Curs 13 3.2 Imobilizarea enzimelor prin reticulare.

Imobilizarea enzimei se poate realiza i fr a se utiliza suporturi prin efectuarea de puni covalente cu ajutorul unor reactivi polifuncionali. Se obin astfel structuri cu nalt mas molecular care devin insolubile. Pentru realizarea unei astfel de reacii se pot folosi numeroi reactivi, dintre care cei mai utilizai sunt :

Principalii reactivi polifuncionali Nume Glutaralde id !cid bis"diazobenzidin"#,#$"disulfonic

Structur

!cid disulfonic

difenil"%,%$"diizotiocianat"#,#$"

&,'"difluoro"#,%"dinitro"benzen

("meto)i"%,%$"difenil metan

diizotiocianat"

*e departe +lutaralde ida este reactivul cel mai utilizat nu numai pentru a se reticula enzimele ci i pentru realizarea aa numiii imuno"adsorbani. ,n acest proces enzima este diluat cu o protein inert, cum este albumina, pentru a se limita fenomenele de denaturare i a crete eficacitatea metodei de imobilizare. *erivaii rezultai pot fi i sub form de membrane. -bservaii la microscopul electronic au permis precizarea structurii fine a acestor tipuri de derivai. Pentru obinerea unor derivai cu o structur foarte poroas asemntoare bureilor, amestecul de enzim, albumin i +lutaralde id este con+elat rapid dup care se crete temperatura p.n la %/0 n mod lent. 1n astfel de proces de reticulare se poate aplica nu numai enzimelor ci i celulelor ntre+i. !cestea prezint avantajul, mai ales n cazul n care celula conine o enzim uor accesibil 2cum este cazul enzimelor periplasmatice3, c permit utilizarea activitii catalitice fr a se efectua procesele de e)tracie i purificare consumatoare de ener+ie, timp i bani. ,n &

acest caz putem spune c celula este suportul. *e asemenea se evit eliberarea sistemelor care determin autode+radarea celular printr"o nclzire a sistemului timp scurt la o temperatur de 4//" 5//0. ,n plus acest procedeu permite scderea important a costului enzimei imobilizate i este utilizat pe lar+ pentru imobilizarea +lucoz izomerazei folosit pentru producerea de izo+lucoz, una dintre cele mai importante aplicaii industriale de enzime imobilizat. *e e)emplu cu +lutaralde id firma 6-7- a reticulat Bacillus coagulans, iar GIS8" 9:-0!*;S micelii de Actinoplanes missouriensis. Avantaje i dezavantaje Avantaje Soliditatea le+turii enzim <suport care permite obinerea de compurezisteni la diferite variaii importante ale condiiilor de mediu 2p=, trie ionic3 i, n particular, la splri repetate cu soluii concentrate de clorur de sodiu. ;)ist o foarte mare varietate de suporturi i metode de activare, dei este aproape imposibil de a prevedea a priori eficacitatea unei metode de imobilizare, este ntotdeauna posibil s se +seasc pentru o enzim dat o metod care s dea un randament de imobilizare bun. Stabilitatea le+turilor covalente ntre enzim i suport se poate traduce i prin ri+idificarea structurii tridimensionale a enzimei. *in aceasta rezult noi proprieti, n special printr"o cretere +eneral a rezistenei la factorii de denaturare2temperatur, p=, a+eni denaturani3. ;ste semnificativ c foarte multe enzime imobilizate prezint o temperatur optim de activitate mai mare dec.t a enzimei libere fapt deosebit de important pentru utilizarea enzimei n flu) continuu. Pentru ca ri+idificarea enzimei s nu fie total, fiind necesar o anumit elasticitate, este obli+atoriu s se stabileasc condiiile optime de imobilizare pentru fiecare enzim n parte i pentru fiecare procedur de imobilizare. Dezavantaje Imobilizarea prin le+are covalent este mult mai comple) dec.t prin incluziune sau adsorbie. 0 imia etero+en aplicat pentru a se ajun+e la imobilizare nu duce ntotdeauna la rezultatele ateptate consider.nd reaciile care au loc n fazele omo+ene ca urmare a fenomenelor de interferen din micromediul nconjurtor prezent n sistemele etero+ene. >ormarea le+turilor covalente ntre diferitele +rupri funcionale ale enzimei i suportului conduce la o important modificare a structurii enzimei, care dei este benefic n ceea ce #

privete ameliorarea rezistenei la factori de denaturare, provoac totui o denaturare a structurii moleculei enzimei. *e aceea randamentul de imobilizare e)primat n funcie de activitatea enzimatic rezidual poate avea valori procentuale de la c.teva uniti la mai mult de ?/@. *e e)emplu este suficient ca la le+tur s participe i +rupri din situsul catalitic al enzimei ca activitatea sa s fie perturbat. *e asemenea pot fi amintite i efectele de st.njenire steric i de sc imbare a sensibilitii enzimei la variaii de p= saiu c iar la modificarea valorii optime de p=. ;ste practic imposibil de a se prevedea, c iar dac structura enzimei este cunoscut i reacia de cuplare perfect stp.nit, care va fi randamentul de imobilizare covalent cu o metod sau alta, fiind variabil de la o enzim la alta pentru aceiai metod i pentru o enzim dat diferit pentru diferite metode. 0antitatea de enzim imobilizat per + de suport este n +eneral mai mic dec.t n caz de incluziune sau adsorbie. Suporturile or+anice au adesea inconvenientul c prezint proprieti mecanice necorespunztoare i sunt sensibile la atacul microor+anismelor. Suporturile minerale nu prezint acest dezavantaj dar capacitatea lor de cuplare este mai redus. ,n prezent te nica de imobilizare prin le+are covalent a enzimelor este una dintre cele mai utilizate i nu prezint dezavantajele te nicilor anterioare.