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PARTE II: REVISIN DE MTODOS ESPECTROSCPICOS Y ELABORACIN DE CURVA ESTNDAR DE PROTENA

Objetivos Aplicar un mtodo espectrofotomtrico para medir la concentracin de una protena. Conocer el manejo de micropipetas y espectrofotmetros. Construir curvas de calibracin y comprender su importancia. Determinar el intervalo de sensibilidad de una curva estndar. Comparar el intervalo de sensibilidad de dos mtodos para determinar protenas Introduccin El espectrofotmetro es un instrumento ampliamente utilizado en el anlisis cualitativo y cuantitativo de molculas biolgicas. Parte de la identificacin de una molcula se determina por el trazado del espectro de absorcin (A en funcin de la longitud de onda ) en la regin visible y ultravioleta. Mientras que la cuantificacin de la misma se puede realizar de manera directa (si la sustancia absorbe en alguna regin del espectro) o indirecta (por modificacin del compuesto mediante una reaccin qumica). Leyes que rigen la espectrofotometra Cuando un haz luminoso de intensidad P 0 pasa a travs de una solucin, parte de ste se absorbe, por lo tanto la intensidad de la radiacin emergente P es menor al incidente P0. La relacin entre ambos se denomina transmitancia, T: T= P/P0. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (1) La cantidad de luz absorbida es proporcional al nmero N de iones o molculas capaces de absorber energa; por lo tanto, T disminuye a medida que la concentracin aumenta. Ley de Lambert y Beer, conocida generalmente como Ley de Beer, considera que al dividirse la disolucin en pequeas secciones, en cada una de ellas se absorber una pequea cantidad de radiacin P, que es proporcional a N. Tomando en cuenta que N es directamente proporcional a la concentracin y si la longitud por la que pasa el haz de luz (longitud de la celda) es constante, podemos llegar a la ecuacin general: -log P/ P0= abc . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . (2) donde: c es la concentracin b es la longitud de la celda o paso ptico a es la constante de proporcionalidad llamada absortividad

La absortividad o coeficiente de extincin es una caracterstica propia de cada especie y depende de la estructura qumica de sta. El valor de la absortividad para un compuesto vara con la longitud de onda. Definiendo que la relacin -log P / P0 es la absorbancia de la solucin, la ecuacin final que define a la ley de Beer queda de la siguiente manera: A= abc . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . (3) Es importante mencionar que la constante de proporcionalidad a depende de la longitud de onda por ello se le coloca el superndice as como tambin a la absorbancia A (ec. 3). Si la concentracin se expresa en molaridad, entonces se denomina a la constante de proporcionalidad coeficiente de absortividad molar o coeficiente de extincin ( ). Convencionalmente, el paso de la luz es de 1 cm, por lo que entonces las unidades de son cm-1mol-1L. Hay que destacar que A es adimensional, ya que por definicin es un ndice. Una grfica de absorbancia de una especie en disolucin, a una longitud de onda dada, como una funcin de su concentracin molar, se le llama curva de calibracin o curva estndar. Es una lnea recta y de acuerdo a la ecuacin 3 la pendiente es b. Conociendo y la longitud del paso de la luz b, la concentracin de la sustancia en cualquier otra muestra puede ser determinada usando la Ley de Beer. La cuantificacin de la especie debe realizarse a la longitud de mxima absorcin. Determinacin de protenas Dos aplicaciones comunes de la determinacin de protenas son: 1) para reportar la actividad especfica de una enzima y 2) para hacer un cargado homogneo de protena en geles de poliacrilamida-SDS. Dado que hay varios mtodos para medir protenas totales, Cmo se escoge entre estos mtodos? Generalmente se selecciona de acuerdo a su aplicacin. Por ejemplo, para el clculo de la actividad enzimtica, el principal propsito es tener exactitud en los resultados, mientras que para colocar cantidades iguales de protena en un gel de poliacrilamida-SDS, la precisin es ms importante. Cuantificacin de protenas por el mtodo colorimtrico de Lowry. El ensayo de determinacin de protenas por Lowry es uno de los ms usados en Bioqumica. Cuando a un pptido o protena en disolucin bsica se le hace reaccionar con cobre se forma un compuesto colorido por coordinacin entre los nitrgenos del pptido con el in metlico. En el mtodo de Lowry el reactivo de Folin-Ciocalteu (fosfomolibdato.fosfotungstato) se aade para incrementar la cantidad de color desarrollado. El aumento en el color ocurre cuando el complejo de cobre tetradentado transfiere los electrones al complejo fosfomolibdato/ fosfotungstato, reaccin que produce una coloracin azul que se lee a 750 nm. La reduccin del reactivo de Folin-Ciocalteu ocurre solamente con los residuos de tirosina y triptfano de la protena. Material y equipo Celdas de metacrilato grado UV para espectrofotmetro Tubos de microfuga

1 gradilla para tubos de microfuga 1 caja con puntas de 200 L (amarillas) para micropipeta. 1 caja con puntas de 1000 L (azules) para micropipeta. 1 Micropipeta 10 L 1 Micropipeta 20-200 L 1 Micropipeta 200-1000 L Vrtex Espectrofotmetro (por grupo) Reactivos Albmina de suero bovino o BSA. Solucin problema de protenas (los profesores la proporcionarn) Disolucin de carbonato-tartrato-cobre (CTC). Ver composicin en apndice. 10% Dodecilsulfato de sodio (SDS) 0.8 N NaOH H2O Reactivo A. Se prepara inmediatamente antes de usarse con partes iguales de CTC, 10% SDS, 0.8 N NaOH y H2O. Reactivo B. Dilucin del reactivo de Folin Ciocalteu. 1 volumen de Folin + 5 volmenes de H2O. Guardar en frasco mbar. Preparar preferentemente poco antes de usarse. Desarrollo experimental Determinacin de protenas por el mtodo de Lowry. 1. Rotular los tubos de vidrio y adicionar los reactivos en el orden que se indica en la Tabla 1.2. Recuerda: debes mezclar con el vrtex despus de aadir cada una de las disoluciones. 2. Encender el espectrofotmetro, seleccionar la de 750 nm. 3. Utilizar las celdas de plstico para realizar las mediciones. 4. Ajustar el espectrofotmetro con la disolucin del primer tubo de la tabla (sin BSA). 5. Realizar las lecturas. 6. Llenar la tabla con los datos de absorbancia. 7. Construir la grficas de absorbancia vs concentracin de protena ( g). 8. Calcular la concentracin de la protena en la muestra

Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos

Tabla 1.1. Reactivos y cantidades a aadir para realizar una curva patrn de BSA y la determinacin de la concentracin de protenas de una muestra problema, utilizando el mtodo de Lowry para su determinacin. Tubo H2O BSA Muestra Reactivo A Reactivo B Protena* A750m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 450 L 445 L 440 L 435 L 430 L 425 L 420 L 415 L 425 L 400 (1mg/mL) Problema* 5 L 10 L 15 L 20 L 25 L 30 L 35 L 25 L 50 L ( g) 500 L 500 L 500 L 500 L 500 L 500 L 500 L 500 L 500 L 500 L 250 L 250 L 250 L 250 L 250 L 250 L 250 L 250 L 250 L 250 L

L * La muestra problema la prepararn y entregarn los profesores. ** Calcular la cantidad de protena que contiene cada tubo de acuerdo a los L que se aadieron del estndar de BSA. Y en el caso de la muestra problema utilizando los datos de la regresin de la curva estndar generada.

Cuestionario 1. Explica qu tipo de factores contribuyen en la desviacin de la lnea recta al graficar la absorbancia contra concentracin (desviaciones a la ley de Beer). 2. cules son los principales mtodos colorimtricos usados en la determinacin de protenas? 3. Qu sustancias pueden interferir con la determinacin de protenas por Lowry? 4. Investiga cual de los siguientes mtodos es ms sensible y menos costoso para determinar la concentracin de protenas de una muestra: Lowry, Absorbancias 280 nm y Bradford. 5. De acuerdo a tus resultados, cul es el intervalo en el que se podra determinar la concentracin de una protena en una muestra utilizando la curva estndar de determinacin de protenas por Lowry? Da una explicacin.

6. Cules son las aplicaciones en general de una curva de calibracin o estndar? Referencias Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. 1982. Molecular cloning a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY. Stoscheck CM. Quantitation of Protein. 1990. Methods in Enzymology 182, 50-69. Peterson GL. 1977. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry 83, 346-356. Wang, Y., et al. 2007. Quantitative analyses reveal the importance of regulated Hdmx degradation for P53 activation. PNAS, (104). 30, 1236512370.

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