Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
sinteza ADN-ului
Ce este replicarea
Replicarea ADN, un proces fundamental care are loc n celulele organismelor vii, este baza ereditii biologice. Realizeaz copierea, mai precis duplicarea, moleculelor de ADN, purttorul informaiei genetice. Este un proces semiconservativ, n care molecula ADN iniial este despicat n lung, ca un fermoar, n cele dou iraguri complementare care o compun. Fiecare din acestea devine un model pentru sinteza unui nou irag complementar, integrnd, dup regula complementaritii bazelor, nucleotidele dispersate n nucleul celulei. Rezult dou molecule ADN identice.
Replicarea este un proces foarte complex care trebuie s asigure integritatea i fidelitatea informaiei genetice, iar helixurile nou formate sa fie copii exacte ale helixului iniial
Astfel ca urmare a replicrii rezult 2 molecule identice, fiecare posednd o caten veche i una nou.
Cele 2 catene ale ADN despiralizate apoi se desfac pe o poriune limitat, servind fiecare ca matri pentru aranjarea nucleotidelor activate, pe baz de complemtaritate (A-T; GC). Apoi intervine ADN polimeraza, care polimerizeaz nucleotidele n direcia 5'-3'.
Anume la acest nivel de bifurcaie au loc procesele mecanismului de replicare semiconservativ, care se realizeaz cu ajutorul unui complex aparat enzimatic n trei etape.
Replicarea I etap
dna A
HU
Punctele de replicare Ori C sunt recunoscute de ctre proteine speciale dnaA ajutate de proteine HU. Secvenele recunoscute au o frecven mai mare de baze azotate A-T . Proteina dnaA denatureaz ADN pe o poriune de 13 nucleotide, i pe aceast poriune se leag proteina-enzim dnaB sau helicaza, care desface cele 2 catene-materne ale ADN (catene matri). Helicaza este ajutat de proteina dnaC. dna C
helicaza
Furca de replicare
Helicaza ADN-ului
Helicaza implicat n procesul de replicare a ADN-ului este un hexamer, ce utilizeaz pentru lucrul ei energia ATP-ului.(consum 2 molecule de ATP pentru 2 legturi de H desfcute).
Single stranded proteins (SSBs) Tetramer Se leag de cele dou catene ADN i le menine separate prevenind renaturarea lor. Prezint o cavitate de 15 ncrcat pozitiv Trebuie s fie ndepartate nainte ca noua caten de ADN s poat fi sintetizat.
Replicarea I etap
Originea replicrii Catena matern Catena fiic
Replicon
Furca de replicare
n ADN eucariotelor, replicarea ADN-ului ncepe n mai multe puncte de origine, de-a lungul catenei gigante de ADN a fiecrui cromozom
n figur sunt vzui 3 repliconi (regiuni de replicare) n catena de ADN. Sgeile arat direcie replicrii ctre cele 2 terminaii-capete a repliconului.
Replicarea ADN n diferite locuri de iniiere este declanat n diferite intervale de timp din faza S a ciclului celular. Replicarea ADN n celulele umane dureaz 8 ore. Lungimea medie a unei macromolecule de ADN dintr-un cromozom uman este de 30000 m. Dac replicarea ar ncepe la un capt i s-ar desfura pn la cellalt capt al moleculei, ar fi necesar circa 500 de ore pentru replicarea unei molecule de ADN. Deoarece replicarea dureaz 6-8 ore, reiese c este iniiat simultan n mai multe puncte de origine a replicrii.
3 4
Replicarea I etap
ADN topoizomerazele previn nclcirea firului de ADN pe parcursul replicrii, provocnd o relaxare a catenei dublu spiralate. Odat cu deplasarea furcii replicative pe catena dubl de ADN, se creeaz aa numita problema rsucirii. Fiecare 10 perechi de baze azotate replicate n furca de replicare corespund unei spire a dublului helix. Astfel, pentru ca furca de replicare s se deplaseze n continuu pe molecula de ADN, este necesar ca ntregul cromozom ce asist furca de replicare, trebuie s se roteasc rapid. Aceast necesit cantiti mari de energie pentru ntreg cromosomul, aplicndu-se o aumit de strategie n acest caz. Se formeaz o rotire n helixul de ADN de ctre proteinele topoizomeraze.
Topoisomerazele enzime care rezolv tensiunile sterice (torsiuni +, de dreapta) aprute n cursul dezrsucirii (cu o vitez de 100 revoluii/sec !!!) duplexului ADN, i care ar putea bloca replicarea
n formarea furcii replicative particip i ADN topoizomerazele (I, II, III), care posed activitate nucleazic, i particip n reglarea superspiralizrii ADN. De exemplu ADN topoizomeraza I rupe legtura fosfodiesteric n una din catenele spiralei duble i covalent se leag de captul 5' n punctul de rupere. Dup ce s-a format furca replicativ enzima lichideaz ruperile i se despinde de ADN.
Participarea ADN topizomerazei n formarea furcii replicative. 1- ADN topoizomeraza scindeaz una din catenele de ADN; ntre restul de Tyr a moleculei enzimei i restul de fosfat se formeaz o legtur covalent. 2 - are loc o dersucire local a spiralei duble de ADN cu ajutorul helicazei; ADNtopizomera I restabilete legtura fosfodiesteric proprie moleculei de ADN.
TOPOIZOMERAZE
Clase de topoizomeraze: topoizomeraza I : Clase de topoizomeraze: topoizomeraza I acioneaz ca o endonucleaz reversibil, printr-un mecanism de tiere-coasere care permite rotaia liber a ADNmc (aciune de suveic) . economic (nu necesit aport energetic): hidrolizeaz o legtur fosfat diesteric a crei energie o conserv ntr-o legtur fosfat esteric implicnd Tyr din centrul activ al enzimei i ulterior o folosete la refacerea catenei incizate tiere relaxare coasere Clase de topoizomeraze: topoizomeraza II : Clase de topoizomeraze: topoizomeraza II ADN-giraza Dimer Introduce n molecula de ADN supertorsiuni (-), spre stnga, n sens contrar celor create de naintarea bifurcaiei de replicare; astfel compeseaz n avans constrngerile impuse de desrsucirea duplexului de ADN Necesit energie (consum de ATP) Acidul nalidixic, Norfloxacinul (Ab cu toxicitate redus, care nu dezvolt rezisten plasmidic transferabil)- inhib activitatea ADN-girazei
Replicarea II etap
Iniierea formrii i alungirea catenelor noi de ADN
Molecula de ADN dublu spiralat este format din dou catene antiparalele cu direcii opuse 3' 5 i respectiv 5'3. Deci, furca de replicare este asimetric. Astfel una dintre catenele noi ale ADN este sintetizat pe o caten-matri cu direcia 3' 5, iar cealalt pe caten-matri cu direcia 5'3. Catena nou (catena fiic ) crete sau se formeaz numai n direcia 5'3.
Formarea noii catene de ADN ncepe de la un segment mic de ARN numit ARN-primer, care are guparea 3-OH liber, care ulterior este alungit cu nucleotide de ctre enzimele polimeraze. Formarea primer-ului este catalizat de enzima primaza. Odat ce catenele parentale au fost separate, primaza alipete ARN-primerul la catena matri.
ARN primer este format din 4-12 ribonucleotide. Noua caten de ADN se constuiete prin adugarea de nucelotide la captul 3 al ARN primer. - ARN primer e nlocuit n final cu ADN.
Primaza, mpreun cu helicaza, proteinele dnaC i alte proteine formeaz un complex primozomul, care se deplaseaz simultan cu furca de replicare (consumnd energia ATP-ului)
Replicarea II etap
Alungirea catenelor noi formate are loc cu ajutorul enzimelor ADN- polimeraza. ADN- polimeraza poate cataliza creterea catenei noi numai n direcia 5'3.
Pe catena-matri cu sensul 3'-5' sinteza catenei noi are loc continuu, i caten nou se numete caten directoare sau prioritar (leading), mrindu-se n direcia de micare a bifurcaiei. A doua caten-nou se formeaz discontinuu, adic se formeaz segmente scurte ce conin 1000-2000 de nucleotide numite fragmente (segmente) Okazaki (mai nti segmentul, apoi B i C, etc). Aceste segmente ulterior sunt unite prin aciunea unei ADN-ligaze. Aceast caten cu sintez ncetinit se numete caten succesoare sau ntrziat i se desfoar n direcie opus bifurcaiei de replicare.
Replicarea II etap
Replicarea II etap
ADN polimerazele
ADN polimeraza III
1000 baze/secund! Principalul constructor al ADN
Roger Kornberg 2006
ADN polimeraza I
20 baze/secund formeaz, repar & nltur primer-ul
ADN poliemraza III
Arthur Kornberg 1959
Replication fork
DNA polymerase III
DNA polymerase I
lagging strand
primase
5 3
ligase
Okazaki fragments
3 5
SSB
3
DNA polymerase III
helicase
5 3
leading strand
direction of replication
SSB = single-stranded binding proteins
Regiunea de terminare : - situat la 180 grade fa de OriC; conine capcane pentru bifurcaia de replicare la acest nivel bifurcaiile de replicare se ntlnesc i dezleag catenele de ADN nc asociate
Situsurile de terminare sunt pori care permit trecerea bifurcaiei de replicare ntr-un singur sens; - conin 23 perechi de baze TerD TerC TerB TerA Situsurile Ter foreaz cele dou bifurcaii de replicare s se ntlneasc ntr-un punct specific.
Dup finisarea replicrii captul 5 al catenelor noi formate este incomplet, din cauza primer-ului, care a fost nlturat, iar locurile unde a fost primerul rmn neconstruite (necompletate). Aceasta are loc din cauza c polimeraza responsabil pentru completarea golurilor, formate dup eliminarea primer-ului, nu poate efectua sinteza catenei de ADN n direcia 35. Astfel, la fiecare replicare captul 5 al catenei noi sintetizate se scurteaz. Dar aceste pierderi de fragmente de ADN nu prezint pericol pentru pstrarea informaiei genetice, deoarece aceste scurtri au loc din contul telomerilor. Telomerii reprezint o succesiune specific de nucleotide, reprezentat de repetri de olinonucleotide (100-1000) GGGTTA, care se mai numesc succesiune telomeric. Prezena telomerilor este necesar pentru finisarea replicrii succesiunilor informative ale capetelor ADN din cromozomi. Pe parcursul replicrilor urmtoare capetele 5 ale catenei ADN rmn nereplicate (neconstruite). Astfel cu fiecare dividere celular, ADN cromozmilor se va scurta. Scurtarea telomerior n majoritatea celulelor pe msura mbtrnirii lor este un factor ce determin longevitatea organismului. n celulele eucariotelor este o enzim telomeraza (nucleo-tidiltransferaza), care asigur restabilirea capetelor 5 - nereplicate. Drept centru activ (grupare prostetic) al acestei enzim este un fragment de ARN, care servete ca matri la sinteza repetrilor telomerice ale cromozomilor. Cu ajutorul ARN ului dat enzima complementar se alipete de captul 3 al catenei noi incomplete de ADN. Telomeraza dup principiul complementaritii succesiv alungete captul 3 al catenei de ADN cu o hexanucleotid GGGTTA. Apoi telomeraza se deplaseaz pe catena de ADN pe o distan egal cu lungimea telomerului i ncepe sinteza unui nou fragment GGGTTA. n majoritatea celulelor somatice telomeraza este inactiv, deoarece celula somatic are o lungime a ADN telomeric suficient pentru durata vieii celulei i a urmailor ei. Dar o activitate moderat a telomerazei a fost depistat n celulele cu o capacitate mare de regenerare, cum ar fi limfocitele, celulele-stem din mduva spinrii, celulele epiteliului, epidermei, pielii.
Telomerazele Sinteza lanului ntrziat a ADN, nu se poate face dac ADN polimeraza atinge extremitatea 3 a catenei matrice. Dac n-ar avea mecanisme particulare, la fiecare replicare ADN cromozomial ar fi scurtat.