BIOCHIMIE MEDICAL I

FARMACEUTIC
APLICAII PRACTICE
PARTEA I
2
3
CUPRINS

I. Organizarea i protecia muncii n laboratorul de biochimie..........5

II.Noiuni de analiz chimic....................................14
II.1.Noiunea de atom-gram, molecul-gram, echivalent-gram.......14
II.2. Soluii. Modul de exprimare a concentraiilor.15
II.3. Uniti i moduri de exprimare n laboratorul clinic....17

III.Sticlria i aparatura de laborator.........................18

IV.Metode analitice folosite n biochimia medical i farmaceutic.............21
IV.1. Metode volumetrice de analiz...............................21
IV.1.1. Volumetria acido-bazic......................................................21
IV.1.2. Determinri volumetrice prin reacii de precipitare.............36
IV.1.3. Determinri volumetrice prin reacii de oxido-reducere......37
IV.1.4. Volumetria prin reacii de complexare................................40
IV.2. Metode optice de analiz....................................................................41
IV.2.1. Metode spectroscopice de analiz.......................................41
IV.2.2. Metode flamfotometrice de analiz.....................................43
IV.3. Metode electrometrice....................45
Msurarea pH-ului...........................................................47
pH-ul izoelectric al aminoacizilor....................48
Determinarea punctului izoelectric al proteinelor............................50
IV. 4. Metode imunologice de analiz.........................................................52
Determinarea complexelor imune circulante...................................52
IV.5. Metode de separare.............................................................................54
IV.5.1. Centrifugarea.......................................................................54
IV.5.2. Ultracentrifugarea................................................................54
Viteza de sedimentarea a eritrocitelor
IV.5.3. Cromatografia......................................................................56
Separarea aminoacizilor din urin prin cromatografie pe
strat subire
IV.5.4. Electroforeza........................................................................57
Electroforeza n gel de agaroz
Electroforeza n gel de poliacrilamid
IV.6. Teste rapide de investigare.................................................................69

V. Analiza biochimic a vitaminelor....................................................................71
V.1. Reacii pentru carotinoide i vitamina A..............................................71
V.2. Reacii pentru provitaminele i vitaminele D......................................73
V.3. Dozarea vitaminei PP...........................................................................74
V.4. Reacii pentru identificarea i dozarea vitaminei C.............................75
V.5. Reacii de identificare i dozare a vitaminei B
1
...................................77
4
VI. Analiza biochimic a proteinelor...............79
VI.1. Reacii de identificare a aminoacizilor.......79
VI.2. Dozarea aminoacizilor prin metoda Sorensen....85
VI.3. Reacii de identificare a proteinelor ...87

VII. Analiza biochimic a glucidelor................94
VII.1. Reacii generale pentru glucide.95
VII.2. Reacii de difereniere a aldozelor i cetozelor......96
VII.3. Reacii de difereniere a pentozelor de hexoze..96
VII.4. Reacii de condensare a monozaharidelor cu fenilhidrazina.99
VII.5. Aciunea alcaliilor asupra ozelor.................100
VII.6. Reacii de reducere..............................................................101
VII.7. Dozarea glucidelor reductoare Metoda Ionescu-Matiu..106

VIII. Analiza biochimic a enzimelor............108
VIII.1. Modaliti de exprimare i de determinare
a activitii enzimatice...................................................................109
VIII.2. Efectul temperaturii i a pH-ului asupra activitii enzimatice......110
Determinarea experimental a activitii
fosfatazei alcaline i acide............................................................113
VIII.3. Dependena activitii enzimatice de concentraia de substrat.......117
Determinarea activitii enzimatice a
colinesterazei serice nespecifice....................................................120
Determinarea activitii transaminazelor.......................................123
Determinarea activitii -glutamiltranspeptidazei serice..............126

IX. Analiza biochimic a lipidelor...................................128
IX.1. Clasificarea lipidelor.............128
IX.2. Reacii de identificare a acizilor grai...129
IX.3. Lipoproteine......................130
IX.4. Tulburri ale metabolismului lipidic.............134

X. Analiza acizilor nucleici..141
X.1. Analiza ADN ului celular....141
X.2. Izolarea acizilor nucleici................................................................142
X.2.1. Izolarea ADN din materiale biologice....144
X.2.2. Izolarea ARN..150
X.3. Dozarea concentraiei de ADN......150
X.4. Metoda Spirin.151


Bibliografie...157


5
I. ORGANIZAREA I PROTECIA MUNCII N LABORATORUL DE
BIOCHIMIE


Pentru ca activitatea practic s se dezvolte n condiii optime i de
siguran trebuie respectate anumite reguli de ordine interioar. Activitatea care se
desfoar n laborator prin specificul ei, pretinde o anumit disciplin, o atitudine
plin de rspundere n mnuirea reactivilor i a diferitelor materiale.
Este cunoscut faptul c n laborator, dezordinea, neatenia, superficialitatea
i cunoaterea insuficient a proprietilor substanelor cu care se lucreaz, precum
i a aparatelor, pot atrage dup sine diferite accidente. Substanele i reactivii
folosii fiind n majoritatea lor toxici, au aciune vtmtoare asupra organismului.
Din aceast cauz, substanele nu se vor gusta niciodat, iar vaporii sau gazele care
se degaj n cursul reaciilor se vor mirosi cu atenie. Anumite operaiuni asupra
crora se va atrage atenia, vor fi fcute cu grij, asigurndu-ne de buna ei
funcionare. Lichidele inflamabile nu se vor nclzi la foc direct, ci numai pe baia de
ap i n aparate specifice acestei operaii. Pentru reaciile care necesit solveni
inflamabili, vom lua msuri ca n laborator s nu existe nici o surs de flacr.
Dac, din nebgare de seam vreun reactiv ajunge pe haine sau pe corp, se
va proceda nti la splarea cu mult ap a locurilor atinse i apoi se vor aplica
substane care neutralizeaz aciunea acestora. Pentru acizi vom folosi substane
slab alcaline ca: NaHCO
3
sau NH
4
OH diluat, iar pentru baze, acizii slabi ca: acidul
boric sau acidul acetic diluat.
Eprubeta ca mijloc curent de efectuare a reaciilor, nu se va umple mai
mult de 1/3 din volumul su, iar nclzirea ei se va face cu atenie, treptat, dinspre
partea superioar a coninutului su ctre cea inferioar, evitndu-se astfel
izbucnirea lichidului din stratul inferior prin suprancalzire. Inclzirea se va face
asigurndu-se o agitare permanent pentru o omogenizare a lichidului din
eprubet. Eprubeta nu se va ndrepta spre colegi sau spre cel ce lucreaz.
La diluarea H
2
SO
4
conc. se va ine cont de marea lui aviditate fa de ap. Se
va aduga acid sulfuric n portiuni mici, sub agitare continu peste ap i nu
invers! Dac nclzirea vasului este prea puternic ca urmare a reaciei exoterme
care are loc, se va rci vasul la exterior sub un curent de ap rece.
Fosforul alb se pstreaz sub ap, metalele alcaline sub petrol, manipularea
lor fcndu-se cu toat atenia. Urme din aceste substane lsate din neglijena n
contact cu aerul pot produce incendii.
Fiecare substan i reactiv vor fi etichetate, iar pentru reactivii n soluie se
va preciza concentraia lor.
La plecarea din laborator se vor controla att becurile de gaz, ct i
robinetele de ap dac sunt nchise, iar aparatele electrice se vor scoate din priz.
n cazul n care se aprinde o substan, se va folosi la stingerea ei ap, numai
n cazul n care aceasta este miscibil cu apa. n celelalte cazuri se va folosi nisip,
stingtorul de incendii sau se va nbui flacra prin acoperire cu o ptur.
6
Disciplina, cunoaterea fiecarei operaiuni de laborator care urmeaz a fi
executat de ctre studeni, sub toate aspectele ei, ne feresc de accidente.

Msuri privind manipularea i utilizarea substanelor chimice n laborator
- La primirea i folosirea substanelor pentru experiene vor fi citite
cu atenie etichetele pentru a nu se utiliza alte substane.
- Reactivii trebuie pstrai n recipientele i ambalajele originale,
deoarece acestea asigur condiiile optime pentru fiecare reactiv
- Manipularea acizilor concentrai, amoniacului, bromului se va face
cu precauie
- Substanele care emit vapori sau gaze toxice se pstreaz n locuri
care permit evacuarea lor rapid
- Lichidele care au tendina s formeze peroxizi organici se pstreaz
departe de surse de lumin

Msuri de igien personal
- Se interzice fumatul, consumul de alimente sau lichide
- Purtarea mnuilor este obligatorie
- Minile se spal dup fiecare manipulare care ar putea implica
contaminarea cu snge, ser, plasm sau alte produse provenite de la
bolnavi, manevr urmat de dezinfecia cu alcool peste 70%
- Minile nu se vor terge niciodat de halat sau mbrcminte

Msuri privind manoperele uzuale
- Se interzice pipetarea cu gura
- Pipetele vor fi manipulate cu baloane de cauciuc sau alte dispozitive
de expiraie
- Dup folosire ustensilele de laborator nu vor fi puse pe masa de
lucru, ci n vasul cu soluie dezinfectant ( cloramin, amestec sulfo-
cromic etc.), vas care trebuie s fie acoperit complet

Msuri de prim ajutor
- n caz de inhalare a unor vapori sau gaze toxice, pacientul trebuie
scos din mediul toxic la aer curat
- n caz de contact cu substane toxice la nivelul ochilor se practic
splarea ochilor cu ap din abunden, innd ochii larg deschii i
micndu-i n toate direciile
- Orice hain contaminat cu substane chimice va fi ndeprtat
- n caz de contaminare la nivelul pielii se va practica splarea cu ap
rece din abunden, evitndu-se folosirea substanelor acide sau
bazice care prin reacii exoterme pot agrava leziunile produse
- n caz de ingestie a substanelor toxice se evit administrarea
oricrei substane
7
- Important: toate persoanele care au suferit accidente trebuie
transportate la spital

Factorii care influeneaz rezultatele analizelor
Un examen de laborator efectuat n timpul vieii unui individ poate da
valori diferite n funcie de starea de sntate sau de boal a organismului.
Cu civa ani n urm, problema variaiilor fiziologice era cel mai adesea
ignorat cnd se interpreta un examen de laborator.
Astzi sunt studiate cu atenie toate cauzele de fluctuaie a rezultatelor i
se cerceteaz influena factorilor de variaie, legai fie de metod, de condiiile de
prelevare sau de diferenele intra- i inter-individuale.
Examenul biologic ce urmrete variaiile fiziologice demonstreaz faptul c
acestea sunt de amplitudine mai mic dect variaiile patologice. Ele sunt deci
mai greu de evaluat i necesit metode de analiz mai fine. Este deci necesar
precizarea riguroas a limitelor n care se ncadreaz populaia sntoas i
stabilirea de intervale de referin. n aceste condiii cunoaterea variaiilor
biologice i a factorilor care afecteaz concentraia diverilor componeni ai
organismului uman este indispensabil.
Trebuie subliniat faptul c conceptul de valori de referin nu poate fi aplicat
dect subiecilor sntoi i deci este necesar s cunoatem biologia omului sntos.
Pentru o interpretare mai bun a analizelor de laborator trebuie s inem
seama de factorii care pot influena rezultatele analizelor.
Din punct de vedere didactic putem distinge dou surse de variaii:
variaii analitice
variaii biologice

Variaii analitice

Lucrrile recente ale lui Statland i Winkel au pus n eviden cele dou
componente principale ale variabilei analitice:
- eroarea pre-instrumental
- eroarea instrumental

Variabila analitic pre-istrumental depinde de toate sursele de variaii
cauzate de la recoltarea probei pn la determinare, cum sunt:
pregtirea bolnavului
recoltarea probelor la care trebuie s se in cont de ora recoltrii, de
felul sngelui (venos, arterial, capilar), de aplicarea garoului sau nu,
de poziia bolnavului, de anticoagulantul utilizat.
8
pregtirea probei pentru analiz: n acest caz trebuie s se in cont
de timpul de la prelevarea probei pn la centrifugare i de utilizarea
sau nu a conservanilor.
Variabila analitic instrumental este eroarea analitic datorat metodelor
de dozare. Ea poate fi separat n variaii analitice pe termen scurt (apreciat prin
repetabilitatea sau reproductibilitatea pe o zi) i pe termen lung (apreciat prin
reproductibilitatea de la o zi la alta). Variaiile analitice de la o zi la alta sunt n
general mai importante dect cele pe o zi. Cnd se efectueaz studii pe termen
lung este de preferat ca eantioanele s se congeleze i s fie analizate
simultan n aceeai serie i n aceeai zi.
Variaiile analitice trebuiesc meninute constante i la un nivel sczut
pentru a mri certitudinea n momentul evalurii unui rezultat individual n
intervalul de referin.

Variabila biologic intra-individual. Aceast noiune se refer la
variabilitatea datorat de-a lungul timpului individului nsui. Ea include deci
toate fenomenele de reglare, n particular toate ritmurile biologice i n primul
rnd procesul de mbtrnire. Dar acesta este dificil de izolat complet de ceilali
factori de variaie.
Pe plan experimental, variaiile intra-individuale pot fi abordate prin
msurarea succesiv, n cursul timpului, a unui parametru la acelai individ.
Alegerea intervalului de timp este foarte variabil, n funcie de obiectivele
urmrite. Aceast variabil este greu de urmrit deoarece este dificil s
constrngi numeroi subieci s participe la un asemenea program. Aceste
studii se efectueaz de obicei pe populaii restrnse de voluntari, care triesc n
instituii sociale, medicale etc.

Variabila biologic inter-individual. Aceast variabil reprezint
ansamblul variaiilor unei populaii. Dar o populaie este foarte heterogen. Dac
inem cont de acest lucru i de faptul c noiunea de omogenitate nu poate fi
definit la modul absolut, ea fiind relativ, este evident c acest numr de
factori pe care va fi necesar s-i controlm este indefinit i este practic
imposibil s fie studiai n totalitate.

Diferitele surse de variabilitate biologic
Clasificarea factorilor de variaie biologic se efectueaz cu greutate. S-a
propus clasificarea lor n variaii intra- i inter-individuale, n variaii genetice i
dobndite, n variaii datorate mediului, n variaii datorate factorilor exogeni i
endogeni.
Dac inem cont de diferenele de concentraie plasmatic a unor
constitueni, putem distinge dou grupe de factori fiziologici:
factori de mas: importana masei musculare, adipoase, hepatice, care
este determinant de exemplu pentru nivelul anumitor enzime care
provin din aceste esuturi
9
factori metabolici: acioneaz pe substratele care sufer variaii rapide
i sunt supuse reglrii hormonale i nervoase.
innd cont de faptul c procesul de reglare intervine foarte net asupra
variaiilor fiziologice, putem distinge 3 categorii de constitueni:
- constitueni foarte bine reglai (electroliii, albuminele), cei care nu
variaz dect foarte puin
- constitueni cu variaii importante (de exemplu produii finali ai
catabolismului, ca ureea, uraii sau enzimele eliberate din esuturi)
- constitueni implicai parial n mecanisme de sintez (glucoza,
colesterolul) care sufer variaii medii
Deci este important s se cunoasc i mecanismele biochimice i
fiziologice care stau la baza variaiilor biologice, ca de exemplu mecanismul de
ieire al enzimelor, timpul de njumtire al diverselor substane, etc.
Deoarece aceti factori sunt greu de clasificat, n continuare vom descrie
factorii mai importani care pot influena rezultatele analizelor.

Vrsta
Variaiile n funcie de vrst sunt bine cunoscute. n primul rnd trebuie s
menionm concentraiile hormonilor care sufer variaii datorit creterii, de la
nou nscut la copil i la adult.
Se cunoate de asemenea variaia colesterolului i a ureei. n ultimul timp
s-a constatat c i activitatea fosfatazei alcaline variaz n funcie de vrst.

Sexul
Numeroi constitueni plasmatici au concentraii diferite n funcie de sex,
enumerm doar civa: hemoglobina, hematocritul, fierul, cuprul, trigliceridele,
etc.
La femei amilaza, transferina au concentraii mai crescute, pe cnd la
brbat activitatea fosfatazelor alcaline, a CPK, a transaminazelor, a ureei i a
uratului sunt mai crescute.

Rasa
Acest capitol a suscitat mult interes, dar este din ce n ce mai greu de
cercetat datorit amestecului populaiilor. S-a constatat c la rasa neagr
concentraia plasmatic n trigliceride, potasiu i sodiu este mai crescut dect la
albi, iar concentraia n acid uric este mult mai crescut la anumite populaii din
Oceania.

Stri fiziologice deosebite: sarcin, menopauz, menstruaie.
S-a constatat n primul rnd o modificare a concentraiei hormonale, care
atrage dup sine i alte modificri. Astfel, n menopauz scade mai nti
progesteronul, apoi estrogenii i mai trziu 17-cetosteroizii. Tot n menopauz crete
net activitatea fosfatazei alcaline, concentraia plasmatic a calciului,
colesterolului, a acidului uric.
10
n timpul menstruaiei, pe lng hormonii implicai n ciclu, apar
numeroase variaii ale aldosteronului, a acizilor aminai, a CPK, colesterolului i
a magneziului.
n timpul sarcinii printre variaiile importante cauzate de aceast stare, pe
lng variaiile hormonale, putem aminti scderea albuminelor plasmatice, a
calciului care este legat de acestea, a imunoglobulinelor, glucoza, acidul uric,
hemoglobina i eritrocitele,a vitaminei C. Se observ o cretere a proteinelor
care transport hormonii, a activitii fosfatazei alcaline care crete de dou ori
prin aportul fosfatazei alcaline placentare.
De asemenea crete -fetoproteina, -1-antitripsina, amilaza, P-
glucuronidaza, ceruloplasmina (i cuprul), leucin-aminopeptidaza. Mai cresc:
colesterolul, trigliceridele, fosfaii i volemia.
n sarcina gemelar -fetoproteina este de dou ori mai crescut dect n
sarcina simpl.

Alimentaia
Alimentaia poate interfera dozarea colorimetric a anumitor constitueni
datorit coninutului lor n diverse principii, cum sunt: pigmenii, carotenii,
antocianii.
Anumite alimente conin serotonin, 5-hidroxi-indolacetat sau
cathecolamine care pot perturba dozarea, prin metode nespecifice, a substanelor
reductoare.
Exist alimente care au efect asupra unor constitueni biologici prin
coninutul lor crescut n anumite substane, cum sunt de exemplu: spanacul,
mcriul care conin cantiti crescute de acid oxalic i care interfer n dozarea
calciului; un exces alimentar de sfecl provoac hiperaldosteronism i
hipokalemie.
Cafeaua i cofeina cresc glucoza plasmatic i acizii grai neesterificai i
scad timpul Quick.
Dar cele mai importante efecte le are un regim alimentar neechilibrat, un
regim vegetarian sau hipercarnat care modific pH-ul, inaniia care duce la
apariia de corpi cetonici, etc. n postul alimentar prelungit, n afara creterii
corpilor cetonici plasmatici, crete secreia de aldosteron, a trigliceridelor,
glicerolului, ureei, a acidului uric.
Ingestia de alimente provoac variaii dificil de controlat. Astfel la dou ore
dup o mas complet (700 cal), la subiecii sntoi se observ o cretere cu
15% a concentraiei plasmatice a glucozei, cu 15% a fosfailor, cu 2% a
albuminelor i proteinelor, cu 20% a AST-ului i 6% a ALT-ului. Colesterolul,
ureea, acidul uric, sodiul, fosfataza alcalin i LDH-ul nu sufer variaii. Dar
unele diferene nu se observ dect la anumite grupe de vrst, cum este cazul
trigliceridelor care dup mas sunt mai crescute la persoane peste 40 de ani.



11
Efortul fizic
Crete concentraia albuminei i a altor enzime plasmatice. Dac efortul este
intens pot crete enzimele de origine celular: LDH, aldolaza, creatinkinaza, AST,
ALT i chiar ornitin-carbamil-transferaza. ntr-un efort de intensitate mic
crete uor fosfatul i proteinele plasmatice.

Stressul
Stressul este un factor important de care trebuie s se in cont mai ales n
momentul recoltrii probelor, deoarece acesta duce la creterea concentraiei
plasmatice a trigliceridelor, colesterolului, acidului uric, glucozei, hormonului de
cretere, noradrenalinei, hormonilor tiroidieni, a acizilor neesterificai.

Altitudinea
Albumina plasmatic scade dup 6 sptmni la o altitudine de 5400 m, la
fel i aldostenuria, efect mai pronunat mai ales la vrstnici.
Hemoglobina, hematocritul, acidul uric, noradrenalina plasmatic cresc. De
asemenea se produce o alcaloz respiratorie de efort datorat hiperventilaiei.

Absena gravitaiei
Provoac creterea catecolaminelor, nespecific, legat de stressul pe care l
reprezint lipsa gravitaiei. Se modific metabolismul fosfo-calcic, aprnd
osteoporoza, creia i-au fost victime cosmonauii americani.

Ortostatismul
Proteinele serice, albuminele i substanele legate de proteine (colesterolul,
calciul) cresc dup 15 minute de stat n picioare, datorit uoarei hipovolemii
indus de ortostatism. Aldosteronul plasmatic crete de 5-10 ori n ortostatism fa
de poziia culcat, la fel i hematocritul care crete cu 10%. n urin
noradrenalina crete de 3 ori.

Ritmurile circadiene
S-a constatat faptul c activitatea plasmatic a fosfatazei alcaline scade de
la 25% pn la 50% dimineaa. Concentraia plasmatic a aldosteronului crete
de la 6 dimineaa pn la 3 dup amiaza, secreia sa fiind mai sczut noaptea.
Probabil acest efect este datorat poziiei ortostatice. Dar pentru
aldosteronemie exist un ritm circadian deoarece pentru o postur neschimbat
secreia maxim se observ la ora 8 i minima la ora 18.
Excreia noradrenalinei este mai crescut ziua dect noaptea.
Concentraia plasmatic a fierului are un ritm circadian cu maxim dup
amiaza i minim la 4 dimineaa.

Mediul
Pesticidele, insecticidele, oxidul de carbon, vaporii de benzin, solvenii
organici, lacurile pentru pr, etc. pot da unele modificri ale examenelor de
12
laborator cel mai adesea din cauza modificrilor toxice (citopenie, anemie
hemolitic, nefrotoxicitate, afeciuni hepatice). Astfel transaminazele,
colinesteraza, bilirubina sunt crescute, iar timpul Quick i elementele figurate
sunt sczute.

Frigul
La temperaturi sczute cresc n plasm catecholaminele, hormonii
tiroidieni, hormonul de cretere i leucocitele. Acizii aminai ca tirozina i
triptofanul plasmatic scad, pe cnd activitatea enzimatic a creatinkinazei crete.

Febra
La persoanele cu febr mare s-a observat o scdere a glucozei plasmatice i
o cretere a ureei, a urailor urinari i a metabolismului bazal.

Greutatea corporal
S-a constatat faptul c hemoglobina, acidul uric plasmatic, creatinina
plasmatic, ALT-ul i y-glutamil-transferaza cresc cu masa corporal.

Tutunul
Pot exista diferene ntre examenele de laborator la fumtori i
nefumtori. Astfel, pe lng oxihemoglobina care este crescut la fumtori, mai
crete acidul ascorbic n plasm, colesterolul, trigliceridele, glucoza plasmatic,
ionul tiocian n saliv. Recent s-a demonstrat valoarea net crescut a
concentraiei de antigen carcino-embrionar la fumtori fa de nefumtori (de
la 3% la 19%).

Medicamentele
Medicamentele pot influena, de asemenea examenele de laborator ele
ocupnd un loc important n acest domeniu. Variaiile pe care le pot da
medicamentele pot conduce la interpretarea greit a examenelor de laborator i
la un diagnostic eronat.
Medicamentele pot influena analizele de laborator sub dou aspecte:
- un aspect pur analitic: medicamentele i / sau metaboliii acestora
pot perturba sau interfera dozarea unor constitueni biologici.
- un aspect biologic: ele pot provoca modificarea unui parametru
biologic printr-un mecanism fiziologic, farmacologic sau toxicologic.
n analizele de laborator trebuie s se in cont de interferenele analitice
induse de ctre medicamente, ele reprezentnd aproximativ 20% din totalul
interferenelor.
Astfel, ele pot da coloraii similare cu unii constitueni biologici, ca de
exemplu salicilaii care dau cu reactivul Folin aceeai coloraie cu aceea a
acidului uric.
Unele medicamente i / sau metaboliii acestora prezint proprieti
reductoare, ca de exemplu acidul ascorbic care interfer asupra a numeroase
13
dozri a constituenilor biologici care prezint aceleai proprieti (glucoza,
acidul uric, creatinina).
Medicamentele pot aciona asupra enzimelor i proteinelor inhibnd
activitile i proprietile caracteristice ale acestora.
Medicamentele pot forma diferite complexe cu compuii biologici, pot
prezenta fluorescene proprii i pot modifica pH-ul.
Datorit acestor interferene analitice ale medicamentelor trebuiesc
introduse metode care s in cont de aceti factori.
Interferenele biologice sunt dificil de pus n eviden. Totui naintea
introducerii unui medicament n terapeutic se fac cercetri pe animal pentru a
urmri influena acestuia asupra constantelor biochimice, asupra funciei
hepatice, renale, ctc.
n acest sens trebuiesc efectuate n mod obligatoriu examenele hematologice, n
particular observarea elementelor figurate, determinri enzimatice, analiza urinei,
clearence-ul creatininei, etc.
Dar este practic imposibil s se atribuie o variaie a rezultatelor
examenelor de laborator pentru un medicament fr s se in cont i de
variaiile date de vrst, sex, greutate corporal, etc.
Menionm doar cteva interferene biologice care pot s apar datorit
medicamentelor:
- fenomenele competitive de fixare a acestora pe proteine: de exemplu
fenilbutazona deplaseaz anticoagulantele fixate pe proteine, poteneaz aciunea
lor i diminu timpul de protrombin (timpul Quick).
- inhibarea sintezei unor substane n organism: antihipertensivele
diminueaz sinteza catecholaminelor
- o aciune asupra mecanismului de secreie: pot provoca contracia
sfincterului Oddi, modific structurile membranare ducnd la eliberarea de
enzime, etc.
n concluzie este necesar s se cunoasc factorii de variaie biologic a
medicamentelor pentru o mai bun interpretare a examenelor de laborator.














14
II. NOIUNI DE ANALIZ CHIMIC


Analiza chimic const n efectuarea unor reacii chimice n baza crora
urmrim s precizm natura sau cantitatea unei substane. Cnd scopul este de a
determina numai natura compuilor necunoscui avem de-a face cu o analiz
calitativ, iar cnd ne intereseaz s precizm i cantitatea acestora, determinrile
efectuate aparin de domeniul analizei cantitative.
Analiza calitativ prezint importan n scopul evidenirii unor compui
care apar patologic n urin, suc gastric i alte lichide sau materiale biologice. Din
acest punct de vedere se cunoate valoarea pe care o are depistarea glucidelor din
urin.
Analiza cantitativ se poate efectua att la componenii care se gsesc
normal ca i constituieni ai unui lichid biologic (ex. Aciditatea sucului gastric), dar
care datorit anumitor condiii poate s apar crescut sau sczut fa de normal,
ceea ce vine n sprijinul precizrii diagnosticului clinic ct i la stabilirea limitelor
cantitative ale unor compui patologici.

II.1. Noiunea de atom-gram, molecul-gram, echivalent-gram

Atomul-gram reprezint cantitatea n grame dintr-un element, egal numeric cu
masa atomic a elementului. De exemplu:
Cl, M
A
= 35,45, atom-gram =35,45
Na, M
A
= 23, atom-gram = 23

Echivalentul-gram reprezint cantitatea dintr-un element, exprimat n grame,
care se combin cu un atom-gram de hidrogen sau cu jumtate dintr-un atom-gram
de oxigen sau care poate nlocui aceste cantiti de hidrogen sau oxigen din
combinaiile lor.

Molecula-gram (mol) reprezint cantitatea n grame dintr-o substan egal cu
valoarea numeric a masei moleculare a substanei respective.
De exemplu:
Molecula Masa molecular Molecula-gram
Cl
2
70,914 70,914
HCl 36,465 36,465
NaOH 40,010 40,010
Este foarte important ca n calculul echivalentului s inem seama neaprat
de reacia chimic ce are loc, n caz contrar calcularea greit a echivalentului-gram
poate duce la erori foarte mari ale rezultatului analizei. Cantitile de substan care
reacioneaz sau se nlocuiesc ntr-un proces chimic sunt echivalente ntre ele.

Echivalentul-gram la acizi se calculeaz mprind molecula-gram la numrul
atomilor de hidrogen ai acidului, care particip la reacia respectiv.
15
Exemplu:
Eg
HCl
= 36,465/1 = 36,465
Eg H
2
SO
4
= 98,08/ 2 = 49,04
Eg H
3
PO
4
= 98,04/3 = 32,68

Echivalentul-gram la baze se calculeaz mprind molecula-gram la numrul de
grupri hidroxil care iau parte la reacia respectiv.
Exemplu:
Eg
NaOH
= 40,005/1 = 40,005
Eg
Ca(OH)2
= 74,1/2 = 37,05

Echivalentul gram la sruri se calculeaz mprind molecula-gram la cifra care
arat numrul de hidrogeni nlocuii de metal sau cifra obinut prin nmulirea
valenei maxime a ionului metalic prin numrul acestor ioni.
Exemplu:
Eg
FeSO4.7H2O
= 273,01 / 2 = 136,505
Eg
Fe2(SO4)3
= 399,9 / 6 =66,66

Echivalentul-gram n reaciile de oxido-reducere reprezint cantitatea de
substan care reacioneaz cu un echivalent-gram n reacia respectiv.
Exemplu:
MnO
4
-
n care Mn este heptavalent reacioneaz diferit n funcie de mediul
n care are loc reacia. Astfel n mediu puternic acid (acid sulfuric) Mn
+7
primete
5e
-
trecnd n Mn
+2
conform reaciei:

MnO
4
-
+

5
e
-

+

8H
+
Mn
+2

+ 4H2O

Eg
KMnO4
= 158,03 / 5 = 31,606

n mediu slab acid sau neutru are loc reacia:

MnO
4
-
+

3
e
-

+

4H
+
MnO
2

+2H2O

Eg
KMnO4
= 158,03 / 3 = 52,67

n mediu puternic alcalin, permanganatul reacioneaz cu un singur electron
conform reaciei:

MnO
4
-
+

e
-

MnO
4
-2

Eg
KMnO4
= 158,03 / 1 = 158,03

II.2. Soluii. Modul de exprimare a concentraiilor

O soluie este un amestec omogen de dou sau mai multe substane, una
care predomin numit dizolvant, iar cealalt sau celelalte care se disperseaz
16
omogen i se numete dizolvat. Orice soluie care urmeaz s fie folosit ca reactiv
se prepar la balon cotat.
Exprimarea cantitii de substan dizolvat ntr-o soluie la un anumit
volum, poart numele de concentraia soluiei, care se poate exprima n diferite
moduri, i anume:
a. Concentraia procentual reprezint cantitatea de substan exprimat
n grame fie la 100g soluie, fie la 100 ml soluie.
Exemplu: Soluia 2% NaCl conine: 2g NaCl i 98g H
2
O

b. Concentraia molar exprim numrul de molecule-gram dizolvate la
1000 ml de soluie.
Exemplu: Soluia 0,15m NaCl conine: - 0,15 moli NaCl la 1000 ml soluie
- 8,75 g substan la 1000 ml soluie
Trecerea de la concentraia procentual la cea molar se face multiplicnd
prima cu 10 i mprind greutatea molecular a dizolvatului.

c. Concentraia normal exprim numrul de echivaleni-gram dintr-o
substan aflai n 1000ml soluie.
Trecerea de la un tip de concentraie la alta se poate face n felul urmtor:
C
moli/l
= C% x 10 / Eg
C% = Cnormal x Eg / 10
C% = Cnormal x molecula-gram / 10

d. Noiunea de titru i factor
Titrul unei soluii reprezint cantitatea de substan exprimat n
grame, care se gsete dizolvat ntr-un ml de soluie. Soluia al crui titru
se cunoate se numete soluie titrat.
Exemplu: Titrul unei soluii soluii exact normale de NaOH este 0,040005g NaOH.

T = 40,0005 / 1000 = 0,040005g NaOH

Titrul se mai poate deduce din concentraia molar sau normal conform relaiei:

T = M x molecula-gram / 1000
T = N x Eg / 1000

Factorul (F) unei soluii reprezint raportul dintre titrul real i titrul
teoretic.
Exemplu: factorul soluiei de NaOH cu T = 0,0380 este 0,95 deoarece:

F = 0,0380 /0,0400 = 0,95

17
Importana factorului const n simplificarea operaiunilor de calcul n
titrimetrie, prin corectarea valorilor aproximative normale sau decinormale la exact
normale sau decinormale.
Exemplu: Pentru titrarea unei soluii de HCL s-au consumat 7,2 ml de NaOH 0,1N
avnd F = 1,05. Acesta este echivalent cu a folosi 7,2 x 1,05, adic 7,56 ml NAOH
exact 0,1N (adic avnd F = 1,00).
Factorul poate avea valori supraunitare sau subunitare, dar cu ct soluiile
sunt preparate mai corect cu att valoarea lui tinde spre 1, deci titrul real se apropie
ca valoare numeric de titrul teoretic.

II.3. Uniti i moduri de exprimare n laboratorul clinic

Valorile diferitelor analize se raporteaz mai ales sub form de mg/dl pentru
snge, lichid cefalorahidian sau de mg (g) n 24 de ore pentru eliminarea urinar. n
ultimul timp se tinde ns spre un mod de exprimare uniform : mmol/l respectiv
mmol eliminai n 24 de ore.
De un interes deosebit n clinic sunt valorile concentraiilor principalilor
ioni: Na
+
, K
+
, Ca
+2
, Mg
+2
, Cl
-
, HCO
3
-
. Exprimarea acestora se face face cel mai
adesea n mEg/l. O valoare util este i modul de exprimare osmoli, respectiv
mosmoli. Prin osmol se nelege presiunea osmotic generat de o soluie 1M a
unei substane neionizate la 0
0
C la interfaa unei membrane impermeabile pentru
substana dizolvat. n cazul ionizrii se va face suma totalitii ionilor exprimai n
moli.
Pentru enzime i uneori pentru vitamine se utilizeaz nomenclatura de
unitate internaional (U.I. sau U).
Exprimarea rezultatelor obinute n urma diferitelor msurtori se face n
funcie de gradul de sensibilitate i precizie al instrumentelor de msur utilizate.
Un rezultat nu poate conine mai multe cifre dect permite gradul de sensibilitate i
precizie a aparatului utilizat.















18
III. STICLRIA I APARATURA DE LABORATOR

Cilindrii gradai sunt cilindri de sticl sau plastic cu talp sau fr talp,
avnd gradaii corespunztoare volumelor de msurat, n general subdiviziuni ale
volumului maxim ce poate fi msurat cu cilindrul respectiv. Capacitatea cilindrilor
variaz de la 5 ml la civa litri. Ei sunt utilizai n general pentru transferul de
lichide.




Biuretele sunt de dou categorii: manuale i automate. Biuretele automate
sunt tuburi de sticl gradate, care au la partea inferioar un dispozitiv pentru
reglarea scurgerii. Tuburile sunt calibrate pentru diferite volume: 10, 20, 50, 100
ml. Pentru analize microvolumetrice se utilizeaz microbiurete de 1-5 ml. Biuretele
se fixeaz n poziie vertical, pe stative de metal, cu ajutorul unor cleme.



Baloanele cotate sunt baloane de sticl, avnd la captul gtului lif i un
dop rodat, ce permite ntoarcerea balonului pentru amestecarea componentelor din
19
soluie fr pericolul ca lichidul s ias din balon. Baloanele cotate sunt utilizate n
special pentru prepararea soluiilor, motiv pentru care este necesar o exactitate
deosebit ntre volumul de lichid din balon i capacitatea declarat a balonului.
Alte instrumente folosite n laboratorul de biochimie sunt: eprubetele,
paharele Erlenmeyer, paharele Berzelius, balonul cu fund rotund, pipetele, etc.




Msurarea maselor diferitelor cantiti de substane se face prin operaia de
cntrire. Aparatele folosite n acest scop se numesc balane. O balan trebuie s
ndeplineasc criteriile de sensibilitate, precizie i exactitate.
Sensibilitatea unei balane reprezint diferena cea mai mic de mas care
poate fi sesizat cu ajutorul balanei respective.
Precizia unei balane reprezint msura gradului cu care aceasta va
reproduce datele obinute la cteva cntriri succesive ale unuia i aceluiai obiect.
Exactitatea unei balane este dat de apropierea valorilor cntririlor unui
obiect de valoarea sa adevrat.
Balanele pot fi mprite n dou categorii: mecanice i electronice.





20

Pentru efectuarea reaciilor la cald se folosete ca i surs de nclzire:
becul Bunsen, baia de ap, plita electric.






















21
IV. METODE ANALITICE FOLOSITE N BIOCHIMIA MEDICAL I
FARMACEUTIC


Metodele analitice folosite n biochimie se clasific n:
- metode chimice, care se bazeaz pe reacii chimice
- metode fizico-chimice care se bazeaz att pe reacii chimice ct i pe
proprieti fizice
- metode fizice care se bazeaz pe proprieti fizice.


IV.1. METODE VOLUMETRICE DE ANALIZ

Volumetria este o metod de analiz prin care se determin capacitatea de
combinarea a unei substane cu alta prin folosirea unei soluii cu o concentraie
bine definit, denumit soluie titrat.
n funcie de natura reaciilor care stau la baza metodelor volumetrice de
analiz distingem:
- volumetria acido-bazic
- volumetria bazat pe reacii de precipitare
- volumetria bazat pe reacii de oxido-reducere
- volumetria bazat pe reacii de complexare.
Pentru stabilirea punctului de echivalen se folosesc indicatori. Indicatorii
sunt substane care au proprietatea de a-i schimba culoarea n funcie de
modificarea proprietilor soluiei.

IV.1.1. VOLUMETRIA ACIDO-BAZIC


DOZAREA ACIZILOR TARI

Dozarea acizilor tari se bazeaz pe reacia de neutralizare, care const n
dozarea unei soluii acide de concentraie necunoscut cu ajutorul unei soluii
bazice de normalitate sau titru cunoscut. Pentru evidenierea punctului de
echivalen se va utiliza indicatorul potrivit n funcie de specificul reaciei.

Tehnica de lucru
ntr-un pahar Erlenmeyer ce conine 10ml soluie acid de concentraie
necunoscut se adaug 1-2 picturi de metiloranj. Soluia colorat n rou se titreaz
cu NaOH 0,1N pn la apariia culorii portocalii. Se noteaz cu N numrul de ml
NaOH 0,1N folosii la titrare.
Exemplu:
HX + NaOH = NaX + H
2
O

22
M
NaOH
.....................................M
HX
N x T
NaOH
..................................a

a = N x T
NaOH
x M
HX
/ M
NaOH
= g HX / prob


10ml prob.................................... a g HX
100ml soluie.................................b

b = (10 x a) g HX%

O alt modalitate de calcul este cea n care intervine factorul soluiei
utilizate la titrare.

1 ml NaOH 0,1N..................................M
HX
/ 1000 x 0,1 g HX
N x F
NaOH
.....................................................a

a = N x F
NaOH
x M
HX
/1000 x 0,1 g HX / prob

DOZAREA ACIZILOR SLABI
Pentru dozarea acizilor slabi se folosete tot o soluie de NaOH 0,1N dar ca
i indicator se folosete fenolftaleina. n mediu acid fenolftaleina este incolor, iar
punctul de viraj corespunde coloraiei roz. n mediu puternic alcalin fenolftaleina
este roie-violacee.


DETERMINAREA REZERVEI ALCALINE

Echilibrul acido-bazic sangvin este meninut de 3 sisteme:
- Hb.oxigenat- Hb.deoxigenat,
- proteine serice i
- cuplul: Na
2
CO
3
/NaHCO
3.

n laboratorul clinic explorarea se face printr-o metod laborioas, care
permite determinarea parametrilor principali i a echilibrului acido bazic. n scop
orientativ, servete ns o metod titrimetric de dozare a cuplului
carbonat/bicarbonat.
Dozarea cuplului carbonat/bicarbonat se face cu o soluie de HCl 0,1 N. ntr-
o prim etap se dozeaz carbonatul n prezena fenolftaleinei, dup care se dozeaz
ntreaga cantitate de bicarbonat cu o soluie de HCl 0,1 N, n prezena
metiloranjului.

NaCl NaHCO HCl CO Na
3 3 2
+ +
O H CO NaCl HCl NaHCO
2 2 3
+ + +
23
Tehnica de lucru
ntr-un pahar Erlenmeyer peste proba de analizat (10 ml) se adaug cteva
picturi de fenolftalein. Soluia colorat n roz- violet se titreaz cu HCl 0,1 N pn
la roz deschis. Se noteaz cu V
1
ml de HCl 0,1 N utilizai. Se continu apoi
titrarea n prezen de metiloranj pn la culoarea rou portocaliu. Se noteaz cu
V
2
- ml HCl 0,1 N utilizai.
V
1
ml HCl utilizai la dozarea CO
3
-2

V = V
2
- V
1
ml HCl utilizai la dozarea HCO
3
-


Calcul
a Vxf
g 008401 0 ml 1
HCl
NaHCO
N 1 0 HCl 3
.. .......... .......... ..........
, ..... .......... ..........
,

3
NaHCO
g Vf 008401 0 a , =


x ml 1000
g a ml 10
3
NaHCO proba
.......... .......... ..........
..... .......... ..........

l NaCO
3
g a 100 x
/
=


b f V
g 0106 0 ml 1
HCl 1
CO N 1 0 HCl
2
3
. .......... .......... .......... .
, ..... .......... ..........
,


proba CO
HCl 1
2
3
g f V 01066 0 b
/
,

=


y ml 1000
g b proba ml 10
2
3
CO
.. .......... .......... ..........
..... .......... ..........


l g b 100 y
2
3
CO
/

=

Interpretarea rezultatelor
Bicarbonatul actual are valori cuprinse ntre 25 27 mEq/l, iar valoarea
carbonatului este de 1,2mEq. Rezult ca raportul bicarbonat/carbonat este de
aproximativ 20.
24
Sngele uman are n mod obinuit un pH n jur de 7,4. Valori ale pH-ului
sub 7,36 ntlnim n cazul acidozei, iar peste 7,44 n alcaloz. Ambele stri sunt
periculoase i se manifest clinic prin semne de afectare a sistemului nervos.
Meninerea unor limite de +/- 0,04 uniti de pH se face prin 3 mecanisme
principale :
1. capacitatea de tamponare a sistemelor fizico-chimice din plasm i
hematii;
2. controlul respirator al eliminrii CO
2
;
3. reglarea renal a acidifierii urinii.



Primele 2 mecanisme intervin imediat, iar cel de-al treilea dup un interval
de timp mai lung. Principalul sistem tampon n hematii este sistemul
hemoglobin/hemoglin oxigenat, iar n plasm sistemul carbonat/bicarbonat.
Datorit ptrunderii ionului bicarbonat prin membrana hematiilor cele 2 sisteme
sunt legate funcional. n plus datorit reversibilitii reaciei catalizate de una din
cele mai active enzime (anhidraza carbonic), excesul de acid carbonic poate fi
eliminat prin respiraie.
Alcalozele i acidozele se mpart n metabolice i respiratorii.

Acidoza respiratorie apare n condiii de cretere a concentraiei CO
2
ca urmare a
unei deficiene respiratorii (emfizem pulmonar, obstacole pe cile respiratorii, etc.)
i se compenseaz prin stimularea respiraiei.

Acidoza metabolic apare ca urmare a ingestiei accidentale de soluii acide. Se
corecteaz n final prin eliminarea urinar sau prin neutralizarea din sucul gastric al
excesului de acizi.

Alcaloza respiratorie apare ca urmare a hiperventilaiei sau a ingestiei de
bicarbonat. Se corecteaz prin hipoventilaie sau, n clinici, prin respirarea unui
amestec bogat n CO
2
.

Alcaloza metabolic apare ca urmare a ingestiei accidentale de soluii sau sruri
bazice sau n cazul pierderii de acizi prin vrsturi. Se corecteaz prin mecanisme
renale.
Se nelege uor c datorit interveniei sistemelor de compensare n
practic se ntlnesc mai ales tipuri mixte de acidoze i alcaloze. Deoarece sistemul
carbonat/bicarbonat este primul care intervine i se modific relativ uor prin
respiraie, totalitatea CO
2
coninut ca atare sau sub form de bicarbonai n 100
ml plasm exprimat ca ml CO
2
la 0
0
C i la 1 atm, formeaz rezerva alcalin (55-
70 ml n mod obinuit).


anhidraza carbonic
H
+
+ HCO
3
-
CO
2
+ H
2
O
25
ECHILIBRUL ACIDOBAZIC

Concentraia ionilor de hidrogen

Reaciile enzimatice i implicit procesele biologice depind n mare msur
de ionii de hidrogen (H
+
) din mediu.
Concentraia ionilor de hidrogen din lichidele biologice este meninut ntre
35-45 nmol. Valori mai mari dect 120 nmol sau mai mici de 20 nmol sunt de
obicei incompatibile cu viaa. n trecut, [H
+
] a fost descris drept pH, dar acum se
obinuiete mai mult ca rezultatele s fie prezentate n unitile concentraiei
molare, ca nmol/l.


Relaia ntre H
+
i pH

Ionii de hidrogen provin din metabolismul intermediar, n special prin
oxidarea unor aminoacizi ce conin sulf (metionin i cistein), din fosfolipide,
fosfoproteine i nucleoproteine. Totalul de ioni de hidrogen rezultat n fiecare zi
prin metabolizarea a 100 g proteine este de 60 mEq. Dac toat aceast cantitate ar
urma s fie diluat n lichidul extracelular (14 litri), H
+
ar ajunge la 4 mmol/l sau de
100.000 de ori mai acid dect normal ! Acest lucru nu se ntmpl ns, deoarece
ionii de hidrogen produi sunt tamponai i eliminai din metabolismul intermediar,
rezultnd cca. 20000-25000 mEq CO
2
, care n organism se transform rapid n acid
carbonic.
Cnd pCO
2
este 402 mmHg, eliminarea pulmonar a CO
2
este egal cu
producia tisular. O cretere a pCO
2
, asociat sau nu cu o modificare de pO
2
, de
pH sau de concentraie

3
HCO , stimuleaz centrul respirator i prin ventilaie pCO
2

este rapid readus ctre valoarea normal. Stimularea centrului respirator ns, poate
fi produs n anumite condiii numai de scderea de pH, astfel nct normalizarea
acestuia din urm se va obine prin scderea compensatorie a pCO
2
.
26
Sisteme tampon

Sistemul tampon este alctuit dintr-un acid slab (puin disociat) i o sare a
acestui acid cu un cation reactiv. Procesul de tamponare nu nseamn i o
ndeprtare din organism a ionilor de hidrogen. Mai degrab, el cur n mod
provizoriu ionii de hidrogen produi n exces, n acelai mod n care un burete
absoarbe apa. Sistemul tampon este o rezolvare numai pe termen scurt a excesului
de ioni de hidrogen. Organismul elimin ionii de hidrogen pe cale renal, digestiv,
cutanat.
Principalele sisteme tampon pentru a menine echilibrul acidobazic constant
din snge sunt:
1. Sistemul H
2
CO
3
/NaHCO
3

2. Sistemul NaH
2
PO
4
/Na
2
HPO
4

3. Sistemul hemoglobin acid/oxihemoglobinat de K
4. Protein acid/proteinat de Na.
Cnd sistemele tampon simple ajung rapid la echilibru devenind ineficace,
aa cum este asocierea ionului de hidrogen cu anionul acidului slab, sistemul
bicarbonat pstreaz funcionalitatea n continuare deoarece acidul carbonic este
ndeprtat sub form de bioxid de carbon. Limita eficacitii sistemului bicarbonat
este concentraia iniial de bicarbonat. Doar cnd tot bicarbonatul este epuizat n
procesul de neutralizare a unor acizi rezultai n urma metabolismului i scade
capacitatea de tamponare. Evaluarea echilibrului acidobazic al pacientului se face
lund n considerare sistemul bicarbonat din snge.
Asocierea ionului de hidrogen cu bicarbonat are loc rapid, dar
descompunerea acidului carbonic la bioxidul de carbon i ap decurge foarte ncet.
Anhidraza carbonic din eritrocite i rinichi accelereaz reacia. Sistemul tampon
bicarbonat ndeprteaz eficient ionul de hidrogen din spaiul extracelular. Bioxidul
de carbon, care se formeaz se elimin la nivelul alveolelor pulmonare iar apa
rezultat intr n constituirea apei totale din corp. Spaiul extracelular conine o
cantitate mare de bicarbonat, cca. 24 mmol/l. Dac ionii de hidrogen ncep s
creasc dintr-un oricare motiv, concentraia de bicarbonat scade imediat ce sistemul
tampon ncepe s funcioneze.

Reglarea eliminrilor renale a ionilor de hidrogen

Ionii de hidrogen, tamponai, sunt eliminai din organism pe cale renal iar,
bicarbonatul reabsorbit reface sistemul tampon.
La nivelul rinichilor este absorbit ntreaga cantitate de ioni de bicarbonat
n strile de alcaloz. Astfel CO
2
ajuns odat cu sngele la rinichi, sub influena
anhidrazei carbonice formeaz H
2
CO
3
, care se ionizeaz punnd n libertate

3
HCO
i H
+
. Ionul

3
HCO difuzeaz din nou n snge, iar ionii H
+
trec n lumenul tubului
contort, unde ntlnesc ionii

3
HCO existeni n urina primar, formnd H
2
CO
3
. La
nivelul tubilor contori distali o parte din ionii H
+
difuzeaz n lumenul tubular
27
unde nlocuiesc n molecula fosfatului disodic un ion de Na
+
, care va fi reabsorbit.
Astfel fosfatul disodic se transform n fosfat monosodic care se elimin prin urin
(Fig. 1.).

Fig. 1. Recuperarea i regenerarea bicarbonatului
prin excreia H
+
la nivelul celulelor tubilor renali


28
Msurarea echilibrului acidobazic

Un indicator asupra echilibrului acidobazic poate fi obinut msurnd
componentele sistemului tampon bicarbonat.
n termeni chimici, sistemul tampon bicarbonat poate fi considerat n
acelai mod ca i oricare alt disociere chimic.

[H
+
]+[

3
HCO ][H
2
CO
3
]

n baza legii maselor:
[H
+
]=K[H
2
CO
3
,]/

3
HCO , unde K este prima constant de disociere a acidului
carbonic.
Dar componenta acidului carbonic este raportat cu bioxidul de carbon
dizolvat. CO
2
dizolvat este proporional cu presiunea parial CO
2
. ntr-adevr,
legea lui Henry arat c [CO
2
] n soluie = s.PCO
2
unde s este solubilitatea gazelor
n ap.
n consecin [H
2
CO
3
] poate fi nlocuit n ecuaia de mas cu pCO
2
. O
nelegere a rolului sistemului tampon bicarbonat n explorarea echilibrului
acidobazic poate fi realizat prin referirea la relaia [H
+
] care este proporional la o
anumit pCO
2
/[

3
HCO ] i demonstreaz c nivelul ionilor de hidrogen n snge
variaz la modificarea concentraiei de bicarbonat i pCO
2
.
Dac n rest totul rmne constant:
Adausul ionilor de hidrogen, ndeprtarea bicarbonatului sau creterea pCO
2
, va
avea drept rezultat o cretere a [H
+
].
ndeprtarea ionilor de hidrogen, adugarea bicarbonatului sau scderea pCO
2

va avea ca efect scderea [H
+
].
Concentraia normal a [H
+
] are valoarea de 40 nmol i este meninut n
aceast limit prin funcionarea normal a respiraiei i a rinichilor.

Tulburri ale echilibrului acidobazic

Orice perturbare a homeostaziei ionilor de hidrogen, va afecta sistemul
tampon bicarbonat/acid carbonic.
Atunci cnd se modific concentraia bicarbonailor apar anomalii de
cauz metabolic: - n diabetul zaharat metabolismul intermediar este perturbat. n
absena insulinei vor fi utilizai acizi grai. Ca urmare se acumuleaz n organism
att acid acetilacetic ct i acid beta-hidroxibutiric care vor nlocui bicarbonaii
consumai n tamponarea ionilor de hidrogen disociai din aceti acizi.
- pierderi de bicarbonai din spaiul extracelular pot s mai
apar n condiiile existenei unei fistule duodenale.
Anomalii de cauz respiratorie se semnaleaz atunci cnd se modific
pCO
2
. Alterarea funcie respiratorii determin creterea pCO
2
n snge iar,
hiperventilaia duce la scderea pCO
2
.
29
Compensare

n dereglrile de cauz metabolic a echilibrului acidobazic, mecanismele
compensatorii se exercit la nivelul plmnilor afectnd pCO
2
care se modific n
acelai sens cu bicarbonatul, scznd n acidoze i crescnd (ineficient) n alcaloze.
Mecanismele de compensare respiratorie au efecte imediate.
n dereglrile de cauz respiratorie, mecanismele compensatorii se
realizeaz la nivel renal prin reglarea reabsorbiei bicarbonailor. Aceste
mecanisme sunt cu efecte ntrziate. Astfel c dac efortul de compensare nu
readuce concentraia ionilor de hidrogen n limite fiziologice, pCO
2
i [

3
HCO ]
rmn modificate. Reaciile compensatorii pot corecta parial sau total valorile pH,
dar [

3
HCO ] i respectiv pCO
2
rmn anormale pn la corectarea anomaliei
primare.
n funcie de modificrile suferite de pH, alcalozele i acidozele pot fi
compensate sau decompensate.
Acidozele i alcalozele sunt termeni clinici care definesc tulburarea
acidobazic primar. Ei pot fi utilizai chiar i cnd concentraia [H
+
] este n limite
normale, de exemplu cnd anomaliile sunt total compensate. Se pot distinge:
1. Acidoze metabolice - anomalia primar este o scdere a concentraiei de
bicarbonat.
2. Alcaloza metabolic - anomalia primar este concentraia de bicarbonat
crescut.
3. Acidoza respiratorie - anomalia primar este creterea pCO
2
.
4. Alcaloza respiratorie - anomalia principal este scderea pCO
2
.

Acidemia i alcalinemia se refer la concentraia de[H
+
] din snge,
reprezentnd o valoare crescut sau sczut fa de normal. Aceti termeni nu sunt
frecvent folosii.



Tulburri ale echilibrului acidobazic de cauz metabolic

Anomaliile de cauz metabolic a echilibrului acidobazic se oglindesc n
schimbrile concentraiei de bicarbonat din spaiul extracelular care se datoreaz
creterii sau scderii concentraiei de ioni de hidrogen. Scderea sau creterea
bicarbonailor va realiza o anomalie de cauz metabolic (Fig. 2.).
Mecanismele de compensare respiratorii intr repede n aciune, aa c la
pacieni cu anomalii metabolice pCO
2
din snge este modificat ca urmare a hipo-
sau hiperventilaiei.

30


Fig. 2. Identificarea tulburrilor metabolice acidobazice
prin urmrirea concentraiei de

3
HCO


Acidoza metabolic

ntr-o acidoz metabolic principala problem este scderea concentraiei
de bicarbonat din spaiul extracelular (Fig. 3.). Aceasta se datoreaz:
1. Cantitii crescute de ioni de hidrogen.
2. Aport de ioni de hidrogen, sau medicamente, care sunt metabolizate la
acizi.
3. Diminuarea excreiei de ioni de hidrogen pe cale renal.
4. Pierderea de bicarbonai pe cale gastrointestinal sau urinar.


31


Fig. 3. Mecanismele de compensare n tulburrile metabolice primare

Cauzele acidozei metabolice
1. Boli renale: ionii de hidrogen sunt reinui mpreun cu anionii, ca de
exemplu sulfatul i fosfatul.
2. Acidocetoza diabetic: exagerarea utilizrii acizilor grai, ca o consecin
a lipsei de insulin, determin producia endogen de acid
acetilacetic i beta hidroxibutiric.
3. Acidoza lactic: aceasta rezult dintr-o serie de cauze, n special din
esutul anoxic. n strile acute de hipoxie, ca de exemplu
insuficiena respiratorie sau stopul cardiac, acidoza lactic
apare n cteva minute punnd viaa n pericol. Poate s
apar i n boli hepatice. Prezena acidozei lactice poate fi
evideniat prin msurarea concentraiei plasmatice a
lactatului.
4. Intoxicaii sau supradozaj medicamentos: mecanismul este comun i
const n producia de metabolii acizi - supradoz de
salicilai, intoxicaii cu etilen glicol.
5. Diareea cronic sau fistula intestinal
6. Acidoza tubular renal: celulele tubulare renale sunt incapabile s
elimine ionii de hidrogen eficient i bicarbonatul se pierde
prin urin.
32
Manifestrile clinice ale acidozei

Rspunsul compensator la acidoza metabolic este hiperventilaia, atunci
cnd creterea [H
+
] servete drept un stimulent puternic pentru centrul respirator.
Respiraia Kussmaul este profund, rapid i zgomotoas, fiind ntlnit n
acidoze. Hiperventilaia este rspunsul fiziologic la acidoz i se instaleaz rapid.
Prezena hiperpotasemiei, care nsoete acidoza poate mri riscul aritmiilor
cardiace care pot conduce la stop cardiac. Apar tulburri ale contienei ce pot duce
la com i deces.

Alcaloza metabolic

Cauzele alcalozei
1. Pierderea de ioni de hidrogen n cursul vrsturilor este ntlnit n cazul
pacienilor cu stenoz piloric. Obstrucia dintre stomac i duoden face ca
pierderile de H
+
s nu fie nsoite de o pierdere de bicarbonai, iar dac nu survine o
eliminare rapid a acestora la nivelul rinichilor se va instala o alcaloz metabolic
(Fig. 3)
2. Administrarea terapeutic a unei cantiti mari de bicarbonat sub form
de infuzii intravenoase sau chiar pe cale oral, poate depi capacitatea de
eliminare renal.
3. Pierderi de potasiu. n pierderile severe de potasiu, adesea o consecin a
terapiei cu diuretice, ionii de hidrogen sunt reinui n celule pentru a nlocui lipsa
ionilor de potasiu. La nivelul tubului renal sunt eliminai mai muli ioni de
hidrogen dect de potasiu. Sodiul nu poate ptrunde n celule ca s nlocuiasc
deficitul de potasiu. n ciuda alcalozei, urina este acid. Aceasta este aciduria
paradoxal.

Manifestrile clinice ale alcalozei
Efectele clinice ale alcalozei includ hipoventilaie, pierderea contienei i
n cele din urm com. Crampele musculare, tetania i paresteziile pot fi o
consecin a scderii concentraiei de calciu plasmatic, care este o consecin a
alcalozei.

Acidoza respiratorie

n tulburrile echilibrului acidobazic de cauz respiratorie apar modificri
datorate pCO
2
n snge (Fig. 4.).
Tulburrile funciei respiratorii sunt n legtur cu schimbrile ventilaiei
pulmonare, sau modificrile funciei alveolare care afecteaz transportul CO
2
sau
O
2
la nivelul membranei alveolare (schimbul de gaze). n ambele cazuri pCO
2
se
modific i concentraia de acid carbonic crete sau scade.

Acidoza respiratorie poate s fie acut sau cronic.
33
Forma acut apare n cteva minute sau ore i este decompensat.
Mecanismele compensatorii renale care regleaz reabsorbia de bicarbonai sunt
eficiente complet doar n 48-72 h.
Problema principal n acidoza respiratorie acut este hipoventilaia
alveolar.


Fig. 4Tulburri acidobazice respiratorii primare recunoscute
prin urmrirea pCO
2


Principala manifestare clinic a acidozei respiratorii const n alterarea
strii de contien, obnubilare mergnd pn la com i poate duce chiar la deces.
Exemple de acidoz respiratorie acut sunt:
obstrucia acut a cilor respiratorii
bronhopneumonia.
criza de astm.
Acidoza respiratorie cronic este, de obicei, o stare de lung durat i
tulburarea este compensat pe cale renal. Problema principal i n aceast situaie
este diminuarea ventilaiei alveolare. Modificrile pot fi compensate parial sau
complet. La nivelul tubilor renali excreia ionilor de hidrogen crete, cu generarea
bicarbonailor. Concentraia sanguin a [H
+
] are tendine de normalizare.

34

Fig. 5.Intervenia mecanismelor renale
de reglare a acidozei respiratorii primare


Exist un interval de cteva zile necesare de la apariia tulburrii pentru ca
rinichii s rspund la nivelul crescut de pCO
2
i [H
+
] (Fig. 5.). La muli pacieni cu
afeciuni respiratorii cronice, mecanismele renale compensatorii vor pstra
concentraia sanguin a [H
+
] aproape de normal, n ciuda micorrii ventilaiei
pulmonare. n strile stabile de bronit cronic [H
+
] este n limite normale cu toate
c pCO
2
are valori crescute. Acest lucru este realizat numai meninnd o
concentraie de bicarbonai de dou ori mai mare dect cea normal. pO
2
este de
obicei sczut, i scderea se accentueaz pe msur ce afeciunea pulmonar
evolueaz n timp.
Exemple de afeciuni cronice respiratorii sunt: - emfizemul,
- bronita cronic.

Alcaloza respiratorie

Alcaloza respiratorie este mai puin frecvent dect acidoza. Poate s apar
ca urmare a unei respiraii accelerate i cnd efortul compensator renal are o
eficien limitat.
Tratamentul are drept scop nlturarea cauzei care a determinat
hiperventilaia cu revenirea la normal a echilibrului acidobazic. Exemple sunt:
- criza de isterie,
- respiraia asistat,
- leziuni tumorale
- intoxicaii
- afeciuni cardiace etc.

Tulburri acidobazice mixte
O tulburare acidobazic este considerat mixt cnd este produs de
intervenia a cel puin doi factori etiologici ce acioneaz concomitent.
Unii bolnavi pot s aib ambele tipuri de dezechilibre: acidoz metabolic
35
i respiratorie, ca n bronitele cronice cu deteriorarea funciei renale. Concentraia
[H
+
] crete, pCO
2
de asemenea, iar bicarbonaii vor avea valori sczute.
Tulburrile care intervin pot fi convergente (aditive pe modificarea de pH)
sau pot fi divergente (modific pH n sens opus).
Poate exista o acidoz metabolic i o alcaloz respiratorie coexistent, cum
apare n intoxicaiile cu salicilai.
Alcaloza mixt, metabolic i respiratorie apare n unele situaii ca de
exemplu: - la bolnavii hepatici tratai cu diuretice,
- tratament cu diuretic la un bolnav cu metastaze osoase,
- ventilaie asistat la bolnavi ce au pierdut ioni de H
+
prin vrsturi.
Alcaloza respiratorie cu acidoz metabolic poate apare n insuficiena
renal cu stare septic, oc septic.
Acidoza respiratorie cu alcaloz metabolic se ntlnete ntr-o boal
pulmonar cronic cu hipoventilaie alveolar cruia i s-a administrat un tratament
diuretic masiv.

Explorarea echilibrului acido-bazic

Explorarea echilibrului acido-bazic se poate efectua din sngele arterial i
venos. Recoltarea se face n seringi ce conin heparin. Puncia arterial este
neplcut pentru pacient, astfel c recoltarea poate fi limitat la cteva situaii cum
ar fi evaluarea pO
2
, dac pacientul este respirat artificial, dac se suspicioneaz o
exacerbare a unei boli pulmonare cronice etc.
Determinrile de pH i de bicarbonai se fac cu ajutorul unor analizoare
automate. Se msoar astfel pH-ul, presiunile pariale de oxigen i de bioxid de
carbon i pornind de la aceti parametri se pot calcula i:
Bazele exces care reprezint cantitatea de acizi sau baze care ar putea restabili
echilibrul acido-bazic ntr-un litru de snge la un pCO
2
de 40 mmHg. Valoarea
normal este ntre +2,3 i -2,3 nmoli/l sau mEq/l.
Bazele tampon reprezint suma anionilor tampon din snge (proteine,
bicarbonai, hemoglobin) care pot accepta H
+
. Valoarea normal este de 47
nmoli/l pentru un coninut de 15 g/dl de hemoglobin.
Bicarbonatul real care reprezint coninutul de bicarbonat din sngele
bolnavului la pCO
2
existent. Valoarea normal este ntre 24-27 nmoli/l.
Coninutul total de CO
2
este o sum a bicarbonatului real adunat cu produsul
ntre pCO
2
i factorul 0,03.
Bicarbonatul standard este coninutul de bicarbonai al sngelui dac pCO
2
ar fi
40 mmHg.
pH-ul standard indic valoarea pH dac pCO
2
ar fi 40 mmHg.
Dozarea concentraiei de potasiu este de asemenea important n explorarea
echilibrului acido-bazic.
Corectarea echilibrului acido bazic se efectueaz n funcie de etiologie i
de mecanismul de producere a anomaliei.
36
IV.1.2. DETERMINRI VOLUMETRICE PRIN REACII DE
PRECIPITARE

Reaciile de formare de precipitate sunt numeroase i sunt folosite pe scar
larg n titrimetrie. Din acest tip de reacii mai des sunt folosite cele bazate pe
precipitarea halogenurilor cu o soluie de AgNO
3
. Acest tip de volumetrie se
numete argentometrie.
Argentometria cuprinde metodele de dozare ale ionilor de halogen ( I
-
, Br
-
,
Cl
-
) i a unor combinaii organice, cu ajutorul unor soluii de AgNO
3
cu titru sau
factor cunoscut.

DOZAREA CLORURILOR ( METODA MOHR )

Principiul metodei
Clorurile sunt precipitate n mediu neutru sau slab acid sub form de clorur
de argint cu o soluie de azotat de argint de normalitate cunoscut. Ca indicator se
folosete cromatul de potasiu care n prezena unui exces de azotat de argint va da
un precipitat rou de cromat de argint (n soluie fiind att clorura de argint,
precipitat alb, ct i cromat de argint, precipitat rou, va apare o nuan crmizie).




Reactivi :
1. AgNO
3
0,1 N
2. K
2
CrO
4
10%
Tehnica determinrii :
ntr-un vas Erlenmeyer se pipeteaz 10 ml urin i 1 ml indicator. Se titreaz
din biuret cu o soluie de AgNO
3
0,1 N pn la culoare crmizie. Se noteaz cu
N numrul de ml de azotat de argint folosit la titrare.
Calcul: concentraia clorurilor n urin se exprim n grame NaCl la litru.

x f N
NaCl g 058 0 N 1 0 AgNO ml 1
3
AgNO
3
..... .......... .......... .......... .
. ..... .......... .......... ,


proba g 058 0 Nf x
NaCl AgNO
3
/ , . =

Interpretarea rezultatelor
Valori normale: n cazul unei diete obinuite, la subiecii sntoi,
cantitatea de cloruri eliminat n 24 de ore, este cuprins ntre 10-15g.
Variaii fiziologice: dup cteva zile de regim hipoclorurat, cantitatea
clorurilor urinare scade la valori sub 1g/24 de ore i invers, n cazul unui regim
hiperclorurat, crete peste valorile normale.
NaCl + AgNO
3
2AgNO
3
+ K
2
CrO
4
AgCl + NaNO
3
Ag
2
CrO
4
+ 2KNO
3
37
Valori patologice: - hiperclorurii - n cazuri de poliurie,
- crize postinfecioase
- hipoclorurii apar n: - pneumonii,
- formarea edemelor,
- boli febrile acute,
- insuficien cardiac,
- ocluzie intestinal,
- diferite leziuni renale.


IV.1.3. DETERMINRI VOLUMETRICE PRIN REACII DE
OXIDO-REDUCERE

Reaciile de oxidoreducere constituie o surs important pentru metodele de
analiza biochimic. Ca exemple de reacii de oxido-reducere folosite n biochimie
ntlnim: dozarea calciului urinar, dozarea acidului uric din urin, determinarea
indicelui de iod al grsimilor, etc.

DOZAREA CALCIULUI URINAR
Principiul metodei
Calciul se precipit sub form de oxalat de calciu cu o soluie de oxalat de
amoniu, mpiedicnd precipitarea Mg prin adugarea clorurii de amoniu. Prin
tratare cu acid sulfuric, oxalatul de calciu pune n libertate acidul oxalic care se
trateaz cu o soluie de permanganat de potasiu, la baz stnd o reacie de oxido-
reducere.
Reactivi:
1. soluie saturat de oxalat de amoniu;
2. soluie amoniac 2%
3. soluie de H
2
SO
4
2N
4. soluie de KMnO
4
0,01N
5. urin.







Tehnica de lucru:
Se pipeteaz ntr-o eprubet 2 ml urin i se adaug 5 ml soluie saturat de
oxalat de amoniu. Se omogenizeaz bine i se las n repaus la temperatura camerei
timp de 30 de minute. Dup aceasta se centrifugheaz i se ndeprteaz lichidul
CaCl
2
+ 2H
4
NOOC - COONH
4
(COO)
2
Ca + H
2
SO
4
(COOH)
2
+ 2KMnO
4
+ 3H
2
SO
4

2NH
4
Cl + (COO)
2
Ca
CaSO
4
+ HOOC - COOH
2MnSO
4
+ K
2
SO
4
+ 8H
2
O + 10CO
2
38
clar de deasupra, iar precipitatului rmas i se adaug 4 ml soluie NH
3
2% pentru
splare. Se centrifugheaz i se repet splarea de 3 ori cu cte 5 ml ap distilat.
Dup ultima splare, peste precipitatul rmas se adaug 2 ml de H
2
SO
4
2N
i se nclzete soluia pe baie de ap la 80
0
C timp de 15 minute.
Soluia cald se titreaz cu KMnO
4
0,01N pn la culoarea slab roz, care
trebuie s persiste minimum 1 min. n paralel se lucreaz i o prob n alb, identic
cu proba de cercetat, urina fiind nlocuit cu ap distilat i titrnd tot cu o soluie
de KMnO
4
0,01 N.

Calcul:
x f V
g 0002 0 N 01 0 KMnO ml 1
4
KMnO
Ca 4
.......... .......... .......... .......... .
, ..... .......... .......... ,

proba g Vf 0002 0 x
Ca
/ , =
2 1
V V V =

V
1
ml KMnO
4
utilizai la titrarea probei de analizat
V
2
- ml KmnO
4
utilizai la titrarea probei n alb

y ml 100
g x ml 2
urina
Ca proba
.. .......... ..........
..... .......... ..........

Ca
g V 01 0 V 0002 0 50 x 50 y , , . = = =

Valorile normale ale calciului urinar sunt cuprinse ntre 0,14 0,20 g/24 de ore.
Variaii patologice :
Valori crescute apar n: - hiperparatiroidism,
- osteoporoze,
- metastaze osoase,
- acidoze tubulare,
- intoxicaii cu vitamina D,
- hipercalcemie.
Valori sczute se ntlnesc n: - insuficiene renale avansate,
- hiperparatiroidie,
- sarcin,
- anumite osteopatii.

DETERMINAREA INDICELUI DE IOD AL GRSIMILOR

Indicele de iod (Hubl) reprezint cantitatea (n g) de iod care se adiioneaz
la 100 g grsime.
39
Determinarea indicelui de iod se face lsnd s acioneze asupra unei
cantiti de grsime cunoscut o cantitate definit de halogen i titrnd excesul de
halogen nereacionat.

Determinarea indicelui de iod cu reactivul HANUS

Principiu :
Grsimile dizolvate n cloroform sau tetraclorur de carbon adiioneaz la
nivelul dublelor legturi a acizilor grai, iodura de brom. Excesul de BrI n prezen
de KI pune n libertate I
2
care se titreaz cu tiosulfat de sodiu.






Reactivi:
1. ulei sau grsime;
2. Reactiv Hanus (BrI) : se dizolv 13 g iod pulverizat n puin acid acetic
glacial, se adaug 8 g brom i se completeaz cu
acid acetic glacial la 1000 ml;
3. Na
2
S
2
O
3
0,1 N;
4. KI (cristale sau soluie 10% n ap distilat);
5. Soluie de amidon 1% n ap distilat;
6. Solveni organici, de ex.: cloroform;
Tehnica de lucru :
ntr-un vas Erlenmeyer se cntresc aproximativ 0,15 1g grsime. n cazul
uleiului se pipeteaz 0,1 ml i se adaug 5 ml cloroform i 5 ml reactiv Hanus. Se
recomand nchiderea balonului cu un dop de sticl rodat, plut sau vat i se las n
repaus timp de 15 min, agitnd din cnd n cnd. Se adaug 5 ml soluie de KI 10%
i se titreaz cu tiosulfat de sodiu n prezena amidonului ca indicator, pn la
dispariia coloraiei albastre i se noteaz numrul de ml cu n.
n paralel se efectueaz i o prob martor care conine 5 ml reactiv Hannus,
5 ml soluie KI 10% i amidon care se titreaz cu tiosulfat de sodiu 0,1 N pn la
dispariia culorii albastre a indicatorului i n care se noteaz cu N numrul de ml
de tiosulfat utilizai la titrare.
Calcul:
0,0127 echivalentul n iod pentru solutia de Na
2
S
2
O
3
0,1 N

( )
g
100 0127 0 n N
Indice
2
I
. , .
=
unde g reprezint cantitatea de grsime cntrit.
n cazul uleiului care a fost msurat cu pipeta se va face corecia necesar
innd cont de densitatea uleiului.
R - CHI - CHBr - R'
I
2
+ KBr
2NaI + Na
2
S
4
O
6

R - CH = CH - R' + BrI
BrI + KI
I
2
+ 2 N
2
S
2
O
3
40
Interpretare :
Indicele de iod ofer informaii asupra gradului de nesaturare al acizilor
grai respectivi din grsime. Cu ct indicele de iod este mai mare, cu att grsimea
conine o proporie mai mare de acizi grai nesaturai.

IV.1.4. VOLUMETRIA PRIN REACII DE COMPLEXARE


DOZAREA CALCIULUI CU EDTA

Calciul n prezena de EDTA i a murexidului ca indicator formeaz un
complex chelat, complexonatul de calciu, colorat n violet. Iniial murexidul
fixeaz calciul, culoarea soluiei devenind roz, iar la titrare cu EDTA, indicatorul
este eliberat i soluia se coloreaz n violet.











Reactivi:
1. EDTA 0,01 M
2. NaOH 0,1N
3. Murexid
Tehnica de lucru
ntr-un pahar Erlenmeyer se introduc 10 ml urin deproteinizat, 10 ml
NaOH 0,1 N i cteva cristale de murexid. Soluia colorat n roz se titreaz cu
EDTA 0,01 M pn la virajul soluiei de la roz la violet. Se noteaz cu N- numrul
de ml de EDTA folosii la titrare.
Calcul
x f N
gCa 0004008 0 M 01 0 mlEDTA 1
EDTA
........ .......... .......... .
, ........ .......... ,


proba Ca g 0004008 0 f N x
EDTA
/ . . . =
CH
2
N
CH
2
-COO
-
CH
2
-COO
-
Ca
+2
Ca
CH
2
-COO
-
CH
2
-COO
-
N CH
2
CH
2
N
CH
2
-COO
-
CH
2
-COO
CH
2
-COO
-
CH
2
-COO
N CH
2
41

y ml 1000
Ca g x proba ml 10
..... .......... .......... ..........
....... .......... ..........

proba Ca g 04008 0 f N x 100 y
EDTA
/ , . . = =

Interpretarea rezultatelor
Cantitatea de calciu urinar eliminat n 24 de ore este cuprins ntre 0,07
0,3 g/24 de ore.
Cantiti crescute apar n: - hiperviatminoza D,
- hiperparatiroidism,
- osteoporoz
- dup fracturi.
Cantiti sczute ale calciului urinar apar n: - rahitism,
- hipoparatiroidism,
- spasmofilie etc.


IV.2. METODE OPTICE DE ANALIZ

IV.2.1.METODE SPECTROSCOPICE DE ANALIZ

Metodele spectroscopice de analiz se bazeaz pe determinarea i
interpretarea spectrelor de absorbie i de emisie.

Legea absorbiei radiaiilor
Analiza spectroscopic care urmrete determinarea de concentraii are la
baz dou legi fundamentale. Aceste legi se aplic n cazul modificrii puterii
radiante a unei radiaii monocromatice odat cu modificarea grosimii stratului
strbtut de radiaie i modificarea concentraiei.
Prima din legile absorbiei radiaiilor este atribuit lui Bouguer-Lambert i
afirm c pe msur ce crete grosimea unei probe absorbante, intensitatea radiaiei
transmise prin prob descrete.
Dependena absorbiei de concentraie se exprim prin legea lui Beer:
coeficientul de extincie este proporional cu concentraia.
Din combinarea celor dou legi rezult legea lui Bouguer-Lambert-Beer.

A = a x c x b, unde:
a = absorbitivitatea
c = concentraia
b = grosimea stratului
A = absorbana
42
Absorbitivitatea reprezint extincia unei soluii avnd concentraia de
1gram/litru la o grosime de strat de 1 centimetru.
Msurtorile de absorbie de radiaie se utilizeaz pentru determinri de
concentraii. Determinarea concentraiei substanelor pe baza absorbiei n vizibil,
n particular (reacii de culoare) se poate practica n urmtoarele situaii:
- substana de cercetat are o absorbie (culoare) proprie
- substana n urma unei sau a unor reacii conduce la un compus care
absoarbe (colorat)
- substana elibereaz un compus care absoarbe (colorat) n urma reaciei
- substana de analizat interacionnd cu o substan absorbant (colorat)
face s dispar din aceasta o anumit cantitate.


Stabilirea spectrului de absorbie al cianhemoglobinei

Principiu
Fericianura de potasiu oxideaz Fe
+2
din hemoglobin la Fe
+3
. Aceasta face
ca toate felurile de hemoglobin din snge (exceptnd verdohemoglobina) s treac
n methemoglobin, iar methemoglobina pe msur ce se formeaz, se combin cu
cianura de potasiu trecnd n cianmethemoglobin, derivatul de hemoglobin cel
mai stabil.
Reactivi:
1. Reactivul Drabkin: 0,14g fosfat monopotasic, 0,2g KCN i ap distilat
ad. 1000ml (pH = 6,4). Soluia se pstreaz n flacoane de sticl brun bine nchise.
Se pstreaz la frigider timp de 2 luni.
2. Standard de cianmethemoglobin.
Tehnica de lucru
n dou eprubete de hemoliz se pipeteaz cte 5 ml reactiv Drabkin. n una
din eprubete se pipeteaz cu o micropipet 0,02 ml soluie standard de
hemoglobin, iar n cealalt se pipeteaz 0,02 ml snge (venos sau capilar).
Se omogenizeaz eprubetele prin agitare, apoi dup 20 de minute se citete extincia
probei de analizat i a probei standard fa de proba n alb (ap distilat) la 540 nm.
Calcul:
hemoglobina/100ml ser = Ep/Es x 13 ,unde 13 = conc standardului

Observaii:
- pH-ul trebuie s fie 7,2-7,5. La pH acid, precipit proteinele, iar la pH
alcalin, precipit lipidele.
Valorile normale sunt:
- femei: 11 15g/100ml ser
- brbai: 13-17g/100ml ser.

43
IV.2.2.METODE FLAMFOTOMETRICE DE ANALIZ

n contextul necesitii determinrilor electroliilor n mod curent, metodele
chimice nu ar fi fcut fa numrului mare de analize. Fa de 1-2 ore ct dura o
metod chimic, flamfotometria permite determinri ce dureaz mai puin de un
minut i cu precizie mult mai mare.
Principiul flamfotometriei se bazeaz pe capacitatea unor elemente chimice
ca prin introducerea lor n flacr neluminoas s emit lumin la o lungime de
und caracteristic atomilor respectivi. Atomii acestor elemente trec, datorit
energiei termice a flcrii, ntr-o stare excitat, revenind spontan apoi la nivelul
iniial, fundamental, dar emind surplusul de energie sub form de lumin, la o
lungime de und caracteristic, de exemplu 589 nm pentru sodiu. n anumite limite,
cantitatea de lumina emis, este proporional cu concentraia atomilor introdui n
flacr, cu condiia aspirrii soluiei de analizat cu o vitez constant. Cantitatea de
lumin mai variaz n funcie de temperatura flcrii. Att aspirarea soluiei de
analizat, ct i debitul gazelor care ntrein flacra trebuiesc ntreinute riguros
constant.
Lungimea de und caracteristic fiecrui element de analizat este
monitorizat printr-un sistem de prisme i filtre specific fiecrui tip de
flamfotometru. Intensitatea luminii emise este msurat printr-o fotocelul cuplat
cu un aparat adecvat de msurat. Curentul electric obinut va permite citirea
concentraiei elementului chimic n mv sau direct n miliechivaleni, n funcie de
tipul aparatului. Determinrile se fac intercalnd obligatoriu un standard din
elementul de msurat. La calibrarea metodei, trebuie verificat domeniul liniar al
relaiei dintre intensitatea luminii emise i concentraia elementului n condiiile
experimentale constante de temperatur i debit al gazelor.
Prezena unui element ntr-o cantitate mare poate interfera cu msurarea
concentraiei altui element, cum este cazul determinrii potasiului n prezena unor
concentraii mari de sodiu. La aparatele moderne, se minimalizeaz acest efect, dar
oricum standardele de potasiu trebuie s conin i o concentraie de sodiu
cunoscut, asemntoare aceleia obinut prin diluarea serului: 140 mEq/l Na i 5
mEq/l K, iar n urin 50 mEq/l pentru fiecare.
Procedeul de utilizare al flamfotometrelor este simplu i difer de tipul
aparatului. n general, amestecul de propan i aer produce o flacr cu o
temperatur de 1900-2000
0
C, dar cu alte gaze se obin temperaturi mai mici
insuficiente pentru msurarea altor elemente. Indiferent de tipul aparatului, toate
necesit folosirea unui standard intern. Acesta const dintr-o concentraie cunoscut
dintr-o sare de litiu sau cesiu, care se adaug standardelor i martorului, tocmai n
scopul evitrii interferenelor. Aparatele moderne permit determinarea simultan a
sodiului, potasiului i litiului. Toate lichidele biologice, n care se msoar
elementele anorganice sunt diluate 1:100 sau 1:200 cu ap deionizat i cu un
standard intern de litiu de 15 mEg/l. Prin flamfotometrele obinuite se determin
curent sodiul si potasiul, i uneori calciul dac flacra este suficient de puternic.

44
Dozarea sodiului i a potasiului

Pentru dozarea acestor dou elemente se folosete astzi fotometria de
flacr, metoda fizic foarte rapid, care nu necesit dect cantiti foarte mici de
snge. Metodele chimice mai vechi sunt foarte laborioase, necesit cantiti
importante de snge, motiv pentru care nu se mai folosesc astzi.
Principiu.
Proba se introduce n flacr i pentru o temperatur constant a flacrii n
anumite condiii, intensitatea radiaiei emise este proporional cu concentraia
metalului n soluie. Se determin intensitatea liniei emise, selecionate cu ajutorul
unor filtre (de interferen, specifice fiecrui metal).
Aparatura:
- fotometrul cu flacr,
- vase din material plastic pentru pstrarea soluiilor etalon i efectuarea
diluiilor,
- pipete,
- baloane cotate sau
- biurete.
Reactivi: Ca regul general, toi reactivii vor fi pstrai n flacoane de polietilen
i nu n vase de sticl, fiindc silicaii din sticl cedeaz mai mult sau mai puin
ionii de sodiu i potasiu n soluie. La prepararea soluiilor etalon se va folosi ap
bidistilat sau tridistilat.
Soluiile etalon se prepar din NaCl i KCl uscate n prealabil timp de 24 de
ore la 110
0
C ntr-o etuv i lsate s se rcesc ntr-un exicator.
1. soluie etalon NaCl: 7,35 g NaCl, 5 ml formaldehid 40% i ap
bidistilat ad 1000 ml. Soluia conine 3mg Na/ml i se dilueaz 1/500 la folosire.
2. Soluie etalon KCl: 1.91g KCl, 5 ml formaldehid 40% i ap bidistilat
ad 1000 ml. Soluia conine 1mg K/ml i se dilueaz 1/100 n momentul folosirii.
Tehnica de lucru
1. Dozarea se poate face pe ser sau plasm. n primul caz decolarea
cheagului nainte de centrifugare produce o uoar hemoliz, ceea ce introduce o
eroare important, avnd n vedere c hematiile conin de 20 de ori mai mult K
dect plasma. Dac se lucreaz pe plasm, sngele se va recolta pe anticoagulant
lipsit de Na i K ( heparinat de litiu i amoniu) i se vor separa hematiile n prima
or dup recoltare, altfel se obin valori fals crescute pentru K. Practic se recolteaz
5 ml snge pe cteva picturi de heparinat de litiu, eventual direct ntr-un tub de
centrifug.
2. Diluiile serului sau ale plasmei variaz n funcie de aparat. Pentru
fotometrul Zeiss-Jena se face o diluie 1/100 la dozarea K i 1/500 pentru dozarea
Na. Pentru fotometrul Jouan se poate face o diluie 1/200 pentru Na i 1/100 pentru
K. Diluiile se aleg n funcie de curba de etalonare utilizat (fcut cu soluiile
etalon). Se recomand ca diluiile s se fac cu foarte mare grij, iar pentru
msurarea apei bidistilate se recomand folosirea unei biurete, n acest caz eroarea
de msurare a volumului fiind constant.
45
Practic, se poate proceda n felul urmtor: se pipeteaz 0,1 ml ser ntr-un
flacon de material plastic i se adaug 9,9 ml ap bidistilat dintr-o biuret de 10
ml. Se agit bine. Se ia 1 ml din aceast soluie (1/100), se introduce n alt flacon i
se adaug 4 ml ap bidistilat din biuret. Se obine astfel diluia de 1/500.
Pentru adaptarea ultramicroanalitic se iau 50l ser i 4,95 ml ap pentru
diluia 1/100. Din aceasta se ia 1 ml i se adaug 4 ml ap ( diluia 1/500).
Procedeul de msurare a intensitii radiaiei emise depinde de tipul
fotometrului cu flacr care se utilizeaz.

Valori normale :

Vrsta Na (mEg/l) K (mEg/l)
n.nscui 130-139 3,5-5,1
48 ore 130-146 3,9-4,7
5 zile 135-146 3,8-5,1
Luna1 139-146 4,1-5,3
Lunile 5-7 137-155 3,8-5,3
Lunile 11-15 135-144 3,8-5,4
2-3 ani 138-145 3,5-4,7
Aduli 135-150 3,4-5,4
Spectrofotometria de absorbie atomic

Principiul acestui aparat este destul de asemntor cu flamfotometrul, cu
deosebirea c n acest tip de aparat se msoar lumina emis de atomii neexcitai.
De altfel i n cazul flamfotometriei, n flacr erau mai muli atomi neexcitai dect
cei excitai. n spectrofotometrele de absorbie atomic, elementele sunt
vaporizate printr-o descrcare ntr-un catod de heliu sau argon. Proba este
aspirat n flacra format dintr-un amestec de aer i acetilen, asemntor
flamfotometrului.
Acest tip de spectrofotometru permite separarea datorit construciei
deosebite a sistemului de emisie a luminii produs de catodul cu vaporizare (curent
pulsatoriu) de cea emis de atomii excitai din flacr (curent continuu).
Msurndu-se lumina absorbit, se va aplica legea Lambert Beer, astfel c se va
putea etalona domeniul liniar al relaiei concentraie-absorbie.
Aparatele moderne au lmpi multiple calciu-magneziu i cupru-fier-zinc.
Pentru alte elemente (Pb, Cd , Co, Mn, Ni) sunt necesare lmpi speciale.


IV.3 METODE ELECTROMETRICE


Metodele electrometrice implic msurarea semnalelor electrice asociate cu
sisteme chimice care sunt ncorporate ntr-o celul electrochimic. Celula const
din doi sau mai muli electrozi care realizeaz interfaa dintre un sistem chimic i
46
un sistem electric. Sistemul electric msoar sau controleaz parametrii electrici ca
tensiunea i curentul, caracteristici pentru un sistem chimic particular.
n laboratorul clinic, metodele electrometrice se utilizeaz de rutin pentru
determinarea unor ioni, medicamente, hormoni, metale i gaze.

Concepia de acid i baz
n biochimie se folosete definirea acizilor i bazelor prin capacitatea de a
ceda sau de a accepta protoni. Un acid este o substan capabil s cedeze protoni
iar bazele sunt substane capabile s accepte protoni. Aceast teorie este general i
este exprimat prin concepia acido-bazic a lui Brnsted. Cnd un acid Brnsted
cedeaz un proton se formeaz o baz Brnsted. Acidul original i baza rezultat
formeaz o pereche de acid conjugat i baz conjugat. n toate reaciile de ionizare
a unui acid sau a unei baze sunt implicate dou perechi acid conjugat i baz
conjugat.




Concepia de pH i pOH

pH este o exprimare foarte scurt care desemneaz activitatea ionilor de
hidrogen. Prin definiie pH-ul este logaritmul negativ al activitii ionilor de
hidrogen. n mod similar se calculeaz logaritmul negativ al activitii ionilor de
hidroxil, exprimat sub form de pOH.

] [
log ] [ log log log
+
+
+
+
+
+

= = = =
H
1
H
a
1
a pH
H
H
H
H

] [
log ] [ log log log

= = = =
OH
1
OH
a
1
a pOH
OH
OH
OH
OH


n soluii apoase echilibrul de ionizare a apei este dat de ecuaia:
14
10 OH H
+
= ] ][ [ .
De aici, dac este cunoscut concentraia ionilor de hidrogen se poate
calcula concentraia ionilor de hidroxil i invers folosind relaia dintre pH i
pOH.
HA + B
-
[acid conjugat] [baza conjugata]
A
-
+ HB
[baza conjugata] [acid conjugat]
47
p
K OH H =
+
] ][ [
Prin logaritmare:
p
K OH H log ] log[ ] log[ = +
+

p
K OH H log ] log[ ] log[ =
+

pH H =
+
] log[ pOH HO =

] log[
p p
pK K = log
p
pK pOH pH = +

14
p
10 K

= 14 10 pK
14
p
= =

log

Dac una dintre aceste valori este cunoscut se pot calcula i celelalte.


Msurarea pH-ului
Determinarea pH-ului se poate realiza cu indicatori colorai sau cu pH-
metru (determinare electrometric).
Exemple de indicatori de pH:

Indicator Schimbarea de culoare n
sensul creterii de pH
Interval de viraj
Acid Baz
Albastru de timol rou galben 1,2 2,8
Rou de Congo albastru rou 3,0 5,0
Albastru de bromfenol galben albastru 3,0 4,6
Metiloranj rou galben 3,1 4,4
Verde de bromcrezol galben albastru 3,8 6,3
Turnesol rou albastru 6,0 8,0
Rou de fenol galben rou 6,8 8,4
Fenolftalein incolor rou 8,3 10,0
Timolftalein incolor albastru 9,3 10,5
Galben de alizarin R galben rou 10,1 12,1

48
Metoda de msurare a pH-ului cu pH-metrul este mai exact dect cea cu
substane (hrtie) indicatoare i se folosete ori de cte ori este necesar stabilirea
cu exactitate a valorii pH-ului. PH-metru este un poteniometru care msoar
potenialul dezvoltat ntre un electrod de sticl i unul de referin. Instrumentele
moderne fososesc electrozi combinai (electrodul de sticl i electrodul de referin
sunt combinai ntr-un singur electrod). nainte de a efectua o determinare, pH-
metrul trebuie etalonat cu o soluie tampon.

pH-ul izoelectric al aminoacizilor
Determinarea pH
i
al glicocolului prin trasarea curbei de titrare

Principiu
Fiecare aminoacid are cel puin dou grupri ionizabile legate la atomul de
C

: una acid (carboxilul) i alta bazic (gruparea amino). Pentru cazul cel mai
simplu, acela al unui aminoacid monoaminomonocarboxilic, cum este glicocolul,
exist cele dou trepte de disociere, fiecare cu pK
a
care pot fi scrise astfel:



] [
] ][ [
log
COOH CH N H
H COO CH N H
pK
2 3
2 3
a
1
+
+ +
=



] [
] ][ [
log
+
+
=
COO CH N H
H COO NCH H
pK
2 3
2 2
a
2


Att pentru aminoacizi ct i pentru marea majoritate a proteinelor exist un
pH la care numrul sarcinilor pozitive este egal cu cel al sarcinilor negative. Acest
pH la care sarcina net a moleculei este zero se numete punct izoelectric i se
noteaz cu pH
i
. Valoarea sa se poate considera ca fiind media aritmetic a valorilor
pK
a
pentru treptele de disociere din jurul speciei moleculare cu un numr egal de
sarcini pozitive i negative.
Modificnd concentraia protonilor prin adugarea de acizi sau baze la
soluia unui aminoacid monoaminomonocarboxilic se poate aprecia valoarea pK
a

din forma curbei de neutralizare. n jurul acestei valori pH-ul variaz foarte puin
fa de echivalenii adugai, comparativ cu valorile extreme de la nceputul i
sfritul titrrii soluiei, ceea ce se poate deduce din ecuaia lui HENDERSON-
HASSELBACH.
H
3
N
+
- CH
2
- COOH H
3
N
+
- CH
2
- COO
-
+ H
+
H
2
N - CH
2
- COO
-
+ H
+
H
3
N
+
- CH
2
- COO
-
49
] [
] [
log
ramas acid
formata sare
pK pH
a
+ =
Reactivi:
1. Glicocol (pulbere)
2. NaOH 2N
3. H
2
SO
4
2N

Tehnica de lucru:
Se cntresc 375 mg glicocol, se dizolv n 50 ml ap bidistilat. Pentru a
vedea ce volume de acid (i baz) consum de fapt glicocolul este necesar s se
titreze n prealabil 50 ml ap distilat, adic volumul de solvent utilizat. n acest
scop se iau 50 ml ap distilat i se adaug volume cunoscute de acid sulfuric,
notnd pH-ul indicat de aparat pentru fiecare adugare de acid. Menionm c
aparatul de msur utilizat, pH-metrul, indic pH-ul soluiei datorit diferenei de
potenial ce se creeaz ntre concentraiile ionilor de H
+
n interiorul electrodului de
sticl, fa de exterior, adic fa de soluia de titrare.
Se reprezint grafic pe hrtie milimetric lund pe ordonat cte 1 mm
pentru fiecare unitate de pH i pe abscis cte 3 cm pentru fiecare ml de H
2
SO
4
2N.
Se procedeaz identic cu cei 50 ml soluie de glicocol, notnd volumele de
H
2
SO
4
consumat pentru fiecare valoare de pH. Se aleg apoi mai multe valori de
pH, de preferat 10 valori, i se noteaz ntr-un tabel ce volume corespund pentru
fiecare valoare a pH, pentru ap i soluia de glicocol. Se noteaz ntr-o rubric
separat diferena n ml ce corespunde acidului sulfuric necesar strict pentru titrarea
glicocolului. Cu aceste valori difereniale se construiete apoi curba corectat de
titrare a glicocolului indicnd pe ordonat 1 cm o unitate de pH i pe abscis pentru
1cm, mEq acid (1 ml H
2
SO
4
2N = 2mEg ).
Se procedeaz similar pentru domeniul alcalin, adugnd volume crescnde
de NaOH 2N la 50 ml ap i apoi la 50 ml soluie ce conine 375mg glicocol. Se
construiete curba necorectat, se fac diferenele cu care se traseaz n mod similar,
curba corectat de titrare a glicocolului, reprezentnd pH-ul fa de mEq de baz
adugai. Se stabilete jumtatea domeniului de inflexiune att pe curba de titrare
cu acid, ct i pe cea de titrare cu baz. Proiecia acestor puncte pe axa pH-ului
indic cele 2 valori pK
a
ale glicocolului.

50
Fig. nr. 6. Curba de neutralizare a glicocolului

Tabel cu 5 valori de pH

pH Ap + alcool Ap Diferena
3,5 0,103 0,003 0,100
3,0 0,355 0,020 0,515
2,5 0,667 0,032 0,635
2,2 0,063 0,063 1,00
2,0 1,425 0,200 1,225

Determinarea punctului izoelectric al proteinelor

Datorit raportului dintre gruprile funcionale libere: -COOH i NH
2

proteinele se comport fie ca acizi, fie ca baze. Disocierea gruprilor carboxil este
cu att mai intens cu ct aciditatea mediului este mai redus.



Gradul de disociere al gruprilor aminice este condiionat de alcalinitatea
mediului: cu ct concentraia ionilor H
+
este mai mic cu att disocierea gruprilor
amino este mai intens, i invers:
(H
2
N)
m
- R - (COOH)
n
(H
2
N)
m
- R - (COO
-
)n + nH
+
51



Sarcina electric global a unei proteine este suma algebric a sarcinilor
pozitive i negative i care depinde de reacia (pH-ul) mediului. n mediu alcalin
proteina posed o ncrcare electric negativ, iar n mediu acid o ncrcare
electric pozitiv.
Pentru fiecare protein exist o concentraie a ionilor de hidrogen la care
suma algebric a sarcinilor pozitive i negative este egal cu zero, proteina fiind
indiferent fa de curentul electric. Acest pH al mediului se numete punct
izoelectric. La acest pH proteina precipit, deoarece are cea mai mic presiune
osmotic i cea mai mic solubilitate.
n consecin, proteinele n soluii tampon cu pH corespunztor pH
i
pierd
sarcinile electrice, devin neutre, nestabile i precipit. Adausul de solveni organici
(alcool, aceton) favorizeaz precipitarea. pH-ul izoelectric reprezint o constant
important deoarece fiecare protein are un pH
i
caracteristic, de exemplu:
hemoglobina = 6,8; caseina = 4,7 ; gelatina = 4,6.

Determinarea punctului izoelectric al caseinei
Se urmrete precipitarea caseinei n raport de pH-ul unei serii de soluii de
acid acetic.

Reactivi :
1. Soluie de casein 0,5%: 0,25g casein pur se suspend n 20 ml ap
distilat, se adaug apoi 5 ml NaOH 1N i dup neutralizare cu 5 ml acid acetic 1N
se completeaz cu ap la 50 ml.
2. Soluii de acid acetic: 1N, 0,1N, 0,01N.
Tehnica de lucru
n 9 eprubete se prepar soluiile indicate n tabelul de mai jos, se adaug
soluia de casein i se agit. Dup 15 minute se noteaz gradul de precipitare din
fiecare eprubet. pH-ul eprubetei care prezint precipitarea maxim corespunde
punctului izoelectric al caseinei.

Reactivi ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Acid acetic 0,01N 0,6 1,25 2,5 5,0 - - - - -
Acid acetic 0,1N - - - - 1 2 4 8 -
Acid acetic 1N - - - - - - - - 1,6
Ap distilat 8,4 7,75 6,5 4,0 8,0 7,0 5,0 1,0 7,4
Casein 1 1 1 1 1 1 1 1 1,0
pH 5,9 5,6 5,3 5,0 4,7 4,4 4,1 3,8 1,5




R - NH
3
+
+ OH
-
R - NH
3
]OH
52
IV.4. METODE IMUNOLOGICE DE ANALIZ


Metodele imunologice de analiz sunt metode de nalt specificitate i
sensibilitate care au la baz reacia dintre antigen i anticorp. Aceste metode sunt
utilizate pentru determinarea cantitativ a unor substane aflate n concentraii
foarte mici n produsele biologice i care, n plus, trebuie difereniate de alte
substane cu structuri apropiate.
Antigenul este o molecul recunoscut de limfocitul B i mpotriva cruia
se dirijeaz producia de anticorpi. Anticorpul este o imunoglobulin produs de
limfocitul B activat, n urma contactului cu un antigen.

Determinarea complexelor imune circulante

Decelarea CI (complexe imune) difer ca metologie n funcie de localizarea
acestora:
1. Decelarea CI tisulare (depuse). CI tisulare pot fi evideniate prin IFI pe
seciuni de esuturi, folosind seruri fluorescente anti-Ig i anti-C, precum i cu
reactivi marcai cu enzime sau izotopi radioactivi.
2. Decelarea CI circulante (CIC). Complexele imune circulante, manifeste
clinic prin diferite semne (urticarie, eritem nodos, arterite, glomerulonefrite,
iridociclite, trombocitopenie, hemoliz, crioglobulinemie, coagulare intravascular
diseminat) se pot evidenia in vitro prin dou categorii de tehnici: tehnici
independente de natura antigenului i tehnici dependente de natura Ag.
A.Tehnicile independente de natura Ag se bazeaz pe (Mc Dougal, 1985 ):
a. proprietile fizice ale CIC (tehnici de ultracentrifugare analitic,
precipitare cu polietilenglicol, precipitare crioglobuline), precipitatele obinute
fiind analizate ulterior prin tehnici de imunobiochimie ca IDRS (imunodifuzia
radial simpl), dubla difuziune, imunofixarea;
b. fixarea complementului: inhibarea aciunii hemolitice a
complementului (activitatea anticomplementar a CIC), fixarea C1q pe CIC;
c. interaciunea cu factorii reumatoizi;
d. legarea de receptori celulari diveri, receptori Fc, receptori pentru
complement, inhibarea rozetelor EAC receptori ai celulelor Raji.
B. Tehnicile dependente de natura Ag (caracterizare epitopic) sunt posibile
pentru unele antigene bacteriene (streptococ), virale (Ag HBS), parazitare
(schisostomiaz) i unele antigene tumorale (CEA).
Pentru standardizarea determinrii CIC, se recomand folosirea unui
preparat de referin, internaional sau propriu laboratorului.
Determinarea CIC se utilizez pentru:
- orientarea diagnosticului n cazul suspiciunii de boal mediat prin CIC,
- pentru monitorizarea terapiei,
- stabilirea prognosticului,
- studierea patogenezei unor boli.
53
Utilitatea practic a determinrii CIC, pn n prezent, se limiteaz la: LES,
glomerulonefrite, vasculite i unele arterite.
Datorit heterogenitii structurale a CIC, unele tehnici nu permit
diferenierea lor de Ig agregate.
Pentru o real evaluare a rolului CIC n patogenia bolii, se recomand
determinarea lor prin mai multe metode i urmrirea lor dinamic.

METODA PEG
Metoda PEG folosete precipitarea pentru complexe imune circulante
(metoda Haskova et al, modificat).
Principiu
Complexele imune circulante (CIC), datorit dimensiunii lor mari, pot fi
precipitate prin polimeri cu greutate molecular mare, ca polietilenglicol (PEG),
chiar la concentraii mici ale complexelor.
Materiale:
1. Tampon-borat pH 8,4;
- Acid boric 0,1 M6,18g;
- Tetraborat de Na 25mM9,53g;
- Clorur de Na .....75nM4,38g;
- Ap distilat..................1000 ml;
Se pstreaz la +4
0
C;
2. Soluie Polietilenglicol (PEG
6000
);
- PEG
6000
....................3,73g;
- Tamponat borat la 100 ml;
Se pstreaz la +4
0
C cteva luni;
3. Ser de cercetat: se poate pstra cteva zile la +4
0
C;
Metoda de lucru.
Pipetare .
Martor
2,9 ml tampon borat;
0,1 ser de cercetat;
2,9 ml PREG sol. 3,75 g%
0,1 ml ser de cercetat .
Pstrare la + 4
0
C peste noapte .
Citire i interpretare:
Citirea se face la spectofotometru, fa de ap, la o lungime de und () =
450 nm, n cuva de 1 cm.
Calcul: ( Extincia probei Extincia martor ) x 1000 .
Valori normale: pn la 70 uniti densitate optic (UDO) ( Ionescu, 1986;
ieica, 1984).
Pentru explicarea valorilor CIC peste limita normalului sunt de luat n
consideraie urmtorele:
a. fiabilitatea metodei de determinare CIC;
54
b. momentul determinrii CIC n raport cu evoluia afeciunii:
determinarea precoce poate gsi titruri crescute ale CIC nainte ca
fenomenele de eliminare fiziologic a acestora din circulaie s fie
maxime;
c. intensitatea fixrii tisulare i a activitii patologice a complexelor
imune, n sensul c dozarea efectuat tardiv, la un pacient cu manifestri
clinice interne, poate da o valoare normal a CIC, deoarece acestea s-au
fixat deja la nivelul organului int unde au amorsat procesul patologic.


IV.5. METODE DE SEPARARE

IV.5.1.Centrifugarea

Centrifugarea este o operaie care permite separarea rapid a componentelor
cu densiti diferite aflate n amestec sub forma unei suspensii ntr-o faz lichid.
n funcie de densitatea particulelor suspendate raportat la cea a fazei lichide
suspensia se poate depune spontan pe fundul vasului formnd un depozit numit
sediment acoperit de faza lichid numit supernatant (procesul numindu-se
sedimentare), respectiv poate forma un strat de flotaie care plutete deasupra fazei
lichide (procesul numindu-se flotaie). Fazele lichide pot fi ndeprtate prin aspirare
sau decantare.
Centrifugarea se realizeaz cu ajutorul unor aparate numite centrifugi.

IV.5.2.Ultracentrifugarea
Ultracentrifugarea reprezint o separare a unor particule mici
(macromolecule, componente subcelulare, virusuri, etc.) utiliznd acceleraii de
ordinul sutelor de mii de g. Ultracentrifugile sunt aparate de construcie special.
Pe baza vitezei de sedimentare se calculeaz constanta de sedimentare, care
caracterizeaz comportamentul oricrei particule supuse ultracentrifugrii. Pentru a
putea compara constantele de sedimentare ntre ele se utilizeaz noiunea de
coeficient de sedimentare standard.

Viteza de sedimentare a eritrocitelor (VSE)

Determinarea VSE se bazeaz pe proprietatea eritrocitelor de a sedimenta in
vitro ntr-o prob de snge tratat n prealabil cu un anticoagulant.
Material necesar:
1. Soluie izotonic steril de citrat trisodic (3,8g/100ml ap distilat)
2. pipete i stative Westergreen
3. tuburi gradate de 5 sau cel mult 10ml
4. materialul necesar pentru puncie venoas
55
Tehnica
1. Se repartizeaz cte 0,4ml soluie izotonic de citrat trisodic n tuburi
gradate. Se pregtesc numai attea tuburi cte sunt necesare pentru ziua
respectiv. Tuburile se in nchise cu dopuri de cauciuc.
2. Peste soluia de citrat trisodic se recolteaz cu o sering sau preferabil direct
pe ac 1,6 ml snge venos (pn la nivelul de 2 ml). Se amestec.
3. Se aspir sngele citratat n pipet Westergreen pn la diviziunea 0mm.
Aceast operaie se execut pentru toate probele din ziua respectiv, dup
terminarea recoltrii.
4. Se aaz pipetele Westergreen n stativ, n poziie perfect vertical timp de
o or.
5. Dup o or se face citirea. Rezultatul este reprezentat de distana pn la
care a cobort coloana de eritrocite exprimat n mm.
Stabilitatea produsului este de 4-5 ore din momentul amestecrii sngelui
cu soluie de citrat trisodic.
Valori normale:
- nou-nscui 1-2mm
- sugari 7-10mm
- copii mici 7-11mm
- brbai 3-8mm
- femei 6-11mm
VSE este o reacie de disproteinemie, ntruct modificrile sale sunt
condiionate de modificrile cantitative ale fibrinogenului i -globulinelor.
Creterea VSE se observ n:
- infecii acute i cronice,
- tumori maligne,
- nefroze,
- boli de colagen
- unele hemopatii (n special n plasmocitom, macroglobulinemie,
leucemie acut, anemii hemolitice autoimune i
limfogranulomatoz).
- scderea numrului de eritrocite
- sarcin.
ncetinirea VSE este semnalat n:
- policitemie,
- unele boli de ficat de staz, prin insuficien cardiac.
- administrare de medicamente (corticoizi, salicilatul i
tiosemicarbazona).
Determinarea VSE ne poate furniza uneori informaii suplimentare:
- plasma foarte deschis la culoare indic lipsa de fier,
- plasma de culoare galben-portocalie - bilirubinemie crescut,
- un aspect tulbure lptos al plasmei - o stare de hiperlipidemie
- prezena unui strat opac albicios la partea superioar a coloanei de
eritrocite - indicaie orientativ asupra creterii numrului de leucocite
56

IV.5.3.Cromatografia

Cromatografia este o metod fizico-chimic modern de separare,
identificare i determinare cantitativ a componentelor dintr-un amestec complex.
Cromatografia pe strat subire (CSS) este o metod care permite separarea
componentelor unui amestec pe baza diferenei lor de deplasare de-a lungul unui
strat adsorbant (faza staionar) sub aciunea unui sistem de solveni (faza mobil).


Separarea aminoacizilor din urin prin cromatografie pe strat subire

Separarea aminoacizilor din urin se face prin cromatografie pe strat subire
bidimensional, cu scopul de a diagnostica aminoaciduriile determinate de
defectele enzimatice la nivelul metabolismului aminoacizilor.
Reactivi
1. Faza staionar: silicagel G depus n strat subire pe o plac de sticl
2. Faza mobil:
a. prima migrare: developantul I (butanol: ap: piridin = 1:1:1)
b. a doua migrare: developantul II (soluie apoas de fenol i amoniac
0,5%).
3. Reactiv de culoare: soluie acetonic de ninhidrin
Tehnica de lucru
Proba de urin se pregtete prin trecerea unui volum de 10ml urin peste o
rin schimbtoare de ioni. Proba prelucrat anterior se aplic pe o plac
cromatografic cu ajutorul unei pipete Pasteur la 0,5cm fa de marginea plcii. Se
aplic volume mici i dup fiecare aplicare se ateapt evaporarea dizolvantului,
astfel ca pata s nu depeasc 5mm n diametru. Se usuc 5 minute la etuv, la 70
0
C.
Developarea plcii
I. Prima migrare
Se introduce placa cromatografic n camera cromatografic ce
conine developantul I, astfel ca stratul de lichid s nu depeasc 3-
4mm. Se acoper camera i se las placa pn cnd frontul de migrare al
developantului a ajuns la 0,5cm distan fa de extremitatea superioar
a plcii. Se scoate placa i se usuc timp de 5 minute la 70
0
C.
II. A doua migrare
Se introduce placa n camera cromatografic ce conine
developantul II astfel ca migrarea s se fac n direcie perpendicular
pe direcia primei migrri. Dup ce developantul a migrat se scoate
placa, se usuc 5 minute la 70
0
C i apoi se reveleaz spoturile prin
pulverizarea peste plac a reactivului de culoare. Se usuc 5 minute la
70
0
C pn la apariia spoturilor colorate.
57
Interpretarea rezultatelor
Pentru interpretare se compar cromatogramele obinute cu urina patologic
cu cromatograma obinut cu urina normal. Cromatograma obinut cu urina
normal prezint 5 spoturi intense corespunztoare glicocolului, serinei, alaninei,
glutaminei i histidinei.
Tipul i cantitatea aminoacizilor sunt modificate n aminoaciduriile
ereditare. Exist 5 categorii de aminoacidurii:
1. Aminoacidurii determinate de defecte enzimatice la nivelul metabolismului
unui aminoacid.
Exemplu: fenilcetonuria, tirozinemia, urina cu miros de arar (val, leu, ile),
histidinemie, hiperprolinemie, hiperlizinemie.
Denumirea bolii Enzima deficitar Aminoacizi provenii
din urin
Fenilcetonurie Fenilalaninhidroxilaza
hepatic
Fenilalanina
Tirozinemie Oxidaza acidului
hidroxifenilpiruvic
Tirozina
Urina cu miros de arar Decarboxilazele
aminoacizilor ramificai
Valina, leucina,
izoleucina
Histidinemie Histidinaza Histidina
Hiperprolinemia Prolinoxidaza Prolina, hidroxiprolina
Hiperlizinemie Lizin NAD- oxidoreductaza Lizina

2. Aminoacidurii determinate de boala nespecific generalizat a tubilor renali
proximali.
3. Aminoacidurii determinate de transportul defectuos de la nivelul celulelor
jejunale i a tubilor renali proximali.
4. Aminoacidurii determinate de producerea excesiv a unor metabolii
nefrotoxici (ex: galactozo-1P n galactozemie).
5. Aminoacidurii ce nsoesc bolile dobndite: necroza hepatic, distrofia
muscular, hipovitaminoza B, C, D, endocrinopatii, intoxicaii cu metale
grele i compui organici.

IV.5.4.Electroforeza

Electroforeza este metoda cea mai accesibil clinic pentru separarea
macromoleculelor ncrcate electric pe baza mobilitii lor n cmp electric. n astfel
de cmp, particulele ncrcate pozitiv vor migra spre electrodul ncrcat negativ
(catod), iar cele ncrcate negativ spre anod. Viteza de migrare este invers
proporional cu dimensiunea (greutatea) particulelor i direct proportional cu
sarcina lor electric. Deci particulele cele mai uoare i mai puternic ncrcate vor
migra cel mai repede.
Utilizarea principal a electroforezei este separarea proteinelor, posibil
datorit gruprilor reziduale -COOH i -NH
2
ale aminoacizilor. Aceste grupri au
58
caracter amfoter i pot fi ncrcate electric, cu sarcini pozitive sau negative n
funcie de pH-ul tamponului folosit. La valori acide de pH, gruprile carboxi (-
COOH) sunt doar uor ionizate, iar cele amino vor forma ioni -NH
3
+
, astfel c
proteina va cpta o sarcin pozitiv. n mediu alcalin, gruprile amino vor fi uor
ionizate, iar cele -COOH vor forma ioni -COO
-
, conferind macromoleculei o
sarcin negativ. innd cont de multitudinea de grupri reziduale, cu grade diferite
de afinitate pentru ionii H
+
i HO
-
, fiecare protein se va ncrca diferit n funcie de
pH-ul soluiei. Punctul izoelectric corespunde unei valori de pH, caracteristic
fiecrei proteine cnd sarcina electric global este zero.
Pentru proteinele plasmatice, se folosete o valoare pH de 8,5, pstrat
constant prin tamponul respectiv. Mai pot fi separate electroforetic lipoproteine,
imunoglobuline, izoenzime i hemoglobine.
Aparatul tipic de electroforez este compus dintr-o camer din material
plastic (plexiglas) cu dou compartimente separate n care se gsete tamponul
respectiv. n fiecare compartiment se gsete cte un electrod din platin sau
crbune. ntre cele dou compartimente se gsete suportul poros sau hrtia de filtru
special, mbibate cu tampon. Probele se pun cu ajutorul unui aplicator, se nchide
ermetic i se deschide circuitul electric permind migrarea o perioad de timp n
funcie de suport. n ultimul timp s-a renunat la hrtia de filtru (tip Whatman) din
cauz c era necesar o perioad de 16 ore pentru o migrare optim, folosindu-se
plci prefabricate din gel de agar, amidon, poliacrilamid. n cazul plcilor, acestea
trebuie s vin n contact cu tamponul prin aa numitele fitile.
Dup ncheierea timpului stabilit, se usuc rapid suportul migrat pentru a
preveni difuzia, apoi se coloreaz cu un colorant apropiat. Ideal, colorarea
fraciunilor corespunde ca intensitate cu concentraia fraciunilor proteice, astfel c
acestea pot fi citite cu un densitometru care este o variant simplificat a unui
spectrofotometru. Banda este micat cu o vitez constant n faa unui fascicol de
lumin monocromatic, iar variaiile absorbiei sunt interpretate grafic pe o ax xy,
obinndu-se direct fraciunile proteice respective. Densitometrele mai noi au
ncorporate un integrator care msoar suprafaa fiecrei fraciuni i elibereaz prin
buletin direct concentraiile fraciunilor proteice. Desigur, n lipsa acestui
densitometru se folosete vechea metod de eluare.
A doua component a aparatului de electroforez este sursa de curent
electric continuu i constant. n timpul electroforezei se produce cldur care scade
rezistena electric, determinnd o migrare accelerat dac se folosete un voltaj
constant. Creterea cldurii va accelera evaporarea mrind tria ionic a
tamponului. Sursa de curent este construit pentru a funciona la intensitate sau
voltaj constant. Dac se folosete varianta cu intensitate constant, pe msur ce
migrarea decurge trebuie redus voltajul curentului.
n cazul separrii izoenzimelor (creatin fosfokinazei, LDH, amilazei) dup
efectuarea electroforezei obinuite, n loc de colorare, se va trata banda cu o soluie
coninnd substratul enzimei (anticorpii specifici), dup care se execut reacia de
culoare specific. Mare atenie trebuie acordat triei ionice, , care este
concentraia nsumat a ionilor tampon
59
=
i i
Z C
2
1
. , unde C
i
este concentraia unui ion, iar Z
i
, sarcina ionului.
Tria ionic afecteaz norul de ioni ce nconjoar o particul ncrcat
electric. Creteri ale triei ionice scad mobilitatea ionilor, favorizeaz mrirea
temperaturii, care poate denatura unele proteine termolabile.
Focalizarea izoelectric este tot o variant a electroforezei, n care
particulele ncrcate migreaz pe un suport ce are un gradient continuu de pH.
Proteinele individuale migreaz n cmpul electric pn ating o valoare pH
corespunztoare punctului izoelectric, cnd se opresc.

Electroforeza n gel de agaroz

Electroforeza n gel de agaroz este utilizat pentru a aprecia mrimea
fragmentelor de ADN, obinute prin digestie enzimatic sau a fragmentului obinut
prin metoda PCR. Prin aceast metod se obin fragmente de 0,1 2,5 kb (1
kilobaz =1000 perechi de baze). Pentru fragmente mai mari, pn la 10.000 kb se
utilizeaz electroforeza n cmp pulsator.
Mobilitatea electroforetic a ADN-ului n gelul de agaroz depinde de o
serie de factori.
Agaroza este un polizaharid extras din specii diferite de alge roii.
Moleculele de dizaharide polimerizate formeaz o reea n care moleculele de ADN
ncrcate negativ, datorit resturilor fosfat, vor migra spre electrodul pozitiv (anod)
n funcie de :
- porozitatea gelului ( variaz n funcie de concentraia agarozei)
- masa molecular a ADN
- conformaia ADN ( CCC-ADN, OC-ADN, ADN liniar )
- soluia tampon utilizat pentru electroforez
- voltajul aplicat
- prezena coloranilor intercalai
Aceti parametri acioneaz mpreun i influeneaz migrarea moleculelor
de ADN n gelul de agaroz.
Concentraia agarozei

n geluri cu concentraie diferit, fragmentele de ADN liniare migreaz cu
vitez diferit. Pentru separarea fragmentelor mari de ADN, se utilizeaz agaroz
de concentraii mici (0,3-0,5 %), n timp ce pentru separarea fragnementelor de
ADN mici se utilizeaz agaroz de concentraii mari (0,7-1%). Gelul de agaroz de
1% ofer o rezoluie bun pentru vizualizarea fragmentelor de ADN ntre 500 i
4000 pb (perechi de baze).
Concentraia agarozei utilizat pentru separarea fragmentelor de ADN de
diferite mrimi:
60

Concentraia agarozei (%) Mrimea fragmentelor (kb)
0,3 5-60
0,5 1-30
0,7 0,8-12
1,0 0,5-10
1,2 0,4-7
1,5 0,2-3
2,0 0,1-2

Tabel dup Ausubel (1987) i Sambrook (1989)

Moleculele liniare de ADN migreaz n gelul de agaroz cu o vitez invers
proporional cu logaritmul masei moleculare. Moleculele mari migreaz cu vitez
mai mic, comparativ cu moleculele mici.

Tamponul de electroforez
Mobilitatea electroforetic a moleculelor de ADN este influenat de
compoziia i puterea ionic a tamponului utilizat. n absena ionilor (dac
tamponul este omis din gel), conductana electric este minim i fragmentele de
ADN migreaz cu vitez mic n gel. Tamponul cel mai utilizat pentru
electroforeza probelor de ADN este TBE (TrisBoratEDTA) i TAE (Tris
AcetatEDTA). TAE are capacitate de tamponare mai mic dect TBE. Soluiile
tampon sunt preparate sub forma unor soluii stoc concentrate 10X sau 5X.
Cmpul electric
Cmpul electric aplicat nu trebuie s depeasc 8-10 V/cm (cm = distana
msurat ntre cei doi electrozi), pentru a obine o separare electroforetic foarte
bun. La diferene de potenial mici, mobilitatea electroforetic a fragmentelor de
ADN este proporional cu intensitatea cmpului electric.

Colorarea gelurilor de agaroz
Pentru a permite vizualizarea probelor de ADN, gelurile de agaroz se
coloreaz cu un colorant ct mai specific. Cel mai frecvent utilizat este bromura de
etidiu, un colorant fluorescent, care reduce mobilitatea electroforetic a ADN-ului
cu 15%. Acest colorant se intercaleaz ntre perechile de baze azotate fcnd astfel,
ca ADN-ul s fie mai rigid i mai puin mobil. Bromura de etidiu poate fi adugat
nainte sau dup terminarea electroforezei. Este mai indicat s se adauge nainte de
efectuarea electroforezei, n acest caz adugndu-se n concentraie de 0,5 g/ml la
agaroza topit i se mixeaz amestecul. Dup efectuarea electroforezei gelul se
spal cu ap nainte de examinare pentru a ndeprta excesul de bromur de etidiu.
Atenie! Bromura de etidiu este o substan mutagen i foarte toxic, prin
urmare se recomand manipularea cu atenie a acesteia.
Complexul ADN bromur de etidiu are o fluorescen mai mare comparativ
cu a colorantului aflat singur n soluie. Expunerea gelurilor colorate cu bromur de
etidiu n lumin UV (la 254-366 nm) permite vizualizarea benzilor de ADN.
61
Imaginea gelului poate fi fotografiat cu un aparat polaroid. Lumina UV poate
afecta negativ ochii i pielea; se recomand protejarea acestora n timpul utilizrii
luminii UV.
Este necesar s adaptm condiiile de electroforez n funcie de
circumstanele speciale i particularitile experimentale, indiferent dac
electroforeza este pe vertical sau pe orizontal. Este mai convenabil electroforeza
pe orizontal, deoarece este mai uor de manevrat, este mai stabil, mai ales pentru
concentraii mai mici de 0,8 % ale agarozei.
Prepararea gelului de agaroz
- Se cntrete cantitate exact de praf de agaroz, care se dizolv complet n
soluia tampon special
- Amestecul se nclzete la 50-60C (ntr-un cuptor cu microunde) 2-4
minute, pn se obine un gel transparent.
- Se pot aduga colorani pentru vizualizarea benzilor de ADN. n acest sens
se poate utiliza bromfenol sau bromur de etidiu. Dac se utilizeaz bromur
de etidiu, benzile de ADN pot fi vizualizate cu ajutorul unui transiluminator.
Gelul astfel iluminat se poate fotografia, cu aparate polaroide echipate cu
filtru rou pentru eliminarea razelor UV.

Redm n continuare reeta de preparare a gelului de agaroz de diferite
concentraii: gelul se prepar ntr-un pahar Erlenmeyer de 500 ml.

Concentraia
gelului
0,7% 1,0% 2,0%
Agaroz 1,05 g 1,5 g 3,0 g
20X TAE 7,5 ml 7,5 ml 7,5 ml
Ap distilat 142,5 ml 142,5 ml 142,5 ml
EtBr(5mg/ml) 25 l 25 l 25 l
Volumul total 150 ml 150 ml 150 ml

- Gelul transparent obinut se toarn n suportul pentru turnarea gelului
astfel nct gelul s aib o grosime de 3-5 mm. n suport se introduc pieptenii
(cu rol n marcarea godeurilor n gel) nainte sau dup turnarea gelului i se
ateapt polimerizarea gelului timp de 30-40 minute.
- Se pstreaz o distan de 0,5-1,0 mm de la baza godeului pn la baza
suportului pentru a permite formarea unui godeu optim i pentru a mpiedica
scurgerea probelor (se evit prezena bulelor de aer n gelul de agaroz sau ntre
godeuri).
- Dup polimerizare se ndeprteaz pieptenii i se umple tancul de
electroforez cu soluie tampon TBE sau TAE n aa fel nct s acopere gelul
de agaroz (soluia tampon cu care se umple tancul de electroforez trebuie s
fie identic cu tamponul utilizat pentru prepararea gelului).
- Se aplic probele de ADN (amestecate cu gel loading buffer) n godeuri.
Vrful pipetei se introduce pn la baza godeului i se evacueaz lent proba
62
(atenie ca gelul s nu fie rupt cu vrful pipetei). Dup ce probele au fost
aplicate pe gelul de agaroz aparatul de electroforez nu se mai mic pentru a
preveni amestecarea probelor ntre ele prin ieirea din godeuri.
- Aparatul de electroforez se nchide ermetic i se deschide circuitul
electric permind migrarea probelor. Electroforeza se desfoar la 1-10 V/cm,
pn cnd colorantul are o distan apreciabil de migrare; aceasta depinde de
mrimea fragmentului de ADN care urmeaz a fi vizualizat, de concentraia
gelului de agaroz.
- Dup ncheierea timpului stabilit pentru migrare, se scoate gelul de
agaroz din aparatul de electroforez, se spal bine apoi se usuc pentru a
preveni difuzia.
- Rezultatele migrrii se citesc la transiluminator. Viteza de migrare,
mobilitatea moleculelor de ADN n gel este n funcie de masa molecular.
Moleculele cele mai uoare i cel mai puternic ncrcate vor migra mai repede.
- Distana de la etalon pn n vrful fiecrei benzi se msoar, aceast
lungime corespunznd distanei de migrare. Distana de migrare se mparte la
lungimea gelului, astfel se calculeaz mobilitatea relativ. Se construiete o
curb de migrare care arat masa molecular a diferitelor molecule i care se
compar cu curba de migrare standard, pe care sunt reprezentate masele
moleculare.
Electroforeza n gel de agaroz face posibil separarea unor molecule de ADN
foarte apropiate ntre ele din punct de vedere al greutii moleculare.(figura 9.).
Moleculele cu greutate molecular mai mare rmn aproape de godeuri, n
timp ce moleculele cu greutate molecular mai mic migreaz la distan mai mare
de godeuri.




Fig. 7.Electroforeza n gel de agaroz

63


Fig. 8. Reprezentare schematic a etapelor electroforezei n gel de agaroz



Fig. 9. Migrarea moleculelor de ADN n gelul de agaroz.

Electroforeza n gel de poliacrilamid

Electroforeza n gel de poliacrilamid ( gel de PAA ) este o metod
important pentru separarea i vizualizarea acizilor nucleici.
Gelul de poliacrilamid prezint caliti, ca flexibilitatea, transparena
perfect, stabilitatea chimic la variaii mari de pH i temperatur, rezoluia
ridicat, pentru care este des utilizat.
64
Porozitatea gelului poate fi controlat i variat astfel nct s se obin o
separare eficient a fragmentelor de ADN. Separarea fragmentelor are loc n
funcie de mrimea i ncrcarea lor.
Electroforeza n gel de poliacrilamid se bazeaz pe copolimerizarea
acrilamidei cu bisacrilamida. Polimerizarea este iniiat de persulfatul de amoniu,
iar N,N,N,N- tetrametilen diamina ( TEMED ) are rol de catalizator al reaciei.
Porozitatea gelului este influenat de puritatea acrilamidei i bisacrilamidei,
de concentraia acrilamidei n amestecul de polimerizare, de cantitatea de persulfat
de amoniu i TEMED utilizate, de temperatura de reacie. Concentraia acrilamidei
se alege n funcie de mrimea fragmentelor de ADN care urmeaz a fi separate.

Concentraia acrilamidei n funcie de mrimea fragmentelor de ADN care se separ:

Concentraia acrilamidei ( % ) ADN ( pb )
3,5 100-1000
5 80-500
8 60-400
12 40-200
15 25-150
20 6-100

Dup Sambrook ( 1989 )
Colorarea gelului de poliacrilamid
- prin utilizarea bromurii de etidium: se introduce gelul de poliacrilamid timp
de 30-45 minute la temperatura camerei ntr-un amestec de tampon TBE X 1 i
bromur de etidium (0,5g/ml)
- prin metoda de colorare argentic: se bazeaz pe legarea ionilor de argint de
perechile de baze din ADN i reducerea acestora la argint metalic n condiii
alcaline. Preexpunerea la formamid determin creterea senzitivitii, n timp
ce includerea complexului argint-tiosulfat de sodiu n imaginea developat
descrete colorarea nespecific. Utilizarea unor concentraii ridicate de
formamid n timpul developrii imaginii determin apariia unor benzi negre
cu contrast foarte bun.
Prepararea propriu-zis a gelului de poliacrilamid

Echipament, materiale i reactivi:
- aparat pentru turnarea gelului de PAA
- plci de sticl pentru turnarea gelului de PAA
- spaiatoare i piepteni
- aparat de electroforez vertical
- etanol
- soluie acrilamid/bisacrilamid TEMED
- persulfat de amoniu 10 mg/ml
65
- tampon TBE X 10 (0,89 M Tris baz, 0,89 M acid boric, 20 mM EDTA)
- tampon de ncrcare 6X (0,25% brom fenol blue, 0,25% xylene cyanol FF, 30%
glicerol)

Prepararea gelului de PAA
- se cur cu un detergent plcile de sticl ntre care se va turna gelul de PAA,
spaiatoarele, pieptenii; se spal apoi cu ap distilat
- se spal plcile cu etanol 95% i se usuc
- se asambleaz plcile de sticl pentru turnarea gelului utiliznd spaiatoarele
- se asambleaz aparatul pentru turnarea gelului de PAA
- se adaug 35 l TEMED i 80 l persulfat de amoniu la 100 ml soluie
acrilamid/bisacrilamid (acestea se prepar n funcie de concentraia dorit) i
se amestec. TEMED acioneaz ca i catalizator al reaciei de polimerizare, iar
persulfatul de amoniu acioneaz ca i iniiator al reaciei de polimerizare.
- se aplic soluia obinut ntre plcile de sticl separate de spaiatoare cu
ajutorul unei seringi (este important turnarea continu a gelului pentru a evita
formarea bulelor de aer)
- se introduc pieptenii n gelul de PAA ntre cele dou plci de sticl (dac s-au
format bule de aer acestea trebuie ndeprtate utiliznd o sering cu tampon)
- gelul de PAA polimerizeaz n 60 minute la temperatura camerei i poate fi
depozitat 1-2 zile la 4C (peste gelul de PAA se adaug tampon TBE X 1
pentru a mpiedica uscarea gelului).

Efectuarea electroforezei n gel de poliacrilamid
- se scot plcile de sticl care conin gelul de PAA din dispozitivul de turnare i
se fixeaz n aparatul de electroforez
- se adaug tampon electroforez 1X
- se ndeprteaz pieptenii i se umple godeurile formate i tancul de
electroforez cu tampon 1X (este important utilizarea aceluiai tampon de
electroforez att n gelul de PAA ct i ca tampon de migrare, deoarece
diferene mici n ceea ce privete puterea ionic i pH-ul determin migrare
distorsionat a fragmentelor de ADN)
- nainte de aplicarea probelor se ruleaz gelul de PAA la 60W timp de 30
minute pentru a echilibra gelul de PAA
- se amestec probele cu gel loading buffer i se aplic 3-5 l n godeuri utiliznd
o sering
- se ruleaz gelul la 60W pn cnd brom fenol blue migreaz afar din gel
- se oprete electroforeza i se scoate gelul de PAA cu atenie dintre cele dou
plci de sticl
- se coloreaz gelul de PAA cu bromur de etidium, etap urmat apoi de
fotografierea gelului sau se coloreaz gelul de PAA prin metoda de colorare
argentic, etap urmat de uscarea gelului de PAA la 80C timp de o or, ntre
dou hrtii de filtru, utiliznd un aparat de uscare al gelurilor

66
Determinarea masei moleculare relative a acizilor nucleici prin
metoda electroforetic

Principiul metodei:
Electroforeza, dup cum se cunoate, este influenat de o serie de factori: pH-
ul tamponului, tria ionic, compoziia tamponului, nlimea coloanei de gel,
lungimea plcii de gel, temperatura de lucru, concentraia gelului, concentraia i
cantitatea probelor.
Fora ce se aplic unui ion este direct proporional cu sarcina, determinat de
pH-ul mediului i de natura particulei. Echilibrul dinamic dintre fora electric i
fora de reinere, produs de micarea unei particule de o anumit form i mrime
ntr-un mediu suport cu o porozitate dat, exprim mobilitatea particulei.
Mrind tria ionic, ionii tamponului vor transporta mai mult curent, ceea ce
va duce la frnarea mobilitii macromoleculei de unde i separarea va fi mai bun,
mai net.
Dintre cele mai utilizate suporturi pentru electroforeza acizilor nucleici i a
ribozomilor amintim agaroza, poliacrilamida i amestecul de agaroz i
poliacrilamid.
Mobilitatea electroforetic n gel de agaroz, poliacrilamid sau amestec de
agaroz i poliacrilamid a acizilor nucleici este o funcie linear a logaritmului
masei lor moleculare. Metoda electroforezei n gel este cea mai simpl i
economic pentru determinarea masei moleculare a acizilor nucleici. n practic
aceast metod are nevoie doar de markeri cu mas molecular cunoscut.

Echipament, materiale i reactivi :
- agaroz
- tampon pentru electroforez (Tris 0,01 M; acetat de sodiu 0,02 M; NaCl 0,01M;
EDTA =,001 M, pH = 7,5)
- acizi nucleici cu masa molecular cunoscut (markeri)
- acizi nucleici cu masa molecular necunoscut
- aparat pentru electroforez orizontal

Mod de lucru:
- Prepararea gelului de agaroz: se dizolv prin fierbere 0,3 g agaroz n 30 ml
tampon pentru electroforez. Soluia obinut se rcete la 60C i apoi se
introduce n celula special a aparatului. Pentru a grbi ntrirea gelului celula
se va introduce n frigider la +4C.
- Aplicarea probelor: n primele godeuri - marcate cu ajutorul pieptenelor - , se
aplic probele de acizi nucleici cu masa molecular cunoscut, iar n
urmtoarele probele de acizi nucleici cu masa molecular necunoscut.
- n cutia aparatului de electroforez se introduc 275 ml din soluia tampon
- Introducerea celulei n aparatul de electroforez, dup care celula se conecteaz
la electrozii aparatului de electroforez cu ajutorul unor benzi de hrtie de filtru
mbibate n tamponul de electroforez
67
- n cazul tamponului cu care se lucreaz, migrarea acizilor nucleici se va face la
150 voli i aproximativ la 7-8 mA timp de 2 ore.
- Punerea n eviden a acizilor nucleici se poate face prin mai multe mijloace.
- Cea mai sensibil metod const n imersia gelului timp de 15 minute ntr-
o soluie de bromur de etidiu (0,5 g/ml), dup care se examineaz gelul n lumina
ultraviolet produs de o lamp special.
- A doua metod mai puin sensibil este colorarea cu albastru de toluidin,
n acest caz gelul se imerseaz 30 de minute ntr-o baie de 0,2% albastru de
toluidin. Excesul de colorant se ndeprteaz prin splare cu ap.
- Evaluarea masei moleculare:
O dat localizate benzile acizilor nucleici se vor msura distanele migrate
(de la start), de ctre moleculele cu mas molecular cunoscut (markeri) i de
ctre moleculele cu mas molecular necunoscut. Se reprezint grafic
logaritmul masei moleculare n funcie de mobilitatea acizilor nucleici de
referin (markeri), iar din acest grafic se va determina masa molecular a unui
acid nucleic necunoscut.


Identificarea ADN plasmidial aflat n diferite conformaii moleculare prin
metoda electroforezei n gel de agaroz

Principiul metodei:
Plasmidele sunt elemente genetice extranucleare i extracromozomiale,
prezente att n celula procariot ct i n cea eucariot. Ele se utilizeaz mai ales
ca vectori de clonare.
Moleculele de ADN plasmidial aflate n conformaie molecular de tip I sau
de cerc covalent nchis (CCI) au o activitate electroforetic mai mare dect cele
aflate n conformaie liniar, de tip III sau de cerc deschis (CD), de tip II. Prin
urmare mobilitatea moleculelor n funcie de conformaia molecular variaz n
ordinea:
CCI > liniar > CD.


Fig. 10. Diferite conformaii de ADN plasmidial:
a. tipul CCI
b. tipul CD
c. tipul liniar


68
Echipament, materiale i reactivi:
1. ADN plasmidial extras prin tehnicile descrise n lucrrile anterioare
2. Aparat de electroforez, cu celul orizontal sau vertical.
3. Agaroz
4. Tampon de migrare: Tris 89 mM, EDTA 2,4 mM, H
3
BO
3
89 mM, pH=8
5. Soluie de bromur de etidiu 0,5 mg/ml

Prepararea gelului de agaroz:
Se cntrete agaroza pentru a obine 30 ml soluie de 0,6 %. Agaroza se
introduce ntr-un pahar Erlenmeyer i se adaug 30 ml soluie tampon. Amestecul
se nclzete pe baia de ap pn se topete agaroza.
Soluia se rcete la 45-50C i se introduce ntr-o celul special avnd
dimensiunile de 120 x 80 x 2,5 mm. Pentru o bun gelificare, celula coninnd
soluia de agaroz se las la 4C timp de 30 de minute.

Migrarea electroforetic:
ADN plasmidial se introduce ntr-un godeu de gel, n celelalte godeuri se pun
probe de ADN cu conformaie molecular cunoscut. Se pornete circuitul electric
la 8V/cm (cm = distana msurat ntre cei doi electrozi) i se las probele s
migreze timp de 2 ore.

Examinarea ADN
Dup terminarea electroforezei gelul se introduce n soluia de bromur de
etidiu, timp de 15 minute. Dup acest timp probele se examineaz n lumin
ultraviolet, folosind filtre adecvate (fig.11.).
ADN apare sub forma unui spot colorat n rou, datorit complexului ce se
realizeaz ntre ADN i bromura de etidiu. Se msoar distana de la start pn la
diferitele molecule, astfel determinnd masele moleculare ale diferitelor molecule
de ADN.


a. b. c.

Fig. 11. Electroforez n gel de agaroz pentru identificarea difiretelor conformaii
de ADN plasmidial
a. tipul CCI monocatenar; b. tipul CCI bicatenar; c. ADN cromozomial


69
IV.6. TESTE RAPIDE DE INVESTIGARE
Una din importantele achiziii ale metodologiei moderne n chimia clinic
este introducerea, dezvoltarea i aplicarea pe scar larg a testelor rapide, denumite
Schnell-Testen, screening - test, teste express, bed-side tests, side-room tests,
such-testen i a procedeelor simplificate, cu valoare orientativ n abateri de la
normal a compoziiei biologice curent explorate n snge, urin, LCR.
Creterea n fiecare an a numrului de analize solicitate n practica
medical a impus ca o necesitate actual degrevarea laboratorului de chimie
clinic de balastul analizelor, prin introducerea acestor teste rapide.
Testul rapid este o investigaie de chimie clinic care furnizeaz rezultate
calitative sau semicantitative, ntr-un timp scurt i un mod foarte simplu,
folosindu-se reactivi gata pregtii impregani pe hrtii sub form de stixuri,
tablete sau pulberi de testare.
Majoritatea testelor se bazeaz pe cteva principii simple, n toate cazurile
reactivii fiind coninui n stare solid i uscat.
Principalele variante se bazeaz pe folosirea de benzi de hrtie impregnate
cu reactivi, tablete sau comprimate de substane reactive, pulberi uscate din
substane reactive, hrtii reactive.
Aceste forme se gsesc n comer sub denumiri diferite n funcie de
firma care le livreaz i de componentul sau reacia crora li se adreseaz.
Avantajele testelor rapide
Prin introducerea testelor rapide i a procedeelor simplificate se realizeaz
cteva avantaje care trebuie subliniate n mod special:
Se poate efectua investigarea orientativ n condiii de
dotare redus, fr aparatur (n mediu rural, puncte sanitare,
serviciu de urgen).
Simplificarea i nlturarea efecturii unor analize
inutile, a unor analize laborioase.
Scurtarea timpului de lucru cu reducerea consumurilor
specifice de reactivi.
Pot fi executate n majoritatea lor fr pregtire de
specialitate.
Testele rapide pe care nu este nregistrat data de expirare nu trebuie s fie
acceptate. Se recomand n mod special respectarea condiiilor de manipulare i
conservare indicate de instruciunile care nsoesc testele rapide.
Modul de utilizare a testelor rapide
Dup cum am vzut, principalele variante se bazeaz pe folosirea de:
Benzi de hrtie impregnate cu reactivi, cele mai multe sub form
de vergelue (stixuri sau stripsuri) din material plastic care prezint la
un capt hrtia impregnat cu reactivi. Stixurile pot s fie monoreactive
sau polireactive.
Tablete sau comprimate de substane reactive
Hrtii reactive
70
Expunerea fiecrui test n parte se face dup un plan unitar valabil pentru
utilizarea stripsurilor sau tabletelor n general menionnd la fiecare test n parte
ceea ce are n particular.
Schema de expunere cuprinde: principiul, tehnica sau modul de folosire,
sensibilitatea, specificitatea, stabilitatea i observaii cnd est e cazul. Ca aspecte
comune trebuie subliniate recomandrile pentru manevrarea testelor, i anume:
se previne a nu se atinge cu mna aria reactiv a stixului.
n cazul tabletelor, acestea se apuc cu pensa pentru a fi scoase
din conintor.
Ca mod de utilizare, comun pentru toate stripsurile, se introduce captul
reactiv al stixului pentru scurt timp (1-2 secunde) n vasul de analizat; dac se
prelungete timpul de imersare componentele reactive se pot pierde prin dizolvare
i reacia apare fals negativ. Se scoate apoi stripsul i se preseaz captul imersat
de peretele vasului conintor. Manevra este absolut necesar, n special la testele
bazate pe reacii n care intervine oxigenul, pentru a nu fi mpiedicat accesul
oxigenului atmosferic cerut pentru oxidare, cum este cazul testelor pentru
detectarea glicozuriei prin reacia enzimatic. Citirea se face dup 1 minut,
comparndu-se aria de testare cu scala de evaluare de pe flacon.
n cazul tabletelor sau comprimatelor reactive, se picur 5 picturi de lichid
biologic de analizat n eprubeta de testare (uscat). Se cltete pipeta cu ap
distilat i apoi se picur 10 picturi de ap distilat. Se introduce o tablet
reactiv care se dizolv. Se agit tubul uor i se compar culoarea coninutului
cu scala intensitilor de culoare.




















71
V. ANALIZA BIOCHIMIC A VITAMINELOR


Pentru analiza vitaminelor se pot aplica metode fizico-chimice i biologice.
Cele biologice au avantajul specificitii, dar sunt mai greu de efectuat (necesit
animale de experien, culturi de microorganisme i un timp mai ndelungat), de
aceea se aplic, cel puin orientativ, metodele fizico-chimice care corespund
analizei preparatelor farmaceutice, alimentelor i lichidelor biologice.

V.1. REACII PENTRU CAROTINOIDE I VITAMINELE A

Identificarea carotenoidelor i vitaminelor A cu SbCl
3


Reacia CARR-PRICE

Principiu
Se cunosc reacii comune datorate catenei polienice care n prezen de
fenoli, acizi minerali sau organici, a clorurilor acide genereaz compui colorai.
Cea mai uzual este reacia de culoare cu SbCl
3
( reacia Carr-Price).
Reactivi:
1.Soluie uleioas de vitamina A sau ulei de pete;
2.Soluie cloroformic saturat de SbCl
3
; 30g clorur de stibiu se agit timp
de 2 ore cu 70 ml cloroform ntr-o sticl cu dop rodat. Reactivul se poate folosi
timp de o sptmn.
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet peste 4-5 picturi de soluie de analizat (vitamina A sau ulei
de pete) se adaug 1ml soluie cloroformic de clorur de stibiu i se observ
apariia unei coloraii albastre.
Observaii
1. Muli compui prezeni n grsimile naturale (de ex. Acizii grai
polinesaturai) interfereaz cu vitamina A i falsific rezultatele, de aceea se
recomand eliminarea lor prin saponificare .n acest scop se fierbe produsul de
analizat cu KOH, soluie alcoolic sau apoas, dup caz i se extrage cu eter care
ulterior se evapor i reziduul se reia cu cloroform ( soluiile pure sau farmaceutice
nu necesit aceste operaii).
2. Reacia este dat i de ctre produii de oxidare ai clorofilei, iar vitamina
D d o reacie cu o culoare diferit.
3. Urmele de ap transform triclorura de stibiu n oxiclorur care nu
reacioneaz cu vitamina A i de aceea este absolut necesar s se lucreze n
eprubete uscate i cu reactivi lipsii de ap sau s se adauge cteva picturi de
anhidrid acetic.
4. Reacia se preteaz determinrii cantitative a vitaminei A, prin msurarea
intensitii albastre la 620 nm. Pentru aceast determinare s-au construit
72
colorimetre speciale Lovibond, etalonate pentru culoarea albastr i care au condus
la stabilirea unitilor Lovibond sau uniti albastre.

Identificarea vitaminei A cu acid tricloracetic

Se pipeteaz ntr-o eprubet 4-5 picturi soluie uleioas de vitamina A i
se adaug 1 ml soluie cloroformic de acid tricloracetic (30 g acid tricloracetic
dizolvat n 100 ml cloroform); apare imediat o culoare galben care trece n
albastru.

Dozarea vitaminei A

Principiu
Molecula vitaminei A se oxideaz cu dicromat de potasiu n mediu acid i
se dozeaz excesul de dicromat spectrofotometric.
Reactivi:
1. Soluie de vitamina A de dozat;
2. Soluie de dicromat de potasiu 0,01N;
3. HCl conc;
4. KI 10%;
5. Tiosulfat de sodiu 0,01N;
6. Amidon (indicator);
Tehnica de lucru
ntr-un balon prevzut cu refrigerent ascendent se introduc 0,1 ml soluie de
vitamina A, 14 ml ap, 40 ml dicromat i 2 ml HCl conc. i se fierbe amestecul
timp de o or. Dup rcire se iau n 4 baloane Erlenmeyer cte 14 ml, din soluia
din balon, care se vor titra. n fiecare balon se adaug 5 ml KI 10% i se titreaz cu
tiosulfat de sodiu n prezen de amidon ca indicator.
Calcul
Vit.A (mg/100ml) = (10-N) x 0,00008 x 1,0316 x 4000 x 1,001
Unde: 1,001 factor de corecie
N numrul de ml tiosulfat folosit la titrare
Vit.A (mg/100ml) = (10-N) x 0,33

Cunoscnd c o unitate internaional de vitamina A este echivalent cu
0,344g acetat de vitamina A sau 0,3g vitamina A alcool pur, valoarea gsit n
mg se poate exprima n U.I.





73
V.2. REACII PENTRU PROVITAMINELE I VITAMINELE D

Reacia Liebermann-Burchard

Principiu
Soluia cloroformic de vit.D n prezena anhidridei acetice i a acidului
sulfuric concentrat d natere unei culori, care vireaz de la roz-violaceu la albastru
i apoi la verde.
Reactivi:
1. Soluie cloroformic de provitamina D sau de vitamina D: 0,5 g la 100 ml;
2. Anhidrid acetic;
3. Acid sulfuric concentrat
Tehnica de lucru
La 1 ml soluie de vitamina sau provitamina D se adaug 1 ml anhidrid
acetic i 5 picturi de acid sulfuric; se observ o coloraie roie care trece n final
n verde.
Reacia nu este specific, deoarece este dat i de compuii sterolici.


Reacia cu anilina HCl
Vitaminele din grupul D, n prezena anilinei i a HCl dau o coloraie roie.
ntr-o eprubet se ia 1 ml soluie de vitamina D sau ulei de pete i se adaug
cteva picturi de soluie anilin-HCl (pri egale de anilin i HCl) i se observ
apariia unei coloraii roii.


Reacia CARR-PRICE
1ml soluie cloroformic de vitamina D 0,5% se trateaz cu 4 ml soluie
cloroformic de clorur de stibiu i se obine o culoare galben-portocalie, diferit
de culoarea albastr pe care o d vitamina A n aceleai condiii.


Identificarea vitaminelor D cu aldehide aromatice
Vitaminele D n prezena aldehidelor aromatice (vanilina, furfurol, aldehida
anisdinic) i n prezena acidului percloric d compui colorai. Reacia efectuat
n condiii bine specificate permite i determinarea cantitativ a vitaminelor D.
Reactivi:
1. Soluie de vit.D n benzen
2. Soluie de aldehid aromatic 0,1 g% n benzen
3. Acid acetic glacial
4. Reactiv percloric: 2 ml aldehid acetic, 2,5 ml acid acetic glacial i 0,5
ml soluie 70% de acid percloric se nclzesc la 95-100
0
C timp de or.
74
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet se pipeteaz 1 ml soluie benzenic de vitamina D i 1 ml
soluie aromatic n benzen i se nclzesc la fierbere n baie de ap. Se adaug 2
picturi reactiv percloric i se fierbe nc 1 minut, apoi se las s se rceasc la
temperatura camerei. La soluia tulbure verde se adaug 1,5 ml acid acetic glacial i
se urmrete culoarea format.


Diferenierea ntre vitaminele D
2
i D
3
Vitaminele D
2
i D
3
dau culori diferite cu acidul sulfuric concentrat.
n dou eprubete se iau cte 1ml soluie alcoolic 0,1% de vitamina D
2
i,
respectiv soluie alcoolic 0,1% vitamina D
3
i apoi se adaug n fiecare eprubet
cte 2 picturi ap, dup care se adaug cu precauie pe pereii eprubetei cte 1 ml
acid sulfuric concentrat. La zona de contact apare o culoare portocalie ce trece n
rou pentru vitamina D
2
, n timp ce vitamina D
3
d o coloraie galben.


V.3. DOZAREA VITAMINEI PP

Vitamina PP se precipit n mediu neutru cu o soluie de sulfat de cupru, iar
excesul se determin iodometric.
Reactivi:
1. Soluie vit.PP: 0,5-1 g la 100 ml
2. Soluie fenolftalein 1 g la 100 ml alcool
3. Soluie NaOH 0,1N
4. Soluie CuSO
4
1 g la 100 ml ap distilat
5. Soluie HCl 10 g %
6. Soluie KI 10 g%
7. Soluie tiosulfat de sodiu 0,01N
8. Soluie amidon 1 g la 100 ml ap distilat








Tehnica de lucru
Se pipeteaz ntr-o eprubet 2,5 ml soluie de vitamina PP de dozat i n alt
eprubet (martor) 2,5 ml ap. n fiecare eprubet se adaug NaOH 0,1N, cu
pictura, pn la virajul indicatorului fenolftalein n roz-pal i apoi cte 2 ml
soluie de sulfat de cupru 1%. Dup 30 de minute de repaus se filtreaz prin filtru
de hrtie, splnd de 2-3 ori fiecare eprubet cu cte 2 ml ap i adunnd filtratele
N
O
Cu
O O
N
O
precipitat albastru
75
n 2 flacoane Erlenmeyer. n fiecare se adaug 1 ml HCl 10% i 2 ml KI 10%.
Iodul eliberat se titreaz cu tiosulfat 0,01 N, n prezen de amidon pn la incolor.
Calcul
N ml folosii la titrarea martorului
n ml folosii la titrarea probei cu vit.PP

Vit.PP (g/100ml) = (N-n) x 0,002462 x 40

V.4. REACII PENTRU IDENTIFICAREA I DOZAREA VITAMINEI C


Identificarea vitaminei C cu azotat de argint

ntr-o eprubet la 1 ml sol.0,5% de acid ascorbic se adaug 0,5 ml acid
azotic 10% i 0,3 ml azotat de argint 2%, observndu-se apariia unui precipitat
cenuiu (Ag metalic).

Identificarea vitaminei C cu nitroprusiat de sodiu
1 ml sol.5% de vit.C se trateaz cu 4 picturi de nitroprusiat i 3 picturi de
NaOH 10%, observndu-se apariia unei coloraii galben-verzui, care la adugare
de acid acetic 10% trece n albastru-violet.

Dozarea vitaminei C prin metoda iodometric

Reaciile folosite uzual n scopul evidenierii i dozrii vitaminei C se
bazeaz pe proprietile sale reductoare. Acidul ascorbic are proprietatea de a
reduce soluia de iod 0,01N. Aceast metod de dozare a vitaminei C servete la
dozarea vitaminei din preparatele farmaceutice i din extractele vegetale.
Reactivi:
1. Soluie de vitamina C
2. Soluie de iod 0,01 N
3. Soluie amidon
Tehnica de lucru
ntr-un balon Erlenmeyer se iau 10 ml soluie de vitamina C i se titreaz cu
iod n prezen de amidon, pn la persistena culorii albastre. Se noteaz cu N
numrul de ml de iod folosii la titrare.
Calcul

Vit.C (mg/100ml) = N x 0,88 x 10

76
Dozarea vitaminei C din snge i urin prin metoda ROE i Kuether

Principiu
Acidul ascorbic este oxidat n prealabil la acid dehidroascorbic cu ajutorul
noritului (crbune animal activat). Acidul dehidroascorbic reacioneaz cu 2,4-
dinitrofenilhidrazina n prezena acidului sulfuric formnd un compus colorat.
Reactivi:
1. Norit: 100g norit se suspend n 500ml HCl 10% se nclzete la fierbere i
se filtreaz la vid. Sedimentul se reia cu 50ml ap distilat i se filtreaz din
nou. Operaia de splare se repet pn cnd filtratul d o reacie negativ
sau foarte slab pentru ionul Fe (III). Se usuc 24 de ore la 110-112
0
C.
2. Soluie de acid tricloracetic 7%, ATA.
3. Soluie etalon de acid ascorbic: 100mg acid ascorbic se dizolv n 100ml
ATA 7%
4. Soluie tiouree 5,5% n amestec hidroalcoolic (alcool : ap, 1:1)
5. Soluie 2,4-dinitrofenilhidrazin 2% n acid sulfuric 9N
6. Acid sulfuric 9N
Tehnica de lucru
La 1,5 ml snge recoltat pe oxalat se adaug 6ml ATA i un vrf de spatul
de norit. Se agit i dup 10 minute se filtreaz.
Urina se dilueaz cu ATA n proporie de 1:10. La 0,5ml urin se adaug
9,5ml ATA i un vrf de spatul de norit, se agit i se filtreaz dup 10 minute.
Proba etalon se obine tratnd 0,5ml soluie etalon (reactivul 3) cu 9,5ml
ATA i un vrf de spatul de norit. Se agit i se filtreaz dup 10 minute. Filtratul
conine 50 g acid ascorbic pe ml.
n continuare se pregtesc 4 eprubete astfel:

Reactivi (ml) E1 E2 E3 M
Filtrat sanguin 2 - - -
Filtrat de urin - 2 - -
Filtrat din soluia etalon - - 1 -
ATA - - 1 2
Tiouree 2 picturi 2 picturi 2 picturi 2 picturi
DNFH 0,5 0,5 0,5 0,5
Eprubetele se in 2 ore la 37
0
C i apoi se plaseaz ntr-o baie de ghea
H
2
SO
4
85% 2,5 2,5 2,5 2,5

Dup 20 de minute se citesc extinciile primelor 3 eprubete fa de martor.

Calcul
Ascorbemia (mg%) = 12,5 x E1 / E3
Ascorburia (mg%) = 500 x E2 / E3.


77
V. 5. REACII DE IDENTIFICARE I DOZARE A VITAMINEI B
1


Identificarea vitaminei B
1
sub form de tiocrom

Identificarea vitaminei B
1
se bazeaz pe oxidarea tiaminei sub aciunea
hexacianoferatului (III) de potasiu n mediu alcalin, la tiocrom, compus ce prezint
o fluorescen albastr.

H3C
N
N
N
S
NH2
CH3
CH2CH2OH
+
N
N
N
S
N
CH3
CH2CH2OH
H3C
K3[Fe(CN)6]
tiamina
tiocrom

Reactivi:
1. soluie de tiamin 1%
2. hexacianoferat de potasiu 5%
3. NaOH 10%
4. HCl 10%
5. alcool butilic sau amilic
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet se trateaz 1 ml soluie vitamin B
1
cu 0,5ml NaOH i 0,5ml
hexacianoferat de potasiu. Se adaug apoi 1ml butanol i se agit puternic. n
stratul alcoolic apare o fluorescen albastr care dispare prin acidulare i reapare la
alcalinizare.


Dozarea vitaminei B
1
prin diazotare

Metoda se bazeaz pe reacia de diazotare-cuplare pe care vitamina B
1
o d
cu acidul diazo-benzensulfonic, cu formarea unui compus colorimetrabil. Adausul
de aldehid formic sau alcool butilic stabilizeaz culoarea, n timp ce substanele
reductoare (cisteina, ionii de cupru, mercur, argint) deranjeaz reacia.
Reactivi:
1. Soluie de vitamin B
1

2. Soluie etalon de vitamin B
1
: 0,2mg/ml
3. Reactivul diazobenzensulfonic:
Soluia A: 0,45g acid sulfanilic se trateaz cu 4,5ml HCl concentrat
i aproximativ 40ml ap distilat. Se nclzete pe baie de ap pn la
dizolvare, iar dup rcire se aduce la un volum de 50ml.
Soluia B: se prepar extemporaneu prin dizolvarea a 0,9g NaNO
2
n
20ml ap distilat.
78
Soluia C: se prepar extemporaneu la ghea. Se iau 3ml din soluia
A i 3ml din soluia B. Dup 5 minute se completeaz cu ap la 100ml.
4. Soluie alcalin: 100ml NaOH 1N se amestec cu 100ml NaHCO
3
5,76g%.
5. Formol.
Tehnica de lucru
Se pregtesc 3 eprubete conform tabelului urmtor:

Reactivi (ml) P S M
Soluie de vitamin B
1
0,5 - -
Soluie etalon de vitamin B
1
- 0,5 -
Ap bidistilat - - 0,5
Reactiv C 3 3 3
Soluie alcalin 7 7 7
Formol 0,2 0,2 0,2

Dup o or de repaus se citesc extinciile probei de dozat i a standardului
fa de martor la 530nm.
Calcul
vitamin B
1
(ml/100ml) = Ep / Es x 20


79
VI. ANALIZA BIOCHIMICA A PROTEINELOR

Proteinele sunt componente fundamentale ale materiei vii. Ele pot fi
clasificate dup produii rezultai n urma procesului de hidroliz n:
a. Holoproteine care dau prin hidroliz numai aminoacizi:
1. Fibrilare: colagen, elastin, keratine, etc.
2. Globulare: albumine, globuline, etc.
b. Heteroproteine care prin hidroliz dau pe lng aminoacizi i componente
neproteice (prostetice), de ex. nucleoproteide, mucoproteide, fosfoproteide,
cromoproteide, metaloproteide, lipoproteide.
Aminoacizii constituie unitatea de baz care intr n structura tuturor
proteinelor. Identificarea proteinelor i respectiv a aminoacizilor se bazeaz pe
urmtoarele tipuri de reacii:
- reacii generale datorate gruprilor funcionale ale aminoacizilor: carboxil
i amino.
- reacii datorate radicalilor din molecula aminoacizilor i care sunt, de
obicei specifice pentru aminoacizii care au radical diferit.


VI.1. REACII DE IDENTIFICARE A AMINOACIZILOR

REACIA NINHIDRINEI
Reacia ninhidrinei constituie o reacie de grup pentru compuii cu grupri
aminice libere (culoare albastr) i proteine (culoare violet). Prin nclzirea soluiei
unui aminoacid n prezena ninhidrinei are loc iniial o dezaminare oxidativ i o
decarboxilare a aminoacidului. Se formeaz astfel o aldehid, NH
3
i CO
2
.
Ninhidrina este redus la hidridantin i n etapa urmtoare are loc condensarea unei
molecule de ninhidrin cu hidridantin i NH
3
, cu formarea unui complex albastru
violet.
Reacia are o mare sensibilitate, de aceea poate fi utilizat la evidenierea
aminoacizilor separai prin cromatografie, evidenierea eliminrii urinare crescute a
aminoacizilor, dozarea proteinelor pe baza intensitii culorii formate sau a
msurrii CO
2
obinut n reacie.











+ R - CH - COO
-
NH
3
+
O
O
OH
OH OH
H
O
O
+ R - CH = O + CO
2
+ NH
3
O
O
H
OH
OH
OH
O
O
+ NH
3
+
O
O
O
HO
N
80
REACIA CU IONII DE CUPRU (Cu
+2
) N MEDIU ALCALIN
Aminoacizii formeaz cu Cu
+2
n mediu alcalin un complex colorat n
albastru.






Tehnica de lucru
Peste soluia unui aminoacid se adaug NaOH pentru alcalinizare, dup care
se adaug o soluie de CuSO
4
. Se observ apariia unei coloraii albastre. Aceast
reacie este utilizat i la dozarea spectrofotometric a unui aminoacid.


DETERMINAREA CONCENTRAIEI UNEI SOLUII DE AMINOACID

Aminoacizii formeaz cu ionii de cupru bivaleni, n mediu alcalin un
complex chelat albastru care prezint maxim de extincie la o lungime de und de
620 nm.
Reactivi :
1. Soluie de aminoacid de concentraie necunoscut;
2. Soluie standard de alanin ( 40 nM );
3. Suspensie Cu
3
(PO
4
)
2
.
Tehnica de lucru
Deoarece reactivul de culoare este el nsui colorat este necesar prepararea
unui martor. Conversia extinciei n concentraie se va face pe seama unei curbe de
etalonare efectuate cu o soluie standard de alanin.
Reactivi 1 2 3 4 5 P M
Soluie de
aminoacid
- - - - - 5 -
Soluie
standard de
alanin
1 ml 2 ml 3 ml 4 ml 5 ml - -
Ap distilat 4 ml 3 ml 2 ml 1 ml - - 5 ml
Concentraia
n mM
alanin
8 16 24 32 40 ? 0

Se agit eprubetele i dup 5 minute se centrifugheaz 5 minute la 4000
rpm. Se citesc extinciile la 620 nm n cuva de 1 cm. Extincia probei se va converti
n concentraie prin interpolare grafic.
Aceast metod se poate folosi la urmrirea vitezei de hidroliz a unei
proteine sau gradului de conversie a unui aminoacid.
2 R - CH - NH
2
+ Cu
+2
COOH
R - CH
COO
NH
2
Cu
H
2
N
OOC
HC - R
81
REACIA XANTOPROTEIC
Aceast reacie este specific pentru aminoacizii aromatici, cum ar fi:
tirozina, fenilalanina i triptofanul.
Proteinele care conin aminoacizi aromatici dau n prezena HNO
3
i
alcalinizare ulterioar o culoare galben portocalie, datorit formrii de
nitroderivai.







Reactivi :
1. Soluie proteic diluat;
2. HNO
3
conc.
3. NH
4
OH conc.
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet se iau 2 3 ml soluie proteic la care se adaug aproximativ
1 ml HNO
3
conc. Se constat apariia unui precipitat alb. Se fierbe 1 2 minute, se
rcete i se adaug NH
4
OH (2ml) pn la apariia unui precipitat galben portocaliu.

REACIA MILLON este specific pentru tirozin. n prezena reactivului
Millon (azotat i azotit de mercur n mediu de HNO
3
), soluia de tirozin d prin
nclzire o culoare roie. Proteinele dau n aceste condiii un precipitat alb, care prin
nclzire uoar (60
0
C) devine roz.












Reactivi:
1. Soluie de tirozin 1 g% sau soluie apoas de proteine;
2. Reactiv Millon (5g Hg + 10ml HNO
3
+ 30 ml ap distilat).
HO CH
2
- CH - COOH
NH
2
2HNO
3
2H
2
O
O
2
N
O
2
N
NH
2
CH
2
- CH - COOH HO
HO CH
2
- CH - COOH
NH
2
react iv
Millon
NH
2
CH
2
- CH - COOH HO
ON
NH
2
CH
2
- CH - COOH O
Hg
NH
2
CH
2
- CH - COOH
O
HO - N
82
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet se iau 2 ml soluie proteic i se adaug 0,5 ml reactiv
Millon. Se observ apariia unui precipitat alb. Se nclzete eprubeta la 50 60
0
C
dup care precipitatul devine roz.

REACIA ADAMKIEWICZ-HOPKINS este specific pentru triptofan.
Proteinele coninnd triptofan reacioneaz cu acidul glioxilic n mediu de H
2
SO
4

conc. i formeaz o culoare violet. Reacia are aplicabilitate la evidenierea
triptofanului din lichidul cefalo-rahidian.








Reactivi :
1. Soluie proteic concentrat
2. Acid acetic glacial
3. H
2
SO
4
conc.
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet se iau 1 2 ml soluie proteic concentrat, se adaug 0,5 ml
acid acetic glacial i se las s se preling pe pereii eprubetei 0,5 1 ml H
2
SO
4

conc. La limita de separare apare un inel violaceu.

REACIA SAKAGUCHI este specific pentru arginin.
Arginina datorita restului guanidinic reacioneaz cu alfa-naftolul n prezena
hipobromitului de sodiu i formeaz o coloraie roie.















N
- CH
2
- CH - COOH
NH
2
H
+ OHC - COOH
H
2
O
CO
2
N N
CH
2
CH
2
H
2
N - CH
CH - NH
2
HOOC COOH
H
H
HN = C - NH
2
NH
(CH
2
)
3
CHNH
2
COOH
+ 2
OH
NaOBr
COOH
CHNH
2
(CH
2
)
3
NH
HN = C - N
O
O
Br
83
Reactivi:
1. Soluie proteic diluat;
2. Soluie de hipobromit de sodiu (1 ml NaOH 33% + 2 picturi de brom);
3. Soluie alfa-naftol 0,1 N;
4. NaOH 10%
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet se ia 1 ml soluie proteic diluat, se alcalinizeaz cu 1 ml
NaOH 10%, apoi se adaug 1 ml alfa-naftol i hipobromit de sodiu, pictur cu
pictur, pn la apariia unei coloraii viinii, care indic prezena argininei sau a
compuilor cu grupri guanidinice. La nclzire culoarea dispare.

REACIA ERLICH-PAULI este specific pentru histidin.
Histidina i tirozina n prezena acidului diazobenzensulfonic dau o coloraie
roie-portocalie. Reacia este dat i de fenoli i amine.









Reactivi :
1. Soluie proteic diluat;
2. Acid sulfanilic (5 g la 1000 ml ap distilat);
3. Na
2
CO
3
5 g%;
4. NaNO
2
2-3 g%.
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet se trateaz 1 ml acid sulfanilic cu 2 ml NaNO
2
pentru a
forma acid diazobenzensulfonic. Se adaug 1 ml soluie proteic diluat i 3-4 ml
Na
2
CO
3
. Se obine o culoare portocalie care se intensific la nclzire.

REACII SPECIFICE AMINOACIZILOR CU SULF. Aminoacizii cu sulf din
proteine, prin nclzire cu hidroxizi alcalini formeaz sulfura de sodiu, care n
prezena srurilor de plumb formeaz un precipitat negru de sulfur de plumb.





N
N
H
NH
2
CH
2
- CH - COOH
+ 2[N
+
N SO
3
H + N
2
CO
3
CH
2
- CH - COOH
NH
2
H
N
N
NaO
3
S N = N N = N
SO
3
Na
CH
2
SH
CH - NH
2
+ 2NaOH
COOH COOH
CH - NH
2
+ Na
2
S + H
2
O
CH
2
OH
Na
2
S + Pb(OOCCH
3
)
2
PbS + 2CH
3
COOH
84
Reactivi :
1. Soluie proteic concentrat;
2. NaOH 10%;
3. (CH
3
-COO)
2
Pb soluie saturat.
Tehnica de lucru.
ntr-o eprubet se iau 3 ml soluie proteic concentrat i acelai volum de
NaOH 10%. Dup o fierbere de 3 5 minute se adaug acetat de plumb i se fierb
din nou. Se obine un precipitat de sulfur de plumb de culoare neagr.
Aminoacizii care conin n molecul grupri SH se pot doza
spectrofotometric cu acid 5,5

ditio-bis-2-nitrobenzoic (DTNB). Cisteina datorit

grupei SH pe care o conine, reacioneaz cu DTNB-ul, formnd un produs colorat
n galben care se determin spectrofotometric la 412 nm.















Reactivi :
1. Soluie cistein hidrocloridic 0,2 mM n tampon fosfat 0,05 M, pH=7,4;
2. Soluie DTNB ( 0,0149 g DTNB se dizolv n 130 ml tampon fosfat
0,05 M pH=7,4 i se completeaz la 250 ml cu etanol 95% );
3. Tampon fosfat 0,05 M, pH=7,4;
4. Soluie proteic de analizat sau ser sanguin.
Tehnica de lucru
Se pregtesc o serie de eprubete conform tabelului :

Reactivi (ml) 1 2 3 4 5 6 7
Cistein 0,2 mN 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 - -
Protein - - - - - 0,1 -
Tampon fosfat 0,9 0.8 0,7 0,6 0,5 0,9 1,0
DTNB 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Se las 15 minute, apoi se citesc extinciile la spectrofotometru fa de proba
7 (martor), la 412 nm.
O
2
N
O
2
N
HOOC
HOOC
S
S
+ HS - CH
2
- CH - COOH
NH
2
NH
2
S - S - CH
2
- CH - COOH
HOOC
O
2
N
HOOC
O
2
N SH
85
VI.2. DOZAREA AMINOACIZILOR PRIN METODA SRENSEN

Principiu
ntr-o prim etap aminoacidul formeaz cu formaldehida un produs ce are
gruparea aminic blocat. Aminoacidul rmne doar cu gruparea carboxil liber,
care confer caracterul acid. Astfel n a doua etap gruparea carboxil poate fi
neutralizat cu NaOH n prezena fenolftaleinei.








Reactivi :
1. Soluie de aminoacid de concentraie necunoscut
2. Soluie aldehid formic 10% neutralizat cu NaOH n prezena
fenolftaleinei;
3. HCl 1%;
4. NaOH 0,1N;
Tehnica de lucru
a) Pregtirea martorului;
Deoarece aminoacizii formolizai sunt acizi slabi, srurile lor cu
hidroxizii alcalini hidroliznd puternic, pentru a putea fi dozai se mpiedic
hidroliza prin titrare la un pH alcalin (9-9,5). Din aceast cauz este
necesar pregtirea unui martor i supratitrarea probei pn la culoarea
martorului. Astfel, ntr-un pahar Erlenmeyer se fierb 20 ml ap distilat, se
adaug 10 ml aldehid formic neutralizat, 10 picturi fenolftalein i 0,4
ml NaOH 0,1 N, msurai cu biureta. Se obine o culoare violet.
b) Dozarea solutiei de aminoacid
ntr-un pahar Erlenmeyer se pipeteaz 10 ml soluie de aminoacid, se
adaug NaOH 0,1 N ( sau HCl 1%) pn se obine o culoare slab roz. Se
adaug 10 ml aldehid formic neutralizat i se titreaz cu NaOH 0,1 N
pn cnd se obine intensitatea de culoarea martorului. Se noteaz cu N
numrul de mililitri de NaOH utilizai la titrare.
Calcul.
C concentraia aminoacidului exprimat n mg glicocol/l soluie
7,5 echivalentul glicocolului
0,4 reprezint ml NaOH 0,1 N adugai martorului i respectiv mililitri
NaOH 0,1 N cu care s-a supratitrat proba.

solutie ml 1000 glicocol
mg
10
1000 5 7 4 0 N
c
/
. , ). , (
=
R - CH - COOH + O = CH
2
NH
2
R - CH - COOH + H
2
O
N = CH
2
N = CH
2
R - CH - COOH + NaOH
N = CH
2
R - CH - COONa + H
2
O
86
Aceast metod se utilizeaz la dozarea aminoacizilor din urin, cnd n
prob se pipeteaz 10 ml urin n locul soluiei de aminoacid, iar restul reactivilor
se adaug dup reeta de mai sus.
Pentru calculul aminoacizilor prezeni n proba de urin se folosete
urmtoarea formul de calcul:

N amoniacal = ( N-0,4 ) x 0,0014 x 100g/1000 ml

unde: N ml NaOH 0,1 N cu care s-a supratitrat proba prin aducere la
intensitatea de culoare a martorului
0,0014 echivalentul azotului
Interpretarea rezultatelor
n mod normal cantitatea de aminoacid eliminat n 24 de ore, variaz ntre
50-500 mg azot, ceea ce reprezint aproximativ 2 g acizi aminai liberi sau legai.
Aproximativ 70% din aceast valoare este reprezentat de taurin, glicocol,
histidin, metilhistidin i variaz cu regimul alimentar i vrsta.
Variaii patologice se nregistreaz n afeciuni hepatice, diabet grav,
acidoz, cancer.

GOODWIN a pus la punct o metod mai nou de determinare a aminoacizilor,
fiind utilizat la dozarea acestora din plasm i urin. Metoda const n reacia
aminoacizilor cu 2,4 dinitrofluorbenzen, mai exact n reacia gruprii aminice a
aminoacidului n mediu alcalin cu 2,4-dinitrofluorbenzen.







Reactivi :
1. Indicator: 100 mg fenolftalein se dizolv n 100 ml etanol.
2. NaOH 200 mmol/l
3. Reactiv 2,4dinitrofluorbenzen. Se dizolv 650 l reactiv n 50 ml
aceton. Se poate pstra 2 luni la 4
0
C.
4. Na
2
B
4
O
7
132 mmol/l (50 g Na
2
B
4
O
7
x 10 H
2
O se dizolv ntr-un litru ap).
Se prepar nainte de utilizare.

5. Soluie de 2,4dinitrofluorbenzen de lucru. nainte de utilizare se prepar
o soluie de 2,4dinitrofluorbenzen prin diluarea soluiei stoc. Astfel un
volum din soluia stoc se dilueaz cu 9 volume de tetraborat de sodiu.
6. HCl n dioxan. 2 ml acid clorhidric concentrat se dilueaz cu 100 ml
dioxan.
NO
2
F
NO
2
+ H
2
N - CH - R
COOH
O
2
N NH - CH - R
COOH
NO
2
87
7. Soluie standard stoc de aminoacid 20 mmol/l. Se dizolv 1,471 g acid
glutamic i 0,751 g glicin n 100 ml ap, la care se adaug 2 g benzoat de
sodiu i 700 ml HCl 1 mol/l, apoi aducem cu ap distilat la 1 litru.
8. Soluie standard de aminoacid de lucru. Se dilueaz 1, 2, respectiv 4 ml
din soluia standard stoc de aminoacid la 10 ml cu ap rezultnd soluii ce
conin 2, 4, respectiv 8 mmol aminoacid/l.
Tehnica de lucru
ntr-un pahar de 100 ml se msoar 1 ml urin (din urin colectat n 24 de
ore) i se adaug 10 15 ml ap. Se adaug 24 picturi indicator i NaOH pn
cnd soluia devine roz. Se fierbe uor timp de 15 minute adugnd din nou picturi
de NaOH n acest timp, pn ce soluia colorat n roz nu se mai decoloreaz. Dac
este necesar se adaug ap pentru prevenirea evaporrii la sec.
Se iau 3 eprubete n care se pipeteaz urmtorii reactivi:
- n eprubeta ce constituie proba se adaug 1 ml urin diluat i 1 ml
DNFB de lucru.
- n a doua eprubet ce constituie martor de urin se pipeteaz 1 ml
urin diluat i 1 ml tetraborat,
- n a treia eprubet ce va conine reactivul martor se pipeteaz 1 ml
ap i 1 ml DNFB de lucru.
Eprubetele se incubeaz 15 minute la 70
0
C, apoi se las s stea 5-10 minute
la temperatura camerei, dup care se adaug 5 ml dioxan n HCl.
Se citete extincia probei, a urinei martor i a reactivului martor la 420 nm
fa de o soluie ce conine 1 ml ap i 5 ml dioxan n HCl. Pentru pregtirea
standardului tratm 1 ml din fiecare din cele 3 diluii ale soluiei standard de
aminoacid n aceleai condiii ca i urina, dup care se citete extincia.
Calcul

Azot aminoacidic urinar (mmol/24h) =
E
p
/E
s
x 20 (40 sau 80) x factorul de diluie/1000.volumul urinei din 24h (ml)


VI.3. REACII DE IDENTIFICARE A PROTEINELOR

Proteinele se identific prin reacii de culoare i reacii de precipitare.
Reaciile de culoare, de identificare a proteinelor se suprapun cu reaciile de
identificare ale aminoacizilor. Pe lng reaciile de identificare descrise la
aminoacizi, amintim reacia biuretului i reacia cu |-naftochinona.

Reacia biuretului
Aceast reacie permite identificarea proteinelor, respectiv a compuilor care
conin n structura lor cel puin dou legturi peptidice (-CO-NH-). Denumirea de
reacia biuretului se datorete faptului c biuretul, compus obinut din 2 molecule de
uree, prin eliminarea unei molecule de amoniac, la nclzire, i care conine
gruparea CO-NH- repetat de dou ori, d reacie pozitiv.
88
Culoarea albastr este proprie reactivului (amestec de CuSO
4
i NaOH) i se
rein ca pozitive doar reaciile de culoare roz sau violet. Astfel, biuretul d o
culoare roz i cu exces de CuSO
4
, o culoare violet roietic cu peptidele i o
culoare violet albastr cu proteinele.
Mecanismul reaciei se poate explica prin formarea complecilor de tip
chelai, compleci ce se formeaz atunci cnd un ion metalic se combin cu un
donor de electroni, cu formarea de valene coordinative. n complexul format de
ctre biuret, peptide sau proteine cele 4 molecule de ap legate normal de ionul
Cu
+2
, sunt eliminate i nlocuite cu gruprile amino.













Reactivi :
1. Soluie proteic diluat
2. Uree cristalizat
3. Soluie CuSO
4
1g%
4. Soluie NaOH 10%



R
2
C-ONa
R
1
O
R
3
CH-COONa
R
2
NaO-C
R
1
O
NaOOC
R
3
-CH
Cu
C
N
N
N
N
C
proteinat de cupru


Tehnica de lucru
Reacia se efectueaz comparativ pe 3 probe: soluie proteic, biuret i un
martor.
ntr-o eprubet uscat se iau aproximativ 0,2 g de uree i se nclzesc pn
la topirea cristalelor, cu emanare de amoniac, ceea ce denot transformarea ureei n
4NaOH
Cu(OH)
2
R
3
OH R
2
OH R
1
H
2
2
2
R
3
H O
R
2 H O
R
1
H
2
N
N
N COOH
N
N
N COOH
89
biuret. Masa obinut se dizolv n 1- 2 ml ap i se adaug acelai volum de NaOH
10 % i 2-3 picturi de CuSO
4
. Apare o coloraie roz-violacee.
n alt eprubet se iau 1-2 ml soluie proteic diluat, acelai volum de
NaOH 10 % i 2-3 picturi de CuSO
4
, apare o culoare violet.
n eprubeta martor se iau 1-2 ml ap, acelai volum de NaOH 10 % i 2-3
picturi de CuSO
4
, apare o culoare albastr dat de Cu(OH)
2
.
Reacia are o sensibilitate de 1:10000 i este mult aplicat pentru dozarea
proteinelor prin metoda Gornall.

Reactia cu beta-naftochinona
Aminoacizii, peptidele i proteinele cu grupri alfa-aminice libere se
condenseaz n mediu alcalin cu formarea unei coloraii roii sau roie-brun.









Cu ajutorul acestei metode se determin totalitatea gruprilor -aminice
libere sau azotul -aminic al serului, care este un indicator pentru cantitatea
aminoacizilor liberi, i pe de alt parte, n cursul hidrolizei proteinelor, raportul: N
-aminoacidic/N total constituie un criteriu de apreciere a gradului de hidroliz.
Reactivi:
1. Soluie de aminoacizi, de pepton i soluie proteic diluat;
2. Soluie carbonat de sodiu 2%;
3. Soluie -naftochinonsulfonat 10g%.
Tehnica de lucru
Se iau n eprubete diferite cte 1 ml soluie de aminoacid, pepton i soluie
proteic diluat i n fiecare se adaug cte 1 ml soluie carbonat de sodiu i, apoi cu
pictura reactivul -naftochinon. Dup scurt timp se observ n toate eprubetele
apariia unei coloraii roii sau roie-brun cu nuane i intensiti diferite, dup
concentraia gruprilor -aminice libere.


REACII DE PRECIPITARE ALE PROTEINELOR
Proteinele, datorit structurii lor pot fi separate, identificate i dozate prin
intermediul reaciilor de precipitare. n funcie de natura i concentraia agenilor de
precipitare se pot realiza precipitri reversibile i ireversibile.

2
+ HC - NH
2
R
COO
-
O
O
O
OH
N - CH - COO
-
R
+
OH
OH
90
I. Reacii de precipitare reversibile

1. Precipitarea proteinelor cu sruri (salefierea)
Sub influena unor sruri ale metalelor uoare ca: sulfat de amoniu, sodiu,
magneziu, clorur de sodiu se produce deshidratarea particulelor proteice care
precipit reversibil, deoarece proteinele se solubilizeaz din nou prin diluare sau
prin ndeprtarea srurilor precipitante prin dializ. Metoda este aplicat la
fracionarea proteinelor (separarea globulinelor de albumine; globulinele precipit
la semisaturare cu sulfat de amoniu, iar albuminele numai la saturare).
Reactivi :
1. Soluie proteic diluat;
2. Soluie saturat de sulfat de amoniu;
3. Sulfat de amoniu cristalizat;
4. Clorur de sodiu cristalizat;
5. Sulfat de sodiu cristalizat.
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet se pipeteaz 2 ml soluie proteic diluat i se trateaz cu un
volum egal de soluie saturat de sulfat de amoniu. Se obine astfel o soluie
semisaturat de sulfat de amoniu, n care, dup ctva timp precipit globulinele. Se
filtreaz i peste soluia obinut se adaug cristale fine de sulfat de amoniu pn la
saturare, se observ formarea precipitatului de albumin.
Metoda servete la separarea albuminelor de globuline din ser.
ntr-o serie de alte eprubete se trateaz 2 ml soluie proteic diluat cu
NaCl, MgSO
4
i Na
2
SO
4
, pn la saturare, cnd precipit o parte din proteine, se
filtreaz i se aciduleaz soluia cu acid acetic. Se observ apariia unui nou
precipitat: albuminele.

2. Precipitarea cu alcool
Reaciile se bazeaz pe proprietatea proteinelor de a deveni insolubile n
prezena unor solveni organici. Unii din agenii precipitani (alcool, aceton)
fixeaz apa din molecula proteinelor a cror radicali lipsii de ap floculeaz.
Concentraia optim n alcool, pH-ul, temperatura de precipitare constituie
parametrii care variaz de la o protein la alta. Precipitarea proteinelor cu alcool se
folosete la separarea proteinelor din ser.
Reactivi :
1. Soluie proteic;
2. Alcool de 95
0

Tehnica de lucru
ntr-o eprubet se iau 2 ml soluie proteic, 2 ml alcool i se agit puternic.
Dup ctva timp va apare un precipitat fin de protein. Adugnd peste precipitat 10
ml ap, acesta se redizolv, prin diluarea alcoolului.

91
II. Reacii de precipitare ireversibile

1. Precipitarea proteinelor cu sruri ale metalelor grele
Prin aciunea srurilor metalelor grele (Pb, Cu, Hg, Ag), proteinele precipit
ireversibil, ele nu se redizolv nici prin diluarea soluiilor, nici prin dializ, dei prin
aceste operaii se nltur srurile precipitante. Aceast metod se aplic la
deproteinizarea lichidelor biologice.
Reactivi :
1. Soluie proteic diluat;
2. Soluie Pb(CH
3
-COO)
2
0,5%;
3. Soluie CuSO
4
1g%;
4. Soluie AgNO
3
3g%.
Tehnica de lucru
n 3 eprubete se pipeteaz cte 1 ml soluie proteic i se adaug n prima
soluia de acetat de plumb, n a doua soluia de sulfat de cupru i n a treia soluia de
azotat de argint. n toate eprubetele se observ apariia unui precipitat.

2. Precipitarea proteinelor cu reactivii alcaloizilor
n aceast categorie de ageni de precipitare se includ reactivii care precipit
alcaloizii n mediu acid, dintre care cei mai importani sunt: taninul, acidul picric,
hexacianoferatul de potasiu.
Reactivi :
1. Soluie proteic diluat;
2. Acid acetic 1g% i 10g%;
3. Soluie apoas saturat de tanin;
4. Soluie apoas saturat de acid picric;
5. Soluie de hexacianoferat (II) de potasiu 10g%.
Tehnica de lucru
n 3 eprubete se iau cte 2-3 ml soluie proteic. n prima se adaug 1-2 ml
acid acetic 1g% i 1-2 ml tanin, n a doua se adaug 1-2 ml acid acetic 1% i 1 ml
soluie de acid picric, iar n a treia 1 ml acid acetic 10% i cteva picturi de
ferocianur de potasiu. n toate eprubetele se observ apariia unui precipitat.

3. Precipitarea proteinelor cu acizii minerali
n prezena acizilor minerali, ca de exemplu acidul tricloracetic, acidul
sulfosalicilic, amestecul de acid citric-picric (reactivul Essbach) sunt frecvent
utilizai pentru precipitarea proteinelor din lichidele biologice.

a) Precipitarea proteinelor cu acidul tricloracetic
Precipitarea proteinelor cu acidul tricloracetic este frecvent folosit n
laboratorul clinic pentru deproteinizarea serului sau a sngelui.
Reactivi :
1. Soluie proteic diluat;
2. Soluie acid tricloracetic 5-20g%;
92
Tehnica de lucru
Peste 2-3 ml soluie proteic se adaug 0,5 1 ml soluie acid tricloracetic
cu apariia unui precipitat alb abundent.

b) Precipitarea proteinelor cu acid sulfosalicilic
Aceast metod este una din cele mai utilizate reacii pentru depistarea
proteinelor din urin. Se presupune c acidul sulfosalicilic reacioneaz cu ambele
grupri acide formnd compui de tipul urmtor:











Reactivi :
1. Soluie proteic diluat;
2. Soluie acid sulfosalicilic 15-20 g la 100 ml ap bidistilat;
Tehnica de lucru
Se iau ntr-o eprubet 1-2 ml soluie proteic peste care se adaug cu
pictura aproximativ 0,5 ml soluie de acid sulfosalicilic. Apare un precipitat alb,
sub forma unui nor, care permite urmrirea mersului picturii de reactiv. Aceast
metod are o mare sensibilitate, fapt care o recomand la analiza urinii.

5. Precipitarea proteinelor prin nclzire
Majoritatea proteinelor prin nclzire la diferite temperaturi coaguleaz i se
produce o precipitare ireversibil. Precipitarea este maxim la punctul izoelectric al
proteinei, i, n consecin, la acest tip de precipitare un rol deosebit l are pH
i
.
Prezena diferitelor sruri favorizeaz de asemenea precipitarea.
Reactivi :
1. Soluie proteic diluat;
2. Soluie acid acetic 1% si 10%;
3. Soluie NaCl saturat;
4. Soluie NaOH 10%.
Tehnica de lucru
n 5 eprubete se iau cte 2 ml soluie proteic.
- n prima nu se adaug nici un reactiv, ci se nclzete direct n
flacar. Se observ apariia unui precipitat.
+
........
-
O
3
S
+
........
-
O
3
S
+
........
-
O
3
S
COO
-
........
+
sau
lant proteic (LP)
LP
LP
OH
93
- n a doua eprubet se adaug 1-2 picturi acid acetic 1% i se
nclzete. Precipitarea este mai rapid i mai complet, deoarece pH-ul
soluiei este mai aproape de pH
i
al proteinei.
- n a treia eprubet se adaug 0,5 ml acid acetic 10%. Precipitatul ce
apare este mai puin abundent fa de cel din eprubeta a doua, sau chiar
inexistent, datorit depirii pH
i
al proteinei.
- n a patra eprubet se adaug 0,5 ml acid acetic 10% si 0,5 ml
soluie NaCl saturat. La nclzire apare un precipitat, favorizat de NaCl.
- n a cincea eprubet se adaug 0,5 ml soluie NaOH 10%. Se
observ c proteina nu precipit nici la nclzire, mediul fiind prea alcalin.

























94
VII. ANALIZA BIOCHIMIC A GLUCIDELOR

Ozele sunt compui aldehidici sau cetonici, ce conin una sau mai multe
funciuni alcoolice.

Exemplu:
CH
3
OH-(CHOH)
n
-CH=O aldoz
CH
3
OH-(CHOH)
n
CO-CH
2
OH cetoz

Dup numrul atomilor de carbon din molecul distingem: trioze (3C),
tetroze (4C), etc.
Numeroii izomeri se datoreaz prezenei n molecul a atomilor de carbon
asimetrici, existnd astfel forme dextrogire (D) i levogire (L). Funciunea
aldehidic sau cetonic poate s formeze cu o funciune alcoolic un semiacetal,
rezultnd astfel configuraia ciclic de furan sau piran, n funcie de gruparea OH,
care particip la formarea semiacetalului.










Identificarea i dozarea glucidelor se bazeaz pe reaciile grupelor
funcionale (carbonil i alcoolice), pe interaciile dintre acestea i pe unele
caracteristici ale moleculei ntregi. Astfel glucidele pot s dea urmtoarele tipuri de
reacii: de culoare, de condensare, epimerizare i reducere.
Sub aciunea acizilor minerali concentrai (la cald), prin pierderea a 3
molecule de ap, pentozele se transform n furfural, metilpentozele n
metilfurfural, hexozele n oximetilfurfural. Polizaharidele i dizaharidele sufer o
hidroliz prealabil la monozaharide, care se comport n continuare, ca i
monozaharidele.
Compuii furfuralici formai se condenseaz cu diferii polifenoli cu
formarea unor produi colorai, care permit identificarea i/sau diferenierea
glucidelor.






O
O
CH
2
OH HOH
2
C
CH
2
OH
OH
OH
HO
OH
HO
OH OH
OH
95
VII.1. REACII GENERALE PENTRU GLUCIDE


Reacia PODOBEV MOLISCH UDRANSKY
Glucidele de interes biologic dau n prezen de H
2
SO
4
concentrat derivai
furfuralici, care se condenseaz cu -naftolul cu formarea unor compui colorai n
violet.
















Reactivi :
1. Glucoz 1%, zaharoz 1% , etc.
2. Soluie de -naftol n alcool etilic (proaspt preparat).
3. H
2
SO
4
concentrat
Tehnica de lucru
Se iau ntr-o eprubet 2-3 picturi soluie de glucoz 1%, se adaug 5
picturi soluie de -naftol i se agit coninutul eprubetei. Se toarn ncet, cu
atenie, pe peretele interior al eprubetei aproximativ 1 ml H
2
SO
4
conc. La nivelul
de separare a celor dou lichide se formeaz un inel violet, ceea ce denot o reacie
pozitiv (+).
Observaii :
Reacia este dat i de produii care conin n molecul lor oze, cum sunt de
ex. nucleoproteidele, mucoproteidele, etc.
Inelul de culoare violet (caracteristic) poate fi nsoit sau s fie substituit
cu inele de culori diferite, de ex.:
- inel verde, cauzat de aciunea acidului asupra -naftolului;
- inel alb, n cazul prezenei proteinelor care precipit n mediu acid;
- inel rou, datorat unor substane organice cu alte structuri.



HOHC - CHOH
R - HC CH - CHO
OH HO
H
2
SO
4
-3H
2
O O
R CHO
+ 2
OH
-H
2
O
OH
OH
CH
O
R
O
C
OH
OH
R
ox
96
VII.2. REACII DE DIFERENIERE A ALDOZELOR I CETOZELOR

Reacia cu rezorcin (Reactia SELIVANOFF)
Zaharurile n prezena HCl dil. 1:1 dau compui furfuralici, care prin
condensare cu rezorcin, formeaz compui de tipul trifenilmetanilor, colorai n
rou. Reacia este mai rapid n cazul cetozelor, comparativ cu aldozele, fapt ce
permite diferenierea lor. Reaciile care au loc sunt urmtoarele:














Reactivi :
1. Reactiv Selivanoff: se dizolv 0,1g rezorcin n 100 ml HCl dil.1:1 cu
ap distilat;
2. Fructoz 1% sau zaharoz 1%;
3. Glucoz 1%, arabinoz 1%.
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet se pun 2 picturi soluie de glucoz 1% i n alta 2 picturi
soluie de fructoz sau zaharoz. Se adaug n ambele eprubete cte 2 ml reactiv
Selivanoff i se aeaz ntr-o baie de ap la 30-60
0
C timp de 15 minute sau se
nclzete uor direct n flacar.
n eprubeta cu aldoz apare o coloraie slab roz, galben sau soluia rmne
incolor, n timp ce n eprubeta cu cetoz se produce o coloraie roie. Reacia este
pozitiv cu cetozele: de culoare roie i este negativ cu aldozele: incolor sau
culori slabe.


VII.3. REACII DE DIFERENIERE A PENTOZELOR DE HEXOZE


Reacia cu orcina (Reacia BIAL)
Pentozele n prezena acizilor concentrai se transform n furfural care n
prezena orcinei (metil-rezorcin) formeaz produi de condensare colorai n
ALDOZA
R CH=O
O
HO
OH
+ 2
-H
2
O
O
R O
OH
OH O
OH
R
O
O
97
violet. n aceleai condiii, hexozele dau produi de culoare nedifereniat,
portocalie-brun. Reaciile care au loc sunt urmtoarele:
















Reactivi :
1. Reactiv Bial: 1 g orcin n 1000 ml HCl;
2. Soluii de arabinoz 1%, riboz 1% ,etc.
3. Soluii de glucoz 1%, galactoz 1%, fructoz 1%, etc.
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet se iau 5 picturi soluie pentoz i n alta 5 picturi soluie de
hexoz i se adaug n ambele cte 3 ml reactiv Bial. Eprubetele se in pe baie de
ap n fierbere sau se nclzesc uor n flacr.
n eprubeta cu pentoz se obine o culoare violet (reacie pozitiv), iar n
eprubeta cu hexoz se obine o culoare nedefinit, portocalie-brun (reacie
negativ).

Reacia BIAL modificat
Datorit faptului c reactivul Bial nu se pstreaz dect cel mult o
sptmn, se folosete reactivul Bial modificat, care are o mai bun
conservabilitate (6 luni). n cazul reactivului Bial modificat orcina este dizolvat n
alcool etilic i se adaug i FeCl
3
.

Reactivi :
1. Reactiv Bial modificat: se dizolv 6 g orcin n 200 ml alcool etilic i se
adaug 2 ml FeCl
3
1%;
2. Soluii de pentoze si hexoze 1-2 %;
3. HCl concentrat.
Tehnica de lucru
Se iau ntr-o eprubet 2 ml soluie de pentoz i n alta 2 ml soluie de
hexoz. n ambele se adaug cte 10 picturi reactiv Bial modificat i cte 2 ml HCl
PENTOZ
HEXOZ
HCl (conc)
O
R CHO + 2
CH
3
OH
HO
CH R
O
HO
HO
CH
3
CH
3
HO
HO
98
concentrat. Eprubetele se agit, se acoper cu un dop de vat i se in 10 minute n
baia de ap, care fierbe.
Reacia este pozitiv cu pentozele, obinndu-se o coloraie albastr-verde.


Reacia TOLLENS pentru pentoze
Pentozele n prezena acizilor concentrai se transform n furfural, care n
prezena fluoroglucinei (1,3,5 trihidroxibenzen) sau a pirogalolului (1,2,3-
trihidroxibenzen) formeaz compui colorai n rou-viiniu.
Reactivi :
1. Reactiv TOLLENS: soluie de fluoroglucin 2% n alcool 86
o
;
2. Soluii de pentoze i hexoze 1-2 %;
3. HCl concentrat.
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet se iau 2 ml soluie pentoz i n alta 2 ml hexoz. n ambele
eprubete se adaug cte 3 picturi reactiv Tollens, 2 ml HCl conc. i se nclzesc
pn la fierbere.
Reacia este pozitiv pentru pentoze, care dau o coloraie roz care trece n
rou- viiniu.


Reacia aldopentozelor cu benzidina
Aldopentozele formeaz cu benzidina n mediu de acid acetic glacial o
coloraie roz. Cetopentozele i hexozele nu dau aceast reacie.












Reactivi :
1. Soluie de benzidin pur: 4p. benzidin n 100p. acid acetic glacial;
2. Soluii 2% de oze: aldopentoze (riboz), hexoze (glucoz, fructoz).
Tehnica de lucru
La 0,5 ml reactiv se adaug o pictur din soluia de oz. Eprubeta
coninnd acest amestec se fierbe 3-4 min. i apoi se rcete.
Aldopentozele libere dau o coloraie de la roz la rou, n timp ce hexozele i
cetopentozele nu dau reacia.
PENTOZ 2
CH=O
O
+ H
2
N NH
2
-2H
2
O
N=HC
O
CH=N
O
99
VII.4. REACII DE CONDENSARE A MONOZAHARIDELOR
CU FENILHIDRAZINA


Zaharurile reacioneaz n mediu acid cu fenilhidrazina cu formarea
produilor de reacie: fenilhidrazone i osazone. Fenilhidrazonele se obin prin
tratarea zaharurilor la rece i n raport molecular de 1:1 cu fenilhidrazin, iar
osazonele prin tratarea zaharurilor la cald i cu exces de fenilhidrazin. Reacia se
petrece n 3 etape succesive:
1. condensarea unei molecule de fenilhidrazin cu funcia carbonilic
(aldehid sau ceton) a glucidelor, cu formarea fenilhidrazonei;
2. o reacie de oxido-reducere: fenilhidrazona format n prima etap
reacioneaz cu o nou molecul de fenilhidrazin, care se reduce la anilin i
amoniac, concomitent cu oxidarea unei grupri alcool (din vecintatea C la care s-a
legat fenilhidrazina) cu apariia unei noi grupri carbonilice: la C
2
n cazul aldozei
(iniiale) i la C
1
pentru cetoze;
3. n aceast etap reacioneaz o nou molecul de fenilhidrazin cu funcia
carbonil nou format cu producerea osazonelor.

















Fenilhidrazonele sunt specifice pentru diferitele oze. Osazonele sunt identice
pentru ozele epimere (care difer numai la gruprile de la C
1
i C
3
, de exemplu:
glucoza, fructoza) i diferite pentru zaharurile neepimere i permit astfel, pe baza
proprietilor lor caracteristice (forma cristalelor, punct de topire, solubilitate),
diferenierea zaharurilor (de ex: diferenierea glucozei fa de galactoz).
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet peste 2 ml soluie de glucoz se adaug 2 ml soluie de 2,4-
dinitrofenilhidrazin n H
2
SO
4
. Soluia se nclzete uor pn la apariia
precipitatului rou de 2,4-dinitrofenilhidrazon.
Reacia cu fenilhidrazin permite determinarea glucozei, n soluie pur,
pn la diluia de 0,01g% i prezint un interes deosebit, fiind util n clinic pentru
CHO
H - C - OH
HO - C - H
CH
2
OH
C
6
H
5
-NH-NH
2
H - C - OH
H - C - OH
C
6
H
5
-NH
2
+ NH
3
C
6
H
5
-NH-NH
2
-H
2
O
H - C - OH
H - C - OH
CH
2
OH
HO - C - H
H - C - OH
CH=N-HN-C
6
H
5
CH=N-HN-C
6
H
5
C = O
HO - C - H
CH
2
OH
H - C - OH
H - C - OH
-H
2
O
C
6
H
5
-NH-NH
2
H - C - OH
H - C - OH
CH
2
OH
HO - C - H
C = N-HN-C
6
H
5
CH=N-HN-C
6
H
5
N
N
H
N
HOH
2
C-(CHOH)
3
HN-C
6
H
5
osazon
(formul chelatic)
100
diferenierea glicozuriei (diabet zaharat) de lactozuriile fiziologice, care apar la
unele femei, n ultimele luni de graviditate i n perioada alptrii.

VII.5. ACIUNEA ALCALIILOR ASUPRA OZELOR


n prezena hidroxizilor diluai se produce o epimerizare a ozelor cu
formarea, n cazul glucozei, a unui amestec n echilibru, ntre glucoz-manoz-
fructoz i o form intermediar en-diol:
Procesul de epimerizare continu de-a lungul lanului de atomi de carbon,
formndu-se 2,3endiol, 3,4-endiol, etc. La cald se formeaz caramelul, un produs
cu miros caracteristic, nedefinit chimic.
Reacia de evideniere a en-diolilor este cunoscut sub denumirea de
reacia MOORE.













Reactivi:
1. Soluie de glucoz 1%;
2. NaOH 0,1N i 10%;
3. HCl 0,1 N, cu adaus de 1 ml FeCl
3
10%.

Tehnica de lucru
a) Dac se urmrete numai evidenierea caramelului se trateaz 5 ml
soluie glucoz 1% cu 2 ml NaOH 10% i se nclzete la fierbere. Soluia devine
galben i culoarea vireaz spre brun, concomitent cu apariia unui miros de
caramel, care se accentueaz prin acidularea soluiei. Dac acidularea se face cu
H
2
SO
4
este necesar o rcire prealabil a eprubetei.
b) Dac se urmrete evidenierea compuilor cu grupare en-diol se iau
ntr-o eprubet 2 ml soluie glucoz 1% i exact 5 ml NaOH 0,1 N. Se fierbe i se
obine o culoare galben datorit caramelului. Se rcete soluia i se adaug exact
5 ml HCl 0,1 N (care conine FeCl
3
). n cazul prezenei formei en-diol se observ
o coloraie violet (reacie pozitiv), care nu apare cu soluia de glucoz, ca atare
(care nu a fost nclzit cu baze).
H - C - OH
C - OH
H - C = O
H - C - OH
H - C = O
HO - C - H
CH
2
OH
C = O
endiol
Aldoza I
D-glucoza (63,5%)
aldoza II
D-manoza (2,5%)
cetoza
fruct oza (21%)
101
VII.6. REACII DE REDUCERE


Gruparea carbonil din structura glucidelor le imprim un caracter reductor
ce se manifest, de exemplu, n mediu alcalin i la cald asupra ionilor metalici:
Cu
+2
, Ag
+
, Hg
+2
, Bi
+3
,Se
+4
sau asupra unor compui organici, de exemplu cei care
i schimb culoarea prin oxido-reducere: acid picric-acid picramic, albastru de
metilen-leucoderivat. Concomitent gruparea aldehidic a ozei se oxideaz la acid
aldonic, ceea ce relev c se desfoar reacii de oxido-reducere. n realitate,
adesea, glucidele n mediu alcalin se transform n compui puternic reductori,
care particip i ei n reaciile de reducere.

a) Reacii de reducere ale Cu
+2

Soluiile cu sulfat de cupru n mediu alcalin produc precipitatul de
Cu(OH)
2
, dar care deranjeaz reacia cu glucidele. De aceea pentru evitarea
precipitrii Cu(OH)
2
se adaug diferii compui, n special polialcooli sau hidroxi-
acizi, care formeaz compleci coloidali solubili cu ionul de Cu
+2
,
ca de exemplu:
- reacia Fehling: complexul Na-K-tartrat,
- reacia Benedict: complexul Na-citrat,
- reacia Cole: complexul cu glicerina.
Utilizarea Na
2
CO
3
prezint unele avantaje fa de NaOH: stabilitatea mai
mare a reactivilor i o mai mic interferare cu ali compui reductori, care
reacioneaz similar cu glucidele n mediile cu baze, ca de exemplu: acid uric,
creatinin, cloroform. Totui valoarea ansamblului reaciilor de reducere este
limitat de realitatea c ele sunt relativ nonspecifice deoarece asemntor cu
glucidele reacioneaz i derivaii acestora, de exemplu: glucuronidele de tip ester
(formate cu metaboliii medicamentelor), acizii uronici liberi.
1. Reacia TROMMER
Ionul de Cu
+2
este redus de ctre gruparea carbonilic a glucidelor, n mediu
alcalin i la cald, la ion cupros ( Cu
+
), respectiv la Cu
2
O. Particulele de Cu
2
O, n
absena coloizilor protectori, se depun ca un sediment rou. Concomitent se
produce oxidarea funciei aldehidice la carboxil (de la glucoz la acid gluconic).









Reactivi:
1. Soluie de CuSO
4
10%;
2. Soluie de NaOH 10%;
CuSO
4
+ 2NaOH Cu(OH)
2
+ Na
2
SO
4
Cu
OH
H
2
O
O
RCHO
RCOOH
Cu
OH
OH
OH
Cu
Cu
OH
OH
Cu - OH
Cu - OH
H
2
O
Cu
Cu
O
102
3. Soluii de glucide reductoare 1%: glucoz, galactoz;
4. Soluii de glucide nereductoare 1%: zaharoz.
Tehnica de lucru
Se iau n 2 eprubete cte 2 ml soluie de zahr reductor (glucoz) i
respectiv nereductor (zaharoz), se adaug cte 5 picturi de CuSO
4
10% i 5
picturi de NaOH 10%. Ambele eprubete se nclzesc la partea superioar a
lichidului.
Se observ c n eprubeta cu zahr reductor apare un precipitat galben,
care devine rou, Cu
2
O, care denot o reacie pozitiv, n timp ce n eprubet cu
zaharoz reacia este negativ.

2. Reacia FEHLING
Reacia este similar cu reacia Trommer, doar c n acest caz se procedeaz
la solubilizarea Cu(OH)
2
prin tratarea cu tartrat dublu de sodiu i potasiu (sarea
Seignette), care intr n compoziia reactivului Fehling II. n urma amestecrii celor
doi reactivi Fehling se formeaz ntre Cu
+2
i sarea Seignette un complex cu
structur de chelat care favorizeaz dizolvarea Cu(OH)
2
.
Reactivi:
1. Soluie de zaharuri reductoare 1%: glucoz, galactoz.
2. Soluie de zahr nereductor 1%: zaharoz.
3. Reactiv Fehling I : 35 g CuSO
4
.5H
2
O
5 ml H
2
SO
4
conc.
200 ml ap distilat.
Dup dizolvare se completeaz cu ap distilat la 1000 ml.
4. Reactiv Fehling II : NaOH 3g la 100 -300ml
Sare Seignette -150 ml
Ap distilat la -1000 ml.
Tehnica de lucru
Se iau n dou eprubete cte 2 ml reactiv Fehling I i 2 ml reactiv Fehling II
i se nclzete la fierbere 2 minute. n prima eprubet se adaug 5 ml zahr
reductor i se nclzete 1 minut direct n flacr. Se observ schimbarea culorii i
apariia unui precipitat. Se repet reacia cu a doua eprubet la care se adug 5 ml
zahr nereductor. Dup nclzire n flacr nu se observ schimbri semnificative.
La prima nclzire, amestecul de reactiv Fehling I i II trebuie s-i pstreze
culoarea albastr.
Cea de-a doua nclzire servete reaciei de oxido-reducere, cnd culoarea
albastr a soluiei dispare i se produce un precipitat de culoare galben sau roie,
care indic prezena zaharului reductor: reacie pozitiv (+).

3. Reacia BENEDICT
Reacia este similar cu reacia Trommer i cu reacia Fehling, doar c
pentru solubilizarea precipitatului de Cu(OH)
2
se folosete citratul.


103
Reactivi :
1. Reactiv Benedict: 173g citrat de sodiu.2H
2
O
100g Na
2
CO
3
anhidru
800 ml ap distilat
Se dizolv prin nclzire, se filtreaz i se aduce la 850 ml. Separat
se dizolv 17,3g CuSO
4
pur, cristalizat, n 100-150 ml ap distilat i se
adaug, sub agitare n poriuni mici la soluia precedent i se completeaz
cu ap distilat la volumul final de 1000 ml. Reactivul se poate pstra un
timp destul de lung;
2. Glucoz 5%;
3. Zaharoz 5%.

Tehnica de lucru
n 2 eprubete se iau cte 5 ml reactiv Benedict. n prima se adaug 0,5 ml
glucoz, iar n a doua aceeai cantitate de zaharoz. Se fierb ambele eprubete direct
la flacr timp de 2 minute i se rcesc. n prima eprubet se va forma un precipitat
rou, reacie pozitiv, iar n a doua nu se produc modificri semnificative, reacie
negativ.
Dup culoarea obinut se poate aprecia, cu aproximaie concentraia
glucozei i anume:

- opalescen cu nuan verde -sub 0,1g% glucoz
- turbulen puternic de culoare galben-verde -0,2-0,3g% glucoz
- precipitat galben-portocaliu -aprox.0,5g% glucoz
- precipitat rou -peste 1g% glucoz

Prezena unor compui de tipul creatininei, cloroformului, acidului uric, nu
interfereaz cu reactivul Benedict, spre deosebire de reactivul Fehling, cu care
interfereaz.

4. Reacia COLE
Reacia decurge similar cu reaciile anterioare, cu deosebirea c se folosete
glicerina ca agent de dizolvare a Cu
2
O.
Reactivi :
1. Na
2
CO
3
anhidru;
2. Glicerin;
3. CuSO
4
;
4. Soluii de glucide 1g% i 0,1g%.
Tehnica de lucru
La 5 ml soluie de glucide se adaug un vrf de cuit de Na
2
CO
3
anhidru, 3
picturi glicerin i 2 picturi CuSO
4
1%. Se agit bine i se fierbe 1 minut.
n cazul probei pozitive, Cu
2
O format rmne n soluie sub form hidratat
coloidal de CuOH de culoare galben. Se consider c testul Cole este cel mai
104
sensibil dintre reaciile de reducere i permite diferenierea glucidelor de compuii
cu grupare aldehidic liber sau cu funcie en-diol.

b) Reacii de reducere ale ionului Ag
+


Reacia TOLLENS
Glucidele reductoare transform Ag
+
la Ag
0
care se depune pe pereii
eprubetei sub form de argint metalic fin (oglinda de argint). Concomitent
gruparea aldehidic din molecula glucidelor reductoare, este oxidat la acidul
corespunztor.







Reactivi :
1. Soluie de AgNO
3
2% n ap bidistilat;
2. Soluie de amoniac diluat 5%;
3. Soluie glucoz 2%.
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet foarte curat se pipeteaz, n ordine: 5ml AgNO
3
2% i apoi
soluia de amoniac, pictur cu pictur, pn la apariia i apoi dizolvarea
precipitatului care se formeaz, evitndu-se excesul. Se adaug 3 ml soluie
glucoz, se agit i se las pe baie de ap la 60
0
C timp de 15 minute i se observ
formarea oglinzii de argint .

c) Reacii de reducere ale ionului Bi
+3


Reacia NYLANDER
Reacia se bazeaz pe reducerea azotatului de bismut (III) (subnitrat de
bismut) n mediu alcalin la Bi, n prezena glucidelor reductoare care se oxideaz
la acizii corespunztori.





Reactivi:
1. Reactiv Nylander: se dizolv 2 g nitrat bazic de bismut (III) i 4g tartrat
dublu de sodiu i potasiu n 100 ml NaOH 10%. Se nclzete pe baie de
ap la fierbere, se rcete i se aduce cu ap la 1000 ml;
2. Glucoz 2%;
2AgNO
3
+ 2NH
4
OH
2AgOH + 4NH
4
OH
2[Ag(NH
3
)
2
]
+
OH
-
+ R
-
CHO
2AgOH + 2NH
4
NO
3
2[Ag(NH
3
)
2
]
+
OH
-
+ 4H
2
O
2Ag + 4NH
3
+ H
2
O + R-COOH
Bi(OH)
2
NO
3
+ NaOH
2Bi(OH)
3
+ 3R-CHO
Bi(OH)
3
+ NaNO
3
2Bi + 3H
2
O + 3R-COOH
105
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet se iau 2 ml soluie de glucoz 2% i 0,5 ml reactiv Nylander
i se nclzete direct n flacr, timp de cteva minute. Reacia este pozitiv cnd
se obine un precipitat de culoare neagr (Bi metalic) i este sensibil chiar la
cantiti foarte mici de oze.

d) Reducerea unor compui organici

1. Reducerea acidului picric
Glucidele reductoare, n mediu alcalin i la cald, reduc acidul picric de culoare
galben la acid picramic de culoare roie-portocalie, simultan cu oxidarea gruprii
aldehidice a ozei la gruparea acid.







Reactivi :
1. Soluie de acid picric;
2. Soluie de glucoz;
3. NaOH 10%.
Tehnica de lucru
Se iau ntr-o eprubet 2 ml soluie de acid picric, 1 ml soluie de glucoz i 1
ml NaOH 10% i se fierbe.
Reacia este pozitiv cnd apare o culoare portocalie la nclzire. Persistena
reaciei negative este indicat printr-o culoare galben. Reacia poate servi i la
dozarea glucozei din lichidele biologice, ex. reacia Seifert-Crecelius.

2.Reducerea albastrului de metilen
Glucidele reductoare reduc albastrul de metilen la un leucoderivat (derivat
fr culoare). n prezena oxigenului din aer are loc o reoxidare i recolorare,
proces similar cu aciunea unor dehidrogenaze, cnd albastrul de metilen servete
ca transportor de H de la un donor de H (glucoz) pe un acceptor de H (n
experiena de fa, oxigenul), cu diferena c albastrul de metilen este autooxidabil,
adic reacioneaz direct cu O
2
din aer, ceea ce nu se ntmpl de obicei cu
dehidrogenazele.
OH
O
2
N
NO
2
NO
2
3RCHO
3H
2
O
+ 2H
2
O + 3R-COOH
NH
2
NO
2
O
2
N
OH
106















Reactivi :
1. Soluie de albastru de metilen 0,1 % n ap
2. Soluie glucoz 1%;
3. NaOH 2N.
Tehnica de lucru
Se iau ntr-o eprubet 5 ml ap, 10 picturi soluie de albastru de metilen i 2
picturi de NaOH 2N i se nclzete. Se adaug cteva picturi de glucoz 1%,
treptat, pn se obine decolorarea probei, n timpul nclzirii de cteva secunde la
fierbere.
Dup cteva minute de repaus se agit i se observ recolorarea albastrului
de metilen, datorit efectului oxigenului din aer. Dac eprubeta nu se agit,
recolorarea apare mai ncet, de la suprafaa eprubetei spre interior.

VII.7. DOZAREA GLUCIDELOR REDUCTOARE
Metoda IONESCU-MATIU


Glucidele reduc la cald i n mediu alcalin, fericianura de K (hexacianoferat
III de potasiu). Cnd ntreaga cantitate de fericianur a fost complet redus, primele
picturi de glucoz n exces intr n reacie cu acidul picric (folosit ca indicator) i
culoarea soluiei vireaz de la galben spre rou-portocaliu.
Recativi :
1. Soluia de fericianur: 46g hexacianoferat (III) de potasiu i 46g NaOH se
dizolv n ap distilat i se completeaz cu ap distilat la 1000 ml. Se
pstreaz la frigider.
2. Soluie saturat de acid picric (aprox.1,2 %). Se obine prin dizolvarea a
1,3g de acid picric n 100 ml ap distilat la fierbere.
3. Soluie de glucoz 0,5 % i o soluie de glucoz de concentraie
necunoscut.
R - CH=O
R - COOH
(H
3
C)
2
N
+
N(CH
3
)
2
(H
3
C)
2
N
N(CH
3
)
2
H
2
O
1/2O
2
S
N
S
N
H
107
Tehnica de lucru
a) Determinarea factorului reactivului
ntr-un balon termorezistent se pipeteaz exact 10 ml soluie
fericianur i se adaug 10 picturi soluie de acid picric i 20 ml ap
distilat. Se nclzete la fierbere i se titreaz din biuret cu soluia de
glucoz 0,5%, meninnd tot timpul soluia n fierbere, pn la virajul culorii
de la galben spre rou-portocaliu, notnd cu N ml glucoz utilizai.

1000
N 5
f =

b) Determinarea concentraiei unei soluii necunoscute de glucoz
Se lucreaz exact ca la punctul a), cu singura deosebire c se titreaz
din biuret cu soluia de glucoz de concentraie necunoscut. Se noteaz
numrul de ml glucoz utilizai cu N.

Calcul:
'
) / (
N
f 1000
glucoza
l g
=

Metoda are aplicaie n biochimia clinic la dozarea glucozei din urin.























108
VIII. ANALIZA BIOCHIMIC A ENZIMELOR


Enzimele sau biocatalizatorii sunt substane de natur proteic care au rolul
de a cataliza procesele biochimice ce se desfoar n organism.
Principiile generale i procedeele de preparare a enzimelor n forma pur
sunt cele valabile pentru proteine. Se alege o surs bogat n enzima care ne
intereseaz i se aplic tehnicile cele mai adecvate, exploatnd diferenele ntre
proprietile enzimei i ale tuturor celorlali componeni prezeni, ntre care pot fi
zeci sau sute de alte proteine. De regul este necesar o succesiune de etape care s
conduc n final la un preparat de puritate avansat, cu un bun randament.
Urmrirea purificrii progresive pe parcursul diferitelor faze este condiionat de
aplicarea unei metode sensibile i specifice de msurare cantitativ a activitii
enzimei respective.
Prima operaie este eliberarea enzimei n form solubil din celula intact.
Tehnica de degradare a membranelor celulare (prin mijloace mecanice, tratament de
congelare-decongelare, sonicare, liz cu enzime adugate sau detergeni) i
vehiculul se aleg n funcie de natura i localizarea enzimei. Extractul astfel obinut
este supus apoi fracionrii, care constituie purificarea propriu-zis, realizat prin
ndeprtarea diferiilor contaminani micro- i macromoleculari i ionici. n acest
scop sunt aplicate o serie de operaii bazate pe:
-dimensiunile moleculare: dializa, ultrafiltrarea, centrifugarea de zon, gel filtrarea;
-solubilitate: precipitri cu sruri neutre, cu solveni organici, precipitarea la pH
i
,
tratament termic;
-ncrcare electric: electroforeza, cromatografia pe schimbtori de ioni;
-adsorbia selectiv: pe coloane de silicagel;
-afinitatea biologic pentru un ligand specific: cromatografia de afinitate.
n prezent exist procedee standard care aplic iniial tehnicile bazate pe
dimensiunile moleculare i solubilitate i apoi separri cromatografice. n final, este
adesea posibil s se cristalizeze enzima purificat. Pentru o anumit enzim,
secvena etapelor de purificare se determin experimental, prin analogie cu
metodele folosite la proteine similare.
Fracionarea este controlat prin testarea activitii, enzima fiind considerat
pur cnd se ajunge la o activitate specific maxim i constant. Puritatea este
confirmat de omogenitatea preparatului, stabilitatea prin criterii fizico-chimice
valabile i pentru alte proteine ca: electroforeza pe gel de poliacrilamid, analiza de
sedimentare la ultracentrifugare, gel-filtrarea.






109
VIII.1. MODALITI DE EXPRIMARE I DE DETERMINARE A
ACTIVITII ENZIMATICE

n condiii optime viteza unei reacii depinde direct proporional de
cantitatea enzimei care o catalizeaz. Msurnd viteza reaciei, cantitatea de substrat
ce se transform per unitate de timp, obinem o valoare proporional cu
concentraia enzimei. Un asemenea mod de dozare este mult mai comod, (adesea
singurul posibil) dect dozarea cantitii absolute. Enzimele fiind proteine nu pot fi
deosebite una de alta prin reacii generale, de exemplu reacia biuretului.
Dup modul de exprimare a cantitii substratului i respectiv a unitii de
timp la care se raporteaz, exprimarea activitii se face n:
- UI, o unitate international de activitate enzimatic fiind cantitatea
de enzim care transform 1 mol substrat (10
-6
moli) n timp de 1 minut, la
25
0
C, n condiii optime de reacie.
- Pentru enzimele din preparate biologice sau enzime pure,
activitatea se raporteaz la mg protein i se noteaz cu Act. Specific.
Activitatea specific = UI / mg protein = moli substrat transformat
/min./mg.prot.
- Dac se cunoate GM a enzimei, activitatea enzimatic se poate
exprima n activitate molar sau molecular sau TN (numr de turnover)
= numr de molecule de substrat transformate de o molecul de enzim,
respectiv de un mol de centru activ (dac enzima are mai muli centri activi)
pe minut.
- Activitatea enzimatic se poate exprima i n moli de substrat
transformai de enzim pe secund, katal (Kat), Kat (moli/sec) sau nKat
( nmoli/sec).
Pentru determinarea experimental a activitii enzimatice e necesar
respectarea urmtoarelor condiii:
- meninerea constant i optim a pH-ului i temperaturii mediului de
reacie;
- substratul s fie n concentraie saturant, pentru ca viteza de reacie s nu
depind de concentraia de substrat (V = V
max
);
-s fie prezeni n mediul de reacie coenzime i metale necesare activitii
enzimatice, n concentraii saturante ca s nu fie factori limitani de
vitez.
n aceste condiii activitatea enzimatic i viteza reaciei enzimatice depind
numai de concentraia de enzim i ca atare se poate determina cantitativ.
Pentru determinarea experimental a activitii enzimatice se utilizeaz
metodele colorimetrice, care prezint avantajul de a fi simple, rapide i precise. n
principiu se urmrete variaia extinciei n timp (AE/min), care conform legii lui
Lambert-Beer este proporional cu AC/min, deci tocmai cu activitatea enzimatic.
cd E c =

110
sd
E
c
min /
min /
A
= A

Unde: c = coeficientul mM de extincie.
Pentru a putea urmri o reacie enzimatic prin variaia AE/min este
necesar ca substratul sau produsul de reacie s fie colorat sau s absoarb n UV.


VIII.2. EFECTUL TEMPERATURII I A pH-ULUI ASUPRA
ACTIVITII ENZIMATICE


Viteza reaciilor enzimatice crete cu temperatura ntre anumite limite, n
care enzima este stabil. Exist o valoare numit temperatur optim pentru care
creterea este maxim, peste care ns intervine procesul de denaturare termic a
enzimei, cu reducerea vitezei. Determinarea activitii enzimatice n raport cu
temperatura permite cunoaterea temperaturii optime, a stabilitii termice
(temperatura de denaturare) ct i evaluarea energiei de activare din reacia dat.
Ultimul parametru rezult din relaia lui Arhenius.
RT
E
a
Ae K

= , unde:

A = constant, numit factor exponenial;
e = baza logaritmului natural;
E = energie de activare;
R = constanta general a gazelor;
T = temperatura absolut.
Practic, se msoar viteza de reacie la diferite temperaturi, iar datele
obinute sunt reprezentate grafic, folosind o form linear a ecuaiei lui Arhenius,
obinut prin logaritmare:
T
1
R 3 2
E
A K .
,
. log log = , unde:
-2,3 factor care reprezint trecerea de la logaritmii naturali la cei zecimali
n ceea ce privete pH-ul, se tie c exist o valoare sau un domeniu
restrns de valori n care viteza unei reacii enzimatice este maxim, definit ca pH
optim. n afara acestei zone, activitatea enzimatic scade datorit apariiei unor
specii ionizate aparinnd enzimei sau substratului. De regul, extremele de pH
inactiveaz enzimele prin denaturare.
Msurarea activitii unei enzime n funcie de anumite valori ale pH-ului
permite stabilirea pH-ului optim.
Preincubnd cantiti egale de enzim la diferite valori de pH i determinnd
apoi viteza de reacie la pH-ul optim se pot aprecia limitele ntre care enzima este
stabil, respectiv domeniul de pH n care este denaturat.
111
Efectul temperaturii i a pH-ului asupra activitii catalazei din cartofi

1. Prepararea extractului vegetal:
Materiale necesare:
1. cartofi;
2. CaCO
3
pulbere.
Tehnica de lucru:
50 g cartofi curai i mrunii prin radere se mojareaz cu 25 g CaCO
3
.
Amestecul se suspend n apa distilat, la un volum final de 250 ml i se supune
agitrii timp de or. Rezidiul vegetal i CaCO
3
se elimin filtrnd printr-o pnz
de nylon pe care s-a depus un strat de vat i filtratul obinut se centrifugheaz la
4000 r.p.m. timp de 10-15 min. Rezult un supernatant limpede de culoare brun-
nchis, care se colecteaz din toate tuburile de centrifugare i se amestec.

2. Testarea activitii catalazice:
Principiu:
Catalaza descompune H
2
O
2
conform reaciei:



Activitatea enzimei se apreciaz indirect, prin dozarea iodometric a
excesului de H
2
O
2
rmas dup aciunea catalazei.
Reactivi:
1. H
2
O
2
0,5N;
2. H
2
SO
4
5%;
3. Molibdat de amoniu 1%;
4. Tiosulfat de sodiu 0,1 N;
5. Soluie amidon (indicator).
Tehnica de lucru :
n dou pahare Erlenmeyer se pipeteaz 2 ml i respectiv 10 ml extract
coninnd catalaz (obinut din cartofi) i cte 10 ml ap oxigenat 0,5N. Dup
exact 10 minute de repaus la temperatura camerei, timp n care acioneaz asupra
substratului, se oprete reacia enzimatic pipetnd n fiecare flacon cte 10 ml
H
2
SO
4
i ap, n ordine 10 ml KI i 2-3 picturi de molibdat de amoniu. Se agit i
dup 2-3 minute se titreaz cu tiosulfat de sodiu 0,1N pn la apariia unei culori
galben deschis, cnd se adaug cteva picturi de indicator (amidon) i se continu
titrarea pn la dispariia culorii albastre.
Se constat c, cu ct activitatea enzimei este mai mare, cu att numrul de
ml de tiosulfat de sodiu folosii la titrare va fi mai mic.

2H
2
O
2
2H
2
O + O
2
cat alaza
112
3. Influena temperaturii
Tehnica de lucru:
Se iau 5 flacoane Erlenmeyer (numerotate de la 1 la 5) i n fiecare se
introduce volumul de extract convenabil (2 ml) i diferena pn la 10 ml se
completeaz cu ap distilat:
- flaconul nr.1 se menine la temperatura camerei,
- flaconul nr.2 se ine la 40
0
C (termostat sau n baie de ap) timp de 10
minute;
- flaconul nr.3 se ine la 60
0
C;
- flaconul nr.4 se fierbe cteva minute,
- flaconul nr.5 se ine ntr-un cristalizor cu ghea (la 0
0
C) timp de 10
minute.
- n al 6-lea flacon se pipeteaz numai 10 ml ap distilat (martor).
Dup rcirea flacoanelor 2, 3 i 4 la temperatura camerei, se introduc n
toate 6 flacoanele cte 10 ml H
2
O
2
0,5N i se las n repaus la temperatura camerei
exact 10 minute.
Dup acest interval de timp se pipeteaz n fiecare flacon cte 10 ml H
2
SO
4

i apoi, n ordine 10 ml KI i 2-3 picturi molibdat. Se agit i dup 2-3 minute se
titreaz cu tiosulfat de sodiu 0,1N pn la apariia unei culori galben deschis, cnd
se adaug cteva picturi de amidon i se continu titrarea pn la apariia culorii
albastre.
Se noteaz cu N nr. de ml folosii la titrarea martorului i cu n
1
pn la n
5

ml folosii la titrarea celor 5 probe.
Activitatea enzimatic pentru fiecare caz n parte se exprim prin cantitatea
de H
2
O
2
consumat, rezultat din diferena N-n
1
, N-n
2
, etc.
Se reprezint grafic, lund pe abscis t
0
C i pe ordonat activitatea
enzimatic (n ml tiosulfat de sodiu rezultai prin diferena N-n
1
,N-n
5
).
Curba obinut relev dependena activitii catalazei din cartof de variaia
temperaturii.

4. Influena pH-ului asupra activitii enzimatice
Reactivi:
1. Tampon citrat 50 mM cu pH = 4-6;
Soluia A: 2,1g acid citric monohidratat se dizolv n 100 ml ap;
Soluia B: 2,49g citrat trisodic cu 2 moli ap se dizolv n ap
distilat lipsit de CO, la un volum final de 100 ml;
Pentru a obine cele 3 soluii se procedeaz astfel:
- pentru pH = 4 - 33 ml sol. A + 17 ml sol. B + ap dist. pn la 50 ml;
- pentru pH = 5 - 20,5 ml sol. A + 29,5 ml sol .B + ap dist. pn la 50 ml;
- pentru pH = 6 - 9,5 ml sol. A + 41,5 ml sol. B + ap dist. pn la 50 ml.
2. Tampon Tris 50mM pH = 7,2-9
Soluia A: 4,84g Tris (hidroximetil-amino-metan) se dizolv n 200
ml ap
Soluia B: HCl 0,2 M;
113
Se fac urmtoarele amestecuri:
-pt. pH = 7,2 -50ml sol. A + 44,2 ml sol. B + ap distilat pn la 200 ml;
-pt. pH = 8,0 -50ml sol. A + 26,8 ml sol. B + ap distiltat pn la 200 ml;
-pt. pH = 9,0 -50ml sol. A + 5 ml Sol. B + ap distilat pn la 200 ml.
3. H
2
O
2
0,5 N;
4. Molibdat de amoniu 1g%;
5. Tiosulfat de sodiu 0,1 N;
6. Soluie amidon (indicator);


Observaie: Tampoanele pot fi nlocuite cu tampoane fosfat de concentraii
50 mM i pH ntre 5,0 i 8,2.

Tehnica de lucru
n 6 flacoane Erlenmeyer se ia cte un volum de extract determinat prin
testarea fcut la punctul II. La aceasta se adaug un volum de 4 ori mai mare
dintr-o anumit soluie tampon astfel nct s avem n cele 6 flacoane o zon de pH
cuprins ntre 4,0 i 9,0. n continuare se pipeteaz n fiecare cte 10 ml H
2
O
2
i se
las n repaus exact 10 minute la temperatura camerei, dup care se efectueaz
determinrile ca la punctul II.
Notnd cu p
1
-p
6
numrul de ml de tiosulfat folosii la titrarea celor 6 probe,
calculul i reprezentarea grafic se va face ca la punctul III, folosind acelai martor,
notat cu N. Prin urmare, se fac diferenele N-p
1
,.N-p
6
i se reprezint grafic,
notnd n abscis variabila de pH.


Determinarea experimental a activitii fosfatazei alcaline i acide

Activitatea enzimatic este dependent de pH-ul mediului n care i
desfoar activitatea. Dac se reprezint grafic variaia activitii enzimatice n
funcie de pH se obine o curb n clopot cu un maxim caracteristic pentru fiecare
enzim, care reprezint pH-ul optim. Sub sau peste pH-ul optim activitatea
enzimelor scade mult, cunoaterea pH-ului optim fiind aadar obligatorie atunci
cnd se msoar activitatea unei enzime.
Un exemplu interesant n acest sens l ofer fosfatazele, enzime din clasa
hidrolazelor, subclasa esteraze. Fosfatazele sunt fosfomonoesteraze care catalizeaz
reacii de tipul:


Se cunosc fosfataze care difer prin pH-ul optim de aciune:
- fosfataza alcalin cu pH optim de 10,45;
- fosfataza acid cu pH optim de 4,8.
Pentru determinarea difereniat a activitii acestor dou enzime trebuie s
se lucreze la pH-ul optim respectiv.
R - OPO
3
H
2
+ H
2
O R - OH + H
3
PO
4
114
Determinarea fosfatazei alcaline serice constituie un test curent n
laboratorul clinic. Valorile normale sunt cuprinse la adult ntre 20-40 U/l, iar la
copil ceva mai mari; ntre 38-138 U/l.
Determinarea are valoare diagnostic n:
- afeciuni hepatice ca: hepatita colestatic, icterul mecanic i tumori
hepatice.
- afeciuni osoase ca: sarcom osos sau metastaze tumorale osoase;
- rahitism, cnd se nregistreaz creterea enzimei n ser mult peste
valoarea normal.
Fosfataza acid seric are valoarea normal pn la 11 U/l i crete mult n
cancerul de prostat, cnd prezint valoare diagnostic.
Principiul dozrii
Determinarea activitii celor dou enzime n laborator se bazeaz pe
proprietatea lor de a hidroliza esterii fosforici. Ca substrat se utilizeaz un produs
artificial: esterul acidului fosforic cu p-nitrofenolul (p-nitrofenilfosfatul). Acest
ester incolor este hidrolizat de o enzim cu punerea n libertate a p-nitrofenolului,
colorat n galben n mediu alcalin.






Se urmrete variaia activitii fosfatazelor serice la diferite pH-uri i se
reprezint grafic activitatea enzimatic n funcie de pH.
Reactivi:
1. Soluie de substrat n tampoane de diferite pH-uri;
2. Ser;
3. NaOH 0,02 N.
Tehnica de lucru
Se pregtete o serie de 12 eprubete n care se pipeteaz urmtorii reactivi:

Epr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
PH 3,5 4.0 4,5 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 10,5 11,0 -
Ap dist. - - - - - - - - - - - 1,0
Tampon 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 -
Ser 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Se incubeaz 20 min. la temperatura camerei, dup care se adaug:
pOH
2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

Se citete extincia la 405 nm i se calculeaz activitatea enzimatic n U/l.
O
2
N OPO
3
H
2
+ H
2
O OH + H
3
PO
4
O
2
N
115
Se reprezint grafic U/l n funcie de pH. Maximele de activitate reprezint
activitatea fosfatazic a serului respectiv. Rezultatele se interpreteaz comparndu-
le cu valorile normale.
E 2 43 ser
nm
E
l U
nm 405
,
min /
/ =
c
=

Determinarea fosfatazei alcaline (FA)

Prin denumirea de fosfataz alcalin sunt cuprinse un grup de enzime
(fosfataze), care transfer o grupare fosfat de la un ester fosforic formndu-se un
alcool i un al doilea ester fosforic. Activitatea optim a acestor fosfataze este n
jurul valorii de pH=10 i necesit Mg
+2
i Zn
+2
pentru stabilitate i activitate
maxim. Inhibitorii naturali par s fie Ca
+2
i fosfai anorganici. Majoritatea
tampoanelor folosite cresc mult viteza de reacie a FA, acionnd ca acceptor de
grupri fosfat printr-o reacie de transfosforilare. Necunoscndu-se substratul
natural, pentru msurarea activitii FA s-a folosit glicerofosfatul de sodiu, care a
fost abandonat datorit vitezei mici de reacie. Acum se folosete p-nitrofenilfosfat
sau o-naftol monofosfat.
Nu se pot folosi dect serul sau plasma heparinizat, deoarece ali
coagulani inhib FA prin complexarea magneziului. Nivelul activitii FA reflect
schimbri mai ales intervenite n ficat i oase, dei concentraii mari ale enzimei se
gsesc i n alte organe. n general, activitatea FA crete ntre 1-4 ori n boli de
ficat (hepatit, colestaz).
Creteri mai mari de 5 ori indic osteomalacie, ajungnd ca n boala Paget
sau n cancer cu metastaze osoase s fie de 15-20 de ori mai mari.
Scderi ale activitii FA se ntlnesc n cretinism, hipofosfatasemie,
scorbut.
Determinarea activitii FA se face n prezent cu truse kit, care au la baz
metoda colorimetric cu p-nitrofenilfosfat.
Principiu
Se msoar colorimetric cantitatea de p-nitrofenol rezultat prin aciunea enzimei
asupra p-nitrofenilfosfatului utilizat ca substrat, conform reaciei :





Reactivi :
1. Soluie tampon-substrat cu pH=10,5: tampon glicocol 0,05M, MgCl
2

0,0005M, p-nitrofenilfosfat 0,0055M. Se dizolv 375 mg glicocol, 10 mg
MgCl
2
.6H
2
O i 165 mg p-nitrofenilfosfat sare de sodiu n 42 ml NaOH 0,1N;
2. NaOH 0,02N;
3. Soluie p-nitrofenol 5.10
-5
M. Se dizolv 695 mg p-nitrofenol n 1000 ml
NaOH 0,02N.10 ml, din aceast soluie se dilueaz cu NaOH 0,02N la 1000 ml.
O
2
N OPO
3
H
2
+ H
2
O OH + H
3
PO
4
O
2
N
116

Tehnica determinrii
n 2 eprubete se pipeteaz urmtorii reactivi:

Reactivi Prob Martor
Soluie tampon-substrat 0,2 ml 0,2 ml
Ser proaspt 0,1 ml -
Se agit i se incubeaz 30 de minute la 37
0
C, dup care se adaug
urmtorii reactivi:
NaOH 0,02N 2,5 ml 2,5 ml
Ser - 0,1 ml
Se citete E
p
fa de martor la 405 nm, n cuve de 1 cm.
Calcul:
Activitatea fosfatazei alcaline se obine din tabelul alturat sau din
urmtoarea formul de calcul:

nm 405
E 200 ml mU = /

E
405nm
mU E
405nm
mU E
405nm
mU
0,050 10 0,280 56 0,540 108
0,060 12 0,300 60 0,560 112
0.070 14 0,320 64 0,580 116
0,080 16 0,340 68 0,600 120
0,090 18 0,360 72 0,620 124
0,100 20 0,380 76 0,640 128
0,120 24 0,400 80 0,660 132
0,140 28 0,420 84 0,680 136
0,160 32 0,440 88 0,700 140
0,180 36 0,460 92 0,720 144
0,200 40 0,480 96 0,740 148
0,220 44 0,500 100 0,760 152
0,240 48 0,520 104 0,780 156
0,260 52

Dac E
405nm
depete valoarea de 0,780 se lucreaz cu ser diluat n
proporie de 1:10.

Valori normale:
- adult: 20-40 mU/ml;
- copil: 38-138 mU/ml.

117
VIII.3. DEPENDENA ACTIVITII ENZIMATICE DE
CONCENTRAIA DE SUBSTRAT


Determinarea experimental a K
M
i K
I
pentru colinesteraza nespecific

Pentru un numr mare de enzime numite michaeliene dependena activitii
enzimatice de concentraia de substrat se poate reda matematic prin ecuaia:

M
K S
S
V V
+
=
] [
] [
max


ecuaia MichaelisMenten a crei reprezentare grafic este o hiperbol, unde:
V = viteza reaciei enzimatice (activitate enzimatic);
V
max
= viteza maxim la concentraie infinit de substrat;
[S] = concentraia de substrat;
K
M
= constanta lui Michaelis-Menten, indic afinitatea enzimei pentru
substratul respectiv i este acea concentraie de substrat pentru care
V=V
max
/2. Cu ct K
M
este mai mic cu att afinitatea enzimei pentru
substratul respectiv este mai mare i invers. K
M
reprezint deci o
constant important ce caracterizeaz cinetic o enzim.
Cunoaterea K
M
a unei enzime pentru diferite substrate este
obligatorie pentru determinarea activitii enzimatice i pentru a
cunoate comportarea enzimei fa de diferite substrate sau
inhibitori.
n cazul n care pe lng substratul respectiv n reacie mai intervine un
inhibitor, ecuaia lui Michaelis-Menten devine:
- n cazul inhibiiei competitive :
'
max
] [
] [
M
K S
S
V V
+
=
Unde: K
M

este un K
M
aparent, mai mare dect K
M
cu factorul (1+ [I]/K
I
)

|
|
.
|

\
|
+ =
i
M M
K
I
1 K K
] [
'

- n cazul inhibiiei necompetitive:

M
K S
S
V V
+
=
] [
] [
'
max
unde:
i
K
I
1
V
V
] [
max '
max
+
=
[I] = concentraia de inhibitor
K
i
= constanta de inhibiie
118
Deci n cazul inhibiiei competitive constanta cinetic care se modific este
K
M
, iar n inhibiia necompetitiv V
max
.
K
i
este o constant cinetic la fel de important ca i K
M
, cunoaterea ei
permind stabilirea eficacitii diferiilor inhibitori, inhibitori care au astfel o larg
utilizare n medicin ca ageni chimioterapeutici.
Experimental, determinarea K
M
se face prin msurarea vitezei de reacie
(exprimat n uniti de activitate enzimatic) la diferite concentraii de substrat.
Rezultatele obinute se reprezint grafic cu ajutorul formei liniare a ecuaiei
Michaelis-Menten.Una din posibilitile de linearizare a ecuaiei Michaelis-Menten
este dat de Linewear-Burk prin rsturnarea ecuaiei (1) i rearanjarea termenilor:

] S [
1
x
V
K
V
!
V
1
max
M
max
+ =

Dac se reprezint grafic 1/V n funcie de 1/[S] se obine o dreapt (I) (Fig.
12) a crei pant este K
M
/V
max
, intersecia dreptei cu abscisa este 1/K
M
, iar cu
ordonata 1/V
max
. Se poate calcula deci K
M
i V
max
.
Determinarea experimental a K
i
pentru ambele tipuri de inhibiie, se
realizeaz astfel: se lucreaz n condiii identice cu cele de mai sus urmrind
variaia vitezei de reacie la concentraie constant de inhibitor i concentraii
variabile de substrat. Se reprezint grafic apoi 1/V n funcie de 1/[S] i se
calculeaz de pe grafic K
M

, respectiv V
max

. Datele obinute se introduc n ecuaia

(3), respectiv (4) i se calculeaz K
i
.
Tehnica de lucru
Reactivi :
1. Tampon fosfat pH=7,8;
2. Acetiltiocolin 1mM;
3. Benzoilcolin 1mM;
4. NaF 10mM;
5. Ser dil.1/10;
6. DTNB = reactiv de culoare.
Se determin concomitent K
M
, colinesteraza (ChE) seric pentru
acetiltiocolin ca substrat, (principiul determinrii fiind dat la determinarea
activitii ChE serice) i K
i
pentru benzoilcolin (inhibitor competitiv prin analogie
structural) i pentru NaF inhibitor necompetitiv, astfel:









119













Figura nr. 12. Diagrama reaciilor care se desfoar n prezen de inhibitor n
comparaie cu reacia fr inhibitor

Se pregtesc trei serii de eprubete a cte ase eprubete fiecare conform
tabelului: - seria I conine cantiti variabile de substrat, tampon fosfat pentru a
menine pH-ul constant i o cantitate fix de ser.
- seria II i III conin n plus o cantitate fix de inhibitor.
Seria I fr inhibitor

Reactivi 1 2 3 4 5 M
Tampon fosfat 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 1,8
Acetiltiocolin 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 -
Ser 1/10 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Incubare 10 minute la temperatura camerei.
DTNF 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

Se citesc E
405nm
i se trec n tabelul cu rezultate.

Seria II - inhibitor competitiv / seria III - inhibitor necompetitiv.

Reactivi 1 2 3 4 5 M
Tampon fosfat 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 1,8
Acetiltiocolin 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 -
Benzoilcolin 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 -
Seria II-
benzoilcolin
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 -
Seria III NaF 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 -
Ser 1/10 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Incubare 10 minute la temperatura camerei
DTNB 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0
)
K
I
[I]
1 + (
K
M
V
max
V
max
K
M
panta
fara inhibitor
=
panta
inhibit or
=
fara inhibit or
inhibit ia incompet it iva
inhibit ia necompetit iva
inhibitia competit iva
1
v
0
1
[S]
120
Se citesc E
405nm
i se trec n tabelul cu rezultate.

Calcule:
Concentraia de substrat/prob se d n tabelul de rezultate, iar viteza se
calculeaz conform formulei:
nm 405
nm 405
E 5 1
02 0
4
6 13 10
E
ser dil
mM
E
ml moli V ,
.
.
, .
. .
min /
min/ / = =
c
A
= =

Rezultatele obinute se introduc n tabelul de rezultate:

Nr.
eprub.
S 1/S Fr inhibitor
E
405
V 1/V
Inh. competitiv E
405
V 1/V
Inh. necompetitiv
E
504
V 1/V
1 0,1 10
2 0,2 5
3 0,3 3,3
4 0,4 2,5
5 0,5 1,65

Se reprezint grafic 1/V n funcie de 1/S pentru cele trei serii de rezultate
(Vezi Fig.12), obinnd trei drepte:
Din: - I se calculeaz K
m
i V
max
;
- II - K
m

- III - V
max

.
Pentru calcularea K
I
rezultatele se introduc n relaia:

| |
|
|
.
|

\
|
+ =
I
M M
K
I
1 K K
'
sau:
I M
M
K
I
1
K
K ] [
'
=

Unde: [I] = 0,1 ( inh. competitiv), respectiv
[I] = 1mM (inh. necompetitiv).
I
I
K
I
1
V
V
sau
K
I
1
V
V
] [
} [
'
max
max max '
max
=
+
=


Determinarea activitii enzimatice a colinesterazei serice nespecifice

Colinesterazele sunt enzime din clasa hidrolazelor, subclasa esteraze. Dup
mecanismul de aciune sunt serin-hidrolaze.
Se cunosc dou enzime:
121
- Acetilcolinesteraza, cu o specificitate strict pentru acetilcolin,
este prezent n diferite esuturi, mai cu seam n eritrocite i creier i are un
rol major n transmiterea influxului nervos. Prezena n eritrocite i n alte
esuturi este legat de rolul enzimei n permeabilitatea celular.




- Acilcolinacilhidrolaza sau colinesteraza nespecific (pseudocolin-
esteraza) hidrolizeaz nespecific esterii de colin:



Dozarea acestei enzime n ser (valoare normal: 3-8 U/ml ser) are valoare
diagnostic n laboratorul clinic:
- este un indicator preios n depistarea intoxicaiilor cu organofosforice
cnd activitatea enzimei scade pn la 10% din valoarea normal;
- n insuficiena hepatic (ciroz), este de asemenea sczut datorit
capacitii reduse de biosintez proteic a ficatului.
Principiul determinrii
Pentru vizualizarea produilor de reacie se utilizeaz un analog de substrat:
butiriltiocolina (un atom de O este nlocuit cu S) care prin hidroliz enzimatic n
prezena de ChE pune n libertate tiocolina; aceasta formeaz cu DTNB ( reactiv de
culoare pentru gruprile SH) un compus colorat, cu maxim de absorbie la 412 nm
(cmM = 13,6 ).

















(CH
3
)
3
N
+
- CH
2
- CH
2
- O - OC - CH
3
AcChE
(CH
3
)
3
N
+
- CH
2
- CH
2
- OH + CH
3
COOH
(CH
3
)
3
N
+
- CH
2
- CH
2
- OH + R - COOH
ChE
(CH
3
)
3
N
+
- CH
2
- CH
2
- O - OC - R
(CH
3
)
3
N
+
- CH
2
- CH
2
- S - OC - (CH
2
)
2
- CH
3
ChE
(CH
3
)
3
N
+
- CH
2
- CH
2
- SH + HOOC - (CH
2
)
2
- CH
3
(CH
3
)
3
N
+
- CH
2
- CH
2
- SH +
S
COOH
NO
2
NO
2
COOH
S
O
2
N
HOOC
NO
2
COOH
S - CH
2
- CH
2
-
+
N(CH
3
)
3
+ HS
122
Reactivi :
1. Soluie substrat: butiriltiocolin 10mM n tampon fosfat 20mM pH =7,8;
2. Ser dil.1/100;
3. Reactiv de culoare: DTNB 0,2mM n tampon fosfat 20mM pH = 7 i
etanol 1/1.
Tehnica de lucru :
n 2 eprubete se pipeteaz urmtorii reactivi:

Reactivi P M
Soluie substrat 0,2 0,2
Ser diluat 1/100 0,2 -
Se incubeaz 10 minute
Reactiv de culoare 2,0 2,0
Ap distilat - 0,2

Se citete E
412nm
probei fa de martor.

Calcul:
nm 412
nm 412
nm 412
E 8 8
2
2400
x
136
E
serului dil
E
E
ser m substrat moli ser ml UI
,
.
min /
min/ / /
=
=
A
= =


Pentru determinarea activitii specifice se dozeaz i proteina din serul
respectiv, prin metoda Gornall, astfel:

Tehnica de lucru :
n dou eprubete se pipeteaz urmtorii reactivi:

Reactivi P M
Ser diluat 1/100 1,0 -
Ap distilat - 1,0
Reactiv Gornall 4,0 4,0

Dup 15 minute se citete extincia probei la 540 nm fa de martor.

Calcul:
A E 100 ser ml prot mg
540
. / . =
A = inversul coeficientului de pant stabilit la curba de dozare a
proteinelor.
E
C
A
E
E
=
123
Activitatea specific a ChE serice va fi egal cu:
ser ml prot mg
ser ml UI
/ .
/



Determinarea activitii transaminazelor

Transaminazele sunt enzime care catalizeaz reacii de transaminare.
Reaciile de transaminare decurg dup un mecanism numit: ping - pong. Acest tip
de mecanism cinetic se caracterizeaz prin aceea c unul dintre substrate se leag
de enzim, creia i produce o modificare chimic prin transferul unei grupe
aminice, iar produsul realizat din transferul acestui substrat este ndeprtat.
Urmeaz apoi legarea celui de al doilea substrat pe enzim, substrat care accept
gruparea funcional de la enzim formnd al doilea produs care este i el eliberat.
Modificarea chimic este de fapt suportat de ctre coenzim avnd loc o tranziie
reversibil ntre PALPO i piridoxamin fosfat. n reaciile de transaminare are loc
transferul unei grupri aminice donor pe un o-cetoacid acceptor.

Determinarea activitii GPT

Transaminaza glutamico-piruvic ( GPT ) catalizeaz reacia:







Pentru a doza GPT, se las s reacioneze serul de analizat asupra o-
cetoglutaratului i alaninei n soluie tampon. Cantitatea de piruvat se msoar
fotometric, sub form de 2,4 dinitrofenilhidrazon.

Reactivi:
1. Soluie tampon-substrat (tampon fosfat 100mM pH=7,4; D-L alanina
200mM; acid o-cetoglutaric 2 mM);
2. Reactiv de culoare: 2,4-dinitrofenilhidrazin 1mM;
3. Soluie NaOH 0,4N.

Tehnica determinarii:
n dou eprubete se pipeteaz urmtorii reactivi:



H
3
C - CH - COOH + HOOC - CH
2
- CH
2
- C - COOH
GPT
NH
2
O
O
NH
2
H
3
C - C - COOH + HOOC - CH
2
- CH
2
- CH - COOH
124
Reactivi (ml) P M
Soluie tampon-substrat 0,5 0,5
Ser proaspt nehemolizat 0,1 -
Ap distilat - 0,1
Se agit i se incubeaz 30 de minute la 37
o
C, apoi se adaug:
Reactiv de culoare 0,5 0,5
Se agit i se las la temp. camerei 20 de minute, dup care se adaug:
NaOH 0,4N 5,0 5,0

Se agit i dup 5 minute se citete extincia probei fa de martor (la 540
nm), n cuv de 1 cm.
Dac extincia depete valoarea de 0,375 se dilueaz serul 1:10 i se repet
determinarea n condiiile de mai sus.

Corespondena ntre valoarea E
546nm
i activitatea enzimatic (mU) este dat
n tabelul urmtor:
E
546nm
mU/ml E
546nm
MU/ml
0,025 2 0,200 29
0,050 5 0,225 34
0,075 9 0,250 39
0,100 12 0,275 45
0,125 16 0,300 52
0,125 16 0,300 52
0,175 24 0,350 68
0,375 77

Valorile normale n ser sunt pn la 12mU/ml ser.


Determinarea activitii GOT

Transaminaza glutamico-oxalacetic (GOT) catalizeaz transferul gruprii
amino de la acidul L-aspartic la acidul o-cetoglutaric, rezultnd acid L-glutamic i
acid oxalilacetic.
Reaciile care au loc sunt urmtoarele:









HOOC - CH
2
- CH - COOH + HOOC - CH
2
- CH
2
- C - COOH
NH
2 O
GOT
O NH
2
HOOC - CH
2
- C - COOH + HOOC - CH
2
- CH
2
- CH - COOH
O
HOOC - CH
2
- C - COOH CH
3
- C - COOH + CO
2
O
125
Pentru a doza GOT se las s reacioneze serul de analizat asupra o-
cetoglutaratului i aspartatului n soluia tampon.
Piruvatul rezultat n urma reaciilor de mai sus, reacioneaz cu 2,4-
dinitrofenilhidrazin n mediu alcalin i formeaz 2,4-dinitrofenilhidrazon de
culoare roie, care se msoar fotometric la 546 nm.
Reactivi:
1. Soluie tampon-substrat pH 7,4;
2. Reactiv de culoare: 2,4-dinitrofenilhidrazin 1mM;
3. Soluie NaOH 0,4N.

Tehnica determinrii:
n dou eprubete se pipeteaz urmtorii reactivi:
Reactivi (ml) M P
Soluie tampon-substrat 0,5 0,5
Ser proaspt
nehemolizat
0,1 -
Ap distilat - 0,1
Se agit i se incubeaz 30 de minute la 37
o
C, apoi se adaug:
Reactiv de culoare 0,5 0,5
Se agit i se las la temp. camerei 20 de minute, dup care se adaug:
NaOH 0,4N 5 5

Se agit eprubetele iar dup 5 minute se citete extincia probei fa de
martor la 546 nm n cuva de 1 cm.
Dac extincia depete valoarea de 0,260 se dilueaz serul 1:10 i se repet
determinarea n condiiile de mai sus.

Corespondena ntre valoarea E
546nm
i activitatea enzimatic (mU) este
redat n tabelul urmtor:
E
546nm
mU/ml E
546nm
mU/ml
0,020 4 0,160 34
0,040 8 0,180 40
0,060 11 0,200 48
0,080 16 0,220 57
0,100 19 0,240 67
0,120 24 0,260 80
0,140 28
Dac citirile nu se pot executa la 546 nm se face o curb de etalonare a
piruvatului.
Valorile normale n ser sunt de pn la 12mU/ml.

126
Interpretarea rezultatelor
GOT:
- Creteri marcate (de 10-100 ori fa de valorile normale) se observ n:
- infarctul miocardic,
- hepatit viral acut,
- necroz toxic a ficatului.
- Creteri moderate se observ n:
- evoluia hepatitelor cronice,
- ictere mecanice,
- mononucleoz infecioas,
- anemii hemolitice severe.
GPT:
- Creteri marcate (de aproape 100 ori fa de valorile normale) apar n:
- hepatita viral acut
- necroza toxic a ficatului.
- Creteri moderate apar n:
- hepatita cronic i ciroze,
- ficatul de staz cardiac i
- mononucleoza infecioas.
Raportul GOT/GPT se numete coeficient DE RITTIS = 1,33 la subiecii
normali. Acest raport:
- scade n leziunile inflamatorii ale ficatului, datorit creterii
marcante a GPT.
- leziunile necrotice duc la creterea GOT, iar raportul GOT/GPT
crete.
- hemoliza duce la creteri ale GOT-ului.


Determinarea activitii -glutamiltranspeptidazei serice

Principiu:
-Glutamiltranspeptidaza (-GT) catalizeaz transferul acidului glutamic de
pe un donor (-glutamil-p-nitroanilid), pe un acceptor (glicilglicin). In urma
reaciei se formeaz p-nitroanilin, colorat n galben (cmM = 9,9).
Reactivi:
1. Substrat n Tris HCl;
2. Ser de analizat;
3. Acid acetic 1N.
127















Tehnica de lucru:
Pentru fiecare determinare se pregtesc 2 eprubete n care se pipeteaz:
Reactivi (ml) M P
Substrat Tris n HCl 0,30 0,30
Ser - 0,02
Se incubeaz la 25
o
C timp de 20 de minute, apoi se adaug:
Acid acetic 1N 1,50 1,50
Ser 0,02 -

Se citete extincia probei fa de martor la 405 nm dup 30 de minute de la
adugarea ultimului reactiv.
Calcul:
1 UI este cantitatea de enzim care catalizeaz transferul a 1 mol de acid
glutamic de pe un donor pe acceptor la temperatura de 25
0
C n timp de 1
minut.Activitatea enzimei serice se exprim n U/L.
Activitatea -GT ( U/L ) = 460 x E
405
/20 minute
Interpretarea rezultatelor
Valori normale: 6 - 28 U/L la brbai;
4 - 18 U/L la femei.
Testul -GT este folosit n diagnosticul suferinelor hepatice, fiind mult mai
sensibil dect fosfataza alcalin pentru depistarea formelor de colestaz i este
singurul test enzimatic pentru decelarea hepatopatiilor alcoolice.
Valori crescute se ntlnesc i n:
- hepatite cronice,
- neoplasm primitiv sau metastazic al ficatului,
- insuficien cardiac cu staz hepatic sau
- leziuni pancreatice
- administrare de barbiturice
- la alcoolici.
O
2
N NH - C = O + CH
2
- COOH
(CH
2
)
2
CH - NH
2
COOH
NH - C = O
CH
2
- NH
O
2
N NH
2
+ CH
2
- COOH
NH - C = O
CH
2
- NH
(CH
2
)
2
CH - NH
2
COOH
C = O
128
IX. ANALIZA BIOCHIMIC A LIPIDELOR


Lipidele sunt compui organici care intr n constituia tuturor organismelor
vii i care au o caracteristic comun, aceea de a fi insolubile n ap, dar uor
solubile n solveni organici. Din punct de vedere chimic, lipidele sunt esteri ai
unor polialcooli cu acizii grai superiori. Ele constituie o clas heterogen de
substane organice, iar gruparea lor n aceeai clas de substane se face numai pe
baza proprietilor lor fizice de solubilitate.

IX.1.CLASIFICAREA LIPIDELOR

A. Din punct de vedere structural lipidele se mpart n:
I. Lipide simple : - esteri ai acizilor grai cu glicerina (triacilgliceroli)
- esteri ai acizilor grai cu alcooli superiori
monocarboxilici (ceruri)
II. Lipide complexe: - glicerofosfolipide: esteri ai glicerinei cu acizi grai,
compui azotai i un rest de acid fosforic
- sfingolipide: conin un alcool (sfingozina), acizi
grai, compui azotai i un rest de acid fosforic
Exemple: - fosfolipide
- glicolipide
- sulfatide
- aminolipide
- lipoproteine
III. Derivai ai lipidelor sunt compui rezultai prin hidroliza lipidelor
simple i complexe.
Exemple: - acizii grai: - saturai
- nesaturai
- glicerina
- steroizi
- aldehide grase
- corpi cetonici

B. Din punct de vedere funcional lipidele se mpart n :
I. Lipide de rezerv. Acestea sunt localizate n esutul adipos i sunt
constituite n special din trigliceride de provenien exogen (alimentar)
II. Lipidele citoplasmatice sunt lipide complexe care alctuiesc elementul
constant care variaz numai n funcie de natura esutului.




129
IX.2.REACII DE IDENTIFICARE A ACIZILOR GRAI

Grsimile neutre supuse aciunii hidrolitice ale alcalilor, acizilor minerali
sau enzimelor lipolitice se scindeaz n glicerol i acizi grai conform reaciei:

CH2
OCO
CH OCO
CH2 OCO
R
R
R
+

3 H2O
CH
CH2
OH
CH
2
OH
OH
+3
R COOH


Identificarea acizilor grai prin saponificare

Grsimile se hidrolizeaz sub aciunea NaOH n glicerol i spunul de sodiu
al acidului gras respectiv.
Reactivi:
1. NaOH
2. alcool de 96%
3. acid acetic glacial
4. soluie de clorur de bariu 10%
5. soluie saturat de clorur de sodiu
6. grsime: untdelemn
Mod de lucru
ntr-o eprubet se introduc cteva picturi de ulei (3-4 picturi), se adaug
1-2 buci NaOH i 5 ml alcool. Amestecul se nclzete pe baia de ap i dup cca
10 minute se observ cum grsimea dispare deoarece se formeaz spunul de sodiu
solubil n alcool.
Eprubeta se umple cu ap distilat i se observ apariia unei slabe opalescene
datorit soluiei coloidale de spun. Coninutul eprubetei se mparte n 3 i se fac
urmtoarele reacii:

1. n prima eprubet se ncearc punerea n libertate a acizilor grai din sarea
lor prin adugare de acid acetic pn la reacie acid (se va ncerca cu hrtie
indicator). Acizii grai eliberai fiind insolubili se va obine un precipitat
abundent.

R COONa
+
H3C COOH
R COOH
+
H
3
C COONa

2. n a doua eprubet se adaug cteva picturi dintr-o soluie de clorur de
bariu. n urma unei reacii de nlocuire se formeaz un precipitat bogat de
spun de bariu insolubil.

2 R COONa
+
BaCl2
(R COO)2Ba
+
2 NaCl


130
3. n ultima eprubet se face flocularea spunului coloidal prin adugarea unui
exces de soluie saturat de clorur de sodiu.


Identificarea acizilor grai nesaturai

Identificarea acizilor grai nesaturai din compoziia grsimilor se bazeaz
pe proprietatea lor de a adiiona iod la dubla legtur pe care o conin.


H3C (CH2)n CH CH (CH2)n COOH
+
I2
H3C (CH2)n CH CH (CH2)n COOH
I
I

Reactivi: 1. untdelemn
2. tinctur de iod
3. soluie de amidon
Mod de lucru
La cca 5 ml ulei se adaug cteva picturi de soluie de iod. Se agit bine
pn cnd mediul capt o culoare roie. Prin nclzirea uoar a amestecului se
observ dispariia culorii roii. Dac soluia se rcete i se ncearc prezena
iodului cu cteva picturi de soluie de amidon, se constat c nu se obine culoarea
albastr pe care o d iodul cu amidonul ceea ce denot lipsa iodului liber. Iodul
adugat se fixeaz la dubla legtur formnd un derivat diiodurat al grsimii
cercetate.

IX.3.LIPOPROTEINELE

Exist ase clase de lipoproteine divizate n funcie de dimensiune i
coninutul de lipide. Densitatea acestor lipoproteine i viteza de sedimentare la
ultracentrifug este invers proporional cu coninutul lor de lipide.

Clase de lipoproteine
Lipoproteinele Dimensiuni
[nm]
Compoziia
Proteine Colesterol
liber
Ester de
colesterol
Trigliceride Fosfolipide Locul de
Formare
Chilomicroni 75-1000 2 2 3 90 3 Intestin
Chilomicroni
Rest
30-80 ... ... ... ... ... Capilare
Lipoproteine cu
densitate foarte
sczut
VLDL
30-80 8 4 16 55 17 Ficat i
intestin
Lipoproteine cu
densitate
intermediar
IDL
25-40 10 5 25 40 20 VLDL
Lipoproteine cu
densitate sczut
LDL
20 20 7 46 6 21 IDL
Lipoproteine cu
densitate mare
HDL
7.5-10 50 4 16 5 25 Ficat i
intestin

131
n general, lipoproteinele au o form sferic i conin un miez hidrofob
bogat n trigliceride i esteri de colesterol, nconjurat de fosfolipide i proteine care
reprezint gruparea hidrofil (Fig. 13.).


Fig. 13. Structura LDL, receptorul LDL i legarea LDL de ApoB100
Componentele proteice a lipoproteinelor sunt denumite apoproteine.
Principalele apoproteine sunt: Apo E, Apo C, i Apo B.

Apoproteine
Apoproteine Locul de sintez Funcia
A-I Intestine, ficat activeaz LCAT
AII Intestine, ficat
B
100
Ficat transport trigliceride i colesterol se leag de LDL
B
48
Intestine transport trigliceride
C-I Ficat activeaz LCAT
C-II Ficat activeaz lipoproteinlipaza
C-III Ficat inhib lipoproteinlipaza
E ficat, intestin,
macrofage
se leag de receptorul LDL i probabil i de alt receptor al
ficatului

Exist dou forme de Apo B:
una cu greutate molecular relativ joas Apo B
48
, care este caracteristic
sistemului exogen i care transport lipidele exogene ingerate
Apo B
100
cu greutate molecular mai mare care este caracteristic sistemului
endogen.


Chilomicronii sunt provenii din lipidele alimentare i absorbii n mucoasa
intestinal. Complexele lipoproteice mari intr n circulaie prin canalele limfatice.
Dup mncare, sunt multe astfel de particule n snge, care determin aspectul
lptos al plasmei (hiperlipemia postprandial).
132
Chilomicronii sunt ndeprtai din circulaie sub aciunea
lipoproteinlipazei, care este localizat la nivelul endoteliilor vasculare, n special
al capilarelor. Enzima catalizeaz scindarea trigliceridelor din chilomicroni la acizi
grai liberi i glicerol. Acizii grai liberi intr dup aceea n celulele adipoase i se
reesterific, restul rmai n circulaie se fixeaz de albumin. Lipoproteinlipaza,
care necesit prezena heparinei ca i cofactor, ndeprteaz de asemenea
trigliceridele din lipoproteinele cu densitate foarte joas (VLDL).
Chilomicronii i VLDL conin Apo C, complex de proteine care i desparte
n capilare. O component a complexului, apolipoproteina C-II, activeaz
lipoprotein lipaza.
Chilomicronii din care s-au ndeprtat trigliceridele rmn n circulaie ca i
lipoproteine bogate n colesterol, denumii rest de chilomicroni, care au un
diametru de 30-80 nm. Ei sunt transportai la ficat, unde se leag de receptorii
restului de chilomicroni i LDL. Ei sunt ndat internalizai prin intermediul unor
receptori specializai printr-un proces de endocitoz i degradai n lizozomi.
Chilomicronii i resturile lor constituie un sistem de transport pentru lipidele
exogene ingerate.
Exist de asemenea un sistem endogen format din VLDL, lipoproteine cu
densitate intermediar (IDL), lipoproteine cu densitate joas (LDL) i lipoproteine
cu densitate mare (HDL), care transport trigliceridele i colesterolul n tot corpul.
VLDL se formeaz n ficat i transport trigliceridele formate din acizii
grai i hidraii de carbon din ficat la esuturile extrahepatice. Dup ce trigliceridele
sunt n mare msur ndeprtate cu ajutorul lipoproteinlipazei, VLDL devin IDL.
IDL ndeprteaz fosfolipidele i prin aciunea enzimei plasmatice lecitin-
colesterol aciltransferaz (LCAT), capteaz esterii de colesterol formai din
colesterol n HDL. O parte de IDL este preluat de ficat. IDL rmas dup aceea mai
pierde trigliceride i proteine, probabil n sinusoidele ficatului i devine LDL. n
timpul acestor transformri pierd Apo E, dar Apo B
100
rmn.
LDL furnizeaz colesterol la esuturi. Colesterolul este un constituent al
membranelor celulare i este utilizat de celulele glandulare pentru a sintetiza
hormoni steroizi.
n ficat i n cele mai multe esuturi extrahepatice, LDL este captat de un
receptor prin intermediul endocitozei. Receptorii recunosc componenta Apo B
100
a
LDL. Ei de asemenea leag i Apo E, dar nu leag Apo B
48
(Fig. 14.).




133

Fig.14. Metabolismul lipoproteinelor

Receptorul LDL

Receptorul uman pentru LDL este unul din clasa de receptori care s-au
specializat pentru de transportul macromoleculelor n celule prin endocitoz. Este
un complex molecular mare format dintr-un rest de aminoacid cu cistein n poziia
292 care leag LDL.
Particulele lipoproteice captate de receptori ptrund mpreun cu acetia n
interiorul celulei formnd microvezicule numite endozomi. Prin acidifierea
endozomilor receptorul se desface din complexul cu particula lipoproteic i este
readus la suprafaa celulei.
n cazul receptorului LDL, dar nu i a receptorului restului de chilomicroni,
are loc eliberarea receptorilor LDL, care se recicleaz la membrana celular (Fig.
15.). Endozomii dup aceea se contopesc cu lizozomii, unde colesterolul (format
din esterii de colesterol sub aciunea lipazei acide din lizozomi) devine disponibil
pentru nevoile celulei.
Colesterolul n celule inhib sinteza intracelular de colesterol prin
inhibarea HMG-CoA reductazei, stimuleaz esterificarea colesterolului eliberat n
exces i inhib sintez de noi receptori LDL. Cu ajutorul acestor mecanisme se
realizeaz controlul cantitii de colesterol din celul.
LDL sunt preluai de macrofage cu afinitate redus i nc multe alte celule.
n plus, macrofagele preiau LDL modificat prin oxidare. Oxidarea poate avea loc n
macrofag.
134

Fig. 15. Calea receptorului LDL


Antioxidanii administrai experimental la animale, ca de exemplu vitamina
E, pot ncetini evoluia aterosclerozei. Receptorul LDL de pe macrofage i de pe
celulele asemntoare se numete receptorul epurator scavenger. El este diferit
de receptorul de pe alte celule i are o afinitate mai mare pentru LDL modificat.
Cnd macrofagele devin suprancrcate cu LDL oxidat, se transform n celule
spumoase care se ntlnesc n leziunile iniiale ale aterosclerozei.
n starea staionar, micarea colesterolului n i din celul este echilibrat.
HDL - aceste lipoproteine sunt sintetizate n ficat i intestin. A fost
identificat un receptor separat de HDL. Se gsete n primul rnd n glandele
endocrine care secret hormoni steroizi i n ficat. Sistemul HDL transfer
colesterolul la ficat, care apoi este excretat n bil. Astfel scade colesterolul din
plasm.
Apo E este sintetizat n celulele din creier, splin, plmni, glandele
suprarenale, ovare, rinichi i ficat. Concentraia ei crete n leziunile nervoase, unde
pare s joace un rol n regenerarea esutului nervos.
Gena apolipoproteinei E este prezent la populaia general n trei alele:
Apo-2, Apo-3, i Apo-4. Apo-4 este mai puin comun dect Apo-2 i Apo-3 dar
este bine reprezentat la pacienii cu boala Alzheimer i predispune la aceast
boal.


IX.4. TULBURRI ALE METABOLISMULUI LIPIDIC


Att hiper- ct i hipolipoproteinemiile pot avea un caracter primar sau
secundar unor diverse mbolnviri.
Pn n prezent nu exist o clasificare satisfctoare. Nici clasificarea
genetic, nu s-a dovedit a fi bun, datorit mutaiilor genetice. De exemplu,
hipercolesterolemia familial cu xantelasm, xantoame tendinoase,
hipercolesterolemia sever i ateroscleroza coronarian precoce, se pot datora uneia
135
dintre cele 150 mutaii ale genei receptorului LDL. Hipercolesterolemia familial
care prezint durere recurent abdominal i pancreatit poate fi rezultatul unei
mutaii genetice a lipoproteinlipazei sau a apo C-II.
O clasificare simplificat se face n primare (familiale) i secundare
(ctigate).


Tulburri cu caracter primar


Clasificarea propus de Fredrickson sau OMS este cea mai acceptat pentru
hiperlipemiile primare (Fig. 16.) i se bazeaz pe evaluarea creterii unei anumite
fraciuni electroforetice a lipoproteinelor serice.

Tipul Normal Tipul I Tipul II-a Tipul II-b Tipul III Tipul IV Tipul V
Plasm
(12 h la +4C)

Lipoproteine N Chilomicroni LDL LDL
VLDL
IDL VLDL Chilomicroni
VLDL
Colesterol
total
N N sau N sau N sau
Trigliceride N N
LDL
colesterol
N N sau N sau N N
HDL
colesterol
N N sau N sau N sau N sau N sau N sau

Fig. 16. Clasificarea Fredrickson al dislipidemiilor

Cele ase clase de hiperlipoproteinemii definite n clasificarea Fredrickson
nu sunt la fel de frecvente. Tipurile I i V sunt rare, n timp ce tipurile IIa, IIb i IV
frecvente. Tipul III de hiperlipoproteinemie cunoscut i ca disbetalipoproteinemie
familial, este de frecven medie, 1/5.000.


Hiperlipoproteinemii


Tipul I sau hiperchilomicronemia este o boal rar ntlnit i are un
caracter autozomal recesiv.
Se caracterizeaz prin creterea excesiv a trigliceridelor serice (1.000
mg/dl) n timp ce colesterolul poate varia n limite normale. Electroforeza
lipoproteinelor serice evideniaz creterea chilomicronilor.
Caracteristic este smntnirea plasmei la +4C.
136
Modificrile se datoresc deficitului genetic de lipoproteinlipaz sau unui
deficit de apo C-II.
La aceti subieci se constat hepatomegalie, pancreatit acut, dureri
abdominale i apariia pe tegumente a xantoamelor eruptive.

Tipul II sau hipercolesterolemia familial se caracterizeaz prin creterea
izolat a colesterolului din LDL i implicit a betalipoproteinelor. Transmiterea se
face printr-un mecanism autozomal dominant, iar homozigoii prezint creteri
mari ale colesterolemiei cu valori de peste 600 mg/dl.
Se difereniaz dou subtipuri:
- subtipul II-a sau hiperbetalipoproteinemia pur i
- subtipul II-b, n care alturi de hiperbetalipoproteinemie se
constat i o cretere a fraciunii prebeta i a trigliceridelor.
Dezvoltarea leziunilor aterosclerotice asociate cu fenomene clinice severe
merg pn la infarct miocardic, care survine de multe ori nainte de 20 de ani. Totodat
se produc infiltraii cu colesterol n piele i tendoane constituind aa zisele xantoame
tendinoase, xantelasma i xantoame tuberoase pe genunchi, fese i coate. Mecanismul
de producere const ntr-un deficit sever al receptorilor pentru LDL.

Tipul III sau disbetalipoproteinemia care se caracterizeaz prin creterea
concomitent a trigliceridelor i colesterolului datorit nivelului anormal crescut de
lipoproteine cu densitate foarte joas care au o mobilitate electroforetic anormal
i crora li s-a atribuit termenul de beta-VLDL. Aspectul electroforezei este de
band beta lat, n care izolat prin ultracentrifugare, raportul colesterol/trigliceride
este mai mare ca 0,30, la subiecii normali acest raport fiind sub 0,25.
Anomalia se transmite autozomal recesiv.
Bolnavii prezint risc crescut pentru apariia precoce a manifestrilor
clinice ale aterosclerozei. Ei sunt supraponderali, hiperuricemici i prezint o
toleran sczut la testul de ncrcare cu glucoz. Xantoamele tuberoeruptive i
palmare sunt frecvente.

Tipul IV este o anomalie cu caracter autosomal dominant ce se
caracterizeaz prin creterea lipoproteinelor cu densitate foarte joas (prebeta).
Colesterolul este normal sau uor crescut, n timp ce trigliceridele cresc mult.
Subiecii prezint xantoame eruptive, iar ateroscleroza i infarctul
miocardic survin frecvent.

Tipul V se caracterizeaz prin creterea fraciunii prebeta (VLDL) i a
trigliceridelor, precum i a chilomicronilor. Manifestrile clinice sunt uneori
asemntoare celor din tipul I, iar ateroscleroza nu este frecvent.


Hipolipemii primare
Sunt cauzate de un deficit genetic n procesul de sintez al lipoproteinelor.
137
Abetalipoproteinemia este o afeciune genetic autosomal recesiv.
Anomalia este determinat de un deficit n procesul de sintez a apoproteinei B. Se
constat lipsa total a betalipoproteinelor, prebetalipoproteinelor, i a
chilomicronilor i o scdere a fraciunilor alfa 1.
Boala se asociaz cu:
- tulburri n absorbia lipidelor care se elimin prin scaun,
- modificri de form ale eritrocitelor care au un aspect crenelat
(acantocitoz).
- tulburri nervoase care se caracterizeaz prin ataxie cu
demielinizarea cordoanelor posterioare i laterale.

Hipobetalipoproteinemia sau boala Tangier este o boal genetic cu
transmitere autosomal dominant i const n reducerea vitezei de sintez a
lipoproteinelor beta. Nivelurile LDL i VLDL sunt de aproximativ 50% din cele
normale, colesterolemia oscileaz ntre 55-146 mg/100 ml.
Manifestrile clinice semnalate la subiecii cu abetalipoproteinemie lipsesc.

Hipoalfalipoproteinemia se caracterizeaz prin reducerea nivelului de
HDL i o structur anormal.
Transmiterea bolii este autosomal dominant.
Valoarea colesterolului este sub 100 mg/100 ml, trigliceridele sunt uor
crescute. Bolnavii au hepatosplenomegalie i adenopatii. Exist i un anumit grad
de opacifiere a corneei.

Deficitul familial de lecitin-colesterol aciltransferaz (LCAT) - boala
este caracterizat de insuficienta sintez a enzimei LCAT care catalizeaz reacia
de esterificare a colesterolului prin transferul unui acid gras nesaturat de pe
molecula de lecitin.
Se transmite autosomal recesiv. Colesterolul are valori cuprinse ntre 300-
600 mg/100 ml.
Manifestrile clinice se datoreaz proteinuriei, anemiei i poate evolua spre
insuficien renal.

Tulburri cu caracter secundar


Hiperlipemii secundare

Survin n situaii extrem de variate cum sunt: diabetul zaharat, alcoolismul,
insuficiena renal cronic, hipotiroidism, gut, tratament cu estrogeni, boala
Addison etc.
n cazul diabetului zaharat se produce o mobilizare exagerat a acizilor
grai liberi din esutul adipos care mpreun cu reducerea activitii
lipoproteinlipazei duce la hipertrigliceridemie.
n majoritatea cazurilor de sindrom nefrotic se constat o cretere a
138
colesterolului i a trigliceridelor. Pierderile urinare de proteine reprezint un stimul
important pentru sinteza hepatic de proteine i lipoproteine. Remisiunea
sindromului nefrotic sau corectarea hipoalbuminemiei duce la normalizarea
spectrului lipidic demonstrndu-se astfel caracterul secundar al hiperlipidemiei
nefroticilor.
Hiperlipidemia din alcoolism se caracterizeaz prin creterea trigliceridelor
care se explic prin creterea mobilizrii acizilor grai liberi i ncetinirea oxidrii
acizilor grai.
Caracteristica hiperlipidemiei din hipotiroidism este creterea
colesterolului i n special a LDL-colesterolului.

Hipolipemii secundare

Pot fi consecina unei sinteze deficitare de lipoproteine sau a unui
catabolism exagerat al acestora.
Hipolipemii fiziologice prezint nou-nscuii n cursul primei sptmni de
via pentru ca apoi la aproximativ 4 luni s se stabileasc la valorile ntlnite la
copii ntre 1-16 ani.

Hipolipemii patologice se ntlnesc n:
- denutriie,
- anemiile acute,
- cursul reaciei de faz acut,
- sindroamele de malabsorbie,
- insuficiena hepatic avansat.
- hipertiroidismul sever evolueaz cu o scdere a colesterolului i a
beta lipoproteinelor.

Ateroscleroza

Din punct de vedere biochimic ateroscleroza se caracterizeaz prin
depunerea de esteri de colesterol i de alte lipide n esutul conjunctiv al pereilor
arteriali.
S-a artat c ateroscleroza predispune la infarct miocardic, accidente
vasculare cerebrale, sindrom de ischemie periferic, etc.
Printre factorii incriminai se numr supraalimentaia i, n special,
alimentaia mai bogat n grsimi de origine animal, stri de ncordare psihic i
sedentarismul.
Studii clinice i de laborator au artat c leziunile aterosclerotice survin
frecvent n diabetul zaharat, nefroze i hipotiroidism, afeciuni n care nivelul
colesterolului seric este ridicat.
Dezvoltarea leziunilor aterosclerotice este rezultanta unor interaciuni
complexe ntre lipoproteinele plasmatice i diversele componente ale peretelui
139
arterial.
Fenomenele implicate n aterogenez sunt:
1. Acumularea intra i extracelular de material lipidic, mai ales colesterol,
n prezen de apoB
100
care se fixeaz cu mare afinitate n peretele arterial. Exist
dovezi c macrofagele capteaz mai ales particulele de LDL modificate
(peroxidate, glicozilate, malonilate) relativ bogate n apoB
100
.
2. Migrarea unor monocite din sngele circulant sau macrofage din peretele
arterial n care ptrund fie prin diapedez, fie la nivelul leziunilor i formeaz
celulele spumoase. Macrofagele sau monocitele ncrcate cu LDL i reduc
mobilitatea i rmn blocate n peretele arterial ca macrofag rezistent care continu
s nglobeze LDL oxidate i apoi s se transforme n celule spumoase.
3. LDL oxidate i macrofagele ncrcate cu aceste particule exercit un
efect nociv avnd ca urmare proliferarea celulelor musculare din peretele arterial.
4. Consecina acestui proces este ngroarea plcii ateromatoase i implicit
ngustarea lumenului vascular. Celulele musculare proliferate dobndesc proprieti
secretorii cu formare de fibre de colagen, elastin i proteoglicani. Se formeaz o
capsul fibroas ce include un material cremos glbui format din celule spumoase,
detritusuri celulare i material lipidic extracelular.
5. n condiiile n care se perforeaz capsula fibroas se ulcereaz placa
ateromatoas, coninutul acesteia, care conine i un bogat factor tisular, activnd
coagularea.
6. n contact cu peretele vascular i cu elementele sngelui circulant
determin complicaii trombotice.
Este important de subliniat pentru patologia clinic c dei, proliferarea
celulelor musculare netede i formarea esutului fibros ngusteaz lumenul
vascular, totui contribuie la integritatea plcii. Acest proces determin formarea
unei plci ateromatoase stabile care pe plan clinic corespunde unei afeciuni relativ
benigne. Cu toate acestea, unele plci ateromatoase cu o capsul fibroas subire se
pot fisura uor i pot duce la formarea de trombi, i implicit, la sindroame
coronariene acute precum angin instabil, infarct miocardic i moarte subit.
Tromboza constituie prin urmare cel mai important eveniment n evoluia
natural a plcii ateromatoase. Tromboza oclusiv a arterei produce o complicaie
major a aterosclerozei. Acest lucru depinde i de o eventual predispoziie la
tromboz a pacientului, determinat de o hiperreactivitate a plcuelor i de o
hipercoagulabilitate i/sau de o insuficien a sistemului fibrinolitic.


Tratamentul hiperlipemiilor


Dezvoltarea unei hiperlipemii depinde de factorii genetici i de obiceiurile
alimentare i de via, profilaxia putnd fi considerat ca o problem de educaie
sanitar.


140
Tratamentul const n:

1. Regim igieno-dietetic care va fi adaptat dup tipul de hiperlipemie:
- n caz de hipercolesterolemie se vor exclude alimentele bogate n
colesterol.
- n hipertrigliceridemia endogen (tipul III, IV, V) se recomand reducerea
hidrailor de carbon.
Este deosebit de util i cultura fizic medical. Se aplic n centre
specializate sub control medical strict n funcie de anomalia lipidic.

2. Medicaie cu efect hipolipemiant care s aib efecte secundare minime, s
reduc nivelul colesterolului, fosfolipidelor, trigliceridelor i betalipoproteinelor
- exemplu: Clofibrat, Cuemid, Questran, Lovastatin, Simvastatin etc.



















141
X. ANALIZA ACIZILOR NUCLEICI


Acizii nucleici sunt molecule informaionale cu rol n stocarea, transmiterea
i exprimarea mesajului genetic. Ei reprezint cele mai importante molecule din
celul, asigurnd prin ADN banca de date i centrul de coordonare al celulei, iar
prin ARN punerea n aplicare a comenzilor date de ADN-ul nuclear.
Din punct de vedere chimic acizii nucleici sunt catene polinucleotidice cu
mas molecular mare, n care unitile de baz, nucleotidele, sunt legate ntre ele
prin legturi 3

,5

fosfodiesterice. O nucleotid are n compoziie:

- o baz azotat (purinic sau pirimidinic)
- o pentoz
- o molecul de acid fosforic

X.1.ANALIZA ADN-ULUI CELULAR

Determinarea ciclului ADN-ului celular. Determinarea fazei ciclului
ADN-ului celular n diferite condiii experimentale aduce informaii majore despre
capacitatea de multiplicare a celulei i influena asupra acestei funcii a diverselor
preparate farmacologice.
Monitorizarea procesului de activare sau determinarea degradrii ADN n
cadrul apoptozei celulare este posibil cu ajutorul analizelor de citometrie de flux.
Majoritatea celulelor neactivate sunt diploide, n timp ce iniierea
procesului de proliferare i trecerea celulei de la G0 la M este nsoit de
modificarea nivelului de ploidie.
Iodura de propidiu este o substan fluorescent care absoarbe lumina la
488 nm i emite la 560- 600nm. Ea se ataeaz la ADN-ul i ARN-ul celular dublu
catenar i emite o und de lumin proporional cu cantitatea de material genetic la
care se leag. Eliminarea ARN-ului prin utilizarea ARN-azei permite analiza doar a
ADN-ului celular. Fluorocromul poate ptrunde intracelular numai dac membrana
celular este degradat, membranele celulare intacte nepermind intrarea lui n
celul.
Principiul metodei.
n cadrul activrii lor, celulele pot trece din faza G0 spre G1, S, G2 i, n
final, la faza M, prin modificarea cantitii de ADN pe care o deine. Colorarea
ADN-ului celular cu o substan fluorescent i determinarea intensitii
fluorescenei acesteia furnizeaz informaii despre faza ciclului de diviziune n care
se afl fiecare celul dintr-o suspensie.
Materiale necesare.
- Suspensie de celule,
- iodur de propidiu,
- Triton X-100,
- TFS,
- EDTA,
142
- metanol,
- ribonucleaz (RNA-az),
- sticlrie de laborator,
- centrifug,
- tuburi de plastic 12 x 75 mm (Falcon 2054) cu capac,
- vortex,
- citometru de flux etc.
Tehnic de lucru.
Se pregtete soluia de colorare (care const din 10 mg de iodur de
propidiu, 0,1 ml Triton X-100, 3,7 mg de EDTA i 90 ml de TFS ), soluia de
ARN-az (10 mg de ARN-az n 5 ml TFS) i o baie de ghea pe care se vor lucra
probele.
Suspensia de celule se ajusteaz la 1 x 10 celule/ml n TFS rece, se
porioneaz cte 1 ml n fiecare tub de analiz i se centrifugheaz timp de 10 min
la 200xg, dup care tuburile se in pe ghea. Peste sedimentul de celule se adaug
metanol n picturi, la rece, pn la volumul de 2 ml/tub, n acelai timp agitnd
probele la vortex. Tuburile se incubeaz pe ghea timp de 30 de min, apoi se
centrifugheaz timp de 5 min la 300xg. La sedimentul de celule din fiecare tub se
adaug fie 500l de TFS, care conine iodur de propidiu ( PI ) 100l /ml, fie
acelai volum din soluia de colorare (alegerea depinde de tipul de celule
investigate) i 500l din soluia de ARNaz n TFS (concentraie final 100
uniti/ml).
Probele se agit cu ajutorul unui vortex, se incubeaz pentru 30 min. la
temperatura camerei, apoi se analizeaz la un citometru de flux. Aparatul este
calibrat cu o suspensie de microsfere de polistiren fluorescente cu diametrul de
10m n vederea stabilirii unor standarde dimensionale. Sunt msurate simultan
mrimea i granularitatea celulelor pentru a exclude din analiz debriurile celulare,
iar fluorescena se citete la lungimea de und trecut prin filtrul 578/28 nm.


X.2. IZOLAREA ACIZILOR NUCLEICI

Acizii nucleici (ADN i ARN) sunt macromolecule formate prin
policondensarea nucleotidelor. Un nucleotid este format prin legarea unei baze
purinice sau pirimidinice de o pentoz fosforilat n poziia 5. Astfel fiecare lan
polinucleotidic are un capt 5 i unul 3 .
Bazele purinice din ADN sunt adenina (A) i guanina (G), iar cele
pirimidinice timina (T) i citozina (C).
Bazele purinice din ARN sunt adenina (A) i guanina (G), iar cele
pirimidinice uracilul (U) i citozina (C). Nucleotidele se leag prin legturi
fosfodiesterice.
Acizii nucleici se gsesc peste tot n lumea vie: virusuri, procariote i
eucariote. Spre deosebire de organismele cu organizare celular, virusurile conin
un singur tip de acid nucleic, fiind clasificate n ADN-virusuri i ARN-virusuri.
Diferitele vieuitoare conin molecule de ADN de lungimi diferite i cu succesiuni
143
de nucleotide specifice care codific lanurile polipeptidice din organismul
respectiv, precum i secvenele de control necesare.
Moleculele ADN sunt cel mai adesea formate din dou lanuri
polinucleotidice antiparalele, capetele 5 i 3 fiind orientate invers n cele dou
lanuri. Se formeaz astfel o dubl spiral cu bazele orientate n interior unde
formeaz perechi complementare, prin legturi de hidrogen, A-T (dou legturi de
hidrogen) i G-C (trei legturi de hidrogen). Moleculele de ARN sunt cel mai
adesea monocatenare, alctuite dintr-un singur lan polinucleotidic.


Fig. 17. Structura ADN dublu catenar; dup J.D.Watson i colab. (1992)

Sunt mai multe tipuri de ADN dublu helix descrise de J. Watson i F. Crick
( premiul Nobel n 1963 ) i apoi de alii ( A. Wang, A. Rich ), cel mai frecvent
ntlnit fiind aa numita form B cu 10 nucleotide pe tur, orientate perpendicular
pe axul lung al moleculei. Pasul helixului este de 3,4 nm i diametrul de 2,0 nm.
mperecherea bazelor, pe baza complementaritii, constituie aspectul principal pe
care se bazeaz metodele de identificare a secvenelor de ADN.
n ultimele decenii au fost precizate numeroase aspecte cu importan
teoretic i practic deosebit pentru toate disciplinele biologice. Se poate afirma
144
totui c indiferent de aspectul studiat prima condiie rmne izolarea n stare pur
i cu structura intact, nedenaturat a tipului de acid nucleic care urmeaz a fi
analizat din punct de vedere al proprietilor fizice, chimice sau biologice.

Principii de izolare ale ADN

1. Eliberarea coninutului intracelular. Acest proces se poate face n diferite
moduri depinznd de proba din care vrem s izolm ADN :
- mecanic prin omogenizare urmat de liz cu un detergent
- prin mojarare cu oxid de aluminiu a probelor ngheate n azot lichid
- prin ultrasunete sau liz cu enzime specifice (lizozim pentru bacterii)
2. Precipitarea proteinelor ntr-un mediu care inhib ADN hidrolazele: sunt
folosite diferite amestecuri de solveni organici dup adugarea unui agent care
desprinde proteinele asociate din cromatin. De exemplu se folosesc concentraii
mari de NaCl, iar ca amestec denaturant fenolul simplu sau n amestec cu
cloroform.
3. Purificarea avansat prin adugarea de proteaze i ribonucleaze pentru a
hidroliza ARN
4. Recoltarea prin centrifugare a stratului care conine ADN dizolvat
5. Precipitarea selectiv a ADN cu etanol la rece ( sau alt alcool )
6. Recoltarea ADN prin rsucirea pe o baghet sau prin centrifugare


X.2.1. IZOLAREA ADN DIN MATERIALE BIOLOGICE

Principiu:
Primul pas pentru succesul unei metode de biologie molecular l reprezint
izolarea ADN din celule. Oricare ar fi materialul utilizat, acesta trebuie s fie
proaspt sau congelat nainte de utilizare pentru a mpiedica degradarea ADN-ului
de ctre enzimele prezente n extractul celular.
Celulele trebuie distruse pentru a elibera componentele sale. Eliberarea
coninutului intracelular se poate face n diferite moduri depinznd de proba din
care vrem s izolm ADN.
Urmeaz precipitarea proteinelor, iar apoi purificarea avansat prin adugarea
de proteaze i ribonucleaze, urmat de recoltarea prin centrifugare a stratului care
conine ADN dizolvat.


Metoda de izolare a ADN din timus de viel

Timusul reprezint un organ deosebit de bogat n celule i cu puin substan
fundamental, de aceea este materialul preferat pentru extracia ADN-ului, n cazul
n care nu urmrim scopuri speciale.
Metoda se poate aplica i altor esuturi dar randamentul va fi mai mic.
145

Echipament, materiale i reactivi:
1. Omogenizator
2. Baie de ap termostatat
3. Centrifug cu rcire, cu tuburi de sticl de 100 ml.
4. Agitator mecanic
5. Timus de viel congelat la -20C
6. Soluie NaCl 0,15 M; citrat de Na 0,01 M; pH=7
7. Soluie citrat de Na 0,15 M; pH=7
8. Soluie SDS 20% (dodecilsulfat de sodiu)
9. Amestec fenol saturat cu ap: cloroform: alcool amilic n raport 7:
3,5: 1
10. Etanol absolut
11. Cristale NaCl
12. Tampon Tris-KCl-citrat ( Tris 0,015 M; KCl 0,15 M; citrat de K
0,015 M; EDTA 0,002 M) pH=7

Metoda de lucru:
Un fragment de aproximativ 15g timus congelat este tiat n felii cu ajutorul
unui bisturiu. Fragmentele se plaseaz ntr-un pahar Berzelius ce conine 50 ml
soluie NaCl-citrat. Prin cntrirea nainte i dup adugarea feliilor de timus se
poate calcula prin diferen cantitatea exact de esut luat n lucru. Se
omogenizeaz coninutul cu ajutorul omogenizatorului meninnd temperatura n
jur de 2C plasnd paharul ntr-o baie de ghea.
Omogenatul este centrifugat la 5000g timp de 15 minute. Se recolteaz
sedimentul reprezentat prin cromatin. Cromatina se resuspend n 50 ml soluie
NaCl-citrat i se omogenizeaz din nou, iar apoi se sedimenteaz ca mai sus. Ciclul
omogenizare - centrifugare se repet nc odat.
Sedimentul final se dizolv n 90 ml citrat 0,15 M pH=7 i se adaug 8 ml
soluie SDS. Se nclzete soluia la 55C timp de 15 minute agitnd coninutul cu
o baghet i apoi se adaug 8 g NaCl cristale. Se nclzete din nou soluia la 55C
timp de 10 minute.
Soluia devenit foarte vscoas se rcete ntr-o baie de ghea i se adaug
100 ml amestec fenol: cloroform: alcool amilic. Se agit puternic amestecul cu
ajutorul agitatorului pn cnd se obine o emulsie (timp de 30 minute).
Emulsia se centrifugheaz n tuburi de sticl la 4000 g timp de 15 minute.
Dup centrifugare n tuburile de centrifug se vor observa trei straturi:
- un strat superior apos, care conine ADN, n cea mai mare parte purificat
- un strat intermediar de culoare alb opac
- un strat inferior, care conine solvenii organici
Se recolteaz stratul apos ntr-un pahar Berzelius de 400 ml. ndeprtarea
urmelor de proteine i ARN poate fi fcut prin repetarea tratamentului cu solveni
organici de cteva ori. Pentru scopul lucrrii puritatea atins este suficient.
146
Se adaug 100 ml citrat de sodiu 0,15 M pH=7 i apoi, agitnd continuu cu o
baghet, 100 ml etanol 95%. Se observ formarea unui precipitat gelatinos care
treptat se organizeaz sub form de fibre lungi. Prin nvrtirea baghetei de sticl
fibrele se nfoar pe ea. Bagheta cu ADN se preseaz de pereii vasului, apoi se
spal n etanol 95% prin agitare pn cnd lichidele de splare rmn perfect
transparente.
Precipitatul de ADN se scoate de pe baghet cu ajutorul unei lame i se
dizolv n 50 ml tampon Tris, KCl, citrat de Na, pH=7. Sub aceast form probele
se pot pstra n frigider cteva zile.


Metoda de izolare a ADN din esuturi prin precipitare cu etanol


Echipament, materiale i reactivi:
1. Centrifug
2. Baie de ap termostatat
3. Sol. tampon (EDTA 20 mM; Tris-HCl 20 mM; NaCl 300 mM; SDS 0,4 %)
13. Proteinaza K (concentraia 10mg/ml)
14. Acetat de K 5M
15. Etanol 100 %
16. Ap ultrapur

Mod de lucru:
Buci de esut se pun n 270 l soluie tampon specific pentru proteinaze,
peste care se adaug 30 l proteinaz K. Amestecul se ine la 56C cel puin 3 ore,
dar de obicei se las peste noapte la 37C.
n ziua urmtoare, peste cei 300 l soluie se adaug 60 l acetat de K 5M,
cu care se ine la ghea 30 de minute. n acest timp proteinele vor precipita.
Se face o centrifugare 10 minute la 10000g (13000 rotaii/minut), dup care
se recolteaz cu grij supernatantul, care conine ADN i se transfer ntr-o alt
eprubet. Peste supernatant se adaug 700-750 l etanol absolut. Se agit bine i n
cteva minute are loc precipitarea ADN-ului.
Eprubetele se centrifugheaz din nou 10 minute n acelai condiii, ADN
precipitat rmne la fund, iar supernatantul se arunc.
Se las eprubetele 10 minute cu capac deschis pentru evaporarea etanolului.
Dup aceea se adaug 30 l ap ultrapur i se las la 65C timp de 15 minute,
timp n care ADN-ul se resuspend. Lichidul obinut conine ADN, care poate fi
folosit pentru analize prin tehnica PCR.
Dac se dorete separarea ARN-ului din soluia de acizi nucleici, se trateaz
soluia obinut cu ADN-aze pancreatice, pentru a elimina ADN-ul. Dac se
dorete separarea ADN-ului, se trateaz soluia cu ARN-aze.
147
Pentru a nu permite degradarea ADN-ului n timpul manipulrii de ctre
nucleaze, se adaug n soluie i ageni chelai (ex. EDTA), substane care
sechestreaz ionii de Ca
+2
(cu rol important n activitatea nucleazelor).
Cu ajutorul acestei metode se poate extrage ADN-ul i din preparate fixate,
incluse n parafin, seciuni colorate cu hematoxin-eozin, specimene muzeale etc.


Metoda de izolare a ADN din snge


Echipament, materiale i reactivi:
1. Snge recoltat pe un anticoagulant
2. Soluii tampon: TKM 1, TKM 2
3. Soluie tampon Tris HCl + EDTA
4. Detergent Igepal i SDS (dodecilsulfat de sodiu)
5. Etanol 70%
6. Etanol absolut
7. Centrifug
8. Centrifug cu rcire
9. Cuve de centrifug
10. Tuburi Eppendorf
11. Baie de ap 55C

Mod de lucru:
Pentru izolarea ADN se utilizeaz snge recoltat pe un anticoagulant (minim
5ml/prob). Probele de snge se introduc n eprubete cu dop (etichetate), peste care
se adaug 5ml soluie tampon (TKM1) i 130 l detergent Igepal pentru lizarea
membranelor celulare. Se agit cteva minute eprubetele, dup care se
centrifugheaz 10 min. (2200 tur./min. ). Precipitatul leucocitar se depune la fund
(are culoare roie deschis ), iar supernatantul se arunc.
Peste precipitatul leucocitar rmas pe fundul eprubetei se mai adaug
5ml.tampon (TKM1) i se centrifugheaz nc 10min. (2200tur./min.).
Supernatantul se arunc, iar pe fundul eprubetei apare o pat alb (leucocitele).
Peste leucocite se pun 800 l tampon (TKM2), se agit cu vrful pipetei, se
absoarbe i se introduce n tuburi Eppendorf. n tuburi se mai pun cte 50 l SDS
(dodecilsulfat de sodiu) cu rol n distrugerea proteinelor celulare.
Tuburile se incubeaz 10 min. n baie de ap la 55C. Dup incubare se adaug
300 l NaCl (6 M), cu care se centrifugheaz 5 minute la 4C, pentru a evita
supranclzirea probelor, la 12000 rot./min.
Pregtim eprubete mici cu aprox. 2 ml etanol 100%.
Dup centrifugare, coninutul tuburilor se introduce n eprubetele cu etanol,
pentru precipitare. Peste cteva secunde n eprubete apare ADN-ul.
148
Peleta de ADN se ia cu vrful pipetei, se introduce n tuburi Eppendorf (noi),
peste care se adaug etanol 70% ( 1 ml ). Tuburile se centrifugheaz 5 min.(12000
rot./min. la 4C).
Dup centrifugare ADN-ul ia forma unor ghemuri mici alb-transparente.
Etanolul se arunc (se absoarbe cu pipeta sau se ateapt pn se evapor), tuburile
rmnnd deschise 30 min. pentru evaporarea total a etanolului.
Peste probele de ADN se adaug un tampon (Tris HCl + EDTA) 250 l.
Probele etichetate se pun la congelator, unde se pot pstra timp ndelungat (chiar
i ani de zile).


Metoda rapid de izolare a ADN din snge


Echipament, material i reactivi:
1. Microcentrifug
2. Tuburi de centrifug de 1,5 ml
3. Snge integral
4. Tampon fosfat steril: (PBS 1X; n 1l: 8g NaCl; 0,2g KCl; 1,44g Na
2
HPO
4
; 0,24g
KH
2
PO
4
; pH =7,4; se autoclaveaz)
5. NaOH 0,1 M

Mod de lucru:
Se transfer 30 l snge integral ntr-un tub de 1,5ml i se ajusteaz volumul la
100 l cu tampon PBS.
Se adaug 100 l NaOH 0,1M, se nchide capacul i se fierbe timp de 5 minute.
Se centrifugheaz amestecul la 13000 rot/min. timp de 5 minute.
Se transfer supernatantul ntr-un tub curat i se utilizeaz 1-10 l n reacia
PCR.

X.2.2. IZOLAREA ARN

ARN-ul (acidul ribonucleic) este o macromolecul biologic, de mai multe
tipuri, fiecare tip ndeplinind funcii diferite:
- ARN-ul mesager (ARNm), reprezint 1-5% din cantitatea de ARN
celular total, rezult prin transcrierea ADN-ului, servind ca eantion pentru
sinteza proteinelor. Sinteza proteinelor are loc la nivelul ribozomilor
alctuii la rndul lor din ARN ribozomal (ARNr) i proteine ribozomale.
- ARN-ul ribozomal (ARNr), reprezint 80-85% din cantitatea de
ARN celular total, intr n structura ribozomilor i a riboproteinelor
implicate n procesarea ARN
- ARN de transfer (ARNt), reprezint 15-20% din cantitatea de ARN
celular total, are rol n transportul aminoacizilor la ribozomi, adic la locul
sintezei proteinelor.
149
Multe virusuri conin ARN n loc de ADN ribovirusuri , iar diferitele
specii de ARN denumite ribozime catalizeaz reacii enzimatice asemntor
enzimelor.
Mamiferele conin n celulele lor 10-30 g ARN total. Majoritatea ARN-
ului este ARNt i ARNr. ntr-o singur celul mamifer se gsesc aproximativ
360000 molecule de ARNm, 1-5%, cantitatea acestuia depinznd de tipul de celul
i de starea fiziologic. Proporia de ARN total n nucleu este 14%, iar raportul
ADN:ARN n nucleu este de 2:1.
Comparativ cu ADN-ul, ARN-ul este mai puin stabil. Aceasta se datoreaz
n mare parte ribonucleazelor (RN-aze) care distrug moleculele de ARN. RN-azele
sunt foarte stabile, nu necesit cofactori, acioneaz n cantiti mici i sunt dificil
de inactivat.
Contaminarea cu RN-aze apare ca urmare a contactului cu pielea uman sau
cu particulele de praf. Prin urmare izolarea i analiza ARN necesit tehnici speciale
(utilizarea mnuilor cnd se lucreaz cu reactivii i probele de ARN, schimbarea
mnuilor ct mai frecvent i inerea nchis a tuburilor ct mai mult timp posibil,
pstrarea probelor de ARN n ghea cnd se utilizeaz pentru diferite aplicaii,
utilizarea tuburilor din polipropilen sterile, care sunt tuburi RNase-free, etc.).
Exist un numr mare de metode utilizate pentru izolarea ARN, necesare
pentru revers transcriere.
Metodele standard includ liza celulelor i extracia ARN prin precipitare cu
etanol. Aceste proceduri de extracie presupun i o etap n care se utilizeaz fenol
i nu sunt indicate atunci cnd se lucreaz cu un numr mare de probe.
Pentru analize de rutin se utilizeaz sngele ca material de izolare ARN.
Sngele conine ns o serie de enzime inhibitoare care pot s interfere cu tehnicile
care utilizeaz ARN. Izolarea ARN din snge impune metode care s asigure
obinerea ARN de calitate ridicat i fr enzime inhibitoare.
Hematiile (eritrocitele, globulele roii) nu prezint nucleu i nu sunt
importante n izolarea ARN, ele nici nu sintetizeaz, nici nu conin ARN.
Sursa de ARN o reprezint leucocitele (celulele albe) deoarece ele sunt
nucleate i conin ARN. Deoarece sngele conine de 1000 de ori mai multe
eritrocite dect leucocite, ndeprtarea eritrocitelor simplific tehnicile de izolare a
ARN.
Izolarea ARN se realizeaz prin liza selectiv a eritrocitelor, prin
centrifugarea n gradient de densitate, utiliznd Ficolul.
Deoarece virusurile au ARN-ul mono sau dublu catenar, particulele virale
trebuie mai nti concentrate prin ultracentrifugare, ultrafiltrare sau precipitare.
Urmtorul pas al procedurii l reprezint separarea ARN din amestecul cu
celelalte componente: proteine, lipide, carbohidrai.
ndeprtarea ADN-ului n timpul preparrii ARN se realizeaz prin tratarea
amestecului cu DN-aze care nu au activitate RN-azic.
Contaminarea cu proteine poate fi prevenit prin digestia cu o enzim
proteolitic, proteinaza K. Aceast etap se aplic dac este necesar n toate
protocoalele de purificare a acizilor nucleici.
150
X.3. DOZAREA CONCENTRAIEI DE ADN

Pentru dozarea concentraiei ADN izolat din diferite materiale biologice,
este necesar calibrarea reaciei de culoare.
Calibrarea reaciei de culoare se realizeaz cu patru eprubete. Se pipeteaz
n fiecare conform tabelului:

Reactivi(ml) 1 2 3 4
Standard AND
1mg/ml
0,0 0,2 0,5 1
Ap distilat

3 2,8 2,5 2
Reactiv
difenilamin
6 6 6 6

Se nclzesc eprubetele ntr-o baie de ap la 100C, timp de 10 minute.
Eprubetele se scot din baie i se rcesc la temperatura camerei. Se citete extincia
coninutului eprubetelor 2, 3 i 4 fa de cel al eprubetei 1 (martor), la 260 nm. Se
reprezint grafic curba de calibrare obinut sau se calculeaz factorul de pant
fcnd raportul ntre suma concentraiilor ( 0,2+ 0,5+ 1 ) i suma extinciilor ( E
2
+
E
3
+ E
4
).
Dozarea concentraiei ADN n preparatul final se face similar pipetnd n
patru eprubete dup cum urmeaz:

Reactivi(ml) 1 2 3 4
Preparat ADN 0,0 0,2 0,5 1
Ap distilat

3 2,8 2,5 2
Reactiv
difenilamin
6 6 6 6

La fel ca mai sus se nclzete coninutul eprubetelor n baie de ap la
100C timp de 10 minute i apoi se citesc extinciile la 260 nm fa de coninutul
eprubetei 1 (martor). Eprubeta 1 se poate omite dac o avem pe cea de la calibrare.
Extinciile gsite se nmulesc cu factorul de pant, aflnd astfel mg ADN /
prob.
Pentru a calcula mg ADN/ ml preparat se nmulete valoarea gsit cu
diluia - pentru E
2
cu 5,
- pentru E
3
cu 2,
- pentru E
4
cu 1.


151
Demonstrarea denaturrii termice a ADN i a curbelor de topire

Aa cum se cunoate, prin nclzire, cele dou lanuri ale moleculei de ADN
se desprind unul de altul, datorit ruperii legturilor de hidrogen. Acest lucru se
poate urmri prin scderea vscozitii soluiei (lanurile se nghemuiesc ) sau prin
creterea extinciei la 260 nm, bazele azotate fiind expuse direct razelor UV.
nregistrarea grafic a variaiei acestor parametri ne d de obicei o curb
sigmoidal a crei alur furnizeaz informaii asupra coninutului n baze i a
gradului de mperechere. Cu ct tranziia este mai brusc cu att mperecherea este
mai bun, respectiv cu ct curba este deplasat mai spre dreapta cu att mai multe
perechi G C conine ADN-ul.
Pentru demonstrarea acestui fenomen se plaseaz n fiecare din cinci
eprubete cte 5 ml soluie ADN preparat n lucrrile anterioare. Eprubetele se
astup cu dopuri de cauciuc pentru a evita evaporarea i se plaseaz la diferite
temperaturi: 0C, 25C, 65C, 80C, 90C. Se las fiecare eprubet la temperatura
indicat o or. Apoi se rcesc brusc toate la temperatura camerei.
Dac se lucreaz destul de repede lanurile nu au timp s se reasocieze.
Pentru msurarea vscozitii se noteaz timpul necesar scurgerii ntre dou
repere ale unei pipete cu vrful efilat. Timpul necesar este proporional cu
vscozitatea.
Reprezentnd grafic variaia vscozitii (pe ordonat) fa de temperatur
(pe abscis) se obine o curb de topire din care se poate calcula valoarea T
m
=
temperatura la care lanurile sunt pe jumtate desperecheate.


X.4. METODA SPIRIN

Pentru determinarea cantitativ a acizilor nucleici n diferite esuturi se
poate utiliza metoda Spirin.

Principiul metodei:
Acizii nucleici sunt extrai din materialul biologic prin tratarea acestuia la
cald cu soluii de acid percloric. Hidroliza acizilor nucleici cu formare de
fragmente solubile este complet i extragerea lor din esut este cantitativ i se
realizeaz concomitent.
n alte metode, cum este metoda Schmidt-Thannhausser i Webb,
determinarea cantitativ a acizilor nucleici se efectueaz dup hidroliza
preparatelor obinute prin prelucrarea prealabil a esuturilor. Hidroliza alcalin sau
acid este absolut necesar, deoarece preparatele nehidrolizate ale acizilor nucleici,
la lungimi de und corespunztoare regiunii ultraviolete a spectrului, au densiti
optice diferite, n funcie de starea de agregare a preparatului i de pH-ul soluiei.
Prepararea acizilor nucleici din materialul de analizat prin tratarea acestuia
cu acid tricloracetic n scopul ndeprtrii componenilor tisulari acidosolubili este
incomod, n cazul dozrii acestora prin spectrofotometria n ultraviolet, datorit
152
faptului c acidul tricloracetic are o absorbie maxim n ultraviolet, n regiunea
240-300 nm. Absorbia maxim pentru preparatele de ADN este la 268 nm, iar
pentru ARN la 260 nm, adic n aceeai regiune care este caracteristic i pentru
acidul tricloracetic. Eliminarea acestui inconvenient se poate realiza dac acidul
tricloracetic este nlocuit n procedura de preparare a acizilor nucleici, cu acidul
percloric. Folosirea acidului percloric (HClO
4
) a permis perfecionarea metodei de
determinare a acizilor nucleici.

Echipament, materiale i reactivi:
1. Centrifug ( 5000-6000 rot/min. )
2. Tuburi de centrifug (20 ml. )
3. Baie de ap
4. Spectrofotometru n ultraviolet
5. Probe de esut
6. Acid percloric ( HClO
4
) 0,5 N

Mod de lucru:
n mai multe tuburi de centrifug, cu o capacitate de 20 ml, se introduc 5-
10 ml acid percloric, soluie 0,5 N i probe de esut a cror greutate variaz ntre 5
i 500 mg (n funcie de cantitatea de acizi nucleici din esuturile analizate). Dup
agitare prudent, probele sunt introduse ntr-o baie de ap n clocot (100C), unde
sunt inute timp de 20 de minute.
Ulterior, probele sunt rcite ntr-un curent de ap de robinet, centrifugate la
5000-6000 rot/min., timp de 10 minute. Supernatantul este utilizat pentru citirea
probelor la spectrofotometru.
Densitatea optic total a hidrolizatului, care conine att ARN ct i ADN,
este n funcie de concentraia componentelor rezultate dup hidroliza acizilor i de
raportul cantitativ dintre cei doi acizi nucleici. Dac cantitatea total a acizilor
nucleici n probele hidrolizate este mare, depind o concentraie optim pentru
citirea spectrofotometric, atunci probele sunt diluate cu o soluie de acid percloric
0,5 N.
Citirea probelor se realizeaz la dou lungimi de und diferite: 270 nm i
290 nm, folosindu-se cuve de cuar de 10 mm grosime, lampa de hidrogen (pentru
spectrofotometru), iar ca prob martor soluii de acid percloric 0,5N.
Diferena dintre valorile extinciei citite pentru aceeai prob la cele dou
lungimi de und i divizat cu indicele de 0,19 indic concentraia fosforului
nucleic ntr-un ml soluie (exprimat n mg.). Indicele 0,19 reprezint extincia
specific, este identic att pentru ADN ct i penrtu ARN i a fost gsit
experimental de ctre Spirin, care a utilizat soluii standard ale celor doi acizi, n
care concentraia fosforului nucleic a fost de 1mg fosfor ntr-un ml de soluie, la
grosimea stratului de 10 mm.



153
Formula utilizat pentru calcul este :


D
270
D
290
Cg (P-AN) = , unde:
0,19

- Cg (P-AN) = conc. fosforului nucleic, exprimat n g
- 0,19 = indicele extinciei
- D
270
= densitatea optic a hidrolizatului la 270 nm
- D
290
= densitatea hidrolizatului ARN+ADN la 290 nm

Metoda Spirin poate fi utilizat cu succes i n cazurile cnd n obiectul
cercetat este prezent un singur acid nucleic, numai ARN sau exclusiv ADN,
utilizndu-se ns coeficienii medii de transformare 10,5 (pentru ARN) i 10,1
(pentru ADN), care rezult din faptul c n ARN coninutul procentual al
fosforului reprezint 9,5%, iar n preparatele cu ADN 9,9%.
Controlul determinrilor se realizeaz citind extincia probelor i la 260 nm.
Extincia la aceast lungime de und este, de regul, aceeai sau se ncadreaz n
limita de +15%. Dac densitatea optic depete valoarea de 15% se recomand
tratarea hidrolizatului la rece, cu soluii de acid percloric 0,2 N pentru eliminarea
impuritilor de alt natur.
Metoda este rapid, comod, exact i se preteaz la analiza n serie a
probelor obinute din diferite surse. n cazuri extrem de rare, cnd compoziia
nucleotidic a preparatelor este neobinuit, de exemplu, n cazul acizilor nucleici
obinui pe calea sintezei de laborator, erorile metodei cresc simitor influennd
negativ rezultatele experimentale.


154


Bibliografie


1. Mitrea N., Margin D., Arsene A., Grdinaru D., Burta C., Biochimie
Vitaminele n procesele metabolice, Ed. Didactic i Pedagogic Bucureti,
2008
2. Barrett A.J., Cantor C. R., Enzyme nomenclature, Academic Press, 1992
2. Cristea-Popa E., Popescu A., Truia E., Dinu V., Tratat de Biochimie
Medical, Ed. Medical-Bucureti, 1991.
3. Felszeghy E., Abraham A., Biochimie, Ed. Didactic i Pedagogic
Bucureti, 1972
4. Lehninger A.L. Biochimie, Ed.Tehnic Bucureti, 1987
5. Gilu D., Antonescu A., Dobjanschi L., Gilu R.D., Gilu L., Compendiu
de Biochimie medical, Ed. Imprimeriei de Vest Oradea, 2002.
6. Gilu L. Proinov I., Biochimie, Ed. Universitii din Oradea, 1999
7. Mihele D., Biochimie clinic, Ed.Medical Bucureti, 2001.
8. Thierry Grisar, Elements de biochimie humaine normale et pathologique,
partium I, Les Editions de lUniverite de Liege, 2004
9. rmure Cornelia, Biochimie structural i metabolic vol.I, Ed.Dacia
Cluj-Napoca, 1996
10. Vrana K.E., Biochemistry, Lippincott Williams Wilkins, Philadelphia,1999.
11. Mody Eugen, Funduc I., Alexandrescu R., Dobreanu M., Biochimie clinic,
Editura All Educational, Timioara, 2000
12. Dobjanschi Luciana, Antonescu A., Bogdan N., Codreanu I., Gilu D.,
Murean M., Gilu L., Lucrri practice de biochimie, Editura Imprimeriei
de Vest, Oradea, 2001
13. Mihele Denisa, Biochimie clinic metode de laborator, Editura Medical,
Bucureti, 2000
14. Bettelheim F., Landesberg J., Laboratory Experiments for general,
organic&Biochemistry, Saunders Golden Sunburst Series, 1997
15. Pallag Anamaria, Mraz Camelia, Jebeleanu Gheorghe, Patologie
molecular experimental, Editura Universitii din Oradea, 2004