Biotehnologii animale

Biotehnologii industriale, an III

Biotehnologiile animale
Definiie Set de tehnici prin care organismele vii sunt modificate n beneficiul oamenilor sau altor animale Biotehnologiile animale origini - n urm cu 8000 de ani, prin domesticirea i selecia artificial a animalelor Biotehnologiile moderne nceputul anilor 1960, odat cu descoperirea codului genetic

Biotehnologiile animale
Aplicaii generarea de animale cu proprieti utile (produse lactate, carne, fibre, fertilitate mare) producerea de compui, celule, esuturi, organe sau celule artificiale n scopuri medicale Tehnologii de modificare a liniilor germinale: introducerea de gene noi prin transfecie, vectori sau transpozoni eliminarea sau modificarea genelor prin manipularea direct a liniei germinale propagarea copiilor unui animal prin transfer nuclear

Biotehnologiile animale
Modificarea liniei germinale la mamifere se realizeaz prin: 1. Manipularea direct a ovulului fecundat, urmat de implantarea sa n uter 2. Manipularea spermatozoizilor utilizai pentru generarea zigotului 3. Manipularea esutului embrionar timpuriu 4. Utilizarea celulelor stem embrionare care, dup manipulare i selecie ex vivo, pot fi introduse n embrionii timpurii 5. Manipularea celulelor somatice cultivate ai cror nuclei pot fi transferai oocitelor enucleate, crora le asigur informaia genetic necesar pentru producerea ntregului animal

Celule artificiale

Biotehnologii industriale, an III

Celule artificiale
nceputuri anii 1950, T. M. Chang, F. C. MacIntosh i A. Burgen, Universitatea McGill Artificial cell is not a specific physical entity. It is an idea involving the preparation of artificial structures of cellular dimensions for possible replacement or supplement of deficient cell functions. It is clear that different approaches can be used to demonstrate this idea. (Chang, 1972)

Celule artificiale
Eritrocite artificiale. (A) Caracteristicile eritrocitelor (B) Caracteristicile eritrocitelor artificiale (C) Eritrocite artificiale cu membran de nylon ultrasubire. Celulele sunt sferice n soluie hipoton i devin crenate n soluie hiperton (D) Eritrocite artificiale cu diametrul de 80 nm care conin hemoglobin i enzime eritrocitare

Celule artificiale
Metode fizice de preparare a celulelor artificiale. (A) Metoda picturii de preparare a celulelor artificiale mari. Principiul metodei a fost extins ulterior pentru ncapsularea celulelor, celulelor stem i a celulelor modificate genetic (B) Metoda de separare a emulsiei pentru prepararea celulelor artificiale microscopice. Principiul metodei a fost extins ulterior pentru prepararea celulelor artificiale microscopice i nanometrice

Celule artificiale
Metoda chimic de preparare a celulelor artificiale 1. Unei soluii lipidice i se adaug un compus chimic hidrosolubil, de ex. diamin (un component al nylonului) i coninutul celular 2. Soluia se emulsifiaz 3. Un compus liposolubil, de ex. diacid (tot component al nylonului) se dizolv ntr-un solvent organic i se adaug emulsiei 4. Cnd diamina ntlnete diacidul, are loc polimerizarea interfacial (reacie chimic) i se formeaz o membran de nylon n jurul coninutului celular 5. Se ndeprteaz solventul organic, celulele se spal i se transfer n soluie salin

Caracteristicile celulelor artificiale

Caracteristicile celulelor artificiale
1. Membrana unei celule artificiale separ coninutul acesteia de mediul extern. n acelai timp, membrana permite transportul selectiv al compuilor. Deci, membranele artificiale restricioneaz micarea moleculelor n funcie de mrimea lor, liposolubilitate, afinitatea pentru crui etc. 2. Membranele artificiale pot fi foarte subiri dar, n acelai timp, foarte puternice i pot avea o suprafa foarte mare. De ex., 10 ml de celule artificiale, cu un diametru de 20 m, au o suprafa de 2500 cm2. Aceast suprafa corespunde suprafeei membranare totale a unui rinichi artificial. Membrana celulelor artificiale este de 100 ori mai subire dect a unui rinichi artificial moleculele mici se pot mica de o parte i alta a membranei de 100 de ori mai rapid dect prin membrana unui rinichi artificial 3. Celulele artificiale pot conine acelai material biologic ca i celulele vii. n plus, celulele artificiale sunt mai versatile dect cele vii, deoarece compuii adorbani, materialele magnetice, alte celule, medicamentele pot fi incluse n celulele artificiale separat sau n diverse combinaii

Caracteristicile celulelor artificiale

Caracteristicile celulelor artificiale Sus: Principiile de baz ale celulelor artificiale. Mijloc: Diferite tipuri de celule artificiale bazate pe aceste principii. Jos: Celule artificiale cu o mare diversitate a coninutului, materialului membranar i dimensiunilor.

Caracteristicile celulelor artificiale

Dimensiuni - macrometrice - nanometrice - moleculare Materialul membranar - polimeri - polimeri biodegradabili - lipide - proteine - complexe lipopolimerice - complexe lipoproteice - transportori membranari
Coninut materiale individuale sau n diferite combinaii - celule - celule stem - enzime - sisteme multienzimatice - hemoglobin - materiale magnetice - microorganisme - vaccinuri - gene pentru terapie genic - celule manipulate genetic - adsorbani - medicamente - peptide - proteine .a.

Nanobiotehnologiile i celulele artificiale

Obiectiv obinerea de celule artificiale mai mici, prin utilizarea de nanoparticule, nanosfere i nanocapsule Nanobiotehnologia asamblarea moleculelor biologice n nanostructuri, obinerea de membrane cu grosimea de nanometri sau nanotubuli cu diametru de nanometri. Nanopolihemoglobina Hb este legat, cu ajutorul glutaraldehidei, ntr-o membran ultrasubire, pentru a se obine polinanoHb solubil

Hemoglobina ca transportor de oxigen

Eritrocitele: prezint antigene ntrzieri n situaiile de urgen pot fi depozitate doar 42 de zile nu pot fi sterilizate pentru ndeprtarea agenilor infecioi (hepatit, HIV) Eritrocitele conin: o Hb o enzime antioxidante o sistem multienzimatic care previne conversia Hb la metHb Nanobiotehnologiile permit realizarea unor transportori simpli de oxigen, care conin doar Hb De ce trebuie modificat Hb? Hb este un tetramer (dou subuniti i dou ) care, atunci cnd este infuzat, se descompune in dimeri toxici 11 i 2 2. Dei este un transportor excelent de oxigen, Hb extras din snge nu poate fi utilizat pentru infuzii, deoarece este foarte toxic pentru rinichi datorit dimerilor

Nanobiotehnologiile i celulele artificiale

Exemplu de asamblare a moleculelor biologice pentru a forma poliHb i Hb conjugat.

Comparaie ntre cele patru tipuri de hemoglobin

Hemoglobina modificat

PoliHb utilizat n scop terapeutic.

Hb i imunogenicitatea
Polimerizarea proteinelor crete imunogenicitatea lor poliHb slab antigenic Administrarea repetat, prin injectare subcutanat, la obolan de Hb izolat de la obolan (homoloag) nu crete imunogenicitatea, ns administrarea de Hb izolat de la alte specii (heteroloag) este antigenic Infuzia la obolan de Hb de obolan, poliHb de obolan, Hb de la alte specii sau poliHb de la alte specii nu determin creterea antigenicitii Infuzia la obolani imunizai de Hb de obolan sau poliHb de obolan, nu determin creterea antigenitii, ns injectarea de Hb sau poliHb de la alte specii determin reacii anafilactice

Nanobiotehnologiile i celulele artificiale

Avantajele utilizrii nanopolihemoglobinei (nanopoliHb)
Poate nlocui sngele pierdut n urma interveniilor chirurgicale, meninnd nivelul hemoglobinei sangvine la un nivel acceptabil Spre deosebire de eritrocitele provenite de la donori, nanopoliHb nu prezint specificitate de grup sangvin i poate fi administrat pe loc Nu este contaminat cu ageni infecioi precum HIV, hepatita C, bacterii, parazii etc. n timp ce sngele donorilor poate fi pstrat doar la 4C doar timp de 42 zile, nanopoliHb poate fi depozitat la temperatura camerei mai mult de un an. Astfel, poate fi administrat rapid n ocul hemoragic Datorit dimensiunilor mici, poliHb poate perfuza cu uurin microcirculaia anormal a tumorilor i poate asigura aportul adecvat de oxigen necesar pentru chemo- sau radioterapie

Nanobiotehnologiile i celulele artificiale

Dezavantajul utilizrii nanopoliHb n cazul ocului hemoragic, polinanohemoglobina trebuie administrat rapid, deoarece, n timp, se produc specii reactive de oxigen care lezeaz esutul Soluia realizarea unui complex nanobiotehnologic PolyHb-SOD-CAT

Exemple de diferite tipuri de enzime care conin poliHb obinute prin nanobiotehnologii

Celule artificiale, enzime i terapia enzimatic

Celulele artificiale pot conine o singur enzim sau complexe enzimatice. Enzimele nu ies din celul, dar pot aciona pe substraturi permeante din mediul extracelular Avantaj evitarea reaciilor anafilactice sau producerea de anticorpi Terapia enzimatic se poate face prin administrare oral (ureaz, xantinoxidaz, fenilalaninamoniliaz)

Probleme legate de injectarea enzimelor n soluii

Modul de aciune al enzimelor din celulele artificiale

Celule artificiale, enzime i terapia enzimatic

Cele mai multe enzime din organism funcioneaz ca sisteme enzimatice cu reciclarea cofactorilor. Celulele artificiale care conin trei enzime pot converti deeurile metabolice, ca urea i amoniacul, n aminoacizi eseniali. Cofactorul, NADH, poate fi reciclat i reinut n interiorul celulelor prin legarea cu dextran sau prin utilizarea de membrane lipidice polimerice

Celulele artificiale pot conine sisteme enzimatice

Eritrocitele nanometrice pot conine toate enzimele eritrocitare

Celule artificiale cu compartimente intracelulare

Celulele artificiale pot conine compartimente intracelulare. Sistemele enzimatice sau alte sisteme biologice active pot fi nchise separat sau combinate, n fiecare din aceste compartimente

Celule artificiale cu compartimente intracelulare

Celulele artificiale pot conine materiale magnetice. n acest caz, se poate utiliza un cmp magnetic pentru a direciona celulele. Astfel de celule se folosesc extensiv n bioreactoare sau n ndeprtatea materialelor specifice dintr-un amestec

Celule ncapsulate n celule artificiale

Se folosesc pentru a proteja celulele endocrine ncapsulate de procesele imune ncapsularea se face cu membrane care conin alginatpolilizin-alginat Utilizri Transplantul de insule Langerhans la pacienii cu diabet de tip 1 Transplantul de hepatocite n insuficiena hepatic (scad nivelul bilirubinei, previn respingerea xenogrefei)

Celule ncapsulate n celule artificiale

Celulele ncapsulate n celule artificiale nu mai prezint pericolul rejeciei

Celule stem ncapsulate n celule artificiale

ncapsularea concomitent a hepatocitelor cu celule stem determin creterea viabilitii hepatocitelor att n cultur, ct i dup implantare. Celulele implantate scad nivelul bilirubinei pentru dou luni. n lipsa celulelor stem, acest efect al hepatocitelor este de doar o lun

Celule artificiale care conin bioadsorbani

Consecina dimensiunilor microscopice ale celulelor artificiale este un raport suprafa/volum mare. Din acest motiv, celulele artificiale sunt mult mai eficiente n eliminarea toxinelor i drogurilor din sngele pacienilor comparativ cu hemodializa clasic Cel mai utilizat bioadsorbant carbonul amorf (charcoal). Acesta mpiedic embolizarea i distrugerea celulelor sangvine Aplicaii pacienilor care ncearc s se sinucid cu supradoze de medicamente insuficiena renal insuficiena hepatic

Celule artificiale care conin bioadsorbani

Celule artificiale cu bioadsorbani. Sus: probleme legate de ndeprtarea toxinelor din snge. Mijloc: Bioadsorbanii din celulele artificiale pot fi utilizai n hemodializ. Jos: Adsorbant n interiorul unei celule artificiale.

Celulele artificiale i studiul membranelor

Compoziia membranelor poate fi modificat dup dorin variaia proprietilor membranei (porozitate, grosime, ncrcare electric, compoziia lipidic i proteic, tipul de mucopolizaharide i polimeri) Se pot studia: biofizica transportului membranar relaia ntre proprietile membranei i timpul de supravieuire n circulaie relaia ntre proprietile fizico-chimice ale membranei i elementele figurate ale sngelui Modele experimentale: liposomi cu bistrat lipidic liposomi cu un singur strat lipidic liposomi cu membrane mixte lipide-polimeri, lipide-proteine liposomi cu pompe incorporate (ex., Na-K-ATP-aza)

Celulele artificiale i administrarea medicamentului (drug delivery)

Microcapsule polimerice semipermeabile au fost primele folosite pentru a ncapsula medicamente cu eliberare lent aveau dezavantajul c erau de dimensiuni relativ mari membrana nylon Celule artificiale polimerice biodegradabile, nanoparticule, nanocapsule pot conine enzime, hormoni, vaccinuri, alte materiale biologice au dimensiuni mici i forme diferite membrana poliactid, material biodegradabil Poliactid acid lactic CO2 + H2O

Liposomi primii liposomi erau alctuii din mai multe bistraturi lipidice concentrice. Cantitatea mare de lipide limita cantitatea de medicamente care putea fi ncapsulat actualmente se prepar liposomi unilamelari (cu un singur bistrat lipidic) prin metoda evaporatiei n eter

Alte sisteme artificiale

Celulele artificiale pot avea coninut divers i pot fi folosite n scopuri diverse: Celulele artificiale cu coninut de radioizotopi sau antimetabolii ar putea fi utilizate pentru injectarea intraatrial, n tratamentul tumorilor. n acest caz, o parte din capsule s-ar putea opri la locul tumorii, n timp ce altele ar putea fi transportate prin canaliculii limfatici pentru a aciona asupra celulelor tumorale metastazate n regiunea nodulilor limfatici Celulele artificiale cu material radiopac ar putea fi folosite ca vehicule pentru materialul de contrast n angiografie Celulele artificiale cu coninut de aliaj magnetic ar putea fi folosite pentru msurarea fluxului sangvin n vasele sangvine blocate