Bitehnologia proteinelor microbiene prin bioconversia deeurilor

1. Conversia deeurilor i a subproduselor agricole i industriale Subprodusele i deeurile care rezult din activitile agricole, forestiere i din industria alimentar pot fi folosite n diferite scopuri, n special pentru producerea energiei, contribuind la utilizarea superioar a biomasei i la reducerea polurii mediului nconjurator. Ele pot fi descompuse n produse de fermentaie i transformate n proteine, alcani sau n-parafine, metan i metanol. Tehnologiile de cultivare a algelor n ape reziduale s-au dezvoltat intens i au nregistrat importante perfecionri; ele pot fi utilizate la purificarea apei i la producerea unei biomase bogate n proteine i oligoelemente. n 1978, Programul Naiunilor Unite pentru Mediul nconjurtor a comunicat c din diverse cereale cultivate n lume rezult anual aproximativ 1,7 muliarde tone paie, din care cea mai mare parte se pierde neutilizat; de la cultivarea trestiei de zahr i din industria zahrului rman anual 50 milioane tone de reziduuri i 67 milioane tone de trestie mcinat pe lang melas i alte deeuri de la presele de trestie. Toate aceste reziduuri sunt insuficient folosite, cu toate c efluenii de la fabricile de zahr au fost utilizai ca fertilizani n campurile de orez, reziduurile de presele de trestie au servit pentru ameliorarea solului sau ca furaje pentru animale, iar resturile de trestie mcinat au servit la funcionarea concasoarelor din fabrici. Ananasul este un exemplu tipic pentru multe fructe care sunt n cea mai mare parte risipite; n fabricile de conserve de ananas se folossc mai puin de 20% din fructele ntregi. Pulpa, cojile i deeurile proaspete de ananas sunt adesea prelucrate n continuare pentru a se extrage mai mult suc iar reziduurile uscate sunt administrate ca furaje la animale. 2. Microorganisme utilizate ca surs de proteine Folosirea microorganismelor la producerea de protein ofer numeroase avantaje i anume: au un coninut ridicat de protein (30-60%) de bun calitate (sub raportul aminoacizilor esentiali); se reproduce foarte rapid;

cultivarea microorganismelor nu implic existena unor suprafee foarte mari de teren, i , prin aceasta, scoaterea lor din circuitul agricol; cultivarea microorganismelor este controlabil n cele mai stricte condiii, iar controlul calitii produsului este stpanit cu usurin de om; microorganismele pot utiliza, ca surs organic de carbon, o gam nelimitat de materii prime reziduale de la alte industrii: melase, zer, reziduuri lemnoase, celuloz i stuf, ape de canal, petrol, gaze naturale, metanol. Totui, selecionarea microorganismelor n scopul obinerii de protein are n vedere

anumite condiii pe care trebuie s le ndeplineasca microorganismele respective, printre care cele mai importante sunt: coninut ridicat de proteine i vitamine, iar proteina s aib un coninut ridicat de aminoacizi esentiali; capacitatea de dezvoltare pe substraturi disponibile i ieftine; stabilitate n cultur; cretere viguroas i producere de biomas n cantitate mare; rezistena la contaminani i produsi toxici; separare uoar de mediul de cultur; gust acceptabil i digestie uoar. Microorganismele utilizate ca surs de protein sunt bacteriile, drojdiile (levurile), mucegaiurile i algele. Bacteriile au un coninut mare de protein: 47-87 % i vitamine din grupul B. Proteina este de bun calitate, avand un coninut ridicat de lizin i un coninut bun de metionin i triptofan. Ce le mai utilizate sunt bacteriile strict aerobe din genurile: Pseudomonas, Micrococcus, Corynebacterium, Klebsiella, Arthrobacter, Brevibacterium, Mycobacterium, Methylomonas, Methylophilus, Methylococcus; bacteriile celulozolitetice din genul Cellulomonas; bacteriile albastre-verzi din genurile: Nostoc, Oscillatoria, Spirulina. Bacteriile ofer avantajul unei rate de cretere mai rapide i unui coninut mai mare de triptofan si de aminoacizi cu sulf, dar prezint, n schimb, dezavantajul unui continut mare de acizi nucleici (10-20%) care pot produce perturbri n metabolismul acidului uric n organismul

animal, precum i costul ridicat al separrii celulelor de mediu, datorit dimensiunilor celulare mici. Drojdiile au un coninut de protein de 46-56%. Proteina drojdiilor are un coninut mare de lizin, dar ceva mai sczut de metionin i triptofan. n afar de proteine, drojdiile sunt bogate n vitamine din grupul B, ergosterol i alte substane biologic active. Sunt utilizate drojdiile din genul: Candida, Hansenula, Torulopsis, Pichia. Cea mai important din punct de vedere industrial i cea mai des utilizat este Candida utilis. Spre deosebire de bacterii, drojdiile au avantajul unei separri mai uoare de mediu, datorit dimensiunilor celulare mai mari i au un coninut mai redus de acizi nucleici (5-10%). Mucegaiurile conin 20-40% proteine. Ca i n cazul drojdiilor, coninutul de metionin i triptofan este mai sczut; coninutul n lizin i ali aminoacizi eseniali este bun. Ca i bacteriile i drojdiile, mucegaiurile conin vitamine din grupul B. Cele mai folosite sunt genurile: Rhizopus, Penicillium, Fusarium. Folosirea mucegaiurilor ca surs de proteine prezint o serie de avantaje fa de celelalte microorganisme, datorit: structurii lor filamentoase, care permite o separare uoar de mediu i asigur totodat proprieti fizice specifice, n special de realizare a unor produse structurale, fr a fi necesare eforturi deosebite; coninutului lor n acizi nucleici mult mai mic dect al bacteriilor i drojdiilor. Algele au un coninut proteic de 40-65%. Proteina algelor este mai srac n izoleucin i metionin, dar coninutul celorlali aminoacizi eseniali este bun. Se folosesc alge verzi ca: Chlorella sp., Scenedesmus sp.. Avantajul pe care l prezint algele este determinat de faptul c, fiind microorganisme autotrofe, nu este nevoie de o surs organica de carbon, ea fiind reprezentat de dioxidul de carbon. 3. Materii prime utilizate pentru producia microbian de biomas, respectiv protein Materia prim, aleas n funcie de particularitile de cretere a microorganismelor, trebuie s fie convenabil din punct de vedere economic. De aceea, majoritatea cercettorilor se ndreapt spre utilizarea materiilor reziduale provenite din diferite industrii, care nu sunt numai avantajoase ca pre de cost, dar rezolv i problema polurii mediului. Aceste materii prime aparin la patru categorii: glucide, produse petroliere, metan i alcooli.
3

Glucide: o serie de deeuri glucidice ale diverselor industrii pot servi ca materie prim pentru producerea microbian de biomas. n aceast categorie intr: melasa i borhotul de melas, deeuri ale fabricilor de zahr, care conin ca surs de carbon zaharoza. Pe acestea de dezvolt n special drojdiile din genul Candida: C. Utilis, C. Arborea, C. tropicalis i mucegaiurile din genul Fusarium; zerul, deeu al fabricilor de branzeturi, care conine ca surs de carbon lactoza. Pe acesta se dezvolt drojdii ca: Saccharomyces fragilis i Candida pseudotropicalis, precum i mucegaiuri ca: Penicillium roqueforti i Rhizopus oligosporus; apele reziduale ale fabricilor de amidon, care conin amidon. Pe acestea de dezvolt drojdiile (C. utilis) i mucegaiurile. n cazul drojdiilor amidonul trebuie s fie hidrolizat n prealabil cu un preparat enzimatic amilolitic; deeuri celulozice. Folosirea deeurilor celulozice la producerea de protein microbian este de mare importan, deoarece celuloza este disponibil n mare cantitate i la un pre de cost mic; totodat se rezolv i problema polurii mediului nconjurtor. Deeurile celulozice sunt de dou categorii: deeuri celulozice ca atare: paie de gru, coceni de porumb, coji de floarea-soarelui, rumegu de lemn etc. Pe acestea se dezvolt bacteriile celulozolitice din genul Cellulomonas, fie mucegaiurile ca, de exemplu Chaetomium cellulolyticum; hidrolizate ale diferitelor deeuri celulozice: hidrolizate din stuf, hidrolizate ale deeurilor agricole, leii sulfitice. Toate acestea conin ca surs de carbon hexoze i pentoze. Cele mai folosite sunt leiile sulfitice, deeu al fabricilor de celuloz. n aceste fabrici exist o etap, n care se ndeprteaz lignina i hemicelulozele ce leag fibrele de celuloz m lemn, prin fierberea bucilor de lemn ntr-un lichid acid. n timpul fierberii lignina trece n lignosulfonai solubili, iar hemicelulozele sunt hidrolizate n glucide simple (hexoze i pentoze). Compoziia leiei sulfitice obinute dup ndeprtarea fibrelor de celuloz depinde de tipul de lemn folosit. n cazul arborilor cu lemn moale, leia sulfitic obinut conine n special manoz, deoarece hemicelulozele respective conin mai mult manan. n cazul arborilor cu lemn tare, leia sulfitic conine n special xiloz, deoarece hemicelulozele respective conin mai ales pentozani, n special xilan. Pe leii sulfitice i alte hidrolizate ale deeurilor celulozice se dezvolt drojdiile din genul Candida: C. utilis i C. tropicalis.
4

Produse petroliere ca: petrolul lampant, motorina, ceara de parafin conin hidrocarburi saturate aciclice (n-alcani sau n- parafine), care pot fi folosite de unele microorganisme ca unic surs de carbon i energie. Microorganismele folosesc n-alcanii lichizi cu i n-alcanii solizi cu , existeni n ceara de parafin, produs secundar obinut la producerea uleiurilor lubrifiante din petrol. Motorina i petrolul lampant se obin din petrolul brut printr-o simpl distilare. Motorina conine predominant n-parafine cu , iar petrolul lampant n-parafine cu . Dac se folosesc n-parafine pure, ele se separ prin distilare fracionat din produsele petroliere respective. Microorganismele capabile s foloseasc n-alcani sunt: bacteriile din genurile: Mycobacterium, Corynebacterium, Pseudomonas, Microccocus; drojdiile din genurile: Candida, Torulopsis, Rhodotorula, Pichia; mucegaiurile din genurile: Mucor, Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Cephalosporium. Metanul este un substrat disponibil la un pre foarte sczut n unele regiuni ale globului. Fiind un substrat gazos, metanul ridic probleme la construirea bioreactoarelor, dar prezint n schimb avantajul c nu las n produsul finit reziduuri care s pun probleme sub aspect alimentar, ca n cazul n-parafinelor. Utilizarea metanului la producerea de protein este limitat la un grup aparte de bacterii, bacteriile metilotrofe. Prin convenie internaional, s-a stabilit ca toate microorganismele capabile s utilizeze compuii cu un singur atom de carbon n afar de i drojdii. Bacteriile metilotrofe sunt Gram-negative, bacilare, nesporulate, strict-aerobe, pigmentate n roz sau brun, unele formnd capsul, altele acumulnd cantiti mari de poli -hidroxibutirat. Bacteriile metilotrofe se mpart n dou grupe: obligat metilotrofe care se dezvolt numai pe metan, metanol i metilamin. Ele aparin urmtoarelor genuri: Methylomonas, Methylosinus, Methyloccoccus, Methylobacter, Methylophilus. La microscopul electronis s-a evideniat la aceste bacterii prezena unui sistem membranar intern bine dezvoltat, derivat din membrana plasmatic i pe care ar fi localizat sistemul enzimatic implicat n oxidarea metanului i metanolului;
5

, ca unic surs de

carbon i energie s poarte denumirea generic de metilotrofe. n aceast categorie intr bacterii

 facultativ metilotrofe, capabile s utilizeze i alte surse de carbon i energie n afara metanului, metanolului i metilaminei. Sunt mai numeroase dect cele din prima grup i aparin unor genuri comune ca: Pseudomonas, Microccocus, Bacillus,

Corynebacteriu, Streptomyces. Alcoolii, n special metanolul i etanolul, pot fi utilizai de numeroase microorganisme. Metanolul este o materie prim ideal pentru producia de proteine, deoarece este perfect miscibil n ap; metabolizarea lui necesit un consum mai redus de oxigen dect n cazul hidrocarburilor, nu las reziduuri n celul i poate fi obinut n stare pur la un pre relativ sczut. Pe metanol se dezvolt bacterii metilotrofe obligate i facultative care se dezvolt i pe metan i, n plus, levurile metilotrofe. Spre deosebire de bacteriile metilotrofe, levurile metilotrofe sunt toate facultativ metilotrofe. Dintre sursele cu un singur atom de carbon, levurile folosesc numai metanolul. Levurile aparin la cinci genuri: Kloeckera, Candida (C. boidinii, C. methanolica), Hansenula (H. capsulata), Torulopsis (T. glabrata) i Pichia (P. pinus). 4. Factorii care condiioneaz producia de proteine microbiene Sursa de carbon i energie. n cazul substraturilor zaharate, ele necisit adesea un tratament preliminar, care variaz dup natura substratului folosit. Astfel, melasele sunt diluate, acidifiate, mbogaite n fosfat de calciu i factori de cretere i, dup fierbere i neutralizare, sunt decantate i filtrate. Substraturile amidonoase necesit fierbere prealabil pentru gelificarea amidonului, urmat de zaharificare cu mal, sau un preparat amilolitic microbian. Alcanii trebuie adui sub form de emulsie cat mai fin, pentru a fi accesibili microorganismelor n vederea oxidrii. Indiferent ns de substratul utilizat, adaptarea microorganismului la acesta este de mare importan, lucru care se realizeaz prin pasaje succesive pe substratul respectiv. Sursa de azot. De obicei se folosesc amoniacul, srurile de amoniu sau ureea. Cercetrile au demonstrat influena sursei de azot, n special a ureei, asupra vitezei de cretere i a coninutului de proteine al microorganismului respectiv. Astfel, n cazul drojdiilor cultivate pe nparafine s-a obinut un coninut proteic de 48.5%, cand sursa de azot a fost sulfatul de amoniu n concentratie de 0.5-1 g % i de 56.9%, cand sursa de azot a fost ureea, n concentratie de 0.5 g%.

Aerarea i agitarea. Cantitatea de aer i modul distribuirii sale constitue factori critici n eficiena producerii de mas celular. n cazul n care sursa de carbon este reprezentat de hidrocarburi, consumul de oxigen este de trei ori mai mare, decat n cazul glucidelor, care conin ele nsi oxigen ( jumatate din greutatea lor). n cazul metanolului, consumul de oxigen este intermediar ntre glucide si hidrocarburi. Modul de distribuire a aerului este de asemenea un factor important, dat fiind solubilitatea mic a oxigenului, care n mediul de cultur nu depete 5-6 mg/l. n scopul unei cat mai bune aerari, s-au construit diferite tipuri de reactoare, dintre care cele mai folosite sunt bioreactoarele Vogelbusch, n care dispersia aerului se realizeaz cu diferite tipuri de agitatoare, sau bioreactoarele Lefranois, care realizeaz o amestecare intim a mediului cu aerul, prin crearea unor cureni n interiorul bioreactorului, care determin o urcare a lichidului n partea central i o coborare n zonele periferice. Deoarece aerarea este nsoit de agitare, care antreneaz formarea de spum, folosirea substanelor antispumante este obligatorie. Se folosesc n acest scop: dodecanol, hexadecanol, ulei de ricin sulfonat.

Bibliografie: 1. Petre Raicu, I. Dumitru, O. Boldor, Lidia Popa, 1990, Biotehnologii moderne, Editura Tehnic, Bucuresti. 2. Erica Nimian, 1992, Biotehnologii microbiene, Editura Universitii, Iai. 3. Albert Sasson, traducere din limba englez de Veronica Dimcea, E. Ganea, C. Vior, 1993, Biotehnologii i dezvoltare, Editura Tehnic, Bucureti