Sunteți pe pagina 1din 72

UNIVERSITATEA DE MEDICIN $I FARMACIE

,,GR. T. POPA IA$I


FACULTATEA DE FARMACIE
CERCETAREA FITOCHIMIC SI
FARMACOTOXICOLOGIC A UNOR
PLANTE DIN FAMILIA SOLANACEAE
REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT
Conductor ytiin(ific
PROF. DR. MIHAI IOAN LAZR
Doctorand
Farm. primar CLAUDIA BUTNARU
(CLINESCU)
IA$I
2011
Rezumatul tezei de doctorat
2
Conform deciziei rectorului Universittii de Medicin si
Farmacie Gr. T. Popa Iasi nr. 26115 din 24.12.2010, s-a stabilit
comisia de doctorat:
Prof. univ. dr. Antonia Poiat, U.M.F. Gr. T. Popa Iasi
Prof. univ. dr. Daniela Lucia Muntean, U.M.F. Trgu Mures
Prof. univ. dr. Monica Brc, U.M.F. Carol Davila Bucuresti
Sustinerea public a tezei de doctorat va avea loc n data de 14
aprilie 2011 ora 11.00 n Sala Societtii de Medici si Naturalisti Iasi
Rezumatul tezei de doctorat
3
CUPRINS
Introducere
CAPITOLUL 1
CONSIDERATII GENERALE PRIVIND PLANTELE TOXICE DIN FAMILIA
SOLANACEAE
1
1.1. Descrierea familiei Solanaceae 1
1.2. Plante toxice din familia Solanaceae ce contin alcaloizi tropanici 2
1.2.1. Atropa belladonna L. 2
1.2.1.1. Descriere. Rspndire 2
1.2.1.2. Principiile active toxice 3
1.2.1.3. Proprietti fizico-chimice 3
1.2.1.4. Cazuri de intoxicatii 4
1.2.1.5. Simptomatologie. Tratament 5
1.2.2. Datura innoxia Mill. 6
1.2.2.1. Descriere. Rspndire 6
1.2.2.2. Principiile active toxice. Structura chimic 6
1.2.2.3. Proprietti fizico-chimice 7
1.2.2.4. Cazuri de intoxicatii 7
1.2.2.5. Simptomatologie. Tratament 7
1.2.3. Datura stramonium L. 8
1.2.3.1. Descriere. Rspndire 8
1.2.3.2. Principiile active toxice 8
1.2.3.3. Cazuri de intoxicatii 9
1.2.3.4. Simptomatologie. Tratament 10
1.2.4. Hyoscyamus niger L. 10
1.2.4.1. Descriere. Rspndire 10
1.2.4.2. Principii active toxice 11
1.2.4.3. Cazuri de intoxicatii 11
1.2.4.4. Simptomatologie. Tratament 12
1.2.5. Scopolia carniolica JACQ. 12
1.2.5.1. Descriere. Rspndire 12
1.2.5.2. Principiile active toxice 13
1.2.5.3. Simptomatologie. Tratament 13
1.3. Plante toxice din familia Solanaceae ce contin alcaloizi piridinici 13
1.3.1. Plante din genul Nicotiana 13
1.3.1.1. Nicotiana tabacum L. 13
1.3.1.2. Nicotiana rustica L. 14
1.3.2. Principiile active toxice. Proprietti fizico-chimice 14
1.3.3. Simptomatologie. Tratament 16
1.4. Plante toxice din familia Solanaceae ce contin glicoalcaloizi 17
1.4.1. Solanum nigrum L. 17
1.4.1.1. Descriere. Rspndire 17
1.4.1.2. Principii active toxice. Structur. Proprietti fizico-chimice 17
1.4.1.3. Simptomatologie. Tratament 18
1.4.2. Solanum dulcamara L. 19
1.4.2.1. Descriere. Rspndire 19
1.4.2.2. Principiile active toxice. proprietti fizico-chimice 19
1.4.2.3. Simptomatologie. Tratament 21
1.4.3. Physalis alkekengi L. 22
1.4.3.1. Descriere. Rspndire 22
1.4.3.2. Principiile active toxice 23
Rezumatul tezei de doctorat
4
1.4.3.3. Particularitti farmacodinamice 24
1.4.3.4. Utilizri n medicina popular 25
1.4.3.5. Simptomatologie. Tratament 25
1.5. Concluzii 25
CAPITOLUL 2
METODE DE DETERMINARE A TOXICITTII 28
2.1. Aspecte generale ale evalurii toxicittii 28
2.1.1. Toxic. Toxicitate. Efect toxic 28
2.1.2. Intoxicatia. Definitie. Clasificare 28
2.1.3. Doze toxice si letale 29
2.1.4. Rspunsuri gradate. Rspunsuri cuantale 29
2.1.5. Potential de toxicitate. Factor de cronicitate. Risc 31
2.2. Metode in vivo de determinare a toxicittii 34
2.3. Determinarea toxicittii acute 36
2.3.1. Metoda cu doz fix (Fixed-Dose Procedure) 36
2.3.2. Metoda Acute Toxic Class Method 43
2.3.3. Metoda Up and Down 44
2.3.4. Limitarea metodelor care nlocuiesc testul clasic DL
50
44
2.4. Concluzii 45
CAPITOLUL 3
METODE DE EXTRACTIE SI ANALIZ A PRINCIPIILOR ACTIVE DIN PLANTELE
APARTINND FAMILIEI SOLANACEAE 46
3.1. Metode de extractie 46
3.2. Metode cromatografice 46
3.2.1. Cromatografia pe strat subtire 48
3.2.2. Metode HPLC 51
3.2.3. Metode gaz-cromatografice 58
3.3. Metode spectrale 59
3.3.1. Metode spectrometrice n UV-VIS 59
3.4. Metode LC-MS 60
3.5. Metode electrochimice 62
3.5.1. Metode electroforetice 62
3.5.2. Metode voltametrice 67
CAPITOLUL 4
STRUCTURA ANATOMIC A ORGANELOR VEGETATIVE A PLANTELOR
PHYSALIS ALKEKENGI L. SI SOLANUM DULCAMARA L. 71
4.1. Materiale si metod 71
4.1.1. Recoltare 71
4.1.2. Conditionare 71
4.1.3. Realizarea preparatelor microscopice 71
4.1.4. Examinarea microscopic si microfotografierea preparatelor 71
4.2. Rezultate si Discutii 71
4.2.1. Physalis alkekengi L. 71
4.2.1.1. Rdcina 71
4.2.1.2. Tulpina 72
4.2.1.3. Frunza 73
4.2.2. Solanum dulcamara L. 74
4.2.2.1. Rdcina 74
4.2.2.2. Tulpina 75
4.2.2.3. Frunza 76
4.3. Concluzii 77
Rezumatul tezei de doctorat
5
CAPITOLUL 5
DETERMINAREA COMPUSILOR POLIFENOLICI
DIN PHYSALIS ALKEKENGI L. SI SOLANUM DULCAMARA L. 79
5.1. Introducere. Obiective 79
5.2. Analiza polifenolilor si flavonoidelor prin metode spectrofotometrice 79
5.2.1. Material si metode 79
5.2.1.1. Prelucrarea probelor vegetale 80
5.2.1.2. Determinarea cantitativ a polifenolilor totali, exprimati n acid cafeic 80
5.2.1.3. Determinarea cantitativ a flavonoidelor, exprimate n rutozid si cvercetol 81
5.2.2. Rezultate si discutii 82
5.2.2.1. Continutul de polifenoli totali, exprimati n acid cafeic, n plantele analizate 82
5.2.2.2. Continutul de flavonoide, exprimate n rutozid si cvercetol, n plantele analizate 84
5.3. Analiza polifenolilor si flavonoidelor prin HPLC/MS 86
5.3.1. Materiale si metode 86
5.3.1.1. Metoda de analiz a compusilor polifenolici prin HPLC/MS 86
5.3.1.2. Standarde 86
5.3.1.3. Analiza polifenolilor prin detectie UV 88
5.3.1.4. Analiza polifenolilor prin detectie MS 89
5.3.1.5. Prelucrarea probelor vegetale 97
5.3.2. Rezultate si discutii 97
5.4. Concluzii 125
CAPITOLUL 6
EVALUAREA FITOSTEROLILOR DIN
PHYSALIS ALKEKENGI L. SI SOLANUM DULCAMARA L. PRIN HPLC 126
6.1. Material si metode 126
6.1.1. Prelucrarea probelor vegetale 127
6.1.2. Metoda de analiz HPLC/MS. Validarea metodei 127
6.2. Rezultate si discutii 128
6.2.1. Metoda MS 128
6.2.2. Continutul de fitosteroli n plantele analizate 137
6.2.2.1. Continutul de steroli liberi n plantele analizate 137
6.2.2.2. Continutul de steroli totali n plantele analizate 139
6.3. Concluzii 143
CAPITOLUL 7
DETERMINAREA SCOPOLETINEI DIN PHYSALIS ALKEKENGI L. SI SOLANUM
DULCAMARA L.
144
7.1. Structur si proprietti fizico-chimice. Actiuni farmacologice 144
7.2. Analiza scopoletinei prin CSS 145
7.2.1. Material si metod. Prelucrarea probelor vegetale 145
Extractie cu metanol 70% (v/v) prin refluxare 146
Conditii de lucru pentru CSS 146
7.2.2. Rezultate si discutii 146
7.2.3. Concluziile analizei CSS 147
7. 3. Analiza scopoletinei prin HPLC/MS 148
7.3.1. Material si metod 148
7.3.2. Rezultate si discutii 150
7.3.2.1. Metoda HPLC/MS 150
7.3.2.2. Continutul de scopoletin n plantele analizate 152
7. 4. Concluzii 156
Rezumatul tezei de doctorat
6
CAPITOLUL 8
DETERMINAREA SOLANINEI DIN PHYSALIS ALKEKENGI L. SI SOLANUM
DULCAMARA L. 157
8.1. Introducere 157
8.1.1. Structur si proprietti fizico-chimice. Istoric 157
8.1.2. Toxicitatea solaninei 158
8.1.3. Noi utilizri ale solaninei 159
8.1.4. Obiective 159
8.2. Analiza solaninei prin cromatografie pe strat subtire 159
8.2.1. Material si metod 159
8.2.2. Analiza solaninei din Physalis alkekengi L. prin cromatografie pe strat subtire 160
I. Extractia la cald prin refluxare cu alcool amilic 160
II. Extractia la rece cu alcool amilic (extractia solid/lichid prin macerare) 160
Conditiile de lucru pentru cromatografia pe strat subtire 161
A. Metoda cu reactiv iod 161
B. Metoda cu reactiv Marquis 161
8.2.3. Analiza solaninei din Solanum dulcamara L. prin cromatografie pe strat subtire 162
Extractia solaninei 163
I. Extractia la cald n aparatul Soxhlet cu alcool amilic 163
II. Extractia la cald prin refluxare cu alcool amilic 163
III. Extractia la rece cu alcool amilic (extractia solid/lichid prin macerare) 163
Conditiile de lucru pentru cromatografia pe strat subtire 163
A. Metoda cu reactiv iod 163
B. Metoda cu reactiv Marquis 164
8.2.4. Analiza solaninei din Solanum dulcamara L. si Physalis alkekengi L. prin CSS 165
Extractia lichid/lichid cu alcool amilic 166
Conditiile de lucru pentru cromatografia pe strat subtire 166
8.2.5. Concluziile analizei solaninei prin CSS 167
8.3. Analiza solaninei prin HPLC/MS 167
8.3.1. Material si metod 167
8.3.1.1. Prelucrarea probelor vegetale 168
8.3.1.2. Metoda de analiz HPLC/MS 168
8.3.2. Rezultate si discutii 169
8.3.2.1. Analiza MS 169
8.3.2.2. Continutul de solanin n plantele analizate 172
8.3.2.3. Concluziile analizei solaninei prin HPLC/MS 175
8.4. Concluzii 175
CAPITOLUL 9
ANALIZA ALCALOIZILOR TROPANICI DIN PHYSALIS ALKEKENGI L. SI SOLANUM
DULCAMARA L. 176
9.1. Introducere. Obiective 176
9.1.1. Structura si proprietti fizico-chimice ale atropinei. Actiuni farmacologice 176
9.1.2. Structura si proprietti fizico-chimice ale scopolaminei. Actiuni farmacologice 177
9.2. Materiale si Metod 178
9.2.1. Metoda HPLC 178
9.2.2. Prelucrarea probelor vegetale 178
9.3. Rezultate si discutii 179
9.3.1. Analiza atropinei 179
9.3.2. Analiza scopolaminei 181
9.3.3. Determinarea atropinei si scopolatinei n plantele cercetate 183
9.4. Concluzii 186
Rezumatul tezei de doctorat
7
CAPITOLUL 10
EVALUAREA ACTIVITTII ANTIMICROBIENE A EXTRACTELOR OBTINUTE DIN
PHYSALIS ALKEKENGI L.
187
10.1. Introducere. Obiective 187
10.2. Material si metode 187
10.2.1. Materialul vegetal si prelucrarea probelor 188
10.2.2. Microorganisme test 189
10.2.3. Testarea activittii antimicrobiene 189
10.3. Evaluarea potentialului antimicrobian a extractelor de Physalis alkekengi L. 190
10.3.1. Rezultate 191
10.3.2. Discutia rezultatelor 196
10.4. Concluzii 199
CAPITOLUL 11
EVALUAREA TOXICITTII ACUTE SI A ACTIUNII ANALGEZICE-
ANTIINFLAMATOARE A EXTRACTELOR ALCOOLICE
DIN PHYSALIS ALKEKENGI L. SI SOLANUM DULCAMARA L. 200
11.1. Obiective 200
11.2. Material si metod 200
11.2.1. Substante medicamentoase 200
Ibuprofen 200
11.2.2. Substante auxiliare 200
Carboximetilceluloza sodic CMC-Na 200
Zymosan A 200
Carrageenan lambda 200
11.2.3. Animale de laborator 201
11.2.4. Metode experimentale 201
11.3. Aparatura si instrumentar utilizate pentru determinrile experimentale 202
11.3.1. Testul rspunsului constrictiv abdominal 202
11.4. Metode de interpretare a datelor experimentale 204
11.5. Rezultate si discutii 206
11.5.1 Evaluarea toxicittii acute a extractelor alcoolice de Physalis alkekengi L. si Solanum
dulcamara L. 206
11.5.2. Testul rspunsului constrictiv abdominal indus prin zymosan 208
11.5.3. Testul Randall-Selitto 210
11.7. Concluzii 214
CONCLUZII GENERALE 215
BIBLIOGRAFIE 219
ANEXE
Rezumatul tezei de doctorat
8
Rezumatul tezei de doctorat
9
n teza de doctorat sunt prezentate rezultatele cercetrii
fitochimice si farmacotoxicologice a dou specii din familia
Solanaceae: Physalis alkekengi L. si Solanum dulcamara L., specii
spontane din flora trii noastre. Lucrarea este structurat n dou
prti: Stadiul cunoayterii (trei capitole) si Contribu(ii
personale care cuprinde 8 capitole. Partea Stadiul cunoasterii
include informatii din materialul bibliografic referitoare la subiectul
tezei de doctorat.
STADIUL CUNOA$TERII
Capitolul 1. Considera(ii generale privind plantele toxice din familia
Solanaceae
1.1. Descrierea familiei Solanaceae
1.2. Plante toxice din familia Solanaceae ce contin alcaloizi tropanici
1.3. Plante toxice din familia Solanaceae ce contin alcaloizi piridinici
1.4. Plante toxice din familia Solanaceae ce contin glicoalcaloizi
1.5. Concluzii
Capitolul 2. Metode de determinare a toxicit(ii
2.1. Aspecte generale ale evalurii toxicittii
2.2. Metode in vivo de determinare a toxicittii
2.3. Determinarea toxicittii acute
2.4. Concluzii
Capitolul 3. Metode de extrac(ie yi analiz a principiilor active din plantele
apar(innd familiei Solanaceae
3.1. Metode de extractie
3.2. Metode cromatografice
3.3. Metode spectrale
3.4. Metode LC-MS
3.5. Metode electrochimice
Rezumatul tezei de doctorat
10
CONTRIBUTII PERSONALE
CAPITOLUL 4. STRUCTURA ANATOMIC A ORGANELOR
VEGETATIVE A PLANTELOR PHYSALI S ALKEKENGI L. $I SOLANUM
DULCAMARA L.
n acest capitol am caracterizat din punct de vedere anatomic plantele
luate n studiu. Materialul vegetal proaspt a fost pstrat n alcool de 70%.
Pentru obtinerea sectiunilor transversale prin organele vegetative s-au
utilizat briciul anatomic si microtomul manual, conform tehnicilor uzuale.
Sectiunile obtinute au fost clarificate cu ap de Javel si colorate prin dubla
colorare cu verde de iod si carmin alaunat. Preparatele microscopice astfel
colorate au fost fixate pe lam folosind masa glicero-gelatinoas.
Observarea s-a realizat la microscopul Nikon de tip Eclipse E 400, iar
microfotografierea s-a realizat folosind un aparat de fotografiat digital SLR
Nikon D70.
4.2.1. Physalis alkekengi L.
Rdcina cu structur tipic secundar, n care se mai observ
totusi amprenta structurii diarhe a cilindrului central, din etapa de
structur primar:
saci cu nisip oxalic n mduv si scoarta secundar;
primul strat extern al sectiunii este format din exoderm cu
celule suberificate (2 straturi);
primele straturi ale mezodermei sunt usor colenchimatizate;
endoderma vizibil are punctuatiile caspariene;
periciclu unsitratificat vizibil;
zonele de liber secundar extern si intern sunt flancate de
grupuri de fibre liberiene putin lignificate.
Rezumatul tezei de doctorat
11
Fig. 4.2.
Tulpina cu structur secundar are contur circular costat (3-4
coaste):
n dreptul coastelor se disting masive colenchimatice, iar n
cilindrul central fascicule bicolaterale;
prezenta de fibre periciclice;
epiderma are resturi de peri tectori pluricelulari rupti;
centrul sectiunii este ocupat de mduv;
insule de tesut lemnos intern, n cilindrul central.
Fig. 4.3. Fig. 4.4.
Rezumatul tezei de doctorat
12
Frunza este prevzut cu proeminente la nivelul nervurii mediane,
la ambele fete, dar mult mai accentuat la fata intern:
structura bifacial cu simetrie dorso-ventral si mezofil heterogen-
asimetric;
n nervura median se distinge un fascicul conductor bicolateral
mare si saci cu nisip oxalic n parenchim;
peri tectori epidermici, pluricelulari cu 4-5 celule si vrf ascutit,
frecvent drepti si mai rar ndoiti;
epiderma vzut din fat are celule cu peretii putin ncretiti.
Fig. 4.5. Fig. 4. 6.
4.2.2. Solanum dulcamara L.
Rdcina cu structur secundar prezint numerosi saci cu nisip
oxalic situati n special la nivelul zonei de liber secundar:
n centrul sectiunii transversale prin rdcina se constat nlocuirea
mduvei cu vase lemnoase;
Rezumatul tezei de doctorat
13
la exteriorul sectiunii prin rdcin se observ un periderm cu
suber care prezint lenticele si feloderm colenchimatizat (colenchim
tabular);
att n scoarta secundar ct si n mduv se observ amidon
abundent n parenchim, cu gruncioare foarte mici;
la nivelul masivului lemnos (lemn secundar) se disting 2 inele
anuale de crestere.
Fig. 4.10. Fig. 4.11.
Tulpina cu structur secundar are un contur circular costat
(5 coaste):
fascicule conductoare bicolaterale mai mari n dreptul coastelor;
n centrul sectiunii este prezent o lacun medular;
epiderm cutinizat si prevzut cu peri scurti, conici, unicelulari;
n scoart, zona colenchimatic foarte evident;
liberul intern discontinuu sub form de insule liberiene.
Fig. 4.12. Fig. 4.13.
Rezumatul tezei de doctorat
14
Frunza cu structur bifacial si simetrie dorso-ventral, mezofil
heterogen asimetric:
proeminente ale nervurii mediane la ambele fete, dar mult mai
accentuat la fata inferioar;
mai multe tipuri de peri epidermici: peri tectori bicelulari conici,
verucosi, rari peri glandulari capitati, cu picior unicelular si glanda
pluricelular, rari peri tectori pluricelulari, verucosi, recurbati (crlig) sau
drepti;
saci cu nisip oxalic situati n special n liberul de la partea
inferioar a fasciculului bicolateral din nervura median;
n mezofilul foliar sunt prezente druze, pe lng nervuri, iar
epiderma vzut din fat are celule cu pereti sinuosi;
n nervura median este prezent un fascicul conductori bicolateral
mare cu lemn dispus n siruri radiare, foarte vizibil.
Fig. 4.15 Fig. 4.17.
Rezumatul tezei de doctorat
15
CAPITOLUL 5. DETERMINAREA COMPU$ILOR POLIFENOLICI
DIN PHYSALI S ALKEKENGI L. $I SOLANUM DULCAMARA L.
5.1. INTRODUCERE. OBIECTIVE
Obiective:
determinarea polifenolilor totali exprimati prin acid cafeic
prin spectrofotometrie UV/VIS;
determinarea flavonoidelor, exprimate n rutozid si cvercetol
prin spectrofotometrie UV/VIS;
identificarea si dozarea compusilor polifenolici prin
HPLC/MS.
5.2. ANALIZA POLIFENOLILOR $I FLAVONOIDELOR
PRIN METODE SPECTROFOTOMETRICE
5.2.1. Material yi metode
5.2.1.1. Prelucrarea probelor vegetale
Materialul vegetal constituit din frunze de Solanum dulcamara L. si
Physalis alkekengi L. a fost recoltat din lotul experimental din Grdina
Botanic Anastasie Ftu Iasi, doi ani consecutiv (2005, 2006). Pentru
extractie s-a utilizat metanol absolut si metanol 70 % (v/v).
5.2.1.2. Determinarea cantitativ a polifenolilor totali,
exprimai n acid cafeic
Principiul metodei se bazeaz pe formarea unui compus albastru
ntre acidul fosfowolframic si polifenoli (n mediul alcalin). Concentratia n
polifenoli totali a probelor de analizat s-a calculat cu ajutorul curbei etalon,
realizate n aceleasi conditii ca solutiile prob. Pentru scara etalon s-a luat
n lucru o solutie etalon de acid cafeic 0,025 g/L (figura 5.2).
Rezumatul tezei de doctorat
16
y = 0,2127x + 0,0172
R
2
= 0,9757
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6
concentraia (micrograme acid cafeic/mL)
a
b
s
o
r
b
a
n

a
Fig. 5.2. Curba etalon pentru determinarea cantitativ a polifenolilor,
exprima(i n acid cafeic
5.2.1.3. Determinarea cantitativ a flavonoidelor,
exprimate n rutozidi cvercetol
Principiul metodei se bazeaz pe formarea unui compus colorat
galben-portocaliu prin reactia dintre flavonoide si clorura de
aluminiu. S-au realizat dou scri etalon: una cu solutie etalon de
rutozid 0,1 g/L si una cu solutie etalon de cvercetol 0,1 g/L (figurile
5.3 si 5.4).
y = 0,0308x + 0,0168
R
2
= 0,9999
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 4 8 12 16 20
mg rutozida/mL
absorbana
Fig. 5.3. Curba etalon pentru dozarea flavonoidelor
exprimate n rutozid
Rezumatul tezei de doctorat
17
y = 0.0654x + 0.0198
R
2
= 0.99981
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
1,6 3,2 4,8 6,4
mg cvercetol/mL
A
b
s
o
r
b
a
n

a
Fig. 5.4. Curba etalon pentru dozarea flavonoidelor
exprimate n cvercetol
5.2.2. Rezultate yi discu(ii
5.2.2.1. Coninutul de polifenoli totali, exprimai n acid cafeic,
n plantele analizate
Figurile 5.5. si 5.6. prezint variatia continutului de polifenoli totali
functie de anul recoltrii. Constatm c plantele recoltate n anul 2005 au
fost mai bogate n polifenoli totali, iar extractia cea mai bun a fost cu
metanol 70%.
Rezumatul tezei de doctorat
18
403,6
439,98
466,78
414,7
370
380
390
400
410
420
430
440
450
460
470
480
Extracie cu metanol absolut Extracie cu metanol 70%
(v/v)
mg%
2005
2006
Fig. 5.5. Varia(ia con(inutului de polifenoli totali,
exprima(i n acid cafeic (mg%), pentru Solanum dulcamara
487,76
530,09
450,99
410,36
0
100
200
300
400
500
600
Extracie cu metanol absolut Extracie cu metanol 70%
(v/v)
mg%
2005
2006
Fig. 5.6. Varia(ia con(inutului de polifenoli totali,
exprima(i n acid cafeic (mg%), pentru Physalis alkekengi
Rezumatul tezei de doctorat
19
5.2.2.2. Coninutul de flavonoide, exprimate n rutozidi cvercetol,
n plantele analizate
Pentru probele de Solanum dulcamara L. extractia cea mai bun s-a
realizat cu metanol 70%, valoarea maxim nregistrndu-se pentru proba
recoltat n 2006: 2529,12 mg% rutozid. Observm c probele recoltate n
anul 2006 sunt mai bogate n flavonoide, att pentru Solanum dulcamara L.
ct si pentru Physalis alkekengi L. Variatia valorilor obtinute functie de
anul recoltrii este prezentat n figura 5.7.
1936,96
2529,12
3408,46
3184,82
1740,72
1862,21
1381,61
1057,41
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
Solanum
dulcamara 2005
Solanum
dulcamara 2006
Physalis
alkekengi 2005
Physalis
alkekengi 2006
mg%
Rutozid Cvercetol
Fig. 5.7. Varia(ia valorilor flavonoidelor, exprimate n rutozid yi
cvercetol (mg%), func(ie de anul recoltri yi specie
5.3. ANALIZA POLIFENOLILOR $I FLAVONOIDELOR
PRIN HPLC/MS
5.3.1. Materiale yi metode
5.3.1.1. Metoda de analiz a compuilor polifenolici prin HPLC/MS
Pentru analiza compusilor polifenolici din extracte vegetale s-a
folosit cromatografia de lichide de nalt performant cuplat cu
spectrometria de mas (LC/MS). Metoda de analiz utilizat se
Rezumatul tezei de doctorat
20
bazeaz pe o metoda HPLC publicat n literatura de specialitate la
care s-au adus unele modificri.
Principala modificare adus metodei initiale este schimbarea
fazei mobile (s-a nlocuit fosfatul de potasiu cu acid acetic); astfel
nct de la o faz mobil cu componente nevolatile s-a ajuns la una
volatil. Principalul beneficiu al acestei modificri este faptul c
eluentul din coloana cromatografic poate fi introdus n
spectrometrul de mas (care necesit doar componenti volatili n faza
mobil). n acest mod se pot obtine informatii suplimentare
referitoare la compusii polifenolici continuti n prob, deoarece
spectrometrul nregistreaz masele moleculare si spectrele de mas
ale compusilor detectati.
Metoda se poate aplica pentru analiza calitativ (18 compusi)
dar si cantitativ (14 compusi).
5.3.1.2. Standarde
Au fost utilizate 18 standarde de compusi polifenolici. Acestea
au fost: acid caftaric, acid gentisic, acid cafeic, acid clorogenic, acid
paracumaric, acid ferulic, acid sinapic, hiperozid, isoquercitrin,
rutozid, miricetol, fisetina, quercitrin, cvercetol, patuletina, luteolina,
kemferol si apigenina.
5.3.1.3. Analiza polifenolilor prin detecie UV
Cromatograma unui amestec de standarde corespunztor
compusilor polifenolici mentionati anterior este prezentat n figura
5.9.
Fig. 5.9. Cromatograma unui amestec de 18 polifenoli, detec(ie UV la
330 yi 370 nm
Rezumatul tezei de doctorat
21
5.3.1.4. Analiza polifenolilor prin detecie MS
Datorit prezentei a cel putin a unei grupri fenolice n
molecul (dar si a unei grupri carboxil, n cazul acizilor
polifenolici), toti compusii pot pierde un proton acid transformndu-
se n ioni negativi de tipul [M-H] si pot fi analizati prin ionizare
negativ. Ulterior, spectrometrul izoleaz ionii de interes (pentru
eliminarea interferentelor) si apoi i fragmenteaz, nregistrnd
totodat si spectrul MS.
n cazul probelor de extracte vegetale, compusii se pot
identifica analiznd spectrele MS. Initial se verific masa molecular
a ionului [M-H], iar dac aceasta corespunde se compar spectrul de
mas (MS) al compusului necunoscut cu spectrul de mas al
standardelor. n cazul n care ionii din spectrul de mas sunt aceiasi
se poate considera identificat compusul respectiv.
Au fost nregistrate spectrele de mas ale celor 18 polifenoli
utilizati ca standarde n metoda analitic.
5.3.1.5. Prelucrarea probelor vegetale
Probele de produse vegetale au fost recoltate din diferite locatii
din jurul municipiului Iasi (tabelul 5.7.).
Tabelul 5.7. Probele vegetale yi nota(iile solu(iilor extractive pentru
analiza polifenolilor prin HPLC
Nota(ie
prob
Nota(ie
prob
Specie
Loca(ie recoltare Perioada de
recoltare
R 1 T1 Physalis alkekengi Aroneanu August 2009
R 2 T2 Physalis alkekengi Brnova Septembrie 2009
R 3 T3 Physalis alkekengi Breazu Septembrie 2009
R 4 T4 Physalis alkekengi Bucium Septembrie 2009
R 5 T5 Physalis alkekengi Grdina botanic Iulie 2008
R 6 T6 Physalis alkekengi Grdina botanic Iulie 2007
R 7 T7 Solanum dulcamara Grdina botanic Iulie 2007
R 8 T8 Solanum dulcamara Grdina botanic Iulie 2008
R 9 T9 Solanum dulcamara Zona UMF August 2009
R 10 T10 Solanum dulcamara Zona UMF Septembrie 2009
Am realizat extractie cu metanol 70% (v/v) prin refluxare (probe
notate cu R) si extractie cu etanol 70% (v/v) - tincturi (probe notate cu T).
Rezumatul tezei de doctorat
22
5.3.2. Rezultate yi discu(ii
Au fost analizate n paralel dou probe din fiecare extract
vegetal, una ca atare (nehidrolizat, notat cu Rn, respectiv Tn) si
una hidrolizat (notat cu Rh, respectiv Th). Motivul pentru care s-a
realizat hidroliza este faptul c, n general, unii agliconi flavonici sau
unii acizi polifenolcarboxilici nu se afl n stare liber, ci legat
(glicozide, esteri, etc.). Deci, realizarea unei hidrolize acide va duce
la eliberarea acestor compusi din forma legat si obtinem mai multe
informatii despre compozitia chimic polifenoli a plantei
studiate. Din analiza datelor obtinute se desprind urmtoarele idei:
1. pentru extractele obtinute prin extractie cu metanol 70% (v/v)
apigenina s-a determinat numai n probele hidrolizate
de Physalis alkekengi
kemferolul si acidul p-cumaric s-au determinat numai
n probele hidrolizate att n Physalis alkekengi, ct si
n Solanum dulcamara
rutozidul si quercitrinul apar numai n probele
nehidrolizate att n Physalis alkekengi, ct si n
Solanum dulcamara
isoquercitrinul s-a determinat numai n probele
nehidrolizate de Solanum dulcamara
2. pentru extractele obtinute prin extractie cu etanol 70% (v/v)
kemferolul si acidul p-cumaric s-a determinat numai
n probele hidrolizate att n Physalis alkekengi, ct si
n Solanum dulcamara
rutozidul si quercitrinul apar numai n probele
nehidrolizate att n Physalis alkekengi, ct si n
Solanum dulcamara
apigenina s-a determinat att n probele hidrolizate ct
si n probele nehidrolizate de Physalis alkekengi
3. prin hidrolizare se obtin cantitti mai mari de compusi
polifenolici n extractele vegetale
Avnd n vedere a treia idee formulat mai sus, pentru analiza
statistic am considerat numai probele hidrolizate. S-a calculat
Rezumatul tezei de doctorat
23
concentratia de compus polifenolic exprimat n mg %. Extractia cea
mai bun s-a realizat cu metanol 70% (v/v), cnd valorile au variat
ntre:
17,131 62,717 mg% cvercetol;
33,309 94,704 mg% luteolin;
0,615 1,411 mg% kemferol.
Pentru probele de Solanum dulcamara cantittile de cvercetol
si kemferol n probele hidrolizate au fost mai mari dup extractie cu
etanol 70% (tincturi conform FR X). Astfel pentru cvercetol
concentratiile sunt cuprinse ntre: 3,312 si 128,565 mg%, iar pentru
kemferol: 1,013-5,258 mg%. Functie de perioada de recoltare, se
observ c proba de Solanum dulcamara din Grdina Botanic Iasi,
din iulie 2008, are cele mai mari valori pentru compusii polifenolici
analizati. Pentru probele recoltate n 2009 nu s-a evidentiat prezenta
luteolinei.
Ponderea compusilor polifenolici este reprezentat n figurile
5.13. si 5.14.
8%
1%
5%
2%
42%
41%
1%
Ac ferulic
Ac p-cumaric
Ac sinapic
Apigenina
Kemferol
Luteolina
Cvercetol
Fig. 5.13. Ponderea fiecrui compus polifenolic analizat
n Physalis alkekengi (extras cu etanol 70% din probe hidrolizate)
Rezumatul tezei de doctorat
24
2% 2%
5%
5%
86%
Ac ferulic
Ac p-cumaric
Ac sinapic
Kemferol
Cvercetol
Fig. 5.14. Ponderea fiecrui compus polifenolic analizat
n Solanum dulcamara (extras cu etanol 70% din probe hidrolizate)
Rezumatul tezei de doctorat
25
CAPITOLUL 6. EVALUAREA FITOSTEROLILOR DIN
PHYSALI S ALKEKENGI L. $I SOLANUM DULCAMARA L. PRIN HPLC
Analiza fitosterolilor s-a realizat prin cromatografie de lichide
de nalt performant cuplat cu spectrometria de mas (HPLC/MS).
Metoda de analiz utilizat se bazeaz pe o metoda HPLC publicat
n literatura de specialitate, la care s-au adus unele modificri.
Principala modificare adus metodei initiale este schimbarea
coloanei cromatografice si a debitului fazei mobile. Ca rezultat, fat
de metoda publicat n literatur, timpul de analiz a sczut de la 30
minute la 5 minute fr a afecta separarea si rezolutia sterolilor.
6.2. REZULTATE $I DISCUTII
6.2.2. Con(inutul de fitosteroli n plantele analizate
Concentratiile de steroli liberi sunt incluse n tabelul 6.7.
pentru Physalis alkekengi si tabelul 6.8. pentru Solanum dulcamara.
Tabelul 6.7. Concentra(iile de steroli liberi n probele
de Physalis alkekengi (mg compus/ 100 g produs vegetal)
Loca(ia/perioada de
recoltare
Ergosterol Stigmasterol Campesterol Sitosterol
Aroneanu/august 2009 0,80 9,54 13,12 12,07
Brnova/septembrie 2009 0 13,11 14,42 11,14
Breazu/septembrie 2009 0 13,45 17,94 14,35
Bucium/septembrie 2009 0 17,86 17,80 16,77
Grdina Botanic/iulie 2008 0 15,75 15,54 9,63
Grdina Botanic/iulie 2007 0 14,59 14,83 10,01
Maxima - 17,86 17,94 16,77
Minima - 9,54 13,12 9,63
Tabelul 6.8. Concentra(iile de steroli liberi n probele
de Solanum dulcamara(mg compus/ 100 g produs vegetal)
Loca(ia/perioada de
recoltare
Ergosterol Stigmasterol Campesterol Sitosterol
Grdina Botanic/iulie 2007 0 6,60 2,72 7,46
Grdina Botanic/iulie 2008 0 3,24 1,47 4,40
UMF/august 2009 0 4,18 0,80 2,61
UMF/septembrie 2009 0,16 8,45 2,47 12,76
Maxima - 8,45 2,72 12,76
Minima
- 3,24 0,80 2,61
Rezumatul tezei de doctorat
26
Ergosterolul nu se gseste sub form liber n plantele
analizate. La determinarea sterolilor liberi, fitosterolii apar n
cantitti mai mari n probele de Physalis alkekengi (concentratia
maxim este de 17,94 mg campesterol/ 100 g) dect n cele de
Solanum dulcamara (12,76 mg sitosterol/100g). n Physalis
alkekengi predomin campesterolul, iar n Solanum dulcamara
sitosterolul.
Pentru probele de Physalis alkekengi, am determinat urmtorii
steroli sub form liber: stigmasterolul, valorile au variat ntre 9,54 si
17,86 mg%, campesterolul (13,12-17,94 mg%) si sitosterolul (9,63-
16,77 mg%).
Concentratii mai mici de steroli liberi s-au determinat n
probele de Solanum dulcamara: pentru stigmasterol 3,24-8,45 mg%,
pentru campesterol 0,80-272 mg% si pentru sitosterol 2,61-12,76
mg%.
Concentratiile de steroli totali (dup saponificare) din
materialul vegetal sunt incluse n tabelul 6.11. pentru Physalis
alkekengi si tabelul 6.12. pentru Solanum dulcamara.
Dup saponificare n probele analizate se pstreaz aceleasi
proportii n continutul de fitosteroli. n Physalis alkekengi
concentratia cea mai mare o are campesterolul, iar n Solanum
dulcamara - sitosterolul. Concentratiile variaz diferit functie de
locul recoltrii si perioada de recoltare.
Tabelul 6.11. Concentra(iile de steroli totali n probele
de Physalis alkekengi (mg compus/ 100 g produs vegetal)
Loca(ia/perioada de
recoltare/organ plant
Ergosterol Stigmasterol Campesterol Sitosterol
Aroneanu /august 2009/frunze 1,84 15,83 32,79 17,63
Brnova/septembrie 2009/frunze 0,80 17,68 33,08 17,87
Breazu/septembrie 2009/frunze 1,07 12,74 29,15 17,17
Breazu/septembrie 2009/rcin 0,38 10,33 9,38 20,74
Breazu/septembrie 2009/fructe 2,11 14,36 18,05 26,32
Breazu/septembrie 2009/tulpini 0,77 6,56 8,67 18,99
Bucium/septembrie 2009/frunze 1,88 23,48 35,11 24,43
Grdina Botanic/iulie
2008/frunze
0 13,60 17,88 10,22
Grdina Botanic/iulie
2007/frunze
0 13,64 21,74 12,07
Maxima 2,11 23,48 35,11 26,32
Minima - 6,56 8,67 10,22
Rezumatul tezei de doctorat
27
Tabelul 6.12. Concentra(iile de steroli totali n probele
de Solanum dulcamara(mg compus/ 100 g produs vegetal)
Loca(ia/perioada de
recoltare/organ plant
Ergosterol Stigmasterol Campesterol Sitosterol
Grdina Botanic/iulie 2007/frunze 0 6,15 3,91 9,89
Grdina Botanic/iulie 2008/frunze 0 2,73 3,06 5,50
UMF Iai/august 2009/frunze 0 2,19 0,38 2,91
UMF Iai/septembrie 2009/frunze 0,81 8,63 2,73 14,67
Maxima - 8,63 3,91 14,67
Minima - 2,19 0,38 2,91
Pentru proba Physalis alkekengi/ Breazu/ septembrie 2009 s-a
analizat continutul de steroli totali din prtile plantei: rdcin,
tulpin, frunze si fructe (figura 6.11).
29,15
20,74
26,32
18,99
0,77
2,11
0,38
1,07
14,36
6,56
10,33
12,74
18,05
8,67
9,38
17,17
0
5
10
15
20
25
30
35
frunze cin fructe tulpini
Ergosterol
Stigmasterol
Campesterol
Sitosterol
Fig. 6.11. Concentra(iile de steroli totali n Physalis alkekengi
Rezumatul tezei de doctorat
28
CAPITOLUL 7. DETERMINAREA SCOPOLETINEI
N PHYSALI S ALKEKENGI L. $I SOLANUM DULCAMARA L.
7.1. STRUCTUR $I PROPRIETTI FIZICO-CHIMICE.
ACTIUNI FARMACOLOGICE. OBIECTIVE.
O O HO
H
3
CO
Fig. 7.1. Structura scopoletinei
Obiectivele acestui capitol sunt:
identificarea scopoletinei prin CSS n Physalis alkekengi si
Solanum dulcamara;
identificarea si determinarea cantitativ a scopoletinei n
extractele vegetale ale celor dou plante luate n studiu, prin
HPLC/MS/MS.
7.2. ANALIZA SCOPOLETINEI PRIN CSS
7.2.1. Material yi metod. Prelucrarea probelor vegetale
Am realizat extractii cu metanol 70% (v/v) prin refluxare,
extractele s-au hidrolizat n mediul acid, apoi am fcut extractie
lichid/lichid cu cloroform.
Condiii de lucru pentru CSS
Placa cromatografic: silicagel 60 F
254
10x20 cm
Sistem de solventi: aceton : ap : amoniac (45 + 3,3 + 1,5)
Etalon: scopoletin (Sigma) n metanol 70%, 10 L;
Probe: extract cloroformic 10 L
Revelare: UV la 365 nm, spoturi albastre n UV.
7.2.2. Rezultate yi discu(ii
S-au obtinut dou cromatoplci n conditiile de lucru
prezentate: figura 7.2. pentru probele de Physalis alkekengi si figura
7.3. pentru probele de Solanum dulcamara.
Rezumatul tezei de doctorat
29
Fig. 7.2. Cromatoplaca pentru scopoletin Fig. 7.3. Cromatoplaca pentru scopoletin
pentru probele de Physalis alkekengi pentru probele de Solanum dulcamara
Rf-ul etalonului a fost 0,40 iar pentru probe a variat ntre 0,38
si 0,42 n conditiile de lucru prezentate.
7. 3. ANALIZA SCOPOLETINEI PRIN HPLC/MS
Scopul acestui subcapitol a fost analiza scopoletinei n Physalis
alkekengi si Solanum dulcamara (Solanaceae), substant ce nu a fost
analizat niciodat n aceste dou plante. Mi-am propus identificarea
si dozarea acestei hidroxicumarine printr-o metod optimizat,
modern si rapid. n tara noastr scopoletina a fost studiat n alte
specii din familia Solanaceae, dar metodele de analiz nu au fost
publicate n reviste de circulatie national si international.
7.3.1. Material yi metod
Condi(iile de lucru HPLC: Coloana analitic: Zorbax SB-C18
100 mm x 3,0 mm i.d., 3,5 m (Agilent, SUA); filtru on-line: 0,2
Rezumatul tezei de doctorat
30
microni (Agilent); faza mobil: amestec solutie acid formic 0,1%
(v/v) si metanol 68/32 (v/v), elutie izocratic; Debitul: 1 mL/minut,
temperatura: 40C. Detectia: MS izolare si fragmentare ion cu m/z
193, corespunztor moleculei scopoletinei protonate, apoi
monitorizare ion cu m/z 133 din spectrul MS/MS al analitului.
Condi(iile de lucru MS: Sursa de ioni: APCI (atmosferic
pressure chemical ionisation); mod ionizare: pozitiv; nebulizator:
azot, presiune 70 psi; gaz de uscare: azot, debit 7 L/minut,
vaporizator 425C, temperatura uscare: 325C; potential capilar: -
3500 V; mod analiz: monitorizare tranzitii m/z 193> 133
Prelucrarea probelor vegetale
Tabelul 7.3. Probele vegetale yi nota(iile solu(iilor extractive
pentru analiza scopoletinei prin HPLC
Nota(ie
proba
Nota(ie
prob
Specie
Loca(ie recoltare Perioada de
recoltare
R 1 T1 Physalis alkekengi Aroneanu August 2009
R 2 T2 Physalis alkekengi Brnova Septembrie 2009
R 3 T3 Physalis alkekengi Breazu Septembrie 2009
R 4 T4 Physalis alkekengi Bucium Septembrie 2009
R 5 T5 Physalis alkekengi Grdina botanic Iulie 2008
R 6 T6 Physalis alkekengi Grdina botanic Iulie 2007
R 7 T7 Solanum dulcamara Grdina botanic Iulie 2007
R 8 T8 Solanum dulcamara Grdina botanic Iulie 2008
R 9 T9 Solanum dulcamara Zona UMF Iasi August 2009
R 10 T10 Solanum dulcamara Zona UMF Iasi Septembrie 2009
Am realizat extractie cu metanol 70% (v/v) prin refluxare
(probele notate cu R) si extractie cu etanol 70% (v/v) - tincturi, probe
notate cu T. n urma analizei probelor ca atare cantitatea de
scopoletin liber a fost sub capacitatea de detectie a aparatului. Prin
urmare, probele au fost hidrolizate n vederea eliberrii scopoletinei
din forma glicozilat: scopolin.
7.3.2. Rezultate yi discu(ii
7.3.2.1. Metoda HPLC/MS
Spectrul de mas (full-scan) nregistrat pentru o solutie de
scopoletin, n conditiile descrise anterior este prezentat n figura 7.4.
Ionul asteptat, conform masei moleculare a substantei analizate
(M=192,1) si n functie de modul de ionizare (pozitiv) ar fi ionul cu
m/z 193,1, corespunztor moleculei protonate.
Rezumatul tezei de doctorat
31
114.0 125.9
141.9
158.0
172.1
183.0
193.0
205.0
223.1
239.2
120 140 160 180 200 220 240 m/z
0
1
2
3
4
4
x10
Intens.
Fig. 7.4. Spectrul de tip full-scan al scopoletinei n faz mobil
Pentru cresterea selectivittii metodei de analiz HPLC/MS,
s-a realizat fragmentarea ionului caracteristic scopoletinei (m/z 193)
si s-a nregistrat spectrul MS (figura 7.5.).
133.0
137.0
149.0
165.0
177.9
192.9
100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 m/z
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
4
x10
Intens.
Fig. 7.5. Spectrul de tip MS/MS al scopoletinei n faza mobil
Se observ c prin fragmentare, scopoletina se scindeaz n
cinci fragmente principale, cu m/z 133, 137, 149, 165 respectiv 178.
Ionul cu m/z 133 a fost ales pentru cuantificare, fiind cel mai intens.
7.3.2.2. Coninutul de scopoletin n plantele analizate
Pentru probele hidrolizate de Physalis alkekengi extrase initial
cu metanol 70% (v/v) prin refluxare, valorile obtinute au variat ntre:
Rezumatul tezei de doctorat
32
83,32 si 267,90 mg% scopoletin. Pentru probele extrase cu etanol
70% (tinctur), valorile au fost ntre 86,53-255,14 mg% scopoletin.
Pentru Physalis alkekengi nu se poate face nici o comparatie functie
de anul recoltrii, valorile fiind prea variate.
Se observ c media concentratiei de scopoletin este mai mare
n probele de Physalis alkekengi dup extractie cu metanol 70% (v/v)
prin refluxare (166,18 mg%), comparativ cu media pentru probele
extrase cu etanol 70% (v/v) (159,95 mg%).
La analiza valorilor obtinute functie de anul recoltrii probelor,
se observ c plantele Solanum dulcamara recoltate n 2009 au
concentratii semnificativ mai mari (de dou-trei ori) dect cele
recoltate n anii precedenti 2008, respectiv 2007.
Valorile maxime, minime si medii sunt mai mici pentru
Physalis alkekengi comparativ cu cele obtinute pentru Solanum
dulcamara. Din figurile 7.10. si 7.11. se observ c extractia cu
metanol 70% (v/v) prin refluxare este mai bun dect cea cu etanol
70% (v/v), att pentru Physalis alkekengi, ct si pentru Solanum
dulcamara.
135,10
161,30
267,90
107,94
255,14
179,62
150,40
199,03
83,32
148,56
95,44
86,53
0,00
50,00
100,00
150,00
200,00
250,00
300,00
1 2 3 4 5 6
Probe
mg scopoletin %
RH
TH
Fig. 7.10. Concentra(iile scopoletinei n probele de Physalis alkekengi,
n func(ie de metoda de extrac(ie
Rezumatul tezei de doctorat
33
438,93
132,53
415,68
220,70
186,89
419,79
123,13
428,8
0,00
50,00
100,00
150,00
200,00
250,00
300,00
350,00
400,00
450,00
500,00
1 2 3 4
Probe
mg scopoletin %
RH
TH
Fig. 7.11. Concentra(iile scopoletinei n probele de Solanum dulcamara,
n func(ie de metoda de extrac(ie
n figura 7.12. sunt reprezentate comparativ valorile
concentratiilor de scopoletin (mg%) obtinute din extractele
metanolice de Physalis alkekengi si Solanum dulcamara.
Physalis alkekengi
Solanum dulcamara
186,89
220,7
419,79 438,93
150,4
199,03
135,1
83,32
161,3
267,9
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
S
c
o
p
o
l
e
t
i
n



m
g
%
Probe
Fig. 7.12. Valorile concentra(iilor de scopoletinei n Physalis alkekengi
yi Solanum dulcamara
Rezumatul tezei de doctorat
34
CAPITOLUL 8. DETERMINAREA SOLANINEI
DIN PHYSALI S ALKEKENGI L. $I SOLANUM DULCAMARA L.
8.1. INTRODUCERE
8.1.1. Structur yi propriet(i fizico-chimice. Istoric
Solanina (figura 8.1.) este alctuit dintr-un trizaharid
solatrioza (glucoz, galactoz, manoz) si un aglicon alcaloidic
solanidin.
Fig. 8.1. Structura chimic a solaninei
8.2. ANALIZA SOLANINEI PRIN
CROMATOGRAFIE PE STRAT SUBTIRE
8.2.1. Material yi metod
Condiiile de lucru pentru cromatografia pe strat subire (CSS)
Placa cromatografic: Silicagel 60, 20 x 20 mm, activat la
110C la etuv timp de 1 or, stropit cu solutie de hidroxid de
potasiu 0,1M n metanol
Sistemul de solventi: metanol : amoniac (100 : 1,5)
Timp developare: aproximativ 1 or
Etalon: -solanin (Fluka) n alcool amilic, 5 L
Rezumatul tezei de doctorat
35
Probe: extractele vegetale, 5 L
Revelare: reactiv iod: spoturi verzi-albastre pe fond violet
deschis si reactiv Marquis: spoturi de culoare albastre-violet-brune
pe fond alb
8.2.2. Analiza solaninei din Physalis alkekengi L.
prin cromatografie pe strat sub(ire
Fig. 8.2. Cromatoplaca pentru solanin (reactiv iod)
Rezumatul tezei de doctorat
36
Fig. 8.3. Cromatoplaca pentru solanin (reactiv Marquis)
Rezumatul tezei de doctorat
37
8.2.3. Analiza solaninei din Solanum dulcamaraL.
prin cromatografie pe strat sub(ire
Fig. 8.4. Cromatoplaca pentru solanin (reactiv iod)
Rezumatul tezei de doctorat
38
Fig. 8.5. Cromatoplaca pentru solanin (reactiv Marquis)
Rezumatul tezei de doctorat
39
8.2.4. Analiza solaninei din
Solanum dulcamara L. yi Physalis alkekengi L. prin CSS
Fig. 8.6. Cromatoplaca pentru solanin (reactiv iod)
8.3. ANALIZA SOLANINEI PRIN HPLC/MS
8.3.1. Material yi metod
8.3.1.1. Prelucrarea probelor vegetale
Probele de produse vegetale au fost recoltate din flora
spontan, dup cum urmeaz:
Solanum dulcamara: august-septembrie 2009 zona UMF,
Iasi si Vntori Neamt.
Physalis alkekengi: august-septembrie 2009 Bucium,
Rezumatul tezei de doctorat
40
Brnova si Breazu, Iasi. Izolarea s-a realizat prin ultrasonare cu
amestec de ap:metanol:acid acetic = 49:49:2 (v/v/v).
8.3.1.2. Metoda de analiz HPLC/MS
Aparatura: HPLC cuplat cu spectrometru de mas
HP 1100 Series binary pump
autosampler HP 1100 Series
termostat HP 1100 Series
spectrometru de mas Agilent Ion Trap 1100 SL
Condiiile de lucru HPLC: coloana analitic: Zorbax SB-C18 100
mm x 3.0 mm i.d., 3,5 m (Agilent, SUA); filtru on-line: 0,2 microni
(Agilent); faza mobil: amestec solutie acid formic 0,1% (v/v) si
acetonitril 75/25 (v/v), elutie izocratic; debitul: 1 mL/minut;
temperatura: 40C. Detectia: MS izolare si fragmentare ion cu m/z
869, corespunztor moleculei solaninei protonate, apoi monitorizare
ioni cu m/z 706,4 si 722,4 din spectrul MS/MS al analitului.
Condiiile de lucru MS: sursa de ioni: ESI (electrospray ionisation);
mod ionizare: pozitiv; nebulizator: azot, presiune 55 psi; gaz de
uscare: azot, debit 12 L/minut, temperatura de uscare 350C;
potential capilar: -2500 V; mod de analiz: monitorizare tranzitii
m/z 869> m/z (706,4 + 722,4)
8.3.2. Rezultate yi discu(ii
8.3.2.1. Analiza MS
Spectrul de mas (full-scan) nregistrat al unei solutii de
solanin, n conditiile descrise anterior este prezentat n figura 8.7.
Ionul asteptat, conform masei moleculare a substantei analizate
(M=868) si n functie de modul de ionizare (pozitiv) ar fi ionul cu
m/z 869, corespunztor moleculei protonate.
Pentru cresterea selectivittii metodei de analiz HPLC/MS, s-a
realizat fragmentarea ionului caracteristic solaninei (m/z 869) si s-a
nregistrat spectrul MS (figura 8.8.).
Rezumatul tezei de doctorat
41
869
+MS
0
1
2
3
6
x10
Intens.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z
Fig. 8.7. Spectrul de tip full-scan al solaninei n faza mobil
398.3
560.3
706.4
868.5
+MS2(869)
0
1
2
3
5
x10
Intens.
400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 m/z
Fig. 8.8. Spectrul de tip MS/MS al solaninei n faza mobil
Se observ c prin fragmentare, solanina se scindeaz n patru
fragmente cu m/z 398, 560, 706 si 722. Dintre aceste fragmente, ionii
cu cele mai mari intensitti au fost ionii cu m/z 706 si 722; acesti ioni
au fost alesi pentru cuantificare.
Rezumatul tezei de doctorat
42
8.3.2.2. Coninutul de solanin n plantele analizate
Tabelul 8.7. Concentra(iile de solanin n extractele analizate, precum
yi cantit(ile de solanin n materialul vegetal
Proba
Loc
recoltare
Concentra(ia
n extractul
vegetal
(ng/mL)
Cantitatea de
solanin n
prob (ng)
Concentra(ia
de solanin n
plant
(g/g)
Solanum
dulcamara/frunze
84,332 421,659 4,2166
Solanum
dulcamara/tulpini
76,606 383,029 3,8303
Solanum
dulcamara/rdcini
32,015 160,074 1,6007
Solanum
dulcamara/fructe
UMF Iasi
27,277 136,387 1,3639
Solanum
dulcamara/frunze
15,926 79,632 0,7963
Solanum
dulcamara/tulpini
64,050 320,250 3,2025
Solanum
dulcamara/rdcini
30,232 151,159 1,5116
Solanum
dulcamara/fructe
Vntori
Neamt
31,002 155,009 1,5501
Physalis alkekengi/frunze 0,000 0,000 0,0000
Physalis alkekengi/tulpini 5,636 28,181 0,2818
Physalis
alkekengi/rdcini
4,466 22,328 0,2233
Physalis alkekengi/fructe
Bucium
1,852 9,259 0,0926
Physalis alkekengi/frunze 1,980 9,901 0,0990
Physalis alkekengi/tulpini 0,000 0,000 0,0000
Physalis
alkekengi/rdcini
0,000 0,000 0,0000
Physalis alkekengi/fructe
Brnova
0,000 0,000 0,0000
Physalis alkekengi/frunze 2,885 14,425 0,1442
Physalis alkekengi/tulpini 1,840 9,199 0,0920
Physalis
alkekengi/rdcini
0,000 0,000 0,0000
Physalis alkekengi/fructe
Breazu
0,000 0,000 0,0000
n figura 8.11. sunt prezentate, ca exemplu, cromatogramele
tipice pentru solanina determinat n probele vegetale.
Rezumatul tezei de doctorat
43
PROB_A__000025.D: EIC 706.4; 722.5 +MS2(869.0), Smoothed (0.5,1, GA)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
5
x10
Intens.
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Time [min]
PROB_A__000026.D: EIC 706.4; 722.5 +MS2(869.0), Smoothed (0.5,1, GA)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
4
x10
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Time [min]
PROB_A__000033.D: EIC 706.4; 722.5 +MS2(869.0), Smoothed (0.5,1, GA)
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
4
x10
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Time [min]
Fig. 8.11. Cromatogramele solaninei extrase din probele Solanum
dulcamara/frunze/ UMF (sus), Solanum dulcamara/frunze/Zimbru
(mijloc) yi Physalis alkekengi/frunze/Bucium (jos)
n plantele studiate s-a identificat si dozat solanina, s-au obtinut
valori foarte diferite depinznd n primul rnd de specie si apoi de
locul de recoltare. Variatia concentratiilor de solanin din probele de
Solanum dulcamara comparativ cu cele din Physalis alkekengi este
reprezentat n figura 8.12, se observ c Solanum dulcamara
contine mai mult solanin.
Rezumatul tezei de doctorat
44
0,0000
0,5000
1,0000
1,5000
2,0000
2,5000
3,0000
3,5000
4,0000
4,5000
1 2 3 4 5 6 7 8
Probe
m
i
c
r
o
g
r
a
m
e
/
g
Solanumdulcamara
Physalis alkekengi
Fig. 8.12. Valorile concentra(iilor de solanin
n Solanum dulcamarayi Physalis alkekengi (g/g)
n frunzele de Solanum dulcamara concentratia maxim de
solanin a fost de 4,2166 g/g (zona UMF, Iasi), iar concentratia
minim - 0,7963 g/g s-a determinat n plantele recoltate din zona
Vntori Neamt.
Pentru Physalis alkekengi, n 50% dintre probe analizate
valorile solaninei au fost sub limita de detectie a aparaturii (tabelul
8.7.). Valoarea maxim (0,2818 g/g) s-a nregistrat n proba de
tulpini a plantelor recoltate din zona Bucium, Iasi.
Dac se compar valoarea medie de solanin pentru Solanum
dulcamara cu valoarea medie pentru Physalis alkekengi, se observ
c este mai mare de 21,67 ori.
Rezumatul tezei de doctorat
45
CAPITOLUL 9. ANALIZA ALCALOIZILOR TROPANICI DIN
PHYSALI S ALKEKENGI L. $I SOLANUM DULCAMARA L.
9.1. INTRODUCERE. OBIECTIVE
Obiectiv: n cadrul studiului celor dou plante din familia
Solanaceae am analizat si alcaloizii tropanici: atropina si
scopolamina. Pentru analiza atropinei si scopolaminei din extracte
vegetale s-a folosit cromatografia de lichide de nalt performant
cuplat cu spectrometria de mas (LC/MS/MS).
9.2. MATERIALE $I METOD
9.2.1. Metoda HPLC
Condi(iile de lucru HPLC: coloana analitic: Zorbax SB-C18
50 mm x 2,1 mm i.d., 3,5 m (Agilent, SUA); filtru on-line: 0,2
microni (Agilent); faza mobil: amestec solutie acid formic 0,2%
(v/v) : metanol = 80:20 (v/v); debitul: 0,25 mL/minut, temperatura:
50C; detectia : electrospray pozitiv, MS/MS(MRM) pentru ambii
analiti; timp de retentie: atropina -1,1 minute, scopolamina 1,95
minute, volumul de injectare: 1,5 L
Condi(iile de lucru MS: sursa de ioni: ESI (electrospray
ionisation); mod ionizare: pozitiv; nebulizator: azot, presiune 40 psi;
gaz de uscare: azot, debit 9 L/minut, temperatura 350C; potential
capilar: 2700 V. Mod analiz: pentru atropina: monitorizare
tranzitie m/z 290,2 > m/z 124,2; pentru scopolamina: monitorizare
tranzitii m/z 304,2 > (138,2;156,2)
9.2.2. Prelucrarea probelor vegetale
Probele de produse vegetale au fost recoltate din flora
spontan, dup cum urmeaz:
Solanum dulcamara: august-septembrie 2009 zona UMF,
Iasi si Vntori Neamt.
Physalis alkekengi: august-septembrie 2009 Bucium si
Breazu, Iasi.
Izolarea alcaloizilor tropanici s-a realizat prin ultrasonare
utiliznd un amestec de solventi de extractie: ap:metanol = 25:75
(v/v), cu acid formic 2%.
Rezumatul tezei de doctorat
46
9.3. REZULTATE $I DISCUTII
9.3.1. Analiza atropinei
Am nregistrat spectrul de mas (full-scan) al unei solutii de
atropin, n conditiile descrise anterior. Ionul asteptat, conform masei
moleculare a atropinei (M=289,3) si n functie de modul de ionizare
(pozitiv) ar fi ionul cu m/z 290,2, corespunztor moleculei
protonate. Prin fragmentarea ionului cu m/z 290 s-a obtinut un
spectru n care ionul predominant este 124,2 (figura 9.4.), acesta
fiind ales pentru cuantificarea atropinei.
91.2
124.2
214.3
260.2
290.2
+MS2(290.2)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
6
x10
Intens.
50 100 150 200 250 300 m/z
Fig. 9.4. Spectrul de tip MS/MS al atropinei n faza mobil
9.3.2. Analiza scopolaminei
Spectrul de mas (full-scan) a fost nregistrat pentru o solutie
de scopolamin. Ionul asteptat, conform masei moleculare a
scopolaminei (M=303,3) si n functie de modul de ionizare (pozitiv)
ar fi ionul cu m/z 304. Prin fragmentarea ionului cu m/z 304,2 s-a
obtinut un spectru n care exist doi ioni majoritari, cu m/z 138,2 si
156,2 (figura 9.8.). Ambii ioni din spectru au fost utilizati pentru
cuantificarea scopolaminei.
Rezumatul tezei de doctorat
47
110.3
138.2
156.2
285.3 304.2
+MS2(304.2)
0
1
2
3
4
5
x10
Intens.
100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 m/z
Fig. 9.8. Spectrul de tip MS/MS al scopolaminei n faza mobil
Curba de calibrare pentru dozarea scopolaminei s-a realizat n
intervalul de concentratii 6,85-274 ng/mL.
9.3.3. Determinarea atropinei yi scopolaminei n plantele analizate
n nici una din probele analizate nu s-a pus n evident atropina
si scopolamina.
Rezumatul tezei de doctorat
48
CAPITOLUL 10. EVALUAREA ACTIVITTII ANTIMICROBIENE
A EXTRACTELOR OBTINUTE DIN PHYSALI S ALKEKENGI L.
10.1. INTRODUCERE, OBIECTIVE
Scopul acestui studiu const n evaluarea potentialului
antibacterian al extractelor obtinute din frunze, tulpini, rdcini si
capsule de Physalis alkekengi L. pentru a confirma utilizarea n
medicina traditional n afectiuni asociate cu microorganismele
patogene si a detecta noi surse de agenti antimicrobieni. Date privind
utilizarea terapeutic si propriettile farmacologice ale speciilor de
Physalis au fost comunicate de Ray si Gupta (1997) si Tomassini si
colab. (1999).
10.2. MATERIAL $I METODE
10.2.1. Materialul vegetal yi prelucrarea probelor
Plantele Physalis alkekengi au fost recoltate din zona de
periferie a municipiului Iasi (Breazu, Bucium) n vara anului 2009.
Pentru compararea activittii antimicrobiene am utilizat probe de
anason (Pimpinella anisum L.) coriandru (Coriandrum sativum L.),
chimen (Carum carvi L.) scortisoar (Cinnamomum verum J.Pres.),
cucurma (Cuminum cyminum L.) si cardamom (Elettaria
cardamomum L.). Aceste probe au fost obtinute din surse comerciale
sub form de pulbere si s-au prelucrat prin infuzare cu apa distilat.
Probele testate sunt prezentate n tabelul 10.1.
Tabelul 10.1. Probele de material vegetal incluse n studiu pentru
evaluarea activit(ii antimicrobiene a Physalis alkekengi L.
Proba
Produs
vegetal
Solvent Metoda de extrac(ie
1 rdcini alcool etilic Aparat Soxhlet
2 tulpini alcool etilic Aparat Soxhlet
3 frunze alcool etilic Aparat Soxhlet
4 capsule alcool etilic Aparat Soxhlet
5 rdcini alcool etilic Soxhlet, evaporare, reluare cu hexan
: acetat de etil
6 tulpini alcool etilic Soxhlet, evaporare, reluare cu hexan
: acetat de etil
7 frunze alcool etilic Soxhlet, evaporare, reluare cu hexan
: acetat de etil
Rezumatul tezei de doctorat
49
8 capsule alcool etilic Soxhlet, evaporare, reluare cu hexan
: acetat de etil
9 rdcini alcool etilic 70% tinctur
10 tulpini alcool etilic 70% tinctur
11 frunze alcool etilic 70% tinctur
12 capsule alcool etilic 70% tinctur
13 rdcini alcool etilic 50% tinctur
14 tulpini alcool etilic 50% tinctur
15 frunze alcool etilic 50% tinctur
16 capsule alcool etilic 50% tinctur
17 rdcini alcool metilic tinctur
18 tulpini alcool metilic tinctur
19 frunze alcool metilic tinctur
20 capsule alcool metilic tinctur
21 rdcini alcool metilic 50% tinctur
22 tulpini alcool metilic 50% tinctur
23 frunze alcool metilic 50% tinctur
24 capsule alcool metilic 50% tinctur
25 rdcini ap infuzie
26 tulpini ap infuzie
27 frunze ap infuzie
28 capsule ap infuzie
29 anason ap infuzie
30 coriandru ap infuzie
31 chimen ap infuzie
32 scortisoar ap infuzie
33 cucurma ap infuzie
34 cardamom ap infuzie
n teste au fost incluse si dilutiile de alcool etilic, respectiv
metilic.
10.2.2. Microorganisme test
Au fost incluse n test urmtoarele tulpini procurate din The
American Type Culture Collection: Staphylococcus aureus ATCC
25923, Sarcina lutea ATCC 9341, Bacillus cereus ATCC 14579,
Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 25922,
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Candida albicans ATCC
10231. Bacteriile testate au fost cultivate pe bulion Mueller-Hinton
iar Candida pe mediu lichid Sabouraud. Ampicilina (10 g/disc) si
nistatina (100 g/disc) au fost utilizate pentru controlul pozitiv al
actiunii antimicrobiene.
Rezumatul tezei de doctorat
50
10.3. EVALUAREA POTENTIALULUI ANTIMICROBIAN A
EXTRACTELOR DE PHYSALI S ALKEKENGI L.
Cea mai satisfctoare metod pentru msurarea potentialului
antimicrobian al extractelor investigate este tehnica microbiologic a
difuziei n agar (Sutherland si Rolinson, 1978).
10.3.1. Rezultate
Activitatea antimicrobian evaluat prin metoda cantitativ,
difuzimetric, a extractelor de Physalis alkekengi si a celor de
anason, coriandru, chimen si scortisoar sunt prezentate n
figura 10.2. (a, b, c, d, e, f, g).
a. Staphylococcus aureus
(probele 112)
b. Staphylococcus aureus
(probele 1324)
c. Staphylococcus aureus
(probele 2536)
d. Bacillus cereus
(probele 112)
e. Bacillus cereus
(probele 1324)
f. Bacillus cereus
(probele 2536)
Rezumatul tezei de doctorat
51
g. Bacillus subtilis (probele 2536)
Fig. 10.2. Activitatea antimicrobian a extractelor de Physalis
alkekengi yi a celor de anason, coriandru, chimen yi scor(iyoar
10.3.2. Discu(ii
Tehnica standardizat a difuziei n agar ofer date calitative
privind potentialul antimicrobian, rezultatele sunt reproductibile si
sunt corelate cu valorile concentratiei minime inhibitorie (CMI).
Extractele luate n studiu prezint o actiune antimicrobian bun
asupra cocilor gram-pozitiv. Asupra Bacillus cereus ATCC 14579,
activitate antimicrobian manifest toate variantele de extracte din
frunze si extractele n alcool etilic 50% din rdcini si tulpini.
Actiunea asupra Bacillus subtilis, sczut, este prezent doar n cazul
infuziei din frunze. Toate extractele testate nu au actiune asupra
bacteriilor gram-negativ si nici asupra Candida albicans.
Activitatea antimicrobian a infuziilor obtinute din diverse
sorturi comerciale de anason, coriandru, cimbru si scortisoar este
comparabil cu cea a infuziilor obtinute din rdcini, frunze, tulpini
si capsule de Physalis alkekengi L (figura 10.4.).
Rezumatul tezei de doctorat
52
2
1 1
2
1
2 2 2
0
0,5
1
1,5
2
2,5
cini tulpini frunze capsule anason coriandru chimen scoroar
m
i
c
r
o
g
r
a
m
e
/
m
L
Fig. 10.4. Activitatea antimicrobian a infuziilor
din Physalis alkekengi comparativ cu cea a condimentelor
Concentratiile principiilor active ale extractelor determinate
prin metoda microbiologic a difuziei n agar, propus de Sutherland
si Rolinson (1978) sunt diferite, functie de metoda de extractie
utilizat si partea vegetal prelucrat.
Indiferent de metoda de extractie utilizat, cele mai mari
concentratii ale principiului activ sunt prezente n rdcini iar n
capsule concentratia nu difer semnificativ, fiind cuprins ntre 2,02
3 g/mL.
Concentratia cea mai mare a principiului activ din frunze (10,5
g/mL) s-a obtinut pentru extractul n alcool etilic dup extractie n
aparatul Soxhlet. Cantitti aproximativ echivalente de principiu activ
s-au obtinut pentru extractele n etanol 70% si metanol 50%.
Rezumatul tezei de doctorat
53
CAPITOLUL 11. EVALUAREA TOXICITTII ACUTE $I A ACTIUNII
ANALGEZICE-ANTIINFLAMATOARE A EXTRACTELOR ALCOOLICE
DIN PHYSALI S ALKEKENGI L. $I SOLANUM DULCAMARA L.
11.2. MATERIAL $I METOD
Materialul vegetal a fost recoltat din flora spontan din Iasi:
Physalis alkekengi L. din Bucium n august 2009 si Solanum
dulcamara L. din zona UMF n septembrie 2009. Am realizat
extracte alcoolice din frunzele plantelor cu alcool etilic 70% (v/v) si
le-am analizat n capitolul 7 prin HPLC pentru determinarea
cantitativ a scopoletinei, substant cu efect antiinflamator. Cu P1 s-a
notat extractul obtinut din frunzele de Physalis alkekengi L. si cu P2
s-a notat extractul din frunzele de Solanum dulcamara L. Conform
datelor obtinute prin HPLC proba P1 contine 0,159 mg scopoletin
/mL extract si proba P2 contine 0,275 mg scopoletin /mL extract.
Deoarece extractele contin alcool 70% (v/v), a fost necesar
evaporarea acestuia, lund n lucru reziduul obtinut n urma
evaporrii.
Pentru realizarea acestor studii s-au utilizat soareci albi Swiss,
masculi, adulti cu greutatea ntre 18 - 25 g. Cazarea animalelor a fost
efectuat n incinta vivarium-ului Disciplinei de Farmacodinamie
ntr-o ncpere a crei temperatur a fost controlat (21C 2C), cu
un ciclu de lumin/ntuneric (12 ore/12ore). n fiecare cusc,
prevzut cu adptor, au fost cazate cte 6-10 animale pentru
acomodare. Animalele au primit hran standard si ap ad libitum. Cu
10 zile nainte de a efectua testrile s-a observat comportamentul
acestora. Cu 3 ore nainte de a efectua protocolul experimental s-a
sistat accesul la hran si ap.
Toate procedeele experimentale utilizate n realizarea acestui
studiu au fost efectuate n laboratorul disciplinei de Farmacodinamie-
Farmacie clinic, n acord cu reglementrile internationale de
bioetic referitoare la studiile realizate pe animale de laborator si
reglementrile UMF Gr. T. Popa Iasi.
Rezumatul tezei de doctorat
54
11. 5. REZULTATE $I DISCUTII
11.5.1 Evaluarea toxicit(ii acute a extractelor alcoolice
de Physalis alkekengi L. yi Solanum dulcamara L.
Testul de toxicitate acut s-a efectuat prin administrarea
reziduului suspendat n mucilag de CMC-Na 0,1%, doz unic, apoi
observarea animalelor de experiment timp de 7 zile consecutiv. S-au
utilizat serii succesive de doze n progresie geometric dup cum
urmeaz: pentru proba P1 s-au utilizat: 2389,2; 1192,6; 597,3
mg/kg/p.o. iar pentru proba P2: 2107,33; 1053,66; 526,83
mg/kg/p.o. Peste dozele maxime nu s-au mai putut efectua
administrri p.o. datorit unor probleme de formulare care ar fi dus la
date eronate. Aceste doze au fost considerate ca fiind dozele maxime
tolerate pentru cele dou probe. Pentru toate seriile de doze utilizate
nu am nregistrat mortalitti sau evenimente care s exprime
toxicitate ridicat. Pentru doza maxim tolerat s-a nregistrat o usoar
stare de disconfort mai vizibil la proba P2, tradus prin agitatie si
tremor, care a disprut n primele dou ore de la administrare.
22,89
9,71
4,33
23,52
9,78
3,90
22,61
9,78
4,35
20,71
9,64
5,21
0
5
10
15
20
25
martor P1 lot 1 P1 lot 2 P1 lot 3
greutate (g) consum hran (g) consum ap (mL)
Fig. 11.4. Evaluarea greut(ii corporale, consumului mediu
de hran yi ap / greutate medie animal, pentru proba P1
Rezumatul tezei de doctorat
55
22,89
9,21
4,33
21,71
8,92
3,9
21,66
8,07
3,71
21,9
8,59
3,85
0
5
10
15
20
25
martor P2 lot1 P2 lot2 P2 lot3
greutate (g) consum hran (g) consum ap (mL)
Fig. 11.5. Evaluarea greut(ii corporale, consumului mediu
de hran yi ap/ greutate medie animal, pentru proba P2
n urma analizei rezultatelor s-a constat c la dozele studiate,
probele P1 si P2 s-au dovedit a fi netoxice si nu au influentat
greutatea corporal si comportamentul alimentar al animalelor de
experiment (figurile 11.4. si 11.5).
11.5.2. Testul rspunsului constrictiv abdominal indus prin zymosan
Acest test a fost realizat pentru proba P2. Pentru stabilirea
dozei eficace 50 (DE50) animalele de experiment au fost tratate cu
serii de doze n progresie geometric (cu ratia 2) lund ca punct de
reper doza maxim tolerat pentru proba P2. S-au utilizat
urmtoarele doze: 143,75; 287,50; 575,00; 765,80 mg/kg p.o.
reziduu. Doza de 1150,00 mg/kg a limitat aparitia rspunsului
constrictiv abdominal datorit strii de disconfort indus la animalele
de experiment. Dozele de P2 s-au administrat p.o. sub form de
suspensii n carboximetilceluloz sodic 0,1%. La 45 minute dup
administrarea suspensiilor, s-a administrat, pe cale intraperitoneal
suspensia de zymosan A n ser fiziologic (40 mg/kg corp). Animalele
Rezumatul tezei de doctorat
56
au fost plasate pe grtar sub cristalizoare si s-a nregistrat numrul de
rspunsuri constrictive abdominale timp de 12 minute.
Prin analiza dreptelor de regresie obtinute la testul
rspunsului constrictiv abdominal s-a determinat DE50 pentru
actiunea antinociceptiv a reziduului obtinut prin evaporarea probei
P2: DE50 = 534,28 125,86 mg/kg/p.o. reziduu, cu un continut de
6,966 1,638 mg scopoletin. Actiunea antinociceptiv pentru
modelul indus prin zymosan poate fi explicat prin capacitatea
scopoletinei de a inhiba dependent de doz productia de citokine pro
inflamatorii: TNF-alfa, IL-1beta, IL8.
11.5.3. Testul Randall-Selitto
Acest test a fost realizat pentru proba P2. Pentru realizarea
acestui test si ndeprtarea erorilor, am utilizat un lot martor care a
primit pe cale oral doar vehicolul suspensie de CMC-Na 0,1%. La
30 minute dup aceasta s-a administrat subcutanat, n regiunea
plantar pentru laba stng, 0,05 mL carageenan 3,00% m/v n ser
fiziologic iar pentru laba dreapt ser fiziologic si dup 4 ore (timp
necesar dezvoltrii edemului) s-a msurat perioada de latent pentru
laba inflamat si pentru controlateral. Loturile tratate au primit pe
cale oral suspensie de CMC-Na cu reziduul probei P2 si solutie
ibuprofen, cu 30 minute nainte de administrarea agentului
inflamagen, testarea efectundu-se conform precizrilor anterioare.
Avnd posibilitatea s msurm volumul labei inflamate
(metoda pletismometric) fr a influenta edemul, am ncercat, n
paralel, s evalum si actiunea antiinflamatoare, pe de o parte, tinnd
cont de faptul c substantele luate n studiu prezint ambele actiuni,
iar pe de alt parte pentru a crea posibilitatea separrii nete a actiunii
antinociceptive de cea antiinflamatoare pentru secventele de doze
studiate.
Prin analiza dreptelor de regresie s-a determinat DE50 pentru
actiunea antinociceptiv si antiinflamatoare a reziduului obtinut prin
evaporarea extractului alcoolic pentru proba P2, pentru testul
Randall-Selitto. Pentru actiunea antinociceptiv s-a obtinut DE50 =
848,69 37,735 mg/kg/p.o. reziduu, cu un continut de 11,070
0,492 mg scopoletin, pentru actiunea antiinflamatoare DE50 =
746,90 31,840 mg/kg/p.o. reziduu cu un continut de 9,742 0,415
Rezumatul tezei de doctorat
57
mg scopoletin. Att actiunea antinociceptiv ct si cea
antiinflamatoare pot fi explicate prin capacitatea scopoletinei de a
inhiba PGE2.
Dreptele de regresie ale probei P2 au fost comparate cu
dreptele de regresie ale ibuprofenului, substant medicamentoas cu
actiune antinociceptiv si antiinflamatoare demonstrat. Parametrii
statistici rezultati din studiul de fat indic faptul c reziduul probei
P2 prezint actiune semnificativ antinociceptiv si antiinflamatoare
asemntoare cu cea a ibuprofenului.
Rezumatul tezei de doctorat
58
CONCLUZII GENERALE. CONTRIBUTII ORIGINALE.
PERSPECTIVE DE CERCETARE
CONCLUZII GENERALE
n teza de doctorat sunt prezentate rezultatele cercetrii
fitochimice si farmacotoxicologice a dou specii de plante din
familia Solanaceae: Physalis alkekengi L. si Solanum dulcamara L.,
specii spontane din flora trii noastre. Lucrarea este structurat n
dou prti: Stadiul cunoayterii (trei capitole) si Contribu(ii
personale ce cuprinde 8 capitole. Partea general include informatii
din materialul bibliografic referitoare la subiectul tezei de doctorat.
Capitolul 1 cuprinde consideratii generale privind plantele
toxice din familia Solanaceae. Clasificarea plantelor din aceast
familie s-a fcut n functie de principiile active toxice. Pantele din
familia Solanaceae se clasific astfel: cu alcaloizii tropanici (genurile
Atropa, Datura, Hyoscyamus, Mandragora, Scopolia), plante ce
contin alcaloizi piridinici (genul Nicotiana) si plante cu
glicoalcaloizi (genurile Solanum, Physalis, Lycium). Fiecare
monografie reuneste date privind: descrierea, rspndirea,
propriettile fizico-chimice ale principiilor active toxice, cazuri de
intoxicatii precum si simptomatologie si tratament. Unele plante sunt
citate n literatur ca fiind toxice fr a se cunoaste exact principiile
toxice. Astfel se justific cercetrile fitochimice si
farmacotoxicologice asupra speciilor Solanum dulcamara si Physalis
alkekengi.
n capitolul 2 sunt descrise metodele de determinare a
toxicittii: metoda Fixed Dose Procedure, metoda Acute Toxic
Class Method si metoda Up and Down. Am inclus acest capitol ca
parte de studiu n cercetarea farmacotoxicologic a extractelor
vegetale. Orice substant activ biologic este supus cercetrilor in
vivo iar aceste teste sunt vitale pentru sntatea si siguranta omului.
Capitolul 3 cuprinde date privind metodele de extractie si
analiz a principiilor active din plantele apartinnd familiei
Solanaceae. Pentru extractia alcaloizilor din plante se practic initial
Rezumatul tezei de doctorat
59
o purificare cu eter de petrol sau hexan apoi se extrage cu alcool
(metanol sau etanol). Alcaloizii bazici se extrag n mediu alcalin
(NH
3
sau Na
2
CO
3
), iar alcaloizii acizi si neutri se extrag n mediu
acid (acid tartric, acid citric); ca solventi organici se utilizeaz acetat
de etil, cloroform, eter etilic, benzen.
Metodele de analiz sunt: metode cromatografice (CSS, HPLC
si GC), metode spectrale, metode LC-MS si metode electrochimice
(electroforetice si voltametrice).
Partea tezei de doctorat Contribu(ii personale este
structurat n 8 capitole. Pentru o bun cunoastere a plantelor luate n
studiu am realizat capitolul 4 al tezei de doctorat n care prezint
datele obtinute privind structura anatomic a organelor vegetative ale
plantelor.
Capitolele 5, 6, 7, 8 si 9 includ studiul fitochimic al dou specii
de plante din familia Solanaceae: Solanum dulcamara L. si Physalis
alkekengi L.
n capitolul 5 s-a realizat analiza compusilor polifenolici n
mai multe etape:
A. Prin metode spectrofotometrice conform Farmacopeei
Romne (editia X) s-au determinat cantitativ polifenolii totali
exprimati n acid cafeic si flavonoidele exprimate n rutozid si
cvercetol. Datele obtinute arat c frunzele de Physalis alkekengi
sunt mai bogate n polifenoli totali si flavonoide; iar extractia cea mai
bun este cu metanol 70% (v/v).
B. Validarea metodei HPLC/MS modificat pentru 18
standarde de compusi polifenolici pentru care s-a realizat analiza prin
detectie UV si MS. Pentru acesti compusi am elaborat metoda de
dozare HPLC/MS/MS.
C. Am aplicat metoda HPLC/MS/MS pentru extractele din
plantele analizate.
Din analiza datelor obtinute prin HPLC/MS/MS se desprind
urmtoarele idei:
1. pentru extractele obtinute prin extractie cu metanol 70%
(v/v):
apigenina s-a determinat numai n probele hidrolizate
de Physalis alkekengi
kemferolul si acidul p-cumaric s-au determinat numai
Rezumatul tezei de doctorat
60
n probele hidrolizate att n Physalis alkekengi, ct si
n Solanum dulcamara
rutozidul si quercitrinul apar numai n probele
nehidrolizate att n Physalis alkekengi, ct si n
Solanum dulcamara
isoquercitrinul s-a determinat numai n probele
nehidrolizate de Solanum dulcamara
2. pentru extractele obtinute prin extractie cu etanol 70% (v/v):
kemferolul si acidul p-cumaric s-a determinat numai
n probele hidrolizate att n Physalis alkekengi, ct si
n Solanum dulcamara
rutozidul si quercitrinul s-au gsit numai n probele
nehidrolizate att n Physalis alkekengi, ct si n
Solanum dulcamara
apigenina s-a determinat att n probele hidrolizate ct
si n probele nehidrolizate de Physalis alkekengi
3. prin hidrolizare se obtin cantitti mai mari de compusi
polifenolici n extractele vegetale.
Valorile compusilor polifenolici sunt foarte variate si depind de
specie, modul de extractie, locul de recoltare si perioada recoltrii. O
concluzie important este faptul c dup hidroliza probelor extrase cu
etanol 70% valorile compusilor polifenolici determinate prin
HPLC/MS sunt semnificativ mai mari, de asemenea cantitti
importante de luteolin si cvercetol se gsesc n Physalis alkekengi.
Capitolul 6 cuprinde rezultatele obtinute n cadrul studiului
prezentei compusilor fitosterolici n Solanum dulcamara L. si
Physalis alkekengi L. Mentionm c aceste dou plante din familia
Solanaceae sunt studiate pentru prima dat n Romnia. S-a dezvoltat
o metod HPLC/MS pentru identificarea si dozarea a patru
fitosteroli: sitosterol, stigmasterol, campesterol si ergosterol.
Materialul vegetal s-a prelucrat pentru determinarea sterolilor liberi
prin extractie cu hexan n aparatul Soxhlet si pentru determinarea
sterolilor totali prin saponificare, apoi extractie cu hexan. Dup
saponificare s-au obtinut cantitti mai mari de fitosteroli pentru
ambele plante luate n studiu. Valorile obtinute sunt foarte variabile
si depind de specie, locul de recoltare, perioada recoltrii si prtile
plantei. n Physalis alkekengi L. predomin campesterolul, iar n
Rezumatul tezei de doctorat
61
Solanum dulcamara L. sitosterolul, valoarea medie a sitosterolului n
probele de Physalis alkekengi L. este de dou ori mai mare dect n
probele de Solanum dulcamara L. S-a pus n evident faptul c
fructele de Physalis alkekengi L. sunt bogate n fitosteroli.
n capitolul 7 continum studiul fitochimic al celor dou plante
cu identificarea si dozarea scopoletinei, o hidroxicumarin cu
multiple proprietti farmacologice n cercetare. Analiza s-a efectuat
n dou etape:
A. analiza prin CSS: prezenta scopoletinei s-a evidentiat n
toate probele luate n studiu prin CSS pe suport adsorbant silicagel cu
fluorescent. Extractia scopoletinei s-a realizat dup o prealabil
hidroliz acid prin extractie lichid/lichid cu cloroform. Sistemul de
solventi utilizat a fost aceton : ap : amoniac (45:3,3:1,5). Rf-ul
etalonului a fost 0,40 iar pentru probe a variat ntre 0,38 si 0,42 n
conditiile de lucru prezentate.
B. analiza prin HPLC/MS: scopoletina s-a extras: cu metanol
70% (v/v) prin refluxare si cu etanol la rece 70% (v/v). Extractele au
fost analizate, dup ce n prealabil s-a validat metoda de dozare. n
probele ca atare nu s-a putut doza scopoletina si am realizat o
hidroliz acid. Probele hidrolizate au avut concentratii semnificativ
mai mari de scopoletin: ntre 83,32 si 267,90 mg% pentru Physalis
alkekengi si ntre 123,13 si 438,93 mg% pentru Solanum dulcamara.
Cea mai bun extractie a fost cu metanol 70% (v/v) prin refluxare.
Concentratiile de scopoletin n Solanum dulcamara au fost de dou
ori mai mari dect n Physalis alkekengi.
Rezultatele evalurii solaninei n diferite extracte ale plantelor
studiate sunt incluse n capitolul 8. Solanina este principalul
glicoalcaloid toxic n speciile familiei Solanaceae, responsabil de
intoxicatiile prin confuzie cu alte plante sau prin acumulare n
anumite conditii n speciile alimentare ale familiei Solanaceae.
Cercetarea solaninei s-a realizat n dou etape:
Analiza prin CSS am extras solanina prin mai multe
metode: o metod din literatura de specialitate aplicat pe Solanum
tuberosum - extractia la cald n aparatul Soxhlet cu alcool amilic si
dou metode mai rapide: extractia prin refluxare cu alcool amilic si
extractia lichid/lichid la rece cu alcool amilic. Prin toate metodele de
extractie s-a izolat solanina si s-a identificat prin revelare cu doi
Rezumatul tezei de doctorat
62
reactivi: reactiv cu iod si reactiv Marquis. Rf-ul etalonului de
solanin este 0,65, n conditiile de lucru prezentate. O extractie mult
mai bun a solaninei din cele dou plante studiate s-a realizat n
mediu acid cu o solutie de ap : acid acetic : metabisulfit de sodiu
(100 : 5 : 0,5) si apoi extractie lichid-lichid cu alcool amilic.
Analiza prin HPLC/MS: am stabilit metoda de analiz pe
standard de solanin si am aplicat conditiile de lucru pentru
identificarea si dozarea solaninei n extractele din plante. Pentru
Physalis alkekengi, n 50% dintre probe analizate valorile solaninei
au fost sub limita de detectie a aparatului. Valorile obtinute pentru
Solanum dulcamara variaz ntre 0,7963 g/g (plante recoltate din
zona Vntori Neamt) si 4,2166 g/g (plante recoltate din zona
UMF, Iasi). Cantitatea medie de solanin functie de prtile vegetative
ale plantei variaz astfel: tulpini > frunze > rdcini > fructe.
Scopul capitolului 9 al tezei de doctorat a fost analiza
alcaloizilor tropanici n Solanum dulcamara L. si Physalis alkekengi
L.. Am dezvoltat initial o metod HPLC/MS/MS pentru substantele
standard: atropina si scopolamina, apoi am aplicat aceast metod pe
extractele vegetale obtinute. Concluzia acestui capitol este c nici o
prob analizat nu contine atropin si scopolamin.
n urmtoarele dou capitole (10 yi 11) s-a procedat la studiul
farmaco-toxicologic al plantelor studiate.
Potentialul antimicrobian al extractelor de Physalis alkekengi
L. a fost evaluat n capitolul 10. S-au realizat mai multe extracte cu
diferiti solventi, cea mai eficient metod a fost extractia cu alcool
etilic n aparatul Soxhlet. Actiunea antimicrobian s-a determinat
asupra cocilor gram-pozitiv. Toate extractele nu au actiune asupra
bacteriilor gram-negativ si nici asupra Candida albicans.
Extractele alcoolice, dar si infuziile din rdcini, frunze, tulpini
si capsule de Physalis alkekengi L. prezint o actiune antimicrobian
bun asupra Staphylococcus aureus. Asupra Bacillus cereus,
activitatea antimicrobian se manifest n toate variantele de extracte
din frunze si extractele n alcool etilic 50% din rdcini si tulpini.
Actiunea sczut asupra Bacillus subtilis este prezent doar n cazul
infuziei din frunze. Activitatea antimicrobian a extractelor din
Physalis alkekengi L. s-a comparat cu cea a infuziilor obtinute din
diverse sorturi comerciale de anason, coriandru, cimbru si
Rezumatul tezei de doctorat
63
scortisoar. Concluzia acestui capitol este c principiile active
prezente n extractele studiate manifest proprietti antibacteriene
asupra cocilor gram-pozitiv, comparabile cu cele ale ampicilinei.
n capitolul 11 am evaluat activitatea farmacotoxicologic a
extractelor alcoolice de Physalis alkekengi L. si Solanum
dulcamara L.
1. S-a realizat testul de toxicitate acut pe animale de
experiment pentru probele luate n studiu. Dozele maxime tolerate au
fost 19,08 mg scopoletin (Physalis alkekengi L.) si 27,5 mg
scopoletin (Solanum dulcamara L.). La dozele studiate cele dou
plante s-au dovedit a fi netoxice si nu au influentat greutatea
corporal si comportamentul alimentar al animalelor de experiment.
2. Pentru proba de Solanum dulcamara L. am testat actiunea
analgezic a reziduului prin testul rspunsului constrictiv abdominal
indus de zymosan si am evaluat actiunea antiinflamatoare prin testul
Randall-Selitto. Actiunea analgezic si antiinflamatoare a
scopoletinei (principiul activ testat) a fost comparat cu actiunea
ibuprofenului.
CONTRIBUTII ORIGINALE
1. Am realizat un studiu fitochimic al speciilor Solanum
dulcamara L. si Physalis alkekengi L., care sunt clasificate ca plante
toxice n literatura de specialitate, dar prezint principii active
biologic nevalorificate nc, nici la nivel mondial.
2. Am dezvoltat metode moderne HPLC/MS pentru analiza
calitativ si cantitativ a solaninei si scopoletinei, care le-am aplicat
cu succes pe speciile studiate.
3. Am evaluat actiunea antimicrobian a organelor vegetative
ale speciei Physalis alkekengi L., dup diferite tipuri de extractii si
am fcut o comparare a actiunii antimicrobiene cu cea a infuziilor
unor condimente.
4. Am aplicat o metod HPLC/MS/MS pentru analiza
alcaloizilor tropanici n speciile studiate si am concluzionat c
atropina si scopolamina nu sunt prezente n plantele studiate.
Rezumatul tezei de doctorat
64
5. Am studiat actiunea analgezic si antiinflamatoare a
extractelor alcoolice din frunze de Solanum dulcamara L. si Physalis
alkekengi L..
PERSPECTIVE DE CERCETARE
Tema tezei de doctorat ofer posibilitatea orientrii ctre noi
directii de cercetare:
aplicarea metodelor HPLC/MS dezvoltate n aceast lucrare
n cercetarea fitochimic a altor specii din familia Solanaceae.
evaluarea activittii biologice a luteolinei si cvercetolului din
Physalis alkekengi L..
evaluarea activittii farmacologice a scopoletinei,
hidroxicumarin determinat n concentratii mari n Solanum
dulcamara L..
extinderea studiului farmacotoxicologic al solaninei,
identificat si izolat acum pentru prima dat n Solanum dulcamara
L., premier n Romnia.
realizarea unor cercetri fitochimice ulterioare pe Physalis
alkekengi L. pentru identificarea altor principii active: fizaline,
vitanolide, calistegine n scopul identificrii cu precizie a
substantelor active biologic, mai ales pentru actiunea antimicrobian.
formularea unui nou medicament bogat n fitosteroli extrasi
din fructele de Physalis alkekengi L..
Rezumatul tezei de doctorat
65
BIBLIOGRAFIE SELECTIV
2 Ciulei I, Grigorescu E, Stnescu U, Plante medicinale, fitochimie i fitoterapie, vol. I, II, Ed.
Medical, Bucuresti, 1993
3 Gaillard Y, Cheze M, Pepin G, Human Main Plant Poisining: Revue of the Literature, Ann
Biol Clin, 2001, 59(6): 764-765
5 Griffin WJ, Lin DG, Chemotaxonomy and Geographical Distribution of Tropane Alkaloids,
Phytochemistry, 2000, 53: 623-637
6 Grigorescu E, Lazr MI, Stnescu U, Ciulei I, Index fitoterapeutic, Litografia Institutul de
Medicin si Farmacie, Iasi, 2001
7 Hanganu D, Popescu H, Plante toxice, Ed. Medical Universitar Iuliu Hatieganu, Cluj,
2002
9 Moffat AC, Osselton MD, Widdop B (editors), Clarke`s analysis of drugs and poisons,
Pharmaceutical Press, New York, 2004
10 aksen H, Odaba D, Akbayram S, Cesur J, Arslan S, Uner A, Oner AF, Deadly Nightshade
(Atropa belladonna) Intoxication: an Analysis of 49 Children, Human & Experimental
Toxicology, 2003, 22(12): 665-668
12 Eddleston M, Persson H, Acute Plant Poisoning and Antitoxin Antibodies, J Toxicol Clin
Toxicol, 2003, 41(3): 309-315
15 Raffeey M, A Three Year Study of Drugs, Chemicals and Plant Poisoning in Children,
MJTUMS, 2003, 57: 22-29
17 Klaus F, Nistorescu I, Indexul plantelor toxice din Romnia caiet metodologic, Ministerul
Snttii si Familiei, Institutul de Sntate Public, Bucuresti, 2001
18 Stnescu U, Miron A, Hncianu M, Aprotosoaie C, Bazele farmaceutice, farmacologice i
clinice ale fitoterapiei, Ed. Gr. T. Popa, Iasi, 2002
29 Leikin JB, Paloucek FP, Poisoning & Toxicology Handbook, LEXI-COMP, Inc., Hudson,
Ohio, 2002
36 Hornfeldt CS, Collins JE, Toxicity of Nightshade Berries (Solanum dulcamara) in Mice, Clin
Toxicol, 1990, 28 : 185-192
44 Dornberger K, The Potential Antineoplastic Acting Constituents of Physalis alkekengi L. var.
franchetii Mast., Pharmazie, 1986, 41(4): 265-268
48 Zld E, Esianu S, Csed C, Antioxidanti hidrofili din fructe de Physalis alkekengi L., Revista
de Medicini Farmacie - Orvosi s Gygyszerszeti Szemle, 2004, 50(II) : 69-71
53 Hayes AW (editor), Principles and Methods of Toxicology, Third Edition, Raven Press, of
Toxicology, Third Edition, Raven Press, New York, 1994
54 www.nlm.nih.gov
55 http://europa.en.int/eur-lex/
56 http://eurdor.eur-op.eu.int
57 Roll R, Hfer-Bosse T, Kayser D, New Perspectives in Acute Toxicity Testing of
Chemicals, Toxicol Lett, 1986, Suppl. 31: 86
58 OECD. Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing, Environmental Health and
Safety Monograph Series on Testing and Assessment N., 24, 2001, Paris
60 OECDTest Guideline 420. Acute Oral Toxicity Fixed Dose Procedure, 2001
Rezumatul tezei de doctorat
66
69 Schlede E, Mischke U, Diener W, Kayser D, The International Validation Study of the
Acute- Toxic-Class Method (Oral), Arch Toxicol, 1994, 69: 659-670
71 Spielmann H, Genschow E, Liebsch M, Halle W, Determination of the starting dose for
acute oral toxicity (LD50) testing in the up and down procedure (UDP) from cytotoxicity
data, ATLA., 1999, 27: 957-966
73 Nikolic NC, Stankovic MY, Markovic DZ, Liquid-liquid systems for acid hydrolysis of
glycoalkaloids from Solanum dulcamara L. tuber sprouts and solanidine extraction, Med Sci
Monit, 2005, 11(7): 200-205
75 Vessal M, Akmali M, Bambaee-Row N, Thin Layer Chromatographic Detection of Steroid
and Alkaloid Glycosides in An Ethanolic Extract of Winter Cherry (Physalis alkekengi)
Fruits, Arch Iran Med, 1999, 3: 128-130
78 * * * European Pharmacopoeia 6-th edition 2008
79 Simonovska B, Vovk I, High-performance thin-layer chromatographic determination of
potato glycoalkaloids, J Chromatogr A, 2000, 903(1-2):219-225
81 Matsuda F, Morino K, Miyazawa H, Miyashita M, Miyagawa H, Determination of potato
glycoalkaloids using high-pressure liquid chromatography-electrospray ionisation/mass
spectrometry, Phytochem Anal, 2004, 15(2): 121-124
86 Lazr MI, Lazr D, Corciov A, Analiza medicamentelor, vol. I, Ed. PIM, Iasi, 2007
95 Potterat O, Felten RV, Dalsgaard PW, Hamburger M, Indentification of TLC markers and
quantification by HPLC-MS of various constituents in noni fruit powder and commercial
noni-derived products, J Agric Food Chem, 2007, 55(18): 7489-7494
96 Pintea A, Varga A, Stepnowski P, Socaciu C, Culea M, Diehl HA, Chromatographic analysis
of carotenol fatty acid esters in Physalis alkekengi and Hippophae rhamnoides, Phytochem
Anal, 2005, 16 (3): 188-195
99 * * * Farmacopeea Romn, Ed. a X-a, Editura Medical, Bucuresti, 1993
106 Nit M, Toma C, Motiu Tudose M, Contribuitons la connaissance de la structure de
l`appareil vgtatif de certaines espces de Solanum L. Analele tiinifice ale Universitii
Al. I. Cuza, Iasi, 1990, 36: 15-19
119 Wollenweber E, Dorsam M, Dorr M, Roitman JN, Valant-Vetschera KM. Chemodiversity of
surface flavonoides in Solanaceae, Z Naturforsch, 2005, 60: 661-671.
120 Butnaru C, Mircea C, Aprotosoaie AC, Butnaru E, Lazr MI, Determinarea polifenolilor
totali si flavonoidelor din unele plante din familia Solanaceae, Rev Med Chir Soc Med Nat
Iai, 2007, 111(2, supl 2): 108-111
130 Qiu L, Zhao F, Jiang ZH, Chen LX, Zhao Q, Liu HX, Yao XS, Qiu F, Steroids and
flavonoids from Physalis alkekengi var. franchetii and their inhibitory effects on nitric oxide
production, J Nat Prod, 2008, 71(4): 642-646
138 Hyung JK, Seon IJ, Young JK, Hun TC, Yong GY, Tai HK, Ok SJ, Youn CK, Scopoletin
suppresses pro-inflammatory cytokines and PGE
2
from LPS-stimulated cell line, RAW 264.7
cells, Fitoterapia, 2004, 75(3-4): 261-266
139 Rollinger JM, Hornick A, Langer T, Stuppner H, Prast H, Acetylcholinesterase inhibitory
activity of scopolin and scopoletin discovered by virtual screening of natural products, J Med
Chem, 2004, 47(25): 6248-6254
140 Hornick A, Lieb A, Vo NP, Rollinger J, Stuppner H, Prast H, Effect of the coumarin
scopoletin on learning and memory, on release of acetylcholine from brain synaptosomes
and on long-term potentiation in hippocampus, BMC Pharmacology, 2008, 8(suppl 1):A36
142 Yang JY, Koo JH, Yoon HY, Lee JH, Park BH, Kim JS, Chi MS, Park JW, Effect of
scopoletin on lipoprotein lipase activity in 3T3-L1 adipocytes, Int J Mol Med, 2007, 20(4):
527-531
Rezumatul tezei de doctorat
67
145 Dalvi RR, Bowie WC, Toxicology of solanine: an overview, Vet Hum Toxicol, 1983, 25(1):
13-15
148 Jensen P.H., Juhler R.H., Nielsen N.J., Hansen T.H., Strobel B.W., Jacobsen O.S., Nielsen J.,
Hansen H.C., Potato glycoalkaloids in soil-optimizing liquid chromatography-time-of-flight
mass spectrometry for quantitative studies. J Chromatogr A, 2008, 1182(1): 65-71
149 Sotelo A., Serrano B., High-performance liquid chromatographic determination of the
glycoalkaloids alpha-solanine and alpha-chaconine in 12 commercial varieties of Mexican
potato. J Agric Food Chem, 2000, 48(6): 2472-2475
156 Kumar P, Sharma B, Bakshi N, Biological activity of alkaloids from Solanum dulcamara,
Nat Prod Res, 2009, 23(8): 719-723
159 Friedman M, Lee KR, Kim HJ, Lee IS, Kozukue N, Anticarcinogenic effects of
glycoalkaloids from potatoes against human cervical, liver, lymphoma, and stomach cancer
cells, J Agric Food Chem, 2005, 53(15): 6162-6169
160 Ji YB, Gao SY, Ji CF, Zou X, Induction of apoptosis in HepG2 cells by solanine and Bcl-2
protein, J Ethnopharmacol, 2008, 115(2): 194-202
184 National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) 2005. Methods for dilution
antimicrobial susceptibility. Tests for bacteria that grow aerobically. Approved Standard
M7-A6, Wayne, PA, NCCLS, 2005
187 Silva MTG, Simas SM, Batista TGF, Cardarelli P, Tomassini TCB. Studies on antimicrobial
activity in vitro of Physalis angulata L. (Solanaceae) fraction and physalin B bringing aut the
importance of assay determination, Mem Inst Oswaldo Cruz, 2005, 100, 7: 779-782
209 Moon PD, Lee BH, Jeong HJ, An HJ, Park SJ, Um JY, Hong SH, Kim HM, Use of
scopoletin to inhibit the production of inflammatory cytokines through inhibition of the
lkappaB/NF-kappaB signal cascade in the human mast cell line HMC-1, Eur J Pharmacol,
2007, 26, 555(2-3): 218-25
210 Kim HJ, Jang SI, Kim YJ, Chung HT, Yun YG, Kang TH, Jeong OS, Kim YC, Scopoletin
supppresses pro-inflammatory cytokines and PGE2 from LPS stimulated cell line RAW
264,7 cells, Fitoterapia, 2004, 75(3-4): 261-266
Rezumatul tezei de doctorat
68
Lista lucrrilor publicate din teza de doctorat
1. Claudia Butnaru, Elena Butnaru, Laurian Vlase, Mihai Ioan
Lazr, Determination of scopoletine in Physalis alkekengi and Solanum
dulcamara by high-performance liquid chromatography, Revista Farmacia,
2010, 58 (6):711-718
2. Claudia Butnaru, Laurian Vlase, Doina Lazr, Luminita
Agoroaei, Mihai Ioan Lazr, HPLC/MS analysis of solanine in Physalis
alkekengi and Solanum dulcamara, Revista Farmacia, 2010, n curs de
publicare
3. Butnaru C., Mircea C., Aprotosoaie AC., Butnaru E., Lazr MI.,
Determinarea polifenolilor totali si flavonoidelor din unele plante din
familia Solanaceae, Rev Med Chir Soc Med Nat Iai, 2007, 111(2, supl 2):
108-111
4. Claudia Butnaru, Laurian Vlase, Luminita Agoroaei, Mihai Ioan
Lazr, Determination of phytosterols in Physalis alkekengi L. and Solanum
dulcamara L. by high-performance liquid chromatography, Acta Medica
Marisiensis, 2010, 56(supl 2), p. 69
Rezumatul tezei de doctorat
69
CURRICULUM VITAE
Farm. primar BUTNARU (CLINESCU) CLAUDIA
e-mail: butclaudia@yahoo.com
STUDI I
2003-prezent Doctorat fr frecvent n specialitatea Fitochimie: Cercetarea fitochimic si
farmacotoxicologic a unor specii din familia Solanaceae
2002-2003 Rezidentiat specialitatea Farmacie general
1996-2000 Facultatea de Farmacie, Universitatea de Medicin si Farmacie Gr. T. Popa Iasi
1994-1996 Facultatea de Chimie (sectia Chimie Fizic) de la Universitatea Al. I. Cuza Iasi,
transfer la Facultatea de Farmacie
1990-1994 Liceul teoretic C. Negruzzi din Iasi, clasa de chimie-fizic
SPECI ALI ZARI PROFESI ONALE
2009 Farmacist primar specialitatea Farmacie general
2004 Farmacist specialist Farmacie general
PREGTI RE POSTUNI VERSI TAR
2006 Curs postuniversitar Curs de HPLC. Elaborarea de metode, cod 377, Disciplina
de Analiza Medicamentului, Facultatea de Farmacie, UMF Iuliu Hatieganu Cluj
Napoca
2006 Cursul Opioizii de la clasic la modern, UMF Gr. T. Popa, Iasi
2004 Curs postuniversitar de profesionalizare didactic, Universitatea Al. I. Cuza Iasi
2004 Curs postuniversitar Metode cromatografice de analiz - HPLC, cod I.F. 204,
UMF Gr. T. Popa, Iasi
EXPERIENTA PROFESIONAL
Perioada Func(ia Locul de munc Sarcini yi responsabilit(i
10.2007-
prezent
Farmacist Farmacia Sensiblu Iasi 9 Eliberarea si recomandarea produselor
farmaceutice, OTC, dermatocosmetice
si baby; controlul stocului de
medicamente eliberate pe prescriptii
Tab. III; centralizarea facturilor si
avizelor; verificarea prescriptiilor
medicale
01.2005-
09.2007
Asistent
universitar
Disciplina de Toxicologie,
Facultatea de Farmacie,
U.M.F. Gr. T. Popa Iasi
ndrumarea lucrrilor practice cu
studentii; participarea la contracte de
cercetare CNCSIS si CEEX; elaborarea
materialelor didactice; membru n
comisia stiintific a Faculttii de
Farmacie; membru n comisia
concursului de admitere si n comisia
de licent
01.2002-
12.2004
Preparator
universitar
Disciplina de Toxicologie,
Facultatea de Farmacie,
U.M.F. Gr. T. Popa Iasi
Pregtire reactivi si materiale pentru
lucrrile practice; ndrumarea lucrrilor
practice cu studentii; participarea la
lucrrile de cercetare din cadrul
disciplinei
01.2001-
12. 2001
Farmacist
rezident
Farmacia Spitalului
Sf. Spiridon Iasi
Preparare produse farmaceutice
oficinale; preparare retete pentru
Clinica de Dermatologie
09. 2000
12. 2000
Farmacist Depozitul Farmaceutic
Biosfarm Iasi
Eliberare produse farmaceutice si
parafarmaceutice
Rezumatul tezei de doctorat
70
APARTENENA LA SOCI ETI TI I NI FI CE I PROFESI ONALE
Colegiul Farmacistilor din Romnia
Profesionale
Societatea de Stiinte Farmaceutice din Romnia
Societatea Romna de Istoria Farmaciei
Stiintifice
Societatea Micologic din Romnia
PARTI CI PAREA LA MANI FESTRI TI I NI FI CE
10.2010 Al 14-lea Congres National de Farmacie, Tg. Mures
09. 2009 Al 39-lea Congres International de Istoria Farmaciei, Viena, Austria
05. 2009 Editia a II-a a Simpozionului National Medicamentul - de la concepere pana la
utilizare, Iasi
09. 2008 Al III-lea Colocviu International de Istoria Farmaciei, Tg. Mures
05. 2008 Editia a IV-a a Conferintei Nationale de Fitoterapie, Iasi
2007, 2008 Academia Sensiblu
09. 2007 A XIV-a Reuniune National de Istoria Farmaciei, Pitesti
05.-06.
2007
Editia I-a a Simpozionului National Medicamentul - de la concepere pn la
utilizare, Iasi
09. 2006 Al XIII-lea Congres National de Farmacie- O farmacie puternic ntr-o Romnie
european
05. 2006 Campania pentru marcarea Zilei Mondiale Fr Tutun 31 Mai 2006: masa
rotund cu autoritti si ONG, Iasi
03. 2006 Prima Conferint National despre Tabagism Tutunul si Sntatea, Iasi
12. 2005 Sesiunea stiintific 126 de ani de nvtmnt medical superior la Iasi, Iasi
10. 2005 Conferinta National Antidrog cu participare international - editia a II-a
Romnia si drogurile n perspectiva aderrii la Uniunea European, Cluj-
Napoca
09.10. 2005 A XII-a Reuniune National de Istoria Farmaciei, Iasi
08. 2005 Simpozionul National de Micologie, Editia a XVII-a, Suceava
05. 2005 Simpozionul Farmacia astzi, ntre promovare si cercetare, Timisoara
11. 2004 Sesiunea stiintific 125 de ani de nvtmnt medical superior la Iasi, Iasi
10. 2004 Simpozionul stiintific Farmaceutica Mariesensis, Tg. Mures
08. 2004 Simpozionul National de Micologie, Editia a XVI-a, Sinaia
07. 2004 A XI-a Reuniune National de Istoria Farmaciei, Brila
05. 2004 Al II-lea Simpozion International Noi Resurse pentru Industria Farmaceutic,
Constanta
11. 2003 Sesiunea stiintific Zilele Universittii de Medicin si Farmacie, U.M.F. Gr.
T. Popa, Iasi
11. 2003 Simpozionul cu tema Calitatea Alimentului si Securitatea Alimentar, Iasi
09. 2003 Al 36-lea Congres International de Istoria Farmaciei, Sinaia
09. 2003 Simpozionul National de Micologie, Editia a XV-a, Cluj-Napoca
05. 2003 Conferinta National de Fitoterapie, Iasi
03. 2003 11
th
Panhellenic Pharmaceutical Congress, Atena, Grecia
09. 2002 Simpozionul National de Micologie, Editia a XIV-a, Piatra Neamt si Tg. Neamt
10. 2002 Al XII-lea Congres National de Farmacie, Bucuresti
10. 2002 Sesiunea stiintific Diversitatea, functionalitatea si conservarea organismelor
vii Universitatea Al. I. Cuza, Iasi
11. 2002 Sesiunea stiintific Zilele Universittii de Medicin si Farmacie, U.M.F. Gr.
T. Popa, Iasi
Rezumatul tezei de doctorat
71
ALTE MENI UNI
Membru in colective de cercetare
-membru in Colectivul Centrului de Cercetare CNCSIS (2005, comisia 6), Centrul de
analize fizico-chimice si biologice, U.M.F. Gr. T. Popa Iasi;
-Membru al grantului CNCSIS, tip A, nr. 1221/2005, durat proiect 2 ani; tema Contributii
la prevenirea intoxicatiilor cu ciuperci n judetele din Nordul Moldovei
-Efectuarea determinrilor incluse n Grantul: CNCSIS MEN aprobat 2001; cod 64/158,
director de grant Conf. Dr. Ctlin Tnase, Facultatea de Biologie, Catedra de Biologie vegetal; tema
Impactul polurii asupra diversittii ciupercilor din Valea Bistritei (n aval de Zugreni)
Membru n diferite comisii
-septembrie 2005: secretariat al comitetului de organizare la a XII-a Reuniune National
de Istoria Farmaciei, Iasi ;
-aprilie 2005: membru n comitetul de organizare al Simpozionului National Alimentatia
actual - implicatii toxicologice si clinice Iasi ;
-noiembrie 2004: membru n comisia Contracte sponsorizare pentru organizarea
manifestrilor prilejuite de 125 de ani de nvtmnt medical superior la Iasi;
-noiembrie 2003: secretar sectia FARMACIE, sesiunea stiintific cu ocazia Zilelor
Universittii de Medicin si Farmacie Gr. T. Popa Iasi Tendinte n medicina nceputului de
mileniu;
-mai 2003: membru n comitetul de organizare a Simpozionului de Fitoterapie, Iasi;
-octombrie 1998: membru n Comitetul de primire a invitatilor la Congresul National de
Farmacie din Iasi;
Medalii
decembrie 2005: Medalia de argint Prof. dr. doc. Martian Cotru pentru contributia
adusa la dezvoltarea Stiintelor farmaceutice
Limbi strine cunoscute
engleza
Rezumatul tezei de doctorat
72

Evaluare