AO DE LA INVERSION PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD ALIMENTARIA UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA - LA MOLINA

INFORME N5
IDENTIFICACIN DE HONGOS MEDIO AMBIENTALES y CULTIVO EN CMARA HMEDA
Integrantes:
20111360 20091001 20120456 20100472 Colquehuanca Meja, Eliana Elsye Flores Calderon, Elvis Hedim Norabuena Damian, Juan Bernardo Tantahuillca Landeo, Pat Teresa

Mesa N5

Grupo: Mircoles de 3 a 5 pm

2013

I.

INTRODUCCIN
Se sabe que el hongo es un organismo que prospera en diversos ambientes, incluyendo el aire e interiores. Y este se desarrolla mejor en condiciones clidas, mojadas y hmedas, tambin se propaga y reproduce por esporas, las cuales sobreviven en condiciones ambientales que no favorecen el crecimiento normal de hongo, permaneciendo dormantes hasta que las condiciones ambientales se tornen favorables. Algunas personas son sensibles a los hongos debido a las toxinas que estas liberan, su exposicin a estas personas puede causarle sntomas como congestin nasal, irritacin de los ojos o hasta reacciones ms severas para las que tengan graves alergias. Al interior de la casa, el crecimiento del hongo puede ser disminuido manteniendo los niveles de humedad por debajo del 50% y ventilando las reas por donde se circula. Esto ya que el aire es el medio de diseminacin tanto de hongos como de otras sustancias que a la vez pueden estar cargadas de diversos grupos de microorganismos. Para esta prctica anteriormente se aislaron muestras de diversos ambientes en el hogar como la cocina, los cuartos, el bao y tambin del bus en el que se viaja. Cada placa Petri con agar sabouraud fue incubada por 1 semana

aproximadamente, posteriormente se identificaron los hongos presentes en cada una. Se encontr que en su mayora existen los hongos de tipo Aspergillus sp y Penicillium sp. Adicionalmente se realiz un cultivo en cmara hmeda a partir de los hongos obtenidos en las placas, para poder hacerle un seguimiento sobre su desarrollo vegetativo.

Objetivos:

Determinar los gneros de hongos ms frecuentes presentes en el medio ambiente. Mediante la observacin macroscpica, establecer caractersticas tpicas para poder reconocerlas en adelante. Determinar las caractersticas del desarrollo vegetativo de los hongos a travs de un cultivo en cmara hmeda y mediante observaciones peridicas al microscopio

II.

MARCO TERICO
Los hongos: Son hongos filamentosos que se encuentran en aire libre como en interiores, existe desde hace miles de aos. El moho crece mejor en condiciones clidas, mojadas y hmedas, se propaga y reproduce mediante esporas. Estas pueden sobrevivir en condiciones ambientales desfavorables como la resequedad, que no beneficien el crecimiento normal del moho. Algunas personas son sensibles a los mohos. La exposicin a los mohos puede causar sntomas como congestin nasal, irritacin de los ojos o resuello. Las reacciones severas pueden ocurrir entre trabajadores expuestos a grandes cantidades de mohos en los lugares de trabajo, como en el caso de los granjeros que trabajan todo el da alrededor del heno mohoso. Algunas reacciones severas pueden incluir fiebre y dificultad para respirar. Las personas con enfermedades crnicas, como enfermedad obstructiva de los pulmones, pueden presentar infecciones de moho en los pulmones. Los mohos se encuentran en diversos ambientes y pueden ser detectados, tanto en interiores como al aire libre, durante todo el ao. Las condiciones hmedas y clidas favorecen el crecimiento del moho. Al aire libre pueden encontrarse en reas o lugares hmedos sombreados donde hay descomposicin de hojas o de otro tipo de vegetacin. En los interiores pueden encontrarse en lugares donde los niveles de humedad son altos como los stanos o las duchas. Los tipos ms comunes de mohos son Cladosporium sp, Penicillium sp, Aspergillus sp, Mucor sp y Aternaria sp.

Aspergillus sp: Este microorganismo es la causa ms frecuente de Aspergilosis en humanos y animales. En individuos sin inmunocompromiso alrgeno puede actuar como un potente

o causar infecciones localizadas de los pulmones. En pacientes la inhalacin de

inmunocomprometidos (alteracin del sistema inmunologico)

esporas puede producir una aspergilosis invasora de los pulmones o de los senos paranasales

Cladosporium sp: Este hongo con ms frecuencia en el aire y uno de los hongos alergnicos respiratorios ms importantes, se le implicado en casos de asma y fiebre. Se le asocia a los casos de rinitis en loso que los sntomas no parecen coincidir con la cantidad de polen de gramneas.

No es un agente infeccioso importante, pero en climas clidos, puede producir infecciones cutneas, subcutneas y queratitis. Estas infecciones tienen un

desarrollo lento y su tratamiento incluye exeresis quirrgica de los tejidos afectados.

Penicillium sp: La inhalacin de esporas de Penicillium en concentraciones comparables a la de una exposicin natural puede inducir asma en individuos sensibles. Los penecilos crecen sobre los alimentos, ya sea de origen vegetal o animal. Lo que causa alergias son las micotoxinas, estas consumidas regularmente, aun en cantidades mnimas, causan lesiones irreversibles en rin, hgado, cerebro y tienen actividad teratogenica.

Alternaria sp: Este hongo una de ms infecciosas puede provocar lesiones cutneas y

subcutneas despus de traumatismos en personas con inmunosupresin. Se han observado infecciones invasoras sistemticas en pacientes con sida. Las lesiones cutneas se curan espontneamente con la mejora o la resolucin de los factores subyacentes del enfermo. El tratamiento se basa en la administracin intravenosa de concentraciones elevadas de anfotericina B-desoxilicato durante varias semanas. Hongos en frutas y verduras: La mayora de las frutas son sensibles a varias especies de hongos pero algunas de estas especies de hongos, pero algunas de estas especies afectan solo a una clase de fruta. En la prctica, los aspectos externos de los distintos tipos de lesiones son denominados enmohecimientos, son difciles de diferenciar

Las principales formas de enmohecimientos y alteraciones que se producen son: o o o o o Hmeda: producida por Rhizopus Seca: originada por Gleosporium y Sclerotinia Frutas de pepita (pera y manzadas): se debe a Fusarium, Botrytis, Alternaria Cladosporium, Penicillium. Amarga: Gleosporium , Trichotechium Roa o moteada: Venturia y Fusicladium

Mtodo de aislamiento de hongos de aire: Es la forma ms sencilla su aislamiento consiste: Elegir un punto determinado del ambiente de estudio.

 Destapar la placa Petri exponiendo el medio de cultivo al aire (se asume que las esporas de hongo se encuentran suspendidas). El tiempo de exposicin puede ser de 5 a 10 min, vuelva a tapar la placa , rotular el lugar de muestreo En el laboratorio incubar las placas en una estufa de 30C por 4 a 5 das. Transcurrido el tiempo, examine las placas y realizar una descripcin, detallada de las mismas. Una desventaja es que las UFC (Unidades Formadoras de Colonias) obtenidas no se pueden relacionar con el volumen de aire.

Mtodo de cmara hmeda Un dispositivo para cultivo de cmara hmeda es un sistema esterilizado que consta de una placa Petri conteniendo un disco de papel filtro y una varilla de vidrio en U que soporta dos laminas porta y cubre objetos. Aspticamente se secciona una pequea porcin de medio de cultivo estril (agar sabouraud), y se coloca sobre la lmina porta objetos. Realizada la siembra del hongo en estudio, la preparacin se cubre con otra lmina y el papel filtro se humedece conservando la asepsia. La placa es incubada a temperatura ambiente (20-25 C) por 4 o 5 das. En la presente prctica se observara el crecimiento mittico de los filamentos para solo 2 das despus de la incubacin. Agar Sabouraud Este medio de cultivo es utilizado para cultivos de mohos y levaduras patgenas y no patgenas. Utiliza la peptona, la tripteina y la glucosa son los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El alto contenido de glucosa, la presencia de cloranfenicol, el pH es acido, de pH 5.60.2, inhiben el desarrollo bacteriano y favorecen el crecimiento de hongos y levaduras. El agar es un agente solidificante. Sus caractersticas: Medio de cultivo deshidratado: color beige claro, homogneo, libre deslizamiento. Medio de cultivo preparado: color mbar claro , ligeramente opalescente sin precipitado

III.

PARTE EXPERIMENTAL
Ejercicio 1: Identificacin de hongos medio ambientales
Materiales. Aislamientos de hongos medio ambientales en placas de agar sabouraud.

Procedimiento.Observacin macroscpica 1. Observar el tpico desarrollo de hongos en medio de cultivo. Cada una de las masas de forma definida que puede observar constituye una colonia. 2. Contra el nmero total de colonias que aparecen en cada placa. Se asume que cada colonia desarrollada proviene de una espora captada del aire. 3. Establecer los tipos morfolgicos ms saltantes entre las colonias presentes. Obtenerlos de acuerdo a la observacin de las caractersticas externas en ellas (color, forma y aspecto de la colonia en el haz y envs de la placa). 4. Determinar la frecuencia de cada tipo morfolgico con respecto al nmero total de colonias. 5. Describir cada tipo morfolgico detallando color, forma, aspecto y cualquier otra caracterstica saltante que se observe.

Observacin microscpica 1. Observar en el microscopio compuesto en pequeo y mediano aumento las caractersticas de cada tipo morfolgico. 2. Determinar en detalle los tipos de hifas presentes y las diferenciaciones de hifas en estructuras nutricionales, estructuras de reproduccin, de resistencia, etc. 3. Con ayuda de un Manual de Identificacin de hongos hacer una aproximacin vlida para determinar los gneros aislados. 4. Elaborar con detalle los esquemas correspondientes.

Ejercicio 2: Cultivo en cmara hmeda

Materiales.-

Placas Petri con colonias de hongos aislados del medio ambiente. Agua destilada estril. Dispositivo para cultivo en cmara hmeda. Mechero de alcohol.

Procedimiento.-

1. Utilizando una aguja de klle o estilete, picas una colonia y extraer una fraccin mnima de esporas o micelio. 2. En forma asptica depositar la fraccin sobre la porcin de agar dispuesta en el portaobjetos de la cmara hmeda. 3. Con ayuda de una pinza estril cubrir cuidadosamente la preparacin con la lmina cubre objetos. 4. Humedecer el papel filtro de la placa con agua destilada estril. 5. Incubar la placa a temperatura ambiente (20 - 25 C). 6. Examinar diariamente al microscopio de lmina sembrada hasta verificar el completo desarrollo del hongo. Retirar cada vez la lmina del cultivo de la cmara hmeda y una vez realizada la observacin devolverla a su lugar cuidando de mantener la humedad constante, de ser necesario aadir ms agua al sistema. 7. Observar la germinacin de las esporas, el crecimiento y ramificaciones del micelio, la aparicin de hifas diferenciadas y el desarrollo de las estructuras de reproduccin. 8. Con ayuda de un Manual de Identificacin de hongos determinar el gnero correspondiente. 9. Elaborar en detalle los esquemas de cada etapa de desarrollo.

IV.

OBSERVACIONES y RESULTADOS
4.1 Identificacin de hongos medio ambientales

4.1.1

Observacin macroscpica:

PLACA 1: Lugar de exposicin: Dormitorio Tiempo de exposicin: 15 minutos Tiempo de incubacin: 7 das

Tipos morfolgicos de las colonias presentes y sus caractersticas Nmero total 5 colonias Color Turquesa Verde petrleo Marrn amarillento Frecuencia 2 2 1 Forma Circular Circular Circular Aspecto Aterciopelado Aterciopelado Algodonoso

PLACA 2:

Lugar de exposicin: Cocina Tiempo de exposicin: 15 minutos Tiempo de incubacin: 7 das

Tipos morfolgicos de las colonias presentes y sus caractersticas Nmero total 45 colonias Color Verde petrleo Crema Frecuencia 2 43 Aspecto Aterciopelado Agamuzado Forma Circular Circular

4.1.2

Observacin microscpica

PLACA 1 Divisin: Gnero: Tipo de hifas: Tipo funcional: Tipo de estado: G.A.:

Ascomiceto Penicillium sp Septadas Conidiforo Conidias 400X

PLACA 1 Divisin: Gnero: Tipo de hifas: Tipo funcional: Tipo de estado: G.A.:

Ascomiceto Aspergillus sp Aceptadas Conidiforo Conidias 400X

PLACA 2 Divisin: Gnero: Tipo de hifas: Tipo funcional: Tipo de estado: G.A.:

Ascomiceto Cladosporium sp Septadas Conidiforo Conidias 400X

4.2 Cultivo en cmara hmeda

Da 04 de octubre:

a) Penicillium sp

Vista de 100X

Vista de 400X

b) Cladosporium sp

Vista de 100X

Vista de 400X

V.

DISCUSIONES
5.1 Identificacin de hongos medio ambientales En la placa Petri con agar sabouraud se logr aislar hongos del medio ambiente ms comunes encontrados en lugares como la cocina y el dormitorio de la casa, como se muestra en la figura 1.

Figura1. Placas Petri con agar sabouraud donde han crecido hongos cosmopolitas. Para cada cepa identificada, se muestran caractersticas macroscpicas, microscpicas y el gnero. 5.1.1 Penicillium sp a) Caractersticas macroscpicas: Las colonias presentaron color turquesa, algo

aterciopelado y forma circular. Reverso incoloro a amarillo, pequeas gotas incoloras.

b) Caractersticas microscpicas: Con conidios ramificados, terminantes en filides. Presenta conidiforos de tipo terverticilado.

a.

b.

Figura 2. Penicillium sp. 2a. Penicillium sp macroscpicamente. 2b. Penicillium sp microscpicamente.

5.1.2

Aspergillus sp a) Caractersticas macroscpicas Las colonias se observaron de color marrn amarillento, de aspecto algodonoso y forma circular.

b)

Caractersticas microscpicas Conidiforos cortos, de paredes lisas con cabezas conidiales columnares. globosos a subglobosos. Filides aglomeradas, conidios

a.

b.

Figura 3. Aspergillus sp.3a. Aspergillus sp macroscpicamente. 3b. Aspergillus sp microscpicamente. 400X.

5.1.3

Cladosporium sp a) Caractersticas macroscpicas Las colonias presentaron color verde petrleo,

aterciopeladas y de forma circular, en el centro presenta una elevacin.

b) Caractersticas microscpicas Conidiforos anchos y poco ramificados. Poseen

ramoconidios con septos. Los conidios tienen pared verrugosa.

a.

b.

Figura 4. Cladosporium sp. 4a. Cladosporium sp macroscpicamente. 4b. Cladosporium sp microscpicamente

Se observaron muestras de diferentes gneros que a simple vista parecan iguales y otras nos, como se muestra en la figura 1; sin embargo, al microscopio stas mostraban diferencias por lo que siempre es necesario un estudio detallado al microscopio. De necesitarse una clasificacin evolutiva o taxonmica se requerira de mtodos de gentica como la de secuenciacin de bases. En la figura 2 se puede observar a colonias de pudimos identificar, estas son del genero de hongos ms comunes que sp, segn Soriano

Penicillium

(2007) esta especie es muy comn en suelo, en vegetacin en descomposicin y aire. Adems suele ser considerada como una de las principales especies causantes del biodeterioro de alimentos y otro tipo de sustratos. Se pudo observar que en ambas placas Petri crecieron hongos del gnero Cladosporium sp, por lo tanto se puede considerar esta especie como cosmopolita, al igual que la otra especie muy comn Aspergillus sp.

5.2 Cultivo en cmara hmeda

El primer da de cultivo se pudo observar poco crecimiento, muy pocas hifas. En el segundo da ya se vea un aumento de hifas en el caso del Cladosporium estas eran septadas. Segn Forbes y col. (2007) la velocidad de crecimiento de los hongos es importante para su identificacin, pero este puede variar segn la cantidad de inoculo presente en la muestra, as que es necesario utilizarla junto con otras caractersticas. De acuerdo con estudios realizados en Norteamrica y Europa, las esporas de Cladosporium estn circulando en el ambiente todo el ao. Sin embargo, la concentracin o la poblacin es extremadamente baja durante el invierno. El crecimiento de las especies de Cladosporium son diferentes dentro de las casas y otros edificios depende de la concentracin de los ambientes externos. La concentracin tambin puede estar influenciada por las fuentes interiores del crecimiento.

VI.

CONCLUSIONES
Se logr demostrar que los hongos son organismos cosmopolitas ya que el muestreo se dio en diferentes lugares a diferentes horas y las colonias presentadas en las placas mostraban repeticiones de las mismas que al microscopio se reconoca que pertenecan al mismo gnero. El caso ms frecuente fue Cladosporium sp. el cual presentaba coloracin verde petrleo y Aspergillus sp que presenta color marrn amarillento.

Se demostr que la clasificacin de hongos se basa en la observacin de hifas, si estas son septadas o aseptadas; si presenta conidios o esporangios, la forma y el tamao de estos; etc. Adems si presenta esporangios, observar alguna zona que presente rizoide o no.

Se determin que en el crecimiento vegetativo hay ausencia de rganos reproductivos, y al pasar los das el hongo presentar hifas vegetativas indiferenciadas en los extremos

VII.

BIBLIOGRAFIA
BONIFAZ, A. 1991. Micologa mdica bsica. Editorial Mndez. 2a edicin. Mxico D.F. FORBES, B., Sahm W. 2007. Diagnostico microbiolgico. Editorial Mdica Panamericana. 12 edicin .Espaa. GRANDA, E. M. 2011. Pontificia Universidad Catlica del Ecuador-PUCE, Evaluacin del efecto de la presencia de hongos en la calidad del aire como causa del sndrome enfermo en las edificaciones antiguas de la PUCE. Ecuador. p 34-37. Consultado 8 de octubre del 2013. Disponible en http://www.puce.edu.ec/documentos/Investigacion/2011/PUCEInvestigacion-2011-BIO-Hongos-Calidad-del-aire-PUCE.pdf SORIANO, J. M. 2007. Micotoxinas en alimentos. Ediciones Daz de Santos. Espaa. Los mohos en el medio ambiente 2003, Department of Health and Human Services (en lnea), EEUU, consultado 8 jun. 2013. Disponible en http://www.cdc.gov/mold/es/pdfs/faqs.pdf
a

VIII.

CUESTIONARIO
8.1 De la observacin de hongos del medio ambiente

1. Haga una descripcin morfolgica de 5 gneros de hongos del medio ambiente considerando las caractersticas de desarrollo en medio de cultivo y las caractersticas observadas al microscopio. Aspergillus: Presentan conidiforo corto, liso, vescula con filides, uniseriada, ocupando 2/3 de la vescula. Los conidios en cadenas forman una compacta columna sobre la vescula, son de color verde, finamente rugosos, globosos o subglobosos. La textura de las colonias es aterciopelada, afelpada, vellosa o algo plegada, con margen blanquecino o beis. El color inicialmente es blanco virando en aproximadamente siete das a un verde azulado por la produccin de conidias. El reverso de la colonia es incoloro.

Fusarium: El color de las colonias es blanco, crema, pardo claro o pardo rojizo mezcladas con zonas de color prpura; raramente en cepas de aislamientos clnicos pueden presentar masas mucosas verdes azuladas, formadas por macroconidias que nacen de esporodoquios. La textura es algodonosa o lanosa. Se caracteriza por presentar conidiforos de esporodoquios cortos, ramificados. Conidiforos de hifas areas generalmente no ramificados, muy largos, reducidos a una simple filide ms o menos cilndrica, en cuyo pice se puede encontrar un conidio no desprendido. Macroconidias en masas mucosas, hialinos, mayormente con tres septos, ligeramente curvados, fusiformes, pero con extremos ms o menos redondeados.

Mucor: El color de las colonias es blanquecino al inicio, con el tiempo cambia a marrn. El reverso de la colonia es blanquecino. La textura es algodonosa. Presentan hifas aseptadas y gruesas. Se caracteriza por presentar esporangiforos, esporangios. Carecen de apfisis, estoln y rizoides. Las columnillas son hialinas, siendo visibles si el esporangio se encuentra intacto. Los esporangios son esfricos o redondos y de color gris a negro, estando llenos de esporas.

Rhizopus: Inicialmente son blancas pero luego cambian a gris parduscas. El micelio carece de septos. Presentan estolones y rizoides. Los esporangiforos no son ramificados, tienen una longitud de 2 mm, generalmente estn en grupos, formando verticilos en cuya base se sitan los rizoides. Las apfisis pueden estar presentes pero son poco evidentes. Presentan esporangios esfricos, los cuales son de color gris pardusco a negro. La columnilla es subesfrica. Las esporangiosporas son angulares y con estras longitudinales, grisceas, subesfricas o elipsoidales.

Penicillium: Este gnero se caracteriza por formar conidios en una estructura ramificada semejante a un pincel que termina en clulas conidigenas llamadas filides. En la figura 5.1 se esquematizan los tipos de conidiforos del gnero Penicillium, cuyas ramificaciones se ubican formando verticilos. Si hay slo un verticilo de filides el pincel es monoverticilado. Las ramificaciones de un pincel poliverticilado son ramas,

rmulas, mtulas y filides. Los conidios generados en filides suelen llamarse fialoconidios para indicar su origen. En la filide, al dividirse el ncleo, se extiende simultneamente el extremo apical que luego se estrangula separando a la espora recin formada. Se llama conectivo a la porcin de pared que une entre s a los conidios permitiendo la formacin de cadenas, y en algunas especies se aprecia claramente con el microscopio ptico. Las colonias de Penicillium son circulares si no hay impedimento alguno para su crecimiento, con un borde neto muchas veces sin fructificacin y mostrando el color del micelio. ste es generalmente blanco, pero en algunas especies es amarillo, anaranjado, prpura o pardo claro. La superficie de la colonia madura, o sea con sus conidios formados, puede ser: aterciopelada, ligeramente algodonosa o con pequeos haces (fascculos) de conidiforos. En unos pocos casos los haces miden varios milmetros (coremios) con el extremo constituido por las cadenas de esporas.

2. Los nombres genricos de muchos hongos son derivados de caractersticas morfolgicas. De cules derivarn los nombres de Penicillium, Aspergillus y Rhizopus? El primero deriva de penicillius, que significa pincel en latn, ya que la estructura fructfera asume esta forma. El segundo fue dado por el sacerdote y bilogo italiano Pier Antonio Micheli, quien al ver la estructura reproductiva del hongo le pareci un hisopo de los usados para salpicar agua bendita. Estos, en latn, se llaman aspergillus, sustantivo que proviene del verbo latino spargere, que significa esparcir, salpicar. El tercero se llama as ya que en griego es raz, en referencia a las races de este hongo.

3. Por qu razn algunas de las colonias aisladas del medio ambiente no desarrollan esporas en el medio de cultivo utilizado?

Porque el agar muchas veces satisface las necesidades nutritivas del hongo, por lo que este se extiende de manera vegetativa. Este comportamiento se puede entender considerando que la produccin de esporas es un proceso altamente energtico y de dispersin, por lo que mientras haya nutrientes necesarios y suficientes, se priorizar el crecimiento vegetativo.

8.2 Cultivo en cmara hmeda

1. Cul es la ventaja del empleo de la cmara hmeda en el cultivo de hongos? Permite aislar pequeas cantidades de hongos para separarlos y proceder a su identificacin a travs de la observacin de las estructuras vegetativas, que al ser pocas son ms fciles de observar; a la vez que se exigi el crecimiento de cuerpos fructferos y las estructuras reproductivas se observaron con mayor claridad.

2. Existen diferencias entre los hongos a nivel de crecimiento y diferenciacin del micelio? S, ya que no solo se distinguen entre especies, si no que entre grupos se puede observar diferente tipo de colonizacin. Los basidiomicetos desarrollan la mayor complejidad al formar estructuras erguidas y altamente especializadas. Dependiendo de la estructura del micelio, se puede asignar el espcimen a un orden taxonmico.