Sunteți pe pagina 1din 50

Ministerul Sntii al Republicii Moldova Universitatea de Stat de Medicin i Farmacie Nicolae Testemianu Facultatea Farmacie CATEDRA CHIMIE FARMACEUTIC

I TOXICOLOGIC

TEMA :METODA CROMATOGRAFIEI GAZ-LICHIDE I APLICAREA EI N ANALIZA CHIMICO-TOXICOLOGIC.

(Indicaii metodice pentru studenii anului IV)

CHIINU 2009

Introducere n ultimele decenii n arsenalul preparatelor medicamentoase sau inclus un ir de preparate noi ca: sulfanilamidele, antibiotice, vitamine, antituberculoase, psihotrope, hormonale, cardiace .a. Creterea arsenalului de forme medicamentoase este nsoit de apariia noilor metode de analiz calitativ i cantitativ. Aici nu este lipsit de mister metoda cromatografiei gaz-lichide. Aceasta este, o metod sensibil, universal i specific, care ofer posibiliti de identificare, dozare a substanelor medicamentoase n preparate, lichide biologice, ct i pentru separarea ingredientelor n amestec. n prezent cromatografia gaz-lichide se aplic n lucrul practico-tiinific n laboratoarele biochimice, chimice, clinice .a. Pentru aplicarea acestei metode n practica chimico-farmaceutic nu sunt n de-ajuns surse n literatur. Prin aceast indicaie metodic oferim studenilor un ghid de orientare n vederea analizei chimico-toxicologice a toxicilor volatili. Totodat sunt incluse metodele de ndeplinire a lucrrilor individuale, care ridic amplituda cunotinelor studenilor n vederea determinarii substanelor toxice din materialul biologic: sunt formulate scopurile, planul expus, materialul informativ, subiectele ce stau la baza studierii temei, indicaii pentru lucrul practic al studenilor n laborator. Tema: Analiza toxicilor volatili prin metoda cromatografiei gaz-lichide Scopul studierii temei: Ai nva pe studeni s efectueze analiza chimicotoxicologica asupra toxicilor volatili din materialul biologic n urma izolrii. Planul studierei temei

I. II. III.

Introducere n analiza cromatografiei gaz-lichide a toxicilor Cercetarea materialului biologic asupra toxicilor volatili, care se prin metoda antrenrii cu vapori de ap. Determinarea cantitativ a toxicilor volatili aplicnd cromatografiei gaz-lichide. Determinarea alcoolului etilic n snge i urin prin cromatografiei gaz-lichide.

volatili. izoleaz metoda metoda

Material informativ
Efectele cromatografice au fost cunoscute din cele mai vechi timpuri. nc pe timpul lui Aristotel oamenii dedurizau apa de mare, filtrnd-o prin anumite pmnturi. Metoda cromatografic, ca metod tiinific de separare i analiz a substanelor, a fost elaborat de savantul rus M.S.vet, n anul 1903. Cu ajutorul acestor metode vet a stabilit, c pigmentul verde al plantelor clorofila, care se consider omogen, este ntr-adevr alctuit din cteva substane. Trecnd extractul frunzei verzi printr-o coloan umplut cu praf de cret i splndu-l cu solveni organici vet a obinut cteva zone colorate, fapt care mrturisea incontestabil despre prezena n extract a ctorva substane. Ulterior acest fapt a fost confirmat i de ali cercettori. Aceast metod a fost numit cromatografie (grec chromatos - culoare) dei nsui autorul a demonstrat posibilitatea separrii i a substanelor incolore. n 1941 Martin i Synge bazndu-se pe fenomenul deja cunoscut ei ncearc separarea aminoacizilor, folosind o coloan umplut cu silicagel saturat cu ap, iar faz mobil folosesc cloroform amestecat cu adausuri din ce n ce mai mari de alcool n-butilic. Astfel apare cromatografia de separare pe coloan. n 1944 Gordon i Martin pun bazele cromatografiei pe hrtie. Tehnica de lucru simpl face, ca cromatografia pe hrtie s se dezvolte i s se aplice la separarea amestecurilor de substane organice i ulterior la cele anorganice. Datorit rapiditii aceast metod ofer informaii printr-un efort minim. Cromatografia de gaze s-a dezvoltat datorit perfectrii detectorilor, folosirii diferitelor faze staionare i mobile noi. Clasificarea metodelor cromatografice Metodele cromatografice de separare fac parte din metodele de separare, bazate pe echilibrul ntre faze. n aceste metode este valorificat diferena ntre proprietile de separare a componenilor amestecului ntre dou faze de contact i nemescibile. Clasificarea general a metodei cromatografice este n funcie de natura fazelor (I), procesele, care au loc la separare (II) i modul de efectuare (III)(fig.1). Metodele de separare i analiz cromatografic nu sunt specifice. n procesul de analiz cromatografic se ia n consideraie natura fazelor, ce urmeaz a fi folosite, prezena compuilor care interfer cu compuii analizai.
3

n alte cazuri este necesar izolarea unor compui necunoscui n vederea caracterizrii lor ulterioare, sau analiza complet a unui amestec complex, necunoscut, prin separarea componenilor, urmat de analiz de structur i determinrii cantitative. Tehnicile de separare au fost create n funcie de proprietile amestecurilor n limite extrem de mari), volatilitate i alte proprieti. Complexitatea tehnicilor de separare este corelat cu proprietile componenilor de separat. n cazul izomerilor optici separarea lor poate fi realizat cu tehnici speciale. n alte cazuri proprietile sunt att de diferite nct separarea poate fi realizat printr-o tehnic simpl (distilare). Dup ce componenii din amestec au fost separai se poate alege metoda adecvat de determinare.

Clasificarea metodelor cromatografice


Cromatografie (C)

Cromatografie de gaze (CG)

Cromatografie de lichide (CL)

Cromatografie gaz solid (CGS)

Cromatografie gaz lichid (CGL)

Cromatografie lichid solid (CLS)

Cromatografie lichid lichid (CLL)

Cromatografie de absorbie

Cromatografie de repartiie

Cromatografie bazat pe procese chimice: schimb ionic, complexare, precipitare, oxidoreducere

Cromatografie prin excluziune steric

Cromatografie e bazat pe interaciunea cu cmpul: electroforez

Cromatografie capilar

Cromatografie pe coloan

Cromatografie pe strat subire

Fig. 1. Schema clasificrii metodelor cromatografice


4

Dinamica proceselor cromatografice Determinarea parametrilor de retenie Separarea cromatografic se bazeaz pe distribuia diferit a componenilor unui amestec ntre dou faze nemescibile, dintre care una este staionar i poate fi lichid, solid sau n forma de gel, iar alt este mobil i poate fi n stare gazoas sau lichid. Distribuia componenilor amestecului de analizat ntre cele dou faze se realizeaz, n general, prin diverse procese fizice (sorbie-desorbie, excluziune steric), fizico-chimice (repartiie, dizolvareeliminare), chimice (schimb ionic, precipitare, complexare, oxido-reducere etc.). Cantitativ repartiia componenilor amestecului analizat, ntre cele dou faze e determinat de raportul dintre cantitatea de component n faza staionar i mobil i se numete constant de distribuie a componentului n sistemul dat: CS K= (1) Cm unde: K constanta de distribuie: CS i Cm concentraia (sau cantitatea) total a tuturor formelor unui component analizat, prezent la echilibru n faza staionar i mobil respectiv. n funcie de procesul predominant la separare, cnd componentul analizat e prezent numai ntr-o anumit form n ambele faze deosebim constant de repartiie constanta de adsorbie etc. n acest caz procesele secundare sunt neglijabile. Aceste constante se noteaz i se calculeaz analogic constantei de distribuie, iar CS i Cm reprezint concentraia (sau cantitatea) de component ntr-o anumit form n ambele faze. K depinde de natura fazelor, t0 , pH, fora ionic a soluiei (dac faza mobil este lichid) etc. Substana este introdus pe coloan cu faza mobil. Ea se transport (se reine) n faza staionar total sau parial, fie prin adsorbie, repartiie, excluziune, reacie chimic etc. Tot odat substana reinut deja n faza staionar contacteaz ncontinuu cu noi porii de faz mobil i total sau parial se transfer din nou n faza mobil. Faza mobil deplaseaz ncontinuu substanele analizate pe un sector nou unde iari din nou se realizeaz acelai act elementar de echilibru. Fie c urmeaz s separm, pe o coloan cromatografic, un amestec din doi componeni A i B. Cantitatea de substan n faza mobil i staionar va fi corespunztor: [A]m, [B]m i [A]S, [B]S. Din momentul introducerii amestecului pe coloan, la interfaa dintre cele dou faze nemescibile n conformitate cu legea echilibrului chimic, se stabilesc echilibre dinamice pentru fiecare component. Pentru fiecare component A i B vom avea coeficientul de distribuie KA i KB, respectiv (fig.2).

Fig.2. Coloana cromatografic. Schema de formare a zonei de component n metoda de eluie i repartiyarea sub stanei n zona de component Cu ct componentul se reine mai mult ntr-o faz cu att i concentraia lui va fi mai mare n aceast faz i mai mic n cealalt faz, i invers. De exemplu, dac componentul A se reine mai mult n faza staionar dect componentul B, atunci, coeficientul respectiv de distribuie vor ndeplini relaia: KA > KB. Orice separare cromatografic se caracterizeaz prin factorul de retenie (sau retenia) R, care este raportul dintre viteza de migrare a componentului (VZ) i viteza de migrare a fazei mobile (eluentului) (V) n faza staionar dat: VZ R= (2) V Valoarea numeric a lui R este subunitar (0 < R < 1). n condiii extreme, dac VZ = 0, atunci R = 0 i substana este totalmente reinut pe coloana dat. Dac VZ = V, atunci R = 1 i substana este purtat de faza mobil fr a interaciona cu faza staionar. Retenia depinde de coeficientul de distribuie a substanei date. Dac R reprezint fracia moleculelor componentului ce se afl n faza mobil, atunci 1R va reprezenta fracia moleculelor aflate n faza staionar la echilibru. Prin urmare se poate scrie: CS 1R 1 K= = R= (3) Cm R K+1 Din expresiile (2) i (3) obinem: V VZ = (4)
6

K+1 De aici rezult, c factorul de retenie i viteza de migrare a substanei prin coloan sunt invers proporionale cu constanta de distribuie a ei. Viteza de migrare a substanei prin coloan poate fi definit ca raportul dintre lungimea coloanei parcurs de substana dat (L) i timpul de reinere a substanei (tR) pe coloana dat: L VZ = (5) tR Lund n consideraie expresia (4) obinem: L (K+1) tR = (6) V Deoarece lungimea coloanei i viteza fazei mobile n condiiile date sunt mrimi constante, timpul de reinere este direct proporional cu constanta de distribuie i fiind uor msurabil, servete ca parametru de retenie n analiza calitativ cromatografic i se numete timp de retenie. Timpul de retenie poate fi definit ca timpul n care substana dat a eluat (s-a deplasat) prin coloana de la momentul introducerii i pn la detecia concentraiei maxime la ieirea ei din coloan. Alt parametru de retenie utilizat n cromatografie este volumul de retenie (reinere) total (V2), care poate fi definit ca volumul de eluent msurat de la introducerea probei pe coloan i pn la ieirea concentraiei maxime a componentului de pe coloan. Volumul de retenie (VR) e proporional cu timpul de retenie (tR): VR = tR F (7) unde F este viteza volumetric a gazului purttor. Parametrii de retenii (tR, VR) depind de natura fazelor, de presiunea fazei mobile, masa fazei staionare, pH, t0, parametrii geometrici ai coloanei etc. Dar asupra acestor mrimi pot influena i diferii factori ocazionali. Pentru componenii A i B parametrii de retenie se vor afla n urmtoarele relaii: KA > KB VA < VB tR (A) > tR (B) (8) VR (A) > VR (B) Prin urmare, componenii amestecului analizat, avnd coeficieni de distribuie diferii se vor deplasa n procesul eluiei cu diferite viteze i vor avea un timp de reinere diferit, n condiiile date. n rezultat se va realiza separarea componenilor pe coloana dat. Constanta de distribuie este factorul principal, care determin separarea substanelor pe coloana cromatografic. Cu ct mai mare va fi diferena dintre
7

valorile constantelor de distribuie, cu att mai efectiv va fi separarea cromatografic n condiiile date. Cromatografia poate fi definit ca un proces dinamic bazat pe realizarea multipl a actelor de echilibru la distribuia componenilor amestecului n cele dou faze nemescibile ce vin n contact. n cromatografia de gaze separarea componentelor dintr-un amestec complex se realizeaz ntre o faz mobil gazoas i o faz staionar solid (CGS) sau lichid (CGL). Mecanismul separrii poate fi un proces de adsorbie (CGS) sau de repartiie (CGL). CG permite att separarea substanelor volatile (stabile la temperatura lor de volatilizare) ct i a celor care n urma unor reacii chimice (derivatizare) pot fi transformate n derivai volatili i stabili. Faza mobil este constituit dintr-un gaz inert: He, Ar, Ne, H2, numit i gazul vector (purttor), care antreneaz substanele de determinat. Faza fix (staionar) este format dintr-un adsorbent (CGS) sau dintr-un suport inert granulos (0,15-0,18 mm) impregnat cu un lichid de impregnare puin volatil sau lichid selectiv (CGL). Faza fix se gsete tasat n coloan sau depus pe pereii unor coloane capilare. Aparatul i principiile de lucru n figura 3 este prezentat schema de principiu a unui cromatograf de gaze de tipul Crom-5. Componentele eseniale ale cromatografului cu gaz purttor, care are rolul de faz mobil (1); reductor de presiune (2); usctor purificator (3); blocul de control fin (4); debitmetru (5); dispozitiv de injectare pentru introducerea probei (6); dou coloane montate paralel (7); detectorul (8) i imprimanta (11). Dispozitivul de injectare, coloanele i detectorul sunt amplasate n cuptoare cu reglare i control automatizat al temperaturii.

Fig. 3. Schema de principii a cromatografului de gaze ntr-un cromatograf gazul vector care provine de la sursa de gaz reglat la un anumit debit de reglatorul de debit traverseaz camera de injectare a probei
8

i antreneaz substanele volatile spre coloana cromatografic. Volumul cuprins ntre capul de injectare i captul coloanei trebuie s fie ct mai mic posibil. O metod mai nou const n injectarea direct n coloan, la 1-2 cm umplutur. Din coloan curentul de gaz este introdus n detector. Detectorul transform diferena unei proprieti fizice dintre componentele probei i gazul purttor ntr-un semnal electric, proporional cu concentraia componenilor din faza gazoas i se produce un semnal, care se nregistreaz cu ajutorul unui integrator, ordinator . nregistratorul traseaz o curb n form de clopot. Reprezentarea grafic a semnalelor detectorului n funcie de timp, poart denumire de cromatogram (fig.4).

Picul cromatografic.Parametrii de baz i mrimile derivate


Picul este seciunea cromatogramei semnalizat de detector la apariia componentului n gazul purttor; n cazul separrii incomplete, n acelai pic pot aprea mai multe componente. n gaz-cromatogram se definete linia de baz a cromatogramei seciunea de cromatogram, care se nregistreaz cnd din coloan iese numai gazul purttor.

Baza picului este distana BD dintre limitele sale extreme. Aria (S) a picului reprezint suprafaa mrginit de curb i de baz. nlimea (h) a picului este distana dintre maximul picului i baz, msurat paralel cu axa pe care se nregistreaz semnalul detectorului. Limea B 1D1 a picului este distana dintre interseciile tangentelor duse n punctele de inflexiune cu baza. 0,5 reprezint lrgimea curbei la jumtatea nlimii piculu. Componentele probei se separ din coloan i o prsesc una dup alta ntr-o anumit ordine, dup intervale de timp determina

10

Fig.5. Parametrii de baz ai picului i mrimile derivate Timpul de retenie (tR) timpul aflrii substanei analizate n sistemul cromatografic. n practic se determin ca interval de timp din momentul introducerii probei n coloan i momentul nregistrrii amplitudinii maxime a picului cromatografic. Fiecare substan n unele i aceleai condiii i are timpul su de retenie parametru ce st la baza identificrii componenilor amestecului de analizat. Timpul mort (to) timpul de trecere a eluentului prin sistemul cromatografic prezint mrimea, ce caracterizeaz un sistem cromatografic concret cu o vitez dat a fluxului de eluent. El se determin ca timp de eluare al componentului nereinut.n practic determinarea timpului mort e dificil, ce-i legat de inexistena substanelor absolut nereinute, din care cauz pn n prezent nu-i elaborat o abordare unic de determinare. Astfel la determinarea t o prin metoda HPLC cu faz invers se utilizeaz nitraii, mai rar bromurile sau nitrometanul. Timp de retenie corectat sau net (recalculat) (tR) timpul mediu, n decursul cruia moleculele substanei se gsesc n faza staionar. Se determin ca diferin: tR = tR to. Factor de capacitate (coeficient de capacitate):K= tR/to=(tR- to)/to = tR/to 1. Mrime proporional coeficientului de distribuie a sorbatului ntre faza mobil i staionar. Este parametru mai universal, dect timpul de retenie. ntruct valoare lui nu depinde de demensiunile geometrice a coloanei i de viteza de eluare. Cu mult mai rar se utilizeaz valoarea necorectat a factorului de capacitate: K = tR/to.
11

nlimea picului cromatografic (h) distana dintre vrful picului i linia de baz. Practic ea se determin ca lungimea perpendicularei, cobort din punctul de vrf al picului la linia de baz interpolar ntre capetele picului. Mrimea dat se utilizeaz la calcularea limitei de detecie de asemenea n analiza cantitativ deopotriv cu aria picului. Limea la jumtatea nlimii picului ( 1/2) distana orizontal dintre liniile, ce limiteaz profilul de pic la jumtatea nlimii lui. Pentru picul gaussian 1/2 = 2,345 . Se utilizeaz la calcularea eficienei coloanei i altor mrimi. Limea la baza picului ( ) se determin ca segment retezat la linia de baz de tangentele trasate n punctele de inflexiune pe pantele picului, sau ca distan orizontal dintre punctele situate la nivelul 0,044 h. Pentru picul gaussian = 4 . n practic este complicat de msurat exact aceast valoare, de aceea mai des se utilizeaz mrimea 1/2. Factor de asimetrie (As) mrimea ce caracterizeaz gradul de asimetrie orizontal a picului. Pentru picurile simetrice, printre care i gaussiene As=1; mrimea As< 1 corespunde frontului ascendent mai ntins a picului fronting, iar cnd As > 1 este mai ntins frontul descendent tailing. Exist diverse procedee de determinare a factorului de asimetrie; cel mai des se aplic egalitatea: As = (a0,05 + b0,05) / 2a = 0,05/2a, unde a0,05 i b0,05 limea corespunztor poriunii anterioare i posterioare a picului la nivelul 0,05 h. Eficiena coloanei (N) se exprim prin numrul de talere teoretice i este legat de parametrii funciei Gauss: N = tR/2. Selectivitatea (factorul de separare) (a) capacitatea sistemului cromatografic de a separa doi analii. a = tR2/tR1=(tR2- to)/tR1 - to = K2/ K1. Ea reflect doar gradul de separare a maximelor de pic fr a lua n consideraie limile lor. Factorii care condiioneaz separarea gaz-cromatografic sunt: 1. natura izotermei de repartiie; 2. volumul i principiile de injectare n coloan a probei de analizat; 3. natura gazului vector; 4. programarea temperaturii i a debitului de eluant; 5. natura fazelor; 6. tipul de detector. Forma picului cromatografic depinde de tipul izotermei de adsorbie. La temperatur constant adsorbia se mrete la creterea presiunii gazului ori concentraiei soluiei.

12

Izoterma de adsorbie este dependena cantitii substanei adsorbite de presiunea gazului purtrrttor sau concentraia soluiei la temperatur constant. (fig.6)

Fig.6.Diferite tipuri de iz otermeFig.7 Forma picului n funcie de tipul izotermei de adsorbie

Aceste izoterme sunt descrise de o ecuaie de tip L angmuir de forma: bc (9) ai = am 1+bc unde ai este cantitatea de substan reinut (adsorbit) pe faza staionar n timpul echilibrului; am cantitatea maxim de substan care poate fi reinut (adsorbit) pe faza staionar dat, pentru acoperirea ei cu un strat monomolecular; b constanta caracteristic puterii de adsorbie; c concentraia componentului n faza mobil. Dup Langmuir la suprafaa corpului solid exist un numr de locuri cu energie minim, aezate la anumite intervale pe toat suprafaa. Numrul lor este egal dm. Pe aceste locuri se pot adsorbi molecule de gaz ori din soluie. n domeniul concentraiilor mici izoterma e liniar (fig.6a). Pentru bc << 1 numitorul din ecuaia (9) devine egal cu 1 i ecuaia dat poate fi scris astfel: ai = am bc = KHC (10) Aceast este ecuaia adsorbiei liniar. Corespunde ecuaiei lui Henry (K H constanta lui Henry). Intervalul adsorbiei liniare uneori se mai numete intervalul Henry. n cazul adsorbiei liniare (fig. 6a) forma picului cromatografic este simetric de tip goussian (fig.7a). n practic deseori dependena cantitii substaniei adsorbite de concentraia soluiei sau de presiunea gazului nu este liniar. Izoterma adsorbiei poate fi de exemplu, curbat, de form convex (fig. 6b) i atunci forma picului este asimetric, cu coad (fig.7b) sau de form concav (fig. 6c) i atunci se obin picuri frontale (fig. 7c). Izoterma de repartiie trebuie s fie liniar pentru a obine picuri cromatografice simetrice. n cazul izotermelor neliniare de adsorbie se recomand blocarea
13

parial a centrilor activi de adsorbie prin depunerea unui lichid greu volatil sau s se lucreze la diluii mari. Dispozitivul pentru introducerea probei (fig.8) este amplasat, astfel, nct proba s fie introdus direct n gazul de transport. El const din corpul propriuzis (1), elementul termic (2),radiato rmetalic(3), septum pliabil(4), prin care estinjectat proba.

Fig.8 .Schema simplificat a blocului de injectare. Blocul de injectare este meninut la o temperatur mai ridicat dect temperatura coloanei pentru transferarea complet a substanei la coloan. Probele solide lichide sau gazoase sunt injectate cu ajutorul unei seringi calibrate. Pentru gaze se poate utiliza o sering de 0,5-10,0 l. Lichidele se introduc sub form de soluii cu ajutorul microseringilor Hamilton. Pot fi injectate cantiti de 0-50, 0-10 sau 0-1,0 l, cu o reproductibilitate satisfctoare. Proba este tras de cteva ori n sering pentru a se asigura absena bulelor de gaz i apoi este injectat rapid n curentul de gaz purttor. Substanele solide sunt tratate n dou moduri. n primul caz materialul este dizolvat ntr-un solvent adecvat i apoi injectat sub form de soluie. n al doilea caz substana solid poate fi injectat direct utiliznd o sering special. Aceasta este conceput astfel ca substana s fie ncrcat la captul seringei printr-o crestatur. Proba este injectat, apoi printr-un septum, cu ajutorul unui plunger, direct n instalaie. Dezavantajul acestui procedeu const n lipsa de
14

reproductibilitate, deoarece cantitatea de substan luat n sering nu poate fi msurat cu exactitate. Probele care au presiuni de vapori sczute sunt transformate pe cale chimic n derivai volatili, apoi injectai n instalaie. Acesta este un procedeu util, care s creasc numrul compuilor, care pot fi separai prin cromatografic de gaze. Ca urmare multe categorii de compui ca: aminoacizii, lipidele i polimerii cu masa molecular mare, care n mod normal nu sunt volatili pot fi separai dup transformarea lor n derivai volatili. De exemplu acizii organici cu presiuni de vapori sczute pot fi convertii n cloruri acide cu punctul de fierbere sczut, steroizii pot fi silanizai sau ionii metalici pot fi complexai cu hexafluoroacetilaceton. n toate cazurile presiunea de vapori a derivailor este mult mai ridicat dect presiunea de vapori a moleculei originale. Mrimea probei trebuie s corespund concentraiilor, care se ncadreaz n domeniul liniar al izotermei de repartiie. Se pot determina probe gazoase, lichide i solide. Gazele se introduc n injector prin prelucrarea lor de ctre eluant din dispozitivele speciale; substanele lichide i solide (dup dizolvarea lor n solveni sau dup topire) se introduc cu ajutorul unor microseringi sau capilare n volum de 0,1-10 l (concentraia componentelor n probe fiind de ordinul mcg, mg ). Introducerea probei n injector se face rapid; temperatura injectorului trebuie s fie superioar p.f. al componenilor, pentru a se realiza evaporarea instantanee a acestora. Faza mobil gazul purttor. n mod obinuit n cromatografia de gaze drept faz mobil se folosete heliu sau azot. Aceste gaze sunt folosite n majoritatea cazurilor, deoarece ndeplinesc urmtoarele condiii: - faza mobil trebuie s fie inert - faza mobil trebuie s aib un pre de cost redus, deoarece se folosesc cantiti mari. - faza mobil trebuie s permit ca detectorul s rspund ntr-un mod adevrat. n calitate de rezervor pentru faza mobil se folosete o butelia pentru gaze rezistent la presiune nalt. La ea se ataaz un regulator de presiune pentru a reduce i controla curgerea gazului prin coloan i un debitmetru, pentru a controla debitul de gaz. Natura gazului vector are un rol nsemnat, ea poate influena timpii reteniei a componentelor sau, prin adsorbia acestuia pe suprafaa fazei staionare, i modific proprietile. Alegerea eluantului se face n funcie de sensibilitatea detectorului, de interaciunea acestuia cu componentele de separat, cu faza staionar. n cromatografia cu gradient de temperatur componentele se distribuie n coloan pe direcia gradientului n funcie de volatilitatea lor (cele mai puin volatile la intrare, cele mai volatile la ieire).

15

n cromatografia cu programare de temperatur o temperatur constant pe toat lungimea coloanei variaz n timp dup o funcie liniar sau neliniar. Alegerea fazelor i a suportului pentru un proces cromatografic se realizeaz n dependen de natura substanelor care urmeaz a fi separate. Dac fazele sau suportul reacioneaz cu compuii injectai n coloan pot rezulta picurile de eluie eronate, derive de fond ale detectorului sau chiar distrugerea instalaiei. Numrul de suporturi ineri i de faze lichide staionare disponibile pentru CGL este practic nelimitat. Pentru a realiza o separare satisfctoare, faza lichid aleas trebuie s satisfac urmtoarele condiii. - s fie un solvent bun pentru componenii probei; - s posede o selectivitate sporit, pentru ca puterea sa de solvatare s fie diferit pentru fiecare component al probei; - s posede presiune de vapori ct mai sczut; - s fie stabil din punct de vedere termic; - s fie inert din punct de vedere chimic, fa de componenii probei analizate. Criteriul cel mai important pentru alegerea fazei staionare lichide este polaritatea fazei i a amestecului, care trebuie separat. Cea mai bun separare este realizat atunci cnd faza lichid este similar din punct de vedere structural cu componentele amestecului, deoarece eficiena separrii depinde de presiunile de saturaie a componentelor din amestec i de coeficienii de activitate a lor n raport cu faza dat. n cazul unor componente cu presiuni de saturaie foarte apropiate, separarea va depinde n cea mai mare msur de coeficienii lor de activitate. Coeficientul de activitate () reprezint interaciunile dintre moleculele componentului dizolvat n faza staionar lichid i moleculele fazei staionare. Aceste interaciuni se manifest prin fore Kesson (ntre dou molecule cu dipoli permaneni), fore de inducie Debyl (ntre un dipol permanent i unul indus, fie a fazei staionare, fie a fazei mobile) i fore de dispersie sau fore London (ntre moleculele nepolare), care se datoresc cmpului electric ai dipolilor cu viaa foarte scurt, produi de micarea sistemului nucleu electroni ai unei molecule. Este avantajoas folosirea umpluturilor, suprafaa crora este acoperit cu o pelicul subire de faz staionar lichid. ns micorarea grosimii peliculei este limitat att de interaciunea componentului cu suportul fazei lichide prin fenomenul de adsorbie, care se poate suprapune peste fenomenul de dizolvare, ct i de necesitatea reducerii corespunztoare a cantitii de prob. Fazele lichide pot fi clasificate n: - faze lichide nepolare: hidrocarburi lichide, uleiuri siliconice (cauciuc siliconic, SE-30 etc.). Aceste faze separ componentele n ordinea creterii temperaturii de fierbere.

16

- faze lichide polare conin o cantitate mare de grupe polare (polietilenglicolii dimetilsulfolan etc.) Aceste faze separ numai compui polari. - faze lichide cu polaritate intermediar cuprind fazele lichide cu grupe polare sau polarizabile pe un schelet mare nepolar (SE-52, dizodecilftalat, difenilbenzil etc.). Pe ele se separ compui cu polaritate intermediar. - fazele lichide cu puni de hidrogen sunt faze polare care conin un numr mare de atomi de hidrogen capabili de a forma legturi de hidrogen cu compuii de separat. Caracterizarea fazelor lichide se poate face cu ajutorul constantelor lui Mc Reynolds. Acest sistem se bazeaz pe cel al lui Rohrschnelder i este mai potrivit pentru practica cromatografic. Constantele Mc Reynolds (IR) sunt diferenele ntre indicii de retenie Kovacs (IR) pentru un component i pe faza lichid de studiat i faza de referin (IRo). IR1 = IRi - IRio S-a stabilit, c din toate fazele cunoscute, preferate sunt 12- Ele acoper ntreg domeniul de polariti. Aranjarea ntr-o scar a polaritilor se face prin distana fa de squalan, care se determin pe faza constantelor Mc Reynolds. n figura 9 este redat scara celor 12 faze preferate n cromatografia de gaze i distanele respective fa de squalan.
2000 D 1885 TCEF 1,2,3 Tris (2 cianotoxi)propan 1612 DEGS Dimetilglicolsuccinat 1259 DEGA Dimetilglicoladipinat 1052 PEG-20M Polietilenglicol 1000 821 XE-60 Cianoetilmetil-siloxan 709 GF-1 Trifluorpropilmetil-siloxan 500 488 OV-22 Fenilmetildifenil-siloxan 377 DC-610 Fenilmetil-siloxan 271 OV-3 100 SE-30 Dimetil-siloxan 0 0 Squalan

1500

17

Fig. 9. Cele 12 faze staionare lichide frecvent utilizate n CGL i polaritatea lor n comporaie cu squalanul . Faza staionar solid n CGS este constituit din adsorbeni de tipul: silicagel, crbune activ, site moleculare. Separarea se bazeaz pe un proces de adsorbie. Eficacitatea separrii crete prin impregnarea adsorbantului cu mici cantiti de lichid nevolatili (siliconi) sau cu gaze care se adsorb ireversibil (CO2, H2O, H2S). Mai recent se utilizeaz coloane mplute cu polimeri organici cu porozitate mare, sub form de perle, de exemplu din seria Porapak (etilvinilbenzen-divinilbenzen). Acetia servesc n special la analiza apei, alcoolilor, gazelor cu masa molecular mic i amestecurilor lichide. n scop analitic se utilizeaz coloane de 1-1,5 m lungime i 3-6 mm diametru, care pot fi confecionate din metal, sticl sau material plastic i au form de U sau de spiral. Dintre suporii utilizai amintim cei de tip diatomit (Chromosorb P) Kieselgur (Chromosorb G,W, Sterchamol) polifluoretilena (Fluoropak-80, perle de sticl). n cazul coloanelor capilare, rolul suportului l joac pereii capilarelor, pe care se depune un strat subire de suport solid, care ulterior va fi impregnat cu faza lichid. Capacitatea de separare a fazei staionare lichide, n cazul amestecurilor depinde de raportul tensiunilor de vapori a componenilor ct i de tria legturilor ce apar ntre moleculele componentelor i cele ale fazei staionare. Deosebim legturi ionice, Van der Waals, legturi de hidrogen sau cu transfer de sarcin. Pentru separarea componentelor cu puncte de fierbere foarte diferite, se pot utiliza combinaii de dou sau mai multe coloane n serie sau n paralel, cu un singur, respectiv cu doi detectori (ex. Coloana cu faz lichid nepolar Squalan i una polar Carbowax). Detectori. n cromatografia de gaze, pentru depistarea componentelor, care ies de pe coloan se folosesc detectorii. n funcie de proprietatea msurat deosebim: - detectori de ionizare (detectori de ionizare n flacr, detectori cu captur de electroni); - detectori care msoar o proprietate fizic de volum (detector de conductibilitate termic); - detectori optici (flamfotometru, spectrofotometru); - detectori electrochimici. Clasificai n alt mod, detectorii pot fi: universali, selectiv, specifici. Condiiile generale pentru detectori sunt: sensibilitatea, stabilitatea, fiabilitatea i emiterea unui semnal liniar pentru anumit domeniu de concentraie a probei.
18

Detectorul de conductibilitate termic (DCT) sau catarometrul are cel mai rspndit domeniu de utilizare (fig10). El face parte din categoria detectorilor universali. Este un detector nedestructiv i poate fi utilizat i n cromatografia preparativ.

Fig. 10. Schema de principiu a unui detector cu conductibilitate termic (DCT) Principiul de funcionare se bazeaz pe msurarea diferenei de conductibilitate termic ntre component i eluent. n acest scop se folosete un montaj electronic, cu dou sau patru celule de conductibilitate termic. n figura 12 este redat schema unui montaj cu patru celule. Dou din celule sunt splate continuu cu gaz purttor (R1 i R4 celule de referin), celelalte dou sunt splate de amestecul binar care iese din coloan (R 2 i R3 celule de msur). Constructiv celulele nu pot fi realizate identice. Pentru echilibrarea iniial a punii se folosete poteniometrul 4. Filamentele detectorului sunt confecionate dintr-un material a crui rezisten electric variaz foarte mult n funcie de temperatur. n timpul funcionrii, filamentele sunt nclzite de trecerea unui curent continuu stabilizat, de la o surs de curent 1. Stabilirea curentului de lucru se face cu un poteniometru 2 i se msoar cu miliampermetrul 3. Temperatura detectorului, n procesul de lucru trebuie s fie mai nalt dect temperatura coloanei. Att timp ct la ieirea din coloana cromatografic va aprea numai gazul purttor, rezistenele celulelor vor fi aceleai, puntea va fi echilibrat i instrumentul de msur montat va indica 0. n registrtorul 5 va fi trasat linia zero. Prezena unui component n eluentul, care circul prin celula de msur modific conductibilitatea termic a mediului gazos din aceast celul. n rezultat se modific rezistena electric a filamentelor R2 i R3, care provoac dezichilibrul punii. Intensitatea curentului nregistrat la dezichilibrarea punii este proporional cu concentraia componentului care iese din coloan. Mrimea semnalului detectorului depinde de diferina dintre conductibilitatea termic a componentului i eluentului. Conductibilitatea termic a substanelor depinde de masa molecular ei. Hidrogenul, heliul i
19

azotul, avnd mase moleculare mici posed conductibiliti termice ridicate. Aceste gaze sunt ideale pentru a fi folosite ca gaze purttoare n cromatografia de gaze. Sensibilitatea detectorului depinde de factorul geometric al celulelor (dimensiunile, raza, lungimea filamentului) i de valoarea curentului de alimentare a punii. Sensibilitatea crete la mrirea curentului n punte. Creterea curentului peste o anumit valoare poate duce la distrugerea filamentelor i de aceea valoarea lui este limitat de natura gazului purttor i de temperatura de lucru a detectorului. Linia zero este sensibil la variaiile debitului de gaz purttor i al temperaturii Ppentru ca variaiile temperaturii s fie ct mai mici blocul metalic al detectorului trebuie s aib o mas ct mai mare, iar celulele s fie dispuse simetric n detectori. Detectorul de ionizare n flacr (DIF) este un detector universal, stabil i simplu n construcie. Principiul de funcionare a detectorului cu ionizare n flacr de hidrogen const n msurarea conductibilitii electrice a unei flcri de hidrogen n prezena unui compus organic (fig. 11).

Fig. 11. Schema detectorului cu ionizare n flacr de hidrogen La ieirea din coloan eluentul este amestecat cu un curent de hidrogen i este aprins la captul unei duze din platin sau oel inoxidabil. Duza este montat ntr-o camer de ardere alimentat cu un curent de aer sau oxigen. De asupra flcrii este montat un electrod colector (anod). Alimentarea electrozilor se face de la o surs de tensiune continu, de valoare mare (100-350 V). La arderea H 2 n prezena numai a gazului purttor ntre duz i electrodul colector se stabilete un curent foarte slab (10-14 A). Apariia n flacr a unui compus organic mrete intensitatea curentului (datorit ionizrii acestuia) care poate s ajung pn la 10-5 10-8A. n funcie de natura i concentraia componentului respectiv. Acest curent va fi amplicat i nregistrat.
20

Sensibilitatea detectorului se definete ca fiind cantitatea de sarcin electronic, produs de un gram de component prin ionizare n detectorul cu flacr. Sensibilitatea detectorului pe mol de substan este proporional cu numrul atomilor de carbon din molecul legai numai de hidrogen sau ali atomi de carbon din molecul plus contribuia atomilor de carbon legai de halogeni, amine sau grupe hidroxil. Atomii de carbon oxidai complet din molecul (din grupa carboxil sau carbonil) nu au nici o contribuie la valoare sensibilitii. Detectorul de ionizare n flacr de hidrogen nu poate detecta gazele permanente (N2, H2, He, Xe), oxizii de azot, compuii, care conin un atom de carbon singur legat de oxigen sau sulf (CO2, Cs2, COS) gaze anorganice (NH3, SO2), ap i acid formic. Limita de detecie constituie 10-13 g. Determinri calitative Aprecierea calitativ a unei gaz-cromatograme care prezint un numr de picuri se face n mod obinuit prin: 1) examinare vizual, n comparaie cu gaz-cromatograma unei probe etalon; 2) compararea timpului (tR) sau a volumului de reinere (VR) a probei de determinat cu a etalonului-pur, cromatografiat n condiii identice, sau cu datele menionate n literatur pentru compusul respectiv; 3) compararea cromatogramei amestecului de determinat cu cromatograma aceluiai amestec, la care s-a adugat substana etalon care se bnuiete a fi prezent n prob. Dac picul unui component apare mrit pe a doua cromatogram, acesta este un indiciu al prezenei, n amestec, a substanei adugate probei; n caz contrar, substana adugat d un pic nou pe cromatograma a doua; 4) identificarea componentelor se mai poate realiza cu ajutorul detectorilor specifici; DCE se utilizeaz pentru identificarea compuilor cu afiniti diferite pentru electroni (alcooli, eteri, esteri, derivai carbonici, derivai halogenai). Spectrometrul de mas nregistreaz spectrul de mas (SM) al componentelor prezente n fraciunea de eluant introdus n sursa de ioni a spectrometrului, cu nregistrarea concomitent a cromatogramelor obinute prin trecerea celeilalte fraciuni printr-un detector universal (CT); 5) identificarea prin sorbie sau reacie selectiv se realizeaz prin intercalarea ntre injector i coloana de separare a GC a unei coloane umplute cu adsorbant, sau absorbant specific unei anumite clase de substane, sau a unui microreactor n care are loc transformarea sau reinerea prin reacie chimic a unui component. Timpul de retenie (reinere) brut (tR), exprimat n secunde sau minute, este timpul care se scurge ntre momentul introducerii probei n injector i timpul cnd picul atinge maximul. Timpul relativ (tR) este timpul de retenie al unui component (i) n raport cu al unui component etalon (e) : tRi / tRe.
21

Timpul de retenie corectat este dat de diferena dintre timpul de retenie brut (tR) i timpul la care se separ eluantul sau un component nereinut pe coloan (ideal) i al componentului respectiv: Rx= tR /tRx. Factorul de retenie are valori cuprinse ntre 0,01-0,9, n cazul unei separri optime, cnd valoarea se apropie de 1, nseamn c acel component X, prsete coloana odat cu eluantul. De aici se definete i factorul de separare, pentru doi componeni A i B: tR(A) (AB) = --------- , care trebuie s aib valori 1 (11) tR(B)

Eficacitatea coloanei O importan deosebit n prezentarea teoretic a procesului cromatografic de separare o au dou teorii. Teoria Talerului teoretic i teoria cinetic. Teoria talerului teoretic a fost propus de Martin i Synge. Conform acestei teorii coloana cromatografic se mparte imaginar ntr-un ir de segmente elementare talere i se presupune, c pe fiecare taler se realizeaz un act elimentar de echilibru la distribuia substanei n faza staionar i faza mobil. Fiecare porie nou de faz mobil purttoare (gaz sau lichid) provoac o deplasare a acestui echilibru, n urma cruia o parte de substan se deplaseaz pe urmtorul taler, pe care la rndul su, se stabilete un nou echilibru distributiv i are loc trecerea substanei pe urmtorul taler. n urma acestor procese substana supus cromatografiei se distribuie pe cteva talere. Concentraia substanei pe talere din mijloc este maxim n comparaie cu talerele invecitate. Talerul teoretic poate fi definit ca un segment imaginar din coloana cromatografic n care se realizeaz un echilibru elementar complet de distribuie a componentului dintre cele dou faze nemiscibile, care vin n contact n procesul separrii cromatografice. Talerul teoretic din coloana cromatografic este analogic talerului teoretic dintr-o coloan pentru distilare fracionat. Deosebirea const n aceea, c componena amestecului, care ese de pe coloana cromatografic ncontinuu se schimb dar n procesul de extracie ori distilare se poate de obinut pe parcursul ntregului proces una i aceeai substan. Numrul talerelor teoretice pentru componentul dat i pentru lungimea coloanei date difer de numrul talerelor teoretice pentru ali componeni n aceleai condiii. Numrul talerelor teoretice este direct proporional cu lungimea i diametrul coloanei. Numrul de talere N este un numr adimensional i se numete eficiena coloanei cromatografice, H i n parametrii teoretici, care caracterizeaz

22

eficacitatea de separare a coloanei cromatografice i determin dispersia zonelor de component. Cu ct coloana va avea mai multe talere teoretice pe o unitate de lungime i cu ct nlimea echivalent unui taler teoretic va fi mai mic, cu att mai efectiv va fi coloana pentru separare n condiiile date. Aa dar, condiiile eficacitii de separare pe coloana cromatografic sunt : H s obin valori ct mai mici i N ct mai mari. Dac vom raporta lungimea stratului de faz staionar (L) n care s-a produs separarea amestecului de substane la nlimea talerului teoretic, vom obine numrul de talere teoretice (N) necesare pentru separarea amestecului dat de coloana dat (formula 12). L N= H Teoria talerelor teoretice presupune realizarea procesului cromatografic n trepte, dar n realitate procesul decurge incontinuu. Aceast teorie ne permite s se calculeze parametrului cantitativi importani pentru caracterizarea procesului cromatografic de separare. Aceti parametri i menin importana i n teoria cinetic a cromatografiei, care ine cont de viteza de migrare a substanei, difuzie i ali factori cinetici, care caracterizeaz cantitatea procesului. Teoria cinetic a cromatografiei acord o atenie fundamental cineticii procesului, asociind nlimea echivalent talerului teoretic (H) cu procesele difuziei, stabilirea lent a procesului. Parametrul experimental care determin din punct de vedere dinamic eficacitatea separrii unei coloane cromatografice este limea picului cromatografic, numit n literatur i lrgirea zonei. Zona ngust i compact a componentului de la nceputul coloanei (la introducerea probei) se va lrgi, astfel nct concentraia pe unitate de volum de coloan se va micora. (fig.2). Lrgirea zonei acioneaz n sensul micorrii separrii, ducnd la o reamestecare a componenilor, respectiv la o suprapunere a picurilor cromatografice. Pentru practica cromatografic este necesar cunoaterea tuturor factorilor, care influeneaz dispersia zonei n vederea acionrii asupra lor n sensul obinerii unor picuri ct mai nguste. Giddings a elaborat teoria privind lrgirea zonei (), moleculelor n coloan e considerat ca un proces haotic incontinuu. Principalii factori, care duc la lrgirea zonei unui component ce parcurge coloana sunt: a) difuzia molecular longitudinal; b) cinetica sorbie-desorbie; c) transferul de mas n faza mobil (format din difuzia transversal i structural sau turbulent. Prin nsumarea acestor contribuii se obine nlimea echivalent talerului teoretic. n funcie de viteza fazei mobile, care ntr-o form simplificat e cunoscut sub denumirea de ecuaia lui Van Deemeter:
23

B H=A+ + C V (13) V unde: ABC constante: V viteza fazei mobile. Aceast ecuaie se aplic n cazul cromatografiei cu gaze. Contribuia fiecrui termen al ecuaiei (13) asupra nlimii echivalente talerului teoretice (H) n funcie de viteza fazei mobile (V) e ilustrat n fig.12.

Fig.12. Reprezentarea grafic a ecuaiei Van Deemter Constanta A e n legtur cu aciunea difuziei de vrtej, care depinde de mrimea particulelor i de densitatea fazei staionare n coloana dat. Mrimea B e legat cu coeficientul de difuzie a moleculelor n faz mobil i ia consideraie aciunea difuziei longitudinale. Mrimea C caracterizeaz cinetica procesului de sorbie-desorbie, transferul de mas i alte efecte. Primul termen difuzeaz un aport constant n H. Efectul celui de-al doilea termen e esenial pentru o vitez mic a fluxului. Cu mrirea vitezei fazei mobile crete influena celui de-al treilea termen, iar a celui de-al doilea se micoreaz. Curba rezultant H = f(v) se caracterizeaz printr-o valoare minim a nlimii echivalente talerului teoretic (H min), care corespunde unei viteze optime a gazului purttor (v opt). Pentru a determina acest punct, difereniem ecuaia (13) i egalm cu derivata ei cu zero: dH B =+C=0 (14) 2 dV V obinem V opt = B/C. nlocuind acest mrime n ecuaia (13) determinm nlimea echivalent a talerului teoretic minim (Hmin) la care separarea cromatografic va fi cel mai efectiv: Hmin = A + 2 BC (15)
24

Astfel teoria cinetic ofer baz pentru optimizarea procesului cromatografic. Factorii, care influeneaz eficacitatea de separare: a) Viteza fazei mobile. Influena este redat prin ecuaia lui Van Deemter. b) Mrimea i suprafaa specific a particulelor fazei staionare. Numrul de talere crete odat cu micorarea dimensiunii particulelor suprafeei specifice. Dimensiunile particulelor nu pot fi prea mici, deoarece crete brusc rezistena opus de coloan la trecerea fazei mobile. n literatura de specialitate exist tabele n care se specific relaiile optime dintre diametrul coloanei i mrimra particulelor fazei staionare. c) Natura fazelor. Alegerea fazelor n dependen de natura probei ce urmeaz a fi analizat. Cantitatea de faz staionar, luat pentru separare trebuie optimizat. n cazul cromatografiei gaz-lichid de exemplu, o cantitate prea mare de faz staionar lichid face ca particulele de umplutut s devin lipicioase i s se aglomereze, afectnd astfel, eficacitatea de separare a coloanei i condiioneaz apariia unor picuri cu cozi. Micorarea cantitii de faz staionar lichid mrete eficacitatea coloanei dar o cantitate prea mic va spori interaciunea fazei purttoare cu particulele suportului. d) Parametrii geometrici a coloanei (lungimea, diametrul, forma). Din acest punct de vedere coloanele capilare sunt cele mai eficiente. Creterea lungimii i micorarea diametrului coloanei conduce la creterea numrului de talere. Dar totu exist o lungime i un diametru optim limitat de fenomenele de curgere, care provoac dispepsia zonelor (tendina de reamestecare). e) Temperatura. n cazul cromatografiei de repartiie (gaz-lichid, mrirea temperaturii mrete separarea, dar n cromatografia de adsorbie mrirea temperaturii influeneaz negativ separarea. Eficacitatea coloanei se msoar cu numrul talerelor teoretice. Pentru compararea eficacitii coloanelor trebuie de identificat faza staionar, substana de analizat, temperatura, viteza gazului vector i mrimea probei. Numrul talelor teoretice (N) se determin dup formua:. X N = 16 y n care: X este distana din momentul introducerii probei pn la maximul picului substanei de analizat, mm
25
2

y Distana format de linia de baz a picului cu tangentele duse n punctele de inflexiune ale picului cu baza, mm. 2. nlimea echivalent unui taler teoretic (H): L H= N unde: L lungimea coloanei cromatografice n cm; N numrul de talere teoretice. 3.De trasat curba dependenei H (pe ordonat) de viteza gazului purttor (pe abcis). De determinat condiiile optime. De completat tabelul: VHe X y X/y (X/y)2 N=16(x/y)2 H

Calcularea reproductibilitii experimentului prin metoda gazcromatografic. Fiecare student primete 3 cromatograme a unei substane, descrie condiiile experimentului, msoar nlimea picurilor n mm. Eroarea unei determinri: hmediu h1 = a1 hmediu h2 = a2 hmediu h3 = a3 Eroarea medie:

a1 + a2 + a3 =b 3

Eroarea medie relativ :

b 100

hmediu Eroarea relativ medie: b / hmediu 100. Eroarea relativ medie nu trebuie s fie mai mare de 3-4 %.
26

6) Derivatizarea sau transformarea prealabil a componentelor polare (greu volatile sau care se descompun la temperatura lor de fierbere) n derivai mai puin polari a permis separarea i identificarea omologilor aceleiai clase, a izomerilor etc. Astfel, substanele cu grupe polare (OH, COOH, NH2) se pot transforma n compui cu grupe mai puin polare (OCOR i NHCOR). Analiza cantitativ n cromatografie se bazeaz pe stabilirea unei relaiei dintre mrimea semnalului dat de detector i cantitatea de compus prezent n prob. Semnalul detectorului este msurat prin nlimea sau aria picului. Aria picurilor poate fi calculat conform relaiilor). s = h0 s = h0 s = h0,5 s = 2,507 h Aria picului poate fi msurat cu ajutorul planimetrului, poate fi apreciat dup greutatea fiilor de hrtie tiate dup conturul picurilor. n prezent n acest scop se folosesc integratoare electronice i microcomputere, care nregistreaz foarte rapid i exact orice mrime de pe cromatogram. Metodele principale n analiza cromatografic cantitativ sunt: a) metoda standardului intern, n prob cu o compoziie cantitaiv necunoscut se introduce preventiv o cantitate exact de substan cunoscut, care nu se conine n amestecul dat, nu interacioneaz chimic cu componentele amestecului i este stabil la temperatura la care se efectueaz analiza. Proprietile fizico-chimice ale substanei adugate (standardului intern) trebuie s fie asemntoare proprietilor componentelor amestecului cercetat. Partea de mas (XI) a fiecrui component (n %) se determin din relaia: Si r Xi = Sst unde Si i Sst sunt ariile picurilor componentului analizat i standardului, corespunztor; r raportul masei standardului intern ctre masa probei:
masa standardului r= masa amestecului de analizat fr standard

100

b) metoda normrii ariilor. Aceast metod presupune, c suma tuturor ariilor picurilor corespunztoare componentelor amestecului cercetat constituie 100 %. Partea de mas (Xi) a componentului i (in %) se determin din urmtoarea relaie:

27

Si Xi =
n=i

Si c) metoda etalonrii absolute. Se prepar i se cerceteaz o serie de soluii standard. Se determin experimental dependena nlimii sau suprafeei picului de concentraia substanei i se traseaz curba de etalonare. Apoi se determin aceeai parametri ai picurilor ai amestecului de analizat i din curba de etalonare se determin concentraia substanei analizate. Aceast metod simpl i exact este principal metod de determinare a microimpuritilor. Metoda nu necesit o separare a tuturor componenilor amestecului, dar se limiteaz la analiza componentului studiat n amestecul concret. . La baza determinrilor cantitative st relaia de proporionalitate ntre aria de sub picul cromatografic i cantitatea componentului eluat. Cheia acestor metode const n msurarea ariei i stabilirea acestei proporionaliti. 1) Msurarea ariei se poate face pe mai multe ci: - Msurarea ariilor este nlocuit uneori cu msurarea integral a nlimii picului (h), sau a jumtii ei (h/2) (figf. 7). - n cazul picurilor simetrice aria se msoar prin metoda produsului dintre limea picului (determinat la nlimii picului) i nlimea lui (perpendicular cobort din vrf pe linia de baz) (fig.7) sau din aria triunghiului format de linia de baz cu tangentele duse n punctele de inflexiune ale picului: hy A = -------2 - Aria este proporional cu masa picului decupat i cntrit, cu condiia ca grosimea hrtiei s fie uniform. - Ariile se mai pot determina automat, utiliznd n acest scop un integrator mecanic sau un computer. 2) Corelarea datelor obinute cu compoziia cantitativ a probei. Dintre metodele care stabilesc relaiile pentru transformarea i corelarea corect a ariilor cu concentraia componentelor, amintim: a) Metoda standardului extern: se realizeaz ntr-un mod asemntor curbei de etalonare din spectroscopie. Cantiti cunoscute de prob-etalon se cromatografiaz; se msoar ariile corespunztoare picurilor i se ntocmete curba de etalonare, care are nregistrat n ordonat valoarea ariilor (mm 2) i n abscis concentraia.(g). b) Metoda standardului intern const n introducerea unui standard, (substan de referin) n cantitate cunoscut, n proba de analizat. Drept standard intern se poate utiliza o substan pur, care s se elueze cu o rezoluie bun, cu un timp de reinere apropiat de al componentelor de determinat i care s nu interacioneze cu acestea. Cunoscnd concentraia standardului intern n
28

100 % (41)

prob (Cs) i msurnd ariile picurilor corespunztoare componentei de determinat (Ax) i ale standardului (As) se poate calcula concentraia necunoscut (Cx). n acest scop se ntocmete o curb de etalonare sau se calculeaz factorul de corecie al ariilor pentru compusul de determinat (fx). Curba de etalonare se realizeaz prin cromatografierea a trei soluii de concentraii exacte din componenta de determinat (C1, C2, C3), prin dizolvarea ei n soluia standardului intern (Cs). Se determin, n fiecare caz n parte, raportul ariilor: A1/As; A2/As; A3/As. Se nscriu aceste valori n ordonata i concentraiile C1, C2, C3 n abscisa unui sistem de coordonate i se traseaz curba de etalonare. Factorul de corecie al ariilor (fx) se poate calcula astfel: Se face media aritmetic (Vx) a valorilor rapoartelor obinute mai sus: V1 + V2 + V3 A1/As = V1; A2/As = V2; A3/As = V3; ---------------- = Vx 3 Pentru fiecare concentraie (C1, C2, C3) se calculeaz raportul: C1/Vx; C2/Vx; C3/Vx; Media aritmetic a valorilor obinute pentru aceste trei concentraii, reprezint factorul de corecie mediu, fx, care intervine n formula de calcul. Cx (mg/ml) = fx Vx c) Metoda normrii ariilor. Aceast metod se bazeaz pe faptul c raportul existent ntre aria corespunztoare picului unui anumit component S A i suma ariilor tuturor componentelor prezente ( S) este egal cu procentul de component prezent n amestec. SA A % = --------------------- 100. SA + SB + SC + ... Relaia de mai sus este valabil numai n cazul n care sensibilitatea detectorului este aceeai pentru toate componentele probei, n caz contrar se recomand ca etalonarea s se fac n prealabil cu ajutorul unor factori de corecie. Concentraia se calcul dup curba de etalonare ori dup formula: Setilnitrit C = ------------ F R 100, Spropilnitrit n care: C concentraia S ariile corespunztoare a picurilor F factorul de corecie a ariilor ori a nlimii picurilor, ce se determin n raport cu standardul n condiiile experimentului (faza staionar, t o injectorului, to termostatului, detectorului; viteza gazului vector) F (factorul) se calcul dup formula:
29

Sst F = ------ C %; 'n care: Sx Sst aria picului standardului Sx aria picului substanei de analizat ori hst F = ------ C %; n care hx Sst nlimea picului standardului Sx nlimea picului substanei de analizat. C % - concentraia substanei de analizat. Se calcul F pentru cteva concentraii i apoi se i-a media: masa standardului R = ----------------------------------------------------masa amestecului de analizat fr standard. Identificarea alcoolului etilic prin metoda gaz-cromatografic a) n buturile alcoolice i soluii alcoolice. Metoda const n aceea, c alcoolii sunt transformai n alchilnitrii, care se separ n coloana cromatografic. Pentru aceasta ntr-un flacon de sub penicilin se introduce 0,5 ml soluie de acid tricloracetic 50% i 0,5 ml soluie de alcool etilic cu concentraie exact n limitele 3-4% (soluie standard). Flaconul se nchide cu dopul de gum, care este fixat de un dispozitiv cu un orificiu n dop. Cu ajutorul seringii n flacon prin dop se introduce 0,25 ml soluie de nitrit de sodiu 30%. Coninutul flaconului timp de un minut se agit. Cu alt sering uscat se i-a 3 ml din faza gazoas ce conine etilnitrit i se injecteaz n cromatograf. Dup obinerea cromatogramei soluiei standard se determin timpul de retenie corectat. Apoi tot aa se cromatografiaz soluia de analizat i se compar timpul de retenie brut, corectat cu a soluiei standard. Coinciderea confirm identitatea lor. n snge i urin e asemntor cu identificarea etanolului n buturi alcoolice i soluii alcoolice. Mai nti se cromatografiaz i se determin timpul de retenie a soluiei etanolice (standard). Apoi se determin etanolul n snge i urin. n flacon de sub penicilin se introduce 0,5 ml snge ori urin i 0,5 ml soluie 50% de acid tricloracetic, se nchide cu dop i se fixeaz cu fixatorul. Apoi se introduce prin dop 0,25 ml soluie de nitrit de sodiu 30%. Coninutul flaconului bine se agit timp de un minut. Apoi din flacon cu o sering curat se i-a 3 ml faz gazoas, se introduce n cromatograf i se cormatografiaz. Dac coincide timpul de retenie a soluiei standard i a substanei ce se conine n snge ori urin, atunci se confirm identitatea lor.

30

Lucrarea N 1 Tema: Introducere n cromatografia gaz-lichid a toxicilor volatili. Cercetarea substanelor toxice care se izoleaz din materialul biologic prin metoda antrenrii cu vapori de ap. Scopul lucrrii: Studierea metodelor de identificare a toxicilor volatili aplicnd metoda cromatografiei gaz- lichide. Planul 1. 2. 3. 4. Controlul cunotinelor practice. Lucrul de sinestttor asupra identificrii toxicilor volatili prin metoda CGL. Concluziile lucrrii i controlul deprinderilor practice. Oformarea proceselor verbale.

Subiectele ce stau la baza pregtirii teoretice 1. nsuirea tehnicii de lucru cu cromatograful: a regula parametrii de baz temperatura, viteza gazului vector, a controla lucrul principiilor de dozare. 2. nsuirea tehnicii de analiz a probelor lichide i gazoase cu coninut de substane toxice. 3. Prelucrarea cromatogramelor, calculnd timpul de retenie corectat i relativ. 4. Identificarea toxicilor volatili prin metoda cromatografiei gaz-lichide. 5. Principiile de baz ale CGL. 6. Schema cromatografului gaz-lichid. 7. Camera de evaporare i funciile ei. 8. Coloanele cromatogafice i rolul lor n separarea substanelor. Faza staionar i cerinele fa de ea. 9. Tipurile de detectori i sensibilitatea lor. 10.Noiune de cromatogram i pic cromatografic. 11.Timpul de retenie n coloan. 12.Metodele de determinare calitativ n analiza cromatografiei gaz-lichide. 13.Factorii care acioneaz asupra separrii substanelor n coloana cromatografic eficacitatea coloanei, selectivitatea fazei staionare. 14.Etapele de baz n identificarea toxicilor volatili izolai din materialul biologic prin metoda CGL. 1. Ce factori acioneaz la separarea componentelor n coloana CGL? 2. Explicai noiunea de eficacitate a coloanei cromatografice. 3. Care sunt parametrii ce caracterizeaz nlimea echivalent talerelor teoretice? 4. Cerinele, care se atribuie ctre faz lichid staional. 5. Definiia coeficientului de repartiie componentelor n cercetare prin metoda CGL.

31

6. Natura formelor de interaciune ntre substanele de cercetare i faza staionar. 7. Reciprocitatea dintre coeficientul de repartiie i forele de interaciune a componentului cu faza staionar lichid. 8. Care sunt parametrii de care depinde timpul de reinere i corectat n coloana cromatografului? 9. Principiile de baz pentru identificarea toxicilor volatili n lichidul biologic prin metoda CGL. . Rspundei argumentat la urmtoarele ntrebri 1. n ce compartiment al cromatografului se efectueaz separarea substanelor. 2. Care este prioritatea metodei CGL fa de metodele chimice pentru analiza toxicilor volatili. 3. Cum nelegei definiia nlime, talere teoretice echivalente. 4. Ce dozatore se folosesc pentru transmiterea probelor gazoase i lichide n coloana cromatografului? 5. Cum se schimb mrirea tipului de retenie a substanelor n coloan n timpul analizei calitative? a. De la momentul introducerii probei. b. De la maximum picului de aer. c. De la maximum picului vecin? 6. Ce este timpul de retenie corectat i timpul de retenie relativ i de ce parametrii ai cromatografului depind ei? 1. Cum se va petrece repartiia pe coloana cromatografic, care conine 20 % glicerin a urmtorilor amestecuri? Metanol, etanol, propanol, butanol Propanol, benzen Octan, benzen 2. Argumentai rspunsurile la aceleai ntrebri dac n calitate de sorbent ar fi 20 % ulei de vaselin. 3. Dai explicaie expresiilor: - timpul reinerii - distana de reinere - volumul de reinere 4. Prin ce se determin selectarea fazei staionare lichide? 5. Cu ajutorul crei faze staionare lichide G-1500 ori Triton X-100 este mai eficient rfepartiia amestecurilor eterilor metilici ai acizilor grai? Argumentai rspunsul. Ce proprietate a substanelor de cercetat determin cantitatea necesar a bazei lichide staionare n coloana cromatografic? Artai aproximativ cantitatea fazei lichide staionare pentru repartiia amestecurilor hidrocarburilor aromatice, alcoolilor alifatici, substane medicamentoase
32

Rspundei n scris la urmtoarele ntrebri Problema 1. Pentru separarea substanelor folosirea ca detector n caterometru se folosesc diferite gaze-vectori- azot, heliu, hidrogen, argon. Ce gaz-vector asigur o sensibilitate mai mare a catarometrului. Argumentai rspunsul alctuind urmtoarea tabel. Gaz Conductibilitate termic M. Mol

Problema 2. n secia chimico-judiciar e necesar de determinat cantitatea metanolului n urin prin metoda cromatografiei gaz-lichide. Ce detector trebuie s folosim, ca la determinarea metanolului s nu mpiedice apa? Problema 3. n secia chimico-judiciar trebuie de efectuat analiza-express a materialului biologic asupra microcantitilor de cloroform n snge. Ce tip de detector trebuie s folosim pentru soluionarea acestei probleme? Problema 4. Ceteanul A fost internat n centrul pentru tratarea intoxicaiilor acute cu presupunere de intoxicare cu fenol. A fost efectuat analiza gazcromatografic a urinei acidulate a pacientului. Pe coloana polar timpul relativ de reinere corespundea etilenglicolului i fenolului, iar pe cea nepolar fenolului i toluolului. Ce concluzii a fcut chimistul-expert? Problema 5. Pentru identificarea picului cromatografic se folosesc urmtoarele caracteristici: a. Punctul iniial al picului b. Maximul picului c. Limea picului d. nlimea picului. e. Suprafaa picului. Lucrul practic al studenilor n cadrul lucrrii de laborator Studenii fac cunotin cu tehnica de securitate. Lucrul practic const din 2 etape: I. Determinarea timpului de reinere relativ a substanelor pure pe coloane de polaritate diferit i completarea tabelei generale. II. Identificarea toxicilor volatili n amestecul-model. 1. Fiecare student primete 1 substan o cromatografiaz pe coloane cu polaritate diferit. Se prelucreaz cromatogramele obinute. 2. Fiecare student primete amestecul model, coninnd 2 substane necunoscute i le cromatografiaz pe ambele coloane cu polaritate diferit n aceleai condiii.Cromatogramele se prelucreaz, calculnd

33

timpul de reinere corectat i relativ. Apoi identificarea se efectuaz dup schema aplicat n cercetarea cromatogramelor model. .3 Determinarea timpului de retenie relativ a componentelor pure pe coloana cu faz staionar lichid de polaritate diferit i alctuirea tabelei generale. (Lucrarea I). 4. Identificarea toxicilor volatili n amestecul model (Lucrarea II). Aparatura i detaliile aucziliare 1. Cromatograful gaz-lichid cu detector i termostat la t 100 i m.m. 2. Microsering pentru 1mcl i 10mcl. 3. Flaconul cu lichide pentru splarea microseringelor: cu alcool, cu eter. 4. Linia de msurare, triunghi, lupa. 5. Colba cu ap de spun i periua Regulile pentru studeni la folosirea microseringilor 1. La sfritul lucrului seringa se spal cu alcool, eter, lund fiecare solvent n sering de 2-3 ori i elibernd pe hrtie de filtru. 2. Seringa se aranjaz n penal. 3. Se interzice de a injecta n coloan acul pn a fi colectat proba. 4. Nu se admite colectarea rapid a probei. Pregtirea ctre analiza cromatografic 1. nainte de a ncepe lucrul verificm ermeticitatea camerei de evaporare. Pentru aceasta cu ajutorul periei i soluiei de spun se unge deschiztura evaporatorului, unde ar trebui s troducem acul siringei. Ermeticitatea se constat prin lipsa vaporilor de gaz n aceast regiune. Controlul ermeticitii se efectuaz i n timpul lucrrii. 2. Controlul eficacitii siringii de 1 l se face prin colectarea 0,5 l aceton i dozarea lui pe hrtia de filtru. n timpul dozrii apare o micropictur pe vrful acului, iar la atingerea ei pe hrtie de filtru apare un spot umed. Dac pictura lipsete atunci se ntrete acul de siring. n procesul lucrului ermeticitatea microseringii se controleaz de fiecare dat dup 7-10 probe. ndeplinirea analizei cromatografice Analiza gaz-cromatografic ncepe cu aranjarea bandei de autonscriere. Apoi n microsering se colecteaz 0,5l solvent organic i se introduce n camera de evaporare a cromatografului. Se nseamn cu creionul momentul introducerii probei. Dup aceasta se nregistreaz picul aerului, care se nseamn prin Aer, dup care urmeaz s fie picul probei de analizat compusului standard ori amestecul standard propus de profesor. Analiza aerului i la toate celelalte probe se interpreteaz consecutiv nu mai puin de 2 ori pe aceeai coloan. Astfel se controleaz suprapunerea cromatogramelor paralele dup timpul de reinere, adic dup distana de la momentul introducerii pn la apariia maximului i dup mrimea nlimii lui. Dac rezultatele obinute de pe ambele cromatograme nu se suprapun se repet experiena pn la
34

suprapunerea rezultatelor. n cazuri contrare calitatea cromatogramelor paralele se analizeaz cu profesorul. Analiza substanelor lichide se ndeplinete cu ajutorul microseringei de 1 l ori 10 l .Mrimea probei 1-0,5 l. Sensibilitatea pentru fiecare substan se alege individual. Dup ndeplinirea analizelor paralele seringa se spal de cteva ori cu soluia de analizat i numai atunci este gata de colectat proba pentru ndeplinirea experienei urmtoare pentru aceea prob. Analiza cromatogramelor Iniial se msoar cu ajutorul riglei distana (mm) de la momentul introducerii probei pn la maximul picului de aer (fig.1). Aceast distan corespunde timpului de gsire a componentului n interiorul cromatografului n stare mobil. Mrimea T este distana de reinere a gazului neabsorbit. Se msoar ea cu ajutorul riglei n mm. Distana obinut n mm raportat la viteza micrii corespunde timpului de reinere a gazului neabsorbit n sec ori min. Distana de la maximul picului aerului pn la maximul picului compuilor de analizat, raportat la viteza lentei corespunde timpului de retenie corectatat al amestecului de analizat (T). Dac nu se menioneaz trih atunci este timpul de reinere a gazului neabsorbit, care nu e adecvat pentru calcule. Pentru calculele de identificare se folosete numai timpul corectat (T ), aa cum numai el determin timpul, n care moleculele substanei de analizat a toxicului volatil se gsesc n stare de absorbie (dizolvare) n faz staionar. Numai timpul staionrii este diferit pentru fiecare toxic volatil, dup cum numai el caracterizeaz solubilitatea diferit a toxicilor n una i aceeai faz staionar, ori absorbia diferit in unul i acelai absorbent. Datele valorilor L i T a fiecrui component se nscriu n tabel Tabelul 1 Denumirea compusului Coloana cu sorbentul Coloana cu sorbent polar polar L : Tsec : Trel L : Tsec : Trel - Cloroform - Alcool propilic - Etanol Lx TR = ---------------------C (viteza lentei) Valoarea Trel se calculeaz cu exactitate pn la 0,01. Dup efectuarea calculelor i ndeplinirea tabelului n procesul verbal studentul nscrie o tabel o singur pagin, care conine date despre condiiile cromatografice a tuturor substanelor cercetate.

35

Fig.1. Determinarea distanei de reinere pe cromatogram a momentul introducerii probei; b maximum picului de aer; c maximum picului substanei de cercetat; Lx distana de reinere total Lx distana cercetat de reinere L distana de reinere a gazului neabsorbit Obiectele de cercetare - amestec model din 2 toxici volatili din urmtoarele componente: cloroform, alcool metilic, etilic, butilic, izobutilic, aceton, etilacetat, toluen, dioxan, benzen, tetraclorur de carbon, dicloretan, hexan. Etapele de lucru: I. Determinarea timpului de retenie relativ a componentelor pure pe coloana cu faz staionar lichid de polaritate diferit i alctuirea tabelei generale. (Lucrarea I). II. Identificarea toxicilor volatili n amestecul model (Lucrarea II). Fiecare student primete amestecul model coninnd 2 substane necunoscute i efectueaz cromatografierea pe dou coloane de polaritate diferit n aceleai condiii ce se refer la substanele pure. (Lucrarea I). Cromatogramele se prelucreaz, calculnd timpul de retenie corectat i relativ. Apoi identificarea se efectueaz dup schema dat. Pe cromatogram se arat parametrii, care se folosesc pentru identificare. Indicaii pentru efectuarea identitii toxicelor volatili Identificarea toxicilor volatili prin metoda cromatografiei gaz lichide se reduce la Trel pe 2 coloane cu polaritate diferit. Dac componentul nu se separ pe o coloan sub form de pic, numaidect separarea are loc pe a II coloan.
36

Deaceea analiza amestecurilor se efectueaz pe dou coloane cu sorbent de polaritate diferit. Pe cromatogramele obinute se calculeaz timpul de retenie relativ pentru fiecare pic cromatografic. Parametrii obinui se aranjaz n dou tabele. n prima tabel se includ parametrii de reinere pe coloana cu sorbentul polar, a doua pe coloana cu sorbent nepolar. Aici se finiseaz I etap de lucru. n etapa II se folosesc datele individuale din tabel obinute pentru toxicii volatili n tabelul 2 includ parametrii de reinere i denumirile corespunztoare, la care timpul de retenie relativ nu se deosebete dect cu 0,05, determinat experimental prin analiza amestecurilor de toxici neconoscui. Exemplu de tabel. Datele experimentale i tabelare despre parametrii de reinere a toxicilor volatili necunoscui pe coloana cu sorbent polar. Calculele timpului relativ de reinere este ndeplinit n raport cu benzenul (ori alt solvent). Tabelul 2 Datele despre parametrii de reinere a toxicilor volatili necunoscui pe coloana cu sorbentul polar Nr pic pe Datele experimentale Datele din Determinarea cromatogram tabel substanei L (mm) Trel Trel 1 63 0,84 0,79 Butilformiat 0,81 Propoxibutan 0,85 Metanol 2 125 0,99 1,00 Benzen 1,00 Butilizobutirat 1,01 Cloroform 1,03 Dibutoxibutan Datele din tabele despre parametrii de reinere i determinarea toxicilor volatili, care pot asista n problema de control e necesar s se continu n tabela completat dup rezultatele determinrii timpului de reinere relativ a toxicilor pure substane de comparare pe dou coloane cu polaritate diferit. Aceste tabele sunt rezultatele lucrului practic a lucrrii precedente. Pentru etapa urmtoare lucrul const n compararea tabelelor completate pentru coloanele cu diferit polaritate coninnd date concrete timpul de reinere a toxicilor volatili necunoscui din problema de control i denumirile propuse. De aici rezultat, c componentele care au pic comun pe o coloan s fie n aceeai msur orientate i pe alt coloan. Aceste condiii se respect. Dar cu toate acestea sunt abateri, cnd nectnd la polaritatea diferit, ambele coloane nu sunt selective pentru perechea dat de substane. n acest caz aceste substane urmeaz s fie excluse din ambele tabele i necesitatea identificrii lor se rezolv separat dup cum n amestecul de analizat ar putea s existe n mod separat ori mpreun. n rezultat ambele componente se nscriu n rspunsul problemei convenional identificate.

37

Dup excludere se funcioneaz compararea tabelelor. Aceste denumiri corespund toxicilor, care persist n obiectul de cercetare. Pentru finalizarea acestei etape de lucru urmeaz s completm tabela final, forma creia este dat mai jos. Tabelul 3 Denumirea toxicilor volatili determinai pe fiecare Denumirea toxicului coloan cu polaritate diferit identificat Coloana polar Coloana nepolar Prima rubric a tabelei se completeaz cu toate denumirile, gsite pe coloana polar, a II cu denumirile de pe coloana nepolar. Denumirile subliniate se nscriu n rubrica II. Acestea vor fi la rndul lor denumirea toxicilor cercetai. Aa dar, n procesul identificrii, efectuat pe coloane paralele, denumirea toxicului, care se conine n prob e necesar, ca s fie determinat dup totalitatea parametrilor de repartiie obinui pe fiecare coloan folosit. Dac denumirea toxicului e gsit numai dup datele unei coloane, acest toxic n prob de cercetat nu se conine. Unii i aceeai toxici pe diferite coloane pot fi repartizai n ordine diferit. Dac pe cromatograme se nregistreaz numai un pic i nu este exclus prezena lui n prob n calitate de toxic volatil apare necesitatea de a schimba benzenul cu un alt solvent de exemplu: butilacetat, alcool propilic. Controlul total 1. Aprecierea rezultatelor obinute n urma efecturii lucrului practic. 2. Semnarea proceselor verbale. Bibliografie 1. Materialul prelegerilor 2. .., .. . , , 1978, . 4-10, 15-19. 20-25. 30-53. 3. .. , , , 1989 4. .. , .. . ., , 1970. . 29-39. 5. .. , . 3, ., , 1979, . 356. 6. .. . . . , , 1987, .246.

38

Lucrarea N2 Tema: Metoda cromatografiei gaz-lichide n analiza chimico-toxicologic. Determinarea cantitativ. Scopul lucrrii: A nsui metodele de determinare cantitativ a toxicilor volatili prin metoda CGL. A studia teoretic i a asimila practic metodica de analiz a CGL asupra alcoolul etilic n snge i urin aplicat n laboratoarele Centrului de medicin legal, i laboratoarele chimice. Planul 1. Controlul cunotinelor teoretice. 2. Lucrul de sinestttor asupra metodei de determinare calitativ i cantitativ a alcoolului etilic n lichidele biologice. 3. Concluziile lucrrii i controlul deprinderilor practice. 4. Oformarea proceselor verbale. 1. Subiectele ce stau la baza studierei temei: Bazele teoretice ale CGL. - eficacitatea coloanei cromatografice i fazei staionare lichide - selectivitate fazei staionare - detectorii cromatografului Determinarea cantitativ prin metoda cromatografiei gaz-lichide. Metodele de calculare a suprafeei picurilor: - normrii a ariilor - standardului intern - calibrrii absolute Ce reacie st la baz identificrii i dozrii alcoolului etilic n lichidele biologice prin metoda CGL. Condiiile de identificare a alcoolului n lichidele biologice prin CGL. Obiectele de cercetare asupra alcoolului etilic n analizele chimico-juridiciare i chimice. Cum se msoar valoarea timpului de reinere pe cromatogram de la momentul introducerii probei, de la maximul picului de aer? Ce numim timp de reinere corectat i relativ? Ce detector se folosete la determinarea alcoolului etilic n snge i urin prin metoda CGL? mpiedic oare determinrii alcoolului etilic n lichidele biologice prin metoda CGL alte componente volatile? Explicai construirea curbei de calibrare pentru determinarea etanolului n snge i urin. Ce lum n calitate de standard intern la determinarea alcoolului etilic?
39

2. 3.

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

10.De ce se calculeaz coeficienii de calibrare la determinarea etanolului n snge i urin? Rspundei argumentat la urmtoarele ntrebri: 1. Ce proprieti ale componentelor separate acioneaz la timpul de reinere n baza staionar. 2. Explicai de ce compuii organici nesaturai posed un timp de reinere mai mare n faza staionar polar dect n cea nepolar? 3. Cum are loc cromatografierea n faza staionar lichid benzenul i fenolul? (TR)? 4. Explicai prioritatea metodei CGL fa de celelalte metode. 5. De ce depinde eficacitatea repartiiei componentelor n coloan? 6. Ce parametrii ai picului se folosesc n determinarea cantitativ? 7. Ce se soluioneaz efectund analiza cantitativ prin metoda cromatografiei gaz-lichide. 8. Cum se construiete graficul de calibrare prin metoda standardului intern, calibrrii absolute? 9. De ce prin aplicarea metodei de dozare a standardului intern se ntroduce n cromatograf diferite volume de prob? 10.Cum determinai coninutul etanolului n urin, dac dup analiza cromatogramei nlimea picului de etilnitrat h x=10 mm, nlimea picului de propilnitrat 15 mm, R=1, Ku=1,03. 11.Determinai coninutul etanolului n snge, dac nlimea picului etilnitrat 25 mm, propilnitrat 17 mm, R=1, Ks=1,90. 12.Determinai Cu=Cs (dup problema 1,2) i tragei concluzie de gradul de alcoolizare. Lucrul practic al studenilor la lucrarea de laborator Studenii primesc cromatograme pentru rezolvarea 4 situaii. Cromatogramele se nscriu n caiete. Pe una din ele se demonstreaz ce parametri pe cromatograme se determin. Studentul e dator s cunoasc diferite moduri de calcul a suprafeei picurilor: B unde h nlimea picului S = h --------B baza triunghiului sub pic. 2 S = h unde h nlimea picului - limea picului la jumtatea nlimii

h B
40

Studenii ndeplinesc 4 nsrcinri dup cromatogramele expuse. Metoda normrii ariilor Fiecare student determin componena procentual a amestecului (o cromatogram) prin metoda normrii ariilor de dozare a cromatogramelor. Pentru acesta se calculeaz suprafeele tuturor picurilor. Formula de calcul: SA A = ----------- 100 S Metoda standardului intern Calculai coninutul n % a unui component din amestecul medicamentos prin metoda standardului intern (calculele se efectueaz conform formulei): Sx Kx A% = ----------- R 100 Sst Kst n cazul dat Sst i Kst = 1, iar m standardului R = ------------------------------------------------m amestecului de analizat (fr standard) Fiecare student calculeaz independent, reieind din datele cromatogramei, formula avnd urmtorul aspect: Sx A% = ---- R 100 Sst Cromatograma se prelucreaz calculativ. Toate datele se includ n tabel. Nr Com Analiza cantitativ Analiza calitativ cro h S % Metoda L Viteza TR ma- pone normei standardulu lentei Trel togr nt a interne i aamemei stec Calcularea vitezei optime a gazului vector pentru repartiia componenelor. Fiecare student primete cromatograme a substanei de analizat la diferite viteze a gazului vector-heliu.

41

a) pentru fiecare cromatogram calculai numrul talerelor teoretice dup ecuaia: x x N = 16 (----)2 Y

y
b) Calculai ETT dup formula urmtoare : L cm ETT= -------N unde ETT- nlimea eficacitii talerelor teoretice; L - lungimea coloanei cromatografice (artat pe cromatogram); N numrul talerelor teoretice. c) Construii graficul dependenei ETT (axei ordinatelor) n raport cu viteza gazului vector (axei absciselor). Determinai viteza maxim a heliului dup grafic, corespunztor ETT minime pe grafic. Alctuii tabela. VHe X Y X X N ETT 2 ----(----) Y Y Calcularea reproductibilitii metodei CGL. Fiecare student primete 3 cromatograme a unii component, scrie condiiile experimentului i msoar nlimea picului n mm, calculeaz nlimea medie, greala determinrii separate, abaterea relativ medie. Abaterea determinrii separate: hmed h1 = a1 hmed h2 = a2 hmed h3 = a3 Abaterea medie a1 + a2 + a3 --------------------- = B 3

Abaterea relativ medie B ----------- 100 hmed


42

Abaterea medie relativ nu trebuia s depasc 3-4 %.

Tema: Determinarea alcoolului etilic n snge i urin prin metoda CGL Prelucrarea metodic Lucrul practic al studenilor n laborator Condiiile de lucru: Aparat Crom-4: coloan de oel (sticl) 2 m, faza staionar PEG-1500, umplutura cromaton cu argint N-AW-DMAS, T0coloanei - 680, T0 termostatului 700, T catarometrului 1000, intensitatea curentului n detector 100 am, gazul vector heliu 2,4 l/or, sensibilitatea nscrierii 2, mrimea probei 2 ml. Cloralhidratul, formaldehida, acidul acetic, fenolul, dioxanul, acidul cianhidric, metilsalicilatul, metilmercaptofos, tiofos picuri nu formeaz. Picurile metilnitrilului, hexanului, pentanului se nregistreaz naintea etilnitrilului, cloroformul, tetraclorura de carbon, dicloretanul, acetona, eterul, benzenul, toluenul, xilolul, octanul, propil-, izopropil-, butil-, izobutil, amil-, izoamilnitriii se nregistreaz dup etilnitrit i nu mpedic identificrii. Pentru a dovedi prezena alcoolului etilic ne folosim att de timpul de reinere corectat ct i de timp de reinere relativ. Identificarea alcoolului etilic n amestecul model (scriei chimismul reaciilor) n flacon de penicilin se introduc 0,5 ml sol acid tricloracetic 50%, 5 ml sol n-alcoolpropilic (4 %) i 0,5 ml snge ori urin (ori C 2H5OH), flaconul se nchide cu un dop de cauciuc i se fixeaz n cilindru metalic. Capacul cilindrului se nchide n aa mod ca dopul de cauciuc s nchid ermetic flaconul. Coninutul flaconului se agit cu precauie. Un flacon se ntroduce cu seringa de 1 ml, 0,25 ml soluie nitrit de sodiu 30 %. Flaconul se agit i peste 1 minut cu o alt sering se colecteaz 2 ml prob gazoas i se introduce n injectorul cromatografului. Pe cromatograma nregistrat se determin timpul de reinere corectat i relativ. Timpul de reinere relativ se determin dup n-alcool propilic. Determinarea cantitativ prin metoda standardului intern. Metoda grafic. Construirea curbei de calibrare a soluiei standard de alcool etilic n lichidele biologice ori soluie apoas de etanol. Fiecare student primete 4 cromatograme ale etilnitritului, corespunztor coninutului de etanol n lichidele biologice (snge ori urin). Fiecare cromatogram se prelucreaz dup calculele de determinare calitativ i cantitativ a alcoolului etilic n lichidele biologice. Pentru aceasta se calculeaz timpul de retenie relativ a etilnitrilului. Pentru determinarea cantitativ se determin nlimea picurilor de etilnitrit (hx) i standard - n-propilnitrit (hst) i se calculeaz raportul hx / hst 100. Se construiete graficul pe axa ordinatelor se

43

nscrie raportul hx / hst 100, pe axa absciselor concentraia etanolului n lichidele biologice n promile (o/oo). Soluiile standarde ale etanolului n snge i urin nu sunt stabile i pe ele n practica de lucru e nevoie s le renovm. Mai corect ar fi s folosim soluiile standarde apoase ale alcoolului etilic pentru construirea curbei de calibrare. Prin folosirea datelor acestui grafic se folosesc numaidect coeficienii de calibrare, care pentru determinarea etanolului n snge este egal 0,95, n urin 1,05. Cs = C(H2O ) 0,95, Cur = C(H2O) 1,05 (CH2O valoarea concentraiei etanolului gsit dup curba de calibrare a soluiei apoase de etanol). Metoda de calcul pentru determinarea cantitativ a etanolului n cazul aplicrii standardului intern Analiza cantitativ a etanolului dup metoda standardului intern se efectueaz i prin metoda de calcul fr a construi graficul de calibrare, conform urmtoarei formule: Sx = ------- K R ; R = 1 Sst K - coeficientul de corecie relativ a suprafeelor picurilor (S x, Sst), determinat pentru fiecare component n raport cu standardul n condiiile date. (FLS, temperatura de evaporare. Temperatura de termostatare, detectorul, viteza gazului, vector). De aici reiese calculul coeficientului de corecie care se exprim dup formula: Sst K = ------- , ori suprafaa lui se nlocuete cu nalimea picului. Sx hst (nlimea picului propilnitrit) K = ------------------------------------------ C2H5OH hx (nlimea picului etilnitrit) Pentru calcularea K folosim soluiile apoase de etanol (1, 2, 3, 4) cu standardul intern alcoolul propilic. Soluiile apoase a etanolului se prelucreaz dup metodic pentru dozare i se cromatografiaz. Pe cromatogram se msoar nlimea picului etilnitrit i propilnitrit (n soluie apoas de etanol) i se calculeaz K, apoi se nmulete la 0,95 ori 1,05. n rezultat coeficientul final, care va fi folosit n formula de calcul pentru snge K s = Kmed 0,95, pentru urin Kur = Kmed 1,05. Exemplu de prelucrare a rezultatelor obinute: Conc. nli nlimea hst
44

etanol Cx

1 2 3 4 5

mea picului K = ------- x piculu propilnitr hx i it etilnitr it 62 135 135/62 1 = 2,18 80 99 99/80 2 = 2,48 140 109 109/104 3 = 192 106 2,34 178 78 108/192 4 = 2,20 78/178 5 = 2,25

Kmed

Ks

Kur

2,29

Kmed 0,95 2,11

Kmed 1,05 2,41

Exemplu de calcul: Problema 1 Calculai cantitatea de etanol n snge, dac: h2H5ONO = 60 mm hC3H7ONO = 130 mm 60 2H5OH = ------ 2,11 = 0,97 % 130 Problema 2 Calculai coninutul etanolului n urin, dac : h2H5ONO = 175 mm hC3H7ONO = 80 mm 175 2H5OH = ------ 2,41 = 5,27 % 80 K coeficientul de corecie pentru fiecare concentraie K- coeficientul mediu pentru determinarea coninutului alcoolului etilic n snge i urin Controlul total 3. Aprecierea rezultatelor obinute n urma efecturii lucrului practic. 4. Semnarea proceselor verbale. Bibliografie 7. Materialul prelegerilor 8. .., .. . , , 1978, . 4-10, 15-19. 20-25. 30-53. 9. .. , , , 1989

45

10... , .. . ., , 1970. . 29-39. 11. .. , . 3, ., , 1979, . 356. 12... . . . , , 1987, .246. Lucrarea N 3 Tema: Expertiza chimico- toxicologica a toxicilor volatili din materialul biologic.
Determinarea alcoolului etilic n lichidele biologice prin metoda cromatografiei gazlichide. Metoda cromatografiei gaz-lichide n identificarea i dozarea toxicilor volatili. ndeplinirea buletinului de expertiz. 1. Scopul temei: ntrirea cunotinelor teoretice i practice asupr analizei chimicotoxicologice a toxicilor volatili din materialul biologic. A studia metodica de dozare a etanolului n snge i urin prin aplicare metodei cromatografiei de gaze. Determinarea gradului de alcoolizare n organism. Scopuri practice: 1. A deprinde efectuarea izolrii toxicilor volatili din materialul biologic, aplicnd metoda antrenrii cu vapori de ap. 2. A studia metodele de identificare a toxicilor volatili din distilatul obinut. 3. Determinarea cantitativ a toxicilor volatili. 4. A studia biotransformarea toxicilor volatili. 5. A studia metodica de dozare a etanolului n snge i urin prin aplicare metodei cromatografiei de gaze. 6. Determinarea gradului de alcoolizare n organism. ntrebrile teoretice: 1. Care este principiul metodei de izolare a toxicilor volatili? 2. Explicai prepararea probelor preliminare n analiza chimico- toxicologica a toxicilor volatili. 3. Cum se izoleaz etilenglicolul i acidul acetic din materialul biologic? 4. Particularitile izolrii alcoolului izoamilic, etilic, metilic, fenolului, dicloretanului, aldehidei formice. 5. Analiza chimico- toxicologic a acidului cianhidric i a srurilor lui n extrasele biologice. 6. nsemntatea toxicologic, mecanismul aciunii toxice i metabolismul acidului cianhidric i srurilor lui. 7. Analiza chimico- toxicologic, identificarea i dozarea halogenderivailor(cloroform, dicloretan, cloralhidrat, tetraclorura de carbon) n materialul biologic. 8. Aciunea toxicologic a derivailor halogenai ai hidrocarburilor. 9. Caracteristica alcoolului metilic, etilic, izoamilic i etilenglicolului. Particularitile izolrii, identificrii i dozrii alcoolilor n dependen de obiectul de cercetare. 10. Particularitile aciunii alcoolului etilic. Coma alcoolic. 11. Metodele chimice de confirmare a prezenei formaldehidei n organele cadaverice. 12. Aciunea toxic i biotransformarea formaldehidei n organismul uman. 13. Acetona i acidul acetic. Toxicocinetica i toxicodinamica.
46

14. Analiza chimico- toxicologic a acidului acetic i acetonei. 15. Particularitile cercetrilor chimico- toxicologice asupra fenolului i derivailor si. 16. Biotransformarea fenolului i aciunea toxic a lui. 17. Expertiza intoxicaiilor alcoolice n materialul cadaveric. Factorii ce influeneaz asupra determinrii etanolului. 18. Tetraetilul de Pb i particularitile cercetrii produselor petroliere asupra acestui toxic. Mecanismul aciunii toxice. 19. Analiza ch.- toxicologic a nitrobenzenului, anilinei. 20. Mecanismul aciunii toxice a nitroderivailor. 21. Absorbia, repartiia i eliminarea cianurilor i acidului cianhidric, cloroformului, cloralhidratului, tetraclorurii de carbon, dicloretanului, formaldehidei, acetonei, ac. acetic, alcoolilor alifatici, etilenglicolului, fenolului, nitrobenzenului. 22. Biotransformarea ac. cianhidric, derivailor halogenai, ac. acetic, formaldehidei, etilenglicolului, hidrocarburilor saturate. 23. Absorbia, distribuia i eliminarea alcoolului etilic n organismul uman. 24. Biotransformarea alcoolului etilic. 25. Simptomatologia intoxicaiilor cu alcool etilic. 26. Expertiza intoxicaiilor cu alcool etilic. a) Interpretarea rezultatelor expertizei n dependen de materialul biologic. 27. Intoxicaiile mixte de alcool etilic. 28. Caracteristica metodei gaz-cromatografice n vederea determinrii toxicilor volatili. Prile componente ale cromatografului. 29. Tipurile de detectori. Principii de lucru. 30. Explicai eficacitatea coloanei. 31. De ce depinde selectivitatea fazei staionare? 32. Dai definiia timpului corectat i timpului relativ n coloan. 33. Principiu de identificare a toxicilor volatili prin metoda cromatografiei de gaze. 34. Dozarea toxicilor volatili prin metoda cromatografiei de gaze. Principiu de lucru i metodele de calcul. 35. Dozarea etanolului n lichidele biologice chimismul, metodica, calculele.

ndeplinirea scopului practic


Condiiile experimentului: aparatul Crom-4, coloana de sticl 2 m, faza staionar PEG-1500 10 %, T0 colanei 600C, T0 camerei de evaporare 700 C, T0 catarometrului 1000C, intensitatea curentului 100 am., gazul purttor Heliu, viteza 2,4 l/or, mrimea probei 2 ml. Problema 1 Determinarea coeficientului de corecie pentru analiza cromatografic a lichidelor biologice la prezena alcoolului etilic prin metoda de calcul. Fiecare student primete soluie n ap (cu conc. 1-5 ) i prelucreaz soluia dup metodica [3], dup aceea cromatografiaz amestecul de gaze n aparatul Crom-4. Pe cromatograma obinut se msoar nlimea picului etilnitrit i propilnitrit. Dup datele obinute se efectueaz calculele coeficientului de corecie relativ dup formula: hst (nlimea picului propilnitrit) 1) K = ------------------------------------------ C2H5OH hx (nlimea picului etilnitrit) 2) Se calculeaz Kmed
47

3) Se calculeaz coeficientul de corecie pentru determinarea etanolului n snge n condiiile cromatografice date lund n vedere coeficientul de calibrare. K snge = Kmed 0,95 4) Se calculeaz coeficientul de corecie pentru determinarea etanolului n urin n condiiile experimentului, lund n vedere coeficientul de calibrare. K ur = Kmed 1,05 Problema 2 Dozarea alcoolului etilic n snge i urin prin metoda de calcul. Fiecare 2 studeni primesc problem dou flacoane cu lichid biologic urin i snge cu coninut de alcool etilic. Probele se prelucreaz pentru dozarea alcoolului etilic (Problema 1) i se cromatografiaz produsele gazoase ale reaciei n aparatul Crom-4. Cromatograma obinut se prelucreaz calitativ (distana de reinere L); TR corectat, Trel timpul relativ. Se efectueaz dozarea alcoolului etilic prin metoda de calcul, pentru care se msoar nlimea etilnitritului i propilnitritului i se efectueaz calculele. nlimea picului propilnitrit etanolului(snge) = --------------------------------------- Ksnge nlimea picului etilnitrit nlimea picului propilnitrit etanolului(urin) = --------------------------------------- Kurin nlimea picului etilnitrit Problema 3 Determinarea etanolului prin metoda standardului intern dup graficul de calibrare. a) Pentru ndeplinirea acestei probleme studenii folosesc datele din I problem, ndeplinesc tabela, dup datele obinute construiesc graficul de calibrare.

Conc. etanolului n 1 2 3 4

nlimea picului etilnitrit h -C2H5ONO

nlimea picului propilnitrit h C3H7ONO

h C2H5ONO ----------------- 100 h C3H7ONO

b) Determinarea etanolului n lichidele biologice dup graficul de calibrare. Se prelucreaz sngele i urina dup metodica soluiei apoase de etanol. Se msoar pe cromatogram h -C2H5ONO i h C3H7ONO i se gsete pe grafic concentraia corespunztoare a etanolului (CH2O). Deoarece graficul de calibrare e cunoscut dup soluia apoas de etanol, concentraia adevrat a etanolului n snge Csnge = CH2O 0,95 n urin Curina = CH2O 1,05 n sfrit se compar datele obinute dup graficul de calibrare i metoda de calcul. Se fac concluzii despre coninutul etanolului n snge i urin i gradul de alcoolizare.
48

Bibliografie
1. 2. 3. 4. 5. Conspectul leciilor T.Brodicico, V.Valica Curs de Chimie toxicologic, Chiinu, 2003 .. . : , 1989, .135-143. .. . . , 1994, . 552 .. . : , 1976, . 37-44

Buletin de expertiz
Actul analizei chimico- toxicologice a corpurilor delicte, conform dosarului ceteanului X, transmise anchetatorului__________ Analiza se efectueaz n laboratorul toxicologic al Universitii de Stat de Medicin i Farmacie Nicolae Testemianu de chimistul- expert__________ nceputul___________ Sfritul__________

Examenul exterior Pentru cercetare se ia un borcan de sticl alb, cu volumul de 500 ml, acoperit cu permanganat, cu inscripia Borcanul Nr. 1- buci de ficat i rinichi. Coninutul probei prezint buci de organe indicate cu masa: ficat- 250 g, rinichi- 200 g. Reacia coninutului probei (turnesol- neutr). La miros- nimic deosebit. Cercetatrea chimic 100 g material biologic din borcanul Nr. 1 se amestec cu ap distilat pn la o consisten dens, se aciduleaz cu acid oxalic pn la pH slab acid (hrtia indicator turnesol) i se supune antrenrii cu vapori de ap: 1- a fracie a distilatului n volum de 3 ml s- a adunat ntr- un volum de 5 ml soluie NaOH1%. Fracia a 2- a (25 ml) i a 3- a (25 ml) se adun separat fr adaos de NaOH. Cercetarea distilatului 1. La 1- a fracie de distilat se adaug cteva picturi de sulfat de Fe i 1- 2 picturi sol. clorur de Fe, apoi lichidul se aciduleaz cu HCl pn la pH slab acid. Nici deodat, nici peste 48 ore precipitat albastru n- a aprut. 2. La a 2- a fracie se face proba cu sol. de rezorcin n NaOH, care se nclzete, dar nu se observ coloraie. 3. La a 2- a fracie se efectueaz proba cu sol. de Iod n NaOH. La nclzire pe baia de ap cade precipitat galben cu miros de cloroform. 4. La o parte din fracia a 2- a se adaug volum egal de sol. ac. sulfuric 20% i cteva cristale KMnO4. Peste un interval de timp se simte miros plcut de fructe. Peste 20 min., lichidul se filtreaz i cu filtratul incolor se efectueaz reaciile urmtoare: a.la jumtate din filtrat se adaug 1/5 volum ac. sulfuric conc., n care au fost solubilizate cteva cristale de morfin. Culoare albastr- violet nu s- a observat. b.la a 2- a jumtate de volum a filtratului se adaug acelai volum de ac. fuxin sulfuros i 1 ml ac. sulfuric conc.. Nu se observ nici o coloraie.

49

5. Cteva cristale de acetat de Na se dizolv la 1 ml sol. din distilatul 2, care se amestec cu un volum dublu de ac. sulfuric conc. La o uoar nclzire se simte miros de etilacetat. 6. O parte din distilatul 2 se amestec cu acelai volum sol. alcoolic 5% NaOH i se nclzete atent timp ndelungat, la rcire se adaug ac. azotic i apoi se adaug sol. nitrat de Ag 5%. Formarea opalescenei i precipitatului nu se observ. Reziduurile distilatului 2 se amestec cu al 3- lea i se supun cercetrilor. 7. La o parte din distilat se adaug cteva picturi ap de Br, unde imediat se formeaz opalescen glbuie; o jumtate din distilat se supune deflegmaiei de 2 ori. Dup a 2- a deflegmaie s- a colectat n 1- l distilat 5 ml lichid, n al 2- lea 10 ml lichid. Cu 1- l distilat s- au efectuat reaciile descrise n p. 3, 4, 5 cu acelai rezultate, la efectuarea reaciei descrise n p. 5 mirosul de etilacetat devine mai pronunat. n urma reaciei cu apa de Br, opalescena nu se observ. 8. A 2- a parte a mestecului distilat se unesc, se alcalinizeaz cu carbonat de Na i se repet extracia cu eter. Extraciile eterice se unesc, se filtreaz, iar eterul se nltur la temperatura camerei. Reziduul a fost nensemnat. Dup solubilizarea lui n 2- 3 picturi ap distilat se adaug 2 picturi clorur de Fe, proaspt pregtit. Culoarea violet nu se observ. Concluzie Din analiza efectuat i descris rezult c n materialul biologic al ceteanului X s- a identificat alcool etilic. Nu s- au identificat: ac. cianhidric, alcoolul metilic, cloroformul, tetraclorura de carbon, cloralhidratul, formaldehida, fenolul, alcoolul izoamilic.

50