Caiet de Practica

Proiect cofinanat prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013
Investete in oameni!

CAIET DE PRACTICA

Loc de practica: Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Stiinte Biologice
Tutore: Dr. Alina Butu
Student: Tatu Marian Laurnetiu
Facultate/ specializare/an: Facultatea de Inginerie Medicala/ Substante Materiale si Sisteme
Biocompatibile/ Master II
Tema: Determinarea activitatii antioxidante a unor compusi bioactivi prin metoda fotometrica

1. Studiu bibliografic

a. Principalele notiuni

Conceptul de radical a fost introdus de catre Lavoisier n 1785. Radicali liberi pot fi
definiti ca atomi sau molecule ce contin in structura lor un electron neimperecheat. Acesti
electroni au o energie ridicata ceea ce determina instabilibitatea atomului/ moleculei. Starea
de echilibru caracterizata de o energie mai scazuta deci o stabilitate mai mare a moleculei se
atinge prin punerea in comun/ cuplarea electronilor neimperecheati cu grupari hidrofile ale
altor participanti la reactie.[1,2]
Varietatea radicalilor liberi existenti sau formati in natura ca urmare a multor procese
(radiatii ultraviolete, gama, actiunea unor particule specifice, etc.) face clasificarea acestora
extrem de dificila.
Din punct de vedere al naturii elementului care contine electroni neimperecheati,
radicalii liberi pot fi clasificati in:
1. Radicali liberi ai oxigenului
2. Radicali liberi ai azotului
3. Compusi aromatici
4. Compusi de tip chinonic si semichinonic


5. Acizi nucleici
6. Radicalul thiil.
De fiecare dat cand moleculele normale sunt atacate, acestea pierd electroni,
modificandu-si proprietatile chimice si structurale, la randul lor devenind radicali liberi gata
sa atace alte molecule stabile. Astfel se creaza un lant de reactii biochimice necontrolate, care
pot conduce in cele din urm la intreruperea ciclului celular, avand repercursiuni grave in
timp.[3]
Pentru a se apara impotriva atacului devastator al radicalilor liberi, organismele sunt
protejate prin mai multe cai: compartimentalizarea celulara, existenta compusilor antioxidanti
endogeni, a sistemelor enzimatice, si nu numai. In cazul in care aceste sisteme endogene de
protectie nu mai sunt fiabile, este necesar aportul antioxidantilor exogeni. Acestia sunt
capabili sa doneze un electron suplimentar, completand ultimul strat electronic al radicalului
liber, care isi recapata stabilitatea si pierde astfel capacitatea nociva de actiune.
Cercetatorii au devenit tot mai interesati de studierea efectelor antioxidante ale
compusilor polifenolici. Principalul motiv pentru acest interes este abundenta lor mare n
dieta noastra si rolul lor in prevenirea diferitelor boli asociate stresului oxidativ precum
cancerul, bolile cardiovasculare si neurodegenerative.
Termenul de stres oxidativ a fost introdus de Sies, in 1985, si desemneaza totalitatea
leziunilor oxidative produse de radicalii liberi ai oxigenului. Stresul oxidativ reprezinta
dezechilibrul balantei dintre prooxidanti si antioxidanti, n favoarea primilor, ca urmare a
actiunii exagerate a agresorului sau/si reducerii capacitatii de lupt a aparatorului.
Apararea antioxidanta se realizeaza prin intermediul antioxidantilor endogeni, iar n cazul
in care aceste mecanisme sunt depsite, prin intermediul celor exogeni. Antioxidantii au rolul
de a neutraliza sau de a ndeparta speciile reactive ale oxigenului si azotului si produii de
peroxidare ai moleculelor organice. Este important de semnalat existenta unor antioxidantii
primari, profilactici, care scad frecventa reactiilor ce conduc la formarea de radicali liberi si
blocheaza propagarea celor deja formati. [4,5]


b. Surse

1. Perez-Tortosa, V., A. Lopez-Orenes, et al. (2012). "Antioxidant activity and rosmarinic
acid changes in salicylic acid-treated Thymus membranaceus shoots." Food Chemistry
130(2): 362-369.
2. Akbari, V., R. Jamei, et al. (2012). "Antiradical activity of different parts of Walnut
(Juglans regia L.) fruit as a function of genotype." Food Chemistry 135(4): 2404-2410.
3. Tsai, P. J., T. H. Tsai, et al. (2007). "Evaluation of NO-suppressing activity of several
Mediterranean culinary spices." Food and Chemical Toxicology 45(3): 440-447.
4. Matejic, J. S., A. M. Dzamic, et al. (2012). "Total phenolic content, flavonoid
concentration, antioxidant and antimicrobial activity of methanol extracts from three
Seseli L. taxa." Central European Journal of Biology 7(6): 1116-1122.
5. Roby, M. H. H., M. A. Sarhan, et al. (2013). "Evaluation of antioxidant activity, total
phenols and phenolic compounds in thyme (Thymus vulgaris L.), sage (Salvia officinalis
L.), and marjoram (Origanum majorana L.) extracts." Industrial Crops and Products 43:
827-831.


2. Raport de practica

a. Descrierea activitatii:
Aceste studii au avut drept scop caracterizarea unor extracte vegetale bogate in principii
active de interes i determinarea activitii antioxidante, studiile ai fost realizate cu ajutorul
tehnicilor de spectroscopie de absorbtie in domeniul UV-VIS. Astel, a fost determinata
spectrofotometric concentratia de acizi polifenol carboxilici exprimati in acid cafeic si
concentratia de flavonoide exprimate in quercitina a unor extracte vegetale hidroalcoolice
obtinute din frunze de Thymus vulgaris si muguri de Pinus sylvestris.De asemenea,
activitatea antioxidanta a fost determinata spectrofotometric, folosind ca sistem de generare a
radicalilor liberi agentul DPPH, si a fost exprimata in echivalenti milimolari quercitina
raportati la unitatile de masura adecvate pentru fiecare proba.
S-au preparat mai multe extracte hidroalcoolice folosind ca material vegetal cimbru si
muguri de pin. Extractele au fost realizate folosind doua metode de extractie: macerare si
ultrasonicare.

b. Materiale si metode experimentale:
Reactivii etanol, reactiv Folin, carbonat de sodiu, acid cafeic, acetat de sodiu, clorura de
aluminiu, quercitina, 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) au fost cumparati de la Sigma.
Pentru obtinerea extractelor vegetale s-a folosit cimbru si muguri de pin. La realizarea
experimentelor se va utiliza spectrofotometrul T60 PG INSTRUMENTS, iar datele obinute
au fost prelucrate cu ajutorul programului UVWin5 Software v5.2.0.

c. Metode de analiza:
Prepararea extractelor hidroalcoolice
Materia prima vegetala a fost supusa extractiei cu solventi pentru analiza continutului in
principii active de tip polifenolic. Pentru fiecare specie s-au realizat mai multe variante de
extractie, extractie prin macerare si extractie prin ultrasonicare , la care raportul intre solvent
si planta a fost de 10:1.


S-au realizat patru extraxte hidralcoolice; doua extracte de cimbru si doua extracte de
mugui de pin. Fiecare extract a fost obtinut prin amestecarea a 5g de masa vegetala uscata cu
50 mL etanol 70%. Doua amestecuri au fost lasate la macerat timp de 3 zile dupa care au fost
filtrate la vid si s-a colectat extractul, iar doua amestecuri au fost supuse ultrasonicarii timp
de o ora la temperatura de 40
0
C la o amplitudine de 30%

Determinarea concentratiei de acizi carboxilici exprimati in acid cafeic
5 mL proba se amesteca cu 5 mL reactiv Folin si se agita bine. Apoi 1 mL de amestec se
aduce la un volum final de 10 mL cu o solutie de carbonat de sodiu 20%, se agita bine si
dupa doua minute se citeste absorbanta la lungimea de unde = 660 nm. Absorbanta se
citeste fata de solutia de carbonat de sodiu.

Determinarea concentratiei de flavonoid exprimate in quercitina
2,5 mL proba se trateaza cu 2,5 mL acetat de sodiu 10% si se agita puternic. Peste acest
amestec se adauga 2 mL clorura de aluminiu 2,5% si 3 mL apa distilata. Dupa 45 de minute
de repaus la intuneric se citeste absorbanta la lungimea de unda =420 nm. Ca martor s-a
folosit un amestec de acetat de sodiu, aclorura de aluminiu si apa distilata.

Determinarea activitatii antioxidante
Peste 2 mL etanol 96% se adauga 0,5 mL solutie antioxidanta standard (diferite
concentratii) si 0,5 mL DPPH 1 mM. Se masoara absorbanta la lungimea de unda =517 nm
la 30 de minute dupa declansarea reactiei.
Formula de calcul pentru absorbanta relativa:
r
p
rel
A
A
A =

(1)

unde A
p
este absorbanta probei, iar A
r
este absorbanta radicalului (1,358) in absenta
antioxidantului


d. Rezultate:
Determinarea spectrofotometrica a concentratiei de acizi polifenol carboxilici
exprimati in acid cafeic in extractele obtinute din frunze de Thymus vulgaris si muguri
de Pinus sylvestris

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
A = 0.26191 + 2.24103 X C
A
b
s
o
r
b
a
n
t
a
Concentratie (mg/ml)

Figura 1. Curba de calibrare obtinuta pentru acid cafeic

Pentru validarea curbei de calibrare obtinuta pentru acidul cafeic, au fost raportati
urmatorii parametri statistici: coeficientul de corelatie - 0.99936; coeficientul de regresie
0.9987; deviatia standard - 0.02953.
Formula de calcul a concentratiei de acizi polifenol carboxilici exprimati in acid cafeic a
fost stabilita folosind datele curbei etalon, in functie de valoarea absorbantei.
( )
24103 . 2
26191 . 0
/

=
A
ml mg cafeic Acid


Determinarea spectrofotometrica a concentratiei de flavonoide exprimate in
quercitina in extractele obtinute din frunze de Thymus vulgaris si muguri de Pinus
sylvestris

50 100 150 200 250
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
A = 0.12779 + 0.01173 X C
A
b
s
o
r
b
a
n
t
a
Concentratie (g/ml)

Figura 2. Curba de calibrare obtinuta pentru quercitina

Pentru validarea curbei de calibrare obtinuta pentru quercitina, au fost raportati urmatorii
parametri statistici: coeficientul de corelatie - 0.99374; coeficientul de regresie 0.9875;
deviatia standard - 0.09657.
Formula de calcul a concentratiei quercitinei a fost stabilita folosind datele curbei etalon,
in functie de valoarea absorbante
( )
01173 . 0
12779 . 0
/

=
A
ml g Quercitina

Astfel, tinand cont de dilutiile efectuate asupra probelor analizate, s-au obtinut
urmatoarele rezultate, prezentate in tabelul 1.


Tabel 1. Concentratia de acizi polifenol carboxilici exprimati in acid cafeic si de flavonoide
exprimate in quercitina determinate in extractele obtinute din frunze de Thymus vulgaris si muguri de
Pinus sylvestris
Concentratia de acizi
polifenol carboxilici
exprimata in acid cafeic
[mg/ml]
Concentratia de
flavonoide exprimata in
quercitina [g/ml]
Macerare Ultrasonare Macerare Ultrasonare
Frunze de Thymus vulgaris 2.237 2.008 620.76 523.07
Muguri de Pinus sylvestris 0.797 0.326 533.04 236.88

Pentru extractul obtinut din frunze de Thymus vulgaris s-a determinat o concentratie de
compusi polifenolici mult mai mare comparativ cu cea din extractul obtinut din muguri de
Pinus sylvestris. De asemenea, spre deosebire de metoda de obtinere a extractelor prin
ultrasonare, macerarea a fost mai eficienta, extractele continand o cantitate mai mare de
antioxidanti studiati. Astfel extractul obtinut din frunze de Thymus vulgaris prin macerare
prezinta o concentratie de acizi polifenol carboxilici exprimati in acid cafeic de 2.237 mg/ml
si o concentratia de flavonoide exprimate in quercitina de 620.76 g/ml. Pentru extractul
obtinut din aceeasi planta insa prin metoda ultrasonicarii s-a determinat o concentratie de
acizi polifenol carboxilici exprimati in acid cafeic de 2.008 mg/ml si o concentratia de
flavonoide exprimate in quercitina de 523.07g/ml.
Cantitatea de compusi polifenolici determinati in cazul extractului obtinut din muguri de
Pinus sylvestris este mult mult mai mic: 0.797 mg/ml echivalenti de acid cafeic si
533.04g/ml echivalenti quercitina pentru metoda macerarii si 0.326 mg/ml echivalenti de
acid cafeic si 236.88 g/ml echivalenti quercitina pentru metoda ultrasonicarii utilizata in
obtinerea extractelor vegetale.


Determinarea prin metoda spectrofotometrica a activitatii antioxidante a
extractelor obtinute din frunze de Thymus vulgaris si muguri de Pinus sylvestris

In figura 3 sunt reprezentate grafic valorile absorbantei relative in functie de concentratia
quercitinei in intervalul de concentratie 1 mM 10 mM.

0 2 4 6 8 10
4.5x10
-2
5.0x10
-2
5.5x10
-2
6.0x10
-2
6.5x10
-2
7.0x10
-2
7.5x10
-2
8.0x10
-2
Abs
rel
= 0.07951 - 0.0035 X C
A
b
s
o
r
b
a
n
t
a

r
e
l
a
t
i
v
a
Concentratie quercitina (mM)

Figura 3. Reprezentarea grafica a valorilor absorbantei relative in functie de concentratia
quercitinei in intervalul de concentratie 1 mM 10 mM.

Ecuatia dreptelor de regresie s-a calculat prin metoda celor mai mici patrate si este:

quercitina rel
tie XConcentra Absorbanta 0035 . 0 07951 . 0 =
Activitatile antioxidante ale extractelor hidroalcoolice obtinute din frunze de Thymus
vulgaris si muguri de Pinus sylvestris, calculate cu ajutorul curbei de calibrare, au fost
exprimate in echivalenti milimolari quercitina raportate la 1 gram material vegetal.


Figura 4. Echivalenti milimolari de quercitina / 1g frunze de Thymus vulgaris si muguri de Pinus
sylvestris

Comparand valorile obtinute s-a constatat faptul ca, activitatea antioxidanta a extractului
hidroalcoolic obtinut din frunze de Thymus vulgaris (51,61797 mM QE ultrasonare;
61,88507 mM QE macerare simpla) este mai mare decat a celui obtinut din muguri de
Pinus sylvestris (24,28562 mM QE ultrasonare; 34,79658 mM QE - macerare).
In figura 5 sunt reprezentate grafic valorile absorbantei relative in functie de concentratia
acidului cafeic in intervalul de concentratie 1 mM 10 mM.
0 2 4 6 8 10
4,0x10
-2
4,5x10
-2
5,0x10
-2
5,5x10
-2
6,0x10
-2
6,5x10
-2
7,0x10
-2
7,5x10
-2
8,0x10
-2
8,5x10
-2
Abs
rel
= 0.008507 - 0.0045 X C
A
b
s
o
r
b
a
n
t
a

r
e
l
a
t
i
v
a
Concentratie acid cafeic (mM)

Figura 5. Reprezentarea grafica a valorilor absorbantei relative in functie de concentratia acid
cafeic in intervalul de concentratie 1 mM 10 mM.


Ecuatia dreptelor de regresie s-a calculat prin metoda celor mai mici patrate si este:
Abs
rel
= 0.008507 - 0.0045 x C
acid cafeic

Activitatile antioxidante ale extractelor hidroalcoolice obtinute din frunze de Thymus
vulgaris si muguri de Pinus sylvestris, calculate cu ajutorul curbei de calibrare, au fost
exprimate in echivalenti milimolari acid cafeic raportate la 1 gram material vegetal.

Figura 6. Echivalenti milimolari de acid cafeic / 1g frunze de Thymus vulgaris si muguri de
Pinus sylvestris

Comparand valorile obtinute se poate observa ca frunzele de cimbru au un continut mai
ridicat de acid cafeic decat mugurii de pin, astfel se poate concluziona faptul ca activitatea
antioxidanta a extractelor hidroalcoolice obtinute din frunzele de cimbru este mai mare decat
a extractelor obtinue din muguri de pin.

e. Concluzii:

Materia prima vegetala, provenita de la speciile Pinus sylvestris si Thymus vulgaris a fost
supusa extractiei cu solventi pentru analiza continutului in principii active de tip polifenolic.
Pentru fiecare specie s-au realizat doua variante de extractie, extractie prin ultrasonare si
extractie prin macerare, la care raportul solvent planta a fost de 10:1.


S-a observat ca la extractele de cimbru valorile polifenolilor exprimati atat in acid cafeic
cat si in quercitina sunt mai mari decat la extractele obtinute din muguri de pin. Totodata o
influenta destul de mare asupra concentratiei de polifenoli o are si metoda de extractie
folosita; continutul de polifenoli exprimat in acid cafei si quercitina este mai mare in
extractele obtinute prin macerare.
Determinarea prin metoda spectrofotometrica a activitatii antioxidante a extractelor
obtinute din frunze de Thymus vulgaris si muguri de Pinus sylvestris a aratat ca extractele din
frunze de cimbru au o activitate antioxidanta mai buna decat extractele obtinute din muguri
de pin.

Data, 18.01.2013

Student, Tutore,
Tatu Marian Laurnetiu Dr. Alina BUTU

.. ..

Caiet de Practica

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Caiet de Practica

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Proiect cofinanat prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013

S-ar putea să vă placă și