AISLAMIENTO DE FITOPATGENOS Muchos patgenos pueden identificarse directamente en el tejido enfermo.

Sin embargo, a veces, este no es el caso y debe aislarse el patgeno para obtener cultivos puros que faciliten su identificacin o que puedan usarse para inocular hospederos sanos y comprobar los postulados de Koch. El aislamiento de patgenos tambin se puede hacer para otros fines adems del diagnstico, como para inocular plantas en pruebas de mtodos de combate, pruebas in vitro de fungicidas, estudios epidemiolgicos y muchos otros tipos de investigacin fitopatolgica. La variedad de procedimientos de aislamiento y medios de cultivo es bastante extensa, por lo que a continuacin se exponen los procedimientos ms bsicos.

Aislamiento de Hongos. Un procedimiento tpico de aislamiento de hongos involucra el seleccionar tejidos adecuados, lavarlos, cortar trozos de la zona de avance de la lesin, desinfectarlos superficialmente con hipoclorito de sodio al 0.5% durante 30 a 120 segundos, enjuagarlos con agua estril y colocarlos sobre la superficie de medio slido de papa-dextrosa-agar (PDA), previamente acidificado para reducir el crecimiento de bacterias, y esperar que crezca el hongo (fig.F.1). Hay muchas variaciones de este procedimiento general, de acuerdo con el propsito del aislamiento, el tipo de tejido involucrado y la experiencia del diagnosticador. Variaciones pueden incluir el tipo de desinfectante (por ejemplo usar etanol al 70 % o cloruro de mercurio al 0.1 %), el tiempo de desinfeccin, la eliminacin del desinfectante con papel toalla estril en vez de agua estril, el aislamiento de tejidos internos sin desinfeccin, el uso de antibiticos en lugar de acidificacin para inhibir el crecimiento de bacterias, y otros ajustes que se hacen para acomodar el procedimiento a situaciones particulares. Una vez que el hongo est creciendo, conviene pasarlo a un nuevo medio de cultivo para que crezca en cultivo puro (tambin llamado axnico, esto es, son otros organismos). Una vez que el hongo est creciendo puro, se espera a que produzcan esporas para poder identificarlo. Muchos hongos esporulan fcilmente en los medios de cultivo normales. Algunos que no esporulan fcilmente se pueden inducir por medio de mtodos especiales como la exposicin a la luz blanca corriente o ultravioleta cercano, el cultivo en conjunto con otros hongos, el practicar incisiones en las colonias, o el uso de medios especiales de cultivo. Algunos hongos, los llamados Mycelia Sterilia, no llegan a producir esporas en medio de cultivo, y se reconocen por las caractersticas del micelio. Para aislar hongos del suelo debe eliminarse una gran cantidad de organismos presentes. Para esto se usan medios selectivos, los cuales contienen antibiticos y fungicidas selectivos, o se usan trampas como frutas, hojas, y otras estructuras vegetales que son colonizadas por el hongo de inters y no por los saprfitos. Luego del trampeo se procede al aislamiento tal como se ha descrito.

(img.F.1) Procedimiento tpico de aislamiento de un hongo de un tejido vegetal.

Aislamiento de bacterias. El procedimiento descrito para hongos tambin funciona para aislar bacterias, pero puesto que las saprfitas crecen ms rpido que las fitopatgenas en medios ricos en carbohidratos como el PDA, este mtodo resulta en aislamiento de saprfitas y la posibilidad de no aislar las bacterias de inters. Por eso si se sospecha o se ha comprobado la presencia de bacterias en el tejido, es conveniente tratar de separar desde el principio las saprofitas de las fitopatgenas. Esto se logra mediante la tcnica del rayado. sta consiste en desinfectar el tejido enfermo en forma similar para la descrita en el aislamiento de hongos, macerarlo en agua estril, obtener una gota del macerado y distribuirla sobre la superficie de un medio de cultivo adecuado por medio de pases sucesivos de un asa estril. Se recomienda desinfectar el asa en una llama entre una pasada y otra, y hacer cuatro pases en cuatro direcciones en ngulos rectos. As se asegura la separacin de colonias individuales, las cuales pueden ser separadas y rayadas de nuevo en un medio de cultivo nievo. Otro mtodo consiste en hacer series de diluciones del macerado en agua estril, espaciar unas gotas de cada dilucin en su respectiva placa de Petri, verter sobre ellas el medio de cultivo enfriado a 50 C, mezclar bien y dejar que se solidifique. A los poco das aparecen colonias individuales, las cuales se presenta ms separadas en las placas de Petri en las que se aadieron las suspensiones ms diluidas. El medio ms comnmente usado para aislar bacterias es el agar nutritivo.

http://books.google.es/books?id=I6jDW5Hl9BAC&printsec=frontcover&dq=FITOPATOL OGIA&hl=es&sa=X&ei=STeEUeTaDMiUO6_xgPAG&ved=0CDwQ6AEwAg

En cuanto al aislamiento de bacterias fotopatogenas:

Uno de los requisitos para considerar a una bacteria como el agente inductor de una enfermedad, es el aislarla y purificarla a partir del tejido enfermo. Para llevar a cabo esta etapa existen diferentes metodologas y la eleccin de cualquiera de ellas depender del tipo de sntoma, rgano afectado, grado de avance de la enfermedad y del material y equipo disponible. Entre las tcnicas de aislamiento ms comunes, se encuentran las siguientes:

MACERACIN DEL TEJIDO: en el caso de Manchas, Tizones, Sobrecrecimientos, Roas, Cancros. PUNCIN DIRECTA: Pudriciones, Marchitez. INMERSIN DEL TEJIDO EN AGUA ESTERILIZADA: Manchas, Tizones, Pudriciones, Marchitez,
Sobrecrecimiento, Roas, Cancros.

SIEMBRA DIRECTA DEL TEJIDO ENFERMO:

Manchas foliares: El aislamiento de los patgenos por cualquiera de estas tcnicas puede ser exitosa, siempre y cuando las muestras presenten zonas de avance de la enfermedad y sean frescas, logrndose obtener al o los patgenos en cultivo puro. Sin embargo en algunas ocasiones las muestras tienen un estado muy avanzado o son muy viejas, dificultndose el aislamiento de los patgenos, por la proliferacin de organismos saprfitos. En este caso si no se cuenta con medios selectivos, se puede recurrir primeramente a la reproduccin de sntomas para que una vez que se hayan manifestado, el patgeno se asle de estas muestras, por ejemplo, para aislar a Pseudomonas solanacearum de tubrculos de papa en estado avanzado de descomposicin, se toman unas tijeras de punta fina, se flamean y se introducen en el rengln vascular del tubrculo con movimientos de abrir y cerrar, con estas tijeras se seleccionan las hojas cotiledonarias de plantas de tomate y en unos 5 a 6 das se presentar la marchitez, de donde podr ser aislado al patgeno a partir de los haces vasculares (Nieto, R. 1984).

5.A. AISLAMIENTO DIRECTO (Para muestras con marchitez)

1. Con una navaja flameada y enfriada haga un corte transversal, el tallo que presente flacidez incipiente, de preferencia cerca del nivel del suelo. 2. Haga una ligera presin y espere unos segundos para que salga de las heces vasculares un exudado blanco lechoso. 3. Con el asa previamente flameada y enfriada, tome del exudado y transfiralo a un tubo con agua destilada esterilizada. 4. Agite el tubo para homogeneizar. 5. Con el asa flameada tome una gota de la suspensin y siempre una caja con medio de cultivo por el mtodo estra cruzada. 6. Incube a 28C por 24-48 hrs. 7. De las colonias que se desarrollen despus de las 48 hrs. Y cuya morfologa las transfiere a otra caja con medio de cultivo.

5.B. INMERSION DEL TEJIDO EN AGUA ESTERILIZADA (Para muestras con manchas o tizones)
1. Al microscopio estereoscopico observe los tejidos afectados, para detectar la presencia de exudados o escamas bacterianas, micelio u otras estructuras fungosas. 2. De la zona de avance de la enfermedad haga una preparacin en fresco, y observe el microscopio compuesto. 3. Si en estas preparaciones observa nicamente clulas bacterianas, esto le indica que el sntoma se puede deber a bacterias, por el contrario, si observa micelio, lo mas seguro es que el sntoma sea ocasionado por un hongo. 4. Seleccione un tejido enfermo y lvelo con agua esterilizada 5. Corte pequeos trocitos y desinfctelos con una solucin de hipoclorito de sodio al 1% durante 1 a 2 minutos. 6. Decante el hipoclorito y lave 3 veces con agua esterilizada. 7. Coloque los trocitos en un tubo con agua destilada esterilizada y djelos por 5-10 minutos. 8. Una vez transcurridos los 5 10 minutos, tome una gota de la suspensin con el asa bacteriolgica y con ella siembre por estra cruzada una caja con medio de cultivo. 9. Despus del perodo de incubacin seleccione las colonias bacterianas que se asemejen a las del agente causal, y simbrelas en una nueva caja con medio de cultivo para obtener as, suficiente cultivo puro y continuar con las pruebas de patgenicidad.

5.C. INMERSION DEL TEJIDO EN AGUA ESTERILIZADA (Muestra con sobrecrecimientos)

1. Con un cepillo pequeo y cerdas suaves lave al chorro del agua el tejido afectado (si se trata de fasciacin, estos se harn de la base de las hojas). 2. Coloque los cortes en un tubo con 3ml de agua destilada esterilizada mantngalos as durante unos 10-20 min. 3. Pase 3 asadas de la suspensin anterior a otro tubo con 3ml de agua destilada esterilizada. 4. Siembre 2 cajas con medio de cultivo por estra cruzada. 5. Incube a 22-28C durante 2-4 das. 6. Seleccione las colonias bacterianas con caractersticas del posible patgeno y transfiera a otras cajas con medio de cultivo. NOTA: Cuando el sntoma se sospecha, ser cruzado por Agrobacterium las colonias se hacen visibles a las 36-48 hrs. Si se espera el desarrollo de Rhodococcus las colonias aparecen a los 2 4 das

Identificacion Inicial de Generos Comunes Relativamente, son pocas las caractersticas diferenciales requeridas para identificar a los gneros de bacterias predominantemente fitopatogenas. Convenientemente, estas pueden ser divididas en: 1) aquellas que son fcilmente aisladas sobre un medio estndar bacteriolgico y aquellas las que no lo son. Los gneros del primer grupo son relativamente fciles de diferenciar uno de otro, sobre la base de las caractersticas presentadas en la Tabla 1 y el diagrama de flujo simplificado, presentado en la figura 1. La reaccin Gram est relacionada a las propiedades estructurales y qumicas de la pared celular, esta caracterstica sirve como un paso muy bsico y rpido en la identificacin inicial de bacterias fitopatgenas desconocidas. Esto es importante, la reaccin Gram se usa cuando las clulas estn creciendo rpidamente y recin preparadas La prueba anaerobica es una prueba clave para la identificacin de los gneros Erwinia, Pantoea y Clostridium. Tambin la presencia de esporas es una prueba clave para la diferenciar a las bacterias Gram positivas. La morfologa y pigmentacin de la colonia, creciendo a 40C y la reaccin de oxidasa son pruebas clave para la diferenciacin de Acidovorax, burkholderia, Ralstonia y Pseudomonas. Siempre es seguro incluir cultivos conocidos como controles positivos y negativos para cada una de las pruebas. Cuando la identificacin en una bacteria no es conocida, es absolutamente esencial que se use un cultivo puro del organismo que se va identificar. Podran ser clonadas al menos dos veces por rayado sobre un medio de agar no selectivo. Estando seguro que la colonia seleccionada esta bien aislada, dejar crecer por 4 5 das, para asegurar que otras colonias no aparezcan. Las tcnicas comerciales automatizadas ms rpidas tal como los kits de los anlisis de cidos grasos, biolgico y ELISA son usadas para la identificacin presuntiva de un gran nmero de bacterias aisladas del suelo o de las hojas de las plantas; sin embargo, ellas deben estar respaldadas por la identificacin final. Miembros del segundo grupo (tabla 2) son relativamente nuevos para los fitopatlogos y estn inicialmente identificados sobre la base de: 1. Crecimiento en medio S 2. Crecimiento sobre PW 3. Presencia o ausencia de pared celular 4. Morfologa helicoidal Si el crecimiento ocurre en cualquiera de estos tres medio de cultivo, es aconsejable preparar muestras para el Microscopio electrnico, y el uso de serologa y/o tcnicas basadas en PCR

Tcnicas de aislamiento usando medios semiselectivos diferenciales

Material vegetal. Cuando se asla una bacteria fitopatgena desconocida es una buena prctica el uso de varios medios de cultivo a base de agar diferentes. La mayora de Erwinia, Xanthomonas, Acidovorax, Burkholdera, Ralstonia y Agrobacterium spp. crecen bien y producen colonias caractersticas en medio NBY o en YDC. Sin experiencia, es aconsejable el cultivo en estras, lo que permite comparar las diferentes caractersticas coloniales. Unas pocas especies o pathovares no crecen adecuadamente en YDC. Por ejemplo P. Stewartii, X. oryzae, X. albilineans y X. fragariae crecen pobremente en YDC pero en cambio muy bien sobre NBY. Xylophilus ampelinus crece pobremente sobre YDC o sobre NBY pero mucho mejor en Agar nutritivo. La mayoria de los pseudomonadales y diversas especies de Clavibacter spp. crecen bien y son muy caractersticas del medio de King (KB) (6) y NBY agar, respectivamente. Si hay sospecha de la existencia de Bacillus o Clostridium, debera emplearse el medio Agar casena ms glucosa. Uno de los platos debe ser incubado en una cmara anaerobia. Si se sospecha de la existencia de Streptomyces, incluir agua agar. Para el aislamiento, hay que remover una pequea cantidad de tejido de una porcin donde la lesin haya avanzado utilizando un bistur estril. El tejido debe ser lavado con agua estril o esterilizado en superficie por medio de una dilucin de 1 a 10 de clarasol domstico durante 3 minutos. Despus de enjuagar en agua estril, el tejido debe de ser triturado con un bistur estril en una con una gota de agua en una caja de Petri desechable. Si el tejido es difcil de cortar, se puede usar n mortero estril. Despus de reposar por dos o tres minutos, el macerado es sembrado en estras con un asa bacteriolgica. Si se sospecha que una especie en particular puede ser el agente causal, se deben seguir las tcnicas de aislamiento sugeridas para el organismo en particular, las estras deben de ser hechas en cuatro direcciones en ngulos rectos. Flameando el asa despus de cada una de las cuatro direcciones de las estras. Una colonia individual (bien especiada de las dems), deber ser resembrada en estras en uno de los medios para estar seguro que la poblacin bacteriana es pura. Si no hay colonias resultantes de sta siembra en estras en medios de cultivo comunes, se debe de determinar si el agente causal es un organismo anaerbico (Clostridium spp.), un organismo fastidioso (tal como Xylella fastidiosa o Rhizomonas), o a una bacteria no cultivable por tener crecimiento especfico en el floema tal como el reverdecimiento de los ctricos (Liberobacter). Por ltimo, los organismos pueden ser identificados mediante el uso de tcnicas de PCR