1.

Eamenul coproparazitologic direct pe preparat proaspat cu sol de ser fiziologic Principiu: Pune in evidenta elemente parazitare atat microscopic cat si macroscopic. Tehnica de lucru: Pe o lama de microscopie se pune o picatura de ser fiziologic; cu ajutorul unei baghete de sticla se ia un mic fragment din proba fecala si se disociaza si omogenizeaza in pic de ser fiziologic, prin miscari circulare. Dupa aceea se acopera cu o lamela si se observa la microscop cu obiective uscate, mai intai cu obiectiv de 10 X, apoi cu obiectiv de 20 X, respectiv 40 X. Nu se examineaza cu obiective cu imersie 90 X, respectiv 100X. Examinarea se recomanda a fi facuta pe 2- 3 lame, materialul fiind recoltat din mai multe puncte ale produsului fecal. Rezultatul obtinut in urma examinarii directe, chiar daca sunt identificate eventualele forme parazitare nu are decat caracter preliminar, deci provizoriu. Un rezultat complet nu se poate obtine decat in urma probelor de concentrare. Examinarea: La examinarea la microscop se pot vedea ouale helmintilor, chisturile protozoarelor cat si formele vegetative ale acestora. In observare atenta se pot evidentia eventualele miscari ale pseudopodelor amoebelor. Aceste miscari pot fi cu atat mai bine evidentiate daca in prealabil lama de microscopie si serul fiziologic au fost incalzite la 37oC. 2. Examenul coproparazitologic direct pe preparat proaspat cu solutie Lugol Principiu: Punerea in evidenta a elementelor parazitare atat microscopic cat si macroscopic. Tehnica de lucru: Pe o lama de microscopie se pune o pic de sol Lugol; cu ajutorul unei baghete se ia un mic fragment de material fecal si se disociaza si omogenizeaza in pic de sol Lugol, prin miscari circulare. Dupa aceea se acopera cu o lamela si se observa la microscop cu obiective uscate, mai intai cu obiectiv de 10 X, apoi cu obiectiv de 20 X, respectiv 40 X. Nu se examineaza cu obiective cu imersie 90 X, respectiv 100X. Examinarea se recomanda a fi facuta pe 2- 3 lame, materialul fiind recoltat din mai multe puncte ale produsului fecal. Rezultatul obtinut in urma examinarii directe, chiar daca sunt identificate eventualele forme parazitare nu are decat caracter preliminar, deci provizoriu. Un rezultat complet nu se poate obtine decat in urma probelor de concentrare. Examinarea: Ac tehnica permite evidentierea unor elemente de structura ale formelor vegetative sau chistice ale protozoarelor, precum si ouale helmintilor. Nu pot fi evidentiate insa, eventualele miscari ale pseudopodelor amoebelor. Dar se poate observa ca amidonul digerat de parazit, va apare colorat in roz, iar cel nedigerat colorat in violet; flora iodofila si vacuolele iodofile apar colorate in negru. 3. Tehnici de concentrare prin sedimentare Principiu: Consta in: Cisturile si oochistii protozoarelor au o greutate specifica mai mare decat a mediului in care sunt suspensionate materiile fecale; mediu este de obicei reprezentat de apa sau sol fiziologica. Din acest motiv ele au tendinta de a se depune. Separarea si depunerea elementelor parazitare poate fi grabita printr-un tratament chimic sau centrifugare usoara, astfel inlaturandu-se resturile nedigerate din produsul fecal. a. Sedimentarea cu formol 10% si eter sau acetat de etil

Tehnica de lucru: Se recolteaza din mai multe puncte ale materialului fecal o cantitate de dimensiunea unei nuci de marime medie; se omogenizeaza si se suspensioneaza sau se pune in 10 ml de ser fiziologic. Se filtreaza printr-o sita de material textil intr-un tub de centrifuga cu fundul conic. Se centrifugheaza filtratul obtinut la 2000 rpm. Supernatantul se decanteaza iar sedimentul se reia tot in 10 ml de ser fiziologic si se centrifugheaza din nou. Aceste spalari repetate se reiau pana cand supernatantul ramane limpede. Dupa ultima spalare sedimentul obtinut se amesteca in 10 ml de formalina (formol 10%) si se omogenizeaza prin agitare , apoi se lasa cateva minute sa se depuna. Se adauga cca 1 -2 ml acetat de etil, se inchide tubul si se agita puternic. Are loc o ultima centrifugare la 1500 rpm. La sfarsitul centrifugarii, in tub se pot observa 4 straturi: La suprafata un strat format din acetat de etil, Apoi un strat inchis la culoare ce contine resturi nedigerate, Urmeaza un strat ce contine formalina, Si ultimul strat - sedimentul. Cu ajutorul unui varf de pipeta se desprinde cu grija de pe peretii eprubetei al 2-lea strat si se inlatura. Apoi se decanteaza cele 3 straturi ramase. Cu o pipeta pasteur, sedimentul se repartizeaza pe lame in cate o pic de ser fiziologic sau sol Lugol. Se acopera cu o lamela si se examineaza la microscop. Sedimentarea astfel aplicata poate fi folosita si in cazul probelor fixate in PVA (polivinilalcool). Lamele cu material de examinat trebuie pregatite in cel mult o ora pentru a se evita uscarea materialului. Totusi exista o posibilitate de a preintampina uscarea materialului, adaugandu-se o pic de formalida peste sediment. Pot apare erori in rezultatele obtinute atunci cand nu se foloseste o cantitate corespunzatoare de material fecal, fie prea putin, fie prea mult.

4. Tehnica de concentrare prin flotare Principiu: Chisturile protozoarelor si oole helmintilor avand o greutate specifica mai mica decat a lichidului in care se suspensioneaza pot fi recoltate la suprafata unui lichid de suspensie care are o greutate specifica mai mare. Tehnica de lucru: Intr-un recipient cu deschidere larga se introduc cateva mici fragmente din bolul fecal. Se adauga o mica cantitate din solutia saturata de NaCl, se disociaza bolul fecal cu ajutorul unei baghete de sticla. Se adauga in continuare sol de NaCl pana la limita superioara a recipientului. Cu ajutorul unei pense se depune o lamela de microscopie pe suprafata lichidului. Depunerea se face cu grija astfel incat lamela sa nu se scufunde. Dupa aproximativ 30 min, cu ajutorul pensei, lamela se ridica, pastrandu-se paralelismul cu suprafata lichidului, si se depune pe lama de examinare si se examineaza. Depasirea timpului de flotare, in conditiile in care are loc un proces de evaporare la suprafata lichidului, poate favoriza depunerea cristalelor Na si poate favoriza ingreunarea oualelor care se vor scufunda, nemaiputand fi evidentiate sau vizualizate. Examinare: Metoda nu e eficienta in depistarea oualelor operculate de Botriocefal. 5. Coprocultura pe mediu Loffler (ser coagulat de bou) Principiu:

Metoda este utilizata ptr identificarea , izolarea si cultivarea unor protozoare cu localizare intestinala (Entamoeba histolytica), dar si pentru alte protozoare (Trichomonas vaginalis). Alte protozoare impreuna cu cele de mai sus sunt puse in conditii favorabile de crestere si inmultire, favorizandu-se astfel diagnosticul. Tehnica de lucru: Se scot tuburile cu mediu Loffler, cu cateva ore inaintea insamantarii de la frigider (unde se pastreaza ptr a nu se usca) si se pun in termostat la tep de 37oC. In acest scop se pune si serul fiziologic la 37oC. Se recolteaza in recipient cu ajutorul unei baghete de sticla cateva fragmente din materialul fecal ce urmeaza a fi investigat. Se recolteaza mai ales din zonele mucoase, moi, eventual cu striuri de sange. Se adauga putin ser fiziologic si se omogenizeaza. Cu ajutorul unei pipete pasteur cu para de cauciuc se recolteaza o cantitate din suspensia rezultata si se pun cateva pic din aceasta suspensie pe mediu Loffler. Se adauga apoi putin amidon si streptomicina (un vf de ansa). Se adauga ser fiziologic astfel incat coloana de lichid formata sa nu depaseasca limita superioara a serului coagulat de bou. Se pastreaza la termostat la 37oC cel putin 3 zile; examinarea facandu-se din 24 in 24 de ore. Dupa 24 h se scot tuburile cu cultura de la termostat, se inlatura cu pipeta pasteur cu para de cauciuc faza lichida a mediului pastrandu-se sedimentul. Se recolteaza apoi cateva pic din sediment cu ajutorul pipetei pasteur prin raclarea suprafetei cheagului de ser. Se pune o pic intre lama si lamela si se examineaza la microscop cu obiectiv de 40X. Dupa recoltare, se adauga in cultura ser fiziologic, streptomicina, chiar si amidon, si se pastreaza in continuare la termostat la 37oC alte 48 h. Examinare: Entamoeba poate fi recunoscuta dupa: aspectul refringent al citoplasmei, aspectul nucleului cu un nucleol fin, central si cromatina fina dispusa la periferie, aspectul pseudopodelor formate exploziv si de obicei cate unul intr-o singura directie. O cultura bogata in amoebe face ca amidonul de orez sa fie consumat repede. In absenta amidonului, cultura poate fi pierduta. Amoebele fara amidon fagocitat si care emit in dezordine pe suprafata corpului mai multe pseudopode indica un declin al culturii. 6. Coprocultura pe carbune Principiu: Ac tehnica de diagnostic este utilizata atunci cand examenele clinice si de laborator si datele epidemiologice sugereaza posibilitatea unei infectii cu Ankylostoma, Necator si Strongyloides. Ac tehnica permite: - Formarea si eclozarea larvelor rhabditoide de tip ankylostoma si necator, naparlirea lor si trecerea in stadiu de larve strongyloide - Evolutia larvelor rhabditoide de Strongyloides catre stadiul adult si inmultirea lor prin eliberarea altor generatii de larve. Ac tehnica se bazeaza pe tactismul larvelor, geotropismul negativ si hidrotropismul pozitiv al acestor larve. Tehnica de lucru: Cu ajutorul unei baghete de sticla se recolteaza ccateva fragmente din proba fecala ce urmeaza a fi examinata, se amesteca pana la omogenizare cu o cantitate egala de carbune medicinal. Amestecul se introduce in cutia Petri, modelandu-se o formatiune conica a carei vf sa fie turtit de capac. Peste

capac se pune o bucata de vata umeda. Se pastreaza la temperatura camerei, avand grija ca permanent aceasta sa fie umeda, timp de cateva zile pana la 10 zile. Prin evaporarea apei din vata umeda, cutia petri se raceste usor, astfel incat apa din materialul fecal va condensa pe suprafata interna a capacului. Larvele existente, prin geotropismul lor negativ au tendinta de a se indeparta de partile inferioare ale carbunelui, catre vf si avand hidrotropism pozitiv se vor aduna in pic de apa de condens. Examinare: Examinarea se cu o lupa prin transparenta capacului ce va permite vizualizarea larvelor recunoscute usor, datorita miscarilor lor active. In cazul unei probe pozitive in primele 48 h, pot fi surprinse larve strongiloide provenite prin naparlirea celor rhabditoide si larve de Ankylostoma; in zilele urmatoare pot apare adultii de Strongyloides si noi generatii de larve rhabditoide. Ankylostoma si Necator vor ramane sub forma de larve strongiloide. Deoarece larvele rhabditoide se transforma f. repede in larve strongiloide infectante, este obligatorie folosirea manusilor de cauciuc in manipularea materialului. 7. Coloratia Ziehl Nielsen Principiu: Evidentierea oochistilor de Cryptosporidium parvum. Tehnica de lucru: Se executa frotiuri din materialul fecal ce urmeaza a fi examinat. Se usuca la aer si se fixeaza cu metanol sau acid clorhidric metanol timp de 2-3 min. Se acopera frotiul cu fuxina fenica rece timp de 5-10 min. Se adauga sol de acid clorhidric etanol pana cand colorantul nu mai difuzeaza, apoi se spala cu apa de la robinet. Se contracoloreaza cu sol 3% verde malahit timp de juma de min. Se spala cu apa de robinet, se usuca si se examineaza. Examinare: Se observa oochistii de Cryptosporidium parvum care apar colorati in rosu, iar fondul in verde deschis. Se recomanda examinarea cu obiective cu imersie in scopul recunoasterii unor particularitati de structura ale chistilor. 8. Tehnica amprentei anale Principiu: Este utilizata ptr evidentierea oualelor de Enterobius vermicularis. Femelele de oxiuri depun ouale in pliurile mucoasei anale; tehnicile de depistare uzuale a acestor oua direct din produsul fecal sunt inutile. Tehnica de lucru: Se ia o bagheta de sticla si unul din capetele acesteia se acopera pe o distanta de 1-2 cm cu banda adeziva sau ciolofan, ce se prinde cu un inel de cauciuc fin. Se introduce bagheta intr-o eprubeta de sticla si se acopera cu un dop de vata. A 2-a zi se scoate bagheta din eprubeta, se apropie de zona perianala a pacientului, introducand capatul baghetei 1-3 mm in anus, se roteste usor astfel incat eventualele oua din pliurile mucoasei anale sa poata fi recoltate. Se desprinde pelicula de ciolofan de pe bagheta si se depune pe o lama de microscopie intr-o pic de ser fiziologic sau ulei de cedru sau glicerina. Se acopera cu o lamela si se examineaza la microscop cu obiectiv de 10X. Recoltarea se face dimineata sau seara, inainte de utilizarea tualetei si fara a spala in prealabil zona anala.

Examinarea: In situatia unui rezultat pozitiv se recomanda investigatia si celorlalti membri ai familiei. 9. Examenul parazitologic al bilei Principiu: Permite evidentierea in proportie de 100 % a unei infectii cu Giardia duodenalis. Mai pot fi evidentiate oua de Fasciola hepatica si larve de Strongyloides temporalis. Tehnica de lucru: Se foloseste de obicei bila B si C. Dupa recoltarea bilei de tubaj duodenal, se centrifugheaza la cel mult 500rpm, iar produsul (sedimentul) este examinat pe lama cu lamela la microscop cu obiective uscate. Infectia cu Giardia este depistata prin evidentierea formelor vegetative care nu rezista decat un timp scurt. Se recomanda ca examinarea sa se faca in cat mai scurt timp dupa recoltare. 10. Metoda capsulei enterotest Principiu: Permite evidentierea (diagnosticarea) infectiei cu Giardia duodenalis fara a fi necesare mai multe probe. Tehnica de lucru: Capsula inghitita de pacient, care retine capatul liber al firului. Firul este masurat astfel incat sa nu permita capsulei sa dep[aseasca duodenul. Sub actiunea sucului duodenal capsula este dizolvata iar firul ramane liber si pluteste in lumenul intestinal. Se mentine astfel firul aprox 2 ore, timp in care formele vegetative ale giardiilor care se deplaseaza liber prin sucul intestinal, vor adera la el. Se scoate apoi firul, se spala cu ser fiziologic intr-o eprubeta. Se centrifugheaza si produsul rezultat se examineaza la microscop cu obiective uscate. Ptr ca Giardia se evidentiaza prin forme vegetative, se recomanda ca examinarea sa se faca in cel mai scurt timp posibil dupa recoltare. 11. Diagnosticul pneumocistozei Principiu: Boala data de Pneumocistis carini care da o pneumonie severa, insa nu la orice pacient (bolnav) ci doar celor cu imunitate scazuta (persoane infectate cu HIV). Diagnosticul de certitudine se face prin evidentierea formelor caracteristice de trofozoiti si chisti pe frotiuri de material bioptic sau necroptic, care ne vor orienta spre o pneumocistoza. Materiale folosite sunt: sputa indusa, secretia laringo-traheala. Se folosesc coloratiile Giemsa si albastru de toluidina. Coloratia Giemsa pune in evidenta atat trofozoitii cat si chistii. Trofozoitii apar sub forma aglomerarii de puncte de culoare albastra-violacee, reprezentand nucleii trofozoitilor. Chistii nu se coloreaza la nivelul peretilor dar se coloreaza cei 8 nuclei intrachistici. Coloratia cu albastru de toluidina pune in evidenta doar chistii si coloreaza in albastru doar peretii acestora. Tehnica de lucru: Colorarea sputei (coloratia cu albastru de toluidina): Dupa recoltarea sputei, este necesar sa fie debarasata de mucus. In acest scop este tratata cu o sol mucolitica. Un volum din sputa de cercetat se amesteca cu 9 volume din solutia mucolitica si se agita. Produsul nevascos se filtreaza prin tifon, iar rezultatul in urma filtrarii se centrifugheaza 5 min

la 3000rpm. Sedimentul astfel obtinut se spala in ser fiziologic si se etaleaza pe lame de microscopie. Dupa o prima fixare superficiala cateva sec cu alcool metilic, frotiurile sunt introduse in sol fixatoare 5 min. Se scot din sol fixatoare si se spala cu apa de robinet. Dupa spalare frotiurile sunt introduse 5 min in sol de albastru de toluidina. Dupa colorare frotiurile sunt introduse succesiv cate 15-30 min in 3 bai de alcool etilic de conc din ce in ce mai mare (50% - 95% alcool absolut). Se pastreaza in xilol 1-2 min. Se examineaza cu obiectiv cu imersie 90X. 12. Examenul parazitologic a leishmaniozei Principiu: Leishmaniozele cutanate si ciscerale sunt diagnosticate prin evidentierea parazitilor pe materiale bioptice, etalate sub forma de frotiuri sau amprente, colorate Giemsa. Materialele bioptice mai pot fi si inoculate ptr cultivarea eventualilor paraziti. Tehnica de lucru: In cazul Leishmaniozei cutanate materialul bioptic se recolteaza din profunzimea leziunii, niciodata superficial caz in care exista riscul de izolare a germenilor, mai ales cand leziunea este ulcerata. In cazul Leishmaniozei viscerale ,aterialul bioptic se recolteaza in mod obisnuit prin pctii ganglionare sau osoase. Punctiile splenice , desi dau procentul cel mai ridicat de rezultate pozitive (98%) nu sunt recomandate ptr ca exista riscul de hemoragie severa. Dupa recoltare materialul este etalat pe lame si fixat cu alcool metilic si apoi colorat Giemsa. (tehnica asemanatoare frotiului de sange). Examinare: In probele pozitive apar elemente celulare ce contin parazitul sub forma sa amastigota. Mai pot fi observate forme amastigote extracelulare provenite din distrugerea celulelor parazitate. Materialul bioptic poate fi insamantat pe un mediu special, mediu acelular ce contine geloza si ser defibrinat de iepure. Ac mediu e pastrat la temp de 24oC timp de mai multe zile. Prima citire se face dupa cca. 4 zile; daca totusi dupa 8 zile de cultivare rezultatul ramane negativ, se recomanda o repicare pe un mediu nou si cultivare 8 zile. In cazul unui rezultat pozitiv, parazitul va creste pe mediu in forma sa promastigota. 13. Diagnostic parazitologic al Trichomonazei urogenitale Principiu: Deoarece leucoreea si pruritul sunt principalele semne ale tricomonazei , dar acestea nu lipsesc nici in alte boli genitale (candidoza genitala, sau gonoreea), este bine ca evidentierea parazitului sa se faca in secretiile recoltate. Tehnica de lucru: La femeie se recolteaza secretia vaginala, uretrala si sediment urinar. - Recoltarea secretie vaginale se face corect pre- si post menstrual; se recolteaza din fundul de sac vaginal cat mai profund si lateral cu putinta; se recolteaza la 24-48 h dupa ultima tualeta intima profunda sau dupa ultimul contact sexual; - Recoltarea secretiei uretrale se face la virgine si la femeile ce prezinta leziuni la nivelul mucoasei vaginale, care fac imposibila explorarea vaginului cu instrumental medical; - Recoltarea sedimentului urinar: se utilizeaza prima urin de dimineata din care prin centrifugare se obtine un sediment ce urmeaza a fi examinat; examinand urina mai pot fi evidentiate si alte elemente patologice parazitare (larve de Schistosoma haematobium, oua de Enterobius vermicularis care sunt depuse de femela in mod eratic).

La barbat se recolteaza secreti matinala, adica secretia uretrala sau picatura matinala; aceasta se recolteaza si prin masaj prostatic. Se recolteaza de asemeni sedimentul urinar si lichidul spermatic. Acestea sunt de preferat sa se examineze pe preparat proaspat intre lama si lamela. In cazul in care examinarea imediata nu este posibila, se recomanda fixarea si colorarea ulterioara Giemsa. Examinarea: Miscarea parazitilor va usura mult recunoasterea lor pe preparatele proaspete. Examinarea poate da rezultate favorabile numai in aproximativ 50% din cazuri, mai precis atunci cand numarul parazitilor depaseste 105/ml. Secretiile cu nr mic de paraziti, mai ale s cele recoltate de la barbati se recomanda a fi inoculate pe un mediu de cultura in scopul imbogatirii. Din ac motiv, insamantarea pe medii de cultura a materialului recoltat reprezinta cea mai sigura metoda de diagnostic. In scopul cultivarii se utilizeaza de obicei un mediu cu un bulion nutritiv ce contine triticaca extract de ciuperci cu adaus de fier, ser fetal de vitel si amestec de vitamine. Insa mai poate fi utilizat cu succes si mediul Loffler sau un mediu pe baza de ser coagulat de bou cu adaos de factori nutritivi (extract de splina). 14. Examenul sangelui Principiu: Se practica ptr identificarea a 4 tipuri de paraziti: - Infectiile malarice: cele 4 plasmodii; - Tripanosomele ce dau boala tripanosomiaza, cu 2 specii (cruzii si brucei) - Babesiile - Grupul filariilor: microfilariile ce pot apare in sange sau in limfa (Wuchererria bancrofti, Brugia malayi) , filarioza cutanata (Loa loa care da boala loiaza). Toate aceste infectii parazitare sunt evidentiate prin tehnica frotiului si tehnica picatura groasa. a. Tehnica frotiului - Se dezinfecteaza pulpa degetului - Se inlatura surplusul substantei dezinfectante prin evaporare - Se face punctionarea cu un ac steril, de unica folosinta - Asteptam sa apara pic de sange, fara a apasa; daca nu apare pic de sange, se mai punctioneaza o data - Se pune o pic de sange pe o lama de microscopie,; cu marginea unei a 2-a lame sau lamele se etaleaza sangele pe toata suprafata lemei de examinat pana apare aspectul de franjuri - Se lasa sa se usuce - Frotiurile dupa uscare se fixeaza cu alcool metilic timp de 3 min. Se inlatura fixatorul si se acopera lama cu sol Giemsa timp de 45 min. Se spala cu apa distilata sau apa de robinet si se usuca inaintea examinarii - Se examineaza la microscop b. Tehnica picaturii groase - Se dezinfecteaza pulpa degetului - Se inlatura surplusul substantei dezinfectante prin evaporare - Se face punctionarea cu un ac steril, de unica folosinta

Asteptam sa apara pic de sange, fara a apasa; daca nu apare pic de sange, se mai punctioneaza o data - Picatura de sange se depune la capete sau/si in centru (1-3 pic pe lama); cu coltul unei lame sau lamele, prin miscari circulare se amesteca, se omogenizeaza si se defibrinizeaza - Se lasa apoi sa se usuce departe de orice sursa directa de caldura sau de agenti fixatori - Dupa cateva ore (cel putin 2h) lamele cu pic groasa se scufunda in apa de robinet sau distilata - O pic groasa bine hemolizata va apare pe lama sub forma unei pete fumurii, transparente. Daca operatiile nu au fost corect executate hemoliza va fi incompleta iar stratul gros de hematii va impiedica vizualizarea parazitilor, lamele fiind compromise. - lamele dupa uscare se acopera cu sol Giemsa timp de 45 min. Se spala cu apa distilata sau apa de robinet si se usuca inaintea examinarii - Se examineaza la microscop. Examinarea: Frotiul si pic groasa se examineaza obligatoriu cu obiective cu imersie. In cazul infectiei malarice si al babesiozelor se apreciaza aspectul, marimea, numarul hematiilor parazitate si al parazitilor. In tripanosomiaze parazitii aflati in afara hematiilor se recunosc dupa aspectul contorsionat si prezenta membranei ondulante. In diagnosticul filariozelor larvele sunt recunoscute dupa aspectul contorsionat si dupa prezenta sau absenta asa numitilor nuclei somatici. Parazitii malarici, babesiile si tripanosomele colorate Giemsa au nucleu colorat in rosu, citoplasma in albastru si asanumitele granulatii specifice in portocaliu. Hematiile in functie de pH-ul solutiei de colorant pot avea nuante variind de la roz la violet.