DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR PRODUSE DE STREPTOCOCI

Streptococii aparin unui ansamblu heterogen de coci gram pozitivi, sferici sau ovoidali, dispui n perechi sau lanuri, nesporulai, imobili, facultativ anaerobi, lipsii de citocromi i catalaz, avnd necesiti nutriionale complexe. Din punct de vedere taxonomic streptococii aparin familiei Streptococacceae, care nglobeaz 7 genuri (Streptococcus, Enterococcus, Aerococcus, Gemella, Leuconostoc, Pediococcus i Lactococcus), mprite, la rndul lor, n peste 80 de specii i subspecii. Datorit marii diversiti a acestor germeni, nu este suficient un singur criteriu de clasificare care s-i poat diferenia. Astfel, pe baza tipului de hemoliz produs pe mediile cu snge, streptococii se clasific n: streptococi beta hemolitici, care produc hemoliz complet, clar, denumit hemoliz de tip beta, caracteristic speciilor patogene; streptococi alfa hemolitici care produc hemoliz incomplet, cu aspect voalat, nceoat; streptococi alfa hemolitici care produc hemoliz parial cu apariia unei coloraii verzui a mediului (hemoliz viridans), caracteristic streptococilor viridans i pneumococilor; streptococi nehemolitici. Criteriul de clasificare bazat pe structura antigenic (introdus de Lancefield) este cel mai important din punct de vedere clinic i epidemiologic. Dup natura antigenului polizaharidic C din peretele celular (antigen specific de grup), streptococii se mpart n grupe serologice, desemnate cu literele mari ale alfabetului latin. Pn n prezent s-au identificat serogrupurile notate de la A la H i de la K la V. Fiecare grup poate fi divizat n serotipuri (notate cu cifre arabe), pe baza antigenelor proteice de perete. Grupul A, cel mai important din punct de vedere al patogenitii, se mparte n funcie de proteinele M i T (antigene specifice de tip) n peste 80 de tipuri. Urmeaz, n ordinea frecvenei, grupurile C, G, B, D, F. Streptococii lipsii de antigen de grup (cea mai mare parte din streptococii viridans, S. pneumoniae etc.) nu sunt inclui n grupele Lancefield. n practica curent a laboratoarelor de bacteriologie, clasificarea se bazeaz pe o combinaie de caracteristici care includ tipul de hemoliz pe geloz-snge, structura antigenic, caracterele culturale i biochimice.

11.1. Streptococcus pyogenes (streptococul de grup A)

Diagnosticul de laborator presupune izolarea i identificarea germenilor prin diagnostic bacteriologic i evidenierea anticorpilor antistreptococici prin diagnostic serologic. Semnificaia clinic. Streptococii piogeni produc infecii cu localizri variate i manifestri clinice diverse. Infeciile acute, cu localizare respiratorie (faringita, scarlatina), pot evolua spre complicaii grave, prin mecanism alergic, de tipul reumatismului articular acut, carditei reumatismale, glomerulonefritei acute, eritemului nodos, coreei i purpurei streptococice. Infeciile cu localizare cutanat (erizipel, impetigo, intertrigo, pemfigus), precum i cele genitale post-abortum i post-partum, nediagnosticate la timp i incorect tratate pot evolua spre complicaii poststreptococice supurative, care se manifest precoce (celulite, flegmoane, abcese, septicemii etc.). Recoltarea. Exudatul faringian se recolteaz dimineaa, nainte ca pacientul s mnnce. Se vor terge amigdalele i peretele posterior al faringelui, evitndu-se atingerea cu tamponul faringian a limbii, a luetei i contaminarea lui cu saliv. La purttorii sntoi se recolteaz exudatul nazo-faringian, nazal.

n infeciile plgilor (plgi chirurgicale, arsuri etc.), precum i n alte afeciuni purulente (otite, sinuzite) produsul patologic este puroiul, care se recolteaz cu un tampon. n afeciunile superficiale ale pielii (impetigo, ectima, pemfigusul nou-nscuilor) se ndeprteaz crusta i se recolteaz coninutul vezicular prin frecarea ferm a tamponului de leziune. Manevra este dureroas, dar necesar pentru a asigura un numr ct mai mare de germeni n prob. LCR, sngele, urina etc. se recolteaz conform metodologiei uzuale. Dup recoltare, produsul patologic se va expedia la laborator. Transportul difer n funcie de natura prelevatului. Tampoanele utilizate pentru recoltarea exudatelor (faringian, nazo-faringian, nazal i din leziunile cutanate) se vor transporta n maximum dou ore. Dac acest interval se va prelungi, tampoanele se introduc n eprubete ce conin un mediu selectiv mbogit: mediu Pick (bulion glucozat 0,2%, hematiii de iepure sau berbec, azid de sodiu i cristal violet); bulion Todd-Hewitt (bulion, glucoz 0.2%, neopepton, infuzie de cord de bou). Aceste medii conin substane care favorizeaz dezvoltarea streptococilor (bulionul, glucoza, hematiile) i substane care inhib flora de asociaie (cristalul violet inhib creterea stafilococilor, iar azidul de sodiu pe cea a bacililor gram negativi). LCR, sngele, urina, sputa i alte produse lichide se vor transporta imediat sau n interval de maximum o or de la recoltare. Examenul direct. Examenul macroscopic se poate aplica unui numr restrns de produse patologice, ca de pild n afeciunile purulente n care se va observa aspectul seros al puroiului i n meningite, cnd LCR este tulbure, opalescent. Examenul microscopic. Examenul direct al exudatului faringian, nazal i din leziunile cutanate are valoare redus, datorit existenei n aceste zone a streptococilor nepatogeni, care nu difer morfologic de cei patogeni. Prin urmare examenul microscopic nu este uzual. Tehnicile actuale permit ns detectarea direct a S.pyogenes din exudatele faringiene. Kiturile utilizate n acest scop conin materialele necesare extraciei antigenului de grup A din prelevatul faringian prin mijloace enzimatice sau chimice. Detectarea serogrupului se face fie prin metoda Elisa, fie prin latex-aglutinare sau coaglutinare. Totui aceste teste rapide au valoare orientativ, diagnosticul bacteriologic fiind obligatoriu. LCR i urina vor fi centrifugate i din sediment se vor efectua frotiuri colorate Gram care relev leucocite, coci gram pozitivi, ovalari, dispui izolat sau n lanuri, uneori fagocitai. Izolarea germenilor. Streptococii necesit, n general, medii de izolare cu snge datorit faptului c le lipsete catalaza. Se utilizeaz medii mbogite cu glucoz (care le stimuleaz nmulirea) i lichide organice (snge de iepure, cal, oaie, ser, lichid de ascit), care asigur aportul de aminoacizi i vitamine. Astfel de medii sunt geloza-snge, bulionul Todd-Hewitt, mediul SSP (mediu selectiv pentru streptococ i pneumococ care conine geloz, acid nalidixic, cristal violet, glucoz, snge difibrinat de berbec) etc. Mediul de izolare se alege n funcie de produsul nsmnat. Cel mai frecvent se utilizeaz geloz-snge de oaie 5%. Exudatele faringiene recoltate se pot nsmna n prima zi n mediu Pick care favorizeaz nmulirea streptococilor n dauna altor specii. A doua zi se fac treceri pe geloz snge. Incubarea se face n atmosfer de CO 2 10%. Identificarea se bazeaz pe caracterele culturale i structura antigenic. Caractere culturale. Pe geloz-snge de oaie streptococul de grup A dezvolt colonii mici, pulverulente (diametrul n jur de 0,5 mm), transparente sau translucide, bombate cu zona larg de hemoliz clar de tip beta, ce depsete de 2-4 ori diametrul coloniei. Privite la lup, aceste colonii pot prezenta 4 aspecte: colonii mucoide (rotunde, convexe, opace), matt (plate, confluente, cu suprafaa mamelonat), glossy (mici, rotunde, lucioase, cu centrul ridicat, de consisten apoas) i colonii R, rugoase, (plate, cu margini neregulate).

Primele dou tipuri sunt caracteristice streptococilor viruleni, iar ultimele aparin streptococilor lipsii de antigen M (neviruleni). Aceste aspecte culturale variaz ns considerabil, n funcie de mediul utilizat i atmosfera de incubare. Astfel, pe geloz snge de cal coloniile sunt mari, mucoase cu diametru de 1-2 mm cu o zon de hemoliz clar n jur. Diferenierea bolnavilor de purttorii sntoi se poate face i prin aprecierea semicantitativ a creterii culturale, un numr redus de colonii indicnd, de obicei, starea de portaj. Identificarea grupului. Testul sensibilitii la bacitracin. Este o metod simpl, larg utilizat, care difereniaz streptococii de grup A, sensibili, de restul grupurilor rezistente la bacitracin. Se repic sub lup cteva colonii de streptococi betahemolitici ntr-o eprubet cu bulion glucozat 0,2%. Dup incubare la 37C, timp de 18-24 ore se examineaz cultura, care prezint aspect caracteristic (mediu limpede, cu depozit pe fundul i pereii eprubetei). Se controleaz puritatea culturii printr-un frotiu colorat Gram sau cu albastru de metilen, apoi se nsmneaz foarte dens cu ansa pe o plac cu geloz-snge. n mijlocul ariei nsmnate se depune un microcomprimat de bacitracin i se incubeaz placa la 37C pn a doua zi, cnd se citete i se interpreteaz. Dac tulpina de cercetat aparine grupului A, creterea ei va fi inhibat pe o arie cu diametrul de minimum 10 mm n jurul microcomprimatului. Dac creterea se produce i n jurul microcomprimatului de bacitracin, germenul cercetat aparine altui grup serologic. nsmnarea pe mediul Todd-Hewitt, cu adaos de trimetoprim i sulfametoxazol, permite diferenierea grupurilor A i B, rezistente, de grupurile C i G, sensibile. Dar exist rezerve n privina utilizrii acestei metode, deoarece este costisitoare i prelungete timpul de incubaie, ceea ce ntrzie obinerea rezultatelor. Metode bazate pe reacii Ag-Ac. Determinarea grupului se face prin reacii de precipitare sau aglutinare. Aceste reacii antigen-anticorp impun contactul direct dintre Ag de grup (polizaharidul C) i Ac omolog (ser anti-grup A, anti-grup B etc.). Deoarece antigenul de grup se gsete n profunzimea peretelui celular al streptococilor, n stratul intermediar, el trebuie descoperit de sub stratul proteic care l acoper i nu permite contactul cu serul specific anti-grup. Extracia polizaharidului se poate realiza chimic (cu HCl sau formamid) la cald, sau enzimatic. Reacii de precipitare. Metoda Lancefield este o reacie de precipitare n inel n care se pune n contact Ag de grup (polizaharidul C) cu seruri antistreptococice specifice de grup, extracia carbohidratului realizndu-se cu HCl, la cald. Este foarte rar utilizat deoarece exist tehnici mai simple i mai precise. Reacii de aglutinare (prin extracia enzimatic a polizaharidului C) sunt cele mai utilizate dup testul la bacitracin. Metoda coaglutinrii (testul STREPTIC) este o reacie de aglutinare pe lam, cu seruri antistreptococice absorbite pe proteina A a stafilococilor. Este metoda cea mai accesibil i prin urmare cel mai frecvent utilizat n ara noastr. Institutul Cantacuzino, Bucureti, comercializeaz n acest scop trusa STREPTIC, care conine 1 flacon cu extract pancreatic i 4 flacoane cu seruri antistreptococice de grup A, B, C i G. Se nsmneaz cteva colonii din tulpina de cercetat n bulion glucozat de 0,2%, la care se adaug extract pancreatic. Eprubeta se incubeaz la 37C pn a doua zi, apoi se centrifugheaz. Supernatantul se decanteaz, iar sedimentul se aspir cu pipeta Pasteur, se depune cte o pictur din acesta pe lam i se pune n contact cu o pictur din fiecare ser specific de grup. Antigenul de grup, extras enzimatic, n contact cu anticorpii adsorbii pe stafilococi vor produce n cteva minute o reacie de aglutinare vizibil cu ochiul liber, la serul de grup corespunztor. Metoda latex-aglutinrii este tot o reacie de aglutinare pe lam, dar n care anticorpii specifici de grup au ca suport particule inerte de latex-polistiren, tehnica i interpretarea fiind similare cu coaglutinarea. Recent s-au introdus teste imunologice rapide de identificare a streptococului piogen direct din produsul patologic. Dei sunt mai costisitoare dect cultura pe geloz-snge, ele prezint avantajul rapiditii n obinerea rezultatului (permit evidenierea antigenelor streptococice ntr-un

interval de 10-15 minute, fr a impune apelarea la un laborator bacteriologic). Dintre aceste teste menionm: Ventrex, Directogen, Phadirect Strept A, Clearview etc. Dei sunt specifice i sensibile, ele au eficacitate mai slab dect cea a culturii n diagnosticul infeciilor streptococice i depistarea purttorilor. De aceea, cea mai sigur metod de identificare a streptococilor piogeni rmne cea bacteriologic. Practic, laboratoarele de bacteriologie din ara noastr utilizeaz dou metode de identificare a grupului serologic: testul la bacitracin pentru streptococii de grup A i coaglutinarea pentru streptococii non grup A. Determinarea tipului este necesar n scop epidemiologic la streptococii de grup A. Astfel, se efectueaz: tipajul M, prin reacie de precipitare n tuburi capilare, cu seruri anti-M specifice de tip adsorbite, sau prin dubl difuzie, cu seruri neadsorbite; tipajul T se efectueaz prin reacie de aglutinare pe lam, n prezena serurilor anti-T adsorbite. O tulpin poate fi aglutinat cu un singur ser, identificndu-se astfel tipul, sau cu mai multe seruri, cnd se realizeaz paternele T. n ara noastr tipajul se efectueaz la centrul de referin Institutul Cantacuzino, care identific paternele T; PCR petntru clasificarea germenilor non-M tipabili. Sensibilitatea la antibiotice. n cazul izolrii streptococilor de grup A, antibiograma nu este necesar deoarece pn n prezent nu s-au semnalat tulpini rezistente la penicilin. Pacienii alergici la penicilin pot fi tratai cu eritromicin. Dup identificarea serogrupului A prin testul la bacitracin, examenul bacteriologic se consider ncheiat i se poate elibera buletinul de analiz cu rezultatul definitiv. n cazul izolrii streptococilor de grup C i G, precum i a streptococilor negrupabili, antibiograma este obligatorie. Diagnosticul serologic. Datorit faptului c n evoluia complicaiilor post-streptococice tardive germenii sunt greu evideniabili n cultur, se urmrete determinarea anticorpilor antistreptococici prin teste serologice. Se pun n eviden anticorpii prezeni n ser att fa de componentele endocelulare ct i fa de produii extracelulari streptococici. Astfel se determin anticorpii: anti-SLO (ASLO), fie prin reacie de neutralizare n tuburi (reacie de referin care utilizeaz ca indicator hematiile de iepure), fie printr-o metod rapid de aglutinare pe lam. Reacia d informaii despre o infecie streptococic recent, cnd se evideniaz creterea n dinamic a titrului, despre eficiena terapiei antistreptococice, precum i asupra stadiului evolutiv al complicaiilor poststreptococice tardive. Este cea mai utilizat reacie de diagnostic serologic n infeciile cu S. pyogenes. anti-MAP, prin reacie de latex-aglutinare, au valoare n diagnosticul retrospectiv al infeciei acute, cnd titrul ASLO este normal sau crescut nesemnificativ. Se menin mult timp n ser; anti-C, prin reacie de aglutinare, au evoluie similar cu anticorpii anti-MAP, prezena lor semnificnd constituirea unei valvopatii cronice; anti-DN-az au titrul crescut semnificativ n glomerulonefrita acut post-streptococic, spre deosebire de titrul ASLO, care n acest caz are valori mult mai mici; anti-SK, determinai prin test de neutralizare, au valori paralele cu titrul ASLO. Evidenierea i titrarea anticorpilor ASLO se menine ca metod de rutin. Numai n cazurile n care rezultatele reaciei ASLO nu concord cu suspiciunea clinic, se apeleaz la alte metode serologice. Utilizarea concomitent a mai multor teste, crete ansa diagnosticului etiologic. Reacia ASLO. Reprezint metoda de rutin n serodiagnosticul infeciilor streptococice produse de serogrupurile A, C, G. Este o reacie de neutralizare in vitro care se bazeaz pe proprietatea anticorpilor ASLO de a anihila efectul litic al antigenului (streptolizina O) asupra hematiilor (de iepure).

Reacia are loc n tuburi, n care se pun n contact diluii din serul de cercetat cu cantitatea standard (o unitate combinant) de streptolizin O (SLO). Dup o scurt perioad de incubare necesar cuplrii specifice dintre Ac i Ag se adaug suspensia de hematii ca mijloc revelator. n cazul existenei Ac n ser se produce neutralizarea SLO. Aceasta nu-i poate exercita aciunea litic asupra hematiilor, ceea ce se traduce vizual prin lipsa hemolizei n tuburi (hematiile se depun n buton pe fundul eprubetelor). n eprubetele n care, la diluiile respective, Ac sunt insuficieni pentru a neutraliza SLO, efectul litic al acesteia se observ prin prezena hemolizei. Tehnica reaciei. Materiale necesare: sngele, recoltat prin puncie venoas cu seringa steril, uscat sau splat cu ser fiziologic, se depune ntr-o eprubet steril. Dup centrifugare, serul se decanteaz n alt eprubet steril i se inactiveaz 30 minute la 56C. Se evit posibilitatea contaminrii serului, ntruct serurile contaminate pot conine inhibitori care conduc la rezultate false. Serul trebuie s fie limpede, fr hematii i nehemolizat; soluie rivanol 0,4% necesar pentru tratarea serului cu scopul ndeprtrii inhibitorilor nespecifici. 0,2 ml ser inactivat se trateaz cu 0,7 ml soluie rivanol. Se las n contact 1015 minute la temperatura camerei, timp n care apare un precipitat. Se centrifugheaz i se decanteaz. Supernatantul se dilueaz cu 1,1 ml soluie salin izotonic tamponat i se obine astfel diluia 1/10. Din aceasta se prepar diluiile de lucru 1/100 i 1/500 (vezi schema reaciei); hematii difibrinate de iepure, splate de 2-3 ori cu ser fiziologic. Dup splare se readuce suspensia la volumul iniial i se prepar o diluie 5% n ser fiziologic. n lipsa hematiilor de iepure se pot utiliza hematii de berbec sau de om de grup 0. streptolizina O (livrat de Institutul Cantacuzino n stare liofilizat i activat) se utilizeaz ca atare, prin solvirea coninutului din fiol n ap distilat sau ser fiziologic n cantitatea indicat pe fiol. Se repartizeaz n fiecare tub al reaciei cte 0,5 ml (cantitatea corespunde unei uniti combinante); ser fiziologic steril pentru splarea hematiilor i realizarea diluiilor din serul de cercetat; eprubete: 16/16 cte 3 buci pentru diluiile iniiale de lucru (1/10, 1/100,1/500) 12/12 cte 10 pentru fiecare ser de cercetat 4 eprubete pentru tuburile martor; pipete gradate de 1 ml i 10 ml. Martorii reaciei: Martor pozitiv: ser cu titrul ASLO ridicat peste valoarea normal. Martor negativ: ser cu titrul ASLO mai mic dect valoarea normal. Martor hematii: tub cu hematii + ser fiziologic. Martor antigen: tub cu hematii + SLO. Citirea reaciei se face n doi timpi: prima citire dup scoaterea eprubetelor de la termostat; citirea definitiv a 2-a zi dupa pstrarea probei la +4C. Titrul ASLO este dat de ultima diluie (ultimul tub) n care lipsete complet hemoliza. Citirea martorilor: Martor pozitiv: hemoliz absent (hematii depuse n buton). Martor negativ: hemoliz complet. Martor hematii hematii depuse n buton. Martor SLO: hemoliz complet. Interpretarea rezultatelor. Titrurile normale ASLO se situeaz ntre 166-200 u/ml. Ele variaz n funcie de vrst, arie geografic, sezon. Astfel, sub vrsta de 14 luni o infectie streptococic nu determin creterea ASLO, iar sub 2 ani creterile rmn nesemnificative. n infeciile cutanate titrul ASLO este normal.

Titrul ASLO > 200 u/ml d informaii despre: o infecie streptococic n antecedentele recente ale pacientului, cnd se nregistreaz creterea n dinamic a titrului. Dup o angin streptococic titrul ASLO crete n 2-3 sptmni, atinge nivelul maxim la 5 sptmni i scade apoi lent, pn la 6-12 luni (n cazul n care boala se vindec); instalarea sau agravarea unei complicaii poststreptococice (cu excepia coreei, cnd ASLO este normal); eficiena tratamentului. Antibioticoterapia instituit precoce face c titrul ASLO s creasc mai puin, iar corticoterapia determin revenirea mai rapid la valori normale. n infeciile streptococice netratate titrurile ating valori maximale (pn la 2500 u/ml); starea de purttor sntos. Valori fals pozitive se pot nregistra n hiperlipemii, hiper- -globulinemii (mielom multiplu). Valori fals negative (ASLO normal ) apar la 15-20% din totalul infeciilor streptococice. Reacia ASO-LATEX este o metod rapid de evideniere a anticorpilor ASLO prin latexaglutinare pe lam. Se utilizeaz trusa ASO-LATEX comercializat n ara noastr, dar pot fi efectuate determinri bazate pe aceeai metod folosind alte truse, denumirea lor variind n funcie de firma productoare. Kitul menionat servete la punerea n evident pe lam, a anticorpilor ASLO din ser nediluat (metoda calitativ) sau la determinarea semicantitativ a acestora. Serul de cercetat se pune n contact, pe lam, cu reactivul ASO-LATEX (suspensie de particule uniforme de latex, sensibilizate n prealabil cu SLO stabilizat). Particulele de latex fac posibil observarea cu ochiul liber a reaciei Ag-Ac. Citirea se face dup aproximativ 2 minute. Dac serul de cercetat conine anticorpi ASLO n cantitate suficient, suspensia i pierde aspectul omogen i aglutinarea particulelor devine evident. O granulaie care depete pe cea a controlului negativ indic prezena a cel putin 200 u ASLO/ml. Lipsa aglutinarii indic un titru < 200 u ASLO/ml. Trusa conine de asemenea, un martor pozitiv (soluie de -globulin uman cu titrul ASLO > 200 u/ml) i un martor negativ (soluie de -globulin uman cu titrul ASLO < 200 u/ml).

11.2. Streptococcus agalactiae (streptococul de grup B)

S. agalactiae este un germen comensal al intestinului, vaginului, uretrei (la brbat), perineului i cilor respiratorii superioare. Semnificaia clinic. S. agalactiae poate fi cauza unor infecii severe la nou-nscui i aduli. La nou nscui contaminarea are loc n timpul naterii cu flora tractului genital matern. Infeciile neo-natale mbrac dou forme clinice, n funcie de calea i momentul contaminrii. Forma predominant precoce, la 10 zile dup natere este pneumonia, streptococul fiind de origine matern, iar cea tardiv, la dou sptmni dup natere, meningita, de provenien nosocomial. Bacteriemia este prezent n ambele cazuri i prognosticul este grav. La femei tinere provoac infecii urogenitale, iar la btrni cu diverse tare, meningite, infecii respiratorii, endo- i miocardite acute, septicemii. Recoltarea i examenul direct. n general se recolteaz secreii vaginale i cervicale i LCR. Izolarea i identificarea. Se face pe geloz-snge i geloz chocolat. Se poate nsmna mediu de mbogire Todd-Hewit cu extract de drojdie, colistin i acid nalidixic i apoi pe mediile solide menionate. Dup nsmnare mediile se incubeaz la 37C pentru 24 ore, n aerobioz sau n atmosfer cu CO2. Identificarea se bazeaz pe caracterele culturale i structura antigenic. Caractere culturale. Pe geloz snge streptococii de grup B dezvolt colonii ceva mai mari dect ale streptococilor de grup A, cu hemoliz variabil. Structura antigenic. Identificarea grupului se face prin metode screening i metode bazate pe reacii antigen anticorp (aceleai cu cele utilizate pentru identificarea grupurilor A,C,G).

Metode screening. Testul CAMP. Hemoliza incomplet reprezint primul indiciu de recunoatere a acestor germeni, pe ea bazndu-se identificarea streptococilor de grup B prin testul CAMP. Streptococii de grup B produc o protein termostabil difuzibil, numit CAMP-factor, care intensific zona de hemoliz incomplet produs de -hemolizina stafilococului auriu. Testul se poate efectua prin: a) metoda convenional: pe o plac cu geloz-snge de oaie se nsmneaz n striuri perpendiculare tulpina de identificat i o tulpin de S. aureus productoare de hemolizin; b) pe geloz-snge se nsmneaz cu ansa ntr-un striu unic tulpina de cercetat i la distan de 3-4 mm de striu se depune un disc impregnat cu -hemolizin stafilococic. Placa nsmnat printr-una din cele dou modaliti se incubeaz n aerobioz sau n atmosfer de CO2 i a doua zi se citete. La jonciunea dintre zona de hemoliz a streptococilor i hemoliza incomplet a stafilococului apare o zon de hemoliz total (test pozitiv). Testul este prezumptiv deoarece d rezultate pozitive i la alte grupe de streptococi. De aceea identificarea streptococilor de grup B trebuie confirmat prin alte metode. Pigmentogeneza. Se urmrete pe medii ce conin amidon n prezena cruia S.agalactiae produce un pigment rou-portocaliu. La mediu se mai poate aduga metronidazol i gentamicin, antibiotice la care S.agalactiae este natural rezistent i care vor mpiedica dezvoltarea florei asociate. Testul hipuratului de Na este pozitiv (hidrolizeaz hipuratul de Na). Identificarea tipului. La streptococii de grup B s-au descris pn n prezent 5 tipuri antigenice dup natura polizaharidului de tip (capsular sau de nveli): Ia, Ib, Ic, II i III. Ele se identific la centrul de referin Cantacuzino prin reacii de precipitare cu seruri hiperimune specifice de tip. Sensibilitatea la antibiotice. Testararea sensibilitii este obligatorie, mai ales datorit faptului c s-au semnalat tulpini tolerante sau chiar rezistente la penicilin. n formele grave penicilina poate fi nlocuit sau asociat cu un aminoglicozid.

11.3. Streptococii viridans

Streptococii viridans, denumii i streptococi orali sunt comensali ai cavitii bucale, intestinului, pielii i cilor genitale. Printre speciile care joac un rol etiologic predominant n formarea cariilor dentare i a paradontopatiilor se numr S.mutans, S.sanguis, S. anginosus (S. milleri). Streptococii viridans sunt identificai frecvent ca ageni etiologici ai endocarditei subacute. Ptruni n circulaie cu ocazia extraciilor dentare, a interveniilor n sfera ORL sau maxilofacial i chiar a traumatismelor minore, se grefeaz la nivelul valvulelor cardiace la persoanele cu risc (cardiopatie valvulara) sau a protezelor valvulare. Diagnosticul endocarditei subacute se face prin hemoculturi. S. anginosus este agent patogen ntlnit n infecii purulente (abcese, peritonite, pleurezii, artrite) i infecii neonatale (septicemii i meningite). Diagnosticul de laborator al acestor afeciuni este bacteriologic i se efectueaz numai atunci cnd germenii se izoleaz din lichide organice care sunt n mod normal sterile. Izolarea se face prin insmnarea produselor patologice pe geloza-snge. Dup incubarea plcilor la 37C, 24 de ore se examineaz caracterele culturale. Prezena de colonii mici, cu hemoliza (viridans=verde) sugereaz prezena streptococilor viridans sau a pneumococilor. Pentru precizarea diagnosticului se cerceteaz sensibilitatea la optochin i biloliza (teste de diferentiere cu pneumococii). Pentru stabilirea speciei se cerceteaz propietile biochimice (prin sistemul API). Streptococii viridans se pot identifica prin excludere : nu sunt hemolitici, sunt

insolubili n bil, nu sunt sensibili la optochin, nu au antigen de grup, nu tolereaza NaCl 6.5%, nu cresc la 10C i 45C, majoritatea au testul la bil esculin negativ. Cnd se evideniaz aceste particulariti se confirm prezena S. viridans.

11.4. Streptococcus pneumoniae

Semnificaia clinic. Comensal al cilor respiratorii superioare la om, S. pneumoniae poate deveni virulent atunci cnd este ncapsulat. Este principalul agent etiologic al meningitelor la copii, produce infecii respiratorii (pneumonia franc lobar, bronhopneumonii), uretrite etc. Diagnosticul acestor infecii este bacteriologic. Recoltarea. Se recolteaz sput, LCR, exudate, sngele etc., n funcie de localizarea infeciei. Examenul direct macroscopic este util n pneumonii, deoarece sputa are un aspect ruginiu caracteristic. Examenul microscopic al frotiurilor colorate Gram din sput evideniaz PMN i diplococi gram pozitivi, lanceolai, dispui n lanuri scurte sau perechi izolate, ncapsulai. Au aspect caracteristic, ca dou flcri de lumnare care se ating cu bazele. Izolarea se face pe geloz snge iar incubarea, de preferin, n atmosfer de CO 2, la 37C, timp de 24 ore. Identificarea. Caractere culturale. Pe geloza-snge pneumococul dezvolt colonii mici, netede, mucoide, cu diametrul n jur de 1 mm, cu zona de liz n jur. Coloniile tinere sunt bombate, dar prin nvechire se aplatizeaz i au centrul deprimat datorit elaborrii de autolizine. Aceste aspecte culturale (cu excepia proprietii autolitice) se ntlnesc i la streptococii viridans, ceea ce impune efectuarea testelor de difereniere. Testul la optochin. Se repic n striuri dese pe o plac cu geloz-snge cteva colonii izolate din tulpina de cercetat.n mijlocul ariei nsmnate se depune un microcomprimat de optochin. Se incubeaz 24 ore la 37C. Testul este pozitiv (germenii sunt sensibili la optochin) dac n jurul microcomprimatului de optochin cultura este inhibat pe o arie de minimum 20 mm. Este un test foarte specific, care difereniaz pneumococii (sensibili) de streptococii viridans (rezisteni la optochin). Biloliza (solubilizarea prin bil sau sruri biliare). Se nsmneaz tulpina de cercetat n dou eprubete cu bulion glucozat. A doua zi se adaug ntr-o eprubet 1 ml bil sau 1 ml sruri biliare (dezoxicolat sau taurocolat de Na 10%), iar n cealalt eprubet ser fiziologic (tub martor). Dup o or de incubare la termostat se compar cele dou eprubete. Dac n bulion s-au dezvoltat pneumococi, tubul n care s-au adugat sruri biliare se va limpezi, comparativ cu martorul care rmne opac. Bila sau srurile biliare favorizeaz elaborarea autolizinelor, care vor determin liza pneumococilor. n cazul streptococilor viridans, testul este negativ. Boala experimental la oarece. oarecele alb este foarte sensibil la infecia cu S. pneumoniae. Se injecteaz la baza cozii tulpina de cercetat. oarecele face n 2 zile o septicemie mortal. Prin hemocultur se izoleaz S. pneumoniae, iar pe amprentele din splin se vd diplococii incapsulai cu dispoziie caracteristic. Identificarea tipului serologic se poate face fie direct din produsul patologic (dac acesta este lichid), fie din cultura de 10-14 ore n mediu lichid (dar pe medii speciale pe care pneumococul poate sintetiza capsula). Se utilizeaz reacia de aglutinare pe lam prin tehnica de umflare a capsulei. Pe o lam se pun n contact o pictur din cultura de cercetat sau produs patologic i o pictur din serul specific de tip. Operaia se repet pentru fiecare ser de tip. Apoi se adaug cte o pictur de albastru de metilen la fiecare amestec Ag-Ac. Dup 10 minute se examineaz la microscop, la obiectivul cu imersie. Acolo unde tipul antigenic ntlnete serul omolog se observ aglutinarea pneumococilor i prezena unei capsule bine delimitate, mult mrit comparativ cu celelalte seruri.

Sensibilitatea la antibiotice. S.pneumoniae este sensibil la penicilin. Au fost semnalate i tulpini rezistente motiv pentru care efectuarea antibiogramei devine obligatorie.

11.5. Genul Enterococcus

Genul Enterococcus, intrat recent n taxonomie, include 12 specii, din care 10 s-au izolat n infecii umane: endocardite, infecii uro-genitale, meningite i infecii neonatale. A fcut parte din genul Streptococcus, grupul D. Dintre speciile cu habitat uman, E. faecalis i faecium constituie grupul enterococilor care au capacitatea de a se dezvolta pe medii cu concentraii de NaCl 6,5% sau pe medii cu bil 40%. Izolarea se face pe geloz snge, coloniile fiind mici, cu hemoliz variabil. Identificarea se bazeaz pe structura antigenic (enterococii au polizaharidul de grup D) i pe caracterele biochimice. Genul Enterococcus este definit prin caractere biochimice ilustrate n tabelul 12. Identificarea speciei n cadrul genului se face pe baza formrii de acid din manitol, sorbitol, sorboz i a hidrolizei argininei etc. Sensibilitatea la antibiotice. Cu toate c enterococii sunt sensibili la vancomicin, penicilin, nici unul din aceste antibiotice nu atinge concentraii serice eficiente terapeutic n infeciile grave ca, de pild, n endocardite. n tratamentul acestora se recomand asocierea penicilinei, a vancomicinei cu un aminoglicozid. Testarea sensibilitii la antibiotice este util datorit apariiei tulpinilor rezistente prin plasmide.