. 3$8 Sit(Qfl'l), 416
...............
tis.tema end0mtmtlf8not0. 322
"""
311.313 CIO clonadO mulllplo. 207. 209 de testoocn. 1 99 de fe&toocln ..m~. 20SI
Aot~m.noaclloO.
de secuencia marcl:\dll
VHHSTS
p o peptl(ll!loo. )1 1' 313 SLl, 271
E o diO tahdtl 311 313 ~ unlcot. VMuSTS
Slol--t*M en I'IIDI'IC)IOOn 110
WIIP v... l)<*mOI'IIImO SNP SHP Vease Pdlloo.'Wno SNP snAHA. 7'0 25 l . 271. 280 ~ &afnlnO y U'oOI\ 282
66 $Yf)tflUO, 364 367 s.JI)OIX ido (li$ti'IU!3!a 357 suroo m;t.yor, 46, 48 vnin dt protcinas. 61 suroo me.nor, 46, 48 unin eJe pr'Oteinas. 267 survivlna$. 433 suecep~ l\lmOral 413 434 sustanaa H. VHse antgeno H wsbtucin. VBH6 mut.acin mtodo de preparacan del 'ltfVI I'9COfl'lblnamK, 210 SV40,210 ~ vease eoe:~~~>erue de
IUpclf~ .
y lelomersa. 160 -IOn <N le ~In. 157
<N la lrlducon. 314

Clt la lrsnacr~ln, 255 CIO la lranacf1l(li6n mttooordlal.
267
<Jopendlonte de p. 255 lnCIOpontllonle t 1). 255
PftmA1UI8 dlla lt&dUCCIOn, 351 tetra..da t la lradi.ICCIf\, 352
""""' ,
SCienOidllt
~odeoodOnet , 288 V~.UIIDta Ot 30 nm
-......"'_ --.
cla5111CaCIOf'l, 17$ deONA, 176
..............,
T
IOfmi!'IKio t cadena. Vase MCulr'ICIIICI6n enuntJCa *""Nido! 2S2 2SS t.ti"'""CJo:llldof. 189 ...,...,........ 189 235
su. 2$5
sur
255
........ 33&
... 80idll. 316
gll"'otrt'l
o..
214
tiPC latNIIO 1 ~ 28:l

TAF
vease tactore6 asoclaCIICIS
!ahctr'*"'*'. 223. 308 '~. 71 1ft~ .t03 404

letrald;O. 131 186
...
a TBP talasenwa.. 396 tallo, 70

TAM AA.238 tt\n(lcm, 109, 383
T VMNT
TF V..,_Jadorttdt
ttJnectlpcin TCB, 436 TGFIl 418
um.c~na
de ANA, 177 diSeno, 179
TATA.253, 265, 270
20
roeoooewniento 1)0( TBP, 267

lt\utomelia, 14
en modio HAr, 223

1 1\tltcJa, 132
lluoraacen!ot, 172,2.24
marca.-. 180
Oblenan po1 CIOI'II!ICin, 176 oblenan po1 PCA 176
rolatin con la mu1acin, 353

TJyS8Ch$ (en~ad (le), 350 395 TBP. V6as.! I)IOle;na ele utliOn a TATA. Vease proteM
llgante delleb'neiO 3TC Vease liamMJcllnl
tlmt<Jino qulnasa, 223

lll"'''lf''l 12 OlmtiO. 356, 359
para det:tatla anemia

IAICIIOII'I'It 313
prepatac.on, 175 .SIM&M, 183. 1&4 Slf'lltCIOII, 177 sopone IWO. unin. 171
~171
Telala&e, 99 tebnerasa. l47 158 auset'l()l, 160 00t1 11)01 oenees 158
IPCIM>'> 11 ~ r.tco Z/7

~con~r
_,,
.._,...
131 NOA 91 -72

lll ()NA
lf'l~dtftiiUIIIIdol
para diMCW 1r1 anem.a faleffon'rle 383 para t4tctat RFLP, 381, 313 para otol:* VNTFI 083 $PI* SP6 1n SAEBP, 432 SAP, 324
f'l'll!iC8I'IIS de IICCOl. y cancef. 160
'59
_..,.
TK
Un'WII ghc:ol 3S4 roper.c:~ df _3eO lntiOn 87 80 Sil VNnH

UI~GI9mSiyMay
lfWII'Irll ~ ':m. 425

v....,~ ql.'n8$ll
y Pfofiieoaccw oeUaf'. 160

~-87.91.9'2
~lento. ~IOMS. 92
T 166 tt1IIPCR 189

y cort~ill'lldo _, G~C. US$
tn vf<;klrt$ ele~.
157. 158 180 211
TW.IM
t~netla.J22 IOC)Oi~asa 66.
Sl1PA. ~5
rephcaCIOn. 157 secuencia, 159 slntesis.. 159 y ONA minis<Ull!e, 114 y ONA satlite, 113
84, 87, 151 ao 11po 1. tS2 on la lraMO'\pac)n, 254
1 opolog1t1
ea
1 0.11''1(1 Chtldlictl. 317
468
fNOICE ANALTICO ttansetlpei()tl tegulaeifl epi~IC& . 271 tegulaei6tl gen!liea. 264 regulacin por $01\alleS, 266
regulacin posltwa y negativa,
ln!n$p()(le
TR. VOOse!elomerasa. oomponen1es

lnlduocin, 2. 244, 245
caracleristJCas. 300 oonoodn espacial y te~al con la tran&e~in, 250 elongacin. V6ns. elOngacin
de 18 ttaduocin
266 togulacin posb'an&eripcional, 284

regulaCin y acoe:&ibilidad dol ONA.. 263 rogulacin, t.rminologia, 265 relacin con la oonttenS31ein del ONA, 250 sentido oonlratto en cada 1\eCf'a.
249 sustratos, 246 temWtacln. 256 tell'l*'ologta. 2.08, 249 unlOOd de, 252 y eucromculna, 250 y fibra de 10 nm, 250 tran&eripc;in inYef'&a, 2
transcri~ .
enorg!iea,. 31 S la$C$ o ~ai)U , 302 frecvoncia. 319

inhibiOotes, 316
tran&membrana., 323 V'C'Sicular. m ~r.~~n$C>O$a$a, 367 transposiCin, 367 11anspoen, 367 transversln, 347 lrastado de la mela, 182 trbol, estructura del lANA. 74
lriC01iodistrofia, 363
trifosfato. 10 lriplo hlioe, 60 lripkrte. VNse ood6n lripiQiOia, 94, 403 tripsina, 336 il"'hill:::iCin por anliripsina, 376 proteolisis dO la ONApoll, 147 tripsingeno, 336 triplOiat'IO. bbs(ntesls del'klente. 214 cttstosfato. 29 tri&omia. 403, 404, 406 001 cr(ll'l'l()$0m.a 13, 406 <let QrQtn()$01'1\8 18, 406 ctet ~ma 21. 345, 406 de cromosomas sexuales. 406 mecanismo, 405 tritilo, 179 tRNA. 10. 71 ftpecificidad PQt aminoikido, 71 estruetura lereiarla, 75
IniCio. vusc Inicio de &a lraduccion

macromolculas Implicadas, 300
regtAacln. 318<!20 resumen. 302. 315 sentiOO, 300

lasa de error. ':YJ7
termnaCin. 314
velOCidad. 318 trfico de proteinM. 322324
"""' elementos o factores,
$:uet!Cias, 266
VHH ANA POiimerm

tr~I)UtS&
265
inversa, 147, 244
VMse tami:Hn Golgi trM$Cripon. 2. 243. 245 as:imetria, 249 earactoristic\'IS oomp3r~ oon rupli<:acin, 248
en 1~ lransposicin, 368
dlil)idoros., 23
~PCR,196
oolaetores. 247
eoml)3raci0n entro procaolas y eucariotas, 250
oonexin -.paclal y tefT1)0!aJ oon la b'aduccin, 250

del gonoma mitC)()QI'I(t!ill. 257 direocin. 247 e intetl8$0. 250 elongaCin. vease elongacin ae la tr~in energtica, 246 enUnotogra. 246 ewpas, 252 hebras positiva y negativa. 24&
preparar c:ONA. 206 &eeoonciar ONA. 235 ~ see~iar ANA, 239 transcrita. Vaullebr'a b'anserita transcrito primano. VMse pre-RNA transdtA:ciOn do &eal. 417, 418,
pan~
isoaceptOt. 304 maduracin, 282 modelo mctecular, 75

nomonclatvra, 71 nUmoro de moi6W~s dif.,emos.. 297 papel ~adoren la traduccin, 269 polimernsa que lo transct't)e, 251 procursores de, 251 separacin del polipptido al ~erminar la tradl.lcein, 315 sil'l6nimo, 304 lANA-. 306
420
m~a g100e1, 421
ttar'l$etter\1lcaeln. 281, 303 ttat~Sfeocln, 212
ttans:!etasa leO'nlnal. 206 ttanefetencfa tras electrofofesis,

111 , 173 transferrina, receptor de, 319
trans~cin ~eriana, 211.
hebras codificante y no (;Q(Iifieame, 248 helbtt\$ f#l stnti<:So
y anti$0ntidO, 248
Mbras in10r'I"Nltlva y
no lntormattva, 248
Mbr'as molde
y no molde, 248
21 2 ltati$10$10rllaCIOn, 281 transluSin. compatibilidad, 370 transiCin, 347 ttatlsiOcadn de protatnas del ci\0601 al retra~o endopt&mico,
tRNA,.- y tAN!\-. 306

complejo lernario con e1F2 y GTP, 309, 310 IRNA niJCioolietlfransttt~s;a. 283
nebras tra.nscnta y no transcrita..
324
de Robertson, 409 del ribo$oma. 312, 313 1)3pol de las eatetlinas. 337 redproca. 409
248
lnhibidores, 258 lnloo. Vtiitse inicio do
1~
lrolobia.sto. 119
~. (Ort)oxiacln,
3:27
IIM$CfCXi6n
mecanismo de la teaocln. 247
Otlgen.
vease origen
rrans10casa Vase eEF-2 y v8se rbolorina

lfan&peptidacin, 312, 313 transpeptidasa. VMse pep!idiltransfornsa
llat'l$1)1)110 a trt1v6$ do poros nUCleares., 244 do mRNA, 318
ttq)O(lina T, get1 y ayuste allematlvo. 286 TFIPI, 214 TRT. Vasttlelomerasa.

compor~ente:s
de ltansc~ln promo1or. voose pron'lotot reaccin comparada con replicaCI6n. 247 reaccin global, 246 reaccin inicial, 2S4
ITO.A. 363 rumor. VtMu I.Mlbin C6noec'

l"'"'al9'W:>.414
primario benigno, 413
regulacin. 261
regulacto, 323
secundario, 413,414 wmorognesls., A 1 3
iNOICE ANALfnCO
rungsteno. rmcroesfetas paro clonacin. 212 Tumer (~lndrome de). 404
469
valOr vnrin en e CIClO oeltAat,
VISC061dad, 34
variacin en la desnallJra!izacin
C1e1 DNA. 165
100
u
U1, U2. U3, U4, OS. U6. V.Mse
snRNA y vttase st~RNP

VBF. 271 ubiCllcin del nmir'loaeiHRNA. 312
ubiQuilin;<~ , 341
varial>ilidacl gentica V6aso polimorfismo va&QUiariUlcin. 414

ARSICENfTEL, 211 BAC. 211 dasltlcaC*Sn. 208 e6miclo, 210 de clOnacin, 203, 206 de elq)lesln, 206, 215
<Mamna B,.. V6-ase cobatamina vilamina C. 328 vi1amitla K. 327

VNTR. 221. 383
w
WAF1 (ptOteina). 426 watson y Ctiek. 2. vease tsmDJen enlaCe oe hidrgeno mOdelo pata el DNA, 39
Westem. 173
vbiQuilina pro!ell'lll llgasa. 34 1 ubiQuilinacin. 342 UCE, 271 UDPgatactosa. 332 VDPgat&CIOSa epwnetasa. 374
ese ln~in. 20&. 210
VOPiJIUC0$1t. 332
VOPfii!U00$8 Qit0'06!0tllasa. 374 UDPNaoelllgalaciOSamlna. 332 UDP-n..at:e1!1g!uoosamina, 332 uttracentnlugacin, 136 isop(cnica.. 67 ultravioleta. Vtiase radiacin unidad de codificacin. IM\81\0, 268 <So f(:pOtiein. vease DNA repet!INO <le teJ)Iicacln. vease rE!J)IIcn de transc~in. 252 de transcril>Cin mi10001'1()1al, 258 \ric:i'90CiOMI. VdaU ~~~n triYersa!idad. vease OOd!go gene.tlco wacilo, 12 reconoc:wnierrto en el ONA. 362 wacilo-ONA g!ic:osiua. 362 urea. 134. 166. Hl9 urdla'O. 27 undilil1ransferua. 374
de propagacin, 206 de sustitucin. 210 plasmtdico. 209 preparaCIn, 207 propagacin. 209 tamao dol qerto itdmilidt),
..... 208
comparado con Southern y Northem, 173
X
xamina, 13 como rodado de la
desamin~CIOn. 353
virieo, 210, 212 YAC, 211 vellosidades corinlcas, 120 velocidad de sedimen1aC*Sn. 122,
124
""'
,ccrodefmi3 pgmentou o de Kaposi, 360, 363 Xgat. 186. 214 XP. V.ase xerodetmla pigmen.osa
XPA.360
vesiculas. 323 viabilidad. 129 vida media de ptoternas. 340 del ANA. 286 VI H. Vaso virus de 101 inmunodoliCionci<t humana viroid&:S, 78 virus. V6ase ramDMtt l!Eicterilagos ader.ovlrus., 431
c&pi(Sa, 4
X.PC, 360 XPF, 360 XPG. 360
y
VAC, 209, 211
yoduro de propidio, 130. 131 VV1 . 270
z
Z31eiUlllWI. 23
urdn, 20
V
vai!HANA slntelasa. OOtTeocin de errores, 307 valor C. 6. 94 06 vatlaciOn en la tecundacln. 1 vatlacln en la mebsi~. 104
Cle .18 inmunOdetielencls ttumMa. 23 e1e1 mosaico e1e1 labaoo. 2 Clet papiloma, 431 e~leo como vectet. V6-asevector virioo
re~tes,210
ZONA. 55
mOdelos moleCulares, 55 zeiOSIS, 432 zidOINdlna, 23 zlgzag dispo5lCin en el ZONA. 56 zimgenos. 336 zinc Va.so dedo de znc
SV40, 431
tumorale6, 431
U~I"'VI'II""'1"'\.
V~I~I"""I,"",I"""-
1.1""
,-
-_
_-
TECNICA DE MAPEO MEDIANTE HiBRIDOS DE CELULAS SOMATICAS

tres posibilidades de fusion: Celulas humanas de distinto tipo (linfocitos perifericos en cultivos a corlO plazo, fibroblastos, lineas celulares transformadas, cultivos linfoblasticos, lineas celulares fetales, etc.) Celulas de roedor (normalmente, raton 0 hamster) en cultivo 2IF46 2n+2IF86
Ci)
cQ)
2IF40 (raton)
"Fusion eelular":
determinadas condiciones experimentales inducen la union de dos celulas (citoplasma comun, nucleos independientes)
Las celulas se cultivan repartidas en pocillos y se diluyen progresivamente hasta que en cada pocillo quede un minimo numero de elias. De este modo, al final se consigue que cada pocillo contenga una sola celula, que dara lugar a un clon (colonia formada por celulas geneticamente identicas)
"Seleeeion":
cultivo en un medio que solo permite el crecimiento de las celulas hibridas (p.ej., medio HAT, descrito en figura aparte)
Selecci6n y Crecimiento en cultivo
En la primera mitosis las dos membranas nucleares se disgregan y en cada celula hija los cromosomas se agrupan ya en un unico nucleo
_~0
4 clones,procedentescada uno de'una celula hibrida distinta(cadauno conservacromosomasdistintos)
Sin embargo, las celulas hibridas son inestables y en las sucesivas mitosis van perdiendo la mayoria de los cromosomas humanos, con 10que el cIon presente en cada pociUo retiene aleatoriamente uno solo 0 unos pocos Coleccion 0 panel de clones de celulas hibridas que han retenido solo unos pocos cromosomas humanos. A partir de cada uno se pueden establecer posteriormente lineas celulares estables en cultivo
@@@@
(Cariotipo ){}
;
{}
{}
{}
\..
Se determina el cariotipo para averiguar que cromosomas humanos estan presentes en cada cIon (se distinguen de los del roedor por su tamano y patron de bandeado). Tambien pueden localizarse los cromosomas humanos mediante algun marcador, por ejemplo una sonda para la secuencia Alu, que se distribuye uniformemente por todo el genoma humano pero esta ausente en el de raton.
(Deteeeion ){}
{} {} {}
'En paralelo al cariotipo, se detecta la presencia en los clones del gen 0 marcador de interes: a) En el caso de algunos genes, por analisis de la funcion de sus productos proteicos (p.ej., actividad enzimatica). b) En general, mediante tecnicas de hibridacion (in situ 0 Southern) con sondas especificas (si se conoce la secuencia del marcador) 0 con el propio marcador como sonda (si no se conoce su secuencia), 0 por PCR con cebadores especificos para el marcador.
Qnterpretaeion ){}
{} {} {}
~
A partir de los resultados (positivos y negativos) de cada clon en la deteccion y los datos aportados por la determinacion del cariotipo, se deduce en que cromosoma humano se encuentra el marcador (gen 0 region de DNA de interes).
228
GEN6MICA.
OBTENCI6N
DE LOS MAPAS GENETICO Y FIsICO DEL GENOMA
deduccion del mapa se puede facilitar si, en lugar de la doble digestion simultanea, (}) seLahace la digestion con ambas enzimas de forma sucesiva, extrayendo del gel cada uno de los fragmentos de una digestion simple y tratandolo despues con la otra enzima
se extraen del gel por parado los fragmentos y se digieren con "B"
A3 A4
II kb
5,5 kb 5 kb 1,5 kb
IOkb
5,5 kb 5 kb 1,5 kb 1 kb
10 kb 5,5 kb 5 kb
1,5 kb
1 kb
La aparici6n de 2 bandas indica que hay I sitio de restricci6n para B y esta en el fragmento A I, de II kb (dando 10+I)
La aparici6n de 2 y 3 bandas indica que hay I sitio de restricci6n para A en el fragmento B I (dando 10+5) y 2 sitios en el B2 (5,5+ 1,5+ 1)
La deduccion del mapa (del caso 1) se puede facilitar tambien si se dispone de sondas que hibriden con el DNA en estudio
anal isis electroforetico de los fragmentos de restricci6n e hibridaci6n Southern con las dos sondas:
15 kb
11 kb
Al 8 kb A2 A3 A4
--* *'-
Bl B2 10 kb 5,5 kb 5 kb 1.5 kb
--*
A_
ABI AB2 AB3 AB4 AB5
I I 0 1,5 .A
5,5 7
18
A
23
A B
--l
el fragmento A4 forma parte del B2; Al YAB 1 forman parte de B 1
(sigue sin resolverse
U L.
-+
la doble soluci6n)
Finalmente; debe resaltarse que, puesto que un mapa de restriccion no identifica la posicion de genes, su utilidad es tanto mayor cuando mas pueda ser relacionado con un mapa genetico. Para establecer esta relacion es necesario encontrar mutaciones que afecten a los sitios de restriccion y determinar su Iigamiento con alteraciones que afectan a genes, tales como las que producen enfermedades u otros cambios fenotfpicos. Ello permite situar ese gen dentro del mapa de restriccion (y otros que puedan haberse localizado respecto a aquel en un mapa genetico); este es un ejemplo de como se complementan los diversos abordajes de mapeo para ir construyendo el mapa completo del genoma.
17.3.2.3
Mapas fisicos de STS y EST
Cada vez con mayor frecuencia, para la construccion de mapas fisicos se utilizan marcadores no genicos (pag. 218). Dos de los tipos de marcador mas extendidos 10 constituyen los lIamados "secuencias de referencia", "sitios marcados unicos", "sitios de secuencia marcada" 0 STS (sequence-tagged sites) y las "etiquetas 0 marcas de secuencias expresadas" 0 EST (expressed sequence tags). En ambos casos, se trata de regiones cortas del genoma (50-500 pb) que se han podido secuenciar y para las que se han desarrollado cebadores de PCR (tema 15), 10 que permite su amplificacion y consiguiente deteccion. Se llama STSs a los marcadores encontrados en el DNA genomico, mientras que los ESTs se identifican en moleculas de cDNA, resultantes de la transcripcion inversa de mRNAs. En consecuencia, los STSs son marcadores que sirven para elaborar mapas fisicos de todo el genoma, y los ESTs solo para mapas de la parte del genoma de mayor interes aplicado, los genes responsables de la sintesis de proteinas. Entre otras cosas, estos ultimos se han.empleado para estimar el numero de genes del genoma humano (pag. 240). A pesar de que la posicion de estos marcadores en el genoma se desconoce inicialmente, se puede usar una coleccion de ellos para caracterizar los clones componentes de una genoteca (pag. 216) -genomica en el caso de los STSs, de cDNA can los ESTs-, mediante la deducci6n del so/apamiento de clones, 0 construccion de mapas de
conl/gos.
~1:"'Ut:I"",",I"'''''IUI'''
U&;;;;L \,;U;;'."'VIIII"'\
r n.v I
1-"" I "'''"' """"'1''''''''''''
8.2.1
arcaje de una hebra del DNA

el de 5', de la as
ormalmente se parte de un DNA de doble hebra, generalmente obtenido por restriccion de uno mayor, aunque metodo puede aplicarse igualmente a un DNA de hebra sencilla. Esta primera etapa consiste en el marcaje de uno los extremos de cada hebra. Lo habitual es emplear polinucleotido quinasa y ATP radiactivo para marcar el extremo aunque pueden tambien emplearse fluorocromos 0 marcar el extremo 3'. En el marcaje radiactivo es comun el uso 32p, pero por su elevada energia produce seiiales dispersas y hace dificil distinguir bandas adyacentes en electroforesis. Otros isotopes de menor energia, tales como 33p 0 358 (este sustituyendo a un oxigeno), dan band mas nitidas, aunque precisan mayor tiempo de exposicion.
' 5 P _______________
DNA de doble hebra
IOH 3'
3' HO----_..,.~_~~~_______----IP polinucleotidOqUmasa~ ' *P________________ ~ 5 3' HO----------------'P* enzima derestriccion que corte enunsolopunto 5' *P 3' HO----------P ,OH3' 5' 5' P
del fago T4 - "---.-
5' 'OH 3' 5'
*P-P-P-A ([y_J2p]_ATP, [y_JJp]_ATP 0 [y_J5S].tioATP)

I P-P-A(ADP) + p.
IOH3' 5'
3' HO-------IP*
-==C
Separaci6n de ambos fragmentos (por electroforesis) y secuenciaci6n por separado. Si el DNA de partida fuese de hebra sencilla, habria bastado con marcarlo y no se precisa separaci6n alguna.
Al ser el DNA de doble hebra, resultan marcados los dos extremos. Deben separarse ambos, de 10 contrario se secuenciarian ambas hebras a la vez y el resultado no seria interpretable. Una forma de separar ambos extremos es por desnaturalizaci6n y aislamiento de cada hebra. Otra forma, comun, es cortar el DNA y continuar con uno de los fragmentos, que ya s610 tiene un extrema marc ado.
18.2.2
Modificaci6n
de las bases y fragmentaci6n
del DNA
es conseguir fragmentos de conocido. De esta forma, la con tratamientos quimicos
Esta es la etapa caracteristica del metodo quimico de secuenciacion. EI proposito DNA de hebra sencilla, marcados, de lengitud variable y que terminen en un nucleotido longitud de cada fragmento indicara la posicion de ese nucleotido. Ello se consigue independientes que producen esos fragmentos.
CD..............
.~ ~ ~ ~
TI T2 T3 A T4 T ~ Molecula origina,l, para *p las 4 ahcuotas
la muestra de DNA
Aunque el DNA sigue siendo de doble hebra, s610 una esta marc ada y es la unica que se detectara. Por ello, a partir de aqui se representa s610 la hebra marcada, por simplicidad. Secuencia ejemplo:
p:~e~i~i~~~:~o~as
y cada una rectbe un tratamiento quimico diferente \ C GAT p
5' *pATCGATTCTCGGAGTCACACG
3'
111111
p p p p p A T C A P P P P P P hidr61isiscon piperidina o aleali A T C
Para facilitar la secuencia de reacciones, los lavados para retirar reactivos, etc., en la practica se puede adsorber el DNA sobre un papel especial, del que se eluye al final. Se han desarrollado 4 tratamientos para eliminar separadamente G, C, las bases purinicas (G y A), Y las pirimidinicas (C y T). En todos los casos, se rompe el enlace Nglicosidico, dejando un sitio abasico (apurinico 0 apirimidinico) y manteniendo el esqueleto fosfato-desoxirribosa-fosfato. Eliminaci6n de guanina La guanina se metila am6nico 50 mM. La tratar con piperidina (en alicuota TI): con dimetilsulfato 1% Y formiato metilguanina resultante se pierde al en medio basico.
"
Q)
una base, por ej., G.bajo el *p tratamlento TI
tratamiento especifieo para eliminar eada base
m:d~~~~~a en
111111
P P P
"
Eliminaci6n de guanina y adenina (en alicuota T2): Se realiza una despurinaci6n en medio acido, concretamente f6rmico al 80%. Eliminaci6n de citosina (en alicuota T3): Con hidroxilamina 4 M a pH=6, 0 con hidrazina yalta concentraci6n salina. Eliminacion de citosina y timina (en alicuota T4): Con permanganato potasico 0, I M, 0 con hidrazina sin sales. Hidr6lisis: A continuacion, en los 4 casos se consigue la ruptura de los enlaces fosfodiester a ambos lados del sitio abasico, generando dos fragmentos polinucleotidicos (solo uno de ell os marc ado) y la desoxirribosa.
Q)
2
marcado, termin~ ~n el P nucleottdo anterior a G
:~~~::r~,s; 111 + pJpJp, ... *

+
desoxirribosa (eorrespondiente al nucleosido euya base se ha eliminado)
METODO QUiMICO DE 5ECUENCIACION
DEL DNA
233
Es importante resaltar que los cuatro tratamientos de eliminaci6n de bases se deben realizar restringiendo el :iempo de reacci6n y las concentraciones de reactivos, para evitar que se escindan todas las bases de un tipo jeterminado presentes. 5610 debe perderse, aleatoriamente, una de las bases en cada mohkula de DNA (del tipo :orrespondiente al tratamiento aplicado). De esa forma, el resultado es una mezcla de moleculas de DNA modificadas 3n distintos puntos.
Resultados de los 4 tratamientos para la secuencia ejemplo: 5' *pATCGATTCTCGGAGTCACACG
3'
mezcla de moleculas de DNA resultante de la reacci6n en condiciones limitantes (r representa la desoxirribosa en el nucle6tido abasico):
*pATCGATTCTCGGAGTCACACr *pATCGATTCTCGGArTCACACG *pATCGATTCTCGrAGTCACACG *pATCGATTCTCrGAGTCACACG *pATCrATTCTCGGAGTCACACG *pATCGATTCTCGGAGTCACACr *pATCGATTCTCGGAGTCACrCG *pATCGATTCTCGGAGTCrCACG *pATCGATTCTCGGArTCACACG *pATCGATTCTCGGrGTCACACG *pATCGATTCTCGrAGTCACACG *pATCGATTCTCrGAGTCACACG *pATCGrTTCTCGGAGTCACACG *pATCrATTCTCGGAGTCACACG *prTCGATTCTCGGAGTCACACG *pATCGATTCTCGGAGTCACArG *pATCGATTCTCGGAGTCArACG *pATCGATTCTCGGAGTrACACG *pATCGATTCTrGGAGTCACACG *pATCGATTrTCGGAGTCACACG *pATrGATTCTCGGAGTCACACG *pATCGATTCTCGGAGTCACArG *pATCGATTCTCGGAGTCArACG *pATCGATTCTCGGAGTrACACG *pATCGATTCTCGGAGrCACACG *pATCGATTCTrGGAGTCACACG *pATCGATTCrCGGAGTCACACG *pATCGATTrTCGGAGTCACACG *pATCGATrCTCGGAGTCACACG *pATCGArTCTCGGAGTCACACG *pATrGATTCTCGGAGTCACACG *pArCGATTCTCGGAGTCACACG
(se representa s610 la hebra marcada)
nQ de nuele6tidos en eada fragmento mareado:

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r
~
Tl
hidr61isis
TI'
*pATCGATTCTCGGAGTCACACp *pATCGATTCTCGGAp + pTCACACG *pATCGATTCTCGp + pAGTCACACG *pATCGATTCTCp + pGAGTCACACG *pATCp + pATTCTCGGAGTCACACG *pATCGATTCTCGGAGTCACACp *pATCGATTCTCGGAGTCACp + pCG *pATCGATTCTCGGAGTCp + pCACG *pATCGATTCTCGGAp + pTCACACG *pATCGATTCTCGGp + pGTCACACG *pATCGATTCTCGp + pAGTCACACG *pATCGATTCTCp + pGAGTCACACG *pATCGp + pTTCTCGGAGTCACACG *pATCp + pATTCTCGGAGTCACACG *p + pTCGATTCTCGGAGTCACACG *pATCGATTCTCGGAGTCACAp + pG *pATCGATTCTCGGAGTCAp + pACG *pATCGATTCTCGGAGTp + pACACG *pATCGATTCTp + pGGAGTCACACG *pATCGATTp + pTCGGAGTCACACG *pATp + pGATTCTCGGAGTCACACG *pATCGATTCTCGGAGTCACAp + pG *pATCGATTCTCGGAGTCAp + pACG *pATCGATTCTCGGAGTp + pACACG *pATCGATTCTCGGAGp + pCACACG *pATCGATTCTp + pGGAGTCACACG *pATCGATTCp + pCGGAGTCACACG *pATCGATTp + pTCGGAGTCACACG *pATCGATp + pCTCGGAGTCACACG *pATCGAp + pTCTCGGAGTCACACG *pATp + pGATTCTCGGAGTCACACG *pAp + pCGATTCTCGGAGTCACACG
20
13
11 10
3
"G" 20 18 16
13
hi"'oli,i, ~ T2' "G+A"
T2
12 11 10 4
3
0 19 17 15
9
hidr61isis
"e"
T3'
7 2 19 17 15 14
9
~
T4
hid,oli,i, ~ T4' "C+T"
8 7 6 5 2 1
.~
:NZIMOLOGiA
DE LA TRANSCRIPCION:
MECANISMO
DE LA REACCION
RNA POLIMERASA
Observese finalmente que al ser la cadena de RNA nuevo complementaria a la hebra de DN~ molde, Iparecen como un hibrido RNA-DNA. Como se vera, este desaparece a medida que progresa la sintesis, hasta r II RNA en forma libre al final de la misma.
19.2.2 Orientaci6n de la secuencia
La posicion de las bases en cualquier gen a region de DNA rE31acionadacan el proceso de la transcrrpCion siempre ie refiere a la hebra no-molde, codificante. Par convenio, su orientacion es la del sentido de transcripcion. Los lucleotid_os ~!il~sta hebra se numeran a partir del Runto de inicio de la !!:anscripcion, al que se asigna el valor +1 positivo) y se denomina origen de transcripci6n. No -existe el nucleotido numero cero. Los situados hacia el extremo~ se dice que estan "corrlente arriba" y se indican con numeros negativos consecutivos (-1, -2, etc.). Los r:!ucleotido~ ;ltuados_elLeLsentido_deJa transcDPclon, hacia el extremo 3', estan 'corriente abajo" y se indican con !lumeros ~lV9~ consecutivos (+2, +3, etc.). ---
origen de la transcripci6n
"",.,nd,, ",orri,n"
numeraci6n de la cadena:
""b'' + ",.,nd"
"oorri,n"'ba;o"
G B EEE B
5' 3'
B3'
hebra codificante
DNAJ
\
5'
19.2.3 Caracter asimetrico
A diferencia de la replicacion, donde las dos hebras se copian simultaneamente (caracter simetrico; pag. 153), la ranscripcion nunca se produce de forma slmultanea en las dos hebras. AI transcribirse cada RNA a partir de una sola Ie las hebras del DNA, se dice que el proceso es asimetrico. Ademas, tam bien al contrario que la replicacion, la ranscripcion de distintas regiones del DNA no se reaTizade forma coordinada en todo el genoma, sino independiente lara cada gen. Dado el sentido unico 5'~3' de la sintesis, la transcripcion ocurre en sentido contrario en cada hebra.
DNA
.....3'----------------5'
transcritos de RNA formados a partir de una hebra del DNA
...
3'
5'
transcritos de RNA formados a partir de la otra hebra del DNA
La informaci6n para la sintesis de los distintos RNAs de la celula esm repartida entre ambas hebras del DNA. De este modo, unos RNAs se transcriben empleando como mol de una de las hebras, mientras que otros se transcriben, en senti do opuesto, sobre la otra hebra.
A pesar de que las dos hebras nunca se transcriben simultaneamente (10 que se pretende indicar can el adjetivo IsimtMrico), en algunos casos las dos hebras de una region de DNA se transcriben de forma independiente y no imultanea, portando mensajes geneticos diferentes; se dice entonces que contienen dos genes solapantes (pag. 246).
5'
A
gen I hebra codificante 2 B 3
>
c
4
genes no solapantes hebra molde

3
B
3'
3'
hebra molde
5'
A
gen I hebra codificante 2 B
>
<
Glles sOlapa~
C 3
hebra codificante gen 2
hebra molde
B
3'
3'
2A hebra codificante
hebramo< gen 2
5'
I
264
CONTROL DE LA EXPRESION GENICA: PRETRANSCRIPCIONAL
Y TRANSCRIPCIONAI
Un factor impor;tante en los mecanismos b y c anteriores es la acetilaci6n de las histonas de la particula Existen enzimas en la celula que unen grupos acetilo a los residuos de lisina de las histonas, reduciendo asi positiva de estas. proteinas, 10 cual probablemente disminuye su interacci6n con el DNA. Varias de estas acetiltransferasas son factores de. transcripci6n (en especial, coactivadores, pag. 270). Existen igualmente desacetilasas que catalizan la reacci6n opuesta de desacetilaci6n.
nuclec la carg; histon: histon:
Histonas no aeetiladas
histona
Histonas aeetiladas
--------....
acetiltransferasas histona desacetilasas
._(Lys)-NH'i=D-CHj
~
A pH fisiol6gico, los gropos amino primarios de la cadena lateral de lisina estin protonados. La existencia de multiples Lys y Arg en cada histona les confiere fuerte carga positiva, base de su interaccion con el DNA La acetilacion de las lisinas produce grupos amida, que no se protonan a pH fisiologico. Las histonas pierden asf cargas positivas. Como consecuencia, la cromatina se descondensa mas facilmente.
Bajo grado de acetilaci6n: Cromatina mas condensada, transcripcionalmente inactiva, Genes reprimidos, no se expresan
Alto grade de acetilaci6n: Cromatina menos condensada, transcripcionalmente activa, Genes activos, se expresan
Los genes activos, aquellos que se estan expresando, corresponden a regiones con histonas acetiladas, mientral que en las zonas de cromatina transcripcionalmente inactiva las histonas no estan acetiladas. Como ejemplo, E cromosoma X inactivo en la mujer, en forma de heterocromatina (pag. 87), esta hipoacetilado, indicando que esta form de las histonas es un requisito para la maxima condensaci6n de la cromatina, mientras que el otro cromosoma) transcripcionalmente activo, tiene un grade de acetilaci6n normal.
20.3
REGULACION GENETICA DE LA TRANSCRIPCION
EI control de la transcripci6n debe describirse hoy dia en' relaci6n con los dos componentes implicados en I estructura molecular del QNA en organismos complejos: los cuatro nucle6tidos que forman la secuencia (regulaci6 genetica) y los grupos metiloincorporados al DNA (regulaci6n epigenetica).
EI mecanismo de control que se describe normal mente, la visi6n tradicional de la regulaci6n de la transcripci6n, s' basa en el componente genetico, la secuencia del DNA, identica en todas las celulas de un organismo determinadc Efectivamente, la expresi6n de la mayo ria de los genes eucari6ticos se controla en el inicio de la transcripci6n, po mecanismos conceptual mente muy similares a los encontrados en bacterias. Esta regulaci6n se centra en la interacci6 de los promotores con los factores de transcripci6n (TF). A fin de simplificar nuestro estudio, se prestara atenci6 preferente al control por promotores y TFs de la sintesis del mRNA por la RNApol-lI, es decir, la transcripci6n de genel de clase II. Mas adelante se describira brevemente el control de la transcripci6n de los genes de c1ases I y III.
20.3.1
Elementos q~e actuan en cis y trans como reguladores de la transcripci6n
Debido a la magnitud del genoma eucari6tico, el numero de unidades de transcripci6n es mucho mayor que e procariotas. Ademas, cada una de elias esta controlada por varios promotores, con 10que en total el numero de estos e: aun superior (decenas 0 centenares de miles de promotores en un genoma). Es decir, las regiones promotoras estal mas extendidas y tienen mas elementos de control en eucariotas que en procariotas.
Un promotor 0 secuencia promotora es una regi6n de DNA que regula el inicio de la transcripci6n de un ger Corresponde, por tanto, a 10 que se ha denominado regi6n reguladora del gen (pag. 245). Actualmente se los suel, lIamar tambien "factores que actuan en cis", 0 'factores cis", simplemente por encontrarse en la misma molecula d DNA cuya expresi6n regulan. Existen numerosos promotores, diferentes para los genes de las clases I, II Y III, asi com algunos de ellos distintos para cada gen.
Una caracteristica de la transcripci6n eucari6tica es que su regulaci6n se debe a la afinidad especifica por 10 promotores de ciertas proteinas denominadas factores de inicio de la transcripci6n, 0 simplemente factores d4 transcripci6n (TF). A cada promotor se puede unir un numero variable de factores de transcripci6n, que actua favoreciendo 6 dificultando la uni6n y la actividad de la RNApol, 0 de otros factores de transcripci6n y, en consecuenci~ determinando la posici6n y la eficacia del inicio de la trans,cripci6n. Por tanto, los TFs tienen mas responsabilidad que I:
268
CONTROL DE LA EXPRESION GENICA: PRETRANSCRIPCIONAL
Y TRANSCRIPCIONAL
Factores de transcripcion
J- -50
J- +1 J- +10
J- +30
~Z>
lFIIA lFIIB .
TBP (30-38 kDa) se une al surco menor en la caja TAT A, cubriendo unos 10 pb. La asociacion de varios TAFs con TBP constituye el factor D (700-800 kDa), que cubre unos 35 pb .
EI factor A se une corriente arriba al factor D, posiblemente estabilizando su union al DNA.
A continuacion se une el factor B, corriente abajo del factor D. Parece definir el sitio de inicio, atrayendo a ella RNApol-II.
_lFIIF
( RNApol-II )
Entonces se une el factor F, formando un complejo con la polimerasa. Aumenta la afinidad de esta por el promotor y desestabiliza su interaccion inespecifica con otras regiones del DNA.
.
lFIIE
La union consiguiente del factor E, que interacciona con la RNApol-II, modula la actividad de TFIIH y posiblemente favorece la desnaturalizacion del promotor. En este punto, el complejo cubre aproximadamente entre -45 y +30 . Finalmente, se une el factor H, formado por multiples subunidades, que separa las hebras por su actividad helicasa (y posiblemente otro factor TFIU). EI conjunto se denomina "complejo de preiniciacion" y permite que la RNApol-II comience a transcribir el DNA ... Tras incorporar unos 10 nt al RNA naciente (fase de inicio ), la fosforilacion del dominio CTD de la polimerasa por la actividad proteina quinasa del factor H hace que la DNApol II se libere del complejo y comience su avance a 10 largo del DNA (elongaci6n).
. &&lFIIH
f'"
..
--0
RNA
LOL
-IVI"'UUI'V-\\"IUI'I Ut::L 1'(1'1'" U t'I'(U\"t::;)"'IVIlt::1'I1 U t'U;) I t<AN::j\.I'(It'''''IUNA
Primeramente, se escinde el transcrito primario en el extremo 5' del intron, mediante un ataque nucleofilico del 2 OH del adenilato del centro de ramificacion. Quedan asi'unidos ambos por un enlace fosfodiester atipico 5'-2', y s Iibera el exon 1 con un extremo libre 3'-OH . A continuacion, se escinde el centro de ayuste 3', por ataque nucleofilico del extremo 3'-OH libre del exon 1, con I que quedan unidos los dos exones y el intron se libera con su extremo 3'-OH libre y su extremo 5' formando u lazo (en ingles lariat; curiosamente derivado de la palabra espanola "Ia reata"). En este, la adenosina del centro d ramificacion esta enlazada simultaneamente a 3 nucleosidos, por sendos enlaces fosfodiester en sus posicione 2',3' Y 5'. EI intron en lazo se degrada luego rapidamente.
Como se puede observar, en ambas etapas se escinde un enlace fosfodiester a la vez que se forma otro, e sendas reacciones de transfosforilacion (un tipo de transesterificacion). Como consecuencia, las reacciones transcurre sin gasto energetico apreciable, no hay consumo de ATP. Sin embargo, si que se requiere hidrolisis de ATP para E ensamblado previa del ayustosoma. Tipos, tamaiio snRNA U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U11 Tama.no (nt) 165 188 210 142 116 107 65 131 y funci6n de los RNAs nucleares pequeiios (snRNAs) mutuas)
Funcion de la snRNP respectiva (U1. U2. U4. U5 Y U6 participan en el ensamblado del ayustosoma por interacciones corte y empalme: reconoce y se une al extremo 5' del intron corte y empalme: se une al centro de ramificacion, 10ace rca al centro 5' procesamiento del pre-rRNA
corte y empalme: inicialmente asociado con U5 y U6, acerca U6 al sitio 5' corte y empalme: se asocia inicialmente con U4 y U6; se une a ambos extremos del intron corte y empalme: asociado inicialmente con U4 y U5; parece que participa en la catalisis procesamiento del extremo 3' de los pre-mRNAs de histonas de pre-mRNAs
terminacion y poliadenilacion
(*) corresponden
a los snRNAs de mamiferos; en levaduras son de 2 a 10 veces mayores
21.3.3.5
Otros tipos de intrones
La descripcion anterior corresponde al proceso de corte de los intrones de genes de mRNA eucarioticos. Exister ademas, otros tipos de intrones, en funcion de su ubicacion en distintos genes y de caracteristicas concretas dE mecanismo de maduracion. Se c1asifican en 4 tipos:
Grupo I: Incluye los intrones de algunos genes que codifican transcritos primarios de rRNA (nucleare! mitocondriales y de cloroplastos). Su procesamiento requiere, como cofactor externo, un nucleosido 0 nucleotido d guanina (guanosina, GMP, GDP 0 GTP; su grupo 3'-OH actua como nucleofilo). EI proceso de corte y empalme n utiliza ATP como fuente de energia.
Grupo II: Aparecen en genes de mitocondrias 0 cloroplastos que codifican transcritos primarios de mRNA. N requieren cofactor externo, sino que utilizan el 2'-OH de un residuo adenilato del propio intron, produciendo intermedio en lazo (pag. 281). En este sentido, se asemejan mas al mecanisme de corte y empalme recien estudiado, aunqu difieren por no existir ayustosoma. AI igual que el grupo I, no necesita ATP como cofactor energetico, yexperimenta auto-corte y empalme (auto-ayuste), catalizado por el propio RNA en lugar de por enzimas proteicas clasicas. Esto RNAs con funcion autocatalitica constituyen uno de los casos de ribozimas (pag. 77).
Grupo III: Es el mas numeroso, con los intrones presentes en la mayoria de los genes nucleares eucarioticos qu codifican transcritos primarios de mRNA. Su proceso de corte y empalme, el que ya se ha estudiado (pags. 280-282 sigue el mismo mecanismo de formacion de lazo que los intrones del grupo II, pero catalizado por la ribonucleoproteinas componentes del ayustosoma). Grupo IV: Se encuentran intrones de los grupos I y II. en ciertos genes de tRNAs. EI corte y empalme requiere ATP, a diferencia
de 10
21.4
PROCESAMIENTO
DE LOS RNAs RIBOSOMICO Y DE TRANSFERENCIA
Los rRNAs y tRNAs tambien sufren maduracion postranscripcional, tanto en procariotas como en eucariotas. pesar de su importancia, no se expondran con detalle sus caracteristicas; por razones didacticas, se consider suficiente como modelo la maduracion del mRNA. En procariotas, un solo transcrito primario da lugar, por varias reacciones de corte catalizadas por endonucleasa (RNasas), a los tres rRNAs y uno 0 varios tRNAs, los cuales sufren modificaciones adicionales en sus extremos 3' y 5' en sus nucleosidos (vease la tabla) hasta dar las formas maduras, funcionales.
""...,""I'V"'\vIV
. U'L.;,L.
n.1"t1"\
\wi
r"V,",J:.~I-\IVIII:N I U t"'U;:)
I t"(AN,:)l"KIt""l,;
exones:
- fIl.
gen de la troponina T X a ~ I""2l J'j"'1
'4
z
5,-
exones:
gen de la cadena pesada (11) de la inmunoglobulina IgM J.ll J.l2 J.l3 Jl4 MI
M2
-ril '21
rj"1
141
'5
~
isofonna a de la troponina T (en musculo liso)
~
isofonna ~ de la troponina T (en otros tejidos)
~
polipeptido con dominio C-tenninal hidrof6bico, que 10 ancla a la membrana dellinfocito B: IgM de membrana
~
polipeptido sin el dominio C-tenninal hidrof6bico: IgM soluble, secretada
Las tres modificaciones esenciales que experimentan los transcritos primarios durante su maduraci6n (forma-de la caperuza 5', poliadenilaci6n en 3'y reacciones de corte y empalme) parecen ser cruciales para que el RNA pasar al citoplasma e intervenir en la traducci6n a proteinas (tema 23). Este transporte a traves de los poros nuclea esta perfecta mente regulado, pudiendo afectar tambien al control de la expresi6n.
21.6.2
Vida media y degradaci6n del mRNA
Cada molecula de mRNA se emplea muchas veces como molde para la traducci6n; dando lugar a numerl copias del polipeptido que codifica. Como consecuencia, el tiempo de permanencia de una molecula de mRNA e.. _ celula es esencial para determinar la cantidad de proteina producida. Ese tiempo (vida media de la molecula) depenc-2 tanto de la velocidad con que se sintetiza, madura y sale al citoplasma el mRNA, como de la rapidez con que -degrada en este compartimento subcelular. La degradaci6n intracelular del mRNA es un proceso que tiene lugar continuamente, a mayor 0 menor velocida como consecuencia de la actividad de ribonucleasas especificas (pag. 198). Estas pueden ser tanto endonuclea como exonucleasas. Frente a estas ultimas es importante la acci6n protectora de la poliadenilaci6n, pues debe digeri por completo la cola de poli(A) antes de que se alcancen las secuencias codificantes del mRNA. De hecho, /;:l<: moleculas de mRNA tienen una vida media tanto mas prolongada cuanto mayor es la longitud de su cola. Como consecuencia de estas variables, existen aparentes contrastes entre la abundancia de los distintos tipos dE RNA en una celula y la velocidad con la que se sintetizan. Asi, por ejemplo, en E. coli el rRNA es mayoritario (83%) y e mRNA minoritario (3%), mientras que la velocidad de sintesis es superior para el mRNA (y ademas varia en funci6n dla situaci6n experimental). En eucariotas, la vida media del mRNA es unas 10 veces mas larga que en procariotas, I que se debe probablemente al procesamiento postranscripcional, que retarda su degradaci6n; esto es esencial dada la necesidad de que se transporte desde el nucleo al citoplasma (pag. 250). Como datos representativos del significado de este control pueden mencionarse los correspondientes, a grandes rasgos, a la diferente estabilidad de las moleculas de RNA (expresada por su vida media). Existe, en general, una relaci6n directa entre este parametro y el grade de maduraci6n sufrido. La estabilidad tam bien aumenta con el grade de estructura secundariay terciaria de la molecula de RNA. Los tRNAs y rRNAs de eucariotas y procariotas son extremadamente estables (horas 0 dias), pues sufren un gran procesamiento postranscripcional y presentan abundante apareamiento de bases y plegamiento de la cadena. Los rRNAs estan ademas fuertemente protegidos por su asociaci6n con las proteinas ribos6micas. Los mRNAs de eucariotas tienen una estabilidad intermedia (horas), porque experimentan una extensa maduraci6n pero casi no presentan estructura secundaria. Como casos extremos, pueden citarse el mRNA de c-fos con una vida de 10 a 30 min y los de globina y ovoalbumina, que alcanzan 24 h. Los mRNAs de procariota~ son los menos estables (minutos), ya que no sufren madura.ci6n alguna y apenas tienen estructura secundaria. EI mRNA de E. coli se degrada rapidamente una vez formado (se calcula que las . nucleasas degradan en 3 min la mitad del mRNA sintetizado en ese tiempo). Existen tambien mecanismos de control de la vida media que dependen de proteinas que se unen al mRNA, protegiendolo de la degradaci6n. Mas adelante se tendra ocasi6n de comentar un ejemplo (pag. 319). En cualquier caso, 10 importante de estas consideraciones es poner de manifiesto la dificultad de estudiar el control del proceso de maduraci6n postranscripcional. Sin lugar a dudas, este se relaciona a su vez con los mecanismos ya descritos para el control de la transcripci6n (tema 20) y los que regulan la traducci6n (pag. 318).
~ RACTERisTICAS
ESPECiFICAS
295
22.4.3
Degeneraci6n
Esta es una de las caracterlsticas mas lIamativas del c6digo. Se entiende por degeneraci6n el hecho de que un oacido este codificado por mas de un cod6n; a los cod ones que codifican el mismo aminoacido se los llama ones sinonimos. Aunque a primera vista pueda parecerla, ella no supane indefinici6n 0 ambigOedad alguna, pues secuencia concreta de bases define inequivocamente los aminoacidos que deben incorporarse; Sl habria "goedad si un mismo cod6n codificase varios aminoacidos. La degeneraci6n es una consecuencia directa del ravit de codones sobre aminoacidos (recuerdese, pag. 288, que existen 64 tripletes posibles y s610 20 . oacidos). Esta degeneraci6n del c6digo, ademas, no es uniforme, pues cada aniinoacida esta codificado 2"ente de codones sin6nimos, desde s610 uno (Met, Trp) hasta un maximo de 6 (Arg, Leu, Ser). por un numero
el conjunto de codones sinonimos para cada aminoacido se puede resumir, empleando los simbolos habituales: N = cualquier nucleotido R = purinico (A 0 G) Y = pirimidinico (C 0 U)
aminmicidos
M W D Met Trp Asp Asn Cys Phe Glu Gin His Lys Tyr lie Ala Gly Pro Thr Val Arg Leu Ser metionina triptOfano aspartico asparragina cisteina fenilalanina glutamico glutamina histidina lisina tirosina isoleucina alanina glicina prolina treonina valina argmma leucina serina
codones sinonimos
AUG UGG GAC AAC UGC UUC GAA CAA CAC AAA UAC AUA GCA GGA CCA ACA GUA CGA CUA UCA GAU AAU UGU UUU GAG CAG CAU AAG UAU AUC GCC GGC CCC ACC GUC CGC CUC UCC AUU GCG GGG CCG ACG GUG CGG CUG UCG GCU GGU CCU ACU GUU CGU CUU UCU AGA UUA AGC AGG UUG AGU GAY AAY UGY UUY GAR CAR CAY AAR UAY
2 codones
sinonimos (siempre difieren en la 3" base y ambas son purinicas 0 ambas pirimidinicas)
N C F E
Q
H K Y I
4 codones
sinonimos (siempre difieren en la 3" base)
A G P T
- .-
, GCN GGN
"
CCN ACN GUN CGN+AGR CUN+UUR UCN+AGY
6 codones
sinonimos (un grupo de 4 y uno de 2, con las caracteristicas indicadas arriba)
V R L S
..
SeNeSe que 17 aminaacidos estan cadificados par codanes situados en una misma cuadricula de la aci6n tradicional del c6digo, y s610 3 (Ser, Leu, Arg) 10 estan por codones de dos cuadrfculas distintas. Esto e la asignaci6n de codones a un aminoacido no es aleatoria, sino que entre los codones sin6nimos existe una ilitud. Una consecuencia importante de la degeneraci6n del c6digo es que dlsmlnuye la posibilidad de que las es puntuales puedan provocar la incorporaci6n de un aminoacido distinto (pag. 348).
t:L l.UUI\.:iU \.:iI:NI: fiCO
22.4.3.1
Hipotesis del balanceo

por por
EI triplete del anticod6n de un tRNA (formando parte de un aminoacil-tRNA) puede interaccionar complementariedad de bases con un cod6n del mRNA (pag. 289). Esta lectura 0 reconocimiento se realiza apareamiento antiparalelo de las bases 1, 2 Y 3 del cod6n con las bases 3, 2 Y 1 del anticod6n, respectivamente.
3'
el tRNA se ha girado con respecto a su representaci6n habitual (observense 3' y 5')
CS-S)
base fluctuante o de balanceo
anticodon
5'
'm
J
codon
Si los tres apareamientos tuviesen lugar de acuerdo con los reglas de Watson y Crick s610 habria una posibilidad de interacci6n anticod6n/cod6n, por 10que existiria igual numero de tRNAs (anticodones) que de codones, es decir, 61. Sin embargo, se sa be que en las celulas hay menos moleculas diferentes de tRNA, 10 que quiere decir que un mismo anticod6n puede reconocer varios codones. Para poder explicar este hecho se propuso la "hip6tesis del balanceo" 0 "de la fluctuaci6n", que se puede expresar en dos reglas: 1. Las bases 3 y 2 del anticod6n forman puentes de hidr6geno de tipo Watson y Crick bien definidos con las bases 2 2 1 y 2 del cod6n, determinando la especificidad de interacci6n cod6n/anticod6n. 2 2. La 1 base del anticod6n (posici6n 5' del tRNA) puede orientarse de formas ligeramente distintas (/0 que se ha lIamado balanceo 0 fluctuaci6n) para interaccionar con distintas bases en la posici6n 32 del cod6n. Este apareamiento tiene lugar mediante enlaces de hidr6geno diferentes de los c1asicos de Watson y Crick. Debido a ello, la interacci6n es mas debil (coloquialmente, un apareamiento "sue Ito").
2 2
anticodon (tRNA)
mediante un desplazamiento, el uracilo puede tambien aparearse con la guanina
9~~
:
H---:---""'---~
N
H/ .
H
:
~A) ~ N
N
'LN
'"
apareamiento de Hoogsteen, menos favorable
apareamiento clasico de Watson y Crick
A esta f1exibilidad de interacci6n contribuyen no s610 los apareamientos atipicos entre bases normales, sino tambien la presencia, en el anticod6n de algunos tRNAs, del nucle6sido infrecuente inosina (abreviado como I, con la base nitrogenada hipoxantina, pags. 13 y 21), capaz de establecer apareamiento tanto con A como con U 0 C. La inosina se genera por la acci6n de una adenosina desaminasa sobre la A presente en el transcrito primario del tRNA (reacci6n en pag. 353).
FASE PREVIA: ACTIVACION
DE LOS AMINOAclDOS
EN FORMA DE AMINOACIL-TRNAS
305
aminoacidos cuyos codones (1, 2 0 3) requieren al menos I anticodon (pag.298) MetTrp Gin Glu Lys PheTyr His AsnAsp Cys lie
aminoacidos cuyos 4 codones requieren al menos 2 anticodones (pag.298)
aminoacidos cuyos 6 codones requieren al menos 3 anticodones (pag.298)
total
20
aminoacidos
Ejemplo:@
0
()
@
total
~
0
()
Q)
,Ql
"0 '0
()
OJ 0
Q)
OJ 0 OJ
'6
()
'0
0 "0 C
::J
OJ
Q)
en
tRNAGln
"
t
.-...
20
aaRSs
tRNAProl
tRNAPro2
"'
tRNASeq
tRNASeQ
tRNASer3
--
total
Anticodon Codones
(s')CAA(J') (5")CAG(3') (S'lCCA(3') (S')CCUJ') (s')CCG(3') (s')CCC(J')
~'~Guj
(s')UCA(3') (S')UCG(3') (S'lUCU(Y) (S')UCC(J')
0
(S'lAGU(3') (S'lAGC(3')
31
tRNAs (al menos, pag. 297) total
61
codones
complejo entre tRNAAsp y aspartil-tRNA sintetasa
representando solo el esqueleto de las moleculas se observan los contactos principales con el brazo del anticodon y el brazo aceptor, y la introduce ion de este ultimo en el centro activo de la sintetasa
el modelo compacto permite apreciar el estrecho contacto entre el tRNA y la sintetasa, que implica varias zonas de la molecula de tR A
EI mecanismo general de reconocimiento es diferente del de las proteinas de uni6n al DNA (pag. 60), Estas )Ueden formar puentes de hidr6geno con grupos adecuados en los surcos mayor y menor de la doble helice del B-DNA. :110 no es valido para el tRNA, una molecula sin estructura regular, con una conformaci6n condicionada por la presencia le regiones en hebra sencilla (que forman salientes, burbujas, lazos,." pag.70) y regiones en doble hebra con :onformaci6n de tipo "A". EI surco mayor en esta es mas estrecho y mucho mas profundo que el del B-DNA (pag. 52), lor 10 que el tRNA no es tan adecuado para interaccionar con la proteina como 10 hace el DNA.
23.2.3
Correccion de errores cometidos por las sintetasas
La elevada especificidad de las sintetasas hace que los errores sean infrecuentes. A pesar de ello, se dispone de necanismos de correcci6n que actuan sucesivamente, en el centro activo de la enzima, antes y despues de cada etapa le la reacci6n de sintesis. .
306
SiNTESIS DE PROTEiNAS:
TRADUCCI6N
aminoacil-tRNA sintetasa
aminm\cido
I I I
I
~~,'"
I I I
I I I
Reconocimiento selectivo del aminoacido. Depende de la energia de fijaci6n del aminm\cido en el centro activo (energia de enlace); proviene de las interacciones E-S, que constituyen la principal fuente de energia libre utilizada para disminuir la energia de activaci6n (Ea) Y formar el aminoacil-AMP. A mayor energia de enlace, menor Ea Y mayor actividad catalitica (mayor velocidad de reacci6n).
I I
I I I I
@
Verificacion del aminoacil-AMP. Un centro activo hidrolitico, pr6ximo pero distinto al de la uni6n, hidroliza el ;Iminoacil-AMP intermediario cuando es incorrecto, con 10 que no tiene lugar la posterior uni6n al tRNA.
\
~
fase 1 ~ (activacion)
Si las interacciones de fijaci6n no son suficientes para discriminar entre aminoacidos entra en juego el segundo
IATP
mecanismo.
PPi
"
~
IAMPI
+ ~ + ~
(hidr61isis delenlace anhidrido)
(Ia reacci6n prosigue) fase2 ~
(union) ''-----.IAMPI
\
\ \
"
Verificacion del aminoacil-tRNA. La mayoria de las sintetasas son capaces de hidrolizar el enlace ester entre eI aminoacido y el tRNA. En general, la hidr6lisis se acelera mucho cuando hay un tRNA cargado incorrectamente.
--------------
...
+@
@.
(Ia sintesis finaliza)
Ejemplo 1. La enzima isoleucil-tRNA sintetasa (lIeRS) no distingue bien entre lie (su sustrato especffico) y Val aminoacido de estructura similar, aunque de menor tamano por tener un grupo metileno menos. La activaci6n preferente de lie respecto a Val en la primera etapa de la activaci6n (formaci6n de lIe-AMP-E frente a Val-AMP-E) esta de acuerdc con la interacci6n mas favorable del centro activo con lie (energia de fijaci6n superior en 3 kcal/mol a la de Val). A pesal de esta preferencia, dado que in vivo la concentraci6n de Val es unas 5 veces mayor que la de lie Val deberi~ incorporarse err6neamente con gran frecuencia (en torno al 1%). EI hecho de que la tasa de error observada sea mu) inferior (0,01 %) indica que existen mecanismos adicionales de correcci6n.
('"~ .,,;'" ,". """. d, ~ , AM'
contactos adicionales aumentan la energia de uni6n de lie $
lIe
Val
/CH2 CH3 CH3
NH3 / CH_C~ e / COO
CH3....... CH CH-
H3
CHI
'cOOe
~ , .. '" """V I I: II'lJo\;:);
I KAUUl,;l,;IOIIi
23.3.3.2
Union del'aminoacil.tRNA y del mRNA a la subunidad menor del ribosoma: complejo de preiniciacion (paso 2)
A continuaci6n se incorporan a la subunidad menor del ribosoma el tRNA y el mRNA; no esta aun claro en que orden /0 hacen. Se suele decir que se forma primero un "complejo binario de preiniciaci6n" y despues uno "ternario". En ambos casos intervienen nuevos facto res de iniciaci6n. EI mRNA se une con la subunidad menor del ribosoma a traves de su caperuza 5', que es reconocida por uno de los factores, eIF-4E, denominado tambien por ello CBP (cap-binding protein). En esta uni6n y en el posterior desplazamiento del ribosoma corriente abajo del mRNA, hasta encontrar el primer cod6n AUG (el mas pr6ximo a la caperuza), intervienen ademas los factores eIF-4A y eIF-4B y se produce la hidr6lisis de ATP. Estos factores posiblemente actuan tambien desplegando la molecula de mRNA a su forma completamente extendida. EI metionil-tRNAjMet, por su parte, se incorpora despues de formar un complejo con el factor de iniciaci6n e1F-2 y GTP. Este factor reconoce exclusivamente el tRNA iniciador. (Mas adelante se vera que todos los aminoacil-tRNAs que participan en la elongaci6n 10 hacen tambien asociados con un factor proteico que une GTP, pag. 311.)
23.3.3.3
Union de la subunidad mayor: complejo de iniciacion (paso 3)

de un polipeptido, el complejo de preiniciaci6n 40S debe unirse con la
Para que pueda comenzar la sintesis subunidad mayor del ribosoma, 60S.
En primer lugar, la asociaci6n de un nuevo factor e1F.5 activa la capacidad GTPasa de eIF-2. La forma eIF-2:GOP resultante no retiene la afinidad por el Met-tRNA, con 10 que se disocian todos los factores y queda un complejo ternario de iniciaci6n 40S "desnudo" de factores proteicos. Este puede ya reasociarse con la subunidad mayor del ribosoma, Iiberada del factor e1F-6 que la mantenia separada, formando el definitivo "complejo ternario de iniciaci6n 80S". Con esta asociaci6n de las dos subunidades del ribosoma, y la presencia del tRNA y el mRNA correctamente ubicados, este complejo queda dispuesto para la elongaci6n.
23.3.3.4
Reutilizacion de los factores de iniciacion
De los factores elF implicados en el proceso anterior, todos se recuperan intactos y pueden volver a participar en el inicio de una nueva cadena polipeptidica, a excepci6n del factor eIF-2, que comenz6 en su forma GTP y ha terminado con GOP. La regeneraci6n de ese GTP, que evidentemente requiere la energia de hidr61isis de una molecula de NTP, no se hace de forma directa, sino por un intercambio de nucle6tidos mediado a su vez por otro factor proteico, eIF.2B.
~ -15i
11L CJ) ".,~/

Ci( ~
~vr--.lAI
"" ::f::~~~:'f
.J
")-1
~fJ-" -~.
~\
/i,\
'VC--.lAI
.~ -w"'\-" """ " ., ,,'
"--
.
eIF-2: al ribosoma de Met-tRNAMet
balance completo del cicio del factor de iniciaci6n
GTP ~
GDP + Pi + incorporaci6n
23.3.3.5
Balance energetico de la iniciacion
Como se acaba de ver, dos pasos de la fase de inicio requieren un consumo energetico. En primer lugar (paso 2), el reconocimiento de la caperuza y el desplazamiento hasta encontrar el cod6n de inicio, y mas tarde (paso 3), la regeneraci6n del GTP hidrolizado por eIF-2. Nos referiremos a estos como segundo y tercer gastos energeticos de la traducci6n, de cara al balance global (pag. 315).
318 23.8
SiNTESIS DEPROTEiNAS:
TRADUCCI6N
REGULACION DE LA SiNTESIS PROTEICA: NIVELES DE CONTROL
La traduccion se regula en las celulas a traves de varios mecanismos. Su velocidad depende en cierto modo de la secuencia del mRNA molde; por ejemplo, un mRNA con muchos codones raros se traduce mas lentamente (y, por tanto, menos frecuentemente) que otro con codones mas comunes. Ademas, la velocidad de comienzo varia con la secuencia que rodea al codon de inicio. Se sabe que una union fuerte del mRNA a su sitio en el ribosoma produce un inicio mas eficiente (al menos en procariotas). . '. .
N/VELES DE REGULAC/ON
Control pretranscripcional
DE LA EXPRES/ON
GENICA EN EUCARIOTAS
DNA
Accesibilidad del DNA a la transcripci6n: .Condensaci6n de la cromatina .Metilaci6n del DNA Frecuencia/velocidad de inicio de la transcripci6n .Velocidad de elongaci6n del RNA (poco regulada) Eficacia de terminaci6n de la transcripci6n
Tema 20
Puntos de inicio accesibles Factores de transcripci6n Eficacia de los promotores
RNA
transcrito primario
RNA
maduro
) )
Control de transcripci6n
Control postranscripcional: Control de procesamiento del RNA Corte y empalme Modificaciones
Velocidad de procesamiento .Maduraci6n altemativa
Tema21
NUCLEO ~ eITO ' LA:.IlVlA
Control de trans porte del RNA
.Selecci6n de que RNAs son transportados .Transporte activo a traves de los poros
RNA
maduro (mRNA)
Control de degradaci6n del RNA .Estabilidad del mRNA maduro
Control de traducci6n
.Frecuencia/velocidad de inicio de la traducci6n .Velocidad de elongaci6n del polipeptido .Eficacia de terminaci6n de la traducci6n
selecci6n de que mRNAs son traducidos Eficacia de los complejos -{ de iniciaci6n
Polipeptido
Control de procesamiento de proteinas
Tema 23
.Eficacia de modificaciones postraduccionales
Pmtdna funcional
) )
Protema inactiva
Control de actividad de proteinas
23.8.1
Control del transporte
de mRNA
Es importante resaltar la importancia (aunque su mecanisme es poco conocido) del transporte del mRNA maduro desde el nucleo a citoplasma, necesario para que este disponible para la traduccion. Se asume que una vez reaJizado el procesamiento postranscripcional del transcrito primario (tema 21) el mRNA maduro se transporta a traves de los poros nucleares e inicia la traduccion en el ribosoma citoplasmatico en 1-5 minutos. Una de las dificultades para este estudio es la distincion entre proteinas que ayudan al transporte del mRNA desde nucleo a citoplasma y proteinas que intervienen en el procesamiento postranscripcional del RNA (ultimo paso en el nucleo) y la traduccion (primer paso en el citosol). Estos procesos constituyen un mecanismo celular de control de la traduccion en respuesta a las necesidades bajo diferentes condiciones ambientales. Surge as; el termino regulaci6n traduccional para referirse a estos casos de modulacion de la frecuencia de traduccion por factores extrinsecos. EI estudio de este control tiene un interes especial en relacion con el desarrollo animal; en este sentido se ha estudiado intensamente, por ejemplo, en Drosophila.
354
BASES MOLECULARES
DE LA MUTACION Y LA REPARACION
DEL ON
Observese que la unica base habitual (A,G,C,T) que se transforma por desaminacion en otra base igualmente habit es la citosina. Sin embargo, su producto (U) puede ser reconocido como ajeno al DNA y la mutacion corregida. Esta es une ventaja de la presencia en el DNA de T: si el DNA estuviese formado por uracilo, no se podrian distinguir los residuos dE uracilos "correctos" de los generados por la desaminacion de citosina, y el mensaje genetico seria por ello menos estable.
b) Perdida de bases por inestabilidad qufmica del enlace N-glicosfdico
Como ejemplo, pueden citarse las despurinaciones espontaneas, en las que se pierde una purina por hidrolisis de enlace N-glicosidico, dando lugar a un sitio apurinico. Analogamente, pueden generarse sitios apirimidinicos, aunque cor menos frecuencia. Ambos tipos de proceso se pueden tambien conseguir en el laboratorio bajo condiciones quimica~ controladas (pag. 35). En la posicion afectada, el nucleosido queda reducido solo al esqueleto, es decir, un residuo dE desoxirribosa unido por ambos enlaces fosfodiester.
NH2
o o
l~:r)
N N
0
sitio apurinico I en el DNA NH2
O=~-O'C~2 I.
..
o
I
o=rO~H
o
(~N)
N ~
adenina
adenosina en el DNA
c) Modificaci6n de las bases por mutagenos end6genos

EI propio metabolismo de la celula genera en ocasiones compuestos quimicos bases, 0 en general con los nucleosidos, modificandolas. EI caso mas frecuente oxigeno, radicales libres producidos en el metabolismo oxidativo de la celula, en principales son el anion superoxido y el radical hidroxilo, que danan el DNA rompiendo nitrogenadas.
que pueden reaccionar con la~ son las especies reactivas dE especial de la mitocondria. La~ una hebra u oxidando las base~
el super6xido es un ani6n y un radical libre
O2
~~O~~ 1 e-
~. 1 eradicales
~ H202
~/~
1 e-
OH +-OH
del DNA
libres, producen
dafios por oxidacion
~
~CH3
l~\--{)H
H2N N
8-h;dwx;gu,n;no
dm;n, glknl
HIT~OH
OH
I
ex6genas: mutagenesis
25.5.2
Mutaciones inducidas
Ademas de las transformaciones espontaneas de nucleotidos y de los errores de replicacion, se producen tambier mutaciones por efecto de agentes fisicoquimicos ajenos a la celula, denominados mutagenos ex6genos.
25.5.2.1
Lesiones 0 mutaciones inducidas poragentes-quimicos
A diferencia de la inestabilidad del DNA discutida anteriormente, producida por cambios quimicos espontaneos er las bases (esencialmente por desaminaci6n 0 despurinaci6n), tambien pueden modificarse quimicamente las bases pO la acci6n directa de diversas sustancias quimicas del ambiente (naturales 0 no). La lista de estos agentes mutagenos e~ muy grande, y los mecanismos y efectos producidos son muy diversos. Muchos de ellos se identificaron hace mas dE dos siglos como responsables de canceres localizados en obreros en contacto con el humo y hollin. Algunos actuar como mutagenos directos y otros requieren ser activados a carcin6genos activos por la acci6n de ciertas enzimas.
366
DIVERSIDAD
DEL GENOMA:
POLIMORFISMOS
tanto mayor cuantos mas individuos contenga, viene determinado por el numero de alelos distintos existentes para un locus concreto y se refleja en el grado de heterocigosis, 0 proporci6n de individuos heterocig6ticos que forman parte de poblaci6n (pag. 96).
L6gicamente, la causa ultima de la existencia de polimorfismo es la mutaci6n del DNA. La distinci6n entre el us de los terminos mutacion y polimorfismo no es clara ni unanime, pero en general se asocia el primero con situaciones excepcionales, en especial patol6gicas, mientras que se habla de polimorfismo cuando la presencia de la variaci6 genetica es razonablemente comun en la poblaci6n y, por tanto, estable y nada 0 poco perjudicial. Por convenio, se dice que un locus es polim6rfico cuando la variabilidad afecta a mas del 1% de la poblaci6n. Ejemplos alelo hipoteticos de la frecuencia locus B 98% polim6rfico 2% polim6rfico de alelos en 5 locus de una poblaci6n locus C 99,5% normal 0,3% mutado 0,2% mutado locus 0 93,5% polim6rfico 5% polim6rfico 1,5% polim6rfico locus E 95,7% polim6rfico 4% polim6rfico 0,3% mutado
locus A 99,5% normal 0,5% mutado
2 3
Todo polimorfismo es, pues, reflejo del genotipo de los individuos (constituci6n alelica para un locus determinado 0 para un conjunto de ellos). Surge, por tanto, el concepto de individualidad genetica, entendida como la presencia er todo individuo de un genoma con una secuencia caracteristica, unica para ese individuo. En este tema se pres'entan los fundamentos moleculares del polimorfismo y sus consecuencias reservando para el tema siguiente la descripci6n de las tecnicas empleadas para su detecci6n. funcionales
26.2
DIVERSIDAD GENETICA DENTRO DE UNA ESPECIE
Nuestro objetivo es estudiar la individualidad genetica de individuos en especies con reproducci6n sexual, caso de los animales superiores, incluyendo los humanos, en los que el polimorfismo se presenta en dos versiones. Polimorfismo fisiol6gico 0 normal, de interes en estudios familiares, en la identificaci6n de individuos (indicios criminales 0 investigaci6n biol6gica de la paternidad), expresi6n de proteinas fisiol6gicas (describiendo, por ejemplo el color de los ojos 0 la capacidad atletica 0 artistica), para el analisis de ligamiento que conduce al mapeo genetico. etc. Polimorfismo patol6gico, de interes en el diagn6stico presintomatico y prenatal de enfermedades geneticas, en la detecci6n de individuos portadores, para determinar la compatibilidad para trasplantes, etc. Igualmente, puede definir el riesgo para padecer enfermedades (Alzheimer, diabetes, etc.) y condicionar la respuesta a farmacos (existe un gran numero de personas con graves problemas de salud debido a reacciones adversas a farmacos). Curiosa mente, los primeros indicios de la variabilidad genetica en humanos surgieron, a principios del siglo XX, de la observaci6n, en la alcaptonuria y otras patologias, de proteinas distintas de las normales. Hoy sabemos que esta "diversidad proteica" es el resultado de que distintos individuos poseen alelos diferentes en el locus del gen que codifica la proteina (polimorfismo gElnico).
26.3
MECANISMOS IMPLICADOS EN LA VARIABILIDAD GENETICA
Son varios los mecanismos que, actuando en combinaci6n, nunca aisladamente, dan cuenta de la variabilidad genetica durante el complejo proceso de la morfogenesis (desde el cigoto a las primeras capas de tejidos embrionarios y su transformaci6n en 6rganos) y a todo 10 largo de la vida del individuo adulto. De estos mecanismos, se han considerado ya larecombinaci6n hom610ga (pag.106), la segregaci6n de cromosomas (pag. 105) y la mutaci6n (tema 25). Se comentara a continuaci6n el efecto de la duplicaci6n y la transposici6n.
~IL
u.
v &;;;;.n.~IL.lI"'\LI LlI;;;;,~\,;n;;;;,nV.YII"'\.
rVLIIYlv~rlvl"IV"
mRNA y proteina formados por el

Mutaciones con respecto a A: sustitucion (transicion) 297 A~G
alelo B:
sustitucion (transicion) 703 G~A sustitucion sustitucion (transversion) (transversion) 796 C~A 803 G~C
sustitucion (transversion) 526 C~G
...~cGpUcl
... Thr Phe... 99 100 silenciosa
F~
Gly Leu . II 7 I 18
. . ...@uGpGcl... ...Eccj1lGCI... ...jUAcj1lUGFGGpCGI

... Val Gly... ... Pro Ser... ... Tyr Met Gly Ala . 175 176 234 235 265 266 267 268 no silenciosas, de sentido equivocado
mRNA y proteina formados por el

Mutacion can respecto a A: delecion. terminacion 261 G => camblO del marco de lectura => prema tu ra
5'
alelo 0:
~CCEuupG
.J
PUPC
$GtpAAI....
Gly ~ I I7 ~
...jUGCpcl
ECGPC
...~CC~1GGpGGpG
... Val Val Pro Leu Gly... 86 87 88 89 90
His Ser... 99 100
La region C-terminal de la "proteina 0" (residuos 88 a 117) tiene una secuencia completamente diferente a las glicosiltransferasas A y S, Y el tamano de la proteina completa es 2/3 inferior (117 frente a 354); como consecuencia de todo ello, la proteina O'no tiene actividad glicosiltransferasa.
En cuanto al aspecto bioquimico de este polimorfismo, los antigenos A y B se sintetizan por la acci6n enzimatice de dos glicosiltransferasas distintas, codificadas por los alelos A y B. Ambas actuan sobre el antigeno H, ur oligosacarido componente de glicoproteinas y glicolfpidos que, a su vez, es generado previamente por otre glicosiltransferasa codificada por el gen independiente del locus H. La especificidad antigemica de A, B Y H, que define e grupo sanguineo y determina la producci6n de los anticuerpos, viene definida por los azucares terminales de 1m oligosacaridos.
'S.~ancia
distintos productos segun alelo del gen Hh que se poseaJ=--.
clI
fUcoslltransferasa
(producto del alelo H del gen Hh)
. er ~
.--:.._-----H .
precurs~)
~R
(R es un oligosacarido unido a una glicoproteina 0 a un glicolipido)
---------h
GDP-Fuc
el producto del alelo h del gen Hh no es funcional: no se modi fica la sustancia precursora, no se forma antigeno H
"Sustancia H" Antigeno H
0-
-0;-
v ------------------- --------------distintos productos segun el alelo del gen ABO que se posea
UDP-Ga'INAc ~;UDP-Gal
A galactosaminiltransferasa
(producto del alelo A del gen ABO)
galactosiltransferasa
(producto del alelo B del gen ABO)
O
o
el producto del alelo 0 del gen ABO no es funcional: no se modi fica el antigeno H
f..Etige12.0 H
oJ'
LollY I;;;;. n...;J1L.l1"\.U' U'L-L. UL.nVIIII"\..
rVL.IIYlvn.rl..;JIYIV~
26.4.2.3 Polimorfismo de la u1-antitripsina
La al-antitripsina (aI-AT 0 A1AT) es una proteina plasmatica que inhibe la actividad de varias proteasas, com tripsina, quimotripsina y elastasa. Actua principalmente regulando la elastasa leucocitaria, para evitar que esta destruy la elastina y otras proteinas del tejido conjuntivo pulmonar, produciendo dano en la pared alveolar. La deficiencia en a, AT se asocia con enfisema (enfermedad pulmonar degenerativa) y con enfermedades hepaticas (cirrosis y cancer). S ha podido determinar que tal deficiencia y sus sintomas clinicos corresponden a la presencia de algunos de los multiple alelos existentes para el locus de la aI-AT, denominado locus PI (de Inhibidor de Proteasas) y situado en la band cromosomica 14q32.1. Estos alelos (se han identificado mas de 75) codifican variantes 0 isoformas de la protein< algunas de las cuales se pueden distinguir por su migracion en electroforesis 0 isoelectroenfoque.
aiel os mas comunes
posicion 101 Arg Arg His Arg His Arg Arg Arg 160 Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr stop
en la secuencia 213(0) 264 Ala Val Val Val Val Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Val
proteica 342 Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu 376 Glu Glu Asp Asp Glu Glu Glu
fenotipo
(proteina)
M1A
(el mas antiguo evolutivamente)
M1V
(el mas frecuente hoy en dial
M2 M3 M4
Z .(el mas frecuente de los palol6gicos) S Nulo (variante "Granite Falls")
isoformas ligeramente diferentes, pero todas funcionalmente normales
concentracion en plasma reducida 15%) casi normal forma truncada, no funcional
(*) Las variantes M1A y Z pueden distinguirse del resto por RFLP (pag. 381), pues la mutacion GCG (Ala) ~ GTG (Val) hace aparecer una diana para Bst Ell.
Se ha podido establecer la base molecular de la alteracion funcional que sufre la isoforma Z. En la estructur tridimensional de la proteina normal, el residuo Glu-342 (con carga negativa) se situa proximo al Lys-290 (con carg positiva) y ambos forman un puente salino. La mutacion Glu(342)~Lys, caracteristica del alelo Z, impide este puent salino, provocando la agregacion de la proteina dentro de la celula, que impide su secrecion al plasma, disminuyendo I actividad y provocando la susceptibilidad a la enfermedad. EI efecto se manifiesta especialmente, como es logico, en 10 homocigoticos ZZ.
26.4.3
Polimorfismo en regiones genicas no codificantes
Teniendo en cuenta la definicion mas completa de gen, la que se establece bajo un criterio funcional (pag. 244 existen regiones del DNA que forman parte del gen, pero no codifican su producto genico. Tal es el caso de las regione reguladoras (promotores), los intrones y las regiones 5' y 3' que, aunque se conservan en el mRNA, no son traducida~ Se debe por ello considerar la posibilidad de polimorfismos en estas regiones genicas no codificantes. Evidentemente aunque tal polimorfismo no afectara a la secuencia de la proteina, puede afectar a su expresion, dependiendo de I funcion que ejerza la secuencia no codificante que 10 sufre. Muchos polimorfismos en los intrones no tendran efect alguno, y seran equivalentes al polimorfismo en regiones no genicas, estudiado a continuacion. Otros pod ran afectar ( corte y empalme, resultando un polimorfismo proteico. Las variaciones en secuencias promotoras probablement perturben la expresion del gen. Por tanto, el polimorfismo en regiones genicas no codificantes puede manifestarse 0 n en un efecto fenotipico.
~ No parece conveniente complicar la exposicion profundizando en este aspecto, pero no debe dejarse de tener e cuenta. Como ejemplo similar, se ha mencionado una mutacion en secuencias reguladoras del gen del factor IX de I coagulacion, causante de hemofilia B (pag. 348); aunque por su baja frecuencia no entra en la categoria d polimorfismo, como ya se ha indicado el principio de la mutacion y el polimorfismo es el mismo.
26.4.4
Polimorfismo en regiones no genicas
La mayor parte de las mutaciones del genoma ocurren en regiones del DNA que no codifican ningun productc debido a su mayor abundancia en el genoma humano y de otros eucariotas (tema 10). Por tanto, los cambios de base en este DNA no tienen efecto fenotipico alguno: no se altera la secuencia, la estructura 0 la funcion proteicas, de ahi qu tam poco tengan un interes patologico directo. Son, sin embargo, polimorfismos de gran interes aplicado; principalmente para la busqueda de genes relacionados con enfermedades y para la identificacion genetica de individuos.
La elevada cantidad de loci polimorficos que se encuentran en DNA no codificante, junto a la falta d trascendencia funcional de sus alteraciones (que permite que se perpetue libremente en sucesivas generaciones hacen que sea este el DNA que mas difiere de unos a otros individuos. Como consecuencia, una de las propiedade
382
ANALISIS
DE GENES. DETECCI6NY
APLICACIONES
DE LOS POLIMORFISM
ICaso 2: dentro del fragmento

mm
de restrieei6n deteetado existe inserei6n
deleci6n en un alelo
AleloA: ., todos los SltlOSde corte presentes Alelo B: ---mm'l'l'l'l ---. una mutaci6n inserta un trozo de DNA Genotipo: Fragmentos detectados:
- ... ---mserclOn Sandas en electroforesis: (2 cortos) (I corto y I largo) (2 largos) ~
AA
AB
SB
,
I
SS
hibridaci6n Southern
--AB AA
(t)
Los perfiles de Southern obtenidos sobre muestras de distintos individuos, dentro de una cierta similitud propia de la especie, reflejan la diversidad del genoma en la poblacion. AI disponer hoy dia de miles de enzimas de restriccion y de sondas, son enormes las posibilidades de combinacion para el analisis genetico; se han detectado much os sitios RFLP en el genoma humano. Por ello, adquieren el caracter de marcadores geneticos (pag.218), con multiples aplicaciones (pag. 384). Por convenio, como ya se ha indicado (pag. 366), esta variacion solo se califica estrictamente como polimorfismo si aparece en mas del 1% de la poblacion.
27.3.1.1
Ejemplo: Polimorfismo
en la 13-globina, causante de la anemia falciforme
Se propone como ejemplo uno de los primeros RFLP descritos, el polimorfismo en un solo nucleotido del gen de /3globina, que permite el diagnostico (comunmente prenatal) de la anemia falciforme. Esta es una enfermedad hereditaria (pag. 396) causada por una hemoglobina anormal (hemoglobina S, falciforme 0 a213s2) que ejerce un transporte deficiente de oxigeno y ademas provoca una deformacion caracteristica en los eritrocitos (forma de hoz 0 luna creciente), que dificulta su circulacion por los vasos sanguineos. EI gen de l3-globina esta situado en el cromosoma 11 y codifica las cadenas 13componentes de la hemoglobina (2 por molecula; las otras 2, cadenas a, estan codificadas por un gen diferente, situado en el cromosoma 16). Su variante normal, el alelo A (I3A-globina) posee, entre otras, tres dianas (CCTNAGG) para la enzima de restriccion Mst II. Un 87% de los enfermos de anemia falciforme poseen I3S-globina, proteina anomala codificada por el alelo S (de sickle eel/, celula falciforme). Este se diferencia del alelo A en un solo nucleotido (mutacion estudiada en pag. 350), cambio que anula una de las dianas para Mst II. Como consecuencia, los fragmentos de restriccion que se obtienen a partir de ambos alelos son diferentes, 10 que permite emplear la tecnica RFLP para la deteccion de este polimorfismo y, consecuentemente, para el diagnostico de la anemia y el rasgo falciformes. los 3 sitios de restriccion en el alelo A originan 2 fragmentos
1,2 kb
cromosoma I I humano
DNA
~H x
I
-X
I
0,2 kb
exon I
intron A
i
I
:
I
Alelo A (~A-globina)
Polipeptido:
CCT'T!CC;'G
I I
I
CCTG~GGAG
CCT,T~GG
10
I
...-Pro-Glu-Glu- ...
J-
I
j
Alelo S (~S-globina)
Polipeptido:
X
CCTT~GG
~
CCTGTGGAG
I I
J5,
CCrrrT~GG
I I I I
J.
1 1'"
301
ex on 2
l t-...
p=
la enzima de restriccion Msl II
"",
hace que se pierda una de las dianas
m"""'o
...-Pro-Val-Glu- ... '1,4 kb
.-J
-----=;---
los 2 sitios de restriccion en el alelo S originan un solo fragmento
398
ENFERMEDADES
MOLECULARES:
ENFERMEDADES
MONOGENICAS
Aparte de estas consideraciones, en el caso hipotetico de una enfermedad 0 trastorno ligado al cromosoma Y, la~ mujeres no padecerian la enfermedad ni la transmitirian. Los varones la padecerian siempre que tuvieran el alele patologico (P) y la transmitirian a todos sus hijos varones. No tiene sentido el concepto de dominancia, pues nunCE coinciden dos alelos en la misma persona.
varon enfermo I
[Ligada a
vi
II
Solo los varones son portadores del gen, para los aiel os normal (N) y patologico (P). La enfermedad se transmite solo a varones, y a todos ellos. La enfermedad se manifiesta solo en varones hemicigoticos (P-). Son sanos los varones hemicigoticos (N-). Cada varon afectado tiene su padre afectado. Por ser ligada al Y
28.3.4
Enfermedades mitocondriales
Estrictamente, algunas enfermedades mitocondriales (es decir, donde se ve afectada la funcion de esto~ organulos) estan causadas por defectos en la parte del genoma nuclear que codifica proteinas mitocondriales. Sir embargo, nos centraremos en aquellas cuya causa esta en el genom a mitocondrial. La herencia mitocondrial es una dE las excepciones a los principios de transmision mendeliana de las enfermedades monogenicas. Esto se debe a dOl caracteristicas peculiares: la herencia por linea materna y la heterogeneidad genetica 0 heteroplasmia.
a) Herencia materna. Todos los individuos heredan el DNA mitocondrial (mtDNA) de su madre, ya que el ovulo el muy rico en mitocondrias (entre 100.000 Y 300.000 por ovulo), mientras que el espermatozoide tiene muchal menos (unos cientos) y ademas se degradan especificamente tras la fertilizacion. Por tanto, una mutacior patologica en el genoma mitocondrial de una mujer se puede transmitir a toda su descendencia, mientras que e varon en raras ocasiones transmite una mutacion an810ga.
varon sana
mujer enferma
[ Mitocondrial
II
III
todos los descendientes sanos
b) Heteroplasmia. Cad a celula tiene varias mitocondrias, y cada una de estas multiples copias del mtDNA. Es decir en una celula hay muchas moleculas independientes de mtDNA, que no siempre tienen exactamente la mism. secuencia, en especial debido a su elevada tasa de mutacion (pag. 377). Esta heterogeneidad del mtDNA en cad. celula, y tam bien entre las distintas celulas de un individuo, se llama heteroplasmia. Ademas, cuando la celula Sl divide por mitosis, sus mitocondrias se reparten de modo aleatorio entre las dos celulas hijas. Como consecuenci. de todo esto, la proporcion de genomas mitocondriales mutados respecto a los originales es variable dentro dl cada mitocondria, cada celula, cada tejido y cada individuo. Esto hace que la manifestacion de la enfermedal asociada a la mutacion sea muy variable y complica los estudios c1inico y genealogico. Las enfermedade: mitocondriales poseen sintomas muy variados, de gravedad diversa, y afectan a distintos tejidos, incluso para un. misma causa genetica.
MECANISMOS
DE TRANSFORMACION
DE CELULA NORMAL EN TUMORAL
411
Receptores de facto res de crecimiento 0 de hormonas, presentes en la membrana 0 dentro de la celula. Para el caso de un factor de crecimiento u hormona estimuladores de la proliferaci6n, la forma oncoproteica del receptor puede ser aquella con una conformaci6n que la mantiene activa aunque no se Ie una el ligando. Si se trata del receptor de un factor u hormona inhibidores del crecimiento, la oncoproteina es aquella que no responde a la uni6n delligando . Ejemplo: el protooncogen erbB codifica el receptor de membrana para el factor de crecimiento epidermico EGF. Proteinas citoplasmaticas que intervienen en los sistemas de transducci6n de senales. La mutaci6n hace que el oncogen exprese una proteina que se mantiene activa sin necesidad de que Ie lIegue la senal. Ejemplo: el protooncogen ras codifica una proteina G monomerica (pag. 421). Factores de transcripci6n que controlen la expresi6n de genes que codifican a su vez proteinas implicadas en la senalizaci6n, el control del cicio celular 0 la apoptosis . Ejemplos: protooncogenes (os, jun y myc . EI protooncogen erbA codifica el receptor intracelular para hormonas tiroideas, que es un factor de transcripci6n. Finalmente, proteinas responsables de la activaci6n directa del cicio celular (tales como las ciclinas 0 las quinasas y fosfatasas activadoras de las Cdk, pag.424) 0 de la inhibici6n de la apoptosis (pag.432). Los oncogenes respectivos expresan proteinas en mayor cantidad 0 con funci6n aumentada . Ejemplos: el protooncogen bcl-1 codifica la cic/ina D1 . EI protooncogen cdk1 codifica la quinasa dependiente de ciclina Cdk1 (pag. 426) . EI protooncogen mdm-2 codifica un antagonista de la proteina p53 (pag. 431) . EI protooncogen bcl-2 codifica una proteina mitocondrial que bloquea la apoptosis al inhibir las caspasas (pag.433).
Gen estimulador:
Ejemplo de protooncogen que impulsa el cicio celular gen cuya proteina contribuye al avance del cicio, directa 0 indirectamente; por ejemplo, ayudando a superar los
PO",O'DootrOI
~<E3
mutacion inactivadora gen mutado, la proteina no se sintetiza 0 es inactiva: la celula no avanza por el cicio, 0 10 hace con menor frecuencia
..
Proliferaci6n celular excesiva e incontrolada, basta con que el individuo sea heterocig6tico para el gen mutado. En este caso, al gen mutado se Ie llama ONCOGEN y al gen normal, PROTOONCOGEN. La celula se divide menos de 10 normal 0 no la hace: deficiente crecimiento y proliferaci6n, grave s6lo si el individuo es homocig6tico para el gen mutado (posible muerte celular)
;J
Caracteristicas de la expresi6n de los oncogenes
Puesto que existe ganancia de funci6n en la oncoproteina, basta con que este mutado uno de los dos alelos del otooncogen para que se exprese el efecto de la oncoproteina anormal. En consecuencia, los oncogenes se expresan caracter dominante (pags. 96 y 395), Y los individuos heterocig6ticos para un oncogen (genotipo protooncogengen, 0 nP) sufren sus efectos de forma similar a los homocig6ticos (genotipo oncogen-oncogen, 0 PP). La~herencia oS oncogen sera acorde con este caracter, pero s610 si la mutaci6n del protooncogen afecta a celulas germinales 'g.434).
,
425
REGULACION DEL CICLO CELULAR
Una vez fosforiladas por las Cdk, las proteinas ~sustrato pueden, perder';lps grupos fosfato P.o~ acclo_n d~ fosfoproteina fosfatasas igualmente especificas. Esta reversibilidad de la fosforilaci6n es crucial para el control del :iclo celular. '
proteina, sustratO para la quinasa proteina quinasa del tipo
Ho.Ser (6 Ho.Thr)
Tyr.oH
protein a fosfatasa
(0 fosfoproteina fosfatasa)
r "'"
~
serina/~reonina qumasa
del tipo fosfoserina/fosfotreonina fosfatasa
r:L-a-s-p-ro-te"""in-a-s .... Cdk Dos tipos de pertenecen a quinasas que este grupo actuan sobre proteinas
(DsQ"
(6 p-Thr) proteina,sustrato para la quinasa Ho.Ser
fosfoproteina, sustrato para la fosfatasa
protein a quinasa del tipo tirosina quinasa
Tyr-oH
proteina fosfatasa
(0 fosfoproteina fosfatasa)
del tipo fosfotirosina fosfatasa
Ho.Ser
Q
TyrfP\
'-J
fosfoproteina, sustrato para la fosfatasa durante el cicio celular,
A diferencia de las ciclinas, la concentraci6n de las Cdk no varia de forma importante aunque puede estar regulada por ciertas senales estimuladoras 0 inhibidoras del crecimiento.
Cantidad de quinasas dependientes de ciclinas (Cdk), esten activas 0 no como quinasa

EI grasor del anillo extemo (amarillo) indica la cantidad 0 la actividad de las Cdk en la celula en cada momento del ciclo celular.
Actividad como quinasa de las quinasas dependientes de ciclinas (Cdk)

activas al unirse a ciclinas mitoticas
Las quinasas dependientes de ciclina estan presentes en cantidad similar a 10 largo de todo el ciclo, pera s610 son activas cuando estan unidas a ciclinas.
Cactivas al unirse a ciclinas de inicio J

En algunos organismos (Ievaduras, por ejemplo) existe una sola Cdk, que actua tanto en el punto decontrol G1/S como en el G2/M (uniemdose a distintas ciclinas), mientras que en otros (mamiferos) esas funciones se distribuyen entre varias Cdk. En humanos se han encontrado al menos B miembros de esta familia, denominados Cdk1 a CdkB, eada uno de los cuales forma complejos quinasa activos con ciclinas distintas.
Resumen de las distintas ciclinas y quinasas dependientes de ciclina (Cdk) conocidas en humanos, Se indica las parejas que se asocian y los puntos de control del cicio en los que actuan,
Observaciones: La asignaci6n exacta de puntos de control difiere segun las fuentes; las indicadas entre parentesis estan menos confirmadas . Cdkl se llama comunmente Cdc2, par ser hom610ga de la Cdc2 de levaduras, EI complejo Cdk2/ciclina A parece actuar a 10 largo de toda la fase S, mientras que los demas actuan principal mente en las transiciones entre GJ Y S 0 entre Gz Y M (puntos de control) . CdkIlB parece actuar tambien durante la fase M, Cdk7 Y ciclina H son subunidades componentes de TFIIH, factor de transcripci6n (pag:267) interviene en la reparaci6n del DNA (pig. 360), que ademas
MARCADORES
TUMORALES
431
Otras enzimas
Can ceres diversos

0
Isoenzimas de la creatinquinasa (CK): SS 0 CKI, en cerebro; MS 0 CK2, en musculo cardiaco, y MM musculo esqueletico. La isoenzima SS aparece en neoplasias malignas de prostata, pulmon y sangre. Isoenzimas IV y V de la lactato deshidrogenasa Ribonucleasa: cancer de prostata. Hexosa fosfato isomerasa: carcinoma hepatico, de tubo digestivo 5' -Nucleotidasa: cancer de ovario y metastasis hepaticas. Aspartato aminotransferasa y y-giutamiltranspeptidasa: metastasis hepaticas.
0
CK3, en
(LDH). Cancer de prostata metastasico. de pulmon.
b) Citocinas
mediadores solubles de origen celular
De acuerdo con su acci6n especifica, tambiiln se subdividen en: linfocinas, monocinas, interferones, factores de necrosis tumoral, factores estimulantes de colonias y factores de crecimiento. La concentraci6n serica de varias de elias aumenta en determinadas situaciones clinicas, algunas de elias canceres.
30.9.2.2 Marcadores tisulares

Aunque son a veces indistinguibles de los marcadores tumorales, estan mas relacionados con la propia biologia neoplasica y vienen dados por parametros de definici6n imprecisa, no referidos a alteraciones bioquimicas. Su detecci6n se basa, en general, en el empleo de anticuerpos monoclonales. Aun no se ha lIegado a un reconocimiento generalizado de su utilidad c1fnica, aunque tienden a usarse de forma creciente. Ejemplos: Oncogenes Genes oncosupresores Receptores de hormonas esteroides Proteinas asociadas a los receptores de estero ides (pag.416) (pag.418) Los mas conocidos son los receptores de estr6genos y de progesterona, presentes en el citosol. Se yen alterados en los tumores malignos de mama. Algunas proteinas de choque termico (muchas de elias carabinas moleculares que facilitan el plegamiento adecuado de otras proteinas, pag. 337). Proteina pS2, inducida por estr6genos. Filamentos Queratinas Componentes citoesqueleto del Queratinas intermedios. de tipo 8 (antigeno polipeptidico de tipo 18 (antigeno polipeptidico tisular, TPA). especifico tisular, TPS).
Estan presentes en el citoesqueleto de celulas epiteliales, normales y malignas, pero se determinan en Iiquidos biol6gicos (suero). En general, no son especificas de ningun tipo histol6gico, pero son utiles como indicador de proliferaci6n y para el diagn6stico y seguimiento de muchos tumores. Oligosacaridos Glicoproteina Lex, sial ii-Lex, sialil-Lea, sialil-Tn y sialosil-Tn. P.
Antigenos de membrana Factores de crecimiento Receptores de los facto res de crecimiento Moleculas de adhesi6n Proteasas y sus inhibidores
TGFa, FGFI3, IGF-1 Y TGF-131.
Integrinas, cadherinas y selectinas.
30.9.3
Marcadores genotipicos
moleculares
En la busqueda del marcador tumoral "perfecto" se plantea en la actualidad una clasificacion molecular de los tumores basad a en la detecci6n directa de los cam bios genotipicos responsables del cancer. En definitiva, ello supone un analisis molecular de las mutaciones en todo tipo de secuencias del genoma, tanto genicas (oncogenes, genes oncosupresores) como no genicas (secuencias repetidas) e incluso en las regiones telomericas (pag. 92). Esto seria de gran validez para el diagn6stico (confirmaci6n y seguimiento del desarrollo del tumor), la prevenci6n (aparici6n precoz, cancer asintomatico, evaluaci6n del riesgo y la susceptibilidad hereditaria) y la terapia (tratamiento farmacol6gico y su seguimiento). Este anal isis molecular de los marcadores tumorales se esta potenciando enormemerite. como consecuencia del desarrollo de los biochips (pag. 387).

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Biologa Molecular e Ingeniera Gentica

Biologa Molecular e Ingeniera Gentica

Jos Luque Cabrera

Angel Herrez Snchez

Ocpanamcntv tk Bic.J.qumka y Biologa Molecular Universidad de Alcal.i AlcJij de llenares. Miidl'it.l

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'1."'" .. _... 1\rt.mt P.t

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d.,.._ .............. ........

A nuestros alumnos, Inspiradores de <Hite estucrz.o.

A nuestros compaeros profesores, Montse, Cristina. Jos Carlos,

y por el tJempo que han cedido.

Protesoc Asoaado. Opto. Sxlquimic.1 v Biologiil MQioc:~r Univtrsid:ad Cle Crctob3

fTflfflM 12 )' r$)

M Oolores de Arri;J.ga G!n4tr

Protewil Tcu\ar, Opto e.o<wimic:<t y BOIOgitl MOIOO!Mt

Profesora nUJiar. Opto. &oiog~ Ceh.W y Genbett

Mflogros e.,nostcrot Gont-'Jet

u Dolores Delgado Vinar

Pt-oCew Tit!A31, Opto. ~miel vS!OI(lga Mofular

Jos6 M. Gonui~ de Bultrago

.SOrge Mooknol Sanz Ldo. en Slologia y Tcnico de Cltomstria.

U" c,rmen Lastra Gonz,le% ProfNOra Trlular,

Op$0 Oufrrnca Analitica e lngerrieri;; Qvifni~ lfflersidad de Alca& (Te!T/8 11)

Rat~l Oliva VlrgiU SotviC:iO <te Gcn61iea Hospital C11nlco, Saroelona

(Temas 17y tB)

Jos M '" Uacarulla Greole$

lt41fcodes M;utln t.t.'lrqufMZ

Prole$0r& nu,llar, OpiO. Blologfa Veoetal Uni\'Ot&ldad dl:t Alc:aili

Profesora TTiutar. OtAo Sioqvlmiea y BloiOgla Molecular lkwer&~dad O. ln fTem<~s 2, 3 y t6)

W Begoi'la Martfnez Jatrela

Cenlro de 81ologfa MOlecular "SevetO Ocht

Atfredo Prieto Martin ProleSOf Asociado. Opto. Medicina Umotersldacl de Alcal

Bar1olom Sabater Garcia Cate<*tUico. Opto. 81ol0g!tl Vegetal Un1vc-1$idad do Alcl\!j

Pilar Sanc:ho lpez ProleSa Tllt.llaf, Opto. Stoqutmica y Siologt'a Motecular

Nieve-s Rodt~ue z Henche ProleSO(S Tttular lntoona.

Joaquin Soler ,..ed1na

Ut'IIV&f'$idad d& Alcaf

Jos Cario& Rodri.guez Rey

Alumnos de licenciatura y de doctorado

especial dediCIICi(ln 1 em3s <I'ICretos.

Gema Alonso Poves LlcenCia<la Paloma calleja Lampatero

Ttre&.a GoozaJo L<izar o

Maria P;~z Jlmnez Hetnhdez

bcanci&dt'l' industria tarmaoullc:a

Jos AntonJo Jotdn Hernndel

Ooe1or. profesor de enseflan:za !100\M<Iatla

Helena Rodero Torres

cenaado; IOdUSITia farmacutica:

fitima Rodrig!Jel: Barrios 8ccana prOOociiOrat

An tonio Jos M.attf~z Osorlo

Alicia Rodrigt.N!"tBobada Jlmnez Ex-afunma

Joa A.lbOrto Rojo Lpoz Llc:onclado

Sara <MI AO$al MonecltWo

Elena Mollino Centeno

Juan CaiiOS Murciano Fcm&nctez

lnvesligador ~oral M lnmacut.a<:ta Navarro PGrot liCenciada

Rosa Snehez Sinchez

Ooelora; farmacutica eitvlor

Stlt a Otti.z Gatrudo