Modificarea i validarea unei metode HPLC pentru dozarea piroxicamului

[M.F. Abdulkarim et al., nternational !ournal of "ru# "eliver$ % &'())* +), +-.

REZUMAT
Piroxicamul e/te un antiinflamator ne/teroidian lar# folo/it 0n tratamentul durerilor articulare i o/teoartritei. 1biectivele prezentului /tudiu au con/tat 0n modificarea i validarea unei metode HPLC pentru a ob2ine o metod3 exact3, /en/ibil3 i preci/3 care /3 permit3 analizarea cantitativ3 a piroxicamului dintr,o formulare farmaceutic3 topic3, f3r3 interferen23 din partea excipien2ilor. Metoda de/cri/3 e/te o adaptare a metodei publicate de 14en et al., a/tfel 0nc5t cerin2ele de mai /u/ /3 poat3 fi 0ndeplinite. Modificarea a vizat compozi2ia fazei mobile, 0ntruc5t faza mobil3 de/cri/3 de autori nu permitea o /eparare a picului core/punz3tor /ub/tan2ei active de picurile excipien2ilor. Faza mobil3 modificat3 con/t3 0ntr,un ame/tec de /olu2ie fo/fat di/odic +mM &pH6%, a7u/tat cu acid ortofo/foric*, metanol, acetonitril i acid acetic #lacial, 0n raport '89'(9+'9). Metoda a fo/t validat3 i /,a demon/trat a prezenta /pecificitate, precizie, acurate2e i reproductibilitate c:iar i atunci c5nd a fo/t condu/3 0n momente diferente din cadrul aceleai zile /au 0n zile diferite. Limitele de detec2ie i de cuantificare au fo/t calculate a fi de (,(%+ ;#<ml, re/pectiv (,(='+ ;#<ml. >n concluzie, acea/t3 metod3 poate fi folo/it3 pentru determinarea concentra2iei de piroxicam din probele colectate 0n urma /tudiilor de permeabilitate in vitro, folo/ind o membran3 /intetic3 /au piele excizat3 de obolan.

INTRODUCERE
Piroxicamul e/te un antiinflamator ne/teroidian lar# folo/it 0n tratamentul durerilor articulare i o/teoartritei. Au fo/t de/cri/e numeroa/e metode HPLC pentru dozarea piroxicamului din pla/m3. Pentru detectarea in vitro a piroxicamului tran/ferat printr,o membran3 celulozic3 /au piele, folo/ind o celul3 Franz de difuzie, /e impune utilizarea unei metode cu 0nalt3 /en/ibilitate, 0ntruc5t cantitatea de piroxicam difuzat3 0n celula,receptor e/te mic3. Metoda publicat3 de 14en et al. &)?@8* a fo/t adaptat3 i modificat3 a/tfel 0nc5t /3 0ndeplinea/c3 cerin2ele enumerate mai /u/. Modificarea a vizat compozi2ia fazei mobile, 0ntruc5t faza mobil3 de/cri/3 de autori nu permitea o /eparare a picului core/punz3tor /ub/tan2ei active de picurile excipien2ilor. Aceti excipien2i reprezint3 con/tituen2i ai nano, cremei9 e/teri ai acidului palmitic, A4een @(, Bpan '( i tampon,fo/fat

reprezent5nd faza extern3. "e a/emenea, interferen2a /e poate datora con/tituen2ilor pielii ceda2i 0n mediul receptor 0n timpul proce/ului de difuzie. 1biectivele prezentului /tudiu au con/tat 0n modificarea i validarea unei metode HPLC pentru a ob2ine o metod3 exact3, /en/ibil3 i preci/3 care /3 permit3 analizarea cantitativ3 a piroxicamului dintr,o formulare farmaceutic3 topic3, f3r3 interferen2a excipien2ilor i a con/tituen2ilor pielii ceda2i 0n mediul de difuzie.

MATERIALE I METODE
Materiale:
Fo/tatul di/odic a fo/t furnizat de CDM C:emical/ &EF*. Acidul ortofo/foric i acidul acetic #lacial au fo/t furnizate de G"H &EF*. Metanolul i acetonitrilul &puritate HPLC* au fo/t ac:izi2ionate de la !.A. Gaker &BEA*. Membranele filtrante din n$lon &diametrul porilor de (,-+ ;m* au fo/t ac:izi2ionate de la H:atman nternational &EF*.

Metode:
Aparatur Bi/temul HPLC B:imadzu &BCL,)(A* e/te compu/ dintr,o pomp3 izocratic3 &B:imadzu LC,)(,AAIP*, auto,/ampler &B:imadzu, B L,)(A"* i un detector EI,I B, model BP",)(AI. Proce/ul de cromato#rafie 0n faz3 inver/3 a fo/t condu/ utiliz5nd o coloan3 analitic3 de o2el inoxidabil &)+( mm x ',( mm*, 0n interiorul c3reia /e #3/ete faza /ta2ionar3 C)@ cu dimen/iunea particulelor de + ;m, prote7at3 cu un /i/tem cartu Becurit$Juard AM &P:enomenex* i un filtru 0n linie de (,-+ ;m. Condiiile cromato ra!ice Faza mobil3 modificat3 con/t3 0ntr,un ame/tec de /olu2ie fo/fat di/odic +mM &pH6%, a7u/tat cu acid ortofo/foric*, metanol, acetonitril i acid acetic #lacial, 0n raport '89'(9+'9). >naintea folo/irii, faza mobil3 a fo/t filtrat3 printr,o membran3 filtrant3 de n$lon cu diametrul porilor de (,-+ ;m i de#azat3. Faza mobil3 folo/it3 de 14en et al. &)?@8* a con/tat 0ntr,un ame/tec de (,(%K acid fo/foric &pH6',+*9acetonitril 0n raport ++9-+. Probele au fo/t pla/ate 0n auto,/ampler. Probe a c5te '( ;l au fo/t in7ectate 0n coloana cromato#rafic3, la un debit de ) ml<min, la temperatura camerei, iar detec2ia /,a f3cut cu a7utorul unui detector EI, I B, la lun#imea de und3 de %+( nm. "repararea #oluiilor #toc $i #tandard Bolu2ia /toc de piroxicam ) m#<ml a fo/t preparat3 prin dizolvarea cantit32ii core/punz3toare de piroxicam 0n acetonitril i depozitare la - oC.

Bolu2ia /toc a/tfel preparat3 a fo/t ulterior diluat3 cu acetonitril pentru a ob2ine /olu2ia /tandard de piroxicam '+ ;#<ml. "repararea #oluiilor #tandard pentru cur%a de cali%rare Bolu2ia /tandard de piroxicam a fo/t diluat3 cu faz3 mobil3 pentru a ob2ine concentra2ii de (,(='+, (,)'+, (,'+, (,+, ) i ' ;#<ml.

&alidarea metodei
Linearitate Linearitatea curbei de calibrare pentru intervalul de concentra2ii 0n piroxicam de (,(='+,' ;#<ml a fo/t evaluat3 utiliz5nd probe proa/p3t preparate de /olu2ii /tandard pentru curba de calibrare. A fo/t analizat3 liniaritatea pe un numar de = curbe de calibrare, fiecare curb3 de calibrare fiind alc3tuit3 pornind de la cele = concentra2ii prezentate 0n para#raful anterior. Probele au fo/t cuantificate prin m3/urarea 0n3l2imii picului core/punz3tor piroxicamului. Curba de calibrare a fo/t reprezentat3 #rafic ca 0n3l2imea picului pentru piroxicam din cromato#ramele HPLC ver/u/ concentra2ia /olu2iei /tandard pentru curba de calibrare. "rept criteriu de acceptare a fo/t ale/ o valoare a coeficientului de corela2ie limit3 mai mare de (,???. 'peci!icitate Au fo/t analizate prin aceeai metod3 probe placebo pornind de la formularea L)=, care con2in toate componentele, cu excep2ia piroxicamului, i probe L)=, care con2in inclu/iv piroxicam. Cantit32i c5nt3rite din fiecare prob3 au fo/t dizolvate 0n faza mobil3 i apoi diluate cu acea/ta. Aoate probele au fo/t analizate pentru a determina prezen2a /au ab/en2a interferen2elor din partea altor componente ale formul3rii a/upra timpului de reten2ie al piroxicamului. "reci(ie $i acuratee Precizia i acurate2ea metodei au fo/t evaluate pe baza rezultatelor determin3rilor efectuate 0n aceeai zi i 0n zile diferite. Pentru determin3rile condu/e 0n zile diferite, au fo/t te/tate = /eturi de probe cu = concentra2ii diferite 0n = zile diferite. Pentru determin3rile efectuate 0n aceeai zi, au fo/t te/tate = /eturi de probe cu = concentra2ii diferite. Precizia calculat3 nu trebuie /3 fie mai mare de M)+K pentru concentra2ii din intervalul de calibrare i mai mult de M'(K pentru cea mai mic3 valoare a concentra2iei din curba de calibrare &EBF"A9 Juidance for indu/tr$, bioanal$tical met:od validation , '(()*. >n mod /imilar, varia2ia acurate2ei nu trebuie /3 fie mai mare de M)+K pentru concentra2ii din intervalul de calibrare i mai mult de M'(K pentru cea mai mic3 valoare a concentra2iei din curba de calibrare.

Precizia a fo/t calculat3 pe baza ecua2iei9 "evia2ie /tandard<medie x )((. Acurate2ea a fo/t determinat3 pe baza ecua2iei9 Concentra2ie determinat3<Concentra2ie real3 x )(( Limit de detecie $i limit de cuanti!icare L1" e/te definit3 ca fiind concentra2ia mimin3 la care care m3/urarea picului HPLC pentru un anume analit e/te de % ori nivelul z#omotului de fond &raportul /emnal9z#omot e/te de %9)*. L1N e/te concentra2ia la care 0n3l2imea picului analitului e/te de cel pu2in + ori mai mare ca nivelul z#omotului de fond.

REZULTATE I DI'CU)II
Linearitate Curba de calibrare a prezentat linearitate excelent3 pentru intervalul de concentra2ii =',+,'((( n#<ml. Lcua2ia dreptei de re#re/ie, calculat3 ca medie a celor = curbe de calibrare determinate, e/te $ 6 '(%),)x O ),-@+, cu un coeficient de corela2ie de (,???@. 'peci!icitate Cromato#rama HPLC a eviden2iat ab/en2a oric3rei interferen2e din partea excipien2ilor prezen2i 0n formulare care /3 modifice timpul de reten2ie de -,8 minute core/punz3tor piroxicamului. "reci(ie $i acuratee "atele ob2inute &Aabelul ).)* /u#ereaz3 pentru determin3rile condu/e 0n aceeai zi o acurate2e 0ntre @+,(=,)(),?-K, cu o precizie 0ntre ),8(,=,)+K. Bimilar, pentru experimentele de/f3urate 0n zile diferite &Aabelul ).'*, acurate2ea /e afl3 0ntre @=,+(,)(8,8=K, cu o precizie de (,-),+,@@K. Pentru toate valorile concentra2iei din curba de calibrare, varia2ia acurate2ei i precizia au fo/t /ub pra#ul de )+K. Cezultatele /u#ereaz3 c3 metoda e/te reproductibil3 i preci/3 pentru intervalul de concentra2ii luat de calcul. Aabel ).)
Concentraie real *+ ,ml(,(='+ (,)'+( (,'+(( (,+((( ),(((( ',(((( Concentraie determinat *+ ,ml-: medieMB" &P6=* (,(8)@M(,(()' (,)%'=M (,((@' (,'-8+M(,()%(,-?(%M(,((@= (,?@=+M(,('8' ',((@8M(,(+8= Acurat ee *.@+,(= ?%,?) )((,?? )(),?)(),%+ ??,+8 "reci (ie *.),8( =,)+ +,-% ),8+ ',8+ ',@8

Aabel ).'
Concentraie real *+ ,ml(,(='+ (,)'+( (,'+(( (,+((( ),(((( ',(((( Concentraie determinat *+ ,ml-: medieMB" &P6=* (,(8(?M(,((') (,)%?(M(,((@' (,'%(=M(,(('= (,-@8@M (,(('( (,??++M(,('@' ',((=8M(,()%' Acurat ee *.@=,+) @@,8@ )(8,8= )(',-% )((,-+ ??,=8 "reci (ie *.',?% +,@@ ),)) (,-) ',@(,==

Limit de detecie $i limit de cuanti!icare Pe baza 0n3l2imii picului calculat3 la de % ori nivelul z#omotului de fond, L1" a fo/t determinat3 ca fiind (,(%+ ;#<ml, iar la 0n3l2imea picului de + ori fa23 de nivelul z#omotului de fond, L1N a fo/t calculat3 ca fiind (,(='+ ;#<ml.