Curs de Biofizic

V rugm: gndii!

9
Prof.dr. Cipriana tefnescu Disciplina de Biofizic i Fizic medical

MICROSCOPIA ELECTRONIC

Antarctic Mite -

Subiecte principale:
Principiul fizic al microscopiei electronice Interaciunea dintre un fascicul de electroni i preparat Partile principale ale unui microscop electronic - Microscopul electronic de transmisie -TEM - Microscopul electronic de baleiaj - SEM Tehnici n relaie cu microscopia electronic

Istoria microscopiei electronice

DATA NUME EVENIMENT 1897 1924 J. J. Thompson Louis de Broglie Descoperirea electronului Identificarea lungimii de unda a electronilor in miscare =h/mv unde: = lungimea de unda h = constanta lui Planck m = masa v = viteza (Pentru un electron la 60kV, = 0.005 nm) 1926 1929 1931 1931 1934 1938 1940 1945 H. Busch E. Ruska Knoll & Ruska Davisson & Calbrick Driest & Muller von Borries & Ruska RCA Efectul de lentila (asupra electronilor) al cmpurilor magnetice sau electrice (Teza de doctorat) cu privire la lentilele magnetice Construirea primului microscop electronic Proprietatile lentilelor electrostatice Depirea rezoluiei MO Primul EM (Siemens) - 10 nm rezolutie EM comercial cu rezolutie 2.4 nm 1.0 nm rezolutie

Microscopie electronica TEM imagini ale membranei

Scala lucrurilor vizibile macro si microscopic:

Rezoluia

Microscopia optica: detalii care nu sunt vizibile cu ochiul liber. Microscopia electronica putem vedea detalii care nu sunt vizibile nici cu ochiul liber si nici in microscopia optica.
a) Drosophila melanogaster, o musculi des folosita ca model animal b) detalii din zona capului (microscopie optica) c) detalii ale ochiului (SEM) (Tobin, Morell)

Principiul fizic al microscopiei electronice

Ipoteza: Orice particul n micare asociaz o und cu lungimea de und Ecuaia lui Louis de Broglie, 1923:

= h/p = h/mv
unde: h constanta lui Planck p = impulsul particulei m = masa particulei v = viteza particulei

Dac viteza crete, scade, puterea de

rezoluie crete:
= h/p = h/mv d = /2n sin u pr = 1/d = 2n sinu /
dar

unde: pr = puterea de rezoluie d = distana minim dintre 2 puncte care pot fi vzute separat n = indicele de refracie u = unghiul de deschidere al microscopului.

Ex:

pt 10 kV, - 130 nm, pt 100 kV, - 30 nm .

Interactiunea dintre fasciculul de electroni si preparat

Tipuri de semnal dupa interactiunea fascicului de elctroni cu preparatul

Fascicul incident de electroni (5-40 kV) Electroni retrodifuzai Raze X: nuclear microanalysis Semnal n vizibil, U.V., I.R. Fenomen de catodoluminescena electroni Auger preparat Electroni secundari: SEM

Electroni transmii: TEM Electroni transmii nedeviai Electroni mprtiai inelastic

Electroni mprtiai elastic

Producerea diferitelor tipuri de particule la interactiunea electronilor incidenti cu atomii:

Imagini TEM

Prtile principale ale unui microscop electronic:

- Microscopia electronica de transmisie - TEM - Microscopia electronica de baleiaj - SEM

Comparatie intre principiul microscopului optic si cel al microscopului electronic:

Partile principale ale unui microscop electronic:

Tunul electronic :
Filament Tungsten

Catod

Fascicol de electroni Anod

Efect termionic

Sursa de electroni

Lentilele electromagnetice
Un cmp magnetic intens este generat prin trecerea unui curent electric printro spiral metalic. Acest cmp magnetic acioneaz ca o lentil convex asupra traiectoriei electronilor. Distana focal poate fi modificat prin modificarea intensitii curentului electric. Imaginea este rotit dependent de puterea lentilei.

Microscopul electronic prin transmisie

Principiul TEM
Se folosesc electroni transmii elastic prin prob e sunt focalizai de 2 lentile condensor, n final e trebuie s iradieze toat suprafaa probei Proba este aezat pe o gril electrostatic Lentil obiectiv Lentil intermediar, reglaj fin Lentile de proiecie Ecran fluorescent sau film

Microscopul electronic de transmisie

comparatie cu microscopul optic

Sursa Lentile condensor Lentile obiectiv Lentile de proiecie

Gril electrostatic: 100 nm grosime (cupru, molibden, aur platina)

Grosime preparat: sute de nanometri

Imagine MET

Bacillus subtilus Cross section through rat ventricular myocytes. A. Nucleus, B. Mitochondria, C. cross section of myosin (thick filaments) and actin (thin filaments), D. caveolae, scale bar 500nm Parisa Asghari, Researcher in Dr. Ed Moore's lab, Department of Cellular and Physiological Sciences, UBC

Microscopul electronic prin transmisie

Calitatea imaginii
Mrirea: raportul dintre mrimea imaginii i mrimea obiectului Rezoluia: 0,1 0,2 nm Luminozitatea: depinde de numrul de electroni transmii (intensitatea fascicolului incident + caracteristicile probei) Marcheri electrono-opaci: elemente cu numar atomic mare (Osmiu, Plumb) care cresc contrastul (absorb electroni)

Calitatea imaginii
mrirea, raportul dintre mrimea imaginii/mrimea obiectului, rezoluia, cu att mai bun cu ct este mai mic i apertura mare (care, ns, mrete aberaiile de sfericitate) la diafragme de 20-70 m rezoluia este 0,1-0,2 nm, luminozitatea imaginii depinde de numrul de electroni transmii intensitatea fascicolului incident caracteristicile probei, raportul semnal/zgomot (semnal util/perturbator), marcherii electrono-opaci utilizai.

Microscopul electronic cu baleiaj

Principiu
Un spot de electroni baleiaz suprafaa probei (punct cu punct) Se folosesc electronii secundari emii din prob Energie mic (0 50 eV) Imaginea se formeaz pe un ecran fluorescent sau pe o pelicul fotografic Se obin imagini ale suprafeei unei celule, a unui microorganism sau a unui esut, de unde impresia de imagine tridimensional. Mrire maximum 200 000 x, cu rezoluie de 3,5 nm.

Microscopul electronic cu baleiaj

Alctuire: - tun electronic: fascicol de e cu diametrul de 50nm - 2-3 lentile condensoare: spot e de 2 nm - o lentil condensoare de reglaj fin - detector , cristal de scintilaie, amplificare - ecranul unui tub catodic sau al unui monitor

Caracteristici
Mrire: maxim x 200 000 (dependent de lungimea baleiajului orizontal) Rezoluie 3,5 nm; cu att mai bun cu ct diametrul spotului este mai mic Luminozitatea fiecrui punct depinde de numrul de e secundari emii i nregistrai din punctul respectiv (unghiul sub care cade spotul de e pe preparat, prezena metalelor grele emit mai muli e). Un fascicul de e cu energie prea mare smulge mai muli e secundari; scade contrastul.

Proporii

Influenarea emisiei de electroni secundari:

- unghiul sub care cade spotul pe preparat, - elementele grele apar mai luminoase, deoarece emit mai muli electroni secundari, - energia electronilor incideni: un fascicol de electroni de energie mare smulge mai muli electroni secundari, din toate zonele preparatului, astfel nct micoreaz contrastul.

Diffrents grains de pollen MEB - des rythrocytes humains vieilles

limphocyt B

Leptocit si microsferocit

Transformare in sferocit Hematii normale

Transformare in echinocit

TEM
versus

SEM

In TEM electronii traverseaz preparate foarte subiri (50-1000 nm). Fascicol de e care iradiaz toat suprafaa probei (bulk). In SEM semnalul (electroni secundari) este emis de pe suprafaa preparatului care are grosime mai mare. Fascicolul de e este foarte fin (subire).

SEM: imagini ale suprafeei

TECHNIQUE RESULTS
1 m

Cilia (a) Scanning electron microscopy (SEM). Micrographs taken with a scanning electron microscope show a 3D image of the surface of a specimen. This SEM shows the surface of a cell from a rabbit trachea (windpipe) covered with motile organelles called cilia. Beating of the cilia helps move inhaled debris upward toward the throat.

TEM: detalii ale structurii interne:

Longitudinal section of cilium (b) Transmission electron microscopy (TEM). A transmission electron microscope profiles a thin section of a specimen. Here we see a section through a tracheal cell, revealing its ultrastructure. In preparing the TEM, some cilia were cut along their lengths, creating longitudinal sections, while other cilia were cut straight across, creating cross sections. Cross section of cilium
1 m

TEM/SEM

Glomerular membrane

The head of an ant

TEM / SEM: limfocit infectat de un retrovirus

TEM

SEM

Microscopul electronic de transmisie (TEM) 1: Tunul de electroni.. 2 Lentile electro-magnetice pentru dirijarea si focalizarea fascicolului de electroni in interiorul coloanei. 3: Sistemul pompelor de vid. 4: Deschiderea prin care se introduc obiectele pentru observatie in camera de vidare. 5: Panouri de operare (stanga pentru aliniere; dreapta pentru marire si focalizare; sageti pentru pozitionarea obiectului in interior). 6: Ecran pentru afisarea meniului si a imaginii. 7: Apa pentru racirea instrumentului.

Microscopul electronic de baleiaj (SEM) 1: Tunul de electroni. 2 Lentile electro-magnetice pentru dirijarea si focalizarea fascicolului de electroni in interiorul coloanei. 3: Sistemul pompelor de vid. 4: Deschiderea prin care se introduc obiectele pentru observatie in camera de vidare in modul SEM normal. 5: Panoul de operare cu instrumente de focalizare, aliniere si marire precum si un joystick pentru pozitionarea obiectului. 6: Ecran pentru afisarea meniului si a imaginii. 7: Unitate-Cryo pentru prepararea materialelor inghetate inainte de introducerea in camera de observare in modul Cryo-SEM . 8: Partea de electronica a microscopului aflata sub masa de lucru.

Tehnica de criofractur :

Criofractura a permis evidenierea aranjrii proteinelor n biomembrane

SEM imagini ale hematiei:

Paianjen acoperit cu atomi de aur, preparat pentru MEB

Imaginea MEB (SEM) a unui paianjen

Electron microscope image of a fly foot

Avian flu virus is one of at least a dozen potentially deadly infectious diseases that may become more widely distributed because of global climate change.

Microanaliza nuclear
1948-1950, Raymond Castaing printele microanalizei nucleare (teza de doctorat)

La interacia unui fascicul ngust (sub un micrometru) de electroni cu un eantion, fiecare element chimic produce radiaii X cu o lungime de und caracteristic, conform legii Moseley. Cu ajutorul unui spectrograf de radiaii X se obine reprezentarea grafic a lungimilor de und a radiaiilor X emise i se poate afla, deci, natura chimic a elementelor prezente.

- MEC - microsonda electronica - spectrograf de radiatii X

1 tun electronic, 2 anod, 3 lentila condensor, 4 spectrometru cu raze X, 5 lentila objectiv, 6 preparat, 10 sistem vacuum (vid).

kn = R(Z-)2 (n-2 - k-2)

Legea Moseley: se refer la radiaia X caracteristic emis de atomi. Frecventa radiatiei X emise de un atom depinde de: -Numrul atomic Z al ellementului -Numerele cuantice principale ale nivelelor ntre care are loc tranziia (n,k) -2 constante (Riedberg - R, o constant de ecran - )

Principiu

Microscopia ionica

Imaginea unor atomi de tungsten prima imagine in microscopia ionica

Principiu asemanator cu al MEB, dar se utilizeaza un fascicul de ioni (rezultat din trecerea unui curent printr-un mediu intens ionizat) care interactioneaza cu suprafata probei, determinand producerea de alti ioni, in relatie cu natura atomilor de suprafata. Acestia sunt colectati de un spectrometru de masa si determina formarea imaginii.

Microscopul prin efect tunel (MET)

Imaginea unui fragment de ADN vzut pentru prima oar graie MET.

Schema de principiu

Atom de aur - imagine obinut cu MET Imaginea obinut cu ajutorul unui MET se poate distinge poziia atomilor

Microscopul electronic cu baleiaj prin efect tunel (MET)

A fost proiectat (inventat) de Gerd BINNING (Germania) i Heinrich ROHRER (Elveia) n anul 1982. n 1986 cei doi fizicieni au fost distini cu premiul Nobel pentru Fizic, mpreun cu Ernst RUSKA (Germania, pentru proiectarea i construirea n 1933 a primului microscop electronic prin transmisie). n cazul microscopului cu efect tunel (MET) nu este necesar o surs extern de radiaii, energia fiind furnizat de nii electronii din stratul superficial al preparatului. n conformitate cu fizica clasic, un electron poate prsi atomul numai dac primete o energie mai mare dect energia sa de legtur. Adic, trebuie s treac peste bariera de potenial. n mecanica cuantic, dat fiind caracterul dual al electronilor, corpuscul i und, i datorit incertitudinii poziiei lor (principiul lui Heisenberg) electronii pot trece prin bariera de potenial, cu o probabilitate cu att mai mare cu ct bariera de potenial este mai ngust. Acest efect poart numele de EFECT TUNEL. Similar, n cadrul fizicii clasice, electronii nu pot prsi proba dect dac primesc suficient energie. Conform mecanicii cuantice, ei formeaz, prin efect tunel, un nor de electroni deasupra suprafeei. Densitatea norului de electroni variaz exponenial cu distana: scade de 10 ori la o distan de 1 (10-10 m sau 0,1 nm). Acest fapt este folosit n microscopul cu efect tunel.

n principiu, MET este alctuit dintr-un electrod (ac extrem de fin, cu vrful format dintr-un singur atom), o parte electronic i un calculator. Electrodul se apropie de suprafaa probei de examinat la o distan de circa 10 pt a ptrunde n norul electronic al atomilor probei. Se aplic o diferen de potenial de civa zeci de milivoli ntre electrod (+) i suprafa. ntre electrod i suprafaa preparatului apare un curent electric datorit efectului tunel care, dup cum am menionat, const n trecerea unor electroni prin bariera de potenial. Acest curent are o intensitate foarte slab, de civa nA sau chiar pA. Ca urmare, este indispensabil un sistem de amplificare. Electrodul baleiaz o parte din suprafaa de civa micrometri ptrai. n timpul acestui baleiaj un sistem electronic foreaz electrodul s i modifice distana (fa de poziie medie) astfel nct intensitatea curentului tunel s fie pstrat constant. Prin nregistrarea acestor variaii de distan se obine un fel de hart n relief i n perspectiv a suprafeei. Cea mai mare dificultate const n eliminarea oricrei vibraii mecanice, care ar falsifica rezultatele. De asemenea, este necesar prepararea suprafeei n ultravid, pentru prevenirea contaminrii acesteia. Totodat, se impune controlul manevrelor de apropiere a electrodului i baleierea unor distane foarte mici ale suprafeei. Dac se baleiaz o lungime de 1 nm, care se afieaz pe un ecran de 10 cm, rezult o mrire de 100 000 000 (108). Se poate obine o rezoluie lateral de 2. Cu microscopul cu efect tunel pot fi identificate elementele chimice, deoarece norul electronic are o configuraie specific fiecrui element.

MET- elemente esentiale

Densitatea norului de electroni variaz exponenial cu distana. EFECT TUNEL rezoluie de 2 Cu microscopul cu efect tunel pot fi identificate elementele chimice, deoarece norul electronic are o configuraie specific fiecrui element.

Microscopia de forta atomica

BINNING a inventat n 1986 microscopul de for atomic. n acest caz se folosete pentru explorarea suprafeei, n locul curentului tunel, deplasarea acului datorit forei exercitate ntre prob i ac.

STM: shaded area. HM: high-resolution optical microscope. PCM: phase-contrast microscope (S)TEM: (scanning) transmission electron microscope SEM: scanning electron microscope REM: reflection electron microscope FIM: field ion microscope.
Binnig and Rohrer, 1982

Comparison of resolutions of different microscopes.