Boli Albine

Antonia ODAGIU
Ioan Gh. OROIAN
Consideraii ecopatologice la insecte, abordare molecular
Volumul 1. Apis mellifera L.
Editura BIOFLUX, CLUJ NAPOCA, 2010 eISBN: 978-606-8191-07-2
Antonia ODAGIU, Ioan Gh. OROIAN Caracteristici ecopatologice la insecte, abordare molecular. Volumul 1. Apis mellifera L. Cuprins
CUPRINS
pag. Lista figurilor ........................................................................................ Lista tabelelor ........................................................................................ Introducere ............................................................................................ 5 8 9
CAPITOLUL I. BOLILE I PARAZIII ALBINELOR ..................................... 1.1. BOLILE ALBINELOR ............................................... 1.1.1. Boli provocate de virui .................................. 1.1.2. Boli provocate de bacterii ............................... 1.1.3. Boli provocate de protozoare .......................... 1.1.4. Boli provocate de ciuperci i mucegaiuri ....... 1.2. PARAZIII ALBINELOR .......................................... 1.2.1. Acarapis woodi ............................................... 1.2.2. Varroa sp. ........................................................ 1.2.3. Tropilaelaps clareae ........................................ 17 18 18 28 32 36 39 41 42 51
CAPITOLUL II BAZELE GENETICE ALE REZISTENEI ALBINELOR LA BOLI I PARAZII ..................................... 2.1. 2.2. 2.3. MECANISME FIZIOLOGICE .................................... MECANISME COMPORTAMENTALE ................... EVIDENIEREA COMPORTAMENTULUI IGIENIC LA APIS MELLIFERA L. N STUPINE DIN TRANSILVANIA ................................................ 2.3.1. Metode ............................................................. 2.3.2. Rezultate .......................................................... 2.4. MECANISME ANATOMICE .................................... 69 69 71 79 53 55 57
CAPITOLUL III MARKERI MOLECULARI ASOCIAI CU REZISTENA LA PARAZII I BOLI LA ALBINE ...................................... 3.1. MARKERI PROTEICI ................................................ 3.1.1. Izozimele ......................................................... 3.1.2. Alozimele ........................................................ 3.2. MARKERI ADN ......................................................... 3.2.1. Polimorfismele lungimii fragmentelor de restricie (RFLP) ........................................ 3.2.2. Polimorfismele lungimii secvenelor simple (SSLPs) ................................................ 3.3.3. Polimorfismul lungimii fragmentelor de ADN amplificate (AFLP) ................................ 110 98 95 82 91 92 92 94
3.3.4. Polimorfismul ADN-ului amplificat la ntmplare (RAPD) ..................................... 3.2. UTILITATEA IMPLEMENTRII MARKERILOR LA MOLECULARI N STUDIUL REZISTENEI BOLI I PARAZII LA APIS MELLIFERA L. ......... 3.3. GENE UTILIZATE N STUDIUL COMPORTAMENTELOR COMPLEXE LA ALBINE ................................................................ 123 118 112
CAPITOLUL IV TEHNICI DE BIOLOGIE MOLECULAR UTILIZATE N ANALIZA GENETIC LA ALBINE .................................. 4.1. TESTAREA PROTOCOALELOR DE IZOLARE A ADN-ULUI DE LA ALBINA MELIFER (APIS MELLIFERA L.) ................................................ 4.1.1. Protocolul propus de Hunt i col. .................... 4.1.2. Protocolul propus de Wilkes i Oldroyd ......... 4.2. TEHNICA REACIEI N LAN A POLIMERAZEI PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) .......... 4.3. 4.4. VIZUALIZAREA PROBELOR .................................. APLICAII ALE PCR ................................................. 4.4.1. Tehnica SAGE ................................................ 4.4.2. Tehnica RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism Polimorfismul fragmentelor de restricie) ................................................... 162 146 153 156 156 134 139 142 129
4.4.3. Tehnica RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA Polimorfismului ADN-ului Amplificat la Intmplare) .............. 4.4.4. Tehnica AFLP (Amplified Length Polymorphism Polimorfismul amplificat al lungimi fragmentelor de ADN) ................... 4.4.5. Tehica RT PCR (Reverse Transcriptase PCR - Revers Transcripia PCR) ............... Bibliografie ........................................................................................... 182 188 171 165
LISTA FIGURILOR
Figura 1. Relaia dintre factorii de mediu i patologia necontagioas la albine Figura 2. Indivizii coloniei de albine, a - matc, b - albin lucrtoare, c trntor Figura 3. Albin lucrtoare Figura 4. Matc nconjurat de albine lucrtoare Figura 5. Ciclul de via al parazitului Varroa sp. Figura 6. Transmiterea comportamentului igienic la Apis mellifera L. Figura 7. Structura defensinei la Apis mellifera L. (AA) cu evidenierea reziduurilor de cistein cu grad nalt de conservare Figura 8. Structura apidecinelor i abaecinei la Apis mellifera L. (AA) cu evidenierea reziduurilor cu grad nalt de conservare Figura 9. Modul de aciune intracelular a polipeptidelor antimicrobiene Figura 10. Localizarea zonelor de prelevare a probelor i testare a strii de sntate a albinelor Figura 11. Experiena cresctorilor de albine prezentat comparativ pe judeele studiate (% din total apicultori chestionai) Figura 12. Tipul de apicultur practicat, prezentat comparativ pe judeele studiate (% din total apicultori chestionai)
5
Figura 13. Numrul de intervenii practicate, prezentat comparativ pe judeele studiate (% din total apicultori chestionai) Figura 14. Tratamentele practicate mpotriva Varroa, prezentate comparativ pe judeele studiate (% din total apicultori chestionai) Figura 15. Celule descpcite,judeul Alba Figura 16. Celule descpcite,judeul Bistria Nsud Figura 17. Celule descpcite, judeul Cluj Figura 18. Celule descpcite, judeul Covasna Figura 19. Celule descpcite, judeul Harghita Figura 20. Celule descpcite,judeul Hunedoara Figura 21. Celule descpcite, judeul Mure Figura 22. Celule descpcite,judeul Satu-Mare Figura 23. Celule descpcite, judeul Slaj Figura 24. Celule descpcite, judeul Sibiu Figura 25. Distribuia valorilor medii ale procentului de celule descpcite Figura 26. Clasificarea markerilor moleculari utilizai n studiile de biologie molecular aplicate la insecte Figura 27. Exemplu de STS (Sequence-tagged Site) polimorfic Figura 28. Transmiterea la descendeni a STS Figura 29. Gelul de electroforez al produilor PCR ai STS polimorfici Figura 30. Harta genomului circular la Apis mellifera L. Figura 31. Plasarea probei n vederea cuantificrii Figura 32. Poziionarea probei pe parcursul cuantificrii Figura 33. ndeprtarea probei dup cuantificare Figura 34. Schema de principiu a funcionrii unui spectrofotometru n domeniul UV VIS Figura 35. Cantitatea de ADN (ng/l) extras din probele analizate Figura 36. Puritatea ADN-ului extras din probele analizate
6
Figura 37. Cantitatea de ADN (ng/l) extras din probele analizate Figura 38. Puritatea ADN-ului extras din probele analizate Figura 39. Fragment de ADN din care se va amplifica gena B Figura 40. Etapele PCR Fig. 41. Sinteza produilor scuri ai PCR Figura 42. Principiul tehnicii SAGE (www.ergito.com) Figura 43. Etapele SAGE (www.ergito.com) Figura 44. Diagrama schematic a RAPD Figura 45. Gelul obinut n urma amplificrii ADN-ului polimorfic generat de primerul UBC-239 Figura 46.Harta de linkage la Apis mellifera L. alctuit pe baza markerilor RAPD Figura 47. Reprezentarea schematic a principiului AFLP Figura 48. Principul RT PCR
LISTA TABELELOR
Tabelul 1. Valorile medii i indicii dispersiei pentru procentul de celule descpcite n cadrul experimentului de testare a comportamentului igienic la albinele din stupinele studiate n judeele din Transilvania
Tabelul 2. Kit-uri comerciale disponibile pentru utilizare n tehnicile moleculare folosite la Apis mellifera L. (dup L o x d a l e i col., 1998)
Antonia ODAGIU, Ioan Gh. OROIAN Caracteristici ecopatologice la insecte, abordare molecular. Volumul 1. Apis mellifera L. Introducere
INTRODUCERE
La fel ca orice organism viu, insectele sunt vulnerabile la aciunea agenilor patogeni, bacterii, fungi, virusuri, parazii etc. Pentru insectele cu rol benefic n economia mediului a existat o preocupare continu de-a lungul timpului n gsirea soluiilor menite att s reduc riscul la mbolnviri, dar i s creasc sau intensifice rezistena natural a unor specii sau populaii din rndul acestora la atacul patogenilor. Pentru soluionarea acestei problematici complexe, n ultimele decenii, au ctigat tot mai mult teren abordrile sistemice, care mbin concepte ecopatologice cu cele de ordin genetic i de domeniul biologiei moleculare (http://www.lifescience-zurich.ch/focus1/material_method-en.asp).
Datorit att unor considerente de ordin etologic ct i productiv Apis mellifera L. este poate cea mai important reprezentant a clasei insectelor. Din acest motiv, prevenirea i combaterea bolilor albinelor constituie una dintre preocuprile majore ale apicultorilor pe plan mondial. Att mierea ct i produsele apicole secundare (polen, lptior de matc, propolis, cear) sunt bogate n factori nutritivi i au aciune terapeutic valoroas.
9
De asemenea, albinele sunt un important vector n procesul de polenizare al plantelor i ca urmare a progresului nregistrat de biotehnologii s-au obinut rezultate notabile chiar n transformarea lor n virtuali ageni de vehiculare al transgenelor provenite de la plantele modificate genetic (D e z m i r e a n , D. i col., 2007; R a k o s y - T i c a n , E l e n a , 2005)
n ceea ce privete ecopatologia, aceasta a devenit de mai bine de cinci decenii un concept familiar n soluionarea pe baze tiinifice a problemelor ridicate de patologiile multifactoriale frecvente n practicarea agriculturii intensive. Aceast abordare implic o pregtire atent a stragiilor menite s asigure un management eficient al strii de sntate a ntregului ecosistem, gestionat prin intermediul unui grup de lucru competent alctuit, ce include specialiti din diverse domenii (ex. ingineri, agricultori, medici veterinari, statisticieni etc.).
Prin interpretri statistice multidimensionale ale datelor colectate sunt gsite soluii optime ce includ att identificarea ct i prevederea potenialilor factorilor de risc, care, luai n considerare n programele de sntate aplicate fermelor vegetale i animale contribuie la soluii preventive i non-medicale n msur s rezolve principalele probleme legate de starea de sntate n agricultur (F a y e B . i col., 1999).
Introducerea acestei abordri alturi de diagnoza bazat pe metode moleculare n sistemele de cretere a albinelor se constituie ntr-o valoroas oportunitate menit s deschid calea pentru crearea de instrumente importante i mult mai eficiente comparativ cu cele tradiionale, pentru suportul decizional conceput pentru asigurarea strii de sntate a stupului, simultan cu reducerea la minimum a demersurilor invazive a acinilor curative.
10
Pe baza acestor considerente, a crescut disponibilitatea ipotezelor care pot permite aprofundarea cunotinelor despre maladiilor specifice familiilor de albine.
Bolile albinelor pot fi de natur necontagioas sau contagioas. Cele de natur necontagioas au cauze fiziologice, pe cnd cele contagioase sunt provocate de diversitate larg de ageni patogeni de natur bacterian, viral, micotic i/sau parazitar (M r g h i t a , L.Al., 2003).
Bolile necontagioase cel mai frecvent ntlnite la albine sunt: puietul rcit (boala apare primvara n familiile slabe care au cuiburile nerestrnse i nempachetate), diareea albinelor (este n principal consecina consumului de hran de calitate inferioar) i anomaliile mtcilor (apar ca rezultat al distrofiilor sistemului neuroendocrin, sau sunt de natur congenital).
Apariia i manifestarea acestora este frecvent asociat cu influena exercitat de mediu, ce are consecine directe asupra strii fiziologice a albinelor (fig. 1). Condiiile de ecomediu sunt ilustrate de o varietate larg de factori, ce pot fi reprezentai de la clim i grad de poluare, pn la sistemele de cretere i/sau tipul de alimentaie practicate n apicultur.
Bolile contagioase reprezint o ameninare mult mai sever asupra strii de sntate a albinelor, comparativ cu cele necontagioase, n special datorit largii diversiti a factorilor care le produc. Dei influena mediului asupra acestora este minor, uneori condiiile climatice sau de practicare a apiculturii pot constitui factori favorizani n atacul agenilor bacterieni, virali, micotici sau parazitari.
11
Clim
Alimentaie
Sistem de cretere
Familii slabe, cuiburi slab organizate
Puietul rcit
Diareea albinelor
Anomaliile mtcilor
Maladii congenitale
Distrofii ale sitemului neuro endocrin
Figura 1. Relaia dintre factorii de mediu i patologia necontagioas la albine 12
Printre cei mai rspndii ageni bacterieni ce produc boli contagioase la albineputem enumera: Bacillus larvae (loca american), Bacillus pluton, Bacillus alvei, Bacillus orpheus, Bacterium euridice, Streptococcus apis (loca european), B.apisepticus (septicemia), Bacillus parathyphi alvei (paratifoza).
Boala puietului de albine puietul n sac este provocat de virusul Morator aetatule, iar boala neagr, cunoscut i sub denumirile de boala de pdure sau paralizia are drept cauz tot un virus dar detalii referitoare la natura acestuia nu sunt nc pe deplin elucidate.
Cele mai frecvente boli micotice ale albinelor sunt: ascosferoza (boala puietului vros) provocat de Ascosphaera apis, aspergiloza (boala puietului pietrificat) provocat de Aspergillus flavus i uneori de Aspergillus niger i melanoza al crei agent patogen este Melanosella mors apis.
Bolile parazitare sunt provocate de diveri parazii care triesc pe corpul albinelor i care pe lng faptul c se hrnesc cu hrana i/sau hemolimfa acestora sunt i ageni patogeni ai unor boli endo- sau ectoparazitare, n funcie de localizarea acestora. Dintre endoparazitoze amintim: nosemoza (provocat de protozoarul unicelular Nosema apis), amiboza (provocat de parazitul unicelular Malphigamoeba mellifica) i acarioza (provocat de acarianul Acarapis woodi). Bolile ectoparazitare sunt provocate de parazii, iar dintre acestea cele mai des ntlnite sunt: brauloza (Braula coeca), varooza (Varroa destructor), senotainioza (Senotainia tricuspis) i triunghiulinoza (Melo verigatus i Melo
proscarabeus).
13
Au fost identificate albine ce prezint rezisten natural la boli i parazii. Astfel, experimente efectuate n SUA pe unele linii de albine provenite din Rusia, ce se presupunea c sunt rezistente la Varroa destructor (jacobsoni) au demonstrat faptul c acestea aveau exprimat cel puin un mecanism de rezisten. La coloniile ce nu prezentau rezisten s-a nregistrat un grad de infestare a puietului de 65 75%, n timp ce albinele care se presupunea c prezint rezisten la parazit au nregistrat rate de infestare considerabil reduse (R i n d e r e r , T.E. i col., 1999)
L i a k o s , V. i col. (2002) a efectuat ncercri de identificare a unor linii de albine care prezint rezisten natural la Varroa destructor n coloniile de Apis mellifera macedonica. n acelai timp se ncearc i obinerea unor linii de albine rezistente prin procese de selecie, n care rezistena este motenit de la prini la descendeni ca nsuire aditiv (L e w e y L. i col. 2003).
Numeroase programe de ameliorarea a populaiilor de albine n vederea mririi rezistenei acestora la boli au fost lansate i dezvoltate n ntreaga lume.
Creterea albinelor rezistente la aciunea paraziilor cu ajutorul programelor de selecie convenionale ce utilizeaz mtci cu caracteristici dezirabile
mperecheate cu trntori aparinnd coloniilor selecionate au condus la rezultate promitoare. O cale promitoare de a obine prin selecie albine rezistente la boli i parazii o constituie i selecia gameilor provenii de la masculi homozigoi, care s-a dovedit deja eficient n procesele de selecie a albinelor n funcie de performanele de producie (J a n d r i c i c , S.E. i col., 2003).
14
n acest context, biologia molecular ofer importante mijloace de control i monitorizare a prezenei agenilor patogeni, a paraziilor i a bolilor provocate de acestea.
Identificarea locilor nsuirilor cantitative asociate cu rezistena la boli i parazii la albine are o deosebit importana economic, pentru c ofer instrumentele necesare seleciei indivizilor cu nsuiri dezirabile i includerea lor n schemele de ameliorare a cror alctuire este facilitat de selecia asistat de markeri (MAS Marker Assisted Selection)
La albine, au fost utilizai markeri moleculari att pentru identificarea relaiilor filogenetice dintre populaii (C a m e r o n , S.A., 2003), ct i n studiile de evideniere complet a genomului (Crozier i col., 1993), caracterizarea unor regiuni intergenice n ADN-ul mitocondrial (C o r n u e t i col., 1991), i a unor secvene de ADN cu un grad nalt de conservare (T a r s , S. i col., 1993), pentru punerea n evidena a unei rate nalte de recombinare la nivelul locusului sexului (B e y e , M. i col., 1999). Markerii genetici s-au dovedit a fi de o deosebit importan i utilitate n procesele de selecie a albinelor rezistente la boli, ct i pentru studiul diversitii paraziilor, n vederea stabilirii structurii polulaionale i a relaiilor taxonomice (N a v a j a s , M. i col., 2000).
La populaiile de albine, unde variaia alozimelor este relativ sczut, se acord importan markerilor ADN care prezint un polimorfism adecvat studiilor necesare identificrii rezistenei la boli i parazii n cadrul acestor populaii. Aceti markeri ADN pot prezenta fie variaii ale situs-urilor de restricie, cum sunt markerii RAPD, fie variaii ale lungimii, cum este cazul microsateliilor (R o w e i col., 1997).
15
Multitudinea de markeri moleculari utilizai n entomologie poate fi inclus n dou mari categorii, markeri proteici i markeri ADN (L o x d a l e , H.D. i col., 1998). Dac markerii moleculari sunt reprezentai de izozime (enzime cu funcii similare produse la loci diferii) i alozime (pentru o enzim dat, alozimele sunt produi ai diferitelor alele la un anumit locus), markerii ADN prezint o mult mai mare variabilitate, n funcie de tehnicile n care acetia i gsesc utilizarea.
Comparativ cu markerii proteici, izozimele i alozimele, markerii ADN utilizai la insecte (inclusiv la albine) sunt mai numeroi. Acetia sunt: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Polimorfismele Lungimii Fragmentelor de Restricie SSLPs (Simple Sequence Length Polymorphisms) Polimorfismele Lungimii Secvenelor Simple Minisateliii sau VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats) Numrul Variabil al Repetiiilor n Tandem Microsateliii
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) Polimorfismul lungimii fragmentelor de ADN amplificate RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Polimorfismul ADN-ului amplificat la ntmplare
Importana tuturor acestor markeri rezid n posibilitatea utilizrii acestora la alctuirea hrilor de linkage i a identificrii locilor nsuirilor cantitative, care au un rol decisiv n furnizarea de date utile n controlul rezistenei la boli i duntori la populaiile de albine.
16
Antonia ODAGIU, Ioan Gh. OROIAN Caracteristici ecopatologice la insecte, abordare molecular. Volumul 1. Apis mellifera L. Bolile i paraziii albinelor
CAPITOLUL I
BOLILE I PARAZIII ALBINELOR

Albina melifer (Apis mellifera L.) este o insect social cu trei caste. Face parte din regnul Animalia, clasa Insecta, ordinul Hymenoptera, familia Apidae, genul Apis. O colonie de albine (fig. 2, 3, 4) const din matc (regin) - femela fertil (2.a, 4), cteva mii de lucrtoare - femele care nu au capacitatea de a se reproduce (2.b, 3) i din cteva sute de trntori masculi (2.c).
Figura 2. Indivizii coloniei de albine, a - matc, b - albin lucrtoare, c trntor (www.liis.lv/kukaini/lkuk2.htm - This image may be subject to copyright) 17
ndatoririle albinelor lucrtoare sunt diversificate pe parcursul vieii acestora, de la asigurarea cureniei, cldirea fagurilor i hrnirea puietului, pn la activitile de hrnire a mtcii.
De la vrsta de 15 zile asigur ventilaia coloniei, paza i culegerea polenului. La nceputul anului, o colonie de albine const din regin i cteva sute de lucrtoare care au iernat (M r g h i t a , L. Al., 2003).
Pe msur ce crete lungimea zilei,matca ncepe s depun ponta. n condiii normale, din oule fertilizate (diploide) se dezvolt lucrtoare, iar din cele nefertilizate haploide, trntorii.
Figura 3. Albin lucrtoare

(www.uni-bayreuth.de/departments/ toek1/fortner/This image may be subject to copyright)
18
Figura 4. Matc nconjurat de albine lucrtoare

(www.tuat.ac.jp/~ethology/ Sasaki/queen-L.jpeg - This image may be subject to copyright)
Timpul de dezvoltare a lucrtoarelor i trntorilor de la stadiul de ou pn la cel de adult este o caracteristic de cast i difer mult. n medie, o lucrtoare se dezvolt din ou pn la stadiul de adult n 21 de zile, iar un trntor n 16 zile (W i n s t o n , 1987, citat de D e n h o l m , C.H., 1999).
Tipul hranei administrate larvei diploide femele dup vrsta de 3 zile va conduce la obinerea unei lucrtoare, sau regine. Iniial, toate larvele sunt hrnite cu lptior de matc (secreie bogat n proteine a glandelor mandibulare i hipofaringiene a doicilor).
Larvele destinate a ajunge regine sunt hrnite cu cantiti mai mari de lptior de matc pe toat perioada existenei lor. Dup vrsta de 3 zile, larvele albinelor lucrtoare i ale trntorilor nu mai sunt hrnite cu lptior de matc, ci cu nectar (care cu ajutorul enzimelor salivare este convertit n miere) i polen (D e n h o l m , C.H., 1999).
19
1.1. BOLILE ALBINELOR

1.1.1. Boli provocate de virui
Toate formele de via sunt atacate de virui, existnd o foarte mare varietate a tipurilor acestora. Fiecare tip de virus are ns o gazd specific, sau un spectru foarte restrns de gazde. Particulele virale constau dintr-un fragment de material genetic, ARN sau ADN, situat n interiorul unui nveli proteic. Ele se nmulesc doar n interiorul celulelor vii ale gazdei.
Cea mai mare parte a viruilor care atac albinele au drept efect scurtarea vieii acestora. Acetia produc boli grave sau chiar fatale, se nmulesc i se rspndesc n organismele gazd pe o perioad ndelungat, fr a cauza semne aparente ale bolii pe care o provoac. Aceast particularitate este caracteristic n
cvasitotalitate bolilor provocate de virui la albine.
Exist diferite clasificri ale viruilor identificai la albine, toate realizate n funcie de relaiile filogenetice existente ntre acetia. Pe baza metodelor ce utilizeaz secvenirerea fragmentelor de ADN din genomul viral, s-a stabilit faptul c majoritatea viruilor identificai la albine sunt de tip picorna (E v a n s , J. D., i col., 2000).
Metode directe de control a virusurilor la albine nu au fost nc stabilite, diagnosticul precis al prezenei acestora fiind greu de stabilit.
20
Paralizia cronic Dei aceast boal a fost descris nc de acum un secol, cauza sa a fost identificat abia n anul 1963. Iniial s-a considerat c parazitul Acarapis woodi ar fi cel care provoac boala, abia ulterior demonstrndu-se c aceasta este rezultatul aciunii unui virus virusul paraliziei cronice.
Acest virus este probabil ntotdeauna nsoit de un virus satelit - virusul asociat al paraliziei cronice a crui aciune nu se cunoate cu exactitate, dar se pare c este implicat n mecanismele de aprare.
La albine acest virus satelit inhib replicarea particulelor virale cu dimensiunile cele mai mari i cu capacitatea infectant cea mai ridicat.
n cazul acestei boli se ntlnesc dou tipuri de simptome. Primul este caracteristic aa numitei boli a insulei Wight identificat n Marea Britanie la nceputul secolului XX i const n pierderea capacitii de zbor, dilatarea abdomenului, distanarea aripilor nsoit de micri necoordonate.
Coloniile sever afectate adesea colapseaz, n special la mijlocul sezonului de var. Al doilea tip de simptome caracterizeaz aa numita boal neagr. Acestea sunt identice cu primele, dar n plus albinele i pierd nveliul pilos, avnd ca urmare corpul negru cu aspect unsuros.
Se presupune c apariia acestor dou tipuri diferite de simptome cauzate de acelai virus se datoreaz diferenelor genetice dintre albine (M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997).
21
Paralizia acut Aceast boal este provocat de virusul paraliziei acute i afecteaz albinele adulte, n special pe perioada de var. Iniial nu a fost asociat cu inducerea vreunei boli sau cu provocarea morii pentru c albinele infestate preau sntoase. Mecanismul inducerii bolii nu este nc elucidat, se tie doar c purttor al virusului ce o provoac este parazitul Varroa destructor (jacobsoni), ce acioneaz ca un vector de transmitere a lui la albine adulte, sau la puiet, aa cum demonstreaz i observaiile efectuate n Europa, SUA i America central (H u n g i col., 2000; B a l l i col., 1988, B a i l e y i col., 1979; S h i m a n u k i i col., 1994, citai de M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997). Analize serologice au demonstrat prezena masiv a acestui virus n Ungaria (B e k e s i , L. i col., 1999).
Pentru evidenierea acestuia sunt utilizate analize ale secvenei nucleotidice izolate din coloniile de albine infestate (E v a n s , J. D., 2002). Albinele adulte infectate pot constitui la rndul or focare de infecie pentru larvele tinere, prin secreia unor cantiti mari de virus n hrana acestora.
Boala produs de virusul albinelor din Kashmir (KBV) KBV a fost iniial detectat la albinele adulte din Asia, Apis cerana ( B a i l e y i Woods, 1977, citai de M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997), dar ulterior a fost identificat i la Apis mellifera n Europa, Australia i America de Nord (A l l e n i col., 1995; A n d e r s o n , 1990; B r u c e i col., 1995; H u n g i col., 1995 citai de H u n g , A.C.F., 2000). Acesta este un virus nrudit serologic cu virusul paraliziei acute, are o aciune similar lui. Unii autori consider c acesta
22
ar fi vehiculat de parazitul Varroa destructor (jacobsoni) (H u n g A. C. i col.,1999). Pentru evidenierea KVB au fost utilizate iniial metode serologice (H u n g A. C. i col., 1999), dar la momentul de fa sunt utilizate analize ale secvenei nucleotidice izolate din coloniile de albine infestate (E v a n s , J. D., 2002, H u n g , A.C. i col., 2002).
Spre deosebire de virusul paraliziei acute, toate tulpinile KBV sunt extrem de virulente, virusul se nmulete rapid n hemolimfa albinelor adulte sau a puietului, producnd moartea doar n trei zile.
Boala puietului n sac Virusul care provoac aceast boal este Morator aetatule, fiind unul dintre primele virusuri detectate la albine. Organizarea genomic a virusului este similar membrilor familiei Picornaviridae, cu gene structurale la captul 5 i gene nestructurale la captul 3 (G h o s h , R. i col., 1999, citat de G r a b e n s t e i n e r , E. i col., 2001).
Virusul se nmulete rapid n mai multe esuturi larvare, iar larvele par s aib o dezvoltare normal pn dup cpcire. Apoi devin galbene, cenuii sau brune, cu capul de culoare mai nchis dect corpul, sunt ntoarse complet cu partea ventral n sus i cea dorsal se sprijin pe pereii inferiori ai celulei lund aspectul unor saci cu lichid. Acest lichid care conine milioane de particule virale este situat ntre corpul larvei i pereii celulei. Larvele mor apoi curnd, se usuc i primesc o coloraie maro nchis. Viruii existeni n larvele moarte i pierd repede capacitatea de a infecta noi indivizi, n special pe timpul iernii. Pericolul de infestare este mai
23
mare la lucrtoarele tinere pe perioada n care cur celulele fagurilor. Se pare c trntorii, care niciodat nu mnnc polen nu sunt afectai de acest virus.
La vrsta de dou zile larvele sunt cel mai susceptibile la aciunea virusului. Perioada de vrf a infestrii este cea de la sfritul primverii i nceputul verii. Este interesant de observat faptul c efectele virusului puietului n sac sunt identice cu cele produse de anestezia rapid cu CO2.
Malformaia aripilor Este o anomalie produs de un virus, numit virusul ce produce malformaia aripilor, care a fost iniial identificat la Apis mellifera din coloniile infestate cu Varroa destructor (jacobsoni) n Japonia. Albinele din coloniile infestate au aripile slab sau foarte slab dezvoltate. Virusul are o perioad ndelungat de nmulire. n cazul infestrii oulor, la scurt timp dup eclozionare larvele mor, la puiet moartea se produce n stadiile de dezvoltare timpurie, iar dac infecia se produce la albinele adulte, acestea nu prezint malformaii, dar moartea se produce. Se pare c virusul produce mortalitate i n coloniile neinfestate cu Varroa destructor (jacobsoni), iar mecanismul su de transmitere este similar cu ce ntlnit la virusul paraliziei acute (B a l l , 1989, citatde M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997). Cercetri similare efectuate n Anglia de B o w e n - W a l k e r i col. (1998) i de van O e r s i col. (2000) n Olanda confirm rolul de vector pe care l are Varroa destructor (jacobsoni) n transmiterea virusului ce provoac malformaia aripilor la albine (DWV deformed wing virus). Cu toate acestea, pentru a cauza boala virusul trebuie s se gseasc peste o anumit concentraie n pupele albinelor infestate (B r o w e n W a l k e r i col., 1998).
24
Boala produs de virusul albinelor din Egipt Aceast boal este ntlnit doar n Egipt i este produs de un virus denumit virusul albinelor din Egipt, despre care ns nu se cunoate nimic nici n privina apariiei sale i nici detalii despre mecanismele sale de aciune (B a i l e y i col., 1979 citai de M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997).
Paralizia lent Virusul paraliziei lente este responsabil de producerea acestei boli. Indivizii infestai mor la 12 zile de la inducerea experimental a bolii prin injectarea virusului n hemolimf, iar cu dou zile nainte de colaps se produce paralizia celor dou perechi de membre anterioare. Recent s-a descoperit ca acest virus este letal n coloniile infestate cu Varroa destructor (jacobsoni), dar nu se cunosc nc date referitoare la istoricul bolii sau la rspndirea acesteia (M o r s e , R . A . & F l o t t u m , K ., 1997).
Boala produs de virusul celulei negre a mtcii Virusul celulei negre a mtcii constituie cauza morii larvelor de matc dup nchiderea n celule. Este un virus de tip picorna i a fost iniial izolat de la albinele din Africa de Sud (L e a t , N. i col., 2003). Pereii celulelor devin maro nchis sau negri. Larvele bolnave au o coloraie galben pal semnnd cu cele infestate de virusul ce provoac boala puietului n sac. Adesea, virusul este prezent la albinele infestate cu Nosema apis (A l l e n i col., 1993 citai de B e n j e d d o u , M. i col., 2002). Exist ncercri de manipulare a genomului acestui virus n vederea exploatrii potenialului acestuia ca vector viral i
25
utilizarea lui n experimente conduse cu scopul aprofundrii cunotinelor despre PMS la albine (B e n j e d d o u , M. i col., 2002).
Boala produs de virusul filamentos Virusul filamentos a fost iniial identificat n SUA (C l a r k , 1978, citat de M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997). El se nmulete n corpul gras i n esutul ovarian al albinei adulte. La indivizii care prezint infestare sever, hemolimfa devine de culoare alb lptoas, acesta fiind singurul simptom cunoscut al aciunii virusului.
Boala produs de virusul Y al albinelor Virusul Y al albinelor se nmulete doar cnd este introdus n organism odat cu hrana. Nu se cunosc detalii despre acesta i nici despre simptomele infeciei.
Virusul celulei negre a mtcii, cel filamentos i virusul Y al albinelor se nmulesc n organismul albinelor adulte atunci cnd acestea sunt infestate cu protozoarul Nosema apis (M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997).
Boala produs de virusul X al albinelor Aceast boal este produs de un virus nrudit serologic cu virusul Y al albinelor i denumit virusul X al albinelor, fiind aproape imposibil de separat de acesta pe cale fizic sau chimic. Spre deosebire de virusul Y, virusul X al albinelor nu este asociat cu Nosema apis, dar s-au gsit uneori asocieri ntre acesta i
26
protozoarul Malpighamoeba mellificae. Virusul se rspndete predominant prin fecalele contaminate. Prezena sa n albinele deja contaminate cu M.mellificae accelereaz moartea acestora (M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997).
Boala produs de virusul aripilor opace Infestarea albinelor cu virusul aripilor opace devine vizibil n momentul n care aripile acestora devin opace. Diagnoza precis a acestei boli poate fi stabilit doar serologic. Virusul se nmulete n capul i toracele indivizilor infestai.
Prezena acestuia conduce la scurtarea vieii, iar coloniile cu infestare masiv devin inactive dup care colapseaz la scurt timp (M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997).
Boala produs de virusul Apis iridiscent Virusul Apis iridiscent este un iridiovirus asociat cu boala clusterelor identificat n India la Apis cerana. Infestarea cu acest iridiovirus conduce la inactivitatea coloniilor n principal vara, colapsul producndu-se la un interval de circa dou luni de la infestare.
Se nmulete n diferite esuturi: corpul gras, tractusul alimentar, glandele hipofaringiene i ovarele albinelor (M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997).
27
Boala produs de virusul albinei din Arkansas Virusul ce produce aceast boal - virusul albinei din Arkansas, a fost iniial identificat n Arkansas la albine aparent sntoase, fr a se cunoate detalii despre acesta. Nu a fost ntlnit n afara granielor SUA.
n California, L o m m e l i col., 1985 (Morse, R.A. & Flottum, K. Eds., 1997) a ntlnit un virus asemntor pe care l-au denumit virusul Berkley al albinelor, dar nu se cunoate nc dac acesta este identic cu virusul albinelor din Arkansas (M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997).
1.1.2. Boli provocate de bacterii

Datorit pierderilor economice considerabile pe care acestea le produc apicultorilor, bolile provocate de bacterii au fost cele mai studiate boli ale albinelor.
Loca american W h i t e n 1907 (Morse, R.A. & Flottum, K. Eds., 1997) a fost primul care a demonstrat faptul c loca american este rezultatul infestrii cu bacteria sporulat B.larvae. Este foarte contagioas i dac nu este tratat la timp i corespunztor poate conduce la dispariia ntregii colonii, rspndindu-se i la alte stupini.
28
Aceast boal este una dintre cele mai grave boli ale albinelor n ntreaga lume, agentul patogen fiind Bacillus larvae.
Cadavrele larvelor infestate reprezint sursa de infecie. Albinele lucrtoare ncercnd s elimine din stup larvele infestate i moarte, preiau sporii bacteriei pe piesele bucale, picioare i corp, devenind ageni infectani. Contaminarea se face pe cale bucal, ncepnd cu a doua zi a stadiului larvar cnd puietul ncepe s fie hrnit de ctre albine. Cel mai frecvent, boala se transmite de la un stup la altul prin intermediul albinelor hoae, sau prin achiziionarea necontrolat a unor familii de albine sau mtci.
Dei la indivizii aduli infestarea este greu de identificat, diagnosticul poate fi stabilit prin examinarea puietului infestat. Larvele au culoare galben maronie i miros similar cu cel al cleiului de oase. Cel mai frecvent larvele mor dup cpcire, cpcelele fiind perforate i concave. Cadavrul larvei se deshidrateaz i ader la peretele celulei cu care formeaz un corp comun.
Loca european Aceast boal este considerat de majoritatea apicultorilor mai puin grav dect loca american.
Dei a fost studiat nc de la sfritul secolului al XVIII-lea (S c h i r a c h , 1771 n Honey Bee Pests, Predators, and Diseases, 45, Morse, R.A. & Flottum, K. Eds., 1997) detaliile referitoare la aceast boal nu sunt nc elucidate.
29
Agentul patogen este
Melissococcus pluton, o bacterie care iniial a fost
cunoscut sub denumirile de Bacillus pluton i Streptococcus pluton. Este rspndit pe tot globul, apare primvara timpuriu pn toamna. Contaminarea se face pe cale bucal, prin consumul de hran infestat, iar rspndirea n principal prin albinele hoae i trntori.
Boala este dificil de depistat la nceput. Larva devine la nceputul mbolnvirii mai transparent, corpul se nmoaie, i schimb poziia, devine glbui, iar la 3 4 zile de la infestare larvele mor i se descompun. n locul acestora apare un lichid opalescent care devine cafeniu i vscos.
Cnd boala apare la puietul cpcit, cpcelele celulelor se adncesc i devin mai nchise la culoare.
n 1984, P i n n o c k i
F e a t h e r s t o o n e (citai de M o r s e , R.A. & (enzyme-linked
F l o r t t u m K., Eds., 1997)au artat c testul ELISA
immunosorbent assay) poate fi utilizat cu succes n identificarea Melissococcus pluton, punnd astfel n eviden existena bolii nc din stadiile timpurii cnd coloniile infestate par sntoase.
Septicemia La albine, septicemia este o boal bacterian a albinelor adulte descris pentru prima dat de B u r n s i d e nc de la nceputul secolului XX (n Honey Bee Pests, Predators, and Diseases, 51, Morse, R.A. & Flottum, K. Eds., 1997). Boala este provocat de Bacillus apisepticus, bacterie reclasificat n anul 1959 de ctre
30
L a n d e r k i n i K a t z n e l s o n (n Honey Bee Pests, Predators, and Diseases, 51, Morse, R.A. & Flottum, K. Eds., 1997) ca Pseudomonas apiseptica. Aceasta este o bacterie nesporulant gram-negativ. Contaminarea se produce pe cale respiratorie, agentul patogen ptrunde n hemolimf care are un aspect lptos i mobilitate redus. n hemolimf se nmulete i n final produce moartea, la 20 30 ore dup infestare.
Boala este favorizat de condiii necorespunztoare de ntreinere, mai ales locuri umbroase i rcoroase. Se pot nregistra vindecri spontane atunci cnd cauzele care au favorizat apariia acesteia dispar.
Paratifoza Aceast boal este tot o boal a albinelor adulte favorizat de condiiile nefavorabile de ntreinere. Agentul patogen este Bacillus parathyphi alvei. Contaminarea se face pe cale bucal prin intermediul apei infestate. Albinele infestate i pierd capacitatea de zbor, au abdomenul inflamat, prezint diaree dup care intervine moartea. Boala poate fi confundat cu nosemoza i acarioza i pentru stabilirea unui diagnostic corect trebuie utilizat examenul microscopic.
Boala produs de Bacillus pluvifaciens Este o boal ntlnit destul de rar, probabil datorit faptului c nu este uor de identificat (M o r s e , R . A . & F l o t t u m , K . E d s ., 1997). Este produs de
31
Bacillus pluvifaciens, o bacterie sporulat gram-pozitiv. Ea afecteaz doar larvele albinelor, iar etiologiei ei nu este nc elucidat.
Boala produs de spiroplasme Spiroplasmele sunt bacterii din clasa Mollicutes. C l a r k , 1977b, 1978 (citat de M o r s e , R . A . & F l o t t u m , K . E d s ., 1997). a descoperit n SUA o
specie aparinnd acestei clase, letal pentru albine. Nu se cunosc detalii referitoare la boal.
Boala produs de Rickettsia Rickettsia este o bacterie gram-negativ care are aciune parazitar intracelular. La albine au fost identificate puine cazuri de mbolnviri produse de aceast bacterie (P o l t e v i col., 1967 n Rusia, W i l l e 1964b, 1966, 1967 n Elveia, W i l l e 1964b n Germania).Cercetri efectuate dup 1970 aduc n discuie natura viral (C l a r k , 1977a, 1978) sau bacterian (B a i l e y , 1981) a speciei, ns acest aspect nu a fost nc elucidat.
1.1.3. Boli provocate de protozoare

Protozoarele sunt organisme unicelulare cu aciune patogen asupra insectelor, cauzndu-le infecii cronice care pot fi sau nu letale pentru gazda infestat.
32
La albine nu se cunosc semne clinice n cazul infestrii cu protozoare, de aceea diagnosticul poate fi stabilit doar prin examen microscopic.
Dei s-au efectuat multe studii referitoare la protozoarele care infesteaz albinele i la bolile pe care acestea le produc, sunt nc multe necunoscute cu privire la genetica i ciclul de via al protozoarelor (M o r s e , R . A . & F l o t t u m , K . E d s ., 59, 1997).
Nosemoza Boala este produs de protozoarul Nosema apis. Acesta infecteaz celulele epiteliale ale peretelui intestinal al albinelor unde se nmulete, mpiedicnd digestia i asimilarea hranei. Agentul patogen are dou forme, vegetativ i sporulat. n forma vegetativ se multiplic n ventricul, care devine n ntregime infestat n dou sptmni de la contaminare (F r i e s i col., 2003). Forma sporulat apare dup moartea albinelor, sau cnd protozoarul este eliminat n mediul exterior, unde rezist timp ndelungat, iar cnd ajunge din nou n organismul albinei se transform n form vegetativ.
Contaminarea se face pe cale bucal, prin consumul de ap sau hran infestat. Boala se poate transmite i prin contact direct ntre matca infestat i albinele care o ngrijesc, sau mai ales primvara n timpul curirii fagurilor infectai.
Familiile infestate prezint o activitate redus primvara. Albinele bolnave prezint diaree, au abdomenul umflat, i pierd capacitatea de zbor, tremur, paralizeaz i apoi mor.
33
mbolnvirea cu Nosema conduce la scderea produciei de miere i la pierderi mari n timpul iernii, n ciuda lipsei unor evidene clare ale instalrii bolii.
Amoeboza Boala a fost identificat n 1916 de ctre Maassen care observat prezena unor chiti amoebici n tubii Malpighi ai albinelor infestate. Aceast amoeb a fost denumit Malpighamoeba mellificae (P r e l l , 1962b, citat de M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997). Acest protozoar este rspndit n toate continentele dar are o frecven mai redus de ct Nosema apis.
Trntorii i mtcile sunt foarte rar infestate. Boala se transmite prin chitii de Malpighamoeba mellificae din depozitele de fecale, mai ales primvara cnd albinele cur fagurii.
Nu se cunosc simptome clare ale infestrii cu acest protozoar. Diagnosticul poate fi stabilit doar prin examenul microscopic, atunci cnd se observ prezena chitilor n amoebici tubii Malpighi.Celulele epiteliale ale tubilor infestai se aplatizeaz i vor fi consumate de ctre parazit.
De asemenea, prezena Malpighamoeba mellificae cauzeaz disfuncii ale reglrii osmozei la albinele infestate.
Boala provocat de gregarine Gregarinele sunt protozoare ce formeaz o clas mare care cuprinde peste 1500 de specii (L e v i n e , 1982, citat de M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997).
34
Unele dintre acestea au fost identificate n tractusul intestinal al albinelor, atacnd epiteliul stomacului.
Speciile identificate la albine nu sunt specifice pentru aceast gazd (W a l l a c e , 1966, citat de M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997) dar pot proveni din nectarul cules, sau din ap, ori chiar prin contaminare de la alte insecte.
Dei pot produce modificri patologice n celulele pe care le atac, gregarinele nu produc efecte negative majore n coloniile pe care le atac. Climatul cald se pare c este favorabil rspndirii bolii, fiind identificat n SUA i America Latin.
Boala provocat de flagellate Flagellatele sunt protozoare nesporulate ce posed flagel, pseudopode, sau ambele mijloace de locomoie. La albine au fost identificate flagellate din clasa Kinetoplastida, care a u form alungit i prezint flagel.
n intestinul albinelor a fost identificat prezena Leptomonas apis (L o t m a r , 1946, citat de M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997) care produce semne vizibile ale prezenei sale atacnd peretele intestinal n regiunea piloric, dar nu exist nici o dovad c prezena acestora ar cauza vreo stare patologic.
35
1.1.4. Boli provocate de ciuperci i mucegaiuri

Ciupercile i mucegaiurile sunt organisme saprofite frecvent ntlnite att n faguri, ct i la albine. Bolile pe care acestea le produc la albine, micozele, sunt boli infecto contagioase i evoluia lor este influenat de condiiile de mediu.
Ascosferoza (Puietul vros) Puietul v ros este o micoz ce atac larvele albinelor. Ea este cauzat de Ascosphaera apis , o ciuperc ce are micelii de ambele sexe.
Boala are o r spndire larg peste tot n lume i apare n lunile aprilie mai. Primele observa ii privitoare la boal au fost efectuate n 1913 de c tre Maassen n Germania (L o t m a r , 1946, citat de M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997).
Contaminarea se face pe cale bucal prin intermediul albinelor care igienizeaz stupul i care vin n contact cu albinele sntoase. Umiditatea i temperatura ridicat favorizeaz apariia bolii.
n primul rnd este atacat puietul de trntori, pentru c de obicei acesta se afl la periferia fagurilor, unde umiditatea este mai mare i temperatura mai sczut, extinzndu-se mai apoi i la restul puietului de albine.
36
Larvele infestate se nnegresc, i pierd segmentaia, pielea se asprete, iar corpul se acoper cu un miceliu alb. Larva moare, iar n urma evaporrii apei se usuc, avnd aspect mumificat i devine asemntoare unor pietricele de var.
Boala provocat de mucegaiul polenului Aceast micoz este produs de ciuperca saprofit Bettsia alvei care acioneaz asupra polenului depozitat n celulele fagurelui. Are o rspndire larg n Europa i Noua Zeeland. Boala nu atac puietul. Ea poate fi confundat cu ascosferoza, dar spre deosebire de aceasta apare iarna. Infestarea coloniilor cu aceast ciuperc nu constituie o problem grav, neproducnd maladie grav sau moartea.
Aspergiloza (puietul pietrificat) Aceasta este o boal rar i apicultorii o considerau de importan minor, dar ulterior s-a dovedit a fi foarte periculoas, fiind transmisibil i omului cruia i atac mucoasele oculare i pe cele ale aparatului respirator. Este rspndit n stupinele de pe toate continentele.
Boala este provocat de specii de ciuperci aparinnd genului Aspergillus. Cel mai frecvent boala este produs de Aspergillus flavus, dar ocazional este produs i de A.fumigatis i A.niger. Sunt atacate larvele, nimfele i albinele adulte.
Contaminarea cu Aspergillus se produce mai frecvent dup un cules abundent de polen, cnd datorit netasrii corespunztoare ciuperca l infesteaz, boala fiind agravat de aciunea factorilor negativi de mediu. Primele semne ale infestrii
37
sunt reprezentate de nelinite, dup care albinele prezint micri anormale, paralizeaz i n final mor.
Larvele infestate cu Aspergillus se deshidrateaz, au o consisten dur (de aici numele de puiet pietrificat), devin glbui, sau galben verzui.
Nu se cunoate cu exactitate modalitatea de rspndire a bolii, dar se presupune c aceasta s-ar extinde prin intermediul schimbului de rame pe care l realizeaz cresctorii, adic prin ramele provenite din coloniile bolnave i ajunse n cele sntoase.
G i a u f f r e t i T a l i e r c i o (1967) (citai de M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997) au evideniat posibilitatea ca boala s fie legat i de administrarea antibioticelor, care modific echilibrul florei intestinale normale la albine, precum i de influena unor factori de mediu (umiditate, lipsa ventilaiei, o hran cu un coninut prea mare de ap etc.), sau genetici care favorizeaz apariia bolilor produse de fungi.
Melanoza Este o boal ce afecteaz sistemul reproductor al mtcilor, producnd sterilitate. Boala a mai fost denumit H melanoz (de la cuvntul german Hefe care nseamn drojdie) pentru a fi deosebit de B melanoza care este produs de o bacterie. Nu se cunosc detalii despre incidena natural a bolii.
38
Agentul patogen care produce H melanoza este Melanosella mors apis. Se pare c acesta intr prin orificiul vaginal n oviducte i ovare unde produce melanoza, adic o coloraie neagr.
Punga cu venin i glandele veninoase ale albinelor sunt de asemenea afectate, prezentnd inflamaii negre extinse, care exercit presiune asupra oviductelor, iar oule sunt pierdute, matca devenind steril (Fyg, 1964, citat de M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997).
1.2. PARAZIII ALBINELOR

Paraziii albinelor aparin clasei Arachnida, subclasa Acari, avnd urmtoarele caracteristici: patru perechi de picioare segmentate, un corp nesegmentat, iar cavitatea bucal alctuit din dou pri, papilele senzoriale i chelicerele ascuite.
Stupul de albine reprezint un habitat potrivit pentru o larg diversitate de parazii. Au fost identificate peste 86 de specii de parazii n habitatul albinelor (d e J o n g i col., 1982b, citai de M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997). Acetia pot fi clasificai n patru categorii (E i c k w o r t , 1988, citat de M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997): parazii vidanjori care se hrnesc cu resturile din stup (buci vechi de faguri cu miere, resturi de albine moarte, fungi etc.) i care invadeaz proviziile de hran depozitate. Acetia sunt parazii globulari cu micri lente, corp de culoare deschis i membrele de culoare nchis. Din aceast categorie fac parte Glycyphagus sp., n spe
39
Glycyphagus domesticus care se hrnete exclusiv cu fungii din stup, Acarus sp. n special Acarus siro i Acarus immobilis care se hrnesc att cu fungi ct i cu alte resturi de natur organic, precum i
Tyrophagus sp. Tyrophagus putrescentiae, Tyrophagus longior i Tyrophagus palmarum. Dei se gsesc n numr mare, aceti parazii nu aduc prejudicii coloniilor sntoase, neconstituind un pericol pentru acestea.
parazii prdtori care se hrnesc cu paraziii vidanjori, se gsesc n cea mai mare parte n resturile din stup. Cu mici excepii, acetia nu au drept habitat stupul, dar se afl acolo unde organismele pe care le atac i procur hrana. Majoritatea aparin subordinului Mesostigmata, fiind parazii cu micri rapide i corp aplatizat. Cei mai des ntlnii aparin familiilor Ascidae, Macrochelidae i Parasitidae. Cea mai mare parte pot fi observai cu ochiul liber i nu aduc nici un prejudiciu albinelor i/sau puietului.
parazii foretici, care se instaleaz pe albine cu scopul de ajunge la locul din care acestea i procur hrana (flori, stupi). Cei mai rspndii aparin genului Neocypholaelaps. Acetia se ataeaz ntr-un anumit stadiu al dezvoltrii lor de o insect adult proaspt aprut pentru fi transportai ntr-un cuib nou.
parazii care paraziteaz albinele adulte i puietul lor. Acetia reprezint cea mai important categorie de parazii datorit efectelor lor duntoare att asupra albinelor adulte ct i asupra puietului. Varroa
40
destructor i Acarapis woodi sunt paraziii cu cele mai serioase efecte asupra albinelor i puietului, att datorit aciunii lor parazitare propriuzise ct i datorit bolilor pe care acetia le vehiculeaz. Aici trebuie amintii i paraziii aparinnd genului Tropilaelaps (T. clareae i T. koenigerum), dar a cror aciune este restrns la perimetrul Asiei. Mai exist i alte specii de parazii caracteristici altor gazde i care doar accidental paraziteaz albinele. Din aceast categorie fac parte cei aparinnd Piemontes sp. (Piemontes ventricosus, Piemontes anobii i Piemontes tritici), care sunt parazii polifagi ai larvelor insectelor i care invadeaz albinele doar ocazional.
Dintre categoriile de parazii mai sus menionate doar trei produc mortalitate masiv n familiile de albine, respectiv Varroa destructor (jakobsoni), Acarapis woodi i Tropilaelaps clareae n Asia.
Toi fac parte din categoria celor care paraziteaz albinele adulte i puietul lor.
1.2.1. Acarapis woodi

Apicultorii din ntreaga lume se confrunt cu pierderi masive datorit bolii produse de invazia acestui parazit, care mai poart numele de parazit al traheilor datorit faptului c se hrnete i e reproduce n traheea albinelor.
41
Este un parazit cu dimensiuni microscopice, corp oval, segmentat i opt picioare. Femelele au o lungime de 143 174 m i o lime de 77 88 m, n timp ce masculii sunt de dimensiuni mai reduse, 125 136 m lungime i 60 77 m lime.
Att adulii, ct i larvele i oule lor au ca habitat sistemul respirator al albinelor. La nivelul primei perechi de stigme toracice care se deschide ntr-o mic excavaie n depresiunea mezotoracelui femelele depun oule, producnd pn la 20 de descendeni, care ajung la maturitate dup circa 11 12 zile masculii i 14 15 zile femelele. n mod obinuit acarienii produc doar o generaie n aceeai gazd. Acest acarian infesteaz att albinele lucrtoare ct i mtcile i trntorii
(P e t t i s i col., 2003), dei trntorii datorit tuburilor traheale mai largi sunt infestai preferenial (D a w i c k e , 1991, citat de M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997).
Contaminarea se face prin intermediul albinelor hoae, a trntorilor, mtcilor i roiurilor infestate. Albinele parazitate i pierd capacitate de zbor, cad n faa urdiniului, abdomenul este dilatat, iar corpul prezint tremurturi. Aripile au micri nesincronizate i sunt ndeprtate.
La o infestare masiv, traheile i schimb culoarea, din alb sidefiu devenind mate, galben castanii i apoi negre. Coloniile cu un grad ridicat de infestare sunt mai slbite i produc mai puin puiet (S c o t t - D u p r e e i O t i s , 1988, citai de M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997).
Exist o serie de tratamente n combaterea acestui parazit, cele mai utile dovedindu-se acelea pe baz de mentol (T e w , J.E., 2003).
42
1.2.2. Varroa sp.

Datorit efectelor sale extrem de nocive i rspndirii largi Varroa destructor (jacobsoni) constituie o problem major pentru apicultorii din ntreaga lume. Varroa sp. este un parazit ce face parte din regnul Animalia, ncrengtura Arthropoda, Clasa Arachnida, Ordinul Acari, Familia Parasitidae, Genul Varroa, Specia destructor (W a l k e r , K .L. i col., 1997).
Cercetrile efectuate n ultimii zece ani au demonstrat faptul c Varroa reprezint nu numai o specie (A n d e r s o n , D., 2000), iar n Europa, efectele duntoare produse de Varroa jacobsoni se datoreaz de fapt speciei Varroa destructor (A n d e r s o n , D., 2000; D e l a p l a n e , K. i col., 2005).
Iniial Apis cerana, albina asiatic, a fost gazda parazitului. Se pare c Varroa destructor (jacobsoni) a nceput s infesteze Apis mellifera doar n ultima sut de ani, odat cu ptrunderea ei n Asia, adaptndu-se la noua gazd. Doar dou tulpini ale parazitului Varroa destructor au devenit parazii ai albinei europene (Apis mellifera L.) peste tot unde este prezent (A n d e r s o n , D., 2000).
Este un parazit extern care poate fi observat cu ochiul liber. Femela are o lungime de 1,1 1,2 mm i 1,5 1,6 mm lime, de culoare maro-rocat, corpul transversal oval, aplatizat. Masculul, de culoare alb cenuie, are dimensiuni mai reduse, cu lime i lungime de aproximativ 0,7 mm (http://MAAREC. cas.psu.edu,2000, http://www.beekeeping.com/vita/bdiseases/varroam.htm, 2003, http://www.main.org/cahbs/varroam. htm, 2003).
43
Masculii se dezvolt din ou nefertilizate i more dup mperechere, iar femelele din ou fertilizate. Femela se fixeaz att pe abdomen ct i pe torace i membre (fig. 5).
Figura 5. Ciclul de via al parazitului Varroa sp. (www.mossopshoney.co.nz/From+hive+to+honeypot/)
Depune 7 8 ou n celulele cu puiet sau pe larvele de trntori (Boot i col., 1992, citai de M o r s e , R.A. & F l o r t t u m K., Eds., 1997), din care dup 2 zile ies larvele ce se hrnesc cu hemolimfa larvelor i nimfelor de albin i ajung la
44
maturitate dup 7 zile cnd se mperecheaz nainte de eclozionarea albinelor (C o r r a - M a r q u e s , M. H. i col., 2003).
Femelele mperecheate trec pe albinele lucrtoare, trntori i matc unde se hrnesc cu hemolimfa acestora producndu-le n final moartea (M e d i n a , M. L. i col., 2002).
Contaminarea se face prin intermediul albinelor hoae, a trntorilor, roiurilor, fagurilor cu puiet, precum i prin practicarea stupritului pastoral.
La nceputul infestrii, parazitul nu poate fi observat cu ochiul liber, datorit numrului redus de indivizi, precum i datorit poziiei acestuia ntre inelele abdominale. n timpul iernii paraziii nelinitesc familia de albine, se produce un consum mai ridicat de miere i se produce apariia diareei.
Cnd exist un numr mare de parazii, dup 2 3 ani de la infestare, albinele eclozionate vor fi neviabile, cu aripile nedezvoltate, capul i picioarele diforme. Acestea cad pe fundul stupului i sunt evacuate de ctre albinele sntoase.
Cnd infestarea atinge 30 40% din efectivul stupului, familia slbete i moare (M r g h i t a , L. Al., 2003).
Varroa destructor (jacobsoni) este un parazit care are aciune destructiv major asupra familiilor de albine predominant n zonele temperate (W i l k i n s o n , D. i col., 2002; F r i e s , I. i col., 2003; H a r r i s , J. W. i col., 2004).
45
Aciunea nociv a parazitului nu se datoreaz doar parazitrii coloniilor de albine cu hemolimfa crora se hrnete, ci mai ales faptului c el constituie un puternic vector al viruilor ce infesteaz coloniile de albine (B e n o i t , J. B. i col., 2004).
Infestrile severe cu Varroa sp. sunt de obicei nsoite de o multitudine de simptome denumite generic Sindromul parazitic (PMS - Parasitic Mite Syndrome). Pe lng asocierile cu transmiterea virusului paraliziei acute, virusul paraliziei lente, sau cel al malformaiei aripilor (N o r d s t r m , S., 2000), se pare c Varroa destructor (jacobsoni) este asociat i cu un alt virus de tip picorna (picorna like virus) recent izolat att din parazit, ct i din albinele infestate cu Varroa sp. (V l a k , J. M. i col., 2003).
Cercetri efectuate pe populaii de albine infestate simultan cu Acarapis woodi i Varroa destructor (jacobsoni) au indicat faptul c ar putea exista o interaciune biologic ntre cei doi parazii la nivel individual, ceea ce ar aduce prejudicii suplimentare coloniilor infestate (D o w n e y , D. L. i col., 2000).
Combaterea eficient a parazitului constituie una dintre cele mai mari provocri ale apicultorilor din ntreaga lume (T e w , J. E., 2000; M o o s b e c k h o f e r , R. i col., 2003; D o n z , G., 1998).
Una dintre cele mai mari probleme ale apicultorilor de azi const n rezistena parazitului la tratamentul cu Apistan (pesticid piretroid avnd component activ tau fluvalinatul), una dintre substanele cu cea mai mare utilizare n combaterea Varroa destructor (jacobsoni), dar i la cele cu Amitraz i Cumafos (P e t t i s , J. S., 2003).
46
Cercetrile efectuate la nivel molecular au evideniat posibilitatea asocierii acestei rezistene a parazitului la Apistan, dar i la celelalte substane de sintez utilizate n tratamente care intr n categoria pesticidelor (O d a g i u , A n t o n i a i col., 2005), cum sunt, de exemplu, Cumafos-ul (produs de sintez pe baz de compui organoclorurai ce intr de obicei n compoziia pesticidelor) i Amitrazul (pe baz de antibiotice) cu mutaiile punctiforme aprute la nivelul genelor canalului sodiului (W a n g , R. i col., 2002; W a n g , R. i col., 2003; W a n g , R. i col., 2003).
Experimentele desfurate n Italia, Frana, Germania, Belgia, Austria, Spania .a. ncepnd cu 1994, au demonstrat experimental prezena fenomenului
(H i l l e s h e i m , E. i col., 1996; M i l a n i , N., 1995; T r o u i l l e r , J., 1996; B r u n e a u , E. i col., 1997; T r o u i l l e r , J. i col., 1997; H i g e s , M. i col., 1998; T r o u i l l e r , J., 1998). Rezistena parazitului Varroa sp. la principalii produi de combatere, bazai pe piretroizi s-ar putea explica prin mecanisme identificate la momentul de fa.
Aceasta, ns, n contextul mai larg al dezvoltrii rezistenei la pesticide att a plantelor ct i al altor organisme (echinoderme, insecte, arahnide etc.), care se pare c sunt guvernate de procese similare (D o y l e , K. i col., 1991; S i b b e s e n , O. i col., 1995; B e s t e n , P.J., 1998; V a l l e s , Rinderer, T.E. i col., 1999; S.M. i col., 2003; Tan, J. i col., 2005; E l e f t h e r i a n o s , I. i col., 2008, .a.).
Unul
dintre
ele
este
reprezentat
de
prezena
anumitor
esteraze
(monooxigenazele), care stau la baza unui mecanism metabolic de rezisten specific, mediat de acestea - detoxifierea.
47
n prezena monooxigenazelor piretroizii sintetici sunt oxidai, ceea ce conduce la anihilarea activitii lor toxice asupra paraziilor (S a m m a t a r o , D i a n a i col., 2005). Aceste monooxigenaze fac parte dintr-un grup mai extins (L e w i s ,
D.F.V., 2001) localizat n reticulul endoplansmatic i este desemnat ca Citocrom P 450 (CYP sau P450). Acestea aparin superfamiliei de proteine care conin cofactorul Hem (hemoproteine).
Denumirea atribuit acestui grup enzimatic se datoreaz localizrii celulare a acestora (cito), dar i caracteristicilor spectrofotometrice (crom) cnd fierul din Hem este redus, P450 absoarbe radiaiile luminoase cu lungimea de und carcteristic de 450 nm.
Reacia de baz prin care Citocromul P450 i manifest rolul catalitic, este tipic monooxigenazelor (oxidare prin introducerea unui atom de oxigen ntr-un substrat organic RH i reducere prin formarea apei cu participarea celuilalt atom de oxigen):
RH + O2 + 2H + 2e
NADH/NADH+ ROH + H2O
La echinoderme a fost evideniat dependena de P450 a metabolismului compuilor piretroidici (B e s t e n , P. J. i col., 1990; B e s t e n , P. J., 1998).
48
n cazul insectelor,
a fost confirmat prezena oxidazelor din complexul
enzimatic microzomal P450, care utilizeaz sistemul NADPH/NADH pentru a cliva reductor oxigenul atmosferic, conducnd la o funciune organic i o molecul de ap (S c h u l e r , M a r y A., 1996; D o n g , K., 2007; S o d e r l u n d , D. M., 2008). Descrierea acestor mecanisme a facilitat explicarea fenomenului de rezisten a parazitului Varroa sp. la piretroizi. Pe baza lor tulpinile rezistente la produii de combatere i-au dezvoltat capacitatea de a detoxifica insecticidele prin oxidare.
Cellalt mecanism al rezistenei poate fi explicat prin mutaiile punctiforme produse la nivelul genei, care controleaz canalele sodiului. Canalele sodiului caracterizate de un potenial electric sunt constituite integral din proteine transmembranare i sunt responsabile de faza de cretere rapid a potenialului de aciune al celulei care face parte din categoria celor cu excitabilitate ridicat. Insecticidele piretroide au efect de reducere a cineticii activrii i dezactivrii canalului sodiului. Consecina direct este deschiderea prelungit a canalelor individuale, ceea ce conduce la paralizia i n final moartea insectelor ce vin n contact cu aceti compui (W a n g , R. i col., 2002; W a n g , R. i col., 2003; W a n g , R. i col., 2003).
Multe dintre insectele ce prezint rezisten la piretroizi au suferit mutaii punctiforme la nivelul genei canalului sodiului.
Teste efectuate asupra oocitelor de Xenopus ce au exprimate canalele sodiului, au demonstrat c aceste mutaii reduc sensibilitatea acestor canale la piretroizi, ceea ce confirm faptul c acesta reprezint mecanismul major de rezisten la piretroizi la diverse specii de insecte (S o d e r l u n d , D.M. i col., 2003).
49
Studii efectuate asupra a 12 specii de insecte (S o d e r l u n d , D.M. i col., 2003; S o d e r l u n d , D.M., 2008) au evideniat o mutaie la nivelul genei IIS6 ce determin rezistena acestor populaii de insecte la piretroizi.
W a n g , R i col. (2003) au reuit s evidenieze gena pentru canalul sodiului de la arahnide gena VmNa i la Varroa destructor O.
Izolarea integral a genei VmNa a reprezentat un moment important pentru caracterizarea complet a modului de funcionare a acestui mecanism de rezisten la produse pe baz de piretroizi.
n cazul fluvalinatului, rezultatele experimentale au condus la concluzia c n vederea combaterii parazitului n condiiile dezvoltrii rezistenei la piretroizi, cea mai bun strategie ar fi utilizarea compusului activ utilizat n tratamente ( fluvalinatul) n alternan cu alte tipuri de compui activi, pentru ca acesta s-i pstreze eficiena (M i l a n i , N . i col., 2002; E l z e n , P a t t i i col., 2004).
Constatri similare au fost enunate i de ali cercettori, pe toate continentele (H u a n g , Y. G. i col., 2001, n China; M a r t i n , S.J., 2004, n UK; S a m m a t a r o , D i a n a i col., 2005 etc.).
Printre soluiile eficiente, pentru folosirea n alternan, se numr substanele: timolul, acidului formic sau acidului oxalic.
n urma unor experimente realizate la scar pilot, cercettorii americani (USDA, 2006) au evideniat posibilitatea utilizrii 2 heptatonei (secretat chiar de albine) n combaterea parazitului.
50
Producerea sintetic a substanei i administrarea ei ca insecticid ar putea constitui o soluie valoroas, att datorit eficienei ct i a faptului c este bioegradabil i nu afecteaz calitatea produselor stupului.
1.2.3. Tropilaelaps clareae

Este un parazit e dimensiuni medii, lungimea 1,03 mm limea 0,55 mm, uor, de culoare maro-rocat. Apis dorsata este gazda sa iniial, iar parazitul se gsete doar n Asia, fiind mai r. Cnd paraziteaz i Apis mellifera efectele asupra acesteia sunt mai dezastroase dect cele produse de Varroa destructor (jacobsoni), albinele infestate prezentnd pete de culoare nchis n principal pe extremiti (B u r g e t t i A k r a t a n a k u l , 1985).
Datorit chelicerelor primitive, nespecializate Tropilaelaps clareae nu este capabil s strpung membranele albinelor adulte pentru a-i procura hrana i din acest motiv se hrnete doar cu hemolimfa puietului, fiind foretice pe cele adulte (G r i f f i t h s , 1988). Ciclul su de via este similar cu cel al Varroa destructor (jacobsoni).
Tropilaelaps clareae este mult mai virulent n regiunile cu clim tropical i subtropical, fiind mai uor de controlat n zonele cu clim temperat.
51
Multitudinea bolilor (peste 30) induse att de virui i bacterii, ct i de protozoare, ciuperci i mucegaiuri precum i a paraziilor care infesteaz populaiile de albine din ntreaga lume, a impus cercettorilor din domeniu gsirea unor soluii suplimentare de combatere a efectului uneori dezastruos produs de acestea. Astfel, tratamentul specific fiecrei maladii, bazat n spe pe antibiotice, pe lng faptul c atrage dup sine riscul contaminrii produselor stupului cu reziduuri i implicit la excluderea acestora de pe pia, produc rezisten n populaiile infestante ceea ce are drept rezultat reducerea eficienei tratamentului.
52
Antonia ODAGIU, Ioan Gh. OROIAN Caracteristici ecopatologice la insecte, abordare molecular. Volumul 1. Apis mellifera L. Bazele genetice le rezistenei albinelor la boli i parazii
CAPITOLUL II
BAZELE GENETICE ALE REZISTENEI ALBINELOR LA BOLI I PARAZII

O examinare atent a diverselor colonii de albine relev nu numai faptul c acestea difer ntre ele prin dimensiune, culoare, organizare, producie de miere i polen etc., dar i prin rezistena la boli sau la aciunea diverilor parazii.
Examenele microscopice au scos n eviden i mai mult faptul c exist o mare variabilitate n ceea ce privete ncrctura unei colonii cu parazii sau ageni patogeni. Mare parte din aceast variabilitate este rezultatul expunerii accidentale a coloniei la aciunea paraziilor, patogenilor, sau a altor componente de mediu care contribuie la scderea mecanismelor de aprare a coloniei mpotriva acestui flagel.
53
Cu toate acestea, variabilitatea observat poate fi i consecina diferenei n ceea ce privete componena genetic a coloniilor.
Diferenele genetice individuale dintre lucrtoare precum i dintre colonii constituie materialul brut pentru creterea albinelor bazat pe selecia speciilor rezistente la boli.
Dei eliminarea riscului apariiei bolilor prin selecie nu este un obiectiv realist pentru cresctori, prin aplicarea seleciei se ajunge la reducerea considerabil a riscului la mbolnviri. Creterea albinelor pe principiile seleciei implic mai multe etape:
I. Coloniile, sau indivizii (lucrtoarele, trntorii, mtcile) sunt evaluate n cadrul populaiei de baz din care este selectat efectivul luat n studiu II. Mtcile coloniilor care prezint caracteristicile dorite sunt selectate pentru a asigura perpetuarea caracteristicilor dorite la generaiile viitoare III. Se practic nmulirea controlat ntre mtcile i trntorii aparinnd efectivului selectat IV. Descendenii noilor mtci sunt evaluai att individual, ct i pe ntreaga colonie.
Dac o proporie suficient de mare a variaiei nsuirilor observate n populaia parental este datorat diferenelor genetice dintre indivizi, descendenii lor vor semna cu prinii i astfel se va obine ameliorarea prin selecie.
54
La albine, variabilitatea genetic a fost demonstrat ca fiind cauza a trei mecanisme generale de rezisten la boli: fiziologic, comportamental i anatomic. Aceste mecanisme pot aciona simultan asupra aceluiai agent patogen sau parazit. De asemenea, un singur mecanism poate aciona asupra mai multor patogeni, parazii, sau asupra ambelor clase.
2.1. MECANISME FIZIOLOGICE

ntr-un fel sau altul, larva ori chiar albina adult sunt sursa unui produs care mpiedec creterea, dezvoltarea sau reproducerea agentului patogen ori a parazitului. Variabilitatea genetic ntlnit n cazul acestui tip de rezisten a fost demonstrat n cazul rezistenei larvelor la loca american i are implicaii n dezvoltarea speciilor rezistente la agentul viral al paraliziei albinelor.
Studii efectuate pe diverse populaii de albine au demonstrat faptul c n coloniile de albine n care diversitatea genetic este mare, incidena bolilor este redus, comparativ cu coloniile n care exist diversitate sczut. Astfel, n coloniile de Bombus terestri L. B a e r i Schmidt-Hempel (2001, citai de T a r p y , D., 2003) s-a observat o intensitate a infestrii cu parazii i o prevalen mai sczut a acestora n coloniile ce prezentau diversitate genetic mare. La baza diversitii genetice crescute st poliandria mtcilor (capacitatea femelei de a se mperechea cu mai mult dect un mascul; albinele, se mperecheaz n medie cu 12 masculi - Strassmann, 2001, citat de T a r p y , D., 2003 -).
55
S-a nregistrat variaie genotipic n rezistena la multe dac nu chiar la toate bolile ce infesteaz coloniile de albine. La genotipuri diferite s-au obinut grade diferite de infestare cu Varroa destructor, Acarapis woodi, Nosema apis (G u z m a n i col., 1996, 1998, W o y c i e c h o w s k i i col., 1994 citai de T a r p y , D.R., 2003).
Cercetrile realizate de T a r p y , D.R. (2003) pe populaii de albine nsmnate artificial au avut drept rezultat creterea diversitii genetice cu efecte pozitive asupra viabilitii puietului i a comportamentului igienic. n conformitate cu prediciile modelului parazit i patogen (S h e r m a n i col., 1988, S c h m i d H e m p e l i C r o i z e r , 1999 citai de T a r p y , D.R., 2003), n coloniile cu diversitate genetic mare prevalena bolilor a fost mai sczut dect n coloniile cu diversitate sczut. Astfel, s-a constatat o inciden mai sczut a puietului vros la coloniile cu diversitate genetic mai mare.
Rmne ns neclar dac poliandria a evoluat la albine ca rspuns la atacul paraziilor i bolilor (Hamilton, 1987; Sherman i col., 1988; Hamilton i col., 1990; Shykoff i col., 1991 a, b, citai de Neumann i col., 1999), sau dac reducerea prevalenei bolilor este rezultatul inevitabil al mperecherilor multiple.
Gradul de dezvoltare larvar ar putea constitui alt posibil mecanism fiziologic al rezistenei larvelor la loca american. Sutter i col., 1968, citat de Page, R.E. i col., 1997 (n Honey Bee Pests, Predators, and Diseases, 475, Morse, R.A. & Flottum, K. Eds., 1997) au demonstrat faptul c larvele rezistente la agentul viral al paraliziei au dimensiuni mai mari dect cele nerezistente pe tot parcursul
56
perioadei larvare timpurii, aceasta fcndu-le probabil mai puin susceptibile la infecia cu spori provenii de la Bacillus larvae.
De asemenea, coloniile cu o dezvoltare mai rapid n aduli (un stadiu post cpcire mai scurt) sunt mai rezistente la Varroa dect cele cu stadii post-cpcire mai ndelungate.
Acest tip de rezisten poate fi considerat drept consecin a timpului scurt pe care l are parazitul de a se dezvolta pn la stadiul adult datorit perioadelor post-cpcire prea scurte (Moritz i Hanel, 1984, n Honey Bee Pests, Predators, and Diseases, 476, Morse, R.A. & Flottum, K. Eds., 1997).
2.2. MECANISME COMPORTAMENTALE
Cel mai cunoscut mecanism comportamental de rezisten la boli i parazii, n cazul albinelor, este comportamentul igienic, descris iniial de Park, O.W. (1937), citat de Morse, R.A. & Flottum, K. Eds., 1997. Practic, este vorba despre dou activiti deosebite realizate n dou etape succesive (L a p i d g e , K.L. i col., 2002), prima implicnd descpcirea, iar a doua eliminarea propriuzis a corpului existent n celul. Rothenbuhler (1964a,b), citat de Morse, R.A. & Flottum, K. Eds. (1997), a presupus faptul c aceste dou activiti sunt controlate de dou mecanisme genetice diferite. El a presupus c fiecare dintre aceste dou activiti este controlat de ctre o gen cu dou alele (fig. 6).
57
Figura 6. Transmiterea comportamentului igienic la Apis mellifera L. (http://members.aol.com/queenb95/genetics.html)
Analiza genetic a comportamentului la insecte a nceput s se dezvolte nc din anii 60, dar iniial s-a limitat n a stabili dac o nsuire comportamental este heritabil sau nu i determinnd daca modul su de transmitere este dominant sau recesiv (Ho y, M.A., 1994).
Dac iniial analiza genetic tradiional a comportamentului la insecte implica doar experimente de ncruciare i selecie, n zilele noastre se face uz de tehnicile geneticii moleculare ce utilizeaz markeri genetici.
58
La Apis mellifera L., termenul de comportament igienic este utilizat pentru a descrie un proces n dou etape realizat de albinele lucrtoare dup detectarea larvelor sau pupelor moarte. Iniial, procesul implic descpcirea (ndeprtarea cerii ce acoper celula), iar apoi ndeprtarea larvelor sau pupelor moarte aflate n celul. R o t h e n b u h l e r (1964) a fost cel care a efectuat un experiment de retroncruciare. Iniia a ncruciat o linie cu un pronunat comportament igienic cu o linie ce nu a prezentat comportament igienic. Coloniile hibride F1 au prezentat comportament neigienic.
Indivizii acestei linii au fost apoi retroncruciai cu indivizi aparinnd liniilor igienice. Coloniile rezultate n urma retroncrucirii au segregat n patru fenotipuri comportamentale conform celei de a doua legi mendeleene. Aceste date l-au determinat pe R o t h e n b u h l e r (1964) s presupun c cele dou componente ale comportamentului igienic (descpcirea i respectiv ndeprtarea larvelor moarte) sunt controlate fiecare de ctre un locus independent. Lucrtoarele homozigote recesive (uu) la locusul descpcirii descpcesc celulele ce conin pupe moarte, n timp ce lucrtoarele Uu sau UU nu decpcesc celulele cu larve moarte.
Lucrtoarele rr la locusul ndeprtrii ndeprteaz pupele moarte din celulele descpcite, n timp ce lucrtoarele Rr i RR nu ndeprteaz larvele moarte. In consecin, Rothenbuhler (1964) a concluzionat c exprimarea
comportamentului igienic necesit ca lucrtoarele s fie homozigote recesive la nivelul ambilor loci (rruu).
Mai trziu, reanaliznd datele obinute de Rothenbuhler, Moritz (1988) a concluzionat c de fapt cel puin trei gene sunt implicate n comportamentul
59
igienic al albinelor. Recent, Lapidge i col. (2002) au demonstrat cu ajutorul tehnicilor moleculare i a cartarii linkage-ului locilor nsuirilor cantitative (QTL quantitative trat loci) faptul c mecanisme mult mai complexe dect s-a crezut stau la baza genetic a comportamentului igienic i se pare c un numr mai mare de gene ar fi implicate n manifestarea acestui caracter. n experimentul efectuat de ei au fost identificai apte loci ai nsuirilor cantitative asociai cu comportamentul igienic.
Acest comportament are o importan extrem de mare n mecanismul comportamental de rezisten la boli (boala puietului vros, loca american, loca european, la infestrile cu Varroa destructor, sau Acarapis woodi fig. 5 etc.).
De asemenea, este demn de subliniat i importana economic a acestui mecanism comportamental de rezisten la boli i parazii, care conduce la reducerea costurilor ntreinerii familiilor de albine, necesitnd o frecven mai redus a tratamentelor n comparaie cu liniile ce nu prezint comportament igienic. n acelai timp se va face mai puin uz de pesticide ceea ce atrage dup sine costuri mai sczute ale ntreinerii familiilor de albine, precum i diminuarea riscului de contaminare a mierii i a celorlalte produse ale albinelor (S p i v a k , Marla i col., 2001).
Metode eficiente de evidenierie a comportamentului igienic al albinelor au fost elaborate abia la sfritul anilor 90 (S p i v a k , M a r l a , 1998). Studiile
privitoare la mecanismele implicate n comportamentul igienic al albinelor, au sugerat c acest tip de comportament constituie o nsuire recesiv (R o t h e n b u h l e r , 1964 citat de S p i v a k , M a r l a , 1998).
60
Cercetri efectuate la Universitatea Minnesota (S p i v a k , M a r l a i col., 2001) utiliznd mtci aparinnd unor linii cu comportament igienic mperecheate pe cale natural au demonstrat faptul c s-au obinut grade mai reduse de infestare cu Varroa i apariia puietului vros la lucrtoarele adulte, pe parcursul unui an, n comparaie cu coloniile care nu au acest comportament, rmnnd nc deschis problematica legat de posibilitatea rezistenei sporite la infestare cu parazii i bolii a albinelor rezultate n urma mperecherii mtcilor aparinnd liniilor cu comportament igienic cu trntori aparinnd aceluiai tip de linii.
A fost studiat efectul compoziiei genotipice a coloniilor de albine asupra comportamentului igienic, n experimente conduse cu ajutorul unor colonii alctuite din albine aparinnd att unor linii cu comportament igienic, ct i unor linii care nu manifest acest tip de comportament n condiiile unui atac cu Varroa destructor (jacobsoni).
Rezultatele experimentelor au demonstrat faptul c performanele igienice au fost mai ridicate n coloniile n care au predominat albine aparinnd liniilor igienice, ceea ce a condus la presupunerea c o imfluena major asupra performanelor comportamentului igienic o are compoziia genotipic a coloniei.
Vrsta la care albinele au comportament igienic variaz n funcie de compoziia coloniei i genotip. Cel mai frecvent albinele au un comportament igienic cu randament maxim nainte de a atinge vrsta mijlocie (17 19 zile), iar vrsta maxim pn la care s-a observat manifestarea acestui comportament a fost de 56 de zile (Arathi, H.S. i col., 2001).
61
Studii efectuate asupra comportamentului igienic la Apis mellifera iberica prin infestare artificial cu Varroa au demonstrat existena unor corelaii pozitive n ceea ce privete comportamentul igienic fa de celulele infestate artificial cu 2 sau 3 parazii (F l o r e s , J.M. i col., 2001).
Cercetrile efectuate de B o e c k i n g , O. i col. (2000) asupra comportamentului igienic la albine, au demonstrat existena unui determinism genetic n ceea ce privete rezistena la loca american, la boala puietului vros i la infestarea cu Varroa destructor (jacobsoni). Au fost obinute valori ale heritabilitii pentru comportamentului igienic egale cu h2 = 0,18 0,27, corelaia genetic dintre rspunsul comportamentului igienic la infestarea cu agenii patogeni a avut valoarea rg = 0,61 0,51, n timp ce corelaia fenotipic a fost rf = 0,11 0,28. Aceste valori au indicat potenialul aplicrii seleciei la coloniile de albine n scopul obinerii unor familii cu rezisten crescut la boli i prazii.
De asemenea, n ultima vreme se bucur de un deosebit interes studiul efectelor comportamentului de curare ntlnit la albinele din colonii cu nivel ridicat de infestare cu Varroa. Peng i col., 1987a,b (Moritz i Hanel, 1984, citai de Morse, R.A. & Flottum, K. Eds., 1997) au artat c lucrtoarele aparinnd speciei A.cerana i cur paraziii de pe corp i i omoar zdrobindu-i ntre mandibule.
n exprimarea omportamentului igienic, un loc central l ocup sistemul imunitar al albinei.
62
Sistemul imunitar al insectelor este mult mai simplu dect cel uman, al crui mecanism nu este nc pe deplin elucidat, n ciuda progreselor tiinifice realizate n ultimele decade (R o i t t i col., 1989, citat de D e n h o l m , C.H., 1999).
O diferen important ntre sistemul imunitar al omului i cel al insectelor este acela c organismul uman i amintete infeciile la care a mai fost supus i n felul acesta poate combate o eventual infecie ulterioar produs de aceeai ageni patogeni, sau parazii. Imunitatea implic producerea de anticorpi specifici constituenilor agenilor patogeni sau paraziilor, astfel c o serie de mecanisme sunt induse n vederea preveniri infeciilor.
Acest tip de imunitate poate fi exploatat prin expunerea organismului uman la ageni patogeni inactivai ceea ce are drept rezultat protecia fa de infecie ca urmare a prezenei naturale a parazitului sau a agentului patogen, fenomen cunoscut sub numele de vaccinare.
Spre deosebire de organismul uman, insectele printre care se numr i albinele, nu produc anticorpi. Astfel, nu este posibil o abordare profilactic a bolilor i paraziilor ce pot constitui o ameninare pentru sntatea acestora.
Din punct de vedere filogenetic, explicaia existenei unui sistem imunitar mai puin evoluat la insecte n comparaie cu mamiferele, se datoreaz faptului c acestea au o via relativ scurt, iar la majoritatea indivizilor reproducerea se realizeaz n primul an de via, n timp ce mamiferele sunt nevoite s supravieuiasc ntr-un mediu mai mult sau mai puin ostil pentru o perioad mult mai ndelungat n vederea asigurrii perpeturii speciei.
63
Cu toate acestea, odat ce B a i l e y i col., 1963 (citat de D e n h o l m , C.H., 1999) au demonstrat c n ciuda infestrii virale, albinele pot tri fr a manifesta semne evidente ale mbolnvirii, s-a emis fie ipoteza existenei unei anumite imuniti antivirale, fie cea conform creia viruii se replic n aa fel nct n final nu se instaleaz infecii evidente.
Un rol important n elucidarea aciunii agenilor patogeni i implicit prevenirea bolilor l au studiile privitoare la genele care codific peptidele antimicrobiene.
Astfel, la Apis mellifera L. a fost pus n eviden bagajul imunitar ce const din patru polipeptide care sunt induse de infeciile cu patogeni i care produc un spectru larg de mecanisme de aprare antibacterian (C a s t e e l s - J o h n s o n , K. i col., 1994).
Polipeptide antimicrobiene (B u l e t , P. i col., 1999) prezente la Apis mellifera L. sunt : Polipeptide bogate n cistin defensinele (fig. 7), respectiv royalizina izolat din lptiorul de matc i defensina izolat din hemolimfa albinelor infectate cu bacterii, ambele fiind codificate de aceea gen polimorfic, defensina 1. Recent a fost pus n eviden o alt gen ce codific o alt defensin la Apis mellifera L., desemnat sub numele de defensina 2 (K l a u n d r y , J. i col., 2005).
VT C DLLSFKGQVNDSA C AAN C LSLGKAGGHCEKGV C ICRKTSFKDLWDKRF

Figura 7. Structura defensinei la Apis mellifera L. (AA) cu evidenierea reziduurilor de cistein cu grad nalt de conservare 64
polipeptide ce conin prolin apidecinele Ia, Ib, II, III; abaecina (fig. 8). O supraproducie de apidecine este nregistrat ca urmare a aciunii
unice a unui mecanism de amplificare codificat genetic (C a s t e e l s J o h n s o n , K. i col., 1994); i polipeptide bogate n glicin (himenoptecinele). Apidecina Ia Apidecina Ib Apidecina II Apidecina III Abaecina G G G G N N N N NRPVYIP NRPVYIP NRPVYIP NRPVYIP Q Q Q Q PRPP PRPP PRPP PRPP HPR HPR HPR HPR I L L I
YVPLPNVPQPG R RPFP T FPGQ G PFNP K IKW P Q G Y
Figura 8. Structura apidecinelor i abaecinei la Apis mellifera L. (AA) cu evidenierea reziduurilor cu grad nalt de conservare
Studii efectuate asupra acestora au condus la izolarea i identificarea structurii lor (C o r n e t , B. i col., 1995) fcnd astfel posibil caracterizarea acestora (R e e s , J.A. i col., 1997; M a r d o n e s , G. i col., 2000), precum i evidenierea precursorilor acestora (C a s t e e l s - J o h n s o n , K. i col., 1994).
De asemenea, studii recente au condus i la evidenierea modului de aciune intracelular a activitii polipeptidelor cu aciune antimicrobian (B r o g d e n , K.A., 2005), exemplificndu-se acest mecanism pentru situaia n care microorganismul gazd este E.coli (fig. 9).
65
Figura 9. Modul de aciune intracelular a polipeptidelor antimicrobiene (dup B r o g d e n , K.A., 2005),
Studii efectuate asupra rspunsului imun al larvelor albinelor n condiiile infestrii cu Paenibacillus larvae (E v a n s , J.D., 2004) au demonstrat existena transcriptelor acestora pe toat perioada experimental, constatndu-se i o intensificare de 24 de ori a suprareglrii aebacinei cnd s-a efectuat inocularea oral experimental cu P. larvae, mai exact n momentul n care bacteria traverseaz epiteliul intestinal al albinelor.
66
S-a constatat c expresia ambelor peptide antimicrobiene prezint circa 1000 variaii n diferitele familii de albine, ceea ce a dus la ipoteza existenei unei componente alelice a expresiei lor.
De asemenea, s-a emis ipoteza conform creia diferenele nregistrate n rspunsul imun al albinelor la infestarea cu aceast bacterie s-ar datora variabilitii genetice dintre colonii (B a c h a n o v a , K. i col., 2002)
Cercetrile efectuate n domeniul imunologiei insectelor s-au intensificat datorit presupunerii c molecule implicate n mecanismele de aprare ale acestora ar putea conduce la producerea unei noi clase de antibiotice (C a s t e e l s , 1990).
Introducerea markerilor moleculari la albine i a tehnicilor adecvate utilizrii lor a condus la elucidarea a o serie de mecanisme ce stau la baza comportamentelor complexe, dar i a unor aspecte legate de evoluia speciei n timp.
Este bine cunoscut faptul c la utilizarea markerilor moleculari n entomologie se recurge fie pentru a transforma un organism cu efecte benefice ntr-unul cu performane i mai bune, fie pentru a transforma un organism cu efecte nocive, ntr-unul cu efecte negative atenuate (A l v a r e z , J.M., 1998).
Prima parte a acestei aseriuni i gsete ilustrarea la Apis mellifera L., n programele MAS puse n practic att cu scopul obinerii unor produse apicole superioare, ct i cu cel al obinerii unor familii mai puternice cu o stare de sntate superioar.
67
La noi n ar au fost efectuate experimente cu scopul identificrii acestui comportament la specia de albine autohtone (Odagiu, Antonia i col., 2006, 2007).
Au fost efectuate cercetri privitoare la rezistena la boli n general i la Varroa destructor O. n particular, pe populaii de albine din stupine situate n cele 10 judee din Transilvania, Alba, Bistria-Nsud, Braov, Cluj, Covasna, Harghita, Hunedoara, Mure, Slaj i Sibiu (fig. 10).
Figura 10. Localizarea zonelor de prelevare a probelor i testare a strii de sntate a albinelor
68
2.3. EVIDENIEREA COMPORTAMENTULUI IGIENIC LA APIS MELLIFERA L. N STUPINE DIN TRANSILVANIA

2.3.1.Metode
Pentru a se obine un tablou general privitor la rezistena la boli n general i la aciunea parazitului Varroa n particular, n stupinele din judeele Transilvaniei sa optat pentru aplicarea metodei chestionarului.
Acesta a fost elaborat de aa manier nct s ofere informaii utile i uor de prelucrat privitoare la tipul de apicultur practicat de ctre apicultor, experiena acestuia, gradul de atac al patogenilor i duntorilor, precum i numrul de intervenii practicate de apicultor pe parcursul unui an.
Chestionarul a fost individualizat i completat de 100 apicultori n judeul Alba, 50 n judeul Bistria-Nsud, 78 n judeul Braov, 213 n judeul Cluj, 50 n judeul Covasna, 115 n judeul Harghita, 45 n judeul Hunedoara, 67 n judeul Mure, 40 n judeul Slaj i 91 n judeul Sibiu.
Colectarea chestionarelor s-a realizat pentru fiecare jude.
69
Au fost selectate stupine n care s-a testat comportamentul igienic al populaiilor de albine. Aceasta s-a realizat cu ajutorul metodei de nepare a celulelor cpcite cu acul de gmlie (S p i v a c , M a r l a , 1998).
CHESTIONAR APICOL Nr. 1. ntrebarea De cnd practicai apicultura ? mai puin de 1 an 11- 15 ani 2 5 ani 16 20 ani 6 10 ani peste 20 ani Ce fel de sistem de apicultur practicai? Pastoral Staionar Mixt Cte intervenii sanitare efectuai pe an ? 0 2 5 intervenii 1 intervenie peste 5 intervenii Facei tratamente profilactice mpotriva parazitului Varroa ? Da Nu
2.
3.
4.
Capacele celulelor proaspt acoperite au fost nepate cu un ac fin. Un procent de descpcire i curare a celulelor de 90% indic prezena comportamentului igienic la populaiile studiate. n fiecare stupin, s-a ales randomizat un stup i de pe o ram cu puiet au fost nepate cte 40 de celule. Dup 24 de ore, au fost numrate celulele descpcite i curate, rezultatul fiind exprimat procentual.
Datele colectate au fost prelucrate statistic cu programul STATISTICA v. 7.0, 1994 2008. Au fost calculai urmtorii parametri statistici: media, eroarea standard
70
a mediei, deviaia standard i coeficientul de variabilitate (C o i e r V i o r i c a i A . V l a i c , 2007; V l a i c A . i col., 2004)
Pentru a mri gradul de ncredere a interpretrii, calculul stastistic a vizat i parametrii asimetriei.
Pentru fiecare reprezentare grafic s-au calculat att boltirea ct i gradul de asimetrie, n funcie de a cror valori a fost apreciat gradul de reprezentativitate a mediei (M e r c e E . i col., 2009).
2.3.2. Rezultate
Rezultatele chestionarului privitoare la experiena cresctorilor de albine demonstreaz faptul c n majoritatea judeelor predomin cresctorii de albine cu experien de 2 5 ani, respectiv 37,70% apicultori n judeul Alba, 25% n judeul Bistria - Nsud, 42,85% n judeul Braov, 45% n judeul Cluj, 57,14% n judeul Covasna, 39,21% n judeul Hunedoara, 67 n judeul Mure, i 44,25% n judeul Sibiu, n timp ce 34,29% n judeul Harghita i 44,41% n judeul Slaj au reprezentat cresctorii cu experien mai mare de 20 de ani (fig.11).
n ceea ce privete tipul de apicultur practicat (fig. 12), apicultorii prefer sistemul pastoral n 37,98% apicultori n judeul Alba, 37,50% n judeul BistriaNsud, 85,72% n judeul Braov, 57,14% n judeul Covasna, 82,16% n judeul Harghita, 51,23% n judeul Hunedoara, 74,12 n judeul Mure, 64,15% n
71
judeul Slaj i 71,22% n judeul Sibiu, n timp ce n judeul Cluj predomin cei care practic sistemul mixt, respectiv 55%.
n ceea ce privete numrul de intervenii pe an, se nregistreaz o proporie mare de apicultori care nu le efectueaz. Cele mai reperezentative valori, n acest sens, au fost: 41,66 % n judeul Bistria-Nsud, 42,15 % n judeul Hunedoara i 44,12% n judeul Slaj.
AB 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
BN
BV
CJ
CV
HR
HA
MU
SJ
SB
Subieci chestionai, %
mai mult de 1 an
2-5 ani
6-10 ani
11-15 ani
16-20 ani
peste 20 de ani
Experiena cresctorului
Figura 11. Experiena cresctorilor de albine prezentat comparativ pe judeele studiate (% din total apicultori chestionai)
72
AB
BN
BV
CJ
CV
HD
HA
MU
SJ
SB
100 90 80 Subieci chestionai, % 70 60 50 40 30 20 10 0 Pastoral Mixt Stationar Tipul de apicultur
Figura 12. Tipul de apicultur practicat, prezentat comparativ pe judeele studiate (% din total apicultori chestionai)
Cea mai mare proporie ns o ocup n toate judeele apicultorii care efectueaz ntre 2 i 5 intervenii pe an, respcetiv 49,51% n judeul Alba, 44,23 % n judeul Bistria-Nsud, 62,12% n judeul Braov, 54,33% n judeul Cluj, 52% n judeul Covasna, 44,98% n judeul Harghita, 45 % n judeul Hunedoara, 58,14% n judeul Mure, 58,14% n judeul Slaj i 62,14% n judeul Sibiu (fig.13). Privitor la tratamentul mpotriva varoozei, acesta a fost practicat n proporie de 100% de ctre toi apicultorii din toate judeele n care a fost distribuit chestionarul (fig.14).
73
AB Subiec i chestiona i, %
BN
BV
CJ
CV
HD
HA
MU
SJ
SB
80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 intervenie 2-5 interventii peste 5 interventii Nr. intervenii
Figura 13. Numrul de intervenii practicate, prezentat comparativ pe judeele studiate (% din total apicultori chestionai)
AB
Subieci chestionai, %
BN
BV
CJ
CV
HD
HA
MU
SJ
SB
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Varoa Parazitul
Figura 14. Tratamentele practicate mpotriva Varroa, prezentate comparativ pe judeele studiate (% din total apicultori chestionai)
74
Rezultatele experimentelor desfurate n cele 10 judee din Transilvania n ceea ce privete comportamentul igienic al albinelor din stupinele analizate (fig. 15 24) au condus la nregistrarea unor valori medii ale procentului de descpcire cuprinse n intervalul 67 78%, cu valoarea medie minim de 67,54% nregistrat n judeul Harghita i maxim de 78,72% n judeul Cluj.
Variabilitatea observat a fost redus, coeficienii de variabilitate avnd valoarea minim de 1,74% n judeul Braov i maxim de 4,26% n judeul Hunedoara (tabelul 1).
Figura 15. Celule descpcite, judeul Alba
Figura 16. Celule descpcite, judeul Bistria - Nsud
Figura 17. Celule descpcite, judeul Cluj 75
Figura 18. Celule descpcite, judeul Covasna
Figura 19. Celule descpcite, judeul Harghita
Figura 20. Celule descpcite, judeul Hunedoara
Figura 21. Celule descpcite, judeul Mure
Figura 22. Celule descpcite, judeul Satu-Mare
Figura 23. Celule descpcite, judeul Slaj
Figura 24. Celule descpcite, judeul Sibiu
76
Tabelul 1. Valorile medii i indicii dispersiei pentru procentul de celule descpcite n cadrul experimentului de testare a comportamentului igienic la albinele din stupinele studiate n judeele din Transilvania Judeul Alba Bistria - Nsud Braov Cluj Covasna Harghita Hunedoara Mure Slaj Sibiu TOTAL Numrul de celule testate 400 400 400 400 400 400 400 400 400 400 4000 s 1,462 2,034 1,213 2,172 1,932 1,628 2,991 1,795 2,095 1,738 1,873 V% 2,049 2,922 1,742 2,759 2,706 2,411 4,260 2,597 2,977 2,233 2,349
X
71,375 69,625 69,625 78,725 71,400 67,548 70,225 69,100 70,350 77,825 71,58
sX
0,231 0,322 0,192 0,343 0,306 0,257 0,473 0,284 0,331 0,275 0,298
Distribuia procentului de descpcire a celulelor n funcie de frecvena rezultatelor conduce la o histogram asimetric, aseriune confirmat i de valoarea coeficientului de asimetrie a lui Pearson = 0,38. Valoarea pozitiv calculat pentru acesta, indic asimetria de dreapta.
n ciuda discontinuitii (nu s-au nregistrat valori ale procentului de descpcire n intervalul 72 76%), datorit gradului moderat asimetric ( = 0,38), se poate aprecia c valoarea medie (71,58%) pe ansamblul judeelor studiate are o reprezentativitate corespunztoare. Proporia de descpcire situat n intervalul 70 72 % este cea mai frecvent (fig. 25).
Distribuia procentului de descpcire a celulelor n funcie de frecvena rezultatelor conduce la o histogram asimetric, aseriune confirmat i de valoarea coeficientului de asimetrie a lui Pearson = 0,38. Valoarea pozitiv calculat pentru acesta, indic asimetria de dreapta.
77
distribuia ateptat (normal) distribuia nregistrat (real)
Frecvena rezultatelor
E = 0,35 > 0
= 0,38
% descpcire Figura 25. Distribuia valorilor medii ale procentului de celule descpcite
n ciuda discontinuitii (nu s-au nregistrat valori ale procentului de descpcire n intervalul 72 76%), datorit gradului moderat asimetric ( = 0,38), se poate aprecia c valoarea medie (71,58%) pe ansamblul judeelor studiate are o reprezentativitate corespunztoare. Proporia de descpcire situat n intervalul 70 72 % este cea mai frecvent (fig. 25 ).
Valoarea kurtosisului (E = 0,35 > 0) ne indic o repartiie leptokurtic, care vine s confirme rezultatul analizei parametrului asimetriei, conform creia valoarea medie a procentului de descpcire (71,58%) pe ansamblul judeelor studiate are o reprezentativitate corespunztoare (fig. 25).
78
Rezultatele obinute demonstreaz c n nici una dintre stupinele studiate, familiile de albine analizate nu au manifestat comportament igienic.
Procentul mediu de descpcire a nregistrat valoarea maxim n judeul Cluj, maximumul nregistrat fiind de 78,72%, situat mult sub limita de 91% de la care familiile de albine se consider c manifest rezisten natural la boli i parazii ca urmare a comportamentului igienic.
Cea mai mic medie pentru procentul de descpcire a fost nregistrat n judeul Harghita, 67,54%.
2.4. MECANISME ANATOMICE

Sturtevant i Revell, 1953 (citai de Morse, R.A. & Flottum, K. Eds., 1997) au artat c speciile de albine difer ntre ele n ceea ce privete capacitatea lor de a reduce numrul de spori aparinnd B.larvae din mierea depozitat produs din siropul de zahr contaminat.
Ei au sugerat c la baza acestui fenomen ar sta mecanismul de filtrare a sporilor prin valva proventricular. Ipoteza acestor cercettori a fost confirmat i de rezultatele cercetrilor realizate de Plurad i Hartmen, 1965 (M o r i t z i H a n e l , 1984, n Honey Bee Pests, Predators, and Diseases, Morse, R.A. & Flottum, K. Eds., 1997), dar cu toate c aceste studii au demonstrat implicaiile
79
variabilitii genetice n procesul de ndeprtare a sporilor, nu au reuit s conduc la concluzii care explic mecanismul propriu-zis.
Ei au mai sugerat i faptul c pe lng aciunea de stopare a invaziei sporilor exercitat de valva proventricular, n reducerea numrului acestora ar mai putea fi implicate i mecanisme bacteriostatice sau bactericide.
Rezultate promitoare n obinerea unor familii de albine cu rezisten crescut la boli au fost nregistrate odat cu identificarea genelor responsabile de sinteza polipeptidelor microbiene, ce alctuiesc echipamentul imunitar al organismului acestora (defensinele, apidecinele, abaecina i
himenoptecina) utilizat contra atacului agenilor patogeni, aspect cu importan crescut odat cu apariia ipotezei conform creia cunoaterea aprofundat a precursorilor i mecanismelor lor de aciune ar putea conduce la producerea unei noi clase de antibiotice. Markerii moleculari utilizai n selecia efectuat n acest scop au devenit deja disponibili i au nceput s fie utilizai n practic.
80
Progresul nregistrat n ultimele decenii n domeniul geneticii moleculare a pus la dispoziia cercettorilor mijloacele suplimentare ce pot fi utilizate cu succes n combaterea bolilor i a duntorilor albinelor. Lund n considerare mecanismele genetice (fiziologice, anatomice, dar mai ales comportamentale) putativ implicate n rezistena la boli i duntori, cercetrile au fost ndreptate n direcia gsirii unor markeri moleculari specifici cu ajutorul crora s se identifice populaii de albine ce prezint rezisten natural, iar pe baza acestora s se ntocmeasc programe de selecie n vederea nmulirii coloniilor ce prezint aceste caractere.
Pe baze experimentale s-a demonstrat faptul c albinele prezint comportament igienic (parte a mecanismelor genetice comportamentale identificate la albine) iar acesta se presupune c ar constitui baza rezistenei la parazii i boli. O determinare exact a numrului, poziiei n genom i a nivelului relativ de influen a locilor ce influeneaz direct comportamentul igienic la Apis mellifera L. se poate realiza cu ajutorul markerilor ADN asociai cu genotipurile igienice.
81
Antonia ODAGIU, Ioan Gh. OROIAN Caracteristici ecopatologice la insecte, abordare molecular. Volumul 1. Apis mellifera L. Markeri moleculari
CAPITOLUL III
MARKERI MOLECULARI ASOCIAI CU REZISTENA LA PARAZII I BOLI LA ALBINE

Genetica hymenopterelor are un istoric de peste 150 de ani (P a g e Jr., R.E. i col., 2002), perioad de-a lungul creia i-a adus contribuia la elucidarea mecanismelor ce stau la baza determinrii genetice a sexului, a evoluiei genomului i nsuirilor adaptative, precum i la determinarea genetic a comportamentului.
n ultimele decade, ca urmare a evoluiei rapide a tehnicilor de biologie molecular i acumulrii de date privitoare la mecanismele rezistenei la boli i parazii s-au nregistrat progrese din ce n ce mai mari n procesele de selecie a albinelor rezistente la agenii patogeni.Tehnicile specifice biologiei moleculare fac posibil localizarea i vizualizarea direct la nivel molecular a markerilor moleculari, precum i a genelor de interes.
82
Markerii moleculari joac un rol esenial n toate procesele de identificare a rezistenei la boli i parazii la insecte n general i albine n particular.
Markerii moleculari pot fi definii ca fragmente de ADN noninformaionale (regiuni hipervariabile de ADN sau introni), sau uneori chiar gene informaionale (gene funcionale) utilizate pentru detectarea segmentelor cromozomiale implicate n manifestarea unui caracter precum i a genelor care stau la baza manifestrii acestora.
Markerii moleculari ideali sunt cei cu polimorfism ridicat, caracterizat prin posesia a dou sau mai multe alele difereniabile, codominante i care pot fi difereniate cu mare uurin. Cu toate acestea, nu toi markerii se preteaz la orice studiu. Potenialele lor aplicaii sunt strns legate de specificul studiului realizat.
n vederea obinerii unor rezultate optime prin utilizarea tehnicilor moleculare efectuate n vederea efecturii studiilor filogenetice, ecologie, evolutive, sau a comportamentelor complexe, markerii moleculari ideali (C r u i c k s h a n k , R.H., 2002), indiferent de specie, ar trebui s corespund unor caracteristici comune:
1. S fie prezeni ntr-o singur copie (sau copii omogene multiple) n genoamele haploide, un marker molecular ideal ar trebui s fie prezent ntr-o singur copie, dei nu este ntotdeauna uor de identificat care marker este cel prezent ntr-o singur copie, iar amplificarea unei singure copii este deseori greu de realizat.
83
Copiile multiple corespund de asemenea unui marker ideal, dac toate copiile prezint aceeai secven, astfel nct rezultatul s fie identic indiferent de copia secvenat. Acestea sunt uor de amplificat i produc benzi consistente, uor de vizualizat.
Exist dou tipuri de gene care se ncadreaz n aceast categorie: genele mitocondriale i genele ribozomale nucleare.
2. S fie uor de aliniat Datorit deleiilor i duplicrii unor regiuni mici de ADN, lungimea unei gene poate varia mult ntre specii, sau chiar ntre rase, motiv pentru care secvenele ar trebui aliniate anterior analizei genetice.
Aceasta este uor de realizat pentru genele ce codific proteinele, datorit breelor produse n mod obinuit n grupuri de cte trei, corespunznd codonilor. La genele ribozomale, care nu sunt traduse n proteine i nu au aceast structur de codon cu trei perechi de baze, alinierea poate s se dovedeasc mai greu de realizat.
Incertitudinea alinierii va conduce la rezultate incerte ale analizei. n aceste cazuri, fie se vor ndeprta regiunile cu alinieri incerte, fie se va utiliza o structur informativ secundar n vederea obinerii unei alinieri cunoscute (G a t e s y i col., 1993, K j e r , 1995, citai de C r u i c k s h a n k , R.H., 2002).
84
3. Toate situs-urile s poat varia n aceeai msur Datorit structurii de codon a genelor ce codific proteinele, doar o treime din situs-uri pot varia liber fr a se altera secvena proteic. Este foarte probabil ca mutaiile care altereaz structura proteic s aib un efect de deleie asupra funciei sale, astfel c aceste modificri, numite substituii nesinonime, sunt nedorite. Din acest motiv doar o treime din situs-urile secvenate se presupune c ar avea valoare informativ.
4.Rata de substituie s fie suficient de ridicat pentru a furniza un numr suficient de situs-uri Markerii diferii evolueaz la niveluri diferite, astfel c este foarte important s se aleag un marker cu o rat de substituie adecvat scopului n care este utilizat. Spre exemplu, n cazul unor specii nrudite, o gen cu un grad nalt de substituire va trebui s acumuleze un numr suficient de mutaii n timpul scurt al evoluiei speciilor respective.
5. Rata de substituie s fie suficient de sczut pentru a evita un numr excesiv de substituii multiple Dac se utilizeaz o gen neadecvat, vor exista situs-uri n care s-au produs dou sau mai multe substituii. Astfel, substituiile ulterioare le vor masca pe cele anterioare. Acest fenomen poart numele de saturaie.
Situaia poate fi exacerbat de echilibrul compoziiei bazelor, care face foarte probabil ca producerea celei de a doua mutaii la un anumit situs s fie reversul strii iniiale (ex. A T, urmat de T A). La genele ce codific proteinele se
85
poate produce o rat foarte mare a substituiilor sinonime dei iniial s-au produs puine substitui nesinonime.
6. Compoziii ale bazelor sensibil diferite Dac compoziia bazelor este echilibrat, vor crete ansele ca aceeai mutaie s se produc de mai multe ori. Aceasta va conduce la creterea homoplaziei, ceea ce poate fi o probleme n cazul genelor mitocondriale, ce au tendina de a fi mai bogate n AT.
7. Compoziie constant bazelor n cadrul aceleai specii Variaiile n cadrul compoziiei bazelor n cadrul aceleai specii poate conduce la probleme n analizele moleculare ale comportamentelor complexe i de filogenie.
8. Existena unor primeri universali Din motive practice, este mult mai uor s se utilizeze aceeai primeri pentru diverse tipuri de analize. Primerii cu aplicabilitate larg au anse mai mari de conservare, reducndu-se astfel posibilitatea producerii mutaiilor la nivelul situsului primer-ului. Cu toate acestea, trebuie evitat utilizarea primeri-lor cu un grad foarte larg de utilizare, pentru c n acest fel se poate ajunge la amplificarea unor secvene nedorite (simbioni, parazii, contaminani din mediu etc.).
Astfel, n cazul studiile efectuate pe albine, este preferabil utilizarea primeri-lor specifici hymenopterelor.
86
9. S fie utilizabili pe scar larg pentru a permite integrarea rezultatelor Utilizarea unor gene care sunt implicate n studii multiple (ecologice, comportamente complexe, filogenie etc.) se dovedete foarte valoroas pentru c se preteaz coroborrii cu rezultatele altor studii conducnd la rezultate fundamentate, cu un grad de siguran superior.
Imposibilitatea ca un singur marker molecular de a satisface toate cerinele unui marker ideal este uor de neles. Astfel, la nivelul markerilor situai pe genele ribozomale alinierea se poate realiza cu dificultate, dar la nivelul acestor gene se gsesc mai multe situs-uri informative dect la nivelul genelor care codific proteinele. Chiar dac regiunile ce nu pot fi aliniate sunt ndeprtate, rmn mai multe situs-uri informative dect cele existente la nivelul genelor de aceeai dimensiune ce au rolul de a codifica proteinele.
Dei ncepnd cu anii 60 principalii markeri moleculari utilizai la insecte au fost alozimele, locul lor fost preluat n ultimii ani de markerii ADN. Aceasta se datoreaz faptului c dei tehnicile ce utilizeaz aceti markeri sunt relativ uor realizabile, ele nu dau informaii dect despre cel mai conservat tip de ADN (ADN-ul codificator).
Tehnicile ce utilizeaz alozime nu sunt capabile s furnizeze date despre variaia genetic existent la nivelul ADN-ului necodificator. La insecte, ns, acest tip de ADN prezint importan datorit faptului c poate constitui de la 30% pn la 90% din genom.
87
ADN-ul necodificator a primit denumirea de junk, selfish, sau parasitic ADN. Este alctuit din segmente nefuncionale replicate de-a lungul
regiunilor cromozomiale cu funciuni vitale.
Pseudogenele, secvenele de ADN repetate n tandem i secvenele de ADN dispersat repetitive ce par s nu aib funcii, dar care totui se acumuleaz ca urmare a crossing-over-ului inegal, constituie exemple de junk ADN (K i n g , R.K. i W.D. S t a n s f i e l d , 2002).
Dac se ncearc o clasificare a markerilor, acetia ar putea fi ncadrai n dou categorii: markeri proteici i markeri ADN (fig. 26).
Att markerii ADN ct i cei proteici au revoluionat tiinele biologice, lrgindule cu mult domeniile de studiu att n domeniul biologiei aplicate ct i a celei pure, gsindu-i utilitatea chiar i n studiile de dinamic a populaiilor i filogenie.
Tehnicile de biologie molecular bazate pe markeri genetici au condus la obinerea datelor de interes ce permit combinarea analizelor de linkage cu datele obinute cu ajutorul cu tehnicilor statistice de ultim or, ceea ce conduce la identificarea tuturor regiunilor de ADN asociate cu fenotipurile complexe, categorie din care face parte i comportamentul igienic.
88
Alozime
Markeri proteici
Izozime
Markeri moleculari RFLP
Minisateliii (VNTR)
Markeri ADN
Microsateliii (SSR)
AFLP
RAPD
Figura 26. Clasificarea markerilor moleculari utilizai n studiile de biologie molecular aplicate la insecte 89
Pe lng tehnicile clasice, au fost dezvoltate i o serie de alte tehnici. Astfel, la albine a fost pus la punct o metod de generare a markerilor variabili n regiuni ale genomului adiacente secvenelor markerilor stabilii cu ajutorul unei tehnici PCR bazate pe tehnica walking chromosome, urmat de o analiza de restricie arbitrar. Aceasta a fost denumit ECAPS (extended cleaved amplified polymorphic site situl polimorfic cu clivaj extins amplificat).
Pentru a putea pune n aplicare aceast tehnic, este ns necesar cunoaterea n prealabil a unor informaii referitoare la secvena de interes (B e y e , M. i col. 2001). n procesele de selecie a albinelor pentru rezistena la boli i parazii, un rol determinant l au att diversitatea genetic existent n cadrul coloniilor ct i comportamentul igienic al acestora.
Tehnologia ADN-ului recombinat i tehnicile moleculare bazate pe Reacia n Lan a Polimerazei au revoluionat studiul geneticii comportamentale, ceea ce a avut o deosebit importan asupra identificrii locilor direct implicai n influenarea comportamentului igienic la albine i a mecanismelor prin care acetia l influeneaz (W i l k e s , K. i col., 2002).
ncercrile de elucidare a mecanismelor implicate n rezistena la boli a albinelor fac uz de tehnicile moleculare ce faciliteaz identificarea i localizarea n genomul albinelor a locilor nsuirilor cantitative (Quantitative Trait Loci QTL). Identificarea QTL necesit alctuirea unei hri de linkage a genomului pe baza locilor markerilor cu polimorfism ridicat. Cartarea locilor care sunt responsabili pentru nsuirile cantitative este dificil de realizat cu ajutorul markerilor moleculari tradiionali (n spe alozimele) datorit faptului c au nivel sczut de polimorfism i nu se gsesc n cantiti suficiente n genom.
90
Din acest motiv sunt preferai markerii ADN, datorit polimorfismului lor ridicat i abundenei acestora n genom. De asemenea, ei prezint avantajul c sunt neutrii din punct de vedere fenotipic, nu prezint efecte de epistazie i sunt codominani (W i l k e s , K. i col., 2002).
Tehnicile uzuale implicate n cercetrile mai sus menionate (RAPD, tehnica microsateliilor, AFLP etc.) se bazeaz pe identificarea markerilor moleculari legai de regiunile ce controleaz domeniile de interes n demersul tiinific condus pentru elucidarea mecanismelor de rezisten la boli i parazii la albine.
Acestea nu sunt altceva dect variante modificate ale reaciei n lan a polimerazei - PCR. Utilizarea lor conduce la obinerea mai rapid a hrilor de linkage, precum i a unei acuratei mai mari n determinarea numrului i localizrii n genom a locilor de interes (QTL) studiai n acest tip de investigaii tiinifice.
3.1. MARKERI PROTEICI

Markerii proteici utilizai n entomologie, att n studiul biologiei paraziilor i agenilor patogeni, ct i a insectelor asupra crora acetia acioneaz sunt reprezentai de izozime i alozime. Aceti markeri au fost utilizai cu precdere pn n momentul apariiei markerilor ADN care au permis atingerea unei acuratei superioare n determinri.
91
3.1.1. Izozimele
Izoenzimele sau izozimele sunt proteine complexe formate din subuniti de perechi polipeptidice ce catalizeaz importante ci metabolice (King, R.C. i Stansfield, W.D., 2002). Ele pot fi definite ca enzime cu funcii similare produse la loci diferii, sau mai simplu, forme multiple ale unei singure enzime. Dei izoenzimele unei anumite enzime catalizeaz aceeai reacie, ele pot prezenta proprieti diferite (ex. pH-ul sau concentraia la care au activitatea maxim poate fi diferit pentru izoenzimele aceleai enzime).
3.1.2. Alozimele
Alozimele sunt markerii proteici cu cea mai larg utilizare. Alozimele unei anumite enzime sunt produii diferitelor alele la un locus specific, sau altfel exprimat, sunt proteine produse de forme alelice la acelai locus. Organismele diploide (2n) pot fi homozigote pe un anumit locus al unei enzime avnd dou copii ale aceleai alele, sau heterozigote avnd alele diferite ce codific variantele aceleai enzime. De aici provine denumirea de alozime.
Att alozimele ct i izozimele au puncte izoelectrice diferite, motiv pentru care pot fi separate electroforetic n gel de amidon, poliacrilamid sau acetat de celuloz utiliznd amestecuri de reacie specifice enzimelor.
Acest proces de separare, dup cum se va vedea n continuare, include patru etape (Loxdale, H.D. i G. Lushai, 1998):
92
Extracia. Cea mai mare parte a enzimelor separate prin electroforez sunt solubile, deci o rupere simpl a pereilor celulari este suficient pentru a le obine n soluie.
Separarea. Proteinele sunt molecule cu sarcin electric ce migreaz n cmp electric, n consecin, proteinele cu masa diferit i proprieti conformaionale diferite vor migra diferit. Un mediu de migrare solid, cum este amidonul sau acrilamida este necesar pentru ca separarea s se menin dup ce a fost ndeprtat cmpul electric. Acest mediu este utilizat pentru separarea moleculelor dup dimensiune i form.
Colorarea. Enzimele pot fi detectate fie prin ncorporarea unui colorant n produsul final, fie pot fi vizualizate direct n lumin UV dac pe parcursul reaciei apar modificri ale fluorescenei.
Interpretarea. Benzile obinute pe gel sunt utilizate pentru a stabili bazele genetice ale fenotipurilor analizate i observate. Alelele separate prin electroforez sunt identificate prin msurarea distanei benzii de la punctul de aplicare (n cazul gelurilor din acetat de celuloz) sau de la partea superioar a gelului (pentru gelurile din poliacrilamid) i compararea lor cu un standard de referin.
Aceti markeri au diverse aplicaii fiind implicai i n studiile privitoare la rezistena la insecticide a duntorilor (Maa & Terriere, 1983, citai de Loxdale, H.D. i G. Lushai, 1998), precum i n evidenierea paraziilor himenopterelor (Walton et al., 1990ab, citai de Loxdale, H.D. i G. Lushai, 1998).
93
3.2. MARKERI ADN

Utilizarea markerilor ADN a permis mari progrese prin furnizarea unor date imposibil de obinut cu ajutorul markerilor proteici (ex. detalii referitoare la secvenele nucleotidice). Astfel, prin examinarea direct a ADN-ului au putut fi identificate gradele nalte de polimorfism, precum i mutaiile, inseriile i deleiile, ceea ce nu este posibil cu ajutorul markerilor proteici.
Analizele ce utilizeaz markeri ADN presupun urmtoarele etape:
Extracia. ADN-ul total este extras din celule prin liz cu ajutorul unei proteaze i separat prin precipitare cu soluie srat de etanol 100%, sau printr-un procedeu simplificat cu Chelex (un agent de chelare polivalent de natur rezinic). Daca extracia s-a efectuat corect, molecula de ADN nu este degradat i este compus din fragmente e dimensiuni mari, 29 100 kb.
Clivarea. ADN-ul extras poate fi tiat de o manier previzibil i reproductibil cu ajutorul enzimelor de restricie (endonucleaze). Acestea recunosc secvene specifice de 4 6 pb lungime i cliveaz ADN-ul de cte ori ntlnesc secvenele respective. n cazul secvenelor ntmpltoare, enzima de restricie care recunoate fragmente de 4 6 pb lungime taie molecula la de ADN la 256 pb n medie. O enzim ce recunoate fragmente de 6 pb lungime va efectua clivajul la fiecare 4096 pb.
94
Separarea i vizualizarea segmentelor de ADN. De obicei, separarea prin electroforeza se efectueaz n gel de agaroz. ADN-ul poate fi vizualizat n UV dup colorare cu bromur de etidiu. ADN-ul genomic clivat parial cu enzime de restricie va aprea ca o pat n gelul colorat cu bromur de etidiu datorit faptului c exist foarte multe fragmente de mrimi diferite.
Pentru a putea fi utilizai, markerii ADN trebuie s posede cel puin dou alele. Doar trei tipuri de secvene de ADN ndeplinesc aceast cerin: Polimorfismele Lungimii Fragmentelor de Restricie (RFLPs Restriction Fragment Length Polymorphisms), Polimorfismele Lungimii Secvenelor Simple (SSLPs Simple Sequence Length Polymorphisms) i Polimorfismele unei singure Nucleotide (SNPs Single Nucleotide Polymorphisms) Markerii ADN cel mai frecvent utilizai pentru identificarea la populaiile de albine a unor markeri moleculari asociai cu rezistena la parazii i boli sunt: RFLP, SSLP (minisateliii i microsateliii), RAPD i AFLP.
3.2.1. Polimorfismele lungimii fragmentelor de restricie (RFLP)

Enzimele de restricie taie moleculele de ADN la nivelul secvenelor specifice de recunoatere. Aceasta nsemn c la tratarea unui fragment de ADN cu o anumit enzim de restricie va rezulta ntotdeauna acelai set de fragmente. Cu toate acestea, nu ntotdeauna se ntmpl aa n cazul moleculelor de ADN genomic, datorit faptului c situs-urile de restricie prezint polimorfism, existnd sub forma a dou alele.
95
Una dintre acestea prezint secvena corect pentru situs-ul de restricie i va fi tiat atunci cnd molecula de ADN va fi tratat cu enzima respectiv, iar cealalt alel avnd secvena modificat enzima nu va mai recunoate situs-ul de restricie. Rezultatul acestei modificri a secvenei const n aceea c cele dou fragmente de restricie adiacente rmn mpreun dou tratarea cu enzima de restricie rezultnd un polimorfism al lungimii. Acesta este un Polimorfism al Lungimii Fragmentelor de Restricie (RFLP) i poziia sa n genom poate fi determinat prin urmrirea transmiterii alelelor sale.
Fragmentele rezultate sunt inserate randomizat n plasmide ce sunt apoi clonate n colonii bacteriene. Fragmente analoge (probe de ADN utilizate n studii desfurate n paralel) provenite de la alte organisme sunt apoi utilizate pentru a evidenia ADN-ul clonat. Odat ce ADN-ul omolog clonat (insertul de ADN care leag probele analoge) este gsit, poate fi utilizat ca prob specific pentru o specie, dup o prealabil izolare i purificare.
Ca urmare a capacitii de detecie a ADN-ului analog pe ambele perechi de cromozomi omologi, tehnicile bazate pe RFLP produc markeri mendeleeni codominani non-epistatici care au o puternic rezoluie genetic datorit numrului mare de combinaii enzim de restricie prob existente.
Se preconizeaz utilizarea markerilor RFLP att n vederea evidenierii rezistenei albinelor la infestrile cu Nosema apis n studiile efectuate de R.N. R i c e (2001) la coloniile de Apis mellifera L. din Australia. De asemenea, utilizarea acestor markeri se consider util pentru secvenierea anumitor regiuni ale genomului de la Nosema apis n vederea diferenierii tulpinilor virulente de cele inofensive (R i c e , R.N. 2001).
96
Dei punerea n eviden la Apis mellifera L. a unor markeri RFLP ce ar putea fi utilizai n vederea identificrii rezistenei la boli i parazii nu a dat nc rezultate, este util menionarea utilizrii acestora n cazul unor microorganisme ce produc mbolnviri.
Astfel, D j o r d j e v i c S.P. i col. (2000) au evideniat infestarea cu Paenibacillus alvei (bacterie ce constituie agentul patogen al paratifozei) att a unor probe de miere, ct i a larvelor de Apis mellifera L. din Australia cu ajutorul markerilor RFLP. Aceast bacterie produce o toxin tiol activat, alveolizina, iar identificarea genei acestei toxine cu ajutorul markerilor RFLP confirm prezena Paenibacillus alvei n coloniile de albine infestate. Cercetrile efectuate pe coloniile de albine din estul Australiei la care s-au nregistrat multe cazuri de paratifoz au fcut uz de Analiza de Restricie a ADN-ului Ribozomal Amplificat (ARDRA) al genei alveolizinei (D j o r d j e v i c S.P. i col. 2000).
Din izolatele de Paenibacillus alvei au fost amplificate fragmentele genei alveolizinei - 16S rRNA (1.555 pb) -, iar RFLP au fost detectate cu enzimele CfoI, Sau3AI i RsaI. Primerii alveozin specifici utilizai pentru amplificarea ADN-ului n vederea evidenierii markerilor RFLP au fost ALV100, respectiv 5 TAAAAAGGGGATGACTGTAT 3 poziiile 1 20 i ALV 101
5AATGAGGAGATGTTCATACA 3, respectiv poziiile 1555 1536. Pentru confirmarea identificarea ampliconului de 1.555 pb separat prin electoforez s-a utilizat PCR semicuibrit cu primerii ALV 102
5CTTGAAAGGAAGGAAAGTAC 3, poziiile 39 58 i ALV 101. Endonucleazele de restricie DraI i HinfI au produs RFLP-uri identice cu cele prezise de soft-ul utilizat, n timp ce profilurile RFLP produse cu ajutorul endonucleazelor de restricie CfoI, RsaI i AluI nu au corespuns cu cele prezise de
97
program. Prezena unui numr mare de RFLP-uri n probele analizate a sugerat faptul c Paenibacillus alvei este o specie genetic eterogen. Utilizarea
enzimelor de restricie DraI i HinfI pentru analiza RFLP-urilor utilizate ca markeri moleculari n vederea identificrii genei 16S rRNA a condus la identificarea cu precizie a prezenei Paenibacillus alvei n probele analizate, asigurnd totodat diferenierea acestei specii de speciile nrudite.
3.2.2. Polimorfismele lungimii secvenelor simple (SSLPs)

Polimorfismele Lungimii Secvenelor Simple sunt profiluri de secvene repetate care prezint variaii ale lungimii, alele diferite conin numere diferite de uniti repetitive. SSLPs pot fi multialelelice, astfel fiecare SSLP poate avea un numr de variante de lungimi diferite. Exist dou tipuri de SSLP: minisateliii i microsateliii.
Minisateliii
Minisateliii, cunoscui i sub denumirea de Numr Variabil al Repetiiilor n Tandem (VNTRs Variable Number of Tandem Repeats) sunt formaiuni n care unitatea repetitiv are o lungime mai mare de 25 pb. Acetia nu sunt rspndii n tot genomul, ci se gsesc n zona telomeric de la captul cromozomilor.
98
Cele mai multe alele ale minisateliilor au dimensiuni mai mari de 300 pb pentru c unitile repetitive sunt relativ mari i tind s se adune mai multe ntr-o singur formaiune.
Conform unor cercetri de dat recent realizate n Australia (R i c e , R.N., 2001), se pare c utilizarea minisateliilor ca markeri moleculari la Apis mellifera L. n vederea identificrii rezistenei la Nosema apis va conduce la obinerea unor informaii mult mai complete dect cele obinute pn la momentul de fa.
Microsateliii
Datorit dificultilor tehnice ntmpinate de procedeele utilizate n biologia molecular, folosirea microsateliilor ca markeri moleculari n studiile efectuate asupra insectelor cu comportament social este de dat recent (E s t o u p i col, 1993, 1994 citat de R o w e i col, 1997).
Microsateliii sau secvenele simple repetate (SSR simple repeat sequence) sunt fragmente de ADN compuse din secvene foarte scurte (2 6 pb) bazate pe repetiii n tandem. Acetia pot fi homopolimeri ('... TTTTTTT ...'), repetiie dinucleotidic ('.... CACACACACACACA .....'), trinucleotidic ('....
AGTAGTAGTAGTAGT...') etc. CACACACACA este secvena cel mai des ntlnit. Datorit aciuni polimerazei, pe parcursul replicrii ADN-ului exist puine anse ca aceste secvene repetate s fie alterate. Se pot crea sau ndeprta copii ale unitilor repetate.
99
Microsateliii au variabiliti foarte mari, motiv pentru care exist lungimi diferite ale aceluiai microsatelit n doi cromozomi diferii. Microsateliii alctuiesc cea mai mare parte a heterocromatinei din jurul centromerului.
Unicitatea lor const n faptul c muli dintre acetia sunt asociai cu locii care conin regiuni codificatoare.
Schimbrile de baze n aceste repetiii se produc mult mai frecvent dect n regiunile codificatoare, iar variaia polimorfismului lungimii poate fi nregistrat.
Exemple de microsatelii: (CA)n repetiie simpl (CAAAC)n - repetiie simpl (CACTG)n - repetiie simpl
O limitare major a SSR const n timpul i costul necesare izolrii i caracterizrii fiecrui locus, atunci cnd nu exist anterior o secven de ADN disponibil. Acest proces necesit construirea i evidenierea unei biblioteci genomice alctuit din fragmente de ADN selectate n funcie de dimensiune cu probe specifice de SSR, urmat de secvenarea clonelor pozitive izolate, sinteza primerilor PCR i testarea (E d w a r d s , K.J. i col., 1996 i O s t r a n d e r E.A. i col., 1992 citai de H a y d e n , M.J. i col., 2001).
Doar dup aceasta poate fi determinat numrul de copii, informaiile pe care acestea le dau i poziia cromozomial a locilor SSR.
100
Economiile semnificative att n ceea ce privete costul ct i timpul ce au putut fi realizate datorit renunrii la evidenierea bibliotecilor de gene, n acelai timp cu obinerea de informaii pentru mai mult dect un locus SSR pentru fiecare clon plasmidic. Au fost ncercate o serie de mbuntiri ale tehnicii utilizrii microsateliilor ca markeri genetici.
Microsateliii s-au dovedit a fi instrumente deosebit de utile n analiza genetic a coloniilor de insecte sociale. Cu ajutorul lor, a fost determinat compoziia genotipic a coloniilor i a fost pus n eviden variabilitatea acestora, ceea ce are implicaii directe asupra stabilirii markerilor genetici implicai n rezistena la boli i parazii.
N e u m a n n i col. (1997) au evideniat genotipul i variabilitatea acestuia la Apis mellifera L. utiliznd 4 loci ai microsateliilor ADN, respectiv A76, A43, A107 i B124.
S o l i g n a c , M. i col. (2004) au alctuit o hart de linkage la Apis mellifera L. tot pe baza microsateliilor. n acest scop, au fost folosii 552 markeri descrii anterior de S o l i g n a c i col., 2003 (citai de S o l i g n a c , M. i col. 2004) alctuii n principal din minisatelii.
Harta genetic obinut de acetia are o lungime de 4061 cm, cu 18% mai mare dect cea obinut de H u n t i P a g e (1995).
Rezultatele ale cercetrilor structurii genetice la Apis mellifera L., varietatea specific bazinului Mediteranean (insulele Baleare, Spania), realizate pe baza polimorfismului microsateliilor au fost evideniate pe probe provenite din 22 de
101
localiti (de la Ra, P. i col., 2003). La aceste probe au fost analizai opt microsatelii polimorfici: B124, A113, A7, A8, A35, A24, A28 i A88.
Analiza structurii genetice s-a efectuat cu ajutorul programului GENEPOP version 1.2 (R a y m o n d , M. i col., 1995, citai de de la Ra, P. i col., 2003)., iar variaia microsateliilor n cadrul unei populaii i ntre populaii cu ajutorul programului FSTAT version 1.2 (Goudet, J., 1995, citat de de la Ra, P. i col., 2003). Rezultatele cercetrii efectuate cu ajutorul microsateliilor au demonstrat c nu exist diferene notabile n cadrul populaiilor dintr-o insul, dar ntre insule exist diferenieri.
Acest tip de analize prezint deosebit importan n cartarea locilor implicai n rezistena la boli i parazii la Apis mellifera L. cu ajutorul markerilor moleculari. Dei implicarea cercetrilor structurii genetice a albinelor i a filogeniei n studiile de genetic molecular privitoare la rezistena la boli este indirect, datele obinute n urma acestor studii contribuie la facilitarea stabilirii markerilor moleculari cu ajutorul crora se vor alctui hrile de linkage i se vor stabili QTL cu rol n mecanismele de rezisten la boli i duntori.
La populaii de Apis mellifera din Costa Rica (S e g u r a , J.A.L., 2000) au fost puse n eviden niveluri ridicate de variabilitate genetic cu ajutorul a doi markeri genetici cu polimorfism nalt evideniai n genom (microsatelitul A7 i regiunea intergenic COI - COII din ADNmt).
Pentru analiza regiuni intergenice mitocondriale COI - COII au fost utilizai primerii 5 TCTATACCACGACGTTATTC 3 i 5
GATCAATATCATTGATGACC 3 legai de poziiile nucleotidice 3090 i 3940,

102
pe baza hrii mitocondriale realizat la Apis mellifera L. de C r o z i e r i C r o z i e r (1993).
Determinarea dimensiunii exacte a alelelor la nivelul microsatelitului A7 cu secvena miez (CT)3(T)7CCTTCG(CT)24 (E s t o u p , A. i col., 1995) s-a dovedit dificil. Aceasta s-a datorat faptului c secvena miez mai sus menionat include repetiii a cte dou i a unei singure nucleotide.
E s t o u p , A. i col. (1993) au pus n eviden la albine (Apis mellifera L.) un set de microsatelii alctuit din repetiii cu predominan perfect, 52 (CT)n i 23 (GT)n la distane de 15 kb i respectiv 34 kb. Aa cum era i de ateptat, autorii au identificat un nivel ridicat de polimorfism intrapopulaional n studiile referitoare la localizarea microsateliilor la Apis mellifera L.
Acestea au o distribuie asociativ i regiunile care le flancheaz sunt suficient de asemntoare pentru a putea permite amplificarea PCR i al alte specii de albine i vor putea fi utilizai n evidenierea QTL implicai n comportamentul igienic al acestora.
Studiile efectuate de acest grup de cercettori (E s t o u p , A. i col., 1995) au fost continuate pe populaii de albine aparinnd la 3 subpopulaii ale Apis mellifera L. cu scopul de a identifica variaia microsateliilor i implicaiile acesteia n structura genetic ierarhic a populaiilor. Dintre cei 75 de microsatelii cunoscui la Apis mellifera L. (E s t o u p , A. i col., 1993) au fost utilizai 12 microsatelii, dintre care apte au fost implicai n toate studiile (A7, A24, A28, A43, A88, A113, B124), iar patru doar n studiul unei singure subpopulaii (A14, A35, A29, A76, i A107).
103
Analizele de linkage au artat c dintre acetia, 11 sunt independeni genetic. Pentru identificarea minisatelilor au fost desemnate perechi de primeri specifici 5- 3. Structura genetic identificat a fost determinat cu ajutorul programului GENEPOP version 1.2. (R a y m o n d i R o u s s e t , 1994, citai de E s t o u p , A. i col., 1995).
Utilizarea acestor microsatelii n studiul de fa a evideniat faptul c aceti markeri ADN pot fi utilizai cu succes n cercetrile privitoare la identificarea variabiliti n cadrul unei specii, dar i ntre specii.
De asemenea, folosirea microsateliilor a confirmat existena i compoziia celor trei ramuri evolutive dup care R u t t n e r i col. n 1978 (citai de E s t o u p , A. i col., 1995) au presupus pe baza analizelor morfometrice c ar fi evoluat subspeciile de albine (A subspeciile africane, M subspeciile din Vestul Europei i C subspeciile asiatice i din Nordul Mediteranei), precum i posibilitatea de a diferenia subspeciile i populaiile din cadrul speciilor.
Cu ajutorul microsateliilor i STMP (H a y d e n M.J. i col., 2001) L a p i d g e i col. (2002) au pus n eviden apte QTL ce influeneaz comportamentul igienic la albine, stabilind un punctaj numeric al nivelului mediu al acestuia. Dintre acetia, ase au prezentat un linkage sugestiv cu locii ce contribuie la exprimarea variaiei fenotipice a comportamentului igienic al albine, iar al aptelea a prezentat un linkage puternic.
Cu toate acestea, n cadrul experimentului nu s-a identificat nici un QTL cu efect major asupra comportamentului igienic, ns se pare c acest comportament este motenit de manier cantitativ.
104
Cercetri efectuate n Australia de ctre R o w e i col. (1997) au descoperit la Apis mellifera apte microsatelii (B7, ED-R, FE1, FE2, FM-F, GJ, HC) i o secven putativ minisatelit (GH-F). Dintre acetia cinci sunt repetiii GA (trei repetiii perfecte, dou imperfecte i una perfect ntrerupt), unul const n repetiii perfecte AT, iar cel de al aptelea este o repetiie mononucleotidic T.
Pentru evidenierea microsateliilor au fost utilizate 12 clone cu sonde (GA)10 i o clon GH pentru evidenierea secvenei putativ minisatelit. Utilizarea microsateliilor n acest caz se datoreaz faptului c pot fi caracterizai i analizai cu uurin. Pentru identificarea minisatelilor i microsateliilor au fost desemnate perechi de primeri specifici 5-3 cu lungimi ntre 110 270 pb pentru microsatelii i 220 pb pentru secvena putativ minisatelit.
Pentru microsatelii au fost utilizate perechile de primeri cu denumirile: B7-f, B7-r; ED2-f, ED2-r; FE1-f, FE1-r; FE2-f, FE2-r; FM1-f, FM1-r GJ-f, GJ-r; HC-f, HC-r, iar pentru secvena putativ minisatelit GM-f i GM-r. Pentru secvenele minisatelit FE1, FE2 i HC primerii nu au fost testai nc. Aceti microsatelii, precum i secvena putativ minisatelit i vor dovedi ulterior utilitatea la identificarea QTL implicai n mecanismele de identificare a rezistenei la boli.
STS (Sequence-Tagged Sites) sunt markeri moleculari adesea utilizai pentru a confirma identitatea grupelor de linkage dintre diferite hri. Un STS reprezint o regiune scurt din genom (cu lungimea de 200 300 pb) a crei secven exact nu se gsete n nici o alt poriune din genom. Aceast unicitate a secvenei se stabilete prin demonstrarea faptului c poate fi amplificat prin PCR.
105
Secvena ADN a unui STS poate conine elemente repetitive, secvene care mai apar i n alte regiuni ale genomului, ns atta vreme ct secvenele situate la ambele capete ale sit-ului sunt unice, se pot sintetiza primeri ADN unici complementari acelor terminaii, apoi se amplific regiunea cu ajutorul PCR i astfel se demonstreaz specificitatea reaciei prin electroforeza n gel produsului amplificat (D o g g e t t , N.A., 1992).
Un exemplu de STS-uri polimorfice poate fi reprezentat de un locus variabil ce conine o secven scurt repetat cum este secvena dinucleotidic repetitiv (GT)n, flancat de dou secvene unice (D o g g e t t , N.A., 1992). Aceste STS-uri sunt markeri moleculari cu un nalt grad de potenial informativ i cu aplicabilitate valoroas n analizele de linkage.
Dimensiunea produsului amplificat pentru STS-ul reprezentat n exemplul nostru de (GT)n va diferi n funcie de valoarea lui n la acel locus, motiv pentru care STS prezint polimorfism. Fiecare individ este purttor a dou copii ale markerului STS, cte una pe fiecare cromozom al unei perechi omoloage i fiecare copie poate avea o valoare diferit pentru n, devenind astfel o alel diferit a STS polimorfic (fig. 27).
5 secven unic GTGTGT GT secven unic 3 (GT)n
Figura 27. Exemplu de STS (Sequence-tagged Site) polimorfic (dup D o g g e t t , N., 1992) 106
Din cei 14 loci STS descrii de H u n t i P a g e (1998) la albine i testai n cadrul experimentului realizat de acetia, doar 3 au prezentat polimorfism n cazul experimentului realizat de W i l k e s K. i col. (2002) n vederea realizrii hrilor de linkage i a determinrii QTL responsabili pentru comportamentul igienic la Apis mellifera L. (W i l k e s K. i O l d r o y d , B., 2002)
n experimentele realizate de H u n t i P a g e civa markeri RAPD au fost convertii n markeri STS (O l s o n i col., 1989 citai de H u n t i P a g e 1995) prin clonarea fragmentelor ce prezentau polimorfism i desemnarea primerilor specifici situai pe secvena nucleotidic terminal a clonei.
Primerul utilizat pentru generarea acestor markeri bazai pe STS a fost stsQl6.58, 5 AGTGCAGCCAGCTACTGAGAG.
S u b r a m a n i a n , S. i col. (2002) au pus la punct un sistem de baz de date a microsateliilor (MRD microsatellite repeats database) care s permit accesul la informaii referitoare la microsateliii din genoamele eucariotelor a cror secvene informaionale sunt disponibile.
MRD stocheaz informaii referitoare la secvenele simple repetate n tandem de k-ori, unde k = 1 6 (de la monomer pn la hexamer). Astfel, este asigurat accesul la informaii referitoare la distribuia microsateliilor aflai n regiunile codificatoare precum i n cele necodificatoare ale genomului.
Se pare c cercetrile efectuate n Australia cu scopul identificrii de markeri moleculari implicai n mecanismele de rezisten a albinelor la Nosema apis au
107
condus la concluzia c utilizarea microsateliilor n acest scop ar da rezultate pozitive, n majoritatea cazurilor.
Mai mult, se preconizeaz aceti markeri au un potenial ridicat pentru a fi folosii pentru a face distincie ntre speciile virulente i cele nevirulente ale Nosema apis ce infesteaz coloniile de Apis mellifera L. (R i c e , R.N., 2001).
PCR este o tehnic ce s-a dovedit indispensabil n evidenierea STS (sequencetagged sites), markeri moleculari ce constau din secvene scurte de ADN (200 500 pb) ce iniial au fost identificate n genomul uman i au proprietatea c se gsesc doar ntr-o anumit zon a genomului i ntr-o singur copie. Ele provin din ADNc (www.hyperdictionary.com).
Ulterior, aceti markeri au fost utilizai i la alte specii, la albine fiind implicai n studiile de identificare a comportamentului igienic (L a p i d g e , K.L. i col., 2002). Utilizarea STG faciliteaz identificarea QTL n genomul Apis mellifera L. i alctuirea hrilor de linkage (H u n t G.J., 1997 citat de L a p i d g e , K.L. i col., 2002).
D o g g e t t , N. (1992) prezint un exemplu a modului n care un locus variabil ce conine o secven scurt repetat, cum este dinucleotida (GT)n flancat de dou secvene unice, poate deveni STS (fig. 27). Dimensiunea produsului amplificat pentru acest STS va diferi n funcie de valoarea lui n la locus-ul respectiv, deci STS este polimorfic. Fiecare individ este purttor a dou copii ale marker-ului STS unul pe fiecare cromozom al unei perechi omoloage i fiecare copie poate avea o valoare diferit a lui n constituind astfel o alel diferit a STS polimorfic.
108
STS este un marker polimorfic ce se transmite la descendeni (fig. 28). n gelul obinut n urma electroforezei sunt evideniai produii PCR pentru fiecare STS a fiecrui membru al familiei. Cele dou alele ale tatlui sunt diferite de cele dou alele purtate de mam, iar descendenii motenesc cte o alel a STS de la fiecare printe (fig. 28 i 29).
Prini
Descendeni
Figura 28. Transmiterea la descendeni a STS (dup D o g g e t t , N., 1992)
1 Lungimea fragmentului 154 150 146 -
140 -
Figura 29. Gelul de electroforez al produilor PCR ai STS polimorfici (dup D o g g e t t , N., 1992) 109
3.3.3. Polimorfismul lungimii fragmentelor de adn amplificate (AFLP)
Acest tip de markeri sunt de fapt forme modificate ale RFLP, n care este evideniat prezena sau absena fragmentelor de restricie i nu diferenele dintre acestea n ceea ce privete lungimea lor.
Din acest motiv, nu este posibil identificarea imediat a formei homo- sau heterozigoiei unui locus din prezena sau absena unei benzi pe gelul de electroforez. ADN-ul genomic este evideniat prin utilizarea unui situs comun i rareori cu ajutorul unei enzime specifice care cliveaz situs-ul la un anumit locus.
Secvenele nucleotidice adaptoare sunt ligate n aceste fragmente de ADN. Aceste secvene AFLP constau din dou pri, o aa-zis secven miez i o secven enzimatic specific. Daca aceste dou situs-uri se gsesc la o distan convenabil pentru amplificare, n urma amplificrii PCR se produc cantiti discrete de ADN. Polimorfismele sunt amplificate i vizualizate n gel de poliacrilamid utiliznd autoradiografia.
Markerii AFLP sunt utilizai cu predilecie pentru a face distincie ntre organisme cu grad de nrudire foarte apropiat, inclusiv liniile izogene.
Diferenele dintre lungimile fragmentelor generate cu ajutorul tehnicii care implic markerii AFLP pot fi identificate pe baza modificrii bazelor aflate la nivelul situs-ului de restricie, ori a inseriilor sau deleiilor din fragmentul respectiv de ADN.
110
Markerii AFLP trebuie tratai de obicei ca markeri dominani, pentru c identitatea homo- sau heterozigoilor nu poate fi stabilit dect dac studiile de pedigre sunt conduse n vederea determinrii schemelor de transmitere a echipamentului genetic sau a unei anumite nsuiri sau grupuri de caractere, de la prini la descendeni, pe fiecare band obinut n gelul de electroforez (A m a d o r , D.M., 2001).
Avantajele utilizrii markerilor AFLP constau n faptul c permit vizualizarea seturilor de fragmente de restricie cu ajutorul PCR fr cunoaterea prealabil a secvenei nucleotidice, precum i n aceea c prin utilizarea lor este posibil coamplificarea specific a unui numr mare de fragmente de restricie, de obicei ntre 50 i 100.
n comparaie cu alte tehnologii care utilizeaz markeri genetici, de exemplu RAPD, RFLP sau microsateliii, AFLP ofer aceeai performan sau chiar una superioar n termenii reproductibilitii, rezoluiei i eficienei n timp.
Cu toate aceste nsuiri, markerii AFLP au devenit un standard molecular cu un spectru larg de aplicabilitate pretnu-se la investigaii din domeniul sistematicii pn la cele de genetica populaiilor, (V o s , P. i col., 1995, S a v e l k o u l , P.M.H. i col., 1999).
Identificarea AFLP la Apis mellifera L. prezint particulariti specifice speciei. Din acest motiv, protocolul de baz utilizat n vederea identificrii acestui tip de polimorfism a fost simplificat i optimizat, efectundu-se o serie de modificri
111
att n procesul de digestie a ADN-ului, ct i a enzimelor de restricie i a gelului n care se efectueaz migrarea electroforetic.
De asemenea, vizualizarea s-a fcut cu bromur de etidiu i nu prin autoradiografierea primerilor marcai. n acest fel s-a obinut o reproductibilitate ridicat a benzilor obinute prin electroforeza produilor PCR i o sensibilitate sczut la condiiile de amplificare (Suazo, A. i col., 2004)
3.3.4. Polimorfismul ADN-ului amplificat la ntmplare (RAPD)

Polimorfismul ADN-ului amplificat la ntmplare (RAPD) reprezint
polimorfismul unei secvene nucleotidice utiliznd un test bazat pe amplificarea ADN-ului n care se face uz doar de o secven nucleotidic aleas arbitrar, uneori palindromic.
Aceast evideniere a polimorfismului ADN-ului amplificat la ntmplare implic utilizarea unui primer scurt, alctuit cel mai frecvent din 10 baze nucleotidice. Acesta se leag de ADN-ul genomic n dou sit-uri diferite pe catene opuse ale matriei de ADN, la o distan de circa 3000 pb.
Daca aceste dou situs-uri se gsesc la o distan convenabil pentru amplificare, n urma amplificrii PCR se produc cantiti discrete de ADN. Benzile sunt vizualizate cu bromur de etidiu (W i l l i a m s i col., 1990).
112
Prezena fiecrui produs de amplificare conduce la identificarea complet sau parial a omologiei secvenei nucleotidice dintre ADN-ul genomic i primerul oligonucleotidic la fiecare terminaie a produsului de amplificare.
Fiecare primer va dirija amplificarea mai multor loci n genom, fcnd din acest test o cale eficient de evideniere a polimorfismului secvenelor nucleotidice la diferii indivizi.
n acest caz, un anumit fragment de ADN care este generat doar pentru un individ i care nu coincide cu cel generat pentru alt individ prezint un polimorfism caracteristic al ADN-ului respectiv, putnd fi astfel utilizat ca marker genetic. Aceti markeri sunt transmii la descendeni pe cale mendeleean (T i n g e y i col., 1993).
Principalul avantaj al acestei tehnici const n aceea c nu necesit cunoaterea detaliilor referitoare la secvena de ADN.
De asemenea, aceti markeri prezint i avantajul c utilizarea lor nu implic o tehnic sofisticat i nici costuri ridicate, conducnd n acelai timp la obinerea unor date cu un grad de complexitate superior n comparaie cu cele obinute cu ajutorul altor markeri (W e e d e n i col., 1993).
Hunt i Page (1995) au alctuit o hart de linkage la Apis mellifera L pe baza markerilor RAPD, ceea ce a condus la reale progrese n procesul de identificare de markeri moleculari asociai cu rezistena la boli i parazii.
113
Harta a constat n 26 grupuri de linkage i conine gena malatdehidrogenazei (Mdh-1), gena culorii negre corporale (blk) i locusul major al determinrii sexului la albin (locusul X), fiind alctuit pe baza segregrii a 365 markeri RAPD utiliznd descendena haploid de sex masculin a unei singure mtci.
Markeri RAPD au fost generai cu ajutorul PCR n conformitate cu metoda elaborat de Williams i col. (1990), cu aproximativ 2,8 loci cartai la fiecare primer 10-nucleotidic utilizat n PCR.
n experimentul efectuat de ctre acetia, a fost utilizat un mascul haploid (16 cromozomi) i o femel diploid (32 cromozomi), provenii din stupine comerciale din California, n vederea obinerii unei mtci F1.
Aceasta a fost apoi introdus ntr-o colonie, iar 94 dintre descendenii ei masculi (haploizi) au fost utilizai n vederea analizelor de linkage. S-a preferat utilizarea populaiei haploide pentru a evita pierderile de informaie cauzate de dominana markerilor RAPD.
Au fost evideniai 1000 primeri pentru cei doi prinie F ct i pentru matca F1. Markerii RAPD au fost denumii dup denumirea primer-ului urmat de o linie i dimensiunea aproximativa, exprimat n kilobaze.
Secvena
primerilor
utilizai
pentru
markerii
RAPD
fost
AGTTGACAGAGATTAC i 5 - GCAGCCAGAATATAAGACGCTGTT.
Analizele de linkage au fost efectuate cu ajutorul programului MAPMAKER software version 2.0. Rezultatele experimentale au demonstrat c markerii RAPD
114
pot furniza date demne de ncredere n procesul e cartare a organismelor haploide n condiiile evidenierii i seleciei corecte a primerilor.
Datele obinute sunt similare celor evideniate de Dietrich i col. n 1992 (citai de Hunt i Page, 1995) care au reuit s realizeze o hart de linkage la oarece pe baza SSR.
De o deosebit importan este asocierea dintre markerii genetici i locii nsuirilor cantitative (QTL).
QTL reprezint regiuni ale genomului ce au un efect msurabil asupra unei nsuiri investigate. Analizele QTL au scopul de a calcula statistic o asociere dintre expresia unei nsuiri de interes i un grup de markeri genetici.
Cartarea QTL necesit existena prealabil a unei hri de linkage a genomului alctuit pe baza locilor markerilor polimorfici, precum i o variaie msurabil a nsuirii studiate n cadrul sau ntre populaii ori specii (Falconer i Mackay 1996 citai de Wilkes i Oldro yd, 2002).
Metodele de identificare a QTL au stat la baza studiului bazelor genetice ale schemelor comportamentale complexe, din care face parte i comportamentul igienic la Apis mellifera L.
n vederea identificrii mecanismelor implicate n comportamentul igienic la Apis mellifera L., Wilkes i Oldro yd (2002) au realizat experimente n care cu ajutorul mai multor tipuri de markeri ADN, printre care i markeri RAPD, au ncercat s evidenieze numrul de gene care influeneaz comportamentul igienic
115
la Apis mellifera L., nivelul relativ de influen al acestor gene, precum i localizarea lor n genom.
Harta de linkage a fost efectuat pe baza markerilor RAPD i microsateliilor la 119 trntori. Markerii RAPD au ocupat 3110 cm n cadrul a 26 grupuri de linkage, cu distana medie dintre markeri de 9,5 cm. n condiiile n care dimensiunea genomului a fost estimat la 3450 cm (Hunt i Page, 1995).
Dei o mare parte din markerii RAPD utilizai de Hunt i Page (1995) au fost utilizai i n acest experiment, a fost imposibil identificarea grupurilor de linkage individuale comune celor dou hri.
Aceasta era i de ateptat innd cont de faptul c locii markerilor produc benzi diferite i prezent niveluri diferite de polimorfism n ncruciri diferite. Analizele de linkage au fost efectuate cu ajutorul programului
MAPMARKER/EXP v3.0 software, PC version (Lander et al., 1987; Lincoln et al., 1992, citai de Wilkes K. i Oldro yd, B., 2002).
Genernd markeri RAPD, alturi de microsatelii i STS, Lapidge i col. (2002) au alctuit o hart de linkage a locilor nsuirilor cantitative asociate cu comportamentul igienic la Apis mellifera L. Lapidge K.L. i Oldro yd B.P. (2002) au efectuat experimentul utilizat iniial de Rothenbuhler (1964) dar au fcut uz de nsmnarea artificial (Spivak i Gilliam, 1998).
Dei conform studiilor lui Rothenbuhler (1964) sau a celor realizate de Moriz (1988) s-ar fi ateptat s obin 2 sau respectiv 3 markeri, autorii acestui studiu au reuit evidenierea existenei a 6 markeri ce au prezentat un linkage sugestiv
116
pentru locii care contribuie la variaia fenotipic global legat de comportamentul igienic i unul care a prezentat un linkage puternic i un LOD semnificativ cu valoarea de 3,37.
Existena acestor apte markeri rmne ns de confirmat prin cercetri ce urmeaz a fi efectuate n continuare. Astfel, utilizarea markerilor RAPD a confirmat faptul c baza genetic a comportamentului igienic la albine este mult mai complex dect s-a crezut iniial i c mai multe gene sunt implicate n determinarea acestei nsuiri.
Cercetri efectuate la Departamentul de cretere a albinelor de la Institutul de Cercetare a Animalelor Mici de la Gdll, Ungaria (Hidas, A. i col., 2004) n vederea studierii toleranei diferite a populaiilor de albine din Ungaria la infestarea cu Varroa destructor, au utilizat markeri RAPD.
Analiza molecular a demonstrat existena unei variabiliti reduse n cadrul unei colonii, ceea ce a permis utilizarea ca prob a unui numr redus de indivizi dintro colonie. Markerii RAPD s-au dovedit eficieni n evidenierea rezistenei familiilor de albine studiate la Varroa.
117
3.2. UTILITATEA IMPLEMENTRII MARKERILOR MOLECULARI N STUDIUL REZISTENEI LA BOLI I PARAZII LA APIS MELLIFERA L.
Este bine cunoscut faptul c la baza mecanismului genetic de rezisten a albinelor la boli i duntori, st comportamentul igienic al acestor insecte (paragraful 2.2., pag. 47).
La insecte, majoritatea comportamentelor pot fi caracterizate fcnd uz de instrumentele caracteristice nsuirilor cantitative (ex. agresivitatea, inteligena etc.). La albine, n particular, nvarea i inhibiia latent, agresivitatea, precum i comportamentul igienic se ncadreaz, de asemenea, n categoria acestor nsuiri cantitative.
O nsuire motenit cantitativ este determinat de un numr de gene care acioneaz mpreun. nsuirile cantitative prezint o variaie ce descris de curba gaussian. Un locus al unei nsuiri cantitative (QTL) poate fi definit ca o zon cromozomial despre care se crede c regleaz fenotipul unui organism pentru respectiva nsuire cantitativ.
Pentru a realiza o analiz a nsuirilor cantitative urmtoarele aspecte trebuie clarificate: numrul genelor care influeneaz exprimarea nsuirii cantitative studiate; care este nivelul de influen al fiecrei gene asupra nsuirii; unde sunt localizate genele pe cromozom;
118
care este rolul fiecrei gene.
Sunt necesare dou categorii de informaii n vedere realizrii unei analize QTL: 1. Hart de linkage a genomului speciei studiate. 2. Utilizarea unei metode adecvate n vederea msurrii modului de variaie a comportamentului la animalele studiate.
Este necesar i efectuarea unui experiment de mperechere a animalelor a cror comportament a fost msurat i care au fost genotipizate, cu analiza acelorai parametri i la descendenii acestora.
Pentru prezenta mecanismul de analiz QTL trebuie s se in cont de faptul c la majoritatea animalelor cromozomii sunt n perechi. ntr-o anumit zon cromozomial, secvenele ADN ale markerilor utilizai variaz ntre dou copii ale cromozomului. Pe parcursul meiozei, se produce crossing-over-ul i segmentele cromozomiale se schimb ntre ele, rezultnd recombinarea genetic.
Spre exemplu, dac exist doi markeri genetici diferii n cromozom, sunt anse mari ca recombinarea s se produc dac acetia sunt situai la distan mare unul de altul, ansele fiind mici dac sun apropiai.
Dac genele care regleaz comportamentul studiat sunt apropiate de marker ele vor sta legate de marker pe parcursul recombinrii. Dac sunt situate la distane mari, probabilitatea ca acestea s rmn legate de marker este sczut.
Localizarea QTL poate contribui i la determinarea identitii genei ce influeneaz comportamentul studiat. n acest caz, problema const n faptul c
119
localizarea QTL nu este cunoscut cu exactitate. Progresele tiinifice nregistrate pn la momentul de fa ofer date care arat doar localizarea ntre doi markeri (C h a n d r a , S.B.C. i col., 2001).
Aceast problem poate fi rezolvat prin secvenarea poriunii de cromozom situat ntre cei doi markeri (n amonte upstream dinspre unul i n aval
downstream dinspre cellalt). Acest lucru este posibil tehnic, dac distana dintre cei doi markeri nu este prea mare.
Comparnd secvenele de ADN cu secvenele genelor cunoscute se poate determina identitatea genelor dintre markeri. Astfel, se pot emite ipoteze privitoare la genele situate n zona QTL ce au efect asupra comportamentului.
Pentru a stabili existena corelaiilor dintre variabilitatea comportamentului studiat i markerii utilizai se folosesc programe special elaborate n acest scop (F l i n t , J., 2003, citat de B r e e d , M.D., 2003).
Dac se urmrete o familie inclus n experiment (femela, masculul i descendenii lor), iar nivelul de manifestare a comportamentului este ntotdeauna ridicat atunci cnd este prezent un anumit marker i ntotdeauna sczut cnd este prezent alt marker, este foarte probabil ca gena ce controleaz respectivul comportament s fie n apropierea acelui marker, pe cromozom.
Dac variaia comportamentului este mai mult sau mai puin ntmpltor legat de prezena marker-ului, ntre comportament i zona cromozomial respectiv exist linkage sczut, sau nu exist. Nivelul asocierii dintre comportament i
120
localizarea pe cromozom a genei care l guverneaz poart numele de punctaj LOD (M c C l e a n , P., 1998).
Cea mai mare parte a nsuirilor cantitative, inclusiv nsuirile comportamentale, au punctaje LOD mari pentru dou pn la patru localizri cromozomiale n genomul unui organism. Cu ct punctajul LOD are o valoare mai mare, cu att se pare c este mai mare importana genei ce regleaz comportamentul respectiv.
Cu ajutorul Metodei Punctajelor LOD se pot calcula distanele de linkage. Aceast metod a fost introdus de N.E. M o r t o n i este o abordare iterativ n care sunt calculate o serie de punctaje LOD pentru un numr dat de distane de linkage (M c C l e a n , P., 1998).
Principiul metodei const n estimarea unei distane de linkage, a crei valoare va fi utilizat pentru calcularea probabilitii produceri unei anumite secvene. Aceast valoare va fi mprit la valoarea probabilitii producerii secvenei presupunnd c genele nu sunt linkate. Apoi, se calculeaz logaritmul acestui raport, valoare ce reprezint punctajul LOD pentru distana de linkage estimat.
Se utilizeaz formula:
probabilitatea producerii unei secvene cu o valoare de linkage dat Punctaj LOD = z = log probabilitatea producerii unei secvene fr linkage
121
Metoda impune folosirea mai multor astfel de distane de linkage la care se aplic formula de mai sus i astfel se ajunge la obinerea a mai multor astfel de punctaje LOD. Distana de linkage pentru care s-a obinut cel mai mare punctaj LOD este considerat estimata distanei de linkage.
Aceast modalitate de calculare a distanelor genetice, cu ajutorul creia se poate determina punctajul LOD a fost iniial utilizat pentru msurarea linkage-ului la nivelul genomului uman.
Progresul tiinific continuu a condus la extinderea utilizrii acestei metode nu numai la genomul animal ci i la cel vegetal. Astfel, punctajul LOD a devenit un instrument util n determinarea QTL ce guverneaz comportamentul igienic, ce st la baza mecanismului rezistenei la boli i parazii la Apis mellifera L.
Importana metodei punctajului LOD este evideniat i de utilizarea pe scar larg a algoritmilor ce stau la baza calculelor ce sau la baza acestei metode i n pachetele soft folosite pentru cartrile genetice.
Un exemplu l constituie programul MAPMAKER, de care se face uz n cercetrile de cartare (M c C l e a n , P., 1998)
122
3.3. GENE UTILIZATE N STUDIUL COMPORTAMENTELOR COMPLEXE LA ALBINE
Din multitudinea de markeri proteici i ADN identificai la insecte (L o x d a l e , H.D. i col., 1998) majoritatea sunt utilizai i la albine.
Studiul acestor markeri este posibil datorit rezultatelor cercetrilor privitoare la genomul Apis mellifera L. efectuate pe plan mondial, se cunoate att secvena complet a ADN-ului mitocondrial (fig. 30), ct i genomul (C r o z i e r , R.H. i C r o z i e r Y.C., 1993; www.sci-ed-ga.org).
Au fost utilizate urmtoarele notaii: Genele pentru RNAt - o singur liter pentru aminoacizii corespunztori Genele RNAt cu asteriscuri corespund celor de la D. yakuba. Genele codificatoare ale proteinelor - COI Genele ce codific subunitile 1, 2 i 3 ale citocromoxidazei c - COlll Genele pentru citocrom b - Cyt b Genele ce codific subunitile 1 6 i 41 ale NADHdehidogenazei - NDI-6 i ND4L Regiunea bogat n AT despre care se crede c ar conine originea replicrii pe baza organizrii mitocondrale a ADN-ului la D.melanogaster (G o d d a r d i
123
M O l s t e n h o l m e 1978, 1980, citai de C r o z i e r , R.H. i C r o z i e r Y.C., 1993) - AT
Figura 30. Harta genomului circular la Apis mellifera L. (dup Crozier, R.H. i Crozier Y.C., 1993)
Direcia de transcripie pentru fiecare regiune codificatoare este indicat prin sgei. ADN-ul mitocondrial la Apis mellifera L. are o lungime de 16.343 pb i cuprinde 22 de gene pentru ARNt.
n comparaie cu Drosophila melanogaster, 11 dintre genele ADNt sunt situate n poziii diferite, dar celelalte ocup aceleai poziii.
Codul genetic identificat la Apis mellifera L este identic cu cel decodat la Drosophila melanogaster, dar difer anticodonii pentru doi ARNt (Crozier, R.H. i Crozier Y.C., 1993).
124
Markerii moleculari implicai n studiile filogenetice, evolutive, ecologice sau ale comportamentelor complexe la albine sunt situai la nivelul unor gene situate la diverse niveluri celulare.
Regiunile necodificatoare Acestea includ regiunea mitocondrial de control, intronii genelor nucleare i regiunile spaiului transcripional intern al genelor ribozomale nucleare. Pentru c aceste regiuni se afl sub o presiune de selecie sczut tind s evolueze rapid i sunt utilizate doar n studiile efectuate la speciile nrudite.
Datorit
ratei ridicate de substituie, la nivelul acestor gene se observ
heterozigoie, motiv pentru care este necesar clonarea produilor PCR naintea secvenrii.
Genele mitocondriale Datorit faptul c se gsesc ntr-un numr mare de copii sunt mult mai uor de utilizat dect genele nucleare existente ntr-o singur copie, iar transmiterea caracterelor acestora strict pe cale matern are mare utilitate la nivel intraspecific. Genele mitocondriale sunt de dou categorii: gene ribozomale i gene ce codific proteinele. Exist dou gene mitocondriale ribozomale, 12S ADNr i 16S ADNr, care nu sunt separate prin spaii transcripionale interne.
n general, poziia a treia a genelor ribozomale ce codific proteinele evolueaz mai rapid dect genele ribozomale, dar pot fi utilizate cu rezultate bune primele dou poziii ale acestora.
125
Una dintre problemele poteniale n utilizarea genelor mitocondriale const n faptul c pot fi transferate din regiunea mitocondrial n cea nuclear. Aceste gene, numite numts (nuclear copies of mitochondrial genes copii nucleare ale genelor mitocondriale) sau pseudogene mitocondriale, pot fi amplificate i secvenate din greeal, conducnd astfel al erori.
Dei nc nu s-a semnalat existena acestora n studiile de specialitate la Hymenoptere, este util s se in seama de existena lor pentru a se putea evita eventualele erori induse de prezena lor. B e s a n s s o n , D. i col. (2001) a elaborat o serie de strategii pentru identificarea i utilizarea acestor pseudogene mitocondriale.
Gene nucleare codificatoare ale proteinelor Aceste gene au un grad nalt de substituie i pot fi utilizate n diverse studii moleculare. Una din marile probleme pe care le ridic ns utilizarea lor este paralogia. Ele pot fi adesea duplicate i n acest fel nu se poate tii cu exactitate care copie a genei a fost secvenat.
Datorit faptului c aceste gene au o structur intron/exon , vor putea fi desemnai primeri cu un grad nalt de conservare pentru exonii ce vor amplifica secvenele, contracarnd astfel efectul intronilor cu variabilitate ridicat. Aceast situaie este desemnat prin EPIC (exon primed intron crossing) i constituie o surs de markeri nucleari cu variabilitate ridicat utilizai n studiile specifice.
126
Dei n practic nu se ntlnesc markeri moleculari ideali care s ndeplineasc simultan toate nsuirile dorite (s fie prezeni ntr-o singur copie, sau copii omogene multiple i uor de aliniat; toate situs-urile s poat varia n aceeai msur; rata de substituie s fie suficient de ridicat pentru a furniza un numr suficient de situs-uri; rata de substituie s fie suficient de sczut pentru a evita un numr excesiv de substituii multiple; s aib compoziii ale bazelor sensibil diferite i compoziie constant bazelor n cadrul aceleai specii; s existe pentru acetia primeri universali i s fie utilizabili pe scar larg pentru a permite integrarea rezultatelor), la nivelul regiunilor necodificatoare, a genelor mitocondriale i a celor nucleare codificatoare ale proteinelor au fost localizai markeri care le ndeplinesc pe majoritatea i sunt utilizai cu rezultate bune n MAS.
127
Din multitudinea de markeri moleculari utilizai n prezent pentru a evidenia rezistena la parazii i boli, la albine i gsesc utilizarea mai puin cei proteici (alozimele i izozimele) datorit polimorfismului sczut. Cea mai larg utilizare au ns markerii genetici (RFLP, minisateliii, microsateliii, AFLP i RAPD) care datorit specificului i gradului lor nalt de polimorfism au fost utilizai cu succes n acest tip de investigaii.
Se preconizeaz obinerea la Apis mellifera L. a unor producii superioare cantitativ i calitativ prin identificarea cu ajutorul markerilor moleculari (microsatelii, STS, markeri RAPD, RFLP i AFLP) a locilor nsuirilor cantitative (QTL Quantitative Trait Loci) dorite, situai pe hrile de linkage alctuite la aceast specie i selecia familiilor n funcie de acetia.
128
Antonia ODAGIU, Ioan Gh. OROIAN Caracteristici ecopatologice la insecte, abordare molecular. Volumul 1. Apis mellifera L. Tehnici de biologie molecular utilizate la albine
CAPITOLUL IV
TEHNICI DE BIOLOGIE MOLECULAR UTILIZATE N ANALIZA GENETIC LA ALBINE

Indiferent de tehnicile utilizate n vederea identificrii markeri-lor moleculari la albine, de importan major este att luarea probelor ct i pstrarea acestora pn n momentul analizei, precum i extracia ADN-ului.
Tehnicile de luare a probelor s-au perfecionat n aa msur, nct la momentul de fa este posibil chiar luarea probelor fr efect letal asupra albinelor (C h l i n e , N. i col., 2004).
Cea mai eficient metod de prezervare a probelor de albine, dei nu ntotdeauna disponibil, const n pstrarea acestora la 800C, imediat dup recoltarea lor.
129
Ca o alternativ poate fi utilizat depozitarea lor la 200C, dup ce au fost n prealabil introduse n alcoole etilic 100%.
Extracia ADN-ului, dei etap preliminar n diversele analize genetice, este de importan major pentru efectuarea n condiii optime a studiilor ulterioare i acurateea rezultatelor obinute.
Exist dou categorii de metode de extracie a ADN-ului, extracia brut i metode de extracie speciale ce furnizeaz ADN de puritate ridicat.
a). Metodele brute de extracie a ADN-ului. Aplicarea acestora nu necesit o purificare prealabil pentru amplificarea cu succes a ADN-ului. Materialul proaspt este introdus ntr-o soluie tampon de liz (Tris-HCl 10 mM la pH = 8, EDTA 1 mM, Nonidet P 40 1%, proteinaz K 100 mg/100 ml). Se depoziteaz peste noapte la 40C (B l a c k i col., 1992).
Extracia cu Chelex. Materialul proaspt se aduce n 500 l Chelex 5%. Se incubeaz la 560C (0,5 4 ore) dup care la 95 - 1000C (5 15 minute), dup care se centrifugheaz, iar supernatantul se depoziteaz la - 210C. Datorit cantitilor mici de ADN utilizate, este recomandat folosirea ca martor a unei extracii blank, atunci cnd se plic acest protocol (C a n o i col., 1993).
b). Metode de extracie ce conduc la obinerea ADN-ului de nalt puritate
Metoda de extracie n soluie salin. Utilizarea acestei metode conduce la obinerea unui ADN-genomic de puritate nalt, dei este una dintre cele
130
mai rapide metode i n acelai timp puin costisitoare. Avantajul principal const n eliminarea folosirii unor reactivi nocivi i foarte scumpi (ex. fenolul) i adaptabilitatea sa pentru aplicare la diverse organisme (S u n n u c k s i col., 1996).
Liza se efectueaz n: - 400 l TEN (Tris-HCl 10mM, pH = 8; EDTA 0,2 mM, pH = 8; NaCl 0,4 M) - 40 l SDS 20% - 8 l proteinaz K Se amestec si se incubeaz la 550C timp de 1 or.
Se adaug 300 l NaCl 5 6 M i se supune i se supune la vortex 15 30 secunde.
Se centrifugheaz la 10.000 40.000 g.
Se transfer supernatantul ntru-n Eppendorf nou i ADN-ul este precipitat n amestecul 1 : 1 propanol : etanol 100% (de la ghea). Se pstreaz la - 210C timp de 5 60 minute. Se centrifugheaz la 40C timp de 15 20 minute, dup care peletul este splat cu etanol 70% i se las s se usuce.
ADN-ul se pstreaz pn la utilizare sub form de suspensie n 20 50 l ap steril.
131
Atunci cnd probele au fost recoltate sau pstrate n condiii neadecvate i pentru a evita procedeele costisitoare de purificare, se utilizeaz metoda descris mai jos (C h l i n e , N. i col., 2004).
Soluia de liz: - tiocianat de guanidiu 0,5 M - EDTA 0,1 M - acetat de amoniu 7,5 M de la ghea
Se amestec, iar amestecul st la ghea 10 minute, dup care se adaug 500 ml soluie cloroform : pentanol (21 : 1).
Amestecul este centrifugat la 14.000 timp de 10 minute. Se colecteaz supernatantul i se trece ntr-un Eppendof nou.
Se adaug izopropanol. ADN-ul este precipitat la - 200C i colectat dup centrifugare la 14.000 g timp de 20 minute.
Peletul de ADN este splat de trei ori cu etanol 70%, uscat n curent de aer i resuspendat n ap steril.
De asemenea, sunt disponibile kit-uri comerciale. Acestea sunt produse n vederea izolrii ADN-ului din esuturi microscopice, pe o lam steril i urmeaz un protocol ntr-o singur etap (B u r t o n i col., 1998). Aceste
132
kit-uri sunt mai mult sau mai puin utile n funcie de analiza ADN ce se urmrete a fi efectuat.
n studiul ADN-ului la albine cele mai frecvent utilizate protocoale de extracie se bazeaz pe aceleai principii menionate n cele descrise mai sus, ns cu adaptri specifice (W i l k e s , K. i col., 2003)
Protocolul propus de Wilkes i Oldroyd (2003) Albinele utilizate trebuie s fie proaspete, sau depozitate la 700C. ADN-ul este extras prin liz cu CTAB (Hunt i col., 1995).
Abdomenul i capul se plaseaz individual ntr-un Eppendorf (1,5 ml). Se adaug 200 l soluie de liz: - CTAB 1% - Tris 50 mM (pH =8) - EDTA 10mM - NaCl 1,1 M - proteinaz K 100 g/ml esutul este zdrobit cu un pestle i incubat la 600C timp de 1 5 ore.
Probele sunt extrase n mod repetat prin inversie lent cu 100 l fenol (pH = 7,4) i 100 l cloroform i centrifugare la 15000 g timp de 10 minute. Stratul apos superior este transferat n alt Eppendorf.
133
Extracia este repetat cu 200 l cloroform agitare lent prin inversie i centrifugare 2 3 minute. ADN-ul este precipitat cu 20 l acetat de sodiu 3M (pH = 5,2) i 400 l etanol rece 100%. Probele sunt incubate 10 minute la -700C, apoi centrifugate 20 minute la 7000 g.
Peletul rezultat este splat n etanol 70% rece, uscat sub vid i dizolvat n 100 l TE0,1: - tampon Tris 10 mM (pH = 7,6) - EDTA 0,1 mM prin nclzire la 650C timp de 10 minute. ADN-ul concentrat este diluat 1 : 200 n ap steril pentru a fi apoi utilizat pentru amplificare.
4.1.TESTAREA PROTOCOALELOR DE IZOLARE A ADN-ULUI DE LA ALBINA MELIFER (APIS
MELLIFERA L.)
Probele au fost recoltate din 358 stupine din judeul Slaj, 24 stupine apicultori din judeul Cluj, 14 stupine din judeul Satu Mare, 40 stupine din judeul Alba i 35 stupine din judeul Tulcea.
Aparatura utilizat Autoclav, Raypa Baie de ap, Fisher Bioblock Scientific Microentrifug, Sigma 1-15
134
Containere pentru deeuri, Biohazard Deionizator de ap, Smeg WP 3000 Vortex, Bioblock Spectrofotometru NanoDrop 1000
Spectrofotometrul NanoDrop 1000 Principala component a echipamentului de cuantificare a ADN este Spectrofotometrul NanoDrop 1000 (fig. 31 33).
Acesta acoper ntreg spectrul UV VIS (220 750 nm) i este destinat n principal msurrii absorbanei probelor de ADN, ARN i proteine.
Are dimensiuni relativ reduse (20 cm x 14 cm). Durata msurrii este doar de 10 secunde, iar domeniul de msurare acoper un domeniu larg de concentraii att pentru ADN dublu catenar (2 - 3700 ng/l) ct i pentreu ADN i ARN monocatenar ( 2400 ng/l i respectiv 3000 ng/l).
Datorit sistemului de funcionare perfecionat, cu ajutorul acestui aparat pot fi cuantificate cantiti foarte mici din proba de analizat, o simpl pictur fiind suficient.
La deschiderea aparatului, cu pipeta automat se plaseaz o pictur din proba de analizat n locaia destinat plasrii probei.
135
Figura 31. Plasarea probei n vederea cuantificrii
Figura 32. Poziionarea probei pe parcursul cuantificrii
Cnd aparatul este nchis, braul adus la poziia iniial comprim pictura de prob care este supus msurtorii spectrale. Tensiunea de suprafa este singura for care menine proba.
136
Cuantificarea se realizeaz pe baza msurrii spectrului de radiaii emis la o lungime a drumului optic de 1 mm, cu dou fibre optice, sursa de emisie fiind o lamp de Xenon.
Cnd msurarea este finalizat, aparatul se deschide, iar proba este ndeprtat prin simpla tergere cu un ervet de laborator.
Figura 33. ndeprtarea probei dup cuantificare
Principiul de funcionare al aparatului (fig.34) se bazeaz pe existena unei lmpi de Xenon, care emite radiaii focalizate pe o lentil de difracie (care funcioneaz ca o prism).
Fluxul luminos rezultat n urma trecerii prin prism este alctuit din radiaii cu diverse lungimi de und i este direcionat diferit. Prin fant trece doar radiaia cu lungimea de und dorit.
137
Figura 34. Schema de principiu a funcionrii unui spectrofotometru n domeniul UV VIS
Exist trei posibiliti:
1. Daca aceasta ajunge n zona transparent a discului rotativ ajunge direct n locul n care este plasat proba de analizat, dup care este orientat spre cel de al doilea disc rotativ prin intermediul unei oglinzi. Aici vine n contact cu oglinda acestuia, care o direcioneaz spre detector.
138
2. Dac
radiaia ajunge n zona de oglind a discului rotativ, aceasta este
direcionat spre celula de referin, apoi este orientat spre al doilea disc rotativ i direcionat spre detector.
3. Dac radiaia vine n contact cu zona neagr a discului, aceasta este blocat. Detectorul convertete semnalul luminos n semnal electric. Intensitatea luminoas a radiaiei msurat n celula de referin este notat cu I0, iar cea rezultat n urma trecerii prin celula ce conine proba cu I. Raportul dintre cele dou intensiti luminoase poart numele de absorban i este dat de relaia A = log I0/I. Datele rezultate de la msurtori sunt stocate automat n memoria dispozitivului specific i pot fi vizualizate fie cu un software tip DataViewer sau programe tip MS Excel.
4.1.1.Protocolul propus de Hunt i col.

Albinele utilizate trebuie s fie proaspete, sau depozitate la 700C. ADN-ul este extras prin liz cu 350 l CTAB. Trntorii sau mtcile se plaseaz individual ntr-un Eppendorf (1,5 ml). Se adaug 200 l soluie de liz: CTAB 1% Tris-Cl 50 mM (pH =8) EDTA 10mM NaCl 750 mM proteinaz K 100 g/ml
139
esutul este zdrobit cu un pestle i incubat la 600C timp de 2 ore. Se adaug o treime din volumul de NaCl 1,5M/Tris-Cl 50 mM (pH=8), pentru a preveni precipitarea CTAB i a polizaharidelor.
Probele sunt extrase n mod repetat prin inversie lent cu 100 l fenol (pH = 7,4) i 100 l cloroform i centrifugare la 15000 g timp de 10 minute.
Stratul apos superior este transferat n alt Eppendorf. Extracia este repetat cu 200 l cloroform agitare lent prin inversie i centrifugare 2 3 minute.
n continuare: ADN-ul este precipitat cu 20 l acetat de sodiu 3M (pH = 5) i 400 l etanol rece 100%. Probele sunt centrifugate 10 minute la 4000 g.
Peletul rezultat este splat cu etanol 70% rece i apoi se adaug Tris 10mM (pH = 7,6) i EDTA 1mM.
ADN-ul poate fi cuantificat cu un fluorometru, sau spectrofotometru i diluat la 3 ng/l n Tris 10 mM i EDTA 0,3 mM.
Cte 10 masculi din stupinele studiate din fiecare dintre judeele analizate au fost supui protocolului de izolare a ADN-ului propus de Hunt i col. (1997).
Performanele constructive i funcionale ale Spectrofotometrului NanoDrop 1000 permit eliminarea etapei de trasare a curbei de calibrare, precum i cele ce implic necesitatea calculului concentraiei i puritii probelor.
140
n urma cuantificrii ADN-ului extras i a puritii acestuia, cu ajutorul Spectrofotometrului Nanodrop, nu s-au obinut nici cantiti, nici puriti satisfctoare (fig. 35, 36).
n cazul cantitii de ADN extrase, au fost nregistrai coeficieni de variabilitate foarte mari, cuprini ntre 20,63% (albinele din Cluj) i 40,21 % (Tulcea).
Puritatea ADN-ului extras, a fost nesatisfctoare (cu valori cuprinse ntre 1,34% i 1,55%) dar coeficienii de variabilitate au fost mici, ntre 5,77% (albinele din Slaj) i 11,56 % (Cluj).
S laj
Cluj
Satu Mare
Alba
Tulcea
Cantitatea de ADN (ng/microlitru)
100
80
69,65 59,1 54,22
60
48,54 43,12 35,31 32,11 40,21 18,98 17,14 14,37 16,25 14,22
40
20,63 34,17
20
0 Media Coeficientul de variabilitate Deviaia standard Parametru statistic
Figura 35. Cantitatea de ADN (ng/l) extras din probele analizate
141
Slaj
Cluj
Satu Mare
Alba
Tulcea
15 Puritatea ADN-ului (%) 11,56 10,19 10 8,91 6,71
5,77
5 1,55 1,43 1,49 1,48 1,34 0,15 0,08 0,18 0,17 0,21
Media
Coeficientul de variabilitate
Deviaia standard
Parametru statistic
Figura 36. Puritatea ADN-ului extras din probele analizate
4.1.2.Protocolul propus de Wilkes i Oldroyd (2003)

Albinele utilizate trebuie s fie proaspete, sau depozitate la 700C. ADN-ul este extras prin liz cu CTAB (Hunt i col., 1995).
Abdomenul i capul se plaseaz individual ntr-un Eppendorf (1,5 ml). Se adaug 200 l soluie de liz:
142
CTAB 1% Tris 50 mM (pH =8) EDTA 10mM NaCl 1,1 M proteinaz K 100 g/ml esutul este zdrobit cu un pestle i incubat la 600C timp de 1 5 ore.
Probele sunt extrase n mod repetat prin inversie lent cu 100 l fenol (pH = 7,4) i 100 l cloroform i centrifugare la 15000 g timp de 10 minute. Stratul apos superior este transferat n alt Eppendorf.
Extracia este repetat cu 200 l cloroform agitare lent prin inversie i centrifugare 2 3 minute.
ADN-ul este precipitat cu 20 l acetat de sodiu 3M (pH = 5,2) i 400 l etanol rece 100%. Probele sunt incubate 10 minute la -700C, apoi centrifugate 20 minute la 7000 g.
Peletul rezultat este splat n etanol 70% rece, uscat sub vid i dizolvat n 100 l TE0,1: tampon Tris 10 mM (pH = 7,6) EDTA 0,1 mM prin nclzire la 650C timp de 10 minute. ADN-ul concentrat este diluat 1 : 200 n ap steril pentru a fi apoi utilizat pentru amplificare.
143
n urma cuantificrii ADN-ului extras i a puritii acestuia, cu ajutorul Spectrofotometrului Nanodrop, s-au obinut cantiti i puriti superioare celor obinute n cazul aplicrii protocolului (fig. 37, 38).
Slaj
Cluj
Satu Mare
Alba
Tulcea
Cantitatea de ADN (ng/microlitru)
100 76,15 80 72,19 80,11 68,34
60
40
20
9,15
19,26 18,22 20,23 14,76 16,22 11,43 11,42 15,34 10,21 13,81
0 Media Coeficientul de variabilitate Deviaia standard Parametru statistic
Figura 37. Cantitatea de ADN (ng/l) extras din probele analizate
n cazul cantitii de ADN extrase, au fost nregistrai coeficieni de variabilitate foarte mari, cuprini ntre 10,21% (albinele din Alba) i 20,23 % (Satu Mare).
Puritatea ADN-ului extras, a fost satisfctoare (cu valori cuprinse ntre 1,75% i 1,93%) iar coeficienii de variabilitate au fost mici, ntre 3,14% (albinele din Slaj) i 9,11 % (Cluj).
144
Slaj
Cluj
Satu Mare
Alba
Tulcea
15 Puritatea ADN-ului (%)
10
9,11
8,88 8,91 7,81
5 1,82 1,75 1,93 1,91 1,78
3,14
0,19 0,12 0,16 0,14 0,21 0
Media
Coeficientul de variabilitate
Deviaia standard
Parametru statistic
Figura 38. Puritatea ADN-ului extras din probele analizate
n urma cuantificrii ADN-ului extras de la Apis mellifera carpatica i a puritii acestuia, cu ajutorul Spectrofotometrului Nanodrop, metoda propus de O l d r o y d i col., (2002) s-a dovedit cea mai eficient. Tehnicile moleculare implicate n identificarea de markeri moleculari la albine sau diversificat mult n ultimul deceniu, ns toate fac uz de tehnica Reaciei n Lan a Polimerazei, cu largi aplicaii n evidenierea maladiilor albinelor (B a k o n y i T. i col., 2003).
145
4.2. TEHNICA REACIEI N LAN A POLIMERAZEI PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

Bazele acestei tehnici moleculare au fost puse de K a r y M u l l i s la mijlocul anilor 80 (V l a i c , A., 1997) bazndu-se pe caracteristicile replicrii ADN-ului. Este o tehnic rapid, necostisitoare i permite copierea unor fragmente specifice de ADN n cantiti foarte reduse. Adesea PCR este utilizat pentru a amplifica secvene de ADN cunoscute. Se alege secvena ce se dorete a se amplifica, apoi primerii care se vor ataa i vor flanca secvena de interes n prezena unei polimeraze, n felul acesta PCR conducnd la amplificarea unui anumit segment de ADN.
PCR include trei etape:

Denaturarea fragmentele de ADN sunt nclzite la temperaturi
ridicate ce determin denaturarea ADN-ului, iar catenele devin accesibile primeri-lor;
Cuplarea temperatura se reduce, primerii se ataeaz la regiunile
complementare situate pe catenele complementare ale ADN-ului matri i se formeaz din nou catena dubl ntre primeri i secvenele complementare;
146
Elongaia
(extensia)
ADN-polimeraza
sintetizeaz
caten
complementar. Enzima citete secvena de pe catena opus i extinde primerii prin adugarea nucleotidelor n ordinea n care acestea se pot mperechea. ntregul proces se repet.
Iniial amplificarea s-a realizat cu ajutorul ADN-polimerazei provenit din E.coli. Aceast ADN-polimeraz are un optim de funcionare la temperatura de 370C. Datorit temperaturii de reacie ridicate n cazul PCR aceasta se denatureaz, fiind necesar nlocuirea ei la nceputul fiecrui ciclu. Din acest motiv s-a renunat la utilizarea sa, la momentul de fa fiind utilizat ADN-polimeraza Taq izolat din bacteria Thermus aquaticus care triete n mediu acvatic la temperaturi de pn la 950C (B r o w n , T.A., 2002). Aceasta este o enzim stabil la temperatura de lucru avnd un optim de funcionare la 720C.
Spre exemplu, dac se ia n considerare un fragment de ADN ce conine 3 gene (fig. 39), n condiiile unei reacii PCR simple, prin care se urmrete amplificarea doar a genei B se realizeaz un amestec de reacie alctuit din gena B, Taq polimeraz, nucleotide i doi primeri care se vor ataa la fiecare capt al genei B. Acetia din urm sunt secvene scurte de nucleotiode (15 35) complementare capetelor secvenei de ADN ce urmeaz a fi amplificat.
gena A
gena B
gena C
Figura 39. Fragment de ADN din care se va amplifica gena B
147
n prima etap, denaturarea (fig. 40), reacia este nceput prin nclzirea amestecului de reacie la 940C, temperatur la care se rup legturile de hidrogen dintre cele dou catene polinucleotidice ale helixului, ADN-ul denaturndu-se i devenind o molecul unicatenar. n etapa a doua, cuplarea (fig. 40), temperatura se reduce la 50 600C, ceea ce are drept rezultat realturarea unora dintre catenele simple ale ADN-ului, dar n acelai timp permite i primerilor s se ataeze n poziiile complementare aflate la capetele genei de interes. Cei doi primeri se leag la capetele 3 ale genei urmrite pe cele dou catene, motiv pentru care acetia se numesc primeri sens i antisens.
Regiunea ce urmeaz a fi amplificat (gena B) 5

ADN-ul int
5 Denaturare la 940C 3
Rcire la 50 600C
148
Primeri
Sinteza ADN-ului la 720C 5 3
3 Produi lungi 5
Figura 40. Etapele PCR
Din acest moment ncepe sinteza ADN-ului, iar temperatura este ridicat la 720C, temperatur optim pentru aciunea Taq polimerazei.
n etapa a treia a reaciei, elongaia (fig. 40), se sintetizeaz o serie de produi lungi din fiecare caten a ADN-ului int. Polinucleotidele au aceleai terminaii 5, dar terminaiile 3 sunt ntmpltoare i reprezint poziiile n care sinteza ADN-ului se ncheie la ntmplare.
149
Cele trei etape ale PCR-ului se desfoar pe cicluri: Ciclul 1 pe parcursul denaturrii (1 minut, 950C) catenele de ADN se despart pentru a forma catene separate: pe parcursul atarii (aproximativ 1 minut, 45 - 600C ) un primer se leag de o caten de ADN, iar cellalt de catena complementar. Sit-urile de ataare a primeri-lor sunt alese n aa fel nct s asigure sinteza ADN-ului n regiunea de interes pe parcursul extensiei (1 minut, la aproximativ 720C) cnd sinteza ADN-ului se desfoar n regiunea de interes pe distane variabile n zona de flancare (flanking region) producnd fragmentele lungi de dimensiuni variabile.
Ciclul 2 cnd ncepe ciclul 2, exist dou tipuri de matrie: 1. Catenele originale de ADN i 2. Catenele de ADN nou sintetizate ce constau din regiunea int i lungimi variabile ale zonei flancatoare situat la captul 3.
Cnd n acest ciclu se utilizeaz ultima matri se replic doar regiunea int.
Ciclul 3 Regiunea int de ADN nou sintetizat (ex. fr regiunile flancatoare) joac rol de matri. Molecula original de ADN este nc prezent i va fi pn la sfritul reaciei. Dup cteva cicluri, fragmentul de ADN nou sintetizat se stabilizeaz rapid i devine matria predominant.
Cnd se repet ciclul denaturare cuplare sintez (fig. 41), produii lungi acioneaz ca matrie pentru noile sinteze de ADN dnd natere la produi scuri a cror terminaii 3 i 5 sunt stabilite de poziiile de cuplare a
150
primerilor. Pe parcursul ciclurilor urmtoare numrul produilor de reacie scuri se acumuleaz exponenial (dublndu-se pe parcursul fiecrui ciclu) pn la epuizarea unuia dintre compuii de reacie.
5 3 5 5
Produii rezultai din primul ciclu 3
Denaturare
Sinteza ADN-ului
151
Produii rezultai din al doilea ciclu
Denaturare
Sinteza ADN-ului
Produii celui de al reilea ciclu
Produs scurt (se acumuleaz exponenial)
Fig. 41. Sinteza produilor scuri ai PCR
Aceasta nseamn c dup 30 de cicluri vor exista peste 250 milioane de produi provenii din fiecare molecul iniial. Adic, din cteva nanograme de fragment de ADN ce se dorea a fi amplificat (ex. gena B) vor rezulta cteva micrograme de
152
produs al PCR. Astfel, este amplificat doar gena de interes (B) care va fi purificat pentru a fi n continuare utilizat.
Rezultatele PCR pot fi vizualizate i verificate pe diferite ci. De obicei, produii sunt analizai prin electroforez pe gel de agaroz, sau poliacrilamid.
Astfel, produii de reacie separai prin electroforeza n gel de agaroz sau poliacrilamid sunt identificai n funcie de calitatea lor i dimensiunea fragmentului amplificat.
4.3.VIZUALIZAREA PROBELOR
Ei pot fi vizualizai direct prin colorare cu bromur de etidiu sau argint, sau prin marcare cu radioizotopi i autoradiografie.
a). Colorarea Colorarea cu bromur de etidiu este convenabil n cazul n care sunt disponibile cantiti mari de ADN, cum este cazul produilor PCR, cnd rezult ADN purificat utilizat apoi n analize de ADN specifice, fiind mai puin adecvat n cazul ADNm, care este detectat cu acuitate mai mare utiliznd alte tehnici.
Utilizarea bromurii de etidiu d cele mai bune rezultate n cazul gelurilor de agaroz. Nu este recomandat utilizarea acesteia n cazul gelurilor de poliacrilamid folosite pentru identificarea cu o rezoluie nalt a unor cantiti reduse de ADN.
153
Molecula de bromur de etidiu capabil s se intercaleze ntre cele dou brae ale helixului ADN-ului absoarbe lumina UV (la 300 nm), oscileaz, pierde energie i emite fluorescen de culoare portocalie (cu lungimea de und de 590 nm).
Colorarea cu argint (S a m b r o o k i col., 1989) este utilizat n principal cnd electroforeza se efectueaz n gel de poliacrilamid (mai frecvent pentru RFLP i microsatelii).
Prepararea colorantului se efectueaz sub agitare blnd. Gelul este introdus n soluia tampon A (180 ml ap steril, 40 ml etanol 100%, 2 ml acid acetic glacial) timp de 4 minute. Soluia A este ndeprtat i se introduce gelul n soluia B (100 ml ap steril, 0,1 g azotat de argint) timp de 10 minute. Gelul se spal de dou ori cu ap steril. Gelul este introdus n soluia tampon C ( 150 ml ap steril, 2,25 g hidroxid de sodiu, 15 g borohidrur de sodiu, 0,6 ml formaldehid) pn n momentul apariiei benzilor. Nu trebuie ns supraexpus, pentruu c exist riscul nnegririi gelului i nu se vor mai putea vizualiza benzile. Se cltete n ap steril, dup care se introduce din nou n soluia tampon A pentru fixare.
b).Marcarea Marcarea cu radioizotopi se realizeaz prin ncorporarea marker-ului respectiv (radioactiv sau fluorescent) ntr-o copie nou sau parial sintetizat a secvenei iniiale de ADN. Aceasta se poate realiza prin mai multe procedee (marcare ntpltoare, translaie Nick, sau marcarea captului moleculei de ADN).
154
Marcarea ntmpltoare conduce la un grad nalt de ncorporare a markerului n molecula de ADN. Lungimea moleculei de ADN poate constitui un factor limitant n obinerea unei caliti corespunztoare a semnalului. Alegerea izotopului ce va fi utilizat depinde de secvena de nucleotide prevalent n prob (dCTP, dATP, dGTP, dTTP).
Ordinea descresctoare a capacitii de emisie radioactiv a radioizotopilor utilizai este urmtoarea:

32
P,
33
P i
35
S. Fiecare dintre aceti izotopi sunt
disponibili cu diferite activiti de emisie n funcie de analiza n care sunt folosii: [32P] dCTP 3000 Ci/mmol pentru analizele de amprent genetic, [33P] dATP 2500 Ci/mmol pentru analizele de microsatelii, i [35S] dATP 1000 Ci/mmol pentru secveniere.
Proba este iniial purificat, dup care este denaturat pentru a obine ADN unicatenar, dup care se pstreaz la ghea pn n momentul amestecului cu markerul radioactiv.
Translaia Nick asigur un grad mai redus de ncorporare a markerului dar necesit un ADN mai puin pur. n cazul folosirii izotopului radiomarcat [32P] dCTP, la proba purificat denaturat se adaug: - ap steril i 10 x tampon de translaie Nick (dATP, dGTP i dTTP cte 0,2 mM fiecare i soluie tampon de reacie), - amestec enzimatic (ADNazI/ADNpolimeraz) - i radioizotpul, dup care se amestec. Se incubeaz la 370C timp de o or, dup care se utilizeaz. Markerii de translaie Nick sunt introdui la ntmplare n catenele de ADN de ctre DNaza I i ADN polimeraz. Efectul const n obinerea unor noi
155
molecule marcate uniform, cu marker-ul ncorporat la locusul de substituie a nucleotidei C.
Marcarea captului moleculei de ADN const n marcarea radioactiv a unui capt a ADN-ului n prezena transferazei terminale, Co2+ i [32P] dATP. Se mai poate realiza i prin fosforilarea direct a terminaiilor H 5 dup ndeprtarea gruprilor 5fosfat cu ajutorul fosfatazei alcaline i marcarea cu [32P] dATP n prezena polinucleotid kinazei T4.
4.4. APLICAII ALE PCR

4.4.1.Tehnica SAGE
De asemenea, perfecionarea i adaptarea tehnicii PCR n vederea cuantificrii simultane a nivelului ARNm total prezent ntr-o prob a condus la punerea la punct a tehnicii SAGE (serial analysis of gene expression analiza n serie a expresiei genice).
Tehnica SAGE se bazeaz pe principiul c o secven de 10 pb poate fi suficient pentru a identifica ARNm (fig. 42).
Datorit dimensiunilor lor reduse, un numr mare de asemenea capete pregtite pentru o populaie de ADNc pot fi ligate mpreun i analizate simultan prin tehnici de secveniere.
156
Frecvenele relative cu care apar aceste capete n secvena total sunt identice cu cele ale diferitelor molecule de ARNm din proba original. Etapele SAGE sunt prezentate schematic n fig. 43.
Figura 42. Principiul tehnicii SAGE (www.ergito.com) 157
n primele dou etape, moleculele de ARNm se leag de paturi la captul 3. Se sintetizeaz ADNc i apoi se face scindarea cu o endonucleaz de restricie ce recunoate secvenele de 4 perechi de baze (pb).
Figura 43. Etapele SAGE (www.ergito.com) 158
Etapa a 3-a. Se colecteaz paturile, se izoleaz fiecare fragment a fiecrui ADNc ce corespunde captului 3 a transcriptului original. Proba se mparte n dou i una dintre cele dou molecule de ADN linker este ligat. Fiecare linker conine o secven ce va fi utilizat pentru urmtoarea PCR, constituind n acelai timp i situs asimetric de recunoatere pentru endonucleaze de restricie IIS (care scindeaz la distan de situs-urile de recunoatere).
Etapa a 4-a. Enzimele de tipul IIS scindeaz secvena ADNc punnd n libertate un fragment de ADN care conine linkerul la un capt i aproximativ10 pb ale ADNc la cellalt capt. Aceast secven de 10 pb constituie captul (tag). Fragmentele sunt purificate prin simpla colectare urmat de eliminarea paturilor.
Dup utilizarea ADNpolimerazei pentru a crea capete plate e fragmente, acestea se combin i se produce ligarea. n felul acesta se obin capete duble (ditags) ce constau din dou capete (tags) ataate cap la cap n mod ntmpltor.
Etapa a 5-a. Capetele duble (ditags) cu situs-uri pentru primeri diferii la terminaiile lor sunt amplificate selectiv prin PCR i apoi purificate.
n etapa anterioar sunt produse i capetele duble (ditags) cu situs-uri pentru acelai primer la ambele terminaii. Aceste capete duble (ditags) nu sunt amplificate prin PCR pentru c cele dou capete ale fiecrei molecule se ataeaz unele de altele i cu de primer. Din acest motiv proba trebuie scindat n dou.
Etapa a 6-a. Capetele duble (ditags) purificate sunt scindate cu aceeai endonucleaz de restricie care a fost utilizat iniial pentru a scinda moleculele
159
de ADNc. Aceasta conduce la producerea de fragmente interne care compuse n cea mai mare parte din secvene ale celor dou capete (tags).
sunt
Etapa a 7-a. Aceste fragmente sunt apoi purificate i ligate formnd concatemeri lungi n care fragmentele sunt ncorporate ntmpltor. Concatemerii sunt apoi clonai pentru a forma o bibliotec SAGE. Apoi, clone individuale sunt luate la ntmplare i secvenate.
Etapa a 8-a. Cu ajutorul soft-ului specializat pentru acest tip de analiz se numr fiecare tip de capt (tag) i se determin frecvena apariiei sale fa de celelalte. Se realizeaz corespondena dintre capete (tags) i ADNc cu ajutorul unei liste de capete (tags) prezise pe baza unor molecule de ADNc cunoscute.
Dei capetele (tags) conin doar o secven de 10 11 pb, pentru c provin dintr-o anumit zon bine definit din cadrul fiecrei molecule de ADNc (foarte aproape de captul 3 a situs-ului 3 a primei enzime de restricie) sunt suficiente pentru a identifica cu exactitate 410 molecule de ADNc.
Aplicaiile SAGE vizeaz: caracterizarea transcriptelor specific celulare din cadrul diferitelor esuturi, identificarea genelor induse n celula ca rspuns la tratamentul cu un factor de cretere sau difereniere, identificarea modificrilor produse n expresia genic n diferite stadii de dezvoltare, monitorizarea diferenelor aprute n expresia genic dintre celulele normale i canceroase.
160
Principiile tehnicii PCR i-au gsit aplicabilitate n pentru evidenierea i utilizarea microsateliilor. Odat cu identificarea markeri-lor de tipul STS, au fost dezvoltate i o serie de alte tehnici care au la baz prezena acestora: OCS ordered catenation of sequence-tagged sites (Higasa, K. i col., 2002) STMP - sequence-tagged microsatellite profiling ( H a y d e n , M.J. i col., 2001), care utilizeaz principiile SAGE pentru a genera o bibliotec ST pentru caracterizarea rapid a locilor SSR n cadrul unui genom de interes din care pot fi identificai i utilizai markeri de tipul microsateliilor. TALEST tandem arrayed ligation of expressed sequence tags (S p i n e l l a , G.D. i col., 1999), ce ofer o modalitate relativ simpl de analiz cantitativ a profilurilor globale ale expresiei genice din celule i esuturi.
Acestea tehnici au implicaii importante n studiile efectuate pe albine.
La albine, n particular, tehnica PCR i adaptrile acesteia utilizate n vederea identificrii microsateliilor i-au adus contribuia n diverse studii genetice prin evidenierea:
Genotipului i variabilitii acestuia la Apis mellifera L. utiliznd 4 loci ai microsateliilor ADN (N e u m a n n i col., 1997) .
Variabilitii ridicate a populaiilor de Apis mellifera L. din Costa Rica (S e g u r a , J.A.L., 2000) cu ajutorul a doi markeri genetici cu polimorfism nalt evideniai n genom (microsatelitul A7 i regiunea intergenic COI-COII din ADNmt).
161
Existenei QTL implicai n comportamentul igienic al populaiilor de Apis mellifera L. cu ajutorul unui set de microsatelii alctuit din repetiii cu predominan perfecte, 52 (CT)n i 23 (GT)n la distane de 15 kb i respectiv 34 kb. Acestea au o distribuie asociativ i regiunile care le flancheaz sunt suficient de asemntoare pentru a putea permite amplificarea PCR ( E s t o u p , A. i col., 1993, 1995)
Existenei a apte QTL ce influeneaz comportamentul igienic la albine, stabilind un punctaj numeric al nivelului mediu al acestuia. (H a y d e n M.J. i col., 2001, L a p i d g e i col., 2002)
Identificarea la Apis mellifera iberica a QTL implicai n mecanismele de identificare a rezistenei la boli cu ajutorul a apte microsatelii (B7, EDR, FE, FM-F, GH-F, GJ, HC) (R o w e i col.,1997).
4.4.2. Tehnica RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism Polimorfismul fragmentelor de restricie)
Markerii RFLP au fost primii markeri ADN studiai. La tratarea moleculei de ADN cu o enzim de restricie se obine ntotdeauna acelai set de fragmente, ceea ce semnific faptul c respectivele enzime scindeaz molecula de ADN la nivelul unor secvene de recunoatere specifice.
162
Aceast aseriune nu este valabil i la nivelul ADN-ului genomic, pentru c unele situs-uri de restricie prezint polimorfism.
Adic, la acest nivel exist dou alele, una cu secvena specific situs-ului de restricie la nivelul creia enzima de restricie va scinda molecula de ADN, iar cealalt alel prezint modificri secveniale i nu va fi recunoscut de enzim, care nu va scinda molecula la nivelul acesteia.
Rezultatul modificrii secvenei uneia dintre cele dou alele este acela c cele dou fragmente de restricie adiacente rmn legate mpreun i dup tratamentul cu enzima de restricie, ceea ce conduce la apariia unui polimorfism al lungimii. Acesta este de fapt un polimorfism al fragmentelor de restricie (RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism), ce poate fi utilizat ca marker ADN.
Tehnica RFLP const din scindarea moleculei de ADN n dou pri cu ajutorul unei enzime de restricie la fiecare parte a regiunii ce prezint polimorfism, astfel nct aceasta s rmn intact.
Fiecare molecul de ADN este digerat cu aceeai enzim de restricie. Fragmentele de ADN sunt plasate pe gel de agaroz.
La migrarea pe gel, fragmentele de ADN de dimensiuni mai reduse migreaz mai repede dect cele de dimensiuni mai mari, rezultnd un profil specific.
Fragmentele de ADN dublu catenar sunt ulterior denaturate obinndu-se ADN monocatenar i trasferate ulterior prin atracie capilar pe o membran din nylon pe care sunt fixate i meninute ca ADN monocatenar.
163
Se utilizeaz o prob (fragment de ADN marcat capabil s recunoasc specific polimorfismul obinut) pentru a vizualiza fragmentele de ADN complementar. n felul acestea poate fi determinat dimensiune secvenei repetate n funcie de poziia sa pe membran.
Rezultatul final este obinut prin utilizarea a patru probe diferite cu puteri discriminatorii diferite.
Membrana de nylon este ulterior expus razelor X, obinndu-se un film care n momentul developrii va prezenta cte o band ntunecat la locul n care se gsete proba hibridizat cu ADN-ul complementar.
Utilizarea acestei tehnici poate fi dificil atunci cnd nu exist o cantitate de ADN suficient.
Cercetri efectuate pe plan mondial (Yang Jiang Lu i col., 1992, http://nilgs.naro.affrc.go.jp) arat rezultatele foarte bune obinute n cazul utilizrii tehnicii RFLP pentru evidenierea variaiei genetice n cadrul populaiilor de albine.
Pentru aceasta se poate utiliza amplificarea segmentului genic 16s ADNr (965 pb) se va utiliza perechea de primeri: 5 CAACATCGAGGTCGCAAACATC 3 i 3 AGTTGGGACTATGTTTTCCATG 5, iar pentru amplificarea segmentului genic CO I (1028 pb), perechile de primeri: 5
GATTACTTCCTCCCTCATTA 3 i 3 AATAAGTCTGATAGGTCTAA 5 (Nielsen i col., 1999, citai de B r o w n T.A., 2001).
164
Amplificarea prin PCR se realizeaz cu 5 l amestec (0,5 x tampon TaqADNpolimeraz + 1,5 mM MgCl2 + 2 x 0,2 mM dNTP + 2 pM din fiecare primer + 0,5 l ADN matri + 0,25 U Taq ADNpolimeraz). Profilul de temperatur este urmtorul: 3 minute la 940C, 5 secunde la 500C 30 de cicluri, 5 secunde la 680C.
Dup ciclul final se mai realizeaz un ciclu suplimentar timp de 10 minute la 720C.Dup amplificare, segmentele de ADNm vor fi supuse aciunii enzimelor de restricie. Pentru ADNm: Ss I, Dra I, Hinc II, EcoR I, Pst I i Alu I. Pentru segmentul genic CO I: Sau3A I, Fok I, Bcl I, Ssp I, BstU I i Xho I.
Segmentele obinute n urma aciunii enzimelor de restricie sunt separate prin electroforez n gel de agaroz 2% x tampon TBE, colorate cu bromur de etidiu i vizualizate n lumin ultraviolet.
4.4.3. Tehnica RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA Polimorfismului ADN-ului Amplificat la Intmplare)
Este o tehnic bazat pe PCR, perfecionat de W i l l i a m s i col. (1990) i W e l s h i M c C l e l l a n d (1990). Cu ajutorul acestei tehnici sunt amplificate segmente de ADN despre care nu se cunosc detalii (ntmpltoare).
165
Cu ajutorul acestei tehnici este identificat polimorfismul unei secvene nucleotidice utiliznd un test bazat pe amplificarea ADN-ului n care se face uz doar de o secven nucleotidic aleas arbitrar.
In vederea amplificrii ADN-ului genomic se utilizeaz un singur primer alctuit din 10 baze nucleotidice. Acesta se leag de ADN-ul genomic n dou sit-uri diferite pe catene opuse ale matriei de ADN.
Daca aceste dou situs-uri se gsesc la o distan convenabil pentru amplificare, n urma amplificrii PCR se produc cantiti discrete de ADN (fig. 44).
Prezena fiecrui produs de amplificare conduce la identificarea complet sau parial a omologiei secvenei nucleotidice dintre ADN-ul genomic i primerul oligonucleotidic la fiecare terminaie a produsului de amplificare.
Fiecare primer va dirija amplificarea mai multor loci n genom, fcnd din acest test o cale eficient de evideniere a polimorfismului secvenelor nucleotidice la diferii indivizi. Astfel, un anumit fragment de ADN care este generat doar pentru un individ i care nu coincid cu cel generat pentru alt individ prezint polimorfism al ADN-ului, putnd fi astfel utilizat ca marker genetic. Aceti markeri sunt transmii la descendeni pe cale mendeleean.
Principalul avantaj al acestei tehnici const n aceea c nu necesit cunoaterea detaliilor referitoare la secvena de ADN. De asemenea, merit subliniat faptul c este o tehnic uor de realizat, utilizeaz fluorescena n locul radioactivitii (Williams i col, 1992 citat de T i n g e y i col., 1993) i necesit cantiti de ADN doar de ordinul nanogramelor.
166
Distana dintre primeri
3 5
.............. ................ 5 3
Figura 44. Diagrama schematic a RAPD
n vederea identificrii unor gene care confer rezisten la boli i duntori la albine, este necesar att evidenierea genomului (C r o z i e r i col., 1993) ct i alctuirea unei hri de linkage.
n vederea alctuirii unei hri de linkage, H u n t i col. (1995) au generat markeri RAPD cu ajutorul primer-ului UBC-239, demonstrnd polimorfismul tipic al acestora (fig. 45).
Primul culoar din stnga corespunde mamei mtcii F1, iar celelalte culoare conin ADN amplificat de la descendenii trntorilor haploizi ai mtcii F1 cu excepia markerul-ui de greutate molecular situat pe culoarul central (*).
167
Cei cinci markeri care au contribuit la cartarea grupelor de linkage au fost: 239-1, 239-96f, 239-59, 239-4 i 239-29f.
Figura 45. Gelul obinut n urma amplificrii ADN-ului polimorfic generat de primerul UBC-239 (dup , H u n t i col., 1995)
Harta de linkage alctuit de H u n t i col. (1995) s-a realizat pe baza segregrii a 365 markeri RAPD utiliznd descendena haploid de sex masculin a unei singure mtci.
Acetia s-au dovedit foarte eficieni n cartare, cu aproximativ 2,8 loci cartai la fiecare primer 10-nucleotidic utilizat n PCR (fig. 46).
168
Figura 46. Harta de linkage la Apis mellifera L. alctuit pe baza markerilor RAPD (dup , H u n t i col., 1995) 169
Figura 46 continuare Harta de linkage la Apis mellifera L. alctuit pe baza markerilor RAPD (dup , H u n t i col., 1995)
170
Comparaii efectuate ntre markerii RAPD i microsatelii identificai la o populaie de erpi (Sistrurus c. catenatus) utilizai n studii populaionale i de variabilitate au demonstrat cu ajutorul analizei de varian (ANOVA) faptul c acetia prezint performane asemntoare. Cu toate acestea, se pare c microsateliii ar fi mai adecvai n studiile realizate la nivelul populaiilor (L o u g h e e d , S.C., 2000).
Variabilitatea genetic din cadrul unor populaii la viespi (Polybia eaquatorialis) a fost evideniat prin aplicarea tehnicii RAPD, ceea ce a condus la relevarea unor informaii interesante i privitoare la diviziunea muncii n coloniile respective. S-a emis de asemenea ipoteza c aceast diviziune a muncii ar putea fi un factor ce contribuie la meninerea unui grad nalt de variabilitate genotipic n cadrul acestor colonii (O D o n n e l l , S., 1996)
4.4.4. Tehnica AFLP (Amplified Length Polymorphism Polimorfismul amplificat al lungimi fragmentelor de ADN)
Aceast tehnic este o variant a RFLP, prin care este evideniat prezena sau absena fragmentelor de restricie i nu lungimea lor.
Ea se bazeaz pe ligarea adaptorilor de fragmentele de restricie genomice, dup care urmeaz amplificarea prin PCR cu primeri specifici adaptorilor (S a v e l k o u l , P.H.M. i col., 1999).
171
Diferenele dintre fragmentele generate prin aceast tehnic pot fi detectate ca urmare a modificrilor situs-urilor de restricie/adaptorului, sau a
inseriilor/deleiilor din fragmentul de ADN. Pentru aceast tehnic nu este necesar cunoaterea genomului, datorit utilizrii adaptorilor unei secvene cunoscute ce este ligat de fragmentele de restricie.
Pentru analiza AFLP sunt necesare cantiti reduse de ADN genomic purificat, iar principiul metodei este prezentat n fig.47.
Figura 47. Reprezentarea schematic a principiului AFLP (dup S a v e l k o u l , P.H.M. i col., 1999)
172
Realizarea tehnicii AFLP implic patru etape (A m a d o r , D.M. i col., 2001):
Restricia ADN-ului genomic Fragmentele de restricie din ADN-ul genomic sunt produse cu ajutorul a dou enzime de restricie MseI (4 pb) care scindeaz la distane mici i EcoRI (6 pb) la distane mai mari.
Ligarea adaptorilor oligonucleotidici Adaptorii dublu catenari constau din o secven miez i o secven specific enzimei. Ei sunt specifici att pentru situs-ul EcoRI ct i pentru MseI. Restricia i ligarea se produc n cadrul unei singure reacii. Ligarea adaptorului la nivelul situs-ului de restricia a ADN-ului modific situs-ul de restricie astfel nct previne producerea celei de a doua scindri dup ce s-a produs ligarea.
Se utilizeaz urmtorul amestec de restricie ligare: - tampon de ligare 10 x T4 - NaCl 0,5 M - BSA 1 mg/ml - 50 M adaptori MseI (5-CTC GTA GAC TGC GTA CC-3 3-CAT CTG ACG CAT GGT TAA-3) - 5 M adaptori EcoRI (5-GAC GAT GAG TCC TGA G-3 3-TA CTC AGG ACT CAT-5) - EcoRI 20 U/ ml - MseI 4 U/l - ADN ligaz T4 3 U/l
173
Reactivii se adaug n ordinea indicat n tub, dup care se adaug ADN-ul genomic (0,5 1 g).
Se amestec i se centrifugheaz la 14.000g timp de 15 secunde. Se incubeaz 2 ore sau mai mult la 370C (sau pe timpul nopii la temperatura camerei).
Amplificarea preselectiv Primerii utilizai n aceast etap constau dintr-o secven miez, o secven specific enzimei de restricie i o extensie selectiv alctuit dintr-o singur baz la captul 3.
Secvenele adaptorilor i situs-urilor de restricie servesc ca situs-uri de legare a primeri-lor pentru amplificarea PCR preselectiv.
Fiecare primer preselectiv posed o nucleotid selectiv care recunoate subsetul fragmentelor de restricie ce au perechea nucleotidic n aval de situs-ul de restricie.
Produii primari ai acestei etape sunt acele fragmente ce au fost scindate o dat de MseI i o dat de EcoRI i posed nucleotidele pereche.
Etapa de amplificare preselectiv conduce la reducerea de 16 ori a complexitii fragmentului de ADN analizat.
174
Se utilizeaz urmtorul amestec amplificare preselectiv: - ap - tampon PCR (ap/MgCl2 15 mM) x 10 - dNTP mM - primeri PS EcoRI A (5- GACTGCGTACCAATTC A - 3) - primeri PS MseI C (5- GATGAGTCCTGAG TAA C - 3) - ADN polimeraz termostabil 5 U/ l
n fiecare tub se adaug 15 l, amestec de preamplificare i 5 l din probe. Se amestec i se centrifugheaz la 14.000g timp de 15 secunde. Amplificarea preselectiv se realizeaz cu urmtorul program pentru termocycler:
720C ...................2 minute
Incubare iniial
940C .................. 20 secunde ..... denaturare 560C .................. 20 secunde ..... cuplare 720C .................. 20 secunde ..... extensie 20 de cicluri
720C .................. 2 minute 60 C ................. 30 minute

0
Extensie final Incubare final
Se adaug 180 l tampon TE (diluat de 10 ori).

175
Amplificarea selectiv cu primeri marcai Primerii selectivi sunt marcai att radioactiv ct i fluorescent. Ei constau dintr-o secven identic cu cea a primeri-lor utilizai la amplificarea preselectiv plus nc dou nucleotide selective la captul 3.
Aceste dou nucleotide suplimentare pot fi oricare dintre cele 16 combinaii posibile ale celor patru nucleotide.
Din numrul imens de fragmente generate de enzimele de restricie, doar cele ce se potrivesc nucleotidelor vor fi amplificate (50 200 fragmente). Aceast etap reduce complexitatea produsului PCR de 256 de ori.
Diferitele combinaii de primeri vor genera fragmente diferite. Este necesar o evideniere preliminar pentru a niveluri de variaie adecvate. alege perechea de primeri care genereaz
Amestecul de amplificare selectiv: - ap - tampon PCR (ap/MgCl2 15 mM) x 10 - dNTP mM - primeri EcoRI A 0,46 M (5-FAM-GACTGCGTACCAATTC ACT -3) - primeri MseI C 2,75 M (5- GATGAGTCCTGAG TAA CAG -3) - ADN polimeraz termostabil 5 U/ l n fiecare tub se adaug 15 l, amestec de preamplificare i 5 l din probe.
Se amestec i se centrifugheaz la 14.000g timp de 15 secunde
176
Amplificarea preselectiv se realizeaz cu urmtorul program pentru termocycler:
720C ................... 2 minute
Denaturare iniial 940C .................. 20 secunde ..... denaturare 560C .................. 20 secunde ..... cuplare 720C .................. 20 secunde ..... extensie 940C ................................ 20 secunde ..... denaturare Se scade 10C/ciclu ......... 30 secunde ..... cuplare 720C ................................ 20 minute ..... extensie 9 cicluri
940C .................. 20 secunde ..... denaturare 560C .................. 20 secunde ..... cuplare 720C .................. 20 secunde ..... extensie 600C ................. 30 minute 20 de cicluri
Incubare final
Analiza fragmentelor amplificate obinute n gel Datorit faptului c fragmentele sunt marcate cu colorani ce prezint
177
fluorescen pot fi separate i cuantificate cu ajutorul secvenatorului.
Proba multipl (amplificat cu seturi separate de primeri, fiecare marcat cu o culoare fluorescent diferit) poate fi plasat pe un singur gel alturi cu un standard marcat de ADN.
n secvenator se introduc 5 l din produsul de reacie rezultat de la amplificarea selectiv i se adaug 5 l colorant fluorescent.
Schematic, principiul AFLP poate fi redat astfel:
RE , situs-ul 1 RE, situs-ul 2
ADN genomic
ADN restricionat
178
Adaptorii complementari ai secvenei cunoscute sunt ligai de terminaiile restrictive ale ADN-ului. Dac enzimele de restricie utilizate la tierea ADNului genomic nu sunt labile termic, secvena adaptoare nu trebuie s regenereze secvena de recunoatere original. Adaptori complementari
Matria de AND ligat este acum gata pentru amplificarea PCR. Fragmentul ligat
Pentru a reduce din start complexitatea populaia fragmentului adaptat, amplificarea PCR se realizeaz cu primeri complementari secvenelor adaptoare, fiecare cu o nucleotid selectiv. Teoretic, presupunnd existena de frecvene nucleotidice egale i c fiecare baz adiional se extinde n regiunea necunoscut de AND ar trebui s reduc numrul fragmentelor generate cu 4n (n numrul de baze adiionale). PCR se realizeaz n condiii stricte asigurndu-se ca doar cuplrile perfecte s ajung la elongaie.
179
Primer 1
+T
C+ Primer 2 Populaia fragmentelor preselective generate prin PCR const n primul rnd din cele cu urmtoarea frecven:
Produii preselectivi sunt din nou amplificai la fel ca n etapa anterioar, dar unul dintre primeri, cu posibile nucleotide selective multiple va fi marcat cu fluorofor. Doar fragmentele ce conin un situs cu primer complementar primerului marcat cu fluorofor va fi vizualizat n continuare.
180
Numrul de nucleotide selective necesar pentru distribuia optim a fragmentului este n mare msur dependent de complexitatea ADN-ului int care variaz mult printre clasele de organisme.
Primer 1
+ TX
XC + Primer 2
Datorit faptului c utilizeaz markeri ADN ce au polimorfism ridicat, aceast tehnic i-a dovedit utilitatea n construirea de hri de linkage n vederea
identificrii QTL pentru nsuirile legate de comportamentul igienic la albine (W i l k e s , K. i col., 2002).
Aplicarea AFLP a contribuit i la evidenierea a peste 315 STS utilizate n alctuirea hrii de linkage la Apis mellifera L., ceea ce se preconizeaz c ar avea drept rezultat facilitarea muncii de cercetare n vederea alctuirii unei liste de gene candidate asociate cu comportamentele complexe la aceast insect (S c h l i p a l i u s D.I., 2004).
181
4.4.5.Tehica RT PCR (Reverse Transcriptase PCR Revers Transcripia PCR)
Aceast tehnic este tot o variant a PCR-ului, n care amplificarea pornete de la cteva molecule de ARNm. n prezena revers transcriptazei, molecula de ARNm devine matri pentru sinteza ADNc, dup care procesul de amplificare decurge n mod normal (fig. 48). 3 5 ARNm
Revers Transcriptaz 5 3 ADNc
Figura 48. Principul RT PCR
182
Cuantificarea expresiei genice se bazeaz pe presupunerea c se pstreaz o anumit proporionalitate ntre cantitatea de ADN de la nceputul reaciei i cantitatea produsului de amplificare.
O apreciere a cantitii de ARNm prezent nainte de transcrierea invers poate fi fcut prin compararea intensitii benzilor ntr-un gel de agaroz.
Este demn de subliniat faptul c aplicarea PCR la moleculele de ARN necesit o modificarea a PCR n prima etap.
Pentru c molecula nu poate fi copiat n prezena Taq polimerazei, aceast etap este catalizat de revers transcriptaz, enzim n prezena creia este sintetizat molecula de ADN pe matria de ARN.
Copia de ADN este apoi amplificat n prezena Taq polimerazei, prin tehnica specifica RT-PCR.
Descoperirea enzimelor termostabile (ex. ADN-polimeraza T obinut din bacteria Thermus thermophilus) cu ajutorul crora pot fi obinute copii termostabile de ADN att de pe matrie de ADN ct i de pe matrie de ARN deschide va face posibil aplicarea RT PCR n condiiile n care va fi necesar o singur reacie n prezena unei singure enzime (B r o w n , T.A., 2002).
Aplicarea acestei tehnici i-a dovedit utilitatea n special la identificarea nor markeri moleculari la Apis mellifera, cu ajutorul crora este pus n eviden prezena viruilor n organismul insectei, n cercetrile efectuate n ntreaga lume.
183
Avantajul ei const n faptul c s-a dovedit un instrument rapid, specific i sensibil n diagnoza viral la albine, punnd n eviden acizii nucleici virali cu o acuratee mult superioar metodelor tradiionale de analiz (G r a b e n s t e i n e r , E. i col., 2001).
n 2002, E v a n s , J.D. i H u n g , A.K., n SUA, au realizat o clasificare a virusurilor ce atac albinele. Conform acestor cercetri, ele aparin la dou clase de virusuri: cele de tip picorna, precum i o clas de virusuri cunoscute sub numele de virusuri de tip Drosophila.
L e a t , N.i col. (2003), n Africa de Sud, au pus n eviden cu ajutorul RT-PCR virusul celulei negre a mtcii, stabilind n acelai timp i apartenena acestuia la virusurile de tip picorna.
Tot n Africa de Sud, cercetri efectuate n ultima decad (D a v i s o n , S. i col., 2003) au pus n eviden i caracterizat 18 virui ce infesteaz albinele, obinndu-se i secvena complet a genomului pentru cei de tip picorna (virusul paraliziei acute, celulei negre a mtcii, puietului n sac i a aripilor deformate).
B e k e s i , L. i col. (1999) i B a k o n n y i , T. i col. (2002) au evideniat prin aceeai tehnic gradul de infestarea a stupinelor din Ungaria cu virusul paraliziei acute, a crui agent viral este parazitul Varroa destructor.
Existena unor cazuri de coinfecie realizat de virusurile paraliziei acute i Kashmir asupra organismului albinei a fost pus n eviden de E v a n s , J. (2002). De asemenea, H u n g , A.C. a evideniat i posibilitatea determinrii existenei virusului Kashmir cu ajutorul RT-PCR din excreta albinelor.
184
Tot cu ajutorul RT-PCR a fost evideniat rolul de agent viral al parazitului Varroa destructor n vehicularea unei mari varieti de virui. Aplicaia cea mai important a fost demonstrat n cazul virusului aripilor diforme la albine n stupinele din Anglia i Suedia (B o w e n - W a l k e r , P.L. i col., 2002; N o r d s t r m , S., 2003).
n Austria, evidenierea prezenei virusului puietului n sac (G r a b e n s t e i n e r , E. i col., 2001) s-a realizat tot prin tehnici moleculare, avnd drept principal instrument de laborator tehnica RT-PCR, renunndu-se la studiile tradiionale ce implic microscopia electronic i analizele RIA.
* * *
Perfecionarea tuturor acestor tehnici moleculare a contribuit la dezvoltarea concomitent a o serie de firme cu renume n ziua de azi (Sigma, Promega, BioRad, Cambridge Bioscience, New England Biolabs, Appligene, Clonetech, Stratagene etc.) care dispun de propriile lor laboratoare i care pun la dispoziia cercettorilor implicai n acest domeniu nu numai reactivi de nalt puritate ci i kit-uri comerciale, ce faciliteaz n mare msur munca de cercetare.
Sunt furnizate kit-uri att pentru o analiz complet a ADN-ului, ct i pentru etape separate (extracie, marcare, clonare) sau pentru identificarea de markeri moleculari prin diverse tehnici (tabelul 2).
185
Tabelul 2. Kit-uri comerciale disponibile pentru utilizare n tehnicile moleculare folosite la Apis mellifera L. (dup L o x d a l e i col., 1998) Companiile comerciale Boehringer Mannheim Cambridge Bioscience Amersham Appligene Clonetech Bio-Rad
New England Biolabs
Pharmacia
Stratagene
Promega
Kit-uri Extracia ADN-ului genomic Marcare ntmpltoare Translaie Nick Marcare final Radioizotopi Marcare cu biotin Colorare cu argint Fluorescen PCR Clonare Secveniere (normal) Secveniere pe cicluri Geluri pretratate Markeri moleculari
186
Sigma
Markerii genetici i gsesc utilitatea n alctuirea hrilor de linkage care sunt utilizate cu mult succes n identificarea QTL. n toate aceste analize se face uz de soft-uri specifice elaborate n vederea facilitrii procesului de cartare.
Importana identificrii localizrii exacte a QTL rezid n posibilitatea utilizrii acestora n design-ul experimental a unor programe de ameliorare aplicate n vederea obinerii nsuirilor dorite (comportamentul igienic ce favorizeaz rezistena la boli i parazii la Apis mellifera L.). Cunoscnd care zone cromozomiale prezint importan, pot fi efectuate
manipulri genetice n favoarea nsuirii urmrite.
187
Antonia ODAGIU, Ioan Gh. OROIAN Caracteristici ecopatologice la insecte, abordare molecular. Volumul 1. Apis mellifera L. Bibliografie
BIBLIOGRAFIE
1. 2.
3.
4.
5.
6.
7.
Alvarez J.M., 1998, Molecular Markers for Insect Ecology, www.ergito.com Amador D.M., D. Brazeau, B. Farmerie, A. Blake, G. Clark, and M. Whitten, 2001, Introduction to AFLP, and General features of AFLP markers, AFLP Workshop, Interdisciplinary Center for Biotechnology Research, University of Florida, Gainesville, Florida, June 11 13, 2001 Anderson D., J.W.H. Trueman, 2000, Varroa jacobsoni (Acari: Varroidae) is more than one species, Experimental & Applied Acarology, No. 24, 165-189 Arathi H.S., Marla Spivak, 2001, Influence of colony genotypic composition on the performance of hygienic behavior in the honeybee, Apis mellifera L., Animal Behavior, 62, 57 66 Bachanova K., J. Klaudiny, J. Kopernicky, J. Simuth, 2002, Identification of honeybee peptide active against Paenibacillus larvae larvae through bacterial growth inhibition assay on polyacrylamide gel, Apidologie, vol. 33, 259 - 269 Bakonyi, T., Derakhshifar, I., Grabensteiner, E., Nowotny, N., 2003, Development and evaluation of PCR assays for the detection of Paenibacillus larvae in honey samples: comparison with isolation and biochemical characterization, Applied and Environmental Microbiology, vol. 69, no. 3, 1504 - 1510 Bakonyi T., R. Farkas, A. Szendroi, M. Dobos Kovacs, M. Rusvai, 2002, Detection of acute bee paralysis virus by RT PCR in honey bee and Varroa destructor field samples: rapid screening of representative Hungarian apiaries, Apidologie, vol. 33, 63 74
188
Bekesi L., B.V. Ball, M. Dobos Kovacs, T. Bakonyi, M. Rusvai, 1999, Occurrence of acute paralysis virus of the honey bee (Apis mellifera) in a Hungarian apiary infested with the parasitic mite Varroa jacobsoni, Acta Veterinaria Hungarica, vol. 3, no. 47, 319 324 9. Benjeddou M., N. Leat, M. Allsopp, and S. Davison, 2002, Detection of Acute Bee Paralysis Virus and Black Queen Cell Virus from Honeybees by Reverse Transcriptase PCR, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 67, No. 52384 - 2387 10. Benoit J. B., J.A. Yoder, D. Sammataro, L.W. Zettler, 2004, Mycoflora and fungal vector capacity of the parasitic mite, Varroa destructor (Mesostigmata: Varroidae) in honey bee (Hymenoptera: Apidae) colonies, International Journal of Acarology, Vol. 30, No. 2, 103 106 11. Besansson D., D.X. Yhang, D.L. Hartl, G.M. Hewitt, 2001, Mitochondrial pseudogenes: evolutions misplaced witnesses, Trends in Ecology and Evolution, no. 16, 314 - 321 12. den Besten P. J. , H.J. Herwig, E.G. van Donselaar and D.R. Livingstone, 1990, Cytochrome P-450 monooxygenase system and benzo(a)pyrene metabolism in echinoderms, Marine Biology, Vol. 107, No. 1, 171 177 1 3 . d e n B e s t e n P . J . , 1 9 9 8 , C y t o c h r o me P4 5 0 mo n o o x y g e n a s e s y s t e m i n e c h i n o d e r ms , C o m p a r a t i v e B i o c h e m i s t r y a n d P h ys i o l o g y P a r t C : P h a r m a c o l o g y, T o x i c o l o g y a n d E n d o c r i n o l o g y, V o l . 1 2 1 , N o . 1 - 3 , 1 3 9 1 4 6 1 4 . Be ye M . , G. J . Hu n t , R . E. P age, M . K. Fo n d rk , L. Gro gm an n , an d R . F. A. M o ri t z , 1 9 9 9 , Us u a l l y h i gh reco mb i n a ti o n ra te d etect ed i n s ex l o cu s reg i o n o f th e h o n ey b eee ( A p i s m el l i fer a ) , Gen et i cs , n o . 1 5 3 , 1 7 0 1 - 1 7 0 8 15. Beye M., M.K. Fondrk, M. Hasselmann, R.E. Page, 2001, A strategy to generate variable DNA markers from known sequences for marker based mapping procedures in honey bees, Methods Mol. Biol., no. 85, 75 78 1 6 . Bl ack W . C . , N. M . Du Teau , G. J . P u t erk a, J . R . Nech o l s , & J . M . P et t o ri n i , 1 99 2 , Us e o f th e ra n d o m a mp l i f i ed p o l y mo rp h i c DNA p o l y me ra s e ch a i n rea c ti o n (RA PD PC R) to d etec t DNA p o l y mo rp h i s ms i n a ph i d s (H o mo p t era : Ap h i d i d a e) , Bu l l et i n o f En t o m o l o gi c al R es earch 8 2 , 1 5 1 1 5 9 . 1 7 . Bo eck i n g, O. , Bi en en fel d , K. , Dr e s ch er, W . , 2 0 0 0 , H eri ta b i l i ty o f th e Va r r o a s p eci f i c h y g i en i c b eh a v i o r i n h o n ey b ees ( H ym en o p t er a : A p i d a e ) , J o u rn al o f An i m al Bre ed i n g an d G en et i cs , v o l . 1 1 7 , n o . 6 , 4 1 7 4 2 4 18. Bowen-Walker, P.L., Martin, S.J., and Gunn, A., 1998, The transmission of Deformed Wing Virus between honeybees (Apis mellifera L.) by the
8. 189
ectoparasitic mite Varroa jakobsoni, Experimental and Applied Acarology, vol. 22, 437 441 19. Breed M.D., 2003, Quantitative trait loci (QTLs), www.animalbehavioronline.com/qtl.html 20. Bruneau E., F. Jacobs, and J. Trouiller, 1997, Rsultats de la campagne dedtection de la rsistance de Varroa aux pyrthrinodes en Belgique - 1997. Abeilles et Compagnie, No. 60, 5 6 2 1 . Bro gd en K. A. , 2 0 0 5 , An ti mi cro b i a l p ep ti d es : p o re f o rme rs o r meta b o l i c i n h i b i to rs i n b a cte ri a ? , Nat u r e R ev i ews M i cro b i o l o g y 3 , 2 3 8 -2 5 0 nd 22. Brown T.A., 2002, Genomes, 2 Edition, BIOS Scientific Publishers Ltd., 101, 121, 122 23. Bulet P., C. Hetru, J.L. Dimarcq, D. Hoffmann, 1999, Antimicrobial peptides in insects: structure and function, Developmental and Comparative Immunology, vol. 23, 329 344 24. Burton M.P., B.G. Schneider, R. Brown, N. Escamilla-Ponce, & M.L.Gulley, 1998, Comparison of histologic stains for use in PCR analysis of microdissected, paraffin-embedded tissues, Biological Techniques 24, 86 92 25. Cameron S.A., P. Mardulym, 2003, The major opsin gene is useful for inferrring higher level phylogenetic relationships of the corbiculate bees, Molecular Phylogenetics and Evolution, no., 28, 610 613 26. Casteels Josson K., W. Zhang, T. Capaci, P. Casteels, P. Tepst, 1994, Acute Transcriptional Response of the Honeybee Peptide Antibiotics Gene Repertoire and Required Post transitional Conversion of the Precursor Structures, Journal of Biological Chemistry, vol. 269, no. 46, 28569 28575 27. Chline N., L.W.F. Ratnieks, N.E. Raine, N.S. Badcock, T. Burke, 2004, Non lethal sampling of honey bee Apis mellifera, DNA using wing tips, Apidologie, vol. 35, 311 318 28. Chandra, S.B.C., G.J. Hunt, S. Cobey, and B.H. Smith, 2001, Quantitative Trait Loci Associated with Reversal Learning and Latent Inhibition in Honeybees (Apis mellifera), Behavior Genetics, vol. 31, no. 3, 275 - 285 29. Cornet B., J.M. Bonmatin, J. Hetru, J.A. Hoffmann, M. Ptak, F. Vovelle, 1995, Refined three dimensional solution structure of insect defensin A, Structure, vol. 3, no. 5, 435 - 448 30. Cornuet, J-M., L. Garnery, and M. Solignac, 1991, Putative origin and function of the intergenic region between COI and COII of Apis mellifera L. mitochondrial DNA, Genetics, no. 128, 393 403
190
31.
32. 33.
34. 35.
36.
37.
38.
39.
40. 41. 42.
43.
Correa-Marques M.H. L.M. Medina, S.J. Martin, and D. De Jong, 2003, Comparing data on the reproduction of Varroa destructor, Genetic Molecular Research No. 2, 1 - 6 Coier Viorica, A. Vlaic, 2007, Abordarea practic a problemelor de genetic animal, Editura Todesco, Cluj - Napoca Crozier R.H., Y.C. Crozier, 1993, The mitochondrial genome of the honeybee Apis mellifera: complete sequence and genome organization, Genetics, no. 133, 97 117 Cruickshank R.H., 2001, Molecular markers for the phylogenetics of mites and ticks, Systematic & Applied Acarology, no. 7, 3 - 14 Davison S., N. Leat, M. Benjeddou, 2003, Development of molecular tools for honeybee virus research: the South Afican contribution, African Journal of Biotechnology, vol. 2, no. 12, 698 713 Dezmirean S. D., L.Al. Mrghita, Graia I. Dezmirean, Georgeta Dini, Otilia Bobi, Laura Laslo, Adela Moise, Antonia Odagiu, A. Fiiu, I. Paca, Cristina Bojan, Simona Brsan, O. Maghear, C. Coroian, M. Man, 2007, Reccomandations regarding prophylaxis of honey contamination during primary processing, Apicultura de la tiin la agribusiness i apiterapie, 82 - 84 Delaplane K., J.A. Berry, J.A. Skinner, J.P. Parkman, W.M. Hood, 2005, Integrated pest management against Varroa destructor reduces colony mite levels and delays treatment threshold, Journal of Apicultural Research, No. 44, 157 162 Denholm C.H., 1999, Inducible honey bee viruses associated with Varroa jacobsoni, Ph.D. thesis Keele University, Staffordshire, and IACR Rothamsted, Hertfordshire, UK Djordjevic S.P., Wendy A. Forbes, Lisa A. Smith, and M.A. Hornitzky, 2000, Genetic and biochemical diversitz among isolates of Penibacillus alvei cultured from Australian honeybee (Apis mellifera) colonies, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 66, No. 3, 1098 - 1106 Doggett N.A., 1992, The Polymerase Chain Reaction nd Sequencetagged Sites, Los Alamos Science, No. 20, 128 - 134 Dong K., 2007, Insect sodium channels and insecticide resistance, Invertebrate Neuroscience, Vol. 7, No. 1, 1493 - 1104 ODonnell S., 1996, RAPD markers suggest genotypic effects on forager specialization in an eusocial wasp, Behavioral Ecology Sociobiology, no. 38, 83 88 Donz G., Silvia Schnyder-Candrian, S. Bogdanov, P.A. Diehl, P.M. Guerin, Verena Kilchenman. F. Monachon, 1998, Aliphatic alcohols and aldehydes of the honey bee cocoon induce arrestment behavior in Varroa jacobsoni (Acari: Mesostigmata), an ectoparasite of Apis
191
mellifera, Archives of Insect Biochemistry and Physiology, Volume 37, Issue 2, 129145 44. Downey D.L., T.T. Higo, M.L. Winston, 2000, Single and dual parasitic mite infestations on the honey bee, Apis mellifera, Insectes Sociaux No. 47, 171 176. 45. Doyle K., D.C. Knipple, 1991, PCR-Based Phylogenetic Walking: Isolation of Para-Homologous Sodium Channel Gene Sequences From Seven Insect Species and an Arachnid, Insect Biochemistry, No. 21, 689 696 46. Eleftherianos I., S.P. Foster, M.S. Williamson and I. Denholm, 2008, Characterization of the M918T sodium channel gene mutation associated with strong resistance to pyrethroid insecticides in the peach-potato aphid, Myzus persicae (Sulzer), Bulletin of Entomological Research, No. 98,183 191 4 7 . Elzen P.J ., and D. Westerv elt, 20 02, Detection of cou maphos resis ta nce in Varro a d es tructor in Flo rida , Ameri can Bee J ourn al, No .142, 291 29 2 48. Estoup A., M. Solignac, M. Harry and J.M. Cornuet, 1993, Characterization of (GT)n and (CT)n microsatellites in two insect species: Apis meliffera and Bombus terrestris, Nucleic Acids Research, vol. 21, Issue 6, 1427 1431 49. Estoup A., L. Garnery, M. Solignac, and J-M. Cornuet, 1995, Microsatellite variation in honey bee (Apis mellifera L.) populations: hierarchical genetic structure and test of the infinite allele and stepwise mutation models, Genetics, no. 140, 679 695 50. Evans J.D., A.C. Hung, 2000, Molecular phylogenetics and the classification of honey bee viruses, Archives of Virology, vol. 145, no.10, 2015 2026 51. Evans J.D., 2002, Genetic Evidence for Coinfection of Honey Bees by cute Bee Paralysis and Kashmir Bee Viruses, Journal of General Virology, vol. 7., no.4, 1716 52. Evans J.D., 2004, Transcriptional immune responses by honey bee larvae during invasion by the bacterial pathogen, Paenibacillus larvae, Journal of Invertebrate Pathology, vol. 85, no. 2, 105 - 111 53. Faye B, D. Waltner-Toews, J. McDermott, 1999, From ecopathology to agroecosystem health, Vol. 39 (2), 111 - 128 5 4 . Flores J .M., J .A. R uiz, J .M. Ruiz, F. Puerta, M. Bustos, 2001, Hygi enic b eh avior of Apis m ellifera ib erica agains t brood cells a rtifici ally infested with varroa , J ourn al o f Apicultu ral R es earch, vol. 40 , no. 1, 29 34
192
Fries I., H. Hansen, A. Imdorf, P. Rosenkranz, 2003, Swarming in honey bees (Apis mellifera) and Varroa destructor population development in Sweden, Apidologie, 34, 389 - 397 56. Grabensteiner, E., Ritter, W., Carter, M.J., Davison, S., Pechhacker, H., Kolodziejec J., O. Boecking, I. Derakhshifar, R. Moosbeckhofer, E. Licek, N. Nowotny, 2001, Sacbrood Virus of the Honeybee (Apis mellifera): Rapid Identification and Phylogenetic Analysis Using Reverse Transcription PCR, Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, vol. 8, no.1, 93 104 5 7 . Harris J.W., J.D. Villa, R.G. Danka, 2004, Environmental effects on the growth of Varroa mite populations , Bee Culture, Vol.132, No. 5, 23 25 58. Hayden M.J., and P.J. Sharp, 2001, Sequence-tagged microsatellite profiling (STMP): a rapid technique for developing SSR markers, Nucleic Acids Research, vo. 29, no. 8, 43 52 59. Hidas A., M.E. Edvi, Enik Szalai Matray, 2004, Molecular genetic studies on honeybee of different varroa tolerance, First European Conference on Apidology, Udine 19 23 September 2004, 34 60. Higasa,K., and K. Hayashi, 2002, Ordered catenation of sequencetagged sites and multiplexed SNP genotyping by sequencing, Nucleic Acid Research, vol. 30, no. 3, e11, i-xiv 61. Higes M., J. Llorente, A. Sanz, A. Meana and R. Calonge, 1998, Varroa: sensibilidad al fluvalinato, Vida Apicola, No.89, 41- 45 62. Hillesheim E., W. Ritter, and D. Bassand, 1996, First data on resistance mechanisms of Varroa jacobsoni (Oud.) against tau-fluvalinate, Exp. Appl. Acarol. No. 20, 283 296 63. Huang Y.G., W. LiMing, L. QuiLian, 2001, Preliminary research on mechanism of fluvalinate resistance in Varroa jacobsoni Chinese Bulletin of Entomology, Vol. 38, http://www.cababstractsplus.org/ abstracts%5C Abstract.aspx?AcNo=20063106666 64. Hung A.C.F., 2000, PCR detection of Kashmir bee virus in honey bee excreta, Journal of Apicultural Research, vol. 34, no. 3 4, 103 106 65. Hunt G.J. and E. Page Jr., 1995, Linkage map of the honey bee Apis mellifera, based on RAPD markers, Genetics, no. 139, 1371 1382 66. Hoy, Marjorie, A., 1994, Insect Molecular Genetics, an Introduction to Principles and Applications, Academic Press Inc. 67. Jandricic S.E., G. Otis, 2003, The potential for using male selection in breeding honey bees resistant to varroa destructor, Bee World, vol. 84, no. 4, 155 164 68. King R.K., W.D. Stansfield, 2002, A dictionary of genetics, Sixth Edition, Oxford University Press
55. 193
Klaudini J., S. Albert, K. Bachanova, J. Kopernicky, J. Simuth, 2005, Two structurally different defensin genes, one of them encoding a novel defensin isoform, are expressed in honey bee, Apis mellifera, Insect Biochemistry, Molecular Biology, vol. 35, no. 1, 11 22 70. Lapidge K.L., B.P. Oldroyd, M. Spivak 2002, Seven suggestive quantitative trait loci influence hygienic behavior of honey bees, Naturwissenschaften, 89, 565 568 71. Leat N., B. Ball, V. Govan, S. Davison, 2003, Analysis of the complete genome sequences of black queen cell virus, a picorna like virus on honey bees, Journal of General Virology, vol. 8, no. 81, 2111 72. Lewey L., and C. Coates, 2003, Identifying genetic basis for Varroa mite resistance in honey bee, Apis mellifera, Sixth Annual Graduate Student Forum, Texas A & M University Department of Entomology 73. Liakos V., Ch. Batzios, M. Kokkinis 2002, Colonies of Apis mellifera macedonica (Ruttner) resistant to Varroa destructor, http://www.abstracts_greece.doc 74. Lougheed S.C., H.L. Gibbs, K.A. Prior, and P.J. Weatherhead, 2000, A comparison of RAPD versus microsatelite DNA markers in population studies of the Massasauga Rattlesnake, American Genetic Association, no. 91, 458 463 75. Loxdale H.D., and G. Lushai, 1998, Molecular markers in entomology review article, Bulletin of Entomological Research, no. 88, 577 - 600 76. Mardones G., A. Venegas, 1999, Chromogenic plate assay distinguishing bacteriolytic from bacteriostatic activity of an antibiotic agent, Journal of Microbiological Methods, www.sciencedirect.com 77. Martin S. J., 2004, Acaricide (pyrethroid) resistance in Varroa destructor, Bee World, No. 85, 67 - 69 78. Mrghita, L.Al., 2003, Albinele i produsele lor, Ed. Ceres, Bucureti 7 9 . McClean P., 1998, LOD Score Method of Estimating Linkage Distances ,www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/pl sc 431 /linkage/linka ge6.htm 80. Medina M.L., S.J. Martin, Espinosa Montao, and Ratnieks, F.L.W., 2002, Reproduction of Varroa destructor in worker brood of Africanized honey bees (Apis mellifera), Experimental and Applied Acarology, 27: 79 88 81. Merce E., C.C. Merce, 2009, Statistic. paradigme consacrate i paradigme integratoare, Editura AcademicPres Cluj-Napoca 82. Milani N., 1995, The resistance of Varroa jacobsoni Oud. to pyrethroids: a laboratory assay, Apidologie 26, 415 429
69.
194
83.
84.
85. 86.
87.
88.
89.
90. 91.
92.
93.
94.
Milani N., G. Della Vedova, 2002, Decline in the proportion of mites resistant to fluvalinate in a population of Varroa destructor not treated with pyrethroids, Apidologie, No. 33, 417 422 Moosbeckhofer R., M. Baumgartner, E. Licek, H. Pechhacker, 2003, Effects of oxalic acid evaporation on bee mortality in cage tests, 8th European Meeting on Integrated Varroa Control, KirchhainRauischholzhausen, http://www.ages.at Morse R.A., K. Flottum Eds., 1997, Honey Bee Pests, Predators, and Diseases, Third Edition, A.I. Root Company, Medina Ohio, USA Navajas M., B. Fenton, 2000, The application of molecular markers in the study of diversity in acarology: a riview, Experimental and Applied Acarology, vol., 24, no. 10/11, 751 774 Neumann P., R.F.A. Moritz, and D. Mautz, 1997, Testing the reliability of the honeybee performance yard Schwarzenau using DNA microsatellites, Apidologie, no. 28, 216 - 217 Neumann P., K. Fondrk, R.E. Pahe Jr., and R.F.A. Moritz, 1997, Testing the reliability of DNA microsatellites in instrumentally inseminated queen honeybees (Apis mellifera L.), in Soziale Insekten, IUSSI Tagung Graz, Crailsheim K., Stabenhteiner A. Eds. Neumann P., R.F.A. Moritz, 1999, The impact of polyandry on the phenotype of honeybee (Apis mellifera L.) colonies, Behavioral Ecology, 46 59 Noedstrm S., 2000, Virus infections and Varroa mite infestation in honeybee colonies, Doctoral Dissertation, Uppsala, Suedia Odagiu Antonia, A. Vlaic, L.Al. Mrghita, D. Dezmirean, M. Man, 2005, Molecular mechanisms involved in Apistan resistance in Varroa mite a review, Proceedings of XL Croatian Symposium on Agriculture with International Participation, 625 626 Odagiu Antonia, A. Vlaic, L.Al. Mrghita, D. Dezmirean, Laura Laslo, 2006, Preliminary research concerning the hygienic behavior in honeybees from the counties of Cluj, Buletinul USAMV Cluj-Napoca, Seria Zootehnie i Biotehnologii, Vol. 62, 320 325 Odagiu Antonia, A. Vlaic, L.Al. Mrghita, D. Dezmirean, I. Cornoiu, Laura Laslo, 2007, Research into the hygienic behaviour of honeybees in Transylvania, Proceedings of the 42nd Croatian&2nd International Symposium on Agriculture, 13-16 February, 302 306 Odagiu Antonia, A. Vlaic, L.Al. Mrghita, D. Dezmirean, 2007, The hygienic behavior testing honeybee colonies from Transylvanian area, n Apicultura de la tiin la agribusiness i apiterapie, Mrghita L.Al., D. Dezmirean - Coordonatori, Editura AcademicPres, Cluj Napoca, 17 - 19
195
von Oers O.M., D. Peters, J.M. Vlak, 2000, Comparative study of a novel virus of the Varroa mite and Deformed Wing Virus (DWV) of honeybee, htp://www.wageningen-ur.nl/viro/research/baculo%20biology % 20and%20biotechnoogy.html 96. Page Jr. R.E., J.Gadau, and M. Beye, 2002, The emergence of Hymenopteran Genetics, Genetics, no. 156, 375 379 97. Pettis J.S., 2003, A scientific note on Varroa destructor resistance to coumaphos, U.S. Apidologie, Vol. 35, 91 - 92 98. Rakosy Tican Elena, L.Al. Mrghita, 2007, The bees as vehicles for transgene transfer from genetically moddified plants to other organisms theoretical issues, n Apicultura de la tiin la agribusiness i apiterapie, Mrghita L. Al., D. Dezmirean Coordonatori, Editura AcademicPres, Cluj Napoca, 184 188 99. Rice R.N., 2001, Nosema Disease in Honeybees, Genetic Variation and Control, RIRDC Publication No 01/46, viii 100. Rinderer T.E., G.T. Delatte, L.I. de Guzman, J.L. Williams, J.A. Stelzer, V.N. Kuznetsov, 1999, Evaluation of the Varroa resistance of honey bees imported from Far-Eastern Russia, American Bee Journal no. 139, 287 - 290 101. Rowe D.J., T.E. Rinderer, J.A. Stelzer, B.P. Oldroyd, and R.H. Crozier, 1997, Seven polymorphic microsatellite loci in honeybees (Apis mellifera), Insectes Sociaux, No. 44, 85 93 102. de la Ra Pilar, J. Galin, J. Serrano, R.F.A. Moritz, 2003, Genetic structure of Balearic honeybee populations based on microsatellite polymorphism, Genet. Sel. Evol., 35, 339 - 350 103. Rees J.A., M. Moniatte, P. Bulet 1997, Novel antibacterial peptides isolated from an European bumblebee, Bombus pascuorum (Hymenoptera, Apoidea), Insect Biochemistry Molecular Biology, vol. 27, no. 5, 413 422 104. Rinderer T.E., G. T. Delatte, L.I. de Guzman, J.L. Williams, J.A. Stelzer, V.N. Kuznetsov, 1999, Evaluation of the Varroa resistance of honey bees imported from Far-Eastern Russia, American Bee Journal, No. 139, 287 - 290 105. Sambrook J., E.F. Fritsch & T. Maniatis, 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. New York, Cold Spring Harbour Laboratory Press 106. Sammataro Diana, Pia Untalan, F. Guerrero and Jenifer Finley, 2005, Distance of Varroa mites (Acari: Varroidae) to acaricides and the presence of esterase , International Journal of Acarology, Vol. 31, No. 1, 67 74 107. Savelkoul P.M.H., A.H.J. Marts, J. de Haas, L. Dijkshoorn, B. Duim, M. Otsen, J.L.W. Rademaker, L. Schouls, and J.A. Lenstra, 1999, Amplified95. 196
Fragment Length Polymorphism Analysis: the State of Art minireview, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 37, No. 10, 3083 3091 108. Schlipalius D.I., C.M. Emore, S.B.C Chandra, O. Rueppell, R.E. Page, G.J. Hunt, 2004, Integrating a high-density genetic linkage map of Apis mellifera with the honeybee genome project, Plant & Animal Genomes XII Conference San Diego, http://www.intlpag.org/12/abstracts/ 109. Schuler Mary A., 1996, The Role of Cytochrome P450 Monooxygenases in Plant - Insect lnteractions, Plant Physiology, No.112, 1411-1419 110. Segura J.A.L., 2000, Highly polymorphic DNA markers in an Africanized honey bee population in Costa Rica, Genetics and Molecular Biology, vol. 23, no. 20 28 111. Sibbesen O., Birgit Koch, Barbara Ann Halkier and Birger Lindberg Mller, 1995, Cytochrome P-450 Is a Multifunctional Heme-Thiolate Enzyme Catalyzing the Conversion of L-Tyrosine to pHydroxyphenylacetaldehyde Oxime in the Biosynthesis of the Cyanogenic Glucoside Dhurrin in Sorghum bicolor (L.) Moench, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 270, No. 8, 3506 - 3511 112. Sunnucks P., P.E. England, A.C. Taylor & D.F. Hales, 1996, Microsatellite and chromosome evolution of parthenogenetic Sitobion aphids in Australia, Genetics 144, 747756 113. Soderlund D.M., and D.C. Knipple, 2003, The molecular biology of knockdown resistance to pyrethroid insecticides, Insect Biochemistry and Molecular Biology, No. 33, 563 577 114. Soderlund D.M., 2008, Pyrethroids, knockdown resistance and sodium channels, Pest Management Science, Vol. 64, No. 6, 610 - 616 115. Solignac M., D. Vautrin, E. Baudry, F. Mouguel, A. Loiseau and J-M Cornuet, 2004, A Microsatelitte-Based Linkage Map of the Honeybee, Apis mellifera L., Genetics 167, 253 - 262 116. Spinella D.G., A.K. Bernardino, A.C. Redding, P.W.Z. Kouty, E.K. Pratt, K.K. Myers, G. Chappell, S. Gerken and S.J. McConnell, 1999, Tandem arrayed ligation of expressed sequence tags (TALEAS): a new method for generating global gene expression profiles, Nucleic Acid Research, vol.27, no. 18, e22, i-viii 117. Spivak Marla, 1998, Honey bee hygienic behavior as a defense against Varroa jacobsoni mites, Resistant Pest Management, vol. 9, no. 2, 22 24 118. Spivak Marla, M. Gilliam, 1998, Hygienic behavior and its application for control of brood diseases and varroa. Bee World 79: 124 - 134
197
119. Spivak
Marla, and Reuter, G.S., 2001, Varroa destructor infestation in untreated honey bee (Hymenoptera: Apidae) colonies selected for hygienic behavior, Journal of Economic Entomology, vol. 94, no. 2, 326 331 120. Suazo A., H.G. Hall, 2004, Modification of AFLP protocol applied to honey bee (Apis mellifera L.) DNA, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ query.fcgi? cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=1 121. Subramanian S., Madgula, V. M., George, R, Mishra, R.K., Pandit, M.W., Kumar, C. S., and Singh, L., 2002, MRD: a microsatellite repeats database for prokaryotic and eukaryotic genomes, Genome Biology, no.3, http:// genomebiology.com /2002/3/12/preprint/0011 122. Tan J., Z. Liu, R. Wang, Z. Y. Huang, A. C. Chen, M.Gurevitz, and K. Dong, 2005, Identification of Amino Acid Residues in the Insect Sodium Channel Critical for Pyrethroid Binding, Molecular Pharmacology, Vol. 67, No. 2, 513 522 123. Tars S., J-M. Cornuet, and P. Abad, 1993, Characterization of an unusually conserved AluI high reiterated DNA sequence family from the honeybee, Apis melllifera, Genetics, no. 134, 1195 - 1204 124. Tarpy D.R., 2003, Genetic diversity within honeybee a colony prevents severe infections and promotes colony growth, Proc.R.Soc. London B, 270, 99 103 125. Tew E.J., D. Sammataro, D. Heilman, 2003, Controling Tracheal Mites in the bee hive, http://www.ohioline.osu.edu 126. Tingey S.V., J.A. Rafalski, and J.G.K. Williams, 1993, Genetric Analysis with RAPD markers, Application of RAPD Technology to Plant Breeding, 3 - 8 127. Trouiller J., 1996, Rsistance de varroa au fluvalinate: les faits, Sant de lAbeille 153, 110 - 117 128. Trouiller J., and J.P. Faucon, 1997, Rsistance de varroa au fluvalinate Rsultats 1997 des analyses de laboratoire, Sant de lAbeille 1 - 2, 35 - 36 129. Trouiller J., 1998, Monitoring Varroa jacobsoni resistance to pyrethroids in Western Europe, Apidologie, No. 29, 537 546 130. Valles S.M., O.P. Perera, and C.A. Strong, 2003, Relationship Between the para-Homologous Sodium Channel Point Mutation (g c at Nucleotide 2979) and Knockdown Resistance in the German Cockroach Using Multiplex Polymerase Chain Reaction to Discern Genotype, Journal of Economic Entomology, Vol. 96, No.3, 885-891 131. Vlaic A., 1997, Inginerie genetic, realizri, sperane, neliniti, Ed. Promedia Plus 132. Vlak J.M. R.W. Goldbach, 2003, Characterization of a picorna like virus isolated from the mite Varroa destructor and its potential use as
198
a biological control agent against this mite, Research project 2002 2004, Dutch Research Data Base, http://www.niwi.knaw.nl 133. Vos P., R. Hogers, M. Bleeker, M.Reijans, T. van de M. Lee, Mornes, A. Frijters, J. Pot, J. Peleman, M. Kuiper, and M. Yabeau, 1995, AFLP: a new technique for DNA fingerprinting, Nucleic Acids Research, vol. 23, no. 21, 4407 4414 134. Walker K.L., Kathryn Sparks, 1997, Studies on the Apoidae (bees) biodiversity and plant associations in Central Australia: the forgotten pollinators, http://catalogue.nla.gov.au/Record/1895711? 135. Wang R., Z. Liu, K. Dong, P.J. Elzen, J. Pettis, Z.Y. Huang, 2002, Association of novel mutations in sodium channel gene with fluvalinate resistance in the mite, Varroa destructor, Journal of Apicultural Research, Vol. 40, No. 1-2, 17 -25 136. Wang R., Z.Y. Huang, K. Dong, 2003, Molecular characterization of an arachnid sodium channel gene from the varoa mite ( Varroa destructor), Insect Biochemistry and Molecular Biology, No. 33, 733 739 137. Wang R., K. Dong, and Z. Y. Huang, 2003, Cloning and Sequencing of a Putative Sodium Channel Gene from a Parasitic Mite of the Honey Bee, Varoa jacobsoni, http://cyberbee.msu.edu/lab/ray/poster.html 138. Weeden N.F., G.N. Timmerman, M. Hemmat, B.E. Kneen M.A. Lodhi, 1993, Inheritance and Reliability of RAPD Markers, Application of RAPD Technology to Plant Breeding, 12 - 17 139. Welsh J., and M. McClelland, 1990, Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Research no. 19, 303 306 140. Wilkes K., B. Oldroyd, 2002, Breeding hygienic disease resistant bees, Report for the Rural Industries Research and Development Corporation Australia, Project no. US 39A 141. Wilkinson D., and G.C. Smith, 2002, Modeling the Efficiency of Sampling and Trapping Varroa destructor in the Drone Brood of Honey bees (Apis mellifera), American Bee Journal, 209 - 212 142. Williams J.G.K., A.P. Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafalski, and S.V. Tingey, 1990, DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers, Nucleic Acids Research no. 18, 6531 6535 143. Yang-Jiang Lu, M. J. Adang, D. J. Isenhour, G. D. Kochert, 1992, RFLP analysis of genetic variation in North American populations of the fall armyworm moth Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), Molecular Ecology, Volume 1, Issue 4, 199 208 144. ***, 2000, Mid-Atlantic Apicultural Research & Extension Consortium (MAAREC), http://MAAREC.cas.psu.edu 145. ***, 2002, How to study questions in ecology and evolution, http://www.lifescience-zurich.ch/focus1/material_method-en.asp
199
146. ***,
2003, Varroa mite, http://www.beekeeping.com/vita/bdiseases /varroam.htm 147. ***, 2003, Varroa mites, http://www.main.org/cahbs/varroam.htm 148. http://members.aol.com/queenb95/genetics.html 149. http://nilgs.naro.affrc.go.jp 150. www.liis.lv/kukaini/ lkuk2.htm 151. www.uni-bayreuth.de/departments/ toek1/fortner/ 152. www.tuat.ac.jp/~ethology/ Sasaki/queen-L.jpeg 153. www.mossopshoney.co.nz/From+hive+to+honeypot/ 154. www.hyperdictionary.com 155. www.sci-ed-ga.org
200

Boli Albine

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Boli Albine

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Antonia ODAGIU

Ioan Gh. OROIAN

Consideraii ecopatologice la insecte, abordare molecular

Volumul 1. Apis mellifera L.

Editura BIOFLUX, CLUJ NAPOCA, 2010 eISBN: 978-606-8191-07-2

Familii slabe, cuiburi slab organizate

Distrofii ale sitemului neuro endocrin

Figura 1. Relaia dintre factorii de mediu i patologia necontagioas la albine 12

BOLILE I PARAZIII ALBINELOR

Figura 3. Albin lucrtoare

Figura 4. Matc nconjurat de albine lucrtoare

1.1. BOLILE ALBINELOR

cvasitotalitate bolilor provocate de virui la albine.

1.1.2. Boli provocate de bacterii

Agentul patogen este

Melissococcus pluton, o bacterie care iniial a fost

F e a t h e r s t o o n e (citai de M o r s e , R.A. & (enzyme-linked

F l o r t t u m K., Eds., 1997)au artat c testul ELISA

1.1.3. Boli provocate de protozoare

1.1.4. Boli provocate de ciuperci i mucegaiuri

1.2. PARAZIII ALBINELOR

1.2.1. Acarapis woodi

1.2.2. Varroa sp.

Figura 5. Ciclul de via al parazitului Varroa sp. (www.mossopshoney.co.nz/From+hive+to+honeypot/)

NADH/NADH+ ROH + H2O

a fost confirmat prezena oxidazelor din complexul

1.2.3. Tropilaelaps clareae

BAZELE GENETICE ALE REZISTENEI ALBINELOR LA BOLI I PARAZII

2.1. MECANISME FIZIOLOGICE

2.2. MECANISME COMPORTAMENTALE

Figura 6. Transmiterea comportamentului igienic la Apis mellifera L. (http://members.aol.com/queenb95/genetics.html)

n exprimarea omportamentului igienic, un loc central l ocup sistemul imunitar al albinei.

VT C DLLSFKGQVNDSA C AAN C LSLGKAGGHCEKGV C ICRKTSFKDLWDKRF

YVPLPNVPQPG R RPFP T FPGQ G PFNP K IKW P Q G Y

Figura 9. Modul de aciune intracelular a polipeptidelor antimicrobiene (dup B r o g d e n , K.A., 2005),

2.3. EVIDENIEREA COMPORTAMENTULUI IGIENIC LA APIS MELLIFERA L. N STUPINE DIN TRANSILVANIA

Colectarea chestionarelor s-a realizat pentru fiecare jude.

a mediei, deviaia standard i coeficientul de variabilitate (C o i e r V i o r i c a i A . V l a i c , 2007; V l a i c A . i col., 2004)

100 90 80 Subieci chestionai, % 70 60 50 40 30 20 10 0 Pastoral Mixt Stationar Tipul de apicultur

80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 intervenie 2-5 interventii peste 5 interventii Nr. intervenii

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Varoa Parazitul

Figura 15. Celule descpcite, judeul Alba

Figura 16. Celule descpcite, judeul Bistria - Nsud

Figura 17. Celule descpcite, judeul Cluj 75

Figura 18. Celule descpcite, judeul Covasna

Figura 19. Celule descpcite, judeul Harghita

Figura 20. Celule descpcite, judeul Hunedoara

Figura 21. Celule descpcite, judeul Mure

Figura 22. Celule descpcite, judeul Satu-Mare

Figura 23. Celule descpcite, judeul Slaj

Figura 24. Celule descpcite, judeul Sibiu

distribuia ateptat (normal) distribuia nregistrat (real)

2.4. MECANISME ANATOMICE

MARKERI MOLECULARI ASOCIAI CU REZISTENA LA PARAZII I BOLI LA ALBINE

regiunilor cromozomiale cu funciuni vitale.

Markeri moleculari RFLP

3.1. MARKERI PROTEICI

3.2. MARKERI ADN

Analizele ce utilizeaz markeri ADN presupun urmtoarele etape:

3.2.1. Polimorfismele lungimii fragmentelor de restricie (RFLP)

3.2.2. Polimorfismele lungimii secvenelor simple (SSLPs)

GATCAATATCATTGATGACC 3 legai de poziiile nucleotidice 3090 i 3940,

pe baza hrii mitocondriale realizat la Apis mellifera L. de C r o z i e r i C r o z i e r (1993).

5 secven unic GTGTGT GT secven unic 3 (GT)n