UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERINAR CLUJ-NAPOCA FACULTATEA DE AGRICULTUR COALA DOCTORAL

Ing. Laura Gabriela Fogarai (cs. Dobo)

Studii privind bioremedierea solurilor poluate cu petrol folosind microorganisme selecionate din microflora autohton
REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT

Conductor tiinific Prof. univ. dr. Carmen PUIA

CLUJ-NAPOCA 2011

REZUMAT Poluarea mediului nconjurtor reprezint contaminarea cu diverse materiale care interfereaz cu sntatea uman, calitatea vieii sau funcia natural a ecosistemelor (organismele vii i mediul n care triesc). Bioremedierea solurilor contaminate cu petrol i produse petroliere constituie procesul biologic n care hidrocarburile acestora sunt degradate prin intermediul microorganismelor. Microorganismele folosite n acest proces sunt cu preponderen cele indigene, dar pot fi folosite i microorganismele izolate din alt parte i inoculate pe solurile contaminate. n acest sens s-a observat faptul c numeroase microorganisme au capacitatea de a utiliza hidrocarburile att n stare gazoas ct i n stare lichid i solid din seriile alifatice, aromatice i asfaltice, pe care le folosesc ca surs de carbon i energie ( Zarnea, 1994). Acestea degradnd hidrocarburile parial sau complet iar rezultatul rmas n urma activitii lor microbiene este nepoluant pentru mediu fiind alctuit din ap, CO2 i substane netoxice. Microorganismele care particip n procesul de biodegradare a hidrocarburilor sunt: bacteriile, fungii, levurile i algele. Cele mai importante grupe de microorganisme care particip la biodegradarea hidrocarburilor sunt bacteriile i fungi.

OBIECTIVELE TEZEI Obiectivele propuse pentru realizarea temei de cercetare au fost urmtoarele: Izolarea pe diferite medii de cultur a principalelor grupe de microorganisme (bacterii i fungi) din solurile poluate cu petrol. Obinerea de tulpini pure i identificarea lor taxonomic. Testarea capacitii de biodegradare a microorganismelor selectate i izolate n cultur pur, pe medii cu petrol. Multiplicarea microorganismelor i crearea de consorii microbiene n vederea degradrii hidrocarburilor petroliere din solurile poluate. Studiul sinergismului microorganismelor implicate n consorii. Aplicarea i verificarea consoriilor microbiene n casa de vegetaie, pe variante de sol poluate cu petrol.
241

MATERIALUL BIOLOGIC Materialul biologic folosit n realizarea experienelor privind depoluarea biologic a solurilor contaminate cu petrol a fost constituit din microorganismele izolate din probele de sol poluate i prelevate de pe dou situri petroliere aflate n dou zone geografice diferite: Ploieti i Suplacu de Barcu. Din probele de sol prelevate de pe situl petrolier Ploieti au fost izolate 21 tulpini bacteriene (CBP) i nou tulpini fungice (FP) iar din probele de sol recoltate de pe situl petrolier Suplacu de Barcu au fost izolate 20 tulpini bacteriene (CBS) i 12 tulpini fungice (FS). Pentru testarea efectului bioremediator al consoriilor microbiene aplicate pe solul poluat artificial cu diferite concentraii de petrol s-a folosit ca plant indicatoare salata (Lactuca sativa var. capitata), soiul Attraktion, deoarece perioada de vegetaie este scurt i este sensibil la toxicitatea solului (Banks and Schultz, 2005; Hublek et al., 2007).

METODELE DE CERCETARE N LABORATOR Metodele de cercetare folosite n experienele din laborator au constat n: izolarea principalelor grupe de microorganisme din probele de sol; obinerea culturilor pure; testarea capacitii de biodegradare a microorganismelor (izolate n cultur pur); identificarea microorganismelor care au prezentat capacitate ridicat n biodegradarea hidrocarburilor petroliere; multiplicarea tulpinilor bacteriene i a tulpinilor fungice; crearea consoriilor microbiene. Izolarea, cuantificarea i meninerea tulpinilor microbiene s-a realizat n plci Petri pe mediu nutritiv agarizat iar multiplicarea tulpinilor microbiene s-a efectuat n vase Erlenmeyer n mediu nutritiv lichid. Pentru a preveni aglomerarea celulelor microbiene s-a utilizat metoda diluiilor decimale.
242

Pentru izolarea coloniilor bacteriene i fungice s-a folosit metoda de nsmnare n profunzime. nsmnarea, n acest caz s-a realizat cu ajutorul unei micropipete nainte de solidificarea mediului de cultur. Pentru testarea capacitii biodegradative a hidrocarburilor petroliere, tulpinile bacteriene i fungice izolate au fost cultivate pe mediu mineral la care s-au adugat concentraii diferite de iei provenit de la Ploieti i Suplacu de Barcu. METODELE DE CERCETARE N CASA DE VEGETAIE Efectul bioremediator al consoriilor microbiene Pentru testarea capacitii biodegradative a consoriilor microbiene au fost nfiinate trei experiene amplasate n casa de vegetaie a Universitii de tiine Agricole i Medicin Veterinar Cluj-Napoca. Prima experien urmrete efectul bioremediator al celor trei tipuri de consorii microbiene asupra solului poluat cu diferite cantiti de iei. Experiena cuprinde variante de sol poluate cu diferite concentraii de iei, la care s-au adugat consoriile microbiene obinute n laborator. n cadrul experienei fiecare variant luat n studiu a fost reprezentat de un vas de vegetaie cu capacitatea de cinci litri. Variantele din cadrul experienei au fost repartizate ntr-un numr de trei repetiii, cu aezare randomizat conform schemei din figura 4.13. Factorii experimentali au fost: factorul A = locaia ieiului - Ploieti (P) - Suplacu de Barcu (S) factorul B = cantitatea de iei aplicat pe sol: - 1% (10.000 mg/kg) - 3% (30.000 mg/kg) - 5% (50.000 mg/kg) factorul C = consoriul microbian - Ploieti (CMP) - Suplacu de Barcu (CMS) - combinat (CMC) n cadrul experienei, la intervale de 60 de zile dup aplicarea consoriilor microbiene, au fost recoltate probe de sol pentru a se determina coninutul de hidrocarburi petroliere. Prelevarea probelor s-a realizat din mai multe puncte din cadrul
243

fiecrui recipient pentru a se obine un rezultat ct mai exact al coninutul de iei rmas n sol. Analiza solului privind coninutul de hidrocarburi petroliere a fost realizat n laboratoarele Institutului de Cercetri pentru Instrumentri Analitice Cluj (ICIA Cluj). Coninutul de hidrocarburi petroliere a fost determinat prin analiza FTIR. Analiza care are la baz metoda spectrofotometric prin infrarou. Eficacitatea bioremedierii pe plante de salat Pentru verificarea eficacitii bioremedierii, cu ajutorul plantelor de salat, au fost nfiinate dou experiene: prima experien s-a nfiinat dup dou luni de bioremediere a solurilor contaminate; a doua experien a fost nfiinat la finalizarea procesului de bioremediere (dup patru luni). nfiinarea celor dou experiene s-a realizat simultan cu perioada n care au fost efectuate analizele biochimice ale solului cu privire la coninutul hidrocarburilor petroliere din sol. Principalele obiective urmrite n fiecare experien au constat n: influena concentraiilor de iei asupra creterii i dezvoltrii plantelor de salat; influena tipului de iei folosit n experien asupra creterii i dezvoltrii plantelor salat; influena consoriilor microbiene asupra creterii i dezvoltrii plantelor de salat. Observaiile fenologice urmrite au fost creterea i dezvoltarea plantelor de salat precum i numrul de frunze formate. Observaiile i msurtorile asupra plantelor de salat s-au efectuat la diferite intervale de timp: la 28 zile, 43 zile i 57 zile de la semnat. Aceste experiene cuprind variante de sol poluate cu diferite concentraii de iei la care s-au adugat consoriile microbiene. Din fiecare variant s-au prelevat cte 0,5 kg sol n trei repetiii. Probele de sol din cele trei repetiii au fost omogenizate obinndu-se
244

proba medie. Fiecare prob medie a fost repartizat n cte trei vase de vegetaie cu diametrul de 12 cm n care au fost semnate un numr de 20 semine de salat. Vasele de vegetaie s-au amplasat randomizat conform schemei din figura 4.14. REZULTATE EXPERIMENTALE OBINUTE Degradarea hidrocarburilor petroliere Tulpinile bacteriene CBP1, CBP2, CBP6, CBP7, CBP8, CBP10, CBP11, CBP13, CBP14, CBP15, CBP16, CBP17, CBP18, CBP19, CBP20, CBP21, CBS1, CBS2, CBS3, CBS4, CBS8, CBS10, CBS15, CBS16, CBS17, CBS18, CBS19, CBS20 au folosit ca surs de carbon hidrocarburile din iei. Acestea au fost utilizate n vederea crerii consoriilor microbiene alturi de fungii izolai din probele medii de pe siturile petroliere Ploieti i Suplac u de Barcu. n urma procesului de testare a tulpinilor fungice se remarc faptul c toate tulpinile fungice au avut o foarte bun i bun dezvoltare pe una dintre mediile minerale cu adaos de iei. Identificarea i ncadrarea taxonomic a tulpinilor bacteriene i fungice Din proba de sol de pe situl petrolier Ploieti au fost identificate 16 tulpini bacteriene din genurile Acinetobacter, Klebsiella, Bacillus (ase tulpini), Burkholderia, Pseudomonas i speciile Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa (trei tulpini), Pseudomonas fluorescens, Burkholderia cepacia i nou tulpini fungice din genurile Aspergillus, Fusarium, Paecylomices, Penicillium (dou tulpini), Rhizopus, Scopulariopsis, Trichoderma (dou tulpini). Din proba de sol de pe situl petrolier Suplacu de Barcu au fost identificate 12 tulpini bacteriene din genurile Acinetobacter, Bacillus (trei tulpini), Burkholderia i speciile Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Burkholderia cepacia, Burkholderia gladioli (dou tulpini), Enterobacter clocae (dou tulpini) i 12 tulpini fungice din genurile Aspergillus (cinci tulpini), Acremonium, Crysosporium, Mortierella (dou tulpini), Paecylomices, Penicillium (dou tulpini) izolate din proba de sol prelevat de pe situl petrolier Suplacu de Barcu.
245

Efectul bioremediator al consoriului microbian Ploieti n urma analizelor efectuate, la finalizarea experienei s-a observat o scdere a coninutului de hidrocarburi la toate variantele experimentale, cele mai evidente rezultate fiind remarcate n cazul solului contaminat cu iei de pe situl petrolier Ploieti. n cazul solurilor poluate cu 1% iei se observ o reducere a coninutului de hidrocarburi sub 5000 mg/kg ncepnd cu intervalul 0 - 60 zile de la aplicarea consoriului microbian, ceea ce indic, conform anumitor autori (Zisu i Iano, 2008), pretabilitatea reintegrrii acestor soluri n circuitul agricol, aceast cantitate de petrol favoriznd creterea i dezvoltarea plantelor. La finalizarea experienei, n cazul variantelor poluate cu petrol de la Ploieti i bioremediate, s-a observat intensitatea maxim a activitii microbiene la varianta poluat cu 5% petrol, cu o reducere a coninutului de hidrocarburi de 333,33 mg/kg/zi, urmat de varianta contaminat cu 3%, cu 175,83 mg/kg/zi hidrocarburi reduse/zi i varianta poluat cu 1% la care reducerea hidrocarburilor a fost de 66,67 mg/kg/zi. Dup finalizarea procesului de bioremediere, n cazul variantelor contaminate cu iei de la Suplacu de Barcu, s-a nregistrat cea mai intens activitate microbian la varianta poluat cu 5%, coninutul de hidrocarburi fiind redus cu 300,00 mg/kg/zi, urmat de varianta contaminat cu 3%, cu 100,00 mg/kg/zi hidrocarburi reduse i varianta poluat cu 1% la care reducerea hidrocarburilor a fost de 51,66 mg/kg/zi. Aceste aspecte indic necesitatea unei perioade de bioremediere mai lungi dect 120 zile n cazul solurilor poluate cu concentraii de petrol mai mari de 1%. Efectul bioremediator al consoriului microbian Suplacu de Barcu Analiznd capacitatea biodegradativ a consoriului microbian Suplacu de Barcu asupra variantelor de sol poluate cu iei provenit de pe situri diferite, se constat o capacitate ridicat de biodegradare n primele 60 de zile pe solul poluat cu iei de la Suplacu de Barcu. n a doua perioad de bioremediere (120 zile) acest consoriu microbian a fost mai eficient n biodegradarea hidrocarburile provenite din ieiul de la Ploieti, ceea ce confirm datele din literatura de specialitate (Rodica Stnescu i colab., 2006), adic bioremedierea solurilor poluate se poate realiza att cu microorganismele indigene ct i cu microorganismele izolate din alt parte i inoculate pe sol poluat.
246

n cazul variantelor contaminate cu 3%, respectiv 5% petrol chiar dac activitatea microbian a fost foarte intens, coninutul de hidrocarburi rmas n sol dup 120 de zile nu este favorabil creterii i dezvoltrii plantelor, conform datelor din literatura de specialitate (Zisu i Iano, 2008; Baek et al., 2004). Din acest considerent se recomand ca procesul de bioremediere s aibe o durat mai mare de 120 zile. Efectul bioremediator al consoriului microbian combinat n urma datelor obinute se poate concluziona faptul c solul contaminat cu 1% iei i remediat biologic att 60 de zile ct i 120 de zile poate fi folosit ca i suport pentru cultivarea plantelor, n timp ce solul poluat cu 3%, respectiv 5% iei i bioremediat 120 de zile nu este pretabil n circuitul agricol fiind necesar aplicarea unui tratament biologic cu un interval de timp mai mare de 120 zile. nlimea plantelor de salat pe sol poluat cu iei provenit de la Ploieti Solul poluat cu o concentraie de 1% iei i bioremediat dou luni poate fi folosit ca suport pentru cultivarea plantelor de salat precum i a altor specii legumicole (figura 5.165). La variantele poluate cu 3% iei i bioremediate, plantele de salat au avut o dezvoltare foarte viguroase, nlimile medii nregistrnd valori mult mai mari n cadrul experienelor realizate dup finalizarea procesului de bioremediere - solul remediat biologic cu ajutorul consoriilor Ploieti i Suplacu de Barcu timp de patru luni (figura 5.166) se poate folosi n circuitul agricol. La sfritul perioadei de bioremediere se remarc creterea plantelor pe sol contaminat cu 5% iei i bioremediat timp de patru luni, comparativ cu plantele care au pierit pe solul contaminat cu aceeai concentraie de iei dar bioremediat timp de dou luni ns nu se recomand folosirea solului pentru cultivarea plantelor, deoarece plantele au o dezvoltare slab. Cele mai bune rezultate s-au nregistrat pe solurile contaminate cu petrol de pe situl petrolier Ploieti i bioremediate cu consoriu microbian format din microorganismele izolate de pe aceleai sit petrolier.
247

nlimea plantelor de salat pe sol poluat cu iei provenit de la Suplacu de Barcu Solul poluat cu concentraia de 1% iei i remediat biologic dou luni cu consoriu Ploieti i consoriu combinat (figura 5.171) este pretabil pentru cultivarea plantelor de salat sau a altor specii legumicole. Solul poluat cu concentraia de 3% iei i bioremediat timp de patru luni cu consoriu microbian Suplacu de Barcu poate fi folosit pentru cultivarea plantelor de salat. n urma observaiilor i msurtorilor efectuate la sfritul perioadei de bioremediere se remarc o bun dezvoltare a plantelor dezvoltate pe sol contaminat cu 5% i bioremediat comparativ cu plantele care au pierit pe solul contaminat cu aceeai concentraie de petrol dar bioremediat timp de dou luni. Numrul frunzelor de salat pe sol poluat cu iei provenit de la Ploieti Plantele de salat au format un foliaj bogat, numrul mediu de frunze nregistrnd valori mult mai mari n cadrul experienelor realizate dup finalizarea procesului de bioremediere comprativ cu variantele bioremediate timp de dou luni. n urma observaiilor i msurtorilor efectuate la sfritul perioadei de bioremediere se remarc o bun dezvoltare a plantelor dezvoltate pe sol contaminat cu 5% iei i bioremediat timp de patru luni comparativ cu plantele care s-au ofilit pe solul contaminat cu aceeai concentraie de petrol dar bioremediat timp de dou luni. Numrul frunzelor de salat pe sol poluat cu iei provenit de la Suplacu de Barcu Plantele de salat au format un foliaj dens, verde, frumos; numrul mediu de frunze nregistrnd valori mult mai mari n cadrul variantelor bioremediate timp de patru luni fa de variantele bioremediate timp de dou luni. La sfritul perioadei de bioremediere se remarc o bun dezvoltare a plantelor dezvoltate pe sol contaminat cu 5% i inoculat cu consoriile microbiene, comparativ cu plantele care au pierit pe solul contaminat cu aceeai concentraie de petrol dar bioremediat timp de dou luni.
248

CONCLUZII Au fost izolate un numr de 21 tulpini bacteriene i 9 tulpini fungice de pe situl petrolier Ploieti iar de pe situl petrolier Suplacu de Barcu au fost izolate un numr de 20 tulpini bacteriene i 12 tulpini fungice. Tulpinile bacteriene din genurile Acinetobacter, Bacillus, Burkholderia, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas i tulpinile fungice din genurile Aspergillus, Acremonium, Crysosporium, Fusarium, Mortierella, Paecilomyces, Penicillium, Rhizopus, Scopulariopsis, Trichoderma au fost utilizate n vederea crerii consoriilor microbiene. Identificarea bacteriilor izolate s-a efectuat pe baza caracterelor morfologice, aspectelor culturale ale coloniei i caracterelor biochimice. Identificarea fungilor izolai s-a realizat pe baza caracterelor morfologice i culturale ale fiecrei tulpini fungice. n cazul solurilor poluate cu 1% iei (Ploieti i Suplacu de Barcu), s-a observat, o reducere a coninutului de hidrocarburi la o valoare sub 5000 mg/kg, la 60 de zile de la aplicarea consoriilor microbiene, ceea ce nseamn c solurile pot fi folosite ca suport pentru cultivarea plantelor, aceast cantitate favoriznd creterea i dezvoltarea lor. n cazul solului poluat cu 3%, respectiv 5% iei (Ploieti i Suplacu de Barcu), sa constatat, o reducere a coninutului de hidrocarburi, ns aceste soluri bioremediate nu sunt pretabile n circuitul agricol fiind necesar aplicarea unui tratament biologic cu un interval de timp mai mare de 120 zile. Plantele de salat au fost folosite pentru a se urmri efectul bioremediator al consoriilor microbiene create asupra solului contaminat cu iei de pe siturile petroliere Ploieti i Suplacu de Barcu. n urma observaiilor i msurtorilor efectuate la sfritul perioadei de bioremediere s-a observat o bun dezvoltare a plantelor dezvoltate la toate variantele contaminate i bioremediate comparativ cu plantele dezvoltate la aceleai variante ns bioremediate timp de dou luni

249

BIBLIOGRAFIE SELECTIV
1. BAEK K.H., H.S. KIM, H.M. OH, B.D. YOON, J. KIM, I.S. LEE, 2004, Effect of crude oil, oil components and bioremediation on plant growth, Journal of environmental science and health, Part A Toxic/Hazardous Substances & environmental engineering vol. A39 (9): 2465-2472. 2. BANKS M.K., K.E. SCHULTZ, 2005, Comparison of plants for germination toxicity tests in petroleum - contaminated soils, Water, Air and Soil Pollution 167: 211-219. 3. HUBLEK T., SIMONA VOSHLOVA, V. MATJU, NORA KOVOV, ENK NOVOTN, 2007, Ecotoxicity monitoring of hydrocarbon-contaminated soil during bioremediation: A Case Study, Arch. Environ. Contam. Toxicol. 52: 17. 4. STNESCU RODICA, LILIANA BOBIRIC, OANAMARI ORBULE, 2006, Remedierea solurilor contaminate, Ed. Agir, Bucureti, 235 pag. 5. ZARNEA G., 1994, Tratat de microbiologie general. Bazele teoretice ale ecologiei microorganismelor. Microorganismele i mediile lor naturale, Ed. Academiei Romne, Bucureti, 943-947. 6. ZISU I., GH. IANO, 2008, Aspects regarding the pollution of agricultural lands from banat with petroleum hydrocarbons, Annals of West University of Timisoara, Series Chemistry, 17 (1): 97-102.

250